FR 2629717 A1 19891013 FR 8904668 A 19890410 Préparation de vaccin Cette invention concerne une préparation de vaccin. Plus particulièrement, la présente invention concerne une préparation de vaccin comprenant, comme composition effi- cace, une toxine ou une sous-unité de celle-ci. Les vaccins sont employés pour protéger contre divers types de maladies et donnent des résultats satisfaisants. Cependant, on observe parfois des effets secondaires ou un effet insuffisant du vaccin, et il s'est donc exprimé une forte demande pour son amélioration. Afin de réduire l'effet secondaire d'un vaccin, on a essayé de préparer un vaccin plus purifié ou d'administrer une quantité moindre de vac- cin, cependant ces essais ont conduit à un effet moindre du vaccin. On prépare actuellement divers vaccins pour l'homme à partir d'un pathogène ou d'un constituant de celui-ci. On ne peut donc pas éviter la contamination du constituant qui entre dans la construction du pathogène, ou du milieu uti- lisé pour la culture du pathogène, dans un vaccin et cela entraîne donc un effet secondaire de l'inoculation du vac- cin. Il est nécessaire de mettre au point un vaccin efficace ayant une efficacité immunitaire accrue sans effet secon- daire. Pour diminuer cet inconvénient, on a employé plusieurs moyens d'amélioration comme la diminution de la taille de l'inoculum du vaccin et le changement du mode d'administra- tion. On a découvert que l'on peut améliorer l'efficacité im- munitaire du vaccin en administrant le vaccin avec une toxi- ne bactérienne, en particulier la toxine du choléra, l'hémo- lysine a du staphylocoque, l'hémolysine 6 du staphylocoque, la Vibrio hémolysine directe thermostable, la toxine coque- lucheuse ou la toxine thermolabile de E. Coli, ou une sous- unité de celles-ci. Un but de la présente invention est de fournir une pré- paration de vaccin ayant une efficacité immunitaire accrue avec une quantité moindre d'administration de vaccin, sans diminuer l'efficacité immunitaire. Un autre but de la présente invention est de fournir une préparation de vaccin comprenant une toxine ou une sous- unité de celle-ci comme constituant efficace. Un autre but de la présente invention est encore de fournir une préparation de vaccin contenant une toxine bac- térienne. Un autre but de la présente invention est également de fournir une préparation de vaccin contenant une toxine bac- térienne choisie dans le groupe constitué par la toxine du choléra, l'hémolysine a du staphylocoque, l'hémolysine 6 du staphylocoque, la Vibrio hémolysine directe thermostable, la toxine coquelucheuse ou la toxine thermolabile de E. coli. Un autre but de la présente invention est encore de fournir une préparation de vaccin dans laquelle la sous- unité de la toxine est la sous-unité B. Un autre but de la présente invention est aussi ce fournir un vaccin choisi dans le groupe constitué par le vaccin antigrippal, le vaccin anticoquelucheux, l'anatoxine diphtérique et tétanique combinée au vaccin anticoquelu- cheux, le vaccin contre l'encéphalite japonaise, le vaccin contre l'hépatite B, le vaccin contre le rotavirus, le vac- cin antimorbilleux, le vaccin antirubéoleux et antiourlien et le vaccin antimycoplasmique. Un autre but de la présente invention est aussi de fournir une préparation de vaccin constituée par un mélange de vaccin et de toxine ou d'une sous-unité de celle-cl dans un rapport 1:0,0001 à 1:10 000 (% en poids/volume). Un autre but de la présente invention est aussi de fournir une préparation de vaccin comprenant un vaccin in- tranasal. Un autre but de la présente invention est également de fournir une préparation de vaccin sous forme injectable, pulvérisable ou sous forme d'administration orale. Pour illustrer la présente invention, on prendra comme exemple de vaccin le vaccin antigrippal et comme exemple de toxine bactérienne la toxine du choléra (désignée dans la suite par CT) et la sous-unité B de la toxine du choléra (désignée dans la suite par le CTB). On s'est intéressé à la toxine du choléra, qui est une endotoxine protéinique produite par Vibrio choiera, comme immunomodulateur local contre un vaccin administré par voie intranasale. La toxine du choléra est un immunogène intesti- nal efficace et est responsable de la diarrhée dans le cho- léra. En outre, on sait qu'il s'agit non seulement d'un im- munogène efficace qui provoque la production d'anticorps IgA, mais que c'est également un agent immunomodulant qui stimule les réponses immunitaires à l'antigène proteinique non apparenté administré simultanément, lorsqu'on administre simultanément la CT et l'antigène non apparente. Un effet de la CT a été défini comme une action qui augmente le taux in- tracellulaire de l'acide adénylique cyclique 3',5' dans les cellules de la muqueuse intestinale. Un mécanisme de l'ac- tion de la CT, qui se compose d'une sous-unité A et d'une sous-unité B, est que la CTB se lie au GM, ganglioside dans une membrane cellulaire, et à la sous-unité A qui pénètre dans la cellule et active l'adénylcyclase. La CTB, qui est le constituant non toxique de la CT, est egalement connue comme immunogène de la muqueuse de l'intestin lorsqu'elle est administrée simultanément à un antigène proteinique non apparenté. Ces faits suggèrent que CT et CTB peuvent toutes deux agir sur la muqueuse respiratoire, aussi bien que sur la muqueuse intestinale, pour stimuler les réponses lmmunl- taires locales aux antigènes coexistants non apparentés. On a examiné l'efficacité de la CT et de la CTB comme adjuvant sur la production locale et sérique d'anticorps pour la vaccination nasale de la souris en utilisant le vac- cin antigrippal HA (désigné dans la suite par vaccin HA). De plus, on a examiné l'efficacité de la CT et Qe la CTB comme adjuvant pour l'effet de la vaccination. Augmentation de l'effet de vaccination de la CTB, pour la vaccination nasale utilisant le vaccin HA, sur la réponse immunitaire: On a étudié les effets de la CTB sur les réponses des anticorps au vaccin HA (A/Yamagata) chez des souris recevant le vaccin avec la CTB par voie intranasale. Simultanément, on a comparé le résultat de l'administration intranasale avec celui des autres modes d'inoculation. Quatre semaines après la vaccination nasale, adminis- trée par l'introduction de gouttes de vaccin HA (2 gg) seul ou avec de la CTB (5 lg) par voie intranasale chez la souris (ou administrée par voie intraperitonéale ou sous-cutanée), on a dosé les taux d'anticorps dans le sérum inhibant l'he- magglutinine (dans la suite HI) et les taux d'anticorps IgA spécifiques à la grippe (dans la suite anticorps IgA anti- HA) et d'anticorps IgA spécifiques à la CTB (dans la suite anticorps IgA anti-CTB) dans un lavage nasal. Comme l'indique le tableau 2, le groupe temoin de sou- ris ayant reçu le vaccin HA seul par voie intranasale ne fait apparaître qu'un faible taux d'anticorps HI sérique. L'inoculation nasale de CTB avec le vaccin HA conduit à un taux d'anticorps HI sérique 64 fois plus élevé. On a egale- ment observé dans le lavage nasal des anticorps IgA anti-HA et IgA anti-CTB. L'inoculation intrapéritonéale ou sous-cu- tanée de vaccin HA seul a fait apparaitre un taux élevé d'anticorps HI sériques et les inoculations de vaccin HA avec CTB ont fait apparaître des taux encore accrus, de 4 à 8 fois supérieurs, d'anticorps HI sériques. Cependant, il n'y a pas eu apparition d'anticorps IgA anti-HA ou IgA anti- CTB nasals décelables. En conclusion, la CTB était un adjuvant efficace qui stimulait la production nasale d'anticorps IgA anti-HA lors- qu'elle était administrée par voie intranasale avec le vac- cin HA. Bien que le tableau 2 ne l'indique pas, on n'a décelé aucune IgA anti-HA sérique. Effet de la CTB sur la reponse primaire aes anticorps au vaccin HA après administration intranasale: On a examiné l'évolution de la production d'anticorps chez des souris ayant reçu par voie intranasale le vaccin HA (A/Yamagata, 2 lg) avec la CTB (5 lg). Commel'indique la figure 1, la production d'anticorps pour le vaccin sérique accompagne de la CTB a connu une aug- mentation rapide au cours de 1 à 2 semaines, puis a diminué progressivement jusqu'à la fin d'une période de 4 semaines. La quantité totale d'IgA dans le lavage nasal a rapidement augmenté jusqu'à un niveau maximum au bout d'une à deux se- maines d'inoculation, d'environ 6 fois celui du groupe té- moin. La quantité d'IgA anti-HA contenue dans ce lavage a augmenté progressivement après une à quatre semaine. On a commencé à pouvoir déceler les anticorps anti-HA dans le lavage nasal au bout d'environ 2 semaines apres l'administration de la CTB et du vaccin. Effet de la CTB sur les réponses primaires et secondaires des anticorps au vaccin HA: On a étudié l'effet de la CTB (5 lg) et de différentes quantités de vaccin HA (A/Yamagata) sur la réponse des anti- corps anti-HA. On a étudié la production primaire d'anticorps chez des souris ayant reçu une inoculation intranasale primaire des différentes doses de vaccin HA avec de la CTB, au bout de 4 semaines d'inoculation, puis la production secondaire d'an- ticorps a été détectée pendant 2 semaines supplémentaires chez des souris ayant reçu la seconde inoculation intrara- sale de vaccin HA (2 ig) seul. Comme l'indique le tableau 3,on a observe un faible ni- veau de production d'anticorps primaire, même à 8 gg d'ino- culation de vaccin HA seul. En revanche, la production d'an- ticorps IgA anti-HA nasals et la production d'anticorps HI sériques ont augmenté avec une augmentation de la dose intranasale de vaccin HA, même à 0,03 lg d'inoculation, lorsqu'on a administre en même temps la CTB. En outre, chez les souris ayant reçu la seconde inoculation intranasale de vaccin HA seul, après l'inoculation primaire, le niveau de production des anticorps anti-HI et IgA anti-HA s'est élevé énormément et était indépendant de la dose de vaccin HA pri- maire inoculée avec la CTB. Les souris ayant reçu une inocu- lation primaire de CTB de vaccin HA ont presente des taux extrêmement élevés de production d'anticorps HI et IgA anti- HA indépendants de la quantité d'inoculation primaire du vaccin HA. En particulier, le taux d'anticorps IgA anti-HA nasals était d'environ 50 à 100 fois plus eleve qu'après l'inoculation primaire. Ces résultats montrent que l'inocu- lation primaire de CTB stimule fortement la production d'anticorps au moment de l'inoculation secondaire sans pa- rallèle avec la quantité de vaccin HA. Autrement dit, la CTB peut produire efficacement la mémoire immunologique pour la production d'anticorps IgA nasals contre le vaccin HA en concentration relativement faible. Effets de la CTB sur l'augmentation de la réponse immunl- taire et sur la protection de la souris contre l'affection par le virus de la grippe: On a augmenté la reponse immunitaire contre le vaccin HA en administrant en même temps la CTB chez des souris. On a testé l'efficacité de la CTB comme adjuvant en realisant des expériences employant une souris adaptée au virus de la grippe, souche PR8. Les souris ont reçu une inoculation in- tranasale à la fois de vaccin HA PR8 (1,5 lg) et de CTB (5 4g) et, 4 semaines plus tard, une infection intranasale du virus PR8. Trois jours après l'infection, on a déterminé, à titre d'indice de protection, les titres pulmonaires du vi- rus. Comme l'indique le tableau 4, l'inoculation du vaccin avec la CTB a fourni une protection complète contre l'infec- tion déclenchante, sans permettre de deceler de virus dans le poumon des souris, ainsi que la production de taux élevés à la fois d'anticorps HI sériques et d'anticorps IgA anti-HA nasals chez les souris, et aucune souris n'a été infectée. Afin de confirmez le titre pulmonaire du virus au bout de 3 jours d'infection virale, à titre d'indicateur cae la résistance à l'infection contre l'infection virale chez la souris, on a inoculé les souris avec à la fois le vaccin HA et la CTB et, 4 semaines plus tard, on leur a inoculé par voie intranasale la souche PR8 du virus. Après l'infection, on a déterminé la variation des titres pulmonaires du virus. Comme l'illustre la figure 2, les souris, chez lesquel- les on a observé 3 jours après l'infection un virus pulmo- naire une indication de la résistance à l'infection. Effet de la dose de CTB ou de CT sur l'augmentation de la réponse immunitaire et la protection de la souris contre les infections par le virus de la grippe: On a étudié les effets de la dose de CT ou de CTB, ino- culée par voie intranasale avec le vaccin HA PR8 (1,5 gg) sur la protection contre la provocation par le virus PR8 et sur la production d'anticorps. Comme l'indique le tableau 5, on a observe une légère résistance à l'infection avec une dose de CTB (0,05 zg) et l'inoculation du vaccin avec 5 ig de CTB a produit une protection complete contre l'infection déclenchante. Le degré de résistance a l'infection semble être directement proportionnel au taux des anticorps IgA anti-HA dans le lavage nasal et au taux d'anticorps HI dans le sérum au bout de 4 semaines après l'inoculation du vaccin avec CTB. On a observé une protection complète à l'infection à des taux de CT supérieurs à 0,05 lg et, dans ces conditions, on a observé l'augmentation des anticorps HI dans le sérum et des anticorps IgA anti-HA dans le lavage nasal liée à l'augmentation du taux de CT. Ces résultats suggèrent que la CT est au moins 10 fois plus efficace que la CTB, sur la base de la dose, pour aug- menter la production d'anticorps HI dans le sérum et la pro- duction d'anticorps IgA anti-HA dans le lavage nasal neces- saires à. la protection contre l'infection. On peut utiliser la CT comme adjuvant efficace à faible dose, par rapport à la CTB, s'il n'y a pas d'effet secon- daire. On suggere qu'il est nécessaire, pour une protection complète contre l'infection par le virus PR8, que le titre d'anticorps HI soit de plus de 32 fois ceiui des anticorps dans le sérum et que le taux d'anticorps locaux soit supe- rieur à 2 unités d'anticorps IgA anti-HA. Le tableau 1 indique les activités adjuvantes de diffé- rentes toxines bactériennes. 26 2 9 7 1 7 Tableau 1 Taille de l'inoculurm Production Nbre de Toxines Toxine HA grippe HI d'anticorps souris (pg/souris) (pg/souris) 2) survivantes traitées Hemolysine m du O 5 1r 5 10,o 0 +l 7 5/5 staphylocoqu, Hemolysine 5 Vibrlo àmo- lysine direc 5 1i 5 11t 5 5/5 te thermo- 0 5 5 97 8+ 1 5/5 stable Toxine thermo- lablle de 5 1r 5 11, 8+0, 4 5/5 E. coli 0 5 1r5 10 8+2,2 5/5 Toxine 5 17 5 1 I1t 6+01 5 5/5 coquelucheus 0 5 17 5 10 2+ 11 7 5/5 Témoin O I 5 Tableau 2: Augmentation de la réponse des anticorps antiviraux au vaccin HA antigrippl. (A/Yarsagata) due a la CTB Inculaticn RGtue Subseta-obe bOe RPxnsesdes antiorps (4 smines) n0 Va3zin HA CTB Titre HI IqA nasales (2p g) (5 g) serpe IgA anti-HA IgA anti-CIB (2n) (,.té) ( Utuniés) 1 - - - 3 +0, 3 O 3 + - Intranasal 2s 3 7, 4 + 1t + - Intrap6riton6al2' 8 - 0, 3+0/ 1 2"5 + , 4, 5+2/ 1 6 0,. 03 + 2' 0O 7+01 3 215,s+ 7 60 +4 I%) ox ro 7 or 5 + 20,s + ,? 2, 5+ 0, 4 22,5s+"7 13+27 8 8 + 2"h,5+,' 4, 6+0t 3 2"1s+*' 78+1 0 Tableau 4: Protection contre l'infection avec le virus de la grippe (PR8) inoculé avec le vaccin HA et la CTB IuaLicn nasiae Anticrs antiviraux 4 Titre pLmeraire Frèce Galue Vaain HA CTB seanres aprs l 'inoculatkn des soris 3 los de l 'infectin n (1, 5#g) (51g) A,_tiors IgAanti-HA apxsl'infazicn (%) HI seériqes (tottés) E I Dso (2") (10") 1- - 3 + - 4 + + 2"' +"'' 4, 6 0, 7 10'5 0/5 (0) N Tableau 5: Effet de la dose de CTB ou de CT sur la protection contre l'infection PRawros des Inrulatin nsale répes des antic (4 semiro açis l'irxlatiUn) saris 3 jour GQue Vamin HA CTB (CT) Titre sriqe Nasal apés l'infeC in No. (1, 5Pg) (Cg) d'anto HI IgA anti-H IgA anti-CIB (EDso) (2")(1 (-..:s (u.it.s_ 1 2 - CTB (5) 3 + - 4 + CTB (0, 05) + 'CTB (O, 5) 2' s + ' 1t 2 +09 1 5 +1 0 10 l, 6 + CTB (5) 2'05 +s' 4t 6 0 7 3/ 7+0r 6 10 faits suivants. (1) L'administration du vaccin HA antigrippal avec la CT ou la CTB augmente la production immunitaire. (2) L'inoculation intranasale du vaccin HA avec la CTB élève l'augmentation de la production d'anticorps HI séri- ques et de la production d'IgA antl-HA intranasales locales. On n'observe pratiquement pas de production d'anti-corps IgA anti-HA intranasals locaux lorsqu'on effectue une inocula- tion intrapéritonéale ou sous-cutanée, mais on constate un taux élevé de production d'anticorps dans le sérum. On en conclut que la CTB révèle une augmentation d'ac- tivité de la production d'anticorps quelle que soit la voie d'inoculation. Ce fait signifie que l'administration mélangee de CT, de CTB, d'hémolysine a du staphylocoque, d'hémolysine b du staphylocoque, de Vibrio hémolysine directe thermostable, de toxine coquelucheuse ou de toxine thermolabile de E. coli avec le vaccin anticoquelucheux, l'anatoxine diphterique et tétanique combinée au vaccin anticoquelucheux, le vaccin contre l'hépatite B, le vaccin contre l'encéphalite japo- naise, le vaccin antimorbilleux, le vaccin antirubéoleux, le vaccin antiourlien, le vaccin mélangé antimorbilleux, anti- rubéoleux et antiourlien, le vaccin contre le rotavirus ou le vaccin antimycoplasmique, révèle un titre élevé en compa- raison de celui d'une seule dose de vaccin. En d'autres termes, on peut reduire la taille de l'ino- culum de vaccin en l'administrant avec une toxine et une sous-unité de celle-ci. (3) Le taux d'antigènes IgA anti-HA nasals locaux est accru au bout de 2 à 4 semaines grace à l'inoculation intra- nasale du vaccin avec la CTB. (4) La production d'anticorps au bout de 4 semaines après l'inoculation intranasale de vaccin avec la CTB est proportionnelle à la dose de vaccin inoculee. (5) Chez les souris ayant reçu la seconde inoculation intranasale du vaccin seul 4 semaines après l'inoculation primaire du vaccin avec la CTB, le taux de production d'an- ticorps secondaire 2 semaines après la seconde inoculation est énormément élevé et est indépendant de la dose de vaccin primaire inoculée avec la CTB. Par conséquent, la CTB peut efficacement produire la mémoire immunologique. (6) L'inoculation intranasale du vaccin avec la CTB chez la souris a produit une protection complete contre l'infection par le virus de la grippe et on a observe la production de taux élevés d'anticorps serlques et d'anti- corps IgA anti-HA nasals. Dans les présentes conditions expérimentales, chez les souris ayant conservé des taux d'anticorps HI sériques de plus de 32 fois les titres d'anticorps et des taux d'anti- corps nasals locaux de plus de 2 unites, on a observé une protection complète contre l'infection par le virus PR8. (7) La taille de l'inoculumn de CTB necessaire pour pro- voquer la production d'anticorps pour permettre la protec- tion complète contre l'infection, inoculée par voie intrana- sale avec le vaccin, est de l'ordre du ig. La CT peut provo- quer la production d'anticorps nécessaire pour une produc- tion complète contre l'infection à des doses inférieures au dixième de celles de la CTB. On peut préparer les toxines ou leurs sous-unités, uti- lisées dans la présente invention, conmme la CT ou la CTB, par des procédés connus, et elles sont également disponibles dans le commerce. La CT est toxique lorsqu'elle est adminls- trée en grande quantité, mais est non toxique lorsqu'elle est inoculée par voie intranasale ou intraperitoneale. La CTB est moins toxique que la CT et ne pose aucun probleme d'administration intranasale. Des exemples d'autres toxines sont l'hémolysine a du staphylocoque, l'hémolyslne 6 du sta- phylocoque, la Vibrio hémolysine directe thermostabme, la toxine coquelucheuse et la toxine thermolabile de E. coli. Des exemples de vaccins sont le vaccin antigrippal, le vaccin anticoquelucheux, l'anatoxine diphtérique et téta- nique combinée au vaccin anticoquelucheux, le vaccin contre l'hépatite B, le vaccin contre l'encéphalite Japonaise, le vaccin antimorbilleux, le vaccin antirubéoleux; le vaccin antiourlien, le vaccin mélangé antimorbilleux, antirubéoleux et antiourlien, le vaccin contre le rotavirus et le vaccin antimycoplasmique, ainsi que d'autres. On peut les produire par des procédés courants connus. La production et un pro- cédé de production sont décrits ci-dessous. Vaccin antigrippal: vaccin comprenant la totalité ou une partie de l'hémagglutinlne (HA), la neuraminldase (NA), la nucléoprotéine (NP) et la proteine matrice (M) que l'on obtient en purifiant le virus, qui est cultivé dans des oeufs fécondés, avec de l'éther et un detergent, ou par des tecnniques de génie génétique ou par synthese chimique. * Vaccin anticoquelucheux: vaccin comprenant la totalité ou une partie de la toxine coquelucheuse (PT), 1l'hémagglutinine (FHA) et l'agglutinine K, que l'on obtient à partir de la toxine avirulente avec de la formaline que l'on extrait par relargage ou ultracentrifugation dans un bouillon de culture ou des cellules bactériennes de Borde- tella pertussis, ou par des techniques de génie génétique ou par synthèse chimique. Anatoxine diphtérique et tétanique comDinee avec le vaccin anticoquelucheux: vaccin mélangé comportant le vac- cin anticoquelucheux et l'anatoxine diphtérique et téta- nique. Vaccin contre l'encéphalite japonaise: vaccin compre- nant la totalité ou une partie de la proteine antigene que l'on obtient par culture du virus dans le cerveau de la sou- ris et purification des particules de virus par centrifuga- tion ou à l'aide d'alcool.éthylique et inactlvation de ce- lui-ci, ou par une technique de genie genetlque ou par syn- thèse chimique. Vaccin contre l'hépatite B: vaccin comprenant la tota- lité ou une partie de la protéine antigene que l'on obtient par isolement et purification de l'antigène Hbs par relar- gage ou ultracentrifugation, obtenu à partir d'un sang por- teur de l'hépatite B, ou par génie génétique ou par synthèse chimique. Vaccin antimorbilleux:vaccln comprenant la totalité ou une partie du virus cultivé dans des cellules embryon- naires de poussin ou dans un oeuf fécondé, ou l'antigène protecteur obtenu par une technique de génie génétique ou par synthèse chimique. Vaccin antirubéoleux: vaccin comprenant la totalité ou une partie du virus cultivé dans des cellules embryonnaires de poussin ou dans un oeuf fécondé, ou l'antigène protecteur obtenu par une technique de genie génétique ou par synthèse chimique. Vaccin antiourlien: vaccin comprenant la totalite ou une partie du virus cultivé sur des cellules de lapin ou dans un oeuf fécondé, ou l'antigène protecteur obtenu par une technique de génie génétique ou par synthese chimique. Vaccin mélangé antimorbilleux, antlrubéoleux et an- tiourlien: vaccin comprenant le mélange des vaccins anti- morbilleux, antirubéoleux et antiourlien. Vaccin contre le rotavirus: vaccin comprenant la tota- lité ou une partie du virus cultivé dans des cellules MA 104 ou isolé dans les selles des patients, ou l'antigène protec- teur obtenu par une technique de génie genetique ou par syn- thèse chimique. Vaccin antimycoplasmique: vaccin comprenant la tota- lité ou une partie des cellules mycoplasmlques cultivees dans un milieu de culture liquide pour les mycoplasmes, ou l'antigène protecteur obtenu par une technique de genie ge- nétique ou par synthèse chimique. Les vaccins illustrés ci-dessus se trouvent sous forme liquide ou poudreuse. La forme liquide du vaccin est préférable pour l'admi- nistration intranasale, par exemple la pulvérisation lntra- nasale, l'instillation ou l'application ou l'injection avec la toxine ou sa sous-unité. On peut également appliquer une pulvérisation intranasale en poudre. La dose peut etre de 5 wil-50 gl par voie intranasale chez la souris et est de pre- férence de 0,1-0,5 ml pour l'administration intranasale ou l'injection chez l'homme. Ces posologies peuvent également être modifiées en conséquence. Le rapport de-mélange du vaccin et de la toxine ou de sa sous-unité est de 1:0,001 à 1:10 000 (en pourcentage en poids/volume) et dépend de la dose chez l'homme. On peut préparer le vaccin de la presente invention en mélangeant levaccin illustre ci-dessus avec la toxine ou sa sous-unité selon la proportion souhaitée. La préparation doit être faite strictement aseptiquement et chaque produit doit être aseptique. Les pyrogènes ou les allergènes doivent naturellement être éliminés aussi complètement que possible. La préparation du vaccin de la présente invention peut être effectuée par préparation séparee du vaccin proprement dit et de la toxine de sa sous-unite et melange avant l'ino- culation ou par inoculation séparée de chacun d'eux. L'exemple de référence suivant illustre le vaccin de la présente invention comprenant le vaccin antlgrippal et la CT ou la CTB, et son effet. Exemple de référence Animal: souris femelles Balb/c, âgées de 6 à 8 se- maines. Vaccin HA: les vaccins HA ont été préparés à partir du virus de la grippe par traitement à l'éther pour éliminer la composition lipidique. Le vaccin HA contient environ 30% du constituant HA. La taille de l'inoculum indiquee sur les ta- bleaux 2-5 est exprimée en quantité de HA. CT et CTB: la toxine de choléra (CT) et sa sous-unité B (CTB) ont été achetées chez Sigma Chemical Co., U.S.A. La préparation de CTB utilisée dans les présentes expériences n'a révélé aucune contamination décelable par la sous-unité A, ce que l'on a déterminé par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide. Immunisatlon: on a préparé une préparation de vaccin en diluant le vaccin HA ou l'adjuvant avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Les souris ont été anesthésiées par in- jection intrapéritonéale d'amobarbital sodium, puis immuni- sées par instillation intranasale de 20 il de la preparation de vaccin. En variante, elles ont été immunisées par injec- tion sous-cutanée ou intrapéritonéale de 100 il du vaccin. Echantillons de sérum et de lavage nasal: On a recueilli des échantillons de sérum chez des sou- ris en prélevant le sang entier de leur coeur. On a obtenu les échantillons de lavage nasals en lavant les cavités na- sales, 2 fois chacune avec au total 1 ml de PBS. Réaction d'inhibition de l'hémagglutlnatlon HI): On a préparé le sérum destiné au dosage du titre de HI après avoir éliminé des inhibiteurs non specifiques par un enzyme détruisant le récepteur (RED). On a dilue le serum 2 fois sur une plaque de microtitrage de type U et on l'a me- langé avec un virus à 16 unités de HA, que l'on a laisse re- poser pendant 30 minutes à la temperature ambiante. On y a ajouté, pour le dosage, 10 érythrocytes ce poussin. On a déterminé les résultats après un repos a la tempe- rature ambiante d'une heure. Dosage des IgA anti-HA, des IgA anti-CTB et des IgA to- tales: Les taux d'anticorps IgA antlviraux, anti-CTB et des IgA totales dans le lavage nasal et dans le serum ont été mesurés par ELISA. Les puits de chaque plaque EIA de 96 puits (demi-surface, Costar, Cambridge, MA) ont éte recou- verts de 50 u1 de vaccin HA (5 lAg/ml) ou bien de CTB (5 ig/ml). La plaque a été incubee pendant 2 heures a la tempe- rature ambiante, puis lavée 3 fois avec PBS-Tween. La solu- tion dans PBS (100 >1) contenant 1% de sérumalbumine ae bo- vin (BSA) et 0,1% de NaN3, a éte placée dans les puits pour les recouvrir et incubée pendant une nult à 4 C. Apres un lavage au PBS-Tween, on a introduit dans les puits chaque échantillon du sérum ou du lavage nasal. Les plaques ont ete incubées pendant 2 heures à la temperature ambiante et la- vées avec PBS-Tween. On a ajouté dans chaque puits des anticorps de chevre anti-IgA de souris couplés à l'alcaline-phospnatase (spéci- fiques à la chaîne c, 1:1000, Zymed LaDoratories, Inc., U.S.A., 50 1l). On a incube chaque plaque a la temperature ambiante pendant une heure, puis on l'a lavée avec PBS- Tween. On a enfin ajouté dans chaque puits du phosphate de p-nitrophényle (i mg/ml, Sigma Co.) dans au tampon a 10% de diéthanolamine à pH 9,8 (100 1l). Au bout de 20 à 30 minutes, on a lu l'absorbance des plaques à 410 nm (DO410) sur un "Auto Reader"I SJeia (modèle ER-8000, Sanko Junyaku Co., Tokyo). On a prepare une courbe d'étalonnage pour chaque plaque. On a construit, pour chaque dosage, une courbe de régression étalonnee, qui est trans- formée par une équation logit-log, et on a interpolé les in- connues en utilisant un programme sur l'Auto Reader SJeia. Une solution de mesure etalon d'IgA anti-HA est définie comme étant un étalon à 8 unités pour les anticorps IgA an- tiviraux, c'est-à-dire les échantillons nasals des souris ayant reçu 5 inoculations nasales répetees au vaccin HA à 2 semaines d'intervalle. Une solution etalon de mesure d'IgA anti-CTB est définie comme étant un étalon à 8 unites pour les anticorps IgA antiviraux, c'est-a-dire des échantillons nasals de souris 4 semaines après les inoculations nasales de CTB (5 ug). Les IgA totales ont été déterminées de la même manière que ci-dessus, sauf qu'on a ajouté dans chaque puits l'anti- corps de chèvre anti-IgA de souris (50 il, 1 gg/ml). On a employé, comme solution étalon, pour la mesure des IgA to- tales, des myélomes d'IgA de souris purifiés (Miles Labs. U.S.A.). Infection de la souris avec le virus PR8: On a anesthésié des souris, puis on les a infectées par instillation intranasale de 20 Al de suspension de virus contenant 0,01% de BSA dans la cavité nasale gauche. On a préparé la suspension de virus sous forme d'une suspension à 1/5 000- 10 000 du pool de virus initial, de 108,5 EID50, préparé par inoculation de 148 transferts chez le furet, de 596 transferts chez la souris et de 72 transferts chez la souris et 72 transferts dans des oeufs fécondés. Dans ces conditions infectieuses, plus de 90% des sujets non immuni- sés sont morts au bout de 14 jours ou ont formé une consoli- dation des poumons. Titrages du virus dans le poumon: Trois jours après l'infection, on a prélevé les poumons des souris, on les a homogénéisés pour obtenir une suspen- sion à 10% dans PBS, que l'on a centrifugée à 2500 t/min. On a préparé des dilutions successives (1:10) du surnageant d'homogénéisats de poumon individuels et on a injecté chaque dilution dans 5 oeufs fécondés. On a déterminé le titre pul- monaire du virus de chaque souris par le pouvoir d'hémagglu- tination du fluide allantoïdien et on l'a exprimé par la di- lution la plus faible de l'homogénéisat de poumon de EID50 qui provoquait l'infection dans les oeufs. Le titre pulmonaire du virus a été exprimé par la moyenne l'écart type. Dans certaines expériences, on a ré- uni les poumons de 5 souris dans un groupe pour préparer la suspension de poumon. Fréquence des infections: Les fréquences des infections ont été représentées par le hombre de souris infectées dans lesquelles le virus était présent à raison de plus de 101 dans l'homogénéisat de pou- mon (10%), pour 5 souris étudiées. Statistiques: Les valeurs de probabilité ont été calculées par le test de t de Student. Les exemples suivants illustrent la présente invention, mais ne sont pas destinés à la limiter. Exemple 1 Vaccin antiqrippal HA-CTB (préparation intranasale): On a mélangé le vaccin antigrippal HA (1 mg de HA/ml) et la CTB, dissoute dans PBS et filtrée de façon aseptique, pour préparer la solution intranasale de vaccin antigrippal HA-CTB (20 1Ll) contenant 1,5-2 ig de vaccin antigrippal HA et 3,5-250 gg de CTB, avec l'addition d'un conservateur et d'un stabilisant, et on l'a introduite dans des bouteilles. La préparation de vaccin a été conservée dans un endroit frais et sombre au-dessous de 10 C. L'effet de la prépara- tion de vaccin est illustré ci-dessus. Exemple 2 Vaccin antigrippal HA-CTB (injection): On a mélangé le vaccin antigrippal HA (1 mg de HA/ml) et la CTB, dissoute dans PBS et filtrée de façon aseptique, pour préparer la solution injectable de vaccin antigrippal HACTB (0,5 ml) contenant 1,5-2 gg de vaccin antigrippal HA et 2,5-250 gg de CTB, avec l'addition d'un conservateur et d'un stabilisant, et on l'a introduite dans des fioles. La préparation de vaccin a été conservée dans un endroit frais et sombre au-dessous de 10 C. L'effet de la préparation de vaccin est illustrée ci-dessus. Exemple 3 Vaccin contre l'hépatite B-CTB (injection): On a préparé le vaccin contre l'hépatite B-CTB pour in- jection en mélangeant le vaccin contre l'hépatite B et la CTB, dissoute dans PBS et filtrée de façon aseptique, pour préparer un mélange contenant l'antigène Hbs (40 ug de pro- téine) et la CTB (2,5-250 lg) dans 20 microlitres de solu- tion, avec l'addition d'un conservateur et d'un stabilisant, et on l'a introduit dans des fioles. On a conservé la prépa- ration de vaccin dans un endroit frais et sombre au-dessous de 10 C. On a inoculé la préparation de vaccin contre l'hépatite B ainsi préparée et CT à des souris et on a mesuré le titre sérique au bout de 3 semaines d'inoculation. Comme l'indique le tableau, les souris ayant reçu le vaccin contre l'hépatite B ont présenté un titre d'hémagglu- tination passive (PHA) de 25,6 unités et les souris ayant reçu en plus CT ont présenté un titre de PHA de 26,6 unités, ce qui prouve que la production d'anticorps a augmenté. Tableau: Augmentation de la production d'anticorps par addition de CT au vaccin contre l'hépatite B Titre d'anticorps FHA CT 26,6 pas d'addition 25,6 On a mesuré le titre d'anticorps par la réaction d'hé- magglutination passive. Les titres d'anticorps sont exprimés sur une moyenne de 5 souris. Exemple 4 Vaccin anticoquelucheux-CTB (intranasal): On a mélangé le vaccin anticoquelucheux et la CTB, dis- soute dans PBS et filtrée.de façon aseptique, pour préparer le vaccin anticoquelucheux-CTB intranasal en préparant un mélange de vaccin anticoquelucheux (14 ig d'azote protéique) et la CTB (25-250 gg) dans 20 il, et d'un conservateur et d'un stabilisant, et on l'a conditionné dans une bouteille. On a conservé le produit dans un endroit frais et sombre au- dessous de 10 C. On a ajouté de la CTB ou de la CT à 20.l de vaccin an- ticoquelucheux (13.g d'azote protéique) et on l'a inoculé par voie intranasale à des souris. Au bout de 4 semaines, on a administré par voie intranasale aux souris la même taille d'inoculum de vaccin et on a détermine le titre d'anticorps. Comme l'indique le tableau, les souris ayant reçu le vaccin anticoquelucheux seul ont présenté un taux d'anti- corps anticoquelucheux inférieur à 4,1 unités, et le vaccin anticoquelucheux avec la CTB ou la CT a produit respective- ment des taux d'anticorps anticoquelucheux de 140,3 unités et de 232,5 unités. Les taux d'anticorps anti-FHA des souris ayant reçu une inoculation de vaccin seul, de vaccin avec addition de CTB ou de vaccin avec addition de CT, étaient respectivement La production d'anticorps a augmenté chez les souris ayant reçu une administration de vaccin et de CTB ou de CT. Tableau: Augmentation de la production d'anticorps par le vaccin anticoquelucheux avec addition de CT ou de CTB Titre d'anticorps Anti-PT Anti-FHA CT 232,5 43,9 CTB 140,3 32,0 sans addition Exemple 5 Anatoxine diphtérique et tétanique combinée au vaccin anti- coquelucheux-CTB (intranasal): On a préparé l'anatoxine diphtérique et tétanique com- binée à une préparation intranasale de vaccin anticoquelu- cheux-CTB en mélangeant une anatoxine diphtérique et téta- nique combinée à un vaccin anticoquelucheux (désigné dans la suite par vaccin combiné), avec une CTB dissoute dans PBS et filtrée de façon aseptique, en préparant un mélange (20 1) du vaccin combiné (50 gg d'azote protéique) et de CTB (2,5- 250 gg), on a ajouté un conservateur et un stabilisant et on l'a introduite dans une bouteille. On a conservé la préparation dans un endroit frais et sombre au-dessous de 10 C. On a ajouté de la CTB au vaccin combiné, on l'a inoculé à des souris par voie intranasale et, au bout de 4 semaines, on a administré de nouveau la même taille d'inoculum, puis on a mesuré les titres d'anticorps. Comme l'indique le tableau, les souris ayant reçu le vaccin combiné seul ont présenté moins de 2,0 unités d'anti- corps anti-toxine coquelucheuse (PT), moins de 1,5 unités d'anticorps antidiphtérique (DT) et moins de 1,5 unités d'anatoxine antitétanique (TT) . La production d'anticorps a augmenté respectivement jusqu'à 150,0 unités, 110,5 unités et 120,0 unités, grâce à l'addition. de CTB. Tableau: Augmentation de la production d'anticorps par addition de CTB au vaccin combiné Antigène: taille CTB Production d'anticorps de l'inoculum | Titre ELISA Vaccin anticoque- lucheux 14 Zig 150,0 Anatoxine diphté- 5 lig rique 16 ig 110,5 Anatoxine tétani- que 15 gg 120,0 Vaccin anticoque- lucheux 14 ig Anatoxine tétani- que 15 _g Exemple 6 Vaccin contre l'encéphalite japonaise-CTB (injection): On a préparé le vaccin contre l'encéphalite japonaise - CTB (injection) en mélangeant le vaccin du virus de l'encé- phalite japonaise avec de la CTB dissoute dans PBS et fil- trée de façon aseptique, en préparant un mélange (1 ml) de particules de virus inactivé correspondant à 107,0 PFU d'encéphalite japonaise et 10,00 lig de CTB), on a ajouté un conservateur et un stabilisant, et on l'a introduit dans un flacon. On a conservé la préparation dans un endroit frais et sombre au-dessous de 10 C. Le vaccin contre l'encéphalite japonaise, avec ou sans la CTB ou la CT, a été inoculé à des souris 2 fois à inter- valle d'une semaine et on a mesuré le titre sérique d'anti- corps. Les titres d'anticorps neutralisant de virus d'encé- phalite japonaise, avec ou sans CTB ou CT, sont respective- ment de 101,88, >102,58 et >103,20, et la production d'anticorps a augmenté grâce à l'addition au vaccin de CTB ou de CT. Tableau: Augmentation de la production d'anticorps par addition de CT ou de CTB au vaccin contre l'encéphalite japonaise Titre Concentration neutralisant 10 0,05 gg/souris 3,39 CT 0,5 gg 3,20 ,0 ig 3,52 0,05 ig/souris 2,58 CTB 0,5 gg 2,70 ,0 ig 3,39 sans addition 1,88 Titres d'anticorps de sérums réunis de 10 souris Exemple 7 Vaccin antimorbilleux-CTB (intranasal): On a préparé la préparation intranasale de vaccin anti- morbilleux - CTB en mélangeant le vaccin antimorbilleux avec la CTB dissoute dans PBS et filtrée de façon aseptique, en préparant un mélange (20.l) de particules de virus corres- pondant à 20 il de vaccin antimorbilleux et à 5 ug de CTB, on a ajouté un conservateur et un stabilisant et on l'a in- troduite dans une bouteille. On a conservé la préparation dans un endroit frais et sombre au-dessous de 10 C. On a inoculé à des souris le vaccin antimorbilleux, avec ou sans CTB, 2 fois à 3 semaines d'intervalle, et on a mesuré la production d'anticorps sériques. Le titre d'anticorps ELISA après administration du vac- cin antimorbilleux seul était de 0,144, et celui après admi- nistration du vaccin additionné de CTB était supérieur à 0,209. On a observé une augmentation de la production d'an- ticorps en administrant le vaccin avec la CTB. Tableau: Augmentation de la production d'anticorps par addition de CTB au vaccin antimorbilleux Taille de l'inoculum Production d'anticorps Titre Antigène CTB ELISA Vaccin antimorbil- leux 20 lg 5 lg 0,21 Témoin 20 gg 5 gg 0,144 Exemple 8 * Vaccin antirubéoleux-CTB (intranasal): On a préparé une préparation intranasale de vaccin an- tirubéoleux-CTB en mélangeant le vaccin antirubéoleux avec la CTB dissoute dans PBS et filtrée de façon aseptique, en préparant un mélange (20 1il) de particules de virus corres- pondant à 20 ul de vaccin antirubéoleux et à 5 ig de CTB, on a ajouté un conservateur et un stabilisant et on l'a intro- duite dans une bouteille. On a conservé la préparation dans un endroit frais et sombre au-dessous de 10 C. On a inoculé à des souris le vaccin antirubéoleux, avec ou sans CTB, 2 fois à 3 semaines d'intervalle, et on a me- suré la production d'anticorps sériques. Le titre d'anticorps ELISA, après administration du vaccin antirubéoleux seul, était de 0,095, et celui produit par le vaccin additionné de CTB était supérieur à 0,920. On a observé une augmentation de la production d'anticorps lorsqu'on a administré le vaccin avec la CTB. Tableau: Augmentation de la production d'anticorps par addition de CTB au vaccin antirubéoLeux Taille de l'inoculum Production d'anticorps Titre Antigène CTB ELISA Vaccin antirubéoleux 20 zg 5 ig 0,920 Témoin 20 Wg 0;g 0,095 Exemple 9 Vaccin antiourlien-CTB (intranasal): On a préparé une préparation intranasale de vaccin an- tiourlien-CTB en mélangeant le vaccin antiourlien avec la CTB dissoute dans PBS et filtrée de façon aseptique, en pré- parant un mélange (20 1l) de particules de virus correspon- dant à 20 Al de vaccin antiourlien et à 5 zg de CTB, on a ajouté un conservateur et un stabilisant et on l'a intro- duite dans une bouteille. On a conservé la préparation dans un endroit frais et sombre au-dessous de 10 C. On a inoculé à des souris le vaccin antiourlien, avec ou sans CTB, 2 fois à 3 semaines d'intervalle, et on a me- suré la production d'anticorps sériques. Le titre d'anticorps ELISA, après administration du vaccin antiourlien seul, était de 0,028, et celui produit par l'administration du vaccin additionné de CTB était supé- rieur à 0,045. On a observé une augmentation de la produc- tion d'anticorps lorsqu'on a administré le vaccin avec la CTB. Tableau: Augmentation de la production d'anticorps par addition de CTB au vaccin antiourlien Taille de l'inoculum Production d'anticorps Titre Antigène CTB ELISA Vaccin antiourlien gg 5 ig 0,05 Témoin 20 gg 0 gg 0,028 Exemple 10 Vaccin mélangé antimorbilleux, antirubéoleux et antiourlien- CTB (intranasal): On a préparé une préparation intranasale de vaccin mé- langé antimorbilleux, antirubéoleux et antiourlien-CTB en mélangeant le vaccin mélangé avec la CTB dissoute dans PBS et filtrée de façon aseptique, en préparant un mélange (20 il) de particules de virus correspondant à 7 gg de vaccin antimorbilleux, à 1 gg de vaccin antirubéoleux et à 7 gg de vaccin antiourlien, ainsi qu'à 5 gg de CTB, on a ajouté un conservateur et un stabilisant et on l'a introduite dans une bouteille. La préparation a été conservée dans un endroit frais et sombre au-dessous de 10 C. On a inoculé à des souris le vaccin, avec ou sans CTB, 2 fois à 3 semaines d'intervalle, et on a mesuré la produc- tion d'anticorps sériques. Le titre d'anticorps ELISA, après l'administration du vaccin seul, était de 0,14, 0,09 et 0,15 respectivement pour le vaccin antimorbilleux, le vaccin antirubéoleux et le vac- cin antiourlien, et celui produit par le vaccin additionné de CTB était de 0,29, 0,30 et 0,24 respectivement. On a ob- servé une augmentation de la production d'anticorps lors- qu'on a administré le vaccin avec la CTB. Tableau: Augmentation de la production d'anticorps par addition de CTB au vaccin mélangé antimorbilleux, antirubéoleux et antiourlien Taille de l'inoculum Production d'anticorps -_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ Titre Antigène CTB ELISA Vaccin antimorbil- Morbilleux leux 7 g 0,29 Vaccin antirubéo- 5 gg Rubéoleux leux 7 gg 0,30 Vaccin antiourlien Ourlien 7 ug 0,24 Morbilleux 0,14 Témoin Rubéoleux 0,09 Ourlien ___ _0,15 Exemple 11 Vaccin contre le rotavirus-CTB (oral et intranasal): On a préparé une préparation orale et intranasale de vaccin contre le rotavirus-CTB en mélangeant le vaccin contre le rotavirus avec la CTB dissoute dans PBS et filtrée de façon aseptique, en préparant un mélange (20 il) des par- ticules de virus correspondant à 3,3 gl de vaccin contre le rotavirus et à 5 tg de CTB, on a ajouté un stabilisant et on l'a introduite dans une bouteille. La préparation a été conservée dans un endroit frais et sombre au-dessous de 10 C. On a inoculé à des souris le vaccin contre le rotavi- rus, avec ou sans CTB, 2 fois à 3 semaines d'intervalle et on a mesuré la production d'anticorps sériques. Le titre d'anticorps ELISA, après administration du vaccin seul, était de 0,089 pour l'administration intrana- sale, et celui produit par le vaccin addionné de CTB était de 0,281, et les chiffres pour l'administration orale étaient de 0,018 pour le vaccin seul et de 0,277 pour le vaccin addionné de CTB. On a observé une augmentation de la production d'anti- corps lorsqu'on a administré le vaccin avec la CTB. Tableau: Augmentation de la production d'anticorps par addition de CTB au vaccin contre le rotavirus T a i 1 1 e d e 1 ' i n o c u 1 u m Production i It ____________._ dd'anticorps A n t i g è n e CTB V a c ci n 3, 3 5 g g 0, 2 8 1 S4 9 Te m o n 3, 3 0 8 g9 c Vaccin 3,3 5#g 0 227 C i. O H i u O Témoin 3, 3 Qpg 001 Exemple 12 Vaccin antimycoplasmique-CTB (injection) On a préparé une préparation injectable de vaccin anti- mycoplasmique-CTB en mélangeant le vaccin antimycoplasmique avec la CTB dissoute dans PBS et filtrée de façon aseptique, en préparant un mélange (1 ml) de mycoplasme correspondant à 2,0 x 1010 UFC (unité formant des colonies) de vaccin et à lg de CTB, on a ajouté un stabilisant et on l'a intro- duite dans un flacon. La préparation a été conservée dans un lieu frais et sombre au-dessous de 10 C. On a inoculé à des poulets le vaccin, avec ou sans CTB, 3 fois à 2 semaines d'intervalle, et on a observé le nombre de lésions après provocation par l'infection mycoplasmique. L'administration de vaccin additionné de CTB a présenté un effet protecteur marqué en comparaison de celui du vaccin seul. Tableau: diminution des lésions après provocation par infection mycoplasmique par administration d'un vaccin antimycoplasmique avec CTB Taille de l'inoculum Lésion Antigène CTB Cellules mycoplasmiques totales*** * ** 1, 0 x 1010 UFC 5 gg 3/10 125 Traitement par ultrasons 1,0 x 1010 UFC 5 g 3/11 129 Témoin 1,0 x 1010 UFC 0.g 10/10 277 *: Nombre d'animaux présentant des lésions/nombre d'animaux étudiés **: Valeur moyenne des lésions **: UFC Exemple 13 Vaccin anticoquelucheux-CTB (intranasal): On a préparé un vaccin anticoquelucheux-CTB (intrana- sal) en mélangeant le vaccin anticoquelucheux avec la CTB dissoute dans PBS et filtrée de façon aseptique, en prépa- rant un mélange (20 gl) de vaccin anticoquelucheux (14 Hg d'azote protéique) et de 2,5-250 jg de CTB, en ajoutant un conservateur et un stabilisant et en l'introduisant dans une bouteille. La préparation a été conservée dans un lieu frais et sombre au-dessous de 10 C. On a ajouté la CTB ou la CT à 20 il de vaccin antico- quelucheux (13 ug d'azote protéique) et on l'a inoculé à des souris par voie intranasale. Au bout de 4 semaines, on a ad- ministré par voie intranasale à des souris la même taille d'inoculum de vaccin et on a déterminé le titre d'anticorps. Comme l'indique le tableau, les souris ayant reçu le vaccin anti-PT seul ont présenté moins de 4,2 unités d'anti- corps anti-PT et celles ayant reçu le vaccin anti-PT avec la CTB ou la CT ont présenté respectivement 150,3 unités d'an- ticorps anti-PT et 230,5 unités d'anticorps anti-PT. Les anticorps antiFHA de souris inoculés avec le vaccin seul, avec le vaccin plus CTB ou CT, étaient respectivement unités, ticorps a augmenté chez les souris ayant reçu une adminis- tration du vaccin avec la CTB ou la CT. Tableau: Augmentation de la production d'anticorps par le vaccin anticoquelucheux additionné de CT ou de CTB Titre d' anticorps Anti-PT Anti-FHA CT 230,5 40,5 CTB 150,3 30,0 sans addition Exemple 14 Anatoxine diphtérique et tétanique combinée avec le vaccin anticoquelucheux-CTB (intranasal): On a préparé une préparation intranasale d'anatoxine diphtérique et tétanique combinée au vaccin anticoquelu- cheux-CTB en mélangeant une anatoxine diphtérique et téta- nique combinée avec le vaccin anticoquelucheux (désigné dans la suite par vaccin combiné) avec la CTB dissoute dans PBS et filtrée de façon aseptique, en préparant un mélange (20 il) du vaccin combiné (50 gg d'azote protéique) et de 2,5- 250 g de CTB, on a ajouté un conservateur et un stabilisant et on l'a introduite dans une bouteille. La préparation a été conservée dans un lieu frais et sombre au-dessous de 10 C. On a ajouté de la CTB au vaccin combiné, on a inoculé la préparation à des souris par voie intranasale et, au bout de 4 semaines, on a ensuite administré la même taille d'ino- culum, puis on a mesuré les titres d'anticorps. Comme l'indique le tableau, les souris ayant reçu le vaccin combiné seul ont présenté moins de 1,8 U.I. d'anti- corps antitoxine coquelucheuse (PT), moins de 1,4 unités d'anticorps antidiphtérique (DT) et 1,2 unités d'anatoxine antitétanique (TT). La production des anticorps a augmenté de 0,3, par addition de CTB, respectivement à 140,0, 80,5 et ,5 U.I. Tableau: Augmentation de la production d'anticorps par addition de CTB au vaccin combiné Antigène: Taille de l'inoculum CTB Production d'anticorps Titre ELISA Vaccin anticoquelucheux 14 ig 140,00 Anatoxine diphtérique 16 gg 5 ig 80,5 Afiatoxine tétanique 15 __ 100,2 Vaccin anticoquelucheux 14 gg Exemple 15 Vaccin antirubéoleux-CTB (intranasal): On a préparé une préparation intranasale de vaccin an- tirubéoleux-CTB en mélangeant le vaccin antirubéoleux avec la CTB dissoute dans PBS et filtrée de façon aseptique, en préparant un mélange (20 il) de particules de virus corres- pondant à 3 gg de vaccin antirubéoleux et à 5 ig de CTB, en ajoutant un stabilisant et en l'introduisant dans une bou- teille. La préparation a été conservée dans un lieu frais et sombre au-dessous de 10 C. On a inoculé à des souris le vaccin antirubéoleux, avec ou sans CTB, 2 fois à 3 semaines d'intervalle, et on a me- suré la production d'anticorps sériques. Le titre d'anticorps ELISA, après administration du vaccin antirubéoleux seul, était de 0,133, et celui produit par le vaccin additionné de CTB était supérieur à 0,854. On a observé une augmentation de la production d'anticorps lorsqu'on a administré le vaccin avec la CTB. Tableau: Augmentation de la production d'anticorps par addition de CTB au vaccin antirubéoleux Taille de l'inoculum Production d'anticorps Antigène CTB titre ELISA Vaccin antirubéoleux 3 gg 5 gg 0,854 Témoin 3 lg 0 lg 0, 133 Exemple 16 Vaccin antimorbilleux-CTB (intranasal) On a préparé une préparation intranasale de vaccin an- timorbilleux-CTB en mélangeant le vaccin antimorbilleux avec la CTB dissoute dans PBS et filtrée de façon aseptique, en préparant un mélange (20 il) des particules de virus corres- pondant à 20 lg de vaccin antimorbilleux et à 5 gg de CTB, on a ajouté un stabilisant et on l'a introduite dans une bouteille. La préparation a été conservée dans un lieu frais et sombre au-dessous de 10 C. On a inoculé à des souris le vaccin antimorbilleux, avec ou sans CTB, 2 fois à 3 semaines à d'intervalle, et on a mesuré la production d'anticorps sériques. Le titre d'anticorps ELISA, après administration du vaccin antimorbilleux seul, était de 0,182, et celui produit par le vaccin additionné de CTB était supérieur à 0,332. On a observé une augmentation de la production d'anticorps lorsqu'on a administré le vaccin avec la CTB. Tableau: Augmentation de la production d'anticorps par addition de CTB au vaccin antimorbilleux Taille de l'inoculum Production d'anticorps Antigène CTB titre ELISA Vaccin antimorbilleux 20 lg 5 g 0,332 Témoin 20. g 0 lg 0,182 Exemple 17 Vaccin antiourlien-CTB (intranasal): On a préparé une préparation intranasale de vaccin an- tiourlien-CTB en mélangeant le vaccin antiourlien avec la CTB dissoute dans PBS et filtrée de façon aseptique, en pré- parant un mélange (20 il) des particules de virus correspon- dant à 20 gg de vaccin antiourlien et à 5 gg de CTB, on a ajouté un stabilisant et on l'a introduite dans une bou- teille. La préparation a été conservée dans un lieu frais et sombre au-dessous de 10 C. On a inoculé à des souris le vaccin antiourlien, avec ou sans CTB, 2 fois à 3 semaines à d'intervalle, et on a me- suré la production d'anticorps sériques. Le titre d'anticorps ELISA, après administration du vaccin antiourlien seul, était de 0,023, et celui produit par le vaccin additionné de CTB était supérieur à 0,074. On a observé une augmentation de la production d'anticorps lorsqu'on a administré le vaccin avec la CTB. Tableau: Augmentation de la production d'anticorps par addition de CTB au vaccin antiourlien Taille de l'inoculum Production d'anticorps Antigène CTB titre ELISA Vaccin antiourlien 20 gg 5 Zg 0,074 Témoin 20 gg 0 g 0,023 Exemple 18 Vaccin mélangé de vaccin antimorbilleux, antirubéoleux et antiourlien-CTB (intranasal): On a préparé une préparation intranasale de vaccin mé- langé antimorbilleux, antirubéoleux et antiourlien-CTB en mélangeant le vaccin mélangé avec la CTB dissoute dans PBS et filtrée de façon aseptique, en préparant un mélange (20 il) de particules de virus correspondant à 7 gg de vaccin antimorbilleux, à 1 gg de vaccin antirubol1eux et à 7 Ug de vaccin antiourlien, ainsi qu'à 5 ug de CTB, on a ajouté un stabilisant et on l'a introduite dans une bouteille. La préparation a été conservée dans un lieu frais et sombre au-dessous de 10 C. On a inoculé à des souris le vaccin, avec ou sans CTB, 2 fois à 3 semaines d'intervalle, et on a mesuré la produc- tion d'anticorps sériques. Le titre d'anticorps ELISA, après administration du vaccin seul, était respectivement de 0,18, 0,07 et 0,13 pour le vaccin antimorbilleux, le vaccin antirubéoleux et le vac- cin antiourlien, et celui produit par le vaccin additionné de CTB était respectivement de 0,34, 0,27 et 0,28. On a ob- servé une augmentation de la production d'anticorps lors- qu'on a administré le vaccin avec la CTB. Tableau: Augmentation de la production d'anticorps par addition de CTB à un vaccin mélangé antimorbilleux, antirubéoleux et antiourlien Taille de l'inoculum Production _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _d'anticorps Antigène CTB titre ELISA Vaccin antimorbilleux 7 lg Morbilleux 0,34 Vaccin antirubéoleux 1 gg 5 gg Rubéoleux 0,27 Vaccin antiourlien 7 l Ourlien 0, 28 Morbilleux 0,18 Témoin 0 gg Rubéoleux 0,07 Ourlien 0,13 Exemple 19 Vaccin contre le rotavirus-CTB (peroral et intranasal): On a préparé une préparation orale et une préparation intranasale de vaccin contre le rotavirus-CTB en mélangeant le vaccin contre le rotavirus avec de la CTB dissoute dans PBS et filtrée de façon aseptique, en préparant un mélange (20 il) de particules de virus correspondant à 3,3 ig de vaccin contre le rotavirus et à 5.g de CTB, on a ajouté un stabilisant et on l'a introduite dans une bouteille. La préparation a été conservée dans un lieu frais et sombre au-dessous de 10 C. On a inoculé à des souris le vaccin contre le rotavi- rus, avec ou sans CTB, 2 fois à 3 semaines d'intervalle, et on a mesuré la production d'anticorps sériques. Le titre d'anticorps ELISA était, pour l'administration intranasale, de 0, 063 après administration du vaccin seul et de 0,348 après administration du vaccin additionné de CTB, et, pour l'administration orale, de 0,024 avec le vaccin seul et de 0,177 avec le vaccin additionné de CTB. On a observé une augmentation de la production d'anti- corps lorsqu'on a administré le vaccin avec la CTB. Tableau: Augmentation de la production d'anticorps par addition de CTB au vaccin contre le rotavirus Taille de l'inoculum Production d'anticorps A n t i g è n e- C B titre ELISA Vaccin 3,3 pg 5 p g 0, 3 4 8 > oa Témoin 3/3 ieag e0 v i 06t3 4-sj Q s- H sm Vaccin 3m3 pg 5-P g 0v 1 7 7 U U Témoin 3,3 #g 0 #u g 0, 0 2 4 Exemple 20 Vaccin antimycoplasmique-CTB (injection) on a préparé une préparation injectable de vaccin anti- mycoplasmique-CTB en mélangeant le vaccin antimycoplasmique avec de la CTB dissoute dans PBS et filtrée de façon asep- tique, en préparant un mélange (1 ml) de mycoplasme corres- pondant à 2,0 x 1010 UFC (unité formant des colonies) de vaccin et à 10 gg de CTB, on a ajouté un stabilisant et on l'a introduite dans un flacon. La préparation a été stockée dans un lieu frais et sombre au-dessous de 10 C. Le vaccin, avec ou sans CTB, a été inoculé à des pou- lets 3 fois à 2 semaines d'intervalle et on a observé le nombre de lésions après provocation par infection mycoplas- mique. L'administration de vaccin additionné de CTB a présenté un effet protecteur marqué en comparaison de celle du vaccin seul. Tableau: Diminution des lésions après provocation par infection mycoplasmique après administration du vaccin antimycoplasmique avec CTB Taille de l'inoculum Lésions Antigène CTB Cellules mycoplasmiques totales*** * ** 1, 0 x 1010 UFC 5 ig 3/12 1,23 Traitement par ultrasons 1,0 x 1010 UFC 5 gg 2/11 1,27 Témoin 1,0 x 1010 UFC 0 Hg 10/10 2,77 *:nombre d'animaux présentant une lésion/nombre d'animaux utilisés **: moyenne des lésions/groupe **: UFC Les figures lA-1D représentent la production d'anti- corps primaires en fonction du temps par administration d'un vaccin de la présente invention. La figure 2 représente le nombre de lésions par infec- tion au poumon après administration d'un vaccin de la pré- sente invention. R E V E N D I C A T IONS 1.- Préparation de vaccin comprenant une toxine ou une sous-unité de celle-ci comme constituant efficace. 2.- Préparation de vaccin selon la revendication 1, carac- térisée en ce que la toxine est une toxine bactérienne. 3.- Préparation de vaccin selon la revendication 1, carac- térisée en ce que la toxine bactérienne est la toxine de choléra, l'hémolysine a du staphylocoque, l'hémolysine 6 du staphylocoque, la Vibrio hémolysine directe thermostable, la toxine coquelucheuse ou la toxine thermolabile de E. coli. 4.- Préparation de vaccin selon la revendication-1, carac- térisée en ce que la sous-unité de toxine est la sous-unité B ou une partie de la sous-unité B. 5.- Préparation de vaccin selon la revendication 1, carac- térisée en ce que le vaccin est le vaccin antigrippal, le vaccin anticoquelucheux, le vaccin contre l'encéphalite ja- ponaise, le vaccin mélangé anti-coquelucheux et d'anatoxine diphtérique et tétanique, le vaccin contre l'hépatite B, le vaccin contre le rotavirus, le vaccin antimorbilleux, le vaccin antirubéoleux, le vaccin antiourlien, le vaccin com- biné antimorbilleux, antirubéoleux et antiourlien, ou le vaccin antimycoplasmique. 6.- Préparation de vaccin selon la revendication 1, carac- térisée en ce que le rapport de mélange du vaccin et de la toxine ou de sa sous-unité est de 1:0,0001 à 1:10 000 (en poids/volume). 7.- Préparation de vaccin selon la revendication 1, carac- térisée en ce qu'il s'agit d'un vaccin intranasal. 8.- Préparation de vaccin selon la revendication 1, carac- térisée en ce qu'elle est sous forme injectable, sous forme de pulvérisation ou sous forme d'administration orale.