FR 2628429 A1 19890915 FR 8802925 A 19880308 La présente invention concerne des variants de l'hi- rudine, leurs utilisations et les procédés pour les obtenir. L'hirudine naturelle est un mélange de peptides de 65 et 66 acides aminés secrétés en très petite quantité par les glandes salivaires de la sangsue médicinale (Markwardt 1970; Petersen et al. 1976; Chang 1983; Dodt et al. 1984, 1985, 1986; Harvey et al. 1986). Le premier variant décrit, HV1, correspond à l'hirudine qu'on isole du corps de la sangsue; le deuxième, HV2 (Harvey et al. 1986) diffère du premier par 9 acides aminés, le troisième (Dodt et al. 1986) est identique à HV2 jusqu'à la sérine 32 mais diffère par 10 acides aminés dans la partie C-terminale, qui comprend en outre un acide aminé supplémentaire (kla6e). Ce troisième variant est désigné par HV3. Les structures de ces trois variants sont décrites sur la figure 1. Les séquences de ces variants naturels comportent 65 ou 66 acides aminés et peuvent être considérées comme deux domaines: une partie N-terminale globulaire qui contient 3 ponts disulfures et une partie C-terminale acide qui présente une homologie avec le site de clivage par la thrombine dans la molécule de prothrombine. Cette homologie a permis de penser que la région qui entoure la position 47 pouvait être un site de fixation de l'hirudine sur la thrombine. C'est pourquoi la Demanderesse a déjà décrit, dans la demande de brevet européen ne 87402696.6 des variants de l'hirudine qui comportent un acide aminé différent de l'acide aminé existant dans la forme naturelle en position 47. En particulier, le variant HV2 (Lys41) a été décrit comme présentant des cinétiques d'inhibi- tion de la thrombine améliorées et une activité antithromboti-. que plus grande que la molécule non-modifiée. La présente invention a pour objet de nouveaux variants de l'hirudine présentant des propriétés biologiques améliorées. Tout d'abord, afin d'améliorer le profil pharmacoci- nétique de la molécule d'hirudine pour prolonger son action in vivo et ainsi diminuer la dose thérapeutique nécessaire, on peut introduire des modifications post-traductionnelles cova- lentes, en particulier des chaînes latérales hydrocarbonées qui peuvent masquer les sites du polypeptide responsables de l'élimination de la molécule de la circulation. C'est pourquoi on crée sur la molécule un ou piu- sieurs sites de glycosylation susceptibles de favoriser l'ad- dition des chaînes hydrocarbonées. La glycosylation s'effectue souvent sur des résidus Asn en des sites spécifiques de recon- naissance Asn-X-Thr ou Asn-X-Ser et sur l'hirudine, une modi- fication possible consiste à remplacer l'acide aminé Lys35 par l'acide aminé Thr35, ce qui conduit à la séquence Asn33-Gly34- Thr3 5. D'autre part, l'hirudine naturelle ne possède pas de sites spécifiques de reconnaissance par les récepteurs de surface des cellules sanguines. Pour modifier le mode d'action in vivo de l'hirudine, il a paru intéressant d'introduire dans la molécule d'hirudine une séquence Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS) pour permettre une meilleure interaction avec les récepteurs de surface des cellules. Cette séquence RGDS est présente dans le fibrinogène sur un site impliqué dans la liaison avec le récepteur plaquettaire GpIIb/IIIa. Des travaux récents (Ruggeri et al., 1986) ont pu démontrer que l'interaction fibrinogène, GpIIb/IIIa était nécessaire pour l'agrégation plaquettaire et que les peptides comportant une séquence RGDS inhibaient l'agrégation plaquettaire. Enfin, dans les cas o l'hirudine est préparée par les techniques du génie génétique, notamment par expression et sécrétion à partir de la levure Saccharomyces cerevisiae, on a constaté qu'au cours de sa production l'hirudine pouvait subir des dégradations indésirables à l'extrémité C-terminale sous l'effet de carboxypeptidases. Pour réduire ces dégradations l'invention propose de modifier l'extrémité C-terminale de la molécule en lui ajoutant un ou plusieurs acides aminés, par exemple la proline. L'invention a donc pour objet des variants de l'hi- rudine, caractérisés en ce que la structure peptidique de ces variants comporte, par rapport aux variants de base HV, une des modifications suivantes: - dans au moins un site Asn-X-Y de HV o X est un acide aminé quelconque, Y est choisi parmi Ser ou Thr; - une séquence Arg-Gly-Asp-Ser remplace une séquence d'acides aminés; - au moins un acide aminé supplémentaire est ajouté à l'extré- mité C-terminale; les variants de base HV sont choisis parmi: HVl, HV2, HV3, HV2 (Val1, Val2), HV1 (AA63), HV2 (AA63), HV3 (AA64), HV2 (Val1, Val2, AA63), HV2 (Lys47), HV2 (Val1, Val2, Lys47), HV2 (Lys47, AA63), HV2 (Val1, Val2, Lys47, AA63), et AA est choisi parmi Glu et Asp. Les variants de base peuvent être obtenus selon des procédés décrits dans la demande de brevet européenne 87.402696.6 au nom de la Demanderesse. L'invention concerne en particulier une famille de molécules hybrides dans lesquelles HV est HV2 (Lys47) et qui, en plus d'au moins l'une des modifications précédentes, ou comme seule modification, comportent à la place des acides aminés Ilel-Thr2 les acides aminés Vall-Val2. Il s'agit en particulier des variants de: HV2 (Lys47), HV2 (Lys47, AA63), HV2 (Vall, Val2, Lys47), HV2 (Val1, Val2, Lys47, AA63). L'un des sites plus particulièrement utilisable pour effectuer la première modification se situe au niveau des acides aminés 33 à 35 de HV2, en remplaçant (Lys35) par (Thr35) ou (Ser35). 4 2628429 L'un des sites plus particulièrement utilisable pour effectuer la seconde modification se situe sur les acides aminés 33 à 36 et les variants (Arg33, Asp35, Ser36) sont les plus intéressants, en particulier le variant de HV2 (Lys47). Bien qu'il soit possible d'ajouter un acide aminé quelconque à l'extrémité C-terminale, on préfère utiliser la proline, par exemple le variant HV2 (Lys47, Pro66). Enfin, pour obtenir une plus forte activité inhi- bitrice de la thrombine, des propriétés pharmacocinétiques améliorées, une plus grande stabilité et une action antithrom- botique améliorée par rapport au variant HV2 (Lys47) qui a été décrit par la Demanderesse dans la demande de brevet européen n 87402696.6, les variants suivants présentent un grand intérêt: A B TYR THR ASP CYS THR GLU SER GLY GLN ASN LEU CYS LEU CYS GLU GLY SER ASN VAL CYS GLY LYS GLY ASN LYS CYS ILE LEU GLY SER ASN GLY LYS GLY ASN GLN CYS VAL THR GLY GLU GLY THR PRO LYS PRO GLU SER HIS ASN ASN GLY ASP PHE GLU GLU ILE PRO GLU GLU C LEU GLN dans laquelle A-B représente Ile-Thr ou Val-Val et C représen- te Glu ou. Asp. En effet, la sulfatation de la tyrosine 63 constitue peut-être une différence importante entre l'hirudine naturelle et l'hirudine obtenue par recombinaison génétique, comme le suggéraient les études cinétiques de Stone et Hofsteenge (1986). C'est pourquoi, dans les dérivés précédents, la (Tyr63) a été remplacée par Glu ou Asp. Les modifications précédentes peuvent se cumuler. Parmi les variants en cause, il faut citer de préférence: HV2 (Lys47, Asp63) HV2 (Lys47, Asn33-Gly34-Thr35) HV2 (Lys47, Arg33, Asp35, Ser36) HV2 (Lys47, Pro66) ainsi que les variants: (Val1-Val2) HV2 (Lys47) (Val1Val2) HV2 (Lys47, Asp63) (Vall-Val2) HV2 (Lys47, Thr35) (Vall-Val2) HV2 (Lys47, Arg33, Asp35, Ser36) (Vall-Val2) HV2 (Lys47, Pro66). Les différents variants qui ont conservé la Tyr63 peuvent être utilisés sous forme sulfatée ou non. Cette sulfatation peut être obtenue chimiquement ou par voie biologique. La présente invention s'étend aux procédés biologi- ques et/ou chimiques permettant de préparer les variants men- tionnés ci-dessus. On peut en effet obtenir ces variants par synthèse, hémisynthèse et/ou par les techniques connues du génie généti- que. Ainsi par exemple le clonage et l'expression de la séquence codant pour HV2 et l'obtention de l'hirudine corres- pondante à partir de levures ont été décrits dans la publica- tion européenne de brevet EP.A.200 655. Les variants selon l'invention peuvent être obtenus par des techniques équivalentes après avoir modifié la séquen- ce codant pour HV2 par exemple par mutagénèse dirigée. En particulier par mutagénèse dirigée in vitro on a construit des variants HV2 o l'asparagine 47 est remplacée par une lysine et o soit la lysine 35 est remplacée par une thréonine, soit l'asparagine 33 est remplacée par une argini- ne, la lysine 35 par un aspartate et la glycine 36 par une sérine, soit la tyrosine 63 est remplacée par un aspartate soit encore la séquence Ile1 Thr2 est remplacée par Vall-Val2. En particulier, il est possible d'utiliser des blocs d'expression fonctionnels dans la levure tels que décrits dans la demande de brevet EPA-200 655 et dans lesquels la séquence de l'hirudine code pour les variants précédents; ces blocs fonctionnels d'ADN peuvent être portés par un plasmide vec- teur. Pour diriger l'expression et la sécrétion par la levure des gènes correspondant aux différents variants, ceux- ci sont intégrés dans un vecteur de levure qui comprend, de préférence, les éléments suivants, qui ont été décrits dans la demande EP-A-200 655: l'origine de réplication du plasmide de levure 2 y, - le gène ura3, - une origine de réplication dans E. coli et un marqueur de résistance à un antibiotique, - un promoteur de transcription, la séquence "leader" et la séquence pre-pro du précurseur du facteur alpha, fusionnée en phase, en amont de la séquence codante du variant de l'hirudine, - le terminateur de transcription du gène PGK de la levure, qui sera placé en aval du gène dudit variant. L'invention concerne également les levures transfor- mées par ces vecteurs ou par ce bloc fonctionnel d'ADN et leur application à la préparation des variants de l'hirudine. En particulier, l'invention concerne un procédé de préparation d'un variant de l'hirudine par fermentation d'une levure selon l'invention et récupération de l'hirudine pro- duite dans le milieu de culture sous forme mature ou sous forme d'un précurseur maturable in vitro. Les techniques mises en oeuvre ont déjà été décrites plus en détail dans les demandes de brevet EP-A-200 655 et EP- 87 401649.6. Les variants de l'hirudine ainsi obtenus peuvent être utilisés comme cela est décrit dans la demande de. brevet EP-A-200 655 en tant qu'inhibiteur de la thrombine, tant in vivo que in vitro. En particulier, ces variants peuvent être utilisés dans des compositions pharmaceutiques, seuls ou en combinaison avec d'autres principes actifs, ou bien dans le cadre de tests ou de diagnostic, in vitro ou in vivo. Dans ce dernier cas, il peut être intéressant de marquer les variants, par exemple par un marquage radioactif, fluorescent, enzymatique ou autre. La présente invention est illustrée par les exemples suivants à l'aide de la figure 1 qui représente les séquences des 3 variants naturels de l'hirudine et de la figure 2 qui représente le pourcentage d'inhibition de l'activité protéoly- tique de la thrombine sur le chromozyme en fonction des volu- mes de surnageants des cultures de levure produisant les variants de l'hirudine HV2 (Lys47), notés HV2L. Exemple 1 Obtention de gènes mutés codant pour des va- riants de l'hirudine HV2 (Lys47), par mutagénèse dirigée in vitro. Pour effectuer une mutagénèse dirigée in vitro, le fragment d'ADN que l'on veut modifier est cloné dans la forme réplicative d'un phage M13 simple brin; le génome du phage recombinant est isolé et mis à hybrider avec un oligonucléoti- de synthétique qui porte la séquence mutée. Cet oligonucleoti- de sert d'amorce & la synthèse du brin complémentaire et 1'ADN rendu ainsi double brin est utilisé pour transformer une bac- térie réceptrice qui va produire du phage portant la mutation recherchée (Zoller and Smith, 1983). La séquence codante de l'hirudine HV2 a été manipu- lée pour en faire une "cassette d'expression" fonctionnelle dans la levure et pour assurer la sécrétion de la protéine synthétisée. Pour cela, un segment d'ADN codant pour la sé- - quence pre-pro de l'a-phéromone de levure a été placé en amont du gène. Cette construction s'appelle pTG1833. La cassette d'expression de l'hirudine a été récupé- rée sous forme de fragment PstI-BglII pour être introduite dans un dérivé du phage M13, le M13TG131 (Kieny et al. 1983), pour y effectuer les mutagénèses ultérieures. Une mutagénèse a été effectuée dans la séquence pre- pro pour créer un site HindIII qui permettra la fusion des séquences codantes de l'hirudine et l'échange aisé de celles- ci avec les diverses séquences mutées, tout en préservant la phase de lecture et en assurant la maturation correcte de la protéine synthétisée. La séquence mutée est la suivante: + séquence pre-pro modifiée E Hirudine - 5...... Glu Ala Val Ser Leu Asp Lys Arg Ile Thr...... GAA GGG GTA AGC TTG GAT AAA AGA ATT ACG...... HindIII Une mutation a été introduite dans la séquence co- dante de l'HV2 pour remplacer l'Asn47 par une Lys47. Cette mutagénèse a été effectuée avec l'oligonucléotide suivant: ' CTTTCAGGTTTCGGTGTAC 3' Le dérivé du phage M13 portant la cassette d'expres- sion avec ces 2 mutations, appelé M13TG1945, servira de matri- ce à toutes les mutagénèses suivantes. Pour induire de nouvelles mutations dans la séquence codante de HV2, les oligonucléotides suivants ont été utili- sés: TG1152: 5' CTAATGGAACTGGCAACCA 3' TG1153: 5' TGGGTTCTAGAGGAGACAGCAACCAATG 3' TG1154:5' CAGAAGAAGATTTACAATG 3' TG1155:5' GATAAAAGAGTTGTTTATACAGACT 3' TG1156: 5' TATTTACAACCATAAATGAAAGAA 3' Les séquences mutées correspondent respectivement aux variants suivants: HV2 (Lys47, Thr35) HV2 (Lys47, Arg33, Asp35, Set36) HV2 (Lys47, Asp63) HV2 (Lys47, Val1, Val2) HV2 (Lys47, Pro66) La mutagénèse a été effectuée dans les conditions suivantes: picomoles de chaque oligonucléotide ont été phosphorylés dans 100 i1 de milieu réactionnel et environ 20 picomoles d'oligonucleotide phosphorylé ont été hybridés avec 1 picomole d'ADN simple brin du phage M13TG1919 dans 25 microlitres de tampon d'hybridation. Après hybridation, le mélange d'ADNs a été soumis à l'action de la polymérase de Klenow et à la ligase du phage T4. Chaque mélange ainsi traité a servi & transfecter la souche de E. coli 71/18 (mut L) sur tapis de bactéries indicatrices JM103 (Messing et al. 1981). Les cellules infectées sont repé- rables parce qu'elles forment des plages à croissance plus lente; les colonies ont été repiq.uées sur milieu complet puis transférées sur papier Whatman 540 en vue d'un criblage des cellules présentant les phages mutés. L'identification des phages portant la séquence mutée est effectuée par hybridation in situ avec l'oligonu- cléotide qui a été utilisé pour la mutagénèse. Les phages suivants, portant les séquences mutées ont été obtenus: M13TG1946 > HV2 (Lys47, Thr35) M13TG1947 > HV2 (Lys47, Arg33, Asp35, Ser36) M13TG1948) HV2 (Lys47, Asp63) M13TG1949) HV2 (Lys47, Val1, Val2) M13TG1950 - HV2 (Lys47, Pro66) 11 2628429 Exemple 2 Transfert des gènes mutés dans un vecteur d'expressionsécrétion et transformation des levures-hôtes. Le vecteur d'expressionsécrétion pTG2835 comprend les éléments suivants: 1. L'origine de réplication et le gène de résistance à l'ampi- cilline du plasmide pBR322, permettant la multiplication du plasmide et sa sélection dans E. coli. 2. L'origine de réplication du plasmide 2 A de levure et le gêne ura3 de levure comme marqueur de sélection dans une souche de levure ura3-. 3. Un autre marqueur de sélection, le gène leu2 de levure qui peut être utilisé pour complémenter un gène leu2 défectif de la souche hôte. 4. Le promoteur de transcription du gène de l'a-phéromone de levure et le terminateur de transcription du gène PGK de levure. 5. La séquence prepro du gène de l'a-phéromone de la levure, manipulée pour y créer un site HindIII permettant la fusion du gène de l'hirudine, en phase et de manière à assurer la maturation correcte de la protéine synthétisée. Les séquences codantes de l'hirudine portant les mutations sélectionnées et portées par les phages M13TG1946, 1947, 1948, 1949 et 1950 ont été récupérées sous forme de fragments HindIII et réintroduites dans le vecteur pTG2835 pour donner les plasmides suivants: pTG2982 - HV2 (Lys47, Thr35) pTG2983) HV2 (Lys47, Asp63) pTG2988 -) HV2 (Lys47, Arg33, Asp35, Ser36) pTG2989 - HV2 (Lys4i, Val1, Val2) pTG2990. HV2 (Lys47, Pro66) Une souche de levure S. cerevisiae TGYlsp4 (mata ura3.251.373.38 his03.11.15) a été transformée par ces diffé- rents plasmides. L'activité antithrombiniie des différents variants de l'hirudine produits par ces souches a été comparée (voir figu- re 2). On a ensemencé 20 ml de culture (YNBG + casamino acides 0.5 %) a DO660 0. 02 avec chaque souche. Après 48 h d'agitation à 30 C, les cultures sont centrifugées (5000 rpm, 5 min) et les surnageants sont doses. Une culture de TGYlsp4 pTG881 (plasmi- de ne portant pas de séquence codant pour HV2) est utilisée comme contrôle. L'activité des surnageants bruts est mesurée par leur effet inhibiteur sur l'activité de la thrombine (ac- tivité protéolytique sur un substrat synthétique, le chromozy- me TH - Boehringer Mannheim). Le pourcentage d'inhibition en fonction des volumes de surnageant est donné dans la figure 2. Cette étude montre clairement que les modifications -20 de la séquence de l'hirudine n'entrainent aucune perte d'ac- tivité antithrombine ni aucune perte de productivité dans la levure. L'usage de ces nouvelles molécules in vivo, comme agent antithrombotique, peut donc être envisagé. REFERENCES Chang, J.Y. FEBS Letters 164, 307-313 (1983). Dodt, J., Mueller, H.P., SeemUller, U. and Chang, J.Y. FEBS Letters 165, 180-184 (1984). Dodt, J., SeemUller, U., Mascheler, R. and Fritz, H. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366, 379-385 (1985). Dodt, J., Machleidt, W., SeemUller, U., Maschler, R. and Fritz, H. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367, 803-811 (1986). Harvey, R.P., Degryse, E., Stefani, L., Schamber, F., Cazenave, J.P., Courtney, M., Tolstoshev, P. and Lecocq, J.P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1084-1088 (1986). Kieny, M.P., Lathe, R. and Lecocq, J.P. Gene 26, 91-99 (1983). Markwardt, F. Methods Enzymol. 19, 924-932 (1970). Messing, J., Crea, R., Seeburg, P.H. Nucl. Acids Res. 9, 309- (1981). Petersen, T.E., Roberts, H.R., Sottrup-Jensen, L. and Magnusson, S. Protides, Biol., Fluids, Proc. Colloq. 23, 145-149 (1976). Ruggeri, Z.M., Houghten, R.A., Russell, S.R. and Zimmerman, T.S. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5708-5712 (1986). Stone, S.R. and Hofsteenge, J. Biochem. 25, 4622-4628 (1986). Zoller, M.J. and Smith, M.N. Methods in Enzymol. 100, 469 (1983). 14 É628429 REVENDICATIONS 1) Variants de l'hirudine, caractérisés en ce - que la structure peptidique de ces variants comporte, par rapport aux variants de base HV, une des modifications suivan- tes: - dans au moins un site Asn-X-Y de HV o X est un acide aminé quelconque, Y est choisi parmi Ser ou Thr; - une séquence Arg-Gly-Asp-Ser remplace une séquence d'acides aminés; - au moins un acide.aminé supplémentaire est ajouté à l'extré- mité C-terminale; les variants de base HV sont choisis parmi: HV1, HV2, HV3, HV2 (Val1, Val2), HV1 (AA63), HV2 (AA63), HV3 (AA64), HV2 (Val1, Val2, AA63), HV2 (Lys47), HV2 (Val1, Val2, Lys47), HV2 (Lys47, AA63), HV2 (Val1, Val2, Lys47, AA63), et AA est choisi parmi Glu et Asp. 2) Variant selon la revendication 1, caractérisé en ce que HV est choisi parmi: HV2 (Lys47), HV2 (Lys47, AA63), HV2 (Val1, Val2, Lys47) et HV2 (Val1, Val2, Lys47, AA63). 3) Variant selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi: HV (Thr35) et HV (Ser35). 4) Variant selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi: HV2 (Lys47, Thr35) et HV2 (Ser35, Lys47), HV2 (Vall, Val2, Thr35, Lys47) et HV2 (Vall, Val2, Ser35, Lys47). ) Variant selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comporte une structure partielle (Arg33, Asp35, Ser36). 2628429 6) Variant selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit de: HV2 (Lys47, Arg33, Asp35, Ser36). 7) Variant selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comporte un acide aminé supplémentaire à l'extrémité C-terminale. 8) Variant selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'acide aminé supplémentaire C-terminal est Pro. 9) Variant selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un composé HV2 (Lys47, Pro66). ) Variant selon la revendication 1, choisi parmi: HV2 (AA63, Lys47) et HV2 (Val1, Val2, AA63, Lys47) o AA est Glu ou Asp. 11) Variant selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il est sulfaté. 12) Variant selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la chaîne peptidique est glycosylée. 13) A titre d'inhibiteur de la thrombine, un variant selon l'une des revendications 1 à 12. 14) A titre d'agent anticoagulant, une compositi- on contenant à titre de principe actif au moins un variant selon l'une des revendications 1 à 12. ) A titre de médicament. un variant selon l'une des revendications 1 à 12. 16) Procédé de fabrication d'un variant selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisé en ce qu'il com- porte des étapes de synthèse, d'hémisynthèse et/ou de manipu- lation génétique. 17) Procédé selon la revendication 16; caractéri- sé en ce qu'il comporte la fermentation d'une levure préala- blement transformée soit par un plasmide comportant: - l'origine de réplication du plasmide de levure 2 y, - le gène ura3, - une origine de réplication dans E. coli et un marqueur de résistance à un antibiotique, - un promoteur de transcription, la séquence "leader" et la séquence pre-pro du précurseur du facteur alpha, fusionnée en phase, en amont de la séquence codante du variant de l'hirudine, - le terminateur de transcription du gène PGK de la levure qui sera placé en aval du gène dudit variant, soit par un bloc fonctionnel d'ADN codant pour ledit variant de l'hirudine.