FR 2633931 A1 19900112 FR 8909206 A 19890707 La présente invention conzerne un procéda pour la production de ú -polylysine libre. On sait déjà que de la -polylysine libre est obtenue, par exemple, en cultivant Streptomyces albulus sous-esopèce lysinopolymerus N 346 com'e dé- crit dans la demande de brevet japonais mise à l'ins- pection publique sous le N 53-72896/1978. Comme représenté par la formule suivante, la substance ci-dessus est un polymère de L-lysine et un comnosé de haut poids moléculaire dans lequel les groupes amino de la position t de la L-lysine forment des liaisons peDtidiques avec des groupes carboxyle adjacents de L-lysine sur sa chaîne droite. H NH-(CH2)4CH-CO OH lNH2 j Etant donné que la substance est un polymère de la L-lysine qui est un acide aminé essentiel, elle est utilisable en toute sreté et constitue une matiè- re aux propriétés particulières du fait qu'elle com- Porte de nombreux groupes amino. La mise a profit de ces propriétés a fait progresser son application aux articles de toilette, cosmétiques, complêments d'ali- mentation, produits chimiques pour l'agriculture, ad- ditifs alimentaires, matériaux pour l'électronique, etc. Un procédé classique de production de e-po- lylysine s'exécute comme suit: après avoir séparé les microorganismes d'un bouillon de culture de ú -polyly- sine, le pH du bouillon de culture est ajusté à 8,5 par addition d'une solution alcaline, la solution mé- langée est amenée à passer à travers une résine échan- geuse de cations faiblement acide et la E--polylysine est adsorbée sur la résine. La résine est lavée à l'eau, et la 6--polylysine est séparée de la résine par élution avec de l'acide chlorhydrique 0,1N. L'éluat recueilli est concentré et décoloré par du charbon actif, puis la e -polylysine est précipitée par addition d'un solvant tel que le méthanol, l'acé- tone, etc. La t -polylysine préparée à partir du bouillon du culture par le procédé ci-dessus est le chlorhydrate de t -polylysine. Cependant, il est également nécessaire de fournir de la t-polylysine libre aux secteurs de la pharmacie, des additifs alimentaires, des produits chimiques pour l'agriculture, etc. Il n'a pas été connu jusqu'à présent de procédé pour produire de la ú -polylysine libre à partir d'un bouillon de culture de ú -polylysine, d'un sel acide de t -polylysine (par exemple le sul- fate, le chlorhydrate, le nitrate ou le phosphate) ou d'une solution de celui-ci. Un but de la présente invention est de produire en un rendement élevé cet- te 6 -polylysine libre à l'échelle industrielle. En outre, lorsque la 6 -polylysine est sé- parée par élution d'une résine échanaeuse de cations dans le procédé classique susmentionné, l'élution doit être conduite avec une solution aqueuse acide. Il en résulte que la t -polylysine est obtenue sous forme d'un sel acide par précipitation par un solvant, lyophilisation ou séchage par atomisation. Le sel acide de t -polylysine ne pose pas de problèmes lors- qu'il est utilisé sous forme d'une solution aqueuse. Ce>endant, à cause de sa piètre solubilité dans un solvant organique, le sel acide ne Deut être utilisé sous forme de préparations alcooliques pour la con- servation de produits alimentaires par dissolution dans l'alcool éthylique. Pour augmenter la solubilité dans l'alcool éthylique, la 6 polylysine doit être sous forme de, -polylysine libre. Le but de la présente invention est de sur- monter ces problèmes en utilisant une résine échan- geuse d'anions basique ou une résine échangeuse de cations acide et de fournir un procédé pour produire la t-polylysine libre avec un rendement élevé à l'échelle industrielle. La présente invention fournit un procédé pour la production de t -polylysine libre, qui con- sistè à faire passer une solution de k -polylysine, de préférence une solution d'un sel acide de ú -poly- lysine ou une solution obtenue en séparant les micro- organismes d'un bouillon de culture de ú -polylysine, à travers une résine échangeuse d'anions basique, et à traiter la solution recueillie par une opération choisie entre la précipitation dans un solvant orga- nique, la lyophilisation et le séchaqe par atomisa- tion, pour obtenir la L -polylysine libre. De plus, la présente invention fournit un procédé pour la production de t -polylysine libre, qui consiste à faire passer une solution de. -poly- lysine à travers une résine échangeuse de cations acide pour adsorber la e -polylysine sur la résine, à séparer la ú -polylysine de la résine par élution avec une solution alcaline, a enlever l'excès de ma- tière alcaline de la solution au moyen d'une membrane d'ultrafiltration et à traiter la solution par une opération choisie entre la précipitation dans un sol- vant organique, la lyophilisation et le séchage par atomisation, pour obtenir la 6 -polylysine libre. La solution de sel acide de e -polylysine qui est utilisée dans la présente invention est de préférence un bouillon de culture de e polylysine purifié ayant été traité par une résine échangeuse de cations, une membrane d'ultrafiltration ou autre. Des sels acides tels que le sulfate, le chlorhydra- te, le nitrate, le phosphate, etc., peuvent être donnés en exemple. En outre, le bouillon de culture de t -polylysine peut être utilisé tel quel. On peut utiliser une résine échangeuse d'anions faiblement ou fortement basique, mais une résine échangeuse d'anions fortement basique est préférée. On peut utiliser une résine échangeuse de cations faiblement ou fortement acide, mais une ré- sine échangeuse de cations faiblement acide est pré- ferée. La solution alcaline est une solution qui contient un cation qui peut être échangé contre la F-polylysine ainsi qu'un groupe hydroxyle provenant d'hydroxyde de sodium, hydroxyde de potassion, hy- droxyde de calcium, hydroxyde d'ammonium, etc. On peut utiliser une membrane d'ultrafil- tration qui laisse passer une solution alcaline et ne laisse par passer la i -polylysine, et il s'agit de préférence d'une membrane ayant un poids molécu- laire de seuil d'environ 1000. Dans le procédé pour préparer la ú -polyly- sine libre consistant à utiliser une quantité de la résine échangeuse d'anions basique capable d'échanger une quantité d'anions équivalent ou supérieur avec la t -polylysine d'une solution de & -polylysine tel- le qu'une solution acide de t -polylysine ou un bouil- lon de culture de 6 -polylysine, les anions sont échangés par réaction avec la résine sous forme de co- lonne ou sous forme -e lots séparés. La é -polylysine libre produite est précipitée dans un solvant organi- que, lyophilisée ou séchée par atomisation. Dans le procédé pour préparer la -polyly- sine libre consistant a utiliser une quantite de la résine échangeuse de cations a-zide capable d'échanger une quantité de cations équivalent ou supérieur contre la t -polylysine, une solution de a -polylysine est mise a réagir avec la résine sous forme de colonne ou sous forme de lots séparés, et la t -polylysine est adsorbée sur la résine. Ensuite, la t polylysine est séparée de la résine par élution avec une solu- tion alcaline, et la solution éluée est traitée par une membrane d'ultrafiltration pour enlever l'excès de matière alcaline. La t -polylysine est ensuite ob- tenue par précipitation dans un solvant organique, lyophilisation ou séchage par atomisation. L'intérêt de l'invention réside en ce qu'une 6-polylysine libre peut être produite industrielle- ment et avec un haut rendement par un procédé simple et peu coûteux et être fournie aux secteurs des addi- tifs alimentaires, des produits chimiques pour l'agri- culture, de la pharmacie, etc. Les exemples non limitatifs suivants illus- trent plus particulièrement la présente invention, mais sans en préciser les applications pratiques. EXEMPLE 1 On place dans une colonne un litre de résine échangeuse d'anions Amberlite IRA-402 (type OH-) humide et l'on fait passer à travers la colonne 1000 ml d'une solution de chlorhydrate de t -polylysine à 5 % à un débit de VS (vitesse spatiale) = 0,2. Ensuite, on fait passer 1000 ml d'eau distillée au même débit a travers la colonne. On recueille et lyophilise les 2000 ml de liquide ayant passé et l'on obtient 35,0 g de 6 -polylysine libre. La teneur en chlore du produit est inférieure à 0,1%. EXEMPLE 2 On cultive Streptomyces albulus pendant 96 heures dans un petit fermenteur à cuve, on filtre le bouillon et l'on obtient 2,0 litres de filtrat. La concentration en ï-polylysine du filtrat est de 8,07 g/l. On ajuste 1,0 litre du filtrat à pH 8,5 et on le filtre. On fait passer le filtrat à un débit de VS = 1 à travers une colonne contenant 200 ml de résine échangeuse de cations faiblement acide Amber- lite IRC-50 (type H+) et la t -polylysine est ad- sorbée sur la résine échangeuse de cations. On lave la résine avec 800 ml d'une solution d'acide acéti- que O,2N, puis avec 800 ml d'eau distillée (dans chaque cas à un débit de VS = 2). Ensuite, on fait passer 1000 ml d'une solution d'acide chlorhydrique 0.1N à travers la résine échangeuse de cations à un débit de VS = 1, et la ú-polylysine est séparée par élution. Le volume de solution éluée avec la solution extraite est de 1000 ml. La teneur en é.polylysine de la solution est de 6,06 g/l et le rendement en -polylysine est de 75 %. On dialyse les 1000 ml de solution éluée au moyen d'une membrane d'ultrafiltration ayant un poids moléculaire de seuil de 1000, fabriquée par Fuji Filter Industry Company, Japon (nom commercial: Filtron NOVA 1K, surface: 700 cm2). Les conditions d'ultrafiltration sont telles qu'indiquées ci-des- sous: Débit de circulation: 700 ml/min; Pression d'entrée: 98,1 kPa; Pression de sortie: 58,8 kPa. Dans l'opération d'ultrafiltration, on con- centre 1,0 litre de solution éluée venant de la rési- ne échangeuse de cations jusqu'à un volume de 400 ml, on mélange 600 ml d'eau distillée à la solution con- centrée, puis on dialyse la solution mélangée au moyen d'une membrane d'ultrafiltration jusqu'à l'ob- tention de 400 ml de solution concentrée. On répète la dialyse trois fois et l'on obtient 400 ml de solu- tion concentrée. La concentration en 6 -polylysine de la solution obtenue est de 14,1 g/l et le rende- ment en i -polylysine est de 93 %. On fait passer les 400 ml de solution con- centrée à travers 200 ml de résine échangeuse d'anions basique Amberlite IRA-402 (type OH-) à un débit de VS = 0,2, et l'on fait passer 500 ml d'eau distillée à travers la résine. Le volume de la solution recueil- lie est de 900 ml. La concentration en t -polylysine de la solution recueillie est de 5,99 g/1 et le rende- ment en t -polylysine est de 95,6 %. On lyophilise la solution obtenue. Le poids du produit iyophilisé est de 5,60 g, sa couleur est blanche et sa pureté est de 96,0 %. La teneur en chlo- re du produit est inférieur à 0,1%. EXEMPLE 3 On cultive Streptomyces albulus pendant 96 heures dans un petit fermenteur à cuve, on filtre le bouillon et l'on obtient 2,0 litres de filtrat. La concentration en t -polylysine du filtrat est de 8,07 g/l. On dialyse 1000 ml du filtrat au moyen d'une membrane d'ultrafiltration ayant un poids moléculaire 30.de seuil de 3000, fabriquée par Fuji Filter Industry Company (nom commercial: Filtron NOVA 3K, surface: 700 cm2). Les conditions d'ultrafiltration sont les mêmes que celles employées dans l'Exemple 1 avec la membrane d'ultrafiltration à poids moléculaire de seuil de 1000. On obtient 1,8 litre de liquide dialysé ayant traversé la membrane d'ultrafiltration à poids moléculaire de seuil de 3000. La concentration en t-polylysine du liquide obtenu est de 4,17 g/l et le rendement en É -polylysine est de 93 %. On dialyse le volume de 1,8 litre de li- quide obtenu au moyen d'une membrane d'ultrafiltra- tion ayant un poids moléculaire de seuil de 1000,. fabriquée par Fuji Filter Industry Company (non com- mercial: Filtron NOVA 1K, surface: 700 cm2). Les conditions d'ultrafiltration sont les mêmes que cel- les employées dans l'Exemple 2 avec la membrane d'ultrafiltration à poids moléculaire de seuil de 1000. On concentre jusqu'à 250 ml ce volume de 1,8 litre de liquide dialysé qui avait traversé la mem- brane d'ultrafiltration à poids moléculaire de seuil de 3000. La concentration en t -polylysine de la so- lution concentrée est de 26,88 g/1 et le rendement en & -polylysine est de 93 %. On fait passer les 250 ml de solution con- centrée à travers 200 ml de résine échangeuse d'anions basique Amberlite IRA-402 (type OH-) à un débit de VS = 0,2, et l'on fait passer 500 ml d'eau distillée à travers la résine. Le volume de la solution recueil- lie est de 700 ml. La concentration en 6 -polylysine de la solution recueillie est de 8,56 g/l et le rende- ment en 6 -polylysine est de 95,6 %. On lyophilise la solution obtenue. Le poids du produit lyophilisé est de 6,70 g, sa couleur est blanche et sa pureté est de 96,0 %. EXEMPLE 4 On place dans une colonne un litre de rési- ne échangeuse de cations faiblement acide Amberlite IRC-50 (type NH4) humide et l'on fait passer 1000 ml d'une solution de chlorhydrate de ú polylysine à 5 % (contenant 40 g/1 de t -polylysine libre) à pH 8,5 à un débit de VS = 1 pour adsorber la E -polylysine sur la résine. On fait masser 3000 ml d'eau distil- lée à travers la colonne au même débit pour laver la colonne. Après avoir lavé la colonne, on fait passer à travers la résine échangeuse de cations 3000 ml d'une solution d'hydroxyde de sodiutr O,1N à un débit de VS = 1, et la. -polylysine est sépa- rée par élution. Le volume de solution éluée avec la solution extraite est de 3000 ml. Lateneur en &-polylysine de la solution est de 10,39 g/1 et le rendement en -polylysine est de 77,9 %. On dialyse les 3000 ml de solution éluée au moyen d'une membrane d'ultrafiltration ayant un poids moléculaire de seuil de 1000, fabriquée par Fuji Industry Company, Japon (nom commercial; Fil- tron NOVA 1K, surface: 700 cm2). Les conditions d'ultrafiltration sont données ci-dessous Débit de circulation: 700 ml/min; Pression d'entrée 98, 1 kPa; Pression de sortie 58,8 kPa. Dans l'opération d'ultrafiltration, on concentre 3000 ml de solution éluée venant de la résine échangeuse de cations jusqu'à un volume de 1500 ml, on mélange 1500 ml d'eau distillée à la solution concentrée, puis on dialyse la solution mélangée au moyen d'une membrane d'ultrafiltration pour obtenir 1500 ml de solution concentrée. On répète la dialyse trois fois et l'on obtient 1500 mI de solution concentrée. La concentration en polylysine de la solution obtenue est de 19,3 g/1 et le rendement en J -polylysine est de 93 %. On lyophilise les 1500 ml de solution concentrée et l'on obtient 28,9 g de. -polylysine libre. La teneur en sodium du produit est inférieu- re à 0,1 %. EXEMPLE 5 On cultive Streptomvces albulus pendant 96 heures dans un petit fermenteur à cuve, on fil- tre le bouillon et l'on obtient 2/0 litres de fil- trat. La concentration en t-polylysine du filtrat est de 8,07 g/1. On ajuste les 1000 ml du filtrat à pH 8,5 et on le filtre. On fait passer le filtrat à travers une co- lonne contenant 200 ml de résine échangeuse de ca- tions faiblement acide Amberlite IRC-50 (type NH4 +) à un débit de VS = 1, et la -polylysine est adsorbée sur la résine échangeuse de cations. On lave la résine avec 800 ml d'eau distillée (VS = 2). Après le lavage, on fait passer 1000 ml d'une solu- tion d'hydroxyde de sodium O,1N à travers la résine échangeuse de cations à VS = 1, et la t -polylysine est séparée par élution. Le volume de solution éluée avec la solution extraite est de 1000 ml. La teneur en ú polylysine de la solution est de 6,06 g/l et le rendement en ú -polylysine est de 75 %. On dialyse les 1000 ml de solution éluée au moyen d'une membrane d'ultrafiltration ayant un poids moléculaire de seuil de 1000, fabriquée par Fuji Industry Company, Japon (nom commercial: Fil- tron NOVA 1K, surface: 700 cm2). Les conditions d'ultrafiltration sont les mêmes que celles employées à l'Exemple 4. Dans l'opération d'ultrafiltration, on con- centre 1,0 litre de solution éluée venant de la rési- ne échangeuse de cations jusqu'à un volume de 400 ml, on mélange 600 ml d'eau distillée à la solution con- centrée, puis on dialyse la solution mélangée au moyen d'une membrane d'ultrafiltration pour obtenir 400 ml de solution concentrée. On répète la dialyse il cinq fois et l'on obtient 400 ml de solution concen- trée. La concentration en t -polylysine de la solu- tion obtenue est de 14,1 g/l et le rendement en t-polylysine est de 93 %. On lyophilise les 400 ml de solution obte- nue. Le poids du produit lyophilisé est de 5,60 g, sa couleur est blanche et sa pureté est de 99,0 %. La teneur en sodium du produit est inférieure à 0,1 %. EXEMPLE 6' On prépare 400 ml d'une solution concen- trée par le même mode opératoire qu'à l'Exemple 5. On ajoute 6,0 g de dextrine aux 400 ml de solution concentrée et l'on sèche le mélange par atomisation. Le poids de la poudre obtenue est de 11,0 g, la cou- leur de la poudre est blanche et sa teneur en L -po- lylysine est de 45 % en poids. EXEMPLE 7 On prépare 400 ml d'une solution concen- trée par le même mode opératoire qu'à l'Exemple 5. On ajoute 1600 ml d'acétone à la solution et il se forme un précipité. On recueille le précipité par centrifugation et le sèche sous vide. Le poids de la poudre obtenue est de 4,76 q, sa couleur est blanche et sa pureté est de 98,3 %. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la production de é--polyly- sine libre, caractérisé en ce qu'il consiste à faire passer une solution de i -polylysine à travers une résine échangeuse d'anions basique, à recueillir la solution ayant passé et à traiter la solution recueil- lie par une opération choisie entre la précipitation dans un solvant organique, la lyophilisation et le sé- chage par atomisation, pour obtenir la & -polylysine libre. 2. Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que l'on utilise une ú-polylysine obte- nue en cultivant des microorganismes ayant la faculté de produire de la ú -polylysine. 3. Procédé selon la revendication 2. carac- térisée en ce que les microorganismes ayant la facul- té de produire de la ú -polylysine sont de l'espèce Streptomyces albulus. 4. Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que la solution de L -polylysine est une solution obtenue en enlevant les microorganismes d'un bouillon de culture de 9 -polylysine, ou une solution d'un sel acide de t -polylysine. 5. Procédé selon la revendication 4, carac- térisé en ce que la solution de sel acide de t -poly- lysine est une solution obtenue en séparant la j -po- lylysine d'une résine échangeuse de cations par élu- tion avez une solution acide après avoir adsorbé sur la résine échangeuse de cations le filtrat du bouil- lon de culture obtenu en cultivant des microorganis- mes ayant la faculté de produire de la i -polylysine. 6. Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que la solution de 1 -polylysine est une solution obtenue en traitant au moyen d'une membrane d'ultrafiltration ayant un poids moléculaire de seuil de 10CO0 ou moins une solution obtenue en séparant les microorganismes d'un bouillon de culture obtenu en cultivant des microorganismes ayant la faculté de produire de la & -polylysine, et en recueillant les fractions qui ne passent pas à travers la mem- brane d'ultrafiltration. 7. Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que la solution de 6 -polylysine est une solution obtenue en traitant au moyen d'une membrane d'ultrafiltration ayant un poids moléculaire de seuil d'au moins 3000 une solution obtenue en séparant les microorganismes d'un bouillon de culture obtenu en cultivant des microorganismes ayant la faculté de produire de la t -polylysine, puis en traitant la so- lution ayant traversé, contenant la -polylysine, au moyen d'une membrane d'ultrafiltration ayant un poids moléculaire de seuil de 1000 ou moins, et en recueil- lant les fractions qui ne passent pas à travers la membrane d'ultrafiltration. 8. Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que la résine échangeuse d'anions basi- que est Amberlite IRA-402. 9. Procédé pour la production de é -polyly- sine libre, caractérisé en ce qu'il consiste à faire passer une solution de t -polylysine à travers une résine échangeuse de cations acide pour adsorber la t -polylysine sur la résine, à séparer la ú -polyly- sine de la résine par élution avec une solution alca- line, à enlever l'excès de matière alcaline de la so- lution au moyen d'une membrane d'ultrafiltration et à traiter la solution par une opération choisie entre la précipitation dans un solvant organique, la lyophi- lisation et le séchage par atomisation, pour obtenir la t -polylysine libre. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'on utilise une ' -polylysine obtenue en cultivant des microorganismes ayant la faculté de produire de la -polylysine. 11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la résine échangeuse de ca- tions acide est Amberlite IRC-50. 12. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que les microorganismes ayant la faculté de produire de la i -polylysine sont de l'espèce Streptomyces albulus. 13. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la solution de i -polylysine est un bouillon de culture de t -polylysine ou une solution d'un sel acide de -polylysine.