FR 2631975 A1 19891201 FR 8807009 A 19880526 263 1975 -- 1 -- J PROCEDE DE PREPARATION D'ACIDES ARYLOXY-2 OU ARYLTHIO-2 ALKANOIQUES OPTIQUEMENT ACTIFS La présente invention concerne un procédé de préparation d'acides aryloxy2 ou arylthio-2 alkanoiques optiquement actifs de formule générale: v# A / \ COOH Ar Ar (I) par hydrolyse énantiosélective des amides racémiques correspondants Dans la formule (I) Ar représente un radical aromatique éventuellement substitué par au moins, un groupe alkyle, alkoxy, halogéno, hydroxyle, les groupes alkyles ou alkoxy ayant de préférence 1 à 4 atomes de carbone. -. A représente un atome d'oxygène ou de soufre. R représente un radical alkyle ayant 1 à 6 atomes de carbone Plus particulièrement, la présente invention concerne la préparation des énantioméres R (+) des acides aryloxy-2 ou arylthio-2 alkancïques de formule générale (i). Plus'particulièrement encore, la présente invention concerne la préparation des énantioméres R (+) des acides phénoxy-2 ou phéenythic-2propioniques de formule générale: 4 0 COCCH Ar (II) dans laquelle Ar a la même signification que dans la formule I. La présente invention a encore plus particulièrement pour cbjet la préparation de l'acide (hydroxy-4, phénoxy)-2 propionique R[_E 2- Il a maintenant été trouvé, et c'est ce qui fait l'objet de la présente invention, que les acides aryloxy-2 ou arylthio-2 alkanoiques de formule générale (I) sous forme R peuvent être obtenus par hydrolyse énantiosélective des amides racémiques correspondants au moyen de microorganismes ou d'enzymes sélectionnés en fonction de leur capacité à hydrolyser l'"-phényl- propionamide racémique en acide K-phénylpropionique S (+). La sélection des agents permettant l'hydrolyse énantio- sélective des amides des acides aryloxy-2 ou arylthio-2 alkanoïques de formule générale (I) racémiques est effectuée en mettant en contact l'agent avec l'1-phénylpropionamide racémique en milieu convenable jusqu'à ce que 20 % du produit soit converti puis en mesurant l'excès énantiomérique. Sont sélectionnés les agents qui hydrolysent, dans ces conditions, l'"-phénylpropionamide racémique en acide K-phénylpropionique S(+) avec un excès énantiomérique supérieur à 65%. Parmi les microorganismes qui conviennent particulièrement bien peuvent être citées des souches appartenant au genre Brevibactérium ou Corynebacterium et plus particulièrement Brevibacterium R312 (CBS 717.73) et Corynebacterium N711 (FERM P 4445) ou Corybacterium N 774 (FERM P 4446) qui permettent d'obtenir des acides aryl-2 alkanoiques S avec un excès énantiomé- rique en isomère S généralement supérieur à 90% à partir de l'amide correspondant. i est surprenant de noter que, parmi ces microorganismes, Brev:bacterium R 312, qui est décrit dans FR 7 9C1 803/2 447 359 et dans Advances in Biochemical Engineering, vol. 14, p. 1-32 (1980) comme possédant une amidase générale non stérécspécifique hydrolyse stéréospéciúiquement les amides des acides aryl-2 alkanoïques racem:ques alors que son mutant A4 qui possède une amidase L szerospécifique n'hydrolyse pas es amides des acides aryl-2 alkanoiques racémiques. il y a lieu de noter que Corynebacterium N 771 et Corvbacterium N 774, qui sont décrits dans EP 0 187 680, hydrolysent par exemple le lactonitrile en acide D, L lactique et l'"-aminophénylpropionitrile en D, L-phénylalanine sans observer de stéréosélectivité. 263 1975 -3- Selon la présente invention, le procédé est généralement mis en oeuvre en milieu aqueux ou hydroorganique homogène ou hétérogène, dans des conditions de température et de pH déterminées en fonction de la nature du microorganisme et de l'enzyme, en agitant une suspension de cellules ou d'extraits cellulaires du microorganisme et de l'amide de l'acide aryloxy-2 ou arylthio-2 alkanoique racémique. Le procédé conduit à un mélange de l'acide aryloxy-2 ou arylthio-2 alkanoïque R et de l'amide de l'acide aryloxy-2 ou arylthio-2 alkanoique S. Lorsque le microorganisme utilisé possède la propriété d'hydrolyser les nitriles associée à la propriété d'hydrolyser énantiosélectivement l'c-phényl propionamide, il est possible d'obtenir un acide phénoxy-2 ou phénylthio-2 alkanoïque R soit à partir du nitrile de l'acide phénoxy-2 cu phénylthio-2 alkanoïque racémique soit à partir de l'amide de l'acide phénoxy-2 ou phényl- thio-2 alkanoique racémique. Les exemples suivants, dchnés à titre non limitatif, montrent comment l'invention peut étre mise en pratique. EXEMPLE 1 a) La souche Brevibacterium R 312 (CBS 717.73) est cultivée en fiole agitée à 28 C pendant 14 heures dans un milieu dont la composition est la suivante: - Glucose 10 g - fNH,)SO4 5 g - KH P04 1,0 g - N&HPC0, 12H0G 1, 64 g - K,HPO4 0,82 g - Ca Cl, 2H-0 0,012 g - ZnCl 0,0012 g - FeSO4, 7H:0 0,0012 g - MnSO4, H:0 0,0012 g - MgSO_, 7H:9 0,5 g - Chlorhydrate de thiamine 0,0C2 g - eau q.s.p. 1000 cm3 - 4 - Cette préculture est utilisée pour ensemencer un milieu de culture ayant la même composition mais contenant du N-méthyl-acéta- mide à la concentration de 20mM. La culture est effectuée en fiole agitée pendant 24 heures à 28 C. La biomasse obtenue est séparée par centrifugation puis lavée deux fois par une solution de chlorure de sodium à 9 g/litre. b) Un culot de centrifugation contenant 13 mg de cellules de Brevibacteriuum R 312, exprimés en matières sèches, est mis en l0 suspension dans 2 cm3 de tampon phosphate (50 mM) à pH = 7. On ajoute 25 mg de phényl-2 propionitrile racémique (190 pmoles). Après 24 heures d'agitation à 25 C, le mélange réactionnel est dilué par addition de 23 cm2 d'un mélange acétonitrile-acide chlorhydrique N (90-10 en volumes). Les bactéries sont éliminées par centrifugation. La composition du surnageant est déterminée par chromatographie liquide à haute performance (CLHP). Le surnageant contient 119 gmol de phényl-2 propionamide 62 pmol d'acide phényl-2 propionique. 2* On ajoute du chlorure de sodium pour favoriser la séparation des phases aqueuses ou organiques. Après évaporation à sec de la phase organique, le résidu est repris par 20 cm2 d'un mélange chloroforme-soude 0,1N (1-1 en volumes). La phase basique est acidifiée puis extraite au chloroforme. La mesure du pouvoir rotatoire montre que l'excès énantiomérique en isomère S (-) est de 100 %. Après dérivation de l'acide phenyl-2 prcpicnique avec la R (+) méthylbenzylamine, "'analyse par CLHP montre que l'excès énanticmérique est de 96,4 %. EXEMPLE 2 Un culot de centrifugation contenant 1,_3 mg de cellules de Brevibacterium R 312 exprimées en matières sèches est mis en suspension dans 2 ml de tampon de phosphate (50 mM) à pH 7,0. On ajoute 32,6 mg de (hydroxy-4 phénoxy) -2 propionamide racémique (0,!80 mmol). Après 24 heures d'agitation à 250C, le mélange réactionnel est dilué par addition de 23 cm3 d'un mélange acétonitrile-acide chlorydrique N (90-10 en volumes). Les bactéries sont éliminées par centrifugation. La composition du surnageant est déterminée par chromatographie liquide à haute performance (CLHP). 0,0884 mmol de (hydroxy-4 phénoxy) -2 propionamide 0,0864 mmol d'acide (hydrcxy-4 phenoxy) -2 propionique On ajoute du chlorure de sodium pour favoriser la séparation des phases organiques et aqueuses. Apres évaporation à sec de la phase organique, le résidu est repris par 10 ml d'acétate d'éthyle plus 5 ml d'une solution d'hydrogénocarbonate de sodium à 10 % p/v dans l'eau. La solution aqueuse, après décantation est extraite avec deux fois 10 ml d'acétate d'éthyle. La phase aqueuse est acidifiée à pH 1,0 avec une solution d'acide chlorydrique N puis extraite par tois fois par 10 m! d'acétate d'éthyle. Ces phases organiques contenant l'acide sont séchées sur sulfate de sodium et évaporées à sec. Le résidu est repris dans l'acétone. La mesure du pouvoir rotatoire de cette solution acétonique montre que l'excès énantiomérique est de 99 % en isomère R (+). Après dérivatin de l'acide (hydroxy-4 phéncxy) -2 propionique avec la R(+) î méthylbenzylamine, l'analyse CLH? montre que l'excès énanziomérique est de 94 % er. iscmere R[-). 2S EXEMPLE 3 a; On cultive en fiiole agitée à 28 CZ pendant 14 heures la souche Corynebacterium N 7v1 (FERM ? 4445) dans un milieu ayant la composition suivante-: - extrait de leavure g - extrait de malt 3 g - lactopeptcne 5 g - glucose 10 g - FeSO4, 7H:O 0,1 g - eau q.s.p 2 litre le pH es austé à 7,5 par addition de soude avant et dont le pH est a:usté a 7,5 par addition de soude avant - 6 - stérilisation. Cette préculture est utilisée pour ensemencer au 1/40ème un milieu de même composition. Après incubation pendant 24 heures & 28 C en fiole agitée, la biomasse est séparée par centrifugation puis lavée deux fois par une solution aqueuse de chlorure de sodium à 9 g/litre. b) Un culot de centrifugation contenant 11,3 mg de cellules de Corynebacterium N 771, exprimés en matière sèche, est mis en u suspension dans 2 cm' de tampon de phosphate (50 mM) pH 7. On ajoute 34 mg de hydroxy-4 phénoxy)-2 propignamide racémique (0,187 mmol) puis on agite 24 heures à 25 C. Le:mélange réactionnel est traité dans les conditions de l'exemple 2. Le surnageant contient: 0,083 mmol d'(hydroxy-4, phénoxy)-2 propionamide 0,08379 mmol d'acide (hydroxy-4, phénoxy)-2 propionamique. 0,079 mmol d'acide (hydroxy-4, phénoxy)-2 propionique. Les excès énantiomériques de l'acide (hydroxy-4 phenoxy)-2 propicnique mesurés par le pouvoir rotatoire et après dérivation avec la R(+) O méthylbenzylamine sont respectivement de 95 % et 91 % en isomère R(+). EXEMPLE 4 Les cellules de Ccrvbacterium N774 sont préparées dans les conditions décrites dans l'exemple 3a/ pour la préparation d'un culot cellulaire de Corynebacterium N771. Un culct de centrifugation contenant 10,8 mg de cellules de Corynebacterium N774, exprimés en matière sèche, est mis en suspension dans 2 cm. de tampon phosphate (50 mM) pH 7. Cn ajoute 34,5 mg d'(hydroxy-4 phénoxy)-2 prcpionamide racé- mique'(0,190 mmol) puis on agite 24 heures à 25 C. Le mélange réacticnnel est traité dans les conditions de l'exemple 1. Le surnageant contient: 0,078 mmcl d'(hydrcxy-4, phéncxy)-2 propioamide 0, 080 mmcIl d'acide (hydroxy-4, phénowy)-2 propionique Les excès énantlomériques de l'acide (hydroxy-4, phénoxy)-2 propionique mesurés par le pouvoir rotatoire et après dérivation avec la R(+) a methylbenzylamine sont respectivement de 95% et 92% en isomère R(+). - 7 - REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation des énantiomères S (+) des acides aryloxy-2 ou arylthio-2 alkanoïques de formule générale: H d,\\\R A COOH Ar (I) dans laquelle Ar représente un radical aromatique- éventuel- lement substitué, R représente un radical alkyle ayant 1 à 6 atomes de carbone, et A représente un atome d'oxygène ou de soufre caractérisé en ce que l'on hydrolyse énantiosélecti- vement les amides des acides aryloxy-2 ou arylthio-2 alka- noiques racémiques correspondants, éventuellement préparés in situ, en présence d'un microorganisme ou d'une enzyme issue de ce microorganisme sélectionné en fonction de sa capacité à hydrolyser enantiosélectivement l'o-phénylpropionamide radé- mique en acide OE-phénylpropionique S avec un excès énantio- mérique supérieur à 65%, puis sépare l'acide aryloxy-2 ou arylthio-2 alkanoïque R de l'amide de l'acide aryloxy-2 ou arylthio-2 alkanoïque S. Procédé selcn la revendicaticn 1 caractérisé en ce que les microorganismes sont -hoisis parmi les Brevibacterium et les Ccrynebacterium. 3. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que les mi-croorganismes sont choisis parmi Brevibacterium R 312 (CBS.717. ^), Corvnebacterium N 771 (FERM P 44451 Corynebacter..um N 774 (FERM P 4446'. 4. Proccdé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le microorganisme possède une activité n-trilase associée à la capacité d'hydrolyser énantiosélectivement l'"-phénylpropio- namide racémique en acide O-phénylpropionique S. 2631 975 -- 8 - 5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que l'on hydrolyse directement le nitrile de l'acide aryloxy-2 ou arylthio-2 alkanoique racémique en acide aryloxy-2 ou arylthio-2 alkanoique R. 6. Procédé selon l'une des revendications 4 ou 5 caractérisé en ce que les microorganismes sont choisis parmi les Brevibacterium et les Corynebacterium. 7. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que les microorganismes sont choisis parmi Brevibacterium R 312 (CBS 717.73), Corynebacterium N 771 (FERM P 4445) et Corvnebacterium N 774 (FERM P 4446). 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 pour la préparation des acides de formule générale (II) \CH, G CO>H Ar (II) dans laquelle Ar a la même signification que dans la formule I). 9. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que le composé de formule (II) esz l'acide (hydroxy-4, phénoxy)-2 propionique sous forme R (+).