FR 2633518 A1 19900105 FR 8808806 A 19880630 Procédé de stabilisation des vaccins et associations de vaccins à virus atténués conservés sous forme lyophilisée, et compositions obtenues L'invention concerne un procédé de stabilisation des vaccins et associations de vaccins à virus atténués qui sont conservés sous forme lyophilisée en présence d'au moins un excipient de lyophilisation. L'invention concerne également les compositions obte- nues par le procédé conforme à l'invention. De nombreux vaccins contre les maladies virales sont fabriqués à partir de virus vivants atténués. La lyophilisa- tion est utilisée pour leur conservation. Cette technique de dessiccation de produits préalablement congelés s'applique aux vaccins préparés par mélanges appropriés de virus atténués avec des excipients de lyophilisation dont le rôle est de protéger le produit (STONES P.B., WARDEN D. and KERR J. Symposium on stability and eçffectiveness of measles, poliomyelitis and pertussis vaccines (1976) Zagreb - Yougos- lavie. The stability of measles vaccine and factors affecting its efficacy). Dans les associations de vaccins, chaque valence a en général un excipient de lyophilisation qui lui est propre. Cependant, malgré la lyophilisation, on observe, avec certains vaccins, une perte d'activité sensible du vaccin lyophilisé lorsqu'il est conservé à température ordinaire. On pense que cette perte d'activité serait en partie due à une dégradation des particules virales atténuées, certains virus atténués y étant plus sensibles que d'autres. La présente invention a pour objectif de remédier à ce problème en fournissant un procédé de stabilisation aboutis- sant à une meilleure conservation dans le temps des vaccins et associations de vaccins à virus atténués conservés sous forme lyophilisée. Un objectif de l'invention est de fournir un procédé qui soit simple à mettre en oeuvre, sûr et peu onéreux et qui utilise des produits qu'il est possible d'obtenir en quantités suffisantes et qui soient exempts de toxicité pour l'homme. L'invention a pour objet un procédé de stabilisation des vaccins et associations de vaccins à virus atténués qui sont conservés sous forme lyophilisée en présence d'au moins un excipient de lyophilisation, caractérisé en ce qu'on ajoute, de préférence avant la lyophilisation, une quantité appropriée d'au moins un composé répondant à la formule générale: NH R1 = C R2 dans laquelle R1 est un atome d'oxygène ou un atome de soufre et R2 un groupement NH2 ou une chaîne linéaire, insaturée ou non, du type: -O-C..., -NH-C... ou -C... avec, éventuellement, des substitutions hydroxyle. Ainsi on peut envisager des composants répondant à la formule: NH /N2 R1 = C >NH R1 = C NH 235par exemple le biuret. par exemple le biuret. Le composé stabilisant selon l'invention ne se substi- tue pas aux excipients de lyophilisation habituels mais au contraire vient compléter la stabilisation des vaccins et associations de vaccins visés par l'invention. De préférence, le composé stabilisant est l'urée, qui présente l'avantage d'être un produit physiologique naturellement présent dans l'organisme: NH2 O = C NH2 Parmi les autres composés stabilisants selon l'invention, on peut citer: NH2 - la thiourée S = C NH2 NH2 - l'allylurée O = C NH -CH2 - CH = CH2 NH2 - l'acétamide 0 = C CH3 NH2 - le méthylcarbamate 0 = C 0-CH3 NH2 - le butylcarbamate 0 = C 0 - CH2 - CH2 - CH2 - CH3 Bien entendu, cette énumération n'est pas limitative. Le produit stabilisant est utilisé à une concentration finale très faible, par exemple de l'ordre de 0,5 % (en poids). Chaque produit peut avoir une plage de concentration plus ou moins étendue, avec un effet stabilisant, et au delà de cette plage, un effet néfaste pour le ou les virus. Par exemple pour l'allylurée, il est préférable de ne pas dépasser 0,5 %. L'urée peut être utilisée à une concentration finale allant de 0,125 à 2 % environ, étant entendu que cette plage de concentration préférée n'est pas limitative. On préfère introduire le composé stabilisant avant la lyophilisation. Toutefois, l'action du stabilisant peut être démontrée, même si on l'introduit après cette dernière (réhydratation et nouvelle lyophilisation). L'étude détaillée qui va suivre prend comme exemple le vaccin triple rougeole, oreillons, rubéole dans lequel les valences rougeole et oreillons sont sujettes à des pertes d'activité importantes. Mais l'invention concerne tous les vaccins à virus atténués recontrant des difficultés de con- servation à l'état lyophilisé pour des raisons similaires, telles que la présence de neuraminidase et/ou de glycoprotéines sensibles. Le tableau I retrace les résultats d'une étude de l'action de l'urée sur des lots de vaccin industriels. TABLEAUI Comparaison des pertes du titre Infectieux en 7 jours à + 37'C, sur des lots industriels, avec et sans Urée. UREE TITRES EN DICTSO/DOSE PERTE MOYENNE VALENCE | LOT -20C 7jours -37'C (lo)* A 1264 3,93 2,73 O A 1265 3,86 2,97 0,86 A 1266 4,03 3,53 ROUGEOLE.. B 1193 3,68 3,00 0,5 B 1331 4,13 3,53 0,61 B 1379 3,98 3,43 A 1264 4,45 3,23 0 A 1265 4,40 3,00 1,34 A 1266 4,48 3,07 REILLONS B 1193 4,36 3,80 0,5 B 1331 4,37 3,80 0,55 B 1379 4,59 - 4,07 A 1264 3,58 3,13 O0 A 1265 3,72 3,30 0,38 A 1266 3,57 3,30 RUBEOLE. i B51193 3,49 3,20 0,5 B 1331 3,43 3,17 0,34 B 1379 3,68 3,20 * Logarithme base 10 Pour chacune des valences du vaccin triple, on a obtenu une stabilité supérieure à celle obtenue uniquement avec les mêmes excipients de lyophilisation mais sans adjonction d'urée, en particulier après dégradation d'une semaine à 37C, excepté pour la valence rubéole dont la stabilité est déjà assurée de façon satisfaisante. L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide d'exemples non limitatifs s'appliquant au vaccin tri- ple rougeole, oreillons, rubéole. Pour ces exemples, le mode opératoire est identique: Les produits viraux concentrés rougeole, oreillons et rubéole, conservés congelés à basse température, sont décongelés puis mélangés extemporanément. Ce mélange est ensuite réparti entre les différents essais, avec l'excipient de lyophilisation additionné ou non de produit stabilisant selon l'invention. On procède ainsi de façon à obtenir les proportions de solutions finales suivantes: rougeole: 1,5 volume; oreillons: 0,01 volume; rubéole 1,0 volume et excipient 2,5 volumes. Ces différentes proportions, indiquées par rapport aux exemples, peuvent varier, selon le titre des produits viraux concentrés et ne sont pas limitatives. Les essais sont répartis en petits flacons puis lyophilisés suivant un cycle standard. Les tests de sta- bilité sont faits en plaçant des flacons pendant 7 jours à +37'C ou 6 jours à + 45'C, avec des témoins à + 4'C. Ces flacons sont ensuite réhydratés et titrés. L'activité est déterminée par le nombre de doses infectieuses à 50 % en culture de tissu (DICT50). Pour la méthode des dilutions limites, sur microplaques, cela correspond à la dilution théorique calculée, pour laquelle la moitié des cupules ensemencées présente un effet cytopathique caractéristique. Les cellules utilisées pour les titrages des valences rougeole et oreillons sont des cellules Vero et, pour la valence rubéole, des cellules RK13. Pour chaque valeur indiquée dans les tableaux, le chiffre de titre est une moyenne de quatre titrages différents, au minimum. Exemple 1: Effet de l'urée sur le vaccin rougeole, oreillons, rubéole, en présence de différents excipients de lyophilisation. Les différents excipients de lyophilisation utilisés ont une composition classique pour la lyophilisation (pro- duits dits de charge, cryoprotecteurs, etc.). Leur composi- tion diffère au niveau des sucres et des acides aminés, ce qui est suffisant pour modifier la stabilité des différentes valences, en l'absence de produit stabilisant. Les différents titrages de cet exemple ont été réalisés par essais. Un témoin commun (T) permet de comparer les différentes valeurs obtenues. Les pertes d'activité en 7 jours à + 37'C ou en 6 jours à + 45'C, permettent de juger de la stabilité de chaque valence en fonction de l'excipient de lyophilisation utilisé, ainsi que de l'effet stabilisant de l'urée pour chacun d'eux. TABLEAUX A. - Valmncs ROUGEOLE: TITRES EN DICTEO/DOSE a STABILISATEURJ 7 iours à + 4'C 17 jours à 37'CI Perte (lo) 16ioursàa 45'CPerte(lw)t 48--'-; 4,05 3. 52 j 0,53 3,20 0,851 48-3 + U 4,11 3,75 1 0.36 3,33 0,78! 4-3 (T) 4,31 3,57 0,74 3,08 1,23 16-3 4,20 3,20 10, n3,05 1,15 1-3 + U 4,40, 3,85 0,55 3,68 07 48-3 (T) 4,07 3,35 0,72 2,91 I,16 17-1 3,45 32,95 0,50 2,70 0,75 17- 1+ U 4,35 405 0.30 360 0,75 263351 - Yalence OREILLONS: ______ fTITRES EN DICT5O/DOSE STABLISATEUR I 7 iours a -4 'C17 ours a- 37'CI Perte (log) 16 iours a 45.CIPerte (loc 48-3 (T)I 4,03 3,04 ' 03 9 2, 86 1,17 48-3 * U. 4.28 3,99 0,29 3,47 081 48-3 (T) 4,28,37 0,91 3,07 1021 16-3 3. 37 i 0,32 16-3 4,65 3,7 0 0,95 3,30 1,35 16-3. U 4,58 4,00 0.58 3,85 0.73 48-3 (T) 4,29 3,3 0,99 2,88 0,4 17-T 4,38 3,23 1,15 2,85 1,53 17-1 + U 4,70 3,98 30,72,78 0.92 - Valence RUBEOLE: TiTRES EN DICTSO/DSE__ STABILISTEUR 7 ours ée 4lCa tours e- 37't ' Pere (lo) 16 iours +45'CIPevrte (!1c 48-3 (T) d3,333,18 p 0,t15 2,81 p 0,52 t 48-3. U 1 3.43 3.06, 0.37 3.05 0.38 | 48-3 (T) 3,35 3,08 0,27 3X03 0,32 16-3 3,0 t2,83 0,27 2,60 0,50 16-3 * U 3.88 3.55 0.33 3.35 0.5. 48-3 (T) 3,28 2,87 0,41 2,74 0,54 17-1 2,93 2,43 0,50 2,35 0,58 17-1 +,, O.,, 0.35 3.43 0/'7 U = Urée 0,5 % final Cet effet stabilisant est essentiellement net pour les valences rougeole et oreillons. La valence rubéole est relativement stable avec les trois excipients de lyophilisation testés. aExemsle 2: Effet stabilisant de plusieurs produits proches. L'urée, la thiourée et l'allylurée ont été testés avec le même excipient de lyophilisation et pour les trois valences du vaccin. L'acétamide, le méthylcarbamate et le butylcarbamate ont été testés de la même manière uniquement par rapport à la valence oreillons qui est la plus instable. Les différents essais ont été réalisés pour des vaccins préparés en excipient sans produit stabilisant selon 263351 l'invention (Témoin) et avec produit stabilisant selon l'invention (produits étudiés). Les titrages ont été réalisés sur ces différents produits. Dans cet exemple, les produits sont tous utilisés à la même concentration finale: 0,5 %. TABLEAUX B. - Valence ROUGEOLE: TITRES EN DICTSO/DOSE STABILiSATEUR 7 lours à + 4'C 7 Jours à + 37C Perte (1og) / 4,05 3,52 0,53 UREE 4,11 3,75 0,36 i / 4,21 3,59 0,62 THIOUREE 4,34 3,80 0,54 / 4,10 3,70 0,40 ALLYLUREE 4,43 3,90 0,53 - Valence OREILLONS: I_______ _ _TITRES EN DICT50/DOSE STABILISATEUR 7 ours a + 49C 7 jours à + 37'C i Perte (log) / t 4,03 3,04 0,99 UREE 4,28 3,99 0,29 / 4,36 3,24 1,12 THIOUREE 4,64 3,98 0,66 / 3,90 3,05 0,85 ALLYLUREE 4, 13 3,78 0,35 LZ'O 9 ú! S"ú! dnIlllv I Ci "0 c 8 jS i L '0 ú0'ú 0'ú 33JNOIHl Lú'O ú98 Z| I'ú / 9c'0 90'ú | _.|33Jn SL'0 ' úc' / (Dol) 8'Jad 3.Lú +, sJno! L o.' + e sin0ot L i r3!vi! 3SO/OSQlIO N3 S3d111 I : 31039iU 8O3UleA - Ot'/' 0 ss ' E sO ' T. VN"SV O']aX.Tt' SZ' I OZ'ú ó,', / szI st&OZ' (601) 8aJad O.Lú + V lO Jnof/ 0.L, no [ L Jr33 9gV 3-OG/OSll0 N3 S3d111 SN0O113ti0 aDualeA - 01, il L'effet stabilisant de ces produits est proche et se manifeste surtout au niveau de la valence oreillons, avec l'excipient de lyophilisation utilisé. Exemple 3: Effet de la concentration en produit sta- bilisant sur la stabilité du vaccin triple. Cette étude a été réalisée avec l'urée et l'allylurée, sur les trois valences et en présence de l'excipient de lyo- philisation de l'exemple 2, pour des concentrations en pro- duit selon l'invention variant de 0,125 à 2,0 % en final. TABLEAUX C. - UREE: TITRES EN DICT50/DOSE ROUGEOLE OREILLONS RUBEOLE Concentration 7 jours à 7 jours à Perte 7 jours à 7 jours à Perte 7 jours à 7 jours à Perte % + 4'C + 37'C (log) + 4'C + 37'C (loqg) + 4'C + 37'C (loq) 0 3,30 2,75 0,55 3,80 2,83 0,97 3,50 3,43 0,07 0,125 3,60 3,23 0,37 4,25 3,45 0,80 3,73 3,33 0,40 0,25 3,70 3,18 0,52 4,20 3,60 0,60 3,80 3,20 0,60 0,50 3,40 3,15 0,25 4,13 3,88 0,25 3,68 3,33 0,35 1,0 3,60 3,20 0,40 4,20 3,65 0,55 3,35 3,33 0,02 2,0 3,35 3,05 0,30 4,10 3,90 0,20 3,35 3,33 0,02 os, Ma La w OL'O Oú'Z 00'ú Sú'1 ú1'Z 91'ú 09'0 z úZ'ú y ú9'ú O'Z SO' 0 ú0'ú 90'ú LZ'O 8b'ú SL'ú úú'0 S9'ú 81'i,> 0' LZ'O 91'ú Sv,ú Sú'0 9L'ú ú1'b úS' O 06'ú ú1'17 OS' O Sl'O úZ'ú 9ú'ú ú1'0 09'ú ú6'ú 01,'0 09'ú OZ'l SZ'o Ol'O úú'ú úV ú 06'0 Sú'ú sz'1 SS'o Sq'ú Okt,> qSZ'O 01'0 90'ú Q1'ú S8'O SO'ú 06'ú 0t'0 OL'ú 01'1, 0 (Dot) 3.Lú 3' 0, + (Dol) O.Lú + O., * (Doi) '.Lú +.' ' ... elJad 9 SJno[ L 9 sJnof L,e!Jed 9 sJno[ L 9 sJnof L alJad _ sJno[ L sJno[ L UolleJiUeUoo 1103]fliu SNOlIlF'uO 310:i910 3SO/OS101a N3 S3flli 263351L Pour l'urée, la stabilité du vaccin augmente avec la concentration du produit jusqu'à 0,5 % puis, au-delà, la stabilité ne change pas. Avec l'allylurée, on obtient la même progression de la stabilité du vaccin jusqu'à 0,5 % puis, au-delà, une diminu- tion allant jusqu'à une stabilité inférieure à celle du témoin sans allylurée. Pour cet exemple, les essais et les titrages ont été regroupés par produit, pour leur réalisation, ce qui permet de comparer le niveau des titres à + 4'C, + 37'C, ainsi que les pertes, obtenus pour un même produit. Exemple 4: Effet de l'urée sur des vaccins rougeole, oreillons, rubéole lyophilisés, réhydratés en présence ou non d'urée, puis relyophilisés. L'étude a été élargie à des vaccins du commerce. Ces vaccins, nommés A, B, et C, n'ont pas tous la même souche de virus ourlien. Ces vaccins ont été réhydratés soit avec de l'eau, soit avec une solution d'urée à 0,5 % puis relyophilisés selon un cycle standard. Ces vaccins ont été traités dans les mêmes conditions, avec une référence (vaccin de la déposante, I.M.) étudiée en présence ou non d'urée au moment de la première lyophilisation et au moment de la deuxième lyophilisation. L'étude a été effectuée uniquement sur la valence oreillons qui est la plus instable. r.3 orTABLEAU D: p- Ort P-(D'1 f>r) 0 El M 0 e (DE_ __ __ __ _ __ __ ___ 3 TITRES EN DICT50/D0 SE oX X..VACCINS + 4C 7 jours + 37'CPerte6 tours à. 45C Perte i' p --. I - 4,50 3,70 0,80 3,03 1,47 H - 0 O - 3,65 2,90 0,75 2,45 1,20 P) C p crC n U 3,50 3,58 # o 2,80 0,70 (D(D' 3. o 0 M H I: vaccins normaux (une lyophilisation) : H II vaccins repris et relyophilisés en présence ou non d'urée O U:urée u H *4 Itt-I tj O.. Ca ON._ (bcMJcf 263351 REVENDICATIONS 1. Procédé de stabilisation des vaccins et associations de vaccins à virus atténués notamment rougeole, rubéole, virus ourlien qui sont conservés sous forme lyophilisée en présence d'au moins un excipient de lyophilisation, caractérisé en ce qu'on ajoute, de préférence avant la lyo- philisation, une quantité appropriée d'au moins un produit répondant à la formule générale: NH2 R1 =C R2 dans laquelle R1 est un atome d'oxygène ou un atome de soufre et R2 un groupement NH2 ou une chaine linéaire, insaturée ou non, du type: -O-C..., -NH-C..., ou -C... avec, éventuellement, des substitutions hydroxyle. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit est l'urée. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit est la thiourée. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit est l'allylurée. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit est l'acétamide. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit est le méthylcarbamate. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit est le butylcarbamate. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le produit est utilisé à une concentration finale de l'ordre de 0,5. 9. Procédé selon l'ensemble des revendications 2 et 8, caractérisé en ce que l'urée est utilisée à une 263351 concentration finale allant de 0,125 à 2 % environ. 10. Composition vaccinale lyophilisée obtenue selon le procédé défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 9.