FR 2628297 A1 19890915 FR 8803034 A 19880309 La présente invention concerne un nouveau procé- dé pour préparer un aliment utilisable en aquaculture. Plus particulièrement, la présente invention con- cerne un procédé pour la préparation d'un aliment hautement digestible par les mollusques et crustacés, leurs larves et les alevins, ainsi que par les invertébrés aquatiques qui constituent leurs aliments. Le développement de l'aquaculture a conduit de nombreuses équipes à-étudier l'alimentation des ale- vins et des larves aquatiques. L'alimentation de ces animaux a deux sources: - les algues microscopiques ou micro-algues, - les invertébrés microscopiques (Artémia, ro- tifères par exemple) se nourrissant-eux-mêmes de micro- alques. Les micro-algues constituent donc le premier maillon de la chaîne alimentaire applicable en milieu aqua- tique. Néanmoins, ces algues ne sont pas aisément dis- ponibles. Il faut les cultiver de manière intensive, ce qui contribue à élever notablement le prix de revient des pro- duits aquacoles. Il serait donc particulièrement intéressant de pouvoir remplacer les micro-algues par un produit de sub- stitution. Un tel substitut doit avoir une valeur nutri- tionnelle élevée et ne pas modifier les caractéristiques de l'eau. De plus, il doit répondre aux exigences du pré- dateur, c'est-à-dire avoir une taille lui permettant d'être avalé en une seule fois sans le fracturer (sans pour autant avoir une consistance pulvérulente), être appétant, et di- gestible. Des recherches récentes ont abouti à l'élabora- tion d'aliments microencapsulés (tel CAR de Frippak- Royaume-Uni); mais leur coût très élevé de fabrication et le fait qu'une partie des nutriments s'échappe de la micro- capsule font que ces produits sont d'application délicate et limitée. Un autre substitut des micro-algues est consti- tué par des protéines d'origine unicellulaire (Single Cell Protein ou SCP) et plus particulièrement les levures. Ces produits sont actuellement utilisés dans la formulations de certains aliments, notamment pour le bétail. Bien que ce type de produit à base de SCP soit l'objet d'un certain engouement depuis ces dernières années, leur utilisation se heurte à des difficultés provenant en particulier de leur digestibilité qui est assez mauvaise. Cette mauvaise digestibilité implique qu'avant leur incor- poration aux aliments pour bétail, on fasse éclater les cellules, par broyage ou traitement thermique. Un tel produit traité est admissible pour nourrir du bétail, mais est incompatible avec l'alimentation d'ani- maux en milieu aquatique. En effet, l'utilisation d'un tel produit conduit à une pollution importante de l'eau qui est difficilement acceptable. Des expériences poursuivies par la Demanderesse ont permis de mettre au point des produits tels que le TOPAL (Artemia Systems - Belgique) qui utilise des cellules de levures non éclatées pour l'alimentation en aquaculture. Bien que ce produit constitue une amélioration, notamment dans l'alimentation de certaines espèces de cre- vettes, il est difficilement digéré par les larves d'hu - tres et par Artemia. Aucune recherche n'a, jusqu'à présent, abouti à la préparation d'un substitut des micro-algues conve- nables, c'est-à-dire, présentant les avantages nutrition- nels des micro-algues, mais étant plus faciles à obtenir que ces dernières. La Demanderesse propose maintenant un procédé pour préparer un tel produit. Plus précisément, la Demanderesse a découvert un procédé permettant d'obtenir un substitut de micro-algues à partir de levures. Le procédé selon l'invention permet la prépara- tion d'une levure hautement digestible, notamment par les mollusques, les crustacés et leurs larves, caractérisé en ce que les cellues de levure sont traitées pour hydrolyser au moins partiellement les mannanes de la paroi cellulaire sans endommager la paroi elle-même. Les essais réalisés avec des réactifs hydroly- sant les ponts disulfure, soit par voie chimique, soit par voie enzymatique, par exemple les thiols tels que le mer- captoéthanol ou le dithiothréitol, les acides aminés tels que les acides aminés soufrés comwela cystéine ou la méthio- nine, et les réducteurs tels que sulfure de sodium (Na2S), ont montré que les cellules de levure ainsi traitées pré- sentaient une digestibilité améliorée bien que les cellules traitées gardent leur intégrité. De manière particulièrement avantageuse, le pro- cédé selon l'invention permet d'obtenir des levures qui sont accessibles aux enzymes digestives de leurs préda- teurs mais dont la paroi reste suffisamment intacte pour que le contenu cellulaire ne se répande pas dans l'eau. Une telle stabilité de la levure hautement di- gestible ainsi obtenue selon le procédé empêche la pollu- tion de l'eau par le contenu cellulaire. Le procédé selon l'invention peut avantageusement être mis en oeuvre selon les étapes suivantes: - lavage de la levure, - remise de la levure en suspension dans une solution contenant un réactif, - incubation de la suspension, - récupération des cellules, - rinçage, - stockage. Le lavage de la levure se fait de manière pré- férée au moyen d'une solution aqueuse d'EDTA disodique ou d'un de ses équivalents. La concentration en EDTA disodi- que est comprise entre 30 et 70 mM,de préférence égale à mM. Le pH de la solution d'EDTA est ajusté de préférence avec du NaOH, à une valeur comprise entre 7 et 12. La remise en suspension de la levure s'effectue dans une solution identique à celle utilisée pour le la- vage, à laquelle on a ajouté un thiol à une concentration variant entre 0, 01 et 6 % (v/v), ou un acide aminé soufré, ou un réducteur. Parmi les thiols avantageusement utilisés, on trouve les mercaptoalcools et leurs alcoolates. On pré- fère tout particulièrement le mercaptoéthanol et le di- thiothréitol que l'on rajoute à raison de 0,01 à 5 % (v/v). Parmi les acides aminés soufrés, on peut utiliser la cystéine ou la méthionine que l'on incorpore à rai- son de 0,01 à 0,1 M à la solution de lavage. Le sulfure de sodium est un réducteur qui *donne dé bons résultats. On peut l'incorporer à raison de 0,01 à 0,1 M. On remet la levure en suspension à une concen- tration comprise entre 300 mg/ml et 700 mg/ml (poids mouillé), de préférence égale à 500 mg/ml. On obtient de très bons résultats avec un pH de solution de lavage égal à 9 et une concentration (v/v) en mercaptoéthanol de 5 %. La suspension ainsi obtenue récupérées par cen- trifugation ou tout autre moyen équivalent et lavées 3 fois à l'eau de mer, afin d'éliminer toute trace de réactif. Les cellules ainsi obtenues peuvent être stoc- kées à une température voisine de 4 C dans l'eau de mer pendant au moins une semaine, sans que l'on constate de lyse de la paroi cellulaire. Les levures traitées selon le procédé peuvent servir pour les mollusques, les crustacés et les larves de ces derniers. Elles peuvent aussi servir d'aliments pour des petits invertébrés qui servent eux-mêmes de nourriture vivante pour les animaux cités ci-dessus. C'est le cas, par exemple, pour les Artemia et les rotifères. Le procédé selon l'invention permet donc de préparer des produits de substitution des micro-algues hautement digestibles par les rotifères, les mollusques et lescrustacés et leurs larves. Il s'agit d'un procédé facile à mettre en oeuvre et faisant appel à des matières premières aisées à trouver et peu onéreuses. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples ci-après. EXEMPLE 1 Comparaison entre les résultats d'élevage d'Artemia avec un aliment standard et avec une levure modifiée selon le procédé de l'in- vention Tous les élevages sont réalisés dans les mêmes % conditions physiques, dans la même eau de mer artificielle. a) Réalisation de l'eau de mer artificielle L'eau de mer utilisée pour les élevages est préparée selon Dietrich et Kalle (1963, d'après Kalle, 1971). Pour 10 litres,la composition est la suivante: - NaCl..................... ..... 239,0 g - MgCl2.6H20................... 108,3 g - CaCl2 (anhydre)...DTD: ............ 11,5 g - SrCl2.6H20.................... 0,04 g - KCl.........DTD: .................. 6,82 g KBr........................... 0,99 g - NaSO4.10H20................... 90,6 g - NaHCO3........................ 0, 20 g NaF........................... 0,003 g - H3BO........................DTD: .0,027 g 3 3 - eau distillée................. 9560 ml b) Conditions d'élevaae Des cystes secs d'Artemia (souche du Grand Lac Salé), crustacés de la sous-classe des Anostraces, sont hydratés dans de l'eau de mer artificielle à 25 C sous..DTD: éclairement constant. On récolte les nauplii après 24 heures d'incu- bation et on les répartit dans des tubes Falcon Blue Max 1070, à raison de 25 nauplii par tube. Chaque tube contient 50 ml d'eau, de mer artificielle aérée au moyen d'une pipette Pasteur. Les élevages durent une semaine. La nourriture est aménée quotidiennement selon la répar- tition décrite dans le paragraphe d) et le tableau 1. Le quatrième jour, avant alimentation, quinze larves sur- vivantes sont transférées dans des tubes remplis d'eau de mer artificielle fraîche. c) Préparation de la levure On décide d'appliquer le procédé à la levure- de boulanger fraîche Saccharomyces cerevisiae (Gist & Spriritusfabricken Bruggeman, N.V.). On met en oeuvre les étapes suivantes: - lavage de la levure avec une solution d'EDTA Na (50 mM) dans l'eau distillée dont on a ajusté le pH à 8 avec du NaOH, - addition de 2 % de mercaptoéthanol à la solu- tion décrite ci-dessus, - remise en suspension à raison de 500 mg/ml (poids mouillé) de la levure dans la solution ainsi obte- nue, - incubation pendant 30 minutes à 30 C, - récupération des cellules par centrifugation, - lavage à l'eau de mer, trois fois. d) Réalisation des élevages - la levure ainsi obtenue est donnée comme ali- ment pour un élevage d'Artemia, - un autre élevage d'Artemia est réalisé avec la même levure mais non traitée, - un troisième élevage est réalisé avec du pro- toplaste de Saccharomvces cerevisiae obtenu par des pro- cédures routinières, - un quatrième élevage est réalisé avec une microalgue unicellulaire vivante Dunalliela tertiolecta connue pour être un aliment adapté à Artemia. e) Résultats Au 4ème et au 8ème jour, on détermine: X: moyenne du nombre de larves survivantes s S: taux de survie s -S Xc: moyenne des longueurs des larves S: taux de croissance des larves c n:nombre d'élevage pour chaque type d'alimen- tation sachant que: % de survie au 4ème jour = 25 % de survie au 8ème jour = 15 La longueur des larves est mesurée au moyen d'un microscope binoculaire équipé d'un miroir à dessin. Les résultats sont consignés dans le Tableau 1 ci-après. 4ème jour Aliment Survie Longueur ( %) (ra) (min) S n X Sn s sc Protoplaste 86 8 29 1,77 0,10 6 Levure brute 72 15 11 1,31 0,06 6 Levure traitée 81 7 12 1,63 0,17 6 Micro-algue 94 7 5 1,80 0,15 5 8ème jour Aliment Survie Longueur (%) (mm) X Ss n X S n Xs s Protoplaste 67 14 12 3,98 0,31 6 Levure brute 29 8 5 2,91 0,10 5 Levure traitée 68 13 6 4,63 0,26 6 Micro-algue 95 6 5 4,24 0,18 5 Les performances du protoplaste de levure sont bon- nes, indiquant aue le contenu de la cellule de levure est un bon aliment pour Artemia. Les performances de la levure brute sont faibles, à cause de la paroi cellulaire empêchant la digestion du contenu cellulaire. Les performances de la levure traitée sont presque aussi bonnes que celles du protoplaste sans en avoir les inconvénients (pollution de l'eau). La levure traitée selon le procédé allie donc les avantages du protoplaste du point de vue nutrition et ceux de la levure brute du point de vue inocuité vis à vis de l'eau. EXEMPLE 2 Comparaison entre les résultats d'élevage d'Artemia avec des levures traitées selon différentes variantes du procédé Toutes les conditions d'élevage sont les mêmes que celles décrites dans l'exemple 1. a) Préparation de la levure On applique à 2 lots de la même levure que celle utilisée dans l'exemple 1, deux variantes du pro- cédé: Première variante - le pH de la solution d'EDTA Na2 est ajusté à 9 avec NaOH, - on ajoute à cette solution, lors de la remise en suspension de la levure, 5 % de mercaptoéthanol (v/v). Seconde variante - le pH de la solution d'EDTA Na2 est ajusté à 12 avec NaOH, - on ajoute à cette solution, lors de la remise en suspension de la levure, 0,02 % de mercaptoéthanol (v/v). b) Réalisation des élevages - un élevage est réalisé avec la levure brute, - un second élevage est réalisé avec la levure telle que modifiée dans l'exemple 1, - un troisième élevage est réalisé avec la le- vure telle que modifiée selon la première variante décri- te ci-dessus, - un quatrième élevage est réalisé avec la le- vure telle que modifiée selon la seconde variante décrite ci-dessus, enfin, un élevage témoin est réalisé avec la micro-algue utilisée dans l'exemple 1. 1 0 Résultats Les résultats de survie et de croissance au 4ème et au 8ème jour sont regroupés dans le tableau 2 ci-après: 4ème jour Aliment Survie Croissance (%) (mm) Xs Ss n X S n s s c c Levure brute 85 7 6 (1,16) - Levure traitée selon l'exemple 1 96 5 6 (1,82) - Levure traitée selon la 1ère variante 95 5 6 (1,87) - Levure traitée selon la 2ème variante 99 2 6 (1,49) - - micro-algue 98 2 5 (2,04) - - 8ème jour Aliment Survie Croissance (%) (mm) X S n X S n s s c c Levure brute 31 17 6 1,69 0,22 6 Levure traitée selon l'exemple 1 66 15 6 4,76 0, 25 6 Levure traitée selon la 1ère variante 74 7 6 4,91 0,24 6 Levure traitée selon la 2ème variante 67 12 6 4,68 0,13 6 micro-algue 93 9 5 4, 37 0,30 5 - l1 - On constate de meilleures performances pour la levure traitée selon les modalités décrites dans l'exemple 2, en particulier dans le cas de la seconde variante qui met en oeuvre des concentrations très faibles en mercapto- éthanol. EXEMPLE 3 Comparaison entre les résultats d'élevage d'Artemia avec des levures traitées avec des acides aminés et des réductants Toutes les conditions d'élevage sont les mêmes que celles décrites dans l'exemple 1. a) PréDaration de la lvure On applique à 2 lots de la même levure que celle utilisée dans l'exemple 1, deux variantes du procédé: Première variante - on ajoute à la solution d'EDTA Na2, de la cystéine à une concentration de 0,1 M, - on ajuste le pH de la sclution à 8, lors de la remise en suspension de la levure. Seconde variante - le pH de la solution d'EDTA Na2 est ajusté à 9 avec NaOH, - on ajoute à cette solution, lors de la re- mise en suspension de la levure, 0,1 M de sulfure de sodium (Na2S). b) Réalisations des élevaÂes - un élevage est réalisé avec la levure telle que modifiée dans l'exemple 2 (variante 1), - un deuxième élevage est réalisé avec la le- vure telle que modifiée selon la description ci-dessus (variante 1), - un deuxième élevage est réalisé avec la le- vure telle que modifiée selon la description ci-dessus (variante 2). Résultats 4ème jour Aliment Survie Croissance (%) (mm) -X S n X S n s s c c Levure traitée selon l'exemple 2 (variante 1) 97 6 6 (1,49) - Levure traitée selon l'exemple 3 (variante 1) 91 5 6 (1,76) - - Levure traitée selon l'exemple 3 (variante 2) 95 4 6 (1,58) - - 8ème jour Aliment Survie. Croissance (%) (mm) Xs S n XC S n Levure traitée selon l'exemple 2 (variante 1) 76 11 6 4,17 0,36 6 Levure traitée selon l'exemple 3 (variante 1) 70 12 6 4,07 0,65 6 Levure traitée selon l'exemple 3 (variante 2) 41 14 6 4,61 0,27 6 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de levure hautement digestible utilisable notamment comme aliment en aqua- culture, caractérise en ce que les cellules de levure sont traitées pour hydrolyser au moins partiellement les mannanes de la paroi cellulaire sans endommager la paroi elle-même. 2. Procédé selon la revendication 1, caractéri- sé en ce que l'hydrolyse des mannanes est effectuée à l'aide d'un réactif qui hydrolyse les ponts disulfure. 3. Procédé selon la revendication 2, caracté- risé en ce que le réactif est choisi parmi les composés - chimiques et les composés enzymatiques. 4. Procédé selon la revendication 3, caractéri- sé en ce que le composé chimique est un thiol, un acide aminé, ou un réducteur. 5. Procédé selon la revendication 4, caractéri- sé en ce que le thiol utilisé est choisi parmi les mercap- toalcools et les thioalcoolates correspondants, que l'acide aminé est choisi parmi les acides aminés soufrés, et que le réducteur est choisi parmi les sulfures. 6. Procédé selon la revendication 5, caractéri- sé en ce que le réactif est choisi parmi le mercaptoéthanol, le dithiothréitol, la cystéine, la methionine, et le sulfure de sodium. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 6, comprenant les étapes suivantes: - lavage de la levure, remise de la levure en suspension dans une solution contenant un thiol, ou un acide aminé soufré, ou un sulfure, - incubation de la suspension, récupération des cellules, - rinçage. 8. Procédé selon la revendication 7, caracté- risé en ce que le pH de la solution de lavage est com- prise entre 7 et 12. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 7 ou 8, caractérisé en ce que la levure est en suspension à raison de 300 à 700 mg/ml (poids mouillé) de préférence à raison de 500 mg/ml. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 7 à 9, caractérisé en ce que la solution, dans laquelle la levure est remise en suspension, est identi- que à la solution de lavage à laquelle on rajoute 0,01 et 6 % (v/v) de thiol. 11. Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 7 à 9, caractérisé en ce que la solution dans laquelle on remet la levure en suspension de lavage dans laquelle on rajoute entre 0,01 et 0,1 M d'acide aminé soufré, ou entre 0,01 et 0,1 M d'un sulfure. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 7 à 11, caractérisé en ce que l'incubation dure entre 15 minutes et 45 minutes, de préférence 30 minutes. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 7 à 12, caractérisé en ce que la température d'in- cubation est comprise entre entre 25 C et 35 C, de préfé- rence égale à 30 C. 14. Aliment utilisable en aquaculture, carac- térisé en ce qu'il contient une levure hautement digesti- ble préparée par la mise en oeuvre du procédé selon les revendications 1 à 13.