FR 2628750 A1 19890922 FR 8803475 A 19880321 VECTEUR MODIFIE PAR UNE SEOUENCE CODANT POUR UNE SEOUENCE D'ACIDES AMINES CONTENUE DANS UNE PROTEINE DE MAMMIFERE AYANT UNE ACTIVITE BIOLOGIOUE DE RECEPTEUR MEMBRANAIRE. EXPRESSION DE CETTE SEOUENCE DANS DES CULTURES UNICELLULAIRES TRANSFORMEES PAR CE VECTEUR. PROCEDE D'ETUDE DE LIGANDS RECONNAISSANT CES RECEPTEURS L'invention concerne un vecteur réplicable dans des cultures d'organismes unicellulaires, ce vecteur contenant un gène codant pour une protéine eucaryote, ayant une activité biologique de récepteur membranaire et interagissant avec une protéine de régu- lation -dite protéine G- apte à fixer des molécules de guanosine triphosphate (GTP). L'invention est également relative à des organismes unicellulaires transformés par des gènes codant pour ces récepteurs membranaires et portant à leur surface des séquences peptidiques reconnues par des ligands spécifiques desdits récepteurs membranaires. L'invention concerne aussi des trousses (ou kits) pour l'identification de protéines de mammifères ayant des caractéristiques permettant de vérifier qu'ils appartiennent à une famille de récepteurs membranaires de mammifères ou, à l'inverse, d'étudier le degré d'affinité de certaines substances pour des récepteurs membranaires déterminés. D'une façon générale, les protéines G sont des protéines ayant la capacité de s'interposer structura- lement et fonctionnellement entre des récepteurs et des enzymes catalysant la production de médiateurs intra- cellulaires (tels que l'adénylate cyclase, la guanylate cyclase, les phospholipases, les kinases) ou entre des récepteurs et des canaux ioniques dont l'ouverture contrôlée entraine un flux d'ions (tels que les ions calcium, potassium, sodium, hydrogène) dans la cellule. Ces protéines ont-.des fonctions de trans- duction et de couplage et sont caractérisées par une structure monomère composée de trois sous-unités pro- téiques alpha, bêta, gamma. On peut distinguer diffé- rentes protéines G à partir des variations observées dans leur sous-unité alpha ou parfois dans leur sous- unité bêta. Ces protéines G ont été décrites en détail dans l'article de Allen M.Spiegel(21). Des récepteurs membranaires de cellules de mammifères normalement couplés à une protéine G, ont été identifiés par clonage, complétés pour certains d'entre eux par l'analyse de leur séquence. Ces récepteurs com- portent des régions exposées à la surface des cellules hôtes, ayant des affinités spécifiques respectives pour une grande variété de ligands, hormones, neurotrans- metteurs et autres stimulants sensoriels capables de transmettre des signaux à l'intérieur desdites cellules, via les récepteurs correspondants et les protéines G. Des récepteurs intéressants dans le cadre de l'invention sont notamment les récepteurs suivants: - les récepteurs 0 adrénergiques:(récepteur avaire p1, de mammifère 91 et 92), récepteur'du Glucagon, de l'hor- mone adrénocorticotrope, de l'hormone parathyroide (PTH: abréviation anglaise de "Para Thyrold Hormone"), de l'hormone thyréotrope, du facteur libérant de l'hormone de croissance, de la prostaglandine E, les récepteurs D1 dopaminergique, du peptide vasoactif intestinal, les récepteurs muscariniques M1 à M6, le récepteur de la serotonine S1,S2, le récepteur D2 dopa- minergique, du neuropeptide substance K, de la vaso- pressine, de la somatostatine, de la thyréostimuline, de la bombésine, de la cholécystokinine (CCK), les ré- cepteurs de la lumière, du peptide Met-Leu-Phe chemo- tactique, les récepteurs a adrénergiques (a1,a2), le récepteur H1 histaminique, le récepteur des opioides (enkephalines, endorphines), du neuropeptide substance P, de l'angiotensine II, de la prostaglandine, du facteur libérant l'hormone corticotrope, de la bradyki- nine, de la sécrétine, le récepteur olfactif. Une famille préférée de récepteurs selon l'invention, qui présentent des caractéristiques géné- tiques et moléculaires qui leur sont essentiellement communes, comprend des récepteurs P1-, 02-, al et a2- adrénergiques (1)(2)(3)(4), des récepteurs muscariniques appartenant aux sous-types M1 à M4 (5)(6) et le ré- cepteur du neuropeptide connu sous la désignation "substance K"(7). Ces récepteurs paraissent posséder une organisation structurale commune au sein de la membrane plasmatique, normalement caractérisée par sept segments transmembranaires hydrophobes entre lesquels s'interca- lent des boucles extra- et intra-cellulaires, par une région aminoterminale extracellulaire et par une région carboxyterminale cytoplasmique. Plusieurs gènes codant respectivement pour certains de ces récepteurs ont été rendus capables, après leur introduction dans des cultures de cellules de mammifères appartenant à des espèces étrangères de s'y exprimer. Les opérations de transformations nécessaires à l'expression de ces gènes dans des cellules de mam- mifères appartenant à des espèces étrangères sont assez complexes et ne peuvent être aisément généralisées à l'expression d'autres récepteurs. L'invention a pour but de fournir des procédés et moyens rendant aisée l'identification et l'étude de nouveaux récepteurs membranaires présentant des ca- ractéristiques structurales communes avec les récepteurs membranaires du type sus-indiqué. A l'inverse elle a pour but l'étude aisée du niveau d'affinité éventuel de molécules susceptibles de se comporter comme des ligands à l'égard de ces récepteurs membranaires. En particulier, l'invention concerne un vecteur réplicable dans une culture d'un hôte unicellu- laire contenant un insérat de nucléotides codant pour une séquence d'acides aminés contenue dans une protéine de mammifère et ayant une activité biologique de récepteur membranaire, ce vecteur étant caractérisé en ce que l'insérat est placé sous le contrôle d'une sé- quence, incluse dans ce vecteur, autorisant l'expression de cet insérat dans ledit hôte cellulaire, et comportant notamment un promoteur reconnu par les polymérases de cet hôte unicellulaire, et en ce que cet insérat code pour une séquence d'acides aminés contenue dans une protéine présentant des éléments de structure en commun avec les récepteurs membranaires susdits, notamment les récepteurs a- ou p-adrénergiques, les récepteurs musca- i5 riniques, les récepteurs neuropeptidiques, en parti- culier la "substance K". L'invention résulte de la découverte que le fait de placer une séquence de nucléotides codant pour un récepteur membranaire de mammmifère sous le contrôle d'un promoteur reconnu par les polymérases de l'hôte unicellulaire dans des conditions permettant l'expres- sion de cette séquence de nucléotides au sein de l'or- ganisme unicellulaire permet également, lorsque se manifeste cette expression, le transport du produit d'expression dans les membranes de l'hôte unicellulaire, et que cette expression s'accompagne également de l'exposition, également à l'extérieur de ces hôtes uni- cellulaires, des sites caractéristiques des récepteurs membranaires qui affleurent à la surface des cellules de mammifères d'origine, et ce sous une configuration spa- tiale conservée à l'échelle moléculaire, de sorte que ces sites peuvent être reconnus par les mêmes ligands. Par "hôte unicellulaire" on entend tout or- ganisme susceptible d'être maintenu en culture en l'absence de différentiation cellulaire. L'organisme unicellulaire de choix est constitué par Escherichia Coli. Mais d'autres microorganismes peuvent être utilisés tout aussi aisément, naturellement sous réserve que l'on connaisse pour chacun d'entre eux des vecteurs notamment plasmidiques susceptibles de s'y répliquer et des séquences de nucléotides insérables dans ces vecteurs et capables, lorsqu'elles sont suivies dans ces vecteurs par un insérat codant pour un polypeptide ayant les propriétés d'un récepteur membranaire dans les conditions sus-indiquées, d'assurer l'expression de cet insérat dans les organismes choisis et leur transport dans les membranes de ces hôtes unicellulaires. S'agissant de réaliser l'expression dans E.coli, la séquence dirigeant l'expression de l'insérat peut comporter, par exemple, les éléments de régulation, notamment le promoteur de l'opéron lactose ou de l'opéron-. tryptophane. D'autres organismes unicellulaires suscepti- bles d'être mis en oeuvre et par conséquent d'autres vecteurs, eux-mêmes modifiables par une séquence susceptible de diriger l'expression d'un récepteur membranaire ou analogue dans ces organismes unicel- lulaires, sont indiqués dans le tableau ci-après: Organisme Type Région unicellulaire vecteur promotrice S.Cerevisiae plasmide 2p alcool deshydrogénase I (ADH.I) S.Cerevisiae plasmide PBM 258 promoteur du gène galactokinas e (GAL I) Les organismes sus-indiqués et les vecteurs modifiés correspondants se prêtent avec avantage à l'expression de séquences génétiques codant pour des molécules ayant des caractéristiques de structure en commun avec des récepteurs membranaires déjà connus de mammifères et à leur transport à la membrane de ces hôtes unicellulaires dans les conditions sus-indiquées. A titre d'exemples de récepteurs susceptibles d'être aussi placés et exprimés dans des organismes unicellulaires, notamment E.coli, on mentionnera: - les différents récepteurs p-adrénergiques et musca- riniques décrits dans le chapitre intitulé "the P-adré- nergic receptors and 6-proteins" (récepteurs P-adré- nergiques et 6-protéines) de A.D.Strosberg, dans l'ouvrage édité sous la direction du même auteur sous le titre "The Molecular Biology of receptors - Techniques and Applications of Receptor Research" (La Biologie Moléculaire des récepteurs-Techniques et Applications de la recherche de récepteurs) et publié par Ellis Horwood Ltd. Chichester - Grande Bretagne (VCH) - ou encore les récepteurs décrits dans les publications de Brian K.Kobilka et al, Nature, Vol. 329, 75-79 du 3 Septembre 1987 ou de L.J.Emorine et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 84, p. 6995-6999, Octobre 1987. L'invention permet non seulement l'étude des récepteurs membranaires de mammifères qui ont été indiqués, mais aussi de ceux des récepteurs ou polypeptides ayant des éléments de structures semblables, qui peuvent être obtenus ou purifiés à partir de techniques classiques, par exemple - soit par des cADNs obtenus par transcription reverse d'ARN messagers et séquences, par exemple selon les techniques décrits par Dixon.R.A.F. et al (1986) Nature, 321, 75, Dixon,R.A.F. et al (1987)Nature, 326, 73, Yarden, Y. et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 35679-6799, 6795-6799, - soit en ayant recours à des oligonucléotides utilisés comme sondes d'hybridation, permettant l'isolement de polynucléotides codant pour des récepteurs du gène en question selon des techniques connues, comprenant des réactions d'hybridation sélective. Lesdites sondes consistent par exemple en des oligonucléotides-sondes dérivés de fragments d'ADN de régions à fortes homologies entre les différents ré- cepteurs. Des sondes utilisables pour isoler des sé- quences de nucléotides codant pour des récepteurs mem- branaires peuvent aussi, par exemple, consister en des fragments conservés, obtenus à partir de séquences nucléotidiques codant pour l'une des sept séquences peptidiques transmembranaires hydrophobes représentées aux pages 148-149 de l'ouvrage déjà cité et édité sous la direction de A. D.Strosberg. Ces différentes séquences peptidiques respectivement visées par les chiffres ro- mains de I à VII, sensiblement analogues entre-elles sont issues respectivement de récepteurs P2-adréner- giques de hamster, de récepteurs 0-adrénergiques de l'homme, de récepteurs p-adrénergiques de la dinde, de récepteurs muscariniques de l'acétyl choline de cerveau de porc et d'opsine de bovin. Dans le cas de l'opsine de bovin, on aura recours, pour préparer une des sondes précédentes, à l'ADNc correspondant à l'ARN génomique du récepteur. A titre d'exemple, les sondes suivantes pour- ront être mises en oeuvre pour isoler des séquences nu- cléotidiques codant pour des récepteurs membranaires. CTTGGTCAGCTTGGCCTGTGCTGATCTGGTCATG (segment trans- membranaire II) GCTTTCATGGTCAGCTGGCTGCCCTAC (segment transmembranai- re VI) On peut aussi mettre en oeuvre des ensembles de sondes généralement représentables par les formules suivantes: - ensembles transmembranaires II: 5'X 1X2TX3X4TX5X6X7CX8TGGCX9X1oXl X12GCTGAX13CTX14X15 TX16ATG3' dans laquelle X1 à X16 ont indépendamment les uns des autres, les significations suivantes: X1 est C ou T X2 estT ou A X3 est G ou C X4 est G ou T X est C ou G X est A ou T X7estG ou C X est T ou C X est C ou G X10 est T ou G X1l est G ou T X12 est T ou G X13 est T ou C X14 est G ou C X15 est G ou T X16 est C ou G et ensembles transmembranaires VI: 'GCY1TTCATY2Y3TY4Y5Y6CTGGY7TY8CCY9TY1oC3' dans laquelle Y1 à Y10 représentent indépendamment les uns des autres: Y1 est T ou G Y2 est G ou C 2 Y3 est G ou C Y4 est C ou G Y est A ou T Y6 est G ou C Y7 est C ou G Y8 est G ou C Y9 est C ou G Y10 est A ou T Pour isoler des séquences nucléotidiques pré- sumées coder pour un récepteur membranaire, on utilisera de préférence deux ou plusieurs séquences sondes telles que définies ci-dessus, choisies pour leur appartenance à des régions différentes des séquences nucléotidiques présentant une communauté de séquence dans la partie correspondant aux sept segments transmembranaires dé- crits plus haut. En particulier, on mettra en oeuvre des sondes du type de celles décrites plus haut avec leurs séquences complémentaires respectives. On pourra également avoir recours à des en- sembles des ces sondes. On apprécie que le procédé selon l'invention permet alors, pour chaque récepteur membranaire exprimé à la surface des organismes unicellulaires, notamment bactériens, de mesurer les degrés d'affinité de diffé- rentes molécules présumées se comporter comme ligands vis-à-vis de ces récepteurs. Ces ligands peuvent d'ail- leurs être utilisés également pour repérer au sein de colonies diverses transformées un grand nombre de fragments d'acide nucléique d'origines diverses (expé- rience dite de "shot gun") parmi lesquels des fragments codant pour ces polypeptides de mammifères. Seront alors détectées celles des colonies gui, en raison de l'ex- pression d'une séquence codant pour le récepteur mem- branaire de mammifère, forment une liaison avec le ligand correspondant. A l'inverse, l'invention permet aussi l'étude de l'affinité de diverses molécules possibles à l'égard d'un récepteur membranaire déterminé consistant dans le produit d'expression d'un insérat correspondant inséré dans un vecteur modifié dans les conditions sus-définies et incorporé à un hôte cellulaire dans lequel ce vecteur est réplicable.. De -même l'invention permet de comparer les affinités réciproques d'un récepteur déterminé avec différentes molécules ayant des motifs structuraux en commun avec des récepteurs différents membranaires de mammifères, d'o la possibilité de classer lesdits récepteurs par ordre d'affinité. Tout ligand approprié peut être mis en oeuvre dans ces essais comparatifs. On mentionnera à titre d'exemple de ligands des pindolols, des iodocyano-pindolols, des propranolols, des alpre- nolols, etc...On peut encore se référer à l'ouvrage édité sous la direction de A.D. Strosberg, dans lequel sont identifiés de nombreux autres agonistes, ou an- tagonistes de récepteurs membranaires répondant aux définitions de l'invention. Dans l'une de ses applications préférées l'invention concerne donc des cultures cellulaires formées de cellules unicellulaires, notamment de bactéries, contenant des vecteurs réplicables au sein de ces organismes, ces vecteurs répondant aux conditions indiquées plus haut et contenant un insérat codant pour un récepteur membranaire de mammifères répondant aux définitions sus-indiquées, l'expression de ces insérats étant inductible ou ayant fait l'objet d'une induction entrainant le transport à la membrane des récepteurs membranaires correspondants, selon la nature du promoteur utilisé. Dans un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, le vecteur modifié est caractérisé en ce que l'insérat code pour une séquence d'acides aminés contenue dans un récepteur de mammifère du genre sus- indiqué, comportant dans sa structure des segments transmembranaires hydrophobes intercalés dans des boucles extra et intra-cellulaires, un segment in- tra-cellulaire carboxy-terminal, et un segment amino- terminal extracellulaire et des sites de liaisons constitués par des régions hydrophiles formées dans la membrane. Pour la réalisation du vecteur selon l'in- vention, on mettra en oeuvre de manière avantageuse un promoteur inductible. Un tel promoteur est régulable et n'est fonctionnel qu'après induction par une molécule biochimique ou par un traitement physique (traitement par la température, les rayons ultra violets...). L'utilisation d'un tel promoteur inductible permet donc de faire exprimer la séquence nucléotidique contenue dans le vecteur d'expression modifié, dans des condi- tions préalablement déterminées par l'opérateur, seule- ment au moment de l'emploi. De cette façon on évite la dégradation des cellules de la culture hôte transformée par le vecteur modifié, chaque fois que le récepteur étranger devant être exprimé dans la cellule et trans- porté dans la membrane présente un certain niveau de toxicité pour cette culture. Suivant un autre mode de réalisation du vecteur selon l'invention, l'insérat codant pour le récepteur peut être placé en amont d'une "séquence leader" ou "séquence signal" et en phase avec celle-ci, pour former une unité de transcription, cette séquence "leader" devant alors faciliter le transport du produit d'expression de l'insérat jusqu'à la membrane de l'hôte unicellulaire. Cette séquence "leader" code normalement pour une séquence N-terminale d'un précurseur d'une protéine de l'hôte unicellulaire, normalement transpor- tée à la membrane de la cellule, ce peptide N-terminal étant normalement clivé à l'occasion du transport de la protéine naturelle correspondante à la membrane de l'hôte unicellulaire. De la même façon le gène de fusion entre cette séquence "leader" ou signal et l'insérat doit normalement être exprimé sous la forme d'une protéine hybride clivée en aval de la séquence signal à l'occasion du transport du récepteur à la membrane de l'hôte unicellulaire. En variante, l'insérat est fusionné à une séquence codant pour tout ou partie d'une protéine hydrophile (par exemple la 0-galactosidase) cette fusion permettant d'assurer la solubilité de la protéine hy- bride, produit de l'expression de l'insérat et de la séquence codant pour la protéine hydrophile, pendant le transport du récepteur résultant de l'expression de l'insérat dans l'hôte unicellulaire et dans la membrane de celui-ci. L'invention se rapporte encore aux organismes unicellulaires eux-mêmes transformés par un vecteur modifié tel que décrit plus haut, et plus particuliè- rement des cultures d'organismes unicellulaires portant à leur surface des sites ou déterminants reconnus par les ligands spécifiques des récepteurs membranaires de mammifères correspondants. Pour mettre en oeuvre l'invention et réaliser l'expression de la séquence nucléotidique correspondant à la protéine choisie, on utilisera de préférence un organisme unicellulaire sélectionné parmi les bactéries, les levures ou tout autre organisme unicellulaire ac- ceptant le vecteur modifié selon l'invention et permettant sa réplication ainsi que l'expression de la protéine choisie et son transport à la surface de la cellule. L'invention est également relative à un procédé pour l'obtention d'organismes unicellulaires comportant, exposés à leur surface, des sites ca- ractéristiques d'un récepteur membranaire de mammifère, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend: a/ - la transformation d'un organisme unicellulaire par un vecteur réplicable dans cet organisme, préalablement modifié contenant un promoteur reconnu par les poly- mérases de l'hôte unicellulaire et fonctionnel dans celui-ci et un insérat placé sous le contrôle de ce pro- moteur et codant pour une séquence d'acides aminés normalement contenue dans un récepteur membranaire de mammifère tel qu'il a été décrit plus haut. b/ - la sélection des organismes unicellulaires trans- formés, dans lesquels le susdit insérat est exprimé ou exprimable sous une forme telle que sa structure com- prenne un ou plusieurs sites, exposés à l'extérieur des membranes cellulaires et capable(s) d'être reconnu par un ligand correspondant. En variante la détection de l'expression peut être réalisée en ayant recours à des anticorps spécifiques, notamment monoclonaux, recon- naissant spécifiquement les mêmes sites. Lorsque l'organisme unicellulaire est transformé par un vecteur modifié contenant un promoteur inductible en amont de la séquence nucléotidique à ex- primer, une étape intermédiaire entre les étapes a/ et b/ précitées est nécessaire, cet étape consistant en l'induction dudit promoteur, notamment sous l'effet de la substance appropriée (par exemple l'IPTG (isopropyl- D-thiogalactopyranoside) dans le cas du promoteur de l'opéron lactose pour le tryptophane dans le cas du promoteur de l'opéron tryptophane) ajoutée au milieu de culture lorsque cette induction est souhaitée. La présente invention est encore relative à un procédé de détection de la capacité d'une molécule à se comporter comme un ligand vis-à-vis d'un récepteur mem- branaire, ce procédé comprenant: Àa/ - la mise en contact de la molécule avec un organisme unicellulaire préalablement transformé par un vecteur lui-même modifié par'un insérat codant pour ce récepteur membranaire, cet organisme portant à sa sur- face un ou plusieurs sites spécifiques de ce récepteur, le cas échéant après induction de l'expression de cet insérat, cette mise en contact étant effectuée dans des conditions permettant la formation d'une liaison entre l'un au moins de ces sites spécifiques et ladite molé- cule dès lors qu'elle s'avèrerait effectivement posséder une affinité pour ce récepteur. b/ - la détection de la formation éventuelle d'un complexe du type ligand-récepteur. Les conditions permettant la formation de la susdite liaison, correspondent normalement à celles dans lesquelles celles-ci se forment entre les récepteurs naturels et les ligands concernés. L'invention est aussi relative à un procédé pour l'étude de l'affinité d'un récepteur de mammifère appartenant à la classe de ceux qui sont couplés à une protéine G, pour un ou plusieurs ligands déterminés, caractérisé par: - la transformation d'une culture unicellulaire avec un vecteur, notamment un plasmide ou un phage dans lequel avait auparavant été incorp6rée une séquence de nucléotides ou codant pour le polypeptide contenu dans ce récepteur de mammifère, sous le contrôle d'éléments de régulation, notamment d'un promoteur, permettant l'expression dans la culture unicellulaire utilisée de ladite séquence de nucléotides, - la culture des organismes unicellulaires transformés dans des conditions permettant l'expression dudit insérat, 3O - la mise en contact de ces organismes unicellulaires avec ces ligands déterminés, - la détection d'une réaction affine entre lesdits organismes unicellulaires transformés et lesdits ligands déterminés. L'invention vise également une trousse (ou kit) pour la détection de l'affinité éventuelle d'un ligand pour un récepteur membranaire de mammifère déterminé, comprenant: - une culture d'organismes unicellulaires transformés par un vecteur modifié tel que décrit dans les pages précédentes, dans lequel l'insérat code pour le susdit récepteur membranaire, - des moyens physiques ou chimiques pour induire l'expression de la séquence nucléotidique contenue dans le vecteur modifié, lorsque le promoteur placé en amont de cette séquence est un promoteur inductible par les- dits moyens physiques ou chimiques, - un ou plusieurs ligands témoins ayant des affinités déterminées pour ledit récepteur membranaire, - des moyens physiques ou chimiques pour la caracté- risation de l'activité biologique de ladite protéine. L'invention fournit donc des moyens permettant aussi l'étude du comportement de protéines fonction- nelles en tant que récepteurs, grâce à l'exposition de - leurs sites spécifiques à la surface d'organismes uni- cellulaires lorsque ceux-ci auront auparavant été trans- formés par des vecteurs contenant un insérat codant pour ladite protéine fonctionnelle. Elle permet aussi la dé- tection ou la vérification de l'affinité d'une protéine en tant que récepteur vis-à-vis d'un ligand déterminé. Elle permet encore l'étude de la spécificité de liaison de ces récepteurs vis-à-vis de différents ligands choi- sis pour leur intérêt, par exemple dans la perspective de traitements thérapeutiques futurs. Un avantage particulier de l'invention résulte dans la substitution des récepteurs dont la purification est extrêmement difficile et la durée de conservation minime, par des cellules exprimant -ou susceptibles d'exprimer à leurs surfaces, les sites caractéristiques de récepteurs qui peuvent-être reconnus par les ligands étudiés. Ces.cellules peuvent être aisément conservées, surtout lorsque le vecteur modifié comprend un promoteur inductible au moment de l'emploi. Grâce à leur capacité à être cultivée, les cellules permettent la régénération à la demande des sites spécifiques de ces récepteurs en quantités pratiquement illimitées. Les cultures d'organismes unicellulaires transformés par un vecteur modifié précédemment décrit peuvent être notamment conservées en l'attente d'usage notamment en les plaçant dans du glycérol 20 % en final dans la solution à -70'C. Elles peuvent encore être con- servées sous forme de spores. L'invention se prête à de nombreuses applica- tions. On en mentionne quelques unes ci-après à titre d'exemples. Des applications particulièrement intéres- santes en particulier dans le domaine de la thérapie consistent dans l'étude de la capacité de substances -bloquantes nouvelles susceptibles d'agir au niveau des récepteurs g-adrénergiques, notamment 01adrénergiques (au niveau du coeur) ou ?2-adrénergiques (dans le poumon).On a constaté que de nombreuses substances dites 0-bloquantes se lient à la fois aux récepteurs * g1 et 02-adrénergiques. Certains traitements théra- peutiques nécessitent cependant l'utilisation de mé- dicaments spécifiques de l'un ou l'autre de ces récepteurs et impliquent donc la détermination de sous- types de récepteurs, capables de se lier à des ligands spécifiques. L'invention permet la réalisation de cultures unicellulaires capables de faciliter le criblage des ligands selon les natures de leurs activités vis-à-vis des différents types de récepteurs 0-adrénergiques: elle permet donc la détermination aisée-des spécificités pharmacologiques et thérapeuti- ques de médicaments à l'étude. L'invention fournit aussi des moyens simples pour l'étude des effets de modifications introduites dans des récepteurs, vis-à-vis de leurs interactions avec des substances chimiques, notamment de ligands connus pour leur aptitude à se lier avec ces récepteurs dans leurs formes non modifiées. D'autre caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description et dans les exemples, notamment en rapport avec les dessins et le tableau dans lesquels: - la figure 1 représente de façon schématique les ré- gions codant pour le récepteur humain _2-adrénergique (hu-g2 R) recombiné avec le gène de la 9-galactosidase (lac Z) du phage Agtll (11). - La figure 2 témoigne des variations de l'affinité de liaison.entre les molécules d'un ligand, le ICYP et des cellules intactes de E.coli exprimant la séquence hu-p2R de la figure 1 contenue dans le gène de fusion. - La figure 3 témoigne de l'expression détectée à l'aide d'un marquage par photo-affinité de récepteurs P2-adré- nergiques exprimés dans la membrane de E.coli. - Le tableau 1 contient les résultats observés avec des ligands gadrénergiques liant le récepteur hu-P2 exprimé dans des cellules E.coli intactes et leur comportement en présence d'agonistes et d'antagonistes compétitifs. Sur la figure 1 apparaissent les sites de res- triction utilisés pour la construction du gène de fu- sion. Le codon d'initiation pour le gène hu-02 R est compris dans le site de restriction NcoI et son codon de terminaison est localisé 19 paires de bases en amont vers l'extrémité 5' du site de restriction Dra I. Dans la partie inférieure de la figure, à la jonction entre les deux gènes, l'adaptateur synthétique s'étendant des sites Eco RI à NcoI et qui maintient le cadre de lecture du gène lac Z en correspondance avec celui du gène hu-02 R est souligné. La séquence d'acides aminés correspondante est représentée sous la séquence nucléotidique, en utilisant les codes suivants pour la désignation des aminoacides: M Méthionine L Leucine I Isoleucine V Valine -F Phenylalanine S Sérine P Proline T Thréonine A Alanine Y Tyrosine H Histidine Q Glutamine N Asparagine K Lysine D Acide Aspartique E Acide glutaminique C Cystéine W Tryptophane R Arginine G Glycine Exemple: Expression du récepteur humain 02-adrénergique dans E.coli. 1/ CONSTRUCTION DU GENE RECOMBINANT. Dans cette étape il s'agit d'insérer la région codante du récepteur humain p2-adrénergique dans le vecteur d'expression Agt11 au niveau du site de res- triction Eco RI, près de l'extrémité 3' du gène lac Z codant pour la $-galactoidase. Dans une première étape, un adaptateur syn- thétique (linker) s'étendant du site Eco RI au site NcoI) est lié au fragment d'ADN purifié de 1,3kb s'étendant des sites NcoI à DraI, contenant la région codante du récepteur humain 02-adrénergique. Cet adaptateur contient. une séquence codant pour la séquence d'acides aminés Asp-Asp-Pro et faci- litera la séparation de la protéine de fusion obtenue après l'étape ultérieure d'expression du gène recombi- nant, par hydrolyse de la liaison Asp-Pro, au moyen d'un clivage acide doux. Après extraction au phénol et précipitation à l'isopropanol, des adaptateurs Eco RI ont été liés à cette construction qui, après digestion par Eco RI et purification, a été insérée au niveau du site unique EcoRI dans le vecteur Agt11. Un contrôle a été effectué pour vérifier que les sites de restriction Eco RI et NcoI ainsi que l'orientation du gène inséré avaient été préservés. Le fragment de recombinaison (ou gène recom- binant) obtenu entre le fragment issu du gène lac Z et le fragment hu-02 R par l'intermédiaire de l'adaptateur sont représentés à la figure 1. Elle fait également apparaître en traits fins les parties 3' et 5' de l'ADN de Agt11, de part et d'autre du fragment de recombi- naison. 2/ EXPRESSION DU GENE RECOMBINANT DANS E.coli. Le vecteur recombinant obtenu a été inséré dans une souche Y1089 E.coli par lysogènisation de cette dernière avec le phage recombinant par une technique classique, notamment celle-.décrite dans (11). Les cellu- les ont été récoltées et remises en suspension dans un tampon 10mM tris, pH 7,4, 90mM NaCl. L'expression de la protéine de fusion peut étre obtenue après induction du -20 promoteur par un choc thermique et par la mise en con- tact des cellules transformées avec l'isopropyle O-D- thio-galactopyranoside (IPTG). Une analyse du lysat bactérien par un test immunoblot en présence d'anticorps anti-p-galactosidase a montré' la présence de produits dont la taille variait entre 100 et 162kDa. 3/ ETUDE DE L'ACTIVITE DES RECEPTEURS AINSI EXPRIMES A LA SURFACE DE E.coli. AVEC DES LIGANDS CAPABLES DE FORMER DES LIAISONS DU TYPE RECEPTEUR-LIGAND. Pour réaliser cette étude on utilise plusieurs ligands-0-adrénergiques ainsi que des contrôles négatifs comprenant par exemple la bactérie E. coli transfectée avec le vecteur d'expression dépourvu de séquence nu- cléotidique codant pour le récepteur 0-adrénergique, ou encore ce vecteur contenant la susdite séquence insérée dans le sens opposé au sens de lecture. Des cellules E.coli Y1089 exprimant le gène chimérique sous forme d'une protéine de fusion, sont en suspension dans une solution de 10mM Tris (à pH 7,4), et mM NaCl. Des aliquots contenant 6 x 107 cellules sont ensuite, après induction de l'expression du récepteur, incubés pendant 1 heure à 37C dans un volume final de iml de ICYP ([125I] iodocyanopindolol, 2080Ci/mmol, des Laboratoires AMERSHAM) à différentes concentrations (de 1 à 80pM). Les réactions sont stoppées par filtration sur des filtres WHATMAN GF-F, suivie par 4 lavages rapides avec 4 ml de tampon. L'existence de fixations non spé- cifiques est déterminée en présence de I pM de propa- nolol; ces fixations sont inférieures à 23%. La figure 2 représente la courbe montrant la variation de la proportion de ligand fixé par 6x107 bactéries, en fonction de la concentration en ligand (ICYP) (de 1 à 80 pM de [125] ICYP). Cette courbe est une courbe de saturation; elle correspond à une classe unique de sites de fixation caractérisés par un Kd de -12 ,3 1,9 x 102 M (r=0,93). Le calcul montre que le nombre maximum de sites permettant la liaison du récepteur au ligand est de 25,5 5,2 par bactérie. Les expériences semblables réalisées avec des bactéries infectées par le vecteur Agt11 sauvage (dé- pourvu du gêne du récepteur humain p2) ou avec des bactéries infectées par un phage contenant le gène de ce récepteur, inséré dans la direction opposée, a montré que moins de 0,5% de liaisons a été mesuré. On a noté que l'expression du récepteur humain $2-adrénergique est maximale après 2 heures d'induction et stable jusqu'à 20 heures. Ceci correspond à la den- sité de bactéries maximum; cette observation suggère qu'il existe un effet inhibiteur sur la croissance bactérienne du produit exprimé par le gène inséré dans le vecteur d'expression. La fixation ou la liaison du ligand peut être déplacée par des ligands distincts susceptibles d'entrer en compétition avec le premier (voir par exemple le déplacement complet du ligand ICYP par le ligand hydro- phile CGP 12177 dans les essais décrits plus loin en rapport avec le tableau. Après séparation du cytoplasme l'activité reste liée avec les membranes (voir discus- sion de la fig. 3). Les cellules intactes non induites ont pu être conservées dans un mélange de 10mM Tris, 90mM NaCl à pH 7,4 pendant au moins 3 jours à 4'C, sans qu'il y ait perte de leur activité de liaison à l'égard du ligand. 4/ MAROUAGE PAR PHOTOAFFINITE DU RECEPTEUR B2-ADRENER- GIQUE EXPRIME DANS LA MEMBRANE DE E.COLI. Des bactéries préparées selon un protocole analogue à celui décrit dans l'étape précédente, sont resuspendues dans un volume correspondant à 1/20 de leur volume de culture d'Qrigine dans un tampon contenant 10 mM Tris (à. pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,5 mM de fluorure de sulfonyl-phénylméthane, 2 mM EDTA, 5pg par ml de leupeptine, 7pg par ml de pepstatine, 10.000 U par ml de trasylol et 4 pg par ml de benzamidine. Ce tampon sera encore utilisé dans toutes les étapes ultérieures. Les cellules sont ensuite congelées (dans de l'azote liquide) puis dégelées 4 fois jusqu'à obtenir leur lyse complète. L'ADN est ensuite brisé par ultra- sons (3 périodes de 10 secondes à 10 watts) pour dimi- nuer la viscosité, et le lysat est centrifugé 20 minutes à 6.000 g pour en retirer les débris et les cellules non lysées. Le surnageant a ensuite été centrifugé pendant 2 heures à 100 000 g. Le culot de centrifugation a été resuspendu dans 4 ml de tampon, homogénéisé dans un récipient de verre, et l'activité de liaison avec l'ICYP a été mesurée à la fois dans le culot de centrifugation et dans les fractions de surnageant. L'activité associée avec les protéines cyto- plasmiques était de 0% (déterminée par précipitation dans 12% de polyéthylène glycol 6.000) alors que 26,6% de l'activité de liaison ou fixation initiale a été retrouvée dans la fraction membranaire. Pour le marquage en photoaffinité, environ fmoles de sites capables de se lier avec l'ICYP, ont été incubés dans lml dans l'obscurité pendant 1 heure avec 500pM de ICYP-D (Iodo.CyanoPendolol-Diazirine) (AMERSHAM 1800 Ci/mmol à 37C, en présence ou non de 5pM (-) propanolol. 4ml de tampon ont été ajoutés, et les membranes ont été lavées 3 fois par centrifugation (15 minutes à 45.000 g) et resuspendues. Une photolyse a été effectuée dans des conditions décrites précédemment (15). Les membranes marquées ont été solubilisées dans un tampon Laemmli (16) contenant 5% SDS, puis soumises à l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 10% et autoradiographiées. Ces résultats montrent que l'activité du récepteur est pour l'essentiel concentrée dans les membranes, comme en témoignent les identifications des produits de fusion repérés à 162 kDA et du récepteur libre (46 kDa). Les données présentées dans 'le tableau résultent d'expériences de liaison par compétition réalisée avec des bactéries telles que celles auxquelles la figure 2 se réfère en utilisant 20 pM d'ICYP comme ligands marqués radioactivement, et différentes concen- trations de ligands différents capables d'entrer en compétition avec le premier. L'analyse des effets des ligands de compétition sur les courbes de liaison du ligand ICYP aux cellules et la détermination des valeurs IC50 ont. été réalisées grâce à l'utilisation d'un programme d'ordinateur adapté aux tests dans le cadre de compétitions simples (12). Chaque substance de compétition a été testée de 2 à 4 fois dans des expériences indépendantes. Les valeurs Ki ont été calculées à partir des valeurs IC50, tel qu'il est rapporté dans (14). Les stéréoisomères sont indiqués par (+) ou (-). Les profils pharmacologiques découlant des possibilités de déplacement du ligand fixé (ICYP) ou non sous l'effet des autres substances se sont avérés être de même nature que ceux qui caractérisent les mêmes récepteurs dans leurs hôtes cellulaires normaux (de mammifères). Cependant, contrairement à ce que l'on observe dans l'hôte cellulaire normal, aucun couplage ou aucune interaction apparentés n'ont été observés entre le récepteur humain 02adrénergique et l'adenylate-cyclase en particulier à l'occasion de la mise en contact des ligands actifs avec les cellules transformées, en parti- culier l'isoproterenol, et ce bien que E.coli contienne le facteur d'élongation Tu, qui est lui-même une pro- téine G capable de contrôler des synthèses de protéines (17) et d'agir en tant que régulateur de l'activité adenylate-cyclase. Ce manque apparent de couplage est peut être à mettre au compte de différences entre les protéines G de bactéries et les protéines G de mammi- fères. Une souche de culture cellulaire de E.coli transformée par un vecteur modifié selon l'invention par le gène hu-02-adrénergique et désignée par HU-02-Coli a été déposée à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes de l'Institut de Paris (CNCM) sous le numéro I-737,le 3 mars 1988. REFERENCES 1. Frielle, T.Collins, S.Daniel, K.W.Caron, M.G.Lefkowitz, R.J. & Kobilka B.K. Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 84.7920-7924(1987). 2. Dixon, R.A.F. et al. Nature 321, 75-79 (1986). 3. Emorine, L.Marullo, S.Delavier-Kl-utchko, C.Durieu- Trautmann, O. & Strosberg, A.D.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84.6995-6999 (1987). 4. Kobilka, B.K., Matsui, H. Kobilka, T.S. Yang-Feng, T.L.Francke, U.Caron, M.G.Lefkowitz, R.J.&Regan, J.W. Science 238, 650-656(1987). 5. Kubo, T. et al. Nature 323, 411-416 (1986) 6. Bonner, T.I., Buckley, N. J. Young A.C. & Brann, M.R.Science 237, 527-532 (1987). 7. Masu,Y.Nakayama, K.Tamaki,H.Harada, Y.Kuno, M.& Nakanishi S.Nature 329, 836-838 (1987). 8. Spiegel, A.M.Mol. Cell. Edocrinol. 49, 1-16 (1987) 9. Engelman, D.M. Goldman, A.& Steitz, T.A.Meth.Enzym.88, 81-88 (1982). 10. Huynh, T.V.Young, R.A.& Davis R.W. in DNA Cloning, a Practical Approach Vol.1, 49-78 (IRL,Oxford, 1985) 11. Minneman, K.P.Hegstrand, C.R. & Molinoff, P.B. Mol. Pharmacol. 16,34-46 (1979). 12. Cheng, Y.& Prusoff, W.H.Biochem. Pharmacol.22, 3099- 3108 (1973). 13. Fowler, A.V.& Zabin I.J.Biol.Chem.258, 14354-14358 (1983) 14. Rousset, J.P.Gilson, E.& Hofnung M.J.Mol.Biol. 191, 313-320 (1986) 15. Cervantes-Olivier. P.Delavier-Klutchko, C.Durieu- Trautmann, O.Kaveri, S.Desmandril, M.& Strosberg, A.D.Biochem. J. in press (1988). 16. Laemmli, U.K.& Favre M.J.Mol. Biol. 80, 575-599 (1973) 17. Reddy. P. Miller, D.& Peterkofsky, A.J.Biol. Chem. 261, 11448-11451 (1986). 18. Stiles, G.Arch. Biochem. Biophys. 237, 65-71 (1985) 19. Cervantes-Olivier. P. Durieu-Trautmann, O. Delavier- Klutchko, C.& Strosberg, A.D.Biochemistry 24, 3765-3770 (1985). 20. Hanada, K. Yamato, I.& Anraku, Y.J.Biol. Chem. 262, 14100-14104 (1987). 21. Allen M.Spiegel, Signal transduction by guanine nucleotide binding proteins Molecular and Cellular Endocrinology, 49(1987)1-16 Elsevier Scientific Publishers Ireland, Ltd. REVENDICATIONS 1/ Vecteur réplicable dans une culture d'un hôte unicellulaire contenant un insérat de nucléotides codant pour une séquence d'acides aminés contenue dans une protéine de mammifère et ayant une activité biologique de récepteur membranaire, ce vecteur étant caractérisé en ce que l'insérat est placé sous le contrôle d'une séquence, incluse dans ce vecteur autorisant l'expres- sion de cet insérat dans ledit hôte cellulaire, et com- portant notamment un promoteur reconnu par les polymé- rases de cet hôte unicellulaire, et en ce que cet in- sérat code pour une séquence d'acides aminés contenue dans une protéine présentant des éléments de structure en commun avec les récepteurs membranaires susdits, notamment les récepteurs a- ou 0-adrénergiques, les récepteurs muscariniques, les récepteurs neuropepti- diques, en particulier la "substance K". 2/ Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que le promoteur est un promoteur inductible. 3/ Vecteur modifié selon la revendication 1, ou la revendication 2, caractérisé en ce que l'insérat con- tenu dans le vecteur code pour une séquence d'acides aminés contenue dans une protéine eucaryote comportant dans sa structure au sein de la membrane plasmique, sept segments transmembranaires hydrophobes entre lesquels s'intercalent des boucles extra et intra-cellulaires, une région aminoterminale extracellulaire et une région cytoplasmique carboxyterminale, et des sites de liaison constitués par des régions hydrophiles formées dans la membrane. 4/ Vecteur selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 3, caractérisé en ce que l'insérat code pour un récepteur humain a-adrénergique. / Vecteur selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 3, caractérisé en ce que l'insérat code pour un récepteur humain 0-adrénergique. 6/ Vecteur selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 3, caractérisé en ce que l'insérat code pour un récepteur muscarinique. 7/ Vecteur selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 6, caractérisé en ce que l'hôte unicellu- laire est un hôte bactérien, notamment E.coli et en ce que le promoteur bactérien est celui de l'opéron lactose. 8/ Vecteur selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 7, caractérisé en ce que l'insérat est dépourvu de la région promotrice qui lui est norma- lement associée dans les cellules de mammifère, qui constituent l'hôte normal de la séquence codante con- tenue dans l'insérat. 9/ Organisme unicellulaire transformé par un vecteur modifié selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 8, et capable de synthétiser un polypeptide comportant, après induction de l'expression de l'in- sérat, des séquences affleurant à la surface de cet organisme et reconnues par les ligands reconnaissant le récepteur membranaire naturel. 10/ Organisme unicellulaire transformé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les bactéries notamment E.coli, les levures. 11/ Culture cellulaire transformée par un vecteur modifié, désignée par HU-02-Coli et déposée à la CNCM sous le numéro 1-737. 12/ Procédé de détection de la capacité d'une molécule à se comporter comme ligand vis-à-vis d'un récepteur appartenant à la classe des récepteurs normalement fixés à une protéine G, caractérisé par: - la mise en contact de la molécule avec un organisme unicellulaire préalablement transformé par un vecteur lui-même modifié par un insérat codant pour ce récepteur membranaire, cet organisme portant à sa surface un ou plusieurs sites spécifiques de ce récepteur, le cas échéant après induction de l'expression de cet insérat, cette mise en contact étant effectuée dans des condi- tions permettant la formation d'une liaison entre l'un au moins de ces sites spécifiques et ladite molécule dès lors qu'elle s'avèrerait effectivement posséder une affinité pour ce récepteur. b/ - la détection de la formation éventuelle d'un complexe du type ligand-récepteur. 13/ Procédé pour l'étude de l'affinité d'un ré- cepteur de mammifère appartenant à la classe de ceux qui sont couplés à une protéine G, pour un ou plusieurs ligands déterminés, caractérisé par la transformation d'une culture unicellulaire avec un vecteur, notamment un plasmide ou un phage, dans lequel avait auparavant été incorporée une séquence de nucléotides ou codant pour le polypeptide contenu dans ce récepteur de mammifère, sous le contrôle d'éléments de régulation, notamment d'un promoteur, permettant l'expression dans la culture unicellulaire utilisée de ladite séquence de nucléotides, - la culture des organismes unicellulaires transformés dans des conditions permettant l'expression dudit insérat, - la mise en contact de ces organismes unicellulaires avec ces ligands déterminés, - la détection d'une réaction affine entre lesdits organismes unicellulaires transformés et lesdits ligands déterminés. 14/ Kit pour la détection de l'affinité éventuelle d'un ligand pour un récepteur membranaire de mammifère déterminé comprenant: - une culture d'organismes unicellulaires transformés par un vecteur modifié tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 8 ou une culture d'organismes unicellulaires selon la revendication 9, - des moyens physiques ou chimiques pour induire l'expression de la séquence nucléotidique contenue dans le vecteur modifié lorsque le promoteur placé en amont de cette séquence est un promoteur inductible par les- dits moyens physiques ou chimiques, - un ou plusieurs ligands témoins ayant des affinités déterminées pour ledit récepteur membranaire, - des moyens physiques ou chimiques pdour la caracté- risation de l'activité biologique de ladite protéine. / / / / /