FR 2634220 A1 19900119 FR 8909393 A 19890712 1. La présente invention concerne un procédé de préparation du facteur de croissance épidermique humain (hEGF) utilisant efficacement une technique de génie gén6- tique. Il est à présent clairement établi que l'hEGF est la même substance que la -urogastrone. La présente invention fournit un hEGH qui est utilisable comme médi- cament, par exemple comme agent anti-ulcéreux, etc., à grande échelle,d'une manière simple. On connaît déjà une technique de génie génétique pour effectuer les séries d'opérations (1) à (4): (1) intégration d'un gène codant pour une substan- ce objectif dans un vecteur, (2) transformation de l'hôte E. coli en utilisant ce vecteur, (3) culture du transformant ainsi obtenu, et (4) récupération et collecte de la substance objectif à partir de la solution de culture.Divers dispositifs ont été construits pour se 2. procurer des protéines traces utilisables pour l'homme conformément à cette technique. Des détails sont don- nés dans: Tacon, W., Carey, N., Emetage, S.: Molec. Gen. Genet., 177, 427 (1980) Tacon, W., et. coll.: Gene 23, 255 (1983) Kawai, S., et. coll.: J. Ferment. Technol., 64, 503 (1986) Oka, T., et. coll.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 7212 (1985) et d'autres. Conformément à la technique la plus récente, - on a décrit un procédé qui comprend la création d'un ADN recombinant portant à la fois un gène codant un promoteur dérivé du gène de la phosphatase alcaline d'E. coli et un gène codant un peptide signal sous son contrôle, et ayant également intégré un gène codant l'hEGF, pour obtenir finalement l'hEGF (demandes de brevet japonais publiées non examinées N 003799/89 et 003800/89). Dans ce procédé, en vue d'augmenter le rendement, diverses inventions ont été effectuées au. cours de l'incubation, par exemple en cultivant dans une zone à basse température avant d'induire la capaci- té de synthèse des protéines et dans une zone à tempé- rature élevée après l'induction d'une capacité de syn- thèse des protéines; ou en cultivant dans un milieu faiblement acide ou neutre avant d'induire la capaci- té de synthèse des protéines, mais dans un milieu faiblement alcalin après l'induction de la capacité de synthèse des protéines. Ces inventions donnent de bons résultats. Conformément à la technique antérieure décri- te ci-dessus, le hEGF recherché peut effectivement être produit avec un certain rendement. Cependant, dans le cas o l'on désire une culture de haute densité accom- pagnée d'une sécrétion et d'une expression dans un 3. milieu, la technique antérieure comporte de nombreux défauts. Par exemple, (1) la technique antérieure ne peut pas contrôler librement le moment auquel le E. coli transformé commence à produire du hEGF;(2) pour cette raison, il est impossible de faire prolifé- rer suffisamment le E. coli transformé avant de commencer la production de hEGF; et (3) par conséquent, il est impossible au E. coli transformé de contrôler le cours de la production de hEGF en "culture de haute densité" (ce qui se réfère à une culture par E. coli ou à une D0550 supérieure à 40 dans la description). Compte-tenu de son principe, il a été égale- ment impossible d'appliquer le système "fed-batch" (technique de culture continue tout en complétant un milieu au cours de la culture) impérativement exigé pour une culture de haute densité. Les expériences effectuées par la demande- resse révèlent une tendance à l'inhibition de la proli- fération du E. coli transformé lui-même lorsque le E. coli transformé commence à produire du hEGF. Bien que la raison n'en soit pas nécessairement claire, on suppose qu'une forte contrainte serait imposée au E. coli transformé,compte tenu du phénomène spécifique au hEGF selon lequel le hEGF produit ne reste pas dans le cytoplas- me du E. coli transformé ni dans le périplasme (entre la membrane interne et la membrane externe),mais est secrété à l'extérieur des cellules. Sur la base de ce phénomène, on suppose que c'est parce que la prolifé- ration de E. coli transformé lui-même serait inhibée en même temps lorsque le hEGF est produit. Compte-tenu de ce qui précède, pour réaliser une culture à haute densité, il était nécessaire d'amor- cer la production de hEGF au moment o le E. coli a suffisamment proliféré, et pour cette raison,il était nécessaire de régler librement le temps de production 4.. de hEGF. L'essentiel de la présente invention réside dans les points suivants. (1) On utilise comme promoteur un gène codant un promoteur pour l'opéron du tryptophane (trp). (2) En ajoutant de l'acide 3-indoleacrylique (IAA), le moment. auquel le E. coli transformé produit du hEGF est réglé. (3) Dans la culture, un système "fed-batch" dans lequel le taux de complément du milieu à ajouter est variable est efficacement utilisé. (4) Les sources de carbone du milieu de complé- ment sont le glucose ou le glycérol; ou le glucose et le glycérol associés. (5) En outre, dans le système fed-batch (4) ci-dessus, on utilise du glucose, puis du glycérol,comme sources de carbone pour compléter le milieu du système "fed-batch". On décrira ci-après en détail les points ci- dessus. Lorsqu'on utilise comme promoteur un promoteur dérivé du gène de la phosphatase alcaline d'E. coli, la productivité du hEGF s'arrête en raison de la présence de phosphate dans le milieu. Le E. coli transformé pro- lifère, et au cours de cette prolifération, le phospha- te est consommé et sa concentration réduite à une valeur inférieure à une concentration définie. Ensuite,le promo- teur dérivé du gène de la phosphatase alcaline d'E. coli commence à entrer en action pour amorcer la production de hEGF.La technique antérieure consistait à contrôler le phénomène se produisant au cours des opérations par régla- ge du pH et de la température de la solution de culture, pour augmenter ainsi la productivité du hEGF. Dans la présente invention, le promoteur préci- té de l'opéron du trp est utilisé à la place du 5. promoteur dérivé du gène de la phosphatase alcaline de E. coli décrit ci-dessus. Dans la présente invention, on ajoute au préala- ble au milieu environ 50 mg/1 de tryptophane. Au fur et à mesure que le E. coli transformé prolifère, le tryp- tophane est consommé;lorsque la concentration du tryptopha- ne tombé au-dessous d'une certaine valeur,le promoteur de l'opéron du trp commence à entrer en action pour amor- cer la production de hEGF. Cependant, lorsqu'une quan- tité de tryptophane suffisante est présente dans le milieu, il n'y a aucune chance que le promoteur de la présente invention amorce la production de hEGF. En ou- tre, comme on le montrera plus loin dans les exemples, le E. coli transformé, en particulier, a cette propriété que lorsqu'il sécrète du hEGF, sa vitesse de prolifé- ration est réduite ou sa prolifération est arrêtée. Sur la base de ces faits, on a trouvé que le plasmide vecteur d'expression de la sécrétion por- tant le promoteur du trp utilisé dans la présente inven- tion convenait extrêmement bien pour l'utilisation pour une culture à haute densité de E. coli transformé qui est décrite plus loin, car son expression peut être strictement contrôlée d'une manière simple. C'est-à- dire que pour porter la quantité de sécrétion du hEGF sécrété à plus de 150 mg/l, l'incubation est effectuée en présence de tryptophane; lorsque le E. coli trans- formé a proliféré à une densité suffisamment élevée, du IAA est immédiatement ajouté et le produit peut être récupéré dans -Ie milieu au bout de peu de temps (10 à 18 heures). En outre,par addition de glycérol dans le milieu dans le système "fed-batch" à la place du gluco- se, ou en remplaçant le glucose par le glycérol lors de l'addition,. il est possible de contrôler d'une ma- nière ingénieuse le moment auquel sera amorcée l'action 6. du promoteur du trp, comme il sera décrit ci-après. L'IAA est une substance ayant une structure similaire à celle du tryptophane et il a une affini- té pour la protéine répresseur plus forte que celle du tryptophane. En conséquence, l'IAA se lie principale- ment au répresseur, empêchant le répresseur de se lier au promoteur (opérateur). Par conséquent, en incorpo- rant du IAA au milieu, ce promoteur commence à entrer en action même lorsque du tryptophane est présent dans le milieu. De ce qui précède, on conclut que dans la pré- sente invention, la production de hEGF peut être amorcée par addition de IAA à n'importe quel stade de la cul- ture. La caractéristique importante de la présente inven- tion réside en fait dans ce point. Il est connu que lorsque la prolifération du E. coli transformé est améliorée, la production ulté- rieure de hEGF est proportionnellement augmentée. La densité du E. coli transformé dans le milieu peut être augmentée par la conception du milieu lui-même ou en utilisant le système "fed-batch". Par conséquent, c'est seulement en faisant démarrer la production de hEGF après que la prolifération du E. coli transformé a été augmentée, que le hEGF peut être recueilli d'une manière aussi efficace. Dans la présente invention, on peut utiliser de manière appropriée les techniques classiquement uti- lisées en génie génétique ordinaire. Par exem- ple, on peut utiliser, comme E. coli hôte, une souche de E. coli dérivant de K12 largement utilisée. En outre, com- me vecteur, un plasmide du commerce peut être recom- biné par une technique de génie génétique pour pou- voir être utilisé. Plus précisément, les souches de E. coli suivantes peuvent être utilisées dans la pré- sente invention. 7. JMolZ, TB1, HB101, RR1, DH1, MM294, C600galK, Y1090 (souche déficiente en pMC9). En outre, on peut également utiliser des sou- ches dérivées de celles-ci. Dans la présente invention, par exemple, on peut utiliser le plasmide et l'ADN de phage suivants: - pDR540 (fabriqué par la Société Pharmacia Fine Chemicals Inc.), M13mpl8 et mpl9 (fabriqués par la So- ciété Takara Shuzo., Ltd.). En outre, dans la présente invention, on peut par exemple utiliser comme milieu de base et comme mi- lieu de complément les milieux suivants: Milieu LB (10 g/l de bactotrypton, 5 g/l d'extrait de levure, 5 g/l de chlorure de sodium) Milieu M9 (6 g/l d'hydrogénophosphate disodi- que, 3 g/l de dihydrogénophosphate de potassium, 0,5 g/l de chlorure de sodium, et de chlorure d'am- monium,sulfate de magnésium 2 mM, chlorure de calcium 0,1 mM) Milieu 4YTM9 (milieu M9 complété avec les cons- tituants suivants: 32 g/1l de bacto-trypton, 20 g/l d'extrait de levure). Le milieu peut être préparé en ajoutant de la gé- lose au milieu présent dans la boîte à une concentration de 1,5 %,et au milieu de la couche supérieure de phase M13 à une concentration de 0,6 %. Pour cultiver un E. coli contenant tous les plasmides, de l'ampicilline est ajoutée au milieu à raison de 100 mg/l,empêchant ain- si les plasmides d'être "cuits". Comme enzymes de restriction et comme enzymes modifiant l'ADN utilisées dans la présente invention, on peut utiliser de manière appropriée celles utilisées en génie génétique ordinaire. Par exemple, des enzymes fabriquées par les sociétés Takara Shuzo, Ltd., Toyobo, Ltd., Pharmacia Fine Chemicals Inc. et 8. Boehringer Mannheim. Dans la présente invention, ces en- zymes peuvent être utilisées conformément-aux manuels et publications (Molecular Cloning; a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). En outre, pour la transformation de E. coli, la purification du plasmide et la purification de i-'ADN de phage dans la présente invention, on peut utiliser de manière appropriée les techniques utilisées en génie génétique ordinaire. On peut aussi suivre les manuels et publications (Molecular Cloning). L'oligonucléotide de la présente invention peut être préparé par synthèse en utilisant de manière appropriée les techniques classiquement utilisées pour la synthèse de l'ADN ordinaire (par exemple, la métho- de au triester). D'autre part, l'oligonucléotide peut également être préparé par synthèse en utilisant un synthétiseur d'ADN du commerce (modèle 380B, fabriqué par la société Applied Biosystem Inc.). De plus, pour la ligation de l'oligonucléotide dans la présente invention, on peut utiliser de manière appropriée des techniques utilisées en génie génétique ordinaire. Plus précisément, par exemple, on phosphoryle 1 gg de chacun des oligonucléotides synthétiques dans 20 Al de tampon linker kinase (par Clonage Moléculaire),puis on mélange. Après chauffage à 70 C pendant 10 minutes, on refroidit progressive- ment le système à la température ambiante sur une du- rée d'une heure environ. Puis on ajoute au mélange le même volume de tampon linker kinase à la concentration unitaire que le mélange et on lui ajoute ensuite la. T4 ADN ligase. On laisse reposer le mélange pendant une nuit à 16 C. Puis on chauffe le mélange à 70 C pen- dant 10 minutes pour inactiver la ligase de l'ADN T4. On échange ensuite le tampon par la méthode de -9. précipitation par l'éthanol. Après clivage avec des enzymes de restriction aux deux extrémités de manière à former le fragment recherché, on effectue le frac- tionnement par électrophorèse sur une plaque de gel de 5.polyacrylamide à 8 %. A partir du gel contenant le fragment d'ADN recherché, on purifie l'ADN par extrac- tion avec un tampon (par Clonage Moléculaire). Cette technique est un exemple typique de ligation d'oligo- nucléotide dans la présente invention. Pour déterminer la quantité de hEGF qui est le produit recherché dans la présente invention, on peut utiliser de manière appropriée les techniques utilisées en génie génétique ordinaire. En par- ticulier, la quantité d'hEGF peut être déterminée par un dosage radio-immunologique (en utilisant le nécessai- re fabriqué par la société Amersham Inc.),en utilisant par exemple un hEGF du commerce (fabriqué par les socié- tés Wakunaga Pharmaceutical Ltd., ou Amersham Inc.) comme étalon EXEMPLES La présente invention est décrite ci-après de manière plus détaillée en se référant à des exemples de référence et à des exemples. EXEMPLE DE REFERENCE 1 /Préparation d'un plasmide d'expression de sécrétion7 (1) Synthèse du promoteur du trp, séquence de SD et gène du peptide signal de la phosphatase alca- line d'E. coli: Le promoteur du trp et la séquence de SD (site lié au ribosome de Shine-Dargarno) utilisés ont été placés de T à la position 60 par rapport à A à la position +26 lorsque A, en tant que site de début de la transcription, a été placé en +1. A l'extrémité 5' de T à la position -60, on a disposé un site de clivage Hind III, en tenant compte de la ligation avec le 10. vecteur. Le gène du peptide signal de la phosphatase alca- line d'E. coli a suivi la séquence naturelle,mais en tenant compte de la ligation avec le vecteur et de la ligation avec le gène de hEGF,le GTG du codon d'initiation a été mo- difié en ATG,le GCT sur l'extrémité C a été modifié en GCG, et un site de clivage EcoR I a été placé à l'extrémité 3'.La séquence qui précède a été préparée par synthèse en la di- visant en 8 oligonucléotides qui ont été liés d'une manière classique.Le produit a été purifié en tant que fragment d'ADN Hind III-EcoR I.Ensuite,ce fragment a été inséré en- tre les sites de clivage Hind III-EcoR I de l'ADN de la forme réplicative du phage Ml3mpl8 et sa séquence de nu- cléotides a été confirmée par la méthode de séquençage didéoxy (figure 1). (2) Synthèse de gène de hEGF La séquence du gène de hEGF a été établie sur la base de la séquence d'aminoacides du hEGF naturel.Lors de l'établissement de la séquence,les 3 points suivants ont été pris en considération: utilisation du codon uti- lisé avec une fréquence élevée dans E. coli, élimination de la séquence de répétition qui peut prendre une structu- re secondaire et création d'un site de clivage Sph I au milieu du gène, nécessaire pour la ligation du gène. En particulier, le gène du hEGF a été préparé en tant que fragment de l'ADN EcoR I-Sac I composé de 21 nu- cléotides. Tout d'abord, 11 nucléotides constituant la pre- mière partie du fragment d'ADN EcoR I-Sac I ont été pré- parés par synthèse et liés d'une manière classique,puis ils ont été insérés entre le site de clivage EcoR I-Sph I de l'ADN de la forme réplicative du phage Ml3mpl8. La séquence de nucléotides a été confirmée par la méthode de séquençage didéoxy. 11. Ensuite, on a préparé par synthèse 10 oligo- nucléotides constituant la dernière partie du fragment d'ADN Sph I-Sac I, on les a liés d'une manière classique, et on les a insérés alors entre le site de clivage Sph I-Sph I de l'ADN de la forme réplicative du phase Ml3mpl8. La séquence de nucléotides a été confirmée par la métho- de de séquençage didéoxy. Dans les ADN de la forme réplicative du phage M13 recombinant respectifs, on a excisé le fragment d'ADN EcoR I-Sph I et le fragment d'ADN Sph I-Sac I et on les a liés l'un à l'autre pour produire le gène hEGF. Dans le gène hEGF terminé, l'extrémité 5' cons- titue le site de clivage EcoR I et cette portion cor- respond à l'asparagine de l'aminoacide N-terminal. Son extrémité 3' constitue le site de clivage Sac I et elle est telle que les codons de terminaison TGA et TAG vien- nent juste avant. Le fragment d'ADN EcoR I Sac I du gène du hEGF lié a été inséré dans le site de clivage EcoR I-Sac I de l'ADN de la forme réplicative du phage Ml3mpl8. La séquence de nucléotides a été à nouveau confirmée par la méthode de séquençage didéoxy (figure 2). (3) Production du plasmide d'expression de la sécrétion Tout d'abord, le site de clivage EcoR I de pDR540 (fabriqué par la Société Pharmacia Fine Chemicals Inc.) a été effacé d'une manière classique en utilisant le fragment de Klenow de la polymérase de l'ADN et la li- gase T4 pour produire le plasmide pDR54OE Puis, un linker préparé par synthèse et lié d'une manière classique a été inséré dans le site de clivage BamH I de cet ADN PDR540E,et des sites de clivage avec EcoR I, Xho I, Sac I et Pvu II ont été nouvellement introduits dans celui-ci. En outre, la séquence du terminateur du trp A 12. (fabriquée par la Société Pharmacia Fine Chemicals Inc.) a été insérée dans ce site de clivage Pvu II pour prépa- rer le plasmide pATGt. Le fragment d'ADN EcoR I-Sac I con- - tenant le gène du hEGF synthétique a été inséré entre le site de clivage Ecor I et le site de clivage Sac I de cet ADN de plasmide de pATGt pour préparer le plasmide pBTl9. Ensuite,le fragment ADN Hind III-EcoR i contenant le promoteur du trp, la séquence SD et le gène du peptide du signal de la phosphatase alcaline d'E. coli a été inséré entre le site de clivage Hind III et le site de clivage Ecor I de pBT19 pour produire le plasmide d'ex- pression de la sécrétion de hEGF pBT23 (Fig.3 et Fig.4). EXEMPLE DE REFERENCE 2 LExpression de hEGF et sa répartition/. Au moyen de pBT23,E. coli C600 galK a été trans- formé pour obtenir un E. coli transformé contenant pBT23. Cette souche C600 galK- contenant du pBT23 a été cultivée avec agitation dans 0,1 litre de milieu LB pendant une nuit (solution de préculture).La solution de précultu- re, 4 ml,a été inoculée (inoculation à 2 %) sur 0,2 litre de milieu M9 (contenant 5 g/1 de Casamino acide, 2 g/l de glucose, 10 mg/l de vitamine B1 et 100 mg/l d'ampicil- line),introduite dans un flacon à agitation d'un volume de 0,5 litre,après quoi on a effectué une culture avec - agitation à 37 C à 125 fois/minute.Dans la phase de croissance exponentielle (dans ce cas la DO550 est d'envi- ron 0,l),on a ajouté de l'acide 3-indoleacrylique (IAA) à une concentration de 20 mg/l pour induire le promoteur de trp.Des échantillons ont été prélevés 1, 2, 4, 6, 8 et 24 heures après le début de la culture et centrifugés pour séparer le milieu et les constituants cellulaires les uns des autres.A partir des cellules,on a encore séparé leur fraction périplasme par la technique de choc osmotique.La quantité de hEGF dans le milieu et dans le périplasme a 13. été déterminée par un dosage radio-immunologique (né- * cessaire fabriqué par la société Amersham Inc.).Les résultats sont donnés dans le Tableau I. TABLEAU I Répartition du hEGF Temps de culture i Quantité de hEGF (mg/l) I Périplasme Milieu 1 0,011 0,017 2 0,016 0,030 4 0,022 0,190 6 j 0,017 0,430 8 0,014 0,490 24 - 0,004 [ 0,730 La quantité de hEGF dans le milieu a atteint le maximum, soit 0,73 mg/1, 24 heures après le début de la culture. Le hEGF accumulé dans le périplasme a atteint son maximum 4 heures après le début de la culture, mais sa quantité était d'environ 0,02 mg/l au maximum. Le hEGF a diminué et a presque disparu 24 heures après. Ces faits confirment que le hEGF secrété était pour la plus grande partie présent dans le milieu. Par conséquent, dans les essais suivants, la quantité de hEGF produite n'a été mesurée que dans le milieu. EXEMPLE DE REFERENCE 3 - /Etude sur la souche d'E. coli hôte7 En utilisant l'ADN pBT23, les souches d'E. coli HB101, RR1, DH1, MM294, Y1090 (souche déficiente en pMC9), JM!01 et TB1 ont été transformées pour obtenir des transformants d'E. coli contenant le pBT23 respectif. Les transformants ont été cultivés dans les mêmes conditions que dans l'exemple de référence 2, ils comprenaient aussi le transformant C600 galK précé- dent. L'induction du promoteur du trp avec 1'IAA a été effectuée 9,5 heures après le début de la culture. A 14. ce moment et 24 heures après, la quantité de hEGF dans le milieu a été mesurée (Tableau 2). TABLEAU 2 Quantité de hEGF dans divers transformants d'E. coli i Quantité-de hEGF (mg/l) Souche d'E. coii 9,5 heures après 24 heuresaprès C600 galK 0,54 1, 25 HBlO1 0,54 1,25 RR1 1,23 0,93 |DH1 0,64 0,45 MM294 0,28 0,50 Y1090 (souche défi- ciente en pMC9) 0,03 0,02 JM101 0,81 0,67 TB1 2,30 4,00 Parmi les 8 transformants d'E. coli, le TB1 donne la plus forte production et il a atteint 4 mg/l. Puis venaient le C600galK et le HBlO1 qui ont atteint tous deux 1,25 mg/l. Ces souches ont été considérées comme convenant pour la production d'hEGF. EXEMPLE DE REFERENCE 4 /Etude du moment approprié pour l'induction du promoteur du trp7 En utilisant le transformant HB101 contenant du pBT23,une culture a été effectuée dans les mêmes con- ditions que dans l'Exemple de Référence 2. De l'IAA a été ajouté à une concentration de 20 mg/l dans les sta- des intermédiaire, final et stationnaire de la pha- se de croissance exponentielle, respectivement, pour exa- 3O miner la quantité d'hEGF dans le milieu. Les résultats sont donnés dans le Tableau 3. 15. TABLEAU 3 Moment approprié pour l'induction du promoteur du trp et pour la production d'hEGF Quantité de hEGF (mg/l) Temps Phase de croissance exponentielle' de de Stade intermé Dernier stade Phase station- cul- S tur diaire naire ture 0,5 i1,5 2,5 (additionné d'IAA) 3,5 0,18 0,16 0,14 4,5!.0,65 0,43 0,33 (additionné d'IAA) ,5 1,69 0,83 0,63 6,5 2,28 0,98 0,90 7,5 2,63 1,10 1,10 9,5 2,41 1,63 1,66 2, 24,0 5,75 8,95 8,95 On a observé que l'addition de l'IAA dans le dernier stade de la phase de croissance exponentielle ou de la phase stationnaire produisait de plus grandes quantité de hEGF. EXEMPLE DE REFERENCE 5 En utilisant le transformant HB101 contenant du pBT23,une culture a été effectuée dans les mêmes condi- tions que dans l'Exemple de Référence 2 (excepté que l'on a utilisé les milieux indiqués dans le Tableau 4).Lors- qu'on a utilisé comme milieux AYTM9,. M9-1 et M9-2,de 1'IAA a été ajouté 5,5 heures après et lorsqu'on a utilisé M9-3 et M9-4, 9 heures après,.à une concentration de mg/l. La quantité d'hEGF dans chaque milieu a été mesurée 9 et 24 heures après le début de la culture. 16. TABLEAU 4 Composition du milieu 4YM9 M9-1 M9-2 M9-3 M9-4 Milieu M9. Bact-trypton ICasamino acide 5 g/i 2 g/l acr2o g/1 32 g/l 10 g/l Extrait de j Glucose 5 g/i 2 g/l! levure g/i - Vitamine B1 10 mg/l Ampicilline mg/ 1 + TABLEAU 5 Composition du milieu-et quantité de hEGF produite Quantité de-hEGF (mrg/l) Milieu 9 heures après 24 heures après tAYTM9 0,04 I 0,09 !M9-1 0,68 0,70 M9-2 1,98! 1,69 - M9-3 3,03 7,25 M9-4 0,91 2,38 Lorsqu'on a utilisé du milieu M9-3 (contenant g/l de Casamino acide et 2 g/l de glucose), ia quanti- té d'hEGF a atteint le maximum (7,25 mg/l). On a noté également que dans le milieu composé principalement de constituants naturels (par exemple extrait de levure, Bacto-trypton) contenant de fortes quantités de trypto- phane, la quantité de hEGF produite était faible. , EXEMPLE DE REFERENCE 6 /Contrôle du promoteur du trp par le tryptophane présent dans le milieu7 La culture des exemples de référence décrits ci-dessus ne contient pas de tryptophane dans le milieu 17. et elle est le système d'induction naturel dans lequel l'induction du promoteur du trp se produit au moment o la concentration du tryptophane provenant de la solution de préculture a été abaissée au-dessous d'une certaine valeur alors que E. coli a proliféré. Dans ce système,l'addition de l'inducteur IAA pourrait augmenter la production d'hEGF, mais ne pourrait pas déclencher directement l'induction du promoteur du trp. Par conséquent, du tryptophane a été ajouté au préalable au milieu pour voir si l'induction prove- nant du promoteur trp pourrait être inhibée et, en sup- posant que tel est le cas, pour voir s'il était possi- ble d'éliminer l'inhibition en ajoutant de l'IAA. Les quantités du tryptophane ajoutées ont été de 1, 3, 10, 20, 30 et 40 mg/l et de l'IAA a également été ajouté aux concentrations indiquées dans le Tableau 6. En utilisant le transformant HBlOl contenant du pBT-23, la culture a étéeffectuéee dans les mêmes conditions que dans l'Exemple de Référence 2. De 1'IAA a été ajouté 5 heures après le début de la cul- ture. La quantité d'hEGF dans le milieu a été détermi- née. Les résultats sont donnés dans le Tableau 6. 18. TABLEAU 6 Concentration du tryptophane dans le milieu et quantité d'hEGF produite Con- Con- Quantité de hEGF (mq/1) ce-n- cn cen- cen- 1l h 3 h 5 h 7 h 9 h 11 h 24 h tra- tra- tion tion japres après après après après après après du de Tryp- i'IAA to(mg/ phanel) (mg/ 1) I ( 1) 0 0 ( 2)' o 20 (5) 3 O ( 6) 3 20 7) 10 O 1 8) 10 20 9) 20 O 1 20105 06710 (10) 20 20 (11) 20 40 (12) 20 80 (13) 30 0 (14) 30 80 (15) 40 O (16) 40 80 Lorsque la concentration du tryptophane ajouté dans le milieu était inférieure à 10 mg/1, la quantité -de hEGH produite était de 6 à 10 mg/1, tandis que lors- que la concentration du tryptophane était de 20 à 40 mg/1, la quantité de hEGF produite était fortement réduite (à 1 - 1,5 mg/1). On a noté par conséquent qu'une concen- tration de tryptophane supérieure à la concentration dé- finie inhibait la production de hEGF. 19. En outre, dans le cas o la concentration du tryptophane était de 20 mg/1, la quantité de hEGF pro- duite était multipliée par 8 environ en ajoutant 20 ou mg/1 de IAA. Lorsque l'on ajoutait 80 mg/1 de IAA cependant, la quantité de hEGF produite n'était multipliée que par 4 environ. Lorsque la concentration du tryptopha- ne était de 30 à 40 mg/l, l'augmentation de la-quantité de hEGF produite par addition de 80 mg/l d'IAA était d'environ 1,5 fois seulement. Les résultats qui précèdent confirment que l'ad- dition de tryptophane dans une quantité appropriée (20 mg/l dans cet exemple) inhibe l'induction par le pro- moteur du trp et que l'addition de IAA (20 à 40 mg/1) supprime l'inhibition par le tryptophane pour mettre en circuit le promoteur du trp. On a également noté que l'addition de tryptophane à l'état de trace favorisait la prolifération des transformants d'E. coli (la quanti- té de cellules devient 1,5 à 2 fois plus élevée par ad- dition de 10 à 40 mg/l de tryptophane). On a en outre noté que l'addition d'IAA en quantité excessive telle que plus de 40 mg/1 inhibait la prolifération de E. coli, conduisant à une réduction de la quantité de hEGF produite. Les résultats précédents sont résumés ci-dessous. (1) La quasi-totalité du hEGF recherché est secrétée dans la solution de culture par une incubation suffisante. (2) HB101, TB1 ou C600 galK conviennent comme souche d'E. coli hôte. (3) L'induction du promoteur du trp par l'IAA est optimale lorsqu'il est ajouté dans la dernière phase de croissance. (4) Un milieu complété avec 5 g/l de Casami- no acide, 2 g/l de glucose et lO mg/l de vitamine B est approprié comme milieu. 20. (5) En ajoutant de 1'IAA, l'induction du pro- moteur du trp est possible, bien que du tryptophane soit présent dans le milieu. En supposant qu'une culture-de haute densité dans un fermenteur à bocaux soit rendue possible à grande échelle en utilisant ces faits comme indices, on a effec- tué des expériences suivantes. En outre, pour résister à l'expérience à grande échelle, la purification du hEGF dans le liquide surnageant de la culture de E. coli a été examinée et le procédé suivant a été découvert. EXPERIENCE 1 /Purification du hEGF/ (1) Adsorption sur résine échangeuse de cations (BIO-REX70: fabriqué par la société Biorad Inc.) (pH 3,0) + élution (acétate d'amonium, pH 8,0) + dialyse (acétate d'ammonium, pH 5,5). (2) Chromatographie sur colonne échangeuse d'anions (Q-Sepharose Fast Flow: fabriqué par la Société Pharmacia Fine Chemicals Inc., (acétate d'ammonium, pH 5,5). (3) Chromatographie sur colonne en phase inver- sée (C18) (PepRPC: fabriqué par la Société Pharmacia Fine Chemicals Inc., acide trifluoracétique à 0,1 %/acé- tonitrile) + lyophilisation. Par ce procédé,l'ensemble des opérations peut être effectué en 2 à 4 jours.En outre,le procédé n'implique pas la chromatographie de filtration sur gel classique- ment utilisée, de telle sorte que l'augmentation d'échel- le est aisée. Par exemple, 10 mg de hEGF purifié ont pu être obtenus à partir de 10 litres du liquide surnageant -de la culture par ce procédé. Le hEGF purifié a la même séquence d'aminoaci- des que le hEGF naturel, et il a la même séquence d'amino- acides N-terminale que le hEGF naturel. En outre, le 21. hEGF présentait une activité biologique dans l'expérien- ce suivante. EXPERIENCE 2 /Capacité de liaison au récepteur de l'EGF7 En suivant le mode opératoire décrit ci-dessous, on a confirmé la capacité de liaison du hEGF purifié au récepteur du EGF de la surface,des cellules humaines. Des cellules humaines A431 ont été mises en suspension dans du milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (milieu DMEM: fabriqué par la société Nissui Co., Ltd.) contenant 10 % de sérum de foetus de veau (fabriqué par la société Gibco Ltd.) dans 104 cellules/ml. La sus- pension de cellules a été introduite dans une plaque de culture à 24 puits, à raison de 1 ml par puits, après quoi on l'a cultivée à 37 C pendant 24 heures dans du C02 à 5 %. Après avoir lavé les cellules deux fois avec du milieu DMEM (tampon de liaison) contenant de l'acide N,Nbis(2-hydroxyéthyl)-2-aminoéthanesulfonique mM (BES, pH 6,5) et de la sérum albumine de bovin à 0,1 % (BSA: fabriquée par la société Sigma Inc.) , on a ajouté 0,3 ml du tampon de liaison contenant 0,2 ng/ml de hEGF marqué au 125I (fabriqué par la société Amersham Inc.) et 0,1 à 10 000 ng/ml de hEGF. Après les avoir laissé reposer à la tempéra- ture ambiante pendant 1 heure, on a lavé deux fois les cellules avec le tampon de liaison et on a ajouté une solution d'hydroxyde de sodium 0,2M à raison de 0,3 ml par puits pour lyser les cellules. Puis on a mesuré la radioactivité du hEGF marqué au 125I lié au récepteur de 1'EGF. Les résultats sont donnés dans le Tableau 7. 22. TABLEAU 7 Capacité de liaison du hEGF purifié au récepteur du EG' humain - hEGF Taux d'inhibition de la liaison (%) ng/puits/10 cellules /hEGF purifié7 0,1 0 1 8 10 38 82 1 000 95 000 98 Les résultats ci-dessus confirment que le hEGF purifié a une capacité de liaison au récepteur du EGF des cellules de culture humaines. EXPERIENCE 3 /Activité d'accélération de la croissance des cellules/ En suivant le procédé décrit ci-dessous, on a confirmé l'activité d'accélération de la croissan- ce des cellules du hEGF purifié. Des cellules de souris Swiss 3T3 ont été mises en suspension dans un milieu DMEM contenant 10 % de sé- rum de foetus de veau dans 105 cellules/ml. La suspen- sion de cellules a été introduite dans une plaque de culture à 24 puits à raison de 1 ml par-puits et culti- vée à 27 C dans du C02 à 5 % jusqu'à ce que les cellules atteignent le stade intermédiaire de la phase de crois- sance exponentielle. Le milieu a été échangé avec du milieu DMEM contenant du sérum de foetus de veau à 0,2 %, après quoi on a effectué une nouvelle culture à 370C dans du C02 à 5 %. Lorsque presque toutes les cellules ont atteint la phase stationnaire, du hEGF a été ajouté et la culture a été poursuivie pendant 8 heures supplémentaires. De la /méthyl- 3 H/ thymidine 23. (247,9 GBq/mmole; fabriquée par la société Amersham Inc.) a été ajoutée à raison de 0,5 "Ci par puits. Après culture pendant 24 heures, la radioactivité de la / 3H thymidine incorporée aux cellules a été déter- minée. Les résultats sont donnés dans le Tableau 8. TABLEAU 8 Activité d'accélération de la croissance des cellules du hEGF purifié -3Concentration;Fixation de / 3H/ thymidine (ng/ml) (cpm) |Proportion 0,0 2864 1 1,00 0,3 i 3671 1,28 1,0 3753 1,31 3,0 4742 1,66 Les résultats qui précèdent confirment l'ac- tivité d'accélération de la croissance des cellules du hEGF purifié. EXPERIENCE 4 /Inhibition de la formation d'acide dans les celluies de la paroi gastrique du cobaye/7 En suivant le procédé décrit ci-dessous, l'ac- tion inhibitrice du hEGF purifié sur la formation du suc gastrique dans des cellules de la paroi isolées a été confirmée en utilisant comme indice l'accumulation de 4C-aminopyrine (AP). Après avoir maintenu à 37 C-pendant 20 minutes,dans un courant d'oxygène à 100 %,une suspension de cellules de paroi isolées (1,80 x 105 cellules/ml, solution de Hanks contenant'0,2 % de BSA (fabriquée par la société Nissui Co., Ltd.)) on a ajouté à la suspension 0,1 gCi de 14C-AP (4,37 GBq/mmole; fabriqué par la so- ciété Amersham Inc.), du hEGF purifié et 3 AM d'histamine (fabriquée par la société Nakarai Chemical,Ltd.) ou de l'AMP dibutylyl cyclique lmM (dbc- AMP, fabriqué par la 24. société Sigma Inc.) comme stimulant et on a maintenu à nouveau le mélange à la même température. Soixante minutes après, on a ajouté au mélange 4 ml de solution de Hanks refroidie à la glace. Puis on a effectué une centrifugation à faible vitesse à 4 C pour arrêter la réaction. Les cellules ont été lysées par addition de 0,3 ml d'une solution d'hydroxyde de sodium 2M. Après neutralisation avec de l'acide chlorhydrique 2M, la radioactivité a été mesurée par un compteur à scintil- lation liquide. L'accumulation de 14C-AP a été déterminée en posant égale à 100 % la valeur obtenue en soustrayant la valeur du témoin de la valeur de fixation lors de la stimulation et l'activité du hEGF purifié a été exprimée en pourcentage de stimulation. Les résultats sont donnés dans le Tableau 9. TABLEAU 9 Activité inhibitrice du hEGF purifié vis-à-vis de la formation d'acide Stimulation % Histamine 3 "M 100 " + EGF 1 nM 105 " + EGF 10 nM 38,1 " + EGF 100 nM 23,1 dbc-AMP 1 mM 100 " + EGF 1 nM 106 " + EGF 10 nM 82,1 " + EGF 100 nM -50,8 Les résultats ci-dessus confirment que le hEGF purifié a aussi une activité d'inhibition de la formation de suc gastrique dans les cellules de la pa- roi gastrique du cobaye par stimulation à la fois de l'histamine et du dbc-AMP. 2634ZZ0 25. EXEMPLE 1 /Système discontinu/ Sur la base des diverses observations obtenues * lors de la culture en ballon décrite ci-dessus, la cultu- re a été effectuée à grande échelle en utilisant un fer- menteur à bocaux d'un volume de 10,litres. Comme fermen- teur à bocaux, on a utilisé un fermenteur à bocaux de table d'un volume de 10 litres fabriqué par la société Oriental Yeast Ltd. Le fermenteur à bocaux a été équi- pé d'un dispositif de contrôle pour la régulation du pH et de la concentration en oxygène dissous du milieu. Le HB101 a été utilisé comme hôte. La préculture a été effectuée dans du milieu LB et l'on a inoculé 2 % de la solution de préculture. Comme milieu, on a utilisé 6 litres de milieu M9 (con- tenant 5 g/l de Casamino acide, 2 g/l de glucose, mg/l de vitamine B et 100 mg/l d'ampicilline). L'incu- bation a.été effectuée dans des conditions d'aération de 1 vvm (volume/volume/minutes; alimentation avec la même quantité d'air que le volume de culture par minute avec un compresseur à air; 6 litres/minute dans ce cas) à 37 C, concentration en oxygène dissous de 4 ppm (la- quelle a été réglée en faisant varier la vitesse de ro- tation des ailettes d'agitation entre 100 et 1000 tours/ minute), pH de 7, 0 (réglé par addition goutte à goutte d'une solution d'hydroxyde de sodium 4M), et élimina- tion automatique de la mousse (l'élimination de la mous- se a été effectuée en détectant l'état mousseux avec un capteur dans la partie supérieure du fermenteur et en ajoutant automatiquement, goutte à goutte,un agent anti-mousse du type silicone). De l'IAA a été ajouté 4,5 heures après et sa concentration d'addition était de 20 mg/l. Comme témoin, on a effectué une culture en bal- lon dans un milieu de même composition en utilisant la 26. même solution de préculture dans les mêmes conditions que dans l'Exemple de Référence 2.Les résultats sont don- nés dans la figure 5. Tant dans la culture en fermenteur que dans la *culture en ballon,la production d'hEGF a démarré 4 heu- res après et s'est poursuivie presque dans la même quan- tité jusqu'à 9 heures après. Cependant, 24 heures après, on a observé une production de 9 mg/1 dans la culture en ballon,tandis que dans la culture en fermenteur,la pro- duction était de 2 mg/l,presque la même que celle notre 9 heures après. Par conséquent,il est clair qu'il était impossi- ble d'améliorer la production d'hEGF dans un système dis- continu classique.On pense que ceci provient de ce que,dans la culture en fermenteur, la quantité d'oxygène dissous et le pH du milieu ont été maintenus constants et les conditions optimales pour la prolifération d'E. coli ont toujours été réalisées, de telle sorte que le tryptophane présent dans le milieu a été consommé et sa concentration réduite au-dessous d'une valeur définie; lorsque le pro- moteur du trp a commencé à travailler, les sources d'agent nutritif (sources de carbone, sources d'azote, etc.) présentes dans le milieu ont été épuisées. Ctest pourquoi on a essayé, comme il est décrit ci-dessous,le système "fed-batch" dans lequel un milieu frais est complété en continu au cours de la culture. EXEMPLE 2 /_Système Fed-batch - partie 1/ Dans les mêmes conditions de culture que dans l'Exemple 1, un milieu de complément (milieu M9 contenant 20 g/l de Casamino acide,200 g/l de gluco- se, 10 mg/l de vitamine B1, 100 mg/l d'ampicilline et mg/l d'IAA) a été complété à raison de 30 ml/h pendant 24 heures en utilisant une pompe à tube, au même moment que l'addition d'IAA. Pour le témoin, on a également 27. effectué une culture en ballon. Les résultats sont don- nés dans la Figure 6. Dans la culture en fermenteur, la production d'hEGF a augmenté à partir de 6 heures après,et elle a été de 25 mg/l 9 heures après et de 55 mg/l 24 heures aprèssoit environ 25 fois celle du système discontinu de l'Exemple 1. Cependant, le maximum était toujours d'environ mg/l, et la prolifération des cellules était d'en- viron 6 à D0550, résultats qui étaient très supérieurs aux résultats envisagés dans la culture à haute densité. Par conséquent, on a effectué une étude supplémentaire. Il est connu que par addition préalable de tryptophane dans le milieu, la quantité de cellules augmente. Par conséquent, du tryptophane a été ajouté au milieu de base pour inhiber l'action du promoteur du trp, de telle sorte qu'on a essayé d'augmenter la quanti- té de cellules. Dans ce cas, on a constaté que lorsque du tryptophane restait dans le milieu, il inhibait l'ac- tion du promoteur du trp lors de l'addition d'IAA. Il était donc souhaitable que le tryptophane ait été dégra- dé lors de l'addition de l'IAA. D'autre part, le glycérol ne provoque pas de répression des catabolites, contrairement au glucose. Il est également connu que lorsque la répression du catabo- lite disparaît, de la tryptophanase (enzyme de dégrada- tion du tryptophane) est produite pour dégrader le tryptophane dans E. coli. Compte-tenu de ce qui précède, on a tenté d'utiliser du glycérol dans le milieu de complément à la place du glucose. En opérant ainsi, on s'attend à ce que se produise un mécanisme suivant lequel lorsque le glucose présent dans le milieu de base est épuisé, la répression des catabolites disparaît, de la trypto- phanase est produite, le tryptophane est complètement 28. utilisé et par conséquent, le promoteur du trp commence à fonctionner. En outre, on fait également varier le débit d'addition du milieu de complément suivant la prolifé- ration de E. coli pour tenter des combinaisons éla- borées. EXEMPLE 3 LSystème Fed-batch - partie 27 La composition du milieu et les conditions de culture étaient identiques à celles de l'Exemple 1, ex- ception faite de l'addition de tryptophane au milieu de base à raison de 30 mg/1. Un milieu de complément (milieu M9 contenant 5 g/l de Casamino acide, 200 g/l de gluco- se, 10 mg/l de vitamine B1, 100 mg/l d'ampicilline et 5 mg/1 d'IAA) a commencé à être ajouté au milieu à partir de 3 heures après et de i'IAA a été ajouté 4 heures après. L'IAA a été ajouté à une concentration de 5 mg/l, car un excès de IAA aurait inhibé la proli- fération de E. coli et la production d'hEGF. Pour l'addition du milieu, on a utilisé une pompe à tube PI (fabriquée par la société Pharmacia Fine Chemicals Inc.) et un ordinateur personnel (PC 9801 VX41, fabriqué par la société Nippon Electric, Ltd.). Le débit d'addition a été programmé pour repré- senter 49 renouvellements au total au cours de l'addi- tion. La prolifération d'E. coli et la quantité d'hEGF produite sont indiquées dans la figure 7. A partir d'environ 5 heures après que la vitesse de prolifération d'E. coli ait diminué, la production d'hEGF a démarré et a atteint 70 mg/1 24 heures après. La prolifération des cellules a égale- ment augmenté jusqu'à 9 à D0550. Sur la base des résultats qui précèdent, on constate que la quantité de hEGF produite augmente lors- que la quantité de cellules augmente. 29. Par conséquent, pour effectuer la culture à une densité plus élevée, la composition du milieu et le mo- ment approprié pour l'addition ont été étudiés en dé- tail. En particulier, les aminoacides nécessaires à la prolifération du E. coli utilisé comme hôte ont été ajoutés au milieu et le glucose utilisé comme source de carbone dans le milieu de complément a été remplacé par du glycérol. Comme il a été décrit ci-dessus, en présence de glucose, le tryptophane est consommé lorsque le E. coli prolifère,mais n'est pas dégradé par la trypto- phanase. On a par conséquent essayé d'ajouter le gluco- se et le tryptophane au milieu de complément initial pour faire proliférer suffisamment E. coli, tout en empê- chant le promoteur du trp d'agir. Puis on a ajouté de 1'IAA et en même temps, on a remplacé le milieu de complé- ment par un milieu contenant du glycérol, de telle sorte que le tryptophane a été dégradé en renforçant l'ac- tion de l'IAA, et que par conséquent la quantité de hEGF produite a augmenté. EXEMPLE 4 /Système Fed-batch - partie 3/ La culture a été effectuée de la manière sui- vante, par un système fed-batch semblable à celui ci- dessus. (1) Composition du milieu 1) Milieu de base On a complété le milieu M9 avec ce qui suit. 2,5 g/l de Casamino acide, 10 g/l de glucose, 50 mg/l de tryptophane, 0,5 g/l de proline, 1,0 g/l de leucine, 10 mg/l de vitamine B1, 100 mg/l d'ampicilline et des sels de métaux-traces. 2) Milieu de complément 1 On a complété le milieu M9 avec ce qui suit. 40 g/l de Casamino acide, 300 g/l de glucose, 30. mg/l de tryptophane, 5 g/l de proline, 5 g/l de leuci- ne, 10 mg/l de vitamine B1, 100 mg/1 d'ampicilline et des sels de métaux-traces. 3) Milieu de complément 2 On a complété le milieu M9 avec ce qui suit. 4,0 g/l de Casamino acide, 300 g/1 de glycé- rol, 5 g/l de proline, 5 g/l de leucine, 10 mg/i de vitamine B1, 100 mg/l d'ampicilline et des sels de mé- taux-traces. (2) Conditions de culture Le plasmide (hôte) était pBT23 (HB101). Le volume de culture (milieu de base + milieu de complément 1 + milieu de complément 2) était de litres + 0,5 litre + 1,0 litre. La température de culture était de 37 C et le pH était de 7,0. L'aération était de 1,5 vvm (7,5 litres/min). La vitesse d'agitation était de 900 tours/minu- te. L'élimination de la mousse était automati- sée (par addition goutte à goutte d'un agent anti-mous- se du type silicone). Le moment approprié pour l'addition du milieu était de 0,5 à 6 heures (le débit d'addition était va- riable) après le début de la culture pour le milieu de complément 1, et il était de 6 à 24 heures (le débit d'addition était constant, 50 ml/heure) après le début de la culture pour le milieu de complément 2. L'IAA a été ajouté 6 heures après le début de la culture et sa concentration était de 5 mg/1. Le milieu de préculture était identique au milieu de base. La quantité inoculée était de 10 %. Le débit d'apport du milieu de complément 1 a été programmé pour réalisei 20 renouvellements au 31.- total au cours de l'addition. La prolifération d'E. coli et la quantité d'hEGF produite sont indiquées dans la Figure 8. La D0550 24 heures après était de 42, indi- quant que l'on avait obtenu une culture d'une densité plus élevée. La quantité d'hEGF produite était de mg/l. 4. Brève description des dessins La figure 1 montre une séquence du promoteur du trp conforme à la présente invention, la séquence de SD et le gène du peptide signal de la phosphatase alcaline d'E. coli. La figure 2 montre une séquence du gène de hEGF conforme à la présente invention. La figure 3 illustre les progrès de la produc- tion du plasmide d'expression de la sécrétion conforme à la présente invention. La figure 4 illustre une séquence d'un frag- ment Hind III-BamH I du plasmide d'expression de la sé- crétion pBT23 conforme à la présente invention. La figure 5 donne les résultats de l'Exem- ple 1, le temps de culture (en heure) étant en abscis- ses, et la quantité (en mg/l) de hEGF dans le milieu en ordonnées: * désigne une culture en fermenteur et désigne une culture en ballon. La figure 6 donne les résultats de l'Exem- ple 2, le temps de culture (en heure) étant en abscis- ses et la quantité (en mg/l) de hEGF dans le milieu étant en ordonnées: * désigne une culture en fermenteur et a désigne une culture en ballon. La figure 7 donne des résultats de l'Exem- ple 3, le temps de culture (en heures) étant donné en abscisses et la quantité (en mg/l) de hEGF et la quanti- té de cellules (exprimée par la D0550) dans le milieu étant en ordonnées: o désigne la quantité de cellules 32. et e désigne la production de hEGF. La figure 8 donne les résultats de l'Exemple 4, le temps de culture (en heures) étant en abscisses et la quantité (en mg/l) de hEGF et la quantité de cellules (exprimée par la DO550) dans le milieu étant en ordon- nées: o désigne la quantité de cellules et a désigne la production de hEGF. La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de modifications et de variantes qui apparaîtront à l'homme de l'art. 33. REVENDICATIONS 1 - Dans une technologie de génie génétique qui comprend le fait d'effectuer une série d'opérations (1) à (4): (1) intégration dans un vecteur d'un gène co- dant pour une substance désirée, (2) transformation de E. coli utilisé comme hôte en utilisant ce vecteur, (3) culture du transformant ainsi obtenu, et (4) récupé- ration et collecte de la substance désirée dans la solution de culture: un procédé pour produire du hEGF, caractérisé par (a) et (b) ci-dessous: (a) la substance désirée est.l'hEGF; (b) dans l'opération (1) ci-dessus, un gène codant un promoteur pour l'opéron du tryptophane (trp) et un gène codant un peptide signal pour le gène de la phosphatase alcaline d'E. coli sont intégrés dans un gène du hEGF dans la région en amont et deux codons de terminaison continus et un terminateur de transcription sont intégrés dans la région en aval. 2 - Procédé pour produire du hEGF selon la re- vendication 1, dans lequel de l'acide 3-indoleacrylique (IAA) est ajouté au cours de la culture, grâce à quoi la période de temps et la quantité de hEGF produite par l'E. coli hôte sont réglées. 3 - Procédé pour produire de l'hEGF selon la revendication 2,dans lequel ladite culture est une cul- ture de haute densité utilisant efficacement un système fed-batch dans lequel on règle le débit d'addition. 4 - Procédé de production de l'hEGF selon la revendication 3, dans lequel du glucose ou du glycérol ou du glucose et du glycérol en association sont utili- sés comme sources de carbone.pour un milieu de complé- ment dans le système fed-batch. - Procédé de production de l'hEGF selon la revendication 3, dans lequel on utilise du glucose, puis 34. du glycérol, comme source de carbone pour un milieu de complément dans le système fed-batch.