FR 2624019 A1 19890609 FR 8716996 A 19871207 L'invention a trait à la médecine, et, plus par- ticulièrement, à une préparation pour la régulation phy- siologique du système neuro-endocrinien, la stimulation de l'immunité et l'inhibition de la croissance des tu- meurs hormono-dépendantes, ainsi qu'à un procédé d'obten- tion de ladite préparation. On connait un extrait de produits biologiquement actifs, isolés de l'épiphyse des bovins ainsi que son pro- cédé de préparation, consistant en l'extraction des pro- duits biologiquement actifs de l'épiphyse par une solu- tion aqueuse d'acide acétique ("Voprosy onkologii", t. XIX, No 10, 1973; V.N. Anisimov, V.G. Morozov, V.Kh. Kha- vinson, V.M. Dilman "Comparaison de l'activité antitumrora- le des extraits de l'épiphyse et de l'hypothalamu- - méla- tonine et siguétine chez les souris portant un cancer mam- maire greffé", pp. 99-101, en russe). L'injection de l'extrait susmentionné produisait chez les souris une inhibition de la croissance de la tu- meur mammaire transplantée. Cependant, cet extrait d'épi- physe contient une grande quantité de produits d'accompa- gnement (ballast) et de corps étrangers (protéines de haut poids moléculaire, hydrates de carbone), ce qui peut entraîner à la suite de son administration dans l'orga- nisme l'apparition de réactions allergiques. Pour.cette raison ledit extrait d'épiphyse ne peut pas être utilisé chez l'homme. Le problème posé dans la présente invention con- siste à élaborer une préparation efficace et inoffensive pour l'homme, ayant pour objectif la régulation physiolo- gique du système neuroendocrinien, la stimulation de l'immunité et l'inhibition de la croissance des tumeurs hormono-dépendantes ainsi qu'à mettre au point un procédé pour son obtention. La préparation suivant l'invention consiste en un complexe de polypeptides hydrosolubles, extraits du tissu de la zone épithalamo-épiphysaire du cerveau d'ani- maux, d'une masse moléculaire de 250 à 11.000 daltons, ayant un point isoélectrique de 3,0 à 10,5 unités de pH, et contenant de l'azote entrant dans la composition des acides aminés à raison de (0,34-4,0).10-3 pmol/mg. Notons que la zone épithalamo-épiphysaire du cerveau comprend l'épiphyse, l'organe sous-commissural et le noyau de l'habénula. On a conventionnellement appelé Epithalamine la préparation suivant l'invention. C'est un produit po- lypeptidique à bas poids moléculaire efficace, qui peut être utilisé dans la pratique médicale à titre de régula- teur du système neuro-endocrinien, d'immunostimulateur ainsi que d'agent pour l'inhibition de la croissance des tumeurs hormono-dépendantes. Selon l'invention, le procédé d'obtention de ladite préparation est caractérisé en ce qu'on traite le tissu de la zone épithalamo-épiphysaire du cerveau des animaux par un solvant organique à une température de +5 C au maximum, puis on élimine le solvant organique et on soumet au broyage le tissu traité; on extrait du tis- su broyé le complexe de polypeptides par une solution aqueuse à 1 - 10 % d'acide acétique en présence de chlo- rure de zinc à raison de 0,2 à 2,0 g par litre de solu- tion aqueuse d'acide acétique, et on sépare le substra- tum obtenu en sédiment et en liquide surnageant; on fait précipiter dans le liquide surnageant le complexe de polypeptides par un solvant organique à une tempéra- ture de O à -10 C, on élimine par lavage le sédiment du complexe de polypeptides par un solvant organique à une température de O à -10 C, on le sèche à une température de 15-20 C, et on extrait à l'eau à partir du sédiment séché le complexe de polypeptides hydrosolubles; on sépare le substratum ainsi obtenu en sédiment et en li- quide surnageant, puis on stérilise le liquide surnageant par filtration et on le lyophilise. Dans le but d'extraire au maximum le complexe de polypeptides, il est recommandé de réaliser l'extrac- tion par une solution aqueuse d'acide acétique à 1-10 % pendant 48-72 heures à un pH de 2,5-4,0 et à une tempéra- ture de 5 à 15 C. Dans le but d'extraire au maximum le complexe de polypeptides hydrosolubles tout en conservant leur structure, il est recommandé de réaliser l'extraction à l'eau pendant 1-2 heures à une température de 15 à 25 C. Dans le procédé suivant l'invention, il est recommandé d'utiliser, à titre de solvant organique, l'acétone, le chloroforme ou l'éthanol. Le procédé suivant l'invention se caractérise par une technologie simple et il est facilement repro- ductible dans les conditions industrielles. Ce procédé permet d'obtenir la préparation selon l'invention à par- tir du tissu de la zone épithalamo-épiphysaire du cer- veau des animaux avec un haut degré de pureté, cette préparation ne produisant pas, après son administration dans l'organisme, d'effets secondaires et de réactions allergiques. On a établi par chromatographie par échange d'ions que la préparation suivant l'invention comporte en pourcentages déterminés trois fractions qui se dis- tinguent par leurs propriétés électrochimiques. Le ta- bleau 1 présente les caractéristiques physico-chimiques des fractions contenues dans la préparation suivant l'invention. TABLEAU 1 Caractéristiques physico-chimiques des fractions de la préparation suivant l'invention () Teneur en Azote Masse moléculaire Point ( Fraction fraction de d'acides aminés, de la fraction isoélectrique, () la préparation pmol/mg unités de pH ( % en poids () ( I 70-80 1,4.10-3 250 3,0) (II 10-20 0,34.10-3 il 000 5,0) () ( III 5-15 4,0.10-3 1 200 10,5) () f) ro o Les fractions I, II et III se composent de dif- férents polypeptides, déterminés par le procédé d'élec- trophorèse zonale. La masse moléculaire de chaque frac- tion a été déterminée par filtration sur gel. On a utilisé pour le dosage des acides aminés dans la préparation suivant l'invention l'analyseur au- tomatique d'acides aminés "LKB-3201" (Suede). La composition en acides aminés de la prépara- tion suivant l'invention figure dans le tableau 2. TABLEAU 2 Composition en acides aminés de la préparation suivant l'invention () Quantité des acides ( Acides aminés aminés dans la préparation) ( -) pmol/mg () 1 2 () la manière suivante. On utilise, à titre de matière première pour l'obtention de la préparation suivant l'invention, le tis- su de la zone épithalamo-épiphysaire du cerveau d'animaux, par exemple, des porcs, moutons, chevaux ou bovins. On re- tire du tissu de la zone épithalamo-épiphysaire du cerveau des animaux les vaisseaux et les caillots sanguins, puis on traite ce tissu par un solvant organique, par exemple par l'acétone, le chloroforme ou l'éthanol, à une tempéra- ture non supérieure à 5 C. Par suite de ce traitement, le tissu se dégraisse et se déshydrate. Puis on élimine le solvant organique et on broie le tissu traité. A partir du tissu broyé, on extrait un complexe de polypeptides par une solution aqueuse à 1-10 % d'acide acétique en présence de chlorure de zinc à raison de 0,2-2 g par litre de solu- tion aqueuse d'acide acétique. Les conditions optimales de l'extraction sont: pH = 2,5 à 4,0; température = 5 à C; durée de 48 à 72 heures. Au terme de cette extraction, on sépare le sub- stratum obtenu en sédiment et en liquide surnageant, par exemple par centrifugation. On fait précipiter dans le liquide surnageant le complexe de polypeptides par un sol- vant organique, par exemple par l'acétone, le chloroforme ou l'éthanol, à une température de O à -10 C. On lave le précipité déposé au moyen d'un des solvants mentionnés ci- dessus à une température de O à -10 C, après quoi on le sèche à une température de 15-20 C. On extrait à l'eau, à partir du précipité séché, le complexe de polypeptides hydrosolubles. Il est recom- mandé de réaliser ladite extraction à une température de à 25 C pendant une ou deux heures. Après avoir achevé cette extraction, on sépare le substratum obtenu en sédi- ment et en liquide surnageant. Le liquide surnageant, qui est une solution transparente, est stérilisé par fil- tration, versé dans des flacons stériles, par exemple à raison de 1 ml, et lyophilisé; après quoi, on ferme les flacons avec des bouchons de caoutchouc stériles. Chaque flacon peut contenir de 1 à 10 mg de préparation suivant l'invention, isolée du tissu de la zone épithalamo-épi- physiaire du cerveau d'animaux. La préparation suivant l'invention, ainsi ob- tenue, est un-complexe de polypeptides hydrosolubles de masse moléculaire de 250 à 11 000 daltons, de point iso- électrique de 3,0 à 10,5 unités de pH et comportant de l'azote entrant dans la composition d'acides aminés à raison de (0,34-4,0).10-3 pmol/mg. L'invention sera maintenant illustrée à l'aide des exemples de réalisation suivants. EXEMPLE 1 On utilise à titre de matière première, pour l'obtention du tissu de la zone épithalamo-épiphysaire du cerveau l'encéphale de bovins âgés de 1 à 3 ans. Immédiatement après que les animaux sont abattus et que le cerveau a été extrait, on dégage la zone épithalamo- épiphysaire, plus précisément l'épiphyse, l'organe sous- commissural et le noyau de l'habénula, on sépare les morceaux de cerveau ainsi obtenus des vaisseaux et des caillots sanguins et on pèse lesdits morceaux. Pour l'obtention de la préparation suivant l'invention, on prend 1 kg de morceaux de cerveau, dégagés des vais- seaux et des caillots sanguins (c'est-à-dire le tissu de la zone épithalamo-épiphysaire du cerveau). Dans le but d'effectuer une déshydratation partielle, un dégraissage et une dénaturation partielle des protéines macromoléculaires, on verse sur le tissu de la zone épithalamo-épiphysaire du cerveau 9 litres d'acétone refroidie (t = 1 C) et on brasse périodique- ment, toutes les 6 heures. Au bout de 24 heures, on re- nouvelle l'acétone par de l'acétone franche et, après encore 24 heures, on déverse l'acétone. On pèse la ma- tière première. Apres le traitement par l'acétone le poids de la matière première se réduit de 30 % du fait de la perte d'eau et de graisses. Le poids devient appro- ximativement égal à 700 g. On broye le tissu de la zone épithalamo-épiphy- saire du cerveau des animaux, traité par l'acétone, au moyen d'un hachoir à viande. On verse sur la matière pre- mière broyée une solution aqueuse à 3 % d'acide acétique à la température de 10 C (rapport en poids de la matière première à la solution 1:7), le pH de la solution étant de 2,5. On réalise l'extraction du complexe de polypep- tides pendant 72 heures en malaxant périodiquement (tou- tes les 6 heures). Dès le début de l'extraction, on ajoute à la solution d'acide acétique du chlorure de zinc à raison de 1 g par litre de solution. Au terme de l'extraction, on centrifuge le substratum pendant 20 minutes à la vitesse de 3000 tours/mir On décante le liquide surnageant transparent et on y ajoute de l'acétone à la température de -5 C, le rapport en poids du liquide surnageant à l'acétone étant égal à 1:6. Pendant une heure, on malaxe le mé- lange ainsi obtenu, et, deux heures après le début de la précipitation du sédiment, on décante le liquide surnageant. On lave le sédiment qui reste avec de l'a- cétone à la température de -5 C. Puis on place le sé- diment sur un filtre et on le sèche à la température de 17 C. On prélève sur le filtre la poudre qui s'est formée et on la sèche à l'air dans le but d'en élimi- ner les vapeurs d'acétone. Le poids de la poudre obte- nue est égal à 7 g. On verse sur la poudre de l'eau distillée et on réalise l'extraction du complexe de polypeptides hy- drosolubles pendant une heure à la température de 20 C. On utilise l'eau en une quantité permettant d'obtenir une solution à 1 % de polypeptides hydrosolubles. Au terme de l'extraction, on sépare le sub- stratum en précipité et en liquide surnageant par fil- tration. Puis, on stérilise par filtration le liquide surnageant, qui est une solution transparente, on le verse dans des flacons stériles à raison de 1 ml par fla- con, le lyophilise et on bouche les flacons avec des bou- chons de caoutchouc stériles. EXEMPLE 2 On utilise, à titre de matière première pour l'obtention du tissu de la zone épithalamo-épiphysaire du cerveau, l'encéphale de porcs âgés de 1 à 3 ans. Im- médiatement après l'abattage des animaux et l'extraction du cerveau, on dégage la zone épithalamo-épiphysaire (épiphyse, organe sous-commissural et noyau de l'habénu- la). On élimine des morceaux de cerveau ainsi dégagés les vaisseaux et les caillots sanguins et on pèse. Pour l'obtention de la préparation suivant l'invention, on prend 5 kg de morceaux de cerveau dégagés des vaisseaux et des caillots sanguins (c'est-à-dire le tissu de la zone épithalamo-épiphysaire du cerveau). Dans le but d'effectuer une déshydratation partielle, un dégraissage et une dénaturation partielle des protéines macromoléculaires, on verse sur le tissu de la zone épithalamo-épiphysaire du cerveau 45 litres de chloroforme refroidi (t = 5 C) et on brasse périodi- quement, toutes les 6 heures. Apres 24 heures, on renou- velle le chloroforme par du chloroforme frais, et après encore 24 heures, on déverse le chloroforme. On pèse la matière première. Apres le traitement par le chloroforme le poids de la matière première se réduit de 30 % du fait de la perte d'eau et de graisses. Le poids devient approximativement égal à 3,5 kg. On broie le tissu de la zone épithalamo-épiphy- saire du cerveau des animaux, traité par le chloroforme, au moyen d'un hachoir à viande. On verse sur la matière première broyée une solution aqueuse à 1 % d'acide acéti- que à la température à 5 C (pour un rapport en poids de la matière première à la solution égal à 1:5), le pH de la solution étant établi à 3, 5. On réalise l'extraction du complexe de polypeptides pendant 48 heures en mala- xant périodiquement (toutes les 6 heures). Dès le début de l'extraction, on ajoute à la solution d'acide acéti- que du chlorure de zinc à raison de 0,2 g par litre de ladite solution. Au terme de l'extraction, on centrifuge le sub- stratum pendant 20 minutes à la vitesse de 3 000 tours/ min On décante le liquide surnageant transparent et on y ajoute du chloroforme à la température de 0 C, le rapport en poids du liquide surnageant au chloroforme étant égal à 1:6. Pendant une heure, on malaxe le mélange ainsi ob- tenu, et deux heures après le début de la sédimentation on décante le liquide surnageant. On lave le sédiment qui reste avec du chloroforme à 0 C. Ensuite, on place le sé- diment sur un filtre et on le sèche à la température de 15 C. On prélève du filtre la poudre qui s'est formée et on la sèche à l'air pour éliminer les vapeurs de chloro- forme. Le poids de la poudre obtenue est égal à 35 g. On verse sur la poudre de l'eau distillée et on réalise l'extraction du complexe de polypeptides hydroso- lubles pendant 1,5 heure à la température de 15 C. On utilise l'eau en une quantité permettant d'obtenir une solution à 1 % de polypeptides hydrosolubles. A la fin de l'extraction, on sépare le substra- tum en sédiment et en liquide surnageant par filtration. Puis, on stérilise par filtration le liquide surnageant, qui est une solution transparente, on le verse dans des flacons stériles à raison de 1 ml par flacon et le lyo- philise, après quoi on bouche les flacons avec des bou- chons de caoutchouc stériles. EXEMPLE 3 On utilise, à titre de matière première pour obtenir le tissu de la zone épithalamo-épiphysaire du cerveau, l'encéphale de chevaux âgés de 1 à 3 ans. Im- médiatement après l'abattage des animaux et l'extrac- tion du cerveau, on dégage la zone épithalamo-épiphysai- re (épiphyse, organe sous-commissural et noyau de l'ha- ii bénula). On libère les morceaux de cerveau ainsi dégagés des vaisseaux et des caillots sanguins et on pèse. Pour l'obtention de la préparation suivant l'invention, on prend 10 kg desdits morceaux de cerveau, dégagés des vaisseaux et des caillots sanguins (c'est-à-dire le tis- su de la zone épithalamo-épiphysaire du cerveau). Pour effectuer une déshydratation partielle, un dégraissage et une dénaturation partielle des protéines macromoléculaires on recouvre le tissu de la zone épitha- lamo-épiphysaire du cerveau de 90 litres d'éthanol refroi- di (t =-5 C) et on brasse périodiquement, toutes les 6 heures. Au bout de 24 heures, on déverse l'éthanol et on le remplace par de l'éthanol frais et encore 24 heures plus tard, on déverse l'éthanol. On pèse la matière pre- mière. Après le traitement par l'éthanol le poids de la matière première se réduit de 30 % du fait de la perte en eau et en matières lipidiques. Le poids devient appro- ximativement égal à 7 kg. On broye le tissus de la zone épithalamo-épi- physaire du cerveau des chevaux, traité par l'éthanol, au moyen d'un hachoir à viande. On verse sur la matière première broyée une solution aqueuse d'acide acétique à % à la température à 15 % (pour un rapport en poids de la matière première à la solution de 1:10), le pH de la solution étant de 4,0. On réalise l'extraction du com- plexe de polypeptides pendant 56 heures en malaxant pé- riodiquement (toutes les 6 heures). Dès le début de l'ex- traction, on ajoute à la solution d'acide acétique du chlorure de zinc à raison de 2 g par litre de ladite so- lution. Au terme de l'extraction, on centrifuge le sub- stratum pendant 20 minutres à la vitesse de 3 000 tours/ min. On décante le liquide surnageant transparent et on y ajoute de l'éthanol à la température à -10 C, le rapport en poids du liquide surnageant à l'éthanol étant égal à 1:6. Au bout d'une heure, on malaxe le mélange ainsi ob- tenu et, deux heures après le début de la sédimentation, 26240'19 on décante le liquide surnageant. On lave le sédiment qui reste avec de l'éthanol à -10 C. Ensuite, on place le sé- diment sur un filtre et on le sèche à la température de C. On prélève du filtre la poudre qui s'est formée et on la sèche à l'air pour éliminer les vapeurs d'éthanol. * Le poids de la poudre ainsi obtenue est égal à 70 g. On verse sur la poudre de l'eau distillée et on réalise l'extraction du complexe de polypeptides hydroso- lubles pendant 2 heures à la température de 25 C. On uti- lise l'eau en une quantité permettant d'obtenir une solu- tion à 1 % de polypeptides hydrosolubles. A la fin de l'extraction, on sépare le substra- tum en sédiment et en liquide surnageant par filtration. Puis on stérilise par filtration le liquide surnageant, qui est une solution transparente, on le verse dans des flacons stériles à raison de 1 ml par flacon, et le lyo- philise, après quoi on bouche les flacons avec des bou- chons de caoutchouc stériles. La préparation suivant l'invention est une pou- dre amorphe de couleur blanche ou blanche-jaunâtre, solu- ble dans l'eau, le soluté physiologique (solution à 0,9 % de chlorure de sodium), et la solution aqueuse de novo- caine, et exempte de protéines macromoléculaires. On stocke dans un local sec, à l'abri de la lumière, à une température ne dépassant pas 30 C, le délai de stockage étant de 3 ans. La préparation suivant l'invention, convention- nellement nommée épithalamine, a été soumise à des études expérimentales chez les animaux de laboratoire. 1. REGULATION PAR L'EPITHALAMINE DU SYSTEME NEURO-ENDO- CRINIEN. Expérience 1 Les résultats de l'étude de l'action de l'épi- thaiamine sur la fonction cyclique des ovaires chez les rattes de différents âges montrent que la préparation suivant l'invention n'agit pratiquement pas sur le cycle oestral des animaux jeunes et mûrs, et provoque chez les rattes âgées avec un oestrus stable continu l'apparition de phases de dioestrus et la restitution de l'activité cyclique des ovaires, qui est caractéristique pour les animaux plus jeunes (tableau 3). - TABLEAU 3 Action de l'épithalamine sur le rapport des phases du cycle oestral chez les rattes de différents âges Rapport des phases du cycle oestral (%) (Age des Nombre ----------- (animaux d'animaux Avant l'admi-:Au cours de:Après l'admi- ((mois) nistration:l'administra-:nistration de) dé ( d'épithalamine:tion de:l'épithalamine ( -: 1 - l'épithalamin.(après 10-) :: jours) () O P DO:0O P DO: O P DO ( -à- à:____:---- --)---- 3 (jeunes) 15 40 29 31:30 28 42:25 39 36 (3) (17-19 (mûrs) 12 36 32 32 35 29 36 29 32 39) (26-28 (âgés) 14 95 5 O 52 28 20 65 23 12 () Nota: 0 oestrus; P - prooestrus+métaoestrus; DO - dioestrus. Expérience 2 L'analyse des résultats de l'examen cytologi- que des frottis vaginaux dans une expérience portant sur des rattes montre que, chez les animaux d'âge mûr avec un cycle normal, l'administration de l'épithalamine, aussi bien en injections quotidiennes qu'en injections intermittentes dans les différentes phases du cycle, ne présente aucune action sur les cycles sexuels. Dans le lot d'animaux présentant un oestrus continu (provoqué par éclairage continu) l'administration de l'épithalamine produit une interruption de l'oestrus 3 - 4 jours plus tôt que chez les animaux témoins. Dans le lot de rattes vieillissantes avec un oestrus permament l'administration quotidienne de la préparation suivant l'invention produit l'interruption de l'oestrus dans 80 % des cas, et l'admi- nistration intermittente dans 100 % des cas. Dans le lot témoin, aucune des rattes vieillissantes ne sortait de l'oestrus. L'étude morphologique établit que l'administra- tion d'épithalamine aux rattes âgées avec un oestrus con- tinu produit une augmentation du nombre de follicules en maturation, l'apparition de corps jaunes fonctionnants, une importante diminution du nombre de kystes folliculai- res, et on constate la lutéinisation du revêtement d'une partie des kystes restants. Chez les témoins, on n'a pas décelé de tels remaniements. Expérience 3 L'étude morphologique de la structure de l'hy- pophyse des rattes âgées avec un oestrus continu montre que le volume des nuclei des deux types de gonadotrophes est significativement plus grand que chez les animaux en maturité avec un cycle normal. Ces données témoignent de l'accroissement de l'activité gonadotrophine de l'adéno- hypophyse. L'administration de l'épithalamine aux rattes âgées produit une réduction significative du volume des nuclei des gonadotrophes folliculostimulantes et lutéini- santes, ce qui s'accompagne de la normalisation de leur fonction. Les résultats des expériences 1 à 3 montrent que l'administration de l'épithalamine contribue à la normalisation (restitution) de la fonction du système neuro-endocrinien chez les animaux. II. STIMULATION DE L'IMMUNITE PAR L'EPITHALAMINE L'étude de l'action de l'épithalamine sur la réactivité immunologique de l'organisme des cobayes a établi que l'administration de la préparation suivant l'in- vention accroit de 3 fois la réaction intradermique d'hy- persensibilisation retardée à la tuberculine par rapport aux témoins. Cela signifie une stimulation de la réponse d'immunité cellulaire. A la suite de l'étude de l'action de l'épithala- mine sur la réponse d'immunité coopérative envers l'anti- gène thymodépendant (hématies de mouton), on a établi que la préparation accroit nettement le nombre de cellules formant les anticorps dans la rate des animaux soumis à l'expérience (tableau 4). TABLEAU 4 Action de l'épithalamine sur la quantité de cellules formant les anticorps (CCAC) dans la rate des souris ( Nombre Dose uantité de (Lots de d'éDithala- CCAC par million) (d'aniaux souris mine (mg) de cellules de P () ( la rate) (Témoin 30 - 56 4 - (Expériental 30 0,1 140 20 0,01 (Expérimental 30 1,0 180 26 0,01) () _ _- III. INHI3ITION PAR L'EPITHALAMINE DE LA CROISSANCE DES TUMEURS HORMONODEPENDANTES Les résultats des expériences concernant l'ac- tion de l'épithalamine sur la croissance des tumeurs transplantables de différentes souches figurent dans le tableau 5. L'évaluation de ces résultats permet de cons- tater une importante action de l'épithalamine sur la croissance des tumeurs hormonodépendantes. L'étude his- tologique de l'adénocarcinome mammaire et de l'hépatome 22a (femelles, dose d'épithalamine 2 g) a établi que chez les souris cui recevaient l'épithalamine la quanti- té de mitoses était de 5 à 7 fois inférieure à celle des animaux témoins, recevant seulement le solvant de la pré- paration suivant l'invention (solution aqueuse de 0,9 % de chlorure de sodium). Le volume moyen des noyaux des cellules de la tumeur RSM chez les souris témoins était de 592 62 pm3, alors que chez les animaux obtenant l'épi- thalamine, elle était de 311 57 mI3 (P me des noyaux des cellules de l'hépatome 22a fut respec- tivement égal dans le lot témoin à 730 43 um3 et dans le lot expérimental à 262 15 pm3 (P vert dans le tissu tumoral des souris ayant reçu l'épi- thalamine des foyers de nécrose parmi lesquels étaient disposées des zones de cellules tumorales conservées. Dans les cellules tumorales, on a constaté d'importants remaniements dégénératifs et dystrophiques. Autour des foyers de nécrose et entre les zones de cellule tumorales conservées, on a observé de larges plages de nouveau tis- su conjonctif. Il convient de noter que pour les mêmes doses d'administration, l'épithalamine s'est avérée deux fois plus efficace chez les femelles que chez les mâles. Ainsi donc, il a été établi que l'administration de l'épithalamine chez les animaux portant des tumeurs transplantables hormonodépendantes apporte une inhibition de la croissance desdites tumeurs du fait de la destruc- tion du tissu tumoral et de la mort d'une partie des cel- lules, de la réduction de l'activité mitotique et fonc- tionnelle des cellules tumorales et de leur remplacement par du tissu conjonctif. TABLEAU 5 Action de l'épithalamine sur la croissance des tumeurs transplantables de la souris () Souche Lignée Sexe Nombre Dose de la Dur.e de Inhibition de tumorale des des préparation l'adr:inistration la croissance.) souris animaux par souris d'ëpithalaiine de la tumeur par P c) (mg) (jours) rapport aux) témoins (%) () - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -) |Adénocarcinome C3HA femelles 25 1 10 40,0 (RSM) 25 2 10 82,0 40,01 ( (005 (utérin) ( (SCC) femelles 26 2 10 78,9 O 0,01) _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _) Hépatome C3HA femelles 28 2 10 88,7 0,01 ( 22a mâles 26 2 10 44,3 co o --% No La préparation suivant l'invention (l'épitha- lamine) a été soumise à un essai clinique. La préparation a été administrée par la voie intramusculaire. Dans ce but, avant l'injection, on a dilué la poudre d'épithalamine, se trouvant dans le fla- con à raison de 10 mg, par 1 ml de soluté physiologique (solution aqueuse de 0,9 % de chlorure de sodium) ou de solution aqueuse à 0,25 - 0,5 % de novocaïne, ou d'eau distillée. On a injecté la préparation quotidiennement à raison de 3 à 30 mg pendant 3 à 14 jours (dose de trai- tement de 9 à 420 mg). Essai 1 Régulation par l'épithalamine de la teneur en hormones chez les femmes en période climatérique Il est bien connu que pendant le dimatère, il se produit chez les femmes d'importantes perturbations de l'équilibre hormonael. Ceci conditionne l'apparition de pathologies diverses (tumeurs hormonodépendantes, hé- morragies de climatère, inhibition de l'immunité cellu- laire). Compte tenu de ces données, ainsi que de la ca- pacité de l'épithalamine de régler le système neuro-en- docrinien dans l'expérience, on a réalisé l'étude de l'action de la préparation suivant l'invention sur la teneur en hormone folliculo-stimulante (FSH) et en hor- mone lutéinisante (LH) du sérum sanguin de 60 femmes, âgées de 38 à 65 ans. Les résultats de cet essai figu- rent au tableau 6. TABLEAU 6 Action de l'épithalamine sur la teneur en FSH et LH du sérum sanguin des femmes en période climatérique Hormone Teneur en hormone, ng/ml P à) () Femmes saines Femmes malades () (à ( Avant l'administration Après l'administration ( d'épithalamine d'épithalamine () ( FSH 22,4 6,1 73,3 6,1 33,8 3,0 0,01 (), ( LH 13,1 +3,7 10,7 1,9 11,3 2,0 0,05 () () c __________________________________________ Il découle de ce tableau que l'épithalamine ré- duit significativement le taux initialement élevé de FSH, sans toutefois agir sur le niveau initialement normal de LH. Essai 2. Action de l'épithalamine sur l'hémorragie climatèrique, conditionnée par une pertur- bation de la fonction du système neuro- endocrinien L'essai a porté sur 33 femmes d'âge moyen de 47,1 ans et avec une durée des troubles du cycle men- struel de 1,5 mois à 10 ans. L'administration de l'épi- thalamine chez ces femmes a contribué à la cessation de l'hémorragie chez 27 femmes (81,8 %). Par ailleurs, sous l'action de l'épithalamine, le degré des remanie- ments prolifératifs dans l'endomètre s'est réduit de près de deux fois. Les résultats du dosage des hormo- nes chez ces femmes sont rapportés dans le tableau 7. TABLEAU 7 Action de l'épithalamine sur la teneur en hormones du sérum sanguin chez les femmes en période climatérique c) ( Teneur en hormone, ng/ml P) ( Femmes malades () ( Hormone Femmes --------------------- - saines Avant l'administration Après l'administration ( (norme) d'épithalamine d'épithalamine) () ( FSH 22,4 6,1 46,3 9,1 24,8 4,3 () ( LH 13,1 3,7 17,2 3,5 18,9 4,2 >0,05) () () (Progestérone 1,0 0,12 1,1 0,2 1,9 0,3 > 0,05) () () Il ressort de ce tableau que l'administration de l'épithalamine favorise la normalisation de la teneur en FSH du sang périphérique, ce qui est positif pour les femmes malades. Essai 3 Action de l'épithalamine sur la réacti- vité immunologique chez les malades atteints de cancer Compte tenu de ce que, chez les malades por- tant des tumeurs hormonodépendantes, il se produit à la suite de la radioet chimio-thérapie une inhibition supplémentaire importante de l'immunité cellulaire, on a étudié l'efficacité clinico-immunologique de l'épi- thalamine chez cette catégorie de malades. L'épithala- mine a été utilisée chez 153 malades cancéreux âgés de 19 à 88 ans (tableau 8). La vérification histologique de la tumeur a été obtenue dans tous les cas. Avant le traitement, on notait chez les malades une réduction significative du taux de lymphocytes, de lymphocytes-T, de helpers-T (OKT4+), du rapport helpers-T/suppresseurs- T (OKT4+/OKT8+), ainsi qu'une réduction de la produc- tion de lymphokine dans la réaction de retardement de la migration des globules blancs avec la concanavaline A. TABLEAU 8 Efficacité clinico-immunologique de l'épithalamine chez les cancéreux avec des tumeurs primaires de différente localisation Nombre total Nombre de malades Efficacité clinico- Diagnostic de patients recevant immunologique de) l'épithalamine l'épithalamine (%) () l'immunité cellulaire. On notera particulièrement l'aug- mentation du nombre de helpers-T et du rapport OKT4+/ OKT8+, ce qui signifie une restitution partielle de la différentiation des lymphocytes-T. Chez les malades des groupes témoins, ne rece- vant que des vitamines et un traitement symptomatique, l'efficacité de la thérapie (en ce qui concerne la res- titution des paramètres de l'immunité cellulaire) était de: pour le cancer du sein - 27 %, le cancer du corps utérin - 32 %, le cancer du col utérin - 26 %, et pour 1e cancer des ovaires - 15 %. Les résultats de cette étude montrent d'une manière probante que l'épithalamine contribue à la res- tauration de l'immunité cellulaire chez les malades on- cologiques. Ainsi donc, la préparation de l'invention re- présente, conformément aux essais cliniques, un régula- teur physiologique efficace du système neuro-endocri- nien et un stimulant de l'immunité chez les malades at- teints de tumeurs hormonodépendantes. REVENDICATIONS 1. Préparation pour la régulation physiologique du système neuro-endocrinien, la stimulation de l'immu- nité et l'inhibition de la croissance des tumeurs hormon- dépendantes, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un complexe de polypeptides hydrosolubles, extraits du tissu de la zone épithalamo-épiphysaire du cerveau d'ani- maux, dont la masse moléculaire est de 250 à 11 000 dal- tons, le point iso-électrique est de 3,0 - 10,5 unités de pH et qui contiennent de l'azote, entrant dans la -composition des acides aminés, à raison de (0,34 - 4,0). -3 pmol/mg. 2. Procédé d'obtention de la préparation selon la revendication 1, caractérisé en ce que le tissu de la zone épithalamo-épiphysaire du cerveau des animaux est traité par un solvant organique à une température ne-dé- passant pas 5 C, puis le solvant organique est éliminé, le tissu traité est broyé et, à partir du tissu broyé, on extrait le complexe de polypeptides par une solution aqueuse à 1 - 10 % d'acide acétique en présence de chlo- rure de zinc à raison de 0,2 - 2,0 g par litre de solu- tion aqueuse d'acide acétique, le substratum obtenu est séparé en sédiment et en liquide surnageant, on précipi- te, à partir du liquide surnageant, le complexe de poly- peptides par un solvant organique à une température de O à -10 C, on élimine le sédiment du complexe de poly- peptides par lavage avec un solvant organique à une tem- pérature de O à -10 C, on le sèche à une température de à 20 C, on extrait par l'eau du sédiment séché le com- plexe de polypeptides hydrosolubles, puis on sépare le substratum en sédiment et en liquide surnageant, après quoi on stérilise par filtration le liquide surnageant et on le lyophilise. 3. Procédé selon la revendication 2, caracté- risé en ce que l'on réalise l'extraction par une solu- tion aqueuse à 1 - 10 % d'acide acétique pendant 48 à 72 heures dans des conditions de pH de 2,5 à 4,0 et de température de 15 à 25 C. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on effectue l'extraction par l'eau pendant 1 à 2 heures à une température de 15 à 25 C. 5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on utilise, à titre de solvant organique l'a- cétone, le chloroforme ou l'éthanol.