FR 2628441 A1 19890915 FR 8903176 A 19890310 La présente invention a pour objet une méthode de diagnostic d'une maladie maligne du sein et des kits destinés a la mise en oeuvre d'une telle méthode. En résultat d'études du mécanisme d'oncogénese du virus de la tumeur mammaire de la souris (VTMS), deux locis ont été identifiés dans le génome de la souris sous forme de sites dans lesquels l'intégration du VTMS a éte observée. Ces sites ont été appelés int-l (Nusse et Varmus, 1982) et int-2 (Peters et collaborateurs, 1983), et il a été montré ultérieurement qu'ils s'adaptent a des chromoso- mes de souris différents (Peters et collaborateurs, 1984; Nusse et collaborateurs, 1984). Les homologues humains de ces deux gènes ont été & présent isolés et ils s'adaptent également à des chromosomes humains différents (van't Veer et collaborateurs, 1984, et Casey et collaborateurs, 1986). -Il existe encore peu d'informations concernant l'importance de l'un ou l'autre de ces agents oncogènes, ou bien de ces deux agents, dans le développement du cancer du sein humain, bien que l'amplification de séquences int-2 ait été détectée dans un certain nombre de tumeurs humaines, comprenant des carcinomes du sein et des carcinomes squameux de la tête et du cou (Zhou et collaborateurs, 1988). Une étude de modifications concernant dif- férents agents oncogènes cellulaires connus, comprenant c- mvc et HER-2/neu, a été mentionnée dans un ensemble de carcinomes primaires du sein (Varley et collaborateurs, 1987). Des modifications concernant à la fois c-myc et HER- 2/neu ont été observées respectivement dans 22% et 19% de carcinomes du sein (Varley et collaborateurs, 1987). Il a été montré que ces modifications sont-en corrélation avec un pronostic défavorable a court terme et que plus de 36% des échantillons présentaient une modification concernant un ou plusieurs agents oncogènes cellulaires. La présente invention résulte de l'enquête de la Demanderesse effectuée sur les carcinomes du sein en ce qui concerne des modifica- tions d'agents oncogènes cellulaires, et résulte en particulier des recherches de la Demanderesse concernant l'organisation génomique de int2 dans le même ensemble de tumeurs. La présente invention est basée sur la découverte qu'il existe une corrélation entre la présence d'une maladie maligne du sein et la perte apparente d'un site EcoRI dans l'agent oncogène humain int-2. Ainsi, conformément à une caractéristique de la présente invention, il est proposé une méthode de diagnos- tic d'une maladie maligne du sein qui consiste à détecter, dans un échantillon, la présence ou l'absence du site EcoRI de diagnostic (tel qu'il est défini dans la présente invention) dans l'agent oncogène humain int-2. La figure 4 du présent mémoire représente une carte de restriction du gène int-2 humain, telle qu'elle a été déterminée par G. Casey et collaborateurs et publiee dans Molecular and Cellular Biology, février 1986, 6, page 502-510. Les sites de clivage pour les enzymes de restric- tion suivants: B=BamHI; Bg: Bgl II; E=EcoRI, et H=HindIII K=KDnI; P=PstI; S=SacI et X=XbaI sont identifiés sur la figure 4 et le site EcoRI de diagnostic précité est défini comme étant le site EcoRI marqué avec un astérisque sur la figure 4. La carte de restriction est constituée d'un fragment de 25 kb d'ADN humain et est un composite à base de trois clones d'ADN recombinant indépendants. Grossièrement, il s'agit d'une représentation fidèle de la région int-2 humaine, telle qu'elle existe chez 15 individus distincts. La figure 4 représente également une série de fragments de restriction particuliers qui servent de sondes de séquences remar- quables pour le locus int-2 humain, ces fragments étant: un fragment SacISacI de 1,5 kb désigné sous le nom de SS3, un fragment BamHI-KpnI de 1,9 kb désigné sous le nom de BK4, un fragment BamHI-EcoRI de 1,4 kb désigné sous le nom de BEI et un fragment SacI-HindIII de 2,9 kb désigné sous le nom de SHI. La présence ou l'absence du site EcoRI de diagnostic (tel qu'il a été défini précédemment) peut être déterminée par n'importe quelle technique connue, telle que l'utilisation d'une sonde marquée appropriée, par exemple le fragment SacI-SacI de 0,9 kb désigné sous le nom de SS6, tel qu'il est décrit ci-après. La découverte qu'il existe une corrélation entre la présence d'une maladie maligne du sein et la perte apparente du site EcoRI de diagnostic dans l'agent oncogène humain int-2 offre une méthode moins ambiguë de diagnostic d'une maladie maligne du sein et permet ainsi l'utilisation d'un kit de diagnostic comprenant des moyens de détection de la présence ou de l'absence du site EcoRI de diagnostic (tel qu'il a été défini précédemment) dans l'agent oncogène humain int-2. Il est avantageux d'incorporer au kit de diagnostic des moyens de détection de la présence ou de l'absence d'une ou plusieurs mutations chez d'autres agents oncogènes dont on sait qu'ils sont modifiés en conséquence dans une maladie maligne du sein. Ces autres agents oncogènes comprennent, par exemple c-myc, ras et/ou HER- 2/neu. L'analyse initiale d'échantillons d'ADN tumoral a fait intervenir le sondage d'ADN génomique, digéré par BamHI, au moyen de la sonde SS6. Comme la figure 1 permet de le constater, cette sonde détecte un polymorphisme de longueur de fragment de restriction (PLFR) d'un site BamHI (Casey et collaborateurs, 1986). L'absence de ce site a pour résultat un fragment BamHI de 8,4-kb et la présence du site a pour résultat deux fragments BamHI hybridants de 5,6 et 2,8 kb. La fréquence de ces deux allèles a été examinée dans un ADN obtenu à partir de 31 échantillons de car- cinome primaire du sein et s'est révélée être égale a 0,66 pour l'allèle de 8,4 kb et à 0,34 pour l'allèle de 5,6/2,8 kb. Ces valeurs sont similaires aux fréquences qui peuvent être calculées à partir des résultats donnés par Casey et collaborateurs (1986), dans lesquels des fréquences alléliques de 0,5/0,5 sont obtenues par analyse de trois lignées cellulaires de carcinome du sein et 9 tumeurs primaires du sein, et par Zhou et collaborateurs (1988), dans lesquelles des fréquences alléliques de 0,77/0,23 sont obtenues à partir d'une étude de 46 carcinomes primaires du sein. Le nombre d'échantillons disponibles est encore trop limité pour parvenir à des conclusions définitives concernant une relation possible entre la fréquence allélique et l'état de la tumeur, et une analyse supplémen- taire d'un nombre plus important d'individus normaux serait particulièrement appropriée. L'amplification de séquences int-2 a été observée dans 1'ADN obtenue auprès de neuf des quarante échantillons de carcinome primaire du sein (tableau 1). Les taux d'amplification allaient de moins de 2 fois à plus de fois. L'analyse de l'ADN digéré par BamHI a permis l'identification de l'allèle amplifié (tableau 1), mais il ne se révèle pas que chaque allele soit amplifié préféren- tiellement. Les taux d'amplification ont été confirmés par analyse de l'ADN, digéré par EcoRI, hybride avec les sondes BB4 et SS6. Ces dernières expériences confirment également que la totalité des trois exons est impliquée dans chaque tumeur lorsqu'une amplification est détectée. L'ADN dérivé de lymphocytes ou de placentas provenant d'un total de 27 individus normaux a été examiné en ce qui concerne l'amplification des séquences int-2, et aucune amplifica- tion n'a été observée. De plus, aucune amplification n'a été observée dans de l'ADN provenant de n'importe lequel des échantillons bénins (un total de 13 échantillons) pas plus que d'échantillons provenant d'un fibrosarcome. Ces résultats indiquent qu'une amplification de l'agent oncogène int-2 se produit seulement dans des cellules tumorales et non dans des cellules normales ou bénignes, ce qui s'est révélé être le cas pour d'autres agents on- cogènes, comprenant des gènes de la catégorie mvc et HER- 2/neu (Escot et collaborateurs, 1986; Slamon et col- laborateurs, 1987; Varley et collaborateurs, 1987). Une comparaison supplémentaire de schémas d'hybridation de la sonde SS6 à de l'ADN digéré par EcoRI, provenant de biopsies tumorales et de tissus normaux, a révélé la présence d'une bande d'hybridation supplémentaire de haut poids moléculaire dans certains échantillons d'ADN tumoral (figure 2) . Une telle bande supplémentaire n'a pas été observée dans n'importe lequel des échantillons-témoins normaux, ni dans n'importe lequel des échantillons bénins. Une bande supplémentaire d'hybridation était présente dans neuf tumeurs et a semblé présenter des dimensions très similaires dans chaque cas bien que, lorsque le fragment était très grand, une détermination précise des dimensions était difficile. Afin de déterminer si ces bandes sup- plémentaires représentaient des séquences int-2 ayant subi un réarrangement, tel qu'une translocation, une délétion ou une insertion, ou spécifiquement une modification du site EcoRI, l'ADN provenant d'une tumeur avec une bande EcoRi supplémentaire a été analysé en détail et a été comparé à un échantillon d'ADN normal. La figure 2 représente certains résultats classiques obtenus par cette analyse et démontre que la modification concerne seulement le site EcoRI, tous les autres fragments de restriction ayant les dimensions escomptées, sans aucune bande supplémentaire d'hybridation visible même sur une autoradiographie surexposée. Pour mieux localiser la modification, des ADN tumoraux avec une bande EcoRI supplémentaire ont été digérés avec EcoRI plus BamHI ou bien avec EcoRI plus HindIII. Comme la carte de la figure 1 permet de le constater, une modification au niveau du site EcoRI à l'extrémité 5' du gène a pour résultat un fragment supplémentaire lorsque le fragment SS6 est utilisé pour le sondage d'ADN digéré par EcoRI-hamHI, mais non lorsque le fragment BB4 est utilisé. Cependant, une modification au niveau du site EcoRI en position 3' a pour résultat une bande supplémentaire seulement -lorsque le fragment BB4 est utilisé pour le sondage de l'ADN digéré par EcoRI-HindIII. L'analyse de sept des neuf tumeurs avec un fragment EcoRI supplémentaire de haut poids moléculaire a montré que, dans chaque cas, la modification ne concernait pas le site en position 5' (voir figure 3). Parmi les neuf tumeurs présentant un taux démontrable d'amplification de int-2, sept possédaient également une modification au niveau du site EcoRI 5'. Dans seulement un cas, il existait une amplification quelconque du fragment EcoRI nouveau de haut poids moléculaire. Dans d'autres cas, l'intensité de la bande supplémentaire indiquait que les séquences qu'elle représentait étaient' présentes à une teneur normale. Dans certains cas, la bande supplémentaire d'hybridation était très faible, une observation qui peut être expliquée par l'hétérogénéité à l'intérieur de la tumeur, seule une partie des cellules à l'intérieur de la tumeur possédant les séquences modifiées. Une analyse supplémentaire des échantillons d'ADN tumoral digérés par EcoRI-BamHI, sondés avec SS6, a démontré que, dans chaque cas o le patient était hétérozy- gote pour le site BamHI polymorphe et il était en consé- quence possible de différencier les deux allèles, l'allèle qui était amplifié était présent sur le même chromosome que le gène int-2 avec le site EcoRI modifié (voir figure 3). Cependant, de la manière décrite ci-dessus, les séquences avec le fragment EcoRI modifié n'étaient pas toujours amplifiées, conduisant à se poser certaines questions mécanistiques embarrassantes. La corrélation entre la perte du site EcoRI en position 5' et l'amplification est hautement significative (p Varley et collaborateurs, 1987), il y avait une modifica- tion touchant à la fois int-2 et HER-2/neu et l'ADN tumoral de ce patient.possédait également un gène c-myc amplifié. Dans l'ADN isolé d'une métastase de ganglions lymphatiques provenant de ce patient, une amplification du gène int-2 a été détectée mais il n'existait aucun fragment EcoRI supplémentaire. La comparaison des résultats présentés ici avec l'analyse précédente de la Demanderesse de modifications portant sur c-myc et HER-2/neu amène la proportion de patients ayant une modification concernant un ou plusieurs de ces agents oncogènes cellulaires a 54%. A titre de contrôle du nombre de copies du chromosome 11 dans des cellules tumorales lorsqu'une amplification de int-2 a été détectée, on a utilisé initialement une sonde pMS51 fournie par le Dr A. J. Jeffreys. Il a été montré que cette sonde s'appliquait au chromosome lq13 (N J Royle et A J Jeffreys, observations non publiées), au même emplacement chromosomique que int-2 (Casey et collaborateurs, 1986) et le récepteur de la progestérone (Law et collaborateurs, 1987). Deux des neuf échantillons présentant une amplification des séquences int-2 présentaient également une amplification des séquences pMS51 (échantillons 328 et 357, voir tableau 1). Les taux d'amplification des séquences int-2 et pMS51 se sont révélés être similaires a ceux de deux échantillons d'ADN tumoral, indiquant une amplification conjointe des deux séquences. Dans les sept échantillons restants dans lesquels une amplification des séquences into2 a été détectée, les taux de séquences pMS51 étaient normaux. A titre de contrôle supplémentaire des échantillons présentant une amplification conjointe de int- 2 et pMS51, les filtres ont été réhybridés avec une sonde spécifique de la P-globine. Ce gène est situé sur le chromosone 11p15.5. Dans les deux échantillons, lorsqu'une amplification de int-2 et pMS51 a été détectée, les taux de P-globine étaient normaux, démontrant que l'amplification était réelle et ne traduisait pas une grossière anomalie numérique du caryotype et des copies multiples du chromo- some Il. Dans la description de l'invention, les résultats d'une étude de l'organisation de l'agent oncogène int-2 dans un ensemble de tissus normaux, dans des affections bénignes du sein et dans le carcinome du poumon, sont décrits. Les seules modifications constatées concer- nant la séquence int-2 se sont produites dans de 1'ADN isolé du tissu tumoral de patients présentant un carcinome primaire du sein et dans des métastases des ganglions lymphatiques provenant de ces tumeurs (voir figure lB). 1l n'a pas été détecté une modification quelconque des sequences int-2 dans l'ADN provenant de tissus normaux de patients sains (n = 27), ni dans l'ADN isolé de lésions bénignes du sein (n = 13). Il a été détecté une amplification des séquences int-2 de l'ADN provenant de neuf carcinomes primaires du sein (tableau 1). Des métastases de ganglions lymphatiques de trois de ces carcinomes étaient disponibles et, dans chaque cas, une amplification a été également détectée dans le tissu métastatique. Le pourcentage d'échantillons d'ADN tumoral avec des séquences int-2 amplifiées est égal à 23%, ce qui est une valeur similaire à celle trouvée pour l'amplification de c-myc ou HER-2/neu dans le même ensemble d'ADN tumoraux (respectivement 19,5% et 19%, Varley et collaborateurs, 1987). Ces dernières valeurs sont également similaires à celles mentionnées par d'autres groupes pour l'amplification de c-myc (Escot et collaborateurs, 1986) et de HER-2/neu (Slamon et col- laborateurs, 1987; van der Vijver et collaborateurs, 1987). Zhou et collaborateurs (1988) ont indiqué que, dans une étude de 46 carcinomes primaires du sein, int-2 était amplifié dans quatre cas (9%), bien que Casey et col- laborateurs (1986) n'aient trouvé aucune amplification dans trois lignées de cellules mammaires et neuf tumeurs primaires. Cependant, Casey et collaborateurs (1986) n'indiquent pas la possibilité que leurs méthodes n'aient pas détecté un faible taux d'amplification (2-3 fois). En conséquence, il semble que l'amplification de séquences - int-2 se révèle être aussi fréquente dans le carcinome du sein que celle de c-mvc ou HER2/neu, ce qui augmente l'ensemble d'agents oncogènes déjà connus comme étant conséquemment modifiés dans ces tumeurs. Dans l'enquête de la Demanderesse effectuée sur 41 carcinomes du sein, il a été identifié à ce jour une modification portant sur un agent oncogène cellulaire connu dans 54% des échantillons (Varley et collaborateurs, 1987, et la présente étude). On a analysé les résultats disponibles sur les trois agents oncogènes cellulaires qui ont été examinés jusqu'ici pour voir si une modification concernant int-2 était corrélée à une modification de c-myc ou HER-2/neu. Il n'existait aucune corrélation notable entre des modifica- tions concernant c-myc et int-2 (p>0,1), mais il existait une corrélation négative hautement significative entre une amplification de HER-2/neu et une amplification de int-2 (p croissance épidermique (SCE) humain (Schocter et col- laborateurs, 1984; Coussens et collaborateurs, 1980; King et collaborateurs, 1985; Semba et collaborateurs, 1985) et il a été montré qu'il code pour un domaine tyrosine-kinase et un domaine extracellulaire qui peut jouer un rôle dans la liaison d'un ligand encore non identifié (Stern et collaborateurs, 1986). Un degré important d'homologie a été trouvé entre int-2 et les facteurs de croissance des fibroblastes acide et basique (aFCF et bFCF, Dickson et Peters, 1987) et, plus récemment, cette homologie a été étendue au gêne transformant hst (Yoshida et collaborateurs, 1987). En conséquence, le gène int-2 semble susceptible de coder pour une protéine qui est un membre d'une famille de facteurs de croissance qui jouent le rôle de mitogènes pour des types cellulaires très divers. L'observation que les FCF sont de puissants mitogènes pour les cellules endothéliales vasculaires, qu'ils peuvent ainsi jouer le rôle de facteurs angiogéniques, est particulièrement intéressante. Cette propriété peut être particulièrement importante si les gènes codant pour ces facteurs sont réarrangés ou sur- exprimés dans des cellules tumorales. Il est également intéressant de noter que les FCF (et peut être des facteurs de croissance apparentés) peuvent stimuler les myofibro- blastes, qui sont des cellules courantes du stroma dans certains types de cancer du sein, et qui sont apparentés à la réaction desmoplastique observée fréquemment dans les tumeurs du sein (Schurch et collaborateurs, 1981; Tamaimi et Ahmned, 1987). Une telle réaction desmoplastique, lorsqu'il existe un développement excessif de constituants du tissu conjonctif, peut en fait faciliter l'isolement de la tumeur et inhiber sa propagation. L'observation effectuée par la Demanderesse concernant la présence d'une corrélation négative hautement significative entre une amplification de HER-2/neu et une modification au niveau des séquences int-2 génomiques peut indiquer que les produits de ces deux gènes interagissent d'une certaine manière in vivo. Cependant, il est considéré comme étant improbable que les produits des deux gènes - représentent une paire facteur de croissance-récepteur car, si cela était le cas, il faudrait s'attendre a une corrélation similaire entre un pronostic défavorable et une modification de l'un ou l'autre gène, ce qui n'est nettement pas le cas. Les récepteurs pour bFCF, aFCF ou int-2 n'ont pas été encore identifiés. Hudziak et collaborateurs (1987) ont montré que la sur-expression du gène HER-2/neu en l'absence de toute modification génétique peut provoquer une transformation des cellules NIH 3T3 et qu'il existe certainement une sur-- expression de HER-2/neu dans les carcinomes du sein dans lesquels il existe une amplification des séquences génomiques (par exemple Venter et collaborateurs, 1987). On n'a pas encore étudié l'expression de int-2 dans n'importe laquelle des tumeurs indiquées dans le mémoire lorsque les quantités d'ARN extraites de tumeurs primaires sont faibles et, à ce jour, il n'existe aucun rapport décrivant l'identification de produits de transcription int-2 dans une quelconque matière d'origine humaine. Il semble vraisemblable que les taux de produits de transcription dans des tumeurs humaines du sein sont faibles, comme dans les cellules de souris dans lesquelles l'intégration du VTMS s'est effectuée en position adjacente à int-2, les produits de transcription étant encore présents à moins de copies par cellule (Dickson et collaborateurs, 1984). Il est peut être nécessaire que la protéine int-2 soit exprimée seulement à des teneurs très faibles afin de manifester des effets phénotypes. La corrélation négative entre des modifications génétiques portant sur int-2 et HER-2/neu peut être un indice tentant concernant le mécanisme d'action de ces deux produits de gènes. Dans sept des neuf exemples o on a détecté une amplification de int-2, on a également détecté un fragment EcoRI supplémentaire de haut poids moléculaire qui s'est hybride à des sondes spécifiques de int-2. En outre, on a détecté le fragment EcoRI hybridant supplémentaire dans deux échantillons d'ADN de carcinome dans lesquels il a été impossible de détecter une quelconque amplification. La présence de ce fragment supplémentaire ne correspond pas à une séquence grossièrement réarrangée (telle que par translocation, insertion et délétion) car les fragments escomptés ont été seulement obtenus lorsqu'une gamme d'autres enzymes de restriction était utilisée pour digérer l'ADN afin d'effectuer une analyse par la méthode de Southern. L'analyse d'ADN provenant de métastases de ganglions lymphatiques a montré que, dans deux cas, la bande supplémentaire était également détectable dans l'ADN provenant du ganglion lymphatique concerné mais, dans le troisième cas, malgré la détection d'une amplification à la fois dans la tumeur primaire et le ganglion lymphatique, il n'y avait aucun fragment EcoRI supplémentaire dans l'ADN provenant du ganglion lymphatique. Il a été montré, par une analyse histologique, que la matière du ganglion lymphati- que utilisé dans cette étude était remplacée en grande partie par des cellules tumorales. Une très forte corrélation a été trouvée en présence de la bande EcoRI hybridante supplémentaire et l'amplification des séquences int-2 (p possibles pour la production de la bande EcoRI supplémen- taire. Le premier mécanisme peut faire intervenir une modification génétique, telle qu'une mutation ponctuelle, ou une très petite insertion ou délétion à l'intérieur du site EcoRI conduisant à une perte de la séquence de reconnaissance. Le second mécanisme peut être épigénétique et peut indiquer que la structure chromosomique du gène dans cette région seulement a été modifiée de telle manière que l'ADN est inaccessible à l'endonucléase de restriction. La première explication est préférée pour plusieurs raisons. Toutd'abord, l'intensité de la bande hybridante supplémentaire est constante d'un gel à l'autre et n'est pas modifiée par une incubation prolongée avec un large excès d'enzyme. Deuxièmement, l'intensité de la bande est, dans tous les cas sauf un, approximativement égale à l'intensité normale, indépendamment du degré d'amplifica- tion du même allèle. Dans le cas exceptionnel, le fragment EcoRI modifié est présent à un taux amplifié. La Demanderesse se livre conjointement au clonage de séquences d'ADN comprenant le site EcoRI modifié, provenant de deux échantillons de carcinome du sein. L'analyse de la séquence de ces régions et la comparaison des résultats obtenus aux séquences génomiques normales permettra de résoudre la question d'un effet génétique par rapport à un effet épigénétique. Quel que soit le mécanisme engendrant le fragment EcoRI supplémen- taire, la corrélation entre sa présence et l'amplification du gène existe. Cette corrélation suggère fortement une relation de causalité entre les deux caractéristiques, mais la relation précise reste à élucider. Le site EcoRI se trouve dans le premier intron du gène int-2 humain (Casey, résultats non publiés) et, en conséquence, n'est pas considéré comme modifiant la structure de la protéine int- 2. Il est plus vraisemblable que l'expression du gène peut être modulée d'une certaine manière. A titre de contrôle du nombre de copies chromosomiques dans des cellules tumorales offrant une preuve de la présence de séquences int-2 amplifiées, on a initialement soumis les échantillons d'ADN à un resondage avec une sonde hypervariable spécifique du locus, obtenue auprès du Dr A. J. Jeffreys. De manière inattendue, deux des neuf échantillons offrant une preuve de l'amplification de séquences int-2 (328. et 357, voir tableau 1) montraient également un taux identique d'ampli- fication de la sonde spécifique du locus. Les deux sondes s'adaptent à la même bande chromosomique (11q13) et une hybridation ultérieure avec une sonde f-globine (11p15.5) a montré que l'amplification était authentique et ne traduisait pas simplement la présence de multiples copies du même chromosone. L'importance de la co-amplification n'est pas connue, mais il est possible que les deux éléments soient relativement proches l'un de l'autre et l'importance de pMS51 comme marqueur génétique peut mériter de faire l'objet de recherches. MATERIELS ET METHODES Analyse des tumeurs et de l'ADN Tous les procédés de préparation d'ADN à partir de biopsies de tumeurs du sein ont été décrits en détail par Varley et collaborateurs (1987). L'ADN a éeté préparé à partir de 40 tumeurs primaires du sein, des métastases de ganglions lymphatiques provenant de 10 de ces tumeurs, 8 cas de maladie fibrocystique bénigne du sein, 5 échantil- lons de fibro-adénomes et un fibrosarcome, de la maniere décrite précédemment (Varley et collaborateurs, 1987). La numérotation des échantillons dans cette communication est identique à celle donnée par Varley et collaborateurs (1987). En outre, de l'ADN a été préparé à partir de 27 tissus normaux, comprenant des lymphocytes provenant de 10 volontaires normaux et à partir d'une matière placentaire obtenue à partir de 17 foetus sains normaux. Une analyse par transfert de Southern, uneautoradiographie et une densitométrie par balayage laser de tous les échantillons ont été également effectuées de la manière décrite par Varley et collaborateurs (1987). Sondes Des transferts par la méthode de Southern de produits de digestion par une endonucléase de restriction de tous les échantillons ont été sondés en utilisant l'une des deux sondes spécifiques du locus int-2 humain. L'une de ces deux sondes, appelée SS6, est décrite par Casey et collaborateurs (1986), l'autre, appelée BB4, correspond à une région située vers l'extrémité 3' du gène (voir figure 1) . La sonde spécifique du locus, appelée pMS51, a été aimablement fournie par le Dr A. J. Jeffreys et s'est révélée s'adapter au chromosome humain lq13 (N. J. Royle et A. J. Jeffreys, résultats non publiés). Comme sonde pour la détection des séquences de P-globine (adaptation au chromosome lp15.5), un fragment d'ADN correspondant au gène 6-globine a ete isolé du plasmide pTKH68 -G-4 (Spandidos et Paul 1982). REFERENCES Casey, G., Smith, R., McGillivray, D., Peters, G. et Dickson, C. (1986). Mol. Cell. Biol., 6, 502-510. Coussens, L., Yang Feng, T.L., Liao, Y.C. et 9 autres auteurs (198_ Science, 230, 1132-1139. Dickson, C. et Peters, G. (1987) Nature, 326, 833. Dickson, C., Smith, R., Brookes, S. et Peters, G. (1984). Cell, 37, 529-536. Escot, C., Theillet, C., Lidereau, R., Spyratos, P., Champeme, M, H., Gest, L. et Callahan, R. (1986). Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 83, 4834-4838. Hudziak, R.M., Schlessinger, J. et Ullrich, A. (1987). Proc, Natl. Acad. Sci. USA., 84, 7159-7163. King, C.R., Kraus, M.H. et Aaronson, S.A. (1983) Science, 229, 974- 976. 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TABLEAU 1 Détails concernant les échantillons de carcinomes du sein dans lesquels une amplification de int-2 ou bien un fragment EcoRI modifié, a été détecté. N' d'échan- Fragmnts Fragment Taux d'am- Fragent EgRI tillonl Bamri détectés _BauI plification2 supplémentai- par SS6 amplifié re 328 8,4 8,4 20x OUI 349 8,4 8,4 lox OuI 357 8,4, 5,6, 2,8 5,6, 2,8 7x oui 377 N.E. N.E. 383 8,4, 5,6, 2,8 AUCUIN AUCIN OUI 390 8,4 AUICN AUCUN CoUI Notes concernant le tableau 1. 1 La numérotation des échantillons correspond à celle donnée par Varley et collaborateurs (1987), qui donnent tous les détails concernant les patients. 2 Les taux d'amplification ont été déterminés par densitométrie par balayage laser d'auto- radiographies d'ADN digéré à la fois par BamHI et EcoRI, sondé avec SS6. N.E., non effectué. LEGENDES DES FIGURES Figure 1 A) Carte de restriction limitée, modifiée a partir de celle de Casey et collaborateurs (1986), montrant les sites de restriction intéressants autour du locus int-2 humain, et indiquant l'origine des sondes utilisées dans cette étude. B, BamHI; E, EcoRI; et H, HindIII. Le site BamHI marqué d'un astérisque est polymorphe et, lorsqu'il est présent, la sonde SS6. (marquée sous la carte) détecte des fragments de 5, 6 et 2,8 kb. Lorsque le site BamHI est absent, la sonde SS6 détecte seulement un allèle de 8,4 kb. B) Analyse par transfert suivant la méthode de Southern de l'ADN isolé de carcinomes primaires du sein (voies A, B et C) et de métastases de ganglions lymphati- ques obtenues à partir de ces tumeurs (voies A', B' et C'). Tous les échantillons d'ADN ont été digérés avec BamHI et hybridés à la sonde SS6. L'ADN dans les voies A, A', B et B' montrent une hybridation de la sonde seulement à un allèle de 8,4 kb, révélant que les deux patients sont homozygotes pour le PLFR BamHI de 8,4 kb. Les voies C et C' montrent que le patient est hétérozygote pour le PLFR BamHI et qu'il existe une hybridation à des bandes de 8,4, 5,6 et 2,8 kb. Les voies A et A' sont obtenues à partir d'un patient ne présentant aucun signe d'amplification des séquences int-2, et en conséquence, représentent le cas normal. Dans les voies B et B', ainsi que dans les voies C et C', une amplification nette des séquences int-2 peut être constatée. Dans les voies C et C', l'amplification concerne le PLFR BamHI 5,6/2,8 kb, l'allèle de 8,4 kb étant présent à la teneur normale. Il faut noter que la sonde SS6 ne s'hybride pas efficacement au fragment de 5,6 kb, la région d'homologie entre cette sonde et le fragment de ,8 kb étant petite (voir figure 1A). Ficure 2 Analyse par transfert suivant la méthode de Southern comparant l'ADN provenant d'un carcinome primaire du sein comprenant des séquences int-2 amplifiées (voies 1, 3, 5, 7 et 9) à l'ADN normal isolé d'un placenta (voies 2, 4, 6, 8 et 10). Le transfert a été sondé avec SS6 (voir figure 1A) et les échantillons ont été digérés avec EcoRI (voies 1 et 2), BoqlII (voies 3 et 4), HindIII (voies 5 et 6), KpnI (voies 7 et 8) et XbaI (voies 9 et 10). Les dimensions des bandes s'hybridant à la sonde SS6 sont identiques dans chaque cas, sauf en ce qui concerne l'hybridation de SS6 à une bande de haut poids moléculaire dans l'ADN de. carcinome digéré par EcoRI, qui n'a pas été observée dans l'ADN provenant du témoin normal. Les dimensions sont exprimées en kb. Ficure 3 Analyse par transfert suivant la méthode de Southern d'échantillons d'ADN provenant de cinq carcinomes primaires du sein, digérés avec BamHI et EcoRI et sondés avec SS6. Les bandes à 6,9, 5,6 et 1,3 kb (petites flèches) sont considérées comme provenant de l'analyse du PLFR BamiHI présent dans chaque cas. Des bandes hybridantes supplémen- taires peuvent être observées dans chaque échantillon à 8,4 kb ou à 2,8 kb (grandes flèches) et représentent une perte du site EcoRI immédialement en position 5' du BamHI polymorphe (voir figure 1A). Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Méthode de diagnostic d'une maladie maligne du sein, caractérisée en ce qu'elle consiste & détecter dans un échantillon la présence ou l'absence du site EcoRI de diagnostic (tel qu'il est défini dans la présente invention) dans le site int-2 oncogène humain. 2. Kit de diagnostic, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens de détection de la présence ou de l'absence du site EcoRI de diagnostic (tel qu'il est défini dans la présente invention) dans le site int-2 oncogène humain.