FR 2635334 A1 19900216 FR 8810789 A 19880810 La présente invention a pour objet un procédé amélioré pour la production d'acide lactique par fermentation d'hydrates de carbone au moyen de microorganismes. Elle concerne plus particulièrement un procédé microbiologique par conversion de sucres dérivés de l'amidon. La synthèse d'acides organiques par fermentation de sucres en présence d'un microorganisme approprié est universellement connue. Des acides typiques de telles fermentations microbiennes comprennent notamment l'acide acétique, l'acide lactique, l'acide citrique, les acides gluconique et 2-cétogluconique, l'acide fumarique, l'acide itacbnique. Ces acides sont utiles dans les industries agroalimen- taires, pharmaceutiques, chimiques et autres. Des procédés de prépa- ration sont decrits par exemple dans l'ouvrage "Chemicals by fermen- tation" S.J. Gutcho-Noyes Data Corporation 1973. Dans les fermentations industrielles, le choix du substrat hydrocarboné est basé à la fois sur sa disponibilité, sur son coût et sur son aptitude a permettre des productivités élevées. L'amidon a souvent été préconisé comme source de carbone bon marché. Cependant, tous les microorganismes ne sont pas capables de métaboliser l'amidon alors que la majorité d'entre eux métabolisent le dextrose. En conséquence, l'amidon doit être hydrolysé/saccharifié avant la fermentation. I1 en résulte un coût de production accru. La présente invention a pour but principal de proposer un procédé de fermentation économique utilisant l'amidon comme source de carbone nutritive et ayant une productivité au moins égale a celle obtenue avec le glucose ou les hydrolysats d'amidon riches en glu- cose. Il a été trouvé que l'acide lactique pouvait être synthétisé en effectuant la fermentation au moyen du microorganisme produ-teur simultanément à l'hydrolyse enzymatique de l'amidon. Outre le gain de temps résultant de la suppression de l'étape préalable de sacchari- fication de l'amidon, la vitesse de production de l'acide, de manière inattendue, n'est pas affectée comparativement à l'emploi d'un substrat de glucose, même si les conditions de la fermentation (pH et - température) sont éloignées des conditions optimales d'activité de l'enzyme hydrolysante. Selon l'invention, le procédé de production d'acide lactique par fermentation à l'aide de mircoorganismes d'un milieu nutritif aqueux contenant de l'amidon comme source de carbone assimilable est carac- térisé en ce que la fermentation est conduite en présence addition- nelle d'au moins une enzyme amylolytique saccharifiante. L'amidon utilisé comme source de carbone selon l'invention peut être n'importe quel amidon de céréales comme l'amidon de blé, de maïs, de sorgho, de riz, de tapioca, de seigle, d'avoine ou un amidon de tubercules comme l'amidon de pomme de terre. L'amidon peut être mis en oeuvre sous forme brute, liquéfié ou partiellement saccha- rifié. Le terme "amidon" inclut selon la présente description l'amidon brut en dispersion aqueuse et les hydrolysats d'amidon résultant de l'hydrolyse incomplète de l'amidon comme l'amidon fluidifié (liquifié), les sirops d'amidon et les hydrolysats riches en dex- trose. Les hydrolysats d'amidon diffèrent entre eux par leur degré d'hydrolyse, exprimé en équivalent dextrose D.E. et leur contenu en oligosaccharides et polysaccharides plus élevés. Les amidons fluidi- fiés présentent un D.E. compris entre environ 3 et 20 et renferment généralement 50 à 95 % de polysaccharides, de degré de fermentation supérieur à G 7 (7 unités glucose). Les sirops d'amidon ou sirops de glucose de faible équivalent dextrose présentent un D.E. allant de environ 20 à 68 avec 10 à 50 % de polysaccharides supérieurs & G 7. Les hydrolysats d'amidon ou sirops riches en dextrose ont un D.E. pouvant atteindre 90-98 %. La préparation des hydrolysats d'amidon est bien connu dans la technique. Conventionnellement, les amidons fluidifiés et les sirops d'amidon sont obtenus par hydrolyse acide et/ou enzymatique au moyen d'une " amylase de liquéfaction, éventuel- lement suivie d'une g amylase. Pour les hydrolysats riches en glucose, l'amidon est le plus souvent transformé selon un procédé en 2 étapes, par action d'une " amylase de liquéfaction puis par action d'une enzyme de saccharification comme la glucoamylase, connue aussi sous le nom d'amyloglucosidase. Dans la pratique du procédé selon l'invention on utilisera de préférence un sirop d'amidon et encore plus préférentiellement un amidon fluidifié. L'emploi des hydrolysats riches en glucose n'est pas intéressant du point de vue économique étant donné qu'il implique une saccharification préalable qui est une étape longue, même dans les conditions d'activité maximales de l'amyloglucosidase qui se situent à une température supérieure à 50 C et à pH de 4,5-5. L'amidon et ses produits d'hydrolyse peuvent être employés directement dans le procédé de l'invention sous forme non purifiée, après stérilisation. On peut bien entendu mettre en oeuvre des produits. commerciaux purifiés, concentrés ou déshydratés comme les maltodextrines. L'amidon est présent dans le milieu de fermentation en quantité nécessaire pour fournir environ 0,9 à 18 % en poids de glucose par rapport au milieu de fermentation. Exprimé en amidon brut, sur une base sèche, des quantités convenables peuvent être comprises entre 10 et 200 g/l, de préférence entre 60 et 160 g/i du milieu de fermen- tation. Les enzymes amylolytiques de saccharification que l'on ajoute selon le procéde de l'invention dahs le milieu de fermentation contenant le microorganisme producteur d'acide itaconique sont capables de transformer les dextrines de l'amidon en glucose et maltose. Comme enzymes de saccharification on peut citer les C amy- lases saccharifiantes comme l'ô amylase de Bacillus subtilis var. amylosaccharitiens, l'-. 'ylase fongique, les F amylases, la glucoamylase, l'isoamylase, la pullulanase. Ces enzymes peuvent être employées seules ou en mélange entre elles. On donne la préférence à la glucoamylase du fait de sa haute spécificité. La glucoamylase peut être toute glucoamylase fongique telle que celles appartenant aux genres Aspergillus, Endomyces ou RhizoDus. Dans le cas notamment o l'on utilise l'amidon brut comme source de carbone, il est encore possible d'employer un enzyme liquéfiante en addition à l'enzyme saccharifiante, par exemple un mélange î amylase liquéfiante - amylase ou e amylase liquéfiante - glucoamylase. Des préparations enzymatiques industrielles sont décrites dans l'ouvrage Encycl. of Pol. Sc. Vol 6, pp 46-53. L'enzyme amylolytique de saccharification, éventuellement de liquéfaction, est ajoutée dans le milieu de fermentation en quantité nécessaire pour effectuer la saccharification, respectivement la fluidification, de l'amidon. La quantité minimale utile est fonction de l'activité de l'enzyme, de la quantité et du D.E. de l'amidon présent dans le milieu et peut être déterminée facilement par l'homme de métier. De manière générale, on utilise des quantités suffisantes pour fournir 0,04 à 2 unités d'activité enzymatique, de préférence 0,1 à 1 unité, par gramme d'amidon (exprimé en matières sèches). A titre d'exemple d'enzyme saccharifiante, l'AMG 200 Ls, commercialisée par NOVO INDUSTRY et qui est une glucoamylase, peut être ajoutée en quantité de 0,02 à 1 %, de préférence entre 0,05 et 0,5 % en poids basé sur le poids de solides contenu dans l'amidon liquéfié présent dans le milieu de fermentation. N'importe quel microorganisme ayant la capacité de produire l'acide lactique D- ou L+ en présence de sucres peut être utilisé dans le procédé de l'invention. On peut notamment citer les bactéries appartenant au genre Lactobacillus telles que L. delbruckii, L. lactis, L. leichmanii, L. bulgaricus, L. jugurt, L. casei, L. ita- licus, L. plantarum; au genre Steptococcus telles que S. thermo- phylus, S. faecium; au genre Pedioccccus telle que P. pentosaceus, aux germes Bacillus et Sporolactobacillus et des champignons tels que Rhizopus orizae. En dehors de la source de carbone et de l'enzyme amylolytique utilisées selon l'invention, le milieu de production et les condi- tions de la fermentation peuvent être choisis parmi ceux décrits dans la littérature. Des milieux de production convenables sont décrits par exemple dans l'ouvrage Chemicals by fermentation déjà cité et dans de nombreux brevets, par exemple, US-A-3 125 494, FR-A-1 356 647, EP-A-69 291, EP-A-72 010, EP-A-113 215, US-A-4 564 594. La source d'azote peut notamment être choisie parmi les composés organiques et/ou minéraux métabolisables, tels que l'extrait soluble de maïs (CSL) et/ou de soja, l'urée, la levure de bière, les pepto- nes, les protéolysats de poisson, le sulfate d'ammonium, chlorure d'ammonium, phosphate d'ammonium, nitrate d'ammonium, etc... et leurs mélanges. Le milieu contieht en outre des sels minéraux tels que sulfates, chlorures, phosphates de Ca, Mg, Na, K, Fe, Ni, Co, Cu, Mn, Zn, ainsi que des vitamines d'autres additifs conventionnels tels que des agents de contrôle de pH et/ou des agents anti-moussants. Le microorganisme est introduit dans le milieu de fermentation de manière connue en soi à l'aide d'inoculums ou de cultures d'inter- médiaires. L'enzyme amylolytique est, de préférence, ajoutée dans le milieu stérile immédiatement avant inoculation. La fermentation est convena- blement réalisée à un pH pouvant aller de environ 3,0 à 8,0, de préférence de 5,0 à 7,0 et à une température d'environ 20 C à environ C, les conditions optimales dépendant de la souche particulière du microorganisme employé. Des pourcentages élevés d'acide lactique ont été obtenus en utilisant Lactobacillus lactis à un pH préférentiel- lement compris entre 5,5 et 6,0, la température étant maintenue à environ 35 à 45 C. L'agent neutralisant qui permet d'ajuster le milieu au pH convenable est choisi parmi les hydro:.,des ou carbonates alcalins, alcalino-terreux ou d'ammonium et peut être introduit avant inoculation ou à tout stade de la fermentation, en continu ou en discontinu. Apres achèvement de la fermentation, l'acide lactique produit peut être récupéré du moût et purifié selon les méthodes connues telles que filtration, concentration, cristallisation ou extraction par solvants. On comprendra que la description ci-dessus vise un procédé spécifique pour préparer de l'acide lactique par fermentation à l'aide de microorganismes d'un milieu contenant une source d'hydrate de carbone produite a partir d'amidon, en présence d'enzymes capables d'hydrolyser l'amidon ou ses produits de dégradation en mono- et disaccharides et que l'invention elle-même ne se limite pas à la composition précise du milieu de fermentation ni aux modes de réali- sation particuliers. Les exemples suivants illustrent l'invention. Exemple 1 a) PreDaration d'amidon brut fluidifié Dans un fermenteur de capacité utile 50 litres, on introduit 6,75 kg d'amidon de blé (Ets ROQUETTE). La mise en suspension est effectuée a l'eau potable sous agitation dans un volume total de 20 litres. Le pH de la suspension est ajusté à 6,5 par H2SO et l'on ajoute 3,65 ml d'une préparation enzymatique contenant une x amylase thermostable (TERMAMYL 120LS - NOVO Industry)). La suspension d'amidon est fluidifiée par injection de vapeur pendant 30 mn à C, puis refroidie à température ambiante. b) Fermentation Dans le fermenteur contenant l'amidon fluidifié, on introduit 1,750 kg d'eau de lavage de maïs concentrée (CSL), 0,270 kg de protéolysat de poisson, '25 ml d'acide phosphorique. Le mélange est dilué à l'eau potable à un volume de 27 litres. La solution est agitée, ajustée à pH 6,0 par NaOH et stérilisée par injection de vapeur pendant 1 h à 100 C. Dans un stérilisateur annexe, on dilue 4,2 kg de carbonate de calcium dans 13 1 d'eau potable. La solution est stérilisée sous agitation par injection de vapeur pendant lh30, refroidie et trans- férée stérilement dans le fermenteur. La température est ajustée à C. On ajoute 15,6 ml d'une-préparation enzymatique contenant une glucoamylase (AMS 200LG - NOVO Industry). Le milieu est ensemencé par 1,7 1 d'une culture de Lactobacillus lactis ATCC 12314 préalablement incubée dans un milieu MRS (Milieu de De Man, Rogosa et Sharpe - réf. 0881-01 de DIFCO). Le milieu de fermentation, ayant un volume final de 50 litres, est agité et incubé sous atmosphère d'azote stérile à C. La durée de la fermentation est de 45 heures. On obtient 123,3 g d'acide lactique D, soit une productivité de 2,74 g/I/h. Exemples 2 à 4 (comparatif) On réalise une série de fermentations de la manière décrite à l'exemple 1 b) à l'aide de la même culture de Lactobacillus lactis ATTC 12314 mais en l'absence de glucoamylase. La source de carbone est constituée de - 6,50 kg de glucose monohydraté (exemple 2) ou - 9,150 kg d'hydrolysat d'amidon (74968 commercialisé par les Ets ROQUETTE) ayant un contenu en matières sèches de 71% en poids et un DE d'approximativement 96-98 (exemple 3) ou - 6,75 kg d'amidon brut fluidifié dans les conditions décrites à l'exemple 1 (exemple 4} Dans chaque exemple, le volume final du milieu de fermentation est de 50 litres. La durée des fermentations et la productivité sont répertoriées dans le Tableau 1. Au cours de chacun des exemples 1 à 4, des échantillons de mot sont prélevés périodiquement pour détermination de la teneur en acide lactique par chromatographie liquide à haute performance. Les résul- tats sont représentés graphiquement sur la Figure 1 o les courbes 1 à 4 représentent la quantité Q d'acide lactique produit, exprimée en 3,'1 du milieu de fermentation, en fonction de l'âge en heures (h) de la fermentation, selon les exemples 1 à 4 respectivement. Exemples 5 et 6 On réalise deux fermentations dans les conditions décrites à l'exemple 1 à l'aide de la même culture, avec les différences sui- vantes: Exemple 5 Exemple 6 Amidon flidifié par C amylase 6,50 kg - 7,25 kg Glucoamylase 15,0 ml 16,7 ml CaCO, 4,0 kg 4,5 kg Les résultats sont répertoriés dans le Tableau 1. Ln Tableau 1 tr% %O ACIDE LACTIQUE D- SOURCE CARBONEE SOURCE AZOTEE AGENT ACIDE DUREE DE N . GLUCO- DE LACTIQUE DE LA PRODUC- ESSAIS GLUCOSE HYDROLYSAT AMIDON AMYLASE CSL PROTEOLYSAT SALIFI- PRODUIT FERMEN- TIVITE D'AMIDON (2) DE POISSON CATION TATION g/1 (1) g/1 g/1 ml/1 g/1 g/1 g/l (heures) g/l/h 1 135 0,312 35 5,4 CaCO, 123,3 45 2,74 Co 2 130 35 5,4 CaCOi 121 85 1,42 3 183 35 5,4 CaCOj 121,3 107 1,13 4 135 35 5,4 CaC03 91,5 65 1,40 130 0,30. 35 5,4 CaCOà 113 40 2, 82 6 145 0,337 35 5,4 CaCOj 134,6 60 2,24 (1) Contenu en glucose 71 % (2) CSL = "corn steep liquor" = eau de lavage de maïs concentrée Exemple 7 Production d'acide lactique L+ Dans un fermenteur contenant 7 kg d'amidon de blé fluidifié dans les conditions décrites à l'exemple 1, on ajoute 1, 750 kg d'eau de lavage de mais concentrée, 0,270 kg de protéolysat de poisson, 25 ml d'acide phosphorique. Le mélange est dilué à l'eau potable & un volume de 27 litres, agité, ajusté à pH 6,0 par NaOH et stérilisé par injection-de vapeur pendant 1 heure. On ajoute 16 litres d'une solution stérile aqueuse contenant 4,35 kg de carbonate de calcium. La température est ajustée à 40 C. Le milieu est additionné de 16,1 ml d'une préparation enzymatique contenant une glucoamylase (AMG 200L5 - NOVO Industry) et ensemencé par 1,7 litres d'une culture de Lactobacillus casei IFO 3425 préala- blement incubé dans un milieu MRS. Le milieu de fermentation (volume final 50 litres) est agité et incube sous atmosphère d'azote stérile a 40 C. La teneur en acide lactique L+ est déterminée périodiquement par méthode HPLC. Age de la fermentation 20 h 40 h 60 h 80 h 107 h Acide lactique L+ 21 g/l 47,5 g/1 66 g/1 98 g/l 120,2 g/l Exemples 8 à i1 Dans un fermenteur de capacité utile 50 litres, on introduit 6 kg d'amidon. La mise en suspension est effectuée à l'eau potable sous agitation dans un volume total de 27 litres. Le pH de la suspension d'amidon est ajusté a 6,5 par H2SO, et l'on ajoute au milieu, 3,25 ml d'une préparation enzymatique conte- nant une c amylase thermostable (TERMAMYL 120L - NOVO Industry). La suspension d'amidon est ensuite fluidifiée en chauffant par injection de vapeur pendant 30 mn à 100 C. La solution d'amidon fluidifié est refroidie, additionnée de 1,750 kg de corn steep liquide, 0,270 kg de protéolysat de poisson, ml d'acide phosphorique. Le volume est ajusté à 38 litres par de l'eau potable et le pH ajusté à 6,0 par NaOH. La solution ainsi obtenue est stérilisée par injection de vapeur pendant 1 h à 100 C. Le volume au terme de cette étape est, après refroidissement à 40 C, égal à 50 litres. Le milieu est additionné de 13,8 ml d'une préparation enzyma- tique contenant une gluco amylase (AMG 200LM - NOVO Industry) et ensemencé par 1,7 litre d'une culture préliminaire de Lactobacillus lactis ATCC 12 314 dans un milieu MRS convenablement incubé. La préparation est agitée et incubée à 40 C sous atmosphère d'azote stérile. Le pH est maintenu à 6,0 par addition automatique d'un agent de salification: NH3, NH-OH, NaOH ou KOH selon les exemples 8 à l respectivement. La teneur en acide lactique D- déterminée par méthode HPLC 'est la suivante Age de la fermentation: 25 h 50 h 75 h 85 h 90 h Acide lactique D (g/l): Exemple 8 (NHj) 39 76 98 101,8 102,3 Exemple 9 (NHOH) 35 71 91 93,5 94,5 Exemple 10 (NaOH) 30 68 87 89,9 - Exemple 11 (KOH) 31 7i 88 93,3 l1 Revendications 1. Procédé de production d'acide lactique par fermentation au moyen de microorganismes d'un milieu nutrifif aqueux contenant de l'amidon comme source de carbone assimilable caractérisé en ce que la fermentation est conduite en présence additionnelle d'au moins une enzyme amylolytique saccharifiante. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'amidon est mis en oeuvre sous forme liquéfiée ou partiellement saccharifiée. 3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'amidon est mis en oeuvre sous forme brute. 4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que le milieu de fermentation contient une enzyme de liquéfaction en addi- tion a l'enzyme saccharifiante. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l'amidon est présent en quantité nécessaire pour fournir 0,9 à 18 % en poids de glucose par rapport au milieu de fermentation. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que l'enzyme saccharifiante est choisie parmi les " amylases, les amylases, la glucoamylase, l'isoamylase, la pullulanase et leurs mélanges. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que l'enzyme saccharifiante est utilisée en quantité suffisante pour fournir 0,04 à 2 unités d'activité enzymatique, de préférence 0,1 à 1 unité, par g d'amidon exprimé en matières sèches. 8. Procédé salon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que l'enzyme saccharifiante est une glucoamylase et est utilisée ean quantité comprise entre 0,02 et 1 %, de préférence entre 0,05 et 0,5 %, en poids basé sur le poids de solides contenu dans l'amidon. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que le microorganisme est choisi parmi les microorganismes appar- tenant au genre Lactobacillus, au genre Streptococcus, au genre Pediococcus, au genre Bacillus et Sporolactobacillus et les champi- gnons appartenant au genre Rhizopus. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisé en ce que la fermentation est réalisée à un pH compris entre 3,0 et 8,0 de préférence entre 5,0 et 7,0. 11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que la valeur du pH est contrôlée à l'aide d'un additif choisi parmi les hydroxydes ou carbonates alcalins, alcalino-terreux ou d'ammonium.