FR 2624742 A1 19890623 FR 8816751 A 19881219 SJnaen3 ap;e sieDue ep qT$JeATp eun,p uoTsseJa2S el JenboAoJd.nod eDoejje. ;uv em'jioz enbTpuT e; ú v eAn;dopv eTdeJ.q;ounwmwT,î 'eiduwexe. d 'arp eeu ap pe;,i Je2elnos.nod;uassTIS selle 'lueat;d nB seJ;sluIupw;uos sagAo; o, uue mnbSolounmw s$lnllae ses enbsiol -snJTA un.id sageDajuT selnllaD Sel no salvJomn; selnlleD sael 4unIu Oú sealqT selnllez sauTvaeDa elle; uaJge gad uo5j ap auTnj;p ap no jesAl ep selqedvo xnep sel seno;- uos 3X{ selnlueS set;ae '0 selnlleD se- '(q-se; w.oqdAI jrnuziB Ei,) saie lnuisae;XDotldmXl spuei2 no '(XN-JaeIT. 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Milieu LAK milieu de culture tissulaire contenant une quantité de rIL-2 suffisante pour induire une activité LAK dans des lymphocytes sensibles Milieu conditionné milieu LAK dans lequel les lympho- cytes ou d'autres cellules appro- priées ont déjà été cultivés pour stimuler l'activité LAK. Figure 1: Production d'activité LAK à partir de LGL adhérents recueillis à différents moments après l'addition de rhIL-2. Des cellules de rate F344 non- adhérentes à la laine de Nylon ont été cultivées dans du milieu LAK pendant 2, 24, 48 ou 72 heures. A chaque point du temps, les cellules nonadhérentes ont été enlevées, et les cellules adhérentes, réalimentées avec du milieu conditionné. Toutes les cultures étaient ensuite poursuivies pendant un total de 5 Jours. L'activité cytolytique sur les cibies YAC-1 et P815, de même que l'incorporation de H-TdR ont été déterminées au jour 5. Diagramme supérieur: unités lytiques/10 cellules. Diagramme inférieur: unités lytiques totales/culture et incorporation de H-TdR dans l'ADN. Figure 2: Relation dose-réponse de l'interleukine-2 pour la production d'activité LAK & partir de cellules de rate F344 adhérentes à la matière plastique. contenant diverses quantités de rhIL-2. Au bout de 48. heure_. les cellules non-adhérentes ont été enlevées, et les cellules adh4rentes-, réalimentëes avec le milieu conditionné et remises en culture pendant 3 Jours supplémentaires. Les unités cytolytiques totales par culture ont alors été déterminées pour les cellules cibles YAK-1 et P815. Figure 3: Développement des LGL adhérents à la matière plastique sur une période de 5 Jours. Des cellules de rate F344 non-adhérentes à la laine de Nylon ont été cultivées pendant 48 heures dans du milieu LAK. Les cellules adhérentes à la matière plastique ont été recueil- lies, et mises en culture sur plaque à 5 x 104 cellules/ml dans un milieu conditionné de 48 heures ou du milieu frais, avec ou sans rhIL-2. La croissance des cellules a alors été suivie sur les 5 Jours suivants (diagramme de gauche). Les nombres au-dessus de chaque courbe indiquent le multiple du développement des LGL au pic du développement sans réalimen- tation. Le diagramme de droite montre L.e développement de l'activité cytotoxique vis-à-vis des cibles YAK-1 et P815, exprimé en tant qu'unités lytiques totales par culture sur la même période de temps. Figure 4: Cinétique de la synthese de 1'ADN dans des cellules de rate adhérentes versus non-adhérentes à différents moments de la culture. A l'aide du même protocole que celui décrit en liaison avec la Figure 5, des cellules manifestant un développement intense des grains nucléaires par autoradiographie ont été marquées comme étant positives. 500 cellules ont été comptées pour chaque point des données. Les blocs pleins représentent des cellules adhérentes, les blocs ouverts sont les cellules non- adhérentes. Le nombre au-dessus des blocs indique les unités lytiques d'activiti cytotoxique pour 10 cellules de chaque population sur des cibles P815. 262474! e Tableau!: Illustre comment l'activité LAK est produite dans les LGL purifies qui ont été isolés par leur adhérence à des surfaces de matière plastique. Tableau 2: Compare le phénotype des marqueurs de surface entre des LGL adhérents à la matière plastique induits par rhIL-2 et des LGL obtenus par des Gradients de Percoll. Tableau 3: Compare le phénotype des marqueurs de surface entre des cellules traitées conformément au procédé de l'invention, des LGL purifiés sur Percoll, et des cellules provenant de cultures en masse standard. Tableau 4: Comparaison de l'activité LAK produite par des LGL adhérents à la matière plastique, des LGL purifiés sur Percoll, et des cellules provenant de cultures en masse standard. Tableau 5: Illustre la production de cellules LAX adhérentes sur différentes bouteilles de matière plastique et de verre. La présente invention est basée sur la découverte que l'une des premières réponses des LGL ou d'un sous-ensemble de ceux-ci après stimulation par hIL-2 est leur fixation à des surfaces de matière plastique ou de verre. Les LGL adhérents à la matière plastique ou au verre, activés par hIL-2, peuvent se développer entre 30 Jusqu'à 100 fois ou plus en l'espace de 3 à 4 Jours de culture, pour produire des taux. extrêmement élevés de cellules présentant une activité LAK, en particulier en présence de Milieu Conditionné provenant de lymphocytes activés. L'invention porte sur un procédé pour isoler des LGL à partir d'une population semi-purifiée de lymphocytes, ce procédé consistant à cultiver une population semi- purifiée de lymphocytes avec hIL-2 dans des récipients en matière plastique ou en verre, d'o il résulte que setrls les sjole %nad inb 's XDoqdw SI @p aT'nd-tss uoT-tndod wm uenj;Suo: UOIlN @p au;T 2I seUeJgqpp-UOU selnilez sel gZ (S&6I) 59:ú 'A6oiounmunI JO Imulnor ucadoJn3.uL) s5Tqnd úepoq;tu xnv;UeWtWJOJuOD 'UOIXN ap auT1 @p sauuoloz s@p ins saJTegIznuouom selnIlaz @p uoT;mJedgjd QT Jasssd a@J;mj} %nad uo 'aldmexe ed 'snbTuqzs; ml sup' senuuoz uelq SSpOg4g@ Sep V %uSW9sOjUOD 'g SalnTl(S Sel %a seîeqdoJDt On sel 'se %ouou sel -@ui;uT -nod ed.xozue úsaeTaJnd aTnsue uos saIe 'anbedXH-IIoD>T4 szup pe ans uoTSn3lJTJ4ueD sQdv 'Sa%;j p Ss nIIUs ep no sauTnful s Ssinllez ap JT;jd V sanueqo;uos saJ;pgInuouom saInTiae sel TS (úg6I) 996-gG6;:0I ''Ioun7'=I 'ú ' (%96I) 916- %uos s$,1.'-m-nfix-c sp ginD.nod rs;TlTen -=iwp;P- OTi !l 3 les cellules ont développé une activité cytolytique LAK en réponse & rIL-2 4) les cellules sont de grands lymphocytes granulaires. Cette observation est en accord avec les résultats précédents dhez le rat, l'homme et la souris, qui ont indiqué que la maJorité de l'activité de précurseur de LAK est contenue à l'intérieur du sous-ensemble LGL/NK des lymphocytes. Il est connu, dans cette technique, que les LGL peuvent synthétiser l'ADN et proliférer très rapidement en réponse à hIL-2. Une prolifération des LOL adhérents a été notée a un temps aussi précoce que 24 heures après la culture et elle a atteint des niveaux de plateau en l'espace de 48 à 72 heures (voir Figure 4>. Le développement des cellules LGL/NK à l'aide de cette méthodologie apparait supérieur par rapport à la méthodologie de culture standard des LAK. Ces cultures produisent des niveaux significativement supérieurs d'activité cytolytique totale par culture et des niveaux supérieurs d'activité LAK vis-à-vis de plusieurs cibles tumorales fraîches résistantes aux NK. Il est probable qu'il en est ainsi parce que les LGL adhérents ne représentent qu'un faible pourcentage des cellules dans une population lymphocytaire non-fractionnée (culture en masse) (aux environs de 1-3%), et étant donné que ces cellules sont capables de développement rapide pour produire des niveaux d'activité cytolytique sensiblement supérieurs à celui qui est observé dans des cultures en masse. - La présente invention porte également sur un procédé d'immunothérapie, qui consiste à administrer à un suJet des lymphocytes à activité LAK, qui ont été obtenus conformément au procédé de l'.invention. Les cellules peuvent être administrées seules ou n 7; e 'St8g[ '{N xne %UBes$s$J ao;%Do;sem np asXI g1 '.e; ueJnoD uo5g eG: sa[eJomn; saLnLao (AN 'uMo;uwmJeo) su D;TuoDeL e sPato a uo uesl;%n eAT;dope aîqdviq;ounum;,p sgppzoJd se- asgJgtdoDnal el ueAm suwlnm %sounm s;uae3 s@az;ne,p no/%s ?-qig zeae gTeJ; ax %ned d ual;%d el 'Ji;g% z %uev4%gd np ai;;ed ç esJgaqdoDnal Jed senueqo %uos e;deJgqounmi,î inod sestlI;;n.V saLnleD s@;t FS -euioqu. n dtnuxi no @Up;D SJnep no e-- q,rib s;3 *5;toeînm;;vOUnwt; 5stz- jna;3nld no un ue uoseu;qtsoD U@ ale ap suoi;%jdajd sal suep a sel.niiSe p a2e; uaDnod el saaowgdo apow aD @ Je saSTpslTn;a SaAQT 'SaTITTanaDa 9;%;uo saua@UpB-uoU S[InITiao[ $a 'SD: @P %0 'D.Lú W 0o9I-iid ap lm OZ zO uvpuad 2 x 00ú '(g O'T =' 9;%suap) anbadXH-l-OT. ap s$uaTpsS sap ins uos;e2nn;-Jua sjde sanua;qo 9l% siole uo saJeegIlnuouom saInITa saa 'sags kuTedag sanSuTas sap suap anbvTpuvz uoTauod ivd nua;qo %9 a anbTjgqdTigd 2ues n. 'sa;nu;w oz;uepuad '2 x OOú (t/'I -;hsuap) anbed H -ITODTd ap sh^uaTpmj2 ins uoT;eSnjTj;uD s9jde sanua;qo 9% uo sanbFuglds saeJ glonuouom sn sena sa SO ap %0I oa-%e O9TlidU naTITui np suep sagwdaid sellTnp;TApuT salnllTa ap suoTsuedsns sap la enb;Idasm uo5ej ap sgeaIUa,a; uo sae_ sa@s: sapçoqdMZT salnllaD ep uoTelpdSJd Àau-,aîoid ep Bu/E-7qiq ap s$Tun gO x SZ'T 4Teua;uoD @113 '(Vs 'aiTa:J{aaX) uoT;eJodJoo snao jed a;uunoj 9% e (v-qIt) auTwenq a; ueuTqmozai Z-ausupnalje u,;u;: Z-aui--nalja% uI XN 9;TA 5:>,I aP nahlrSpuP a=t o isT-T;n 9%l e XN xng aqTqsuas XaUOloN ap sn.TA el.id; TnpuT 1-X>V amoqdwxT el '9OiaVW1 aSouToJlouppe,p sTeiJ sapTloS xnaJoWnf s; ueldxa sep ae 9T-MNI aTmeznal ap astpaj anbT;TDsv inaWn; sun s;ldmoo K 'saXqTS.unoD s;sTIi;;n,@9 huo sTwaj xnvioWnf suvldxa sap 'sed snaTsnld sutG 'anb;%o;q;:;u sap;a SOd eP '%.01 ZaAV o9gl-Iwdu naT.T'- np suep sepu2lI aseD s%;ne 9, z été, de façon conséquente, réduit à moins de 2% (par analyse par cytom4trie de flux à l'aide d'anticorps anti-Ig), et le pourcentage de monocytes/macrophages à moins de 0,3% (par analyse morphologique de préparations cytocentrifuges colorées au Giemsa). Dans certaines expériences, les LGL ont été purifiés à partir des cellules de sang ou de rate non-adhérentes à la laine de Nylon par centrifugation sur densités de Percoll, comme décrit par Reynolds et al; J. Immunol 127:282. En résumé, les leucocytes non-adhérents. à la ? de Nylon ont été placés sur des gradients de Percoll à 4 niveaux, présentant des densités de 48, 52, 56 et % de Percoll. Les gradients ont été centrifugés à 400 x g pendant 30 minutes, et les LGL ont été obtenus'à partir de l'interface 48/58%. Production des cellules présentant une activité LAK A. Cultures standard: des cellules présentant une activité LAK ont été obtenues par culture dans rhIL-2. Les conditions de milieu pour la production de l'activité LAK ont été déterminées dans des expériences préliminaires et comprenaient les conditions suivantes: milieu RPMI-1640 (GIBCO) supplémenté par 10% de FCS inactivé par la chaleur -5 (GIBC--', t'- M de glutamine, 5 x 105 M de mercapto-2 éthano., des antibiotiques (streptomycine/pénicilline), (ci- après désigné comme milieu LAK), contenant 103 U/ml de rIL-2 Le tampon Hepes a été omis du milieu. Les cellules lympho-des ont été cultivées à une densité optimale de 2 x 10 cellules viables/ml dans du milieu LAK dans % de CC2/95% d'air à 37"C. B. Cultures par adhérence: 50 x 10 leucocytes mononucléaires non-adhérents à la laine de Nylon ont été cultivés' dans 25 ml de milieu LAK (contenant 1000 U/ml de rhIL-2' dans des flacons T-75 (Corning, Corning, NY). Les cell. 2 c-t été cultivées pendant diverses périodes de 262474t termps (allant de 2 & 72 heures), à 37'C, après quoi les cellules non-adhérentes ont été décantées, et les cellules adhérentes ont été lavées 3 fois avec 20 ml de RFPMI-1640 chaud approximativement 37'C), contenant 2% de FCS. Les cellules adhérentes ont ensuite reçu 25 ml, soit de milieu LAK frais contenant de la rhIL-2 fraîche, soit de milieu conditionné à partir duquel elles avaient été cultivées initialement. Ce milieu conditionné a été préparé par retrait dés cellules nion-adhérentes par centrifugation et passage du milieu à travers un filtre Millipore de 0,45 micron. Le milieu conditionné peut, de façon classique, être utilisé directement à une concentration de 100%, ou bien il peut également être utilisé à l'état dilué 1:1 avec du milieu frais. Ce milieu peut également être stocké'à -20'C sans perte de l'activité favorisant la croissance. Les cultures ont été ensuite poursuivies à 37'C pendant un total de 5 à 7 Jours. Pour élimfner les LGL adhérents, le milieu a été décanté, et 5 ml de 5 mir EDTA dans du PBS ont été ajoutés, et le flacon, raclé à l'aide d'une racle de caoutchouc. Une population relativement homogène de lymphocytes à activité LAK, telle que présentée par l'analyse des marqueurs de surface, comme établi à l'Exemple 2, a été obtenue. ExemDle 2 Pour l'analyse des marqueurs de surface, 2 x 105 lymphocytes, obtenus à partir de l'Exemple 1, ont été placésdans des tubes de verre de 12 x 75 mm,dans 0,1 m. de tampon de coloration (PBS, pH 7,3, 0,1% azide de sodium, 2% FCS). Divers antisérums ou sérums normaux ont été ajoutés (dilution finale de 1:20 à 1:100), pendant minutes, à 4'C. Les cellules ont été lavées 2 fois et remises en suspension dans des fragments F(ab')2 marqués par FITC d'anti-IgG-de l'anticorps primaire snbTi;,o2vqd sud;uaTe;,u sa;ueJaT4qp salnl1e@ seo saiswqdoJa-eu./s5@;Douow 1ed uoTeuTiLBUtuoo ap sud %ua;uasu$.da. eu;% uoT; eAT%; @un Tqns;uo saelnlle se@ enb enbTpu; 'se.inaiq 9;a Z vp s;uaJ.iqpe q0'l sap ans ( sanaTq g9 ap smua.iqpQ sanbTugids lio sep ins gAJe3qo q% v e noleue sinanbaui ap Ii*oud un f a.* I ' (gZ()6úXO ' (U(IO)Z/eL '( GO) Z81.Z9Z -DtS @p uol;ej3qFl jv.d axo;o;o.av0tT. 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Les faibles taux d'unités lytiques totales par culture, obtenus avec des cellules adhérentes de 2 heures, est indicateur du faible nombre de cellules adhérentes obtenu % 2 heures, de même que de leur faible taux de développement sur les 5 Jours suivants. Des cultures de 48 heures ont été choisies. ExemDle 5 La relation dose-réponse de l'interleukine-2 pour la croissance optimale des LOL adhérents à la matière plasti.es a été déterminée. Des expériences dose-réponse ont été conduites pour déterminer le taux optimal de rhIL-2 nécessaire pour produire et développer des cellules de rate adhérentes. Ainsi, 20 x 106 cellules de rate non-adhérentes à la laine de Nylon ont été placées dans différents flacons T-25 et cultivées dans différents taux de rIL-2. Au bout de 48 heures, les cellules adhérentes ont été recueillies, *réalimertées avec leur milieu conditionné, et on les a lai développer pendant 3 Jours supplémentaires (5 j..^. au total). Lès résultats de ces expériences sont présentés sur la figure 3. Alors que des cellules adhérentes ont pu être produites dans aussi peu que 4 unités/ml de rhIL-2, des taux optimaux de développement-et de production de l'activité cytolytique totale par culture ont été obtenus dans des cultures contenant au moins * 100 unités/ml de rhIL-2. Chez le rat, c'est également la plage de doses optimales de rhIL-2 pour produir.e une activité LAK dans des cultures en masse standard. * uoTsoddo a;;au ue;einox es $ao 'aPú-H ep s@Jneq z ap uo$slndtl eun suep 91elap @moo 'NGV I aP %uaTms;quXs Sa;uejggp; s$elnlueD sep %9g 'eJnlnlnz ap s@Jne@ 99 uanb aurnbTpu; 9 aJnS;I et ans sguasjd seAeIunnz s;,uuop sel a'NCv, e aTlq uobvj ap %uvsT;gqt;uXs s@nllao @p aî%ueznod el jeuTmue;p inod senbuoz q;q;uo s3aueaJdxa sep 'salou Oú 9;9;UeTg p Pu-H @P uoT; eJodioDu,p enb awtix ep e? ilnlliaz :uaddoIaagp ap s-Al xnf% Sep anb ua;a * (S[b aJn3Tq) ajnXlnz Jsd Iemo1 anbT-XIoAX 91TA;Dslp sgael9 xne; ap uoj^vsninznzvi *Id pu3vdmooe lueasle2g;eT qe O sap seZ epTde%uamaddolsagp @q * @49 UG;VQ,@,S selle Eavnbnp JiTn teid B.,auuoT4Tpuo:> ne-piTW el OZ- DAv sagAT;;Inz %uaTv;q s;usagqp salnlla sIl enbsiol 'anb @nb-i a B uo 'J ano US -(s;ol 06 ap;uameddolaagp un no) t/sa$lnII e90I- x g cI' anb sagnasl Tssne smnaea S@p s uta pB uo s5;@Tsuap sa5 '(g -ns Z) uTJidxs ssu; e;ze su; vi' e n2çs Ta a I a-JnT_4) S;ueAPns sino t gî ú sel rns lI/$salnlle 901 x o,;a g'I 8 T;ua sas$tdmoz sI;Tsuap sap uîa;q;uo seln1laD so saJTe5;uauWlddns sanop t-ú;uvpuad jaddolaeAp as essTsl a sal uo qa 'lm/salnllS 010 x ap 9aTsuap sun e mnbvld Jns aan;inD ua sasTmai sTnd saTIITanza p% %uo (Ci[ ap %L6) saJnaq l g ep saueaj4pv 0 selnllae sep '$za, -suTwjal;p inod 'sToj 06 anb ss;uv;-odm- Tssn; sJnaleA sep %ula;s %uaanos %uo 0uamaddola0t p ap sse;pu; ssl '(Is;o; hg 5JnlInz ap sJnof 9-S 5J;p--;s5,p> s$JT;uameslddns sinof t_-;uepuad Z'IIq4 suep sasnas g8 ap s$;uajsqpv salnlleS sap Jaddolesap as @ssTBI B uo, nbsol t anb %uanb;puT b aTan9T vIl ns s$agua$sgdai ssauuop se-l aTps.z p e 's-pJ Jed s,@lDe 'anb;svld saw el u s;utaiggpe qOq sap oiJ;A UT;uawaddoTiea*p a- 9 laO'uaxa IZ par rapport aux cellules non-adhérentes dans lesquelles seulement 18% des cellules synthétisaient l'ADN. Exemple 7 On illustre que le développement des LGL adhérentes à la matière plastique produit des cellules destructrices (LAK) largement cytotoxiques plus efficaces. Des cellules de rate F344 non-adhérentes à la laine de Nylon ont été cultivées pendant 48 heures et les LGL adhérents à la matière plastique, recueillis et cultivés pendant 3 heures supplémentaires dans du milieu conditionné. Ces cellules ont été alors testées pour l'activité cytolytique vis-à-vis de plusieurs cellules tumorales incluant des explants frais de 2 différentes cibles résistantes aux NK syngéniques (MADB106 et CRNK-16). L'activité cytolytique des LGL adhérents développés a été comparée à des cultures en masse de cellules LAK produites dans des conditions standard et à des LGL spléniques purifiés sur Percoll (qui contenaient 55% de LGL et au moins 10% de cellules T matures au démarrage de la culture). Les données du Tableau 4 indiquent que des taux sensiblement supérieurs d'activité cytolytique (LAK) étaient produits dans des LOL adhérents purifiés cultivés, par comparaison avec soit des cultures LAK standard, soit des LGL spléniques partiellement purifiés. Alors que l'invention a été décrite en liaison avec le mode de réalisation préféré, il est bien entendu-que domaine de protection n'est pas limité à la-forme particulière décrite, mais au contraire, il est entendu.que soient protégés les variantes, modifications et équivalents qui peuvent être inclus dans l'esprit et le domaine de l'invention. Tableau 1 Production d'activité LAK à partir de LGL purifiés sélectionnés par leur adhérence aux surfaces de nmatière plastique Activité Cytolvti4ue Heures Cellules/l Proliferationités Lyticues 110 cell GrouSe d'lncubation Cellules 'II6 ILL QFPM x 10'3) YAC-1 P815 O Rate 2,00 3 NT z0 0 2 NA 2,00 3 2,9 102 0 AZH 0,02 94 5,7 1008 0 24 NA 2,00 3 32, 1 110 20 ADH 0,03 96 144,3 54S8 1105 48 NA ?2,00 7 32,3 195 110 ADH O, 09 97 324,3 72M6 1581 72 NA 2,00 14 118,2 841 145 ADH 0,13 97 397,4 5221 948 2O 2 48 NA 2,00 9 NT 123 11 ADH 0,02 9 NT 2011.221 Des cellules mononucléaires de rate F344 (Groupe 1) ou de sang périphérique (Groupe 2), non-adhérentes à la laine 2 5 6 de Nylon, ont été cultivées à 2 x 10 /ml dans 1000 U/ml de rIL-2 pendant 2, 24, 48 ou 72 heures. A chaque point de temps, les cellules adhérentes (ADH) et non-adhérentes (NA) ont été récoltées, comptées et testées pour la prolifération (incorporati.on de H-TdR dans l'ADN en l'espace de 4 heures), la cytotoxicité vis-à-vis des cellules cibles YAK-1 et P815, et le pourcentage de LGL. Le point de temps 0 représente des cellules de rate fraiches non-adhérentes à la laine de Nylon. ( lduoD Selnllt OOOI) vsmeTo nQ sagJoloa auTdso;Xa p suo$;vjdgJdd OF sap ugd seq$jT;uQnb 7;q %uo IO sal;a xnlj ap aTu;gwo;i igd aDe3jns ap sanonbJwm sieaSp ap uoTssaadxa jnal inod sapsXlvuv qa;uo salnlIeD seao 'ilozad eps;ueapvjs ins uol;lvnJ;$uaD no (sainag g> no sajnaq Z) anbl; svld ajg$;vm el À azueJpqpv imd saTJund 7Oq sal %a snua;qo 9g 9;9;uo 'uolXN ap aulQl el g SueJaqpQ-uOu 'anbTjsgdlagd Sues ap no tt1 aea ap saXDoqdtuI saG v IN c 6 ll 6 IN ve OS SS (eVeu) 11" d Z V l V Z Z9 98 96 Z6 (lad) 1ItO Jd C9V I t V S 6 L6 96 86 (ae) (sain Vq 8;) àUT5àugp 5 I sueUp 1 s931l33 30 3 3f19W3SN3-SAOs aO s$A3Ai ON s$u3AtBiu 1AII$Jdd S ap s;uaeTpi2 ap a %d q snuaeqo -19 snsJaa Z-lIJ atd s$;npu$ suejqpv iqr ap aDmJjns ap sinanbJQum sapsadXougqd Tableau 3 Phénotype de cellules développéesau jour 5, produites par des LGL adhérents & la matière plastique, des LOL purifiés sur Percoll ou dans des cultures en masse standard % DE CELLULES POSITIVES1 -____________________________________-_________-_______________ Cellules LAK MARQUEURS NK MARQUEURS DES CELLULES T AUTRES -'Cellules LAiK issues de $ ÉLâ'8 61 laminineOX19R1-383ï3/25S0X 1. L6L Adhérents 99 80 95 94 4 1 2 9 63 2 L6L purif is sur Percoll d 95 84 78. 68 6 S 6 NT 60 4 LAK Standard e42 8s 92 54 41 32. 4 27. 56 12 a Détermination par cytométrie de flux. b b Préparation de cytospine colorée au Giemsa 3 jours supplémentaires. d d LGL de sang périphérique purifiés sur Percoll. Le pourcentage de LGL dans la population purifiée était de 94% au démarrage de la culture. Les cellules ont été cultivées pendant 5 jours. - e e Cellules de rate F344 non-adhérentes à la laine de Nylon, cultivées pendant 5 jours. 91-MNUO aFVDfnl9 ap aT4D8J- eanbTaDsi jfnweitn aun no 0 O golaIvNSnbTu7SuXs seqD;vJ sjnaewn ap s;ueldxa sep;a gSgd I-0VA.ns a9%P;sa; 9P9 (;xoola m7(sgnof ap 1t1oi un jnod) seJS;mueawvddns sJno ú %uvpuad quuo;%TpuoD reITm Jnale suop seaTInD 9q9 %uo sa neq 8 ap s;ueajc t set sJno g;uQpued xvi naTiTtw np suvp sgaTInD 9%;u% iloziad c- ans sOS}Tjnd 'To sel (Iol ap %ú6) (maanam 98) Z-1I ud s%;npuT'enblsPld axlTim QI azuajpqpv jed no (q10 ap %S5) IloDoid apSuaTpzJ2 Jlns uoT;gSnj;; uaz umd sgTjTnd a^ uo -70 se- v'E:. smJ ap JT;avd sanua;qo 9% %uo uolXN ap auTvl vl p sa;uaJglpv-uou aeJ ap selnllaz saa oz L9 LZ CEZ 68 9ou x T'Z ps x I'$ aessgH ue aJn;lin9 OZI itOiT 16Z OLZI 901 x 8' IloDJad Jns sTiJfnd senbTulds 7101 LOZ 6t9I 69Zi tggú 01 x 9'1 s4uaj9mp 1q1 91xNi - 96rq 919d 1-XV1k S n-t s;D:a3 4tnU80 Im/selnlleo 01 ('salnlla3L O- 'O sanb$ sl-;--) anbtxo;oli3 91:a$V pJBpUR S 5; assw ua saJn;tln sap;a IlooJd Jns s ;jiand 70 sap IsaJneq 89 ap s;uaJgqpv -0 sep JVd a%;npoJd ';, t;:IV ncelqú Tableau 5 Production de cellules LAK adhérentes(A-LAK) sur différents flacons de matière plastique et de verre. D Donneur-: Cellules de rate F344, passées sur laine de Nylon Culture: 2 x 10 cellules/ml Flacons Falcon T75 1000 u/ml rIL-2 Gibco T75 Corning T75 Flacons de prescription de 24 0- (A700 g) Nombre de cellules présentes dans le flacon au jour 5 % de destruction au Condition de la culture jour 5 de la culture Cellules Totales Cellules Cellules (lavées au YAC-1 P815 jour 2) 10:1 2:1 10:1 2:1 Falcon Cellules non séparées 29 x 106 36 9 21 6 A-LAK 18 x 106 79 56 66 34 Gibco Cellules non 6 séparées 31 x 10 32 12 24 8 A-LAK 14 x 106 82 61 69 36 Corning Cellules non séparées 30 x 106 39 15 25 5 A-LAK 16,6 x 106 79 66 65 39 Flacon Cellules non séparées 26 x 106 33 15 22 9 A-LAK 14,9 x 10 81 65 62 41 REVENDICATI0NS I - Procédé d'isolement de grands lymphocytes granulalres à partir d'une population purifiée de lymphocytes, caractérisé par le fait qu'il consiste à - cultiver la population Cemi-purifiée de lymphocytes avec hIL-2 dans des récipients en matière plastique ou en verre, d'o il résulte que seuls les grands lymphocytes granulaires adhéreront à la matière plastique ou au verre. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que hIL-2 est rhIL-2. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que la population semi-purifiée de lymphocytes est cultivée dans des récipients en matière plastique. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que les lymphocytes sont cultivés pendant un laps de temps allant de 2 à 72 heures, à environ 32-38'C, dans des milieux de culture tissulaire contenant environ -1200 U/ml de rhIL-2. - Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que les lymphocytes sont cultivés pendant environ 24 & 72 heures. 6 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que les lymphocytes sont cultivés à environ 37'C dans des milieux de culture tissulaire contenant environ 1000 U/ml de rhIL-2. 7 - Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que le milieu de culture contient du sérum de veau fotal, des antibiotiques, de la glutamine et du mercaptoéthanol. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que la densité de la population de lymphocytes 3 7 purifiée cultivée va de 10 à 10 cellules viables/ml. 9 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé par' le fait que la densité de la population de lymphocytes, purife cult e et d'envron 2 x 1 cellule viabsm. purifiée cultivée est d'environ 2 x 10. cellules viables/ml. - Procédé selon la revendication 9, caractérisé Tar le fait que les récipients en matière plastique sont des boites de Petri ou des flacons Falcon. 11 - Procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait que les milieux de culture sont décantés après la culture et que seuls les grands lymphocytes granulaires adhérents à la matière plastique restent. 12 Procédé pour le développement et la !0 conversion de grands lymphocytes granuleires en lymphocytes à activité LAK, caractérisé par le fait qu'il consiste à recultiver dans hIL-2 des grands lymphocytes granulaires qui ont été isolés par adhérence à la matière plastique ou au verre. 13 Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que les grands lymphocytes granulaires ont été isolés par adhérence à la matière plastique. 14 - Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que les milieux de culture contiennent 100-1200 U/ml de rhIL-2. - Procédé selon la revendication 14, caractérisé par le fait que les lymphocytes adhérents à la matière plastique sont recultivés pendant 4 à 8 Jours à 32-38'C. 16 - Procédé selon la revendication 15, caractérisé par le fait que les lymphocytes adhérents à la matière plastique sont-recultivés pendant un laps de temps d'environ 5 à 7 jours, à environ 37'C, dans des milieux de culture contenant approximativement 1000 U/ml de rhiL-2. 17 - Procédé selon la revendication 16, caractérisé par le fait que les milieux de culture sont des milieux LAK frais. 18 - Procédé selon la revendication 17, caractérisé par le fait que les mllieux sont des milieux conditionnés.. - TneD eanb ei4nv Xa ns un,p; uauueiAoJd XVI 9;TAT;zv ei aa;;uvp salnllj se@l @nb Tej el Jed iS L O UOT; TpuaAej UT UoleS gPgojd -'Q' euTqogdtAl no auT.o;Xz aj;ne aun;se suvInmwTsoun=uT; uae e.À;ne,l enb;Te; ael ed sTJ%;DzeD gz uo;;DTpueAeJ gel uoles 9p9OjO - LZ uoJjJ;auT'n;s. 0ú uQlnmTsoununXT;uepg eaJn, ernb; IjI e jed qs7;,xve% gz UOo;QTpUueAaj I UOles gpgOJd - 9z Z-iîw-;5@ uvjnmj; sounmwT;ueSe ejqnv',j anb;Tej al Jed,SJ@éé t UOT; zDîpUaAeJ el UO@,peDoJd - s;ugltntu;sounuinT suae2 sajene,p saDwvTzjj s;;uegnb sep oeAs $auwnuToPuoa sgJosTuTut$pe;uos XvI sTT;gv e. sapX oqd=lA sel $ nb;Te; e% jed psTJgJeDI ú UOT;E'TPUAaJ VI UOISS 9p::oJd - tz onb T, se d 0, Izz UOT; %ZTpUaAaj eI UOleS 9pvzoad - Sz Y.aA% ne no enbT;seld jn;eui el e. azuajqpv jed solosi saiTvTnueu sa;XzoqdMiI spup.i5 @p snss; 'snddoleAipV-, TAT;le %s ssxDoqdmXl apaDeDTn pT;uenb aun;sans un o JJsTuTupze p a;sTsuo ITonb;Age et jvd le 'eIdiuJ@qpounw=Tp uPpgo.Jd - 6Z vicia% @p;ugue;uoz e; P4dsoqd ne equuodumg; euTms uoT;nîos aun;se uodw; e@l anb;jej el jed gsg; z OT oZ UOi;VDTpue@eJ el UOeS,p9zOud - I Z 9;noPu;sa gTJdoJdde uodmq; un, nb;T;j el jed gsTiJ^e;zJe 6T uoT4D:TpueAaJ el Uol@es 9PezOJd - OZ Xvl. ATAT%;z e sealnllae sel J;ua;qo inod enbT;svld eJqjlgw ep ezgjjns el ep aîeleiD;e s@,x@ ue aen;InD ap xne;îlT sep uo;9;ueDp jed g;îoo.i;uos s ddoîeAgp VI,@;TX\%;De ie otXdwat set anb;;gT e8 -éd el;jze t uo;; QDTpueAeJ el uolDres p?,ld - &; trait er. 29 - Procédé selon la revendication 28, caractérisé par le fait que les cellules devant âtre à activité LAK proviennent du sujet & traiter. 30 - Procédé selon la revendication 29, caractérisé par le fait que le suJet est d'abord traité ayec un agent immunostimulant connu, avant la leucophérèse. 31 - Composition relativement homogène de grands lymphocytes granulaires. 32 - Composition relativement homogène de lymphocytes à activité LAK, issus de grands lymphocytes granulaires adhérents à la matière plastique.