FR 2631826 A1 19891201 FR 8807110 A 19880527 I 2631826 La présente invention concerne un nouveau vecteur particu- laire utile notamment pour le transport de molécules à activités biologiques. Parmi les procédés utilisés pour faire pénétrer et réagir un composé (principe actif) à l'intérieur d'un système biologique ou biochimi- que il est parfois intéressant d'utiliser un vecteur particulaire dans lequel le produit actif est encapsulé. C'est le cas notamment - Des composés ayant à l'état libre une durée de vie trop faible dans l'organisme ou dans des systèmes biologiques ou biochimiques. Le vecteur permet alors de le protéger et de lui assurer une diffusion constante. - Des composés qui doivent agir sur un type de cellules particulier ou être présentés d'une certaine manière. C'est le cas des produits anticancéreux et des antigènes. Le vecteur peut alors assurer la présentation et le ciblage vers la cible choisie. - Des composés qui ne sont pas résorbés naturellement au niveau des muqueuses: intestin, système ORL, vagin ou de la peau. Le vecteur sert alors d'enrobage pour faciliter le passage à travers la barrière. Un tel vecteur particulaire doit satisfaire à un certain nombre d'exigences touchant notamment: à sa charge utile, sa stabilité, sa biométabolisation et ses possibilités de diffusion des principes actifs. Pour être intéressant, il doit, en outre, par ses propriétés, tendre à se rapprocher le plus possible des systèmes naturels de transport de molécules dans l'organisme ou rencontrés dans les milieux naturels, ceci afin de ne pas perturber l'équilibre physiologique et pouvoir éventuellement profiter des avantages liés aux processus vitaux naturels. Parmi les systèmes de transport naturels que les vecteurs peuvent tenter de mimer, deux sont plus particulièrement intéressants à étudier: les lipoprotéines et les chylomlcrons. 263 1826 Les chylomicrons sont chargés de transporter les graisses dans le système lymphatique après la digestion. Sur le plan structural, ils sont constitués d'un noyau sphérique hydrophobe contenant des triglycérides et du cholesterol, cqe noyau étant entouré d'un feuillet externe de phospholipi- des. Les lipoprotéines, qui sont chargées entre autres de transporter le cholesterol, reprennent la même structure générale mais avec la présence d'une apoprotéine ancrée sur le feuillet phospholipidique et qui assure le guidage de la lipoprotéine. Le vecteur synthétique le plus proche de ces vecteurs naturels est le liposome qui est constitué d'une bicouche phospholipidique entourant une vacuole aqueuse. Les liposomes ont fait l'objet de nombreux travaux pour développer leur utilisation en tant que vecteurs de principes actifs. Ils présentent cependant un certain nombre d'inconvénients qui ont empêché leur application dans l'industrie pharmaceutique. Ce sont notamment leur fragilité, leur hétérogénéité, leur faible capacité de transport et les difficultés posées par leur production à l'échelle industrielle. Il est donc souhaitable de disposer d'un vecteur proche structurellement des vecteurs naturels mais ne présentant pas les inconvénients rencontrés avec les liposomes. L'invention en cause concerne des vecteurs particulaires de nature phospholipide-glycolipide-polysaccharidique encore appelées Bio Vecteurs Supra Moléculaires (BVSM) qui permettent le transport de molécules d'origine naturelle, synthétique, hémisynthétique ou recombinan- te au sein de systèmes biologiques et biochimiques divers: eucaryotes, ou procaryotes, pour des réactions enzymatiques, chimiques, immunologiques, des tests de diagnostics, ou encore pour des fermentations. Bien que les systèmes particulaires de transport de substances actives aient déjà été décrits, aucun d'entre eux ne présente la structure multicouche particulière des vecteurs particulaires selon l'invention qui permet l'obtention d'entités de taille définie, modulables, très stables, lyophilisables. stérilisables, entièrement métabolisables, et dont la structure et la surface présentent une grande similitude avec celles des vecteurs naturels. 2 6 3 1 8 2 6 Plus particulièrement, la présente invention concerne un vecteur particulaire caractérisé en ce qu'il comporte: - un noyau hydrophile non liquide, essentiellement un polymère hydrophile, polysaccharide par exemple, réticulé, - une première couche ou couronne de nature lipidique généralement liée au noyau par des liaisons covalentes et, - une seconde couche ou feuillet de composés amphiphiles par exemple des phopholipides; des détergents biocompatibles ou des tensioactifs capables de s'organiser en micelles, cette couche étant en général stabilisée sur la première par les interactions hydrophobes. Le noyau hydrophile, notamment polysaccharidique peut être obtenu par différentes méthodes, en particulier lorsqu'il s'agit d'un polysaccharide, on utilisera de préférence un polysaccharide biodégradable qu'il soit linéaire ou ramifié, par exemple des polysaccharides naturels ou non de type dextrane, amidon, cellulose, ou les dérivés de ces composés. Le poids moléculaire de ces polysaccharides peut varier très largement de 50.000 à plusieurs millions de Daltons. Les procédés de réticulation des polysaccharides sont connus dans l'état de la technique et peuvent être effectués par l'utilisation d'agents bifonctionnels capables de réagir avec les fonctions hydroxyles des sucres, il s'agit notamment de l'épichlorhydrine, l'épibromhydrine, les bis-époxydes ou des urethanes. Au niveau de la synthèse de la première couche lipidique, si les réactions de greffage sont effectivement connues de l'homme de l'art, le procédé selon l'invention apporte cependant une modification intéressante dans un mode de mise en oeuvre préféré en effectuant la réaction dans un non solvant des polysaccharides. Ceci permet, en effet, de réaliser une dérivation superficielle et non dans la masse du noyau comme ce serait le cas avec un solvant des polysaccharides comme la pyridine. Cette modification est très importante car elle permet, d'une part, de conserver un noyau central hydrophile et, d'autre part, de maintenir la structure particulaire du noyau. Cette structure est obtenue en effet grâce à la réaction de réticulation mais également grâce à la présence de liaisons hydrogènes entre les sucres qui ne sont pas pontés par l'agent de réticulation. Ces liaisons sont détruites lorsqu'on réalise une dérivation 263 1 826 dans la masse en utilisant un solvant des polysaccharides comme la pyridine et on a montré que l'on perdait du même coup la structure particulaire (on obtient alors une structure en fibre du type acétate de cellulose). Les paramètres particuliers de la mise en oeuvre de ce type de procédé sont connus de l'homme de métier. On obtient généralement un gel. Ce gel doit être broyé mécaniquement afin d'obtenir des particules ayant quelques dizaines de microns de diamètre. Il est ensuite nécessaire pour obtenir des vecteurs selon la présente invention d'effectuer une. nouvelle fragmentation, celle-ci pouvant être effectuée par des méthodes ultra-sonores ou par des méthodes telles que l'extrusion à la presse de French. Pour les vecteurs particulaires selon la présente invention, on préfère utiliser des noyaux ayant une taille de 10 à 100 nm, bien que dans certains cas, des particules ayant des tailles supérieures ou inférieures puissent être eventuellement utilisées, les particules préférées sont des particules ayant entre 20 et 70 nm et de préférence aux alentours de nm. Bien entendu, dans certains cas, on pourra être amené lorsque l'on souhaite avoir des gammes de dimension homogène, à effectuer une purification en fonction des diamètres des particules obtenues, par toute méthode appropriée. notamment par centrifugation différentielle. La première couche ou couronne est obtenue de préférence par couplage chimique à partir des fonctions hydroxy ou des fonctions hydroxy dérivées du noyau en utilisant des réactifs lipidiques, c'est-à-dire notamment des stérols, des acides gras, des amines grasses, des phospholipi- des, des acides aminés hydrophobes ou des alkoxyéthers. Ce type de greffage est connu dans l'état de la technique et consiste à utiliser des réactions de modifications des hydroxy des sucres dans un non-solvant des polysaccharides tels que le dichlorométhane, 1' hexane, le toluène, et le couplage du radical hydrophobe du composé lipidique correspondant. Enfin le feuillet lipidique externe peut être réalisé avec des phospholipides ou avec n'importe quel tensioactif ionique ou non ionique capable de s'organiser en micelles comme cela a été dit précédemment. Ce 2 6 3 1 8 2 6 feuillet externe est obtenu de préférence par des méthodes analogues à celles qui servent à la préparation des liposomes, c'est-à-dire projection d'éther, la dialyse de détergents, la préparation en phase inverse ou la méthode du ballon qui est la plus connue. Ces véhicules particulaires sont plus particulièrement destinés à véhiculer dans l'une des couches ou noyaux une molécule à activité biologique. Parmi ces molécules à activité biologique, il faut citer -les antibiotiques et les anti-viraux, - les protéines, les protéoglycanes, les peptides, - les polysaccharides, les lipopolysaccharides, - les anticorps, - les insecticides et fongicides, - les composés agissant sur le système cardio-vasculaire, - les anti-cancéreux, - les anti-malariques, - les anti-asthmatiques. Sur le choix de la molécule transportée, il n'y a, a priori, pas de limitations. Pratiquement toutes les molécules possédant une activité biologique peuvent être encapsulées. On peut ajouter bien d'autres composés. par exemple les anti-inflammatoires. les anesthésiques, les contraceptifs, les peptides, les antiparasitaires, les vitamines, les prostaglandines, les neuroleptiques, les antidépresseurs, etc. Dans certains cas il est possible d'utiliser des vecteurs particulaires selon l'invention uniquement marqués, notamment par des méthodes radioactives ou par des méthodes de type fluorescence ou détection RMN, ceci afin de permettre une imagerie et/ou un diagnostic. Les principes actifs peuvent être insérés soit à l'intérieur du noyau polysaccharidique, soit dans la couronne lipidique soit dans le feuillet phospholipidique externe. Cette insertion peut être réalisée soit spontanément par l'intermédiaire de liaisons hydrophobes ou hydrogènes, soit après greffage chimique d'un ligand approprié. Dans ce dernier cas, les molécules peuvent être localisées à l'extérieur de la particule et lui être liées par un ligand hydrophobe. On distingue ainsi quatre zones spatiale- ment définies. C'est cette partition en zones spatiales qui a fait adopter la terminologie Supra Moléculaire. L'invention concerne enfin les compositions pharmaceutiques ou de diagnostic ou d'imagerie comportant un vecteur particulaire selon l'invention. Dans les exemples ci-après, on décrira le chargement de différents produits en fonction de leurs caractéristiques et notamment: d'un produit hydrophile de petite taille, un antibiotique de la famille des aminoglycosides, la butirosine, - d'un produit amphiphile, le propranolol, localisé dans la couronne lipidique interne, - du même propranolol mais localisé cette fois dans le feuillet phospholipidique externe, - d'un composé très hydrophobe, un antibiotique insecticide, la deltaméthrine, localisé dans la couche lipidique interne, - d'une protéine membranaire le cytochrome C, - d'un composé hydrophile de grande taille mais possédant un reste lipidique, le lipopolysaccharide de Salmonella minnesota formé S, - d'une protéine enzymatique modifiée par des chaines d'acide gras, - d'un anticorps monoclonal modifié par des chaines d'acide gras, - d'un antibiotique hydrophobe, l'érythromycine. Un exemple illustrera également le chargement au niveau du noyau polysaccharique avant la réaction d'acylation. Les véhicules particulaires selon la présente invention peuvent être stérilisés notamment par filtration ou bien par autoclavage à 1200C pendant 2G min par exemple. Ils peuvent être congelés sans précautions particulières. La lyophilisation peut être réalisée en présence d'un additif de lyophilisation comme le maltose, bien que cela ne soit pas indispensable, afin de permettre la réhydratation. Les exemples ci-après permettront de 2 6 3 1 8 2 6 7 2631826 mettre en évidence de façon plus claire certains des procédés mis en oeuvre afin d'insérer les produits dans les différentes couches des vecteurs particulaires en cause. Outre leur degré de variabilité important, les BVSM présentent des caractéristiques physico-chimiques intéressantes. Parmi les nombreux avantages de ce type de nanoparticules, on peut citer notamment - le type de construction modulaire en multicouchesautorisant. une adaptation au produit à transporter, à son taux d'encapsulation requis ainsi qu'à la cible choisie, - la possibilité de modification de l'état de surface de la particule pour favoriser sa réactivité ou son adsorption intestinale et cutanée, - de façon analogue aux liposomes, le feuillet externe phospholipidiques des BVSM présente une similitude avec la membrane cellulaire et est capable d'interagir avec cette dernière, - une très grande stabilité chimique due à la structure polymérique du noyau polysaccharidique, - une entière biodégradabilité et biométabolisation, une capacité d'encapsulation importante de produit actifs de nature chimique -variée. -une taille définie et la possibilité d'obtenir de façon homogène des très petites tailles (50 nm) permettant une régulation de la diffusion dans les systèmes et tissus biologiques, - la possibilité d'industrialiser le procédé de fabrication. Les exemples ci-après permettront de mieux mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. EXEMPLE 1 PREPARATION DES NOYAUX DE POLYSACCHARIDE RETICULE Dans un réacteur de 2 litres muni d'un piège à soude, on mélange 150 g de dextrane de poids moléculaire de 229 000 avec 150 ml d'une solution de soude I M. Lorsque la solution de dextrane est homogène, on verse 12 ml d'epichlorhydrine, tout en agitant vigoureusement. Le mélange réactionnel est chauffé à 80 C à l'aide d'un bain-marie. L'agitation est arrêtée après l'ajout de l'epichlorhydrine tandis que la température est maintenue à 80 C pendant 10 heures. On obtient un gel un peu élastique et cassant. Ce gel est mis en suspension dans 1.850 I d'eau puis broyé mécaniquement avec un appareil à hélice (type Waring blender) afin d'obtenir des particules de quelques dizaines de microns de diamètre. On effectue ensuite une ultra fragmentation du dextrane reticule pour obtenir les nanoparticules de 50 nm. La fragmentation peut être effectuée par toute méthode suffisament énergétique pour permettre un nanobroyage. Les deux méthodes suivantes sont données à titre d'exemple. a) Ultra fragmentation par ultra-sons La suspension brute précédement obtenue est soniquée à l'aide d'une sonde à ultra-sons (puissance 250 watts) pendant 30 mn. On obtient un mélange hétérogène contenant 20 % de particules ayant un diamètre inférieur à 100 nm. b) Fragmentation par la presse de French La suspension brute précédemment obtenue ext extrudée à l'aide d'une presse de French sous une pression réelle de 140 MPascal. Cette opération est répétée 3 fois. La proportion de particules ayant un diamètre supérieur à 100 nm est alors inférieure à 5 %. Le diamètre moyen déterminé par microscopie électronique est de 50 nm. 263 1 826 Les nanoparticules sont purifiées par centrifugation différen- tielle entre 1000 g et 6000 g (15 mn). Les particules sédimentant en dessous de 2000 g ont une taille supérieure à 100 nm tandis que celles sédimentant entre 2000 et 5000 g ont une taille comprise entre 10 et 100 nm. La taille des particules est mesurée en microscopie électroni- que (grossissement 20.000 et 100.000 fois). Les particules se présentent sous la forme de sphéroïdes relativement réguliers. Le polysaccharide de départ est retrouvé à 90 9% sous forme réticulée insoluble tandis que 10 , est retrouvé sous forme de polysaccha- ride soluble. Le dosage est effectué avec la méthode de l'anthrone. EXEMPLE 2: PREPARATION DE LA COURONNE LIPIDIQUE SELON L'EXEMPLE 1 A 100 g de particules polysaccharidiques lyophilisées mis en suspension dans I I de dichlorométhane, sont ajoutés 75 g de diméthylam- minopyridine et 100 g de chlorure d'acide octanoique. L'ensemble est laissé sous agitation à l'abri de l'air, à 37 C pendant 20 h. La récupération et le lavage des particules après réaction est réalisé par évaporation du dichlorométhane suivi de trois lavages au méthanol. Entre chaque lavage, les particules sont récupérées par centrifugation (20 mn à 5000 rpm). L'étude de la cinétique de la réaction permet, en fonction de la stoechiométrie des composants. du solvant utilisé et de la température choisie d'obtenir une couche lipidique plus ou moins dense et établie plus ou moins profondément à l'intérieur de la particule. Exemple de variation du taux de greffage d'acide gras en fonction des conditions opératoires. Rapport poids de particules/ Durée Taux poids de chlorure d'acide Température de réaction de greffage ( C) (heure) (% en poids) I 37 18 1,4 37 18 0,2 0,5 37 5 0,5 Les acides gras greffés sur le noyau polysaccharide ont été dosés par la méthode de LAUWERYS. EXEMPLE 3: PREPARATION DU FEUILLET LIPIDIQUE EXTERNE A 150 g de particules (30-100 nm) acylées par l'acide octanoîque (1,5 % d'acide gras) sont ajoutés 30 g de phospholipides (1/3 phosphatidylethanolamine, 1/3 P. choline, 1/3 P. inositol) dans 1,5 I de chloroforme. L'ensemble mis dans un ballon de 5 1 est amené à sec sous pression réduite au rotavapor puis, après addition de 2 I d'eau distillée, est placé à 40 C pendant 30 mn en agitant toutes les 10 mn. On peut utiliser une variante de cette méthode en mélangeant les noyaux acyles et les phospholipides à l'état de poudre et en ajoutant ensuite progressivement la quantité d'eau nécessaire tout en agitant. Cette variante est naturellement plus adaptée à la préparation de quantités importantes de BVSM. Les BVSM sont ensuite obtenus sous forme d'une suspension homogène par sonication (1 H 30 au bain) ou par extrusion à la presse de French. Les liposomes ayant pu se former au cours de l'opération par suite de la présence d'un excès de phospholipides sont éliminés par une centrifugation (5000 rpm. 10 min), les BVSM ayant sédimentés sont récuperes. 263 1826 l Les BVSM remis en suspension se présentent sous la forme d'une solution laiteuse. Cette suspension est stable mais finit par décanter après plusieurs jours, une simple agitation peu énergique suffit alors pour reobtenir la suspension de départ Le dosage des phospholipides est effectué par le dosage du phosphore par la méthode d'AMES et DUBIN. Dans le cas des noyaux présentant un taux de greffage d'acide octanoîque de 1,4 % la quantité de phospholipides associée aux BVSM est de 10 %. EXEMPLE 4: STERILISATION DES BVSM DE 50 NM PAR FILTRATION La stérilisation des BVSM de diamètre inférieure à 100 nm est obtenue par filtration sur membranes d'acétate de cellulose ou de polycarbonate (pores de 0,1 pm ou de 0,22 pm de diamètre). Cette filtration nécessite l'emploi d'une pression élevée mais n'entraine pas de phénomènes de colmatage. Deux filtrations successives sont nécessaires pour obtenir une stérilisation complète. Après filtration, la suspension obtenue est remarquablement homogène et présente une tendance à sédimenter extrêmement faible (plusieurs semaines) qui doit traduire l'état très dispersé de la suspension provoqué par l'effet d'extrusion de la membrane. Les BVSM ainsi obtenus peuvent être autoclaves sans précautions particulières à 120 C pendant 2t minutes. Après autoclavage, les suspensions de BVSM apparaissent inchangées. Les BVSM peuvent être également congelés sans précautions particulières. Après décongélation, la suspension obtenue est identique à celle de départ. La lyophilisation directe des BVSM peut être réalisée mais l'adjonction d'un additif de lyophilisation comme le maltose à 5 6 permet d'obtenir de meilleurs résultats et une suspension parfaite après lyophilisa- tion et réhydratation (voir paragraphe AED). 263 1826 EXEMPLE 5: ETUDE DES BVSM L'observation en microscopie électronique des BVSM après coloration négative (grossissement 100.000 lois) indique que ces derniers présentent une forme sphéroide plus ou moins régulière de diamètre moyen de 40 nm. Les particules sont observées à l'état dispersé sans présence d'aggrégats. La présence d'une auréole autour des particules de BVSM et. absente sur les noyaux polysaccharidiques seuls est révélatrice de la présence du feuillet externe phospholipidique. L'étude d'analyse enthalpique différentielle a été réalisée sur des BVSM entourés de dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) et par comparaison avec des liposomes de DPPC. On observe dans ce dernier cas une température de transition de 40 C qui est en accord avec les données 15. de la littérature. Des températures de transition analogues sont observées pour les BVSM de grandes tailles (20-80 um) et quel que soit l'acide gras présent dans la couronne lipidique: C8-40,9 C, C12-40,2 C, C16-40,7 C. Dans le cas des BVSM de 50 nm, on n'observe une transition que pour les BVSM acylés avec l'acide octanoîque (40 C). Ces résultats indiquent que le feuillet lipidique externe présente bien une architecture organisée de type liposomiale. Cette organisation est toutefois dépendante de la nature des acides gras constituants la couronne lipidique et de la taille des particules. La température de transition n'est, par ailleurs, pas affectée par la lyophilisation des BVSM. EXEMPLE 6: CHARGEMENT DE LA BUTIROSINE DANS LES BVSM La butirosine est une molécule constituée d'un aminocylitol lié par des iiaisons glycosidiques à des sucres aminés. Il s'agit donc d'un produit très polaire et ionique, soluble uniquement dans l'eau et les mélanges d'eau et d'alcools inférieurs. On prépare d'abord des - BVSM blancs à partir de 50 g de noyaux polysaccharidiques acylés en C8 (0,18 % d'acide gras) et de 10 g d'asolectine (Fluka) par la méthode du ballon décrite précédemment. 263 1826 Après lavage des BVSMI pour éliminer d'éventuels liposomes contaminants, les BVSM sont remis en suspension dans 250 ml d'un mélange méthanol/eau (50:50) contenant 10 g de butirosine sulfate (Parke-Davis). La suspension ainsi obtenue est concentrée sous pression réduite (30 C, 30 mmHg) au moyen d'un évaporateur rotatif. Lorsque la suspension devient pateuse, on rajoute 250 ml du mélange méthanol/eau. L'opération est ainsi répétée trois fois. Après la dernière concentration, le résidu est repris dans 250ml d'eau puis centrifugé et la butirosine est dosée dans le surnageant par chromatographie liquide haute performance de paire d'ion et par dosage microbiologique sur Bacillus subtilis. Les résultats indiquent la présence de 3 g de butirosine dans le surnageant soit, par différence, 7 g dans le culot contenant les BVSM. On obtient ainsi un taux de charge de 14 U% par rapport au poids de noyaux acylés et un rendement d'encapsulation de 70 %. Après lavage de la butirosine libre par centrifugations successives, l'analyse du surnageant des suspensions contenant les BVSM ne permet pas de mettre en évidence la présence de butirosine. Cette dernière est donc encapsulée de manière stable à l'intérieur des BVSM. La butirosine encapsulée dans les BVSM n'est de plus pas active sur Bacillus subtilis en boîte de Petri. L'ensemble de ces résultats démontre que la butirosine est localisée à l'intérieur des particules, dans le noyau polysaccharidique. Des résultats analogues ont été obtenus avec d'autres aminoglycosides notamment la gentamicine. EXEMPLE 7: CHARGEMENT DU PROPRANOLOL DANS DES BVSM a) Chargement dans la couronne lipidique interne Le propranolol est un béta-bloquant qui possède une structure amphiphile et est soluble dans des solvants polaires et apolaires. On réaiise une suspension avec 50 g de noyaux acylés en CS (1.4 % en poids) dans 500 ml d'un mélange méthanol/eau (50:50). On ajoute à cette suspension, 10 g de propranolol, et on evapore le solvant sous pression réduite (40 C, 30 mm Hg) avec un évaporateur rotatif. Après évaporation complète, le résidu est repris par 200 ml du même mélange méthanol/eau et avaporé à nouveau. Après trois cycles d'evaporation, on ajoute au résidu l0 g de phospholipide (asolectine) sous forme de poudre. On ajoute alor.s 500 ml d'eau par petites fractions et en agitant régulièrement. La suspension est ensuite homogénéisée à l'aide d'abord dtune appareil type Waring blender puis en soniquant ou en extrudant à la presse de French. La suspension est centrifugée et le propranolol est dosé dans le surnageant par la mesure de l'absorption à 290 nm. On trouve une. quantité de 4 g de propranolol dans le surnageant soit par différence 6 g dans les BVSM. Le rendement d'encapsulation est donc de 60 % avec un taux de charge de charge de 12 %. b) Chargement du propranolol dans le feuillet lipidique externe On procède ici comme dans le cas de la gentamicine. On prépare d'abord les BVSM blancs puis on ajoute le propranolol dans une solution methanol/eau (50:50) et on effectue plusieurs cycles de concentra- tion (sans aller à sec toutefois). Le résidu est ensuite resuspendu dans de l'eau, homogénéisé, centrifugé (5000 g, l0 mn) et le propranolol est dosé par spectrométrie UV à 290 nm dans le surnageant. Avec les mêmes quantités que précédemment, on trouve un rendement d'encapsulation de 30 0% et un taux de charge de 6 %, soit des valeurs inférieures de moitié aux valeurs précédentes. EXEMPLE S: CHARGEMENT DE LA DELTAMETHRINE DANS LES BVSM La deltaméthrine est un insecticide de la famille des pyréthrinoîdes. C'est un composé extrêmement hydrophobe, soluble seulement dans les solvants organiques. Le chargement est réalisé à partir de 50 g de noyaux C16 (2 98 d'acide gras greffés). Ces noyaux sont mis en suspension dans 500 ml d'éthanol contenant 5 g de deltamethrine. Le solvant est évaporé sous pression réduite (30 C. 3$ mm Hg) à l'aide d'un evaporateur rotatif. Le résidu est repris dans 300 ml d'éthanol et évaporé à nouveau. Après trois cycles d'évaporation. on ajoute 10 g de phospholipides (asolectine) au résidu sec et on ajoute 500 ml d'eau par petites fractions en agitant constamment. La suspension est ensuite homogénéisée au mixeur Waring et à la presse de French puis centrifugée. Etant donné l'insolubilité de la deltamethrine dans les solutions aqueuses, le dosage ne s'effectue pas sur le surnageant mais après extraction de la deltaméthrine des BVSM. Après plusieurs lavages (eau et mélange méthanol/eau), la suspension est centrifugée (5000g, l0 mn). Le surnageant est éliminé et le culot contenant les BVSM est remis en suspension dans l'éthanol absolu (500 ml)). Après agitation pendant 30. mn, la suspension est centrifugée (3000 g, 5 mn), le surnageant est récupéré et le culot est remis en suspension dans 500 ml d'éthanol absolu. Après trois extractions, les surnageants sont rassemblés et la deltamethrine est dosée par mesure de la densité optique à 278 nm. On trouve 5 g de deltamethrine, soit un rendement d'encapsu- lation de 100 % et un taux de charge de 10 0%. La valeur très élevée du rendement d'encapsulation est certainement due à la grande hydrophobie de la deltamethrine et à sa non solubilité dans l'eau. EXEMPLE 9: CHARGEMENT DU CYTOCHROME C DANS LES BVSM Le cytochrome C est une protéine membranaire qui doit donc posséder une bonne affinité pour les régions lipidiques: couronne interne et feuillet externe. Pour comparer l'efficacité des différents protocoles, nous avons réalisé l'encapsulation sur les noyaux acylés, sur les BVSM et en conjuguant les deux méthodes. Les protocoles appliqués sont les mêmes que ceux utilisés précédemment. Les quantités employées sont: 50 g de noyaux C8, 10 g d'asolectine et 10 g de cytochrome C, l'acétonitrile, moins dénaturant pour les protéines, est substitué au methanol. Conjugaison des deux méthodes Une première encapsulation est réalisée sur les noyaux C8, on prépare ensuite les BVSM par ajout des phospholipides et le traitement habituel. A ce niveau, au lieu de centrifuger les BVSM et de doser le cytochrome dans le surnageant, on rajoute de l'acétonitrile et on refait deux cycles de concentration sous pression réduite (30 C, 30mmHg). Le résidu est alors remis en suspension dans l'eau, homogénéisé, centrifugé et le cytochrome C est dosé dans le surnageant par mesure de la densité optique à 407 nm. On obtient les résultats suivants Protocole Rendement d'encapsulation Taux de charge (%) (%) Noyaux acylés 75 15 BVSM 67 13,4 2 méthodes conjuguées 82 16,4 L'utilisation des deux méthodes conjuguées donne les meilleurs résultats. EXEMPLE 10: CHARGEMENT DU LIPOPOLYSACCHARIDE (LPS) DE SALMONELLA MINNESOTA (S) DANS LES BVSM Le LPS est une macromolécule composée d'une partie polysaccharidique (ou O-antigénique) et d'une partie hydrophobe, le lipide A. Il s'agit d'un constituant membranaire des bactéries gram- normalement situé à l'extérieur des bactéries. La localisation choisie pour le LPS est donc le feuillet externe phospholipidique. On reprend ici le protocole utilisé pour la gentamicine et le propranolol en partant des BVSM blancs. Les BVSM blancs sont préparés comme précédemment, le LPS (L 2137, Sigma) est ajouté aux BVSM en suspension dans un mélange méthanol/eau (30/70). On opère trois cycles de concentration, on resuspend dans l'eau, on homogénise, centrifuge,, et on dose le LPS dans le surnageant par la méthode de Dubois (anthrone). Partant de 50 g de noyaux C8 et de 5 g de LPS. on parvient à encapsuler 4 g de LPS soit un rendement d'encapsulation de 80 % et un taux de charge de 8 %. EXEMPLE 11: CHARGEMENT DE L'ALPHA-CHYMOTRYPSINE MODIFIEE PAR DES CHAINES HYDROPHOBES DANS LES BVSM Préparation de l'alpha-chvmotrypsine modifiée: On ajoute 50 mg de chlorure d'acide palmitique dissous dans ml d'acétone à 100 ml d'un tampon phosphate 10-3 M. 0,145 M NaCI et 1 % de cholate à pH 8. La solution est homogénéisée à l'aide d'un appareil à ultra sons. On ajoute alors l'alpha-chymotrypsine (250 mg) dissous dans 10 ml de tampon. Après deux heures à 4 C, le précipité est séparé par centrifugation (1 heure, 20.000 g) et le détergent est dialysé. Incorporation de l'alpha-chvmotrvpsine modifiée dans les BVSM: On prépare une suspension de BVSM blancs selon la méthode habituelle à partir de 2 g de noyaux C8 et de 400 mg d'asolectine, la solution d'alpha-chymotrypsine modifiée obtenue précédemment est ajoutée à la suspension de BVSM blancs, le mélange est ajusté à 10 % en acetonitrile puis concentré sous pression réduite (1 mmHg, 4 C) au rotavapor. L'opération est répétée 3 fois puis le résidu est remis en suspension dans 50 ml d'eau, homogénéisé et centrifugé. Le dosage des protéines dans les BVSM par la méthode de Bradford indique une quantité de 200 mg, soit un rendement d'encapsulation de 80 % et un taux de charge de 10 9. EXEMPLE 12: CHARGEMENT D'UN ANTICORPS MONOCLONAL MODIFIE PAR DES CHAINES D'ACIDE GRAS DANS LES BVSMN Préparation de l'anticorps modifié: Un milligramme d'anticomplexe HLA-B2m, SAF1 Classl (Biosys) purifié est ajouté à 22 pg de N-hydroxysuccinimide ester d'acide palmitique dans 500 ul de tampon PBS contenant 2 % de désoxycholate. Le mélange est incubé a 37 C pendant 12 heures puis chromatographié sur une colonne Séphadex G 75 dans un tampon PBS contenant 0,15 6 de désoxycholate pour éliminer l'excès d'acide palmitique. Le pic de volume mort contenant l'immunoglobuline est collecté et dialysé. Incorporation de l'anticorps dans les BVSM On utilise une suspension de BVSM blancs correspondant à mg de noyaux C8 dans 200 pIl d'eau. On ajoute la solution d'anticorps obtenue précédemment et on complète à 10 % en acétonitrile. Le mélange est alors concentré sous pression réduite (sans aller à sec) à l'aide d'un appareil type Speed Vac (4 C, 0,01 mmHg). Le mélange est remis en suspension dans 500 pl d'une solution acétonitrile/eau (10:90), puis concentré à nouveau. Après trois cycles de concentration, la suspension est reprise dans 500 pl d'eau, homogénéisée et centrifugée. Le dosage des protéines dans le culot par la méthode de Bradford indique la présence de 1 mg de protéine soit environ 100 % de rendement d'encapsulation et un taux de charge de 5 %. EXEMPLE 13: CHARGEMENT DE L'ERYTHROMYCINE DANS LES BVSM 15. On réalise une suspension avec 50 g de noyaux acylés en C12 (1,5 % en poids) dans 500 ml d'un mélange eau/méthanol (50:50). On ajoute à cette suspension 10 g d'érythromycine, et on évapore le solvant sous pression réduite (40 C, 30 mmHg) avec un évaporateur rotatif. Après évaporation complète, le résidu est repris par 200 ml du même mélange méthanol/eau et evaporé à nouveau. Apres trois cycles d'évaporation, on ajoute au résidu l0 g de phospholipides (Asolectine) sous forme de poudre. On procède ensuite selon la méthode habituelle. L'érythromycine est dosée dans le surnageant par CLHP sur colonne Cl$ et detecte en U.V. à 228 nm. Dans le surnageant, on ne trouve pas d'érythromycine, tout le produit a été encapsulé dans les BVSM. Le rendement d'encapsulation est donc de 100 % avec un taux de charge de 20 %. EXEMPLE 14: CHARGEMENT DES BVSM A PARTIR DU NOYAU POLYSACCHARIDIQUE Ce chargement est possible avec les composés suffisamment polaires pour pénétrer dans le maillage polysaccharidique. Il existe également théoriquement une limite de taille qui est le volume élémentaire définie par une maille (ou diamètre d'exclusion). 2 6 3 1826 Protocole Le-composé à encapsuler (20 g) est ajouté à une suspension de noyaux polysaccharidiques (100 gr dans I I d'eau). Le mélange est evaporé sous pression réduite (30 C. 30 mmHg) et le résidu sec est remis en suspension dans l'eau et re-évaporé à nouveau. Après trois cycles d'évaporation, le résidu est séché sous vide poussé (0,01 mmHg). Les noyaux polysaccharidiques sont alors mis en suspension dans 500 ml de toluene contenant 10 g de chlorure d'acide octanoique et 5 g de diméthylamino- pyridine. Après une heure à 30 C sous agitation, les noyaux acylés sont centrifugés, lavés par du méthanol et séchés sous vide (15 mmHg). Les BVSM sont ensuite préparés selon la technique habituelle à partir de ces noyaux acylés. Les conditions de la réaction d'acylation sont très douces et l'acylation n'a lieu que sur l'extrême périphérie des noyaux. Une faible partie du produit encapsulé doit cependant être également acylée. Ce protocole a eté appliqué à la réalisation de BVSM colorées par de l'encre de chine (platinium ink). Cette dernière est en effet constituée de particules colloidales extrêmement fines (4 nm) qui peuvent pénétrer dans le maillage polyusaccharidique. L'application du protocole ci-dessus a permis d'obtenir des BSM noires, les dosages précis n'ont pas été effectuées. La séparation entre les particules d'encre de chine encapsulées et libres se fait * facilement par sédimentation différentielle. EXEMPLE 15: ETUDE DE LA STABILITE DES PRODUITS ENCAPSULES DANS LES BVSM Cette étude a été réalisée en détail sur les BVSM chargés au propranolol. comme décrit à l'exemple 7. Des résultats similaires ont également été obtenus avec les autres produits. La fuite de propranolol a eté évaluée par la mesure de la densité optique à 290 nm du surnageant d'une suspension de BVSM chargé à 8,4 % en propranolol. Les BVSMN (500 mg de noyaux, 42 mg de propranolol) sont mis en suspension dans 20 ml d'eau. L'analyse du surnageant indique la présence de 1,76 mg de propranolol libre soit 4 % du total. Conservation à,4 C Temps de conservation (jours) 0 1 2 3 4 D.O. 0,241 0,415 0,234 0,228 0,241 % de propranolol libre 4 6,8 3,8 3,8 4 Congélation avant après D.O. 0,241 0,295 % de propranolol libre 4 4,8 Lyophilisation avant après D.O. 0,241 0,247 % de propranolo libre 4 4,1 Dans tous les cas, le taux de fuite est très faible. EXEMPLE 16: ETUDE DE LA PHARMACOCINETIQUE D'ANTIBIOTIQUES ENCAPSULES Afin d'évaluer l'influence de l'encapsulation sur la pharmaco- cinétique de deux antibiotiques: la butirosine selon l'exemple 6, et l'érythromycine selon l'exemple 13, nous avons procédé au dosage plasmatique en fonction du temps de ces deux antibiotiques, après administration sous forme libre et sous forme encapsulée. 2 6 3 1 8 2 6 Protocole expérimental Les injections sont effectuées sur des lapins mâles type "White New-Zealand" d'environ 3 kg, par voie sous-cutanée. Les prélevements sont effectués au niveau de la veine latérale de l'oreille à raison de 200 ul de sang/prélèvement. Le sang est aussitôt centrifugé à 8000 rpm pendant mn. Le sérum est prélevé et conservé à 4 C jusqu'à son utilisation. Méthode de dosage La butirosine, comme l'érythromicine, est dosée par la mesure des zones de lyse (méthode des cylindres d'agar) en milieu gélosé (bioMérieux) ensemencé avec 1000 cfu/ml de Bacillus subtilis et incubé à 37 C pendant 18 heures. Le milieu gélosé bioMérieux consiste en bioGelytone 6 g, extrait de levure 3 g, extrait de viande de boeuf 1,5 g et gélose 15 g pour 1 1 d'eau distillée. Le milieu est ajusté à pH = 9. Protocole Les échantillons de sérum sont déposés dans les puits réalisés sur le milieu gélosé (30 ul/puit). Des solutions de référence représentant des quantités connues d'antibiotique, sont également déposées sur la boîte. BUTIROSINE pg/ml gamme étalon 0,5 1 2 5 10 20 50 Diamètre (mm) 14 17 19 22 24 26 28 Les quantités injectées sont de I ml contenant 9 mg de butirosine sous forme libre ou encapsulée. Temps 30 mn 1lh 2h 4h 6h 12h 18h Butirosine 0 mm 24 23 22 18 13 0 0 libre pg/ml 9 7 5 2 0,1 0 0 Butirosine 0 mm 0 0 0 16 16 14 15 encapsulé pg/ml 0 0 0 0,8 0,8 0,5 0,6 BVSM seuls ipg/ml 0 0 O O O O 0 On constate que la butirosine libre diffuse très rapidement dans le plasma et est éliminée après 6 heures. Au contraire, la butirosine encapsulée apparait dans la circulation beaucoup plus tard (4h) et se maintient à un taux bas mais significatif. ERYTHROMYCINE Les quantités injectés sont de I ml contenant 15 mg d'érythromycine libre ou encapsulée. Pour des raisons de solubilité, l'érythromycine libre est dissoute dans un mélange eau-ethanol (85-15). pIg/ml gamme étalon 10 25 100 250 I 000 Diamètre (mm) 26 29 31 33 37 ?63 1826 Temps 1 h 3h 6h 9h 12h 24h Erythromycine 0 mm 37 35 28 27. 26 libre pg/ml I 000 500 25 15 10 Erythromycine 0 mm 0 32 27 26 26 26 encapsulé pg/ml 0 250 15 10 10 10 BVSM seuls 0 mm 0 0 0 0 0 0 pg/ml 0 0 0 0 0 0 , On constate que l'érythromycine diffuse relativement lentement dans le plasma. La forme libre permet d'atteindre un taux plasmatique initial plus élevé que la forme encapsulée. Au bout de 24 heures aucune différence n'est plus observee entre les deux formes. ?63 1826 REVENDICATIONS 1. Vecteur particulaire, caractérisé en ce qu'il comporte - un noyau hydrophile non liquide - une première couche ou couronne de nature lipidique liée au noyau par des liaisons covalentes - une seconde couche ou feuillet externe de composés amphiphiles liée à la première couche lipidique par des interactions hydrophobes. 2. Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que le noyau hydrophile est constitué d'un polymère hydrophile réticule. 3. Vecteur selon la revendication 2, caractérisé en ce que le polymère hydrophile réticulé est un polysaccharide réticulé. 4. Vecteur selon la revendication 3, caractérisé en ce que le polysaccharide est choisi parmi: le dextrane, l'amidon et la cellulose et leurs dérivés. 5. Vecteur selon l'une des revendications I à 4, caractérisé en ce que le noyau a une dimension moyenne comprise entre 10 et 100 nm. 6. Vecteur selon la revendication 5, caractérisé en ce que le noyau a une dimension moyenne comprise entre 20 et 70 nm. 7. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la première couche est constitué par un composé choisi parmi: les stérols, les acides gras, les amines grasses, les phospholipides, les acides aminés hydrophobes et les alkoxyéthers. 8. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la couche lipidique est couplée chimiquement au noyau par les fonctions hydroxy ou les fonctions dérives des fonctions hydroxy desdits noyaux. 263 1826 9. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la seconde couche est constituée d'un phospholipide ou d'un agent tensioactif. 10. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, dans l'une des couches ou le noyau, une molécule à activité biologique. 11. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la molécule à une activité biologique est choisie parmi - les antibiotiques et les anti-viraux. - les protéines, les protoglycanes, les peptides, - les polysaccharides, les lipopolysaccharides, - les anticorps, - les insecticides et fongicides, - les composés agissant sur le système cardio-vasculaire, les anti-cancéreux, - les anti-malariques, - les anti-asthmatiques. 12. Vecteur selon l'une des revendications I à 11, caractérisé en ce que le vecteur est marque. 13. Vecteur selon la revendication 12, caractérisé en ce que le vecteur est marqué radioactivement. 14. Vecteur selon l'une des revendications I à 13, caractérisé en ce qu'il est stérilisé. 15. Vecteur selon l'une des revendications I à 14, caractérisé en ce qu'il est sous forme lyophilisé avec un agent de lyophilisation. 16. Vecteur selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'agent de lyophilisation est un sucre. ?631826 17. Procédé de préparation d'un vecteur particulaire selon l'une des revendications I à 16, caractérisé en ce que: a) on prépare un noyau par réticulation d'un polymère hydrophile dans des conditions permettant d'obtenir des particules de l'ordre de 10 à 100 nm, b) on couple chimiquement sur les fonctions réactives à la surface du noyau des composés lipidiques afin de former la première couche, c) on introduit enfin des composés amphiphiles en contact hydrophobe avec la première couche afin de créer la seconde couche. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la réticulation de l'etape a) est effectuée dans un non solvant des poly- I 5 saccharides. 19. Procédé selon l'une des revendications 17 et 18, caractérisé en ce que dans l'étape a), les particules sont obtenues par fragmentation. 20. Procédé selon l'une des revendications 17 à 19, caractérisé en cer que l'etape c) est conduite à l'aide d'une methode de préparation des liposomes. 21. Procédé selon l'une des revendications 17 à 20, caractérisé en ce qu'on introduit une molécule à activité biologique durant l'une des étapes du procédé ou dans le vecteur terminé. 22. Composition à activité biologique, caractérisée en ce qu'elle comporte un vecteur selon l'une des revendications 1 à 16. 263 1826 23. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comporte à titre d'agent actif un vecteur particulaire selon l'une des revendications 10 et 11. 24. A titre d'agent de diagnostic, un vehicule particulaire selon l'une des revendications 12 et 13.