FR 2634397 A2 19900126 FR 8808871 A 19880630 La présente invention a pour objet un nou- veau procédé de préparation de systèmes colloidaux dispersibles d une protéine sous forme de particules sphériques de type matriciel et de taille inférieure à 500 nm (nanoparticules). Le brevet principal N' 86 18446 a pour objet un procédé de préparation de systèmes colloidaux dis- persibles d'une substance, sous forme de particules sphériques de type matriciel et de taille inférieure à 500 nm. (nanoparticules), caractérisé en ce que: (1) on prépare une phase liquide constituée essentiel- lement par une solution de la substance dans un sol- vant ou dans un mélange de solvants, et pouvant être additionnée d'un ou de plusieurs surfactifs, (2) on prépare une seconde phase liquide constituée essentiellement par un non-solvant ou un mélange de non-solvants de la substance et pouvant être addi- tionnée d'un ou de plusieurs surfactifs, le non-sol- vant ou le mélange de non-solvants de la substance étant miscible en toutes proportions au solvant ou mélange de solvants de la substance, (3) on ajoute sous agitation modérée, l'une des phases liquides obtenues sous (1) ou (2) à l'autre, de ma- nière à obtenir pratiquement instantanément une sus- pension colloidale de nanoparticules de la substance, et (4) si l'on désire, on élimine tout ou partie du sol- vant ou du mélange de solvants de la substance et du non-solvant ou du mélange de non-solvants de la subs- tance, de manière à obtenir une suspension colloidale de concentration voulue en nanoparticules ou à obtenir une poudre de nanoparticules. Selon la présente invention, ladite subs- tance est une protéine et éventuellement une substance biologiquement active, ledit solvant est l'eau ou un mélange aqueux à une température inférieure à la tem- pérature de coagulation de la -protéine, ledit non-sol- vant de la substance est l'eau à une température supé- *5 rieure à la température de coagulation de la protéine et peut éventuellement contenir une substance biolo- giquement active, et lesdites deux phases liquides (1) et (2) sont rassemblées dans des conditions de.pH éloigné du point isoélectrique de la protéine. Ainsi, le présent procédé est caractérisé en ce que: (1) on prépare une phase liquide constituée essentiel- lement par une solution.de la protéine et éventuelle- ment d'une substance biologiquement.active dans l'eau ou dans un mélange aqueux à une température inférieure à la température de coagulation de la protéine, et pouvant être additionnée d'un ou de plusieurs surfac- tifs, (2) on prépare une seconde phase liquide constituée essentiellement par de l'eau ou d'un mélange aqueux à une température supérieure à la température de coagu- lation de la protéine, pouvant contenir une substance biologiquement active et pouvant être additionnée d'un ou de plusieurs surfactifs, (3) on ajoute sous agitation modérée, l'une des phases liquides obtenues sous (1) ou (2) à l'autre dans des. conditions de pH éloigné du point isoélectrique de la protéine, de manière à obtenir pratiquement instanta- nément une suspension colloidale de nanoparticules de la protéine et éventuellement de la substance biologi- quement active, et (4) si l'on désire. on élimine tout ou partie de l'eau ou du mélange aqueux, de manière à obtenir une suspen- sion colloidale de concentration voulue en nanoparti- cules ou à obtenir une poudre de nanoparticules. La protéine est notamment une protéine natu- relle telle qu'une sérumalbumine (par exemple la sé- rumalbumine humaine ou bovine) ou une élastine (bovi- ne, etc). La substance biologiquement active peut être un principe actif médicamenteux ou un précurseur médi- camenteux, un réactif biologique ou un principe cosmé- tique. L'invention permet d'obtenir des nanoparticules de protéine seule (utilisables telles quelles) ou avec la substance biologiquement active. Il est également possible et même souhaitable en cas d'instabilité thermique, de fixer la substance biologiquement active sur les nanoparticules de protéine déjà formées. Le solvant de la phase (1) qui est l'eau ou un mélange aqueux (par exemple de l'eau acidifiée ou basifiée) se trouve notamment à une température allant de '0 à 50'C. par exemple environ à la température ambiante. Le non-solvant de la protéine dans la phase (2), qui est de l'eau ou un mélange aqueux (par exem- ple de l'eau acidifiée ou basifiée) se trouve notam- ment à une température allant de 80' à 100'C (sous pression atmosphérique), par exemple environ à la tem- pérature d'ébullition. Le pH du mélange des phases (1) et (2) doit être éloigné du point isolélectrique de la protéine afin d'éviter sa floculation. Cette différence de pH souhaitable est de l'ordre de 2 à 3. Les protéines naturelles ayant souvent un pH de l'ordre de 5 à 6, il est souhaitable que la solution finale ait un pH d'en- viron 3 ou d'environ 9. A cet effet, l'acide ou la base peut être ajouté(e) indifféremment à la phase (1) ou (2). La concentration de protéine dans la phase (1) peut varier de 0,1 à 10Z, préférentiellement de 0,5 à 4*. Le rapport des volumes phase (1)/phase (2) peut varier de 0,1 à 1, préférentiellement de 0,2 à 0,6. Finalement, la solution colloidale de nano- particules peut être à volonté concentrée, stérilisée, tamponnée (par exemple au pH physiologique), lyophi- lisée ou réticulée. L'invention permet d'obtenir des nanoparti- cules de protéine notamment de 150 à 300 nm. Les exemples suivants illustrent l'inven- tion: Exemple 1: Préparation de nanoparticules de sérumal- bumine humaine (SAH). Phase 1 SAH 1,0 g Acide chlorhydrique N 0.3 g Eau déminéralisée ou distillée 100,0 g à la température ambiante Phase 2 Eau déminéralisée ou distillée portée à l' ébullition 180,0 g La phase 1 est ajoutée sous agitation magné- tique à la phase 2. Le milieu devient immédiatement opalescent par formation de nanoparticules de SAH. La taille moyenne des nanoparticules, mesurée dans un diffractomètre à rayon laser (Nanosizer R de chez Coultronics) est de 190 nm avec un indice moyen de dispersion de 0,5. La suspension peut etre concentrée sous pression réduite au volume désiré, par exemple 100 cm Exemple 2: Préparation de nanoparticules de sérumal- bumine humaine stériles. On procède comme dans l'exemple 1. puis la suspension est stérilisee à l'autoclave à 134'C pen- dant 15 minutes. La taille moyenne des particules demeure pratiquement inchangée après stérilisation. Exemple 3: Préparation de nanoparticules de sérumal- bumine humaine lyophilisées. On procède comme dans l'exemple 2, puis la suspension stérile est lyophilisée. L'addition d'un cryoprotecteur (maltose, tréhalose... etc) n'est pas indispensable, mais favo- rise la remise en suspension du lyophilisat. La taille moyenne des particules demeure inchangée après lyophi- lisation. ExemDle 4: Préparation de nanoparticules de sérumal- bumine humaine réticulées. On procède comme dans l'exemple 1, mais en ajoutant 0,06 g d'une solution aqueuse de glutaraldé- hyde à 25. (p/v) à la phase 1. La taille moyenne-des particules demeure inchangée après réticulation. Exemple 5: Préparation de nanoparticules de sérumal- bumine bovine (SABS). On procède comme dans l'exemple 1, en rem- plaçant la SAH par de la SAS et en remplaçant l'acide chlorhydrique normal par la même quantité de soude 0,01N. La taille moyenne des nanoparticules est de 150 nm avec un indice moyen de dispersion de 0,5. Les nanoparticules de SAB peuvent être réti- culées,stérilisées à l'autoclave et lyophilisées comme celles de SAH. Exemole 6: Préparation de nanoparticules d'élastine. On procède comme dans l'exemple 1 mais en remplaçant la SAH par de l'élastine. La taille moyenne des nanoparticules est de 280 nm avec un indice moyen de dispersion de 1. Les nanoparticules d'élastine peuvent être 26q397 réticulées, stérilisées à l'autoclave et lyophilisées comme celles de SAH. Exemple 7: Adsorption d'un principe actif sur des nanoparticules protéiques. Aux nanoparticules préparées selon l'exemple 1 (SAH) ou selon l'exemple 5 (SAB) on ajoute des quan- tités croissantes (de 0,25g à-2,50g) de salicylate de sodium. Le taux de fixation du salicylate de sodium sur les nanoparticules, mesuré après ultracentrifuga- tion, est de 60B de la quantité mise en oeuvre, quelle que soit la quantité de principe actif ajouté. Exemple 8: Préparation de nanoparticules en présence d un principe actif. On procède selon l'exemple 1 (19 de SAH) ou selon l'exemple 5 (19 de SAB), mais en présence de 0,50g de salicylate de sodium dissous dans la phase 1. La taille moyenne des nanoparticules est de 200 nm avec un indice moyen de dispersion de 0,5. Le taux de fixation du salicylate de sodium sur les nanoparticu- les, mesuré après ultracent-rifugation, est de 601 de la quantité mise en oeuvre. Exemple 9: Variante de l'exemple 8. On procède selon l'exemple 8, mais le sali- cylate de sodium est dissous dans la phase 2. Les nanoparticules obtenues ont les memes caractéristiques que celles de l'exemple 8. Exemple 10: Préparation de nanoparticules protéiques de doxorubicine. Aux nanoparticules préparées selon l'exemple I (SAH) ou selon l'exemple 5 (SAB) on ajoute 50 mg de chlorhydrate de doxorubicine. Le taux de fixation de la doxorubicine sur les nanoparticules, mesuré après ultracentrifugation, est de 90Z de la quantité mise en oeuvre. 2631r3 7 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de systèmes col- loidaux dispersibles d'une substance sous forme de nanoparticules selon la revendication 1 du brevet principal, dans lequel (1) on prépare une phase liquide constituée essen- tiellement par une solution de la substance dans un solvant ou dans un mélange de solvants, et pouvant être additionnée d'un ou de plusieurs surfactifs, (2) on prépare une seconde phase liquide constituée essentiellement par un non-solvant ou un mélange de non-solvants de la substance et pouvant être addition- née d'un ou de plusieurs surfactifs, le non-solvant ou le mélange de non-solvants de la substance étant mis- cible en toutes proportions au solvant ou mélange de solvants de la substance, (3) on ajoute, sous agitation modérée, l'une des pha- ses liquides obtenues sous (1) ou (2) à l'autre, de manière à obtenir pratiquement instantanément une sus- pension colloidale de nanoparticules de la substance, et (4) si l'on désire, on élimine tout ou partie du sol- vant ou du-mélange de solvants de la substance et du non-solvant ou du mélange de non-sulvants de la subs- tance, de manière à obtenir une suspension colloïdale de concentration voulue en nanoparticules ou à obtenir une poudre de nanoparticules, caractérisé en ce que ladite substance est une pro- téine et éventuellement une substance biologiquement active, ledit solvant est l'eau ou un mélange aqueux à une température inférieure à la température de coagu- lation de la protéine, ledit non-solvant de la subs- tance est l'eau à une température supérieure à la tem- pérature de coagulation de la protéine et peut éven- tuellement contenir une substance biologiquement acti- ve, et lesdites deux phases liquides obtenues dans (1) et (2) sont rassemblées dans des conditions de pH éloigné du point isoélectrique de la protéine. 2. Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que la protéine est une sérumalbumine. 3. Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que la protéine est une élastine. 4. Procédé selon '1 une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la substance biologiquement active est un principe actif médicamenteux ou un pré- curseur médicamenteux, un réactif biologique ou un principe cosmétique. 5. Procédé s.elon l'une quelconque des reven- dications 1 à 3, caractérisé en ce que'la substance biologiquement active est fixée sur les nanoparticules de protéine seule déjà formées dans l'étape (3). 6. Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 5, caractérisé en ce que l'eau ou le-mé- lange aqueux de la phase préparée en (1) est à une température de '0 à 50'C. 7. Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 6, caractérisé en ce que l'eau ou le mélange aqueux de la phase préparée en (2) est à une température de 80' à 100C. 8. Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 7, caractérisé en ce que le pH du mélan- ge des phases préparées en (1) et (21 est éloigné de 2 à 3 du point isoélectrique de la protéine. 9. Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 8, caractérisé en ce que la concentra- tion de protéine dans la phase préparée en (1) est de 0,1 à 101, préférentiellement de 0.5 à 4X. 10. Procédé selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 9. caractérisé en ce que le rapport des volumes phase préparée en (1)/phase préparée en (2) est de 0,1 à 1, préférentiellement de 0,1 à 0,6. 11. Procédé selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 10, caractérisé en ce que dans l'étape (4) la totalité de l'eau est éliminée par lyophilisation. 12. Procédé selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 11. caractérisé en ce que les nano- particules ont une taille d'environ 150 à 300 nm.