FR 2634495 A1 19900126 FR 8808978 A 19880701 L'invention concerne des systèmes d'expression inductibles, les souches transformées correspondantes et leurs méthodes d'obtention pour produire des protéines, notamment des protéines hétérologues, dans les levures. La technique de l'ADN recombinant permet d'exprimer des gènes de protéines hétérologues dans les levures. Ainsi, la construction de vecteurs renfermant des séquences promoteurs de levure correspondant aux gènes d'enzymes glycolytiques de Saccharomyces cerevisiae tels que la 3phosphoglycérate kinase (PGK), une alcool déshydrogénase (ADHI) ou la glycéraldéhyde 3 phosphate déshydrogénase (GPD), ont permis de produire des protéines intéressantes par fusion de leur séquence codante au promoteur de levure, par exemple l'interféron leucocytaire selon Hitzeman R.A. et al. Nature 293, 717-722 (1981) ou l'antigène de surface de l'hépatite B selon Bitter G.A. et ai. Gene 263-274 (1984). Dans de nombreux cas, il a été observé que la protéine hétérologue produite est toxique pour la celule hôte et provoque l'instabilité des plasmides et la sélection. de cellules qui n'expriment plus la protéine concernée. Des méthodes permettant de réprimer l'expression du gène de la protéine pendant la phase de croissance cellulaire, puis d'induire une production élevée de la protéine pendant le stade final de culture, ont été trouvées en utilisant un promoteur régulé par un changement en sources carbonées, par exemple le promoteur du gène de la galactokinase (GALI) ou le promoteur du gène de l'uridine diphosphoglucose 4-épimérase (GALIO) qui correspondent à deux des quatre gènes responsables de l'utilisation du galactose chez la levure et dont l'expression est réprimée par le glucose et induite par le galactose. Des vecteurs comprenant le promoteur GALI lié à un gène hétérologue ont été décrits, permettant de faire croître la levure dans un milieu contenant du glucose, puis de faire exprimer la protéine quand le galactose est présent dans le milieu. Des souches de levure transformées avec de tels vecteurs sont décrites, par exemple dans la demande de brevet GB 2 137 208 qui, sous le contrôle du promoteur GALI, expriment en présence de galactose des protéines telles que l'hormone de croissance bovine ou la prorénine. La plupart des promoteurs de levure renferment en amont d'éléments TATA qui médient l'initiation de la transcription, des éléments régulateurs de la transcription "upstream activating sequence" (noté UAS) qui représentent le site de fixation de protéines régulatrices de la transcription, tels que GAL4 pour l'activation des gènes du métabolisme du galactose, elles- mêmes sous le contrôle de leurs propres promoteurs. Différents moyens ont déjà été proposés pour améliorer l'efficacité de transcription de gènes hétérologues dans les levures. En particulier, il a été- proposé d'utiliser des promoteurs hybrides qui comportent, en amont de l'élément TATA d'un promoteur constitutif de levure, une séquence régulatrice UAS extrinsèque, telle que UASg qui correspond à la séquence intergénique GALI-GAL10 et que l'on insère par exemple en amont de l'élément TATA d'un promoteur constitutif de levure tel que GPD, comme cela est décrit dans la demande de brevet WO 86/00680, ou tel que PGK, comme cela est décrit dans la demande de brevet EP 258 067. Les séquences UASg insérées permettent successivement de réprimer puis d'exprimer le promoteur constitutif par la source de carbone utilisée telle que le glucose comme répresseur et le galactose comme inducteur. Cependant, la mise en oeuvre des promoteurs en général ou de tout promoteur hybride implique une maîtrise difficile à réaliser des niveaux totalement réprimés ou induits parce qu'ils font intervenir un ensemble de protéines régulatrices de la transcription. Ainsi, le gène GAL4 active la transcription par la présence de galactose qui est directement ou indirectement responsable de la dissociation d'un complexe entre GAL4 et une protéine antagoniste GAL80, tandis que d'autres protéines intervien- draient dans la répression par le glucose, telles que GAL82 et GAL83 selon Yocum R.R. et al., MBC 4 1985-1998 (1984). En plus des inconvénients évoqués précédemment, ce type de systèmes inducteurs au galactose et/ou iépresseurs au glucose ne sont pas très polyvalents, en effet, ils ne peuvent pas être utilisés pour des levures qui n'assimilent pas le glucose et/ou le galactose et ne peuvent pas être utilisés dans le cas o l'un de ces éléments constituent tout ou partie du substrat carboné du milieu de culture. Il est donc intéressant de disposer chez les levures de systèmes inducteurs pouvant être induits par des produits qui ne sont pas, en euxmêmes, nécessaires à la culture de ces cellules, c'est le cas par exemple des hormones, notamment des hormones stéroldiennes. C'est pourquoi, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une protéine par des levures, selon lequel - on cultive des cellules de levure qui contiennent: une séquence d'ADN codant pour ladite protéine sous le contrôle d'éléments assurant son expression dans les levures, lesdits éléments comprenant une séquence de contrôle de transcription inductible par un complexe formé par un récepteur et un ligand,. 15. une séquence d'ADN fonctionnelle dans la levure codant pour ledit récepteur, le récepteur comprenant deux parties essentielles dont l'une reconnaît le ligand de façon à former un complexe avec ledit ligand et l'autre se fixe sur ladite séquence contrôle de transcription, la partie du recepteur qui reconnaît le ligand est d'origine eucaryote supérieure et le ligand n'est pas nécessaire à la culture des cellules mais est susceptible de pénétrer dans lesdites cellules lorsqu'il est ajouté au milieu de culture, - on ajoute ledit ligand dans le milieu de culture à un moment convenant pour l'induction, - on récupère la protéine synthétisée. L'expression des protéines par des levures utilisant les techniques des ADN recombinants est considérée comme étant bien connue de l'homme de métier. Un nombre considérable de publications ont déjà décrit la préparation de protéines, notamment de protéines hétérologues, grâce à des levures en utilisant des vecteurs d'expression. Ces vecteurs d'expression comportent la plupart du temps, outre la séquence codant pour ladite protéine, les éléments contrôlant son expression dans les levures, c'est-à-dire en général un promoteur et un terminateur. Dans la plupart des cas, ces vecteurs sont des vecteurs non intégratifs, c'est-à-dire des plasmides, ils comportent alors une origine de réplication efficace dans les levures, notamment l'origine du plasmide 2p ou une séquence ars propre à ladite levure. Ces vecteurs d'expression non intégratifs comportent, en outre, des éléments permettant d'assurer leur maintien dans les cellules, soit en utilisant comme marqueur de sélection un gène de résistance ou bien un élément complémentant une auxotrophie de la souche hôte URA3 ou LEU2 par exemple. Dans certains cas, et afin de pallier les inconvénients liés à l'utilisation de vecteurs à autoréplication, on a pu développer des vecteurs assurant l'intégration des séquences en cause au niveau chromosomique. Ce type de vecteur permet d'obtenir une souche plus stable mais l'amplification au niveau de l'expression est parfois plus faible qu'avec un plasmide non 1 5 intégratif. Les vecteurs d'intégration comportent la plupart du temps au moins une séquence homologue d'une séquence chromosomique qui assurera l'échange et l'intégration. Il doit être compris que - la présente invention portant essentiellement sur l'induction de la transcription, les vecteurs d'expression qui seront mis en oeuvre peuvent être aussi bien de type intégratif que non intégratif. Bien que le procédé en cause soit plus particulièrement destiné à la préparation de protéine hétérologue, il est possible de l'utiliser pour exprimer des protéines de levures, notamment dans le cas de systèmes assurant l'hyperexpression d'un gène qui peut conduire dans certains cas à la mort des cellules avant que l'optimum de biomasse soit obtenu. Par "protéine hétérologue", on entend une protéine étrangère à la cellule hôte qui l'exprime, c'est-a-dire d'origine différente de celle de la cellule hôte qui, selon l'invention, est une levure. La protéine peut être d'origine bactérienne, par exemple la béta-galactosidase d'Escherichia coli, ou d'origine d'eucaryotes supérieurs, par exemple d'origine humaine, telle que par exemple les lymphokines, les facteurs de la coagulation sanguine, des hormones, des antigènes vaccinaux, et, d'une manière générale, toute protéine d'intérêt thérapeutique ou industriel. Comme cela a été indiqué, l'élément essentiel de l'invention est l'association d'une séquence de contrôle de transcription et d'un récepteur complexé à un ligand. Le choix de la première est conditionné par le choix du deuxième. Parmi les séquences de contrôle de transcription utilisables, on peut citer en particulier les séquences habituellement fonctionnelles dans les cellules eucaryotes supérieures, c'est-à-dire des séquences naturelles d'activation de la transcription de cellules eucaryotes supérieures, telle que par exemple un HRE "pour "hormone responsive element") ou un variant ou un dérivé synthétique d'une telle séquence, et qui dans la levure remplit également cette fonction d'activation de transcription. Ces séquences sont, en général, des séquences palindromiques parfaites ou imparfaites, naturelles ou synthétiques. Ainsi, par exemple, dans le cas o la séquence contrôle de transcription utilisée est une séquence HRE, le récepteur est l'hormone correspondante. On entend donc par "récepteur" au sens de l'invention, une protéine fonctionnelle dans des cellules eucaryotes supérieures, o.u des variants ou dérivés synthétiques correspondants qui présentent dans la levure les propriétés fonctionnelles du récepteur natif. Le terme "récepteur" comprend également des protéines chimériques, c'està-dire une structure dans laquelle les deux parties essentielles sont d'origines différentes. Par exemple, une combinaison préférée consiste à préparer un récepteur hybride dans lequel la partie qui reconnaît le ligand est d'origine eucaryote supérieure et la partie qui se fixe sur la séquence de contrôle de transcription est d'origine de levure, mais il est possible d'utiliser des séquences provenant de tout autre microorganisme, par exemple des bactéries. La séquence de contrôle de transcription comprend alors une séquence fonctionnelle dans les levures, c'est-à-dire une séquence naturelle d'activation de la transcription dans les levures. On peut citer, par exemple, I'UAS du promoteur GALI qui est un promoteur de levure. L'invention a donc pour objet les différentes combinaisons fonctionnelles entre une séquence de contrôle de transcription, qu'elle soit naturelle ou dérivée, notamment par synthèse chimique, et le récepteur qui peut être un récepteur naturel, dérivé ou chimérique. La nature du ligand est à son tour déterminée par le choix du récepteur. Parmi les récepteurs utilisables, il faut citer les récepteurs nucléaires, notamment à un stérotde, et les autres récepteurs nucléaires, par exemple aux rétinoîdes ou aux hormones thyroïdiennes ainsi que la vitamine D3. Le récepteur à un stéroîde peut être un récepteur naturel aux hormones stéroides, par exemple le récepteur aux oestrogènes, le récepteur à la progestérone, le récepteur à la testostérone ou un récepteur variant ou un dérivé chimérique, fonctionnel vis-à-vis de la séquence contrôle de la transcription. Le stéroîde peut être un stéroîde naturel tel que l'oestradiol, la progestérone, la testostérone ou un analogue ou un dérivé, fonctionel dans le complexe auquel est sensible la séquence contrôle de la transcription que renferme le vecteur de l'invention. Le récepteur aux oestrogènes peut être le récepteur naturel (noté plus loin hER) ou un variant ou un dérivé chimérique, fonctionnel en présence d'oestradiol vis-à-vis de la séquence contrôle de la transcription que renferme le vecteur de l'invention. L'invention concerne particulièrement le cas dans lequel la séquence de contrôle est la séquence -605 à -634 du gène de la vitellogénine de poulet qui est la séquence contrôl61e de la transcription de ce gène, sensible à l'oestradiol (notée plus loin ERE pour "estrogen responsive element"). La synthèse d'oligonucléotides, renfermant cette séquence ou des répétitions de celle-ci permet d'obtenir, selon l'invention, un vecteur d'expression comprenant cette séquence ou des répétitions de. celle-ci (notée plus loin EREI ou ERE3). Un des avantages de l'invention est que l'induction de l'expression peut être déclenchée de façon très simple, par ajout au milieu de culture d'un ligand adapté au récepteur. La mise en oeuvre de l'induction devient donc totalement indépendante de la nature du milieu de culture. Le moment convenant pour l'introduction du ligand peut être facilement déterminé; en pratique, il s'agira du moment o un haut niveau de biomasse a été atteint dans la cuve de fermentation. L'invention concerne tout particulièrement les vecteurs dont la structure et le procédé d'obtention seront donnés plus loin à titre d'exemple dans la partie expérimentale. Il convient de remarquer que les éléments d'expression de la protéine et les éléments assurant l'expression du récepteur peuvent se trouver sur un seul plasmide ou sur deux plasmides différents comportant chacun une origine de réplication fonctionnelle dans les levures. Mais il est également possible de prévoir l'utilisation de vecteurs assurant l'intégration de certains de ces éléments, par exemple la production du récepteur peut provenir de séquences intégrées sur un chromosome de la cellule. C'est pourquoi la présente invention concerne également les vecteurs portant les séquences utilisables pour la transformation des cellules de levures. L'invention s'étend aussi aux souches de levures utilisables dans le procédé selon de l'invention. Comme souches de levures, toutes les souches utilisées habituellement pour l'obtention de protéines recombinantes peuvent être utilisées. On peut citer notamment les souches de Saccharomyces telles que S. cerevisiae. En particulier, on peut citer les souches présentant une ou plusieurs déficiences en activité protéolytique, par exemple présentant la mutation pep4. L'utilisation de ces souches permet d'améliorer la qualité des protéines obtenues. Sur les figures annexées, la figure I représente la structure de pTG848, la figure 2 schématise la stratégie permettant de préparer pYERE, la figure 3 schématise la stratégie permettant de préparer pYERE/hER, la figure 4a schématise les structures de pYEREI/hER, pYEREm/hER, pYERE3/hER, pYGAL/hER et montre les séquences des éléments ERE et EREm, 5. la figure 4b montre, pour les ARN extraits des cellules induites ou non induites contenant les plasmides indiqués, les fragments ARN protégés de la digestion par les ribonucléases A et TI après hybridation avec une sonde ARN Gall anti-sens. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE 1: Construction des vecteurs pYERE/hER Méthodes Les techniques de Biologie Moléculaire utilisées pour la construction des différents plasmides sont décrites dans les manuels "Molecular cloning a laboratory manual", T. Maniatis, E.F. Fritsch et 3. Sambrook, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1982) et "Current Protocols in Molecular Biology" F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, 3.A. Smith, 3.G. Seidman et K. Sruhl, Greene Publishing Associates and Wifey Intersceinces (1987). Elles comprennent notamment la digestion de l'ADN par les enzymes de restriction, la séparation des fragments ADN par électrophorèse en gel agarose ou polyacylamide, la ligation de fragments ADN par l'enzyme T4 DNA ligase, la transformation de E. coli par les plasmides recombinants, la détermina- tion de la séquence nucléotidique par la technique de Sanger. Les plasmides utilisés portent le gène de résistance à l'ampicilline, ce qui permet la sélection des bactéries transformées par un plasmide sur boite agar contenant de l'ampicilline (50 lig/ml). La souche de E. coli utilisée est la souche DH5 génotype: F-, endAl, HsdR17(rk-md+), supE44, thi-l, lambda-, reca&, gyrA96, relAI (Hanahan DNA'cloning:a practical approach (Vol. 1= p. 109-135, ed. D.M. Glover, IRL Press, Oxford (1985)). Les techniques de transformation et de croissance des souches de levure sont décrites dans "Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics", F. Sherman,G.R. Find et J.B. Hicks, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1986). La souche de levure utilisée est la TGYI4-la, pep4.3 genotype Mat a, ura3251-373-328, leu2, pep4.3 le plasmide parent pTG848, décrit dans le brevet n EP200655, est un plasmide navette E. coli/levure, qui permet l'expression dans la levure d'un gène exogène sous le contrôle mdu promoteur du gène phosphoglycerate kinase (PGK). Ce plasmide contient une origine de réplication pBR 322 et le gène de résistance à l'ampicilline pour la sélection dans E. coli, une origine de réplication 2 pm et les gènes ura3 et leu2 pour la sélection dans la levure, ainsi que le promoteur du gène PGK et son extrémité 3 contenant le.signal de polyadénylation. Ce gène a été modifié de manière à introduire un site Bgll au niveau de l'ATG initiateur, ce qui permet d'insérer la région codante d'une autre protéine entre ce site et le site BgAII situé en amont du signal de polyadénylation (figure 1) Construction des plasmides pUC18 EREI, PuCUI8 EREm, PUCl8 ERE-3 le plasmide pUC18 (C. Yanisch-Perron, J. Vieira et J. Messing, Gene 33, 103-1190 (1986)) contient une origine de réplication pBR322, le gène de résistance à l'ampicilline et un polylinker comprenant notamment les sites Xbal et HindllI. Ce plasmide a été digéré par les enzymes de restriction Xmal et HindIll; au plasmide ainsi digéré on ajoute alors par les techniques oligonucléotides complémentaires: '-CCGGGTCTAGAAGATCTA3' 3'CAGATCTTCTAGATTCGA5' Le plasmide dérivé pUC18 BgllI a alors un polylinker qui contient dans l'ordre les sites Xmal, Xbal, BgllI et HindllI. Dans ce plasmide digéré par BglII, on introduit respective- ment les fragments constitués des oligonucléotides complémentaires EREI: 5'GATCCAATATTCCTGGTCAGGCGTGACCGGAGCTGA3' 3'GTTATAAGGACCAGTCGCACTGGCCTCGACTCTAG5' EREm: 5'GATCCAATATTCCCCGTCAGCGTGACCGGAGCTGA3' 3'GTTATAAGGGGCAGTCGCACTGGCCTCGACTCTAG5' ERE3 qui consiste en une répétition directe de trois fragments EREI. EREI contient la séquence ERE( (pour "estrogen responsive element")-605 à -634 du promoteur de la vitellogénine. EREm est un mutant o une transversion GC dans la séquence ERE réduit considérablement son activité dans les cellules MCF-7. Construction des plasmides PLREREI, pLREREm, pLRERE3 Le plasmide pLRI 620 est décrit dans l'article de R.W. West, R.R. Yocum et M. Ptashne, Molecular and Cellular Biology 4, 2 467-2 478 (1984). Ce plasmide contient un gène actif et chimérique de béta- galactosidase sous contrôle du promoteur GAl l (figure 2). le but de la construction est de remplacer les UAS ("upstream activating sequence) du gène Gall 1, situées entre les sites Xmal et Xhol de la région promoteur Gall 1, par les fragments EREI, EREm, ERE3, respectivement, pLREREI: Le plasmide pUC18EREI est digéré par l'enzyme de restriction BgllI. Le site est rempli avec la DNA Polymerase I (fragment de Klenow) en présence des 4 déoxynucléotides triphosphates. Un linker XhoI (Biolabs ref. 1030) est alors ajouté aux extrémités: le plasmide est ensuite digéré par XmaI et XhoI et le fragment XmaI-XhoI contenant la séquence EREI est isolé. Ce fragment est ensuite cloné dans le plasmide pLRI 20 entre les sites XmaI et XhoI pour donner le plasmide pLREREI. pLREREm, pLRERE3: On construit de la même façon les plasmides pLREREm et pLRERE3 en remplaçant pUC18EREI par UC18EREm et pUC18ERE3, respectivement, dans le protocole ci-dessus. l Construction des plasmides PYEREI, pYEREm, pYERE3: Les plasmides pLREREl, pLREREm, pLRERE3 possèdent à l'extrémité 3' du gène chimérique lacZ (beta-galactosidase) un site TthlllI (figure 2). pYEREI: le plasmide pLREREI est digéré par l'enzyme Tthl III; le site est ensuite rempli avec la DAN Polymérase I (fragment de Klenow). Un linker Xmal (Biolabs ref. 1048) est alors ajouté aux extrémités. L'ADN est digéré par XmaI, et le fragment XmaI-XmaI contenant le gène chimérique lac Z sous contrôle du promoteur hybride (EREA-Gall) est inséré au site unique Xmal du plasmide pTG848, pour donner le plasmide pYEREI. pYEREm, pYERE3: On construit de la même façon les plasmides pYEREm et pYERE3 en remplaçant pLREREI par pLRERE3, respectivement, dans le protocole ci-dessus. Construction du plasmide pYGAL Le plasmide pLRIe20 est digéré par l'enzyme de restriction Tthl lll, le site est ensuite rempli avec' l'ADN polymérase I (fragment de Klenow). Un linker XmaI (Biolabs ref. 1048) est ajouté aux extrémités, puis l'ADN est digéré par l'enzyme XmaI. Le fragment XmaI contenant le gène chimérique lacZ sous contrôle du promoteur Gall est inséré au site XmaI du plasmide pTG848, donnant le plasmide pYGAL. Construction des plasmides pYEREI/hER, pYEREI/hERR, pYEREm/hER, pYERE3/hER, pYGAL/hER: Le but de ces constructions est de placer le cADN codant pour le récepteur oestrogène humain (hER) sous contrôle du promoteur PGK, au site Bglll des plasmides pYEREI, pYEREm, pYERE3, pYGAL (fig. 3). Le plasmide pKCR2-ER contenant le cADN du récepteur oestrogène humain (S. Green et coll. Nature 320, 134-139 (1986)) est digéré par l'enzyme de restriction EcoRI, le site est ensuite rempli par l'ADN polymérase I (fragment de Klenow). Un linker BamHI (Biolabs ref. 102) est alors ajouté aux extrémités. Après digestion par BamHI, le fragment codant pour le récepteur oestrogène humain est isolé. I1 est inséré dans le vecteur pYERE1 digéré par BgllI pour créer les plasmides pYEREI/hER et pYEREI/hERR, qui diffèrent. par l'orientation du cADN hER relativement au promoteur PGK. Dans pYEREI/hER, le promoteur PGK est situé en 5' du cADN hER et induit donc la transcription de l'ARNm codant pour la protéine hER. Dans pYEREI/hERR, l'orientation est inverse et induit donc la transcription d'un ARN anti-sens de l'ARN messager hER. pYEREm/hER, pYERE3/hER, pYGAL/hER sont construits sur le même modèle que pYEREI/hER en remplaçant pYEREI par pYEREm, pYERE3, pYGAL, respectivement, dans la construction précédente. Ces plasmides (fig. 4a) construits dans E. coli DH5 sont transférés dans la souche de levure TGY14.la qui porte la mutation ura3. La présence du gène ura3 sur ces plasmides permet la complémentfation, pour les levures transformées par un plasmide, qui sont donc sélectionnées sur boîte agar contenant un milieu sans uracile (préparation: 0,67 g milieu Difco n 0919-15, 0,5 g casaminoacides, I g glucose, 2 g Agar, pour 100 ml). EXEMPLE 2: Induction par l'oestradiol de la transcription pour les promoteurs hybrides ERE Gall portés par les vecteurs pYERE/hER Les différentes levures contenant les plasmides pYEREI/hER, pYEREm/hER, pYERE3/hER, pYEREI/hERR, pYGAL/hER, respectivement, sont cultivées dans le milieu de base pour levure (Difco n 0919-15) à raison de 0,67 g/100 ml et 0,5 % casaminoacides contenant du glucose I % ou du galactose 2 % ou 100 nM oestradiol (ajouté à la culture 2 heures avant de récupérer les cellules) comme indiqué fig. 4b. L'ARN est préparé à partir de 109 cellules selon le protocole décrit dans Methods in Yeast Genetics, p-143-144. Pour mesurer l'activité transcriptionnelle des promoteurs Gall ou EREGall, ces ARN sont hybridés avec une sonde ARN radiomarquée dérivée de l'extrémité 5' du gène Gall (brin complémentaire de I'ARN messager). Les fragments hybridés seront protégés de la digestion par les RNases A et TI. La sonde est préparée à partir du fragment EcoRI (contenant le promoteur Gall 1) du plasmide pLRI 20 (R.W. West, R.R. Yocum et M. Plashne, Molecular and Cellular Biology 4, 2467-2478 (1984)) cloné dans le plasmide Bluescribe M13+ (Stratagène ref. 211201). Le plasmide résultant est ensuite linéarisé par HindII et la sonde radiomarquée est ensuite synthétisée à partir du promoteur du phage T7 avec le Kit Stratagène n 211604. La taille de la sonde est de l'ordre de 1000 nucléotides. Il existe plusieurs sites d'initiation de la transcription dans le promoteur Gall, la sonde est complémentaire de I'ARN de Gall sur une longueur de 154 à 165 nucléotides. La sonde est incubée avec 20 gpg d'ARN et le mélange contenant les hybrides éventuels est digéré avec les ribonucléases A et TI selon le protocole décrit dans Current Protocols in Molecular Biology. Les fragments non digérés sont ensuite identifiés par électrophorèse en gel polyacrilamide-urée et autoradiographie (fig. 4b). Pour les constructions exprimant le récepteur hER, on observe, en présence d'oestradiol, l'induction d'un ARN messager spécifique du promoteur hybride ERE-Gall; les sites d'initiation de la transcription sont identiques à ceux du promoteur Gall (pYGAL) induit par le galactose fragments protégés de même taille. L'induction de la transcription à partir du promoteur hybride ERE-Gall est strictement dépendante de la présence d'oestradiol. L'induction par l'oestradiol nécessite la présence du récepteur hER (la construction pYERE/hERR est inactive). Elle nécessite également la présence d'un élément ERE (pour la construction pYGAL/hER il n'y a pas d'induction par l'oestradiol. La quantité d'ARN Gall détectée pour les cellules contenant pYERE3/hER est environ 10 fois plus élevée que pour celles contenant pYEREI/hER: la répétition en tandem des éléments ERE (pYERE3 contient un trimère ERE, pYEREI un monomère) paraît donc avoir un effet de synergie sur l'activation de la transcription. EXEMPLE 3: Expression inductible par l'oestradiol de la bétagalactosidase dans des levures contenant les vecteurs pYERE/hER L'activité béta-galactosidase est mesurée selon le protocole de West et coll. (1984). Le tableau 1 ci-après montre l'activité béta- galactosidase des souches de levure portant respectivement les plasmides pYEREI/hER, pYERE3/hER, pYEREm/hER, pYEREI/hERR, pYGAL/hER en présence ou absence du glucose, galactose ou oestradiol, comme indiqué dans le tableau. Le niveau d'activité constitutive des promoteurs est très bas et n'est pas affecté par la présence de la protéine hER (pYGAL et pYGAL/hER ou pYEREI/hER et pYEREI/hERR, donnent le même taux d'activité). Par contre, l'addition d'oestradiol entraîne une forte induction des promoteurs hybrides de pYEREI/hER et pYERE3/hER. Le fait que les promoteurs de pYEREm/hER et pYGAL/hER ne soient pas sensibles à l'induction par l'oestradiol montre la nécessité d'un élément ERE fonctionnel, dans le promoteur contrôlant l'expression de lacZ, tandis que l'absence d'induction pour pYEREI/hERR montre que la présence durécepteur hER est également nécessaire pour observer l'induction par l'oestradiol. Le niveau d'expression atteint est comparable à celui obtenu à partir du promoteur Gall (cas de pYGAL/hER) en présence de galactose. La présence de trois éléments ERE en tandem (cas de pYERE3/hER) donne une activité deux fois supérieure au cas o le promoteur contient un seul élément ERE (pYEREI/hER). Tableau I Induction en présence d'hormone de l'activité béta-galactosidase par le yhER PLASMIDE MILIEU ACTIVITE BETA-GALACTOSIDASE Glucose Galactose Oestradiol (unité) pYERE 1 /hER + - - 60 pYEREl/hER + -+ 1 060 pYERE/hERR + - - 60 pYEREl/hERR + - + 60 pYERE3/hER + - pYERE3/hER - + 2 060 pYERE3/hER * - + 2 060 pYEREM/hER + - - 60 pYEREM/hER + - + - 260 pYGAL/hER + - - 180 pYGAL/hER + - + 180 pYGAL - - 180 pYGAL + - 2 300 Les levures transformées par les plasmides indiqués sont mises en culture en présence de 1 % de glucose ou 2 % de galactose, comme mentionné dans le tableau; pour l'induction par l'oestradiol, on ajoute nM d'hormone 2 heures avant la récolte des cellules. Les tests d'activité béta-galactosidase sont effectués de manière classique (West R.W. jr., Yocum R.R. et Ptashne M., Mol. Cell. Biol., 4, 2467-2478 (1984). La souche Saccharomyces TGY 14-la pYERE3/HER a été déposée à la Collection Nationale de cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur rue du Docteur-Roux, 75724 Paris Cédex 15 (France) - le 17 juin 1988 sous le n 1-770. REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation d'une protéine par des levures, selon lequel on cultive des cellules de levure qui contiennent 5.une séquence d'ADN codant pour ladite protéine sous le contrôle d'éléments assurant son expression dans les levures, lesdits éléments comprenant une séquence de contrôle de transcription inductible par un complexe formé par un récepteur et un ligand, une séquence d'ADN fonctionnelle dans la levure codant pour ledit récepteur, le récepteur comprenant deux parties essentielles dont l'une reconnaît le ligand de façon à former un complexe avec ledit ligand et l'autre se fixe sur ladite séquence contrôle de transcription, la partie du recepteur qui reconnaît le ligand est d'origine eucaryote supérieure et le ligand n'est pas nécessaire à la culture des cellules mais est susceptible de pénétrer dans lesdites cellules lorsqu'il est ajouté- au milieu de culture, - on ajoute ledit ligand dans le milieu de culture à un moment convenant pour l'induction, - on récupère la protéine synthétisée. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence de contrôle de transcription est une séquence fonctionnelle dans les cellules eucaryotes supérieures. 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence de contrôle de transcription comprend une séquence ayant la structure et/ou l'activité d'une séquence UAS de cellules eucaryotes supérieures. 4) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la' séquence de contrôle de transcription est la séquence ERE. ) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la séquence de contrôle de transcription est une séquence fonctionnelle dans les levures ou tout autre microorganisme et en ce que les deux parties essentielles du récepteur sont d'origine différente. 6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la partie du récepteur qui reconnaît le ligand est d'origine eucaryote supérieure, la partie qui se fixe sur la séquence de contrôle de transcription est d'origine de levure ou de tout autre microorganisme et la séquence de contrôle de transcription comprend une séquence ayant la structure et/ou l'activité d'une séquence UAS de levure ou d'un site de fixation d'une protéine transrégulatrice de tout autre microorganisme. 7) Procédé selon l'une des revendications I à 6, caractérisé en ce que la séquence de contrôle de transcription est une séquence palindromique parfaite ou imparfaite, naturelle ou synthétique. 8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite séquence palindromique est répétée plusieurs fois. 9) Procédé selon l'une des revendications I à 8, caractérisé en ce que le récepteur est un récepteur nucléaire et le ligand est le composé spécifique correspondant. ) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit récepteur est le récepteur de l'oestrogène, ledit ligand est un oestrogène et la partie essentielle reconnaissant le ligand provient du récepteur hER. 11) Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que, dans la levure, la séquence d'ADN codant pour ladite protéine sous le contrôle d'éléments assurant son expression dans les levures et/ou la séquence d'ADN codant pour ledit récepteur, se trouvent sur un plasmide comportant une origine de réplication fonctionnelle dans la levure. 12) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que les deux séquences d'ADN se trouvent sur le même plasmide. 13) Procédé selon l'une des revendications I à 12, caractérisé en ce que la séquence d'ADN fonctionnelle dans la levure codant pour ledit récepteur est portée par un chromosome de la levure. 14) Procédé selon l'une des revendications I à 13, caractérisé en ce qu'on utilise une souche de levure déficiente en protéases. ) Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le ligand est ajouté à la fin de l'étape de croissance cellulaire. 263-4495 16) Vecteur d'expression inductible d'une protéine déterminée dans des cellules de levures transformée par ledit vecteur, caractérisé en ce qu'il comprend -une séquence d'ADN codant pour ladite protéine sous le contrôle d'éléments assurant son expression dans les levures, lesdits élements comprenant - une séquence de contrôle de la transcription d'origine eucaryote- supérieure inductible par un complexe formé par un récepteur et son ligand, lesdites cellules de levures renfermant une séquence d'ADN fonctionnelle dans la levure codant pour ledit récepteur. 17) Vecteur selon la revendication 16, caractérisé en ce que la séquence d'ADN codant pour ledit récepteur est portée par le vecteur d'expression inductible. 18) Vecteur d'expression selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisé en ce que la séquence contrôle de la transcription d'origine d'eucaryotes supérieurs est sensible au complexe formé par un récepteur à un stéroîde et le stéroîde correspondant. 19) Vecteur d'expression selon l'une des revendications 16 à 18, caractérisé en ce que la séquence contrôl61e dé la transcription d'origine d'eucaryotes supérieurs est sensible au complexe formé par le récepteur à l'oestradiol et l'oestradiol. ) Vecteur d'expression selon l'une des revendications 16 à 19, caractérisé en ce que la séquence contrôle de la transcription d'origine d'eucaryotes supérieurs comprend la séquence, ou des répétitions de celle-ci, de -605 à -634 du gène de la vittelogénine de poulet. 21) Les souches de levures transformées par le vecteur d'expression selon l'une des revendications 16 à 20.