FR 2632820 A1 19891222 FR 8808315 A 19880621 1i- 2632820 La présente invention a trait à la cryobiologie et à la cryomédecine, et plus précisément, elle se rap- porte à un procédé de conservation à basse tempé;-ature du sperme. L'invention pourra être le plus avantageusement utilisée pour la congélation profonde du sperme -humain, destiné à une utilisation clinique pour le traitement de l'infécondité. Cela contribue à la création de banques à basse température pour le stockage du sperme, permettant de réa- liser la sélection d'après la qualité des cellules congé- lées. Par-ailleurs, compte tenu de l'efficacité du traite- ment des différentes formes d'infécondité par le biais de la fécondation extracorporellle de I'ovule de la femme (fécondation hors de l'organisme), l'utilisation du sperme congélé se montre actuellement très efficace. *La présente invention peut trouver son applica- tion dans d'autres domaines de cryobiologie, par exemple dans l'agriculture pour la sélection de nouvelles espèces -dans un court délai. La conservation à basse température du sperme des espèces du poissons dtun intérêt commercial, de valeur ou rares permet de réaliser rapidement leur reproduction. Ainsi, l'utilisation des basses températu- res pour la conservation dub sperme gagne de plus en plus de terrain dans les sphères-de l'activité économique de l'homme et de la santé publique. La large utilisation actuelle du sperme congelé dans la pratique clinique impose la nécessité de perfec- tionner les procédés de sa conservation, étant donné que ces procédés déjà connus n'assurent pas la cryopréserva- tion requise des spermatozoides à- cause du développement du processus de cristallisation qui, en fin de compte, en- traîne, dans une partie des cellules, la perte de leurs propriétés de pénétration. L'importance de l'élaboration de procédés de cryoconservation du sperme, fondés sur la vitrification',dans un but d'augmenter la viabilité des cel- lules, est donc évidente. 2 2632820 On connaît un procédé de congélation du sperme par addition, goutte à goutte, de glycérine anhydre à l'éjaculat jusqu'à une concentration définitive de 10%' (Fertil. and Steril., v. 14, No 1, 1963 I.K.Sherman "Improved Methods of Preservation of Human Spermatoza by Freezing and Freeze-Drying"). Après coulage à raison de 0,5 ml du sperme avec le cryoprotecteur dans des ampoules de verre ou de polyéthylène et étanchéification de ces dernières, le sperme est refroidi à la vitessse de 25 C par minute jusqu'à - 75 C, puis à la vitesse de 16 C par minute jusqu'à -180 C. Après décongélation, la viabilité des spermatozoïdes ne dépasse guerre 60O%. Les inconvénients de ce procédé concernent les lésions osmotiques des cellules, conditionnées par l'addi- tion directe de glycérine dans l'éjaculat. Les lésions latentes de l'appareil membraneux de la cellule qui en découlent, en particulier de son capuchon microsomique, s'approfondissent au cours de la congélation, ce qui en- traîne, dans un grand nombre de cellules, des lésions irréversibles des structures biologiques. On connaît un procédé de conservation à basse température du sperme avec cryoprotecteur sous forme de granules, consistant à verser, gouttes à goutte, le sperme dans des alvéoles à la surface de carboglace (Treatment of Male Infertility, 1982, Berlin-Heidelberg-New York, J. Barkay, H. Zuckerman "Cryopreservation and Pooling of Sper- matozoa", pages 263-281). Le processus de congélation des échantillons d'un volume de O,1 à -0l5 ml est ici réalisé de façon très rapide, en moins de 60 secondes. On utilise, pour la congélation du sperme dans les granules, un dispo- sitif special avec thermostat contrôlable, au moyen duquel on contrôle le processus de congélation à basse tempéra- ture. Dans ce cas, la viabilité du sperme atteint 70 à 75%'. l'inconvénient du procédé connu ci-dessus men- tionné réside dans le fait quela congélation du sperme s'accompagne d'un processus de cristallisation, et que le sperme se congèle sous la forme de sphères. Il apparaît alors un gradient de température dans l'échantillon du 3 2632820 sperme à congéler, conditionné par la différence de vitesse de refroidissement des cellules au centre de l'alvéole et à proximité de ses parois. D'autre part, il n'e-' pas pos- sible de réaliser la congélation dans les granules de fa- çon.aseptique. On connaît un procédé de 'conservation à basse tem- pérature du sperme (SU, A, 1103837), o est prévue une lente addition, au sperme, d'un cryoprotecteur, la glycé- rine,jusqu'à une concentration définitive de 10%, et en- suite on coule le sperme dans des tubes stériles à une quantité de 0,5 ml et on hermétise les tubes. La congéla- tion s'effectue en deux étapes: au début, on refroidit le sperme à la vitesse de 0,5 - 1,0 C par minute jusqu'à une température. de +4 C à 5 C puis on le maintient à cette -température pendant 30 à 60 minutes, ensuite se poursuit le refroidissement à 1-a vitesse de 20 - 25 C par minute jusqu'à'une température de -1800C à -190 C. On conserve le sperme congelé dans l'azote liquide. La décongélation s'effectue au bain-marie à +36 C. Dans ce procédé la via- bilité des spermatozoides atteint 66%. L'inconvénient du procédé ci-dessus décrit réside dans le fait que la conservation à basse température des spermatozoïdes s'accompagne d'un processus de cristallisation, dont le développement est freiné par les conditions de la congélation qui, néamoins, ne produisent pas de vitrifica- tion. Par ailleurs, l'action positive du cryoprotecteur sur ce processus est nivélé par les phénomènes négatifs, relevant de l'introduction directe, dans l'éjaculat, de glycérine, à une concentration de 10,%. Cela entraîne la lésion de la membrane cytoplasmique des spermatozoïdes, et par conséquent la réduction de sa cryorésistance. D'autre part, l'addition directe de glycérine anhydre dans le sperme produit de puissants écarts osmotiques dans l'éja.- culat. La forte déshydratation des cellules qui en résulte entraîne une dénaturation partielle des molécules protéi- que et une désorientation des organelles cellulaires. L'exposition prolongée des cellules dans le milie.u de glycérine à haute concentration est liée à la manifesta- 4 2632820 tion toxique de ce cryoprotecteur. le problème posé dans la présente invention con- siste à mettre un procédé de conservation à basse tempé- rature du sperme au point, dans lequel le refroidissement du sperme serait réalisé à une vitesse suffisante pour le développement de la vitrification de la partie essentielle de l'eau extra - et intracellulaire,tout en assurant une réduction de l'intensité de l'action lésionnelle de la cristallisation sur la structure biologique du sperme au cours du réchauffement de celui-ci. Ce problème est résolu par le fait que, dans un procédé de conservation du sperme à basse température, comportant l'introduction, dans le sperme, d'un cryoprotec- teur et le refroidissement jusqu'à la température de l'a- gent frigorifique, selon l'invention, on introduit, dans le sperme, un tampon salin et un constituant anti-choc, qui forment,avec le cryoprotecteur, un cryoconservant, et l'on mène le refroidissement du sperme dans le milieu du cryoconservant dans un produit pulvérulent de haute conduc- tibilité thermique, refroidi au préalable jusqu'à la tem- pérature de l'agent frigorifique, la concentration du cryo- protecteur étant telle qu'elle soit suffisante pour le développement de la phase sans cristallisation au cours de la congélation du sperme et du cryoconservant. Le procédé selon l'invention permet d'augmenter l'effet de préservation morpho-fonctionnelle des spermatozoî- des moyennant le développement de la vitrification, ce qui donne la possibilité d'atteindre un niveau élevé de leur viabilité (85%). Cet objectif est atteint par l'utili- sation, au cours du refroidissement du sperme, d'un pro- duit pulvérulent de haute conductibilité thermique, en excluant la formation d'une couche calorifuge de vapeurs de l'agent frigorifique autour de l'objet soumis au refroi- dissement grâce à l'absence de contact direct de l'agent frigorique avec cet objet. L'augmentation importante de la vitesse de refroidissement qui est ainsi obtenue s'avère suffisante pour le développement de la vitrification et permet de réduire la concentration du cryoprotecteur jus- -,26'32820 qu'à des valeurs contribuant à la réalisation de ce proces- sus. Le procédé selon l'invention permet d'éviter le développement du processus de cristallisation du sperme au cours de sa congélation et, par conséquent, -d'exclure tous les facteurs extrêmes qu y contribuent. En outre, le procédé selon l'invention permet de simplifier le processus de conservation à basse tempé- rature grâce à la réduction du nombre d'opérations et du temps de Ieur réalisation. Par ailleurs; à cause de la diminution du cycle de conservation à basse température, la présente invention contribue à l'augmentation de la productivité du travail et à la réduction du prix de re- vient du procédé. Dans la forme de réalisation préférentielle'de la présente invention, on utilise, à titre de produit. pulvé- rulent de haute conductibilité thermique, de l'oxyde d'alumi- nium (A1203). Cela s'explique par le fait que, pour le développement de la vitrification des spermatozoides dans le milieu du cryoconservant, proposé selon la présente inven- tion, on obtient une vitesse de refroidissement qui est. suffisante pour la congélation sans cristallisation. Cela est conditionné par les dimensions relativement petites de ces cellules par rapport aux autres, par exemples aux embryons, et donc par une plus petite quantité d'eau dans les spermatozoïdes à congéler. I1 est très avantageux d'utiiiser le cryoprotec- teur à une concentration de 1,5 à 2,5%.. A cette concen- tration, le cryo.protecteur ne- manifeste pas de propriétés toxiques ni osmotiques, bien qu'elle soit suffisante-pour le-développement de la vitrification dans les conditions données de refroidissement. Conformément à l'une des formes d'exécution de l'invention, le cryoconservant contient uns substance biologiquement active. Les substances biologiquement actives sont utili- sées dans la cryoconservation du sperme, afin d'augmenter la viabilité des cellules par protection de la membrane 6 2632820 cytoplasmique contre un choc de température et contre "'l'effet de solution" au cours de la transformation de phase de l'eau en glace. I1 est avantageux d'utiliser, à titre de subs- tance biologiquement active, du chlorure de choline. Le chlorure de choline, qui est un agent de méthy- lation dans les processus biologiques, à cause du haut potentiel énergétique du radical azotique, de la présence de trois radicaux méthyliques et d'un groupe hydroxyle, est pourvu d'une forte basicité, qui conditionne l'hydra- tation active des molécules d'eau par cette substance, ce qui amène une augmentation des propriétés cryopréservatrices du cryoconservant. Les radicaux méthyliques stabilisent la structure native des membranes biologiques, et par cela même, augmentent leur cryorésistance. Il est très avantageux que le chlorure de choline soit utilisé à la concentration de 2%. La réduction de la concentration n'assure pas l'accroissement de l'efficacité cryoprotectrice du cryo- conservant, alors que de plus fortes concentrations de ce composé biologiquement actif produisent une augmentation de son interaction hydrophobe avec les macromolécules biologiques, ce qui apporte. non pas la stabilisation des structures des membranes, mais leur altération. Les autres buts et avantages de la présente inven- tion seront bien compris à l'aide de la description exhaus- tive qui suit d'exemples non limitatifs de sa réalisation. Afin de réaliser le procédé selon l'invention, on introduit l'agent frigorifique, de l'azote liquide, dans un récipient métallique rempli de produit pulvérulent de haute conductibilité thermique, dans lequel on immerge un conteneur contenant le sperme dilué. Le procédé selon l'invention est réalisé comme suit. Après fluidification, on mélange le sperme au milieu du cryoconservant qui représente une solution aqueuse, contenant du glucose, du citrate de sodium comme tampon salin, du jaune d'oeuf de poule comme constituant anti-choc, de la substance biologiquement active ou solu- tion de chlorure de choline et du cryoprotecteur ou glycé- rine. Après équilibrage, on verse le sperme- dil:4 dans des conteneurs en feuille métallique dont on dudgeonne les bords libres, et que l'on immerge dans le produit pulvéru- lent de haute conductibilité thermique, refroidi à la tem- pérature de l'agent frigorifique, ou azote liquide, et en- suite on transfère rapidement dans l'azote liquide pour le stockage. La décongelation s'effectue au bain-marie. Exemple 1 Placer 2 ml de sperme pendant 25 - 30 minutes dans un thermostat à 37 C pour sa fluidification, puis y ajouter à un rapport de 1:1, le milieu contenant 4,0 g de glucose, 1,2 g de citrate de-sodium, 26,0. ml de jaune d'oeuf de poule, 2,0 ml d'une solution à 20% de chlorure de choline et.3,0 ml de glycérine, le reste étant de l'eau. La concentration définitive de. glycérine est de 1,5o%. Maintenir le sperme dilué pendant 45'minutes, puis le ver- ser à raison de-0,5 ml dans des conteneurs feuille métallique de 0,3 mm d'épaisseur, dudgeonner les bords libres de ce conteneurs. Réaliser la congélation en immer- geant les conteneurs dans une chambre'de congélation, for-. mée d'un récipient métallique rempli de poudre de A1203 et immergé dans de l'azote liquide, et maintenir' les conte- neurs dans la poudre de A1203 pendant 5 à 10 secondes, et les transférer ensuite dans de l!azote liquide pour leur stockage. Réaliser la décongélation à l'échéance de trois semaines après la cryoconservation en immergeant le cpn- teneur dans un bain-marie à une température de 40 C. Après la décongélation, pH 75, la quantité des spermatozoïdes est la suivante: 52 millions dans 1 ml, mobilité: 66%; mobilité active: 51,8,o, formes normales: 72%. La viabilité des spermatozoïdes s'établit selon la forme suivante. de spermatozoïdes mobiles après réchauffement x 100 % de spermatozoïdes mobiles avant la congélation et atteint, dans l'exemple donné, 82,2%. Exemple 2 Placer 2 ml de sperme pendant 25-30 minutes dans un thermostat à 37 C pour sa fluidification, puis y ajou- ter, au rapport de 1:1, le milieu, contenant 4,0 g de glu- cose, 1,2 de citrate de sodium, 26,0 ml de jaune d'oeuf de poule, 2,Oml de solution à 20% de chlorure de choline, et 4,0 ml de glycérine, le reste étant de l'eau. Concen- tration définitive de la glycérine: 2,0%9. Maintenir pen- dant 45 minutes le sperme dilué et le verser à raison de 0,5 ml dans des conteneurs en feuille métallique de 0,3 mm d'épaisseur et dudgeonner les bords libres de ces conte- neurs. Réaliser la congélation par immersion des conte- neurs dans une chambre de congélation, représentée par un récipient métallique rempli de poudre A1203 immergé dans l'azote liquide, et maintenir les conteneurs dans la pou- dre de A1203 pendant 5 à 10 secondes, puis les transférer dans de l'azote liquide pour leur conservation. Réaliser la décongélation à l'échéance de trois semaines après la cryoconservation, en immergeant le con- teneur dans un bain-marie à une température de 40 C. Après la décongélation, pH 7,5, le nombre total de sperma- tozoïdes est de 52 millions dans 1 ml, mobilité: 66,'O sperma- tozoïdes à mobilité active: 53,1%, formes normales: 72,%. Viabilité 'selon la formule: % de spermatozoïdes mobiles après x 100 = 84, 2% réchauffement % de spermatozoïdes mobiles avant la congélation. Exemple 3 Placer 2 ml de sperme pendant 25 à 30 minutes -dans un thermostat à 37 C pour sa fluidification, puis y ajouter, au rapport de 1:1, le milieu, contenant 4,0 g de glucose, 1,2 g de citrate de sodium, 26,0 ml de jaune d'oeuf de poule, 2, 0 ml de solution à 20% de chlorure de choline et 5,0 ml de glycérine, le reste étant d- l'eau.. Concentration définitive de la glycérine: 2,5%. Mainte- nir le sperme dilué pendant 45 minutes,- puis le verser dans des conteneurs en fuille métallique de 0,3 mm d'épais- seur et dudgeonner les bords libres. Réaliser la congéla- tion en immergeant les conteneurs dans la chambre de congéla- tion, formée d'un récipient métallique rempli de poudre de A1203 et immergé dans l'azote liquide, et y maintenir les conteneurs dans la poudre de A203 pendant 5 à 10 secon- *2 3pedn5à10sc- des, les transférer ensuite dans l'azote liquide pour leur conservation. Réaliser la décongélation à l'échéance de 3 se- maines après la cryoconservation en immergeant les conte- neurs dans un bain-marie à une température de 40 C. Après la-décongélation, pH 7,5 le nombre total des spermato- zoides est de 52 millions dans 1 ml, mobilité: 66 ,' sper- matozoides à mobilité active: 54,7,%, formes normales: 72%. Viabilité selon la formule o de spermatozoïdes mobiles après réchauffement x 100 = 86,5,% % de spermatozoides mobiles avant la congélation' Dans le but de confirmer que l'utilisation, dans le procédé selon l'invention, d'une concentration réduite de glycérine dans les limites stipulées et d'une congéla- tion rapide dans le milieu d'une poudre de A1 203 permet d'atteindre l'objectif attendu, les tableaux de résultats d'expériences, dont ceux des exemples ci-dessus me;;tionnés, sont donnés ci-dessous. Tableau 1. Viabilité des spermatozoïdes, soumis à une conservation à basse température, en fonction de la composition du milieu de congélation. No. Concentration de glycérine (%) Viabilité des spermatozoïdes (%) 1. Sperme natif sans cryoconser- vant ni glycérine 37,5 + 1,46 2. Sperme avec cryoconservant mais sans glycérine 49,1 + 2,18 3. 1,0 67,2 + 3,18 4. 1,5 82,2 + 2,22 5. 2,0 84,2 + 1,81 6. 2,5 86,8 + 1,16 7. 3,0 78,2 + 1,17 8. 5,0 71,0 + 3,18 Tableau 2. Mobilité des spermatozoïdes en fonction du milieu de congélation. No. Concentration en glycérine (%) Mobililité des spermatozoïdes (%) 1. Sperme natif sans cryoconservant ni glycérine 22,5 + 1,36 2. Sperme avec cryoconservant mais sans glycérine 28,0 + 2,16 3. 1,0 42,0 + 2,86 4. 1,5 51,8 + 1,12 5. 2,0 53,1 + 2,16 6. 2,5 54,7 + 1,61 7. 3,0 50,2 + 1,56 8. 5,0 44,0 2,74 Tableau 3. Mobilité des spermatozoïdes en fonction des procédés de conservation à basse température Mode de conservation Mobilité des spermatozoïdes avant après conservation réchauffement Selon l'invention 64,1 + 3,18 54,68 + 1, 12 connu 65ll + 3,64 43,67 + 2j47 -' -- p o0,05 p,est le degré de signification des différences observées d'après Student-Fisher. 1 2 Les données figurant au tableau 3 témoignent de ce que, dans les deux cas, la mobilité des spermatozoi- cldes décongelés est réduite par rapport à la mobilité que possédaient les spermatozoïdes avant la congélation. Néan- moins, par rapport au procédé connu, le procédé selon l'invention permet d'obtenir du sperme de plus grande activité. Les exemples susmentionnés témoignent de ce que les plus mauvais résultats sont obtenus à la suite de la cryoconservation du sperme natif. Quand on y additionne du cryoconservant sans glycérine, le taux de cellules pré- servées augmente légèrement. La cryoprotection est plus nette à la suite de l'introduction, dans le cryoconser- vant, du glycérine, le niveau maximum de cryoprotection étant obtenu lorsque sa concentration dans le milieu de congélation atteint 1,5 - 2,5%. L'utilisation de la glycé- rine à une concentration de 2,5%, en appliquant le pro- cédé susmentionné de congélation, permet d'accroître la viabilité des spermatozoides de 19,8%, ce qui est un in- dice très significatif de la préservation des spermato- zoides. Ainsi donc, la présence, dans le cryoconservant, de glycérine à basse concentration et de chlorure de cho- line,crée les conditions nécessaires pour que se mani- feste, au maximum, l'efficacité de cryoprotection sans aucune action négative. Cela se traduit, en particulier, par le fait que les cellules dans le oryoconservant, proposé dans la présente invention, présentent une plus haute viabilité que dans le sperme natif. 1 3 R E V E N D I C A T I 0 N S 1. Procédé de conservation à basse temg;--rature du sperme, du type comportant l'introduction, dans le sperme, d'un cryoconservant et le refroidissement à la température de l'agent frigorifique, caractérisé en ce que l'on introduit, dans le sperme, un tampon salin et un constituant anti-choc, qui forment, avec le cryopro- tecteur,.un. cryoconservant, et le refroidissement du sperme est réalisé dans le milieu du cryoconservant dans un produit pulvérulent de haute conductibilité thermique, préalablement refroidi à la température.de l'agent frigo- rifique, la concentration du cryoprotecteur étant telle qu'elle soit suffisante pour le développement d'une phase sans cristallisation au cours de la congélation du sperme et. du cryoconservant. - 2. Procédé selon la revendication 1-, caractérisé en ce qu'à titre du produit pulvérulent de haute conducti- bilité thermique, on utilise de l'oxyde d'aluminium (A1203). 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le cryoprotecteur est utilisé à la concentra- tion de-1,5 à 2,5%. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le cryoconservant contient une substance biolo- giquement-active. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'à titre de substance biologiquementactive, on utilise du chlorure de choline. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le chlorure de choline est utilisé à une concen- tration de 2,%.