FR 2631449 A1 19891117 FR 8906269 A 19890512 "Biodétecteur à membrane" 5 La présente invention est relative aux dispositifs électroniques qui comportent des membranes sélectives pour mesurer, par exemple, des entités chimiques, telles que des composés et des ions, ou des stimuli. De nombreux dispositifs existent à l'heure actuelle 10 pour mesurer une entité à fonction biologique, telle qu'un antigène, dans un fluide biologique. De tels dispositifs comprennent des immunodétecteurs, des électrodes à enzymes, des détecteurs électrochimiques, des électrodes à membrane biocatalytique, des détecteurs à cristal piézoélectrique, .15 des détecteurs chimiques, des dispositifs optoélectroni- ques, des électrodes sensibles aux ions et des appareils utilisant la spectrométrie de masse et la résonance magné- tique nucléaire (voir par exemple Schramm et al., 1987 "The Commercialization of Biosensors", Medical Device & Diag- 20 nostic Industry, vol. 9, p. 52). Un immunodétecteur est un dispositif qui comporte un détecteur associé à une population d'anticorps ou anti- gènes qui lient sélectivement l'anticorps ou l'antigène à mesurer. Le complexe anticorps-antigène "ne peut pas être 25 mesuré directement par des moyens physicochimiques" et de ce fait un générateur de signaux est nécessaire, par exemple un conjugué antigène-enzyme. Schramm et al., Id. p. 54. Le conjugué convertit une substance pour l'enzyme en un produit électroactif qui est détecté par un détecteur 30 électrochimique. La quantité d'analyte ou entité à analyser présent est déterminée par la réponse du détecteur. Dans le brevet des Etats-Unis McConnell 4.490.216 dont le contenu est incorporé par référence dans la pré- sente descripion, est décrit un dispositif électroanalytique ayant une couche solide, électriquement sensible, avec une couche de lipide qui lui est liée par un processus 2631449 2 non diffusant. Ce dispositif comprend également une seconde couche de lipide formée sur la première couche de lipide et ayant des groupes de tête ou d'extrémité, hydrophobes et polaires, disposés à distance de la première couche de 5 lipide. Ces groupes polaires forment une couche qui agit en tant que couche électrostatique dont la polarité peut être détectée par la couche solide électriquement sensible. Des variations de la polarité de cette couche sont détectées par la couche solide. La couche polaire peut être modifiée 10 en liant un membre de la paire ligande-récepteur à l'un des lipides dans les couches, par exemple en liant du nitroxyde de dipalmitoyle phospholipide (DPN). Un tel dispositif modifié permet de détecter l'autre membre de cette paire liante, si une telle liaison produit un changement de champ 15 électrostatique dans la couche polaire. L'invention est en partie une extension de la cons- tatation que les protéines réceptrices d'une membrane agissent en tant qu'éléments transducteurs qui sont capa- bles de convertir un stimulus tel qu'un contact avec une 20 molécule spécifique, en un signal électrique ou chimique pour produire une réponse à partir de la cellule. Un changement, provoqué par un stimulus, dans la structure tridi- mensionnelle de la protéine réceptrice, semble -être une étape universelle dans ce procédé. Par exemple la liaison 25 d'un produit chimique en un site spécifique de la protéine réceptrice provoque un changement de configuration du récepteur qui peut modifier la perméabilité de la membrane vis-à-vis des ions et ainsi provoquer une transduction électrochimique ou exposer un site à l'intérieur de la 30 membrane et ainsi activer un procédé enzymatique. De tels changements de conformation peuvent également provoquer un changement de distribution des chaînes latérales chargées sur la protéine par rapport à la surface de la membrane et ainsi produire des changements dans le potentiel électrique 35 à la surface de la membrane. L'invention consiste en des détecteurs à membrane 2631449 3 qui mettent en oeuvre cette propriété des entités telles que des protéines maintenues à l'intérieur des membranes. De tels détecteurs peuvent détecter des petits déplacements (par exemple inférieurs à environ 2 Angstroms) de charges 5 se produisant à l'intérieur de la portion hydrophobe de la membrane en mesurant un changement local du champ électri- que de la membrane. Ils peuvent détecter non seulement le mouvement de telles charges mais également la dynamique de ce mouvement. D'autres changements, par exemple des chan- 10 gements optiques, peuvent également être détectés par les détecteurs selon l'invention. Par conséquent l'invention a pour objet un dispo- sitif pour détecter une première entité, comprenant un support sur la surface duquel est liée d'une manière non 15 diffusante une première couche hydrophobe revêtue d'une seconde couche hydrophobe pour former une bicouche. Dans la bicouche est présente une seconde entité capable de réagir avec la première entité pour produire un changement local dans une propriété détectable de la structure de la bi- 20 couche. Dans les modes de réalisation préférés : - la première ou la seconde couche hydrophobe con- tient plusieurs molécules ayant des chaines aliphatiques d'au moins six atomes de carbone; 25 - la première entité est une entité chimique; - la seconde entité est une protéine (de préférence une protéine de récepteur à membrane) qui est mobile libre- ment à l'intérieur de la bicouche; - la propriété détectable est une propriété élec- 30 trique ou une propriété physique telle que la lumière; et - les première et seconde entités sont capables de réagir pour former un complexe d'affinité (par exemple un complexe entre une protéine de récepteur et la protéine ou l'autre entité pour laquelle elle est spécifique, par exem- 35 ple des facteurs de croissance et leurs protéines de récep- teur liées à la membrane, par exemple l'interleukine-2 et 2631449 4 le récepteur d'interleukine-2 sur des lymphocytes, ou des neuroémetteurs et des neurorécepteurs, ou des hormones et des récepteurs d'hormones, ou un complexe immunitaire) dans lequel les première et seconde entités interagissent d'une 5 manière non covalente. L'invention fournit des moyens pour connecter les possibilités de détection des récepteurs biologiques aux possibilités de traitement de signaux existantes de dispo- sitifs optiques et microélectroniques à l'état solide. Les 10 ensembles de détection biomïmétiques selon l'invention offrent des possibilités de mesure exceptionnelles résul- tant de l'utilisation de protéines réceptrices de membrane ou de molécules semblables dans un environnement presque naturel. Ainsi la réponse de ces protéines à différents 15 stimuli peut être mesurée et cette réponse reliée à la concentration de molécules dans une solution qui réagit à ces protéines. Ces membranes peuvent également être cons- truites en utilisant une gamme étendue d'entités y compris non seulement des protéines de récepteur à membrane mais 20 également d'autres protéines par exemple des anticorps, des antigènes et des enzymes aussi bien que des polypeptides modifiés. Dans les dispositifs selon l'invention dans les- quels l'entité mobile dans la bicouche est une protéine, le 25 dispositif répond à des stimuli qui activent ou changent les propriétés fonctionnelles de la protéine. Du fait que l'environnement de la membrane simule l'environnement dans lequel la protéine fonctionne naturellement, sa sensibilité maximale se trouve dans le domaine biologique intéressant. 30 La molécule de protéine, maintenue dans un environnement aussi naturel que possible, retient sa dynamique de confor- mation et répond ainsi à ses stimuli naturels; en d'autres termes le détecteur détectera des stimuli naturels, posi- tifs et négatifs, aussi bien que les simulations de tels 35 stimuli. Les détecteurs selon l'invention peuvent être 2631449 5 utilisés pour des diagnostics médicaux, des screenings pharmaceutiques, la guerre chimique et la détection d'autres agents toxiques ainsi que la surveillance de l'utilisation illégale de drogues et dans la recherche de 5 la mécanique des récepteurs à membrane. En plus de leur capacité de détecter des entités chimiques telles que des protéines en solution, les dispositifs selon l'invention peuvent également être utilisés pour détecter la lumière, des odeurs ou parfums et des changements de pH et de 10 température. D'autres caractéristiques et avantages de l'inven- tion apparaîtront au cours de la description ci-après de modes de réalisation préférés. Sur les dessins annexés : 15 la figure 1 est une représentation schématique d'un ensemble simulant une membrane; la figure 2 est une vue en coupe à travers un tran- sistor à effet de champ à porte isolée; et la figure 3 est une vue schématique d'un appareil 20 de dialyse apte à réaliser un dispositif selon l'invention. En se référant tout d'abord à la figure 1, la structure 8 de membrane liée en surface, conçue pour détec- ter une première entité, comprend un support 10 ayant une surface 12 à laquelle est liée d'une manière non diffusante 25 (c'est-à-dire covalente) une première couche hydrophobe 14. Une seconde couche hydrophobe 16 (lipidique), contenant des molécules 17 de lipides ayant des groupes de tête polaires 18 est liée à la couche 14 par interaction hydrophobe. Les groupes de tête lipidiques polaires 18 sont dirigés vers 30 l'extérieur, en direction opposée du substrat 10. Des molé- cules 20 d'une seconde entité (par exemple une protéine réceptrice) sont à incorporer dans la bicouche, ces molé- cules 20 étant librement mobiles dans la bicouche. La structure de membrane 8 est associée à une électronique 35 auxiliaire standard pour fournir un signal détectable lorsque la première entité à détecter réagit avec la 2631449 6 seconde entité de la membrane. Chaque composant va mainte- nant être décrit en détail. 1) Première couche hydrophobe. La première couche hydrophobe fournit une surface 5 avec laquelle peuvent réagir les lipides polaires pour former la structure de bicouche ressemblant à une membrane naturelle. Cette couche est formée en faisant réagir la surface du substrat avec une solution qui contient des com- posés hydrocarbures à longue chaîne et réactifs capables de 10 former des liaison covalentes avec le support, par exemple l'octadécyltrichlorosilane qui peut réagir avec des groupes hydroxyles sur la surface du verre, comme décrit par J. Sagiv., 1979, Isr. J. Chem., vol. 18, p. 46. D'autres solutions formatrices de couches hydrophobes qui peuvent conve- 15 nir sont décrites dans McConnell mentionné ci-dessus. 2) Seconde couche hydrophobe (couche lipidique). La couche lipidique est déposée sur la surface en même temps que la protéine réceptrice, par exemple par un procédé de dialyse de détergent, décrit ci-après. La couche 20 lipidique est maintenue -contre la surface et est orientée comme décrit ci-dessus par interaction avec la première couche hydrophobe. Les groupes de tête polaires sont diri- gés vers l'extérieur à partir de la surface et les molécu- les lipidiques individuelles peuvent diffuser librement 25 dans le plan de la membrane. Des exemples de lipides conve- nant pour cette couche sont donnés dans McConnell mentionné ci-dessus. Les lipides tant dans la première que dans la seconde couche hydrophobe peuvent être réticulés ou polymé- 30 risés pour réduire la diffusion à l'intérieur de l-a couche. 3) Seconde entité. La seconde entité est de préférence une protéine ou un composé semblable à une protéine et d'une manière plus préférable une protéine réceptrice. La seconde entité est 35 retenue dans la structure de bicouche par son interaction avec l'intérieur hydrophobe de la bicouche. 2631449 7 De préférence la seconde entité est une protéine qui peut se déplacer librement & l'intérieur de la bicouche et peut subir librement des réarrangements de conformation. Deux classes générales de protéines sont associées aux 5 membranes biologiques - les protéines périphériques qui se lient A la surface hydrophobe de la membrane et les pro- téines intégrales qui sont insérées à 1 'intérieur hydro- phobe de la membrane. Des structures de membrane préférées selon l'invention utilisent des protéines de membrane inté- 10 grales, particulièrement celles ayant une chaine polypep- tidique qui traversent la jonction entre les deux couches de membrane plus d'une fois. Ces protéines du type "trans- membrane" sont particulièrement importantes dans les pro- cédés de détection biologique, par exemple la détection de 15 la lumière au moyen de rhodopsine, protéine sensible à la lumière. Comme mentionné ci-dessus, un attribut important des structures de membrane selon l'invention est le fait qu'elles réalisent un environnement autour de la protéine 20 ressemblant étroitement aux bicouches de membrane natu- relles, de sorte que la -protéine est maintenue dans un environnement optimal pour le fonctionnement de la protéine de la membrane. 4) Electronique auxiliaire. 25 La figure 2 montre la structure d'un transistor classique à effet de champ à porte isolée (IGFET), référen- cé 30, qui peut être associé d'une manière fonctionnelle à la structure de membrane 8 en utilisant des techniques standards connues. Pour donner une brève description, le 30 transistor précité comporte une base 32 formée de silicium de type p. Celui-ci est traité pour former du silicium de type n dans une région de drain 34 et dans une région de source 36. Les contacts métalliques pour les régions de source et de drain sont appliqués, suivis d'un isolant 39 35 et une couche métallique, pour former une électrode de porte 38 au-dessus de l'isolant 39. Dans de tels tran- 2631449 8 sistors le potentiel appliqué à l'électrode de porte 38 attire ou repousse les porteurs de charge à partir de la surface de silicium du transistor. En réglant la population des porteurs de charge à la surface, le potentiel de porte 5 contrôle l'écoulement de courant entre la source 36 et le drain 34. Cet écoulement de courant est une mesure sensible du champ de potentiel à la surface du transistor. Celui-ci répond essentiellement à l'accumulation ou à l'appauvris- sement, qui dépend du potentiel, des porteurs à la surface 10 du silicium isolée. Pour mesurer les mouvements des charges dans le fonctionnement de la protéine de membrane selon l'inven- tion, la structure classique du transistor à effet de champ à grille isolée de la figure 2 est modifiée en remplaçant 15 l'électrode de porte métallique 38 par l'ensemble 8 de membrane liée en surface de la figure 1. Dans ce système la membrane agit comme surface de porte du transistor. Le dispositif est encapsulé au moyen d'un polymère approprié (par exemple une résine époxy) de manière à laisser la 20 région de porte avec la membrane liée en surface exposée à la solution contenant l'analyte. L'isolant isole le reste du dispositif y compris les électrodes de source et de drain. Lorsqu'utilisée de cette manière, on doit ajouter une électrode de référence dans la solution qui est mesurée 25 afin de fournir un contact électrique avec la solution. Le substat (support) est choisi pour répondre à la même propriété que la couche bilipidique qui se modifie en réponse à un stimulus. Par exemple un substrat répondant électroniquement, tel qu'un transistor à effet de champ, 30 détecte des mouvements de charges induits par l'interaction de la protéine réceptrice avec un stimulus, tandis qu'un substrat à réponse optique détecte des changements dans les propriétés optiques de la pellicule après interaction avec le stimulus. Un tel substrat est décrit dans le brevet des 35 Etats-Unis Hafeman et al., n 4.591.550, dont le contenu est incorporé par référence dans la présente demande. 2631449 g D'autres types de substrats tels que des fibres optiques peuvent être utilisés. La surface du substrat est généra- lement modifiée pour produire des groupes chimiquement réactifs qui sont nécessaires pour être couplés' à la couche 5 hydrophobe de la structure de membrane 8. Des substrats convenables sont constitués par le verre, l'oxyde de pla- tine, le dioxyde de silicium, le nitrate de silicium ou du silicium revêtu ou toute autre surface qui peut être dotée d'hydrocarbure à longue chaîne. La surface peut être plane 10 ou non plane, par exemple des billes peuvent être utilisées aussi bien que des surfaces plates. D'autres substrats convenables sont décrits dans McConnell mentionné précé- demment. 5) Fabrication. 15 Les structures de membrane selon l'invention sont formées directement sur des surfaces de substrats solides en utilisant une technique de dialyse de détergent modi- fiée. Des surfaces avec des groupes hydroxyles ou d'autres groupes réactifs exposés sont modifiées par réaction avec 20 divers organosilanes pour former la première couche de la bicouche. Par exemple le substrat est rendu hydrophobe par liaison d'acides gras à longue chaîne aux groupes de surface comme cela est réalisé par réaction avec de l'octadécyltrichlorosilane. La seconde couche de la bicouche est 25 déposée par dialyse de détergent avec incorporation simul- tanée de protéine. La protéine et le feuillet externe de la bicouche sont maintenus à la surface du substrat par in- teractions hydrophobes avec le feuillet de groupe alcoyle interne, fixé d'une manière covalente, de la bicouche. 30 Dans la dialyse de détergent, le détergent est enlevé lentement des solutions solubilisées lipide/pro- téine/détergent et les lipides et les protéines se recom- binent pour former des structures de bicouche vésiculaires. Si 1l'on effectue des choix corrects pour le détergent et 35 les autres conditions, on peut former des vésicules de membrane fonctionnelles. Le détergent utilisé ne doit pas 2631449 10 dénaturer la protéine et il doit avoir une concentration en micelles relativement fort critique pour faciliter son élimination par dialyse. Le déoxycholate et le glucoside d'octyle sont préférés. Si une surface hydrophobe conve- 5 nable est présente pendant la dialyse alors certains des lipides et des protéines sont entraînés pour se lier à ladite surface au lieu de former des vésicules flottant librement. Les structures créées par ces techniques ont des compositions et des caractéristiques électriques qui sont 10 consistantes avec la formation de membranes de bicouches sur les surfaces des substrats. La protéine photoréceptrice rhodopsine a été incor- porée dans les structures de membrane comme suit. Des disques de segments externes de bâtonnets de la rétine ont 15 été isolés par la méthode de Smith et al., 1982, Meth. Enzymol., vol. 81, p. 57, solubilisés avec le détergent constitué par l'octylglucoside (OG) et placés dans la chambre C de l'appareil de dialyse par écoulement, de la figure 3, de sorte que la solution de membrane solubilisée 20 soit en contact avec le support planaire 10 précédemment alcoylé par traitement avec l'octadécyltrichlorosilane. La dialyse a été réalisée en utilisant une membrane de dialyse A contre un gradient linéaire de concentration en octylglu- coside (illustré sur la figure 3) décroissant de 50 mM à 0 25 mM, pendant 5 heures, suivie d'une dialyse contre un tampon exempt de détergent pendant 18 heures. La quantité de li- pide et protéine dans la suspension dépassait celle exigée pour créer une monocouche sur la surface et ainsi des quantités substantielles de vésicules se sont formées. Le 30 substrat plan 10 a été libéré de ces vésicules en le plon- geant dans des solutions-tampons. Si des billes de verre plutôt que des surfaces planes sont revêtues, elles sont séparées des vésicules par centrifugation dans du sucrose à 50% qui est suffisamment 35 dense pour faire flotter les vésicules mais non les billes de verre revêtues de membrane. 2631449 11 Les substrats résultants ont des propriétés qui sont consistantes avec la formation de structures de type membrane sur les surfaces alcoylées. La teneur en rhodo- psine sur des billes de verre ayant un diamètre de 37 5 microns est de 145*28 mg de rhodopsine retenue par gramme de bille. Ceci correspond à une molécule de rhodopsine (Rh) par 2600 Angstroms2 de surface, ce qui est comparable aux 2500 Angstroms2 à 3600 Angstroms2 estimés comme valeur pour une membrane de disque naturelle. La teneur en lipide de 10 ces billes est calculée en tant que 83 15 moles de phos- phate (P)/mole de Rh. Encore une fois cette valeur est très proche de celle mentionnée usuellement comme valeur pour une membrane de disque naturelle (50 à 100 moles de P/mole de Rh). Ces résultats indiquent que ces structures à sur- 15 face liée ont la composition attendue pour une bicouche imitant une membrane. Lorsque l'ensemble précité est formé sur la surface oxydée d'une électrode de platine plane et que les pro- priétés électriques sont déterminées par voltamétrie cy- 20 clique, la résistance mesurée est 107 ohm-cm2 et la capa- cité est 0,2 - 0,5 iF/cm2. Ces résultats sont proches des valeurs typiques pour les membranes naturelles (résistance 103 - 106 ohm-cm2 et capacité 1 gF/cm2). 6) Utilisation. 25 Les ensembles de membranes selon l'invention peu- vent être utilisés pour détecter toute entité qui réagit avec la protéine ou autre entité dans la bicouche. Par exemple la protéine dans la bicouche peut être le récepteur de l'interleukine-2 (IL-2) chez l'homme-(décrit par exemple 30 dans Leonard et al., 1982, Nature (Lond.), vol. 300, pp. 267-269) et le dispositif utilisé pour détecter ou mesurer IL-2 dans les fluides biologiques tels que le sérum pour fournir une information sur l'état immunitaire d'un patient humain. 35 L'invention est également applicable à-la détection ou à la mesure d'entités qui réagissent avec tout autre 2631449 12 récepteur de membrane et élément de transduction y compris des transmetteurs visuels olfactifs ou neuronaux et les récepteurs hormonaux. La combinaison de systèmes biolo- giques avec des systèmes électroniques et optiques fournit 5 une nouvelle classe de détecteurs dont la spécificité est déterminée en choisissant une protéine réceptrice de mem- brane appropriée. Des détecteurs basés sur des récepteurs chimique- ment sensibles peuvent être établis pour répondre à une 10 variété de composés biologiquement actifs y compris les hormones, les neurotransmetteurs et les toxines. Ces dis- positifs répondent à la fois au stimulus naturel et aux composés qui inhibent l'interaction entre le récepteur et le stimulus. De tels dispositifs chimiquement sensibles ont 15 des applications très étendues y compris la détection d'agents toxiques et leur dosage, la surveillance des drogues, les diagnostics médicaux et le screening pharma- ceutique. D'autres modes de réalisation peuvent être réalisés 20 dans le cadre de l'invention. Par exemple la structure de membrane de l'invention peut être construite par des techniques connues telles que celle de Langmuir-Blodgett, plutôt que par dialyse de détergent. 25 30 35 2631449 13 REVENDICATIONS 1. Dispositif pour détecter une première entité, caractérisé en ce qu'il comprend en combinaison : un support (10) ayant une surface (12), 5 une première couche hydrophobe (14) liée d'une manière non diffusante à ladite surface, une seconde couche hydrophobe (16) recouvrant la première couche pour former une bicouche, et une seconde entité (20) réagissant avec la première 10 entité, disposée dans la bicouche, cette seconde entité, pendant qu'elle se trouve dans la bicouche, étant capable de réagir avec la première entité pour produire un change- ment local d'une propriété détectable de la structure de la bicouche. 15 2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite première ou ladite seconde couche hydro- phobe comprend plusieurs molécules ayant des chaines ali- phatiques d'au moins six atomes de carbone. 3. Dispositif selon la revendication 1 ou 2, carac- 20 térisé en ce que la première entité est une entité chi- mique. 4. Dispositif selon la revendication 1 ou 2, carac- térisé en ce que la première entité est un stimulus phy- sique. 25 5. Dispositif selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que la seconde entité est une protéine qui est librement mobile à l'intérieur de la bicouche. 6. Dispositif selon l'une quelconque des revendica- 30 tions précédentes, caractérisé en ce que ladite propriété détectable est une propriété électrique. 7. Dispositif selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 5, caractérisé en ce que la propriété détectable est une propriété optique. 35 8. Dispositif selon la revendication 5, caractérisé en ce que la protéine est une protéine réceptrice. 2631449 14 9. Dispositif selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que les première et seconde couches hydrophobes comprennent une région polymé- risée ou réticulée. 5 10. Dispositif selon l'une quelconque des revendi- cations i à 3 et 5 à 9, caractérisé en ce que la seconde entité est capable de réagir avec la première entité pour former un complexe d'affinité dans lequel les première et seconde entités sont liées d'une façon non covalente. 10 11. Procédé pour réaliser un dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend les phases successives suivantes : a) on forme la première couche hydrophobe sur le substrat solide, 15 b) on mélange la seconde entité à un liquide hydrophobe et à un détergent pour former un mélange liquide, c) on met en contact le substrat avec le mélange précité, et d) on dialyse ce mélange pour éliminer le détergent 20 du mélange. 25 30 35