FR 2631344 A1 19891117 FR 8906190 A 19890511 - 1 - La présente invention concerne une fine poudre d'acide hyaluronique ou d'hyaluronate de sodium (désignés ci-après en abrégé par "acide hyaluronique (hyaluronate)" ayant une taille moyenne de particules de 3 à 20 pm, et un procédé pour sa préparation. L'acide hyaluronique se rencontre dans les tissus ani- maux, par exemple dans le liquide synovial, l'humeur vitrée, le cordon ombilical, le cartilage, la peau, les crêtes de coq, et il joue un rôle important dans l'organisme vivant. L'acide hyaluronique est une substance à haut poids molécu- laire. Etant donné qu'en solution il est très visqueux et élastique et présente une forte rétention de l'eau, il est largement utilisé dans la préparation de cosmétiques. Jusqu'à présent, la préparation industrielle de l'acide hyaluronique (hyaluronate) a été effectuée par extraction à partir de crêtes de coq ou par incubation de micro-organismes ayant la capacité de produire de l'acide hyaluronique (pro- cédé de fermentation). L'acide hyaluronique (hyaluronate) obtenu par le pro- cédé d'extraction ou de fermentation est purifié par ultra- filtration, dialyse, précipitation dans un solvant, traite- ment avec une résine échangeuse d'ions, précipitation frac- tionnée, traitement avec du charbon actif et similaires, et 2.- on obtient ensuite un précipité pulvérulent d'acide hyaluro- nique (hyaluronate) par addition d'un solvant dans une solu- tion aqueuse d'acide hyaluronique (hyaluronate), puis on le sèche. Traditionnellement, en tant que composant de cosmé- tiques, on a utilisé l'acide hyaluronique (hyaluronate) dans des crèmes ou des laits. Récemment, on a constaté qu'il est possible d'éviter la formation de craquelures dans des cosmé- tiques comprimés, par addition d'une petite quantité d'une poudre fine d'acide hyaluronique (hyaluronate) obtenue par broyage d'acide hyaluronique (hyaluronate), et que les cosmé- tiques comprimés contenant de l'acide hyaluronique (hyaluro- nate) ne donnent pas de sensation d'étirement de la peau. En conséquence, l'utilisation sous forme de poudre fine de cette substance dans des produits cosmétiques-en poudre s'est répandue. Jusqu'à présent, on a préparé l'acide hyaluronique (hyaluronate) sous forme de poudre fine par broyage à sec. Toutefois, étant donné que l'acide hyaluronique (hyaluronate) est une substance naturelle à haut poids moléculaire et qu'il est fortement hygroscopique, en utilisant le broyage à sec il a été très difficile d'obtenir une poudre fine d'acide hyalu- ronique (hyaluronate) ayant une taille moyenne de particules de 20 pm ou moins, pour la préparation de produits de beauté en poudre. Les auteurs de la présente invention ont effectué des recherches pour résoudre les problèmes ci-dessus et obtenir une poudre fine d'acide hyaluronique (hyaluronate) ayant une taille moyenne de particules de 3,0 20 pm, et pour mettre au point un procédé pour sa préparation. Ils ont découvert ainsi qu'une poudre fine d'acide hyaluronique (hyaluronate) ayant une taille moyenne da particuies de 20 pn ou moins est aisément obtenue par mise en suspension d'acide hyaluronique (hyaluronate) dans un solvant organique dans lequel l'acide hyaluronique (hyaluronate) est insoluble, et par broyage de 3 - la suspension à l'aide d'un broyeur par voie humide. En conséquence, un objet de la présente invention est de fournir une poudre fine d'acide hyaluronique (hyaluronate) ayant une taille moyenne de particules de 3,0 - 20 pin, à uti- liser comme matériau pour cosmétiques en poudre, à l'aide d'un procédé caractérisé en ce qu'il comprend la mise en sus- pension d'acide hyaluronique ou d'hyaluronate de sodium dans un solvant organique dans lequel l'acide hyaluronique ou l'hyaluronate de sodium est insoluble, le broyage de la sus- pension au moyen d'un broyeur par voie humide, l'élimination du solvant organique et le séchage de l'acide hyaluronique broyé ou de l'hyaluronate de sodium broyé. Comme solvant organique, on peut utiliser l'alcool éthylique, l'alcool méthylique,' l'acétone, le n-propanol, I'isopropanol, l'acétonitrile ou des mélanges de deux de ceux-ci ou plus. Le broyeur par voie humide utilisé dans le procédé selon la présente invention est un broyeur de type à éléments broyeurs, un broyeur à rotor tournant à grande vitesse, ou une combinaison de ceux-ci. En ce qui concerne le broyeur à éléments broyeurs, on peut utiliser un broyeur vertical, un broyeur de type cuve à agitation, un broyeur tubulaire à écoulement ou un broyeur de type annulaire. Dans un mode de réalisation préféré, le broyeur par voie humide de type à rotor tournant à grande vitesse est un broyeur de type colloidal. L'acide hyaluronique (hyaluronate) utilisé dans le pro- cédé de préparation de la présente invention est obtenu par extraction à partir de crêtes de coq ou par un procédé de fermentation. Ce dernier procédé comprend la culture d'un micro- organisme ayant la capacité de produire de l'acide hyaluro- nique, tel que Streptococcus pyoienes, Streptococcus equi, Streptococcus equisimilis, Streptococcus disgalactiae, -4 - Streptococcus zooepidemicus, etc., avec secouement ou aéra- tion dans un milieu de culture-contenant, par exemple, 20- g de D-glucose, 5 g d'extrait de levure, 3 g de dihydro- génophosphate de potassium, 2 g de monohydrogénophosphate de potassium, 0, 1 g de thiosulfate de sodium, 0,1 g de sulfate de magnésium x 7H20, 0,02 g de sulfite de sodium, 0,01 g de chlorure de cobalt, 0,01 g de chlorure de manganèse et 5 g d'un antimousse, dans 1 litre du milieu de culture, à des températures d'incubation de 25 à 40"C, de préférence de 30 à 35 C, pendant une durée de 1 à 3 jours, à pH 6,0-8,5 et de préférence à pH 7,0, l'acide hyaluronique (hyaluronate) pro- duit s'accumulant dans le milieu de culture, l'élimination des micro-organismes hors du milieu de culture par centrifu- gation ou filtration, et l'élimination des substances à bas poids moléculaire par ultrafiltration ou dialyse du surna- geant ou du filtrat. On traite ensuite la solution résultante par précipitation fractionnée avec du bromure de cétyl- triméthylammonium et ensuite par chromatographie d'échange d'ions et par passage sur du charbon actif (pour la décolora- tion). Après concentration de la solution résultante, on obtient une solution aqueuse concentrée d'acide hyaluronique (hyaluronate) purifié. On prépare l'acide hyaluronique (hya- luronate) pulvérulent par séchage par atomisation, lyophili- sation, etc. Une autre possibilité consiste à ajouter à la solution aqueuse concentrée d'acide hyaluronique (hyaluro- nate) purifié un solvant organique soluble dans l'eau, tel que l'alcool éthylique, l'alcool méthylique, l'acétone, l'isopropanol et similaires, dans lequel l'acide hyaluronique (hyaluronate) est insoluble, puis à séparer le précipité obtenu, à le laver avec le solvant organique soluble dans l'eau, et à le sécher pour obtenir l'acide hyaluronique (hya- luronate). L'acide hyaluronique (hyaluronate) de la présente invention est une poudre fine ayant une taille moyenne de particules de 3 à 20 gm et qui est obtenue par fin broyage de - 5 - l'acide hyaluronique (hyaluronate) obtenu comme décrit ci- dessus. Si la taille moyenne des particules est inférieure à 3 pm, la poudre ne convient pas à être utilisée sous forme de produit de beauté en poudre, car les pores de la peau sont bouchés par la.poudre. Lorsque la taille moyenne des parti- cules excède 20 pm, la poudre ne convient pas non plus en tant que produit de beauté en poudre, car elle ne s'applique pas bien sur la peau. La taille moyenne de particules de la poudre fine d'acide hyaluronique (hyaluronate) peut être mesurée par une méthode de transmission de la lumière. Le solvant organique, dans lequel l'acide hyaluronique (hyaluronate) est insoluble, qui est utilisé dans le procédé pour la préparation de l'acide hyaluronique (hyaluronate) en poudre de la présente invention, n'est pas particulièrement limité, mais le solvant est de préférence l'alcool éthylique, l'alcool méthylique, l'acétone, le n-propanol, l'isopropanol, l'acétonitrile ou des mélanges de deux de ceux-ci ou plus. Pour la mise en suspension de l'acide hyaluronique (hyaluronate) dans le solvant organique, dans lequel l'acide hyaluronique (hyaluronate) est insoluble, on peut ajouter audit solvant organique l'acide hyaluronique (hyaluronate) en poudre séché, ou bien on peut avec succès utiliser telle quelle la suspension obtenue par addition du solvant orga- nique soluble'dans l'eau au précipité obtenu par lavage avec le solvant organique soluble dans l'eau indiqué ci-dessus. Bien que la quantité d'acide hyaluronique (hyaluronate) qui est mise en suspension dans le solvant organique varie avec le type de broyeur, elle est de préférence d'environ 20 à 400 g par litre de suspension. Si la quantité d'acide hya- luronique (hyaluronate) dans la suspension est trop élevée, on peut ne pas obtenir une taille moyenne de particules de pm ou moins. Si la quantité ci-dessus est insuffisante, les parties mobiles du broyeur seront usées et les particules provenant de l'usure des pièces seront mélangées en tant qu'impuretés à l'acide hyaluronique (hyaluronate). Pour cette - 6 - raison, la quantité d'acide hyaluronique (hyaluronate) dans le solvant sera de préférence déterminée à la suite d'essais de broyage répétés. On peut effectuer le broyage de la suspension d'acide hyaluronique (hyaluronate) en une fois ou, de préférence, en la répétant plusieurs fois, comme par exemple de trois à cinq fois, ce qui permet d'obtenir de l'acide hyaluronique (hyalu- ronate) broyé de façon uniforme. En outre, on peut effectuer le broyage de la suspension à la température ambiante ou, de préférence, à basse température, ce qui permet un broyage aisé. On peut utiliser dans la présente invention un broyeur par voie humide de type quelconque, mais on utilisera de pré- férence un broyeur à éléments broyeurs ou un broyeur par voie humide à rotor tournant à grande vitesse. Après le traitement de broyage fin, on élimine par fil- tration ou centrifugation le solvant organique soluble dans l'eau. On sèche sous vide le tourteau de filtration résultant et on obtient une poudre fine d'acide hyaluronique (hyaluro- nate) ayant une taille moyenne de particules de 3 à 20 pim. L'avantage du procédé de la présente invention est qu'il permet de préparer aisément la poudre fine d'acide hya- luronique (hyaluronate) ayant une taille moyenne de parti- cules de 3 à 20 pm. La présente invention est illustrée à l'aide des exemples descriptifs et non limitatifs ci-après. Exemple 1 On prépare un mélange constitué de 200 ml d'alcool éthylique et 400 g de poudre séchée (taille des particules: 150 pm) d'hyaluronate de sodium obtenu par un procédé de fer- mentation. On agite bien le mélange pour obtenir une suspen- sion uniforme. On broie la suspension à l'aine d'un broyeur de type à éléments broyeurs (nom commercial: Coball Mill, type MS-18, fabriqué par Fryma, Suisse), dans les conditions suivantes: -7- Elements broyeurs: billes de verre Diamètre des billes: 1-1,5 gm Vitesse périphérique du rotor: 13 m/s Cadence d'alimentation: 500 ml/min Température de la suspension: 7"C à l'entrée, 7 C à la sortie. On broie finement la suspension en la faisant passer trois fois dans le broyeur. On sépare par filtration avec aspiration la suspension finement broyée d'avec l'alcool éthylique, puis on la sèche sous vide. La quantité de la poudre obtenue est 388 g. A la suite de mesure de la taille des particules par une méthode de transmission de la lumière, la taille moyenne de particules obtenue est 3,0 pm. Exemple 2 Dans 300 litres d'une solution aqueuse purifiée d'hya- luronate de sodium obtenue par un procédé de fermentation (contenant 900 g d'hyaluronate de sodium), on dissout du chlorure de sodium pour obtenir une concentration de 0,2 mole/l. En maintenant la solution sous vigoureuse agita- tion, on ajoute lentement 900 litres d'alcool éthylique pour faire précipiter l'hyaluronate de sodium. Après avoir inter- rompu l'agitation et séparé le précipité par filtration, on ajoute 900 litres d'alcool éthylique au précipité résultant et on agite à nouveau le mélange, puis on le lave avec l'alcool. Après lavage, on sépare le précipité par filtra- tion. Sous agitation, on ajoute 30 litres d'alcool éthylique au précipité d'hyaluronate de sodium résultant. On obtient une suspension uniforme. On broie la suspension à l'aide d'un broyeur par voie humide de type à rotor tournant à grande vitesse (nom commercial: Bockvolt Homogenizer, Type 100, fabriqué par Bockvolt, RFA, dans les conditions suivantes: Ecartement: 0, 07-0,08 mm Cadence d'alimentation: 10 litres/min. 8 - On broie finement la suspension en la faisant passer pendant 10 minutes dans le broyeur. On sépare la suspension finement broyée d'avec l'alcool éthylique par filtration avec aspiration, puis on la sèche sous vide. La quantité de la poudre obtenue est 722 g. Mesurée par la méthode de transmis- sion de lumière, la taille moyenne des particules se révèle être 8,5 pmn. Exemple 3 A 300 ml d'alcool éthylique, on ajoute 5 g de poudre séchée (taille moyenne de particules: 150 pm) d'hyaluronate de sodium obtenu par un procédé de fermentation. On agite bien le mélange pour obtenir une solution uniforme. On broie la suspension à l'aide d'un broyeur de type à éléments broyeurs (nom comercial: DYNO-MILL, type KDL, fabriqué par Willy A. Bachofen AG, Suisse), dans les conditions suivantes: Elémments broyeurs: billes de verre. Diamètre des éléments broyeurs: 0,5-0,75 mm. Vitesse périphérique du disque agitateur: 10 m/s. Cadence d'alimentation: 50 ml/min. Température de la suspension: 20 C. On broie finement la suspension en l'envoyant au broyeur à l'aide d'une pompe péristaltique et en la mainte- nant sous agitation à l'aide d'un agitateur magnétique. On sépare la suspension finement broyée d'avec l'alcool éthylique par filtration avec aspiration, puis on la sèche sous vide. La quantité de la poudre obtenue est 4,82 g. La mesure de la taille des particules par la méthode de trans- mission de lumière donne une taille moyenne de 4,1 pimn. Exemple 4 A 2 000 ml d'acétone, on ajoute 400 g de poudre séchée (taille moyenne de particules: 150 pm) d'hyaluronate de sodium préparé par un procédé d'extraction. On agite bien le mélange et on obtient une suspension uniforme. On broie la suspension en procédant comme dans l'exemple 1, et on sépare la suspension finement broyée d'avec l'acétone par filtration 9avec aspiration, puis on la sèche sous vide. La quantité de la poudre obtenue est 390 g. La mesure de la taille des par- ticules par une méthode de transmission de la lumière donne une taille moyenne de particules de 3,5 pmn. Exemple comparatif 1 On introduit 20 g de la même poudre séchée (taille moyenne de particules: 150 pm) d'hyaluronate de sodium que celle utilisée dans l'exemple 1, dans un broyeur à billes en alumine, d'un volume de 950 ml, contenant des billes d'alu- mine, et on effectue le broyage pendant 4 heures à tours/min en atmosphère sèche. En mesurant par la méthode de transmission de lumière la taille des particules de la poudre obtenue, on constate une taille moyenne des particules de 40 pm. - 10 - REVENDICATIONS 1. Procédé pour la préparation de poudre fine d'acide hyaluronique ou d'hyaluronate de sodium, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en suspension d'acide hyaluronique ou d'hyaluronate de sodium dans un solvant organique dans lequel l'acide hyaluronique ou l'hyaluronate de sodium est inso- luble, le broyage de la suspension à l'aide d'un broyeur par voie humide, l'élimination du solvant organique et le séchage de l'acide hyaluronique broyé ou de l'hyaluronate de sodium broyé. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le solvant organique est l'alcool éthylique, l'alcool méthylique, l'acétone, le npropanol, l'isopropanol, l'acétonitrile, ou un mélange de deux de ceux-ci ou plus. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le broyeur par voie humide est un broyeur de type à élé- ments broyeurs, un broyeur par voie humide de type à rotor tournant à grande vitesse, ou une combinaison de ceux-ci. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le broyeur de type à éléments broyeur est un broyeur vertical, un broyeur de type cuve à agitation, un broyeur tubulaire à écoulement ou un broyeur de type annulaire. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le broyeur par voie humide à rotor tournant à grande vitesse, est un broyeur colloidal. 6. Poudre fine d'acide hyaluronique ou d'hyaluronate de sodium, caractérisée en ce que la poudre est obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendicatione 1 à 5 et a une taille moyenne de particules allant 3,0 à 20 pim.