FR 2630827 A1 19891103 FR 8805668 A 19880428 l La présente invention est relative a un dispo- sitif et à un procède pour la determination qualitative et quantitative rapide d'un ligand réactif présent dans un fluide. L'invention s'applique plus particulièrement, mais 3 non limitativement. à la détection de la présence d'anticorps ou d'antigènes dans un fluide biologique, à la détection de substances toxiques, de virus ou de bactéries dans un fluide quelconque (eaux, produits fluides des in- dustries agro-alimentaires, effluents industriels, fluides 1C biologiques, etc....), au dosage chimique de substances (telles qu'hormones, vitamines, enzymes, médicaments, etc...) présentes dans un fluide (notamment biologique). Les méthodes de détermination de la présence ou de la concentration de substances antigéniques dans des i_ fluides biologiques, par voie immunologique, sont à présent bien connues; elles sont basées sur la formation d'un com- plexe entre la substance antigénique à déterminer et un ou des anticorps, l'un des composants du complexe pouvant être marqué par un élément radioactif (tel que 125I, par 2' exemple) pour permettre sa détection et/ou son analyse quantitative après séparation de l'antigène ou de l'anticorps marqué complexé, de l'antigène ou de l'anticorps marqué non complexé. Dans les méthodes de détermination immunolo- 2' gique par compétition, la substance antigénique contenue dans l'échantillon de liquide à analyser, entre en compéti- tion avec une quantité connue d'antigène marqué pour une quantité limitée de sites de fixation de l'anticorps: la quantité d'antigène marqué liée à l'anticorps est inverse- ZM ment proportionnelle à la quantité d'antigène contenue dans l'échantillon. Les tests immunométriques utilisent un anti- corps marqué: la quantité d'anticorps marqué associée au complexe est proportionnelle à la quantité de substance an- tigénique contenue dans l'échantillon. 26308.27 Des tests immunometriques particulièrement adaptés à la détection d'antigènes polyvalents, c'est-à- dire de substances antigéniques capables de se complexer avec au moins deux anticorps en même temps, consistent à E utiliser une quantité d'anticorps non marqué lié à un sup- port solide insoluble dans le liquide à analyser, et une quantité d'anticorps soluble portant un indicateur, tel qu'un isotope radioactif, qui permet la détection ou la dé- termination quantitative du complexe ternaire formé entre l'anticorps en phase solide, l'antigène et l'anticorps mar- qué. Ces méthodes consistent à mettre tout d'abord en contact l'anticorps lié à la phase solide avec l'échantillon à analyser, pour extraire l'antigène de l'échantillon, par formation d'un complexe binaire entre 1l l'anticorps en phase solide et l'antigène. Après une pé- riode d'incubation, le support solide est lavé pour en éli- miner le résidu d'échantillon liquide, y compris l'antigène éventuel n'ayant pas réagi, puis mis en contact avec une solution contenant une quantité-connue d'anticorps marqué. Après une seconde période d'incubation pour permettre à l'anticorps marqué de se complexer avec l'antigène lié au support solide par l'intermédiaire de l'anticorps non mar- qué, le support solide est lavé une seconde fois pour enle- ver l'anticorps marqué n'ayant pas réagi, puis la présence d'anticorps marqué sur le support solide lavé est détectée (par exemple par mesure du rayonnement émis. si l'indicateur est un élément radioactif) et éventuellement soumise à un processus de détermination quantitative. Ces méthodes sont connues sous le nom de mé- thodes "sandwich" ou "bi-site", du fait que l'antigène porte deux anticorps liés à sa surface en deux sites diffé- rents. Elles sont décrites par WIDE dans "Radioimmuno assay Methods" (Kirkham et Hunter, E. et S. Livingstone, Ed., Edimbourg, 1970, p. 199206). Des applications spécifiques (test de détection de l'antigène lié à l'hépatite) sont dé- crites dans le Brevet des Etats-Unis d'Amerique N 3 867 517; des variantes de ces méthodes ("simultanées" ou "inverses") sont décrites par JEONG et al. dans "Comparison S of RIA with a single-incubation two-site immunoradiometric assay (IRMA) as applied to the determination of human thy- roïd stimulating hormone (HTSH)", Bio-Rad Laboratories, 1979; dans le Brevet des Etats-Unis d'Amérique NV 4 174 384 (marquage de deux anticorps par un chromophore fluorescent (fluorescéine) et par un chromophore qui ab- sorbe la lumière émise par la fluorescéine); dans le Brevet des EtatsUnis d'Amérique N' 4 098 876. Ces méthodes utilisaient initialement des anticorps polyclonaux, dont la sensibilité est insuffisante en raison de l'existence d'une réactivité croisée avec d'autres antigènes. Le Brevet Français HYBRITECH Ne 81 15030 publié sous le N0 2 487 983, a proposé de remplacer dans ces tests immunométriques, les anticorps polyclonaux par des anticorps monoclonaux, pour augmenter de façon importante la sensibilité de ces mé- thodes. Le Brevet Français LIOTTA Ne 82 16973, publié sous le Ne 2 514 511, décrit un dispositif et un procédé pour déterminer la présence d'antigènes dans des fluides biologiques, par la méthode ELISA, tout en éliminant les E opérations de dilution et de lavage qu'elle nécessite et en réduisant la durée de la période d'incubation. Le disposi- tif proposé comprend une matrice formée d'un ruban en pa- pier de nitrocellulose ou de diazobenzyloxymnéthyle (DBM), en gel poreux tel que polyacrylamide, agarose ou collagène, _0 dans les pores duquel l'antigène peut être piégé ou bien il peut être réticulé avec le gel par l'intermédiaire des groupes amine du ligand et des groupes carboxyle portés par la matrice, ou bien d'ur ruban de cellulose ou de fibres de matière plastique à l'intérieur duquel sont piégées des particules ou des billes qui contiennent le ligand. Confor- mément à ce brevet LIOTTA, le dispositif comprend: - une première zone qui conti.ent des antigènes et des anticorps liés à une enzyme, ces anticorps étant situés dans ladite première zone de telle manière qu'ils soient éliminés de cette première zone lorsqu'ils ont réagi avec des antigènes (non liés) contenus dans l'échantillon à tester, traversant cette première zone, mais qu'ils n'en soient pas éliminés en l'absence de tels antigènes, - et une seconde zone contenant une substance.capable de réagir avec lesdits an- ticorps liés à une enzyme, pour produire une réaction colo- rée révélant la présence desdi'ts anticorps. De façon spéci- fique,le dispositif de dosage immunologique décrit dans le Brevet LIOTTA comprend un stratifié à trois couches de ma- trice poreuses dont la première est imprégnée d'un anti- corps spécifique lié à une enzyme, la seconde couche po- reuse contient un antigène de référence immobilisé (lié), et la troisième couche contient un substrat produisant une couleur, qui réagit avec l'enzyme liée à l'anticorps. L'antigène libre à doser présent dans l'échantillon à ana- lyser, mis en contact avec la première couche, diffuse dans la seconde, puis dans la troisième couche. L'antigène libre présent dans l'échantillon entre en compétition avec l'antigène de référence lié, immobilisé dans la seconde couche, pour se combiner à l'anticorps lié à une enzyme. Si l'anticorps -lié à une enzyme se combine à l'antigène libre, 2$ il diffuse librement dans la troisième couche et produit une réaction colorée. Par contre, si l'échantillon à analy- ser ne contient pas d'antigène, tous les anticorps liés à une enzyme possèdent des sites de liaison libres et se com- binent avec l'antigène immobilisé présent dans la seconde couche; l'anticorps lié à une enzyme, qui se combine à l'antigène immobilisé dans la seconde couche, ne diffuse pas dans la troisième couche et aucune réaction colorée ne se produit. Le Brevet Français LIOTTA 87 08007, pubiié sous le N 2 599 845 décrit une variante de ce dispositif, qui ne comprend que deux couches, dont la couche supérieure porte l'antigène avec les deux anticorps réactifs et dont la couche inférieure contient un substrat chromogène, les deux zones, la zone de piegeage et la zone de substrat, pouvant également être juxtaposees. Les couches poreuses a travers lesquelles diffuse l'antigène de l'échantillon, combiné à l'anticorps lié à une enzyme, jouent donc le rôle d'un filtre sélectif qui ne laisse passer que l'antigène combiné à l'anticorps marqué par une enzyme, mais ne fonc- tionne pas si l'anticorps n'est pas combiné à de l'antigène, c'est-à-dire en l'absence d'antigène. Le Brevet américain HYBRITECH N0 4 632 901 (et la Demande Internationale PCT correspondante N 85/05451) décrit un procédé et un dispositif de réalisations d'immunoessais qui ne nécessitent pas le recours à des étapes d'incubation de longue durée associées à plusieurs i5 lavages, et permettent, par leur simplicité, leur mise en oeuvre par le médecin, à sa consultation, et même par le patient chez lui. Le dispositif en question comprend un premier élément qui est poreux et qui est constitué par une membrane ou un filtre auquel est lié un anticorps, monoclo- nal ou polyclonal, qui reconnait l'antigène que l'on cherche à identifier, et un deuxième élément, qui est ab- sorbant et comporte des passages capillaires perpendicu- laires à ses surfaces supérieure et inférieure; ce second élément est en communication capillaire avec la membrane, ou analogue, poreuse, qui forme le premier élément du dis- positif, et présente une dimension de pores telle qu'il induise la traversée de liquide à travers le premier élé- ment sans application de moyens externes. La membrane po- reuse filtrante peut être du Nylon portant des groupes NH2 auxquels les anticorps sont liés par covalence, par cou- plage à l'aide de glutaraldéhyde et l'élément absorbant peut être en matière filtrante fibreuse telle que fibres d'acétate de cellulose, de polyester, de polyoléfine, etc... Ces deux éléments peuvent être séparés l'un de l'autre par un autre élément poreux (en polyéthylène par exemple) qui ne fixe pas d.'anticorps de façon non- spéci- fique et empêche que de- l'anticorps marqué ne se fixe de façon nonspécifique sur la surface supérieure de l'élément absorbant. De même, la Demande de Brevet Européen ABBOTT LABORATORIES N2 186 100 décrit un dispositif qui vise à dé- terminer la présence ou la quantité d'une substance dans un échantillon à tester, et qui comprend une matrice fibreuse poreuse, non-absorbante, telle que du verre, imprégnée d'un polymère hydrophobe qui forme un revêtement de surface sur au moins une partie de la matrice et auquel est fixé un réaétif, par exemple un anticorps ou un antigène, capable de réagir avec la substance recherchée dans l'échantillon, ce dispositif pouvant être associé à une couche de matière absorbante sous-jacente et/ou à une couche de matière fi- breuse telle que fibres de verre ou papier-filtre en cellu- lose, qui recouvre la matrice fibreuse et peut jouer le rôle de "pré-filtre". La Demande de Brevet Européen MUREX CORPORATION N' 206 561 fait également connaître un dispositif de diagnostic qui comprend un élément filtrant comportant au moins une zone de réaction associée à au moins une zone pé- riphérique, un élément absorbant associé uniquement à la zone périphérique du premier élément et un élément de main- tien du filtre en position appropriée. La "réaction" qui se 2' produit dans la zone de réaction peut aussi bien être une séparation par filtration qu'un couplage immunologique et c'est dans la même zone qu'apparaissent les signaux de lec- ture de la réaction. L'échantillon liquide à tester par- vient sur le filtre par un entonnoir dont l'orifice de dé- charge est calculé de telle manière que son diamètre soit suffisant, en combinaison avec la pression du liquide dans l'entonnoir, pour que le liquide se décharge sur la sur- face supérieure du filtre mais ne traverse pas ce dernier, la pression hydrostatique étant, par suite, ajustée de telle manière que le liquide pénètre dans le filtre par gravité et est diffusé à travers ce dernier par action ca- pillaire, sans le traverser perpendiculairement de part en part. Tous ces dispositifs ont en commun la présence d'un élément filtrant, poreux, à travers lequel s'écoule l'échantillon liquide à tester, des moyens étant prévus, le cas échéant, pour ralentir l'écoulement du liquide. Toute- fois, un tel élément filtrant ne permet pas un temps de contact suffisant entre le réactif lié à l'élément fil- trant, et la substance recherchée dans l'échantillon li- quide, et ne permet pas, de ce fait, l'obtention d'une réaction dont la sensibilité soit telle qu'elle soit apte à détecter de très faibles concentrations de ladite substance dans l'échantillon; de plus, l'écoulement de l'échantillon contenant, le cas échéant, un complexe ligand-récepteur, 1' tel que, notamment, un complexe antigène-anticorps, à tra- vers un élément filtrant est susceptible d'engendrer des erreurs de lecture. La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à un dispositif et à un procédé pour la détermination qualitative et quantitative rapide de la présence d'un ligand réactif, dans un fluide, qui répon- dent mieux aux nécessités de la pratique que les disposi- tifs et procédés visant au même but proposés dans l'Art an- térieur, notamment en ce que le dispositif conforme à l'invention présente une sensibilité très supérieure à celles indiquées dans l'Art antérieur, puisqu'il peut dé- tecter de très faibles concentrations de ligand, notamment d'antigène, dans un fluide, notamment biologique, qui peu- vent être aussi basses que 5 picogrammes, alors que les procédés de l'Art antérieur ne permettent pas de détecter des concentrations aussi faibles, et ne sont sensibles qu'à partir de quelques gg; en ce qu'il permet de réaliser deux réactions entre un réactif et une substance à détecter, en deux endroits totalement séparés, ce qui donne lieu à des réactions très spécifiques et évite ainsi à coup sûr les réactions croisées et les faux positifs ou négatifs, sans recourir aux méthodes par compétition; en ce qu'il est ca- pable de mettre en oeuvre plusieurs types d'anticorps mono- clonaux simultanément et s'applique à tous les modes de lecture des résultats, tels que colorimétrie, fluorescence, chimioluminescence, radioactivité, etc... et en ce qu'il permet de réaliser des dosages quantitatifs. La présente invention a pour objet un disposi- tif pour la détermination qualitative et quantitative ra- pide de la présence d'un ligand réactif, dans un fluide, du type comprenant une zone de réaction contenant un réactif marqué, notamment un anticorps ou un antigène marqué, des- tiné à réagir avec le ligand recherché, et une zone de ré- vélation, lequel dispositif est caractérisé en ce qu'il comprend, en combinaison: - une première zone de réaction qui comprend une membrane au moins temporairement imperméable, prévue pour recevoir un échantillon de fluide à tester et destinée à être associée à au moins un réactif convenablement mar- qué, apte à reconnaître le ou les ligands recherché(s) éventuellement contenu(s) dans ledit échantillon, et à des moyens de perméabilisation de ladite membrane; - une deuxième zone de réaction, distincte de la première et au moins temporairement isolée de celle-ci par la membrane susdite, comprenant une phase solide conte- nant un réactif de référence, non marqué, apte à recon- naître le ou les ligands que l'on cherche à identifier et au moins temporairement close du côté opposé à celui o se trouve la première membrane, par une deuxième membrane au moins temporairement imperméable, et - une troisième zone de réaction au moins tem- porairement isolée de la deuxième zone de réaction susdite par ladite deuxième membrane, qui contient des moyens de révélation de la réaction qui s'est éventuellement produite dans la première ou la deuxième zone de réaction. Selon un mode de réalisation avantageux du dis- positif conforme à la présente invention, au moins l'une des deux membranes susdites est réalisée en un matériau im- perméable pendant une première période de temps suffisante pour permettre à la réaction qui doit se produire dans la zone de réaction intéressée, d'avoir lieu, ledit matériau étant tel qu'il est perméabilisé au bout de cette première période de temps, pour laisser passer des produits de la réaction qui y a eu lieu, vers la zone de réaction sui- vante. Selon un autre mode de réalisation du disposi- 1O tif conforme à la présente invention, les moyens de perméa- bilisation d'une ou des membrane(s) sont indépendants de la membrane concernée. Selon encore un autre mode de réalisation avan- tageux du dispositif conforme à la présente invention, les i5 moyens de perméabilisation d'une ou des membrane(s) sont incorporés à la membrane concernée. Selon une disposition avantageuse de l'invention, lesdits moyens de perméabilisation sont constitués par une substance de dissolution d'une ou des membrane(s). Selon une autre disposition avantageuse de l'invention, lesdits moyens de perméabilisation sont constitués par un agent de lyse d'une ou des membrane(s). Selon encore une autre disposition avantageuse 2 de l'invention, les matériaux au moins temporairement im- perméables utilisés pour réaliser une ou les membrane(s) susdite(s), sont pris dans le groupe qui comprend, notam- ment, des hydrates de carbone, de la gélatine. Selon un autre mode de réalisation avantageux du dispositif conforme à la présente invention, la première zone de réaction est propre à recevoir une phase solide, avantageusement supportée par la première membrane, qui comprend au moins un réactif convenablement marqué, éven- tuellement associé à un agent de lyse de ladite membrane. Conformément à l'invention, le réactif marqué est marqué de manière appropriée, notamment par une enzyme, par un radioisotope, par un produit chimique chromophore fluorescent ou chimioluminescent et il peut être avantageu- sement un anticorps ou un antigène. Egalement conformément à l'invention, le maté- riau dont est constituée au moins la première membrane est tel que celleci est dissoute au bout d'un temps approprié, par la phase liquide aqueuse de l'échantillon à tester. Conformément à la présente invention, l'agent de perméabilisation est constitué. par un agent de lyse, tel qu'une enzyme appropriée, de la membrane concernée, qui peut être soit incorporé dans celle-ci, soit associé à la- dite membrane par introduction dans le dispositif conforme à l'invention, soit associé dans la phase solide qui com- prend le réactif susdit. Selon encore un autre mode de réalisation avan- tageux du dispositif conforme à la présente invention, la phase solide contenant un réactif de référence, non marqué, qui se trouve dans la deuxième zone de réaction, est constituée par un support insoluble sur lequel est fixé le- dit réactif (anticorps ou antigène, notamment) non marqué, qui correspond. au ligand que l'on cherche à détecter, lequel support insoluble est choisi dans le groupe qui com- prend notamment les microsphères, les microplaques ou autres. Selon un mode de réalisation avantageux du dis- positif conforme à la présente invention, la troisième zone de réaction contient un substrat chromogène lorsqu'il est prévu que la lecture de la réaction doit se faire par colo- rimètrie. Selon un autre mode de réalisation avantageux du dispositif conforme à la présente invention, le disposi- tif comporte entre la première et la deuxième zones de réaction, une zone intermédiaire qui comprend un réactif marqué, auquel cas la première zone de réaction comprend un réactif non marqué. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la zone intermédiaire comprend au moins une couche de structures vésiculaires multicouches dans les- quelles est incorporé au moins un réactif propre à être li- béré au bout d'un temps approprié par un agent de lyse ap- proprié, tel, notamment, qu'une enzyme. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la zone intermédiaire est formée d'une membrane intermédiaire intercalée entre la première mem- brane susdite et la deuxième zone de réaction, laquelle membrane intermédiaire est avantageusement associée à un réactif marqué, auquel cas la première membrane est asso- ciée à un réactif de même nature que la membrane intermé- diaire susdite. _ Le mode de réalisation du dispositif conforme à l'invention, qui comporte trois zones de réaction, permet d'effectuer des déterminations qualitatives de la présence ou de l'absence de ligands réactifs dans un fluide, notam- ment d'antigènes ou d'anticorps dans un fluide biologique. 2C Le mode de réalisation du dispositif conforme à l'invention qui comporte une zone supplémentaire permet de procéder à des dosages semi-quantitatifs de tels ligands. Conformément à la présente invention, il est également possible de réaliser des dosages quantitatifs, en associant la troisième zone du dispositif à un appareillage de quantification connu en lui-même, tel que RIA, spectro- photomètre, etc. Selon un mode de réalisation avantageux du dis- positif conforme à la présente invention, les zones de 3G réaction susdites sont superposées pour former un étage su- périeur contenant la première zone de réaction, un étage médian contenant la deuxième zone de réaction et un étage inférieur contenant la troisième zone de réaction, et éven- tuellement un étage intermédiaire entre l'étage supérieur et l'étage médian, qui contient la zone de réaction inter- médiaire. 2630827 - La présente invention a également pour objet un procédé de détermination qualitative et quantitative rapide de la présence d'un ligand réactif dans un fluide, qui est caractérisé en ce qu'au cours d'une première étape, un échantillon du fluide à analyser est mis en contact avec un réactif marqué, tel qu'un anticorps ou un antigène marqué, notamment, dans une zone temporairement isolée des zones dans lesquelles ont lieu les étapes ultérieures du procédé, pendant un temps suffisant pour permettre à la réaction ligand-réactif de se produire, au bout duquel l'isolement de ia zone dans laquelle a eu lieu ladite réaction, est rompu pour permettre au produit éventuel de la réaction d'entrer en contact, au cours d'une deuxième étape, avec un second réactif, non marqué, correspondant au ligand que l'on cherche à identifier dans l'échantillon de fluide sus- dit, dans une seconde zone temporairement isolée de la zone qui la suit, après quoi l'isolement de la seconde zone est rompu pour permettre au produit de la première ou de la deuxième réaction d'entrer en contact, au cours de la troi- sième étape du procédé, avec des moyens de révélation de la présence - ou de l'absence - du ligand que l'on cherche à détecter. Selon un mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention, l'échantillon de fluide est mis en contact, au cours de la première étape du prô- cédé, avec un réactif non marqué et la seconde étape du procédé est précédée d'une étape intermédiaire au cours de laquelle le complexe ligand-réactif non marqué formé au cours de la première étape, est mis en contact avec un réactif marqué de même nature que le réactif mis. en oeuvre dans la première étape, dans une zone temporairement isolée de l'étape suivante. Selon une modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le réactif non marqué mis en contact avec l'échantillon de fluide à analyser au cours de la première étape du procédé, est introduit à raison d'une quantité dé- a3 terminée qui correspond à une quantité connue de ligand tel que celui que l'on cherche à détecter, le ligand en excès, c'est-à-dire non lié au réactif au cours de la première étape, est piégé, au cours de l'étape intermédiaire du pro- cédé, par le réactif marqué, sur lequel ledit excès de li- gand se fixe, d'o il résulte que la réaction de révélation de la présence éventuelle du ligand dans le fluide à analy- ser n'est positive que si le taux de ligand dans ledit fluide est supérieur à la quantité susdite, permettant lc ainsi une détermination semi-quantitative du ligand présent dans ledit fluide. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du pro- cédé conforme à la présente invention, la première étape du procédé est une phase d'absorption et la deuxième étape du I procédé est une phase de désorption, et la troisième étape du procédé est une phase d'absorption. Lorsque le procédé conforme à l'invention com- porte une étape intermédiaire intercalée entre la première et la deuxième étape du procédé, cette étape intermédiaire est, comme la première étape, une phase d'absorption. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comporte encore d'autres dispositions, qui res- sortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère aux dessins annexés dans lesquels: - la Figure 1 est une représentation schéma- * tique en coupe orthogonale, d'un mode de réalisation du dispositif conforme à la présente invention; _O - la Figure 2 représente un schéma des étapes du procédé de détermination qualitative de la présence d'antigènes; - la Figure 3 représente un schéma des étapes du procédé de détermination qualitative de la présence d'anticorps, et - la Figure 4 représente la courbe de dosage quantitatif de l'ACE présente dans du sérum humain. I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces dessins et les parties descriptives correspondantes, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Le dispositif conforme à la présente invention, représenté à la Figure 1, comprend, de bas en haut, un sup- port 7 qui porte une pastille de substrat chromogène 6, au- dessus de laquelle est disposée une membrane 3' qui sera décrite de façon plus détaillée plus loin. Au-dessus de cette membrane 3' est disposée une couche de microsphères 5 qui seront décrites de façon plus détaillée dans la suite _n du présent Mémoire descriptif. Les microsphères sont avan- tageusement, mais non nécessairement, protégées de part et d'autre part par des couches de protection qui peuvent être en tous matériaux appropriés, et notamment en textile. Une seconde membrane, 3, est disposée au-dessus de la couche 5 de microsphères; la structure 2 forme conjointe- ment avec le support 7 et un cadre intermédiaire 8, le bâti du dispositif. Dans l'échancrure 9 en forme de coupe de la structure 2 est insérée une pastille 1 de préférence lyo- philisée, d'un réactif qui reconnaît le ligand dont la dé- 2- tection sera réalisée à l'aide du dispositif conforme à la présente invention. Les ligands que l'on cherche à détecter à l'aide de ce dispositif sont des antigènes et des anti- corps, mais aussi toutes sortes de substances chimiques ou biologiques. Les applications du procédé et du dispositif conformes à la présente invention sont très nombreuses; l'on peut citer parmi elles: le diagnostic des affections virales et microbiennes, les dosages enzymatiques, le dé- pistage des maladies auto-immunes et de la maladie d'Alzheimer, le dépistage précoce de cancers, la réalisa- tion de groupages sanguins rapides, le dosage. de médica- 1' ments circulants, la détection d'allergènes et le diagnos- tic d'allergies, le dosage des récepteurs membranaires, les dosages d'hormones, les dosages d'éléments chimiques, et notamment des anions et des cations de l'ionogramme. Bien entendu, cette énumération n'est pas exhaustive, ni limita- tive. Les réactifs qui reconnaissent le ligand à dé- tecter sont essentiellement des anticorps ou des antigènes, qui sont mis en oeuvre de préférence à l'état lyophilisé, sous forme de pastilles 1. Les anticorps ou antigènes contenus dans la pastille 1 sont des anticorps ou antigènes marqués par un marqueur approprié tel qu'un radio-isotope, une enzyme, une substance fluorescente, un produit chimique susceptible de donner avec un substrat approprié une réaction colorée, etc. La membrane 3 qui forme l'étage supérieur du dispositif est réalisée en matériau qui est temporairement imperméable, pendant une durée suffisante pour permettre à une goutte d'échantillon de fluide à examiner mise en contact avec la pastille 1, de réagir pour former, si le fluide contient effectivement le ligand à détecter, un com- plexe ligand-anticorps ou antigène marqué, la membrane 3 perdant son imperméabilité au bout de ce temps pour laisser passer en totalité le fluide contenant éventuellement le complexe susdit, jusqu'à l'étage médian. Il est avantageux de réaliser la membrane 3 en gélatine qui est imperméable dans des conditions normales, mais est dissoute en l'espace de 20 secondes à 1 minute par 0i une enzyme appropriée telle que la collagénase. Il est avantageux d'inclure l'enzyme de lyse de la gélatine dans la pastille 1 d'anticorps ou d'antigène, car la durée né- cessaire pour que le ligand et le réactif (anticorps ou an- tigène) contenu dans la pastille 1 réagissent entre eux, Z5 est du même ordre que la durée nécessaire à l'enzyme de lyse pour dissoudre la membrane 3. Il peut être avantageux de renforcer la membrane 3 de gélatine, en y noyant une structure en fibres de verre qui constitue le squelette de la membrane 3 après la dissolution de la gélatine. L'étage médian du dispositif conforme à la pré- sente invention comprend une couche 5 de microsphères réa- lisées en tous matériaux appropriés tels que métaux et leurs alliages, polyacrylamide, etc., de diamètres va- riables compris entre 10 et 250 mm, portant un réactif (antigène ou anticorps), identique ou similaire au ligand que l'on cherche à détecter, destiné à retenir les réactifs marqués restés libres à l'étage supérieur.. Dans ces conditions, si l'on recherche un anti- gène dans une goutte de fluide biologique, en cas de réac- tion positive l'antigène présent dans ledit fluide se lie à l'anticorps contenu dans la pastille 1, sur la membrane 3, qui est dissoute par une enzyme appropriée dès que la réac- tion ci-dessus a eu lieu; le fluide contenant le complexe antigène-anticorps précité traverse la couche de micro- sphères, 5, sans être retenu par ces dernières, puis par- vient sur la membrane 3' qu'il dissout par l'intermédiaire de la collagènase contenue dans ledit fluide, pour per- mettre au fluide de parvenir dans la zone de révélation qui contient un substrat 8 qui est coloré par contact avec le fluide examiné. 2S En cas de réaction négative, c'est-à-dire si le fluide examiné ne contient pas d'antigène, l'anticorps mar- qué de l'étage supérieur est retenu par l'antigène non mar- qué fixé sur les microsphères et ne colore donc pas le sub- strat. 3O Les modalités sont les mêmes, mutatis mutandis, si c'est un anticorps que l'on recherche dans le fluide. Si on veut obtenir une détermination semi-quan- titative, le réactif de l'étage supérieur est non marqué, tandis qu'un étage intermédiaire fait suite à l'étage supé- rieur et comprend des structures vésiculaires multicouches ou des microcapsules à l'intérieur desquelles sont incorpo- rés des réactifs marqués. Le réactif associé à la membrane 3, tel qu'anticorps par exemple, est introduit à raison d'une quantité qui correspond à une quantité déterminée d'antigène, soit x ng/ml d'antigène, par exemple 10 ng/ml d'antigène. Si le fluide testé contient une quantité plus élevée d'antigène, l'excès est fixé sur les anticorps mar- qués, incorporés aux structures vésiculaires de l'étage in- termédiaire, dès l'ouverture de celles-ci sous l'action de l'enzyme de lyse, en sorte que l'on obtient des résultats par rapport à un seuil, c'est-à-dire des résultats semi- quantitatifs. La Figure 2 illustre le dosage qualitatif d'antigènes, avec obtention- d'une réaction positive: on y voit le complexe anticorpsantigène formé, désigné par la iS5 référence 10, traverser l'étage médian sans être retenu sur les microsphères, pour former une ré-action positive. En ef- fet, la totalité des anticorps marqués de la pastille 1 est saturée par les antigènes présents dans le sérum, au bout de 30 secondes environ, en sorte que lorsque le complexe saturé parvient, après la lyse de la. membrane supérieure 3, après ces- 30 secondes, sur les microsphères de la couche 5 sur laquelle sont fixés des antigènes de même nature que ceux qui sont recherchés dans le sérum, les microsphères ne peuvent fixer ces complexes saturés, qui, à travers la mem- brane 3' lysée, parviennent dans la zone de révélation. De façon plus spécifique, le dosage illustré à la Figure 2 s'applique au dosage qualitatif de la présence d'antigènes de la syphilis. Les anticorps marqués qui constituent le réactif de l'étage supérieur 13 sont des IgG humaines (500 picogrammes) provenant de sérums de contrôle positifs (Code 76751 Pasteur), marquées à la péroxydase (Merck) sur de la concanavaline A (méth. de GUESDON et AVRAMEAS, 1980). La pastille qui contient le réactif contient également 5 3ze unités de collagénase (collagénase Clostridium de Calbiochem). La membrane 3 est une membrane en 263082? polycarbonate DMF, de 10pm d'épaisseur, comportant des pores de 3 Pm bouchés à chaud par une solution éthanolique à 3 % de gélatine, la gélatine qui bouche les pores étant lysée par la collagénase au bout de 30 secondes. La membrane 3 est supportée par une structure en fibres de verre. Les anticorps polyclonaux marqués 14 utilisés comme réactifs, mis en contact avec les antigènes sériques 15 t contenus dans la goutte de sérum mise en contact avec la pastille qui contient le réactif 14, forment un complexe anticorps marqué-antigène 10. Comme un sang positif en antigènes VDRL en contient environ 200 picogrammes par goutte de 50 microlitres, les 500 picogrammes d'anticorps marqués introduits à l'étage supérieur 13 sont suffisants pour capter les antigènes sériques 15; cet excès d'anticorps a d'ailleurs une incidence sur l'accélération de la vitesse de la réaction Ag-Ac. En effet, sur les 500 picogrammes d'anticorps marqués 14 de l'étage supérieur 13, picogrammes vont se lier aux antigènes sériques 15 pour former le complexe Ag-Ac 10, qui ne se fixera pas à la phase solide constituée par les microsphères 5 de l'étage médian 11. Ces microsphères (5 pl) en "Magnogel" (IBF) comportent un coating d'antigène VDRL-LATEX (1 ng/5 pl) sur protéine A + glutaraldéhyde (Réactif IBF) et VDRL, (Diag Pasteur Code 52675). Dès que la gélatine de la membrane 3 est lysée, 300 picogrammes d'anticorps marqués restés libres vont se fixer sur les antigènes VDRL-LATEX portés par les microbilles 5 de l'étage médian 11, tandis que les picogrammes dianticorps marqués saturés par les antigènes sériques, 10, vont traverser la membrane 3' 3C inférieure (identique à la membrane 3), dès que la gélatine qui bouche ses pores est lysée, pour aboutir à l'étage inférieur 16, qui est la zone de révélation qui contient le substrat (S) avantageusement constitué par de la 3,3',5,5'- tétraméthylbenzidine stabilisée (ICN-LAB. MILES) sur un support approprié tel que papier Wathman N 1, par exemple par combinaison avec le substrat (S), le complexe 10 donne une réaction colorée (12); la coloration peut appa- raître avec seulement 20 picogrammes si outre le 3,3',5,5'- TMB, le substrat contient le complexe Glucose-Oxydase/B-D- Glucose qui produit de l'eau oxygénée, au contact de sérum, permettant ainsi l'amplification de la coloration. La Figure 3 illustre le dosage qualitatif d'anticorps avec obtention d'une réaction positive: apres secondes environ, la totalité des antigènes marqués est saturée par les anticorps sériques, puis la membrane supé- rieure 3 est lysée, permettant le passage de tous les com- plexes anticorps-antigènes marqués, vers les microsphères de l'étage médian, auxquelles sont fixés des anticorps non marqués de même nature que les anticorps recherchés. Comme les épitopes (sites antigéniques) sont saturés par les an- ticorps sériques, ils ne sont pas reconnus par les anti- corps fixés sur les microsphères et parviennent dans la zone de révélation, dans laquelle ils réagissent avec le substrat pour donner une réaction colorée. L'exemple illustré à la Figure 3 s'applique plus particulièrement à la détection d'anticorps de la toxoplasmose. L'étage supérieur 13 reçoit en tant que réactif constitué- par des antigènes marqués, des antigènes de la toxoplasmose (Code 52721 Diag. Pasteur) avantageusement lyophilisés (250 picogrammes), marqués à la péroxydase (MERCK). La pastille lyophilisée contenant les Ag 17 contient également 5 unités de collagénase (Collagénase Clostridium de Calbiochem). La membrane 3, avantageusement supportée par une structure en fibres de verre, est telle que celle décrite en relation avec la Figure 2. Les anti- gènes marqués 17, utilisés comme réactif, mis en contact avec les anticorps sériques (polyclonaux) 18 contenus dans la goutte de sérum mise en contact avec la pastille qui contient le réactif 17, forment un complexe Antigène mar- qué-anticorps sérique 19. Comme un sang positif en anti- corps antitoxoplasmose en contient 100 à 150 picogrammes, les 250 picogrammes d'Antigènes marqués 17 saturent ces an- ticorps sériques 18 et les empêcheront de se fixer sur les microbilles (5p1) 20 - telles que microbilles de "Magnogel" (IBF) comportant un coating d'anticorps anti-toxoplasmose (1 ng/5 l) sur protéine A + Glutaraldéhyde (réactifs IBF; anticorps Institut Pasteur) - qui se trouvent à l'étage mé- dian 11. Dès la perméabilisation de-la membrane 3, par lyse de la gélatine qui bouche ses pores, les antigènes marqués 17 non saturés par les anticorps sériques 18, se fixent sur les anticorps supportés par les microbilles 20, tandis que les complexes antigènes-marqués - anticorps, 21, franchis- sent la membrane inférieure 3' dès qu'elle est à son tour -perméabilisée, pour se combiner au substrat (S) qui peut être le même qu'à l'Exemple 2, en donnant une coloration, qui peut éventuellement être amplifiée comme décrit en re- lation avec la Figure 2. La Figure 4 représente une courbe de dosage de l'ACE contenue dans des échantillons de sérum humain. Les échantillons testés ont un volume de 50 plitres. 10 échantillons de même.volume de sérum humain à tester et un échantillon de sérum humain test ne conte- nant pas d'ACE sont traités comme suit: on verse un échan- tillon sur la pastille lyophilisée 1 qui est supportée par la membrane 3 et qui contient 1250 picogrammes d'IgGl 2>5 murine anti-épitope 328.C de l'ACE marquée à la péroxydase. Au bout de 30 secondes, la totalité des anticorps marqués a été saturée par les antigènes sériques. La lyse de la membrane 3, qui est en gélatine (renforcée par un réseau de fibres de verre) par la collagénase n'a lieu qu'après ces 30 secondes, ce qui provoque l'écoulement du sérum contenant les anticorps marqués saturés par les antigènes sériques, dans la deuxième zone de réaction dan3 laquelle ils sont mis en contact avec les microbilles de la couche 5, revêtues des mêmes antigènes. Ils ne sont pas retenus par les antigènes qui revêtent les microbilles 5, car les sites Fab des anticorps marqués sont saturés par les antigènes sériques; l'enzyme présente dans le fluide qui traverse la seconde zone de réaction, lyse alors la deuxième membrane 3', ce qui provoque l'écoulement du fluide dans la troisième zone de réaction; dans cette zone, la totalité des anticorps marqués liés aux antigènes sériques, arrivent au contact de la pastille de substrat, qui est de la 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine, et provoquent une coloration quasi-immédiate en présence de péroxydase. Une bandelette disposée sous le dispositif conforme à l'invention recueille le produit de filtration et révèle ainsi le signal-réponse qui indique le taux de matériel marqué qui traverse les microbilles Les différentes concentrations en ACE de l'échantillon analysé, qui sont de 0, 5 - 1 - 1,5 - 2 - 2.5 - 5 - 10 - 15 - 20 nanogrammes d'ACE /ml de sérum, soit 25- -75-100-125-250-500-750-1000 picogrammes d'ACE dans les gl d'échantillon à doser, sont représentées dans la Figure 4. En raison des seuils de détectabilité très bas que permettent le dispositif et le procédé conformes à la présente invention, 1il est possible de réaliser des déterminations dans le cadre de la présente invention avec une seule goutte de sang de 50 pl. Il est également possible de réaliser une pluralité de diagnostics conjointement en utilisant des microsphères portarVt différents marqueurs de diagnostic. La sensibilité des dosages est de l'ordre de 5 à 125 picogrammes, selon la sensibilité de l'anticorps monoclonal mis en oeuvre: c'est pourquoi il est recommandé d'utiliser des anticorps monoclonaux ultraspécifiques. Comme on l'a dit plus haut, les étages successifs du dispositif conforme à la présente invention constituent des phases présentant des affinités différentes vis-à-vis de l'eau; c'est ainsi que l'étage supérieur est une phase d'absorption, l'étage médian est une phase de désorption et l'étage inférieur est une phase d'absorption. Cette alternance est obtenue, dans l'exemple décrit, grace à l'établissement d'un gradient osmotique glucose. Il en résulte que tous les liquides sont aspires vers le substrat de l'étage inférieur, alors que, en cas de S réaction négative, seul le matériel marqué est retenu sur les microsphères. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. Z3 REVENDICATIONS 1. Dispositif pour la détermination qualitative et quantitative rapide de la présence d'un ligand réactif, dans.un fluide, du type comprenant une zone de réaction contenant un réactif marqué, notamment un anticorps ou un antigène, marqué, destiné à réagir avec le ligand recherché, et une zone de révélation, lequel dispositif est caractérisé en ce qu'il comprend, en combinaison: - une première zone de réaction (13) qui comprend une membrane (3), au moins temporairement imperméable, prévue pour recevoir un échantillon de fluide à tester et destinée à être associée à au moins un réactif convenablement marqué, apte à reconnaitre le ou les ligands recherché(s) éventuellement contenu(s) dans ledit é5 chantillon, et à des moyens de perméabilisation de ladite membrane; - une deuxième zone de réaction (11), distincte de la première et au moins temporairement isolée de celle- ci par la membrane (3) susdite, comprenant une phase solide contenant un réactif de référence,-non marqué (5 ou 20), apte à reconnaître le ou les ligand(s) que l'on cherche à identifier et au moins temporairement close du côté opposé à celui o se trouve la première membrane, par une deuxième membrane (3') au moins temporairement imperméable, et 2_d - une troisième zone de réaction (16) au moins temporairement isolée de la deuxième zone de réaction susdite par ladite deuxième membrane (3'), qui contient des moyens de révélation de la réaction qui s'est éventuellement produite dans la première ou la deuxième zone de réaction. 2. Dispositif selon la Revendication 1, caractérisé en ce qu'au moins l'une des deux membranes (3, 3') susdites est réalisée en un matériau imperméable pendant une première periode de temps suffisante pour permettre à la réaction qui doit se produire dans la zone de réaction intéressée, d'avoir lieu, ledit matériau étant -4 tel qu'il est perméabilisé au bout de cette première période de temps, pour laisser passer des produits de la réaction qui y a eu lieu, vers la zone de réaction suivante. 3. Dispositif selon l'une quelconque des Revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les moyens de perméabilisation d'une ou des membrane(s) sont indépendants de la membrane concernée. 4. Dispositif selon l'une quelconque des Revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les moyens de perméabilisation d'une ou des membrane(s) sont incorporés à la membrane concernée. 5. Dispositif selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, caractérisé en ce que lesdits moyens de perméabilisation sont constitués par une substance de dissolution d'une ou des membrane(s). 6. Dispositif selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, caractérisé en ce que lesdits moyens de perméabilisation sont constitués par un agent -de lyse d'une ou des membrane(s). 7. Dispositif selon l'une quelconque des Revendications i à 6, caractérisé en ce que la première zone de réaction (13) est propre à recevoir une phase solide (1), avantageusement supportée par la première membrane (3), qui comprend au moins un réactif convenablement marqué, éventuellement associé à un agent de lyse de ladite membrane. 8. Dispositif selon l'une quelconque des Revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la phase solide contenant un reactif de référence, non marqué,- qui se trouve dans la deuxième zone de réaction (11), est constituée par un support insoluble (5 ou 20) sur lequel est fixé ledit réactif (anticorps ou antigène, notamment), non marqué, qui correspond au ligand que l'on cherche à détecter. 9. Dispositif selon l'une quelconque des Revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la troisième zone de réaction (16)contient un substrat chromogène lorsqu'il est prévu que -la lecture de la réaction doit se faire par colorimétrie. 10. Dispositif selon l'une quelconque des Revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le dispositif comporte entre la première et la deuxième zones de réaction, une zone intermédiaire qui comprend un réactif marqué, auquel cas la première zone de réaction comprend un réactif non marqué. 11. Dispositif selon la Revendication 10, caractérisé en ce que la zone intermédiaire comprend au moins une couche de structures vésiculaires multicouches dans lesquelles est incorporé au moins un réactif propre à être libéré au bout d'une temps approprié par un agent de lyse approprié, tel, notamment, qu'une enzyme. 12. Dispositif selon la Revendication 11, caractérisé en ce que la zone intermédiaire est formée d'une membrane intermédiaire intercalée entre la première membrane susdite et la deuxième zone de réaction, laquelle membrane intermédiaire est avantageusement associée à un réactif marqué, auquel cas la première membrane est associée à un réactif de même nature que la membrane intermédiaire susdite. 13. Dispositif selon l'une quelconque des Revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la troisième zone dudit dispositif est associée à un appareillage de quantification connu en lui-même, tel que RIA, spectrophotomètre, entre autres. 14. Dispositif selon l'une quelconque des Revendications 1 à 13, caractérisé en ce que les zones de réaction susdites sont superposées pour former un étage supérieur contenant la première zone de réaction, un étage médian contenant la deuxième zone de réaction et un étage inférieur contenant la troisième zone de réaction, et éventuellement un étage intermédiaire entre l'étage supérieur et l'étage médian, qui contient la zone de réaction intermédiaire. 15. Procédé de détermination qualitative et quantitative rapide de la présence d'un ligand réactif dans un fluide, caractérisé en ce qu'au cours d'une première étape, un échantillon du fluide à analyser est mis en contact avec un réactif marqué, notamment tel qu'un anticorps ou un antigène marqué, dans une zone Ic temporairement isolée des zones dans lesquelles ont lieu les étapes ultérieures du procédé, pendant un temps suffisant pour permettre à la réaction ligand-réactif de se produire, au bout duquel l'isolement de la zone dans laquelle a eu lieu ladite réaction, est rompu pour permettre au produit éventuel de la réaction d'entrer en contact, au cours d'une deuxième étape, avec un second réactif, non marqué, correspondant au ligand que l'on cherche à identifier dans l'échantillon de fluide susdit, dans une seconde zone temporairement isolée de la zone qui 2 C lui fait suite, après quoi l'isolement de la seconde zone est rompu pour permettre au produit de la première ou de la deuxième réaction d'entrer en contact au cours de la troisième étape du procédé, avec des moyens de révélation de la présence - ou de l'absence du ligand que l'on 2'5 cherche à détecter. 16. Procédé selon la Revendication 15, caractérisé en ce que l'échantillon de fluide est mis en contact, au cours de la première étape du procédé, avec un réactif non marqué et la seconde étape du procédé est précédée d'une étape intermédiaire au cours de laquelle le complexe ligand-réactif non marqué formé au cours de la première étape, est mis en contact avec un réactif marqué de même nature que le réactif mis en oeuvre dans la première étape, dans une zone temporairement isolée de l'étape suivante. 2 7 17. Procédé selon la Revendication 16, caractérisé en ce que le réactif non marque mis en contact avec 'l'échantillon de fluide à analyser, au cours de la première étape du procédé, est introduit à raison d'une quantité déterminée qui correspond à une quantité connue de ligand tel que celui que l'on cherche à détecter, le ligand en excès, c'est-à-dire non lié au réactif au cours de la première étape, est piégé, au cours de l'étape intermédiaire du procédé, par le réactif marqué sur lequel ledit excès de ligand se fixe, d'o il résulte que la réaction de révélation de la présence éventuelle du ligand dans le fluide à analyser n'est positive que si le taux de ligand dans ledit fluide est supérieur à la quantité susdite, permettant ainsi une détermination semi- quantitative du ligand présent dans ledit fluide. 18. Procédé selon l'une quelconque des Revendications 15 à 17, caractérisé en ce que la première étape du procédé est une phase d'absorption et la deuxième étape du procédé est une phase de désorption, tandis que la troisième étape du procédé est une phase d'absorption. 19. Procédé selon la Revendication 18, caractérisé en ce que lorsqu'il comporte une étape intermédiaire intercalée entre la première et la deuxième étapes du procédé, cette étape intermédiaire est, comme la première étape, une phase d'absorption.