FR 2623628 A1 19890526 FR 8716314 A 19871120 Sérum étalon, de nature humaine, reconstitué à partir des fractions rejetées (non-utilisées en thérapeutique), du fractionnnement du plasma humain, du sang humain, du sang placentaire ou rétroplacentaire. La présente invention a pour objet la fabrication d'un sérum de contrôle de nature humaine, reconstitué à partir de sous-fractions non-utilisées du fractionnement du plasma humain, du sang humain, ou du sang rétroplacentaire ou placentaire; ainsi que l'utilisation de ce sérum reconstitué pour le contrôle de qualité des laboratoires d'analyses des co posants du sang humain. - On sait que l'utilisation de standards d'origine humaine (sérums ou plasmas de contrôle) est obligatoire en biologie clinique chaque fois que des tests de détermination de paramètres, utilisent une méthode de nature immunologique, ou lorsqu'il s'agit de mettre en évidence une activité biologique spécifique de nature humaine tels que: enzymes, facteurs de la coagulation ou facteurs du complément. - On sait que, actuellement, la plupart des standards humains utilisables, utilisent des sérums humains complets naturels ou du sang placentaire ou rétroplacentaire. Tous produits de disponibilité réduite, de coût élevé et utilisés à des usages thérapeutiques. Compte-tenu cependant de la difficulté de disposer facilement d'un sérum humain entier pour une utilisation comme réactifs, de la difficulté de disposer de grandes quantités de sang placentaire et du coût important, en tout état de cause de ces produits, un substitut a été envisagé et notamment à partir des fractions non-utilisées en thérapeutique provenant du fractionnnement du sang ou du plasma. Dans les centres de fractionnement du plasma humain, c'est généralement la méthode de COHN - ou toute méthode qui en est dérivée-qui est utlisée pour obtenir les fractions utilisées en thérapeutique tels que facteurs de la coagulation, immunoglobulines, albumine, fibrinogène. Au cours de ces fractionnements, certaines fractions, sous forme de pâtes ou de surnageants liquides, ne sont pas utilisées en thérapeutique et sont généralement détruites par incinération. Exemple n 1: le schéma I donne un exemple de fractionnement selon la méthode de COHN du plasma humain prélevé sur ACD. - 2 - Exemple n 2: le schéma II donne un exemple d'une variante de ce fractionnement. Dans l'un et l'autre exemple, les fractions encadrées sont des fractions non-utilisées en thérapeutique et les fractions soulignées sont des fractions actuellement utilisées en thérapeutique. De nombreuses autres variantes existent et, en particulier, des variantes au cours desquelles le polyéthylène glycol {PEG) est utilisé en place ou en sus de l'alcool, dans certaines étapes. L'invention a donc pour but d'utiliser les fractions rejetées, de les modifier par des méthodes physico-chimiques ou chimiques, de les mélanger en proportions variables pour disposer d'un substitut du sérum humain dans les contrôles de qualité des laboratoires. Elle vise également à fournir un procédé de manipulation et de modification de ces fractions rejetées. Elle vise à obtenir un sérum humain reconstitué, économique, ayant des caractéristiques chimiques et physico-chimiques semblables à celles d'un sérum humain naturel et, en particulier, en ce qui concerne sa limpidité, sa viscosité, sa couleur, sa teneur en différents composés, son profil électrophorétique. Elle vise, en outre, en mélangeant les fractions modifiées en proportions variables, de fabriquer un "sérum reconstitué" déplété en certains composés gênants au cours de certains dosages. Les fractions utiles, désignées dans l'invention, sont caractéristiques en qu'il s'agit principalement de la pâte III (obtenue après isolement du fibrinogène, des facteurs VIII et Super VIII et du PPSB), de la pâte IV (obtenue après isolement du fibrinogène, des facteurs VIII et Super VIII, du PPSB et des immunoglobulines), du surnageant V (obtenu après précipitation de l'albumine). L'invention réside également dans le fait que les pâtes III et IV sont homogénéisées dans deux volumes d'un soluté physiologique quelconque tel que le soluté de RINGER normal ou modifié comme suit: NaCl 585 g; KCl 37 g; urée 30 g; créatinine 1 g; glucose 100 g; Na H2 P04 H20 6,8 g; ammonium sulfate Fer2+ 6 H20 2 g; NaH CO3 340 g; Zn SO4 2H20 1,5 g; Cu SO4 1,25 g; Mg Cl2 6 H20 20 g et que la suspension est dialysée au moins 24 heures contre un soluté physiologique, à l'aide de membrane à seuil de coupure d'au moins 1 000, à raison de 1 litre de suspension pour 50 litres de liquide de contre-dialyse, ce qui permet l'élimination de l'alcool, la - 3 - remise en solution d'un maximum des protéines, et l'équilibrage en ions et substrats. Les fractions de l'invention sont caractérisées également en ce que les suspensions obtenues sont clarifiées par centrifugation ou par filtration, soit directement, soit après précipitation des lipoprotéines par toute technique connue et, en particulier, par la méthode de BURNSTEIN- SCHOLNICK et MORFIN (1970)- et que la concentration protéique est ramenée à environ 50 g/l par ultrafiltration sur membrane à zone de coupure 10 000 daltons. De la même façon, l'invention réside dans le fait que la fraction surnageant V est concentrée par ultrafiltration sur membranes à zone de coupure 10 000 daltons jusqu'à des teneurs protéiques de 30 à 80 g/l; que la solution est dialysée, dans les mêmes conditions que pour les fractions III et IV, contre un soluté physiologique pour rééquilibrer en électrolytes et en substrats et pour éliminer le restant de l'alcool. Cette fraction surnageant V peut être avantageusement remplacée par une solution albumineuse humaine pyrogène (non-utilisée en thérapeutique) ou bovine. L'invention réside également en des mélanges en proportions variables des solutions obtenues à partir des pâte III (produit A), pâte IV (produit B), surnageant V (produit C) pour obtenir un sérum reconstitué à teneur protéique contrôlée et à teneur en divers paramètres ajustés. Par exemple, on mélange avantageusement 50 à 70 % de C avec O à 30 % de B et O à 30 % de A pour obtenir un sérum reconstitué dont les caractéristiques sont reportées dans le tableau I. Ce sérum reconstitué, filtré stérilement sur 0,20 um et conservé en flacons stériles, a une conservation d'au moins deux ans, telle que rapportée dans le même tableau I. -4 PLASMA ACD Ethanol 10 - 40 C - 2 Cryoprécipitation Pâte I Surnageant I Surnageant du Cryoprécipité Lavage 2 x. cryoprécipité Facteur VIII Ethanol 10 % et Super VIII Citrate Chromatographie Fibrinogène Surnageant pH = 9 FFbrinogène Eg In lat 'ElE1--I Filtrat Eluat II Eluat III -PBS Ethanol 19 % pH = 5,85 - 50 C Pâte II Surnageant II Alcool 13 % Ethanol 38 % *pH = 5,10 pH = 6,10 iii pH:,1 - 30 C 5 C /'J-Pt IVI Surnageant III Pte e Surnageant IV Alcool 25 % Ethanol 41 % pH = 7,2 pH = 4,85 NaCl 3 g/l 120 C - 7 C Pâte V Surnageant V Immunoglobulines Surnageant des Albumine immunoglobulines Schéma I - 5 - PLASMA ACD Ethanol 10 % 40 C - 2 2 ripitation Pâte I Surnageant I Surnageant Cryoprécipité Lavage 2 x cryoprécipité Facteur VIII Ethanol 10 % et Super VIII Citrate Chromatographie F4brinogène Surnageanti\ Fibrinogène Il Eluat I -Filtrat Eluat II /V Eluat III__ PBS Ethanol 19 % pH = 5,85 -5 C Pâte II Surnageant II Eth.anol 8 % Ethanol 38 % pH= 4,7 pH = 6,10 -50 |Pâte III A Surnageant III A L|Ethanol 14 %Z Pte IV Surnageant IV pH = 5 Ethanol 41 % J '|pH = 4,85 Surnageant III B Pate III B - 120 C Ethanol 25 % '- pH = 7,2 Pâte V [Surnageant V j NaCl 3 g/l - 70 C Immunoglobulines Surnageant Albumine Immunoglobulines Schéma II - 6 Exemple STABILITE DES VALEURS D'UN LOT DE SERUM ETALON RECONSTITUE Date de fabrication: 29 mars 1985 Mise 3ème 6ème 15ème 2lème en service mois mois mois mois Protides 68 70 69 69 69 IgG g/1 13.0 4.1 3.2 3.3 4.2 IgA g/1 2.0 2.1 2.05 2.2 2.2 IgM g/l 1.5 1.5 1.55 1.56 1.55 Transferrine 2.7 2.5 2.9 2.6 Haptoglobine 1.0 1.0 1.01 Orosomucolde > 0.5 > 5.5 > 2.72 > 3 1 Antitrypsine 0.8 1.2 0.95 a 2 Macroglobuline 2.7 2.8 2.2 2.15 2.3 Céruléoplasmine 0.2 0.2 0.18 0.23 0.23 C3 0.5 0.48 0.55 0.59 0.46 RBP 44 55 35 47 48 HCG 57 56 57 52.9 LH 13.5 13.7 21 12.4 13 FSH 23.8 24.2 20.5 25.8 25 STH 3.7 3.5 3.3 3.7 3.4 Insuline 11 10 10 5 7 Cortisol 16 17 19 18 14.6 Prolactine 5 5 5 3 Ag Carcino. Embr. 60 54 29 36 30 Peptide C 2.97 3.20 2.58 2.6 2.5 a Foetoprotéine 3 4 3 3 3 Turbidité 0.250 0.260 0.240 Tableau I -7 REVENDICATIONS 1. Sérum étalon de contrôle de qualité, de nature humaine, caractérisé en ce qu'il est reconstitué à partir de sous-fractions, non- utilisées en thérapeutique, du fractionnement du.plasma humain ou du sang humain ou du sang placentaire ou du sang rétroplacentaire. 2. Sérum étalon, caractérisé en ce qu'il est formé à partir de la pâte III du fractionnement de COHN ou des pâtes équivalentes des variants de ce même fractionnement. 3. Sérum étalon, caractérisé en ce qu'il est formé à partir de la pâte IV du fractionnement de COHN ou des pâtes équivalentes des variants de ce même fractionnement. 4. Sérum étalon, caractérisé en ce qu'il est formé à partir du surnageant V du fractionnement de COHN ou du surnageant équivalent des variants de ce même fractionnement. 5. Sérum humain reconstitué, de nature humaine, selon les revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il peut provenir, soit de l'une des fractions citée dans les revendications i à 4, soit d'un mélange en proportions variables de ces mêmes-fractions. 6. Sérum étalon préparé selon les revendications 2 et 3 et caractérisé en ce que les fractions "pâte III" et "pâte IV" sont homogénéisées dans un soluté physiologique tel qu'un soluté de RINGER et dialysées contre ce même soluté à travers une membrane à zone de coupure d'au moins 1 000 daltons pour éliminer les solvants- organiques, équilibres en ions et substrats, et redissoudre le maximum de protéines. 7. Sérum étalon préparé selon les revendications 2, 3 et 6 et caractérisé en ce que les homogénats décrits dans la revendication 6 sont clarifiés par ultracentrifugation ou par filtration directement, ou également par ultracentrifugaiton ou filtration après précipitation préalable des lipoprotéines. 8. Sérum étalon préparé selon les revendications 2, 3, 6 et 7 et caractérisé en outre par le fait que les fractions décrites dans les revendications 2, 3, 6 et 7 sont ramenées à une concentration protéique d'environ 50 grammes par litre, par ultrafiltration sur membrane à zone de coupure 10 000 daltons. -8- 9. Sérum étalon préparé selon les revendications 1, 4 et 5 et caractérisé en ce que le "surnageant V" du fractionnement de COHN est concentré par ultrafiltration sur membrane à zone de coupure 10 000 daltons, jusqu'à des teneurs en protéines de 30 à 80 grammes par litre. 10. Sérum étalon préparé selon les revendications 1, 4, 5 et 9 et caractérisé en outre par le fait que la fraction obtenue par la revendication 9 est dialysée contre un soluté physiologique, comme décrit pour les fractions "pâte III" et "pâte IV" dans la revendication 6. 11. Sérum étalon préparé selon les revendications 1 à 10 et caractérisé en outre par le fait que les fractions obtenues par les revendications 4, 9 et 10 sont remplacées par une solution d'albumine humaine pyrogène non-utilisée en thérapeutique, ou par une solution d'albumine bovine. 12. Sérum étalon préparé selon les revendications 1 à 10 et tel que: si on appelle produit A le produit obtenu selon les revendications 1, 2, 6, 7 et 8; si on appelle produit B le produit obtenu selon les revendications 1, 3, 6, 7 et 8; si on appelle produit C le produit obtenu selon les revendications 1, 4, 9, 10 et 11, on mélange les produits A, B et C dans les proportions suivantes: 0 à 30 % de A, O à 30 % de B, 50 à % de C. 13. Sérum étalon préparé selon les revendications 1 à 12 et complété par l'utilisation des autres fractions rejetées du fractionnement de COHN et, en particulier, le "surnageant fibrinogène", les "éluats I et II" après chromatographie du surnageant du cryoprécipité, le "surnageant des immunoglobulines". 14. Utilisation du sérum étalon péparé selon les revendications 1 à 13 dans le contrôle de qualité ou l'étalonnage des appareillages, dans les laboratoires de biologie et d'analyses médicales.