FR 2624121 A1 19890609 FR 8716764 A 19871203 L'invention concerne de nouveaux plasmides provoquant des densonucléoses, leur procédé d'obtention et leur application dans la Lutte biologique contre les insectes ravageurs. Les densonucléoses sont les maladies affectant un grand nombre d'invertébrés, essentiellement des insectes, provoquées par les Densovirus. Le terme densonucléose reflète l'hyper- trophie caractéristique des noyaux dans lesquels les Densovi- rus se multiplient. Dans des conditions naturelles, une mortalité avoisinant 100% peut être atteinte en 4 ou 5 jours. Ces virus, classés dans le genre Densovirus, constituent avec les 2 genres Parvovirus et Dependovirus de parvovirus de vertébrés, la famille des Parvoviridae Les Densovirus sont de petits virus isométriques non enveloppés, à ADN, fortement pathogènes pour plusieurs espèces d'insectes ravageurs d'importance économique, notamment les lépidoptères chez lesquels ils ont été originellement décou- verts. Dans les milieux naturels, ils sont responsables d'épizooties qui participent efficacement à la régulation des populations de leurs hôtes. On a isolé à ce jour une vingtaine de Densovirus à partir d'insectes de différents groupes: lépidoptères, diptères, orthoptères, dictyoptères provenant de toutes les régions du globe. Les Densovirus présentent donc de très intéressantes potentialités d'utilisation vis - à - vis d'insectes d'impor- tance économique et notamment de lépidoptères, ce nouveau moyen de lutte microbiologique pouvant se substituer à la lutte chimique ou la compléter. Par ailleurs, il est important de souligner qu'en dépit de leur forte virulence vis-à-vis des insectes, des essais préliminaires et l'expérience de plusieurs années de labora- toire, n'ont pas révélé d' effets pathogènes pour l'homme. Des préparations à base d'autres virus entomopathogènes comme Les baculovirus sont commercialisées actuellement. Les méthodes de production industrielle de ces virus, qui reposent sur l'infection d'insectes en élevage de masse, entrainent des coûts de production élevés. Les tentatives de production en masse de ces virus sur cultures cellulaires se sont heurtées aux mêmes problèmes de prix de revient. Comme pour les baculovirus,la multipLication des densovirus est obtenue normalement sur des larves (Ann. Rev. Entomol.1979 24: 63 87), ce qui implique un coût élevé de production. Par ailleurs, plusieurs souches de densovirus ne peuvent être multipliées sur leurs hôtes, compte tenu des grandes difficultés rencontrées pour mettre au point des milieux artificiels nécessaires aux élevages industriels. Il était donc très intéressant de trouver d'autres voies de production du matériel infectieux, ne faisant pas interve- nir la multiplication sur l'hôte. Or, la possibilité d'obtenir cette production par génie génétique est possible pour les densovirus. En effet, la taille de leur génome est compatible avec une insertion dans un plasmide bactérien alors qu'elle ne peut être envisagée pour un virus à génome de très haut poids moléculaire comme les baculovirus. L'invention a donc pour objet de nouveaux plasmides recombinants capables de se répliquer dans Escherichia coli caractérisés en ce qu'ils contiennent une séquence complète ou partielle de l'ADN double ou simple brin d'un densovirus provoquant une densovirose chez un insecte sensible. Tous les densovirus dont une séquence complète ou par- tielle de l'ADN est contenue dans les plasmides de l'invention sont cités dans Intervirology 23: 61-73 (1985). Les Densovirus de lépidoptères ravageurs les plus étudiés sont les Densovirus de Junonia, de Galleria et d' Agraulis. L'invention concerne donc particulièrement des plasmides caractérisés en ce qu'ils contiennent une séquence complète ou partielle double ou simple brin d'un Densovirus de Junonia, de Galleria ou d'Agraulis et tout particulièrement des plasmides caractérisés en ce qu'ils contiennent une séquence complète ou partielle de l'ADN double ou simple brin du Densovirus de 3u Junonia (=J-DNV).Ces derniers plasmides sont appelés PJ ci- après dans le texte. Le génome des densovirus est constitué d'une molécule d'ADN linéaire simple brin de 5 à 6000 bases. Au cours de la morphogénèse virale, les virions des densovirus encapsident indifféremment mais toujours séparément et en proportion équimoléculaire, des chaines + et des chaines -. L'extraction dans des conditions de force ionique élevée (0,I SSC) d'ADN à partir d'une telle population virale, conduit à la formation de molécules bicaténaires par appariement des chaines compté- mentaires. Truffaut et al (1967) et Arch. Ges. Virusforsch.21, 2 6 2 4 121 469-474. et Barvise, A. H., and walker, 1.0. (1970). FEBS lett. 6, 13-16. Ainsi, par Leur faible poids moléculaire et leur propriété de former des chaines bicaténaires, ces génomes se prêtent particulièrement bien à leur intégration dans des plasmides. IL faut souligner que L'ADN bicaténaire extrait des virions est infectieux aussi bien en cultures cellulaires que par transfection de larves de l'espèce sensible. JOUSSET. 1er Congr.Soc.fr.Microbiol,Toulouse(France), Avril 1986, CP59, p. 44. et JOUSSET Soc. Invertebr. Pathol., 1986, p.121. Colloq. Invertebr., Veldhoven (The Netherlands), August 1986. Le clonage de l'ADN bicaténaire du Densovirus de Junonia a été ainsi réalisé et est décrit plus loin dans la partie expérimentale. La séquence du génome cloné ainsi obtenu a été déterminée selon les méthodes usuelles (Sanger et aL (1977) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74 p. 5463 - Maxam A.M. et Gilbert W. (1980) Methods Enzymol. 65 p. 499). L'invention a donc aussi pour objet la séquence complète du génome viral du Densovirus J-DNV qui est donnée à la figure 1. Elle concerne tout particulièrement la séquence complète de l'ADN viral du Densovirus J-DNV correspondant à la séquence donnée à la figure I dans Laquelle sont éliminées les deux extrémités X et Z. L'invention concerne donc particulièrement les plasmides caractérisés en ce qu'ils contiennent la séquence complète du génome viral du Densovirus J-DNV donnée à la figure 1. L'invention a aussi particulièrement pour objet les plasmides caractérisés en ce qu'ils contiennent la séquence complète ou partielle de l'ADN double ou simple brin du Densovirus de Galleria. Ces plasmides sont appelés pG ci-après dans le texte. Parmi les vecteurs pJ définis ci- dessus, le vecteur pBRJ est le vecteur préféré. Ce plasmide est caractérisé en ce qu'il renferme la séquence complète de l'ADN viral du Densovirus J-DNV cloné correspondant à la séquence donnée à la figure 1 dans laquelle sont éliminées les deux extrémités "X" et "Z" le principe de construction du plasmide est donné plus loin dans le texte et sa construction est détaillée dans la partie expérimentale. 4 2 6 22624121 La construction des plasmides selon l'invention fait appel aux techniques habituelles utilisées dans le domaine. Ces techniques sont celles décrites par exemple dans Maniatis Molecular cloning: A - Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) ou dans Basics methods in molecul biology Davis - Dibner Battney - Elsevier (1986). Le vecteur de départ utilisé dans la construction des plasmides selon l'invention est de préférence pBR 322 mais tout autre vecteur classique de clonage peut être utilisé, o10 comme par exemple le vecteur PUC18 ENorrander, J et al, Gene 26, 101 - 106 (1983)] ou le vecteur pAT153 ETwigg - A.J. and sheratt D, Nature 283,216 - 218 (1980)]. Ce vecteur de départ est digéré par une ou plusieurs enzymes de restriction, dans un site de clonage qui est de préférence un site unique. Le choix de ce site est dicté par les connaissances antérieures concernant la cartographie du génome viral du Densovirus. Ainsi, les plasmides pJ déjà définis précédemment, peuvent être construits à partir du vecteur de départ pBR 322 digéré par des enzymes générant des bouts francs comme par exemple ECoR V ou NrUI ou des enzymes générant des bouts collants comme par exemple Pst I. Ces différentes possibilités lécoulent de la cartographie du génome viral J-DNV donnée à la figure 2. La même stratégie de clonage peut bien entendu s'appliquer aux autres plasmides de l'invention, comme par exemple aux plasmides pG déjà définis précédemment qui sont contruits en utilisant l'enzyme de restriction PstI. La construction du plasmide préféré de l'invention, le plasmide pBRJ, est détaillé à la figure 3. L'ADN viral a été obtenu à partir du virus Junonia selon les techniques connues d'extraction et de purification. L'ADN purifié, après traite- ment à la polymérase est intégré au site unique ECoR V de pBR 322 linéarisé. Après transformation dans Escherichia coli, seules les colonies résistantes à l'ampicilline et sensibles à la tétracycline sont selectionnées. Des minilyses des bactéries recombinantes sont effectuées afin de ne retenir que les colonies renfermant les plasmides ayant inséré un fragment de taille voisine à celle de l'ADN génomique. Le schéma de construction de pBRJ est donné à la figure 3. L'invention concerne par ailleurs les bactéries hâtes Escherichia coli transformées par les plasmides recombinants capables de se répliquer dans Escherichia coli caractérisés en ce qu'ils contiennent une séquence complète ou partielle de l'ADN double ou simple brin d'un densovirus provoquant une densovirose chez un insecte sensible. Elle concerne notamment les bactéries tranformées par les plasmides pJ et tout is particulièrement par le plasmide pBRJ. Tous les plasmides tels que définis ci-dessus et notamment les plasmides pJ et parmi ceux-ci le plasmide pBRJ, peuvent être utilisés pour lutter contre les insectes ravageurs. Les essais décrits dans- la partie expérimentale montrent en effet que la transfection par injection du plasmide pBRJ dans l'hémolymphe de larves de Spodoptera permet de reproduire une densovirose identique- à celle provoquée par inoculation du virion ou de l'ADN viral J. La même sensibilité au pBRJ a été démontrée sur des souches de Spodoptera résistantes aux insecticides chimiques comme la deltamétrine. L'invention concerne donc l'application dans la lutte biologique contre les insectes ravageurs, des plasmides de l'invention et notamment des plasmides pJ et parmi ceux-ci, l'application du plasmide pBRJ. Les insectes d'importance économique concernés par une telle application sont certains diptères vecteurs, d'intérêt médical et vétérinaire et des lépidoptères et coléoptères ravageurs de cultures vivrières et industrielles (coton, mais,soja, palmier à huile, bananier). L'invention englobe également toutes les formulations insecticides adaptées à une telle application. Les formulations adéquates sont celles qui permettent un enrobage del'ADN des plasmides de l'invention. Les vésicules enrobant cet ADN doivent répondre à plusieurs critères: - cavité interne hydrophile, de diamètre suffisant. - assurer la protection de l'ADN du plasmide dans le tractus intestinal. - libérer leur contenu au niveau des cellules cibles, celles de l'intestin moyen par exemple. De telles vésicules sont par exemple des niosomes, des liposomes, des microcapsules de gélatine ou de polymères hydrosolubles ou d'acrylamide ou tout autre type de microcap- sules compatibles avec les critères définis ci-dessus. Des formes d'encapsidation dans des phages monocaténaires du type M 13 sont aussi à envisager. Les résultats expérimentaux donnés ci-dessous illustrent l'invention sans toutefois la limiter. Construction du plasmide oBRJ 101) Purification de l'ADN du virus 2) Clonage de l'ADN du virus 3) Séquence de l'ADN du virus 4) Résultats des transfections des larves de Spodoptera littoralis par l'ADN du Densovirus cloné ou non dans pBR 322. 51) Purification de l'ADN a) Purification du virus. à 30 larves Spodoptera littoralis infectées par le Densovirus de Junonia sont broyées au Potter dans du tampon TrisHCl 0,1M pH 7,4 acide ascorbique 2%. Le broyat est clarifié par une centrifugation de 10' à 10. 000 g. Les virions sont ensuite culottés par une centrifugation de 90' à 35000 rpm dans un rotor SW41 à 4C. Le culot est repris et déposé sur un gradient de rénographine 20-76% et centrifugé 15 heures à 35000 rpm dans un rotor SW41. La bande de virus localisée dans le 1/3 inférieur du gradient est récupérée puis dialysée contre du tampon TE (Tris HCl 10mM EDTA lmM pH 8.0) pendant 3 jours avec un changement de tampon toutes les 12 heures. La pureté des suspensions virales est ensuite contrôlée par microscopie électronique et spectrophotométrie UV. Leur concentration est estimée par mesure de la densité optique à 260 nm. Une unité de DO à 260 nm est équivalente à 100ug de virion par ml. b) Extraction de l'ADN Le tampon de la suspension virale est ajusté à 4mM EDTA, à 100ug de protéinase K par ml et à 2% sarkosyl. Apres une incubation de 2 heures à 37 C, la suspension est extraite trois fois par un même volume de phénol saturé de tampon TE. La phase aqueuse est récupérée puis dialysée contre du tampon TE. L'ADN est ensuite précipité par addition d'acétate de sodium ou de chlorure de lithium à 0. 2M final et deux volumes d'éthanol de 12 heures à 16 heures à -20 C. 7 2624121 Le culot d'ADN est rincé trois fois à l'alcool à 70% puis repris dans du tampon TE. La pureté de la solution d'ADN viral est contr6ôlée et sa concentration déterminée par spectrophoto- métrie UV. 2) Clonaqe de l'ADN du virus. a) Préparation de l'ADN du virus. Les extrémités du virus sont réparées par l'ADN polymérase de E. CoLi fragment de Klenow. 3,ug d'ADN du virus sont réparés dans un volume de 75 ut à l'aide de 7,5U d'ADN polymérase de E.Coli (Boehringer Mannheim Biochemicals = BMB cat no 1014531). Le tampon de réparation contient les deoxyadénosine, deoxycytosine, guanosine et thymidine à la concentration de 4OuM,du MgCl2 5mM,10mM béta- mercaptoéthanol, de la sérum albumine de boeuf 100,ug/mt et du Tris HCl 10mM pH 7,5. La réaction est incubée à 25 C pendant une heure. Apres une heure à 65"C, la réaction est extraite au phénol saturé Tris pH 7,5 0,1M puis précipitée en présence d'un volume d'acétate 0,3M et deux volumes d'éthanol 100%. b) Préparation de L'ADN du vecteur oBR322 L'ADN de PBR322 est préparé selon la méthode décrite par Maniatis et Coll. Molecular Cloning: A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). 2,Sug d'ADN de pBR322 sont digérés par l'enzyme de restriction EcoRV dans les conditions décrites par le fournisseur BMB en utilisant 18U/ug d'ADN d'enzyme dans un volume de SOul pendant 4 heures à 37'C. La digestion de l'ADN est vérifiée sur un gel d'agarose à 1%. L'ADN est ensuite déphosphorylé à l'aide de la phosphatase alcatine d'intestin de veau. On ajoute donc 2,ul de phosphatase alcaline BMB cat n 713023 à 22U/yl. Après une incubation d'une heure à 372C, la réaction est arrêtée par une incubation de 45 minutes à 65eC. Apres une extraction au phénol saturé Tris 0,1M pH 7,5. La phase aqueuse est précipitée à l'éthanol en présence d'acétate 0,3M. c) Liqation de l'ADN du Virus Junonia sur le vecteur oBR322 linéarisé Dar l'enzyme de restriction EcoRV. Apres précipitation et séchage l'ADN du vecteur est repris à une concentration de 40ng/ul, l'ADN du virus est repris à une concentration de lug/ul. La ligation est pratiquée dans un volume de 25ul dans les conditions décrites par le fabricant (New England Biolabs). Apres une incubation d'une nuit à 4 C. 8 2624121 Le mélange est prêt pour transformer les bactéries Escherichia Coli (MC1061). (Casabadan MJ. Methods in Enzymol. (1983) 100 p.293-3080. d) transformation des bactéries compétentes. Les bactéries compétentes sont préparées selon le proto- cole décrit par Hanahan (Maniatis 1982) et conservées à -70 C sous forme de fractions de 200ul. A 100>ul de bactéries compétentes décongelées à 37 C sans dépasser O'C, on ajoute 1jlu de la solution précédente contenant l'ADN du virus et le vecteur pBR322. Apres une incubation de 15 minutes à O0C puis un choc thermique de 5"à 37 C, on ajoute 900,ul de milieu LB (lOg Bactotryptone DIFCO, 5g Yeast extract DIFCO, 5g NaCl par litre Autoclaver à 120DC). Les bactéries recombinantes sont sélectionnées sur des boites de milieu LB gélosé contenant de l'Ampicilline à 100,ug/ml. Sur 253 colonies résistantes à l'Ampicilline 50 colonies sensibles à la tétracycline sont sélectionnées. e) mini-lyse des bactéries recombinantes et obtention du DBRJ. Parmi ces bactéries recombinantes sensibles à la tétracy- cline une seule porte l'ADN du virus cloné au site EcoRV. A partir d'une culture (1,5ml) en milieu L-B de chacun des clones recombinants, les ADN plasmidiques ont été préparés selon la méthode alcaline (Maniatis 1982). Chacun des ADN a été digéré par l'enzyme de restriction EcoR1. Une seule colonie porte un ADN plasmidique correspondant à un ADN de pBR322 avec du Densovirus de Junonia inséré au site EcoRV détruit lors du clonage. Le plasmide correspondant pBRJ est préparé en grande quantité à partir d'un litre de culture à saturation en milieu L-B par la méthode à l'hydroxyde de sodium et au sodium dodécyl sulfate (Maniatis 1982). Des digestions par les enzymes de Restriction BamH1, Pvu2, Bgl2, Nrul, Acc1, Pvul, BstE2, Sphl, EcoR1, Hind3, Rsal, Bgll ont permis de vérifier que l'ADN du Densovirus était inséré au site EcoRV détruit pendant le clonage dans l'orientation décrite sur la figure 3. 3) Séaquence de l'ADN du Densovirus de Junonia. La séquence de l'ADN du virus a été déterminée par la méthode de Sanger (Sanger 1977) pour sa plus grande partie. La jonction virus pBR322 du côté du site Hind 3 de pBR322 est séquencée par la méthode de Maxam et Gilbert. 9 2 6 22624121 a) méthode de Sanqer. 1) Clonace au hasard. méthode enzymatique. Des clonages au hasard sont réalisés avec les enzymes de restriction: Sau3A1, Xho2, Alul, Hae3, Accl. L'ADN du virus a été digéré par ces enzymes de restriction qui coupent fréquemment l'ADN du Densovirus de Junonia pour obtenir des fragments de l'ordre de 100 paires de bases (pb) à 1000 pb. Les fragments obtenus sont sous-clonés dans les vecteurs M13mp8 et M13mp9 (Messing, J. et Viera, Gene, 19, 259-268 (1982)) digérés par l'enzyme BamH1 (digestions Sau3A, Xho2), par L'enzyme Smal (digestions Alul, Hae3) et par l'enzyme Accl (digestion Accl). - méthode par sonication. l'ADN du virus a été soniqué jusqu'à obtenir des fragments de l'ordre de 500pb. Les fragments obtenus ont été réparés à l'aide de la DNA polymérase de E.Coli fragment de Klenow selon le protocole décrit précédemment. Les fragments obtenus sont ensuite sous clones dans les vecteurs M13mp8 et M13mp9 digérés par l'enzyme Smal. 2) Sous cLonaae de fragments identifiés d'après la cartoora- phie de restriction. On réalise le sous-cLonage des fragments de restrictions identifiés dont la taille est inférieure à 2000pb, obtenus par digestions avec les enzymes de restrictions (voir cartographie de restriction à la figure 2). BamH1, EcoR1, Hind3-BstE2, BstE2-BamH1, BstE2-Hind3, Hind3-Pvu2, Xba1- BstE2, Xbal, Hae3, Pvu2-Hae3, EcoR1-Xba1, Xbal-BstE2, Hae3-EcoR1, Hae3- Xbal, EcoR1-Pvu2, Hae3-BstE2. Les fragments d'un poids moléculaire de 110pb à 2000pb obtenus par digestion avec les enzymes de restriction ci- dessus sont sous clones puis séquencés de proche en proche en utilisant des amorces (Sanger 1977) Proc.Nat.Acad.Sci. USA 74 p.5463; Biggin (1983) Proc.Nat.Acad.Sci. 80 p. 3963). b) Méthode de Maxam et Gilbert. Un fragment de 375 pb Hind3 et BsteII, proche du site EcoR1 de pBR322 s'est révélé impossible à séquencer en utilisant la méthode de Sanger. La séquence de ce fragment a été obtenue à partir du site Hind3 et du site BstE2 en marquant avec La T4 DNA polynucléotide kinase et l'ATP 32p 1 0 2 6 2624121 ou avec la DNA polymérase fragment de Klenow et le dTTP 32 p ou dCTPP32 (Maxam et Gilbert). Les réactions sont mises à migrer sur un gel dénaturant acrylamide, urée (Sanger and Carbon (1978) F.E.B.S. lett. 87, p. 107).en présence de formamide à 40%. c) Organisation des séquences. Les séquences obtenues sont rentrées dans un ordinateur de type Microvax2. Elles sont comparées à l'aide des programmes du DB SYSTEM écrit par R. STADEN. (Nucleic Acids Research 12 (1) Juin 1987, p.387-395). Apres édition des séquences à l'aide du programme d'édition EDIT sous VAX/VMS, les séquences sont comparées entre elles à l'aide du programme DBCOMP de STADEN puis sont organisées à l'aide du programme DBUTIL. La séquence consensus obtenue est présentée à la figure 1. 4) Résultats des transfections des larves de sDodooptera littoralis par l'ADN du Densovirus cloné ou non dans pBR322. a) Protocole de transfection par inoculation. Différentes concentrations d'ADN J ou de pBRJ sont inoculées à des jeunes larves de Spodoptera littoralis (stade 2 ou 3) dans un tampon TE, pH 8,0 (Tris 10mM, EDTA lmM) additionné de DEAE-dextran (2 mg/ml final). b) Surveillance des larves. Les larves transfectées et celles des lots témoins sont élevées individuellement sur milieu axénique à 25eC. Chaque jour - les larves mortes sont prélevées, - la date de nymphose est notée, - les nymphes sont prélevées 6 jours après la nymphose. c) Contrôle des insectes transfectés. Chaque individu est broyé individuellement dans lml de PBS +2% azoture de sodium. Les broyats sont clarifiés et la présence de virus recherchée dans les surnageants par la méthode indirecte ELISA, en utilisant des anticorps titrés anti Densovirus Junonia préparés sur souris et des antilgG de souris marquées à la peroxidase. Certains échantillons sont contrôlés au microscope électronique. d) Résultats. La transfection des jeunes larves de Spodoptera littoralis par inoculation d'ADNJ ou d'ADN de pBRJ aux concentrations de ng d'ADN-J par larve et de 56ng pBRJ/larve a conduit à un pourcentage d'infection supérieur à 80% dans les deux cas. Des résultats comparables sont obtenus en transfectant des larves de Spodoptera littoralis d'origine maLgache résistante à La deltaméthrine. Par ailleurs, aucune infection n'est'apparue dans les lots témoins inoculés soit avec du tampon d'extraction TE soit avec de l'ADN pBR322 à la concentration de 30ng à lng/larve. lGExempLe de composition insecticide. Liposome à base de { phosphatidyl choline............. 5 mg { phosphatidyl sérine.............. 5 mg { cholestérol...................... 2,Smg pBRJ................................................ 28 ug l5Eau q.s.p........................................... I ml. 12 2624121 REVENDICATIONS 1/. Plasmides recombinants capables de se répliquer dans Escherichia coli caractérisés en ce qu'ils contiennent une séquence complète ou partielle de l'ADN double ou simple brin d'un densovirus provoquant une densovirose chez un insecte sensible. 2/. Plasmides tels que définis à la revendication 1 caractéri- sés en ce qu'ils contiennent une séquence complète ou par- tielle double ou simple brin du Densovirus de Junonia, de Galleria ou d'Agraulis. 3/. Plasmides tels que définis à la revendication 1 caractéri- sés en ce qu'ils contiennent une séquence complète ou par- tielle de l'ADN double ou simple brin du Densovirus de junonia (=J-DNV). 4/. Séquence complète du génome viral du Densovirus J-DNV. I (X),GTATITCCAC CGACGACGAC GACGGCAGTC CC1CCGGCG AÀGCCGGCCG 51 CCGCG GCG GCAAGGGACT GCCGTCGTCG TCGTCGGTGG CAATACTCGT 101 AGAGTATAÀG CAAGTACTCA GCATGTATAG AGTACTTGAT GACG'TCACGG 151 TGACCTTGAC CTriACCTT CTATATGACC TT3GACCTACT TCI'TGACCT 0 201 TCTGGTCTAC TGACC'Tr A CCTKfAGC TGATGTCTAC TGACCTGATG 251 ATGGAGAGGA TCCGAAGACC TITGAGCTGA AGGTGGAACA CAGGACCTGA 301 T'ITA TGAA GGACAGCAAT AGTGTGCGAG TGAGATAGCA CTATAGCAAC 351 T'ITAGAGCG AGATAGCAAT ATGGTrAAA& GAGATAGCAT GCAAAC AAC 401 CTTGAGATAA TTTATGCGCA TrITATTXATC TT&T rA GACCTCGTT 451 GACCGGCAAA C'TCGCGTCGA GGCTGGCCG TGTGCA AAC AGGATGVGGC 501 TGGCCAGCGG ACCATTGACT ATATAÀAGGC TGACGTGTIC TATTTPrAGT 551 cCAGTATGTCT TTCTACACGG CCGGGTAArT ACATCGT&CG CGACCCGG&T 601 ATCGTATTAT ACCAGAAAGT ACTGCTACTG AAGATATTGA CTIG' CT 651 ATTGGAGAAG AAACTCCATT ATTAAGTGAA GGATGCTG CTCCTGTAGA 701 AGAÀAGTGCT GCTGTTGGTT TACCAGAACT TGGTGCTGGA CTTGCTGGT 751 CTATTIGAAC ACATGCTGAC GTATTGTATA GAAATAGAAA CGTT'rITAA 801 AGGTrIT AA CTGGAAATrA TACCGATITA AAAGGCAÀÀTC CTITAAAACA 851 ACGAAACGCT ATTTCTGAAU AACTA ACA ACTITGAAGA GGA&TATTTC 13 2624121 901 AAGGCGATTr CAACCGTGCA TICCTGATGÀ ATTrAAAATT GGAAACTGAA 951 CAAGAAAAÀA AAGAITTACT ACGTATAT AATCACÀATA GAAGATTAGC 1001 TGGATT AGT GAAGCTTATC CACAAGGG A AGGATACGCT TATGCT AAA 1051 GTCAAAAAGT ATrAGAAGCT GAACGACGAG GATTAACTGT TCCCGGATAT 1101 AAATATCTTG GTCCTGGAAA TCACTÀTAAC AGAGGTCAAC CTACTAATCA 1151 AATAGACGAA GACGCTÀAGG ACACGACGA AGCATACGAT A AGCGÀAAA 1201 CAAGTCAAGA AGTAAGTCAA GCAGATAATA CATTJGTCAA TAAAGCGTTA 1251 GATCACATAG TITATGCTAT CAATCTrAAA GAA CTCCT G C GTAACGCTTT 1301 TGGAGCIGCT ATCGGAGCTA TIGGTrGG ÀAACTAAGCÀAA GCTATCGAAA -1351 AACACAÀGIG AGTÀATCTAC CC'TTIC'Pl7f CAGGTATGTC CCGTCAATT 1401 AATTCTAAAT ACTrbTAGT CTGGCATGAC TGGTTIGAGC A TAAACA 1451 TàAATAATITTr GAGGAATAC ATTACCAGA GGAC'IrTAC ACAGAAGAAC 1501 AAACTCTTITC AGATTCACCG ATGTCAGAGG GAACAAAACG TA AGCTGAT 1551 ACTCCTITG AAGAAGGTCC TrCTAAAAAA GGTGCATA ACGCTCCACA 1601 TAACTCGCAA GGTACAGATC CTCAAATCC TAGTTCTTCC GGAGCAACTA 1651 CTKCTT TTGA CGTTG ATG GCT ATTCAT TACCTGGAAC TGGTTIGGA 1701 ACATCATCTG GAGGAGGCAA CACTTCAGGT CAA&GÀGGIT ATGTAA7TCC 1751 TCGTCCATIT TCGAACTTPI GTAAAAATr AAGTACTrTT ACA AGTCTC 1801 ATAAATITAT GATATITGGT CTGCCAATA ATGI7TATTG ACCTACAGGT 1851 ACTGGTAÀCAA CAGCTGTà A TCGTTTAATr AC CT=P TGGCGAAATI T 1901 TCCATGGCAG AAÀTrGCCTT TTATATGAA CCAATCTGAA TrMGATITAT 1951 TACCTCTIGrG TAGTAGAGTA GTTGAATGT A GIAAGT AATATTCAGA 2001 ACTATCGTA TTCCATTI'TGA GCTAGTTCA ACTTCTACTA AACAAGCTAC 2051 ATTGAATCAA ATATCTAAT TACAAACTGC TGTTGATrA AAT A CTI'G 2101 GATGGGGTAT TGITAGATCA TAcIGC TTC TCAGA I TAACCCATGm 2151 ATrCCCACTIG CTACTAGTGC ACCAAATAT GA&CCTTATA CGGT ACGC 2201 TGGTrATAGA GGTATGATAG CTGAflTrA TGGTrCTGAT TCTCTAATG 2251 AT CTPCÀT TGGTAITGCT GGTAACTATC CTCATCATCA ArÀGTGT CA 2301 IT ACITTrA TÀCAAAITA TTATTGTATG TATCAACAAA CCAATCAAGG 2351 TACTGGAGG C 7T T AGTACTGAACA TCTTCAACIA TITGAT CTT 1 4 2624121 2401 AAACT&TTAA TAATCAATGT TTAATTGATG TAACTATAA ACCTAàAATG 2451 CIGTAATTA AACCACCGTr ATAT ATAAA ATIATTCGTC AACCTACTGCC 2501 AAAAGGTÀCT ATATCPI'TG GTATAATrr AGTTAACATG CGAGGAGCTG 2551 TTGTAATAAA TCCACCTGAA GCAACACAAT CTGTrACTGA ATCAACTCAT 2601 AATITGACTC GC AATIPCC AGCTAAITG TIT ATATT ATrCTGACAT 2651 TGAAAAATCT CAAATTITAC ATAAAGGACC TPAGGGCAC GAAAATCCAC 2701 AGATACAACC AAGTITCAT ATIGGTATrC AAGCrGTACC AGCATITACT 2751 ACAGGAGCIT TACTTGTAAA T CAAGTCCT TrAAATICAT GGACTGATTC 2801 TATGGGTrAT ATÀGATGTA TGTCTAGTIr TACITITATG G =AATCTCGC 2851 CTACCACA/T- TCCAT'ITCG ACTGATGCTA ATACTAACCC TGGTAÀTACC 2901 ATATCGTA TrAA'ITCTTAC ACCGAACTCT CITACTAGTG CTTCAATGG 2951 ATIrTACGGT AATGGAGCTÀ CTICGTAA CGTrÀAAATA AAACAATAAT 3001 GTATCCCATA ACCATTATT AAArATGTAAT ATATATITAA CTCAATAAAA 3051 GGAAÀAATGT CATTGATGT GGTTTCAATT CATAATCCT TAAGÀATGGC 3101 GCAGCATTCC ACTIGTATrG AATAATICTA TCACTAAAG CAGTTTICATA 3151 CATAAAAGGT ACAGTAT'AT TAGTAGTGTAT TATAACTGGA GTGCGT1TTA 3201 CATITIGCATC CATACGATT ITAACPCTAA CAGTATAAGG ATCTCCTCCA 3251 AÀCATCA = TAAT'ITATC AGTTAAAGAA CTCTCATAGT TAGGTTCATr 3301 CCÀATAATAAT ACACGTTAGGTGCTTC A TT'GAAATGCA AACAACITAT 3351 GTCTATIAGC TTIGACCTAAC TGACCATAAG ATAGTAATAA TCCAAAGATC 3401 ATATCAAAAA AGAATTTIIT ACCAGCACTT GGAGGAGATA TAATAAGAAA 3451 AGCATITAAC TTAGGTATAC GACGGTCTAA TACATTGACC AAATAGTAA 3501 G AàCTCTAC AXITATTCT TCDAT AT ATCATrCGAI; A TITAGTAAT 3551 TCTATAATAA TATTCAAAGA AÀTItAAGA ITATCATATT TCATAGAAGA 3601 AATAAACAA GCATATGGAT T AGTTCA M TrCTCAGTA AAATATAATT 3651 CTTCAGTAAG TAÀAATATAA ATTCTCTCA AAGACATAGC ATTAAATCC 3701 TTACCAAAGT CATCGCATGC TGC ATA TAATCACGiT TTTAGGATC 3751 ACATAACAAA TCATCATCAC GAAATITCG CACATCACAT ATAGCACTCA 3801 CTGGAGACAC ATATATA'IT' CTTAATAACG CITTT1GTCT TITCCGTATTG 3851 TiATGCGAATTr TCCCT'GCCGA ATAGGCITTTC TTITCATAAA GTCTCCGTr - 152624121 3901 AGAACTGCCA GCATCTGATC TACGGCTAAT TTGSC TC, ITICAC 3951 ACTCATAGTA ATCCGTC AA TCGGAGCTTG ATACCATTTC TCTfTCTTTA 4001 AACTC'lT. G TCCATCGTAC ACATTCATCG TrACTCGGTA TTTCCACT 4051 TrlnCTCTA ACGTATATTG CACGC'TCTCC CCGITITCGT ACLAGAAAT 4101 AGAÀTGAGAC ATCGTACCAG TCTIU CGCT TGAATKCCA GATGAATTTG 4151 ACIGGTITGC CAGTrTTTCT AACAGATCCG kAGGCTP CTITGACTAAT 4201 CCAGATGTCC CTGC C'1 GATTGGrGTA AGAGCAATCG TGGATGACGT 4251 GGMATGTGATCM TCCTTITITCA GA AATCCGA ACAGTCCGTT TCGTCTACTT 4301 CTTCCGTACT CACGCAAGAC GTCCAAACAT TGATCACGGA GCTGAATATC 4351 TCGTAAGATA ATGACATCGC TGATATATGC GCTGGAAGGT TTAATACTIT 4401 GCCCAGTAAC GTATCCAAAG AAT1CACTGC CCATITTr C CAGTTCTTCT 4451 GCCATATATT GAAAGTFTTC TTGAGATIC TIVIGCA1ATUC TGGCCATT T 4501 TCCTCGTCCT CCATGTGACC ATTCACGTTT TCTAGAIGT TTPTGCCACCA 4551 TGCTACATTG TTCACTAGGG GATGTTCTTC CTGAAGAXTC TCGTATAATG 4601 TCTGAÀTAG GICTG TAGT AGCTATCGGTT CTCTGTImTG TGTTCATrT 4651 GrtATITGT AATrAATTC TACTATTAGG ATGlITTCA TAAAA CTAT 4701 TAGACATÀTA TrCGTCCTCT TCTGAACTAC TIGAGTATCT CCTTTITTTA 4751 TTAGGAGAGT TTTCATAAAT TACAGATTAT TrAAACAATG GACAAGTATG 4801 ACATATTTGA CACCAACTAC TACCATCTTG TAATCTTITTT ATATATCT 4851 CAGCATCTIC TACG CACA GTDT A'ITAT ACATAAATCT GTATTCATCT 4901 GGATCITCAC AATrAGTATA ACAAAATTTA CAAATTI'CC ACATAG'rrr 4951 AAAGGGCTITr CCATTCATAT TCCATGCATr AAATTCACA GTATCATAAG 5001 GGTCCTATG GTrAATrAAT TCTTT T AATACACACA TTCTATCAGC 5051 ATAGTITCAT CTAACCATrC AGGTATTITA T IAAATGCA TAACAGCTAA 5101 ATATAACTGG AAAGGTAATC TGTTTT'r' TGTCCAATCC CAGTGTITTA 5151 ArCTITCAT AGCTAAAGT TGATCTATGT CTPCDCACA AGCAATAATC 5201 TGATTATCTA G TCATGCTG CATAIT AGT ATAGG5TTAG GCAAATTGA 5251 CAAGTCTAGA CCATrAAGTC TAGCAGTCIT ATAAGCCTCA TAGAACAAAG 5301 ACTTTrGAT GTACACTITT TCAAATA AC GAACGAACAC A AGAAACCT 5351 GGCAATAGAC AT CCGATrA TATICTCiGAA CCACTI'TTGC ACAACACTAC 16 2624121 5401 TImTCACTG AGATGTICAC TC.CGAACTG CTGCTCGTAG ACTGÀATrATj 5451 GCGC7TGCT GMTATCTCTA mTATAGCCA ATGGTCCGCT GGCCAGCCAC 5501 ATCCTCFI=T GCACACGGCC CAGCCTCGAC GCGAGTITGC CGGTCA ACG 5551 AGGTCACAAT AACAAGATAA TAAAATGCGC ATAAATrATC ÀTCAAGGTTTG 5601 TICATGCT ATCTCTSYTA CTCATATIGC TATCTCGCTC TAACAGTITGC 5651 TATA CTA TCTCAGCTCC, ACACrTATIC TG'TCCTCAC TAACATCAGG 5701 TCCTGTGTTC CACCTICAGC TCCAGGTCT TCGGATCCTC TCCATCÀATCA 5751 GGTCArÀAGA CCATCAGCTC AGAAGGTCAA AG CAGTTG ACCAGAAGGT 5801 CACAGAAGTA GGTCAGGTC ATATAGAAGG TCAAAGGTCA AGGTCACCGT 5851 GACGTCATCA AGTACTCTAT ACATGCTGAG TA TT ACTCTACGA 5901 GTATIFCC(Z)p X et Z représentant les bases A ou C ou G ou T, n représentant un nombre entier pouvant varier de 1 à 50 et p de 1 à 130, cette numérotation ne tenant pas compte des bases X et Z et M représentant les bases A ou C et Y les bases C ou T. 5./ Séquence complète de l'ADN viral du Densovirus J-DNV clôné correspondant à la séquence telle que définie à la revendica- tion 4 dans laquelle sont éliminées les deux extrémités "X" et ",Z". 6./ Plasmides tels que définis à la revendication 1, caracté- risés en ce qu'ils contiennent la séquence complète du génome viral du Densovirus J-DNV, telle que définie à la revendica- tion 4. 7./ Plasmides tels que définis à la revendication 1, caracté- risés en ce qu'ils contiennent la séquence complète ou partielle de l'ADN double ou simple brin du Densovirus de Galleria. 8./ Plasmide pBRJ. 9./ Bactérie hôte Escherichia coli caractérisée en ce qu'elle est transformée par un plasmide tel que défini aux revendica- tions 1, 2, 3, et 7. 10./ Bactérie hôte Escherichia coli, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un plasmide tel que défini à la revendication 6. 11./ Bactérie hôte Escherichia coli, caractérisée en ce 17 2624121 qu'elle est transformée par pBRJ. 12./ Application à la lutte biologique contre les insectes ravageurs, des plasmides tels que définis aux revendications 1, 2, 3, et 7. 13./ Application à la lutte biologique contre les insectes ravageurs, des plasmides tels que définis à la revendication 6. 14./ Application à la lutte biologique contre les insectes ravageurs du plasmide pBRJ. 15./ Formulations insecticides contenant les plasmides tels que définis aux revendications 1, 2, 3 et 7. 16./ Formulations insecticides contenant les plasmides tels que définis à La revendication 6. 17./ Formulations insecticides contenant le plasmide pBRJ.