FR 2631970 A1 19891201 FR 8806892 A 19880524 N-POLYOSYL-POLYPEPTIDES La présente invention concerne des substances peptidiques modifiées par couplage covalent à des chaînes polyosidiques biocompatibles, ces dernières n'étant fixées à la substance peptidique que par leur extrémité réductrice. L'invention concerne également un procédé de préparation des substances peptidiques modifiées en question ainsi que les compositions pharmaceutiques les contenant et leur usage en thérapeutique. Les polylpeptides, surtout lorsqu'il s'agit des protéines et plus particulièrement des enzymes, sont des produits souvent peu stables dans l'organisme. Les préparations les contenant perdent de leur activité dans le temps et, lorsqu'elles sont administrées à l'homme en tant que médicament, elles sont rapidement catabolisées; leur demi-vie est ainsi de courte durée. Différents moyens ont déjà été utilisés pour tenter de pallier ces inconvenients, et plus particulièrement le couplage covalent à des chaînes macromoléculaires. Parmi ces dernières, on a utilisés des chaînes aliphatiques linéaires hydroxylées, telles que le polyethylène glycol ou le polypropylène glycol (PEG ou PPG) ou des polyosides de type dextran, les couplages s'effectuant entre les groupements hydroxylés et, selon les procédés, les groupements aminés ou carboxylés des protéines. Plus récemment, on a également proposé d'utiliser comme chaîne macromoléculaire un glycosaminoglycane particulier, la chondroitine sulfate, brevet européen 242 416. Les couplages proposés sont effectués par l'établissement de liaisons amides entre les restes des groupements carboxyles des chondroitines sulfates et les groupements amino des protéines. Qu'il s'agisse de chaînes macromoléculaires de type PEG ou PPG, de polyosides de type dextran ou de chondroitines sulfates, il existe, pour chaque chaîne macromoléculaire dans les travaux décrits, plusieurs points de couplage, ce qui entraîne une déformation de la structure tertiaire de la protéine couplée et une diminution de son activité. Il était donc intéressant de rechercher une méthode permet- tant de respecter davantage la structure tertiaire des polypep- tides tout en leur conférant des caractéristiques pharmacologi- ques et pharmacocinétiques in vivo améliorées et une meilleure stabilité in vitro. Selon la présente invention, il est possible d'effectuer un greffage de la chaîne polyosidique sur la chaîne peptidique en un point unique de ladite chaîne polyosidique en ayant recours à un groupe aldéhydique unique présent ou généré à l'extrémité de la chaîne polyosidique. Il est bien connu que les sucres en général et les polysac- charides en particulier sont caractérisés par une structure hémiacétalique (cyclique ou fermée) en équilibre avec la struc- ture aldéhydique correspondante (linéaire ou ouverte) selon le Schéma (A) H OH t CHO (A) R R R étant par exemple un hydroxyle ou un groupe amino libre ou sulfaté, ledit équilibre étant, dans les sucres naturels, presque totalement déplacé vers la gauche. Il est en outre connu que certaines méthodes de dépolyméri- sation de polysaccharides, notamment la dépolymérisation par action de l'acide nitreux, ci-après désignée "dépolymérisation nitreuse", conduisent à la transformation des unités osidiques. Ainsi, par exemple, les unités glycosidiques de l'héaprine sont transformées, par la dépolymérisation nitreuse, en unités 2,5- anhydromannosidiques selon le Schéma (B) 0 O OH > (B) CHO NHSO3 ladite unité 2,5-anhydromannosidique présentant un groupe aldéhy- dique. La technique de dépolymérisation nitreuse a permis de préparer des héparines de bas poids moléculaire ayant à l'extré- mité de la majorité des espèces le groupement 2,5-anhydromannose, donc un groupe aldéhydique. On a maintenant trouvé qu'en faisant réagir un polysacchari- de avec un polypeptide, la forme aldéhydique dudit polysaccharide réagit avec des amines libres dudit polypeptide pour donner une poly-base de Schiff. Cette réaction comporte le déplacement de l'équilibre du Schéma (A) ci-dessus vers la droite et la forma- l0 tion de la poly-base de Schiff. On a aussi trouvé que la même réaction a lieu avec des polysaccharides obtenus par dépolymérisation nitreuse selon le Schéma (B) ci-dessus, et que la poly-base de Schiff se forme rapidement avec des rendements satisfaisants. De plus, comme les polyosides n'ont qu'une seule extrémité réductrice, le couplage ne peut avoir lieu qu'au niveau de cette extrémité et la structure tertiaire du polypeptide est ainsi conservée. On a encore trouvé que par réduction des poly-bases de Schiff on obtient des conjugués polysaccharide/polypeptide qu. sont stables en milieu physiologique et qui confèrent au polypep- tide une pharmacocinétique améliorée. Dans certains cas, ces conjugués possèdent à un dégré supérieur l'activité du polyp-epti- de. On a ultérieurement trouvé qu'en faisant réagir le poLysac- charide avec le polypeptide en présence d'un agent réducteur, on obtient directement le conjugué polysacchar-ide/Dolypeptide sans isoler la polybase de Schiff intermédiaire, avec de très bons rendements. Ainsi, la présente invention concerne, selon un de ses aspects, un N-polyosylpolypeptide de formule (Oside-Z'-CH2-NH-)n7' (I) _n dans laquelle - P' est le radical n-valent d'un polypeptide P lié aux n groupes 263197 0 NH provenant de n groupes amino libres présents à l'origine dans la molécule de P; - Z' est l'unité saccharidique terminale réductrice du polysac- charide Oside-Z dans sa forme aldéhydique, soit naturelle, soit provenant de la dépolymérisation nitreuse, privée du groupe aldéhydique de Z; Oside est le reste du polysaccharide Oside-Z; - n est un nombre entier de 3 à 30; ou, le cas échéant.,un de ses sels pharmaceutiquement acceptables. Dans la présente description, le polypeptide, désigné "P'l, est schématiquement représenté par la formule PO(NH2)m (Il) dans laquelle P est le radical m-valent du polympeptide P auquel sont liés ses m groupes fonctionnels NH2 libres, lesdites m groupes fonctionnels NH étant le groupe amino terminal et les (m-l) groupes amino en position epsilon des lysines contenues dans le polypeptide. Dans la formule (II) ci-dessus, m représente la totalité des groupes amino disponibles pour la formation des poly-bases de Schiff, mais le couplage n'a lieu que sur un certain.ombre, désigné "n", de ces groupes amino; le radical n-valent lié aux groupes amino qui ont réagi avec le groupe aidéhydique de Z est ci-après désigné P'. Il est entendu que, dans la présente description, le concep- te élargi de "valence" se réfère aux liaisons libres des r-adicaux ou des structures concernés. Ainsi, le radical P' m-valent ou n-valent est le résidu du polypeptide P avec ses m ou n liaisons libres telles cu'illustrées ci-dessus et les structures bivalen- tes la", Ib", c" et Id" ci-dessous s'explicuent toutes seules. Dans la présente description, le polysaccharide est schéma- tiquement représenté par la formule Cside-Z (II) Z étant l'unité saccharidique terminale réductrice dudit polysac- charide dans sa forme aldéhydique soit naturelle, soit provenant d'une dépolymérisation nitreuse et Oside étant le reste de la chaîne dudit polysaccharide. Le radical monovalent Oside-Z'- représente le polysaccharide Oside-Z tel que défini ci-dessus, privé du groupe aldéhydicue de Z. Plus particulièrement, dans la formule (I) Oside- représente le radical d'un polysaccharide Oside-Z (III), appelé également "polyoside", provenant de substances naturelles biocompatibles, sans résidus aglycones, ledit polyoside étant privé d'une unité saccharidique terminale réductrice (Z). Le terme "biocompatible" tel qu'utilisé dans le présent descriptif désigne la propriété de polysaccharides naturels, ayant un poids moléculaire de préférence inférieur à 103.000, notamment compris entre 1. 200 et 50.000, et de leurs dérivés ou analogues dont les constituants se trouvent naturellement dans l'organisme des mammifères et qui, de ce fait, peuvent être facilement métabolisés et éliminés. De façon avantageuse, le polyoside provenant de substances naturelles biocompatibles est un glycosaminoglycane tel que défini par R.W. Jeanloz, Arthritis and Rheumatism, 1963, 3, 233-237 et par B. Casu, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, 1985, 43, 51-134. De façon préférentielle, dans la formule: ci-dessus, Oside représente le radical d'un glycosaminoglycane Oside-Z choisi parmi l'héparine, les fragments d'héparine, la chondroitine sulfate 4-S, la chondroitine sulfate 6-S, l'héparane sulfate et le dermatane sulfate, privé de l'unité terminale réductrice Z. Dans un aspect particulier et avantageux de l'invention, le N-polyosyl-polypeepide provient d'un glycosaminoglycane du type héparinique Oside-Z dont le motif Z représente le motif terminal réducteur d'une chaîne d'héparine ayant subi une dépolymérisation nitreuse. Il est représenté par la formule (la) suivante: |oside ' O ' (Ia) l H2p ....... CH2-N- p' n qui correspond à la formule (I), le groupement entre les lignes en pointillé étant le radical Z' et R1 étant H ou SO3. Dans la formule (Ia) ci-dessus, Oside désigne, selon un aspect préférentiel de la présente invention, le radical prove- nant d'une héparine, représenté par la formule > COO C-2- OR COO i I ' (Ia') O O dans laquelle R1 représente l'hydrogène ou un groupe SO3, R2 représente un groupe acétyle ou un groupe SO3 et p est de 4 à 24. Il est entendu que la valeur de p, dans le radical (Ia'), est telle qu'elle représente le nombre d'unités disaccharidiques de fragments d'héparine provenant d'une dépolymérisation nitreuse de l'héparine naturelle, dans des mélanges ayant avantageusement une masse moléculaire moyenne se situant entre 2000 et 8000 daltons, de préférence d'environ 4500 daltons ou d'environ 2500 daltons. Dans un autre aspect particulier de l'invention, le N-poly- osyl-polypeptide provient d'un polysaccharide Oside-Z dont le motif Z représente le motif terminal réducteur naturel d'un glycosaminoglycane de type héparinique. Il est représenté par la formule (Ib) suivante: Oside ' O HH' P' (Ib) NHR2 n L0 qui correspond à la formule (I), le groupement entre les lignes en pointillé étant le radical Z', R1 étant H ou SO3, R2 étant SO3- ou acétyle et Oside étant le reste de la chaîne héparinique. Dans la formule (Ib) ci-dessus, R2 représente de préférence SO3 ou acétyle et Oside représente de préférence le radical (Ia'), dans lequel p est de 10 à 100, la valeur de p étant telle qu'elle représente le nombre d'unités disaccharidiques qui forment les mélanges de -chaînes présentes dans l'héparine natu- relle. Dans un autre aspect particulier de l'invention, le N-poly- 0 osyl-polypeptide provient d'un polysaccharide Oside-Z dont le motif Z représente le motif terminal réducteur naturel d'un glycosaminoglycane de type chondroitine ou dermatane sulfate. Il est représenté par la formule (Ic) suivante: ' RiO OH' Oside CH - NH- P' (ic) NHCOCH n qui correspond à la formule (I), le groupement entre les lignes en pointillé étant le radical Z', l'un des R1 étant H et l'autre SO3 et Oside étant le reste de la chaîne de la chondroitine sulfate ou du dermatane sulfate. Dans la formule (Ic) ci-dessus, le radical Oside est représenté par la formule (Ic') COO CH OR COO COH H ^ t OA ( ICI') H NHCOCH3H m o l'un des R1 représente l'hydrogène et l'autre un groupe SO3 et p est de 10 à 100, la valeur de p étant telle qu'elle repré- sente le nombre d'unités disaccharidiques qui forment les mélan- ges des chaînes présentes dans la chondroitine sulfate ou le dermatane sulfate. Dans un autre aspect particulier de l'invention, le N-poly- osyl-polypeptide provient d'un polysaccharide Oside-Z ayant subi une dépolymérisation dans des conditions telles que la chaîne possède un nombre de motifs impairs dont le motif Z réducteur représente un acide uronique, acide D-glucuronique ou L-iduroni- que. Il est alors représenté par la formule (Id) suivante: COO- H ' Cside - H CH2-NH- ' (Id) OR, _L L n qui correspond à la formule (I), le groupement entre les lignes en pointillé étant le radical Z', Ri étant H ou SO3-, et Oside étant le reste de la chaîne polysaccharidique. La présente invention comprend également des composés de formules (Ia) et (Ib) ci-dessus, dans lesquelles Oside représente le reste de fragments d'héparine homogènes au regard de leur masse moléculaire (formule Ia', -p = 1-10) et contenant éventuellement le site de fixation à l'antithrombine III. Elle comprend en outre des composés de formule Ib ci-dessus, dans laquelle Oside représente le reste. d'un oligosaccharide de synthèse (formule Ia', p = 1-6). Dans les formules (Ia), (Ib), (Ic) et (Id) ci-dessus, le radical Z' peut être mieux représenté par les structures bivalen- tes respectives suivantes: CH2OR1 I 2R1 O CHOH 0 -0 H -O-CH-CH-CH- I II OH NHR2 (Ia") (Ib") CH2OR! L 5 1 2 1 CHOH CO- l I CHOR.C CHH I 'I -O-CH-CH- et -O-CH-CH-CH- I I I NHCOCH3 OH OR1 z0 (Ic") (:d T) dans lesquelles R. et R2 sont tels que définis ci-dessus et ia 1.2 stéréoconfiquration est celle de l'unité terminale réductrice Z. Dans la formule I ci-dessus, P' est avantageusement le radical n-valent d'un polypeptide P choisi parmi les protéines, les hormones peptidiques, les enzymes et les inhibiteurs d'enzy- mes, ledit polypeptide P étant naturel ou chimiquement modifieé ou obtenu par recombinaison génétique. Par exemple, P' peut être le radical n-valent d'une protéine telle qu'un anticorps, un fragment d'anticorps ou une interleuki- ne, de préférence l'IL-2. De même, P' peut être le radical n-valent d'un enzyme thrombolytique tel que l'urokinase, l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA), la prourokinase, naturels, chimiquement 26319 70 modifiés ou obtenus par combinaison génétique, ou la superoxyde- dismutase. P' peut également être le radical n-valent d'une hormone peptidique telle qu'une hormone de croissance, notamment l'hormo- ne de croissance humaine (hGH), le facteur libérant l'hormone de croissance (GRF), humain ou animal, naturel ou chimiquement modifié, ou un fragment actif, par exemple le GRF 1-44 ou le GRF 1-29. P' peut aussi être le radical n-valent d'un polypeptide P inhibiteur d'enzymes, tel que l'hirudine, l'aprotinine, l'alpha- 1-antitrypsine ou l'antithrombine III. D'une manière avantageuse, le N-polyosyl-polypeptide de l'invention correspond à la formule (Ia) ci-dessus, dans laquelle P' est le résidu d'une molécule d'urokinase, et n est égal ou inférieur à 6, de préférence 6, 4 ou 3. Dans un autre aspect avantageux de l'invention, P' est le radical d'une molécule de l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) et n est égal ou inférieur à 8, de préférence 8 ou 5. Il va de soi que P' peur être le radical n-valent de toute autre substance peptidique dès lors qu'elle possède les groupe- ments amino libres permettant la liaison covalente avec le polyoside. Selon un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet un procédé de préparation du N-polyosyl-polypeptide de l'invention par greffage covalent de motifs amines libres d'une substance peptidique P sur des chaînes polyosidiques d'origine naturelle ne comportant chacune qu'un seul groupement aldéhydique susceptible de réagir avec un motif amine. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé pour la préparation d'un N-polyosyl-polypeptide de formule (I) ci-dessus caractérisé en ce qu'on traite un polypep- tide P représenté par la formule 263197O dans laquelle PO est le radical m-valent du polypeptide P auquel sont liés ses m groupes fonctionnels NH2 libres, lesdits m groupes fonctionnels NH2 étant le groupe amino terminal et les groupes amino en position epsilon des (m-l) lysines contenues dans le polypeptide, avec un excès d'un polyoside représenté par la formule Oside-Z (III) O Z étant l'unité saccharidique terminale réductrice dudit polysac- charide dans sa forme aldéhydique soit naturelle, soit provenant d'une dépolymérisation nitreuse et Oside étant le reste de la chaîne dudit polysaccharide et on soumet la poly-base de Schiff ainsi obtenue de formule Cside-Z -CH=N-)n-' (IV) dans laqueile le radical monovalent CsideZ'- représente le polysaccharide Cside-Z tel que défini ci-dessus, privé du groupe O aldéhydique de Z, et 7' et n scnt tels cue définis ci-dessus, à une réduction avec un cyanoborohydrure. De façon avantageuse, les poiyosides naturels biocompatibles Oside-Z utilisés comre produius de départ il sont des glycosami- noglycanes tels cue edéfinis ci-dessus (GAGs), notamment des !5 substances constituées de chaînes dans lescuelles alternent des acides uroniques (acide D-giucurcnique ou acide L-iduronique) et des sucres amines, ces derniers pouvant ê-re des glucosamines lorsqu'il s'agit de glycosaminoglycanes de type héparinique, ou des galactosamines icrsqu'il s'agit de.glycosaminoglycanes de type chondroitine su'lfate, à savcir la chondroitine sulfate 4-S, la chondroitine sulfate 6-S et le dermatane sulfate, les groupe- ments carboxyles des motifs osidiques desdits GAGs pouvant être salifiés cu estérifiés, les groupes hydroxyles étant diversement substitués par des groupements fonctionnels, de préférence des groupes sulfates, et les groupements aminés étant substitués soit par des groupes sulfate, scit par des groupes acétyle. 263 1970 De tels GAGs sont constitués d'un mélange de chaînes hétéro- gènes au regard de leurs poids moléculaires, ceux-ci pouvant varier de 1. 800 à 50.000 daltons, et au regard de la position et du nombre de leurs groupements fonctionnels. De préférence, le polyoside de départ III est un glycosami- noglycane choisi parmi l'héparine, les fragments d'héparine, la chondroitine sulfate 4-S, la chondroitine sulfate 6-S, l'héparane sulfate et le dermatane sulfate, privé de l'unité terminale réductrice Z. Des composés de départ III particulièrement préférés sont les glycosaminoglycanes de type héparinique, c'est-à-dire l'hépa- rine, l'héparane sulfate et leurs dérivés obtenus soit par fractionnement à partir de l'héparine ou de l'héparane sulfate, soit par hémi-synthèse ou synthèse. De tels polyosides ont été largement décrits dans la littérature. Il peut s'agir de produits naturels obtenus par fractionnement ou synthèse, tels que ceux décrits dans les brevets français 2 440 376 et 2 461 719 ou dans EP 84 999 et 113 599; i1 peut s'agir également de produits obtenus par dépolymérisation tels que ceux décrits dans les brevets européens 37 319, 40 144 et 181 252, ou encore de pro- duits sursulfatés comme ceux décrits dans le brevet européen 214 879. Dans un aspect particulièrement préféré de l'invention, on utilise des mélanges de fragments d'héparine obtenus par dépolymérisation nitreuse ayant une masse moléculaire inférieure à 10.000 daltons, en particulier soit ceux ayant une masse moléculaire moyenne se situant entre 2.000 et 8. 000 dalzons, soi_ ceux ayant une masse moléculaire moyenne d'environ 4. 500 daltons, soit encore ceux ayant une masse moléculaire moyenne d'environ 2.500 daltons. On peut également avantageusement utiliser des fragments d'héparine homogènes au regard de leur masse moléculai- re ou des oligosaccharides obtenus par synthèse qui sont homogè- nes tant en ce qui concerne leur masse moléculaire que la posi- tion et le nombre de leurs groupes fonctionnels. Dans la suite du texte, le mélange de chaînes hépariniques obtenues par dépolymé- risation nitreuse et ayant un poids moléculaire moyen de 4.500 daltons, préparé comme décrit dans l'Exemple la ci-dessous, sera désigné par la référence "CY 216-CHO". Un autre produit de départ avantageux Oside-Z est le mélange de fragments d'héparine obtenu par dépolymérisation nitreuse et décrit dans EP 37 3.19; il est désigné "CY 222-CHO". On peut également choisir comme polyosides des dérivés de l'héparine dépourvus de site de fixation à l'antithrombine III (AT III), soit que les chaînes d'héparines aient été fractionnées de manière à éliminer les chaînes oligosaccharidiques comportant 0 le site de fixation à l'AT III en ayant recours par exemple à une chromatographie d'affinité sur résine Sépharose-AT III ou à des chromatographies d'échange d'ions, comme il est décrit dans E. Sache et al., Thromb. Res., 1982, 25, 443-458, soit que ces sites aient été détruits par exemple par dépolymérisation à l'acide L5 periodique et béta-élimination exhaustive. On rappellera ici que l'antithrombine II_ ou AT 111 est un inhibiteur plasmatique de la coagulation, actif sur différentes protéases plasmatiques et dont l'activité est fortement accrue par l'héparine agissant comme co-facteur. Il va de soi que les indications ci-dessus sont données uniquement à titre d'exemple, mais que tout polyoside naturel décrit dans la littérature et possédant les caractéristiques décrites peut être utilisé. Les substances peptidiques P utilisées dans le procédé de ia Z5 présente invention peuvent être soit des polypeptides, soit des protéines ou des hormones de tyve protéique, soit des enzymes ou des inhibiteurs d'enzymes naturels chimiquement modifiées ou obtenus par recombinaison génétique. Dans un autre aspect avantageux de l'invention, les enzymes choisis sont des enzymes thrombolytiques. D'une manière préférée, les enzymes thrombolytiques utilisés comme produits de départ sont l'urokinase, l'activateur tissulai- re du plasminogène, la pro-urokinase et leurs dérivés et analo- gues obtenus par recombinaison génétique ou par tout autre procédé. D'une manière avantageuse, le couplage entre l'un des motifs aminés de la substance peptidique P et de la chaîne polyoside Oside-Z s'effectue au niveau du motif terminal de chaîne Oside-Z, cette dernière ayant ou non subi une opération préalable de fragmentation par dépolymérisation. Selon la présente invention, il est possible de mettre en oeuvre directement une chaîne polyosidique possédant un motif hémi-acétalique situé à son extrémité réductrice. Ce motif est en effet sous forme d'équilibre entre la forme cyclisée (fermée) et la forme linéaire (ouverte) et, au fur et à mesure de la consom- mation des groupements aldéhydiques par couplage de ces derniers aux groupements aminés de la substance peptidique P, de nouveaux groupements aldéhydiques sont libérés. Cette façon de procéder est avantageuse lorsque le polyoside ne possède pas de glucosami- ne N-sulfate sensible à l'acide nitreux ou lorsque l'on veut disposer de chaînes de masse moléculaire élevée. Néanmois, elle présente l'inconvénient de nécessiter une durée de réaction beaucoup plus longue pouvant aller jusqu'à 10 à 15 jours. Il est donc d'une manière génèrale plus avantageux d'utiliser un poly- saccharide Oside-Z dont le groupe aldéhydique a été généré par dépolymérisation selon une méthode appropriée, par exemple celle à l'acide nitreux. Lorsqu'on utilise, comme produit de départ, un GAG Cside-Z dont le motif terminal Z est un groupe 2,5-anhydromannosique obtenu par dépolymérisation nitreuse selon le Schéma (3) ci- dessus, il est préférable que la réaction de couplage soit effectuée sur ledit Oside-Z immédiatement après sa préparation, pour éviter que le groupe aldéhydique, notoirement peu stable, perde sa réactivité. Dans la mesure o l'on souhaite obtenir une chaîne polyosi- dique de type héparinique dépourvue de site de fixation à l'anti- thrombine II, il est avantageux d'utiliser comme produit de départ un GAG ayant subi une dépolymérisation à l'acide pericdi- que, suivie d'une béta-élimination exhaustive, ce procédé permet- tant de couper préférentiellement la chaîne héparinique entre les carbones en positions 2 et 3 de tous les acides uroniques non sulfatés tel que le GAG décrit par Casu et al., Arzneim. Forsch. /Drug Res., 1986, 36 (1), n. 4, 637-646. Or, on sait qu'un tel motif est présent dans le site de fixation de l'héparine à l'antithrombine III. La quantité de chaînes polyosidiques à mettre en oeuvre doit être en fort excès par rapport aux chaînes peptidiques dans un rapport de 100 à 2000 moles de Oside-Z pour 1 mole de la substan- ce peptidique P. Cet excès est avantageusement de 500 à 1500 moles d'Oside-Z pour i mole de la substance peptidique P. De préférence, lorsque l'on met en oeuvre de l'urokinase, on utilise 500 à 650 moles de Oside-Z pour 1 mole d'urokinase; et, lorsque l'on met en oeuvre l'activateur tissulaire du plasminogène, on utilise de préférence 600 à 1350 moles de Oside-Z pour 1 mole de l'enzyme. Le milieu réactionnel est un milieu aqueux qui doit être dépourvu d'amines primaires ou secondaires susceptibles d'inter- férer avec la réaction de couplage entre Oside-Z et le polypepti- de P. D'une manière avantageuse, le milieu aqueux est un tampon tel qu'un tampon phosphate ou bicarbonate ou tout autre tampon susceptible d'être ajusté au pH approprié par addition d'un acide minéral ou d'un hydroxyde alcalin. Eventuellement, il peut être additionné d'un solvant organique miscible à l'eau tel que l'éthanol, l'acétone, la diméthylformamide. Dans un mode préféré de l'invention, on utilise un tampon phosphate 0.05 M additionné de chlorure de sodium. On y adjoint, si nécessaire, du polysorbate 80 (dérivés du sorbitane monooléate ou tween), par exemple à raison de 1 p. 10.000, ce surfactant permettant d'éviter l'absorption de la substance peptidique P sur les surfaces. Le pH du milieu réactionnel est choisi de façon à ce que l'amine soit sous forme protonée, il peut varier de 6 à 9, il est toutefois avantageusement de 7 à 8, de préférence voisin de la neutralité. La température de réaction peut varier en fonction de la substance peptidique utilisée, elle se situe avantageusement entre +2 C et +350C pendant 2 à 15 jours. De préférence, on opère 2-31970 à température basse, par exemple à +4'C, sourtout lorsque la substance peptidique est un enzyme, un grand nombre de ces derniers étant thermolabiles, ce qui est en particulier le cas des enzymes thrombolytiques. Il faut noter toutefois que plus la température est basse, plus la cinétique de la réaction est lente. La durée de la réaction sera donc variable selon la température choisie. De façon avantageuse,' on laisse la réaction s'effectuer sous agitation à +4 C pendant 2 à 8 jours si le polyoside utilisé possède un groupement aldéhydique provenant d'une dépolymérisation nitreuse. En particulier lorsque la substance peptidique mise en oeuvre est un enzyme thrombolytique tel que l'urokinase, la pro-urokinase ou l'activateur tissulaire du plasminogène, le maintien dela réaction à +4 C pendant une durée de 3 à 5 jours permet d'obtenir un rendement de greffage satisfaisant. La poly-base de Schiff de formule (IV) ainsi obtenue peut être isolée selon les techniques connues, par exemple par préci- pitation avec un sel approprié, tel que le sulfate d'ammonium, et soumise à une réduction avec un cyanoborohydrure, tel que le cyanoborohydrure de sodium. La réduction peut également être faite directement dans le milieu réactionnel, sans isoler la poly-base de Schiff. Il est également possible de passer directement aux composés I par réaction du polypeptide P avec le polyoside Oside-Z en présence de cyanoborohydrure de sodium dans les conditions ci-dessus. De cette façon, la poly-base de Schiff intermédiaire est réduite au fur et à mesure qu'elle se forme et le produit est isolé en tant que seul produit final. Pour séparer le conjugué ainsi obtenu des produits qui n'ont pas réagi, on peut opérer par précipitation, cette opération pouvant s'effectuer par exemple au moyen de sulfate d'ammonium que l'on additionne au milieu réactionnel en quantité suffisante pour saturer la solution, c'est-à-dire à raison d'environ 600 mg/ml. On laisse ensuite décanter et on centrifuge. Cette opération peut être répétée après reprise du précipité en additionnant à nouveau celui-ci de sulfate d'ammonium dans les mêmes conditions. Pour récupérer le N-polyosyl-polypeptide sous forme pure, on effectue une gel perméation à l'aide d'un gel choisi en fonction de la nature et de la taille du polypeptide. La gel filtration s'effectue de manière avantageuse sur une colonne contenant un gel de type ultrogel, par exemple celui vendu par la Société IBF (France) sous le nom d'Ultrogel (R) AcA 44 ou celle vendue par * Pharmacia sous le nom de Sephacryl (R) S 200. Dans un mode de réalisation avantageux, on dissout le précipité obtenu à l'étape précédente dans un tampon approprié à la substance peptidique P mise en oeuvre, on dépose ensuite la solution sur la colonne qui a été préalablement équilibrée à l'aide du même tampon. La gel filtration est suivie au moyen d'un spectrophotomètre à 280 nm et le pic de protéine est récupéré. Il contient la totalité du produit, dont on effectue ensuite la caractérisation et le dosage. Les poly-bases de Schiff de formule (iV) ci-dessus sont des produits nouveaux qui représentent les intermédiaires clé dans la préparation des N-polyosyl-polypeptides de formule (I). Elles constituent donc un aspect ultérieur de la présente invention. De façon préférentielle, dans la formule (^V) ci-dessus, Oside représente le radical d'un glycosaminoglycane Cside-Z choisi parmi l'héparine, les fragments d'héparine, la chondroiti- ne sulfate 4-S, la chondroitine sulfate 6-S, l'héparane sulfate et le dermatane sulfate, privé de l'unité terminale réductrice Z. Particulièrement avantageuses sont les poly-bases de Schiff provenant d'un polysaccharide Oside-Z dont-le motif Z représente le motif terminal réducteur d'une chaîne de glycosaminoglycane héparinique ayant subi une dépolymérisation nitreuse. Elle est représentée par la formule (IVa) suivante: R | Oside - u, 'f | '(IVa) ' CH=N- p' n qui correspond à la formule (IV), le groupement entre les lignes en pointillé étant le radical Z' et R1 étant H ou SO3. Dans un autre aspect particulier de l'invention, la poly- base de Schiff provient d'un polysaccharide Oside-Z dont le motif Z représente le motif terminal réducteur naturel d'un glycosami- noglycane de type héparinique. Elle est représentée par la formule (IVb) suivante: Oside 0 O CH=N- ?' (IVb) 11R n qui correspond à la formule (IV), le groupement entre les lignes en pointillé étant le radical Z', R. étant H ou SO3, R2 étant SO3 ou Ac et oside étant le reste de la chaîne héparinique. Dans un autre aspect particulier de l'invention, ia poly- base de Schiff provient d'un polysaccharide Oside-Z dont le motif Z représente le motif terminal réducteur naturel d'un glycosami- noglycane de type chondroitine sulfate. Elle est représentée par la formule (IVc) suivante: 1R en pointillé étant le radical Z', 'u des R1 OHétant H et l'autre SO et oside étant le reste de la chaîne du type chondroitineV) sulfate. Dans un autre aspect particulier de l'invention, la poly- base de Sohif f provient d'un polysaccharide Oside-Z ayant subi une dépolymérisation dans des conditions telles que la chaîne NHCOCH3 _ n qui correspond àAla formule (IV), le groupement entre les lignes possède un poinombre de motifs impairs dotant le motifradical Z', l'un des R rédtant Het l'autreur SO3représente tun acide uronique, acide aD-glucuroniqute honduroitinei- sulfate. Dans un autre aspect particulier de l'invention, la poly- base de Schiff provient d'un polysaccharide Oside-Z ayant subi une dépolymérisation dans des conditions telles que la chaine possède un nombre de motifs impairs dont le motif Z réducteur représente un acide uronique, acide D-g!ucuronique ou L-iduroni- que. Elle est alors représentée par la formule (IVd) suivante: 0 OH ' H' Oside - O H ' CH=N- ?' (-Vd) OR, n qui correspond à la formule (IV), le groupement entre les lignes en pointillé étant le radical Z', R. étant H ou SO3, et Oside étant le reste de la chaîne polysaccharidique. D'une manière avantageuse, la poly-base de Schiff de l'in- vention correspond à la formule (IVa) ci-dessus, dans laquelle P' est une molécule d'urokinase, et n est égal ou inférieur à 6, de préférence 6, 4 ou 3. Dans un autre exemple avantageux de l'invention, P' est une molécule de l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) et n est égal ou inférieur à 8, de préférence 8 ou 5. Les poly-bases de Schiff (IVa), (IVb), (IVc) et (IVd) ci-dessus sont transformées, selon la présente invention, dans les N-polyosylpolypeptides correspondant (Ia), (Ib), (Ic) et (Id) par réduction avec le cyanoborohydrure de sodium. L'invention a également pour objet l'utilisation des N-poly- osyl-polypeptides de l'invention à titre de nouveaux médicaments, les indications thérapeutiques variant en fonction des activités particulières aux substances peptidiques utilisées pour la préparation du N-polyosyl-polypeptide. L'invention concerne en particulier, selon un aspect ultérieur, des compositions pharma- ceutiques contenant à titre de substance active une quantité efficace d'au moins un quelconque des N-polyosyl-polypeptides de l'invention en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Notamment, dans les compositions pharmaceutiques utilisables par voie parentérale, le véhicule pharmaceutique utilisé est un soluté chloruré ou glucose. Les compositions pharmaceutiques en question sont utilisables par voie intravei- neuse, intramusculaire ou sous-cutanée, ou dans des perfusions. De telles compositions pharmaceutiques peuvent contenir de $ à 100 mg par unité de prise. De façon avantageuse, lorsque le polypeptide utilisé est l'urokinase, le N-polyosyl-polypeptide utilisé dans la composition pharmaceutique est présent à raison de 0,2 à 2 mg par ml de préparation injectable. Lorscue le polypeptide utilisé est l'activateur tissulaire du plasminogène, le N-polyosyl-polypeptide utilisé dans la préparation injectable est présent à raison de 0,2 à 2 mg par-.l de la préparation injectable. Dans une autre réalisation de l'invention les compositions pharmaceutiques sont destinées à l'a&ministration par voie orale et sont associées à des véhicules pharmaceutiques appropriés pour la préparation de gélules, tablettes, comDrimés. 3 D Dans une autre réalisation de l'invention, les compositions pharmaceutiques sont déstinées à des applications topiques et sont préparées sous forme de pommades, onguents, crèmes, gels, sprays, suppositoires, en association avec des excipients pharma- ceutiques appropriés, il peut s'agir également de soluté isotoni- que aux larmes pour application oculaire, d'une manière générale sous toute forme pharmaceutique à la disposition du pharmacien. L'invention concerne également à titre de réactif biologique nouveau les N-polyosyl-polypeptides de l'invention. En particu- lier, selon les substances peptidiques choisies, ils peuvent être utilisés comme réactif enzymatique ou comme produit de diagnostic ou à toute autre fin. L'invention ne se limite pas aux aspects plus particuliers qui viennent d'être décrits, elle en embrasse au contraire toutes les variantes et elle sera mieux comprise à l'aide des exemples d'application qui suivent. EXEMPLE 1: Préparation d'un N-polyosyl-polypeptide dans lequel P est l'Urokinase et Z-oside est le CY 216-CHO. L'urokinase utilisée est préparée à partir d'urine humaine. Elle est constituée pour sa majeure partie d'urokinase de type S. d'un poids moléculaire de 54.000 daltons. Une telle urokinase existe dans le commerce. Son titre est de 85700 uI/mg selon la technique décrite par la Pharmacopée Européenne (Réf. 4ème Edition). Expérimentation n 1: (a) Génération de la terminaison aldéhydique par dépolrmérisation de l'héparine: Le fragment d'héparine a été préparé de la manière suivante: 500 g d'héparine injectable, sous forme de sel de sodium, sont mis en solution dans 4500 ml d'eau déminéralisée, à une température de 18 C. Le rapport YW/USP de l'héparine utilisée est voisin de:, ces titres présentant une valeur de l'ordre de 160-170. La solution obtenue est mise sous agitation énergique, et son pH est abaissé à 2,5 par addition d'acide chlorhydrique - concentré. On ajoute alors 15 g de nitrite de sodium dissous dans 300 ml d'eau. Le pH de la réaction est ajusté à 2,5 par de l'acide chlorhydrique concentré et le volume total de la solution est amené à 5000 ml. On laisse la réaction s'effectuer pendant 45 minutes puis on vérifie l'absence d'ions nitreux résiduels dans la solution réactionnelle, par exemple au moyen de papier indicateur imprégné d'iodure de potassium amidonné (développement d'une coloration bleue-vio- lacée en présence d'ions NO2). On laisse la réaction se poursuivre jusqu'à disparition tota- le des ions nitreux en absence de réaction au papier iodo- amidonné, en effectuant des contrôles toutes les 3 ou 4 minutes. Lorsque ces contrôles deviennent négatifs, la réaction est considérée comme étant achevée. Les produits de la réaction sont récupérés par addition de 10 litres d'éthanol. Après 48 heures de repos, le produit est décanté et on élimine le surnageant. Le précipité est redissous dans 9 litres d'eau déminéralisée. On ajoute 100 g de chlorure de sodium, et on abaisse le pH de la solution à 3,8 à l'aide d'acide chlorhydrique con- centré. Le volume est ajusté exactement à 10 litres à l'aide d'eau déminéralisée, et l'on ajoute sous agitation énergique 10 litres d'éthanol. On laisse reposer 48 heures. On siphonne le surnageant que l'on écarte. Le précipité est récupéré, lavé à l'éthanol, broyé, séché sous vide. On obtient 230 grammes de prcduit Cv 216-CHO ayant les carac- téristiques suivantes: Titre US? = 52 uI/mg Titre Yin et Wessier = 225 uI/mg Poids moléculaire moyen = 4000 à 5000 daltons (b) Couplage de l'urokinase avec le CY 216-CHO: 700 mg d'urckinase titrant 60.000.000 d'unités internateiona- les sont mis en solution dans 900 ml de tampon phosphate D.05 M, NaCl 0.5 M, pH 7. Cn ajoute 42 g de CY 216-CHO et 3 t de cyanoborohydrure de sodium (NaBH3CN). On réajuste le pH à 7 avec de la soude 2N et on laisse réagir pendant 5 jours sous agitation, à la température de + 40C. (c) Précipitation: On ajoute ensuite 600 mg/ml de sulfate d'ammonium (NH4) SO4 26319 70 et on laisse décanter, puis on centrifuge à 15.000-20.000 rpm pendant 10 minutes. On récupère le culot que l'on redissout dans 50 ml du même tampon phosphate et l'on effectue une deuxième précipitation dans les mêmes conditions. (d) Gel filtration: Le produit récupéré à l'étape précedente est remis en solu- tion dans le même tampon phosphate et est déposé sur une co- lonne Ultrogel(R) AcA 44 (Pharmacia, Suède) faisant 10 x 100 cm. L'opération est suivie au spectrophotomètre à 280 nm et on récupère le pic de protéine. Le pic correspond à 51.000.000 uI d'urokinase, soit un rendement en activité de %. (e) Caractérisation du produit: On étudie le taux de couplage du produit en dosant les pro- téines par la méthode au Bleu de Coomassie (S.M. Read et D.H. Northcote, Ann. Biochem., 1981, 116, 53-64) et le CY 216-CH.O par la méthode au carbazol (dosage des acides uroniques, R. Bitter et H. Muir, Ann. Biochem., 1962, 4, 330-334). Les résultats sont calculés pour un PM moyen de 4.500 daltons en ce qui concerne le CY 216-CHO et 54.000 daltons en ce qui concerne l'urokinase. On obtient 5 moles de CY 216-CHO pour 1 mole d'urokinase. Le produit ainsi obtenu porte la référence IC 1857. Expérimentation n 2: Différents essais ont été réalisés en faisant varier certains des paramètres opératoires: lère série d'expérience pH basique: Variation de la durée de réaction: CY 216-CHO 500 mg (111iM) Urokinase 20 mg (0,18 yM) NaCNBH3 50 mg Tampon phosphate K 0,2 M, pH 9 Température 4 C Résultats: Durée Rapport molaire CY 216-CHO-UK dans le conjuqué 3 j. 3/1 j. 3/1 7j. 3/1 2ème série d'expérience pH neutre: - Variation de température: CY 216-CHO 1400 mg (311".M) Urokinase 30 mg (0, 54.M) NaCNBH3 100 mg Tampon phosphate Na 0,05 M, pH 7, NaCl 0,5 M Durée 5 jours Résultats: TemDérature Rapport molaire CY 216-CHO--UK dans le conjuqué 4 C 6/1 C 6/i Dans la première série d'ex-ériences ci-dessus, on opère à un rapport molaire de 617, a un PH basique et à une température de + 4 C. Dans ces conditions, le taux de couplage est le même, c'est-à-dire 3 moles de CY 216-CHO pour i mole d'urokinase, et le rendement en activité enzymat:cue est de 100%. Dans la deuxième sèrie d'experiences ci-dessus o le rapport molaire et les quantizés d'agent réducteur sont sensiblement les mêmes, mais o le pH utilisé est neutre, le résultat de couplage est supérieur à celui obtenu à un pH basique. il est le même que l'on opère à + 40C ou 20oC. Toutefois, le rendement en activité enzymatique est supérieur à basse température, respectivement 85% au lieu de 60% de l'actvi. engagée. EXEMPLE 2: Préparation d'un N-poiyosyvl-polypeptide dans lequel P est ie PA et '-oside est le CY 216-CHO. Le tPA utilisé possède un poids moléculaire de 60.000 daltons et titre 550.000 uI/mg. L'activité du produit est testée sur plaque de fibrine selon la technique de Ploug et Kjeldgaard (Biochim. Biophys. Acta, 1957, 24, 27S-28-2). Expérimentation n 1: (a) Génération de la terminaison aldéhydique: Le fragment d'héparine CY 216-CHO a été préparé comme décrit à l'Exemple i ci-dessus. (b) Couplage du tPA avec le CY 216-CHO: 2 mg de tPA sont mis en solution dans 3 ml de tampon phospha- te 0.05 M, NaCl 1 M,tween 1 p. 10.000, pH 7. On ajoute 200 mg de CY 216CHO et 8 mg de NaCNBH3. On ajuste le pH à 7 avec quelques gouttes d'acide chlorhydrique IN. On laisse réagir pendant 5 jours sous agitation, à la température de + 4 C. A ce stade le rendement de couplage est de 90% (récupération O de 990.000 uI). Ceci montre bien que la technique de couplage n'altère pas l'activité enzymatique. (c) Précipitation au sulfate d'ammonium: On sépare les produit qui ont réagi de ceux qui n'ont pas réagi par une précipitation au sulfate d'ammonium. On ajoute i5 au milieu réactionnel 650 mg/ml de (NH4)2SO. On laisse décanter pendant 8 heures puis on centrifuge à 15.000-20.000 rpm pendant une demi-heure à + 4 C. Le précipité formé est récupéré. On effectue ensuite une deuxième précipitation. Pour ce faire, on redissout le précipité précédemment formé récupéré dans 3 ml d'eau distillée et on ajoute à nouveau 650 mg/ml de (NH4)2SO4 et on laisse à nouveau décanter 8 heures. On centrifuge à 18.000 rpm pendant une demi-heure à + 4 C. Le précipité formé est récupéré et redissout dans 5 mI de tampon phosphate 0,05 M, NaCl 1M, Iween 1 p. 10.000, pH 7. (d) Caractérisation du produit: On prélève un aligcuot de 0,2 ml de la solution précédemment obtenue. On effectue une gel filtration sur une colonne de Sephacryl (R) S 200 (Pharmacia, Suède) (100 cm x 2,5 cm) équilibrée avec de la soude 0,2 N. concentration nécessaire pour récupérer le tPA. On récupère le pic de protéines et on dose les protéines par la méthode au Bleu de Comassie (réf. ci-dessus) et le CY 216-CHO par la méthode au carbazol (dosage des acides uroni- ques, ré-f. ci-dessus). Les résultats sont calculés pour un PM moyen de 4.500 daltons en ce qui concerne le CY 216-CHO et 60.000 daltons en ce qui concerne le tPA. On obtient 8 moles de CY 216-CHO pour 1 mole de tPA. Le produit ainsi obtenu porte la référence IC 1903. Expérimentation n" 2: Un essai a été effectué en faisant varier le rapport molaire des produits mis en oeuvre: CY 216- HO et tPA tPA 2 mg (0,033 >M) 'NaCNBH3 8 mg Tampon phosphate Na 0,05 M, pH 7, NaCl 1 M, Tween 1 p. 10.000 Durée 5 jours Température 4'C Résultats Raonort molaire CY 216-CHO-tPA du conjugué CY 216-CHO: 200 mg (44)M) 8/1 CY 216-CHO: 100 mg (22>uM) 5/1 On constate qu'avec un rapport molaire de 1346, on obtient un rendement de couplage de 8 moles de CY 216-CHO pour 1 mole de tPA, alors qu'avec un rapport de moitié, le rendement de couplage baisse notablement, 5 pour 1. EXEMPLE 3: ACTIVITE PHARMACOLOGIQUE IN VITRO DES PRODUITS DE L'INVENTION 3.1. Activité enzymatique du produit IC 1857: L'activité urokinase du produit de couplage IC 1857 a été testée selon la technique de Ruyssen R. et Lauwers A. (Pharmaceuticals Enzymes, E. Story-Scientia, Gand, Belgium, 1978, 135-139) sur substrat synthétique AGLME. Le principe de la méthode consiste à doser au pH Staat l'hydrolyse de la N-alpha-acétyl-glycine-L-lysine méthyl ester. Les résultats obtenus, comparés à ceux de l'urokinase de départ ont été les suivants: UK de départ: 87.500 uI/mg IC 1857: 74.000 uI/mg. 263 1970 3.2. Activité enzymatique du produit IC 1903: L'activité tPA du produit de couplage IC 1903 est effectuée sur plaque de fibrine selon la technique de Ploug et Kjeld- gaard comme indiquée plus haut. Le principe de la méthode consiste à déposer un aliquot de la solution à doser sur une boite de Petri à la surface de laquelle on a formé un fil de fibrine contenant son propre plasminogène. L'activité du produit à tester se traduit par des zones de lyse du fil de fibrine proportionnelles à la quantité de tPA déposée, par rapport à un étalon (étalon international de l'Organisation Mondiale de la Santé). Les résultats obtenus, comparés à ceux du tPA de départ sont les suivants: tPA de départ: 550.000 uI/mg IC 1903: 302.000 uI/mg. EXEMPLE 4: ACTIVITE PHARMACOLOGIQUE IN VIVO DE IC '857 Activité in vivo sur un modèle de détresse respiratoire provo- quée, chez le hamster. Le modèle utilisé consiste à mesurer, chez le hamster, le temps de détresse respiratoire provoquée par une embolie pulmonaire consécutive à une injection de thrombine. Description du protocole: Trois lots de cinq animaux sont utilisés: - le ler lot reçoit la thrombine seule, - le 2ème lot reçoit la thrombine + UK (7.000 uI/kg), - le 3ème lot reçoit la thrombine + IC 1857 (7.000 uI/kg). Le produit à tester est injecté avant l'njecion de la thrombi- ne. Les produits sont injectés par voie intraveineuse à 'aide d'une pompe à perfusion (Palmer). La détresse pulmonaire est observée et quantifiée par mesure de la durée de détresse, en distinguant la "détresse aigue" et la "détresse totale". Le résultats figurant dans le tableau ci-après sont exprimés en pourcentage de réduction par rapport au témoin thrombine. Traitement % de réduction de P % de réduction de P "détresse totale" "détresse aigue" Urokinase 7.000 uI/kg 36,5 IC 1857 7.000 uI/kg 91,7 En conclusion, on constate que la réduction de détresse respira- toire obtenue avec le conjugué IC 1857 est beaucoup plus impor- tante que celle obtenue avec de l'urokinase seule, et ce, qu'il s'agisse de la détresse totale aussi bien que de la détresse aigue. EXEMPLE 5: ETUDE PHARMACOCINETIQUE 5.1. Etude pharmacocinétique de IC 1903: On a étudié comparativement la cinétique d'action du tPA natif et celle du produit préparé selon l'invention IC 1903 (Exemple 2, expérimentation 1). L'expérience a été effec- tuée chez le lapin (6 animaux par produit). 2C Protocole d'étude: Apres anesthésie, l'artère carotide gauche de chaque animal est cathétérisée. Un premier prélèvement de 2,5 ml de sang est pratiqué au temps 0 (T.0) sur citrate 3,8 % rapport au 1/10. L'injection de 10.000 unités/kg du produit de référence et de IC 1903 est effectuée à la veine marginale de l'oreille droite, sous un volume moyen de 0,5 ml. Des prélèvements sont effectués à 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 45 et 60 minutes. Le sang total est centrifugé pour récupérer le 33 plasma pauvre en plaquettes (PPP) et les euglobulines sont précipitées suivant une technique modifiée de N.A. Marsh et al. (Thromb. Haemost., 1977, 38, 545-546) et de J. Gram et al. (Thromb. Res., 1986, 49, 781-789). Les euglobulines sont ensuite déposées sur plaque de fibrine bovine et les aires de lyse sont mesurées après 18 heures à 37:C. 263197e Résultats: L'activité lytique observée sur plaque de fibrine est rapportée ci-dessous: Prélèvements tPA de référence IC 1903 T.0 61,66 + 35,48 68,66 + 36,81 T + 1 min. 246,66 + 66,49 355,83 + 98,70 T + 2 min. 213,16 + 50,55 301,50 + 54,96 T + 3 min. 170,16 + 49,11 272,00 + 64,66 T + 4 min. 176,83 + 75, 00 259,33 + 55,46 T + 5 min. 156,00 + 40,61 247,50 + 67,24 T + 7 min. 123, 00 + 35,60 218,83 + 49,90 T + 10 min. 123,20 + 29,52* 197,66 + 45,39 T + 15 min. 100,50 + 28,14 160,33 + 43,66 T + 20 min. 111,60 + 18,74* 142,00 + 58,94* T + 30 min. 92,00 + 46,00* 131,66 + 58,94** T + 45 min. 104,00 + 53,75* 110,75 + 58,27*** T + 60 min. 121,60 + 58,75* 119,16 + 43,73 N.B.: - surface de lyse en mm2: moyenne + SD * nombre d'animaux = 5 2Z ** nombre d'animaux = 3 *** nombre d'animaux = 4 5.2. Etude pharmacocinétique de IC 1857: On a étudié comparativement la cinétique d'action de l'uro- kinase native et celle du produit préparé selon l'invention IC 1857 (Exemple 1, expérimentation 1). L'expérience a été effectuée chez le lapin (7 animaux par produit). Protocole d'étude: Les animaux sont anesthésiés comme dans l'exemple 5.1. ci-dessus et un premier prélèvement effectué au temps T.0. 3% Les animaux reçoivent ensuite 10.000 u/kg de produit de référence et de IC 1857, dans les mêmes conditions que précedemment. Des prélèvements sont effectués à i, 5, 10, , 20 et 30 minutes. Le sang totale est centrifugé pour récupérer le plasma et les échantillons sont testés en tube à essai pour évaluation de leur activité amidolytique sur 263 1970 substrat S 2444 de KabiVitrum (Suède) selon la technique décrite par Kabi. L'activité lytique est mesurée par densitométrie et trans- posée en unités Urokinase, selon une courbe d'étalonnage obtenue en passant dans les mêmes conditions opératoires un étalon Urokinase. Les résultats ont été les suivants: Prélèvements UK de référence IC 1857 u/ml u/ml T.0 0,0 0,0 T + 1 min. 209,8 + 40,7 85,8 + 10,2** T + 5 min. 84,6 + 25,7* 51,2 + 18,2 T + 10 min. 26,2 + 15,4* 34,8 11,6 T + 15 min. 8,6 + 7,0 17,8 + 9,1** T + 20 min. 4,1 - 4,8* 16,5 + 11,8 T + 30 min. 0,7+ 1,3 5,2 + 5,3 N.B.: * nombre d'animaux = 6 ** nombre d'animaux = 5 On constate une pharmacocinétique allongée de IC 1857 par rapport à l'urokinase de référence, puisqu'aux temps + 15 min., + 20 min. et + 30 min., il y a encore une activité urokinasique dans le plasma des animaux. EXEMPLE 6: ETUDE TOXICOLOGIQUE DES PRODUITS DE L'INVENTION IC 1857 et IC 1903 ont été administrés en une injection unique à des souris, par voie intraveineuse, à la dose de 2 mg/kg. Les animaux ont été observés pendant 8 jours et n'ont présenté aucun signe de toxicité. Comme il ressort de ce qui précède, les produits de l'invention présentent un très grand intérêt en tant que médicaments. En effet, la méthode de couplage choisie est particulièrement avantageuse. Le maintien d'une configuration spatiale appropriée de la substance peptidique couplée permet de conserver l'activi- té de la substance active et la conjugaison à un support poly- osidique entraîne un renforcement de l'activité et un prolonge- ment de celle-ci. 263 1970 Les enzymes thrombolytiques tels que l'urokinase et l'activateur tissulaire du plasminogène conjugués au support polyosidique constituent donc un médicament thrombolytique très remarquable qui pourra être utilisé pour le traitement des thromboses et embolies veineuses et artérielles de formation récente, par exemple les thromboses coronaires, les embolies pulmonaires, les phlébites, l'infarctus du myocarde. De manière avantageuse, IC 1857, produit de conjugaison de l'urokinase avec un fragment d'héparine pourra être administré à l'homme à raison de 1.000 à 10.000 uI/kg/heure, de préférence 2.000 à 4.000 uI/kg/heure, soit par perfusion intraveineuse continue ou injection intraveineuse lente, seul ou associé à un traitement de plasminogène. Revendications 1. N-polyosyl-polypeptide de formule (Oside-Z,-CH2 NH-)nP (I) dans laquelle - P' est le radical n-valent d'un polypeptide P lié aux n groupes NH provenant de n groupes amino libres présents à l'origine dans la molécule de P; - Z' est l'unité saccharidique terminale réductrice du polysaccharide Oside-Z dans sa forme aldéhydique, soit naturelle, soit provenant de la dépolymérisation nitreuse, privée du groupe aldéhydique de Z; - Oside est le reste du polysaccharide Oside-Z; - n est un nombre entier de 3 à 30; ou, le cas échéant,un de ses sels pharmaceutiquement accepta- bles. 2. N-polyosyl-polyvpeptide selon la revendication 1, caractérisé par la formule (i) ci-dessus, o Oside représente le radical d'un glycosaminoglycane Cside-Z choisi parmi l'héparine, les fragments d'héparine, la chcndroltine sulfate 4-S, la chon- droitine sulfate 6-S, l'héparane sulfate et le dermatane sulfate, privé de l'unité terminale réductrice Z. - 3. N-polyosyl-polypeptide selon l'une queiconque des revendica- tions 1 et 2, caractérisé par la fcrmule (1) dans laquelle P' et n sont tels que définis dans la revendication 1; - Z' est l'unité saccharidicue terminale réductrice d'un glycosaminoglycane du type héparinique Oside-Z dans sa forme aldéhydique provenant de la dépolymérisation nitreuse de l'héparine, ledit Oside-Z étant consistué par un mélange de fragments d'héparine ayant une masse moléculaire moyenne se situant entre 2000 et 8000 daltons; - Oside est le reste du polysaccharide Cside-Z. 4. N-polycsyl-polypeptide selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 3, caractérisé par la fermule (I) dans laquelle P' et'n sont tels cue définis dans la revendication 1; - Z' est l'unité saccharidique terminale réductrice d'un glycosaminoglycane du type héparieique Oside-Z dans sa forme aldéhydique provenant de la dépolymérisation nitreuse de l'héparine, ledit Oside-Z étant consistué par un mélange de fragments d'héparine ayant une masse moléculaire moyenne d'environ 4500 daltons; - Oside est le reste du polysaccharide Oside-Z. 5. N-polyosyl-polypeptide selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 4 caractérisé par la formule (I) dans laquelle Z' a la structure CH2OR iH OR -0 o R1 est l'hydrogène ou un groupe SO3 6. N-polyosyl-polypeptide selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 5, caractérisé par la formule (1) dans laquelle - P' est le radical n-valent d'un enzyme thrombolytique lié aux n groupes NH provenant de n groupes amino libres présents à l'origine dans la molécule dudit enzyme thrombo- lycique; - n est de 3 à 8. 7. N-poiyosyl-polypepcide selon l'une quelconque des revendica- tions i à 6, caractérisé par la formule (1) dans laquelle - P' est le radical n-valen. de l'urokinase lié aux n groupes NH provenant de n groupes amino libres présents à!'origine dans la molécule de ladite urokinase; - n est de 3 à 8. 8. N-polyosyl-polypeptide selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 6, caractérisé par la formule (I) dans laquelle - P' est le radical n-valent du tPA lié aux n groupes NH provenant de n groupes amino libres présents à l'origine dans la molécule dudit tPA; - n est de 3 à 8. 9. N-polyosyl-polypeptide de formule COO CHOR COO CHOR, LO R, OR __NH-3 dans laquelle - Ri est l'hydrogène ou un groupe SC3, - R est un groupe acétyle ou un groupe S03, O - P' est le radical trivalent de l'urokinase lié aux 3 groupes NH provenant de 3 groupes amino libres présents à l'origine dans la molécule de l'urokinase, et - p, de 4 à 24, représente le nombre d'unités disaccharidi- ques de fragments d'héparine provenant d'une dépolymérisa- tion nitreuse dans unmélange ayant une massemoléculaire moyenne d'environ 4500 daltons et contenant le site de fixation à l'AT III. 10. N-polyosyl-polypeptide de formule o 0 - tH "V-./ - p, de 4 à 24, représente le nombre d'unités disaccharidi- ques de fragments d'héparine provenant d'une dépolymérisa- tion nitreuse dans un mélange ayant une masse moléculaire d'environ 4500 daltons et contenant le site de fixation à V'AT 11-. 11. N-polyosyl-polypeptide de formule /I C o CHOR, X U20 COO CH OR COO CHR C'2: I --o OH -oH OH,, H OR1;HR, OR, dans laquelle - R1 est l'hydrogène ou un groupe SO3, - R2 est un groupe acétyle ou un groupe S03, L0 - P' est le radical octovalent du tPA lié aux 8 groupes NH provenant de 8 groupes amino libres présents à l'origine dans la molécule du tPA, et - p, de 4 à 24, représente le nombre d'unités disaccharidi- ques de fragments d'héparine provenant d'une dépolymérisa- tion nitreuse dans un mélange ayant une masse moléculaire d'environ 4500 daltons et contenant le site de fixation à AT IiI. 12. Procédé pour la préparation d'un N-polyosyl-polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on traite un poly- peptide P représenté par la formule Pl (NH) ii) dans laquelle PO est le radical m-valent du polypeptide P auquel sont liés ses m groupes fonctionnels NEH2 libres, lesdites m groupes fonctionnels NH, étant le groupe amino terminal et les groupes amino en position epsilon des (m-l) lysines contenues dans le polypeptide, avec un excès d'un polyoside représenté par la formule Oside-Z (III) Z étant l'unité saccharidique terminale réductrice dudit polysaccharide dans sa forme aldéhydique soit naturelle, soit provenant d'une dépolymérisation nitreuse et Oside étant le reste de la chaîne dudit polysaccharide et on soumet la poly-base de Schiff ainsi obtenue de formule. (Oside-Z'-CH=N-)nP' (IV) dans laquelle le radical monovalent Oside-Z'représente le polysaccharide Oside-Z tel que défini ci-dessus, privé du groupe aldéhydique de Z, et P' et n sont tels que définis dans la revendication 1, à une réduction avec un cyanoboro- hydrure. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que comme polyoside Oside-Z de départ on utilise un mélange de fragments d'héparine obtenus par dépolymérisation nitreuse ayant une masse moléculaire moyenne se situant entre 2000 et 8000 daltons. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 et 13, caractérisé en ce que comme polyoside Oside-Z de départ on utilise un mélange de fragments d'héparine obtenus par dépolymérisation nitreuse ayant une masse moléculaire moyenne d'environ 4500 daltons. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que comme cyanoborohydzure on utilise le borohydrure de sodium. 16. Procédé selon l'un quelconque des revendications 12 à:.4, caractérisé en ce que comme cyanoborohydrre on utilise le cyanoborohydrure de sodium, la réaction entre PO(N7-)m et Oside-Z étant conduite en présence dudit cyanoborohydrire de sodium de façon à obtenir directement le N-polyosyl-polyep- tide final. 17. Poly-base de Schiff de formule (Oside-Z'-CH=N-)nP' (IV) dans laquelle - P' est le radical n-valent d'un polypeptide P lié aux n groupes NH provenant de n groupes amino libres présents à l'origine dans la molécule de P; - Z' est l'unité saccharidique terminale réductrice du polysaccharide Oside-Z dans sa forme aldéhydique, soit naturelle, soit provenant de la dépolymérisation nitreuse, privée du groupe aldéhydique de Z; - Oside est le reste du polysaccharide Oside-Z; - n est un nombre entier de 3 à 30. 18. Poly-base de Schiff selon la revendication 17, caractérisée L0 par la formule I ci-dessus, o Oside représente le radical d'un glycosaminoglycane Oside-Z choisi parmi l'héparine, les fragments d'héparine, la chondroitine sulfate 4-S, la chon- droitine sulfate 6-S, l'héparane sulfate et le dermatane sulfate, privé de l'unité terminale réductrice Z. 19. Poly-base de Schiff selon la revendication 17, caractérisée par la formule IV dans laquelle - Z' est l'unité saccharidique terminale réductrice d'un glycosaminoglycane du type héparinique Oside-Z dans sa forme aldéhydique provenant de la dépolymérisation nitreuse de 1'héparine, ledit Oside-Z étant constitué par un mélange de fragments d'héparine ayant une masse moléculaire moyenne se situant entre 2000 et 8000 daltons; - Oside est le reste du polysaccharide Oside-Z. 20. Poly-base de Schiff selon la revendication 17, caractérisée par la formule IV dans laquelle P' et n sont tels cue définis dans la revendication 17; - Z' est l'unité saccharidicue terminale réductrice d'un glycosaminoglycane du type héparinique Oside-Z dans sa forme aldéhydique provenant de la dépolymérisation nitreuse de l'héparine, ledit Oside-Z étant constitué par un mélange de fragments d'héparine ayant une masse moléculaire moyenne d'environ 4.500 daltons; - Oside est le reste du polysaccharide Oside-Z. 21. Poly-base de Schiff selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, caractérisée par la formule IV dans laquelle Z' a la structure 263 1970 CH2OR1 O -O dans laquelle R1 est l'hydrogène ou un groupe SO3 22. Poly-base de Schiff selon l'une quelconque des revend.ications 17 à 21, caractérisé par la formule (IV) dans laquelle - P' est le radical n-valent d'un enzyme thrombolytique lié aux n groupes NH provenant de n groupes amino libres présents à l'origine dans la molécule dudit enzyme thrombo- lytique; - n est de 3 à 8. 23. Poly-base de Schiff selon l'une quelconque des revendications 17 à 22, caractérisé par la formule (IV) dans laquelle - P' est le radical n-valent de l'urokinase lié aux n groupes NEI provenant de n gro. upes amino libres présents à l'origine dans la molécule de ladite urokinase; - n est de 3 à 8. 24. Poly-base de Schiff selon l'une quelconque des revendications 17 à 22, caractérisé par la formule (IV) dans laquelle - P' est le radical n-valent du tPA lié aux n groupes NE provenant de n groupes amino libres présents à l'origine dans la molécule dudit tPA; - n est de 3 à 8. 25. Poly-base de Schiff de formule H OHtO 3/ sOR. I dans laquelle - R, est l'hydrogène ou un groupe SO3, - R2 est un groupe acétyle ou un groupe SO3 - P' est le radical trivalent de l'urokinase lié aux 3 groupes NH provenant de 3 groupes amino libres présents à l'origine dans la molécule de l'urokinase, et - p, de 4 à 24, représente le nombre d'unités disaccharidi- ques de fragments d'héparine provenant d'une dépolymérisa- tion nitreuse dans un mélange ayant une masse moléculaire moyenne d'environ 4500 daltons et contenant le site de fixation à l'AT III. 26. Poly-base de Schiff de formule COO CHOR, X 00 CH, OR H 0 o"HO c o a5 dans laquelle - R est l'hydrogène ou un groupe SO3, - R2 est un groupe acetyle ou un groupe SC3, - P' est le radical pentavalent du tPA lié aux 5 groupes NH provenant de 5 groupes amino libres présents à l'origine o dans la molécule du tPA, et - p. de 4 à 24, représente le nombre d'unités disaccharidi- ques de fragments d'héparine provenant d'une dépolymérisa- tion nitreuse dans un mélange ayant une masse moléculaire moyenne d'environ 4500 daltons et contenant le site de fixation à i'AT hI1. 27. Poly-base de Schiff- de formule \ 'I->- CHOR. X_^C CH.R, i OR, OR,, 1 O \ 9 R. MEOR, -8 dans laquelle - R1 est l'hydrogène ou un groupe SO3, - R2 est un groupe acétyle ou un groupe SO3, - P' est le radical octovalent du tPA lié aux 8 groupes NE provenant de 8 groupes amino libres présents à l'origine dans la molécule du tPA, et - p, de 4 à 24, représente le nombre d'unités disaccharidi- ques de fragments d'héparine provenant d'une dépolymérisa- tion nitreuse dans un mélange ayant une masse moléculaire moyenne d'environ 4500 daltons et contenant le site de fixation à l'AT III. 28. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle renfer- me à titre de substance active une quantité efficace d'au moins un Npolyosyl-polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 en association avec un véhicule pharma- ceutique. 29. Réactif biologique constitué par un produit selon l'une quelconque des revendications I à 11.