FR 2631236 A1 19891117 FR 8905867 A 19890503 - 1 - Système agent actif pour l'échange de lipides avec des struc- tures cibles, procédé pour sa préparation et son utilisation et produits le contenant L'invention concerne un système agent actif pour le transfert de composants lipophiles et/ou amphiphiles sur des structures cibles ou, à partir de celles-ci, sur le système agent actif, ainsi que pour l'échange de ceux-ci avec les structures cibles, grace auquel des composants lipophiles et/ou amphiphiles peuvent comme on le désire être transportés afin de modifier ainsi dans un but précis la composition de structures cibles, et par conséquent de modifier leurs pro- priétés en fonction des exigences imposées. Dans le cas pré- sent, on utilise pour le transport dans un seul sens le terme "transfert", pour le transport dans les deux sens, on utilise le terme "échange". En ce qui concerne les structures cibles, il peut s'agir de systèmes technologiques comme par exemple des émulsions, micelles, liposomes, aérosols, systèmes mono-, oligo- ou multicouches de liquides ou de solides, ou bien de systèmes biologiques, comme par exemple des lipoprotéines, vésicules, organelles, bactéries, champignons, virus, para- sites, ainsi que de structures pathologiques, comme par exemple des cellules tumorales, des dépôts tissulaires, des pigments dus à l'âge, etc. Jusqu'à présent, on a réalisé un échange de lipides entre des structures différentes par transport vésiculaire, 2- collision, fusion, ou au moyen d'éléments monomères contenus dans le milieu. Ces processus se déroulent toutefois très lentement, avec des durées de demi-transfert de l'ordre de plusieurs heures, de sorte qu'il n'est en général pas pos- sible de réaliser de cette façon une modification efficace et recherchée de structures lipidiques. En plus de la faible vitesse de transfert, il faut également tenir compte du fait que d'autres mesures, comme par exemple l'utilisation de sol- vants organiques, de détergents, de températures élevées, etc., détruisent fréquemment l'intégrité de la structure cible, manquent de spécificité et ont assez souvent des effets secondaires indésirables. On ne connaissait pas jusqu'ici de systèmes technologi- quement réalisables, basés sur la fusion d'agrégats lipi- diques de taille relativement grande, pour la modification rapide et dans un but précis de structures lipidiques. Une fusion est indiquée dans PCT/US 85/00621, portant le n0 de publication WO 85/04880. Dans le langage technique de la biophysique des membranes, par "fusion" on entend la fusion de deux membranes. Au moyen d'une fusion prise dans ce sens, s'effectue le transfert de nombreuses molécules sous forme d'une membrane déjà présente, ce qui ne permet pas une modification, dans un but précis, de la structure cible sur le plan moléculaire. Avec la fusion décrite dans PCT/US 85/00621, il n'est pas possible de transférer des molécules qui ne peuvent pas former de membrane, par exemple des molécules lipidiques. En outre, les protéines membra- naires citées dans cette référence ne représentent pas fonda- mentalement des protéines de transfert, ce qui est déjà immé- diatement visible par le fait que les protéines membranaires - comme leur nom l'indique - se trouvent dans la membrane. Ne serait-ce qu'en raison de leurs propriétés hydrophobes, les protéines membranaires de ce type, telles qu'elles sont décrites dans la référence, ne peuvent essentiellement pas remplir de fonction de transfert de lipides. - 3 - Dans un système de fusion selon cette référence, ne sont pris en considération en tant que composants lipidiques que des membranes proprement dites. Une extraction de molé- cules lipidiques individuelles par la fusion est en outre absolument impossible. En conséquence, le but de l'invention est de fournir des systèmes pour l'échange rapide, spécifique et efficace, dans un but précis, de lipides avec des structures cibles différentes, dans le but de modifier à l'aide de ces systèmes la composition, les propriétés ou les fonctions des struc- tures cibles. Ce but est atteint à l'aide d'un système agent actif du type mentionné au début, qui est caractérisé par le fait qu'au moins un composant lipidique et au moins une protéine de transfert constituent le système agent actif. Dans le cas du système agent actif selon l'invention, il s'agit d'un transfert consistant, dans le domaine de la biophysique des membranes, en un processus de base totalement différent de la fusion. Dans le cas du système agent actif selon l'invention, une modification recherchée de structures cibles sur le plan moléculaire est possible par le transfert de molécules individuelles, par exemple par le transfert lipidique de molécules lipidiques. Des molécules lipidiques de ce type, qui par exemple ne peuvent pas former de mem- brane, ne peuvent absolument pas être transférées par la fusion dont il a déjà été question, mais peuvent l'être à l'aide du système agent actif selon l'invention. Le transfert selon l'invention des diverses espèces lipidiques sur les structures cibles ne s'effectue pas selon les lois du hasard, ce qui entraînerait de longues durées ou de faibles rende- ments de transfert, en raison du petit nombre de molécules lipidiques individuelles dans le milieu aqueux; au contraire, à l'aide du système de transfert de lipides selon l'inven- tion, le transfert est accéléré par des protéines de trans- fert. Etant donné que ces protéines font partie du système de - 4 - transfert, en tant que telles elles sont capables de cataly- ser le transfert. Les protéines de transfert de lipides, qui se trouvent dans le milieu aqueux et qui contiennent en leur sein le composant lipidique, transportent celui-ci dans le milieu aqueux, afin de le transférer sur une structure cible. Dans un système de transfert, la source de lipide accompagnant la protéine de transfert peut se trouver sous forme d'émulsion, tandis que dans un système de fusion, on ne prend en considération en tant que composant lipidique que des membranes proprement dites. En outre, les protéines de transfert sont des composants qui ne conviennent pas à des processus de fusion. Par conséquent, le système de transfert selon l'invention est incompatible avec des systèmes de fusion, aussi bien du point de vue du lipide que du point de vue de la protéine. Le système de transfert de lipides permet également une extraction de molécules lipidiques individuelles. Pour un transfert ou un échange avec les structures cibles, on utilise des composants lipophiles ou amphiphiles, comme par exemple la lécithine, la sphingomyéline, le choles- térol, la phosphatidylsérine, la phosphatidyléthanolamine, le phosphatidylglycérol, le phosphatidylinositol, des ganglio- sides, des cérébrosides, des vitamines liposolubles et leurs dérivés, des triglycérides, etc, qui constituent le système agent actif avec une ou plusieurs protéines de transfert de lipides. Le composant lipidique peut en ce cas se trouver sous des formes variées, comme par exemple sous forme de liposome, de micelle, d'aérosol, d'émulsion, etc. Pour le transfert ou l'échange des composants lipo- philes ou amphiphiles, on met en contact le système agent actif respectif avec la structure cible. Les avantages qui peuvent être obtenus avec l'invention résident dans la modification recherchée de structure et de fonction d'associations complexes de composants lipophiles et amphiphiles, comme par exemple des membranes, tissus, -5- micelles, émulsions, cellules, organelles, bactéries, virus, parasites, dépôts tissulaires, etc. Des sources de composants lipophiles ou amphiphiles déterminés pour le transfert ou pour l'échange sont connues du spécialiste. Elles sont disponibles soit sur la base de l'isolement à partir de sources naturelles, par exemple de sources animales ou végétales, soit sur la base de synthèse chimique, ou sur la base de procédés biotechnologiques à partir de sources microbiennes. Des sources de protéines aidant l'échange ou le trans- fert des composants lipidiques sont également connues du spé- cialiste. Les protéines peuvent être obtenues, avec une spé- cificité variable, par isolement à partir de sources natu- relles, par exemple de tissus animaux, ou par synthèse par génie génétique. L'isolement peut être effectué par exemple selon le procédé suivant: 1. Désagrégation des tissus 2. Centrifugation 3. Collecte du surnageant à 100 000 g 4. Précipitation des protéines d'accompagnement- au moyen d'un acide au moyen de sulfate d'ammonium 5. Dialyse 6. Filtration sur gel 7. Chromatographie d'échange d'ions 8. Chromatofocalisation. Selon l'objectif d'utilisation et le site d'action, on met ensemble un composant lipidique et un composant protéique pour l'1obtention de systèmes agents actifs de configuration variée, la spécifité résultant du lipide utilisé et de la protéine de transfert utilisée, ainsi que du sens du trans- fert de lipides. Le tableau ci-après donne un aperçu de configurations possibles des associations lipidiques: - 6- Dépendant Objectif du lipide Site d'action d'utilisation aérosols poumons, voies res- produit de rem- piratoires, peau, placement de sur- muqueuses factant contre le dessèchement des muqueuses émulsions peau, sang nutrition de structure cutanée micelles lipides mem- peau, systémique, véhicule de médi- branaires caments lipides géné- petite taille raux à frag- (fenêtres) ments molécu- laires hydro- philes ou hydrophobes liposomes " peau, systémique, véhicule de médi- muqueuses, ocu- caments, défauts laires par ex. de membrane, troubles du méta- bolisme lipidique, extraction de lipides. Pour obtenir des systèmes de transfert de lipides sous forme d'aérosols, on émulsionne des lipides, des protéines de transfert de lipides en solution aqueuse et des additifs, et on atomise en aérosol. Pour l'obtention de systèmes de trans- fert de lipides sous forme d'émulsion, on ajoute des additifs aux protéines de transfert de lipides, en solution aqueuse, pendant l'émulsification des lipides. Pour obtenir des sys- tèmes de transfert de lipides sous forme de micelles, on ajoute les lipides tels quels à une solution aqueuse de pro- téines de transfert de lipides. - 7 - Pour obtenir des systèmes de transfert de lipides sous forme de liposomes, on peut utiliser des procédés de dialyse avec des détergents ou d'extrusion ou de microémulsification, ainsi que des procédés d'homogénéisation sous pression élevée ou de traitement par ultrasons. Dans la dfalyse de détergent, on reprend le mélange séché de lipide/détergent dans une solution aqueuse de protéines de transfert de lipides, et on élimine ensuite le détergent par dialyse. Dans le procédé d'extrusion, on reprend le lipide tel quel dans une solution aqueuse de protéines de transfert de lipides, et on fait passer ce mélange sous pression à travers des membranes à taille de pores décroissante. Dans le procédé de microémulsification, on reprend dans une solution aqueuse de protéines de transfert de lipides la substance lipidique telle quelle, et on la fait passer sous pression élevée à travers une chambre d'interaction en la faisant recirculer. Le système agent actif selon l'invention peut être obtenu comme suit: A partir d'un tissu, cervelle de beuf par exemple, on isole une protéine de transfert de lipides, à spécificité appropriée pour des phospholipides. On ajoute le composant lipidique approprié, par exemple de la phosphatidylcholine, en un excès 5 fois molaire, à une solution aqueuse de la pro- téine de transfert de lipides. On transforme en une émulsion le mélange par des techniques appropriées, par exemple homo- généisation sous pression élevée, microfluidisation, etc. On ajoute une partie aliquote de cette émulsion (par rapport à la fraction protéique) à une suspension aqueuse de liposomes unilamellaires, et on mesure l'activité de transfert par des méthodes appropriées, comme par exemple à l'aide de tech- niques de fluorescence ou de mesure de la radioactivité. Le système de transfert normalisé est alors prêt à l'emploi. Le fonctionnement du système de transfert de lipides repose sur le fait que les systèmes de protéines de transfert - 8 de lipides utilisent le composant lipidique en tant que don- neur pour le transfert des lipides sur les diverses struc- tures cibles. Il en résulte la possibilité, par combinaison de protéines déterminées de transfert de lipides avec des composants lipidiques correspondants, d'extraire des lipides hors des structures cibles et de les transférer sur les com- posants lipidiques. Les systèmes de protéines de transfert de lipides assurent dans les deux cas un rapide échange des lipides entre le composant lipidique et la structure cible. Les systèmes de transfert de lipides de ce type peuvent être utilisés pour des membranes. Ainsi, par analyse compara- tive de la fraction lipidique échangée au moyen de protéines de transfert de lipides, et à l'aide de la teneur totale en lipides d'une membrane lipidique, il est possible de consta- ter une répartition asymétrique des lipides dans le système à deux couches. Dans le marquage de membranes, on incorpore dans des structures membranaires, à l'aide des systèmes de transfert de lipides, des lipides radiomarqués, marqués par fluorescence et marqués par marquage RME ou RMN. Grace à l'utilisation de systèmes de transfert de lipides, on peut engendrer des répartitions asymétriques de lipides dans des structures membranaires à deux couches, naturelles ou synthétiques. Par extraction, on peut obtenir une construction spécifique de lipides (technologie des mem- branes) à partir de membranes naturelles ou synthétiques. Dans la stabilisation, des systèmes de transfert de lipides peuvent stabiliser des cellules, organelles ou struc- tures membranaires, par exemple des liposomes, naturelles ou transformées, car ils remédient aux défauts des membranes par incorporation de lipides. Le système agent actif peut être utilisé en technologie pour le maintien ou pour la construction d'une monocouche sur des matériaux, par exemple sous forme de film de glissement, pour l'empêchement d'un mouillage direct par l'eau ou pour l'amélioration de la biocompatibilité de surfaces de sépara- - 9 tion. En cosmétique ainsi qu'en dermatologie, le système agent actif sert à la réorganisation de structures membra- naires (peau) vieillissantes ou à fonctionnement perturbé. En médecine, le système agent actif trouve une applica- tion en tant que véhicule de médicaments, pour la stabilisa- tion de liposomes vis-à-vis de constituants du sang. Une autre application en médecine consiste à utiliser le système agent actif pour la préparation de liposomes asymétriques pour l'acheminement de médicaments vers des cibles ("drug targeting"). L'utilisation-des systèmes agents actifs, grâce auxquels le cholestérol est extrait, est d'un intérêt parti- culier dans le traitement de l'artériosclérose. A cette fin, on utilise en tant que composant lipidique des liposomes exempts de cholestérol, en association avec des protéines de transfert de lipides. Une autre application des systèmes agents actifs réside dans le traitement de troubles du métabolisme des lipides. Ainsi, on peut par exemple utiliser des systèmes de transfert de lipides pour la régulation de la synthèse des acides biliaires. Le système agent actif peut être contenu dans divers produits utilisés en technologie, dans le domaine médical ou dans celui des cosmétiques. Ainsi, le système agent actif peut se présenter par exemple sous forme de pommade, crème, gel ou aérosol. Le système actif selon l'invention peut constituer la substance active de compositions pharmaceutiques contenant en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable. - 10 - REVENDICATIONS 1. Système agent actif pour le transfert de composants lipophiles et/ou amphiphiles sur des structures cibles ou, à partir de celles-ci, sur le système agent actif, ainsi que pour l'échange de ceux-ci avec les structures cibles, carac- térisé par le fait qu'au moins un composant lipidique et au moins une protéine de transfert constituent le système agent actif. 2. Procédé pour la préparation du système agent actif selon la revendication 1, sous forme d'aérosol, caractérisé par le fait qu'on émulsifie des lipides, des protéines de transfert de lipides, en solution aqueuse, et des additifs, et on met l'émulsion sous forme d'aérosol. 3. Procédé pour la préparation du système agent actif selon la revendication 1, sous forme d'émulsion, caractérisé. par le fait qu'on ajoute des additifs aux protéines de transfert de lipides, en solution aqueuse, pendant l'émulsi- fication des lipides. 4. Procédé pour la préparation du système agent actif selon la revendication 1, sous forme de micelles, caractérisé par le fait qu'on ajoute des lipides tels quels à une solu- tion aqueuse de protéines de transfert de lipides. 5. Procédé pour la préparation du système agent actif selon la revendication 1, sous forme de liposomes, caracté- risé par le fait qu'on reprend dans une solution aqueuse de protéines de transfert de lipides un mélange séché de lipides et détergent, et on élimine ensuite le détergent par dialyse. 6. Procédé pour la préparation du système agent actif selon la revendication 1, sous forme de liposomes, caracté- risé par le fait qu'on reprend dans une solution aqueuse de protéines de transfert de lipides la substance lipidique telle quelle, et on fait passer ce mélange sous pression à travers des membranes à taille de pores décroissante. 7. Procédé pour la préparation du système agent actif selon la revendication 1, sous forme de liposomes, caracté- - 1t - risé par le fait qu'on reprend dans une solution aqueuse de protéines de transfert de lipides la substance lipidique telle quelle, et on la fait passer sous pression élevée à travers une chambre d'interaction en la faisant circuler, on l'homogénéise sous pression élevée ou on la soumet à un trai- tement par ultrasons. 8. Utilisation du système agent actif selon la reven- dication 1, caractérisée par le fait qu'on l'utilise pour le maintien ou pour la formation d'une monocouche ou de couches multiples sur des matériaux. 9. Utilisation du système agent actif selon la reven- dication 1, caractérisée par le fait qu'on l'utilise pour la réorganisation de structures membranaires (peau) à fonction- nement perturbé ou vieillissantes, pour des applications dermatologiques ou cosmétiques. 10. Utilisation du système agent actif selon la reven- dication 1, caractérisée par le fait qu'on l'utilise pour la stabilisation de liposomes, en tant que véhicules de médica- ments, vis-à-vis de constituants du sang. 11. Utilisation du système agent actif selon la reven- dication 1, caractérisée par le fait qu'on l'utilise pour la préparation de liposomes asymétriques pour l'acheminement de médicaments vers des cibles ("drug targeting"). 12. Utilisation du système agent actif selon la reven- dication 1, caractérisée par le fait qu'on l'utilise pour l'extraction du cholestérol dans le traitement de l'artério- sclérose. 13. Utilisation du système agent actif selon la reven- dication 1, caractérisée par le fait qu'on l'utilise pour le traitement de troubles du métabolisme des lipides. 14. Produits caractérisés en ce qu'ils contiennent le système agent actif selon la revendication 1. 15. Composition pharmaceutique contenant une substance active et un véhicule pharmaceutiquement acceptable, caracté- risée en ce que la substance active est le système agent actif selon la revendication 1.-