FR 2626288 A1 19890728 FR 8800923 A 19880127 La présente invention concerne un procédé de préparation d'acides aryl-2 propioniques optiquement actifs de formule générale: - H3 Ar - CH - COOH (I) par hydrolyse énantiosélective des amides racémiques correspondants. >Dans la formule générale (I), Ar représente un radical aromatique monocyclique ou polycyclique eventuellement substitué ou un radical hétérocyclique aromatique éventuellement substitué. Plus particulièrement, la présente invention concerne la préparation des énantiomères S des acides aryl-2 propioniques qui possèdent des propriétés anti-inflammatoires. Parmi les acides aryl-2 propioniques thérapeutiquement actifs peuvent être cités, par exem- ple, le ketoprofene, le naproxene, l'ibuprofène, le suprofene, le feénoprofene, le bénoxaprofène, le carprofene, le cicloprofène, le pirproféne, le flurbiprofène et le fluprofène. Plus particulièrement encore, la présente invention concerne la préparation de l'énantiomére S (+) de l'acide (benzoyl-3 phényI)-2 propionique [kétoprofene S (+)]. - Il est connu de préparer les énantiomères S des acides aryl-2 propioniques par oxydation stéréosélective d'aryl-2 propanes au moyen de microorganismes choisis parmi des champignons et des levures (EP-A-205215) ou par hydrolyse stéréospécifiques des esters raceémiques au moyen d'une lipase d'origine extra-cellulaire ou microbienne (EP-A-227078). Il est connu également (FR 7 901 803 / 2 447 359) de préparer des acides "-aminés optiquement actifs par hydrolyse biolo- gique de nitriles K-aminés au moyen d'un agent contenant.une nitri- lase générale et une amidase L stéréospécifique ou d'amides C-aminés au moyen d'un agent contenant une amidase L stéréospécifique. Les agents utilisés sont des bactéries ou des préparations acellulaires d'origine bactérienne possédant une amidase L stéréospécifique qui proviennent de la mutation de souches possédant une amidase générale. L'hydrolyse des nitriles "-aminés ou des amides "-aminés conduit à un mlange de L K-aminoacide et de D K-aminoamide; le D K-aminoamide pouvant être hydrolysé en D O-aminoacide au moyen d'un agent possé- dant une amidase générale et ne possedant pas de racémase. Il a maintenant été trouvé, et c'est ce qui fait l'objet de la présente invention, que les aryl-2 propionamides racémiques peuvent être hydrolyses énantiosélectivement en acides aryl-2 propio- niques de formule générale (I) sous forme S au moyen de microorganis- mes ou d'enzymes sélectionnés en fonction de leur capacité à hydroly- ser sélectivement l'x-phénylpropionamide racémique en acide "-phé- nylpropionique S. La selection des agents permettant l'hydrolyse énantiosé- lective des aryl-2 propionamides racémiques est effectuée en mettant en contact l'agent avec l'o-phénylpropionamide racémique dans un milieu convenable jusqu'à ce que 20% du produit soit converti puis en mesurant l'excès énantiomérique. Sont sélectionnes les agents qui hydrolysent, dans ces conditions, l' -phénylpropionamide racémique en acide "phénylpropionique S avec un excès énantiomerique supérieur à 65%. Parmi les microorganismes qui conviennent particulièrement bien peuvent être citées des souches appartenant au genre Brevibacte- rium ou Corvnebacterium et plus particulièrement Brevibacterium R 312 (CBS 717.73) et Corynebacterium N 771 (FERM P 4445) ou Corynebacte- rium N 774 (FERM P 4446) qui permettent d'obtenir les acides aryl-2 propioniques S avec un excès énantiomérique en isomère S supérieur à %. Il est surprenant de noter que, parmi ces microorganismes, Brevibacterium R 312, qui est décrit dans FR 7 901 803 / 2 447 359 et dans Advances in Biochemical Engineering, Vol. 14, p. 1-32 (1980) comme possédant une amidase générale non stéréospécifique hydrolyse stéreospécifiquement les aryl-2 propionamides racémiques alors que son mutant A4 qui possède une amidase L stéréospécifique n'hydrolyse pas stéréosélectivement les aryl-2 propionamides racémiques. Il y a lieu de noter que Corynebacterium N 771 et Coryne- bacterium N 774, qui sont décrits dans EP 0187680, hydrolysent par exemple le lactonitrile en acide D,L lactique et l'a-amino-phenylpro- pionitrile en D,L-phénylalanine sans observer de stéréosélectivité. Selon la présente invention, le procédé est généralement mis en oeuvre en milieu aqueux ou hydroorganique homogène ou hétéro- gène, dans des conditions de température et de pH déterminées en fonction de la nature du microorganisme et de l'enzyme, en agitant une suspension de cellules ou d'extraits cellulaires du microorga- nisme et de l'aryl-2 propionamide racémique. Le procédé conduit à un mélange de l'acide aryl-2 propio- nique S et de l'aryl-2 propionamide R, l'aryl-2 propionamide R pouvant être racémisé selon des techniques connues en aryl-2 propio- namide racémique qui peut à nouveau être hydrolysé en acide aryl-2 propionique S dans les conditions données précédemment. Par exemple, la racémisation de l'aryl-2 propionamide R peut être effectuee par chauffage avec de l'ammoniaque à une tempéra- ture comprise entre 80 et 160 C. Lorsque le microorganisme utilisé possede la propriété d'hydrolyser les nitriles associée à la propriété d'hydrolyser énantiosélectivement l'o-phénylpropionamide, il est possible d'obte- nir un acide aryl-2 propionique S soit à partir de l'aryl-2 propioni- 'trile racémique soit à partir de l'aryl-2 propionamide racémique. Le procédé selon la présente invention convient particu- liérement bien pour préparer le kétoprofène S (+) a partir du (ben- zoyl-3 phényl)-2 propionamide racémique et éventuellement du (ben- zoyl-3 phényl)-2 propionitrile racémique. Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, montrent comment l'invention peut étre mise en pratique. EXEMPK 1 a) La souche Brevibacterium R 312 (CBS 717.73) est culti- vée en fiole agitée à 28 C pendant 14 heures dans un milieu dont la composition est la suivante: - Glucose 10 g - (H4)2SO4 5 g Rz PO 1,01 g - KHE PO4 2 4 1,64g - Na2HPO4, 12H20 1,64g 2 4' 2 -2 4 0,82 g - Ca c2 2H0 0,012 g - ZnCl -0,0012 g - FeSO4, 7H202 --FeSO, 7H2O 0,0012 g - MnSO4, H20 0,0012 g - MgS04, 7H20 0,5 g - Chlorhydrate de thlamine 0,002 g - eau q.s.p. 1000 cm3. Cette preculture est utilisée pour ensemencer un milieu de culture ayant la même composition mais contenant en plus du N-methyl- acétamide à la concentration de 20mM. La culture est effectuée en fiole agitée pendant 24 heures à 280 C. La biomasse obtenue est séparée par centrifugation puis elle est lavée deux fois par une solution de chlorure de sodium à 9 g/litre. b) Un culot de centrifugation contenant 13 mg de cellules de Brevibacterium R 312, exprimés en matières sèches, est mis en suspension dans 2 cm3 de tampon phosphate (50 mM) à pH = 7. On ajoute mg de phényl-2 propionitrile racémique (190 pmoles). Apres 24 heures d'agitation à 25 C, le mélange reactionnel est dilué par additon de 23 cm3 d'un mélange acetonitrile-acide chlorhydrique N (90-10 en volumes). Les bactéries sont eliminées par centrifugation. La composition du surnageant est déterminée par chromatographie liquide à haute performance (CLHP). Le surnageant contient: 119 gmoles de phényl-2 propionamide 62 gmoles d'acide phényl-2 propionique. On ajoute du chlorure de sodium pour favoriser la sépara- tion des phases aqueuses ou organiques. Après évaporation à sec de la phase organique, le résidu est repris par 20 cm3 d'un mélange chloro- forme-soude 0,1N (1-1 en volumes). La phase basique est acidifiée puis extraite au chlorofor- me. La mesure du pouvoir rotatoire montre que l'excès énantio- mérique en isomère S (+) est de 100%. Après dérivation de l'acide phényl-2 propionique avec la R (+) xméthylbenzylamine, l'analyse par CLHP montre que l'excès enantiomerique est de 96,4%. uodue; ap úEm Z suPp uoTsuadsns ua sTw sa 'aqDas aaaT;ew ue sawTadxa ZIE U mnT2aa eqTAael ap salnlIaD ap 6w ú1 juvuauoD '(e I aldwaxa, Sú ap suoT. 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On ajoute 25 mg de phenyl-2 propionamide racemique (167 1moles). On agite pendant 24 heures a 25 C. Le mélange réactionnel est traite dans les conditions de l'exemple 1. Le surnageant contient: 95,2 gmoles de phényl-2 propionamide 56,1 4moles d'acide phényl-2 propionique. Les exces enantiomeriques de l'acide phényl-2 propionique mesurés par le pouvoir rotatoire et après dérivation avec la R (+) ac-méthylbenzylamine sont respectivement de 99 et 95% en isomère S (+). EXEMPLE 4 Un culot de centrifugation obtenu cans les conditions de l'exemple 1 a) contenant 66 mg de cellules de Brevibacterium R 312, exprimés en matières sèches, est mis en suspension dans 2 cm3 de tampon phosphate de potassium (50 mM) à pH = 7. On ajoute 25,9 mg de (benzoyl-3 phényl)-2 propionamide racémique (102 gmoles). On agite pendant 72 heures à 25 C. Le mélange réactionnel est dilué par addition de 23 cm3 d'un mélange acétonitrile acide chlorhydrique N (90-10 en volumes). Les bactéries sont éliminées par centrifugation. Le surnageant, analyse par chromatographie liquide à haute performan- ce, contient: 46 pmoles de kétoprofène 59 gmoles d'amide du ketoprofène. On ajoute du chlorure de sodium pour favoriser la sépara- tion des phases aqueuses et organiques. Après évaporation à sec de la phase organique, le résidu est repris par 20 cm3 d'un mélange chloro- forme-soude O,1N (1-1 en volumes). La phase basique est acidifiée puis extraite au chlorofor- me. Après dérivation du kétoprofene avec la R (+) x-méthylbenzylami- ne, l'analyse par chromatographie liquide à haute performance du mélange des deux diastéréoisomères montre que l'excès énantiomérique du kétoprofene S (+) est de 93%. EXEMPLE 5 Un culot contenant 180 mg de ce'lules de Corynebacterium N 771 obtenu dans les conditions de l'exemple 2 a), exprimés en matière sèche, est mis en suspension dans 2 cm3 de tampon phosphate de potassium (50 mM) a pH = 7. On ajoute 25,3 mg d'amide du kétoprofène racémique (100.moles). On agite pendant 48 heures à 25 C puis on ajoute 23 cm3 d'un mélange acétonitrile acide chlorhydrique N (90-10 en volumes). Les bactéries sont éliminees par centrifuga- tion. Le surnageant, analyse par chromatographie liquide à haute performance, contient: 76,03 gmoles d'amide de kétoprofene 24,7 imoles de ketoprofène. On ajoute quelques mg de chlorure de sodium. Les phases aqueuse et organique se séparent. Après évaporation a sec de la phase organique, le résidu est repris par 20 cm3 d'un melange chloroforme - soude 0,1 N (1-1 en volumes). La phase aqueuse est acidifiée puis extraite au chloroforme. Apres dérivation du kétoprofene avec la R (+) xméthylbenzylamine, l'analyse par chromatographie liquide à haute performance du mélange des deux diasterécoisoméres montre que l'excès énantiomérique du kétoprofene S (+) est de 94%. EXEMPLE 6 Un culot de centrifugation, obtenu dans les conditions de l'exemple 1 a), contenant 24 mg de cellules de Brevibacterium R 312, exprimés en matière sèche, est mis en suspension dans 2 cm3 de tampon phosphate de potassium (50 mM) à pH = 7. On ajoute 23,5 mg de (ben- zoyl-3 phényl)-2 propionitrile racémique (nitrile du ketoprofène) soit 100 gmoles. On agite pendant 65 heures a 25 C puis on ajoute 23 cm3 d'un mélange acétonitrile - acide chlorhydrique N (90-10 en volumes). Les bactéries sont éliminées par centrifugation. Le surna- geant, analysé par chromatographie liquide à haute performance, contient: 2,2 gmoles du nitrile du kétoprofène 53 pmoles d'amide du kétoprofène 44,7 pmoles de kétoprofène. On ajoute quelques mg de chlorure de sodium. Les phases aqueuse et organique se séparent. Apres évaporation à sec de la phase organique, le résidu est repris par 20 cm3 d'un mélange chloroforme - soude 0,1 N (1-1 en volumes). Après décantation, la phase organique est évaporée à sec. Le résidu (13,5 mg) contenant l'amide du ketopro- fène est dilue dans 2 cm3 de chloroforme. La mesure du pouvoir rotatoire de cette solution montre que l'excès enantiomérique de l'amide du kétoprofène R (-) est de 84%. La phase aqueuse, basique, est acidifiee puis extraite par du chloroforme. Apres dérivation du kétoprofene avec la R (+) C-mé- thylbenzylamine, l'analyse par chromatographie liquide à haute performance du mélange des deux diasteréoisomères montre que l'excès énantiomérique du kétoprofène S (+) est de 96%. EXEMPLE 7 Un culot cellulaire de Corynebacterium N 774 (FERM P 4446) est prépare dans les conditions décrites dans l'exemple 2 a) pour la préparation d'un culot cellulaire de Corynebacterium N 771. On met un culot cellulaire contenant 176 mg de cellules, exprimés en matière sèche, en suspension dans 2 cm3 de tampon phosphate de potassium (50 mM) à pH = 7. On ajoute 25,3 mg d'amide du kétoprofène racémique (100. moles). On agite pendant 48 heures à 25 C puis on traite le mélange réactionnel dans les conditions de l'exem- ple 1. L'analyse du mélange réactionnel montre qu'il contient: 78,6 pmoles d'amide du ketoprofene 22,4 gmoles de kétoprofène. L'excès énantiomérique du kétoprofene en isomère S (+) déterminé après dérivation est de 95%. EXEMPLE 8 Dans un autoclave de 5 cm3 contenant 1 cm3 d'ammoniaque à 28% (p/v) on introduit 20 mg d'amide du kétoprofène pur optiquement actif (79 Moles). Apres fermeture, l'autoclave est placé pendant 2 heures dans un four à 150 C. Apres refroidissement le contenu de l'autoclave est versé dans 5 cm3 d'eau. On ajuste le pH à 1 par addition d'acide chlorhydrique 1 N. La phase aqueuse est extraite au chloroforme. La phase chloroformique est séchée sur sulfate de sodium. Apres filtration, le volume est ajusté à 2 cm3 par concen- tration. Le pouvoir rotatoire de cette solution chloroformique est nul. L'analyse par CLHP montre que cette solution contient 72,2 pmoles d'amide du kétoprofène et 4,1 Mmoles de kétoprofène. R E V E N D I C A T I ON S 1 - Procédé de préparation des enantiomeres S des acides aryl-2 propioniques de formule générale: CH 1 3 Ar - CH -COOH dans laquelle Ar représente un radical aromatique monocyclique ou polycyclique éventuellement substitué ou un radical hétérocyclique aromatique éventuellement substitué, caractérise en ce que l'on hydrolyse énantiosélectivement les aryl-2 proplonamides racémlques correspondants, éventuellement prépares in situ, en présence d'un microorganisme ou d'une enzyme issue de ce microorganlsme sélectionné en fonction de sa capacité à hydrolyser selectivement l'x-phénylpro- pionamide racemique en acide x-phénylproplonique S avec un excès énantiomérique supérieur à 65%, puis sépare l'acide aryl-2 propioni- que S de l'aryl-2 propionamide R. 2 - Procédé selon la revendication 1 caractérise en ce que les microorganismes sont choisis parmi les Brevibacterium et les Coryne- bacterium. 3 - Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que les microorganismes sont choisis parmi Brevibacterium R 312 (CBS 717-73), Corynebacterium N 771 (FERM P 4445) et Corynebacterium N 774 (FERM P 4446). 4 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le micro- organisme possède une activité nitrilase associée à la capacité d'hydrolyser énantioselectivement l'o-phénylpropionamide racémique en acide K-phénylpropionique S. - Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que l'on hydrolyse directement l'aryl-2 propionitrile racémique en acide aryl-2 propionique S. 6 - Procédé selon l'une des revendications 4 ou 5 caractérise en ce que les microorganismes sont choisis parmi les Brevibacterium et les Corynebacterium. 7 - Procédé selon la revendication 6 caractérise en ce que les microorganismes sont choisis parmi Brevibacterium R 312 (CBS 771. 73), Corynebacterium N 771 (FERM P 4445) et Corynebacterium N 774 (FERM P 4446). 8- Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 pour la préparation de l'acide (benzoyl-3 phényl)-2 proplonique S (+).