FR 2633625 A1 19900105 FR 8908011 A 19890616 DERIVES PHOSPHATES DE LA MYTOMYCINE, PROCEDE POUR LEUR PREPARATION ET COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LES CONTENANT La présente invention concerne des dérivés N7-alkyl- phosphates de la mitomycine, leur utilisation comme agents antitumoraux et les compositions pharmaceutiques les conte- nant. Les mitomycines et la porfiromycine forment un groupe d'antibiotiques antitumoraux étroitement apparentés. A l'heure actuelle, la mitomycine C (Ia) est commercialisée aux Etats- Unis sous la désignation commerciale Mutamycin(R), pour le traitement de l'adénocarcinome disséminé de l'estomac ou du pancréas, en des combinaisons éprouvées avec d'autres agents chimidthérapeutiques homologués. Les structures des mitomyci- nes C et A (Ib), de la porfiromycine (Ic) et de la Nla-méthyl- mitomycine A (Id) sont représentées ci-dessous, avec la numé- rotation de la partie cyclique des molécules. Tout au long de la présente description, N7- se rapportera à l'atome d'azote fixé sur la position 7, et Nla- se rapportera à l'azote d'azi- ridine. La partie encadrée par des tirets est appelée dans la technique le "mitosane". à t t * t * t e et_ OCNHZ --- -....CH3 4: &--.--------------------------... 1 a: X=NHH; Z=H b: X-OCH3; ZCH c: XuNHP; Z'CHa d: X=OCH3; ZCH3 Un grand nombre d'analogues de la mitomycine ont été pré- parés, avec comme objectif de trouver un composé présentant, par rapport à la mitomycine C, des propriétés thérapeutiques plus favorables, comme une activité antitumorale plus élevée et/ou un caractère moins myélosuppresseur. Parmi les référen- ces bibliographiques et les brevets portant sur les dérivés de la mitomycine, ceux présentés ci-après sont considérés comme s'appliquant à la présente invention. Iyengar et al. décrivent des composés IIa - IIc dans J. Med. Chem., 1981, 24:975-981 et J. Med. Chem., 1983, 26:16-20. O o Il l/OC OCNM ,_ I a: fla; R1uH; utMON b X(C-3; Res; Kt-OI c: n:3; Rl'eCHi;RetOw Kaneko et al., dans le brevet US N 4 642 352, décrivent des dérivés de la mitomycine de formule III 0 1 1 Il R7N OCNHZ 0CM3 dans laquelle R1 est choisi dans le groupe comprenant l'hydro- gène, les radicaux alkyle en C1_6 et R7; et R7 est, entre autres, (RbO) 2P(X)- et (Ra)2P(X)-, o Ra est par exemple H ou un radical alkyle, cycloalkyle ou aryle; et Rb est par exemple un radical alkyle, aryle ou aralkyle. Les composés de la présente invention sont les phosphates de composés de formule II; ils présentent une bonne activité antitumorale et une toxicité plus faible que le composé hydroxy de base. Le principe des phosphates en tant que pro- drogues potentielles est rapidement discuté dans la compila- tion intitulée "Rational for Design of Biologically Reversible Drug Derivatives: Prodrugs" (Sinkula et Yalkowsky, J. Pharm. Sci., 1975, 64:181-210, pages 189-191). Des exemples de phos- phates d'agents antitumoraux connus comprennent la camptothé- cine (fascicule japonais Kokai 21-95 394 et 21-95 393, Derwent Abst. respectivement N 87-281016 et 87-281015) et la daunoru- bicine (brevet US N 4 185 111). La présente invention a pour objet des composés de for- mule IV X -CNHZ CH ll POCH CH,d _ dans laquelle X et Y, indépendamment l'un de l'autre, sont chacun un oxygène ou un soufre; alk représente une chaine carbonée linéaire ou ramifiée ayant de 2 à 8 ato- mes de carbone; et R1 est H ou le radical méthyle; ou l'un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables. Par "sels pharmaceutiquement acceptables", on entend, mais sans y être limité, les sels à base de métaux alcalins, à base de métaux alcalino-terreux ou contenant de l'azote organique. Une forme de réalisation préférée fournit des composés de formule IV dans laquelle Y est de l'oxygène. Une autre forme de réalisation préférée fournit des composés de formule IV dans laquelle alk est (CH2)2 ou (CH2)3. Encore une autre forme de réalisation préférée fournit un composé de formule IV dans laquelle R1 est H. L'invention se rapporte aussi aux compositions pharmaceu- tiques comprenant les dérivés précités. L'invention sera mieux comprise en regard de la descrip- tion ci-après et des dessins annexés, dans lesquels: La Figure 1 présente l'effet des composés V et IIa sur la croissance de tumeurs H2981 sur des souris rasées. Les flèches indiquent les jours d'administration des médicaments; La Figure 2 présente les effets cytotoxiques de la mito- mycine C, des.composés IIa et V, et du composé V ayant subi un prétraitement par de la phosphatase alcaline. Les composés de la présente invention sont préparés à partir de la mitomycine A (Ib) ou de la Nla-méthyl-mitomycine A (Id) par réaction avec un phosphate d'aminoalkyle de formule (HO)2P(X)-Y-alk-NH2, o alk est comme défini ci-dessus. La réaction est généralement mise en oeuvre dans un solvant approprié, comme le méthanol, ou dans un mélange de solvants, comme l'eau et le méthanol, à la température ambiante. On peut incorporer dans le mélange réactionnel une base de type amine tertiaire, comme la triéthylamine. Le produit peut être con- verti en un sel par traitement avec une base; ainsi, par exemple, un traitement par du bicarbonate de sodium donne le sel disodique des N7alkylphosphates de mitomycine de formule IV. Le dihydrogénophosphate de 2aminoéthyle est un produit du commerce, et des modes opératoires permettant de préparer d'autres phosphates d'aminoalkyle ou thiophosphates d'amino- alkyle peuvent être trouvés par exemple dans Helv. Chim. Act., 1956, 39:1455; Helv. Chim. Acta, 1958, 44:1168; Acta Chim. Scand., 1959, 13:1479 et le brevet US N 3 501 557. Selon une variante, on peut préparer les composés de la présente invention en traitant la mitomycine A ou son dérivé Nla-méthylé avec un aminoalcanol ou un aminoalkylthiol pour obtenir les intermédiaires N7-hydroxyalkyl- ou N7-thioalkyl- mitomycine C, qui sont ensuite phosphorylés ou thiophosphory- lés par des techniques classiques connues. Cependant, ce mode opératoire ne peut convenir à la préparation de phosphates de la N7-mercaptoéthyl-mitomycine C, car il ne s'agit pas de com- posés stables (Senter et al., 1988, J. Antibiotics, 41:199- 201). Quand la mitomycine A est la matière de départ, il est souhaitable de protéger l'azote du cycle aziridine avant la réaction de phosphorylation. La protection peut être réalisée par des techniques connues, comme une acylation, la formation de dérivés de l'urée ou de l'uréthanne, et analogues. Des méthodes pour bloquer et débloquer une amine sont discutées dans des manuels, comme "Protective Groups in Organic Chemistry", J.F.W. Mc0mie, Ed., Plenum Press, 1973. D'une manière représentative, la phosphorylation ou la thiophospho- rylation sont réalisées par traitement d'un dérivé de N7- hydroxyalkyl- ou N7-thioalkyl-mitomycine avec du chlorure de phosphoryle ou de thiophosphoryle, opération suivie si néces- saire d'une hydrolyse et de la déprotection de l'azote d'azi- ridine; et l'on obtient le sel si l'hydrolyse est mise en oeuvre en présence d'une base. Ou bien encore, on peut faire réagir les dérivés de la N7-hydroxyalkyl- ou de la N7- thioalkyl-mitomycine avec un composé de formule (G-0)2P(X)-L o G est un groupe protecteur de phosphate et L est un groupe éliminable, par exemple Cl; l'élimination du groupe proté- geant le phosphate et du groupe protégeant l'azote, s'ils sont présents, donne les composés de la présente invention. L'activité antitumorale du composé de l'Exemple 1 (V) a été évaluée sur des souris femelles Balb C nu/nu (âge 4-6 semaines, achetées auprès de Life Science, St. Petersburg, Fl), auxquelles a ét implanté par voie sous-cutanée une xéno- greffe d'une tumeur de poumon humain H2981 dans le flanc pos- térieur droit. Le composé IIa a servi de témoin positif. Le traitement médicamenteux a été lancé le jour 15 (le jour 0 étant le jour d'implantation de la tumeur), date à laquelle les tumeurs avaient un volume d'environ 100 mm3. On a injecté par voie intrapéritonéale les jours 15, 21, 31 et 37 0,2 ml des composés d'essai (1 mg/ml pour le composé IIa, et 3 mg/ml pour le composé V dans une solution physiologique tamponnée par un tampon phosphate). Les résultats sont représentés gra- phiquement sur la Figure 1 et montrent que le temps nécessaire pour atteindre un volume moyen de tumeur de 750 mm3 était de 45 jours chez les souris traitées par le composé IIa, de 63 jours chez les souris traitées par le composé V et de 27 jours dans le groupe témoin non-traité. Ainsi, le composé phospho- rylé a présenté un effet antitumoral plus fort que l'alcool correspondant. On a déterminé sur des souris Balb C nu/nu la toxicité relative des composés IIa et V. L'administration intrapéri- tonéale des médicaments, en deux doses égales espacées de 4 jours, a donné pour les composés IIa et V des DL50 respective- ment de 45 et de 90 mg/kg de poids corporel. Il s'est aussi avéré que l'on pouvait administrer une quantité considérable- ment plus importante de médicament en faisant appel à des doses plus faibles sur un laps de temps plus prolongé. Des quantités totales allant jusqu'à 40 mg/kg du composé lIa et mg/kg du composé V sont tolérées lorsqu'elles sont admi- nistrées en quatre doses égales sur une période de 25 jours. Ces études ont montré qu'une quantité significativement plus importante de prodrogue était tolérée, du fait de sa toxicité réduite. On a déterminé la cytotoxicité des composés V, IIa et de la mitomycine C à l'aide de la lignée cellulaire de tumeur de poumon humain H2981. Ainsi, une suspension de cellules H2981 dans un milieu d'Iscove (IMDM) contenant 10 % de sérum de foe- tus de veau a été appliquée sur des plaques de microtitrage à 96 réservoirs (10 000 cellules/réservoir). Au bout d'une heure, le milieu a été enlevé, on a ajouté une solution du médicament à une solution physiologique tamponnée par un tam- pon phosphate (PBS) à pH 7,2, et on a commencé une incubation à 37 C pendant 1 heure. Puis les cellules ont été lavées deux fois, et l'incubation s'est poursuivie pendant encore 17 heu- res, opération suivie d'une impulsion pendant 6 heures à l'aide de 3H-Thy (1,0 pCi/réservoir). Les plaques ont été gelées à -70 C pour détacher les cellules, et les cellules ont été récoltées sur des disques de fibres de verre. Les filtres ont été comptés à l'aide d'un compteur à scintillation Beckman 3701. On a utilisé comme indicateur des effets cytotoxiques l'inhibition de l'incorporation de la 3H-Thy. Les résultats sont présentés sur la Figure 2. Tant la mitomycine C que la mitomycine IIa se sont révélées fortement cytotoxiques, avec des CI50 proches de 1 pM. On a observé une faible activité cytotoxique pour le phosphate V, mais un prétraitement du com- posé V par de la phosphatase alcaline a donné une cytotoxicité comparable à celles du composé IIa et de la mitomycine C. Ainsi, un autre aspect de la présente invention concerne un procédé pour inhiber des tumeurs, procédé consistant à administrer à un hôte portant une tumeur une quantité anti- tumeur efficace d'un composé de formule IV. Dans ce but, le médicament peut être administré par des voies classiques, comprenant, sans y être limité, les voies intraveineuse, intramusculaire, intratumorale, intra-artérielle, intralympha- tique et orale. Les posologies et régimes optimaux, pour un hôte mammifère donné, peuvent être facilement déterminées par l'homme de métier. On comprendra bien évidemment que la dose effectivement utilisée va varier avec la composition particu- lière formulée, le composé particulier utilisé, le mode d'application et le site, l'hôte et la pathologie traités par- ticuliers. De nombreux facteurs qui modifient l'action du médicament seront pris en compte, et comprennent l'âge, le poids, le sexe, le régime alimentaire, le moment de l'adminis- tration, la voie d'administration, la vitesse de sécrétion, l'état du patient, les combinaisons médicamenteuses, les sen- sibilités & la réaction et la gravité de la maladie. Un autre aspect de la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un composé de formule IV et un excipient pharmaceutiquement acceptable. La composition anti-tumeur peut être formulée pour donner toute forme.phar- maceutique convenant au mode d'administration voulu. Des exem- ples de ces compositions comprennent les compositions solides pour administration orale, comme les comprimés, les gélules, les pilules, les poudres et les granulés; les compositions liquides pour administration orale, comme les solutions, sus- pensions, sirops ou élixirs; et les préparations pour admi- nistration parentérale, comme les solutions stériles, les sus- pensions ou émulsions. On peut aussi les réaliser sous forme de compositions solides stériles pouvant être dissoutes dans de l'eau stérile, dans une solution physiologique ou dans un autre milieu injectable stérile immédiatement avant utilisa- tion. D'autres buts et avantages de la présente invention appa- raitront & la lecture de la description suivante et des exem- ples donnés à titre illustratif et nullement limitatif. Exemple 1 Sel disodique du 9a-méthoxy-7-[[(phosphonooxy)éthyl]- amino]mitosane (V) IlCIl 11LO (MAo)tPoCHtCHe#. H....__, OC#X2 CH H^^^^ Une solution de 56 mg (0,4 mmole) de dihydrogénophosphate de 2aminoéthyle dans 0,35 ml d'eau et 0,3 ml (2 mmoles) de triéthylamine a été ajoutée à 140 mg (0,4 mmole) de mitomycine A dans 6 ml de méthanol. On a laissé la réaction se poursuivre jusqu'au lendemain à la température ambiante, on a ajouté 1,4 ml d'une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium, et la solution a été partagée entre de l'eau et du chlorure de méthylène. La phase aqueuse a été concentrée jusqu'à la sic- cité, et plusieurs portions de méthanol ont été ajoutées et évaporées. Le résidu a été repris dans du méthanol, filtré et appliqué sur une colonne de silice C-18 (en phases inversées) de 2 x 10 cm. Le produit a été élué à l'eau, et on a évaporé toutes les matières volatiles. Du méthanol a été ajouté et évaporé comme ci-dessus, et le résidu a été séché pendant 24 heures sous vide poussé dans un dessiccateur à l'aide de pentoxyde de phosphore. On a obtenu le composé de l'intitulé sous la forme d'une poudre fine bleue (190 mg, 97 %). RMN-1H 360 MHz (D20): 6 1,94 (s, 3H, CH3), 2,9-3,1 (m, 4H), 3,20 (s, 3H, OCH3), 3,28 (s, 1H), 3,36 (s, 1H), 3,5-3,65 (m, 4H), 4,1-4,25 (m, 2H), 4,50-4,57 (dd, 1H, 10-H). Spectre de masse M+ 503,0912 (calculé pour C17H21N409PNa2 503,0920). Exemple 2 On reprend le mode opératoire général de l'Exemple 1 à l'aide de la Nla-méthyl-mitomycine A à la place de la mito- mycine A, pour donner le sel disodique du 9a-méthoxy-la- méthyl-7-[[(phosphonooxy)éthyl]amino]mitosane. Exemple 3 On reprend le mode opératoire général de l'Exemple 1 en utilisant du dihydrogénothiophosphate de 2-aminoéthyle à la place du dihydrogénophosphate de 2-aminoéthyle, pour obtenir 2t33625 le sel disodique du 9a-méthoxy-7-[[(phosphonothio)éthyl]- amino]mitosane. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation ci-dessus décrits et représentés, à partir des- quels on pourra prévoir d'autres modes et d'autres formes de réalisation, sans pour autant sortir du cadre de l'invention. Revendications 1. Composé, caractérisé en ce qu'il présente la formule suivante: x o 2P-V-alkN H OCNHt 0CM CH: F-RI dans laquelle X et Y, indépendamment l'un de l'autre, sont chacun l'oxygène ou le soufre; alk représente une chaîne carbonée linéaire ou ramifiée ayant de 2 à 8 ato- mes de carbone; et R1 est H ou le radical méthyle; ou l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables. 2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que Y est l'oxygène. 3. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R1 est H. 4. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que alk est (CH2)2 ou (CH2)3. 5. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le sel pharmaceutiquement acceptable est le sel de sodium. 6. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il a la formule suivante: o tPOCHaCENZ OcNHZ CH2CH ou l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables. 7. Sel disodique du composé selon la revendication 6. 8. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité inhibitrice de tumeur d'un composé selon une quelconque des revendications 1 à 7 et un excipient ou véhicule pharmaceutiquement acceptable.