FR 2635008 A1 19900209 FR 8810652 A 19880805 Agent activateur de la productivité spécifique des cellules animales recombinantes à base de polyvinylpyrrolidone et milieu de culture défini le contenant. La présente invention se rapporte au domaine de la production de protéines par voie génétique et concerne plus particulièrement un agent activateur de la productivité des cellules animales recombinantes à base de polyvinylpyrrolidone. Elle concerne également les milieux de culture définis contenant l'agent activateur de la productivité pour la culture de cellules animales transfectées par un vecteur recombinant codant pour une protéine d'intérêt. Les milieux de culture sont généralement constitués d'un milieu de base, qui contient les éléments nutritifs essentiels au développement des cellules, complémenté par du sérum sanguin, le plus souvent du sérum de veau foetal. Les cultures cellulaires sont réalisées soit en suspension, c'est *le cas par exemple des hybridomes, soit sur supports, par exemple celles des cellules animales adhérentes. L'utilisation du sérum sanguin dans les milieux de culture conduit à des milieux de culture non définis dans la mesure o la composition du sérum sanguin varie d'un lot à l'autre et dans laquelle peuvent figurer des composants favorisant ou inhibant la croissance et la production protéique des cellules. Des recherches ont été entreprises depuis longtemps pour d'une part remplacer le sérum sanguin et d'autre part améliorer les conditions de culture de cellules. Parmi les diverses substances qui ont été proposées à cet effet, on peut citer les biopolymères et les polymères de synthèse, lesquels ont été testés en culture classique comme en fermentation industrielle: - soit en remplacement du sérum de veau foetal; ils sont alors utilisés comme agents viscosifiants pouvant jouer sur la pression oncotique des milieux de culture; - soit comme agents protecteurs; en effet ils peuvent adsorber différentes molécules toxiques ou non. Ce rôle peut être couplé- avec un rôle de transporteur puisque certains ont la propriété de pénétrer dans la cellule sans être dégradés; - soit pour améliorer le transfert en oxygène dans les fermenteurs. Les polymères les plus couramment utilisés dans ce domaine sont d'une part l'hydroxyéthylamidon, la carboxyméthylcellulose, la gélatine, les cyclodextrines, le dextrane et d'autre part les polyéthylèneglycols, la polyvinylpyrollidone et les copolymères d'oxyde de propylène et d'oxyde d'éthylène (connus sous la dénomination commerciale PLURIOL). A cet effet on peut citer notamment: - l'article de MIZRAHI dans "Develop. Biol. Standard. Vol. 55 pp. 93-102" qui décrit l'utilisation de polymères, tels que la carboxyméthylcellulose, l'hydroxyéthylamidon et les polyols pluroniques comme adjuvants de milieux de culture pour le développement des cellules en suspension. Ces polymères ne sont pas métabolisés, mais protègent les cellules des dommages mécaniques occasionnés par l'agitation et l'aération des milieux. - la demande internationale WO 88/00967 qui décrit un milieu de culture exempt de sérum, contenant en solution un polymère agissant comme protecteur des cellules par réduction du drainage filmogène autour des cellules. Les polymères utilisés à cet effet sont les polyéthylèneglycols, la polyvinylpyrollidone et les polymères contenant un ou plusieurs groupes oxyde d'alkylène. - la demande de brevet EP 14.519 qui préconise l'utilisation de polyéthylèneglycol comme agent de fusion pour la fabrication d'hybridomes. - le Derwent abstracts n 87-133257/19 qui préconise la culture de cellules animales à haute densité en présence de polyglycol. Au niveau industriel, il est plus intéressant d'augmenter la productivité spécifique des cellules plutôt que d'améliorer leur croissance, de manière à obtenir des rendements élevés en protéines sans mettre en oeuvre des quantités importantes de cellules. D'autre part, il est souhaitable de disposer de milieux de culture exempts de sérum. p On a maintenant trouvé que la polyvinylpyrrolidone pouvait être utilisée comme agent activateur de la productivité spécifique des cellules animales recombinantes et permettait l'obtention de milieux de culture définis pour des cellules animales transfectées par un vecteur recombinant codant pour une protéine d'intérêt et notamment pour les cellules d'ovaire de hamster Chinois (Chinese Hamster Ovary Cells), dénommées ci-après cellules CHO.. Les cellules CHO sont des cellules animales de choix pour la production, de protéines par voie génétique. Elles sont généralement cultivées sur des milieux de culture constitués du milieu de MEM (milieu de base minimum) complémenté de 5 % de sérum de veau foetal. L'agent activateur de productivité spécifique selon l'invention est donc constitué de polyvinylpyrrolidone. On peut utiliser selon l'invention les polyvinylpyrrolidones ayant un poids moléculaire moyen d'au moins 2500 et de préférence compris entre 2500 et 750.000 environ. Les polyvinylpyrollidones préférées aux fins de l'invention sont celles ayant un poids moléculaire moyen de 40.000 environ. L'agent activateur selon l'invention peut en outre contenir un copolymère d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène de poids moléculaire moyen calculé à partir de l'indice d'OH, comprise entre 1100 et 8500 environ. Des exemples de copolymères d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène appropriés aux fins de l'invention sont ceux connus sous la dénomination commerciale PLURIOL. Le PLURIOL PE 6800 de poids moléculaire moyen de 8500 est particulièrement préféré aux fins de l'invention. La quantité de copolymère d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène doit représenter environ 1 à 40 % de la teneur en polyvinylpyrrolidone. L'invention concerne également les milieux de culture définis contenant l'agent activateur de productivité spécifique selon l'invention; ce milieu permet d'augmenter la productivité sélective des cellules animales et plus particulièrement des cellules CHO tout en minimisant la croissance de celles-ci. Il comprend: - un milieu de base défini; - un inducteur de croissance, - un agent activateur de la productivité spécifique à base de polyvinylpyrrolidone, la teneur globale en inducteur de croissance dans ledit milieu n'excédant pas 50 mg/l et la teneur en agent activateur de productivité spécifique étant comprise entre 0,1 et 10 ?c en poids par rapport au volume du milieu. Il est connu que, de manière générale, on prépare un milieu de base défini en mélangeant au moins deux milieux de base classiques. A titre d'exemples de tels milieux de base on peut citer notamment. le milieu minimum essentiel MEM décrit par EAGLE, H. (1959) Science 130, 432 ou le milieu de base F 12 décrit par HAM, R.G. (1965) (Proc. Nat. Acad. Sci. 53, 288. De manière avantageuse, le mélange de milieux de base est complémenté en oligoéléments et en acides aminés. Il appartiendra à l'homme de l'art de sélectionner par des essais de routine, les oligoéléments et les acides aminés appropriés ainsi que leurs proDortions relatives en fonction des milieux de base mis en oeuvre et des cellules à cultiver. L'inducteur de croissance du milieu de culture selon l'invention est une protéine telle que l'insuline qui favorise l'initiation de la croissance; celle-ci peut être avantageusement utilisée en combinaison avec un transporteur du fer, tel que par exemple la transferrine. Alors que dans les milieux de culture classiques complémentés avec du sérum, la quantité de protéines à mettre en oeuvre est d'environ 2 g/l de milieu, on notera que dans le milieu de culture défini selon l'invention, la teneur globale en substances protéiques ne doit pas dépasser environ 50 mg/l. Elle est de préférence comprise entre environ 4 mg/l et 10 mg/l. En effet au delà de cette teneur, l'activité cellulaire décroit ainsi que la productivité spécifique. Par contre, pour des teneurs en substances protéiques inférieures à 50 mg/1, la productivité spécifique est considérablement accrue même si la croissance cellulaire est diminuée. La teneur du milieu de culture en agent activateur de productivité spécifique doit être compris entre 0,1 et 10 % en poids par rapport au volume du'milieu. Selon une variante préférée de l'invention, le milieu de culture comprend en poids par rapport au volume du milieu, 3 à 6 % de PVP ayant un poids moléculaire de 40.000 et 0,5 % de PLURIOL 8500. De plus, le milieu de culture selon l'invention est tamponné à pH 7,2 à l'aide d'un tampon approprié, tel que les tampons MOPS ou HEPES. Le milieu de culture selon l'invention est particulièrement approprié pour la production de IL2 par des cellules CHO transfectées; il permet en effet d'augmenter la production totale en IL2 par exemple d'un facteur 1, 5 et d'augmenter la productivité spécifique par. exemple d'un facteur d'au moins 2. La présente invention va être maintenant décrite en détail par l'exemple illustratif mais non limitatif ci-après. EXEMPLE. Dans cet exemple on a cultivé des cellules CHO (clone de CHO K1 - DHFR, décrit par URLAUB et al. dans Pro. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 77, n 7, pp. 4216-4220, Juillet 1980) transfectées par le plasmide recombinant codant pour la protéine IL2 humaine glycosylée décrit par FERRARA et al. dans FEBS Letters Vol. 226, n 1, p. 47-52, 1987. 1) sur un milieu de culture défini selon l'invention constitué d'un milieu de base défini comprenant un mélange de deux milieux de base MEM et F12 complémenté par un stock d'oligoéléments et d'acides aminés non essentiels et contenant de l'insuline (I} de la transferrine (T), de la polyvinylpyrollidone et éventuellement du PLURIOL 6800. La composition de ce milieu est donné dans les tableaux ci-après; 2) sur un milieu témoin à des fins de comparaison. Ce milieu témoin comprend un milieu de base défini (mélange des milieux de base MEM et F12) complémenté par un stock d'oligoéléments et d'acides aminés non essentiels auquel on ajoute 500 mg/l d'une fraction de sérum. Cette fraction correspond à la fraction IV.1 décrite par COHN et al. dans (J. Am. Chem. Soc. 1946, 68, 459). Ce substitut de sérum permet une croissance et une production équivalente à celles obtenues avec un milieu complémenté en sérum pour une cellule d'hybridome de souris ES-6 (MacLeod et al. Develop. Biol. Standard, Vol. 60 p.55-61 - S.Karger, Basel, 1985). Ce milieu témoin dénommé ci-après milieu MEM/F12 FIV.1, permet de diminuer le contenu protéique d'un facteur quatre par rapport à un milieu classique contenant 5 %/ de sérum de veau foetal. On notera que le milieu de repiquage ou de stockage des cellules, utilisé au cours de ces essais est un milieu de base minimum MEM contenant 5 % de sérum de veau foetal. Les cultures ont été réalisées en situation de procédé en réacteur agité (dit réacteur spinner) d'un volume utile de 100 ml, par ensemencement de 3.105 cellules par millitre au départ. La culture dure 16 jours avec présence de microporteurs (cytodex 3) à g/l, avec un renouvellement du milieu du réacteur par jour, et sous agitation (30t/min) dans une chambre chaude à 37 C. Au cours de ces essais on a utilisé comme mode d'analyse, le comptage cellulaire en culture sur microporteurs par coloration au cristal violet et comptage des noyaux cellulaires sur cellules de NEUBAUER. Le dosage de IL2 dans le milieu de culture a été réalisé par mesure de l'activité biologique du milieu de culture selon le test calorimétrique de Mosmann, T. (1983) J. Immunol. Methods, 65, -63 - sur la prolifération de la lignée de lymphocytes-T de souris IL-2- dépendante CTLL-2 (Baker, P. et ai (1979) J. Exp. Med., 149, 173). A titre de témoin, la préparation de référence décrite dans Lymphokine Research ((1984), 4, 193-227) a été utilisée. Les résultats obtenus sont reportés sur les figures 1 et 2 annexées sur lesquelles: -La Figure 1 représente les courbes de croissance des cellules obtenues en réacteur avec les milieux ci-après: 1) milieu sans PVP: MEM/F12 (I) + (T) 2) milieu témoin: MEM/F12 F IV.1 3) milieu avec PVP: MEM/F12 (I) + (T) + PVP 40 à 3 % 4) milieu avec PVP+PLURIOL: MEM/F12 (I) + (T) + PVP 40 à 3% + PLURIOL 0,5 % 5) milieu avec PVP+ PLURIOL: MEM/F12 (I) + (T) + PVP 40 à 6, + PLURIOL 0,5 O%. Le PVP mis en oeuvre dans ces essais est du PVP 40, c'est-à-dire un PVP ayant un poids moléculaire moyen de 40.000. Ces courbes de croissance ( nombre de cellules/ml en fonction du temps en jours) montrent que: - plus la concentration de PVP est forte, plus la croissance est limitée. - les milieux 1,3,4 ont à peu près les mêmes caractéristiques de croissance; L'adjonction de PVP à 3 % et de PLURIOL modifie donc peu l'allure de la courbe de croissance (3.106 cellules/ml). On peut voir une légère diminution de la croissance. - le milieu témoin présente une meilleure capacité de croissance (5.106 cellules/ml). La Figure 2 donne les courbes d'accumulation en IL-2 exprimée en unités internationales par ml en fonction du temps en jours. On peut constater en observant cette figure que: - l'accumulation en IL2 est du même ordre de grandeur entre le milieu témoin 2 et les milieux 3 ou 4, alors que lé milieu 1 présente deux fois moins d'accumulation. - la production en IL est donc augmentée par un facteur 2 en utilisant dans le milieu défini du PVP à 3 % et la productivité spécifique par un facteur 1,3. - l'adjonction de PLURIOL à 0,5 % permet de dépasser la production en IL2 du milieu témoin sans toucher à la croissance. La productivité spécifique est alors augmentée d'un facteur 3 par rapport au milieu défini seul. - la productivité spécifique optimum est obtenue avec la plus forte concentration en PVP (6%) puisque l'on a la meilleure accumulation de produit pour une croissance très ralentie. La présence de PVP dans le milieu défini selon l'invention permet, même s'il limite la croissance, d'augmenter la production totale d'IL2. La présence de PLURIOL amplifie ce phénomène pour les plus faibles concentrations en PVP. g TABLEAU I CONSTITUTION DU MILIEU DEFINI ACIDES AMINES: PM: mg/l mM * L- Alenine: 89,09: 13,35: 0,15 -L- Arginine. HC1: 210,7: 168,5: 0,8 L- Asparagine. H20 150 22,5 0,15 L- Cystine. 2HC1: 313,2: 15,65: 0,05 L- Cysteine. HC1. H20: 175,6: 17,55: 0,10 L- acide glutamique: 147: 22,05: 0,15 L- Glutamine: 146: 292: 2 L- Glycine: 75,07 : 11,25: 0,15 L- Histidine. HCl. H20: 209,7: 31,48: 0,15 j L- Isoleucine: 131,2: 27,97: 0,21 L- Leucine: 131,2 : 32,55: 0,25 L- Lysine. HC1: 182,7: 54,5: 0,30 L- Methionine: 149,2: 9,74: 0,065 L- Phenylalanine: 165,2: 18, 5: 0,11 L- Proline: 115 : 28,75: 0,25 L- Serine: 105 : 15,75: 0,15 LThreonine: 119,1: 30: 0,25 L- Tyrosine: 181,2: 29,89: 0,165 LTryptophane: 204,2: 6: 0,03 L- Valine: 117,2 : 28,85: 0,246 L- acide aspartique: 133: 19,95: 0,15 VITAMINES: PM: mg/: mM Biotine: 244,3 : 3,65 10-3: 0,015 10-3 Chlorure de choline: 139,6: 7,48: 0,05 Acide folique: 441,4: 2,45: 0,003 Nicotinamide: 122,13 : 0,518: 4,6 10-3 Pyridoxal. HCl: 203,63: 0,5: 2,5 10-3 Pyridoxine. HCl: 205,6: 0,031: 3 10-4 Riboflavine: 376,4 : 0,069: 2 10-4 Thiamine. HCl 337,3: 0,67: 2 10-3 Cyanocobalamine: 1355,4: 0,68: 5 10-4 Pantothenate de calcium D: 238,3: 0,74: 3 10-3 SELS INORGANIQUES: P': mg/: mM CaCl2: 110,99 : 86,5: 0,78 KCl: 74,56 : 311,8: 4,18 KH2 P04: 136,09 : 30: 0,22 FeSO4. 7H20 278,02: 1,8: 6,5 10-3 MgSO4: 120,37 : 48,84: 0,4 NaCl: 58,44 : 7800: 133 NaHC0O3 84,01: 350: 4,1 MgCi2 95,22: 28,5: 0,3 Na2HPO4 141, 96: 94,94: 0,67 OLIGOELEMENTS: PM: mg/1: mM CuSO4. 5H20: 249,68 : 1,5 10- 3: 6 10-6 MnSO4. H20 169,02: 0,845 10-3 5 10- Na2SeO3. 5H20 263,01: 3,42 10-2 1,4 10- NiCl2. 6H20: 237,70 : 1,19 10-6 5 10-9 (NH4)6 M07024. 4H20: 1235,89: 1,235 10--3: 1 10-6 NH4 VO3: 116,99 : 5,845 10-4 5 10-6 SiO2 Na20. 5H20 212,14 0,1067: 5 10- SnC12. 2H20: 225,63 : 1,12 10-6 5 10-9 Zn S04. 7H20: 287,54 2,13 7 10-3 AUTRES CONSTITUANTS PM: mg/l: mM D. Glucose: 18 : 1800: 10 Rouge de phénol (sel:: : sodique): 1: l Pyruvate de Sodium: 110: 110: 1 Hypoxanthine (sel sodique): 136,1: 2,38: 1,75 10-2 Acide lipoique: 206,3: 0,105: 5 10-4 Acide Linoléique: 278,44: 0,042: 1,5 10-4 Putrescine 2HCl: 161,1 0:,0805: 5 10-4 i-Inositol: 180,2 : 10: 5,5 10-2 Thymidine 242,2 0, 365 1,5 10-3 ADJUVANTS PM. mg/i: mM MOPS 209,3: 6279: 30 Insuline: 3: Transferrine: 1 Pluriol 6800: 500: PVP (*): 30000 ou: :60000: (*) PVP 2500, 10.000, 20.000, 40.000 et 750.000. 2635008- REVENDICATIONS 1. Agent activateur de productivité spécifique de cellules animales recombinantes, caractérisé en ce qu'il est constitué par une polyvinylpyrrolidone ayant un poids moléculaire moyen d'au moins 2500. 2. Agent activateur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par une polyvinylpyrrolidone ayant un poids moléculaire moyen compris entre 2500 et 750.000 environ. 3. Agent activateur selon l'une des revendications i ou 2, caractérisé en ce qu'il contient en outre un copolymère d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène de poids moléculaire moyen, calculé à partir de l'indice d'OH, compris entre 1100 et 8500 environ. 4. Agent activateur selon l'une quelconque des revendications i à 3, caractérisé en ce que le copolymère d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène représente environ 1 à 40 % de la teneur en polyvinylpyrrolidone. 5. Milieu de culture défini pour cellules animales recombinantes caractérisé en ce qu'il comprend: - un milieu de base défini; - un inducteur de croissance, -un agent activateur de productivité sélective selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, la teneur globale en inducteur de croissance dans le dit milieu n'excédant pas 50 mg/ml et la teneur en agent activateur de productivité spécifique étant comprise entre 0,1 et 10 % en poids par rapport au poids du milieu. 6. Milieu de culture selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des oligoéléments et des acides aminés non essentiels. 7. Milieu de culture selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisé en ce qu'il contient 3 % d'une polyvinylpyrrollidone ayant un poids moléculaire de 40.000 comme agent activateur de productivité spécifique. 8. Milieu de culture selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il contient en outre 0,5 % d'un copolymère d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène ayant un poids moléculaire moyen de 8.500. 9. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce qu'il est tamponné à pH 7.2. 10. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisé en ce que l'inducteur de croissance est l'insuline. 11. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications 5 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend en outre I un transporteur de fer, tel que la transferrine.