FR 2627062 A1 19890818 FR 8801707 A 19880212 2 7 70G2 Utilisations dans les industries alimentaires de microorganismes exprimant les gènes de transglutaminase pour texturer des mélanges protéiques L'objet de la présente invention concerne les grandes voies par lesquelles des microorganismes ayant reçu par manipulations génétiques le ou les gènes d'une transglutaminase peuvent être utilisés dans des fermentations microbiennes exploitables dans les industries alimentaires ou chimiques. Les transglutaminases constituent une classe d'enzymes qui catalysent la réaction des résidus glutaminé des protéines avec un groupement aminé, d'une amine ou d'un acide aminé basique comme la lysine. Ces enzymes permettent donc de désamider les protéines riches en glutamine, de greffer la lysine sur une protéine pauvre en cet acide aminé ou de réticuler des protéines diverses entre elles. Ces enzymes appartiennent au monde des eucaryotes et sont naturellement absentes des procaryotes (bactéries). Elles ont des structures variées et chez les mammifères elles peuvent être cellulaires dans le foie, les follicules des poils, la prostate, l'utérus, le placenta, ou sanguines dans le plasma et les plaquettes. Dans ce dernier cas une transglutaminase (facteur XIII) intervient dans la coagulation sanguine et le premier usage alimentaire de cette enzyme est sa contribution à la fabrication du boudin. L'emploi de transglutaminases ajoutées sous forme de préparation enzymatique plus ou moins purifiées est un procédé connu. Parmi les publications ou brevets parus sur les utilisations potentielles des transglutaminases il y a plusieurs techniques décrites. La désamidation de certaines protéines (caséines) par l'action d'une transglutaminase avec ou sans acylation- préalable accroit la solubilité et les propriétés émulsifiantes des préparations protéiques (Brevet AJINOMOTO KK - 59210097 A 841128). Le greffage d'acides aminés variés (lysine, méthionine, cystéine, tryptophane) sur des supports protéiques plus ou moins riches en glutamine 2 49 277062 par catalyse à l'aide d'une transglutaminase a donné lieu à la prise de deux brevets. Dans les deux cas il s'agit d'accroïtre les propriétés nutritionnelles de protéines alimentaires (caséine, soja, gluten, viande,- poisson, mais, riz) ou de leurs produits de décomposition, et le rôle de l'ion Ca++ dans la réaction est souligné (Brevet SNOW BRAND MILK PRODUCTS - J 58028234 A 830219 - Brevet AJINOMOTO - J 61067497 A 860407). La fixation d'enzymes ou de coenzymes sur les protéines les plus diverses correspond à quatre brevets. x Sur des protéines animales, végétales ou bactériennes la fixa- tion du coenzyme NAD ou NADP à l'aide d'une transglutaminase a été décrite pour des usages pharmaceutiques ou de dépollution (Brevet SNOW BRAND MILK PRODUCTS - J 58028295 A 830219). x Plusieurs types d'enzymes peuvent être immobilisées dans une membrane constituée par réticulation d'une protéine (caséine, autre protéines animale ou végétale) à l'aide d'une transglu- taminase. Les enzymes ainsi incluses présentent tous les avan- tages des catalyseurs fixés sur une membrane (Brevet AJINOMOTO KK - J 61227783 A 861009). x La transglutaminase peut être fixée par l'intermédiaire d'un de ses anticorps monoclonaux lui-même lié à une protéine por- teuse. Il est ainsi possible de diriger l'activité transgluta- minase sur plusieurs cibles spécifiques (Brevet AJINOMOTO KK - J 59175884 A 841004). x Deux brevets décrivent la mise en oeuvre des transglutaminases pour préparer des structures particulières. Sur des protéines dispersées en phase liquide (protéines laitières, collagène, gélatine, protéines de graines végétales) la transglutaminase permet d'obtenir des spécialités cosmétologiques très hydratées, les gels protéiques obtenus étant capables de retenir une importante proportion d'eau (Brevet AJINOMOTO KK - J 61172807 A 860804). Une variante de cette technique prévoit le moulage du gel protéique, suivi du séchage partiel, ce qui permet de fabriquer des membranes protéiques stables dans l'eau bouil- lante, insolubles sur une large gamme de pH et d'une résistance mécanique suffisante pour en faire des films d'emballage bio- dégradables ou des supports de fixation d'enzymes (Brevet AJINOMOTO KK - J 61152247 A 860710). x Un usage intéressant la fabrication de spécialités consiste à immobiliser des enzymes utiles dans des préparations ali- mentaires ou pharmaceutiques par addition de transglutaminase à une protéine pour en faire un réseau gélifié qui inclut ces enzymes. Les protéines mises en oeuvre peuvent être des protéines de soja, ou de la gélatine. Les enzymes citées en exemple sont la glucosidase, la mannosidase, la glucose oxydase, la catalase, l'acide glutamique deshydrogénase et la ribo- nucléase A (Brevet AJINOMOTO KK - J 59066886 A 840416). x Enfin deux brevets concernent directement l'industrie alimen- taire. L'un décrit un procédé d'obtention de gels protéiques pour préparations alimentaires réalisées par addition de trans- glutaminase à des émulsions contenant des protéines, de l'huile ou une graisse et de l'eau (Brevet AJINOMOTO KK - J 59059151 A 840404). L'autre, premier déposé sur ce thème, décrit la préparation de gels protéiques par réticulation de protéines en solution sous l'action d'une transglutaminase (Brevet AJINOMOTO KK - J 58149645 A 830906). Outre tous ces brevets, plusieurs publications scientifiques rapportent des travaux réalisés en collaboration avec AJINOMOTO KK sur la mise en oeuvre des transglutaminases. Ces travaux recoupent exactement 1e contenu des brevets déposés préalablement. Aucun de ces documents ne rapporte ou évoque la présente invention. L'originalité de notre invention par rapport aux découvertes antérieures et aux brevets précités consiste à ne pas apporter une préparation enzymatique de transglutaminases objet de tous les brevets cités, mais un germe qui, par suite de modification génétique, est capable de produire ces enzymes en cultivant dans le mélange ou le produit à transformer. - Ce procédé est beaucoup plus économique, puisqu'il élimine toutes les opérations de production et de séparation de l'enzyme antérieures à son emploi. - Ce procédé est aussi beaucoup plus souple, puisqu'il permet de retarder et moduler la production d'enzyme in situ en jouant sur les. conditions physicochimiques qui permettent l'expression du gène, pour en obtenir l'effet au moment optimal, et, en fonction de son action, d'arrêter cette production à l'instant désiré lorsque le résultat souhaité est obtenu. Il permet donc de compenser les variations de réactions des matières premières, notamment agricoles, au vu des résultats, en modulant la quantité d'enzymes produites. Ce gui est impossible par les techniques d'addition enzymatique antérieurement découvertes, au moins lorsque l'enzyme a pour effet de solidifier le milieu réactionnel. - Cette découverte permet aussi, par le choix judicieux de la souche modifiée, d'obtenir simultanément plusieurs effets, par exemple de combiner une texturation avec une acidification grace à des bactéries lactiques, ou de combiner une production de gaz (C02) avec une texturation pour obtenir un produit aéré nouveau, par l'emploi de levures. - Une variante du procédé consiste à précultiver le germe en milieu liquide, puis concentrer la culture par ultrafiltration, osmose inverse ou lyophilisation avant de l'utiliser, de façon à limiter le temps de culture pour éviter le développement éventuel de germes pathogènes. Après que l'information génétique des enzymes nommées transglutaminase ait été introduite dans des microorganismes, l'invention consiste à utiliser ces microorganismes, transformés par manipulation génétique, dans des mélanges de différentes protéines, avec ou sans amines, et contenant des glucides, pour réaliser plusieurs modes de texturation des protéines au cours d'une fermentation. L'enzyme dont le gène a été cloné dans les microorganismes peut avoir plusieurs origines: transglutaminases (appelées TGases) de foie de cobaye ou de lapin, de placenta ou de plaquettes sanguines. La TGase considérée peut avoir une ou plusieurs sous-unité. La transformation génétique des microorganismes utilisables dans la présente invention est réalisable par les techniques classiques du génie génétique par exemple en utilisant une banque de cDNA ou un RNA messager isolé d'un organe animal comme source de gène, multiplication du gène via un microorganisme intermédiaire (par exemple Escherichia coli), et introduction du gène dans le microorganisme cible à l'aide d'un vecteur approprié. Une étape de ce travail est décrite par K. IKURA, T. NASU, H. YOKOTA, R. SASAKI et H. CHIBA (Cloning of cDNA coding for Guinea Pig liver transglutaminase - Agric. Biol. Chem., 51, (3), 957-961, 1987). Le gène clone est alors exprimé dans le microorganisme et la TGase peut-être excrétée ou fixée à la surface de la paroi du microorganisme: les cellules de ce microorganisme en suspension en milieu aqueux ont donc à la fois une activité TGase et une propriété fermentaire. Les microorganismes transformés peuvent être différentes souches de Levures: Saccharomyces cerevisiae apte à fermenter des solutions contenant du glucose et ou du saccharose, Kluyveromyces lactis apte à fermenter des solutions de lactose et d'autres glucides, Yarrowia lipolytica apte à se développer sur des solutions protéiques. Les microorganismes transformés peuvent être des bactéries utilisables dans les industries alimentaires comme Bacillus subtilis ou déjà mises en oeuvre comme les bactéries lactiques: Streptococcus lactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus lactis, Lactobacillus plantarum. Ces bactéries lactiques transformées ayant conservé leur aptitude à fermenter le lactose du lait peuvent générer de l'acide lactique tout en exprimant une activité TGase. L'invention consiste à mettre une souche ou plusieurs souches de ces microorganismes transformés dans des mélanges constitués par des solutions artificielles de protéines contenant ou non un glucide fermentescible, contenant ou non l'ion Ca++ (qui stabilise l'enzyme TGase) , ou dans des mélanges naturels comme le lait, les purées de viande les pâtes et bouillies céréalières, ou dans des mélanges mixtes. La fermentation peut être conduite à toute température convenant au germe modifié: généralement elle se situera entre 10 C et 40 C pour obtenir une action convenable de la transglutaminase. Il en est de même du pH, dont la zone d'activité de la transglutaminase se situe entre 4 et 10 et l'optimum entre 6 et 8,3. Les protéines en solution, seules ou en mélange peuvent être dénaturées par un traitement thermique préalable au démarrage de la fermentation. Ce traitement dénaturant peut être nécessaire pour rendre certaines protéines aptes à réagir avec la TGase. La conduite de la fermentation détermine à chaque instant la concentration de l'enzyme TGase active dans la solution: cette conduite doit être pilotée par le réglage de la température, et si le microorganisme est acidifiant, par le réglage du pH. La concentration initiale en glucides dans la solution est l'un des moyens de régler la variation du pH, donc l'activité TGase. Le processus peut être arrêté par un dernier traitement thermique à une température égale ou supérieure à 65 C (température de dénaturation de l'enzyme). Dans ces conditions toutes les chaines polypeptidiques contenant des résidus glutaminyle peuvent être désamidées, ou réticulées, ou désamidées et réticulées. Si le mélange contient une acylamine lipophile, les protéines peuvent être acylées et acquérir ainsi des propriétés émulsignnantes et/ou moussantes. La réticulation conduit à des gels très hydrophiles, bases de nouvelles textures. Pratiquement toutes les protéines alimentaires d'origine animale, végétale ou microbienne peuvent être transformées par cette nouvelle technologie microbienne de texturation. Exemple 1: Structuration de viande hachée: on utilise un Lactobacillus plantarum génétiquement modifié pour produire une transglutaminase. Moyen pour obtenir avec de la viande hachée une pièce de viande ayant une texture aussi cohésive qu'un muscle entier, donc se prêtant au tranchage, avant et après cuisson, de façon similaire aux pièces de viandes non broyées, et à cuire de la même manière. a) 100 Kg de viande de boeuf refroidie à 3 C contenant 10% de lipide, sont hachés au broyeur à la grille de 3 mm; cette viande est transvasée dans un pétrin et on lui ajoute 0,5 kG de sucre, 500 ml de culture de 24h de Lactobacillus plantarum génétiquement modifié à 109 germes/ml; une fois bien homogénéisée, cette pâte est transférée dans un poussoir sous vide doseur, conditionnée sous vide en sacs plastiques par portions de 100 g. Les sachets sont scellés sous vide, puis étuvés 10H à 20 C, puis 15h à 15 C avant d'être congelés. On obtient un steack de texture comparable à un beefsteack découpé dans un muscle. b) variante du précédent Les 100 Kg de boeuf, 0,5 Kg de sucre, 500 ml de culture sont hachés et homogénéisés au cutter, poussés en pains cylindriques de 1 kG, de diamètre mm; ils subissent le même étuvage et sont, de même, congelés. On obtient l'équivalent d'un rôti de boeuf-de 1 kG avec une texture et des capacités à être tranché comparables. Exemple 2: Rôti précuit; 100 Kg de viande de boeuf sont hachés à 3 mm, cuits aux microondes de façon à porter la température à 80 C pendant 2 minutes, essorés, puis additionnés de 0,4 Kg de sucre, de 500 ml de la culture de Lactobacillus plantarum précédemment décrite, poussés en sachets plastiques et étuvés comme dans les exemples précédents. Ce procédé permet d'éliminer les éventuels pathogènes résistant à l'acidification provoquée par Lactobacillus plantarum modifié génétiquement. Exemple 3: Même procédé que ceux antérieurement cités o les 500 ml de culture de Lactobacillus plantarum sont remplacés par 50 ml d'une culture du même germe préconcentré 100 fois par centrifugation et l'étuvage réduit à 10 h à 20 C. Exemple 4: Prendre 100 Kg de rétentat concentré 5 fois, delactosé par dialyse, à pH 6,4 (rétentat doux), y ajouter 100 1 d'eau, 1 l'de culture à 108 g/ml de Saccharomyces cerevisiae modifié génétiquement, 20 kG de sucre, l'arôme de fraise de Firmemich pour obtenir le goût désiré, bien mélanger, couler 40 g en coupelles plastiques rectangulaires de 100 cm3, étuver 15 h à 20 C, colorer le dessus au rocou, chauffer à 75aC 1 minute, thermosceller. On obtient un produit ressemblant à un pain, tranchable, très riche en protéines. Exemple 5: Mélanger 100g de protéines de soja, lOOg de caséinate haute viscosité, 1O000g d'eau, 20g de sel, du carmin de cochenille, des épices au goût souhaité, lOg de sucre, 10Og de crème et 1% de culture de Kluyveromyces lactis modifié. Brasser fortement sous vide, couler en pains de lkg, porter 24h à 35 C puis cuire lh30 à 900C en étuve humide après avoir emballé sous plastique sous vide. On obtient un pain de simili viande. Exemple 6: Même procédé que précédemment o les protéines de soja sont remplacées par une poudre de gluten, additionnée de lysine ce qui permet de rééquilibrer cette protéine en même temps que de la texturer. Mélanger 200 g de gluten, 10 g 'de lysine, 1000 g d'eau, 20 g de sel, 2 g de poivre, 5 g d'ail, 0,2 g de muscade, 0,1 ml de solution de carmin de cochenille, 10 g de sucre, 100 g de saindoux, 100 g de culture de Kluyveromyces lactis modifié, bien mélanger, couler en pains de 1 g sous gaine de plastique de diamètre 80 mm, porter 24 h à 35 C puis cuire lh30 à 85 C en étuve humide. On obtient un pain rose semblable à une mortadelle. Exemple 7: Prendre 60 kG de rétentat doux, pH 6,4, concentration 3, délactosé par rinçages successifs à 0,5% de lactose, y ajouter 40 Kg de crème douce à 40% de matière grasse, ajouter 1 Kg de lactate de sodium, 1, 5 Kg de sel, 1 Kg de culture de Kluyveromyces lactis génétiquement modifié, ajouter 1 Kg de concentrat de culture de Brevibacterium linens obtenu sur lait et concentré 5 fois par osmose inverse; bien mélanger, couler en forme de Pont l'Evêque, étuver 10h à 35 C, porter 2 mn à 75 C aux microondes, refroidir, colorer la surface avec une solution de rocou, ensemencer avec B. linens et porter 8 jours en haloir selon les conditions opératoires fromagères ordinaires, emballer et livrer comme un Pont l'Evêque ordinaire. On obtient un fromage avec un rendement double de l'ordinaire. Ces exemples ne sont pas limitatifs, ils sont donnas à titre d'illustration de l'intérêt de notre invention, et du progrès considérable qu'elle présente par rapport à la production et la séparation de l'enzyme avant son éventuel usage. Ils montrent en même temps, l'intérêt de fermentations à double but. io 2627062 REVEND ICA T IONS 1. Procédé de fermentation microbienne utilisable dans les industries alimentaires ou chimiques-à l'aide de micro-organismes transformés par manipulation génétique aver pour effet- la production de transglutaminases fonctionnelles in situ. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on met. au moins une souche de micro-organismes transformés par manipulation génétique et clonage d'un gène d'enzyme transglutaminase dans des protéines en presence de glucides assimilables. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, caracterise en ce que l'on cultive les micro-organismes dans une gamme de températures comprise entre 5'C et 5O'C, à des pH supérieurs à 4 et inférieurs ou égaux à 10, en réglant la concentratin en glucides du milieu. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait qu'on traite thermiquement les micro-organismes à une température égale ou supérieure à 65'C pour arrêter l'activité transglutaminase. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par l'addition d'un sel de calcium à la solution en fermentation permettant de stabiliser et activer l'enzyme transglutaminase au fur et à mesure de sa production microbienne dans le milieu de culture. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, consistant à apporter la ou les souches microbiennes sous forme concentrée, notamment par ultrafiltration, osmose inverse ou lyophilisation. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à. 6, caractérisé en ce que la fonction des transglutaminases produites in situ est la modification de la texture des protéines seules ou associées à d'autres ingrédients alimentaires. B. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la fonction des transglutaminases produites in situ est la texturation de solutions ou suspensions de protéines variées. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 6, caractérisé en ce que la fonction des transglutaminases produites in situ est la modification de la valeur alimentaire des protéines. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la fonction des transglutaminases produites in situ est le greffage sur les protéines d'enzymes ou de co-enzymes par fermentation microbienne à l'aide de micro-organismes transformés. 11. Produits obtenus par le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 10.