FR 2631342 A1 19891117 FR 8813989 A 19881026 La nrésente invention concerne un procédô de pré- paration de cyclodextrines 2 ramifications glucosyliques mul- tiples. La préparation des cyclodextrines rumifiées, et leur utilisation et développement ont été en rapide progrès par suite de leurs excellentes Propriétés physiques telles que leur grande solubilité et, jusqu'ici, des méthodes con- nues ont permis de préparer des cyclodextrines à ramification. unique possédant une dextrine ramifiée telle que le 6 -1,4- glucane et le panose fixée à leurs cycles cyclodextrine, et des cyclodextrines à ramifications multiples ayant deux branches de maltooligosaccharides tels que le glucose, le maltose et le maltotriose, fixées à leurs cycles cyclodextri- nes, par exemple la diglucosyl-cyclodextrine ayant deux glu- coses attachés au même cycle cyclodextrine, la dimaltosyl-cy- clodextrine ayant deux maltoses attachés au même. cycle cyclo- dextrine et la glucosyl- ou maltosyl-cyclodextrine ayant des ramifications glucose ou maltose fixées au même cycle cyclo- dextrine. Ces cyclodextrines sont préparées en faisant réa- gir une enzyme de synthèse de cyclodextrine sur des dextri- nes ramifiées ou en faisant réagir un mélange de CC-1,4-glu- cane tel que le maltose ou le maltotriose ou une dextrine ramifiée telle que le panose avec une cyclodextrine, sur une enzyme de déramlfication. Il existe aussi une méthode de pré- paration des cyclodextrines ramifiées qui consiste à faire réagir un mélange de fluorure de malto-oligosyle ou de fluo- rure de glucosyle avec une cyclodextrine sur une enzyme de déramification. Les cyclodextrines monoramifiées, qui ne compor- tent qu'une branche, ont une solubilité bien supérieure à celle des cyclodextrines de départ, et peuvent être utili- sées dans des applications plus larges. Toutefois, comme de telles cyclodextrines monoramifiées à une seule branche, par exemple la cyclodextrine monoramifiée, sont affectés par les amylases-d'Aspergillus oryzae (Taka-amylase), il s'est créée une demande de plus en plus forte pour des cyclodextri- nes fortement résistantes à de telles enzymes et pour une pré- paration efficace de telles cyclodextrines. Er. particulier, il existe maintenant une forte de- mande pour des cyclodextrines à glucosyles multiples, étant donné qu'elles sont à peine touchées par les amylases et ont une solubilité excellente. Cependant, la préparation des cy- clodextrines à ramifications glucosyliques multiples envisa- gés jusqu'ici met seulement en jeu la transformation des rami- fications des cyclodextrines à maltosyles multiples de produc- tion conventionnelle en groupes glucosyles par coupure avec la glucoamylase. De plus, les rendements des cyclodextrines à maltoxyles multiples selon les méthodes conventionnelles sont bas et atteignent tout au plus 22,3 %. Ainsi, il n'y a pas eu jusqu'ici de méthode efficace développée pour la préparation des cyclodextrines 'à ramifications giucosyliques multiples. Jusqu'ici, on a connu des méthodes de production à partir de maltose, de maltotriose, de panose et cyclodextri- nes de maltosyl-cyclodextrines, maltotriosyl-cyclodextrines, panosyl-cyclodextrines et dimaltosyl-cyclodextrines en utili- sant les réactions de synthèse inverse d'enzymes de déramifi- cation telles que la pullulanase et, en se basant sur ces ré- sultats, la préparation de cyclodextrines à ramifications uniques et multiples a pu être établie. D'autre part, on sait que des cyclodextrines à ramifications multiples telles que la glucosyl-cyclodextrine, la maltosyl-cyclodextrine sont formées à partir de malto-oligosaccharide et glucosyl-cyclo-- dextrines par réactions de synthèse inverse des enzymes de déramification. D'autre part encore, on sait que les ramifi- cations liées à de telles cyclodextrines peuvent être scin- dées en groupes glucosyles sous l'action de la glucoamylase. Un objet de la présente invention est, par consé- quent, de fournir un procédé de préparation de cyclodextri- nes à ramifications glucosyl multiples par combinaison de ré- sultats tels que ceux mentionnés ci-dessus. De façon à réaliser cet objectif, on mélange d'a- bord le maltose avec une cyclodextrine selon les méthodes conventionnelles pour obtenir une maltosyl-cyclodextrine par réaction de synthèse inverse d'une enzyme de déramification. Après séparation du mélange réactionnel en maltose et compo- sants cyclodextriniques (cyclodextrines ramifiées et non-ra- mifiées), on fait ensuite réagir la glucoalyr..se sur les com- posants cyclodextrines pour former une glucosyl-cyclodextrine non modifiée par l'enzyme de déramification et une cyclodex- trine intacte. Après séparation et-élimination du glucose produit, on mélange à nouveau les composants cyclodextrines avec du maltose et les fait réagir avec l'enzyme de déramifi- cation et la glucoamylase. Il en résulte que 70 % ou plus de la cyclodextrine initiale sont convertis en une cyclodextri- ne ramifiée par les trois réactions, et la conversion en cy- clodextrine multiglucosylés atteint jusqu'à 35 % ou plus. La présente invention a donc été réalisée sur la base de tels résultats. Les précédents et autres objets et caractéristi- ques de la présente invention apparaitront maintenant à la lecture de la description détaillée suivante en se référant à la Fgure qui lui est annexée et qui représente un schéma opérationnel illustrant un mode de réalisation du procédé selon la présente invention. Dans la présente invention, il est entendu que le terme "cyclodextrines ramifiées" se rapporte généralement à des cyclodextrines possédant une branche telle que glucose et maltose fixée à leur cycle cycloeextrine, et le terme "cyclodextrines à ramifications multiples" à des cyclodex- trines possédant deux ou plusieurs branches attachées à leur cycle cyclodextrine. Si une cyclodextrine possède un seul type de.ramifications dont le nombre se situe quelque part entre deux et un nombre plus grand, on l'appelera alors, par exemple, la multiglucosyl-cyclodextrine, nom dans lequel le type de ramifications est intercalé entre les termes "multi" et "cyclodextrine". En particulier dans le cas o les c;clo- dextrines ont des ramifications limitées en termes de type et nombre, on s'y référera ci-dessous sous les termes de di- glucosyl-cyclodextrine, glucosyi- et maltosyl-cyclodextrine par exemple. Dans les formules schématiques données par la suite, cyclodextrine, glucosyl-cyclodextrine, maltosyl-cyclo- dextrine, glucose, maltose, etc., seront abrégés en CD, G1- CD, G2-CD, Go, G2, etc., respectivement. Le présent procédé est caractérisé par le fait que os05 l'on produit les cyclodextrines à ramifications glycosyles multiples finales en combinant la réaction de synthèse inver- se de l'enzyme de déramification avec la réaction d'hydrolyse de la glucoamylase. La présente invention a donc pour objet un procédé de préparation de cyclodextrines à ramifications glucosyles multiples, qui consiste à mettre en contact une enzyme déra- mifiante avec un mélange de maltose ou d'une autre substance renfermant un malto-oligosaccharide et d'une cyclodextrine pour obtenir un produit réactionnel duquel on sépare une cy- clodextrine ramifiée, à transformer par l'action de glucoamy- lase ladite cyclodextrine ramifiée en glucosyl-cyclodextrine, que l'on mélange ensuite avec du maltose ou une autre sub- stance contenant un malto-oligosaccharide, et à faire succes- sivement agir une enzyme déramifiante et de la glucoamylase sur le mélange résultant. De façon plus détaillée, la présente invention fournit un procédé de préparation de cyclodextrines à ramifi- cations glucosyles multiples, caractérisé en ce que l'on mé- lange une cyclodextrine avec un saccharide ou des saccharides ramifiants choisis parmi les malto-oligosaccharides tels que le maltose pour former une cyclodextrine ramifiée par la ré- action de synthèse inverse d'une enzyme et de déramification; après séparation du (des) saccharide(s) ramifiants, on con- vertit la cyclodextrine ramifiée des composants cyclodextri- nes en glucosyl-cyclodextrine par action de glucoamylase; et on mélange à nouveau de la cyclodextrine inaltérée et de la glucosyl-cyclodextrine avec le (les) saccharide(s) rami- fiants et convertit en une cyclodextrine à ramifications multiples sous l'action de l'enzyme de déramification, et en ce qu'une telle série de réactions est ainsi répétée pour augmenter le pourcentage en cyclodextrine ramifiée. Plus le cycle réaction de synthèse inverse de l'enzyme de déramification action de la glucoamylase est répété de fois, plus fort est le pourcentage de cyclodex- trine à glucosyles multiples et, finalement, la cyclodextri- ne est totalement convertie en multiglucosyl-c'-clodextrine. La Figure 1 illustre un mode de réalisation du procédé selon l'invention, qui peut éventuellement être uti- lisé dans des applications plus larges. Si l'on se réfère à l'étape (1) de la Figure 1, toute enzyme déramifiante, comme la pullulanase du commerce, peut être utilisée comme matériau enzymatique. On peut uti- liser dans la présente invention un réacteur membianaire faisant appel à des enzymes libres; toutefois, des enzymes immobilisées peuvent aussi être plus avantageusement utili- sées pour un procédé en continu. En ce qui concerne l'étape (2) de la Figure 1, tout matériau capable de séparer les composants cyclodextri- nes et le (les) saccharide(s) pour ramification, tels que ODS, résines échangeuses d'ions et carbone active, peut être utilisés pour la séparation sur colonne. Toutefois, comme la séparation sur colonne fait appel à un éluant provoquant une diminution des concentrations en substrat, on obtient de meil- leurs résultats en installant en des points appropriés de la ligne opératoire des concentrateurs tels que des membranes d'osmose inverse et des évaporateurs à effets mutilples. Dans le cas o on utilise une colonne ODS, il est préférable d'ef- fectuer une élution à l'éthanol pour la séparation des compo- sants cyclodextrines de façon à maintenir l'efficacité de la colonne. On peut, cependant, faire usage d'une membrane lache d'osmose inverse pour décharger simultanément l'éthanol et l'eau du sein du système. En ce qui concerne l'étape (3) de la Figure 1, n'importe quel matériau enzymatique libre et immobilisé peut être utilisé comme enzyme; toutefois, il est plus avanta- geux d'utiliser les enzymes immobilisées dans les systèmes en continu. Pour ce qui est des types de tels matériaux enzy- matiques à utiliser, on peut faire appel aux produits commer- cialement disponibles allant des produits bruts aux produits raffinés. Les composants sucres issus de l'étape (3) renfer- ment une cyclodextrine inaltérée, la glucosyl-cyclodextrine, et du glucose qui peut ou non être éliminé. Par conséquent, on peut se passer de l'étape (4) chaque fois que cela est possible. Lorsque le glucose n'est pas éliminé, il y a une telle accumulation de glucose que l'on a une diminution de la réactivité, si le système est en continu. Pour cette rai- son, une fois que le pourcentage de glucose atteint un niveau prédéterminé, on peut séparer le glucose du produit sur le trajet de ré-utilisation du maltose f(2)-(1)7 grâce à un sys- tème de séparation de type à lit mobile tel que celui utilisé pour la séparation de GF. De plus, ce système peut aussi être appliqué à la séparation des composants cyclodextriniques et non-cyclodextriniques (oligosaccharides comme le-glucose et le maltose). En tant que saccharides ramifiants, on peut utili- ser le maltose, le sirop de maltose et un mélange de maltose avec du maltotriose tel que l'"oligotose", aussi bien que du sirop ou sirop de poudre renfermant un maltooligosaccharide. Les cyclodextrines à utiliser comme produits de départ peu- vent être l'f -, - o T-cyclodextrine ou un mélange de ces dernières ou encore un sirop de poudre de cyclodextrine. Quand le maltose est utilisé comme saccharide pour la ramification, le composant sucré évolue, lors des étapes respectives, de la manière résumée ci-dessous: 1) G2 + CD-*G2 + CD + G2 - CD, 2) C2 + CD + G2 - CD-->G2 (renvoyé à l'étape (1) après avoir atteint une concentration prédéterminée) et CD + G2 - CD, 3) CD + G2 - CD->G1 + CD + G1 - CD, 4) G1 + CD + G1 - CD-*G1 et->CD + G1 - CD (également renvoyé à l'étape (1) après concentration à une concentra- tion prédéterminée). Grâce à ce cycle, le pourcentage en sucre est globalement modifié, comme il ressort de CD ->-G1 - CD - (G1)n - CD (n = 2 et 3). Quand G1 + CD + G1 - CD retourne au stade (1) en l'absence du stade (4) et après concentration à une concentration prédéterminée, le composant sucre devient finalement aussi G1 + (G1)n - CD (n = 1, 2 et 3). Pour cette raison, des produits peuvent être obtenus contenant du gluco- se, ou bien le glucose peut être éliminé au stade final. Il est possible de préparer des produits ayant des pourcentages divers en (G1)n - CD (n = 1, 2 et 3) en fixant le numéro de ce cycle. Selon la présente invention, les cyclodextrines à ramifications glucosyles multiples peuvent aisément être pro- duites en quantité industrielle en combinant la réaction de synthèse inverse de l'enzyme de déramification avec la réac- tion d'hydrolyse de la glucoamylase, et ainsi leurs produits peuvent être fournis à bas prix. De plus, étant donné leurs excellentes propriétés physiques telles que la solubilité, on attend de ces produits de larges applications y compris dans-les industries alimentaire, médicale et cosmétique. De plus encore, les produits préparés par la présente invention ont un pourcentage en cyclodextrine ramifiée bien supérieur à celui des produits conventionnels contenant de la maltosyl- cyclodextrine. En particulier, les multiglucosyl-cyclodextri- nessont avantageuses de par leur stabilité si grande qu'elles ne sont pratiquement pas affectées par les amylases. On note que les cyclodextrines ayant un nombre différent de ramifica- tions glucose, qui sont contenues dans le produit de la pré- sente invention, peuvent être isolées individuellement pour emploi. La présente invention est expliquée de façon spéci- fique mais pas exclusive dans les exemples suivants. -EXEMPLE 1 On fait circuler un liquide sucré contenant de lt'O- cyclodextrine et du maltose dans un rapport pondéral de 1:5 et ajusté à une concentration substratique de 60 % et un pH de 5,0 à travers une colonne d'enzyme immobilisée a 650C pen- dant 6 heures, colonne dans laquelle de la pullulanase par- tiellement raffinée (fabriquée par NOVO) a été immobilisée sur un support céramique par la méthode de couplage au silane, et l'introduit ensuite dans une colonne ODS maintenue à tempé- rature ambiante pour la séparation du maltose.. On augmente en- suite la température à 70 C pour l'élution des composants cy- clodextrines. On fait passer l'êluat à travers une colonne de glucoamylase immobilisée du commerce, puis le fait encore pas- ser à travers la colonne ODS de la même manière que ci-dessus pour éliminer le glucose, et on obtient ainsi un liquide sucré contenant 52,0 % d'oC-cyclodextrine, 40,6 % de glucosyl-c- cyclodextrine et 7,4 % de diglucosyl-O-cyclodextrine. On concentre ce liquide sucré à'.travers une membra- ne d'osmose inverse, et ajoute du maltose au concentrat selon un taux pondéral de 5:1, et l'on ajuste ensuite à une concen- tration substratique de 60 %. Ensuite, on soumet à nouveau le produit aux traitements: pullulanase., colonne, glucoamylase et colonne, ce qui donne un second liquide sucré contenant 33,2 % d' ne et 22,8 % de diglucosyl-od-cyclodextrine. D'une manière similaire à précédemment, on obtient un troisième liquide sucré, qui contient 25,5 % d' dextrine, 37,2 % de glucosyl- -cyclodextrine et 37,3 % de diglucosyl-" -cyclodextrine. On note que l'analyse du sucre a été réalisée par chromatographie liquide haute performance dans les conditions suivantes: colonne - NH2, 5; éluant - acétonitrile à 50 %; et vitesse d'élution - 0,8 ml. EXEMPLE 2 Les opérations sont effectuées de la même manière que pour l'exemple 1, sauf que l'oC -cyclodextrine est rempla- cée par la} -cyclodextrine, et l'on obtient un premier li- quide sucré renfermant 66,7 % de} -cyclodextrine, 26,0 % de glucosyl-: -cyclodextrine, 7,0 % de diglucosyl-. -cyclodcax- trine et 0,3 % de triglucosyl- -cyclodextrine; un deuxième liquide sucré renfermant 44,5 % de. -cyclodextrine, 34,7 % de glucosyl-,P -cyclodextrine, 16,7 % de diglucosyl- -cyclo- dextrine et 4,1 % de triglucosyl- -cyclodextrine; et un troisième liquide sucré renfermant 29,7 % deÉ-cyclodextrine, 34,9 % de glucosyl-.P-cyclodextrine, 24,5 % de diglucosyl- - cyclodextrine et 10,9 % de triglucosyl- -cyclodextrine. - EXEMPLE 3 Les opérations ont été conduites de la mbme façon que pour ltExemple 1, sauf que 1' -cyclodextrine est rempla- cée par laT-cyclodextrine, et l'on obtient ainsi un premier liquide sucré contenant 63,8 % de T -cyclodextrine, 28,0 % de glucosyl-1 -cyclodextrine, 8,0 % de diglucosyl- r-cyclo- dextrine et 0,2 % de triglucosyl-T-cyclodextrine; un deu- xième liquide sucré contenant 40,7 % deT -cyclodextrine, ,9 % de glucosyl-'r-cyclodextrine, 18,7'% de diglucosyl-.1- cyclodextrine et 4,7 % de triglucosyl-T-cyclodextrine; et un troisième liquide sucré contenant 25,9 % de T -cyclodex-- trine, 36,9 % de glucosyl-T -cyclodextrine, 26,9 % de diglu- cosyl-T-cyclodextrine et 10,3 % de triglucosyl-3-cyclodex- trine. REVENDICATION Procédé de préparation de cyclodextrines à ramifi- cations glucosyles multiples, qui consiste à mettre en con- tact une enzyme déramifiante avec un mélange de maltose ou d'une autre substance renfermant un malto-oligosaccharide et d'une cyclodextrine pour obtenir un produit réactionnel du- quel on sépare une cyclodextrine ramifiée, à transformer par l'action de'glucoamylase ladite cyclodextrine ramifiée en glucosyl-cyclodextrine, que l'on mélange ensuite avec du mal- tose ou une autre substance contenant un malto-oligosacchari- de, et à faire successivement agir une enzyme déramifiante et de la glucoamylase sur le mélange résultant.