FR 2625221 A1 19890630 FR 8718186 A 19871224 La présente invention concerne des compositions de proto- plastes bactériens stabilisés, un procédé de préparation de ces compositions et un procédé de conservation des protoplastes bacté- riens. Dans EP-A-O 246 163, on a décrit un procédé de traitement du lait en vue de l'obtention de fromages. Ce procédé consiste à ensemencer le lait à l'aide de protoplastes bactériens avant l'emprésurage de celui-ci. Les protoplastes bactériens mis en oeuvre dans ce procédé sont préparés selon les techniques connues de l'art antérieur, qui consistent essentiellement à éliminer la paroi bactérienne. Selon une de ces techniques, on met en oeuvre du lysozyme pour la préparation de suspensions de protoplastes. Ces suspensions de protoplastes sont à utiliser dans un délai très court après l'adjonction du lysozyme à la suspension bactérienne. Pour un emploi différé, de telles suspensions doivent être stabilisées notamment par l'incorporation à la suspension de protoplastes d'un stabilisant osmotique tel que du saccharose ou du lactose, à la concentration de 0,5 M ou par reconstitution, à l'aide de ladite suspension de protoplastes et de lait écrémé en poudre, d'un lait dont la pression osmotique est voisine de celle du contenu intracellulaire des protoplastes. Toutefois, de telles suspensions stabilisées ont une durée de conservation limitée. On a maintenant trouvé de façon surprenante des composi- tions de protoplastes bactériens au sein desquelles les proto- plastes sont stabilisés, c'est-à-dire ne subissent pas, au cours d'un temps de conservation prolongé, de dégradations qui, affectant leur membrane cellulaire, pourraient conduire à leur lyse. Selon un premier aspect, l'invention concerne donc des compositions de protoplastes stabilisés caractérisées en ce qu'elles sont constituées d'une suspension, à l'état congeLé ou à l'état lyophilisé, de protoplastes bactériens dans un milieu cryoprotecteur. D'une manière avantageuse, le milieu cryoprotecteur est du Lait écrémé. De telles compositions peuvent être préparées à partir des souches bactériennes connues. Parmi celles-ci, Les souches utiles pour une fermentation dans Le domaine des industries agro-alimentaires constituent un matériel de choix. Les souches de bactéries lactiques sont particulièrement bien adaptées. Parmi ces souches Lactiques, on peut classer notamment Les genres LactobaciLLus, Leuconostoc et Streptococcus; on peut également citer les bactéries alcalinisantes du groupe corynéforme parmi lesquelles le genre Arthrobacter et l'espèce Brevibacterium Linens jouent un rôLe déterminant, ainsi que les microcoques ou les bactéries propioniques dont l'action est bien connue pour les fromages présentant des ouvertures internes, tels que le gruyère de comté, et représentées essentiellement par le genre Propionibacterium. Les protoplastes mis en oeuvre dans les compositions selon l'invention sont obtenus selon l'art antérieur par action d'enzymes capables de rompre la paroi bactérienne. On opère avantageusement en présence de lysozyme selon le mode opératoire décrit dans le brevet EP-A-O 246 163. La suspension de protoplastes ainsi obtenue, éventueLLe- ment stabilisée par un stabilisant osmotique, tel que le saccha- rose, le lactose, à la concentration de 0,5 M, est ensuite soumise à une congélation dans un liquide cryoprotecteur. Il est possible en outre de soumettre le mélange congelé obtenu à une lyophi- lisation. La congélation doit nécessairement être rapide de manière à éviter la formation de cristaux de grande taille susceptibles d'altérer la membrane cellulaire des protoplastes. D'une manière préférée, le liquide cryoprotecteur est du lait écrémé. Bien entendu, on peut utiliser tout liquide présentant, notamment en ce qui concerne son niveau d'osmolarité, des propriétés équivalentes à celles du lait écrémé. Un traitement de congélation préféré consiste à placer, dans une enceinte dont la température est inférieure à -45 C, du lait écrémé contenant 101 à 1012 protoplastes par ml et réparti dans un ou plusieurs récipients de manière à constituer une couche de liquide de 0,5 à 2 cm d'épaisseur. Dans ces conditions, la composition congelée ainsi préparée acquiert une structure cristal- line complète en à peu près 1 heure. Cette composition peut ensuite être lyophilisée. La lyophitisation doit être conduite selon les règles connues de l'homme de l'art en tenant compte de la nature fragile du matériel biologique ici considéré. Les compositions de protoplastes bactériens ainsi obtenues peuvent être utilisées dans le procédé selon le brevet EP-A-0 246 163. Lorsqu'il s'agit de compositions congelées, iL convient au préalable de placer les récipients les contenant à une tempéra- ture permettant leur décongélation. Lorsqu'il s'agit de composi- tions lyophilisées, il convient de les réhydrater avec de l'eau distillée. Selon un autre aspect, l'invention concerne un procédé de conservation de protoplastes bactériens caractérisé en ce que a) les protoplastes sont introduits dans un liquide cryoprotecteur, b) la suspension résultante est soumise à une congélation et c) la composition congelée est stockée jusqu'à son utilisation. Un stockage à -80 C est particulièrement approprié. Ce procédé de conservation peut être perfectionné en soumettant la composition congelée à une lyophilisation. La compo- sition lyophilisée peut être stockée avantageusement à -25 C. Les exemples ci-après illustrent de manière non limita- tive l'invention. EXEMPLES I - PREPARATION DE COMPOSITIONS LYOPHILISEES A BASE DE PROTOPLASTES 1) Souches 8 souches ont été mises en oeuvre. Brevibacterium linens (CNRZ 221) Leuconostoc cremoris (CNRZ 361) Micrococcus sp. (CNRZ 468) Propionibacterium freundereichii subsp. shermanii (CNRZ 82) ci-après Propionibacterium. Streptococcus cremoris (CNRZ 106), ci-après S. cremoris Streptococcus lactis (souche isolée à partir du méLange lyophilisé commercialisé par les laboratoires ROGER sous l'appellation "Ferments mésophiles pâtes molles"), ci-après S. Lactis Streptococcus lactis diacetylactis (CNRZ 124) , ci-après S. lactis diacetylactis Streptococcus thermophilus (CNRZ 302), ci-après S. thermophilus * CNRZ = Centre National de Recherches Zootechniques (France) 2) Milieux, solutions et réactifs: - Milieux de croissance: MILIEU A (Milieu connu sous l'appellation M17 décrit par B. Terzaghi et al. dans Applied Microbiology, 23,6, 1975: 807-813) Composition: * Partie a: Peptone papainique de soja (Biokar, référence 116002)..... 5 g Peptone caséine viande (Biokar, référence 104008)..... 5 g Extrait de levure (Difco, référence 0127-05-3)... 2,5 g Extrait de boeuf (Difco, référence 0126-01-08).. 5 g Acide ascorbique........................................ 0,5 g Glycérophosphate disodique................................ 1 g MgS04,7 H20 I1 M........................................... 1 ml Eau distillée...............................qsq 950 ml Après ajustement du pH à 7,2 avec NaOH 4N, la partie a..DTD: est stérilisée par traitement thermique (120 C, 20 min). * Partie b: Lactose........................................... 10 g Eau distillée...............,.....................qsq 50 ml La partie b est stériLisée par filtration sur membrane de porosité 0,22 pm. Le miLieu A est obtenu en ajoutant La partie b à ta partie a. MILIEU B Bacto tryptic soy broth (Difco, référence 0370-01)..... 40 g Tampon MOPS acide 3-(n-morpholino) propane-sulfonique (Sigma, référence M 1254)....... ...................... 2 g Extrait de levure (Difco, référence 0127-053).......... 5 g Eau distillée........................................qsq 1 000 ml Après ajustement du pH à 7,2 avec de la soude 4N, le..DTD: milieu est stérilisé par traitement thermique (120 C, 20 min). MILIEU C Composition: D-glucose................................................. 10 g Extrait de boeuf (Difco, référence 0126-01-08)............ 10 g Peptone trypsique caséine (Biokar, référence 104001)...... 10 g Extrait de levure (Difco, référence 0127-05-3)............ 5 g Acétate d'ammonium. ..................................... 5 g Acetate de sodium...............DTD: ........................... 2 g Monolaurate de polyoxyéthyLènesorbitane (Tween(r80)........ 1 g MgSO4,7H20..........................................DTD: ....... 0,2 g MnS04,4H20............................................... 0,05 g Oligo-éléments en solution................................ 1 ml H3B03. ................................ 30 mg ZnCL2.200 mg Na2MoO4,2H20.....DTD: .......................... 20 mg FeCL 3,6H20..............................DTD: ... 50 mg CuSO4,5H20................................ 200 mg Eau distillée...........................qsp 500 ml Eau distillée................DTD: ..........................qsp 1000 ml..DTD: Le pH est ajusté à 6,7 avant stérilisation. Le milieu est stérilisé par traitement thermique (120 C, min). MILIEU D Composition: - Solution 1 D-glucose....................................... ..... 10 g Na2HP04,2H20.......................................... 2 g..DTD: KH2P04................................................ 2 9 24.2 g MgS04,7H20............................................ 0,5 g MnS04, 4H20............................................ 0,05 g Eau distillée..... ...............................qsq 900 ml..DTD: Le pH est ajusté à 6,8 avant stérilisation. La solution est stérilisée par filtration sur membrane de porosité 0,22 pm. - Solution 2 Composition: Extrait de levure (Difco, référence 0127-05-3).. ..... 10 g Eau distillée.......................................qsq 100 ml..DTD: Le pH est ajusté à 6,8 avant stérilisation. La solution est stérilisée par traitement thermique (120 C, 20 min). Le milieu D complet est obtenu en ajoutant la solution 2 à la solution 1. - Tampon pour l'obtention de protoplastes Composition: Saccharose......... .................................. 171 g NaCl.............................DTD: ...................... 0,584 g MgCl2......................................DTD: ........... 1,02 g Tampon tri (hydroxyméthyl) aminométhane-HCl mM, pH 8...DTD: .....................................qsq 1000 mI Le tampon est stérilisé par traitement thermique (120 C,..DTD: min). - Lait écrémé Du lait écrémé est reconstitué par addition de 930 mL d'eau distillée à 100 9 de poudre Régilait(. Il est stérilisé par traitement thermique (110 C, 20 min). - Solution de saccharose à 0,5 M Composition: Saccharose.................. ...............;.......... 171 g Eau distillée............................DTD: ............qsq 1000 ml Cette solutioQn est stérilisée par traitement thermique..DTD: (120 C, 20 min). - Solution de lysozyme de blanc d'oeuf Composition: Chlorhydrate de lysozyme des laboratoires G. ROGER (activité enzymatique 22.500 unités SHUGAR/mg)........... 2,5 g Eau distillée................................. ......qsq 100 ml Cette solution est stérilisée par filtration sur membrane..DTD: de porosité 0,22 pm. 3) Mode opératoire *Principe général: Les souches sont mises en culture de manière à disposer pour chacune d'elles d'une suspension de travail. L'obtention des protoplastes a pour point de départ ces suspensions de travail. Les suspensions de protoplastes obtenues sont soumises à une congélation puis à une lyophilisation. a) Culture des souches Les conditions de culture sont portées dans le tableau 1 ci-après. TABLEAU 1 TEMPS DEITEMPS DE TEMPERATURE PRECUL- CULTURE SOUCHE MILIEU ATMOSPHERE ( C) TURE (h) (h) Brevibacterium I linens B aerobiose 30 5 12 Leuconostoc cremoris - C aérobiose 30 5 18 Micrococcus sp. B aérobiose 30 5 8 Propionibacterium D anaérobiose 30 - 26 S. cremoris | A aérobiose 30 5 10 S. lactisA aérobiose 30 5 8 |S. lactis diacetylactis A aérobiose 30 5 10 S. thermophilus A aérobiose 37 5 16 Pour chaque souche à l'exception de celle de Propionibacterium, à partir d'une ampoule congelée à -80 C conte- nant environ 500 pl de suspension bactérienne, on inocule 10 ml de milieu de culture. Après incubation, cette préculture est trans- férée dans 500 ml de même milieu. La suspension obtenue est incubée sous agitation douce. La souche de Propionibacterium est également mise en culture à partir d'une ampoule congelée. Elle n'est pas soumise à une préculture. Le milieu ensemencé directement est mis à incuber sans agitation. Des suspensions de travail (ST) contenant environ 109 bactéries dénombrées sous forme d'unités formant des colonies (UFC) sont recueillies. b) Obtention des protoplastes. 1 I de suspension (ST) obtenue en a) est centrifugé (4825 g, 30 minutes). Le surnageant (S1) est éliminé. Le culot bactérien 'C1) est repris dans 300 mL d'eau physiologique. La suspension (SCI) obtenue est centrifugée (4825 g, 30 minutes). Le surnageant (S2) est éliminé. Le culot bactérien (C2) est repris dans 300 ml d'eau physiologique. La suspension (SC2) obtenue est centrifugée (4825 g, minutes). Le surnageant (S3) est éliminé. Le culot bactérien (C3) est repris dans 130 ml de tampon de protoplastisation. La suspension (SC3) obtenue est alors homogénéisée par agitation. Aux 130 ml de la suspension (SC3) qui contient env-on 1012 UFC sont ajoutés 20 ml de la solution de lysozyme. Le méla-ge obtenu est mis à incuber à 44 C sous agitation douce pencant 4 heures pour la souche de Micrococcus sp. et 2 heures pour chacne des autres souches. La suspension obtenue (SP1) contient les prc:o- plastes et des bactéries encore pourvues de leur paroi. L'efficacité des opérations conduisant à l'obtention zes protoplastes a été vérifiée par dénombrement des protoplas:es contenus dans les suspensions (SP1) à l'aide d'une cellule de MALASSEZ et par dénombrement des éléments figurés incapables de donner naissance à une colonie bactérienne après étalement de la suspension sur milieu gélosé. On a ainsi constaté que n'ont rés2sté au traitement décrit ci-dessus qu'une seule bactérie sur 10000 cour la suspension ST de S. lactis, qu'une seule bactérie sur 1000 cour les ST de Brevibacterium linens et qu'une seule bactérie sur 100 pour les suspensions ST de Micrococcus sp. et de Propionibacter-um. c) Congélation et lyophilisation La suspension (SP1) obtenue en b est centrifugée (à 2e30 g pendant 30 minutes, à +4 C). Le surnageant (S4) est éLi- miné. Le culot (C4) est repris dans 150 ml de la solution de saccharose. La suspension obtenue (SC4) est centrifugée (à 2830 g, pendant 30 minutes, à +4 C). Le surnageant (S5) est éliminé. Le culot (C5) est repris dans 12 ml de lait écrémé. La suspension obtenue (SC5) est homogénéisée avec pré:au- tion par aspiration et refoulement dans une pipette de 25 ml, puis est répartie, en flacons de type pénicilline, de façon que la suspension ait une épaisseur de 5 mm; des bouchons adaptés sont positionnés sur les flacons. Les flacons sont disposés sur les plateaux d'un lyophilisateur. Les plateaux sont portés dans un congélateur réglé à -80 C. Après un séjour d'au moins une heure dans cette enceinte, les plateaux sont introduits dans le lyophilisateur dont la cuve a été préalablement refroidie à -45 C. La lyophilisation est réalisée en 24 heures en portant en fin de lyophilisation le produit à 20 C. La fermeture des flacons est assurée dans la cuve de sublimation par abaissement des plateaux. II - Caractéristiques des compositions LyophiLisées Les 8 compositions préparées en I s'avèrent contenir un nombre élevé de protoplastes par unité de volume, après réhydrata- tion par addition d'eau physiologique sous un volume équivalent à celui que présentait la composition avant lyophilisation. Les comptages de protoplastes ayant été effectués à l'aide d'une cellule de MALASSEZ, les résultats ci-après ont été obtenus, les rendements inscrits exprimant le pourcentage de proto- plastes ayant résisté à la lyophilisation. TABLEAU 2 RENDEMENT DE LYOPHILISATION (%) Brevibacterium linens 41 Leuconostoc cremoris 24 Micrococcus sp. 50 Propionibacterium 33 S. cremoris 53 S. lactis 50 S. lactis diacetylactis 24 S. thermophitus 26 III- UTILISATION DE CONPOSITONS LYOPHILISEES A BASE DE PROTO- PLASTES LYOPHILISES EN FABRICATION FROMAGERE Deux essais ont été réalisés, l'un portant sur la fabri- cation d'un fromage à pâte molle stabilisée et à croûte mixte et morgée (1er essai), et l'autre portant sur la fabrication d'un fromage à pâte molle et à croûte lavée (2e essai). Les fabrications ont été conduites de manière tradition- nelle. Les protoplastes ont été ajoutés au lait en cuve de fabrica- tion avant l'addition de présure. Pour évaluer l'action des protoplastes, on a déterminé (1er essai) le degré d'affinage par mesure d'un paramètre physique. Des tests organoleptiques (2e essai) ont également été effectués. 1) Fabrication d'un fromage à pâte molle stabilisée et à croûte morgée mixte a) Protocole de fabrication La souche de Streptococcus lactis a été mise en oeuvre. Deux suspensions de protoplastes dans de l'eau physiologique, contenant l'une 1012 protoplastes et l'autre 101 protoplastes, sont préparées à partir d'une composition lyophilisée telle qu'obtenue au paragraphe I.2.c. L'essai a été partagé en 2 séries, différant l'une par rapport à l'autre par la quantité de protoplastes ajoutés, soit pour 100 litres de lait de fabrication non encore emprésuré: * série 1: 1010 protoplastes * série 2: 1012 protoplastes Description du fromage Fromage maigre: 25 % matière grasse/extrait sec 30. Format: unités de forme circulaire d'un poids moyen de 1,5 kg. Paramètres de fabrication Lait maturé à pH 6,4 avant addition de présure Ensemencement en flore lactique avec ferments FLORA DANICA Addition de présure Léger déLactosage en cuve Egouttage spontané jusqu'à pH 5,20 Salage en saumure pour obtenir un taux de sel compris entre 1,2 et 1,3 %. Paramètres d'affinage * Nature des ensemencements microbiens: Ensemencement dans le lait de microcoques et de ferments du rouge Ensemencement en surface d'un cocktail microbien constitué de microcoques, de ferments du rouge et de spores de Geotrichum candidum * Conduite de l'affinage: Maintien des fromages pendant 17 jours à 13-14 C Emballage Maintien des fromages à 8 C. Parallèlement aux séries 1 et 2, une fabrication témoin, pour laquelle il n'y a pas addition de protopLastes, a été réa- lisée. Des prélèvements d'échantillons sur les fromages des séries 1 et 2 et sur ceux de la fabrication témoin ont été effec- tués: - 48 heures après sortie saumure, - à l'emballage, - 8 jours après l'emballage, et 25 jours après l'emballage. b) Mesures effectuées L'évolution du degré d'affinage a été suivie pendant 38 jours en effectuant, sur des extraits aqueux préparés à partir des échantillons prélevés, une mesure de leur point de congélation et le calcul de l'écart (dans le sens d'un abaissement) le séparant de celui de l'eau distillée. 1) Méthode La méthode mise en oeuvre est une adaptation de cetlLe décrite par M. COURROYE (Revue Laitière Française, 462, 1987: 53-54). Chaque échantillon est traité comme indiqué ci-après: à 40 g de matière prélevée par carottage vertical à mi-distance entre le bord extérieur et le centre de chaque pièce de fromage sont broyés à l'aide d'un mixeur à usage culinaire. 10 g du broyat sont remis en suspension dans 40 ml d'eau ultra-purifiée. Cette suspension est mise à incuber à 80 0C pendant 20 minutes. L'extrait aqueux est prélevé. La pâte insoluble formée est lavée 2 fois avec 5 ml d'eau ultra-purifiée. Enfin, l'extrait aqueux et les eaux de lavage sont réunis et leur volume est complété, à l'aide d'eau ultra-purifiée, jusqu'à 50 ml. L'extrait global ainsi préparé est filtré sur papier WHATMAN I n 42. Le filtrat est recueilli; il est utilisé pour la détermination du degré d'affinage. Cette détermination s'effectue de manière indirecte par la mesure du point de congélation du filtrat puis le calcul de l'abaissement de celui-ci par rapport à celui de l'eau distillée. Plus le degré d'affinage est élevé et plus cet abaissement est important. L'appareil utilisé est un osmomètre automatique cryosco- pique (Roebling. Cet appareil mesure, à partir d'une prise d'essai de 100 pl de filtrat, le point de congélation de celui-ci, détermine l'abaissement résultant en le comparant à celui de l'eau distillée et, convertissant la valeur obtenue, affiche directement l'osmola- lité du filtrat. Par souci de cohérence avec les données de M. COURROYE cité ci-dessus qui exprime le degré d'affinage en termes d'abaisse- - ment cryoscopique mesuré en C, les valeurs d'osmolalité obtenues ont été converties en les reportant sur une courbe d'étalonnage construite à partir des données suivantes (tableau 3): TABLEAU 3 SOLUTION DE NaCl OSMOLALITE CONTENANT Xg de NaCl PAR REELLE ABAISSEMENT kg D'EAU milliosmoles CRYOSCOPIQUE ( C) X = 3,087 100 0,186 X = 6,260 200 0,371 X = 9,463 300 0,556 X = 12,684 400 0,741 X = 15,916 500 0,925 X = 19,147 600 1,109 X = 22,380 700 1,292 2) Résultats Les courbes portées sur la figure 1 rendent compte des mesures effectuées pour la série 1. La courbe Y1 correspond à la fabrication d'essai, la courbe TY1 correspond à une fabrication témoin réalisée dans des conditions identiques mais sans addition de protoplastes. On a vérifié par un test statistique que les écarts constatés entre les deux valeurs essai et témoin de chaque couple de mesures effectuées un même jour étaient significatifs. On observe que l'affinage sur la fabrication d'essai est toujours à un stade plus avancé que celui de la fabrication témoin. Un résultat identique a été observé avec la série 2. Sur le tableau 4 ci-après, on a reporté les valeurs mesurées, pour cette série 2, le 38e jour d'affinage: TABLEAU 4 ABAISSEMENT CRYOSCOPIQUE MESURE LE 38e JOUR t TEMOIN ( C) ESSAI ( C) _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ i _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ SERIE N 1 0,256 0,292 SERIE N 2 0,247 0,275 Il est ici constaté qu'il est possible en outre de con- trôler le degré d'affinage en introduisant plus ou moins de proto- plastes, l'affinage étant d'autant plus accéléré que la quantité de protoplastes ajoutée est importante. 2) Fabrication d'un fromage à pâte molle et à croûte lavée a) Protocole de fabrication 4 séries d'expériences ont été réalisées. Pour chaque série, une suspension de protoplastes, préparée à partir d'une souche particulière, a servi à l'ensemencement de 100 litres de lait de fabrication non encore emprésuré (tableau 5). TABLEAU 5 [QUANTITE DE PROTOPLASTES SOUCHE POUR 100 LITRES DE LAIT SERIE I Streptococcus lactis 103 SERIE 2 Brevibacterium linens 1012 SERIE 3 Micrococcus sp. 1012 SERIE 4 Streptococcus thermophilus 1012 Description du fromage Pâte molle à croûte Lavée, % de matière grasse/extrait sec, Format: unités de forme circulaire et d'un poids moyen de 500 g. Paramètres de fabrication Lait prématuré 14 heures à 11 C avec 0,1 % de ferments jusqu'à obtention d'un pH de 6,6 Maturation en cuve pendant 1 h 30 à 25 C avec 0,1% de ferments, Emprésurage à pH 6,45, Décaillage puis moulage, Egouttage en moule pendant 24 h, Saumurage pendant 1 heure (taux de sel: 1,8 % dans le fromage). Paramètres d'affinage Ressuyage des fromages Affinage des fromages à 13 C avec lavage deux fois par semaine avec une solution salée de Brevibacterium linens Les prélèvements d'échantillons ont été réalisés après: - 30 jours d'affinage, et 45 jours d'affinage. b) Mesures effectuées Des tests organoleptiques ont été réalisés le trentième et le quarante-cinquième jour d'affinage: 1. Méthodes Les tests ont consisté pour un jury de 4 personnes à: * apprécier de manière visuelle le degré d'affinage * apprécier de manière gustative le degré d'affinage * apprécier globalement la présentation des fromages. Les tableaux 6 et 7 rendent compte des résultats de ces tests. TABLEAU 6 Tests organoleptiques du trentième jour d'affinage appréciation Fabrication globale de la appréciation j Fabrication présentation appréciation visuelle gustative du | ______|des fromages du degré d'affinage degré d'affinage Témoin Normale Coeur dur important Arôme non développé Série 1 Normale Coeur légèrement dur Arôme et goût Série 2 Normale beaucoup moins étendu développés et Série 3 Normale que celui du témoin caractéristiques Série 4 Normale TABLEAU 7 Tests organoleptiques du quarante-cinquième jour d'affinage appréciation !globale de la appréciation |présenta- appréciation gustative tion des visuelle. du du degré Fabrication fromages degré d'affinage d'affinage Témoin Coulure sous Coeur dur Arôme plat La croûte importante Série 1 Normale Arôme et goût bien I développés i5 Série 2 Normale Pâte souple Tendance à l'amer- Affinage sensible- turne ment identique à Série 3 Normale celui constaté le Arôme et goût bien 30e jour développés Série 4 Normale Arôme et goût bien développés Préalablement à l'analyse des résultats, il doit être noté que l'obtention d'un arôme et d'un goût bien développés néces- site habituellement, pour une fabrication traditionnelle identique à celle ici mise en oeuvre pour le témoin, un affinage de deux à deux mois et demi et que le plus souvent certains défauts tels qu'une couture sous la croûte sont effectivement constatés lorsque les fromages sont examinés le quarante-cinquième jour de l'affi- nage. Les résultats présentés indiquent que l'addition de protoplastes a permis d'obtenir en 30 jours des fromages dans un état de maturation auquel on n'a pu parvenir sans protoplastes qu'au bout de 45 jours. L'accélération de l'affinage, ici mis en. évidence, n'a pas été accompagnée d'une altération de leur valeur gustative ou de leur présentation. Il doit être d'autre part noté que d'une manière surprenante l'affinage de ces fromages d'essai s'est stabilisé: aucune évolution notable n'étant constatée entre le trentième et le quarante-cinquième jour d'affinage. Ce dernier résultat est remarquable; ceci indique que de tels fromages pourraient être livrés après seulement 30 jours en cave d'affinage et être proposés à la vente sans évolution pendant une période prolongée. REVENDICATIONS 1. Composition de protopLastes bactériens stabilisés, carac- térisée en ce qu'elle est constituée d'une suspension, à L'état congelé ou à l'état lyophilisé, de protoplastes bactériens dans un milieu cryoprotecteur. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le milieu cryoprotecteur est du lait écrémé. 3. Composition selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que les protoplastes sont issus d'une souche bactérienne utile pour une fermentation dans le domaine des industries agro-alimentaires. 4. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite souche bactérienne est une souche de bactéries lactiques. 5. Procédé de préparation d'une composition selon la reven- dication 1, caractérisé en ce que l'on soumet des protoplastes en suspension dans un liquide cryoprotecteur à une congélation. 6. Procédé de préparation selon la revendication 5, caracté- risé en ce qu'en outre la suspension congelée est soumise à une lyophilisation. 7. Procédé de préparation selon l'une ou l'autre des reven- dications 5 et 6, caractérisé en ce que le liquide cryoprotecteur est du lait écrémé. 8. Procédé de conservation de protoplastes bactériens, caractérisé en ce que a) les protoplastes sont introduits dans un liquide cryoprotecteur, b) la suspension résultante est soumise à une congélation et c) la composition congelée est stockée jusqu'à son utilisation. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en outre en ce que la composition congelée est soumise à.une lyophilisation et la composition lyophilisée est stockée jusqu'à son utilisation.