FR 2628324 A1 19890915 FR 8903085 A 19890309 i I 1 La presente invention est relative a des compositions pharmaceutiques antivirales et immunostimulantes. Un autre aspect de la présente invention concerne la fourniture d'un procédé pour la préparation de ces compositions. ) L'action antivirale avantageuse d'acides- gras w-3 polyinsaturés [l'acide 5,8,11,14,17-eicosapentaènofque [par la suite: I'EPA) et l'acide 4,7,10,13,16,19-docosahexaènoique (par la suite: le DHA)] a attiré fortement l'attention. Szads [Antimicrobial Agents and Chemoterapy 12, 523 (1977)] a montré par des expériences in vitro, que des acides gras polyinsaturés, par exemple à la fois l'EPA et le OHA, sont capables d'inhiber une réplication de virus. Ce fait a été indiqué par Reinhardt et coll. [J. of Virology 25, 479 [1977]] étudiant l'inhibition de la réplication sur un bactériophage PR 4. L'effet antiviral d'acides gras polyinsaturés et entre , autres, celui de l'EPA et du DHA, est décrit en détail dans la description du brevet US No. 4.513.008. L'effet de l'EPA et du ODHA a été comparé dans des expériences animales effectuées sur des souris et des cobayes, à celui de l'Acyclovir [9-(2- hydroxyéthoxyjméthyl)-guanine], qui est l'agent antiviral le plus souvent utilisé actuellement Il a été établi que les compositions contenant en particulier du DHA, étaient plus actives contre le virus de l'herpès que l'Acyclovir. Un certain nombre d'articles a été consacré à l'effet antiviral du DHA et de l'EPA, comme ceux de Whitaker et col. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5919 (1979)] ainsi que de Goodnight et coll. [Arteriosclerosis, 2, 87, (19821] et de Yoshiaki [Biochimica et Biophysica Acta 793, 80 [1984)1. Prichett et coll. [lmmunolog= 46, 819 (1982)1] ont montré que la réponse immune humorale était stimulée par l'acide eicosapentaènoïque utilisé en tant qu'analogue de l'acide arachidonique. Avec un régime riche en EPA, la production spécifique d'lg et d'lgE en réponse à l'albumine de l'oeuf, était augmentée de 4 à 8 fois par rapport au témoin, chez des rats Sprague-Dawley consanguins. Selon cet article, une réponse accrue en anticorps était induite par le régime riche en EPA. De plus, il a été montré par- les études que I'EPA agit en inhibant le système de prostaglandines suppresseur et peut ainsi inhiber ou corriger, respectivement, l'immunodéficience accompagnant le vieillissement ou d'autres processus pathologiques (processus a.utoimmuns, tumorogénèse). Ges constatations ont été rapportées dans les articles de Kelley et coll. [J. of Immunol. 134, 1914 ( 1985)] ainsi que de Homey et coll. [Clin. Exp. Immunol; 65, 473 (19861]. On sait depuis longtemps grâce à des études in vive de Pearson et col. [Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 79, 409 [1952)] que la L- lysine a un effet d'inhibition du virus de l'encéphalomyélite. Plus tard, Tankerslay [J. Bact. 87, 609 (1964)] a attiré l'attention sur le fait que la réplication du virus de l'herpès simplex (par la suite: HSV) est inhibée par la lysine dans des cellules humaines dans des conditions in vitro, A partir d'examens humains, Kagan a rapporté [The Lancet, 1, 137 (1974)] qu'à la fois les lésions orales et génitales induites par HSV disparaissaient très rapidement à la suite d'un traitement avec la L-lysine. Griffith et coil. [Dermatologica, 156, 257 (1978)] ont étudié l'action thérapeutique de la L-lysine à diverses doses sur 45 malades infectés par HSV I et HSV Il, pendant des. périodes de traitement variées. L'âge des malades (surtout des femmes) était compris entre 8 et 60 ans. Il a été établi que la L-lysine exerçait uniquement un effet suppresseur mais pas d'effet curatif sur le HSV. Le but de la présente invention est de fournir une nouvelle composition pharmaceutique combinant les effets thérapeutiques avantageux d'acides gras w-3 insaturés à ceux d'aminoacides et de certains aminoacides essentiels, en particulier la uysine, I'ornithine et l'histidine, et présentant une action plus forte que celle de tout agent antiviral connu jusqu'à maintenant. L'invention repose sur la constatation selon laquelle les effets antiviraux avantageux connus séparément in se des acides gras w-3 insaturés, en particulier de l'EPA et-du DHA, ainsi que des aminoacides, respectivement, en particulier de la lysine, sont augmentés de façon synergique dans un mélange formé à partir de ceux-cl et de plus, le mélange présente également une action immunostimulante. Ainsi, la présente invention concerne une composition pharmaceutique antivirale et/ou immunostimulante, qui comprend comme composants actifs, des aminoacides apparaissant dans des organismes vivants (comme la taurine, la cyclosérine, I'homosérine, l'homocystéine, la canavanine, la sarcosine, I'hydroxyproline, l'hydroxylysine, la 4-hydroxyphénylalanine, des aminoacides essentiels) et/ou leurs dérivés dans lesquels le groupe carboxy est substitué par un groupe alkyle en C 1-4 ou un groupe amino ou par un cation métal alcalin, métal alcalino-terreux ou ammonium, de préférence un cation sodium ou potassium; ou les hydrates et/ou sels de ces composés, avec un ou plusieurs acides gras en Cl 8-24 contenant un groupe alkyle portant au moins deux doubles liaisons, *15 éventuellement en mélange avec des supports et/ou des additifs et des antioxydants utilisés couramment dans l'industrie pharmaceutique, dans laquelle le rapport molaire de l'aminoacide et du ou des acides gras est de 1:4 à 4:1. Des acides gras w-3 en C1 8-24 contenant au moins deux doubles liaisons et des aminoacides, de caractère basique, sont de préférence utilisés comme composants des compositions selon la présente invention. il est convenable d'utiliser la lysine, I'histidine ou l'ornithine, ou leurs dérivés comme aminoacides essentiels ayant un caractère basique. iDes substances habituellement employées dans l'industrie pharmaceutique comme le lactose, l'amidon ou le stéarate de magnésium, peuvent être utilisées comme supports et additifs dans les compositions selon l'invention. Pour inhiber l'oxydation de la composition, il convient d'utiliser de l'ttocophérol [vitamine El, du glutathion ou des antioxyJdahts traditionnels comme le butylhydroxytoluène. Parmi les compositions selon l'invention, l'activité et la toxicité éventuelle de mélanges contenant un mélange d'acides gras -3 polyinsaturés (contenant 27,6% d'EPA et 44,6% de OHA) et de la L-lysine selon des rapports molaires de l:1, 1:4 et 4:1, respectivement (compositions d'essai) ont été étudiées par l'intermédiaire de l'effet que ces mélanges exercent sur la propagation et la morphologie des cellules Hel 2 (lignée cellulaire de tumeur épithéliale humaine). Ces expériences ont été effectuées sur une feuille de culture de tissus en matière plastique, contenant 6x4 espaces creux (trous ayant une surface au sol de 1,9 cm2 chacun). Une solution mère contenant la composition d'essai à une concentration de 10 mg/ml, a été préparée dans un milieu MEM d'Eagle (fabriqué par Serva EmbH Co., Heidelberg, PFA}. Un aliquot de la solution mère a été dilué l0 fois, la solution obtenue a été diluée deux fois et ensuite, la dernière solution a été soumise à deux reprises à la dilution double, fournissant des concentrations successivement décroissantes de la composition d'essai (solutions No. 1 à 5}. Les cellules ont été traitées avec 1 ml de chacune des solutions contenant le composant actif aux concentrations suivantes: Solution No. Concentration Jlg/ml 1 10000 2 1000 3 500 4 250 5 125 Le traitement a été effectué pendant 1 heure, puis les cultures ont été lavées deux fois avec une solution tamponnée de chlorure de sodium (solution saline tamponnée au phosphate, dénommée par la suite PBS), puis un milieu nutritif a été ajouté aux cultures. 24 heures plus tard et après fixation par du méthanol, les cultures ont été teintées par une solution 13iemsa éthanolique (fabriquée par Peanal, Budapest, Hongrie) et la morphologie des cellules a été évaluée au microscope à éclairement. On a pu établir que le composé d'essai ne se révélait toxique qu'au dela d'une concentration de 1000 Jig/ml. L'effet d'inhibition de la réplication virale a été examiné sur des cellules IHep 2 de la façon décrite plus haut Le Type I de HSV a été utilisé pour l'infection. La concentration du virus s'élevait à environ 1000 PFU (unité formant une plaquel. Des solutions contenant la composition d'essai à la concentration de 1000, 500 et 250 Jig/mi, respectivement, ont été utilisées et pour le traitement, 0,1 ml de solution était ajouté à la suspension de virus non diluée. Le mélange a été incubé à 37C pendant 1 heure. Ensuite, les cellules ont été traitées par le virus préincubé avec la composition d'essai et le développement d'altérations cytopathologiques (CP) a été observé pendant 7 jours, On a pu établir que la réplication virale était directement inhibée par une dose de 500 Ilg/ml ou de 250 pg/ml de la composition d'essai: la valeur du titre infectieux de la dose cytopathologique (nég. log. CPOso) était de 1,75 à 2,04 calculée pour 0,1 mi, par rapport à la valeur de néZ. Ioi. CPDOO de 4,5 présentée par la culture de virus témoin non traitée. La valeur de l'inhibition virale dépasse de deux ordres de grandeur celle du témoin. Dans les mêmes conditions, I'EPA et le DI-HA ne manifestaient aucune inhibition virale notable et la lysine elle-même n'inhibait la réplication virale que d'environ un ordre de grandeur de plus par rapport au témoin. Le virus vaccin a été aussi traité dans une expérience in vitro effectuée de la façon décrite ci-dessus. La valeur de nég. log. CPOSO de la composition d'essai mesurée sur le virus vaccin était de 1,75 à 2,15 par rapport à la valeur de 5,5 du virus témoin non traité, c'est-àdire que la composition d'essai présentait un effet d'inhibition du virus qui était de trois ordres de grandeur supérieur à celui du témoin. L'action in vitro sur le système immun des compositions selon l'invention a été étudiée sur l'activation des lymphocytes par des mitogènes polyclonaux On a étudié la transformation blastique des lymphocytes en déposant à la pipette une population cellulaire de lymphocytes obtenue sur un gradient Fico Uromiro [Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21, 97 (19681] dans les trous creux de feuilles à fond plat, puis en ajoutant 25 JIp/ml de Concanavaline A (dénommée Con A). (fabriquée par Pharmacia, Uppsala, Suède) et ensuite une solution contenant les compositions selon l'invention à une concentration de 0,1, 1,0 ou 10 jg/ml respectivement, dans chacune des cultures parallèles. Une culture contenant 25 ig/ml de Con A sans composition d'essai a été utilisée comme témoin. Les feuilles ont été maintenues dans une atmosphère d'air contenant 5% de dioxyde de carbone à 37'C pendant 72.heures et 0,4 JCi de 3H-thymidine a été ajouté à chaque échantillon 64 heures plus tard, avant l'arrêt de la culture. 72 heures plus tard, les cultures ont été filtrées à travers un filtre en verr-e, les filtres ont été placés dans une cuvette de scintillation et la radioactivité a été mesurée à chaque fois dans 5 ml de solution toluènique avec un dispositif compteur de rayonnement béta. Les résultats sont rassemblés dans le tableau suivant. No. Composé Conc. du Coups/minute Evaluation de (nom) comp. actif (cpm) I'effet (ig/g) I Témoin 25 8969 + 2984 (Con A) 2 L-tyrosine 0,1 12915 2045 croissance peu significative 3 L-lysine 0,1 11063 + 1528 pas significatif 1,0 11833 + 1823 croissance peu significative 4 Sel de Na d'un 0,1 12332 + 2235 pas significatif mélange d'acides gras w-3 (voir la 1,0 12039 1640 pas significatif comp. dans. ex 1) - Témoin 25 8396 2233 (Con A) 6 Prod. de l'ex. 5 0,1 14605 1747 croissance forte- ment significative 1,0 12010 +2285 pas significatif 7 Prod. de l'ex. 1 0,1 16085 + 2063 croissance forte- ment significative 1,0 14681 1769 crois. significative 8 Prod. de l'ex. 3 0,1 12661 + 1548 crois. significative 1,0 12420 + 1452 crois. significative 9 Prod. de l'ex. 4 0,1 11920 + 2005 crois. significative 1, 0 12240 1950 crois. significative Il est évident d'après ces examens que les compositions selon l'invention, en particulier le mélange d'acides gras polyinsaturès utilisé avec la lysine et la tyrosine, ont donné un résultat significatif dans les essais, c'est-à-dire un fort effet 3_5 immunostimulant, tandis que les composants séparés des matières d'essai selon l'invention en eux-mêmes n'avaient qu'une action biologique faible ou nulle. Il convient d'utiliser comme matière de départ d'acides gras w-3 insaturés en Cl8-24 représentant un composent de la composition, principalement des huiles pouvant être obtenues à partir de poissons des mers septentrionales comme le saumon, la morue, la sardine ou de leur foie, mais des huiles provenant de poissons d'eau douce peuvent aussi être employées. Les acides gras w-3 polyinsaturés peuvent être obtenus à partir des huiles ci- dessus par une méthode connue [J. Am. Chem. Soc. 59, 117 (1982)]. Ces acides gras sont susceptibles de subir une oxydation. Pour inhiber l'oxydation, il convient d'utiliser des antioxydants comme par exemple la vitamine E. Les composants actifs mentionnés plus haut peuvent f5 être mis sous forme de gélules, comprimés, dragées ou d'autres compositions pharmaceutique formulées selon une méthode connue en elle-même. Les principaux avantages de la composition pharmaceutique selon la présente invention peuvent être résumés de la façon suivante; a) L'effet thérapeutique antiviral des composants actifs de la composition est augmenté de façon synergique. b) Elle peut être utilisée contre des infections virales aiguës, en particulier des. infections par un virus de l'herpès, pour supprimer l'infection au cours d'une étape initiale. c) Grâce à l'effet immunostimulant, elle peut être de préférence utilisée contre des rétrovirus, en particulier contre les syndromes d'immunodéficience (par exemple le SIDA) induits par les virus de types HTLV III et IV. d) Elle contient exclusivement des composés actifs naturels qui sont essentiels du point de vue biologique; ainsi, elle est utile pour.un traitement prophylactique, de longue durée, de type cure en cas de risque d'infection virale ainsi que dans des maladies du système immun. e) Elle agit aussi de façon interne; on peut ainsi éviter le 9- traitement externe incommode couramment utilisé dans le traitement antiviral. Les compositions suivant la présente invention sont illustrées en détail dans les exemples non limitatifs suivants. EXEMPLE 1 164 g 1 mole) de L-lysine monohydratée et 320 g [environ i mole) d'un mélange d'acides gras w-3 polyinsaturés (contenant 27,6% d'EPA et 44,6% de DOHA sont mélangés à la' température ambiante. Le mélange homogène ainsi obtenu est introduit par un procédé d'encapsulation connu, dans des gélules de gélatine dure capables de recevoir 500 mg de composant actif. EXEMPLE 2 165 g (1 mole) de L-histidine sont mélangés avec 320 g (environ 1 mole) d'un mélange d'acides gras w-3 polyinsaturés, (contenant 27,6% d'EPA et 44,6% de DHA). La procédure décrite dans l'exemple 1 est ensuite suivie. EXEMPLE 3 41,0 g (0,25 fnole) de L-lysine monohydratée sont mélangés avec 320 g (environ 1 mole) d'un mélange d'acides gras w-3 polyinsaturés (contenant 90,0% d'EPA et 0,1 % de vitamine E), puis la procédure décrite dans l'exemple 1 est suivie. EXEMPLE 4 La procédure de l'exemple 3 est suivie, sauf que164 g 1 mole) de L-lysine monohydratée et en tent qu'acide gras polyinsaturé, 328 g (1 mole) d'acide docosahexaènoique (1HA) [fabriqué par Sigma, St Louis, USA, sous le numéro de catalogue D- 6508 (1987)] sont utilisés. EXEMPLE La procédure de l'exemple 1 est suivie, sauf que la L-lysine est remplacée par 181 g (1,0 mole) de L-tyrosine. EXEMPLE 6 La procédure de l'exemple 1 est suivie, sauf que la L-lysine est remplacée par 120 g! 1,0 mole) de L-thréonine. EXEMPLE 7 La procédure de l'exemple 3 est suivie, sauf que 164 g (1 mole) de Llysine monohydratée et 80 g (environ 0,25 mole) d'un mélange d'acides gras w-3 polyinsaturés (contenant environ 90,0% de DFHA et 0,1% de vitamine E) sont utilisés. EXEMPLE 8 La procédure de l'exemple 3 est suivie, sauf que 164 g (1 mole) de Llysine monohydratée et qu'à la place d'un mélange d'acides gras polyinsaturés, 302 g ( 1 mole) d'acide eicosapentaènoîque (EPA) [fabriqué par Sigma, St Louis, USA, sous le numéro de catalogue E-7006 (1 987)] sont utilisés. EXEMPLE 9 La procédure de l'exemple 1 est suivie, sauf que la L-lysine est remplacée par 132 g ( 1,0 mole) de L-ornithine. EXEMPLE 10 La procédure de l'exemple 3 est suivie, sauf que la L-lysine est remplacée par 33 g (0,25 mole) de L-ornithine, EXEMPLE I 1 La procédure de l'exemple 4 est suivie, sauf que la L-lysine est remplacée par 132 g (1,0 mole) de L-omrnithine. EXEMPLE 12 La procédure de l'exemple 1 est suivie, sauf que la L-lysine est remplacée par 133 g ( 1,0 mole) d'acide L-aspartique. EXEMPLE 13 La procédure de l'exemple 1 est suivie, sauf que la 1!, L-lysine est remplacée par 211 g (1,0 mole) de chlorhydrate de L-arginine. EXEMPLE 14 La procédure de l'exemple 1 est suivie, sauf que la L-lysine est remplacée par 105 g ( 1,0 mole) de L-sérine. EXEMPLE 15 La procédure de l'exemple 1 est suivie, sauf que la L-lysine est remplacée par 145 g (1,0 mole) de L-g!utamine. EXEMPLE 16 Préparation de comprimés Des comprimés sont préparés à partir de la composition décrite dans l'exemple 1; ils contiennent chacun les composants suivants: mg Composition de l'exemple 1 600 Lactose 120 Amidon 63 Polyvinylpyrrolidone 3,5 Stéarate de magnésium 3,6 Les comprimés peuvent éventuellement être revêtus d'un enduit de sucre avec une machine adéquate. REVENDICATIONS 1. Composition pharmaceutique antivirale et/ou immunostimulante, caractérisée en ce qu'elle comprend en tant que composants actifs; des aminoacides apparaissant dans des organismes vivants et/ou leurs dérivés dans lesquels le groupe carboxy est substitué par un groupe alkyle en C14 ou un groupe amino ou par un cation métal alcalin, métal alcalinoterreux ou ammonium; ou les hydrates et/ou sels de ces composés, avec un ou plusieurs acides gras en C 1 8-24 contenant un groupe alskyle portant au moins deux doubles liaisons, éventuellement on mélange avoc dos supports et/ou des additifs et des antioxydants utilisés couramment dans l'industrie pharmaceutique, dans laquelle le rapport molaire de l'aminoacide et du ou des acides gras est de 1:4 à 4: 1. 2. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend des acides gras obtenus à partir des huiles de poissons en tant qu'acides gras insaturés. 3. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend l'acide eicosapentaènoique (EPA) et la L-lysine comme composants actifs. 4. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend l'acide docosahexaènoique (DHA) et la L-lysine comme composants actifs. 5. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend l'acide docosahexaènoique, l'acide eicosapentaènoïque'et la L-lysine comme composants actifs. 6. Procédé pour la préparation d'une composition pharmaceutique antivirale et/ou immunostimulante, caractérisé en ce qu'on mélange en tant que composants actifs: des aminoacides apparaissant dans des organismes vivants et/ou leurs dérivés dans lesquels le groupe carboxy est substitué par' un groupe alkyle en C1l-4 ou un groupe amino ou par un cation métal alcalin, métal alcalino-terreux ou ammonium; ou les hydrates et/ou sels de ces composés, avec un ou plusieurs acides gras en C 18-24 contenant un groupe alkyle portant au moins deux doubles liaisons, éventuellement avec des supports et/ou des additifs et des antioxydants utilisés couramment dans l'industrie pharmaceutique, et qu'on les met sous formQ d'une composition pharmaceutiquQ, dans laquQliQ IQ rapport molaire de I'aminoacide et du ou des acides gras est de 1:4 à 4:1. 7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce qu'on utilise des acides gras obtenus à partir des huiles de poissons en tant qu'acides gras insaturés. 8. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce qu'on utilise l'acide eicosapentaènoique (EPA) et la L-lysine comme composants actifs. 9. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce qu'on utilise l'acide docosahexaènoique (DHA) et la L-lysine comme composants actifs. 10. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce qu'on utilise l'acide docosahexaènoîque, I'acide eicosapentaènoique et la L-lysine comme composants actifs.