FR 2632309 A1 19891208 FR 8807530 A 19880607 L'invention concerne la séparation de protéines, notamment de Facteur VIII, à partir d'une fraction de plasma humain ou animal par chromatographie d'échange d'anions selon une technique permettant d'obtenir en une seule étape un taux de purification très important. La mise à disposition de protéines du sang nécessite, pour leur utilisation à des fins thérapeutiques, des techniques de purification permettant d'obtenir des produits de haute pureté et totalement dépourvus de contaminants, notamment d'autres protéines ou de substances d'origine étrangère telles que des anticorps. Ainsi, il est essentiel, dans le traitement de l'hémophilie A, de disposer de concentrés de Facteur VIII de très haute pureté car, du fait de la haute répétabilité des traitements par les concentrés de Facteur VIII, les malades - sont soumis à des apports simultanés de quantités importantes de fibrinogène et d'immunoglobulines G qui peuvent altérer leurs fonctions immunitaires.'Le besoin en concentré de Facteur VIII de très haute pureté pourrait ainsi être particulièrement, mais non exclusivement, pressant chez les hémophiles A atteints de Sida, ou les malades séropositifs, pour lesquels les fonctions immunitaires sont altérées. Les concentrés de Facteur VIII sont le plus souvent préparés à partir de la fraction plasmatique humaine cryoprécipitée. La pureté des concentrés de Facteur VIII généralement obtenus dans les centres industriels de traitement du plasma humain est souvent de l'ordre de 1 UI/mg et n'excède généralement pas les limites de 10 à 20 UI/mg. Les techniques de production classique font appel à des étapes de précipitation qui visent à éliminer, souvent très imparfaitement, les contaminants protéiques tels que le fibrinogène, la fibronectine, et les immunoglobulines. Ces techniques peuvent utiliser ou combiner une précipitation à faible température (10 C), ou l'adjonction d'agents de précipitation des protéines; ainsi des polymères hydrophiles tels que le PEG (Newman et al., Br. J. Haematol 21:1-20, 1971; Hao et al., in Methods of Plasma Protein Fractionation Academic Press 1980. pp. 57 - 74), la polyvinylpyrrolidone (Casillas et Simonetti, Br. J. Haematol, 50:665-672, 1982), le dextran, le Ficoll, le Percoll, l'amidon hydroxyéthylé et lialbumine ont été proposés comme agent de précipitation du complexe Facteur VIII (Farrugia et coll., Thromb Haemostas, 51:338-342, 1984). Il en est de même de l'usage de glycocolle et de chlorure de sodium préconisé par Thorell et Blômback. De la même façon, certains auteurs (Ng et ai, Thrombosis Res., 42:825-834, 1986) ont réussi à combiner trois agents de précipitation qui sont le PEG, le glycocolle, et le chlorure de sodium pour obtenir des concentrés de Facteur VIII à activité spécifique comprise entre 10 et 16 UI/mg. On a fait appel aussi à des techniques de chromatographie d'exclusion stérique, ou tamisage moléculaire, qui visent à la récupération d'une fraction de haut poids moléculaire contenant le complexe Facteur VIII:c- Facteur Willebrand partiellement dépourvu de fibrinogène. Cette technique fournit à faible rendement un produit dont l'activité spécifique ne dépasse pas 30' UI/mg et qui requiert l'adjonction d'albumine comme stabilisant (conduisant à un abaissement de l'activité spécifique à environ 3 à 5 UI/mg). Cette technique pose quelques problèmes d'adaptation à grande échelle car il est difficile de maintenir constant dans le temps le pouvoir de résolution des colonnes industrielles de tamisage moléculaire. Des concentrés de Facteur VIII ont été produits également en intégrant au protocole de production un contact avec des billes de silice poreuse destinées à emprisonner les contaminants protéiques de faible poids moléculaire (Margolis et al., Vox Sang. 46:341-348, 1984). L'activité spécifique du produit reste relativement faible: lUI/mg. Des techniques nouvelles sont récemment apparues dans l'élaboration de concentrés de Facteur VIII de très haute pureté. Ainsi les firmes Hyland et Travenol ont elles proposé des concentrés obtenus par des méthodes de chromatographie d'immunoaffinité (Zimmerman et Fulcher, Thrombosis Res., Suppl. VII, p. 58, 1987; Berntorp et Nilsson, Thrombosis Res., Suppl. VIii p. 60, 1987; Levine et al., Thrombosis Res, Suppl. VII, 1987). Ces techniques consistent à purifier le Facteur VIII à l'aide d'anticorps anti-Facteur VIII:c ou anti-Facteur Willebrand immobilisés sur un support chromatographique.De plus, ces techniques exigent l'emploi de solutions drastiques pour désorber le Facteur VIII soit de son anticorps soit du Facteur Willebrand. Une étape supplémentaire d'ultrafiltration visant à éliminer les agents chimiques indésirables est donc nécessaire mais elle peut nuire à l'activité biologique du Facteur VIII. L'activité spécifique du Facteur VIII peut atteindre 1000 à 3000 UI/mg en cours de production, mais sa fragilité exige l'adjonction d'un stabilisant, tel que l'albumine, avant l'étape de lyophilisation, ce qui réduit l'activité spécifique du Facteur VIII à 3 à 5 UI/mg. Le plus grave problème posé par ces produits reste néanmoins la présence d'anticorps résiduels; ceux-ci étant d'origine murine, ils peuvent entrainer chez les malades l'apparition de réactions immunologiques vis à vis de ces protéines étrangères à l'organisme humain. On a égflement utilisé des techniques de chromatographie d'échange d'ions, mais compte tenu de la complexité des processus opératoires et des faibles rendements obtenus, ces techniques sont restées au stade du laboratoire. Ainsi l'article de J.J. Morgenthaler (Thromb. Haemostas., Stuttgart, 47(2) 124 - 127 (1982>) étudie la purification de Facteur VIII:c à partir de précipité au polyéthylèneglycol par passage sur une résine de Sepharose modifiée. Aucune indication n'est donnée sur le rendement et la reproductibilité des différentes techniques testées. Il est donc tout à fait essentiel de disposer de nouvelles méthodes d'obtention de concentrés de protéines, et notamment de Facteur VIII, applicables à l'échelle industrielle et donnant des produits de très haute pureté, totalement dépourvus de protéines d'origine étrangère telles que des anticorps d'origine animale. La Demanderesse a ainsi mis au point un procédé de purification par chromatographie d'échange d'anions, qui, grâce à un choix judicieux de la résine utilisée, permet de séparer sur une seule colonne chromatographique les protéines recherchées dans des conditions suffisamment ménagées pour rendre inutile les traitements ultérieurs,tels que l'ultrafiltration, qui augmentent la complexité du procédé et provoquent en outre une baisse importante de l'activité de la protéine séparée. L'invention concerne donc un procédé de purification de protéines du plasma, et plus particulièrement de Facteur VIII, de fibrinogène, de fibronectine et de Facteur Willebrand, caractérisé en ce qu'on soumet une fraction solubilisée d'un précipité de plasma humain ou animal à un traitement par voie chromatographique sur une résine échangeuse d'anions de caractère ionique relativement modéré et permettant également la mise en jeu d'interactions hydrophobes, qui n'adsorbe pas certaines protéines et qui en fixe d'autres que l'on élue ensuite spécifiquement par augmentation de la force ionique du tampon. On peut ainsi utiliser comme fraction de départ une fraction plasmatique cryoprécipitée ayant éventuellement subi un traitement préalable de purification. Ce traitement préalable peut consister par exemple en une précipitation au gel d'alumine et/ou une précipitation à basse température selon les techniques classiques de traitement de telles fractions. Parmi les différentes résines testées il s'est avéré que les résultats les plus satisfaisants étaient obtenus en utilisant des groupements DEAE greffés sur un gel de polymère vinylique, tel que le Fractogel TSK. Une résine de ce type est disponible dans le commerce sous l'appellation Fractogel TSK-DEAE 650 (M) (Merck). Ce support chromatographique a fourni des résultats nettement supérieurs aux autres gels testés, comme la DEAESépharose CL-6B, DEAE-Sépharose CL-6B Fast-Flow (Pharmacia), ou la DEAE-Trisacryl LS (IBF). En utilisant une telle résine pour traiter une fraction de plasma contenant du-Facteur VIII, par exemple une solution plasmatique purifiée du cryoprécipité, on obtient, dans des conditions de tampon appropriées, un concentré de Facteur VIII de très haute pureté isogroupe (activité spécifique supérieure à 100 UI/mg), à une concentration, sans avoir à recourir à une étape d'ultrafiltration, de l'ordre de 50 UI/ml et de grande stabilité, c'est-à-dire qui ne nécessite pas l'adjonction d'un stabilisant de nature protéique. On obtient aussi parallèlement des fractions de fibrinogène, fibronectine et Facteur Willebrand répondant aux paramètres physico- chimiques satisfaisant à un usage thérapeutique ou à titre de réactif. La mise en oeuvre du procédé selon l'invention s'effectue dans ce cas comme suit.'- La fraction de plasma contenant en plus du Facteur VIII les protéines majeures du cryoprécipité, c'est-à-dire le fibrinogène, la fibronectine et le Facteur Willebrand, passe sur une résine échangeuse d'anions telle que spécifiée ci-dessus; Le Facteur VIII, le Facteur Willebrand et la fibronectine s'adsorbent sur la résine tandis que le fibrinogène se retrouve dans le filtrat des protéines non adsorbées. Par une première augmentation de la force ionique du tampon on élue la fibronectine et une grande partie du Facteur Willebrand. Par une augmentation supplémentaire de la force ionique du tampon le Facteur VIII s'élue en présence de faibles quantités de Facteur Willebrand et peut être directement lyophilisé sans qu'il soit nécessaire de lui ajouter un stabilisant ou de le soumettre à une étape d'ultrafiltration. Le tampon utilisé contient avantageusement de la lysine à une dose de l'ordre de 2 à 4 g/l ainsi que du glycocolle à une dose de l'ordre de 8 à il g/l. L'utilisation d'autres acides aminés ou même de l'un seulement de ces deux acides donne des résultats nettement moins satisfaisants. L'augmentation de la force ionique du tampon se fait par adjonction de chlorure de sodium. En effet, l'utilisation unique de cette résine de caractère ionique modéré et de nature légèrement hydrophobe permet d'utiliser ce sel pour désorber le Facteur Willebrand avant l'élution du Facteur VIII ce qui évite le recours au chlorure de calcium, qu'il serait ensuite nécessaire d'éliminer par ultrafiltration, pour dissocier Facteur VIII: c et Facteur Willebrand. On peut bien entendu prévoir un traitement d'inactivation virale selon une technique connue, à un stade quelconque du procédé. Dans le cas o on utilise un agent chimique d'inactivation virale, il sera judicieux d'effectuer cette inactivation juste avant le passage de la fraction de plasma sur la résine. De cette façon l'étape chromatographique servira à l'élimination efficace des agents d'inactivation. On a obtenu de bons résultats en utilisant la technique d'inactivation par solvant-détergent, telle que décrite dans la demande de brevet européen No. 0 131 740. Pour la préparation de Facteur VIII l'étape de chromatographie peut être réalisée sur toute fraction protéique le contenant, par exemple sur une fraction plasmatique cryoprécipitée prépurifiée qui a été soumise à un traitement au gel d'alumine éventuellement suivi ou précédé d'une précipitation à basse température, selon des méthodes classiques de production de concentrés de Facteur VIII. L'activité spécifique du Facteur VIII:c dans la fraction de départ peut être aussi basse que 0,1 UI/mg. Le facteur de purification obtenu par une seule étape de chromatographie d'échange d'anions est selon l'invention de l'ordre de 400 à 700 fois. Le rendement de cette étape est compris entre 75 et 90%. Le concentré de Facteur VIII obtenu est de très haute pureté, son activité spécifique étant supérieure à 100 UI/mg de protéines. Il est dépourvu de fibrinogène et d'immunoglobulines G tout en étant nettement appauvri en fibronectine. Ce produit est dépourvu ou ne contient que des doses infimes d'anticorps humains de groupe et est de - qualité isogroupe selon les techniques préconisées par la Pharmacopée Européenne, ceci même en utilisant comme matériel d'origine un plasma non sélectionné par groupe sanguin. Il-peut être très avantageusement utilisé en thérapeutique dans le traitement de l'hémophilie A ou tout autre usage thérapeutique ou de réactif nécessitant un Facteur VIII de très haute pureté. Les éluats obtenus par le passage de la fraction plasmatique sur la résine et par la première augmentation de la force ionique du tampon sont également intéressantes pour les protéines qu'ils contiennent, à savoir respectivement le fibrinogène d'une part et la fibronectine ou le Facteur Willebrand d'autre part. L'exemple suivant illustre l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE: - On utilise comme matière de départ une solution aqueuse contenant du Facteur VIII à une activité spécifique comprise entre 0,6 à 1,1 UI/mg, obtenue à partir de la fraction plasmatique cryoprécipitée qui a été soumise à une précipitation à 10 C et à un traitement au gel d'alumine. - Cette solution est ensuite injectée sur la colonne de chromatographie contenant la résine Fractogel TSK-DEAE 650 (M) équilibrée dans un tampon contenant du citrate de sodium trisodique (2,94 g/l), du chlorure de calcium (1 mM), du chlorure de sodium (0,1lM), du glycocolle (9 g/l), et de la lysine (3 g/l). Un pic de protéines non adsorbées contenant essentiellement du fibrinogène est élué et on attend le retour de la valeur de la densité optique à 280 nm à son niveau initial. La colonne est ensuite soumise à une élution par le même tampon contenant alors 0,15 M de NaCl, ce qui sépare une grande partie de la fibronectine et du facteur Willebrand. Après retour à la ligne de base de la densité optique de l'effluent de la colonne, l'élution du Facteur VIII est réalisée par accroissement de la force ionique du tampon à 0,25 M NaCl. Le Facteur VIII s'élue alors à une concentration de l'ordre de 30 à 50 UI/mg et peut être réparti directement sans étape d'ultrafiltration. Les caractéristiques biochimiques moyennes du produit sont indiquées cidessous: Protéines (g/l): 0,16 - 0,25 Facteur VIII:c (UI/ml): 30-45 UI/ml Activité spécifique Facteur VIII:c/mg: 120 - 250 Fibrinogène: Fibronectine (mg/1): 15 - 40. Après lyophilisation, la solubilité du produit est instantanée et le produit est limpide. Le taux de Facteur VIII:c est stable sur 24 heures à température ambiante. Les injections sur l'homme indiquent une récupération du Facteur VIII:c comparable à celle obtenue sur les produits de moindre pureté. De même la demi-durée de vie est équivalente à celle des autres produits. Ce concentré s'avère être un produit de très haute valeur thérapeutique susceptible d'apporter une amélioration dans le traitement général de l'hémophilie, particulièrement chez les malades aux fonctions immunitaires altérées. Les fractions de fibrinogène d'une part, de fibronectine et de Facteur Willebrand d'autre part, répondent aux normes physico-chimiques requises pour les destiner à un usage thérapeutique ou de réactif, soit directement soit en tant que matière première pour la préparation d'autres produits. REVENDICATIONS 1.- Procédé de purification de protéines du plasma humain ou animal, caractérisé en ce qu'on soumet une fraction solubilisée d'un précipité de plasma à une étape chromatographique sur une résine échangeuse d'anions de caractère ionique modéré et permettant la mise en jeu d'interactions hydrophobes et on élue ensuite spécifiquement certaines protéines par augmentation de la force ionique du tampon. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé - en ce que la fraction de départ contient du Facteur VIII. 3.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la fraction de départ contient également du fibrinogène, de la fibronectine et du Facteur Willebrand. 4.- Procédé selon la revendication 2 ou 3,- caractérisé en ce que l'activité spécifique du Facteur VIII:c dans la fraction de départ est supérieure ou égale à 0,1 UI/mg. 5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la fraction de départ est une fraction solubilisée de cryoprécipité de plasma humain ou animal. 6.- Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que la fraction de départ a subi un traitement de purification préalable. 7.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la fraction plasmatique cryoprécipitée a été soumise à un traitement au gel d'alumine. 8.- Procédé selon la revendication 6 ou 7 caractérisé en ce que la fraction plasmatique cryoprécipitée a été soumise à une précipitation à basse température. 9.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 8 caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: a) on fait passer la fraction solubilisée de cryoprécipité sur une résine comportant des groupements DEAE greffés sur un gel de type polymère vinylique, qui adsorbe il le Facteur VIII, le Facteur Willebrand et la fibronectine et laisse passer dans l'éluat le fibrinogèner b) on augmente une première fois la force ionique du tampon pour éluer la fibronectine et une grande partie du Facteur Willebrand, et c) on augmente encore la force ionique du tampon pour éluer le Facteur VIII. 10.- Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le tampon contient de la lysine et du glycocolle. 11.- Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le tampon contient 2 à 4 g/l de lysine et 8 à 11 g/l de glycocolle. 12.- Procédé selon l'une quelconque-des revendications 9 à 11 caractérisé en ce qu'on augmente la force ionique du tampon à l'aide-de chlorure de sodium. 13.- Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la concentration en chlorure de sodium est de 0,11 M pour l'étape a), de 0, 15 M pour l'étape b) et de 0,25 M pour l'étape c). 14.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 caractérisé en ce qu'on effectue un traitement d'inactivation virale en présence d'agents - chimiques d'inactivation sur la fraction de plasma juste avant de la soumettre à l'étape chromatographique. 15.- Concentré de Facteur VIII isogroupe d'activité spécifique supérieure à 100 UI/mg caractérisé en ce qu'il est obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 14. 16.- Concentré de fibrinogène caractérisé en ce qu'il consiste en l'éluat de l'étape a) du procédé selon la revendication 9. 17.- Concentré de fibronectine et de Facteur Willebrand caractérisé en ce qu'il consiste en l'éluat de l'étape b) du procédé selon la revendication 9.