FR 2626890 A1 19890811 FR 8803516 A 19880318 La présente invention est relative d un procédé pour la préparation d'algues ayant des effets biologiques améliorés. Les algues ont été utilisées depuis des temps immémoriaux par l'humanité à des fins de nutrition et d'iImentatlion. Les algues sont donc principalement consomeaes par les peuples de l'extrême Orient;. ces derniers temps, cependqnt, eliles sont largement utilisées sous formesèche ou sous ia forme de comprimés également dans lea pays dévetoppés. Les algues sont les -supports de matières nutritives extrêmement Intéressantes pulsque leur forme séchée contient en fortes concentrations, des substances qui sont essentielles pour une vie en bonne santé, comme des vitamines, des protéines, des complexes de protéines avec des icroéléments, des sacharides, des acides gras polginsaturds et similaires. La pollut ion de I 'environnement est devenue -un problème mondlal ces dernières années. Rctuellement, la contamii- nation des mers et des océans par des métaux lourds toxiques (par exemple le plomb, le mercure, le cadmium, le cuivre) ainsi que par des agents induisant des tumeurs (par exemple des composés. aromatiquea polgycl iques condensés), n'est pas négligeable. Le fait que ces agents soient accumulés dans les.algues constitue un problème difficile. Rinsi, 'des algues completes' provenant de la mer ou cultivées dans d'autres conditions naturelles, ne peuvent pas être utilisées à des fins de nutrition humaine ou animale, pour des produits alimentaires, cosmétiques et thérapeutiques; on ne peut utiliser que les fractions de ces 'agues complètes' qui ont été pr6éalablement débarassies par purification des matières nuisibles du point de vue biologique. Un procédé de purification de ce tgp est décrit par exmple par Carmes- de S6uoxa [Cosmetics and 38 Toiletries eU 4T (l98 Cependant, une-opération de-purificatito signifie une intervention décomposant une.partie des substances biolegiquement actives de l'algue, si bien que la valeur biologique de la fraction d'aigue ainsi obtenue est notablement réduite [Zajic: Properties and Products of RIlgae, Edition Planum, Hew-York, (1970)3. Il en résulte que la préparation d'algues stériles qui ne sont pas gatêes par l'environnement, est devenue de-plus en plus importante. On cannait un' certain nombre de procédés de culture artificielle d'algues' qui peuvént être effectués, par exemple, dans un bassin ouvert a la lumaère solaire ou dans un espace clos dans des conditions assurant la stéri:ité, -soit sous un éclairage naturel o.u artificiel, soit à l'-abri de toute lumière. Selon la demande publiée de brevet japonais No. 56.96690, des algues sont cultivées à partir de souches d'algues maritimes dans de l'eau de mer stériiisée, dans une solution contenant divers sels nutritifs sous une source de lumi.re art ificiel le, Selon la demande publiée de brevet japonai's lo. 45.17146, Ia culture industrielle d'algues Chlorella uertes' unicellulaires est effectuée sur un ailieu de culture d'eau douce stérile 6 l'exclusion de dioxyde de carbone et de lumière. La culture des algues vertes unicellulaires d:eau douce est ausi décrite dans la spécification de brevet français No'.2,103.462, selon laquelle la culture à l'échelle industrielle est réalisée photosynthétiquement h l'aide de solutions nutritives contenant des sels nutritifs appropriés.- Selon des demandes publiées de brevet hongrois No. 4613/84 et 4614/84, la culture des algues est accomplie dans une eau minérale d'origine naturelle, une eau médicinale ou thermale ou dans un mélange de celles-ci enrich.es par un composé métallique jusqu'à une concentration de 10'2 mole/litre. Dans l'une quelconque des solutions connues, des algues devant étre utilisées pour la fabrication d'alitent, de fourrage ou de médicaments sont produites de façon artificielle dans des conditions atériles. Dans ces procédés, des algues sont cultivées dans des conditions telles que. les propriétés des algues obtenues sont analogues à celles des algues se développant spontanément dans la nature dans des conditions du milieu sans danger, ou les propriétés des algues oainsi produites ne diffèrent 3 * Z6289 que trs peu, en fonction du mode de culture artifIcielle. Les alues cultivées artificiellement selon les procédés de! 'art antérieur ne contiennent que des traces, ai elles en contiennent, de plusieurs éléments tels que le sél1n-ium, le zinc ou l'argent. On sait de plus, que le sélénium a des fonctions biologiques variées, comme cela est publi6 dans un rapport complet de Thressa et coïl. [Nutrition Revie 35, 7 (1977)], Shamberger- [J. of Env. Path. and Tax. _, 305 (1980)], ou lasukawa et coli. [Experientia 39, 405 (1983)]. Le sélénium en lui-mRme, a un effet hypotenseur, il améliore les états ischémique, hypoxique et infarci du coeur et il inhibe lao lipofuscinose céroidole du syastème nerveux central; Il exerce aussi un effet bénéfique sur la périodontite et il a 6t6 montré qu'il diminue la probabilité du développement des maladies cancéreuses; de plus, on considère qu'il est un agent inhibant la mutagénêse. On a démontré que de nombreuses modifications ou maladies> respectivement, comme une nécrose du foie, une mgonécrose, une destruction de la membrane des - érythrooytes, des lésions interstitielles, une élévation de ST dans I'ECG le syndrome de Kwashiorkor (sous-alimentation en protéines) et une schiérose en plaques, sont induites par une insuffisance en séldnium. L'action bénéfilque du seélénium repose surtout sur son effet d'activation dirigé contre l'enzyme glutathion peroxgdase, qul est l'inhiblteur endogêne le plus important des processus nocifs de peroxydation. Dans la mesure oQ le sélénium est un constituant Indispensoble du groupe prosthétiique de V'enzyme glutathion peroxgdase, il est l'une des substances les plus importantes et {es plus indispensabtes i la vie qui,'est pas 310 accumui domns 'omunise et doit donc être fourni en cmntinu. Jusqu'à maintenant, le sélénium a été exclusivement introduit-dans I 'organisme sous la forme de composés inorganiques (dioxyde de sélénium, sélénlte de sodium ou slmiJaire). La présente invention a'pour but de fournir des algues agant des propriétés biologiques particuliàres et qui sont> gréce à leur teneur accrue en sélénium, capables d'assurer -l'effet biologique du séléniui. L'invention repose sur la constatation selon laquelleJ dans certaines conditions, I'a!gue peut non seuleient ître aintenue vivante dans des solutions contenant du sélénium, c'est-ô-dire ne pas périr, mais égaleiment se développer et elle peut donc être cultivée.dans une solution nutritive contenant du sélénium en forte concentration. Cette constatation est surprenante puisque, selon l'art antérieur> on s'attend à ce que l'algue soit tuée par le sélénium toxique. De plus, l'invention-repose sur la constatation selon laquelle le sélénium est incorporé dans l'organisie d'une algue cultivée sur un milieu de culture contenant du sélénlum dans certaines conditions. L'i nvention concerne donc un procédé pour la préparation d'algues ayant des effert biologiques améliorése, selon lequel la souche d'algue choisle est cultivée dans des conditions stériles sur un milieu de- culture consistant en eau douce et en sels nutritifs en présence de dioxyde de carbone et de.lumière de façon photosynthétique, ou à' I 'exclusion de lumière sur un milieu de culture contenant aussi une.source de oarboae, 'd'hydrogène, d'oxygène et d'azote, après quoi -l'algue ainsi obtenue est séparée. Selon le procédé de la présente invention, un ou plusieurs composés inorganiques et/ou organiques du sélénium sont ajoutés au milieu dé culture a une concentration de 1.07 à 2xlO-3 sole/litre, puis le milieu de culture est inoculé avec une culture d'algue pure capable d'incorporer facilement le sélénium, La culture pure est obtenue par inoculation de la souche d'algue choisie sur un milieu de - culture liquide contenant des at tires nutritJves Inorganiques et éventuellement organiques et ensuite traitement de celle-ci avec de la N-m6thyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine. On choisit parmi les individus de la souche ainsi obtenus par mutation, ceux qui wont capables d'incorporer facilement du sélénium.lorsqu'ils sont cultivés après mutation sur un milieu de culture contenant du sélénium et qui ont un taux de croissance identique au moins à celui de la souche sauvage. Après l'noculation du milieu de culture avec Il culture pure ainsi obtenue et la période de culture, l'algue est séparsée, éentuellement séchée à une teneur en eau donnée et décomposée par ultrason ou broyage de façon connue en elle-Mme. Selon la presente invention, la culture d'algue pure' qui est capable d'incorporer du séléidium, est de préférence préparée à partir d'algues unicellulaires bleues ou vertes, comme Chiorella sp., Scenedesmus sp. ou Spirulina sp., de telle façon 1U que, après le traitement avec la N-méthyl-t"-nitro- X-nitrosoguanidine, les cellules sont soigneusement lavées et dispersés sur une série de milieux de culture solides, dilués successivement à moitié et complétés avec un composé de sélénium à une concentration comprise entr.e 17et 2x-3 mole/I itre. On sélectionne parmi les souches qui se développent ici, les souches les plus avantageuses qui ont une croissance rapide et sont capables d'incorporer facilement du s éléniui et on les cult ive à nauveau dans un mil ieu l iquide, puis on soumet la culture d'algue pure ainsi maintenue à une production industrielle. Le sélénium est donc incorporé pendant la croissance dans l'organisme de l'algue traitée de la façon décrite plus haut, ô une concentration qui est en mogenne 104 fois supérieure n celle de la souche d'algue d'origine. L'eau distillée est âtihisée conme liquide dans le milieu de cuiture employé pour la culture industrielle de la souche d'algue qui est capable d'incorporer facilement le sélénium, En plus des matières nutritives connues couramment utilisées, ces milieux de culture sont complétés aussi avec des composés inorganiques etjou urganiques du séléniuà. Le milieu de culture ainsi prépare et stérilisé est inoculé avec la souche d'algue,' obtenue de ula façon dé6orite plus haut, qui est capable d' incorporer facilement le sélénium, Tout en se développant, l'algue incorpore le sélénium dans son propre organisme sans les contaminations taxilues indésirées discutées plus haut. L'algue ainsi préparée est séparée du milleu de z6268 90 culture et soi gneusement séchée de façon connue dans des conditi ons douces 6à une température optimale de 65 C et ne dépassant pas 80 C. L'algue séchée est convenablement décomposée par broyage à une - dimension particulaire d'environ 1 pm. Dons une variante, le concentrat d'algue humide est décomposé par ultrason et ensuite séché dans les conditions définies plus haut. L'algue ainsi obtenue est unre poudre contenant 250 à 4000 pg/g de sélénium, qui peut étre directement consoemmée ou utilisée en elle-mê6me ou dans des aliments, des fourrages, des cosmétiques ou avec des substances actives biologiquetent et utiles du point de vue thérapeutique et/ou en tant qu'additifs de ceux-ci, sous la forme d'une queleonque formu.lation disponible Industriellement de ces produits, de préférence sous la forme de comprimés et de capsules ou d'autres formes. 1.5 - Les principaux' avantages du procédi selon l'invention peuvent être résumées comme suit: a) L'algue peut être cultivée dans un équipement simple avec un procédé bon marché et facile à mettre en oeuvre. b) Rucune purification. ou traitement- à plusieurs étapes n'est requis après la culture. c) L'algue est cultivée dans des conditions stériles> à l'exclusion des contaminations de l'environnement si bien que l'algue peut être utilisée sans problème pour la consommation humaine8 d) il est possible de préparer des algues ayant une forte teneur en sélénium et possédant des effets physiologlques et biologiques amé liorés par rapport à ceux des algues connues. e) Les algues obtenues par le procédé de l'invention peuvent être largement et de préférence utilisées par exemple pour l'alimentatlon, dans l'industrie cosmétique, pour des buts thirapeutiques et dans d'autres domainese L'utilisation des oalgues cult ivées par le procédé de l'invention est plus préférée en -théraple, puisque le sélénium est un agent activant du groupe prosthétique de l'enzyme glutathion peroxydase, Le sélénium n'eSt pas accumule dans l'organisme, i bien que son apport complémenrtaire est rendu possible avec les algues obtenues par le procédé de l'invention et qu'on.peut ainsi traiter tous les troubles de la santé résultants d'une insuffisance en séléniun. Le procédé de l'invention est 1 lullstré en détail par les exemples non limitatifs suivants.' Exemple t Une culture de Scenedesmus obtislusculus est maintenue 1B dans un flacon de 250 'ml dans une culture secouée sur un mil 'ieu de culture Ilquide de Bold contenant 100 à 500 pg/mil de t-méthyl-H'-nitro-:N-nitr-ooguanidine i 25-270C pendant 30 minutes. Après ce traitemrnt, les cellules sont soigneusement lavées à l'eau et dispersées sur une série de milieux de culture de Bold solidifiés par de l'agar, Cette série de milieux de culture contient du sélénium dont la concentration est doublée r6guli6rement û chaque fois de 3,125 pg/!l à 400 pg/ml. Les colonies formées ô partir des cellules qui se développent et survivent sur cette série de milieux de culture sent isolées et les 1 ignées de cel luleos' séleet ionnées sont reproduites l 'échel le du laboratoire dans une solution nutritive de Bold.contenant au moins Mg/ml de sélénium. Les colonies qui se développent, incorporent plus avantageusement du sélénium et ont un taux de croissance prat iquement identique a celui d'une souche sauvqge (témoin) danse un milieu de culture contenant au mains 20 pg/ml de sélénium. La teneur en sélénium de l'algue est déterminée par séchage à 65 C des cellules préalablement isolées et soigneusement lavées à l'eau, décomposition de celles-ci par ultrason et ensuite mesure de la teneur en sél6nium par une méthode d'absorption 3 atomique. La teneur en sélénium de la -poudre d'algue ainsi obtenue est indiquée ciaprs: Souche Teneur en sélénium (pg/g de poudre d'algue) Souche I sauvage non traitee 50 Souche Il sauvage non traitée 30 Souche Code No. FM-1-120 1300 Souche Code oi. FM-1-1871 2400 Southe Code No. FM-441/87 1600 Souche Code Mo, FM-449/87 100 Exemp:l:e 2 mg de sélénite de sodium sont ajoutés à 8 'litres de !5 milieu de culture de Knop-Pringsheim introduit dans un flacon en verre de culture d'algue ayant un volume de 10 litres, La solution nutritive résultante est stérilisée à 1210iC sous une surpression de 1 bar pendant 30 minutes. Ensuite, la soiution stérile est refroidie et inoculée avec une culture pure de Scenedesmue ' obtislusculus qui est capable d' incorporer facilement du sélénium* On fait barbotter de l'air stérile contenant 5% en volume de dioxyde de carbone à travers le milieu de culture à 25.C, tout en éclairant le système par un tube à décharge électrique travaillant avec 4000 lux, à une longueur d'onde de 440 6.520 et de 640 a 700 IJm. Après une période du culture de 14 jours, l'algue est séparée du milieu de culture, puis lavée à l'eau. La masse d'algues ainsi obtenue est décomposée par ultrason et soigneusement séchée à une température inférieure à 65C. Lo teneur en sélénium de le 3 poudre d'algue ainsi obtenue est de 1200 pg /g. ExnDp 3- 8i0 g de nitrite de sodium, 0,8 g de sulfate de oagnésium heptahydrat6, 0 8 g de phosphate acide dipotassîque, 2,5 mlI de solution dtotigoéléments d'firnon ainsi que 5 g de glucose, 0,1 g de cystléine et 0,1 g de mthlonlne sont dissous dans 8 litres d'eau distillée introduite dans un fermenteur de culture d'algue ayant un volume de 10 litres. La solution nutritive ainsi obtenue est complétée avec 50 mg de sélénite de sodiumJ puis la solution est versée ô travers un filtre stérilisant et Inoculée dans des conditions stériles maintenues avec soin, avec une culture d'algue pure de Scenedesmus obtisiuscu-rlus capable d' incorporer facilement le séleénium. Aprè une période de culture de 4 jours à -28*C dans l'obscurité, l'algue est séparée du-mi lieu de culture et lavée à l'eau. La masse d'algues ainsi obtenue est décomposée par ultrason et finalement séchée à une température inférieure a 651C. La teneur en sélénium de la poudre d'algue ainsi obtenue est de 130 pg/g. xeple 4 Le procédé décrit dans il'exemple 2 est répété, sauf qu'au lieu d'être traité à chaud, le milieu de culture est stérilisé par écoulement à travers un filtre stérilisant les À bactéries du type 6-5. La teneur en sélénium de la poudre d'algue ainsi obtenue est de 1300 pg/g. Exemp!e 5 Le procédé décrit dans l'exemple 2 ou 3 est répété, sauf que la souche Scenedesmus obtisiusculus est remplacée par une souche d'algue Chlorella vulgaris capable d'incorporer facilement du sélénium et qui a été soumise au traitemernt de mutation décrit dans l'exemple 1. La teneur en sélénium de la po.udre d'algue ainsi obtenue st indiquée claprès: 2626 8 9 0 -: i mlln.]. À........ Souche Teneur en séléniu' (pg/g de poudre d'algue) Souche I 'sauvage' 140 Souche Il "sauvage"' 140 Souche DU-35-42 3200 Southe DU-78-20 2300 Souche DU-104-21 1500 Exemple 6 Le procédé décrit dans l'exemple 2 ou 3 est répéteé sauf que la souche Scenedesmus obtislusculus est remplacée par une souche d'algue Chlorella minitisslma capable d'incorporer facilement du sélénium, La teneur en sélénium de la poudre d'algue ainsi obtenue est de 1400 p9g/g. * Exemple 7 On répète le procédé décrit dans l'exemple 2 ou 3> sauf que l'on laisse l asolution nutritive se réchquffer à une température d'au maximmum 500C et qu'on utilise une souche d'algue fphanocapsa thermalis qui est thermodurique-et capable d'incorporer facilement du sélénium, La teneur en sélénium de la poudre d'algue ainsi obtenue est indiquée ci-après- Souche Teneur en séléniua ("{pglg de poudre d4algue) Souche 'sauvage' 130 à---- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ------à-- Souche DU-12-220 1100 Souche DU-12-340 1550 35. li Exemple 8. Le procédé décrit dons Ifexemple 2 est répété, sauf que la souche Scenedesmus obtisiusculus est remplacée par une souche d'algue Spirul ina sp. appartenant aux algues bleues, capable d'incorporer facilement du sélénium., La teneur en sélénium de la poudre d'algue ainsi obtenue est indiquée ci-après: Souche. Tene ur en selénium (ygtg de poudre d'algue) Souche I 'sauvage' 50 Souche Il "sauvage 30 ______________-___ ------------------ --------------__-----------_ Souche 87-104 11 00 Souche 89-241 1200 Souche 89-302 1500 Exemple 9 On répète le procédé décrit dans [l'exemple 2J sauf que l'on abaisse la température de la solution nutritive o 8 C et qu'on utilise une souche d'algue tostoc commune bleue filiforme qui résiste. au froid et est capable d'incorporer facil ement du sélinium. La teneur en sélénium de la poudre d'algue ainsi obtenue est indiquée ci-apres: Souche - Teneur en sélénium (pgol de poudre d'algtue) Souche sauvage" 140 Souche BK-1218-2 1140 35., = -: 12' Exemple 10 x 10-3n de sélénite de sodium est ajouté à 8 litres de milieu de culture de Bold stérilisé par filtration et introduit dans une flatcon de culture d'algue ayant un volume de 10 litres, Le milieu de culture ainsi obtenu est Inoculé avec une culture puse de Chlorella fusca préparée selon la procédure décrite dans l'exemple i et capable d'incorporer facilement du sélénium, L'algue est cultivée pendant 14 jours selon la procédure de l'exemple 2. La -masse d'algues est ensuite filtrée, soigneusement aivëe û l'eau et séchée à moins de 80 C, La teneur en sélénium-de la poudre d'algue ainsi obtenue est de 2700 pg/g. Epxeple Une souche Scenedesmus obliquvs cultivée de la façon décrite dans I'exemple 1 et capable d'incorporer facilement du sélénium, est inoculée dans un flacon de culture contenant 8 litres de solution nutritive de BoId et 10-7M de sélénite de sodium, Le procédé de l'exemple 10 est ensuite suivi pour obtenir une poudre d'algue ayant une teneur en sélénium de 300 pg/g9, Exemple 12 Le procédé décrit dans l'exemple 2 est répété, sauf que l'algue séparée est séchée à 65 C et ensuite. décomposée par broyage à une dimension part iculaire de I pe. La teneur en sélénium de la poudre d'algue ainsi obtenue est de 1200 pg/g, -REUEHDIlCATIOHS 1. Procédé pour la préparation d'algues ayant un effet biologique amélioré, selon lequel lao souche d'algue choisie est cultivée dans des conditions stériles sur un eilieu de culture consistant en eau douce et en sels nutritifs en présence de dioxgde de carbone et de lumière de fpçon phot6synthétique, ou à l'exclusion de lumière sur un milieu de culture contenant aussi une source de carbone, d'hydrogène, d'oxygène et d'atozote, puis l'algue ainsi obtenue est séparée, caractérisé en ce qu'il comprend 1 l'addition au milieu de culture d'un au de plusieurs composés inorganiques et/ou organiques du sélénium à une concentration de -? à 2xl0-s mol/litre, l'inoculation du milieu de culture avec une culture d'algue pure capable d'incorporer f.aci lement du sélénium, si cela est désiré, le séchage de l'algue obtenue après culture et la décomposition de celle-ci par ultrason ou broyage. et encequela culturepureest obtenue par inoculation de 1a souche d'algue sélectionnée sur un %ilieu de culture liquide contenant des matières nutritives inorganiques et éventuel lement organiques, traitement de celle-ci avec de la - Na mthyl-K'-nitro- M-nitrosoguanidine,. puis culture de la souche sur un milieu de' culture contenant aussi du sélénlum et enfin sélection des individus qui incorporent facilement le sélénium et qui ont un taux de croissance identique au moins. a celui de la souche sauvage. 2. Procédé suivunt la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend l'utilisation de sélénite de sodium et/ou de dioxyde de sélénium coame composants inorganiques du sélénium dans le milieu de culture, 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé on ce qu'il comprend l'utilisatlon de sélênocystdlne et/ou de 3 eélnom6thionine cue 'compusonts organiques du saélnium dans le milieu de culture. 4. Procédé suivant la revendication I, caractérisé en ce qu'il comprend l'utilisation d'une souche d'algue Chlorella ou Scenedesmus comme souche d'algue sélectionnée. 5. Procédé suivant la revendication 1, caractérlsé en ce qu'il comprend l'utilisatlon d'Aphanocapsa thermails comme souche d'algue sél1ectionnée. 6. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend I 'util isation de Nostoc commune comme southe d'algue sélectionnée. 7. Procédé 'suivant là revendication 1, caractéris6 en ce qu'il comprend Il'utilisation de Ch!6re!la minitissima ou de Chlorella fusoa comme souche d'algue séIectionnée. 8. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend ltutilisation d'une souche d'algue bleue d'eau douce comme souche d'a Igue sélectionnée. 9. Procéde suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il coamprend l'utilisation de Spirulina sp, 6onme souche d'algue bleue. 1f0. Procédé suivant l arevendication. 1, caractérisé en- ce qu'il comprend l'utilisation 'de Scenedesmus obtisiusculus ou de Scenedesmus obli quus comme souche d'algue sélectionnée,