FR 2631972 A1 19891201 FR 8806891 A 19880524 263 1 972 LUTTE BIOLOGIQUE CONTRE DES MICROORGANISMES PHYTOPATHOGENES L'invention concerne un procédé de lutte biologique contre des microorganismes phytopathogènes, plus spécialement des bactéries et des champignons, dans lequel on utilise des mutants avirulents dérivés de ces microorganismes par recomblnaison génétique. Parmi les bactéries phytopathogènes, Pseudomonas Solanacearum et Xanthomonas campestris sont responsables des dégâts les plus importants causés aux cultures à travers le monde. Ainsi, au moins trente familles botaniques, avec plus de deux cents espèces, sont naturellement sensibles à la bactériose produite par P.Solanacearum. Des cultures d'importance économique considérable, atteintes par P. Solanacearum, comprennent les Solanées, par exemple le tabac, la pomme de terre, la tomate, le poivron, l'aubergine, ou encore les Musacées, comme le bananier. Les souches de X.Campestris s'attaquent notamment aux cltrus, au coton et au riz. Selon le processus d'infection, la souche sauvage virulente pénètre dans la plante-hôte par le système vasculaire, au niveau des ébauches des racines. secondaires. Les bactéries gagnent ensuite le système vasculaire (vaisseaux du bois). Leur propagation rapide à l'intérieur de la plante provoque un flétrissement irréversible. Divers moyens ont été proposés pour tenter de réduire les graves conséquences socio-éco- nomiques de ces bactérioses. L'un des plus courants consiste à utiliser des variétés tolérantes. Cependant, en raison de la nature polygénique de la résistance vis-à-vis de cette bactériose ainsi que de la grande variabilité du pouvoir pathogène exprimée dans les diverses régions du 263 1972 monde, l'obtention de variétés résistantes met en jeu des méthodes longues, de mise en oeuvre difficile et aléatoires. D'autres méthodes sont basées sur les procédés de lutte biologique. Le principe de ces procédés consiste à installer, au niveau racinaire, et particulièrement à l'intérieur des vaisseaux du bois, un mutant avirulent dérivé de la souche sauvage virulente dont la présence doit empêcher l'invasion ultérieure d'une souche virulente soit par antagonisme direct, notamment, par compétition ou production de bactériocines, soit en stimulant un état général de défense chez la plante-hôte. Dans le cas de P.Solanacearum, les essais préliminaires décrits chez la pomme de terre par Kempe et Sequeira dans (1) et chez le tabac par Tanaka (2) s'appuient sur l'utilisation de mutants avirulents spontanés et de Pseudomonas saprophytes du sol (les références bibliographiques sont données en fin de description). Cependant, l'installation de ces mutants à l'intérieur des tissus de la plante à protéger reste très limitée, conférant une faible protection. Cette protection est limitée dans le temps car les mutants spontanés ne se multiplient pas dans la plante. Au niveau des racines, en dehors des tissus de la plante, ils sont soumis à un antagonisme microbien qui peut être important dans le sol. Un pouvoir colonisateur élevé a été en revanche rapporté par Trigalet et Demery (3) chez la tomate avec des mutants avirulents de la souche sauvage GMI1229 de P.Solanacearum induits par insertion ponctuelle du transposon Tn5 selon (4). Il s'agit d'une insertion ponctuelle de l'élément transposable dans l'un des gènes impliqués dans le..pouvoir pathogène de la bactérie, la plupar- de ces gènes étant regroupés et localisés sur un méçgplasmide. Un cosmide appelé pVir2, portant une grande partie de cette région a pu être isolé (6). Les 'travaux effectués ont montré que certains de ces mutants sont capables de pénétrer par le système racinaire et de se multiplier à des degrés divers dans la tomate. La poursuite de ces recherches par les inventeurs a montré que des mutants de ce type peuvent 12 constituer d'excellents compétiteurs de la souche sauvage in planta. Le développement de ces travaux a permis d'élaborer par recombinaison génétique des mutants utilisables dans la lutte biologique contre les microorganismes phytopathogènes. Fr L'invention a donc pour but de fournir de nouveaux mutants non pathogènes dotés d'un fort pouvoir antagoniste vis-à-vis de la souche sauvage in planta. Elle a également pour but de fournir des mutants parfaitement identifiés génétiquement et 2. d'obtention aisée par recombinaison génétique L'invention vise également à fournir un procédé de lutte biologique de grande efficacité contre les microorganismes phytopathogènes. Les mutants selon l'invention proviennent- de microorgan smes phytopathogènes, plus spécialement de bactéries et de champignons, dont les gènes impliqués dans le pouvoir pathogène renferment des séquences de nucléotides capables de s'hybrider avec un gène de pathogénicité P.Solanacearuim. 33 Ces mutants sont caractérisés en ce qu'ils sont non pathogènes, capables de pénétrer dans la plante-hôte et de s'y multiplier, dotés de propriétés antagonistes vis-à-vis des microorganismes phytopathogènes dont ils sont dérivés, et qu'ils 263 1 972 comportent une insertion ponctuelle, constituée par une séquence de nucléotides écologiquement acceptable, ou une délétion, dans les régions de leur génome impliquées dans le pouvoir pathogène, ces régions comportant des séquences de nucléotides capables de s'hybrider avec - une région a) comprenant une séquence d'environ 30 kb du génome de la souche GMI 1000 de P.Solanacearum qui correspond à l'insert du cosmide pVir2 à laquelle s'ajoute une séquence adjacente de 5 kb d'ADN génomique immédiatement située en amont de la région portée par pVir2, ou - une région b) comprenant une séquence d'environ 40 kb du génome de la souche GMI 1000 de P.Solanacearum correspondant à l'ensemble de l'ADN génomique de P.Solanacearum porté par le plasmide pGMI880 à laquelle s'ajoute une séquence adjacente de 7 kb située en amont de la séquence de 40 kb. pGMI880 est décrit dans (6). De tels mutants constituent des compétiteurs des souches sauvages de grand intérêt, à l'intérieur de la plante-hôte. Le pouvoir antagoniste qu'ils exercent vis-à-vis des souches sauvages est plus stable et plus durable que celui d'un mutant avirulent spontané. D'une manière avantageuse, les mutations ponctuelles (insertion) et les microdélétions, affectant environ 1 à 5 kb dans les régions a et b définies ci-dessus, sont contrôlées et reproductibles. Elles permettent ainsi l'élaboration de mutants antagonistes de souches virulentes indigènes, parfaitement adaptés à une zone de culture donnée. Les régions a et b évoquées plus haut sont caractérisées en ce qu'elles comportent des sites de restriction dans l'ordre suivant: Région a: BamHl - BamH1 - EcoRI - EcoRI - EcoRI - EcoRI - EcoRI - EcoRI - BamH1 - HindiII - KpnI - HindIII - EcoRI Région b: BamH1 - EcoRI - BamH1 -EcoRI - BamH1 - HindIII - BamHl - HindIII - BamH1 - HindIII - BamH1 - BamH1 - BamH1 - BamH1 - EcoRI - Des mutants protecteurs de grande efficacité comportent une insertion ponctuelle ou une microdélétion dans la séquence correspondant au quatrième fragment EcoRI de la région a. D'autres mutants protecteurs préférés comportent une insertion ponctuelle ou une microdélétion dans le troisième fragment EcoRI de la région b. Dans un grand nombre de souches sauvages de P.Solanacearum et de X. Campestris, chez des Corynebactéries telles que Corynebacterium michiganense, et chez des champignor.s phytopathogènes du genre * Verticillium sp, et Fusarium sp, qui provoquent des syndromes de flétrissement, et différents pathovars de ces souches, ces régions a et b sont avantageusement conservées avec une bonne homologie. Quelles que soient les différences intervenues dans l'évolution des différents microorganismes, les séquences correspondant à ces régions de pathogénicité sont toutefois capables de s'hybrider avec des gènes de pathogénicité de P.Solanacearum GMI 1000. Des mutants dotés d'un pouvoir protecteur élevé vis-à-vis des souches sauvages dérivent de P.Solanacearum GMI 1229 ou P.Solanacearum GMI 1000. Les insertions ponctuelles réalisées conformément à l'invention correspondent plus spécialement à des fragments d'ADN portant au moins un gène marqueur. De nombreux marqueurs, dès lors qu'ils sont écclogiquement acceptables et qu'en particulier ils ne confèrent pas de résistance aux antibiotiques, peuvent être utilisés. Le choix sera naturellement effectué en fonction des propriétés que l'on souhaite conférer aux mutants protecteurs. Avantageusement, on introduit des insertions de marqueurs conférant aux mutants l'aptitude à métaboliser un substrat carbone, une résistance à un sel de métal lourd, ou encore des propriétés de bioluminescence. Des séquences appelées communément "cassettes lac" peuvent être ainsi introduites dans le site désiré des régions a et b. Ces insertions sont effectuées en opérant selon les techniques classiques du génie génétique. L'étude in vitro des propriétés protectrices de ces mutants vis-à-vis de souches sauvages pathogènes a permis de mettre en évidence leur grande efficacité. Les essais dont les résultats sont rapportés ci-après montrent que dans des conditions expérimentales de développement maximum de la maladie, les mutants génétiquement modifiés assurent une protection pouvant atteindre 100%o. Ces résultats mettent en valeur le caractère hautement compétitif des mutants de l'invention par rapport aux mutants avirulents de l'art antérieur. L'invention vise donc également des compositions pour la lutte biologique contre les souches phytopathogènes caractérisées en ce qu'elles renferment de tels mutants. Ces compositions sont constituées de suspensions des cellules de mutants dans un milieu approprié, plus spécialement dans de l'eau. La concentration de ces compositions est avantageusement telle que le rapport entre la concentration de mutant et celle de souche sauvage est d'au moins 100. De telles compositions renferment ainsi 9 7 d'environ 107 à 109 cellules de mutants/ml. Les mutants utilisés pour élaborer ces compositions prviennent de cultures effectuées dans les mêmes conditions que les souches sauvages, sur milieu physiologique glucosé classique. L'invention vise en outre un procédé de lutte biologique contre les microorganismes phytopathogènes, plus spécialement contre les bactéries et les champignons. Ce procédé est caractérisé en ce qu'on utilise un mutant tel que défini ci-dessus, ou une composition le renfermant. Pour l'application, on inocule avantageusement une suspension de mutant, en particulier une suspension aqueuse en arrosant à la racine les plantes à traiter. *5 Cette application est réalisée de préférence au stade pépinière, sur les semences (graines, tubercules). plantules, plants, boutures. Le procédé de l'invention permet de lutter de manière efficace contre les dégâts causés aux cultures, en particulier aux cultures de Solanées et de Musacées respectivement par P.Solanacearum et X.Campestris. La vaste répartition géographique de ces bactérioses dans le monde (entre les 45' de latitude sud et nord, du niveau de la mer jusqu'aux plateaux de 3000 m) et la gamme d'hôte étendue concernée permettent de mesurer l'intérêt des nouveaux moyens de protection fournis par l'invention. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans la description qui suit d'esais réalisés sur- la tomate et en se reportant aux figures 1 et 2 qui représentent les cartes de restriction des régions a et b respectivement avec les insertions dans les mutants. Les mutants des essais rapportés ci-après répondent à l'ensemble des caractéristiques des mutants de l'invention mais comportent une insertion Tn5 portant un gène de résistance à un antibiotique. Ils illustrent cependant l'invention dès lors qu'ils correspondent aux mutants de l'invention sur un plan structurel. I. MATERIELS ET METHODES Souches bactériennes: Comme souche sauvage de référence, on a utilisé P. Solanacearum GMI1229. Cette souche est 0 résistante à la streptomycine (Smr) et à la rifampicine (Rifr). Les mutants Tn5 avirulents dérivent de cette souche et sont de plus résistants à la kanamycine (Kmr). Inocolum bactérien: Les bactéries sont cultivées sur un milieu TTC gelosé puis en phase liquide dans un milieu physiologique comme décrit dans (4). L'inoculum est. préparé à partir d'une préculture en phase iliquide, dans des Erlens d'un litre contenant 400 ml de milieu, sur un agitateur K6tterman indice n' 6, à 30'C. Les bactéries sont récoltées à la fin de leur phase exponentielle de croissance soit 30 heures après l'ensemencement du milieu. L'inoculum est ensuite ajusté à la concentration désirée en fonction d'une mesure de la densité optique à 620 nm (colorimètre Jouan AE.11) contrôlée par une numération bactérienne à l'aide d'un ensemenceur spirale (Spiral plate Maker model D, Interscience, France). Matériel végétal: On a utilisé alternativement des cultivars sensibles de tomate H63-5 et Supermarmande. Inoculum: Les plants de tomate ont été inoculés après avoir atteint environ 15 cm en hauteur (stade 4 à feuilles). Les plants de tomate contenus dans des pots en tourbe ont été mis en place, à raison de 12 plants, dans des bacs (30 x 40 x 10 cm) contenant le mélange tourbe/terreau horticole décrit dans (3). Pour l'inoculation, on a arrosé au pied de chaque plant avec ml de suspension bactérienne ajustée à la concentration désirée. Les bacs ont été ensuite conservés dans une chambre d'incubation dans les conditions suivantes: 18 heures d'éclairement 120 microEinstein/s/m2, humidité relative 90%, température + 'C; suivies d'une période de nuit de 6 heures, température + 28'C, humidité relative 90 à 100%. Notation des résultats: L'évaluation du développement de la maladie a été effectuée selon l'échelle de 0 à 5 préconisée par Winstead et Kelman dans (5) et utilisée dans les essais de lutte biologique décrits par Kempe et Seque:ra dans (1) et par Tanaka dans (2). Cette échelle est la suivante: indices de maladie: 0, aucun symptôme externe de maladie, 1, jusqu'à 25% du feuillage est flétri, 2, de 25% à 50% 3, de 50% à 75% 4, de 75% à 100% , l'ensemble du plant est totalement flétri. L'indice moyen de maladie (IM) est alors défini par la relation suivante: IM = (O.no + 1.n1 + 2.n2 + 3.n3 + 4.n4 + 5.,5)/N o N est le nombre total de plants inoculés, et ni (i variant i de 0 à 5) le nombre de plants montrant les indices de maladie correspondant de 0 à 5 respectivement. Le pourcentage de protection est défini selon Tanaka (2): % P = (1 - IM) 100 -p TM IM = indice moyen de la maladie dans l'expérience p (mutant + sauvage), IM* = indice moyen de la maladie chez le témoin sauvage. Isolements Des isolements ont été effectués sur des plants sans symptômes externes apparents, à différents niveaux dans la plante, et à différents temps après l'inoculation, comme décrit dans (3). II. EXPERIENCES SUR DES PLANTS DE TOMATE SENSIBLES. cv.H63-5 (STADE 3 à 5 FEUILLES, 18 PLANTS/ TRAITEMENT). Ces plants ont été arrosés par un mélange de suspensions de P. Solanacearum contenant des quantités comparables 2 x 10 CFU: ml1 d'un mutant Tn5 avirulent et de la souche sauvage GMI1229. Les indices moyens de maladie obtenus à différents temps après l'inoculation de ces mélanges sont rapportés dans le tableau 1: to +7 +12 +20 +25 +50jours Eau distillée 0 0 0 0 Sauvage GMI1229 1,1 5 5 5 5 Mélange sauvage/mutant " /GMI1360 1,1 2,2 5 5 /GMI1358 0,5 2,5 5.5 " /GMI1332 0,7 2,7 5 5 " /GMI1333 0 2,7 5 5 " /GMI1355 O 1,1 5 5 " /GMI1357 0 3,3 4,4 5 " /GMI1353 0,5 2,2 3,3 3,8 " /GMI1351 0,5 2,7 2,7 3,3 " /GMI1350 O 0,5 0,5 0,5 Tomates cv.H63-5, stade à 5 feuilles, 18 plants/trai- tement. 1 1 L'examen de ces résultats montre que dans ces conditions, l'inoculation simultanée d'un mélange mutant Tn5 avlrulent/sauvage se traduit par un retard dans l'évolution de la maladie, comparée à celle du témoin référence GMI1229. En effet, ce témoin atteint % de maladie (IM = 5) en 7 jours seulement alors que la totalité des lots inoculés par le mélange mutant Tn5/sauvage n'expriment 100% de maladie qu'au bout de 25 jours. Trois mutants semblent montrer un pouvoir protecteur supérieur aux autres, à savoir GMI1353, 1351 et 1350, dans la mesure o 50 jours après l'inoculation mixte l'indice moyen de maladie varie de 3,8 à 0,5 respectivement. Dans une autre série d'expériences, on a vérifié l'influence de la concentration relative du À mutant Tn5 avirulent par rapport à celle de la souche sauvage, sur l'indice moyen de la maladie. Les plants de tomate cv.He3-5 (stade 3 à 5 feuilles, 18 plants/traitement) ont été inoculés avec des mélanges de suspensions de P. Solanacearum, les concentrations en mutant Tn5/souche sauvage étant dans des rapports quantitatifs de 1 et de 10. On rapporte dans le tableau 2 les résultats obtenus avec les trois mutants GMI1353, 1351 et 1350. to +7 +20 +35 I. ) jours Eau distillée O O 0 ci Sauvage GMI1229() 2,2 5 5 " GMI1229 (c2) 1,6 4,4 5 Mélange sauvage/mutant 1229cl/1353c1 2,2 3,3 3,3 1229cl/1351cl 0,5 1 1 2,7 1229cl /1350cl 0 1,1 1,1 1229 c2/1353cl 1,60 2, 7 2,75 1229c2/1351cl O 1,1 1,1 1229c2/1350cl 0 0,5 0,5 cl: 9.108 CFU-ml1 c2: 9.107 CFU-ml 1 On constate que s: le mélange contient dix fols plus de mutant avirulent que de souche sauvage, l'indice moyen de maladie baisse notablement par rapport à l'indice moyen de maladie obtenu à l'aide d'un mélange en quantité comparable. Dans d'autres expériences réalisées sur des tomates cv.Supermarmande, stade 5 à 8 feuilles (28 plants/traitement), le mutant Tn5 avirulent et la souche sauvage ont été inoculés séparément. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 3 qui donne les indices moyens de maladie obtenus à différents temps après l'inoculation de la souche sauvage, différée d'un jour par rapport à celle du mutant, avec différents rapports en concentration 263 1972 13 2 mutant/sauvage. Les concentrations c et c en mutant et/ou souche sauvage sont respectivement de 2 x 109 CFU.m-l et 2 x 108 CFU.ml- to +7 +12 +25 +35 Dours Eau distillée 0 0 0 0 Sauvage GMI1229(cl) 5 5 5 5 " GMI1229( c2) 2,1 5 5 5 4 Mutant + (différé 1 jour) sauvage A 1353cl /1229cl 2,5 3,2 4,3 4,6 B 1353cl /1229c2 0 0 0 0 Isolement Expérience B IMsauvage = 5 IM mutant = 0 p % P = 100% On observe qu'une quantité dix fois plus grande de mutant par rapport à la souche sauvage se traduit par une baisse notable de l'indice moyen de. maladie. Dans cette expérience, une quantité comparable mutant/sauvage se traduit au bout de 50 jours par un indice moyen de maladie de 4,6 alors que la protection devient totale (IM = O) lorsque l'inoculum mutant Tn5 est dix fois plus concentré que celui de la sauvage. Parmi les 28 plants sans symptômes externes de maladie, inoculés par le mutant GMI1353 à la concentration de 2.109 CFU.m1-1 puis 24 heures plus tard à l'aide d'une suspension dix fois moins concentrée de la souche sauvage, une série de 10 plants, choisis au hasard, et répertoriés, a donné lieu à des isolements échelonnés dans le temps. Un tronçon de tige de 5 mm d'arête a été prélevé au niveau de la feuille n'3 (+ 20 cm par rapport au niveau du sol) au temps to+12 jours. Un nouveau tronçon a été prélevé au niveau + 18 cm au temps to+25 jours et enfin au niveau + 16 cl au temps to+35 jours. Lors de ce dernier prélèvement tous les plants ont été sacrifiés et un isolement au niveau cotylédonnaire (+ 5 cm) a été opéré. On a constaté qu'aucun isolement dans la partie aérienne supérieure (feuille n'3) des plants de tomate ne révèle la présence de la souche sauvage, même 34 jours après l'inoculation de cette dernière. Les résultats ci-dessus montrent l'intérêt de l'utilisation de mutants génétiquement modifiés selon l'invention dans la lutte biologique contre les bactéries phytopathogènes. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. KEMPE J. et SEQUEIRA L.; Plant Disease 1983, 67:499-503 2. TANAKA H. Bull. Utsunomiya Tobacco Exp. Station 1985. 21:1-64 3. TRIGALET A. et DEMERY D.; Physiol. Mol. Plant. Pathol. 1986, 28:423-430 4. BOUCHER C. et al, J. Gen. Microbiol. 1985, 131:2449-2457 5. WINSTEAD N.N. and KELMAN A.; Phytopathology 1952, 42:628-634 6. BOUCHER C. et al, J. Bact. 169, 12, 5626-5632. 263 1 972 REVENDICATIONS 1. Mutants dotés d'un effet protecteur vis-à-vis de microorganismes phytopathogènes, plus spécialement de bactéries ou de champignons, dont les gènes impliqués dans le pouvoir pathogène renferment des séquences de nucléotides capables de s'hybrider avec un gène de pathogénicité de P. Solanacearum, caractérisés en ce qu'ils sont non pathogènes, capables de pénétrer dans la plante-hôte et de s'y multiplier, dotés de propriétés antagonistes vis-à-vis des microorganismes phytopathogènes, et qu'ils comportent une insertion ponctuelle ou une microdélétion dans les régions de leur génome impliquées dans le pouvoir pathogène, ces régions comportant des séquences de nucléotides capables de s'hybrider avec - une région a) comprenant une séquence d'environ 30 kb du génome de la souche GMI 1000 de P.Solanacearum qui correspond à l'insert du cosmide pVir2 à laquelle s'ajoute une séquence adjacente de 5 kb d'ADN génomique immédiatement située en amont de la région portée par pVir2, ou - une région b) comprenant une séquence d'environ 40 kb du génome de la souche GMI 1000 de P.Solanacearum correspondant à l'ensemble de l'ADN génomique de P.Solanacearum porté par le plasmide pGMI 880 à laquelle s'ajoute une séquence adjacente de 7 kb située en amont de la séquence de 40 kb. 2. Mutants selon la revendication 1, caractérisés en ce que les régions a et b comportent les sites de restriction dans l'ordre suivant: Région a: BamH1 - BamH1 - EcoRI - EcoRI - EcoRI - EcoRI - EcoRI - EcoRI - BamH1 - HindIII - KpnI - HindIII - EcoRI Région b: BamH1 - EcoRI - BamH1 -EcoRI - BamH1 - HindIII - BamH1 - HindIII - BamH1 - HindIII - BamH1 - BamH1 - BamH1 - BamH1 - EcoRI - 3. Mutants selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils comportent une insertion ponctuelle d'ADN ou une microdélétion dans la séquence correspondant au quatrième fragment EcoRI de la région a. 4. Mutants selon la revendication l ou 2, caractérisés en ce qu'ils comportent une insertion ponctuelle d'ADN ou une microdélétion dans la séquence correspondant au troisème fragment EcoRI de la région b. 5. Mutants selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que les insertions d'ADN portent au moins un gène marqueur, écologiquement acceptable, avantageusement un marqueur capable de conférer aux mutants l'aptitude à métaboliser un substrat carboné, une résistance à un sel de métal lourd ou des propriétés de bioluminescence. 6. Mutants selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisés en ce qu'ils dérivent de P.Solanacearum, notamment des souches GMI1229 ou GMI1000, ou de X. Campestris, ou de champignons du genre Fusarium sp., Verticillium sp., de Corynebactéries telle que Corynebacterium michiganense. 7. Compositions pour la lutte biologique contre les microorganismes phytopathogènes, en particulier les bactéries et les champignons, caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace d'un mutant selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, en suspension dans un milieu approprié, plus spécialement de l'eau. 8. Compositions selon la revendication 7, caractérisées en ce qu'elles renferment de 107 à 109 cellules de mutants/ml. 9. Procédé de lutte biologique contre les microorganismes phytopathogènes, caractérisé en ce qu'on utilise un mutant selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou une composition selon la revendication 7 ou 8.