FR 2626882 A1 19890811 FR 8801439 A 19880208 La présente invention concerne des conjugus ' médicament-transporteur qui utilisent comme médicaments des alcalobdes vinca pour le traitement du cancer. Ces drogues ont la propriété de bloquer la multiplication de cellules tumorales, mais également celle -de cellules normales ayant une grande fréquence de division, cornmme c'est le cas des cellules hématopoïétiques et des X cellules épithéliales de ltintestin. En outre, ces médi- caments peuvent avoir un effet toxique pour d'autres tissus et sont respectivement cardio- et neurotoxîqmes. Les dérivés daalcalodes- de vinca les plus utilisés actuellement -sont la vinblastine et la vin- cristine. La vinblastine et la vincristine-sont deux dérivés dimères extraits des feuilles de Catharanthus- Roseus. La vindésine est un dimbre hémisynthétique obtenu & partir de la vinblatine. Ces trois dérivés sont les plus utilisés &. l'heure actuelle en clinique humane dans- le traitement des divers types d maladies cancéreuses. Cette utilisation se justifie par leur très nette acti- vité contre des tumeurs humaines, telles que la maladie de Hodgkin, les tumeurs du sein et du poumon pour la vinblastine, les lymphosarcomes, la leucémie mphblas- - tique, les transformations aiguës des leucémies lymphz-. blastiques chroniques pour la vincristine et la vindé- sine. L'utilisation de ces substances est cependant limitée par leur toxicité neurologique et hématologique.- Depuis plusieurs ariies un programme de recherche a été entrepris, qui visait à développer des nouveaux dérivés moins toxiques de vincristine et de vinblastine, De nombreux dérivâs d'alcaloIdes vinca ont été sSynthétisés dans le but d'obtenir des activités pharmacologiques antitumorales plus intéressantes. Selon l'invention, des méthodes sont développées afin de coupler des dérivés d'alcaloides de vinca à des transporteurs macromolécu- laires dans le but, selon l'approche conceptuelle du pilotage de médicaments, de permettre d'augmenter l'ac- tivité thérapeutique tout en réduisant la toxicité inhérente à ces médicaments. Par exemple, un transporteur, qui est proposé selon l'invention, est-l'albumine hu- maine galactosylée qui est reconnue sélectivement par les 1l hépatocytes et les cellules de l'hépatome humain. Des techniques sont au point afin de produire cette ndoglyco- protéine dans des conditions aseptiques et apyrogènes permettant son administration à l'homme. Enfin/ des hybridomes ont été créés qui sécrètent des anticorps monoclonaux ayant une haute affinit. et une bonne sélec- tivité pour les cellules de l'hépatome humain. La con- jugaison à des anticorps monoclonaux a également été réalisée. Plus précisément, la présente invention se rapporte à de nouveaux conjugués de dérivés d'alcaloïdes de vinca du typeindole-dihydroindole avec des agents de pilotage. La spécificité de l'approche du problème de la chimiothérapie des cancers selon l'invention repose sur le concept de pilotage des médicaments qui viser en fait, à augmenter la sélectivité des agents antitumoraux en les couplant à des transporteurs reconnus le plus spécifiquement possible par Jes cellules que l'on désire toucher. Outre une activité plus grande résultant du fait que la quasi totalité du médicament administré devrait atteindre sa cible, cette approche vise à réduire consi- dérablement la toxicité des agents antitumoraux. Cette approche est basée sur le type de lien chimique que l'on intercale entre le médicament et son transporteur. Zn effet, les liens, selon l'invention, sont covalents, ce qui permet d'éviter la dissociation de conjugués non covalents par simple effet de dilution; ils sont égale- ment sélectionnés en fonction de leur stabilit. dans les liquides biologiques extracellulaires et de leur réver- sibilité en présence d'enzymes lysosomiaux. De préférence, les conjugués médicament-transporteur qui sont développés doivent être, d'une part, reconnus par des sites spécifiques présents à la surface des cellules tumorales, mais ils doivent, d'autre part, être endocytés et rejoindre les lysosomes. *Par agent de pilotaget on entend donc désigner dans la présente demande des transporteurs macromolécu- laires spécifiques, pilotant sélectivement la substance active vers des cellules cibles à traiter. Il slagit en général de protéines telles que AHgal ou un facteur de croissance tel que l'EGPou des fragments de protéire,. notamment d 'immunoglobulines ou fragments d immunoglo- buline. Par exemple, dàns le cas du cancer, qui est ici concerné, des anticorps monoclonaux dirigés. contre des antigènes associés aux tumeurs sont particulirement adaptés. Comme il a été évoQgué préc6demment, les systèmes de pilotage ou conjugués, impliqu6s par la présente invention, requièrent la présence. outre de I agent de pilotage et de le eabstence active d'u lien -30 chiique covalent entre ces deux composs. Il peut stair d'une liaison entre une fonction chiqte terminale de 2626,82 la substance active et une fonction chimique complémen- taire de l'agent de pilotage par exemple COORH et NH2. Il peut également s'agir d'.un groupement chimique ou bras assurant la liaison entre les deux composés. On trouvera la description des caractéristiques qui doivent présenter des différents éléments impliqués dans le concept de pilotage dans la demande de brevet FR-85 10 234 déposée par la Demanderesse. Les dérivés d'alcaloïdes de vinca ont fait l'objet de nombreuses recherches, études et brevets, en vue de la préparation de substances plus actives, plus sélectives et moins toxiques comme agent anti-tumoral, sous forme de conjugués. Le couplage de dimères indole-dihydroindoles. une protéine a été envisagé jusqu'à présent essentielle- ment selon deux voies: 1) Couplage en position C-4 a) par l'intermédiaire d'un groupe ester dérivé'du groupe hydroxyl du carbone4 du squelette de l'alcaloïde de vinca (demande de brevet européen EP-124 502). Il s'agissait alors de coupler la- vindésine par un bras hémisuccinate à une immuno- globuline. b) par 'intermédiaire d'un dérivé organique bi- fonctionnel du type maléoylaminoacide, notamment Ala-Mal dans la demande de brevet luxembourgeois n" 86 212 particulièrement. on trouve cependant d'autres couplages en C-4 selon ces deux types dans les demandes de brevet EP 121 388 et FP 123 441. 2) Couplage en position C-3 a) la vindésine a été couplée directement une i'munoglobuline par l'intermédiaire d'un dérivé azide dans la demande de brevet européen EP 56 322. b) des demandes EP 206 666 et EP 206 667 proposent également des couplages d'hydrazide de vinblastine liés par un bras du type hémisuccinate à une immunoglobuline. - La présente i vention se prpose d'obtenir de nouveaux conjugués de dérivés d'alcaloïdes de vinca à partir des nouveaux dérivés décrits dans les demandes de brevet FR 86 00 364 et FR 86 17 412 déposées par la: Demanderesse. - La présente inventioi aen effetpour objet des conjugués de dérivés de vinca (indole-dihydroindole)com- portant en position C-3 une chaine détergente d'au moins 7 atomes de carbone aliphatique liée par un lien covalent à un transporteur macromoléculaire de nature -poypepti- dique. Plus particuliîrement, la présente invention a- pour objet des conjugués de dérivé de vinca (idole- dihydroindole)-alcalolde comportant en position 'C-3 une chaîne détergente d'au moins 7 atomes de carbone alipha- tique, chatne substituée à son extrémité par un radical -25 COOH couplé à une fonction amino libre d'un transporteur macromoléculaire de nature polypeptidique par 1i 'ntermé-. diaire d'une liaison amide -CO-}. Plus part/culirmmt les conjuguées- qui ré- - pondent à la formule - o; R4 C-R -T dans laquelle: (R1, R2) représentent (-Et, -OH) ou (-HE, Et) R4 représente '-H, -Me ou -CHO, R3 représente -OH ou -O-C-CH3 R représente-A- R'-ç-, A étant choisi parmi -NH-, -X-alk-,o -NH-alk-g-NH- ou bien A est le radical divalent d'un aminoacide entrant dans la constitution des protéines se terminant par -NH et -C-O ou -NH et t -C-NH, alk désignant une chatne hydrocarbonie divalente droite ou ramifiée en C1 à f R' représente un radical hydrocarboné aliphatique ayant au moins 7 atomes de carbone aliphatique, -5.R est substitué par un reste provenant d'un radical -COOH terminal de R' coupld une fonc- tion amino libre du transporteur T par l'inter- médiaire d'une liaison - -NH+, -R-T pouvant donc être représenté par -A-RC-NH-P avec -T = -NE-P. Parmi les radicaux hydrocarbonds aliphatiques, il faut 'citer les radicaux: *. alkyle en C C20, droits ou ramifies, et alkényle en C1 à C20, droits ou ramfiés, ces - radicaux étant de préférence droits; lorsque ces radicaux sont substitués, ils le. sont de préférence en bout- de chatne. Parmi les radicaux alk, il faut citer les radi- caux hydrocarbond.s' droits ou ramifies, en Ci à C7 de préférence C1 à Cs, non substitués ou substitués par un. ou plusieurs radicaux OH, Nou CdoH. Lorsque A est un radical divaleût dun amino- acide entrant dans la constitution des protéines, il peut être sous forme D ou sous forme L lorsqufil comporte un atome de carbone.asymétrique - Le radical-A peut provenir de Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Plhe, Ser, Thr, Lys, Lys-0H, Arg, Asp, ASp-NH2, Glu, Glu-NE2, Cys-S, Met, Tyr- Trp ou His, mais de préfé- rence Ala. Lorsque ces radicaux présentent des fonctions autres que les fonctions de liaison, -celles-ci peuvent être protégées par des groupes de protection connus dans la chimie des protéines, tels que le groupe Cbz carbo- benzyloxy) par exemple. on peut citér notament les conjugués pour lesquels R3 - -Z et A = -NH-. Parmi les conjugués de formule I, on peut également citer plus particulièrement les conjugués sous lesquels (R R2) = (-Et, -OH) et R4 = Me. Des conjugués particulièrement intéressants sont obtenus lorsque -A-R' est choisi parmi -NH-(CH2)11, -NH-(CH2) 17 NH- (CH2)7-CH=CH-(CH2) De préférence, le transporteur macromolécu- laire est choisi parmi les protéines, néoglycoprotéines et immunoglobulines IGg ou des fragments de-celles-ci. Parmi les protéines ou néoglycoprotéines, on peut citer: * la sérum albumine de bovin ou l'albumine humaine galactosylde, ainsi que * les facteurs de croissance comme l'EGF (Epider- mal Growth Factor). On peut en effet citer notàammtent deux types de transporteurs. Tout d'abord, des néoglycoprotéines qui exposent des résidus de galactose et qui sont reconnus par un récepteur présent à la surface des hépatocytes, mais aussi de cellules d'hépatome humain. D'autre part, dans le cas de cellules tumo- rales, un autre type de tranisporteurs, peut être cité, en l'occurrence les anticorps monoclonaux. Cette approche tire profit de la sélectivîté de la réaction antigène- anticorps et est basée sur l'hypothèse que des cellules tumorales pourraient exprimer à leur membrane plasmique des antigènes plus ou moins spécifiques. Les premiers antigènes contre lesquels on peut produirte des anticorps - sont les antigènes organotypiques. Ceci permet de limiter la capture des conjugués médicaments-transporteurs à un seul type cellulaire, mais n'empêche pas ltaccès du conjugué aux cellules normales exprimant les antigènes Un second type de cible est constitué par les antigènes associés aux tumeurs. Dans cette catégorie on peut inclure les antigènes présents à la surfade des cellules embryonnaires qui réapparaissent lors de la traiforma- tion maligne ou encore des antigènes -présents en très' petit nombre à la surface des cellules normales, mais dont le nombre augmente considérablement au cours de la can- cérisation. Dans certains cas également, ce sont des -: antigènes d'origine virale gui apparaissent à la surface de cellules infectées et transformées. Le troisième type d'antigènes que l'on peut considérer comme cible est constitué par des. antigènes spécitfiques des cellules tum- rales. Bien que le sujet soit encore largement contro- versé, il semble que des antigènes spécifiques pourraient appara tre lors de la transformation cancéreuse et être exprimés-à la surface des cellules tumorales. Des anti- corps dirigés contre de tels antigènes représentent les transporteurs idéaux. Un exemple dantigènelconsiddré comme fonctionnellement spécfique de tumeur, est ll'dio- type des immunoglobulines de surface portées par cer- taines cellules de leucémie Bou de lymphomes. On peut donc citer omme transpreu abu- mine humaine galactosylde qui est reconue sélectivement par les h6patocytes et les cellules de l1hdpatome humain. On peut également utiliser parmi des anticorps monoclonaux ayant une haute affinité et une bonne sélectivité pour les cellules de l'hMpatome humain, l'anticorps CT-M-01 décrit dans la demande FR 85 10 234. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation de conjugués, caractérisé en ce que 1) on prepare le dérivé d'alcalolde de vinca en C-3 d coupler j a) en faisant réagir l'hydrazide de formule 1.0 MeOC, R4CO)NHNH12 avec un nîtrite pour former i 'azide correspondant en position C-3 et. b) en faisant réagir X'azide avec une amine de for- mule: H - A - P.' - coZ avsous forme d'un ntgroupe dre protectionsde corresponu dans en position C-3 et b) en faisant réagir l'azide avec une amine de for- mule: H A RI - C0Z_ la fonction COOH terminale de 5 1 tant protégée sous forme d'un groupe de protections connu dans la chimie des protéines Z, notaMent le groupe benzyl, c) en déprotégeant la fonction COO terminale de Rt du dérivé obtenu après l'étape b). - 2) on couple. le dérivé obtenu à 'létape c) avec le trans- porteur polypeptidique - a) en activant la fonction COOH du dérivé obtenu à l'étape l)c} sous forme -COZ'.dans laquelle Z'est un groupe labile connu dans la chimie des petides - qui permet b) de réaliser un lien amide covalent avec un groupe - amino libre du transporteur polypeptidique. i ZE peut être un groupe connu dans l'état de la technique tel que ceux décrits dans Peptide Synthesis de Bodanszky, Y.S. Klausner et M.A. Ondetti, Seconde Edition (1976) John Wiley & Sons, notamment pages 85 à 136. On peut citer pour ZV le groupe (-N3), un halogène, notamment brome ou chlore, un groupe acyloxy de formule R5CO.O dans laquelle R est un reste ali- phatique ou aromatique tel que, par exemple, un' al}l en C -C3, un groupe alcoxy de préférence en Cl-C, ou un groupe aryloxy un méthanesulphonyloxy, tosyloxy ou benzènesulphonyloxy, un radical imida- zolyl ou le reste d'un dérivé N-acylhydroxylamine, par exemple Z' peut être un succiniidozxy, un phthalimi-' doxy ou un benzotriazolyloxy. Les exemples préfférés sont les gropes N-aclhydzylamne, notamment les esters N-ydroxysuccimie prépares en utilisant le. 1 -cyclohexyl-3- (2-morpholhnoétbyl1 -=arbodiimide métho- p-toluènesulphonate ou 1, 3 dicyclohexyl-carbodiimide ou via un anhydride mixte tel que ceux obtenus en utilisant l'isobutylchloroformate. * Quand Z'est un radical imidazolyl, il peut ôtre préparé en utilisant un radical carbonyl di-imidazole et quand Z' est RS Co.o avec R5 qui est un alkyl C1-C3, notamment éthyl et isobutyl, il peut &tre préparé par utilisa- tion d'un 1-éthoxycarbonyl-2-éthoxy-1,2-dihydroquinoline et l'isobutyl chloroformate respectivement. La réaction est effectuée comme suit. L'hydrazide est dissous dans un solvant tel que le MeOH en milieu acide, HCL 1 N par exemple, la solution est refroidie et on ajoute un nitrite tel que le nitrite de sodium, le pH est alors ajusté avec une base faible telle que l'hydrogéno- carbonate de sodium, on obtient ainsi un azide acide qui est extrait par un solvant non miscible tel que le dichlorométhylène. Après séparation, l'azide, séché et concentré, est traité par l'amine correspondant au produit désiré (H-A-R'-C07) et le produit brut est séparé du mélange réactionnel et éventuellement purifié. L'amide obtenu est séparé du milieu réac- tionnel par tout procédé approprié Le dérivé à fonction COOH protégée est ensuite déprotégé,par exemple il est mis à hydrogâner dans du méthanol en présence de charbon palladié 10 %. Enfin le couplage avec la protéine est de préférence effectué en milieu aqueux à une température entre 5C et 250C par exemple à la température ambiante et à pH7 entre 7,5 et 9,5, de préférence 8 et 9. Le couplage 4 lieu sur un groupe amino libre de la protéine 1.3 vectrice, par exemple un groupe amino d'un reste lysine, Enfin, l'invention a également pour objet, à titre de produit intermédiaire utile dans le procédé sélon la revendication 6, un aérivé de vinca en C-3 comportant en position C-3 une chaîne déter.gente d'au moins 7 atomes de carbone aliphatique, chaîne substi- tuée a son extrémité par le groupe COZ', de l'étape 2al du procédé de la revendication 6. L'invention concerne également 1 ' application des conjugués à titre de médicament, ainsi que es compositions pharmaceutiques les incorporant et copor- tant des excipients, supports ou vecteurs pharmaceutiques acceptables. Les composés selon la-présente invention présentent en effet des propriétéS antinéoplasiques qui les rendent particulièrement intéressantes dans le traitement des néoplasies malignes telles que les leucé- mies, la maladie de Hodgkin généralisée, certains lym-. phomes, les sarcomes ou, carcinomes notamment. - D'autres caractéristiques et avantages de la. présente invention apparaîtront à la lumière des exemples suivants illustrés par les figures 1 â 3 dans lesquels la figure 1 représente la masse tumorale relative en fonction du temps pour les hpatomes Hep2 traités par le conjugué 2060 MHgal à différentes doses; la figure 2 représenite la courbe de stabi- lité danms le sérum d'un coju gu 2060 AHgal selon lin- vention; la figure 3 représente la courbe de digestin -du même conjugué par les enzymes lysosomiaux.- EXEMPLE 1 Préparation de carboxamide de 4-désacétyl-vinblastine C-3 N-(11 carboxyundécyl) (composé n* 2060) Le procédé est décrit en-référence au schéma de synthèse I ci-après. A) 4-dCsacétl-vinblastine C-3 N-(11 carbobenzyloxy- undecyll (3) On dissout l'hydrazide de désacétyl-vinblastine (1) dont la préparation a été décrite dans (CONRAD et al. J. Med. Chem. 22,391 (1979)) à raison de 0,600 g (0,78 millimole) dans un mélange contenant 12 ml de méthanol et 36 ml de 'XC! 1N. La solution est refroidie à 0 C, puis est additionnée de 0,1t23 gr (1,78 millimole) de NaNO2 sec. en une fois et sous agitation.'Aprês 13 mi- nutes, le pH de la solution est ajusté à 8,5 avec une solution saturée froide de NaECO3. On extrait-rapidement l'azide acide de la désacétyl-vinblastine avec 4 x 15 ml de CH2C!2, puis on le lave avec une solution saturge de NaCl. 20. Les extraits sont séchés sur Na2SO4 et con- centrés en un volume de 20 ml. A la solution de CH2C12, on ajoute du benzyl ester de l'acide 12-aminododécanolque (2) à raison de 0,354 g (1, 16 millimoles) et la solution est agitée pendant 2 heures à la température ambiante. La chromatograph.ie en couche mince révèle un composant - majeur (RF = 0. 46; méthanol.:-chlorure de méthylène ::95). Le solvant est évaporé et le résidu chromato- graphié sur silice en éluant avec un mélange d'acétate * d'éthyle 2 mthanol (96:4). Les fractions appropriées- sont combinées et les solvants enlevés pour conduire,. 450 mg de 4-désacdtyl-vinblastine C-3 N-(1 carbo- benzyloxyundécyl) (3) (rendement: 55 %), avec les carac- téristiques physiques suivantes RF: 0.46 (silice, CH2C12 CH3OH 95:.5) SM: Spectroscopie de masse (DCi, isobutane} 1043 RMN: (CDC13, 200 Mz}: 9,52 (Ox 1Hr), 8,03 (NHE, IR) f,- 7,51 HH4, H-12') (2),t 7,45-7r,04 (Aromatiques, 7H})r 6,61 (a-12, Ia), 6, 07 (11-9, 1H), 5,83 (11-14, -15, 2H), 5,12 (CH2-Ph, 2H)2, 4,19 (H-17, 11), 3,9:6 (E-17 A,, 1H), 3,77 (OC3,r 3H), 3,58 (OMe, 3E), 3,35 {H-2), 2,79 (N-CH3), 2,64 (1H-21) IR: (KBr, cm: 3460, 2930, 2858, 1734, 1660, 1614, 1 50S, 1460,- 1228,- 740 Formule moléculaire: 62 H 83 a 509 Poids moléculaire: 1 041,617. B) 4-désaaétyl-vinblastine C-3 N-f11 caroxyundécZl> (41) Une solution de 400 mg (0,38 mitlimole} de 4-désacétyl-vinblastine C-3 N- (t 1 carbobenzyloyxundecyl) (3) dans 25 ml de méthanol est mise à hydrogéner à tempé- rature ambiante et à press:on atmosphérique en présence d'une pointe de spatule de Charbon Palladiî 10 S%. Apres s15eures d-,atation 2 ai de h satré n n3 sont ajoutés et la solution est filtrée sur d4calite. Le filtre est lavé avec 2-x 10 ml de méthao*i, Le filtrat est concentré sous vide. Le résidu obtenu est ensuite purifié par chromatographie-sur silice en utilisant un mélange d'éluants composé d'éther, de méthanol et d'ammoniaque aqueux 15 N. dans un rapport 50/49,5/0,5. -Les fractions appropriées sont combinées et les solvants enlevés pour conduire à 307 mg (0,32 milli- mole) de 4-désacétyl-vinblastine C-3 N-t11-carboxy- undécyl). rdt: 84 %. Après trituration dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole, le produit est obtenu sous forme d'une poudre blanche amorphe ayant les carac- téristiques physiques suivantes: RF: 0.33 (silicer CH2C12: CH3OH 90:10) SM: (DCI) 952, 892, 809, 749, 709, 663, 651, 610, 598, MIN: (CDC13, 200 MHz), 8,02 (NH., 1H), 7,52 (H-11, H-12, 2H), 6,49 (H-12, 1H), 6,07 (H-9, IHJ, 5,81 (H-14-15, 2H), 4,15.(H-17, 1H), 3,77 (OMe, 3H), 3,58 (OMe, 3H), 3t,33 (H-2), 2,79 (N-Me), 2,58 (H-21) IR: (KBR, cm 1 3460., 2925, 2853, 1719, 166.0, 1613, 1501, 1460, 1229. Formule moléculaire: C55H 77N509 Poiads moléculaire: 951,57 Le sel bis méthane sulfonate est préparé en * dissolvant du carboxamide de vinblastine C-3 N-011 carboxy- undécyl) (4) (110 mg) dans de l'éthanol anhydre et en. ajoutant de acide -thanoliu/a M an=sulfOn gue O 2 %. La solution est concentrée sous vide. On ajoute au résidu. 3 ml d'eau distillée et la solution obtenue est lyophilisée pour donner 133 mg de sel bis-méthane sulfonate. -QN I ii h hi X 23 CL) SRJ. - CHAS ',, 0 L 262688 ? EX-MPLE 2 Conjugué entre la 4-déàacétyl-vinblastine C-3 N- (1 carbo- xEundcyl) _4) ( et l'albumine de sérum humain _alactsXle Une solution d'isobutylchloroformate (16 Al). dans le dioxanne sec (2mg) est ajoutée à 100C goutte à goutte sous agitation à de la 4-désacétyl-vinblastine C-3 N-(11 carboxyundécyl) (97 ug) et de la triéthylamine (17 Al) dissoutes dans le dioxanne (80 ml). Après minutes d'agitation, le mélange organique est.trans- féré goutte à goutte sous-agitation dans 185 ml d'une - solution d'albumine de sérum humain galactosylée (5,4 mg/ml) dans du tampon phosphate 0,15 M (pH 8,5). Le mélange est agité à température ambiante pendant 15 heures. Il es.t ensuite purifié par filtration sur gel G25 équilibré avec une solution NaCl 9 %. Le pic exclu est récupéré, filtré sur Millipak 40 (0,22 g)), concentré jusqu'à obtention d'un volume de 16 ml, et stérilisé. Le contenu en protéines est mesuré par la technique de Lowry.et le contenu en alcalofdes estimé par mesure de la radioactivité. Le conjugué ainsi préparé contient 6,2 moles de 4-dâsacétyl-vinblastine C3 N-(11 carboxyundécyl) par mole d'albumine galactosylée. -M=ise au toint de la technmine de couplage du détergent 2060 (V -(CH2)1CO}) à l'AHgal 3. 211, ; _ ' Il convient d'obtenir des conjugués ayant le. rapport molaire médicament/transporteur maximal tout' en gardant le meilleur rendement possible en forme monomère 1.9 du transporteur macromoléculaire. Au-delà d'un certain seuil dans le rapport molaire drogue/transporteur, il se produit très rapide- ment une polymérisation du transporteur le rendant inutilisable. I1 apparait =que cette polymérisation affecte les propriétés de reconnaissance de la protéine. Rapport engag Z de dioxanne Rapport obtenu HPLC moles vincalwoles lysine:mrles v1nca/molesAHgal X Mo P P.., PM. M i.ô s..]4 s7.:l4a 0,3 7,3 2 6,- 0,3 1 l, 6. 7 0,3 30 8 45 S5 0,6 30 14, J7 29 70.1 0,9 3 2 17 82 1 :3e, '.:: .. EXEMPLE 3 3.1 Activité chimiothdrapeutique sur la leucémie P 388- Des essais d'activité autitumoralede dérivés de conjugués de la VLB des exemples 1 et 2 pnt dté conduits sur des souris de la faeon suivante- 3.1.1. Paramètres d*activi-t Deux paramètres d'activité sont-utilisés z le paramètre 'l L.$ " représente l'augmentation de la durée de vie# en p=uxcei=tge et selon la relation suivante: r - epZ".L.S.% ee = a(m xt llu ladrg ei' ee.. elto 26 268.E 2 T ten jours) étant la durée moyenne de vie des souris traitées, C (en jours) étant la durée moyenne de vie des souris témoins. - le paramètre wsurvivants & long terme" dont le calcul en pourcentage est effectué au Jour 60. 3.1.2. Administration întrapéritoneale 106 cellules de leucémie P388 sont inoeulées par voie intrapéritonéale chez des souris BDF1 femelles au jour 0. Le lendemain, le composé 2060 est administré par voie întrap6ritonéale. Produit Dose Nombre ILS Survivants Remarques mg/kg/jour de souris % au jour 60 2060 25 7 82 0/7 NaCI 9 %,, 7 186 0/7 20 7 105 0/7 NaCI 9 %0 7. 156 2/7 i H2 7 -38 0/7 NaCl 9 % g|,..,#iu =... - 2060 V3-(CH)l-CC OH Le conjugué du dérivé 2060 couplé a l'albu- mine galactosylée humaine (Agg) a'donné les résultats remarquables suivants. Activité Ch-iloothrapeutique du Conjugue 206&-Mg sur 1a leu-nie P388 imnlant4e par vole i.P. chez la souris BDF1 femelle (I0 cellules i.p. traitement 1.u: au jour I). N Exp. Dose Dose Nombre de X Survivants Rapport Lot Vinca Prot souris ILS au jour 60 moltaire conjuguE Mono mg/kg mg/kg - 537 20 259 7 > 582 4/7 6,2 1166 59 543 20 318 7 >689 4t7 5,1I 1182 53 543 30 477 7 197 3/7 5,*1 1182 53 537 40 617 7 -31 0/7 6,2 1166 59 556 20 360 7 267 2/7 4,5 1205 57 3.2 - Activité chimiothdrapeutigue sur l'h6patome nepG Des fragments de l'hépatome HPG2 de plus ou moins 2 mm3 sont implantées en sous-cutané bi. atéral dorsal chez la souris nue Balb/c femelle au jour O. Lorsque les tumeurs atteignent une masse conum4 (environ 500 mg), le traitement est administré par voie i.v. Lévolution des masses tumorales est suivie au cours du temps. Les dia- mètres tumoraux sont mesurés afin de déterminer la masse tumorale par la relatironL longueur 1 = largeur.. LeS rapports des masses tumorales au-jour x/masse tumorale au 1er jour du traitement sont portés en graphique en fonction du temps (masse relative ou MR/T). Les produits administrés sont du NaCl 9 %o pour les contrôles et le conjugué 2060-AHgal aux doses res- pectives de 15, 20 et 25 mg/kg. Le graphique de la figure 1 reprend les moyennes des masses relatives en fonction du temps. Le traitement a été administre en 5 injections i.v. respectivement aux jours 26, 33, 40, 47 et 54. Les résultats de la figure 1 Contrent une inhibition partielle de croissance des tumeurs significa- tives aux trois doses évaluées. Pour les HepG2, on observe une disparité très grande dans les tumeurs et il arrive qu'une tumeur d'une certaine masse arrête à un certain moment de se développer. C'est ce que l'on observe avec la série contrôle. En effet, la moyenne des masses relatives des contrôles évolue jusqu'à atteindre 25 fois la valeur de départ. Les souris avec les tumeurs les plus grosses meurent et on observe donc une chute de la moyenne. Celle-ci retombe à une valeur très faible correspondant à un hépatome qui a arrêté son développement. En effet, normalement la moyenne devrait retomber à 0. En ce qui doncerne -l'effet du conjugué, on observe une inhibition très nette du développement des masses tumorales. Apres l'arrêt du traitement, on observe une recrudescence des tumeurs. La survie des animaux traités est également supérieure à celle des contrôles. EXEMPLE 4 4.1 - Stabilité du conjugué 2060-AHgal dans le sérum. Le conjugué 2060-2Hgal a été incubé à 37TC en présence de 80 % de sérum humain ou de NaCl 9 %O (sérum physiologique). Après différents temps T d'incubation, les protéines non dégradées sont précipitées, apres addition de 5 mg d'albumine sérique, par deux volumes d'acéto- nitrile. Après incubation des échatilos à 4'C pen- dant une heure, ceux-ci sont centrifugés et la radio- activité du surnageant est estimée par comptage d'une partie aliquote en scintillation liquide. La radioactivité soluble est une mesure de la digestion du conjugué. Les valeurs figurant dans le tableau i ci- après représentent le pourcentage de radioactivité soluble (Vinca tritié). Les rdsultats du tableau I reproduits également dans la figure 2 établissent la bonne stabi- lité du conjugué dans le sérum. 4.2 - Digestion du conjugué 206-AHgal par les enzymes lysosomia 1es _.:::. Le conjugué a été incubé 37c ean présence de cystéine 5 mM, de tampon acétate 40 mM et d'enzyTmes lysosomiales (T.S.) ou d'eau. Après différents temps d'incubation, les protéines non dégradées sont pr6cipites, après addition de 5 mg d'albumine sérique, par deux volumes di'acéto- nitrile. Après i atin dem chantillons à 4*C pen- dant 40 minutes et centrifugation à 3000 RPX pendant minutes, la radioactivité du surnageant est estime par comptage d'une partie aliquote en scintillation li- quide. La radioactivité soluble est une mesure de la digestion du conjugué. Le pourcentage de radioactivité soluble reproduit dans le tableau I et dans la figure 3 montre qu'environ 80 % des conjugués ont été digérés par les enzymes lysosomiales (T.S.). Tableau I - = - -_ _V - 3-C12-AHgal (2060-AG) STABILITE 80Y. SERUM HUMAIN DIgESTION TS TEMPS(H) NACL 9 %o SERUM H20 TS 0 14 12.2 12.3 14.3 24.3 16.8 8 11.2 67.8 47.*55 16.6 9 12.3 77.3 71.5 13.3 18.4 14.1 82.8 EXEMPLE 5 - Couplage du 4-désacetyl-vinblastine C-3N- (11-carboxyund6cyl) à l'anticorps monoclonal J=,. * (type IgG CTM01) - Une solution d'isobutylchloroformate (2,8 41) dans du dioxanne sec (0,5 ml) est ajoutée à 10VC goutte à goutte sous agitation à de la 4-désacétylvinblastine C-3 N-(11 carboxyundécyl) (16 mg) et de la triéthylamine- (2,6 41) dissoutes dans I ml de dioxanne. Aprâs 15 minutes d'agitation, le mélange organique est transféré goutte à goutte sous agitation dans 20 ml d'une solution d'anti- corps monoclonal (8,5 mg p/ml) dans du tampon phosphate 0,1 x pH 8,5. Le mélange est agité à température ambiante pendant.1 nuit. Il est ensuite purifié par filtration sur 2.5 gel Sephadex G25 équilibré dans une solution de NaCi1 9 %, pH 7,5. Le pic exclu est collecté, concentré par ultrafiltration et stérilise. Le contenu en protéines est mesuré par la md- thode de Lowry et le contenu en alcalo!des est estimé par mesure de la radioactivité. - Le conjugué ainsi préparé contient 1 mole de 4-désacétyl vinblastine C-3 N-011 carboxyundecyl) par mole d'anticorps monoclonal. eEVENDICATIOtNS 1. Conjugués de dérivé de vinca (indole- dihydroindole) comportant en position C-3 une chaine dé- tergente d'au moins 7 atomes de carbone aliphatique liée par un lien covalent à un transporteur macromoléculaire de nature polypeptidique. 2. Conjugués de dérivé de vinca (indole- dihydroindole)-alcaloïde Comportant en position C-3 une chaine détergente d'au moins 7 atomes de carbone alipha- tique, chaîne substituée à son extrémité par un radical COOH couplé à une fonction amino libre d'un transporteur macromoléculaire de nature polypeptidique par 1'intermé- diaire d'une liaison.amide (-CONH-). 3. Conjugués selon:.la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce que les dérivés couples au trans- porteur macromoléculaire T répondent à la formule géné- rale I g.- Mo 1- " * (z} À0- - R4 JC$R-,v mo. 3 ! -R3 dans laquelle:. * (R1, R2) représentent (-Et, tOH) ou (-EH, Et> * R4 représente -H, -Me ou -CHO, R3 représente -OH ou-O--CH3 - % représente -A-U!.- A étant choisi parmi -NH-, -No-alk-u i, -X-alk -NH u -bien- A est le radical divalent d'un aminoacide entrant-dans la constitution des protéines se terminant par -- et -g-0 ou -il- et -g-NH 10. alk désignant une chalne hydrocarbone divalente- droite ou ramifiée en C C7, R représente un radical hydrocarbon6 aliphatiqu: ayant au moins 7 atomes de carbone aliphatique, R est substitué par un reste - provenant d'un radical: -COOHE en extrémité de R' couplé à une fonction amino libre du transporteur T par l'intermédiaire d'une liaison 4C-NE-+, -R-T pouvant donc être représenté par -A-R'-C-NB-P avec T = MH-P. 4. Conjugués selon la revendication 2ï caractérisés en ce que '- R3 =OH et A = -NH-. 5. Co.jugués selozn wune e revendications 3 ou 4, caraotérisés en c que. (R1, R2) = -Et, -Os), et R4 Me. 6. Conjugués selon l'une des revendications 3 5, córacterisés en ce que -A-R' est choisi parmiNH-i(CH2)11 ' * 7. Conjugués selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce que le transporteur macro- moléculaire est choisi parmi les protéines, néoglyco- protéines ou des fragments de celles-ci, protéines et néoglycoprotdines, telles que 10. la sérum albumine de bovin l'albumine humaine galactosylée, ou les facteurs de croissance tels que l'EGF. 8. Conjugués selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce que le transporteur est choisi parmi les immunoglobulines IGg ou des fragments de celles-ci, telles que des anticorps monoclonaux, notam- ment l'anticorps CTM-01. * 9. Procédé de préparation de conjuguds'selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce.-que 1) on prépare le dérivé d'alcaloïde de vinca en C-3 à- coupler 2626SEZ a) en faisant réagir lhydrazide de formule Meo avec un nitrite pour former 1'azide correspondant en position C-3 et: b} en faisant réagir llazide avec-une amine de formule: -H - Ah R - ' -COZ g 2la fonction de COOH de R: étant protégée sous forme d'un groupe de protections connu dans la chimie des protéines Z tel que le groupe benzyl> c)en déprotégeant la fonction COQH de R' du dérivé otenu après l'étape b). 2) on couple le dérivé obtenu à l'étape c) avec le trans- porteur polypeptidique a) en activant la fontion COH du dérivé obtenu à l'étape 1lu soUS e O--OZ' dans laquelle-Z' est un groupe labile connu dans la chimie des peptideb qui permet b) de réaliser un lien amide covalent avec un groupe amine libre du transporteur polypeptidique. 10. A titre de produit intermédiaire utile dans le procédé selon la revendication 9, un dérivé de vinca en C-3 comportant en position C-3 une chalne détergente d'au moins 7 atomes de carbone aliphatique, chaîne subs- titude A son extrémité par le groupe COZ', de ltétape 2a) du procédé de la revendication 9. 11 Composition pharmaceutique comportant un conjugué selon l'une des revendications I h 8, à titre de principe actif. 12. Composition selon la revendication 11, carac- térisde en ce'qu'elle est sous forme injectable.