FR 2626584 A1 19890804 FR 8800973 A 19880128 26-26584 I= -:- La présente invention concerne des séquences de répliction autonome chez Yarrowiva lip.olyticga, des procédés pour leur.préparatiorn et leur utilisation dans des procédés mettant en oeuvre les ADN recombinants. L'existefice, le rôIe et le clonage de séquences conférant l'autonomie de réplication à des plasmides de levure a été très documentée chez Saccharomyces cerevisiae (1,2). Un plasmide bactérien (type pBR322) dans lequel a été clonr un gêne marqueur de levure (par exemple un gène codant pour une enzyme biosynthétique, comme LEU:2s URA3 LYS TRPI, etc.) est capable de s'intégrer à faible fréquence dans le chromosomen le plus sotvent par recombinaison homologue au locus considéré; Si on introduit dans un tel plasmide une séquence dite ars (pour autonomously replicating sequence), la transformatiorin. revêt alors les. caractres suivants haute efficacité (plus- de 10 000 t.ransfomants/g d'ADN); réplication extrachromosomique des plasmides, - 13 - relative instabilité en mitose. Ces séquences ars sont des séquences d'ADN soit de la même espèce, soit d'espèces différentes. Elles peuvent être d'origine chromosomi-. que ou extrachromosomique (plasmides, mitochondries..). Mais les revues réalisées par plusieurs auteurs (1t2. montrent bien que dans la plupart des cas les séquences manifestant une propriété ars dans un hôte hétérologue n'ont pas cette caractér'stique dans l'organisme de- départ. Dans un contexte homologue, l'hypothèse la plus couramment admise est que les ars isilées du chromosome correspondent aux origines de replicatio., qu'on estime espacées eii moyenne de 20 a 40 kb sur les chromosomes de levures. Chez la levure industrielle Yarrowia lpolytit, la transforma- tion intégrative a ité décrite avec le gêne LYS2 de S. cerevisiae (3) et le gene LEU2 de Y. lipolytica (>.- Le promoteur de ce nMme gene a été utitisé (5) pour diriger l'expression de gènes hétérologues (résistance à la phléomycine et béta-galactosidase) intégrés dans le chromosome au locus leu2. Par ailleurs, il. a été montré (4) que lorsqu'on linéarise le plasmide transformant avec une enzyme de restriction ne présentant qu'un site de coupure, on accroit la fréquence de transformation d'un facteur 100 (on - passe alors de moins de 100 a plus.de 10 000 transformants par lig d'ADN). - Cet effet recombinogène des extrémités cohésives générées par enzyme de restriction, déjà connu chez 5. cerevisiae, est bien. plus 'notable chez Y. lipolytica. Quand on veut cloner un gène par complémentation en utilisant la transformation integrative chez Y. lipolytica, on se.heurte aux difficultés suivantes: (a) la banque d'ADN étant réalisée dans un plasmide intégratif de type pBR322+LEU2, on ignore si les sites de restriction présents une seule fois dans ce plasmide ne sont pas également présents dans les 1 iO fragments clonés; par conséquent, pour linéariser l'ADN on est obligeé d'opérer' des restrictions partielles (et de * faire cet essai avec différentes enzymes) dont l'efficacite en transformation est plus faible; (b) une fois les cldnes obtenus par complémentation, il faut procéder à une I15.analyse fine de la carte de restriction du fragment cloné et intégré dans le génome, à l'aide de la technique de Southern et de sondes radioactives; l'étude de cette carte permet de savoir par quelle enzyme on peut couper l'ADN total du transformant pour ressortir le plasmide, qu'on sélectionne, après ligation, par- transformation dans Escherichia col. -- Ces deux inconvénients sont supprimés si on peut réaliser la banque d'ADN dans un plasmide réplicatif contenant une séquence ars; en effet, il est dès lors inutile de couper le plasnmide par enzyme de restriction et. celui-ci se maintenant de façon extrachrofinosomique, peut être aisément récupéré chez E. coli. La présence d'une séquence ars permet.en principe également d'amplifier un gène, car les plasmides sont généralement multicopies. Toutes ces raisons ont justifié la recherche d'une ars pour Yarrowia lipolytica. Plusiéurs tentatives de sélection s'étant soldées, dans plusieurs laboratoires, par des échecs (6), on a émis l'hypothèse que le mode de division cellulaire de cette levure pourrait ent être la cause. En effet, (figure 1) Y. lipolytica est dimorphiqjue, produisant à la fois du mycélium et des-formes levuriformes. Il a été montré chez S. cerevisiae (7) que les plasmides ars présentent un fort biais maternel de ségrégation, c'est-a-dire 3. " que l'ensemble des copies ont tendance à. ségréger coimme un bloc et ne passent pas systématiquement à la cellule fille. Si.celle-ci est un bourgeon d'une cellule levurifortne, elle va certes cesser de se diviser en milieu séleçtif, mais la cellule mère aura enbore la possibilité de transmettre le plasmide lors d'une prochaine division (chez S. cerevisiae une cellule mère peut se diviser une vingtaine de fois). En revanche, s'il sragt d'un. artice de mycelium, cfaque cellule ne donne naissance qu'à une cellule fille- Si le plasmide n'est pas passé ldrs d'une division, la colonie cesse de se diviser en milieu sélectif. En s'appuyantsur cette hypothèse, ona donc sélectionné des mutants incapables de former du mycelium et on leà utlisés pour ta recherche de sequences ars. De telles séquences ont été effectivement- isolées et il s'est avéré 'qutles étaient aussi fdnctionnellies dans des cellules de type mycélien,. La présente ire.ntion concerne une séquence ars efficace dins Yarrowia lpolytica ainsi qu'une séquence d'ADN comportant une telle séquence ars. En particulier, a présente invention concerne la séquence ars efficace dans Y. Ila:olytca por.tée par le fragmeit ADN de.22 kb BamH/BamHt présentant la carte de restriction de la figure 8B, ainsi que les plasmides comporant ces-séquences. La présente invention concerne plus particulièrement un plasmide portant une séquence ars efficace chez Yarrowia tlpolytica et qui peut être obtenu notamment par le procédé suivant:. a) on constitue une banque de fragments génomiques de Y. ipolytica dans un vecteur intégratif complémentant une auxotrophie de Y. lipolytica b) on transforme une souche hôte de Y. lipolytica, présentant une auxotlrophie pouvant être complémentée par le- vecteur intégratif précédent, par les plasmides de la banque précédente c) on hybride sur colonie avec une sonde détectan.t le vecteur intégratif et on sélectionne les transformants présentant le signal le plus fort d) on effectue un minilysat des clones vecteurs et on met.en évidence les -plasmides extrachromosonmiques - e) ces plasmides portent une séquence ars que l'on peut confirmer en testant' leur pouvoir de transfiormation qui est au moins 5 fois supri'eur au pouvoir de transformation du vecteur d'origine,. -Comme cela sera rappelé dans les exemples, les colonies de Y. lipolytica présentent des morphologies différentes sur le plan macroscopique, à savoir des colonies dites "frisées" ou rugueuses formant des peaux et entourées d:un chevelu à la surface de Il'agar, cette morphologie étant plus 5.nette quand les cellules ne sont pas- trop nombreuses par botte, et, d'autre * part, des colonies dites "non frisées" qui ne présentent pas ces caractéris- tiques. Le phénotype frisé sera noté dans ce qui suit "Fil+" et le génotype correspondant "fl+". Comme cela ressortira des exemples, dans le cas o ia souche- réceptrice est une souche Fil-, il est possible entre l'étape b et c de tester la stabilité -des transformants et de sélectionner les 'transformants. presentant.la plus faible stabilité. En effet, il s'agit du procédé qui a été utilisé pour la sélection des premières séquences ars. Toutefois, lorsqu'on utilise des souches Fil+, il est preférable d'utiliser le procédé décrit précédemment. Il convient de remarquer, bien entendu, que ce processus peut subir de nombreuses modifications tout en conduisant, dans chaque cas, à la sélection de plasmides portant la séquence ars. De façon préférentielle, le procédé selon la présente invention sera mis en oeuvre de la façon suivante - constitution d'une banque de fragments génomiques d' Y. lipolytica dans un vecteur Intégratif, type pINA62; - - transformation de plasmides circulairès surenroulés de cette banque dans une souche Fil+, sélection des transformants LEU+ (peuvent contenir un plasmide intégré ou des plasmides réplicatifs) - hybridation sur colonies avec une sonde pBR322: on s'attend à trouver un signal plus fort dans les transformants réplicatifs multicopie; lsolemnent de 'clones ars potentiels - minilysats des clones retenus, transfert de Southern d'ADN non restreint mise en évidence de plasmides extrachromosomiques avec une sonde pBR322 - transformation d'E. coli avec l'ADN des minilysats et amplification des plasmides ars - caractérisation éventuelle de l'instabilité des clones. e - Le processus décrit précdemment correspond, bien entendd, à l'utilisation de vecteurs spécifiques -dériyée de pBR322 tels que p.NA62.. LUs différentes techniques qui sont évoquées dans ce processus, comme dans le processus général, sont bien connues de l'homme de métier et elles seront décrites plus en détail dans les' exemples ci-annexés sans - que ces caractéristiques de détail puissent être considérées comme déterminantes pour la réalisation de la présente invention. Comme cela sera également décrit dans les exemples, il est possible, à partir des plasmides comportant Ies sequences ars, d'effectuer un isolement des séquences ou du moins de sequences plus larges partant la séquence ars Ces séquences ainsi isolées ou même des fragments des plasmides isolés sont. utilisables pour la réhhsation de pasmides vecteurs d'expression car la présence de ces séquences ars permet auxdits plasmides de se maintenir à- l'état extrachromosomique et de pouvor être amplifies, ceci conduisant à une surproductlon de la protéine.exprimée par ledit plasmide. Divers vecteurs drexpression ont déjàa ét.decrits dans la technique antérieure, en particulier dans le brevet européen n0 O 220 864 ainsi que les brevets européens no a 138 508 et no 0 166 65?9 Ces différents brevets dcrlvent, pour l'essentiel, des Vecteurs dits d'intégration dont on a mentionné préalablement les inmonvénients. Toutefois, ces vecteurs d'intégration peuvent être transformés en plasmides extrachromosomiques si on leur adjoint les sequences ars décrites précédemment. La technologie des vecteurs d'expression ne sera pas décrire en détail, il sagit, en effet, d'une technologie qui est déjà largement décrite.dans les brevets précédents, tant pour ce qui.concerne les éléments d'expression des gènes dans Y. lpolytic.a, en particulier les promoteurs, que pour ce qui concerne les types de gènes qui peuvent être dclonés. Parmi -les gènes qui peuvent être dclonés, il faut citer par exeraple les gènes codant pour la prorennine et l'anaphylatàxine CSA humaine{ comme cela est décrit dans le brevet européen no 0. 220 864. ': A titre d'exemple, dans le cadre de la présente invention il sera uniquement fait mention de l'expression de la -béta-galactosiiase afin de montrer l'efficacité des séquences ars correspondantes, mais il serait - évidemment tout à fait Possible d'effectuer le même type de construction en utilisant les plasmides décrits dans le brevet européen n 0 220.864 et en leur adjoignant la séquence ars. La p.résente invention concerne donc également, outre les - séquences d'ADN portant une séquence ars efficace dans Y. lipolytica, les plasmides incorporant 'ladite séquence et, en particulier, les plasmides d'expression d'une protéine industrielle. Ces plasmides d'expression d'une protéine -industrielle dans Y. lipolytica comportant, outre la séquence codant pour ladite protéine, l'ensemble des éléments, notamment une région de cofitrôle comportant un promoteur, permettant d'assurer l'expression desdites protéines da'is Y. lipoiytica et comportent, en outre, une séquence ars. Il peut, en outre, être intéressant de disposer d'un plasmide d'intégration comportant ce type de séquence ars et susceptible de complémenter une auxotrophie de Y. lipolytica. L'invention concerne également la souche de Y. lipolytica transformée par un plasmide tel que décrit précédemment, cette souche pouvant être Fil+ ou Fil-. Enfin, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une protéine- industrielle caractérisé en ce qu'on cultive, sur un milieu assurant sa croissance, une souche de Y. lipolytica selon l'invention. Les exemples ci-après permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. Les figures ci-annexées sont les suivantes Figure I - Schéma de transmission d'un plasmide extrachromosomique présentant un biais de ségrégation maternel, dans des cellules à croissance mycéIienne ou dans des cellules levuriformes. La croissance (C) ou l'arrêt de la croissance (A) sont dus à la presence '(respectivement l'absence) du plasmide (symbolisé par un cercle vide) qui porte le gèine marqueur sélectif, le npyau est représenté par le çercle plein. Figure 2: Morphologie des colonies de la souche parente Fil+ (INAG33122) et du mutant Fil- (INAG33129), vues de dessus (A) ou du dessous (B). Grossissement 5 à 10 fois. -. Figure 3: Morphologie des cellules de la souche Fl+. (A) -et du mutant Fil- (B) observées au microscope optique (grossissement 400 fois). Figure 4: Carte du Vecteur intégratif pINA62 montrant la stratégie de construction de la bânque de fragments MgII (en noir) au site unique BamH -de ce plasmide. La région hachurée est le gene bla de rsisance a I'ampicilline, la région en pointillé est le gènê LEU2 de Y. lipolytca et représente l'origine bactérienne de réplication du plasmide. Figure 5: Mise en évidence des piasmides dans les t'rnsformants instables. L'ADiN non restreint de la souche réceptrice Fil- (puits A et f) et de divers transformants (puits B à 3) a été hybriaé (après migration et transfert sur Biodyne) avec une sonde radioactive (marquée au 32P) constituée par le plasmide piNA62. Deux ensembles de gels sont présentés; à gauche.on Voit les transformants 2-18 (puits B), 2-26 (puits C), 2-39 (puits D), 3-19 (puits E) et 2,75 (puits F); à droite, les transformants 2-18-(Puits G), 1-68 (puits - H), 1-77 (puilt 1) et 1-27 (puits 3). Dans le noh des transformants, le premier chiffre indique le "pooP" d'origine et le second est un numéro d'ordre. L'ADN. chromosomique est revelé par la partie LEU2 de la sonde sous forme d'une bande diffuse ('ADN n'étant pas restreint), etest visible dans la plupart des puits (voir en particulier la souche réceptrice o elle constitue le seutlsignat puits À et K). Les différences d'intensité reflètent en fait des quantités d'ADN variables déposées sur le gel. Les plasrmides sont presents au moins sous iomne circulaire ouverte (OC), et plusieurs fois également sous forme CCC. L'observation- de la figure permet de distinguer classes de tailles de plasmides, à savoir, dans lJ'ordre croissant, n 1 (puits. D), n0 2 (puits B, C, F; G, nu 3 (puits H), n 4 (puits E) et n' 5 (puits I et 3). Figure 6: Carte de restriction des 5 plasmides isolés a partir de transformants représentatifs des 5 classes définies à la figure 5, À savoir: pINAI 19 provient du transformant 2-18 (classe 2) pINAI23 provient du transformant 1-68 (classe 3) pINAI24 provient du transformant 1-77. (classe 5) pINAI25 pr.ovient du transformant 2-39 (classe 1) pINAI26 provient du transformant 3-19 (classe 4) La partie pBR322 est figurée en noir, le gêne LEU2 en pointilleé, et l'insertion portant la séquence ars en blanc. Les Plasmides sont représentés ouverts par le site SalI de pBR322, mais la carte SalI n'a pas été établie pour les insertions. les sites de restriktion sont les suivants: B - BamHI,' G-= BglII, E = EcoRI, H = HindIII, B/G = site BamHI détruit par le clonage du fragment BgIL La flèche indique la région homologue (délimitée par deux sites BglII) avec son orientation. Figure 7: Carte de restriction du plasmide ars pINAI19. -La partie portant la séquence ars est figurée en hachuré et celle portant LEU2 en polntillé. Les dimensions sont à l'échelle (en kilobases). Les enzymes utilisées sont; A = ApaI, B = BamHI, G =.gII, E = EcoRI, H = HindII, P = PstI, 5 SalI et X = XhoL En bas du diagramme figurent les délétions et les reclonages réalisés et leur efficacité en transformation à haute fréquence chez la * souche leu2-35 de Y. lipolytica (avec de I1'ADN non restreint). Seul le plasmide pINA171 contenant le.fragment BamHI-BamHII de 2,2 kb est efficace. Figure 8: Construction d'un mini;ecteur pour Y. lipolytica. A - Ce vecteur de 8,2 kb' contient le fragment ars de 2,2 kb (BamHI-BamHI) , ce qui permet sa réplication dans Y. lipolytica le gène LEU2 (partie codante sans le terminateur, soit 3 kb de SalI à ApaI); --- l'origine de réplication bactérienne colEl, ce qui permet sa propagation dans E. coil; * les promoteurs des bactériophages T3 et T7 qui permettent de faire des ARNs à haute efficacité (donc par exemple de synthétiser des sondes radioactives très chaudes); les séquences de M13 qui facilitent le séquençage (les séquences amorces complénientaires des brins d'ADNs de part et d'autre du multisite sont disponibles commercialement); un. multisite qui permet soit le clonage ultérieur de gènes, soit le démarrage de délétions in vitro, grade à l'exonucléase III, ou à l'enzyme Bal31 per exemple. B - Carte fine du fragment ars dans sa région BamHI-BamHI de 2,2 kb (schéma à l'échelIe, en paires de bases). Sur cette figure, les sites de restriction sont symholisé par A = Ra B = BamHl, C - Acc, H H= indIIl, N Not-, R Rsa, -S s- alI, T -azz, V = ECoRV. FigEure 9: Expression de la béta-galactosidase. Schéma de construction.du. plasmide.pINAI35 à partir du plasmnide intégratif pINAl9. Le clonage de l'ars entre les deux sites BglII présents sur le fragment SaII-SalI drADN de Y. lipolytica qui porte le gèine LEU2 est sans effet sur l'expression de ce dernier, car ces sites sont à l'extérieur de la sequence codante proprement dite. On reconnaît le promoteur de LEU2 (fragment Sau3a cloné dans BamHli, voir réf. 5) en amont du gène lacZ. EXEMPLE i -. ISOLEMENT DE MUTANTS. -La formation de mycélitum l'échelle-microscopique se traduit - par une morphologie ddifférente des-colonies sur le plan macroscopique, à savoir: colonies dîtes "frisées" ou rugueuses (angl. rough), formant des peaux et entourées d'un chevelu à la surface de Plagar (fig. 2). Cette morphologie est plus nette quand les cellules ne sont pas trop normbreuses par boite (moins de 100) et qu'elles sont sur un milieu riche avec forte concentration en glucose. Pratiquement, on irradie une culture de la souche INAG33122 (MatB, eu2-35, xr2, ys2-5, adel) aux rayons U.V., à une dose permettant % de survie. Apres une phase d'expression en milieu complet, les cellules sont étalées (environ 500/boîte) sur.milieu YPD30 (yeast extract 1 %, peptone I %, glucose 30 g/! agar 20 g/1l) ou YPD10 (avec seulement 10 g/li de glucose). Apres 8 jours d'incubation à 28QC, les colonies présentant une morphologie atypique sont repérées à la loupe binoculaire, puis purifiées. Leur phénotype est confirmé par des étalements à faible densité coloniale et observation microscopique (fig. 3). Finalement 7 rmftants sont retenus sxr 30.61 000 colonies initiales (fréquence 1.1 i-0'- et un seul présente un phénotype assez net et stable pour la suite des expériences. Ce phénotype est appelé Fil- et le génotype est noté fitl-1. La souche porte le nom INAG33129 (MatB, leu2-3-5 XPr2, a fuI-i> ' EXEMPLE 2 CONSTRUCTION DE LA BANQUE La souche réceptrice possédant la mutation (très stable) leu2-35 (en provenance de la souche DX465-7B de D.M. Ogrydziak, décrite *5 dans le brevet cité en r.férence 8), on construit une banque dans le plasrhide pINA62 (réf, 5) qui contient l'allèle LEU2 cloné au site SalI de. pBR322 (fig. 4). L'ADN de la souche.15901-4 (MatB, Ora2-21, lyc1l-5, LYSI5) de Y. lipolytica a été digéré. totalement par l'enzyme BglII et mélangé au plasmide pINA62 préalablement coupé par BamHI et déphospho- rylé avec. la phosphatase alcaline, La banque ne couvre pas entièrement le génome et est. constituée de 4 ensembles (ou "pools") représentant un total de 7 000 clones dont 89 % sont 'dits- hybrides (c'est-à-dire contiennent un fragment clone). La tailie moyenne des insertions, estimée sur une vingtaine de plasmides pris au hasard,, est voisine de 5,2 kb. L'ADN de ces pools a été extrait 'et purifié sur gradient de chlorure de césium avec bromure d'éthldium. EXEMPLE 3 SELECTION DES SEQUENCES ARS Partant toujours de l'hypothèse selon laquelle les ars devraient être chez Y. lipolytica relativement instables, on transforme d'abord la souche INAG33129 avec l'ADN des pools et recherche ensuite parmi eux des clones instables. L'ADN des pools n'a pas été restreint préialablement, pour permettre une sélection directe de séquences à réplication extrachromoso- mique; on vérlifie cependant sur un petit échantillon que cet ADN coupe partiellement ou totalement par l'enzyme ApaI (site unique dans le plasmide de départ pINA62 et situé dans la séquence LEU2) est capable de transformer par intégration comme pINA62 (même si c'est à une fréquence plus faible que ce dernier). Les nombres de transformants sont indiqués :dans le tableau I, en mêrne temps que le nombre de clones testés et le pourcentage d'instables (qui est voisin de 10 %).' Tableau I Eficacité des différents pools d'ADN de la. banque pour la transformation de Y. Iipolytica et pour l'obtention de clones instables N Taile Efficacité de ' Nbre de clones Nbre de % de clones du du transformation (obtenus avec clones instables pool (i (Tr/pg d'ADN) 'AIDN non CoUpé) inables 11) ADN coupée ADN non testés pour la par ApaI stabilité 1 2500 3700 l5.85 '.-12 2 2500 1500 300 16 12 16 3 1000 10500 70- 44 1 2 4 1000 N.T. 10 13 a (-=20=... (1) Nombre de clones bactériens Pour tester l'instabilité des clones transformants, ceux-ci sont striés sur milieu riche et, apres. croissance, sont répliqués sur milieu minimum (Yeast Nitrogen Base sans sulfate drammonium 1,7 gil, lysine source d'azote I g/i, adénine-HCI 100 mg/Il, glucose 10 g/l, agr 20 g/) et milieu minimum suppléménté en L-leucine (200 mg/1). Les clones instables sont ceux qui ont ségrégé significativement des colonies Leu. EXEMPLE 4 30..CARAC;ERISATION DES PLASMIDES ARS Les colonies instables sont maintenues sur milieu sélectif, et leur ADN total est extrait par une méthode de minilysats qui a déjà étée décrite (9). Cet ADN a subi une électrophorèse en gel d'agarose et a été 1.2 ensuite transféré sur. membrane de nylon (Biodyne, Pall France) par la méthode de Soutiern (10) et hybridé avec. l'ADN du plasmide pINA62 mnarqué au 32p par la technique de déplacement de coupure (Nick- * Translation Kit, Amersham France). *5 Cette sonde radioactive permet de repérer l'allèle LEU2 chromosomique, sous forme d'une bande très diffuse, l'ADN n'etant- as restreint, et une bande extrachromosomique correspondant au plasmide transformant (pINA62+ insertion). D'après les différences de migration des bandes plasmidiques (fig. 5), qui correspondent d'ailleurs souvent à des formes circulaires fermées (dites CCC pour "covalent closed circular"'), on peut voir qu'il y a au moins 5 tailles de plasmides. Les bandes additionnelles que l'on voit dans certains puits pourraient correspondre soit à l'existence de plusieurs plasmides dans. la même souche, soit à des formes circulaires ouvertes (OC pour '"open circular'") de la même molécule. Pour distinguer entre less deux hypothèses, on transforme la souche HBIOl (hsdR-, hsdM, recA13, supE44, lacZ4Y leuB6, proA2, thi-!-,SmR) d'B. col! avec l'ADN extrait des transformants en sélectionnant des colonies résistantes à l'ampicilline (le gène bactérien de résistance étant présent sur pINA62). Pour chacun des transformants de levure retenus, on obtient des colonies de E. coli desquelles le plasmide est extrait et analysé par enzymes de restriction. Il s'avère que chaque transformant de levure ne contient' qu'un seul type de plasmlde. Les cartes -de restriction des 5 plasmides sélectionnés sont présentées sur.la figure 6. L'analyse de ces cartes, ainsi que les résultats d'hybridation (données non décrites au présent brevet) réalisées entre des restrictions de ces plasmides et l'une des séquences ars (un. fragment du plasmide pINAI19) montrent que 3 des fragments ars clones sont en fait homologues. Il s'agit du même fragment BlII-Bg1II de 4,5. kb, auquel se joignent éventuellement (dans le cas de pINAIl19 et pINA126) d'autres fragments lors de la ligation. En conclusions 3 séquences ars différentes sont disponibles, portées par les plasmides pINAt19, pINAI23 et pINA124 et localisées sur des fragments d'ADN de 5,2 kb, 6,6 kb et 17,8 kb respectivement: E. XEMPLE 5. TRANSFORMATION. DE Y. LIPOlYTICA AVEC LES SEQUENCES CLONEES -Pour montrer que les plasmides que l'on a.sectIOnns comme molécules extrachromosorniques dans Y. l ipoiyica sont capables de transformer cette levure à -haute frequences on utilisé la souche mutante Fil- (1NAG33129), mais égalemnent la souche Fil+ (INAG33122). Il s'avère que toutes deux sont transformables à haute fréquence par pINA 19 (tableau IIl expériences I et. 2). On peut voir sur, ces résultats que l'optimum de transformation de la souche INAG-33129 par intégration (ici plasmúdes pINA62 ou pINAI 19 restreints par Ap) ne eorrespond pa àa l'optimum de transformation réplicative' obtenu avec pINAhI19 non restreint (conmparer l'expérience 3 pour le premier cas avec les expériences 1 et 2 pour let second). Le déterminisme bidlogique de cet optimum est encore inconnu;, ce qui explique la très nette fluctuation quantitative des résultats drune expérience à l'autre. Cependant, cette fluctuation ne met pas en cause le fait que le plasmide pINAiI9 transformne toujours de 20 à 100 fois plus que le plasmide pINA62 intact de départ, ce qui teémoigne bien de la présenace de l'ars. Dans l'expérience* 3, les pasmides pINAI25 et pINAi26, q s'avèrent porter un fragment commun avec pINAI19, transforment à peu près à la mrnême fréquence la souche INAG33129 (pINA125 qui est un peu plus petit transforme mieux) On peut considérer que pINA123 et pINAl24 sont à peu près aussi efficaces, d'autant plus que plINA124 a une taille presque double de pINAI19. Par ailleurs, l'ensembte des données du tableau Il révèle que la souche Fil+ est également transformable par les plasmides ars, quolqa'à moins haute fréquence que le mutant Fil- dans cette experience. Ces plasrmides transforment au moins 100 fois mieux-la souche INAG33122 que p!NA62 non restreint Ce rés.ultat paraît très surprenant du fait de l'hypothèse initiale rnettant en cause le mode de division cellulaire -dans la sélection des ars. Il est donc nécessaire de regarder si un plasminlde ars se t Tableau Il Efficacités de transformation de divers plasmides sur les deux souches Fili et Fil-, exprimées en nombre de transformants par pIg d'ADN A.D.N. plNA62.I plNA 119 pINAI71 plNAIM 23 plNAI24 pINAI25 pINA126Expérience Souche Phénotype *. NRR.NR R NR NR NR NR NR 1 INAG33129 Fil- NT 20000 15000 16000 NT NT NT NT NT 2 INAG33129 Fil- NT 8900'47000 15000 1 NT NT NT NT N T * INAG33122 FiI+ NT 80000 55000 25000 3 INAG33129 Fil- 800d 88000 6000 NT 3300 6900 2.100 15000 6100 INAG33122 Fil+ 0 12000 600 NT 1000. 250 375 750 500 NR. non restreint R restreint par Apal NT: non déterminé ox ru Co " maintient également de façon extrachromosomique dans la souche Fil+. Une experience d'hybridation apres transfert de Southern analogue. celIle décrite à lexem1le 4 montre que tel est bien le cas daps des transformants Fil+ obtenus par pINAI19 (données non présentées). Pour caractériser davantage cette situation inattendue, on étudie la stabiiité des transfor-' mants. -.. EXEMPLE 6 STABILITE DES SEQUENCES ARS La stabilité des 5 plasmides pINAI19 et pINAI23 à plNA126 est estimée après 5 à 10[ générations en milieu sélectif (sans leucine) liquide et étalement parallèle sur milieu minimurnrr et milieu supplémenté en leucine. Le rapport du normbre de colonies comptées sur lun et ltautre milieu donne le pourcentage de prototrophes tel que présenté sur le tableau 111 A. Ce pourcentage varie de 65 % à 84 % et il n'y a pas de différence statistiquement significative entre les stabilités de' différentes séquences ars dans la souche INAG33129. En revanche, il est remarquable que ce pourcentage soit si élevé, contrairement au comportement des séquences ars chez S. cerevislae (2). Pour étudier an détail cette stabilité, on s'intéresse plus particulièrement à la séquence ars présente sur pINAi -9 Des transformants obtenus soit dans la souche Fil- (1NAG33129), soit dans la souche Fil+ (INAG33122) sont cultivés pendant environ 10 générations en milieux sélectif et-non sélecf et le pourcentage d'auxotrophes estimé comme précédemment, dans chaque cas. Les résultats du tableau III B confirment la 25. relative stabilité de Pars en milieu sélectif dans INAG33129, mais semblent indiquer une stabilité encore plus grande dans la souche Fil+, Pour confirmer ce résultat, on transforme une souche leu2- 35 dont le phénotype de croissance mycélienne est encore plus marqué (souche. dite Fil++)- et on constate une stabilité très haute, voire absolue dans cette souche. On -vérifie {données non présentées) que l'ADN de pINAI19 est toujours visible comme une bande extrachromosomique par hybridation, La stabilité en milieu non sélectif, bien que plus faible qu'en miliu sélectif dans chaque cas, suit également la même progression en fonction du phénotype FiI-/Fi +. Tableau III A) Stabilité après 5 générations en milieu sélectif dans la souche INAG33l29 (Fil-) ADN pINA119 pINAI 23 pINAI24 pINA125 pINAI.26 96 prototrophes 65 72 84 79 69 B) Stabilité du plasmide pINAlI9 après 1' générations sur divers milieux et dans plusieurs sotfches !5 Souche Phénotype % de prototrophes sur milieu sélectif non sélectif iNAG33.J29 Fil- 60-70 10-15 INAG33122 Fil+ 70-80 60 MLi1* Fil++.85-100 80-90 C On pense donc que, contrairement à l'hypothèse initiale, l'échec dans l'isolement des ars n'est pas dQ à une.trop grande instabilité de ces séquences qui empêcherait leur propagation dans les mycéliums, mais plutôt au fait qu'on ne pouvait jamais les retrouver en cherchahnt des clones instables. En effet, dans les souches Fil+, ces séquences semblent aussi stables que des intégrations. Dans ces conditions, il.est nécessaire de démontrer que les plasmides restent toujours extrachromosomiques et que lI stabilité n'est pas due à l'existence d'une copie intégrée. Pour cela, on cultive 30 transfor- mants de INAG33122 et 30 transformants de INAG33129 pendant 50 générations sur milieu sélectif pour voir si on trouve un changement.dans la stabilité de ces clones. Le protocole détaillé de l'expérience est fourni au schéma ci-après et au tableau IV: 26Z6584 17- génératibns sur milieu minimum sans leucine 2 jours sur milieu, 2 jours sur milieu minimum + leucine minimum 4- eucine -.1.S-N Etalements parallèles Etalements parallèles sur milieu minimum et sur milieu minimum et milieu minimum + leucine - - milieu minimum + leucine Stabilité initiale Stabilité finle I5 ' - Tableau IV Fgffet d'un passage en miluieu - séetl pendant - générations sur la stabilité - (Les résultats sont exprimés en nombre de clones se rangeant dans une catégorie donnée de ségrégations (% -de prototropheS. Lecpérience porte sur 30 clones de la souche Fil+ et 3Q clones de la souche Fil-> Souche Stabilité 9 de prototrophes 60 %, initiale O 1l L9 FiI+ finale 5 13 12 initiale -4 * i8 8 Fi- F * finale 12 Il 7 L'estimation qualitative en pourcentage de prototrophes obtenus par unpassage.de deux jours en milieu non sélectif, s6it- avant, soit après les 50 générations, montre (tableau IV) qu'il n'y a pas de translation vers un profil plus stable, qu'il s'agisse de la souche Fil+ ou de la souche Fil-. Pour démontrer l'absence d'intégration, on extrait I'ADN de transformants Fil+ et Fil- avant et après qurils aient subi les 50 générations et on les restreint par les enzymes ApaI et Bam-IL Les ADN restreint et non restreint sont transférés sur Biodyne après migration sur gel d'agarose (0,7 % en tampon Tris 89 mM, acide borique 89 mM, EDTA 23,5 mM, pH 8,3) et hybridés à une sonde radioactive pBR322. Le résultat (non présenté) montre clairement la présence des bandes plasmidiques et l'absence de bandes. dues à une intégration. EXEMPLE 8 ANALYSE FINE DE L'INSERTION PRESENTE DANS pINAl 19 Chez S. cerevisiae, il est connu que certaines séquences aês sont répétées dans le génome (en particulier celles qui se trouvent pros des extrémités télomériques) alors que d'autres sont présentes à un seul exemplaire (1,2,11). On regarde ce qu'il en. est pour la séquence ars de pINA 19. Pour ce faire, on purifie un fragment interne PstI-EcolRI de 4,â kb (fig. 7) qui couvre la quasi-totalité de l'insertion et on l'utilise comme sonde contre des transferts de, restriction d'ADN plasmidique et génomique ayant migré. en parallèle sur gel d'agarose. Les résultats, analysés à la lumière de la carte de restriction de pINAI19 déjà présentée à la figure 6 (voir aussi fig. 7), montrent qu'il s'agit probablement d'une séquence unique (à moins d'une répétition exacte en tandem d'un fragment 1BglI-BgII). La bande interne 'BamHI de 2,2 kb se retrouve à la même position dans le génome, de même que la bande interne HindIll de 2,3 kb.- Le fragment BgII revélé dans le génome par la sonde correspond bien a une seule bande de 4, 5 kb qui est identique au fragment cloné qui porte l'ars dans pINAIll9 (en fait dans pINA 19 il y a deux fragments BgII qui ont été associés lors de la ligation, il s'agit ici du plus grand des deux, qui est homologue aux insertions de pINA125 et pINA126). Certe taille étant certainement (par comparaison avec les ars décrites chez S. cer.evisiae (1,2, 1) largement supierure à celle de la séquence. minimale requise pour la fonction ars, on procède a des expériences de délétions et de reclonages pour localiser plus précisémept l'ars dans l'insertion de pINAI19 La stratégie suivie est- idécrite sur la figure 7, d'o l'on peut cnclure que l'ars doit être portée par le fragment interne BamHI-BamHl de 2,2 kb qui est present dans pINAI71. Ce plasnmide est capable de transformer à haute fréquence aussi bien la souche Fil+ que la Fil- (tableau It) Il est capable de s'y maintenir de façon extrachromo- somique- (donnée non présentée) et sa stabi.lité y est analogue à celle de ptNAI 19 (environ 65 % de prototrophes après 5 génératirons en milieu sélectif dans la souche INAG33129 et 81 % dans INAG33122) Ce plasmide a servi de base à des constructions ultérieures en vue d'amplifications de gènes. Par ailleurs; le fragment Barm-M-BamHI a été recloné dans un vecteur "Bluescript Ml13" qui est un hybride entre le phage -MlI3L et Ie piasmide bactérien de type colEl. Ce vecteur porte un multisite de clonage qui a permis, dt'une par d'insérer l'ars au-site Barmn Iet, d4au. tre part, la séquence codante minimale de 3 kb de LEU2 comprise entre un site Sall et un site Apa (que l'on a cloné entre XhoI et Apal du multisite). Ce -vecteur de 8,2 kb est capable de transformer Y. lipolytica INAG33129 à haute fréquence et a servi de base à une nouvelle série 'de /délitions et de reclonages liés à letablissement d'une carte fine de t.ars décrite.sur la figure 8. Ces constructions n'ont pas encore eti testées dars la levure. EXEMPLE 9 Expression et amplification de gènes grace à la séquenae ars Afin de démontrer l'utlité de Pars présente sur pINAI19 pour amplifier des gènes, on réalise la construction plasmidique suivante i le gène lacZ d'E col codant pour Ia béta-galactosidase pouvant être exprimé chez Y. Iipolytica sous le controle du promoteur de LEUJ2 (5), on clone le- fragment ars BamHli-BamHl de 2,2 kb dans un site BglI qui -est present sur pINA98 (fig. 9),. plasmide intégratif portant LEU2' et la construction d'expression de lacZ. Le nouveau plasmide pINAI35 est donc réplicatif et' est introduit dans INAG33122 et INAG33129. 20. L'expression de la bêta-galactosidase est repérée d'abord sur botte de milieu minimum contenant le substrat chomogène X-gal. apres toluénisation pendant une minute, les boîtes sont mises à.incuber à. 37 C et on observe que l'intensité de la coloration développée par les transformants réplicatifs est bien supérieure à celle du transformant monocopie. Pour quantifier cet effet, on réalise dés extraits bruts des transformants et on dose l'activité béta-galactosidase selon le protocole de Miller (12) et on la rapporte à la quantité de protéines estimée selon la méthode de Bradford (13). Cette activité spécifique de la béta- galactosidase est corrigée par le pourcentage de cellules prototrophes dans la culture au moment o les cellules sont broyées. Ce pourcentage est estimé par des étalements parallèles$ en milieux sélectif 'et non sélectif. Les résultats d'activité présentés sur le tableau V montrent que l'amplification obtenue avec l'ars varie d'un facteur 2 à 9 et est voisin dans les souches Fil+ ou Fil- __- Tableau Vy Souche Plasmide Densité Activité ' % de Activité Ampli- cellulaire spécifique prototrophes sapécique fication corrigee Fil+ piNAI71 2,3.107 - 1,6 81 1,6 0 Fil- pINA171 5,0.106 43 64 43. 0 - 3,7.107 218 100 218 Fil+ pINA98 390 1 1,5.107 562 100 562 eL.107 2141 100 2L41 5,5 Fil+ pINAI35 8,6.107 1101 100 1101. 2,8 1,0.108 2447 70 3496 9 2,7.1Q7 690 83.831 2,1 Fil- pINA135 6 6,.5.106 17t44 87 2001 5,1 Mesure de l'activitée spécifique de la béta-gàlactosidase dans des exl:raits bruts. La densité cellulaire au moment de l'extraction est exprimée.-en nombre de cellules par ml; l'activité spécifique est en unités internationales (une unité est. définie comme -la quantité d'enzyme qui hydrolyse 109moles par min. d'orthornitrophénol-galactoside à 37"C) et elle est ensuite corrigée 'pour tenir compte du pourcentage de prototrophes dans la culture. Un niveau de I est arbitrairement attribué à la moyenne de deux mesures obtenues avec des clones --transformés par pINA93 (plasmide intégratif). Le niveau zéro correspond aux souches transiformées par pINAI71 (LEU2+ars sans iacZ). Les différentes lignes de résultats avec pINlA135 {plasmide réplicatif décrit figure 9) dans les souches Fil+ ou Fil correspondent à des transformants indépendants.. Les squches suivantes ont été déposées, le 21 -janvier 1988, à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'institut Pasteur, 28 rue du Docteur-Roux - 75724 Paris. Cédex 15: - Escherichia col! INAG 20 -580/p1NA23- sous le n 1-724 - Yarrowia lipolytica: INAG 33.129 sous le n 1-725 Yarrowià lipolytica INAG 334621pINAI 19 sous le n* 1-726. - REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. Wllliamson D.H.: Yeast, 1985, 1, (I-2), 1-14. 2. Kearsey S.: Bio Essaysy 4j (4), 157-161. 3. Gaillardin C., Ribet A-M., Hesiot. H.: Curr. Genet., 1985, 10, 49-58. 4. Davidow L.S., Apostolakos D., O'Donnell M.M., Proctor A.R., Qgrydziak D.M., Wing R.A., Stasko I, De Zeeuw J.R.: Curr. Genet., 1985,. _0, 39-48. 5. Gaillardin C., Ribet A-M.,: Curr. Genet., 1987, 11, 369-375. 6. Wing R.A., Ogrydziak D.M.: in Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Timberlake W.E. (Ed.), UCLA Symposia vol. 34 1985, 367-382. 7. Murray A.W., Szostak i..:..; Cell, 1983, 34, 961-970. 8. Davidow L.S., De Zeeuw J.R.,: European Patent Publication number 0 138 508-A1i 1984. 9. Fournier P., Gallardin C., Persuy M-A., Klootwijk J., van Heerikhuizen H.; Gene, 1986, 42, 273-282. 10. Southern E.M.: 3. Mol. Biol., 1975, 98, 503. 11. 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Iipolytica; b) on transiorme un souche hôte de Y. lipoIyticat présentant une auxotrophie pouvant être complmentée car ie vecteur intègratif précédent, par les plasmides de a bane pr'cédente c) on hybride sur colonie avec une sonde detectant- le vecteur- Intégratif et on sélectionne les transformants présentant le signal te plus fort; d) on eiffectue un minilysat des clones vecteurs et on met en évidence les plasmides extrachromosomiques e) ces plasmides portent une séquence ars qu& lon peut confirrmer en testant leur pouvoir de transformation qui est au moains 5 fois supérieur au pouvoir de transformation du vecteur d'origine. 6) Plasmide selon la revendication 5 pour lequel le procédé. comprend les étapes suivantes * - constitution d'une banque de fragments gédmiques d'Y. lipiolytica dans un vecteur intégratif type pINA62. - transformation de plasmides circulaires surenroulés de cette banque dans une souche Fil+, sélection des transformrants LEU+ (peuvent contenir un plasmide infégré ou des plasmides réplicatifs);> *- hybridation sur colonies avec uine sonde pBR322. on s'attend trouver un signal plus fort dans les transformants- réplicatius multicopie isolement.de clones ars potentiels, - minilysats des clones retenus, transfert de Southern d'ADN non restreint: mise en évidence de plasmides extrachromosomiques avec une sonde pBR322 - transformation d'E. coli avec l'ADN des minilysats et amplification des plasmides ars - caractérisation éventuelle de l'instabilité des clones. 7) Plasmide selon la revendication 6, caractérisé en ce que pour une souche hôte Fil- on teste, en outre, l'instabilité des transformants et on sélectionne les transformants présentant la plus faible stabilité. 8) Séquence d'ADN portant une séquence ars obtenue à partir d'un plasmide selon l'une des revendications 5 et 6. 9) Plasmide comportant un vecteur d'intégration complémen- tant une auxotrophie de Y. lipolytica comportant une séquence ars efficace dans Y. lipolytica. 10) Plasmide d'expression d'une protéine industrielle dans Y. lipolytica comportant l'ensemble des éléments permettant d'assurer l'expression de ladite protéine dans Y. lipolytica, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence ars. 11i) Souche de Y. lipolytica transformée par un plasmide selon l'une des revendications 4 à 7 et 10. 12) Souche selon la revendication 11, caractérisée en ce que ledit plasmide comporte au moins une séquence hétérologue. 13) Souche selon l'une des revendications 1 1 et 12, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche Fil+. 14) Souche selon l'une des revendications 11 et 12, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche Fil-. ) Procédé de préparation d'une protéine industrielle, caractérisé en ce qu'on cultive, sur un milieu assurant sa croissance, une souche de Y. lipolytica selon l'une des revendications 11 à 14. 16) Protéine obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 15.