FR 2629985 A1 19891020 FR 8804944 A 19880414 La présente invention concerne l'application comme pro- duits sucrants faiblement caloriques d'oligosaccharides fruc- tosylés et les aliments, produits diététiques et boissons les renfermant. La grande majorité du sucre alimentaire est constituée de saccharose qui est un disaccharide comprenant un glucose et un fructose,liés entre eux par leurs carbones anomériques. Hormis un rôle d'agent sucrant dans l'alimentation, le saccharose a aussi un rôle énergétique, puisque la combustion de 1 g de saccharose apporte 4 Kcal à notre organisme. Par ses propriétés fonctionnelles (température de fusion, solubilité, capacité à cristalliser), il assure aussi un rôle d'agent de structure et de conservateur dans les aliments. Depuis peu, il existe une forte tendance à la réduction de l'apport calorique des aliments, de façon à prévenir l'obésité (plats cuisinés "allégés", boissons "diététiques"...) et par voie de conséquence, une demande pour des sucres, substituts de saccharose faiblement caloriques. Il a déjà été trouvé que certains oligosaccharides fruc- tosylés possèdent à la fois un pouvoir édulcorant approprié et des propriétés faiblement cariogènes et/ou anti-carie (BF 24500876). Or, il vient d'être découvert et c'est l'objet de la présente invention que des oligosaccharides fructosylés peuvent réduire aussi, de façon inattendue, l'apport calorique journalier par rapport au saccharose. Il faut préciser en effet, que le fait qu'un sucre soit acariogène ou faiblement cariogène n'implique pas du tout qu'il soit faiblement calorique. On peut citer, entre autres, les cas du xylitol (J.J. BEEREBOOM CRC Critical Reviews in Food Science and Nutrition May 1979r p. 401-413) et des "coupling-sugars" (TSUJI Y. et Coll., J. Nutr. Sci. Vitaminol., 32, 93-100, 1986) oligosaccharides fructosylés produits par la Société HAYASHIBARA (BF 2559490), qui sont faiblement cariogènes mais s'avèrent caloriques. La présente invention a donc pour objet une méthode des- tinée à réduire l'apport calorique journalier chez l'homme ou l'animal, caractérisée en ce qu'un ou plusieurs oligosaccha- rides fructosylés renfermant de 3 à 15 unités osidiques reliées par des liaisons béta, remplacent tout ou.partie des sucres caloriques dans les produits destinés à l'alimentation ou à la diététique. La méthode indiquée ci-dessus a notamment pour objet d'améliorer l'apparence physique chez l'homme en favorisant la perte de poids. Les sucres caloriques présents dans l'alimentation sont essentiellement le saccharose mais d'autres sucres tels que le fructose, le glucose, le sirop de glucose/fructose éventuelle- ment enrichi en fructose sont aussi utilisés. On entend par sucres faiblement caloriques des sucres qui contrairement au saccharose sont très peu ou pas dégradés par les enzymes digestives: amylases salivaires, amylase pancréa- tique, disaccharidases de la bordure en brosse intestinale. Les résultats donnés dans la partie expérimentale montrent que les oligosaccharides utilisés dans la méthode de l'inven- tion ne sont pas dégradés par les amylases salivaires et pancréatiques et très faiblement ou pas du tout dégradés par les disaccharidases de la bordure en brosse intestinale. Compte tenu de ces résultats, on peut s'attendre à ce que la méthode de la présente invention réduise d'au moins 10 % l'apport calorique journalier chez l'homme, par rapport au saccharose. Les oligosaccharides fructosylés utilisés dans la méthode de la présente invention sont constitués d'unités osidiques simples reliées par des liaisons béta, l'unité osidique ter- minale étant une molécule de fructose. L'invention concerne notamment une méthode destinée à réduire l'apport calorique journalier chez l'homme, caractéri- sée en ce que les oligosaccharides fructosylés utilisés ren- ferment de 3 à 8 unités osidiques reliées par des liaisons béta et sont plus particulièrement des trisaccharides. L'invention a tout particulièrement pour objet la méthode définie cidessus, caractérisée en ce que les trisaccharides utilisés sont constitués d'une molécule de saccharose et d'une molécule de glucose, les unités glucosidiques étant reliées soit par une liaison bétal 12 pour former le sophorofructose, soit par une liaison bétal_3 pour former le laminaribiofruc- tose, soit par une liaison bétal 14 pour former le cellobiofru- ctose, soit par une liaison bétal6 pour former le gentiobio- fructose. Les oligosaccharides fructosylés utilisés dans la méthode de l'invention peuvent être préparés, par exemple, selon le procédé décrit par S. HESTRIN et G. AVIGAD (Biochem J., 69, 388-398, 1958) par l'action d'une lévane-saccharase (Enzyme Code E.C. 2.4.1.10) (enzyme nomenclature Academic Press. 1984 - IUB) sur une solution de substrats contenant du saccharose et seuls ou en mélange, des sucres tels que le gentiobiose, le cellobiose, des oligosaccharides de degré de polymérisation de 3 & 14 obtenus par hydrolyse partielle de polymères osidiques, tels la cellulose, dont les unités osidiques simples sont reliées par des liaisons béta. On obtient ainsi seuls ou en mélange, tous les oligosaccha- rides fructosylés utilisés dans la méthode de l'invention et notamment le gentiobiofructose, le cellobiofructose et des oligosaccharides de degré de polymérisation de 3 à 15 fruc- tosylés. Les oligosaccharides fructosylés peuvent aussi être prépa- rés selon un procédé d'hydrolyse enzymatique inverse réalisée en présence d'une forte concentration de substrat décrit dans le brevet n' WO 87/05936. On soumet ainsi à l'action d'une ou plusieurs carbohydrolases un mélange constitué d'une solution concentrée de saccharose, utilisé en tant qu'accepteur de résidus osidiques, et de sucres simples ou de polymères osidi- ques. On fait agir par exemple des béta glucosidases (EC 3.2.1.21), béta glucanases (EC 3.2.1.39), cellulases ou complexes cellu- lolytiques (EC 3.2.1.4), laminarases (EC 3.2.1.6), sur des solutions concentrées de saccharose, et de glucose, de béta glucoside de méthyle, de cellobiose, de gentiobiose, de sopho- rose, de laminaribiose, d'oligodextrines dont les unités osidiques simples sont reliées par des liaisons béta, des polymères osidiques dont les unités osidiques simples sont reliées par des liaisons béta. Tous ces donneurs de résidus osidiques sont utilisés seuls ou en mélange. L'analyse des oligosaccharides fructosylés formés suivant l'un o l'autre des procédés peut être effectuée par exemple par HPLC phase inverse sur une colonne Nucléosil C18. La structure des oligosaccharides fructosylés formés peut être confirmée, par exemple, par RMN du carbone 13 et du proton après isolement, à. l'état pur, de ces oligosaccharides par HPLC phase inverse sur colonne préparative Nucléosil C18. L'éluant est l'eau, pour les oligosaccharides ayant un degré de polymérisation compris entre 3 et 5 ou un mélange adéquat eau/méthanol pour ceux ayant un degré de polymérisation supé- rieur ou égal à 5. Les oligosaccharides fructosylés utilisés dans la méthode de l'invention peuvent être isolés et purifiés, de façon préparative, en utilisant par exemple, la chromatographie sur poudre de charbon activé, la chromatographie par échange d'ions, à partir du mélange de sucres obtenu par l'un ou l'autre des procédés. On peut également utiliser le mélange d'oligosaccharides tel quel. Les oligosaccharides fructosylés obtenus ont des proprié- tés physiques et chimiques, stabilité, solubilité, viscosité en solution, capacité de rétention d'eau, qui sont proches de celles du saccharose. Ils sont aussi non toxiques et donc compatibles avec la règle- mentation alimentaire. D'autre part, comme le saccharose, ce sont des sucres non réducteurs, qui ne donnent pas lieu à des réactions de Maillard. Toutes ces propriétés les rendent parfaitement-utilisables dans les produits alimentaires ou diététiques. Lors de leur utilisation dans les aliments, les produits diététiques ou les boissons, les oligosaccharides peuvent être utilisés seuls, ou si nécessaire en combinaison avec d'autres édulcorants, comme par exemple le saccharose, le glucose, le sucre isomérisé, le sirop de glucose/fructose enrichi ou non en fructose, le maltose, le sorbitol, le maltitol, le lacti- tol, le xylitol, l'aspartame, l'acesulfame K, la saccha- rine. Ils peuvent aussi être associés avec des agents de charge comme par exemple le polydextrose, l'amidon, les maltodextrines et le lactose, des matières colorantes, des parfums et des assaisonnements. L'invention concerne donc des produits ou boissons alimen- taires ou diététiques, caractérisés en ce que les sucres caloriques qu'ils contiennent sont remplacés totalement ou partiellement par un ou plusieurs oligosaccharides fructosylds renfermant de 3 & 15 unités osidiques reliées par des liaisons bêta. L'invention concerne plus particulièrement de tels pro- duits ou boissons caractérisés en ce qu'ils renferment le cellobiofructose, le gentiobiofructose, le laminaribiofructose et le sophorofructose. Par ailleurs, ces aliments ou boissons sont caractérisés en ce qu'ils renferment en poids, au moins 1-% d'un ou plusieurs oligosaccharides fructosylés renfermant de 3 à 15 unités osidiques reliées par des liaisons béta. Les oligosaccharides fructosylés peuvent être utilisés dans tous les aliments et boissons, sous forme de sirop, de poudre, de lyophilisat, sous forme cristallisée ou en mor- ceaux. Les termes aliments et boissons comprennent tous les aliments et boissons en général, tels que les confiseries, confitures, gâteaux, pâtés, assaisonnements, plats quotidiens, boissons carbonatées, aliments pour animaux domestiques et d'une manière générale tous les produits utilisés par voie orale, ainsi qu'édulcorants contenant les oligosaccharides fructosylés. Par ailleurs, l'invention a aussi pour objet l'utilisation des oligosaccharides fructosylés renfermant de 3 à 15 unités osidiques reliées par des liaisons béta, pour préparer des produits pharmaceutiques destinés à réduire chez l'homme l'apport calorique journalier et en particulier l'utilisation du gentiobiofructose, du laminaribiofructose, du sophorofruc- tose et du cellobiofructose pour préparer de tels produits pharmaceutiques. On utilise ces produits par exemple, pour favoriser la perte de poids chez l'homme, dans le traitement de l'obésité, du diabète; les oligosaccharides fructosylés peuvent aussi être utilisés comme excipient sucrant dans les dentifrices, dans tous les médicaments destinés à la voie orale par exemple, dans les sirops, les pastilles, les gouttes buvables. L'invention concerne les oligosaccharides fructosylés renfermant de 3 à 15 unités osidiques reliées par des liaisons bêta, pour leur utilisation dans une méthode diététique consistant à réduire l'apport calorique journalier et notam- ment le gentiobiofructose, le laminaribiofructose, le sophoro- fructose et le cellobiofructose pour une telle utilisation. Par ailleurs, l'application & titre de sucres faiblement caloriques, des oligosaccharides fructosylés renfermant de 3 à 15 unités osidiques reliées par des liaisons béta, notam- ment du gentiobiofructose, du laminaribiofructose, du sophoro- fructose et du cellobiofructose, entre dans le cadre de l'invention. Les exemples donnés ci-après illustrent l'invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE 1: Hydrolyse du gentiobiofructose ou du cellobiofruc- tose par l'alpha amylase salivaire humaine. 1.1: Préparation de la solution de gentiobiofructose ou de cellobiofructose. La synthèse de gentiobiofructose ou de cellobiofructose est effectuée par action d'une lévane-saccharase sur une solution de substrat contenant du saccharose et du gentiobiose (cellobiose) selon le procédé décrit par S. HESTRIN et G. AVIGAD. Le gentiobiofructose (cellobiofructose) formé est ensuite isolé et purifié à partir du milieu réactionnel par HPLC semi- préparative en phase inverse (colonne Nucléosil C18 - éluant eau), concentré, puis lyophilisé. Le produit est ensuite dissous dans du tampon phosphate de sodium, 0,1 M (pH 7.0), de façon à obtenir une concentration finale de 3 g/l d'oligosaccharide fructosylé. 1.2: Essai d'hydrolvse des oligosaccharides fructosvlés. Le mélange comprenant 2 ml de la solution d'oligosaccha- ride fructosylé (préparée en 1.1) et 17,8 unités d'alpha amylase salivaire humaine (SIGMA Réf. A 0521) est incubé 2 heures à 37'C. Au bout de 2 heures, la réaction est arrêtée par chauffage. Le glucose apparu est mesuré par la méthode enzymatique à la glucose oxydase/peroxydase (test Boehringer Réf. 124036). De la même façon un essai témoin est effectué avec des malto- dextrines type glucidex 21 (Sté Roquette, France). les résultats obtenus sont donnés en micromoles de glucose formé par unité d'enzyme et par heure. I II SUBSTRAT ACTIVITE DE L'ALPHA AMYLASE l l SALIVAIRE MALTODEXTRINES 235 GENTIOBIOFRUCTOSE I 0 I II CELLOBIOFRUCTOSE t 0 I I I -I I, EXEMPLE 2: Essai d'hydrolyse du gentiobiofructose ou du cellobiofructose pour l'alpha amylase pancréatique. Le mélange contenant 2 ml de la solution d'oligosaccharide fructosylé (préparée en 1.1) et 19 unités d'alpha amylase pancréatique porcine (SIGMA Réf. A1278) est incubé 2 heures à 37C. La réaction est arrêtée par chauffage. Le glucose apparu est mesuré par la méthode enzymatique à la glucose oxydase/ peroxydase (Test Boehringer Réf. 124036). Un essai témoin est effectué avec des maltodextrines type glucidex 21 (Sté ROQUETTE, France). Les résultats sont exprimés en micromoles de glucose formé/unité d'enzyme/heure. SUBSTRAT ACTIVITE DE L'ALPHA AMYLASE II |PANCREATIQUE MALTODEXTRINES 224 I I,I GENTIOBIOFRUCTOSE 0 I I.I CELLOBIOFRUCTOSE 0 EXEMPLE 3: Hydrolyse des oligosaccharides fructosylés par un homogénat de jejunum de rat. 3.1: Préparation de gentiobiofructose ou de cellobiofructose. La synthèse de gentiobiofructose ou de cellobiofructose est effectuée par action d'une lévane-saccharase sur une solution de substrat renfermant du saccharose et du gentio- biose (cellobiose) selon le procédé décrit par S. HESTRIN et G. AVIGAD. Le gentiobiofructose (cellobiofructose) formé est purifié par HPLC semi préparative (colonne Nucléosil C18 - éluant: eau) puis lyophilisé. Le produit est dissous, ensuite, dans un tampon phosphate de sodium 0,05 M, pH 6.0 de façon à avoir une concentration molaire de 2,924 mmoles/l. 3.2: Préparation de l'homogénat de jeiunum de rat. cm de jejunum sont prélevés sur un rat mâle Sprague Dawley (préalablement mis à la diète pendant 24 h) et rincés par une solution de sérum physiologique. Le jejunum (pesant environ 150 mg) est broyé en présence de Nacl 0,9 % (p/V) à l'aide d'un homogénéisateur type "Polytron", puis le broyat est amené à 10 ml (avec la solution de Nacl 0,9%). 3.3: Hydrolyse du gentiobiofructose ou de cellobiofructose par l'homoqenat de ielunum de rat. Le mélange réactionnel contenant 2 ml de la solution d'oligosaccharide fructosylé et 2 ml d'homogénat est mis à incuber pendant 24 h à 37C, sous agitation magnétique. Des prélèvements sont effectués à intervalles réguliers, et les enzymes intestinales sont inactivées thermiquement. Un essai est effectué en parallèle sur une solution témoin renfermant du saccharose. Le glucose libéré, au cours du temps, est dosé par la méthode enzymatique à la glucose oxydase/peroxydase. Le degré d'hydrolyse est calculé comme suit: DH % = glucose libéré () x 100 glucose total libérable (g) 100 TABLEAU 1 _ T i. i I Temps 1 Saccharose I GentiobiofructoselCellobiofructose (heures)I DH% J DH % DH % I O I O I O0 1 1 8 h 301 57.6 1 0 0 117 h 30 1 66.7 1 0.4 3.7 124 h 00 1 92.7 1 0.4 5. 4 I I_ _i_ _ _ I _ _ _ I_ _ _ _ _ I Dans une deuxième série d'essais on a suivi l'évolution, au cours du temps, de la composition de l'oligosaccharide fructosylé par HPLC phase inverse (colonne Nucléosil C18 - éluant eau) le sucre témoin étant toujours le saccharose. Les résultats sont donnés dans le tableau n 2. TABLEAU 2 I 1 I Composition en carbohydrate % *1 IProduits | Temps I i i i 1 testés I(heures) lGlucose +lSaccharose Gentiobiol Cellobio I I IFructose 1 Ifructose Ifructosel I I I I I I I Saccharosel Oh 0 O I 100 _ 8h30. _ I. 1 24hO0 96 4 - - I I I I I I I IGentiobio Oh I O 100 - Ifructose | I| 8h30 0 ND *2 100 - I I 24hO0 0,4 I ND 99,6 - I I I I I II Cellobio.I Oh 0 O - 100 fructose I 8h30 3.0 ND - 97.0 I |I 24hO0 6.4 ND 93.6 *1: % HPLC: Surface du Dic considéré x 100 Surface représentée par tous les pics *2: Non détectable. Ainsi qu'on peut le constater en regardant les tableaux 1 et 2, les résultats montrent que les oligosaccharides fruc- tosylés sont très peu hydrolysés par les enzymes de la bordure en brosse intestinale du rat, à la différence du saccharose. De plus les résultats des essais 1 et 2 montrent l'absence totale d'hydrolyse par l'alpha amylase salivaire humaine, et l'alpha amylase pancréatique de porc. On peut en conclure que les oligosaccharides fructosylés conviennent comme édulcorant à faible pouvoir calorique. REVENDICATIONS 1) Méthode destinée à réduire l'apport calorique journalier chez l'homme ou l'animal, caractérisée en ce qu'un ou plu- sieurs oligosaccharides fructosylés renfermant de 3 à 15 unités osidiques reliées par des liaisons bêta, remplacent tout ou partie des sucres caloriques dans les produits des- tinés à l'alimentation ou à la diététique. 2) Méthode telle que définie par la revendication 1, carac- térisée en ce que les oligosaccharides fructosylés utilisés renferment de 3 à 8 unités osidiques reliées par des liaisons béta. 3) Méthode telle que définie par les revendications 1 et 2, caractérisée en ce que les oligosaccharides fructosylés utili- sés sont des trisaccharides. 4) Méthode telle que définie par les revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les trisaccharides utilisés sont constitués d'une molécule de saccharose et d'une molécule de glucose, les unités glucosidiques étant reliées soit par une liaison bétal_2 pour former le sophorofructose, soit par une liaison btal_3 pour former le laminaribiofructose, soit par une liaison bétal_ 4 pour former le cellobiofructose, soit par une liaison bétal 16 pour former le gentiobiofructose. ) Produits ou boissons alimentaires ou diététiques, carac- térisés en ce que les sucres caloriques qu'ils contiennent sont remplacés totalement ou partiellement par un ou plusieurs oligosaccharides fructosylés renfermant de 3 à 15 unités osidiques reliées par des liaisons béta. 6) Produits ou boissons alimentaires ou diététiques tels que définis par la revendication 5, caractérisés en ce qu'ils renferment en poids, au moins 1 % d'un ou plusieurs oligo- saccharides fructosylés renfermant de 3 à 15 unités osidiques reliées par des liaisons béta. 7) Produits ou boissons alimentaires ou diététiques tels que définis par les revendications 5 et 6, caractérisés en ce qu'ils renferment le cellobiofructose, le gentiobiofructose, le laminaribiofructose et le sophorofructose. 8) Utilisation des oligosaccharides fructosylés renfermant de 3 à 15 unités osidiques reliées par des liaisons béta, pour préparer des produits pharmaceutiques destinés à réduire chez l'homme l'apport calorique journalier. 9) Utilisation du gentiobiofructose, du laminaribiofructose, du sophorofructose et du cellobiofructose pour préparer des produits pharmaceutiques destinés à réduire chez l'homme l'apport calorique journalier. ) Oligosaccharides fructosylés renfermant de 3 à 15 unités osidiques reliées par des liaisons béta, pour leur utilisation dans une méthode diététique consistant à réduire l'apport calorique journalier. 11) Gentiobiofructose, laminaribiofructose, sophorofructose et cellobiofructose pour leur utilisation dans une méthode diété- tique consistant à réduire l'apport calorique journalier. 12) Application à titre de sucres faiblement caloriques, des oligosaccharides fructosylés renfermant de 3 à 15 unités osidiques reliées par des liaisons béta. 13) Application à titre de sucres faiblement caloriques, du gentiobiofructose, du laminaribiofructose, du sophorofructose et du cellobiofructose.