FR 2630129 A1 19891020 FR 8904903 A 19890413 Réactif pour l'analyse des triglycérides et procédé d'analyse le mettant en oeuvre. La présente invention est relative à un réactif utile pour l'analyse des triglycérides et à un procédé d'analyse des triglycérides le mettant en oeuvre. Plus particulièrement, la présente invention est relative à un réactif comprenant des lipases et des mono- glycéride lipases,qui est utile pour l'analyse quantita- tive rapide des triglycérides, en particulier de ceux con- tenus dans le sérum du sang, et à un procédé perfectionné d'analyse des triglycérides en utilisant ce réactif. On a analysé le triglycéride contenu dans des échantillons, notamment dans des échantillons tels que des fluides de l'organisme, en hydrolysant le triglycéri- de en faisant habituellement appel à des lipases, jusqu'au glycérol et à l'acide gras, en passant par le diglycéride et le monoglycéride successivement, puis en dosant le glycérol ou l'acide gras libéré par le triglycéride par un procédé mettant en oeuvre une réaction enzymatique ou une réaction chimique. On effectue le dosage,par exemple, d'une manière simple, en utilisant des électrodes ou des indicateurs. Pour effectuer une analyse efficace du triglycé- ride contenu dans du sérum du sang, on a utilisé des enzymes protéolytiques, tels que des protéases et des lipoprotéine lipases, pour libérer le triglycéride des protéines liées, suivi d'une analyse de triglycéride. La demande de brevet publiée au Japon sous le No 9518/1979 (demande de brevet japonais No 114493/1978) propose d'uti- liser, à la fois, des lipases et des protéases. En outre, pour favoriser la réaction d'hydrolyse des triglycérides en glycérol, on a proposé une association de diverses lipases ayant des propriétés différentes les unes des au- tres et l'addition d'agents tensio-actifs ou d'agents chimiques à la solution d'échantillon. On propose, par exemple, une hydrolyse en utilisant une association de lipases ayant des propriétés différentes les unes des au- tres (demande de brevet japonais publiée sous le numéro 25694/1977, publication du brevet japonais No 29/1981 et publication du brevet japonais No 28276/1982), une hydro- lyse utilisant une association de lipases et de cholesté- rol estérases (publication du brevet japonais No 46799/ 1981), une hydrolyse utilisant une association de lipases et d'agents tensio-actifs (publication de brevet japonais No 39158/1982), une hydrolyse utilisant une association de lipases, d'agents tensio-actifs et de dérivés du phé- nol ou de l'aniline (publication de brevet japonais No 5677/1983), une hydrolyse utilisant une association de lipases, d'une carboxy-estérase provenant du foie de porc et des alcoylsulfates de métal alcalin ou de métal alcalino-terreux (brevet japonais publié sous le numéro 64495/1974), et une hydrolyse utilisant des lipases, des lipases pancréatiques et des sels de l'acide biliaire (brevet japonais publié sous le No 11987/1977). Comme décrit ci-dessus, les procédés analytiques classiques ont été effectués en séparant le triglycéride des protéines liées et en favorisant la réaction d'hydro- lyse du triglycéride en glycérol. Mais la vitesse d'hydro- lyse n'est pas très grande, de sorte qu'il faut beaucoup de temps pour l'analyse, puisque presque toutes les lipa- ses utilisées dans ces procédés sont susceptibles d'hydrolyser le triglycéride jusqu'au glycérol, mais ne sont pas suffisamment actives sur le e-monoglycéride - produit par l'hydrolyse du triglycéride, c'est-à-dire qu'elles ont une faible aptitude à donner une hydrolyse pour produire du glycérol à partir du monoglycéride. On a donc souhaité accélérer la réaction d'hydrolyse du mo- noglycéride en glycérol, et écourter la durée d'analyse. On a maintenant réussi à isoler un microorganis- me produisant une monoglycéride lipase et appartenant à la souche Bacillus H-165, qui est capable de catalyser la réaction d'hydrolyse du monoglycéride en glycérol, dans le sol entourant la source chaude de la station ther- male de Kirishima, Kagoshima-ken, Japon, et on a obtenu une monoglycéride lipase en le cultivant (demande de bre- vet japonais No 80299/1987). On a également trouvé que la monoglycéride lipase obtenue est capable d'agir sur un a-monoglycéride ou sur un S-monoglycéride d'une maniè- re extrêmement intense, à la différence des lipases clas- siques qui n'agissent que faiblement sur le monoglycéride. On a trouvé, en outre, que la monoglycéride lipase a une valeur optimum de pH de 5 environ, un point isoélectrique de 4,6 et une masse moléculaire aussi faible que 27.000, présente une activité maximum à une température optimum de 75 C et résiste d'une manière excellente à la chaleur, de sorte qu'elle n'est guère désactivée à 70 C et conser- ve 20 % de son activité, même après un traitement à 90 C. On a en outre trouvé que l'utilisation en asso- ciation de la monoglycéride lipase et de lipases est susceptible d'écourter la durée requise pour l'analyse du triglycéride contenu dans une solution d'échantillon, parce que la monoglycéride lipase agit intensément et d'une manière spécifique sur le monoglycéride formé à partir du triglycéride, en passant par le diglycéride par l'action de la lipase, ce qui accélère la réaction d'hy- drolyse du triglycéride en glycérol. Sur la base de ce qui précède, l'invention vise un réactif d'analyse des triglycérides qui comprend des lipases et des monoglycéride lipases. L'invention vise en outre un réactif d'analyse des triglycérides qui com- prend des lipases, des monoglycéride lipases et des réac- tifs de dosage du glycérol. L'invention vise enfin un procédé d'analyse des triglycérides, qui consiste à mettre des lipases en contact avec une solution d'échan- tillon contenant du triglycéride et à doser le glycérol ou l'acide gras libéré, ce procédé consistant à mettre un système contenant la monoglycéride lipase à réagir sur la solution d'échantillon, puis à doser les consti- tuants consommés ou produits dans la réaction pour doser le glycérol ou les acides gras. Les objectifs, caractéristiques et avantages de la présente-invention, mentionnés ci-dessus, ainsi que d'autres apparaîtront dans la description aui va suivre, en liaison avec les dessins annexes dans lesquels: la figure 1 représente la durée nécessaire pour la réaction, en l'absence ou en la présence de la monogly- céride lipase en une quantité de 0,2 U/ml; la figure 2 représente la courbe optimum de pH de la monoglycéride lipase utilisée dans l'invention; la figure 3 représente une courbe optimum de température de la même enzyme que celle de la figure 2; la figure 4 représente la courbe de stabilité en fonction du pH de la même enzyme que celle de la figure 2; la figure 5 représente une courbe de stabilité thermique de la même enzyme que celle de la figure 2; la figure 6 représente une courbe d'élution du procédé de purification de la même enzyme que celle de la figure 2; la figure 7 représente une courbe d'étalonnage du monoglycéride; ZQ3OlC7 la figure 8 représente l'effet de raccourcisse- ment de la durée de réaction dans l'analyse du triglycé- ride des sérums, en la présence de la monoglycéride lipase; et la figure 9 représente la différence entre les courbes d'étalonnage de triglycéride en l'absence et en la présence de la monoglycéride lipase en une quantité de 0,2 U/ml. La monoglycéride lipase que l'on peut utiliser dans la présente invention n'est pas limitée, d'une ma- nière particulière, pour autant qu'elle est capable de catalyser d'une manière intense, au moins la réaction de préparation de glycérol et d'acides gras à partir de -- monoglycéride, et est incapable ou guère capable d'agir sur le triglycéride et le diglycéride. Une monoglycéride lipase préférée est préparée en cultivant Bacillus stea- rothermophilus H-165 (FERM BP-1673) dans un milieu de culture. Suivant la présente invention, on peut utiliser n'importe quelle souche, pour autant qu'elle est capable de produire la monoglycéride lipase qui agit d'une maniè- re intense sur le monoglycéride. La présente invention sera illustrée en détail en se référant à la monoglycé- ride lipase obtenue en utilisant la souche Bacillus stearothermophilus H165 (FERM BP-1673) de la manière suivante. (1) Performance: Monoglycéride + H20 -+ glycérol + acide gras (Le monoglycéride peut être un a-monoglycéride ou un e-monoglycéride). (2) Masse moléculaire:.27.000 + 2.700 [mesurée en utilisant une colonne de gel de polyvinyle "TSK3000SW" (marque de fabrique; produit de Toyo Soda Mfg., Co., Ltd.) et un tampon au phosphate mM (pH 6,5) contenant 0,2 M de NaCl comme phase mobile]. (3) pH optimum. On utilise un procédé de mesure de l'activité enzymatique que l'on décrira ultérieurement. On fait réagir de la monolaurine et l'enzyme l'une sur l'autre, pendant 10 minutes, en utilisant séparément un tampon au diméthylglutarate (pH 4 à 7; *- à la figure 2) et un tampon au tris-HCl (pH 7 à 9,5; -A- à la figure 2) com- me tampons. On fait bouillir ensuite le mélange réaction- nel pendant 2 minutes pour inactiver l'enzyme, ce qui met fin à la réaction. On fait incuber ensuite le mélan- ge réactionnel à 37 C, puis on effectue une mesure enzy- matique de la quantité de glycérine formée. Les résul- tats sont indiqués à la figure 2. Le pH optimum est voisin de 5. (4) Température optimum. En utilisant un tampon au PIPES-NaOH (pH 7,3), on effectue des réactions séparément, aux températures indiquées à la figure 3. On fait bouillir séparément les mélanges réactionnelsaprès qu'ils ont réagi. En suivant le procédé de mesure décrit ci-dessous, on mesure séparé- ment les quantités de glycérine formées. Les résultats sont indiqués à la figure 3. L'activité maximum est obte- nue à 75 C. (5) Stabilité en fonction du pH. On prépare séparément des solutions (1,0 U/ml) de la présente enzyme et d'un tampon au diméthyl glutara- te 10 mM NaOH (pH 4 à 7 - à la figure 4), d'un tampon au tris-HCl (pH 8 à 9; 4 - à la figure 4) et d'un tam- pon à la glycine-NaOH (pH 9 à 10); -A- à la figure 4). Après avoir fait incuber les solutions à 75 C pendant minutes, on mesure l'activité restante par le procédé de dosage décrit ci-dessous de l'activité enzymatique. Les résultats obtenus sont indiqués à la figure 4. L'activité enzymatique reste stable dans une plage de pH de 7 à 8. (6) Stabilité thermique. On prépare une solution (1,0 U/ml) de la présente enzyme et d'un tampon au tris-HC1 10 mM (pH 7,5). Après avoir fait incuber la solution pendant 10 minutes aux températures indiquées à la figure 5, on mesure l'acti- vité restante par le procédé de dosage de l'activité en- zymatique décrit ci-dessous. Les résultats obtenus sont indiqués à la figure 5. L'activité enzymatique reste stable jusqu'à 70 C. (7) Point isoélectrique. pH 4,6 + 0,4 (après avoir appliqué un courant sous une tension constante de 700 V à 4 C pendant 40 heures par une électrophorèse isoélectrique à focalisa- tion utilisant un ampholyte comme porteur, on mesure l'activité enzymatique de chaque fraction. (8) Spécificité du substrat. On étudie la spécificité au substrat de la mono- glycéride lipase de l'invention, en effectuant le procé- dé de dosage décrit ci-dessous de l'activité enzymatique de la monoglycéride lipase. Comme résultat, on indique, telle que résumée au tableau 1, l'activité maximum à l'encontre de l'a-monolaurine. La monoglycéride lipase n'agit pas sur le diglycéride ou sur le triglycéride ser- vant de substrat, puisqu'on ne détecte pas de glycérol hydrolysé à partir de ces substrats en la présence de la monoglycéride lipase, quand on utilise comme substrat un diglycéride provenant de la lécithine du jaune d'oeuf, de la 1,2-dilinoléine, de la 1,3-dilinoléine et de la trioléine. L'action de la monoglycéride lipase sur un - monoglycéride pour la spécificité du substrat est la suivante. 1) Confirmation de l'acide gras libéré du a- linoléoyl-S-oléoyl-diglycéride servant de substrat, par chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC): i) On ajoute de la lipase pancréatique (50 ul) à 1,0 ml d'un mélange réactionnel comprenant 0,5 mg d'a- linoléoyl-6-oléoyl-diglycéride, 1,8 mg d'agent tensio- actif non ionique ("Triton X-100", marque de fabrique; produit de Sigma Chemical Company), 3,8 mg d'acide déso- xycholique, 20 U de colipase, 0,15 mg de chlorure de cal- cium et 200 pl d'acide N-tri(hydroxyméthyl)méthyl-3-amino- propanesulfonique 0,1 M (TAPS)-NaOH (pH 8,3). Après avoir laissé le mélange réagir à 37 C pendant 10 minutes, on met fin à la réaction. On applique un aliquote de 15 pl du mélange réactionnel à une colonne et on effectue une chromatographie en phase liquide à haute performance dans les conditions suivantes. Colonne: "Zorbox ODS" (marque de fabrique; sec- tion 4,6 mm x 25 cm). Solvant: acétonitrile: H20 (96:4). Détection: absorption ultraviolette à 205 nm. Débit: 1,2 ml/minute. On ne détecte pas d'acide oléique, mais de l'acide linoléique pour une durée de rétention de 23 minutes. Cette détection de l'acide linoléique lié en la position- a montre que la lipase pancréatique agit seulement sur la position-a d'un substrat à base d'a,S-diglycéride, jusqu'à production du B-oléoyl-monoglycéride. ii) On ajoute la monoglycéride lipase (0,5 U) à une solution réactionnelle ayant la même composition que celle utilisée ci-dessus, et on laisse se dérouler la réaction de la même manière que ci-dessus. On détecte les acides gras libérés par chromatographie en phase liquide à haute performance, c'est-à-dire que l'on confirme la présence d'acide linoléique et d'acide oléi- que pour des durées de rétention de 23 minutes et de 31 minutes, respectivement. Ce résultat montre que la mono- glycéride lipase agit sur le substrat à base de e-mono- glycéride produite à partir de l'a,-diglycéride par la lipase pancréatique, jusqu'à libération de l'acide lino- léique lié en la position-E. On détecte également le glycérol libéré de l'a,6-diglycéride. 2) Spécificité au substrat de la monoglycéride lipase en utilisant de l'a,e-diglycéride comme substrat. i) On applique de la lipase pancréatique et de la monoglycéride lipase au substrat à base d'a,B-di- glycéride décrit ci-dessous. Leurs positions en a sont hydrolysées par la lipase pancréatique, puis on laisse réagir les -monoglycérides obtenus sur la monoglycéride lipase, afin d'analyser le glycérol ainsi libéré. On détecte du glycérol pour les substrats que sont l'a-olé- oyl-3-palmitoyldiglycéride, l'a-palmitoyl-E-oléoyldigly- céride et l'a,8-dilinoléoylglycéride. Mais on ne détecte pas de glycérol quand on utilise seulement de la lipase pancréatique. (9) Effet d'agent tensio-actif et d'ions métalliques. Quand on ajoute un agent tensio-actif, tel que le "Triton X-100" (marque de fabrique) et de l'acide cholique, il apparaît nettement au tableau 2 que l'on observe une inhibition de l'activité dans la plage su- périeure des concentrations. La monoglycéride lipase n'est pas affectée par l'addition d'ions métalliques divalents tels que Ca++ et Mg. Tableau 1 Spécificité au substrat de la monoglycéride lipase Substrat Activité de lipase (%) -monoglycéride: monoacétine 10,1 monobutyrine 47,1 monocaprine 89,1 monolaurine 100,0 monomyristine 85,7 monopalmitine 39,5 monooléine 56,3 -monoglycéride: monooléine 75,6 Diglycérides: dérivés de lécithine purifiée de jaune d'oeuf:: 1,2-dilinoléine O 1,3-dilinoéline O Triglycéride: trioléine O ::Procédé de préparation: On met à réagir de la phospholipase C sur de la lécithine purifiée de jaune d'oeuf. On utilise une fraction extraite par un mélange de chloroforme et de méthanol. Tableau 2 Effets des agents tensio-actifs et des ions métalliaues sur la monoalycéride lipase Activité de lipase Réactif Concentration Activité de lipase (%) - -100 Triton X-100 0,1 % 81,7 Triton X-100 0,5 % 46,5 Acide cholique 1 mM 100,0 Acide cholique 10 mM 92,6 -15 CaC12 1 mM 100,0 MgC12 1 mM 100,0 EDTA 1 mM 86,0 Tampon au PIPES 0,2 M NaOH (pH 7) 0,1 ml 4-aminoantipyrine à 0,3 % 0,05 ml TOOS:::: à 0,2 % 0,05 ml Peroxydase (45 U/ml) 0,05 ml MgCl2 20 mM 0,025 ml ATP 20 mM 0,025 ml Glycérol kinase (25 U/ml) 0,01 ml Glycérophosphate oxydase (1000 U/ml) 0,015 ml Eau purifiée - 0,075 ml (::::TOOS: N-éthyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)- méta-toluidine). A 0,4 ml d'une solution ayant la composition ci- dessus, on ajoute 50 p1 de monolaurine 10 mM (solution aqueuse à 0,5 % de "Triton X-100"). On fait pré-incuber le mélange obtenu à 37 C pendant 2 à 3 minutes et on y ajoute 50 41 d'une solution d'enzyme pour initier une réaction. Exactement 10 minutes plus tard, on ajoute 2,5 ml de SDS à 5 % (dodécyl sulfate de sodium) pour mettre fin à la réaction. On mesure l'absorbance à 550 nm. Pour ce qui concerne l'activité enzymatique, on dé- finit comme une unité (1 U) l'activité capable de produi- re 1 pmole de glycérol à la minute. On utilise l'équation suivante pour calculer l'activité enzymatique (activité): Activité enzymatique (U/ml) = LA 550 x 2,95 x 1.000 x 1 178 È 50 10 dans laquelle LA 550 est l'absorbance à la longueur d'onde de 550 nm 2,95 est le volume total du mélange réactionnel (ml) 18,0 est le coefficient d'extinction millimolaire de l'eau oxygénée (cm2/pmole) est le volume de la solution d'enzyme utilisée (pl) est la durée de réaction (mn). La description ci-dessus montre aue l'enzyme obtenue par l'incubation de la souche de Bacillus stearothermophilus H-165 (FERM BP-1673) a une spécifici- té au substrat sur le monoglycéride et est capable de catalyser la réaction: monoglycérides + H20 - glycérol + acides gras. La souche Bacillus stearothermophilus H-165, qui est un exemple des microorganismes capables de produire la monoglycéride lipase, a les caractéristiques mycologi- ques suivantes. A. Observation visuelle: Cultivée entre 50 et 55 C pendant 18 à 44 heures. (1) Culture sur gélose inclinée nutritive: Présente une couleur gris blanchâtre nuancée d'une couleur jaune. Croit d'une manière filiforme. La croissance est bonne et sans production de pigments solubles. (2) Culture sur gélose nutritive plate: Présente une couleur grise nuancée d'une couleur jaune. Il se forme une colonie entière circulaire et plate, mais sans production de pigments solubles. (3) Milieu liquide: On observe une bonne croissance. Le milieu de- vient uniformément trouble. (4) Milieu lacté BCP: Le milieu reste inchangé. B. Caractéristiques morphologiques: (1) Forme et disposition: La souche a un bacille cylindrique qui est droit ou légèrement incurvé à l'une ou aux deux extrémités. Les cellules sont discrètes ou liées ensemble deux à deux. Il peut se former parfois des chaînes courtes. (2) Dimensions: 0,6 à 0,8 x 2,5 à 4,0 pm. (3) Mobilité: Aucune. (4) Spore: Un spore, sous la forme d'un oeuf ou d'un cercle allongé, se trouve en une partie centrale de chaque cel- lule ou en un emplacement proche du contour de chaque cellule. Sa dimension est de 0,8 à 1,2 x 1,5 à 2,0 Vm. La cellule s'élargit par le spore. (5) Polymorphisme: Aucun. C. Caractéristiques physiologiques et biochimiques: Prise du Gram + Réaction à KOH Colorant anti-acide Formation de capsule - Test OF (milieu Hugh-Leifson) sans modification Test OF (milieu modifié):::::: O (oxydé) Croissance dans des conditions anaérobies Température de croissance 60 C + 50 C + 47 C + pH de croissance 8,6 - 7,7 + ,6 + 4,4 - Résistance aux sels O % + 3% + % Hydrolyse de la gélatine Hydrolyse de l'amidon + Hydrolyse de la caséine Hydrolyse de l'aesculine + Hydrolyse de la cellulose Hydrolyse de l'arginine + Production de catalase + Production d'oxydase + Production d'uréase (milieu SSR) - Production d'uréase (milieu Chris.) + Production d'indole - Production de sulfure d'hydrogène - Production d'acétolne - Test MR - Réduction des nitrates + Dénitrification' ::::::Composition du milieu: (NH4)2HPO4 1,0 g MgS04,7H20 0,2 g Glucose 10,0 g BTB (solution aqueuse à 0,2 %) 10,0 g KCl 0,2 g Extrait de levure 1,0 g Gélose 3,0 g Eau distillée 1000,0 ml (pH 7,0). Test d'assimilation (milieu de Simons): Sels de l'acide citriaue Sels de l'acide maléique Sels de l'acide malique + Sels de l'acide gluconique + Sels de l'acide propionique Sels de l'acide malonique Sels de l'acide succiniaue + Test d'assimilation (milieu de Christensen): Sels de l'acide citrique + Sels de l'acide maléique Sels de l'acide malique + Sels de l'acide gluconique + Sels de l'acide propionique + Sels de l'acide malonique - Sels de l'acide succinique + Production de gaz à partir du glucose - Production d'acides à partir de sucres [(NH4)2HP04 est utilisé comme source de N] Adonitol - L(+)-arabinose Cellobiose + Dulcitol Méso-érythritol Fructose + Galactose - Glucose + Glycérine + Inositol Inuline Lactose Maltose + Mannitol + Mannose + Melezitose + Melibiose + Raffinose + L(+)-rhamnose D-ribose + Salicine + Sorbitol Sorbose Amidon + Saccharose + Trehalose + Xylose + A partir des caractéristiques mycologiques décri- tes ci-dessus, on peut définir la souche H-165 comme une * bactérie aérobie thermophile, qui est un bacille cylin- drique non mobile ayant une forme droite ou légèrement incurvée à une extrémité ou à ses extrémités, qui prend le gram, qui a une dimension de 0,6 à 0,8 x 2,5 à 4,0 pm, qui forme une spore et qui subit un élargissement de la cellule par la spore, qui décompose le glucose par oxyda- tion et donne un acide et qui est positif pour la produc- tion de catalase et d'oxydase. Une souche ayant ces di- verses caractéristiques est considérée comme appartenant à la famille de Bacillus, parce que c'est une bactérie formant une spore prenant le gram, aérobie et en forme de verge. Comme autres souches de microorganismes presen- tant les mêmes caractéristiques que la souche ci-dessus pour la production d'acétolne, la production d'indol, la production de gaz à partir du glucose et l'aptitude à la croissance dans des conditions anaérobies, il y a (A) Bacillus stearothermophilus, (B) Bacillus alcalophilus, (C) Bacillus badius et (D) Bacillus firmus. Les caracté- ristiques mycologiques de ces espèces de bactéries et celles de la souche H-165 sont comparées, dans ce qui suit: [+: positif, -: négatif, d: différent suivant les souches, ND: aucune donnée disponible]. A B C D Souche H-165 Prise du gram + + + + + Elargissement de la cellu-d + le par la spore Croissance anaérobie.. . Production de la catalase + + + + + Hydrolyse de la gélatine + + ND + - Hydrolyse de l'amidon + + - + + Hydrolyse de la caséine d + + + - Production d'indole. .. Production d'acétoine. .. Réduction des nitrates d - _ d + Assimilation des sels d de l'acide citrique Production de gaz à partir du glucose Production d'acide à partir du L-arabinose d + Production d'acide à + + partir du D-glucose Production d'acide à d + + partir du mannitol Production d'acide à d + partir du d-xylose Croissance à 60C + + Croissance à 60 C + ---+ De la comparaison qui précède, on trouve que les caractéristiques de la souche H-165 se conforment très bien à celles de Bacillus stearothermophilus, à l'excep- tion de la dégradabilité de la gélatine. C'est pourquoi la souche H-165 est identifiée comme une souche apparte- nant à Bacillus stearothermophilus, et désignée Bacillus stearothermophilus H-165, et a été déposéesous l'apella- tion FERM BP-1673 au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science of Technology, Ministre du Commerce International et de l'Industrie, Gouvernement du Japon. Le Bacillus stearothermophilus H-165 décrit ci- dessus est simplement un exemple de microorganisme de Bacillus produisant des monoglycéride lipases utiles pour la mise en pratique de l'invention. L'invention n'est pas limitée à l'utilisation de cette souche parti- culière et on peut utiliser, suivant l'invention, tout microorganisme capable de produire une telle monoglycé- ride lipase. On cultive un microorganisme capable de produire la monoglycéride lipase par un procédé utilisé d'une ma- nière routinière pour la préparation d'antibiotiques, d'enzymes, etc. On peut effectuer la culture en milieu liquide ou en milieu solide. Pour une application indus- trielle, il est souhaitable d'inoculer des cellules d'un microorganisme produisant de la monoglycéride lipase à un milieu, puis de soumettre les cellules à une culture submergée avec agitation d'aération. Comme sources nutritives pour le milieu, on peut utiliser diverses sources nutritives employées habituel- lement pour la culture des microorganismes. Comme source de carbone, on peut utiliser n'importe quel composé car- boné, pour autant qu'il est assimilable. Il est donc possible d'utiliser, par exemple, des hydrates de carbone tels que le glucose, le saccharose, le lactose, le galactose, le maltose, le mannitol, le sorbitol, la dex- trine et l'amidon, divers acides organiques, des huiles végétales telles que l'huile de soja et l'huile d'olive, des huiles animales et des graisses telles que du sain- doux et de la graisse de volaille, etc. Comme source d'azote, on peut employer n'importe quel composé azoté pour autant qu'il est assimilable. On peut utiliser, par exemple, de la peptone, de l'extrait de levure pulvérisé, de l'extrait de viande, de la farine de soja, de la ca- séine, de la farine dégraissée de graine de coton, etc. En outre, on peut aussi utiliser, suivant les besoins, un ou plusieurs sels divers tels que des phosphates, des sels de magnésium, des sels de calcium, des sels de po- tassium, des sels de sodium, des sels de zinc, des sels de fer, des sels de manganèse et des sels halogénés, de la liqueur de macération du mais, diverses vitamines, etc. On peut faire varier la température de culture dans la plage de température dans laquelle un microorga- nisme capable de produire la monoglycéride lipase croît et produit l'enzyme désirée. Mais la température de cul- ture préférée est comprise entre 40 et 65 C et particu- lièrement entre 45 et 50 C. Bien que la durée de culture varie, suivant les conditions de culture, il est seule- ment nécessaire de mettre fin à la culture à un instant convenable en surveillant le moment o l'enzyme atteint l'activité maximum. La durée de culture préférée est com- prise entre 10 et 22 heures. On prépare ensuite la monoglycéride lipase à par- tir du bouillon ainsi cultivé du microorganisme produi- sant de la monoglycéride lipase. Comme l'enzyme est pro- duite dans ses cellules, les cellules sont recueillies du bouillon de culture par un procédé tel qu'une filtra- tion ou une centrifugation. On rompt ensuite ces cellules en choisissant ou en combinant divers procédés de rupture des cellules tels que des procédés de rupture mécanique comme les ultrasons, le procédé au moyen d'une presse française et le traitement par des billes de verre et des procédés de rupture par voie enzymatique, par exemple un traitement au lyzozyme, en obtenant une solution brute contenant la monoglycéride lipase. On peut ajouter, si nécessaire, un agent tensio-actif tel que le "Triton X-100" (marque de fabrique). On obtient la monoglycéride lipase sous la forme purifiée à partir de la solution brute en utilisant un procédé connu d'isolation et de purification pour des pro- téines, des enzymes, etc. On peut recueillir l'enzyme par exemple par précipitation fractionnée ou par précipitation à l'aide d'un sel. On effectue le premier procédé en ajoutant un solvant organique tel que l'acétone, le mé- thanol, l'éthanol ou l'isopropanol à la solution enzyma- tique brute contenant la monoglycéride lipase, tandis qu'on effectue le second procédé en ajoutant du sulfate d'ammonium, du chlorure de sodium, du sulfate de sodium ou autres à la solution enzymatique brute. Le précipité obtenu peut ensuite être purifié par un ou par plusieurs procédés de chromatographie, tels que la chromatographie sur tamis moléculaire et, en outre, par électrophorèse, par ultracentrifugation ou autre, jusqu'à obtention d'un pic unique. Comme procédés de purification, il est néces- saire de choisir des procédés de purification qui font usage des propriétés de la monoglycéride lipase recher- chée. C'est ainsi, par exemple, qu'après avoir dissous le précipité cidessus dans de l'eau ou dans un tampon, et si nécessaire après avoir dialysé la solution obtenue à travers une membrane semi-perméable, on soumet la solu- tion ou le dialysat à une chromatographie par échange d'ions sur une résine d'échange d'anions telle que DEAE- cellulose, DEAE-"Sephacel" (marque de fabrique), DEAE- "Sepharose" (marque de fabrique), DEAE-"Sephadex A-50" (marque de fabrique), ou DEAE-"Toyo Pearl" (marque de fabrique), ou sur un milieu en gel de filtration tel que "Sephadex G-100" (marque de fabrique), "Sephadex G-75" (marque de fabrique), "Sephacryl S-200" (marque de fabri- que). Après avoir appliqué deux ou plusieurs de ces procé- dés en combinaison, on purifie la monoglycéride lipase par électrophorèse, par ultracentrifugation ou autre, jusqu'à obtention d'un pic unique. On peut alors ajouter un agent stabilisant tel qu'un sucre, par exemple du mannitol, du saccharose ou du sorbitol, un acide aminé tel que l'acide glutamique ou la glycine, ou un peptide ou une protéine telle que l'albumine sérique du boeuf, puis on fait suivre d'un autre traitement tel qu'une lyophilisation pour obtenir la poudre de l'enzyme sous une forme purifiée. La monoglycéride lipase ayant les propriétés phy- siques et chimiques telles que décrites ci-dessus n'a été mentionnée qu'à titre illustratif. La description détaillée ci-dessus des propriétés physiques et chimiques des caractéristiques mycologiques de la monoglycéride lipase, l'identification et le nom des microorganismes à partir de laquelle la lipase est préparée correspon- dent à ce qui est décrit à la demande de brevet japonais No 80299/1987. Les lipases, à utiliser avec la monoglycéride lipase décrite ci-dessus pour la préparation du réactif suivant l'invention destiné à analyser les triglycérides, seront illustrées ci-dessous. On peut utiliser, suivant la présente invention, n'importe quelle lipase, pour autant qu'elles soient utilisées pour l'analyse quantitative des triglycérides et soient au moins capables de catalyser la réaction d'hydrolyse des triglycérides en diglycérides et en aci- des gras et celles des diglycérides en monoglycérides et en acides gras. Des exemples sont celles préparées à partir de microorganismes tels que Rhizopus delemar (ATCC 4858, ATCC 9374, ATCC 20134 et ATCC 24864), Rhizopus arrhizus (ATCC 10260, ATCC 24563 et ATCC 24865), Chromobacterium viscosum (ATCC 12472, ATCC 6918, NRRL B- 3673 et FERM P-137), Aspergillus niger (ATCC 10864, ATCC 1004 et ATCC 1018), Aspergillus flavus oryzae (ATCC 9376, ATCC 11495 et ATCC 12891), Candida lipolytica (ATCC 8661, ATCC 20287 et ATCC 20363), Candida cylindracea (ATCC 14830), Mucor miehei (ATCC 16457 et ATCC 26282) et Mucor pusillus (ATCC 16458 et ATCC 16459). On peut utiliser des lipases obtenues de sources animales, telles que du pancréas de boeuf. En outre, on peut utiliser des lipa- ses préparées à partir d'autres microorganismes connus et produisant des lipases, telles que celles préparées à partir de Pseudomonas [Y. Kosugi, J. Ferment. Technol., Vol. 49, 968-980 (1971)], Corynebacterium [K. Weaber, Appl. Microb., Vol. 21, 639-642 (1971)], Staphilococcus [J.A. Troller, Appl. Microb., Vol. 20, 480-484 (1970)], Propionibacterium [A. Oterholm, Appl. Microb., Vol. 20, 16-22 (1970)], Alcaligenes [Y. Kokusho, Agric. Biol. Chem., Vol. 46, No 5, 1159-1164 (1982)], etc. I1 y a de nombreuses publications sur la lipase produite à partir des microorganismes produisant de la lipase et apparte- nant à Pseumodonas telles que, par exemple, les publica- tions des brevets japonais Nos 7836/1966, 28516/1981, 28517/1981, 42312/1982, 42313/1982, 52835/1982 et 59753/1982. En outre, des enzymes dénommées cholestérol estérases ayant la même action que les lipases peuvent être utilisées à la place des lipases ci-dessus. Les lipases qui peuvent être utilisées dans la présente in- vention ne sont pas limitées à celles décrites ci-dessus et englobent d'autres lipases connues, ainsi que celles obtenues par un processus de génie génétique. Le procédé de mesure de l'activité des lipases est le suivant. Composition du mélange réactionnel (ml) Solution tampon au tris-HCl 0,2 M 0,2 (pH 7,5) Dilinoléoyl glycéride 27,5 mM 0,05 (Triton X-100 15 %) CaC12 50 mM 0,01 ATP 200 mM 0,005 CoASH 100 mM 0,005 Acyl-CoA,synthétase (50 U/ml) 0,01 Eau (quantité pour compléter à 0,5 r1 0,5 ml On fait subir à la solution, ayant la composition ci-dessus (0,5 ml) et placée dans un tube à essai, une pré-incubation à 37 C pendant 2 à 3 minutes, puis on y ajoute une solution d'enzyme (50 p1) contenant un tampon au PIPES 10 mM NaOH (pH 7,3) et de l'albumine sérique de boeuf. On laisse le mélange réagir à 37 C pendant 10 mi- nutes. On ajoute ensuite au mélange réactionnel successi- vement de la N-éthylmaléimide 10 mM (0,5 ml) et un réac- tif (R-2) ayant la composition suivante (0,5 ml) et on laisse réagir le mélange réactionnel à 37 C pendant 5 minutes. Ensuite, on interrompt la réaction en ajoutant du dodécylsulfate de sodium à 0,5 % (1,5 ml). Puis on analyse colorimétriquement le mélange réactionnel à une longueur d'onde de 550 nm. Une activité libérant l'acide linoléique en une quantité de 1 pmole par minute est considérée comme étant une unité (1 U). Composition du réactif R-2 (ml) Solution tampon au PIPES 0,2 M NaOH 0,05 (pH 7,3) 4-aminoantipyrine à 0,3 % 0,05 TOOS 0,3 % 0,05 Peroxydase (45 U/ml) 0,05 Composition du réactif R-2 (suite) (ml) AcylCoA,oxydase (500 U/ml) 0,02 ATP 0,2 M 0,01 Eau 0,27 On peut utiliser les lipases et la monoglycéride lipase, utilisées pour la préparation du réactif d'ana- lyse des triglycérides, en une quantité suffisante pour effectuer suffisamment la réaction. Tout ce qui est né- cessaire est de déterminer les quantités qui dépendent, en particulier, de la teneur en le triglycéride à analy- ser. Habituellement, on peut utiliser la monoglycéride lipase en une quantité de 0,05 U/ml ou davantage et, de préférence, de 0,1 à 0,5 U/ml par essai et les lipases en une quantité de 50 à 1000 U/ml et, de préférence, de à 500 U/ml. On peut utiliser chacune des enzymes telle qu'elle est ou sous la forme d'une solution dans un tampon, ou sous une forme lyophilisée. Le réactif de dosage du glycérol est illustré par ce qui suit. Le réactif de dosage inclut les systèmes habi- tuels dans le dosage classique du glycérol, dans les- quels on utilise une enzyme agissant sur le glycérol pro- duit. On préfère un dosage qui utilise une glycérokinase- glycérophosphase oxydase, le glycéro-3-phosphate, formé à partir du glycérol en la présence d'ATP en utilisant la glycérokinase, étant oxydé par l'action de la glycéro- phosphate oxydase. En variante, on peut utiliser un dosa- ge utilisant une glycérol oxydase. Dans ces procédés, les paramètres du dosage sont l'eau oxygénée, qui est le pro- duit final de ces dosages, l'oxygène qui est consommé ou le dihydroxyacétone phosphate ou la dihydroxyacétone qui y est produite. C'est ainsi, par exemple, que dans le procédé à la glycérokinaseglycérophosphate oxydase, on ajoute, au glycérol produit à partir du triglycéride, de la glycérokinase (0,1 à 2 U/ml), de la glycérophosphate oxydase (3 à 30 U/ml), de l'ATP (1 à 10 mM) et un sel en- gendrant des ions magnésium, tel que du chlorure de magné- sium (1 à 10 mM) qui augmente l'activité enzymatique de la glycérokinase, ce qui produit de l'eau oxygénée et du dihydroxyacétone phosphate par consommation de l'oxygène. Puis on dose l'oxygène consommé au moyen d'électrodes à oxygène ou d'un dispositif de mesure de l'oxygène dissous. En variante, on dose le dihydroxyacétone phosphate pro- duit d'une manière classique [Method of Enzymatic Analysis, Vol. 3, 1314 à 1319]. On peut effectuer le dosa- ge de l'eau oxygénée produite par un procédé électrochi- mnique en utilisant des électrodes à l'eau oxygénée. En variante, on soumet l'eau oxygénée produite à une réac- tion sur de la peroxydase, de la 4-aminoantipyrine et un réactif coloré tels que des composés phénoliques ayant la formule (I) suivante ou des composés d'aniline ayant la formule (II) suivante, puis on détermine la substance colorée obtenue (publication de brevet japonais numéro 3480/1985). Z Y X OH (I) dans laquelle X est un halogène, Y est l'hydrogène, un halogène, un groupe alcoyle inférieur ou un groupe alcoxy inférieur, et Z est l'hydrogène ou un groupe sulfonyle ou' un groupe carbonyle, R1 \R3 dans laquelle R1 est l'hydrogène ou un groupe alcoyle inférieur ou un groupe alcoxy inférieur, et R2 et R3 sont chacun un groupe alcoyle inférieur, un groupe alcoxy inférieur, un groupe alcoyle inférieur contenant un acétylamide ou un groupe alcoyle inférieur contenant un groupe sulfo. Des exemples des composés phénoliques ayant la formule (I) sont le pchlorophénol, le p-bromophénol, le 2,4-dichlorophénol, le 2,4-dibromophénol et le 2,4-dichlo- rophénolsulfonate. Des exemples des composés d'aniline ayant la formule (II) sont la diéthylaniline, la N,N- diéthyl-m-toluidine, la m-méthoxy-N,N-diméthylaniline, la N-éthyl-N(3méthylphényl)-N-acétyl-éthylènediamine, la N-éthyl-N-(3-sulfopropyl)-m-toluidine sodiaue, la N- éthyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-diméthoxy-aniline sodique. Un autre dosage de l'eau oxygénée consiste à uti- liser une composition indicatrice capable de former un produit décelable par une réaction sur l'eau oxygénée. La composition indicatrice peut être une composition susceptible de virer de coloration en la présence d'eau oxygénée. Elle englobe au moins un réactif coloré, un réactif de fluorescence ou un réactif de luminescence. Comme réactifs colorés qui donnent un changement de colo- ration dans le domaine visible, on utilise un mélange contenant une substance ayant une action peroxydase et un précurseur d'agent colorant. La peroxydase, qui pro- vient du raifort sauvage, est utilisée habituellement comme substance ayant une action peroxydase. On utilise habituellement comme précurseur de l'agent colorant une association de 4-aminoantipyrine et du composé phénoli- que de formule (I). Mais on peut également utiliser com- me précurseur de l'agent colorant une association de 4- aminoantipyrine et du composé d'aniline de formule (II). C'est ainsi, par exemple, qu'il existe un dosage de l'eau oxygénée dans lequel on peut mesurer, par l'inten- sité de coloration, une quantité de matière colorée pré- parée par réaction entre la 4-aminoantipyrine, la-per- oxydase et la N-éthyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)m-tolui- dine (TOOS). Il existe des dosages en vue de mesurer une quantité de la matière colorée par l'intensité de colora- tion, cette matière étant produite par une réaction en- tre la diéthylaniline ou la diméthylaniline et la 3- méthyl-2-benzothiazolinonehydrazone, ou par une réaction entre du xylénol orange et un composé de titane tétra- valent susceptible de produire une substance rouge sta- ble avec de l'eau oxygénée. En outre, il existe des dosa- ges dans lesquels on utilise comme peroxydase une asso- ciation de 2,6-dichlorophénol indophénol et de peroxyda- se, une association de résine de gayac et de peroxydase, etc. On peut utiliser ces indicateurs sous la forme d'une solution mixte préparée à l'avance, suivant les fins visées. Dans la réaction ci-dessus utilisant les compo- sés de phénol ou d'aniline, la 4-aminoantipyrine et la peroxydase on peut utiliser par exemple le phénol ou le TOOS en une quantité de 0,01 à 0,1 % environ, la 4-amino- antipyrine en une quantité de 0,01 à 0,05 % et, de préfé- rence, de 0,03 % et la peroxydase en une quantité de 3 à 30 U/ml et, de préférence, de 4 à 6 U/ml, par rapport au mélange réactionnel total respectivement. Au lieu des compositions de réactif coloré dé- crites ci-dessus, on peut utiliser d'autres réactifs dont la modification est dosée spectrophotométriquement, par exemple des réactifs de fluorescence tels que l'acide homo-vanillique susceptible de produire une fluo- rescence par exposition à un rayonnement ultraviolet, des réactifs de luminescence, etc. Dans le dosage o on utilise la glycérol oxydase, on fait réagir la glycérol oxydase-(5 à 50 U/ml) sur le glycérol produit par le triglycéride, en produisant de la dihydroxyacétone et de l'eau oxygénée, par consomma- tion de l'oxygène, puis on mesure l'oxygène consommé ou la dihydroacétone ou l'eau oxygénée produite. On préfère un dosage de l'eau oxygénée produite que l'on effectue en utilisant le même réactif que celui pour le dosage de l'eau oxygénée dans la méthode à la glycérokinase-glycé- rophosphate oxydase. Dans le cas du dosage de l'oxygène consommé, on peut utiliser, comme décrit ci-dessus, des électrodes à oxygène ou un dispositif de mesure de l'oxy- gène dissous. En outre on peut doser d'une manière connue, la dihydroxyacétone [Method of Enzymatic Analysis, Vol. 3, 1442 à 1445]. En outre, on peut effectuer le dosage quantita- tif du glycérol par les modes opératoires suivants. On utilise de la glycérophosphate déshydrogénase et du NAD à la place de la glycérophosphate oxydase mentionnée ci- dessus, en mesurant le NAD réduit en utilisant des réac- tifs connus. Un autre dosage consiste à soumettre le glycérol produit à une réaction sur 1'ATP et la glycéro- kinase, en mesurant l'ADP produit à partir de l'ATP par utilisation d'un réactif utilisé dans un procédé connu [Method of Enzymatic Analysis, Vol. 4, 2127 à 2129]. On peut utiliser, à cet effet, divers réactifs familiers au spécialiste pour des dosages du glycérol. Pour faciliter le dosage des triglycérides, on peut utiliser avec avantage des agents tensio-actifs non ioniques, des additifs pour augmenter la réaction de pro- duction du glycérol et des acides gras à partir des mono- glycérides et d'autres additifs pour augmenter les acti- vités de l'enzyme pour doser le glycérol produit. C'est ainsi, par exemple, que l'on peut utiliser du Triton-X- (produit de Rohm et Haas), comme agent tensio-actif non ionique, en une quantité de 0,05 à 1 %, du chlorure de magnésium comme agent pour augmenter la glycérokinase en une quantité de 1 à 10 mM et une solutiontampon au PIPES-NaOH comme agent pour maintenir le pH de la réac- tion à une valeur déterminée, par exemple entre 6 et 8 et, de préférence, à 7,3 à une concentration de 20 à 500 mM. On peut préparer le présent réactif d'analyse des triglycérides suivant l'invention en mélangeant les lipases et la monoglycéride lipase en même temps que des quantités données à l'avance d'additifs choisis correcte- ment parmi les divers additifs mentionnés ci-dessus, des enzymes pour le dosage du glycérol produit et, si on le souhaite, des indicateurs pour l'eau oxygénée produite. On peut utiliser le réactif suivant l'invention sous une forme qui convient pour une détection intégrée, par exemple sous la forme d'un réactif prêt à l'emploi, fa- briqué en appliquant le réactif en revêtement sur une pellicule solide. Dans l'analyse du triglycéride contenu dans une solution d'échantillon, on peut mesurer quantitativement les acides gras produits en même temps que le glycérol, au lieu du dosage décrit ci-dessus du glycérol qui est un constituant du monoglycéride. Dans ce cas on peut uti- liser, à la place du réactif de dosage du glycérol, un réactif de dosage d'un acide gras (brevet japonais publié sous le No 8797/1982). On peut utiliser n'importe quelle solution d'échantillon, pour autant qu'elle contient un triglycéride comme substrat des lipases. Des exemples sont les fluides de l'organisme et le sérum du sang. On peut utiliser habituellement la solution en une quantité de 0,01 à 5 ml pour l'analyse. La présente invention se déroule schématiquement de la manière suivante, par exemple dans le cas du système glycérokinase-glycérophos- phate oxydase: triglycéride + H20 monoglycéride + acide gras monoglycéride + H20 monoglycéride lipasee glycerol + acide gras glycérol glycérokinaseATP glycéro-3-phosphate + ADP glycéro-3-phosphate glycérophosphate oxydase,02 H202 + dihydroxyacétonephosphate. On fait incuber une solution d'échantillon conte- nant un triglycéride et une quantité donnée à l'avance du réactif d'analyse du triglycéride, puis on mesure les constituants consommés ou produits suivant la réaction ci-dessus. Quand le constituant mesuré est par exemple de l'oxygène, on effectue la mesure en utilisant des électrodes à oxygène ou des dispositifs de mesure de l'oxygène dissous. On n'a pas besoin d'indicateur de l'eau oxygénée. C'est ainsi que l'on effectue la mesure du dihydroxyacétonephosphate. Parmi les constituants à mesurer, on préfère l'eau oxygénée. La mesure de l'eau oxygénée s'effectue par colorimétrie, par fluorométrie ou par mesure de luminescence en utilisant un indicateur de l'eau oxygénée. En variante, on peut utiliser un dis- * positif à électrode de mesure de l'eau oxygénée, tel qu'un dispositif de mesure de l'oxydase fabriqué par YSI. On effectue la réaction entre le réactif suivant l'invention et la solution d'échantillon contenant du triglycéride pendant une durée déterminée à l'avance, à une température déterminée à l'avance, de p'éférence en- tre 25 et 40C, puis on mesure certains des constituants consommés et produits. Après avoir mesuré quantitativement l'oxygène consommé ou l'eau oxygénée produite par l'un quelconque des procédés décrits ci-dessus, on calcule quantitative- ment le triglycéride en utilisant la courbe correspondan- te d'étalonnage. Pour la mesure quantitative de l'eau oxygénée en utilisant l'indicateur, on mesure l'absor- bance à une longueur d'onde qui convient pour la colori- métrie en utilisant cet indicateur, telle que par exemple à 600 nm ou à celle qui convient pour la fluorométrie. L'invention vise un réactif d'analyse des tri- glycérides comprenant des lipases et la monoglycéride lipase et on peut effectuer divers procédés analytiques d'une manière efficace en utilisant ce réactif. C'est ainsi, par exemple que, dans le domaine du diagnostic clinique, o il faut effectuer une analyse des triglycé- rides en utilisant des instruments d'analyse automatiques, il est possible d'effectuer l'analyse avec une précision excellente en peu de temps, même pour un échantillon con- tenant des triglycérides en une concentration élevée. Les exemples suivants illustrent l'invention. Exemple 1 Composition d'un réactif d'analyse des triglycé- rides contenues dans le sérum du sang. PIPES-NaOH pH 7,3 100 mM (autres divers tampons qui conviennent) ATP 5 mM MgC12 2 mM 2 m Glycérokinase 0,7 U/ml Glycérophosphate oxydase 5,0 U/ml Peroxydase 5,0 U/ml Agent tensio-actif non ionique 0,2 % (Triton X-100) Lipase 233 U/ml Monoglycéride lipase 0,15 U/ml 4-aminoantipyrine 0,03 % DAOS:: 0,03 % ::DAOS: 3,5-diméthoxy-N-éthyl-N-(2-hydroxy-3- sulfopropyl)-aniline. On ajoute 20 p1 de sérum du sang servant de solu- tion d'échantillon chaque fois à 3,0 ml de réactif res- pectif d'analyse de triglycéride ayant la composition ci- dessus (teneur en lipase: 300 U/ml), avec ou sans mono- glycéride lipase (0,2 U/ml), et on laisse réagir chaque mélange à 37 C. On mesure l'absorbance à 600-nm en fonc- tion du temps. Comme le montre la figure 1, dans le cas o l'on n'ajoute pas de monoglycéride lipase (-O-) l'arrêt de la réaction n'est pas net, mais il semble avoir lieu 3,5 minutes environ après, tandis que, dans le cas de l'addition de 0,2 U/ml de monoglycéride lipase (* -), la réaction atteint l'équilibre et s'achève en 2 minutes. Exemple 2 On ajoute chaque fois 20 p1 d'un sérum du sang servant de solution d'échantillon à 3,0 ml de réactif respectif d'analyse des triglycérides avant la composi- tion ci-dessus (teneur en lipase de 233 U/ml) et conte- nant de la monoglycéride lipase en des quantités variant de O à 0,2 U/ml et on laisse réagir chaque mélange à 37 C. On mesure la durée nécessaire pour que la réaction colorée soit complète. Comme l'indique la figure 8 (-O -), l'effet de raccourcissement de la durée de réaction ne change plus dès que l'on ajoute de la monoglycéride lipase en une quantité de 0,05 U/ml ou davantage et, de préférence, de 0,1 U/ml. Exemple 3 On ajoute chaque fois 20 pl d'une solution diluée d'un sérum de graisse très neutre, à des réactifs respec- tifs d'analyse des triglycérides ayant la composition ci-dessus (teneur en lipase: 300 U/ml) et ne contenant pas de monoglycéride lipase (- -) indiqué à la figure 9) ou contenant 0,2 U/ml de monoglycéride lipase (-0-) représenté à la figure 9) et on laisse réagir chaque 263 0 129 mélange à 37 C pendant 3 minutes. On mesure l'absorbance à 600 nm. Comme le montre la figure 9, les résultats révè- lent que le triglycéride est mesuré linéairement jusqu'à 1500 mg/dl, dans le cas o on utilise le réactif conte- nant 0,2 U/ml de monoglycéride lipase. REVENDICATIONS 1. Réactif d'analyse des triglycérides, caracté- risé en ce qu'il comprend des lipases et des monoglycé- ride lipases. 2. Réactif suivant la revendication 1, caracté- risé en ce que la monoglycéride lipase est capable de catalyser une réaction enzymatique représentée par l'équation réactionnelle suivante, et capable d'agir sur un monoglycéride avec une spécificité au substrat, l'équation réactionnelle étant monoglycéride + H20 ± glycérol + acide gras. 3. Réactif suivant la revendication 1, caracté- risé en ce que la monoglycéride lipase est une enzyme obtenue à partir de microorganismes produisant une mono- glycéride lipase et appartenant au genre Bacillus. 4. Réactif d'analyse des triglycérides, caracté- risé en ce qu'il comprend des lipases, des monoglycéride lipases et des réactifs de dosage du glycérol. 5. Réactif suivant la revendication 4, caracté- risé en ce que le réactif de dosage du glycérol contient de la glycérol oxydase ou une association de glycérokina- se, de glycérophosphate oxydase et d'adénosine triphos- phate (ATP). 6. Réactif suivant la revendication 4, caracté- 26O0129 risé en ce que le réactif de dosage du glycérol-contient au moins un indicateur susceptible de changer de colora- tion, en la présence d'eau oxygénée qui est le produit final dans le dosage du glycérol. 7. Réactif suivant la revendication 6, caracté- risé en ce que les indicateurs sont des réactifs colorés, des réactifs de fluorescence ou des réactifs de lumines- cence. 8. Réactif suivant la revendication 7, caracté- risé en ce que les réactifs colorés contiennent de la 4- aminoantipyrine, de la N-éthyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopro- pyl)-m-toluidine, du phénol et de la peroxydase. 9. Procédé d'analyse de triglycéride en mettant une lipase en contact avec une solution d'échantillon contenant un triglycéride, et en mesurant le glycérol libéré ou l'acide gras libéré, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre un système contenant une monoglycéride lipase en contact avec la solution de l'échantillon, puis à mesurer un constituant consommé ou produit dans la réaction pour mesurer le glycérol ou les acides gras. 10. Procédé suivant la revendication 9, caracté- risé en ce que le système contenant une monoglycéride lipase est capable de catalyser une réaction enzymatique représentée par l'équation réactionnelle suivante, et est capable d'agir sur un monoglycéride avec une spéci- ficité au substrat, l'équation réactionnelle étant monoglycéride + H20 C glycérol + acide gras. 11. Procédé suivant la revendication 9, caracté- risé en ce que la monoglycéride lipase est une enzyme obtenue à partir de microorganismes produisant une mono- glycéride lipase et appartenant au genre Bacillus. 12. Procédé suivant la revendication 9, caracté- risé en ce que le système contenant une monoglycéride lipase contient en outre des lipases. 13. Procédé suivant la revendication 12, caracté- risé en ce que le système contenant une monoglycéride lipase et des lipases contient en outre des réactifs de dosage du glycérol.