FR 2632307 A1 19891208 FR 8807355 A 19880602 Nouveaux dérivés de tétrahydro-2,3.6,7,1H.5H,11H- (1)benzopyrano(6,7,8.ii)quinolizinone-11 utilisables comme marqueurs de composés organiques en vue de la détection de ces composés par chimiluminescen- ce ou fluorescence. La présente invention concerne de nouveaux marqueurs, utilisables en particulier pour le marquage de composés organiques comportant des groupements -NH-, -NH2, -CHO, -COOH ou -CO-, en vue de la détection de ces composés par chimilumi- nescence ou fluorescence dans des procédés de dosages tels que les dosages par chromatographie liquide. On sait que le dosage par chromatographie liquide d'amines, d'aldéhydes, de cétones ou d'acides dépourvus de propriétés spectrales nécessi- te, pour atteindre une grande sensibilité, de transformer ces composés à l'aide de réactifs marqueurs pour - leur conférer des prophiétés d'absorption, de fluorescence ou de chimilumines-cen- ce. L'utilisation de marqueurs de ce type pour la détection de dérivés carboxyliques ou d'amines est décrite en particulier par H. Cisse, R. Farinotti, S. Kirkiacharian et A. Dauphin dans Journal of Chromatography, 225(1981), p. 509-515; par M. Tsitini Tsamis, A.M. Mange, R. Farinotti et G. Mahuzier dans Journal of Chromatography 277(1983), p. 61-69; par N. Kubab, R. Farinotti et G. Mahuzier dans Analusis, 1986, v.14, n 3, p. 125130; et par D. Amir et E. Haas dans Int. J. Peptide Protein Res. 26(1986), p. 7-17. Dans les procédés de dosage par chromato- graphie liquide,on recherche en particulier des marqueurs chimiluminescents car l'analyse par chimiluminescence est en plein développement et permet d'améliorer la sensibilité du dosage. En effet, les méthodes par chimiluminescence permettent d'atteindre une limite de détection de l'ordre de la femtomole, alors que, dans les méthodes par spectrofluorimétrie, la limite de détection atteinte est couramment de l'ordre de quelques centaines de femtomoles. Une méthode de détection par chimilumines- cence en chromatographie en phase liquide est décrite en particulier par M. Tod, R. Farinotti et G. Mahuzier dans "Analusis, 1986, v.14, n 6, p. 271-280". Les marqueurs chimiluminescents actuellement utilisés tels que l'ortophtalaldéhyde, la fluorescamine et les dérivés anthracéniques et dansylés, présentent certains inconvénients. Ainsi l'orthophtalaldéhyde et la fluorescamine sont peu sensibles. Les dérivés anthracéniques sont inhibés par l'oxygène dissous et les dérivés dansylés sont inhibés par certains produits de la réaction d'excitation. De plus, certains de ces marqueurs chimiluminescents présentent une toxicité non négligeable, c'est le cas en particu- lier des dérivés anthracéniques et des dérivés dansylés. A la suite de recherches récentes, on a découvert que des noyaux coumariniques présentaient un certain intérêt car ce sont des composés ayant une sensibilité équivalente aux produits les plus performants, qui ne présentent ni toxicité, ni sensibilité vis-à-vis des inhibiteurs usuels tels que l'oxygène dissous, les halogénures et les dérivés nitrés. Par ailleurs, ils sont faciles à mettre en oeuvre dans des condi- tions d'excitation et de chromatographie variées. La présente invention a précisément pour objet de nouveaux dérivés coumariniques qui sont des dérivés de tétrahydro-2,3,6,7,1H,5H,11H- (1)benzopyrano(6,7,8.ij)quinolizinone-11 répondant à la formule: o (I) dans laquelle R1 représente le radical de formule: 2(NH)m-(CH2)n{ C1- 0-N 0m dans laquelle m est égal à 0 ou à 1, et n est égaL à 0 ou est un nombre entier allant de I à 12 à condi- tion que n soit égal à 0 lorsque m est égal à ACI, ou le radical de formule: -NH-(CH2)n-NH2 dans laquelle n à la signification donnée ci-dessus. Dans ces nouveaux dérivés, l'utilisation du noyau coumarinique de formule: i0 permet d'obtenir des propriétés de fluorescence et de chimiluminescence améliorées; par ailleurs, le choix d'un groupement -CO- R1 approprié fixé sur ce noyau coumarinique, permet d'obtenir des mar- queurs susceptibles d'être utilisés pour un grand nombre de composés organiques. Ainsi, les nouveaux dérivés de l'invention ont l'avantage d'avoir une bonne sensibilité, de pouvoir être utilisés comme marqueurs pour différents composés, d'être utilisables en phase normale ou inversée, de ne pas être inhibés par les quenchers usuels tels que l'oxygène dissous, les halogénures et les nitrates, de ne pas présenter de toxicité et de réagir rapidement avec les composés à marquer dans des conditions relativement douces. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, Le radical R1 représente le radical: 0 350- Ce dérivé est la tétrahydro-2,3,6,7,1H,SH,11H(1)-benzopyrano(6,7,8- ij) succinimidoxycarbonylméthyl-9 quinolizinone- 11, dénommée ci-après luminarine-1, qui répond à la formule: 0o H2 --C--O--N.. peut réagir avec les composés comportant des fonc- tions amine primaire ou secondaire, et le dérivé formé après cette réaction peut être chromatographié en phase liquide et détecté par absorptiométrie, par fluorimétrie ou par chimiluminescence. Dans ce dernier cas qui correspond à la sensibilité maximale, La réaction d'excitation peut utiliser un ester oxalique et du peroxyde d'hydrogène qui forment le peroxyoxalate, intermédiaire réactionnel à haute énergie, qui transfère son énergie au dérivé de formule (II) qui se désexcite en émettant de la Lumière. Ce dosage par chimiluminescence peut être appliqué à des moLécules d'intérêt bichi- mique ou pharmacologique en vue d'études de métabo- lisme ou de pharmacocinétique, notamment aux dosages des acides aminés, des amines biogènes du type histamine, des neuromédiateurs du type catéchoLami- - ne, des polypeptides hormonaux et des métabolites des phénothiazines, des imipraminiques etc. Ce dérivé de formule (II) trouve donc de nombreuses utilisations. Selon un second mode de réalisation de l'invention, R1 représente le radical de formule: Es Il NH -(CH2)5-C-0-N Dans ce cas, le dérivé coumarinique répond à la formule: 0l -Ha C - NH - (CH2)5-C-0- Ce dérivé dénommé ci-après luminarine- 2, peut réagir comme la luminarine-1 avec des composés comportant des fonctions amine primaire ou secondaire. Le dérivé formé peut être chromatographié et détecté par absorptiométrie, fluorimétrie, ou chimiluminescence. Ainsi, on peut utiliser la luminarine-2 pour le dosage des amines biogènes du type histamine et hydroxyéthyl histamine en milieu aqueux. Selon un troisième mode de réalisation de l'invention, R1 représente le radical de formule -NH-NH2. Ce dérivé coumarinique, dénommé ci-après luminarine-3, répond à la formule: 2-C-NH - NH2 W 4(IV) Il peut réagir avec les cétones et les aldéhydes et peut de ce fait être utilisé pour le dosage des stéroides en milieu polaire, par exemple en milieu hydroalcoolique. Selon un quatrième mode de réalisation de l'invention, le radical R1 répond à la formule: -NH-(CH2)4-NH2 Le dérivé coumarinique correspondant dénommé ci- apres luminarine-4, répond à la formule: O H C-NH -(CH2)4- NH2 (V) Ce dérivé peut réagir avec Les acides carboxyliques (ou lesanhydrides correspondants) et il convient de ce fait à la détection des acides en milieu polaire, par exemple en milieu alcoolique. A titre d'exemple, on peut l'utiliser pour le dosage de l'acide méthylimidazolacétique. Les nouveaux dérivés coumariniques de L'invention peuvent être préparés par des procédés classiques. Ainsi, on peut préparer le dérivé de formule (II) par un procédé comprenant les étapes successives suivantes: 1 ) faire réagir la 8-hydroxyjulolidine de formule: OH H (VI) avec un ester alkylique de l'acide oxo-3-glutarique de formule R2COO-CH2-C-CH2-COOR2 Il o dans laquelle R2 est un radical alkyLe, pour former un composé de formule: CH2-COO R2 C (VII) ) hydrolyser l'ester alkylique de formule (VII) obtenu précédemment pour obtenir l'acide de formule: COOH (VIII) 3 ) faire réagir l'acide de formule(VIII) ainsi obtenu avec l'oxalate de dihydroxysuccinimide de formule: 0 0 | NO-CO-COON - (IX) Dans ce procédé, la première étape peut être effectuée en portant au reflux sous agitation la 8-hydroxyjulolidine avec l'ester alkylique de l'acide oxo-3-glutarique, en présence de chlorure de zinc anhydre, et en solution alcoolique. Le composé de formule (VII) obtenu peut être séparé par extraction au moyen d'un solvant organique tel que l'acétate d'éthyle. Dans la deuxième étape du procédé, on peut réaliser l'hydrolyse de l'ester alkylique de formule (VII) par une solution aqueuse de soude dans une solution alcoolique constituée par exemple de méthanol. La troisième étape du procédé peut être réalisée par exemple en faisant réagir l'acide de formule (VIII) avec l'oxalate de dihydroxysucci-- nimide dans un solvant organique anhydre, en présen- ce de triéthylamine anhydre.Dans ces conditions, on peut obtenir le dérivé coumarinique de formule (II) avec un degré de pureté élevé, d'environ %. Les dérivés coumariniques répondant à la formule 0 H2 C R3 (X) dans laquelle R3 représente le radical de formule o35o -NH35CHz)n1- dans LaqueLLe n est un nombre entier allant de 1 à 12, peuvent être préparés par un procédé comprenant les étapes successives suivantes: a) faire réagir le composé de formule: O O il(l H2 -_O-N 9(I avec un aminocarboxyLate d'alkyle de formulp: 2HN-(CH2)n- C OR4 dans laquelle R4 est un radical alkyle de 1 à 4 atomes de carbone et n a la signification donnée ci-dessus,pour former un composé de formule: o il 1. 4100 H2--C- NH- (CH2)n-C OR 2o4 (XIII) b) hydrolyser l'ester de formule (XIII) obtenu, pour former l'acide de formule: 0 H.--NH- (CH2)nC m oH (xiv)OH W ONOO N (XV) 2) l'oxalate de dihydroxysuccinimide, ou 3) L'hydroxysuccinimide en présence de dicyclohexyL- carbodiimide. A titre d'exemple, lorsque n est égal à 5, on peut faire réagir la luminarine-1 de formule (II) avec L'amino-6 hexanoate de méthyle, puis hydrolyser l'ester obtenu en acide et transformer l'acide en ester d'hydroxy succinimide par action de carbonate ou d'oxalate d'hydroxysuccinimide, ou par action d'hydroxysuccinimide en présence de dicycLohexylcarbodiimide. Les dérivés coumariniques répondant à la formule (X) dans Laquelle R3 est le radical de formule -NH-(CH2)n-NH2 dans laquelle n est un nombre entier allant de I à 12, peuvent être préparés par un procédé consistant à faire réagir le composé de formule: 3I :H --C--O- avec un diaminoalcane de formule 2HN-(CH2) n-NH2 dans laquelle n a la signification donnée ci-dessus. A titre d'exemple, lorsque n est égal à 4, on peut faire réagir l'ester méthylique de formule (VII) sur la butane diamine-1,4. Le dérivé coumarinique répondant à la formule: Il CH2-C-NH-NH2 2O (IV) peut être préparé par le procédé comprenant les étapes successives suivantes: 1 ) faire réagir la 8-hydroxyjulolidine de formule: Nlc OH (VI) avec un ester alkylique de l'acide oxo-3-glutarique de formule: R2COO-CH2-C-CH2-COOR2 I0 o dans laquelle R2 est un radical alkyle, pour former un composé de formule: t \ -oo R2 (Vii) 2 ) faire réagir l'ester alkylique de formule (VII) ainsi obtenu avec l'hydrate d'hydrazi- ne 2HN-NH2, H20. L'ester de formule (VII) peut être en particulier l'ester méthylique. Dans les procédés décrits ci-dessus pour la préparation de dérivés coumariniques de formule (II) ou de formule (X), l'ester alkyLique de l'acide oxo-3-glutarique est un ester dans Lequel le groupe alkyle a de préférence de I à 2 atomes de carbone. A titre d'exemples, on peut utiliser l'ester éthylique. Les produits de départ utilisés dans ces différents modes de préparation des dérivés coumariniques de l'invention sont des produits du commerce ou peuvent être préparés par des procé- dés classiques à partir de produits du commerce. Comme on l'a indiqué précédemment, Les dérivés coumariniques de l'invention peuvent réagir avec différents composés organiques, par exemple des amines dans le cas de La luminarine-1 et de luminarine-2, des aldéhydes et des cétones dans le cas de la luminarine-3, et des acides carboxyli- ques dans le cas de la luminarine-4. Aussi, ces dérivés coumariniques peuvent être utilisés comme marqueurs de composés organiques comportant des fonctions amine primaire ou secondai- re, aldéhyde, cétone, ou acide carboxylique, et servir à la détection de ces composés dans des méthodes de dosage par chromatographie en phase liquide. La détection peut être effectuée par absorptiométrie, fluorimétrie ou chimiluminescence, en utilisant les méthodes classiques telles que celles décrites par M.Tsitini Tsamis et aL dans Journal of chromatography, 277,(1983), 61-69; par D. Amir et E. Haas dans Int. J. Peptide Protein Res. 26, 1986, p.7-17; par H. Cisse et aL dans Journal of Chromatography, 225, (1981), p. 509-515 et par M. Tod et aI dans Analusis, 1986, v14, n 6 p. 271-280. Aussi, l'invention a également pour objet un procédé de détection d'un composé compor- tant une fonction amine primaire ou secondaire par chromatographie en phase liquide, qui consiste à faire réagir le composé à détecter avec un dérivé répondant à la formule: o0 Il CH2--C- R1 dans laquelle R1 représente le radical de formule: -(NH)M-(CH2)n-. C ON dans laquelle m=O ou 1 et n=O ou est un nombre entier allant de 1 à 12 à condition que n=O Lorsque m=O, pour former un dérivé du composé à détecter, à réaliser ensuite une séparation de ce dérivé par chromatographie en phase liquide et à détecter ensuite ce dérivé par absorptiométrie, fluorimétrie, ou chimiluminescence. De préférence, on réalise la détection par chimiluminescence en utilisant un ester oxalique et du peroxyde d'hydrogène. A titre d'exemple, l'ester oxalique peut être le bis-(trichloro-2,4,6 phényl)oxalate (TCPO)ou le bis-(dinitro-2,4 phényl)oxalate (DNPO). L'invention sera mieux comprise à la lecture des exemples suivants, donnés bien entendu à titre illustratif et non limitatif, en référence au dessin annexé sur lequel: - la figure 1 représente le spectre de masse de la luminarine-1, - La figure 2 représente le spectre en résonance magnétique nucléaire du proton de la luminarine-1, - la figure 3 représente le spectre infrarouge de la luminarine-1, - la figure 4 représente le spectre de masse du dérivé obtenu par réaction de la penty- lamine avec la luminarine-1, - la figure 5 représente le spectre de masse du dérivé obtenu par réaction de la dipro- pylamine avec la luminarine-1, - la figure 6 représente le spectre- de masse de la luminarine-2, - la figure 7 représente le spectre de masse de la luminarine-3, - la figure 8 représente Le spectre en résonance magnétique nucléaire du proton de la luminarine-3, - la figure 9 représente le spectre de masse de la luminarine-4, et - la figure 10 représente le spectre en résonance magnétique nucléaire du proton de la luminarine-4. ExemDle 1: Synthèse de la luminarine-1 répondant à la formule: 1 5 Ha --C - -O- ( II) a) préparation du composé de formule (VII) avec R2 représentant le radical éthyle. La réaction effectuée ici correspond au schéma réactionnel suivant: 1 7 CH2-COOC, H OH (VI) (i + O COOC2HS CH2--COO R2 0( VII) On introduit dans un récipient 2,12g de 8-hydroxyjulolidine, 2,22g d'ester éthylique de l'acide oxo-3-glutarique, 1,71g de chlorure de zinc anhydre et 6ml d'éthanoL anhydre, et on porte au reflux pendant 24h, sous agitation à l'abri de l'humidité. Après refroidissement, on introduit La solution dans 200ml d'eau, puis on extrait par 200ml, puis 100mL d'acétate d'éthyle. On lave la phase organique à l'eau, on la sèche sur sulfate de magnésium et on la concentre à sec. On recristallise ensuite dans 5 parties d'acé- tate d'éthyle. On obtient ainsi l'ester éthylique de formule (VII) avec un rendement de 56%. b) Hydrolyse de l'ester éthylique de formule (VII) obtenu Drécédemment. On introduit dans un récipient 2g de l'ester éthylique obtenu précédemment avec 42ml d'une solution aqueuse de NaOH à 1,2% P/V et 40ml de méthanol, puis on porte à 45 C pendant une heure. Après refroidissement, on extrait le milieu !632307 réactionnel par 50mL, puis 40mL de chLoroforme. Après dégazage, on acidifie La phase aqueuse avec 16mL d'acide chlorhydrique 3N, puis on maintient le mélange réactionnel sous agitation pendant 15min. On ajuste alors le pH à 6,5 avec 13ml de soude 2,5N. On filtre alors le précipité formé, on le rince à l'eau et on le sèche. On obtient ainsi l'acide de formule (VIII) avec un rendement de 90%. c) Obtention de la luminarine-1. Dans cette troisième étape, on fait réagir l'acide de formule (VIII) obtenu dans l'étape précédente avec l'oxalate de dihydroxysuccinimide selon le schéma réactionnel suivant: H- COOH 0 0 202 -1 H2-o- 1 + - On introduit dans un récipient 1',5g de l'acide de formule (VIII), 2,13g d'oxalate de dihydroxysuccinimide, 0,51g de triéthylamine anhydre et 220ml d'acétonitrile anhydre. On main- tient le mélange sous agitation, à l'abri de l'humi- dité, pendant une heure à la température ambiante, puis pendant une heure -à une température de 35-40 C. On filtre alors un léger insoluble, puis on concen- tre sous vide et on purifie par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme solvant d'élu- tion le mélange dichLorométhane / tétrahydrofuranne (THF) avec un rapport en volume de 1/1. On concentre les fractions 11 à 14, et l'on obtient ainsi la- luminarine-1 avec un rendement de 21%. On vérifie la structure de la luminarine-1 par les méthodes suivantes: - - 1) détermination de la formule brute: C21 H2006N2 C R N O0 CalcuLé 0,64 0,051 0,071 0,24 Trouvé 0,635 0,051 0,070 0,24 - 2) Spectrométrie de masse en impact électronique à 70eV avec introduction directe. Le spectre obtenu est représenté sur la figure 1, et on y trouve le pic moléculaire à 396 et les principaux fragments à 298, 282, 254 et 226, ce qui correspond à la structure suivante: H2 -N f I I I I I J/z * - ' - J396 M/z ' 98 m/z /n-l z 82 nM/z 354 m/z 226 - 3) Spectrométrie par résonance magnéti- que nucléaire (RMN). Le spectre RMN du proton de la luminarine-1 dans l'acétone deutérié est représenté sur la figure 2. Il correspond aux résultats sui- vants: DEPLACEMENT NATURE HAUTEUR ORIGINE (Ppm) 1,94 Multiplet 4 H CH2-CH2-N-CH2-CH2 2,78 Sextuplet 4 H CH2-N-CH2 2, 88 Singulet 4 H Succintmide 3.29 Multiplet 4 H CH2 en 6 et 8 4,18 Singulet 2H -CH2-HO 6,11 Singulet 1 H -C-H en 3 7,13 Singulet 1 H H en 5 -__-------____------- - 4) Spectrométrie infrarouge. Le spectre infrarouge de La luminarine-1 en pastille de KBr est représenté sur la figure 3. Il correspond aux résultats suivants: Nombre d'onde Transmission Origine cm-l 2. 2940 53 Val. asymétrique CH3 2840 58 Val symétrique CH3 1 0 1800 45 1770 34 Val. CO de succinimide 1730 3 Val. C-O de pyrone 1700 8 Val. C-O de l'ester 1590 11 1550 35 Val. C-C aromatique 1510 39 1420 32 1370 24 - 1 5 1310 23 Val. C-N aromatique 1260 54 Val. C-O-C pyrone 1200 20 1090 20 990.920 72 - Df C-H aromatique 840.,800.655 68,69.,68 On détermine également la pureté de la luminarine-1 par chromatographie liquide sous haute pression et - détection fluorimétrique. Cette pureté est de 90%. On observe par ailleurs que la principale impureté est constituée par l'acide de formule (VIII). Une analyse par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse permet d'identifier en plus de l'acide de formule (VIII), d'autres impuretés en petites quantités qui sont l'ester éthylique de formule (VII) et le produit de décarboxylation de l'acide de formule (VII). La luminarine-1 est une poudre jaune cristalline que l'on peut conserver en flacon brun à l'abri de la lumière, et que l'on peut mettre en solution dans Le tétrahydrofuranne, l'acétone ou le méthanol, sa solubilité dans ces solvants organiques étant d'environ lg/l. La stabilité d'une solution à 2.10-3mol/L de luminarine-1 dans le tétrahydrofuranne a été étudiée par chromatographie liquide sous haute pression et détection fluorimétrique. On constate ainsi que le produit en solution se dégrade de façon significative en quelques heures à la tempéra- ture ambiante par hydrolyse, avec formation de l'acide de formule (VIII). En revanche, la solution congelée se conserve au moins deux mois sans dégra- dation apparente. Exempte 2: Réaction de la luminarine-1 avec la pentylamine. Cette réaction correspond au schéma réactionnel suivant. oh O O H-C-0-N +C5 H 11 -NH 2 *O 0 -C- 5 H 5+ Ho- -(XHlI)H -- On fait réagir 4g de luminarine-1 avec 0,9g de pentylamine dans 2000ml de TH-F à 50%C pendant min. On obtient ainsi le dérivé de la pentylamine de formule (XI) avec un rendement de 97%. La struc- ture de ce dérivé a été confirmée par chromatogra- phie en phase gazeuse et spectrométrie de masse. La figure 4 représente le spectre de masse du dé-rivé de -La pentylamine et de la luminari- - ne de formule (XI). Exemple 3: Réaction de la luminarine-1 avec la dipropylamine. La réaction est effectuée comme dans l'exemple 2 en faisant réagir 4g de luminarine avec 0,9g de dipropylamine dans 2000ml de THF, à 80 C pendant 30min, en présence de pyridine comme catalyseur. On analyse le produit obtenu par chromatographie en phase gazeuse et spectromé- trie de masse. Le spectre de masse est représenté sur la figure 5 et confirme la structure correspon- dant à la formule ci-dessous ô C3H7 C3H 3 7 (XII) Exemple 4: Utilisation de la luminarine-1 pour détecter la pentylamine par chromatogra- phie en phase liquide. Dans cet exemple, on soumet à une chromatographie liquide le dérivé de la pentylamine obtenu dans l'exemple 2. L'installation de chromatographie liquide comprend une pompe Chromatem 380, un amortisseur de pulsations, un injecteur Rhéodyne de 20Pl, une colonne de silice et un détecteur fluorimétrique Schoeffel FS 970 avec un enregistreur Servotrace. Ce système est complété par un mélangeur post-colon- ne Kratos UFR 051 de 5001l et un four à colonne Shimadzu lorsqu'on réalise la détection par chimilu- minescence. On utilise comme phase stationnaire une colonne de silice greffée octadécyle licrosphè- re de 300x4,6mm avec une dimension moyenne des particules de 5pm. La phase liquide mobile est un mélange d'acétonitrile et d'eau avec un rapport en volume acétonitrile / eau de 70/30. On introduit cette phase liquide à un débit de lml/min et on y ajoute la luminarine-1 pure ou le dérivé de luminarine-1 et de pentylamine. On détecte les produits obtenus en sortie de colonne par fluorescence en réalisant l'excitation à 380nm et en détectant l'émission avec un filtre passe haut à 470nm. Dans ces conditions la luminarine-1 est détectée 3,2min après l'injection, ce qui correspond à un k' de 2,2, et le dérivé de luminari- ne-1 et de pentylamine est détecté 3,8min après l'injection, ce qui correspond à un k' de 2,8. Dans une deuxième expérience, on détecte les produits en sortie de colonne par chimilumines- cence en utilisant le bis(trichloro-2,4,6 phényl)- oxalate (TCPO) et H202. Dans ce cas, on utilise comme phase stationnaire une colonne de silice greffée octadécyLe 'Licrosphére de 150x4,6mm avec une dimension moyenne de particules de 3pm. La phase mobile est un mélange d'acétonitrile et de tampon imidazole-nitrate à pH 8 et à 10- 2mol/l, avec un rapport en volume acétonitrile/tampon de 70/30, et un débit de -mL/min. La réaction de chimiluminescence est effectuée en utilisant une solution à 10-2mol/l de TCPO dans de l'acétate de méthyle, à un débit de 0,25ml/min et une solution à 0,2moL/l de H202 dans -le tétrahydrofuranne, à un débit de 0,25ml/min. On utilise le même filtre passe haut à 470nm et un four de colonne maintenu à 30 0C. Dans ces conditions, le dérivé de pentyla- mine et de luminarine sort après 1,4min, ce qui correspond à un k' de 3,5. Dans une troisième expérience, on détecte les produits en sortie de colonne par chimilumines- cence en utilisant le DNPO et H202. Dans ce cas la phase soL-de utilisée est une colonne de silice de 150x4,6mm avec une dimension moyenne de particu- les de 5pm. La phase liquide mobile est un mélange de chloroforme, d'hexane, d'acétate de méthyle et d'acide acétique dans un rapport en volume de 66/17/17/0,1, avec un débit de 2mL/min. Pour la réaction de chimiluminescence, on utilise une solution à 0,4mol/l de H202 dans l'acétonitrile à un débit de 0,50mL/min et une solution à 0,006mol/L de bis-(dinitro-2,4 phényl)oxalate (DNPO) dans l'acétate de méthyle à un débit- de 0,17mL/min. La détection est réalisée avec le filtre passe-haut à 470nm. Dans ces conditions, le dérivé de pentyLa- mine et de luminarine sort à 2,4min, ce qui corres- pond à un k' de 3,0. P632307 On précise que la Limite de détection du dérivé de pentylamine et de luminarine en chroma- tographie liquide avec détection fluorimétrique est de 380fmol, et qu'elle est considérablement améliorée avec la détection par chimiluminescence o elle passe à 2fmol injectées, la réponse étant linéaire entre 2 et 500fmol injectées. A titre d'exemple, on donne dans le tableau I annexé, les résultats obtenus dans les mêmes conditions avec d'autres marqueurs chimilumi- nescents. Au vu de ce tableau 1, on constate que La limite de détection la plus faible est obtenue avec la luminarine-1 en chimiluminescence. ExéempLe 5: Synthèse de la luminarine-2 de formule: Il ' Na H C H- - (CH2) 5-C-0 (III) On part de la luminarine-1 (II) décrite dans l'exemple 1, et on réalise les étapes suivan- tes: a) action de l'aminohexanoate de méthyle sur la luminarine-1: La réaction correspond au schéma réaction- nel suivant: o H2-C-O-N C (CH2)5 - N2 - (II) NH- ( CH2) -c 1 0 CH3 On prépare de La Luminarine-1 (II)par action de 11,26g (0,0377 mol) d'acide (VIII), 3,81g de triéthylamine ('0,0377 mol) et 10,62g de di-NN' succinimidyle carbonate (0,0415 mol dans 560mL d'acétonitrile sec (solution A). On fait réagir 30g de carbonate de potas- sium sur une solution de 30g de chlorhydrate d'aminohexanoate de méthy(solution B); On filtre après 30 heures. On méLange Les solutions A et B et on agite durant 8 heures. On ajoute 20g d'éthanolamine et on agite une demi-heure. On filtre, lave à l'eau, sèche le soLvant et met à sec. Le résidu d'évaporation est purifié par chromatographie sur colonne de silice (solvant: CH2CI2, CH2Cl2-THF 85: 15, puis CH2CL2-THF 75-25). Les fractions enrichies sont recristaLlisées dans L'acétate d'éthyle. Rendement 5,76g (36%). b) Hydrolyse de l'ester éthylique (XIII) obtenu: à partir de 1,25g de l'ester (XIII), on obtient 0,76g de l'acide (XIV) en opérant exacte- ment comme dans l'exemple 1 b)(Rt: 63%). c) Obtention de la luminarine-2 (III), ester d'hydroxysuccinimide de l'acide (XIV): Il de M,-C-NH- (CH2) 5-C OH 1 0 -oc o- XIV) o 0 Il 1 5 + N 0 - c - 0 - N (XV -J ll On fait réagir, durant 6 heures, 0,750g d'acide (XIV), 0,912g de triéthylamine, 0,512g de carbonate de dihydroxysuccinimide (XV) dans 27ml d'acétonitrile. Apres filtration et évaporation, on purifie par chromatographie sur colonne de silice. (Solvant: CH2Cl2, CH2Cl2-THF 85: 15 puis CH2Cl2- THF 75: 25). Rendement des fractions pures: 175mg (19%). On obtient ainsi la luminarine-2 et l'on vérifie par spectrométrie de masse que sa structure correspond à la formule donnée ci-dessus. Le spectre de masse est représenté sur La figure 6 et confirme bien cette structure. ExempLe 6: Synthèse de La Luminarine-3 de formuLe: [à0 :H2 -C--NH-NH2 On part de L'ester (VII) (R2=CH3) décrit dans L'exemple 1. a) que L'on fait réagir sur L'hydrate d'hydrazine, selon Le schéma suivant: CH2-COO R2 + NH2-NH2; H20 - (VII) o I H2 -C-NH-NH2 (IV) On fait réagir durant 4 heures, sous agitation, 5g d'ester (VII) (15mmoles) et 8mL d'hydrazine (150mmoles), dans 100mL de méthanol. Après 4 heures, on filtre, rince avec 0lmL de méthanol, puis avec 0lmL de dichlorométhane. Rendement: 3,6g (77%) - On vérifie par spectrométrie de masse et par RMN que Le composé obtenu est bien la lumina- rine-3. Le spectre de masse est représenté sur la figure 7 et le spectre RMN sur la figure 8; ils confirment bien que le composé obtenu correspond à la formule (IV) donnée ci-dessus. Exemple 7: Synthèse de la luminarine-4 de formule: o l-- NH - (CH2)4- NH2 (V) On suit le même mode opératoire que dans l'exemple 5 (paragraphe a) sauf que l'on utilise la diamine de formule NH2-(CH2)4-NH2 au lieu de l'aminohexanoate de méthyle. On part directement de la luminarine-1 (II) purifiée que l'on fait réagir sur le diamino 1-4 butane selon le schéma réactionnel suivant: o Il ' H2-C-0- NI 2HN-(CH2)4-NH2 H.-C- NH - (CH2)4- NH2 N Dans un ballon d'un litre, on fait réagir 16,5g de luminarine-1 (II) (41, 6mmoles) et 18,3g de 1-4 diaminobutane (107mmoLes) dans 4nOmL de THF anhydre, sous agitation durant 24 heures. On filtre un insoLuble marron. On concentre à sec Les eaux mères; on reprend le résidu dans 100ml de dichlorométhane et on extrait par 5x100ml d'eau pour éliminer L'excès de 1-4 diaminobutane. On concentre le solvant à sec. Le résidu est mis sous agitation dans 25ml de dichlorométhane. Rendement: 10,6g (69%). On vérifie par spectrométrie de masse et RMN la structure du composé obtenu. Le spectre de masse est représenté sur La figure 9 et le spectre RMN sur la figure 10 et ils confirment bien que la structure du composé obtenu correspond à ta formule (V) donnée ci-dessus. Exemple 8. Pour mettre en évidence les propriétés améliorées des luminarines de l'invention,- on a effectué des mesures de fluorescence, d'absorbance et de chimiluminescence en utilisant comme fluoro- phore des coumarines de l'art antérieur qui sont la coumarine-1l, diméthylamino-7 méthyl-4 coumarine (DEMC) de formule: :M3 (C2H5)2 0 O et la coumarine-311 , diméthylamino-7 méthyl-4 coumarine (DMMC) de formule: H3 (CH3)2 pour les comparer avec La coumarine-102 ,tétrahydro- 2, 3, 5, 6, 7, 1H, 5H, 11H-(1)- benzopyrano (6, 7, 8- ij) méthyl-9 quinolizinone-11(TBMQ) qui est le noyau de base des dérivés de l'invention de formule: H Les mesures de fluorescence sont effec- tuées avec un spectrofluorimètre Perkin Elmer LS5 avec des largeurs de fentes de 2nm pour les deux monochromateurs. Les mesures d'absorbance sont effectuées avec un spectrophotomètre Jobin Yvon JY3. Les mesures de chimiluminescence sont obtenues en utilisant un spectrofluorimètre Jobin Yvon JY4 en utilisant des largeurs de fentes de lOnm. La cellule d'échantillons liquides est une cuvette de quartz de 10x10mm d'une capacité de 3ml remplie de 2ml de solution, ce qui correspond à un volume réel de solution exposée au photomultiplicateur de 1,35ml. Mesures de fluorescence et d'absorbance. tes mesures ont été effectuées à 20 + 2 C, et on a déterminé les rendements quantiques de fluorescence RF des coumarines-1, 311 et 102 par rapport au bisulfate de quinine dont le rende- ment quantique de fluorescence est de 0,546, en suivant la méthode de Parker décrite dans Analyst, ,(1960), p. 587, avec une solution de bisulfate de quinine à 2mg/l dans H2S04 0,1N. Pour les coumarines, on a utilisé une solution d'acétone et' d'acétate d'éthyle dans un rapport en volume 75/25 avec une concentration en coumarine de 10-6mol/[ en assurant dans chaque cas une absorbance inférieure à 0,05. Mesures de chimiLuminescence. Pour déterminer les rendements quantiques de chimiluminescence RC, on a estimé l'intensité en fonction du temps au maximum de l'émission. Lorsque la décroissance de l'intensité est assez basse, le spectre d'émission est tracé, puis l'in- tensité en fonction du temps est suivie- jusqu'à ce que l'intensité soit tombée à 2% de l'intensité maximale. Les autres paramètres de luminescence sont mesurés directement, il s'agit de l'intensité maximale (Imax), du temps pour atteindre l'intensité maximale (Tmax), et du temps pour atteindre La moitié de L'intensité maximale après le temps maximal (T1/2). Le rendement de chimiluminescence Rc est calcuLé en suivant la méthode de Rauhut décrite dans J. Am. Chem. Soc., 88, 15(1966), 3604. Le rendement d'excitation Rex est détermi- né à partir de la formule: RC = Rex x RF Pour les mesures de chimiLuminescence avec le TCPO, on ajoute à lml de la solution conte- nant 10-3mol/l de coumarine, 0,5mL d'une solution à 2.10-3moL/l de TCPO dans de L'acétate d'éthyLe, 0,5mL d'une solution à 2.10-2moL/l de H202 dans l'acétone et 10Vl d'un tampon imidazole nitrate, pH 7,5, à 0,1mol/l. Lorsqu'on utilise le DNPO, on ajoute à la même solution de coumarine dans l'acétone, 0,5ml d'une solution à 10-3mol/l de DNPO dans l'acétate d'éthyle et 0,5ml d'une solution à 10'2 mol/l de H202 dans de l'acétone. Les propriétés de fluorescence et d'absor- bance de ces coumarines sont données dans le tableau 2, et les résultats de chimiluminescence sont donnés dans le tableau 3. Au vu des tableaux 2 et 3, on remarque que le noyau coumarinique utilisé dans l'invention qui correspond à la coumarine 102, présente les meilleures propriétés de fluorescence, d'absorbance et de chimiluminescence. Dans le tableau 4, on a donné les résul- tats obtenus en ce qui concerne le rendement de chimiluminescence RC en utilisant TCPO et H202 en fonction de la concentration en coumarine-102, ainsi que les valeurs de Imax, Tmax et T1/2. Au vu de ces résultats, on constate que le rendement de chimiluminescence augmente avec la concentration en coumarine-102. Dans le tableau 5, on a donné les varia- tions du rendement de chimiluminescence, de Imax, de Tmax et de T1/2, en fonction du pH de la solution. Les résultats obtenus montrent que le rendement de chimiluminescence croit jusqu'à pH 6 et qu'il décroit ensuite. En revanche les valeurs de Tmax et de T1/2 décroissent lorsque le pH augmente au-delà de 5. L'intensité maximale augmente de façon impor- tante avec le pH. TABLEAU 1 Limite détection (f mol) Réactif Fluorescence Chimiluminescenc Inconvénients Luminarine-1 380 TCPO:2 DNPO: 1 Chlorure de dan- syle 100 TCPO: 10 Toxicité, phase DNPO: 5 i nversée uniquement Orthophta!al- déhyde 2100 TCPO: 94 Sensibilité faible Fluorescamine 500 TCPO: 25 Applications restreintes Amino butyl- éthyl isolumi-: nol --- 20 Durée de réaction: 4H Chlorure de nitro benzoxa- diazote 170 TCPO: 19 Sensibilité faible r. avec matériel usuel r'> TABLEAU 2 E S RF1 365 nm 103 COUMARINE-102 0,57 23 100 36 COUMARINE-1 0,55 38 000 57 COUMARINE-311 0,52 26 900 40 RF = rendement Quantique de fluorescence. = coefficient d'extinction moLéculaire S = sensibilité de fluorescence TABLEAU 3 DMPO TCPO R C RE RC RE 102E.mo11 10 0 2Emo 102 COUMARINE-102 0,26 0,45 0,37 0,65 COUMARINE-1 0,18 0,33 0,37 0,67 COUMARINE-311 0,13 0,24 0,17 0,32 RC = rendement quantique de chimiluminescence RE = rendement d'excitation DNPO = bis-(dinitro-2,4 phényl)oxalate TCPO = bis-(trichloro-2,4,6 phényl) oxalate. TABLEAU 4 (C102) RC x 104 I max Tmax T1/2 E. mol-1 E. mol-1 A.U. in min. 1.4 x 10-3 12,0 301 0,2 0,10 1.4 x 10-6 4,14 75 0,2 0,15 1.4 x 10-7 2,31 31 0,2 0,12 1.4 x 10-8 0,40 3,2 0,2 0,10 1.4 x 10-9 0,20 0,3 0,2 0,08 TABLEAU 5 pH Rc x 104 Imax Tmax T1/2 E. moL-1 A.U. min. min. 4 1,52 24 0,8 5,0 1,58 17 1,0 6,0 6 2,34 25 0,8 5,6 7 2,23 110 0,4 1,a 8 1,60 245 0,2 0,4 REVENDICATIONS 1. Dérivé de tétrahydro-2,3,6,7,1H,5H,11H- (1)benzopyrano (6,7,8-ij)quinolizinone, caractérisé en ce qu'il répond à la formule: i1 H2 -C- R 1 (I) dans laquelle R1 représente le radical de formule: -(NH)M-(CH2)n- Ct - X- 0m dans laquelle m est égal à 0 ou à 1, et n est égal à 0 ou est un nombre entier allant de 1 à 12 à condi- tion que n soit égal à 0 lorsque m est égal à 0, ou le radical de formule: -NH-(CH2)n-NH2 dans laquelle n à la signification donnée ci-dessus. 2. Dérivé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que R1 représernte le radical: O O -NH-(CH2)-C-0- 3. Dérivé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que R1 représente Le radical O 4. Dérivé selon La revendication'1, caracté- risé en ce que R1 représente Le radical -NH-NH2. 5. Dérivé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que R1 représente le radical -NH-(CH2)4- NH2 6. Procédé de préparation d'un dérivé de formule Il OH2 C-- O-- N | caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successi- ves suivantes: 1 ) faire réagir la 8-hydroxyjulolidifre de formule H (VI) 2632307 avec un ester alkylique de l'acide oxo-3-glutarique de formule R2COO-CH2-C-CH2-COOR2 O dans laquelle R2 est un radical alkyle, pour former un composé de formule: CH2-COO R2 (VII) 20) hydrolyser l'ester alkylique de formule (VII) obtenu précédemment pour obtenir l'acide de formule: CH2- COOH ' (VI II) ) faire réagir l'acide de formule (VIII) ainsi obtenu avec l'oxalate de dihydroxysuccinimide de formule 0 0 3OCO - COOCN ' IX 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'ester alkylique- de l'acide oxo-3-glutarique est l'ester éthylique. 8. Procédé de préparation d'un dérivé de tétrahydro-2,3,6,7,1H,5H,11H-(i1) benzopyrano(6,7,8- ij)quinolizinone-11 répondant à La formule: o Il - (X) dans laquelle R3 représente le radical de formule: 0e -NH-(CH2)n-C-0-- o dans laquelle n est un nombre entier allant de 1 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successi- ves suivantes: a) faire réagir le composé de formule: o 0 H C No- N o i(I) avec un aminocarboxylate d'alkyle de formule: 2HN-(CH2)n-COOR4 dans laquelle R4 est un radical alkyle de 1 à 4 atomes de carbone et n a la signification donnée ci-dessus pour former un composé de formule: Q (XIII) b) hydrolyser l'ester de formule (XIII) obtenu, pour former l'acide de formule: H2, -C-NH- (CH2) n-C OH (XIV) c) faire réagir l'acide de formule (XIV) ainsi obtenu avec 1) le carbonate de dihydroxysuccinimide de. formule: 0 0 0 (xv) N - O - C - 0 - N (XV) 2) l'oxalate de dihydroxy succinimide, ou 3) l'hydroxy succinimide en présence de dicyclohexyl- carbodiimide. 9. Procédé de préparation d'un dérivé de tétrahydro-2,3,6,7,1H,5H,11H-(1)benzopyrano(6,7,8- ij)quinolizinone-11 répondant à la formule: (X) dans laquelle R3 représente le radical de formule: -NH-(CH2)n-NH2 dans laqueLLe n est un nombre entier allant de 1 à 12, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir le composé de formule: o0 H2-C- N- h- avec un diamino alcane de formule: 2HN-(CH2) nNH2 dans laquelle n a la signification donnée ci-dessus. 10. Procédé de préparation d'un dérivé de tétrahydro-2,3,6,7,1H,5H,11H-(1) benzopyrano(6,7,8- ij)quinolizinone-11 répondant à la formule: oC BI H--C--NH - NH2 (IV) caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successi- ves suivantes: 1) faire réagir la 8-hydroxyjulolidine de formule: ( @I k OH (VI) avec un ester alkylique de l'acide oxo-3-glutarique de formule: R2COO-CH2-C-CH2-COOR2 Il dans laquelle R2 est un radical alkyle, pour former un composé de formule: CH2-CO0 R2 (VII) 2) faire réagir L'ester alkylique de formule (VII) ainsi obtenu avec L'hydrate d'hydrazine 2HN- NH2, H20 - 11. Procédé seLon la revendication 10, caractérisé en ce que l'ester alkylique de l'acide oxo-3-glutarique est l'ester éthylique. 12. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que R3 représente: C h - NH -(CH2)5 - C - 0 13. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que R3 représente: - NH - (CH2)4 - NH2 14. Procédé de détection d'un composé comportant une fonction amine primaire ou secondaire par chromatographie en phase liquide, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir Le composé à détecter avec un dérivérépondant à La formule: H2- C- R1 I) dans laquelle R1 représente le radical de formule: -(NH)m-(CH2)n-[C1- 0N 0 m u dans laquelle m=O ou 1 et n=0 ou est un nombre entier allant de 1 à 12, à condition que n=O lorsque m=O, pour former un dérivé du composé à détecter, à réali- ser ensuite une séparation de ce dérivé par chromato- graphie en phase liquide et à détecter ensuite ce dérivé par absorptiométrie, fluorimétrie, ou chimilu- minescence. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'on réalise la détection par chimiluminescence en utilisant un ester oxalique et du peroxyde d'hydrogène. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'ester oxalique est le bis- (trichloro-2,4,6 phényl)oxalate ou le bis-(dinitro- 2,4 phényl)oxalate.