FR 2624522 A1 19890616 FR 8717285 A 19871211 - 1 -_ 2624522 L'invention concerne une culture d'un nouveau micro-organisme du genre Klebsiella sp. ou de mutants de ce dernier, et un procédé de production d'un mélange d'oses à teneur élevée en rhamnose mettant en oeuvre cette culture. Il est connu que certains micro-organismes du genre Klebsiella peuvent produire, dans certaines condi- tions de croissance, des polysaccharides, notamment des exopolysaccharides, en une proportion de l'ordre de quel- ques dixièmes de gramme par litre de milieu de croissance, le rhamnose pouvant constituer jusqu'à 66% de ces exopoly- saccharides. Voir à ce sujet l'article de B.A. Bryan, R.J. Linhardt et L. Daniels paru dans la revue "Applied and Environmental Microbiology", vol. 51, N 6, pages 1304- 1308 (Juin 1986). Toutefois, le rendement en rhamnose produit est trop faible pour donner lieu à une application industrielle. La Demanderesse a maintenant trouvé qu'il était possible de produire du rhamnose avec des rendements beau- coup plus élevés que ceux rapportés dans l'article ci-des- sus en ayant recours à une culture d'un nouveau micro- organisme du genre Klebsiella sp. La présente invention a donc pour premier objet de fournir une culture d'un nouveau micro-organisme du genre Klebsiella sp. capable de produire du rhamnose avec un rendement élevé. Un deuxième objet de l'invention est de fournir des cultures de mutants sélectionnés dudit micro-organisme capables de produire du rhamnose avec un rendement encore amélioré. Un troisième objet de l'invention est de fournir un procédé de production d'un mélange d'oses contenant du rhamnose. Plus précisément, l'invention concerne une culture d'un nouveau microorganisme Klebsiella sp., présentant les caractéristiques de la souche BEC 441 déposée sous le numéro 1-714 en date du 10 Novembre 1987 à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (C.N.C.M.) de -2l'Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux - 75724 PARIS CEDEX 15, et capable de produire des polysaccharides con- tenant du rhamnose, en grande partie sous forme d'exo- polysaccharides, par fermentation dans un milieu nutritif contenant des sources assimilables de carbone, d'azote et de substances minérales. Le nouveau micro-organisme qui a été isolé à partir de boues d'une station d'épuration, présente les caracté- ristiques suivantes: ELEMENTS DE BASE - BACILLES DE FORME HOMOGENE, DE GRAND DIAMETRE, SANS ARRANGEMENT NOTABLE MOBILITE - - COLORATION DE GRAM -LYSE PAR KOH à 3%: +++ - CULTURE APPARENTE EN GELOSE PROFONDE: AERO-ANAEROBIE - CULTURE EN BOUILLON, NaCl 0%: +++ - CULTURE EN BOUILLON, NaCl 2%: +++ CULTURE EN BOUILLON, NaCl 4%: +++ - CULTURE EN BOUILLON, NaCl 6%: ++ CULTURE EN BOUILLON, NaCl 8%: + - CULTURE EN BOUILLON, NaCl 10% - MILIEU DE BASE: PYG (peptone: 10 g/l, extrait de levure: 3 g/l, glucose: lg/1)J - CULTURE à 10 C: +++ - CULTURE à 20 C: +++ - CULTURE à 41 C: +++ - CULTURE à 45 C: - [MILIEU DE BASE: BHI (cerveau, infusion de coeur, dia- gnostic Pasteur)j - CULTURE RAPIDE ET LUXURIANTE SUR GELOSES ORDINAIRES: COLONIES ETENDUES, LISSES, CHARNUES, BLANCHATRES, D'UN DIAMETRE DE 8-10 MM (GELOSE COLUMBIA, 30 C, AIR, 4 JOURS D'INCUBATION - CULTURE PROTOTROPHE - PRODUCTION ACIDE A PARTIR DU GLUCOSE: +++ i/l Z'l: VOdHz I/i 6'ú: OdzH : sa uotlTsodluoD ml quop 'auoqJiv ap sezinos sap S apnq,, nod Ii fulm naZilm) ú9W n[IIi NS S3aUnfan - 1 ainrS; -e ans sgInITdvga, quos slnsgi saq 6 'S 'I 'IlOr: SZMlIlDSI 0oNsHa sa sDnou:: u.TvDIiNI (/b S 5O annAal apaeaxa + I/B 5 auolded 0E + snossap-Ta ú94 naITu) jj34: NOISNadSnS ZGf nfIIIW nafDjaA-nafleUOW06E8ú' smqao-saI-a1WtW '''S maqs4S Id amd anpuaA) Ho OS IdV Ng NOIVDIgIGIOV - -::SVNISSVD - sz -: (HIZVA) SVNIYqL9O - - aIIEnT] q'nî D UISVNG - -:n0o,a 3Nfú n SO uns H SVaI'I - - 08 NOSM; [Ia 3SA'IOIAH - + agniosNI NOQImWVi l saoIazHRH -oz -: JVNOHODIfO-qdNd nu 2SArOUGaAH - - saIsonX-qdN a ssIAo70GAH - +++: HGISOID'V -qdNo,l Sa qSAÀOUAH - +++: SSVHWSNVUI - rl NWVflÂ-D - -:,,asvqAXOgvDaa NISAq,. - SL -,,aSSI&AXOgVaD aNIHMIN0O., - -:,asVrIo0AHIa aNINIEHV,. - - aSVNIWVsaCI aNaoldAHU - -: SVNIWVSSC aNIN/VTIANaHd - - aoaINII NOIDIInaoHd - o +++: asMan - -: HSSOanaI. S.VNOIHl,.TT - - as: 9 nuad MVO.rTnsoIHI - + asvionciaH SIIIN - asv+++ i:onad aLyIN - +++: HHOHsof- 590A a NOI0YHa - +++:e Oú DO % +++: DoI ' asoDnIo nu dIlHvd V Z'V au NoIaOanoMd - -- 4 -- (NH4)2S04: 2 g/1 MgS04,7H20: 0,2 g/i FeS04,7H20: 0,05 g/1 EN PRESENCE DE D-GLUCOSE: +++ Ac. ACETIQUE: +++ Ac. MALONIQUE: - Ac. CITRIQUE: +++ Ac. HYDROXY-3-BENZOIQUE: - L-HYDROXY-PROLINE: - REACTIONS A 30 C AIR EXPLICATIONS DES SYMBOLES: -: REACTION OU CULTURE NEGATIVE f: FAIBLE t: TARDIVE +: POSITIVE ++:TRES POSITIVE +++: PARTICULIEREMENT INTENSE ELEMENTS CHIMIOTAXONOMIOUES COMPOSITION EN LIPIDES POLAIRES Analyse comparative par chromatographie sur couche mince de silice Procédé d'extraction: chloroforme/méthanol 1:2 chromatographie monodimensionnelle: solvant de migration: chloroforme/méthanol/eau/ac.acéti- que :25:4:0,8 révélation des phospholipides: molybdate d'ammonium lipides aminés: ninhydrine glycolipides: a-naphtol lipides totaux: vanilline/H2S04 souche de référence: mfl 290: KLEBSIELLA TERRIGENA CIP 80.07 Les chromatogrammes obtenus sont reproduits & la figure 2. La présente invention concerne également les cul- tures de mutants du micro-organisme Klebsiella sp. BEC 441. Des mutants utiles peuvent être obtenus par simple - 5 - sélection de mutants spontanés isolés à& partir d'une cul- ture précédente en fermenteur, ou bien en soumettant une culture de Klebsiella sp. BEC 441 à l'action d'un rayonne- ment énergétique (rayons U.V., rayons X par exemple) ou d'un agent chimique Epar exemple l'ozone, l'acide nitreux, la NTG(N-méthyl-N'-nitroN-nitrosoguanidine) ou 1'EMS (éthane-méthane-sulfonate)7 en vue de tuer une portion importante des micro-organismes, en cultivant les micro- organismes survivants et en sélectionnant ceux produisant davantage de polysaccharides. La présente invention concerne, en outre, un pro- cédé d'obtention d'un mélange d'oses à teneur élevée en rhamnose qui consiste à faire fermenter une culture de Klebsiella sp. BEC 441 ou de mutants sélectionnés de celle- ci dans un milieu nutritif comprenant une source de carbo- ne, une source d'azote et des sels minéraux appropriés, à un pH d'environ 6 à 8, à une température d'environ 30 à C, sous aération et agitation, pendant 4 à 12 jours, & isoler les polysaccharides résultants du milieu de fermen- tation, puis à hydrolyser ces polysaccharides et à ajuster le pH de l'hydrolysat résultant dans la gamme de 5 à 9 environ. L'invention concerne aussi le rhamnose produit à l'aide d'une culture selon l'invention. Comme source de carbone, on peut utiliser, de façon non limitative, des substances telles que le sorbitol, le mannitol, le glucose, le glycérol et leurs mélanges. On préfère, à ce jour, le sorbitol. Il n'est pas indispensa- ble d'utiliser une source de carbone chimiquement pure. On peut, par exemple, utiliser du sorbitol de qualité techni- que contenant, entre autres, du mannitol comme impuretés. A titre indicatif, on peut utiliser de 5 à 100lg de source de carbone par litre de milieu nutritif, de préférence 10 à 50g/1. Comme source d'azote, on peut utiliser, de façon non limitative, des substances telles que la peptone de caséine (obtenue par hydrolyse acide ou enzymatique de la caséine), la liqueur de trempage du mais, l'extrait de - 6 - 2624522 levure, la peptone de soja, la farine de pomme de terre, la Lphénylalanine, la thréonine, le sulfate d'ammonium et leurs mélanges. A ce jour, on préfère la peptone de caséi- ne, la liqueur de trempage du mais et la farine de pomme de terre. La Lphénylalanine donne aussi de bons résultats mais a l'inconvénient d'être relativement coûteuse. A titre indicatif, on peut utiliser de 0,5 & 10g de source d'azote par litre de milieu nutritif, de préfé- rence 1 & 5g/1. Un paramètre important est le rapport en poids carbone/azote du milieu nutritif. Il est avantageux d'uti- liser un rapport d'au moins 5 et pouvant aller jusqu'à 100 et plus. Comme sels minéraux, il faut inclure un sel de magnésium, par exemple MgS04, et au moins un sel phosphate, par exemple choisi parmi M2HP04 o M est un métal alcalin ou l'ion ammonium. Le sel de magnésium peut être présent, par exemple, & raison de 0,1 & 0,3g/l1, tandis que le sel phosphate peut être présent, par exemple, & raison de 2 & g/1. Il est avantageux d'utiliser un mélange de M2HP04 et de MH2P04 car un tel mélange permet de régler le pH du milieu nutritif et, en outre, sert de tampon. La température du milieu de fermentation peut aller de 30 à 35 C et est de préférence de 32-330C. Le pH du milieu doit être compris entre 6 et 8 et est de préférence voisin de la neutralité (pH 7). Les conditions d'aération doivent être suffisantes pour maintenir la pression partielle d'oxygène au-dessus du milieu de fermentation. En général une aération de l'ordre de 0,3 & 3 VVM (volume d'air/volume de milieu/mi- nute) sera suffisante. Il faut aussi maintenir le milieu de fermentation sous bonne agitation pour éviter un épaississementexcessif de celui-ci. En général, une agitation & une vitesse de 300 à 1500 tours/minute conviendra. Il est avantageux par ailleurs, quoique non indis- pensable, d'incorporer au milieu nutritif un agent tensio- actif non toxique pour le micro-organisme afin de faciliter la séparation des polysaccharides du milieu de fermenta- tion. Un exemple d'agent tensio-actif utile est l'agent tensio-actif non ionique vendu dans le commerce sous la marque déposée "Tween 80" (mono-oléate de polyoxyéthylène- sorbitol). On peut en incorporer, par exemple de 0,5 & 2g/1, de préférence environ lg/litre. Il est également avantageux d'incorporer au milieu nutritif une petite quantité d'extrait de levure (si on ne l'utilise pas comme source d'azote principale) afin de réaliser un apport de vitamines. La.durée de la fermentation sera en général de l'ordre de 2 à 12 jours, selon les conditions opératoires et l'objectif de concentration en polysaccharides à obte- nir. L'isolement des polysaccharides produits qui sont sous la forme d'exopolysaccharides et de polysaccharides liés aux cellules, peut être réalisé, par exemple, en soumettant le milieu de fermentation à un traitement ther- mique à 70-120 C environ pendant o10 minutes à 1 heure environ (pour extraire la fraction des polysaccharides liés aux cellules), puis en centrifugeant à froid et en recueillant la couche surnageante claire. Cette couche contient la quasi-totalité des polysaccharides. On peut alors, si désiré, précipiter les polysaccharides de la couche surnageante recueillie par addition d'un liquide organique non-solvant tel que l'acétone ou un alcool infé- rieur tel que l'éthanol ou le propanol, puis séparer par filtration ou centrifugation le précipité et finalement le sécher. En variante, la couche surnageante peut être lyo- philisée. On procède ensuite à une hydrolyse des polysaccha- rides au moyen d'un acide fort tel que H2SO4 OU HCl, pour convertir les polysaccharides en oses, puis à un réglage du pH de l'hydrolysat par une base, telle que NaOH ou KOH, afin d'obtenir un pH dans la gamme de 5 à 9 environ, de préférence voisin de la neutralité. L'hydrolyse peut être conduite directement sur la couche surnageante claire ou sur le produit séché ou - 8 - lyophilisé. L'hydrolyse peut être effectuée par exemple à l'aide d'H2S04 à 100 C pendant 6 heures, la concentration finale en acide dans le volume traité étant d'environ 2N. Typiquement l'hydrolysat neutralisé a la composi- tion d'oses suivante: % rhamnose 50-60% glucose 40-50% autres oses sont utilisables. Le mélange d'oses à teneur élevée en rhamnose ou le rhamnose isolé de ce mélange est un produit de départ utile pour la synthèse d'agents de saveur ou arômes tel que le furanéol et ses dérivés.. Par ailleurs, les polysaccharides produits par la culture de l'invention ont les utilités des polysaccha- rides en général et peuvent être utilisés, par exemple, comme stabilisant, agents de suspension, dispersant, épai- sissant, agent filmogène, agent de rétention d'eau, coagu- lant, collolde, lubrifiant, par exemple, dans des lessi- ves, textiles, adhésifs, papier, peintures, et aliments, ainsi que pour la récupération assistée du pétrole. Afin d'illustrer la présente invention, on donne ci-après les exemples non limitatifs suivants. Dans chacun de ces exemples, on a employé un ino- culum de la culture de l'invention ayant une densité opti- que de 0,15 à 600 nm en une proportion de 10 millili- tres/litre de milieu de fermentation. EXEMPLE 1 On a placé dans un fermenteur de laboratoire (fer- menteur, modèle 105500, vendu par la Société BIOLAFITTE, Saint-Germain en Laye, France, d'une capacité de 2 litres) un milieu de fermentation ayant la composition suivante: sorbitol: 20 g/l phénylalanine: 1 g/1 MgSO47H2 0 0,2 g/l Tween: 1 g/1 K2HP04: 9 g/l K2H2P0 -: 3 g/1 Tween 80 1 g/1 extrait de levure de boulangerie: 20 mg/1 A ce milieu on a ajouté l'inoculum spécifié précé- demment et on a effectué une fermentation dans les condi- tions suivantes: Température: 30 C Aération: 0,5 VVM Agitation: 400 à 600 tours/mn pH initial: 7 (non régulé). Après 7 jours de fermentation, la teneur en rham- nose était de 3 g/l de milieu de fermentation, comme déter- minée par spectrophotométrie. On a alors ajouté au milieu g/l de sorbitol et 5 g/l de phénylalanine. Quatre jours plus tard la teneur en rhamnose était de 5,5 g/l. EXEMPLE 2 On a effectué une fermentation dans les mêmes équipements qu'à l'exemple 1, mais en utilisant le milieu de fermentation suivant: sorbitol: 20 g/1 phénylalanine: 2 g/1 tween 80: 1 g/l MgSO4.7H20: 0,2 g/l K2HP04: 9 g/1 KH2PO4: 3 g/1 Extrait de levure: 20 mg/l1 Les conditions de fermentation étaient les mêmes qu'à l'exemple 1. - 10 -2624522 - 10 - Au bout de 8 jours de fermentation, on a obtenu une teneur en rhamnose de 5,5 g/litre de milieu de fermen- tation. EXEMPLE 3 On a répété l'exemple 2 si ce n'est que les pro- portions de sorbitol et de phénylalanine ont été portées à. 50 g/l et 5 g/l, respectivement. On a pu ainsi obtenir, au bout de 7 jours de fer- mentation seulement, une teneur en rhamnose de 5,5 g/litre de milieu de fermentation. EXEMPLE 4 Cet exemple décrit la préparation de souches mu- tantes hyperproductrices de polysaccharides riches en rhamnose de la souche de départ BEC 441, par un traitement aux rayons U.V. Une culture de la souche BEC 441 est réalisée sur le milieu suivant: sorbitol: 10 g/l - phényl lanine: 1 g/l - tween R80: 1 g/l - MgS047H20 0, 2 g/l - K2HP04: 9 g/l - KH2P04: 3 g/l Après 4 jours d'incubation à 30 C sous aération (0,5 VVM), 5ml de cette culture sont centrifugés (5 mn à 4000 t/mn), et le culot est repris dans 5 ml d'eau phy- siologique. La suspension cellulaire ainsi obtenue est intro- duite dans une botte de Pétri et placée sous une lampe U.V. (Philips 5W) à 20 cm de distance. Pendant toute la durée de l'exposition, une agitation manuelle est effec- tuée. Apres 1 mn d'exposition, les cellules survivantes (environ 1% des cellules totales) sont réintroduites dans ml du milieu précédemment décrit et mises à incuber pendant 3 heures à 30 C, afin de réaliser une expression de phénotype. Après cette incubation, les cellules sont étalées en botte de Pétri sur le milieu suivant: -il - - sorbitol: 50 g/l - phénylalanine: 5 g/l tween 80: 1 g/l - MgSO4,7H20 0,2 g/l - K2HP04: 9 g/1 -KH2P04: 3 g/1 Agar: 15 g/1 Après une semaine d'incubation à 30 C, les colonies mutantes ayant produit davantage de polysaccharides sont identifiées par la présence d'une zone mucolde autour de la colonie plus importante que sur les colonies non mutantes. Ces colonies sont isolées, puis multipliées de la même manière que la souche initiale, et conservées. EXEMPLE 5 Cet exemple décrit la préparation de souches mu- tantes hyperproductrices de polysaccharies riches en rham- nose de la souche de départ BEC 441, par un traitement & l'ozone. Une culture de 1 litre est réalisée dans un fer- menteur sur le milieu liquide et dans les conditions dé- crites à l'exemple 4. Apres 4 jours d'incubatfon, un traitement à l'ozone est effectué à l'aide d'un ozoneur de laboratoire. Pour cela, l'air entrant dans le fermenteur est dérivé par l'ozoneur avant d'être introduit dans le fermenteur. Après 1 heure de traitement, l'aération est rétablie. Le nombre de cellules viables est déterminé avant et après le traitement, le taux de survivants après le traitement est d'environ 10%. Une expression de phénotype est réalisée en lais- sant les cellules incubées 3 heures supplémentaires après le traitement. Puis les cellules sont étalées sur botte de Pétri pour la recherche de mutants hyperproducteurs; cette recherche est réalisée de la même manière qu'à l'exemple 4. EXEMPLE 6 - 12 -2624522 - 12 - Cet exemple illustre la production de polysaccha- rides riches en rhamnose à l'aide de souches mutantes. Identification des souches utilisées: - EP 1 et EP 2: sont obtenues à partir de la souche BEC 441 par mutagé- * nèse U.V. comme décrit à l'exemple 4. _ F4 1 et F4 2: sont des mutants spontanés isolés à partir d'une culture précédente en fermenteur. Les colonies mutantes spontanées hyperproductrices de polysaccharides riches en rhamnose sont identifiables par la présence d'une zone mucolde entourant la colonie plus importante que sur les colonies non mutantes. Milieu de culture emplové: - Sorbitol: 50 g/l - Peptone de caséine: 4,5 g/l - Phénylalanine: 0,1 g/l - Extrait de levure: 0,05 g/l - Tween 80: 1 g/l - MgSO4.7H20: 0,2 g/l - K2H P04: 1,8 g/l - KH2 P04: 0,6 g/l Conditions de culture en fermenteur: - Température: 32 C - pH: régulé à 7, 0 avec NaOH 1N - Aération: 0,5 WM - Agitation: 400 à 1000 tours/minute On suit jour après jour la production de rhamnose et on trace des courbes de la production de rhamnose en fonction de la durée de fermentation pour chacune des souches mutantes utilisées. Les courbes obtenues sont représentées sur la figure 3. On voit que l'on peut obtenir jusqu'à 12 g de rhamnose par litre de milieu de fermentation après moins de 7 jours de fermentation. - 13 - 2624522 REVENDICATIONS 1. Cultures de micro-organisme Klebsiella sp. pré- sentant les caractéristiques de la souche BEC 441 déposée sous le No. 1714 à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes de l'Institut Pasteur, ainsi que de sou- ches obtenues & partir de la souche BEC 441 par mutation, ces souches étant capables de produire des polysaccharides riches en rhamnose par fermentation dans un milieu nutritif contenant des sources assimilables de carbone et d'azote, et des substances minérales. 2. Procédé d'obtention d'un mélange d'oses à. te- neur élevée en rhamnose qui consiste & faire fermenter une culture de Klebsiella sp. BEC 441 ou de mutants sélection- nés de celle-ci dans un milieu nutritif comprenant une source de carbone, une source d'azote et des sels minéraux appropriés, & un pH d'environ 6 à 8, à une température d'environ 30 à 35 C, sous aération et agitation, pendant 2 & 12 jours, à isoler les polysaccharides résultants du milieu de fermentation, puis & hydrolyser ces polysaccha- rides et & ajuster le pH de l'hydrolysat résultant dans -la gamme de 5 à 9 environ. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la source de carbone est choisie parmi le sorbi- tol, le mannitol, le glucose et le glycérol et est présente à raison de 5 à 100 g/litre de milieu nutritif. 4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caracté- risé en ce que la source d'azote est choisie parmi la peptone de caséine, la liqueur de trempage du mals, l'extrait de levure, la peptone de soja, la farine de pom- me de terre, la L-phénylalanine, la thréonine et le sulfa- te d'ammonium, et est présente & raison de 0,5 & 10 g/li- tre de milieu nutritif. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 2 à 4, caractérisé en ce que le rapport en poids carbone/azote du milieu nutritif est dt'au moins 5. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 2 à 5, caractérisé en ce que le milieu nutritif contient, en outre, des sels minéraux choisis parmi les - 14 - sels de magnésium, les sels phosphate et leurs mélanges. 7. Produit selon l'une quelconque des revendica- tions 2 & 6, caractérisé en ce que le milieu nutritif contient en outre une petite quantité d'extrait de levure. 8. Rhamnose produit à l'aide d'une culture telle que définie à la revendication 1.