FR 2629098 A1 19890929 FR 8804130 A 19880323 La présente Invention concerne un nouveau gène chimérique utilisable pour conférer aux plantes une résistance à un herbicide à base de dlhalogéno-2, 6 hydroxy-4 benzonltrile,un procédé de transformation de cellulles végétales à l'aide de ce gène et les plantes transformées régénérées à partir de ces cellules. I1 est connu,d'après la demande européenne 229 042, de conférer à des plantes une résistance à un herbicide du type cité cl-dessus,en particulier le dlbromo-2,6 hydroxy-4 benzonltrlle ou bromoxynil,par Introduction dans le génome des plantes d'un gène codant pour une nltrilase spécifique de la dégradation de ces herblcides.Si cette technique donne des résultats Intéressants,elle demande à être améliorée pour augmenter les chances de succès et valoriser son potentiel économlque,en particulier en ce qui concerne le niveau d'expression dans les plantes et,par conséquent,la qualité de la résistance des plantes à ces herbicides. Dans la présente description,on entend par plante"tout organisme multicellulalre dlfférentié capable de photosynthèse et par "cellule végétale" toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus Indifférenciés tels que des cals ou des embryons ou des tissus différenciés tels que des parties de plantes ou des plantes ou des semences. La présente invention a pour but de répondre à ce besoin. Elle concerne un gène chimérique utilisable pour conférer aux plantes une résistance à un herbicide à base d'un dlhalogéno-2,6 hydroxy-4 benzonltrlle comprenant au moins un gène codant pour une nltrilase de résistance à cet herblclde, un promoteur étranger et éventuellement une zone signal de polyadénylatlon,caractérlsé en ce que le promoteur provient d'un gène s'exprimant naturellement dans les cellules végétales et choisi dans le groupe comprenant le promoteur dde 'ARN 35 S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CamV 35S) et le promoteur de la petite sous-unlté(PSU) de la rlbulose-1,5-bls phosphate carboxylase oxygénase (RublsCO)du tournesol (Hellanthus annuus). Le promoteur du gène chimérique selon l'invention provient d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes,c'est à dire soit de type non végétal,par exemple viral comme l'ARN 35 S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CamV 35S) ou encore et de préférence de type végétal de plantes monocotylédones ou dlcotylédones,en particulier la petite sous unité de la ribulose-I,5-bis phosphate carboxylase oxygénase (RubisCO) de tournesol (Helianthus annuus).On peut utiliser ces promoteurs seuls ou en comblnalson.Le choix dépend de la nature de la plante(mono- ou dicotylédone) à transformer.AInsi il est préféré d'utiliser la petite sous unité RubisCO du tournesol pour la transformation d'une plante dicotylédone. Chacun de ces promoteurs peut être obtenu comme suit: 1) Promoteur de l'ARN 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CamV 35S): L'isolement de ce promoteur a été décrit par Odell et al(I985). Un clone(pJ05-2) contenant environ 850 bp en amont du site d'lnitiation de la transcription a été choisi pour les constructions décrites. Un fragment EcoRI-HindIII a été isolé, les extrémités rendues franches par la polymérase de Klenow,et cloné dans le vecteur pUC 19 (Yannlsh-Perron et al,1985) au site HlncII. Ce clone a été digéré par action de XbaI et PstI et le fragment obtenu traité par la polymérase de phage T4 afin de rendre les extrémités franches. Ce fragment a été cloné dans pUC19 cm (Buckley, I985)coupé par SmaI et XbaI et traité à la polymérase de Klenow. Le clone ainsi obtenu a été nommé p RPA-BL I45. Par traitement à la polymérase de Klenow du site AccI 3' terminai et en le ligaturant avec le site EcoRI traité à la polymérase de Klenow des fragments situés en aval de ce promoteur, on reconstltue un site EcoRI et la séquence alnsi obtenue à partlr du site d'inltlatlon de la transcription est le sulvant: A CA CG C T G A C AA G C T G A C T C A G C TA G A G T C G A A T T C EcoRI 2)Le promoteur de la petite sous unité de la rlbulose-1,5bisphosphate carboxylase(RubisCO)de tournesol (Helianthus annuus. Le gène dont ce promoteur est Issu a été isolé par Wacksman et al (I987). Un fragment EcoRI contenant le promoteur de ce gène a été cloné dans mp 18, la partle 3' du promoteur dlrectement en amont du polyllnker de ce vecteur. Ce clone a ensuite été linéarlsé par BstXI et tralté par l'exonucléase Bal31. Le mélange de fragments ainsl obtenu a été tralté par SalI puls la polymérase de Rlenow et enfln ligaturé à basse concentration d'ADN.Les clones obtenus sulte à cette manipulation ont été séquencés et l'un d'entre eux présentant la séquence sulvante en aval du site putatlf d'lnltlatlon de la transcrlptlon retenu: ' A T T G G A T T C 3'... Un linker Cla I (A T C G A T) a été lntrodult au site PstI de ce clone. Ainsl par traltement de ce slte ClaI à la polymérase de Klenow et ligature avec le site EcoRI traité à la polymérase de Klenow des fragments qui sont placés en aval de ce promoteur, on reconstltue un slte EcoRI et la séquence ainsi obtenue à partir du site d'lnltlatlon de la transcription putatlf est la sulvante: AT T G G A TT C T C G A C C AT C G A A T T C Eco RI Selon un autre aspect de l'lnventlon,le gène chlmérlque comprend une zone intermédialre non traduite(linker)entre le gêne codant et le promoteur et qul peut être cholsie dans le groupe comprenant: - d'une part le linker de pUC 19 modlflé par clonage et ayant la séquence sulvante: GAA T T C G A G C T C G G TA C C C A T G G EcoRI NcoI - d'autre part la zone non traduite de la petite sous unité de la RubisC0 de maïs: cette zone est issue de l'ADNc correspondant au gène décrit par Lebrun et ai (1987).C'est un fragmènt EcoRI-NcoI qul a la séquence suivante: G A A T T C C C A G C A A G C A A G C A G C G A G T A C. EcoRI A T A C A T A C T A G G C A G C C A G G C A G C C A T G NcoIl - d'autre part la zone non traduite de la petite sous unité de la RubisCO du tournesol:cette zone est issue de l'ADNc isolé par Waksman et Freyssinet (I987). Elle n'a pas été isolée en tant que telle et se trouve toujours préceder le peptide de transit de la RublsCO du tournesol. La séquence est la suivante: G A A T T C C G A A A G A C A A A G A T T A T C G Eco RI T AA T G Met Le gène chimérlque selon l'lnventlon comprend éventuellement une zone ou site de polyadénylatlon qui peut être par exemple: 1) Le site de polyadénylatlon du gène de la nopaline synthase de pTl 37 (Bevan et al, I983). Ce site est contenu dans un fragment MboI de 260bp (Fraley et al, I983, demande de brevet PCT 84/02913) qui a été traité par la polymérase de Klenow et cloné dans le site SmaI de M13mpl8 pour Introduire des sites BamHI et EcoRI respectivement aux extrémités 5' et 3'. Le site BamHI a été traité à la nucléase de Vigna radlata et cloné au site SalI traité à la polymérase de Klenow de pUC 19.Ce fragment contient maintenant à son extrémité 5' un site HindIII qui peut être ligaturé à celui situé en 3' du gène de nltrilase. 2) Le site de polyadénylation du gène de la petite sous unité de la RubisCO du maïs: ce site a été Isolé sous forme d'un fragment SmaI-BglII de 540bp du gène décrit par Lebrun et ai (I987). Un 11nker ClaI (ATCGAT) a été Introduit au niveau du site SmaI. Après coupure avec ClaI et remplissage à la polymérase de Klenow, ce fragment a été cloné dans pUC19 coupé par PstI puis traité par la polymérase du phage T4 et recoupé par BamHI. Cette manipulation a permis d'introduire un site HindIII en 5' du site de polyadénylatlon.La séquence obtenue est la suivante: ' A A G C T T G C A T G C C C G A TtG G G C A G..... HlndIII l/SmaI Selon un autre aspect de l'inventlon, le gène chimérique peut comprendre éventuellement et de manière préférée, entre la zone Intermédiaire et le gène de la nitrllase, une zone codant pour un peptide de transit choisi dans le groupe comprenant celui de la petite sous unlté de la RublsCO de maïs et celui de la petite sous unité de tournesol. Le peptide de transit a pour fonction dans le gène naturel de permettre l'entrée de la petite sous unité de la RublsCO dans le stroma des chloroplastes. Ils doivent diriger de même la nitrllase dans ce compartiment dans le cas o ils sont Introduits entre la zone lntermédlalre précédemment décrlte et le gène de structure de la nltrllase: 1) Peptide de transit de la petite sous unité de la RubisCO du maïs: ce fragment est issu de l'ADNc correspondant au gène décrit par Lebrun et al(I987).C'est un fragment Nco I-SphI de 141pb, le site NcoI recouvrant le codon initiateur de la traduction et le site SphI, le site de coupure du peptide de transit. Par traitement de l'extrémité SphI de ce fragment à la polymérase du phage T4 et en la ligaturant avec l'extrémité NcoI traitée à la polymérase de Klenow du gène de la nltrilase,on reconstltue une séquence permettant l'obtention d'une nitrilase non modifiée dans le stroma des chioroplastes. 2) Peptide de transit de la petite sous unité de la RubisCO du tournesol: ce fragment est issu de i'ADNc isolé par Waksman et Freyssinet (1987). Cette séquence ne possède pas à l'origine de site SphI au niveau du site de coupure du peptide de transit. La séquence est la suivante, à ce niveau: ' C A A T G C A T G A A G 3' On a substitué par mutagénèse dirigée un C au A marqué d'une astérique créant ainsi un site SphI. Pour effectuer cette manipulation, on a utilisé laméthode de Zoller et Smith (I984). Un fragment EcoRI-SalI de 270pb a été cloné dans MI3mpl9am4. Ce vecteur dérlvé de M13mpl9 possède une mutation ambre dans le gène 4 à la base 5327 et ne peut se multiplier dans les souches ne possédant pas de suppresseur de mutation de ce type. Après purification de la forme monobrin de ce phage recombinant, trols ollnucléotides ont été hybrldés en une seule étape. La séquence de ces ollnucléotides phosphorylés est la suivante: SphI 1:5'G T T C A A T G C A T G C A G G T G T G G C C A C 3' 2:5' A A G A G T C T G T C C A T C A C 3' 3:5' G T A A A A C G A C G G C C A G T 3' Ils permettent respectivement: 1: la mutation du fragment au niveau du site de coupure du peptide de transit, 2: la correction de la mutation ambre, 3: l'amorce de séquence en amont du fragment à mutagénèse. Après action simultanée de la polymérase de Klenow en présence des quatre nucléotldes et de la llgase du phage T4, le mélange obtenu a été transformé dans la souche HB2154 puis étalé sur un tapis de HB2151(Carter et al,I985). Parmi les clones obtenus, ceux possédant un site SphI supplémentaire ont été séquencés afin d'en vérifier la structure et l'un d'entre eux a été utilisé pour que la création de gènes chimériques. Au niveau du site de coupure du peptlde de transit, la séquence est maintenant la suivante: ' C A A T G' C A T G C Ce fragment est utilisé de façon identique à celle utilisée pour le fragment codant pour le peptide de transit de la petite sous unité de la RubisC0 du maïs. L'assemblage des gènes chimériques s'effectue selon le schéma des figures 1 à 4 avec les éléments précédemment décrits. Les différents gènes ainsi créés ont été placés dans un ou deux types de vecteurs et chaque ensemble a été rapporté à un numéro.Les différents vecteurs ainsi réalisés sont décrits dans le tableau 1 cl-dessous: TABLEAU 1 Assemblage des dlfférents ADN-T contenant les gènes chlmérlques de réslstance en bromoxynill Tldentl- | i Promoteur I zone de Ilalson I [ i IflcatlonlVecteurl I SSU I 5' Ilinker 5' Ipeptide de transltlBR-INOS I SSU I I PRPA-BLI ICamVITourne-IMaïsl ITourne-1 IXN Ipolyl Maïs I I _ I _ I 3531 sol | I | sol Maïs Tournesol I I A Ipoly AI T 203 1150T 1 1 + I+ I I + + 1 204 |150A1 1 + I I + 1 + 1 + I 1 207 1150Al 1 1 + 1+ 1 I I I + 1 + 1 I 208 |150A"I 1 1 + 1+ I I I + I It + + I I 1 217 |150A 1 + I 1 + I I + 1 + 1 I 1 218 |150Avl1 + + + + 1 ++ I 1 221 1150Al1 1 + I 1 + I I + 1 + I 1 222 1i50AAl1 1 + I I I + 1 + 1 235 142 + + I I I + + I 236 142 + I I + I + + I 237 142 1 + + I I I + + I 238 142 1 + I I I + I I + + I 249 142 + + I I I + + 250 142 + I + I + + 251 142 1 + ++ + 252 142 1 + I + + + I, I I I I I,_ _ II1. 1 1 I Isssssssssssssssssssssssss 1I o ru co Vecteurs utilisés: Les différentes constructions chimériques ayant conduit aux vecteurs pRPA-BL-142 et pRPA-BL-150Aalphal représentées aux figures I à 4 ont été introduites dans les plantes grâce au système de transfert d'Agrobacterlum tumefaclens. Les vecteurs de transfert construits à cet effet ont les caractéristiques suivantes: - une origine de réplication et de transfert issue de pBR 322, 0 - un gène de sélection bactérien par exemple la résistance à la gentamicine, - un site COS issu du phage lambda, - les deux bordures droite et gauche de l'ADN-T de pTiA6, éventuellement un gène de sélection eucaryote comme la résistance à la kanamycine, - éventuellement un fragment contenant le gène de complémentation lac alpha de pUCI8. Construction de pRPA-BL-142(Flgures I à 4) _ 0 Les bordures droite et gauche (Fig.l)de 1'ADN-T de gauche de pTIA6 ont tout d'abord été sous clonées: - bordure droite: un fragment BamHI-EcoRI allant de 13774 à 16202 dans le système de numération de Barker et al (1983) a été cloné !5 dans pGEM 1 (Promega Blotech) aux sites correspondants donnant pBL-17.Ce plasmide a été digéré par NruI (14276 et 14475) et par EcoRI (16202) et traité à la polymérase de Klenow. La ligation des sites NruI et EdoRI rempli régénère un site EcoRI à 14276 et donne le plasmide pBL-19. 0W - bordure gauche: un fragment HlndIII allant de 602 à 3390 dans le système de Barker et al (1983) a été cloné dans le site correspondant de pGEM 1 donnant pBL-21,dans lequel la bordure gauche est à l'opposé du polyllnker. Ce plasmlde a été digéré par Acc 1 (1161 et 2687) et traité à la polymérase de Klenow avant d'être ligaturé. Le plasmlde résultant,pBL26 contient un fragment allant de 602 à 1161, inséré entre les sites HindIII et XbaI. Créatlon de l'ADN-T: Par introduction du fragment EcoRI-BamHI de pBL-l9 dans les sites correspondants de pBL-26, un ADN-T a'été reconstitué possédant les bordures droite et gauche de pTiA6 dans leur orientation naturelle. Le plasmide obtenu est désigné par pBL-70. Introduction de 1'ADN-T dans pBR 322 (Fig.2): Après coupure de pBL-70 par HindIII, ce site a été traité par la polymérase de Klenow et le plasmide recoupé par EcoRI. Le fragment obtenu a été cloné dans pBR 322 coupé par PruII-Eco RI.Le clone résultant est désigné par pRPA-BL-112. Clonage d'un gène de résistance à la gentamicine (Flg.3): Le gène de résistance à la gentamlcine a été obtenu à partir de pPHI JI (Hirsh and Bringer,I984). Ce plasmide a été digéré par BamHI et HindIII et l'ensemble des fragments clones dans pUC 19 coupé par les mêmes enzymes. Après sélection sur amplcilline + gentamyclne, plusieurs clones contenant un fragment de 2, 45kpb ont été lsolés.Le clone retenu pour la suite des manipulations a été nommé pRPA-BL-133. Au site BamHI de ce clone, on a introduit un fragment BglII de 1,6Kb isolé de pHC 79 (Hohn and Collins,I980) et contenant le site COS du phage lambda. Ce fragment, inséré dans les deux orientations, a permis d'obtenir deux clones pRPA-BL-134 et pRPA-BL-135. Obtention d'un vecteur lntégratlf (Fig.3): Afin de réunir dans un même vecteur les différentes parties précédemment décrites, les-plasmides pRPABL-134 et pRPA-BL-135 ont été digérés par SmaI et HlndIII et l'lnsert contenant le gène de résistance à la gentamlclne et le site COS du phage lambda traité par la polymérase de Klenow. Le plasmide pRPA-BL-112 a été digéré par PstI et EcoRI et traité par la polymérase du phage T4. Les deux fragments ont été ligaturés et les clones contenant à la fols la résistance à la gentamlclne, le site COS, 1'ADN-T et l'origine de réplicatlon de pBR 322 ont été retenus. Le plasmlde pRPA-BL-134 a donné naissance à pRPA-BL-141 et LO pRPA-BL-142 et pRPA-BL-135 a donné naissance à pRPA-BL-143 et pRPA-BL-144. C'est pRPA-BL-142 qui a été retenu pour l'introduction des gènes chimériques à transférer dans les plantes. A partir de ce vecteur,une construction contenant un gène marqueur NOS-NPTII-NOS (Fig;4) a été obtenue. Le L5 plasmide pRPA-BL-I42 a été digéré par XbaI et les extrémités réduites par action de la nucléase de Vlgna radiata. Par ailleurs pEND4 K (Klee et al,I985)a été digéré par EcoRI et traité par la polymérase de Klenow. Un fragment de 1, 6 Kpb a été isolé contenant le gène chimérique de résistance à la kanamyclne et introduit dans pRPA-BL-142. Le résultat d'une de ces fusions a été nommé pRPA-BL-150 A et a été choisi pour la suite des manipulations. Afin de faciliter le clonage dans ce vecteur, on a introduit au site BamHI traité par la nucléase de Vlgna radiata un fragment HacII traité par la polymérase du phage T4 et contenant le gène de complémentation lac alpha isolé de pUC 18 (Yannlsh-Perron et al,1985). Les deux vecteurs obtenus ont été nommés pRPA-BL-15OAalphal et pRPA-BL- 150Aalpha2. C'est pRPA-BL-150Aalphal qui a servi de base pour l'introduction de gènes dans les plantes. Utilisation de pRPA-BL-142 et de pRPA-BL-150Aalphal Ces vecteurs ne se maintiennent pas seuls dans Agrobacterlum. Pour se maintenir, il leur est nécessaire de s'intégrer par simple recomblnalson dans un plasmlde résident dans cette bactérie. Cela peut se produire via un des fragments tels que le site qui se trouve sur des cosmldes tels que pVK 102 ou autres ou tels que le fragment de pBR 322 pour des plasmides possédant de telles séquences. C'est le cas pour le plasmlde Ti de la souche GV3850 (Zambryskl et al 1983) qui est aussi un h8te pour pRPA-BL-142 et pRPA-BL- 150Aalphal. Utilisant l'origine de réplicatlon de pBR 322, ces plasmides sont transférés dans Agrobacterlum via le système tripartite décrit par Dltte et al (1980). III) Transformation du matériel végétal Afin de tester l'efficacité de ces gênes chimériques,ceux-cl ont été transférés dans du matériel selon les procédures décrites ci-dessous: A - Procédures de transformation 1. Tabac Le vecteur est introduit dans la souche non oncogène d'Agrobacterium EHA 101 (Hood et ai 1987) porteuse du cosmide pTVK 291 (Komarl et al, 1986). La technique de transformation est basée sur la procédure d'Horsh et ai (1985). La procédure de régénération du tabac industriel PBD6 (provenance SEITA, France) est décrite ci-dessous. La régénération du tabac PBD6 à partir d'expiants follalres est réalisé sur un milieu de base Murashlge et Skoog (MS) comprenant 30 g/I de saccharose. Les explants foliaires sont prélevés sur des plantes cultivées en serre ou in vitro et transformé selon la technique des disques foliaires (Science 1985, vol 227, p.l229-1231 en 3 étapes successives. La première étape comprend l'induction des pousses sur un MS+ 30 g de saccharose comprenant 0,05 mg d'ANA et 2 mg/1 de BAP pendant 15 jours. La deuxième étape permet le développement des pousses formées au cours de la lère étape; elle est faite sur un MS+30 g/l de saccharose et ne comprenant pas d'hormone,pendant 10 jours. La troisièlme étape permet l'enracinement des pousses prélevées individuellement. Ce milieu d'enracinement contient les sels, vitamines et sucre dilués de moitié. Il ne contient pas d'hormone. Après 10 à 15 jours, les pousses O enracinées sont passées en terre. Détermination de la balance hormonale La fréquence optimale de régénération a été obtenue en testant 25 balances hormonales BAP 0,2 - 0, 5 - 1 - 1,5 - 2 et ANA 0-0,5 -.0,05 observées pour 1,5 et 2 mg/l de BAP et 0,05 et 0,1 mg/1 d'ANA. Le mélange 0,05 ANA et 3 BAP est retenu. 2. Autres dicotylédones Les dicotylédones présentées dans le tableau 2 ont été transformées en utilisant la souche oncogène O d'Agrobacterium A281 porteuse du cosm1de pTVK291 associé au vecteur correspondant utilisant le matériel végétal tel qu'indiqué dans le tableau 2. B - Mesure de la résistance au bromoxynil l.Tabac :5 La résistance a été mesurée in vitro par croissance de cals en présence de bromoxynil (20 mg/l) sous forme d'octonate et in vivo par pulvérisation follaire avec du bromoxynil ou de l'loxynil à des doses représentant 10 fols la dose recommandée pour un traitement en plein champ. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau Ibis. 2.Autres dicotylédones !5 La résistance a été mesurée in vitro par croissance de cals en présence de 10 mg de bromoxynll (sous forme d'octonate) par litre de mllleu. Dans tous les cas les résultats sont posltlfs (tableau 2). TABLEAU 1 bls Résistance de tabac transformée au bromoxynll lidentification Résistance au tabac pRPA-BL Cal plantes 203 + + 204 + + 207 + + 208 + + 217 + + 218 + + 221 + + 222 2 + + 235 + + 236 + + 237 + +. 238 + + 249 + + 2 250 + + 251 + + 252 + + TABLEAU 2 Résilstance au bromoxyn1l des diverses dlicotylédones matériel p RPA-BL I Plantes végétal 1 203 I 235 I 249 I t ILicoperslcom esculentum hypocotyle + I + + iSolanum tuberosum tubercule + I + + 0 IGlyclne max hypocotyle + | + + IBeta vulgaris racine + | + + lHelianthus annus hypocotyle + I + + IPlsum sativum lentre-noeudsl + I + I + IBrasslca campestris l I I oleacera | hypocotyle + I + + IDaucus carota I racine + I + + IPhaseolus vulgaris | hypocotyle + I + I I II. REVENDICATIONS 1) Gène chimérique utilisable pour conférer aux plantes une résistance à un herbicide à base de dlhalogéno-2,6 hydroxy-4 benzonitrile comprenant au moins un gène codant. pour la résistance à cet herbicide, un promoteur étranger et-éventuellement une zone signal de polyadénylatlon, caractérisé en ce que le promoteur provient d'un gène s'exprimant naturellement dans des cellules végétales et choisi dans le groupe comprenant le promoteur de l'ARN 35S du virus de la mosaïque du chou- fleur (CamV 35S) et le promoteur de la petite sous unité (PSU) de la rlbulose-l,5-bis phosphatocarboxylase oxygénase (RuBisCO de tournesol (Hellanthus annuus) 2) Gène chimérique selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend une zone intermédiaire non traduite (linker) entre le promoteur et le gène codant pour la résistance à l'herbicide, choisie dans le groupe comprenant la zone non traduite de pUC 19 modifié par clonage, la zone non traduite de la petite sous unité de la RuBisCO du maïs et la zone non traduite de la petite sous unité de la RuBlsCO du tournesol. 3) Gène chimérique selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il contient en outre, entre la zone intermédiaire et la zone codante pour la résistance à l'herbicide, une zone codante pour un peptide de transit capable de faire entrer la protéine dans le chloroplaste des plantes à transformer. 4) Gène chimérique selon le revendication 3, caractérisé en ce que la zone codante pour le peptide de transit est celle de la petite sous unité de la RuBlsCO de maïs. ) Gène chimérique selon le revendication 3, caractérisé en ce que la zone codante pour le peptlde de transit est celle de la petite sous unité de la RuBisCO de tournesol. 6) Gène chimérique selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la zone de polyadénylatlon provient du gène de la nopaline synthase. 7) Gène chimérique selon l'une des revendications 1 à 5, 0 caractérisé en.ce que la zone de polyadénylation provient du gène de la petite sous unité de la RuBisC0 du maïs. 8) Gène chimérique selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le gène code pour la résistance au bromoxynil ou à l'ioxynil ou l'un de leurs dérivés dels ou esters. 9) Vecteur utilisable pour la transformation de plantes en !0 plantes résistantes à un herbicide à 'base de dihalogéno-2,6 hydroxy-4 benzonitrile, caractérisé en ce qu'il comprend un gène chimérique selon l'une des revendications 1 à 8. !5 10)Vecteur selon la revendication 9 caractérisé en qu'il est constitué d'un plasmide. ll)Mlcroorganisme contenant un gène chimérique selon l'une des revendications I à 8. DO 12)Cellule végétale comportant un gène de résistance à un herbicide à base de dihalogéno-2,6 hydroxy-4 benzonitrlle obtenue par intégration du gène selon l'une des revendications 1 à 8. 13)Plante ou partie de la plante transformée caractérisée en ce qu'elle est obtenue par régénération à partir de cellules végétales selon la revendication 12. 14)Semences de plantes transformées obtenues à partir de plantes selon la revendication 13. )Procédé de désherbage sélectif de plantes à l'aide d'un herbicide à base d'un dlhalogéno-3,5 hydroxy-4 benzonitrlle caractérisé en ce que l'herbicide est - appliquée à une plante transformée selon l'une des revendications 13 et 14. 16)Utllisatlon du gène chimérique selon l'une des revendications 1 à 8 comme marqueur de sélection de cellules végétales, de cals, de partie de plantes ou de plantes.