FR 2619314 A1 19890217 FR 8711415 A 19870811 Le clonage du cADN du facteur VIII (FVIII) (1-3) a permis de mieux comprendre la structure et les fonctions de cette molécule complexe. Le premier produit de traduction du mARN est une molécule de 2.351 acides aminés, comprenant un peptide signal de 19 acides aminés. On observe des homologies internes dans les séquences en acides aminés qui permettent de définir des domaines: un triplet de domaines A, un domaine B unique et un doublet de domaines C, disposés dans l'ordre suivant: Al-A2-B-A3-Cl-C2 (2, 4). Le domaine B unique est codé par un exon de 3.100 pb (exon 14 du gène FVIII) (5) et contient 19 des 25 sites potentiels de glycosylation (Asn); cette partie de la molécule est clivée et perdue lors de l'activation par la thrombine (2, 4, 6). Le modèle actuel du mécanisme de maturation du fac- teur VIII est schématisé dans la figure 1. Dans ce modèle, la première activation est due à un clivage de la molécule entre les acides aminés Arg1648 et Glu1649 ce qui donne un précurseur de la chaîne légère de 80 Kd et un précur- seur de la chaîne lourde de > 200 Kd. Les 2 chatnes sont probablement reliées par un ion métallique (Ca++ ?) avant que le clivage ne soit réalisé. Ensuite le domaine B est dégradé par plusieurs cli- vages protéolytiques, puis l'activation par la thrombine s'ef- fectue par un clivage entre les acides aminés Arg739 et Ser740 et entre Arg1689 et Ser1690 ce qui donne une chatne lourde de Kd et une chaîne légère de 73 Kd. La nécessité d'un clivage supplémentaire entre Arg371 et Ser372 pour obtenir une activi- té maximale est encore controversée; ce clivage pourrait au contraire déstabiliser la molécule (6, 7). Il est généralement admis qu'une incubation prolon- gée en présence de thrombine entraîne une rapide diminution d'activité. D'autres facteurs peuvent également inactiver le facteur VIII comme la protéine C activée et le facteur Xa qui clive la molécule en plusieurs points, en particulier à Arg336/Met337 (7). Dans ce processus de maturation, en remarque que le domaine B ne joue pas de rôle dans l'activité de la molécule mature puisqu'il est perdu après activation par la thrombine. De plus, Toole et al. (8) ont comparé les séquences nucléoti- diques des gènes du facteur VIII humain et porcin et ont mon- tré que les 2 domaines B sont très divergents alors que les chaînes lourde et légère sont très conservées. Ceci suggère (8, 9, 10, 11) qu'une molécule dépourvue de do- maine B ne perdrait pas sa fonction procoagulante. Deux approches ont été suivies pour tester cette hypothèse: soit la délétion, dans le cADN, de grands frag- ments d'ADN correspondant au domaine B ce qui donne des déri- vés du facteur VIII plus courts (8, 9), soit la co-expressior dans des cellules de mammifères de fragments d'ADN correspon- dant aux chaînes lourde et légère (10, 11). La co-expression dans des cellules de mammifères de chaînes lourde et légère résulte en une production détectablE de FVIII:C mais à un niveau 5 fois inférieur à celui obtenu par l'expression de la molécule complète. Ceci suggère que l'association des 2 chaînes est inefficace ce qui diminue l'activité de la molécule (10, 11). Ces expériences ont montré qu'une molécule dépourvt de la plus grande partie du domaine B mais qui a conservé lez sites de maturation correspondant aux acides aminés 740, 164 et 1690 (qui semblent nécessaires à l'activation) présente ur activité procoagulante normale et de plus, a l'avantage d'êti exprimée 10 fois plus efficacement dans les cellules de mammi fères (8). Cette molécule peut être activée par la thrombine de la même manière que la molécule naturelle entière (9). Le facteur VIII circulant dans le plasma est associé au facteur von Willebrand (fvW) qui semble le stabiliser; en effet la demi-vie du FVIII in vivo diminue très fort en absen- ce de fvW (16). Eaton et al. (9) ont décrit un dérivé du facteur VIII délété dans le domaine B, qui lie efficacement le fvW, ce qui permet d'attendre une demi-vie normale in vivo pour la molécule délé- tée du domaine B. La présente invention concerne l'analogue du facteur VIII dont les acides aminés 771 à 1666 ont été délétés. On l'appellera aussi tout au long de la description et des exem- ples FVIIIAII. L'analogue du facteur VIII selon la présente inven- tion est, de préférence, préparé à partir d'une culture de cellules eucaryotes produisant ledit analogue sur un milieu de culture approprié et de la séparation du facteur VIII obtenu. Les cellules ont, de préférence selon l'invention, été infectées par un vecteur viral recombinant tel que le virus de la vaccine qui assure l'expression du cADN de l'ana- logue du facteur VIII dans les cellules. Il s'agit, de préfé- rence des cellules BHK21. Mais, dans le cadre de la présente invention, on peut aussi transfecter les cellules par un vecteur d'intégra- tion comportant le cADN de l'analogue du facteur VIII entouré des éléments nécessaires à son expression dans les cellules eucaryotes et un segment d'ADN favorisant l'intégration du vecteur dans l'ADN cellulaire. Dans ce cas, le cADN codant pour l'analogue du fac- teur VIII est, de préférence, inséré devant un gène codant pour un marqueur de sélection pour donner un produit de trans- cription bicistronique. 4 2619314 Les cellules transfectées sont, de préférence, des cellules CHO. Enfin, la présente invention concerne une compositi- on pharmaceutique comportant, à titre de principe actif, l'a- nalogue du facteur VIII de la présente invention. Une telle composition peut contenir, en outre, le facteur von Willebrand. La composition pharmaceutique de la présente inven- tion se présente de préférence, sous forme stérile injectable La présente invention sera mieux comprise à la lec- ture des exemples illustrés à l'aide des figures suivantes: Figure 1: Schéma de la maturation de la molécule du facteur VIII par clivages protéolytiques successifs (d'a- près Toole et al. 1984 (2) et Eaton et al. 1986 (7). Figure 2: Schéma de la molécule du facteur VIII et des 2 délétions AI (aa 868 a 1562) et AII (aa 771 a 1666). Les sites de clivage par la thrombine (IIa) et par une protéase inconnue (X1 en position 1649) sont indiqués par des flèches. La ligne inférieure représente la séquence du cADN avec les sites de restriction utilisés dans les diverses constructions. Figure 3: Schéma du vecteur d'expression du rFVIII utilisé pour transformer les cellules CHO. Figure 4: Cinétique d'activation par la thrombine des diffé- rentes molécules de facteur VIII: pd = dérivé du plasma r = molécule recombinante intacte aII = molécule délétée AII Note: La numérotation des nucléotides et des acides aminés est celle de Wood et al. (1). Exemple 1 Construction de plasmides portant des dérivés du cADN du facteur VII, délétés dans la région correspondant au domaine B. Le plasmide de départ est le plasmide pTG1080 qui porte le cADN de facteur VIII, des nucléotides -64 à 8230, cloné dans le site SalI de pUC8 (Ce plasmide a été décrit dans le brevet français 86.08258). A partir de ce plasmide, 2 dérivés ont été préparés, l'un (AI) comprenant une délétion dans le domaine B correspon- dant aux acides aminés 868 à 1562; l'autre (AII) correspon- dant A une délétion des acides aminés 771 à 1666. La construction AII abolit donc le site de clivage en position 15. 1649. Les 2 constructions sont schématisées dans la figure 2. a) Le plasmide pTG1080 a été digéré par l'enzyme PstI pour libérer un fragment de 2.7 kb comprenant l'extrémité 5' correspondant aux nucléotides -64 a 2641 du cADN du facteur VIII. Ce fragment PstI a été cloné dans le vecteur pTGlPOLY (vec- teur de clonage dérivé de pML2 comportant une origine de réplication active dans E. coli et le gène de la p. lacta- mase, dans lequel on a inséré un "polylinker" présentant 12 sites de restriction uniques. Ce vecteur est identique au vecteur pTG14 décrit dans le brevet PCT-FR85/00096, à l'ex- ception du "polylinker" qui remplace le "linker" HindIII. Dans cette construction, le site BglII du polylinker se trouve adjacent du site PstI (nucléotide 2641) de la sé- quence FVIII. Ensuite on introduit dans ce site BglII, la position 3' de la séquence codante du FVIII (nucléotides 4801 à 8230) sous forme de fragment BamHI également isolé A partir du pTG1080. La construction présentant les 2 segments du FVIII dans l'orientation correcte est appellée pTG1501. La séquence di cADN FVIII portée par cette construction est appelée FVIIIAI. La jonction PstI/BglII/BamHI ainsi formée préserve la phase de lecture du FVIII. b) A partir du pTG1501, on récupère un fragment KpnI-SphI (correspondant aux nucléotides 1811 à 6580) pour l'intro- duire dans le vecteur M13TG131 (20) et le déléter des nu- cléotides 2.367 à 5056, par la technique dite de "loop out mutagenesis" (17), avec un oligonucléotide de synthèse ayant la séquence suivante: 'TCATTTCAACTGATATGGTGTCAGTCTT3' Le vecteur délété est appelé M13TG1510; la séquence de cADN FVIII délétée est appelée FVIIIAII. L'analyse par séquençage confirme que la séquence est correcte. Exemple 2 Expression des séquences FVIIIAI et AII par des virus recombinants de la vaccine. Dans le brevet français 86.08258 on a décrit le plasmide pTG1016 qui porte la séquence de cADN du facteur VII en aval du promoteur du gène codant pour la protéine 7.5 K du virus de la vaccine et ce bloc d'expression est inséré dans 1 gène TK du virus de la vaccine. Un dérivé du plasmide pTG1016, le pTG1030 (identiqu au précédent sauf une délétion BglII-PstI dans la région 5' non traduite de la séquence FVIII) a été utilisé pour intègre les constructions délétées, FVIIIAI et AII, à la place de la séquence native, dans le vecteur conçu pour permettre l'inté- gration dans le génome du virus de la vaccine. Le fragment BamHI-BglII (corespondant aux nucléoti- des 1864 à 6056) de la séquence native du pTG1030 est excisé et remplacé par le fragment BamHI-BglI du pTG1501 (FVIIIAI) pour donner le pTGl506 ou par le fragment BamHI-BglI du Ml3TGl510 (FVIIIAII) pour donner le pTGl507. Les blocs d'ADN comprenant le gène TK de la vaccine interrompu par le cADN FVIIIA placé sous le promoteur 7.5 K de la vaccine, sont intégrés dans le génome du virus de la vacci- ne, par recombinaison homologue, selon la technique classique (18). Les virus recombinants correspondants sont appelés VV.TG.FVIII1506 (FVIIIAI) et VV.TG.FVIII507 (FVIIIAII). Les virus recombinants sont utilisés pour infecter des tapis cellulaires de BHK21 (2.106 cellules) avec 1 ufp/ cellule. Après 1 heure d'adsorption, les cultures sont lavées et renouvelées en milieu frais sans sérum, additionné de 1 % BSA et 1 mM CaCl2. Des échantillons de milieu sont prélevés après 24 et 48 heures et dosés pour la quantité de facteur VIII présent, déterminée par dosage radioimmunométrique (FVIII:Ag) et pour l'activité procoagulante du facteur VIII (FVIII:C). L'antigène FVIII ou FVIIIA est dosé "en sandwich" entre de l'immunoglobuline G du sérum de patient hémophile inhibiteur, adsorbée sur la paroi du tube a essai, et un anti- corps monoclonal anti-facteur VIII, spécifique d'un épitope de la chaine légère, radioactif, selon une méthode décrite par Lee et al. (21). La mesure de l'activité du facteur VIII (FVIII:C) est réalisée classiquement par le temps partiel de thrombo- plastine activée (TPTA) (22). Les résultats sont présentés dans le tableau sui- vant. Tableau 1: Détermination de la quantité de FVIII:Ag et de l'activité procoagulante FVIII:C dans le surna- geant de cultures de BHK21 infectées avec les virus WVV recombinants (résultats exprimés en mU/m - seuil de détection = 1 mU/ml). WVV recombinants 24 heures 48 heures FVIII:C FVIII:Ag FVIII:C FVIII: VV.TG.1030 (FVIII) 47.5 78.5 42.5 120.0 VV.TG.1506-9 (FVIIIAI) 110.0 128.0 155.0 187.5 VV.TG.1507-6 (FVIIIAII) 160.0 486.7 548.0 615.C Les résultats montrent que les 2 molécules délétées sont biologiquement actives dans un test de coagulation san- guine et qu'on obtient une plus grande quantité de protéine avec les constructions FVIIIA qu'avec le FVIII intact (augmer tation de 2 fois avec FVIIIAI et de 5 fois avec FVIIIàII). De plus l'activité FVIII:C ne chute pas entre 24 et 48 heures alors qu'elle chute avec la molécule intacte. On sait que celle-ci doit être stabilisée par du facteur von Willebrand pour garder son activité (brevet français 86.08258). Exemple 3 Etablissement de lignées cellulaires exprimant le facteur VIII ou le facteur VIIIAII. 1) Construction de plasmides Les séquences codantes du facteur VIII et du facteur VIIIAII ont été introduites dans un vecteur, pTG384, conçu pour favo. riser son intégration dans le génome de cellules de mammifères sous forme de multicopies. Ce vecteur a été décrit dans le brevet français 86.09043. Les éléments importants de ce vec- teur (voir figure 3) sont: a) un segment d'ADN mitochondrial murin qui favorise l'inté- gration des séquences exogènes d'ADN sous forme de plusi- eurs copies en tandem (15). b) une cassette d'expression comprenant les séquences "enhancer"(activateur de transcription) du SV40 (sé- quences répétitives de 72 pb), le promoteur majeur tar- dif (MLP) de l'Adénovirus 2, le gène codant pour le mar- queur de sélection XGPRT (xanthine-guanine phospho- riboxyl transférase). Le vecteur est conçu pour permet- tre l'insertion en 5 ' du gène XGPRT d'un cADN choisi, de manière à obtenir un produit de transcription bicis- tronique. Le vecteur comprend encore, en 3' du XGPRT, l'intron du petit antigène t de SV40 et ses séquences de polyadénylation. c) la propagation du vecteur dans E. coli est assurée par l'origine de réplication ColEl. Les séquences codantes du FVIII ont été insérées dans le vecteur pTG384, dans le site unique HindIII (en amont du gène XGPRT). Les extrémités libérées par la digestion HindIII sont rendues franches par traitement au fragment Klenow de l'ADN polymérase I. On récupère la séquence complète du FVIII à partir du plasmide pTG1080 (voir exemple 1) sous forme de fragment SmaI-HpaI (le site SmaI est situé dans le "polylinker" en amont de l'ATG initiateur et le site HpaI est situé au nuclé- otide 7.434). La ligation de ce fragment dans le vecteur pTG384 ouvert par HindIII et traité à la Klenow donne le plas- mide pTGl020. Pour faire la construction analogue avec le gène délété du facteur VIII, on échange, dans le pTG1020, le frag- 1 2619314 ment BamHI-BglI (nucléotides 1864 et 6050 du FVIII) avec le fragment FVIIIAII, BamHI-BglI du M13TG1510, selon le même principe que pour la construction de pTG1507. Le vecteur pTG304 ayant inséré le FVIIIAII est appelé pTG1509. 2) Transfection des cellules CHO avec les plasmides pTG1020 et pTG1509. Des tapis de cellules CHO ont été transfectés avec l'ADN des plasmides pTG1020 (FVIII) ou pTG1509 (FVIIIAII) par la méthodE du précipité au phosphate de calcium (19), avec 5 ou 10 g d'ADN par boîte de 8,5 cm de diamètre. 48 heures après la transfection, les cellules sont trypsinées, diluées et inocu- lées en milieu sélectif MEM "2000 supplémenté avec de l'hypo- xanthine (15 mg/l), de la thymidine (10 mg/1), de la xanthine (250 mg/l), de l'aminoptérine (0.2 mg/l), de l'acide mycophé- nolique (25 mg/l) et 10 % de sérum de veau foetal dialysé. Après 2 semaines, les clones de cellules résistantes au miliet sélectif sont prélevés, mis en cultures en cupules de 1 ml puis de 2 ml. Quand les cellules atteignent 70 % de conflu- ence, le milieu est enlevé, les tapis cellulaires sont lavés et renouvelés en milieu frais contenant 5 % de sérum inactivé (pour éviter un important "background" (bruit de fond) dans les tests de coagulation). Après 24 heures le milieu est récolté et analysé pour la pré- sence (FVIII:Ag) et l'activité (FVIII:C) du facteur VIII. Plusieurs clones ont été obtenus. En première analyse, il apparatt que la plupart des clones exprimant le FVIII complet produisent moins de matériel que les clones exprimant le fac- teur VIIIAII. Deux clones ont été sélectionnés: CHO-TG1020-22-12 qui exprime le FVIII complet et CHO-TG1509-18 qui exprime le FVIIIAII. i1 Les niveaux d'expression et d'activité FVIII sont présentés dans le tableau suivant: Tableau 2: Détermination de FVIII:Ag et FVIII:C (en mU) dans le surnageant des clones de CHO (106 cellules), récolté après 24 heures. FVIII:Ag FVIII:C CHO-TG1020-22-12 63 60 CHO-TG1509-18 504 500 On observe une production de facteur VIIIAII 10 fois supéri- eure à celle du facteur VIII complet, ce qui confirme les résultats observés dans le modèle vaccine. Exemple 4 Activation par la thrombine des diverses molécu- les de facteur VIII natif et recombinants. Différentes molécules de facteur VIII ont été compa- rées dans une cinétique d'activation par la thrombine: le facteur VIII natif dérivé du plasma et le facteur VIII recom- binant, complet et AII, exprimés dans les clones CHO. L'activation est mesurée dans un test classique de coagulation (TPTA) après incubation en présence de quantité catalytique de thrombine. La figure 4 montre que le FVIII recombinant et le FVIII plasmatique sont activés de la même façon (d'un facteur ) et suivant des cinétiques très voisines. Le FVIIIAII est activé beaucoup plus fort (d'un facteur 80 après 5 minutes d'incubation avec la thrombine). 12 2619314 Bien que le facteur VIIIAII soit beaucoup plus acti- vé, il n'est pas activé plus rapidement que les 2 autres molé- cules (contrairement à ce qui a été observé par d'autres (9) avec leurs constructions facteur VIIIA) ce qui montre que le facteur VIIIAII n'est pas préactivé, ce qui est important en vue de son utilisation thérapeutique. Le fait que le FVIIIAII n'est pas préactivé est confirmé par la bonne corrélation entre les niveaux de FVIII:Ag et de FVIII:C, a la fois dans le modèle vaccine et dans les lignées CHO. Dépôt de souches représentatives de l'invention Les souches suivantes ont été déposées A la Collec- tion Nationale de Culture des Microorganismes, 25 Rue du Docteur Roux, Paris, le 24 juillet 1987: E. coli BJM83/pTG1020, sous le n 1-679 E. coli 5K/pTG1507, sous le ne 1-680 E. coli BJ1509/pTG1509, sous le no 1-681 13 2619314 REFERENCES 1) Wood, W.I. et al. Nature 312, 330 (1984). 2) Toole,.J.J et al. Nature 312, 342 (1984). 3) Truett, M.A. et al. DNA 4, 333 (1985). 4) Vehar, G.A. et al. Nature 312, 337 (1984). ) Gitschier, J. et al. Nature 312, 326 (1984). 6) Fulcher, C.A. et al. Blood 61, 807 (1983). 7) Eaton, D.L. et al. Biochemistry 25, 505 (1986). 8) Toole, J.J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5939 (1986). 9) Eaton, D.L. et al. Biochemistry 25, 8343 (1986). ) Burke, R.L. et al. Biol. Chem. 261, 12574 (1986). 11) Pavirani, A. et al. In press. 12) Pavirani, A. et al. Bio/Technology (1987). 13) Mulligen, R.C. and Berg, P. Proc. Natl. Acad. Sci. 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REVENDICATIONS 1) Analogue du facteur VIII caractérisé en ce qu'il s'agit du composé délété des acides aminés 771 à 1666. 2) Procédé de préparation de l'analogue du fac- teur VIII selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on cultive des cellules eucaryotes produisant ledit analogue sur un milieu de culture approprié, et en ce qu'on sépare l'analo gue du facteur VIII obtenu. 3) Procédé selon la revendication 2, caractéris en ce que les cellules eucaryotes ont été infectées par un vecteur viral recombinant assurant l'expression du cADN codan pour l'analogue du facteur VIII. 4) Procédé selon la revendication 3, caractéris en ce que le vecteur viral est le virus de la vaccine. ) Procédé selon l'une quelconque des revendica tions 3 ou 4, caractérisé en ce que les cellules infectées sont des cellules BHK21. 6) Procédé selon la revendication 2, caractériE en ce que les cellules eucaryotes ont été transfectées par ur vecteur d'intégration comportant le cADN de l'analogue du facteur VIII et les éléments nécessaires A son expression dar lesdites cellules eucaryotes ainsi qu'un segment d'ADN favori sant l'intégration du vecteur dans l'ADN cellulaire. 7) Procédé selon la revendication 6, caractéri! en ce que le cADN codant pour l'analogue du facteur VIII est inséré devant un gène codant pour un marqueur de sélection pour donner un produit de transcription bicistronique. 8) Procédé selon les revendications 6 et 7, caractérisé en ce que les cellules eucaryotes sont des cellu- les CHO. 9) Composition pharmaceutique comportant à titre de principe actif l'analogue du facteur VIII selon la revendi- cation 1. ) Composition pharmaceutique selon la revendi- cation 9, caractérisée en ce qu'elle contient en outre le facteur von Willebrand. 11) Composition pharmaceutique selon l'une quel- conque des revendications 9 ou 10, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une composition sous forme stérile injectable.