FR 2622207 A1 19890428 FR 8714547 A 19871021 La présente invention concerne de nouveaux vecteurs viraux d'intégration et d'expression d'un gène hétérologue dans des cellules aviaires et constitue un développement de l'invention, objet des demandes de brevet FR 84 15764 et EP 178 996 (85 40 1999) auxquelles il conviendra de se reporter pour la meilleure intelli- gence de la présente demande. La présente invention concerne également des plasmides d'intégration et d'expression d'un gène hété- rologue dans des cellules compétentes. La présente invention concerne en outre des cellules infectées ou transfectées par ces vecteurs vi- raux ou plasmides. Enfin, la présente invention concerne un procé- dé de production d'une protéine par culture de ces cellules infectées ou transfectées, ainsi qu'un procédé de modification génétique d'animaux à l'aide de ces vec- teurs viraux. Le génome rétroviral représente une structure intégrée qui pilote un fonctionnement cyclique; l'une des phases de ce fonctionnement comporte une intégration régulière du génome viral dans l'ADN cellulaire. A cette caractéristique sont associées d'autres propriétés qui, par divers mécanismes, confèrent à certains de ces virus des propriétés pathogènes vis-à-vis de leurs hôtes. Un objectif de la présente invention est d'uti- liser certaines propriétés des structures rétrovirales pour transférer des gènes à des animaux entiers, dans leurs structures somatiques, en vue de "thérapie génique", ou dans leurs structures germinales, en vue de transmission à la descendance. Pour atteindre cet objectif, il faut décomposer le fonctionnement de la structure rétro- virale afin de n'en conserver que les composants dont l'utilisation est justifiée par l'objectif recherché. Simultanément, on éliminera toutes les parties suscep- tibles d'exercer des effets pathogènes. En particulier, on devra proscrire absolument toute transmission, aux sujets cibles, d'oncogènes potentiellement dangereux ou de structures capables de permettre à la multiplication virale de se poursuivre chez la cible choisie. Selon la présente invention, on a recherché l'optimisation de vecteurs rétroviraux L'optimisation des vecteurs a été recherchée en travaillant respectivement sur l'activité des promo- teurs et sur l'efficacité du système de maturation et de traduction des ARN. Les différents promoteurs qui ont été testés ont été placés dans des vecteurs contenant le gène neo. Les constructions réalisées sont présentées ci-après. Le pAG60 produit par COLBERE-GARAPIN a été employé comme point de départ. Il contient le promoteur du gène TK (thymidine kinase) de l'Herpes simplex virus (HSV), le gène neo et la séquence renfermant le site de polyadényl- ation du même gène TK. Le vecteur pAGLTR contient la région promoteur du virus de l'érythroblastose aviaire (AEV) sous la forme de deux LTR en tandem, ainsi qu'une partie de la région leader. Le vecteur pGASneo renferme le promoteur précoce du virus SV40. Le vecteur PRASTneo, enfin, associe l'enhancer de la LTR de RAV-2 aux éléments initiateurs de la transcription précoce de SV40. Ces 4 vecteurs sont clones dans pBR322. L'activité de ces vecteurs, après insertion stable, est examinée sur CEF et sur QT6. Ces cellules sont transfectées par les différents vecteurs selon la méthode décrite par KAWAI. Une gamme portant sur la quantité d'ADN transfecté est réalisée sur CEF. Les cellules transfectées sont soumises à sélection par addition de G418 (200 gg/ml). La sélection est poussée jusqu'à disparition complète des cellules sur une boîte témoin de CEF non transfectées. Puis la sélection est levée et les foyers sont dénombrés. Les meilleurs ré- sultats sont obtenus lorsque l'on transfecte 1 gg d'ADN vecteur; si l'on augmente la quantité d'ADN transfecté, le nombre de transformants stables d1minue. Sur CEF le vecteur pAGLTR conduit à l'obtention du plus grand nombre de foyers, il apparaît 2 fois plus efficace que le vecteur pGASneo. Les vecteurs pAG60 et pRASTneo ne permettent pas l'obtention, sur CEF, de foyers de ré- sistance à la drogue. L'expérience est répétée sur QT6 avec 1 gg d'ADN transfecté: on n'observe pas alors de différences significatives entre les vecteurs pAGLTR, pGASneo et pRASTneo. Le vecteur pAG60 quant à lui ne produit aucun transformant. Ainsi, on observe une gradation dans l'effica- cité relative des différents vecteurs sur CEF. Sur QT6, seul pAG60, dépourvu d'enhancer, reste inefficace. On note, en particulier, que le vecteur pRASTneo est très efficace sur QT6 et pratiquement inefficace sur CEF. Cette différence résulte peut-être de la production, par la cellule QT6, de facteurs capables d'activer les enhancers. La production de tels facteurs pourrait carac- tériser les cellules de Caille par opposition aux cellules de Poulet ou bien tenir au caractère immortel de la lignée employée. Une difficulté majeure, dans l'expression des gènes portés par des vecteurs dérivés de l'AEV, résulte du mécanisme de traduction particulier des oncogènes erb-A et erb-B chez l'AEV sauvage: la traduction n'est pas initiée à des codons AUG respectifs de ces gènes (V-erb A n'a pas d'AGU; l'AUG de V-erb B est un codon interne). L'initiation se fait au codon initiateur du résidu du gène gag situé en 5' du gène erb-A. Il en résulte la production de deux protéines fusion dites gag-erb A et gag-erb B. Plusieurs vecteurs véhiculant le gène néoR ont été construits. Ce gène a été inséré soit à la place de l'oncogène erb-A, soit à la place de l'oncogène erb-B et, pour chacune des deux positions, il a été inséré soit dans la même phase de lecture que l'oncogène qu'il remplace, soit dans une phase de lecture différente. Dans une cons- truction, on a délété la partie 3' terminale du résidu du gène gag en vue de réduire la longueur de la protéine fusion gag-neo. Dans d'autres, cette région a été simple- ment déplacée, de façon à conserver les fonctions d'encap- sidation et de stimulation de transcription qu'elle est susceptible d'exercer. On a cherché à déterminer: - quelles configurations conduisent à une production maximale de néomycine phospho-transférase; - s'il est possible d'obtenir une protéine néomycine phosphotransférase ne comportant pas les acides aminés NH2 terminaux codés par le gène gag et dont la tra- duction serait initiée au niveau de l'AUG propre du gène néoR. Les différentes constructions réalisées ont été transfectées sur des CEF en culture. Les cellules exprimant le gène néoR sont sélectionnées en présence de G418. Un apport initial de virus helper permet d'obtenir des particules virales vecteurs dans le sur- nageant des cultures. Ces particules ont servi à infec- ter d'autres fibroblastes qui, à leur tour, deviennent résistants à l'antibiotique de sélection. Les protéines cellulaires sont alors extraites et l'activité néomy- cine phosphotransférase dosée. Les premiers résultats peuvent être énoncés comme suit: 1. l'activité maximale est obtenue lorsque le gène néoR est inséré dans la même phase de lecture que celle de l'oncogène qu'il remplace (production de protéines fusion gag-néo; vecteurs TXN5', XJ12, TXN3' et TXN3'gag-); 2. pour obtenir la production d'une protéine néomycine phosphotransférase dont la traduction soit initiée à 1'AUG propre du gène néoR, il faut insérer ce dernier dans une phase de lecture différente de celle de l'on- cogène qu'il remplace. Dans ces conditions, l'activité néomycine phosphotransférase détectée est relativement faible lorsque le gène se trouve en position erb B (XJ1); cette activité est en dessous du seuil de sen- sibilité de la méthode lorsque le gène est placé en position erb-A (TXhoN et TSN). Bien que très faible, cette activité suffit pour conférer à ces cellules la résistance au G418; 3. la délétion de la partie 3' terminale du résidu du gène gag réduit l'activité néomycine phosphotransférase d'un facteur 2 (comparer TXN3' avec TXN3'gag-). Chez le RSV, cette région contient une séquence de type enhancer. L'effet observé pourrait donc s'exercer par un mécanisme transcriptionnel. La présence du gène erb-A dans le vecteur entraîne un doublement de la quantité d'enzymes produite. Cet effet se relie peut-être à l'action stimulatrice de ce gène sur la multiplication cellulaire. L'étude de l'activité des promoteurs montre que, dans des cellules de poulet normales, l'emploi d'un promoteur de LTR aviaire s'impose. Les promoteurs du gène TK n'y exercent aucune activité. Le promoteur de SV40 exerce une activité plus faible que celle d'une LTR aviaire. Les cellules QT6 peuvent utiliser une struc- ture mixte LTR-SV40 inefficace dans des CEF. On peut envisager d'exploiter de telles différences d'activité pour produire des vecteurs dans des hôtes différents de la cible définitive envisagée, lorsqu'on souhaite que, dans cette dernière, le gène soit animé par un promoteur qui lui soit propre. L'expression du gène néoR est maximale lorsque son mécanisme de traduction mime celui des oncogènes erb-A ou erb-B qu'il remplace. Il s'instaure alors une compétition entre l'AUG du gène gag et celui du gène néoR pour l'initiation de la traduction; cette compétition s'avère totalement à l'avantage de l'AUG viral. Dans certaines structures, on peut observer le fonctionnement d'un promoteur spécifique du gène neo. Mais le niveau d'expression reste alors très bas. Une amélioration con- siste à introduire un signal d'arrêt de traduction dans le gène gag. Ce signal permet une réinitiation de la tra- duction à l'AUG du gène néoR et donc la production d'une néomycine phosphotransférase non fusionnée à la protéine virale gag. En effet, il s'avère nécessaire pour certaines applications, d'obtenir une expression spécifique de la séquence exogène, afin de conserver toutes les caracté- ristiques de la protéine codée. La présente invention a donc pour objet un vecteur viral d'intégration et d'expression d'un gène hétérologue dans des cellules aviaires, caractérisé en ce que le vecteur est constitué à partir du génome pro- viral de l'érythroblastose aviaire dans lequel le gène hétérologue remplace au moins l'un des gènes V erb A et/ou V erb B et en ce que ce gène hétérologue est sous le contrôle d'un promoteur efficace dans lesdites cellules notamment d'un promoteur de LTR aviaire en particulier pour l'intégration dans les cellules de poulets et d'un promoteur mixte dans les cellules de cailles et en ce que ledit gène hétérologue mime le gène qu'il remplace, c'est-à-dire qu'il est introduit au même endroit et dans la même phase que le gène qu'il remplace. Selon une autre caractéristique, le gène hétérologue est traduit à partir de l'AUG du gène gag avec lequel il est en phase. De préférence, on introduit un codon stop entre le gène gag et le gène hétérologue. Par gène hétérologue, on entend désigner un gène qui n'est pas normalement présent dans le génome du virus de l'érythroblastose aviaire, il peut s'agir d'un gène codant pour une protéine d'intérêt industriel destinée a être obtenue par culture cellulaire ou bien d'un gène pouvant présenter un intérêt particulier dans le traitement ou l'élevage des oiseaux notamment les poulets, gène assurant la vaccination ou un meilleur développement par exemple. Les vecteurs viraux évoqués dans le cadre de la présente invention peuvent être aussi bien des vecteurs plasmidiques ou éventuellement des fragments d'ADN que des vecteurs viraux vrais à ARN comme cela a été déjà mentionné dans les brevets précédents de la demanderesse. De façon appropriée, le gène hétérologue est un gène marqueur. Par exemple, le gène marqueur est un gène de résistance à un antibiotique. Plus particulièrement, l'antibiotique peut être le G418 ou l'hygromycine. L'infection d'une cellule par un rétrovirus entraîne la production d'un ADN proviral circularisé, comportant soit une LTR, soit deux LTR en tandem. Les données récentes ont montré que cette dernière forme remplit une fonction décisive dans le processus d'inté- gration de l'ADN proviral au sein de l'ADN cellulaire. En effet, la disposition de deux LTR en tandem crée une structure appelée att qui comporte 30 nucléotides: 20 sont portés par le segment U5 de la partie 3' terminale de la LTR 3' et 10 sont portés par le segment U3 de la partie 5' terminale de la LTR 5'. Le fonctionnement de cette structure exige l'intervention d'une activité nucléasique portée par le gène Pol. Selon la présente invention, on a exploité les propriétés de la séquence att pour obtenir l'intégration d'ADN plasmidiens sans autre relation avec une séquence rétrovirale. Un segment de 88 pb portant la séquence att a été extrait d'un clone pJS21 portant un doublet de LTR. Ce segment a été inséré dans un plasmide pX343 qui comporte un promoteur SV40 contrôlant un gène bac- térien de résistance à l'hygromycine. En 3' de ce gène, on a placé un fragment de SV40 portant la séquence de polyadénylation des ARN précoces de SV40. Deux vecteurs ont ainsi été produits (pXatt3,pXatt5) portant respec- tivement une séquence att en orientation directe ou en orientation inverse par rapport à celle du gène Hygro. Les plasmides précédents ont été transfectés sur des cellules QT6,soit non infectées, soit préalable- ment infectées par un virus RAV-1 destiné à apporter l'activité Pol. Les cellules ainsi traitées ont été sé- lectionnées par l'hygromycine B à la concentration de gg/ml. L'intervention du virus RAV-1 produit systéma- tiquement une réduction de la viabilité en culture et donc un amoindrissement du nombre de clones résistants obtenus. Compte tenu de l'ensemble des facteurs en cause, il ne semble pas que l'insertion d'une séquence att donne lieu à une intégration intrinsèquement plus fréquente que les intégrations observées en son absence. 13 clones cellulaires, transformés par pXatt5 (7 en présence de RAV-1; 6 en absence de RAV-1) ont été amplifiés et leurs ADN ont été examinés après diges- tion par des enzymes qui ne coupent qu'une seule fois dans les plasmides employés. L'hybridation est faite à l'aide du plasmide pX343. On observe dans tous les cas une bande de 6kb, d'intensité variable selon les clones. Dans la plupart de ceux-ci, on observe, en plus, deux bandes supplémentaires de dimensions variables selon les clones. Dans certains clones, on observe plus de deux bandes supplémentaires. Ces résultats montrent que les intégrations se sont faites sous forme de concatémères. Ceux-ci sont coupés par l'enzyme en fragments d'une longueur égale à celle du monomère initial d'ADN transformant. Les bandes variables représentent les bandes de jonction avec l'ADN cellulaire. La présence de plus de deux bandes dans certains clones peut résulter, soit de plusieurs intégrations réalisées dans la cellule initiale du clone, soit du caractère impur de certains de ces clones qui pourraient représenter, en fait, un mélange de deux ou plusieurs clones. 7 clones transformés par pX343 ont été examinés de la même façon. La principale différence par rapport aux clones transformés par pXatt5 paraît résider dans l'intensité moindre de la bande à 6kb, semblant indiquer que les intégrations portent sur des concatémères plus courts. Ces conclusions ont été confirmées par une analyse des ADN en dot blots: l'intensité de l'hybri- dation peut être comparée à celle d'une gamme de témoins contenant des quantités connues de pX343. On estime ainsi le nombre de copies par clone avec les résultats suivants: transfection par pXatt5 seul...... 2 à 7 copies par cellule transfection par pXatt5 + RAV1.... 2 à 30 copies par cellule transfection par pX343 + RAV1..... 2 copies par cellule. Le caractère unique de la bande majeure observée montre que les concatémérisations s'effectuent entre des segments d'ADN identiques coupés en un même point et assemblés en tandem. Les observations effectuées ne prouvent pas que cette coupure se produit au niveau de la sé- quence att. Cependant, compte tenu de l'effet de l'in- fection par RAV1 et des propriétés endonucléasiques connues de l'enzyme Pol, cette supposition parait vrai- semblable. On imagine que, en présence de cette enzyme dans la cellule, les plasmides peuvent subir une coupure 1 1 uniforme dans des conditions particulièrement favorables à la réalisation d'enchaînements. Un clonage des fragments de jonction serait nécessaire pour savoir si l'intégra- tion dans l'ADN cellulaire s'effectue également au niveau des séquences att. Les clones portant un nombre élevé de copies s'avèrent plus résistants à l'hygromycine que ceux portant des copies en nombre plus faible. De sorte que la fréquence plus élevée de clones transformés observée après trans- fection par pXatt en présence de RAV1 peut être due, pour une part, à une résistance plus élevée de ceux-ci vis-à- vis des toxiques. La présente invention a donc également pour objet un plasmide d'intégration et d'expression d'un gène hétérologue dans des cellules compétentes, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide à ADN comportant au moins une séquence ATT d'un rétrovirus de ces cellules assurant l'intégration. Selon une autre caractéristique, le plasmide comporte en outre des éléments assurant l'expression du gène pol. La production des virions s'effectue le plus commodément sur des lignées cellulaires immortalisées. Deux lignées qui présentent ces propriétés sont employées: - la lignée QT6 de cellules de Caille, issue de traite- ment de ces cellules par des cancérogènes chimiques. Malheureusement, les cellules de Caille ne multiplient que les virus appartenant à certains sous groupes; - une lignée lymphoblastolde de cellules de Poulet (lignée RPL) dérivée de cellules traitées par le virus de la maladie de Marek. L'emploi de cette lignée débute seule- ment. Les lignées précédentes ne sont pas viro- productrices. Leurs propriétés tumorigènes, après in- jection à l'animal, n'ont pas été mesurées. Pour obtenir des préparations de vecteurs viraux défectifs, sans adjonction de virus helper, on a cherché à réaliser des lignées cellulaires helper (assistant) capables de fournir à un génome défectif les protéines gag, pol et env, nécessaires pour lui per- mettre de former des virions. Plusieurs constructions ont été réalisées dans ce but. a/ Une construction pHF13. Celle-ci comporte une LTR de RAV-2 délétée d'une cinquantaine de nucléo- tides dans la région qui porte le signal d'encapsidation. Elle porte les gènes gag, pol, env de RAV1. A son extrémité 3', la LTR 3' a été remplacée par la séquence de polyadénylation du gène TK du virus HSV. Une cons- truction similaire pHF 405 a subi une délétion qui s'é- tend jusqu'au segment PBS du virus, portant en tout sur nucléotides. b/ Une construction pHF13-Hygro a été réalisée à partir de pHF13. Celle-ci comporte un gène Hygro, appor- tant la résistance à l'hygromycine, inséré après la séquence de terminaison portée par pHF13. Le fonctionnement éventuel de ce gène Hygro est conditionné par une réini- tiation de la traduction dans la partie 3' d'un transcrit total. L'emploi de cette construction débute seulement. 1. Des cellules QT6 ont été cotransfectées par les constructions pHF13 ou pHF405 associées respec- tivement au plasmide pXJ12. Après sélection sur G418, 39 clones ont été isolés parmi lesquels 25 ont reçu le plas- mide pHF13 et 14 le plasmide pHF405. Sur l'ensemble de ces clones, 22 montrent un signal positif en Elisa pour la détection de la protéine P27 intracellulaire. Parmi ces clones positifs, 7 seulement relachent la protéine dans le milieu de culture. Ces 7 clones ont été testés pour la production de virions capables de transférer la résistance au G418. Deux clones (AIII2 et AII6) se sont révélés positifs dans le test. Ils renferment tous deux &la construction pHF13. Alors que les surnageants de ces clones transmettent la résistance au G418 à des CEF, ils ne transmettent pas la production virale, ce qui démontre que ces deux clones se comportent comme des clones de cellules helper. Le titrage de l'ac- tivité de ces surnageants montre que la concentration des virions renfermant un gène Neo fonctionnel est faible (environ 50 par ml de surnageant, soit 1000 à 10000 fois moins qu'une culture infectée par RAV1). L'analyse des protéines virales synthétisées - dans les clones AIII2 et AII6 montre que les protéines gag (Pr76 et P27) et pol (Pr180) sont produites à des taux 10 à 20 fois plus faibles que dans les cellules QT6 infectées par un virus helper non déficient; les ARN viraux s'y trouvent à des taux 5 à 10 fois plus faibles que dans une culture infectée. La discordance entre les déficits observés respectivement au niveau des protéines ou des ARN et à celui de la production virale suggèrent que l'explication pourrait se trouver soit dans une production réduite de la protéine env, soit dans une difficulté dans l'assemblage des particules virales. 2. 2x10 cellules QT6 ont été transfectées par les constructions pHF 13 ou pHF 405, en même temps que par une construction indépendante pX343 portant un gène Hygro fonctionnel. Après sélection par l'hygro- mycine, 90 clones cellulaires ont été isolés. Sur chacun de ces clones, on a dosé par Elisa la protéine p27, caractéristique du fonctionnement du gène gag, à la fois dans un lysat cellulaire et dans le surnageant de culture. 44 clones produisent la protéine p27 en intracellulaire. On constate l'existence d'une corrélation entre les con- centrations intracellulaire et extracellulaire de cette protéine. Tout semble se passer comme si les caractères étudiés dépendaient de deux facteurs aléatoires indé- pendants: - l'un d'eux gouvernant la production intracellulaire de la protéine p27; - l'autre gouvernant l'aptitude à voir cette protéine déversée dans le milieu de culture, dans la mesure o elle est produite par la cellule. Parmi ces 44 clones produisant la protéine p27 en intracellulaire, 22 seulement la déversent en quantité notable dans le milieu de culture. Parmi ces 22 clones, 7 se sont avérés non producteurs des virus HELPER. On note que certaines cultures non viroproductrices produisent presque autant de protéine p27 que des cultures de cellules infectées par RAV-1. 4 clones ont été sélection- nés pour leur production de protéine p27 la plus élevée. Ils renferment tous les 4 la construction pHF13. Ces clones ont été transfectés séparément par le vecteur pTXN3'. Après sélection sur G418, les cellules résistantes sont amplifiées en masse. Leur surnageant de culture est capable de transmettre la résistance au G418 à des CEF, mais ne transmet pas la production virale. Les cellules se comportent donc comme des cellules Helper. Le titrage de l'activité de leurs surnageants peut être estimé, selon les clones, à des valeurs comprises entre 3 x 103 et 2 x 104 particules TXN3' par ml de surnageant. La valeur de 2 x 104 obtenue avec le clone MBG est seulement fois plus faible que celle obtenue avec une culture co-infectée par TXN3'/RAV-1. 3. Des cellules QT6 ont été transfectées par la construction pHF13-Hygro. Huit lignées résistantes à l'hygromycine ont été obtenues. Celles qui ont été analysées s'avèrent très fortement productrices de la protéine p27 et non viroproductrices. Leur étude est en cours, ralentie par le fait que la croissance de ces lignées est particulièrement lente. Les résultats observés montrent que la produc- tion de cellules helper aviaires peut effectivement être réalisée. Les lignées obtenues jusqu'à présent sont dotées d'une productivité virale pour créer, par infection à partir des virus obtenus, des lignées cellulaires ré- sistantes au G418 et non viroproductrices. La présente invention a donc également pour objet des cellules infectées par un vecteur viral ou transfectées par un plasmide selon l'invention. Selon une autre caractéristique, la cellule est capable de complémenter le vecteur viral. Enfin, la présente invention a pour objet un procédé de production d'une protéine codée par un gène hétérologue, caractérisé en ce qu'on cultive des cellules infectées ou transfectées, selon l'invention. De même, la présente invention a pour objet un procédé de modification génétique d'animaux, caracté- risé en ce qu'on infecte les cellules germinales ou les cellules à traiter avec un vecteur viral,selon la présente invention. On peut infecter les cellules germinales ou les cellules à traiter avec un vecteur viral non producteur de virus, selon l'invention. Les exemples ci-après décrivent les cons- tructions de divers vecteurs réalisés: A - A partir du virus de l'érythroblastose aviaire (AEV): Ce rétrovirus défectif comporte deux oncogènes v-erb A et v-erb B exprimés indépendamment à partir de deux ARN distincts (voir figure 1). On a délété ces deux oncogènes afin d'utiliser le génome de l'AEV dans des constructions capables de véhiculer deux gènes insérés respectivement aux positions v-erb A et v-erb B. Dans un premier ensemble de constructions, un seul gène (le gène codant pour la néomycine phos- photransférase, le gène NéoR, conférant la résistance à l'antibiotique G418) a été inséré soit en position v-erb A soit en position v-erb B. Selon les constructions réalisées, le codon initiateur de traduction AUG du gène inséré se trouve placé ou non en phase avec l'AUG de la fraction résiduelle du gène rétroviral gag (A gag). Dans un second ensemble de constructions deux gènes ont été insérés, l'un utilisé pour la sélection des cellules après transfection, l'autre servant de gène modèle pour l'étude de l'expression génique dans un vecteur rétroviral. En outre, on a construit des vecteurs dans lesquels des séquences rétrovirales dé- crites comme étant nécessaires à l'intégration du provirus dans le génome des cellules cibles (séquence att), ont été placées en 5' desgènes insérés dans ces vecteurs. B - A partir du génome helper RAV-1 (figure 16 A) Ces constructions visent à placer les gènes rétroviraux gag-pol-env, nécessaires au cycle rétro- viral, sous le contrôle transcriptionnel de divers sé- quences virales. Elles ont été réalisées afin de pro- duire des cellules trans-complémentantes exprimant les gènes gag-pol-env, de manière constitutive en inhibant l'encapsidation des génomes portant ces gènes dans les virions synthétisés. L'expression de ces gènes dans de telles cellules peut alors conduire à l'obtention de lignées cellulaireshelper autorisant la production des seuls virus vecteurs défectifs dérivés de 1'AEV, en stock viraux "helper free". Les exemples comportent deux principaux volets: - le premier dans lequel sont décrites les construc- tions dérivées de l'AEV (exemples 1 à 3), - le second qui concerne les constructions impliquant le génome du virus helper RAV-1 (exemples 4 et 5). Ces exemples sont fait en référence à des dessins sur lesquels: 1S r - La figure 1 représente la structure du génome de l'AEV sauvage (obtenu du Dr J.M. Bishop, US San Francisco), associé aux ARN transcrits et matures (traits pleins) ainsi qu'aux polypeptides traduits (tirets épais). Les gènes v-erb A et v-erb B sont traduits à partir de l'AUG du gène gag pour former les protéines fusions p75 gag-erb A et p61 erb B. ds = site donneur d'épissage as = site accepteur d'épissage. - La figure 2 représente la construction des vecteurs pTSN et pTXN3'. Ces vecteurs sont directement dérivés des vecteurs pBRgag-J-env2LTR (ou pTS) pour le pTSN, pTSN et pXJ12 pour le pTXN3', selon la démarche indiquée cidessus. Il s'agit pour le pTSN de la mise en place du gène Néor en position 5' au site XbaI, derrière la séquence gag du vecteur. Le pTXN3' quant à lui corres- pond au vecteur pXJ12 pour ce qui concerne la position du gène Néor. La différence résidant dans la disparition de toute séquence oncogène. ----squence du ecteur, doublet de LTR,: gène Néor, -pBR322. A:ApaI, B:BamHI, Bg:BglII, E:EcoRI, N:NdeI, P:PvuII, X:XhoI, Xb:Xbal. - La figure 3 représente la construction des vecteurs pTXN3' gag- et pTXhoN. Ces vecteurs sont directe- ment dérivés du vecteur pTXN3' selon la démarche indiquée ci-dessus. Le pTXN3' gag- dérive du pTXN3' après délétion de la séquence gag comprise entre les sites XhoI et. XbaI. La cons- truction du pTXhoN représente la mise en place du gène Néor en position 5' au site XhoI sans tenir compte de la phase de lecture du gène gag. * r séquence du vecteur,_ doublet de LTR, gène Néor, APpBR322.:ho, Xb:Xbl A:ApaI, B:BamHI, Bg:BglII, b.e:blunt end, N:NdeI, P:PvuII, X:Xhol, Xb:XbaI - La figure 4 représente la construction du vecteur pTXN5'. Ce vecteur est indirectement dérivé du pTXN3'. Cette construction a pour but la mise en place du gène Néor en position 5', au site XhoI, en phase de lecture avec l'AUG du gène gag du vecteur. Les séquences indiquées sur la figure et représentées en triplet correspondent aux sites enzymatiques présents ou créés par l'insertion de linkers. Chaque triplet représente un codon indiquant ainsi la trame de lecture ouverte avec l'AUG du gène gag et du vecteur. séquence du vecteur, _ doublet de LTR,: gbne Néor, pBR322. A:ApaI, B:BamHI, Bg:BglII, E:EcoRI, N:NdeI, P:PvuII, X:XhoI, Xb:XbaI. - Les séquences représentées dans la figure 5 correspondent aux portions codantes (représentation en triplet de bases) séparant l'AUG du gène gag (*) de l'AUG du gène Néor dans les différents vecteurs. Un AUG supplé- mentaire est présent dans les séquences des vecteurs TSN et XJI. Il appartient en fait à une séquence du trans- poson Tn5 duquel est issu le gène Néor. L'AUG entre paren- thèses dans la séquence de XJI représenteun AUG du gène v-erb B encore présent dans ce vecteur (voir brevet 8540019999). Lorsque le gène Néor est situé en position 3', et par conséquent exprimé sur l'ARN sous génomique, les sé- quences représentent l'ARN après épissage (le signe / indique la fusion entre le site donneur d'épissage et le site accepteur). - La figure 6 représente la construction du vecteur pNL 35P. Le plasmide pMC 1871,commercialisé par Pharmacia, a été digéré par l'enzyme SalI, et le fragment de 3,1 kb portant le gène LacZ a été purifié sur un gel d'agarose. Ce fragment a été inséré dans le site unique XhoI (les sites XhoI et SalI sont compatibles) situé dans la région gag du vecteur. Il en résulte le vecteur pNL 35P; le gène LacZ dans ce vecteur ne possède pas son propre AUG, il est traduit à partir de l'AUG du gène rétroviral delta-gag, et s'exprime sous forme de protéine fusion delta-gag-Lacz. Le cadre de lecture du gène LacZ est en phase avec l'AUG de delta-gag. - La figure 7 représente la construction du vecteur pNL 53gpt. Le plasmide pMMuLVSV-LacZ a été doublement digéré par les enzymes HindIII et BamHI, et les extrémités ont été réparées par la poij;-.rase de Klenow. Le fragment de 3,5 kb portant le gène Lacz et le fragment de 280 pb du gène gpt a été purifié sur un gel d'agarose puis intégré dans le vacteur pTXN5' préalablement linéarisé par l'enzyme EcoRI et les extrémités réparées par la polymérase de Klenow. Il en résulte le vecteur pNL 53 gpt. Le fragment de 280 pb du gène gpt est représenté par: À La partie hachurée. dans le pMMuLVSV-LacZ correspond à de l'ADN cellulaire murin. À Les flèches portées par les gènes correspondent à leur sens de transcription. B.E.: bout franc. - La figure 8 représente la récupération de la séquence "att" à partir du doublet de LTR de l'AEV. A partir du plasmide pJS21 comportant un doublet de LTR issu de la fusion du génome de l'AEV, bordé de par et d'autre par les résidus des gènes gag et env, et inséré entre les sites EcoRI et BamHI du plas- mide pBR322, a été relaché par la double digestion à l'aide de ces enzymes, le fragment de 1751 pb purifie ensuite sur gel d'agarose. A partir de ce fragment, est relaché en digestion simple HinfI, un sous fragment de 340 pb qui est purifié sur gel d'agarose à 2,5 %. La digestion MaeIII, ainsi que la purification sur gel de polyacrylamide permet d'obtenir un fragment de 88 pb contenant la séquence "att" dont nous donnons la séquence dans la figure 3. (B: BamHI. E: EcoRI, Hf: HinfI, M: MaeIII, Ps: Pst I). - La figure 9 représente le sous-clonage de la séquence "att" munie du polylinker dans le plasmide PX343. Les fragments de 420 pb (ou 508 pour celui issu du Matt55) sont relachés, par digestion PvuII à partir des clones Matt3, Matt5 et Matt55, et purifié sur geld'agarose. Ce fragment est recoupé par EcoRI et l'on récupère le fragment de 266 pb (ou 354 pb) que l'on puri- fie sur gel d'agarose. Les extrémités 5' sortantes géné- rées par cette enzyme sont remplies par la polymérase de KLENOW, et les fragments sous-clonés en amont du pro- moteur de SV40 du plasmide PX343 préalablement linéarisé par l'enzyme PvuII et déphosphorylé. Il en résulte 3 clones portant la séquence "att", soit dans un sens (PXatt3), soit dans l'autre (PXatt5), soit en doublet de même sens que ce dernier (PXatt55). Ces vecteurs sont représentés en prenant les mêmes conventions d'orientation que pour les vecteurs Matt. (B: BamHI, E: EcoRI, F: FspI, Hd: HindIII, K: KpnI, P: PvuII, Ss: SstI, oci-SV: origine de réplication du SV40, polyA-IS-t-SV: séquence de polyadénylation et intron du gène codant pour l'antigène t de SV40). - La figure 10 représente la construction des vecteurs rétroviraux pAFY. Les plasmides PXatt ont été linéarisés par l'endonucléase FspI, et sur les extrémités franches géné- rées par cette enzyme, ont été ligués des linker HindIII. Les fragments de 4 kb portant la séquence "att" -gène Hygro avec le promoteur de SV40 sont isolés sur gel d'aga- rose après digestion HindIII, puis insérés dans le site HindIII du pCNH. L'insertion dans ce vecteur peut se faire dans les deux sens. Deux types de vecteurs pAFY sont obtenus, et identifiés par cartographie de restriction. On définie les pAFY53, pAFY55, pAFY555 comme les vecteurs portant l'ensemble att-hygro dans le même sens que celui de trans- cription rétroviral, et les vecteurs pAFY33, pAFY35, pAFY355 comme les vecteurs portant cet ensemble inséré en sens inverse. (B: BamHI, E: EcoRI, : Hd: HindIII, K: KpnI). - La figure 11 représente les vecteurs rétro- viraux pAFY. Ces vecteurs sont représentés sans la partie plasmidienne qui sert à leur amplification. Les lignes représentent les séquences non codantes d'origines rétro- virales, les petites boites représentent les résidus des gènes rétroviraux gag et env, et les grandes boîtes repré- sentent les LTR ainsi que les séquences qui ne sont pas d'origines rétrovirales. (B: BgLII, E: EcoRI, H. HindIII, K: KpnI, Xb: XbaI, Xh: XhoI) - La figure 12 représente la construction du clone pDIPO 123 véhiculant le promoteur du vecteur défec- tif pHF 13. Les fragments représentés après les diffé- rentes digestions sont obtenus par séparation sur gel d'agarose suivie d'une électroélution. _U5, ' R.: U3, séquence codante des gènes rétrovirsux, m séquence rétrovirale non codante, pBR 322. - La figure 13 représente la construction du clone pGAS-Cla véhiculant le signal de polyadénylation du helper défectif pHF 13. Les fragments représentés après les différentes digestions sont obtenus par sépa- ration sur gel d'agarose suivie d'une électroélution. m origine de réplication du virus SV40, contenant le promoteur et 1'enhancer des gènes précoces,::.. signal de polyadénylation des gènes précoces de SV40, m pro- moteur du gène de la thymidine kinase du virus Herpès Simplex I,:û signal de polyadénylation du gène de la thymidine kinase du virus Herpès Simplex I. - La figure 14 représente la construction du clone pHP2 véhiculant les gènes gag-pol-env sous le contrôle transcriptionnel du promoteur des gènes précoces de SV40. Les fragments représentés après les différentes digestions sont obtenus par séparation sur gel d'agarose suivie d'une électroélution. M U5, r R, '. T U3, 1 séquence codante des gènes rétroviraux, * séquence rétrovirale non codante, pBR 322, M origine de réplication du virus SV40, contenant le promoteur et l'enhancer des gènes précoces,: signal de polyadénylation des gènes précoces de SV40. - La figure 15 représente la délétion de la séquence d'encapsidation et assemblage du clone pHF 13. Les fragments représentés après les différentes digestions sont obtenus par séparation sur gel d'agarose suivie d'une électroélution. U5, R,:r--: U3, séquence codante des gènes rétroviraux, _ séquence rétrovirale non codante, pBR 322 ou coliphage M13 mp11, origine de réplication du virus SV40, contenant le promoteur et l'enhancer des gènes précoces,.= signal de polyadénylation des gènes précoces de SV40, m:. si- gnal de polyadénylation du gène de la thymidine kinase du virus Herpès Simplex I, A indique la délétion de la séquence d'encapsidation. - La figure 16 représente la structure comparée du génome de RAV-1 avec celui du pHF 13. A - Carte des gènes et principales structures impliquées dans le fonctionnement du helper. B - Carte détaillée de la région promoteur de pHF 13. C - Description de la délétion de la séquence d'encapsi- dation dans le génome de pHF 13. Caractères gras: séquence délétée, caractères gras italiques: sé- quence d'encapsidation. U5, R, 'R:: U3, séquence codante des gènes rétroviraux, _ séquence rétrovirale non co- dante. EXEMPLE 1 - Elaboration de vecteurs véhiculant un seul gène 1) PréEparation du clone pTSN (figure 2) Le clone pTSN est préparé à partir du clone pBRgag-J-env2LTR (pTS) qui contient le génome de l'AEV débarrassé de ses séquences oncogènes (voir brevet n 85 4019999). Le gène codant pour la néomycine phos- photransférase II (Néo), issu du transposon Tn5, est pourvu de linkers XbaI à ses extrémités. Il est inséré par ligation dans le vecteur pTS préalablement linéarisé après digestion par l'enzyme XbaI. Le gène Néo est inséré dans le même sens que le sens de transcription des gènes viraux. L'AUG du gène Néo est situé à 803 nucléotides de l'AUG du gène gag et ne se trouve pas dans la même trame de lecture que ce dernier (figure 5). 2) Préparation du clone pTXN3' (figure 2) Le clone pTXN3' dérive à la fois des clones pTS et pXJ12 (voir brevet n 85 4019999). Les clones pTS et pXJ12 sont successivement digérés par les enzymes ApaI et EcoRI. Le fragment de 1,2 kb, issu du clone pXJ12 après digestion et ren- fermant le gène Néo, est purifié par électroélution après séparation sur gel d'agarose. Ce fragment est alors cloné dans le vecteur pTS préalablement digéré pour former le clone pTXN3'. Le clone pTXN3' présente les caractéristiques des deux clones dont il est issu: - il est, comme le clone pTS, dépourvu de séquences oncogènes et possède en 3' de la séquence gag un site de clonage unique XbaI. - il contient, comme le clone pXJ12, le gène Néo en position 3' (à la place du gène v-erb-B). L'AUG de ce gène se situe, après épissage de l'ARN génomique, à 33 nucléotides de l'AUG du gène gag et se trouve dans la même trame de lecture que ce dernier (figure 5). 3) Préparation du clone pTXN3'gag- (fiure 3) Le clone pTXN3'gag- est directement issu du clone pTXN3' (paragraphe 2, figure 2). Le clone pTXN3' est digéré successivement par les enzymes XhoI et XbaI. Les extrémités ainsi obte- nues sont réparées par la DNA polymérase I fragment dit de Klenow (polymérase de Klenow). Le vecteur est ensuite purifié par électroélution après séparation sur gel d'agarose, et religué. Le clone pTXN3'gag- obtenu est ainsi délété d'environ 600 nucléotides de la partie 3' terminale du gène gag. 4) Préparation du clone pTXhoN (figure 3) Le clone pTXN3' (paragraphe 2, figure 2) est successivement digéré par les enzymes NdeI et EcoRI. Les extrémités obtenues sont réparées par la polymé- rase de Klenow. Les fragments sont ensuite purifiés par électroélution après séparation sur gel d'agarose. Le fragment correspondant au vecteur est reli- gué sur lui-même pour former le clone pTX. Ce clone pTX est digéré par l'enzyme XhoI, ses extrémités sont réparées par la polymérase de Klenow. Le fragment correspondant au gène Néor est cloné dans le clone pTX pour former le clone pTXhoN. Dans le clone pTXhoN, le gène Néo se trouve orienté dans le même sens que le sens de transcription des gènes viraux. L'AUG du gène Néo se situe à 255 nucléotides de l'AUG du gène gag et n'est pas dans la même trame de lecture que ce dernier (figure 3). ) Préparation du clone pTXN5' (figure_4) Le clone pTXN3' (paragraphe 2, figure 2) est linéarisé après digestion par l'enzyme BglII. Après réparation des extrémités par la polymérase de Klenow, le clone est ligué en présence de linkers XbaI pour former le clone pTXN3'Xba. Le clone pTXN3'Xba est successivement digéré par l'enzyme NdeI et partiellement digéré par l'enzyme XbaI. Le fragment correspondant au gène Néo est purifié par électroélution après séparation sur gel d'agarose. Le clone pTXN3' est digéré successivement par les enzymes NdeI et BglII. Les extrémités sont réparées par la polymérase de Klenow et religuées pour former le clone pTX. On peut noter que cette opération reconsti- tue le site BglII, le site NdeI étant détruit. Le clone pTX est ensuite linéarisé après diges- tion par l'enzyme XhoI. Les extrémités sont réparées par la polymérase de Klenow. Le clone est alors religué en présence de linkers BglII (dont la séquence exacte est indiquée sur la figure 4) pour former le clone pTXBg1II. Ce clone est soumis a une surdigestion par l'enzyme Bg1II pour éliminer l'excès de linker, et religué. On peut noter que l'adjonction d'un linker BglII sur le site XhoI préalablement réparé, recrée le site XhoI. Le clone pTXBg1II est a son tour linéarisé après digestion par l'enzyme BglII. Les extrémités sont réparées par la polymérase de Klenow. Le clone est religué en présence de linkers NdeI (dont la séquence exacte est indiquée dans la figure 4) pour former le clone pTXNde. Cette opération détruit le site BglII. L'excès de linkers NdeI est éliminé par surdigestion. Le clone pTXNde est successivement digéré par les enzymes XbaI et NdeI. Il est ensuite mis en liga- tion avec le fragment NdeI-XbaI, correspondant au gène Néo précédemment isolé du clone pTXN3'Xba, pour former le clone pTXN5'. Le clone pTXN5' contient ainsi: - le gène Néo en position 5' (à la place du gène v-erb-A). - deux sites uniques de clonage EcoRI et BglII en po- sition 3' (à la place du gène v-erb-B). Le gène Néor se trouve positionné dans le même sens que le sens de transcription des gènes viraux. L'AUG du gène Néo se situe à 267 nucléotides de l'AUG du gène gag et est dans la même trame de lecture que ce dernier (figure 5). EXEMPLE 2 - Vecteurs véhiculant deux gènes respectivement en position verbA et v-erbB Les deux gènes bactériens utilisés codent, l'un pour la néomycine phosphotransférase: Néo (utilisé comme gène de sélection), l'autre pour la bêta galacto- sidase: LacZ (utilisé comme gène d'expression). 1) - Le vecteur pNL35 (figure 6) Il dérive du pTXN3' décrit dans la figure 2. L'ADN du clone pTXN3' a été linéarisé par l'endo- nucléase XhoI dans le site unique situé dans la séquence delta-gag du vecteur (figure 6). Le gène lacZ est isolé à partir du plasmide pMC 1871 (figure 6), par digestion avec l'enzyme SalI. Le fragment de 3,1 kb est purifié sur gel d'agarose, puis inséré dans le site XhoI du pTXN3'; les extrémités XhoI et SalI sont compatibles et conduisent à la recréation des sites SalI. Il en résulte le vecteur pNL 35 (figure 6). - Propriété du vecteur pNL 35. En plus des propriétés du vecteur pTXN3' rapportées dans le paragraphe 1A-2, ce vecteur porte: le gène Lac Z en 5' de la séquence J; ce gène s'exprime sous forme de protéine fusion à partir de l'AUG du gène Bag rétroviral. 20. la protéine fusion delta-Gag-LacZ est fonctionnelle dans les cellules de poulet (CEF), puisque l'acti- vité enzymatique qui se traduit par une coloration bleue en présence de X-Gal (5-bromo,4-chloro,3- indolyl,B-D galactopyranoside) a été révélée dans les cellules qui ont reçu ce vecteur. ce vecteur permet de mettre en évidence et d'étu- dier le fonctionnement de 2 gènes simultanément, le gène codant pour la résistance à la néomycine (les cellules cultivées sur un milieu contenant du G 418 continuent à croître), et le gène codant pour la bêtagalactosidase dont l'activité est mise en évidence par la coloration bleue des cellules en présence de X-Gal. 2) - Vecteur pNL 53 (figure 7) Il dérive du vecteur pTXN5i décrit dans la figure 4. Le vecteur pTXN5' a été linéarisé par l'enzyme EcoRI et les extrémités ont été réparées par la polymérase de Klenow pour obtenir des extrémités franches. Le plasmide pMMuLVSV LacZ (obtenu de chez J.F. Nicholas(Sanes J.S. et al 1986, EMBO J.5; 3133- 3142))porte le gène bactérien LacZ de 3,5 kb limité par les sites HindIII et BamHI dans le génome du rétrovirus murin MMuLV. Ce gène LacZ comprend dans sa partie 5' environ 280 pb du gène gpt. Ce plasmide est doublement digéré par BamHI et HindIII, le fragment de 3, 5 kb LacZ est purifié sur un gel d'agarose et, les extrémités sont réparées par la polymérase de Klenow. Ce fragment est inséré dans le vecteur pTXN 5' préparé comme indiqué ci- dessus. Il en résulte le vecteur pNL 53. - Propriétés du vecteur pNL 53. En plus des propriétés du vecteur pTXN 5' ce vecteur comme le vecteur pNL 35 à la potentialité d'expri- mer 2 gènes: Néo et LacZ. 25. Le gène LacZ peut s'exprimer à partir de l'AUG porté par la séquence du gène gpt en position -15 (figure 7). Cet AUG est dans le même cadre de lec- ture que la séquence du gène LacZ. La protéine fonctionnelle codée par le gène LacZ n'est pas une protéine fusion dans ce cas car la traduction initiée à l'AUG de delta-gag doit être stoppée par l'un des 4 codons de terminaison (TAG, TGA, TGA et TGA) situés dans la séquence du gène gpt, placée en amont du gène LacZ (figure 7). EXEMPLE 3 - Vecteurs de type pAFY - Tous les vecteurs pAFY véhiculent deux gènes de sélec- tion: * Le gène conférant la résistance à la néomycine (Néo) situé dans la partie 5' en position du gène erbA est inséré dans le même sens que le sens de transcription rétroviral. * Le gène conférant la résistance à l'hygromycine si- tué dans la partie 3' du vecteur en position erbB porte dans sa partie 5' le promoteur-enhancer du virus simien SV40 et la séquence "att" rétrovirale. Ainsi, ces vecteurs possédent deux sites potentiels d'intégration spécifiquement rétrovirale; l'un est constitué par le site "att" naturel localisé dans les LTR, l'autre correspond au site "att" surnuméraire inséré à l'intérieur du vecteur en 5' du gène confé- rant la résistance à l'hygromycine B. Ces constructions ont comportées trois étapes principales: la préparation des séquences "att". l'insertion de ces séquences dans le plasmide pX343 véhiculant le gène bactérien conférant la résistance à l'hygromycine B. l'insertion de l'ensemble (séquence "att" - promoteur de SV40 - gène conférant la résistance à l'hygromycine B - signaux de polyadénylation de SV40) dans un vecteur rétroviral. 1) Séguence "att" (Figure 8) 30. Plasmide pJS21: Entre les sites EcoRI et BamHI du plasmide pBR 322 est cloné un fragment EcoRI-BamHI de 1751 nucléotides portant une partie du gène env, un doublet de LTR issu de fusion naturelle, et une partie du gène gag de l'A.E.V. (figure 8). 5. La séquence "att" de 88 nucléotides est isolée à partir de ce plasmide à la suite de 3 séries de di- gestion et purification sur gel; - Double digestion EcoRI/BamHI et récupération du fragment de 1751 pb. - Digestion HinfI et récupération d'un fragment de 340 pb. - Enfin digestion MaeIII et récupération d'un frag- ment de 88 pb. Après réparation des extrémités par la polymérase de Klenow, ce fragment de 88 pb a été sous cloné dans le site SmaI du vecteur M13 mp19 pour bénéficier des sites du polylinker porté par le coliphage M13 mp19. Trois clones, Matt3, Matt5 et Matt55 ont été retenus (figure 9). 2) Insertion de la ségquence "att" dans le plasmide pX343 (fiqure 9) Le plasmide pX343 comporte le fragment EcoRI- PvuII (2295 pb) du plasmide pBR 322, un fragment de 340 pb portant l'origine de réplication du virus SV40, un fragment de 1,2 kb portant le gène bactérien confé- rant la résistance à l'hygromycine, l'intron du gène codant pour l'antigène t et un fragment portant le site de polyadénylation du virus SV 40 (figure 9). Ce plasmide a été linéarisé par l'enzyme PvuII qui possède un site de clivage unique juste en amont de l'origine de réplication de SV40. Après double digestion EcoRI/ PvuII et réparation des extrémités par la polymérase de Klenow, la séquence "att" est récupérée d'une part à partir du Matt3 et du Matt5 dans un fragment de 266 pb et d'autre part à partir du Matt55 dans un frag- ment de 354 pb. Ces trois fragments ont été intégrés séparément dans le site PvuII du plasmide pX343. 3 clones ont été isolés (figure 9): - Le pXatt3 porte la séquence "att" orientée dans le même sens de transcription que celui du gène codant pour l'hygromycine. - Le pXatt5 porte la séquence "att" orientée en sens inverse par rapport au pXatt3. - Le pXatt55 porte un doublet de séquence "att" placé dans le même sens que le pXatt5. 3) Réalisation des vecteurs EAFY (figure 10) A partir du vecteur rétroviral (pTXhoN) rapporté dans la figure 3 le site EcoRI juxtaposé au site XbaI a été transformé en HindIII par intégration d'un linker HindIII, le vecteur résultant est appelé pCNH (fi- gure 10). Sur l'ADN des clones pXatt (figure 9) un site unique FspI (F) porté par le fragment du plasmide pBR322 a été transformé en un site HindIII par intégra- tion d'un linker HindIII. Les fragments HindIII de 3,8 kb issus de chacun de ces plasmides ont été isolés et intégrés séparément dans le site unique HindIII du vecteur pCNH (figure 10 *et figure 11). Six types de clones ont été obtenus; ils peuvent être distingués en deux grandes catégories - soit le fragment de 3,8 kb est inséré de façon telle que le sens de transcription du gène codant pour la résistance à l'hygromycine correspond à celui du rétrovirus et du gène codant pour la néomycine phosphotransférase II, c'est le cas des vecteurs pAFY53, pAFY55 et pAFY555 (figure 11); - soit l'orientation de transcription du fragment de 3,8 kb HindIII est opposée à celle du rétrovirus; c'est le cas des vecteurs pAFY35, pAFY33 et pAFY355 (figure 11). Le vecteur pAFY35 a été étudié sur culture de cellules aviaires: a - La cotransfection de cellules aviaires (CEF, QT6) par l'ADN de ce vecteur et l'ADN correspondant au génome du virus helper RAV1 suivie de culture sur un milieu sélectif contenant du G418 conduit à la production d'un stock viral (stock AFY35). b - Des cellules infectées par ce stock viral et cul- tivées sur un milieu contenant du G418 continuent à croître et, produisent des virions qui trans- mettent la résistance au G418. Ce résultat permet de conclure que le génome proviral est inséré au niveau du site "att" situé entre les LTR, condui- sant ainsi à une production virale normale. Cepen- dant, les cellules résistantes au G418 sont sen- sibles à l'hygromycine. Cette observation peut recevoir deux types d'interprétations: * soit le gène conférant la résistance à l'hygro- mycine n'est pas exprimé quand il est placé dans le sens opposé au sens de transcription rétro- viral. * soit le niveau d'expression de ce gène est trop faible pour permettre la résistance à la drogue (hygromycine). c - Des cellules infectées par ce stock viral (stock AFY35) et cultivées sur un milieu contenant de l'hy- gromycine continuent à croître mais s'avèrent inca- pables de produire des virions transmettant la résis- tance à-l'hygromycine ou au G418; l'analyse immuno- logique (ELISA) du surnageant de ces cellules dé- montre cependant la présence de virions correspondant au helper. Ce résultat permet de conclure que le génome proviral peut être intégré au niveau du site "att" surnuméraire situé à l'intérieur de la séquence virale, entraînant ainsi une désorganisation totale de la structure rétrovirale; dans ce cas, la production du virus vecteur (AFY) est abolie. EXEMPLE 4 - Construction du génome helper défectif La construction helper réalisée comporte les trois gènes viraux gag-pol-env du virus assistant RAV-1 placés sous le contrôle transcriptionnel d'une LTR du même virus. La LTR 3' est remplacée par une séquence de 600 nucléotides contenant les signaux de fin de trans- cription et de polyadénylation du gène de la thymidine kinase du virus Herpès Simplex I. La LTR 3' intervient: - dans la polyadénylation des ARN viraux, - dans la circularisation de l'ARN génomique au cours de l'encapsidation, - dans l'intégration et la transcription du génome viral lors de l'infection secondaire. Son absence constitue donc un premier niveau de blocage de la virémie. La construction du génome helper défectif (pHF 13) comporte également une délétion de 52 nucléo- tides de la séquence leader 5' non traduite. Cette délé- tion englobe une région d'environ 30 nucléotides interve- nant en cis dans l'encapsidation de l'ARN viral. Cette délétion constitue un second niveau de blocage de la virémie. Trois cassettes ont été construites séparément puis assemblées selon le protocole de la figure 15: - le promoteur (figure 12) - le signal de polyadénylation (figure 13) - des gènes viraux gag-pol-env (figure 14). 1) Lepromoteur (clone DIPO-123_ figures 12 et 13) a) Remarques générales Le promoteur est constitué de deux LTR en tandem; l'une située en 3' provient du virus assistant RAV-1 (obtenu du Dr J.M. Bishop, U.C. San Francisco), l'autre, située en 5' est un hybride entre les LTR de RAV-2 et de RAV-1, dans lequel une partie de la séquence U3 (entre les sites Sph I et Tag I) a été délétée. Il en résulte vraisemblablement une LTR infonctionnelle. La structure de l'ensemble de cette région promoteur est schématisée sur la figure 16B. b) Réalisation - le clone pRAV-1 est digéré par l'endonucléase EcoRI. Le fragment véhiculant les séquences plas- midienne est recircularisé pour générer le clone pDIPO 1. Le fragment EcoRI de 0,6 kb est purifié puis recloné au site EcoRI de pBR 322 pour générer pDIPO 3 (figure 12). - le clone pRAV-2 (obtenu du Dr Skalka, Roche Institut Nutley) est digéré par l'endonucléase Sph I. Le fragment véhiculant les séquences plas- midiennes est traité par la T4-DNA polymérase pour générer des extrémités franches. Il est recircu- larisé en présence de linkers Cla I pour générer le clone pDIPO 4 (figure 12). - le clone pDIPO 1 est digéré par les endonucléases EcoRI et SacI. Le clone pDIPO 3 est digéré par les endonucléases EcoRI et TaqI. Le clone pDIPO 4 est digéré par les endonucléases SalI et ClaI. Les trois fragments sont purifiés puis religués entre les sites SacI et SalI de pBR 322 pour générer le clone pDIPO 123 (figure 12). Cette construction est rendue possible grâce à la compatibilité des sites ClaI et TaqI. 2) La structure de polyadénylation (clone pGAS-ClaL fi- gure 13) a) Remarques générales Deux signaux de polyadénylation sont généralement utilisés dans les vecteurs d'expression eucaryotes. - celui des gènes précoces du virus SV40 - celui du gène de la thymidine kinase (TK) du virus Herpès Simplex I. Nous avons choisi celui du gène TK car celui de SV40 comporte un signal d'épissage susceptible d'in- terférer avec ceux du rétrovirus. b) Réalisation - le clone pSV2 gpt (Mulligan et coll.) est digéré par les endonucléases HindIII et ApaI. Le fragment véhiculant l'origine de réplication de SV40 et le signal de polyadénylation est traité par la T4DNA polymérase pour générer des extrémités franches. Il est recircularisé en présence de linkers SacI pour générer le clone pSV-Sac. - le clone pAG 60 (obtenu du Dr A.G. Garapin, Ins- titut Pasteur Paris) est digéré par les endonu- cléases BgIII et Sma I. Le fragment véhiculant le promoteur et le signal de polyadénylation du gène TK est traité par la DNA polymérase I (fragment de Klenow) pour générer des extrémités franches. Il est recircularisé en présence de linkers SacI pour générer le clone pAG-Sac. - le clone pSV-Sac est linéarisé par l'endonucléase EcoRI. Il est traité par la DNA polymérase I de Klenow pour générer des extrémités franches, puis il est redigéré par l'endonucléase SacI. Le fragment SacI-EcoRI contenant le signal de polyadénylation de SV40 est éliminé et remplacé par le fragment SacI-PvuII du clone pAG-Sac qui contient le signal de polyadénylation du gène TK. L'échange génère le clone pGAS dans lequel le signal de polyadénylation du gène TK est associé au promoteur de SV40. L'asso- ciation des sites EcoRI, rendusfrancs par la DNA polymérase, et PvuII génère le site PvuII. - le clone pGAS est finalement linéarisé par l'endo- nucléase PvuII, puis recircularisé en présence des linkers ClaI pour générer le clone pGAS-Cla (figure 13). 3) Les gènes viraux ga_ -ol-env (clone pHP 2) a) Remarque générale Ces gènes viraux dérivent du virus assis- tant RAV-I (sous groupe A). b) Réalisation - le clone pRAV-1 est digéré par l'endonucléase SalI. Le fragment contenant l'extrémité 3' de gène env et les LTR est recircularisé pour géné- rer le clone pEnv. - le clone pEnv est digéré par les endonucléases SalI et AccI. Le fragment contenant l'extrémité 3' du gène env est purifié puis traité par la DNA polymérase I de Klenow pour générer des extré- mités franches. Il est ligué en présence de linkers SacI (on notera que l'addition des linkers SacI sur le site SalI préalablement réparé, recrée le site SalI). Le fragment est redigéré par les endonucléases SacI et SalI, puis religué entre les sites SacI et SalI de pBR 322 pour générer le clone p. 800el (figure 14). - le clone p. 800el est digéré par les endonucléases SalI et SacI pour relacher l'extrémité 3' du gène env. Parallèlement, le clone pRAV-1 est digéré par les endonucléases SacI et SalI pour relacher les gènes gag-pol et l'extrémité 5' du gène env. Les deux fragments sont religués dans le site SacI du clone pSV-Sac pour générer le clone pHP 2 (figure 14). Dans cette construction, les gènes viraux gag-pol-env sont placés sous le contr1ôle trans- criptionnel du promoteur des gènes précoces de SV40 et sous le contrôle de fin de transcription du signal de polyadénylation du gène. 4) Délétion de la séguence d'encapsidation et assemblage des trois cassettes (clone _HF_ 13, figure 5i - Le clone pDIPO 123 est linéarisé au site SacI situé dans la séquence 5' non traduite, immédiatement en 3' de la séquence d'encapsidation (figure 16 C). L'ADN linéarisé est soumis à une digestion ménagée par l'exonucléase Bal,puis digéré par l'endonucléase SalI. Les fragments comportant des délétions plus ou moins étendues sont reclonés dans la forme réplica- tive du coliphage M13 entre les sites SalI et SmaI (extrémités franches). Les clones mp11-DIPO 123 ainsi générés sont analysés par séquençage pour con- trôler l'étendue de la délétion. L'un d'eux, compor- tant une délétion de 52 nucléotides en 5' du site SacI (figure 16 C) a été choisi pour élaborer le helper défectif pHF 13. - le clone mp11-DIPO 123 préalablement sélectionné est digéré par les endonucléases SacI et ClaI. Le frag- ment contenant les LTR et la séquence leader mutée est purifié puis religué entre les sites SacI et ClaI du clone pGAS-Cla décrit au paragraphe 2. Cette construction génère le clone pGAS-LTR. - le clone pHP 2 est digéré par l'endonucléase SacI. Un fragment est relaché véhiculant les trois gènes viraux gag-pol-env. Il est inséré au site SacI du clone pGAS-LTR pour générer le clone pHF 13. La structure du génome pHF 13 et celle du génome de RAV-1 sont représentées sur la figure 16 A. EXEMPLE 5 - Construction d'une cellule helper aviaire 1) Transfection des cellules par le plasmide pHF 13 5.10 cellules (lignée continue de caille: Q16) ont été transfectées par 500 ng du plasmide de sélection pX343 et 3 ug du plasmide pHF 13. Le plas- mide pX343 véhicule le gène de résistance à l'hygro- mycine B et confère la résistance à cet antibiotique aux cellules qui l'expriment. La transfection est réalisée par la technique décrite par Kawai (polybrène DMSO). Après 10 jours de sélection en présence de 50 ug d'hygromycine B par ml de milieu, les clones cellulaires résistants sont isolés et amplifiés. Ils sont alors analysés pour la production de la protéine virale p27 gag dans le sur- nageant des cultures, par une méthode immunoenzyma- tique (ELISA). L'un deux (MBg) a été sélectionné pour sa production de protéines p 27 gag la plus élevée. 2) Transfection du clone cellulaire MBq_ par le nome vecteur pTXN 3' 5.10 cellules du clone MBg ont été transfectées par 500 ng du plasmide pTXN 3'. Le pTXN 3' véhicule le gène de résistance à la néomycine et confère la résis- tance au G418 aux cellules qui l'expriment. Après 10 jours de sélection en présence de 200 ug de G418 par ml de milieu, les clones cellulaires résistants sont amplifiés en masse. La population cellulaire qui en résulte (MBg-TXN 3') est analysé pour sa capacité à produire des particules virales infectieuses de type vecteur. 3) Mise en évidence d'une production de particules vi- raies "TXN 3' helper-free" par des cellules MBq-TXN 3' Trois lots de 10 cellules de la lignée QT6 ont été infectés par respectivement 1 ml, 100 ul et 10 ul du surnageant de culture des cellules MBg-TXN 3'. 24 heures apres l'infection, les cellules infectées par les particules TXN 3', sont sélectionnées par addition de G418 (200 ug/ml). Après 10 jours de sélec- tion, la numération des clones cellulaires résistant à l'antibiotique fournit une estimation du nombre de par- ticules virales vecteur, présent dans le surnageant de culture des cellules MBg-TXN 3'. Le nombre est estimé à 104 particules TXN 3' par ml de surnageant de culture. Les foyers cellulaires, résistant au G418, ainsi obtenus, sont amplifiés. L'analyse de leur surnageant de culture par une méthode immunoenzymatique révèle l'absence d'une production virale. Ce résultat est confirmé en infectant des fibroblastes d'embryons de poulet par ces surnageants. Aucun foyer de résistance au G418 ne s'y développe après 15 jours de sélection à la drogue (200 ug/ml). On en conclut que les parti- cules produites par les cellules MBg-TXN 3' sont exclusivement de type vecteur en l'absence totale de particules helper. Dépôt de souches Les souches suivantes ont été déposées à la Collection Nationale de Culture de Microorganisme de l'Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux - 75724 PARIS Cedex 15 sous les numéros suivants: Souche E. Coli pAFY 53 n I- 696 Souche E. Coli pNL 35 n I- 697 Souche E. Coli pNL 53 n I- 698 Souche E. Coli pAFY 525 n I- 699 Souche E. Coli pAFY 325 n I- 700 Souche E. Coli pAFY 55 n I-701 Souche E. Coli pAFY 35 n I-702 Souche E. Coli pAFY 33 n I-703 Souche E. Coli pTXN3' no 1-704 Souche E. Coli pTXhOL n 1-705 Souche E. Coli pTXN 5' n 1-706 Souche E. Coli pTXN 3' gaz- n 1-707 Souche E. Coli pHF-13 n 1-708 le 16 octobre 1987. REVENDICATIONS 1. Vecteur viral d'intégration et d'expression d'un gène hétérologue dans des cellules aviaires, carac- térisé en ce que le vecteur est constitué à partir du génome proviral de l'érythroblastose aviaire dans lequel le gène hétérologue remplace. au moins l'un des gènes V erb A et/ou V erb B et en ce que ce gène hétérologue est sous le contrôle d'un promoteur efficace dans lesdites cellules, notamment d'un promoteur de LTR aviaire en particulier pour l'intégration dans les cellules de poulets et d'un promoteur mixte dans les cellules de cailles et en ce que ledit gène hétérologue mime le gène qu'il remplace. 2. Vecteur d'intégration et d'expression d'un gène hétérologue dans des cellules aviaires, selon la revendication 1, caractérisé en ce que le gène hétéro- logue est traduit à partir de l'AUG du gène gag avec lequel il est en phase. 3. Vecteur selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'on introduit un codon stop entre le gène gag et le gène bétérologue. 4. Vecteur selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le gène hétérologue est un gène marqueur. 5. Vecteur selon la revendication 4, caracté- risé en ce que le gène marqueur est un gène de résistance à un antibiotique. 6. Vecteur selon la revendication 5, caracté- risé en ce que l'antibiotique peut être le G418 ou l'hygro- mycine. 7. Plasmide d'intégration et d'expression d'un gène hétérologue dans des cellules compétentes, caracté- risé en ce qu'il s'agit d'un plasmide à ADN comportant au moins une séquence ATT d'un rétrovirus de ces cellules assurant l'intégration. 8. Plasmide selon la revendication 7, carac- térisé en ce qu'il comporte en outre des éléments assu- rant l'expression du gène pol. 9. Cellule injectée ou transfectée par un vecteur viral ou un plasmide, selon l'une des revendica- tions 1 à 8. 10. Cellule selon la revendication 9, caracté- risée en ce qu'elle est capable de complémenter le vecteur viral. 11. Procédé de production d'une protéine codée par un gène hétérologue, caractérisé en ce qu'on cultive des cellules infectées ou transfectées, selon l'une des revendications 9 à 10. 12. Procédé de modification génétique d'animaux, caractérisé en ce qu'on infecte les cellules germinales ou les cellules à traiter avec un vecteur viral, selon l'une des revendications 1 à 6. 13. Procédé de modification génétique d'animaux, caractérisé en ce qu'on infecte les cellules germinales ou les cellules à traiter avec un vecteur viral non producteur de virus, selon l'une des revendications 1 à 6.