FR 2614626 A1 19881104 FR 8706205 A 19870430 2 6 1 4 6 2 6 Cette invention concerne un nouveau mode de fécondation des ovocytes humains et animaux. Elle permet non seulement la fécondation des ovocytes mais aussi la culture des embryons et leur replacement dans la cavité utérine. Les techniques de fécondation tendent toutes à se simplifier avec toujours le même souci, celui de conserver ou améliorer les résultats. Nous l'avions déjà montré lors de la présentation d'un premier brevet FR 85 16 558, P.C.T./FR 86/00378 concernant "un conteneur pour fécondation des ovocytes en absence d'air enrichi en C02". Cette invention nous avait permis de montrer que l'on pouvait se dispenser d'air enrichi de 5% de C02 dans les 48 premières heures du développement embryonnaire. Les ovocytes, dès la ponction, étaient placés dans un tube entièrement rempli de milieu de culture (en l'occurence du B2 de Menezo pur) avec les 10 000 a 20 000 spermatozoïdes mobiles par millilitre. Le tube, hermétiquement fermé, sans interposition d'air, était alors placé dans la cavité vaginale durant les 44 à 50 heures de la culture. Après ce délai, le contenu du ou des tubes (jusqu'à 3) était examiné. Les embryons jusqu'au nombre de 4, étaient alors replacés dans la cavité utérine & l'aide d'un cathéter de Frydman. Les embryons surnuméraires étaient congelés. Cette technique nous a permis de constater que les taux de clivage, de transfert et de naissance par ponction étaient identiques sinon supérieurs à ceux obtenus en fécondation classique. Une étude randomisée portant sur 75 tentatives en F.I.V et 75 en C.I.V (Culture Intra Vaginale) a permis de le confirmer. Au début de la technique, seulement 4 ovocytes étaient placés dans chaque tube, puis au cours de son développement ce nombre a été augmenté jusqu'e 7 ou 8, sans que celà ne perturbe les résultats, à condition de ne pas augmenter le nombre des spermatozoides mobiles, principaux consommateurs d'énergie. Cette technique nous a permis de constater certaines données interessantes et d'émettre des hypothèses concernant le mode de fécondation des ovocytes et de culture des embryons: - en effet si une diminution du Ph du milieu était observée, de 0,5 à 1 en moyenne, déterminée par indice colorimétrique et mesuré au Ph mètre, ceci n'interférait pas sur le développement embryonnaire. - un faible volume de milieu de culture était suffisant pour la fécondation puisque le volume ramené par ovocyte (en admettant que chaque ovocyte ait un métabolisme à peL près identique) pouvait aller jusqu'à 400 microlitreîenvlron. - enfin malgré le nombre très faible de spermatozoïdes, la fécondation avait lieu normalement.L'hypothèse d'un facteur histochimique induisant la fécondation est assez peu probable, ou du moins joue un moindre rôle dans la fécondation in vitro en raison du lavage de l'ovocyte avec son cumulus et des spermatozoïdes utilisés pour l'insémination. Par contre, un phénomène physique de choc ou de rencontre de 2 particules type atome (ovocyte) et électrons (spermatozoïdes) nous parait plus plausible. Les chances de rencontre étant accentuées lorsque le nombre de particules est plus élevé ou lorsque le mouvement relatif de l'une par rapport à l'autre est augmenté. Si dans notre technique les chances de rencontre sont plus faibles en raison de la diminution du nombre des spermatozoïdes, ceci est 2 6 1 4 6 2 6 contrebalancé par un mouvement des ovocytes dans le tube crée par les propres mouvements de la patiente. En nous basant en partie sur ces constatations et dans un désir de simplifier encore la technique, nous avons mis au point un nouveau procédé de fécondation: la fécondation en paillette. La population des patientes pouvant bénéficier de cette technique est la même que celle des fécondations in vitro classique. Ces patientes subissent une stimulation ovarienne par du Clomid - HMG, et actuellement de plus en plus par les agonistes de la LH-RH, tels la busereline et le DTR-P-6 qui permettent l'obtention d'un plus grand nombre d'ovocytes, d'embryons et également de grossesses cliniques. Les follicules contenant les ovocytes sont ponctionnés le plus souvent sous contrôle échographique. Les liquides folliculaires ainsi aspirés à la seringue sont immédiatement explorés au laboratoire. Les ovocytes sont recherchés dans les liquides folliculaires comme celA est habituellement réalisé. Ces ovocytes sont alors placés dans le plot d'une boite de culture (Nunc - Danemark) contenant 1 ml de milieu (B2 de Menezo pur) dans lequel se trouvent les spermatozoïdes mobiles, à une faible concentration de 10 000 à 20 000 par ml. Ces spermatozoides sont issus d'un sperme préparé de façon classique. Les ovocytes, jusqu'au nombre de 4, sont alors aspirés dans une méme paillette, habituellement utilisée pour la congélation des embryons. Le remplissage de la paillette s'effectue en aspirant une fraction de B2 contenant les spermatozoïdes mobiles, puis une fraction contenant les ovocytes, enfin une dernière fraction avec des spermatozoides mobiles. Le volume total ainsi aspiré dans la paillette, comportant les 26146 2 6 ovocytes et les spermatozoiïdes mobiles, est d'environ 250 microlitres. La paillette ainsi remplie est fixée à la boite de Nunc, l'extrémité ouverte baignant dans le plot contenant du B2. La boite et la paillette sont placés dans l'étuve durant 20 à 30) heures. Après ce délai le contenu de la paillette est observé. Les embryons et leur stade de développement sont alors déterminés. Ces embryons (ou ovocytes) sont laissés en culture à l'étuve dans du B2 pur jusqu'au lendemain. Lés embryons qui en sont issus sont alors replacés 44 à 50 heures après l'insémination de façon classique dans la cavité utérine à l'aide d'un cathéter de Frydman. L'étude visant à mettre au point ce mode de culture a été entreprise dès décembre 1986. Afin de ne pas compromettre les chances de succès de nos patientes, seulement 22 d'entre elles ont été retenues dans l'étude. Ces patientes devaient présenter plus de 4 ovocytes fécondables par ponction. Les 4 premiers ovocytes, indépendamment de leur stade de maturité, étaient fécondés de façon classique (FIV ou CIV), les ovocytes surnuméraires fécondés suivant la nouvelle technique précedemment'exposée. 174 ovocytes furent ainsi ponctionnés, dans 20 tentatives sous contrôle échographique et dans 2 sous contrôle coelioscopique. Sur ces 174 ovocytes, 145 seulement étaient fécondables en raison d'ovocytes atrétiques ou rompus.88 d'entre eux furent donc techniques en FIV (16) ou en CIV (72), les 57 autres suivant la nouvelle méthode. Dans 4 des tentatives, aucun clivage ne fut obtenu, que ce soit en FIV, CIV ou en paillettes ( pour 3 d'entre elles, aucun clivage n'avait été obtenu lors de tentatives antérieures). 2 6 1 4 6 2 6 Sur les 88 ovocytes techniques en FIV ou en CIV, 44 d'entres eux donnèrent des embryons, soit un taux de clivage de 50%. Sur les 57 ovocytes fécondés en paillettes, 33 embryons furent obtenus après 44 à 50 heures, soit un taux de clivage d'environ 58%. Taux tout à fait satisfaisant et ce d'autant que le stade de développement embryonnaire était identique à celui obtenu classiquement. Deux grossesses peuvent être attribuées avec certitude au replacement d'ovocytes fécondés en paillette. L'une pour laquelle les embryons replacés avaient été uniquement obtenus par cette technique, l'autre pour laquelle le replacement de 4 embryons (2 issus d'une fécondation classique et 2 d'une fécondation en paillette) s'est accompagné d'une grossesse évolutive de quadruplés. Le contenu des paillettes a été observé après 20 à 30 heures de culture en raison du virage au jaune de l'indicateur colorimétrique de Ph du milieu. Ceci correspondait à un Ph de 5 à 6 dans la zone ou se trouvait les embryons. Cette importante variation de Ph n'a pas empêché une poursuite de leur développement une fois replacé dans du B2 pur. Ces résultats nous permettent d'être très optimistes sur le nouveau mode de fécondation in vitro en paillette et de l'envisager en plaçant ces paillettes non plus à l'étuve mais directement dans la cavité utérine, en les glissant par l'orifice du col utérin. Nous n'avons pas encore réalisé de tentative en intra-utérin, la difficulté étant d'immobiliser la paillette dans la cavité utérine pour éviter son ascension ou au contraire sa descente dans la cavité vaginale. C'est l'absence de ce type de conteneur de culture qui nous a incité à penser au dispositif que nous allons décrire (Fig.1). Une paillette (1) transparente avec, comme les paillettes à congélation, une extrémité ouverte (2) qui pourra ëtre ou non fermée par un petit bouchon de substance biodégradable, l'autre extrémité borgne (3) fermée par un bouchon (4). La longueur de cette paillette dépendant de la longueur de la cavité utérine et pouvant aller de 5 cm jusqu'à 7 cm et plus. Le diamètre devant être assez étroit, 3 mm ou moins, afin de la glisser sans traumatisme à travers le col utérin. L'extrémité borgne (3) est prolongée par un manchon (5) en plastique ou autre matière, permettant d'insérer l'embout d'une seringue pour aspirer les ovocytes. Il servirait aussi à fixer l'embout d'une canule avec un mandrin interne pour déplacer le bouchon de la paillette et vider son contenu dans la cavité utérine après les 20 à 30 heures de culture. La surface externe de ce manchon présenterait des aspérités (6) afin de maintenir la paillette à l'aide d'une pince longuette au moment ou l'on fixerait la canule avec son mandrin interne. Ce manchon serait surmonté d'un pas de vis (7) sur lequel pourrait se mobiliser une molette (8) qui repousserait un petit anneau (9) et auquel serait fixé l'extrémité de plusieurs languettes (10) souples en plastique ou autre substance. L'autre extrémité de ces languettes serait fixée sur un anneau soudé (11) à la surface externe de la paillette. Ainsi, un vissage de la molette ascensionnerait l'anneau inférieur (9), ce qui produirait une saillie coudée des languettes qui s'appuieraient ainsi sur les parois internes du col utérin et permettraient d'immobiliser la paillette. La molette devrait être peu épaisse mais large, empêchant ainsi la paillette de remonter par l'orifice du col utérin, la molette (8) et le manchon (5) de fixation de la seringue ou du mandrin débordant dans la cavité vaginale. Ce 26 1 4626 système permettrait d'avoir une saillie plus ou moins marquée des languettes par vissage de la molette et d'en doser l'importance en fonction de la béance du col, et ainsi de fixer-la paillette dans la cavité utérine sans être traumatique.Un autre système de contention pourrait être envisagé comme un petit ballonet venant enserrer la paroi externe de la paillette et comprimer la paroi interne du col une fois gonflé. Un intérêt majeur de ce mode de culture en est que le replacement des embryons dans l'utérus s'effectue a l'aide de la paillette sans la nécessité d'un dispositif supplémentaire comme c'est actuellement le cas, ni risque de perdre les embryons comme celA peut arriver dans la technique conventionnelle, facteur important d'échec, puisqu'au bout des 24 A 30 heures, il suffirait de refouler le contenu de la paillette dans la cavité utérine puis par la suite de dévisser la molette afin d'enlever la paillette. Cette paillette pourrait être fabriquée en matière plastique non toxique ni cassante, transparente et assez souple pour pouvoir éventuellement se déformer lors de passage difficile du col. La molette, le pas de vis, les languettes et le manchon pouvant eux, être en matière plus rigide et ne nécessitant pas d'être transparent. La présentation pourrait se faire en emballage individuel et stérile, A usage unique. Ce système pourrait être envisagé dans une matière plus dure, notamment métal, pour pouvoir le stériliser. La présentation de ce mode de culture pourrait se faire en emballage individuel stérile. La démonstration que nous avons faite est que l'on pouvait se dispenser d'air enrichi en C02 et se contenter d'un faible volume de culture aussi bien en CIV (Culture Intra-Vaginale) que par ce mode de culture en paillette, nous amène a penser que dans un avenir assez proche, cette fécondation des ovocytes pourra s'effectuer dans une petite paillette ou gélule renfermant les ovocytes, les spermatozoïdes nécessaires à la fécondation et le milieu de culture qui peut être variable, B2 de Menezo, llquide folliculaire, sérum ou encore collagène pur tel que nous sommes en train de l'envisager. Elle pourra être secondairement introduite dans les trompes ou le péritoine et surtout dans la cavité utérine en la glissant à travers la lumière du col. Cette gélule ou paillette pouvant être réalisée dans une substance bio-dégradable (collagène ou polymere de sucre) qui permettra la libération des embryons par dégradation de la capsule après un laps de temps précis correspondant à l'obtention des embryons. Ce mode de culture permettra d'éviter un replacement embryonnaire, les embryons issus de la fécondation dans la gélule, se trouvant directement en contact avac l'endomètre après délitation de la capsule. Un autre système peut d'emblée être envisagé: c'est une paillette qui servirait, non seulement de conteneur pour la fécondation des ovocytes et la culture des embryons telles que nous venons de le décrire, mais aussi de mode de sétection des meilleurs spermatozoïdes. On peut en effet envisager une substance de viscosité identique à celle de la glaire, possédant le même pouvoir de filtration ou des qualités approchantes, par exemple collagène pur (travaux en cours sur la sélection des spermatozoïdes). Cette substance serait disposée à l'extrémité de la paillette, à la place du bouchon (4) et pourrait être en contact direct avec le milieu de culture ou séparée de celui-cl par une petite membrane poreuse. Cette substance pouvant mème jouer le rôle de milieu de culture (collagène pur ?). Des petits 2 6 1 4 6 2 6 filtres peuvent aussi *tre envisages, qui viendraient s'adapter sur le manchon ou encore des microfiltres inclus dans la paillettes, seuls ou associés à la substance, le sperme étant disposé à l'extrémité de la paillette ou dans un petit conteneur ou seringue qui viendrait s'adapter sur le manchon (5). Cette sélection des spermatozoïdes par l'intermédiaire de filtre est tout à fait réalisable, une étude en cours portant sur près de 50 patients nous l'a montré. Elle peut remplacer la classique préparation des spermatozoïdes par lavage, centrifugation puis migration, qui demande beaucoup de temps et nécessite une centrifugeuse. Lors du replacement embryonnaire, la substance ayant servi à la sélection des spermatozoïides ou les éléments filtrants, resterait dans la paillette; il suffit pour cela de déterminer la course du mandrin qui repoussera l'ensemble dans la cavité utérine, éventuellement par sécurité, l'extrémité ouverte de la paillette (2) pourrait présenter un orifice rétréci (12). REVENDICATIONS 1) Conteneur permettant la fécondation des ovocytes humains et animaux et le développement des embryons qui en sont issus, en absence d'air enrichi en C02, dans la cavité utérine, dans les trompes ou en étuve, comportant un tube très fin ou paillette (1) dont l'une des extrémités est hermétiquement bouchée (3), l'autre (2) pouvant éventuellement l'être afin de réaliser une culture en conteneur étanche caractérisé en ce que le matériau qui le constitue est d'une matière non toxique ni cassante, par exemple plastique, ou en métal dans le cas d'une paillette, soit en substance biodégradable tel du collagène ou un Dolymère de sucre, qui, en se délitant dans la cavité utérine après le délai nécessaire à la fécondation, permet la libération des embryons; caractérisé en ce que l'une de ses extrémités (3) peut présenter un système de sélection des meilleurs spermatozoides par l'intermédiaire d'une substance ayant des qualités un peu semblables à celles de la glaire, ou par l'adjonction de filtres adaptables a l'embout ou enfin de microfiltres inclus dans la paillette. 2) Conteneur selon la revendication 1, caractérisé en ce que la taille et le volume sont très faibles et varieront en fonction des dimensions de la cavité naturelle qui va le recevoir. 3) Conteneur selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'élément qui permet sa contention dans la cavité utérine est constitué de languettes (10) dont l'une des extrémités est fixée sur la paillette, l'autre sur un anneau mobile (9) qui, refoulé par le vissage d'une mollette (8),.déforme les languettes de façon variable en fonction de la dimension de la lumière du col utérin; ou d'un petit ballonet collé sur le pourtour de la paroi externe de la paillette qui permet là encore, par un remplissage plus ou moins important de doser la contention en fonction du diametre au col utérin et d'immobiliser le conteneur dans la cavité naturelle. 4) Conteneur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il possède à son extrémité bouchée (3) un manchon (5) dans lequel on peut glisser un embout de seringue pour aspirer les ovocytes et les spermatozoides mobiles lors de l'insémination, puis après un laps de temps variable, d'y fixer une canule avec- son mandrin qui permet de repousser le bouchon de la paillette et donc le contenu de celle-ci, dont les embryons dans la cavité utérine. ) Conteneur selon'les revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il peut présenter à l'une de ses extrémités (3) une unité de filtration des meilleurs spermatozoïdes par l'intermédiaire d'une substance dont les qualités sont proches de celles de la glaire, ou par des filtres s'adaptant au manchon (5) ou enfin par des microfiltres, associés ou non à la substance. La paillette étant alors conçue avec un orifice rétréci (12) afin de retenir l'unité de filtration lors du replacement des embryons. 6) Conteneur selon l'ensemble des revendications 1- à 5, caractérisé en ce qu'il est présenté en emballage individuel stérile, type poche de cellophane. 7) Utilisation du dispositif selon les revendications précédemment prises dans leur ensemble pour la fécondation des ovocytes humains et animaux, en absence d'air enrichi en C02, dans les cavités naturelles (utérine, tubaire, péritonéale) ou en étuve et pour le replacement des embryons ainsi obtenus.