FR 2616628 A1 19881223 FR 8708843 A 19870619 - 1 - PROCEDE POUR EXTRAIRE DES PROTEINES DU LACTOSERUM PAR ADSORPTION ET ELUTION. L'invention concerne un procédé pour extraire cer- taines protéines du lactosérum, à savoir les métallo- protéines, notamment celles qui fixent le fer, telles que la lactoferrine, la transferrine et la lactoperoxy- dase. Par "métallo-protéines", on désigne les protéines qui présentent une bonne affinité pour les métaux, no- tamment pour le fer. Ces protéines sont de plus en plus recherchées non seulement pour leur intérêt nutrition- nel, notamment comme apporteur biologique de fer chez les nourrissons (pour la lactoferrine), mais surtout pour leurs propriétés pharmacologiques, notamment comme agents antibactériens. On connait déjà plusieurs procédés d'extraction. Dans le document FR-A-2 399 214, on a suggéré d'ex- traire ces protéines en milieu acide par mise en contact du lactosérum avec une résine échangeuse d'anions, puis mise en contact avec de la silice et enfin élution en pH acide ou basique selon le cas. Cette solution, dans la- quelle le passage sur la résine est indispensable, per- met effectivement de séparer les protéines, mais en bloc, que celles-ci soient recherchées ou non. Ce procé- dé ne permet. donc pas de récupérer sélectivement des protéines déterminées. Dans le document FR-A-2 505 615, on a proposé de récupérer sélectivement les protéines recherchées en adsorbant tout d'abord le lactosérum sur un support solide, rigide,tel que notamment de la silice en milieu -2- -- 2 -- -- faiblement basique (pH de 7,9 à 8,5), puis en éluant les protéines adsorbées au moyen d'une solution acide. Ce procédé qui donne d'excellents résultats pour ce qui concerne l'extraction sélective, ne s'est guère développé, car le lactosérum traité prend un caractère basique qui le rend impropre à la consommation animale, sauf traitement ultérieur onéreux. L'invention pallie ces inconvénients. Elle vise un procédé d'extraction des métallo-protéines du lactosérum, dont celles fixant le fer, par adsorption sur un support solide et ensuite élution des protéines adsorbées, qui soit sélectif, économique et facile à mettre en oeuvre, et surtout permette de récupérer le lactosérum traité sans le modifier, c'est-à-dire qui le laisse utilisable, notamment dans l'alimentation animale, ce que l'on ne savait pas faire jusqu'alors. Ce procédé pour extraire ces métallo-protéines du lactosérum par adsorption sur un support de grains de silice poreuse, puis élution des protéines ainsi adsorbées au moyen de solutions, se caractérise en ce que les parois des grains de silice sont recouverts d'une couche de polysaccharides, greffés en surface. Les grains de silice poreuse dont les parois sont recouvertes d'une couche de polysaccharides, notamment de dextrane, sont déjà connus. De tels composés sont par exemple commercialisés par IBF-BIOTECHNICS sous la marque déposée SPHERODEX. Ces composés sont décrits par exemple dans le document FR-A-2 319 399 (correspondant britannique GB-A-1 544 867). - 3 - D'une manière tout à fait inattendue, les Deman- deurs ont constaté que le choix de ces grains de silice spécifique permettent - d'une part, d'améliorer considérablement le ren- dement d'extraction (deux fois et plus); - d'autre part et surtout, de supprimer le premier passage sur colonne de résine échangeuse d'anions, et par voie de conséquence permettent de simplifier l'ins- tallation et le procédé d'extraction; - enfin, d'extraire spécifiquement les métallo- protéines recherchées du lactosérum. En d'autres termes, l'invention consiste à avoir sélectionné parmi l'ensemble des grains poreux de silice connus, des grains dont les parois sont recouvertes d'une couche de polysaccharides greffés. Cette sélec- tion permet en outre d'opérer dans des conditions de pH voisines de la neutralité, notamment dans des conditions qui permettent alors de recueillir lesmétallo -protéines recherchées sous forme soluble, -donc plus facilement extractibles. Avantageusement,-en pratique: - le polysaccharide recouvrant les parois des grains de silice est du dextrane, ou un dérivé du dex- trane, par exemple un dérivé aminé, déposé par tout pro- cédé connu; ce peut être également un dérivé, aminé no- tamment,de la cellulose, de l'amidon,voire de l'agarose; - le dextrane présente des greffages répartis en surface, tels que notamment des groupements carboxyli- ques, voire des groupements acide sulfonique; - la couche de polysaccharide est monocouche, afin de ne pas obturer les micropores des grains de silice (la quantité déposée peut être de l'ordre de quinze milligrammes par mètre carré); -4- - dans une variante, le lactosérum est traité tout d'abord par passage sur des grains de silice d'un pre- mier groupe du type en question, par exemple contenant des groupements carboxyliques, puis en série par passage sur des grains d'un autre groupe, par exemple du type comprenant des groupements acide sulfonique; - les grains de silice sont des grains sphériques dont: la granulométrie est comprise entre 10 et 1000 microns, de préférence voisine de 500 microns, la surface spécifique est comprise entre 1 et 400 m2/g, de préférence comprise entre et 200 m2/g, 15. le diamètre moyen des pores est compris en- tre 5 et 150 nm; - le lactosérum est un lactosérum doux, c'est-à- dire de laiterie dont le pH est compris entre 6,3 et 6,6, voire un lactosérum de caséinerie dont le pH est compris entre 4,3 et 4,6. La manière dont l'invention peut être réalisée et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation qui suivent donnés à titre indi- catif et non limitatif, à l'appui de la figure unique annexée qui est une représentation schématique d'une installation conforme pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. -5- Exemple 1: Dans un réservoir (1), on introduit quatre cent li- tres de lactosérum (2) doux de laiterie (pH 6,4) que - l'on agite lentement pour le maintenir homogène. De ma- nière connue, on refroidit ce lactosérum à une tempéra- ture comprise entre 3 et 8 C. Ce lactosérum (2) contient par litre environ 74,6 mg de lactoferrine et 50,5 mg de lactoperoxydase. Dans le réservoir (3), on introduit vingt litres d'une première solution (4), contenant environ trois grammes par litre (g/l) de chlorure de sodium (pH 6,4). Dans la colonne (5),on place quatre kilos de grains sphériques de silice (6) poreuse commercialisée par IBF-Biotechnics sous la marque déposée "CMSPHERODEX-LS" ayant une granulométrie comprise entre 100 et 300 mi- crons, un diamètre de pore voisin de 100 nm, une surface spécifique d'environ 25 m2/g et dont les parois des po- res sont recouvertes d'une fine couche continue de dex- trane, greffée par des groupements acides carboxyliques. Dans un premier temps, on laisse tout d'abord s'é- couler le lactosérum (2) du réservoir (1) sur la silice (6) en quatre heures trente minutes. Le lactosérum traité (7) est récupéré dans un ré- servoir (8), puis est envoyé en (9) pour être concentré et séché de manière usuelle, afin de pouvoir être utili- sé dans l'alimentation animale. Lorsque tout le lactosérum (2) a traversé la colon- - ne (6), on bascule la vanne (10) pour envoyer sur la co- lonne adsorbée désignée par la référence (11) les vingt litres de la première solution (4) de lavage à pH 6,4. 261662U -- 6 -- 62 - -6- La silice (6) adsorbe les métallo-protéines recher- chées du lactosérum (2). Une fois que la solution de lavage (4) est passée, 6 on introduit dans le réservoir (3) une seconde solution saline (12) de quinze litres à 20 C, contenant treize grammes par litre de chlorure de sodium. On laisse cette seconde solution (12) s'écouler li- brement sur la colonne (11) adsorbée. Par la vanne'(13), on récupère le liquide de lavage dans le bac (14). On lave ensuite la colonne (6,11) au moyen de quatorze li- tres d'une solution saline à 45 g/l de NaCl que l'on récupère dans un bac séparé (15). Le contenu du bac (14) est envoyé dans un bac (20), puis de là dans un appareil d'ultra-filtration (11), o l'on injecte de l'eau de dialyse (31) pour diminuer la teneur en minéraux. On envoie ensuite le contenu du bac (15) dans le bac (20),et on procède de la même manière. Le retentat (22) est récupéré en tête de la colonne (21) pour être grâce à la vanne (23), soit lyophilisé en bloc (24) soit, après fractionnement en chromatographie (25), séparé en chacune desmétallo -protéines recher- chées, à savoir lactoferrine (26), lactoperoxydase (27), soit séché par tout procédé approprié. On procède ensuite en (29) à un lavage. La silice (6) est ensuite régénérée par une percolation de vingt litres d'une solution d'acétate de sodium à pH 5,5. - 7- Ainsi, pour quatre cent litres de lactosérum (2), on obtient: - d'une part, pratiquement quatre cent litres de lactosérum extrait (9) aptes à être utilisés directement dans l'alimentation anirale: - d'autre part: * 23,6 grammes de lactoferrine,soit 59 mg/1 de lactosérum de départ, * 2,8 grammes de peroxydase, soit 7,0 mg/l de lactosérum. I1 va de soi que lorsque le traitement est terminé, la silice (6) est régénérée ccmme décrit ci-dessus. Exemple 2: Dans une variante, on injecte en (31) une solution de sels de fer. Cela permet de saturer en fer les protéines recherchées, donc d'augmenter leur efficacité nutritionnelle. Exemple 3: On répète l'exemple 1 aux variantes ci-après. On remplace tout d'abord la silice (6) par une même quantité de grains de silice poreuse, commercialisée sous la dénomination SF-SPHERODEX-LS (marque déposée), dont les parois sont reccuvertes d'une couche de dextrane, greffée toutefois par des groupements sulfo-propyle et dont les caractéristiques physiques sont voisines de celles des grains de l'exemple 1. - 8 - Cn traite 306 litres d'un lactosérum doux de fro- magerie contenant 46,2 mg/l de lactoferrine et 44,7 mg/l de lactoperoxydase. Le débit est réglé à 100 litreE/beure. Dans le réservoir (3), on introduit 17 litres d'un première solution (4) contenant 3 grammes/litres de chlorure de sodium. La première -solution d'élution (12) contient 28 litres d'une solution saline à 15 g/l de chlorure de sodium. On obtient alors],23 g de lactoferrine et 0,6 g de lactoperoxydase. La deuxième solution d'élution récupérée en (15) contient 27 litres à 45 g/l de chlorure de sodium. On obtient 2,7 g de lactoferrine et 5,1 g de lactoperoxy- dase. Enfin, on traite par une troisième solution d'élu- tion de 21 litres contenant 60 g/1 de chlorure de so- dium. On obtient 4,0 g de lactoferrine. Ainsi, on a pu récupéré: * 7,93 g de lactoferrine sur les 14 de départ, * 5,7 g de lactoperoxydase sur les 13,7 de départ. Exemple 4: On répète l'exemple 1 en remplaçant le lactoserum doux de fromagerie par 198 litres de lactcserum acide de caséinerie de pH: 4,5, contenant 84,0 mg/l de lactofer- rine et 37,0 mg/1 de lactopéroxydase. On règle le débit du passage du lactoserum sur les grains de silice à groupements carboxyliques à cent litres/heure. -9- Comme précédemment, on lave avec une solution de 21 litres contenant 3 g/l de chlorure de sodium. La première élution (12) est effectuée au moyen d'une solution de 20 litres contenant 15 g/l de chlorure de sodium. On obtient 2,08 g de lactoferrine et 1,6 g de lactoperoxydase. La deuxième élution est effectuée au moyen d'une solution de 31 litres contenant 45 g/l de chlorure de sodium. On obtient 3,7 g de lactoferrine. Ainsi, on récupère: ,78 g de lactoferrine contre 16,6 au départ, 15. 1,6 g de lactoperoxydase contre 7,3 au départ. Exemple 5: On répète l'exemple 3 avec 180 litres de lactosérum acide de caséinerie (pH = 4,5) contenant 87 mg/l de lactoferrine et 33 mg/l de lactoperoxydase. La solution de lavage saline (4) contient 12 litres à 3 g/l de chlorure de sodium. La première élution (12) est effectuée au moyen d'une solution de 38 litres contenant 15 g/l de chlorure de sodium. On obtient 1,3 g de lactoferrine et 0,16 g de lactoperoxydase. La seconde élution est effectuée au moyen de 28 litres d'une solution à 45 g/l de chlorure de sodium. On obtient 3,0 g de lactoferrine et 3,9 g de lactoperoxyda- se. 26166 2 - 10 - Cn récupère ainsi: * 4,3 g de lactcferrine sur les 12 au départ, * 4,06 g de lactoperoxydase sur les 5,9 au départ. Exemple 6: Cet exemple illustre un traitement selon l'inven- tion effectué par passage du même lactosérum sur deux colonnes en série contenant chacune un type différent de grains de silice dont les parois sont recouvertes d'une couche de polysaccharide aminée. Sur une première colonne contenant quatre kilos de grains de silice CM SPHERODEX LS identiques à ceux de l'exemple 1, on percole en deux heures et demi 250 litres d'un lactosérum doux de fromagerie contenant 81,5 mg/l de lactoferrine et 52,0 mg/l de lactoperoxy- dase. On stocke le lactosérum ainsi traité puis on lave la colonne avec 15 litres d'une solution alcaline conte- nant 3 g/l de chlorure de sodium. On élue ensuite tout d'abord avec une première solution de 15 litres à 13 g/l de chlorure de sodium et on recueille une solution contenant 2,37 g de lactcperoxydase et 0,85 g de lactoferrine, puis au moyen d'une seconde solution de 16 litres; 45 g/l de chlorure de sodium permettant de recueillir alors 19,0 g de lactoferrine. On a donc recueilli ainsi: 30. 2,37 g de lactoperoxydase sur les 13 au départ, 19,85 g de lactoferrine sur les 20,3 au départ. - il - Les 250 litres de lactosérum stockés déjà traités sont ensuite percolés sur une seconde colonne ccrtenart 2,5 kilos de grains SP SPHERODEX LS, identiques aux grains de l'exemple 3 avec un débit de iC0 litres/heure. Ce lactosérum qui ne contient pratiquement plus de lactoferrine contient encore 42,1 mg/l de lactoperoxy- dase. -10 Après percolation, on lave la colonne avec une solution de 20,5 litres de chlorure de sodium à 3 g/l. On élue ensuite par 37 litres d'une solution de chlorure de sodium à 15 g/l et on obtient 1,7 g de lactoperoxydase. On élue ensuite par une solution de 18 litres à g/l de chlorure de sodium et cn obtient 9,3 g de lactoperoxydase. Cn effectue enfin une troisième élution au moyen d'une solution à 100 g/l de chlorure de sodium qui per- met de récolter les dernières traces de lactoferrine. On a donc obtenu par ce deuxième traitement 11 g de lactoperoxydase soit la quasi-totalité contenue dans le lactosérum initial. En d'autres temps, les deux opérations successives de percolation du lactosérum sur deux types de grains de silice différents, permettent donc d'extraire la quasi- totalité de la lactoferrine et de la lactoperoxydase présentes dans le lactosérum initial. - 12 - Le procédé d'extraction de l'invention se distingue des procédés proposés jusqu'alors essentiellement par: - sa simplicité, puisque l'on ne fait appel qu'à un seul adsorbant, ce qui réduit les manipulations et l'investissement; - le rendement d'extraction particulièrement élevé, spécialement en lactoperoxydase, puisque celui-ci est près de deux fois plus élevé que les meilleurs rende- ments observés jusqu'alors sur support rigide. Les protéines récupérées de la sorte, à savoir no- tamment celles qui fixent le fer, telles que la lacto- ferrine et la lactoperoxydase, peuvent être utilisées avec succès dans les applications connues à ce jour, telles que par exemple: - en nutrition animale pour la protection du tube digestif et le rôle de facteur de croissance; - dans le domaine vétérinaire pour l'activité anti- infectieuse intestinale et au niveau mammaire - dans le domaine diététique et de la nutrition humaine, notamment comme vecteur de fer; - dans le domaine pharmaceutique: ophtalmologie, gastro-entérologie, paradontologie, dermatologie, gynécologie.. - 1.3 - REVENDICATIONS 1/ Procédé pour extraire des métallo -protéines du lactosérum, par adsorption sur un support de grains de silice poreuse, puis élution des protéines ainsi adsorbées au moyen de solutions, caractérisé en ce que les parois des grains de silice poreuse sont recouvertes d'une couche de polysaccharides greffés. 2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polysaccharide est du dextrane. 3/ Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les greffages du dextrane sont répartis en surface et comprennent des groupements carboxyliques ou des groupements acide sulfonique. DEPOSANTS: 1/ ENTREMONT S.A. 2/ SOCIETE NATIONALE ELF AQUITAINE MANDATAIRE: Cabinet Michel LAURENT / /J