FR 2616437 A1 19881216 FR 8708125 A 19870611 La présente invention concerne de nouveaux polymères composites homogènes à base de silice et de copolymères réticulés tridimensionnels utiles dans les techniques de chromatographie liquide notamment pour la séparation de composés biologiques. Afin de pouvoir être utilisés industriellement, les sup- ports de chromatographie liquide doivent posséder de nombreuses propriétés physicochimiques. En particulier, ils doivent être hydrophiles, chimiquement inertes, stables aux agents chimiques et physiques courants, mécaniquement rigides, non biodégradables, modifiables chimiquement pour le greffage de molécules, de porosité connue et maîtrisée au moment de la synthèse, obtenables sous forme de billes avec une faible dispersion de diamètre et peu coûteux. A l'heure actuelle, aucun support connu ne répond parfai- tement à tous ces impératifs. Il a maintenant été trouvé, conformément à l'invention, de nouveaux polymères composites dont les propriétés physico-chimiques répondent parfaitement aux exigences industrielles. Les polymères composites selon l'invention sont des poly- méres homogènes contenant sous forme interpénétrée 20 % à 80 % en poids de silice et 80 % à 20 % en poids d'un copolymère acrylique, vinylique et/ou allylique réticulé tridimensionnel comprenant sous forme copolymérisee 70 % à 98 % en poids d'au moins un monomère acrylique, vinylique ou allylique monofonctionnel et 2 % à 30 % en poids d'un monomère réticulant acrylique ou allylique bifonc- tionnel. Les polymères composites préférés sont ceux contenant 15 % à 50 % en poids de silice et 50 % à 85 % en poids du copolymère acrylique, vinylique et/ou allylique réticulé tridimensionnel. Comme monomères acryliques monofonctionnels, on peut citer l'acrylamide, le méthacrylamide, le N-[tris(hydroxyméthyl)méthyl] acrylamide, le N[tris(hydroxyméthyl)méthyl]méthacrylamide, le méthylolacrylamide, l'acrylate de polyéthylèneglycol, le N-acryloyl ou N-méthacryloyl amino-2 hydroxyméthyl-2 propanediol-1,3, le mor- pholinoéthylacrylamide, le diéthylaminoéthylacrylamide, le diéthyl- aminoéthylméthacrylamide, le triéthylaminoéthylacrylamide, le triméthylaminopropylméthacrylamide, l'acide acrylique, l'acide méthacrylique, l'acide acrylamido-6 hexanoïque, l'acryloylglycine, l'acryloyl P-alanine, l'acide acrylamidométhylpropanesulfonique, l'acryloylphosphocholamine et l'acroléine. Comme monoméres vinyliques et allyliques monofonctionnels, on peut citer la vinylpyrrolidone et l'allylamine. Comme monomères réticulants acryliques et allyliques bifonctionnels, on peut citer le N,N'-diallyltartradiamide, le N,N'-méthylène-bis-acrylaiide, le N,N'-hexaméthylène-bis-acryla- mide, le N,N'-méthylêne-bis-hydroxyméthylacrylamide, le glyoxal- -bis-acrylamide, l'éthylènediacrylate et le diacrylate de polyéthy- lèneglycol. Les monomères acryliques et vinyliques préférés sont le N[tris(hydroxyméthyl)méthyl]acrylamide, le N-[tris(hydroxyméthyl) méthyl]méthacrylamide, le diéthylamincéthylacrylamide et la vinyl- pyrrolidone. Le monomère réticulant préféré est le N,N'-méthylène- -bis-acrylamide. Les polymères composites selon l'invention peuvent être préparés par polymérisation simultanée ou séquentielle, en milieu aqueux, de silicate de sodium, d'un ou plusieurs monoméres vinyli- ques, acryliques ou allyliques monofonctionnels et d'un monomère réticulant acrylique ou allylique bifonctionnel en présence d'un agent de polymérisation. Le procédé consiste à ajouter une solution aqueuse de silicate de sodium dans une solution aqueuse à pH 4-5 du ou des monomères vinyliques, acryliques ou allyliques et du moncmère réticulant. A ce milieu qui est stable 2 à 3 heures à température ambiante, est ajouté l'agent de polymérisation. La polymérisation est poursuivie à une température variant de 100C à 80 C et de préférence de 20 C à 50 C. La solution du ou des monomères vinyliques, acryliques ou allyliques est acidifiée à pH 4-5 au moyen d'un acide organique ou minéral tels que l'acide acétique ou l'acide sulfurique. La concentration en silicate de sodium de la solution aqueuse soumise à la polymérisation varie de 20 g/l à 200 g/l et de préférence de 30 g/l à 150 g/1l. La concentration en monomères acryliques, vinyliques et/ou allyliques de la solution aqueuse soumise à la polymérisation varie de 2C g/l à 25C g/l et de préférence-de 80 g/l à 160 g/l. Le rapport en poids du ou des monomères acryliques, viny- liques ou allyliques / monomère réticulant est compris entre 50 et 4 et de préférence entre 20 et 5. La concentration des agents de polymérisation dans la solution aqueuse soumise à la polymérisation varie de 1 g/l à 2î0 g/l. L'agent de polymérisation est un agent habituellement utilisé en polymérisation radicalaire. Comme tels, on peut citer les systèmes Red-ox comme persulfate alcalin + N,N,N',N'-tétramé- thyléthylènediamine, persulfate alcalin + diméthylaminopropioni- nitrile et l'azo-2,2'-bis-isobutyronitrile. La polymérisation peut être une polymérisation en bloc ou en émulsion. Dans le cas de la polymérisation en bloc, la solution aqueuse contenant le silicate de sodium, les divers monomères et l'agent de polymérisation est soumise à une polymérisation en phase homogène. Le bloc de gel aqueux obtenu est ensuite fractionné en grains par des moyens physiques classiques, lavé avec de l'eau et/ou des solvants organiques puis séché jusqu'à obtention d'une poudre. 26 1 6437 La polymérisation en émulsion, qui est le mode de prépara- tion préféré car elle fournit directement le polymère sous forme de granulés sphériques de taille déterminée, peut être effectuée en émulsionnant la solution aqueuse de silicate de sodium et des mono- mères avant polymérisation, dans un liquide organique non miscible et sous agitation et contenant éventuellement un agent émulsifiant. La vitesse d'agitation est réglée de manière à obtenir une émulsion de la phase aqueuse dans la phase organique ayant la taille de gouttelettes voulue. Une fois réglée la vitesse d'agitation, on introduit dans l'émulsion l'agent de polymérisation qui déclenche la polymérisation. Les particules sphériques de polymère sont récu- pérées par décantation, neutralisées, filtrées puis lavées à l'eau. A la solution aqueuse soumise à la polymérisation, on peut éventuellement ajouter un produit qui permet d'augmenter la visco- sité du milieu réactionnel tel que le glycérol. Comme liquide organique non miscible utilisable, on peut citer, par exemple, les huiles végétales (huile de soja, huile d'arachide, huile de tournesol, etc...) ou minérales (huile de paraffine, huile de silicones, etc...), les produits de distilla- tion fractionnée du pétrole (benzène, toluène, etc...), les hydro- carbures chlorés (tétrachlorure de carbone, chlorure de méthylène, etc...) et les mélanges de ces divers composés. La phase organique peut éventuellement contenir un agent émulsifiant comme les produits connus sous la dénomination commer- ciale "Arlacel C", "Spans" ou "Tweens" à la concentration de 0,05 % à 5 % en volume. Les perles obtenues par le procédé de polymérisation en émulsion ont un diamètre de particules qui varie, suivant les conditions opératoires, de 5 pm à 500 gm. Il est aissi possible d'obtenir des polymères de forme différente tels que des filtres, des plaques ou des films à condi- tion de préformer ou mouler la solution avant polymérisation. Les polymères selon l'invention sont stables thermiquement et sont insensibles & l'attaque bactérienne ou enzymatique. En outre, ils sont stables chimiquement en présences d'agents chaotro- piques, de détergents et de dissociants et peuvent être utilisés dans une vaste zone de pH. Les polymères selon l'invention peuvent être utilisés dans les techniques de chromatographie liquide notamment pour la sépara- tion de composés biologiques tels que les sucres, -les acides aminés, les nucléotides, les polysaccharides, les protéines, les acides nucléiques et pour la séparation de molécules organiques de différentes tailles y compris les polymères. Ils permettent la séparation de ces composés soit par tamisage moléculaire (monoméres ioniques) soit par échanges ioni- ques (monomères ionisables) soit par spécificité (monomères fonc- tionnalisés spécifiques. Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, montrent comment l'invention peut être mise en pratique. Exemple 1 A 200 ml d'une solution comprenant 150 mg/ml de N-[tris (hydroxyméthyl)méthyllacrylamine et 30 mg/ml de méthylène-bis-acry- lamide dans de l'eau déminéralisée, on ajoute 50 ml d'acide acéti- que glacial puis 5 g de persulfate d'ammonium. A la solution ainsi obtenue, on ajoute 200 ml d'une solution aqueuse de silicate de sodium à 8,8 % soit 10 Bé. Cette nouvelle solution est stable 2 à 3 heures à température ambiante. ml de N,N,N',N'-tétraméthyléthylênediamine (TEMED) sont introduits dans la solution organo-minérale, sous légère agitation. Après quelques secondes, on observe un échauffement du milieu réactionnel et une prise en masse rapide. On obtient ainsi un bloc de gel aqueux, rigide, de couleur blanc ivoire qui peut être desséché à l'air libre ou à l'étuve à une température comprise entre l'ambiante et 120 C. Ce bloc peut être fragmenté en grains par les procédés - classiques. Exemple 2 La solution organo-minérale préparée selon le procédé dé- crit à l'exemple 1 est dispersée dans 2 litres d'huile de paraffine modérément agitée et à laquelle on a préalablement ajouté 1 ml d'agent émulsifiant connu sous la dénomination commerciale d'"Arlacel C". La vitesse d'agitation est réglée de façon à obtenir une émulsion stable dont les gouttelettes ont un diamètre compris entre Pm et 500 gm. A cette émulsion, on ajoute un mélange composé de 50 ml de TEMED, 5 ml d'"Arlacel C" et 150 ml d'huile de paraffine. Apres quelques secondes, or. observe une élévation de tem- pérature d'une dizaine de degrés celsius. Apres retour à la tempé- rature ambiante, on décante, la phase huileuse est éliminée par succion et les perles obtenues sont lavées à l'eau déminéralisée. La suspension de perles est ajustée à pH 6,5-7 par adjonction de soude r.normale, puis laissée sous faible agitation pendant une nuit. Les perles sont tamisées puis desséchées. Ces perles sont utilisables dans les fractionnements chromatographiques par tamisage moléculaire. Exemple 3 A 8 litres d'une solution comprenant 300 g/l de N-[tris (hydroxyméthyl)méthyl]acrylamide et 30 g/l de méthylène-bis-acryla- mide dans de l'eau déminéralisée, on ajoute 1,6 1 d'acide acétique glacial et 160 g de persulfate d'ammonium. Après dissolution de ce dernier, on ajoute 8 litres d'une solution préparée à partir de 2,7 1 de glycérol, 2,7 1 d'eau déminéralisée et 2,7 1 de silicate de sodium à 35 % dans l'eau (40 Bé). La solution organo-minérale ainsi obtenue est versée sous agitation dans 20 litres d'huile de paraffine et 10 ml d'agent émulsifiant connu sous la dénomination commerciale d'"Arlacel C". La vitesse d'agitation est réglée de façon à obtenir une émulsion stable dont les gouttelettes ont un diamètre compris entre Pm et 500 Pm. 26 1 6437 Lorsque la suspension est homogène, on verse 2,3 1 d'une solution comprenant 1,3 litre de TEMED, 256 ml d"'Arlacel C" et 3,2 1 d'huile de paraffine. Une demi heure après ce premier ajout, on ajoute encore 2,3 1 de cette même solution de TEMED. On observe à chacun de ces ajouts de TEMED une augmentation de température; le milieu réactionnel passe ainsi de 25 C à 41 C. Après retour à la température ambiante, on décante. La phase huileuse est éliminée par succion et les perles obtenues sont lavées à l'eau déminéralisée. La suspension de perles est ajustée à pH 6,5-7 par adjonction de soude normale puis laissée une nuit sous agitation. Ces perles peuvent après dessication et réhydratation être utlisées dans les fractionnements chromatographiques par tamisage moléculaire. Exeraple 4 A 200 ml d'une solution comprenant 150 mg/ml de N-[tris (hydroxymnthyl)méthyl;acrylam.de et 30 mg/ml de méthylène-bis- -acrylamide dans de l'eau déminéralisée, on ajoute 70 ml d'acide acétique glacial et 5 g de persulfate d'ammonium. Apres dissolution de ce dernier, on ajoute 200 ml d'une solution de silicate de sodium à 17,5 % soit 20 Bé. La solution organo-minérale ainsi obtenue est versée sous agitation dans 2 litres d'huile de paraffine et 1 ml d'agent émul- sifiant connu sous la dénomination commerciale d'Arlacel C". La vitesse d'agitation est réglée de façon à obtenir une émulsicn stable dont les gouttelettes cnt un diamètre compris entre p. et 5 P0 m. Lorsque la suspension est homogène, on ajoute un mélange de 70 ml de TEMED, 120 ml d'huile de paraffine et 5 ml d"'Arlacel C". Les perles sont récupérées de façon identique que dans les exemples précédents. Ce produit est utilisable comme support chromatcgraphique destiné à la gei-filtration. 2 6 1 6 4 3 7 Exemple 5 A une solution obtenue par chauffage à 55 C de 30 g de N-[tris(hydroxyméthyl)méthyl]acrylamide, 2 g de diméthylaminoéthy- lacrylamide et 6 g de méthylène-bis-acrylamide complétée à 80 mi avec de l'eau déminéralisée et revenue à température ambiante, on ajoute 34 ml d'acide acétique, 80 ml d'une solution de silicate de sodium à 17,5 % et 2 g de persulfate d'ammonium. La solution organo-minérale ainsi obtenue est versée sous agitation dans i litre d'huile de paraffine et 3 ml d'agent émulsi- fiant connu sous la dénomination commerciale d'"Arlacel C". La vitesse d'agitation est réglée de fagon à obtenir une émulsion stable dont les gouttelettes ont un diamètre compris entre gm et 500 Lm. Lorsque la suspension est homogène, on ajoute un mélange de 70 ml de TEM-ED et 70 m' d'huile de paraffine. Les perles sont récupérées selon la méthode décrite dans les exemples 2 et 3. Ce produit est utilisable pour la réalisation d'une chromatographie d'échar:nge d'ions. Exemple 6 On opère comme dans l'exemple 2 mais en remplagant le N'tris(hydroxymnéthyl)méthyl]acrylamide par une quantité identique de N-[tris(hydroxyméthyl')méthyl]méthacrylamide. Les perles obtenues sont utilisables dans les fractionne- ments chromatographiques par tamisage moléculaire. Exemple 7 A 200 ml d'une solution comprenant 230 mg/ml d'acrylamide et 23 mg/ml de méthylène-bis-acrylamide dans de l'eau déminérali- sée, on ajoute 25 ml d'acide acétique glacial puis 5 mg de persul- fate d'ammonium. A la solution ainsi obtenue, on ajoute 200 ml d'une solution aqueuse de silicate de sodium à 10 %. 26 1 6437 La solution organo-minérale ainsi obtenue est versée sous agitation dans 2 litres d'huile de paraffine contenant 1 ml d'émul- sifiant connu sous la dénomination commerciale d'"Arlacel C". La vitesse d'agitation est réglée de façon à obtenir une émulsion stable dont les gouttelettes ont un diamètre compris entre pm et 500 pm. Lorsque la suspension est homogène, on ajoute un mélange de 25 ml de TEMED, 120 ml d'huile de paraffine et 5 ml d'"Arlacel C". Les perles de polymères ainsi obtenues sont récupérées de fagon identique à celle décrite dans les exemples précédents. Ce produit est utilisable comme-support chromatographique destiné à la gel-filtration. Exemple 8 A 200 ml d'une solution aqueuse comprenant 150 mg/ml de vinylpyrrolidone et 50 mg/ml de méthylène-bis-acrylamide, on ajoute ml d'acide acétique glacial puis 5 mg de persulfate d'ammonium. A la solution ainsi obtenue, on ajoute 200 ml d'une solution de silicate de sodium à 14 %. La solution organo-minérale ainsi obtenue est versée dans 2 litres d'huile de paraffine contenant 1 mi d'émulsifiant connu sous la dénomination commerciale d'"A'r:acel C". La vitesse d'agitation est réglée de fagon à obtenir une émulsion stable dont les gouttelettes ont un diamètre compris entre 5 km et 500 pm. Lorsque la suspension est homogène, on ajoute un mélange de 50 mI de TEMED, 120 ml d'huile de paraffine et 5 mi d'"Arlacel C". Les perles ainsi obtenues sont récupérées de fagon simi- laire à celle décrite dans les exemples précédents. Ce produit est utilisable comme support chromatographique destiné à la gel-fitt. Exemple 9 Dans une coicnne de verre de 1,6 cm de diamètre intérieur et de 50 cm de hauteur, on introduit 90 ml du gel obtenu selon l'exemple 3 dont les particules ont ur diamètre ccmpris entre 40 pm et 80 pm. Une fois les perles de polymères tassées dans le tube chromatographique et lavées à l'aide d'une solution tampon tris(hydrométhyl)aminométhane / HCl 50 mM, NaC1 0,15 M, pH 7,4, on introduit en haut de la colonne l'échantillon contenant les substances à séparer. Cet échantillon est constitué par 1 ml de la solution tampon précédente contenant 10 mg d'albumine bovine, 10 mg de P-lactoglobuline, 10 mg de myoglobine et 5 mg de cytochrome C. On élue avec la solution tampon précédente sous un débit de 6,6 ml/h. On sépare ainsi les 4 substances contenues dans l'échantillon. REVENDICATIONS 1 - Polymères composites homogènes contenant sous forme interpénétrée 20 % à 80 % en poids de silice et 80 % à 20 % en poids d'un copolymère acrylique, vinylique et/ou allylique réticulé tridimensionnel comprenant sous forme copolymérisée 98 % à 70 % en poids d'au moins un monomère acrylique, vinylique ou allylique monofonctionnel et 2 % à 30 % en poids d'un monomère rêticulant acrylique ou allylique bifonctionnel. 2 - Polymères se-'n la revendicaticn 1 contenant 15 % à 50 % en poids de silice et 50 % à 85 % en poids du ccpolymère acrylique, vinylique et/ou allylique réticulé tridimensionnel. 3 - Polymères selon l'une des revendications 1 et 2 pour lesquels le ccpolymère acrylique, vinylique ou alyl!ique monofonc- ticnne. est l'acrylaride, le méthacrylamide, le N-[tris(hydroxymé- thyl)méthyl] acrylamide, le N-atris(hydroxynéthyl)méthyl] méthacry- lamide, le méthylolacrylamide, l'acrylate de polyéthylèneglycol, le N-acrylovy ou H-m.thacrloyl amino-2 hydroxyméthyl-2 propane- diol-1,3, le morpholincéthylacrylamide, le diéthylaminoéthylacry- lamide, le diéthylamincéthylméthacrylamide, le triêthylaminoéthyla- crylamide, le triméthylamin.cpropylmêthacrylamide, l'acide acryli- que, l'acide méthacrylique, l'acide acrylamido-6 hexanoïque, l'acryloylglycine, l'acryloyl P-alanine, l'acide acrylamidométhyl- propanesulfonique, l'acryloylphosphocholamine, l'acroléine, la vinylpyrrolidone ou l'allylamine. 4 - Polymères selon l'une des revendications 1 à 3 pour lesquels le monomère réticulant est le N,N'-diallyltartradiamide, le N,N'-méthylène-bis-acrylamide, le N,N'-hexaméthylène-bis-acryla- mide, le N,N'-méthylène-bis-hydroxyméthylacrylamide, le glyoxal- -bis-acrylamide, I'éthylènediacrylate et le diacrylate de polyéthy- lèneglycol. 2 6 4 3 7 - Procédé de préparation des polymères composites selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on polymérise simultané- ment ou séquentiellement en milieu aqueux éventuellement en pré- sence d'un liquide organique non miscible et/ou d'un agent qui permet d'augmenter la viscosité du milieu, du silicate de sodium, un ou plusieurs monomères vinyliques, acryliques ou allyliques monofonctionnel et un monomère rêticulant acrylique ou allylique bifonctionnel. 6 - Application des polymères composites selon l'une des revendications 1 ou 2 dans les techniques de chromatographie liquide.