FR 2618159 A2 19890120 FR 8709935 A 19870715 La présente addition concerne un perfectionnement du procédé de stabilisation d'un vecteur plasmidique contenu dans une bactérie décrit au brevet principal. Le brevet principal propose un procédé de stabilisation dans lequel la bactérie comporte une mutation chromosomique dap et le vecteur plasmidique comporte un gène dap+, la mutation chromosomique en cause pouvant être plus ou moins importante et étant située, de préférence, dans le gène dapD. Afin d'éviter les recombinaisons homologues possibles entre le plasmide dapD+ et le gène dapD muté du chromosome, la présente addition propose une délétion importante du gène dapD du chromosome. C'est pourquoi la présente addition concerne un procédé de stabilisation d'un vecteur plasmidique contenu dans une bactérie selon l'une des revendications 1 à 5 du brevet principal, caractérisé en ce que la mutation chromosomique dap est une délétion d'une partie au moins du gène dapD et en ce que le vecteur plasmidique porte un gène dapD intact. Il est clair qu'affin d'éviter toute recombinaison, une délétion totale du gène dapD sera la solution la plus satisfaisante. Toutefois, un système de sélection si puissant soitil ne peut remédier à l'instabilité propre d'un plasmide. C'est pourquoi, afin d'augmenter la stabilité des vecteurs d'expression en cause par des moyens génétiques, il est possible-d'introduire dans lesdits vecteurs une séquence qui les maintient à l'état de monomères, en particulier la séquence cer Le "cer" (Summers et Sherratt, 1984) est un élément qui ne code pour aucune protéine et dont la présence favorise le maintien monomérique d'un plasmide. Si le plasmide se multimérise, le nombre d'unités distribuables aux cellules filles chute et on obtient plus facilement des cellules dépourvues de plasmide. Indirectement donc, le cer stabilise le plasmide en le maintenant à l'état de monomère. Comme cela a été décrit dans le brevet principal, les vecteurs plasmidiques en cause sont stables sur milieu complet et peuvent être utilisés industriellement pour la préparation de protéines d'intérêt industriel. C'est pourquoi la présente addition concerne également des vecteurs plasmidiques qui comportent en outre le gène codant pour une protéine d'intérêt industriel et les éléments assurant son expression dans la bactérie ho te, et, notamment, le gène codant pour une hirudine ou l'un de-ses variants naturels ou synthétiques, le C2130, l'interféron gamma ou l'alpha-antitrypsine par exemple, ainsi que les souches transformées par ces différents vecteurs et les procédés de préparation des protéines industrielles par culture desdites souches transformées sur milieu complet et récupération de la protéine après culture. Les éléments d'expression des protéines industrielles sont connus, il s'agit essentiellement de promoteurs actifs dans les cellules hôtes, par exemple l'un des promoteurs du phage lambda dans E. coli. Les exemples ci-après permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente addition. Les figures suivantes illustrent les exemples. Figure 1 : Carte de restriction du fragment HindIII-BamHI du pDB6. Figure 2 : Schéma des inserts PstI du pDB6 dans M13mp8 et position des sites EcoRI qui y sont introduits. Figure 3 : Carte de restriction du fragment KpnI-BglII du pTG47. Figure 4 : Démonstration de la délétion du gène dap dans les ADNs chromosomiques de différentes souches, par autoradiographie de "Southern blots". Figure 4A : . sonde = gène kanR porté par le fragment EcoRI du pTG47 bandes 6 à 9 ADs coupé par PstI 10 à 14 ADN coupé par BamHI et HindIII bandes 6 et 10 = souches GC4540 7 et 11 TGE7213 8 et 12 TGE7214 9 et 13 TGE901 14 pDB6 1, 2, 5, 16 marqueurs de poids moléculaires Figure 4B : . sonde = côté 5' du gène dapD porté par le frag ment EcoRI du M13TG620 . bandes 4 à 7 ADN coupé par PstI 8 à 11 ADN coupé par BamHI et HindIII . bandes 4 et 8 = souches GC4540 5 et 9 TGE7213 6 et 10 TGE7214 7 et 11 TGE901 . bandes 13 marqueurs de poids molé culaires 1 et 12 pDB6 coupé par PstI ou BamHI et HindIII 2 M13TG620 coupé par PstI 3 M13TG597 coupé par PstI Figure 4C :. sonde = régions flanquantes du gène dapD portées par le fragment KpnI-BglII du pTG47. , ADNs chromosomiques coupés par PstI. bandes 4 5 souches GC4540 5 TGE7213 6 TGE7214 7 TGE901 , bandes 8 = marqueurs de poids moléculaires 1 fragment BamHI-HindIII de pDB6 coupé par PstI 2 M13TG620 coupé par PstI 3 M13TG597 coupé par PstI Figure 4D : . sonde = régions flanquantes du gène dapD portées par le fragment KpnI-BglII du pTG47. , ADNs chromosomiques coupés par PstI bandes 4 = souches RH5345 5 RL58 6 TGE7615 1, 2, 3 (comme en 4C) Figure 5 : Schéma et carte de restriction du pTG790. Figure 6 : Schéma et carte de restriction du pTG792. Figure 7 : Schéma et carte de restriction du pTG7922. Figure 8 : Schéma et carte de restriction du pTG769. Figure 9 : Schéma et carte de restriction du pTG7406. Figure 10 : Electrophorèse sur gel d'acrylamyde-SDS, révélé au bleu de Coomassie, des protéines synthétisées par TGE7213/pTG7407. , bandes 1 et 8 = marqueurs de poids moléculaires , bandes 2 à 5 = culture à 300C, 4 heures (2 et 3) ou 7 heures (4 et 5) , bandes 6 à 12 : culture induite à 420C, 4 heures (6, 11 et 12) ou 7 heures (7, 9 et 10) C = fraction insoluble ; 20 p1 S = fraction soluble ; 40 l Figure 11 : Schéma et carte de restriction du pTG7675. Figure 12-: Schéma et carte de restriction du pTG7914. Exemple 1 Délétion du gène dapD du chromosome de la bact- rie. sous clonage du gène dapD sur 2 fragments PstI Le plasmide pDB6 et le M13mp8 sont coupés par PstI et ligués. On crible les M13 contenant l'extrémité 5' et l'extrémité 3' du gène par des oligonucléotides spécifiques de ces régions, respectivement TG596 (GCGCTTAATAACGAGTTG) et TG598 (TGTGCATACTTTAGTC). Les candidats SB96 et SB98 sont retenus et l'insertion des fragments voulus confirmée par séquençage. (voir schéma de la figure 1). Introduction d'un site EcoRI dans les extrémités 5' et 3' du gène dapD Des sites EcoRI sont introduits dans SB96 et SB98 par mutation ponctuelle - dans SB98 avec l'oligonucléotide TG597 GTACGCAGGAATTCCTTAATGCCG qui s'apparie avec la région 3' de la fin du gène, mais avant un terminateur de transcription supposé. - dans SB96 avec l'oligonucléotide TG620 AGAGGCCCGAATTCCAAACG qui s'apparie avec la région 5' en amont du promoteur suppo sé du gène dapD. Les transformants sont analysés avec les mêmes sondes qui ont servi à introduire les sites EcoRI. La présence de ce site EcoRI est confirmée en minipréparation d'ADN et ensuite par séquençage des candidats M13 retenus (voir schéma figure 2). Construction d'un vecteur de délétion Le gène de résistance à la kanamycine du plasmide pUC-4K (vendu par Pharmacia) est récupéré sous forme de fragment EcoRI. Les M13TG597 et 620 sont coupés par EcoRI et PstI ce qui libère respectivement l'extrémité 3' du gène dapD (sans le terminateur supposé) et l'extrémité 5' du gène (sans son promoteur supposé). Le vecteur de clonage pTG192 (décrit dans le brevet principal) est coupé par PstI. L'ensemble de ces fragments est ligué. Après transformation de cellules 5K et étalement sur LB + ampicilline 0.1 mg/ml + kanamycine 0.02 mg/ml, on crible les colonies par l'oligonu- cléotide TG596. Une construction a été sélectionnée : pTG47. Sa structure est analysée par minipréparation d'ADN et l'orientation du gène de résistance à la kanamycine et déterminée par digestion du plasmide par Hindili, ce qui libère 2 bandes de tailles 5.3 et 4.0 kb. L'orientation du gène de résistance à la kanamycine dans pTG47 est la même que celle du gène dapD dans pDB6 (dans l'autre orientation on aurait obtenu des bandes de tailles 4.9 et 4.4 kb). Le schéma du pTG47 est représenté dans la figure 3. Délétion du gène dapD du chromosome Délétion du gène dapD du chromosome d'une souche intermédiaire Des cellules RH5345, dont la compétence s'élève à 2.5 10-7 transformants/p g d'ADN de pTG47, sont transformées par le plasmide pTG47 préalablement coupé par KnpI et BglII (voir figure 3). Cette digestion libère un fragment qui contient les régions flanquantes du gène dapD, le gène lui-même étant remplacé par le gene de résistance à la kanamycine. Après étalement sur LB + DAP + kanamycine 0.01 mg/ml on sélectionne 9 candidats- : TGE721 a' TGE729 dont on confirme le phénotype dap-, $kanR. L'absence du gène dapD est confirmée après transformation de ces souches par le pTG764 par leur capacité de se multiplier en milieu LB. Délétion du gène dapD de la souche TGE901 et N5969 La délétion dapD de la souche TGE721 est ensuite transduite dans les souches TGE901 et N5969 par le phage transducteur Plvir/TGE721 et les recombinants dap sélectionnés par leur résistance à 0.01 mg/ml de kanamycine. Les candidats retenus sont respectivement TGE7213, 7214 et TGE7303. Les exigences en ile, val, his de la souche mère, TGE901, en plus du caractère dap"kanR ont été confirmés sur les milieux appropriés, pour un candidat : TGE7214. Exemple 2 Confirmation de la délétion du gène dap dans différentes souches par "blot" chromosomique. Les différentes souches suivantes ont été analysées - les souches parentales TGE901 et RH5345, dapD+ . les souches délétées TGE7213 et 7214 la souche parentale RL58 qui a été employée pour introduire la mutation dapD dans TGE901, et le mutant dapD', TGE7615, qui en dérive . une souche GC4540 qui est résistante à la kanamycine par intégration du Tn5 alors que dans les souches TG... le gène de résistance a' la kanamycine dérive du Tn903 (les 2 gènes ne devraient pas donner d'hybridation croisée par manque d'homologie - Beck et al. 1982) Le choix des enzymes de restriction est basé sur la séquence du pDB6 ; une coupure par - BamHI et HindIII libère un fragment chromosomique de 9 kb contenant le gène dapD et ses régions flanquantes, dans le cas des souches sauvages ; dans le cas des souches délétées le gène de résistance devra être libéré par la digestion par BamHI et coupé en 2 fragments par digestion par HindIII. - PstI libère 2 fragments contenant chacun une partie du gène dapD (2.8 kb de la région 5' et 3.4 kb de la région 3') pour les souches sauvages ; dans le cas des souches délétées la digestion par PstI libère le gène de résistance à la kanam- cine et les 2 régions flanquantes (du côté 5' un fragment de 2.4 kb et du côté 3' un fragment de 2.8 kb) (voir figures 1 et 3). Les sondes ont été choisies pour allumer le gène dap ou ses régions flanquantes ou le gène kanR - pour sonder le gène de résistance à la kanamycine on isole un fragment EcoRI du pTG47 qui ne contient que ce gène de résistance (figure 3). - pour sonder le gène dapD on utilise un fragment EcoRI de 2.4 kb du M13TG620 ne contenant que la région 5' du gène dapD et qui devrait être entièrement délété dans TGE721, 7213j 7214 (figure 2). - pour sonder le chromosome on utilise un fragment KpnI-BglII de pTG47 qui contient le gène de résistance à la kanamycine et les 2 régions (le côté 5' et le 3') du chromosome qui flanquent le gène dapD (figure 3). On s'attend donc à allumer, - dans les souches sauvages, une bande de 2.8 kb correspondan à la région 5' du gène dapD et une bande de 3.4 kb corres pondant à la région 3' de ce gène (figure 1). - dans les souches délétées, le gène de résistance à la kana mycine, la région 5' flanquante du gène dapD qui subsiste (2.4 kb) et la région 3' flanquante du gène dapD qui subsis te (2.8 kb) (figure 3). D'mon.tration de l'incorporation du gne da rôsistance la kanamycine On a comparé les ADNs chromosomiques de GC4540, TGE7213, TGE7214 et TGE901, coupés par PstI ou BamHI et HindIII et sondé par le fragment EcoRI du pTG47. PstI libère la bande de 1.3 kb , une restriction BamHI et HindIII donne 2 fragments de 0.7 et 0.6 kb pour les souches délétées uniquement. Aucune bande ne s'allume dans TGE901 ni dans GC4540 (figure 4A). Ces résultats prouvent que le gène de résistance à la kanamycine est incorporé dans le chromosome des souches délétées et que ce gène provient du pUC-4K. Démonstration de la délétion du gène dapD du chromosome Les ADNs chromosomiques de GC4540, TGE7213, 7214 et TGE901 sont comparés avec comme contrôles M13TG620, M13TG5971 le fragment BamHI-HindIII de pDB6 et le même fragment coupé par PstI (figure 1). Les ADNs chromosomiques sont coupés par PstI ou BamHI et HindIII. On isole M13TG620 coupé par EcoRI de la bande contenant spécifiquement le côté 5' du gène dapD pour l'utiliser comme sonde (figure 4B). Après digestion par PstI on voit que dans les souches sauvages on allume une bande de 2.8 kb correspondant å la région 5' du gène dapD, mais aussi une bande inattendue de 1.7 kb. Après digestion par BamHI et HindIII on allume une bande d'environ 12 kb qui est plus grande que la bande (de 9 kb) en provenance de pDB6. En plus une bande supplémentaire de 2.5 kb est aussi présente dans les souches sauvages (figure 4B). Aucune homologie significative n'est apparente pour les souches délétées, dans aucun fragment de digestion. Ces observations montrent que - une sonde qui couvre la partie 5' du gène dapD n'allume aucune bande dans le chromosome des souches TGE7213, 7214 ce qui démontre la délétion du côté 5' de ce gène. - comme on allume dans les souches sauvages, en plus de la bande attendue, une deuxième bande, spécifique du gène dapD, il semble que ce gène soit dupliqué dans ces souches. Comme une duplication du gène dapD était inattendue, nous avons confirmé cette duplication dans certaines souches sauvages, et confirmé la délétion du gène dap du côté 3' en plus du côté 5'. Les mêmes ADNs chromosomiques et contrôles sont utilisés après digestion avec PstI (figure 3). La sonde est le pTG47 coupé par KpnI et BglII. Cette sonde devrait allumer, en plus des bandes que l'on a prédites plus haut, au moins une bande de 1.7 kb. En effet le pTG47 contient 300 pb et 100 pb homologues au gène dapD, du côté 5' et du côté 3' respectivement, et qui devraient s'allumer dans les souches délétées. La figure 4C montre que - on allume des bandes de 2.8 et 2.4 kb dans les souches délé tées et des bandes de 3.4 et 2.8 kb dans les souches sauva ges ; en plus on allume une bande de 1.3 kb correspondant au gène de résistance à la kanamycine. Ceci prouve la délétion dans les souches TGE7213 et 7214. - on allume aussi des bandes moins intenses, dans les souches sauvages uniquement, dues au gène dapD dupliqué. Comme on sait que la bande de 1.7 kb s'allume avec la partie 5', la bande de 2.1 kb doit provenir du c8té 3'. Ceci prouve que ces souches contiennent effectivement une duplication qui a disparu dans les souches délétées. Nous avons comparé 1'ADN chromosomique coupé par PstI des souches RH5345 et RL58 ainsi que le mutant dapD' obtenu par conjugaison du RL58 avec TGE901. Ces ADNs sont sondés par le fragment KpnI, BglII isolé de pTG47 qui contient le gène de résistance à la kanamycine (qui ne devrait rien allumer) et les régions flanquantes du gène dapD. La figure 4D montre que dans RH5345 on n'allume que les bandes 3.4 et 2.8 kb et pas les bandes dues à la duplication du gène présentes dans GC4540 ou TGE901. De plus on ne remarque qu'une bande de 7 kb pour RL58 et TGE7615, ce qui indique une perte d'un site PstI ; ceci prouve que ces 2 mutants sont identiques et touchés au moins dans le site PstI du gène dapD. En conclusion, ces expériences montrent que - les souches TGE7213, 7214 sont délétées pour le gène dapD et qu'elles contiennent le gène de résistance à la kanamycine. - la mutation dapD' de RL58 et TGE7615 se trouve au moins au niveau du site PstI du gène dapD. - certaines souches de E. coli présentent une duplication du gène dapD et cette duplication n'est pas présente dans les souches délétées. Comme par transduction on réussit à déléter les 2 gènes dapD de la souche réceptrice, on peut conclure que le gène dupliqué doit se trouver proche (à moins de 2' sur la carte chromosomique de E. coli) du premier gène dapD. Exemple 3 Clonage du gène cer. Le gène cer est récupéré b partir du plasmide ColEl, dont la séquence a été publiée par Chan et al. (1985), sous forme d'un fragment HaeII de 1,85 kb. Le fragment HaeII est ensuite coupé par HpaII, traité à la Klenow et une bande de 0.4 kb est récupérée. Le M13mpl30 est coupé par EcoRV et traité à la phosphatase. On ligue le fragment de 0.4 kb du ColEl dans le M13mp130 et on l'introduit dans la souche JM103. La présence du fragment cer de ColEl a été confirmée par séquençage de la bande de 0.4 kb libérée par coupure SmaI et HindIII. Le gène cer inséré dans le polylinker du M13mpl31 est ensuite isolé après digestion par SmaI et Hindili et ligué dans le vecteur pTG720 (portant le gène hirudine, figure 2 du brevet principal) coupé par BglII et traité à la Klenow. Le plasmide résultant est le pTG720cer. Exemple 4 Construction de vecteurs de clonage contenant le gène cer et le gène dapD. Inversion du sens du polylinker de M13mpl31 dans un vecteur codant pour la résistance & l'ampicilline Le pTG192 (figure 1 du brevet principal) est coupé par EcoRI et BglII pour libérer le polylinker de M13mpl31 et est raccourci par digestion HaeIII. On utilise un plasmide portant le gène de la résistance à l'ampicilline, par exemple le pTG730 (vecteur d'expression de 1'hirudine décrit dans le brevet français 86.16723) ; ce plasmide est coupé par BglII et EcoRI et ligué au fragment EcoRI-BglII du pTG192. De cette manière on perd le bloc d'expression comprenant le PL et le gène de structure de l'hirudine du pTG730 que l'on remplace par le polylinker-de M13mpl31. On appelle ce nouveau plasmide pTG790 (figure 5). Introduction du fragment cer dans un- vecteur de clonage Le pTG790 est coupé par SstI et KpnI et traité a la phosphatase. Le fragment résultant de cette digestion est ligué au pTG720cer, coupé par SstI et KpnI (ce qui libère le fragment cer) et raccourci par digestion BglII. Le vecteur résultant, pTG792, contient le fragment cer (figure 6). Introduction du gène dapD dans un vecteur contenant le fragment cer Le pTG792 est coupé par EcoRI, traité à la Klenow et à la phosphatase. Le fragment résultant est ligué avec le fragment AluI de 1.3 kb issu de pDB6 qui contient le gène dapD (figure 1). Il en résulte 2 plasmides pTG7922 et pTG7923 qui ne diffèrent que par l'orientation du gène dapD situé entre 2 sites EcoRI. Pour le pTG7922 les promoteurs des 3 gènes, origine de réplication, résistance à l'ampicilline et dapD sont orientés de la même manière (figure 7). Délétion du gène de résistance & l'ampicilline Les constructions suivantes ont un but multiple - déléter le gène de résistance à l'ampicilline des vecteurs contenant le gène dapD ; - obtenir un vecteur de clonage dapD contenant le gène cer - obtenir un vecteur de clonage dapD qui contient le polylin ker de M13mpl31 (moins le site EcoRV, utilisé pour le clona ge du cer) - obtenir un vecteur dapD avec un seul site EcoRI. On récupère un fragment PstI du pTG7922 et du pTG7923 contenant respectivement la partie 3' et 5' du gène dapD ainsi que le gène cer pour l'introduire dans un vecteur dap contenant un fragment analogue mais pas de site EcoRI ou AvaI, ni le cer. Les vecteurs analogues sont respectivement le pTG767 et le pTG766 décrits dans le brevet principal. Le pTG7922 et pTG7923 sont coupes par PstI, raccourcis par digestion BglII et ligués respectivement dans pTG767 et pTG766 coupés par PstI et traités & la phosphatase. Les vecteurs de clonage qui en résultent sont respectivement pTG769 et pTG768 (le pTG769 est représenté dans la figure 8). Exemple 5 Application du modèle dap à la construction de vecteurs d'expression pour la catéchol 2,3 oxygé nase (C2 ,3O) Vecteur sans site BamHI en amont de la C213 O Le gène de structure de la C2,3 O est récupéré à partir du pTG444 pour être introduit dans le vecteur dap pTG7671 (décrit dans le brevet principal). Le pTG444, est identique au pTG445 décrit par Zukowski et al. (1984) à l'exception d'un site XmaIII non régénéré. Le pTG444 est coupé par BamHI et HindlII et ligué au pTG769 coupé par BamHI et HindIII et traité à la phosphatase. Le plasmide résultant, appelé pTG7401 ne contient que le gène de structure de la C2 '30 Le pTG7671 contient 2 sites BglII : un site en amont du PL faisant partie du polylinker et un site en aval du PL situé dans le site d'attachement des ribosomes, en amont du gène de structure de l'interféron gamma. Le pTG7671 est coupé par BglII et raccourci par digestion KpnI. Le mélange résultant est ligué dans le pTG7401 coupé dans son polylinker par BglII et BamHI et traité à la phosphatase. Par cette ligation on reconstitue le site BglII mais le site BamHI ligué au BglII est perdu.Deux orientations du PL par rapport au gène de structure de la C2,3O sont possibles. Pour distinguer la construction où la C2,3 0 est sous le contrôle du PL, on coupe par BamHI et BglII (en effet pour l'orientation voulue un site BamHI se trouve à proximité du site BglII et la diges tion ne donnera pratiquement qu'une bande de 4.3 kb ; dans l'autre orientation la digestion libère une bande & 3.9 kb et une bande de 0.4 kb). Le plasmide retenu, pTG7407, ayant la C2,3O 80U8 contrôle du a a une structure voisine du pTG7406 décrit plus loin (comparer à la figure 9) mais il a perdu le site BamHI en amont de la C2,30. Vecteur avec un site BamHI en amont de la C2,30 Le pTG769 est coupé par BglII et BamHI, traité à la phosphatase et ligué avec un fragment BamHI-BglII d'un plasmide d'expression quelconque (pTG907) qui contient le PL et le gène N complet, de #. Il en résulte une construction, le pTG7400, qui peut être identifiée par une coupure BamHI et BglII qui libère 2 bandes : à 2.6 kb et 1.3 kb. Cette construction contient le PL et le gène N complet. Le pTG7400 est ensuite coupé par HpaI et on y insère un linker BamHI (vendu par BRL) CCGGATCCGG, phosphorylé et hybridé. Ceci donne le pTG7402 qui a perdu son site HpaI mais contient 2 sites BamHI. Le pTG7402 est coupé par BamHI et religué pour donner le pTG7404. Par cette manipulation on a éliminé un site BamHI et tronqué le gène N. Introduction du gène de la C2,3O dans un vecteur dap-cer Le pTG7402 est coupé par BamHI et HindIII, traité à la phosphatase et le fragment BamHI-HindIII du pTG444 y est introduit pour donner le pTG7406 (voir figure 9). il diffère du pTG7407 par le fait qu'on peut sortir le gène de la C2,3O par une coupure BamHI, HindIII pour récupérer le fragment introduit à partir de pTG444. Expression de la C2,3O dans les souches de E. coli dap transformées par le plasmide pTG7407 L'expression du gène C2,30 dans les bactéries TGE7213/ pTG7407 a été mesurée & 30eC après 4 h et 7 h de culture et au cours de l'induction & 42C après 4 h et 7 h. Pour chaque détermination, un échantillon de la culture est récolté et centrifugé ; le culot est lavé et repris en tampon phosphate (comme décrit par Zukowski et al. 1983) puis traité aux ultra-sons pendant 3 fois 20 secondes. Après centrifugation 10 min. à 10.000 g, on considère le culot comme la fraction insoluble (C) et le surnageant comme la fraction soluble (S). Les protéines présentes dans chaque fraction sont analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS. Les bandes sont révélées par coloration au bleu de Coomassie. Les résultats sont présentés dans la figure 10. On remarque l'intensité de la bande de PM 35.000, en particulier après 7 h d'induction à 420C. Le "scanning" du gel donne environ 64 % et 75 % de C2,30 dans les fractions S et C respectivement. Dans l'échantillon le plus riche (S, 7 h à 4.2'C), on a déterminé l'activité spécifique de la C2,3O (selon la méthode décrite par Zukowski et al. 1983), par addition de catéchol comme substrat. On mesure une activité spécifique de 28 à 35 U/mg L'activité spécifique d'une préparation d'enzyme pure étant de 280 U/mg, les extraits analysés contiennent environ 12 % de C2 ,3O active. Exemple 6 Introduction du fragment cer dans un vecteur d'expression de l'interféron gamma. Le pTG7671 décrit précédemment est coupé au niveau de son polylinker par SstI (identique à 8ace) et KpnI puis traité à la phosphatase et ligué aux fragments de pTG720cer coupé par SstI et KpnI, Après transformation dans TGE7615 on retient un candidat, pTG7675, qui libère 2 fragments de 400 pb et de 3.4 kb après digestion par SstI et KpnI (figure 11). Exemple 7 Mise en évidence de la stabilité des plasmides au cours de l'induction de l'expression de l'in- terféron gamma. a) induction de l'expression de l'interféron gamma en milieu LB à 420C pour un vecteur portant le gène de résistance à l'ampicilline : TGE901/pTG40. Les résultats sont repris dans le tableau I. On mesure les cellules totales/unité de DO/ml afin de déterminer que la perte de la viabilité est un phénomène réel et non un changement de volume des cellules, par exemple. Ces données sont aussi reprises dans le tableau I. Le Fp a été défini dans le brevet-principal et relie le nombre de cellules p au nombre total de cellules présentes à un moment donné. On remarquera que le Fp après 7h30 d'induction atteint une valeur de près de 2 %. I1 est donc moins élevé que dans l'expérience précédente (voir brevet principal exemple 10), ce qu'on ne peut attribuer qu'à une différence dans la structure du plasmide pTG40 dans ces 2 expériences : en effet, quoique la quantité de plasmide soit équivalente à différents moments de l'induction, dans la première expérience le plasmide était sous forme dimérique alors que dans l'expérience décrite ici il est principalement sous forme monomérique (comme le montre une analyse sur gel). L'état du plasmide n'influence pas la production en interféron gamma mais illustre de manière concrète la perte de stabilité si la forme monomérique d'un plasmide n'est pas maintenue. b) Induction de l'expression de l'interféron gamma dans une souche mutée pour le gène dap et transformée par un vecteur contenant le gène dapD et le gène cer, TGE7615/pTG7675 Les résultats sont repris dans le tableau II. On mesure les cellules totales/unité de DO/ml t il n'y a pas de différence notable avec TGE901/pTG40. On confirme donc une réelle perte de la viabilité : après 7h30 d'induction, seulement 0.02 % de la culture reste viable. Ceci est à comparer avec le TGE901/ pTG40 où la valeur obtenue est de 2.4 %. Ceci se traduit au niveau du Fp- qui, dans le cas de TGE7615/pTG7675, est diminué d'un facteur 1000 par rapport au TGE9011pTG40. Pourtant il reste toujours quelques cellules p qui apparaissent en fin d'induction.Le contenu plasmidique présente les mêmes caractéristiques qu'avant, c'est-à-dire augmentation du nombre de copies en fin de croissance mais les formes multimériques présentes en plus ou moins grand nombre avec les plasmides sans cer, sont quasi absentes ici. La production en interféron gamma est légèrement supérieure à celle obtenue avec le pTG40. c) induction de l'expression de l'interféron gamma dans une cellule hôte délétée pour le gène dapD et transformée par un vecteur contenant le gène dapD et le cer, TGE7213/ pTG7675 Les résultats sont repris dans le tableau III. Les conclusions sont identiques à celles tirées de la comparaison entre TGE901/pTG40 et TGE7615/pTG7675 : la mortalité atteint un facteur 3.5 10-4, la quantité de cellules totales/unité de DO/ml ne change pas de manière significative durant l'inducti- on. Par contre même après 7h30 d'induction il n'y a pas d'apparition de cellules p (après 24h toute la culture est devenue p pour TGE901/pTG40 et est restée 100 t p+ pour TGE7213/ pTG7675).Le contenu plasmidique est comparable à celui de TGE7615/.pTG7675 par l'absence de multimères. La production en interféron gamma est légèrement supérieure à celle obtenue avec TGE7615/pTG7675. Tableau I induction de TGE901/pTG40 à 42 C en milieu LB D.O. 600 nm c/ml/D.O. c totales/ml/D.O. Fp0 h 00 0.370 3.9 108 NOTE : Fp- est le pourcentage des p- sur la totalité des cellules présentes à un moment donné. Tableau II TGE7615/pTG7675 à 42 C en milieu LB D.O. 600 nm c/ml/D.O. c totales/ml/D.O. Fp0 h 00 0.310 3.5 108 1 h 00 1.07 3.3 108 4.7 108 2 h 00 1.64 1.5 107 5.1 108 3 h 00 2.31 1.44 107 4 h 00 2.67 7.1 106 7.9 108 6 h 15 3.26 6.1 106 6.1 108 0.0017 % 7 h 30 3.44 6.4 106 0.0018 % Tableau III Induction de TGE7214/pTG7675 à 42 c en milieu LB D.O. 600 nm c/ml/D.O. c totales/ml/D.O. Fp0 h 00 0.400 3.4 108 Exemple 8 Application du modèle dap a la construction d'un vecteur d'expression pour l'alpha-l antitrypsine. Le fragment PstI contenant le bloc d'expression de l'alpha-l antitrypsine c'est-à-dire le promoteur PL du phage lambda, le gène N tronqué, un site d'attachement des ribosomes et le gène de structure de l'alpha-l antitrypsine (Arg358) provenant du pTG2901 (dérivé tronqué du pTG983, décrit dans le brevet 85.07393) est introduit dans le pTG792 (décrit plus haut) coupé par PstI et traité à la phosphatase. Le vecteur d'expression résultant, pTG7913, est ensuite coupé par BglII et SstI et le bloc d'expression contenant l'alpha-l antitrypsine et le gène cer est introduit dans le pTG767 coupé par BglII et SstI et traité à la phosphatase. Le plasmide résultant, pTG7914, contient le gène dapD1 le gène cer et le bloc d'expression de l'alpha-l antitrypsine (Arg358) (figure 12). Dépôt des souches représentatives de l'invention Les souches suivantes ont été déposées à la Collection Nationale de Cultures des Microorganismes (25 Rue du Dr. Roux, Paris) le 10 mars 1987. . TGE7214, souche de coli délétée du gène dapD, sous le n' I652. . TGE7303, souche de coli délétée du gène dap D, sous le ne I653. (les 2 souches sont transformées par le plasmide pTG768 qui porte le gène dapD et cer). . TGE7214/pTG7407, souche dapD transformée par le plasmide d'expression de la C2 ,3O, sous le n I655. REFERENCES Beck, E., Ludwig, G., Auerswald, E.A., Reiss, B. & Schaller, M. Gene 19, 327-336 (1982). Bendiak, D.S. & Friesen, J.D. Mol. Gen. Genet. 181, 356-362 (1981). Bollen, A., Lathe, R., Herzog, A., Denicourt, D., Lecocq, J.P., Desmarez, L. & Lavallé, R. J. Mol. Biol. 132, 219-233 (1979). Bukhari, A.I. & Taylor, A.L. J. Bacteriol. 105, 844-854 (1971). Chan, P.T., Ohmori, H., Tomizawa, J.I & Lebowitz, J. J. Biol. Chem. 260, 8925-8935 (1985). D'Ari, R. & Huisman, O. J. 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REVENDICATIONS 1) Procédé de stabilisation d'un vecteur plasmidique contenu dans une bactérie selon l'une des revendications 1 à 5 du brevet principal, caractérisé en ce que la mutation chromosomique dap est une délétion d'une partie au moins du gène dapD et en ce que le vecteur plasmidique porte un gène dapD intact. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la délétion est une délétion totale du gène dapD. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le vecteur plasmidique porte une séquence qui le maintient à l'état de monomère. 4) Procédé selon la revendication 31 caractérisé en ce que ladite séquence est une séquence "cer". 5) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le vecteur plasmidique porte le gène codant pour une protéine d'intérêt industriel et les éléments assurant son expression dans la bactérie hôte. 6) Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la bactérie hôte est une souche de E. coli. 7) Procédé selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisé en ce que la protéine d'intérêt industriel est choisie parmi l'hirudine, l'interféron gamma, le C2,30 et 1 'alpha-antitrypsine. 8) Souche bactérienne contenant un vecteur plasmidique d'expression stabilisé obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 7. 9) Souche bactérienne selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de E. coli présentant une délétion au moins partielle du gène dapD et transformée par un vecteur plasmidique portant un gène dapD et un gène qui code pour l'expression d'une protéine d'intérêt industriel et les éléments assurant son expression dans la bactérie hôte. 10) Souche bactérienne selon la revendication 9. caractérisée en ce que la protéine d'intérêt industriel est choisie parmi l'hirudine, l'interféron gamma, le C2130 et 1 'alpha-antitrypsine. 11) Procédé de préparation de C213 O caractérisé en ce qu'on cultive sur un milieu complet une souche selon l'une des revendications 8 à 10 dans laquelle le gène codant pour l'expression d'une protéine d'intérêt industriel est le gène codant pour le C2,3O. 12) Procédé de préparation de l'hirudine, caractérisé en ce qu'on cultive sur un milieu complet une souche selon l'une des revendications 8 à 10 dans laquelle le gène codant pour l'expression d'une protéine d'intérêt industriel est le gène codant pour une hirudine ou l'un de ses variants naturels ou artificiels. 13) Procédé de préparation de l'interféron gamma, caractérisé en ce qu'on cultive sur un milieu complet une souche selon l'une des revendications 8 à 10 dans laquelle le gène codant pour l'expression d'une protéine d'intérêt industriel est le gène codant pour l'interféron gamma.