FR 2619567 A1 19890224 FR 8811096 A 19880822 CRISTAUX DE SERUM-ALBUMINE HUMAINE ET PROCEDE POUR LEUR PREPARATION La présente invention concerne des cristaux de sérum- albumine humaine et un procédé pour leur préparation. Plus particulièrement, l'invention concerne la préparation de cristaux de sérum-albumine humaine ayant une forme et une taille appropriées aux études par les rayons X de la structure cristalline. La sérum-albumine, une protéine aux fonctions multiples et aux applications nombreuses, est une des protéines les plus étudiées en biochimie. Plus de 25 000 références bibliographiques portant sur la biochimie et/ou les applications des sérum-albumines ont été publiées depuis 1969. On sait que les sérum-albumines des mammifères sont des protéines résultant de trois duplications de gènes en tandem, qui possèdent un fort taux d'enroulement en hélice (60 %) et une forte teneur en cystéine (17 disulfures) avec des poids moléculaires approximatifs de l'ordre de 65 000 daltons. Les séquences complètes des amino-acides sont connues pour les sérum-albumines bovine, de rat et humaine. Bien que la fonction principale de la sérum-albumine demeure inconnue, elle contribue à de nombreux processus de transport et de régulation. De nombreuses études ont porté sur les propriétés de liaison multifonctionnelle de cette protéine intéressante vis-à-vis de divers métaux, comme Ca et Cu, les acides gras, les hormones et un spectre large d'agents thérapeutiques. La majorité de ces études de liaison a porté sur la sérum-albumine humaine (SAH) et beaucoup ont montré que la distribution, la concentration à l'état libre et le métabolisme de divers agents pharmaceutiques peuvent être notablement modifiés en fonction de l'importance de la liaison à la SAH. Une connaissance détaillée de la structure tridimensionnelle de la sérumalbumine est indispensable à la compréhension complète des modes de liaison ainsi que de beaucoup des propriétés physiques de cette protéine à aspects multiples. De plus, comme de nombreux agents pharmaceutiques nouvellement mis au point sont rendus moins efficaces par la SAH, il est évident que la connaissance de la structure cristalline d'une sérumalbumine, en particulier de la forme humaine, aura des applications très étendues et importantes dans le domaine de la conception rationnelle des médicaments. Par conséquent, les sérum-albumines ont fait l'objet de recherches cristallographiques qui se poursuivent et qui ont permis d'établir plusieurs formes cristallines (tableau 1). Par suite des difficultés relatives i la dimension cristalline, la qualité et/ou la reproductibilité, la structure tridimensionnelle d'une sérum-albumine demeure inconnue. L'invention concerne la technologie nécessaire à la production d'une nouvelle forme cristalline de la SAB qui peut être développée de façon reproductible sous forme de gros cristaux ayant une qualité relativement supérieure appropriée à la détermination de la structure par les rayons X. Dès que la structure tridimension- nelle a été déterminée, il devient possible d'étudier les détails moléculaires relatifs à la liaison de l'albumine avec un grand nombre de composés pharmaceutiques. On peut pour cela faire tremper les cristaux dans une solution stabilisante appropriée contenant les molécules médicamenteuses étudiées. Si les sites de liaison existent dans cette forme cristalline, un réseau cristallin contenant la protéine sérumalbumine et la molécule médicamenteuse se forme. Les détails de l'interaction moléculaire entre le médicament et la protéine peuvent ensuite être déterminés selon les techniques connues de la radiocristallographie. Par suite des capacités de liaison multiple de la SAH, la connaissance de sa structure tridimensionnelle associée à des cristaux appropriés peut également aider à déterminer les structures de diverses petites molécules et peut-être de petites protéines qui se sont révélées difficiles à cristalliser. On connaît des cristaux de sérum-albumine humaine depuis un certain temps. Dès 1952, de gros cristaux de SAR ont été développés. L'examen détaillé aux rayons X de ces cristaux, ainsi que d'autres formes cristallines mentionnées, y compris des cristaux de sérum-albumine de cheval, a été publié par McClure et Craven en 1974 (1), voir le tableau ci-après. Des cristaux de SAR ont également été développés par Rao et collaborateurs (2). Le tableau résume les données cristallographiques publiées à ce jour relativement à plusieurs formes cristallines de la sérum-albumine humaine. Selon Peters, dans un récent tour d'horizon (1985) portant sur les sérum-albumines (3): "Bien qu'elle soit facile i cristalliser, à ce jour l'albumine a révélé peu de ses secrets par radiocristallogra- phie... L'information structurale fournie par ces cristaux est très attendue mais son obtention semble semée d'obstacles. Les cristaux monocliniques actuellement décrits sont mous et cireux et les cristaux étudiés par Rao et coll. (1976) tendent à se dissoudre lors de l'étude". Tableau Données cristallines des polymorphes de la sérum-albumine_ humaine ystème cristallin Tétragonal Monoclinique Orthorhombique Orthorhombique Tétragonal Groupe spatial C2 P212121 P21212 P41212 P4212 ou P43212 Dimension des mailles a = 126,5(3) a = 155(1) a = 137,3(1) a = 84,0(5) a = 187(1) b = 39,2(1) b = 83(1) b = 275(3) c = 276(3) c = 81(1) c = 135, 2(3) c = 122(1) c = 58,02(2) B = 93,3(1) Volume des mailles A3 668 900 1 570 000 2 125 000 1 947 000 2 832 000 Molécules/unité asymétrique 1 2 3 1 2 Limites de diffraction A 2,7 3,7 3, 0 3,8 2,9 Coefficient de Matthew* 2,52 2,95 2,66 3,66 2,66 Fraction de solvant 52 % 59 % 54 % 67 % 54 % Référence (1) (1) (2) (1) Présent travail * Pour un PM de 66 458 de la SAH Références 1. R. J. McClure et B. M. Craven, J. Mol. Biol. (1974) 83, 551-555 %O 2. Rao, S.N. et coll. (1976) J. Biol. Chem., 251, 3191-3193 Ln 3. T. Peters, Advances in Protein Chemistry, Vol. 37, pp 161-243, (1985) 26195 67 Les cristaux de la forme monoclinique mentionnée par McClure et Craven semblent être de qualité maximale; malheureusement, les cristaux sont petits et difficiles à reproduire. Il est difficile de comparer de façon appropriée la qualité cristalline de la forme cristalline tétragonale restante à celle de la forme cristalline tétragonale mentionnée ici, car la résolution de diffraction mentionnée pour cette forme cristalline a été obtenue avec une source classique à tube scellé. L'invention a donc pour buts de fournir: de la SAH sous forme de cristaux convenant aux études par diffraction des rayons X; des cristaux de SAH ayant une taille d'au moins 0,5 mm dans deux dimensions; des cristaux de SAH sous une forme appropriée aux études de liaison avec des médicaments; et un procédé de préparation de ces cristaux. Selon la présente invention, on fournit des cristaux de sérum-albumine humaine sous forme de tables tétragonales appartenant augroupe spatial P4212. Ces cristaux peuvent être facilement développés à une taille bien supérieure à 0,5 mm dans deux dimensions et à une épaisseur de 0,1 mm, cette taille permettant des études de diffraction des rayons X à partir desquelles la configuration moléculaire peut être déduite. Les cristaux sont développés à partir de solutions de polyéthylèneglycol, ce qui présente l'avantage complémentaire de stabiliser divers composés pharmaceutiques et biologiques pour les études de liaison. On sait que la sérum-albumine humaine présente des modifications importantes de la conformation lorsque le pH varie. Cette forme cristalline est la seule à se développer dans des conditions de pH physiologiques et, par conséquent, fournit l'information la plus pertinente en ce qui concerne les études de liaison aux médicaments. Les conditions de cristallisation sont reproductibles et les cristaux diffractent à des résolutions appropriées à la détermination de la nature des modes de liaison de divers composés biologiques et pharmaceutiques. Les cristaux préparés selon l'invention peuvent également se révéler utiles pour effectuer des études de génie génétique. La croissance des cristaux peut être facilement effectuée selon un procédé en "goutte pendante" utilisant une solution dans le polyéthylèneglycol et un agent tampon au dihydrogénophosphate de potassium, le pH de la solution étant ajusté avant le début de la croissance cristalline. L'invention sera mieux comprise i la lecture de la description qui suit faite en regard des dessins annexés, dans lesquels: la figure 1 est une photographie illustrant un cristal de SAH de l'invention; la figure 2 est une photographie de précession des rayons X d'un tel cristal; la figure 3 est une photographie d'oscillation des rayons X d'un cristal de SAH; et la figure 4 est un schéma illustrant une disposition de l'entassement proposé des molécules de SAE dans les cristaux préparés selon l'invention. Les cristaux de SAH de l'invention peuvent être développés à partir d'une solution précipitante de polyéthylèneglycol (PEG) et d'un tampon, la concentration des composés réagissants et le pH étant soigneusement ajustés dans des limites déterminées. On peut utiliser l'une quelconque des trois techniques fondamentales généralement utilisées pour développer des cristaux de protéines, c'est-à-dire les procédés en "goutte pendante" ou par diffusion de vapeur, de dialyse et discontinu, mais on préfère le procédé de en goutte pendante. Dans le procédé en goutte pendante, on place une petite goutte de solution de protéine sur une lamelle couvre-objet ou une lame de vere que l'on retourne sur un réservoir de solution et on scelle. La solution dans le réservoir contient un agent précipitant qui est également présent en une quantité moindre dans la gouttelette de protéine. Le rôle de l'agent précipitant est double. Tout d'abord, la solution dans le réservoir est initialement à une /pression de vapeur inférieure à celle de la gouttelette de protéine, 26 1 9567 si bien que l'évaporation progresse à une vitesse fixée par la différence des pressions de vapeur et la distance sur laquelle la vapeur (généralement d'eau) doit diffuser. Ensuite, l'agent précipitant réduit la solubilité de la protéine dans la solution en entrant en compétition avec la protéine relativement au solvant disponible, si bien que, lorsque l'évaporation de la gouttelette de protéines se produit, la solution devient sursaturée en protéine. Dans les conditions appropriées, y compris le pH, la concentration de la protéine et la température, la cristallisation de la protéine ou de la macromolécule se produit. La solution précipitante utile dans le procédé en goutte pendante contient un PEG, ayant un poids moléculaire de 180 à 800 et de préférence d'environ 400 et à une concentration de 35 à 45 % en volume, les meilleurs résultats étant obtenus à 40 % en volume, et un tampon en une quantité suffisante pour assurer le pH nécessaire. On peut utiliser à cet effet du dihydrogénophosphate de potassium à la concentration de 0,05 à 0,1 M. D'autres tampons, tels que l'acétate de sodium, le citrate de sodium et le tris(hydroxyméthyl) aminométhane-maléate peuvent également être utilisés. La demanderesse a découvert que le pH de la solution précipitante obtenue après mélange du PEG et du tampon est critique pour obtenir une croissance efficace et reproductible des cristaux de SAH. On peut utiliser une solution ayant un pH de 4,6 à 7,2, mais on obtient les meilleurs résultats à un pH d'environ 7,2. Dans un mode de réalisation préféré, on ajuste le pH de la solution précipitante après mélange pour compenser les variations du pH qui peuvent résulter de la variation du poids moléculaire et de la teneur en résidu de PEG. On ajuste aisément le pH par addition de petites quantités d'une solution d'une base, telle que l'hydroxyde de potassium, ou d'un acide, tel que l'acide chlorhydrique, jusqu'à obtention de la valeur désirée. La SAH peut être fournie sous forme d'une solution aqueuse à une concentration de 90 à 200 mg/ml, les meilleurs résultats étant obtenus à 200 mg/ml. On préfère utiliser une SAH essentiellement dépourvue d'acides gras. Dans la mise en pratique du procédé en goutte pendante, on place sur une lamelle couvre-objet une gouttelette de cette solution ayant typiquement un volume de microlitres et une gouttelette de même volume de solution précipitante et on laisse le mélange s'effectuer. On place dans le réservoir de l'appareil une quantité plus importante, telle que 1 ml, de solution précipitante sans SAH. Les cristaux se développent en des périodes de 3 à 10 jours pour atteindre des dimensions de 0,5 x 0,5 x 0,05 mm à 2,0 x 2,0 x 0,3 mm. Les variations des temps de croissance des cristaux dépendent de la concentration en protéine et du pH. A des concentrations de 200 mg/ml et des pH de 6,8 à 7,2, les temps de croissance sont typiquement de 5 jours. Pour les expériences de diffraction des rayons X, on transfère les cristaux de la goutte pendante à une gouttelette de 10 à 20 microlitres de la solution correspondante du réservoir, c'est-à-dire du PEG 400 à 40 % dans du tampon phosphate 0,05 M. Les cristaux sont stables dans ces solutions à 4'C pendant des périodes prolongées. Le pH de cette solution stabilisante peut être ajusté pour accroître la liaison des molécules pour les études de diffraction, dans la plupart des cas sans destruction des cristaux. Le procédé de dialyse utilise une membrane semi-perméable d'exclusion par taille, qui retient la protéine, mais laisse entrer et sortir par diffusion les molécules plus petites (tampons et agents précipitants). On peut utiliser, pour développer les cristaux de protéine, des conditions essentiellement identiques à celles déterminées pour le procédé en goutte pendante (ou vice versa). Lors de la dialyse, au lieu de concentrer la protéine et l'agent précipitant par évaporation, on laisse l'agent précipitant diffuser lentement à travers la membrane et réduire la solubilité de la protéine en maintenant fixe la concentration de la protéine. Les procédés discontinus comprennent généralement l'addition lente d'un agent précipitant à une solution aqueuse de protéines jusqu'à ce que la solution commence à devenir trouble, on scelle alors le récipient et on le laisse reposer pendant un temps prédéterminé. En pratique, dès que le ou les agents précipitants,tampons et les autres variables expérimentales ont été déterminés pour un procédé donné de croissance, on peut utiliser l'un quelconque de ces procédés ou d'autres non mentionnés pour développer des cristaux d'une protéine donnée. Donc, les caractéristiques décrites ci-dessus pour le développement de SAB selon le procédé en goutte pendante peuvent également être utilisées au développement de SAR selon les procédés discontinu ou de dialyse. L'invention est de plus illustrée par les exemples non limitatifs suivants. Exemple 1 On développe des cristaux de SAH à partir de PEG en utilisant les modes opératoires et l'appareil à goutte pendante. On ajoute des portions de 5 1l de PEG (poids moléculaire 400) à 35 à 40 % dans du KH2PO4 0,05 M à pH 4,6 à des portions égales de SAR à à 180 mg/ml, on place sur des lamelles couvre-objets retournées et on scelle sur des réservoirs contenant 1 ml de PEG à 40 % dans du KH2PO4 0,1 M. Des cristaux apparaissent en 24 à 48 heures sous forme de tables tétragonales et atteignent une taille de'0,6 mm x 0,3 mm x 0,1 mm d'épaisseur en 3 à 4 jours. Une photographie d'un des cristaux obtenus est illustrée par la figure 1. On transfère les cristaux préparés comme décrit ci-dessus dans une solution stabilisante constituée de PEG 400 à 35 à 40 % dans du KH2PO4 0,1 M et on les place dans des capillaires de verre. Les photographies de précession des rayons X des cristaux obtenus ont été prises avec un appareil de prise de vues Supper avec comme source une anode tournante Rigaku RU200. Une photographie de précession des rayons X ainsi obtenue est illustrée par la figure 2. Exemple 2 On développe des cristaux de SAH selon le mode opératoire de l'exemple 1, si ce n'est que la concentration du KH2PO4 est de 0,1 M dans la solution précipitante et que le pH de la solution est ajusté à 6,0 avant le mélange avec la SAH. Des photographies d'oscillation ont été prises avec une chambre de prise de vues Enraf-Nonius Ardnt-Vanacott au Brookhaven Synchrotron Light Source fonctionnant à 2619 5 6 7 2,5 GeV avec un courant de faisceau entre 120 et 45 mA. Une photographie d'oscillation ainsi obtenue est illustrée par la figure 3. Les photographies de précession des rayons X indiquent une symétrie 4 mm pour la zone hkO et une symétrie mm pour les zones hhl, hO1 et Okl. Les zones hOO et OkO présentent des absences systématiques pour h ou k = 2n = 1. Il n'y a pas d'absence systématique selon la direction 001. On conclut donc que le groupe spatial est P4212. En accord avec la présence d'un axe isotrope, les cristaux ne provoquent pas d'extinction de la lumière polarisée lorsqu'on les observe suivant l'axe d'ordre quatre. Les constantes de maille mesurées à partir des photographies de précession sont a - b = 187(1) et c - 81(1) A. Une masse volumique cristalline de 1,138 g/cm3 a été déterminée à l'aide de gradients aqueux de Ficoll. Cette valeur de la masse volumique indique la présence de deux promoteurs par motif asymétrique, ce qui correspond à un coefficient de Matthew de 2, 6 A3/dalton et implique une teneur en solvant de 54 %. La figure 4 illustre une orientation proposée des deux molécules dans l'unité asymétrique de la forme P4212. Dans cet entassement, les molécules ombrées et non ombrées sont associées par une pseudo-rotation d'ordre deux pour former une sous-cellule ayant des axes a' = b' = 132 A comme nécessaire et possédant une longueur moléculaire de 100 A. Dans ce cas, des considérations relatives à l'entassement semblent limiter la longueur moléculaire à des valeurs de 130 A ou moins et des valeurs proches de 100 à 110 A semblent plus appropriées, bien que les études de dissolution et de diffraction des électrons conduisent à une estimation de la longueur moléculaire de 140 A. La sous-cellule illustrée par la figure 4 posséderait une pseudo-symétrie P422 et contient une molécule par unité asymétrique. Bien qu'un mode de réalisation préféré de l'invention ait été décrit, cette description n'est qu'illustrative et il est évident que des modifications et variantes peuvent être réalisées sans sortir du cadre fixé par les revendications. 26 1 9567 REVENDICATIONS 1. Cristal de sérum-albumine humaine sous forme de tables tétragonales appartenant au groupe spatial P4212. 2. Cristal selon la revendication 1 ayant les constantes de maille suivantes: a = b = 187(1) A, c = 81(1) A. 3. Cristal selon la revendication 1 ayant une taille d'au moins 0,5 mm dans deux dimensions et une épaisseur d'au moins 0,05 mm. 4. Cristal selon la revendication 3 ayant une taille de 0,5 x 0,5 x 0,05 mm à 2,0 x 2,0 x 0,3 mm. 5. Cristal selon la revendication 1 ayant une masse volumique cristalline de 1,138 g/cm3. 6. Procédé de développement de cristaux de sérum-albumine humaine, caractérisé en ce qu'il consiste à: se pourvoir d'une solution aqueuse de sérum-albumine humaine à une concentration de 90 à 200 mg/ml; se pourvoir d'une solution aqueuse précipitante comprenant du polyéthylèneglycol à une concentration de 35 à 40 % en volume et un tampon à une concentration telle que le pH soit de 4,6 à 7,2; et combiner ladite solution de sérumalbumine humaine avec ' ladite solution précipitante et laisser la solution obtenue reposer pendant une période prédéterminée jusqu'à ce qu'un cristal de sérum-albumine humaine se soit développé à une taille prédéterminée. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel ledit stade de combinaison consiste à mélanger une gouttelette de ladite solution de sérum-albumine humaine avec une gouttelette de ladite solution précipitante; suspendre la gouttelette mélangée obtenue sur un réservoir de solution précipitante dans un récipient scellé, la pression de vapeur de la solution dans ledit réservoir étant inférieure à celle dans la solution formée dans la gouttelette mélangée; et laisser la gouttelette mélangée suspendue reposer pendant une période prolongée jusqu'à ce qu'un cristal de sérum-albumine humaine se soit développé à une taille prédéterminée. 8. Procédé selon la revendication 6, dans lequel ladite solution précipitante est préparée par mélange d'une solution de polyéthylèneglycol avec un tampon et ajustement du pH de la solution mélangée obtenue. 9. Procédé selon la revendication 6, dans lequel on laisse reposer ladite gouttelette mélangée pendant une période de 3 à 7 jours. 10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel on laisse ladite gouttelette mélangée reposer jusqu'à ce que ledit cristal soit développé à une taille de 0,5 x 0,5 x 0,05 mm à 2,0 x 2,0 x 0,3 mm. 11. Procédé selon la revendication 6, dans lequel ladite solution de sérum-albumine humaine est placée dans une membrane semi-perméable d'exclusion par taille et ladite solution précipitante est combinée avec la solution de sérum-albumine humaine par diffusion à travers ladite membrane. 12. Procédé selon la revendication 6, dans lequel on combine ladite solution précipitante avec ladite solution de sérum-albumine humaine par addition lente à celle-ci et on laisse reposer la solution obtenue dans un récipient scellé.