FR 2616318 A1 19881216 FR 8708752 A 19870615 PEAU ARTIFICIELLE ET SON PROCEDE DE PREPARATION La présente invention concerne une peau artificielle permettant la reconstitution simultanée du derme et de l'épiderme tout en évitant la formation de cicatrices hypertrophiques. Elle concerne également le procédé de préparation de cette peau. Cette peau artificielle, entièrement biodégradable, trouvera ses principales applications pour le recouvrement précoce des brûlés après excision précoce des tissus nécrosés, ainsi que pour le traitement des plaies cutanées de l'homme et des animaux. On sait qu'en cas de brûlures profondes et étendues, il est indispensable de reconstruire le plus rapidement et le plus durablement possible une barrière cutanée imperméable, d'une part, pour protéger les brûlés des infections et des pertes calorico-azotées, d'autre part, le derme sert de moule pouréviter les cicatrices hypertrophiques et les rétractions dues à la prolifération anarchique des fibroblastes. Les homogreffes sont coûteuses et ne constituent pas une cou- verture efficace, car elles sont très souvent rejetées, ce qui entraîne un choc supplémentaire pour les malades. Les techniques classiques d'autogreffe ne sont, par ailleurs, réa- lisables que dans le cas de brûlures moyennement étendues. Les progrès de la réanimation médico-chirurgicale permettent, à l'heure actuelle, de maintenir en vie des brûlés atteints à 80 % de la surface cutanée. Ces progrès ont eu comme consequence d'accroître les besoins en peau ou équivalent de peau. De nombreuses recherches ont été entreprises dans ce but. C'est ainsi que Green et O'Connor se sont donné pour but de reconstituer l'épiderme à partir de cultures de kératinocytes provenant des propres cellules du malade. Bell et son équipe ont, par ailleurs, mis au point un équivalent de peau constitué d'une couche dermique de fibroblastes autologues et de collagène bovin et d'une couche épidermique de kératinocytes autologues. Il convient de noter que la mise en oeuvre de ces deux techniques nécessite un temps d'attente de vingt-et-un jours (correspondant à la durée de culture des cellules) avant de pouvoir disposer de la peau artificielle convenant au patient. Une troisième technique a été mise au point par Yannas et Burke (Jal of Biomedical Materials Research-Vol 14, 65-81, 107-131, 511-528 2- (1980) et FR-A-2 332 863). La peau artificielle proposée par ces auteurs comprend deux couches: - un équivalent dermique réalisé à partir de collagène de veau réticulé et d'un glycosaminoglycane (GAG), la chondroTtine 6-sulfate; - un pseudo- épiderme temporaire en résine de silicone, non-biodégradable limitant les pertes exudatives de la phase précoce et faisant office de barrière contre les agents infectieux, venant recouvrir la couche dermique. Cette peau artificielle est mise en place après excision précoce du tissu brûlé au troisième degré (48 à 72 heures après la brûlure). Le réseau collagène - GAG contient des pores à travers lesquels le néoderme endogène est en quelque sorte "canalisé". Ainsi est reconstitué un tissu cicatriciel "domestiqué", très proche du derme normal, et au niveau duquel la synthèse de collagène par les fibroblastes ne se fait pas de façon anarchique à la différence du tissu de granulation habituel. Lorsque la couche dermique est revascularisée (3 à 4 semaines), et lorsque l'on dispose de cellules épi- dermiques, la membrane de silicone est enlevée. On peut alors mettre en place soit une greffe épidermique extrêmement mince, en filet 4 ou 9, (prélevée sur les zones donneuses restantes), soit des kératinocytes auto- logues cultivés (selon le procédé de GREEN par exemple) pendant le temps que dure la période de revascularisation et de pénétration mésenchymateuse du derme. Ce procédé de recouvrement cutané après excision précoce, déjà testé aux USA sur plus de deux cents brûlés, dans cinq centres, s'avère particulièrement efficace, tant pour combattre les pertes exudatives hydri- ques et calorico-azotées de la phase précoce, que pour prévenir l'infection et pour diminuer l'importance des séquelles hypertrophiques et rétractiles. Ce pansement, compact et réticulé, est colonisé par les fibro- blastes du blessé qui synthétisent leur propre collagène et toutes les protéines humaines nécessaires à la reconstitution du tissu conjonctif. Le temps de dégradation du derme artificiel, qui est de vingt-cinq jours, correspond au temps de cicatrisation de la plaie. Ainsi canalisés, les fibroblastes du brûlé peuvent prendre une bonne orientation, ce qui évite les cicatrices hypertrophiques. Il reste naturellement à épidermiser dans un second temps. Ce matériau répond aux besoins d'urgence. Il peut être stérilisé et 2616 3 1 8 stocké en grande quantité. Cette technique, pour intéressante qu'elle soit, présente pourtant plusieurs inconvénients, tant en ce qui concerne le derme, qu'en ce qui concerne le pseudo-épiderme. Pour le derme: L'association du collagène et des glycosaminoglycanes acides décrite par YANNAS et BURKE donne des matériaux composites dans lesquels les constituants sont aisément dissociables en raison notamment de la pauvreté du collagène en fonctions basiques ionisables. Ces matériaux composites sont solubles dans les liquides de l'organisme et doivent être réticulés au niveau du collagène pour que soit possible leur utilisation en milieu aqueux. Cependant, la faible cohésion entre le collagène réticulé et les glycosaminoglycanes acides est responsable d'un relargage progressif des GAG à chaque fois qu'une immersion dans une solution aqueuse est nécessaire (hydratation, lavage, neutralisation, etc. ). Le relargage, qu'il est difficile de contrôler, modifie de façon importante la composition finale des dermes. Pour diminuer sa dégradation, augmenter. sa résistance, il est..DTD: nécessaire de réticuler le coprécipité de collagène-GAG, soit par réticu- lation chimique utilisant le glutaraldéhyde, produit toxique pour l'organisme, ce qui nécessite, d'une part, d'éliminer le glutaraldéhyde en. excès et, d'autre part, de contrôler son élimination du produit fini, soit par réticu- lation physique par action simultanée de la chaleur et du vide. Pour le pseudo-épiderme: Le pseudo-épiderme en résine de silicone n'est pas biodégradable. Il est donc nécessaire de l'enlever chirurgicalement avant d'épidermiser. Il est, par ailleurs, inutilisable comme support de culture in-vitro et in-vivo. La dernière technique en date est celle proposé par WIDRA (EP-A-0 089 152 et EP-A-0 138 385), qui propose une peau artificielle réalisée à partir de l'association de composés anioniques dérivés de la kératine et de biopolymères cationiques tels que le chitosan et le collagène. Ces composés sont applicables en deux étapes pour former, in situ, une membrane hydrogel qui forme une carapace protectrice et, en fin de cicatrisation, durcit et tombe. Les Inventeurs se sont donné pour but de préparer une nouvelle peau artificielle ne présentant pas les défauts des techniques mentionnées ciavant. Dans ce but, ils se sont fixé certains critères auxquels devront satisfaire le derme et l'épiderme. Le derme devra bien entendu - faciliter la migration des fibroblastes et des cellules endothéliales - ne présenter que peu ou pas d'antigénicité, se dégrader à une vitesse contrôlable, - permettre de réduire et de prévenir les contractures, - activer la cicatrisation et prévenir l'infection, - ne pas provoquer de réaction inflammatoire, - diminuer la douleur, - prévenir les cicatrices hypertrophiques. Il devra, en outre, être bien toléré, être résistant et manipulable sans qu'il soit nécessaire de recourir à une réticulation des constituants. L'épiderme devra être entièrement biodégradable et susceptiblede servir de support de culture cellulaire; il devra, en outre, être imperméable aux bactéries, réguler le flux liquidien et présenter des pores de dimensions contrôlées. La peau artificielle selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle est essentiellement constituée d'une couche dermique de type velours comprenant l'association de collagènes type III + I, de chitosan, de chon- droîtines 6 et 4 sulfate et d'acide hyaluronique. Cette couche dermique est associée à un pseudo-épiderme biodégradable à structure membranée. La composition de la couche dermique selon l'invention est tout à fait originale. On sait en effet que l'addition de molécules polyanioniques ou polycationiques à du collagène conduit à la formation de réseaux ioniques dans lesquels interviennent soit les groupements amine soit les groupements carboxyle de cette protéine. La densité de ces liaisons, dans les matériaux composites obtenus dépend de l'accessibilité de ces groupements, de leur répartition et de leur nombre Il existe déjà des complexes associant le collagène et le chitosan. C'est ainsi que KOSUGI et KOTTO (US-A-4378017) préparent des compo- sites collagène bovin fibreux - chitosan macrofibrillaire de crabes utilisable en industrie alimentaire. Les membranes obtenues par les auteurs sont transparentes, très résistantes à la traction, élastiques et thermostables. Elles sont de plus insolubles dans l'eau et en milieu acide contrairement au collagène et au chitosan de départ pris séparément. Ces membranes sont cependant hydratables en milieu aqueux sans qu'il y ait relargage des 26 1 6 3 1 8 constituants et donnent des structures souples et homogènes dont les propriétés physicochimiques et biologiques sont compatibles avec leur utili- sation éventuelle comme support de cultures cellulaires. Dans ce cas, seuls les groupements carboxyles du collagène inter- viennent dans la formation du réseau. Les inventeurs ont découvert qu'il était possible d'obtenir des résul- tats tout à fait exceptionnels en formant des réseaux ioniques dans lesquels interviennent à la fois les groupements carboxyle et les groupements amine du collagène. La participation simultanée de ces deux groupements ionisables est obtenue en associant le collagène à la fois aux chondroîtines sulfate et au chitosan. La structure obtenue est stabilisée par la formation de liaisons ioniques entre les fonctions acides des chondroïtine sulfate et les fonctions amine du chitosan. Cette association est suffisamment forte (densité de liaisons ioniques maximale) pour que le matériau composite obtenu soit insoluble dans l'eau et les solutions salines physiologiques. Cette stabilité qui se traduit en particulier par l'absence de relargage des chondroitines sulfate permet d'éviter l'utilisation des procédés habituels de réticulation par des liaisons covalentes (glutaraldéhyde, azide d'acide, diisocyanates...). Le constituant majoritaire de la couche dermique selon l'invention est le collagène, et de préférence le collagène type I + III, natif ou sans télopeptides à structure hélicoïdale préservée, qu'il s'agisse de collagène de provenance humaine, extrait du placenta et traité enzymatiquement, ou de collagène bovin. Ce collagène soluble dans les fluides de l'organisme est entièrement dégradable par les enzymes cellulaires et est parfaitement toléré par l'organisme humain. Le chitosan (polyglucosamine) est le deuxième composant du derme selon l'invention. Ce chitosan peut être de différentes provenances. Selon un mode de réalisation de l'invention, il est obtenu par Ndésacétylation de chitine (poly-N-acétyl-glucosamine) microfibrillaire de carapaces de crevettes. Ce polyoside aminé présente un haut pouvoir d'absorption des protéines riches en acides aminés acides (acides glutamique et aspartique). La vitesse de dégradation enzymatique du chitosan est fonction à la fois de sa masse moléculaire et de son degré d'acétylation. Le chitosan entrant dans la composition des dermes, objet de l'invention, présente un poids moléculaire moyen compris entre 150.000 et 1.000.000 et des degrés d'acétylation compris entre 40 et 10 %. Les variations dans les poids moléculaires et les degrés d'acétylation permettent de modifier la cohésion des constituants des dermes et de moduler ainsi leurs propriétés biologiques et physicochimiques en fonction des buts recherchés. Par ailleurs, le chitosan présente des propriétés biologiques intéres- santes utilisables en clinique. Il est hémostatique et cicatrisant et peut être utilisé comme support de culture cellulaire. Son rôle de protection de l'organisme animal vis-à-vis des infections bactériennes et fongiques a été également démontré. Il agit par stimulation du système immunitaire et, en particulier, il induit l'activation des macrophages. Cette propriété a été utilisée chez l'animal dans le traitement des tumeurs cancéreuses. Le chitosan et le composite collagène-chitosan présentent donc des propriété physicochimiques et biologiques compatibles avec leur utilisation comme constituant des dermes artificiels. Les 3ème et 4ème constituants, les chondroiïtines sulfate et l'acide hyaluronique sont des glycosaminoglycanes. Les glycosaminoglycanes -font partie intégrante du tissu conjonctif. Les glycosaminoglycanes sont caractérisés par des unités disacchari- diques linéaires, généralement constitués d'un acide uronique (acide glucuro- nique ou acide iduronique et d'une hexosamine (glucosamine ou galactosa- mine) très souvent N-acétylée et estérifiée par l'acide sulfurique. Les principaux glycosaminoglycanes sont - l'acide hyaluronique, - la chondroîtine 4-sulfate ou chondroitine sulfate A (CSA), - la chondroitine 6-sulfate ou chondroitine sulfate C (CSC), - le dermatane sulfate ou chondroitine sulfate B (CSB), - l'héparane sulfate (HS), - le kératane sulfate (KS) qui diffère des autres glycosaminoglycanes par la présence de galactose à la place de l'acide uronique. Les chondroitines 4- et 6-sulfate sont les glycosaminoglycanes les plus répandus. Ce sont des polymères dont l'unité fondamentale est la suivante: glucuronyl ( q 1.3)N-acétylgalactosamine sulfate ( 1.4). Les chondroitines 4- et 6-sulfate ne diffèrent que par la position du groupement sulfate. La molécule de galactosamine est estérifiée soit en position 4 (chondroitine 4-sulfate ou chondroitine sulfate A), soit en position 6 (chondroYtine 6-sulfate ou chondroitine sulfate C). 261631 8 On a démontré que les glycosaminoglycanes sulfatés, à l'exception du kératane sulfate, pouvaient former, in vitro et à des pH physiologiques, des liaisons ioniques avec le collagène. Ces liaisons sont d'autant plus fortes que le contenu en acide iduronique du glycosaminoglycane est élevé. De plus, les interactions entre les protéoglycanes et le collagène du type II, caractéristique-du cartilage, sont plus faibles qu'avec les collagènes du type I et III trouvés dans la paroi artérielle et utilisés dans la présente invention. Ces interactions sont importantes car les protéoglycanes peuvent ainsi influencer la stabilité conformationnelle du collagène monomérique ainsi que la fibrillogenèse et donc modifier l'agrégation plaquettaire induite par ce dernier. La précipitation du collagène bovin par le chondroitine 6-sulfate à pH acide ralentit la dégradation du collagène en masquant le site d'action de la collagènase et diminue son immunogénicité en masquant les sites antigé- niques. Les chondroitines sulfate rendent le collagène hémocompatible en diminuant l'agrégation des plaquettes et la libération de sérotonine. Les chondroitines 6 et 4-sulfate utilisées dans la présente invention, en même temps que le chitosan, comme précisé ci-avant, sont avantageuse- ment associés à l'acide hyaluronique précédemment décrit qui exerce un rôle de régulation de la croissance et de la migration cellulaire.L'acide hyaluronique est le seul glycosaminoglycane non sulfaté. Il s'agit d'un polymère d'unité: glucuronyl ( 1,3) N- acétyloglucosa- mine ( 1,4). L'acide hyaluronique a un poids moléculaire variant entre 100.000 et plusieurs millions selon le tissu considéré. Il faut souligner que l'introduction, dans des formulations à base de collagène et de chondroitines sulfate, de chitosan, outre les améliorations qu'elle communique au derme sur le plan biologique, apporte une solution au problème du relargage et de la réticulation. En effet, ce polysaccharide présente de très nombreuses fonctions aminées ionisables susceptibles de se lier par liaison ionique à chacun des constituants du derme puisqu'ils présentent tous des fonctions acides (carboxylique et sulfonique) en propor- tion importante. Dans ce cas, et contrairement à ce qui se passe après réticulation chimique du collagène seul dans les mélanges collagène-GAG connus, tous les constituants sont liés entre eux par un nombre de liaisons ioniques suffisamment important pour que le relargage soit négligeable. La compo- 2 6 1 6 3 1 8 sition chimique des dermes obtenus reste invariable au cours des opérations nécessitant une immersion dans des solutions aqueuses. La présence de chitosan dans les équivalents dermiques selon l'invention permet donc d'obtenir un matériau de composition très définie et qui présente la particularité d'être insoluble dans les fluides de l'organisme sans qu'il soit nécessaire de recourir à une réticulation chimique covalente. Une telle réticulation peut cependant être envisagée pour modifier si nécessaire les propriétés biologiques et physicochimiques des composites ainsi que leur biodégradabilité. Par ailleurs, la couche pseudo-épidermique recouvrant les dermes arti- ficiels doit avoir des propriétés physicochimiques proches des épidermes naturels. Cette couche doit agir comme régulateur du flux hydrique et comme barrière vis-à-vis des agents infectieux. Elle doit, en outre, par ses propriétés mécaniques, conférer à l'ensemble derme-épiderme une solidité et une élasticité compatibles avec les conditions de manipulation intervenant au moment de la greffe (hydratation, lavage, découpage, suture...). Selon l'invention, cette couche est constituée par un film de chitosan seul ou associé à des chondroîtines-sulfate et/ou du collagène. Elle peut être constituée également de ces éléments seuls ou associés à des protéines de structure modifiées telles que les carboxyméthyl ou aminoéthyl-kératéines substituées. La couche dermique comporte entre 10 et 20 % de chitosan, entre 4 et 10 % de chondroitines 4- et 6- sulfate, ces pourcentages étant calculés par rapport au poids du collagène. L'utilisation d'autres polyélectrolytes en association avec une ou plu- sieurs de ces macromolécules ionisables est possible. En particulier les polyo- sides végétaux (acide polygalacturonique...) ou les poly-aminoacides peuvent être employés pour la constitution de réseaux ioniques présentant les propriétés physicochimiques désirées. Ces films composites sont rendus plus oủ moins- lipophiles par greffage chimique de substituants non toxiques tels que les acides gras ou d'autres substances hydrophobes, ou par application superficielle d'un succé- dané de sébum contenant des acides gras libres ou estérifiés ou toute autre substance contenue dans le sébum. Les pseudo-épidermes selon l'invention présentant-l'avantage, par rapport aux substances chimiques généralement utilisées po.ur l'imperméa- bilisation des dermes, présentent une lipophilie modulable en fonction de la nature des substances grasses utilisées ou de la nature des substituants lipophiles introduits. 2616 5 18 Le procédé de préparation du derme, composant l'essentiel de la peau artificielle selon l'invention, va maintenant être décrit en détail. Préparation de la solution de collagène: Les collagènes préférés appartiennent au type III - I, au type 111, au type 1, au type IV et au type V et se trouvent sous forme natifs ou sans télopeptides, à structure hélicoïdale préservée, en solution ou sous forme fibreuse. Ils sont préparés, de façon classique, à partir de derme de veau (collagènes commercialisés en France par la S.A. de Développement et d'Utilisation du Cuir). Ils peuvent également être obtenus à partir de placenta humain (collagènes commercialisés en France par l'Institut Mé- rieux). La solution est réalisée en mélangeant à l'aide d'un agitateur I % de collagène (poids/volume) dans de l'acide acétique 0,05 M à température ambiante et pH 3,5. Si l'on désire un derme artificiel moins rigide, la concentration de la solution peut être abaissée jusqu'à 0,3 % (poids/volume). Préparation du chitosan: On prépare le chitosan par N-désacétylation de chitine (poly-N-- acétyl-glucosamine) microfibrillaire provenant de carapaces de crevettes. - Le chitosan ainsi obtenu et hautement purifié est ajouté à la solution précédente à raison de 15 6 (poids/poids) par rapport au collagène. Le chitosan joue, en plus de ses propriétés naturelles, le rôle d'agent réticulant ionique. Son poids moléculaire peut varier de 150 000 à 1 000 000. Le degré d'acétylation, que l'on peut faire varier de 40 à 10 %6, détermine le degré de réticulation, et permet donc de jouer sur la vitesse de dégradation du derme artificiel. - Un mélange de chondroîtines 4 et 6 sulfate purifié à 99 % à partir de cloisons nasales d'ovins est ensuite ajouté à la solution coilagènechitosan à raison de 6 % (poids-poids) par rapport à la quantité de collagène initiale. La présence des deux premiers composés facilite la solubilisation des GAG qui se dissolvent rapidement sous agitation à température ambiante. - On peut, à ce stade de la préparation, ajouter à la solution précédente de l'acide hyaluronique, à raison de 1 % (parties en poids) par rapport au collagène. Ce produit permet une amélioration de l'adhésion Z616318 cellulaire et permet également d'améliorer encore la croissance cellulaire, déjà favorisée par les glucosaminoglycanes. Neutralisation: Une fois que l'on a obtenu un mélange bien homogène des différents constituants, on effectue la neutralisation du derme. Le pH est alors ramené à 6,5-7 par une solution de NaOH N ou par un tampon Tris-HCI (pH 10,5). Une autre méthode consiste à effectuer la neutralisation après lyophilisation de la solution. Il faut alors rincer le derme dans deux bains successifs d'eau stérile, de sérum physiologique ou de tampon Tris-HCI. Lyophilisation: La solution homogène obtenue est lyophilisée dans des lyophili- sateurs industriels. L'épaisseur du derme dépend de la quantité de solution versée dans les moules et peut être adaptée aux besoins des utilisateurs. En moyenne, cette épaisseur varie de I à 8 mm selon l'utilisation. On peut aussi réaliser des films à partir de la solution homogène précédemment préparée. Cette solution est versée dans des moules et maintenue dans une étuve à 35 C pendant 48 heures, ce qui permet d'obtenir un derme artificiel lisse et transparent de 0,1 à 0,8 mm d'épaisseur. Stérilisation: Deux principaux procédés de stérilisation sont retenus l'alcool à 70 - les rayons gamma. Alcool à 70 : Les dermes artificiels sont conditionnés dans des poches plastiques remplies d'alcool à 70 selon des techniques classiques évitant au maximum la contamination bactérienne; tous les tests bactériologiques réalisés entre sept jours et six mois après le conditionnement dans l'alcool se sont révélés négatifs. Rayonnement gamma Les dermes artificiels peuvent également être stérilisés par des irradiations ionisantes. Les rayons gamma proviennent d'une source de cobalt 60. La dose de rayonnement peut s'étendre de I à 3 Megarad sans détérioration des propriétés du derme. : 11 Le derme artificiel ainsi obtenu a été soumis à différents con- trôles qui vont être exposés ci-après. Certains de ces contrôles sont représentés au dessin schématique annexé, dans lequel Figure 1 est une courbe représentant la vitesse de dégradation enzymatique du derme selon l'invention par la collagènase; Figure 2 représente les spectres de diffraction aux rayons X du collagène seul Figure 3 représente le spectre de diffraction aux rayons X du derme artificiel selon l'invention, et d'un collagène dénaturé Figure 4 représente les -spectres de diffraction aux rayons X du derme artificiel selon l'invention une fois stérilisé aux rayons X et à l'alcool à 70 ; Figure 5 représente les résultats d'électrophorèse sur un derme réalisé à partir de collagène bovin. Microscopie électronique La microscopie électronique à balayage permet d'observer la structure poreuse des dermes lyophilisés, la structure lamellaire des dermes filmogènes, et de contrôler la taille des pores déterminée par le pourcen- tage de matière sèche du derme. La microscopie électronique à transmission permet de visualiser la structure microfibrillaire du derme selon l'invention. Propriétés mécaniques du derme artificiel Les tests de résistance des matériaux à la traction sont réalisés sur un appareil de mesure ADAMEL LHOMERGY DY 21b. Les échantillons sont préparés sous forme d'haltères de 0,5 cm de large sur 3 cm de long et 0,33 mm d'épaisseur. Chaque extrémité de l'éprouvette est pincée fortement entre les mors de l'appareil. Les mesures d'étirement sont réalisées à une vitesse de 5 ou mm/minute suivant les échantillons. Trois essais sont réalisés pour chaque mesure. Les résultats sont donnés dans le tableau I ci-après. TABLEAU I Echantillons Stérilisation Force Allongement Module de Young da N (mm) Kg/cm2 Collagène H Non stérile 0,01 Très faible / Collagène + GAG Non stérile 0,02 Très faible / Collagène H + Ch + GAG Non stérile 0,9 14,33 0, 16 Collagène H + Ch + GAG Rayons Gamma 0,1 17,3 0,14 Collagène H + Ch + GAG Alcool 70 0,09 15,7 0,145 Collagène H + Ch + GAG + pseudo-épiderme bio- dégradable Alcool 70 0,23 20,1 0,29 Collagène B + Ch + GAG Non stérile 0, 06 12,27 0,13 Collagène B + Ch + GAG Rayons Gamma 0,07 13,00 0,13 Collagène B + Ch + GAG Alcool 70 0,06 13,3 0,12 Collagène H: Collagène humain Collagène B: Collagène bovin Ch: chitosan GAG: glycosarinoglycanes. Caox GAG: glycosaminoglycanes. 261 61 8 La comparaison des échantillons constitués de collagène seul, de collagène et de glycosaminoglycanes et de collagène, chitosan et glycos- aminoglycanes montre que la présence du chitosan augmente de façon importante la résistance mécanique du derme artificiel. Comme on peut le voir, l'incorporation de 15 % en poids de chitosan multiplie par quatre la force nécessaire pour obtenir la rupture du composé. Ceci montre clairement la forte cohésion des trois molécules entre elles. Etude de la vitesse de dégradation enzymatique du derme arti- ficiel par la collagènase: Cette étude permet de déterminer la sensibilité à la dégradation par la collagènase des matières premières et du dermeartificiel lui-même stérilisé ou non. Chaque échantillon est broyé six minutes dans l'azote liquide (diamètre moyen des particules 10 pm). L'expérience est réalisée à 30 C et Ph 8,6 à raison de lg/l de produit dans du tampon tris 5 mM. La collagènase utilisée est de type VII 000 u/ml. Sa concentration finale est 3,75 U/ml. Les résultats sont donnés dans le tableau 1I et à la figure 1. TABLEAU II Echantillons Stérilisation % Activité enzymatique Collagène humain (1) Non stérile 100 Collagène H + Ch + GAG (2) Non stérile 40 Collagène H + Ch + GAG (3) Rayons gamma 53 Collagène H + Ch + GAG (4) Alcool à 70 41 GAG (5) Non stérile 0 Chitosan (6) Non stérile 0 L'addition de chitosan et de GAG diminue de moitié la dégra- dation du collagène par la collagénase. Il n'y a pas de différence significa- tive entre le derme artificiel non stérile et celui stérilisé aux rayons gamma ou à l'alcool à 70 . Etude de la diffraction aux rayons X Cette étude permet de vérifier l'intégrité de la molécule de collagène après fabrication du derme artificiel et après stérilisation. Les échantillons sont préparés à l'emporte-pièce et aplatis de façon à obtenir des pastilles de I cm de diamètre et I mm d'épaisseur. Ces pastilles sont placées dans un appareil de diffraction des rayons X relié à un système informatique. Les résultats sont donnés aux figures 2 à 4. On peut observer les pics P1 et P2 caractéristiques du collagène sur la courbe A représentée à la figure 2. Le pic PI permet de déterminer la distance entre les molécules de collagène. Le Pic P2 traduit la distance entre deux acides aminés. C'est sa présence qui permet de déterminer le degré d'intégrité de la molécule de collagène. Le pic 3 permet de connaître le pas des hélices de la molécule de collagène. C'est un pic particulièrement difficile à visualiser. Le pic 4 n'est pas exploitable car il est donné par tous les éléments amorphes contenus dans le derme artificiel. Sur la figure 3, la courbe B est celle du derme selon l'invention et la courbe C celle du collagène dénaturé. On peut observer que le procédé de fabrication n'altère pas la molécule de collagène, puisque le pic P2 est toujours présent. * Le pic 3 n'est plus visible. Il doit être masqué par les résidus du chitosan et de glycosaminoglycanes. Le pic P1 conserve une amplitude identique dans le derme artificiel et dans du collagène seul. - Les spectres de diffraction des rayons X observés sur la figure 4 montrent que les procédés de stérilisation n'altèrent pas non plus la molécule de collagène. Sur la figure 4, la courbe D est celle du derme stérilisé aux rayons X et la courbe E, celle du derme stérilisé à l'alcool à 700. Electrophorèses Une première série d'électrophorèses sur gel de polyacrylamide en présence de SDS a été réalisée. Elle permet de séparer les chaînes en fonction de leur poids moléculaire. Les résultats d'électrophorèse du derme artificiel obtenu à partir 2616 18 de collagène bovin sont rassemblés à la figure 5. Les pics alphal, alpha2. Bêtail, Bêta12, caractéristiques d'un collagène bovin acido-soluble, sont présents et sont tout à fait comparables à ceux obtenus avec un collagène bovin seul. La fabrication n'altère donc pas les molécules de collagène, ce qu'avait déjà laissé supposer l'étude de la diffraction aux rayons X. Etude de la cytotoxicité Une étude de cytotoxicité directe et indirecte du derme artificiel selon l'invention sur des cultures de fibroblastes et de kératinocytes a été réalisée. Les résultats sont rapportés dans le tableau III. Dans chaque cas, aucun signe de cytotoxicité n'a été observé. La morphologie des cellules reste identique à celle des témoins. La vitesse de croissance est légèrement augmentée. TABLEAU III Echantillon Cytotoxicité Vitesse Directe Indirecte de croissance cellulaire témoin sans derme artificiel / / Normale Collagène H + Ch + GAG stérilisé à l'alcool- Négative Négative Normale Collagène H + Ch + GAG stérilisé aux Rayons Gamma Négative Négative Normale Collagène B + Ch + GAG stérilisé à l'alcool Négative Négative Normale Collagène B + Ch + GAG stérilisé aux rayons 26 16 3 1 8 Gamma Négative Négative Normale Etude de la biocompatibilité du derme artificiel Les dermes artificiels stériles sont rincés dans - deux bains de sérum physiologique et découpés aux dimensions désirées à l'aide de matériel chirurgical stérile. L'animal choisi (rat blanc de laboratoire) est anesthésié par exposition à un mélange d'oxygène et d'halothane. Il est rasé sur le dos et lavé avec une solution antiseptique. Deux excisions de 2 cm2 sont pratiquées jusqu'au muscle sur le dos de l'animal avec un minimum de saignement. L'une reçoit du derme artificiel, l'autre sert de témoin. Un bourdonner est suturé sur chaque plaie et le tout est recouvert d'un pansement. Plusieurs séries de trois rats sont réalisées sur ce modèle. Les animaux sont sacrifiés à j 2, j 7, j 15, j 21 et j 30. L'aspect du derme artificiel est alors noté, une biopsie est prélevée jusqu'au muscle dans les deux plaies pour l'étude en microscopie électronique à balayage et à transmission ainsi que pour l'étude histologique. Le sang de l'animal est prélevé par ponction intracardiaque en vue des recherches d'anticorps. Les résultats obtenus à j 2 montrent une réaction inflammatoire normale suivie à j 7 d'une colonisation cellulaire du derme artificiel. A j 15, aucune surinfection n'a été observée. Les premiers résultats obtenus à j 21 montrent que le derme artificiel est toujours présent et est bien colonisé par les cellules. Le derme artificiel ainsi obtenu peut être épidermisé en un second temps à l'aide d'un pseudo-épiderme biodégradable; selon l'invention on utilise de préférence un pseudo-épiderme à base de chitosan seul ou associé à des chondroitines sulfate et/ou à du collagène, ainsi qu'éventuellement à des protéines de structure modifiée ou à d'autres polyélectrolytes. Une certaine lipophilie est avantageusement conférée au pseudo-- épiderme par greffage chimique ou par application superficielle d'un succé- dané de sébum. Le matériau composite derme + pseudo-épiderme ainsi réalisé présente tous les avantages énumérés ci-avant. Il est de plus entièrement 2616 3 1 8 biodégradable et pourra servir de support pour la culture des propres kératinocytes du sujet et être implanté dans les jours suivants les brûlures. Relais précieux dans les techniques d'excision précoce du tissu brûlé au 3ème degré, il permet un recouvrement immédiat, évite les pertes exudatives et calorico-azotées, présente une barrière aux infections, limite les cicatrices hypertrophiques et les séquelles rétractiques invalidantes. Il est de plus un excellent support permettant d'envisager la culture de cellules épidermiques sur le malade lui-même. Ainsi la reconstitution de la couche épidermique se fera en même temps que celle de la couche dermique, solution attendue par tous les Centres de Brûlés. 26 16 3 1 8 REVENDICATIONS I - Peau artificielle à base de collagène et de glycosaminoglycane, caractérisée en ce qu'elle est essentiellement constituée d'une couche dermique de type velours comprenant en association du collagène, du chitosan, des chondroîtines 4- et 6-sulfate. 2 - Peau artificielle selon la revendication 1, caractérisée en ce que le collagène est choisi parmi les collagènes type III + 1, d'origine humaine ou d'origine bovine, natif ou sans télopeptides, à structure hélicol- dale préservée en solution ou sous forme fibreuse. 3 - Peau artificielle selon la revendication 1, caractérisée en ce que le chitosan provient de la N-désacétylation de chitine (poly-N-acétyl- glucosamine) microfibrillaire de carapaces de crevettes. 4 - Peau artificielle selon la revendication 3, caractérisée en ce que le chitosan présente un poids moléculaire moyen compris entre 150.000 et 1.000.000 et des degrés d'acétylation compris entre environ 10 et 40%. - Peau artificielle à base selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 4, caractérisée en ce que la couche dermique comporte en outre de l'acide hyaluronique. 6 - Peau artificielle selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la couche dermique comporte entre 10 et 20 96 de chitosan, entre 4 et 10 % de chondroitines 4- et 6-sulfate, ces pour- centages étant calculés par rapport au poids du collagène. 7 - Peau artificielle selon les revendications 5 et 6, caractérisée en ce que la couche dermique comporte en outre environ une partie en poids d'acide hyaluronique, par rapport au collagène. 8 - Peau artificielle selon l'une quelconque des revendications I à 7, caractérisée en ce que la couche dermique est associée à un pseudo-- épiderme biodégradable à structure membranée. 9 - Peau artificielle selon la revendication 8, caractérisée en ce que le pseudo-épiderme est un film de chitosan. - Peau artificielle selon la revendication 8 et la revendication 9, caractérisée en ce que le film de chitosan est associé à des chondroitines sulfate et/ou à du collagène. Il - Peau artificielle selon les revendication 9 et 10, caractérisée en ce que les composants du pseudo-épiderme sont associés à des protéines de structure modifiées telles que les carboxyméthyl ou aminoéthyl-kéra- téines substituées, à des polyosides végétaux, ou à des polyaminoacides. 261631 8 12 - Peau artificielle selon l'une quelconque des revendications 8 à I1l, caractérisée en ce qu'une certaine lipophilie est communiquée au pseudo-épiderme par greffage chimique de substituants non toxiques tels que les acides gras ou d'autres substances hydrophobes, ou par application super- ficielle d'un succédané de sébum contenant des acides gras libres ou estérifiés ou toute autre substance contenue dans le sébum. 13 - Procédé d'obtention d'une couche dermique artificielle selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: - Dissolution de collagène acido-soluble ou fibreux de provenance humaine ou bovine dans de l'acide acétique - Addition à la solution de collagène de chitosan de crevettes purifié - Addition à la solution collagène-chitosan d'un mélange de chondroîtines 4- et 6 sulfate, suivie éventuellement d'addition d'acide hyaluronique; - Neutralisation à pH 6,5 - 7; - Lyophilisation ou transformation en film - Stérilisation. 14 - Procédé d'obtention d'une couche dermique artificielle selon la revendication 13, caractérisé en ce que le mélange de chondroîtines 4- et 6- sulfate éventuellement additionné d'acide hyaluronique est ajouté au collagène et en ce que l'ensemble obtenu est additionné de chitosan.