FR 2614026 A1 19881021 FR 8705457 A 19870416 i HEPARINES DE BAS POIDS MOLECULAIRE, A STRUCTURE REGULIERE L'invention a pour objet des héparines de bas PM à structure régulière, leur procédé de préparation et leurs applications biologiques. Elle vise plus spécialement des héparines de bas PM présentant une activité dans le domaine de la régulation de certains systèmes physiologiques tout en étant pratiquement totalement dépourvues de l'activité anticoagulante s'exerçant via l'antithrombine III (ATIII). Il est connu que l'héparine possède une activi- té anticoagulante s'exerçant principalement via l'anti- thrombine III (ATIII). Les travaux effectués sur les relations struc- ture/activité de l'héparine ont montré que ce type d'ac- tivité anticoagulante se trouve tout particulièrement correlée aux régions dites irrégulières de l'héparine, plus spécialement la région correspondant au pent- asaccharide de structure DEFGH décrit dans la demande FR 2.535.324 de formule: ros coor r C#soo - 3:O J-'O 0 =0 / 0 D E F G H On sait également que certaines activités de l'héparine ou de fragments d'héparine peuvent être maintenues jusqu'à un certain degré en l'absence du site de liaison à l'AT III ou lorsque celui-ci est modifié, les structures responsables de telles activités n'étant cependant pas connues. Ainsi Folkman et al (Science Vol. 221 - 1983 - p. 719-725) a rapporté une action inhibitrice de l'angiogénèse pour des mélanges d'hexasaccharides lo dépourvus d'activité anticoagulante, utilisés en association avec des corticoides. Karnowsky et al ont effectué des expériences sur des héparines Odésulfatées et N-désulfatées et ont montré qu'elles possédaient toujours dans une certaine proportion, mais & un moindre degré, les activités inhibitrices de l'héparine standard sur la prolifération des cellules musculaires lisses. En outre, une activité anti-complément de l'héparine, indépendante de l'activité anticoagulante, a été mise en évidence. D'autres travaux ont montré que l'activité anticoagulante de l'héparine pouvait être modifiée en effectuant des coupures au niveau des carbones C2-C3 des acides uroniques non sulfatés à l'aide de periodate de sodium. Ainsi,Fransson et Lewis ont décrit, dans Febs. Letters, vol. 97, ne 1, p. 119 - 123, 1979, des condi- tions opératoires consistant à soumettre l'héparine & l'action du periodate, soit à pH 3, & 4' C, soit à pH 7, à 37 C. Les chaines d'héparine obtenues sont oxydées sélectivement au niveau des acides Dglucuronique dans le premier cas, alors qu'une oxydation au niveau de tous les motifs acides uroniques non sulfatés est obtenue avec le deuxième type de conditions. Les chaînes résultantes sont réduites par NaBH4 ou fragmentées selon un processus de 0 élimination en milieu alcalin. Les auteurs concluent que l'oxydation et le clivage des motifs acide Dglucuronique se traduisent par une légère diminution de poids moléculaire mais une rétention de l'activité anticoagulante. Au contraire, la coupure à pH 7 et 37' C des acides D-glucuronique et Liduronique non sulfatés entraîne la suppression de l'activité anticoagulante et une plus forte fragmentation de la molécule. Dans un article paru dans Carbohydrate Research 36, p. 339-348, 1974, Fransson a rapporté l'oxydation periodique des motifs uroniques dans le dermatane sulfate à divers pH, à 4' C ou 37' C. L'auteur indique qu'en procédant à pH 5, les coupures au niveau des acides glucuroniques ne se font que dans une proportion inférieure à 5% et qu'en procédant à pH 3, ces coupures ne se font pas du tout. Ces résultats apparaissent donc contraires à ceux obtenus avec l'héparine pour laquelle à pH 3, les coupures se font préférentiellement au niveau des acides D-glucu- roniques. L'action du periodate a également été rapportée par Casu et al. dans Arzneim. Forsch./Drug Res. 36 (1) n' 4, p. 637-642, 1986. Selon cet article, différentes préparations d'héparine sont soumises à une oxydation periodique (pH ,3 & 4'C durant 24 h.) coupant entre les carbones en positions 2 et 3 de tous les acides uroniques non sulfatés. A titre de référence, une préparation est soumise à une étape ultérieure d'hydrolyse acide partielle et les fragments obtenus sont dialysés. Cette étape d'hydrolyse acide partielle conduit à une fragmentation importante des chaînes et à une destruction au moins partielle de groupes fonctionnels, comme l'indique Fransson dans Carbohydr. Res. 80, 131-145 (1980). De plus, selon cette méthode, on obtient obli- gatoirement un mélange de chaînes de PM variés dans un intervalle large, en particulier de nombreux di, tetra et hexasaccharides. Or, les inventeurs ont mis en évidence que pour l'obtention de compositions pharmaceutiques stables utilisables en thérapeutique pour la régulation de certains systèmes physiologiques, les caractéristiques suivantes en combinaison sont essentielles: longueur des fragments; taux de charge; absence du site de liaison à l'ATIII, afin d'éviter les effets indési- rables liés à une activité anticoagulante. L'étude des processus de coupure à l'aide d'acide periodique et des moyens de fragmentation les ont conduits à constater qu'en réalisant l'oxydation perio- dique dans des conditions opératoires spécifiques mais également en mettant en oeuvre une combinaison d'étapes particulières, il est possible d'obtenir une composition de fragments d'héparine de bas PM, dans un intervalle favorable, dépourvus du site de liaison à l'ATIII, tout en conservant la majeure partie de leurs groupes fonctionnels. L'invention a donc pour but de fournir des compositions d'héparine gui, aux doses actives, soient dotées de propriétés pharmacologiques de grand intérêt, sensiblement équivalentes & celles de l'héparine,sans présenter les inconvénients d'être dotées de propriétés anticoagulantes. Elle vise également à fournir un procédé de fragmentation de l'héparine permettant d'obtenir des fragments de PM donné, dépourvus cependant du site de liaison à l'ATIII et dont le taux de charge correspond sensiblement à celui des séquences correspondantes dans les chaînes d'héparine naturelle. L'invention vise également les applications de ces compositions pour l'élaboration de médicaments actifs sur la régulation de certains systèmes physiologiques. Les compositions de l'invention sont carac- térisées par le fait qu'elles sont essentiellement formées de fragments dépourvus des acides glucuroniques non sulfatés caractéristiques du site de liaison à l'ATIII et des acides iduroniques non sulfatés, avec un enchaînement de motifs 2-0-sulfo-acide L-iduronique et D-glucosamine répondant à la formule générale suivante: OR3 RI ' o o 8 0H OR1 o R o0s03 NHR2 n dans laquelle OR3 - R représente un atome d'hydrogène ou un motif:R R4 R2 3O - R1 représente un atome d'hydrogène ou un groupe -SO3 - R2 représente un groupe -SO ou -CO-CH3, la proportion 2 3 3 de groupes -S03 étant d'environ au moins 90%, - R3 représente un groupe SO3 ou un atome d'hydrogène, la proportion de groupes -SO3 étant d'environ au moins 70%, - R4 représente un atome d'hydrogène ou un résidu d'acide uronique, - R' représente soit un atome d'hydrogène, soit un mo- tif acide uronique naturel,soit un résidu d'acide uronique modifié au cours de l'oxydation periodique et dont les fonctions aldéhy- des ont été réduites en alcools, avec 7 n 4 15, ce qui correspond.& des chalnes de PM de 4800 & 9000 environ, et ses sels pharmaceuti- quement acceptables. Les compositions de l'invention ont notamment en HPLC déterminée avec une colonne TSK 2000 SW, en utilisant Na2SO4 0,5M comme solvant, avec un débit de 1 ml/min: - un poids moléculaire moyen de l'ordre de 6000-7000 Da, % des espèces étant compris entre 4800 et 9000 daltons et 90% entre 3600 et 11000 Da, - un poids moléculaire au sommet du pic de l'ordre de 6000 à 6500 Da, - moins de 5% de chaînes inférieures & des dodécasac- charides, - moins de 5% de chaînes au-delà de 11.000. Selon un autre aspect,les compositions d'héparine de l'invention sont telles qu'obtenues par fractionnement, & l'aide d'alcool, en présence * d'un sel minéral, -- d'un mélange résultant de la dépoly- mérisation de l'héparine par action d'une base forte sur des chaînes d'héparine soumises au préalable & l'action de periodate, la dépolymérisation étant suivie d'une ré- duction des groupements aldehyde formés lors de l'oxyda- tion periodique. L'invention vise également les sels de ces compositions, en particulier les sels de sodium, potassium, calcium et magnésium ainsi que les sels de cations organiques physiologiquement acceptables. / / / / L'invention a également pour objet un procédé de préparation de compositions de fragments d'héparine tels que définis ci-dessus, comprenant l'oxydation ménagée de l'héparine & l'aide de periodate. Le procédé de la présente invention est caractérisé en ce que: a) on traite une solution aqueuse d'héparine à une con- centration finale de 0,5 & 4% (p/v) avec de l'acide périodique à une concentration finale de 0,6 à 4% (p/v) à un pH de 4,5 à 6,5 & une température de 0 & 10' C; b) on traite les chaines d'héparine ainsi obtenues avec une base forte à une molarité finale en base de 0,1 à 0,3 N; c) on traite les fragments de dépolymérisation ainsi obtenus avec un agent réducteur; d) après élimination éventuelle de l'agent réducteur en excès, on précipite les fragments réduits après addition d'un sel minéral, à l'aide d'un solvant alcoolique. e) on traite une solution aqueuse du précipité ainsi ob- tenu additionné d'un sel minéral par de l'alcool. f) on récupère le produit précipité ainsi formé et on transforme éventuellement le sel correspondant à la base forte utilisée dans un autre sel pharmaceutiquement acceptable. Plus particulièrement, ce procédé comprend en combinaison les étapes suivantes: - l'oxydation ménagée de l'héparine réalisée en faisant réagir de l'héparine, en solution aqueuse & une concen- tration finale de 0,5 & 4% (p/v) avec un sel de l'acide periodique à une concentration finale de 0,5 à 4% (p/v) à un pH situé entre 4,5 et 6,5, à une température de 0 à 'C, durant environ 15 à 48 h. à l'abri de la lumière, - la dépolymérisation des chaînes d'héparine obtenues, par addition d'une base forte telle que la soude, selon une quantité conduisant & une molarité finale en base de 0,1 à 0,3 N environ, - la réduction des fragments de dépolymérisation & l'aide d'un agent réducteur et, après élimination, le cas échéant, de l'agent réducteur n'ayant pas réagi, - la récupération des fragments d'héparine réduits par précipitation à l'aide d'un solvant dans lequel ils sont insolubles, l'isolement des fragments recherchés par fractionnement à l'aide d'alcool, en présence d'un sel minéral, d'une solution aqueuse obtenue en remettant en solution dans l'eau le précipité précédemment isolé et en récupérant le précipité formé. La réalisation de la dépolymérisation suivant un processus particulier, combinée à l'utilisation dans le procédé de l'invention, d'une étape de fractionnement, permet d'isoler une composition de-fragments répondant à un profil thérapeutique particulier et possédant notam- ment un indice thérapeutique satisfaisant. Dans l'étape d'oxydation periodique, on utilise de préférence, l'héparine et le sel de l'acide periodique selon des quantités conduisant à des concentrations fina- les respectives de 1,5 % à 2,5 % (p/v). Le sel de l'acide periodique est constitué avantageusement par du métaperiodate de sodium. Pour éliminer le periodate résiduel, on effectue une dialyse avec des boyaux de dialyse ayant une porosité de 3 à 4000 Da, pendant environ 15 h. Selon un mode préféré de réalisation de l'in- vention, on met l'héparine en solution dans de l'eau, plus spécialement de l'eau déminéralisée, & 4' C, à une concentration d'environ 2% (p/v), on ajoute un sel d'acide periodique tel que du métaperiodate de sodium de manière à obtenir une concentration finale d'environ 2% (p/v). Le pH de la solution est immédiatement ajusté à 5 à l'aide d'acide chlorhydrique dilué ou de soude diluée. La solution est abandonnée à l'obscurité, à + 4' C, de préférence 24 heures. Afin d'éliminer le periodate résiduel, on effectue une dialyse avec des boyaux de dialyse ayant une porosité de 3 & 4000 Da, pendant environ 15 heures, - contre de l'eau déminéralisée courante. Les chaînes d'héparine obtenues sont soumises à une étape de dépolymérisation en milieu basique. A cet effet, on ajoute une base forte, plus spécialement une lessive concentrée de soude, de manière à obtenir une molarité finale en base de 0,2 N. La solution basique obtenue est soumise à agitation 2 heures à température ambiante. On soumet alors les fragments de dépolymé- risation de l'héparine à une étape de réduction afin de transformer les groupes aldéhyde résultant de la coupure de la liaison entre les carbones C2 et C3 des motifs uro- niques. On utilise un agent réducteur tel que le borohydrure de sodium, à raison de 50 mg par gramme d'héparine engagée, et on maintient l'agitation 6 heures à température ambiante. L'agent réducteur n'ayant pas réagi est détruit par abaissement du pH à 4 à l'aide d'acide, par exemple de l'acide chlorhydrique, avantageusement sous agitation vigoureuse, pendant environ 15 minutes. Les fragments d'héparine réduits sont récu- pérés par précipitation. Avantageusement, on ajuste le pH à 7 à l'aide d'une base, notamment de la soude concentrée, puis on ajoute 20 g/litre de sel minéral et on effectue une précipitation à l'aide de 1,5 volume d'alcool. Le sel minéral utilisé est avantageusement constitué par du chlorure de sodium. Pour la précipi- tation alcoolique, on a recours de préférence à de 26 14026 l'éthanol. Le précipité formé est récupéré par centrifu- gation, lavé avec un solvant dans lequel il est insoluble, tel que l'éthanol, et séché & 40' C, sous vide. Pour isoler de ce précipité les fragments de l'invention, on a recours à une étape de fractionnement. On réalise avantageusement un fractionnement alcoolique en procédant comme suit: On remet en solution dans de l'eau, plus spécialement de l'eau déminéralisée à température ambiante à savoir de l'ordre de 18 à.20 C, le précipité de fragments d'héparine, de manière à obtenir une concentration de 5% (p/v). On ajoute un sel minéral, tel que le chlorure de sodium,- en quantité suffisante pour avoir une concentration finale de 1%. Le pH de la solution est ajusté à 3,5 par de l'acide, par exemple de l'acide chlo- rhydrique dilué. On ajoute alors sous agitation modérée 0,85 volume d'un solvant dans lequel les fragments recherchés sont insolubles, tel que l'éthanol. L'ensemble est laissé en repos environ 10 heures à 18-20 C. Le précipité est recueilli par centrifugation, lavé avec un solvant tel que l'éthanol et séché sous vide & 40' C pendant 24 heures. Il est constitué d'un mélange de fragments d'héparine dont la majorité des espèces a un PM compris entre 4800 à 9000 Da environ. Le produit ainsi obtenu peut, le cas échéant, être transformé en un autre sel pharmaceutiquement acceptable, tel qu'un sel de calcium, un sel de potassium ou un sel de magnésium, selon les méthodes connues. Les compositions d'héparine de l'invention, essentiellement formées de fragments de poids moléculaire d'environ 4800 à 9000, dépourvus du site de liaison à l'ATIII, permettent de mettre & profit des propriétés pharmacologiques de grand intérêt, qui sont rattachées aux régions régulières de l'héparine. Ces compositions aux doses actives n'ont qu'une très faible activité anti- coagulante. L'étude de leurs propriétés pharmacologiques a ainsi montré que ces compositions exercent un effet inhibiteur sensiblement équivalent à celui de l'héparine sur la croissance des cellules musculaires lisses. Diverses expériences ont permis de mettre en évidence d'autres effets inhibiteurs, en particulier vis-à-vis de l'activation du complément, et des réactions inflammatoires d'hypersensibilité de type retardé, ainsi que vis-à-vis de l'activité enzymatique de l'héparanase. Elles peuvent exercer également une action potentialisatrice et stabilisante vis-à-vis de certains facteurs de croissance cellulaire. Ces compositions sont, en outre, dotées d'une grande innocuité et sont particulièrement stables. Elles sont ainsi particulièrement appropriées pour constituer des principes actifs de médicaments. L'invention a donc pour objet des préparations pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace d'une composition essentiellement formée de fragments d'héparine, tels que définis ci-des- sus, en association avec un véhicule pharmaceutique. Compte tenu de leurs propriétés, les médica- ments de l'invention sont utilisables tout spécialement dans les indications thérapeutiques suivantes: - prévention de la prolifération des cellules musculaires lisses au cours des angioplasties, - accélération de la réparation tissulaire, notamment lors de maladies cutanées, - prévention de l'extension deslésions athérogènes évo- lutives et des phénomènes de dégénérescence arteriosclé- rotique, - prévention des états de chocs, - prévention de certains développements métastasiques. Les préparations pharmaceutiques de l'invention sont administrables sous différentes formes. Pour l'administration par voie orale, on a recours en particulier à des gélules, tablettes, comprimés, pilules, liposomes. Ces préparations ren- ferment avantageusement de 50 mg à 5 g par unité de prise, de préférence 200 à 250 mg pour les gélules, tablettes et pilules. En conséquence, les formes d'administration dépendent essentiellement de la dose à administrer. Les i5 gélules, tablettes et pilules seront d'une utilisation pratique pour l'administration de faibles doses. Pour l'administration de doses plus élevées, les solutés buvables pourront être d'une utilisation plus pratique. D'autres formes d'administration de l'invention sont constituées par des sprays, des aérosols, des pom- mades ou des crèmes. L'invention concerne également des compositions pharmaceutiques injectables, stériles ou stérilisables pour l'administration tant par voie intraveineuse qu'intramusculaire ou sous-cutanée. Ces solutions renferment avantageusement de 10 & 150 mg/ml environ de principe actif lorsqu'elles sont destinées à l'injection par voie souscutanée ou de 10 à mg/ml environ, lorsqu'elles sont destinés à l'in- jection intraveineuse ou à la perfusion. A titre indicatif, afin d'illustrer l'inven- tion, on indique, ci-après, un exemple de posologie utilisable chez l'homme: cette posologie comprend, par exemple, l'administration au patient d'environ 500 mg/prise, par voie sous-cutanée, deux à trois fois par jour. Par voie intraveineuse, on administre environ 1000 mg/j, sachant que, par perfusion, les quantités injectées peuvent être de plusieurs dizaines de ml. Ces administra- tions sont effectuées de manière discontinue à interval- les réguliers, ou continues par perfusion. L'invention concerne encore les réactifs biologiques dont les principes actifs sont constitués par les compositions de fragments d'héparine telles que définies plus haut. Ces réactifs biologiques peuvent être utilisés comme références ou étalons dans des études comparatives dans différents systèmes physiologiques dans la régulation desquelles les GAGs sont impliqués. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent et en se référant aux figures 1 à 5, - les figures 1 et 3 d'une part et 2 et 4 d'autre part, représentant les courbes HPLC respectivement d'un mélange de dépolymérisation réduit et d'une composition selon l'invention, 1 - la figure 5, le spectre RMN du 13C d'une composition selon l'invention. / EXEMPLE 1: Procédé d'obtention d'une composition de fragments d'héparine. 1/ - CouDure des chaînes d'héDarine à l'aide d'acide periodiaue g d'héparine injectable de mucus de porc, sous forme de sel de sodium, titrant 157 uI/mg dans le dosage Codex et 155 u/mg dans le dosage antifacteur Xa de Yin et al; sont mis en solution dans 250 ml d'eau déminéralisée à 4'C. Le pH de la solution est ajusté à ,0 par de l'acide chlorhydrique concentré. 10 g de métaperiodate de sodium (NaIO4, PM: 213, 89) en solution dans 250 ml d'eau déminéralisée à 4' C sont ajoutés sous agitation modérée. Le pH de l'ensemble est ajusté à 5,0 par de l'acide chlorhydrique concentré. La solution est abandonnée 24 heures, à l'obscurité, en chambre froide à + 4C. 2/ - Elimination du Deriodate residuel On répartit ensuite la solution réactionnelle R dans 3 boyaux de dialyse NOJAX 40 R, (porosité de 3 à 4000 Da) et on la soumet à une dialyse 15 heures contre de l'eau déminéralisée courante. 3/ - DéDolvmérisation en milieu basique Aux 780 ml de solution obtenue après dialyse, sont ajoutés 16 ml de soude 10 N, et l'ensemble est soumis à agitation 3 heures à température ambiante (de l'ordre de 18-21'C). 4/ - Rhéduction 500 mg de borohydrure de sodium (NaBH4, PM: 37,83) sont alors ajoutés et la solution est agitée de nouveau 4 heures à température ambiante. Son pH est ensuite amené à 4 à l'aide d'acide chlorhydrique concen- tré. Après 15 minutes d'agitation, le pH est ajusté à 7 à l'aide de soude concentrée. Aux 820 ml de solution ainsi obtenue sont ajoutés 16,4 g de NaCl puis 1270 ml d'éthanol. L'ensemble est laissé au repos 3 heures, puis centrifugé à 2500 t/minute pendant 20 minutes. Le précipité est recueilli, remis en suspension dans 200 ml d'ethanol pur, broyé & l'Ultra-Turrax Ret finalement récupéré par filtration sur b chner fritté. Il est alors séché sous vide & 40*C pendant 5 heures. On récupère ainsi 8,9 g de produit intermé- diaire ayant les propriétés suivantes: - dosage Codex: 8 uI/mg - dosage APTT: 7 uI/mg - dosage Anti-Xa: 8 u/mg La répartition moléculaire de la composition est rapportée sur la figure 1 qui correspond à la courbe HPLC déterminée dans les conditions évoquées page 6. / - Fractionnement alcoolique Ces 8,9 grammes sont dissous dans environ 120ml d'eau déminéralisée à température ambiante. On ajoute 1,78 grammes de NaCl et le pH de la solution est abaissé à 3,5 & l'aide d'acide chlorhydrique. Le volume de la solution est ajusté à 178 ml à l'aide d'eau déminéra- lisée. 151 ml d'éthanol pur sont ajoutés sous agitation. L'agitation est maintenue 15 minutes après la fin de l'addition puis l'ensemble est laissé au repos 10 heures, à température ambiante. Le précipité formé est recueilli par centrifu- gation 20 minutes & 2500 t/min. Il est remis en suspen- sion dans 150 ml d'éthanol pur, broyé à l'Ultra-Turrax, récupéré par filtration sur buchner fritté, lavé par 300 ml d'éthanol pur et finalement séché sous vide à 40C pendant 24 heures. On récupère ainsi 5,0 g sous forme de poudre blanche 5,0 g du produit IC 1772 ayant les caracté- ristiques suivantes: - titre Codex: 11 uI/mg - titre APTT: 9 uI/mg - titre Anti-Xa: 12 u/mg La distribution moléculaire de la composition obtenue apparaút à l'examen de la figure 2 qui correspond à la courbe HPLC, déterminée dans les conditions çi- dessus. Analyse en RMN du '- Le spectre RMN pour le carbone 13 est représen- té sur la figure 5. Ce spectre a été réalisé sur une so- lution, du composé dissous dans de l'oxyde de deutérium, à 25MHz, à 35 C. Les déplacements chimiques sont mesurés par rapport au méthanol (51,6ppm). L'examen de ce spectre montre qu'il présente les signaux caractéristiques d'un enchainement de disaccharides du type acide 2-O-sulfo-a-L-iduronique (1->4) 6-0-silfo-N-sulfo-a-D-glucosamine (1->4). On constate en particulier la présence des segments des carbones anomères, à 101,7 ppm (acide 2-0- sulfo-a-L-iduronique) alors que les signaux caractéris- tiques des acides D-glucuronique et L-iduronique (104,5 2O ppm) non sulfatés ne sont pas présents, contrairement au spectre d'une préparation d'héparine dans laquelle ils peuvent représenter jusqu'à 30 à 40% du total des signaux des acides uroniques. Dans la région des C-2 de glucosamine, seul le signal à 60,5 ppm (C-2 de la N-sulfo-glucosamine) est présent. Le signal caractéristique de la N-acétyl-gluco- samine (56,4 ppm) est à peine décelable alors qu'il figure dans l'héparine de départ. * Dans la région des C-6 de glucosamine (62,5 pour C-6-OH et 69 pour C-6-OS) . On constate la présence des deux signaux des espèces non sulfatée et sulfatée. Il est important de noter que le rapport d'in- tensité des signaux à 99,4 ppm et 101,7 ppm est égal à 1 ce qui confirme la seule présence d'acide 2-O-sulfo-L- iduronique. On décèle la présence de quelques résidus de N-acétylglucosamine. De même, le signal du NHAc (24,6 ppm) apparaît. Analyse conductimétrique: Le degré de sulfatation déterminé par conduc- timétrie est de 2,3. Le nombre de charges par unité disa- ccharidique est de 3,3. EXEMPLE 2 1/ - 200 g d'héparine injectable, sel de sodium, titrant 154 uI/mg dans le dosage Codex et 158 u/mg dans le dosage anti-facteur Xa sont mis en solution dans 5 litres d'eau déminéralisée, à + 4'C. -15 Le pH de la solution est ajusté à 5,0 par HCl concentré. On ajoute alors sous agitation modérée: g de metaperiodate de sodium en solution dans 5 litres d'eau déminéralisée à + 4C. Le pH de l'ensemble est de nouveau ajusté à 5,0 par HCl concentré. La solution obtenue est laissée 24 heures à l'obscurité, en chambre froide + 4'C, sous agitation modérée. 2/ - Elle est ensuite répartie dans 50 boyaux de dialyse et dialysée 14 heures contre de l'eau déminéralisée courante, à température ambiante. 3/ - A l'issue de cette dialyse, on récupère 14,5 litres de solution à laquelle on ajoute 116 g de soude pure en pastilles. On agite la solution ainsi obtenue 3 heures à température ambiante. 4/ - 10 g de borohydrure de sodium sont ensuite ajoutés et l'agitation est poursuivie pendant 4 heures. Le pH de la solution est abaissé à 4à l'aide d'HCl concentré, pendant 15 minutes, puis il est de nouveau réajusté à 7 par de la soude concentrée; Le volume de la solution ainsi obtenue est de ,2 litres. On ajoute alors 304 grammes de NaCl puis 22,8 litres d'éthanol. L'ensemble est laissé au repos 48 heures à température ambiante. Lesurnageant limpide est siphonné, le précipité est recueilli, remis en suspension dans 3 litres d'éthanol pur, broyé à l'Ultra-Turrax, et récupéré par filtration sur verre fritté. Il est finalement séché sous vide à 40'C pen- dant 15 heures. On récupère 181 grammes de fragments d'héparine ayant les caractéristiques suivantes: - dosage Codex: 10 uI/mg - dosage APTT 9 uI/mg - dosage Anti-Xa: 9 u/mg -répartition moléculaire: voir figure 3. / - Ces 181 grammes sont dissous dans environ 3 litres d'eau déminéralisée, à température ambiante. On ajoute 36,2 grammes de NaCl et le pH de la solution est ajusté à 3,5 par HCl concentré. Le volume de la solution est ajusté à 3,62 litres à l'aide d'eau déminéralisée. On ajoute sous agitation modérée 3,077 litres d'ethanol pur. L'agitation est maintenue 15 minutes après la fin de l'addition et l'ensemble est laissé au repos 10 heures à température ambiante. Le précipité formé est recueilli par centrifu- gation 20 minutes à 2500 t/min. Il est remis en suspen- sion dans 2 litres d'éthanol pur, broyé à l'Ultra- Turrax, récupéré par filtration sur fritté, lavé par 3 litres d'éthanol pur et finalement séché sous vide, à 'C, pendant 24 heures. On obtient finalement 104 grammes de poudre blanche ayant les caractéristiques suivantes: - titre Codex: 13 uI/mg - titre APTT: 10 uI/mg - titre Anti-Xa: 13 u/mg répartition moléculaire: voir figure 4. EFFET ANTICOAGULANT DE IC 1772 EN PLASMA HUMAIN On rapporte, ci-après, les résultats obtenus concernant: 1. les activités anti-IIa et anti-Xa, in vitro, dans différents systèmes. 2. les temps de coagulation par la thrombine (TCT). 1/ - Activités anti-IIa et anti-Xa. in vitro Hêparine IC 1772. Hprn ESSAI IC 1772. Standard u /mg u /mg TCK1 i0 160 USp2 13 - 15 160 Activité antiIIa3 16 160 Activité anti-IIa (sur substrat chromogène 36 160 S.2238 en système purifié) Activité anti-IIa (sur substrat chromogène S 2238 en système plasmatique) Activité anti-Xa4 (Yin et Wessler) 12 - 15 160 Activité antl-Xa (sur substrat chromogène S 2222 en système purifié) 2 - 3 160 Activité antl-Xa (sur substrat chromogéne S 2222 en système plasmatique) 5 - 10 160 Les références des systèmes utilisés pour effectuer les mesures sont les suivantes: 1/ R.R. Proctor et S. Rapaport Ann. J. Clin. Pathol., 1961, 36, 212-219, 2/ XXIème Pharmacopée américaine 3/ Mesurée par l'allongement du temps de thrombine 4/ E.T. Yin, S. Wessler, J.V. Butler, J. Lab. Clin. Med., 1973, 81, 298-310. 2/ -TCT: On rapporte dans le tableau 1 ci-après, les résultats sous forme de temps de coagulation exprimé en secondes, de 3 essais effectués avec les 3 types de plas- mas utilisés pour étudier l'activité APTT. Le contrôle est effectué en milieu plasmatique normal. Les résultats correspondent à la moyenne de deux essais indépendants. TABLEAU 1 pg/ml Plasma normal Plasmas déplétés en ATIII HC II ATIII et HCII 0 22 20 20 20 2,5 36 26 24 22 110 51 27 22 > 300 > 300 40 22 On constate aux doses de 5 et surtout 10 ug/ml un allongement du temps de thrombine qui semble dépendre de HCII. - INHIBITION DE LA PROLIFERATION DES CELLULES MUSCULAIRES LISSES (CML) IN VITRO. Modèle expérimental: Les cellules musculaires lisses (CML) pro- viennent d'un segment abdominal de l'aorte de rat Sprague Dawley. De petits morceaux de media sont mis en culture en milieu RPMI-1640 additionné de 20% de sérum de veau foetal (SVF). Au bout de 1 & 2 semaines, les CML migrent hors des tissus et commencent à proliférer. -8.103 CML sont mises en culture dans des plaques multi-puits. Après 24 heures, on arrête leur croissance par un lavage suivi de l'addition de milieu RPMI + 2% de plasma déplaquetté (ou RPMI + 0,4% de SVF) pendant 72 heures. Les cellules sont alors replacées pendant 5 à 7 jours en milieu RPMI additionné de 20% de SVF avec ou sans le composé à tester, ce dernier & différentes concentrations. La croissance nette des CML, dans les essais témoins ou additionnés des produits à tester, est obtenue en soustrayant le nombre de cellules au départ du nombre de cellules à la fin de l'expérience (mesure en duplicate par compteur Coulter). Le % d'inhibition est donné par la formule suivante: 1 d'inhibition... croissance nette des cellules testées d'inhibition 1 -X 100 15. croissance nette des cellules témoinsJ (voir Castellot et al., J. Cell. Biol., 102, 1986, 1979-1984). Les résultats obtenus selon la concentration de IC 1772 en culture sont les suivants (à titre comparatif, on rapporte les valeurs d'inhibition obtenues avec l'héparine). Ouantité de Droduit inhibition IC 1772 Héparine 1'pg/ml culture 25% 20% pg/ml " 45% 60% pg/ml " 70% 80% On constate une activité dans ce modèle expéri- mental très proche de celle de l'héparine standard. - INHIBITION DE LA PROLIFERATION DES CELLULES MUSCULAIRES LISSES (CML) IN VIVO: MODELE DU CATHETER BALLON. Modèle expérimental: L'expérience est menée sur des rats mâles Sprague Dawley âgés de 5 mois et pesant environ 500 g. Les animaux sont anesthésiés et l'endothélium de l'artère carotide gauche est dénudé par le passage intraluminal d'un cathéter ballon à embolectomie introduit dans la branche externe de la carotide. Le produit à tester ou une solution témoin stérile est administré en infusion continue dans de la solution lactosée de Ringer dans la veine jugulaire gauche (utilisation d'une pompe osmotique à infusion (Alzet) placée sur le dos de l'animal). Le traitement est poursuivi pendant 4 semaines à raison de 2,5 ul/heure. La dose administrée a été de 1 mg/kg/heure. Après 28 jours les animaux sont anesthésiés et les artères carotides prélevées. A 17, 9 et 1 heure avant l'anesthésie, les animaux reçoivent une injection intra- péritonéale de thymidine tritiée. Les résultats sont exprimés par le contenu en DNA dans les carotides droite (CD) lésées et gauche (CG) non lésées selon le mode de calcul suivant: DNA* animaux traités Inhibition) = --X 100 - DNA animaux controle DNACG- DNACD DNA* C DNACD (voir A.W. Clowes et M.M. Clowes, Labor. Investig., 1985, 52 (6), 612-616). Résultats 2 6 1 4 0 2 6 Dans un premier essai portant sur 10 animaux, on constate avec le produit testé IC 1772 une inhibition proche de celle de l'héparine d'environ 50%. INHIBITION DU SYSTEME D COMPLEMENT L'héparine inhibe la génération de la C3 con- vertase amplificatrice alterne du complément, en inhibant la formation du complexe bimoléculaire entre les protéines C3b et B. L'effet de l'héparine et du produit IC 1772 sur la liaison C3b-B a été étudié en utilisant des protéines B marquées à 125I (125 I-B) et des érythrocytes de moutons porteurs de protéine C3b (ESC3b). On appelle IC50 la concentration d'héparine ou de l'oligosaccharide testé nécessaire pour inhiber 50% de la formation du complexe C3b-B. Cette mesure -est faite in vitro, dans un système de protéines purifiées. Système expérimental On incube des EsC3b (0,75-2,5 x 107) dans 125 différentes concentrations de 125I-B dans un tampon véronal contenant 0, 1% de gélatine et 5mM Mg2+ pendant 30 mn à 30' C. Des échantillons de 70 ul, en double pour chaque réaction, sont déposés sur 300 ul d'un mélange de dibutylphtalate (Merck-Clevenot, France) et dinonylph- talate (Coger, Paris) (7:3 v/v) dans des tubes de poly- propylène de 0,5 ml. Les tubes sont centrifugés pendant une minute à 8000 g dans un microfuge Beckman (Beckman, Paris), puis coupés juste au-dessus des précipités. La radioactivité du ligand lié est comptée. Le produit IC 1772 a été dosé comparativement à l'héparine. Les résultats exprimés en IC 50 sont les suivants IC 1772: 0,4 pg/ml Héparine standard: 0,5 pg/ml - Temps de saianement: Le produit est administré chez le lapin par voie intraveineuse & la dose de 5 mg/kg, 15 minutes et une heure avant l'expérience. Le modèle expérimental est celui de Cade, tel que décrit par Cade et al dans Thromb. Res. 35, 613-625, 1986. Les essais effectués montrent que le produit n'entraîne aucune augmentation du temps de saignement & la dose de 5 mg/kg par voie intraveineuse. / / / / REVENDICATIONS 1. Composition d'héparines de bas poids moléculaire, pratiquement totalement dépourvue d'activité anticoagulante, caractérisée en ce qu'elle est essentiel- lement formée de fragments dépourvus des acides uroniques non sulfatés caractéristiques du site de liaison à l'AT III, avec un enchaînement de motifs 2-0-sulfo-acide L- iduronique et D-glucosamine répondant à la formule générale suivante OR3 0R 0 R COQ- H O1 o R S03 NHR2 Jn OR3 0 dans laquelle R - R représente un atome d'hydrogène ORP ou un motif: R0 2HR2 _- R représente un atome d'hydrogène ou un groupe -SO 3 - R2 représente un groupe -SO 3 ou -CO-CH3 la proportion de groupes -S03 étant d'environ au moins 90%, - R3 représente un groupe -S03 ou un atome d'hydrogène, la proportion de groupes -S03 étant d'environ au moins 70%, R4 représente un atome à l'hydrogène ou un résidu d'acide uronique, - R' représente soit un atome d'hydrogène, soit un motif acide uronique naturel,soit un résidu d'acide uronique modifié au cours de l'oxydation periodique et dont les fonctions aldéhy- des ont été réduites en alcools, avec 7 ( n ( 15, ce qui correspond à des chaines de PM de 4800 à 9000 environ, et ses sels pharmaceu- tiquement acceptables. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle présente en moyenne 3,3 charges par unités disaccharidiques. 3. Composition selon l'une quelconque des revendications I ou 2, caractérisée en ce qu'elle présente, en HPLC déterminée avec une colonne TSK 2000 SW en utilisant Na2S04 0,5M comme solvant, avec un débit de 1 ml/min: - un poids moléculaire moyen de l'ordre de 6000-7000 Da,70% des espèces étant comprises entre 4800 et 9000 daltons,et 90% entre 3600 et 11000 Da, - un poids moléculaire au sommet du pic de l'ordre de 6000 à 6500 Da, - moins de 5% de chaînes inférieures à des dodécasac- charides, - moins de 5% de chaines au-delà de 11.000 4. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le spectre RMN est conforme à celui de la figure 5. 5. Composition formée de fragments d'héparine tels qu'obtenus par fractionnement, à l'aide d'alcool en présence d'un sel minéral, d'un mélange résultant de la dépolymérisation de l'héparine par action d'une base forte sur des chaînes d'héparine soumises au préalable à l'action de periodate, suivie d'une réduction des groupements aldehyde formés lors de l'oxydation perio- dique. 6. Composition selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 5, caractérisée en ce que les fragments qu'elle renferme se présentent sous la forme de sels de sodium, de potassium, de calcium ou de magnesium. 7. Procédé de préparation de compositions d'héparines de bas PM telles que définies dans la reven- dication 1, caractérisé en ce que: a) on traite une solution aqueuse d'héparine à une concentration finale de 0,5 & 4% (p/v) avec de l'acide périodique à une concentration finale de 0,5 à 4% (p/v) & un pH de 4,5 à 6,5 à une température de O à 10' C; b) on' traite les chaines d'héparine ainsi obtenues avec une base forte & une molarité finale en base de 0,1 à 0,3 N; c) on traite les fragments de dépolymérisation ainsi obtenus avec un agent réducteur; d) après élimination éventuelle de l'agent réducteur en excès, on précipite les fragments réduits après addition d'un sel minéral à l'aide d'un solvant alcoolique. e) on traite une solution aqueuse du précipité ainsi obtenu additionné d'un sel minéral, par de l'alcool. f) on récupère le produit précipité ainsi formé et on transforme éventuellement le sel correspondant à la base forte utilisée dans un autre sel pharmaceutiquement acceptable. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend en combinaison les étapes suivantes: - l'oxydation ménagée de l'héparine réalisée en faisant réagir de l'héparine, en solution aqueuse à une concen- tration finale de 0,5 à 4% (p/v) avec un sel de l'acide periodique à une concentration finale de 0,5 à 4% (p/v) à un pH situé entre 4t 5 et 6,5, à une température de O à C, durant environ 15 à 48 h. à l'abri de la lumière, - la dépolymérisation des chaines d'héparine obtenues, par addition d'une base forte, telle que la soude, selon une quantité conduisant à une molarité finale en base de 0,1 à 0,3 N environ, - la réduction des fragments de dépolymérisation à l'aide d'un agent réducteur et, après élimination, le cas échéant, de l'agent réducteur n'ayant pas réagi, - la récupération des fragments d'héparine réduits par précipitation à l'aide d'un milieu solvant dans lequel ils sont insolubles, - l'isolement des fragments recherchés par fractionnement à l'aide d'alcool, en présence d'un sel minéral, d'une solution aqueuse obtenue en remettant en solution dans l'eau le précipité précédemment isolé et en récupérant le précipité formé. 9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que dans l'étape d'oxydation periodi- que, on utilise l'héparine et le sel de l'acide perio- dique selon des quantités conduisant à des concentrations finales respectives de 2% (p/v). 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce qu'on réalise 2 l'étape d'oxydation periodique à pH 5, à 4' C. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que le sel de l'acide periodique est du metaperiodate de sodium. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, caractérisé en ce que pour éliminer le periodate résiduel on effectue une dialyse avec des boyaux de dialyse ayant une porosité de 3 & 4000 Da, pendant environ 15 h. 13. Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 7 à 12, caractérisé en ce que la récupération des fragments d'héparine réduits est réalisée en ajus- tant le pH & 7, puis après addition d'un sel minéral tel que du NaCl, en ajoutant 1 à 1,5 volume d'un solvant tel que l'éthanol. 14. Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 7 à 13, caractérisé en ce qu'on dissout, à raison de 5% (p/v), les fragments précipités réduits d'héparine dans de l'eau additionnée d'un sel minéral, afin d'avoir une concentration finale de 1%, le pH de cette solution ayant été ajusté à 3,5, et qu'on ajoute 0,85 volume d'un solvant alcoolique tel que l'éthanol. 15. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle renferme une quantité efficace d'une compo- sition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, en association avec un véhicule pharmaceutique. 16. Composition pharmaceutique selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme d'une solution concentrée, injectable, stérile, contenant de 10 à 150 mg/ml environ, lorsqu'elle 1- 5 est destinée à l'injection sous-cutanée, ou de 10 à 100 mg/ml environ, lorsqu'elle est destinée à l'injection intraveineuse ou à la perfusion. 17. Réactif biologique constitué par une composition selon l'une quelconque des revendications I à 6 6.