FR 2621821 A1 19890421 FR 8811256 A 19880826 Produits biologiques, procédés pour leur préparation et pour leur utilisation en thérapeutique La présente invention concerne des inhibiteurs de l'in- terleukine-1 (abréviation anglaise IL-1 INH), qui inhibent sélectivement l'activité de l'interleukine-1. L'invention concerne également des procédés pour la purification de tels inhibiteurs d'IL-1 à partir d'urine, et pour la production de ces inhibiteurs d'IL-1 par des hôtes transformés par des molécules d'ADN recombinant qui comprennent des séquences d'ADN codant pour les inhibiteurs, ainsi que des compositions et des procédés de traitement caractérisés par la présence de tels inhibiteurs d'IL-1. Ces procédés et ces agents sont utiles dans des applications et thérapeutiques immuno- suppressives et anti-inflammatoires. L'interleukine 1 (IL-1) est une cytokine protéique pro- duite principalement par les cellules de la lignée des macro- phages/monocytes. Il existe deux gènes IL-1 distincts qui sont capables de coder pour les polypeptides IL-1: IL-la et IL-1" [P. Auron et coll., "Nucleotide Sequence of Human Monocyte Interleukin-1 Precursor cDNA" (Séquence nucléoti- dique de l'ADNc précurseur de l'interleukine-1 de monocytes humains), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, p. 7907 (1984); C. March et coll., "Cloning, Sequences and Expresssion of Two Distinct Human Interleukine 1 Complementary DNA's a and e" (Clonage, séquences et expression de deux ADN complémentaires - 2 - distincts, a et C, de l'interleukine-1 humaine), Nature, 315, p. 641 (1985)]. Des études de leurs activités biologiques respectives, au moyen d'IL-la et 3 recombinants, ont indiqué jusqu'à présent que les deux formes d'IL-1 ont en commun de multiples activités biologiques. L'IL-1 a plusieurs activités biologiques distinctes. L'une de ces activités - l'activité de facteur d'activation lymphocytaire (LAF: initiales du terme anglais "Lymphocyte- Activating Factor") - fait de l'IL-1 un médiateur de la réponse immunitaire et, en tant que tel, l'IL-1 stimule la maturation, la différenciation et la croissance de nombreux types cellulaires, tels que les lymphocytes B et T immatures (P. Auron et coll., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, voir plus haut). Une autre des activités de l'IL-1 - '1 activité de facteur cellulaire mononucléaire (MCF: initiales du terme anglais "Mononuclear Cell Factor") - fait que l'IL-1 joue un r6ôle clef dans la régulation de diverses réponses inflamma- toires [C. Dinarello, "An Update of Human Interleukin-1" (Une mise à jour des connaissances sur l'interleukine-1 humaine), J. Clin. Immun., 5, p. 287 (1985)], et en tant que telle l'IL-1 stimule plusieurs types de cellules, par exemple les fibroblastes et les chondrocytes, pour la production, respec- tivement, de prostaglandine E2 (PGE2) et de collagénase. Ces réponses interviennent dans la pathogénèse de maladies arti- culaires, telles que la polyarthrite rhumatoide, ou d'affec- tions associées à la destruction de tissus [J. Dayer, NCyto- kines and Other Mediators in Rheumatoid Arthritis" (Cytokines et autres médiateurs dans la polyarthrite rhumatolde), Springer Semin. Immunopath., 7, p. 387 (1984)]. En outre, l'IL-1 est reconnue induire la production de l'IL-2 [J.W. Lowenthal et coll., "IL-1 Dependant Induction of Both IL-2 Secretion and IL-2 Receptor Expression By Thymona cells" (Induction IL-1dépendante de la secrétion d'IL-2 et de l'expression du récepteur d'IL-2 par des cellules de thy- mome), J. Imm., 137, p. 1226-1231 (1986)], qui intervient 26Z1821 - 3 - dans la prolifération des cellules T. Enfin, on sait égale- ment que l'IL-1 incite des molécules, présentes sur les cel- lules endothéliales, à piéger des globules blancs [J. Oppenheim et coll., "There is More Than One Interleu- kin-1" (Il y a plus d'une interleukine-1", Immun. Today, 7, p. 45 (1986)]. Il était par conséquent intéressant d'identifier et d'isoler un inhibiteur de l'IL-1 qui supprime la proliféra- tion de cellules B et cellules T spécifiques d'antigènes et qui inhibe la synthèse de la prostaglandine et de la colla- génase par les fibrobastes. Un tel composé serait utile pour le traitement de troubles impliquant des réponses immuni- taires et inflammatoires. En outre, il était souhaitable d'isoler un inhibiteur de l'IL-1 capable de supprimer la pro- duction de l'IL-2 sous médiation par l'IL-1. Il était en outre intéressant d'identifier un composé qui inhibe sélecti- vement les activités de l'IL-1 sans inhiber en même temps d'autres protéines, par exemple des facteurs produisant la nécrose de tumeurs, tels que le TNFa (initiales du terme anglais "Tumor Necrosis Factor"), qui ont plusieurs activités biologiques en commun avec l'IL-1, à savoir la production de PGE2 et de collagénase par les fibroblastes dermiques humains [J. Dayer et coll., "Cachectine/Tumor Necrosis Factor Stimulates Collagenase and Prostaglandin E2 Production by Human Synovial Cells and Dermal Fibroblasts" (Le facteur nécrosant de tumeurs/la cachectine stimule la production de la collagénase et de la prostagnaldine E2 par les cellules synoviales humaines et les fibroblastes dermiques humains), J. Exp. Med., 162, p. 2163 (1985)] ou l'induction de la prolifération des fibroblastes [P. Seckinger er coll., "A Urine Inhibitor of Interleukin-1 Activity Affects Both Interleukin-1 a and 0 But Not Tumor Necrosis Factor a" (Un inhibiteur urinaire de l'activité de l'interleukine-1 affecte à la fois l'interleukine la et l'interleukine 10, mais n'affecte pas le facteur a nécrosant de tumeurs), J. Immun., 139, p. 1541 (1987)]. - 4 - A l'heure actuelle, les composés décrits comme manifes- tant des effets inhibiteurs sur l'IL-1, tels que les prosta- glandines, agissent essentiellement comme des inhibiteurs non sélectifs. Il a été également rapporté que l'urine de patients fébriles contient un inhibiteur sélectif de l'IL-1, ayant un P.M. de 20 000 à 30 000 [Z. Liao et coll., "Identi- fication of a Specific Interleukin-1 Inhibitor in the Urine of Febrile Patients" (Identification d'un inhibiteur spéci- fique de l'interleukine-1 dans l'urine de patients fébriles), J. Exp. Med. , 159, p. 126 (1984)]. Liao et coll. ne suggèrent pas que ce composé se trouve sous une autre forme qu'à l'état très brut, ni qu'il inhibe l'activité de MCF de l'IL-1, inhibe la fixation de l'IL-1 à des récepteurs cellulaires cibles ou inhibe la prolifération de fibroblastes en présence d'IL-1. Un second composé donné comme ayant des effets inhi- biteurs de l'IL-1 [W. Arend en coll., "Effects of Immune Complexes on Production by Human Monocytes of Interleukin or an Interleukin-1 Inhibitor" (Effets de complexes immuns sur la production d'interleukine ou d'un inhibiteur de l'inter- leukine-1 par les monocytes humains), J. Immun., 134, p. 3868 (1985)] est produit par des monocytes humains cultivés sur des complexes immuns adhérents. Toutefois, le rapport d'Arend est ambigu en ce qui concerne la question de savoir si le composé inhibe à la fois l'activité de LAF et l'activité de MCF de l'IL-1 (voir page 3874). En tous cas, l'article d'Arend n'indique pas que le composé soit pratiquement pur ni qu'il inhibe la fixation de l'IL-1 à des récepteurs cellu- laires cibles ou inhibe la prolifération de fibroblastes en présence d'IL1. Un troisième composé, donné comme ayant des effets inhibiteurs de l'IL1 [J.-F. Balavoine et coll., "Prostaglandin E2 and Collagenase Production by Fibroblasts and Synovial Cells Is Regulated by Urine-Derived Human Inter- leukin-1 and Inhibitor(s)" (La production de prostaglandine E2 et de collagénase par les fibroblastes et les cellules synoviales est contr8ôlée par l'interleukine-1 humaine prove - 5 - nant de l'urine et par son ou ses inhibiteur(s), J. Clin. Invest., 78, p. 1120 (1986)], est considéré comme étant sous forme très brute, et son mode d'action n'est pas décrit. La présente invention résout les problèmes indiqués plus haut, en fournissant des inhibiteurs d'IL-1 (abréviation anglaise: "IL-1 INH") qui inhibent sélectivement les activi- tés de LAF de l'IL-1 et de MCF de l'IL-1, inhibent la produ- tion de l'IL-2 sous médiation de l'IL-1, inhibent la prolifé- ration de fibroblastes sous médiation de l'IL-1 et se fixent aux récepteurs de l'IL-1 sur des cellules cibles, inhibiteurs destinés à être utilisés dans des compositions, des méthodes et des thérapeutiques immuno-suppressives ou anti- inflammatoires. Les inhibiteurs d'IL-1 selon la présente invention n'inhibent pas la production de PGE2 et de collagé- nase sous médiation par le TNFa dans les cellules cibles. Les inhibiteurs d'IL-1 de la présente invention sont par consé- quent utiles dans diverses compositions et divers procédés pour des applications immuno-suppressives et anti- inflammatoires. Les inhibiteurs d'IL-1 de la présente inven- tion sont caractérisés comme étant des polypeptides ayant un poids moléculaire d'environ 25 000, déterminé par électro- phorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) et un point isoélectrique de 4,7, tel que déterminé par chromatofocalisation. Un mode de réalisation d'un procédé de la présente invention pour la production de ces inhibiteurs d'IL-1 est la purification à partir de sources naturelles. Une telle puri- fication comprend les étapes de concentration d'urine brute de patients fébriles, de précipitation de l'inhibiteur d'IL-1 à partir de l'urine, et de séparation de l'inhibiteur d'IL-1 d'avec les autres protéines de ce précipité par fractionne- ment par une ou plusieurs techniques parmi la chromatographie d'échange ionique, la chromatographie hydrophobe, la filtra- tion sur gel et l'immunoabsorption. - 6 - Un second, et préféré, mode de réalisation d'un procédé de la présente invention pour la production de ces inhibi- teurs d'IL-1 est la production recombinante de ces inhibi- teurs. Dans ce procédé, on utilise des séquences d'ADN qui codent pour les inhibiteurs d'IL-1 de la présente invention, des molécules d'ADN recombinant caractérisées par ces séquences, et divers hôtes unicellulaires transformes par ces molécules et séquences d'ADN, pour produire les inhibiteurs d'IL-1 de la présente invention (avec ou sans résidu méthio- nine N-terminal supplémentaire), ou des fragments de ceux-ci, par fermentation des hôtes transformés. Il doit être entendu que le polypeptide IL-1 INH selon la présente invention, manifestant une activité d'inhibiteur d'IL-1, peut comprendre diverses autres substitutions, additions, ou délétions d'acides aminés à la séquence d'acides aminés de IL-1 INH. Un autre objet de la présente invention est l'utilisa- tion des inhibiteurs d'IL-1 de la présente invention pour déterminer les structures moléculaires et l'emplacement des sites IL-1 INH actifs et l'utilisation de cette information pour la construction de fragments et de peptides à utiliser en tant qu'inhibiteurs d'IL-1 dans les compositions et méthodes immuno-suppressives ou anti-inflammatoires de la présente invention. L'invention est illustrée à l'aide des dessins, sur lesquels la figure 1 représente le profil d'activité de l'inhi- biteur d'IL-1 urinaire obtenu après l'étape de chromatogra- phie sur QAE-Sepharose; la figure 2 représente le profil d'activité de l'inhi- biteur d'IL-1 urinaire obtenu après l'étape de chromatogra- phie sur DEAE-Sepharose; la figure 3 représente le profil d'activité de l'inhi- biteur d'IL-1 urinaire de la fraction obtenue par filtration sur gel AcA54; la figure 4 représente la réponse en fonction de la dose des fractions réunies d'inhibiteur d'IL-1 urinaire après -7 - chaque étape de purification, mesurée dans des dosages de l'IL-1/LAF et de la liaison IL-1/récepteur; la figure 5 montre l'activité de l'inhibiteur d'IL-1, mesurée dans le dosage de l'IL-1/LAF; la figure 6 montre l'activité de l'inhibiteur d'IL-1, mesurée dans le dosage de l'IL- 1/MCF; la figure 7 montre que l'inhibiteur d'IL-1 n'affecte pas la production de PGE2 induite par le facteur HrTNFa; la figure 8 montre l'activité de l'inhibiteur d'IL-1, mesurée par l'essai de prolifération de fibroblastes en pré- sence d'IL-1; la figure 9 montre l'activité spécifique de l'inhibi- teur d'IL-1 mesurée après chaque étape de purification, dans le dosage de la liaison IL-1/récepteur, le dosage du LAF, le dosage des cellules EL-4/CTLL et le dosage du MCF. Afin de permettre une meilleure compréhension de l'in- vention décrite ici, on en donne la description détaillée ci- apres. Dans la description, on utilise les expressions et abréviations suivantes: MCF - (initiales du terme anglais 'Mononuclear Cell Factor"): facteur de cellules mononucléaires. L'activité de MCF de l'IL-1 est définie comme son pouvoir de stimuler la production de prostaglandine E et de collagénase dans de nombreuses cellules cibles, telles que les fibrolastes ou les cellules synoviales. LAF - (initiales du terme anglais "Lymphocyte- Activating Factor): facteur d'activation lymphocytaire. L'activité de LAF de l'IL-1 se définit comme son aptitude à stimuler la prolifération et la différenciation des lympho- cytes B et T. CTLL - (initiales du terme anglais "Cytotoxic T-lympho- cyte Cell Line): lignée cellulaire des lymphocytes T cyto- toxiques. Des cellules de la CTLL sont mises à incuber avec des cellules EL-4, et utilisées pour doser l'effet stimula- -8 - teur de l'IL-1 sur la production d'IL-2 par les cellules EL-4; l'IL2 stimule ensuite la prolifération des cellules de la CTLL, laquelle est mesurable. La présente invention concerne des inhibiteurs d'IL-1 pratiquement purs. Tels que définis par la présente inven- tion, les inhibiteurs d'IL-1 "pratiquement purs" sont prati- quement exempts de contaminants majeurs, en particulier d'apolipoprotéine A1 et d'a2-microglobuline [ou protéine fixant le rétinol ("retinol binding protein")], et migre sous iO forme d'une bande unique dans l'électrophorèse SDS-PAGE. Les inhibiteurs d'IL-1 de la présente invention inhibent sélectivement les activités de LAF de l'IL-1 et MCF de l'IL-1, inhibent la production d'IL-2, sous médiation de l'IL-1, par les cellules EL-4, inhibent la prolifération des fibroblastes induite par l'IL-1, et se fixent aux récepteurs de l'IL-1 sur les cellules cibles. De tels inhibiteurs sélec- tifs sont définis comme ayant le pouvoir d'inhiber l'activité sous médiation de l'IL-1, tout en étant dépourvus du pouvoir d'inhiber d'autres composés ayant certaines activités sem- blables à celles de l'IL-1, tels que le facteur TNFa humain recombinant (initiales anglaises: "hrTNFa") qui est un média- teur de la production de la PGE2 et de la collagénase. Cette spécificité est un facteur important pour inhiber sélective- ment IL-1 sans interférer avec l'activité nécessaire d'autres médiateurs du système immunitaire. Les auteurs de la présente invention ont démontré cette spécificité des présents inhibi- teurs d'IL-1 en comparant l'effet des inhibiteurs d'IL-1 de la présente invention, sur l'activité de l'IL-1, & celle du facteur hrTNFa, au moyen des dosages de l'activité de MCF de l'IL-1 et de l'essai de prolifération des fibroblastes. De préférence, les inhibiteurs d'IL-1 de la présente invention ont un poids moléculaire d'environ 25 000, tel que déterminé par électrophorèse SDS-PAGE, et un point isoélec- trique de 4,7, tel que déterminé pat chromatofocalisation. - 9 - Les inhibiteurs d'IL-1 de la présente invention sont capables d'inhiber une réponse produite sous médiation de l'IL-1 dans un dosage du LAF, dans un dosage du MCF, dans un dosage des lymphocytes T cytotoxiques/EL-4 ("EL4/CTLL") et dans un essai de prolifération des fibroblastes. Dans le dosage du LAF/IL-1, on mesure l'inhibition de la proliféra- tion des cellules T induite par l'IL-la ou i, par détection d'une diminution du taux d'incorporation de [3H]-thymidine en présence de diverses dilutions d'un inhibiteur d'IL-1 de la présente invention. Dans le dosage du MCF/IL-1, on mesure l'inhibition de la production de PGE2 sous médiation de l'IL-1, à l'aide d'un radioimmunodosage à double anticorps, en utilisant de l'antisérum contre PGE2 en présence de diverses dilutions d'un inhibiteur d'IL-1 de la présente invention. La diminution de la quantité de PGE2 dans le milieu, décelée par un radioimmunodosage, indique l'activité de l'inhibiteur d'IL-1. Dans le dosage EL-4/CTLL, on mesure l'inhibition de la production d'IL-2, sous médiation d'IL-1, en présence de diverses dilutions d'un inhibiteur d'IL- 1 de 2D la présente invention. L'inhibition s'exprime par une diminu- tion du taux de fixation de [3H]-thymidine ([3H]-TdR) qui est utilisé comme mesure de la prolifération des cellules de la CTLL. La prolifération n'a lieu qu'en présence d'IL-1, qui induit la production d'IL-2 en fonction de la dose. Dans l'essai de prolifération des fibroblastes, on mesure l'inhi- bition de la fixation de [3H]-TdR par des fibroblastes stimu- mulés par l'IL-1, en présence de diverses dilutions d'un inhibiteur d'IL-1 de la présente invention. Comme indiqué plus haut, les inhibiteurs d'IL-1 de la présente invention se fixent spécifiquement aux récepteurs de l'IL-1 sur les cellules cibles. On a démontré cette fixation à l'aide d'une série d'essais de fixation d'IL-1. On a d'abord mesuré l'effet de concentrations croissantes d'inhi- biteur d'IL-1 sur la fixation d'IL-1 marquée à des récepteurs sur des cellules cibles. On a constaté que des concentrations - 1O - plus élevées d'inhibiteur d'IL-1 réduisaient la quantité d'IL-1 marquée qui était fixée. Ensuite, on a ajouté un excès d'inhibiteur d'IL-1 non marqué et on a examiné l'effet de cet excès sur l'IL-1 marquée qui était fixée à une cellule cible. Cet essai à montré qu'un inhibiteur d'IL-1 en excès entrait avec succès en compétition avec l'IL-1 marquée qui était fixée à la surface des cellules cibles, et la remplaçait. On a ajouté encore un excès d'a2- microglobuline (protéine fixant le rétinol), et on a constaté que celui- ci n'empêchait pas la fixation de l'inhibiteur d'IL-1 aux cellules cibles. Cet essai à montré que les présents inhibiteurs d'IL-1 entrent spécifiquement en compétition avec l'IL-1 pour se fixer aux récepteurs d'IL-1 sur les cellules cibles. L'invention concerne également un procédé de purifica- tion pour l'isolement d'un inhibiteur d'IL-1 de la présente invention à partir de sources naturelles, par exemple de patients hautement fébriles ou de patients atteints du SIDA et souffrant d'infections opportunistes. Ce procédé comprend plusieurs étapes. Dans les grandes lignes, ces étapes sont (1) concentration de l'urine; (2) précipitation d'inibiteur d'IL-1 brut à partir de l'urine concentrée, et séparation de l'inhibiteur d'IL-1 d'avec les autres protéines de ce préci- pité, par fractionnement à l'aide d'au moins une technique parmi la chromatographie d'échange ionique, la chromatogra- phie hydrophobe, la filtration sur gel et l'immunoabsorption. Dans le mode de réalisation préféré de ce procédé, on concentre d'abord de l'urine brute provenant de patients fébriles, au moyen de techniques courantes, ultrafiltration par exemple. A partir du concentré d'urines réunies, on pré- cipite ensuite à l'aide de sulfate d'ammonium une fraction brute contenant l'inhibiteur d'IL-1. Après avoir éliminé par dialyse le sulfate d'ammonium, on sépare d'avec les autres protéines les fractions contenant l'activité inhibitrice d'IL-1, au moyen de chromatographie d'échange ionique. En particulier, dans le mode de réalisation préféré, on utilise - 11 - deux échangeurs d'anions - une colonne garnie de diéthyl-(2- hydroxypropyl)aminoéthyl-Sepharose [colonne de (QAE)- Sepharose] et une colonne garnie de diéthylaminoéthyl- Sepharose [colonne de (DEAE)-Sepharose], indépendamment ou en combinaison, la colonne de DEAE-Sepharose faisant de préfé- rence suite à la colonne de QAE-Sepharose. Pour contrôler l'activité des diverses fractions, on fait appel à des dosages du LAF et de fixation à des récepteurs. Dans ce mode de réalisation de l'invention, on fractionne d'abord les fractions actives d'inhibiteur d'IL-1 sur la base du poids moléculaire, à l'aide de filtration sur gel, de préférence sur un gel AcA54, en sélectionnant à nouveau les fractions actives comme ci-dessus. Les fractions sélectionnées se caractérisent par un poids moléculaire d'environ 25 000 et par le fait qu'elles représentent au moins 90% de la teneur en protéines. Les contaminants principaux sont l'apolipo- protéine AI et l'a2-microglobuline (protéine fixant le réti- nol). Bien qu'il soit possible d'éliminer ces contaminants de diverses façons, on préfère utiliser des anticorps monoclo- naux ou polyclonaux construits contre l'apolipoprotéine et l'a2-microglobuline, par la méthode d'immunoabsorption. On purifie davantage les fractions actives d'inhibiteur d'IL-1 ci-dessus, par chromatographie hydrophobe sur une colonne de phényl-Sepharose qui fractionne les protéines en fonction de leur hydrophobie. L'apolipoprotéine AI et l'a2-microglobuline, par exemple, sont plus hydrophobes que les protéines de la présente invention et seront par consé- quent retenues dans la colonne. En utilisant le procédé préféré décrit ci-dessus, l'activité spécifique de l'inhibiteur d'IL-1 de la présente invention, c'est-à-dire la quantité d'inhibiteur d'IL-1 qui est requise pour produire la moitié de l'inhibition maximale, s'est accrue après chaque étape de purification (voir figure 9). Pour mesurer cette activité spécifique, on a uti- lisé un dosage de liaison IL-1/récepteur, un dosage du LAF, - 12 - un dosage EL-4/CTLL et un dosage du MCF. Cependant, on aurait aussi bien pu utiliser divers autres essais. L'inhibiteur d'IL-1 purifié dans le procédé ci-dessus, ou procédé préféré, peut être utilisé directement dans les compositions et méthodes immunosuppressives et anti- inflammatoires de la présente invention. Cependant, on pré- fère utiliser cette protéine purifiée comme source de données concernant les séquences d'acides aminés, permettant de cons- truire des sondes d'ADN à utiliser dans l'isolement et la sélection d'une séquence d'ADN codant pour un inhibiteur d'IL-1 de la présente invention. On peut ensuite utiliser de telles séquences d'ADN, des molécules d'ADN recombinant les contenant, et des hôtes unicellulaires transformés à l'aide de celles-ci, pour produire de grandes quantités des inhibi- teurs d'IL-1 de la présente invention, pratiquement exempts d'autres protéines humaines, à utiliser dans les compositions et les thérapeutiques de la présente invention. Plus précisément, on détermine les séquences d'acides aminés de diverses portions et de divers fragments de l'inhi- biteur d'IL-1 purifié selon l'invention. On utilise ensuite ces séquences, et les séquences d'ADN déduites comme codant pour celles-ci, pour construire une série de sondes d'ADN potentiellement utilisables dans le criblage de diverses librairies d'ADN destinées à fournir des séquences d'ADN codant pour les inhibiteurs d'IL-1 de la présente invention. Ces librairies comprennent des banques de gènes chromoso- miques et des librairies d'ADN ou d'ADNc préparées à partir de tissus ou de lignées cellulaires qui se sont révélées pro- duire les inhibiteurs d'IL-1 de la présente invention; de telles lignées cellulaires comprennent des lignées cellu- laires monocytiques bien connues dans la techniques. Pour la préparation d'ADNc et finalement le clonage et l'expression de polypeptides IL-1 INH, on isole de l'ARNm poly A à partir d'une source cellulaire productrice d'inhi- biteur d'IL-1, telle que des macrophages stimulés, à l'aide - 13 - de techniques classiques, par exemple celles décrites par Land et coll., "5'-terminal Sequences of Eukaryotic mRNA Can be Cloned With High Efficiency" (Des sequences 5'-terminales d'ARNm d'eucaryotes peuvent être clonées avec un haut rende- ment), Nucleic Acids Research, 9, p. 2251-2266 (1981); Okayoma et Berg, "High Efficiency Cloning of Full-Length cDNA" (Clonage avec un haut rendement d'ADNc entier), Mol. and Cell. Biol., p. 161-170 (1982); et Maniatis et coll. dans "Molecular Cloning" (Clonage moléculaire) (éditions Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA), p. 229-246 (1982). A partir de l'ARNm poly A isolé ci-dessus, on construit ensuite une librairie d'ADNc au moyen de techniques classiques, par exemple celles décrites par Wickens et coll., "Synthesis of Double-Stranded DNA Comple- mentary to Lysosyme, Ovomucoid and Ovalhuman mRNAs", J. Biol. Chem., 253, p. 2483-2495 (1978); Maniatis et coll. dans "Molecular Cloning" (Clonage moléculaire) (éditions Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, p. 229-246 (1982); et V. Gubler et coll., "A simple and Very Efficient Method for Generating cDNA libraries" (Une méthode simple et très efficace pour la production de librairies d'ADNc), Gene, 25, p. 263-269 (1983). Il y a plusieurs façons d'aborder le criblage d'une librairie de clones destiné à en trouver un qui contient une molécule déterminée d'ADN recombinant, c'est-à-dire un clone contenant un insert IL-1 INH. Par exemple, sur la base d'une séquence partielle d'acides aminés de l'inhibiteur d'IL-1 purifié de l'invention, on peut construire des sondes d'ADN qui comprennent une série de fragments d'ADN synthétiques qui codent pour des portions choisies des inhibiteurs d'IL-1 de la présente invention. Les techniques pour la détermination de séquences d'acides aminés sont bien connues. Une fois déterminées les séquences d'acides aminés de diverses régions de l'inhibiteur d'IL-1, on peut faire la synthèse chimique d'ensembles de sondes IL-1 INH dégénérées, à l'aide de tech- - 14 - niques classiques de synthèse d'ADN phosphoramide, à utiliser dans le criblage de diverses librairies d'ADN, afin de sélec- tionner par hybridation les séquences d'ADN apparentées. A l'aide de 32PATP et de polynucléotide kinase de T4, on marque alors au 32p les sondes d'ADN à l'extrémité 5', essen- tiellement comme décrit par A.M. Maxam et W. Gilbert, "A New Method For Sequencing DNA" (Une nouvelle méthode de séquen- çage d'ADN), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, p. 560-564 (1977). En faisant appel à des méthodes classiques, on utilise ensuite ces sondes d'ADN pour cribler de l'ADNc ou des librairies de gènes, par exemple, des librairies d'ADNc pro- venant des lignées de cellules leucémiques monocytiques U937, THP-I et HL60, pour obtenir des séquences d'ADN codant pour les inhibiteurs d'IL-1 de la présente invention. Ces séquences sélectionnées peuvent alors êtremanipulées pour l'expression d'inhibiteurs d'IL-1 dans des hôtes procaryotes ou eucaryotes, transformés par celles-ci à l'aide de tech- niques bien connues. Elles sont également utiles en tant que sondes de criblage pour sélectionner d'autres séquences d'ADN apparentées qui codent pour des inhibiteurs d'IL-1 de mammi- fères. Les séquences d'ADN et les molécules d'ADN de la pré- * sente invention peuvent être exprimées au moyen d'un large éventail de combinaisons hôte-vecteur. Par exemple, des vec- teurs utilisables peuvent consister en des segments de séquences d'ADN chromosomique, non chromosomique et synthé- tique, tels que divers dérivés connus de SV40 et de plasmides bactériens connus, par exemple des plasmides provenant de E. coli, comprenant colE1, pCR1, pBR322, pMB9 et RP4; des ADN phagiques, par exemple les nombreux dérivés de phages, par exemple NM 989 et autres phages à ADN, par exemple M13, ainsi que d'autres phages à ADN filamentaire monocaténaire; des vecteurs utilisables dans des levures, tels que le plasmide 2pi; des vecteurs utilisables dans des cellules eucaryotes, tels que des vecteurs utilisables dans des cellules animales, 262I821 - 15 - comme par exemple celles contenant des séquences d'ADN prove- nant du rétrovirus et de l'adénovirus SV-40, et des vecteurs provenant de combinaisons de plasmides et d'ADN phagiques, tels que des plasmides qui ont été modifiés pour utiliser de l'ADN phagique, ou autres-dérivés de ceux-ci. De tels vecteurs d'expression sont également caractéri- sés par au moins une séquence de contrôle de l'expression qui est fonctionnellement liée à la séquence d'ADN IL-1 INH insé- rée dans le vecteur, afin de contrôler et de régler l'expres- sion de cette séquence d'ADN clonée. Comme exemples de séquences de contrôle de l'expression qui peuvent être utili- sées, on peut citer le système lac, le système trp, le sys- tème tac, le système trc, les principales régions de promo- teur et d'opérateur du phage A, la région de contrôle de la protéine de revêtement fd, les promoteurs glycolytiques de la levure, par exemple le promoteur de la 3-phosphoglycérate kinase, les promoteurs de la phosphatase acide de la levure, par exemple Pho5, les promoteurs des facteurs d'a-conjugaison de la levure, et les promoteurs provenant du polyomavirus, de l'adénovirus, du rétrovirus et du virus simien, par exemple les promoteurs précoce et tardif de SV40, et autres séquences reconnues contrôler l'expression de gènes de cellules pro- caryotes ou eucaryotes et de leurs virus, ou des combinaisons de celles-ci. Parmi de tels vecteurs d'expression utilisables, figurent des vecteurs qui permettent l'expression des séquences d'ADN IL-1 INH clonées dans des hôtes eucaryotes, tels que des cellules animales et humaines [voir par exemple P.J. Southern et P. Berg, J. Mol. Appl. Genet., 1, p. 327-341 (1982); S. Subramani et coll., Mol. Cell. Biol., 1, p. 854- 864 (1981); R.J. Kaufman et P.A. Sharp, 'Amplification and Expression of Sequences Cotransfected with a Modular Dihydro- folate Reductase Complementary DNA Gene" (Amplification et expression de séquences co-transférérées avec un gène d'ADN modulaire complémentaire de la dihydrofolate réductase), J. 2'6r2 1 u 2 I - 16 - Mol. Biol., 159, p. 601-621 (1982); R.J. Kaufman et P.A. Sharp, Mol. Cell. Biol., 159, p. 601-664 (1982); S.I. Scahill et coll., "Expression and Characterization of the Product of a Human Immune Interferon DNA Gene in Chinese Hamster Ovary Cells" (Expression et caractérisation du pro- duit d'un gène d'ADN d'interféron immun humain dans les cel- lules ovariennes de hamster), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, , p. 4654-4659 (1983); G. Urlaub et L.A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77, p. 4216-4220 (1980)]. En outre, dans chaque vecteur d'expression spécifique, on peut sélectionner divers sites pour l'insertion des séquences d'ADN d'inhibiteur d'IL-1 de la présente invention. Ces sites sont habituellement désignés par l'endonucléase de restriction qui les coupe. Ils sont bien connus du spécia- liste. Il doit être entendu qu'un vecteur d'expression qui est utilisable dans la présente invention ne comporte pas nécessairement un site d'endonuléase de restriction pour l'insertion du fragment d'ADN choisi. Au lieu de cela, il est possible de lier le vecteur au fragment par d'autres moyens. Le vecteur d'expression, et en particulier le site choisi dans celui-ci pour l'insertion d'un fragment d'ADN sélec- tionné et sa liaison fonctionnelle à une séquence de contr8ôle d'expression, sont déterminés par divers facteurs, par exemple, par le nombre de sites sensibles à une enzyme de restriction particulière, la taille de la protéine à expri- mer, la sensibilité de la protéine désirée à la dégradation protéolytique par des enzymes de la cellule h8te; la contami- nation ou la fixation de la protéine à exprimer, par des pro- téines de la cellule hôte qui sont difficiles à éliminer lors de la purification; par des caractéristiques d'expression, tels que l'emplacement des codons d'initiation et de termi- naison concernant les séquences du vecteur, et autres fac- teurs connus du spécialiste. Le choix d'un vecteur et d'un site d'insertion pour une séquence d'ADN est déterminé par un équilibre de ces facteurs, toutes les sélections n'ayant pas 2 6 218 21 - 17 - la même efficacité pour un cas donné. Les hôtes d'expression qui sont utilisables comprennent des hôtes eucaryotes et procaryotes bien connus, tels que des souches d'Escherichia coli, comme par exemple E. coli SG-936, E. coli HB-101, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli DHI et E. coli MRC1, de Pseudomonas, de Bacillus, comme par exemple Bacillus subtilis, de Streptomyces, de levures et autres champignons, des cellules animales telles que les cellules COS et les cellules CHO, et des cellules io humaines ainsi que des cellules végétales en culture de tissu. Naturellement, toutes les combinaisons hôte/vecteur d'expression ne fonctionnent pas avec la même efficacité dans l'expression des séquences d'ADN de la présente invention ou dans la production des polypeptides de type IL-1 INH de la présente invention. Cependant, le spécialiste pourra faire un choix particulier d'une combinaison hôte/vecteur d'expression après avoir pris en considération les principes indiqués ici, sans pour autant s'écarter du cadre de la présente invention. 2D Par exemple, le choix devrait être basé sur un équilibre d'un certain nombre de facteurs. Ceux-ci comprennent par exemple la compatibilité entre l'hôte et le vecteur, la toxicité envers l'hôte des protéines codées par la séquence d'ADN, la facilité de récupération de la protéine désirée, les carac- tères d'expression des séquences d'ADN et des séquences de contrôle de l'expression qui sont fonctionnellement liées à celles-ci, la sécurité biologique, les coûts et le replie- ment, la forme ou toutes autres modifications nécessaires de la protéine désirée ayant lieu après l'expression. Les inhibiteurs d'IL-1, produits par fermentation des hôtes procaryotes et eucaryotes transformés par les séquences d'ADN de la présente invention, peuvent alors être utilisés dans les compositions et procédés immunosuppresseurs et anti- inflammatoires de la présente invention. 26 18 1 - 18 - On peut également analyser les inhibiteurs d'IL-1 de la présente invention pour déterminer leurs sites actifs pour la production de fragments de peptides, y compris de peptides synthétiques, ayant l'activité d'inhibiteurs d'IL-1. Parmi les techniques connues pour la détermination de tels sites actifs, figurent la cristallographie aux rayons X, la réso- nance magnétique nucléaire, le dichroisme circulaire, la spectroscopie UV et la mutagénèse spécifique de site. En conséquence, ces fragments ou peptides font également partie de la présente invention et peuvent être utilisés à des fins immuno-suppressives et anti-inflammatoires et dans les procé- dés de l'invention. On peut procéder à l'administration des polypeptides IL-1 INH de la présente invention ou de peptides dérivés ou synthétisés à partir de ceuxci, ou à l'utilisation de leurs séquences d'acides aminés, ou de leurs sels ou dérivés phar- maceutiquement acceptables, en faisant appel à l'un quel- conque des modes d'administration classiquement reconnus d'agents manifestant une activité immuno-suppressive ou anti- 2V inflammatoire. Ces modes d'administration comprennent la voie orale, parentérale, sous-cutanée, intraveineuse, intra- lésionnelle ou locale. On préfère l'injection locale, intra- lésionnelle ou intraveineuse. Les compositions utilisées dans ces thérapeutiques peuvent également se trouver sous diverses formes. Ces formes comprennent, par exemple, des formes pharmaceutiques solides, semi-solides ou liquides, telles que comprimés, pilules, poudres, solutions ou suspensions liquides, suppositoires, solutions injectables et pour perfusions. La forme préférée dépend du mode d'administration prévu et de l'application thérapeutique envisagée. Les compositions comprendront égale- ment, de préférence, des véhicules pharmaceutiquement accep- tables classiques, et pourront comprendre d'autres médica- ments, véhicules, adjuvants, excipients, etc., par exemple de l'albumine de sérum humain ou des préparations à base de 19 - plasma. Les compositions de l'invention se présentent de pré- férence sous forme d'une dose unitaire, et seront générale- ment administrées une ou plusieurs fois par jour. On illustre la présente invention à l'aide des exemples descriptifs et non limitatifs ci-après. Exemple 1 Purification de l'inhibiteur d'IL-1 a) Concentration de protéines provenant d'urine humaine Dans un appareil d'ultrafiltration à fibres creuses Amicon, à 4 C, on a concentré à 2 litres 100 litres d'urines réunies provenant de patients hautement fébriles (>38,5 C), exempts d'infections urinaires. La solution résultante avait une activité spécifique de 12 U/mg de protéine, telle que déterminée par le dosage de la liaison IL-1/récepteur décrit dans l'exemple 2; de 166 U/mg de protéine, telle que détermi- née par le dosage du LAF décrit dans l'exemple 3; de 32 U/mg de protéine, telle que déterminée par le dosage EL-4/CTLL décrit dans l'exemple 4; et de 125 U/mg de protéine, telle que déterminée par le dosage du MCF décrit dans l'exemple 5. Une unité ou "U" est définie comme la quantité d'inhibiteur d'IL-1 (pg) produisant la moitié de l'inhibition maximale dans chaque essai biologique (voir figure 9). b) Précipitation de la protéine provenant d'urine humaine On a d'abord saturé avec du sulfate d'ammonium solide le concentré d'urines réunies, en ajoutant lentement le sulfate d'ammonium, sous constante agitation, à 40C, jusqu'à l'obtention d'une saturation de sulfate d'ammonium égale à 40%. On a ensuite séparé le précipité de la solution par centrifugation pendant 1 heure à 10 000 tours/minute dans une centrifugeuse Sorvall RC- 5B (E. I. DuPont, New Town, Connecticut, USA), en utilisant un rotor GSA à angle fixe. On a ensuite éliminé le culot et on a ajusté le surnageant à une concentration de sulfate d'ammonium égale à 80%, puis on l'a centrifugé pendant 1 heure à 10 000 tours/minute. On a - 20 - ensuite remis le culot résultant en suspension dans 650 ml d'une solution de phosphate de sodium 20 mM (pH 7,2) avec mM de NaCl. On a ensuite dialysé la solution pendant 24 heures contre 45 litres (2 fois) d'une solution contenant 10 mM de Tris-Hcl (pH 8), 2 mM d'EDTA et 5 mM de benzamidine.HCl, afin d'éliminer le sulfate d'ammonium. c) Chromatographie d'échange ionique On a ensuite séparé l'activité IL-1 INH présente en combinaison avec d'autres protéines dans la fraction unie, en mettant à profit la forte affinité de liaison des inhibi- teurs d'IL-1 à deux échangeurs anioniques différents. Chaque écahngeur anionique a été utilisé indépendamment ou en combi- naison, la colonne de DEAE-Sepharose faisant de préférence suite à la colonne de QAE-Sepharose. 1) Colonne de diétyl-(2-hydroxypropyl)aminoéthyl-Sepharose (QAE-Sepharose) Bien que de nombreux systèmes chromatographiques d'échange anionique soient bien connus du spécialiste, on a choisi d'utiliser d'abord une colonne de QAE-Sepharose, de 5 cm de diamètre x 45 cm de longueur (Farmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey, USA). Après avoir intro- duit la solution dialysée ci-dessus, on a lavé la colonne jusqu'à ce qu'aucune protéine non fixée ne soit plus présente dans l'éluat (contrôle par densité optique à 280 nm). On a élué les protéines fixées avec 4 volumes de colonne d'un gra- dient salé constitué de NaCl 0 à 0,8 M, en solution dans le tampon d'équilibrage. La vitesse d'écoulement dans la colonne était 120 ml/h. On a contrôlé l'activité des diverses frac- tions à l'aide des dosages du LAF et de liaison IL-1/récep- teur (voir plus loin) (voir figure 1). Les fractions manifes- festant l'activité biologique de l'inhibiteur d'IL-1 ont été éluées aux environs de 150 mM de NaCl. Les fractions actives réunies avaient une activité spécifique de 33 U/mg de pro- téine, telle que déterminée par le dosage de la liaison IL-1/ récepteur, comme décrit dans l'exemple 2; de 63 U/mg de pro- 262'181 - 21 - téine, telle que déterminée par le dosage du LAF comme décrit dans l'exemple 3; de 27 U/mg de protéine, telle que détermi- née par le dosage EL-4/CTLL comme décrit dans l'exemple 4; et de 200 U/mg de protéine, telle que déterminée par le dosage du MCF comme décrit dans l'exemple 5 (voir figure 9). 2) Colonne de diéthylaminoéthyl-Sepharose (DEAE-Sepharose) On a dialysé les fractions actives réunies, contre mM de Tris-HCl (pH 7) dans une colonne de DEAE-Sepharose à écoulement rapide de 2,5 cm x 30 cm (Pharmacia Fine Chemi- cals, Piscataway, New Jersey, USA). On a lavé avec le tampon d'équilibrage (10 mM de Tris-HCl, pH 7) la colonne chargée avec les fractions actives réunies, jusqu'à ce que la densité optique (à 280 nm) soit égale à 0 environ. On a ensuite élué la protéine fixée avec un gradient de 0 à 0,2 M de NaCl en solution dans le tampon d'équilibrage. Le volume du gradient était égal à 10 fois celui de la colonne. La vitesse d'écou- lement dans la colonne était de 78 ml/h. Là encore, on a contrôlé comme ci-dessus l'activité des diverses fractions. Cette élution a donné l'élution des fractions contenant l'activité IL-1 INH à la fin de l'étape de lavage avec NaCl mM. La figure 2 montre le profil d'activité de l'inhibi- teur d'IL-1 urinaire sur le DEAE-Sepharose, l'activité inhi- bitrice ayant été contrôlée par (A) dosage d'IL-1/LAF et (B) dosage de la liaison IL-1/récepteur (voir plus loin). A l'aide d'un appareil d'ultrafiltration Amicon, en utilisant une membrane YM-10, on a ensuite concentré à un volume de 6 ml les fractions actives réunies. La solution résultante avait une activité spécifique de 50 U/mg de protéine, telle que déterminée par le dosage de la liaison ILi/ récepteur (voir plus loin); de 125 U/mg de protéine, telle que déterminée par le dosage du LAF (voir plus loin); de 40 U/mg de protéine, telle que déterminée par le dosage EL-4/CTLL (voir plus loin); et de 500 U/mg de protéine, telle que déterminée par le dosage du MCF (voir plus loin) (voir figure 9). 262'l21 - 22 - Il doit naturellement être entendu qu'on aurait pu éga- lement choisir d'autres colonnes d'échange d'anions, sans pour autant s'écarter du cadre de la présente invention. d) Ultrogel AcA54 Au moyen d'une filtration sur gel, on a ensuite fractionné deux fois selon le poids moléculaire le concentré préparé comme décrit plus haut. Bien qu'un certain nombre de systèmes appropriés de filtration sur gel soient bien connus du spécialiste, on a choisi d'utiliser un gel AcA54 (LKB, Suède) ayant une plage de fractionnement de P.M. 6 000 à 000. Là encore, on a contrôlé l'activité des fractions comme ci-dessus (voir figure 3). L'ensemble résultant des fractions actives réunies avait une activité spécifique de 1 666 U/mg de protéine, telle que déterminée par un dosage de la liaison IL-1/récepteur (voir plus loin) ; de 526 U/mg de protéine, telle que déterminée par le dosage du LAF (voir plus loin); de 333 U/mg de protéine, telle que déterminée par le dosage EL-4/CTLL (voir plus loin); de 1 110 U/mg de pro- téine, telle que déterminée par le dosage du MCF (voir plus loin) (voir figure 9); et un poids moléculaire d'environ 000. Là encore, il doit être entendu qu'on aurait égale- ment pu utiliser d'autres systèmes d'ultrafiltration. La figure 4 montre la réponse en fonction de la dose de divers ensembles de fractions réunies d'inhibiteur d'IL-1, déterminée par (A) dosage d'IL1/LAF et (B) dosage de la liaison IL-1/récepteur, décrits plus loin. Après chaque étape de purification, à savoir urine concentrée, QAESepharose, DEAE-Sepharose et AcA54 (deux fois), on a constaté une dimi- nution de la concentration (lg/ml) d'inhibiteur d'IL-1 requise pour réaliser l'inhibition, ce qui indique une pro- téine plus pure. e) Immunoabsorption négative On a analysé par séquençage des acides aminés les fractions actives réunies provenant de la filtration sur gel, en utilisant la méthode classique de la dégradation d'Edman - 23 - automatisée, et on a constaté que les deux contaminants majeurs, représentant au moins 90% de la teneur en protéine, étaient l'apolipoprotéine AI et l'a2-microglobuline (protéine fixant le rétinol). Bien que diverses méthodes soient dispo- nibles pour éliminer ces protéines, on a choisi l'immuno- absorption et la chromatographie hydrophobe. En conséquence, on a d'abord séparé par immuno- absorption les contaminants majeurs d'avec les fractions actives d'IL-1 INH réunies après passage sur AcA54. A l'aide de méthodes courantes d'immunisation, on a produit des anti- corps monoclonaux et polyclonaux contre l'apolipoproétéine AI et l'a2microglobuline. On a ensuite purifié partiellement les immunoglobulines G (IgG) par précipitation à 40% de satu- ration de sulfate d'ammonium. On a remis le culot d'IgG en suspension dans une solution de phosphate de sodium 0,2 M, puis on l'a dialysé contre le même tampon. On a ensuite cou- plé les fractions d'IgG réunies à un gel d'agarose activé à la vinylsulfone, en suivant les indications du fabricant (KEM-EN-TEC, Biotechnology Corp., Danemark). Après équili- brage de l'immunoabsorbant avec une solution salée tamponnée au phosphate, on a absorbé les contaminants provenant des fractions IL-1 INH réunies en faisant passer celles-ci à plu- sieurs reprises sur l'immunoabsorbant, jusqu'à ce que toute apolipoprotéine AI et toute a2-microglobuline soient complè- tement absorbées, comme déterminé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE). La solution résultante avait une activité spécifique de 3 334 U/mg de protéine, telle que déterminée par le dosage de la liaison IL-1/récepteur (voir plus loin) ; de 2 500 U/mg de protéine, telle que déterminée par le dosage du LAF (voir plus loin); de 1 250 U/mg de protéine, telle que déterminée par le dosage EL-4/CTLL (voir plus loin); de 2 160 U/mg de protéine, telle que déterminée par le dosage du MCF (voir plus loin) (voir figure 9) et présentait un seul pic dans l'électrophorèse SDS-PAGE. - 24 - f) Phényl-Sepharose On a ajusté à 1 M NaCl l'ensemble des fractions réunies d'inhibiteur de IL-1 immunoabsorbé, par addition de 1 volume de NaCl 2 M dissous dans du Tris-HCl 10 mM (pH 7), et on l'a introduit dans une colonne garnie de phényl-Sepharose (0,5 x 5 cm, cette résine ayant été obtenue auprès de Pharmacia Fine Chemicals, Suède). La résine avait été préala- blement équilibrée avec du Tris-HCl 10 mM, pH 7, contenant 0,2 M de NaCl (tampon d'équilibrage). Après la charge, on a lavé la colonne avec 3 volumes de colonne de tampon d'équili- brage, afin d'éluer toutes les protéines non fixées, puis on a élué les protéines fixées avec un gradient de NaCl 0,2 M à 0 M en solution dans du Tris-HCl 10 mM, pH 7. Le volume du gradient représentait 50 fois le volume de la colonne. La vitesse d'écoulement dans la colonne était 30 ml/h. L'acti- vité de l'inhibiteur d'IL-1 a été éluée aux environs de 0,160 M NaCl, pour donner une protéine d'un poids moléculaire égal à 25 000, ayant un point isoélectrique égal à 4,7. La solution résultante avait une activité spécifique de 38 461 U/mg de protéine, telle que déterminée par le dosage de la liaison IL-1/récepteur décrit dans l'exemple 2; de 2 500 U/mg de protéine, telle que déterminée par le dosage du LAF décrit dans l'exemple 3; de 35 020 U/mg de protéine, telle que déterminée par le dosage EL4/CTLL décrit dans l'exemple 4; de 30 303 U/mg de protéine, telle que déterminée par le dosage du MCF décrit dans l'exemple 5 (voir figure 9), et présentait un pic unique à l'électrophorèse SDS-PAGE. Exemple 2 Pouvoir de fixation de l'inhibiteur d'IL-1 au récepteur Afin de déterminer les caractéristiques de fixation de l'inhibiteur d'IL-1 de l'invention au récepteur d'IL-1 sur des cellules cibles EL-4-6.1, on a d'abord fait des essais pour déterminer si l'inhibiteur d'IL-1 interférait avec la fixation de [125I]-IL-1 aux cellules cibles. On a marqué de l'IL-1 au 125I par la méthode à la chloramine T [Lowenthal et - 25 - coll., "Binding and Internalization of interleukin-1 by T Cells" (Fixation et internalisation d'interleukine-1 par les cellules T), J. Exp. Med., 164, p. 1060], puis on l'a mise à incuber avec un excès d'inhibiteur d'IL-1 non marqué, incuba- tion suivie d'un lavage avec un gradient d'huile. A l'aide d'un compteur gamma, on a ensuite mesuré la substance retenue avec les cellules, et on a constaté qu'une augmentation de la concentration de l'inhibiteur d'IL-1 réduisait la quantité de [ 125I]-IL-1 fixée à la surface des cellules cibles. On a ensuite fait un essai pour déterminer si l'inhibi- teur d'IL-1 interférait avec la fixation du [125I]-IL-1 INH aux cellules cibles, soit que la fixation de [125I]-IL-1 INH puisse être concurrencée par l'IL-1 non marquée, soit que la fixation de [125]-IL-1 INH aux cellules cibles puisse être concurrencée par l'apolipoprotéine AI ou l'a microglobuline (protéine fixant le rétinol). Au moyen de [1 5I], on a marqué l'inhibiteur d'IL-1 par la méthode de Bolton et Hunter [Bolton et Hunter, "The Labelling of Proteins to High Speci- fic Radioactivities by Conjugation to a 125I-Containing Acy- lating Agent" (Le marquage de protéines jusqu'à de hautes radioactivités spécifiques par conjugaison à un agent d'acy- lation contenant du 125I), Biochem. J., 133, p. 529 (1973)]. L'incubation de la substance avec des cellules cibles EL-4-6.1, suivie d'un lavage avec un gradient d'huile, et l'analyse par électrophorèse SDSPAGE ont montré qu'une espèce à poids moléculaire s'élevant à 25 000 environ se fixait aux cellules EL-4. On a constaté que l'incubation simultanée du [12]-IL-1 INH avec un excès d'IL-1 INH non marqué inhibait la fixation de l'espèce à P.M. 25 000 mar- quée. On a également mis simultanément à incuber le [ 125 1-IL-1 INH avec 50 ng d'IL-13 non marquée, et on a constaté que cela empêchait la fixation de l'espèce à P.M. 000 marquée. On a également mis à incuber simultanément le [ 125]-IL-1 INH avec 1 gg d'a2-microglobuline (protéine fixant le rétinol) immunopurifiée, et avec 1 ig d'apolipoprotéine AI - 26 - recombinante, et on a constaté que cela n'empêchait pas la fixation de l'espèce à P.M. 25 000 marquée. Ainsi, l'espèce à P.M. 25 000 présente dans la préparation IL-1 INH marquée se fixe à la surface de cellules EL4-6.1 intactes, et cette fixation est concurrencée par l'inhibiteur non marqué et par l'IL-1, mais ne l'est pas par l'a2-microglobuline ni par l'apolipoprotéine AI. Exemple 3 Dosage d'IL-1/LAF On a démontré l'activité inhibitrice de l'inhibiteur d'IL-1 dans un dosage d'IL-1/LAF, tel que mesuré par la prolifération de thymocytes (cellules T) chez la souris C3H/HeJ [J.M. Dayer et coll., "Human Recombinant IL-1 Stimu- lates Collagenase and Prostaglandin E2 Production by Human Synovial cells" (L'IL-1 recombinante humaine stimule la pro- duction de collagénase et de prostaglandine E2 par les cel- lules synoviales humaines), J. Clin. Invest., 77, p. 645 (1986)]. On a stimulé simultanément les thymocytes pendant 72 heures avec de la phytohémagglutine (PHA) (1 pg/ml) en présence soit de HrIL-la [P. Wingfield et coll., "Purifica- tion and Characterization of Human Interleukin-1 expressed in E. coli (Purification et caractérisation de l'interleukine-1 humaine exprimée dans E. Coli), Eur. J. Biochem., 165, p. 537 (1987)], soit de IL-10 [P. Wingfield et coll., "Purification and Characterization of Human Interleukin-1 Expressed in Recombinant E. coli" (Purification et caractérisation de l'interleukine-10 humaine exprimée dans E. coli recombinant, Eur. J. Biochem., 160, p. 491 (1986)], à différentes concen- trations finales allant de 20 pg/ml à 2 000 pg/ml de hrIL-I, comme représenté sur la figure 5. On a obtenu une inhibition totale de la prolifération des thymocytes co-stimulés en présence de hIL-a ou de hIL-0, lorsqu'on a ajouté aux cel- lules les fractions d'inhibiteur d'IL-1 provenant de l'exemple 1(e). On a contr8ôlé l'activité inhibitrice à trois dilutions de l'inhibiteur d'IL-1: 1/20, 1/40 et 1/80. - 27 - Etant donné que l'addition de l'inhibiteur d'IL-1 à des cellules stimulées par la PHA n'affectait pas l'incorporation de [3H]-TdR en l'absence d'hrIL-1, on en a conclu que l'inhi- bition n'était pas due à un effet cytotoxique ou non spéci- fique, mais bien à une inhibition de l'activité biologique de l'IL-1. Exemple 4 Dosage EL-4/CTLL On a déterminé l'activité inhibitrice d'inhibiteurs d'IL1 en étudiant si l'aptitude d'interleukines-la ou d'interleukines-1l à induire la production d'IL-2 dans des cellules EL-4 pouvait être inhibée [voir par exemple A.J.H. Gearing et coll., "A simple Sensitive Bioassay For IL-i Which is Unresponsive to 103 U/ml Of IL-2" (Un dosage biologique simple et sensible pour l'IL-1, qui est insensible à 103 U/ml d'IL-2), J. Immun. Met., 99, p. 7 (1987)]. On effectue cet essai en cultivant simultanément un sous-clone de cellules EL-4, incapables de fixer la thymidine provenant du milieu environnant, avec des cellules CTLL-2, et en notant si les cellules CTLL-2 prolifèrent. On a cultivé en même temps des cellules EL-4.6.1 cO10 et des cellules CTLL-2, à une concentration de 10 cellules de chaque type par trou de microtitrage (plaque à 96 trous), en présence d'IL-la ou d'IL-1l à environ1 pg/ml, conjointement avec l'inhibiteur d'IL-1 provenant de l'exemple le. Au bout de 18 heures de culture simultanée, a ajouté 1 piC de [3H]-TdR et on a mis à incuber pendant encore 6 heures à 37 C en atmosphère humide. A l'aide d'un collecteur de cellules MASH, on a récolté les cellules sur des bandes de fibre de verre, on les a séchées, puis on les a préparées avec un mélange de scintillation pour le comptage dans un compteur 0. On a obtenu une totale inhibition de l'incorporation d'[3H]-TdR à des dilutions de l'inhibiteur d'IL-1 égales à 1/20, 1/40 et 1/80. - 28 - Exemple 5 Dosage IL-1/MCF Dans un dosage IL-1/MCF, on a encore démontré l'acti- vité inhibitrice de l'inhibiteur d'IL-1, telle que mesurée sur des fibroblastes obtenus à partir de prépuce infantile humain [J. Dayer et coll., "Participation of Monocyte- Macrophage And Lymphocytes In The Production Of A Factor That Stimulates Collagenase And Prostaglandin Release By Rheuma- toid Synovial Cells" (Participation de monocytes-macrophages et de lymphocytes à la production d'un facteur stimulant la libération de collagénase et de prostaglandine par des cel- lules synoviales rhumatoldes), J. Clin. Invest., 64, p. 1386 (1979); J. Dayer et coll., "Induction Of Human Interleukin-1 mRNA Measured By Collagenase And Prostaglandin E2 Stimulating Activity In Rheumatoid Synovial Cells" (Induction d'ARNm d'interleukine-1 humain, mesurée par l'activité de stimula- tion de la production de collagénase et de prostaglandine E2 dans des cellules synoviales rhumatoides), Eur. J. Immunol., 14, p. 898 (1984)]. On a stimulé les fibroblastes avec hrIL-la ou hrIL-1 aux mêmes concentrations que dans le dosage IL-1/LAF, et on a contr8ôlé l'activité inhibitrice aux mêmes dilutions finales d'inhibiteur d'IL-1 que dans le dosage IL-1/LAF. Après avoir cultivé les cellules pendant 72 heures, on a mesuré la production de prostaglandine E2 dans des sur- nageants de fibroblastes, à l'aide d'un radioimmunodosage à double anticorps [J. Dayer (1979), voir plus haut], en utili- sant un antisérum contre la prostaglandine E2. Comme indiqué dans le tableau de la figure 6, on a constaté une réponse de production de prostaglandine, induite soit par hrIL-la, soit par hrIL-1B, en fonction de la dose, jusqu'à des concentra- tions de 100 pg/ml. Il a été possible d'inhiber cette acti- vité biologique par addition des fractions d'inhibiteur d'IL-1 provenant de l'exemple 1(e). On en a conclu que l'in- hibiteur d'IL-1 était là encore efficace contre hrIL-la et *hrIL-1B. - 29 - On a ensuite effectué l'essai ci-dessus en remplaçant l'hrIL-1 par du hrTHFa [A. Marmenout et coll., "Molecular Cloning And Expression Of TNF And Comparison With Mouse TNF" (Clonage moléculaire et expression du TNF et comparaison avec le TNF de la souris), Eur. J. Biochem., 152, p. 512522 (1985)], afin de déterminer la spécificité de l'inhibiteur d'IL-1, car le TNFa est également un médiateur dans la pro- duction de la prostaglandine E2 et de la collagénase. Comme représenté sur la figure 7, la production de prostaglandine E2 induite par le hrTNF n'a pas été sensiblement affecté par l'addition d'inhibiteur d'IL-1 selon l'invention, ce qui montre la spécificité de cet inhibiteur d'IL-1. Exemple 6 Essai de prolifération de fibroblastes On a encore dosé l'activité biologique d'interleukines- 1 en présence de l'inhibiteur d'IL-1 provenant de l'exemple 1(e), au moyen d'un essai de prolifération de fibroblastes, mesuré par incorporation de [ H]-TdR. Après culture de fibro- blastes de prépuce humain dans du milieu essentiel minimal (MEM) d'Eagle additionné de 10 mM d'HEPES, 100 U/ml de péni- cilline, 100 pg/ml de streptomycine, 1% de glutamine, 1% d'acides aminés non essentiels et de 2% de sérum de veau faoetal (FCS), on a inoculé les cellules dans des plaques à 96 trous (2 000 cellules/trou) et on les a cultivées pendant 24 heures dans un incubateur à 37 C, en présence de 5% de CO2. Après avoir éliminé le milieu, on a stimulé les fibro- blastes par addition d'hrIL-la ou d'hrIL-10, et on a ajouté de l'inhibiteur d'IL-1 dans les mêmes dilutions que dans les dosages cidessus. On a attendu 48 heures, puis on a pulsé les cellules avec de la [3H]-TdR pendant encore 16 heures. On a séparé le milieu d'avec les cellules, et on ensuite lavé celles-ci avec une solution de tampon phosphate (STP) puis on les a trypsinées à 37 C pendant encore 15 minutes. A l'aide d'un collecteur de cellules (Skatron, Lier, Norvège), on a récolté les cellules sur des filtres de verre (Skatron Inc., - 30 - Sterling, Virginie, USA), on les a lavées avec de l'eau, puis séchées à l'air, et on a déterminé l'incorporation (cpm= coups par minute) à l'aide d'un compteur de scintillations. Comme le montre le tableau de la figure 8, la prolifération des fibroblastes était fonction de la dose pour hrIL-la et hrIL-1l. On a obtenu une incorporation maximale de la [ H]-TdR avec 250 pg/ml d'hrIL-la ou 0. L'addition de la fraction inhibitrice obtenue sur AcA54 a conduit également à une complète diminution de la prolifération induite par l'hrIL-1. On a également obtenu une réversibilité totale de l'inhibition par accroissement des concentrations d'IL-1 ou par dilution de l'inhibiteur d'IL-1. On a également déterminé la spécificité de cette inhi- bition par stimulation des fibroblastes avec du hrTNFa qui 1s induit la prolifération des fibroblastes en fonction de la dose, jusqu'à des concentrations de 250 pg/ml. L'addition de la fraction inhibitrice obtenue sur AcA54 n'a pas eu pour résultat l'inhibition de l'activité biologique du hrTNFa. Cela confirme la spécificité de l'inhibiteur d'IL-1. Exemple 7 Détermination du point isoélectrique On a utilisé les fractions réunies de protéine éluées provenant de l'exemple 1(e), pour charger une colonne de chromatofocalisation PBE94 (2,5 x 10 cm) (Pharmacia Fine Che- micals, Suède), préalablement équilibrée avec de l'imidazole mM (pH 7,5). On a ajouté un polytampon 74 HCl, pH 4, qui a donné l'élution des protéines fixées, en fonction de leur point isoélectrique. On a constaté que le point isoélectrique de l'inhibiteur d'IL-1 était 4,7. Il doit être bien entendu que la description qui pré- cède n'a été donnée qu'à titre illustratif et non limitatif, et que toutes variantes ou modifications peuvent y être apportées sans sortir pour autant du cadre général de la présente invention, tel que défini dans les revendications ci-annexées. - 31 - REVENDICATIONS 1. Inhibiteur d'interleukine-1 (IL-1) pratiquement pur, l'inhibiteur d'IL1 étant caractérisé par une activité inhibitrice envers l'activité de facteur d'activation lympho- S cytaire (LAF) de l'IL-1, envers l'activité de facteur de cellules mononucléaires (MCF) de l'IL-1, envers la proliféra- tion de fibroblastes sous médiation par l'IL-1, et par une activité non inhibitrice envers la production de prostaglan- dine PGE2 et de collagénase sous médiation par le facteur nécrosant de tumeurs TNFa. 2. Inhibiteur d'IL-1 selon la revendication 1, carac- térisé par une activité inhibitrice envers la production d'interleukine-2 (IL-2) sous médiation par l'IL-1. 3. Inhibiteur d'IL-1 selon la revendication 1, carac- térisé en ce que l'inhibiteur d'IL-1 se fixe spécifiquement à des récepteurs d'IL-1 sur des cellules cibles. 4. Inhibiteur d'IL-1 selon l'une quelconque des reven- cations 1 à 3, caractérisé en ce que l'inhibiteur d'IL-1 a un poids moléculaire d'environ 25 000, mesuré par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE). 5. Inhibiteur d'IL-1 selon la revendication 4, carac- térisé en ce que l'inhibiteur d'IL-1 a un point isoélectrique de 4,5, mesuré par chromatofocalisation. 6. Inhibiteur d'IL-1 selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 5, caractérisé en ce que l'inhibiteur d'IL-1 est pratiquement exempt d'autres protéines. 7. Inhibiteur d'IL-1 selon la revendication 6, carac- térisé en ce que les autres protéines sont choisies parmi l'apolipoprotéine AI et l'a2-microglobuline (protéine fixant le rétinol). 8. Inhibiteur d'IL-1 selon la revendication 1, carac- térisé en ce que l'inhibiteur d'IL-1 a une activité spéci- fique d'au moins 1,2 x 103 U/mg dans un dosage de cellules EL-4/CTLL. - 32 - 9. Inhibiteur d'IL-1 selon la revendication 1, carac- térisé en ce que l'inhibiteur d'IL-1 a une activité spéci- fique d'au moins 3,8 x 104 U/mg dans un dosage de la liaison IL1/récepteur. 10. Inhibiteur d'IL-1 selon la revendication 1, carac- térisé en ce que l'inhibiteur d'IL-1 a une activité spéci- fique d'au moins 6,2 x 104 U/mg dans un dosage d'IL-1/LAF. 11. Inhibiteur d'IL-1 selon la revendication 1, carac- térisé en ce que l'inhibiteur d'IL-1 a une activité spéci- fique d'au moins 3,5 x 104 U/mg dans un dosage de cellules EL-4/CTLL. 12. Inhibiteur d'IL-1 selon la revendication 1, carac- térisé en ce que l'inhibiteur d'IL-1 a une activité spéci- fique d'au moins 3,0 x 104 U/mg dans un dosage d'IL-1/MCF (facteur de cellules mononucléaires). 13. Procédé de purification d'un inhibiteur d'IL-1 selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, comprenant les étapes a) de concentration d'urine provenant de patients fébriles; b) de précipitation d'inhibiteur d'IL-1 provenant de l'urine concentrée; et c) de séparation de l'inhibiteur d'IL-1 d'avec des contaminants par fractionnement par au moins une technique parmi la chromatographie d'échange ionique, la chromatographie hydrophoble, la filtration sur gel et l'immunoabsorption. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'on précipite l'inhibiteur d'IL-1 brut à partir de l'urine concentrée, en utilisant du sulfate d'ammonium. 15. Procédé de purification d'un inhibiteur d'IL-1 selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, comprenant la séparation de l'inhibiteur d'IL-1 d'avec des contaminants par fractionnement par au moins une technique parmi la chromatographie d'échange ionique, la chromatographie hydro- phobe, la filtration sur gel et l'immunoabsorption. 16. Procédé selon la revendication 13 ou 15, caracté- risé en ce que la chromatographie d'échange ionique est - 33 - effectuée sur des colonnes de QAE- ou DEAE-Sepharose, indé- pendamment ou en combinaison. 17. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la filtration sur gel est effectuée sur un gel AcA54. 18. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'on effectue l'immunoabsorption en utilisant des anticorps monoclonaux ou polyclonaux contre l'apolipopro- téine AI et l'a2-microglobuline (protéine fixant le rétinol). 19. Procédé de préparation d'une molécule d'ADN recom- binant caractérisée par une séquence d'ADN codant pour un inhibiteur d'IL-1 selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, comprenant les étapes suivantes: (a) détermination de la séquence d'acides aminés d'un inhibiteur d'IL-1 purifié; (b) préparation d'un ensemble de sondes oligonucléoti- diques basées sur la séquence d'acides aminés de l'étape (a>; (c) criblage d'une librairie d'ADN ou d'ADNc; (d) sélection de clones qui s'hybrident aux sondes dans des conditions classiques; et (e) analyse des clones sélectionnés, par séquençage ou expression, afin de déterminer s'ils contiennent une séquence d'ADN codant pour l'inhibiteur d'IL-1. 20. Molécule d'ADN recombinant, comprenant une séquence d'ADN qui, lors de l'expression, code pour un inhi- biteur d'IL-1 selon l'une quelconque des revendications 1 à 12. 21. Molécule d'ADN recombinant selon la revendica- - tion 20, comprenant en outre une séquence de contrôle de l'expression, ladite séquence de contr8le de l'expression étant fonctionnellement liée à la séquence d'ADN qui code pour l'inhibiteur d'IL-1 dans la molécule d'ADN recombinant. 22. Molécule d'ADN recombinant selon la revendica- tion 21, caractérisée en ce que la séquence de contrôle de l'expression est choisie parmi le système lac, le système trp, le système tac, le système trc, des régions essentielles - 34 - d'opérateur et de promoteur de phage, la région de régulation de la protéine de revêtement fd, les promoteurs précoce et tardif de SV40, des promoteurs provenant de polyomavirus, adénovirus, d'adénovirus et de virus simien, le promoteur de la 3-phosphoglycérate kinase, les promoteurs de la phospha- tase acide de la levure, le promoteur des facteurs d'a-conju- gaison de la levure et des combinaisons de ceux-ci. 23. Procédé pour la production d'un inhibiteur d'IL-1 selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, comprenant l'étape de culture d'un hôte unicellulaire transformé par une molécule d'ADN recombinant selon la revendication 21 ou 22. 24. Composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'un inhibiteur d'IL-1 selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 ou produit par les procédés de l'une quelconque des revendications 13 à 18, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 25. Procédé pour le traitement de maladies immunes et d'inflammation, comprenant l'étape de traitement, d'une façon pharmaceutiquement a acceptable, d'un mammifère avec une composition selon la revendication 24.