FR 2614038 A1 19881021 FR 8705547 A 19870417 La présente invention concerne, d'une façon générale, la mise en oeuvre de réactions d'oxydation et de réduction de molécules organiques, dans un procédé combinant des réactions électrochimiques et des catalyses enzyma- tiques, et, en particulier, un procédé électroenzymatique de production d'un composé de pureté énantiomérique contrôlée. Les échanges d'électrons sont catalysés dans les organismes vivants par des enzymes nommées oxydoréductases. Ces enzymes sont particulièrement intéressantes en techno- logie enzymatique, car elles catalysent des réactions d'oxydation ou de réduction partielles. On peut mentionner, à titre d'exemple de ces enzymes, les déshydrogénases, et, notamment, les déshydrogénases à cosubstrat du type Nicotinamide Adénine Dinucléotide (ci-après désigné par l'abréviation NAD> ou Nicotinamide Adénine Dinocléotide Phosphate modifiés par la réaction. La mise en pratique de tout procédé du type précité suppose que l'on puisse recycler le co-substrat, à savoir, dans l'exemple susmentionné, le NAD (P) si l'on désire utiliser le sens 1 de la réaction ci-dessus, le bilan étant une oxydation du substrat réduit, ou bien le NAD acceptable. 2 2 62614038 Parmi les différentes méthodes de régénération (chimique, enzymatique, microbiologique et électrochimique), la régénération enzymatique, suivant laquelle on utilise une deuxième enzyme, ainsi que d'autres substrats, pour effectuer la régénération, est actuellement considérée comme étant la plus performante en capacité de recyclage. Toutefois, elle présente l'inconvénient de compliquer le procédé, en particulier parce qu'elle implique différentes étapes de séparation. En revanche, la régénération électro- chimique est particulièrement attrayante de ce point de vue, car il ne se forme aucun sous-produit; cependant, la régénération électrochimique est encore considérée dans la littérature comme étant peu performante. Dans le cadre des études qui ont conduit à la présente invention, on a constaté que, contrairement à ce préjugé, l'oxydation électrochimique du NADH en NAD peut être obtenue avec un très haut rendement (supérieur à 99, 99%'), ce qui permet d'obtenir au minimum 10 000 cycles de régénération. Il en résulte que la voie directe de l'oxydation d'un substrat dessus), utilisant des déshydrogénases, est applicable indutriellement par le procédé enzymatique. En revanche, la réduction électrochimique directe du NAD en NADH conduit à un nombre de cycles de régénération très faible, inférieur à 10, et, en conséquence, il n'est pas possible de faire appel à cette technique dans une application effectuée à l'échelle industrielle. Or, du point de vue économique, c'est précisément le sens de réduction (sens 2 du schéma réactionnel ci-dessus) qui est intéressant, car il conduit à des composés optiquement actifs qui présentent une pureté élevée et qui sont difficiles à préparer par des méthodes purement chimiques. A titre d'exemple, on peut citer la réduction chimique ou électrochimique d'une cétone non symétrique, qui conduit à un mélange racémique, difficile à purifier, de stéréoisomères D et L, en règle générale, en des quantités équimoléculaires. Comme on l'a indiqué ci-dessus, la présente invention s'intéresse à la production de ces composés optiquement actifs. Dans ce qui suit, on désignera par S, un substrat de départ, et par P, le produit d'arrivée, qui porte un carbone asymétrique. P peut se trouver sous deux formes isomériques optiquement actives notées respectivement D- P et L-P. Le mélange des deux formes (racémique> est noté D/L-P. Le problème à résoudre est celui d'obtenir, à partir de S (ou de D/L-P ou encore de l'isomère optique inverse de celui que l'on veut préparer) des composés réduits L-P ou D-P, de pureté énantiomérique contrôlée, sans avoir besoin de mettre en oeuvre de réduction électrochi- mique du NAD ou autre co-substrat de l'oxydoréductase utilisée. La solution apportée par la présente invention repose sur l'utilisation simultanée [1] de la réduction électrochimique non stéréospécifique du substrat S, conduisant au mélange racémique D/L-P, et [2) de l'oxydation inverse catalysée par l'enzyme oxydoréductase et stéréo- spécifique, conduisant au substrat S recyclé dans la réduction électrochimique non stéréospécifique, le co- substrat de l'enzyme étant avantageusement régénéré par oxydation électrochimique. Dans ces conditions, chaque cycle de S provoque un enrichissement en l'isomère qui n'a pas été impliqué dans l'oxydation stéréospécifique. Le schéma réactionnel des deux réactions principales [1] et [2], partiellement antagonistes, et de l'oxydation électrochimique du cosubstrat de l'enzyme utilisée, dans le cas o celle-ci est la Ldéshydrogénase dont le co-substrat est NAD, est le suivant: 4 2614038 cathode S + 2e + 2H+ - D/L-P [1] L-déshydrogénase L-P +NAD -... > S + NADH [2] NADH -> NAD' + H+ + 2e- Dans ce cas, l'isomère D-P n'étant pas transformé, chaque cycle de S provoque un enrichissement en D-P. De la mème manière, en choisissant une D-déshydrogénase, on peut enrichir le système en isomère L-P. La présente invention a donc d'abord pour objet un procédé électroenzymatique de production d'un composé de pureté énantiomérique contr6lée, respectivement D-P ou L-P, & partir d'un substrat S constitué par la forme oxydée du racémique correspondant D/L-P, ou dudit racémique D/L-P, ou encore de l'isomère optique inverse de celui que l'on veut préparer, caractérisé par le fait qu'on introduit, dans un réacteur électrochimique, respectivement ledit substrat S, ledit racémique D/L-P ou l'isomère optique inverse de celui que l'on veut préparer, ainsi qu'une enzyme oxydo- réductase capable de catalyser l'oxydation de l'isomère optique inverse de celui que l'on veut préparer; qu'on impose une différence de potentiel entre les électrodes, afin d'effectuer la réduction cathodique non stéréo- spécifique dudit substrat S, Jusqu'à obtention de l'isomère ayant la pureté énantiomérique recherchée; et qu'on régénère le co-substrat de ladite enzyme par oxydation anodique dans ledit réacteur électrochimique. Ce procédé s'applique notamment à la production de composés optiquement actifs, représentés par les formules générales.: H H I I R- C- COOH et R C- COOH. OH (I) 2 Lorsque l'on désire obtenir un composé de formule 0 OH R - C -COOH + 2H + 2e +NH------ R - CH - COOH + H2O il 3 i 2 O NH2 A titre d'exemples de composés que l'on peut préparer selon la présente invention, on peut citer l'acide lactique, l'acide malique, qui sont des composés de formule (I) - et leurs sels -, de nombreux acides a aminés, tels que l'a-alanine, qui sont des composés de formule (II). La liste des composés que l'on peut préparer n'est pas exhaustive, la seule condition étant que l'on puisse associer les deux réactions antagonistes qui sont à la base de l'invention, à savoir la réduction électrochimique non stéréospécifique et l'oxydation enzymatique stéréo- spécifique, selon les critères suivants: - disponibilité, ou possibilité d'induction dans un organisme vivant, de l'enzyme spécifique de l'isomère de P inverse de celui que l'on désire préparer; et - faisabilité de la réduction électrochimique de S dans des conditions physico-chimiques compatibles avec le fonctionnement de l'enzyme. On peut introduire, comme enzyme, une déshydro- On peut introduire, comme enzyme, une déshydro- 6 2614038 génase à co-substrat naturel comme NAD ou NADP, ou bien une oxydase, à co-substrat artificiel (c'est-à-dire n'inter- venant pas normalement dans les chaînes métaboliques>, choisi notamment parmi les accepteurs d'électrons comme les quinones, le ferrocène, le ferricyanure et des colorants, par exemple, le dichlorophénolindophénol. On peut citer, à titre d'exemples particuliers, les D- ou L-lactate déshydrogénases, la L-malate déshydro- génase, la L-alanine déshydrogénase et les D- ou L-amino acides oxydases. Selon l'invention, on conduit avantageusement la réaction en milieu solvant, notamment dans l'eau ou dans un solvant organique compatible avec le maintien de l'activité enzymatique, tout en permettant la fourniture de protons lors de la réduction, l'eau étant préférée. On peut également utiliser les mélanges eau-solvant organique. L'enzyme peut être en solution dans le milieu réactionnel, ou bien être immobilisée sur des particules non poreuses ou poreuses, comme les mousses décrites dans l'article de G. Broun, O. Thomas, G. Gellf, D. Domurado, A.M. BerJonneau et C. Guillon, Biotechnology and Bioengineering 15, 359-375 (1973), ces particules baignant dans le milieu réactionnel, ou encore l'enzyme peut être immobilisée sur l'anode, avantageusement comme décrit dans C. Bourdillon, J.P. Bourgeois et D. Thomas, Journal of American Chemical Society, Vol 102, lère page 4231 (1980). Dans le cas o l'on utilise, comme enzyme, une deshydrogénase à cosubstrat NAD ou NADP, le pH du milieu peut se situer entre 6 et 10 -1,5 V/ECS. Le potentiel de travail de l'anode est choisi de telle sorte que seul le NADH soit oxydé. Ceci ne pose pas en général de problème car les groupements GH ou NH2 des 7 2614038 produits ne sont oxydables qu'à partir de 1,5 V/ECS. Le choix du potentiel de fonctionnement de la cathode se pose dans les mêmes termes. La réduction parasite du NADH commence à partir de -0,9 V/ECS selon la réaction suivante: 2JAD + 2e- --- - -- IAD-IAD (dimÈre enzyzatiquement inactif) Le potentiel de travail est choisi de telle sorte que la vitesse de réduction de S soit supérieure à celle de la dimérisation du NAD. Il est possible néanmoins de tolérer la formation de ce dimère car il se réoxyde aisément en monomére enzymatiquement actif à l'anode vers 0,2 V/ECS. Ceci augmente la consommation d'énergie, mais permet de réduire si nécessaire les substrats à des potentiels inférieurs à -0,9 V/ECS. Dans le cas o l'on utilise, comme enzyme, une oxydase dont le cosubstrat est un accepteur d'électrons, le pH du milieu réactionnel peut se situer entre 4 et 8; le potentiel de travail de l'anode, entre 0,1 et 0,9 V/ECS; et le potentiel de travail de la cathode entre -0,7 et -1,5 V/ECS. Par ailleurs, selon l'invention, on peut utiliser une cathode réalisée en un matériau choisi parmi le mercure et le carbone; et une anode réalisée en un matériau choisi parmi le carbone et les métaux nobles platiné). Les électrodes peuvent revêtir diverses formes. Sur la figure 1 du dessin annexé, on a représenté le schéma réactionnel résumant le procédé dans le cas d'utilisation d'une L-lactate déshydrogénase comme enzyme et du pyruvate comme substrat. Les trois voies possibles d'utilisation du procédé apparaissent sur ce schéma, à savoir qu'en dehors de l'introduction de S et la transformation complète en D-P, on peut également ou bien introduire le racémique L/D-P et effectuer la résolution de ce racémique en D-P, ou bien introduire l'isomère L-P et effectuer son inversion de configuration. Le bilan global correspond & la disparition de S et/ou de L-P. On consomme uniquement de l'énergie électrique et des quantités catalytiques de NAD et d'enzyme. Sur la figure 2, on a représenté schématiquement un premier réacteur électrochimique 1 dans lequel le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre d'une manière extrêmement simple. Ce réacteur 1 comporte un unique compartiment sur le fond duquel repose une nappe de mercure 2, utilisée comme cathode. Le compartiment est rempli d'une solution 3 contenant un tampon acide/base servant d'électrolyte, l'enzyme et le substrat à transformer. Dans la solution 3, plongent une anode 4 en carbone (ou en titane platiné), ainsi qu'un agitateur 5. On conduit le procédé en discontinu en imposant une différence de potentiel entre les deux électrodes 2 et 4 Jusqu'à totale transformation du substrat. Sur la figure 3, on a représenté, schématiquement un second réacteur 100, à boucle de recyclage, pouvant également être utilisé pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention. Ce réacteur 100 comprend une enveloppe 100a renfermant une cathode 102, en feutre de carbone, et une anode 104, également en feutre de carbone , cathode et anode étant séparées par une membrane échangeuse d'ions 106 servant de séparateur entre les deux compartiments. Chaque électrode est relié à un collecteur de courant, respectivement 102& et 104&. La solution à traiter pénètre dans le compartiment anodique par la canalisation 107, elle est extraite de ce compartiment par la canalisation 108 et, de là,- elle est renvoyée dans le compartiment cathodique 102 d'o elle est extraite par la canalisation 109, laquelle comporte une première dérivation O19a qui est la canalisation de sortie des produits et une dérivation 109h, qui est dérivation de recyclage dans la canalisation d'entrée 107, une pompe 110 de recirculation se situant sur le trajet de cette dérivation 109h. Dans ce qui suit, on donnera deux exemples de mise en oeuvre du procédé selon la présente invention. Exemple 1 Production de D-lactate & partir de pyruvate Le schéma réactionnel est le suivant cathode 2H+ + pyruvate + 2e- > mélange racémique de D + L-lactate L-Lactate L-Lactate + NAD............-.> pyruvate + NADH déshydrogénase anode EADH à----------- >NAD + H + 2e Dans un réacteur du type de celui représenté sur la figure 2, contenant 100 cm de tampon phosphate pH 8, 0, 5X, 2 mg de L-lactate déshydrogénase (E.C.1.1.1.27.> (type 2 de la Société "SIGKA") et 7 mg de NAD, on introduit du pyruvate concentré Parallèlement, la différence de potentiel entre l'anode et la cathode est progressivement, en l'espace de 1/2 heure, portée à 1,8 Volt. L'état stationnaire du réacteur étant établi en 1 heure environ, l'alimentation en pyruvate et la différence de potentiel sont maintenues de telle sorte que la concentration en pyruvate soit toujours à -3, pour limiter la réaction inverse de la déshydro- génase. La réaction est poursuivie pendant 30 heures et le courant décroît lentement de 240 à 140 mA. On cesse d'introduire du pyruvate une heure avant l'arrêt du réacteur. La figure 4 montre l'évolution de la concentration en D-lactate dans le réacteur, en fonction du temps. La concentration atteint 45 g/i en D-lactate à l'arrêt du réacteur, dont moins de 1% de L-lactate et de pyruvate résiduels. La transformation d'une mole de pyruvate en D- lactate consomme 4xF coulombs, dans les conditions expérimentales cidessus (réacteur alimenté) Exemple 2 Production de D-lactate à partir du racémique D + L-iactate On procède comme indiqué à l'exemple 1, en introduisant du lactate racémique à la place du pyruvate. On obtient la même concentration en D-lactate qu'à l'exemple 1, en l'espae de 19 heures, avec des courants de l'ordre -de mA. Comme précédemment, le NAD a été régénéré environ 10 000 fois. La transformation d'une mole de racémique consomme 2xF coulombs dans les conditions expérimentales précitées. Exemple 3 Production en continu du D-malate à partir du mélange racémique D + L malate. Le schéma réactionnel est le suivant L-Nalate L-Xalate + NAD oxaloacétate + NADH déshydrogénase cathode oxaloacétate + 2H+ + 2e- > D + L-Malate racémique anode NADH - NAD + 2e- + 2H+ i1 2614038 Ce procédé est mis en oeuvre avec un réacteur à solution percolante, du type de celui représenté sur la figure 3. L'immobilisation de l'enzyme est réalisée par greffage direct de la protéine sur l'électrode de régéné- ration du NAD (anode). Cette configuration est particu- lièrement intéressante pour assurer le déplacement de l'équilibre thermodynamique, qui n'est pas en faveur de la formation d'oxaloacétate. Xéthode d'immobilisation de l'enzyme (morpholino-2 éthyl)-3 carbodiimide méthoxy p-toluène sulfonate prêt à l'emploi. Le fonctionnement du réacteur en situation stationnaire correspond aux paramètres suivants: - le volume de tampon de travail circulant dans la boucle du réacteur est de 100 cm; - le débit de la pompe de recyclage 110 est de 0,5 1/h; - le mélange racémique contenant 1 mole par litre de malate et 10-4 mole par litre de NAD dans le tampon de travail est introduit par la canalisation 107 avec un débit de cm /h 12 26 614038 - la différence de potentiel entre l'anode et la cathode est maintenue à 1,7V et le courant résultant est d'environ 0,3 Ampère; - les concentrations des espèces dans le réacteur à l'état stationnaire sont de 10 -2M pour la somme -4 oxaloacétate + L)-malate, 10 pour NAD + NADH, et 1X pour D-malate. Ces concentrations sont celles obtenues dans la canalisation de sortie 109&. Le D-malate est pur à 1% près dans cette expérience. Cette pureté peut être augmentée ou réduite par ajustement du débit de la pompe de recyclage 110. REVENDICATIONS 1 - Procédé électroenzymatique de production d'un composé de pureté énantiomérique contrôlée, respectivement D-P ou L-P, & partir d'un substrat S constitué par la forme oxydée du racémique correspondant D/L-P, ou dudit racémique D/L-P, ou encore de l'isomère optique inverse de celui que l'on veut préparer, caractérisé par le fait que l'on introduit, dans un réacteur électrochimique, respectivement ledit substrat S, ledit racémique D/L-P ou l'isomère optique inverse de celui que l'on veut préparer, ainsi qu'une enzyme oxydoréductase capable de catalyser l'oxydation de l'isomère optique inverse de celui que l'on veut préparer; qu'on impose une différence de potentiel entre les électrodes, afin d'effectuer la réduction cathodique non stéréospéci- fique dudit substrat S, Jusqu'à obtention de l'isomère ayant la pureté énantiomérique recherché; et qu'on régénère le co-substrat de ladite enzyme par oxydation anodique dans ledit-réacteur électrochimique. 2 - Procédé électroenzymatique selon la revendi- cation 1, caractérisé par le fait que l'on introduit, en tant que substrat S, un acide carboxylique a-cétonique ou un acide carboxylique a-cétonique en présence d'ammoniaque. 3 - Procédé électroenzymatique selon la revendi- cation 1, caractérisé par le fait que l'on introduit, en tant que racémique D/L-P, un acide a alcool ou un acide " aminé. 4 - Procédé électroenzymatique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que l'on introduit, en tant qu'enzyme, une déshydrogénase ou une oxydase. - Procédé électroenzymatique selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'on choisit une déshydrogénase dont le co-substrat est un cosubstrat naturel de type Nicotinamide Adénine Dinucléotide ou Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate. 6 - Procédé électroenzymatique selon la revendi- 26 1 4 038 cation 4, caractérisé par le fait que l'on choisit une oxydase dont le cosubstrat est un co-substrat artificiel, choisi notamment parmi les quinones, le ferrocène, le ferricyanure et les colorants accepteurs d'électrons. 7 - Procédé électroenzymatique selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que l'on conduit la réaction en milieu solvant, notamment dans l'eau ou dans un solvant organique, ou dans un mélange d'un solvant organique avec l'eau, ledit solvant organique étant compatible avec le maintien de l'activité enzymatique, tout en permettant la fourniture de protons lors de la réduction. 8 - Procédé électroenzymatique selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que l'enzyme est en solution dans le milieu réactionnel. 9 - Procédé électroenzymatique selon l'une des revendications 1 & 7, caractérisé par le fait que l'enzyme est immobilisée sur des particules poreuses ou non,baignant dans le milieuqréactionnel. - Procédé électroenzymatique selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que l'enzyme est immobilisée sur l'anode. 11 - Procédé électroenzymatique selon l'une des revendications 1 & 10, suivant lequel on utilise, comme enzyme, une déshydrogénase dont le co-substrat est NAD ou NADP, caractérisé par le fait que le pH du milieu réactionnel se situe entre 6 et 10; le potentiel de travail de l'anode, entre 0,5 et 0,9 V/électrode au calomel et KCl saturé (ECS) et le potentiel de travail de la cathode, entre -0,7 et -1,5 V/ECS. 12 - Procédé électroenzymatique selon l'une des revendications 1 à 10, suivant lequel on utilise, comme enzyme, une oxydase dont le co-substrat est un accepteur d'électrons, caractérisé par le fait que le pH du milieu réactionnel se situe entre 4 et 8; le potentiel de travail de l'anode, entre 0,1 et 0,9 V/ECS; et le potentiel de travail de la cathode, entre -0,7 et -1,5 V/ECS. 2614038 13 - Procédé électroenzymatique selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé par le fait qu'on utilise une cathode réalisée en un matériau choisi parmi le mercure et le carbone, et une anode réalisée en un matériau choisi parmi le carbone et les métaux nobles. 14 - Composé énantiomériquement pur obtenu par le procédé tel que défini à l'une des revendications 1 à 13.