FR 2618794 A2 19890203 FR 8710621 A 19870727 La présente demande de Certificat d'Addition constitue un développement de la demande de brevet FR 87 01925 à laquelle on pourra se référer utilement pour la meilleure intelligence de la présente invention. La présente invention concerne en effet également le clonage du gène de structure de la nitrate réductase de tabac, ainsi qu'une sonde d'ADN obtenue. Les plantes supérieures assimilent l'azote minéral essentiellement par la voie des nitrates. L'en- zyme impliquée dans la première étape enzymatique de cette assimilation est la nitrate réductase (NR). Cette enzyme est présente à l'état de traces dans les tissus végétaux o elle représente au maximum 1/10000ème des protéines totales. Le clonage du gène de structure de la nitrate réductase et sa réintroduction dans une plante sont du plus grand intérêt pour favoriser le développement des plantes que ce soit au niveau foliaire ou racinaire. Dans la demande de brevet principal FR 87 01925 un ADN complémentaire de l'ARN messager de cette enzyme a été identifié notamment par criblage immunologique d'une librairie d'ADNc construite dans le phage Xgtll. L'iden- tification de cet ADNc a été confirmée, d'une part par mesure de la taille du messager auquel il s'hybride (3,5 kb) et, d'autre part par immunosélection d'IgG reconnaissant la chaîne polypeptidique pour laquelle cet ADNc code et par démonstration de l'effet inhibiteur de ces IgG sélectionnées sur l'activité enzymatique de la nitrate réductase. La demande de brevet principal a donc pour objet un vecteur de clonage comportant un ADN complé- mentaire (ADNc) de l'ARN messager (ARNm) de la nitrate réductase de tabac. Parmi ces vecteurs sont cités les vecteurs comportant un ADN complémentaire de 1'ARNm de la NR de tabac comportant sur un fragment EcoRI/EcoRI de cet ADNc, dans l'ordre, les sites suivants XmnI, Hind III, KpnI, EcoRI ou KpnI, Hind III, XmnI, EcoRI. Ces vecteurs sont de préférence des vecteurs constitués d'un phage dans lequel est inséré l'ADNc. Les ADNc isolés dans les exemples représentent plus de 50 % de l'ARNm de la NR de tabac, les inserts ayant d'une manière générale plus de 1,6 kb. La présente invention a pour objet un vecteur de clonage comportant un fragment d'ADNc de l'ARNm de la nitrate réductase de tabac, consistant dans la séquence codante de nucléotides suivante: GAA TTC CCT TCT AA GAA TTC CCC GTT AC CTT GTT TOT GCT CGC AT CGA AGG AAA GAA CAG AAC ATG GTT AAA CA ACC ATT CGGT TTC AAC TGG CCC CCC OCT CCC GTT TCA ACA ACG ATA TCGG CGC GC OGTA CCC CTC CGC GCT TTC CTA AAA CGG TGC CGT GTT TTT AGC AAC AAT AAA GCG GCG CTT AAT GTT TGC TTC GAA GGA GCT GAT GTG TTG CCC GGA GGT CGT GGT TCA AAG TAT GGA ACC AGC ATT AAG AAG GAA TTT GCA ATG GAT CCA GCA CGA GAT ATC ATC GTA GCC TAC ATG CAG AAC GGA GAA AAA TTG GCA CCC GAC CAC GGG TTT CCA GTA CGA ATG ATA ATT CCA GGA TTC ATT CGGA GGA AGA ATG GTG AAA TGG ATA AAG AGG ATT ATA GTC ACC ACC C&A GAA TCA GAC AGC TAT TAT CAT TTC AAG GAC AAT AGA GTT CTT CCT CCC CAT GTT GAT OCT GAA CTTr GCA AAT ACC GAA GCA TGGO TGG TAC AAG CCA GAG TAT ATC ATC AAT GAG CTT AAT ATT AAC TCT GTC ATT ACO ACG CCG TGT CAT GAA GAA ATT TTG CCA ATT AAC GCC TGG ACG ACT CAG CGA CCT TAC ACG TTG AGG GGC TAT TCT TAT TCT GGC GGA GGG AAA AAA GTA ACG CGA GTA GAA GTG ACG TTG GAT GGA GGA GAA ACA TGG CAA GTT AGC ACA CTA GAT CAC CCA GAG AAG CCC ACC AAA TAT GGC AAG TAC TCGG TGT TOGG TGC TTT TGG TCA CTC GAG.GTT GAG GTG TTA GAC TTId CTC ACT GCT AAA GAA ATT GCT GTT CGA GCT TGG GAT GAG ACC CTC AAT ACT CAA CCC GAG AAG CTT ATT TGG AAC GTC ATG GGA ATG ATG AAT AAT TGC TGG TTC CCA GTA AAG ATG AAT GTG TGC AAG CCT CAC MAAG GGA GAG ATT GGA ATA GTG TTT GAG CAT CCG ACT CAA CCT GGA AA MC CMAA TCA GGT GGA TGG ATG GCG AAG GAG AGA CAT TTG GAG ATA TCA GCA GAG GCA CCT CAA ACA CTA AAG AAG AGT ATC TCA ACT CCA TTC ATG MAAC ACA GCT TCC AAG ATG TAC TCC ATG TCC GAG GTC AGG MAAA CAC AGC TCT GCT GAC TCT GCT TGG ATC ATA GTC CAT GGT CAT ATC TAT GAC CCC ACG CGT TTC TTG AAA GAT CAC CCT GGT GGG ACT GAC AGC ATT CTC ATC AMT GCT GGC ACT GAT TGC ACT GAC GAA TTT GAT CCA ATT tAT TCT GAT AAMG GCT MAAG AAG CTC TTG GAG GAT TTC AGG ATT GGT GAA CTC ATA ACT ACT GGT TAC ACC TCT GAC TCT CCT GGC MC TCC TCO CAC GGA TCT TCT TCC TTC AGC AGC TTT CTA GCA CCT ATT MAAG GAA CTT GTT CCA GCG CAG AGG AGT GTG GCC CTA ATT CCA AGA GAG MA ATC CCA TGC AAA CTC ATC CAC MAAG CMAA TCC ATC TCC CAT GAT GTT AGG AAA TTT CGA TTT GCA TTG CCC TCT GAG GAT CM GTC TTG CGC TTC CC GCT TT CGA AAA CAT ATC TTC CTC TGT GCC CTT ATT GAC GAT AAG CTC TGC ATG CGC GCT TAC ACG CCT ACT AGC ACG ATC CAT CGAC GTG GGG TAC TTC GAG TTG GTT GTC AAG ATA TAC TTC AAA CGA ATT La présente invention a également pour objet une sonde d'ADN complémentaire de l'ARN messager de la nitrate réductase de tabac comportant la séquence codante de nucléotidesdu tableau I. Cette sonde peut être exploitée notamment pour l'isolement du gène correspondant qui permet de créer des plants différents dans leurs caractéristiques d'assi- milation des nitrates. L'invention sera explicitée dans la description qui va suivre, celle-ci étant faite en référence aux figures 1 (a-b) et 2 (a-b). Les figures la et lb représentent la séquence de nucléo- tides de l'insert d'ADNc du phage recombinant lambda 13-29, tel que décrit dans la demande de brevet principal et la séquence d'aminoacides correspondante de la partie d'ADNc codée de la protéine de fusion exprimée par ce phage. Les nucléotides sont représentés sur la ligne supérieure et les aminoacides sur la ligne inférieure. Ils sont les uns et les autres numérotés sur la colonne de droite. Les nucleotides aux extrémités, représentés en petites lettres, correspondent aux séquences de la béta-galactosidase. Les séquences soulignées se réfèrent aux deux sites analysés dans les figures 2a et 2b. Les figures 2a et 2b représentent l'alignement de la séquence d'aminoacides de la nitrate réductase dans le site d'attachement à l'haemine et les sites FAD/NADH avec les protéines de la superfamille du cytochrome b5 et la réductase de cytochrome b5 d'erythrocyte humain (RDHUB5). Les séquences identiques avec la NR de tabac sont encadrées. Les restes du site d'attachement à l'haemine ont été numérotés selon les conventions pour le cytochrome b5 de bovin avec les deux histidines liant à l'haemine numéroté His-39 et His-63 (B ?). Le site FAD/NADH a été numéroté à partir du reste N-terminal de la réductase de cytochrome b5 (R ?). Sur ces figures 2a et 2b, les différenteç abréviations suivantes représentent: CBRT5M: cytochrome b5 de mitochondrique de rat (Lederer et al. 1983) (1) CBRT5: cytochrome b5 microsomique de rat (Ozols et Heinemann 1982) (2) CBHO5: cytochrome b5 microsomique de cheval (Ozols et al. 1976) (3) CBRU5: cytochrome b5 microsomique humain (Ncbrega et Ozols. 1971) (4) CBCH5: cytochrome b5 microsomique de poulet (Nobrega et Ozols. 1971) (5) NRTOB: nitrate réductase de tabac (présente invention) NRNEU: nitrate réductase de Neurospora Crassa (Le et Lederer 1983) (6) FLAVB2: flavocytochrome b2 de levure (Lederer et al. 1985) (7) SULFOX: sulfite oxydase de poulet (Guiard et Lederer 1979b) (8). La séquence nucléotidique de la présente inven- tion provient du clone 13-29 décrit dans la demande de brevet principal. Longue de 1662 bases, elle comprend les sites EcoRI, mais ne contient pas de séquences poly- adénylées. Parmi les six cadres de lecture possibles de la séquence, un seul se fait sans interruption par un codon stop et code pour une cha!ne polypeptidique de 554 aminoacides avec une masse moléculaire de 62,175 dalton. Ce cadre de lecture ouvert correspond à une fusion de traduction avec la séquence de la bêta- galactosidase du vecteur. Ce cadre de lecture représente environ 55 % de la taille de l'apoenzyme de nitrate réductase de tabac. Comme présentés sur les figures 1 (a-b) et 2 (a-b), deux domaines d'homologie importante sont observes. De la position 360 à 435, la nitrate réductase de tabac présente une homologie de séquence de 35 à 50% avec les protéines de la superfamille du cytochrome b5, soit avec le cytochrome b5, le flavocytochrome b2 ou la sulfite oxydase selon Guiard et Lederer (1979a) (8). Le et Lederer (1983) (6) ont isolé par protéolyse de la chymotrypsine, le site d'attachement à l'haemine de la nitrate réductase de Neurospora Crassa et montré son homologie avec la famille du cytochrome b5. Une homologie entre la séquence d'aminoacide de la nitrate réductase de tabac et le domaine d'attache- ment à l'haemine de la nitrate réductase fongique est également observée comme on s'y attendait. De la position 476 à 552, la séquence d'amino- acides de la nitrate réductase de tabac présentait une identité de 57 % avec la séquence N-terminale de la ré- ductase de cytochrome b5 humaine (Yubisui et al. 1984) (3). Cette flavoenzyme FAD est connue pour former un complexe binaire avec le cytochrome b5 en effectuant un transfert d'électrons à partir du NADH par divers pro- cessus physiologiques d'oxydoréduction. Comme l'ont montré Le et Lederer 1983 (6), le site d'attachement à l'haemine de la nitrate réductase de Neurospora Crassa est un membre de la superfamille du cytochrome b5. Nos résultats montrent que l'enzyme de tabac présente également une homologie significative avec différents membres de la superfamille. L'homologie du cytochrome b5 recouvre entièrement le domaine d'attache- ment à l'haemine des diverses protéines. Cette séquence définit donc vraisemblablement le site d'attachement à l'haemine de nitrate réductase de tabac. Les treize aminoacides conservés de la super- famille (Lederer et al. 1985)(7) sont présents dans notre séquence de nitrate réductase de tabac qui apparaît plus proche du cytochrome b5 de poulet que des autres membres de la superfamille (figures 2 a-b). La relative différence existant entre les nitrates réductases de plantes et de champignons tend à indiquer une évolution dissemblable pour cette enzyme. Une homologie significative de la séquence co- dante de l'ADNc cloné avec la réductase cytochrome b5 flavoprotéine humaine a aussi été détectée. Cette proté- ine est connue pour catalyser la réduction du cytochrome b5 utilisant NADH comme donneur d'électrons et FAD comme intermédiaire d'oxydoréduction. Ceci peut être comparé fonctionnellement à la réaction catalytique de réduction des nitrates mettant en oeuvre NADH, FAD et le cytochrome b5 comme cofacteurs. Ceci suggère que cette seconde sé- quence homologue est le fragment N-terminal du site NADH/FAD de nitrate réductase de tabac. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES (1) LEDERER F., GHRIR R., GUIARD B., CORTIALS S., ITO A. (1983) Two homologous cytochrome b5 in a single cell. Eur. J. Biochem. 132: 95-102 (2) OZOLS J., HEINEMANN F.S. (1982) Chemical structure of rat liver cytochrome b5. Isolation of peptides by high-pressure liquid chromatography. Biochem Biophys. Acta 704: 163-173 (3) OZOLS J., GERARD C. , NOBREGA F. (1976) Proteolytic cleavage of horse liver cytochrome b5. Primary structure of the heme-containing moiety. J. Biol. Chem. 251: 67676774 (4) (5) NOBREGA F.G., OZOLS J. 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Vecteur de clonage comportant un ADN complé- mentaire de l'ARNm de la nitrate réductase de tabac, selon l'une des revendications 1 à 6 de la demande de brevet principal, consistant dans la séquence codante de nu- cléotides suivante: GAA TTC CCT TOT ACA GAA TTG CCC CTT ACG CTT CTT TGT GCT CGC AAT CGA ACC AAA OA CAG AAC ATG GTT AA CAA ACC ATT GGT TTC AAC TCC CCC CCC OCT CCC CTT TCA ACA ACG ATA TCG CCC GGC CTA CCC CTC CCC GCT TTG CTA AMAA CGG TGC GGT GTT TTT-AGC AAC AAT AAA CCC GCG CTT AAT GTT TGC TTC GA GGA CCT GAT GTG TTG CCC CGA GGT GGT GGT TCA AAG TAT GGA ACC AGC &TT AAG AAG GAA TTT GC& ATG GAT CCA GCA CGA GAT ATC ATC GTA GCC TAC ATG CAG AAC CGA GAA AA TTC GCA CCC GAC CAC GGG TTT CCA GTA CGA ATG ATA ATT CCA GGA TTC ATT GGA GC GA AATG GTG MAA TGG ATA AAG AGG ATT ATA GTC ACC ACC CAA GAA TCA GAC AGC TAT TAT CAT TTC AC CAO &AT AGA GTT CTT CCT CCC CAT GTT GAT GCT GAA CTT GCA AAT ACC GAA GCA TGG TGG TAC AAG CCA GAG TAT ATC ATC AAT GAG CTT &AT ATT AAC TCT GTC ATT ACG ACG CCG TGT CAT GAA GAA ATT TTG CCA ATT LAC CCC TGG ACG ACT CAG CGA CCT TAC ACG TTG ACGG GGC TAT TCT TAT TCT GGC GGA GGG AAA AAA GTA ACG CGA GTA GAA GTG ACG TTG GAT GGA GGA GAA ACA TGG CAA GTT AGC ACA CTA GAT CAC CCA CAG AAGC CCC ACC AAA TAT GGC AAG TAC TGG TGO TGG TGC TTT TGG TCA CTC GAG GTT GAG GTG TTA GAC TTG CTC AGT GCT AAA GAA ATT GCT GIT CGA CCT TGG GAT GAG ACC CTC AAT ACT CAA CCC GAG AAG CTT ATT TCG AAC GTC ATG GGA ATG ATG AAT AAT TGC TGG TTC CGA GTA AAG ATG AAT GTG TGC AAG CCT CAC AACG GGA GAG ATT GGA ATA GTG TTT GAG CAT CCG ACT CAA CCT GGA AAC CAA TCA GGT GGA TGG ATG GCG AACG GAG AGA CAT TTG GAG ATA TCA GCA GAG GCA CCT CAA ACA CTA AAG AAG AGT ATC TCA ACT CCA TTC ATG AAC ACA GCT TCC AAG ATG TAC TCC ATG TCC GAG GTC AGG AAA CAC AGC TCT GCT CAC TCT GCT TGG ATC ATA GTC CAT GGT CAT ATC TAT GAC CCC ACG CGT TTC TTG AAA GAT CAC CCT GGT GGG ACT GAC AGC ATT CTC ATC AAT GCT GGC ACT GAT TGC ACT CAO GAA TTT GAT GCA ATT tAT TCT CAT AACG GCT AAG AAG CTC TTG GAG GAT TTC AGG ATT GGT GAA CTC ATA ACT ACT GGT TAC ACC TCT GAC TCT CCT GGC AAC TCC GTG CAC GGA TCT TCT TCC TTC AGC AGC TTT CTA GCA CCT ATT AAG GAA CTT GTT CCA GCG CAC AGG AGT GTG GCC CTA ATT CCA AGA CAG AAA ATC CCA TGC AAA CTC ATC GAC AAG CAA TCC ATC TCC CAT GAT GTT AGG AAA TTT CGA TTT GCA TTG CCC TCT GAG GAT CAA GTC TTG GGC TTG CCT GTT GGA AAA CAT ATC TTC CTC TOGT GCC GTT ATT tAC CAT AAG CTC TOC ATG CGC GCT TAC ACG CCT LCT AGC ACG ATC GAT GAG GTG CGG AC TTC CAC TTC GTT GTC AACG ATA TAC TTC AM CGA ATT 2. Sonde d'ADN complémentaire de l'ARN messager de la nitrate rêductase de tabac comportant la séquence codante de nucléotides du vecteur de clonage selon la revendication 1.