FR 2615514 A2 19881125 FR 8706916 A 19870518 La présente addition concerne le clonage et la Ca- ractérisation des gènes correspondant aux premières étapes de la biosynthèse de la biotine chez les bactéries. Le brevet principal décrit le clonage et l'expression des séquences d'ADN codant pour les gènes bioA, bioD et bioF de la biosynthèse de la biotine. Comme cela est décrit dans le brevet principal, l'utilisation de vecteurs d'expression portant les gènes précédents permet de transformer des bactéries afin de leur faire produire de la biotine en partant de différents vitamères de ce produit. Toutefois, la préparation de la biotine ne peut être envisagée de façon réellement économique sur le plan industriel que si le vitamere de départ est le pimélate, c'est pourquoi il convenait de pouvoir également assurer l'expression des gènes correspondant aux premières étapes de la biosynthèse de la biotine chez les bactéries, à savoir . le gène bioC, et . le gène bioH. C'est pourquoi la présente addition concerne, tout d'abord, des séquences d'ADN conformes au brevet principal caractérisées en ce qu'elles codent pour les enzymes produits des gènes : . bioF et bioC . bioF et bioH . bioF, bioC et bioH. Plus particulièrement, la présente addition concerne une séquence d'ADN, caractérisée en ce qu'elle correspond à tout ou partie de la séquence décrite dans les figures 2, 3 et 4. De façon générale, la présente addition concerne des séquences d'ADN caractérisées en ce qu'elles codent pout les enzymes produits du gène H ou du gène C. De façon préférable, les séquences d'ADN codant pour les enzymes produits du gene H ou du-gène C porteront également les séquences codant pour l'un des gènes décrits précédemment, à savoir le gène bioA le le gène bioD le gène bioF. Comme cela La été décrit précédemment dans le brevet principal, de préférence les séquences d'ADN en cause pourront être portées par un vecteur plasmidique susceptible d'assurer la transformation d'une bactérie et comportant l'ensemble des éléments assurant l'expression des gènes correspondants. Ceplasmide pourra, comme cela a été indiqué, être de type autonome et auto-réplicable ou bien, au contraire, être non réplicable mais prévu pour assurer son intégration dans le chromosome de- la souche hôte. Pour ce faire les différentes technologies à mettre en oeuvre ont été décrites au brevet principal. Ainsi, dans le cas d'un vecteur non réplicable d'in tégration, celui-ci devra comporter au moins~ une séquence homologue d'une séquence présente dans le génome de la souchi à transformer, ce qui permettra d'assurer lintégration chro mosomique. I1 pourra évidemment s'agir, soit d'une séquence homologue correspondant à une séquence génomique naturelle, soit d'une séquence homologue introduite par un autre vecteu plasmidique d'intégration. De même, ces différents vecteurs plasmidiques pourront comporter des éléments assurant une Sélection tels qu'un gène de résistance à un antibiotique et/ou un gène marqueur, sous la dépendance d'un promoteur de la souche à transformer. Parmi les cellules pouvant servir de souche hôte, il faut mentionner plus particulièrement les bactéries, notamment des genres Escherichia, Bacillus et Pseudomonas ainsi que les levures, en particulier les levures du genre Saccharomyces. Parmi les cellules hôtes particulièrement intéressantes, il faut citer Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis et Escherichia coli. Enfin, les souches plus particulièrement intéressantes pour être transformées par les séquences d'ADN selon la présente addition, sont les souches qui ont déjà été transformées par des vecteurs assurant l'expression des autres gènes de cette voie de biosynthèse, c'est-à-dire les gènes F, A, D et B tels qu'ils sont décrits dans le brevet principal. Dans ces conditions, l'introduction des gènes bioC et bioH dans la bactérie permet à cette bactérie de synthétiser la biotine à partir du premier vitamere de la chaine, à savoir le pimélate, ce qui présente un intérêt économique important sur le plan industriel. Les exemples ci-après sont plus particulièrement destinés à mettre en évidence d'autres avantages et caractéristiques de la présente addition. Les figures suivantes complètent les exemples la figure la représente la carte de restriction de l'insert de B. sphaericus utilisé dans les plasmides suivants . la figure lb schématise les plasmides pTG1418 et pTG1420 . la figure lc schématise les plasmides pTG1422 et pTG1435 la figure ld schématise les plasmides pTG1436 et pTG1437 . la figure 2 représente la séquence LORF X . la figure 3 représente la séquence LORF W la figure 4 représente la séquence LORF F . la figure 5 schématise le plasmide pTG1440 . la figure 6a représente la carte de restriction de l'insert du plasmide pTG1418 . les figures 6b et 6c représentent les différents plasmides dérivés du pTG1418 utilisés dans les tests de complémenta tion. Exemple 1 Complémentation du mutant de B. subtilis bioll2 TG3 (dérivé de JKB 3112, bioC/F-112 aroG932) par transformation intégrative avec pTGl4l8 et dif férents dérivés de celui-ci. Le mutant bioll2 de B. subtilis a été identifié par des tests nutritionnels comme affecté dans la fonction bioF ou bioC (C.H. Pai, 1975, J. Bacteriol 121, 1-8). Dans c mutant, le plasmide pTG475 a été intégré au niveau du locus sac R - sac B, suivant la méthodologie décrite dans le breve principal ; la nouvelle souche ainsi obtenue a été dénosmée bioll2 TG3. La transformation de la souche bioll2 TG3 par dxf- férents plasmides (pTG1418, 1420, 1422, 1435, 1436 et 1437, représentés dans la figure la à ld) a été effectuée, suivie d'une sélection sur milieu LB + chloramphenicol 10 pg/ml + avidine 500 U/1. Les résultats de complémentation sont résumés dans le tableau 1. Comme le test croisé avec le mutant R874 (bioF, his) de E. coli donne lue même résultat, il est vraisemblable que le mutant bioll2 de B. subtilis est affect dans le gène bioF. En analysant les complémentations obtenue en fonction des plasmides utilisés, il est possible de localiser le gène bioF sur l'insert de pTG1418 au niveau dtun fragment délimité par les sites de restriction XmnI et NcoI (voir figure 6). Tableau 1 z Transformation intégrative de la souche de B. subtilis bioll2 TG3. Plasmide Insert complémentation sur LB + 500 U/1 avidine + 10 y/ml 8 chloramphenicol Insert HindIII de ++ I 5.1 kb pTG1422 Insert ClaI de 3.1 ++ kb contenant bioF et une partie de LORF t;; pTG1420 Insert ClaI-HindIII de 2 kb contenant X et une partie de LORF 11 pTG1436 Insert XmnI-NcoI de ++ 1.3 kb contenant le gène bioF pTG1437 Insert NcoI-XmnI de ++ 1.3 kb contenant le gène bioF pTG1435 Insert HpaI-PvuII de 0.6 kb contenant le LORF X Exemple 2 Séquence nucléotidique de l'insert HindIII de 4,53 kb du plasmide pTG1418. L'insert HindIII a été cloné dans le M13TG131 au niveau du site correspondant du polylinker. La méthode dite "cyclone" a été appliquée sur ce pLasmide M13TG1425 et les résultats analysés par ordinateur. Les quelques différences de lecture entre les deux brins complémentaires ont été éclaircies par séquençage à l'aide d'oligonucléotides spécifiques. La séquence est détaillée dans les figures 2 & 4. Il apparatt que cet insert comporte trois cadres ouverts de lecture, codant respectivement pour des protéines (sous-unités) d'un poide moléculaire de 18462, 28048 et 42940 daltons. Le dernier gène, par rapport au sens de lecture, se trouve localisé dans la région identifiée comme bioF, le poids moléculaire de cette protéine de B. sphaericus étant du même ordre de grandeur que celui de la KAPA synthétase de E. coli (M.k. Eisenberg, 1973, Adv. Enzymol 38, 317-372). La juxtaposition des trois cadres ouverts de lecture pourrait entre, comme dans le cas de l'insert du plasmide pTG1400, typique d'une structure opéronique. I1 est à noter que l'on peut identifier, en amont du premier gène, une séquence de quinze paires de bases (soulignée dans la figure 2 présente également en amont du premier gène (bioD) de l'insert du plasmide pTG1400. Cette caractéristique significativ pourrait indiquer que les deux groupes de gènes biotine de B sphaericus sont soumis au moins à une régulation commune. Celle-ci pourrait correspondre au contrôle par la biotine (o un dérivé de cell-ci), comme cela a déjà été décrit pour la KAPA synthétase (bioF) de B. sphaericus (Y. Yzumi, K. Sato, Y. Tani et K. Ogata, 1973, Agric. Biol. Chem. 37, 1335). Du côté 3' du dernier gène de l'insert séquencé, un séquence présentant les caractéristiques d'un terminateur de transcription peut être identifiée (soulignée dans la figure Exemple 3 Complémentation des mutants E. coli R878 (bioC, his) et C261 (bioFCD, his) respectivement, à l'aide des plasmides pTG1418 (1433) et pTGl44O. La méthodologie traditionnelle des complémentations de mutants bio de E. coli a été appliquée en utilisant le plasmide pTG1418 et différents dérivés de celui-ci. Lorsque des cellules compétentes du mutant E. coli R878 (bioC, his) sont transformées avec les plasmides pTG1418 et pTG1433 (voir tableau 2), puis ensuite étalées sur milieu LB + ampicilline 100 )Ig/ml + avidine 200 U/1, une croissance est détectée après 36 h d'incubation à 37il. La fréquence d'apparition des clones transformés sur ce milieu est du même ordre de grandeur que celle mesurée sur le milieu LB + ampicilline 100 Rg/ml. Tableau 2 : Transformation du mutant E. coli R878 bioC. Nom- bre de transformants par microgramme d'ADN. Plasmide Sélection sur milieu Sélection sur milieu LB + ampicilline LB + ampicilline + avidine (100 pg/ml) (100 Rg/ml) (200 U/1) pTG1418 103 103 petits pTG1433 103 103 petits pBR322 103 0 Après 36 h incubation à 37"C Les croissances des clones transformés, normales sur LB + ampicilline, sont ralenties en l'absence de biotine (milieu LB + ampicilline + avidine ; LB + avidine ; minimum plus casaminoacides, dépourvu de biotine).Cette complémentatison de l'auxotrophie en biotine du mutant R878 bioC est tout-à-fait significative, étant donné l'absence totale de croissance résiduelle de ce même mutant, lorsqu'il est transformé par divers plasmides dérivés de pBR322, sur milieu dépourvu de biotine. Les deux inserts des plasmides pTG1400 et pTG1418 ont été clonés dans pBR322 pour donner le plasmide pTG1440 (voir figure 5). Ce plasmide pTG1440, lorsqu'il est introduit dans le mutant E. coli C261 (bioFCD, his), permet la sélec tion de clones sur milieu LB + ampicilline 100 ;sg/ml + avidine 200 U/1. La fréquence de transformation obtenue est directement comparable à celle mesurée sur LB + ampicilline. A nouveau , la croissance de ces clones recombinants, normale sur milieu LB + ampicilline, est ralentie en l'absence de biotine. De ces deux résultats (complémentation de l'auxotrophie en biotine du mutant bioC et bioAFCD), il ressort clairement que l'insert du plasmide pTG1418 contient également le gène bioC de B. sphaericus.Les différents sous-clonages dérivés de l'insert de pTG1418 (voir figure 6) ne permettent pas d'obtenir la complémentation de la mutation bioC de E. coli. Seuls les inserts possédant les trois gènes confe- rent une complémentation effective de la mutation bioC de E. coli. Exemple 4 Complémentation du mutant E. coli bioH (PA505 MAt108, argH, metA, bioH, malA, strr). Ce mutant a été décrit à l'origine comme bioB (D. Hatfield, M. Hofnung et M. Schwartz, 1969, J. Bacteriol. 98, 559-567). I1 a été ensuite caractérisé comme n'excrétant aucun vitamère et capable de croitre sur milieu minéral en présence de KAPA, DAPA, DTB ou biotine. Eisenberg (1985, Annals New York Academy of Sciences 447, 335-349) a ensuite proposé que ce gène code pour une sous-unité de la pimeloyl CoA-synthétase (bioH). Il est à noter que les mutants de E. coli surproducteurs de biotine (sélectionnés soit par un niveau d'excrétion de vitamine permettant la croissance d'un auxotrophe bioB de E. coli, soit par résistance à 1' adéhydrobiotine) ont tous été identifiés génétiquement comme affectés au locus bioR. Ce locus code pour une protéine multifonctionnelle (répresseur de la synthèse des ARN messagers de l'opéron bioABFCD et holoenzyme synthétase fixant la biotine sur un résidu lysine de différentes apoenzymes à fonction carboxylase). Le fait que tous les mutants de E. coli surproducteurs de la biotine identifiés & ce jour, sont localisés dans le gène codant pour le répresseur actif en trans et jamais dans l'opérateur de l'opéron bioABFCD, laisse supposer qu'un autre gène de la biosynthèse de la biotine est soumis à cette régulation. Au regard de la littérature, le meilleur candidat est le gène bîoH. L'insert de pTG1418 contenant les gènes bioF et bioC de B. sphaericus, on a recherché si le troisième gène correspondait à bioH. La complémentation du mutant bioH de E. coli a effectivement été obtenue en utilisant le plasmide pTG1433. Une nouvelle fois, la croissance obtenue sur ce milieu est ralentie, mais tout-à-fait significative par rapport aux témoins (voir tableau 3). Tableau 3 : Transformation du mutant E. coli bioH PA505 t4AtlO8. Nombre de transformants par microgramme d'ADN. Plasmide Sélection sur milieu Sélection sur milieu LB + ampicilline LB + ampicilline + avidine (100 Fg/ml) (100 Fg/ml) (200 U/1) pBR322 104 0 pTG1433 103 3 103 3 petits # après 36 heures d'incubation à 37'C De même que pour la complémentation du mutant bloc, une condition nécessaire et suffisante pour la complémentation du mutant bioH est la présence simultanée des trois gènes de l'insert de pTG1418 sur les plasmides introduits dans la souche (voir figure 6). Au çontraire des mutants bioF de E. coli et de B. subtilis, pouvant être complémentés par un seul gène de B. sphaericus, la croissance en l'absence de biotine des mutants bioC et bioH de E. coli ne peut donc être obtenue que lors de l'introduction des plasmides recombinants porteurs des trois gènes de l'insert HindIII du pTG1418. Ceci pourrait refléter, entre autres, des différences de propriétés enzymatiques entre la pimeloyl-CoA-synthétase de B. sphaericus et l'enzyme correspondante de E. coli (différence d'affinité vis-à-vis des substrats, édifice multienzymatique, ...) ou une synthèse réduite de la pimeloyl-CoA-synthétase de B. sphaericus dans E. coli, limitant le flux métabolique du pimélate vers le KAPA. REVENDICATIONS 1) Séquence d'ADN selon l'une des revendications 1 et 4 & 6 du brevet principal, caractérisée en ce qu elle code pour les enzymes produits des gènes . bioF et bioC bioF et bioH . bioF, bioC et bioH. 2) Séquence d'ADN caractérisée en ce qu'elle correspond à tout ou partie de la séquence décrite dans les figures 2, 3 et 4. 3) Séquence d'ADN selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle code pour les enzymes produits du gène bioH ou du gène bioC. 4) Séquence d'ADN selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle code, en outre, pour au moins l'enzyme produit de l'un des gènes suivants . gène bioA . gène bioD . gène bioF. 5) Vecteur plasmidique comportant au moins une séquence selon l'une des revendications 1 à 6) Vecteur selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur non réplicable qui comporte les séquences d'ADN permettant son intégration dans un chromosome dans la souche hôte. 7) Vecteur selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une séquence homologue d'une séquence présente dans le génome de la souche à transformer et assurant l'intégration. 8) Vecteur selon la revendication 7, caractérisé en ce que la séquence homologue est une séquence génomique naturelle. 9) Vecteur selon la revendication 7, caractérisé en ce que la séquence homologue est une séquence qui a été intégrée dans le génome grâce à un vecteur plasmidique d'intégration. 10) Vecteur selon la revendication 9, caractérisé en ce que le vecteur plasmidique spécifique comporte au moins un gène de résistance à un antibiotique et un gène marqueur sous la dépendance d'un promoteur de la souche à transformer. 11) Vecteur selon la revendication 10, caractérisé en ce que le promoteur est un promoteur inductible. 12) Vecteur selon la revendication 11, caractérisé en ce que le vecteur plasmidique d'intégration est le plasmide pTG475. 13) Vecteur selon la revendication 5, caractérisE' en ce qu'il comporte une origine de réplication autonome. 14) Vecteur selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une origine de réplication autonome dans une souche de Bacillus ou une souche d'Escherichia. 15) Vecteur selon l'une des revendications 13 et 14, caractérisé en ce que les séquences d'ADN codant pour les enzymes de la chaîne de biosynthèse de la biotine sont flanqués d'éléments assurant leur expression dans la souche hôte 16) Vecteur selon la revendication 15, caractérisé en ce que parmi les éléments assurant leur expression figure un promoteur et un terminateur efficaces dans la souche hôte. 17) Cellules transformées par un vecteur selon l'une des revendications 5 & 16. 18) Cellule selon la revendication 17, caractérisée an ce qu'il s'agit d'une bactérie choisie parmi les genres Bacillus, Escherichia ou Pseudomonas. 19) Cellule selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure du genre Saccharomyces. 20) Cellule selon la revendication 18, caractérisée en ce que la bactérie est choisie parmi Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis et Escherichia coli. 21) Procédé de préparation de biotine, caractérisé en ce qu'on fait fermenter un milieu de culture contenant au moins de l'acide pimélique ou l'un des vitamères de la biotine par des cellules selon l'une des revendications 17 à 20, perméables à l'acide pimélique ou audit vitamère de la biotine et en ce qu'on récupère la biotine formée.