FR 2617712 A1 19890113 FR 8809332 A 19880708 La présente invention concerne generalement l'inhibition du développement cellulaire et, plus précisément, une substance inhibitrice puissante du développement cellulaire, ici dénommée "dolastatine 10", qui est obtenue à partir du lièvre de mer de l'Ocean Indien Dolabella, et des préparations pharmaceutiques contenant de la dolastatine 10 en tant qu'ingrédient actif essentiel. Une assistance financière a éte fournie par le National Cancer Institute, subvention PHS CA-16049-U8-11, et par de nombreuses fondations privées. Le grand savant naturaliste romain Caius Plinius Secundus (Pline l'Ancien) a décrit pour la première fois aux alentours de 60 après J.-C., dans son immense compilation, un lièvre de mer de l'Océan Indien extrêmement actif du genre Dolabella (les Romains ont été les premiers à désigner par lièvres de mer des mollusques de la famille des aplysiidés, en raison de la similitude entre les oreilles d'un lièvre et les tentacules auriculés de ces gastropodes). Toutefois, ce n'est que récemment que l'activité de la Dolabella de l'0cean Indien à l'égard de problèmes médicaux modernes a ete prise en considération (cf. brevets US de Pettit n 4 414 205, 8 novembre 1983, Dolastatines 1-3; et n' 4 486 414, 4 décembre 1984, Dolastatines A et B). Il se peut que les dolastatines correspondent aux constituants actifs de D. auricularia (cf. 19(9, these de aAT;:Ino asuodpa aun aouasip-id %ueke 'anuuoo 4uauial-[anole uaTq.xnod aousqns alilanou a:,;aoD.%, u smop. guIuouapTOT 'aFInoTld elFwiUT appdad-duad un,p oú aIevn4onais uoF;çoF; FF$uepTl 1a % uaualosT,l ans egsvq 4sa uoTIdTaosap e;uasgad -- xneTITqmluamaB[u uuoT;daoxe T;;p un sep;.dad sao ap a-anoni s uoFpnonI,s ap 4a. uBUap [DTesB; Tnb Ba ' ) 2no[ ao ç anuuoo (asop alqF; snld el) a^qoa snTd el anbTsIdopuIu- aou-esqns -e IFe I auIveswlop el anb al.tleaudde -Teg;;uo xnvsvaj1 ssaTuma.d sao 6 B I saU $sulop seladdv a %uo Tnb sanSTsQldopuT:-uv no/%a aTminllao aouesssoio le ap sanaBTqTquT (suessTnd;a) xneaAnou sapTIdad fnau aalOST s Tssnga e au. oaioqul ao 'iueuainaTapl. In (ION) a4n.UTsuI.aDougeo IVUOT$4 'S'f.1 ap (Sd aBuXQsXs) g9&d auTFlnm ap!oqdmIX aBimDonal el ap Pv2g,l (aa ap aainp el ap %00I ap snId ap uo;%queu2ng) saBoC>o>a.saqBa.;UOS as Tnb sea;xa sap, uuop e nb F.ueA;deoxam ap aiaQI ao ap suolIueqo9 sep O uaTpuI ueaoO.I. suep 'oano.l. e slnaBnv sap aeoiQoqvl al anb ZL61 ua,nb sS,u ao sBD ST 'saloQTs sap %uepuad a;IaTnsanod r;a a em InDTinv QllaqvloG laB ap aAeT1 al ied saauaBLd sanbLT2oloq si,49...dod sap apnB,fl (IN 'loqi uuy 'DIuj îcITIOcTW. KTsîeAMunf ',,eouoImlnd -wsIXdV pue m l fl etlaql, oT Keioadsa 'saBeH QaS UTFFM2H aUos;o suXoI puvlo %n2pTx aq%.;a K2olo0 pue X-isTmaqo '4X2olootmuieqî aq%;o soadsV amoS,, 'TiGMgH;o fl 'uosq. 'X ap.'I uezvo,î ap uTaeu aiAnI np 4Tvaxa inaeo.; un 'laTuassa Sç T-zQ:uaIpi2aSuT,nb 4ut% ua 'luàuue;iuoo Tnb suoT4lxdgad sanb-seIdoeu suoToa;;e,p sanST;nadQiqq, suTos sel;a %uauaezTig al anod saooT;;a senbT;nsoeu-i-qd 5owad sap lauuo4; oeauoo.nod sepoqq;u sep:e suaKou sep iTu-no; ap 4nqinod aiooue m uo; 4ueAuT euesqid -q oç suTIfmnq saqq sep zaqo quauuaTAins Tnb eaouvo ap sad. X sanaTsnld ap no un,p senbT;nadwQaiq$ suTos sel 4a quema 2z al supp %uaEaien 4a;UamalTTOQ; eaoîdura ea.r assind aule ellenbvî snos amzo0.aun snos auTeXIm aunn vl ap anbTsmldo uT q5 aoue;sqns aun ealosl anod sppooaid e sapoqXam sep aTuano; ap 4sa uoTquaAue auesgad QI ap;nq aaznv un aouQo ap sadXl sanaTsnld ap no un,p uoTssTmea el no suemaddo!aAep np suamassf;uaejB al suep aogo-j;a '%uae2 IaAnou un JTUno; ep îid-ouTzd oz nq inod v uo4uaAu; Ixuasd1'Ia"ouanbgsuoo uS aen:T;suI agoueD WQuoTQN sa4eiS pa;-,un,l ç a2esn ua suipe 4uaemaleîauS salcoooad sel jud ae- insaur;sa T3o-ailo anbs.ioi 'asna-iinou2o;T1.^1v samII-u;oo.a saiqQi- uouxp xnsaeTu sep;uQ 'soeoTo;;B L sanbTnaD=aqd suo;eivd;ad ue slnmaIo; aual. queanad sanbTxo4 uou qa uemanbTnsouamqd saiqs:damoo s5ATJap sanal %a anbT,4quKs %uepuad uos 'aouesqns Q 'ITep ue ssIdg-_o aexIoDp aIiTuem I eap eilaqmloa uaTpuI unoo, ap -ae ap ap ZI np e;msxa x se Tnb ',,O Oum; sIop,.01, apuImouap 'aiTelnlleao uaaeddoleAep np uoqTqîquTp paTAT;ow elxo; aun u1Xm 'alleanou aouvDsqns eun,p a;JeaAnoozp QI v ami.e..x 4sa uoT; uauT aluase-id -e 23/2d b-T ap asop l v 7 %01-69 ap aTA eI ap %uaeulauolold un 4a, g E aewouel- r np uoTIsTITlnp seo ua 2q,/g I'I -'I ap asop %e T-ç ap aTA lI ap %uemaeuo-oad un '(anu splnos> ION np uwurnq amouwliUm ap aiqdei2ounx np pie, V 2 9/Sid 9- Z'V ap acsop eI 2 %Z9 9 v L ap aPn_;2uoI ap seZ 4a N apnfkT:4.e ap.6 e 9Uu aTçrUTxo1ddg S sauTddTITqg xnQ sa2ipt sep aT.II ap, 4TOTxoad e.se eaie -4uaAnad eL-lqvToa sep no al.s au4ne un alTIl ap aleo I ans lu G' Z'l ap nI sl ap napuooiod aun 'E apnTSuol ap g 4a S apnT;vI ap oIZ ? iuamaeu %iTxoadd-,rnqTs naTI 0 un ua 'ueipuI uQE)o0,l su2p aqIneX ajII ap a-Ieuamio a4qco QI Q,, ESauT4Q,4svlop sap. l-QTTUT 4uamalosT,l inod sasTITn vlITqQIoa sep a;oalloo ap a1s el ÀaI;ua apuom al suQp seIelTanoal elleqvloe ap saiiITTQP suopdTIdosap sep auuop laSua 'H ep aDou8iezJ Sz ap a2eIAno,% 'uo OZ e Sl ap auuaXo r ananSuolaun %a aa-od ap amzo; ua sd.oo un osae eATIo a nealnoo ap +;Ie,4 apslTITn Ilaqelo -e 'tnaTmIxa %oadse, -vl-ndi2os a(j 4a o aT.Ia 'a '.ounflz. -CE Que2uoi. J a PTca4 a ç TqduInJ a 'TTUJlad 'J '2ITaU ou Ca 'TTqIT a 'J 'TeIaSS,2q a 'TTUOSaapue 'J 'TzTSS-eB ilaqQloa: 4uos ssoidsa saBD 'TlwnolTanue 1laqWro saearioup;a sanbT4uapT saepnç;uamanaTeTiIn 9,, %uo Tnb 4a' sauaip;;tp sasoddns luam nanIw;u2 %uaTI Tnb ellaq-lo[ ap saoedsa,p uo I% îuinue aun aSgaAno %ao suçp 51 Tssnv afnoul uo 'IllaqIloa ap SUOlIITUqog,p sanalnoo ua saqousld seasnalqmou ap aAnoa; uo '(rt61) 6OZ-L6T 'tZ uapae '1,, u5uuIaTapePaX aqosTzioloZ,, 'Ia2uH 'H 'aouBa9aJ ap a6iAnO un su 2617 7 1 2 collectes séparées, contenaient tous des facteurs d'activité antinéoplasique. Différentes méthodes peuvent être appliquées pour isoler et purifier les différentes dolastatines à partir d'échantillons de lièvre de mer, notamment l'extraction par solvant, la chromatographie de partage, la chromatographie sur gel de silice, la distribution liquide-liquide dans un appareil de Craig ou d'Ito, l'adsorption sur résines et la cristallisation dans des solvants. Un extrait par l'éthanol/2-propanol combinés de D. auricularia (1000 kg à sec, recueillies en 1982) a été concentré & une fraction chlorure de méthylène active par une série de phases de partage entre solvants. Une séparation accentuée par chromatographie sur colonne (exclusion stérique et partage sur Sephadex, partage et adsorption sur gel de silice et chromatographie liquide sous pression élevée) utilisant des techniques d'élution à gradients guidées par essais biologiques a conduit à 28,7 mg de dolastatine 10 pure sous forme de poudre amorphe incolore (à partir de chlorure de méthylène- méthanol): Ce2HssNsOsS par HREIMS (MX moy. obs. 784,4899; calc. 784,4921); P.f. 107-112-C (solide amorphe); [t] 2 -68' (C=O,01, méthanol); Rf 0,43 dans CH7Cl2-CH30H-H0O- NH.OH 90:10:0,8:0,2; et Xm (CH3OH) 216 (e 20 180) et 242 (E 3609) nm. Une hydrolyse vigoureuse de la dolastatine 10 dans des conditions acides (HCl 6N; 110'C; 24 h, 48 h et 70 h) et basiques (Ba(OH)2 aq., 120'C; 20 h) , suivie d'analyses des acides aminés des produits a fourni uniformément la preuve de la présence de valine et de phénylalanine. Cette dernière observation n'était pas en accord complet avec les résultats initiaux du spectre de RMN et a eté une source de préoccupaton jusqu'à ce qu'une structure pour le nouveau Phe masqu, nommé dolaphénine, ait été déduite. Entre-temps, la dolastatine 10 s'est révélée niealqe 2; 'uo;eo il ap que24nsip_ szuet; Sap Ia) SwIS-dS sUOT sap (uiepuvl ua assUI ap eTgUIo.oeds Sú no SX/S1 no aV> suosrutIOloavd (eTInpuT) aeATo0 ea aTvlnoIloTun uoi4tsodmoogp vl oaAe uuemaquTouoo SNIS-dSap senseux ap aseq el ns enboATnbg sues auTui-i;ap a,4a, e 01 au.e-se-op el ap aouanbas e- Àaoeazioo aouenbas g1 anb uoTsenb ua luvssT-l Oç au 'snuuoouT ToT,nbsn squTm sepIow squlenq.Isuoo ae.enb sel inod saeuTurxa,4p %a:uetvv sejnon. %s sap Xa seasiL gue Ea Ip 4uaTeIg (saldg-_o 'assem ap alex;oàds UoTIvlUauI2g.QI -J> [((TE Ob- '0961 'uosau 'uS12 f ' 'T' '4 XQEa 'a Illb '8Z 'LZ6T1 'bucsaè 'u2'Q ' 4*Ve {a uesnetuepog,To> - -OLD-HL e2geleop ap uoI;vIazoo ua 4a 9.'b9 'g9L61' sXqd uiaeq f '1g;e any JO) ú-aIaP'(ZbS 't9 '1961''uosse 'u2X 'ú '1 %4axB Ào) Hi-Ht ASOD ap saeaxdEs sapoqtPm Bp uoT:iesIpn oae zI 00] 0tl m 1a HL Na ap 4a uo;Tnlosea Bn4R af assum 0o ap aloads ap sapna sap ';uemo ao à V aaLoeoonlTla% ueuiadnoi2 ep nAinodQp %ie% (tg-Aoa-> ieuTxue -a '4uu12as al anb Ia anbTll;nq iasa un,p %T-nbuim euTm4aa-oaoa yTiom al anb %,,vsuoo9,4 e IT '(0s -SI %a oB 0-s o o 'E-avyZ suamnnalsuT) IHHH assçm ap 5 aTlOmoaoads ap apATns 'asnezS aseqd ua adeo oqo ed' apliTUap uoTI'.avdgs ap uaXom nV ' )naeap UoT'4TPP12 qa (de(j Ja -ET( ap UI.-l-ad -) XxoTj:,m - s4uamadnol2 xnap sap ala.ied ed OeHZ- suTom ao %a deC ITa 'IeA-AoG -T; ; ou sap %uppuodseaiioo senbTInql;iúo- 0 -oloni;TTl -N sla-sa ua s%;npoud. sap uoTslaeAuoo ap eTATns (anoa;ra g-e o.ogl um Sl lugpuaed l: anbiuoTdold aPTo 4a ouoo DIOHoaa esaloapXq aun 'sagToaxd sanbTseq 4a sapToV suo$Tpuoo sel ailno) alls ed s$AloupXq aun avd aTugno; qe e aTiguil-' apTIded-eduad 5 ap ainzonj4s aun,p alqmnosTpuT eAnead 'q apTIdadTsdap ap aan;onjs aun aUTmTI9 sTu= 'anbTIo o apTpded un aeai2ns Tnb ao 'uo%oT;uods ap:a uoTil.I2;,r,p suo%oai saldmTs ap maiuoeaIa ZlUL9 II)>. L'ion de SP-SIMS à m/z 227 donne m/z 100 comme étant à peu près le seul ion de fragment de CAD, ce qui indique une bonne stabilité pour l'ion immonium (CH3)2N=CH[CH(CH3)>]. Parmi les deux séquences finales, à savoir Dov-Val-Dap-Dil-Doe ou Dov-Val-Dil-Dap-Doe, la seconde a été trouvée correcte par CAD conjointement avec des expériences de HREIMS (cf. Fragmentation spectrale de masse, ci-après) utilisant le peptide intact. La confirmation définitive de la structure de la dolastatSne 10 a été obtenue par des expériences de RMN de différence H-['H]-NOE, comme résumé dans le tableau I. La séquence d'acides aminés de la dolastatine 10 a été ainsi établie. Les expériences de NOE dans CDmCl2,. combinées avec des techniques COSY de RMN 2D dans trois solvants (C6Da, CD2Cl2 et CD30D) ont permis de reconnaître Dil comme un Ile, plutôt qu'.un dérivé de Leu. En outre, LDov-OMe et DOe HBr racémique ont été synthétisés et il a été constaté que les données de RMN 'H et '1C représentaient de bonnes approximations des décalages chimiques attribués à leurs pendants dans la dolastatine 10. Fait intéressant, le motif Dil est un corps apparenté, dans la classe Ile O-mêthyloxy, de l'acide aminé type Leu statine (acide 3-hydroxy-4-amino-6- méthylheptanoïque) que l'on trouve dans les didemnines A à C (SR,4S), composants antinéoplasiques de tuniciers marins, et dans la pepstatine (3S,4S) de plantes inférieures, inhibiteur de protéases acides (par exemple de rénine et de pepsine). Un Ala-analogue 2-methylé apparaît dans le médicament antibiotique anticancéreux bléomycine N C NH N /H 0 CHDO CHC)DO N Ni oOCHJ 2617 7 12 Tableau I. 13 1 Affectations de RMN 13C et H en correlation pour la dolastatine 10 en solution dans le dichlorom6thane-d a. Décalage chimique, ppm Structure 1H(mult: J,Hz: Affectation 13C(mult) Integration) NOE 2 170,51(s) 4 142177(d) 7,717(d;3,31 1H) 118J76(d) 7, 254(d;3,3; 1H) 6 53>02(d) 5S,516(ddd; 5,7, 7,2, 9j3; 1H) 6a 41j48(t) 3j399(dd; 5;7, 14; 1H) 3.256(dd; 517; 14; 1H) 6bl 137j74(s) 6b2,6b6 128, 74(d)x2 7j243(d: 7j9; 2H) 6b3,6b5 129180(d)x2 75214(dd; 7;9,9 2; 2H) 6b4 127r02(d) 7;194(t; 9,2; 1H) 7 7;256(t; 7;6; 1H) 9,9a,10, ab,11 8 175 67(s) 9 44,79(d) 2..Z82(qurbkpt; 7;2; 1H) 7 9a 14,49(q) 1;085(d; 7;1; 3H) 82. 05(d) 3;845(dd; 2;0,8;2; 1H) 7 ab 60J89(q) 3/309(s; 3H) 6,7 11 59 86(d) 3, 985(m;1H) 12 25100(t) 1,804(ddd; 5)5, 710; 19; 1H) 1,608(ddd; 7; 9,2,19; 1H) 13 25/45(t) 1;446(ddd; 417,7,19; 1H) 1;715(ddd; 4;7,7,8, 12.7; 1H) 14 48,03(t) 3J401(dd; 7/8,10; 1H) 17 b 31390(m; 1H) 16 174,01(s) 17 38; 11(t) 21394(ABq; 950; 211) 14 18 78,86(d) 41122(t lar: 8,7; 111) 18ab 58 16(q) 3313(s; 3H) 22 c 19 54J 11(d) 3i26-3t 39 (1H) j b 19a 33j62(d) 1 680 (lH) 19b 26 25(t) 1370( m large 1H) 1jo00o ( m large 1H) 19C 10io92(q) O,823(t; 714; 3H) 19d 19J82(q) 1i003(d; 618; 3H) a 30 09(q) 3J012.(s; 3H) 22 21 17139 (s) 22 54j20(d) 4.761(dd; 6.5, 8.8; 1H) 18,18ab, ,19 22a 31> 42(d) 11983(s 8; 3H) 22c 16109(q) 01977(d; 6;8; 3H) 23 6,861(d; 8]9; 1H) 25bc 24 172>44(s) 76177(d) 2;454(d; 6;9; 1H) 23 bc 49,92(q)x2 2,262(s; 6H) 23 26 28j08(d) 2,073( dhit 6t7; 1H) 27 20124(q) 0J9.64(d; 6>8; 3H) 28 18J18(q) 0;902(d: 6,8; 3H) a) CHDCL2 rèsiduel servant.de référence interne (5,32 ppm) b) Signal de recouvrement c) Signal affecté d'aprés les donn6es de NOE. Tableau II. Dissociations induites par collisions de masses plus élevées sélectionnées, issues de la fragmentation de dolastatine 10 par SP-SIMS1l ions parents 785 559 458 412 M1ll +1 c+ v3 e ions fils ab 753 188a 426 100 Hiil -CI!3011 x5 -cil oi 205 86 214 bl and/or z4 (w 3/e3 (y2/C3) (z2/b 188 374 188 o x5 z+211 x5 -Cl1Oil 559 100 356 352 À +211 d(z l-CH oit z2+21( 2 3 2] 154 154 205 3li (z /e. a+I)-C101 O (z2/e3 +[)-Cl!3011z +211 (y 1.-it 2 3 J 2 J 4J 205 170 170 253 z4+211 (z3/e 4)+tl (z 3/e 4)+l 458 138 138 227 w] (z3/e)+l'-ci3011 (z /e 4)+l'CI3ai0 2 - 527 303 368 (z /e)+i z2+11-CH3OH v4 (xl/e) a) cf. La fragmentation spectrale de masse ci-après; b) Les huit ions fils les plus forts sont énumérés dans l'ordre d'abondance décroissante; c) Les ions m/z 188 très abondants semblent masquer un m/z 186 (z2/e3+H), mais son ion fils apparait à m/z 154. r.- DolavalineValine Dolaisoleuinc Dolaproine Dolaphenine (Dov) (Val (Din) (Dap) (Doe) (i), I C 2? 2B O cb C bd ab 3 13 a a a 0 0aG aa26 M -CH -81a 2 i4a CH-C t-i-H-C + t-CH-C H-CH2-l-H-CH-CH C N / 252a 232221îia a 1 N I1 aI a ^2 |*v1 (1 1 4" CH3 CH I IH g a a 27 28 CbI b 1.131 l2 72CH3 3 j5.9855 IB.54t) 1 xa2 2 3 v3 4 4 5 S * 3 33 73 4 4 412.317(0) e Z 3 3 Fra3yentationspectrale de masse (mt m/e 784,489) de la dolastine In et systèe de nunérotane- 13 - 2617712 Suit une description plus détaillée des techniques expérimentales, afin d'aider & mieux faire comprendre la présente invention. Réthodes générales.- Les solvants utilisés pour les opérations chromatographiques étaient redistillés. Le Sephadex LH-20 (25-100 p) employé pour la chromatographie par perméation du gel et de partage provenait de Pharmacia Fine. Chemicals AB, Uppsala, Suède. Une piste Gilson FC-220 et des colonnes de micro-fractionnement FC- 80, reliées à des détecteurs HM UV-visible Holochrome Gilson, ont été utilisées pour les expériences de fractionnement chromatographique. Dans les opérations de chromatographie sur colonne avec gel de silice, on a utilisé les colonnes 70-230 mesh ou pré-garnies de gel de silice 60, fournies par E. Merck (Darmstadt>. Une colonne Partisil M9'10/50 ODS 2 (phase inverse en C-18) (9,4 mm d.i. x 500 mm) a été utilisée pour la chromatographie liquide sous pression élevée et fournie par Whatman, Inc., Clifton, N.J. Les plaques de couches de préparation ont été également fournies par Whatman, Inc. et les Uniplates GF de gel de silice pour TLC ont été fournies par Analtech, Inc. Newark, Delaware. Les plaques de TLC ont été examinées à la lumière UV, développées avec une pulvérisation d'anisaldéhyde-acide acétique-acide sulfurique (chauffage à 150'C environ pendant 10 mn) ou avec un mélange sulfate cérique-acide sulfurique (chauffage pendant 10 mn). Les analyses d'acides aminés ont été effectuees avec une unité Beckman Model 121. Les spectres UV ont été enregistrés au moyen d'un spectrophotomètre Hewlett- Packard 8405A UV/VIS équipé d'un traceur HP7225A. Les spectres IR ont été enregistrés avec un instrument Nicolet MX-1 FT. Les spectres de masse SPSIXS à haute résolution ont été obtenus à l'aide de spectromètres de masse & triple analyseur V.G. Analytical MM ZAB-2F et Kratos MS-50. Les spectres de masse & chocs d'électrons & -auexat,1 suep aTIITnoq 'seamu O0 -OO00 '.g 9 ITsTACa> aoTITS ap iaS ap seaTuai2 e,;uo (U t'O, x urm zT) aas 5 ua sauuoloo xnac eallaeqoe apumS ? uoT;4iud9-d ep - xnaITump ImO% amnIoA el 'IoUsqaI suep aaasuoo 'E96I ap.(as amem) 9;+ Eooga allDanouaun OeAv SaTnpuoo,%a quo saeaioddwa ToT saeouaTeadxa sei 'selqeied&oo s4ITnspa- sep,uuop e jeu ap aaAIT np sanaTnazln saq.olloo ap aTI$wd sangolvuv 5z soTe.G1x. p aTI as aul 'x/m q,1.nod I,91 xm 009 lnod SeZ ap O/1 4aoddvi un oaAv 'eIIqv% $%$. e (IDO) aBnl.TWsuI iaouoD IsuollR np (Sj auissXs) g9ggú ap!oqdXmI aTurgonalT -el ap p-iegiEp.- ss jou-eq-:, al -rd I.-ea,,xa un,p açamzTjuao a'4T iwguapTooouaTpuI usooIà ap g1ealnoTine wIeaqfIoe o ep auAxTI eq -'epIuImPe saouaTaIedxa;a uogou1a;xa 'xni=Tu saep eaoelloO UeeaToedseJ DL Ia HL Mrna 'e inod zHI Zg9'001 %a îC'00t ç qumuoT;ouo; S suoTslndiT.p inaummi2o d un -a ooo0 ú0SV ina'+UpJo un DaAQ oot-XV xaBnln-i 4To, no-lI. w aaca4imoaoads un,p apTl I sa; Tnpuooe%, 4uo (mUM S ap jaenXg 0t-Hi alqenOE oo alqnop apuos ap a-;. aunp uoTesTIIn oaAe 'SSUAIOS siaITp suVp) Nr ap saouaTladxa sa (oo000o O0 Uv/i) aIAalg UoTfnlosga 9;a A f r anpuo; aoTITs ap -ga auuoloo aun oaA agn4oa;Ba 9% S e saçidoadde sa^.z' -p ap (SX-'> asssm ap -asnazeSassqd ua ' dqooqo B' '$ saloeds sel anb amai ap 'OC-SX;a 09-SX som s4ueaunJ4suT sap ans s$a4sTI2aua B ai 9 uo (0o OI=V/UI/m) uoI.nos a, anfq ZLZ.g9Z "t acétate d'éthyle 7:3). Les 2,75 kg de concentré fonce (noir verdâtre) ont été dissous dans l'acétate d'ethyle (7,56 1), pompés sur la colonne et chromatographis avec utilisation des gradients de solvants suivants à un débit de 60-72 1/h Eluant Fraction Résidu de El uan t Vol. (f) No. - Fraction & /30 hexane: acétate d'6thyle200 I 642 9 /40 " " " 120 2-8 282 /50 240 8-9 78 -14 160 1 -16 58 17-18 72,2 i9-21 749 % acétate d'éthyle 19-21 74.9 22-25 70,6 :5:0,? acétate d'éthyle meLhftInlOeau 120 26-28 1564 29-31 50a5 83:17:1>4 acétate d'éthyle 240 3 5 4277 t 2 40 32-35 42?7l methanol-eau 3 3 16-38 50 3 39 65f 2 76 41-45 (A) 132 67:33:2,5 &cétate d'éthyle methano 1-eau 240 46-50 (B) 7 met hano l--eau517 - 51 77 52-55 209;5 :50: 5acétate d'éthyle Méthano l-efu 56-60 56 m45: th45:ano0 c-tateau 6165 100 methano L-eau 6-931 66-69 305 Chaque fraction a été éluée avec 20 1 de solvant et les Fractions comparables (par TLC) ont été réunies. Ze aTl--iec Ia I aT;l--i _ uoT,4i-i-d"a ap =maqoS np I a-aS 21 su1p stdeTo apnbTpuT eapu -e apI ai %l e g 2.g 8ú> uoT;..rod auli '2 b?'061 iauuop inod 'sapiloes kae eaTunpi,a4g I-uo sucT4o i saq (z-01> oSg" g 2 X/Im L, '8 e i? T tq i- anbTxol 0/l Sd 'S O 'ZL) a uoç:oex; aun 4a (-01; L 2i/2S'j- 0 anbTxa; O/ sa '2 O'Z8I) V uoTo ; aun 'ggd eama;sXs ael suep aeoTu2Ts TATl'o aun puasQld %uo xnap 'uoIluidpad ap 0lH ap SUoT'Q; sl Tuael -'01 aUTgsQTOP 1 ap quaetalOSI UZLU9Z Schéma de séparation - Partie 1 Fraccion A (38 g) ! Serie t T/C (), txique- 16,5 (J30 - 7,5) 1LE- ZO Sephadex [ CHZCIZ-CJ3OH C DC C J :'c('l) Z7 U& 2tt. 39 t?? 5r 05 E050 t6 3.4xo10'4 L3xlO5 O2s 2r4 T/Ccoeg) txue tdp (29 3 -. 6) 22 -t.t) :LatO:0a.L 99:L - L: :LOO:L cuZCLZ-Cmjou l C L M 0r395 0771. L14A a 580 19xlO 2,9x0LO-2LxO-2 6 t&xiqe- LI J a toxiq.E tcçxie - LA0 toxdiu (13 -.3Z) (il -2t7) (iL -2,7) (L7 -2 1) Fractions réunies, K,LM Fraccion (z.b g) (o.$a 4) geL de Silice LH-2O Sephadex 99:1 I;L 45:1l CH ci -CH OH hexan0-CH Ci-CH OH & h x-- 1-CC l- CH'30!1| I o P Q R S T U Vt (m) 78',5. 76j2 21ll,5 j91,0 594,2 Ioa1018 88,2- EDO50 89xlO-3 3jOxlO3 3,6xlO-4 49, 5 25,5 1,6xlO1 3,5x102 n T/C(2t4)t-(L1e- l02 86-120 t ci(me 121-91 u +156:W- (6 6-0 83) (5-0)63) (6,6-0ja5) (6j5-0,B2) (7;8-0,98 ' I t. I I | |. III '1 ' - I) gel de Silice g5el de Silice m e co 99: l-4.1 9:*: CH ci -CH OH 2 2 3 X. (1558 g) 2) gel de Silice 99: l-1: I i EcOAc-CH OH-H O V W x i. x WV (mg) 1.1 6.3-Ft I;t (m)I 14104! 14 ED5 4- 4xIG 9:1:0.1 CH OHH. O 3 2 EcOAc-CH OH-H20 O i) 2 3) LH-20 Sephadec. hexane-C4fCI.,-C.iOH. (50 m3) Dola c a3) La portion principale (152 g) a étê séparee dans une Série II semblable, selon ce qui est décrit dans le Schéma de séparation - Partie 3 et Partie 4, presenté ci- après. Schéma de séparation - Partie 3 Série II Fraetiton A+B (152 g) I. Sephadex LH-20, 1:1 CH 2Ct2-CH OH 2. 9el de Silice 49:1 1007. CH2Ci2-CH3OH 2 2 3 I 1 *a b c uC(r:) r78 6687 1205 ED50 ca l0-l 1'2- LO'3 lo'L gel -e Silice 99,1 - 111 CH 2C12-CH3OH I I i I I { d e f g h L wtcg) 0,66 0,50 1.28 0,77 1, 10 0,44 ED50 lJ5XIO3 2,7xlO4 2,7x10-5 1;7xl0o3 2,5xl0'3 2,3xi0-2 TiC(ntg) t(oic- 120tiaue tit. Lrx-i,150 tf.iqL.-tl ll9I (5$ "063) (6 -0,75) (6.8-,OJ35) (8aB- ljl.) (91;1) (6e O83) ! I...., "i (4,6 C) 9el de Siliee 99,l _ 1,1 útOAc-CH30H I I 1 k Ut (mg) 578J,4 695,7 ED50.2JlxlO3 32&4- gO0 Schéma de séparation - Partie 4 2617 7 12 Fractions j et k réunies * (1,27 8) Sephadex t11-20 :5:L hexane-CH2C12- CH 011 2. 2 3 I mg n Vt (as) 12:1p 7 4 5J7 14 276,1 2 ED50 7,2 x 10 2., c x.10 5j9 x 10o gel de Silice 99:L- 1S1 CUiCl2 -CII OH 91,6 mg _4 DE5sO.4 x 10 (39.2 mg) (44 mc) Pprep lCc q conmme série p j90.10, I EtOAc-Cli OH-HO20 Dolastatine 10 brute 17.8 mg 1818 3t, 1. S1t-20 hexane-Clt2 Cl-Ci1olt 2. 1-20 ,5,lI hexane-EtOAc-CII3 Oi 3. Lll- 20 hexane- to luène-ClI 3011 Dolascatine,10O Dans une série typique d'expériences, les 38 g de la fraction A+B ont été chromatographiés sur une colonne de Sephadex LH-20 (10x120 cm) dans le chlorure de méthylene- méthanol 1:1. La réunion des fractions semblables a donné des fractions CJ, comme schématisé dans le Schéma de séparation, Partie-l ci-dessus. Les fractions actives (in vivo) D et E ont été réunies et divisées en deux parties égales en vue d'une séparation par chromatographie sur colonne de gel de silice. La série 1- l a été encore séparée par chromatographie sur colonne sèche avec un gradient acétate d'éthyle-méthanol-eau de 990:10:0,1 à 100:100:1, pour donner des fractions actives K, L et M. La série parallèle I-2 a été également séparée par chromatographie sur colonne sèche, avec utilisation de chlorure de méthylène-mêthanol et du gradiant 99:1 à 1:1, pour donner la fraction active N. Les fractions K, L, M réunies (2,6 g) ont été séparées par chromatographie sur gel de silice en colonne sèche avec un gradient chlorure de méthylène-méthanol de 99:1 à 1:1, pour donner des fractions actives 0-S (1,15 g), comme indiqué en détail dans le Schéma de séparation, Partie 2 ci-dessus. Les fractions actives 0-S réunies ont été ensuite séparées de nouveau sur une colonne de gel de silice, avec utilisation d'un gradient chlorure de méthylène- méthanol de 99:1 à 4:1, ce qui a donné 155,8 mg de matière active. Cette dernière fraction a éte encore séparée sur une colonne de gel de silice (humide) avec un gradient acétate d'éthyle-méthanol de 99:1 à I:.,l, pour donner des fractions actives V et W. V et W réunies (7,4 mgE) ont été finalement séparées en trois phases, comprenant une TLC de préparation au chlorure de méthylène-méthanol-eau 9:1:0,8 et de nouveau à l'acétate d'éthyle-méthanol-eau 9:1:0,1, suivie de chromatographie de partage avec utilisation de Sephadex LH-20 et d'hexane-chlorure de méthylène 5:5:1 comme solvant. Ainsi, la série I-1 a abouti à 5,0 mg de dolastatine 10. La poursuite de la séparation avec la série I-2, donnant la fraction N (0, 58 g), a nécessité une séparation de partage sur Sephadex LH-20 avec le système de solvants hexane-chlorure de méthylène-méthanol 4:5:1. Les fractions actives T et U ont été réunies (0,19 g) et purifiées encore sur des colonnes de gel de silice (humides avec solvant>, avec utilisation d'un gradient chlorure de méthylène-méthanol de 99:1 à 1:1. La fraction active résultante (18,1.mg) a été purifiée finalement par HPLC (colonne ODS-2) avec un gradient méthanol-eau de 1:1 & 9:1. La série I-2 a donné 3, 8 mg de dolastatine 10 pure. La plus grande part de la fraction A+B (152 g) a été chromatographiée sur des colonnes (10x120 cm) de Sephadex LH-20 en cinq portions dans le chlorure de méthylène- méthanol 1:I, comme décrit dans la Série II, Schema de séparation, Partie 3 ci-dessus. Les fractions actives ont été réunies et séparées de nouveau au moyen d'une colonne (4,5x80 cm) de gel de silice, avec un gradient par échelons de chlorure de méthylène-méthanol (49:1, 23:2, 9:1, 22:3, 17/3, 4:1, 1:1 et enfin' 100% de méthanol), pour donner une fraction active b (6,87. g). La fraction b a été rechromatographiée sur gel de silice (à sec) avec un gradient chlorure de méthylène-méthanol de 99:1 à 1:1. Les fractions actives d-i résultantes (4,6 g) ont été réunies et chromatographiées (colonne sèche) sur gel de silice avec un gradient acétate d'éthyle-mêthanol de 99:1 à 1:1, pour donner des fractions actives J et k (1,27 g). Les deux fractions (J et k réunies) ont été chromatographiées sur Sephadex LH-20. au moyen d'un système de partage hexane-chlorure de méthylène-méthanol !5:1, pour donner une fraction active m. La séparation de la fraction m sur gel de silice (colonne prégarnie Merck Size B) avec un gradient chlorure de methylène- méthanol de 99:1 à 1:1 a donné des fractions actives.p (39,2 mg) et q (44 mg), comme indiqué dans le Schema de 23 2617712 séparation, Série II, Partie 4 ci-après. A ce moment, les fractions p et q ont été purifiées séparément en parallèle, au moyen de TLC de préparation systèmes de solvants hexane-chlorure de méthylène- méthanol 5:5:1, hexane-acétate d'éthyle-méthanol 5:5:1 et enfin hexanetoluène-mêthanol 5:5:1. 'La fraction p a donné 8,6 mg et la fraction q 11, 3 mg de dolastatine pure: rendement. total, 28,7 mg - de 'poudre amorphe (incolore) (P.f. 107-112'C) à partir de chlorure de mêthylène-mbthanol; TLC (tableau III, visualisation trouvée la meilleure par la lumière UV ou la vapeur d'iode); [a]xm> -68,0 (c, 0,01, CH30H); UV (CH3OIH) >mx 209 (e 8100), 216 (e 20 180) et 242 ( la dolastatine 10 a été résumée dans le tableau IV. Tableau III. - Propriétés de chromatographie en couche mince de la dolastatine 10 S,,ilsrrar Système de solvants Valeur R gel de Silice Cl2 a-Cl OIli-iO 90:10,0.8 0lla "" Cl12Ci 2-CC11 3OiO-lHII4OH 90z10z0.8:. 2 0, 43 2'2 3 2 4 EcOAc-CI O-IO 90101.0 0,1 a 2 I2 à,C OAc-Cl3i011-H2 ONII4Oait 90L0:1.0:0. 2 0"7 3 2 4 RP-8 CH3CH-H20 3X1 0,42 " C]13OItI-120 3:1 0II -tia CI13CH-t120 3:1 0,27 " CII3OH-1120 3a I 0;,12 24 2617 7 1 2 Tableau IV. - Activité anticancéreuse de la dolastatine 10 (NSC 376128), système murin in vivo, T/C (rg/kg) Leucémie lymphoide P 388 Leucémie lymphoide L 1210 toxique (08 - 27) toxique (26) 173 (13j5s 152 (13) 161 (8) 135 (8,5) 202 (4) 139 (3;25) 199 (2) 120 (63 Mélanome B16 Sarcome ovarien M 5076 238 1 11) toxique (24) 182 (6167) tox i que (2fi) Zu5 (4t0) 166 (13) 171 (3,4) 142 (fS) 142 (t;44) -15I (3)25) Xénographe de mélanome humain Xénographe mammaire humain à la souris à la souris nue (LOX) nue MX-1 (prolonqement de la vie) toxique et 66.6% gu6risons ( 52) toxique (52) 301 et 50% guérisons (26) toxique (26) 301 et 33.3% guérisons (13) 137 (13) 205 et 16.6% guérisons (65) - 178 (6;25) (3/25) Rfqsrinn de la btmeur de I-1 14 (52) (26) 61 (13) 69 (6;25) T/C = Animal d'essai/témoin, tous deux atteints de tumeur, exprimé en durée de survie. T/C - 100 = % de prolongement de la vie. Hydrolyse de la dolastatine 10.- De petits échantillons de dolastatine 10 ont été soumis & des conditions diverses d'hydrolyse, résumées dans le tableau IV. La présence de valine et de phénylalanine a été mise en évidence par ces procédés. Essais de saponification et d'acétylation de la dolastatine 10.- Un échantillon (O,1 mg) de dolastatine a été traité & la température ambiante pendant 6 h par une solution préparée à partir de 0, 1 ml d'hydroxyde de sodium 0, 1 N et de 0, 1 ml de méthanol. La solution résultante a été acidifiée et le solvant a été éliminé (courant d'azote). L'analyse du résidu par TLC a mis en évidence un unique composant avec. un Rf identique à celui de la dolastatine 10. Une portion de 0,1 mg de dolastatine 10 a été traitée par l'anhydride acétique (0,07 ml)-pyridine (O,1 ml) à la température ambiante pendant 24 h. Le solvant a été évaporé sous azote et le résidu a été analysé par TLC. Un unique composant a été observé et son Rf était identique à celui de la dolastatine 10. L'administration de dolastatine 10, de son pendant synthétique et de ses dérivés pharmacologiquement actifs et physiologiquement compatibles est efficace pour le traitement d'animaux et d'humains atteints d'une affection néoplasique, par exemple de leucémie myéloïde aiguë, de leucémie lymphoïde aiguë, de mélanome malin, d'adénocarcinome du poumon, de neuroblastome, de cancer des petites cellules du poumon, de cancer du sein, de cancer du côlon, de cancer ovarien, de cancer de la vessie ou similaires. La dose administrée dépendra de la nature de l'affection néoplasique, du type d'hôte atteint, notamment de son âge, de son état de santé et de son poids, du genre du traitement simultané s'il existe, de la fréquence de traitement et du rapport thérapeutique. Àaquesi-u=poa aiTnq aun,nb TsuTv 'quasgad 4usmasna2v%uvA S xSa a-izns un nao ueaoolnpç ua9i ui 'uopIme,I no asoo-el aI anb is% alqi4saioD apTonlg un aJl% -.ned 4uvnlTp al 'alqvlqmas uo5vj ap gsTagAlnd:umnlip un oaAe aguelim xd %a au %uaunmesTjni anolnus aun e,nbsnó fio m %ualp, I ap uo$%msTgAlnd Oú evd luemaldmIs sga% sa,ajdiad %uos saipnod sae saaaedgad asa %4aAnad sapTnbTI no sàpTios sanbTBolosod spqTun,p sauroj sap 'al-eo uoTI%%sTuuIpm,l inoa À;Fq ov queTpeaguT un,p saadoaddv sm;T1uvnb sap %uvuaeuoo 'saiTeITm=s no salioS suoTsuadsns no suoiFnlos ap 'saTqeloaeul uou su-osuadsns no suotnlos ap 'salTTls slqmoaçuF suoTsuadsns no suoInlos ap ssa-IoTsoddns ap 'Salnua9 ap 'saapnod ap Isainlid ap 'saTnsdeo ap 's; mPI2dmoo ap aldmaxa -ed isanbT2olosod saip4un,p samalo; sap snos 'xneiiue xne @ OZ suTimnq xn-e uo-TsTuTuIp2,1 inod maausgd aouaea;,ld ap %uss uoTIuaAuI a4uasad QT ap suoTTsodmoo sa A/d S, S uo IAuap aoualg;,aId ap 'uoai4sodmoog me ap A/d %0o F SO' uO UoJIAuap uoT:Qiusouoo aun suep 'I%uaed 51 ogesn e 'suoT:tSodmoo saT suep sa!uoîITsoduoo t1 ap d/d %OZ e I uoilAuà,p aouaiaad ap 'uo$Isodmoo VT ap d/d %Og ? 10'0 uoaTAua,p uoTlqauouoo aun suep 'aaTvinoo no TeqosI 'feuT2QAQuF 'anbiqouoaq 'esuXlaouKxaeqd IeseuevauF 'a ap eT ans Tvooi agmsn ? uoTquaAuT Ol a4uaesld eT ap -suoIITsoddoo saT suvp quagsad al%9 Inad;T:oe:uaTpeauT un 'uoTqvausouoo ap samasq ug aa9q,T ap 8acOdOO spTod ap gx/2 OOI uoTaIua - S 'Ilosaigu aed %a!X/Sz O00I uoTAua s 9 'aTseu 'uoTIVITT:SuT ad!2q/S 001 Uoa-iue - S' alvaO aToA ved!i3/2 og uuOTAua V I 'asT1nosnuieu a-oA aed!oX/2 Oz uo TAua!I0 'amsnauTsA-e-ul aToA led: sDueATns sa-;uos spaqsTuIpe smTo squaTpp4gui sap sanbTiolosod xn-eaAu sal 'uoil%asnlTTp salI V ZZ19Z gz ap 4e aICronsap addoleAua eun,p 'enbt-e-aîuosue alTuTqsa4uT uoj:.daosqe anod 4uauraai un no ggutçouu;gp 5ú uema:EAaa un awd àpn:;çsuoo aoTq.zoaeo..d addoleAue aunp TuQSg;uamasnaSv;u^we aaig 4nad aipm-duroo el saumTudmdoo ue gssauzd a4Tnsua %se g9;TjqnI augl-im a- 'aIWuTm aTltnq aun,p no:v apP 'anbTi-s las ap 'anbTlbas ap1owe,p uo;;pp- oç ad 'ssmTiduioo sap uo0 maLo; ap salnom xnw aouasagqpv -nal.1aeaA,p uuI sagS;aqnl aeQ juaanad samiisd sel (seaTITsd> s;ueaus; ue sgsTIq ae% queanad su-%nsaz smoj Iuemaai.Tv; 1dmT s;puT.ldmoo sal;s esnaleI;sd el saaAal pssvd au4g qnad IT,nb alTp- -seo 'IIT4s-ed 5z aa%4;nad saapnod ap eSuelO ael -'uoîlnuzS el ap a8%uvTIA ap alT4 V 'alqTao un saaea4 90ao0j ap aessvd $ues BjI al ua sa uToQoP,p auTTIonu un no asolnllaol&qDur ap uoTnlos aun 'auTlUIg2 ap uoJ4nlos aun "sIVU ap do-Ts unnb la% -4uTi un oaAv %u oDemnq,I ue saipnod o0 ap a2ueIam ael alnu9i2;nad- uo saITTUmTs no anbfolIoTp a%4qdsoqd al utIoex aI 'aso-4oI el 'uop lno, anb a,4 aseq aun no 4uvnITp un oaAv 'psTaiAInd iuuamaIqvuaAuoo jT;o; ueaTp2u- un 4uea2uç2mi ue saepnod ap a2uelqm l aivd)id uo -sçmTdidmoo ue e2assa-id 4a:uv;Tqnj unp 51 uoT;TppQ 'ae2ITTsed no uoT:inuç2l 'Bsa.pnod ap eSue9ui un,p uoTWJedgad açd s)uuoT;oa;uoo;uos suxTzd=oo saG apTioXISTl. un no a:aauT altnq alne aun 'sa2gil apTnbTT mnIeioi;pd un 'alqeldaooç alvl292A aITlnq aun oaA sjToe squalpga2uT,p ae; d aun,p aupqov -e e asgelnsdeoua 01 ed saeaedpad 4uos sallou auelip ap saEnsdço sas aBvssTIdma ap uoTI.eado,I lnod lumAn pvp uvA.aes 'seB1TeTImTs no mnTolmo ap. %a-me;-s al 'unTsiu2vu ap aeals 'oi-e al anb ls %uvTUlJqn[ un 'aSgSSTIdmea ap uoTmgdo,l q4ueAç 'saupnod ap asumelu m ne Jaeno m,p xneg-qu-Am sa II a2uelipuao oeAv sflnou aUT;VIE)sap sTnq. sap:uvssTidupa- ue.a snssep-_o 4Txogp anb la; sa-pnod ap a2ueIam un; umrdad ua saInsd-o sap;Tnpoid uo 4UVAU aualxqî,aop apxxo.l e uoT-Tsodxa avd 9STIWTaqs aàc.u4nad;-^os 4uaTpap2u-ig uou-î,- d aénqoa;je 5 c.;a sid:nad au Quo sIas gI anb %a 'snossTp aci,p naTI n aInopqaA el suep uoTsuadsns ue spm 4se T.oe i.euaîpaI2uTj anb uopIdaoxe aeao - 'ajQTulm ameam e1 ap.nuamenbTq.'id seaxdid;uos salluagd suoTsuadsns sea -alnopTeA el suvp snossTp aiqq;uaAnad suoduim; sueSv Oç sep %a uoTIAasuoo ap squa$ - sep '1-oot anbTsipqqsau- un,nb sTaq s.uvAn p sae 'O-;rnIeo iueuanbT,4"aa aeuLxa; ap %ae Tardoaddv uoo-I; un no aInoduro aun ITTdma- ue,p %umAe uoT;%.mIT; Jd s;,.i-s e.x qnad uoTnlos aleo %a uoqoa uT anod nue,I sump snosslp 5 ea; 1nad aiqnIosopXlq;oe 1ueTpazsuT. 'suonIos sep Jaaad;ad lnod 'alnoqa ael suwp uoTnIos ue no uoTsuadsns uae sTi z; nad;T:;o 4uaTpîpl2uTgI 'saçTToqo uoTDeaueouoo el %a.am eo; el uoleaS 'eaiggagd ju%,a nde, aeTuiqis aenopA un 4a ITI o;ueTpa,2uT un %uvsTITIn oz ua saie-zdqd;uos sepTniTI sae;Tun senbTgoiosod scuI..xo; sap emlio; inod 'uo;eigesuoo ep s;uaeS sep a, sjuvs;^em-o t. s;ua2e sap 'a-ons np oae xnenbv elnoTqgA un suep sa%.nossTp a-i 4ueanad nve,l suep salqnIos semao; sa iae-sTuTurpe ?;oe -.uelpp-iSuT,p aeauTizale; pp9id aç,4;ugnb aun auuaTluoo uoT$Tsodmoo ap q;vo 9 aleailTno enbvqo enb al.os aTlae ep semzdEazd aa,9 %ueAnad 'suoisuedsns a xsITx;-Il 'sdoJTs anb sallea 'aleo uoT-%Vas;TUTmpm inod seapTnbTi saiT;un sanbTSolosod semio; sea -vqnvuaoo ap a4-o ua ae2ss-Iod ap addolaAue aun,p ea asolnlîeolXq&49u seuIJo; sallaAnou sel 4uvuuaouco suoTqvoi;Togds sae sTnbaanb;;nao=ruvsqdainoTqgA no iuaT;doxe ú 4uQnlTp al oeAi uoçT,çcossw ua lipiTsep enbTInadvaizqw 4a;;e.a1aaTnpoud -nod aalnolTo 'aAe;oQ aouvsqns ap aguTmpaapad ç%;uvnb aun %uvuaquoo q%un enbqo xn-eTuu ja su- mnq s$% ns sep anod sanb-iolosod safun euamoo%ueuueTauoo Tnb seagadgs uux a, sgqun O0 sep auSis;p suo %QoTpusa.1 sel;e uo8 Odîosep QI suvp az.DsTIT. ln a.,^TaTun enbTgolosod amao1," uoTssaadxel *selq$Tsgp no saaîsssogu ai1 4ueAnad Tnb IsuviiTnomu suaese ea suAIos -oo anb sIa- 'sIansn s.4umAnppe sel oai 'saueglTmis S no auvdoad al 'a4oz.I enbTuoqivo apTapúqueI auv; qqpuioionl;TpoaolqoTp al - aidmeaxe.zed 'e;ajnbTT no xnaze2 anestndod un oaAv uoTssaid snos losogee eqmoq. aun suep seilqo a-i4 -kueAnad s;%oe skuaepipSguT saI 'slOSOap,p amioe snos uoTksTjITn aun ino 0 TSToqo UoTi4Qa4sTuTuipep apom al -se UOT:Iel*ensuTT enbslol a l numo; _ioa %4nad eqoQs aapnod euj sau$oiXd saou-4sqns ap aldumaxe nue aun aouesagJd ap apTdouddv anbT;naoLmaeqd elnoiqaA un 4a -;oe 4ueaTpeaSuT un IuvsTliln ua. azagdad jsa apTnbTI a ea4;:un enbTBolosod 51 ameul o;aun ae'isQueauT uoIUIT SUul anoc ÀaenoTqA ap aITAlaes quaAned (saxeoqeo) sTooXl2aeuQlX4Xlod s-uaeaTiTp -a ogoIo ap a.lnaq al aidmeaxa -id 'alqnlos uemaiio; 4sa s nb ainoflipa un no allaoiodoo a-n-ezgdma% el ap sJno-uaIe xn- uo-sn; ap 01 iu!od un Tnb alnoriq;a un- iesTT;%n -nad uo.a-io4Tsoddns un,p uaúom ne.a4sTuTmpv a-: -.nead;T;ov 4ueTpaSuT un 'saasTTin asv 4uaanad elQuT2vA %a aet4oae saToA sal 'aleuaiuaed %a alvIo uoel% sTuTIpml a-4no q.uaTpaI2uTI ap amoo;Tun uoaTnqT.isTp aun aaIoTwV ap u-;g 'uot. Tsodmoo el suep aiodioouT %uerasnaielue.A sa %uèllTnom;ua2e un no TT40o- oTsuB% %uaBe un aI!J4s alnomqaA al suep uotsuadsns ua stm aeaJ8,p sanbTxo; uou -a s; 4ow uamUnbTInaeoImqtd smảvaTfp s.nat %a anbiq;uX s %uwpuad uos 'I auTg1sVTuFIOa el au2Ts9p,, oe uaTpgau$. uoI%;ou el slanbSal suep '%uaAins Tnb saldmaxa sal suep oç saIlaIoDp 4Uossella.uoluaAuT %uasxd 1 s1s;l ouoo anod sagadead %,., %nuo sanbTSolosod sam.o; sanaTsnld IL aldmexa io-aileo %uamalunu utiasTmT au %a uoTIuaauT a.uasgid eI ap saaTvTun SE sanbT2olosod sault0J sap uoTIoa; uoo al %ueasnlTI sa%.uQAîns suo;Tieavded sa' sIIqm$$ uaTq sepgooid sap avd sa,$d$id al.a %uaAhiad;a anb-uqoa. el suep saelquods$p samip-sall a 'uos Inb sanbT:naïovmaqd saou.sqns ap uoDisTITin oDaA saiTQ-Tun sanbITolosod saeo; sallal. oz ap snos sgewedead Iuamalrmov eaq luaAnad senbtsQldogu;Ouv sua$ aumoo xaaoldda sI;Tou s;uaTpeajuT sae axiourgm luaspad al suep sa.Taogp saueo; sanv,p anb Tsuîv 'sauio; sao 'ap. anbuoolanb aun,I ap splosI saldI.nm sap 'suooI; sel 'ssalnodum sel 5 sa+ :no2 sal 'adnos samailTno sal 'ggo - saip-al-rno sel 'sealqoo sel 'alpnod ap s-enbvd sal 'saeiToTsoddis seal 'sallTsed sael 'salnsdvo sal 'sçuxTxdmoo sael uos uoTIuaeUT a4uesad 1î uolas sagîadoaddu sa.iTvTun sanbTgolosad samio; ap saldmexa saa uo-1;uaAuT O0 a4uasçad el ap sanbTsTlaovavo sap quan-.T-%suoo $.a saQ4Tio sao ap saeuvpuedpp Iuema:koaaTp %mos saIa ae uboTIdTIosap aluesapid -l suçp easodxa,nb eall%. au=ioq,l zeaqo anbInadmq% aegsn f aATIov aouwsqns alla- aun %uvuauoo uo; %$soduoo aun,p uoTawdu dS el ap -, suep ae:uajpqu-; uom;çmHTui -e (q);a 'zlua@qo ie$ iaTnoIled enbTInededçEaq% 4a;jal,a e aAoe aouw:sqns eI ap saedojd sanb-psTlsIa;o-o sel CT - inaeTsoaoTm un,p uaXom nU "mTATp guemuuTj>) -Tço- :uaTppa2uT unp Sm Oz iueua4uoo 'aloonq aToA -id a2esn Sz so alTd alnes aun,p allou auT-F,4i2 ap selnsd-o sag ellom auTvla, ap selnsduo s,, uoTIsodmoo TT; o %uBTpajSuT unp 2 Og -a 2 SZ 12 g -id snssap-To asnuloz uI sump 0z swsTITn 9 OZ ssl lus5,ldmsa ua tT;ow %uaspalsuTp Bm og $a SZ 'g ap sesop sap uwusuaouo salnsduo sap alqwlqmus uoSei ap agdpald uo 'alnpiaooId amQm -l lumnbTiddw ua anoF aUd sToj zs-nb- un selnsdeo xnap no aun,p uoTIslzsTuTmpe l-d anbTsIldOcu uoTosag; 9L eun,p %uamasT-L al inod ssoQoTjTa quos selnsdvo saD alIaniTqbq ajTuUm UT ap ilnsdvoue sind $uemamatuT p2uwlau isa unals al auT; alpnod ua sgTnpg s:ueTpleauT sailn2 xna,:noCf %se laTv ? unesTuooTm un,p uaKou nm ipsTAp %uemauiT 'sTT o lusTplgSuT, OL * E znTse)ug= ap aqwaQgl^S 2 oz sjm ap uopTmY oz 9sTuoTou JT:o0 4uaTpgasu! : s:uaTpilguT,p squeAins sag;:uUnb %a sade% sep iTad saidipid %uos 'T;%o %uaTpaESuT un,p u Oz %usvuaouo alnsdeo anbeqo 'alsoonq atoA avd a.esn - saT%ed xnap ua ainp au;çqmaIE ap salnsdvo 0001 ainp auTmIli ap selnsdvo y, uoIT;soduoo LLgZ Iú 5306L aos S S Inb!ozuaq apToy a z anbT-To ap$ov ISTuoUoTm;T'ou IuaeTpiszuI S:ksuaîpE)-1uT,p suvATns sq4T:Iuvnb I+a sadà % sep aî:+avd Es 91Ed,@ ) qo Oú i 9 a.zasTno aun,p asop enbSqo suep '%ueuam4uoo 'al-oonq aTcA -[ed ag-sn -. asnanbw uoTsuadsns. aun,p Im OOOt alwao uoTsuadsnS a(. uo$Tr+sodmoo JT,40Q;+uaTpipa8uT SZ un,p 2 01 $4a 9 SZ lad snssap-$o al-nUmo;: I sump sgs$I$%+n oz sal qu-meldmar- ua ';T og %uespglau$ un,p Ou 01 a Ou SZ ap sasop sep lu-euaeuoo sui-cdwoo sep elqeqmas uoieQ ap aavdzd uo 'a.tnppoo.id amipm el q u-nbTIdd[ ug znop.ed sTo; ajlenb e aun suz]i:dmIoo xnap Oz no un,p al-ei uoxesuTmp,l d anbTs-edogu uaT4oa;;sw aun,p quiaTQa4 al anod saovoT;$a quos samTdImoo sao *;TIov 4+ ueTpiagBuT.1 ap 2a Oz +ueua+uoo imTaduoo anbvqo 'sEm$îdmoo ua sgssaud al. nsua 4uos suvq.Inspa salnuvaS seq 'l I.u alqTao un slaaea E aojoj ap a2vsswd jud sagsTaq duos saliTtwsvd sal g91ITs-ed q+a luemam^uT-l- ipgueim qwsa -4no,4 al sTpnd sjuaTpaBuI sa-lne xne aenopm qsa 'a i x. na?$uoloim un,p ueXcui nv ssATp %uuiemuTj 'jT'+ e -4ualpgalguq 9 S aagl apTnb$I m'neloalgc O0 2 b.. mnTsEauSvm ap alvwravgs 9 0S. s!em ap uopTmV 00ú asoowQ 2 OZ 9sTuoioTmu;T$ov q.uaTP'SpuI : $%uaTpgagu,p s%uwATns sTI%uvnb S :^a sadXl. sap xla^ed es Epg-i-dE)d truos 4_zT'+ ow:+uaTpipSuT. un,p 2m Oz unmeqo IuQuasuoo 'samutdmoo 0001 O, uo9+sod oo 9ZI Zú 33 2617712 Essence de citron 2 g Eau désionisée, q.s.p. 1000 ml. * L'acide citrique, l'acide benzoïque, le saccharose, l'adragante et l'essence de citron sont mis en dispersion dans une quantité suffisante d'eau pour donner 850 ml de suspension. L'ingrédient actif, finement divisé au moyen d'un microniseur & air, est agité dans le sirop jusqu'à ce qu'il soit uniformément distribué. On ajoute une quantité d'eau suffisante pour donner 1000 ml. La composition ainsi préparée est efficace pour le traitement d'une affection néoplasique & la dose de 1 cuillerée & soupe (15 ml) trois fois par Jour. Composition "E" Produit injectable Une suspension aqueuse stérile pour injection parentérale, contenant par ml 30 mg d'un ingrédient actif pour le traitement d'une affection néoplasique, est préparée. à partir des types et quantités suivants d'ingrédients: Ingrédient actif micronisé 3 g Polysorbate 80 5 g Néthylparabène 2,5 g Propylparabène 0,17 g Eau pour injection, q.s.p. 1000 ml. Tous les ingrédients, à l'exception de l'ingrédient actif, sont dissous dans l'eau et la solution est stérilisée par filtration. A la solution stérile, on aJoute l'ingrédient actif stérilisé, finement divisé au moyen d'un microniseur à air, et la suspension finale est versée dans des flacons stériles et les flacons sont fermés hermétiquement. La composition ainsi préparée est efficace pour le traitement d'une affection néoplasique à la dose de 1 ml (1 M) trois fois par Jour. unp uaXou nç asTATp %uamauT 'QsTITa99s JT:$om iUapgu, rl @;BaUno o 'aPI uOs uoTnlos vl y 'uoT%lqT Sú avd 4STaTIs Ss uoT-nlos -e4a nea,l suep snossTp I-uos ';Tkoe %uaTppg2uT,I 3in-s 'sueTpgSuT sel snol l 000 'd's.b 'egsiuo;s;pp nm2 9 0I'euvqmacsXido Z S 'O0 eWsqosATo4 4T -'I J uoToIIDç %ualpgauI : suepaliut,p s%UAns saTunb a sad ; sep %Tlad i sa,çdipd a uos ';Toç kuaFpQgSuT un,p 2m Oz Im ied %ueueuoo 'a-IsguQ-u, uoTmIISuu5 inod eI's asnanbm uosuadsns aun,p IT 0001 -a!esvuelu uoTsuaesnS 0,, uoTsoduoo anbTseIdoiau uoaToa;ev aun,p:ueemaTw el Inod uTSA al no mnoao al suBp sElEsuT %uos saeTo4-soddns saD 0o aouTm anbTII-eam aleTne; aun sup roddoleAue jsa aeTosoddns enb-qo ^ka alnou np alTseXxa 4sa alla sTnd 'iaTpTTpis as a' -pIoTQal uoTsodmoo eI ass-FIluO '00P B sîpToijae uou salnou sap suBp agssaa 4sa uoTsuadsns vl 51 uoT4eT2s snos iuamaeuel aç, gnors jsa X IooKigBauQIKdold al suQp uoTsaedsTp --l 4a npuo;:sa looKigeauaiKqKiplod a 'atojTun UoCsadsTp aunp uo Tuaqoi,nbsn saploloo ap uTinom un saama, ? aSuçlu ael asssed %T; uo sTnd 'ioo iauailXdoad nç gpnoFm %a aTç ç ines-uoao$m OL un,p uaXom ne psTap luamaul; 4sa jTqom:uaTp9s uTJ, À OOSZ 'dsb '009b# IOOKIaUIKq%XIOd 2' O0I looXlIau9lXdoud =iS' 9sTulo;T40:k uaTpgasul : s,4ueTpgaguT,p s-4uvATns sqq.Tluvnb ja sadX 5 sap -qle s;pavedv.d.1.ucs 6;Tioe juaTp;gSuT un,p Sm oz :u-euaquoo 1a 9 gr' unoeqo lu-esad IsaiToqTsoddns OOOI IauT2QA %aa vloea auTo%soddnS ",uoTçmSodmoo Jnop ard sTo; auenb aunS Sn on ap uoT; uelepqui,l d nanbTsisdogu uoTo;; o aun,p uaunaaTexi al Inod aeovo;a Isa uoT;Dsodpoo a;qa0 jaT a nasTuoaoT= un,p uaXom ng 4uamauT; sSTSATp!uos a8a9u2sga; 7uemaaQTSSOS amao; snos jToe 4uaTpiiuT unp 2 01 O0 uoTq.v; l:nsuj 1,, UOT;TSodHroo À.nor avd SToj aa:nb n aun nia,p aaaaA un su-ep uoTsuadsns ua aipnod ap s:aqovs xnap no un,p al'Tio uoT; isTuTmpl aSd sanbTsvldoiu uoTooa; 5z aun,p 4uama;J al dnod sooeoT;;a;uos sa-pnod sas sX-anbud ua asTm na ni oz ap sallanpTATPUT sasop ua a osTdTP%sa assTuozoTm a-pnod eJT nasTuo-ooTa un,p uaXom nme queamauT; sisTATp uos auamgi; -4uemIaITsçoS amao; snos;T;zu;uaTpi2SuT un,p 2 01 OZ aîezo aipnod I.. UOTTsoduoo nop Qa d sTo; aaI enb o aeun a.pnod -l ap uoTInoTaddo uod 'ssTleoo s;uTod sap ua anbTsvedogu uoF3oa;;s aunp 4uauI;s-I. al Inod aaOs; %a o Tsa uoTTsodsoo aiaoq aananooas ad$a o np %uaTdToga un suBp agowrd:. sa aqstuo.ioTui a-ipnod q -'Te anas- uaTu-Jo un,p ua. oUrne;uauau sgSTATP l.u0s eagam2iw uamaJaTssoJ2 amul..o; snos TT 4.ua ppx2uT un,p 2 g aipnoj O!l "H.. UoTrTsOdIMOO alvao no anbTqouoIq 'apSuXuelaBuXavc 'alasvual;uT aToA jud 'amaap al ans vooîl aBusn inod 36 2617712 Composition "K" Capsules de gélatine dure On prépare 100 capsules de gélatine dure en deux parties pour administration orale, chaque capsule contenant 20 mg d'un ingrédient actif. L'ingrédient actif est finement divisé au moyen d'un microniseur à air et encapsulé de la manière habituelle, Ces capsules sont efficaces pour le traitement d'une affection néoplasique, par administration orale d'une à deux capsules une à quatre fois par Jour, En appliquant le même mode opératoire, on prépare de façon semblable des capsules contenant des doses de 5, 25 et 50 mg d'ingrédient actif, en remplaçant les 20 g utilisés ci-dessus par 5 g, 25 g et 50 g de l'ingrédient actif. Exempl 2 P. Des formes posologiques unitaires de dolastatine 10, préparées conformément à des compositions choisies de l'exemple 1, ont été testées suivant le Protocole 1200 décrit dans Cancer Chemotherapy Reports, partie 3, vol. 3, n' 2, septembre 1972, pp. 9 sqq., pour la leucémie lymphoïde P388. La dolastatine 10 a donné un prolongement de la vie de 28 à 40% à la dose de 0,75-2,5 mg/kg de poids corporel de l'hôte, à l'égard de la leucémie lymphoïde murine P388. La dolastatine 10 a également inhibé de façon marquée le développement de la lignée cellulaire in vitro P388 (DEco= 4,5 x 10-r g/ml). Exemple 3 Des formes posologiques unitaires de dolastatine 10 ont été préparées conformément à l'exemple 1 et obt été testées suivant des protocoles admis du National Cancer Institute. La préparation a donné un taux de guérison de 17-67% à la dose de 3,25-26 pg/kg de poids corporel de l'hôte, à l'égard du xénographe murin de mélanome humain du N.C.I. sapxauuv-;o suo;^eoTpuaAau sep aeaXod QI jud anb a;TmTT jsa,u Tnb uoTuaAuT aeuasad QT ap aapvo al suep 4ueu4ua uoT;dTIzsap aluasa-d w1 ap aenq.o;a QT w 1lg, ap ammolql ap 1-T-dsa'T eQ fkuoapuai,& Tnb suor;.e,4d- p-e Xa sa4uTavA 'suoT;%o;tpom mal anb Tos ap A II anpuaeeuT uaalqenbamzl uoSe; ap saoead súnq xnw sno. :uo;slles Tnb seooT;e;a selleAnou sanbiseldoguluv suoT1Jedai sap a aoeoTrea %l nvanou 0nbTs.edoiuI:ue jnane6 un panln %a Iaop aoT. 9%k9 e IT, nb alqTsTA 4uemuia4au sa I$ a 'apioqad Tnb ao s$adv,1 a,4n4fisuj aeouv 1euoT-:ev np sTmpv aloooqod al;uvnbTIddQ ua '12uid I'1 I t't1 ap sasop sap %Pú1 W %,Z ap ap A UI ap %uaenauoload un nualqo e uo;a g9i-g- uwn amoulgu np plmgg,l 1a sa% 9; 'I aldmaxa,l e luame.ao;uoo agazdgad 01o auTi4%esiop ap aalmI4Tun anb-Iolosod amao; aun t aLL9axL 38 2617712 REVENDICATIONS 1.- Substance inhibitrice du développement cellulaire, dénommée dolastatine 10 et répondant à la formule développée: CH3 O /.OCH OCH3 N o CH3 CH3 N HN CH3 N 2.- Préparation pharmaceutique, comprenant un excipient pharmaceutiquement acceptable et contenant, en tant qu'ingrédient actif principal, une quantité efficace d'une substance naturelle ou synthétique ou d'un dérive pharmaceutiquement actif et non toxique de celle-ci, cette substance répondant à la formule développée: 39 2617712 CH3 N N OCH3 OCH3 NH-- C ACH3 CH3 N HN CH3N 3.- Substance inhibitrice du développement cellulaire selon larevendication 1, présentant les caractéristiques de RMN suivantes: 2617712 Décalage chimique PPM Structure 1H(mult: J,Hz: AFfectation13c (mult) Integration) NOE 2 170,51(s) 4 142,77(d) 71717(d;3,3; 1H} 118,76(d) 7> 254(d;3)3; 1H) 6 53,02(d) 5,516(ddd; 5,7, 7,2, 9J3; 1H) 6a 41,48(t) 3,399(dd; 537, 14; 1}H) 3J256(dd: 5,7; 14; 1H}) 6bl 137J74 () 6b2,6b6 128,74(d)x2 7j243(d; 7,9; 2H) 6b3,6b5 129)o80(d)x2 7;214(dd; 7;9, 9,2' 211) 6b4 127,02(d) 7,194(t. 9,2; 1H) 7 7]256(t 7;6; 1H) g,9a,10, iab, ll 83 175 67(s) 9 44,79(d) 21B2(cpinti 712; 1) 7 9a 14,49(q) 1;0B5(d; 7, 1; 3H) lo 82l05(d) 3J845(dd; 2O0,B,2; 1{) 7 lOab 60B89(q) 31309(s; 311) 6, 7 il 59!86(d) 31985(m:lH) 12 2500(t) 1SB04(ddd; 5)5, 710; 19; 1H) 1î60B(ddd; 7; 9,2,19; 11]) 13 25145(t) 1,446(ddd; 417,7,19; 1}{) 1; 715(ddd: 4;7,7,9, 12.7; 1H) 14 48B03(t) 340oi(dd; 79,10: 1}{) 17 31390(m; 111)b 16 174t01(S) 17 Bll(t) 21394(ABq; 9) 0o 21) 14 18 78;>6(d).12(t À 817 1il) 18ab 50;16(q) 3; 313(s 311) 22 41 2 6 2617712 19 54)11(d) 3 26-3 39(1H) 19a 33162(d) 1 680(111)b l9b 26 25(t) 1j370( m large 1H) 1jOOC( m large 1H) 19a 10>92(q) 01823(t; 7]4; 3H) 19d 19982(q) 1/003(d; 6/8; 3H) a 30109(q) 35012(s; 3H) 22 21 171,39(s) 22 54,20(d) 4. 761(dd; 6.5, 8.8; 1H} 13,18ab, ,19 22a 31,42(d) 1,983(sexple: 6;7; 1H) 22b 18,18(q) 0,94(d; 6>8; 3H) 22C li6:y9(q 22c 16 09(q) 01977(d; 6;8; 3H) 23 6,861(d: 8;9; 1H}. 25bc 24 172,44(s) 76,77(d) 2 454(d: 69; 1H) - 23 bc 49,92(q)x2 2,262(s; 611) 23 26 28,08(d) 2,073(sextuplek6t7; 11) 27 20> 24(q) 01964(d; 6;8; 3H) 28 1818(q) 0;902(d: 6j8; 3H) a) CHDCL2 résiduel servant de réfrence interne (5,32 ppm) b) Signal de recouvrement c) Signal affecté d'aprés les-données de NDE. 4.- Préparation pharmaceutique selon la revendication 2, dans laquelle ladite substance a les caractéristiques de R.M.N. suivantes: 42 2617712 Décalage chimique, ppm Structure. H (mult: J,Hz: Affectation13c(mult) Integration) HOE 2 170,51( 4 142177(d) 71717(d;3,3 1H) 118,76(d) 7;254(d;3,3: 1H) 6 53j02(d) 5, 516(ddd; 5J7, 7,2, 93; 1H1) 6a 41 48(t) 3y399(dd, 5 7, 14; 1H) 3/256(dd; 5,7; 14; 1}H 6b1 137, 74 (s) 6b2,6b6 128,74(d)x2 7 243(d; 7,9; 2H) 6b3,6b5 129j80(d)x2 7;214(dd: 7/9,9; 2; 2H) 6b4 127,02(d) 7/194(t; 9,2; 1H) 7 7]256(t 76; 1H) - 9,9a,10, iOab, 11 8 175j67 (s) g9 44,79(d) 2Z82(9r2qlr* tT 72: 11) 7 9a 14,49(q) 1, 085(d' 7,1.; 3H) 82105(d) 38y45(dd; 2;0,8/2 1H) 7 loab 60j 89(q) 31309(s5 3{) 6,7 11 59 86(d) 3,985(ml1H) 12 25100(t) 1j804(ddd; 5)5, 7tO: 19. 1H) lt608(ddd' 7; 912,19; 1H) 13 25145(t) 11446(ddd: 47,7,19; 1) 1/715(ddd: 4/7,7,8, 12.7 1H) 144803(t) J3401(dd: 718,10; 111}) 17 b 31390(m: 1}I) 16 17401(s) 17 38711(t) 2,394(ABq; 9;0' 2ll) 14 18 78,06(d).1122( t lar: 817; li) Ioab 58 16(q) 331>3(s 31) 22 43 2 6 2617712 19 54i11(d) 3 26-3t39(1H) 19a 33; 62(d) 1 G (1H) 19b 26;25(t) 13370( m iarge 1H) OOc ( m large 1H) 10,92(q) 0,923(t; 7,4; 3H) 19d 19J92(q) 11003(d; 618; 3H) a 30J 09(q) 3J012(s; 3H) 22 21 171,39(s) 22 54/20(d) 4. 761(dd; 6.5, 8.8; 1H) 18,18ab, ,19 22a 31>42(d) 1 983(smçbtmLet 6$;7: 1H} 22b 18;18(q) O,94(d: 6)8; 3H) 22t 16 09(q) 0?977(d; 6j8; 3H) 23 6861(d: 89; H) 25bc 24 172j44(s) 76177(d) 2)454(d: 619: 1H) 23 bc 49 92(q) x2 2j262(s;: 6H) 23 26 28 08(d) 2,073 t7dlEt 7; 1H) 9607(gm.W 6t7 1}{}H 27 20,24(q) 01964(d' 68; 3H) 28 18 18(q) 0 902(d: 6,8; 3H) a) CHDCL2 résiduel servant.de r.férence interne (5,32 ppm) b) Signal de recouvrement e) Signal affecté d'aprés les données-de NUE.