FR 2620028 A2 19890310 FR 8712424 A 19870908 Le présent Certificat d'Addition est un développement de la demande de brevet n0 86 17116 déposée le 5 décembre 1986, ainsi que du premier Certificat d'Addition n0 87 02137 déposé le 19 février 1987. La présente invention concerne en effet également un procédé de préparation de microcristaux d'une substance insoluble dans l'eau présentant une affinité pour les phospholipides. Elle concerne évidemment les microcristaux obtenus, ainsi que les compo situions pharmaceutiques en comprenant. Le procédé est caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes a) on évapore le (s) solvant(s) d'une solution de phospholipide(s) et de ladite substance, b) on remet le film obtenu après évaporation de(s) sol vant(s) , en suspension dans une solution aqueuse après agitation vigoureuse. Dans la présente demande, on entend par micro cristaux"les microparticules lipidiques d'aspect cristallin obtenues par le procédé ci-dessus, étant entendu que la structure cristalline n'est pas nécessairement présente strictosensu. Dans ce procédé, il faut entendre par substance insoluble dans l'eau, une substance peu ou pas soluble dans l'eau et par "substance présentant une affinité pour les phospholipides" un composé chimique plus partir culièrement capable d'interagir avec les phospholipides par voie chimique ou par voie physique. Selon la caractéristique essentielle de la présente invention, la substance active en cause est choisie parmi l'amphotéricine B et ses dérivés présen- tant une activité antifongique. On trouvera une description de certains de ces composés dans la littérature #i ] L'amphotéricine B et ses dérivés, notamment dérivés aminoacyl, continuent à être les médicaments de choix pour le traitement de nombreuses infections fongiques profondes en dépit de leur toxicité sévère et d'effets secondaires néfastes importants. Il a déjà été proposé pour réduire la toxicité et augmenter l'activité de l'amphotéricine B de l'encapsuler dans des liposomes. Cependant les résultats obtenus, à ce point de vue, quoique positifs, ne sont pas encore suffisants. Les microcristaux d'amphotéricine B ou de ses dérivés permettent de pallier à ces inconvénients de toxicité importante, tout en augmentant l'activité antifongique desdits substances, de manière nettement plus efficace que les liposomes, vraisemblablement entre autres en vertu d'un effet de pilotage de la substance vers les cellules cibles comme les macrophages, ainsi qu'un effet de libération progressive de la substance active améliorés. En outre, le procédé de oréparation de microcristaux est plus simple à réaliser que lten- capsulation dans des liposomes. La préparation de microcristaux permet également de rendre soluble l'amphotéricine B sans usage du déoxycholate comme dans la fungizone @, celui-ci étant toxique. L'amphotéricine présente une affinité pour les stérols, c'est pourquoi, dans un mode préférentiel de réalisation du procédé selon la présente invention, l'amphotéricine B ou un de ses dérivés sont additionnés de stérol(s), notamment du cholestérol (CH)-ou de l'er- gostérol. Selon une variante du procédé, notamment en l'absence de stérol, l'étape a) du procédé se subdivise ainsi ai) on évapore le(s) solvant(s) de la solution de phospholipide(s), a2) on remet le film lipidique obtenu après évapora tion, en solution, en ajoutant une solution de ladite substance, a3) on évapore le(s) solvant(s) de la solution de phospholipide(s) et de ladite substance. Le phospholipide plus particulièrement utilisé est la phosphatidylcholine (PC). Le rapport molaire entre le ou les phospholipide(s) d'une part, et ladite substance additionnée ou non de stérol(s), d'autre part, est de préférence compris entre 0,1 et 2,5 et de préférence encore compris entre 0,8 et 1,4. Lorsque l'on associe un stérol à l'amphotéricine B ou ses dérivés, du point de vue du rapport molaire ci-dessus mentionné, la seconde quantité visée s'entend des quantités d'amphotéricine ou de ses dérivés et de stérol additionnées. Ainsi, on peut citer notamment le rapport molaire phosphatidylcholine/cholestérol :amphotéricîne B de 4/211 (soit un rapport molaire global entre le phospholipide et la substance à traiter de 4/3). A l'étape b), l'agitation vigoureuse se fait de préférence par traitement aux ultrasons. On peut citer comme solvants utiles pour le procédé selon l'invention, les solvants organiques usuels, tels que le chloroforme, le méthanol et les mélanges de ces solvants. Par exemple, la solution de phospholipide est une solution de chloroforme, la solution d'amphotéricine est une solution de mélange chloroforme/méthanol, et la solution de stérol, le cas échéant, est une solution de méthanol. Dans l'étape b) du procédé, notamment en l'absence de stérol, la solution aqueuse est par exemple une solution de NaCl. En présence de stérol, la solution aqueuse de l'étape b) du procédé peut être de l'eau distillée ou du NaCl. Avantageusement après l'étape b) du procédé, les microcristaux sont purifiés par centrifugation et lavage en solution aqueuse. On peut également avantageusement utiliser comme solution aqueuse des solutions de saccharides, par exemple le lactose ou encore le glucose, notamment des solutions 0,1 M. Les microcristaux obtenus peuvent, dans ces conditions, être lyophilisés, ce qui n'est en général pas possible. Il en résulte une possibilité de conservation à long terme. La présente invention a donc également pour objet des microcristaux obtenus par le procédé selon l'invention. Dans un mode de réalisation particulier, ces microcristaux comportent de l'amphotéricine B ou ses dérivés, additionnée ou non de stérol(s) et de la phosphatidylcholine. Par exemple, les microcristaux comportent de l'amphotéricine B et de la phosphatidylcholine dans un rapport molaire voisin de 1. On peut citer encore des microcristaux comportant de l'amphotéricine B, du cholestérol et de la phosphatidylcholine dans un rapport molaire 1:2:4 respectivement. La présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques comportant à titre de principes actifs des microcristaux selon la présente invention. De préférence, ces compositions pharmaceutiques sont conditionnées sous forme injectable ou pulvérisable. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre sous forme d'exemples. EXEMPLE 1 : Préparation de microcristaux d'amphotéricine B Des microcristaux contenant de l'amphotéricine B et de la phosphatidylcholine dans un rapport équimolaire sont préparés selon le schéma suivant a) Préparation : Dans un ballon de 500 ml, on introduit 15,7 ml de phosphatidylcholine (egg lecithin 99% pure) à 10 mg/ml de chloroforme (0,2 mM). Un film lipidique est formé par évaporation du solvant sous vide à l'aide d'un évaporateur rotatif à une température de 300C. On ajoute ensuite 370 ml d'amphotéricine B à 0,5 mg/ml de mélange chloroforme-méthanol (1:1, en volume), soit 0,2 mM. Après évaporation du solvant sous vide à l'aide d'un évaporateur rotatif, les microcristaux sont formés par addition de 10 ml de NaCl 9 GO et sonication pendant 15 min. dans un bain à ultrasons JULABO modèle USR 6. b) Purification : La préparation de microcristaux d'am photéricine B est centrifugée 2 minutes à 2000 g dans une centrifugeuse de table. Le surnageant est appliqué au sommet d'une colonne de Sépharose 6B éluée par du NaCl 9 %O. La fraction du premier pic la plus enrichie en amphotéricine B contenait 8,23 mg d'ampho téricine B/ml et 7,10 mg de phosphatidylcholine/ml soit un rapport molaire ampho/PC de 0,98. c) Toxicité aiguë chez la souris : A la dose en ampho téricine B de 82,2 mg/kg administrée en intraveineuse, la préparation de microcristaux d'amphotéricine B est toxique vis-d-vis des souris pF1 femelles, le décès de la souris intervenant dans les 3 minutes suivant l'injection. A la dose de 41,1 mg/kg, la souris injectée en intraveineuse est décédée au 2ème jour. En revanche, à la dose de 20,6 mg/kg, la souris injectée en intraveineuse perd environ 20 % de son poids durant les 7 jours suivant l'injection puis récupère son poids au jour 22. L'amphotéricine sous forme de fungizone 3 (amphot#ricine B déoxycholate) administrée en intra veineuse a une LD50 de 1,2 mg/kg selon LOPEZ-BERESTEIN et al. F2#, de 2,3 mg/kg selon SZOKA et al. C31 et de 5 mg/kg selon WRIGHT et al. [ 13. La LD50 de l'amphotéricine B-liposomes par voie intraveineuse varie de 4 à 19 mg/kg suivant la composition des liposomes (SZOKA et al., op. cit.) On observe une toxicité donc nettement réduite pour les microcristaux d'amphotéricine B. d) Activité antifungique directe (c'est-d-dire in vitro sur parasites extracellulaires) : L'activité des microcristau d'amphotéricine B a été comparée à celle de l'amphotéricine B contrôle solubilisée dans du DSO puis diluée dans du milieu de culture RPMI contenant 10 % de sérum déplété en lipides. Vis à-vis de Candida Albicans et de Candida Tropicalis, la MIC (concentration minimale inhibitrice de la croissance des parasites in vitro) des 2 formes d'amphotéricine B est identique et se situe entre 0,05 et 0,1 ssM (0,04 et 0,08 #g/ml). e) Activité in vitro vis-d-vis de macrophages infectés par Candida Tropicalis (parasites intracellulaires) : La concentration inhibant de 50 % le nombre de macrophages infectés par Candida Tropicalis (IC50) est de 0,4 FM pour l'amphotéricine B dissous dans le DMSO et seulement de 0,2 ssM pour la préparation de micro cristaux d'amphotéricine B. EXEMPLE 2 : Préparation de microcristaux d'amphotéricine B contenant du cholestérol L'association de l'amphotéricine B aux stérols est connue (WITZKE et al., [ 4 ] ), en particulier au cholestérol et à l'ergostérol. L'incorporation de stérol aux liposomes contenant de l'amphotéricine B réduit leur toxicité (SZOKA et al., [ 3 ] ). L'addition de cholestérol a le même effet sur les microcristaux d'amphotéricine B. Les microcristaux d'amphotéricine B contenant de la phosphatidylcholine (PC) et du cholestérol (CH) ont été préparés selon le schéma suivant a) préparation : Dans un ballon de 500 mi, on introduit 15,7 mi de phosphatidylcholine (PC) à 10 mg/ml CHCl3 (0,2 mM), 370 mi d'amphotéricine B à 0,5 mg/ml de chloro forme-méthanol (1:1 en volume), soit 0,2 mM et 58 mg de cholestérol (CH) dissous dans 10 mi de méthanol (0,15 mM). Le solvant est évaporé sous vide à 300C à l'aide d'un évaporateur rotatif. Les microcristaux sont formés par addition de 10 mi d'eau et sonication pendant 15 min. dans un bain à ultrasons JULABO modèle USR 6. b) Purification : La préparation est purifiée comme dans l'exemple 1. La fraction du premier pic, la plus riche en amphotéricine B contient 2,55 mg ampho/ml, 9,11 mg PC/ml et 1,93 Chiml, soit un rapport molaire PC/Ch/Amphotéricine B de 4:2:1. c) Toxicité aiguë chez la souris : A la dose de 25,5 mg/kg d'amphotéricine B, administrée par voie intraveineuse à 2 souris OF1 femelles, la préparation de micro cristaux d'amphotéricine B contenant du cholestérol induit une perte de poids maximale de 8 % au jour 6 chez 1 souris et un gain de poids de 9 % au jour 6 chez la 2ème souris (en moyenne : pas de perte de poids). Le poids moyen des 2 souris au jour 19 est de 100 % du poids initial. d) Activité antifongique directe : L'activité antifongique de l'amphotéricine B contrôle (DMSO et RPMI) et la pré paration de microcristaux d'amphotéricine B contenant du cholestérol sont du même ordre. La MIC se situe entre 0,05 et 0,1 M. e) Activité in vitro vis-à-vis de macrophages infectés La MIC de la préparation de microcristaux d'amphoté ricine B contenant du cholestérol est de 0,1 tiM,tandis que pour l'amphotéricine B dissoute dans le DMSO elle est de 0,4 ssM. L'amphotéricine B sous forme de microcristaux contenant du cholestérol est donc au moins 4 fois moins toxique et 4 fois plus active sur macrophages infectés par rapport à l'amphotéricine B. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES CITEES DANS LA DEMANDE C11 : WRIGHT et al. The Journal of antibiotics 1982 Vol. 35 n0 7 pp 911-914. 2 ] : LOPEZ-BERESTEIN et al. The Journal of infections diseases Vol. 145, n0 5, May 1983 pp 939-945. [ 3 ] : SZOKA et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, March 1987, p. 421-429 Vol. 31, n0 3. [ 4 ] : WITZKE et al. Biochemistry 1984, 23, 1668-1674 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de microcristaux d'une substance insoluble dans liteau, présentant une affinité pour les phospholipides selon la revendication 1 du brevet principal, caractérisé en ce que a) on évapore le(s) solvant(s) d'une solution de phos pholipide(s) et de ladite substance, et b) on remet le film obtenu après évaporation, en suspen sion dans une solution aqueuse par agitation vigou reuse, ladite substance étant choisie parmi l'amphotXricine B et ses dérivés, présentant une activité antifongique. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution de ladite substance est additionnée de stérol(s), notamment du cholestérol et/ou de l'ergostérol. 3. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape a) se subdivise ainsi a1) on évapore le(s) solvant(s) de la solution de phos pholipide(s), a2) on remet le film lipidique obtenu après évaporation, en solution, en ajoutant une solution de ladite subs tance, a3) on évapore à nouveau le(s) solvant(s) de la solution de phospholipide(s) et de ladite substance. 4. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le rapport molaire entre le(s) phospholipide(s) d'une part, et ladite substance additionnée ou non de stérol(s), d'autre part, est compris entre 0,1 et 2,5 et, de préférence, entre 0,8 et 1,4. 5. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on utilise comme phospholipide, la phosphatidylcholine. 6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le rapport molaire entre la phosphatidylcholine et l'amphotéricine B en l'absence de stérol est voisin de 1. 7. Procédé selon l'une des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que le rapport molaire 8. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les divers solvants des solutions utilisées sont choisis parmi les solvants organiques usuels, notamment le méthanol, le chloroforme et leurs mélanges. 9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution de phospholipide(s) est une solution de chloroforme. 10. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution de ladite substance est une solution de chloroforme/méthanol. 11. Procédé selon l'une des revendications 2 à 10, caractérisé en ce que la-solution de stérol est une solution de méthanol. 12. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que dans l'étape b) du procédé, la solution aqueuse est une solution de NaCl ou de saccharide 0,1 M. 13. Procédé selon l'une des revendications 2 à 11, caractérisé en ce que, dans l'étape b) du procédé, notamment en présence de stérol, la solution aqueuse est une solution d'eau distillée, NaCl ou de accharide 0,1 M. 14. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'agitation vigoureuse dans l'étape b) du procédé est obtenue par traitement aux ultrasons. 15. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que, après l'étape b) du procédé, les microcristaux sont purifiés par centrifugation et lavage par la solution aqueuse de l'étape b). 16. Microcristaux obtenus par le procédé selon l'une des revendications précédentes. 17. Microcristaux selon la revendication 16, caractérisés en ce qu'ils comportent de l'amphotéricine B ou un de ses dérivés antifongiques, additionnée ou non de stérols, et de la phosphatidylcholine. 18. Microcristaux selon l'une des revendications 16 et 17, caractérisés en ce qu'ils comportent de l'amphotéricine B de la phosphatidylcholine dans un rapport molaire voisin de 1. 19. Microcristaux selon l'une des revendications 16 et 17, caractérisés en ce qu'ils comportent de l'amphotéricine B, du cholestérol et de la phosphatidylcholine dans un rapport molaire 1:2:4 respectivement. 20. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comporte comme principe actif des microcristaux selon l'une des revendications 16 à 19. 21. Composition pharmaceutique selon la revendication 20, caractérisée en ce qu'elle est conditionnée sous forme injectable ou pulvérisable.