FR 2617161 A1 19881230 FR 8709114 A 19870629 i 2617161 NOUVEAUX GLYCERIDES D'ACIDE GRAS INSATURE ET LEURS PROCEDES D'OBTENTION La prEsente invention se rapporte à de nouveaux glycérides d'acides gras poly-insaturEs obtenus à-l'état pur et à leurs procédés d'obtention. Elle a plus particulièrement pour objet les nouveaux glycérides de l'acide (cis,cis,cis)octadécatriEnoique(6,9,12) ou acide gamma-linolénique chimiquement et stériquement purs. Elle a spécifiquement pour objet les glycérides de formule: C -OR 2 i CH2 -OR CH2 --0R3 dans laquelle: R2 est le reste acyle de l'acide (cis,cis,cis) octadécatriénoique(6,9,12); et R et R3, semblables ou différents, sont de l'hydrogène, un reste acétyle i 3Y ou le reste acyle de l'acide cis,cis,cis-octadécatriénoique(6,9,12). Le procédé selon l'invention permet donc d'obtenir: - le triglycéride pur de l'acide cis,cis,cis-octadécatriénoique(6,9,12) ou trigamma-linolénine qui est un composé nouveau; - les diglycérides 1,3- ou 2,3- de l'acide cis,cis,cis-octadéca- triénoique(6,9,12), ce dernier étant prédominant car l'estérification de l'alcool secondaire du glycérol intervient en premier lieu; - les glycérides mixtes de l'acide gamma-linolénique et de l'acide acétique résultant d'une inter-estérification partielle de la tria- cétine par l'acide gamma-linolénique. Tous ces composés stériquement purs sont des composes nouveaux. On sait le rôle joué par l'acide gamma-linolénique en diététique et en pharmacologie. Il fait partie des acides gras essentiels avec l'acide alinolénique et l'acide linoléique. Ce sont des substances qui se 2 2 61716 comportent comme des vitamines car l'organisme n'est pas en mesure d'en faire la synthèse et, de ce fait, ils doivent être fournis par l'alimenta- tion. En outre, l'organisme sait transformer l'acide gamma-linolénique en son homologue supérieur ayant deux atomes de carbone supplémentaire, l'acide dihomogamma-linolénique ou acide éicosatriénoique-8,11,14. Cette voie métabolique joue un r8le essentiel. En effet, cette transformation n'est pas réversible chez l'homme et conduit par des étapes successives sous l'influence alternée de désaturases spécifiques et de réaction d'ho- mologation en acide arachidonique (5,8,11,14-éicosatétraénoique). Cette voie métabolique est bien connue maintenant et apporte la preuve que l'acide gamma-linolénique et les autres acides gras insaturés agissent en tant que précurseurs de la synthèse des prostaglandines de la série 1 qui dérivent de l'acide dihomogamma-linolénique (DGLA) et des prostaglandines de la série 2 qui sont formés au stade suivant à partir de l'acide arachi- donique. Enfin, on a constaté plus récemment que les acides gras en C22 à 4 doubles liaisons formés par métabolisation de l'acide arachidonique conduisent à des homoprostaglandines de la série 2 (voir en particulier la demande de brevet européen 211 502). L'acide gamma-linolénique est donc l'élément clef de cette voie métabolique car il est transformé complètement et rapidement en acide dihomogamma-linolénique. En pratique, administrer de l'acide gamma- linolénique revient à administrer de l'acide dihomoga-mma-linolénique. Les sources naturelles d'acide gamma-linolénique sont peu nombreuses. On peut citer, à cet égard, l'huile d'onagre, l'huile de pépins de cassis ou de framboisier et l'huile de Bourrache. Dans la plupart des huiles, on constate la présence prépondérante d'acide linoléique et d'acide a-linolé- nique. Seule l'huile de Bourrache fournit une quantité importante d'acide gamma-linolénique. Dans la nature, l'acide gamma-linolénique, comme les autres acides gras insaturés, existent sous forme de glycérides et en particulier sous forme de glycérides mixtes, dans lesquels l'acide gamma- linolénique est de préférence fixé sur la fonction alcool en 2 du glycérol. Les autres fonctions alcool sont estérifiées par un ou deux autres acides gras du même type. Les glycérides d'acides gras insaturés constituent la forme d'admi- nistration la plus efficace car ils sont utilisés dans l'organisme alors que l'acide lui même est très peu résorbé. 261 7161 C'est pourquoi, en raison de l'importance de l'acide gamma- linolénique dans cette chaîne métabolique, il était nécessaire de disposer de glycérides d'acide gamma-linolénique purs chimiquement et de confi- guration spatiale cis,cis,cis absolument définie. On connaissait par la littérature un produit dénommé trilinolénine obtenu notamment à partir de l'huile de lin ou par hémisynthàse à partir d'acide linolénique et de glycérol. En fait, ces produits se sont avérés être des esters plus ou moins mixtes de l'acide c-linolénique. Les cons- tantes physiques très diverses mentionnées dans la littérature indiquent que les produits obtenus sont des mélanges de glycérides ou des mélanges de diastéréo-isomères. On a également obtenu un mélange riche en triglycéride de l'acide gamma-linolénique par chauffage de l'acide impur avec du glyce- rol (voir demande européenne 178 442). La présente invention a essentiellement pour objet le triglycéride de l'acide gamma-linolénique pur. Celui-ci est obtenu à partir d'un gamma- linolénate d'alcoyle pur. Ce dernier est préparé par méthanolyse rapide d'une fraction d'une huile riche en acide gamma-linolénique, comme par exemple l'huile de Bourrache. Au cours de la préparation du triglycéride de l'acide gamma- linolénique, il se forme des produits secondaires, à savoir le mono- glycéride de l'acide gamma-linolénique et les diglycérides de l'acide gamma-linolénique, ainsi que des glycérides mono- ou diacétylés. Ces glycérides purs sont obtenus par un. procédé qui consiste à faire réagir un ester d'alcoyle inférieur de l'acide gamma linolénique pur avec la triacétine, en présence d'un agent basique pour obtenir essentiellement le triglycéride de l'acide gamma-linolénique et une petite quantité de mono- et de diglycérides de l'acide gamma-linolénique. La réaction de synthèse selon l'invention peut donc s'écrire: Gammalinolénate) Agent GLA GLA GLA dtalcoyle inférieur > Gly GLA + Glyç. _GLA + Gly- OH basique I O + triacétine) GLA bC OCH3 OH La triacétine a pour formule: CH OCOCH - 2 3 CHOCOCH3 CH20COCH3 Elle est capable d'échanger un ou plusieurs groupes acétyle en milieu basique avec un autre groupe acyle comme le radical octadécatriénoyle. 4 1 7 1 61 Dans cette réaction, l'agent basique est de préférence un alcoolate de métal alcalin comme le méthanolate de sodium ou de lithium, l'éthanolate de sodium, le terbutylate de potassium ou le teramylate de potassium. L'agent basique est utilisé en quantité quasiment catalytique. La réaction d'inter-estérification est effectuée à une température et/ou sous un vide tels que l'acétate d'alcoyle inférieur distille au fur et à mesure de sa formation. Cette séparation assure donc un déplacement constant de la réaction qui est finalement pratiquement totale. La forma- tion de glycéride mixte reste faible. De préférence, on utilise l'ester méthylique de l'acide (cis,cis,cis)- octadécatriénoique(6,9,12) comme matière première et l'acétate de méthyle formé distille vers 65 . De cette façon, la réaction d'interestérification peut être conduite à température relativement basse. On peut néanmoins utiliser d'autres esters de l'acide (cis,cis,cis)- octadécatriénoique(6,9,12) comme l'ester éthylique, isopropylique ou butylique. Les conditions opératoires (température, pression) devront être ajustées de façon à ce que l'acétate d'alcoyle, correspondant qui se forme, soit distillé au fur et à mesure de sa formation. Ce mélange est séparé sur une colonne de gel de silice qui retient le mono- et les diglycérides et fournit le triglycéride d'aci-e gamma- linolénique seulement contaminé par une petite quantité d'ester d'alcoyle de départ et d'un triglycéride formé de deux restes acyles d'acide gamma- linolénique et d'un reste acétyle. Le triglycéride pur d'acide gamma-linolénique est finalement obtenu par une méthode physique qui permet de séparer le triglycéride des esters d'alcoyle. La chromatographie en phase liquide en phase inverse est une méthode appropriée qui permet cette séparation dans les conditions opti- males. La chromatographie en phase liquide en phase inverse permet soit d'effectuer une séparation à l'échelle analytique, soit d'effectuer la séparation des deux constituants à l'échelle préparative. On utilise à cette fin une colonne chargée de Bondapak C18. L'ester d'alcoyle de l'acide gamma-linolénique pur (tout cis,cis,cis) est obtenu à partir d'une huile riche en acide gamma-linolénique comme l'huile de Bourrache, par une réaction d'alcoolyse ménagée qui consiste en ce que l'on met l'huile de Bourrache avec une solution de potasse dans l'alcanol inférieur convenable pendant un temps très court, inférieur à une minute. Dans ces conditions, l'huile de Bourrache ne subit qu'une 2 6617161 saponification en acide gras très limitée et l'essentiel des glycérides présents est transformé en ester d'alcoyle inférieur. L'ester d'alcoyle inférieur est lavé par des mélanges de cyclohexane à concentrations croissantes pour éliminer les acides gras puis à l'eau et enfin purifié par chromatographie liquide haute performance (HPLC). On recueille ainsi un gamma-linolénate d'alcoyle(cis,cis,cis) absolument pur. En particulier, l'alcoolyse par le méthanol permet d'obtenir le gamma- linolénate de méthyle(cis,cis,cis) absolument pur et dont la stéréochimie est prouvée par dichroisme circulaire et par le spectre de RbN. Le gamma-linolénate de méthyle(cis,cis,cis) est un produit nouveau qui n'avait jamais été obtenu à l'état pur. Il est possible également de purifier le mélange obtenu par alcoolyse de l'huile de Bourrache par chromatographie sur colonne chargée avec une résine polyvinylsulfonique sous forme de dérivé métallique. On sépare ainsi les acides gras en fonction de leur degré d'insaturation. Les exemples suivants illustrent l'invention. EXEMPLE 1 Stade A g d'ester méthylique pur d'acide gamma-linolénique et 0,44 g de méthylate de sodium sec sont mélangés dans une fiole conique et chauffés à C sous vide poussé. On ajoute alors 4,44 g de triacétine goutte à goutte en une heure. Après achèvement de l'addition, le chauffage sous vide est poursuivi pendant une heure. L'acétate de méthyle formé au cours de la réaction est éliminé par distillation au fur et à mesure de sa formation. Le mélange réactionnel contient de 75 à 80% de triglycéride, 14% environ d'ester méthylique résiduel et 6 à 10% de mono- et de di-glycérides. Stade B Après refroidissement du mélange réactionnel, on filtre pour éliminer les produits basiques résultant de la décomposition du méthylate de sodium. On passe ensuite le filtrat sur une colonne de gel de silice de 20,3 x 5 cm (qualité chromatographique) en utilisant du n-hexane comme solvant. On recueille des éluats, successivement, renfermant du gamma-linolênate de méthyle qui n'a pas réagi, puis des triglycérides. Par chromatographie en phase gazeuse (GLC) de cette fraction (appelée fraction 1) qui pèse 10,7 g, on détecte la présence: - d'un peu de gamma-linolénate de méthyle, - de triglycéride contenant 2 moles d'acide gamma-linolénique et un radical acétyle, et 6 2 617161 - essentiellement de la tri gamma-linolénine pure. Par élution de la colonne de gel de silice par de l'acétone, on obtient le monoglycéride de l'acide gamma-linolénique et les diglycérides de l'acide gamma-linolénique. Le rendement en cette fraction (fraction 2) est de 6,2 g. Au total, au départ de 20 g de gamma-linolénate de méthyle, on obtient 16,9 g de dérivés glycériques et on récupère une certaine quantité de gamma- linolénate de méthyle. La fraction 1 est soumise à une séparation par chromatographie préparative en phase liquide (HPLC) en phase inverse sur colonne de Bondapak C18. On sépare ainsi le triglycéride pur de l'acide cis,cis,cis- gamma-linolénique(6,9,12). Ce produit est défini par des constantes phy- siques qui le différencient des linolénines déjà décrites dans la litté- rature: l'indice de réfraction est de 1,4878 à 19 C. Le spectre RMN du carbone13 déterminé dans le deuterochloroforme montre dans un champ de 400 MHz un massif à 130 ppm caractéristique des atomes de carbone sur lesquels sont branchées les double liaisons et confirme l'enchaînement purement cis,cis,cis. Les spectres R N sont joints en annexe. Le triglycéride de l'acide (cis,cis,cis)octadécatriénoîque(6,9,12) ou gamma-linolénine peut servir comme médicament en thérapeutique cardio- vasculaire ou comme produit diététique pour assurer à l'alimentation une teneur appropriée en acides gras poly-insaturés. Le di-, le triglycéride ainsi que le diglycéride O-acétylé de l'acide (cis,cis,cis)octadécatriénoique peuvent encore trouver un emploi dans des préparations cosmétologiques ou cosméto-dermatologiques. Le mono- ou les di-glycérides de l'acide cis,cis,cis-octadécatrié- noique(6,9,12) trouvent un emploi en diététique comme apport d'acides gras poly-insaturés essentiels. REVENDICATIONS L'invention a pour objet: I.- Les glycérides de l'acide (cis,cis,cis) octadécatriénoique(6,9,12) de formule gEnérale (I): CH - OR 2 1 CH - OR2 2 CI) CH2 - OR dans laquelle: R2 est le reste acyle de l'acide (cis,cis,cis) octadgcatrignoique(6,9,12); et R1 et R3, semblables ou différents, sont de l'hydrogène, un reste acétyle ou le reste acyle de l'acide cis,cis,cis-octadécatriEnoique(6,9,12). 2.- Le triglycEride de l'acide cis,cis,cis-octadEcatriénoique(6,9,12). 3.- Le triglycéride mixte ayant deux restes acyle de l'acide (cis,cis,cis)octadEcatriEnoique(6,9,12) et un reste acétyle. 4.- Le monoglycéride de l'acide (cis,cis,cis)octadécatriénoique- (6,9,12). 5.- Les diglyc9rides 2,3- et les diglycérides 1,3- de l'acide (cis,cis, cis)octadécatriEnoique(6,9,12). 6.- Un procédé d'obtention des glycdrides de formule générale I selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel on fait réagir un ester d'al- coyle inférieur de l'acide (cis,cis,cis)octadécatriénoique(6,9,12) avec la triacétine, en présence d'un agent basique comme catalyseur, à une tempéra- ture et sous une pression o l'acétate d'alcoyle inférieur formé distille, sépare les triglycérides obtenus du mélange de mono- et de diglycérides puis fractionne par des moyens physiques le mélange de triglycérides pour obtenir séparément le triglycéride de l'acide cis,cis,cis-octadéca- triénoique(6,9,12) et le diglycéride de l'acide cis,cis,cis-octadéca- triénolque(6,9,12) O-acétyle. 7.- Un procédé selon la revendication 6, dans lequel l'agent basique est un alcoolate de métal alcalin. 8.- Un procédé selon l'une des revendications 6 et 7, dans lequel l'alcoolate de métal alcalin est le méthanolate de sodium. 9.- Un procédé selon l'une des revendications 6 à 8, dans lequel l'ester d'alcoyle inférieur de l'acide (cis,cis,cis)octadécatriénolque est un ester ayant de 1 à 4 atomes de carbone. 8 2 2617161 10.- Un procédé selon l'une des revendications 6 à 9, dans lequel la séparation des triglycérides est effectuée par chromatographie sur colonne de gel de silice. 11.- Un procédé selon l'une des revendications 6 à 10, dans lequel le mélange de triglycérides est fractionné par chromatographie haute perfor- mance en phase liquide par inversion de phase. 12.- Utilisation du triglycéride de l'acide (cis,cis,cis)octadéca- triénoique(6,9,12) comme médicament et/ou pour des compositions nutritives et/ou pour des compositions cosmétiques.