FR 2617710 A1 19890113 FR 8709865 A 19870710 La présente invention concerne d'une manière géné- rale une composition dentifrice pour prévenir la carie den- taire, et plus particulièrement une composition dentifrice contenant de l'hydroxyapatite dans laquelle de la glucanase etc... sont immobilisées. "Glucanase" est un terme général pour les enzymes décomposants le glucane. Cependant, il est à noter que le terme "Glucanase" désigne ici une levanase qui décompose le levane, une dextranase qui décompose le dex- trane et une mutanase qui décompose le mutane. Il est bien connu que l'apparition de la carie den- taire est due à la plaque dentaire qui se forme à la surface des dents sous l'effet des polysaccharides produits par diver- ses bactéries de la bouche. On pense que la prévention de la carie dentaire est réalisée par l'élimination de cette plaque dentaire. Le levane, le mutane et le dextrane sont tous des polysaccharides produits par les bactéries de la bouche, et il a été établi qu'ils sont un facteur dans la formation de la plaque dentaire. Parmi les enzymes qui décomposent ces po- lysaccharides, il est bien connu que la dextranase fournit 261771'0 une composition dentifrice ayant un effet amélioré pour la prévention de la carie dentaire, car elle est capable de dis- soudre la plaque dentaire en raison de sa capacité de décom- position du dextrane, telle que divulguée dans le brevet japo- nais N 782 154. Lorsque l'enzyme est incorporée à des pro- duits dentifrices, cependant, elle est aisément décomposée et désactivée en raison de son instabilité relative. Pour la maintenir dans un état stable, il est nécessaire d'utiliser un stabilisant approprié. La dextranase est également utili- sée avec divers stabilisants. Par exemple, il a été proposé d'utiliser la dextranase avec un parfum à base d'hydrocarbu- re terpénique ou d'alcool aliphatique (brevet japonais N 9 242 229),avec de la carvone oudu e-menthol dans un rapport dé- terminé (demande de brevet japonais N 56-110 609), ou avec de l'oxyde d'aluminium utilisé comme agent de polissage (de- mande de brevet japonais N 56-63 915). On peut supposer que l'utilisation d'une enzyme, pour ne pas parler de la dextra- nase, dans un dentifrice exigerait l'incorporation d'un sta- bilisant,comme c'est le cas avec la dextranase. Comme un den- tifrice est utilisé dans la bouche, il doit être sur et commu- niquer une sensation rafraîchissante. Evidemment, on peut pen- ser que des limitations considérables sont imposées au choix des stabilisants. Pour cette raison, on n'a pas réalisé de compositionsdentifrices contenant de la mutanase ou de le le- vanase, en dépit du fait qu'elles sont considérées comme effi- caces dans la prévention de la carie dentaire. Un des buts de la présente invention est de fournir une composition dentifrice contenant comme enzyme, en particu- lier une enzyme décomposant les polysaccharides utilisable pour la prévention de la carie dentaire, plus particulièrement la levanase, la dextranase ou la mutanase, qui supprime les problèmes liés à la sécurité et à la sensation de l'utilisateur provenant de l'utilisation de stabilisants, et qui présente une activité enzymatique stable sur une durée prolongée sans avoir recours à l'utilisation d'aucun stabilisant. Comme les enzymes sont relativement instables et solubles, il est bien connu qu'il est préférable de les immobiliser pour une utili- sation plus efficace. En général, on trouve que les enzymes immobilisées sont stables même sous la forme d'une solution aqueuse. Bien qu'il existe divers procédés pour immobiliser les enzymes, le procédé classique repose sur l'adsorption phy- sique. Comme c'est le cas avec le carbone actif, la kaolinite, le kaolin etc..., l'hydroxyapatite est utilisée comme support pour immobiliser des enzymes par adsorption physique, et il est connu qu'elle convient pour l'utilisation comme agent de polissage. On suppose par conséquent que si la levanase, la dextranase et la mutanase sont immobilisées avec de l'hydroxy- apatite, il doit alors être possible de préparer une composi- tion dentifrice contenant une enzyme qui se passe de tout sta- bilisant. A la suite d'études poussées effectuées sur cette présomption, la demanderesse est parvenue à mettre au point un procédé d'immobilisation de ces enzymes avec l'hydroxyapa- tite. Il consiste à ajouter l'hydroxyapatite utilisée comme agent de polissage à la solution contenant la glucanase et une protéine telle que le lysozyme, l'albumine, la caséine et le cytochrome C qui peuvent être fortement absorbéssur l'hydroxyapatite et qui sont inoffensifs pour l'organisme humain, puis à ajouter goutte-à-goutte une solution de glu- taraldéhyde à cette solution, en agitant énergiquement au- dessous de la température ambiante, et à agiter la solution pendant plusieurs heures pour achever la réaction à la même température après l'addition de la solution de glutaraldéhyde. L'hydroxyapatite immobilisée est obtenue par centrifugation. Comme les hydroxyapatites immobilisées sont aisément prépa- rées par ce procédé, des compositions dentifrices qui ne con- tiennent pas d'agents stabilisants mais de la glutanase et qui ont un effet amélioré de prévention de la carie dentai- re sont préparées en utilisant cette hydroxyapatite comme agent de polissage conformément à la formule de dentifrices classi- que. 2 6 1 7 7 1 0 Pour une meilleure compréhension de l'invention et pour rmontrer comment celle-ci peut être mise en pratique, on se référera à présent, à titre d'exemple, aux exemples de tra- vail et de référence suivants. EXEMPLE 1: pate dentifrice (% en poids) Levanase immobilisée sur hydroxyapatite 13,2 Phosphate de calcium 25,0 Sel de sodium de la CMC 0,3 Carragénane 1,2 Glycérol 10,0 Sorbitol 15,0 Laurylsulfate de sodium 2,0 Parfum 1,2 Sel de sodium de la saccharine 0,1 Silice 2,0 Eau 30,0 EXEMPLE 2: pâte dentifrice Mutanase immobilisée sur hydroxyapatite 20,0 Pyrophosphate de calcium 10,0 Sel de sodium de la CMC 0,5 Carragénane 0,6 Glycérol.20,0 Sorbitol 10,0 Laurylsulfate de sodium 2,0 Parfum 1,0 Sel de sodium de la saccharine 0,1 Silice 2,0 Chlorure de potassium 2,0 Chlorure de magnésium 0,3 Phosphate de sodium 0,5 Eau 30,0 EXEMPLE 3: pâte dentifrice Dextranase immobilisée sur hydroxyapatite 35,5 Sel de sodium de la CMC 1,0 Carragénane 0,3 Glycérol 35,5 Laurylsulfate de sodium 2,0 Parfum 1,0 Sel de sodium de la saccharine 0,1 Silice 2,5 Chlorure de sodium 2,5 Chlorure de magnésium 0,1 Chlorure de potassium 1,0 Eau 20,0 EXEMPLE 4: poudre dentifrice Dextranase immobilisée sur hydroxyapatite 90, 8 Laurylsulfate de sodium 2,0 Parfum 1,5 Sel de sodium de la saccharine 0, 2 Chlorure de sodium 5,0 Chlorure de magnésium 0,5 EXEMPLE 5: dentifrice lubrifiant Dextranase immobilisée sur hydroxyapatite 63,0 Phosphate de calcium 10,0 Sorbitol 10,0 Laurylsulfate de sodium 2,0 Parfum 1,5 Chlorure de sodium 3,3 Chlorure de magnésium 0,08 Saccharine 0,12 Eau 10,0 EXEMPLE DE REFERENCE 1 (1) Préparation d'une dextranase immobilisée sur hydroxyapatite A un mélange de 50 mg de dextranase, de 50 mg de ly- sozyme et de 5 g d'hydroxyapatite utilisée comme agent de polis- sage, on ajoute 500 ml de solution tampon phosphate de potas- sium ayant une concentration de 0,05 mole et un pH de 6,8. On ajoute goutte-à-goutte, en agitant et à 40C,à la solution ob- tenue 500 1a d'une solution aqueuse à 0,2 % de glutaraldéhyde et on poursuit l'agitation à 4 C pendant 5 heures. On recueil- le le produit de la réactionet onlelave 3 fois avec 100-ml de la solution tampon ci-dessus pour éliminer la matière n'ayant pas réagi éventuellement présente. Une lyophilisation ulté- rieure donne 5,06 g d'une poudre. On pèse exactement environ 1 g de la poudre ci-dessus, on ajoute à la poudre pesée 20ml d'une solution tampon phosphate de potassium ayant une concen- tration de 1 mole et un pH de 6,8, et on effectue l'agitation pendant trois heures, après quoi on centrifuge. On lave le précipité avec une solution tampon, on réunit les filtrats pour mesurer la quantité de protéine qui y est contenue par la méthode de Lowry, et on lave le précipité avec de l'eau pure pour le sécher et le peser.On confirme que 10,9 ml de pro- téine sont absorbés par gramme de l'hydroxyapatite séchée. La mesure de l'activité de dextranase'de cette protéine par une méthode qui sera décrite ci-après indique que 0,513 g de dextrane par gramme de la protéine absorbée sont décomposés en 2 heures. (2) Préparation de levanase immobilisée sur l'hydroxyapatite On ajoute 50 ml d'eau pure à un mélange de 100 mg de lysozyme, 100 mg de levanase et 2 g d'hydroxyapatite, après quoi on refroidit à-4 C. On ajoute lentement goutte-à-goutte, en agitant énergiquement,à la solution obtenue 2 ml d'une so- lution aqueuse contenant 28 mg de glutaraldéhyde dans 100 ml d'eau, tout en maintenant la température à 4 C. On poursuit ensuite l'agitation à cette température pendant 2 heures. La centrifugation donne un solide qui est lavé 3 fois avec 50 ml d'eau pure, puis soumis à une lyophilisation pour obtenir 2,05 g de poudre. L'analyse effectuée de la même manière qu'en (1) indique que 11,7 mg de protéine sont liés par gramme d'hydroxyapatite. La mesure de l'activité de levanase de la protéine absorbée, effectuée par la méthode suivante, indique que 0,47 g de levane sont décomposés par gramme de la protéi- ne adsorbée sur l'hydroxyapatite. (3) Préparation de mutanase immobilisée sur hydroxyapatite On opère dans les mêmes conditions qu'en (2), excep- té qu'on utilise la mutanase à la place de la levanase, pour obtenir l'hydroxyapatite immobilisée. L'analyse effectuée de la même manière qu'en (2) indique que 15,0 mg de protéine sont liés par gramme d'hydroxyapatite. La mesure de l'activi- té de la mutanase, effectuée de la manière qui sera décrite ci-dessous, indique que 0,48 g de mutane sont décomposés.par gramme de la protéine liée. EXEMPLE DE REFERENCE II Mesure du titre de l'hydroxyapatite immobilisée On ajoute une quantité pesée de manière précise de chaque échantillon (1 ml de l'échantillon non séché avant lyophilisation pour l'hydroxyapatite immobilise et 2 g de l'échantillon pour le dentifrice 2 à 10ml d'une solution tampon phosphate de potassium contenant 1 % de chaque substrat et ayant un pH de 7,0 et une concentration de 0,05 mole, et on agite la solution-obtenue à 35 pendant deux heu- res, puis on centrifuge. On lave le résidu avec la même solu- tion tampon et on la réunit au centrifugat pour déterminer la quantité de chaque produit de décomposition. Dans le cas de la dextranase, le substrat est le dextrane et la quantité de glucose forméepar décomposition est mesurée par la méthode à la glucose oxydase. Dans le cas de la mutanase, le substrat est le mutane, et la quantité de glucose formée par décomposi- tion est mesurée par la même méthode. Dans le cas de la leva- nase, le substrat est le levane, et la quantité de fluctose produite par la décomposition est déterminée par chromatogra- phie liquide à haute performance. EXEMPLE DE REFERENCE III On trouvera dans ce qui suit les résultats de la mesure de la variation dans le temps de l'activité enzymati- que de l'échantillon de dentifrice préparé dans les exemples 1, 2 et 3. Variation de l'activité spécifique avec le temps à 37 et à pH 7,0 (l'activité aussitôt après la préparation est posée comme égale à 100) jours 40 jours 60 jours 80 jours 100 jour Exemple 1 100 154,0 84,7 70,5 60,3 52,2 Exemple 2 100 155,0 85,3 68,4 55,4 46,4 Exemple 3 100 327,0 185, 5 125,4 96,4 84,3 Il est évident que le dentifrice contenant l'hydro- xyapatite immobilisée obtenue par le présent procédé présente une augmentation d'activité qui cotuence aussitôt après la pré- paration et passe par une valeur maxima d'activité au bout d'un certain temps, après quoi il se produit une diminution progressive d'activité. Cependant, le dentifrice conserve une activité enzymatique supérieure à son activité initiale pen- dant une durée prolongée. La composition dentifrice conforme à la présente in- vention comprend une hydroxyapatite dans laquelle des enzymes telles que la levanase, la dextranase et la mutanase, utilisa- bles pour la prévention de la carie dentaire, sont immobili- sées. Elle se passe de tout stabilisant et présente une excellente stabilité, contrairement aux dentifrices contenant une enzyme classiques.La composition dentifrice de la présen- te invention est également avantageuse en ce qu'elle peut être préparée en utilisant une hydroxyapatite immobilisée obtenue dans la présente invention à la place de l'agent de polissage classique de la manière habituelle, sans avoir recours à aucu- ne technique spéciale. 2617 7 1 0 9. La présente invention n'est pas limi-tée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contrai- re susceptible de modifications et de variantes qui apparaîtront à l'homme de l'art. REVENDICATION 1. Composition dentifrice contenant de l'hydroxyapa- tite,dans laquelle de la glucanase est immobilisée.