FR 2622586 A1 19890505 FR 8814252 A 19881102 La présente invention concerne un procédé amélioré d'obtention des polynucléotides (homo et copolynucléotides) et des complexes de ces corps; l'invention concerne également les nouveaux produits améliorés obtenus selon ce procédé. Différents polynucléotides ont déjà été préparés avec les techniques connues à ce jour mais, jusqu'ici, les produits que l'on obtenait étaient généralement pyrogènes ou plus ou moins toxiques à cause de la présence d'impuretés ou de composés apparaissant lors des différentes étapes menant aux produits recherchés. Ces polynucléotides sont des adjuvants de différents traitements thérapeutiques et plus particu- lièrement du traitement du cancer, du traitement de certaines maladies bactériennes et virales et aussi pour les vaccins. Généralement, les polynucléotides sont obtenus par la réaction d'une polynucléotide-phosphorylase sur le nucléotide monomère approprié. Les différents monomères possibles, tels que l'ADP, le CDP, le GDP, l'IDP et 1'UDP, sont obtenus par des techniques bien connues. La polynucléotidephosphorylase est aussi obtenue par des techniques bien connues, en partant d'une culture de bactéries, puis en utilisant un lysat des bactéries obtenues dans ladite culture, suivi de l'extraction de la polynucléotide-phosphorylase obtenue par la lyse, à partir d'un milieu complexe o peuvent se trouver différents enzymes, telles que les kinases, les phosphatases, les - 2 - nucléases, les diestérases, etc..., composés qui induisent des réactions venant en concurrence avec celle de polymérisation du nucléotide monomère choisi ou du mélange de nucléotides monomères par la polynuclétotide-phospho- rylase. La présence de ces différents enzymes entraine des réactions parallèles indésirables et une dégradation partielle du ou des monomère(s) à polymériser ainsi que du polymère recueilli. Pour ces raisons, la plupart des polynucléo- tides ainsi obtenus sont défectueux soit du fait de leur toxicité ou de leurs caractéristiques pyrogènes soit à cause des deux à la fois. Bien qu'il soit possible de préparer une polynucleotide-phosphorylase suffisamment pure, à une petite échelle, à des fins d'analyse ou pour une expérimentation scientifique limitée, on n'obtient pas facilement les mêmes résultats avec des techniques industrielles, à un coût acceptable. Selon l'invention, on a déterminé qu'il était possible d'obtenir, dans des conditions industrielles acceptables, des homopolymères ou copolymères ou des complexes de polynucléotides ou des analogues très proches de ceux-ci, substantiellement purs, en utilisant, comme agent de polymérisation - au lieu des préparations de polynucléotide-phosphorylase telles qu'on les obtenait suivant les différentes méthodes énoncées plus haut - un enzyme hautement purifié dépourvu des contaminants qui provoquaient des réactions indésirables. Des analogues très proches des nucléotides peuvent comprendre, par exemple, des dérivés hydroxy-6 alcoyle de l'ADP ou les dérivés halo-5 ou OH-5 ou méthyle-5 de l'UDP. Plus particulièrement, on a découvert que, après avoir cultivé une souche de bactéries et après l'avoir lysée, le milieu obtenu devait être filtré 3- successivement à travers trois colonnes, la première contenant une résine échangeuse d'ions comme le DEAE Sephacel pu un équivalent, la seconde contenant une résine hydrophobique comme le phényle Sepharose ou un équivalent et la troisième contenant un tamis moléculaire comme le Sephacryl S300 ou le Sephadex 200 ou tout autre équi- valent. Le produit recueilli à la sortie de la troisième colonne comprend, essentiellement mais pas exclusivement, de la polynucléotidephosphorylase avec des traces de substances dépourvues d'effet sur l'opération de polymérisation qui suivra. Si on veut obtenir un homopolymère, la polynucléotide-phosphorylase obtenue sera utilisée pour la polymérisation du monomère choisi en présence des agents habituels. Si on veut obtenir un copolymère, le monomère choisi est remplacé par un mélange des monomères choisis, dans les proportions adéquates. Si on veut obtenir un complexe, cette même polymérisation est effectuée pour chacun des monomères appropriés et les homopolymères en résultant sont mélangés, dans des proportions adéquates, en présence de NaCl puis précipités dans l'éthanol. Selon une caractéristique importante de l'invention, la polymérisation du monomère choisi ou du mélange choisi de monomères est réalisée dans des conditions différentes de celles que l'on emploie -4- habituellement. Plus précisément, les concentrations utilisées sont bien supérieures aux chiffres habituels (environ 30 fois à 100 fois et de préférence 50 fois ou en mmoles/ml environ 0,06 à 0,2 et de préférence environ 0,1), la polymérisation est réalisée sous addition contrôlée de MgCl2, avec des valeurs pH contrôlées comprises entre 7,4 et 8,6 et pendant des durées d'environ 3 à 6 jours. On emploie environ 200 à 750 unités de phosphorylase. Les polymères ou copolymères en résultant présentent une variation du poids moléculaire qui correspond à des complexes dotés de poids moléculaires allant de 250 000 à 1 500 000 avec un taux de polymérisation homogène et un rendement de polymérisation allant jusqu'à 90-95 %. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description de préparation suivante, comportant cinq étapes, à partir de la culture d'une souche bactérienne (ici des bactéries E. Coli, mais d'autres bactéries peuvent convenir) pour aboutir à un complexe de Poly A / Poly U. Etape 1: Culture de bactéries E. Coli B 1/5 La culture est conservée dans des éprouvettes à température ambiante. Le milieu de culture contient, par litre, 10 g de NaCl, 10 g de Trypticase et 5 g d'extrait de levure. Après stérilisation pendant 45mn à 110 C, on ajoute une solution de glucose à 2 g par litre, stérilisée séparément. Des cultures préliminaires sont réalisées avec 10 ml, puis on prépare 200 ml de milieu pour 10 litres de culture. On agite à 470 tours/mn avec 8 litres d'air par minute. Le temps de doublement à 6600 est de 30mn et les bactéries sont récoltées à une densité optique de 6 à à 600 nm. On en obtient environ 8 g par litre de culture. Le pH de la fermentation est maintenu entre 6,5 et 6,8 en ajoutant du NH40H 2N. Si la culture n'est pas utilisée immédiatement, elle doit être stockée à - 20'C. Etape 2 Lyse des bactéries Tampon A Tris-HCl 5 x 10-2 M, pH 7,9 (à 25 C), contenant de l'EDTA 2 x 10-3 Mi du NaCl 0,233 M (13,63 g/l) et 5 % de glycérol. Tampon B Tris-HCl 10-2 M, pH 7,9, contenant de i'EDTA 10-4 M, du NaC1 0,2 M et 5 % de glycerol. Pour 165 g de bactéries (20 1 de culture). Juste avant l'utilisation, on ajoute 0,4 ml de dithiothréitol (DTT) 0,1 M (15,4 mg/ml) à 400 ml du tampon A, à température ambiante, suivis de 28 pi de mercaptoethanol, 45 mg de Iysozyme et 14 mg de flurorure de phénylméthyle sulfonyle (PMSF) dissous dans 4 ml d'éthanol. Les bactéries gélees (165 g) sont dispersées au mixer dans ce milieu (température finale 10'C) et on laisse la suspension se réchauffer jusqu'à 15 C (environ 20 minutes) en mélangeant de temps à autre, puis on ajoute, en agitant, 272 mg de désoxycholate de sodium, puis 4 mg de désoxyribonuclease (DNAase). On laisse reposer le mélange de lyse pendant 20 mn en agitant de temps en temps et on maintient sa température à 20'C. On lui ajoute 400 ml de tampon B et 0,4 ml de DTT 0,1 M en agitant et, enfin, la suspension est centrifugée à 16 000 g (10 000 tours/mn dans une centrifugeuse Sorvall) pendant 1 heure à 5 C. DNAase 50 679 unités Dornase/mg. Lysozyme 25 000 unites/mg. -6- Le surnageant ( 900 ml), recueilli après la centrifugation, est dilué dans de l'eau distillée pour obtenir 1 litre et les protéines sont précipitées en ajoutant 280 g de sulfate d'ammonium (saturation à 45 %), sous agitation, à 4 C puis le mélange est laissé au repos à 4'C pendant 2 heures. Les protéines sont recueillies par centrifugation à 16 000 g pendant 30 minutes à 5 C. Le précipité (les surnageants sont éliminés) est dissous dans ml de Tris-HCl 10-2M, pH 7,8 et la solution est centrifugée pendant 20 minutes à 16 000 g pour éliminer les corps insolubles. Les surnageants sont dialysés à 4 reprises en changeant chaque fois les 2 1 de Tris-HCl x 10-2 M, pH 7,8, à 4'C, durant 18 heures; la solution est ensuite centrifugée pendant 1 heure à 16 000 g pour éliminer les corps insolubles. 300 ml, pH 7,8, conductibilité Etape 3: Purification de la polynucléotide-phosphorylase E. Coli B 1/5 (PNPase) 1. Les surnagants obtenus ci-dessus sont passés sur une colonne de 280 ml de DEAE Sephacel (40 x 30 cm) équilibrés dans du Tris-HCl 0,1 M, pH 7,4 à 4 C puis la colonne est éluée avec un gradient allant de 1 litre de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,4, à 1 litre de Tris-HCl 0,1 M dans du NaCl 0,4 M, pH 7,4, pour donner 10 ml de fractions. Un pic de l'activité diestérase est élué, suivi par un deuxième pic de l'activité polynucléotide-phosphorylase localisé en fractions de 105 à 125 élue au NaCl 0,21 M et au Tris-HCl 0,1 M. Volume 210 ml: 107 unités/ml, total: 22 470. 2. Cette solution est ajustée à 0,5 M dans du sulfate d'ammonium en en ajoutant 28 g sous agitation, puis la solution est passée sur une colonne de phényle Sepharose (19 x 2 cm), équilibrée dans du (NH4)2S04 0,5 M et du Tris-HC1 0,05 M, pH 7,4. La colonne est lavée avec environ ml de (NH4) 2SO4 0,5 M dans du Tris-HCl 0,1 M, pH 7,4 puis éluee avec un gradient inversé partant de 250 ml de Tris-HC1 0,4 M, pH 7,8 dans du (NH4)2SO4 0,1 m jusqu'à du Tris-HCl 3 x 10-3-M, ph 7,8 à 4 C. On recueille environ 10 ml de fractions. Les fractions actives sont groupées. Volume: 55 ml = 355 unités/ml, total: 19 525. 3. On ajoute du sulfate d'ammonium (20 g) sous agitation (saturation à 55 %) pour précipiter les protéines et le précipité est conservé à 4'C pendant i heure puis centrifugé pendant 15 minutes à 16 000 g. Le résidu est dissous dans un minimum de NaCl 0,1 M, du Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4 (environ 10 ml) et la solution est versée sur une colonne de 350 ml de Sephacryl S300 (50 x 3 cm), équilibrée dans du NaCl 0,1 M, du Tris-HCl 0, 05 M, pH 7,4 et l'enzyme est élue avec le même tampon (10 ml de fractions environ). Les fractions actives sont groupées. Volume: 60 ml, 312 unités/ml, total: 18 750. 540 unités. 6280. L'enzyme est précipitée par addition de 26 g de (NH4)2S04 (saturation à 65 %) et la suspension est stockée à - 30'0. Etape 4: Préparation des polymères g d'ADP Na. (ou 100 g d'UDP Na3) sont 8- dissous dans environ 600 ml d'eau et ajoutés à: ml de Tri-HCl M., pH 8, 3 250 ml d'acétate d'ammonium M. ml d'EDTA 0,1 M., pH 8,0 100 ml de MgCl2 M. dans un flacon de 2 1. Le volume est complété jusqu'à 2 1 avec de l'eau et le pH ajusté à 8,6, à température ambiante, avec du NH4OH 5N. La surface est recouverte d'une couche de toluène. Les nucléosides diphosphates utilisés doivent être dépourvus de métaux contaminants tels que le fer3+ ou le cuivre2+ On ajoute, à une partie aliquote du mélange ci-dessus (80 ml), 200 unités d'enzyme et 2 ml d'une préparation précédente de poly A (ou de poly U) comme amorçage, puis la solution est incubée à 370C pendant 2 heures et transférée sur la souche principale qui était conservée à 37'C. Après 4 heures, on ajoute de nouveau 300 unités d'enzyme et l'incubation continue. Au bout de 24 heures, le pH tombe à environ 8,3 et il est ensuite maintenu à 8,0 - 8,3 par addition de NH4OH 5N. Le total des unités d'enzyme est de 500, c'est-à-dire 5 unités par g.- Si la polymérisation s'effectue à moins de 25 % par 24 heures, on peut ajouter, aux moments opportuns, plus d'enzyme pour augmenter le taux de polymérisation. Des quantités supplémentaires de 25 ml de MgCl2 M. sont ajoutées, en agitant fermement, à environ 30 %, % et 75 % de polymérisation (un total de 175 mmoles de Mg for 200 nmoles d'ADP ou d'UDP), le pH étant maintenu à 8,0 - 8,3 (mesuré à 37 C); La polymérisation atteint 80 - % apres trois ou quatre jours. -9- L'additon progressive de MgCl. maintient la proportion d'ADP libre (UDP) par rapport au Mg à environ 2, aux niveaux de polymérisation mentionnés ci-dessus. A la fin de l'incubation, le mélange est centrifugé pour éliminer le phosphate double de magnésium et d'ammonium précipité, le précipité étant lavé dans un peu d'eau et les surnageants combinés utilisés pour préparer le complexe poly A / poly U. Les conditions optimales de polymérisation sont les suivantes: pH compris entre 8,0 et 8,3 avec addition progressive de MgCl2 et suffisament d'enzyme pour avoir un taux de polymérisation d'environ 30 % par jour. Un pH d'incubation plus élevé (de 8,3 à 8,6) donne un moins grand nombre de polymères. L'addition de la totalité du Mg, au début de l'incubation, donne des polymères de plus peite taille. Etape 5: préparation du complexe Poly A / Poly U La quantité totale de nucléotide contenue dans les solutions est déterminée par hydrolyse du mélange d'incubation dans du NaOH 0,1 N à 100 C pendant 5 minutes en utilisant une dilution de 1 000 pour le poly A et de 500 pour le Poly U (par exemple 10 pl de poly A ou 20 pt de poly U dans 10 ml de NaOH 0,1N ou, plus précisément, par une dilution intermédiaire de 100 j1 de A et de 200 1 de U). On mesure l'absorption à 260 nm et la molarité est estimée en utilisant les valeurs suivantes: 6260 nm x 10-3 pour les solutions molaires. - 10 - pH 7,0 NaOH 0,1 N (hydrolyse) Ap 15,3 15,3 Poly A 9,8 15,3 Up 10,0 7,7 Poly U 9,5 7,7 Les concentrations du polymère sont déterminées à partir du nombre total de nucléotide et du pourcentage de polymérisation. Les volumes, pour un taux stoichiométrique de A/U = 1:1, sont ensuite calculés. Dans un flacon de 10 1 contenant le poly U, on ajoute 200 ml d'une solution de NaCl à 25 % suivi de la solution de poly A, puis les solutions sont soigneusement mélangées (concentration finale de NaCl 0,18 M.) et laissées au repos, à 4 C, pendant au moins 3 heures. Un volume égal d'éthanol est alors ajouté, sous agitation, de façon à précipiter le poly A / poly U, puis le mélange est laissé au repos pendant 1 heure, à 4C. Le complexe est recueilli par centrifugation dans une machine Sorvall 3 B (bacs de 1 litre) à 5 000 tours/mn, pendant 3 minutes; le complexe est alors lavé dans une solution de 2 1 d'éthanol à 55 %. Le résidu est dissous dans environ 4 1 d'eau pure, puis centrifugé pour éliminer toute trace de phosphate double de magnésium et d'ammonium. Aux surnageants ainsi préparés, on ajoute 200 ml d'une solution de NaCl à 25 %; la solution ainsi obtenue est laissée au repos, à 4'C, pendant au moins trois heures. Le complexe est de nouveau précipité par addition d'un volume égal d'éthanol, sous agitation, recueilli par centrifugation, lavé dans une solution d'éthanol à 55 % (environ 2 1), puis dans une solution d'éthanol à 75 % et enfin, à deux reprises, dans une solution d'éthanol à 96 %. Le complexe est ensuite séché sous vide. - il - Rendement: environ 110 - 120 g Il est nécessaire, pour la précipitation du complexe dans la solution d'éthanol à 50 %, que le NaCl (entre 0,15 M et 0,02 M) soit présent. Pour le lavage, on doit utiliser une solution d'éthanol à au moins 55 % (le complexe précipité étant dissous dans une solution d'éthanol à 50 %). - TOXICITE On a recherché la DL50 chez la souris et le rat, par voies IP et IV. On n'a relevé aucun cas mortel aux doses maximum administrées IV, que ce soit chez la souris ou le rat. On n'a relevé aucun cas mortel, chez le rat, en administration IP mais on a déterminé une DL50 d'environ 3g/kg, chez la souris, en administration IP. La recherche d'un effet pyrogène s'est avérée totalement négative. PHARMACOLOGIE Etant donné que les polymères et les copolymères, selon l'invention, sont généralement connus - bien qu'ils n'aient jamais été obtenus, de façon industrielle, sous -une forme suffisament pure - diverses expérimentations pharmacologiques ont été réalisées, depuis des années, sur des échantillons de produits spécialement purifiés à cette occasion qui n'étaient pas réellement - 12 - susceptibles d'être obtenus dans des conditions commercialement raisonnables. On peut apprécier tout l'intérêt de l'invention en prenant connaissance de la bibliographie existante et, par exemple, des articles suivants: À MODULATION OF THE IMMUNE SYSTEM BY SYNTHETIC POLYNUCLEOTIDES - A.G. JOHNSON - Springer Semin. Immunopathol., 2, pp 149-168 (1979), REGULATION OF THE IMMUNE SYSTEM BY SYNTHETIC POLYNUCLEO- TIDES - I. Characteristics of Adjuvant Action on Antibody Synthesis - J.R. SCHIDTKE et A.G. JOHNSON - J. Immunol., 106, pp 1191-1200 (1971) CHANGES IN LYMPHOCYTE SUBPOPULATIONS IN MICE RECEIVING A SINGLE INJECTION OF POLY A - POLY U - M. DONNER, D. VALLIER et F. LACOUR - Ann. Immunol. (Inst. Pasteur) 128C, pp 1039-1052 (1977), SPECTRUM AND MODE OF ACTION OF POLY A - POLY U IN THE STIMULATION OF IMMUNE RESPONSES - V. BRAUN, M. ISHIZUKA, U. YAJIMA, D. WEBB et R. WINCHURCH dans: BEERS R.F., BRAUN W., "Biological effects of polynucleotides" New-York: Springle-Verlag, pp 139- 156 (1971), REDUCED INCIDENCE OF SPONTANEOUS MAMMARY TUMORS IN C3H/He MICE AFTER TREATMENT WITH POLYADENYLATE-POLYURIDYLATE - F. LACOUR, G. DELAGE et C. CHIANALE - Science, 187, pp 256-257 (1975), POLY A - POLY U AS AN ADJUNCT TO SURGERY IN THE TREATMENT OF SPONTANEOUS MURINE MAMMARY ADENOCARCINOMA - F. LACOUR, J. LACOUR et A. SPIRA - Recent Results in Cancer Research, vol. 47, pp 352-356, 2622'586 - 13 - POLYADENYLIC-POLYURIDYLIC ACID: BIOLOGICAL RESPONSE- MODIFYING ACTIVITIES IN MICE. IN VIVO ORGAN DISTRIBUTION AND PHARMACOKINETICS IN RABBITS - F. LACOUR - J. Biol. Resp. Modif., 4, pp 490-494 (1985), 5. A PHASE I CLINICAL TOLERANCE STUDY OF POLYADENYLIC- POLYURIDYLIC ACID IN CANCER PATIENTS - J.P. DUCRET, P. CAILLE, H. SANCHO-GARNIER, J.L. AMIEL, M. MICHELSON, R.G. HOVANESSIAN, J.K. YOUN et F. LACOUR - J. Biol. Resp. Modif., 4, pp 129-133 (1985). PRESENTATION ET POSOLOGIE En thérapeutique humaine, les compositions selon l'invention seront administrées IV sous la forme d'une solution isotonique contenant de 0,01 à 0,1 g de principe actif. I1 est prévu une injection hebdomadaire pendant 6 semaines. REVENDICATIONS 1 ) - Un procédé de préparation de polymères de nucleotides comprenant l'enchainement d'étapes suivant: - effectuer la lyse d'une culture d'une souche bactérienne suivie du passage successif du milieu résultant à travers trois colonnes: la première contenant une résine échangeuse d'ions, la seconde contenant une résine hydrophobique et 10. la troisième contenant un tamis moléculaire, lequel traitement conduit à une solution de polynucléotide phosphorylase substantiellement pure eu égard aux substances gui pourraient gêner la réaction de polymérisation ultérieure, - traitement du nucléotide sélectionné par la polynucleotidephosphorylase ainsi obtenue, consistant à faire réagir environ 200 à 750 unités de phosphorylase dans une solution contenant des tampons usuels et une concentration de 0,06 à 0,2 mmoles/ml du mononucléotide choisi, en présence de MgCl2, ajouté progressivement de façon à contrôler le degré de polymérisation pendant une durée d'environ 3 à 6 jours tout en maintenant les valeurs pH entre 7,4 et 8,6. - séparation et lavage du polymère ainsi obtenu, éventuellement en effectuant la polymérisation d'un second nucléotide choisi, dans les mêmes conditions que décrit ci-dessus, et, dans ce cas, mélange, dans l'eau, des quantités adéquates de chacun des polymères choisis en présence de NaCl et finalement précipitation du complexe résultant par addition d'éthanol. - 15 - ) - Procédé de préparation selon la revendication 1 dans lequel la première colonne contient une résine échangeuse d'ions telle que le DEAE Sephacel ou tout autre équivalent. 3 ) - Un procédé de préparation selon la revendication 1 dans lequel la seconde colonne contient une résine hydrophobe telle que la phényl Sepharose ou tout autre équivalent. 4 ) Un procédé de préparation selon la revendication 1 dans lequel la troisième colonne contient un tamis moléculaire tel que le Sepharyl S300, le Sephadex 200 ou tout autre équivalent. ) - Un polymère ou copolymère de nucléotides tel qu'il est obtenu selon le procédé des revendictions 1 à 4. 6 ) - Un copolymère selon la revendication 5 dans lequel les nucléotides de départ sont de l'acide adénylique et de l'acide uridylique. 7 ) - Le copolymère de la revendication 6 dans lequel les proportions d'acide polyadénylique et d'acide polyuridylique sont d'environ 50 pour 50 en moles. 8 ) - Une composition thérapeutique dans laquelle un des composants actifs est une quantité suffisante d'un polymère ou un copolymère selon l'une des revendications 5 à 7.