FR 2616801 A1 19881223 FR 8708460 A 19870617 Synthèse d'amides gras N-substitués par catalyse enzymatique L'invention concerne un procédé de synthèse d'amides N-substitués consistant à faire réagir au moins un acide organique dont la condensation en carbone s'étale de C2 à C40 avec un syn- thon possédant au moins une fonction amine et éventuellement une ou plusieurs autres fonctions (alcool, thiol, fonction phosphorée amide, ester, acide, etc.); il est à noter que l'acide organique peut également posséder une ou plusieurs de ces fonctions. Dans certains solvants polaires protiques, tels les alcools tertiaires, les synthons aminés difonctionnels à deux ou trois carbones comme l'éthanolamine, l'éthylènediamine, l'éthanethiol- amine, l'amino-l-propanol-3, l'amino éthyl éthanolamine, la propyldiaminel,3 et l'amino-1-propanethiol-3, on obtient des hétérocycles à cinq ou six atomes dont les hétéroatomes sont en position 1-3, les cycles étant substitués en 2. On obtient ainsi respectivement des A2-oxazolines, des A2-imidazolines, des A2-thia- zolines-l-3 des A2-morpholines-lP3 des A2-pyrimidines-l-3 et des A2thiazines-1-3; tous ces composés substitués en position 2 présentent un intérêt particulier en terme d'amphiphilie lorsque R est une longue chaine aliphatique suivant les deux schémas ci- apres. Nx R X N R -- X N R X = 0, S ou N R compte un atome de carbone en moins par rapport à l'acide mis en jeu. La formation de ces cycles est due essen- tiellement à l'effet du solvant et à la configuration des synthons aminés faborable à la cyclisation. Ces exemples ne sont pas restrictifs. Etat de la technique: L'utilisation d'enzymes pour la synthèse organique est devenue aujourd'hui un champ pluridisciplinaire très vaste rassemblant de nombreux chercheurs et suscitant un intérêt gran- dissant au fil des années de la part du monde industriel. Il est à remarquer que,dans la plupart des réactions décrites dans la littérature, les enzymes sont mises en oeuvre pour les réactions très voisines de celles pour lesquelles la na- ture les a destinées in vivo. Les progrès enregistrés aujourd'hui résultent d'une observation qui consiste en ce que les catalyseurs biologiques sont aptes à catalyser des réactions in vitro qui n'ont plus rien à voir avec les réactions pour lesquelles ils étaient programmés in vivo; de même on doit ajouter que les conditions de mise en oeuvre s'écartent très souvent radicalement de celles in vivo: les enzymes sont utilisées en fait comme de simples catalyseurs de la chimie organique, à la différence fondamentale près que les cata- lyseurs biologiques sont très souvent spécifiques, régiosélectifs ou énantiosélectifs pour des réactions pour lesquelles ils n'étaient pas programmés in vivo. La réaction d'un acide avec une amine catalysée par une enzyme peut être schématisée de la manière suivante: R COOH + R'NH:E R - CONH - R' + H20 E = enzyme La réaction est déplacée quantitativement vers la synthèse en piégeant en continu l'eau formée. Les enzymes mises en oeuvre sont des acyltransférases: - Les lipases - Les acylases - Les peptidases - Les proteinases - Les amidases Ces enzymes sont utilisées industriellement quasiment exclusivement dans le sens de l'hydrolyse. Citons par exemple l'emploi de la papaine, enzyme protéo- lytique, dans l'industrie de la bière (clarification), dans l'industrie des cuirs (assouplissement et nettoyage), en boucherie industrielle (hydrolyse de l'élastine pour attendrir les viandes), en diététique hospitalière pour la préparation d'aliments pro- téiques prédigérés. Citons dans l'industrie pharmaceutique l'utilisation de la pénicilline V acylase qui catalyse l'hydrolyse complète de la fonction amide de la phénoxypénicilline (penicilline V) en acide amino-6-pénicillanique (6 APA) et en acide phénoxyacétique. Citons la production d'acides gras de haute qualité par hydrolyse de corps gras à l'aide d'une lipase fixée. Citons enfin l'hydrolyse de l'acrylonitrile en acryl- amide ou en acide acrylique. Les réactions d'hydrolyse sont les plus répandues car ce sont les plus faciles à mettre en oeuvre aussi bien sur le plan technique qu'économique; en effet ces enzymes ne nécessitent pas de co-facteurs, biomolécules très coûteuses et difficiles à recycler quantitativement. Les réactions inverses de synthèse sont également promises à un avenir brillant car un bon nombre de molécules sont inacces- sibles ou d'une accession trop coûteuse par les voies classiques de la chimie organique. La synthèse d'amdes N-substitués revêt un intérêt tout particulier pour l'industrie des amphiphiles dans des domaines aussi divers que les produits tensioactifs: les émulsifiants, les agents mouillants, anticorrosion, adoucissants, etc., ces molécules pouvant trouver des applications aussi bien indus- trielles, ménagères, cosmétiques que pharmaceutiques. Ce type de molécules peut en fait couvrir une grande plage HLB. A notre connaissance aucun brevet n'a décrit la synthèse enzymatique de tels composés: seules trois publications connues de nous font allusion à des transferts d'acyles sur l'atome d'azote. 1) "Ester synthesis catalysed by polyethylene glycol-modified lipase in benzene". Y. Inada, H. Nishimura, K. Takahasshi, T. Yoshimoto, A. Ranjan Saha and Y. Saito Biochemical and Biophysical Research Communications, (1984), 122, 845-850 Dans ce document les auteurs font réagir la laurylamine sur le laurylstéarate pour obtenir le N-laurylstéaramide et l'alcool laurique; c'est une réaction d'aminolyse d'ester. 2) "Synthesis of esters by lipases" G. Lazar, A. Weiss and R.D. Schmid. World conference on emerging technologies in the Fats and Oils Industry. AOCS Congress Cannes 3-8/11/1985, 346-354 Dans ce document les auteurs décrivent l'acylation de composés soufrés ou azotés en milieu aqueux. Les résultats sont consignés dans le tableau suivant: Estérification enzymatique de l'acide oléique avec des composés contenant des atomes d'azote ou de soufre. Lipase(s) Réactif Mucor Pseudomonas Rhizopus spec spec delemar LK 13 LK 15 LK 31 Rendement de la synthèse (%) éthanolamine O O triéthanolamine O O O 2mercaptoéthanol 20 30 30 éthanethiol 10 10 5 2-mercaptoéthylamine HCL O O O L-cystéine O O O L-cystéine HCL O O O On constate que ces auteurs n'ont pas réussi à acyler les fonctions amines de leur substrats. 3) "Hydrolyse et synthèse de liaison ester par la lipase d'un mycé- lium dévitalisé de Rhizopus arrhizus en milieu non aqueux" C. GANCET et C. GRIGNARD Revue Française des Corps Gras, 1986, 33, 423-430 Dans les conclusions de cet article les auteurs écrivent: 26 1680 1 "Il faut également considérer que ce type de catalyse peut s'appliquer à d'autres réactions, non seulement à la synthèse d'esters comme cela vient d'être décrit, mais également à la création de liaison amide, thio-ester et thioamide". Ces auteurs n'ont à ce jour publié aucun article ni brevet sur ces types de réactions. Objet de l'invention Les acides organiques utilisés et les acidesgras, à la différence de ce qui est suggéré ou obtenu dans la littérature, réagissent avec des rendements importants sur les fonctions amines; suivant les conditions opératoires, lorsque la fonction amine est en compétition avec d'autres fonctions, les acides réagissent sur la fonction amine avec une grande sélectivité. En particulier et à titre d'exemple,lorsque l'on fait réagir les acides sur des aminopropanols, on obtient exclusivement les N-acylaminopropanols mais,dans certaines,conditions on obtient des composés cycliques. Description générale de l'invention Selon l'invention le procédé est caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact sous agitation l'acide et l'amine suivant les cas: - En phase homogène dans un solvant organique, l'enzyme étant dispersée dans le milieu soit en l'état,soit fixée sur un support dé synthèse ou biologique (cellules du micro-organisme synthétisant l'enzyme). - En phase hétérogène comprenant une phase organique et une phase aqueuse limitée ou importante. - En milieu homogène fondu c'est-à-dire sans solvant organique. - En milieu aqueux hétérogène sans solvant organique. Suivant le cas l'enzyme libre est en solution dans la phase aqueuse qui peut être tamponnée. Les réactions peuvent être effectuées en batch ou sur colonne à lit catalytique fixe suivant le cas. Dans son aspect le plus général la réaction peut être appliquée à de nombreuses molécules d'amines ou d'acides. On peut citer parmi ces molécules, bien entendu à titre d'exemple non restrictif, les amines linéaires de formule C H2n+l NH2 o n est compris entre 2 et 30, les amines ramifiées, les amines insaturées; les diamines comme l'éthylène diamine, la diéthylène diamine et les hydrazines; les amino alcools comme les amino propanols et les hydroxylamines (NH2 OH et les dérivés N ou O substitués); citons également les acides aminés naturels ou de synthèse, les amines aromatiques et toute amine possédant sur sa molécule une ou plusieurs fonctions organiques comme cité précédemment. Mais l'invention n'est pas limitée à l'utilisation d'amines dans lesquelles la fonction amine est en bout de chaine. Des résultats positifs (formation d'amide) ont également été obtenus avec des produits tels que CH3-CH -CH2OH- NH2 Bien entendu on peut également utiliser sans aucune restric- tion les mélanges de deux ou de plusieurs de ces amines. Parmi les acides organiques, on peut citer les acides linéaires ou ramifiés, saturés ou insaturés,et par exemple les acides gras saturés ou insaturés. L'acide peut présenter dans sa molécule d'autres fonctions organiques comme indiqué précédemment. Citons à titre d'exemple non restrictif l'acide tartrique, l'acide lactique, l'acide salicylique et des dérivés, l'acide adipique, etc. Cette liste n'est évidemment pas exhaustive et le chimiste de l'art pourra aisément comprendre que l'invention est destinée à protéger tous les acides organiques et toutes les amines qui sont connus pour inter réagir et conduire ainsi à des amides. Toutes les lipases peuvent être utilisées dans le cadre de l'invention, ainsi que toute autre acyltransférase comme cité précédemment. A titre indicatif sans restriction on peut citer: - la lipase de Mucor miehei - la lipase de pancréas de porc - la lipase de Rhizopus arrhizus - la lipase de Candida cylindracea - la lipase de Geotrichum candidum - l'acylase d'Aspergillus niger la peptidase de Bacillus licheniformis - la protéinase de Bacillus subtilis - l'amidase de Brevibacterium - l'amidase (Novozyme 217) Les conditions de la réaction en ce qui concerne la durée, le pH de la phase aqueuse lorsqu'elle existe, la température, l'agitation, l'activité de l'eau du catalyseur biologique, la pression ne sont pas critiques mis à part le fait que ces condi- tions ne doivent pas rendre l'enzyme inactive. On conçoit donc que les conditions dépendront dans une certaine mesure du type d'enzyme utilisée et de l'utilisation ou non d'un solvant ainsi que du type de solvant. Le rapport amine/acide organique pourra varier de 90/10 à 10/90. L'invention vient d'être décrite dans son mode de réalisation le plus général afin que l'homme de métier soit à même d'évaluer la portée de celle-ci. Il est maintenant nécessaire de décrire les variantes préférées de l'invention étant bien entendu que celles-ci ne limitent en aucune façon l'invention à ces variantes. En premier lieu, il a été dit précédemment qu'un des inté- rêts de l'invention se situait dans la possibilité d'obtenir une régiosélectivité très forte sur la fonction amine dans le cas d'amines polyfonctionnelles. Ainsi, le procédé de l'invention trouve une application particulièrement intéressante dans le cas o les amines sont précisément polyfonctionnelles. Il est possible de doser le catalyseur biologique (enzyme) à la fois en terme de vitesse de réaction et de régiosélectivité par adjonction de sels tels que le borate de sodium, le chlorure de strontium... A titre d'exemple en ce qui concerne les trois aminopropanols il a été constaté que lorsqu'on opposé l'acide oléique (C18:1) à un aminopropanol le fait d'augmenter le rapport 18:1 / amino- propanol est favorable à la disubstitution dans les trois cas. Dans le cas de l'amino-l-propanol-2, le rapport mole à mole favorise la Nsubstitution avec un bon rendement; il est difficile dans ce cas de synthétiser le disubstitué uniquement. Il semble que,lorsque les fonctions alcool et amine sont vicinales, l'enzyme favorise toujours la substitution de la fonction amine indépendamment de sa position; cependant;sur un plan cinétique, l'amine est substitué plus rapidement en position externe qu'en position interne. Donc le composé idéal pour la synthèse d'un produit monosubstitué ayant un OH libre est l'amino-l-propanol-2; dans ce cas on observe une acylation régiosélective prononcée car seule la fonction amine en position 1 est acylée. Les deux autres aminopropanols sont convenables pour la synthèse des dérivés disubstitués. En règle générale lorsque les deux fonctions OH et NH2 sont en alpha l'une par rapport à l'autre, la fonction amine est acylée préférentiellement. En ce qui concerne les amino propanediols,il a été constaté que tous lesproduits possibles sont synthétisés; cependant dans le cas o les deux fonctions alcools sont vici- nales, l'adjonction d'acide borique par exemple, réputé pour complexer les diols vicinaux, on parvient à orienter nettement la réaction vers l'acylation préférentielle de l'amine. Pour illustrer le phénomène on peut admettre le complexe schématique suivant H CH2- N H I: Amino--propanediol-2-3 H I..OH II: Acide borique CH -o0 CHO: Doublet électronique -OH II: Lacune électronique de l'atome de bore de l'acide CH20 OH borique 2- OH H I La complexation du système vic.diol par l'acide borique est basée sur la tendance des doublets électroniques des deux atomes d'oxygène à combler la lacune électronique de l'atome de base de l'acide borique. Le chlorure de strontium joue un rôle analogue sans que l'on puisse expliquer convenablement le mécanisme. Il est précisé que,lorsqu'on utilise un acide à forte condensation en carbone, l'amine sur laquelle il est prévu de le faire réagir devra de préférence être à faible condensation en carbone et vice versa, sans que ce ne soit une condition absolue. Il est ainsi possible d'obtenir les précuseurs des quatre types de tensioactifs (cationiques, anioniques, zwitterioniques, et non ioniques). D'autre part dans la plupart des cas l'activité des enzymes est inaltérée après 20 cycles; on peut donc espérer travailler en continu en recyclant les réactifs non combinés. L'invention est maintenant illustrée par les exemples non limitatifs ci-après. Exemples effectués en milieu homogène dans un solvant organique Exemple 1 On effectue la réaction dans un solvant organique: l'hexane. On ajoute à ce solvant: 200 mg d'acide oléique, 164 mg de laurylamine, et mg de lipase (lipozyme NOVO). La température est maintenue à 60 C pendant 24h: On obtient l'amide avec un rendement, exprimé en pourcen- tage d'acide oléique consommé de 20%. Exemple 2 Identique à l'exemple 1 mais le solvant est le chloroforme Résultat: Rendement = 10% Exemple 3 Identique à l'exemple 1 mais la laurylamine est remplacée par la butylamine (250 mg) Résultat: Rendement = 70% Exemple 4 Identique à l'exemple 1 mais la laurylamine est remplacée par le dinoram C (241 mg) Dinoram C = R - NH - (CH2)3 - NH2 o R est constitué des chaînes grasses du coprah. Résultat: Rendement = 15% Exemple 5 Identique à l'exemple 1 mais la laurylamine est remplacée par l'amino-lpropanol-2 (66 mg) et le solvant est un mélange 30/70 hexane/CHC13. Résultat: Rendement = 10% de dérivé N-acylé. Exemple 6 Identique à l'exemple 1 mais l'acide oléique est remplacé par l'acide ricinoléique Résultat: Rendement = 10% Exemple 7 Identique à l'exemple 1 mais le lipozyme est remplacé par l'acylase d'Aspergillus niger Résultat: Rendement = 10% Exemple 8 Phase organique: tertiobutanol 15 ml Acide palmitique: 512 mg Ethanolamine: 61 mg Lipase (lipozyme NOVO): 100 mg Température: 40 C Durée: 15 heures Après réaction, l'acide palmitique en excès est éliminé par lavage à la soude. Le résidu solide est recristallisé dans un mélange 1/1 EtOH/Et20. Résultat: on obtient 85 mg (Rendement 30%) de pentadééyl-2, A2-oxazoline. Exemple 9 Identique à l'exemple 8 mais l'éthanolamine est remplacée par l'orthophénylène diamine (108 mg) Résultat: On obtient avec un rendement de 20% le pentadécyl-2, benzimidazole. Exemple 10 Identique à l'exemple 8 mais l'éthanolamine est remplacée par l'éthanethiolamine (77 mg) Résultat: On obtient avec un rendement de 20 % le pentadécyl-2, A2-thazoline. 2616 01 Exemples effectués en milieu biphasique Phase organique/phase aqueuse Exemple 11 Phase organique: hexane 3 ml acide oléique 112 mg Phase aqueuse: eau 1 ml hydroxylamine 138 mg pH 7 Lipozyme: 100 mg Température: 45 C Durée: 24 heures Résultat: Rendement = 75% d'acide oléylhydroxamique (R - CO - NH - OH) Exemple 12 Identique à l'exemple 11 mais l'hydroxylamine est remplacée par l'hydrazine (138 mg) à pH 7. Résultat: Rendement = 70% d'oléyl hydrazine (R - CO - NH - NH2) Exemple 13 Identique à l'exemple 11 mais la réaction se fait sans solvant organique, l'acide oléique est à l'état liquide; on a donc un milieu hétérogène phase organique (acide oléique) et une phase aqueuse contenant l'hydroxylamine à pH 7 tamponnée au tampon phosphate 150 mM. Résultat: Rendement = 75% d'acide oléylhydroxamique. Exemple 14 Identique à l'exemple 13 mais l'hydroxylamine est remplacée par l'hydrazine. Résultat: Rendement = 70% de N-oléyl hydrazine. Exemple 15 Identique à l'exemple 11 mais le lipozyme est remplacé par de l'amidase de Brevi Bacterium R 312 contenue dans la cellule entière. Résultat: Rendement: 5% d'acide oléylhydroxamique. Pour tous les exemples cités les réactions sont effectuées dans des fioles étanches disposées sur un agitateur vibrant dans une enceinte thermorégulée. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la synthèse d'amidesgras N-substitués par réaction d'un composé organique présentant une fonction acide terminale et. un composé organique présentant une fonction amine terminale caractérisé en ce que ladite réaction est effectuée en présence d'une enzyme de la classe des acyltransférases. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la réaction est effectuée entre un acide de formule RCOOH et une amine de formule HX(CH2) -NH2 dans laquelle X est O, S ou NH et n est égal à 2 ou 3 et que l'on obtient un produit hétéro- cyclique de formule XN (CH2)n C - R 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que R est une longue chaîne aliphatique. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérise en ce que la réaction est réalisée en phase homogène dans un solvant organique. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la réaction est réalisée en phase hétérogène comportant une phase organique et une phase aqueuse. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la réaction est réalisée en milieu homogène fondu. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la réaction hétérogène est réalisée en présence d'eau.