FR 2618640 A1 19890203 FR 8810189 A 19880728 Procédé pour former et pour tester une population de plantes hybrides de première génération. La présente invention est relative à un procé- dé perfectionné de production de semence hybride. Plus particulièrement, elle est relative à l'utilisation d'un gène résistant à un produit chimique phytotoxique d'un parent mâle dans un processus d'hybridation, sui- vi de l'administration dosée aux hybrides obtenus du produit chimique phytotoxique, pour éliminer les plan- tes provenant de grains indésirables de contamination. Pour la production commerciale de qrains hybrides, on plante en général les parents mâles et femelles sui- vant une configuration alternée et l'on récolte la graine seulement du parent femelle. Un problème prépon- dérant, pour la production de graines hybrides, est d'assurer que tout le pollen fécondant le parent fe- melle provient du parent mâle. De la graine provenant d'une autre source de pollen contaminera la population hybride de graines. Les sources potentielles de pollen contaminant sont le pollen provenant du parent femelle qui provoque une auto-pollinisation ou du pollen prove- nant d'une parcelle voisine. Il y a 6 moyens d'éliminer le pollen fécondant provenant du parent femelle (Simmonds, Principles of Crop Improvement, 1979): 1. mécanique (par exemple tomates) - émasculation manuelle du parent femelle, suivie d'une pollinisation; 2. dioécie (par exemple l'épinard) - élimina- tion des plantes mâles du génotype duquel de la graine sera récoltée à partir d'une récolte avec des parents mâles et femelles distincts; 3. auto-incompatibilité (par exemple chou) - plantations croisées de deux parents auto-incompati- bles, mais à compatibilités croisées et récolte de toute la graine ou utilisation d'un génotype auto- inconpatible, comme parent femelle, avec un pollinisa- teur auto-fécondant et récolte de la graine provenant seulement du parent femelle; 4. stérilité nucléaire mâle (de nombreuses récoltes) - séparation du parent femelle pour la stéri- lité mâle (ms ms) et pour la fécondité (Ms ms); élimi- nation des plantes mâles fécondes et pollinisation des plantes mâles stériles par du pollen provenant du parent mâle (Ms Ms); 5. stérilité cytoplasmique mâle (par exemple pour des oignons) - utilisation de lignées mâles stéri- les comme parents femelles; et 6. produits chimiques: (a) gamétocides mâles (par exemple pour le blé) - projection sur des parents femelles d'un produit chimique qui induit une stérilité mâle; (b) inversion sexuelle (par exemple pour du curcurma) - projection sur des parents femelles d'hor- mones végétales pour transformer les fleurs mâles en des fleurs femelles. Mais ces solutions posent plusieurs problèmes: (1) La séparation physique des parents femelles et mâles dans des parcelles alternées du champ ne faci- lite pas le transfert efficace du pollen, des parents mâles aux parents femelles, et peut se traduire par une production de graines hybrides inférieure à la pro- duction maximale. (2) Aucune de ces solutions ne peut garantir une élimination absolue du pollen fécondant provenant du parent femelle (et donc l'autopollinisation du parent femelle). Il y a, à cet égard, deux volets: (a) Des erreurs humaines peuvent se produire pendant l'émasculation manuelle et l'élimination des plantes mâles fécondes quand on utilise la diocie et la stérilité nucléaire mâle. En outre, le travail à effectuer, quand on met en oeuvre ces techniques, est très coûteux. (b) Quand on utilise des projections de pro- duits chimiques pour se rendre maitre de l'expression sexuelle, il est difficile d'obtenir une application uniforme qui prévient toute production de pollen par des parents femelles. En outre, une certaine stabi- lité est souvent associée à l'expression de l'auto- incompatibilité et de gènes de stérilité mâle. C'est ainsi, par exemple, qu'il est connu que des températu- res élevées ou qu'une grande humidité diminuent l'auto- incompatibilité, ce qui se traduit par une grande pro- portion de graine auto-pollinisée, en particulier pour les choux (Frankel et Galun, Pollination Mechanisms, Reproduction and Plant Breeding (1977)). Ceci se tra- duit par la formation d'un certain nombre de "hybrides grossiers" contenant plusieurs plantes auto-pollinisées (Simmonds). La restauration de la fertilité de certai- nes lignes mâles stériles d'oignons a rendue peu écono- mique la production d'une graine hybride à partir de croisements qui sont, sinon, excellents (Grant, Onions, Plant Breeding in New Zealand (1983)). 3. En vue de prévenir la contamination par du pollen étranger provenant d'une parcelle voisine, on fait croître des lots de graines hybrides dans des parcelles isolées. Les distances recommandées pour l'isolation varient d'une récolte à l'autre, suivant son mode de pollinisation et peuvent aller de 200 m pour le sorgho, le maïs et le blé, jusqu'à 6,4 km pour le tournesol (Wright, Commercial Hybrid Seed Production, Hybridisation of Crop Plants (1980)). On fait des es- sais pour éliminer toutes les sources de pollen conta- minant à ces distances. Une solution au problème (1) ci-dessus a été proposée auxbrevets des Etats-Unis d'Amérique Nos 4517763, 4658084 et 4658085 (tous de Beversdorf et collaborateurs). Tous impliquent la création dans le même parent femelle d'une combinaison d'une stérilité mâle à héré- dité cytoplasmique et d'une résistance aux herbicides à hérédité cytoplasmique (4517763) ou d'une homozygo- sité pour un gène dominant résistant aux herbicides par hérédité nucléaire (4658084). Ce concept permet de mélanger au hasard les deux parents pour une produc- tion de graines hybrides, en facilitant ainsi le trans- fert du pollen du parent mâle au parent femelle. Si le parent femelle est masculinement stérile et résistant aux herbicides, et si le pa- rent mâle est masculinement fécondant et sensible aux herbicides, la graine produite à partir de ces plantes peut être de deux types: (1) graine hybride véritable provenant du parent femelle (résistant aux herbicides); et (2) graine non hybride provenant de l'auto- pollination du parent mâle. La graine non hybride provenant de l'auto- pollination du parent mâle peut être éliminée, en pro- jetant l'herbicide après pollinisation mais avant la récolte de la graine (en tuant ainsi le parent mâle) ou après ensemencement de la graine provenant de la récolte de bourgeons (en tuant ainsi les plantules non hybrides après germination). Cette source de plantes non hybrides ne s'obtient pas dans une production standard de graines hybrides, puisque dans une produc- tion standard de graines hybrides, les parents mâles et femelles sont séparés physiquement dans des parcel- les alternées du champ, et puisque la graine est récol- tée seulement des parcelles femelles. C'est pourquoi la production d'une composante de graine non hybride fait partie inhérente de ces brevets, en raison de l'ensemencement mixte des deux parents. On revendique également, aux brevets des Etats- Unis d'Amérique Nos 4658084 et 4658085, l'utilisation de la résistance à deux herbicides différents pour per- mettre de planter au hasard, de manière mixte, le pa- rent femelle rendu masculinement stérile par voie cyto- plasmique, sa lignée de maintien et le parent mâle. Des plantes provenant de la lignée de maintien et de la graine non hybride provenant de l'auto-pollinisa- tion du parent mâle sont éliminées par leur sensiblli- té à des herbicides différents. Une solution éventuelle au problème 2(a) ci- dessus a été proposée par Wiebe (A proposal for Hybrid Barley, Agronomy Journal (1960)). Wiebe suggère la possibilité de trouver une liaison étroite entre le gène mâle de fécondité et la sensibilité à un phytocide (DDT). Ceci permet l'identification précoce de plantes mâles fécondes (Msms) dans des populations de parents femelles qui se séparent du point de vue de la fécondi- té mâle (Msms) et de la stérilité mâle (msmns) quand on utilise une stérilité nucléaire mâle. Ces plantes peuvent être donc éliminées de la population de parent femelle avant la floraison et avant toute libération éventuelle de pollen qui peut provoquer l'auto- fécondation du parent femelle. Une proposition identique est suggérée à la deman- de de brevet européen No 86104213.3 (Advanced Genetic Sciences Inc.). Mais cette approche implique l'introduc- tion au hasard de gènes marqueurs par le biais de la transformation en le génome de plantes mâles fécondes (MsMs ou Msms), et de nombreuses plantes transformées indépendamment sont analysées génétiquement pour trou- ver un individu avec une liaison étroite entre le gène marqueur et le locus mâle de fécondité. On souligne tout particulièrement l'utilisation de gènes suicides qui donnent une sensibilité à certains produits chimi- ques. On peut ensuite éliminer les plantes fécondes par une simple projection de produits chimiques au stade de la plantule. Mais/ les quatre brevets passés en revue ci- dessus ne résolvent pas les problèmes associés à la contamination par du pollen étranger et à la contamina- tion par auto-pollinisation du parent femelle due à une défaillance de la stérilité mâle (problèmes 2(b) et 3 ci-dessus). L'invention pallie les deux inconvénients de l'art antérieur qui sont mentionnés ci-dessus. L'invention vise un procédé pour former une population de plantes hybride sensiblement pure de première génération qui consiste: (a) à planter des plantes parentes mâles et femelles sur des parcelles alternées, les plantes pa- rentes mâles étant résistantes à un-produit chimique phytotoxique, cette résistance étant attribuable seule- ment à un gêne marqueur homozygote nucléaire dominant, les plantes parentes femelles n'ayant pas de gènes résistants; (b) à féconder ces plantes femelles par du pollen provenant de ces plantes mâles; (c) à récolter de la graine fécondée provenant seulement des parcelles de plantes femelles; et (d) à administrer, de manière dosée, le produit chimique phytotoxique à la graine fécondée récoltée au stade (c). On peut effectuer le stade (d) avant de planter ou après l'émergence des plantules. Le produit chimique phytotoxique élimine ainsi des plantes provenant de l'auto-pollinisation du parent femelle ou de source étrangère de pollen et permet ainsi d'obtenir une popu- lation hybride de première génération sensiblement homogène. On peut utiliser le procédé ci-dessus pour des espèces de plantes dont les deux parents sont auto- fécondants, ou pour lesquelles un seul parent est auto- incompatible. De préférence, le produit chimique phytotoxique est un herbicide de n'importe quelle classe. En varian- te, ce produit chimique phytotoxique est un antibioti- que, de préférence la kanamycine (complexe antibioti- que produit par Streptomyces kanamyceticus). L'invention vise également un procédé pour for- mer une population de plantes hybride sensiblement pure de première génération dans laquelle les deux pa- rents sont auto-incompatibles, ce procédé consistant: (a) à planter des premières et secondes plan- tes parentes sur des parcelles alternées ou en un mé- lange au hasard, les premières plantes parentes étant résistantes à un produit chimique phytotoxique A, les secondes plantes parentes étant résistantes à un pro- duit chimique phytotoxique B, cette résistance aux produits chimiques phytotoxiques A ou B étant attri- buable, dans chaque plante, seulement à un gène mar- - queur homozygote nucléaire dominant, les secondes plantes parentes n'ayant pas cette résistance génique au produit chimique A et les premières plantes paren- tes n'ayant pas cette résistance génique au produit chimique B; (b) à féconder les premières plantes parentes par du pollen provenant des secondes plantes et à fé- conder les secondes plantes parentes par du pollen pro- venant des premières plantes parentes; (c) à récolter de la graine fécondée provenant des premières plantes parentes et des secondes plantes parentes; et (d) à administrer, de manière dosée, à la grai- ne fécondée résoltée au stade (c), à la fois les pro- duits chimiques phytotoxiques A et B. On peut effectuer le stade (d) avant de plan- ter ou après l'émergence des plantules, pour éliminer les plantes provenant de l'auto-pollinisation sur la première plante parente ou de la seconde plante pa- rente ou de sources extérieures de pollen. On obtient ainsi une population hybride de première génération sensiblement homogène. De préférence, les produits chimiques phytoto- xiques A et B sont des herbicides de n'importe quelle classe. En variante, ces produits chimiques phytotoxi- ques sont des antibiotiques, l'un de ces antibiotiques étant de préférence la kanamycine. De préférence, les gènes marqueurs nucléaires sont insérés par une technique de transformation végé- tale. De préférence, la technique de transformation végétale utilisée est un transfert au moyen d'Agrobac- terium. Certains aspects du transfert de gènes dans des plantes, au moyen d'Agrobacterium, sont décrits à la demande de brevet européen No 116718 (P.Zambryski); 26186 4 0O et à la demande de brevet européen No 84116036.9 (Plant Genetic Systems N. V., page 3, ligne 33); ou cités à la demande de brevet européen No 86104213.3 (colonne 16, ligne 17). The EMBO Journal, Vol. 6 (1987)). En variante, cette technique de transformation végétale est une transformation directe par absorption de DNA (en du protoplast ou en des cellules, en des tissus végétaux ou en des inflorescences). Dans un autre procédé, que l'on peut mettre en oeuvre, le gène marqueur nucléaire est sélectionné dans une culture cellulaire somatique. Les brevets de Beversdorf et col. se réfèrent à un tel procédé. Dans un autre procédé qu'il est possible de mettre en oeu- vre, le gène marqueur nucléaire est sélectionné dans une fusion de protoplast de transfert. Dans un autre procédé encore, le gène marqueur nucléaire est sélec- tionné après avoir induit une mutagénèse végétale. En variante, le gène marqueur nucléaire est obtenu en sélectionnant une plante mâle ou une première plante parente ou une seconde plante parente ayant le gène souhaité. La présente invention vise en outre un procédé pour tester la puretéde populations de plantes hybrides de première génération dont les deux parents sont auto- fécondants ou dont l'un des parents est auto-fécondant, ce procédé consistant à effectuer les stades (a) à (c) du premier procédé décrit cidessus; à planter, à titre d'échantillon, une petite quantité de ces grai- nes; à administrer en quantités dosées aux plantules, après émergence, le produit fini qui est phytotoxique; et à déterminer le pourcentage des plantules qui résis- tent au produit chimique phytotoxique. L'invention vise, en outre, un procédé pour tester la pureté de populations de plantes hybrides de première génération dont les deux parents sont auto- incompatibles, ce procédé consistant à effectuer les stades (a) à (c) du deuxième procédé décrit ci-dessus; à planter une petite quantité de ces graines comme échantillons; à administrer, de manière dosée, aux plantules, après émergence, les produits chimiques phytotoxiques A et B; et à déterminer le pourcentage de plantules résistantes aux produits chimiques phyto- toxiques A et B. L'invention sera décrite, d'une manière plus précise, en se référant aux dessins annexés, dans lesquels: la figure 1 est un schéma représentant l'héré- dité de la résistance à un produit chimique phytotoxi- que en fonction de la production de graines hybrides, suivant un premier mode de réalisation préféré de l'invention; et la figure 2 est un schéma de l'utilisation de la résistance au produit chimique phytotoxique pour la production de graines hybrides suivant un second mode préféré de réalisation de l'invention. En se reportant à la figure 1, (RR) signifie résistance homozygote; (Rr) signifie résistance hété- rozygote; (rr) signifie sensibilité homozygote. L'invention englobe, dans un premier mode pré- féré de réalisation, l'introduction d'un gène marqueur dominant donnant de la résistance à un produit chimique phytotoxique dans le parent mâle d'une variété hybride (RR). Les deux parents sont auto-fécondants, ou l'un des parents seulement est autoincompatible. Pour maxi- miser l'efficacité de l'approche, le parent mâle doit être homozygote pour un tel gène. Dans ce mode de réalisation, toute la graine hybride vraie récoltée du parent femelle (rr) serait hétérozygote pour le gêne marqueur dominant et serait résistante au produit chimique phytotoxique correspondant. Si l'on projette, au stade de la plantule, sur la récolte de graines hybrides, le produit chimique convenable, seules des plantules provenant de la graine hybride vraie (Rr) survivront et toute plantule provenant de pollen conta- minant sera éliminée. La production d'une graine hybride vraie (Rr) est représentée par le trajet illustré en (A) à la figure 1. La graine produite par du pollen contaminant (rr) est illustrée en (B) à la figure 1. De la graine hybride a habituellement, d'une manière prépondérante, une origine vraie de première génération, avec les proportions variables de graine contaminante. On peut éliminer la graine contaminante en fonction de la sen- sibilité à un produit chimique phytotoxique. Apres avoir récolté la graine du parent femelle dans une parcelle de graine hybride, on peut traiter un petit échantillon de graine (par exemple 1000 graines) par le produit chimique convenable, ou le fa- re germer et projeter sur les plantules le produit chi- mique convenable pour déterminer la contamination en pourcentage. On peut faire ensuite des recommandations sur l'augmentation de taux d'ensemencement qui est né- cessaire, pour connaître la proportion de plantules contaminantes qui sont éliminées ensuite. En se reportant à la figure 2, dans un second mode préféré de réalisation de l'invention, l'auto-in- compatibilité des deux parents est utilisée pour la production de graines hybrides et on récolte de la graine des deux parents. Chaque parent doit donc être homozygote pour différents marqueurs à résistance chimique. Il faut ensuite projeter sur les plantules hybrides les deux produits chimiques correspondants, afin d'éliminer les plantules provenant de pollen con- taminant. Le premier parent (AAbb) est résistant au pro- duit chimique A, le second parent (aaBB) est résistant au produit chimique B. Les graines hybrides pures (AaBb) seront résistantes, à la fois, auxproduits chimiques A et B. De la graine non hybride, provenant de pollen contaminant (Aabb ou aaBb) n'aura une résis- tance qu'au produit chimique A ou qu'au produit chimi- que B. Comme les procédés suivant l'invention incluent le stade d'élimination de la graine non hybride pendant la production de la graine hybride, on a bien moins besoin d'isoler des parcelles des plantes parentes de source de pollen contaminant. Ces procédés permettent de produire de la graine hybride d'une manière plus efficace. On peut aussi utiliser de nombreux parents femelles excellents, qui ne pouvaient pas être utili- sés précédemment, pour la production ccmmerciale de graines hybrides, en raison du fait que l'on peut maintenant utiliser l'inversion irrégulière de fécon- dité mêle. Dans la mesure o l'on dispose de sources de plasme germinatif, on peut utiliser des solutions classiques de culture de plantes pour transférer la résistance aux produits chimiques phytotoxiques à des parents mâles ou à des hybrides. On peut ajouter directement des gènes de résistance à des génotypes végétaux particuliers en mettant à profit les progrès récents en génétique des cellules végétales. Les applications de la sélection cellulaire somatique, de la fusion protoplastique et la transformation ont per- mis la manipulation génétique des plantes, en vue de leur conférer une résistance à des produits chimiques particuliers (Conner et Meredith, Genetic Manipulation of Plant Cells, The Biochemistry of Plants. A compre- hensive treatise Vol. 15, Molecular Biology, (1988)). Dans la plupart des cas, ces techniques don- nent des plantes individuelles hétérozygotes pour la résistance, qui doivent être auto-pollinisées, puis la descendance est testée pour engendrer des homozy- gotes. Bien qu'on puisse utiliser des gènes pour confé- rer de la résistance à n'importe quel produit chimique phytotoxique, la solution la plus utile met en oeuvre des gènes donnant de la résistance aux herbicides. Une transformation au moyen d'Agrobacterium offre un procédé particulièrement commode, puisque plusieurs gènes potentiellement utiles ont été clones et donnent de la résistance à des herbicides spécifiques quand ils sont incorporés à des plantes. La production de plantes résistantes aux her- bicides par le biais d'une transformation peut induire une résistance au glyphosate (Shah et col., Engeneering Herbicide Tolerance in Transgenix Plants, Science, Vol. 233 (1986); Comai et col., Nature, Vol. 317 (1985); brevet des Etats-Unis d'Amérique No 4535060 (Comai); Fillatti et col., Bio/Technology, Vol. 5 (1987)) ou de la résistance à la chlorosulforone (Haughn et col., Molecular and General Genetics, vol. 211 (1988)); ou de la résistance au phosphinothrium/ bialaphos (De Block). Exemple 1 L'utilisation de gênes marqueurs dominants ayant de la résistance à un produit chimique phyto- toxique pour prévenir toute contamination par du pollen extérieur, pendant la production d'une graine hybride, est illustrée dans des plantes de Nicotiana plumbagini- folia qui sont résistantes à la kanamycine. A. Essai de la résistance à la kanamycine. * On peut étudier commodément la résistance à la kanamycine chez N. plumbaginifolia en séparant les plan- tules ayant des cotylédons verts (résistance à la kanamycine) de ceux ayant des cotylédons blancs (sensi- bles à la kanamycine) croissant en la présence de kanamycine. On fait macérer les graines pendant une nuit dans de l'acide gibbérellique I mM, on les sté- rilise en surface par de l'hypochlorite de sodium à 3 % pendant 5 minutes, et on les rinces à fond dans de l'eau distillée stérile. On les sème ensuite sur des sels 1/2 MS (Murashige et Skoog, A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays With Tobacco Tissue Culture, Physiologia Plantarum, Vol. 15, (1962)) avec 0,8 % de gélose additionnée de 300 mg de kanamycine/litre. On met les milieux de culture en autoclave pendant 20 minutes sous 121 kPa, de la kanamycine sté- rilisée sur un filtre étant ajoutée après l'autoclavage. On incube à 26 C sous de la lumière fluorescente blan- che froide, des plantules qui germent (100 umole. -2 -1 m.s; lumière pendant 16 heures; 8 heures d'obs- curité par jour). On peut séparer les plantules vertes des plantules blanches 7 à 10 jours après. En utilisant cette solution, on observe une plantule unique verte et résistante à la kanamycine de N. plumbaginifolia parmi plusieurs milliers de plan- tules blanches sensibles à la kanamycine. On transfère cette plantule dans un milieu exempt de kanamycine. 8 semaines après, on la transfère dans le sol. On effec- tue des pollinisations contrôlées à la floraison et on sépare la descendance obtenue en fonction de la ré- sistance à la kanamycine. La plantule d'origine isolée (NpKR) est hétéro- zygote en un locus unique de mutation spontanée donnant de la résistance à la kanamycine. Ceci ressort de la séparation de la descendance autopollinisée et croisée respectivement dans le rapport de 3:1 et 1:1 pour les plantules résistantes à la kanamycine et les plantules sensibles à la kanamycine (tableau 1). A partir de la descendance auto-pollinisée, on identifie une plante unique (NpKR B) reproductrice vraie de la résistance à la kéramycine (tableau 1). Cette plante est manifes- tement homozygote en un locus unique pour la résis- tance à la kanamycine. Tableau 1: Hérédité de la résistance à la kanamycine dans un mutant spontané résistant à la kanamycine de Nicotiana plumbaginifolia (Np KR). On sé- pare la descendance des plantules en fonction de la résistance à 300 mg/litre de kanamycine. Nombre de plantules Croisement Nombre de plantules Rapport Chi (femellexmale) Vertes Blanchesb testé carré Type sauvage(auto- 1.165 - - fécondé) k NpKR (auto-féconde) 1.150 367 3:1 0:5 Type sauvage x 292 266 1:1 1:21 NpKR NpKR x type 256 281 1:1 1:16 sauvage NpKR B (auto- 808 - - fécondé a) Résistance à la kanamycine. b) Sensible à la kanamycine. B. Production de graines hybrides. On simule une production de graines hybrides en utilisant une plante N. plumbaginifolia de type sauvage comme parent femelle et NpKR B (homozygotes pour la résistance à la kanamycine),comme parent màle. On crée trois niveaux de lutte contre la contamination par du pollen extérieur, en pollinisant le parent fe- melle émasculé par: 1. du pollen de NpKR B seulement (niveau fort), 2. du pollen provenant surtout de NpKR B, avec une petite quantité provenant d'une plante de type sau- vage (niveau relâché), et 3. de grandes quantités de pollen provenant à la fois de NpKR B et d'une plante de type sauvage (niveau bas). Comme on pouvait s'y attendre, le pourcentage de graines contaminantes diminue au fur et à mesure que l'on rel&che le niveau de lutte contre le pollen étranger. Cette expérience démontre le principe de l'élimination de graines non hybrides quand on craint une contamination par du pollen pendant la production de graines hybrides. Exemple 2 L'utilisation de gènes marqueurs dominants ayant de la résistance à un produit chimique phytoto- xique, pour prévenir l'auto-pollinisation du parent femelle pendant la production d'une graine hybride est illustrée par des plantes de Nicotiana plumbagini- folia modifiées génétiquement en vue de leur donner de la résistance à la kanamycine. Tableau 2: Utilisation de la résistance à la kanamycine pour éliminer de la graine provenant du pollen conta- minant pendant la production de graines hybrides dans Nicotianaplumbaginifolia. Parent femelle = plantes de type sauvage sensibles à la kanamycine avec divers niveaux d'auto-pollinisation. Parent mâle = NpKR B (homozygote du point de vue de la résis- tance à la kanamycine). On sépare la descendance des plantules en fonction de la résistance à 300 mg/litre de kanamycine. Niveau de lutte % de graines contre la Nombre de hybrydes % de graines contamination graines vraies auto-fécondées par du a séparées de lèreb contaminées pollen étranger génération Important 341 100 0 Relàché 273 86 14 Faible 229 57 43 a Voir ci-dessus. b Plantules vertes survivantes, hétérozygotes vis-à-vis de la résistance à la kanamycine. c Plantules de couleur blanche, sensibles à la kanamycine. A. Transformation Un système vecteur binaire mettant en oeuvre Agrobacterium tumefaciens (souche LBA 4404), "Hoekama et col., A binary plant vector strategy based on separation of vir- and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Tiplasmid, Nature, 303, pages 179-180 (1983)", servant de site au plasmide pKIWI 6 est utili- sé pour la transformation. Ce plasmide contient les bords gauche et droit du T-DNA, 2 gènes chimères capa- bles de s'exprimer dans des cellules végétales. L'un confère la résistance à l'antibiotique qu'est la kanamycine et consiste en une région de codage prove- nant du gène néomycine phosphotransférase II (prove- nant du transposon Tn5 bactérien) sous le contrôle du promoteur qu'est l'octopine synthase et du signal poly A {OCS-NPTII-OCS). L'autre confère l'activé chlo- ramphénicol acétyl transférase (CAT) et consiste en la région de codage de CAT (provenant du transposon Tn9 bactérien), sous le contrôle du promoteur de mannopine synthase et du signal d'octopine synthase poly A. Des morceaux de feuilles provenant de plantes in vitro de N. plumbaginifolia sont immergés dans une suspension de A. tumefaciens (culture pendant une nuit dans un bouillon MG/L -Garfinkel et Nester, Agrobacte- rium tumefaciens Affected in Crown Gall Tumourigenesis and Octopine Metabolism, Journal of Bacteriology, Vol. 144, (1980)), et serait à siccité et cultivé sur un milieu RMOP (Sidorov et col., Isoleucine-requiring Nicotiana Plant Deficient in Threonine Deaminase, Nature, Vol. 294 (1981)). 2 jours après, on transfère les morceaux de feuilles dans le même milieu additionné de 500 mg/l de céfotaxime (pour prévenir toute sur- croissance d'Agrobacterium) et de 300 mg/l de kanamycine (pour sélectionner les cellules végétales transformées). On enracine des pousses régénérées résistantes à la kanamycine sur des sels MS (Murashige & Skoog, 1962), additionnées de 3 % de saccharose et de 0,8 % de gélose, puis on les transfère dans un sol. On effectue des pollinisation contrôlées-à la floraison et on sé- pare la descendance obtenue en fonction de la résis- tance à la kanamycine, comme décrit à l'exemple 1. B. Essai de la résistance à la kanamycine On peut étudier commodément l'hérédité de la résistance à la kanamycine chez N. plumbaginifolia en séparant les plantules ayant des cotylédons verts (résistance à la kanamycine), de celle ayant des coty- lédons blancs (sensibles à la kanamycine), 7 à 10 jours après ensemencement sur un milieu contenant 300 mg/l de kanamycine. On étudie l'hérédité dans 10 plantes transformées; on rapporte ici les résultats d'une seule de ces plantes (NpT 17). La plante d'origine transformée de NpT 17 était hétérozygote du point de vue de l'insertion dans un cycle unique du gène résistant à la kanamycine. Ceci résulte de la séparation de la descendance auto- pollinisée et croisée dans le rapport 3:1 et 1:2 res- pectivement, entre les plantules résistantes à la kana- mycine et les plantules sensibles à la kanamycine (tableau 1). A partir de la descendance auto-pollinisée, on a identifié une plante unique (NpT 17 D) reproduc- trice vraie de la résistance à la kanamycine (tableau 3). Cette plante est manifestement homozygote en un site unique donnant la résistance à la kanamycine. On recroise le NpT 17 D avec le type sauvage pour engendrer une grande population de plantules (plus de 5.000) qui est hétérozygote vis-à-vis des gènes insérés de résistance à la kanamycine. Toute ins- tabilité génétique de résistance à la kanamycine serait reconnue par l'apparition, dans cette population, de rares plantules blanches, sensibles à la kanamycine. Toutes les plantules s'avèrent être résistances à la kanamycine (tableau 3), ce qui indique une grande sta- bilité génétique. C'est pourquoi des gènes ayant de la résistance aux produits chimiques phytotoxiques et in- troduits dans des plantes par le biais d'une transfor- mation au moyen d'Agrobacterium, sont suffisamment sta- bles pour être utilisés comme marqueurs génétiques pour contrôler la pureté des graines de variétés de récolte. Tableau 3: Hérédité de la résistance à la kanamycine dans une plante transformée de Nicotiana plumbaginifolia (NpT 17). On sépare la descendance des plantules en fonction de la résistance à 300 mg/l de kanamycine. Croisement Nombre de plantules Rapport Chi (femelle x male Vertesa Blanchesb testé carré Blanchesb Type sauvage 1.693 - - (auto-fé condé) NpT 17 (auto- 409 141 3:1 0:12 fécondé 1 Type sauvage x 586 552 1:1 1:02 NpT 17 NpT 17D(auto- 1.240 0 - fécondé) NpT 17D x type 5.339 O sauvage a) Résistance à la kanamycine. b) Sensible à la kanamycine. C. Production de graines hybrides. On simule une production de graines hybrides en utilisant une plante de type sauvage N-plumbagini- folia comme parent femelle et NpT 17D (homozygote du point de vue de la résistance à la kanamycine) comme parent mâle. On crée divers niveaux de lutte contre la contamination contre le pollen femelle en émasculant le parent femelle à différents stages du développement de la fleur. N. plumbaginifolia est cleistogame et les fleurs s'auto-pollinisent juste avant l'ouverture de la corolle et le développement-de la pigmentation de la corolle. On établit trois niveaux de lutte contre l'auto-fécondation du parent femelle. 1. On établit un niveau élevé de lutte en émasculant des boutons floraux de 2 à 3 cm de longueur, bien avant que du pollen se répande, 2. on établit un niveau de lutte relaxé en émasculant des fleurs de 4 à 5 cm de longueur, juste au moment o l'on atteint une longueur maximale de la corolle et alors que du pollen commence à se répandre, et 3. on établit un niveau de lutte faible en "émasculant" après le développement du pigment de la corolle et juste au moment o les fleurs s'ouvrent. Il se produit une auto-pollinisation considérable à ce stade. Quand on utilise NpT 17D pour polliniser des fleurs de plantes de type sauvage, à ces divers niveaux de lutte contre la pollinisation, on peut distinguer facilement des plantules hybrides vertes résistantes à la kanamycine de vraies premières générations, des plantules blanches sensibles à la kanamycine provenant de l'auto-pollinisation du parent femelle (tableau 4). Comme on pouvait s'y attendre, le pourcentage de plan- tules contaminantes augmente au fur et à mesure que l'on relâche la lutte contre l'auto-fécondation femelle. Cette expérience démontre le principe de l'élimination de graines non hybrides quand on craint une contamina- tion par du pollen provenant de l'auto-pollinisation du parent femelle, pendant la production de la graine hybride. La graine de NpKR B (exemple 1) et de NpT 17D (exemple 2) ont été déposées ou sont disponibles au Crop Germplasm Resource Centre, Crop Research Division DSIR, Private Bag, Christchurch, Nouvelle-Zélande. Elles sont disponibles sur requête auprès du Conservateur de la collection. Tableau 4: Utilisation de la résistance à la kanamycine pour éliminer de la graine provenant de l'auto-pollinisation du parent femelle chez Nicotiana plunmbaginifolia. Parent femelle = plantes de type sau- vage sensibles à la kanamycine avec divers niveaux d'auto-pollinisation. Parent mâle = NpT 17D (homo- zygote du point de vue de la résistance à la kanamycine)-. On sépare la descendance des plantules en fonction de la résistance à 300 mg/l de kanamycine. Lutte contr de % de graines % de graines Nombre de l'auto- hybrides auto- pollinisation aies vraies lère fécondées du paenta séparées -- du parenta spre génerationb contaminantesc Important 3.110 100 O Relâché 3.854 92 8 Faible 6.039 43 57 a Voir ci-dessus. b Plantules vertes survivantes, hétérozygotes vis-à-vis de la résistance à la kanamycine. c Plantules de couleur blanche, sensibles à la kanamycine. REVENDICATIONS 1. Procédé pour former une population de plan- tes hybridessensiblement pure, de première génération, qui consiste: (a) à planter des plantes parentes mâles et femelles sur des parcelles alternées; (b) à féconder les plantes femelles par du pollen provenant des plantes mâles; (c) à récolter de la graine fécondée, seule- ment des parcelles de plantes femelles; caractérisé en ce que: les plantes mâles parentes (RR) sont résistan- tes à un produit chimique phytotoxique, cette résistan- ce étant attribuable seulement à un gène marqueur homo- zygote nucléaire dominant,ce gène de résistance étant absent des plantes femelles parentes (rr); et le pro- cédé consiste en outre à: (d) administrer en quantités dosées, à la grai- ne récoltée (rr et Rr), le produit chimique phytotoxi- que pour obtenir des plantes hybrides pures de première génération (Rr). 2. Procédé suivant la revendication 1, caracté- risé en ce que les deux parents sont auto-fécondants. 3. Procédé suivant la revendication 1, caracté- risé en ce qu'un seul parent est auto-incompatible. 4. Procédé suivant l'une quelconque des revendi- cations précédentes, caractérisé en ce que le produit fini phytotoxique est un herbicide. 5. Procédé suivant l'une quelconque des reven- dications 1 à 3, caractérisé en ce que le produit phy- totoxique est un antibiotique. 6. Procédé suivant la revendication 5, caracté- risé en ce que l'antibiotique est la kanamycine. 7. Procédé pour former une population de plan- tes hybrides sensiblement pure, de première génération, dans laquelle les deux parents sont auto-incompatibles, qui consiste: (a) à planter des premières et des secondes plantes parentes sur des parcelles alternées ou en un mélange au hasard; (b) à féconder les premières plantes parentes par du pollen provenant de secondes plantes et à fécon- der les secondes plantes parentes par du pollen prove- nant des premières plantes parentes; (c) à récolter de la graine fécondée des premiè- res plantes parentes et des secondes plantes parentes; caractérisé en ce que: les premières plantes parentes (AAbb) sont ré- sistantes à un produit chimique phytotoxique A, les. secondes plantes parentes (aaBB) sont résistantes à un produit chimique phytotoxique B, cette résistance aux produits chimiques phytotoxiques A ou B pouvant être attribuée dans chaque plante uniquement à un gène marqueur homozygote dominant, les secondes plantes parentes (aaBB) n'ayant pas cette résistance génique au produit chimique A et les premières plantes paren- tes (AAbb) n'ayant pas cette résistance génique au produit chimique B; et le procédé consiste, en outre: (d) à administrer à la graine récoltée (Aabb, aaBb, AaBb), à la fois les produits chimiques phyto- toxiques A et B, pour produire des plantes hybrides pures de première génération (AaBb). 8. Procédé suivant la revendication 7, caracté- risé en ce que les produits phytotoxiques sont des herbicides. 9. Procédé suivant la revendication 7, caracté- risé en ce que les produits chimiques phytotoxiques sont des antibiotiques. 10. Procédé suivant la revendication 9, carac- térisé en ce que l'antibiotique est la kanamycine. 11. Procédé suivant l'une quelconque des reven- dications précédentes, caractérisé en ce qu'il consis- te à effectuer le stade (d) avant de planter la graine. 12. Procédé suivant l'une quelconque des reven- dications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer le stade (d) après l'émergence des plantules de la graine. 13. Procédé pour tester la pureté de popula- tion de plantes hybrides de première génération, qui consiste: (a) à planter sur des parcelles alternées des plantes mâles et femelles; (b) à féconder les plantes femelles par du pollen provenant des plantes mâles; (c) à récolter de la graine fertilisée seule- ment des parcelles de plantes femelles; (d) à planter, en tant qu'échantillon, une petite quantité de graines; caractérisé en ce que: les plantes mâles parentes (RR) sont résistan- tes à un produit chimique phytotoxique, cette résistan- ce étant attribuable uniquement à un gène marqueur homozygote nucléaire dominant, ce gène de résistance étant absent des plantes femelles parentes (rr); et le procédé consiste, en outre: (e) à administrer, de manière dosée, aux plan- tules (rr et rR), après émergence, le produit chimique phytotoxique; (f) à déterminer le pourcentages de platules (Rr) résistantes au produit chimique phytotoxique. 14. Procédé pour tester la pureté de popula- tion de plantes hybrides de première génération, dans laquelle les deux parents sont auto-incompatibles, qui consiste à: (a) planter des premières et secondes plantes parentes sur des parcelles alternées ou en un mélange au hasard; (b) à féconder les premières plantes parentes par du pollen provenant des secondes plantes et à fé- conder les secondes plantes parentes par du pollen provenant des premières plantes; (c) à récolter de la graine fécondée des pre- mières plantes parentes et des secondes -plantes pa- rentes; (d) à planter, à titre d'échantillon, une peti- te quantité de ces graines; caractérisé en ce que: les premières plantes parentes (AAbb) sont ré- sistantes à un produit chimique phytotoxique A, les secondes plantes parentes (aaBB) sont résistantes à un produit chimique phytotoxique B, la résistance au pro- duit chimique phytotoxique A ou B est attribuable dans chaque plante seulement à un gène marqueur homozygote dominant, les secondes plantes parentes (aaBB) n'ayant pas cette résistance génique au produit chimique A et les premières plantes parentes (AAbb) n'ayant pas cette résistance génique au produit chimique B; et en ce que le procédé consiste en outre: (e) à administrer de manière dosée aux plantu- les (Aabb, AaBb, aaBb) après émergence, les produits chimiques phytotoxiques A et B; et (f) à déterminer le pourcentage de plantules (AaBb) résistantes aux produits chimiques phytotoxiques A et B. 15. Procédé suivant l'une quelconque des reven- dications précédentes, caractérisé en ce que ledit gène mar- queur nucléaire est inséré par une technique de trans- formation de plantes. 16. Procédé suivant la revendication 15, carac- térisé en ce que la technique de transformation de plantes est une technique s'effectuant au moyen d'Agrobacterium. 17. Procédé suivant la revendication 15, carac- térisé en ce que la technique de transformation de plantes est une transformation par absorption directe de DNA. 18. Procédé suivant l'une quelconque des reven- dications 1 à 14, caractérisé en ce que le gène marqueur nucléaire est choisi dans une culture cellulaire soma- tique. 19. Procédé suivant l'une quelconque des reven- dications 1 à 14, caractérisé en ce que le gène marqueur nucléaire est choisi dans une fusion de protoplaste de transfert. 20. Procédé suivant l'une quelconque des reven- dications 1 à 14, caractérisé en ce que le gène marqueur nucléaire est choisi après avoir induit une mutagénèse végétale. 21. Procédé suivant-l'une quelconque des reven- dications 1 à 14, caractérisé en ce que le gène marqueur nucléaire est présent en sélectionnant une plante pa- rente ayant le gène souhaité.