FR 2612778 A1 19880930 FR 8704079 A 19870324 26 1 2778 La présente invention s'inscrit dans le domaine du traitement thérapeutique de la malaria hu- maine, notamment des formes tissulaires. Les 2,5 milliards de personnes vivant dans les zones endémiques o sévit la malaria rappellent l'échec des efforts développés jusqu'à ce jour pour contrôler cette maladie. 400 millions de personnes vi- vent dans des régions o aucune mesure prophylactique n'est appliquée. L'Organisation Mondiale de la Santé (O.M.S.) estime qu'un million d'enfants de moins de cinq ans meurent chaque année de la maladie, et ce, dans le seul continent africain. Il y a quatre espèces de Plasmodies respon- sables de la maladie chez l'homme. Ils présentent un cycle évolutif similaire impliquant un vecteur, un moustique femelle du genre Anopheles et un hôte, l'homme. Plasmodium falciparum (fièvre tertiaire ma- ligne) est le plus redoutable; il est responsable des complications mortelles de la malaria cérébrale et est une des premières causes de la mortalité infantile dans les régions endémiques. Plasmodium vivax et P. ovale (fièvre ter- tiaire bénigne) sont moins virulents, mais ils produisent des formes latentes dans les hépatocytes, les hypno- zoites. Ce sont ces formes qui sont responsables des rechutes classiques pouvant persister durant de longues périodes (deux à cinq ans) après une seule infection. P. malariae est moins répandu; il est responsable de maladies rénales chroniques telles que les néphrites et les syndromes néphrotiques mortels, et peut persister dans le sang pendant plusieurs années. Plus précisément, la présente invention con- cerne la mise au point de nouveaux médicaments actifs sur de la malaria humaine, notamment ses formes tissu- laires, à savoir de nouveaux dérivés d'aminoquinoléine, notamment de nouveaux dérivés de la primaquine dont la structure est la suivante: CH30" Formule I HN-CH-CH2 C H CH2 NH2 CH3 Dans la présente demande de brevet, on entend par aminoquinoléine un dérivé de quinoléine présentant au moins une fonction amine libre, particulièrement les 8- aminoquinoléines parmi lesquelles figurent la primaquine ú6-méthoxy-8-(4-amino-1'méthylbutylamino)- quinoléineJ, mais aussi d'autres 8-aminoquinoléines ayant une fonction amine primaire en fin de chaîne latérale tellesque le Quinocide [ 6-méthoxy-8-(4- aminopentylamino)-quinoléinejou le SN 3883 [ 6-méthoxy- 8-(4-aminobutylamino)-quinoléine]. Mais, il existe également d'autres dérivés de la primaquine, dont les modifications portent sur le noyau quinoléine (en position 2,4,2-4,5,4-5) et sur la chaîne latérale (4-amino1-alkylbutylamino) qui sont concernés par la présente invention. Dans les traitements classiques du paludisme les schizontocides tissulaires essentiellement repré- sentés par les 8-aminoquinoléines (primaquine, quino- cide) sont responsables de la prophylaxie causale, à savoir la prévention de l'infection sanguine par la destruction des formes tissulaires (exoérythrocytaires) primaires à P. falciparum et du traitement radical par l'élimination des formes tissulaires secondaires de P. vivax et P. ovale. La primaquine, une 6-méthoxy-8- (4-amino-1l'méthylbutylamino)-quinoléine de formule 1, introduite il y a plus de trente ans, est cliniquement efficace sur les formes tissulaires persistantes de P. vivax et P. ovale chez l'homme et est toujours un médicament de choix. Néanmoins, la toxicité de la primaquine limite son emploi à une application clinique contrôlée. L'effet toxique le plus sérieux est l'hémolyse, particulière- ment pour les individus présentant une déficience géné- tique érythrocytaire, par exemple en glucose-6-phosphate déshydrogénase. La méthaemoglobinurie, les troubles gastro-intestinaux ainsi que certains effets sur le sys- tème nerveux central sont également des effets toxiques significatifs de la primaquine et autres 8-amino-quino- léines. Le nombre de médicaments antimalariques possédant une activité thérapeutique prophylactique cau- sale ou curative radicale est extrêmement limité. La primaquine est le seul médicament pour le traitement curatif radical mais les effets toxiques secondaires en limitent sévèrement l'emploi thérapeutique. Il est à remarquer que seuls les composés appartenant aux familles des 8aminoquinoléines sont susceptibles de produire une guérison radicale. Le but de la présente invention est donc de proposer de nouveaux dérivés de quinoléine antimalarique, notamment de nouveaux dérivés de 8aminoquinoléines possédant un index thérapeutique plus favorable. Autrement dit, le but de la présente invention est da réduire la toxicité intrinsèque desdites quino- léines antimalariques telles que la primaquine et d'aug- menter leur activité, notamment pour la primaquine, sur les formes tissulaires hépatiques. Pour ce faire, la présente invention a pour objet de nouveaux dérivés d'aminoquinoléine antimalarique, notamment de nouveaux dérivés de la primaquine, dont la caractéristique essentielle est qu'ils sont représentés schématiquement par la formule PQ-X, dans laquelle - PQ représente une aminoquinoléine antimalarique, notamment la primaquine, - X représente un amino-acide ou un peptide de 2 à 4 amino-acides, - la liaison PQ-X étant une liaison covalente peptidique entre le groupement amine libre de PQ et le groupement carboxylique de X. La primaquine agit comme un oxydant et désta- bilise la membrane des globules rouges provoquant une hémolyse qui est à l'origine de sa toxicité principale. L'adjonction d'un amino-acide ou d'un peptide, conformément à la présente invention, réduit la péné- tration de la primaquine dans les globules rouges en raison de l'encombrement stérique. En outre, de manière tout à fait surprenante, l'activité de ces nouveaux dérivés est apparue, comme on le verra plus loin, beaucoup plus importante. D'un intérêt tout particulier sont les dérivés PQ-X dans lesquels X représente un amino-acide ou un dipeptide, notamment quand PQ est la primaquine ou une autre 8-aminoquinoléine antimalarique. Mais de préférence, les nouveaux dérivés PQ-X, selon la présente invention, sont tels que X repré- sente un amino-acide. Parmi ces amino-acides, on peut citer notamment la L-leucine, la Dleucine, la L-alanine, la D-alanine, la L-isoleucine, la L-phénylalanine, l'acide L-glutamique, la L-lysine, la L-tyrosine et la L-glutamine. Ainsi, pour la L-alanine ou la leucine avec la primaquine, on obtient des résultats particulièrement intéressants, notamment une activité anhimalarique pres- que quatre fois supérieure à celle de la primaquine base. La D-alanine est intéressante aussi en ce qu'on obtient avec elle une très faible toxicité. En effet, la liaison avec le produit D est moins réver- sible. Ainsi, les métabolites pénètrent en moins grande quantité dans les globules rouges. Parmi les peptides particulièrement inté- ressants, on peut citer des dipeptides L-alanyl-L- leucyl, L-leucyl-L-alanyl, mais aussi les tétrapeptides (L-alanyl-L-leucyl)2, (L-alanyl)3 L-leucyl, L-alanyl- L-leucyl-glycyl-L-leucyl, glycyl-L-leucyl-glycyl-L- leucyl. Le dérivé L-alanyl-L-leucyl-PQ(primaquine) présente une activité similaire au composé L-leucyl- PQ, c'est-à-dire qu'il est nettement plus actif et moins toxique que la primaquine. Le composé L-leucyl- L-alanyl-PQ est également nettement moins toxique que la primaquine. Bien sûr, ces exemples ne sont pas limita- tifs. Dans cette demande de brevet, on entendra par dérivés aminoacyles ou dérivés aminoacides d'amino- quinoléine le produit obtenu par greffage d'un ou plu- sieurs aminoacides sur ladite aminoquinoléine, corfor- mément à la présente invention. Il doit être bien entendu que le produit de base aminoquinoléine (PQ) peut être également substitué sans sortir du cadre de protection de la présente in- vention, pourvu qu'il comprenne une chaîne latérale aminée sur laquelle peuvent être greffés un ou plu- sieurs aminoacides (X), conformément à la présente in- vention. Les produits de base PQ ainsi que les pro- duits obtenus PQ-X peuvent se présenter sous forme de leurs sels d'addition avec des acides. La présente invention a également pour objet an procédé de préparation de ces nouveaux dérivés d'aminoquinoléine antimalarique, notamment des nouveaux dérivés de primaquine. Dans la caractéristique essentielle du pro- cédé selon la présente invention, on fait réagir par condensation un aminoacide ou un peptide sous forme acide, dont les fonctions amine sont protégées,avec l'aminoquinoléine ou un de ses sels portant donc une fonction amine libre en présence d'un agent de condensa- tion. Les groupements protecteurs des fonctions amine sont des groupements classiques, mais de préfé- rence on utilise le tertiobutyloxycarbonyle. La fonction acide de l'aminoacide ou du peptide peut aussi être activée par exemple sous forme d'ester avec le N-hydroxysuccinimide. En général, l'agent de condensation est un carbodiimide comme le dicyclohexylcarbodiimide. Selon un mode de réalisation particulier du procédé, on part d'un sel d'aminoquinoléine, par exemple du diphosphate de primaquine et de l'acide aminé ou peptide dont la fonction aminée est protégée par exemple par un groupe terbutyloxycarbonyla et on effectue les étapes suivants: 261Z778 2b1 2 7 7 8 a) on fait réagir de la N-hydroxysuccinimide ou tout autre groupe activant la fonction acide de l'acide aminé ou du peptide, sur le dérivé protégé de l'acide aminé ou peptide, par exemple sur le dérivé Nterbutyloxycarbonyle de l'acide aminé ou peptide, b) on fait réagir l'aminoquinoléine, telle que la pri- maquine, libérée à partir de son sel par exemple par une solution d'ammoniaque, on la fait réagir donc avec par exemple l'ester Nhydroxysuccinimide du dérivé protégé de l'acide aminé ou peptide, c) le produit brut ainsi obtenu est purifié par chro- matographie sur silicagel, d) le groupement protecteur, tel que le terbutyloxy- carbonyle du composé obtenu est ensuite clivé en présence d'acide, par exemple l'acide trifluoro- acétique pour donner le dérivé PQ-X sous forme de sel, par exemple trifluoroacétate. Ce groupement peut en effet être éliminé dans des conditions qui ne détruisent pas la liaison peptidique formée. Selon une autre caractéristique du procédé, le produit obtenu à l'étape d) est purifié par chro- matographie sur support phase inverse. Cette purification présente un intérêt in- dustriel avec la possibilité de mise en série de co- lonnes. Plus précisément, on utilise par exemple comme éluant un mélange d'acétonitrile dans l'eau contenant de l'acide, par exemple trifluoroacétique. Selon une autre caractéristique particu- lière du procédé, le contre anion trifluoroacétate est échangé en chlorhydrate. Dans le but d'inhiber les réactions d'oxydation, une autre caractéristique particulière du procédé prévoit que la solution aqueuse contenant le sel de chlorhydrate de dérivés selon la présente invention est traitée par du bisulfite de sodium. La présente invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques contenant à titre de principe actif les nouveaux dérivés selon la présente invention ou leurs sels pharmaceutiquement acceptables. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lumière des exemples qui vont suivre. Exemples I à VII: SYNTHESE DES DERIVES AMINOACYLES DE LA PRIMAQUINE. Les dérivés aminoacyles de la primaquine sont obtenus en deux étapes au départ de la primaquine diphos- phate et de l'acide aminé dont la fonction aminée est protégée par un groupe N-terbutyloxycarbonyle (N-TBoc). La première étape comprend la réaction de la primaquine base avec l'ester N-hydroxysuccinimide du dérivé N-TBoc de l'acide aminé. Le produit brut ainsi obtenu est alors purifié par chromatographie sur silicagel. On isole avec de bons rendements (+ 70 %) du produit obtenu sous forme d'un solide + cristallin assez hygroscopique. Le groupe TBoc est ensuite clivé en présence d'acide trifluoroacétique. Le dérivé aminoacyle de la primaquine est obtenu sous forme trifluoroacétate (pro- bablement un sel ditrifluoroacétate). Dans le cas o une purification ultérieure est nécessaire, on effectue une colonne de chromatogra- phie à phase inverse et le produit est élué par le mé- lange acétonitrile/H20. Le dérivé aminoacyle de la primaquine sous sa forme base libre peut être obtenu en neutralisant la solution aqueuse contenant le sel de trifluoroacétate d'aminoacyle-Pq par NH4OH jusqu'à pH + 8 suivi d'une extraction vigoureuse par le dichlorométhane. -On obtient, après évaporation du CH2Cl2, une huile verdâtre très difficilement manipulable qui peut être purifiée ulté- rieurement par chromatographie sur colonne de silicagel élué avec un mélange CH2Cl2 - EtOH - NH40H (120-20-1). Dans la méthode de purification des dérivés aminoacyles de la primaquine sous leur forme trifluoro- acétate utilisant la technique de chromatographie sur colonne phase inverse, la colonne utilisée est une co- lonne Merck lobar 8. Le support est une silice greffée par des résidus en C8. Afin d'éviter un processus d'oxydation des dérivés sur la colonne, les solvants d'élution sont soigneusement dégazés. Pour la même raison, on peut envisager d'autres types de silice greffée comme phase stationnaire, notamment complètement déminéra- lisés. Le produit brut dissous en milieu acide aqueux est adsorbé en tête de colonne; on procède ensuite à une étape de désalage (H20-H +) avant d'éluer le produit en utilisant un gradient de CH3CN dans H2O/H+. L'éluant est fractionné. Les fractions contenant le produit (fractions colorées jaune orange) sont analysées par HPLC. Celles contenant le produit avec une pureté supé- rieure à 98 % sont rassemblées et lyophilisées. On obtient une poudre jaune orange vive. Le contre anion trifluoroacétate est alors échangé en chlorhydrate en additionnant à une solution aqueuse du sel de trifluo- roacétate une quantité d'HCl aqueuse correspondant approximativement à deux équivalents d'acide calculé par rapport au poids de sel de trifluoroacétate à échan- ger. La solution obtenue (pH 2,8-3) est lyophilisée à l'abri de la lumière (2 lyophilisations). Le produit obtenu se présente sous forme d'une poudre orange vive très hygroscopique. Même stocké sous atmosphère inerte (argon), le produit se dégrade assez rapidement au cours du temps. Il présente également une stabilité limitée en solution: milieu physiologique ou solution aqueuse à 0 et à l'abri dé la lumière. Le noyau quinoléique est une cible particulière- ment sensible pour toute réaction d'oxydation. Celle-ci explique partiellement l'instabilité observée. Dans le but d'inhiber ces réactions d'oxydation, nous avons traité la solution aqueuse contenant le sel de trifluoroacétate par du bisulfite de sodium (0,1 %). La proportion relative CH3CN-H20/H varie sui- vant la nature et le nombre d'acides aminés greffés sur la primaquine. Exemple I: Synthèse de la N-1-L-alanyl, N-4-(méthoxy-6- quinolinyl-8) pentadiamine-1,4. A 1 g (5,9 mmoles) de N-tBoc-alanine, dissous dans 10 ml de diglyme, maintenu à 0 C, on ajoute 0,61 g (5,3 mmoles) de la N-hydroxysuccinimide et 1,09 g (5,3 mmoles) de dicyclohexylcarbodiimide. Après 4 heures de réaction, on ajoute 1,37 g (5,3 mmoles) de primaquine base. Cette dernière est libérée de la primaquine diphos- phate par l'action d'une solution d'ammoniaque 25 %. Après 17 heures, la dicyclohexylurée est filtrée et le solvant chassé sous vide. L'huile brune obtenue est dissoute dans le CH2Cl2 et lavée à l'eau. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium, filtrée et évaporée. Le produit est purifié sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange dichlorométhane-méthanol. Les fractions pures sont rassemblées et l'éluant évaporé conduisant à 1,5 g (66 %) d'un produit plus ou moins cristallin, assez hygroscopique. RMN: (CDCl3 - TMS): 1.2 - 1.7 (m, 19 H); 3.3 (m, 2 h); 3.64 (m, 1 H); 3.9 (s, 3 H); 4.07 (m, I EH); 5 (m, 1 H); 6 (m, i H); 6.2 (m, 1 H); 5.26 (d, 1 H); 6.33 (D, 1 H); 7.3 (dd, 1 H); 7.9 (dd, 1 H); 8.5 (dd, 1 H). Le composé obtenu précédemment est dissous dans 15 ml d'un mélange 1:1 de dichlorométhane et d'acide trifluoroacétique. Le mélange est agité 30 minutes à température ambiante. Les solvants sont évaporés sous vide et le résidu est repris dans de l'eau et lavé plu- sieurs fois au diisopropyléther. Si nécessaire, le produit est purifié par chromatographie sur phase inverse (Merck lobar 8) en utilisant comme éluant un mélange de 25 % d'acétonitrile dans de l'eau contenant 1 % d'acide trifluoroacétique. Les fractions pures (HPLC) sont rassemblées, l'acétoni- trile chassé sous vide. Après 2 cycles de lyophilisation, on obtient 1,6 g (80 %) d'une poudre orange vive hygros- copique. RMN: (D20-ref externe): 1.65 - 1.50 (m, 6 H);1.88 (m, 4 H); 3.45 (m, 2 H); (m, 1 H); 4.17 (m, 4 h); 7.08 (s, 1 H); 7.13 (d, 1 H); 7.93 (dd, 1 H);8.65 (d, 1 H); 8.88 (à, 1 H). Exemple II: Synthèse de la N-1-D-alanyl, N-4-(méLhoxy-6- quinolinyl-8)pentadiamine- 1,4. En suivant le même mode opératoire que celui décrit à l'exemple I, on isole le composé du titre au départ de la primaquine et de N-tBoc-Dalanine et après déprotection de la fonction amine à l'aide de l'acide trifluoroacétique (52 %). RMN: (cD30H - ref ext.) 1.40 (d, 3H); 1,54 (dd, 3H); 1.80 (m, 4H); 3.80 (m, 1H); 3,94 (q, 1H); 4 (s, 3H); 6.6 (s, 2H); 7,35 (dd, 1H); 8,37 (m, 1H) ; 8.68 (dd, 1H). Exemple III: Synthèse de la N-1-L-leucyl, N-4-(méthoxy- 6-quinolinyl-8)pentadiamine- 1,4. En suivant le même mode opératoire que celui décrit à l'exemple I, on isole le composé du titre au départ de la primaquine et de N-tBoc-Lleucine et après déprotection de la fonction amine à l'aide de l'acide trifluoroacétique (70 %). RMN: (H20 - ref externe): U.71 - 0.81 (rC, 6 Hj; 1.28 (d, 3 H); 1.4 - 1.7 (m, 7 H); 3 - 3.2 (m, 1 H); 3.26 - 3.5 (m, 1 H); 3.6 - 4 (m, 5 H); 6.8 - 6.9 (m, 2 H); 7.65 - 7.72 (m, 1 E); 8.52 (d, 1 H); 8.63 (d, 1 H). Exemple IV: Synthèse de la N-1-D-leucyl, N-4-(méthoxy-6- quinolinyl-8) pentadiamine- 1,4. En suivant le même mode opératoire que celui décrit à l'exemple I, on isole le composé du titre au départ de la primaquine et de N-tBoc-Dleucine et après déprotection de la fonction amine à l'aide de l'acide trifluoroacétique (78 %). RMN: (cD3OD - ref ext.): 1.05 (m, 6H); 1.4 (d, 3H); 1.77 (m, 6H); 3.36 (m, 2H); 3.7 (m, 2H); 4 (s, 3H); 6,66 (s, 2H); 7,67 (dd, 1H); 8.46 (ddd, 1H); 8.72 (dd, 1H). Exemple V: Synthèse de la N-1-L-phénylalanine, N-4(methoxy- 6-quinolinyl-8) pentadiamine- 1,4. i"n suivant le même mode opératoire que celui décrit à l'exemple I, on isole le composé du titre au départ de la primaquine et de N-tBoc-Lphénylalanine et après déprotection de la fonction amine à l'aide de l'acide trifluoroacétique (79 %). RMN: (cD3OD - ref ext.): 1.35 (dd, 3H); 1.62 (m, 4H); 3.16 (m, 2H); 3.40 (m, 2H); 3.71 (m, 1H); 3.92 (d, 3H); 4.03 (dt, 1H); 6.38 (m, 1H); 6.53 (m, 1H); 7.32 (m, 5H); 7.46 (dd, 1H); 8.13 (m, 1H); 8.59 (dd, 1H). Exemple VI: Synthèse de la N-1-L-lysyl, N-4-(méthoxy- 6-quinolinyl-8 pentadiamine- 1,4. En suivant le même mode opératoire que celui décrit à l'exemple I, on isole le composé du titre au départ de la primaquine et de N-tBoc-Llysine et après déprotection de la fonction amine à l'aide de l'acide trifluoroacétique. Exemple VII: Synthèse de la N-1-L-glutamyl, N-4- (méthoxy-6-quinolinyl-8) pentadiamine- 1,4. En suivant le même mode opératoire que celui décrit à l'exemple I, on isole le composé du titre au départ de la primaquine et de l'acide N-tBoc glutamique et après déprotection de la fonction amine à l'aide de l'acide trifluoroacétique. Exemples VIII à XII: MODELES THERAPEUTIQUES Le modèle de la malaria du rongeur, Plasmodium berghei-Anopheles stephensi-souris, mis au point par MOST, H., HERMAN, R. & SCHOENFELD, C. (1967) Am. J. Trop. Med. Hyg. 16, 572-575, permet de déterminer l'activité prophylactique causale (schizontocide tissulaire) de nouveaux composés thérapeutiques. La procédure utilisée est dérivée de celle de MOST, H. & MONTUORI, W.A. (1975) Am. J. Trop. Med. Hyg. 24, 179-182. Il s'agit du sys- tème P. berghei berghei (ANKA)- Anopheles stephensi- souris Swiss OF1. La souche ANKA de P. b. berghei est entretenue cycliquement sur Anopheles stephensi. La souche de souris Swiss OF1 est particulièrement sensible à P. b. berghei qui produit une infection toujours mor- telle. Exemple VIII:Isolement des sporozoites des moustiques et infection expérimentale Les moustiques femelles (80 à 100 individus par préparation) sont débarassés de leurs pattes, ailes et abdomien, puis homogénéisés à 4 C à l'aide d'un potter en verre, dans du milieu M 199 (GIBCO) contenant 10 % de sérum foetal de veau. La suspension de sporozoltes est ensuite purifiée des débris du moustique par deux centrifugations successives ( 2min. à 50 g et 5 min. * à 200 g) et le surnageant recueilli est conservé à 4 C. Après comptage dans une chambre de Petroff-Hausser, le nombre de parasites est ajusté par dilution avec le même milieu froid, à la densité de 2 x 10 sporozoites/ ml. L'ensemble de la procédure est toujours effectuée dans un maximum de 35 minutes et permet de préserver la viabilité et l'infectivité des sporozoites. Un volume de 0,5 ml de la suspension contenant sporozoites est injectée i. v. aux souris Swiss OF1 femelles de 18 à 22 g utilisées pour les tests théra- peutiques. Exemple IX: Traitements chimiothérapeutiques Des groupes de 20 à 25 souris infectées comme décrit ci-dessus sont traités en une seule injection intraveineuse de primaquine diphosphate (Pq) ou des déri- vés monoacyls et aminoaciaes de la primaquine sous formes aicnlorny- drates (X-Pq) trois heures après l'inoculation des spo- rozoites. Le volume injecté est ajusté en fonction du poids de la souris, à raison de 0,5 ml pour un poids de g. Les composés sont dilués dans du tampon phosphate salin (PBS) pH 7.0 et le pH est ajusté à 7.0. Les souris infectées mais non traitées (5 par groupe) reçoivent le tampon seul et servent à contrôler l'infectivité des sporozoites. Exemple X:Paramètres utilisés pour évaluer l'efficacité de la primaquine Les souris expérimentales sont gardées durant une période de 50 jours. Le développement de la para- sitémie est suivi en examinant quotidiennement des frottis de sang, colorés 60 min. au Giemsa à 5 % dans du tampon Sbrensen à pH 7,2, à partir du 5ème jour et ce jusqu'au 15ème jour. Le nombre d'animaux infectés peut ainsi être déterminé. Ces résultats permettent d'établir la survie à long terme (LTS, le nombre de souris survivantes non para- sitées sur le nombre de souris infectées et traitées). L'activité prophylactique causale (CPD50) est obtenue par l'analyse des logits de la réponse (exprimée en % de LTS) en fonction de la dose (mg Pq/kg). L'effet résiduel éventuel des médicaments sur les premières formes érythrocytaires (effet schizontocide érythrocytaire) est déterminé par la méthode de GREGORY, K.G. & PETERS, W. (1970) Ann. Trop. Med. Parasitol. 64, 15-24, basée sur le test des 2 % de Warhurst. Exemple XI: Etude de la toxicité des composés La toxicité aiguë en fonction de la dose unique administrée est déterminée sur des souris de 18 à 22 g. Une série de dilutions de chaque composé est injectée par voie intraveineuse à des groupes de 10 souris. La dose léthale pour 50 % des souris non infectées (LD50) est déterminée par régression linéaire des logitsdu pourcentage des animaux survivants, en fonction du logarithme de la dose injectée (en mg Pq diphosphate équivalent/kg) (Logit Weighted Transfor- mation; BERKSON, J. (1953) J. Am. Stat. Assoc. 48, 565-599. Exemple XII: Activité thérapeutique et toxicologique in vivo de la primaquine et de ses dérivés aminoacides Les animaux infectés à l'aide de sporozoites de P. berghei sont traités trois heures après avec une seule injection des composés par voie intraveineuse. Ce test permet de définir l'activité prophylactique causale des composés ou la dose permettant de guérir 50 % des animaux infectés (CPD50). La dose est toujours exprimée en mg de Pq diphosphate par kg. Les résultats de l'activité prophylactique causale (+ trois heures) de la primaquine et de trois dérivés aminoacyl de la primaquine (L-leucyl, Dleucyl et L-alanyl-primaquine) sont présentés au tableau I. Pour la primaquine, la dose effective minimale (EM) est de 11.5 mg Pq/kg. L'efficacité prophylactique causale (CPD50) de la Pq est de 18,5 mg Pq/kg. Du fait de la toxicité de la Pq dès 25 mg/kg, il n'est pas possible d'obtenir un traitement curatif. L'activité thérapeutique obtenue à 25 mg/kg est de 75 %. Les résultats relatifs à la toxicité de la Pq sont également au tableau I. La dose maximale tolérée (MTD) est de 24 mg Pq/kg et la dose léthale 50 % (LD50) est de 39 mg Pq/kg. L'index thérapeutique de la Pq, repré- sentant le rapport de la LD50 et du CPD50, est de 2.0. Le premier dérivé, la L-leucyl-Pq, se montre quant à lui plus actif que la Pq. La dose maximale effective et le CPD50 sont respectivement de 7,9 mg Pq/kg et de 11,7 Pq/kg. A la dose de 20 mg Pq/kg, un traitement curatif total (100 %) est obtenu. Le dérivé est moins toxique que la Pq avec une MTD et une LD50 respectivement de 36 mg Pq/kg et mg Pq/kg. L'index thérapeutique est de ce fait favo- rable à la L-leucyl-Pq avec une valeur de 3,8. Le second dérivé, la D-leucyl-Pq montre une activité similaire à celle de la Pq. La dose minimale effective est de 12,2 mg Pq/kg. La CPD50 de ce dérivé est de 18,4 mg Pq/kg. Du fait de sa moindre toxicité, ce dérivé est totalement curatif à la dose de 30 mg Pq/kg. La D-leucyl-Pq est moins toxique que la Pq avec une MTD de 29 mg Pq/kg et une LD50 de 40,5 mg Pq/kg. Le troisième dérivé, la L-alanyl-Pq, possède une activité thérapeutique nettement plus grande que la Pq et ses dérivés leu-Pq. La dose minimale effective est de 4 mg Pq/kg tandis que le CPD50 est de 5,6 mg Pq/kg. La dose de 7,5 mg Pq/kg est totalement curative. L'index thérapeutique de la L-alanyl-Pq est de 8,5 (4,3 fois supérieur à celui de la Pq). Le tableau I résume les résultats obtenus sur la toxicité (MTD et LD50) etl'activité thérapeutique causale (CPD50 et TI) de la Pq et des trois dérivés aminoacyl. Il apparaît clairement de ces résultats que l'addition d'un acide aminé sur la chaîne latérale de la primaquine par l'intermédiaire d'un lien peptidique per- met d'une part de réduire la toxicité aiguë de la primaquine (meilleur effet pour la L-leucyl-Pq) et d'autre part d'accroître son activité thérapeutique. Les deux effets combinés permettent une augmentation appré- ciable de l'index thérapeutique particulièrement dans le cas du dérivé L-alanyl-Pq. Tableau I: Toxicité et activité comparéesde la Prima- quine et de ses dérivés aminoacides. Dérivés b d inques a MTD LD50 CPD50 TI iniques a Pq 24,6 38,6 18,5 2,0 Lleu- Pq 36,1 44,9 11,7 3,8 D-leu - P 28,8 40,5 18,4 2,2 L-ala- Pq 34,1 47, 5 5,6 8,5 a: les dérivés sont administrés par voie i.v. trois heures après l'inoculation des sporozoites. Les concentra- tions sont toujours exprimées en mg Pq diphosphate/kg. b: la dose maximale tolérée est définie comme la dose la plus élevée induisant une perte de poids inférieure ou égale à 5 % du poids initial pendant une période de cinq jours suivant l'injection i.v. c c: dose léthale tuant 50 % des souris en une seule injection i.v. d d: dose prophylactique causale permettant de guérir % des souris injectées. e: index thérapeutique défini par le rapport LD50/CPD50. L'activité prophylactique causale de deux dérivés peptidiques de la primaquine, la L-alanyl-L- leucyl-Pq et la L-leucyl-L-alanyl-Pq, a été également déterminée. Pour la L-alanyl-L-leucyl-Pq, la dose effective minimale est de 6,5 mg Pq/kg. Le CPD50 est de 13,5 mg Pq/kg et à la dose de 27 mg Pq/kg, le dérivé se montre totalement curatif. Ce dérivé est nettement plus actif et moins toxique que la Pq; il présente une activité similaire au composé L-leucyl-Pq dont il dérive. Le second dérivé montre une activité similaire à celle de la Pq avec un CPDso de 19 mg Pq/kg. Toutefois, la dose minimale effective est inférieure à celle de la Pq (5 mg Pq/kg contre 11,5 mg Pq/kg) et la dose de 22 mg Pq/kg est totalement curative. Il est également moins toxique que la primaquine. REVENDICATIONS 1. Nouveaux dérivés de quinoléine contenant une fonction amine libre et ayant des propriétés anti- malariques, notamment nouveaux dérivés de la primaquine ou leurs sels d'addition avec des acides, caractérisés en ce qu'ils sont représentés schématiquement par la formule: PQ - X dans laquelle, - PQ représente des quinoléines contenant une fonction amine libre et ayant des propriétés antimalariques, notamment la primaquine, - X représente un amino-acide ou un peptide de 2 à 4 aminoacides, - la liaison PQ-X étant une liaison covalente peptidique entre le groupement amine libre de PQ et le groupe- ment carboxylique de X. 2. Nouveaux dérivés selon la revendication 1, caractérisés en ce que PQ est choisi parmi la primaquine et les autres 8-amino- quinoléines antimalariques et X est choisi parmi un amino-acide ou un dipeptide. 3. Nouveaux dérivés selon l'une des revendi- cations précédentes, caractérisés en ce que X représente un amino-acide choisi notamment parmi la L-leucine, la D-leucine, la L-alanine, la Dalanine, la L-isoleucine, la L-phénylalanine, l'acide L-glutamique, la Llysine, la L-tyrosine et la L-glutamine. 261?78 4. Nouveaux dérivés selon l'une des reven- dications précédentes, caractérisés en ce que X repré- sente un dipeptide choisi notamment parmi les di- peptides L-alanyl-L-leucyl, L-leucyl-L-alanyl, mais aussi les tétrapeptides (L-alanyl-L-leucyl)2, (L- alanyl) 3 L-leucyl, L-alanyl-Lleucyl-glycyl-L-leucyl, glycyl-L-leucyl-glycyl-L-leucyl. 5. Nouveaux dérivés selon l'une des reven- dications précédentes, caractérisés en ce que PQ est la primaquine et X est choisi par les L-alanine, L-leucine et D-leucine, la L-alanyl Lleucyl, la L-leucyl-L-alanyl. 6. Procédé de préparation des nouveaux déri- vés selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on fait réagir par condensation X, dont les fonctions amine sont éventuellement pro- tégées avec PQ ou un de ses sels,portant sa fonction amine libre en présence d'un agent de condensation pour former la liaison peptidique PQ-X. 7. Procédé selon la revendication 6, carac- térisé en ce que le groupement protecteur des fonctions amine est un groupement classique et, de préférence, on utilise le tertiobutyloxycarbonyle. 8. Procédé selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que la fonction acide de l'aminoacide ou du peptide est activée sous forme d'ester avec le Ni-hydroxysuccinimide. 9. Procédé selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce qu'on part d'un sel d'amino- quinoléine (PQ), de préférence du diphosphate de prima- quine, et de l'acide aminé ou peptide (X), dont la fonction aminée est protégée par exemple par un groupe terbutyloxycarbonyle, et on effectue les étapes sui- vantes: a) on fait réagir de la N-hydroxysuccinimide ou tout autre groupe activant la fonction acide de X sur le dérivé protégé de X, par exemple sur le dérivé N-terbutyloxycarbonyle de X. b) on fait réagir PQ libérée à partir de son sel, par exemple par une solution d'ammoniaque, on l'a fait réagir par exemple avec l'ester N-hydroxysuccinimide du dérivé protégé de X, c) le produit brut ainsi obtenu est purifié par chroma- tographie sur silicagel, d) le groupement protecteur, tel que le terbutyloxy- carbonyle du composé obtenu, est ensuite clivé en présence d'acide, notamment l'acide trifluoroacétique pour donner le dérivé PQ-X sous forme de sel, notamment trifluoroacétate. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le produit obtenu après l'étape d) est purifié par chromatographie en phase inverse3. 11. Procédé selon la revendication10, caractérisé en ce qu'on utilise comme éluant en mélange d'acétonitrile dans l'eau contenant de l'acide par exemple trifluoroacétique. 12. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que le contre anion trifluoro- acétate est échangé en chlorhydrate. 13. Procédé selon la revendication précé- dente, caractérisé en ce que le sel chlorhydrate est traité par du bisulfite de sodium. 14. Composition pharmaceutique contenant à titre de principe actif les nouveaux dérivés selon l'une des revendications précédentes ou leurs sels pharmaceutiquement acceptables.