FR 2619012 A1 19890210 FR 8711337 A 19870807 VACCINS DONT L'EPITOPE CARACTERISTIOUE EST INCORPORE DANS UNE PROTEINE DE PICORNAVIRUS, NOTAMMENT DE POLIOVIRUS. Le poliovirus, connu comme étant l'agent d'une maladie infectieuse humaine, la poliomyélite ou maladie de Heine-Madin, a été étudié comme prototype des virus de la famille des picornaviridae. Depuis quelques années, l'essor du génie génétique a contribué à une meilleure connaissance de ce virus et a permis le clonage molécu- laire de l'ARN viral en cADN et la détermination nucléo- tidique de son génome (Kitamura et al.1981; Racaniello et Baltimore, 1981, van der Werf et al., 1981). En outre, la possibilité d'induire un cycle infectieux dans les cellules de primates, à partir de plasmide porteur d'une copie complète du génome viral, a contribué à l'élabora- tion d'autres vecteurs dont l'infectivité spécifique a pu être augmentée (Semler et al., 1984, Kean et al., 1986). L'étude des autres picornavirus progresse rapidement aussi. On rappellera qu'à cette classe de virus se rattachent les entérovirus, dont les poliovirus de types 1, 2 et 3 constituent une sous-classe. Ils englobent aussi les cocksackievirus et les echovirus, les rhinovirus, les cardiovirus, les aphtovirus et le virus de l'hépatite virale A. Les génomes des picornavirus sont des ARNs dont la taille est en général de l'ordre de 7500 nucléotides. Les travaux de Hogle et al.,(1985) joints à ceux de Rossmann (1985) montrent qu'il existe trois sites majeurs de neutralisation chez les picornavirus: NImI sur VP1, NImII sur VP2 et VP1 et NImIII sur VP3 et VP2 (NIm étant une abréviation de l'expression anglaise "neutra- lization antigen", donc en français: "antigène de neutralisation"). Chez le poliovirus de type 1, on a mis en évidence un site NImI (acide aminés 93-104, Wychowski et al., 1983) dont l'épitope C3 est séquentiel, et des sites NImII et NImIII qui déterminent des sites confor- mationnels à la surface du virion. Pour ce qui est de la localisation et de l'iden- tification d'autres épitopes immunogènes, on peut encore, pour les poliovirus, se reporter aux travaux de E.A.Emini, A.Jameson, A.J.Lewis, G. R.Larsen, E.A.Wimmer, J.Virol.43.997(1982); R.Crainic et al., Infect. Immun. 41.1217(1983); P.Minor et al., Nature (London) 301.674 (1983); P. Minor et al. J.Gen. Virol. 65.1159 (1985); M.Fergusson et al., Virology 143.505 (1985); D.C.Diamond et al.Science 229.1090 (1985); D.M.A. Evans et al., Nature (London) vol. 304,459-462. De même, on peut se reporter, par exemple, aux articles de Rossmann M.A. et al., (1985);Sherry B et al., J. Virol 57, 246-257 (1986)DUECHLER et al.Proc.Natl. Acad.Sci. USA, vol.84, pp.2605-2609 (1987) pour ce qui est des études menées pour localiser et identifier des épi- topes neutralisants portés par les rhinovirus. Si la plupart des épitopes immunogènes identifiés à ce jour sont portés par les capsides des virus con- cernés, à la surface de ces capsides, il en est d'autres qui se sont révélés comme susceptibles d'induire des réponses neutralisantes significatives, par exemple chez le rat et le lapin sans être à la surface. Le peptide correspondant à la séquence de résidus d'aminoacides 113-121 de VP1, dont une partie seulement est exposée (B.A. Jameson et al, dans l'ouvrage intitulé "vaccines" (vaccins) de R.Lerner et al, Eds. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbopr N.Y. 1985) pp. 191198), ou des peptides internes aux virus, par exemple ceux correspondant aux séquences de résidus d'aminoacides 61-80 et 180-201 du poliovirus ont ainsi induit des anticorps aux propriétés neutralisantes importantes. L'invention repose sur l'idée d'utiliser un picornavirus susceptible de se répliquer dans les cellules de l'hôte à vacciner contre un agent pathogène déterminé, comme vecteur porteur d'un épitope, hétérologue vis- à-vis de ce picornavirus, immunogène susceptible d'induire chez l'hôte la production d'anticorps neutralisants contre cet agent pathogène, ledit épitope étant incorporé à une protéine du picornavirus, en lieu et place d'un épitope immunogène, neutralisant à l'égard de ce picornavirus. Des picornavirus préférés utilisables en tant que vecteurs sont les poliovirus les aptovirus et les rhino- virus. En d'autres termes l'invention concerne par con- séquent un picornavirus hybride viable contenant un épitope caractéristique d'une protéine vaccinante, hété- rologue vis-à-vis des protéines de ce picornavirus en lieu et place de l'un de ses propres épitopes immunogènes. De préférence, l'épitope hétérologue est exposé à la-surface de la capside du picornavirus. En particulier, l'épitope est alors substitué à un épitope endogène immunogène du picornavirus, normalement exposé à la surface de celui-ci. D'une façon générale il peut être dit aussi que l'épitope hétérologue se trouve incorporé par construction dans la protéine porteuse qui initialement contenait l'épitope endogène, immunogène de ce picornavirus. De préférence on l'a vu, l'épitope hétérologue est exposé à la surface de la capside. Néanmoins, l'invention ne saurait être limitée à ce type d'exposition. Elle concerne tout autant les picornavirus dans lesquels l'épitope hété- rologue serait substitué à un épitope immunogène naturel interne, dont l'activité est néanmoins susceptible de se manifester in vivo. Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'in- vention, le picornavirus vecteur de la capside du polio- virus est un poliovirus du type 1 dans lequel l'épitope hétérologue est substitué à l'épitope C3 normalement ex- posé à la surface de la capside du poliovirus. L'invention concerne également les produits inter- médiaires intervenant dans la construction des picornavi- rus hybrides viables, plus particulièrement les cADNs hy- brides recombinants comprenant la totalité ou tout au moins les parties de cADNs de picornavirus nécessaires à la production d'un virus viable dans une culture de cellules compétentes dans lesquelles le picornavirus non transformé est cultivable, d'une part, et une séquence de nucléotides hétérologue, le cas échéant synthétique, codant pour un épitope distinct, substituée dans ce cADN à une séquence d'ADN endogène ou naturelle codant pour une séquence d'acides aminés immunogène, d'autre part. De préférence la séquence hétérologue est substituée à une séquence endogène qui, dans le picornavirus non modifié et compte tenu de la nature des séquences environnantes, codait pour une séquence d'aminoacides exposée à la surface de la capside de ce picornavirus. Elle concerne plus particulièrement des plasmides recombinants dans lesquels les cADNs hybrides susmen- i5 tionnés ont été incorporés par construction, sous le contrôle d'un promoteur et d'éléments de régulation au- torisant la replication autonome des picornavirus recom- binants correspondants dans des organismes procaryotes ou eucaryotes utilisables pour la production de quantités importantes de picornavirus. A ce titre, l'invention concerne plus particuliè- rement des plasmides porteurs de cADNs recombinants dérivés des cADNs de poliovirus, aphtovirus ou rhinovirus modifiés dans les conditions précédemment indiquées, par un polynucléotide codant pour un épitope immunogène hétérologue, en particulier des plasmides utilisables pour la transformation d'organismes cellulaires procaryotes ou eucaryotes et permettant la réplication autonome et la production du poliovirus, aphtovirus ou rhinovirus modifié correspondant. L'invention concerne aussi des ARNs recombinants contenant la totalité de l'ARN messager du picornavirus correspondant y incluses les séquences codant pour les protéines VPO, VP3 et VP1, et comprenant la substitution correspondante à celle du cADN correspondant. Cet ARN messager peut être obtenu soit in vitro, soit en cultures de cellules préalablement transformées, à partir d'un vecteur contenant le cADN du picornavirus correspondant, sous le contrôle d'un promoteur et d'éléments de régulation appropriés. Il est tout à fait remarquable que les modifi- cations ainsi introduites dans des protéines virales, plus particulièrement dans celles qui présentent normalement des épitopes immunogènes normalement exposés à la surface des capsides des picornavirus, notamment des poliovirus, peuvent être réalisées sans nuire à leur viabilité. L'invention fournit par conséquent des principes actifs utilisables pour la constitution de "vaccins vivants" ou inactivés à partir d'épitopes caractéristiques codés par des oligonucléotides qui peuvent avoir été produits par synthèse. Ces vaccins peuvent naturellement aussi être produits à partir d'une séquence naturelle de nucléotides, obtenue par clivage à partir de l'ADN naturel ou d'un cADN dérivé de l'ARN naturel codant pour la protéine qui con- tient normalement la séquence d'aminoacides de l'épitope. L'invention concerne également les vaccins eux- mêmes obtenus à partir des virus sus-indiqués notamment par inactivation de leur virulence par des méthodes classiques ou des vaccins vivants de virulence atténuée. On observera que les méthodes applicables à l'inactivation du poliovirus pour la constitution de vaccins contre la poliomyélite sont applicables de la même manière; on rappellera pour mémoire et à titre d'exemple seulement, les traitements thermiques par exemple entre 50 et 60'C, les traitements par des agents chimiques tels que formol ou autres aldéhydes appropriés qui peuvent être utilisés pour obtenir ces vaccins inactivés. L'intérêt majeur du vaccin selon l'invention réside dans la possibilité de mettre en jeu les caracté- ristiques parfaitement maîtrisées ou maitrisables de picornavirus, plus particulièrement des poliovirus, et des vaccins contre ces picornavirus, notamment des vaccins contre la poliomyélite pour la fabrication d'autres vaccins. En outre, les épitopes hétérologues des nouveaux vaccins se trouvent présentés à l'organisme de l'hôte vacciné sous une structure tridimensionnelle apparentée à la forme immunogène naturelle des poliovirus. L'invention concerne enfin un procédé pour la production des picornavirus hybrides sus-définis, ce procédé étant caractérisé en ce que, partant d'un cADN obtenu à partir de l'ARN viral, et après avoir au préala- ble localisé un épitope immunogène naturel du picornavirus correspondant, on introduit de part et d'autre de la sé- quence immunogène naturelle à substituer des sites de restriction spécifiques (dans la mesure o ceux-ci n'étaient pas déjà présents) dans le cADN, on clive le cADN au niveau de ces sites spécifiques par les enzymes de restrictions correspondantes, on reconstitue un cADN recombinant hybride formé à partir de tous les éléments du cADN nécessaire à la réplication ultérieure du virus, qui se trouvaient antérieurement associés à la séquence codant pour l'épitope naturel, d'une part, et de la séquence codant pour l'épitope immunogène de substitution, en lieu et place de la séquence codant pour l'épitope naturel, d'autre part, on transfecte une culture cellulaire sensible avec cet ADN recombinant et l'on recueille enfin le picornavirus recombinant correspondant. - Pour ce qui est de l'information des sites spé- cifiques entourant la séquence codant pour l'épitope immunogène endogène à substituer, on peut procéder par toutes méthodes appropriées visant à introduire un site de restriction spécifique à un endroit déterminé d'un acide nucléique. Avantageusement, l'on procèdera par mutagenèse dirigée, par exemple comme décrit dans l'exemple ci-après. 2619 0 1 2 Afin de s'assurer du clivage spécifique aux endroits voulus de l'ADN à traiter, et ce en l'absence de clivages parasites dans d'autres régions de cet ADN, celui-ci aura de préférence été modifié au préalable en ces autres endroits pour faire disparaitre les sites de restrictions semblables qui pouvaient y être présents. Cette dernière opération peut être réalisée par toute méthode appropriée permettant la modification des sites de restriction ou encore par mutagénèse dirigée. Dans ce qui précède, l'on n'a évoqué qu'une substitution limitée du cADN du picornavirus correspon- dant. L'homme du métier appréciera que l'on peut encore envisager la production de virus hybrides plus profondément transformés pour répondre aux besoins de la pratique. Les techniques sus-indiquées permettent par exemple le greffage de tout ou partie de la séquence complète codant pour les protéines successives, VPO, VP3 et VP1, d'un rhinovirus ou du HAV dans le cADN d'un poliovirus, en lieu et place des séquences correspondantes codant pour les protéines VPO, VP3 et VP1 du poliovirus. Il est également nécessaire dans ce cas-là de modifier les sites spécifiques de coupure dans le cADN du rhinovirus ou du HAV par mutagenèse dirigée, afin que les clivages nécessaires à la production ultérieure du virus hybride obtenu entre les protéines VPO et VP3 d'une part, et entre les protéines VP3 et VP1 d'autre part, puissent être effectués sous le contrôle de la séquence codant la protéase spécifique qui, dans le poliovirus naturel, coupe les liaisons glutamine-glycine séparant les protéines sus-indiquées. Cette transformation permet en conséquence l'obtention d'un picornavirus dérivé du poliovirus, mais pourvu d'une capside de rhinovirus, ou du HAV. Il apparaîtra clairement à l'Homme du Métier que des constructions faisant intervenir d'autres associations de différents picornavirus peuvent être envisagées de la même manière, au gré du constructeur, et de la compati- bilité maximum recherchée entre le virus hybride produit et l'organisme de l'hôte à vacciner. Des caractéristiques supplémentaires de 1'in- vention apparaitront encore au cours de la description qui suit, de mode de construction d'un ADN recombinant hybride conforme à l'invention dérivé d'un poliovirus de type 1, en s'appuyant sur les figures la à 5d qui illustrent schématiquement les étapes successives de cette construction et les structures des différents plasmides mis en oeuvre. I CONSTRUCTION DU VECTEUR DE SOUS CLONAGE PBR327 MODIFIE Le plasmide pBR327 (SOBERON et al. 1980) (fig la) capable de se répliquer dans les bactéries E. coli, pot- tant les gènes de résistance à l'ampicilline (Apr) et à la tétracycline(Tc r) et son origine de réplication (ori), est choisi comme vecteur pour effectuer les constructions. Ce vecteur est modifié pour les besoins du clonage de la façon suivante. 1' Remplacement du site HindIII (position 29) de ce plasmide par un site XhoI. Le vecteur est ouvert au site HindIII par l'enzyme de restriction correspondante (BOEHRINGER, conditions d'utilisation fournies par la firme), les bouts cohésifs générés (40 pg DNA/ml) sont remplis par traitement à la DNA polymérase de KLENOV (100 U/ml) en présence des 4 nu- cléotides (dNTP) (200 pM chacun) selon le protocole décrit par MANIATIS et al. (1982). L'ADN linéarisé est déphospho- rylé par traitement à la phosphatase alcaline d'intestin de veau (2 x 0, 02 unités par pg de DNA) dans un tampon mM Tris-HCl pH 8,0 10 mM MgCl2, 0, 1 mM EDTA, 1 mM ZnCl2 (enzyme et protocole d'utilisation BOEHRINGER) deux fois pendant 30 minutes & 37C, avant ligation avec un adapteur (linker) synthétique Xhol phosphorylé (8 nucléotides, com- mercialisé par NEW ENGLAND BIOLABS). La réaction de liga- tion est effectuée pendant 48 heures à + 4C (ou pendant 16 heures à + 15'C) dans une solution 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, en présence d'une unité de T4DNA ligase (BOEHRINGER) par pg de DNA, dans un rapport molaire de 100 (linker/ADN à bouts francs). Le mélange de ligation est utilisé pour transfor- mer les bactéries E. coli HB101 (BOYER, ROULLAND-DUSSOIS, 1969) traitées au chlorure de calcium (protocole MANIATIS et al. 1982). Les bactéries sont ensuite étalées sur boi- tes d'agarose LB contenant de l'ampicilline (100 pg/ml). Les plasmides sont extraits selon la technique décrite par BIRNBOIM et DOLY (1979) et triés dans le but d'isoler ceux contenant le site de restriction XhoI. Un plasmide pAM1 (fig.16) possédant le site de restriction XhoI à la place du site HindIII est retenu. Ce plasmide est préparé en grande quantité après lyse des bactéries au lysozyme-sodium dodécyl sulfate (GODSON et VAPNEK, 1973)! et purification en gradient de chlorure de césium. L'ADN plasmidique prélevé sur le gradient est utilisable après extractions successives volume à volume par le butanol 1 (3 fois), le mélange 1: 1 phénol saturé en TE (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA)- chloroforme, alcool isoamylique (24: 1). La phase aqueuse extraite est précipitée par addition de 2 volumes d'éthanol 95 %, puis centrifugée et le culot repris dans un tampon TE. 2' Remplacement du site EcoRV (position 185) par un site BglII dans le plasmide modifié obtenu D'une façon semblable, le plasmide pAM1 est li- néarisé au site EcoRV, déphosphorylé et mis en ligation avec un "linker" BglII phosphorylé (8 nucléotides). Des clones ampicilline résistants sont obtenus après trans- formation des bactéries HB101 par le mélange de ligation. Les plasmides sont préparés selon la technique précédem- ment décrite et analysés pour la présence du site de res- triction BglII. Un plasmide pAM2 (fig. lc ou fig. 2a) possédant les sites de restriction XhoI et BglII à la place des sites HindIII et EcoRV respectivement est purifié en gradient de chlorure de césium. II SOUS CLONAGE DU FRAGMENT XhoI-BqlII DU cDNA DE POLIOVIRUS TYPE 1 MAHONEY DANS LE VECTEUR PAM2 Le sous-clonage d'un fragment comprenant les 5 601 premiers nucléotides de l'ADN complémentaire (cDNA) du poliovirus type 1 MAHONEY (sur 7 441 nucléotides) est réalisé de façon à ce que les sites de restriction à générer dans ce fragment par mutagénèse dirigée soient uniques dans la construction. Les nouveaux sites de restriction seront ainsi accessibles par des digestions totales par les enzymes de restriction correspondantes, afin que le fragment compris entre ces sites puisse être facilement délété et remplacé par une séquence étrangère de substitution. Le "fragment polio" et le vecteur nécessaire à ce sous-clonage sont obtenus ainsi qu'il est décrit ci-après. l' Fragment polio Le fragment de restriction XhoI-BglII contenant les 5 601 premiers nucléotides du cDNA de polio (5638 paires de bases) est issu du plasmide pKK17 (K. KEAN et al. 1986)(fig. 2b) Ce plasmide contient la totalité du cDNA (représentée par une région hachurée) du poliovirus cloné immédiatement après le promoteur tardif de SV40 PL contenu dans le fragment (TAg) issu de SV40, ainsi que les éléments nécessaires à sa réplication autonome dans des cellules de singe (origine de réplication de SV40), promoteur de la transcription, séquence enhancer de la transcription, antigène T fonctionnel). Il contient également l'origine de réplication bactérienne et le gène codant pour la résistance à l'ampicilline. Le plasmide pKK17 est digéré de façon totale par les enzymes de restriction XhoI et BglII (BOEHRINGER) auxquelles correspondent des sites uniques dans ce plas- mide. Le fragment de 5 638 paires de base (pb) est isolé à partir d'un gel d'agarose à bas-point de fusion (low mel- ting) (WIESLANDER, 1979) purifié par deux extractions au phénol, une extraction par le mélange phénol/chloroforme: alcool isoamylique (IAA) et deux extractions par le mé- lange chloroforme: alcool isoamylique (IAA). 2 Vecteur Parallèlement, le plasmide pAM2 est digéré de fa- çon totale (sites uniques) par les enzymes de restriction XhoI et BglII. Le fragment BglII-XhoI (3 109 pb) contenant l'origine de réplication bactérienne et le gène de résis- tance à l'ampicilline est de même isolé et purifié à par- tir d'un gel d'agarose low melting. 3' Sous-clonage Une réaction de ligation des deux fragments (rap- port molaire insert/vecteur (2: 1)) est effectuée. Les bactéries HB101 sont transformées avec le mélange de li- gation. Des clones ampicilline-résistants sont obtenus. L'ADN plasmidique est extrait puis analysé sur la base de la taille des fragments générés après digestion par les enzymes XhoI et BglII. On recueille pAM3 (fig. 2c ou fig 3a) qui possède la séquence des 5 601 premières paires de bases du cDNA de polio et on le purifie sur gradient de chlorure de césium. III CREATION DE NOUVEAUX SITES DE RESTRICTION DANS LA SEOUENCE 1-5 601 DU POLIOVIRUS Les nouveaux sites de restriction sont créés par la technique de mutagénèse dirigée par oligonucléotide synthétique (MORINAGA et al. 1984), appliquée sur plasmide double brin, en l'occurence pAM3. A cette fin, il a été choisi de créer des sites Hpal ou EcoRV en position 2 756, et un side HindIII en position 2 786 dans la séquence du poliovirus. Ces deux positions encadrent exactement la boucle 93-103 de la protéine de capside VP1 qui correspond à un site antigénique neutralisant de type I du poliovi- rus, située entre deux feuillets Bêta. Les sites de restriction qui seront ainsi générés permettront de déléter la séquence nucléotidique codant pour les acides aminés de cette boucle et de la remplacer par une séquence hétérologue choisie en fonction de son rôle antigénique, avec pour objectif d'exposer cette séquence hétérologue à la surface du virion. La mutation d'un seul nucléotide dans de l'ADN du poliovirus peut être suffisante pour engendrer un nouveau site de restriction. La technique est ici utilisée pour générer (grâce aux paires d'oligonucléotides synthétiques correspondants (cf. fig.3) des doubles mutants du polio- virus contenant, pour les premiers, des sites, HpaI et HindIII par réalisation de mutations ponctuelles dans les positions 2 757-2 791 respectivement et, pour les seconds, des sites EcoRV et HindIII par des mutations dans les positions 2 760 et 2 791 respectivement. Ces techniques sont mises en oeuvre en utilisant, en sus des plasmides sus-indiqués, des oligonucléotides synthétiques. Ceux-ci comportent chacun une mutation ponctuelle par rapport à la séquence nucléotidique d'une partie du "fragment polio" ci-dessus. Leurs longueurs ont été choisies de façon à encadrer le nucléotide muté et à présenter un minimum d'homologie avec les autres séquences du poliovirus sauvage de MAHONEY. On procède notamment dans les conditions qui suivent. 1' Le plasmide pAM3 est digéré par Sal1 (en posi- tion 651 de la partie pBR327) pour générer un fragment li- néaire I (fig. 3b). 2 Le plasmide pAM3 est digéré par XbaI, site présent aux positions 2 546, 2 861, 3 581, 4 886 du frag- ment de cDNA du poliovirus. On génère donc 4 fragments dont l'un (2 546-2 861) est éliminé après séparation sur gel d'agarose "low melting"(à bas point de fusion). On remarquera que le fragment éliminé contenait la séquence d'acide nucléique codant pour la susdite boucle 93-103 de la protéine de capside VP1 ainsi que les nucléotides qui l'entouraient dans ce qui sera appelé plus loin la "séquence poliosauvage". Au contraire les 3 autres fragments sont extraits. Ceux-ci présentent des tailles respectivement de 720 pb: (fragment IIa), 1 305 pb: (fragment IIb), et 6 405 pb: (fragment IIc). Ceci permettra ensuite d'obtenir après dénaturation et hybridation avec le fragment pAM3 digéré par Sall une région simple brin entre les positions 2 546-2 861, o l'on désire introduire les mutations. 3' Les fragments I, IIa, IIb, IIc sont individuel- lement purifiés par extraction au phénol, puis précipita- tion à l'éthanol 95 %. Ils sont dissous dans le tampon TE mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA. Les fragments IIa, IIb, IIc sont ensuite réunis dans une même solution. 4 Les oligonucléotides ont été synthétisés dans un synthétiseur automatique, purifiés par chromatographie en phase liquide de haute performance (HPLC), puis par électrophorèse sur gel 20 % acrylamide contenant de l'urée 7M. Enfin, ils ont été phosphorylés par traitement à la T4 polynucléotide kinase (2 x lunité /pg DNA) dans un tampon mM TrisHCl pH 9,0, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, en présence d'ATP 1 mM pendant 2 x 1 heure à 37'C. Ces oligonucléotides correspondent à des parties de la "séquence poliosauvage" dont la structure suit. En particulier, ils comportent une mutation d'un nucléotide du codon codant pour les acides aminés: - 93 pour l'oligonucléotide A, - 104 pour l'oligonucléotide B, et - 94 pour l'oligonucléotide C. Les nombres qui précèdent corresondent aux numéro- tations des acides aminés de la protéine VP1 codés par les codons correspondant de la "séquence polio sauvage" ci-après. - -/ / 1> 93 103 '-. G ACC GTG GAT AAC CCA GCT TCC ACC ACG AAT AAG GAI AAG C TTT 3...C TGG CAC CTA TTG GGT CGA AGG TGG TGC TTA TTC CTA TTC GATI AAA Thr Val sp Asn Pro Als Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys Leu Phe Hpel Hindill EcoRY i GCA GTG TGG 3' CGT CAC ACC 5 Al YVol Trp Hind III J On a fait apparaître sous les lignes identifiant les codons de la "séquence polio sauvage" et les acides aminés correspondants, l'indication des emplacements re- latifs des oligonucléotides synthétiques (flèches) dont les formules suivent, grâce à une mutation ponctuelle dans leurs structures respectives (encadrés). Ces mutations ponctuelles sont illustrées par l'utilisation de lettres évidées, tant pour désigner le nucléotide de substitution résultant de cette mutation que pour identifier le changement de nature de l'acide aminé codé par le codon muté. Oligonucléotide A Hpel 5' G ACC GTG G''T AAC CCA GC 3' 3' C TGG CAC CQA TTG GGT CG 5' Oligonucléotide stjnthétique 91 93 95 (18-mer) Thr Val M Asn Pro Le site Hpal a été créé en modifiant le codon codant pour le résidu Aspartate (position 93 de VP1) en un codon codant pour la valine (A 2 757 > T). Oliaonucléotide B Hindll 5' G GAT AAG C1 TTT GCA GTG TGG 3' 3 C CTA TTC G6A AAA CGT CAC ACC 5 Oligonucléotide 102 104 108 (22-mer) Asp Lys Leu Phe Ala Y 1 Trp Le site HindIII résulte d'une mutation muette (pour ce qui est de l'acide aminé exprimé) sur le résidu en position 104 VP1 (A 2 791 > T). Oliaonucléotide C EcoRY 5 CCGTGGAT AC CCA GCTTCC 3- 3' GG CAC CTA TiG GGT CGA AGG 5' (20-mer) 92 94 97 VYal Asp DSG Pro Ala Ser Le site EcoRV a été créé en modifiant le codon codant pour un résidu Asparagine (position 94 de VP1) en un codon codant pour une Isoleucine (A 2 760 > T). Les fragments I et II (0,03 pmole de chaque) sont mélangés dans 10 pl d'eau, soit avec les oligonucléotides A et B, soit avec les oligonucléotides B et C, approxima- tivement 20 pmole de chacun des oligonucléotides pour former dans les plasmides hybrides ultérieurs, soit les paires de sites Hpal + HindIII, soit les paires de sites EcoRV + HindIII. A ces mélanges sont ajoutés 2 pl de tam- pon polymérase-ligase 10 fois concentré (1 M NaCl, 65 mM , Tris-HCl pH 7, 5, 80 mM MgC12, 10 M B-mercaptoéthanol). Les fragments du mélange contenus dans un capillaire scellé sont dénaturés par incubation dans un bain marie d'eau bouillante pendant 3 minutes puis la renaturation des mo- lécules se fait par refroidissement lent. Parmi l'ensemble des molécules formées, on trouve des molécules dont un brin de la matrice sauvage est hybridé soit avec les paires d'oligonucléotides A et B, soit avec les paires d'oligonucléotides B et C. Le produit de ces hybridations est illustré dans la fig. 4a, en ce qui concerne plus particulièrement la première alternative ci-dessus. Il ne reste plus alors 2 6 19 0 1 2 qu'à remplir les parties encore monobrins de la matrice illustrées dans les fig. 4b et 4c qui concernent des fragments comportant encore ces parties monobrins et dans lesquelles les insertions sont représentées par de petites saillies angulaires. A cet effet, le mélange est traité par la DNA polymérase de KLENOV (3 unités + 4 dNTP + T4 DNA ligase (3 unités) pendant une nuit à 12,5'C afin que l'ADN simple brin soit converti en un ADN double brin, circulaire et contenant les mutations engendrées par les deux oligonu- cléotides. Les bactéries HB101 sont transformées par le mé- lange; sur plus de 1 000 transformants ampicilline résis- tants obtenus pour chaque construction, 600 transformants sont triés (screening) par hybridation de colonies (selon GRUNSTEIN et HOGNESS 1975). Les oligonucléotides synthé- tiques marquées au 32p par la polynucléotide kinase ser- vent ensuite de sonde d'hybridation pour identifier les bactéries transformées par les plasmides mutés (hybrida- tions réalisées à 42'C, lavages réalisés à 53'C). Une dizaine de clones positifs sont retenus et utilisés pour retransformer des bactéries HB101 afin de séparer les plasmides mutants des "plasmides sauvages" pouvant être contenus dans le même transformant. Les plasmides préparés selon la méthode de BIRNBOIM et DOLY sont testés pour la présence des sites de restriction correspondants, soit Hpal et HindIII, soit EcoRV et HindIII. Les plasmides retenus (fig. 4d) sont: - pAM4: sites Hpal et HindIII - pAM5: sites EcoRV et HindIII. Les plasmides sont préparés et purifiés en CsCl puis séquencés pour confirmer les mutations. Le séquençage se fait selon la méthode de ZAGURSKY directement sur le plasmide préparé selon la méthode de BIRNBOIM et DOLY ou en chlorure de césium. IV CONSTRUCTION DE PLASMIDES HYBRIDES Les sites de restriction Hpal et HindIII uniques dans le plasmide pAM4 (ou EcoRV et HindIII de pAM5) permettent de déléter la séquence nucléotidique corres- pondant aux acides aminés 94 à 102 de VP1 du poliovirus, c'est à dire à l'épitope C3 et de le remplacer par n'im- porte quelle autre séquence codant pour un motif anti- génique hétérologue, par exemple d'un entérovirus (poliovirus type 2 ou type 3 ou de l'hépatite A) ou de * tout autre épitope hétérologue immunogène. Exemple de construction d'un plasmide poliovirus (hépatite A virus HAV) à partir de pAM4 (fig. 5a-5d). Le plasmide pAM4 (également représenté à la fig. 4b) est digéré par les enzymes de restriction Hpal et HindIII, Hpal générant des bouts francs et HindIII des bouts cohésifs, puis déphosphorylé. La séquence d'hépatite A est introduite sous forme de deux oligonucléotides complémentaires synthétisés, purifiés et phosphorylés comme décrit ci-dessus, l'un d'entre eux étant complété par un A et l'autre précédé par une séquence AGCTT (voir ci-dessous) pour restaurer un site HindIII permettant la ligation à bouts cohyésifs avec le vecteur. Les deux oligonucléotides encadrés hybridés entre eux comme montré ci-dessous, sont ensuite incorporés dans la séquence du vecteur poliovirus (dont les nucléotides et aminoacides extérieurs à la séquence HAV sont représentés par des lettres évidées), notamment en procèdant comme indiqué ci-après. Hindill ' 72 YP1 HAY 81 II!l UM 2Qî AAG CCT GGA GAG TCT AGA CAT ACA TCA GAT4I 9UU. Tr[ t 5 3 3 t P,'ITTC GGA CCT CTC AGA TCT GTA TGT AGT CTA TC G8,tYM mu 5' g QS Lgs Pro Glg Glu Ser Arg His Thr Ser Asp (LD [kC [] O 2 6 1 9 0 1 2 La réaction de ligation est effectuée, en présence de T4 DNA ligase pendant 48 h à + 4'C entre le vecteur détété et les 2 oligonucléotides hybridés dans un rapport molaire de 1/20. Les bactéries HB 101 sont transformées avec le mélange et les clones transformants sont analysés par hybridation de colonies avec l'un des 2 oligonucléo- tides de HAV utilisé comme sonde marquée au 32p (hybri- dation à 37'C, lavages à des températures successives de 42'C à 68C). Les plasmides sont extraits des clones positifs selon la méthode de Birnboim et Doly et sont - testés pour la présence du site HindIII par digestion avec l'enzyme correspondante. Un plasmide pAM42 (fig. 5b) est retenu. Sa séquence dans la zone de l'insertion est con- trôlée par séquençage selon la méthode décrite. La séquence I à 5601 de poliovirus contenant une séquence hétérologue est ensuite replacée dans le plasmide pKK17 (représenté à nouveau dans la fig. 5c), de façon à reconstituer un cDNA complet de poliovirus. Pour cela, le plasmide pAM42 est digéré par les enzymes de restriction Xhol et BgIII et le fragment Xhol.BgIII (5641pb) contenant la séquence polio-HAV est isolé et purifié à partir d'un gel d'agarose "low-melting". Parallèlement, le plasmide pKK17 est également digéré par Xhol et BgIII et le fragment BgIII-Xhol (10028pb) contenant les 1840 dernières paires de bases de polio ainsi que les séquences néces- saires à la réplication du plasmide dans les bactéries et dans les cellules de primates, est isolé et purifié de la même façon. Une réaction de ligation est effectuée entre les 2 fragments et les bactéries HB101 sont transformées par le recombinant. Les plasmides extraits des clones transfor- mants sont analysés par doubles digestions par les enzymes de restriction Xhol et Hpal et/ou Xhol + HindIII et triés sur la base de la taille des fragments obtenus. Un plasmide pAM420 (fig. 5d) est retenu: il contient la totalité du cDNA du poliovirus avec l'insérat de HAV, dans un plasmide infectieux pour les cellules de primates. Le plasmide est séquencé selon la technique dé- crite afin de confirmer les séquences de l'insertion. De la même façon, d'autres séquences peuvent être substituées au site antigénique I du poliovirus type 1 Mahoney, par exemple: - la séquence 94 à 102 VP1 du poliovirus type 2 Lansing, grâce aux oligonucléotides synthétiques suivants: HindIll & 94 YP1 T2 102 f] - ' Ai]'CBIAAT GAT GCT CCA ACA AAG CGT GCC AGT 3'r 3- 3-' l2TTA CTA CGA CGT TGT TTC GCA CGG TCA TTC GA. j 5' 9 Asn Asp Aie Pro Thr Lys Arg Ale Ser,T [[ID [PIN if2. 20... .. [UnI]D 3o séquence poliovirus type2 Lansing [] -35 26 19012 ou la séquence 97 à 107 de VP1 du HAV Hind III i i 09 97 VP1 HAY 107 ' *n înIj ACT TTT ACC TTC AAT TCA AAT AAT AAA GAG TAC 3 t 'ru 3 \.5 3'Y ( I TGA AAA TGG AAG TTA AGT TTA TTA TTT CTC ATG TTC G- 4 5 fl t Thr Phe Thr Phe Asn Ser Asn Asn Lys Glu Tgr t93 i D GW = _ Flo@ o oe Séquence HAY Oi a me pour former les séquences d'ADN hybrides (dans laquelle les oligonucléotides synthétiques hybridés sont encadrés) contenant lesdites séquences VP1 de HAV incorporées dans le cDNA du poliovirus. Les constructions faites dans le plasmide pAM5 permettent d'éliminer la mutation engendrée par le site de restriction EcoRV puisqu'elle est contenue dans la séquence délétée alors que, dans le plasmide pAM4, la mutation due au site Hpal située juste en amont de la séquence délétée, subsiste (Valine au lieu d'Aspartate). Une comparaison des deux systèmes est intéressante pour l'étude du rôle de l'acide aminé 93. Par -exemple on a construit dans pAM5 le plasmide hybride poliovirus/HAV 72-81, caractérisé par l'insertion hétérologue ci-dessous: HindIll J3 72 YP1 HAY 81 ai 'M MU[ AAG CCT GGA GAG TCT AGA CAT ACA TCA GAT AM3 Z îM 3' 3'îtX TTC GGA CCT CTC AGA TCT GTA TGT AGT CTA TTC Ghefx CM u î 5' a] l Lys Pro Gly Glu Ser Arg His Thr Ser Asp &OD GO [PDO Z@ I,, i... ... . r1....... M 0E:t::: O Séquence HAY [a V. ETUDE DANS DES CELLULES ANIMALES Les plasmides hybrides type pAM420 sont utilisés pour transfecter, en présence de DEAE Dextran (McCutchan and Pagano, 1965), selon la méthode de Sompayrac and Danna (1981) des cellules de rein de singe CV1 ou VERO, ou des cellules humaines (HeLa, Hep2, etc..) Les DNA sont préparés par la méthode de Birnboim et Doly ou en gradient de chlorure de césium. 106 cellules CV1 ou VERO sont étalées sur des boites de Petri de 60mm et incubées avec 0,4ml d'un mélange à 0,25 pg/ml d'ADN dans le milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) sans sérum, contenant 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 et 500 pg/ml DEAE dextran. L'incubation se fait à 37C dans une étuve à C02 pendant 2 heures. Les cellules sont ensuite lavées avec du DMEM sans sérum, puis entre- tenues dans du DMEM supplémenté par 5% de sérum de veau foetal. Après une dizaine de jours, lorsque l'effet cytopathique (ECP) est total, les cellules sont alors cassées par 5 congélations/décongélations successives dans la carboglace, centrifugées pendant 30mn à 1500 rpm pour éliminer les débris cellulaires; le surnageant est uti- lisé comme mini-stock viral. Les mini stocks viraux sont titrés sur plaque à 6 cupules: les cupules sont ensemencées avec 4.105 cellules CV1 ou VERO chacune, puis infectées par 0,2 ml des dilu- tions successives de la suspension virale dans le milieu DMEM sans sérum supplémenté avec 10 mM MgCl2. L'incubation se fait à 37C dans une étude à C02 pendant 30 min. La suspension virale est alors retirée et les cellules re- couvertes par une gélose contenant du DMEM avec 2% de sérum de veau foetal. Deux jous après l'infection, les plaques sont colorées au cristal violet: la gélose est retirée et la nappe cellulaire, perçée de plages de lyse, est colorée par une solution aqueuse contenant 10% formol, % éthanol et 2g/l de cristal violet. Les plages de lyse sont comptées dans la dilution adéquate. Le titre de la suspension virale est exprimée en unités formant plage (pfu)/ml. Les mini-stocks sont utilisés pour fabriquer des maxi stocks de virus: pour cela, 5.106 cellules CV1 ou 8.10. 6 cellules HEp2 (cellules de cancer épithélial humain, sur lesquelles le poliovirus se développe mieux) sont étalées sur boites de Petri de 100 mm et infectées par la suspension virale à la multiplicité de 1 pfu/ cellule. L'incubation se fait à 37C dans une étuve à C02 pendant 1 heure. Les cellules sont ensuite entretenues dans du DMEM contenant 2% de sérum de veau foetal. 22 heu- res plus tard, quand l'ECP est total, les cellules sont traitées comme décrit pour l'obtention du mini-stock. Le maxi-stock est également titré. La séquence de l'ARN viral extrait des virions composant ce maxi stock est contrôlées au niveau de l'insertion. Dès lors, à partir de ce maxi- stock, différentes analyses sont réalisées: - caractérisation des virus: réactions avec des anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux dirigés contre le poliovirus vecteur, et contre l'antigène auquel on a emprunté l'épi- tope hétérologue. - injection des virus hybrides purifiés à des lapins, analyse des sérums obtenus (ELISA, immunoblot, seroneu- tralisation) - marquage et préparation d'extraits de cellules infectées pour analyse des protéines de capside (notamment VP1) des virus hybrides en gel de polyacrylamide SDS(Laemmli,1970). - au besoin injection à des lapins de peptides synthé- tiques correspondant aux séquences insérées dans le poliovirus: analyse des anticorps obtenus: reconnaissance et neutralisation des virus hybrides. Dans la méthodologie décrite ci-dessus, on a directement utilisé le cADN des hybrides, cloné dans le plasmide infectieux pKK17 (décrit partie II-1) , pour donner naissance aux virus correspondants, par transfection de cellules de primate. Il est également possible de passer par l'inter- médiaire d'une transcription in vitro des cADN et de générer les virus correspondants après transfection des cellules par les ARN de polarité positive obtenus in vitro. L'infectivité de ces ARN est supérieure à celle des clones de cDNA, lors des transfections dans les cellules de primates. Pour cette seconde méthodologie, des cADN hybrides sont clones, par exemple, derrière le promoteur du phage T7 (dans un plasmide décrit par S. van der Werf et al., 1986) ou le promoteur du phage SP6 de Salmonella (dans un plasmide décrit par G.Kaplan et al., 1985). Les cADNs sont transcrits dans un système acellulaire, utilisant la RNA polymérase de T7 purifiée ou la RNA polymérase de SP6 et susceptible de générer in vitro des copies d'ARN viral infectieux, de polarité positive. La très haute spécifi- cité de l'ARN polymérase de T7 pour ses propres promo- teurs, sa capacité à fabriquer des transcrits complets de longs cADN permettent de produire de grandes quantités d'ARN dans ce système. Ces ARN servent de matrice pour la traduction dans les cellules transfectées. Le plasmide pT7PV1-5 décrit par S.van der Werf (1986) permet, de par sa construction, d'obtenir des ARN (+) contenant seulement 2 résidus G excédentaires en 5' et 3 résidus excédentaires en aval du polyA en 3'. L'élimi- nation des longues séquences excédentaires en 5'. et 3' des ARN produits à partir des constructions initiales a permis d'augmenter l'infectivité des ARN de 103 pfu/gg à 105 pfu/ pg (soit environ 5% de l'infectivité des ARN viraux extraits des virions). En outre, ces méthodologies peuvent être appli- quées d'une manière générale à des cADN hybrides sur une plus grande partie de leur génome. Par le même système de "cassette" encadrée par des sites de restriction que l'on peut générer par mutagénèse dirigée, on peut déléter la totalité de la partie P1 du génome du poliovirus et la remplacer par une région Pl d'un autre Picornavirus, et générer des virus hybrides (avec éventuellement complé- mentation par un système pouvant apporter des capsides de poliovirus exogènes si nécessaire). On présente encore, ci-après et à titre d'exemples non li- mitatifs un certain nombre de peptides immunogènes neutra- lisants susceptibles d'être incorporés comme précédemment décrit dans les protéines de capside d'un poliovirus. 2 6 1 9 0 1 2 EXEMPLES DE SEQUENCES IMMUNOGENES POUVANT ETRE INSEREES DANS UN VECTEUR CASSETTE APPROPRIE, TEL QUE pAM4 ou pAM5 1/ Séquences caractéristiques du virus de l'hépatite virale A (HAV) codant pour des peptides immunogènes neutralisants (J.COHEN et al(1986) J.VIROL 61, -59) notamment les séquences correspondant à: - la région 102.110 VP1 HAV 102 110 ' Ser Asn Asn Lys Glu Tyr Thr Phe Pro 3' ' TCA AAT AAT AAA GAG TAC ACA TTT CCA A 3' (28-mer) 3' AGT TTA TTA TTT CTC ATG TGT AAA GGT TTCGA 5' (32-mer) - la région 102-115 VP1 HAV 102 110 ' Ser Asn Asn Lys Glu Tyr Thr Phe Pro Ile Thr Leu Ser Ser 3' 5' TCA AAT AAT AAA GAG TAC ACA TTT CCA ATA ACC TTG TCT TCG A 3' (43-mer) 3' AGT TTA TTA TTT CTC ATG TGT AAA GGT TAT TGG AAC AGA AGC TTCGA (47-mer) 2/ Séquences caractéristiques du virus de l'hépatite B codant pour des peptides immunogènes neutralisants de ce virus, ces peptides correspondant & - la région 120-145 du cadre de lecture codant Pour pre-S (région N-terminale de la protéine moyenne: 33 et 36kD). 130 5' Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala Gly Gly 3' réf. A.R.NEURATH, S.B.H.KENT, N.STRICK (1984). Science, 224, 392-394. 2 6 1 9 0 1 2 - la réqion 12-32 Dre-S 12 20 ' Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly 32 Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro 3' ref. A.R.NEURATH, S.B.H.KENT, N. STRICK, P.TAYLOR, C.E.STEVENS, Nature 315, 154-156 (1985) - la réqion 139147 S 139 147 5' Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys 3' ref. BHATNAGAR et al.(1982), PNAS 79, 4400-4404. THANAVALA et al.(1986), J. Exp. Med;164, 227-236 3/ Séquences codant pour des peptides immunogènes du virus de l'Herpes Simplex type-1, notamment région 8-23 de la glycoprotéine D mature (résidus 33 à 48 de la séquence prédite de gD1). 8 10 ' Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly 23 Lys Asp Leu Pro 3' réf. COHEN et al.(1984), J. Virol. 49, 102.108. - région 340-356 de la alycoprotéine D (résidus 365 à 381 de la séquence prédite). 340 350 5' His Arg Arg Thr Arg Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu Pro His Ile Arg 3' ref. EISENBERG et al.(1985), J.Virol. 53, 634-644 - ou région codée par la séquence de la glycoprotéine D HSV-1: R.J.WATSON, J.H WEIS, J.S.SALSTROM, L.W.ENQUIST.(1982), Science 218, 381-384. 4/ Séquences codant pour un antigène de surface immunodominant du circumsporozoite de lasmodium falciparum, agent de la Malaria, notamment motif anti- génique présent sur la protéine CS (protéine du circumsporozoite -412 acides aminés et contenant 41 répétitions d'un tétrapeptide, en position centrale de la protéine). Le motif antigène utilisable est alors constitué par un certain nombre, par exemple 4 répétitions du tétrapeptide - Pro Asn Ala Asn - réf. V.ENEA et al. (1984)- Science 225, 628-630. J.B. DAME et al.(1985)- Vaccines 85 -Cold Spring Harbor Laboratory (7-11) ref. sequence protéine CS: J.B.DAME et al.(1984) Science 225, 593-599. / Epitope de virus de l'influenza comportant les résidus 138-164 de l'hémagglutinine r15 éf: M.SHAPIRA, M.JIBSON, G.MULLER, R.ARNON (1984) PNAS 81, 2461-2465. 6/ On mentionnera encore, toujours à titre d'exemple, des épitopes caractéristiques de - la glycoprotéine enveloppe de HIV I et HIV 2 - la glycoprotéine du virus de la rage - de l'antigène du choléra (Brevet FR. 83 13.828) etc... I] va naturellement de soi que tout autre épitope pourra être mis en jeu pour la production de vaccins, de préférence des vaccins vivants, utilisant un picornavirus de virulence atténuée à titre de vecteur porteur (par exemple une souche SABIN). Ces vaccins seront destinés à l'homme ou à l'animal, selon la nature de l'épitope choisi et du vecteur choisi. Il apparaîtra aussi immédiatement à l'homme du métier que le picornavirus utilisé à titre de vecteur pourra être aussi, un virus virulent, auquel cas on se servira du recombinant obtenu pour fabriquer un vaccin inactive. Enfin, il revient au clinicien de déterminer les doses et le protocole d'administration du vaccin choisi, selon le mammifère auquel il sera destiné. A toutes fins utiles on indique encore ci-après les références des articles des Auteurs auxquels il a été fait référence ci-dessus. Enfin il va de soi qu'on ne s'est pas limité au seul épitope C3 (site NIM I) mais que les constructions semblables peuvent être entreprises aux sites NIM II (VP2) et NIM III (VP3). En particulier, on peut substituer 2 des 3, voir même tous les 3, sites de neutralisation du picornavirus vecteur (par exemple poliovirus 1) par les 2 ou 3 épitopes de neutralisation correspondant et provenant d'un autre picornavirus (par exemple le HAV). Dans le cas déjà évoqué ci-dessus, o l'on substitue par exemple la capside du rhinovirus à la capside du poliovirus ou vice-versa, il est naturellement entendu que cette capside de substitution peut à son tour être substituée localement par un épitope hétérologue vis-à-vis de cette capside, et ce en remplacement de l'épitope naturel de cette capside qui, dans le picor- navirus dont elle provient, se trouve à la surface de ladite capside. Il va enfin de soi que l'expression "épitope" telle qu'elle a été utilisée dans le cadre du présent texte ne doit pas être interprété de façon restrictive. En particulier, l'expression "épitope" n'est pas limité à la seule séquence d'aminoacides auxquels est attribué la capacité d'induction in vivo d'anticorps neutralisants contre l'antigène auquel cet épitope a été emprunté. L'expression doit être entendue comme englobant éven- tuellement des séquences d'acides aminés plus ou moins courtes qui, normalement, entourent l'épitope (au sens restreint de l'expression) dans l'antigène auquel il a été emprunté. On a vu que ces séquences pouvaient même, dans le cas de picornavirus, aller jusqu'à inclure la totalité des protéines des capsides de celui des picornavirus auxquels l'antigène de substitution a été emprunté. 2 6 1 9 0 1 2 REFERENCE5 Birnboirm,H.C. and Doly.J. ( 1979) Nucl.Acids Res, 7, 1513-1522 Boyer.H.W. and Roulland-Dussois,D. (1969)J.Mol.Blol., 41: 459-472 Emini,E.A., Hughes,J.V., Perlow,D.5. and Boger,J (1985) J.Virol., 55, 836-839 GodsonG.N. andVaepnekD( 1973) Biochm.Blophys.Acta, 299,516-520 Grunstein, M and HogneZs,D.S. (1975) Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 72, 3961-3965 Hogle,J.M.,Chow,M. and Filman,D.J. (1985) Science, 229, 1358-1365 Kaplan, G., Lubinskl,J., Dasgupta,A and Racaniello,V.R. (1985) Proc.Natl.Acad.Sci. 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(1985) Gene Analysis Techniques, 2, 89-94 2619012' REVENDICATIONS 1/ Picornavirus hybride viable contenant un épitope caractéristique d'une protéine vaccinante, hétérologue vis-à-vis des protéines de ce picornavirus, en lieu et place de l'un de ses propres épitopes immunogènes. 2/ Picornavirus selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'épitope hétérologue est exposé à la surface de la capside du picornavirus. 3/ Picornavirus selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est formé d'un poliovirus. 4/ Picornavirus selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il consiste en un poliovirus du type 1 dans lequel l'épitope hétérologue est substitué à l'épitope C3 normalement exposé à la surface de la capside du polio- virus. / Picornavirus selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il consiste en un rhinovirus ou un aphtovirus. 6/ cADN hybride recombinant comprenant la totalité ou tout au moins les parties du génome d'un picornavirus nécessaires à la production d'un virus viable dans une culture de cellules compétentes dans lesquelles le picornavirus non transformé est cultivable, d'une part, et une séquence de nucléotides hétérologue, le cas échéant synthétique, codant pour un épitope distinct, substituée dans ce cADN à une séquence d'ADN endogène ou naturelle codant pour une séquence d'acides aminés immunogène, d'autre part. 7/ cADN hybride selon la revendication 6, caractérisé en ce que la séquence immunogène hétérologue 'est substi- tuée à une séquence endogène qui, dans le picornavirus non modifié et compte tenu de la nature des séquences envi- ronnantes, codait pour une séquence d'aminoacides exposée à la surface de Ia capside de ce picornavirus. 8/ ADN recombinant, notamment plasmide, contenant un cADN hybride selon la revendication 6 ou la revendication 7, et caractérisé en ce que ce dernier est incorporé, par construction, sous le contrôle d'un promoteur et d'élé- ments de régulation autorisant soit la réplication autonome des picornavirus recombinants correspondants dans des organismes eucaryotes utilisables pour la production de picornavirus non modifié, après transformation du susdit ADN recombinant, soit la transcription cellulaire du cADN EN arn hybride infectieux. 9/ ADN recombinant selon la revendication 8, caracté- risé en ce qu'il est dérivé d'un poliovirus d'un rhino- virus ou d'un aphtovirus. / ADN recombinant selon la revendication 8, caracté- risé en ce qu'il est dérivé d'un poliovirus de type 1 et qu'il contient une séquence hétérologue en lieu et place de la séquence C3. 11/ Vaccin actif contre un agent pathogène déterminé dont le principe actif est constitué par un picornavirus hybride viable contenant un épitope caractéristique d'une protéine vaccinante, hétérologue vis-à-vis des protéines de ce picornavirus, en lieu et place de l'un de ses propres épitopes immunogènes, ledit picornavirus étant conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 5 et ladite protéine vaccinante l'étant contre la maladie due au susdit agent pathogène déterminé. 12/ Procédé de fabrication d'un picornavirus hybride conforme à l'une quelconque des revendications i à 5, caractérisé en ce que, partant d'un cADN obtenu à partir de l'ARN viral, et après avoir au préalable localisé un épitope immunogène naturel du picornavirus correspondant, on introduit de part et d'autre de la séquence immunogène naturelle à substituer des sites de restrictions spécifiques (dans la mesure o ceux-ci n'étaient pas déjà présents) dans le cADN, on clive le cADN au niveau de ces sites spécifiques par les enzymes de restriction corres- pondantes, on reconstitue un cADN recombinant hybride formé à partir de tous les éléments de l'ARN viral ou du cADN nécessaire à la réplication ultérieure du virus, qui se trouvaient antérieurement associés à la séquence codant pour l'épitope naturel, d'une part, et de la séquence codant pour l'épitope immunogène de substitution, en lieu et place de la séquence codant pour l'épitope naturel, d'autre part, et on transfecte une culture cellulaire sensible avec cet ADN recombinant et l'on recueille enfin le picornavirus recombinant correspondant.