FR 2618784 A1 19890203 FR 8710798 A 19870730 La présente invention porte sur un concentré de protéines coagulables par la thrombine obtenu à partir du 'plasma, son procédé d'obtention et son utilisa- tion à des fins thérapeutiques. La disponibilité d'un concentré de protéines coagulables par la thrombine permet d'apporter une aide efficace lors de certains épisodes cliniques tels que les greffes de peau, les sutures nervures ou artérielles, les cica- trisations rapides ou toute utilisation o un effet hémosta- tique et/ou bactériostatique est recherché. En effet, le fibri- nogène, constituant majeur d'un tel concentré, subit une dégrada- tion enzymatique au contact avec la thrombine activée par des ions calcium. Après élimination des produits de déora- dation résultants,les molécules de fibrine polymérisent alors spontanément et génèrent de la fibrine soluble, puis de la fibrine insoluble qui joue un rôle coagulant. La présence de Facteur XIII contribue de plus à-stabiliser la fibrine et à intensifier les bénéfices liés à l'uti- lisation. Pour être d'utilisation aisée, il est nécessaire de disposer d'un produit d'origine plasmatique, présentant une bonne solubilité, un haut pouvoir adhésif, une grande élasticité, et stable dans les conditions de son utilisa- tion. L'obtention de telles caractéristiques est directe- ment liée à la nature du produit, et donc à son mode de purification à partir du plasma. Il est donc utile de dis- poser d'une technique de préparation facilement mise en oeuvre à l'échelle industrielle mais qui soit aussi suffi- samment douce pour ne pas altérer les qualités biochimi- ques du produit pour l'utilisation recherchée par les cliniciens. On connaît déjà, notamment d'après les brevets français N s 2 448 900 et 2 448 901, des colles renfermant du fibrinogène et du Facteur XIII. Ces produits sont obtenus à partir de cryoprécipité de plasma par trai- tement avec une solution tampon contenant un inhibiteur- activateur du plasminogène ou inhibiteur de la plasmine, qui se retrouve présent dans la colle à l'état lyophilisé. Ces produits présentent des caractéristiques intéressantes. Toutefois, ces produits sont obtenus selon des méthodes de production du fibrinogène assez complexes qui nécessitent, pour avoir un mélange final satisfaisant, l'adjonction exogène d'autres protéines plasmatiques comme le Facteur XI!. De plus, il faut adjoindre en cours de production, oes inhibiteurs, tels des inhibiteurs de pro- téases, d'oricine animale comme l'aprotinine bovine. Les colles obtenues peuvent ne pas posséder une solubilisation rapide même à 37 C, obligeant à ajouter dans le flacon de lyophilisation du produit un barreau aimanté et de disposer d'un agitateur magnétique pour accélérer la remise en solution. Il serait donc tout à fait bénéfique de disposer d'une méthode simple de production de colle bio- logique permettant d'obtenir sans apport exogène de pro- téines un mélange protéinique répondant aux qualités sou- haitées pour un tel produit. Cette technique de production devrait fournir un concentré possédant donc un contenu satisfaisant de fibrinogène, de Facteur XIII, et de fibro- nectine. Le procédé en question doit aussi s'adapter aisé- ment à des modifications visant à l'introduction d'une étape d'inactivation virale. Le produit en résultant devrait se solubiliser en moins de 10 minutes à la tempé- rature d'utilisation (généralement 18 à 20 C), sans nécessité d'un outillage particulier. Il faudrait aussi que le produit soit stable plusieurs heures pour en faci- liter l'utilisation et en garantir l'efficacité clinique. La Demanderesse a ainsi mis au point un procédé simple qui permet de préparer un concentré de protéines coagulables par la thrombine, ou colle biolo- gique, contenant par le simple fait du'fractionnement mis en oeuvre, plus de 70 % de fibrinogène coagulable par rapport à l'ensemble des protéines présentes, et 10 à UI/ml de Facteur XIII par une technique utilisant une fraction plasmatique disponible dans tous les centres de fractionnement. L'invention concerne donc un concentré de protéines coagulables par la thrombine obtenu par préci- pitation et traitement à l'éthanol de plasma humain ou ani- mal, qui contient avantageusement plus de 70 % en poids de fibrinogène coagulable par rapport aux protéines totales et environ 10 à 30 UI/ml de Facteur XIII. La teneur en fibrinogène coagulable est ainsi dans son volume d'utilisation comprise de préférence entre 84 et 98 g/l. Par ailleurs ce concentré contient également avantageusement 5 à 12 g/1 de fibronectine. Ce concentré est obtenu par un procédé utilisant une précipitation à l'éthanol, à un pH voisin de la neutralité et à basse température, d'un plasma total non soumis à la cryoprécipitation. On ajuste les conditions de mise en oeuvre du procédé de façon à obtenir un précipité peu dénaturé, évitant ainsi les dégradations que subiraient les pro- téines si l'étape de précipitation se déroulait dans les conditions industrielles classiques de traitement du plasma. Ainsi, en dehors des précautions prises, notamment au niveau de la concentration en éthanol et de la tempé- rature, on traite de préférence le plasma dans des réci- pients de petite taille (par exemple 10 litres) munis de barreaux aimantés. Le plasma est donc mis en contact avec de l'éthanol à faible concentration,par exemple de 8 à 12 '%, pendant une durée pouvant atteindre plusieurs jours et en tout état de cause supérieure à 4 heures. Le sur- nageant est alors décanté et est disponible pour la pré- paration d'autres dérivés. Le précipité obtenu est lavé à l'éthanol, toujours à basse température, c'est-à-dire entre 0 et 6 C, et à un degré alcoolique à 8 à 12 %, de préférence 10 % et l'ensemble est centrifugé. Le précipité est alors remis en solution, éventuellement concentré, filtré et de préférence lyophi- lisé avant traitement ultérieur. Eventuellement, il peut être traité directement, c'est-à-dire à l'état non lyophilisé. Le lyophilisat de fibrinogène, ou la p6te fraîche correspondante, sont remis en solution à un taux de protéines de l'ordre de 50 g/l et soumis à un traite- ment à l'éthanol à 8 à 12%, à une température comprise entre 30 et 37 C, préférentiellement à 35 C et pour une durée de l'ordre d'une heure et demie. Cette étape, réalisée en présence de lysine, contribue à la bonne remise en solution de la colle biollgique lyophilisée, tout en apportant une sécurité abcrue vis-à-vis de l'inacti- vation d'éventuels virus pathogènes, dont le virus du SIDA. La quantité de lysine utilisée permet d'avoir par exemple une concentration de l'ordre de 5 à 6 g/l dans le produit prêt à l'emploi. L'éthanol est éliminé par ultra- ou diafiltration et le produit est alors filtré stérilement, réparti dans son flacon d'utilisation et lyophilisé. La reconstitution du produit avant emploi s'effectue par une solution aqueuse d'aprotinine à 3000 UIK/ml, la solution résultante étant mélangée à de la thrombine calcique à 500 UI/ml Le produit s'utilise soit sous forme liquide dispensée par un système de double aiguille (colle biolo- gique reconstituée, d'une part et thrombine calcique d'autre part) soit sous forme sèche (utilisation en poudre) ou par un système de vaporisation. L'exemple suivant illustre l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE: A - PREPARATION DU CONCENTRE PROTEIQUE Le plasma utilisé est obtenu par centri- fugation de sang et congelé à -35 C dans les 6 heures sui- vant le prélèvement. Pour la préparation de la colle, il est décongelé à 37 C. On le soumet ensuite à une préci- pitation à l'éthanol à 10 %, à pH 7,2, à un taux de protéines de 52 g/l, à une température de 4 C. Le mélange est agité durant 30 minutes puis laissé à décanter pour une durée minimale de 4 heures à 4 C. Le surnageant éthanolique est éliminé par centrifugation et le précipité, riche en particulier en fibrinogène et en Facteur XIII,est récupéré. Celui-ci est soumis à un lavage poussé à l'aide d'une solution à 10 % d'éthanol prérefroidi à +4 C puis de nouveau centrifugé. Le précipité est alors remis en solution par une solution tampon Tris/citrate, puis concentré à -20 g/l de protéines, filtré et éventuellement lyophilisé. Le produit résultant est remis en sus- pension à 50 g/l de protéines par une solution de lysine à 3 g/1 (soit une concentration finale de 13 à 17 g/1 de lysine) puis subit un deuxième traitement à l'éthanol à - 10 % pour une heure et demie à 35'C. Après diafiltration pour éliminer l'éthanol et amener le taux de protéines à 35g/1, le concentré est filtré, réparti stérilement et lyophilisé dans le flacon final pour une remise en solution en 0,5, 1, 2 ou 5 ml, par exemple, lors de l'utilisation. B - ANALYSE BIOCHIMIQUE DU CONCENTRE PROTEIQUE La composition en protéines du produit est la suivante (exprimée en g/l) Protéines totales 120 - 130 g/1 - Fibrinogène 84 - 98 g/l - Fibronectine 5 - 12 g/l - Facteur XIII 10 - 30 UI/ml. C - CARACTERISTIQUES GENERALES DU CONCENTRE - Temps de remise en solution: inférieur à 10 minutes, voire 5 minutes, tant à 20 C qu'à 37 C, sans appareillage particulier, par simple mouvement de rotation manuelle. - Stabilité: pas de déstabilisation du produit reconstitué et conservé à 4 , 20 ou 37 C pendant 24 heures. - Pouvoir adhésif: supérieur à 100 g/cm exprimé par test sur l'animal de collage de lambeaux de peau, valeur supérieure à celles obtenues sur d'autres colles pré- parées à partir de cryoprécipité. Ce pouvoir adhésif se maintient à 90 'l de sa valeur après reconstitution de la colle biologique et conservation 24 heures à 4 C ou à 20 C. - Absence d'exsudation lors du mélange du concentré pro- téique avec la thrombine calcique. - Les essais cliniques réalisés ont démontré la grande adaptabilité du produit aux contraintes de l'utilisation: besoin de remise en solution rapide, stabilité aux tem- pératures des blocs opératoires, possibilité d'attente d'utilisation. Les indications de la colle selon l'in- vention découlent de ses propriétés; son pouvoir adhésif et hémostatique en font un adjuvant précieux des inter- ventions chirurgicales au cours desquelles elle assure un gain de temps opératoire. En outre son pouvoir bactério- statique renforce et accélère la cicatrisation des plaies et des sutures. Ses indications s'appliquent ainsi à des domaines très variés de la chirurgie: - Chirurgie plastique et microchirurgie: greffe cutanée des -brûlures, collages et lambeaux, lifting, blépharoplastie. - Neurochirurgie: plastie et suture de dure-mère, hémostase d'exérèse tumorale, hémostase de sinus veineux. - Chirurgie cardio-vasculaire: étanchéité des sutures des prothèses 'vasculaires, dissection aortique, anévrysme. - Chirurgie générale et abdominale: collage de déchirures viscérales(splénique, rénale, hépatique...), ou de biopsie hépatique, anastomoses digestives, fistules, hémostase des cavités opératoires. - Chirurgie osseuse: collage de corticale, suture du tendon, encollage de foyer ostéomyélitique. - Stomatologie: hémostase de foyer d'extractions dentaires chez les malades à haut risque hémorragique (hémophiles). - Oto-Rhino-Laryngologie: réparation de plaie tympanique, amygdalectomie. Le produit selon l'invention peut être préparé à partir de plasma humain ou animal et trouve ainsi intérêt aussi bien en médecine humaine que vétérinaire. REVENDICATIONS 1.- Concentré de protéines coagulables par la thrombine à teneur équilibrée en fibrinogène coagulable, Facteur XIII et fibronectine, caractérisé en ce qu'il est obtenu par précipitation à froid et traitement à l'éthanol de plasma. 2.- Concentré selon la revendication 1, caractérisé en ce que le fibrinogène coagulable représente plus de 70 % des protéines totales et qu'il renferme à 30 UI/ml de Facteur XIII et 5 à 12 g/l de fibronectine. 3.- Concentré selon la revendication i ou 2, caractérisé en ce qu'il contient de la lysine. 4.- Procédé de préparation d'un concentré selon l'une quelconque des revendications à 3, caracté- risé en ce qu'on soumet un plasma total, non cryoprécipité, à une précipitation par l'éthanol à basse température suivie d'un traitement à l'éthanol à chaud. 5.- Procédé selon la revendication 4, carac- térisé en ce que la précipitation est effectuée à une tempé- rature de O à 6 C et à un pH voisin de la neutralité par mise en contact du plasma avec 8 à 12 % d'éthanol pendant une durée suoérieure à quatre heures. G.- Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que le traitement à l'éthanol s'effectue à une température de 30 à 37 C et avec 8 à 12 % d'éthanol. 7.- Procédé selon la revendication 4 ou 6, caractérisé en ce que le traitement à l'éthanol s'effec- tue en présence de lysine. 8.- Colle biologique pour réunir des tissus, à usage humain ou vétérinaire, caractérisée en ce qu'elle est obtenue à partir d'un concentré selon l'une quelconque des revendications 1 à '3.