FR 2620130 A1 19890310 FR 8712407 A 19870908 2620 1 30 La présente invention concerne de nouveaux polysaccharides immunomodulateurs, extraits d'au moins un genre bactérien de type Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae, leur procédé d'obtention, leur application comme médicaments et les compositions les renfermant. Certains extraits d'entérobactéries, notamment des glyco- protéines de Klebsiella pneumoniae sont connus par les demandes EP 0049.181 et 182 et 0115.988; et dans la demande de brevet EP. 0139.551, il est décrit des procédés de préparation de principes actifs immuno- stimulants obtenus par l'action de bactériphages sur diverses bactéries. 0 Il a été apporté un perfectionnement aux procédés précédem- ment cités, permettant d'obtenir de nouveaux polysaccharides hydrosolu- bles, renfermant 65 à 75 % d'oses neutres, 18 à 27 % d'acides uroniques de 5 à 9 % d'acide pyruvique sous forme de pyruvilidène, moins de 1 % de protéines, moins de 0,5 %O d'osamines et ayant une masse moléculaire supérieure à 50. 000. On désigne par oses neutress notamment des hexoses tels que le glucoses le galactose ou le mannose; et par acides uroniques, notam- ment l'acide galacturonique; et par osamines, notamment la glucosamine. La masse moléculaire des polysaccharides a été déterminée 0 par la mesure du coefficient de sédimentation en ultracentrifugation analytique et par tamisage moléculaire. Les polysaccharides de l'invention peuvent être extraits de différentes souches de bactéries ou microorganismes de façon nulle- ment limitative; on retient cependant tout particulièrement ceux qui proviennent des souches d'Escherichia coli et de Klebsiella pneumoniae déposées à l'Institut PASTEUJR de PARIS, respectivement sous les numé- ros 62.23 et 58. 5. L'étude de la structure de ces polysaccharides à l'aide de différentes techniques comme la chromatographie en phase gazeuse, la spectrométrie de masse, l'électrophorèse, l'autoanalyse d'aminoacides, la chromatographie liquide à haute performance, la résonnance magné- tique nucléaire et l'ultracentrifugation analytique a permis d'en pré- ciser la composition telle que mentionnée ci-dessus. Il est à noter que la sous-fraction peptidique n'est pas responsable des activités pharmacologiques de ces polysaccharides. La composition molaire des nouveaux polysaccharides ren- ferme pour une molécule de galactose, de 0,2 à 0,4 molécules de gluco- se, de 2 à 2,5 molécules de mannose, 1 molécule d'acide galacturonique et 1 molécule d'acide pyravique. Les polysaccharides hydrosolubles sont isolés à partir de lysats bactériophagiques de culture d'au moinsun genre bactérien de type Escherichia coli et Klebsiella pneumoniea. Ces différents lysats peuvent être préparés selon une technique notamment décrite dans la demande EP. 0139.551. Et le procédé d'obtention de ces lysats du type lyse bactérienne repose sur une séquence d'au moins deux stades indis- pensables, à savoir une lyse bactériophagique, puis l'élimination des bactéries non lysées et des débris bactériens par filtration, centri- fugation etc... Ce procédé peut être mis en oeuvre à partir d'une bac- térie, ou bien avec utilisation successive de bactéries de genres dif- férents ou encore avec utilisation simultanée de bactéries de genres différents. Selon l'invention, on concentre un filtrat de lyse bacté- riophagique et procède simultanément à une sélection de molécules par passage sur membrane à perméabilité sélective, puis traite la solution de polysaccharides extraits par chromatographie, recueille la première fraction, dialyse, concentre la solution et refractionne par chromato- graphie, recueille la première fraction et amène à sec. Il a été découvert qu'il était possible de perfectionner le procédé en remplaçant le milieu de culture chimiquement non défini par un milieu synthétique défini entièrement dialysable, comme les for- mules de milieu M9 selon Adams (M.H. Adams, Bactériophages Interscien- ces New-York p.446, 1959) enrichi ou le milieu selon Rogers (H.J.Rogers Infect. Immuno. p.445, 1973). Ce milieu peut alors être avantageusement éliminé par l'u- tilisation de dispositifs à perméabilité sélective de molécules. L'uti- lisation de ces mêmes dispositifs permet une concentration des filtrats de lyse et facilite le travail avec de moindres volumes. L'ultrafil- trat peut être amené à sec par exemple par lyophilisation. La technique de sélection de molécules permet d'éliminer le milieu de culture, en particulier par utilisation de membranes à perméabilité sélective, notamment des ultrafiltres, de même la concen- tration des filtrats de lyse est réalisée également par la même métho- de. Les membranes à perméabilité sélective peuvent être de natures di- verses, par exemple en acétate de cellulose, à base de polysulfones, de polymères aromatiques, de copolymères de chlorure de vinyle et d'acrylonitrile, à base de polysulfones sur support de polyéthylène. Ces membranes peuvent se présenter sous forme plane, tubulaire ou en- core sous forme de fibres creuses ou de spirales. Les membranes per- mettent une concentration des molécules de masse moléculaire supérieu- re ou égale à 10'000 et ainsi une élimination par dialyse du milieu de culture des molécules de faible masse moléculaire. Il est souhaitable d'obtenir une concentration d'environ trente fois. Selon une variante, on peut procéder à une phase de purifi- cation préliminaire par traitement de la solution obtenue avec un alca- nol de faible masse moléculaire tel que l'éthanol, le méthanol ou l'isopropanol. Puis, le concentrat est purifié par chromatographie sur 0 colonne. Plusieurs types de chromatographie conviennent à la mise en oeuvre du procédé en conduisant à d'excellents résultats. Ces chromatographies peuvent être du type tamisage molécu- laire en utilisant des passages successifs sur des gels permettant l'exclusion dans un premier stade des molécules de faible masse molé- culaire et, dans un deuxième stade, la séparation des molécules de haute masse moléculaire. Ces chromatographies peuvent être de type chromatographie d'affinité en utilisant des lectines insolubilisées sur gel ou des an- ticorps de type IgG ou IgM insolubilisés sur gel. Les anticorps peu- O!0 vent provenir du sérum d'animaux vertébrés immunisés contre les po y- saccharides recherchés, notamment du lapin, du rat, du cobaye et de la souris. Ces anticorps peuvent être d'origine polyclonale ou monoclonale et produits selon les procédés bien connus du spécialiste. Les lectines et les anticorps sont insolubilisés sur des gels inertes de type agaro- !5 se ou de type polyacrylamide préalablement activés par des techniques connues,telles par exemple,celle au paranitrophényle - chloroformate. Ces chromatographies peuvent être de type chromatographie échangeuse d'ions. Les supports utilisés peuvent être à titre d'exem- ples des gels de polyacrylamide ou de cellulose substitués par des $O groupes diéthylaminoéthyl ou des résines de polystyrène-divinylbenzène substituées. La première séparation par chromatographie peut être avan- tageusement de type affinité avec des anticorps immobilisés sur gel inerte ou de type échangeuse d'ions. C5 La deuxième séparation par chromatographie est de préfé- rence du type échange d'ions. Ces diverses opérations de chromatographie sont suivies à l'aide de procédés classiques notamment par l'utilisation de la réfrac- tométrie différentielle,la spectrophotométrie,la spectrofluorométrie ou l'analyse des hexoses neutres par la méthode au résorcinol sulfurique. La fraction correspondant aux polysaccharides recherchés dans l'invention peut alors être dialysée ou ultrafiltrée et amenée à sec par des procédés tels que l'atomisation ou la lyophilisation. Les polysaccharides de l'invention sont doués de proprié- tés pharmacologiques et thérapeutiques très intéressantes; ils sont notamment dotés de propriétés immunomodulatrices. Ils présentent chez l'homme une excellente tolérance. Ces nouveaux polysaccharides, en tant que médicaments trouvent, par exemple, leur emploi dans le traitement ou la prévention chez l'homme et l'animal de maladies provenant d'une dysrégulation du système immunitaire, dans la prévention ou le traitement des agressiorns infectieuses bactériennes, virales, fongiques ou parasitaires, ainsi qu'en rhumatologie, dans la cicatrisation des plaies et en oncologie. Les médicaments, selon l'invention, peuvent être associés à une substance antibiotique, telles des tétracyclines; antivirale tels des nucléotides synthétiques interférant avec la synthèse de l'acide nucléique viral; antifongique, tel le buclosamide; ou anti- parasitaire, telle la chloroquine. Dans une autre forme de réalisation, les médicaments,selon l'invention, peuvent être associés à d'autres produits et compositions pharmaceutiques, tel un agent anti-tumoral (cytostatiques), un agent immuno-suppressif (ciclosporine, immunoglobulines antilymphocytaires) un agent antimitotique, tels les dérivés de l'acide folique ou anti- inflammatoire, telle l'indométhacine. Les médicaments selon l'invention peuvent aussi être cou- plés à des vecteurs macromoléculaires améliorant leur biodisponibili- té, leur ciblage ou diminuant leur toxicité. A titre d'exemple non limitatif, ces vecteurs peuvent être des liposomes, des anticorps, des protéines ou d'autres macromolécules. La posologie utile est susceptible de larges variations en fonction de la composition du médicament, de l'indication prescrite, de la forme d'administration et de l'âge du sujet traité. La détermi- nation des doses utiles est laissée à l'appréciation du médecin ou du vétérinaire, comme il est de pratique habituelle, dans les traitements de modulations de la réponse immune. A titre d'exemple, la posologie peut comporter des doses allant de 50 kg/jour à 50 mg/jour-par voie orale chez l'homme dans la prévention ou la prophylaxie des infections ou complications infec- tieuses postopératoires, dans les traitements des infections chrori- ques ou récidivantes des voies respiratoires ou urinaires. La dose usuelle par voie parentérale peut être,suivant le sujet traité et l'affection en cause, de 50 ug à 50 mg/jour chez l'homme. A titre de médicament, les polysaccharides de l'invention peuvent être administrés par voie orale, perlinguale, parentérale, aérienne, trans-cutanée, percutanée ou topique. Les compositions pharmaceutiques correspondantes peuvent être solides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceuti- ques couramment utilisées en médecine humaine ou vétérinaire comme par exemple: les comprimés simples ou dragéifiés, les comprimés retard, les gélules, les granulés, les poudres, les solutions, les sirops, les suppositoires, les préparations injectables lyophilisées ou non, les ovules, les crèmes, les gels, les pommades, les lotions, les gouttes, les collyres, les aérosols. Les principes actifs peuvent être incor- porés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, le stéarate de magnésium, la silice colloiïdale, le saccharose, le sorbitol, le mannitol, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les déri- vés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillant ou émulsi- fiant, les conservateurs. Il va être donné maintenant, à titre non limitatif, des exemples de mise en oeuvre de l'invention. Exemple 1 Préparation avec utilisation successive des bactéries de genre Klebsiella et Escherichia. La bactérie du genre Klebsiella, espèce pneumoniae, est de sérotype K68 répertoriée à l'Institut Pasteur de Paris sous la réfé- rence 58,5. La bactérie du genre Escherichia, espèce coli, est de sé- rotype 0119: B14, répertoriée par l'Institut Pasteur de Paris sous la référence 62.23. Le phage, homologue de Klebaiella, appartient au groupe morphologique C1 (nomenclature du Sous-Comité de Taxonomie des Bacté- riophages de l'International Committee for Taxonomy of Virus de l'I.A..S.) , il a une tête icosaédrique, une queue courte, difficile à mettre en évidence, le manchon et la plaque terminale ne sont pas détectables. Sur milieu gélosé, les plages de lyse ont de 0,5 à 3mm et sont de forme très irrégulière, avec des contours estompés et un cen- tre clair. Les clones sont rares. Le coliphage appartient au groupe morphologique C (nomen- clature du sous-comité de Taxonomie des Bactériophages de l'Interna- tional Committee for Taxonomy of Virus de l'I.A.M.S.), il a une tête isométrique, une queue très courte, difficile à mettre en évidence, un manchon et une plaque terminale non détectables. Sur milieu gélosé, les plages de lyse ont un diamètre de 1 à 1,5mm, une forme ronde, des contours réguliers, un centre voilé et des clones r confluents. Les deux souches bactériennes sont cultivées au moyen d'un fermenteur dans un milieu synthétique entièrement dialysable de compo- sition: NE4Cl 1,00 g L-Arginine 180,00 mg KEP4 K 2PO4 3,00 g L-Glutamine 417,00 mg Na2 P4 12I20 6,00 g L-Lysine HCl 104,00 mg gSO 47H2O 4,55 g LMéthionine 22,00 mg D-Glucose 140,00 g L-Phénylalanine 47,00 mg LThréonine 68,00 mg L-Leucine 78,00mg Acide folique 0,50 mg L-Histidine Inositol 1,00 mg HCl 60,00mg Nicotinamide 0,50 mg L-Isoleucine 78,00mg Pyridoxal HCl 0,50 mg L-Valine 67,00mg Panthoténate de Ca 0,50 mg LTryptophane 15,00mg Chlorure de Choline 0,50 mg Thiamine HCl 0,50 mg Le milieu est ensemencé avec un inoculum de Klebsiella pneumoniae qui se trouve en phase de croissance stationnaire. La densi- té initiale est de 1.107 bactéries par ml. La culture est placée à 37 C, sous agitation modérée. A la fin de la phase de latence, soit environ 60 minutes après l'ensemencement, les bactéries sont infectées par leurs phages homologues, la multiplicité d'infection optimale est de 0,03. L'évolution de la lyse est suivie à l'aide d'un compteur cellulaire. Lorsqu'il reste moins de 10 bactéries par ml, le milieu est à nouveau ensemencé avec un inoculum d'Escherichia qui se trouve en phase de croissance statiornnaire. La densité initiale de cette nou- velle culture est de 5-107 Escherichia par ml. A la fin de la phase de latencesoit dans ces conditions expérimentales, 20 minutes après le deuxième ensemencement, les bacté- ries sont infectées par les coliphages. La multiplicité d'infection est optimalement de 0,1. L'évolution de la lyse est suivie à l'aide d'un compteur cellulaire. Lorsqu'il reste moins de 103 Escherichia par ml, la cultu- re est stoppée par passage à travers un filtre membrane stérilisant de 0,22 um. Le filtrat est ensuite dialysé et concentré par ultrafil- tration tangentielle. La solution résultante peut être amenée à sec par lyophilisation ou passée directement sur une colonne de 5cm, de dia- mètre renfermant 1 litre de DEAE Trisacryl. L'évolution se fait par un gradient d'une solution de phosphate de sodium dont la concentration O varie de 50 à 650mM. Le pH de cette solution est de 795. Les fractions correspondant au premier pic d'élution (détection des hexoses neutres par la méthode au résorcinol sulfurique) sont rassemblées et dialysées contre une solution de phosphate de sodium à 10 mM et pH 795. La frac- tion obtenue est alors passée sur une colonne de 2,5 cm de diamètre renfermant 500 ml de résine DOWEX 50-X2 de 100 à 200 mesh (éluant: eau distillée). Les fractions correspondant au premier pic d'élution (dé- tection par réfractométrie ou des hexoses neutres par la méthode au ré- sorcinol) sont neutralisées par de la soude INi ou de l'ammoniaque à 5 %, 0 rassemblées et lyophilisées. On obtient les polysaccharides recherchés purifiésdont la composition molaire est la suivante: pour une molécu- le de galactose, 0,2 molécule de glucose, 2,2 molécules de mannose, 1 molécule d'acide galacturonique, 1 molécule d'acide pyruvique sous for- me de pyruvilidène. !5 Exemple 2: Les polysaccharides sont obtenus selon le mode opératoire de l'exemple 1 en n'utilisant que la bactérie de souche Klebsiella pneu- moniae. La composition des polysaccharides obtenus est la suivante: 69 % d'hexoses neutres, 0,25 % de glucosamine, 7 % d'acide pyruvique, 22,7 % d'acide galacturonique et 0,86 % de protéines. Exemple 3: Le filtrat de lyse des souches bactériennes de Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae, obtenu selon la procédure de l'exemple 1, est dialysé contre un tampon de phosphate de sodium à 150 mM et pH 7,4. Le filtrat est ensuite passé sur une colonne de 5cm de diamètre conte- nant 500 ml de gel GF 2000 Trisacryl sur lequel est fixé de façon co- valente 1,5 mg d'anticorps spécifiques par ml de gel. Après 1 heure d'incubation, la colonne est lavée par 4 fois son volume d'un tampon phosphate 150 mR à pE 7,4. L'élution se fait par une solution du même tampon contenant 2 M de chlorure de magnésium. Une fraction égale à 2 fois le volume de la colonne est retenue et dialysée contre de l'eau distillée. Cette fraction est lyophilisée et contient les polysaccha- rides de composition molaire suivante: pour 1 molécule de galactose, 2,5 molécules de mannose, 0,3 molécule de glucose, 1 molécule d'acide galacturonique, 1 molécule d'acide pyruvique sous forme de pyruvilidène. ETUDES PHARMACOLOGIQUES Les activités sur l'animal et sur l'homme des polysaccha- rides de l'invention ont été testées avec les produits obtenus selon les exemples 1 et 2. Activation des macrophages alvéolaires murins Ce test met en évidence le phénomène d'activation des ma- crophages par une mesure de leur activité cytostatique ou cytotoxique envers des cellules de lignée tumorale. Les leucocytes phagocytaires de la classe des monocytes- macrophages peuvent subir un processus d'activation qui se manifeste par des propriétés telles que l'augmentation de la phagocytose, l'aug- mentation de la sécrétion d'enzymes protéolytiques, de métabolites de l'oxygène tel que l'anion superoxyde ou le peroxyde d'hydrogène et de facteurs cytotoxiques. Ces processus contribuent à accroître le pouvoir bactéri- cide et tumoricide de ces cellules. De plus, ce processus d'activation permet à ces cellules d'augmenter leur capacité de présentation de divers antigènes aux lym- phocytes T coopérants. Enfin, le phénomène d'activation des macrophages permet la sécrétion de monokines telles les interférons ou l'interleu- kine 1 qui interviennent dans le processus de réponse immunitaire. Le test de mesure de l'activation des macrophages consis- te à traiter une culture de macrophages alvéolaires ou péritonéaux de rat ou de souris ou de monocytes humaines par des doses des polysaccha- rides de l'invention variant entre 0,001 et 50 ug/ml. Il est réalisé de la manière suivante: macrophages de souris de souche Balb c, Swiss, C57/B16 ou DBA/2 ou de rat de souche Kyoto ou Wistar sont placés dans une pla- que de microtitration dans du milieu de culture complété ou non par du sérum artificiel et de 1 à 10 Mg/ml de polymyxine. On ajoute les polysaccharides de l'invention ou le tampon correspondant sans polysaccharides comme contrôle négatif. Les cellu- les sont incubées 24 heures à 37oC. On élimine ensuite le surnageant et lave les cellules avec du milieu de culture. On ajoute alors les cellules cibles tumorales L1210 ou P815 dans du milieu complet. Le rapport macrophages/cellules cibles est de 10. On incube alors la culture durant 24 heures à 37 C. Puis on ajoute 1 - 2 x 104iq de thymidine tritiée par puits. Les cellules sont récupérées aprés 4 heures d'incubation à 370C sur un filtre en fibre de verre. Après séchage des filtres, la radioactivité est mesu- rée en présence d'un mélange scintillant. Les résultats correspondent à une moyenne de 3 mesures. Le pourcentage d'activation est exprimé: R- S A% R x 100 R: radioactivité incorporée par les cellules tumorales cultivées en présence de macrophages de référence. S: radioactivité incorporée par les cellules tumorales cultivées en présence de macrophages stimulés. Les résultats consignés dans le tableau I montrent l'acti- vité des produits selon l'exemple 1 et 3. Produit testé Dose % d'activation des macrophages _____ __ alvéolaires de rats Kyoto. Polysaccharides de 0,01 jg/ml 58 % ex,1 p Ag/ml 62 % ex 3 1 >g/ml 60 % ug/ml 86 % Xuramyl dipeptide (XDP) référence positive 0,01 >g/ml 28 % 1 > g/ml 90 % )Ug/ml 92 % Placebo., 0 Activité inductrice d'interféron invivo chez l'homme Les interférons sont un groupe de molécules d'origine pro- téique présentant des propriétés antivirales et immunomodulatrices. Dans des conditions normales, la clairance rapide de l'interféron sé- rique ne permet pas un dosage direct dans le sérum humain. Il est pos- sible, pour surmonter cette difficulté, de mesurer l'activité d'une 2 6 2 0 1 3 0 enzyme induite par l'interféron: la 2'-5' oligo-isoadenylate synthé- tase. On a pu démontrer que cette enzyme est un bon marqueur de l'in- terféron (réf. L.J.Z.Penn et B.R.G.Williams, J.Virol., 49, 1984, p.748- 753) chez les sujets sains, son activité dans les lymphocytes du sang périphérique est constante. Par contre, celle-ci augmente fortement en cas d'infection virale ou lors d'administration exogène d'interféron. L'effet d'une administration orale unique en dose élevée des polysaccharides de l'invention a été testée chez 10 volontaires. Un groupe de 5 individus a reçu un placebo alors que l'au- * tre groupe de 5 individus a reçu une dose unique de 2 mg des polysaccha- rides de l'invention préparés selon l'exemple 1. Des prises de sang ont été effectuées avant l'administra- tion du produit ainsi que 24 et 4P heures après. Les leucocytes péri- phériques ont été isolés et lysés. L'activité de la 2'-5' oligo-isoa- denylate synthétase a été mesurée dans ces lysats. Les résultats reproduits dans le tableau II démontrent qu'une dose unique de 2 mg de produits induisent une augmentation si- gnificative de l'activité de la 2'-5' oligo-isoadenylate synthétase particulièrement 48 heures après la prise orale. TAMBEAU II Variation de l'activité de la 2'-5' oligo-isoadenylate synthétase. Les valeurs initiales ont été rapportées à 100 %. 0 h 24 h 48 h Placebo 100 82 109 2mg produit de l'exemple 1 100 145 208 Induction de facteurs inhibiteurs de la migration des leucocytes (NIF-LIF) Une étude contre placebo a été réalisée chez 2 groupes de volontaires recevant un placebo ou une dose unique du produit selon l'exemple 1 par voie orale à la dose unique de 2 mg. L'administration est réalisée de façon randomisée en double aveugle. Des prises de sang sont effectuées 0 h, 24h, 48h, 72h et 96h après la prise du produit. Les résultats décrits dans le tableau III démontrent clai- rement que le produit induit une inhibition significative de la migra- tion des leucocytes par rapport au placebo. 1 1 TABLEAU III 0 h 24 h 48 h 96 h Placebo 0 0 3 3 Produit de l'exemple 1 2mg 0O 8 22 28 Les résultats sont exprimés en % d'inhibition de la migra- tion. L'induction de tels facteurs solubles démontre l'effet des polysaccharides de l'invention sur les mécanismes effecteurs de la ré- ponse immune. L'intérêt de l'induction de ces facteurs est illustré par les essais cliniques rapportés ci-dessous. Prévention et traitement des infections chroniques ou récidivante des voies respiratoires. Trois expérimentateurs ont étudié sur le plan clinique les polysaccharides de l'invention selon l'exemple 1 chez une population de patients atteint de bronchite chronique. Ces patients ont présenté au moins 2 épisodes infectieux dans les 12 mois précédant l'essai. Ont été exclus les patients présentant des troubles graves des fonctions hépa- tique, rénale ou cardiaque. De même ceux recevant une antibiothérapie systématique, un traitement immunomodulateur ou une corticothérapie. 46 patients entrant dans ces critères ont été traités par une prise orale de 0,06 mg de polysaccharides ou d'un placebo à jeun le matin, 20 jours consécutifs par mois durant 3 mois. L'étude a été menée en double aveugle. Les patients ont été observés durant les 9 mois qui ont suivi le début du traitement. Les résultats consignés dans le tableau IV montrent l'ef- fet du produit durant les 3 mois suivant le traitement. 0 TABLEAU IV Produit de % de dimi- signification l'invention Placebonution statistique Ex.1 nution statistique _ _ _ _ _ _ _ Ex. 1 Nombre d'épisodes s0,57 0,91 37,4 % p Durée de l'anti- biothérapie(jours) 6o,04 10,17 40,6 % p Ces résultats indiquent clairement une diminution signifi- cative des épisodes infectieux, de la durée de ces épisodes et de l'antibiothérapie chez les patients traités par les polysaccharides de l'invention, selon l'exemple 1. Prévention des complications infectieuses post-opératoires La dépression de l'immunité à médiation cellulaire (DTH) consécutive à un choc opératoire est un phénomène bien connu. Trois études ont eu pour objet l'effet d'un traitement oral avec les poly- saccharides de l'exemple 1 sur l'incidence des complications infec- tieuses post-opératoires. 58 patients furent traités durant la période de 7 jours précédant et suivant l'intervention chirurgicale. Les traitements ont été aministrés par voie orale à raison de 0,06 mg par jour selon une méthodologie en double-aveugle randomisée. L'immunité à médiation cel- lulaire a été évaluée 7 jours avant l'intervention, le jour de l'in- tervention et 7 jours après par la mesure de la réaction cutanée ob- tenue en réponse à 7 antigènes entrainant une réponse immunitaire cel- lulaire (système IMC-test de Biomérieux). Les résultats obtenus sont répertoriés dans le tableau V. TABLEAU V Polysaccharides Placebo de l'exemple 1 Différence du score IMC-TEST - 6,3 mm - 11,9 mm entre J-7 et JO I Signification statistique La dépression de l'immunité à médiation cellulaire provo- quée par l'intervention chirurgicale est nettement moins grande chez les patients traités avec le produit que chez ceux sous placebo. D'au- tre part, durant les 7 jours suivant l'acte chirurgical, le produit de l'invention entraine une récupération plus rapide des valeurs normales de l'immunité cellulaire par rapport au placebo. Le risque infectieux étant directement proportionnel au score de l'immunité cellulaire (réf.: J.I. GALLIN and A.S. FAUCI; Advances in Host Defense Mechanisms. Ed. Raven Press, New York, 1986, vol. 6), le produit de l'invention peut être considéré comme efficace dans la prévention et le traitement des complications infectieuses post-opératoires. ETUIDES TOXICOLOGIQUES Toxicité aigie Aucune toxicité des polysaccharides de l'invention n'a été observée 'mortalité, aspect macroscopique des organes) chez le rat après une administration orale de 20'000 fois la dose thérapeutique. Toxicité chronique Aucune toxicité chronique durant 4 mois de traitement chez le rat et le chien pour une dose journalière orale des polysaccharides de l'invention allant jusqu'à 1'800 fois la dose thérapeutique. Mutagénicité Les tests bactériens de Ames ont démontré une absence de pouvoir mutagène des polysaccharides de l'invention. TOLERANCE Les polysaccharides de l'invention administrés durant 3 mois consécutifs à la dose thérapeutique de 0,06 mg/jour sont parfai- tement bien tolérés. Les examens de tolérance biologique réalisés lors des différents essais cliniques n'ont démontré aucune variation anor- male des paramètres suivants: formule sanguine, hémoglobine, électro- lytes, urée, glycémie, protéines sériques, créatinine, acide urique, cholestérol total, ALAT, ASAT, CK, phosphatases alcalines et biliru- bine. La tolérance est jugée par les praticiens et les patients comme excellente. REVENDICATIONS 1. Polysaccharides extraits d'au moins un genre bactérien de type Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae, caractérisée en ce qu'ils renferment 65 à 75 d% d'oses neutres, 18 à 27 % d'acides uroni- ques, de 5 à 9 % d'acide pyruvique sous forme de pyruvilidène, moins de 0, 5 % d'osamines, moins de 1 % de protéines, et ayant une masse moléculaire supérieure à 50'000. 2. Polysaccharides selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'il renferment 65 à 75 % d'hexoses tels que le glucose, le galactose ou le mannose, 18 à 27 % d'acide uronique tel que l'acide galacturonique, 5 à 9 % d'acide pyravique, moins de 1 % de protéines, et moins de 0,5 % de glucosamine. 3. Polysaccharides selon la revendication 1 ou 2, caracté- risés en ce qu'ils renferment pour une molécule de galactose, de 0,2 à 0, 4 molécule de glucose, 2 à 2,5 molécules de mannose, une molécule d'acide galacturonique et une molécule d'acide pyruvique. 4. Polysaccharides selon la revendication 1 ou 2, caracté- risés en ce qu'ils sont extraits d'au moins une souche choisie parmi les souches Klebsiella pneumoniae K 68, Escherichia coli 0119 déposées à l'Institut Pasteur sous les références respectives 58.5 et 62.23. 5. Procédé d'obtention de polysaccharides selon une quel- conque des revendications 1 à 4, à partir d'un filtrat de lyse bacté- riophagique de culture d'au moins un genre bactérien de type Escheri- chia coli ou Klebsiella pneumoniae, caractérisé en ce qu'on concentre le dit filtrat et procède simultanément à une sélection de molécules par passage sur membranes à perméabilité sélective, puis traite la solution de polysaccharides extraits par chromatographie, recueille la première fraction, dialyse, concentre la solution et refractionne par chromatographie, recueille la première fraction et amène à sec. 6. Procédé d'obtention de polysaccharides selon la reven- dication 5, caractérisé en ce que la première chromatographie est de type affinité avec des anticorps immobilisés ou de type échange d'ions, la deuxième chromatographie est de type échange d'ions, et la fraction contenant les polysaccharides est amenée à sec par lyophilisation. 7. Procédé d'obtention de polysaccharides selon la revendi- cation 5 ou 6, caractérisé en ce que le filtrat de lyse bactérienne est obtenu avec utilisation simultanée de bactéries des genres Escheri- chia coli et Klebsiella pneumoniae. 8. Médicament caractérisé en ce que le principe actif est 2620 1 30 constitué par les polysaccharides selon une quelconque des revendica- tions 1 à 4, associé à un excipient adapté au type d'administration. 9. Médicament selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une substance antibiotique, antivirale, anti- fongique ou antiparasitaire. 10. Médicament selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'il comporte en outre un agent anti-tumoral, immuno-suppressif, anti- mitotique ou anti-inflammatoire. 11. Médicament selon la revendication 8, caractérisé en ce O que le principe est couplé à un vecteur macromoléculaire.