FR 2621916 A1 19890421 FR 8714352 A 19871019 L'invention concerne de nouveaux dérivés de la L-tyrosine solubles dans l'eau et un procédé pour leur préparation. La L-tyrosine est un acide aminé important pour l'être humain. L'une des voies biosynthétiques d'utilisa- tion de la L-tyrosine est celle conduisant à la formation de la mélanine dans la peau humaine. L'utilisation de la L-tyrosine dans des produits cosmétiques remonte à une quinzaine d'années aux U.S.A. Ces premières utilisations avaient pour but de stimuler, par un apport externe en acide aminé, la biosynthèse de la mélanine, donc la pigmentation naturelle de la peau blanche. Par cette voie, une autoprotection contre le soleil pouvait être escomptée. A l'heure actuelle, les produits solaires stimulant la mélanogénèse mettent à profit cette propriété de la L,-tyrosine. Néanmoins, la L-tyrosine présente l'inconvé- nient d'être peu soluble dans tous les solvants, même sous la forme d'un sel avec le sodiumr le potassium, les amines ou les bases fortes, aux pH voisins de la neutrali- té. Ceci limite évidemment son utilisation. Il serait donc utile de disposer de dérivés de la L-tyrosine solubles dans l'eau, capables à la fois de franchir la barrière cutanée et d'être transformés dans la peau en L-tyrosine mntabolisable. C'est ce que permet de réaliser la présente invention. Plus particulièrement, l'invention concerne de nouveaux dérivés de la Ltyrosine caractérisés en ce qu'ils ont la formule générale R1- NH - CH - C - R2 CH2 O (I) OH o Rl est un groupe L-malyle, L-lactyle, L-glutamyle ou L-aspartyle et R2 est un groupe -OH, -OM, méthoxy, éthoxy -2 - ou amino, M représentant un métal alcalin. On préfère, à ce jour, les dérivés de la formule générale I dans lesquels R1 est un groupe L-malyle ou L-lactyle et R2 est un groupe -OH ou -OM, M étant un métal alcalin, en particulier Na ou K. Il est à noter que les termes "groupes L-malyle, L-glutamyle et L-aspartyle", englobent aussi bien les groupes L-malyle, L-glutamyle et L-aspartyle proprement dits que leurs sels, en particulier avec des métaux alcalins tels que Na ou K. L'invention concerne également un procédé de préparation d'un dérivé de la L-tyrosine ayant la formule générale I ci-dessus, carac- térisé en ce qu'on condense par voie enzymatique un acide choisi parmi les acides L-malique, L-lactique, L-glutamique et L-aspartique, avec un dérivé de la L-tyrosine de départ choisi parmi les esters éthylique et méthylique et l'amide de la L-tyrosine, en présence d'un enzyme mul- timérique possédant une masse molaire supérieure à 100.000, ne présen- tant aucune activité protéolytique sur la caséine et issu d'une culture de Micrococcus caseolyticus, et dans un milieu aqueux. Selon un mode de mise en oeuvre particulièrement préféré, le milieux aqueux contient un composé de formule générale II comme co-solvant: RO -+(CH2 - CH2 - O-n- R (II) dans laquelle R est un groupe méthyle ou éthyle et n est un nombre entier de 1 à 5. On préfère que R = méthyle et n = 2 ou 3 (diglyme ou triglyme). De préférence, le milieu réactionnel contient, en outre, des cations métalliques, en particulier le zinc et/ou le manganèse, pour accélérer la réaction. L'acide de départ peut être utilisé sous forme de l'acide libre ou d'un de ses sels, par exemple du sel de sodium ou de potassium. L'utilisation d'un sel de l'acide présente l'avantage de simplifier le réglage du pH du milieu réactionnel. La réaction de condensation étant stéréospécifique, l'acide de départ peut être dans la forme stéréospécifiquement pure L ou du mélange racémique D, L. Dans ce dernier cas, seule la forme L sera consommée par la réaction, la forme D n'étant pas "reconnue" par l'enzyme. Le dérivé de L-tyrosine de départ peut être utili- sé tel quel ou sous forme d'un sel d'addition d'acide, par exemple du chlorhydrate, si désiré. On utilisera habituellement une proportion molaire du dérivé de Ltyrosine de départ sensiblement égale à celle de l'acide de départ ou supérieure à celle-ci. La concentration du dérivé de L-tyrosine de départ peut aller, par exemple, de 50 à 500 mM, de préférence de 200 à 400 mM. Celle de l'acide de départ peut aller, par exem- ple, de 50 à 300 mM, de préférence de 100 à 200 mM. La réaction de condensation peut être conduite & un pH de 4 à 8, de préférence 6 à 7 et à une température de 10 à 50 C, de préférence d'environ 30 à 45 C. L'enzyme utilisé dans le procédé de l'invention est un enzyme connu décrit dans le brevet français No. 2 589 479 sous le nom d'enzyme E. Ce brevet enseigne également un procédé pour sa préparation à partir d'une culture de Micrococcus caseolyticus (souche déposée à l'Institut Pasteur à Paris sous le No. 1194>. On peut éga- lement utiliser la version modifiée d'enzyme dont la pré- paration est décrite dans la demande de brevet français No. 87 00323 déposée le 14 Janvier 1987. Le composé de formule II, lorsqu'on l'utilise, sera présent à raison de 20 à 75% en poids, de préférence 50 à 60% en poids, par rapport au milieux aqueux (total eau ± composé de formule II). Le triglyme (tétraoxa- 2,5,8,11-dodécane ou éther diméthylique du triéthylène glycol) est le composé de formule II tout spécialement préféré, suivi du diglyme (éther diméthylique du diéthylè- ne-glycol). Les cations métalliques, tels que les cations zinc et/ou manganèse, si on en utilise, peuvent être apportés par des sels solubles dans l'eau compatibles, tels que les chlorures ou sulfates. Leur concentration dans le milieu réactionnel sous forme de sels solubles dans l'eau peut aller de 0,1 millimole à 5 millimoles par litre (soit une molarité de 0,1 à 5 mM). On préfère l'ion zinc à une molarité de 0,5 à 5 mM. - 4 2621916 L'ordre d'addition des divers constituants est de préférence tel que l'enzyme et le composé de formule II soient ajoutés après ajustement du pH. On a observé, en effet, que le composé de formule II pouvait gêner la mesu- re du pH, lequel doit être correctement ajusté avant d'ajouter l'enzyme. Avantageusement, la préparation du milieu réac- tionnel peut se faire dans l'ordre suivant: a) dissolution de l'acide et du dérivé de L-tyro- sine de départ dans de l'eau et réglage du pH, b) addition du composé de formule II, c) addition éventuelle des cations métalliques (cations de zinc par exemple), et d) addition de l'enzyme; l'étape c) pouvant tou- tefois être exécutée avant l'étape b). La durée de la réaction peut aller de 1 à 36 heu- res, de préférence de 12 à 24 heures. Elle variera en fonction de la concentration d'enzyme utilisée. A titre indicatif, on peut employer des concentrations d'enzyme allant de 5 à 100 unités/millilitre de milieu réactionnel. Les dérivés de L-tyrosine de l'invention se carac- térisent par une solubilité élevée dans l'eau, de l'ordre de plusieurs centaines de grammes par litre, qui les rend éminemment utiles pour la formulation de compositions à usage cosmétique (crèmes photosensibilisantes, par exemple) ou pharmaceutiques (pour l'alimentation parenté- rale, par exemple). Les exemples non limitatifs suivants sont donnés en vue d'illustrer l'invention. Dans les exemples, les dérivés de la L-tyrosine produits ont été analysés par une méthode HPLC (chromato- graphe Millipore-Waters) à l'aide d'une colonne MicroBondapack C18 (Millipore-Waters, longueur: 30 cm; diamètre: 4,7 mm). Le solvant d'élution avait la compo- sition suivante: - acétonitrile: 9% (v/v) - phosphate monosodique 12,5 mM, pH 3,5: 91% (v/v) - Le débit de l'éluant était de 2 ml/mn et la tempé- rature de la colonne était de 40 C. La détection des composés était réalisée & l'aide d'un spectrophotomètre dont la longueur d'onde était fixée & 254 nm. La concentration des produits était déterminée à l'aide du coefficient d'absorption de la Ltyrosine -1 - ( 254 nm = 0,36 mM.cm). L'enzyme utilisé dans tous les exemples avait été produit conformément aux enseignements de la demande de brevet français No. 87 00323 précitée. Cet enzyme était sous forme libre. Il est à noter toutefois, que l'enzyme pourrait aussi être employé sous forme immobilisée sur un support adéquat. EXEMPLE 1: Production et purification du L-malvl-L-tyro- sine (sel disodique) (1) Synthèse de L-malyl-L-tyrosine, ester éthylique: HOOC-CH2-CHOH-COOH + NH2-CH-COO-CH2-CH3 I CH OH Acide L-malique L-tyrosine, ester éthylique HOOC-CH 2-CHOH-CO-NH-CH-COO-CH2-CH3 CH2 OH L-malyl-L-tyrosine, ester éthylique - 6 2- Expérience No. 1 Le milieu réactionnel est préparé comme suit: Dissolution de 9,4 g d'acide L-malique (masse molaire 134) et de 34,3 g de chlorhydrate d'ester éthyli- que de L-tyrosine dans 80 g d'eau déminéralisée. Le pH de la solution est ajusté à 6,4 à l'aide de soude 4N, ce qui convertit l'acide L-malique en L-malate de sodium. On ajoute 0,9 ml d'une solution de sulfate de zinc 0, 2M. Le poids de cette solution est ajusté à 151 g avec de l'eau déminéralisée. Addition de 192 g de triglyme (masse molaire: 178,2). Le milieu réactionnel est agité magnétiquement jusqu'à l'obtention d'une solution homogène et placé dans une étuve thermostatée à 40 C. La réaction est démarrée par addition de 7g de la solution-mère d'enzyme. Cette solution-mère présente une activité égale à 1000 U/g, mesurée dans les conditions suivantes: - L-malyl-L-tyrosine, ester éthylique: 17 mM pH 6,4 - température: 40 C La réaction est suivie par la libération de L-ty- rosine, ester éthylique au cours du temps (analyse HPLC décrite ci-dessus) . L'unité enzymatique U correspond à l'hydrolyse d'une micromole de Lmalyl-L-tyrosine, ester éthylique par minute. Dans le milieu réactionnel résultant, les concen- trations des ingrédients étaient les suivantes: L- malate de sodium: 200 mM; ester éthylique de L-tyrosine: 400 mM; triglyme: 55% en poids; chlorure de zinc: 0,5 mM; et enzyme: 20 U/ml. Le milieu réactionnel est incubé sous agitation douce pendant 15 heures. Lorsque la réaction enzymatique est terminée, la dénaturation de l'enzyme est réalisée par acidification du milieu réactionnel à l'aide de 8 ml d'HCl 2N jusqu'à l'obtention d'un pH compris entre 3 et 4. Expériences No. 2 à 4 -7- On a procédé comme & l'expérience No. l, si ce n'est que les concentrations des ingrédients du milieu réactionnel étaient telles que récapitulées dans le Tableau 1 suivant, qui répète également les conditions utilisées dans l'expérience No. 1. TABLEAU 1 Exp.1 Exp.2 Exp.3 Exp.4 L-malate de Na, rmM4 200 100 100 100 L-tyrosine, ester 400 100 250 250 éthylique, nM Triglyme, % (p/p) 55 55 55 0 C12Zn, M4 0,5 0,5 0,5 0 enzyme, U/ml 20 20 20 20 Après réaction, les milieux réactionnels sont analysés par la méthode HPLC décrite ci-dessus. Les résul- tats récapitulés dans le Tableau 2 ci-dessous ont été obtenus. TABLEAU 2 Concentrations finales de L-malyl-L-tyrosine, ester éthy- lique des milieux réactionnels après 15 heures d'incubation Expérience 1 2 3 4 L-malyl-L-tyrosine, ester éthylique 149 61 91 19 mM* Rendement, % 74 61 91 19 * les concentrations ont été déterminées avant l'étape d'acidification finale. (2) Purification de la L-malyl-L-tvrosine, ester éthylique Cette purification a été réalisée sur le milieu obtenu dans l'expérience No. 1. Ce milieu, d'un volume de 350 ml contenait 17 g de L-malyl-L-tyrosine, ester éthylique. - 8 -- On commence par diluer le milieu réactionnel avec de l'eau de façon à porter le volume total à un litre. La première étape de purification consiste & effectuer plusieurs extractions successives avec 1,5 litre de toluène, un solvant non miscible à l'eau, de façon à éliminer la plus grande partie du triglyme. Apres deux extractions successives, le volume de la phase aqueuse finale, qui contient 16,2 g de L-malyl-L-tyrosine, ester éthylique, est de 855 ml. Le rendement est de 95%. La phase aqueuse (855 ml) est ensuite soumise à une extraction avec 3 litres d'acétate d'éthyle, solvant volatil non miscible à l'eau, de manière à extraire la L-malyl-L-tyrosine, ester éthylique (avec le groupe acide du fragment malyle sous forme acide libre) dans la phase acétate d'éthyle. On élimine ensuite l'acétate d'éthyle par évaporation sous vide à 40 C de façon à obtenir 15,2 g de produit pur (rendement: 89%). On dissout le produit dans de l'eau jusqu'à un volume de 750 ml. Le produit est alors désestérifié de façon à obte- nir le produit final recherché, la L-malyl-L-tyrosine sous forme de son sel disodique. Cette opération est réa- lisée & l'aide d'un enzyme, la chymotrypsine (E.C.: 3.4.21.1.) Q(-chymotrypsine L-malyl-L-tyrosine-ester éthylique. L-malyl-L- tyrosine + CH3-CH2-OH Conditions de la désestérification enzymatique: t Après cette opération, la chymotrypsine est élimi- née par ultrafiltration (module à fibres creuses AMICON; seuil de coupure: 10.000 daltons). L'ultrafiltrat qui contient la L-malyl-L-tyrosine est concentré par évapora- tion sous vide. Volume final: 600 ml. Les quantités de solvant résiduelles présentes dans la phase aqueuse finale sont éliminées par extraction avec 2 litres d'acétate d'éthyle. Le produit désestérifié - 9 - sous forme de sel disodique n'est pas soluble dans l'acé- tate d'éthyle et reste en totalité dans la phase aqueuse. La phase aqueuse est alors concentrée par évaporation sous vide puis lyophilisée. La structure du produit a été vérifiée par analyse élémentaire et spectroscopie RMN. La solubilité dans l'eau & 25 C et pH 6 du sel disodique de la L-malyl-L-tyrosine (masse molaire: 345) est de 485 g/l, soit 1,40 mole/litre. EXEMPLE 2: Synthèse de la L-malyl-L-tyrosine, ester mé- thvlique Conditions opératoires identiques à celles de l'exemple 1, sauf en ce qui concerne: - chlorhydrate de L-tyrosine, ester méthylique: 0 r25M - malate de sodium: 0,1 M Après 20 heures d'incubation à 40 C, la concentra- tion de L-malyl-L-tyrosine, ester méthylique est de 86 mM, ce qui correspond & un rendement égal à 86% (calculé d'après la concentration initiale d'acide L-malique). Cette valeur est sensiblement égale au rendement obtenu avec l'ester éthylique de la L-tyrosine. L'ester obtenu peut être purifié et désestérifié comme décrit à l'exemple 1. Les esters de la L-tyrosine sont relativement instables en solution aqueuse (en particulier pour l'ester méthylique); on observe une désestérification spontanée conduisant à la formation d'un précipité en raison de la très faible solubilité de la L-tyrosine sous forme libre. En conséquence, la réaction de condensation enzyma- tique doit être suffisamment rapide pour éviter une dégra- dation importante du substrat. EXEMPLE 3: Synthèse enzymatique de L-lactvl-L-tyrosine (sel monosodique) - a) Synthèse de L-lactyl-L-tyrosine, ester éthylique CH3-CHOH-COOH + NH2-CH-COO-CH2-CH3 CH ' OH Acide L-lactique L-tyrosine, ester éthylique CH3-CHOH-CO-NH-CH-COO-CH2-CH3 1I CH2 OH L-lactyl-L-tyrosine, ester éthylique Les conditions de synthèse sont identiques à celles décri- tes dans les exemples 1 et 2, sauf pour ce qui concerne: - L-lactate de sodium: 0,1 M - L-tyrosine, ester éthylique: 0,25 M Deux synthèses ont été effectuées, l'une en pré- sence de 55% de triglyme, l'autre en absence de cosolvant. Les données et résultats sont résumées dans le tableau 3. - 11 - TABLEAU 3: Synthèse enzymatique de L-lactyl-L-tyrosine, ester éthylique Concentration de L-lactyl-L-tyrosine, ester éthylique, mM Temps Expérience 1 Expérience 2 d'incubation En présence de heures 55% (p/p) de triglyme Sans cosolvant ___________________________________________________________ 5 40 6 64 13 28 66 16 Rendement final de la réaction 66 16 b) Le lactyl-L-tyrosine, ester éthylique est purifié et désestérifié selon le mode opératoire décrit dans l'Exemple 1, à propos du L-malyl-L-tyrosine, ester éthyli- que, pour obtenir le sel monosodique de la L-lactyl-L-ty- rosine. Ce sel (masse molaire: 274) a une solubilité dans l'eau à 25 C et pH 6 de 330 g/litre, soit 1,2 mo- le/litre. EXEMPLE 4: Mise en évidence de la stéréospécificité de la synthèse vis-à-vis de l'acide orqanique (acide L-malique et acide Llactique) (a) Essai de synthèse avec le D-malate de sodium On opère selon le mode opératoire de l'exemple 1, & l'exception des conditions expérimentales suivantes: - D-malate de sodium: 0,1 M - L-tyrosine, ester éthylique: 0,25 M - incubation: 18 heures Le D-malate de sodium a bté préparé par neutrali- sation à l'aide de soude 4 N de l'acide D-malique (SIGMA M 0750). Ce produit contient 2,5% d'isomère L. - 12 - Après 18 heures d'incubation, on mesure une con- centration de malyl-L-tyrosine, ester éthylique égale à 2,2 mM, ce qui correspond à la concentration de l'isomère L dans le produit de départ. L'isomère D de l'acide malique n'est donc pas reconnu par l'enzyme. (b) Synthèse de L-malyl-L-tyrosine, ester éthylique en pré- sence de D,L-malate de sodium (mélange racémique) On opère selon le mode opératoire de l'exemple 1, à l'exception des conditions expérimentales suivantes: - D,L-malate de sodium: 0,1 M - L-tyrosine, ester éthylique: 0, 25 M - incubation: 18 heures. Après 18 heures d'incubation, on mesure une con- centration de L-malyl-L-tyrosine, ester éthylique égale à 37 mM, ce qui correspond & un rendement de 75% (calculé d'après la concentration initiale d'acide malique sous forme L (50 mM)). Ce résultat confirme la stéréospécificité de la réaction enzymatique vis-à-vis de l'acide L-malique. (c) Essai de synthèse en présence de D-lactate de sodium On opère selon le mode opératoire de l'exemple 1, à l'exception des conditions expérimentales suivantes: - D-lactate de sodium: 0,1 M - L-tyrosine, ester éthylique: 0,25 M - incubation: 21 heures Après 21 heures d'incubation, aucune synthèse n'est observée. (d) Synthèse de L-lactyl-L-tyrosine, ester éthylique en présence de D,Llactate de sodium On opère selon le mode opératoire de l'exemple 1, à l'exception des conditions expérimentales suivantes: - D,L-lactate de sodium: 0,1 M - L-tyrosine, ester éthylique: 0,25 M - incubation: 16 heures Après 16 heures d'incubation, on observe la syn- thèse de L-lactyl-L-tyrosine, ester éthylique à une con- centration égale à 38 mM. Ce résultat confirme la stéréos- pécificité de la réaction vis-à-vis de l'acide L-lactique. - 13 - EXEMPLE 5: Synthèse de L-malYl-L-tyrosinamide HOOC-CH2-CHOH-COOH + NH CH-CO-NH 2 2 H-ON2 CH2 [ Dé OH Acide L-malique L-tyrosinamide HOOC-CH2-CHOH-CO-NH-CH-CO-NH2 CH2 OH L-malyl-L-tyrosinamide On opère selon le mode opératoire de l'exemple l, à l'exception des conditions expérimentales suivantes: - Lmalate de sodium: 0,1 M - L-tyrosinamide: 0,25 M - incubation: 18 heures Apres 18 heures d'incubation, on mesure une con- centration de produit égale à 85 mM. Le rendement de cette réaction est de 85%. En répétant la synthèse en l'absence de co-solvant (triglyme), on mesure une concentration de produit égale à 12 mM seulement. Le produit L-malyl-L-ty- rosinamide peut être facilement désamidé par de la chymo- trypsine comme décrit dans l'exemple 1. EXEMPLE 12: Synthèse des esters éthyliques de L-aspartyl- L-tyrosine et de L-glutamvl-L-tyrosine On a opéré selon le mode opératoire général et les conditions de-l'exemple 1 si ce n'est pour les condi- tions suivantes: - température: 30 C - L-aspartate ou L-glutamate de sodium: 0,lM - L-tyrosine, ester éthylique: 0,25M - 14 - - sulfate de zinc: 1 mM - concentration d'enzyme: 100 U/ml - incubation: 18 heures On a obtenu les composés du titre à des concentra- tions respectives de 6,6 et 17 mM, ce qui correspond à des rendements de 6,6 et 17%, respectivement. Il va de soi que les modes de réalisation décrits ne sont que des exemples et qu'on pourrait les modifier, notamment par substitution d'équivalents techniques, sans sortir pour cela du cadre de l'invention. - 15 - REVENDICATIONS 1. Nouveaux dérivés de la L-tyrosine, caractérisés en ce qu'ils ont la formule générale R. -NH - C - C - R CH 0 OH o Rl est un groupe L-malyle, L-lactyle, L-glutamyle ou L-aspartyle et R2 est un groupe -OH, -OM, méthoxy, éthoxy ou amino, M représentant un métal alcalin. 2. Composés selon la revendication 1, caractérisée en en ce que Rl est un groupe L-malyle ou L-lactyle et R2 est un groupe -OH ou -OM. 3. Un procédé de préparation d'un composé de la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on condense par voie enzymatique un acide choisi parmi les acides L-malique, L-lactique, L-glutamique et L-aspartique, avec un dérivé de la L-tyrosine choisi parmi les esters éthyli- que et méthylique et l'amide de la L-tyrosine, en présence d'un enzyme multimêrique possédant une masse molaire supérieure à 100.000, ne présentant aucune activité pro- téolytique sur la caséine et issu d'une culture de Micrococcus caseolyticus, et dans un milieu aqueux. 4. Un procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le milieu aqueux contient un composé de formule générale II, comme co-solvant: RO C CH2-CH -O)n R (II) dans laquelle R est un groupe méthyle ou éthyle et n est un nombre entier de 1 à 5. 5. Un procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le composé de formule II représente 20 à 75% en poids du milieu aqueux. Z621916 - 16 - 6. Un procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le composé de formule II représente 50 à 60% en poids du milieu aqueux. 7. Un procédé selon la revendication 4, 5 ou 6, caractérisé en ce que le composé de formule II est le diglyme ou le triglyme. 8. Un procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 7, caractérisé en ce que le milieu réactionnel contient en outre des ions zinc. 9. Un procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 8, caractérisé en ce que la réaction de con- densation est conduite à un pH de 4 à 8, de préférence 6 à 7. 10. Un procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 9, caractérisé enxi ce que la réaction de con- densation est conduite & une température de 10 à 50 C, de préférence 30-45 C.