FR 2616444 A1 19881216 FR 8708090 A 19870610 2616 4 4 4 SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES CODANT POUR DES POLYPEPTIDES DOTES D'UNE ACTIVITE LARVICIDE VIS-A-VIS DE LEPIDOPTERES L'invention a pour objet des séquences nucléo- tidiques codant pour des polypeptides dotés d'une activi- té larvicide vis-à-vis de lépidoptères. Elle vise plus spécialement des moyens, en particulier des séquences nucléotidiques, des polypep- tides ou encore des vecteurs, ou des souches bactériennes modifiés par ces séquences et exprimant des polypeptides permettant de préparer des compositions larvicides acti- ves vis-à-vis de lépidoptères, de préférence de S.littoralis, ou capables de transformer les plantes à traiter en leur conférant ce type d'activité. On sait que la plupart des isolats de B.thuringiensis présentent une activité toxique à l'égard de larves de plus de cent espèces de lépidoptères. Cette activité résulte de la capacité des souches de B.thuringiensis à synthétiser, au moment de la sporulation, des inclusions cristallines de nature protéique, ou 6-endotoxines, sous le contrôle d'un ou plusieurs types de gènes. On a montré que l'activité de ces polypeptides est contenue dans la moitié NH 2-terminale ou N-terminale de la protéine. Les travaux réalisés ont montré la spécificité élevée des -endotoxines vis-à-vis de larves d'une espèce donnée. En raison de cette spécificité élevée, de nom- breuses espèces de lépidoptères, notamment de la famille des Noctuelles, ne réagissent que faiblement aux prépara- tions commerciales de B.thurinqiensis disponibles. Il en est ainsi en particulier de l'espèce Spodoptera littoralis (ciaprès S.littoralis), insecte polyphage qui constitue le principal parasite du coton et d'autres cultures industriellement importantes. Parmi ces cultures, on citera le mais, le ricin, le tabac, l'arachide, des plantes fourragères, telles que le trèfle ou la luzerne, ou encore des produits maraichers comme le chou ou la tomate. On conçoit donc l'intérêt de disposer de moyens ciblant spécifiquement et efficacement la famille des Noctuelles et notamment S.littoralis. Les gènes de 6-endotoxines identifiés à ce jour, ne codent pas pour un polypeptide actif pré- férentiellement à l'égard de S.littoralis. La recherche par les inventeurs d'une séquence de nucléotides codant pour un polypeptide actif de préférence vis-à-vis des Noctuelles, plus spécialement vis-à-vis de S.littoralis, les a conduits à étudier les isolats naturels de deux souches de B.thurinuiensis dont l'activité larvicide sur S.littoralis apparait plus élevée que celle des préparations industrielles faites & partir d'autres souches de B.thuringiensis. Il s'agit des souches aizawai 7-29 et entomocidus 6-01. L'étude de ces isolats a permis de mettre en évidence l'existence de plusieurs gènes de 6-endotoxines de structures différentes et de spécificités différentes dont deux gènes préférentiellement actifs contre P.brassicae mais peu actifs vis-à-vis de la Noctuelle du coton et un gène inactif vis-à-vis de P.brassicae et de S.littoralis. En étudiant l'ADN total de ces isolats et en effectuant des hybridations appropriées, suivies du clonage des fragments identifiés par hybridation, les inventeurs ont constaté qu'il est possible d'isoler des séquences nucléotidiques impliquées dans des gènes de 6-endotoxines codant pour des polypeptides actifs, de préférence contre S.littoralis. L'invention a donc pour but de fournir des séquences nucléotidiques capables de coder pour au moins la partie NH2-terminale d'une 6endotoxine toxique contre les Noctuelles, dé préférence contre S.littoralis. Elle a également pour but de fournir un polypeptide de ce type. L'invention vise en outre un procédé d'obten- tion d'une telle séquence et d'un polypeptide présentant l'activité recherchée ainsi que les moyens intermédiaires tels que vecteurs et souches bactériennes utilisables pour l'obtention du polypeptide. L'invention vise de plus les applications de ces séquences et polypeptides pour l'élaboration de compositions larvicides à l'égard des Noctuelles, en particulier de S.littoralis et pour la transformation des plantes susceptibles d'être infectées par ces larves. L'invention concerne une séquence nucléotidique codant pour au moins une partie de la région N terminale d'un polypeptide toxique de manière spécifique vis-à-vis de larves de lépidoptères de la famille des Noctuelles, de préférence vis-à-vis de celles de S.littoralis, carac- térisée par sa capacité d'hybridation avec un gène capable d'exprimer un polypeptide toxique vis-à-vis de larves de S.littoralis. Selon un autre aspect de l'invention, la séquence nucléotidique est caractérisée en ce qu'elle est portée par une séquence de nucléotides d'environ 3kb telle qu'obtenue par recombinaison génétique in vitro de séquences nucléotidiques de B.thurinciensis capables de s'hybrider avec des sondes 1, 2 et 3 de pHTA2 rapportées sur la figure 2. Le fragment de 3kb correspond plus spé- cialement au fragment de restriction BindIII-PstI. Les séquences nucléotidiques de l'invention sont, en outre, caractérisées en ce qu'elles comportent des sites dans l'ordre suivant: HindIII - HincII - B"lII KPnI - HindIII - PstI. De manière préférée, ces séquences nucléotidiques sont obtenues par recombinaison génétique in vitro de séquences d'ADN de deux souches différentes de B.thurinqiensis. Des souches de B.thurinqiensis particulièrement appropriées pour la construction de ces séquences nucléotidiques, sont les souches correspondant à entomocidus 6-01 et aizawai 7-29, déposées le 21 Avril 1987 respectivement sous les n 1-660 et 1-661 à la Collection nationale de Culture de Microorganismes (C.N.C.M.) à Paris. D'une manière avantageuse, les séquences nucléotidiques de l'invention codent pour un polypeptide capable de former un complexe immunologique avec des anticorps dirigés contre des polypeptides présentant l'activité larvicide à l'égard de S.littoralis. Selon encore un autre aspect, les séquences nucléotidiques de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles sont capables de s'hybrider avec une sonde formée à partir de la séquence présentant l'enchainement (I) suivant: -'1 GTC TAC TTG ACA GGG tTA GGA ACA TAA TCG GTC AAT TTT AAA TAT GGG GCA TAT ATT GAT ATT TTA TAA AAT TTG TTA CGT TTT TTG TAT TTT TTC ATA AGA TGT GTC ATA TGT ATT AAA TCG TGG TAA TGA AAA ACA GTA TCA AAC TAT CAG AAC TTT GGT AGT TTA ATA AAA AAA CGG AGG TAT TTT ATG GAG GAA AAT AAT CAA AAT CAA TGC'ATA CC.T TAC AAT TGT TTA AGT AAT 241* CCT GAA GAA GTA CTT-TTG GAT GGA GAA CGG ATA TCA ACT GGT AAT TCA TCA ATT GAT ATT TCT CTG TCA CTT GTT CAG TTT CTG TTA TCT AAC TTT GTA CCA GGG GGA GGA TTT TTA GTT GGA TTA ATA GAT TTT CTA TGG GGA ATA GTT GGC CCT TCT CAA TGG GAT CCA TTT CTA GTA CAA ATT GAA CAA TTA ATT AAT GAA AGA ATA GCT GAA TTT GCT AGG AAT GCT GCT ATT GCT AAT TTA GAA GGA TTA GGA AAC AAT TTC AAT ATA TAT GTG GAA GCA TTT AAA GAA TGG GAA GAA GAT CCT AAT AAT CCA GAA ACC AGG ACC AGA GTA ATT GAT CGC TTT CGT ATA CTT GAT GGG CTA CTT GAA AGG GAC ATT CCT TCG TTT CGA ATT TCT GGA TTT GAA GTA CCCCTT TTA TCC GTT TAT GCT CAA GCG GCC AAT CTG CAT CTA GCT ATA TTA AGA GAT TCT GTA ATT TTT GGA GAA AGA TGG GGA TTG ACA ACG ATA AAT GTC AAT GAA AAC TAT AAT AGA CTA ATT AGG CAT ATT GAT GAA TAT GCT GAT CAC TGT GCA AAT ACG TAT AAT CGG GGA TTA AAT AAT TTA u41 CCG AAA TCT ACG TAT CAA GAT TGG ATA ACA TAT AAT CGA TTA CGG AGA GAC TTA ACA TTC q901 ACT GTA TTA GAT ATC GCC GCT TTC TTT CCA AAC TAT GAC Des séquences de nucléotides codant pour au moins une partie de la région N-terminale d'un poly- peptide toxique de manière spécifique vis-à-vis de larves de lépidoptères de la famille des Noctuelles, de préférence vis-à-vis de S.littoralis, sont caractérisées en ce qu'elles comprennent l'enchaînement (I) défini ci-dessus. D'une manière avantageuse, la séquence nucléo- tidique caractérisée par l'enchaînement défini ci-dessus code pour une partie d'un polypeptide ayant une activité larvicide vis-à-vis de S. littoralis plus élevée que les polypeptides codés par des isolats naturels actuellement connus pour leurs effets vis-à-vis de S.littoralis. Il va de soi que les bases de la séquence nucléotidique considérée peuvent être dans un ordre différent de celui trouvé dans les gènes et/ou que ces bases peuvent être le cas échéant substituées, dès lors qu'une sonde élaborée à partir d'une telle séquence donne une réponse caractéristique et non équivoque quant à la capacité de reconnaître la présence d'un gène de 6-endotoxine codant pour un polypeptide actif à l'égard de S.littoralis. Toute séquence nucléotidique hybridable avec celle de l'enchaînement I, telle qu'obtenue par trans- cription enzymatique inverse de l'ARN correspondant ou encore par synthèse chimique entrant également dans le cadre de l'invention. L'étude de cette séquence nucléotidique montre qu'elle est caractérisée par un codon d'initiation ATG situé en position 190 à partir duquel une phase ouverte de lecture de 750 nucléotides a été identifiée. Cette séquence est également caractérisée par un site d'attachement des ribosomes GGAGG en positions 179 à 183. Selon un autre aspect, la séquence de nucléoti- des de l'invention est caractérisée en ce qu'elle com- porte en amont du codon ATG, une séquence allant du nucléotide en position 86 au nucléotide en position 126 fortement homologue à la région trouvée par Wong et al. (1983) et décrit dans (16) en amont du gène du cristal de la souche kurstaki HD1 Dipel (BTK) et dont les auteurs ont montré qu'elle contenait trois promoteurs BtI, BtII et Ec qui sont respectivement fonctionnels chez ]0B.thuringiensis et E.coli. L'homologie de ces séquences est d'environ 70%. L'invention concerne également une séquence de nucléotides codant pour la séquence (II) d'acides aminés suivante: MET GLU GLU ASN ASN GLN ASN GLN CYS ILE PRO TYR ASN CYS LEU SER ASN 24 1 PRO GLU GLU VAL LEU LEU ASP GLY GLU ARG ILE SER THR GLY ASN SER SER ILE ASP ILE SER LEU SER LEU VAL GLN PHE LEU LEU SER ASN PHE VAL PRO CLY GLY GLY PHE LEU VAL GLY LEU ILE ASP PHE VAL TRP GLY ILE VAL GLY PRO SER.GLN TRP ASP ALA PHE LEU VAL GLN ILE GLU GLN LEU ILE ASN GLU ARG ILE ALA GLU PHE ALA ARG ASN ALA ALA ILE ALA 81 - ASN LEU GLU GLY LEU GLY ASN ASN PHE ASN ILE TYR VAL GLU ALA PHE LYS GLU TRP GLU GLU ASP PRO ASN ASN PRO GLU THR ARG THR ARG VAL ILE ASP ARG PHE ARG ILE LEU ASP GLY LEU LEU GLU ARG ASP ILE PRO SER PHE ARG ILE SER GLY PHE GLU VAL PRO LEU LEU SER VAL TYR ALA GLN ALA ALA ASN LEU 111S LEU ALA ILE LEU ARG ASP SER VAL ILE PHE GLY GLU ARG TRP GLY LEU THR THR ILE ASN VAL ASN GLU ASN TfR ASN ARG LEU ILE ARG HIS ILE ASP GLU TYR ALA ASP HIS CYS ALA ASN THR TYR ASN ARG GLY LEU ASN ASN LEU Uhl PRO LYS SER THR TYR GLN ASP TRP ILE THR TYR ASN ARG LEU ARG ARG ASP LEU THR LEU THR VAL LEU ASP ILE ALA ALA PHE PHE PRO ASN TYR ASP 26 1644 L'invention se rapporte également aux vecteurs recombinants d'expression et de clonage comportant plus particulièrement au moins une séquence de nucléotides telle que définie ci-dessus, en particulier au moins une partie de la séquence d'environ 3kb. Un vecteur recombinant préféré est constitué par le plasmide pHT 671 dont la construction est donnée dans la figure 4 dont il 'est question ci-après. Entrent également dans le cadre de l'invention les souches bactériennes modifiées qui comportent l'une des séquences nucléotidiques définies cidessus ou encore un vecteur recombinant d'expression et de clonage défini précédemment, de préférence le plasmide pHT 671. L'invention vise en outre un polypeptide toxique vis-à-vis des larves de lépidoptères et de manière préférentielle vis-à-vis de S.littoralis, s'attaquant aux feuilles de coton ou des autres cultures telles qu'énumérées ci-dessus, caractérisé en ce qu'il est capable de former un complexe immunologique avec des anticorps dirigés contre des polypeptides à activité larvicide vis-à-vis de S.littoralis. L'invention vise plus particulièrement la partie NH2-terminale de ce polypeptide qui renferme l'activité larvicide. L'extrémité de la partie NH2-terminale active répond à la séquence (II) d'acides aminés donnée ci- dessus. Pour obtenir une séquence nucléotidique codant pour au moins la partie NH2-terminale active d'un poly- peptide présentant une toxicité spécifique vis-à-vis de larves de lépidoptères de la famille des Noctuelles, de préférence vis-à-vis de S. littoralis, on a recours, conformément à -l'invention, aux étapes suivantes, à savoir: - la réalisation d'une hybridation moléculaire entre d'une part une séquence nucléotidique d'une souche de 2 6 1 6 4 4 B.thurinqiensis active contre S.littoralis, et d'autre part au moins deux séquences nucléotidiques, utilisées comme sondes, provenant de la partie 5' d'un fragment de restriction d'un gène de 6-endotoxine de B. thurinaiensis, cette partie codant pour la partie NH2 terminale du polypeptide actif sur lépidoptères et de la partie 3' de ce fragment codant.pour la partie COOH du polypeptide, - l'isolement du fragment hybridé, - son clonage dans un vecteur, suivi de sa purification. De manière avantageuse, les sondes d'hybrida- tion utilisées sont obtenues à partir d'un gène de 6-endotoxine provenant de la souche aizawai 7-29 codant pour une protéine de 130 kDa, active contre P.brassicae et inactive vis-à-vis de S.littoralis, ce gène ayant été cloné dans le plasmide recombinant pHTA2. De préférence, le fragment recombiné au vecteur dans l'étape de clonage est élaboré à partir de plusieurs séquences de nucléotides issues de vecteurs recombinants contenant des séquences de nucléotides d'au moins deux souches différentes de B.thurinaiensis, possédant les mêmes cartes de restriction et contenant elles-mêmes tout ou partie des séquences de nucléotides capables de coder pour un polypeptide actif, de manière préférentielle, vis-à-vis de S.littoralis. Le fragment recombiné utilisé dans l'étape de clonage est un fragment de 3kb environ, élaboré avanta- geusement à partir d'un fragment de restriction HindIII-HincII d'environ 1,1kb provenant de la souche entomocidus 6-01 et d'un fragment HincIIPstI d'environ 1,9kb de la souche aizawai 7-29. Il correspond à un gène tronqué de 6-endotoxine. Les fragments de restriction HindIII-HincII et HincII-PstI sont portés plus spécialement par les plasmi- des recombinants respectifs pHTE6 et pHTA6 tels qu'isolés à l'aide d'une sonde constituée par un fragment PvuII de 2kb du plasmide pBT 15-88 correspondant à la partie interne d'un gène de cristal chromosomique de la souche berliner 1715, à partir de clones renfermant des séquen- ces nucléotidiques issues de souches de B.thurinqiensis toxiques, vis-àvis des larves de lépidoptères, inter alia de S.littoralis. L'étude de la toxicité, vis-à-vis des larves de lépidoptères, des souches bactériennes modifiées à l'aide des séquences de nucléotides définies ci-dessus, a permis de mettre en évidence leur activité toxique élevée, notamment à l'égard des chenilles de S.littoralis. Cette activité a été appréciée au regard de l'indice de spécificité correspondant au rapport CL50 S.littoralis CL50 P.brassicae dans lequel "CL50" représente la concentration léthale tuant 50% des larves en 72 heures. L'utilisation d'un tel indice permet d'évaluer l'activité des souches bactériennes étudiées sans avoir à considérer le taux d'expression des polypeptides. Les résultats obtenus, qui sont rapportés dans les exemples qui suivent, et les valeurs de DL 50 qui en sont déduites, ont montré que les souches bactériennes modifiées selon l'invention présentent une activité toxique vis-à-vis de S.littoralis plus spécifique que les protéines de cristal native des souches azawai 7-29 ou berliner 1715. L'invention vise donc l'application, pour l'élaboration de compositions larvicides toxiques de préférence vis-à-vis de S.littoralis, de ces souches modifiées, de vecteurs recombinants renfermant les séquences nucléotidiques définies plus haut, en particulier du plasmide pHT671, et de ces séquences elles-mêmes. Les compositions larvicides de l'invention sont alors caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace de polypeptides tels que définis ci- dessus ou exprimés par les séquences nucléotidiques évoquées plus haut. Pour produire ces polypeptides on met avanta- geusement en oeuvre les gènes tronqués de 6-endotoxine correspondant aux séquences nucléotidiques de l'inven- tion. Ces gènes peuvent être utilisés pour produire en excès le polypeptide toxique dans des microorganismes permettant l'expression des vecteurs recombinants ci-dessus. Des souches de microorganismes appropriées comprennent E.coli ou encore B.subtilis. Ces gènes tronqués peuvent être réintroduits dans les souches de B. thurinqciensis ou dans des espèces apparentées telle que B.cereus, selon les techniques classiques, par exemple, par transformation, conjuguaison ou transduction. Ces techniques permettent de produire le polypeptide toxique en grande quantité sans avoir à modifier au préalable la région naturelle du promoteur des gènes de 6-endotoxine de B.thurinaiensis. Cette transformation peut être effectuée en utilisant des méthodes dérivées de la transformation des protoplastes de B.subtilis selon (11) ou des cellules végétatives de B.thurinqiensis comme décrit dans (12). L'introduction de plasmides recombinants par un système de type conjugaison, peut être réalisée en utilisant B.thurinqiensis comme souche hôte et B.subtilis ou Streptococcus faecalis comme souches de type donneur, en opérant selon (13) et (14). En variante, les séquences de nucléotides sont introduites dans des microorganismes vivant dans l'environnement ou en association avec les plantes et capables d'exprimer des vecteurs recombinants renfermant ces séquences. L'introduction peut être effectuée dans des micoorganismes tels que Pseudomonas en opérant selon le procédé décrit dans (17), par l'intermédiaire de 26 1 6 4 4 vecteurs plasmidiques contenant le transposon Tn5 et le gène de la toxine, ou Azospirillum ou Rhizobium par l'intermédiaire de vecteurs suicides dérivés du plasmide RP4 et de plasmides mobilisateurs fonctionnels chez les bactéries gram négatives (pRK2013 par exemple) selon les procédés décrits dans (18). Les gènes tronqués sont seuls dans les souches de Bacilli, ou en variante sont associés à différents gènes de 6-endotoxine ce qui permet d'obtenir des cris- J0 taux synthétisés par ces souches spécifiquement toxiques, vis-à-vis d'espèces données de Noctuelles, ou toxiques à la fois vis-à-vis des Noctuelles et d'insectes sensibles aux autres 6-endotoxines. Ces recombinaisons, effectuées in vitro ou in vivo avec les séquences nucléotidiques de l'invention et d'autres gènes de 5-endotoxines présentant des spécificités toxiques différentes, conduisent à la construction de nouveaux gènes codant pour de nouvelles protéines toxiques hybrides -présentant un large spectre d'activité vis-à-vis des insectes. Ces nouveaux gènes et ces nouvelles protéines entrent également dans le cadre de l'invention. Dans ces applications, les séquences nucléoti- diques de l'invention peuvent être transférées et exprimées dans des plantes sensibles à S.littoralis afin de diminuer les ravages causés par ces insectes. Parmi les plantes à protéger, on citera: le coton, le trèfle, la tomate et la luzerne. Le transfert du gène tronqué dans des plants de coton, peut être réalisé par transformation mettant en jeu des souches telles que Agrobacterium comme décrit dans (15). L'invention concerne en outre les cellules végétales, les plantes et les graines renfermant les - séquences nucléotidiques definies ci-dessus. 35.Les cellules végétales selon l'invention sont des cellules dont le génome, après transformation par un 26 1 6 4 4 procédé non essentiellement biologique, possède de façon stable une séquence de nucléotides capable d'exprimer un polypeptide toxique vis-àvis de S.littoralis, telle que définie ci-dessus. L'invention concerne également les cellules végétales issues de leur division. Les plantes selon l'invention sont des plantes transformées par un procédé non essentiellement bio- logique, ayant en particulier pour prédateur S.littoralis, dont le génome possède de façon stable une séquence de nucléotides telle que définie cidessus, capable d'exprimer un polypeptide toxique vis-à-vis de S. littoralis. Il s'agit aussi de plantes issues de leur reproduction, de leur multiplication ou de croisements hybrides. Selon un autre aspect, l'invention concerne des plantes ayant en particulier pour prédateur S. littoralis, possédant en plus de leurs caractères génotypiques et phénotypiques initiaux la propriété d'exprimer un poly- peptide toxique de manière préférentielle vis-à-vis de S.littoralis, cette propriété résultant de l'insertion dans leur génome par manipulation génétique d'une séquence de nucléotides capable d'exprimer ledit polypeptide. L'invention vise en outre des graines capables de donner une plante telle que définie ci-dessus ou issues d'une telle plante, caractérisées en ce qu'elles ont intégré dans leur génome, par manipulation génétique, une séquence de nucléotidesdécrite plus haut. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans la suite de la description et en se reportant aux exemples dans lesquels: - la figure 1 représente la carte de restriction des plasmides pHTA6 et pHTE6. - la figure 2, la carte de restriction d'un gène d'une protéine de cristal de la souche aizawai 7-29 cloné dans 26 1 6 4 4 le plasmide pHTA2 et définissant les fragments d'ADN qui sont utilisés comme sonde. - la figure 3, présente le fragment de 6,6kb cloné dans pHTA6 et le résultat d'une hybridation effectuée entre ce fragment et les sondes décrites dans la figure 2. - la figure 4, la carte de restriction du plasmide pHT671. \ 1 \ EXEMPLE I - Construction d'une séquence d'ADN de 3kb environ contenant un gène chimère d'une toxine insec- ticide Cette construction comprend: 1/ la préparation de banques de gènes de B.thurinaiensis 2/ la sélection et la caractérisation des clones trans- formants renfermant les gènes d'une protéine du cristal et des séquences nuclé'otidiques responsables de l'acti- vité larvicide, 3/ recombinaison in vitro de ces séquences dans un vecteur de clonàge avec construction du plasmide pHT671. Ces différentes étapes sont réalisées comme suit: 1/ Préparation de banques de qènes de B. thurinqiensis. L'ADN total des souches aizawai 7-29 et entomocidus 6-01 de Bacillus thurinqiensis est purifié en utilisant la méthode rapportée dans (1) et 50pg de chaque ADN purifié sont complètement digérés avec l'enzyme de restriction PstI. L'ADN digéré par PstI est analysé par élec- trophorèse horizontale sur gel d'agarose à 0,8% et des fragments d'ADN d'une taille de 5 à 8 kb sont récupérés à partir des gels d'agarose, par électroélution, de la manière décrite dans (2). Les fragments d'ADN purifiés de 5-8 kb de la souche aizawai 7-29 sont ligaturés à l'ADN du vecteur de clonage pUC18 digéré par PstI selon (3). Les fragments d'ADN purifiés de 5-8 kb de la chaîne entomocidus 6-01 sont ligaturés à l'ADN du vecteur de clonage pUC9 digéré par PstI. Les cellules de E.coli JM83 sont transformées avec le mélange de ligature comme décrit dans '(4). Les clones transformants de E.coli sont sé- lectionnés sur milieu LB contenant 100 pg/ml d'ampicil- line. 2/ Isolement et caractérisation des clones transformants contenant les gènes d'une protéine de cristal. A/ Criblage des cellules de E.coli transformées à l'aide d'un fragment interne d'un gène de la protéine du cristal marqué au 32p, utilisé comme sonde: Des clones transformants contenant des plasmi- des recombinants portant le gène du cristal sont détectés par hybridation sur colonies, suivant la méthode décrite dans (5), en utilisant comme sonde un fragment PvuII de 2 kb du plasmide pBT 15-88 correspondant à une partie interne du gène de la protéine du cristal, situé sur le chromosome de la souche berliner 1715. B/ Caractérisation des plasmides recombinants pré- sents dans les clones qui réagissent avec la sonde ci- dessus. Deux plasmides recombinants, pHTA6 et pHTE6, isolés respectivement des banques de gènes construites à partir des souches aizawai 7-29 et entomocidus 6-01, pré- sentent une homologie avec cette sonde. Dans chaque cas, un fragment d'ADN d'environ 6,6 kb a été clone. La carte de restriction des deux plasmides est donnée sur la figure 1. La comparaison des sites de restriction montre que les deux fragments d'ADN clones semblent identiques. Afin de délimiter les séquences correspondant au gène de la -endotoxine, différents fragments d'ADN marqués au 32p, provenant d'un gène du cristal précédem- ment caractérisé, et cloné dans le plasmide recombinant pHTA2, sont utilisés comme sondes. Ce dernier gène du cristal également originaire de la souche aizawai 7-29 code pour une protéine de 130 kd active contre P.bras- sicae mais pas contre S.littoralis. Ce type de gène pos- sède la même carte de restriction que le gène de la 6-endotoxine issu de la souche bezliner 1715. Sur la figure 2, on a rapporté la carte de restriction de ce gène de la protéine du cristal de la souche de aizawai 7.29 cloné dans le plasmide pHTA2. Les traits épais indiqués au-dessus de la carte correspondent aux fragments utilisés comme sondes d'hybridation. Les plasmides pHTA6 et pHTE6 sont hydrolysés par différentes endonucléases de restriction, analysés par électrophorèse horizontale sur gel d'agarose à 0,8% et hybridés avec les différentes sondes. Le transfert de l'ADN sur des filtres de nitro- cellulose est réalisé suivant la méthode de SOUTHERN dé- crite dans (6). L'hybridation est conduite à 42*C pendant 24 heures dans une solution contenant: 5X SSC, 30% de formamide et un mélange 1X Denhardt décrit dans (7) en présence d'une sonde d'ADN marquée au 32p. Les filtres sont ensuite lavés à 42'C pendant 20 minutes, en uti- * lisant successivement les solutions suivantes: 5 SSC dans 50% de formamide, 5 SSC, 2 SSC, 1 SSC et 0,5 SSC avant d'être séchés à la température ambiante. Les résultats de ces expériences d'hybridation sont résumés sur la figure 3. Il apparait que chaque extrémité des fragments d'ADN de 6,6 kb clones présente une homologie avec les sondes. Le fragment PstI-KDnI de 1,5 kb réagissant avec la sonde n' 3 correspond à l'ex- trémité 3' d'un gène de la protéine du cristal présent à la fois dans les souches aizawai 7-29 et entomocidus 6-01. Comme il est indiqué sur la figure 3, les sondes n' 1 et n' 2 correspondant à l'extrémité 5' du gène de la 5- endotoxine de pHTA2, s'hybrident avec le fragment HindIII-HincII de 1,1 kb contenu dans le plasmide pHTA6. La sonde n'3 qui couvre l'extrémité 3' du gène de la 5- endotoxine de pHTA2, s'hybride avec le fragment HindIII-PstI de O,4kb contenu dans le plasmide pHTA6. Il doit être noté qu'un faible signal d'hybridation est obtenu avec la sonde n' 2 alors que les deux autres sondes donnent des signaux facilement détectables. A partir de ces résultats, les inventeurs ont établi que le fragment d'ADN HindIII-PstI de 3 kb cor- respond à une grande partie d'un gène de la -endotoxine qui commence près du site HindIII central. Il apparait clairement au vu des résultats des expériences d'hybri- dation que le gène de la 5-endotoxine présente des dif- férences substantielles avec ceux caractérisés dans l'art antérieur.. Sur la base de ces résultats il a été décidé de cloner le fragment de 3 kb HindIII-PstI dans le vecteur pUC9. 3/ Construction du plasmide DHT 671 contenant un qène chimère de la toxine insecticide reconstitué. d- Le fragment d'ADN HindIII-HincII de 1,1 kb issu du plasmide pHTE6 et le fragment d'ADN HincII-pstI de 1,9kb issu du plasmide pHTA6 sont purifiés sur gels d'agarose. Des quantités égales des deux fragments d'ADN purifiés et de l'ADN de pUC9 digéré avec HindIII et PstI sont mélangées et ligaturées. Le mélange de ligature est utilisé pour transformer des cellules compétentes de E.coli JM83, puis les cellules transformées de E.coli sont selectionnées sur milieu LB contenant de l'ampi- cilline. L'un des clones recombinants interessant examiné contient un plasmide désigné par pHT671, dont la carte de restriction a été déterminée et est représentée sur la figure 4. Ce plasmide (pHT671) contient un fragment d'ADN de 3 kb inséré dans le vecteur pUC9. Cette séquence d'ADN a la même carte de restriction que les fragments HindIII- PstI de 3 kb contenus dans les plasmides pHTA6 et pHTE6, mais correspond à une molécule d'ADN reconstituée construite par recombinaison in vitro à partir de sé- quences d'ADN provenant des souches aizawai 7-29 d'une part et entomocidus 6-01 d'autre part. 2 6 1 644 EXEMPLE II: Etude de la séquence nucléotidique de la réqion du promoteur et de la région codant pour la partie NH2 terminale de la 5-endotoxine active contre les Noctuidae. Le fragment HindIII-HincII de pHT671 est séquencé conformément à la méthode décrite dans (8) en utilisant un système M13. Pour obtenir des fragments d'ADN clonés se chevauchant partiellement qui seront utilisées dans le séquençage de l'ADN, on a recours à la méthode de sous-clonage par délétion dans M13, développée par DALE et al (9). La séquence de 940 nucléotides du fragment HindIII-HincII qui est d'une longueur d'environ 1 kilo- base correspond à l'enchainement I ci-dessus. L'analyse de cette séquence montre que la plus grande phase ouverte de lecture commence à.la position et qu'un site potentiel de liaison aux riboso GGAGG se trouve six paires de base en amont de ce co ATG (position 179 à 183). La région localisée entre les nucléotides 86 et 126 (position -103 à -63 en amont du codon ATG) est fortement homologue à la région présente en amont du gène du cristal de la souche kurstaki HD1 Dipel (BTK) séquencée par WONG et al (1983) et décrite dans (16) et dont les auteurs ont montré qu'elle contient trois promoteurs BtI, BtII, et Ec fonctionnels dans B.thurinqiensis et E.coli respectivement. La comparaison entre les séquences en acides aminés déduites des 750 premiers nucléotides des gènes de BTK et pHT671, montre que ces polypeptides présentent des différences signi- ficatives au niveau de la moitié N-terminale de la partie active issue de la protoxine (seulement 66% d'homologie stricte). Il est important de noter que c'est la première fois qu'un gène de la -endotoxine isolé à partir d'une souche active contre les lépidoptères code pour un polypeptide qui présente des différences substan- tielles dans cette région. En effet, ce domaine N-termi- nal apparaît fortement conservé (plus de 97% d'homologie stricte) parmi tous les gènes du cristal actifs sur lépi- doptères qui ont été séquences jusqu'à présent. Par.ail- leurs, les inventeurs ont montré que le taux de variabi- lité est du même ordre si l'on considère les séquences nucléotidiques de pHT671 et des autres gènes de type lépidopères. EXEMPLE III: Etude de la toxicité spécifique du clone recombinant JM83 (DHT671) contre S.littoralis. La toxicité du clone recombinant JM83 (pHT671) a été déterminée par des tests biologiques sur des che- nilles de l'espèce P.brassicae et S.littoralis comme décrit par LECADET et MARTOURET dans (10). Les résultats ont été comparés avec la toxicité spécifique des pro- téines de cristal natives et purifiées à partir des sou- ches berliner 1715 et aizawai 7-29 contre les deux espè- ces d'insectes. La toxicité spécifique du clone recom- binant et des souches de B.thurinaiensis est exprimée en termes d'"indice de spécificité" défini précédemment. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau ci-après. Dans ce tableau, pour des souches de E.coli, la concentration 1 correspond à une culture bactérienne de 14 heures concentrée 60 fois, désintégrée par ultrasons; pour les souches de B.thurinqiensis la concentration est exprimée en pg de protéine cristal par pl de préparation. L'activité toxique des préparations a été testée par in- gestion forcée sur des chenilles au 5ème stade de déve- loppement avec 5 pl de préparation, ou par une technique d'ingestion libre en utilisant des larves au deuxième stade de développement. 26 1 6 4 4 T A B L E A U Toxicité comparée d'un clone recombinant et de deux souches de B. thuringiensis vis-à-vis de S.littoralis et P.brassicae. souches et S.littoralis P.brassicae Indice de spécificité: plasmides CL50 S.littoralis CL50 P.brassicae CL50 CL50 CL50 2ème 5ème 5ème stade stade stade lar- lar- larvaire vaire vaire JM83 (pUC18) > 1 > 1 > 1 JM83 (pHT671) 0,04 0,1 11 0,1 berliner 1715 cristaux natifs ND 0,11 0,007 15,7 aizawai 7.29 cristaux natifs ND 0,02 004 05 L'examen des valeurs de CL50 résumées dans ce tableau montre que les extraits de protéine du clone re- combinant hp sont préférentiellement toxiques contre S.littoralis. En second lieu une comparaison des valeurs de l'indice de spécificité montre que l'activité larvici- de du clone recombinant est plus spécifique envers S.littoralis que les protéines du cristal natives de la souche aizawai. Par ailleurs, le clone recombinant de JM83 (pHT671) est très actif contre un autre insecte de la famille des Noctuidae, Mamestra brassicae (la valeur CL50 est de 0,016, en utilisant des larves du deuxième stade de développement). Ces deux résultats montrent que le gène de la toxine larvicide construit et cloné dans le plasmide pHT671 code pour une protéine spécifiquement active contre S.littoralis. Sur la base des valeurs de la CL50 rapportées dans le tableau ci-dessus et d'un poids individuel moyen de 41 mg par larve L5 (cinquième stade larvaire) de S.littoralis, la valeur de la DL50 a été estimée à 2,4pg/ gramme de larve pour les cristaux natifs de la souche aizawai 7-29. Sur ces mêmes bases et sur la base de facteurs d'équivalence permettant de passer de la masse bacté- rienne totale à la quantité de protéines spécifiques (2% environ des protéines totales chez E.coli JM83 (pHT671), la DL50 correspondant à la toxine produite par l'expres- sion chez E.coli JM83 du gène selon l'invention cloné dans le plasmide pHT671, a été déterminée et estimée à une valeur proche de 5,5 à 6 pg/gramme de larve. Sur ces mêmes bases et après détermination de la CL50 d'extraits protéiques solubles préparés à partir de cultures broyées de E.coli JM83 (pHT671), la valeur de la DL50 correspondant à la toxine présente dans ces extraits a été estimée à 4,15 pg/gramme de larve. Dans les deux cas et particulièrement dans le cas des broyats de E.coli, les valeurs de DL50 calculées sont approximatives et supérieures à celle des cristaux natifs, puisqu'il ne s'agit pas de toxine purifiée. Cependant ces données indiquent sans ambiguité que le gène exprimé par pHT671 détermine une 6-endotoxine pré- sentant la spécificité vis-à-vis de S.littoralis. En effet, le même type d'estimation réalisé avec des extraits de E.coli JM83 (pHTA2) portant un gène de 6-endotoxine de spécificité différente conduit à des valeurs 30 à 50 fois supérieures à la DL50 des extraits solubles, vis-à-vis de S. littoralis (135 à 350 pg/gramme de larve). Les données qui précèdent permettront aisément à l'homme de l'art d'élaborer des compositions larvicides actives avec les protéines de l'invention. 2 6 6 4 4 Les références bibliographiques dont il est question dans les exemples sont les suivantes: (1)KLIER, A.F., LECADET, M-M. and DEDONDER, R., 1973, Sequential modifications of RNA polymerase during spo- rogenesis in Bacillus thurinaiensis, Eur. J. Biochem., 36 : 317-327. (2)MANIATIS, T., FRITSCH, E.F., SAMBROOK, J., 1982, Molecular cloning: A laboratory manual. 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(9)DALE et al.(1985) A rapid single-stranded cloning strategy for producing a sequential series of overlapping clones for use in DNA, Plasmid 1985, 13: 31-40 (10)LECADET.M.M. et MARTOURET D.1987, Host specificity of the Bacillus thurinaiensis 5-endotoxin toward Lepidopteran species: Spodoptera littoralis Bdv and Pieris brassicae L, J. of Invert. Pathol., 49 (n' 1): 37-48. (11)CHANG et al., 1979, High frequency transformation of Bacillus subtilis protoplasts by plasmid DNA- Mol Gen Genet 168:111-115 (12) HEIERSON et al., 1987, Transformation of vegetative cells of Bacillus thurinaiensis by plasmid DNA, Journal of Bacteriology, Mar.1987, p.1147- 1152, (13)KLIER et al., 1983, Mating between Bacillus subtilis and Bacillus thurinaiensis and transfer of cloned crystal genes, Mol Gen Genet (1983) 191:257.262 (14)LERECLUS et al., 1983, Isolation of a DNA, sequence related to several plasmids from Bacillus thurinaiensis after a mating involving the StreDtococcus faecalis plasmid pAMP1, Mol Gen Genet (1983) 191:307-313 (15)UMBECK et al., 1987, Genetically transformed cotton (Gossypium hirsutum L.) plants - Biotechnology vol.5 March 1987. (16)WONG et al., 1983, Transcriptional and translational start sites for the Bacillus thurinaiensis crystal protein gene. J. of Biol. Chem., 258: 1960-1967. (17)OBUKOWICZ M.et al (1986). Tn5 mediated integration of the 5-endotoxin gene from B. thurinaiensis into the chromosome of root colonizing Pseudomonas. J. Bacteriol., 168, 982-989. (18)SIMON, R. et al, (1983). A broad host range mobiliza- tion system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in Gram-negative bacteria. Biotechnology, 1, pp. 784-791. REVENDICATIONS 1/ Séquence de nucléotides codant pour au moins une partie de la région Nterminale d'un polypeptide to- xique de manière spécifique vis-à-vis de larves de lépi- doptères de la famille des Noctuelles, de préférence vis-à-vis de S. littoralis, caractérisée par sa capacité d'hybridation avec un gène capable d'exprimer un poly- peptide toxique vis-à-vis de larves de S.littoralis. 2/ Séquence nucléotidique de 3 kb environ corres- pondant au fragment de restriction HindIII-PstI provenant de B. thurinqiensis capable de s'hybrider avec les sondes 1, 2, 3 de pHTA2 rapportées sur la figure 2. 153/ Séquence selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comporte des sites dans l'ordre suivant Hind III - Hinc II - Bal II - Kpn I- Hind III - Pst I - 4/ Séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications I à 3, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par recombinaison génétique in vitro de séquences d'ADN de deux souches différentes de B.thurinaiensis. / Séquence selon la revendication 4, caractérisée en ce que les 2 souches de B.thurinaiensis correspondent respectivement aux souches entomocidus 601 et aizawai 7-29. 6/ Séquence de nucléotides, caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide capable de former un complexe immunologique avec des anticorps dirigés contre des polypeptides à activité larvicide vis-à-vis de S.littoralis. 7/ Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle est capable de s'hybrider avec une sonde formée à partir de la séquence présentant l'enchaînement (I) suivant: 3V9 l1i 3vv VDa Ili 311 139 D39 31V IV9 Vil VO19 1V 011 V3V Vll 3V9 VoV 993 Vll v93 iYV Iv1 ViDV Vlv 991 1V9 VV li S 3V 131 VVV 933 1'+G lui Vll v V lVV Vll i99 993 lVV 1v 93 1 V v39 191 oi. IV9 139 lIV VV9 1v9 11V LV ]gZ 99V llV V13 vOV lVV lvi 3VV VV9 lVV 319 IlVV Vl 93v vIv 911 von 991 V9V VV9 v99 1ZL Ili liv V19 1î1 l9o VV Vlil vlv 139 vi3 13 91o lVv 339 939 VV3 139 lVi 119 331 Vl 113-333 vi VV9r Ili V9O 1l3 IlV V93 III 931 133 liV 3V9 99V VV9 113 V13 999 T09 IV9 1l3 ViV 193 Ili 393 IV9 l1V V19 vsV 3 99V 3v v vV9 vi3 Ivv IVY 133 ivo vv9 vvs 991 VVO vvv Ili V39 Vvs9 19 lil VilV VV 311 Ilv 3vv V99 vil v9o vvr Vil IVV 139 l 139 139 L ssv 19 vLL vv 1339 vîv vsv VV9 iV lîv Vll vv3 Vrr ILV Vv3 1Z V19 vi3 Ili V39 Iv5 991 Vv3 131 133 399 119 vlV v99 991 V19 111i 1v9 vlv Vll vo99 19C 119 v11 Ili v99 V99 999 33 V19 111 3vv 131 Vil 913 111 9V3 119 113 V3al 913 131 loc I Oú rvi 1v9 1Vl val v3l úVv 199 l3V v3l vil 993 vvs v99 Ivo 011 113 V19 VvO Yvv 133 TZ vvl 19V Vil 191 IVY 3vl 133) iV.301 vv3 lYV VV3 lVV iVY vV9 gvs 9lY 1ii iil sjv *r91 093. Vv vvv vlv Vil 19V 199 111 av 9V lvi 3VV v31 V19 vY VV Vol91 VVi 991 931 vvv 1v 191 v v 319 191 vov ViV 311 11 ll 911 111i 19 Vl 911 lvv vvil Vil lV IV9 v lvl V39 o999 lVi vvv 111 ilVV 319 931 VYVl V3v v99 Vl9 999 V3 911 3l1 319 26 1 6 4 4 8/ Séquence de nucléotides codant pour au moins une partie de la région N-terminale d'un polypeptide to- xique de manière spécifique vis-à-vis de larves de lépi- doptères de la famille des Noctuelles, de préférence vis- à-vis de S.littoralis, caractérisée en ce qu'elle com- prend l'enchaînement (I) défini dans la revendication 7. 9/ Séquence selon la revendication 8 codant pour la partie N-terminale du polypeptide, définie par un codon d'initiation ATG situé en position 190. 10/ Séquence selon la revendication 8 ou 9, ca- ractérisée par un site de liaison aux ribosomes GGAGG en positions 179 à 183. 11/ Séquence selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisée en ce qu'elle comporte la séquence comprise entre les nucléotides en position 86 et 126 (position -103 à -63 en amont du codon d'initiation ATG) qui est h- omologue à raison d'environ au moins 70% à la région pré- sente en amont du gène du cristal de la souche kurstaki- HD1 Dipel,(BTK) qui contient les trois promoteurs BtI, BTII et Ec fonctionnels dans B.thurinaiensis et E.coli respectivement. 12/ Séquence de nucléotides, caractérisée en ce qu'elle code pour la séquence- (II) d'acides aminés suivante: dSV VAL NSV OUd 3Hd 3Hld VIV VIV 311 dSV fn31 VA UHI fn31 uH1 n31 dSv 9Uv 9uV n31 9V NSV UAL uH1 311 dUl dSV N19 AL v1H1 13s S11 Oud loL 9uv 3! n31 9V ISV Y u1 NSV n19 NSv IVA NSV 311 dHl UH1 n33 119 dUl 9UV ni9 119 lZL 3Hd 311 iVA 13S dSV 9uV n33 331 V1V fn31 SIH n31 NSV V1V V1V NID VOV VAL IVA 13S n31 n31 Oud ivA n 26!644 13/ Vecteur recombinant d'expression et de clonage comportant au moins une partie de la séquence nucléoti- dique telle que définie dans l'une quelconque des reven- dications 1 à 12. 14/ Plasmide pHT671 tel que représenté sur la fi- gure 4. / Souches bactériennes modifiées, caractérisée en ce qu'après transformation elles comportent une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 12. 16/ Souche bactérienne selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins un vecteur recombinant selon la revendication 13, de préférence le plasmide pHT671. 17/ Polypeptide toxique vis-à-vis des larves de lé- pidoptères et de manière préférentielle vis-à-vis de S.littoralis, caractérisé en ce qu'il est capable de former un complexe immunologique avec des anticorps dirigés contre des polypeptides à activité larvicide vis-à-vis de S.littoralis. 18/ Polypeptide selon la revendication 17, ca- ractérisé en ce qu'il comprend la séquence (II) d'acides aminés définie dans la revendication 12. 19/ Procédé d'obtention d'une séquence nucléo- tidique codant pour au moins une partie de la région N-terminale d'un polypeptide toxique de manière spéci- fique vis-à-vis de larves de lépidoptères de la famille des Noctuelles, de préférence vis-à-vis de S.littoralis, caractérisé par les étapes suivantes: - la réalisation.d'une hybridation entre d'une part une séquence nucléotidique d'une souche de B.thuringiensis active contre S.littoralis et d'autre part, une ou plu- sieurs séquences nucléotidiques utilisées comme sondes provenant de la partie 5' d'un fragment de restriction d'un gène d'une 6-endotoxine de B. thurinaiensis cette partie codant pour la partie N-terminale d'un polypeptide toxique sur lépidoptères et de la partie 3' de ce fragment codant pour la partie COOH du polypeptide, - l'isolement du fragment, son clonage dans un vecteur, suivi de sa purification. / Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que les sondes d'hybridation utilisées sont obte- nues à partir d'un gène d'une 8-endotoxine provenant d'une souche aizawai 7-29 codant pour une protéine de 13OkDa active contre P.brassicae et inactive vis-à-vis de S.littoralis, ce gène ayant été cloné dans le plasmide recombinant pHTA2. 21/ Procédé selon la revendication 19 ou 20, ca- ractérisé en ce que la fragment recombiné au vecteur dans l'étape de clonage est élaboré à partir de plusieurs séquences de nucléotides issues de vecteurs recombinants contenant des séquences de nucléotides d'au moins 2 sou- ches différentes de B.thuringiensis, possédant les mêmes cartes de restriction et contenant elles-mêmes tout ou partie des séquences de nucléotides capables de coder pour un polypeptide actif de manière préférentielle vis- à-vis de S.littoralis. 22/ Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le fragment recombiné au vecteur dans l'étape de clonage est élaboré à partir d'un fragment de res- triction HindIII-HincII provenant de la souche entomo- cidus 6-01 et d'un fragment de restriction HincII-PstI provenant de la souche aizawai 7-29. 23/ Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que les fragments de restriction NindIII-HincII et HincII-PstI sont portés préférentiellement par les plas- mides recombinants respectifs pHTE6 et pHTA6 tels qu'iso- lés à l'aide d'une sonde constituée par un fragment PvuII de 2kb du plasmide pBT15-88 correspondant à la partie interne d'un gène du cristal chromosomique de la souche berliner 1715, à partir de clones transformants renfer- mant des séquences nucléotidiques issues de souches B.thuringiensis actives vis-à-vis de larves de lépi- doptères interalia de S.littoralis. 24/ Composition larvicide & activité préférentielle vis-à-vis de S.littoralis, caractérisée en ce qu'elle renferme une quantité efficace de polypeptide tel que défini dans l'une des revendications 17 ou 18 exprimé par les séquences nucléotidiques selon l'une des reven- dications 1 à 12, le vecteur selon la revendication 13, ou le plasmide selon la revendication 14 ou la souche bactérienne selon la revendication 15 ou 16. / Application des séquences de nucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 pour produire un polypeptide toxique vis-à-vis de lépidoptères, de pré- férence S.littoralis, dans des microorganismes capables d'exprimer des vecteurs recombinants renfermant ces sé- quences tels que E.coli, B.subtilis, B.cereus ou B.thurinaiensis. 26/ Application selon la revendication 25, caracté- risée en ce que les séquences de nucléotides sont intro- duites dans des microorganismes vivant dans l'environ- nement ou en association avec les plantes, tels que Pseudomonas, AzosDirillum ou Rhizobium et capables d'ex- primer des vecteurs recombinants renfermant ces sé- quences. 27/ Application selon la revendication 25 ou 26, caractérisée en ce que les séquences de nucléotides sont introduites dans des microorganismes en association avec différents gènes de 5-endotoxine. 28/ Application des séquences nucléotidiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 à la trans- formation des plantes sensibles à S.littoralis, caracté- risée en ce qu'elle comprend le transfert et l'expression de ces séquences dans ces plantes. 29/ Cellule végétale dont le génome, après trans- formation par un procédé non essentiellement biologique, possède de façon stable une séquence de nucléotides ca- pable d'exprimer un polypeptide toxique vis-à-vis de S.littoralis, telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 12 et, cellules issues de leur di- vision. / Plantes ayant en particulier pour prédateur S.littoralis, transformées par un procédé non essentiel- lement biologique, dont le génome possède de façon stable une séquence de nucléotides telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 12, capable d'exprimer un polypeptide toxique vis-à-vis de S.littoralis et, plantes issues de leur reproduction, de leur multipli- cation, ou de croisements hybrides. 31/ Plante ayant en particulier pour prédateur S.littoralis, possédant en plus de leurs caractères génotypiques et phénotypiques initiaux la propriété d'exprimer un polypeptide toxique de manière préféren- tielle vis-à-vis de S.littoralis, cette propriété résultant de l'insertion dans son génome par manipulation génétique d'une séquence de nucléotides capable d'ex- primer ledit polypeptide. 32/ Graine capable de donner une plante selon la revendication 30 ou 31 ou issue d'une telle plante, ca- ractérisée en ce qu'elle a intégré dans son génome, par manipulation génétique une séquence de nucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 12.