FR 2606030 A1 19880506 FR 8615234 A 19861031 RETROVIRUS RECOMBINANT DEFECTIF. SON PROCEDE DE FABRICATION ET SES APPLICATIONS. NOTAMMENT POUR L'ETUDE DE L'INTERACTION DES RETROVIRUS SAUVAGES AVEC DES LIGNEES CELLULAIRES INFECTABLES PAR CELUI-CI L'invention concerne des moyens (produits et procédés) pour l'étude des interactions d'un rétrovirus déterminé avec des lignées cellulaires susceptibles d'être infectées par des virus et, le cas échéant, de l'influence d'agents extérieurs sur cette interaction. Dans l'une de ses formes d'applications préférées, l'invention vise & permettre la détection de la capacité d'un rétrovirus déterminé à infecter une lignée cellulaire donnée, ou l'identification de ceux des clones cellulaires qui, au sein d'une culture cellulaire, sont infectables par ce rétrovirus. Dans une autre de ses formes d'applications préfé- rées, l'invention vise & permettre l'étude de l'influence d'agents extérieurs sur la capacité d'infection des li- gnées cellulaires par ce rétrovirus, par exemple de prin- cipes actifs de médicaments visant & inhiber le caractère infectieux in vivo de ce rétrovirus. On conçoit les difficultés que l'on peut rencon- trer dans ce type d'étude, lorsque l'on utilise l'agent infectieux luimême, et ce même si l'on fait abstraction des risques que peut entraîner sa manipulation pour l'ex- périmentateur. Certes la capacité d'un rétrovirus à in- fecter une culture cellulaire déterminée peut être appré- ciée par la propagation du virus d'une culture à l'autre. Mais ce premier résultat ne permet pas, dans bien des cas, l'identification au sein de la culture cellulaire, de ceux des clones cellulaires qui sont effectivement infectés et qui sont le support direct de la réplication virale. Enfin l'influence éventuelle d'agents extérieurs, tels que des principes actifs de médicaments possibles, sur le degré d'infectiosité o la réplication virale est extrêmement difficile & observer dans des systèmes d'essais mettant en jeu l'agent infectieux lui-même, à supposer que les pre- mières difficultés mentionnées plus haut aient même été surmontées. L'invention a pour but de remédier au moins en partie à l'ensemble de ces difficultés, notamment de fournir des moyens d'étude qui, substitués & l'agent rétroviral infectieux, permettent néanmoins l'étude du comportement de ce dernier vis-à-vis des hôtes cellulaires qu'il est susceptible d'infecter. L'invention a encore pour but de fournir des moyens de ce type qui, en outre, assurent un marquage de ceux des clones cellulaires qui, au sein de la culture étudiée, sont infectables par le rétrovirus considéré. Enfin l'invention a pour but la possibilité d'apprécier dans quelle mesure des agents extérieurs peuvent interférer avec l'interaction du rétrovirus étudié, avec des clones cellulairs infectables, grâce à l'influence que ces agents extérieurs sont susceptibles d'exercer sur le susdit marquage. L'invention met à profit la capacité, déjà observée pour des recombinants rétroviraux contenant un gène exogène dont l'expression est recherchée, à s'incorporer dans le génome de cellules individuelles infectables par le rétrovirus sauvage correspondant et à assurer l'expression -du gène exogène, dans les cellules individuelles infectées, ce gène exogène étant trans- missible d'une génération cellulaire à l'autre. L'invention concerne plus particulièrement un rétrovirus recombinant défectif dérivé d'un rétrovirus sauvage ou natif, contenant les parties agissant en ncis" du virus sauvage et assurant normalement l'empaquetage du rétrovirus, sa réverse-transcription en une molécule ADN et son intégration dans le génome de la cellule hôte, ainsi que le site de polyadénylation de cet ARN, ce rétro- virus recombinant étant plus particulièrement caractérisé par la substitution partielle ou totale des séquences codant pour ces protéines virales par une séquence génique contenant elle-même une séquence codant pour une protéine choisie parmi celles qui peuvent agir en tant que mar- queurs de cellules infectées, le cas échéant isolées, notamment grâce à leur coloration sélective, éventuellement sous l'action ultérieure d'un révélateur. La séquence génique susdite comprend éventuelle- ment elle-même un promoteur susceptible d'être reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire infectable (par exemple un promoteur de SV40, lorsque l'hdte cellulaire est constitué par des cellules de mammifères). En variante la séquence génique peut être limitée pour l'essentiel à la séquence codant pour le marqueur, placée sous le contrdle direct du promoteur rétroviral correspondant, notamment de la région LTR5 du rétrovirus. En variante encore, l'une ou l'autre des régions LTR, ou.les deux à la fois, sont dépourvues de promoteur(s), la séquence génique codant pour le marqueur étant alors sous le contrble d'un promoteur distinct. Par exemple un rétrovirus recombinant défectif conforme à l'invention comprend successivement: - la région LTR5 du rétrovirus sauvage correspondant, suivie de la région d'encapsidation et d'empaquetage; - le site d'initiation de l'ARN correspondant aux pro- téines virales normalement codées par les gènes gaa, Dol et env; -la séquence génique susdéfinie, concernant la séquence codant pour le marqueur, en lieu et place de tout ou partie de la région rétrovirale comportant ces gènes aag. Do1 et env, cette séquence étant placée sous le contrble d'un promoteur approprié, le cas échéant de la région e5' LTR elle-mme; 3. - la région LTR3', qui coincide avec le site de polyadé- nylation de 'ARN. Le marqueur lui-même est avantageusement constitué par une protéine produite dans les cellules infectées par le virus recombinant défectif, pour lui conférer une coloration particulière ou par toute protéine capable d'agir sur un substrat pénétrant dans les cellules infectées et de subir une modification de coloration, ou plus généralement de son spectre d'absorption des radia- tions lumineuses, sous l'action de cette protéine. A titre d'exemples de protéines codées par la séquence codante, contenue dans la séquence génique mise en oeuvre dans l'invention, on mentionnera la 0galactosidase ou la P-glucuronidase. Il va de soi que l'on peut avoir recours & toute autre séquence codante, dès lors qu'elle code pour une protéine susceptible de jouer le rôle de marqueur permettant de repérer aisément les cellules transformées. Quelle que soit la construction envisagée, le ré- trovirus recombinant défectif selon l'invention est tel qu'il conserve sa capacité d'infecter un hôte cellulaire compétent, cette capacité d'infection étant cependant épuisée' dès lors que le rétrovirus recombinant a pénétré dans l'hdte cellulaire compétent, faute de disposer des séquences essentielles codant pour les protéines virales du rétrovirus sauvage, qui lui permettraient de s'y propager. Cependant, grâce & la capacité que possède alors le rétrovirus recombinant & s'intégrer sous forme de provirus au génome de la cellule hôte, et à l'expression alors induite du marqueur, les cellules transformées peuvent être aisément détectées, le cas échéant après une opération de révélation postérieure de ce marqueur. D'une façon générale, le procédé selon l'invention pour la détection du pouvoir infectieux d'un rétrovirus "sauvage" déterminé & l'égard de tout ou partie d'une culture cellulaire est donc caractérisé: - par la mise en contact de cette culture cellulaire, avec un rétrovirus recombinant défectif tel que défini ci- dessus dans des conditions éventuellement susceptibles d'autoriser cette infection, en présence ou non d'agents extérieurs susceptibles d'interférer éventuellement avec la manifestation de ce pouvoir infectieux, ce rétrovirus recombinant défectif ayant en commun avec le rétrovirus sauvage les parties agissant en cis" du virus sauvage (autrement dit des vecteurs directement associés au rétrovirus recombinant) et assurant normalement la transcription virale, l'empaquetage du rétrovirus dans le génome de la cellule hôte, ainsi que le site de polyadé- nylation de cet ARN, et - par la visualisation, le cas échéant & l'aide d'un révélateur approprié, de celles des cellules dans les- quelles le marqueur est exprimé. Une expression effective traduit alors une capa- cité infectieuse du rétrovirus sauvage correspondant à l'égard desdites cellules, dans des conditions semblables à celles mises en oeuvre dans les essais d'infection avec le rétrovirus recombinant défectif, tandis que la non- expression du marqueur dans aucune des cellules traitées autorise & conclure à la vraisemblable absence de pouvoir infectieux du rétrovirus sauvage correspondant à l'égard desdites cellules, dans des conditions d'infection sem- blables. L'invention concerne également les vecteurs re- combinants contenant l'ADN du virus recombinant défectif sus-défini, incorporé à tout vecteur permettant l'amplifi- cation de l'ensemble dans un hdte cellulaire compétent, par exemple un plasmide bactérien. L'invention concerne également un procédé de fa- brication du rétrovirus recombinant défectif selon l'invention, ce procédé comprenant: - la transfection avec un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus, d'une lignée cellulaire auxiliaire contenant, incorporée à son propre ADN génomique, une séquence nucléique (ci-après dénommée 'séquence de complémentation") capable de suppléer à l'absence dans le vecteur recombinant des séquences, notamment celles contenant les parties essentielles des gènes aaa. vol et env du rétrovirus sauvage correspondant, par un apport men trans (autrement dit un apport extérieur) de protéines virales permettant la réplication d'un virus recombinant défectif contenant dans son génome les autres séquences rétrovirales du vecteur recombinant; - la culture de la lignée cellulaire auxiliaire ainsi transfectée dans des conditions permettant la réplication de ce rétrovirus recombinant in situ, grâce à l'apport par complémentation men trans" des protéines virales codées par la susdite 'séquence de complémentation"; la récupération du virus recombinant défectif produit dans le surnageant de culture de ladite lignée cellulaire auxiliaire. De préférence la séquence de complémentation contient plus particulièrement la partie de l'ADN géno- mique du rétrovirus sauvage correspondant, dont le vecteur recombinant est lui-même dépourvu, codant notamment pour les protéines virales, à savoir les gènes aaq, Dol et env du rétrovirus sauvage correspondant. Cependant il n'est pas nécessaire que la séquence de complémentation" coïncide toujours exactement avec une partie du rétrovirus sauvage, dont est également issu l'ADN rétroviral contenu dans le vecteur recombinant. Séquence de complémentation et ADN rétroviral peuvent éga- lement être issus de rétrovirus voisins présentant entre eux le degré de compatibilité requis, pour que l'apport en trans des protéines virales puisse s'opérer. Avantageusement la lignée cellulaire utilisée contient, sous forme de provirus, la totalité du rétre- virus sauvage correspondant, dont cependant les séquences d'empaquetage ont été délétées. Ainsi le procédé selon l'invention permet'il, grâce à la complémentation qu'assure la séquence de complémentation, de suppléer au caractère défectif du génome du virus recombinant introduit dans le génome des cellules de la lignée auxiliaire et de permettre la ré- plication, la production et l'excrétion par cette lignée auxiliaire d'un virus recombinant défectif, lequel peut à son tour être utilisé comme virus infectieux - une fois - à l'égard d'une culture cellulaire à étudier, soit que l'on veuille détecter la capacité de cette culture cellulaire à être infectée par le rétrovirus correspon- dant, voire identifier celles des cellules qui au sein de la culture cellulaire sont susceptibles d'être infectées, soit que l'on veuille évaluer l'action de substances éventuellement inhibitrices de la capacité du rétrovirus sauvage correspondant à l'infecter, dès lors que la sen- sibilité de cette culture cellulaire à ce rétrovirus aurait auparavant été reconnue. On observe que l'hdte cellulaire auxiliaire peut également contenir, incorporé à son ADN génomique, la to- talité du rétrovirus sauvage à l'état de prophage. L'uti- lisation d'un tel hdte cellulaire sera cependant suscep- tible d'entraîner la production par celui-ci, du rétro- virus sauvage parallèlement à celle du rétrovirus recom- binant selon l'invention. Le mélange de rétrovirus ainsi obtenu pourra également être utilisé pour la réalisation des essais sus-décrits, dès lors que le rétrovirus natif infectieux ne s'opposera pas au marquage des cellules infectées par le rétrovirus recombinant défectif dans les conditions qui ont été indiquées. La réalisation des essais pourra néanmoins s'en trouver compliquée, surtout dans le cas o le rétrovirus sauvage ou natif présente un caractère fortement pathogène. Cette dernière technique fournit néanmoins, en variante, un procédé de détection (ou de diagnostic in vitro) de l'existence ou non d'un provirus, comprenant les gènes qaqg Dol et env du rétrovirus dans des cultures cellulaires susceptibles de le contenir, dès lors que ces cultures cellulaires sont amenées à jouer le rble du susdit hôte cellulaire auxiliaire vis-à-vis du rétrovirus recombinant. Ce cas peut se présenter, par exemple dans le cas de lymphocytes T4 obtenus à partir d'un individu dont le sérum se sera révélé contenir des anticorps anti-HIV (abréviation de l'expression anglaise "Human Immunodeficency Virus") (Virus Humain d'Immunodéficience, aussi dénommé LAV ou HTLV-III). La transformation de tels lymphocytes par un vecteur recombinant conforme à l'invention, dérivé de HIV, ne pourra en effet s'accompagner de la production du rétrovirus recombinant que sous réserve que ces lympho- cytes contiennent HIV à l'état de prophage latent. En l'absence de provirus, et par conséquent des gènes aag, p-l, env et pX correspondants, aucune complémentation, et par conséquent aussi aucune production de virus recombi- nant ne pourait être observée. Au contraire, l'observation d'une production du virus recombinant conforme à l'inven- tion conduirait nécessairement à la conclusion que l'in- dividu chez lequel une réponse séropositive avait été constatée, portait nécessairement aussi le virus HIV. Dans les exemples indiqués plus loin, les possibi- lités de l'invention sont illustrées en rapport avec la production d'un virus recombinant défectif dérivé du Virus Moloney de la Leucémie Murine (M-MuLV; abréviation du nom anglais du même virus: "Moloney Murine Leukemia Virus"). En particulier une production d'un rétrovirus recombinant correspondant sera décrite, cette production impliquant alors la transformation d'une lignée auxiliaire, consti- tuée de cellules *2, telles que décrites par Mann et al (1983), Cell, 33. 153-159. Cette lignée dérivée de cel- lules de souris contient, intégrée dans son propre génome, la totalité de l'ADN génomique de M-MuLV, à l'exception de la région d'empaquetage du rétrovirus qui avait été délétée. L'article de Mann et al décrit également un procédé pour incorporer cet ADN génomique, pourvu de ces mêmes délétions, dans le génome de lignées cellulaires normalement infectables par M-MuLV. Il est & remarquer que la technique décrite par Mann et al est directement trans- posable à la production de toute autre lignée cellulaire contenant, incorporée & son génome, la totalité du génome d'un autre rétrovirus, dont la région d'empaquetage du génome rétroviral aura au préalable été délétée, dès lors que les conditions suivantes sont remplies. D'une part, la capacité de cette autre lignée cellulaire à être infectée par le rétrovirus sauvage correspondant a été reconnue et, d'autre part, la structure du génome de cet autre rétro- virus a été suffisamment élucidée pour que sa région d'em- paquetage ait été localisée et délétée, notamment grâce à l'utilisation des enzymes de restriction appropriées, mises en oeuvre dans des conditions bien connues de l'homme de métier. Il est donc tout & fait clair que l'invention s'adresse à la détection de tout type de rétrovirus éven- tuellement infectieux vis-à-vis de cultures cellulaires déterminées et présentant les caractéristiques essentielles de structure dont il a été question plus haut. En particulier, elle s'appllique à la fabrication de rétrovirus recombinants défectifs permettant, dans les conditions qui ont été indiquées, la détection du pouvoir infectieux des rétrovirus connus sous les dénominations HTLV I, HTLV II, HIV I (ou encore LAV ou HTLV III), HIV II (ou LAV II), HTLV IV et de nombreux rétrovirus infectieux & l'égard de l'animal. A titre d'exemple, on mentionnera les rétrovirus leucémiques des bovins (Bovine Leukemia Viruses). Grâce à sa capacité d'incorporation dans le génome des cellules qu'il infecte, le rétrovirus recombinant se- lon l'invention peut également, lorsque cette incorpora- tion est stable et transmissible au cours des générations, être utilisé pour des études de généalogie cellulaire. Ces études revêtent un intérêt particulier, lorsqu'elles sont appliquées à des cultures cellulaires susceptibles de se différencier. Il importe alors naturellement que soit con- servée la capacité d'expression du marqueur au cours de cette différentiation. Le cas échéant, pour s'en assurer, on aura recours aux techniques décrites dans la demande de brevet européen n' 85.401914.8/0178220 déposée le 1er oc- tobre 1985. L'invention concerne encore les nécessaires ou kits permettant la production 'à la demande' du rétrovirus recombinant conforme à l'invention, les éléments essen- tiels de ces kits consistant: - en un vecteur recombinant contenant le génome du rétro- virus conforme à l'invention; - en un hôte cellulaire auxiliaire susceptible d'être transfecté dans les conditions qui ont été décrites, pour produire le rétrovirus recombinant lui-même; auxquels s'ajoutent éventuellement - des tampons et réactifs nécessaires à la réalisation de la susdite transfection; - et, le cas échéant, un hôte cellulaire compétent, notamment bactérien, permettant une production amplifiée du susdit vecteur recombinant. Des caractéristiques supplémentaires de l'inven- tion apparaitront encore au cours de la description de l'un de ses exemples de réalisation, appliquée à la production d'un rétrovirus recombinant conforme & l'in- vention, dérivé de M-MuLV. Les techniques décrites à titre d'exemple peuvent être considérées comme représentatives de celles qui pourraient être mises en oeuvre pour la détection du pouvoir infectieux de tout autre type de rétrovirus à l'égard de cellules déterminées, dans des conditions également déterminées. Il sera dans ce qui suit fait référence aux fi- gures dans lesquelles: la fig. 1 est une représentation schématique d'un plasmide recombinant conforme à l'invention; - la fig. 2 concerne des résultats d'analyse en gel d'électrophorèse et par hybridation avec des sondes appropriées de certaines des séquences contenues dans ce plasmide; - la fig. 3 montre la corrélation entre les longueurs des séquences dont les tailles résultent de la fig. 2 avec les tailles qui pouvaient être prédites des fragments de restriction par certaines enzymes; - la fig. 4 fournit des résultats de l'activité rétrovi- rale de rétrovirus recombinants conformes à l'invention, produits par des cultures de cellules auxiliaires, dans les conditions qui ont été définies plus haut. Production d'un rétrovirus recombinant: Le plasmide pMMuLV-SV-lac Z (fig. la) a été cons- truit en ayant recours aux techniques décrites par Maniatis et al. (1982), Cold Spring Harbor, N.Y., et ce en utilisant des enzymes de restriction fournies par BOEHRINGER-MANNHEIM. Cette fabrication a été réalisée à partir de trois fragments. Le premier fragment, contenant les séquences bac- tériennes (dérivées de pBR322) et les séquences rétrovi- rales, a été obtenu à partir du plasmide pB6 décrit par P. Yermanian (1984) Dissertation" (Université Paris XII, Paris) et contenant le génome proviral de M-MuLV (Harbers et al. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Il78. 7609-7613. Ce premier fragment consistait donc en fait dans le fragment de 8,2 kb qui a été isolé à partir de pB6, après digestion de ce plasmide avec SalI et BamHI. Le second fragent, contenait le promoteur SV40 et une partie du gène de X coli lacZ. Ce second fragment a été isolé à partir du plasmide pCH110 décrit par Hall et al. (1983), J. Mol. Appl. Genet. 2, 101-109, si ce n'est qu'un site de restriction SalI avait au préalable été inséré, dans son site PVUII, à proximité de l'extrémité 5' du promoteur SV40. Le second fragment consistait plus particulièrement dans le fragment de 3,6 kb isolé à partir de ce plasmide, après digestion de celui-ci avec SalI et EcoRI. Le troisième fragment qui contenait une région d'extrémité 3' du gène lacZ a été obtenu à partir d'un plasmide pMLB524, décrit par Parsot et al. (1982), Mol. Gen. Genet., 188, 455-458, si ce n'est que le site AvaI de ce plasmide avait auparavant été transformé en un site BamHI. Ce troisième fragment de 320 paires de bases a été obtenu à partir du plasmide pMLB524 modifié comme indiqué ci-dessus, par digestion de celui-ci avec BamHI et EcoRI. Ces trois fragments ont été ligués pour fournir le plasmide pMMuLV-SVlacZ, représenté à la fig. 1 et dans lequel: - les parties A et _ proviennent de M-MuLV; - la partie h comprend un promoteur SV40 (SV sur le dessin) suivi d'une séquence lacZ de E. coli; - les séquences d et 1 proviennent d'un ADN génomique de souris, lesquelles étaient initialement contenues dans pB6 et, enfin, - la séquence _ provient de pBR322. L'analyse des éléments de structure du plasmide recombinant obtenu, d'une part, et d'un provirus incorporé dans des cellules NIH.3T3. suite à leur infection avec un rétrovirus recombinant ultérieurement produit à l'aide de ce plasmide (voir ci-après), d'autre part, résulte des fig. 2 et 3. Cette analyse a été faite par digestion de ce plasmide et de ce provirus & l'aide des enzymes de res- triction XbaI, d'une part, et SalI et BamHI, d'autre part, et par électrophorèse sur gel d'agarose. Une sonde d'hybridation consistant en un fragment SV-lacZ purifié, a été utilisée pour identifier les fragments portant des séquences communes. Les distances relatives de migration des fragments hybridant dans la technique dite du "Southern blot" (bu- vyard de Southern) et respectivement issus du plasmide (bandes de gel marquées d'un "P") et des fragments issus du provirus (bandes de gel marquées d'un "C") apparaissent dans la fig. 2. Les tailles de ces fragments, telles qu'elles découlent de leurs distances relatives de migrations ob- servées vis-à-vis des distances de migration de molécules témoins de poids moléculaires connus, coincident sensi- blement avec les tailles des fragments rétroviraux SalI- BamHI et XbaI-XbaI correspondants contenus dans le vecteur recombinant (fig. 3). Production d'un rétrovirus recombinant conforme à l'in- vention: Le rétrovecteur recombinant décrit ci-dessus a été utilisé pour la production d'un rétrovirus recombinant conforme à l'invention dans une lignée de cellules auxilaires de souris *2 contenant un génome de provirus M-MuLV dont la région fournissant normalement un signal d'empaquetage avait été délétée. Cette lignée ne produit pas de virus sauvage. Les cellules *2 ont été transfectées simultanément avec le rétrovirus recombinant sus-décrit et avec un plasmide pSVtkneoO (Nicolas et al. (1983), eds. Silver, L.M., Martin, G.R. et Strickland, S., Cold Spring Harbor Conferences on cell proliferation, 1Q, 469-485, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) utilisé à titre de marqueur eucaryote. Le plasmide pSVtkneoo contient un gène codant pour une enzyme confé- rant aux cellules une résistance à l'aminoglycoside G418, ce plasmide permettant par conséquent de sélectionner des clones co-transformés par les deux plasmides dans un mi- lieu de culture contenant du G418, décrit par Colbère- Garapin et al. (1981), J. Mol. Biol. 150, 1-14, ces clones co-transformés se révélant à la fois résistants au G418 et capables d'exprimer la p-galactosidase (cellules P-galac- tosidase positives). Les différents clones P-galactosidase positifs ont été testés pour leur capacitéà produire un rétrovirus re- combinant conforme à l'invention en procédant comme suit. Les surnageants de ces clones ont été introduits dans le milieu de culture de cellules de souris NIH 3T3 et les cellules ayant incorporé le rétrovirus ont été détectées grâce à leur capacité à exprimer une activité -galacto- sidase. Le clone meilleur producteur de rétrovirus recom- binant, dénommé LZ1, a été isolé et son ADN a été étudié, par analyse de restriction. Il s'est révélé contenir une structure de provirus ne différant pratiquement pas de la structure rétrovirale contenue dans le rétrovecteur recombinant initialement mis en oeuvre. Infection unique de cellules infectables Par le rétrovirus Combinant: Toute méthode appropriée peut être mise en oeuvre pour détecter l'eXpression de la séquence lacZ. Une mé- thode avantageusement utilisée est la méthode de colora- tion histochimique de la p-galactosidase selon Lojda (1970), Histochemie, 23, 266-288, pour détecter l'expres- sion de lacZ dans des cellules infectées par le virus. On peut notamment procéder comme suit. Les cellules sont rincées avec une solution NaCl 150 mM, de phosphate de sodium 15mM et tamponnées à pH 7,3 avec le tampon PBS. Les cellules sont ensuite fixées pendant 5 minutes à 4C dans une solution de PBS contenant 2 % de formaldéhyde et 0,2 % de glutaraldéhyde. Les cellules sont ensuite lavées avec du PBS et recouvertes avec le milieu de réaction histochi- mique contenant 1 mg/ml de 4-Cl-5-Br-3-indolyl- f-D-galac- toside (X-Gal), 5 mM de ferricyanine de potassium et 2 mM MgCl2. Le X-Gal est dissous dans une solution de 40 mg/ml de diméthoxysulfoxide (DMSO), avant d'être introduit dans le milieu de réaction. Le cas échéant 1 % d'agar peut être ajouté au milieu de culture pour minimiser le détachement des cellules de leur support. L'incubation est en général conduite à 37'C pendant 14-18 heures. C'est une telle méthode qui a été utilisée pour repérer les cellules NIH 3T3 qui avaient été infectées. A l'issue de la mise en oeuvre de ce test, les cellules ayant incorporé leprovirus comportant lui-même le gène lacZ apparait fortement coloré vis-à-vis des cellules dont les génomes n'ont pas été modifiés. Le même test de détection peut être mis en oeuvre dans les essais de détection des cultures cellulaires qui, dans des conditions déterminées, peuvent ou non etre in- fectées par le rétrovirus recombinant selon l'invention. Essai d'infection de cellules déterminées par le rétro- virus recombinant selon l'invention: Les conditions dans lesquelles une telle infection peut être réalisée ont déjà été partiellement évoquées cidessus. Il est néanmoins avantageux, pour la sensibilité du test, de concentrer au préalable le rétrovirus recombinant produit par les cellules auxiliaires, par exemple par centrifugation ou filtration, le sédiment ou le produit retenu sur le filtre étant ensuite remis en suspension dans un petit volume du milieu de culture, complété avec du sérum de veau. Par exemple, le sédiment ou le virus retenu sur le filtre est remis en suspension dans un volume de O, 2 à 2 % de celui du milieu de culture dans lequel il avait initialement été libéré. Les cellules à tester peuvent alors être exposées soit au surnageant des cellules auxiliaires ayant produit le rétrovirus recombinant ou à un concentrat de rétrovirus. Les cellules éprouvées sont alors ensuite soumises au test de détection par coloration décrits ci- dessus deux jours plus tard. Il est avantageux de réaliser les opéations qui précèdent en présence de polybrène. Ce composant favorise le titre en virus produit. La fig. 4 fait apparaître les accroissements re- latifs d'activité 0-galactosidase mesurés (unités -ga- lactosidase) selon que l'on opère avec un surnageant viral non concentré (courbe de droite de la moitié gauche de la figure) ou concentré (courbe de gauche de la moitié gauche de la figure). La partie droite de la fig. 4 fait apparaître la variation d'activité 0galactosidase mesurable selon la concentration en polybrène du milieu. En apparence, en présence de 5 à 10 pg/ml de polybrène, on multiplie le titre infectieux apparent par un facteur supérieur à 10. Les unités d'activité p-galac- tosidase par mg de protéine cellulaire sont telles que définies par Miller J. (1972), Cold Spring Harbor Labora- tory, Cold Spring Harbor, N.Y.. Bien entendu, les conditions expérimentales qui précèdent n'ont aucun caractère limitatif. Elles peuvent être aménagées en fonction de chaque type de rétrovirus et les conditions expérimentales recherchées, par exemple lorsqu'il s'agit d'apprécier l'effet d'un principe actif de médicament dont doit être étudié l'effet inhibiteur potentiel à l'égard du pouvoir infectieux du rétrovirus à l'égard des cellules étudiées. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés; elle en embrasse au contraire toutes les variantes; en particulier l'inven- tion concerne encore un rétrovirus recombinant contenant au moins une séquence hétérologue supplémentaire codant pour une activité biologique distincte, également sus- ceptible d'être exprimée dans des cellules transfectées avec le rétrovirus recombinant selon l'invention, en particulier dans des essais visant & étudier la capacité d'un agent extérieur déterminé & inhiber ou non cette activité biologique distincte. REVENDICATIONS 1. Rétrovirus recombinant défectif dérivé d'un rétrovirus sauvage ou natif, contenant les parties agis- sant en cise du virus sauvage et assurant normalement l'empaquetage du rétrovirus, sa réverse-transcription en une molécule ADN et son intégration dans le génome de la cellule hdte, ainsi que le site de polyadénylation de cet ARN, ce rétrovirus recombinant étant caractérisé par la substitution partielle ou totale des séquences codant pour ces protéines virales par une séquence génique contenant elle-même une séquence codant pour une protéine choisie parmi celles qui peuvent agir en tant que marqueurs de cellules infectées, notamment grâce à leur coloration sélective, le cas échéant sous l'action ultérieure d'un révélateur. 2. Rétrovirus selon la revendication 1 caractérisé en ce que la séquence codant pour le marqueur est placée sous le contrdle d'un promoteur susceptible d'être reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire infectable, ce promoteur étant soit contenu dans la séquence génique, soit à la fois hétérologue vis-à-vis de la séquence gé- nique et des promoteurs des régions LTR. 3. Rétrovirus recombinant selon la revendication 1 caractérisé en ce que la séquence codant pour le marqueur est placée sous le contrôle direct du promoteur rétroviral correspondant, notamment de la région LTR5 du rétrovirus. 4. Rétrovirus recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend successivement: - la région LTR5 du rétrovirus sauvage correspondant, suivie de la région d'empaquetage; - le site d'initiation de l'ARN correspondant aux pro- téines virales normalement codées par les gènes _a., roi et env; -la séquence génique susdéfinie, concernant la séquence codant pour le marqueur, en lieu et place de tout ou partie de la région rétrovirale comportant ces gènes gag, Dol et env, cette séquence étant placée sous le contrôle d'un promoteur approprié, le cas échéant de la région LTR ellemême; 3. - la région LTR3, qui coincide avec le site de polyadé- nylation de l'ARN. 5. Rétrovirus recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 & 4, caractérisé en ce que la sé- quence génique contient une séquence nucléique qui code pour la 0-galactosidase ou la 0-glucuronidase. 6. Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il contient, incorporé à un vecteur, l'ADN du rétrovirus selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 7. Procédé de fabrication d'un rétrovirus recom- binant selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend: - la transformation avec un vecteur recombinant selon la revendication 6 d'une lignée cellulaire auxiliaire contenant, incorporée & son propre ADN génomique, une séquence nucléique capable de suppléer à l'absence dans le vecteur recombinant des séquences contenant les parties essentielles des gènes gag DOl et env du rétrovirus sauvage correspondant, par un apport 'en trans" de pro- téines virales permettant la réplication d'un virus re- combinant défectif contenant dans son génome les autres séquences rétrovirales du vecteur recombinant; - la culture de la lignée cellulaire auxiliaire ainsi transformée dans des conditions permettant la réplication de ce rétrovirus recombinant in situ, grâce à l'apport par complémentation "en trans" des protéines virales codées par la susdite séquence de complémentation"; - la récupération du virus recombinant défectif produit dans le surnageant de culture de ladite lignee cellulaire auxiliaire. 8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que la séquence de complémentation contient plus par- ticulièrement la partie de l'ADN génomique du rétrovirus sauvage correspondant, dont le vecteur recombinant est lui-même dépourvu, codant notamment pour les protéines virales, à savoir les gènes aga, mol et env du rétrovirus sauvage correspondant. 9. Procédé de détection du pouvoir infectieux d'un rétrovirus sauvage" déterminé à l'égard de tout ou partie d'une culture cellulaire, caractérisé: - par la mise en contact de cette culture cellulaire, en présence ou non d'agents extérieurs susceptibles d'inter- férer éventuellement avec cette capacité d'infection, avec un rétrovirus recombinant défectif conforme à l'une quel- conque des revendications 1 à 5 dans des conditions susceptibles d'autoriser cette infection, ce rétrovirus recombinant défectif ayant en commun avec le rétrovirus sauvage les parties agissant en "cis" du virus sauvage et assurant normalement l'empaquetage du rétrovirus, sa ré- verse-transcription en une molélcule ADN et son intégra- tion dans le génome de la cellule hôte, ainsi que le site de polyadénylation de cet ARN, et - par la visualisation, le cas échéant à l'aide d'un révé- lateur approprié, de celles des cellules dans lesquelles le marqueur est exprimé. 10. Nécessaire ou kit pour la production du rétro- virus selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 consistant: - en un vecteur recombinant contenant le génome du rétro- virus conforme à l'invention; - en un hôte cellulaire auxiliaire susceptible d'être transformé dans les conditions qui ont été décrites, pour produire le rétrovirus recombinant lui-même; auxquels s'ajoutent éventuellement - des tampons et réactifs nécessaires à la réalisation de la susdite transformation; - et, le cas échéant, un hôte cellulaire compétent, notamment bactérien, permettant une production amplifiée du susdit vecteur recombinant.