FR 2599639 A1 19871211 FR 8707874 A 19870605 La présente invention se rapporte à un dispositif pour la fabrication de perles d'alginate qui peuvent être produites à une dimension sensiblement constante. Les perles comprennent une enveloppe extérieure en alginate et une partie centrale qui peut être un liquide ou un gel ou une émulsion d'eau dans l'huile, ce gel ou ce liquide contenant des cellules captives en suspension ou des particules biologiquement actives en suspension. Le noyau peut également être composé d'une huile ou d'une substance huileuse pouvant 10 également contenir une substance biologiquement active. Si on le désire, on peut ensuite enlever l'enveloppe d'alginate. Les perles peuvent être fabriquées à des dimensions de l'ordre de grandeur du millimètre et on peut fabriquer des perles dans une plage de dimension sensible15 ment constante désirée. Le dispositif suivant l'invention comprend trois conduits par lesquels on amène une solution d'alginate, une solution ou suspension qui constitue ensuite le noyau de la perle, et un courant de gaz. Les perles résultantes tom20 bent dans une solution prévue pour solidifier l'enveloppe d'alginate des perles, qui sont ensuite lavées. La matière active peut être présente dans un prépolymère et, dans ce cas, on peut mettre la perle, après durcissement de l'enveloppe d'alginate, en contact avec un milieu apte à poly25 mériser le prépolymère. Bien qu'elle soit principalement destinée à la fixation de cellules et autres substances biologiquement actives dans des perles de dimension millimétrique, la même enveloppe d'alginate peut également être fabriquée pour contenir une huile, telle qu'une huile végé30 tale ou de paraffine, ou des suspensions ou émulsions à base d'un milieu hydrophobe insoluble dans l'eau. On s'intéresse beaucoup, depuis quelques années, à l'immobilisation de cellules entières. On connaît plusieurs procédés d'immobilisation de cellules entières (pour 35 récapitulation, voir J. Klein et F. Wagner, App. Biochem. Bioeng. 4, 12-51, 1983). Les avantages inhérents aux systèmes de cellules immobilisées, par exemple la réutilisation de biocatalyseur, la souplesse de conception du réacteur et la stabilité de fonctionnement sensiblement meil5 leure, ont conduit au développement et à l'utilisation de systèmes de cellules immobilisées, au laboratoire, sur installation pilote et à l'échelle industrielle (pour récapitulation, voir P. Linko & Y. Linko, CRC Critical Reviews in Biotechnology, 1, 289- 338, 1984). La méthode la plus courante d'immobilisation de cellules est par capture sur gel. On met en suspension les cellules dans une solution aqueuse d'un monomère ou d'un prépolymère puis, par changement physique ou chimique tel que refroidissement, modification de pH, introduction d'un 15 déclencheur de polymérisation, on transforme la solution en un gel pour emprisonner physiquement les cellules. Depuis quelques années, on s'intéresse beaucoup à l'immobilisation de cellules dans un gel par réticulation de prépolymères synthétiques (S. Fukui & A. Tanaka, Ad. Biochem. Eng. 29, 2-33, 1984). La demanderesse a développé dans ses laboratoires une nouvelle technique d'immobilisation sur gel, basée sur une réticulation chimique d'un polyacrylamide linéaire, soluble dans l'eau, partiellement substitué avec des groupes acylhydrazide. Le procédé est basé sur la mise en suspension de cellules, organelles ou enzymes,dans une solution de poly.acrylamidehydrazide (PAAH) et réticulation par addition de quantités réglées de dialdéhyde (par exemple glyoxal). Après durcissement, on fragmente mécaniquement le bloc de 30 gel résultant. On a trouvé que cette technique est utile pour l'immobilisation de bactéries, levures, cellules végétales, microsomes du foie et enzymes (pour récapitulation, voir A. Freeman, Annal, N.Y. Acad.: Sci. 434, 418-426 1984). Les avantages de cette technique comprennent une rétention 35 d'activité (90% et plus de l'activité d'entrée), une forte porosité, une bonne stabilité chimique, biologique et mécanique, et une stabilisation des cellules immobilisées à l'égard des solvants organiques. La présente invention a pour objet un dispositif pour la fabrication de perles de dimension sensiblement constante, d'un diamètre de l'ordre du millimètre, comprenant une enveloppe extérieure d'alginate et contenant une suspension de cellules ou des cellules emprisonnées dans un gel, ou une matière biologiquement active, telle qu'enzymes 10 ou anticorps, immobilisée sur un élément porteur approprié, à l'intérieur de ladite enveloppe. L'invention vise également un dispositif pour la préparation de macrocapsules comprenant une enveloppe extérieure d'alginate contenant des gouttelettes d'un com15 posant hydrophobe, tel qu'huile végétale ou de paraffine, ou des solutions, émulsions ou suspensions à base d'un milieu hydrophobe non miscible à l'eau. Conformément à l'invention, les objectifs cidessus sont atteints par un dispositif comprenant trois 20 conduits qui se terminent à un orifice de sortie commun, l'un de ces conduits amenant une suspension de cellules,ou une suspension de petites particules auxquelles est fixée une matière biologiquement active, dans un milieu liquide quipeut être un prépolymère polymérisable, le deuxième 25 conduit amenant une solution aqueuse d'alginate, et le troisième conduit amenant un flux d'un gaz, le débit de chacun de ces conduits étant réglable à volonté. De préférence, le conduit intérieur amène la suspension de cellules ou de particules. Conformément à un mode préféré de réalisation de l'invention, les trois conduits sont sous la forme de trois pièces tubulaires concentriques, la pièce intérieure -amenant lasuspension, la deuxième l'alginate, et la troisième le gaz. On peut régler la distance exacte des sorties 35 les unes par rapport aux autres, ce qui permet d'obtenir, en combinaison avec le réglage du débit de chacun des trois composants, des perles de dimension, d'épaisseur d'enveloppe et de cadence de production prédéterminées. L'invention vise en outre un procédé pour la fabrication de telles perles d'alginate. D'autres objets et avantages de l'invention apparaîtront à la lumière de la description de ses modes préférés de réalisation, non limitatifs, illustrés sur les dessins annexés dans lesquels: Fig. 1 est une coupe schématique longitudinale, non à l'échelle, d'un dispositif conforme à l'invention; Fig. 2 illustre la comparaison des granulométries de préparations de levure immobilisées sur PAAH; en haut à droite: procédé antérieur, une fragmentation; en haut 15 à gauche: procédé antérieur, deux fragmentations; en bas: préparation de perle; Fig. 3 est un graphique illustrant la conversion de glucose en éthanol par Saccharomyces cerevisiae en suspension libre et dans le cas d'immobilisation dans des per20 les de PAAH; Fig. 4 est un graphique illustrant la Xl-déshydrogénation d'hydrocortisones par Arthobacter simplex libre et immobilisé dans des perles de PAAH; et Fig. 5 illustre la courbe de libération de Cyolane à partir de perles d'alginate de Ca en fonction d'un nombre de jours,et la vitesse de libération. Comme représenté sur la figure 1, le dispositif injecteur conforme à l'invention comprend trois pièces tubulaires coaxiales 11, 12 et 13, appelées "aiguilles" dans 30 ce qui suit, le repère 14 désignant l'entrée de la suspension de cellules,le repère 15 l'entrée de la solution d'alginate et le repère 16 l'entrée du flux de gaz. Chacun de ces composants peut être réglé à volonté, en ce qui concerne la vitesse d'écoulement et le volume. On peut régler la dis35 tance des extrémités des aiguilles, définissant les sorties, par modification à volonté des distances h1 et h2. Le dispositif expérimental illustré a une longueur totale de 5 à cm environ et les dimensions exactes des composants sont indiquées ci-après. Il est clair que ces valeurs sont don5) nées à titre d'illustration seulement et on peut apporter diverses modifications à la disposition et à la dimension des composants. Les cellules emprisonnées dans des perles de PAAH peuvent être facilement préparées en grande quantité, dans 10des conditions stériles et anaérobies, par un procédé continu. Les cellules emprisonnées dans des perles présentent les avantages inhérents à la technique au PAAH: rétention d'une activité élevée, forte porosité et bonne stabilité. Les perles sont très uniformes et on peut régler leur di15 mension dans la plage de 1 à 5 mm en diamètre. La couche d'alginate occupe 5 à 10% environ du volume total. L'aiguille intérieure reçoit une alimentation réglée d'une suspension de cellules dans du PAAH (ou une autre solution) par l'orifice d'entrée 14. Cette aiguille est placée dans une aiguille de plus grand diamètre qui reçoit une solution d'alginate de sodium par l'orifice d'entrée 15. Les deux aiguilles sont tenues au centre d'une troisième aiguille coaxiale qui reçoit un flux réglable d'air ou d'un autre gaz, par l'orifice d'entrée 16. On peut régler les distances exac25 tes entre les aiguilles, par modification des distances h1 et h2. L'appareil décrit a une longueur de-5 à 10 cm environ et il est maintenu mécaniquement dans une position verticale. Par réglage du débit de la suspension de cellules, 30 de la solution d'alginate et du gaz, on forme des gouttelettes comprenant un noyau intérieur, constitué par l'alimentation 14, encapsulé dans une enveloppe extérieure provenant de l'alimentation 15. Ces gouttelettes sont détachées et étirées vers le bas par le flux de gaz venant de l'alimentation 16 et elles sont de dimension très constante. Lorsqu'on introduit une solution d'alginate par l'entrée 15, l'enveloppe est gélifiée par contact avec une solution de CaCl2. Les perles tombent de l'injecteur dans une solution de CaCl2 et on les laisse durcir, puis on remplace le milieu par un tampon contenant du glyoxal.Le glyoxal traverse la couche d'alginate et, par suite, la solution intérieure de PAAH est réticulée. Après lavage, les perles sont prêtes à l'emploi. Le procédé permet l'immobilisation d'une grande variété de cellules, en perles de polymère de dimension 10 constante, réticulées et chimiquement stables. D'une manière analogue, par introduction en 14 d'huiles, de solutions à base d'huile, d'émulsions ou de suspensions dansdes huiles, on obtient des macrocapsules constituées d'une enveloppe extérieure d'alginate de cal15 cium et remplies de gouttelettes intérieures à base d'huile. L'invention est mieux illustrée par les exemples ci-après. EXEMPLE 1 Conversion de glucose en alcool par Saccaromyses cerevisiae 20 immobilisé dans des perles de PAAH. a) Préparation des solutions: 1. Suspension de cellules Dans une solution aqueuse à 5% (p/v) de polyacrylamide-hydrazide (poids moléculaire moyen de 100 000 contenant 0,8 25 meq de groupes acryl-hydrazide), on ajoute une quantité prépesée de levures, fournies par "Paka" Industries Ltd., Bat-Yam, Israel, dans un rapport de 0,5 g (p/v) de levures pour 20 ml de mélange réactionnel formant un gel, et on homogénéise la suspension par agitation magnétique pendant 30 15 minutes à température ambiante. 2. Solution d'alginate de sodium On prépare une solution à 3% (p/v) par dissolution d'alginate de sodium (BDH) dans l'eau sous agitation magnétique pendant 24 heures à température ambiante. Cette solution 35 est dégazée sous vide avant utilisation. b) Spécifications du dispositif d'injection (voir la fig.1) Dimensions et débits: 1. Tube intérieur: diamètre intérieur A 0,35 mm - 2,0 mm débit 0, 7 - 0,9 ml/mn 2. Tube intermédiaire: diamètre intérieur B 2,2 mm - 3,0 mm débit 0,5 - 0,7 ml/mn 3. Tube extérieur: diamètre intérieur C 2,0 mm - 5, 0 mm débit 2,5 - 4,0 ml/mn Distances entre les sorties des tubes: h1 (voir schéma 1) 2,0 - 2,2 cm h2 2,2 - 2,5 cm c) Alimentations par les tubes A, B et C 1. Par le tube A: cellules en suspension dans une solution aqueuse de polyacrylamide-hydrazide (3 à 5% en poids par volume) ou dans une solution tampon appropriée. 2. Par le tube B: solution d'alginate de sodium (BDH à 20 2-4% en poids par volume). 3. Par le tube C: azote ou air. d) Immobilisation de levures dans des perles de PAAH On introduit la suspension de levure homogénéisée par le tube intérieur A du dispositif, au débit indiqué ci-dessus. 25 La solution d'alginate et l'air sont fournis aux débits indiqués. On collecte les gouttes formées, dans une solution aqueuse de CaCl2 à 1% (p/v) et, après une heure d'incubation, on remplace cette solution par 50 ml de tampon phosphate (50 mM, pH = 7) contenant 2 ml de solution de glyoxal 30 à 5% (dans un tampon phosphate à 50 mM, pH = 7). On laisse le noyau de PAAH se prendre en gel, par incubation pendant 24 heures à 4 C. On lave ensuite les perles avec un tampon citrate froid à 0,3% (p/v), à pH 5. e) Essai Des perles de gel,de 1,5 à 2,0 mm de diamètre, contenant 0,5 gramme de levures immobilisées,sont lavées trois fois avec ml d'un milieu froid contenant 10% (p/v) de glucose, 0,15%(p/v) d'extrait de levure, 0, 25% (p/v) de NH4Cl, 0,55% (p/v) de KH2PO4, 0,025% (p/v) de MgSO4.7H20, 0,01% (p/v) 5 de NaCl, 0, 001% (p/v) de CaCl2 et 0,3% (p/v) d'acide citrique, pH = 5. Finalement, on ajoute le même milieu,à un volume final de 50 ml. On transfère ensuite ce dernier mélange réactionnel dans un vase erlenmeyer à chicane de 125 ml 10 qu'on secoue dans un secoueur alternatif à 100 coups/mn à 30 C, en permettant au CO2 dégagé de s'échapper par un petit orifice. On prélève des échantillons de 1 ml pour effectuer des déterminations d'éthanol et de glucose, pendant 20 heu15 res. Dans ces conditions, on observe une conversion complète du glucose en éthanol, en 20 heures d'incubation. Détermination de l'éthanol: La concentration en éthanol dans les échantillons est déterminée par G.C. Détermination du glucose La concentration en glucose est déterminée à l'aide de la trousse "Glucostat" de Sigma. Dans les conditions employées, la conversion du glucose par la levure immobilisée en perles de PAAH est la même que cel25 le du témoin de levure en suspension libre (voir la figure 2). EXEMPLE 2 1-déshydroqénation d'hydrocortisone par des cellules d'Arthrobacter simplex immobilisées en perles de PAAH 30 a) Culture et récolte des cellules 1. Une colonie d'Arthrobacter simplex (ATCC 6946) est raclée à partir d'agar couché, dans 30 ml d'une solution stérilisée de bouillon nutriant (oxoide CM 15) à 8g/l, dans une bouteille universelle fermée de 250 ml, et on laisse incuber pendant 48 heures à 30 C sur un secoueur ro- tatif à 150 t/mn. Dans un erlenmeyer à chicane de 2,5 1, on ajoute 2,5 g d'extrait de levure, 0,75 g de (NH4)2SO4, 0,66 g de K2HPO4.3H20, on dissout dans 225 ml d'eau, avec 0,25 ml d'une solution d'oligo-éléments comprenant: ZnSO4.7H20 1,44 g/l MMSO4.4H20 1,12 H3BO3 0,31 CuSO4.5H20 0,63 Na2Mo4.2H20 0,25 2 4' 2 02 COCl2.6H20 0,24 Kl 0,42 " FeSO4.7H20 2,78 H2SO4 1-2 ml et on stérilise la solution finale à 121 C. En parallèle, 3,75 g de glucose et 25 mg de MgCl2 sont dissous dans 25 ml de H20, stérilisés et ajoutés à la solution ci-dessus. On transfère 1 ml de la suspension de cellules dans le flacon et on laisse incuber le flacon pendant 24 heures à 20 30 C sur un secoueur rotatif à 210 t/mn. On utilise 5 ml de cette suspension pour une inoculation dans un erlenmeyer à chicane de 2,5 1,dans le même milieu, puis incubation pendant 16,5 h à 30'C sur un secoueur rotatif. Après cette incubation, on ajoute 0,25 g d'hydrocortisone en suspension 25 fine (sous agitation magnétique pendant une nuit) dans 5 ml d'une solution à 2, 5% (p/v) de Tween 80 dans l'eau. On laisse l'induction se développer pendant 6,5 h.On collecte les cellules par centrifugation, on les congèle dans l'azote liquide et on les stocke à -20 C. 2. Suspension de cellules Avant l'utilisation, une quantité pesée de cellules congelées est transférée dans du tris à 0,05 M refroidi à la glace, à pH 7,8 (0,1 g WW (20 mg dcw) cellules par ml),et agitée magnétiquement sur de la glace pendant 30 minutes. La suspension est ensuite homogénéisée par un homogénéiseur verre-téflon, pour assurer la formation d'une suspension uniforme. b) Immobilisation des cellules en perles de PAAH. Dans 10 ml de solution de prépolymère (poids moléculaire 100 000) à 5%, sous agitation magnétique et avec refroidissement sur de la glace, on ajoute 0,4 ml de suspension de cellules, puis on homogénéise la suspension de cellules par agitation magnétique. La suspension fine de cellules dans le prépolymère est ensuite traitée pour fabriquer des 10 perles de PAAH comme dans l'exemple 1. Après prise en gel pendant une minute, dans un tampon phosphate 0,05 M (pH 7,8, contenant 2 ml de solution de glyoxal à 5%), on lave les cellules immobilisées en perles de PAAH trois fois avec un tampon tris 0,05 M (pH 7,8) et on porte à un volume fi15 nal de 40 ml avec le même tampon.c) Essai On dissout 40 g d'hydrocortisone dans 4 ml d'éthylène glycol, puis on ajoute progressivement 4 ml d'eau et 2 ml de tampon tris 0,25 M, pH 7,8. On transfère ensuite le substrat dans un erlenmeyer à chicane de 250 ml contenant les cellules immobilisées en perles de PAAH susmentionnées. On ajoute du tampon tris 0,05 M, pH 7,8, pour amener le volume final à 50 ml. On fait ensuite incuber le flacon dans un secoueur rotatif à 30 C et 150 t/mn. On extrait le substrat et le produit avec CH2C12 et on procède à l'analyse par HPLC. Dans ces conditions, on observe une conversion de 50% d'hydrocortisone en prednisolone, en trois jours (voir la figure 4). EXEMPLE 3 Perles contenant des gouttelettes d'huile 1. Par application d'huile de paraffine liquide (Cat. N 29437, BDH, Poole, England) à un débit de 4,5 ml/mn par le tube A et d'une solution d'alginate de sodium (BDH) à 3% (p/v) à un débit de 12 ml/mn par le tube B et d'azote-à un débit de 6 1/mn par le tube C, ainsi que d'une solution 35 de CaCl2 à 2% (p/v) dans l'eau ordinaire, on obtient des gouttelettes d'huile de paraffine encapsulées dans une enveloppe d'alginate de calcium. 2. D'une manière analogue, par utilisation d'huile de mals à 0,4 ml/mn par le tube A, d'une solution d'al5 ginate de sodium à 3% à 2,0 ml/mn par- le tube B et d'azote à 10 1/mn par le tube C, on obtient des gouttelettes d'huile de mais encapsulées dans une enveloppe d'alginate de calcium. D'une manière analogue, on encapsule une solution de (0-carotène dans l'huile de mais, à l'intérieur d'une 10 enveloppe d'alginate de calcium. EXEMPLE 4 Préparation d'une composition à libération réglée pour insecticides systémiques Par utilisation de "Cyolan" ou 2-(diéthoxyphosphinylimino)15 1,3 dithiolane (American Cyanamid Co., USA), en solution à 10 mg/ml dans une solution d'huile de mais-alcool 1-dodécylique (Cat. N 29276, BDH) dans le rapport 40:60 (v/v), à 40 C et à un débit de 0,4 ml/mn par le tube A, d'une solution d'alginate de sodium à 3% à 2,0 ml/mn par le tube 20 B, et d'azote à 10 1/mn par le tube C, on peut obtenir une solution de cyolan solide dans de l'huile de mais-dodécanol, encapsulée dans une enveloppe d'alginate (dans une solution à 3% de CaCl2 dans l'eau ordinaire). Après une heure d'incubation pour le durcissement 25 dans la solution de CaCl2, on transfère les perles dans du méthanol pendant 5 minutes puis dans l'hexane pendant 1 minute. On sépare les perles par filtration et on place 8 g de perles (WW) dans 50 ml d'eau distillée, dans un bécher. On prélève journellement des échantillons puis on 30 lave les perles avec 20 ml d'eau et on procède à une nouvelle incubation dans 50 ml d'eau distillée neuve. On détermine la concentration en Cyolan dans l'eau, par HPLC. Les échantillons (5 gl) sont contrôlés sur une colonne Lichrochart RP-8 (4 g) de 12,5 x 0,4 cm (Merck, Darmstadt, 35 FRG) en utilisant du méthanol-eau, (60:40) comme phase mobile à un débit de 0,6 ml/mn (temps de séjour 4 mn). Les témoins et les échantillons sont détectés à 245 nm. La courbe de libération du Cyolan dans ces conditions est représentée sur la figure 5. Il est entendu que des modifications de détail peuvent être apportées dans la forme et la mise en oeuvre du procédé et de l'appareil suivant l'invention, sans sortir du cadre de celle-ci. Revendications 1. Dispositif pour la fabrication de perles, d'une dimension de l'ordre du millimètre, comprenant une enveloppe d'alginate et un noyau sous forme liquide ou de gel de substance biologiquement active ou d'une substance 5 huileuse, caractérisé en ce qu'il comprend trois conduits de fluide (11, 12,13) réglables individuellement,et des moyens pour régler la distance entre les extrémités respectives de ces conduits à un orifice de sortie coaxiale commun, le conduit intérieur servant à l'amenée de la substance constituant le noyau, le deuxième conduit servant à l'amenée de la solution d'alginate et le troisième conduit étant un conduit de gaz. 2. Dispositif suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les conduits sont sous la forme de trois 15 pièces tubulaires coaxiales comportant une sortie commune dirigée vers le bas. 3. Procédé pour la fabrication de perles d'alginate d'une dimension de l'ordre du millimètre, comprenant une enveloppe d'alginate et un noyau d'une substance biolo20 giquement active ou d'une substance huileuse, caractérisé en ce qu'il consiste à fournir simultanément des flux séparés de la substance de noyau par l'intermédiaire d'un conduit du dispositif suivant la revendication 1, de la solution d'alginate par l'intermédiaire du deuxième conduit, 25 et d'un gaz par l'intermédiaire du troisième conduit, et à laisser tomber les gouttes ainsi obtenues dans une solution capable de coaguler l'alginate et à laisser les perles dans cette solution de façon à ce que l'enveloppe durcisse. 4. Procédé suivant la revendication 3, caracté30 risé en ce que la substance du noyau est une suspension de cellules, d'organelles ou de particules d'une substance biologiquement active, dans une solution d'un prépolymère qui est ensuite polymérisé. 5. Procédé suivant la revendication 4, caracté- risé en ce que le prépolymère est le polyacrylamide-hydrazide (PAAH) qui est ensuite réticulé au moyen de glyoxal. 6. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que la substance biologi5 quement active est choisie parmi des bactéries, champignons, cellules de levure, cellules végétales, enzymes et anticorps. 7. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisé en ce que la substance active est emprisonnée dans une matrice de polymère et en ce que 10 l'enveloppe d'alginate est ensuite enlevée. 8. Perles de dimension sensiblement constante de l'ordre du millimètre, caractérisées en ce qu'elles contiennent un noyau de substance biologiquement active et une enveloppe extérieure d'alginate, obtenues par un procé15 dé suivant l'une quelconque des revendications 3 à 7. 9. Perles à enveloppe d'alginate d'une dimension de l'ordre du millimètre, caractérisées en ce qu'elles contiennent un noyau d'une suspension de protéines biologiquement actives ou de cellules ou d'une telle substance 20 emprisonnée dans une matrice de polymère qui ne nuit pas à l'activité biologique de ces matières.