FR 2608988 A1 19880701 FR 8618446 A 19861231 La présente invention a pour objet un nou- veau procédé de préparation de systèmes coloidaux dispersibles d'une substance sous forme de particules sphériques de type matriciel et de taille inférieure à 500 nm (nanoparticules). Des particules submicroscopiques d'un dia- mètre inférieur à 500 nm sont déjà connues notamment d'après les brevets BE-A-808 034, BE-A-839 748, BE-A- 869 107 et FR-A-2 504 408. Selon BE-A-808 034 et -839 748, les particules submicroscopiques sont formées par polymérisation micellaire d 'un monomère tel qu'un dé- rivé de l'acide acrylique. De même, BE-A-869 107 et FR-A-2 504 408 décrivent la préparation de nanoparti- cules biodégradables obtenues par polymérisation d'un cyanoacrylate d'alkyle et contenant une substance bio- logiquement active. Les méthodes font appel à une po- lymérisation en solution et sont donc limitées à l'u- tilisation d'un nombre limité de polymères pouvant être obtenus notamment par vinyl-addition et ne peu- vent convenir à des polymères naturels ou hémisynthé- tiques. De plus il est difficile de maîtriser le poids moléculaire du polymère constitutif des nanoparticules et il est nécessaire, notamment en vue d'usage biolo- gique, d'éliminer les monomères et oligopolymères ré- siduels, le cas échéant les réactifs de polymérisation (initiateur et catalyseur) en excès, ainsi que les surfactifs s'ils sont utilisés à forte concentration ou ne sont pas biocompatibles. Or la purification (ultracentrifugation, dialyse) s'avère souvent lourde, car la filtration des nanoparticules, vu leur taille, n'est pas toujours possible. On a aussi décrit des méthodes par émulsifi- cation-évaporation. faisant appel à des polymères préformés et selon lesquelles une solution organique de polymère non miscible à l'eau est émulsifiée dans une phase continue aqueuse, puis le solvant est éva- poré afin de conduire à une suspension de polymère insoluble dans l'eau Cependant, si l'intérêt majeur de cette méthode est d'être utilisable pour de nom- breux polymères d'origine synthétique ou hémisyn- thétique et de permettre ainsi l'obtention de nano- particules à partir de polymères bien définis, son inconvénient réside dans la difficulté de réaliser des émulsions ultra-fines et homogènes pour l'obtention de nanoparticules inférieures à 500 nm qui seraient elles-mêmes de taille homogène. De plus, la nécessité d'utilisation de surfactifs dans des proportions sou- vent importantes (20Z) et qui devront être éliminés, et la mise en oeuvre d'appareillages sophistiqués et gourmands en énergie (sonicateurs, homogénéiseurs,..) constituent des handicaps sérieux à leurs applications industrielles. On a aussi proposé l'obtention de nanopar- ticules dans le cas des protéines, notamment par déna- turation à chaud d'une émulsion eau dans l'huile d'une solution protéique, telle que l'albumine, (Kramer, P. A J3. Pharm. Sci., 63, 1646 (1974), ou par désolva- tation d'une solution protéique, telle que la géla- tine, par un sel minéral ou l'éthanol (Marty et coll., dans Austr. 3. Pharm. Sci., 6, 65 (1978), ou dans Pharm. Acta Helv. 3, Nr. 1 ((1978)), puis, dans les deux cas, par durcissement au moyen d'un aldéhyde. La méthode de Kramer a pour inconvénient principal de nécessiter une émulsification préalable de la solution aqueuse de la matière première macromoléculaire dans une phase continue huileuse. Cette émulsion devant être très fine, l'utilisation de surfactifs et d'ap- pareillages ad-hoc (sonicateur, etc) est indispensable pour obtenir des nanoparticules de taille convenable. Quant à la méthode de Marty, elle fait appel à des quantités importantes de sels minéraux qu'il faut éliminer, de même que l'excès d'aldéhyde et le sulfite ou le métabisulfite utilisé pour neutraliser ce dernier. Toutes les méthodes décrites ci-dessus ne sont applicables qu à certaines catégories de molé- cules et font intervenir des opérations coûteuses (ultracentrifugation, sonication, etc) ou difficile- ment contrôlables (polymérisation), tout en ne per- mettant pas d'obtenir une homogénéité satisfaisante de la taille des particules ou même des particules suffi- samment petites (inférieures à 500 nm) pour assurer leur stabilité à long terme sous forme d'une suspen- sion colloidale. L'invention propose un nouveau procédé de préparation de nanoparticules, ne présentant pas les désavantages précédents et utilisable aussi bien pour des substances polymèriques synthétiques et naturelles que pour diverses substances organiques (médicaments, lipides, etc) ou minérales (sels, pigments, etc), ainsi que leurs mélanges. La présente invention a pour objet un pro- cédé de préparation de systèmes colloïdaux dispersi- bles d'une substance, sous forme de particules sphé- riques de type matriciel et de taille inférieure à 500 nm. (nanoparticules), caractérisé en ce que: (1) on prépare une phase liquide constituée essen- tiellement par une solution de la substance dans un solvant ou dans un mélange de solvants, et pouvant être additionnée d'un ou de plusieurs surfactifs, (2) on prépare une seconde phase liquide constituée essentiellement par un non-solvant ou un mélange de non-solvants de la substance et pouvant être addition- née d'un ou de plusieurs surfactifs, le non-solvant ou le mélange de non-solvants de la substance étant mis- cible en toutes proportions au solvant ou mélange de solvants de la substance, (3) on ajoute sous agitation modérée, l'une des phases liquides obtenues sous (1) ou (2) à l'autre, de ma- nière à obtenir une suspension colloïdale de nanopar- ticules de la substance, et (4) si l'on désire, on élimine tout ou partie du sol- vant ou du mélange de solvants de la substance et du non-solvant ou du mélange de non-solvants de la subs- tance, de manière à obtenir une suspension colloidale de concentration voulue en nanoparticules ou à obtenir une poudre de nanoparticules. Dans l'étape (3), les nanoparticules se for- ment pratiquement instantanément. La solution devient blanche, laiteuse et présente l'effet Tyndall carac- téristique des suspensions colloïdales. Dans cette étape, on ajoute de préférence la phase liquide obte- nue dans l'étape (1) à la phase liquide obtenue dans l'étape (2), notamment si celle-ci est aqueuse mais l'inverse est toutefois possible comme le montrent les exemples. La substance" utilisée selon le procédé de l'invention peut être pratiquement n'importe quelle substance suffisamment soluble dans un solvant donné. La substance" peut être en particulier un polymère, aussi bien un polymère synthétique, par exemple l'acide poly (d,l) lactique (PLA), etc, un polymère hémisynthétique comme par exemple l'acétate butyrate de cellulose, l'éthylcellulose, le phtalate d'hydroxyméthyl-propylcellulose (HPMCP), etc, qu'un polymère naturel, par exemple la gélatine, la gomme arabique, etc. De nombreux autres polymères peuvent être utilisés, par exemple: l'acéto-phtalate de p- lyvinyle, l'acéto-phtalate de cellulose; des dérivés maléiques (par ex. "Gantrez"); les copolymères d'acide acrylique et d'acrylates et les polymères acryliques (par ex. Eudragit R); l'acide polylactique d ou 1, et (d,l); les copolymères d'acide lactique et d'acide glycolique, polypeptides, glycolides (dérivés de pro- piolactone, butyrolactone, pivalolactone, -capro- lactone, etc); les polymères obtenus à partir d'esters cycliques des acides hydroxybutyrique, hydroxyisobu- tyrique, hydroxyméthylvalérique, phényl-lactique, hy- droxyéthylbutyrique; le poly béta malate de benzyle; les copolymères de l'acide malique et du malate de benzyle; un copolymère polyvinylpyrrolidone-acétate de vinyle réticulé. les polycyanoacrylates d'alkyle; les poly (éthylène-vinylacétate); les polymères hydroso- lubles (gélatine, gomme arabique, méthylcellulose, etc); les oligomères (styrène allyl alcool), etc. La "substance" peut être un corps gras, par exemple un mono-, di- ou tri-glycéride d'acide gras; une huile hydrogénée comme par exemple l'huile de ricin hydrogénée, une huile solide à température am- biante, comme par exemple l'huile de coprah; une cire. comme par exemple la cire d'abeille, un ester d'acide gras de de polyéthylèneglycol (PEG), comme par exemple le distéarate de PEG 6000. etc. La "substance" peut aussi être une substance biologiquement active, notamment un principe actif mé- dicamenteux ou un précurseur de principe actif médica- menteux, ou encore un produit de contraste ou un réac- tif biologique. Dans ce cas, il peut être intéressant de préparer des nanoparticules comprenant à la fois une substance biologiquement active et un polymère en tant que "substance", comme on le verra plus loin. La "substance" peut aussi être un pigment, une encre, un lubrifiant, un agent de traitement de surface, etc. Il est évident que le procédé selon l'inven- tion peut s'appliquer aussi bien pour une substance que pour plusieurs. A cet égard, selon une variante du procédé, on peut fixer une seconde substance par adsorption à la surface de nanoparticules déjà formées dans l'étape (3), par simple addition à la suspension colloidale du polymère, éventuellement après concentration. Cette seconde substance peut être en particulier une subs- tance biologiquement active. Le "solvant" ou le mélange de solvants uti- lisé est un liquide capable de dissoudre la substance (par exemple le polymère et/ou la substance biologi- quement active). Par ailleurs le solvant doit être miscible avec le nonsolvant de la substance utilisé dans la préparation. Ainsi, dans la plupart des cas, le solvant sera organique de sorte que la phase li- quide (1) constituera la phase organique tandis que la phase liquide (2) pourra constituer la phase aqueuse, mais il est possible d'utiliser soit deux phases orga- niques soit deux phases aqueuses dans la mesure o les conditions de solubilité, d'insolubilité et de misci- bilité sont remplies. D'un autre côté, le solvant devra être suffisamment volatil pour pouvoir éventuel- lement être éliminé. Par exemple, dans le cas o lasubstance est un polymère (additionné ou non d'une substance biologiquement active), le solvant peut être choisi parmi un alcool inférieur (méthanol, éthanol, isopropanol, etc), une cétone inférieure (acétone, méthyl-éthyl-cétone, etc), un hydrocarbure léger ou un mélange d'hydrocarbures légers (hexane, éther de pé- trole, etc) un hydrocarbure léger chloré (chloroforme, chlorure de méthylène, trichloréthylène, etc), ou d'autres solvants légers usuels tels que l'acétoni- trile, le dioxanne, etc. Le "non-solvant", ou le mélange de non-sol- vants de la substance est un liquide ne dissolvant pas la substance tout en étant miscible au solvant uti- lisé. Ainsi, par exemple, lorsque la substance est un polymère tel que P.L.A., le solvant peut être l'acé- tone et le non-solvant peut être l'éthanol ou l'eau distillée; si la substance est par exemple un polymère R acrylique tel que Eudragit L100R, le solvant peut être une phase aqueuse alcaline et le non-solvant peut être une phase aqueuse acide..Il peut être avantageux d'ajouter au solvant une faible proportion (inférieure à 20Z en volume, par exemple environ 10Z en vol.) de non-solvant, dans la phase liquide (1), ce qui permet d'obtenir des nanoparticules plus petites, notamment inférieures à 100 nm. Il est souhaitable, pour obtenir une suspen- sion plus stable, d'ajouter un ou plusieurs surfactifs (ou émulsifiants). Les surfactifs peuvent être anio- niques (par exemple laurylsulfate de sodium), catio- niques (par exemple ammonium quaternaire) ou non ioni- ques (par exemple monoesters de sorbitanne polyoxy- éthylénés ou non, éthers d'alcools gras et de polyo- xyéthylène-glycols, polyoxyéthylène-polypropylène gly- col, etc). Toutefois, les nanoparticules peuvent être obtenues selon l'invention sans surfactifs, et ceux-ci ne sont d'ailleurs pas nécessaires si dans l'étape (4) la totalité des solvants et des non-solvants est éli- minée, par exemple par lyophilisation. On peut ainsi obtenir des nanoparticules lyophilisées dont la con- servation est de longue durée. La proportion en surfactifs dans la sus- pension colloïdale obtenue dans l'étape (3) lorsqu'ils sont présents, peut aller notamment de 0,1Z à 10Z en poids, et de préférence entre 0,2 et 2% en poids. Dans le cas ou la substance est un polymère, la concentration du polymère dans le solvant ou le mélange de solvants peut être comprise entre 0,1 et 10Z, de préférence entre 0,2 et 2Z en poids. Le rapport de volumes des solvants et des non-solvants doit être tel qu'il puisse permettre la précipitation du polymère. Lorsque ce rapport aug- mente, la taille des nanoparticules diminue. L'agitation modérée de la préparation dans l'étape (3) est liée à la quantité de produits mise en oeuvre. Elle n'est pas nécessaire pour de faibles quantités. L'influence de la température et du pH sont limitées dans le procédé selon l'invention, de sorte qu'il n'est généralement pas nécessaire d'opérer dans des conditions particulières. Toutefois, lorsqu'on utilise deux phases aqueuses (1) et (2), leurs pH res- pectifs devront être différents, pour remplir respec- tivement les conditions de solvant et de non-solvant. Par ailleurs, la présence d'électrolyte (par exemple le chlorure de sodium) ne semble pas avoir d'influence sur l'obtention des nanoparticules. Ainsi après formation des nanoparticules dans l'exemple 1, une concentration de 25 mg/ml de chlorure de sodium n'entraîne pas de coalescence ou de précipitation des nanoparticules formées. Les particules obtenues selon l'invention sont autoclavables si les propriétés physiques de la substance le permettent. Le procédé d'obtention de nanoparticules selon l'invention apporte les avantages suivants par rapport aux procédés connus: - obtention de nanoparticules inférieures à 500 nm et notamment d'environ 200 nm par une méthode simple ne nécessitant pas un grand apport d'énergie; - dans le cas o la substance comprend un polymère, les nanoparticules ne sont plus obtenues par polymérisation d'un monomère mais par "nanoprécipi- tation" d'un polymère bien défini; - utilisation de polymères naturels aussi bien que synthétiques dont l'innocuité est reconnue et l'application dans le domaine de la santé est très ancienne; - utilisation de polymères qui, selon leur nature, peuvent être biocompatibles; - possibilité d'utilisation de polymères qui peuvent se dissoudre à partir d'un certain pH dans l'organisme, d'o l'assurance d'une non-concentration dans l'organisme de particules de polymères; - possibilité d'utilisation *de polymères qui, selon leur nature peuvent être biorésorbables, les produits de dégradation étant d'une totale ino- cuité; - obtention de particules sphériques avec une faible dispersion des tailles. Les exemples suivants illustrent l'inven- tion. Les nanoparticules obtenues sont visibles au microscope électronique à transmission (x 25000-150- 000) et se présentent, après coloration négative avec l'acide phosphotungstique, sous la forme de particules non contrastées sensiblement rondes. ExMmole 1: Préparation de nanoparticules de poly- mères. On dissout d'une part, 125 mg d'acide poly (d.l) lactique (P.L.A.) dans 25 ml d'acétone et, d'au- tre part, 125 mg de polymère mixte d'oxyde d'éthylène et de propylèneglycol (Pluronic F68 R ou Poloxamer 188), agent de surface non ionique, dans 50 ml d'eau purifiée. On ajoute, sous agitation magnétique (100 r.p. m.), la phase acétonique à la phase aqueuse. Le milieu devient immédiatement opalescent par formation de nanoparticules du polymère (P.L. A.). La taille moyenne des nanoparticules, mesurée aussitôt après préparation dans un diffractomètre à rayon laser (Na- nosizerR de la firme Coultronics), est de 200 nm avec un indice moyen de dispersion de 0,5. L'acétone est éliminée sous pression réduite (vide de la trompe à eau), puis la suspension est con- centrée dans ces mêmes conditions jusqu'au volume désiré, par exemple: 10 ml. La suspension concentrée de nanoparticules est filtrée sur un verre fritté (pores 9-15 um) ou sur une membrane filtrante (pores 5 um), et la taille des nanoparticules, à nouveau mesurée dans le filtrat, demeure inchangée ainsi que l'indice de dispersion. L'examen en microscopie électronique à transmission montre l'aspect sphérique régulier des nanoparticules d'acide (d,l) polylactique. Après un repos prolongé (18 mois), l'aspect de la suspension de nanoparticules demeure inchangé et on n'observe. en particulier, aucune sédimentation irréversible, ni variation de la taille des nanopar- ticules. ExemolQZ 2(variante de l'exemple 1) On procède comme dans l'exemple 1, mais en ajoutant la phase aqueuse à la phase acétonique. Les nanoparticules obtenues présentent les mêmes carac- téristiques que dans l'exemple 1. Exemple 3 (variante de l'exemple 1) On procède comme dans l'exemple 1, mais en ajoutant la phase acétonique à la phase aqueuse sans agitation du milieu. Les nanoparticules obtenues ont une taille moyenne de 205 nm avec un indice moyen de dispersion de 1. Exemole 4 (variante de l'exemple 1) On procède comme dans l'exemple 1, mais sans ajouter d'agent de surface à la phase aqueuse. Les nanoparticules obtenues ont une taille moyenne de 207 nm, avec un indice moyen de dispersion de 1,3. Exemole 5: Préparation de nanoparticules contenant de l'indométacine (principe actif lipophile) a) On procède comme dans l'exemple 1, mais on ajoute 5 mg d'indométacine dans la phase acéto- nique. Les nanoparticules obtenues ont une taille moyenne de 180 nm avec un indice moyen de dispersion de 1,5. Après ultracentrifugation et dosage de l'indo- métacine dans la phase dispersante, la quantité de principe actif incorporé dans les nanoparticules re- présente 80Z de la quantité initiale. b) Essai pharmacologique: Administrée par voie orale chez le rat à jeun (5 mg/kg d'indométacine) la suspension de nano- particules conduit à une absorption digestive de l'indométacine plus rapide et plus complète que celle observée après adminsitration de la même dose d'in- dométacine en solution. Après administration répétée chez le rat à jeun (Smg/kg d'indométacine, 3 jours de suite), la suspension de nanoparticules conduit à une meilleure tolérance digestive, objectivée par le nom- bre des ulcérations et.hémorragies, que celle observée après administration de la même dose d'indométacine en solution. Administrée par voie intraveineuse chez le rat (5 mg/kg d"indométacine) la suspension de nano- particules conduit à un profil chronologique des con- centrations plasmatiques d'indométacine mettant en évidence, par rapport à 1'injection d'indométacine en solution, une distribution extravasculaire plus impor- tante du principe actif (majoration d'un facteur voi- sin de 2 du volume de distribution de l'indométacine), suivie d'une élimination plus lente (majoration d'un facteur voisin de 2 de la demi-vie biologique de l'in- dométacine). Exemle 6 Préparation de nanoparticules contenant de la doxorubicine (principe actif hydrophile) a) On procède comme dans l'exemple 1, mais on ajoute 12,5 mg de doxorubicine dans la phase aqueu- se. Les nanoparticules obtenues ont une taille moyenne de 288 nm et un indice moyen de dispersion de 2. Après ultracentrifugation et dosage de la doxorubicine dans la phase dispersante, la quantité de principe actif incorporé dans les nanoparticules représente 50Z de la quantité initiale. b) Essai pharmacologique: Administrée à la dose de 10 mg/kg pendant trois jours chez le rat, la suspension de nanoparticules de doxorubicine a montré une nette amélioration de la toxicité cardiaque du principe actif par rapport à son administration en so- lution, résultats comparables à ceux observés par COUVREUR et coll. (3. Pharm. Sci., 71, p. 790, (1982) avec des nanoparticules préparées par polymérisation d'isobutylcyanoacrylate. Exemple: I Fixation d'un principe actif (doxorubi- cine) sur des nanoparticules de polymère. On procède comme dans l'exemple 1. Puis, on ajoute à la suspension de nanoparticules de P.L.A., concentrée sous un volume de 10 ml, 12,5 mg de doxo- rubicine. Après 72 h. de contact, la taille moyenne des nanoparticules est de 220 nm avec un indice moyen de dispersion de 2. Après ultracentrifugation et do- sage de la doxorubicine dans la phase dispersante, la quantité de principe actif fixé sur les nanoparticules représente 32Z de la quantité initiale. Exemle 8: Addition de non-solvant à la phase du sol- vant. On procède comme dans l'exemple 1, mais le polymère est dissous dans un mélange acétone/eau (90/10, v/v), au lieu d'acétone pure. La présence d'une faible proportion de non-solvant du polymère dans son solvant, conduit à des nanoparticules dont la taille moyenne est de 90 nm avec un indice moyen de 2O dispersion de 1,5. Exemole 9: Utilisation de deux phases aqueuses. a) D'une part, 625 mg d'un polymère acryli- R que (Eudragit L 100) sont dissous dans 125 ml d'eau purifiée additionnée de 3,45 ml. de soude 0,1 N. D'autre part, 625 mg de polymère mixte d'o- xyde d'éthylène et de propylène glycol. (Pluronic F68 R) sont dissous dans 250 ml d'eau purifiée additionnée de 0,85 ml d'acide acétique pur. La phase aqueuse polymérique basique est ajoutée, sous agitation magnétique à la phase aqueuse acide. Les nanoparticules d'Eudragit L100R se forment immédiatement, rendant le milieu opalescent. Après concentration de la suspension sous pression réduite, la taille moyenne des nanoparticules est de 130 nm avec un indice moyen de dispersion de 2,3. b) Préparation de comprimés. La suspension de nanoparticules d'Eudragit L 100 R obtenue ci-dessus a été utilisée pour préparer une formulation d'enro- bage de comprimés par pulvérisation. Les comprimés enrobés ont montré qu'ils étaient gastro-résistants pendant au moins 2 h. à pH acide (milieu gastrique de la Pharmacopée US) mais libéraient leur principe actif i pH neutre (milieu intestinal de la Pharmacopée US). Exemple 10 Utilisation de deux phases organiques polaires. D'une part, 125 mg d'acide poly (d,l) lac- tique sont dissous dans 25 ml de tétrahydrofuranne. D'autre part, 125 mg de polymère mixte *15 d'éthylène et de propylèneglycol (Pluronic F 68 R sont dissous dans 50 ml d'éthanol absolu. La phase polymérique est ajoutée, sous agi- tation magnétique, à la phase éthanolique. Les nano- particules d'acide poly (d,l) lactique se forment im- * médiatement, rendant le milieu opalescent. Après con- centration de la suspension, sous pression réduite et à faible température, jusqu'à un volume de 4 ml, sui- vie d'une filtration sur verre fritté (pores 9-15 um). la taille moyenne des nanoparticules est de 201 nm avec un indice moyen de dispersion de 1,6. Exemple 11: Utilisation de deux phases organiques apolaires. a) D'une part, 125 mg de polymère acrylique R (Eudragit L100) sont dissous dans 25 ml de chloro- forme. D'autre part, 0,2 ml de mono-oléate de sor- R bitanne, (SPAN 80 R agent de surface non ionique) sont dissous dans 50 ml d'heptane. On ajoute, sous agitation magnétique, la phase chloroformique à la phase heptanique. Les nano- particules d'Eudragit L100R se forment immédiatement, rendant le milieu opalescent. Après concentration de la suspension sous un volume de 30 ml, les nanoparticules ont une taille moyenne de 350 nm avec un indice moyen de dispersion de 1. b) Préparation de comprimés. Utilisée dans les mêmes conditions que dans l'exemple 9b, la suspension de nanoparticules d'Eu- R dragit LD100 a permis la fabrication, par enrobage, de comprimés gastro-résistants. Exemole 12: préparation de nanoparticules de lipide. D'une part, 125 mg de stéarate de glycérol sont dissous dans un mélange acétone/tétrahydrofuranne (90/10, v/v). D'autre part, 0,25 ml de mono-oléate de sor- R bitanne polyoxyéthyléné (TWEEN 80R, agent de surface non ionique) sont dissous dans 50 ml d'eau purifiée. -On ajoute, sous agitation magnétique, la phase organique lipidique à la phase aqueuse. Les na- noparticules de stéarate de glycérol se forment immé- diatement, rendant le milieu opalescent. Apres concentration de la suspension sous un volume de 10 ml, les nanoparticules ont une taille moyenne de 300 nm avec un indice moyen de dispersion de 3. Exemple 13 (Variante de l'exemple 12) D'une part, 125 mg de palmito-stéarate de glycérol et 0,1 ml de mono-oléate de sorbitanne (SPAN R) sont dissous dans 50 ml d'éthanol absolu. D'autre part, 0,1 ml de mono-oléate de sor- bitanne polyoxythyléné ml d'eau purifiée. On ajoute, sous agitation magnétique, la phase alcoolique lipidique à la phase aqueuse. Les na- noparticules de palmito-stéarate de glycérol se for- ment instantanément, rendant le milieu opalescent. Après concentration de la suspension sous un volume de 10 ml, les nanoparticules ont une taille moyenne de 160 nm avec un indice moyen de dispersion de 2. Exemple 14: Préparation de nanoparticules d'indomé- tacine. a) On procède comme indiqué dans l'exemple 1, mais en remplaçant le polymère par 25 mg d'indomé- tacine. Après concentration de la suspension par évaporation du solvant organique, les nanoparticules d'indométacine ont une taille moyenne de290 nm et un indice moyen de dispersion de 2. L'examen en micros- copie électronique à transmission montre l'aspect sphérique et non cristallin des nanoparticules d'in- dométacine. b) Essai pharmacologique Admistrée par voie orale chez le rat à jeun (5 mg/kg) la suspension de nanoparticules d'indomé- tacine conduit à une absorption plus rapide et plus complète que celle observée par administration de doses égales d'indométacine en solution. Administrée par voie intraveineuse chez le rat (5 mg/kg) la suspension de nanoparticules d'in- dométacine conduit à un profil chronologique des con- centrations plasmatiques d'indométacine mettant en évidence, par rapport à l'injection de doses égales d'indométacine en solution, une distribution extra- vasculaire plus importante du principe actif (majora- tion du volume de distribution), suivie d'une élimi- nation plus lente (majoration de la demi-vie biolo- gique). Exemole 15: Lyophilisation des nanoparticules de po- - ymère On procède comme indiqué dans l'exemple 1. Après concentration de la suspension de nanoparticules de P.L.A. jusqu'à un volume de 20 ml, on ajoute à celle-ci 200 mg de tréhalose, puis on lyophilise. Après dispersion du lyophilisat dans 10 ml 1Q d'eau purifiée, les nanoparticules ont une taille moyenne de 275 nm avec un indice moyen de dispersion de 1,5. Exemple 16: Stabilité des nanoparticules de polymère en présence de forces ioniques variables. On procède comme indiqué dans l'exemple 1. Après concentration de la suspension de nanoparticules de P.L.A. jusqu'à un volume de 10 ml, on ajoute pro- gressivement à celle-ci des quantités croissantes de chlorure de sodium. La suspension de nanoparticules est parfaitement stable lorsque la concentration en chlorure de sodium correspond à l'isotonie avec le sang, et le demeure jusqu'à des concentrations en chlorure de sodium supérieure à 3 fois la concentra- tion isotonique. Exemple 17: Préparation de nanoparticules en présence d'un sel. On procède comme indiqué dans l'exemple 1, mais la phase aqueuse est additionnée de 90 mg de chlorure de sodium. Après concentration de la sus- pension de nanoparticules jusqu'à un volume de 10 ml, correspondant compte tenu du chlorure de sodium à l'isotonie avec le sang, les nanoparticules ont une taille moyenne de 250 nm avec un indice moyen de dis- persion de 2. La suspension demeure stable dans le temps et ne présente, après 12 mois de conservation, ni sédimentation irréversible, ni variation de la taille des nanoparticules. Les nanoparticules obtenues selon l'inven- tion peuvent trouver des applications dans de nombreux secteurs techniques, En tant que vecteurs" de médicaments, en thérapeutique humaine et animale les nanoparticules permettent d'envisager: - d'atteindre de nouveaux sites d'action, en particu- lier intracellulaires, voire intralysosomiaux; - d'utiliser de nouvelles voies d'administration pour des médicaments connus, en augmentant la stabilité et/ou l'absorption des médicaments, ou en permettant la réalisation de formes injectables, par voie intravasculaire, de médicaments insolubles; - de modifier la distribution tissulaire des médica- ments, par un meilleur ciblage vers les sites d'action favorables et/ou un détournement des sites d'effets indésirables voire toxiques (amélioration de l'index thérapeutique). En pharmacie, les dispersions colloïdales de nanoparticules peuvent permettre: - de réaliser des formes injectables de médicaments insolubles, - de stabiliser un principe actif médicamenteux, et - de réaliser des enrobages de formes galéniques à partir de dispersions aqueuses de polymères filmogé- nos. Dans le domaine de l'agrochimie les nano- particules peuvent véhiculer des insecticides, des pesticides etc... Leur taille peut permettre d'envisa- ger une action plus puissante par une meilleure péné- tration à travers la cuticule. La faible viscosité de la dispersion autorise une pulvérisation très facile sous forme de gouttelettes de très petite taille, plus efficaces car plus couvrantes. Dans le domaine des peintures, vernis, et- traitement des surfaces d'une manière générale, les nanoparticules permettent de véhiculer des pigments, des réactifs, des décapants etc... sous forme de dis- persion aqueuse de très faible viscosité, aisés à pul- vériser ou à appliquer, et qui peut, si nécessaire, être rendue visqueuse, voire adhésive-(remise en sus- pension des nanoparticules dans un véhicule appro- prié). La taille réduite des nanoparticules conduit à une très grande finesse du dépôt et à une très grande homogénéité, par exemple de pigmentation. Les nanoparticules obtenues selon l'inven- tion peuvent aussi être utilisées dans les domaines de l'imprimerie et de la reprographie, du traitement de surface des textiles et fibres, de la photographie, de la lubrification, etc... REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de systèmes col- loidaux dispersibles d'une substance, sous forme de particules sphériques de type matriciel et de taille inférieure à 500 nm (nanoparticules), caractérisé en ce que: (1) on prépare une phase liquide constituée essen- tiellement par une solution de la substance dans un solvant ou dans un mélange de solvants, et pouvant être additionnée d'un ou de plusieurs surfactifs, (2) on prépare une seconde phase liquide constituée essentiellement par un non-solvant ou un mélange de non-solvants de la substance et pouvant être addition- née d'un ou de plusieurs surfactifs, le non-solvant ou la mélange de non-solvants de la substance étant mis- cible en toutes proportions au solvant ou mélange de solvants de la substance, (3) on ajoute, sous agitation modérée, l'une des pha- ses liquides obtenues sous (1) ou (2) à l'autre, de manière à obtenir une suspension colloidale de nano- particules de la substance, et (4) si l'on désire, on élimine tout ou partie du sol- vant ou du mélange de solvants de la substance et du non-solvant ou du mélange de non-solvants de la subs- tance, de manière à obtenir une suspension colloidale de concentration voulue en nanoparticules ou à obtenir une poudre de nanoparticules. 2. Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que l'on ajoute dans l'étape (3) la phase liquide obtenue dans l'étape (1) à la phase liquide obtenue dans l'étape (2). 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que l'on ajoute au solvant, dans l'étape (1), une faible proportion de non-solvant. 4. Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 3, caractérisé en ce que le(s) surfac- tif(s) sont présents en une proportionde 0,1 à 10Z en poids de la suspension colloidale obtenue dans l'étape (3). 5. Procédé selon la revendication 4, carac- térisé en ce que le(s) surfactif(s) sont présents en une proportion de 0,2 à 2Z en poids. 6. Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 5, caractérisé en ce que la substance est un polymère. 7. Procédé selon la revendication 6, carac- térisé en ce que la concentration du polymère dans le solvant ou le mélange de solvants est comprise entre 1*5 0,1 et 10Z en poids. 8. Procédé selon la revendication 7, carac- térisé en ce que la concentration du polymère est com- prise entre 0,2 et 2Z en poids. 9. Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 5, caractérisé en ce que la substance est une substance biologiquement active. 10. Procédé selon l'une quelconque des re- vendications 6 à 8, caractérisé en ce que la substance comprend un polymère et une substance biologiquement active. 11. Procédé selon l'une quelconque des re- vendications 6 à 8, caractérisé en ce qu'une seconde substance est fixée sur les nanoparticules de polymère déjà formées dans l'étape (3). 12. Procédé selon la revendication 11, ca- ractérisé en ce que la seconde substance est une subs- tance biologiquement active. 13. Procédé selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 5, caractérisé en ce que la substance est un corps gras. 14. Procédé selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 13, caractérisé en ce que dans l'étape (4) la totalité des solvants et des non- solvants est éliminée par lyophilisation. 15. Procédé selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 14, caractérisé en ce que les nano- particules ont une taille d'environ 200 nm.