FR 2602519 A1 19880212 FR 8711056 A 19870804 PROCEDE ET INSTALLATION DE PRODUCTION EN CONTINU DE FRUCTOSE-1,6-DIPHOSPHATE AU MOYEN DE LEVURE IMMOBILISEE La présente invention fournit un procédé de production 5 en continu de fructose-1,6-diphosphate et, plus spécifiquement, un procédé qui combine l'emploi de l'ultrafiltration à fibres creuses avec la phosphorylation enzymatique du glucose en FDP réalisée dans un fermenteur au moyen de cellules de levure immobilisées par le glutaraldéhyde. L'invention concerne également une installation servant à mettre en oeuvre ce procédé. L'emploi de fructose-1,6-diphosphate (FDP) et de ses sels s'est développé récemment, en particulier dans le domaine pharmaceutique. Il y a également eu parallèlement une 15 augmentation de la production à l'échelle industrielle de ce composé. Selon la technique de l'art antérieur, on obtient le FDP par phosphorylation du glucose au moyen de levure, en exploitant les propriétés de phosphorylation de cette der20 nière. Dans le déroulement de ce procédé, la levure s'épuise à cause des pertes enzymatiques liées à l'écoulement du FDP vers l'extérieur à travers les membranes cellulaires; cela oblige à remplacer la levure à la fin de chaque cycle de phosphorylation, ce qui a rendu les procédés de fabrication en continu impossibles à réaliser jusqu'à présent. La demanderesse a récemment mis en oeuvre un procédé qui fait l'objet de la demande de brevet italien N 19 865 A/86 et qui permet de préserver l'activité de phosphoryla30 tion de la levure à l'aide de l'immobilisation intracellulaire des enzymes glycolytiques par le glutaraldéhyde. Ce procédé permet "d'ajuster" la perméabilité cellulaire, le FDP pouvant s'écouler vers l'extérieur depuis l'intérieur de la cellule, tandis que les pertes enzyma35 tiques qui se produisent habituellement dans la levure per- méabilisée employée dans ce but sont simultanément inhibées. Grâce à la possibilité de maintenir les propriétés de la levure Pratiquement inchangées, il a été possible de mettre au point un procédé, qui fait l'objet de la présente invention, de production en continu de FDP. Plus spécifiquement, le procédé selon l'invention a pour objet la phosphorylation enzymatique du glucose en FDP, à partir de levure immobilisée par le glutaraldéhyde, et la récupération subséquente du fructose-1,6-diphosphate dans 10 une unité d'ultrafiltration à fibres creuses. On va maintenant décrire la présente invention en détail, à l'aide du dessin unique annexé, qui montre un schéma d'une installation de fabrication de FDP selon le procédé de l'invention. L'installation comprend essentiellement un fermenteur 1 pourvu d'un agitateur et de moyens de régulation de la température et relié, par l'intermédiaire d'une pompe péristaltique 2, à une unité d'ultrafiltration à fibres creuses 3. Entre le fermenteur 1 et l'unité 3 est insérée une sou20 pape 4 de type connu, permettant d'ajuster la vitesse du liquide se dirigeant vers l'unité d'ultrafiltration. Le fermenteur 1 est en outre relié, par l'intermédiaire d'une seconde pompe péristaltique 5, à une cuve d'alimentation 6 contenant un mélange nutritif de glucose et de phos25 phates. Une conduite 7 relie la sortie de l'unité d'ultrafiltration 3 au fermenteur 1, afin de permettre le recyclage de la levure, tandis qu'un réservoir 8 est relié à l'unité à fibres creuses 3, pour recueillir le FDP obtenu. On met en oeuvre le procédé en préparant d'abord une quantité suffisante de levure perméabilisée (par exemple Saccharomyces carlsbergensis) traitée par du glutaraldéhyde, comme le décrit la demande de brevet italien N 19 865 A/86, pour conserver son pouvoir de phosphorylation. La levure ainsi traitée est mise en suspension dans de 3 2602519 l'eau (30% en poids/volume) et introduite dans le fermenteur 1; ensuite, une quantité de mélange nutritif égale à la moitié de son volume est ajoutée, ce mélange étant constitué de dextrose (IM), de phosphate de sodium (0,5M), de chlorure de magnésium (10 mM) et d'acide phosphorique jusqu'à pH 6,5. On amène la température du fermenteur à 28 C et, après avoir réglé la soupape 4 en position d'ouverture maximale, on recycle la levure à travers l'unité d!ultrafiltration d'o elle retourne à chaque fois vers le fermenteur - pen10 dant environ 4 heures, durée nécessaire pour que la réaction démarre. Pendant cette étape, le gradient de pression dans les fibres de l'unité d'ultrafiltration étant nul, il n'y a pas effectivement de perméation. A la fin de ce premier cycle, après avoir atteint un niveau constant de phosphorylation, on règle la soupape 4 à une position d'ouverture telle qu'elle permette le remplacement complet du mélange nutritif en environ 10 heures. Pendant cette étape, on recueille la substance qui est passée 20 par perméation et qui contient le FDP, par les fibres de l'unité 3, cette substance étant stockée dans le réservoir 8, tandis que la levure retourne vers le fermenteur en passant par la conduite 7. Le fermenteur 1 reçoit, à intervalles réguliers, une quantité de mélange nutritif provenant 25 de la cuve 6, nécessaire pour compléter la quantité de substance qui est passée par perméation et qui est transportée depuis l'unité d'ultrafiltration vers le réservoir 8. Puisque la phosphorylation du glucose en FDP est le résultat de l'action combinée de l'exoquinase et de la phos30 phofructoquinase, lesquels nécessitent la présence d'ATP pour que leurs effets se poursuivent, il est nécessaire, afin que le procédé soit réalisé en continu, de maintenir un niveau prédéterminé minimum tant d'ATP que de NAD (ce dernier cofacteur étant indispensable pour la régénération de 1'ATP par le cycle de fermentation alcoolique qui accompagne nécessairement la production enzymatique de FDP à l'aide de levure). Comme ces deux facteurs, du fait de leur masse moléculaire faible, traversent par perméation les fibres creuses de l'unité 3, on ajoute au mélange nutritif, pour compenser leur fuite, une quantité égale à 2% en v/v d'extrait de levure déprotéiné. Le fructose-1,6-diphosphate présent dans la substance passée par perméation et recueilli dans le réservoir 8 peut être récupéré si on charge cette substance pas10 sée par perméation sur une colonne de résine anionique, par exemple par le procédé décrit dans la demande de brevet N 24 355 A/83 de la demanderesse. On va maintenant décrire l'invention en détail, à l'aide des exemples non limitatifs, mais simplement indica15 tifs, suivants. L'installation décrite pour la fabrication en continu du FDP peut même fonctionner en mode discontinu, dans lequel la phosphorylation du glucose en FDP à lieu par lots à intervalles réguliers, par addition de la quantité nécessaire 20 de mélange nutritif à chaque cycle, et par récupération du FDP dans la suspension de levure à la fin de chaque cycle, au moyen d'une ultrafiltration. Exemple 1 On perméabilise 50 g de levure centrifugée, provenant 25 de la brasserie DREHER de Popoli, puis on l'immobilise au glutaraldéhyde selon le procédé décrit dans la demande de brevet italien N 19 865 A/86. A la levure (remise en suspension dans 30 ml d'eau du robinet) on ajoute 2 ml d'une solution à 20% de chlorure de 30 magnésium, ainsi que 20 ml de mélange nutritif (dextrose 2M, phosphate de sodium 1M et acide phosphorique jusqu'à pH 6,5). On chauffe la levure dans une double chaudière à 35 C pendant une heure. On y ajoute 50 ml de levure désintégrée, ml de dithiothréitol et, après refroidissement de la masse à 28 C, 1,5 ml de glutaraldéhyde à 25%. Au bout de 60 minutes, on centrifuge la masse à 3000 tours par minute pendant 15 minutes, on élimine la liqueur surnageante, on remet le gâteau en suspension dans l'eau (30% en poids/volume) et on l'introduit dans un réacteur de 250 ml de volume relié à 5 une unité d'ultrafiltration à fibres creuses ayant une surface de membrane globale de 300 cm2 et une porosité nominale de 0, 1 wn. Après avoir ajouté 40 ml de mélange nutritif et réglé le thermostat à 280C, on recycle la suspension dans l'unité à un débit de 900 ml/mn. Après une phase préliminaire de 5 heures, dans laquelle la soupape d'ajustage du concentré est grand ouverte (sans perméation effective), on atteint dans le réacteur la concentration maximale de FDP (14 mg/ml). Ensuite, en empêchant partiellement le retour de l'écoulement du concen15 tré, on règle le débit de la substance passant par perméation à 20 ml/h, le réacteur étant en même temps alimenté au même débit avec le mélange nutritif dilué (1:3) auquel on a ajouté 2% d'extrait de levure déprotéiné. Dans ces conditions, la concentration en FDP dans la substance passant par perméation est pratiquement constante sur une semaine. Cela correspond à un rendement de 134 mg de FDP/g de levure humide par jour. Exemple 2 On perméabilise 50 g de levure centrifugée provenant de la brasserie PERONI de Bari, puis on l'immobilise au glutaraldéhyde de la manière décrite dans l'exemple 1. On réalise la phosphorylation du glucose en FDP dans le même système réacteur/unité d'ultrafiltration que celui de 30 l'exemple 1. On y ajoute 50 ml de mélange nutritif, 10 ml d'extrait de levure déprotéiné et on règle la température à 28 C. Au bout de 10 heures, période pendant laquelle on atteint généralement la concentration maximale en FDP (58-60 mg/ml), on soumet la suspension de levure à une ultrafiltra35 tion pour récupérer le FDP produit. Pour cela, on recycle la suspension à un débit de 1500 ml/mn et on ajuste l'ouverture de la soupape de régulation du concentré de manière à avoir, à l'intérieur de l'unité, une pression de service de 103,4 kPa (15 psi). Dans ces 5 conditions, on obtient un débit de perméation moyen de 5 ml/mn. Afin d'éviter que les fibres ne se bouchent lorsque la concentration en levure augmente-continuellement, pendant l'étape d'ultrafiltration, on ajoute 50 ml de mélange nutri10 tif dilué (1:8) dans le réacteur pour 50 ml de substance passée par perméation et recueillie. On recueille 250 ml de substance passée par perméation au total, à une concentration moyenne en FDP de 25-28 mg/ml. On redémarre un autre cycle, qui comprend l'addition de 15 50 ml supplémentaires d'extrait de levure déprotéiné, l'incubation à 280C pendant 10 heures, l'ultrafiltration, etc. Le rendement en FDP est pratiquement constant dans ces circonstances, pendant 8 à 10 jours, avec un rendement moyen 20 de 250 mg de FDP/g de levure humide par jour, pendant un fonctionnement continu pendant la nuit. L'homme de métier peut apporter de nombreuses modifications et variations à la présente invention, sans toutefois sortir de son cadre. REVENDICATIONS R E V E N D I C A T I O N S 1.- Procédé de production en continu de fructose-1,6-diphosphate, 'caractérisé en ce que l'on réalise la phosphorylation du dextrose au moyen de levure traitée au glutaraldé5 hyde pour conserver son activité de phosphorylation, puis la séparation de la substance passée par perméation et contenant du FDP à l'aide d'une ultrafiltration à fibres creuses. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on recycle en continu, à travers une unité d'ultrafiltra10 tion à fibres creuses, une suspension de levure traitée au glutaraldéhyde à laquelle a été ajoutée la moitié de son volume d'un mélange nutritif de dextrose et de phosphates. 3.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la levure employée est Saccharomyces carlsbergensis ou Saccharomyces cerevisiae. 4.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la suspension dans l'eau de la levure traitée au glutaraldéhyde est en concentration de à 35% (poids humide/volume) et en ce que le mélange nutritif contient du dextrose 1M, du phosphate de sodium 0,5M et de l'acide phosphorique jusqu'à pH 6,5. 5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on ajoute 2% en volume/volume d'extrait de levure déprotéiné au mélange nu25 tritif afin de garantir la présence de la quantité nécessaire d'ADP et de NAD qui servent à la phosphorylation du glucose en FDP. 6.- Installation de réalisation du. procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce 30 qu'il comporte: - un fermenteur pourvu de moyens permettant de maintenir constante sa température; - une unité d'ultrafiltration à fibres creuses reliée au fermenteur, à l'entrée et à la sortie; - des moyens permettant de faire circuler en continu un fluide depuis le fermenteur jusqu'à l'unité d'ultrafiltration et à l'entrée et à la sortie; - des moyens convenables pour faire circuler de manière continue un fluide depuis ledit fermenteur jusqu'à l'unité de l'ultrafiltration et vice et versa; - des moyens pour ajuster la vitesse du fluide; - des moyens pour recueillir la substance passée par perméation en provenance de l'unité d'ultrafiltration; et - des moyens pour ramener le niveau du mélange dans le fer10 menteur aux conditions initiales qui consistent à introduire une quantité de mélange nutritif égale à celle de la substance passée par perméation et recueillie. 7.- Emploi du bioréacteur selon la revendication 6, pour la production discontinue de FDP par phosphorylation par lots, 15 puis la récupération de FDP par recyclage de la levure à travers l'unité d'ultrafiltration, à une vitesse de perméation élevée. 8.- Procédé de fabrication de FDP selon la revendication 7, caractérisé en ce que le cycle d'accumulation du FDP a une 20 durée de 10 à 12 heures et est effectué au moyen d'un seul lot de mélange nutritif ayant un rapport 1:1 (poids de levure humide/volume du mélange) 9.- Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que la récupération du FDP est effectuée sous une pres25 sion de 82,7-103,4 kPa (12-15 psi) et à une vitesse de perméation de 1 ml/h/cm2, par addition à la suspension de levure, dans le bioréacteur, de 50 ml de mélange nutritif dilué (1:8) pour 50 ml de substance passée par perméation et recueillie.