FR 2601956 A1 19880129 FR 8610630 A 19860722 i NOUVEAUX DERIVES DE DESOXY-2' ADENOSINE, LEUR PROCEDE D'OBTENTION PAR VOIE DE SYNTHESE ET LEURS APPLICATIONS BIOLOGIOUES. L'invention a pour objet de nouveaux dérivés de désoxy-2' adénosine, leur procédé d'obtention par voie de synthèse et leurs applications biologiques. Il est maintenant bien connu des spécialistes d'avoir recours pour la détection et l'isolement des 10 séquences d'ADN ou d'ARN, à des techniques basées sur l'hybridation entre une séquence déterminée de nucléotides, utilisée en tant que sonde, et une séquence de nucléotides complémentaires de ceux de la sonde, éventuellement contenus dans une composition renfermant des acides nucléiques. De manière classique, la détection de fragments d'ADN complémentaire (ADNc) ou d'ARN messager (ARN-m) a été basée sur l'hybridation de ces fragments avec des oligodésoxynucléotides marqués avec des radio20 isotopes, principalement un isotope du phosphore (32P). De telles sondes marquées radioactivement et appelées de manière courante sondes chaudes, permettent une grande sensibilité de détection. Toutefois, l'utilisation de marqueurs radioactifs est limitée en raison de différents inconvénients. D'une part, la durée de vie généralement courte des éléments radioactifs utilisés nécessite constamment le renouvellement des sondes, ce qui entraine un prix de revient élevé. D'autre part, l'emploi de substances radioac30. tives demande un équipement spécialisé et des autorisations administratives quelquefois difficiles à obtenir. De plus, l'automatisation des dosages réalisés avec de telles sondes chaudes s'avère difficile à mettre en pratique. Récemment, des travaux ont été développés pour 5 construire par voie enzymatique des sondes ne comportant pas d'éléments radioactifs. De telles sondes communément appelées sondes froides permettent la détection de l'ADN ou de l'ARN par réaction enzymatique ou immuno-enzymatique. VCET Il s'agit par exemple dans l'article de VINCENT C.et al, Nucleic Acids Res. 1982, 10, page 6787, de sondes froides basées sur le système antigène-anticorps monoclonaux(1,2), ou le système biotine-avidine (3) couplés avec une enzyme telle que la peroxydase, la phosphatase alcaline ou la galactosidase (3,4,5). Depuis 1985, on a proposé des nucléotides modifiés en vue de leur incorporation et de leur détection enzymatique. Parmi ces nucléotides, on citera des dérivés de phosphoramidites biotinylés en 51,(6,7), des 20 dérivés avec la photobiotine (8) et des nucléotides '-amino (9,10) qui peuvent être aussi bien incorporés dans les sondes froides que servir pour le séquençage d'ADN. Dans la demande de brevet FR n' 84 13095, dé25 posée le 22.08.1984, au nom des Demandeurs, on a décrit également des sondes constituées de fragments d'oligonucleotides comportant, en tant que base purique, des groupes adénines modifiés. La poursuite des travaux réalisés par les in30 venteurs dans ce domaine leur ont permis d'élaborer de nouveaux dérivés pouvant être incorporés par voie enzymatique dans des séquences d'oligonucléotides. L'invention a donc pour but de fournir de nouveaux dérivés de désoxy-2' adénosine permettant de mettre à profit les avantages des bases modifiées déjà mises au point, tout en disposant de produits possédant des propriétés améliorées. Elle vise également à fournir un procédé permettant d'obtenir aisément ces nouveaux dérivés et avec des rendements plus élevés. L'invention vise en outre l'application de ces 10 dérivés à la synthèse de séquences d'oligonucléotides et l'utilisation de ces séquences en biologie, notamment pour l'élaboration de sondes de grande précision, stables dans le temps, avec lesquelles la détection est réalisée par des méthodes non radioactives faciles à utiliser. Les dérivés de l'invention sont caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule (I): NH2 7 HRN8 7 3 R1_ (I) R2 dans laquelle: - R est choisi parmi le groupe -OH, -OPO3H2, -OP206H3, OP309H4, ou un oligonucléotide, - R2 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un groupe -OH, un oligo- ou-un polynucléotide, _ - R représente une chaîne aminoalcoyle. e., Cette chaine R répond plus spécialement à la structure -(CH2)n - NHX, avec n représentant un entier de 4 à 12, X un atome d'hydrogène ou un groupe capable de servir de marqueur pour la molécule. Des groupements marqueurs appropriés sont des groupements colorés ou fluorescents tels que la rhodamine, la fluorescéine ou le dansyl. D'autres groupements X comprennent des haptènes. D'autres groupements X encore sont formés par des enzymes, telles que la phosphatase ou la peroxydase. Les peptides sont également utilisables en tant que groupement marqueur X. D'une manière avantageuse, X représente la 15 biotine. Les dérivés selon l'invention permettent d'élaborer des sondes ayant une stabilité et une sensibilité accrues. Ils présentent également l'avantage de pouvoir être détectés par des méthodes immunoenzyma20 tiques. Selon un autre aspect de grand intérêt, ces nucléotides peuvent être incorporés par voie enzymatique (par exemple avec une polymérase, terminal-nucléotidyltransférase, ligase) dans un fragment d'ADN ou d'ARN. Dans un groupe préféré de dérivés selon l'invention, le groupement X de la chaine de substitution aminoalcoyle représente un atome d'hydrogène. Ces produits permettent l'accrochage avant ou après incorporation dans une séquence nucléotidique sur 30 un groupe marqueur. Dans un autre groupe préféré, le groupe X est un groupe marqueur, ce qui permet dans des essais d'hybridation avec des oligonucléotides renfermant de tels complémentaires de l'oligonucléotide, et ce d'une manière avantageuse sans marquage radio-actif. Avantageusement, X est choisi parmi des groupements colorés ou fluorescents, notamment la rhodamine, la fluorescéine, le dansyl. En variante, X est un haptène par exemple le dinitrophényle. Dans d'autres dérivés avantageux, X représente une enzyme, notamment une peroxydase, une phosphatase. 1O Dans un autre mode de réalisation, X représente la biotine. Les dérivés d'adénosine définis ci-dessus peuvent être incorporés enzymatiquement dans une chaine nu15 cléotidique par l'intermédiaire de R1 et d'un groupe -OH en position 3' du motif sucre. Les oligo ou polynucléotides résultants entrent également dans le cadre de l'invention. L'invention vise en outre un procédé d'obten20 tion des dérivés définis ci-dessus par voie de synthèse. Ce procédé comprend la réaction d'un dérivé de désoxy-2' adénosine dont la position 8 de la base purique est activée, avec une diamine de formule (II): NH2-(CH2)n-NHX (II) dans laquelle n et X sont tels que définis ci-dessus. Comme dérivé d'adénosine activé sur la position 8, on utilise avantageusement un halogénure. Il s'agit plus spécialement.d'un bromure ou encore d'un chlorure. La réaction avec la diamine de formule (II) est réalisée en présence d'un solvant organique. Des solvants appropriés comprennent le méthanol, l'éthanol, le propanol, la pyridine. Les dérivés de l'invention dans lesquels la 35 position 5' du motif sucre comporte un groupe phosphate, sont obtenus de préférence par phosphorylation avec un agent tel que le cyano-éthyl-phosphate, soit directement sur le nucléoside lorsque X représente un atome d'hydrogène, soit après blocage de la fonction amine libre. Un blocage approprié est réalisé ave le groupe benzyloxycarbonyle. Les dérivés di- et triphosphates correspondants sont obtenus par action de dérivé 5'-morpholidate avec un sel de phosphate ou de pyrophosphate. Les nucléotides de l'invention peuvent être incorporés enzymatiquement dans un oligonucléotide. Avantageusement, cette incorporation est effectuée par la technique dite de "nick-translation". Cette procédure permet l'incorporation uniforme de nucléotides dans un fragment d'ADN ou d'ARN, à des sites espacés régulièrement, en traitant ledit fragment d'ADN ou d'ARN avec une enzyme, notamment l'ADNase I d'E. coli, qui agit en fournissant des èxtrémités libres 3'-OH. La réaction avec l'ADN polymérase I 20 permet ensuite l'incorporation des nucléotides souhaités dans le fragment d'ADN ou d'ARN. En variante, l'incorporation enzymatique des nucléotides de l'invention peut être réalisée par l'utilisation de la terminaldéoxytransférase avec un frag25 ment d'ADN simple ou double brin. Selon un autre mode de réalisation utilisant des dérivés préférés de l'invention dans lesquels R représente une chaine -(CH2)n NH2, avec a tel que défini ci-dessus, on incorpore enzymatiquement le dérivé de l'invention dans une séquence nucléotidique, puis on 30 introduit chimiquement la biotine par action de l'ester N-hydroxy-succinimide de la biotine sur la séquence nucléotidique. Les différents groupes X peuvent être intro35 duits par réaction analogue. Les dérivés de l'invention constituent des intermédiaires de synthèse de grand intérêt pour l'élaboration de séquences de nucléotides utilisables comme sondes pour la détection et l'isolement d'une séquence d'acides nucléiques présents par exemple dans un mélange biologique liquide ou dans un lysat cellulaire. Ces séquences de nucléotides, grâce aux modifications apportées au groupe adénine, sont capables o de s'hybrider avec une sensibilité élevée avec des séquences complémentaires, formant des hybrides de grande stabilité. Les sondes obtenues à partir de séquences de nucléotides renfermant les dérivés de l'invention pré15 sentent de plus une grande stabilité dans le temps, et 15. peuvent être conservées pendant plusieurs années. La détection des séquences nucléotidiques com-plémentaires s'hybridant avec la séquence nucléotidique contenue dans la sonde est réalisée par des méthodes 20 non-radioactives basées sur le groupement X. Par méthodes non-radioactives, on entend par exemple une réaction de détection par chimie luminescence, à l'aide de produits colorés ou fluorescents. En variante, la détection peut être réalisée 25 par une réaction immunoenzymatique, utilisant des enzymes ou des anticorps. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention o le nucléotide est modifié par l'introduction d'une molécule de biotine, on réalise un couplage entre 30 la biotine et une enzyme. Avantageusement, on utilise l'avidine, qui forme avec la biotine un complexe stable. Ce couplage peut être effectué après la réaction d'hybridation. Selon une variante de réalisation, l'avidine est couplée elle-même avec un produit de détection, par exemple, un composé coloré ou fluorescent, tel que la rhodamine ou la fluorescéine. Selon une autre variante, l'avidine est couplée avec une enzyme formant, apres réaction, des produits insolubles faciles à détecter. Avantageusement, cette seconde enzyme est une 10 phosphatase alcaline ou une peroxydase. La détection de la biotine peut également être réalisée en utilisant un anticorps anti-biotine. Il va de soi que cette modification chimique doit être telle qu'elle n'empêche pas l'hybridation ul15 térieure éventuelle de la sonde avec la séquence ou le fragment d'ADN recherché. Les sondes de l'invention sont avantageusement utilisées pour détecter des séquences d'ADN complémentaires chez des bactéries et virus infectieux. Parmi 20 ceux-ci, on citera Chlamydia, Campylobacter, Brucella, Parvovirus, le virus responsable de la rhizomanie de la betterave, le virus de l'hépatite B. Ces sondes sont également utilisables pour détecter des résistances bactériennes aux antibiotiques. 25 D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent relatifs à la synthèse de dérivés désoxy-2' adénosine et à leur utilisation pour l'élaboration de sondes. EXEMPLE DE SYNTHESE DE DERIVES PURIQUES SUBSTITUES EN POSITION 8 PAR UNE CHAINE BIOTINYLEE. N-[amino-1 décanyl-10]-8 désoxy-2' adénosine (composé 1) Un mélange (15, 17 g, 47 mmoles) de bromo-8 désoxy-2' adénosine (3) et (32 g, 186 mmoles) de diamino35 1, 10 décane dans 350 ml d'éthanol est porté à reflux pendant 24 heures. La solution est ensuite concentrée à 260 1956 sec et le résidu obtenu lavé plusieurs fois à l'éther éthylique pour extraire la diamine en excès. Une fraction du résidu est purifiée sur colonne de silice sous légère pression utilisant, comme solvant le mélange tertiaire isopropanol-NH4OH-H20, (6-1-1). F: 190'C Analyse Calculée pour C20H35N703 (421) C 56,98; H 8,37; N 23,25 Analyse Trouvée C 56,83; H 8,59; N 23,65 10 N-[N-benzyloxycarbonylamino-1 décanyl-10]-8 désoxy-2' adénosine (composé 2) 3,7 g (8,5 mmoles) de composé 1 sont dissous en chauffant dans un mélange de 30 ml d'eau et de 40 ml d'éthanol. A la solution revenue à la température ambiante, on ajoute (4,5 g, 17,7 mmoles) de chlorure de N-benzyloxy carbonyle N'méthyle imidazolium et on maintient sous agitation magnétique pendant 24 heures. La solution est concentrée jusqu'à sécheresse et le sirop 20 obtenu purifié par chromatographie sur silice (CH2Cl2-MeOH) (MeOH = méthanol). On obtient 3,33 g de produit benzyloxycarbonylé corrrespondant à un rendement de 72%. N-benzoyl-6 N-[N-benzyloxycarbonylamino-1 décanyl-10] 25 -8 désoxy-2' adénosine (composé.) 2,38 g (4,28 mmoles) du composé 2 sont séchés par deux coévaporations avec de la pyridine (Merck) puis dissous dans 15 ml de ce même solvant anhydre. A O'C (bain: eau plus glace) on ajoute goutte à goutte 30 3,7 ml de chlorure de benzoyle et on laisse le mélange revenir à température ambiante; après 24 heures on détruit l'eycès de réactif par addition de 5 ml de méthanol et on concentre la solution à sec. Le résidu est dissous dans 100 ml de CH2C12 et lavé avec une solution 35 saturée de NaHCO3 puis à l'eau; la phase organique est séchée sur sulfate de sodium, filtrée et évaporée sous vide. Au sirop dissous dans un mélange de 12,6 ml de pyridine et 6,4 ml d'éthanol (refroidi dans un bain d'eau et de glace) on ajoute 9,5 ml de soude 8N. Après une demi-heure la solution est neutralisée à l'aide de résine Dowex 50 WX8 sous forme H+; la résine est filtrée, rincée au méthanol et le solvant est concentré jusqu'à sécheresse. Le dérivé monobenzoylé cristallise dans l'éthanol F: 87-88'C (éthanol) RMN 1H 400 MHz: (CDC13 + TMS): 6 = 1,20 (m, 16H, CH2(3,8); 1,38 (m, 2H, CH2(9); 1,55 (m, 2H, CH2 (2)); 2,22 (m, 1H, H"2); 2,67 (m, 1H, H'2); 3,10 (m, 2H, 15 CH2(10)); 3,35 (m, 2H, CH2 (1)); 3,87 (m, 2H, H5'5") ; 4,08 (m, 1H, H'4); 4,69 (m, 1H, H'3); 4,76 (s, 1H, NH); 5,06 (s, 3H, CH20 + NH); 6,50 (q, 1H, H'1); 7,37 (s, 5H, o); 7,41-7,49 (m, 3H, H Q'pH 0'mm'); 7,98-8,00 (s+s, 2H, Ho'oo'); 8,4 (s, 1H,H2). N-benzoyl-6 benzoyl-3' N-[N-benzyloxycarbonylamino-1 décanyl-10]-8 désoxy2' adénosine (Composé 4) A 2 g (3 mmoles) du composé 3 dissous dans 6.5 ml de pyridine, on ajoute 1,13 g (3,3 mmoles) de chlorure de diméthoxytrityle. Après 2 heures et demie à 25 température ambiante, on détruit l'excès de réactif par addition de quelques gouttes de méthanol, on concentre à sec et on dissout le résidu dans du CH2C12, on lave avec une solution saturée de bicarbonate de sodium puis à l'eau. On sèche la phase organique sur sulfate de 30 sodium. Après filtration et évaporation sous vide, on lave le précipité à l'éther de pétrole. On dissout le dérivé tritylé (1,85 g, 1,9 mmole) dans 25 ml de pyridine (Merck) et on ajoute 2,6 g (11,4 mmoles) de chlorure de benzoyle et 115 mg de DMAP. 1 1 Après une heure et demie à température ambiante, on concentre sous vide, on dilue avec du CH2Cl2, on lave avec une solution saturée de bicarbonate de sodium puis à l'eau et on précipite à l'éther de pétrole. -Le précipité est dissous dans 30 ml d'un mé5 lange CH2Cl2-MeOH (7-3) contenant 2% de BSA; 10 minutes après et à température ambiante, la solution est lavée (NaHCO3 et H20), séchée et concentrée sous vide. Le résidu est purifié par chromatographie sur silice 10 (solvant CH2Cl2-MeOH). RMN 1H 400 MHz: (CDCl3 + TMS): 6 = 1,25 (m, 16H, CH2 (3-8)); 1,46 (m, 2H, CH2 (9)); 1,63 (m, 2H, CH2(2)); 2,47 (dd; 1H, H"2); 2,97 (m, 1H, H'2); 3, 17 (q, 2H, CH2 (10)), 3,47 (q, 2H, CH2 (1)); 4,03 (d, 15 1H, H"5); 4,16 (d, 1H, H'5); 4,31 (m, 1H, H'4); 5,08 (s, 2H, CH^2); 5,71 (d, 1H, H'3); 6, 66 (q, 1H, H'1); 7,33 (s, 5H, $); 7,45-7,65 (m, 2H, HO'mm'); 7,82 (d, 1H, H$'p); 8,00-8,12 (2d, 2H, Ho'oo'); 8,57 (s, 1H, H2); 9,10 (s, 1H, NCO'). N-[amino-1 décanyl-10]-8 désoxy-2' triphosphate-5' adénosine (composé 5) Une solution de 327 mg (0,428 mmole) du composé 4, I mmole de cyano éthylphosphate sel de pyridinium (1 ml d'une solution stock à 1 mmole/ml) dans 5 ml 25 de pyridine est concentrée sous vide à 30'C; le sirop obtenu est dissous à deux reprises dans 10 ml de pyridine puis évaporé à sec; on recommence la même opération avec de la pyridine anhydre. Le résidu sec est dissous dans 5 ml de pyri30 dine anhydre, on ajoute environ 0,5 g (6 eq.) de N, N'-dicylohexylcarbodiimide (DCC) et on laisse le mélange à température ambiante 48 heures sous agitation magnétique. On ajoute 3 ml d'eau, on laisse sous agitation pendant une heure, on chasse la pyridine à sec et on reprend e résidu avec 10 ml d'eau; on filtre la et on reprend le résidu avec 10 ml d'eau; on filtre la dicyclohexylurée formée et on la rince avec 10 ml d'eau. On concentre le filtrat et on reprend le résidu dans 30 ml d'NH4OH 6N et on l'incube 24 heures à 60'C; on con5 centre la solution ammoniacale et on purifie le sirop obtenu sur Sephadex G10 utilisant comme solvant le mélange éthanol-eau, (EtOH-H20), (1-2). -Après lyophilisation des fractions positives en UV et au dosage du phosphore on obtient 178 mg (rendement 49%) de monophosphate. mg de monophosphate sont dissous dans un mélange eau-méthanol (1-1) puis la solution est passée sur une colonne (3 x 1 cm) de résidu Dowex 50 WX8 sous forme morpholinium; la colonne est lavée avec ce mélange 15 jusqu'à ce que l'effluent n'absorbe plus dans l'UV. La solution est concentrée; on reprend le résidu dans 3 ml d'alcool terbutylique et 3 ml H20, on ajoute 105 pl de morpholine distillée (4 eq.) et, goutte à goutte, 259 mg (1,25 mmole) de DCC dissous dans 4,5 ml d'alcool terbutylique. On porte à reflux pendant 4 20 heures. Une chromatographie sur couche mince de silice, utilisant comme solvant le mélange isopropanol-NH4OH-H20 (7-1-2) indique que la réaction est terminée. La solution est refroidie à température am25 biante, on filtre le précipité formé que -l'on lave à 25 l'alcool terbutylique; le filtrat est évaporé à sec. Le résidu est dissous dans l'eau et la phase aqueuse extraite 3 fois à l'éther (15 ml). La concentration de la phase aqueuse conduit au morpholidate avec un 30 rendement de 75%. A 178 mg (1 mmole) d'acide pyrophosphorique dissous dans 5 ml d'eau, on ajoute 10 ml de pyridine (Merck) et 1,0 ml (4,2 mmoles) de tri-nbutylamine distillée. Cette solution homogène est évaporée jusqu'à obtention d'un sirop que l'on déshydrate par 4 coévaporations successives avec 10 ml de pyridine anhydre. 260 1956 La pyridine résiduelle est ensuite éliminée par deux coévaporations avec du toluène (5 ml) fraîchement distillé et recueilli sur tamis moléculaire 4'A. Le pyrophosphate 'sel de tri-n-butylamine est ensuite rajouté au morpholidate dissous dans du diméthyle sulfoxyde (DMSO) (5 ml, anhydre). A la solution maintenue à température ambiante on ajoute après 24 heures, 0,5 mmole du sel de tri-nbutylamine de l'acide pyrophosphorique préparé comme précédemment. Après 3 jours à température ambiante, le 10 morpholidate a disparu, on ajoute 5 ml d'eau et l'on dépose la solution sur une colonne (2,5 x 30 cm) de DEAE cellulose sous forme bicarbonate. La colonne est lavée à l'eau jusqu'à ce que l'effluent n'absorbe plus dans l'UV 15 puis éluée avec un gradient linéaire 0-0,35 M de bicarbonate de triéthylammonium. Les fractions (3 ml) contenant le triphosphate identifié (UV - phosphore) sont réunies et évaporées à sec (bain-marie 30-35'C); le TEAB est éliminé après 20 plusieurs évaporations avec du méthanol, plusieurs dissolutions dans l'eau suivies de lyophilisations. A partir de 200 mg de monophosphate, 36 mg de triphosphate ont été obtenus, soit un rendement de 23%. Spectrométrie de masse Théorique C20Hî$N7012P3 M = 661,16 Trouvé [M + HI = 662,16 RMN 1H 400 MHz: (D20): 6 = 1,8 (m, 14H, decyl protons); 1,49 (t, 2H, decyl protons); 1,61 (m, 2H, de30 cyl protons); 2,18 (dd, 2H, H"2); 2, 68 (m, 1H, H'2); 2,84 (t, 2H, decyl protons); 3,38 (m, 2H, H5'5"); 4,14 (dd, 1H, H'4); 4,30 (t, 1H, H'3); 4,65 (HDO); 6,35 (q, 1H, H'l); 7,98 (s, 1H, H2). 260.1956 RMN 31P 162 MHZ: (D20): par rapport à PO4H3 = - 8,209 (d, 1P, P, P Pp = 19,45 Hz); - 9,866 (d, 1P, Pa,' JP PS' JP Po = 19,45 Hz, Jp=_P = O HZ); 20,987 (t, 1P, Po, JpP" = Jp- P + 19,45 Hz). N-[N-biotinyl-1 décanyl-10]-8 désocy-2' triphosphate-5' adénosine (composé 6) Au triphosphate 5 (9 mg) on ajoute une solution de bicarbonate de sodium 1 M (200 pl) et de l'ester 10 de la N-hydroxy succinimide de la biotine (5 mg) dissous dans du diméthylformamide (DMF) (100 pl) fraîchement distillé. Après 24 heures à 4C (test ninhydrine: négatif) on ajoute de l'eau (1 ml) au milieu réactionnel 15 puis on le dépose sur une colonne de chromatographie Séphadex G10. L'élution à l'eau fournit essentiellement deux pics absorbant dans l'ultraviolet, seul l'un d'eux donne une réponse positive au test des sucres et négative au test des amines; les fractions de ce dernier (3 ml) sont réunies et évaporées à sec puis purifiées en 20 chromatographie à phase liquide à haute performance (CLHP) (colonne Nucléosil 5C18 4,6 x 250 mm) et lyophilisées. On obtient un rendement de 16%. Spectroscopie de masse théorique C30H2N90 14SP3M = 887 trouvé [M + H] = 888,63 On donne ci-après un exemple de détection d'une séquence d'ADN réalisée avec des dérivés préférés de l'invention. Détection d'une séquence nucléotidigue d'ADN comportant une Partie du aénome du virus de l'hépatite B I. MATERIELS ET METHODES Le composé 6 est incorporé enzymatiquement par la technique de "nicktranslation" dans le plasmide 35 pCP10 (12) contenant deux fois les parties du génome du virus de l'hépatite B. L'incorporation enzymatique a été réalisée en présence de dCTP tritié afin de pouvoir suivre indirectement le taux de substitution. Le composé. constitue un substrat utilisable pour l'ADN polymérase I de E.coli. En présence de 0,2 mM de composé 6, 14 % des adénosines ont été substitués dans 300 ng du plasmide pCP10. cte La détermination du seuil de détection de cette sonde biotinylée a été ca'lculée en utilisant la technique suivante: Un microlitre de différentes concentrations de la sonde biotinylée est déposé sur une membrane de nitrocellulose. Cette membrane est ensuite cuite pendant 2 heures à 80C sous vide, saturée en présence de tampon tris-HCl 10 mM, pH 8, contenant du chlorure de sodium (0,15 M) de l'albumine bovine (1 %) et du Tween (0,1 %) afin de diminuer les adsorptions non spécifiques. La dé20 tection de la sonde immobilisée sur la membrane est réalisée par une incubation d'1 heure avec de l'avidine, de la streptavidine ou des anticorps anti-biotine marqués par la phosphate alcaline, suivie d'une incubation de 30 minutes dans le substrat approprié. Quelque soit le sys25 tème de détection (avidine, streptavidine ou anticorps) et dans les conditions utilisées il a été possible de détecter jusqu'à 1,5 pg de sonde. L'utilisation de cette sonde biotinylée pour détecter l'ADN cible contenant une séquence d'ADN homo30 logue, montre que la limite de détection est égale à 8 pg en suivant le protocole classique d'hybridation sous forme simple brin à 68C pendant 16 heures avec la sonde concentrée à 75 ng/ml (13). La sonde biotinylée peut également être utilisée à 42'C avec 50 % de formamide. Elle est parfaitement stable dans ces conditions. Ainsi qu'il a été déjà dit et comme il résulte d'ailleurs de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement aux exemples de réalisation qui ont été plus particulièrement décrits mais en embrasse au contraire toutes les variantes. BIBLIOGRAPHIE 1. Methods in enzymology, 92, 47 2. C. VINCENT, P. TCHEN, M. COHEN-SOLAL et P. KOURILSKY, Nucleic Acids Res. (1982), 10, 6787 3. D.C. WARD et coll. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981), 78, 6633; (1983), 4045 4. M. RENZ et C. KURTZ, 10 Nucleic Acids Res. (1984), 12, 3435 5. A. MURASUGI et R.B. WALLACE DNA (1984), 3(3), 269 6. A. CHOLLET et E.H. KAWASHIMA Nucleic Acids Res. (1985), 13, 1529 7. T. KEMPE, W.I. SUNDQUIST, F. CHOW et S.L HU, Nucleic Acids Res. (1985), 13, 4 8. A.C FOSTER, J.L. Mc INVES, D.C. SKINGLE et R.H. SYMONS, Nucleic Acids Res. (1985), 13, 745 9. L.M. SMITH, S. FUNG, M.N. 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Dérivés selon la revendication 1, caractérisés en ce que la chaîne R répond à la structure 25 -(CH2)n -NHX, avec n représentant un entier 4 à 12, X un atome d'hydrogène ou un groupe capable de servir de marqueur pour la molécule. 3. Dérivés selon la revendication 2, caractérisés en ce que le groupe marqueur est choisi dans les 30 groupements colorés ou fluorescents tels que la rhodamine, la fluorescéine ou le dansyl, des haptènes, des enzymes telles que la phosphatase ou la peroxydase, des peptides ou de la biotine. 4. Procédé d'obtention des dérivés selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 par voie de synthèse, caractérisé en ce qu'il comprend la réaction d'un dérivé de désoxy-2' adénosine dont la position 8 de la base purique est activée avec une diamine de formule (II): NH2-(CH2)n-NHX (II) dans laquelle n et X sont tels que définis ci-dessus. 5. Procédé selon la revendication 4, caracté10 risé en ce qu'on utilise un dérivé d'adénosine substitué 1O par un halogène en position 8. 6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que, pour obtenir des dérivés de formule (I) dans laquelle la position 5' est un groupe 15 phosphate, on fait, en outre, réagir un agent de phosphorylation soit directement avec le nucléoside substitué par un chaîne aminoalcoyle lorsque X représente de l'hydrogène, soit après blocage de la fonction amine libre. 7. Sondes de détection et d'extraction d'ARN-m et d'ADN-c par hybridation, caractérisées en ce qu'elles sont élaborées à partir de dérivés selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.