FR 2601590 A1 19880122 FR 8709960 A 19870715 - 1 Polypeptide utilisable pour la préparation de vaccins antipaludéens et de nécessaires de diagnostic pour la détection d'affections paludéennes, procédé de sa répar aij__ _n_utilisation. La présente invention concerne un polypeptide utili5 sable pour la préparation de vaccins antipaludéens et de nécessaires de diagnostic pour la détection d'anticorps antisporozoltes dans des échantillons cliniques provenant de sujets atteints de paludisme. L'agent étiologique de la maladie est un protozoaire appartenant au genre Plasmodium, ayant un cycle vital alternant entre un hôte invertébré, dans lequel il manifeste une forme de reproduction sexuée, et un hôte vertébré dans lequel il se multiplie par schizogonie. Parmi les nombreuses espèces de Plasmodium qui pro15 voquent le paludisme chez des hôtes vertébrés, quatre seulement sont des pathogènes de l'homme: Plasmodium ovalis, Plasmodium malariae, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum. Ce dernier, en particulier, est l'agent étiologique dans la forme la plus grave du paludisme, le paludisme 20 dénommé fièvre tierce maligne. Malgré les développements de nouveaux insecticides et de nouveaux médicaments, tels que la chloroquine, le paludisme se classe actuellement parmi les maladies parasitaires les plus graves. -2 En effet, on estime que cette maladie frappe chaque année de 200 à 400 millions de personnes, provoquant un taux de mortalité dans la première enfance qui peut représenter un chiffre aussi élevé que 50% des cas. Le besoin n'en est que plus pressant pour la mise au point d'un vaccin antipaludéen efficace, c'est-à-dire un vaccin qui soit capable d'inciter le système immunitaire à produire des anticorps capables d'attaquer et de neutraliser le parasite, et à développer une immunité protectrice à long 10 terme, indépendamment de l'espèce de Plasmodium. Toutefois, la complexité du cycle vital du parasite, caractérisée par un grand nombre de cibles potentielles pour l'action de processus immunologiques spécifiques, n'a pas permis jusqu'à présent la mise au point d'un vaccin doté des 15 caractéristiques désirées. L'infection paludéenne chez l'homme débute par la piqûre du moustique anophèle, qui libère dans la circulation sanguine un certain nombre de sporozoTtes. En l'espace d'une heure, chaque sporozolte atteint une 20 cellule hépatique dans laquelle, après avoir subi une série complexe de transformations, il donne naissance à la formation de mérozoltes. Ensuite, chaque mérozolte pénètre dans un érythrocyte, dans lequel il se multiplie par voie asexuée, jusqu'à ce que 25 l'érythrocyte éclate et libère de 10 à 20 nouveaux mérozoltes. Certains d'entre eux donnent des gamétocytes mâles et des gamétocytes femelles, débutant ainsi le cycle sexué du parasite. Les gamétocytes sont ensuite ingérés par un moustique, en même temps que les érythrocytes, arrivent à maturité à l'intérieur du tube digestif, et fusionnent pour former un zygote. Ce dernier passe finalement par une série de divisions 35 et de transformations qui conduisent à la formation d'un spo- - 3 rozolte mature, prêt à déclencher un nouveau cycle infectieux. En conséquence, une immunité protectrice peut agir aussi bien contre les sporozoites que contre les formes asexuées du parasite dans le sang. D'un intérêt particulier est la mise au point d'un vaccin contre les sporozoltes du parasite, vaccin qui puisse, à condition qu'il soit efficace sur l'homme, empêcher le développement des stades subséquents qui sont responsables de la 10 maladie et de la transmission de l'infection. Le principal antigène de surface du sporozolte de P. berghei (R.S. Nussenzweig et coll., Science, 207, 71, 1980) et Plasmodium, lesquels provoquent le paludisme chez des singes et chez l'homme (F. Santoro et coll., J. Biol. Chem., 15 258, 3341, 1983; E.H. Nardin et coll., J. Exp. Med., 156, 20, 1982) est une protéine de membrane qui revêt la totalité de la surface du sporozolte; elle est dénommée "protéine circumsporozolte" ou "protéine CS". Dans EP-A 166 410, Dame et coll. ont récemment décrit 20 le clonage du gène codant pour la protéine CS de P. falciparum, dont la séquence est caractérisée par un domaine central, formé par 37 tétrapeptides ayant une séquence (Asn-Ala-Asn-Pro) (NANP) et 4 tétrapeptides (Asn-Val-Asp-Pro), encadré par de plus courtes séquences d'acides aminés dénommées respectivement "Région I" ("RI") et "Région II" ("RII"). En utilisant des anticorps monoclonaux, Dame et coll. ont trouvé que l'épitope immunodominant de ladite protéine est constitué de la séquence répétée, et ont synthétisé des 30 peptides contenant de 1 à 3 tétrapeptides (NANP) capables de bloquer la liaison d'anticorps monoclonaux à la protéine CS. A présent, cinq autres protéines de surface (protéines CS) de Plasmodium ont été identifiées, et elles montrent toutes le même caractère répétitif des séquences d'acides aminés et le même caractère d'immunogénicité. Ainsi, des pep- -4 tides synthétiques contenantou constitués par lesdites séquences répétitives se révèlent particulièrement appropriés pour la préparation d'un vaccin antipaludéen. On a toutefois constaté que, bien que la séquence d'acides aminés soit maintenue dans le peptide répété, ladite séquence peut varier d'espèce à espèce et, dans certains cas, à l'intérieur de la même espèce (S. Sharna et coll., Science 229, 779, 1985). Cela constitue une limitation à l'immunoprophylaxie du 10 paludisme, du fait qu'un vaccin, basé sur l'utilisation d'immunogènes spécifiques d'une espèce, fait preuve d'une efficacité limitée. Dame et coll. (EP 166 410) et L.S. Ozaki et coll. (Cell, 34, 815, 1985) ont constaté que la Région I qui est 15 adjacente au domaine central de la protéine Cs montre, à la différence de l'épitope répété, une considérable analogie de séquence chez différentes espèces de Plasmodium et présente une haute polarité. On pourrait par suite en déduire que cette région peut intervenir dans des fonctions déterminées 20 du sporozolte et constituer par conséquent un-immunogène approprié pour la préparation d'un vaccin antipaludéen. L'immunogénicité de la Région I de la protéine CS de P. falciparum a été ensuite déterminée par injection de ladite région à des animaux expérimentaux, sous forme d'un peptide synthétique conjugué avec un support protéique hétérologue (Ballou et coll., Science, 228, 953, 1985; Vergara et coll., J. Immunol., 134, 3445 [1985]). On a ainsi constaté que lesdits peptides induisent la formation d'anticorps capables de reconnaître les sporozoltes 30 de différentes espèces de Plasmodium, mais sont incapables d'empêcher la pénétration de cellules hépatiques humaines par les sporozoltes, de provoquer une réaction de précipitation de la protéine CS (Ballou et coll.) et de stimuler la prolifération de lymphocytes T (Vergara et coll.), essentielle pour lacréation d'une mémoire immunologique. - 5 Lesdits peptides synthétiques se révèlent par conséquent ne pas être très appropriés pour le développement d'un vaccin antipaludéen, du fait qu'ils sont incapables de conférer une protection in vivo (Ballou et coll. ) ou d'induire une immunité à long terme. On a découvert à présent qu'il est possible de remédier aux inconvénients de l'état de la technique, au moyen d'un polypeptide constitué du peptide synthétique de la Région I, lié par une liaison covalente à un vecteur protéique homo10 logue, lequel peut être obtenu sous une forme pure au moyen d'un procédé simple et avantageux du point de vue économique. En conséquence, un objet de la présente invention est un polypeptide utilisable pour la préparation de vaccins antipaludéens et de nécessaires de diagnostic pour la détec15 tion d'anticorps antisporozoltes dans des échantillons cliniques prélevés sur des sujets atteints de paludisme. Un autre objet de la présente invention est un procédé pour la préparation dudit polypeptide. Encore un autre objet de la présente invention est l'utilisation dudit polypeptide pour la préparation de vaccins antipaludéens et de nécessaires de diagnostic pour la détection d'anticorps antisporozoltes dans des échantillons cliniques prélevés sur des sujets atteints de paludisme. La description ci-après et les dessins ci-annexés 25 feront encore apparaître d'autres objets de l'invention. Le polypeptide selon la présente invention est constitué du polypeptide synthétique qui répète la Région I de P. falciparum, et d'un ensemble formé par un nombre variable d'unités du tétrapeptide répété (NANP) de la protéine CS de 30 P. falciparum, liés l'un à l'autre par une liaison amide entre la proline de queue de la Région I et l'asparagine de tête du premier polypeptide. En particulier, le polypeptide de la présente invention peut être défini par la formule générale suivante: - 6 Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-GlnPro-Gly-Asp-Gly-AsnPro-(Asn-Ala-Asn-Pro)n-Asn-Ala (I) dans laquelle - Asn = asparagine - Ala = alanine - Asp = acide aspartique - Lys = lysine - Leu = leucine - His = histidine - Gly = glycine - Gln = acide glutamique - Pro = proline et n a une valeur comprise dans la plage allant de 3 à 40. On peut préparer-le polypeptide (I) selon des tech15 niques générales connues, soit en phase homogène, soit en phase solide. Selon la présente invention, on synthétise le polypeptide (I) en phase solide par un procédé comprenant a) la condensation du premier acide aminé, à groupe a-amino 20 protégé, sur un support solide insoluble, au moyen d'une réaction d'estérification entre le groupe carboxyle activé et le groupe d'accrochage sur le support solide; b) l'élimination du groupement protecteur du groupe a-amino; c) la condensation de l'acide aminé, lié au support solide insoluble, et d'un second acide aminé à groupe a-amino protégé, au moyen d'une réaction d'acylation entre le groupe amino qui n'est plus protégé et le groupe carboxyle activé du deuxième acide aminé; d) l'élimination du groupement protecteur du groupe a-amino du deuxième acide aminé; e) la condensation des acides aminés successifs selon les modes opératoires des étapes c) et d) ci-dessus, jusqu'à achèvement du polypeptide (I); - 7 f) la séparation, au moyen d'une hydrolyse acide, du polypeptide (I) ainsi obtenu, d'avec le support solide insoluble; g) la récupération et la purification du polypeptide (I) par chromatographie. Selon la présente invention, les supports solides insolubles sont choisis parmi des résines polyacrylamide, des résines polystyrène réticulées avec le divinylbenzène, des résines phénoliques. On utilise en particulier une résine polyacrylamide du 10 commerce, qui est fonctionnalisée avec de la norleucine (Nle) en tant que l'acide aminé de référence interne, et un groupe d'accrochage pour la liaison réversible peptide-résine, tel que par exemple acide p-hydroxyméthylphénoxyacétique. Avant la condensation des acides aminés, on fait gon15 fier la résine fonctionnalisée en la traitant par le N,Ndiméthylformamide (DMF), à la température ambiante, ou à des températures voisines de la température ambiante. Selon la présente invention, on peut ajouter les acides aminés à la résine, soit individuellement, soit, après une 20 synthèse préliminaire en phase homogène, sous forme de peptides préconstitués. Les acides aminés sont condensés sur la résine après une protection préliminaire du groupe a-amino et des éventuelles fonctions réactives latérales, et l'activation du groupe carboxyle terminal. Comme exemples de groupements protecteurs du groupe a-amino, appropriés pour le but recherché, on peut citer les groupements benzyloxycarbonyle, triphénylméthyle, tertamyloxycarbonyle, 2nitrophénylsulfonyle, fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc) et tertbutyloxycarbonyle (Boc). Parmi ceux-ci, on préfère les groupes Fmoc et Boc, lesquels peuvent être éliminés dans des conditions douces. On préfère en particulier le groupe fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc). On protège les groupes fonctionnels réactifs éventuel35 lement présents sur les chaînes latérales des acides aminés, -8 au moyen de groupements protecteurs connus dans la technique de la synthèse des peptides. On utilise normalement des groupements protecteurs qui sont stables dans les conditions d'élimination du groupement protecteur de groupe a-amino. Comme exemples de ces groupements-protecteurs, on peut citer, pour la lysine: les groupes tert-butyloxycarbonyle (Boc), ortho-bromobenzyloxycarbonyl (BrZ) et benzyloxycarbonyle; pour l'acide aspartique, le groupe ester tert10 butylique (OBu); et pour l'histidine, le groupe triphénylméthyle (Trityle, Trt). On élimine lesdits groupes protecteurs en même temps que l'on sépare le polypeptide (I) d'avec la résine. Selon la présente invention, on effectue l'activation 15 des radicaux acides aminés Lys, Leu, Ala, Pro, Asp et Gly au moyen de la réaction avec le dicyclohexylcarbodiimide (DCI), pour former l'anhydride symétrique dudit acide aminé au niveau du groupe carboxyle terminal. En général, on effectue la réaction par dissolution de 20 l'acide aminé, dont le groupe a-amino est protégé, dans un solvant organique inerte (non réactif), en présence de dicyclohexylcarbodiimide, à la température ambiante (20250C). Une fois la réaction terminée, on élimine la dicyclo25 hexylurée par filtration ou centrifugation, on élimine le - solvant par évaporation et-on recueille l'anhydride symétrique ainsi formé. On effectue l'activation des radicaux acides aminés Asn et Gln au moyen d'une réaction avec un dérivé du phénol, pour 30 former l'ester actif sur le groupe carboxyle terminal. Les dérivés du phénol qui peuvent être utilisés selon la présente invention sont les dérivés fluorés ou chlorés du phénol, comme par exemple pentachlorophénol, trichlorophénolet pentafluorophénol0 et le p-nitrophépol. - 9 On effectue la réaction d'activation du groupe carboxyle de l'acide aminé à groupe a-amino protégé, par mise en contact dudit acide aminé et dudit dérivé du phénol, dans un solvant organique inerte, à la température ambiante ou à une température voisine de la température ambiante. Des exemples de solvants organiques appropriés pour le but recherché sont choisis parmi les solvants aprotiques, comme par exemple acétate d'éthyle ou hydrocarbures aliphatiques chlorés. On refroidit ensuite à une température d'environ 0 C la solution ainsi obtenue, et on y ajoute un agent de condensation, avec un rapport molaire agent de condensation/acide aminé égal ou approximativement égal à 1. L'agent de condensation normalement utilisé est le 15 dicyclohexylcarbodiimide (DCI). Etape (a) Dans l'étape (a) du procédé de la présente invention, la réaction d'estérification entre l'anhydride symétrique de l'acide aminé Ala, à groupe a-amino protégé, et le groupe 20 d'accrochage de la résine est effectuéedans un solvant organique inerte, en présence de catalyseurs. Des solvants organiques appropriés pour le but recherché sont des hydrocarbures aliphatiques chlorés, des cétones aliphatiques ou des esters d'alkyle. Comme exemples spécifiques desdits solvants, on peut citer le N,N-diméthylformamide (DMF), le chloroforme, l'acétate d'éthyle, le tétrahydrofuranne. Les catalyseurs sont choisis parmi ceux connus dans la technique. On utilise en particulier la 4-diméthylamino30 pyridine et la N-méthylmorpholine. La température à laquelle on effectue la réaction d'estérification se situe généralement dans la plage allant de -10 à 40 C, et la durée de réaction correspondante est la durée requise pour achever ou achever pratiquement la réac35 tion. De préférence, la température est la température ambiante (20-25 C). - 10 Etapes (b) et (d) A la fin de la réaction d'estérification, on élimine dans l'étape (b) le groupement protecteur du groupe a-amino. En particulier, lorsque le groupement protecteur est le groupe fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc), on effectue cette élimination par traitement de l'ensemble résine-peptide avec un mélange de pipéridine/DMF (20:80, v/v), pendant une durée totale de 10 minutes environ à la température ambiante. 10 Etapes (c) et (e) Après l'élimination du groupement protecteur du groupe a-amino, et lavages adéquats de l'ensemble résine-peptide, on condense, dans les étapes (c) et (e) de la présente invention, les acides aminés successifs, au moyen de la réaction 15 d'acylation entre les acides aminés convenablement protégés et préactivés au niveau de leur groupe carboxyle, et le groupe amino, qui n'est plus protégé, de l'acide aminé lié à la résine. En particulier, on effectue la réaction d'acylation dans un solvant organique inerte, en présence ou non de catalyseurs. Les solvants organiques inertes sont choisis parmi des hydrocarbures aliphatiques chlorés, des cétones aliphatiques ou des esters d'alkyle. On utilise de préférence le N,N25 diméthylformamide (DMF), le chloroforme, l'acétate d'éthyle, le tétrahydrofuranne. Les catalyseurs sont par exemple le l-hydroxybenzothiazole, la 4-diméthylaminopyridine et la N-méthylmorpholine. En particulier, pour les radicaux Asn et Gln, on uti30 lise le 1hydroxybenzotriazole (HOBT). La température à laquelle on effectue la réaction d'acylation se situe en général dans la plage allant de-10 à C. La réaction est de préférence effectuée à la tempéra35 ture ambiante ou à une température voisine de la température 26È01590 - 11 ambiante, et la durée correspondante est celle requise pour achever ou achever pratiquement la réaction, Etape (f) La séparation du polypeptide d'avec le support solide 5 insoluble peut être effectuée selon des techniques générales connues, par hydrolyse acide ou basique, aminolyse ou alcoolyse. On effectue normalement la réaction par mise en suspension de l'ensemble résine-peptide dans une solution d'acide 10 trifluoroacétique et eau (90:10, v/v), à une température de à 30 C. Une fois la réaction terminée, on sépare par filtration la résine hors du mélange réactionnel, on la lave avec plusieurs reprises avec de l'eau, et on la sépare à nouveau par 15 filtration. On concentre par évaporation à siccité les filtrats réunis, on dissout dans de l'eau le résidu obtenu, puis on le lyophilise. Etape (g) On purifie ensuite le polypeptide (I) brut, obtenu dans l'étape (f), successivement par chromatographie par perméation de gel et chromatographie sur échangeur d'ions. On recueille les fractions correspondant au produit recherché, et on les lyophilise. Une fois effectué le procédé de la présente invention, on obtient un rendement chromatographique global de 74% et un rendement en fraction purifiée égal à 40%, par rapport au poly-peptide séparé de la résine. Les polypeptides de formule (I) sont dotés d'une bonne 30 activité immunogène. Les peptides dans lesquels n va de 3 à 10 sont particulièrement appropriés aux fins de la présente invention. Selon la présente invention, on a testé l'immunogénicité du polypeptide RI-(NANP)3-NA, synthétisé comme indiqué 35 dans l'exemple 1, par immunisation de lignées de souris de - 12 différentes variétés, puis analyse par essai immunoenzymatique et essai d'immunofluorescence des sérums prélevés à différents intervalles de temps après les inoculations. Les résultats obtenus montrent que les anticorps formés sont spécifiques de la région I, qu'ils reconnaissent les sporozoltes de P. falciparum et inhibent la pénétration de cellules hépatiques humaines par les sporozoltes à un degré plus élevé que celui obtenu avec des sérums de souris immunisées avec le seul peptide répété (NANP)n10 On a en outre constaté que le polypeptide RI(NANP)3NA induit la prolifération de lymphocytes T. L'utilisation dudit polypeptide dans un essai immunoenzymatique a permis de déceler, dans des sérums de sujets exposés à une infection paludéenne, la présence d'anticorps 15 anti-Région I à la fois dans des sérums positifs pour les anticorps anti-(NANP)40 et dans des sérums qui se sont révélés négatifs pour ces anticorps. En conséquence, lesdits polypeptides peuvent être utilisés pour la préparation d'un vaccin antipaludéen et de né20 cessaires de diagnostic pour la détection d'anticorps antisporozo!tes dans des échantillons cliniques prélevés sur des sujets atteints de paludisme. La présente invention est illustrée plus en détail à l'aide des dessins ci-annexés. Sur ces dessins: Les figures 1A et lB montrent la production d'anticorps en réponse au polypeptide RI-(NANP)3-NA dans des souris C57 BL/6 (e), BALB/c ( (figure 1A), ou 10 pg/ml de peptide RI (figure lB). Les flèches indiquent les jours d'immunisation. - 13 Les figures 2A et 2B montrent la prolifération cellulaire: On recueille les cellules de ganglions lymphatiques de souris C57 BL/6 (figure 2A) et BALB/c (figure 2B), 105 12 jours après la deuxième immunisation avec RI-(NANP)3-NA. Les résultats sont exprimés par la différence en cpm obtenus dans des cupules contenant différentes concentrations de RI-(NANP)3-NA (o), (NANP) 4 ( cupules contenant du DMEM. l0 La figure 3 montre la spécificité d'anticorps anti(NANP)n et anti-RI chez des souris C57 BL/6 immunisées au moyen du peptide RI-(NANP)3-NA. On mélange avec les peptides (NANP)40 ou RI les sérums prélevés 6 jours après la dernière immunisation, et on les 15 teste, en double, par l'essai immuno-enzymatique, sur des plaquettes contenant (NANP)40 ou RI. On compare les résultats à ceux obtenus avec des sérums n'agissant pas par compétition. A des fins de comparaison, on donne les résultats obtenus avec des sérums de souris C57BL/6 20 immunisées avec le peptide (NANP)40. La figure 4 montre la spécificité d'anticorps humains anti-RI. On mélange avec différentes quantités de peptide (NANP)40 (o) ou RI (e) les sérums de sujets présumés atteints 25 de paludisme, et on les soumet ensuite à un essai immunoenzymatique sur des plaquettes enduites de peptide RI (10 pg/ml). ( La présente invention est illustrée par les exemples descriptifs et non limitatifs ci-après. 30 Exemple 1 Synthèse de Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-LeuLys-Gln-Pro-Gly-AspGly-Asn-Pro-(Asn-Ala-Asn-Pro) 3-Asn-Ala-[RI-(NANP) 3NA] On a effectué la synthèse du conjugué peptidique sur un synthétiseur automatique Beckman modèle 990 B, en utilisant 35 une résine polyacrylamide du commerce (Cambridge Research 260 1 590 - 14 Biochemicals), fonctionnalisée avec de la norleucine, en tant que l'acide aminé de référence, et de l'acide p-hydroxyméthylphénoxyacétique en tant que groupement d'accrochage pour la liaison réversible peptide-résine. On a fait gonfler 1 g de la résine ainsi fonctionnalisée, pendant 16 heures à la température ambiante (20-25 C), avec 32 ml de N,Ndiméthylformamide (DMF), et on a ensuite lavé 10 fois avec du DMF, à raison d'une minute chaque fois. On a ensuite estérifié sur la résine le premier radical 10 acide aminé (Ala), au moyen de la réaction avec l'anhydride symétrique de l'acide aminé, à groupe a-amino protégé par un groupement protecteur fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc). On a fait réagir 2,17 g (1,8 mmole) de (Fmoc-Ala)20 avec la résine dans 16 ml de DMF, en présence de 0,022 g (0,18 mmole) 15 de 4-diméthylaminopyridine (DMAP) et 0,200 ml (1,8 mmole) de N-méthylmorpholine (NMM), à la température ambiante (20-25 C) pendant 30 minutes. Une fois terminée la réaction d'estérification, on a lavé la résine 5 fois avec du DMF (à raison d'une minute chaque fois), deux fois, à savoir une fois pen20 dant 3 minutes et une fois pendant 7 minutes, avec une solution de pyridine/DMF (20:80, v/v), dans le but d'éliminer le groupement protecteur Fmoc, et enfin 10 fois avec du DMF, à raison d'une minute chaque fois. - On a ensuite introduit tous les autres acides aminés, un à la fois, selon la séquence désirée, au moyen de la réaction d'acylation entre le radical acide aminé, à groupe carboxyle activé et à groupe a-amino protégé par le groupement Fmoc, et la chaîne polypeptidique croissante. Entre une réaction d'acylation et la suivante, les opérations de lavage 30 avec du DMF et d'élimination du groupement Fmoc ont été effectuées comme indiqué ci-dessus. On a effectué la réaction d'acylation à la température ambiante (20-25 C) pendant 60 minutes. Les radicaux acides aminés Lys, Leu, Ala, Pro, Asp et Gly (1,8 mmole de l'an35 hydride symétrique dans 16 ml de DMF) ont été introduits sous - 15 forme d'anhydrides symétriques; Asn et Gln ont été introduits sous forme de leurs esters p-nitrophényliques (1,8 mmole) dans 16 ml de DMF, en présence de 0,244 g (1,8 mmole) de 1hydroxybenzotriazole (HOBT). Finalement, on a activé in situ le radical Fmoc-His au moyen de l'addition, directement dans le réacteur contenant la résine, de 1,115 g (1,8 mmole) de Fmoc-His-(Trt)-OH et 0,371 g (1,8 mmole) de dicyclohexylcarbodiimide (DCI) dissous dans 16 ml de DMF. Juste avant la réaction d'acylation, on a préparé l'anhydride symétrique des acides aminés protégés, en faisant réagir 3,6 mmoles d'acide aminé-Fmoc et 0,371 g (1,8 mmole) de DCI dans 20 ml de CH2Cl2, à la température ambiante, pendant 10 minutes. Une fois la réaction terminée, on a séparé par filtration la dicyclohexylurée, on a évaporé le solvant 15 et on a recueilli l'anhydride symétrique ainsi obtenu. Pour chaque réaction d'acylation, on a vérifié l'achèvement de la formation de la liaison amide, au moyen de l'essai à la ninhydrine (E. Kaiser et coll., Anal. Biochem., 34, 595, 1980), et de l'essai à l'acide trinitrobenzènesulfo20 nique (W.S. Hancock et coll., Anal. Biochem., 71, 261, 1976). On a prélevé les échantillons après 30 minutes de réaction, et ils ont donné des résultats positifs. Une fois terminé l'assemblage de la séquence désirée, on a procédé à l'analyse des acides aminés de l'ensemble 25 résine-peptide, en obtenant les résultats suivants: His Leu Lys Glx Gly Asx Pro Ala Nle 0,88 1,00 5,04 1,11 2,19 9,11 5,89 4,61 1,25 Les valeurs théoriques pour les mêmes acides aminés étaient respectivement: His Leu Lys Glx Gly Asx Pro Ala 1,00 1,00 5,00 1,00 2,00 9,00 6,00 4,00 Glx représente soit Gln, soit Glu,; Asx représente soit Asn, soit Asp. On a ensuite séparé d'avec la résine le peptide ainsi synthétisé, au moyen de la réaction avec 50 ml d'une solution - 16 d'acide trifluoroacétique et eau (90:10 v/v), à une température de 20 pendant 3 heures. On a ensuite séparé la résine hors du mélange réactionnel par filtration sous vide, on l'a lavée 3 fois avec 20 ml d'eau chaque fois, puis on l'a sépa5 rée par filtration. On a réuni les filtrats et on les a concentrés par évaporation à siccité, puis on a redissous dans de l'eau le résidu et on l'a lyophilisé. On a purifié le polypeptide ainsi obtenu (1,255 g, 0,405 mmole) par chromatographie par perméation de gel, en 10 utilisant une colonne de 84 x 2,6 cm, une résine fine Sephadex G-25 et, en tant qu'éluant, CR3COOH 0, 1 M. On a en outre purifié le peptide par chromatographie sur échangeur d'ions, en utilisant une colonne de 45 x 2,0 cm, une résine Whatman CM-52, et en éluant avec un gra15 dient d'acétate d'ammonium allant de 0,1 M à 0,5 M, pH 6,6. On a recueilli les fractions correspondant au peptide purifié, et on les a lyophilisées. Le rendement chromatographique global s'est révélé être de 74%. La fraction purifiée correspondait à 40% du peptide 20 séparé de la résine. L'analyse des acides aminés contenus dans le peptide purifié, effectuée par hydrolyse pendant heures avec HCl 6 N à 110 C, a donné les résultats suivants: Valeurs trouvées: -His Leu Lys Glx Gly Asx Pro Ala 1,00 1,00 4,78 1,08 1,99 8,75 6,18 3,99 Valeurs théoriques: His Leu Lys Glx Gly Asx Pro Ala 1,00 1,00 5,00 1,00 2, 00 9,00 6,00 4,00 30 Exemple 2 Immunogénicité du polypeptide RI-(NANP)3NA On a immunisé des souris C57BL/6 (ISREC, Lausanne, Suisse), C57BL/10, B10.A (5R), BALB/c et CBA/Ca (CMU, Genève, Suisse), des deux sexes, âgées de 8 à 12 semaines, avec le polypeptide RI-(NANP)3-NA et avec le peptide correspondant à - 17 la Région I seule (RI), ces deux polypeptides ayant été synthétisés comme décrit dans l'exemple 1. En particulier, on a dissous les peptides à une concentration de 10 ig/ml dans de l'eau, on les a émulsionnés à un rapport de 1:1 avec de l'adjuvant complet de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Mi, USA, et on a inoculé aux souris ml desdites émulsions, par injection intramusculaire à la base de la queue. On a répété l'inoculation 15 jours plus tard, en utili10 sant de l'adjuvant incomplet de Freund, et à nouveau 15 jours plus tard, par inoculation, par voie intrapéritonéale, de 500 pl/souris d'une solution de sérum physiologique contenant les peptides RI et RI-(NANP)3-NA. On a ensuite effectué des prélèvements de sang au 15 niveau du plexus rétro-oculaire, à différents jours, et jusqu'à 6 jours après la dernière inoculation. On a ensuite analysé les sérums individuels pour déterminer la présence dans ceux-ci d'anticorps spécifiques antiRégion I, au moyen de la méthode immuno-enzymatique, en uti20 lisant des plaquettes enduites de 10 pg/ml de peptide RI et de 1 pg/ml de peptide (NANP)40, comme décrit dans la demande EP-A 209 643, déposée le 16 avril 1986. Les résultats, représentés sur la figure 1A, montrent l'absence d'anticorps anti-RI dans les sérums de souris immu25 nisées au moyen du peptide RI seul, et la présence, 17 jours après la première inoculation, d'anticorps anti-(NANP), chez les souris C57BL/6 immunisées avec le polypeptide RI-(NANP)3-NA. La quantité desdits ?anticorps augmente après la deuxième et la troisième inoculation, en raison de l'apparition d'anticorps anti-RI (figure lB). Au moyen de l'essai immuno-enzymatique, on a déterminé la présence d'anticorps spécifiques anti-Région I dans les sérums (93) de sujets vivant dans des régions o le paludisme 35 est endémique (Gabon) et dans les sérums (102) de sujets - 18 sains. Comme on peut le voir d'après le tableau 1 ci-dessous, les anticorps anti-RI ont été décelés dans 39 sérums. 34% de ceux-ci se sont révélés positifs également pour des anticorps anti-(NANP)40, tandis que 5 sérums ne se sont révélés positifs que pour les anticorps anti-RI. Tableau 1 Fréquence d'anticorps anti-(Asn-Ala-Asn-Pro)40 (NANP40) et anti-Région I dans les sérums de sujets originaires du Gabon 10 Anticorps anti-(Asn-AlaAsn-Pro) Positifs Négatifs Total Anticorps Positifs 34 (36,5) 5 ( 5,3) 39 (41,8) anti-(RI) Négatifs 27 (29,1) 27 (29,1) 54 (58,2) Total 61 (65,6) 32 (34,4) Les sérums ont été considérés comme positifs lorsque leur DO à 492 nm était supérieure à 0,25, calculée en tant que moyenne des valeurs obtenues de la DO, par essai de 102 sérums (dilués à 1:200) de sujets sains. On a déterminé la spécificité des anticorps anti-RI et 20 des anticorps anti-(NANP) sur le sérum de souris C57BL/6 immunisées, respectivement, avec le peptide (NANP)40 et le polypeptide RI-(NANP)3-NA. Les sérums prélevés 6 jours après la dernière inoculation, ont été dilués à 1:200 et ont été mélangés avec les peptides (NANP)40 et RI (250 ug/ml) dans de l'eau salée tamponnée au phosphate (PBS}, contenant 0,05% de Tween 20 et 2,5% de lait en poudre, et ensuite mis à incuber pendant 1 heure à 37 C. On a testé 100 pl desdits mélanges, en double essai, 30 par l'essai immuno-enzymatique, en utilisant des plaquettes enduites de peptide (NANP)40 et de peptide RI. Les résultats, représentés sur la figure 3, montrent que seuls les peptides analogues inhibent la liaison entre les anticorps et les peptides adsorbés sur les plaquettes. - 19 En outre, la figure 4 montre que la liaison entre le peptide RI et les anticorps présents dans les sérums positifs de sujets exposés à une infection paludéenne, est inhibée lorsque tous les sérums sont pré-incubés avec RI. S Exemple 3 Prolifération cellulaire induite par le polypeptide RI-(NANP) 3-NA 8 à 10 jours après la deuxième inoculation, on a recueilli les ganglions lymphatiques inguinaux et péri10 aortiques des souris immunisées comme indiqué dans l'exemple 1. On a mis les cellules en suspension dans du DMEM contenant de la L-glutamine (2 mM), du tampon HEPES (25 mM), du 2mercaptoéthanol et de la séro-albumine foetale (5%), et on les a ensuite transférées (2x105) dans 200 ml de 15 milieu de culture, puis déposées sur des microplaques (Greiner, Nurtingen, RFA), en présence de 0,1, 1,0, 10,0 et ig/ml des peptides à tester. Au bout de 4 jours, on a irradié les cultures avec 1 pCi de [3H]thymidine, et 18 heures après, on a recueilli 20 les cellules et on a mesuré la thymidine incorporée dans celles-ci. Les résultats, représentés sur la figure 2A, montrent une forte prolifération cellulaire pour les souris C57BL/6, C57BL/10 et B10A (5R), en présence de 10 pg/ml de peptide RI-(NANP)3-NA et de peptide (NANP)4, et l'absence de prolifération cellulaire chez toutes les souris immunisées avec le peptide RI. Ces résultats montrent que le peptide (NANP)3 lié à la Région I agit en tant que viecteur d'immunogène, et stimule la 30 réponse immunitaire avec production d'anticorps spécifiques de l'épitope RI. - 20 Exemple 4 Essai de l'effet inhibiteur de RI-(NANP)3-NA sur la pénétration des sporozoltes dans des hépatocytes humains On a ensemencé des cellules d'hépatome humain, à une concentration de 10 cellules/cuvette, dans des cuvettes en matière plastique Lab-Tek (Miles) et on les a cultivées pendant 24-48 heures. On a ensuite introduit dans chaque cuvette 24 pl d'une suspension contenant 5,104 sporozoltes de P. falciparum et 10 25 pl d'une solution 1:5 de l'échantillon à l'essai. Les sporozo tes avaient été obtenus à partit de glandes salivaires d'Anopheles stephensi infecté avec P. falciparum. Deux jours et six jours plus tard, on a déterminé par immunofluorescence le nombre d'hépatocytes infectés, en uti15 lisant des anticorps monoclonaux anti-protéine CS de P. falciparum. Les résultats obtenus montrent que les sérums de souris C57BL/6 immunisées avec RI-(NANP)3 inhibent (à 86%) la pénétration des sporozoltes de P. falciparum dans les cellules 20 hépatiques, et que ladite inhibition est supérieure à celle obtenue avec les sérums de souris immunisées avec le peptide (NANP)40 seul. - 21 REVENDICATIONS 1. Polypeptide utilisable pour la préparation de vaccins antipaludéens et de nécessaires de diagnostic pour la détection d'anticorps antisporozoltes dans des échantillons 5 cliniques, caractérisé en ce qu'il est constitué du peptide synthétique-répétant la région I de la protéine. circumsporozoite de P. falciparum, et d'un ensemble formé par un nombre variable d'unités du tétrapeptide répété de la protéine circumsporozolte de Plasmodium falciparum, liés l'un à l'autre par l'extrémité proline de la 10 Région I et l'asparagine de tête du premier polypeptide, défini par la formule générale-suivante: Lys-Pro-Lys-His-LysLys-Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-AsnPro-(Asn-Ala-Asn-Pro) -Asn-Ala (I) n dans laquelle - Asn = asparagine - Ala = alanine - Asp = acide aspartique - Lys = lysine - Leu = leucine - His = histidine - Gly = glycine - Gln = acide glutamique - Pro = proline et dans laquelle n a une valeur comprise dans la plage allant 25 de 3 à 40. 2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que n va de 3 à 10. 3. Procédé pour la préparation du polypeptide selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que a) on condense le premier acide aminé (Ala), à groupe a-amino protégé, sur un support solide insoluble, au moyen d'une réaction d'estérification entre le groupe carboxyle activé et un groupe d'accrochage sur le support solide; b) on élimine le groupement protecteur du groupe a-amino; - 22 c) on condense l'acide aminé Ala, lié au support solide insoluble, et le deuxième acide aminé Asp, à groupe a-amino protégé, au moyen d'une réaction d'acylation entre le groupe amino qui n'est plus protégé et le groupe carboxyle Sactivé du deuxième acide aminé; d) on élimine le groupement protecteur du groupe a-amino du deuxième acide aminé; e) on condense les acides aminés successifs, selon les modes opératoires des étapes (c) et (d) ci-dessus, jusqu'à 10 l'achèvement du polypeptide (I); f) on sépare d'avec le support solide insoluble, au moyen d'une hydrolyse acide, le polypeptide (I) ainsi obtenu; g) on recueille le polypeptide (I) et on le purifie par chromatographie. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que le groupement protecteur de groupe a-amino est le groupe fluorénylméthyloxycarbonyle. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'on effectue la réaction d'estérification dans 20 un solvant organique inerte, en présence de catalyseurs, à une température comprise dans la plage allant de -10 à 40 C. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que le solvant organique est le N,N-diméthylformamide. 7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que les catalyseurs sont la N-méthylmorpholine et la 4-diméthylaminopyridine. 8. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que la température est la température ambiante (2030 25 C). 9. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que dans les étapes (b) et (d) l'élimination du groupement protecteur de groupe a-amino est effectué au moyen d'un mélange de pipéridine et N,N-diméthylformamide (20:80 35 v/v), à la température ambiante. - 23 10. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que dans les étapes (c) et (e) on effectue la réaction d'acylation dans un solvant organique, en présence de catalyseurs, à une température de -10 à 40 C. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait que le solvant organique est le N,N-diméthylformamide. 12. Procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait que les catalyseurs sont le 1-hydroxybenzotriazole, 10 la 4diméthylaminopyridine et la N-méthylmorpholine. 13. Procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait que la température est la température ambiante. 14. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que dans l'étape (f) on effectue la réaction de sépa15 ration au moyen d'une solution d'acide trifluoroacétique et eau (90:10, v/v), à une température comprise dans la plage allant de 10 à 30 C. 15. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que dans l'étape (g) on effectue la purification par 20 chromatographie par perméation de gel et chromatographie sur échangeur d'ions. 16. Utilisation du polypeptide selon les revendications 1 et 2, pour la préparation de vaccins antipaludéens. 17. Utilisation du polypeptide selon les revendica25 tions 1 et 2, dans un nécessaire de diagnostic pour la détection d'anticorps antisporozoltes dans des échantillons cliniques prélevés sur des sujets atteints de paludisme.