FR 2605225 A1 19880422 FR 8713486 A 19870928 La présente invention a pour objet la lyse théra- peutique des caillots de fibrine chez des patients humains. On sait que des enzymes d'origine naturelle participent à la lyse des caillots de fibrine et ont été utilisées en théra- peutique pour la lyse de caillots chez des patients, par exemple des patients atteints d'affections coronaires, chez lesquels se sont formés des caillots mettant leur vie en danger. Deux de ces enzymes sont la prourokinase et l'urokinase. Cette dernière semble être synthétisée in vivo sous forme d'une pro-enzyme à chaîne unique (pro-urokinase) qui est transformée en une forme à chaîne double par clivage protéolytique (urokinase). La pro-urokinase est également dénommée activateur urinaire du plasminogène, à chaîne unique (scu-PA). Les deux enzymes, l'urokinase et la pro-urokinase, peuvent être utilisées en thérapeutique comme agents thrombolytiques lors d'infarctus frais du myocarde afin de limiter ou même d'empêcher la nécrose totale du myocarde. Dans ce but,l'urokinase est utilisée à des doses supérieures à i 000 000 U.I., les doses par voie intraveineuse étant de préférence comprises entre 2 000 000 et 3 000 000 U.I. par application. L'utilisation de la pro-urokinase pour cette indication est encore à l'étude, et jusqu'ici les résultats ont montré que des doses supérieures à 6 500 000 U.I. sont nécessaires pour obtenir de bons résultats. On s'attendait à l'origine à ce que les effets de la pro- urokinase et de l'urokinase soient, dans le meilleur des cas, strictement additionnels. Cependant, la Demanderesse a trouvé maintenant de façon surprenante que l'urokinase exercait un effet synergique sur l'activité thérapeutique de la pro-urokinase. En particulier, on a trouvé qu'après une injection initiale rapide d'urokinase, l'administration subséquente de pro-urokinase est bien 2605225. plus efficace, ce qui permet de réduire considérablement la dose totale requise afin d'obtenir un effet thérapeutique bénéfique. La Demanderesse a également trouvé que cet effet synergique n'est pas limité au cas o l'administration d'urokinase est suivie par l'administration de pro-urokinase, mais s'exerce aussi lorsqu'on administre la pro-urokinase en premier, puis l'urokinase, ou lorsqu'on administre la pro-urokinase et l'urokinase simultanément par perfusions ou injections séparées, par injection unique avec une seringue à double compartiments, ou par injection ou perfusion uniques d'un mélange de pro-urokinase et d'urokinase. L'invention a donc pour objet l'utilisation de l'urokinase ensemble avec la pro-urokinase, sous forme d'une association libre ou fixe, comme agent thrombolytique. L'invention a également pour objet l'utilisation de l'urokinase pour la prépa- ration d'un agent destiné à potentialiser l'effet thrombolytique de la pro-urokinase. Par "effet synergique" on entend une activité de lyse d'un caillot de fibrine, supérieure (soit en termes de vitesse de lyse accrue ou de lyse plus importante, ou les deux) h celle résultant de la simple addition des effets de chaque substance administrée séparément. L'urokinase peut être utilisée sous une forme à bas poids moléculaire (poids moléculaire/, 33 000 daltons) ou sous une forme à poids moléculaire élevé (poids moléculaire v 55 000 daltons), la forme à poids moléculaire élevé étant préférée. L'urokinase peut être obtenue à partir de sources naturelles (par exemple l'urine) ou par les techniques de recombinaison génétique comprenant le clivage de la forme à chaîne unique formée initialement (pro-urokinase), comme décrit par W.E. Holmes et col. dans Bio/Technology 3 923 (1985). L'urokinase à poids moléculaire élevé est disponible sur le marché sous la marque Ukidan ou Actosolv, et l'urokinase à bas poids moléculaire sous la marque Abbokinase. On peut également obtenir la pro-urokinase à partir de l'urine comme décrit dans le brevet européen n 40238, ou à partir de cultures de lignées cellulaires naturelles ou de lignées cellulaires transformées selon les techniques de recombinaison génétique, sous des formes variant dans le degré de glucosylation ou sous d'autres aspects. La pro-urokinase utilisée selon la présente invention sera normalement une pro-urokinase d'origine humaine ayant la séquence d'amino-acides telle que décrite pour la pro-urokinase à la figure A de la demande de brevet européen n 92182, sans tenir compte de la séquence -20 à -1. Cependant, la pro-urokinase utilisée selon la présente invention peut différer de cette structure par substitution, suppression ou addition de un ou plusieurs restes d'aminoacides, à condition qu'elle conserve essentiellement la même activité biologique. Ainsi, par exemple, une pro-urokinase d'origine non humaine ou un composé tel que décrit dans la demande interna- tionale PCT WO 86/04351 ayant un autre amino-acide à la place du Lys-135 et/ou du Phe-157, ou tel que décrit dans la demande de brevet européen n 200 451 ayant le Phe-157 ou le Lys-158 supprimé ou substitué par un autre amino-acide, tombent sous la définition de "pro-urokinase" à condition que ces composés conservent une activité biologique. En outre, des formes tronquées de pro-urokinase, telles que celles décrites par exemple par Rijken et col. dans Thrombosis Research 42 p.749-760 et 761768 sont inclues dans la définition de "pro-urokinase" à condition qu'elles conservent leur activité biologique. De telles molécules peuvent avoir leur amino terminal au Lys-136, correspondant à l'urokinase à bas poids moléculaire à chaîne unique, ou à tout autre site approprié, par exemple au Ala-132, au Lys-144 et au Glu-150. D'autres formes de pro-urokinase ayant des amino-acides supplémentaires, par exemple une méthionine initiale, sont également inclues, à condition qu'elles soient actives. L'urokinase utilisée selon la présente invention peut également différer de manière correspondante de l'une des deux molécules normales d'urokinase humaine (urokinase à poids moléculaire élevé et urokinase à bas poids moléculaire), à condition qu'elle conserve'son activité biologique. L'invention est particulièrement appropriée pour les patients ayant subi une opération récente, ceux ayant eu récemment un infarctus du myocarde provoqué par des caillots et ceux souffrant d'une thrombose veineuse profonde. La pro-urokinase et l'urokinase, séparément ou en association, sont formulées avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, par exemple une solution physio- logique saline, et administrées par voie parentérale soit par voie intraveineuse, soit par injection dans les artères touchées du coeur. L'administration par voie intraveineuse est préférée, et peut être effectuée par perfusion, par injection rapide, ou par une combinaison des deux. De préférence on administre au patient de l'héparine, par exemple une injection rapide de 5 000 U.I. d'héparine avant l'administration de la pro-urokinase ou de l'urokinase, éventuellement suivie d'une perfusion de 1000 U.I./heure d'héparine. L'héparine peut également être administrée sous forme d'un mélange avec la pro-urokinase ou l'urokinase, ou sous forme d'un mélange de ces trois composés. La quantité préférée d'urokinase administrée selon l'invention est de 100 000 U.I. à 300 000 U.I., plus préférablement de 150 000 U.I. à 250 000 U. I., en particulier de 200 000 U.I. La quantité préférée de pro-urokinase administrée est inférieure à 6 500 000 U.I., plus préférablement comprise entre 2 000 000 et 4 000 000 U.I. La quantité d'urokinase mentionnée ci-dessus est plus efficace lorsqu'on l'administre par injection rapide 15 minutes ou moins avant l'administration de pro-urokinase.Cependant, pour faciliter l'administration, il peut être préférable d'administrer un mélange de prourokinase et d'urokinase en une seule injection ou perfusion, de préférence en une seule injection rapide. Selon un autre aspect, l'invention a donc également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un mélange synergique d'urokinase et de pro-urokinase en association avec un diluant ou véhicule pharmaceutiquement acceptable, ou un mélange synergique d'urokinase et de pro-urokinase sous forme lyophilisée pure. Les composants du mélange synergique de l'invention peuvent aussi être présentés sous forme d'un emballage jumelé, c'est-à-dire sous un emballage -unique contenant des doses unitaires séparées d'urokinase et de pro-urokinase ainsi que les instructions pour une administration concomitante. La composition est de préférence essentiellement pure, c'est-à-dire qu'elle ne contient pas de quantité significative d'une quelconque substance pharmaceutiquement active autre que l'urokinase et la prourokinase. La composition est préférablement analytiquement pure, c'est-àdire qu'elle ne contient aucune protéine autre que l'urokinase et la prourokinase, en quantité décelable par des méthodes analytiques disponibles à la date de la présente demande. Lorsqu'un diluant ou véhicule est présent, il s'agit de préférence d'eau stérile pour injection ou de solution physiologique isotonique stérile. Le rapport pondéral de l'urokinase à la pro-urokinase dans la composition selon l'invention est compris de préférence entre 1:40 et 1:6,7, plus préférablement entre 1:20 et 1:10, en particulier entre 1:15 et 1:10. La composition est de préférence présentée sous forme de doses unitaires, par exemple de flacons pour injection ou de bouteilles pour perfusion, contenant chacun de 000 à 300 000 U.I. d'urokinase et de 2 000 000 à 4 000 000 U.I. de pro-urokinase, plus préférablement 200 000 U.I. d'urokinase et entre 2 000 000 et 3 000 000 U.I. de pro-urokinase. Une telle dose unitaire contient une dose totale combinée d'urokinase et de pro-urokinas comprise entre 2 100 000 et 4 300 000 U.I., correspondant à environ 21-43 mg de protéine. Les quantités de chaque composé sont ainsi plus faibles que la quantité de chacun d'entre eux utilisée pour la lyse optimale du caillot lorsqu'ils sont administrés en l'absence de l'autre pour la même indication thérapeutique. Selon un autre aspect de l'invention, le patient reçoit une injection rapide d'urokinase et une injection rapide de pro- urokinase suivies par une perfusion de pro-urokinase. La quantité d'urokinase administrée par injection rapide est telle qu'indiquée plus haut, c'est-à-dire comprise de préférence entre 100 000 et 300 000 U.I., plus préférablement entre 150 000 et 250 000 U.I., particulièrement de 200 000 U.I. La quantité de pro-urokinase administrée par injection rapide est comprise de préférence entre 300 000 et 1 000 000 U.I., plus préférablement entre 400 000 et 600 000 U.I., en particulier de 500 000 U. I. Ces quantités peuvent être administrées en deux injections rapides séparées, délivrées dans n'importe quel ordre, ou à l'aide d'une seringue à double compartiments, ou en une seule injection rapide d'un mélange d'urokinase et de pro-urokinase, ce qui représente une autre composition de l'invention. Le rapport pondéral de l'urokinase à la pro-urokinase dans cette composition est compris de préférence entre 1:10 et 1:1, plus préférablement entre 1:4 et 1:1,6, en particulier de 1:2,5. Cependant, on administre de préférence l'urokinase avant la pro-urokinase. Il peut également être souhaitable d'administrer l'héparine en même temps que l'injection rapide d'urokinase et/ou de pro-urokinase. La quantité d'héparine à ajouter aux quantités indiquées plus haut d'urokinase, de pro-urokinase ou de mélange d'urokinase et de pro- urokinase, est comprise de préférence entre 1000 et 10 000 U.I., plus préférablement d'environ 5000 U.I. La quantité de pro-urokinase administrée postérieurement par perfusion est de préférence d'environ 100 000 U.I./minute, pouvant être administrée pendant environ 40 minutes, soit un total de 4 000 000 U.I. Dans de nombreux cas, le dégagement de l'artère obstruée peut se produire au bout de 30 minutes ou avant, et la perfusion peut être arrêtée au bout de ce laps de temps si le dégagement de l'artère est constaté, par exemple par angiographie coronaire. Pour l'utilisation selon cet aspect, l'invention a pour objet un kit comprenant une dose unitaire d'urokinase pour in- jection, une dose unitaire de pro-urokinase pour injection, et une dose unitaire de pro-urokinase pour perfusion. Le kit est présenté de préférence sous un emballage unique, contenant les instructions pour l'administration. Les doses unitaires pour l'injection peuvent se présenter sous forme de solutions stériles d'urokinase ou de prourokinase dans de l'eau pure ou dans une solution physiologique saline, ou sous une forme solide lyophilisée ou séchée par congélation à laquelle on peut ajouter de l'eau stérile ou une solution physiologique saline avant l'injection. La dose unitaire de pro-urokinase pour perfusion peut être une solution de pro-urokinase dans une solution saline physiologique ou dans tout autre milieu aqueux stérile pour perfusion, ou un solide lyophilisé ou séché par congélation ou un concentré liquide à partir desquels on peut préparer une solution pour perfusion. La solution pour injection ou perfusion peut contenir d'autres composants, par exemple des sels tampons tels que Na2HPO4/NaH2P04 et des conservateurs, par exemple le mannitol et l'albumine humaine, ces composés pouvant également se présenter sous une forme solide lyophilisée ou séchée par congé- lation. La quantité d'urokinase et de pro-urokinase dans les doses unitaires pour injection est de préférence telle que décrite plus haut, en particulier 200 000 U.I. d'urokinase et 500 000 U.I. de pro-urokinase; la quantité de pro-urokinase dans la dose unitaire pour perfusion est de préférence comprise entre 3 000 000 et 5 000 000 U.I., plus préférablement de 4 000 000 U.I. L'association d'urokinase à faible dose (200 000 U.I.) et de pro-urokinase à faible dose (3 000 000 U.I.) permet une thrombo- lyse efficace dans la majorité des cas d'infarctus du myocarde. Pour atteindre le même taux de réussite en utilisant l'urokinase seule, des doses comprises entre 2 000 000 et 2 500 000 U.I. seraient nécessaires, et à ces doses, il apparaît des effets secondaires tels que la fibrinogénolyse systémique et la perte de plasminogène. Pour atteindre les mêmes résultats avec la pro-urokinase administrée seule, des doses bien supérieures à 6 500 000 U.I., par exemple 9 000 000 U.I.,peuvent être nécessaires. Ces résultats indiquent une interaction synergique entre l'urokinase et la pro-urokinase dans la thrombolyse. La quantité de chaque composé est exprimée ci-après soit en poids (mg) soit en U.I. selon "The Intenational Reference Preparation for Urokinase" du National Institute for Biological Standards and Control, Londres, déterminées sur plaque de fibrine normalisée (Brakman, Fibrinolysis, A Standardized Fibrin Plate Method and a Fibrinolytic Assay of Plasminogen, Scheltema et Holkema NV, Amsterdam, 1967, p 1-24). La pro-urokinase est essayée après activation par la plasmine comme décrit par Gurewich et col. , dans J. Clin. Invest. (1984) 73, p 1731-1739. L'urokinase (autant les formes à poids moléculaire élevé que celles à bas poids moléculaire) et la pro-urokinase ont montré des activités spécifiques similaires (environ 100 000 U.I./mg), ce qui a permis de comparer les concen- trations de protéine (1 U.I. = 10 ng de protéine). Attendu que l'urokinase est disponible en ampoules contenant 250 000 U.I., une dose de 250 000 U.I. d'urokinase peut remplacer 200 000 U.I. dans la description et les exemples. L'utilisation d'une dose de 250 000 U.I. évite la difficulté d'évaluation des 4/5 d'une ampoule, et donne les mêmes effets bénéfiques que la dose de 200 000 U.I. Exemple 1 Une femme de 58 ans souffrant d'un infarctus du myocarde a reçu une injection rapide de 200 000 U.I. d'urokinase par voie 260 65225 intraveineuse puis une injection rapide de 1 000 000 U.I. de prourokinase et une perfusion de pro-urokinase à une cadence de 5,5 millions d'U.I./heure. La perfusion partielle a été atteinte au bout de 15 minutes et la perfusion complète au bout de 30 minutes, c'est-à-dire après administration d'un total de 3 250 000 U.I. de pro-urokinase. 24 heures après l'administration, la circulation sanguine était encore rétablie. Exemple 2 Un homme souffrant d'infarctus du myocarde a reçu un mélange de 200 000 U. I. d'urokinase et 2 500 000 U.I. de pro-urokinase par perfusion pendant 15 minutes. La circulation sanguine était rétablie à la fin de cette période. Exemple 3 Formulations a) Mélange pour injection On dissout 200 000 U.I. d'urokinase et 2 000 000 U.I. de pro-urokinase dans 20 ml de solution physiologique isotonique stérile et on conditionne dans un flacon pour injection. b) Mélange lyophilisé On lyophilise 200 000 U.I. d'urokinase et 3 000 000 U.I. de pro-urokinase et on scelle le résidu solide dans un flacon auquel on peut ajouter une solution physiologique saline pour injection. c) Seringue double compartiment Un compartiment de la seringue préemballée contient 000 U.I. d'urokinase dans 10 ml de solution physiologique isotonique stérile, et l'autre contient 3 000 000 U.I. de pro- urokinase dans 10 ml de solution physiologique isotonique stérile. d) Emballage jumelé Un emballage jumelé comprend un flacon contenant 000 U.I. d'urokinase sous forme lyophilisée et un flacon contenant 3 000 000 U.I. de pro-urokinase sous forme lyophilisée, avec les instructions pour une administration concomitante. Exemple 4 On prépare également des formulations telles que décrites à l'exemple 3 en utilisant 500 000 U.I. de pro-urokinase au lieu de 2 000 000 ou 3 000 000 U.I. de pro-urokinase. Exemple 5 Dans un essai clinique prospectif multi-centre, ouvert,et non comparatif, on a utilisé le protocole suivant: Critères de participation - 1) douleur d'une durée d'au moins 30 minutes, caracté- ristique de l'infarctus du myocarde, 2) apparition des symptômes moins de 5 heures avant le début de la thérapie lytique 3) signes caractéristiques sur ECG d'infarctus du myocarde 4) consentement éclairé du patient. Critères d'exclusion 1) contre-indications d'angiographie coronaire 2) contre-indications de thérapie lytique -15 a) début de thérapie sous héparine ou coumarine b) ponctions veineuses ou artérielles dans les 8 derniers jours c) accident cérébrovasculaire dans les deux derniers mois d) saignements actifs e) ulcère gastrique ou duodénal au cours de l'année écoulée f) opération chirurgicale dans les 8 derniers jours g) diathèse hémorragique 3) obstruction imcomplète d'une artère coronaire (telle qu'indiquée par angiographie coronaire) 4) rétablissement partiel ou complet de l'irrigation sanguine après administration de nitroglycérine ) coma cardiaque 6) maladies valvulaires ou cardiaques graves, cardio- myopathie hypertrophique 7) maladies rénales ou hépatiques graves, pouvant perturber l'excrétion de pro-urokinase. 8) utilisation de contraceptifs oraux. *11 Méthode On administre 5000 U.I. d'héparine à des patients répondant aux critères ci-dessus, et on effectue une angiographie coronaire. Si on observe une obstruction artérielle totale, on administre par voie intracoronaire entre 100 et 200 Mg de nitro- glycérine, et on effectue une angiographie du vaisseau obstrué. Si on n'observe pas de dégagement après administration de nitrogly- cérine, on administre au patient 200 000 U.I. d'urokinase à poids moléculaire élevé par injection rapide par voie intraveineuse, suivie de 500 000 U.I. de pro-urokinase par voie intraveineuse par injection rapide en l'espace de 3 minutes. On effectue immédiatement après une perfusion intraveineuse de 4 000 000 U.I. de pro-urokinase en l'espace de 40 minutes. On effectue une angiographie coronaire toutes les 15 minutes pour vérifier l'évolution de la lyse du caillot, et on procède de même 60 minutes après la réussite de la lyse, et également 24 heures et 3 semaines après le traitement, afin d'écarter tout danger d'une nouvelle obstruction. Résultats Sur 19 patients traités selon ce protocole, on a observé chez 14 (74%) d'entre eux un dégagement ou une désobstruction de l'artère obstruée au bout de 40 minutes de perfusion. Parmi ces patients, deux ont eu une nouvelle obstruction au bout de 24 heures. REVENDICATIONS 1. L'utilisation de l'urokinase en association avec la pro-urokinase, sous forme d'une association libre ou fixe, comme agent thrombolytique. 2. L'utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la dose d'urokinase est comprise entre 100 000 et 300 000 U.I. et la dose de pro-urokinase est inférieure à 6 500 000 U.I. 3. L'utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que la dose d'urokinase est comprise entre 150 000 et 250 000 U.I. et la dose de prourokinase est comprise entre 2 000 000 et 4 000 000 U.I. 4. L'utilisation selon l'une quelconque des revendi- cations précédentes, caractérisée en ce que l'urokinase est administrée par injection rapide avant l'injection ou la perfusion de pro-urokinase. 5. L'utilisation de l'urokinase pour la préparation d'un agent destiné à potentialiser l'effet thrombolytique de la pro- urokinase. 6. Un emballage jumelé, caractérisé en ce qu'il contient des doses unitaires séparées d'urokinase et de pro-urokinase ainsi que les instruction pour une administration concomitante. 7. Un emballage jumelé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la dose unitaire d'urokinase est comprise entre 100 000 et300 000 U.I. et la dose unitaire de pro-urokinase est inférieure à 6 500 000 U.I. 8. Un emballage jumelé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la dose unitaire d'urokinase est comprise entre 150 000 et 250 000 U.I. et la dose unitaire de pro-urokinase est comprise entre 2 000 000 et 4 000 000 U.I. 9. Un kit comprenant une dose unitaire d'urokinase pour injection, une dose unitaire de pro-urokinase pour injection et une dose unitaire de pro-urokinase pour perfusion. 10. Un kit selon la revendication 9, caractérisé en ce que la dose unitaire d'urokinase pour injection est comprise entre 000 et 250 000 U.I. , la dose unitaire de pro-urokinase pour injection est comprise entre 400 000 et 600 000 U.I. et la dose unitaire de pro-urokinase pour perfusion est comprise entre 3 000 000 et 5 000 000 U.I. 11. Un emballage jumelé ou un kit selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, caractérisés en ce qu'au moins l'une des doses unitaires d'urokinase ou de pro-urokinase contient également de 1 000 à 10 000 U.I. d'héparine. 12. Une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange synergique d'urokinase et de pro-urokinase en association avec un diluant ou véhicule pharmaceutiquement acceptable, ou un mélange synergique d'urokinase et de pro-urokinase sous forme lyophilisée pure. 13. Une composition pharmaceutique selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle ne contient pas de quantité significative d'une quelconque substance pharmaceutiquement active autre que l'urokinase et la pro-urokinase. 14. Une composition pharmaceutique selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle ne contient aucune protéine autre que l'urokinase et la pro-urokinase en quantité décelable selon les méthodes analytiques. 15. Une composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisée en ce que le rapport pondéral de l'urokinase à la pro-urokinase est compris entre 1:40 et 1:6,7. 16. Une composition pharmaceutique selon la revendication , caractérisée en ce que le rapport pondéral de l'urokinase à la pro-urokinase est compris entre 1:15 et 1:10. 17. Une dose unitaire de la composition pharmaceutique selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle contient de 000 à 300 000 U.I. d'urokinase et de 2 000 000 à 4 000 000 U.I. de pro-urokinase. 18. Une composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisée en ce que le rapport pondérai de l'urokinase à la pro-urokinase est compris entre 1:4 et 1:1,6. 19. Une dose unitaire de la composition pharmaceutique selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'elle contient de 000 à 250 000 U. I. d'urokinase et de 400 000 à 600 000 U.I. de pro-urokinase. 20. Une dose unitaire selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'elle contient en outre de 1000 à 10 000 U.I. d'héparine.