FR 2601019 A1 19880108 FR 8705285 A 19870414 La présente invention concerne un nouveau procédé de préparation d'un dérivé de la glucosylmoranoline représenté par la formule I suivante CH20H CH2OH 0 NH oH H (I) Ho OH OH Le composé I de la présente invention présente une action inhibitrice marquée contre l'augmentation de la glycémie par ingestion de sucre, et il est très utile comme produit pharmaceutique, par exemple comme agent thérapeutique pour le diabète sucré (voir demande de brevet japonais 56/081595). Le procédé suivant a été utilisé pour la préparation 20 du composé de la présente invention. On fait agir une solution aqueuse contenant de la moranoline répondant & la formule III CH2 0H 10 (cm) et de la cyclodextrine ou de l'amidon soluble sur de la cyclodextrine glycosyltransférase (EC 2.4.1.19> pour préparer un mélange d'oligoglucosylmoranolines représenté 15 par la formule (II) CH2 OH CH2 O H CH2 OH HO [II] (dans laquelle n est un entier de 1 & 5) et de ()1>. Dans la solution réactionnelle ci-dessus, du (III), n'ayant pas réagi et du (II) ayant réagi à l'excès sont généralement présents en plus du (I) désiré. Le rapport de 30 ces composés dans la solution réactionnelle peut évidemment varier en fonction des conditions réactionnelles. En tout cas, il est indispensable de purifier sélectivement le (I) désiré à partir du mélange. Conformément à l'étude de la demanderesse, le CII) 35 peut être transformé en (I) avec un rendement élevé en traitant le mélange par la glucoamylase (alpha-l,4glucaneglucohydrolase EC 3.2.1.3) (voir Demande de Brevet Japonais 57/058890>. Bien que ce procédé soit un bon procédé de préparation, du (Il) n'ayant pas réagi est toujours présent dans le mélange après le traitement par la glucoamylase, et en outre, de la 4-Oalpha-D-maltosylmoranoline et une très faible quantité de (II) sont également présentes dans certaines conditions réactionnelles. Pour obtenir le composé désiré à partir d'une telle solution réactionnelle, il était nécessaire d'utiliser un fractionnement par masses moléculaires en utilisant du Sephadex ou un produit analogue ou une chromatographie sur colonne en phase inversée en utilisant du Lichroprep CN (marque déposée; Nerck Co) ou du Microbonda pack-NHa. Pour surmonter les inconvénients cidessus, la demanderesse a effectué des études poussées, et elle a trouvé que l'utilisation de la cristallisation fractionnée en utilisant un solvant polaire était efficace pour tourner cette difficulté technique, et elle a déposé une demande de brevet (voir Demande de Brevet japonais 59/237326). Ce procédé est une application des propriétés qui sont communes aux moranolines dans lesquelles l'atome d'azote est substitué par un groupe alkyle inférieur, en plus de la 25 glucosylmoranoline de la présente invention. La demanderesse à poursuivi les études en vue d'améliorer les avantages de la cristallisation fractionnée ci-dessus, et elle a trouvé qu'en ce qui concerne les monoglucosylmoranolines N-non substituées de la présente invention, il existe un procédé qui donne des résultats bien supérieurs que ceux de l'invention ci-dessus, et elle a réalisé la présente invention. Ainsi, un des buts de la présente invention est de fournir le composé de la présente invention avec un 35 rendement plus élevé, une pureté plus élevée et sans difficulté. La première caractéristique de la présente invention est de soumettre un mélange des composés (1), (II) et (III) cidessus & une "cristallisation fractionnée" en utilisant du méthanol, qui est un solvant polaire. La demanderesse a trouvé tout d'abord que l'utilisation de méthanole sur des monoglucosylmoranolines N-non substituées donne un effet caractéristique de la présente invention. La seconde caractéristique de la présente invention est d'effectuer une opération d'agitation lorsqu'on soumet le mélange de (I), (II) et (III) à une cristallisation fractionnée. Le fait physico-chimique qu'une opération aussi simple que l'agitation conduise & un résultat marqué de la présente invention a été découvert pour la première 15 fois par la demanderesse. Le contenu de la présente invention sera illustré plus en détail ci-dessous. Comme il a déjà été indiqué, la présente invention concerne la préparation du composé (I) désiré avec un rendement très élevé et dans une opération très simple à partir d'un mélange de (I), (II) et (III) au cours de la préparation de (I). Lorsqu'on effectue la présente invention, on fait agir la cyclodextrine glycosyltransférase sur une solution aqueuse contenant du (III) et de la. cyclodextrine ou de l'amidon soluble pour préparer un mélange de (I) et de (II), puis on la traite par la glucoamylase pour transformer (II) en dépasse pas 2 % du tout. Dans la présente invention, le mélange ci-dessus est 35 par exemple chauffé dans de l'eau ou dissous dans de l'eau à la température ambiante, et on y ajoute du méthanol. Puis on agite la solution, si nécessaire, à une certaine vitesse et à une-certaine température, de telle sorte que les cristaux se séparent. Un bon résultat est obtenu en agitant pendant 24 h, et un résultat suffisant est obtenu en agitant & environ 200 tours/mn. Evidemment, la vitesse d'agitation peut être plus élevée ou plus faible que celle-ci. Les cristaux qui se séparent peuvent être recueillis, 10 par exemple par filtration. Les cristaux peuvent être recristallisés si nécessaire. Comme il sera indiqué plus loin, il est connu que ces cristaux sont un composé moléculaire de (I) avec le méthanole. L'expression" composé moléculaire" de la glucosyl15 moranoline avec le méthanol signifie ici que du méthanol se combine avec la glucosylmoranoline dans un état tel qu'ils ne soient pas séparés aisément, et qu'il s'agit d'un composé nouveau, un composé d'addition de la glucosylmoranoline avec le méthanol, dans lequel le 20 méthanol est un composé solvatant. Une autre caractéristique de la présente invention est d'utiliser une cristallisation fractionnée dans laquelle de l'éthanol est utilisé pour donner un composé moléculaire de (I) avec le méthanol tel que préparé ci-dessus. Les moyens de fractionnement utilisant la différence de solubilité d'un composé moléculaire de (I) avec le méthanol dans la séparation de (I) d'un mélange de (I), sans signification si (I) n'était pas séparé à l'état pur 30 du composé moléculaire de Pour l'élimination du méthanol du composé moléculaire de (I) avec le méthanol, il est inefficace de le chauffer sous vide pendant 24 h. La recristallisation dans l'eau donne un taux de récupération d'environ 35 % seulement, et 35 elle est moins pratique du point de vue industriel. En conséquence, il a été nécessaire de dissoudre ce composé moléculaire dans de l'eau, d'éliminer le méthanol en le traitant par une résine échangeuse d'ions fortement acide, puis en le lavant soigneusement & l'eau, puis d'éluer la résine avec de l'ammoniaque et de faire évaporer l'ammoniaque sous vide pour donner des cristaux. Un tel procédé est très fastidieux, et en conséquence, il n'est pas possible d'utiliser pleinement l'effet de la présente invention d'obtention de (I) en passant par un composé 10 moléculaire de celui-ci avec le méthanol. Lorsqu'on effectue la présente invention, le produit de réaction contenant un composé moléculaire de (I) avec le méthanol est par exemple chauffé dans de l'eau ou dissous dans de l'eau & la température ambiante, et de l'éthanol lui est ajouté. Puis la solution est agitée si nécessaire à une certaine vitesse et à une certaine température pour donner des cristaux & partir de celle-ci. Dans ce cas, on obtient de bons résultats en agitant pendant 24 h environ. En ce qui concerne la vitesse d'agitation, une vitesse de rotation d'environ 200 tours/mn donne un résultat suffisant. Les cristaux qui se séparent peuvent être recueillis, par exemple par filtration. Les cristaux peuvent être recristallisés si nécessaire. En outre, si nécessaire, on peut appliquer un chauffage sous vide ou 25 d'autres moyens. Conformément aux essais effectués.par la demanderesse, les cristaux obtenus par le procédé ci-dessus ne contiennent que 0,03 à 0,1 % d'éthanol comme solvant résiduel. Cet éthanol ne constitue pas un compose moléculaire avec moléculaire de (I) avec le méthanol. Il est connu qu'en général, les composés moléculaires contenant un solvant comme constituant ne sont pas aisément solubles dans ce solvant. Les solubilités de (III) et de (I) dns ' w-thanon' queux sont preque les mê-mes, et il été confirmé par la demanderesse qu'avec le temps, la solubilité de (I) diminue. On suppose que ceci est dû au fait que (I) produit un composé moléculaire avec le méthanol au cours du temps, de sorte que sa solubilité diminue. Il est connu qu'en général, méme lorsque les solubilités dans les solvants sont les mémes, il existe une différence entre les substances en ce qui concerne le temps pendant lequel elles peuvent exister dans un état stable à l'état sursaturé, ce temps étant connu sous le nom de temps d'amorçage de la cristallisation. En général, pour les sucres dans des solvants aqueux, ce temps est long. Comme l'a confirmé la demanderesse, le phénomène caractéristique selon lequel ce temps d'amorçage de la cristallisation est raccourci par une simple opération d'agitation s'observe avec le composé de la présente invention. Il n'est pas aisé 20 de prévoir les relations entre l'agitation et le raccourcissement du temps d'amorçage de la cristallisation. Dans la présente invention, la cristallisation fractionnée par l'éthanol est en outre appliquée, mais la raison pour laquelle l'éthanol chasse le méthanol et pour laquelle le composé de la présente invention ne forme pas un composé moléculaire avec l'éthanol tandis qu'il le fait avec le méthanol n'est pas suffisamment claire. Conformément à la présente invention, il est possible de préparer le composé de haute pureté désiré par un procédé simple. Pour la purification d'un sucre à partir d'un mélange de sucres, celui-ci a été séparé par exemple par chromatographie sur une colonne de carbone, ou par chromatographie sur colonne en utilisant une résine échangeuse de cations fortement acide du type métal alcalin 35 ou métal alcalinoterreux, mais en tout cas, il était indispensable de passer par des stades très compliqués. La présente invention a complètement résolu tous ces problèmes techniques. La présente invention est également importante en ce que, comme il a déjà été indiqué, le temps d'amorçage de la cristallisation est réduit. Il était nécessaire de laisser reposer le mélange réactionnel pendant une durée prolongée pour augmenter à la fois la pureté et le rendement, alors que, dans la présente invention, il suffit de 10 fois plusieurs heures (?), et.par conséquent, le procédé de la présente invention est industriellement avantageux. Le procédé de la présente invention est également utile dans la fabrication de médicaments en ce sens que le méthanol, qui est nuisible pour l'organisme humain et qui est présent dans le composé désiré en faible quantité, peut être éliminé sous la forme d'un composé moléculaire. Les exemples et exemples de travail ci-dessous sont donnés à titre d'illustrations supplémentaires de la présente invention. Exemple d'essai Les modifications des quantités de glucosylmoranoline (GM) et de moranoline (M) dissoutes au cours du temps, et l'effet de l'agitation sur celles-ci dans du méthanol aqueux à 33,3 % De la GM (210 mg) et 90 mg de M ont été introduits dans un ballon de 50 ml et ont été dissous dans 0,3 ml d'eau & 60'C. Du méthanol étaient les mêmes que celles indiquées dans l'Exemple de référence 1 ciaprès. Les résultats sont donnés dans le Tableau 1. Temps écoulé (heures) Substance Quantité dissoute (g/litre) 'C agitation 'C repos agitation repos 1,5 15 3,0 ,0 24,0 20 X GM GX GX O 101 0 23,0 10,2 5,5 , 1 4,2 9,9 3,1 6,8 3,2 ,0 23,0 9,8 22,1 10,1 22,0 10, 0 19, 0 10, 1 9,? ,0 23,0 10,5 6,2 11,4 4,4 10,2 3,2 10,5 3,1 , 0 23, 0 9,7? 21,1 9,9 21,3 9,8 18,2 9,7 7,9 Dans le tableau, le terme "repos" signifie que le ballon a été agité & la main 4 à 5 fois par jour pour 25 mélanger le contenu. Il ressort du tableau que, dans le cas de la moranoline, il ne s'est produit presque aucune modification de la solubilité jusqu'à 10 h tant à l'état "agité" et qu'au "repos". Dans le cas de l'agitation, on a observé une 30 tendance à une diminution de la solubilité à 5'C pendant 24 h. Au contraire, dans le cas de la glucosylmoranoline, il ne s'est produit presque aucune modification jusqu'à 3 h tant pour 5'C que pour 20'C à l'état de "repos", tandis 35 qu'à 10 h, on a observé une diminution, et, avec une - 10 tendance progressivement remarquable, la quantité s'est abaissée & la moitié de la quantité initiale au bout de 24h. En outre, la quantité s'est déjà abaissée & un quart au bout d'une heure et demi, lorsqu'on agitait, dans le cas de la glucosylmoranoline. Par conséquent, l'effet de l'agitation sur la quantité dissoute est très net. En tout cas, il est vraissemblable que l'effet de la température sur la solubilité est faible. Exemple de référence 1 1) On dissout de la moranoline (21 g) dans une faible quantité d'eau, et on ajuste la solution à pH 5,7 avec de l'acide chlorhydrique 6N. Après l'ajustement, on ajoute de l'eau pour faire 350 ml. On y dissout de l'amidon soluble (72 g) alors que la solution est encore chaude. On maintient ensuite la solution à 50'C, on y ajoute 350 ml de solution d'enzyme brute à 1000 unités/ml de cyclodextrine glycosyltransférase, et on fait réagir le mélange à 50'C pendant 2 jours. Après la réaction, on chauffe le mélange à 'C pendant 15 mn, on y ajoute 5,6 g de glucoamylase (Glucozyme AF-6, fabriqué par l'Amano Seiyaku KK), et on fait réagir le mélange à 50'C pendant 24 h. Après réaction, on le chauffe à 80'C pendant 15 mn, on le centrifuge, on fait passer le fluide surnageant à travers une colonne de Dowex 50W x 2 (Ht) (dans laquelle la quantité de résine est 25 de 500 ml), et on absorbe la substance basique avec celleci. On lave soigneusement la colonne à l'eau, on l'élue avec de l'ammoniaque 1X, on concentre l'éluat sous vide et on fait passer la solution concentrée à travers une colonne de résine échangeuse d'ions fortement basique (Diaion SA30 11A, la quantité de résine étant de 100 ml) . On lave soigneusement cette résine avec de l'eau et on réunit la solution qui a traversé et l'eau de lavage, après quoi on concentre sous vide à sec, et l'on obtient 34,8 g de poudre. On analyse cette poudre par chromatographie liquide à hautes performances, et l'on trouve qu'il s'agit d'un mélange comprenant 26,1 % de moranoline, 71,9 de glucosylmr-.aDrrline -+ 9 ' de 4-O-ó'ph--Dmallocy])-moranoline. Les conditions utilisees pour la chromatographie 5 liquide à hautes performances étaient les suivantes: Sumipax R741 (Nucleosil 5NHa2, 5 microns, 4 mm de DI x 25 cm). Eluant: acétonitrile-eau (70:30); débit: 1 ml/mn; détection RI hautes performances, et l'on trouve qu'il s'agit d'un mélange comprenant 29,2 % de moranoline, 70,0 % de glucosylmoranoline et 0,8 % de 4-O- On dissout un mélange (34,7 g) obtenu dans l'Exemple de référence 1 dans 83 ml d'eau, on y place un agitateur magnétique et on ajoute 1305 ml de méthanol, en agitant à tours/mn environ. On agite ce mélange à la température 30 ambiante pendant une nuit, et on recueille les cristaux qui s'en séparent par une filtration suivie d'un séchage sous vide à 60'C pendant 16 h, ce qui fournit 22,4 g de cristaux. Les cristaux obtenus contiennent 6,8 % (P/P) de méthanol, et l'analyse par chromatographie liquide à hautes 35 performances montre que leur titre en glucosylmoranoline est de 99,9 %. Le taux de récupération est de 83,3 %. [x]D24 +114,3' (c: 1,07 % eau). Compos.élémentaire: calculé pour C.Ha.NOs.0,65CH=.OH: calc., (%): C 43,90, H 7,45, N 4,05 5 trouvé (%): C 43,65, H 7,76, N 4,15 1H-R M N: 6 (ppm); 2,45 (1H, dd, Jla, le, 12,3Hz, Jla, 2, 10,3Hz, H1A), 2,612,71 (1H, m, H5), 3,11 (1H, dd, Jla, le 12,3Hz, Jle, 2, 4,9Hz, Hle), 3,34 (2,4H, 10 s, CH. OH), 3,35'3,88 [11H, m, 4H (-CH.jOH), 5H (-CEOH), 1H (H-4), 1H (H-5')], 5, 32 moléculaire avec le méthanol. La détermination du méthanol résiduel a été effectuée 25 par chromatographie en phase gazeuse dans les conditions suivantes. Appareil: Gas-Chro Model 103C 'C, colonne 120'C; Gaz porteur: 1,0 kg/cm=' d'azote 30 calculé en eau (10 microlitres/mn). Exypl e 2 On dissout les cristaux (10 g) obtenus dans l'Exemple 1 dans 20 ml d'eau & 60'C, on refroidit la solution en la laissant reposer jusqu'à la température ambiante, et on y 35 ajoute 90 ml d'éthanol, en agitant avec un agitateur magnétique. On agite ce mélange pendant une nuit, on recueille par filtration les cristaux qui s'en séparent, on les sèche & 60'C pendant 16 h sous vide, et l'on obtient 7,5 g de crietaix. aux de récupération = 80,5 %. On détermine le solvant résiduel qui s'y trouve par chromatographie en phase gazeuse de la même manière que dans l'Exemple 1, et l'on trouve environ 0,06 % d'éthanol. Cependant, la teneur en méthanol n'est pas supérieure à 0,005 %, et la pureté de la glucosylmoranoline est de 100%. 10 Exmp On dissout le mélange (10 g) obtenu dans l'Exemple de référence 2 dans 15 ml d'eau, et l'on ajoute 285 ml de methanol, en agitant au moyen d'un agitateur magnétique. On agite ce mélange pendant une nuit et on recueille par filtration les cristaux qui s'en séparent. On les sèche sous vide à 60'C pendant 10 h, ce qui donne 7,1 g de cristaux. Taux de récupération = 91,7 %. On analyse ces cristaux par chromatographie liquide à hautes performances, et l'on trouve qu'ils contiennent 3,1 20 % de moranoline et 96,9 % de glucosylmoranoline. On détecte également 6,1 % de méthanol résiduel. Exemple On dissout le mélange sous vide, et l'on obtient 5,3 g de cristaux. Taux de 30 récupération = 81,5 %. On détermine la teneur en solvant résiduel du produit, et l'on trouve qu'elle est de 0,05 % d'éthanol et de 0,005% au maximum de méthanol. En ce qui concerne la glucosylmoranoline, la pureté est de 100 %. RBVENDICATIOIS 1. Procédé de préparation d'un composé moléculaire du méthanol avec la Slucosylmoranoline, représentée par la formule (I) CH20H CH20H O NH H OH HO OH OH caractérisé en ce qu'on applique une cristallisation fractionnée en utilisant du méthanol & un mélange des trois 15 constituants suivants: la glucosylmoranoline représentée par la formule (I), l'oligoglucosylmoranoline représenté par la formule (II) CH20H CH20H CH20H 0 0 NH OH OH H HO 0 '0 OH OH n OH C Hi OH CH20H H NH 35.. V (III) H0 2. Procédé de préparation de la glucosylmoranoline représentée par la formule (I) CH20H CH20H O0 NH HO O OH H caractêrisé en ce qu'on soumet un composé moléculaire de la 15 glucosylmoranoline représentée par la formule (I) avec du méthanol & une cristallisation fractionnée en utilisant de 1 ' éthanol.