FR 2608052 A1 19880617 FR 8617265 A 19861210 Procédé de préparation d'un vaccin contre l'hépatite B et vaccin obtenu. La présente invention a trait à un procédé de préparation d'un vaccin contre l'hépatite B ainsi qu'au vac- cin obtenu par la mise en oeuvre-du procédé. Les difficultés de toutes natures rencontrées pour la préparation industrielle de vaccins contre l'hépatite B par purification de l'antigène HBsAg à partir du sang humain ont conduit tout naturellement à rechercher l'expression de protéines antigéniques à partir de gènes codants du virus de l'hépatite B par des micro-organismes transfectés. M. Michel et al. ont exprimé des antigènes de l'enveloppe du virus de l'hépatite B à partir de cellules ovariennes de hdmster chinois (CHO) (voir référence 1), transfectées par un plasmide portant le gène complet HBsAg. Ces cellules excrètent de façon continue, dans le milieu de culture cellulaire, des particules HBsAg contenant à la fois les protéines pré-S2 et S. Cependant, lors de cette expression, les par- ticules HBsAg se retrouvent dans le milieu de culture cellu- laire contenant des substances indésirables telles que protéines du sérum de veau utilisé pour la croissance cellu- laire, protéines et ADN cellulaires, et des particules rétrovirales. Ces particules rétrovirales sont issues de la cellule d'origine avant transfection. La présente invention se propose de remédier à ces inconvénients et de fournir un procédé de préparation d'un vaccin contre l'hépatite virale B par expression du gène HBsAg introduit dans des cellules CHO, qui permette de produire, de façon industrielle, un vaccin contre l'hépatite B. Un autre objectif de l'invention est de four- nir un tel procédé de préparation qui permette de réaliser un tel vaccin présentant un degré de pureté extrêmement élevé, notamment en ce qui concerne l'ADN ou des fragments d'ADN'viral ainsi qu'en ce qui concerne le rétrovirus con- taminant les cellules CHO. Un autre objectif de l'invention est de réaliser un tel vaccin qui présente un pouvoir protecteur particulièrement élevé. L'invention a pour objet un procédé de préparation d'un nouveau vaccin recombinant contre l'hépatite B, dans lequel on produit des particules antigéniques de surface de l'hépatite B par expression à partir d'une culture de cellules CHO transfectées par un plasmide portant le gène HBsAg de façon à libérer les parti- cules de surface antigéniques dans le milieu- de culture, caractérisé en ce que - l'on récupère le milieu surnageant de culture d'au moins une culture, de préférence effectuée avec une faible teneur en sérum animal, - on effectue une filtration stérilisante du sur- nageant, on pcó,cède a une concentration, de préférence d environ cinquante fois, de préférence par ultrafiltration, on effectue une précipitation du concentrat à l'aide d'un agent précipitant non dégradant dans des conditions précipitant les classes lourdes d'ADN, ladite précipitation entraînant également les particules rétrovirales, et des protéines, - on effectue une nouvelle concentration de la prétparation antigénique, de préférence à l'aide d'un agent précipitant non dégradant dans des conditions précipitant les particules antigéniques de surface HBsAg, puis reprenant 1e précipitant dans un faible volume, - on effectue une centrifugation zonale de vélocité dans un gradient de densité non chaotropique pour les rétrovirus de sorte que leur intégrité soit conservée pour permettre leur séparation des particules HBsAg, suivant leurs taille et densité, de préférence en obtenant aussi une discrimination entre les particules antigéniques HBsAg d'une part, une séparation entre HBsAg, ADN et protéines, d'autre part. - on effectue une centrifugation zonale isopycnique de flottation éliminant les acides nucléiques légers et lourds, et les protéines, -- on effectue une chromatsgraphie sur échangeur !'anions pour adsorber les traces d'acides nucléiques et de protéines non HBsAg restantes. Par agents précipitants non dégradants, on entend des agents qui, bien sûr, ne dégradent pas les antigènes HBsAg, et notamment ceux de type S et pré S, mais aussi qui n'ont pas d'effet chaotropique ou dissociant pour les particules rétrovirales. L'agent préféré est le polyéthylène glycol (PEG). Parmi d'autres agents, on peut citer notamment le sulfate d'ammonium. Les étapes de purification ne dénaturent donc pas les particules HBsAg, et notamment ne dénaturent pas les protéines pré S qui sont les plus exposées. Parmi les agents précipitants convenables, on préfère le polyéthylène glycol (PEG) en choisissant notamment un poids moléculaire de. l'ordre de 4.000 à 20.000, ce qui permet dans des conditions convenables, telles que notamment une concentration en PEG de l'ordre de 5%, de précipiter les particules rétrovirales en permettant également de précipiter notablement les classes lourdes d'ADN tout en conservant dans le surnageant du précipité les particules HBsAg. Celles-c:i peuvent être récupérées dans un volume très faible, de préférence après 1(F avoir précipitées par addition de PEG à concentration plus forte. Le gradient de densité dans lequel on effec- tue la centrifugation zonale de vélocité est également prévu pour ne pas altérer l'antigène HBsAg, antigénicités S et pré S incluses. De plus, ce gradient est prévu pour ne pas avoir d'effet chaotropique sur les particules rétrovirales de sorte que leur intégrité soit conservée. De préférence, ce gradient, de faible force ionique, est un gradient de sac-- charose. En variante, on peut également utiliser d'autres gradients de densité,-notamment le glycérol. La centrifugation zonale de vélocité qui est ainsi effectuée dans un tel gradient de densité permet ainsi d'é1iminer, de façon extrêmement efficace, les particules r:trov Lles. En même te.mps, on peut obtenir une certaine purification en ADN, notamment en chaînes lourdes, et en prcté.n es. La centrifugation zonale isopycnique de flot tation sur un gradient salin de densité, tel que KBr, est ainsi effectuée sur une préparation pratiquement totalement dépourvue de particules rétrovirales. Cependant, si des particules rétrovirales comtaminaient l'échantillon à purifier, l'effet chaotropique du sel constituant le gra- dient de densité, détruirait la structure virale et - libérerait le génome viral à ARN dans la zone dense du gra- dient o i] stationnerait, permettant ainsi sa séparation de l'antigène HBsAg. Cette étape permet une élimination de -la presque totalité des protéines ainsi que des traces d'ADN légur ou lcurj Jubsistantes. Enfin l'étape de chromatographie d' échange d'anions permet d'adsorber les éventuelles traces d'acides nu1-léiques, aussi bien ADN qu'ARN encore restantes, et de D 'aut res avantages et caractèristiques de 1' ivent iLoI apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif. 1. PREPARATION DE LA CULTURE CELLULAIRE. Un clone de lignée cellulaire CHO transfectée par un plasmide recombinant (demande de brevet FR-A-84.03564 publiée sous le n' 2.560.890) comprenant le gène du virus de l'hépatite B codant pour l'antigène HBs (régions pré-S et S), est démultiplié à partir d'une ampoule de banque cellu- laire, en unités de fermentation de volumes croissants. La dernière démultiplication est réalisée en fermenteur de 300 litres, lez cellules se propageant sur des microbilles en suspension dans le milieu de culture. Pour ces étapes de 2. ié.ml.tiplication, le milieu de croissance contient 4 à 10 % de SV 's,rum de veau), préférablement 5 . *2. UL'TURES, RECOLTES ET CONCENTRATION. La première récolte est effectuée au bouit de 3 à 4 jours de culture dans le fermenteur de 300 litres.: après décantation des billes supportant les cellules, 250 litres de milieu surnageant sont soutirés et remplacés par un vclume équivalent de milieu neuf contenant 0,2 à 4 % de SV, préférablement 1 à 2 *. Ia culture cellulaire est pour- suivie dans le fermenteur pendant 3 à 4 jours au *30 bout desquels une nouvelle récolte de 250 litres est effectuée. On peut opérer ainsi jusqu'à 10 récoltes succes- sives, qui sont conservées à +4'C en vue d'être purifiées. En règle générale, la première récolte et la récolte n' 7 et les suivantes ont un faible titre en antigène HBs, de sorte qu'elles ne sont pas retenues pour les étapes de purifica- tion. Dans l'exemple présent, les récoltes n' 2 à 5 ont été conservées pour être purifiées et contenaient 1 % de SV. Après mélange des récoltes, la préparation d'un volume de 1250 litres est filtrée sur membrane 0,2 pm, puis concentrée par ultrafiltration d'environ 50 fois, sur membrane de point de coupure 100.000 daltons, ce qui donne la récolte concentrée R. 3. PRECIPITATIONS FRACTIONNEES. La récolte concentrée R est soumise à un fractionnement par précipitations sélectives, dans un prem- ier temps des composants de poids moléculaires élevés, particulièrement classes lourdes d'ADN et particules rétrovirales, l'antigène HBs restant en suspension, et dans un deuxième temps de l'antigène HBs. L'agent précipitant est choisi de manière telle que les particules rétrovirales con- servent leur taille et leur densité d'origine d'une part, et que d'autre part l'antigénicité des particules HBs ne soit pas altérée. L'agent précipitant préféré est le polyéthylène glycol, préférablement de PM 6.000. On utilise une concentration de 5 % en PEG 6.000 pour la première précipitation et le précipité obtenu est éliminé par centrifugation. Le surnageant S est addi- tionné de PEG 6.000 pour une concentration finale de 9,5 %; après centrifugation, le précipité est dissous totalement dans un volume égal environ au 625ème du volume de récoltes traité, soit 2 litres, environ, de préparation antigénique EC. A ce stade, les performances d'élimination de l'ADN cellulaire et des protéines non-HBsAg sont indiquées dans le tableau suivant: Volume ADN Protéines non-HBsAg en 1 ig/ml ug totaux % pg/ml pg totaux % Mfélan- ge 1250 520 x 10-3 650000 100 740 925 x 106 100 écolt. 25,15 41 x 10-3 1031 0,16 14860 374 x 106 40,4 R urnag. 27,84 1,3 x 10-3 36,2.5 0,0056 8666 241 x 106 26,0 S _ l. 2,03 7,67 x 10-3 15,6 0,0024 11850 24,06 x 106 2,6 Tandis que le taux de récupération de l'antigène HBs était de 80 %, des facteurs d'élimination de 42.000 pour l'ADN et de 38,5 pour les protéines ont été constatés. L'activité reverse transcriptase reflétant le titre en rctroviruz, est non détectable dans les récoltes et parfois lgèrement positive dans la récolte concentrée de 50 fois et, dans Lous les cas, elle est négative dans le sur- nageant après traitement au PEG 5%C Le pouvoir d'élimination d'un rétrovirus par cette étape de traitement au PEG 5 % a été mesuré en supplémentant une récolte concentrée avec du MuLV (Murine Leukemia Virus) : un facteur d'élimination de 7 a été obtenu. 4. CENTRIFUGATION ZONAILE DE VELOCITE. Un gradient de saccharose (O - 40 %) est formé dans un rotor K2Electronucleonics (référence 2); lorsque la vitesse de rotation atteint 35.000 t/mn, le rotor est alimenté à un débit continu de 2 l/h d'abord avec 500 mi d'échantillon EC à purifier (concentrat), puis pendant les mn suivantes avec un tampon phosphate 65 mM pH 6,8. Après arrêt du rotor, le contenu du rotor est fractionné et les fractions titrées pour leur contenu en antigène HBs. Les fractions riches en HBsAg sont retrouvées dans les couches les moins denses du gradient, contenant moins de 25 % de saccharose; elles sont mélangées avec celles issues du traitement, dans des conditions identiques, des autres frac- tions de 500 ml de concentrat. Le mélange de ces fractions est dialysé pour éliminer le saccharose et ensuite concentré par ultrafiltra- tion jusqu'à un volume de 0,36 1. On obtient une préparation Z10. Le rendement en HBsAg est de 80 %. Les performances d'élimination de l'ADN et des protéines non HBsAg ont été: j Volume | ADN i Protéines non- HBsAg en 1 |g/ml pg totaux % [ g/ml pg totaux % I l I I IEC 2,03 7,67x10-3 15,6 0,0024 I 11850 24,06x106 2,6 I! Z10 0,36 16,2x10-3 5,825 0,00093 17330 6, 24x106 0,67 I-k I Bien que donnant des résultats appréciables d'élimination de l'ADN et des protéines non--HBsAg, cette centrifugation de vélocité est surtout intéressante pour son pouvoir de discrimination entre l'antigène et les particules rétrovirales. En effet, lorsque: le concentrat est délibérément contaminé par un rétrovirus murin (Murine Leukemia Virus), puis soumis à cette centrifugation dans les conditions précitées, on retrouve les particules rétrovirales titrées en reverse transcriptase dans les couches denses du gradient avec un pic d'activité enzyma- tique vers 33-35 % de saccharose. Les particules rétrovirales ont rejoint leur zone isodense du gradient, en parcourant la plus grande par- tie du gradient, tandis que dans le même temps les parti- cules HBsAg, de constante de sédimentation plus faible (40 S) n'ont pu parcourir qu'un faible chemin dans le gradient. Leur séparation est assurée par un temps court de centrifu- gation. L'activité reverse transcriptase mesurée dans le mélange des fractions riches en HBsAg représente 0,013 % de celle retrouvée dans le pic rétroviral, soit un facteur d'élimination de 77. 5. CENTRIFUGATION ISOPYCNIQUE DE FLOTTATION. Le rotor est un rotor zonal de type Ti15- Beckman vendu par la société Beckman, Palo Alto, Californie, USA, de capacité totale 1700 ml environ (référence 3). Un gradient de densité est constitué en introduisant par la périphérie du rotor des volumes successifs de solution de bromure de potassium (KBr) de manière à constituer un gra- dient de densités comprises entre ",17 et 1,35. L'une des couches introduites est constituée de l'échantillon addi- tionné de KBr pour que la densité de la couche soit égale à 1,25, de sorte qu'en début de centrifugation, toutes les impuretés et l'antigène se retrouvent dans la partie dense du gradient. Après centrifugation à 31.000 t/mn pen- dant 20 h, et après fractionnement du contenu du rotor, les particules HBsAg sont retrouvées dans leur zone isodense (d 1,22 - 1,23) tandis que la presque totalité des autres protéines et de l'ADN est retrouvée dans les couches denses du gradient. Le mélange des fractions riches en HBsAg est dialysé contre du tampon phosphate 65 mM pH 6,8 pour éliminer le KBr et équilibrer l'échantillon dans le tampon qui sera utilisé pour la chromatographie. On obtient la- préparation Z20. Tandis que le rendement en HBsAg dans cette centrifugation est proche de 100 %, des facteurs très impor- tants d'élimination d'ADN et protéines non-HBsAg sont obtenus: Volume ADN Protéines non-HBsAg à-- - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - -----I en 1 ug/ml Fg totaux % fg/ml pg totaux % I r--------------------------------- ----- Z10 0,360 0,0162 5,825 9,3x10-4 17330 6,24x106 0,67 Z20 0,458 36x10-6 0, 0166 2,7x10-6 234 107x103 0,011 Ils sont respectivement de 350 pour l'ADN et de 58 pour les protéines non-HBsAg. Un facteur d'élimination de rétrovirus n'a pu être calculé dans cette étape, car l'activité reverse tran- scriptase est totalement détruite en milieu KBr. Cette inac- tivation est due vraisemblablement à l'effet chaotropique du sel sur le virus. Il est intéressant de noter que cet effet chaotropique devrait libérer le génome viral (ARN) dans le milieu qui se retrouverait après centrifugation dans les couches denses du gradient comme l'ADN cellulaire, et ainsi séparé du pic d'antigène. 6. CHROMATOGRAPHIE D'ECHANGE D'ANIONS.. La préparation antigénique Z20 dialysée après la centrifugation isopycnique est passée sur échangeur d'anions, préférablement sur.DE 52cellulose Whatman il préalablement équilibrée en tampon phosphate 65 mM pH 6,8. Dans ces conditions, l'antigène HBs n'est pas adsorbé sur l'échangeur, tandis que les traces d'ADN résiduelles et les protéines contaminantes se fixent sur l'échangeur: Volume ADN Protéines non-HBsAg en 1 ààà___________ -à------------- pg/ml pg totaux % jug/ml Fg totaux % Z20 0,458 36x10-6 0,0166 2,7x10-6 234 107x103 0,011 apr es xl 6 cnromato 0,600 12,5x106 n'est plus décelable par la technique dot-blot après hybri- dation avec une sonde marquée au P32 (limite de sensibilité = 12,5 pg/ml). Pour mesurer le facteur d'élimination de l'ADN, une préparation Z20 a été additionnée d'une quantité connue d'ADN et chromatographiée sur l'échangeur d'anions. Le taux d'ADN retrouvé dans l'effluent de la colonne était 1.000 à 10.000 fois inférieur au titre initial. La préparation antigénique ainsi obtenue après purification présente les caractéristiques suivantes: - Protéine HBsAg.............1 Fg Protéine non HBsAg......... 50 ng ADN..... .................. 10-5 pg Après électrophorèse sur gel de polycrylamide en milieu dissociant, les polypeptides colorés par le nitrate d'argent se distribuent en 3 bandes majeures: 5. P22 de poids moléculaire apparent 22.000 daltons P26 de poids moléculaire apparent 26. 000 daltons P34 de poids moléculaire apparent 34.000 daltons qui sont reconnus tous les trois par immunoempreinte avec un anticorps monoclonal anti-S et dont seul le polypeptide P34 est reconnu par immunoempreinte avec un..DTD: anticorps monoclonal anti-pré S2. 7. PREPARATION DE VACCINS ET IMMUNOGENICITE. La préparation chromatographiée est filtrée sur membrane stérilisante, puis elle est chauffée à +60C pendant 60 mn et, après refroidissement, elle est additionnée de formaldéhyde (100 ug/ml) et incubée pendant 48 h à +30'C. Cette préparation antigénique est diluée en tampon physiologique et additionnée d'un adjuvant tel que l'hydroxyde d'aluminium pour obtenir des vaccins. Des doses différentes d'antigènes HBs ont été injectées par voie souscutanée à des cobayes, et les réponses anticorps (anti-S et anti-pré S2) ont été mesurées et comparées à celles obtenues chez des animaux injectés avec des doses égales d'antigène dérivé du plasma humain (vaccin Hévac B - Pasteur Vaccins - MARNES-LA-COQUETTE - FRANCE). ANIMAUX REPONDEURS / ANIMAUX INJECTES Anti-S réponse Anti-pré S2 réponse HEVAC B CHO HEVAC B CHO fg 5/10 8/10 7/10 10/10 ig 4/9 4/10 2/10 10/10 2,5 pg 1/10 0/10 2/10 5/10 Puissance 1,0 1,2 1,0 3,0 Les anticorps anti-S, généralement appelés antiHBsAg, étaient mesurés par la technique Ausab-Abbott (Abbott Laboratories, USA) et les anticorps anti-pré S2 étaient mesurés par méthode immunoenzymatique en utilisant un peptide synthétique de 31 aminoacides sur la phase solide, comprenant l'épitope pré S2, pour capter les anticorps qui étaient reconnus dans un deuxième temps par un anticorps anti-IgG conjugué à la peroxydase; après addition du substrat (H202) et d'un chromogène (orthophénylène diamine), la coloration développée était mesurée à 492 nm, dont l'intensité est proportionnelle à la quantité d'anticorps captés. Comme l'indiquent les résultats du tableau, une réponse équivalente en anti-S est obtenue avec les deux types de vaccin hépatite B, tandis qu'une plus forte réponse anti-pré S2 est observée avec le vaccin recombiné (CHO). Références. 1. M. Michel, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,7708-7712. 2. Progress In Separation and Purification, édité par Perry and Van Oss, Copyright 1971 by John Wiley & Sons Inc, USA. 3. A. Fritsch, Les Centrifugations Préparatives en Gradient de densité, 2ème édition. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un nouveau vaccin recombiné contre l'hépatite B, dans lequel on produit des particules antigéniques de surface de l'hépatite B par expression à partir d'une culture de cellules CHO tranfectées par un plasmide portant le gène HBsAg de façon à libérer les particules de surface antigéniques dans le milieu de culture, caractérisé en ce que - on récupère le milieu surnageant de culture d'au moins une culture, notamment en un milieu à faible teneur en sérum animal, - on effectue une filtration stérilisante du sur- nageant, - on procède à une concentration du surnageant, - on effectue une précipitation du concentrat à l'aide d'un agent précipitant non dégradant dans des conditions précipitant les classe lourdes d'ADN, les particules rétrovirales, ainsi que des protéines, - on effectue une nouvelle concentration, - on effectue une centrifugation zonale de vélocité dans un gradient non chaotropique pour les particules rétrovirales et choisi pour permettre leur séparation d'avec les particules HBsAg d'après leurs-taille et densité, - on effectue une centrifugation zonale isopycnique de flottation éliminant les acides nucléiques légers et lourds et des protéines, et, - on effectue une chromatographie en milieu échangeur d'anions pour adsorber les traces d'acides nucléiques res- tantes et les protéines non-HBsAg restantes. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue la précipitation au polyéthylène glycol, notamment PEG 6000. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on effectue une première précipitation à une concentration de PEG de l'ordre de 5 %. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on effectue la- nouvelle concentration à l'aide d'un agent non dégradant précipitant les particules antigéniques HBsAg, après quoi on reprend le précipité dans un faible volume. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'on effectue cette précipitation au PEG, notamment PEG 6000 à 9,5 %. 6-. Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on effectue la cen- trifugation zonale de vélocité en gradient saccharose. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on effectue la centrifugation dans un rotor K2-Electronucleonics. 8. Procédé selon l'une des revendications 6 et 7, caractérisé en ce que l'on sélectionne les fractions ayant un taux de saccharose inférieur à 25 %, les autres fractions étant rejetées. 9. Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 8, caractérisé en ce que l'on effectue la con- centration zonale de flottation en gradient KBr. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'on recueille les fractions du pic de densité 1,22-1,23. 11. Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 10, caractérisé en ce que l'on effectue la chromatographie sur DE 52 cellulose. 12. Vaccin obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, ledit vaccin étant remarquable par une immunogénicité S et surtout pré-S élevée.