FR 2601386 A1 19880115 FR 8610177 A 19860711 l 1 0 La présente invention concerne la bioconversion sélective des fonctions ester nitrique en fonctions hydroxy dU dinitrate d'isosorbitol (DINIS) On distingue deux mononitrates d'isosorbitol qui sont dénommés MONIS. Lorsque la fonction hydroxy est en position exo, le composé est dénommé MONIS-5, et, lorsque cette fonction est en position endo, MONIS-2. Les MONIS sont connus comme vasodilatateurs coronaires à l'instar du dinitrate d'isosorbitol (DINIS) et de la nitroglycérine. Les MONIS sont actuellement préparés par des procédés qui présentent des inconvénients. La synthèse par nitration de l'isosorbitol nécessite l'utilisation d'un mélange de nitration HNO3 anhydride acétique - acide acétique pouvant conduire à la formation de nitrate d'acétyle considéré comme un explosif plus sensible que la nitroglycérine. Un autre procédé consiste à préparer les acétates d'isosorbitol puis à les nitrer; là encore, les risques d'explosion sont importants et le procédé long et de rendement faible. De nouveaux procédés ont permis de limiter les risques dans la préparation de ce type de composés mais sans pour autant être parfaitement satisfaisants sur le plan de la sécurité et/ou du rendement, comme cela ressort du brevet français 2 500 835. C'est pourquoi des techniques douces de préparation de ces composés mettant en oeuvre des bioconversions présentent un grand intérêt. Le procédé selon la présente invention est plus particulièrement destiné à la bioconversion sélective de DINIS 15 en MONIS-5, et est caractérisé en ce que le DINIS est ajouté à un milieu contenant au moins un microorganisme possédant une gluthation transférase ou un extrait acellulaire d'un tel microorganisme, de préférence d'ailleurs le milieu en cause sera un:milieu de culture du microorganisme. Parmi les microorganismes utilisables dans le cadre de la présente invention, il faut citer plus particulièrement les protozoaires, les fongis et les bactéries. Parmi les protozoaires, il faut citer plus particulièrement Tetrahymena, et, parmi les fongis, il faut citer plus particulièrement Beauveria, 25 Aspergillus, Streptomyces et Cunninghamella. La fermentation de ces microorganismes dans un milieu contenant du DINIS conduit à la formation de MONIS, avec une prépondérance du MONIS-5 par rapport au MONIS-2. Bien que la bioconversion du DINIS puisse être effectuée dans un milieu ne contenant que les cellules des microorganismes, il est préférable d'effectuer cette bioconversion dans un milieu de culture. Ce milieu de culture sera, de préférence, un milieu minimum contenant, de préférence, 5 à 20 g/1 de glucose, des extraits de levure, et la bioconversion sera effectuée à une température de l'ordre de 20 à 30 C à un pH voisin de la neutralité. Les expériences mises en oeuvre ont permis de montrer que l'addition d'acides aminés dans le milieu de culture augmentait 10 nettement le rendement en MONIS-5. Dans les conditions précédentes, une concentration en DINIS comprise entre 1 et 5 g/1 est utilisable. Il est, en outre, préférable d'utiliser, lorsque cela est possible pour les fongis, un mycelium déjà âgé qui donne des 15 rendements de bioconversion supérieurs. Bien entendu, lorsque l'on utilise un milieu de croissance, il est nécessaire de prévoir une aération du milieu. Comme cela a été indiqué précédemment, il est également possible de prévoir d'utiliser le mycelium dans un milieu qui ne 20 soit pas un milieu de croissance, on peut même utiliser, dans certains cas, des extraits partiellement débarrassés de structure cellulaire, ceci facilite les opérations-ultérieures de séparation. Dans certains cas, les microorganismes pourront être utilisés sous forme immobilisée, par exemple par adsorption sur un support ou par encapsulation dans un polymère, agar par exemple. Les conditions de mise en oeuvre de cette bioconversion permettent d'écarter tout risque lié à la manipulation de ce type de produit et permettent d'obtenir des rendements en MONIS-5 très importants, comme cela ressortira des exemples ci-après. 30 Le DINIS utilisé dans le cadre de la présente invention à titre de produit de départ est un produit explosible, mais il est possible de le manipuler en toute 4 2601386 sécurité dans la mesure o ce produit est humide ou imprégné de solvant ou en solution. Les exemples ci-après sont destinés à mettre en évidence d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention. EXEMPLE 1 Bioconversion du DINIS par des cultures de Cunninghemella echinulata (C. ech.) NRRL 3655 et Cunninghamella elegans (C. el.) ATCC 3245 Les précultures sont effectuées en tube d'agar incliné, à 24 sur gélose de pomme de terre (I.P.P.). Les cultures (50 ml) sont réalisées en milieu liquide "farine de soja" dans des erlenmeyers de 250 ml, agités (180 tours/min.) à 24 C. Les ensemencements sont effectués par addition de 15 0,5 à 1 ml d'une suspension de spores à la densité moyenne de 3.105 spores/ml. Après 44 heures de croissance, et selon les essais, le DINIS est ajouté soit à la culture, soit à la suspension de mycelium dans du tampon phosphate 0,05 M pH 7, et incubé à 24 C pendant les périodes de temps choisies. Différentes conditions de biotransformation ont été étudiées: a) Incubation en milieu de culture, le DINIS est ajouté à 1 g/l en solution dans le méthanol (50 mg/ml). b) Incubation en tampon phosphate 0,05 M pH 7, le DINIS est 25 ajouté à 1 g/l en solution dans le méthanol (50 mg/ml). c) Incubation en tampon phosphate 0,05 M pH 7, le DINIS est ajouté en poudre à 1 g/l. Les quantités de MONIS-5 et MONIS-2 formées au cours du temps, par bioconversion, ont été estimées par 30 analyse par HPLC sur colonne de gBondapack C-18. Les résultats obtenus sont rassemblés pour C. ech. au tableau 1 et pour C. el. au tableau 2. 2601386 TABLEAU 1 Biotransformation du DINIS par Cunninghamella echinulata NRRL 3655 (ATCC 36190) a) Incubation en milieu de culture; DINIS 1 g/l dans le méthanol (50 mg/ml); âge des cultures 44 heures; quantité de mycelium: 73 g/l; Heures DINIS (mg/l) MONIS-2 (mg/l) MONIS-5 (mg/l) 4 8 21 595 570 535 8 26 56 27 64 134 28 33 46 473 445 351 66 73 83 175 186 232 339 100 239 73 262 104 268 182 103 197 b) Incubation en tampon phosphate 0,05 M, pH 7; DINIS 1 g/l dans le méthanol (50 mg/l); âge des cultures 44 heures; quantité de mycelium: 80 g/l; Heures DINIS (mg/l) MONIS-2 (mg/l) MONIS-5 (mg/l) 4 8 21 33 46 73 120 507 655 442 443 394 328 272 10 24 27 62 76 83 103 26 51 108 148 198 209 227 c) Incubation en tampon phosphate 0,05 M, pH 7; DINIS 1 g/l en poudre; âge des cultures 44 heures; quantité de mycelium 101 g/l; Heures DINIS (mg/1) MONIS-2 (mg/l) MONIS-5 (mg/1) 8 21 605 533 42 64 33 510 48 101 46 73 480 56 136 406 82 145 Concentration initiale de DINIS: Les concentrations évaluées en DINIS, MONIS-2 et MONIS-5 n'ont pas été corrigées. (Une évaporation de l'ordre de 10 à 15 % doit être prise en compte). 6 2601386 TABLEAU 2 Biotransformation du DINIS par Cunninghamella elegans (ATCC 9245) a) Incubation en milieu de culture; DINIS méthanol (50 mg/ml); âge des cultures: quantité de mycelium: 73 g/l; 1 g/1 dans le 44 heures; Heures DINIS MONIS-2 MONIS-5 (mg/1) (mg/1) (mg/l) 678 18 26 21 545 112 99 33 441 165 121 46 242 185 160 265 314 214 73 123 305 230 14,5 170 188 b) Incubation en tampon dans le méthanol (50 quantité de mycelium phosphate 0,05 M, pH 7; DINIS 1 g/l mg/ml); âge des cultures: 44 heures;: 80 g/l; Heures DINIS (mg/1) MONIS-2 (mg/1) MONIS-5 (mg/1) 631 13 23 625 19 32 21 517 63 71 33 463 98 102 46 344 115 115 73 325 149 126 Concentration initiale de DINIS: Les concentrations évaluées en DINIS, MONIS-2 et MONIS-5 n'ont pas été corrigées. (Une évaporation de l'ordre de 10 à 15 % doit être prise en compte). 1. Les deux souches C. ech. et C. el. convertissent le DINIS en MONIS-5 et MONIS-2. 2. Le meilleur taux de conversion est observé lorsque la souche C. ech. est incubée en milieu de culture 5 pendant 73 heures. Un temps d'incubation prolongé conduit à la chute du rendement global (DINIS + MONIS-5 + MONIS-2) vraisemblablement par conversion ultérieure des dérivés mononitrés en isosorbide. Dans ces conditions, on obtient avec un rendement 10 global de 58 % le mélange DINIS, MONIS-5, MONIS-2. Les dérivés mononitrés sont formés avec des rendements respectifs de 33 % en MONIS-5 et 13 % environ en MONIS-2 (rendement calculé sur la quantité de DINIS consommée), soit un rapport: MONIS-5 = 2,6 MONIS-2 Et Afin d'améliorer les rendements de conversion,des essais ont été effectués sur une quantité de DINIS réduite à 500 mg/1; les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau 3 ci-après: TABLEAU 3 Biotransformation du D echinulata NRRL 3655 INIS par Cunninghamella (ATCC 36190) Heures DINIS (mg/1) MONIS-5 (mg/l) 48 69 93 116 140 Essai 268 270 169 107 68 60 169 116 86 75 * 1 143 190 216 218 244 2 150 197 219 225 238 MONIS-2 (mg/1) 67 95 71 93 89 98 106 96 (50 mg/ml); incubation en DINIS 500 mg/1 dans le méthanol milieu de culture; âge des cultures: 44 heures; quantité moyenne de mycelium: 78 g/1; * Les concentrations évaluées en DINIS, MONIS-5 et MONIS-2 n'ont pas été corrigées. (L'évaporation de l'ordre de 10 à 15 % doit être prise en compte). 9 2601386 Dans ces conditions, il est possible d'obtenir, pour des périodes d'incubation variant de 63 à 93 heures, le mélange (DINIS + MONIS-5 + MONIS-2) avec un rendement global de 80-90 %. Les dérivés mononitrés MONIS-5 et MONIS-2 sont formes avec des rendements respectifs de 50 et 22 % (calculés sur la quantité de DINIS consommée). Contrairement à la souche C. ech. qui conduit à la formation préférentielle de MONIS-5, la souche C. el. effectue la conversion du DINIS préférentiellement en isomère 2. 10 Ces résultats indiquent que dans une même famille de Phycomycetes, les différentes souches sont susceptibles de contenir, en proportions variables, des enzymes qui spécifiquement doivent permettre la conversion du DINIS en chacun des isomères MONIS-5 et MONIS-2. 15 EXEMPLE 2 Essais de mutagénèse de Cunninghamella echinulata Mise au _point d'une mutagénèse _à_ l'aziridine.1-hxièneimine) Après différentes tentatives, il est apparu que 20 le traitement de spores de C. ech. pendant 4 minutes avec une solution léthale à 5 % d'aziridine induisait la formation de mutants détectables après 72 heures d'incubation sur gélose. Conditions de mutagqénèse Les spores de C. ech. prélevées sur 2 tubes 25 inclinés de pré-cultures ont été lavées avec 8 ml d'eau (4 ml/tube) et remises en suspension dans 4,75 ml d'eau auxquels sont additionnés 0,25 ml d'aziridine (solution finale 5 %). Après 4 minutes des échantillons (0,5 ml) ont été 30 prélevés, dilués (102, 103, 104 fois) puis ensemencés sur des bottes de Petri de gélose de pomme de terre à raison de 0,2 ml/boîte. Beauveria bassiana ATCC 7159 Aspergillus ochraceus ATCC 18500 Aspergillus foetidus ATCC 10254 Aspergillus allicaeus ATCC 10060 Aspergillus niger ATCC 9142 Stroptomyces Tu 96 Streptomyces incarnatus.Les expériences préliminaires qui sont rapprotées ont été faites dans les conditions utilisées pour C. ech. 10 (exemple 1). Les pré-cultures ont été effectuées sur gélose inclinée de pomme de terre. Les cultures ont été réalisées en milieu liquide "farine de soja" pendant 48 heures. Le DINIS a été ajouté (500 mg/l) au milieu de culture et incubé pendant 15 44 et 68 heures. Les taux de bioconversion ont été effectués par dosages par HPLC. Les résultats obtenus (tableau 4) indiquent que: 1. Toutes les souches étudiées effectuent la conversion du DINIS en MONIS5 et MONIS-2 en proportions 20 variables et à des vitesses variables. 2. La souche Beauveria bassiana ATCC 7159 est remarquable; elle conduit après 68 heures d'incubation à une conversion complète et quantitative du DINIS en MONIS-5 et MONIS-2 avec des rendements respectifs de 85 et 15 %. 11 - 2601386 TABLEAU 4 Biotransformation du DINIS par différentes souches de champignons Souche Durée de l'incubation (heure) Quantité de substance MONIS-2 MONIS-5 DINIS Beauveria bassiana ATCC 7159 44 68 46 66 252 361 Aspergillus foetidus ATCC 10254 Aspergillus alliaiens ATCC 10060 Aspergillus niger ATCC 9142 44 68 18 23 31 38 430 425 44 68 61 71 97 286 212 44 68 0 10 43 58 383 377 Aspergillus ATCC 18500 ochraceus 44 68 o 27 38 396 373 Streptomyces Tu 96 Streptomyces iscariatus 44 68 44 68 o 28 53 21 47 497 413 100 400 360 Le DINIS (500 mg/ml) a été additionné à la culture après 48 heures de pousse. L'évaluation du rendement tient compte de la perte du groupement NO2 lors de la conversion DINIS (PM 236) en MONIS (PM 191). 1i EXEMPLE 4 1) Conditions de culture de la souche Beauveria bassiana (ATCC 7159) 1.1) Pré-cultures Les pré-cultures sont effectuées à 24 C pendant 6 jours en tube d'agar sur 2 milieux au choix: - gélose de pomme de terre (I.P.P.) ; - milieu M2 constitué de"Bacto Yeast extract" 4 g, "Bacto Malt extract" 10 g, "Bacto Dextrose" 4 g, agar 20 g pour 1 litre d'eau, pH 7, selon E.B. Shirling et D. Gottlieb (Intern. J. Syst. Bact. 16, 313-340, 1966). Une sporulation plus abondante est observée sur milieu M2. 1.2) Cultures Les cultures de B. bassiana (B. b.) sont réalisées en milieu liquide "farine de soja" selon R.E. Betts, D.E. Walters, J.P. Rossaza (J. Med. Chem. 17, 597-602, 1974), constitué de farine de soja 5 g, glucose 20 g, "Yeast extract" 5 g, NaCl 5 g, K2HPO4 5 g, sels minéraux Fe+ 0,1 mg/l, Zn+2 0,1 mg/l, 2+2 4+2 +2 Mo 0,01 mg/l, Cu2 0,02 mg/l, Mn+2 0,01 mg/l, eau à pH 7. ml de milieu sont ensemencés avec 0,5 à 1 ml d'une suspension de spores (500 000 à 300 000 spores/ml) préparée à partir d'un tube d'agar repris par 6 ml d'eau distillée. Les cultures effectuées dans des erlernmeyers de 250 ml sont agitées sur un agitateur rotatif à-180 tours/min. à 24 C. 2) Analyse des produits de biotransformation Les concentrations relatives de DINIS, MONIS-5 et MONIS-2 ont été évaluées par HPLC. L'analyse a été réalisée sur un appareil Waters équipé d'un, détecteur U. V. (Pye Unicam) et d'un intégrateur Waters. 2601386 - colonne.Bondapack C18 (10 Nm - 4 x 250 mm) - solvant MeOH/H20: 25/75 - débit 0,5 ml/min. - détecteur U.V. X = 220 nm, sensibilité 0,08/5. 5 La séparation des 3 composés est satisfaisante: - MONIS-5: Rt = 10 min 20 sec - MONIS-2: Rt = 9 min - DINIS: Rt = 25 min 20 sec. La sensibilité très grande de la technique permet 10 d'évaluer des quantités de substances de l'ordre'de 60 ng (3 mg/l) jusqu'à 6 gag (300 mg/l) pour 20 il injectés, donc des concentrations compatibles avec les conditions utilisées dans les essais de bioconversion. La réponse linéaire obtenue pour les trois composés entre la surface des pics et les 15 quantités de substances injectées permet l'évaluation des concentrations des différents constituants présents dans le milieu d'incubation. 3) Extraction des constituants du milieu de culture 0,5 ml de milieu de culture après filtration 20 (ou centrifugation) du mycelium est mis sur colonne en verre (diamètre 0,5 cm) remplie de 1 g de silice Kieselgel 60. On passe 10 ml d'éther éthylique. On évapore sous vide l'éther à sec, et dilue l'échantillon avec 2 ml du mélange MeOH/H20 (25/75). Cette solution est injectée directement dans un 25 appareil HPLC. L'extraction est quantitative. 4) Etude des conditions de bioconversion du DINIS par Beauveria bassiana D'une façon systématique, les études ont été faites sur des cultures de volume 50 ml, âgées de 48 heures, le DINIS a été ajouté en solution dans le méthanol à 50 mg/ml. 4.1) Incubation en milieu de culture: importance de la concentration du DINIS (OL5 et 1 g_ L La bioconversion a été évaluée entre 17 et 45 heures d'incubation, les résultats obtenus sous une concentration de DINIS à 0,5 g/l (tableau 5) indiquent une bioconversion quasi complète dès 25 heures (quantité de DINIS résiduel 3 %), et totale à 38 heures, qui conduit à la formation du mélange MONIS-5 (85 %) et MONIS-2 (15 %), soit un rapport MONIS-5/MONIS-2 = 5,16/1, avec un rendement de 93 % TABLEAU 5 Biotransformation du DINIS par Beauveria bassiana ATCC 7159 Temps Quantité de substance (heure) MONIS-5 MONIS-2 DINIS 17 108 33 361 18 190 48 304 307 62 15 38 315 61 O 290 59 O Incubation de B. bassiana en milieu de culture. Concentration du DINIS: 500 mg/ml. Lorsque la concentration de DINIS est portée à 1 g/l pour la même quantité de Mycelium (tableau 6), 68 heures d'incubation sont nécessaires pour observer une consommation 25 complète du DINIS, la formation du MONIS-2, MONIS-5 est effectuée avec un rendement global de 91 %. Cependant, cette bioconversion plus lente conduit au mélange-MONIS- 5/MONIS-2 = 3,9/1, donc moins favorable à l'obtention de l'isomère 5. TABLEAU 6 Biotransformation du DINIS par Beauveria bassiana ATCC 7159 Temps Quantité de substance (heure) MONIS-5 MONIS-2 DINIS 17 91 41 851 449 138 438 68 588 150 0 Incubation de B. bassiana en milieu de culture. 10 Concentration du DINIS:'1 g/l. L'importance du rapport quantité de DINIS/quantité de mycelium pour la sélectivité de la biotransformation est illustrée par ces expériences. 4.2) Incubation dans l'eau 15 Une seconde série d'expériences a été effectuée dans l'eau. Ces conditions devaient permettre une extraction simplifiée des produits de bioconversion du milieu d'incubation dépourvu des constituants du milieu de culture. Un mycelium obtenu à partir d'une culture de 20 48 heures a été mis en suspension dans de l'eau en présence d'une solution méthanolique de DINIS à la concentration finale de 1 g/l. L'analyse du milieu de bioconversion (tableau 7) montre que dans ces conditions B. bassiana hydrolyse très 25 lentement le DINIS. Après 30 heures d'incubation, 40 % de DINIS sont encore présents dans le milieu. TABLEAU 7 Biotransformation du DINIS par Beauveria bassiana ATCC 7159 Temps (heure) Quantité de substance MONIS-5 MONIS-2 DINIS 17 45 68 90 48 171 330 432 21 44 91 987 767 600 l 'eau. Incubation de B. bassiana dans DINIS: 1 g/1 REVENDICATIONS 1) Procédé de bioconversion sélective de DINIS en MONIS-5, caractérisé en ce que le DINIS est ajouté à un milieu contenant au moins un microorganisme possédant une glutathion transférase ou un extrait acellulaire d'un tel microorganisme. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le DINIS est placé dans un milieu de culture contenant un microorganisme possédant une glutathion transférase. 3) Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, 10 caractérisé en ce que le microorganisme est choisi parmi les protozoaires, les fongis et les bactéries. 4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le microorganisme est choisi dans les genres: Tetrahymena, Cunninghamella, Aspergillus, Beauveria et 15 Streptomyces. ) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le microorganisme est choisi dans le genre Beauveria. 6) Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, 20 caractérisé en ce que la bioconversion est effectuée à une température de l'ordre de 20 à 30 C. 7) Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le milieu est un milieu de culture minimum contenant de 5 à 20 g/1 de glucose et une source d'azote 25 organique contenant des acides aminés. 8) Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le DINIS est ajouté à une concentration de 1 à 5 g/1 de milieu. 9) Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, 30 caractérisé en ce que le pH du milieu est voisin de la neutralité.