FR 2601591 A1 19880122 FR 8710156 A 19870717 -- I -La présente invention concerne une préparation pharma5 ceutique contenant un facteur de stimulation de la lignée granulocytaire. En particulier, la présente invention concerne une préparation pharmaceutique stabilisée, contenant un facteur de stimulation de la lignée granulocytaire, qui est protégée contre la perte ou l'inactivation du composant actif (à savoir le facteur de stimulation de la lignée granulocytaire), dues à l'adsorption sur les parois d'un contenant dans lequel est placée la préparation, ou à l'association, la polymérisation ou l'oxydation dudit composant. Une méthode appliquée pour le traitement de diverses maladies infectieuses est la chimiothérapie, mais on a récemment constaté que la chimiothérapie est la cause de certains problèmes cliniques graves, tels que l'apparition d'organismes résistant aux médicaments, la modification des organismes pathogènes et la manifestation de nombreux effets secondaires. Dans le but d'éviter ces problèmes associés à la chimiothérapie, qui fait appel à l'utilisation d'agents thérapeutiques tels qu'antibiotiques et bactéricides, on fait actuellement des tentatives pour utiliser une substance activant les capacités prophylactiques de l'hôte d'un organisme 25 pathogène, et apporter ainsi une solution radicale aux pro- - 2 blèmes précités de la chimiothérapie. Parmi les diverses capacités prophylactiques de l'hôte, l'action bactéricide phagocytaire des leucocytes est considérée avoir les effets les plus marqués dans la période initiale de l'infection bac5 térienne, et on considère par consequent qu'il est important d'accroître les capacités protectrices de l'hôte contre l'infection, en favorisant la croissance des polynucléaires neutrophiles et leur différenciation aboutissant à la maturité. Le facteur de stimulation de la lignée granulocytaire (G-CSF= 10 Granulocyte Colony Stimulating Factor) est l'une des substances très utiles qui manifestent de telles actions, et la déposante de la présente invention a déposé précédemment une demande concernant un agent de protection contre l'infection, utilisant le G-CSF (JP-A 23777/1985). Comme mentionné plus haut, telle qu'elle est actuellement pratiquée, la chimiothérapie entraîne divers problèmes inévitables, et de grands efforts sont faits en ce moment pour utiliser une substance médicamenteuse qui soit capable d'activer les fonctions prophylactiques de l'hôte ou du sujet 20 qui a été infecté. Il va sans dire que le G-CSF manifeste en soi la capacité d'activer les fonctions prophylatiques de l'hôte, et on a également constaté que le GCSF fait preuve d'effets thérapeutiques plus marqués dans des applications cliniques lorsqu'on l'utilise en conjonction avec une substance qui active lés capacités prophylactiques de l'hôte. On utilise le G-CSF en une très faible quantité, et on utilise habituellement une préparation pharmaceutique contenant 0,1-500 pg (de préférence 5-50 pg) de G-CSF, à une fré30 quence d'administration de 1-7 fois par semaine pour un adulte. Toutefois, le G-CSF a tendance à être adsorbé sur la paroi de son contenant, tel qu'ampoule pour injection ou seringue. En conséquence, lorsqu'on utilise le médicament sous forme d'une préparation injectable telle qu'une solution 35 aqueuse, il est adsorbé sur la paroi de son contenant, tel - 3 qu'une ampoule ou une seringue. Ce phénomène d'adsorption, soit conduit à l'incapacité du G-CSF à manifester totalement son activité en tant qu'agent pharmaceutique, soit nécessite l'incorporation de G-CSF en une quantité plus que nécessaire, tenant compte de la perte possible de celui-ci, due à l'adsorption. En outre, le G-CSF est labile et extrêmement sensible à des facteurs ambiants tels que température, humidité, oxygène et rayons ultraviolets. Sous l'action de ces facteurs, le 10 G-CSF connait des changements physiques ou chimiques tels qu'association, polymérisation et oxydation, et subit une grande perte d'activité. Ces phénomènes font qu'il est difficile de garantir un accomplissement total d'un acte thérapeutique par administration d'une très faible quantité de G-CSF 15 d'une façon très précise. Il est par conséquent nécessaire de mette au point une préparation pharmaceutique stable de G-CSF qui soit totalement protégée contre une perte de l'activité de son composant actif. Ceci fait l'cbjet principal de la présente invention, 20 laquelle fournit une préparation pharmaceutique stable de G-CSF. Les auteurs de la présente invention ont poursuivi des recherches poussées dans le but d'accroître la stabilité d'une préparation pharmaceutique contenant du G-CSF, et ils 25 ont découvert que ce but peut être réellement atteint par addition d'un surfactif, un saccharide, une protéine ou un composé à haut poids moléculaire, pharmaceutiquement acceptable. En conséquence, la préparation pharmaceutique stable de 30 la présente invention, contenant du G-CSF, est caractérisée en ce qu'elle contient à la fois du G-CSF et au moins une substance choisie parmi un surfactif, un saccharide, une protéine et un composé à haut poids moléculaire, pharmaceutiquement acceptables. -4 Le G-CSF qui doit être contenu dans la préparation pharmaceutique de la présente invention peut être obtenu par l'un quelconque des procédés tels que ceux décrits dans JP-A 153273/1984, 269455/1985, 269456/1985, 270838/1985 et 5 270839/1985. Par exemple, on peut préparer un G-CSF humain soit par culture d'une lignée cellulaire (CNCM numéro 1-315 ou 1483) provenant de cellules tumorales de patients atteints de cancer de la cavité buccale, ou par l'expression d'un ADN recombinant (ayant été préparé sous l'action d'un 10 gène codant pour le G-CSF humain) dans une cellule hôte appropriée (par exemple E. coli, cellule C 127 ou cellules ovariennes de hamster d'Asie. Tout G-CSF humain ayant été purifié à un haut degré peut être utilisé en tant que le G-CSF destiné à être contenu 15 dans la préparation pharmaceutique de la présente invention. Des G-CSF humains préférés sont ceux obtenus par isolement à partir du surnageant de la culture d'une cellule productrice de G-CSF humain, ainsi qu'une glycoprotéine ou un polypeptide, ayant l'activité du G-CSF humain, que l'on obtient 20 par transformation d'un hôte par un vecteur recombinant dans lequel est incorporé un gène codant pour un polypeptide ayant l'activité du G-CSF humain. On donne ci-dessous deux exemples particulièrement préférés de G-CSF humains: (1) G-CSF humain ayant les propriétés physico-chimiques suivantes: I) poids moléculaire: environ 19 000 + 1 000, tel que mesuré suré par électrophorèse en gel de polyacrylamide-dodécylsulate de sodium; 30 II) point isoélectrique: ayant au moins l'un des trois points isoélectriques: pI= 5,5 + 0,1, pI= 5,8 + 0,1 et pI= 6,1 + 0,1; III) absorption dans l'ultraviolet: ayant une absorption maximale a 280 nm et une absorption 35 minimale à 250 nm; -5 (IV) séquence d'acides aminés des 21 restes à partir de la terminaison N: H2N-Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-SerSer-Leu-Pro-Gln-SerPhe-Leu-Leu-Lys-Cys-Leu-Glu-Gln-Val(2) G-CSF humain contenant soit un polypeptide ayant l'activité du facteur humain de stimulation granulocytaire, lequel est représenté par la totalité ou une partie de la séquence d'acides aminés indiquée ci-dessous, soit une glycoprotéine comportant à la fois ledit polypeptide et une portion de chafne glucidique: 10 20 30 (Met)nThr Gin Ser Arg Lys Glu Lys Leu Cys His Ser Ser Cys Cys Leu Tyr Gln Ser Pro Gln Leu Trp Gln Ala Leu Phe Ala Val Leu Glu Val Gln Pro Phe Leu Ile Gln Leu (Val His Pro Leu Gly Pro Ser Ser Gln Gly Leu Glu Leu Asp Val Gln Met Gln -Pro Ser Ala Val Ala Ser Tyr Leu Gly Ser Glu Ile Gin Leu Leu Gly Ala Glu Thr Phe Ser Arg Lys Cys Asp Gly Glu)mCys Glu Leu Pro Trp Ala Leu His Ser Gln Ala Pro Thr Asp Phe Glu Leu Gln Gly Gln Arg His Leu Val Leu Pro Leu Gly Pro Ala Ser Leu Ala Ala Val Ala Gln Gly Leu Leu Ala Gly Ala Arg Gln Arg Ser Glu Ala Thr Leu Pro Leu Leu Glu Asp Thr Met Met Ala Ser His Leu Gln Leu Tyr Leu Leu Ala Phe Gly Thr Thr Ala Pro Gly Phe Leu Pro Val Gln Lys Gly Ser Gly Leu Ile Leu Ile Pro Ala Gly Leu Ala (étant entendu que m est 0 ou 1; et n est 0 ou 1). -6 Pour des détails concernant le procédé de préparation de ces deux types de G-CSF, voir JP-A 153273/1984, 269455/1985, 269456/1985, 270838/1985 et 270839/1985, toutes ces demandes ayant été déposées par le cessionnaire de la présente invention. Un autre procédé qui peut être utilisé consiste à effectuer la fusion d'une cellule productrice de G-CSF et d'une cellule de tumeur maligne auto-proliférante, et à cultiver l'hybridome résultant, en présence ou en absence de 10 mitogène. La solution obtenue, contenant du G-CSF humain, peut être stockée à l'état congelé, ou après avoir été purifiée davantage et concentrée, si nécessaire, par une technique connue quelconque. Une autre possibilité consiste à stocker la solution après l'avoir déshydratée par des moyens tels que lyophilisation. On peut traiter selon la présente invention tous les G-CSF humains ainsi préparés, afin d'obtenir des préparations pharmaceutiques stables contenant du G-CSF. Dans la liste ci-dessous, on donne des exemples caractéristiques du surfactif utilisé pour l'obtention des preparations pharmaceutiques stables, contenant du G-CSF, de la présente invention: surfactifs non ioniques ayant un HLB (équilibre hydrophile-lipophile) allant de 6 à 18, tels qu'esters d'acides aliphatiques et de sorbitanne (par exemple monocaprylate de sorbitanne, monolaurate de sorbitanne et monopalmitate de sorbitanne), esters d'acides aliphatiques et de glycérol (par exemple monocaprylate de glycérol, monomyristate de glycérol et monostéarate de glycérol), esters 30 d'acides aliphatiques et de polyglycérol (par exemple monostéarate de décaglycéryle, distéarate de décaglycéryle et monolinoléate de décaglycéryle), esters polyoxyéthyléniques d'acides aliphatiques et de sorbitanne (par exemple monolaurate polyoxyéthylénique de sorbitanne, mono-oléate poly35 oxyéthylénique de sorbitanne, monostéarate polyoxyéthylénique -7 de sorbitanne, monopalmitate polyoxyéthylènique de sorbitanne, tri-oléate polyoxyéthylénique de sorbitanne et tristéarate polyoxyéthylénique de sorbitanne), esters polyoxyéthyléniques d'acides aliphatiques et de sorbitol (par exemple tétrastéarate polyoxyéthylénique de sorbitol et tétra-oléate polyoxyéthylénique de sorbitol), esters polyoxyéthyléniques d'acides aliphatiques et de glycérol (par exemple monostéarate polyoxyéthylénique de glycéryle), esters d'acides aliphatiques et de polyéthylèneglycol (par exemple 10 distéarate de polyéthylèneglycol), polyoxyéthylène-alkyléthers (par exemple polyoxyéthylène-lauryléther), polyoxyéthylènepolyoxypropylène-alkyléthers (par exemple polyoxyéthylènepolyoxypropylène-glycoléther, polyoxyéthylènepolyoxypropylène-propyléther et polyoxyéthylène-polyoxy15 propylène-cétyléther), polyoxyéthylènealkylphényléthers (par exemple polyoxyéthylène-nonylphényléther), huile de ricin polyoxyéthylée, huile de ricin polyoxyéthylée solidifiée (huile de ricin polyoxyéthylée hydrogénée), dérivés polyoxyéthylés de cire d'abeilles (par exemple dérivé de sorbi20 tanne et cire d'abeilles polyoxyéthylé), dérivés de lanoline et polyoxyéthylène (par exemple polyoxyéthylènelanoline), et dérivés de polyoxyéthylène et amides d'acides aliphatiques (par exemple polyoxyéthylène-amide stéarique); surfactifs non ioniques tels que sels d'acides alkylsulfuriques ayant un 25 radical alkyle en C14-C18 (par exemple cétylsulfate de sodium, laurylsulfate de sodium et oléylsulfate de sodium), sels d'acides alkylsulfuriques polyoxyéthyléniques dans lesquels le nombre moyen de moles d'oxyde d'éthylène ajoutées va de 2 à 4 et le radical alkyle a de 10 à 18 atomes de carbone (par exemple laurylsulfate polyoxyéthylénique de sodium), sels d'esters de type alkylsulfosuccinate dans lesquels le groupe alkyle a de 8 à 18 atomes de carbone (par exemple laurylsulfosuccinate de sodium); et surfactifs naturels tels que lécithine, glycérophospholipides, sphingophospholipides 35 (par exemple sphingomyéline) et esters d'acides aliphatiques -8 et de saccharose, dans lesquels l'acide aliphatique a de 12 à 18 atomes de carbone. Ces surfactifs peuvent évidemment être utilisés soit individuellement, soit en mélange. On utilise les surfactifs énumérés ci-dessus de préfé5 rence en quantités allant de 1 à 10 000 parties en poids, par partie en poids de G-CSF. Le saccharide utilisé dans la production de la préparation pharmaceutique stable, contenant du G-CSF, de la présente invention, peut être choisi parmi des monosaccharides, 10 oligosaccharides et polysaccharides, ainsi qu'esters phosphoriques et dérivés nucléotidiques de ceux-ci, dans la mesure o ces composés sont pharmaceutiquement acceptables. On peut citer comme exemples caractéristiques: alcools glucidiques à trois fonctions alcool et plus, tels que glycérol, érythri15 tol, arabitol, xylitol, sorbitol et mannitol; acides glucidiques tels qu'acide glucuronique, acide iduronique, acide neuraminique, acide galacturonique, acide gluconique, acide mannuronique, acide cétoglycolique, acide cétogalactonique et acide cétogulonique; acide hyaluronique et ses sels, sulfate 20 de chondroftine et ses sels, héparine, inuline, chitine et leurs dérivés, chitosane et ses dérivés, dextrine, dextrane ayant un poids moléculaire moyen allant de 5 000 à 150 000, et acide alginique et ses sels. Tous ces saccharides peuvent avantageusement être utilisés soit individuellement soit en mélange. On utilise les saccharides énumérés plus haut de préférence en quantités allant de 1 à 10 000 parties en poids, par partie en poids de G-CSF. Des exemples caractéristiques de la protéine à utiliser 30 dans la production de la préparation pharmaceutique stable, contenant du G-CSF, de la présente invention, comprennent: albumine de sérum humain, globuline de sérum humain, gélatine, gélatine traitée par un acide (poids moléculaire moyen= 7 000 - 100 000), gélatine traitée par un alcali (poids molé35 culaire moyen = 7 000 - 100 000) et collagène. Il va sans dire que l'on peut utiliser ces protéines soit individuelle- -9 ment soit en mélange. On utilise les protéines énumérées ci-dessus de préférence en quantités allant de 1 à 20 000 parties en poids, par partie en poids de G-CSF. Des exemples caractéristiques du composé à haut poids moléculaire, à utiliser dans la production de la préparation stable, contenant du G-CSF, de la présente invention, comprennent des polymères naturels tels qu'hydroxypropylcellulose, hydroxyméthylcellulose, carboxyméthylcellulose sodique 10 et hydroxyéthylcellulose; et des polymères de synthèse, tels que polyéthylèneglycol (poids moléculaire = 300 - 6 000), alcool polyvinylique (poids moléculaire = 20 000 - 100 000) et polyvinylpyrrolidone (poids moléculaire = 20 000 000). Il va sans dire que ces composés à haut poids molé15 culaire peuvent être utilisés soit seuls, soit en combinaison. On utilise les composés à haut poids moléculaire, énumérés ci-dessus, de façon souhaitable en quantités allant de 1 à 20 000 parties en poids, par partie en poids de G-CSF. 20 Dans la production de la préparation pharmaceutique, contenant du G-CSF, de la présente invention, on peut également incorporer, outre le surfactif, le saccharide, la protéine ou le composé à haut poids moléculaire, décrits plus haut, au moins une substance choisie parmi un acide aminé, un 25 agent réducteur sulfureux et un antioxydant. Comme exemples d'acides aminés on peut citer la glycine, la thréonine, le tryptophane, la lysine, l'hydroxylysine, l'histidine, l'arginine, la cystéine, la cystine et la méthionine. Comme exemples d'agents réducteurs sulfureux, on peut citer: N-acétylcystéine, N-acétylhomocystéine, acide thioctique, thiodiglycol, thioéthanolamine, thioglycérol, thiosorbitol, acide thioglycolique et ses sels, thiosulfate de sodium, hydrogénosulfite de sodium, pyrosulfite de sodium, sulfite de sodium, acide thiolactique, dithiothréitol, glutathion et un 35 agent réducteur sulfureux doux comportant un groupe sulfhy- 2601591- - 10 dryle, tel qu'un acide thioalcanoique en C1-C7. Comme exemples d'antioxydants, on peut citer: acide érythorbique, dibutylhydroxytoluène, butylhydroxyanisole, dl-a-tocophérol, acétate de tocophérol, acide Lascorbique et ses sels, L-ascorbopalmitate, L-ascorbostéarate, gallate de triamyle, gallate de propyle et agents chélateurs tels qu'éthylènediaminetétra-acétate disodique (EDTA), pyrophosphate de sodium et métaphosphate de sodium. On utilise les acides aminés, agents réducteurs sulfu10 reux et antioxydants, énumérés plus haut, ou des mélanges de ceux-ci, de préférence en quantités allant de 1 à 10 000 parties en poids, par partie en poids de G-CSF. Pour la formulation de la préparation stable contenant du G-CSF de la présente invention, en une forme pharmaceu15 tique appropriée, on peut incorporer un ou plusieurs des agents suivants: un diluant, un solubilisant, un agent d'isotonie, un excipient, un modificateur de pH, un édulcorant et un tampon. La préparation pharmaceutique de G-CSF stabilisée de la 20 présente invention peut être formulée soit pour l'administration orale, soit pour l'administration parentérale, comme par exemple administration par injection effectuée de diverses façons, et on peut utiliser diverses formes pharmaceutiques selon le mode spécifique d'administration. Les formes pharma25 ceutiques caractéristiques comprennent celles destinées à l'administration orale, telles que comprimés, pillules, capsules, granulés et suspensions; solutions, suspensions et préparations lyophilisées destinées essentiellement à l'injection intraveineuse, l'injection intramusculaire, l'injec30 tion sous-cutanée et l'injection intradermique; et celles destinées à l'administration transmucosale, telles que suppositoires rectaux, compositions administrées par voie nasale et suppositoires vaginaux. Selon la présente invention, on ajoute à-la préparation 35 pharmaceutique, contenant du G-CSF, au moins une substance - 1 choisie parmi un surfactif, un saccharide, une protéine ou un composé à haut poids moléculaire, de sorte que l'on empêche son adsorption sur les parois de son contenant ou d'une seringue,et en même temps celle-ci reste stable pendant une durée prolongée. Le mécanisme détaillé par lequel les substances mentionnées plus haut ont stabilisé le G-CSF ou l'empêchent d'être adsorbé reste encore à éclaircir. En présence d'un surfactif, le GCSF, qui est une protéine hydrophobe, aurait 10 sa surface recouverte par le surfactif en devenant ainsi solubilisé, de manière à empêcher efficacement l'adsorption du G-CSF, présent à l'état de traces, sur la paroi de son contenant ou d'une seringue. Un saccharide ou un composé hydrophile à haut poids moléculaire formerait une couche hydratée entre le G-CSF et la surface adsorbante de la paroi de son contenant ou d'une seringue, empêchant ainsi d'une façon efficace l'adsorption du G-CSF. Une protéine entrerait en compétition avec le G-CSF pour l'adsorption sur la paroi de son contenant ou d'une seringue, inhibant ainsi efficace20 ment l'adsorption du G-CSF. En plus de la prévention de l'adsorption du G-CSF, les substances mentionnées plus haut contribueraient également à empêcher l'association ou la polymérisation des molécules de G-CSF. En présence d'un surfactif, d'un saccharide, d'une protéine ou d'un composé à haut poids moléculaire, les molécules individuelles du G-CSF sont dispersées dans ces substances, et l'interaction entre les molécules du G-CSF est suffisamment réduite pour entraîner une diminution importante de la probabilité de leur association ou polymérisation. En outre, ces substances retarderaient l'auto-oxydation du G-CSF qui est accélérée à haute température ou en présence d'un haut degré d'humidité, ou empêcheraient l'association ou la polymérisation du G-CSF à la suite de son auto-oxydation. Ces effets de retardement de l'auto-oxydation du G-CSF ou d'in35 hibition de son association ou de sa polymérisation seraient - 12 encore accrus par addition d'un acide aminé, d'un agent réducteur sulfureux ou d'un antioxydant. Les problèmes décrits plus haut sont particulièrement perceptibles dans des solutions injectables et dans des sus5 pensions, mais ils -peuvent également apparaître dans le processus de formulation du G-CSF en d'autres formes pharmaceutiques telles que comprimés. L'addition de surfactifs, saccharides, protéines ou composés à haut poids moléculaire est également efficace dans ce dernier cas. Grâce à l'addition d'au moins une substance choisie parmi un surfactif, un saccharide, une protéine et un composé à haut poids moléculaire, le G- CSF est hautement stabilisé et maintient son activité pendant une durée prolongée, comme on va le démontrer dans les exemples qui suivent. Pour obtenir 15 ces résultats, la quantité de chacune de ces substances est critique, en particulier sa limite inférieure, et les plages suivantes sont souhaitables: 1 - 10 000 parties en poids de surfactif, 1 - 10 000 parties en poids de saccharide, 1 000 parties en poids de protéine et 1 20 000 parties en 20 poids de composé à haut poids moléculaire, pour une partie en poids de G-CSF. Selon la présente invention, on utilise en une concentration spécifiée un surfactif, un saccharide, une protéine et/ou un composé à haut poids moléculaire, et cela est effi25 cace non seulement pour empêcher l'adsorption du G-CSF sur la paroi de son contenant ou d'une seringue, mais également pour accroître la stabilité d'une préparation pharmaceutique contenant du G-CSF. Il en résulte qu'il devient possible de garantir l'administration d'une dose faible mais très précise 30 de G- CSF à des patients; comme le G-CSF est coûteux, son utilisation efficace doit entraîner des coûts plus faibles pour la production de préparations pharmaceutiques contenant du G-CSF. Les exemples qui suivent sont donnés dans le but d'il35 lustrer plus en détail la présente invention, mais ne doivent - 13 en aucune manière être considérés comme limitatifs. Dans ces exemples, on a déterminé l'activité résiduelle-du G-CSF par l'une des méthodes suivantes. (a) Méthode au milieu gélosé semi-solide utilisant des cel5 lules de moelle osseuse de souris: On a mélangé 0,4 ml de sérum de cheval, 0,1 ml de l'échantillon, 0,1 ml d'une suspension de cellules de moelle osseuse de souris C3H/He (femelles) (0,5 - 1 x 105 cellules nuclées), et 0,4 ml d'une solution de culture de McCoy 5A modifiée, contenant 0,75 % de gélose, on a versé le mélange dans une boite en matière plastique pour culture de tissus (35 mm de diamètre), on l'a laissé prendre en masse, et on a effectué la culture pendant 5 jours à 37 C dans une atmosphère constituée de 95% d'air et 5% de CO2, et à 100% d'humi15 dité. On a compté le nombre des colonies formées (une colonie consistant en au moins 50 cellules), et on a déterminé l'activité en définissant une unité comme l'activité pour la formation d'une colonie. La solution de culture de McCoy 5A modifiée, utilisée 20 dans la méthode (a), était préparée de la façon suivante. Solution de culture de McCoy modifiée (double concentration) On a dissous deux fois dans 500 ml d'eau distillée 12 g de solution de culture de McCoy 5A (Gibco), 2,55 g de milieu aux acides aminés et vitamines MEM (Nissui Seiyaku Co. Ltd.), 25 2,18 g de bicarbonate de sodium et 50 000 unités de pénicilline G potassique, et on a stérilisé la solution par filtration à travers un filtre Millipore (0, 22 gm). (b) Chromatographie liquide à haute performance en phase inversée: En utilisant une colonne C8 à phase inversée (4,6 mm x 300 mm; 5 pm) et un mélange de n-propanol et acide trifluoroacétique en tant que phase mobile, on a déterminé l'activité résiduelle du G-CSF (injecté en une quantité équivalente à 1 pg) dans les conditions de gradient suivantes: - 14 Temps (s) Solvant (A) Solvant (B) Gradient 0 100% 0% linéaire 0% 100% 2 % linéaire 100% 0% Solvant (A): 30% de n-propanol et 0,1% d'acide trifluoroacétique. Solvant (B): 60% de n-propanol et 0,1% d'acide trifluoro10 acétique. On a effectué la détection à une longueur d'onde de 210 nm, et on a calculé le pourcentage de l'activité résiduelle du G-CSF au moyen de la formule suivante: quantité résiduelle de G-CDF après 15 Activité résiduelle = un intervalle de temps déterminé x100 du G-CSF (%) quantité initiale de G-CSF La quantité résiduelle de G-CSF déterminée par cette méthode était en très bon accord avec le résultat obtenu dans la mesure par la méthode au milieu gélosé semi-solide (a), 20 utilisant des cellules de moelle osseuse de souris. Exemple 1 On a ajouté à 5 pg-de G-CSF un des agents de stabilisation énumérés dans le tableau 1, et on a dissous le mélange aseptiquement dans une solution tampon de phosphate 20 mM (contenant 100 mM de chlorure de sodium; pH 7,4) , pour produire une préparation pharmaceutique contenant 5 pg de G-CSF par ml, que l'on a ensuite lyophilisée. On a mesuré par la méthode (a) la variation de l'activité du G-CSF en fonction du temps, et les résultats sont donnés dans le tableau 1. Dans le tableau, le terme "activité (%)" représente l'activité résiduelle du G-CSF par rapport à l'unité initiale, et il est défini par la formule suivante: unités d'activité après un Activité (%) = intervalle de temps déterminé x 100 35 unités d'activité initiales - 15 On a effectué la lyophilisation par la méthode suivante: On a placé dans un flacon de verre traité au sulfate, stérile, la solution de G-CSF contenant un agent de stabili5 sation, on l'a congelée à -40 C, on l'a soumise à un premier séchage par chauffage de -40 à 0 C en l'espace de 48 heures, en augmentant la pression de 3,99 à 13,3 Pa (0,03 - 0,1 torr), puis à un second séchage par chauffage de 0 à 20 C pendant une période de 12 heures, en augmentant la pression 10 de 3,99 à 10,64 Pa (0,03 - 0,08 torr); après cela, on a rempli l'intérieur du flacon avec de l'azote gazeux sec, stérile, jusqu'à l'obtention d'une pression égale à la pression atmosphérique, puis on a fermé le falcon avec un bouchon de coutchouc pour lyophilisation, et on l'a ensuite scellé avec 15 une capsule en aluminium. tableau 1 ACTIVITE QUANTITE (partie en Après stock- Après stockANT STABILISANT poids) age à 4 C - age à 37 C pendant 6 pendant 1 mois mois xylitol 10 000 92 86 mannitol 10 000 91 85 acide glucuronique 10 000 86 82 acide hyaluronique 2 000 92 89 dextrane(m.w. 40,000) 2 000 95 90 héparine 5 000 85 80 chitosane 2 000 93 91 acide aiginique 2 000 90 90 albumine de sérum humain 1 000 98 99 globuline de sérum humain 1 000 98 95 gélatine traitée par un 2000 97 95 acide gelatine traitée par un 1000 99 96 alcali 1 0 0 99 96 collagène 2 000 95 90 (po.yw.thy negycol 10 000 94 90 (m.w. 4,000) hydroxypropylcellulose 1 000 98 94 carboxymerhyl 1000 88 80 cellulose sodique hydroxymethylcellulose 5 000 92 90 carboxyméthylcellulose 2 000 96 95 (P. M. 50 000) polyvinylpyrrolidone 2000 95 94 (P.M. 50 000) I albumine de sérum humain 2 000 mannitol 2 000 100 97 cystéine 100 - 17 - TABLEAU 1 (suite) l - ACTIVITE QUANTITE AGENT STABILISANT (partie en Après stock- Après stock.poids) - age à 4 Cage à 37 C pendant 6 pendant 1 fiois mois albumine de sérum humain 2 000 polyoxy6thylene monolaurate de sorbitanne 99 96 mannitol 2 000 albumine de sérum huamin 2 000 hydroxypropylcellulose 500 98 92 dextrane(P. M. 40, 000) 2 000 polyoxyéthylène 100 monolaurate de sorbitanne;, 98 96 sorbitol 2 000 huile de ricin polyoxyéthyléE 100 durcie 94 92 dextrane(P.M. 40 000) 2 000 Aucun - 74 58 Exemple 2 On a ajouté à 10 pg de G-CSF un des agents de stabili25 sation énumérés dans le tableau 2, et on a dissous aseptiquement le mélange dans une solution de tampon phosphate 20 mM (contenant 100 mM de chlorure de sodium; pH 7,4) pour produire une préparation pharmaceutique contenant 10 gg de G-CSF par ml. On a introduit aseptiquement la préparation dans un 30 flacon de verre traité au sulfate, et on a scellé celui-ci pour préparer une solution de G-CSF. On a mesuré, par la même méthode que celle utilisée dans l'exemple 1, la variation de l'activité du G-CSF dans cette solution en fonction du temps, et les résultats sont donnés dans le tableau 2. 26015 91 TABLEAU 2 ACTIVITES QUANTITE (partie Aprs stock- Aps stdk Apres stxckAGENT STABILISANT enpoids) age à 4 C ag à 4 C age parlat pa3-dt 7 p3ait 2 1 mois à la jurs miths tfltrabre ar iante mannitol 5 000 91 87 82 acide hyaluronique 2 000 93 87 70 dextrane(P.M. 40 000) 2 000 96 95 85 glyceriol 10 000 90 90 88 acide neuraminique 5 000 93 91 84 chitine 2 000 95 92 86 dextrine 2 000 90 92 87 albumine de sérum humain 1 000 99 95 92 globuline de sérum humain 1 000 98 94 90 éclatine traitée par un 2 000 97 96 87 gélatine traitée par un 500 99 95 92 alcali collagene 2 000 99 94 88 Ppolyethyleneglycol 10 000 94 89 90 (P. M. 4 000) hydroxypropylcellulose c. 2 000 98 95 92 carboxymethyl- 2 000 92 91 80 cellulose sodique hydroxyethylcellulose. 4 000 92 94 90 alcohol polyvinylique 4 000 97 93 90 4 000 97 93 90 (P.M. 50 000) polyvinylpyrrolidone 4 000 95 95 92 4 000 95 95 92 (P.M. 50 000) monolaurate de sorbitanne 400 97 96 95 polyoxyéthylene monolau- 400 1 96 9 400rate de sorbitanne96 94 rate de sorbitanne TABLEAU 2 (suite) ! ACTIVITE QUANTITE QUArTITE AFres stock- ApFrs stxck- AFrs stockAGENT STABILISANT en poids) a à 4 C age à 4 C age peiat npOlt 7 pan-it 2 1 mis à la jars ma*hs - te[irrc a*ite polyoxyéthylene monosté- 400 98 97 94 arate de sorbitanne polyoxyéthylène polyoxypropylène 400 100 94 93 g1 ycoléther huile de ricin polyoxyéthylée solidifiée 400 99 98 90 laurylsulfate de sodium 2 000 97 93 87 lecithine 2 000 97 94 90 albumine de sérum humain 2 000 mannitol 2 000 100 99 97 cystéine 100 albumine de sérum hamain 2 000 monolaurate de polyoxyéthylène de sorbitanne 100 99 97 95 99 97 95 mannitol 2 000 albumine de sérum humain 1 000 hydroxypropylcellulose 500 99 97 95 dextrane(P.M. 40,000) 2 000 monopalmitate derpolyoxyéthylène sorbitanne 96 96 93 sorbitol 2 000 huille de ricin polyoxyéthylée solidifiée 92 92 dextranc(p.M. 40 000) 2 000 Auncun 72 61 47 - Exemple.3 On a ajouté à 10 pg de G-CSF un des agents de stabilisation énumérés dans le tableau 3, et on a dissous aseptiquement le mélange dans une solution de tampon phosphate 20 mM 5 (contenant 100 mM de chlorure de sodium; pH 7, 4), pour produire une préparation pharmaceutique contenant 10 gg de G-CSF par ml. On a introduit 1 ml de la préparation dans un flacon de verre traité au sulfate, revêtu de silicone, et on a maintenu celui-ci à 4 C. On a évalué l'efficacité de chaque agent 10 stabilisant dans l'inhibition de l'adsorption de G-CSF, en mesurant l'activité résiduelle du G-CSF dans la solution après 0,5, 2 et 24 heures. On a effectué la mesure par la méthode (b) utilisant la chromatographie liquide à haute performance en phase inversée. Les résultats sont donnés dans le 15 tableau 3. TABLEAU 3 QUANTITE ACITIVITE RESIDUELLE (%) AGENT STABILISANT (partie en Poids) initial- 0,5 h 2 h 24 h monnitol 5 000 100 93 90 91 acide hyaluronique acide 2 000 100 97 92 92 dextrane(P. x 40 00Q) 2 000 100 98 95 96 glycérine 10 000 100 94 91 90 he'parine 2 000 100 92 90 90 acide glucuronique 5 000 100 96 90 91 acide cétoglycolique 5 000 100 92 88 90 albumine de sérum humain 1 000 100 100 101 99 globuline de sérum humain 1 000 100 98 100 98 g$a1tine traitée par un 500 100 99 98 99 acide gélatine traitée par un 2 000 100 99 97 97 alcali__ _ _ _ _ _ _ _ _ alcali 2 000 100 99 97 97 collagene 2 000 100 100 98 99 polyethylènecelulose 10 000 100- 100 0 100 99 (p. 4 4,000) hydroxypropylcellulose 2 000 100 100 100 99 carboxym'éthyl 2 000 100. 98 96 95 cellulose sodique hydroxyethylcellulose 4 000 100 96 93 92 alcool polyvinylique (PM. 50 -000) 4 000 100 99 100 98 (P -M. 50 -000) polyvinylpyrrolidone 4 000 100 98 98 96 (P.M. 50 000) monocaprylate de sorbitanne 400 100 100 100 98 monostearate de polyoxyéthylène de sorbitanne 400 100 100 98 100 huile de ricin polyoxyethy1de solidifiye 400 100 99 101 99 TABLEAU 3 (suite) QUANTITE ACTIVITE RESIDUELLE (%) (partie AGENT STABILISANT en poids) initiale 0,5 h 2 h 24 h laurylsulfate de sodium 2 000 100 100 99 97 lecithine 2 000 100 99 100 98 albumine de sérum humain 2 000 mannitol 2 000 100 100 100 101 cysteine 100 albumine de sérum humain 2 000 monolaurate de polyoxyéthy- 100 100 100 98 99 lène sorbitanne mannitol 2 000 albumine de sérum humain 1,000 hydroxypropylcellulose 500 100 101 99 100 dextrane(p. M. 40,000) 2 000 :monolaurate de polyoxyéthy- 100 lène sorbitanne 100 99 99 sorbitol 2 000 huile de ricin polyoxyéthy- 100 lée solidifiée 100 98 97 dextrare (P. x 40 000) 2 000 Aucun - 100 91 72 73 - 23 REVENDICATIONS 1. Préparation pharmaceutique stable contenant un facteur de stimulation de la lignée granulocytaire, laquelle contient, en plus du facteur de stimulation de la lignée granulocytaire présent en tant que le composant actif, au moins une substance choisie parmi un surfactif, un saccharide, une protéine et un composé à haut poids moléculaire, pharmaceutiquement acceptables. 2. Préparation pharmaceutique stable contenant un fac10 teur de stimulation de la lignée granulocytaire selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient le surfactif en une quantité de 1 000 parties en poids, par partie en poids du facteur de stimulation de la lignée granulocytaire. 3. Préparation pharmaceutique stable contenant un facteur de stimulation de la lignée granulocytaire selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit surfactif est au moins un composé choisi parmi un surfactif non ionique, un surfactif anionique et un surfactif naturel, le 20 surfactif non ionique étant un ester d'acide aliphatique et de sorbitanne, un ester d'acide aliphatique et de glycérol, un ester d'acide aliphatique et de polyglycérol, un ester polyoxyéthylénique d'acide aliphatique et de sorbitanne, un ester polyoxyéthylénique d'acide aliphatique et de sorbitol, 25 un ester polyoxyéthylénique d'acide aliphatique et de glycérol, un ester d'acide aliphatique et de polyéthylèneglycol, un polyoxyéthylènealkyléther, un polyoxyéthylène-polyoxypropylène-alkyléther, un polyoxyéthylènealkylphényléther, une huile de ricin polyoxyéthylée solidifiée, un dérivé de cire d'abeilles polyoxyéthylé, un dérivé de lanoline polyoxyéthylé ou un polyoxyéthylène-amide d'acide aliphatique, le surfactif anionique étant un sulfate d'alkyle, un sel d'acide alkylsulfurique polyoxyéthylénique ou un sel d'ester sulfosuccinate d'alkyle, et le surfactif naturel étant la lécithine, un glycérophospholipide, un sphingophospholipide ou un ester d'acide aliphatique et de saccharose. - 24 4. Préparation pharmaceutique stable contenant un facteur de stimulation de la lignée granulocytaire selon la revendication 1, laquelle contient le saccharide en une quantité allant de 1 à 10 000 parties par partie en poids du facteur de stimulation de la lignée granulocytaire. 5. Préparation pharmaceutique stable contenant un facteur de stimulation de la lignée granulocytaire selon la revendication 1 ou 4, dans laquelle ledit saccharide est au moins un composé choisi parmi le glycérol, l'érythritol, l'arabitol, le sorbitol, le mannitol, l'acide glucuronique, l'acide iduronique, l'acide galacturonique, l'acide neuraminique, l'acide glyconique, l'acide mannuronique, l'acide cétoglycolique, l'acide cétogalactonique, l'acide cétogulogulonique, l'acide hyaluronique et leurs sels, le sulfate de 15 chondroltine et ses sels, l'héparine, l'inuline, la chitine et leurs dérivés, le chitosane et ses dérivés, une dextrine, un dextrane ayant un poids moléculaire moyen de 5 000 000, et l'acide alginique et ses sels. 6. Préparation pharmaceutique stable contenant un fac20 teur de stimulation de la lignée granulocytaire selon la revendication 1, laquelle contient la protéine en une quantité allant de 1 à 20 000 parties en poids, par partie en poids du facteur de stimulation de la lignée granulocytaire. 7. Préparation pharmaceutique stable contenant un fac25 teur de stimulation de la lignée granulocytaire selon la revendication 1 ou 6, dans laquelle ladite protéine est au moins une substance choisie parmi l'albumine de serum humain, une globuline de sérum humain, la gélatine, la gélatine traitée par un acide ou par un alcali, ayant un poids moléculaire 30 moyen de 7 000 à 100 000, et le collagène. 8. Préparation pharmaceutique stable contenant un facteur de stimulation de la lignée granulocytaire selon la revendication 1, laquelle contient le composé à haut poids moléculaire en une quantité de 1 - 20 000 parties en poids, 35 par partie en poids du facteur de stimulation de la lignée granulocytaire. 9. Préparation pharmaceutique stable contenant un facteur de stimulation de la lignée granulocytaire selon la revendication 1 ou 8, dans laquelle ledit composé à haut poids moléculaire est au moins un composé choisi parmi l'hydroxypropylcellulose, l'hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose sodique, l'hydroxyéthylcellulose, un polyéthylèneglycol ayant un poids moléculaire de 300 à 6 000, un alcool polyvinylique ayant un poids moléculaire de 20 000 10 à 100 000, et une polyvinylpyrrolidone ayant un poids moléculaire de 20 000 à 100 000. 10. Procédé pour la production d'une préparation pharmaceutique stable contenant un facteur de stimulation de la lignée granulocytaire, caractérisé en ce qu'on ajoute au facteur de 15 stimulation de la lignée granulocytaire présent en tant que le composant actif, au moins une substance choisie parmi un surfactif, un saccharide, une protéine et un composé à haut poids moléculaire, pharmaceutiquement acceptables.