FR 2610006 A1 19880729 FR 8700741 A 19870122 Procédé de reconstitution in vitro de tumeurs. La présente invention a pour objet un procédé de reconstitution in vitro de tumeurs en trois dimensions. Le screening des molécules pouvant servir de principe actif pour un médicament en vue du traitement d'un tissu Lésé est facilité si l'on dispose de cultures de cellules de ce tissu permettant une expérimentation in vitro. La méthode de primo-culture d'explants de tissus - maintenant connue sous l'appellation méthode de culture sous lattice compacte couvrante - décrite par Claire LUGASSY, Odile ENJOLRAS et Jean-Paul ESCANDE (C.R. Acad. Sc. Paris, t.301, Série III, n 17, pp. 779-784, 1985) s'est révélée d'une aide particulièrement efficace à cet effet. La demanderesse poursuivant ses travaux vient de montrer qu'il était maintenant possible de reconstituer des tumeurs en trois dimensions, à partir de cellules sortant de l'ensemble formé par une lattice et un expIant d'un tissu pathologique mis en culture selon la méthode de culture sous lattice compacte couvrante. Il s'agit là d'un résultat particulièrement important qui devrait permettre, par l'observation des tumeurs reconstituées et des populations cellu- laires qui en sont issues, notamment en précisant les potentialités invasives des cellules, de mieux poser le diagnostic et de parfaire le choix des médicaments appropriés au traitement du tissu pathologique concerné. La présente invention concerne précisément,selon un premier aspect, un procédé de reconstitution in vitro d'une tumeur en trois dimensions, caractérisé en ce qu'on soumet à une incubation en présence de collagène une suspension cellulaire préparée à partir de la population cellulaire hétérogène sortie de l'ensemble formé par une Lattice et un expIant d'un tissu pathologique mis en culture selon la méthode de culture sous lattice compacte couvrante, ladite population étant constituée,d'une part, de cellules différenciées organisées en colonies sur un tapis de cellules d'aspect fibroblastique et, d'autre part, desdites cellules d'aspect fibroblastique. L'expiant mis en oeuvre est issu d'un tissu patholo- gène. Ce tissu peut être notamment une tumeur. IL peut alors s'agir d'une tumeur bénigne ou maligne. Le procédé selon l'invention convient particulièrement à La reconstitution de mélanomes malins. Les mélanomes malins reconstitués sont désignés ci-après par l'abréviation MMR. Partant d'un tissu pathologique, la préparation des explants et leur primo-culture se font comme il est indiqué dans l'article de C. LUGASSY et al. cité ci-dessus. La primo-culture d'un expLant conduit à l'obtention d'un ensemble formé par l'expIant et la lattice dont on l'a recouvert. La mise en culture de cet ensemble à l'issue de la primo-culture de L'expIant a pour conséquence notamment la sortie de cellules quittant l'ensemble vers le milieu de culture et se fixant sur la paroi du flacon. Cette sortie est également observée lorsque l'ensemble-formé par la lattice et l'expIant est transféré du récipient o l'on a réalisé la primo-culture dans un autre récipient contenant un milieu nutritif neuf puis remis en incubation. Cette même sortie de cellules est encore observée chaque fois que l'on retransfère ledit ensemble dans un récipient contenant un milieu nutritif neuf. Les cellules sortantes, quel que soit le moment o elles quittent l'ensemble formé par la lattice et l'expIant, soit à l'issue de la primoculture de l'expIant, soit après un transfert dudit ensemble, constituent une population hétérogène P1 comprenant, d'une part, des cellules différenciées et, d'autre part, des cellules d'aspect fibroblastique, les premières s'organisant en colonies reposant sur un tapis constitué par les secondes. L'addition d'un agent, tel que la trypsine, dans le flacon de culture permet de détacher les cellules qui adhèrent à la paroi du flacon. La population P1 peut ensuite être recueillie et mise en suspension dans un milieu nutritif convenant au métabolisme des cellules la constituant. Un milieu ayant les caractéristiques du milieu RPMI éventuellement complété par de la L-glutamine, du sérum de veau foetal et un ou plusieurs antibiotiques peut être notamment utilisé. Après avoir procédé à'un dénombrement des cellules à l'aidepar exemple,d'une chambre de Thomas, on peut éventuellement ajuster le nombre de cellu- les. Une suspension contenant 2.10 cellules par ml peut, par exemple, être préparée. La suspension ainsi obtenue est la suspension S1. Le collagène utilisé est obtenu à partir de tissus conjonctifs; les tendons de la queue du rat sont une source facile d'emploi. On prépare une solution de colLagène légèrement acide, le collagène étant après extraction et purification en solution par exemple dans une solution à 1 pour 1000 (v/v) d'acide acétique. La solution de colLagène mise en oeuvre peut contenir de 0,1 à 5 mg de collagène par ml. D'une manière préférée, elle contient 1 mg par ml. A la solution de collagène placée dans un récipient à fond plat, tel qu'une boîte de Pétri, sont ajoutés, de préférence simultanément, la suspension S1, du milieu nutritif ainsi qu'un agent neutralisant, tel que de la soude. Lorsqu'on utilise une suspension S1 de 2.106 ceLlules par ml sous un volume de 0,5 ml, pour 1,5 ml d'une solution de colla- gène à 1 mg par ml dans une boîte de Petri de 6 cm de diamètre, et en présence d'un milieu de culture, tel que le milieu RPMI, de 0,25 ml de NaOH 0,1M et de 0,45 ml de sérum de veau foetal, on obtient ainsi après 4 à 8 jours de rétraction un disque irrégulier de 5 à 10 mm de diamètre sur 1 à 2 mm d'épaisseur qui est une tumeur reconstituée en trois dimensions. Cette tumeur (tumeur TR1) préparée à partir de la suspension cellulaire S1 est dite de première génération. Il est possible à partir de la tumeur TR1 de préparer en série d'autres tumeurs reconstituées. La tumeur TR1 mise en culture donne issue par migration à partir de la tumeur vers le milieu de culture à une population cellulaire P2 constituée également de cellules tumorales différenciées et de cellules d'aspect fibroblastique. Cette population P2 peut à son tour être utilisée selon la même technique pour fabriquer une ou plusieurs tumeur(s) TR2 dite(s) de deuxième génération. Une tumeur TR2 mise en culture donne alors issue à une population cellulaire P3 qui peut également à son tour être utilisée pour fabriquer une ou plusieurs tumeur(s) TR3 dite(s) de troisième génération. On peut ainsi en répétant les mêmes opérations préparer une série de tumeurs reconstituées en trois dimensions. Il convient de noter que, avant l'addition de trypsine ou d'un réactif équivalent dans le flacon contenant un MMR de énième génération et la population cellulaire n + 1 à laquelle il a donné issue, il est possible à l'aide, par exemple, d'une pipette de prélever le MMR et de le porter dans un second flacon contenant du milieu nutritif. Le MMR ainsi transféré peut alors donner issue à une seconde population cellulaire n + 1. Chacune des populations n + 1 peut être utilisée pour préparer un MMR de génération n + 1. La présente invention concerne ainsi selon un autre aspect un procédé de préparation en série de tumeurs reconstituées, caractérisé par les opérations successives suivantes: 1. incubation en présence de colLagène d'une suspension cellulaire préparée à partir de la population cellulaire hétérogène consti- tuée de cellules tumorales différenciées et de cellules d'aspect fibrobLastique issues d'une tumeur de première génération recons- tituée selon le procédé de l'invention décrit ci-dessus, jusqu'à l'obtention d'une tumeur reconstituée de deuxième génération, 2. incubation en présence de collagène d'une suspension cellulaire préparée à partir de la population cellulaire hétérogène constituée de cellules tumorales différenciées et de cellules d'aspect fibroblastique issues de la tumeur reconstituée de deuxième géné- ration obtenue en 1, jusqu'à l'obtention d'une tumeur reconstituée de troisième génération. Bien que généralement l'obtention d'une tumeur recons- tituée de quatrième génération puisse s'avérer plus difficile, la présente invention concerne également tout procédé de préparation en série de tumeurs reconstituées qui comprendrait en outre la répétition de l'opération 2, de telle sorte que, partant d'une tumeur reconstituée de génération n, on obtienne une tumeur reconstituée de génération n + 1. Dans ce qui suit, des exemples non limitatifs de réalisation de l'invention sont présentés. EXEMPLE PREPARATION EN SERIE DE MELANOMES MALINS RECONSTITUES EN TROIS DIMENSIONS 1. MATERIEL - Tumeurs Les explants tumoraux utilisés provenaient de quatre métastases cutanées (MCI à MCIV) de mélanomes malins prélevés chez quatre patients différents. 2 6 1 0 0 0 6 - Cellules mises en oeuvre pour la _ré2paration de mélanomes reconstitués de première úénération Les explants tumoraux ont été cultivés par la méthode de culture sous lattice compacte couvrante, et une population hétérogène P1 constituée de cellules tumorales mélanocytaires différenciées, organisées en colonies sur un tapis de cellules d'aspect fibro- blastique, a été obtenue. La population P1 comprenait les cellules mélanocytaires différenciées et les cellules d'aspect fibroblas- tique. Ces cellules ont été obtenues soit en primo-culture, soit après un transfert et une remise en culture dans un flacon neuf de l'ensemble constitué par l'expLant tumoral et la lattice. - Collaène Du colLagène de type I a été extrait de queues de rats et préparé selon la technique connue (dont on trouvera une description dans Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol. 76, n 8, 1979, p. 1274), sous la forme d'une solution purifiée aqueuse à 1 pour 1000 (v/v) d'acide acétique contenant 1 mg de collagène par ml. - Milieu de culture complet On a utilisé du milieu RPMI 1640, commercialisé par la Société GIBCO, auquel ont été ajoutés: 1% de Lglutamine, 15% (v/v) de sérum de veau foetal (S.V.F.) et, par millilitre, 100 unités de pénicilline et 100 mg de streptomycine. - Flacons de culture Des flacons plats dont le fond présente une surface de 25 cm commercialisés par la Société Falcon ont été utilisés. 2. MODE OPERATOIRE 1 Préparation de mélanomes malins reconstitués de première qgénération (MMR1) A - Préparation préalable d'une suspension cellulaire Sl. On verse dans le flacon contenant la population P1 une solution de trypsine à 0,25% (p/v). La trypsine agit en détachant de la paroi du flacon Les cellules qui y adhèrent et L'on recueille Les cellules dans le miLieu de culture complet décrit ci-dessus. La suspension cellulaire obtenue est ajustée de manière à contenir 2.106 cellules par mL (suspension S1). B - Préparation d'une lattice à partir de la suspension S1. On réalise une lattice dans une boite de Pétri de 6 cm de diamètre en faisant rétracter à 37 C le collagène par la sus- pension S1 dans les conditions suivantes: - solution de collagène 1,5 ml milieu de culture complet 2 ml - NaOH 0,1M 0,250 ml - sérum de veau foetal 0,450 ml - suspension S1 0,50 ml On met donc en incubation 10 cellules en présence de 1,5 ml d'une solution de collagène à 1 mg/ml. C - Obtention d'un mélanome malin reconstitué. Après 4 à 8 h de rétraction à 37 C, la lattice se transforme en une masse cellulaire qui est la reconstitution d'un méLanome malin et à partir de laquelle on peut notamment observer une sortie de cellules. Le mélanome malin reconstitué ainsi obtenu est dit de première génération (mélanome MMR1). 2 Préparation en série de mélanomes malins reconstitués Le mélanome MMR1 obtenu en 1C est transféré dans un second flacon contenant du milieu de culture complet et l'on place ce flacon en incubation à 37 C. Le MMR1 donne issue par migration hors de sa masse vers le milieu de culture à une population cellulaire P2, constituée également de cellules mélanocytaires différenciées et de cellules d'aspect fibroblastique. A partir de cette population P2, on prépare une suspension S2 contenant 2.10 cellules par ml selon le mode opéra- toire indiqué ci-dessus en 1A. Un méLanome malin de deuxième génération (MMR2) est alors recons- titué à partir de la suspension S2 en procédant comme indiqué ci-dessus en lB puis en 1C. D'une manière identique, à partir de La suspension S3 préparée à partir de la population P3 également constituée de cellules méLano- cytaires différenciées et de cellules d'aspect fibroblastique à laquelle donne issue le mélanome MMR2, un méLanome malin de troisième génération (MMR3) est reconstitué. 3 Transfert des mélanomes malins reconstitués Chaque MMR est mis en culture jusqu'à ce que les cellules auxquelles il donne issue dans le flacon parviennent à confluence du fait de leur prolifération. Le MMR est alors transféré et remis dans un flacon neuf contenant du milieu de culture complet. L'opération est renouvelée toutes les 4 à 8 semaines en fonction de la rapidité de la croissance cellulaire. 4 Méthodes d'observation des mélanomes malins reconstitués et des populations cellulaires - Observation macroscopigue Lors de chaque transfert, on observe: * la rétraction, l'adhérence et La pigmentation du MMR * la couleur du culot centrifugé après recueil des cellules à confluence, qui permet d'estimer la pigmentation cellulaire - Observation microscopigue Les cellules issues des MMR in vitro sont observées à l'aide d'un microscope inversé du type Olympus Q C.K. avec contraste de phase. Traitement des mélanomes malins reconstitués en vue de Leur étude histologique Les fragments des MMR inclus en paraffine sont colorés par l'hématéine éosine safran. 3. RESULTATS I Mélanomes maLins reconstitués obtenus: 9 MMR ont été obtenus - 3 à partir de la métastase MCI (cas I), à savoir: 1 MMR de première génération (MMR I 1) I MMR de deuxième génération (MMR I 2) 1 MMR de troisième génération (MMR I 3) - 1 à partir de la métastase MC II (cas II) , à savoir: 1 MMR de première génération (MMR II 1) - 2 à partir de La métastase MC III (cas III), à savoir: I MMR de première génération (MMR III 1) 1 MMR de deuxième génération (MMR III 2) - 3 à partir de La métastase MC IV (cas IV), à savoir: 1 MMR de première génération (MMR IV 1) 1 MMR de deuxième génération (MMR IV 2) 1 MMR de troisième génération (MMR IV 3) 2 Suivi macroscopique et microscopique du contenu des flacons (cf. tabLeau I) A - MMR de premiere _genération - Observation macroscopique des MMR I T A B L E A U I Rétraction Adhérence Pigmentation Culot cellulaire Colonies tumorales Tapis fibroblastique MMR I - I 1 +++ +++ ++ brun clair +++ ++ puis s'amenuise - II 1 ++ +++ +++ brun ++ puis 0 ++ puis souffrance - III I ++ +++ + jaunâtre+++ ++ puis s'amenuise - IV I ++ +++ ++ brun +++ ++ puis s'amenuise MMR2 'o - I 2 ++ + + jaunâtre ++ + - III 2 + O blanc ++ O IV 2 + + + brun clair ++ MMR3 - I 3 + O O blanc ++ - IV 3 +. brun très clair + O r c, os o o La lattice préparée à partir de la suspension S1 est un disque translucide de 6 cm de diamètre. Après 4 à 8 jours de rétraction, il devient un disque irrégulier et blanchâtre de à 10 mm de diamètre sur 1 à 2 mm d'épaisseur. Puis la rétraction peut se poursuivre. Elle a fourni par exemple, pour le cas I, une tumeur de 3 mm de diamètre pour le MMR1. L'adhérence au flacon des MMR1 mis en culture est importante. Au cours du temps, une pigmentation est apparue progressive- ment. Elle est demeurée inhomogène et discrète pour les MMR I 1 et III 1; elle a atteint le brun foncé pour le MMR IV 1, le noir pour le MMR II 1. Le culot cellulaire obtenu à partir de la population P2 était brun clair pour le MMR I 1, brun pour les MMR Il 1 et III 1, jaunâtre pour le MMR IV 1. - Observation microscopique des populations cellulaires P1 et P2. La population P1, utilisée dans la préparation des MMR1, était constituée dans les quatre cas I à IV de colonies tumorales mélanocytaires différenciées visibles à l'oeil nu dans le flacon et associées à un tapis de cellules d'aspect fibroblastique. Les cellules tumorales différenciées étaient de type fibroide pour le cas I, en fuseau plus globuleux pour les cas II et IV, de type épithéliolde pour le cas IV. Elles formaient de volumineuses colonies sans aucune inhibition de contact. * dans les quatre cas I à IV, la primo-culture de chaque MMR1 a donné une population P2 de même type que la popu- lation P1, * lors des transferts successifs pour les MMR I 1, III 1 et IV 1, on a pu constater, après respectivement une observation de 20 mois pour le cas I 1, de 10 mois pour le cas III 1 et de 6 mois pour le cas IV 1, que les colonies qui, dès le départ étaient moins volumineuses, ont persisté alors que s'amenuisait le tapis de cellules d'aspect fibroblastique, * pour Le MMR II 1, on a pu constater que Les cellules sont progressivement toutes devenues d'aspect fibroblas- tique, avec croissance ralentie et signes de souffrance (après six mois). Seul un MMR1 de première génération a été réalisé dans ce cas. B - MMR de deuxièmegénération Ils ont été réalisés avec les populations P2 issues respective- vement des MMR I 1, III 1 et IV 1. - Observation macroscopique des MMR2 * la rétraction était moins importante que pour les MMR1, en particulier pour le MMR III 2 o le disque est resté flasque et d'environ 2 cm de diamètre. De même, l'adhérence au flacon était diminuée, surtout pour les MMR I 2 et III 2 qui se décollaient facilement, * la pigmentation est restée partielle, touchant surtout la périphérie et la surface supérieure libre des MMR, pour les MMR I 2 et IV 2, complètement nulle pour le MMR III 2, * le culot cellulaire obtenu à partir de la population P3 était plus clair que le culot P2 et complètement blanc pour les cellules issues du MMR III 2. - Observation microscopique des populations cellulaires P3 La population P3 issue de chaque MMR2 comportait des cellules tumorales se multipliant à partir du MMR, mais les colonies disséminées étaient dans l'ensemble moins volumineuses, les cellules semblant avoir acquis une certaine inhibition de contact. Les cellules d'aspect fibroblastique étaient, après une observation de respectivement quatre mois pour le MMR I 2, deux mois pour le MMR III 2 et trois mois pour le MMR IV 2, encore plus rares, limitées au pourtour du MMR pour les MMR I 2 et IV 2, complètement absentes pour le MMR III 2. C - MMR de troisième énération Ils ont pu être réalisés avec Les populations P3 issues respec- tivement des MMR I 2 et IV 2, mais non avec La population P3 issue du MMR III 2 qui ne rétractait pas du tout Le coLLagène. - Observation macroscopique des MMR3 Pour Les MMR I 3 et IV 3, les phénomènes déjà observés se sont accentués: rétraction moins importante, adhérence au flacon diminuée, pigmentation faible pour le MMR IV 3 et nulle pour Le MMR I 3. - Observation microscopique des populations cellulaires P4 On observe toujours une multiplication de cellules tumorales à partir de chaque MMR3, mais les colonies tumorales sont dans l'ensemble moins importantes. Les culots obtenus à partir des populations P4 issues des MMR3 sont apparus encore plus clairs. Enfin, on a constaté, après une obser- vation de respectivement trois mois pour Le MMR I 3 et d'un mois pour le MMR IV 3, que Le tapis fibrobLastique se raré- fiait pour Le MMR I 3 et avait même disparu pour le MMR IV 3. 3 Etude histologique des MMR La présence de ceLLules volumineuses, polyédriques, comportant un large noyau central et nucLéoLé, dont certaines étaient très pigmentées, était très évocatrice d'une prolifération méLanocy- taire tumorale. 4. COMMENTAIRES Les cellules issues de la culture sous lattice compacte couvrante d'explants de mélanomes malins (métastases cutanées) peuvent donc être utilisées pour reconstituer in vitro, une fois mélangées à du collagène, une tumeur en trois dimensions dont il est facile de suivre l'évolution. Les paramètres les plus intéressants à suivre sont: la rétraction, la pigmentation et l'adhérence. Leur étude permet de suivre in vitro les diverses étapes de formation de la tumeur méLanocytaire maligne. Les celLules issues des MMR se caractérisent par la variabiLité de Leurs potentialités à se multiplier, à se pigmenter, à former des colonies disséminées dans le flacon de culture à distance des MMR. Il est possible d'établir un Lien entre les caractéristiques évolutives d'un MMR et les particularités des cellules qui en sont issues. Pour l'essentiel, plus la pigmentation du MMR devient intense, moins la multiplication cellulaire et la migration sous forme de colonies disséminées trouvent facilement à se réaliser. D'autre part, l'importance en taille et en nombre des cellules des colonies devient moindre au fur et à mesure que se raréfie le tapis de cellules d'aspect fibroblastique qui leur était associé. Ces phénomènes deviennent plus caractéristiques encore lorsque l'on étudie la reconstitution en série de MMR. Il est également possible d'envisager des facteurs spécifiques et distincts conditionnant en particulier les potentialités de pigmen- tation, de multiplication et de migration cellulaires. R E V E N D I C A T I 0 N S 1: Procédé de reconstitution in vitro d'une tumeur en trois dimensions, caractérisé en ce qu'on soumet à une incubation en présence de colLagène une suspension cellulaire préparée à partir de la population cellulaire hétérogène sortie de l'ensemble formé par une lattice et un expiant d'un tissu pathologique mis en culture selon la méthode de culture sous lattice compacte couvrante, ladite population étant constituée, d'une part, de cellules tumorales différenciées organisées en colonies sur un tapis de cellules d'aspect fibroblastique et, d'autre part, desdites cellules d'aspect fibro- bLastique. 2. Procédé de reconstitution in vitro d'une tumeur en trois dimensions selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'expLant mis en oeuvre est issu d'une tumeur. 3. Procédé de reconstitution in vitro d'une tumeur selon la revendication 2, caractérisé en ce que la tumeur dont est issu l'expiant est une tumeur maligne. 4. Procédé de reconstitution in vitro d'une tumeur selon la revendication 3, caractérisé en ce que la tumeur dont est issu l'explant est un mélanome malin. 5. Procédé de reconstitution in vitro d'une tumeur selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le collagène est utilisé sous forme d'une solution purifiée aqueuse contenant de 0,1 à 5 mg de collagène par ml. 6. Procédé de reconstitution in vitro d'une tumeur selon la revendication 5, caractérisé en ce que le colLagène est utilisé sous forme d'une solution contenant 1 mg de collagène par mL. 7. Procédé de reconstitution in vitro d'une tumeur selon l'une quelconque des revendications 4 et 6, caractérisé en ce que 106 cellules de la population hétérogène issue de la culture d'un mélanome malin sont mises en incubation en présence de 1,5 ml d'une solution de coilagène à I mg/ml. 8. Procédé de préparation en série de tumeurs reconsti- tuées, caractérisé par les opérations successives suivantes: A incubation en présence de coLLagène d'une suspension cellulaire préparée à partir de la population cellulaire hétérogène, cons- tituée de cellules tumorales différenciées et de cellules d'aspect fibroblastique, issue d'une tumeur reconstituée de première génération obtenue-selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 7, jusqu'à l'obtention d'une tumeur reconstituée de deuxième génération, B - incubation en présence de collagène d'une suspension cellulaire préparée à partir de la population cellulaire hétérogène, cons- tituée de cellules tumorales différenciées et de cellules d'aspect fibroblastique, issue de la tumeur reconstituée de deuxième génération obtenue en A, jusqu'à l'obtention d'une tumeur reconstituée de troisième génération. 9. Procédé de préparation en série de tumeurs reconstituées selon la revendication 8, caractérisé en outre par la répétition de l'opération B, de telle sorte que, partant d'une tumeur reconstituée de génération n, on obtienne une tumeur reconstituée de génération n + 1.