FR 2604726 A1 19880408 FR 8713672 A 19871002 4 2604726 SOUCHE DE BACILLUS SUBTILIS DONT LES ACTIVITES DE PROTEASE EXTRA-CELLULAIRE SONT REDUITES. PROCEDE POUR OBTENIR LA SOUCHE ET PROCEDE POUR FAIRE SECRETER DES PROTEINES EN UTILISANT LA SOUCHE La présente invention concerne une nouvelle sou- che de Bacillus subtilis utile en tant qu'hôte pour la production secrétoire hautement efficace de protéines désirées en faisant sécréter par l'hôte les protéines désirées par utilisation des techniques de l'ADN recom- binant, et un procédé pour la production sécrétolre hau- tement efficace des protéines désirees en utilisant la souche en tant qu'hôte. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé pour produire efficacement la pro- téilne désirée en utilisant une combinaison de (a) une nouvelle souche de B. subtilis en tant qu'hôte, obtenue en introduisant un gène pour la stimulation de taux de protéase extra-cellulaire, dérivé d'une bactérie du gen- re Bacllus, dans une souche de B. subtilis réceptrice dont les activités de protéase extra-cellulaire sont dé- jà réduites de telle sorte que les activités de protéase extra-cellulalre de la souche résultante deviennent ln- férieures & celles de la souche réceptrice; et (b) un plasmide recombinant contenant un géne codant pour la protéine désirée, joint & un gene de protéase extra-cel- lulaire ou a une sequence d'ADN dérivée de celui-ci de façon à exprimer le gène et sécréter la protéine ainsi exprlmee. Les techniques de l'ADN recombinant ont récem- ment permis de faire exprimer des gènes étrangers par des microorganismes utilisés en tant qu'hôtes et par consequent des produits de gènes étrangers désirés peu- vent être produits en utilisant ces techniques. 2.604726 En tant que microorganisme hôte, différentes bactéries comprenant Escherichia coli, B. subtilis et différentes levures ont été utilisées de façon générale. Du point de vue de la production de matière ef- ficace, des tentatives ont été faites pour secréter des protéines étrangères dans les milieux de culture de transformants capables de produire les protéines étran- gères. En tant que microorganlsme hôte utile dans ce but, le genre Bacillus ayant le caractère de sécréter de grandes quantités de protéines extra-cellulaires telles que la protease, l'amylase et autres a été au départ considéré comme un hôte convenable. Dans le genre Bacillus, B. subtilis a en parti- culier attiré l'attention, non seulement parce qu'il est lnoffensif, mais également parce qu'on a accumulé beau- coup d'informations & son sujet dans les domaines de la génétique, de la biochimie, de la biologie moléculaire et de la microbiologie appliquée. Par conséquent, des efforts ont été faits pour construire des systèmes hôte- plasmide recombinant capables de sécréter des protéines étrangères dans les milieux de culture en utilisant B. subtilis comme hôte. Dans de nombreux cas de tentatives de l'art an- térieur pour faire sécréter des protéines étrangères par B. subtilis en tant qu'hôte, les taux d'accumulation des proteines sécrétées étaient toutefois encore faibles, en particulier lorsque les protéines étrangères étaient dé- rivées d'eucaryotes supérieurs. Par conséquent, les techniques relatives & la sécrétion de protéines étran- geres de l'art antérieur ne sont pas encore satisfaisan- tes en termes de production industrielle. On a supposé que la faible accumulation des protéines sécrétées peut être provoquée par la dégrada- tion des protéines étrangères dérivées d'eucaryotes su- périeurs pendant ou après la sécrétion parce que, bien que les ARNm fussent synthétisés en des quantités suffi- samment importantes, les protéines étrangères s'accumu- laient seulement en de faibles quantités (référence 1). La souche de B. subtilis dont les activités de protéase extra-cellulaire sont réduites pour empêcher la dégradation de la protéine désirée a été considérée com- me un hôte convenable, compte tenu de l'état de la tech- nique existant. Toutefois, on ne connaît pas à partir des diffé- rents résultats expérimentaux rapportés dans l'art anté- rieur de souches de B. subtilis convenables en tant qu'hôte pour la sécrétion en quantités suffisantes de protéines étrangères provenant d'eucaryotes supérieurs. Par exemple, Palva et coll. ont construit une souche de B. subtilis dont les activités de protéase extra-cellulaire étaient réduites, y ont introduit un plasmide recombinant contenant une combinaison d'une sé- quence d'ADN codant pour le peptide signal de l'a-amyla- se et un gène d'interféron-a humain joint à son côté aval, c'est-à-dire 3', puis ont obtenu des transfor- mants. Dans leur expérience relative à la sécrétion d'interféron-a humain par les transformants, les taux d'accumulation atteignaient 10 unités par litre de ml- lieu de culture. Cette valeur correspond à approximatl- vement 1 mg/l de milieu de culture d'interféron-a hu- main, et ce taux est beaucoup plus faible que celui de l'a-amylase (référence 2). Les présents inventeurs ont essayé d'obtenir une production sécrétoire d'interféron- humain en utili- sant, en tant qu'hôte, une souche de B. subtilis dont les activités de protéase neutre et alcaline extra-cel- lulaire étaient réduites. Dans ce cas, bien que la sou- che, dont les activités de protéase étaient réduites, fût utilisée comme hôte, le taux d'accumulation (10 mg/l de milieu de culture) de l'interféron-s humain sécrété n'était pas aussi élevé que les présents inventeurs l'avaient espéré. Ils ont également confirmé que la pro- téine étrangère produite était rapidement dégradée en l'absence d'un inhibiteur de protéase dans le milieu de culture (référence 3). Comme décrit ci-dessus, il a été difficile dans les procédés de l'art antérieur d'accumuler les protéi- nes étrangères désirées, dérivées d'eucaryotes supé- rleurs, en grandes quantités dans les surnageants de culture en utilisant seulement en tant qu'hôte des sou- ches de B. subtilis dont les activités de protéase neu- tre et alcaline extra-cellulalre étaient réduites par les procédés de l'art antérieur. Les présents inventeurs ont effectué des recher- ches en tenant compte des problèmes décrits ci-dessus et ont trouvé que, lorsqu'un gène pour la stimulation de taux de protéase extra-cellulaire qui avait été isolé précédemment par les présents inventeurs (référence 4) était introduit dans une souche de B. subtilis dont les activités de protéase extra-cellulaire étaient déjà ré- duites, la formation d'un halo sur une plaque de caséi- ne-gélose indiquant l'activité protéolytique de la sou- che de B. subtilis résultante portant le gène était ré- glée, par l'introduction du gène dans l'ADN génomique de la souche réceptrice, à un niveau réduit inférieur au niveau du témoin, ou de la souche réceptrice elle-même, contrairement à ce qu'on pouvait attendre. La présente invention a donc été réalisée sur la base de cette nouvelle découverte des présents inven- teurs. L'un des objets de la présente invention est de fournir une nouvelle souche de B. subtilis dont les ac- tivités de protéase extra-cellulaire sont encore rédui- tes et qui est utile en tant qu'hôte pour la production sécrétoire d'une protéine désirée en utilisant les tech- niques de l'ADN recombinant. Un autre objet de la présente invention est de fournir un procédé pour construire la nouvelle souche de B. subtilis. Un autre objet encore de la présente invention est de fournir un procédé pour produire efficacement une protéine désirée en utilisant la nouvelle souche de B. subtilis en tant qu'hôte. La présente invention permet donc de produire efficacement la protéine désirée en introduisant un plasmlde recombinant contenant un gêne codant pour la protéine désirée inséré dans un vecteur d'expression-sé- crétion ayant une structure capable d'exprimer le gène et de sécréter la protéine ainsi exprimée, dans une sou- che de B. subtilis dont les activités de protéase extra- cellulaire sont encore réduites par l'introduction du gene pour la stimulation de taux de protéase extra-cel- lulaire dans son ADN génomique. Comme indiqué dans les exemples qui suivent, les présents inventeurs ont réussi à accumuler 200 mg d'hor- mone de croissance humaine par litre de milieu de cultu- re en utilisant le transformant obtenu en introduisant un ADN recombinant contenant un gène codant pour l'hor- mone de croissance humaine, lequel gène suit une séquen- ce d'ADN dérivée du promoteur et de la région codant pour le prépro-peptide d'un gêne de protéase extra-cel- lulaire, dans la souche de B. subtilis portant le gène pour la stimulation de taux de protéase extra-cellulaire dans l'ADN génomique. Ce taux d'accumulation est cinq à dix fois supé- rieur à celui obtenu dans le cas des souches déficientes en activité de protéase neutre et alcaline extra-cellu- laire constuites selon les procédés de l'art antérieur. Dans les dessins annexés: - la figure 1 montre la structure du plasmide phGH427. Dans ce dessin, les traits obliques représen- tent la partie dérivée du gène de la protéase neutre ex- tra-cellulaire. Pm, prépro et hGH représentent la région "promoteur", la région codant pour le prépro-peptide et le fragment d'ADN contenant le gène codant pour l'hormo- ne de croissance humaine mature, respectivement. - la figure 2 représente la séquence nucléoti- dique de la partie dérivée de la région codant pour le prépro-peptide de protéase neutre extra-cellulaire con- tenue dans phGH427 et la séquence d'amino-acides corres- pondant à la séquence nucléotidique. Comme gène pour la stimulation de taux de pro- téase extra-cellulaire, on connait par l'analyse généti- que Pap (référence 5), sacO (référence 6), hpr (référen- ce 7) et d'autres gènes. Comme gène pour la stimulation de taux de pro- téase extra-cellulaire, tout gène qui a pour effet de régler la formation d'un halo sur une plaque de caséi- ne-gélose dans une souche de B. subtilis déficiente en activité de protéase extra-cellulaire à un niveau encore réduit par l'introduction du gène dans l'ADN génomique de la souche, peut être utilisé dans le cadre de la pré- sente invention. Le gène pour la réduction des activités de pro- téase extra-cellulaire résiduelles de la souche en tant que récepteur du gène peut aussi être soit un gène qui est déjà connu, soit un gène qui est nouvellement isolé par des techniques d'ADN recombinant. Afin de mettre facilement en oeuvre la présente invention, on préfère des gènes isolés par des techni- ques d'ADN recombinant car ils sont facilement accessi- bles. Parmi ceux-ci, un fragment d'ADN contenant la séquence d'ADN qui a été au préalable isolée à partir de B. amvloliquefaciens par les présents inventeurs (réfé- rence 8) et dont l'un des brins comprend la séquence nucléotidique suivante: GTGTCACGCA GATACTTTTA CACATACTTT TCGGTGAAAA ATCCCGCAAA AACGTTTACA CTATTAGTAA CAGATCAAAT ACCTAGGACT CGTTCACCAT ACACAATTCA TTGATCTTTC AAAAAAAGGA GTGTGGAAAC GGTGGAAAAG AAATTAGAAG AAGTAAAGCA ATTATTATTC CGACTTGAAA ATGATATCAG AGAAACAACC GACTCATTAC GAAACATTAA CAAAAGCATT GATCAGCTCG ATAAATTCTC ATATGCAATG AAAATTTCTT AAAAAGACTT GGAAACAAGT CTTTTTTTTG TGCATTTTTC ACCCATTTCA TGGATAAAGT ATTATACGAT est utile. Afin d'obtenlr la souche de B. subtilis de la présente invention en introduisant le gène pour la sti- mulation de taux de protéase extra-cellulaire dans l'ADN génomlque, on peut utiliser une recombinaison génétique basée sur l'homologie de séquence d'ADN entre l'ADN gé- nomlque de la souche de B. subtilis réceptrice et le gè- ne introduit. Toute autre méthode par laquelle le gène peut être introduit dans l'ADN génomique de la souche réceptrice peut également être employée. La souche de B. subtilis dont les activités de protéase neutre et/ou alcaline extra-cellulaire sont ré- duites, utilisée en tant que récepteur pour le gène pour la stimulation de taux de protéase extra-cellulaire peut être obtenue par des procédés utilisant la mutagénèse ou la recomblnaison génétique. Pour la mutagénèse, on peut utiliser le contact avec par exemple des agents mutagènes, des rayons ultra- violets ou des rayons gamma. Pour la recombinaison génétique, on peut utili- ser un procédé qui comprend les étapes consistant essen- tiellement à isoler un gène de protéase extra-cellulaire à partir d'une souche de B. subtilis, à soumettre le ge- ne isolé à une délétion in vitro et à renvoyer le gène présentant cette délétion dans la souche d'origine. On peut, si nécessaire, combiner des procédés utilisant la mutagénèse et la recombinaison génétique. Toutefois, des procédés utilisant la recombinai- son génétique sont préférables parce que la délétion pertinente peut facilement être provoquée dans le gène de protéase extra-cellulaire. Les présents inventeurs ont maintenant trouvé, comme base de la présente invention, que les activités de protéase extra-cellulaire résiduelles de la souche réceptrice obtenue de la manière décrite ci-dessus peu- vent, de façon surprenante, être encore plus réduites en introduisant un plasmide contenant le gène pour la sti- mulation de taux de protéase extra-cellulaire dans le récepteur ou en insérant le gène dans l'ADN génomique du récepteur de sorte que le gène soit retenu dans l'ADN génomique du récepteur. La production de la protéine étrangère désirée selon la présente invention utilisant un procédé de sé- crétion peut être mise en oeuvre en introduisant un ADN recombinant pour la sécrétion de la protéine désirée dans la souche de B. subtilis portant le gène ci-dessus pour la stimulation de taux de protéase extra-cellulai- re, dans son ADN génomique en tant qu'hôte et en culti- vant les transformants ainsi obtenus. Le plasmiderecombinant pour la sécrétion de la protéine désirée, utilisé dans ce but peut comprendre tout plasmide qui est capable de sécréter la protéine désirée. Le plasmide recombinant peut être construit en joignant un gène codant pour la protéine désirée ou un fragment d'ADN le contenant du côté aval (3') d'une ré- gion nécessaire à l'expression du gène et à la sécrétion de la protéine désirée. Comme région nécessaire à l'ex- pression et à la sécrétion, on peut utiliser une région dérivée du promoteur et la région codant pour le pré- pro-peptide, l'une et l'autre étant dérivées du gène de la protéase extra-cellulaire d'une bactérie du genre Ba- cillus. Par exemple, les présents inventeurs ont déjà construit, en tant qu'ADN recombinant utile, pPIF25 pour la sécrétion de l'interféron-s humain (référence 9) et d'autres plasmides recombinants. On peut utiliser tout gène de protéase extra- cellulaire d'une bactérie du genre Bacillus en tant que matière pour l'ADN recombinant pour construire la région impliquée dans l'expression du gène et la sécrétion de la protéine. Les gènes de protéase extra-cellulaire pour la construction du plasmide recombinant comprennent, par exemple, des gènes de protéase neutre et alcaline extra- cellulaire dérivés de B. amyloliquefaciens; des gènes de protéase neutre et alcaline extra-cellulaire dérivés de B. subtilis; et des gènes de protéase neutre et al- caline extra-cellulaire dérivés de B. licheniformis. L'ADN recombinant pour l'expression et la sécré- tion peut être introduit dans la souche hôte portant le gène pour la stimulation de taux de protéase extra-cel- lulaire dans son ADN génomique par tout procédé classi- que de transformation, y compris par exemple la trans- formation de protoplaste. La protéine désirée peut être produite en culti- vant le transformant obtenu par le procédé décrit ci- dessus dans un milieu de culture liquide. Pour cette culture, on peut employer tout procédé de culture clas- sique. La protéine désirée peut être préparée à partir du milieu de culture par tout procédé classique utilisé pour la récupération et la purification des protéines. Comme décrit plus haut, la présente invention permet de faire produire par une souche de B. subtilis hôte une protéine étrangère provenant d'un eucaryote su- périeur en une grande quantité qui ne pouvait être obte- nue par les procédés de l'art antérieur. De plus, la protéine désirée accumulée en une grande quantité dans le milieu de culture peut être fa- cilement récupérée et purifiée. La présente invention est expliquée plus en dé- tail dans les exemples qui suivent. Toutefois, ces exem- * ples ne peuvent être considérés comme susceptibles de limiter la portée de la présente invention. EXEMPLE 1 Construction d'une souche de B. subtilis portant un gène pour la stimulation de taux de protéase extra-cellulaire dans son ADN génomiaue: Dans cet exemple, on utilise la souche B. sub- tilis MT-400(FERM BP-1078). Cette souche est une souche déficiente en protéase neutre et alcaline extra-cellu- laire préparée génétiquement et ses activités de protéa- se extra-cellulaire correspondent à 5 % ou moins de cel- le de la souche de type sauvage en ce qui concerne les activités de protéase extra-cellulaire. Un gène pour la stimulation de taux de protéase extra-cellulaire est introduit dans la souche de B. sub- tilis MT-400 selon le processus suivant: Tout d'abord, le plasmide pNP181 (référence ) dans lequel un gène pour la stimulation de taux de protéase extra-cellulaire est clone, est préparé à par- tir de la souche B. subtilis MT-0181(FERM BP-343) por- tant le plasmide pNP181, par la méthode de Gryczan et coll. Pour cette préparation, on utilise des cellules de B. subtilis MT-0181 ayant poussé dans un litre de milieu LB à 30'C pendant 12 heures. Les sites de clivage par des endonucléases de restriction du plasmide ainsi obte- nu sont analysés en traitant le plasmide avec différen- tes endonucléases de restriction. Donc, le plasmide pré- paré est identifié pNP181. Â1 Séparément, on prépare une culture compétente de la souche de B. subtilis MT-400 selon le procédé de Sai- to et coll. (référence 17). Puis, on ajoute 0,5 pg du plasmide pNP181 à la culture compétente (500 pl) et le mélange est incubé à 37C pendant 1 heure. Après l'incubation, l'ensemble de la culture (500 pl) est ajouté à 20 ml de milieu de sporulation de Schaeffer (référence 11) additionnés de 5 pg/ml de kana- mycine puis on poursuit l'incubation à 37C pendant 24 heures. Ensuite, on extrait une portion de 1,5 ml de la culture en tant qu'échantillon et on la chauffe à 70'C pendant 10 minutes. Après le traitement thermique, la 4 5 6 culture est diluée 10, 10 et 10 fois avec du milieu salin puis on transfère 100 pl de chaque solution diluée sur des plaques TBAB (produit de la Société Difco). Les plaques inoculées sont incubées à 37'C jusqu'au lendemain puis les colonies ayant poussé sur les plaques sont transférées à la fois sur des plaques TBAB fraiches et sur des plaques TBAB fraîches contenant pg/1 de kanamycine pour tester la résistance à la ka- namycine. Les plaques inoculées sont encore incubées à 37C pendant 15 heures. Lorsque l'incubation est terminée, 200 colonies ayant poussé sur les plaques TBAB mais non sur les pla- ques TBAB-kanamycine sont sélectionnées et transférées sur des plaques de caséine-gélose (référence 12). Les plaques sont incubées à 37C pendant 60 heures pour tes- ter les activités de protéase extra-cellulaire. Après l'incubation de 60 heures, la formation d'un halo autour de chaque colonie ayant poussé sur les plaques est observée. Sauf pour une colonie, 199 colo- nies forment des halos clairs autour d'elles. La colonie qui ne forme pas de halo est désignée comme étant la souche B. subtilis MT-430(FERM BP-1079). Lorsque la souche B. subtilis MT-430 est culti- vée dans un bouillon de Penassay (produit de la Société Difco), on observe que les cellules dans la phase de croissance logarithmique sont de longs filaments. Ce changement morphologique est caractéristique des cellu- les de B. subtilis transformées par le plasmide pNP181. Séparément, la perte du plasmide dans la souche MT-430 est confirmée par le procédé de préparation alca- line de plasmide (référence 14). Etant donné que la souche B. subtilis MT-400 portant le pNP181 ne forme pas de halo sur la plaque de caséine et présente le changement morphologique mention- né plus haut, similaire à la souche MT-430 et étant don- né que la souche MT-430 ne porte pas de plasmide, on considère que la souche MT-430 retient le gène de la stimulation de taux de protéase extracellulaire dérivé du plasmide pNP181 dans son ADN génomique. De plus, les présents inventeurs ont confirmé que l'ADN génomique de la souche MT-430 ne pouvait pas transformer une souche sauvage de B. subtilis en ce qui concerne les activités de protéase extra-cellulaire en une souche surproduisant la protéase. Ainsi, on a conclu de cette analyse génétique que le gène de la stimulation de taux de protéase extra- cellulaire existe dans l'ADN génomique de la souche B. subtilis MT-430. EXEMPLE 2 Introduction d'un ADN recombinant contenant une combi- naison de qène de Protéase extra-cellulaire et de qène d'hormone de croissance humaine dans la souche B. subti- lis MT-430: On utilise en tant qu'ADN recombinant pour la sécrétion d'hormone de croissance humaine le plasmide phGH427 (figure 1). Ce plasmide contient un premier fragment d'ADN comprenant le promoteur, la région codant pour le pré-peptide et une portion de la région codant pour le pro-peptide (composée de 63 nucléotides codant pour 21 amino-acides), toutes ces régions étant dérivées du gène de la protéase neutre de P. amvloliguefaciens; et un second fragment d'ADN joint au côté aval (3') du premier fragment d'ADN qui comprend une séquence d'ADN codant pour l'hormone de croissance humaine mature. Le plasmide phGH427 est construit par le procédé comprenant les étapes consistant à traiter le plasmide pNP150 (construit précédemment par les présents inven- teurs: référence 13), dans lequel on a cloné le gène de la protéase neutre de B. amyloliquefaciens, avec l'exo- nucléase Bal 31 en hydrolysant le plasmide à partir du site de clivage pour l'endonucléase de restriction Pvu I situé dans la région codant pour le prépro-peptide du gène de protéase neutre et à joindre le fragment d'ADN -résultant à un fragment d'ADN comprenant le gène codant pour l'hormone de croissance humaine mature au moyen d'un fragment d'ADN portant des sites de restriction dé- finis, appelé "linker". Le plasmide pNP150 utilisé dans le processus ci- dessus est préparé à partir de B. subtilis MT-0150(FERM BP-425) selon la méthode traditionnelle, et le fragment d'ADN comprenant le gène de l'hormone de croissance hu- maine est synthétisé chimiquement sur la base de la sé- quence nucléotidique connue publiquement, codant pour l'hormone de croissance humaine mature (référence 16). La souche B. subtilis MT-430 est transformée par le plasmide phGH427 par transformation de protoplaste. Puis, 50 colonies sont sélectionnées parmi les transfor- mants résistants à la kanamycine résultants. Des cellules de chaque colonie sélectionnée sont mises en suspension dans du milieu LB, et la suspension résultante est incubée en la secouant, à 30C pendant 15 heures. Lorsque l'incubation est terminée, le surnageant de chaque culture est récupéré et l'accumulation d'hor- mone de croissance humaine dans les surnageants de cul- ture est examinée par immuno-essai enzymatique et détec- tée par l'essai de double immunodiffusion. On montre que toutes les colonies sélectionnées sont capables de sé- créter l'hormone de croissance humaine. L'un des transformants résultants capables de sécréter l'hormone de croissance humaine est désigné par B. subtilis MT-430 (phGH427)(FERM BP-1080) et la produc- tion sécrétoire de l'hormone de croissance humaine en utilisant cette souche est étudiée dans l'exemple sui- vant. EXEMPLE 3 Production sécrétoire d'hormone de croissance humaine en utilisant la souche B. subtilis MT-430(phGH427) en tant Qu'hôte: La souche B. subtilis MT-430(phGH427) et la sou- che B. subtilis MT-400(phGH427) utilisée en tant que té- moin, obtenue par transformation de la souche B. subti- lis MT-400(FERM BP-1078) par le plasmide phGH427 selon le procédé décrit dans l'exemple 2, sont cultivées sépa- rément en secouant dans 100 ml de milieu LB, à 30'C pen- dant 17 heures. Lorsque la culture avec secouements est termi- née, les cellules sont récupérées par centrifugation et mises en suspension dans un milieu LB frais doublement concentré. Puis on poursuit la culture avec secouements à 30'C. Après 8 heures, les densités cellulaires (A660) des deux cultures atteignent 9,86 et 10,00, respective- ment, et les pH de leurs surnageants de culture sont de 8,06 et 7,98, respectivement. Puis, on étudie l'accumulation d'hormone de croissance humaine dans leurs surnageants de culture par immuno-essai enzymatique et on la détecte par un essai de double immunodiffusion. Les résultats de l'essai im- muno-enzymatique montrent que la souche MT-430(phGH427) accumule 205 mg/l de milieu de culture d'hormone de croissance humaine, tandis que la souche MT-400(phGH427) accumule 30 mg/l de milieu de culture d'hormone de croissance humaine. Dans l'essai de double immunodiffusion, l'hormo- ne de croissance humaine sécrétée par les deux transfor- mants ne peut être distinguée de celle dérivée de l'hy- pophyse humaine. La souche B. subtilis MT-430(pHGH427) est culti- vée à 30'C pendant 17 heures et on prépare un surnageant de culture. Puis on ajoute de l'acide trichloroacétique à 100 pl du surnageant de culture pour obtenir un préci- pité. Le précipité résultant est recueilli et dissous encore dans une solution tampon pour échantillon et sou- mis à une électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide selon Laemmli (référence 15). Le résultat montre que 20- 30 % du précipité est de l'hormone de croissance humai- ne. Comme décrit dans les exemples ci-dessus, il est clair que la présente invention permet de produire effi- cacement une protéine étrangère, en une grande quantité, dans un système hôte-plasmide recombinant, comprenant une combinaison de la souche B. subtilis MT-430 en tant qu'hôte et un plasmide recombinant pour la sécrétion de la protéine étrangère désirée contenant la région impli- quée dans l'expression du gène et la sécrétion de la protéine qui est dérivée d'un gène de protéase neutre extra-cellulaire d'une bactérie du genre Bacillus. Le niveau ou taux d'accumulation de la protéine sécrétée, qui ne pouvait être atteint selon l'art antérieur en utilisant B. subtilis, peut être obtenu par la présente invention. 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Souche de Bacillus subtilis à activité de protéase extra-cellulaire réduite, caractérisée en ce qu'elle résulte de l'introduction d'un gène pour la sti- mulation de taux de protéase extra-cellulaire, dérivé d'une bactérie du genre Bacillus dans l'ADN génomique d'une souche de Bacillus subtilis réceptrice dont l'ac- tivité de protéase extra-cellulaire est déjà réduite, pour réduire encore l'activité de protéase extra-cellu- laire résiduelle de ladite souche réceptrice. 2. Souche de Bacillus subtilis selon la revendi- cation 1, caractérisée en ce que l'un des brins du gène pour la stimulation de taux de protéase extra-cellulaire comprend la séquence nucléotidique suivante: GTGTCACGCA GATACTTTTA CACATACTTT TCGGTGAAAA ATCCCGCAAA AACGTTTACA CTATTAGTAA CAGATCAAAT ACCTAGGACT CGTTCACCAT ACACAATTCA TTGATCTTTC AAAAAAAGGA GTGTGGAAAC GGTGGAAAAG AAATTAGAAG AAGTAAAGCA ATTATTATTC CGACTTGAAA ATGATATCAG AGAAACAACC GACTCATTAC GAAACATTAA CAAAAGCATT GATCAGCTCG ATAAATTCTC ATATGCAATG AAAATTTCTT AAAAAGACTT GGAAACAAGT CTTTTTTTTG TGCATTTTTC ACCCATTTCA TGGATAAAGT ATTATACGAT 3. Souche de Bacillus subtilis selon la revendi- cation 1 ou 2, caractérisée en ce que la bactérie du genre Bacillus est B. amyloliquefaciens. 4. Souche de Bacillus subtilis selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'activité réduite de protéase comprend des activités de protéase neutre et alcaline extra-cellulaire. 5. Souche de Bacillus subtilis selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'activité réduite de protéase est une activité de protéase neutre extra-cellulaire. 2604T26 6. Souche de Bacillus subtilis selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'activité réduite de protéase est une activité de protéase alcali- ne extra-cellulaire. 7. Souche de Bacillus subtilis ayant le numéro de dépôt FERM BP-1079. 8. Procédé pour réduire encore l'activité de protéase extra-cellulaire résiduelle d'une souche de B. subtilis déficiente en activité de protéase extra-cellu- laire, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à introduire un gène pour la sti- mulation de taux de protéase extra-cellulaire, lequel gène est dérivé d'une bactérie du genre Bacillus, dans l'ADN génomique de ladite souche de B. subtilis. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'un des brins du gène pour la stimulation de taux de protéase extra-cellulaire comprend la séquence nucléotidique suivante: GTGTCACGCA GATACTTTTA CACATACTTT TCGGTG"AAAA 2) ATCCCGCAAA AACGTTTACA CTATTAGTAA CAGATCAAAT ACCTAGGACT CGTTCACCAT ACACAATTCA TTGATCTTTC AAAAAAAGGA GTGTGGAAAC GGTGGAAAAG AAATTAGAAG AAGTAAAGCA ATTATTATTC CGACTTGAAA ATGATATCAG AGAAACAACC GACTCATTAC GAAACATTAA CAAAAGCATT GATCAGCTCG ATAAATTCTC ATATGCAATG AAAATTTCTT AAAAAGACTT GGAAACAAGT CTTTTTTTTG TGCATTTTTC ACCCATTTCA TGGATAAAGT ATTATACGAT 10. Procédé selon la revendication 8 ou'9, carac- térisé en ce que la bactérie du genre Bacillus est B. amvloliauefaciens. 11. Procédé selon l'une des revendications 8 à , caractérisé en ce que l'activité réduite de protéase comprend des activités de protéase neutre et alcaline extra-cellulaire. 12. Procédé selon l'une des revendications 8 à , caractérisé en ce que l'activité réduite de protéase est une activité de protéase neutre extra-cellulaire. 13. Procédé selon l'une des revendications 8 à , caractérisé en ce que l'activité réduite de protéase est une activité de protéase alcaline extra-cellulaire. 14. Procédé pour produire une protéine désirée comprenant essentiellement les étapes consistant à in- troduire un plasmide recombinant qui est construit en joignant un gène codant pour la protéine désirée à un gène de protéase extra-cellulaire d'une bactérie du gen- re Bacillus ou à une séquence d'ADN dérivée dudit gène de protéase extra-cellulaire, de sorte que le gène co- dant pour la protéine désirée puisse-être exprimé et que la protéine désirée puisse être sécrétée dans B. subti- lis, dans la souche de B. subtilis selon l'une des re- vendications 1 à 7, et à cultiver les transformants ain- si obtenus. 15. Procédé selon la revendication 14, caractéri- sé en ce que le gène de protéase extra-cellulaire utili- sé pour la construction du plasmide recombinant est un gène de protéase neutre extra-cellulaire. 16. Souche de B. subtilis FERM BP-1080 portant le plasmide recombinant phHG427 pour la sécrétion de l'hor- mone de croissance humaine.