FR 2600655 A1 19871231 FR 8609476 A 19860630 L FRACTION FROTEIQUE EXTRAITE DES ACTIVITES FACTEJURg DE CROISSANCE. OBTENTION ET APPLICATION COMME AGENT DE STIXULATION ET DE POTENTIALISATION DES ACTIVITES FACTEURS D; CROISSANCE La présente invention se rapporte à une nouvelle fraction protéique extraite des activités facteurs de croissance, aux procédés qui permettent de l'obtenir, ainsi qu'à son application comme agent de stimulation et de potentialisation des facteurs de croissance. Dans la littérature, on a décrit des activités facteurs de croissance qui sont obtenues a partir d'un grand nombre de tissus, notamment a partir de l'hypophyse, du cerveau, de l'hypothalamus, de la rétine et de différents tissus oculaires, du cartilage et des chondrosarcomes, et 15 également du rein, du foie, du placenta, du corpus lutéum, des muscles, etc. Il ressort de- nombreux travaux de recherches que la plupart de ces facteurs appartiennent à deux groupes ayant ces activités. Ces protéines ont été séparées et caractérisées par différents procédés de purification, et leur structure primaire a été élucidée. Le premier groupe de ces protéines a été décrit sous les noms de FGF (ou basic FGF), AGF2 (astroglial growth 25 factor), EDGFI, PHBGF (bêta heparin binding growth factor>; quant au deuxième, il a été décrit sous les noms de ECGF, acidic FGF, AGFI, EDGFII, RDGF (retinal derived growth factor),O-HBGF. Par simplification, ces facteurs de croissance connus seront dénommés bFGF et'aFGF. A titre de références bibliographiques concernant les facteurs de croissance, on citera Roy R. Lobb et al dans "Analytical Biochemistry 154, 1-14 (1986) et J. Courty et al dans "Biochem. Biophys. Res. Commun., 136, 102-108 (1986)" Dans la présente description, l'expression 35 "activites facteurs-de croissance" désigne des extraits contenant des composés capables d'agir sur la prolifération 9938FR cellulaire. Les références bibliographiques sus-mentionnees décrivent également les méthodes de mise en évidence de l'activité biologique de ces facteurs de croissance. Il a maintenant été découvert qu'en réalisant des chromatographies, sur des résines particulières, des activités facteurs de croissance, on pouvait isoler une fraction protéique distincte des facteurs de croissance, cette fraction protéique présentant la propriété intéressante de stimuler l'activité biologique de ces 10 facteurs de croissance. Cette fraction protéique, son obtention et ses applications font donc l'objet de la présente invention-. La fraction protéique selon la présente invention est caractérisée par le fait que son poids moléculaire est 15 déterminé comme étant de 20 000 daltons environ en électrophorèse en condition non réductrice, laquelle fournit un spectre & bande unique et comme étant de 19 000 daltons environ en électrophorése en condition réductrice, laquelle fournit un spectre à deux bandes, et que, par la méthode de 20 chromatographie en phase liquide haute performance phase inverse, elle fournit un spectre à trois pics. Sa composition en acides aminés, déterminée après hydrolyse acide et avant HFLC phase inverse est donnée dans le tableau suivant: :35 99;8FR TABLEAU Composition en acides aminés de la fraction protéique selon l'invention (calculée par rapport à un poids moléculaire de 19 OOC daltons) 15 20 Acide amine Nombre de résidus par molécules Asx 12 Glx 18 Ser 15 His 5 Gly 23 Thr 11 Arg 15 Ala 14 Tyr 4 Met 3 Val 6 Phe 6 Ile 4 Leu 9 Lys 26 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Cette composition indique que la fraction protéique selon la présente invention est différente des 30 facteurs de croissance aFGF et bFGF et qu'elle est caractérisée par la présence d'un nombre important de résidus lysine. En outre, la fraction protéique selon l'invention peut également être caractérisée par le fait qu'elle possède 35 la propriéte de stimuler les facteurs de croissance. 9938FR La présente invention porte également sur chacune des trois sousfractions résultant d'une séparation par la technique de HPLC de la fraction protéique qui a été définie ci-dessus On indiquera ci-apres trois procédés permettant d'obtenir la fraction protéique selon l'invention. Un premier procéde pour obtenir la fraction protéique selon l'invention comprend les étapes consistant à: (al) purifier un facteur de croissance, par chromatographie d'affinité sur une résine (I), afin d'obtenir une fraction F constituée par des traces du facteur aFGF et la fraction protéique recherchée, en réalisant une élution avec un tampon pH neutre, d'une force ionique 15 équivalente à celle d'une solution de NaC1 voisine de 1M, la résine I étant à base de polysaccharides sur lesquels est fixée de l'héparine. (L'héparine est un mélange de glycosaminoglycanes extraits de l'intestin de porc et présentant une large distribution de poids 20 moléculaires; l'héparine purifiée utilisée est majoritairement constituée d'une séquence linéaire de disaccharide d'acide a-L-idopyrannuronique-2 sulfate et de 2-déoxy-2-sulfamino-a-D-glucopyrannose-6-sulfate); et (b2> purifier la fraction F précitee, par chromatographie d'affinité sur une résine Ii, afin d'obteni6"a fraction protéique recherchée, en réalisant une élution avec un tampon pH neutre, d'une force ionique équivalente à celle d'une solution de NaCl voisine de 2M, la résine II étant constituée d'un dextrane réticulé qui présente des fonctions carbox:yméthyle, eventuellement des fonctions carboxymethylbenzylamide, et qui présente egalement des fonctions carboxyméthylbenzylamide suLfonate, et dont le comportement biologique est celui 3S5 de l'héparine C'38 P On utilise, comme matériel de départ, un facteur de croissance d'origine humaine ou bien un facteur de croissance d'origine animale. En particulier, on peut mentionner un facteur de croissance issu du cerveau humain. 5 Conformement à un mode de réalisation préféré, la première chromatographie, c'est-à-dire celle effectuée sur la résine I, s'effectue sur un extrait acido-soluble de cerveau humain. Cet extrait peut être obtenu par la succession 10 d'étapes suivantes: broyage du cerveau humain en tampon phosphate à pH neutre; - obtention des protéines par précipitation au sulfate d'ammonium entre 20 et 60%; isolement des protéines restant solubles en milieu acide, au voisinage de pH 3; et - dialyse contre un tampon à pH neutre. Dans la première chromatographie d'affinite, les meilleurs résultats ont été obtenus avec une résine I commercialisée sous la dénomination "Heparin Sepharose" par la Societé "Pharmacia". Dans la deuxième chromatographie d'affinité, les meilleurs résultats ont eété obtenus avec une résine II du type de celle décrite dans la publication de H. Mauzac, N. 25 Aubert et J. Jozefonvicz: "Antithrombic activity of some polysaccharide resins", Biomaterials, 1982, 3, 221-224, en particulier avec la résine "Sephadex carboxyméthylbenzylamide sulfonate", qui possède une activité "heparin-like" de 0,2 UT/mg et dont la structure 30 est un polymère constitué par les motifs suivants: 9938FR O O O CH2 CH2 CH2 COO- Na+ CO CO I I NH NH IO I i CH10 CH2 CH2 [t t NH S-NH + [COO-]=81 oo3 Na [S5] 9 / Un deuxième procédé pour obtenir la fraction protéique sel-on la présente invention, consiste à réaliser une purification identique à celle effectuée à l'étape protéique obtenue sera relativement moins pure. Le choix préféré du matériel de départ et celui de 25 la résine I sont les mêmes que ceux décrits en référence au premier procédé. Un troisième procédé pour obtenir la fraction protéique selon la-présente invention consiste à purifier un facteur de croissance, par chromatographie d'affinité sur la 30 résine II telle que définie cidessus, afin d'obtenir ladite fraction protéique, en réalisant une élution avec un tampon pH neutre, d'une force ionique équivalente à celle d'une solution de NaCl voisine de 2X. L'intérêt de ce procède est que les facteurs de croissance aFGF et bFGF sont faiblement retenus sur la résine II, la fraction protéique recherchée s'adsorbe sur la colonne de chromatographie à 0,653 NaCl (ou 9938FR une force ionique équivalente) et est éluée à 2M NaCl séparation de la fraction recherchée. Le choix préféré du materiel de départ et celui de la resine II sont les mêmes que ceux décrits en référence au premier procédé. Comme indiqué ci-dessus, la technique de HPLC permet de séparer la fraction protéique selon l'invention,que l'on obtient par l'un ou l'autre des 10 procédés susindiqués, en trois sous-fractions. Dans ce qui suit, on décrit l'obtention de la fraction protéique selon l'invention à partir d'un extrait acido-soluble d'un facteur de croissance issu du cerveau 15G humain,conformément aux deux premiers procédés mentionnés ci-dessus, ainsi que la mise en évidence de son activité stimulatrice et potentialisatrice de l'activité biologique des facteurs de croissance. I - OBTENTION DE LA FRACTION PROTEIQUE SELON L'INVENTION Ia - MISE EN OEUVRE DU PREMIER PROCEDE (a) Préparation de l'extrait acido-soluble de cerveau. Toutes les opérations ont lieu à 4'C.4 kg de tissus sont homogénisés à l'aide d'un broyeur Turax dans 1 1 de tampon PBS. Les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation à 10 000g pendant 45 mn (Rotor Beckmann JA 10). Le surnageant, appelé extrait brut, est ajusté à une concentration de 20% (NH4)2SO4 et centrifugé.45 mn à 10 000 g. Le deuxième surnageant est passé sur laine de verre, S0 afin d'éliminer les traces de lipides, puis ajusté à une concentration de 60% (NHa).:ISO., et centrifugé à 10 000 g pendant 45 mn. Le précipite obtenu est redissous dans un volume minimum de PBS (environ 400 ml) et la solution est ajustée à pH 3,2 avec de l'acide acétique glacial, puis immédiatement centrifugée pendant 30mn a 10 000 g. Le surnageant est reajuste à pH 7 avec de la soude concentrée 9 98FR et dialysé extensivement contre du PBS. La solution est ensuite centrifugée 30 mn à 20 000 g (Rotor Beckmann JA 20), afin d'eliminer toute trace de précipité. Ce dernier surnageant est appelé extrait acido-soluble. protéines et en activité biologique. La figure 1 du dessin annexé représente le chromatogramme obtenu. On constate l'existence: - d'une fraction de tête F {l,10}, éluée à 1M NaCl, suivie d - d'une fraction F, {11,25), encore luée à 1M NaCl; et - d'une fraction F. {30,40}, éluée à 2M NaCl. La figure 2 représente le spectre de ces trois fractions F, Fi et F.-, lequel a été obtenu par électrophorese en condition réductrice sur gel de polyacrylamide L'observation de ce spectre montre que la fraction F (iigne a) est constituée par une nouvelle fraction protéique, avec, à l'état de traces, le facteur h-aFGF, la fraction Fi correspondant au facteur h-aFGF (ligne b) et la fraction Fr au facteur h-bFGF (ligne c> (c) Chromatographie d'affinité sur la résine II (résine "Sephadex carboxyméthylbenzylamide sulfonate") La fraction F, recueillie à l'étape précédente, est ensuite soumise à une chromatographie d'affinité sur la résine II sus-indiquée. Le mode opératoire est le suivant: Urne colonne 2, 8 x 16 cm (100 ml) est équilibrée avec du PBS à un débit de 10 ml/h/cm:': 1 mg de proteines 9938FR par millilitre de résine est déposé sur le haut de la résine. Les protéines retenues sur la colonne sont eluees successivement par de:s solutions de PBS Tween 20 0,02%ajustées respectivement a 0,65M NaCl, 2, 15M NaCi, puis 6M urée. L'élution est réalisée par 250 ml de ces 3 solutions. Chaque fraction est collectée. Les quantités de protéines et d'activite biologique sont évaluées. Comme le montre la figure 3, qui représente le spectre obtenu en électrophorèse en condition réductrice sur gel de polyacrylamide, une protéine homogène, de poids moléculaire de 19000 daltons environ est obtenue par élution avec du tampon PBS-Tween 20 0,2%-NaCl 2M non retenue sur la résine précitée). Le chromatogramme obtenu en HPLC phase inverse de 20 5 pg de la fraction F, ainsi purifiée sur Heparin Sepharose, fait l'objet de la figure 4. Il comporte trois bandes éluées entre 24 et 26% d'acétonitrile, la bande centrale majoritaire représentant environ 50-600% du matériel élué. (Conditions de cette chromatographie: Colonne C=L taille des 25 pores: 300 ; éluant: H20/CH.CN/0O,l% d'acide trifluoroacétique). La purification est très satisfaisante, les résultats, exprimés à partir de lkg de matériel de départ,étant rapportés dans le Tableau ci-après. 9938FR Tableau Fractions Quantité de proteines(mg) Fraction acido-soluble 175 Fraction {1-10} (Heparin-Sepharose) 0,020 Chromatographie sur SCMBS.: -Fraction non retenue ( 0,65X NaCl) 0,004 -Fraction éluée ( 2M NaCl) 0,016 25 30 Ib - MISE EN OEUVRE DU SECOND PROCEDE On prépare un extrait acido-soluble de cerveau et on réalise la chromatographie d'affinité sur la résine I Heparin Sepharose, comme décrit aux points respectivement (a) et (b) de IA. On a analysé la fraction F obtenue en HPLC phase inverse. Le chromatogramme résultant fait l'objet de la figure 5. Il comporte trois bandes éluées entre 24 et 26% d'acétonitrile et fait apparaître une bande centrale majoritaire représentant environ 50 à 60% du matériel élué. (mêmes conditions de chronmatographie que celles indiquées au paragraphe Ia - point (c>; 56pg de la fraction {1-10}). II - KISE EN EVIDENCE DE L'ACTIVITE STINULATRICE DES FACTEURS DE CROISSANCE PRESENTEE PAR LA FRACTION PROTEIQUE SELON L'INVENTION 99.3 8FR Z1 Le test biologique-mis en oeuvre est base. sur la stimulation de cellules confluentes par des fractions contenant un facteur de croissance. L'évaluation de cette stimulation est faite par mesure de l'accroissement de la population cellulaire après incorporation d'un desoxynucléotide marque, la thymidine tritiée qui est détectée par comptage de la radio-activité. Les cellules sont ensemencées dans des puits d'une boîte de culture. Six jours plus tard, les cellules sont confluentes dans les puits tandis que le milieu est épuisé en sérum. C'est à ce stade que les facteurs de croissance peuvent être inoculés, afin de tester leur potentiel à stimuler les cellules dans les conditions optimales. (a) Protocole expérimental (Déroulement du test) Les facteurs de croissance h-aFGF ou h-bFGF avec ou sans la fraction protéique de l'invention, sont filtrés stérilement, sur filtre 0,22 im (Millex) et sont inoculés en triplicate sous des volumes de 10 à 50 il a 5 dilutions successives. 24 heures plus tard, on ajoute aux cultures l1Ci de thymidine tritiée (25 Ci/mM, CEA France), préalablement diluée avec du PBS stérile. L'incorporation de thymidine tritiee est arrétée après 4 h par aspiration du milieu de culture, suivie de deux rinçages avec du PBS. Les cellules sont ensuite lysées avec 500 pl de soude 0,IN. Chaque lysat est aspiré et dilué dans 3 ml de liquide scintillant (PACKARD INSTAGEL>. La radioactivité incorporée est mesurée à l'aide d'un compteur à scintillation liquide (LKB RACKBETA). Chaque comptage est 30 effectué pendant 60 secondes. (b) Expression des résultats Dans les conditions experimentales choisies, il existe une relation entre la quantité de facteur de croissance ajoutée au milieu et la quantité de radioactivité 35 incorporée par les cellules en culture dans ce milieu. On peut tracer une dose - réponse en exprimant la radioactivité 99383FR incorporée en fonction de la quantité de protéines ajoutées par millilitre de milieu de culture, l'axe des abcisses étant porté selon une échelle logarithmique. Des expériences ont fait apparaître que la fraction protéique selon l'invention ne possède en elle-même aucune activité sur la croissance des cellules BEL, CC1-39 ou FR-3 T3. En revanche, lorsqu'elle est ajoutée aux facteurs croissance h-aFGF et h-BFGF, à des concentrations du même 10 ordre de grandeur (ng/ml), elle accroît par un coefficient de 2 à 5 l'activité stimulatrice des facteurs de croissance. C'est ce que montrent les courbes dose-réponse des figures 6 à 8, les figures 6 et 7 illustrant l'effet potentialisateur de la fraction protéique selon l'invention 15 sur la stimulation respectivement des fibroblastes FR-3T3 et CCL-39 par les facteurs h-aFGF (A) et h-bFGF (B) en l'absence de sérum de veau foetal, et la figure 8 illustrant l'effet potentialisateur de la fraction protéique selon l'invention sur la stimulation des cellules BEL par le 20 facteur h-aFGF en présence d'héparine, et en absence de sérum de veau foetal (A) ou en présence de 6 % de sérum de veau foetal: Figures 6 et 7: e esans la fraction protéique de l'invention O o avec la fraction protéique de l'invention (2 ng/ml dans le cas de la figure 6 et 20 ng/1 dans le cas de la figure 7). Figure 8: o__ h-aFGF seul + - avec héparine 5 "g/ml m e avec héparine 5 pgi/ml et fraction protéique de l'invention 13 ng/l. L'examen de l'ensemble de ces figures 6 à 8 permet de constater que la fraction protéique de l'invention est capable de potentialiser l'effet stimulateur des facteurs 9938FR h-FGFs sur les trois types cellulaires précités, en présence ou en l'absence de sérum de veau foetal. La figure 8 montre également que la présence d'heparine aux concentrations utilisées est sans influence sur l'effet potentialisateur de la fraction protéique selon l'invention. Il a également été démontré que la fraction protéique selon l'invention présente la méme action sur les cellules bovines endothéliales de la cornée. 1O De plus, on a pu montrer que les sous-fractions correspondant à chacun des trois pics obtenus en HPLC présentaient la propriété de stimuler les facteurs de croissance.Leur utilisation, dans ce but, fait également l'objet de la présente invention. Les applications de la fraction protéique selon l'invention, ainsi que des trois sous-fractions précitées, sont toutes celles dans lesquelles sont impliqués les facteurs de croissance: pour la fabrication de milieux de culture; en cosmétologie; pour la cicatrisation de la peau 20 et de la cornée; dans des applications thérapeutiques, par exemple pour la potentialisation de l'effet angiogénique des facteurs de croissance. 9938FR Jr -REVENDICAIIQNS 1 - Fraction protéique, caractérisée par le fait que son poids moléculaire est détermine comme étant de 20000 dalton5 environ en électrophorèse en condition non réductrice, laquelle fournit un spectre à bande unique; et comme étant de 19000 daltons environ en électrophorèse en condition réductrice, laquelle fournit un spectre à deux bandes, et que, par la méthode de chromatographie en phase liquide haute performance, elle fournit un spectre à trois!0 pics. 2 - Fraction protéique selon la revendication 1, caractérisée par le fait que sa composition en acides aminés déterminée après hydrolyse acide et avant HPLC phase inverse (calculée par rapport à un poids moléculaire de 19000 daltons) est la suivante (acide aminé/nombre de résidus de l'acide aminé par molécule): Asx/12; Glx/18; Ser/15; His/5; Gly/23; Thr/!l; Arg/15; Ala/14; Tyr/4; Met/3; Vai/G; Phe/6; Ile/4; Leu/9; Lys/2G. 3 Fraction protéique selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée par le fait qu'elle possède la propriété de stimuler les facteurs de croissance. 4 - Chacune des trois sous-fractions résultant d'une séparation par la technique de HPLC de la fraction protéique telle que définie à l'une des revendications 1 à 3. - Procédé d'obtention de la fraction protéique telle que définie a l'une des revendications l1à 3, caractérisé par le fait qu'il comprend les étapes consistant 30 à: (al) purifier un facteur de croissance,, par chromatographie d'affinité sur une résine I, afin d'obtenir une fraction F constituée par des traces du facteur aFGF et la fraction protéique recherchée, en réalisant une élution avec un tampon pH neutre, d'une force ionique équivalente a celle d'une solution de NaCl voisine de IX, la résine I étant à base de polyssacharides sur lesquels est fixée de l'heparine; et (bt. purifier la fraction F précitée, par chromatographie d'affinité sur une résine II, afin d'obtenir la fraction protéique recherchée, en réalisant une élution avec un tampon pH neutre, d'une force ionique équivalente à celle d'une solution de NaCl voisine de 2X, la résine II étant constituée d'un dextrane réticulé qui présente des fonctions carboxyméthyle, éventuellement des fonctions carboxyméthylbenzylamide et qui présente également des fonctions carboxymêthylbenzylamide sulfonate, et dont le comportement biologique est celui de l'héparine. 6 - Procéde d'obtention de la fraction protéique 15 telle que définie à l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que l'on réalise une purification identique à celle effectuée à l'étape (al)> telle que définie à la revendication 5. 7 - Procédé d'obtention de la fraction protéique 20 telle que définie à l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que l'on purifie un facteur de croissance, par chromatographie d'affinité sur la résine II telle que définie à la revendication 5, en réalisant une élution avec un tampon pH neutre, d'une force ionique équivalente à celle d'une solution de NaCl voisine de 2X. 8 - Procédé selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé par le fait que l'on utilise,conmme matériel de départ, un facteur de croissance d'origine humaine. 9 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé 30 par le fait qu'on utilise, comme matériel de départ, un facteur de croissance issu du cerveau humain. - Procédé selon l'une des revendications 5 a 7, caractérisé par le fait que l'on utilise, comme matériel de départ, un facteur de croissance d'origine animale. 35 1 Dû 1! - Procédé selon la revendication 9, caractérisê par le fait qu'on utilise, comme materiel de départ, un extrait acido-solubIe de cerveau humain. 12 - Procédé selon la revendication 11, caractérise par le fait que l'on obtient l'extrait acidosoluble par la succession d'étapes suivantes:broyage du cerveau humain en tampon phosphate a pH neutre; - obtention des protéines par précipitation au sulfate 10 d'ammonium entre 20 et 60%: isolement des protéines restant solubles en milieu acide, au voisinage de pH 3; et - dialyse contre un tampon à pH neutre. 13 - Procédé selon l'une des revendications 5 et 15 6, caractérisé par le fait qu'on utilise, comme résine I, une résine "Heparin Sepharose" 14 - Procédé selon l'une des revendications 5 et 7, caractérisé par le fait que-l'on utilise, comme résine Il, une résine "Sephadex carboxyméthylbenzylamide sulfonate", qui possède une activité "heparin-like" de 0,2UT/mg et dont la structure est un-polymère constitué par les motifs suivants: i H^O- i Hob -i H(lO--CH2- CH2 H2 [t) t CH2 CH2 H COO - Na+ C ! CO NH N ! NH CH2 I Ch2 CH2 [coo-]:81 S0g Na+ [S0i]o N.+ - Utilisation de la fraction protéique telle que définie à l'une des revendications 1 à 3, et des trois sous-fractions telles que définies à la revendication 4 comme agent stimulateur ou potentialisateur des facteurs de croissance.