FR 2598511 A1 19871113 FR 8706384 A 19870506 259851 1 La présente invention a pour objet de manière générale une électrode destinée à détecter et/ou doser des constituants du sang et, plus précisément, une telle électrode qui offre un mécanisme de détection stable et 5 robuste adapté à là détermination des teneurs sanguines en glucose, dans des applications in vivo ou in vitro. L'électrode consiste essentiellement en un substrat d'oxyde d'iridium traité par un silane portant un film de glucose-oxydase lié par covalence. Une couche ou un film servant de revêtement externe protecteur, perméable au glucose et à l'oxygène est utilisà également, le film servant de revêtement externe protégeant la surface du film d'oxydase lié par covalence du contact direct avec le sang, tout en présentant de bonnes propriétés de transport du 15 glucose et de l'oxygène présents dans le sang. La détermination des teneurs sanguines en glucose est utile dans diverses applications. Une application particulière concerne l'utilisation par des diabétiques en association avec un système de pompe implantable 20 pour l'injection lente d'insuline. L'utilisation des pompes à insuline implantables est fréquemment indiquée pour des patients, en particulier les diabétiques dont l'état est traité ou stabilisé au mieux par l'utilisation de pompes implantables à injection lente d'insuline. Les 25 dispositifs de détection du glucose sont utiles en association avec ces pompes, puisque ces dispositifs de détection peuvent être utilisés pour déterminer des teneurs en glucose et donner une information utile au système pour contrôler l'administration d'insuline en 30 réponse à des variations réelles et/ou anticipées des teneurs sanguines en glucose. Par exemple, on sait que les teneurs en glucose varient en réponse à l'absorption d'aliments et de boissons, ainsi qu'à la fonction métabolique normale. Bien que certains diabétiques soient 35 capables de maintenir des teneurs en glucose-insuline convenables avec une injection classique d'insuline ou d'autres techniques d'administration d'insuline, certains sujets présentent des problèmes inhabituels donnant lieu au besoin: d'un système de contrôle pratiquement constant 5 du glucose afin de maintenir dans leurscorps un équilibre glucose-insuline approprié. L'électrode de la présente invention offre un moyen de déterminer la teneur immédiate en glucose dans le sang, la détermination étant utile pour ajuster la teneur en glucose à un moment donné, futur ou anticipé. De cette manière, les teneurs en glucose peuvent être ajustées de manière contrôlable ou réalisées d'une autre manière dans l'activité normale anticipée du sujet dont le système est en train d'être contrôlé. Une attention est portée aux retards qui sont propres à toutes les fonctions corporelles, en particulier les processus métaboliques, offrant ainsi un moyen de parvenir à un équilibre insuline-glucose convenable de manière prolongée. Par l'utilisation du dispositif de détection de la présente invention, les teneurs en glucose et/ou 20 en insuline peuvent être maintenues en équilibre convenable et à des teneurs désirées et appropriées, par injection lente au moment opportun de quantités appropriées d'insuline dans le système du patient. Les teneurs en glucose dans le courant sanguin 25 d'un patient varient au cours du temps et dépendent normalement de l'activité physique du sujet, de son absorption d'aliments, de boissons et de sucre, de son taux métabolique, ainsi que d'autres facteurs. En conséquence, des variations de l'équilibre insuline30 glucose se produisent en réponse directe à ces variables dépendantes du temps. Certaines pompes implantables pour l'injection lente d'insuline sont capables de fonctionner à des vitesses d'administration variables et/ou programmables, ces vitesses variant en réponse aux augmentations 35 et diminutions de la teneur en glucose détectée ainsi que 25985 11 de la teneur en glucose désirée. Exprimé d'une autre manière, les pompes d'injection lente à vitesse variable délivrent de l'insuline à une vitesse déterminée en partie par la teneur sanguine immédiate en glucose, et un dispo5 sitif de détection du glucose est utilisé pour fournir une information sous forme d'un signal indiquant la teneur immédiate en glucose dans le système du patient. D'autres facteurs ou informations utiles pour le fonctionnement des pompes d'injection lente à vitesse variable comprennent 10 le régime alimentaire et l'activité physique, l'activité passée immédiate et l'activité future étant considérées comme présentant de l'intérêt. Une pompe à injection lente convenablement programmée utilise une telle information, parmi d'autres, afin d'assurer son fonctionnement et d'aider le patient à maintenir un équilibre d'insuline convenable dans son système de manière prolongée. Le glucose, en tant que composé, est difficile à doser directement par électrochimie, puisque ses propriétés entraînent un comportement relativement médiocre 20 au cours de l'activité par oxydation et/ou réduction. De plus, les teneurs sanguines en glucose sont difficiles à déterminer dans la mesure o la plupart des mécanismes pour la détection et/ou la détermination des teneurs en glucose sont affectés par la présence d'autres constituants 25 ou composés normalement présents dans le sang. Pour ces raisons, il s'est révélé souhaitable d'utiliser divers enzymes et/ou autres matières protéiques qui offrent des réactions spécifiques avec le glucose et donnent des lectures et/ou des sous-produits qui permettent des analyses quantitatives. En conséquence, un certain nombre de techniques sont disponibles pour la détermination quantitative du glucose, comprenant la détermination quantitative du glucose dans le sang au moyen d'enzymes. Cependant, ces techniques ne sont normalement pas adaptables 35 à des applications in vivo et, pour la plupart, se révèlent d'adaptation difficile même pour de simples dosages in vitro. Plus récemment, des électrodes modifiées chimiquement ont été appliquées à certaines opérations de détection électrochimique. A ce propos, des enzymes ou d'autres protéines servant de réactifs peuvent être fixés par covalence à la surface d'une électrode, permettant ainsi de préparer une électrode simple qui peut être utilisée pour effectuer des'dosages électrochimiques par ampérométrie ou potentiométrie. On peut parvenir à des dosages 10' précis dans chaque mode de fonctionnement. La présente invention utilise un système d'électrode dans lequel un enzyme est lié par covalence à un substrat traité en surface, l'électrode étant stable, robuste et utile pour des dosages biologiques. La surface du substrat est en iridium oxydé auquel est appliqué un film traité par un silane, puis une couche de glucose-oxydase est liée par covalence à la surface du substrat traitée. Un revêtement protecteur sous forme d'un film de caoutchouc de silicone est de préférence appliqué à l'enzyme lié par covalence, ces films assurant 20 le transport du glucose et de l'oxygène pour des détermi- nations quantitatives convenables et précises. Conformément à la présente invention, une électrode est proposée pour la détection du glucose, l'électrode fonctionnant sur une base ampérométrique. 25 L'électrode comprend un substrat en iridium ayant une surface oxydée à laquelle un certain nombre de films sont liés successivement - le premier film étant constitué de gammaaminopropyltriéthoxysilane traité par un silane, et le second film étant constitué de glucose-oxydase qui est lié par covalence au substrat. Un film de revêtement, tel qu'un film de caoutchouc de silicone, est formé et/ou appliqué sur la surface externe de la couche de glucose-oxydase. Le système d'électrodes, lorsqu'il est immergé dans du sang, donne un signal indiquant la concentration en glucose et, en conséquence, est utile 25985 11 comme dispositif de détection du glucose sanguin dans diverses applications. Une application particulièrement utile concerne l'association avec une pompe implantable, à vitesse variable ou programmable, d'injection lente d'insuline. Des pompes implantables, à vitesse variable, pour l'injection lente d'insuline sont bien sur actuellement connues et des dispositifs électroniques sont disponibles pour programmer l'activité de la pompe de manière à fournir un taux souhaitable et approprié 10 d'insuline dans le sang du patient à n'importe quel moment. Les possibilités de programmation de la pompe implantable d'injection lente tiennent compte ou s'adaptent d'une autre manière à l'activité journalière normale anticipée du patient, comprenant l'ingesLion 15 d'aliments et de boissons, les périodes d'exercice, les périodes de repos, etc. Le fonctionnement de la pompe d'injection lente, comprenant la vitesse d'administration d'insuline au patient, est ajusté, au moins en partie, par le dispositif de détection du glucose sanguin, dispo20 sitif de détection donnant une indication de la teneur immédiate en glucose dans le sang du patient. En conséquence, un objectif essentiel de la présente invention consiste à proposer un système d'électrode perfectionné qui est particulièrement adapté 25 à la détermination des teneurs ou concentrations sanguines en glucose, système convenant pour des applications in vitro ou in vivo. Un autre objectif de laprésente invention consiste à proposer un dispositif d'électrode perfec30 tionné qui est particulièrement avantageux pour la détermination d'une concentration sanguine en glucose dans des applications in vitro ou in vivo, et dans lequel l'électrode indicatrice est fiable, stable et robuste. Encore un autre objectif de la présente invention consiste à proposer un procédé et une technique pour la préparation d'un dispositif de détection du glucose qui est particulièrement adapté à donner un signal électrique sensible aux teneurs sanguines en glucose, et dans lesquels le dispositif de détection convient pour l'utilisation en association avec une pompe à vitesse variable d'injection lente d'insuline. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre, faite en regard du dessin 1.0 annexé, sur lequel - la figure uique est un graphique de l'intensité du courant en fonction de la concentration en glucose, utilisant le système d'électrodes de la présente invention. Un substrat d'iridium est choisi à partir d'une 15 longueur de filament d'iridium ayant un diamètre de 0,0508 à 0,1270 mm, muni d'une lame plate, généralement rectangulaire, fixée à son extrémité distale. La lame est généralement carrée ou rectangulaire, et est d préféreme u carré d'environ 10 mm. Le filament d'iridium et la lame qui y est fixée sont alors munis d'un revêtement in situ d'oxyde d'iridium par traitement thermique à l'air, à une température de 700 C. Bien que des couches d'oxyde d'iridium thermique soient généralement préférées, il faut noter que des couches d'oxyde d'iridium préparées par voie 25 électrolytique peuvent également être utilisées avec succès. Le substrat d'iridium revêtu d'oxyde est alors immergé dans une solution de gamma- aminopropyltriéthoxysilane (30 % en volume) dans l'hexane à 700C pendant une heure, pour obtenir le dépÈt sur le substrat d'un film d'alumine traité par un silane. L'électrode traitée par un silane est rincée avec de l'eau désionisée et traitée avec une solution de glutaraldéhyde à 2,5 % dans un tampon au phosphate à pH 7,4 pendant une durée d'une heure à température ambiante. L'électrode traitée au glutaraldéhyde est alors rincée et traitée avec une solu- ?598511 tion aqueuse de glucose-oxydase contenant 140 unités/cm3, dans une solution de tampon au phosphate à pH 7,4. La mise en contact avec la glucose-oxydase donne un film de glucose-oxydase lié par covalence à l'électrode d'iridium/oxyde d'iridium. EXEMPLE 1 Un fil d'iridium de 0,0508 mm avec une lame carréede mm côteet 0,050 est immenrgédans l'ide slfuiqe dcaud pour éliminer tout revêtement d'oxyde en surface. Si 10 nécessaire, les composants sont alors dégraissés avec de l'acétone. Le fil d'iridium est alors soudé par points à la lame d'iridium servant d'électrode. Le fil servant de composant est normalement aplati à une extrémité pour accroître l'aptitude de liaison, l'aplatissement étant 15 effectué à l'étau ou bien par martelage. Les surfaces à souder l'une à l'autre sont bien sûr propres et dépourvues d'oxyde ou de graisse en surface. Afin de préparer les électrodes pour le soudage, les surfaces de contact sont initialement nettoyées avec du papier de verre N 500, puis essuyées avec de l'acétone. Un appareil de soudure par points ayant des électrodes classiques de 3,2 mm de diamètre est approprié pour l'opération, une énergie de 12 à 15 watts/seconde étant fournie à des intervalles d'impulsions courtes. L'électrode d'iridium soudéeest alors plongée dans une solution de bicarbonate de sodium saturée ou bien, en variante, de KOH 0,1M. L'électrode est alors chauffée dans un four à l'air, à une température comprise entre 600 C et 700 C pendant une minute. Le chauffage est 30 effectué dans un plateau en alumine, l'électrode étant placée de manière que la portion en forme de lame ne soit pas en contact direct avec le plateau ou les parois du four chaud. On sort alors l'électrode oxydée de la zone de chauffage et on la laisse refroidir à température ambiante 35 en une durée de 6 à 10 minutes. 1 5 20 25 3 0 35 Les étapes de trempage dans du bicarnat e de sodium, de chauffage et de refroidissement sont rdpztêes jusqu'à formation sur la surface d'un film unifcrme d'oxyde d'iridium noir-bleuâtre. Normalement, 4 a, de ces cycles répétés sont utilisés. Après formation de l'oxyde d'iridium, l'électrode est soumise à une ébullition dans de l'eau distillée pendant 30 minutes, et elle est alors prate pour le traitement avec le gammaaminopropyltri-és'oxysilane. Le traitement dans un silane comprend une immersion dans une solution de aamma-aminopropyltriéthcxvsilane à 30 % en volume dans l'hexane, la solution étant chauffée à une température de 70 C. L'immersion est poursuivie pendant une heure. Après élimination de la solution de silane, l'électrode traitée par un silane est rincée avec de l'eau désionisée, puis immergée dans une solution de glutaraldéhyde à 2,5 % dans un tampon au phosphate à pH 7,4 pendant une heure. L'opération de traitement au glutaraldéhyde est suivie par un rinçage dans l'eau désionisée, puis l'électrode est immergée dans une solution aqueuse de glucose-oxydase à 140 unités/cm3, dans une solution de tampon au phosphate à pH 7,4. Les tampons au phosphate utilisés dans cette opération sont de préférence des mélanges de phosphate monosodique et de phosphate disodique à une concentration d'environ 0,1 M, les rapports étant ajustés de manière à obtenir un pH égal à 7,4. Afin de terminer la préparation de l'électrode de travail, un film de caoutchouc de silicone est appliqué sur la surface du film de glucoseoxydase lié par covalence. Plus précisément, le caoutchouc de silicone disponible auprès de Dow Chemical Corp. de Midland, Michigan, disponible dans le commerce sous la désignation de code "Silicone Type A, Silastic Medical Adhesive" peut être utilisé. Ces films, possédant des épaisseurs comprises entre environ 0,0762 et 0,2032 mm sont utiles, une épaisseur de film d'environ 0,1270 mm étant préférée. Ces films, tout en protégeant la surface des matières comportant de la glucose-oxydase de l'exposition ou du contact direct avec le sang, fournissent néanmoins un mécanisme de transport du glucose et de l'oxygène présents dans le sang. L'électrode résultante donne une réponse FEM 10 forte au glucose. Plus précisément, la réponsede l'électrode aux variations de concentration de glucose normalement rencontrées dans le sang a été mesurée à approximativement 90 mV/facteur 10 de variation de concentration en glucose. De même, la surface d'oxyde 15 d'iridium peut être réoxydée de manière réversible en oxyde d'iridium, l'intensité du courant d'oxydation s'étant révélée également proportionnelle à la concentration en glucose. La figure 1 est un graphique de l'intensité 20 du courant en fonction de la concentration en glucose, en utilisant le système d'électrode de la présente invention. L'intensité du courant est exprimé en A x 109, avec des concentrations croissantes, la concentration en glucose étant exprimée en g/dl. Les intensités de sortie 25 du courant ont été déterminées à température ambiante en utilisant un tampon au phosphate à pH 7,4, 50 ml KH2PO4 0,1 M + 39,1 ml NaOH 0,1 M + 8,8 g NaCl (la solution résultante a une molarité égale à 0,15 dans NaCl. La tension est égale à 0,031 par rapport à une électrode au 30 calomel saturée. Le système d'électrodes à la glucose-oxydase est-utilisable par rapport à des électrodes au calomel et également des électrodes argent/chlorure d'argent. L'électrode de la présente invention offre des 35 avantages pour des déterminations de teneurs sanguines en glucose invivo ainsi qu'in vitro. La réponse électrique, plus précisément la réponse ampérométrique, s'est révélée être spécifique des concentrations en glucose et, en conséquence, le système d'électrodes présente une utilité 5 pour l'utilisation comme dispositif de dosage du glucose. Le film de glucose-oxydase est robuste et durable, étant lié par covalence à la surface de l'électrode, les autres films utilisés conjointement avec ce film composite présentant également des propriétés avantageuses 10 d'adhérence et de cohésion. La surface d'oxyde formée sur le substrat d'iridium est également avantageuse en raison de sa nature poreuse, contribuant ainsi en outre à la stabilité, la fiabilité et la robustesse du produit résultant. 1 1 REVENDICATIONS 1. Dispositif de détection du glucose, caractérisé en ce qu'il est destiné à engendrer in vivo un signal électrique en réponse à la présence de glucose dans le courant sanguin et à déterminer ainsi électriquement des concentrations sanguines en glucose, ledit dispositif de détection comprenant un substrat en iridium avec une surface externe d'oxyde d'iridium oxydée in situ, à laquelle sont liés un premier et un second films superposés, 10 le premier film étant lié à la surface d'oxyde d'iridium et consistant essentiellement en gammaaminopropyltriéthoxysilane traité par un silane et le second film consistant essentiellement en glucose-oxydase et étant fixé in situ par covalence sur le premier film. 2. Dispositif de détection du glucose, caractérisé en ce qu'il est destiné à engendrer in vivo un signal électrique en réponse à la présence de glucose dans le courant sanguin et à déterminer ainsi électriquement une concentration sanguine en glucose, et comprenant un 20 substrat en iridium ayant à sa surface un revêtement d'oxyde d'iridium effectué in situ, ainsi qu'un premier film lié par adhérence à celui-ci et un second film lié par adhérence et en série à la surface du premier film, ledit premier film consistant essentiellement en une 25 couche, traitée par un silane, de gamma-aminopropyltriéthoxysilane et ledit second film consistant essentiellement en glucose-oxydase lié par covalence à la surface du premier film, un film de caoutchouc de silicone étant appliqué à la surface externe du film de glucose30 oxydase. 3. Procédé de préparation d'un dispositif de détection du glucose destiné à la détermination électrique de concentrations sanguines en glucose, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant: 1) à oxyder la surface d'un support en iridium pour former sur celui-ci in situ une couche d'oxyde d'iridium 2) à exposer ensuite la surface d'oxyde d'iridium à une solution de gamma-aminopropyltriéthoxy5 silane pour préparer sur celle-ci un film traité par un silane 3) à traiter ensuite le revêtement traité par un silane avec une solution aqueuse de glucose- oxydase pour former un film, lié par covalence, de glucose-oxydase 10 sur le film traité par un silane; et 4) à traiter ensuite le film de glucose- oxydase par application d'un film de caoutchouc de silicone à la surface de celuï-ci. 4. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé particulièrement en ce que le revêtement in situ d'oxyde d'iridium est formé par traitement thermique d'un substrat d'iridium à l'air à une température de 600 -700 C pendant une durée d'environ une minute, le film composite résultant étant refroidi, puis plongé dans une solution 20 aqueuse de KOH. 5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé particulièrement en ce que la solution aqueuse de KOH possède une concentration égale à environ 0,1 M de KOH. 6. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que les étapes de chauffage, de refroidissement et de trempage sont répétées jusqu'à formation d'une couche bleu-noir de IrO2 à surface uniforme. 4.Prcéésuvatlareeniaton3