FR 2610198 A1 19880805 FR 8701257 A 19870203 Le domaine technique de la présente inven- tion est généralement celui des conjugués actifs com- portant un agent de pilotage, par exemple tel quedéfini dans lademande de brevet n 85 10234, lié par un lien covalent à une substance à activité pharmacologique ou à accu- mulation intracellulaire dans des cellules cibles. Plus précisément, la présente invention con- cerne des conjugués actifs incorporant des médicaments anticancéreux, choisis dans la famille des dérivés d'alcaloïdes de vinca, par exemple parmi la vinblastine ou la vindésine. La vinblastine est un alcaloïde antitumoral connu, isolé à partir de Vinca rosea. La vinblastine (ci- après dénommée VBL) a été l'objet de nombreuses recher- ches, études et brevets en vue de la préparation de substances antitumorales plus actives, plus sélectives et moins toxiques. La présente invention vise à obtenir des com- posés encore plus spécifiques de la maladie ou de la tumeur à traiter. En effet, les compcsitions comportant par exemple de la vinblastine, doivent être administrées actuellement, à de fortes concentrations ou principe actif, en vue d'atteindre l'efficacité désirée. Ces fortes concentrations entraînent inévitablement des effets secondaires. Des liens covalents sont déjà connus de la technique antérieure et il faut citer, par exemple, les bras hémisuccinyl déjà utilisés pour coupler la vindé- sine en position C4 et le bras tétrapeptidique déjà utilisé pour coupler la daunorubicine, la doxorubicine et la primaquine. La présente invention propose un lien du type hydrazide, c'est-à-dire qu'un dérivé de la substance à activité pharmacologique du type R-CO-NH-NH2 sera conju- gué à un anticorps monoclonal, agent de pilotage. Dans l'Art Antérieur, ce type de conjugués incorporant des dérivés hydrazidesde vinblastine n'avaient jamais pu être obtenus. La présente invention concerne donc particu- lièrement les hydrazides de vinblastine, composés de formule générale I: MO -R4CONHNH2 dans laquelle: À (R1, R2) représentent (-Et, -OH) ou (-H, Et) R4 représente -H, -Me ou -CHO, R3 représente -OH ou -O-C-R'3. O R1 représente un radical hydrocarboné ayant de I à 20 atomes de carbone, le radical hydrocarboné pouvant être non substitué ou substitué par un ou plusieurs radi- caux amino, di (C1-C3 alkyl)amino, mono (C1-C3 alkyl)amino, NH (C2-C5) alcanoyl, cyano, COOH, S-(C1-C3 alkyl), COO-(C1-C3) alkyl ou COO-aryle. Dans le cadre de la présente invention, mais de manière non limitative, on utilisera plus particu- lièrement à titre d'Ac comme agent de pilotage un anti- corps monoclonal d'origine animale ou humaine, par exemple une immunoglobuline du type IgG. De façon en- core plus précise, on utilisera un Ac monoclonal dressé contre la membrane de globules graisseux de lait hu- main ou contre des antigènes de la membrane plasmique de cellules de carcinomes humains. La présente invention a donc particulièrement pour objet des conjugués originaux, caractérisés en ce qu'ils sont constitués d'hydrazides de vinblastine liés à une immunoglobuline. Ces composés permettent en effet de réduire considérablement les doses à administrer tout en attei- gnant l'efficacité désirée. Selon une caractéristique particulière de l'invention, la liaison entre l'hydrazide et l'immuno- globuline est réalisée au niveau de la région Fc de celle-ci. Une immunoglobuline est un anticorps qui, très schématiquement, a une structure en forme de Y. Les "branches" de Y forment la partie reconnaissante du tissu cible et éventuellement de l'antigène caractéristique de la maladie. Si l'on fixe des molécules douées d'une acti- vité thérapeutique sur cette partie, la reconnaissance du tissu cible sera gênée. C'est pourquoi, selon la présente invention, on fixe l'hydrazide de vinblastine sur la partie non-reconnaissante ou région Fc de l'immunoglobuline. De cette façon, le tissu à soigner est mieux ciblé, et par conséquent, une dose relativement faible de principe actif est nécessaire pour combattre la maladie. L'invention a également pour objet un procédé de préparation de ces dérivés conjugués. Selon la caractéristique essentielle du procédé, on fait réagir dans un solvant organique l'hydrazide de vinblastine sur une immunoglobuline oxydée en aldéhyde dans sa partie sucre. Avantageusement, la réaction de l'hydrazide de vinblastine a lieu sur la région Fc de l'immunoglobu- line oxydée. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent. Les immunoglobulines ont été oxydées et conju- guées selon deux méthodes. Exemple 1: Oxydation d'immunoglobulines G non-spéci- fiques de chèvres Procédure la Une solution de 2 mg/ml d'immunoglobuline G dans un tampon de phosphate de sodium (pH = 6; 0,05 M) est placée au froid. A cette solution, on ajoute un dixième en volume d'une solution à 100 mM de NaIO4. Le mélange est gardé au froid et à l'obscurité pendant une heure, puis on le passe à travers une colonne Sephadex F G25 (1,6 x 38 cm) équilibrée avec un tampon de phosphate de sodium (pH 6, 0,05 M). Le pic d'exclusion est collec- té et concentré à 2 mg/ml. Procédure lb A une solution de 4 mg/ml d'immunoglobuline G dans l'eau, on ajoute 0,5 ml d'une solution de NaIO4 (0,15 M). Le mélange est agité pendant 30 minutes à la température ambiante,puis dialysé contre de l'acé- tate de sodium (0,001 M, pH 4,4). Le même tampon est renouvelé trois fois. Le mécanisme réactionnel est une oxydation de la partie hydrocarbonée de l'immunoglobuline en aldéhyde. Exemple 2: conjugaison d'immunoglobulines G non- spécifiques de chèvre Procédure 2a Une solution stable à 5mM d'hydrazide de vin- blastine (VBL-NH-NH2) marquée, est préparée en dissol- vant 3,81 mg de VBL-NH-NH2 dans 50 il de âioxanne, et 950 gl d'une solution de phosphate de sodium (pH = 7; 0,01 M). A l'immunoglobuline G oxydée (procédure la: 2 mg/ml, phosphate de sodium pH 7, 0,01 M), on ajoute le VBL-NH-NH2 jusqu'à une concentration de 500 gM. Le mélange est agité pendant 4 heures à la température am- biante, conservé au froid pendant une nuit. Le conjugué est ensuite isolé par filtration sur gel à l'aide d'une colonne Sephadex G 25 (2,6 x 90 cm) équilibrée avec du phosphate de sodium (0,05 M; pH 6). On récupère le pic d'exclusion, on le concentre, on effectue le dosage en protéines par la méthode de Lowry et en VBL-NH-NH2 par radioactivité. Le conjugué ainsi préparé contient 1,7 moles de VBL-NH-NH2 par mole d'immunoglobuline G. Par filtration sur gel, on détecte 95 % de monomère d'IgG. Procédure 2b A 25 mg d'IgG oxydée (procédure lb) ont été ajoutés 2 ml de solution stable 5 mM de VBL-NH-NHa marquée, ainsi que 2 ml de NaHCO3 (0,5 M, pH: 9,5). Le mélange a été agité b 4 C pendant une nuit et le VBL-NH-NH2 inaltéré a été éliminé par dialyse contre du NaCL 9%o pendant quatre jours à 4 C. Le cmnjugué a été concentré et dosé en protéine par la méthode Lowry et en VBL-NH-NH2 par radioactivité. Le conjugué ainsi préparé contient deux moles de VBL-NH-NH2 par mole d'IgG. Par filtration sur gel HPLC, il a été détecté % de monomères d'IgG. Le mécanisme réactionnel de la conjugaison est le suivant: Ac-C-H + NH2NH-VBL --- - CH=N-NH-VBL Il o Exemple 3: Effet du pH et du solvant sur le couplage Les IgG non-spécifiques de chèvre ont été oxydées suivant la méthode la. Elles ont été conjuguées par la suite suivant la procédure 2a en utilisant quatre types de conditions différentes: a. tampon PO0 pH 5 + dioxanne b. tampon PO. pH 6 + dioxanne c. tampon P04 pH 7 + dioxanne d. tampon P04 pH 6 + DIF. Aux IgG, à la concentration de 1,8 mg/ml dans le tampon, on ajoute 1:10 en volume d'une solution 5 mM de VBL-NH-NH2 dans le solvant correspondant (DMF ou dioxanne). Les solutions sont agitées 4 h à 20 C dans le noir, puis dialysées extensivement contre du NaCL 9 %,. Le tableau I ci-dessous montre l'effet du pH et du solvant sur le couplage VBL-NH-NH,/IgG par oxyda- tion des sucres. Tableau I (: À...) ( s. HPLC (Essai IgG Oxydation Couplage:Rapport %.rnaoMres) (C: : : VBLNH-: d'IgG) :(:NH2/IgG:) ___________________--_-------- -----______----- ---- ----- (: a:noe-spécifique: 4 C 1 4h 20C (:: tanpcn P04:taznç P04) (-) pH 6 pH 6dicvcanne: c rcspcfce:: ) :: pH 6: pH 7 dioanne: ( *) cd rcn-spécifique:4C1h 4h20C 1 h2, 91 %) 0C m ÀÀ) :: tsXP O4: cP 4 P04 :: pH 6: pH 6 diMFnne: ( drioe-spécifique: 4 C 1 h 4 h 20=C 2 1,5 % 1) :a rP e4: m4: : Exemple 4: Estimation du degré d'oxydation des immuno- globulines G Le degré d'oxydation des IgG a été évalué selon la méthode décrite par R. Radcliffe: à 0,5 mg (0,25 ml) d'IgG oxydée, on ajoute du pnitrophényl hydrazine (PNH) jusqu'& une concentration finale de 1 mM. Après avoir laissé réagir pendant une heure à température ambiante, le mélange est passé à travers une colonne Sephadex G25 (1,6 x 12 cm). Le pic d'exclusion est collecté, ajusté à pH 8,5 avec NaOH et dosé par speçtrométrie à 395 et 280 nm. Le degré d'oxydation est calculé à l'aide de la formule: Mole PNH Mole IgG Le degré d'oxydation obtenu varie de 7 à 10 quelque soit la méthode d'oxydation utilisée. Exemple 5: Digestion enzymatique des conjugués IgG-VBL- NH-NH2 préparés suivant les techniques 2a et 2b de l'exemple 2. Pour l'étude de la digestion enzymatique, 700 il de conjugué sont incubés à 37 C pendant 48 h. en présence de cystéine 5 mM, de tampon acétate 40 mM, pH 4,5 et d'enzymes lysosomiales. Au cours du temps des parties aliquotes sont prélevées et les protéines pré- cipitées par addition de 2 volumes de TCA (acide trichloro- acétique) 40 %. La digestion est estimée par mesure de la radioactivité soluble dans le surnageant. Après 48 h on mesure 40 % de digestion pour le conjugué de la 2' procédure 2a et 35 % de digestion pour le conjugué 2b. Ainsi, on a vérifié que les conjugués selon l'invention libéraient bien le principe actif après in- cubation en présence d'enzymes lysosomiales. Exemple 6: Préparation de conjugués de VBL-NH-NH2 et d'immunoglobuline spécifique CTMO1 Dans les exemples qui suivent, on utilisera plus particulièrement un anticorps dénommé CT-M-O1 qui présente l'ensemble des propriétés énumérées dans la demande de brevet n" 85 10234. Le protocole expérimental utilisé pour la préparation des Ac monoclonaux dressés contre la mem- brane de globules graisseux de lait humain est compa- rable à celui qui a été décrit dans la demande n 85 10234. Les immunoglobulines monoclonales ont été oxydées suivant la procédure la de l'exemple 1 puis conjuguées suivant la procédure 2a de l'exemple 2, à différents pH. Le tableau II donne le rapport VBL-NH-NH2/ immunoglobuline et le pourcentage de monomères d'immuno- globuline détecté. (: :: : HPLC (Immunoglobuline Oxydation Couplage Rapport: % mono (VBL-N mères) :(::S*NH2/Ig de Ig) () c CTMO1 40C, 1 h 200C, 4 h 0,6 8 tampon PO4 tampon PO4 * À) pH 6 pH 6 dioxanne ( -:; (CTMO1 4 C, 1 h 20C, 4 h) (: tampon P04--O tampon PO4: 0,9.99 %) (pH 6 pH 5 dioxann) Tableau II Tableau Il- Exemple 7: Interaction des conjugués avec les cellules MCF-7 On a étudié la réactivité avec la membrane de cellules MCF-7 en culture (cellules d'un carcinome hu- main de la glande mammaire). Les cellules MCF7 confluentes (2.106 cellules/ cm2) sont incubées & 4 C en présence de différentes concentrations d'anticorps CTMO 1, d'anticorps couplés aux Vincaalcaloldes: VBL monohydrazide - IgG CTM 01 CTM 01 - Vinca 998 (poids moléculaire) etCTM 01 - Vinca 979.Après 90 minutes d'incubation, les cellules sont lavées une fois avec du milieu de culture et une fois avec du PBS avant d'être réincubées 90 minutes à 4 C en présence de 1 gg/ml d'anticorps CTM 01 marqué à l'Iode 123 (CTM 01-I123). Après avoir été lavées une fois au milieu et trois fois au PBS, les cellules sont récupé- rées dans du Doc 1 % pH 11.3. La radioactivité associée aux cellules est comptée en compteur y et les protéines sont dosées par la méthode de Lowry. On obtient des résultats de fixations sur les cellules similaires pour l'anticorps CTM 01 seul, les anticorps couplés CTM 01-VINCA 979 (CTM 01- deacetyl VBL hemisuccinate) et CTM 01-VINCA 998 (CTM 01-VBL monohydrazide). On obtient des résultats de fixations sur les cellules similaires pour l'anticorps CTM 01 seul, les anticorps couplés CTM 01-VINCA 979 et CTM 01-VINCA 998. On a donc ainsi vérifié que les conjugués, selon l'invention, conservaient leur affinité d'anti- corps pour les antigènes présents à la surface des cellules MCF 7. tl Exemple 8: Activité des conjugués selon l'invention Des cultures non confluentes de cellules MCF-7 ont été incubées pendant 24 h à 37 C en présence de différentes concentrations de: 5. VBL monohydrazide (PM = 765) VBL monohydrazide - IgG CTM 01 (998) VBL monohydrazide - IgG chèvre (P4 = 974). A la fin de l'incubation, les cellules ont été lavées (trois fois avec du PBS) et testées pour leur contenu en protéines (méthode de Lowry). On observe un effet cytotoxique amélioré dans les cellules MCF-7 pour les conjugués hydrazides. REVENDICATIONS 1. Conjugués actifs incorporant une substance à activité anticancéreuse et un agent de pilotage du type immunoglobuline, la substance à activité cancéreuse et l'agent de pilotage étant liés par un lien convalent du type hydrazide, caractérisée en ce qu'ils sont cons- titués de dérivés d'hydrazide d'alcalo!de de vinca lié à une immunoglobuline. 2. Conjugués selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils sont constitués d'hy- drazide de vinblastine de formule générale (I) R2 Me02C O Meo 3! R R4 CONHNH2 dans laquelle À (R1, R2) représentent (-Et, -OH) ou (-H, Et) À R4 représente -H, -Me ou -CHO, * R3 représente -OH ou -O-C-R'3, li O R. représente un radical hydrocarboné ayant de 1 à 20 atomes de carbone, le radical hydrocarboné pouvant être non substitué ou substitué par un ou plusieurs radi- caux amino, di (C1-C3 alkyl)amino, mono (C1-C3 alkyl)amino, NH (C2-Cs) alcanoyl, cyano, COOH, S-(C1-C3 alkyl), COO-(Cl-C3) alkyl ou COO-aryle. l'hydrazide de vinblastine étant lié à une immunoglo- buline. 3. Conjugués selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce que la liaison entre l'hydrazide et l'immunoglobuline est réalisée au niveau de la région Fc de celle-ci. 4. Conjugués selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce que l'immunoglobuline est un anticorps monoclonal d'origine animale ou hu- maine, du type IgG. 5. Conjugués selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce que l'immunoglobuline est un anticorps monoclonal dressé contre la membrane de globules graisseux de lait humain ou contre la mem- brane plasmique de cellules de carcinomes humains. 6. Conjugués selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce que l'immunoglobuline est l'anticorps CTM 01 ou une immunoglobuline IgG de chèvre. 7. Dérivés selon l'une des revendications précédentes, caractérisés en ce que le rapport VBL-NH-NH2/immunoglobuline en nombre de molécules est compris entre 0,5 et 4. 1 4 B. Procédé de préparation de conjugués actifs incorporant une substance b activité anticancéreuse et un agent de pilotage du type immunoglobuline, caracté- risé en ce qu'on fait réagir dans un solvant organique un dérivé hydrazide de vinblastine comme substance à activité cancéreuse sur une immunoglobuline oxydée, l'hydrazide de vinblastine étant de formule générale I: R/3 14.0 MeO2C CONHNH2 dans laquelle: (R1, R2) représente (-Et, -OH) ou (-H, Et) 10. R4 représente -H, -Me ou -CHO, R3 représente -OH ou -O-C-R'3, RI représente un radical hydrocarboné ayant de 1 à 20 atomes de carbone, le radical hydrocarboné pouvant être non substitué ou substitué par un ou plusieurs radi- caux amino, di (Cl-C3 alkyl)amino, mono (C1-C3 alkyl)amino, NH (C2-Cs) alcanoyl, cyano, COOH, S-(C1-C3 alkyl), COO-(Cl-C3) alkyl ou COO-aryle. l'hydrazide de vinblastine étant lié à une immunoglobuline. 9. Procédé selon la revendication 8, caracté- risé en ce qu'on fait réagir le dérivé hydrazide sur la région Fc de 1'immunoglobuline oxydée. 10. Procédé selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce que l'oxydation des immunoglo- bulines se fait par oxydation des sucres en aldéhydes. 11. Procédé selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que l'immunoglobuline est du type IgG. 12. Procédé selon l'une des revendications 8 à 11, caractérisé en ce que l'immunoglobuline est l'anti- corps CTM 01 ou une immunoglobuline IgG de chèvre. 13. Procédé selon l'une des revendications 8 à 12, caractérisé en ce que le rapport VBL-NH-NH2/ immunoglobuline en nombre de molécules est compris entre 0,5 et 4. 14. Procédé selon l'une des revendications 8 à 13, caractérisé en ce que la conjugaison, entre le dérivé hydrazide et l'immunoglobuline, se fait dans un solvant organique à température ambiante dans une solution tampon à pH entre 5 et 7. 15. Procédé selon l'une des revendications 8 à 14, caractérisé en ce que l'oxydation de l'immuno- globuline à lieu dans une solution tamponnée à pH entre 5 et 7, à froid, par adjonction d'une solution d'iodate de sodium. 16. Procédé selon l'une des revendications 14 et 15, caractérisé en ce que les solutions tampons sont des solutions de phosphate de sodium. 17. Procédé selon l'une des revendications 8 à 16, caractérisé en ce que le solvant organique est du dioxanne ou du DMF. 18. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend, b titre de principe actif, un dérivé conforme à l'une des revendications précédentes.