FR 2609807 A2 19880722 FR 8701738 A 19870211 La présente Addition a pour objet de compléter les travaux exposés et revendiqués dans le Brevet principal. Il a été établi conformément au Brevet principal que le virus NANB épidémique est fréquemment impliqué dans l'hépatite NANB sporadique et qu'il s'agit, en fait, d'un même agent viral responsable aussi bien de la forme épidémique que de la forme sporadique de l'hépatite NANB. D'autre part, bien que l'agent NANB épidémique soit considéré comme un virus véhiculé par l'eau, son rôle dans l'hépatite sporadique laissait à penser à l'inventeur qu'il pouvait être transmis par d'autres voies que l'eau et notamment par la voie sanguine transfusionnelle. Par ailleurs, l'inventeur a mis au point des réactif s de diagnostic utilisables dans la méthode de diagnostic de l'hépatite NANB décrite et revendiquée dans le Brevet principal et il a également développé un kit prêt à l'emploi pour la réalisation de ladite méthode de diagnostic. A cet égard, le Brevet principal décrit un mode de mise en oeuvre du procédé de détection des anticorps présents dans le sang d'un malade atteint d'hépatite NANB ou d'un convalescent d'hépatite NANB, ou dans des produits utilisés en transfusion sanguine ou dans des fractions dérivées de sang et ayant été -en contact avec le virus agent causal de l'hépatite NANB tel que défini dans le Brevet principal, selon lequel mode de mise en oeuvre le sérum du malade ou du patient convalescent est mis en contact avec la préparation virale conforme au Brevet principal (ou avec une fraction de celle-ci) après centrifugation et isolement de la bande correspondant à une densité de 1,28-1,32. Egalement conformément au Brevet principal, il est possible de caractériser une activité anticorps dans les IgM d'un patient en vue d'un diagnostic sérologique très précoce de la maladie, en utilisant des anti-IgM humaines ou bien en captant les IgM d'un sérum et en les faisant réagir avec le virus ou ses fractions et en caractérisant l'antigène fixé sur l'lgM du malade. La présente Addition a pour objet des réactifs immunologiques pour la détection de l'hépatite NANB épidémique, sporadique ou post-transfusionnelle, qui sont caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des immunoglobulines isolées du sérum de convalescents humains ou de sérum de singes préalablement infectés par le virus de l'hépatite NANB, lesquels réactifs sont aptes à former un immuncomplexe antigène-anticorps lorsqu'ils sont incubés avec des extraits de fèces contenant des antigènes d'hépatite NANB. Selon un mode de réalisation avantageux des réactifs immunologiques conformes à la présente Addition, ceuxci sont aptes à former un immuncomplexe par incubation avec des extraits de fèces d'individus contaminés par du virus NANB selon l'invention et purifiés par centrifugation et filtration. La présente Addition a également pour objet un réactif immunologique pour la détection de l'hépatite virale NANB épidémique, sporadique ou post-transfusionnelle, caractérisé en ce qu'il est constitué par un anticorps antihépatite NANB préparé à partir de sérums d'animaux artificiellement infectés par ingestion d'extraits de fèces de patients atteints d'hépatite virale NANB ou de sérums d'animaux immunisés par le virus NANB ou ses fractions purifiées. Selon un mode de réalisation avantageux de ce réactif immunologique, l'anticorps anti-hépatite NANB (IgM ou IgG) est fixé sur un support solide. Selon une modalité avantageuse de ce mode de réalisation, le support solide revêtu d'anticorps antihépatite NANB est en outre recouvert d'une protéine, telle que BSA en particulier, de préférence en solution tamponnée. Le réactif immunologique conforme à la présente Addition est mis en oeuvre dans le procédé de détection d'antigène NANB conforme au Brevet principal en l'incubant avec des extraits de fèces ou des produits sanguins ou du sérum de patients, puis avec des fractions d'anticorps purifiés à partir de sérums de patients convalescents d'hépatite NANB épidémique, ou de sérums d'animaux infectés artificiellement, immunisés contre ce virus, lesdits anticorps étant marqués par une enzyme convenable telle que la B-galactosidase, par exemple. La réaction est développée à laide d'un substrat révélateur approprié tel que l'ortho nitrophényl -B-D-galactopyranoside . Le procédé de diagnostic in vitro de la présence du virus de l'hépatite NANB conforme au Brevet principal et à la présente Addition consiste donc à mettre en contact un sérum ou un autre milieu biologique d'un patient dont on cherche à établir le diagnostic, avec au moins une des protéines ou des glycoprotéines du virus NANB ou avec un lysat viral ou avec un extrait viral, puis à détecter la réaction immunologique par la méthode ELISA ou par une autre méthode immunoenzymatique ou une méthode par immunofluorescence, qui peut mesurer directement ou indirectement l'îmmunofluorescence ou la réaction immunoenzymatique. C'est la raison pour laquelle la présente Addition englobe également les extraits viraux marqués, qu'ils soient marqués par une enzyme, par fluorescence ou qu'ils soient marqués par un radioisotope. Les méthodes- d'immunodétection comprennent, comme on le sait - le dépôt de quantités d'extrait spécifique ou des protéines virales conformes à l'invention, dans ou sur un support tel que les puits d'une microplaque de titration - l'introduction de dilutions croissantes du sérum à diagnostiquer sur ledit support, tel que lesdits puits - l'incubation du support tel que la microplaque susdite - le lavage soigneux du support tel que la microplaque susdite à l'aide d'un tampon convenable - l'introduction/ d'anticorps anti-immunoglobuline humaine marqués spécifiques dans ou sur le support tel que les puits de la microplaque susdite, le marquage étant réalisé par une enzyme choisie parmi celles capables d'hydrolyser un substrat de telle manière que l'absorption de radiations par ce dernier soit modifiée au moins dans une bande spécifique de longueurs d'ondes, et - la détection, de préférence de manière comparative, par rapport à un témoin, de la quantité de substrat hydrolysé, à la fois par la mesure du produit biologique dangereux et par la présence effective de la maladie. La présente Addition a également pour objet un kit -ou ensemble- prêt à l'emploi pour la réalisation du procédé de diagnostic (recherche de l'anticorps ou du virus NANB) conforme au Brevet principal et à la présente Addition, lequel kit est caractérisé en ce qu'il comprend - un extrait ou une fraction purifiée de l'agent viral conforme au Brevet principal, lequel extrait ou fraction est marqué, par exemple par un radioisotope, une enzyme ou par immunofluorescence - des anti-immunoglobulines humaines ou une protéine A éventuellement fixées sur un support insoluble dans l'eau tel que sphères d'agarose ou de latex, magnétiques ou non - des tampons et, si nécessaire, des substrats pour visualiser les marquages. Le réactif apte à être utilisé pour la détection d'hépatite NANB conforme à la présente Addition, est préparé et utilisé comme décrit ci-après. Des singes sont artificiellement infectés par ingestion d'extraits de fèces de patients atteints d'hépatite NANB épidémique. Les sérums de singes utilisés sont ceux collectés le 27ème jour après l'infection, à partir des singes infectés artificiellement comme indiqué plus haut. Ces sérums sont chromatographiés sur une colonne de gel de dextrane dans un tampon Tris-NaCl 0,lu, pH 8 pour isoler les anticorps recherchés qui sont des IgM anti-NANB. Les IgM ainsi isolées sont fixées sur des supports solides, tels que de préférence des plaques de PVC, en mettant les IgM à des concentrations d'environ 10 à 50 ug de protéines par ml de PBS, en contact avec les supports solides pendant 18 à 24 heures à +40C. I1 est préféré que ces plaques de PVC revêtues des IgM anti-hépatite NANB, soient ensuite recouvertes d'une couche de PBS contenant 1 % de BSA (sérumalbumine bovine) et 0,1 % de "Tween 20". Les plaques de PVC doublement revêtues sont alors prêtes à l'usage en tant que réactif de diagnostic utile pour la détection de l'agent viral associé à l'hépatite NANB. Le procédé de diagnostic conforme au Brevet principal et à la présente Addition commence de préférence par l'incubation desdites plaques de diagnostic avec des extraits de fèces à diagnostiquer, pendant 1 heure à 370C. Les plaques sont ensuite incubées avec des fractions d'IgG obtenues par purification de sérums de patients convalescents d'hépatite NANB épidémique, par chromatographie sur une colonne de DEAE-Trisacryl et marquées par une enzyme, de préférence la bêta-galactosidase, d'hydrolyse d'un substrat révélateur en présence duquel a lieu la réaction, et qui est de préférence l'orthonitrophényl-bêta-D-galacto- pyranoside. En complément de la méthode de détection décrite dans le Brevet principal, elle peut consister à rechercher la présence d'anticorps NANB dans le sérum ou autre milieu biologique d'un malade ou d'un convalescent ; en pareil cas, le sérum est mis en contact avec la préparation virale conforme au Brevet principal - collectée par exemple après centrifugation et isolement de la bande de densité à 1,281,32 g/cm3 correspondante -, ou avec une fraction de cette préparation virale ; cette préparation virale, ou l'une de ses fractions, est mise en réaction avec une préparation d'IgM ou d'IgG qui revêt les parois d'une microplaque d'une manière bien connue de l'Homme de l'Art.La formation d'un immuncomplexe (virus ou fraction de celui-ci - Anticorps humains anti-virus) s'oppose alors à la révélation de l'antigène qu'il contient par l'IgG de convalescent marquée par exemple par une enzyme. La recherche d'anticorps à l'aide de cette méthode de détection peut être effectuée dans le sang de malades ou de convalescents, dans les produits utilisés dans les transfusions sanguines et dans les fractions dérivées du sang de personnes ayant été exposées à l'agent causal de l'hépatite NANB tel que défini dans le Brevet principal, dont les souches I-617 et I-616 et celles présentant une réaction immunologique croisée avec ces deux souches de référence, notamment la souche isolée de patients atteints d'hépatite NANB post-transfusionnelle, dont les propriétés immunologiques sont identiques à celles de la souche I-617; et qui est identifiée comme souche virale "H-SET" déposée le 5 Février 1987 sous le No 87.02.05.02 auprès de la Collection ECACC (Grande-Bretagne). Bien que les données cliniques et épidémiologiques aient pu suggérer que la forme épidémique de l'hépatite NANB présentée par des patients atteints d'hépatite NANB épidémique est due à un virus différent de celui qui est à l'origine de l'hépatite NANB post-transfusionnelle transmise par injection parentérale, conformément à la présente Addition l'inventeur a pu isoler de patients atteints d'hépatite NANB post-transfusionnelle une nouvelle souche de virus NANB dont les propriétés immunologiques sont pratique ment identiques à celles des souches déposées le 30 Octobre 1986 sous les Nos I-616 et I-617 auprès de la CNCM de 1'Institut Pasteur.Des tests sérologiques très sensibles de présence de virus HAV et HBV ont permis d'exclure ces deux virus en tant qu'agents étiologiques et d'exclure, de même, d'autres virus hépatotropes tels que le cytomegalovirus, le virus d'Epstein-Barr et le virus de la fièvre jaune. La présente Addition a en outre pour objet un nouvel agent viral purifié impliqué dans les formes sporadique, épidémique et post-transfusionnelle-- de l'hépatite NANB. Ce virus se distingue des virus HAV et HBV en ce qui concerne l'homologie antigénique de ses protéines en tant que matériel génétique. Les compositions préparées conformément au Brevet principal et à la présente Addition (antigènes viraux purifiés, protéines recombinantes obtenues par l'expression du virus NANB dans des cellules procaryotes ou eucaryotes ou peptides synthétiques déduits de la séquence du génome) peuvent être utilisées pour le diagnostic de l'hépatite NANB ou pour la vaccination propre à induire la synthèse d'une réponse immune protectrice après administration à l'hôte. La présente invention englobe toutes les compositions de ce type contenant un antigène présentant des propriétés immunologiques équivalentes à celles du virus NANB Clamart (CNCM I-617) ou Côte d'Ivoire (CNCM I-616). En effet deux protéines ou antigènes sont considérés comme équivalents dans le cadre de la présente invention lorqu'ils sont capables d'être reconnus par les mêmes anticorps. Les produits exprimés par des séquences correspondantes du matériel génétique codant des séquences génétiques correspondantes sont, par suite, compris dans le cadre de tels antigènes équivalents. La présente Addition englobe également les sérums pouvant être produits à partir d'animaux par inoculation à ces derniers de virus NANB à l'aide des compositions précitées. En particulier la présente Addition englobe les anticorps polyclonaux spécifiquement dirigés contre chacun des antigènes du virus NANB. Elle englobe également les anticorps monoclonaux susceptibles d'être obtenus par les méthodes classiques et dirigés plus spécifiquement contre les antigènes du virus NANB. Ces anticorps polyclonaux et monoclonaux peuvent être utilisés dans un grand nombre d'applications au nombre desquelles on peut citer la neutralisation de l'antigène correspondant ou du virus total. Ils peuvent être utilisés pour détecter des antigènes viraux dans des préparations biologiques ou pour purifier des antigènes correspondants. La présente Addition englobe également tout virus de l'hépatite NANB équivalent présentant les mêmes caractéristiques immunologiques. Les travaux menés par l'inventeur ont montré la relation immunologique entre les matériels antigéniques isolés d'extraits de fèces de malades atteints respectivement d'hépatite NANB épidémique, sporadique et post-transfusionnelle. C'est ainsi que la souche de type Clamart (déposée sous le No I-617 auprès de la CNCM et également déposée auprès de la Collection ECACC sous le No 87.02.05.02) a été isolée à partir des selles d'une malade qui présentait une hépatite aigüe NANB dument caractérisée comme hépatite NANB transfusionnelle. Les selles contenaient l'antigène conforme au Brevet principal, précédemment caractérisé dans les hépatites épidémiques (Côte d'Ivoire) et sporadiques (France). Un antigène associé au virus de l'hépatite NANB a été caractérisé pendant 15 jours à la phase aigüe de la maladie. D'autres cas similaires ont été observés avec caractérisation du même antigène dans les selles et isolement d'un virus présentant les caractéristiques immunologi ques identiques aux virus I-616 et 1-617. I1 résulte des travaux de l'inventeur que ce virus, appelé virus de l'hépatite NANB épidémique, sporadique et transfusionnelle (en abrégé : "H-SET") est responsable de l'apparition d'hépatite de type non A non B chez des malades transfusés. Une étude comparative comprenant des malades polytransfusés sans hépatite infectieuse et des malades atteints d'hépatite A ou B a montré l'absence d'antigène associé au virus dans leurs selles et l'absence de virus cultivables dans les conditions dans lesquelles le virus "H-SET" se multiplie. La souche "H-SET" I-617 isolée des selles d'un malade souffrant d'hépatite NANB transfusionnelle, a pu être cultivée sur cellules PLC/PRP5 dans les conditions décrites dans le Brevet principal. Les lésions correspondant notamment à de nombreuses formations syncitiales apparaissent à J6-J7 précédant le décollement des cellules infectées. Un procédé identique de culture pourra être utilisé par l'Homme de l'Art pour un isolement du virus à partir d'un prélèvement sanguin. Les cultures infectées peuvent être utilisées comme source d'antigène non purifié en vue de la caractérisation à leur surface des molécules d'anticorps provenant d'un sujet ayant contracté l'infection (le complexe virus-anticorps étant révélé à l'aide d'antiimmunoglobulines humaines marquées). La souche Clamart s'est avérée infectante pour deux singes rhésus (inoculation par ingestion typer os) avec 0,5 ml d'un extrait de selle à 10 %) avec apparition de l'antigène dans les selles ent-re les 20e et 24e jours après l'inoculation et avec augmentation des transaminases entre le 28e et le 32e jours (signe caractéristique d'atteinte hépatique). REVENDICATIONS 1.- Nouvel agent viral purifié selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 du Brevet principal, caractérisé en ce qu'il est constitué par un agent viral purifié impliqué dans l'hépatite virale NANB épidémique, sporadique et post-transfusionnelle. 2.- Réactif immunologique pour la détection de l'hépatite virale NANB épidémique, sporadique ou post-transfusionnelle, par le procédé selon la revendication 15 du Brevet principal, caractérisé en ce qu'il est constitué par des immunoglobulines isolées de sérum de convalescents humains ou de sérum d'animaux préalablement artificiellement infectés par le virus de l'hépatite NANB. 3.- Réactif immunologique selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est constitué par un anticorps formé d'immunoglobulines préparées à partir de sérums d'animaux artificiellement infectés par ingestion d'extraits de fèces de patients atteints d'hépatite NANB épidémique. 4.- Réactif immunologique selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est constitué par un anticorps anti-NANB préparé à partir de sérums d'animaux immunisés par le virus NANB ou ses fractions purifiées. 5.- Réactif immunologique selon la revendication 2, 3 ou 4, caractérisé en ce que l'anticorps anti NANB est fixé sur un support solide. 6.- Réactif immunologique selon la revendication 5, caractérisé en ce que le support solide revêtu d'anticorps anti-NANB est en outre revêtu de protéines. 7.- Procédé d'isolement d'anticorps anti-NANB de sérums d'animaux artificiellement infectés par ingestion d'extraits de fèces de patients atteints d'hépatite NANB épidémique, caractérisé en ce que lesdits sérums sont chromatographiés sur une colonne de dextrane dans du tampon Tris-NaCl 0,1M, pH 8 pour isoler les IgM anti-NANB. 8.- Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les sérums d'animaux artificiellement infectés sont des sérums de singes, collectés à partir du 27e jour après l'infection par des extraits de fèces. 9.- Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les sérums isolés conformément à la revendication 6 sont fixés sur des supports solides, notamment sur des plaques en PVC, par contact entre les IgM à des concentrations de l'ordre de 10 à 50 pg de protéines par ml de PBS, et lesdits supports pendant 18 à 24 heures à +40C environ. 10.- Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que lesdits supports solides, revêtus d'anticorps anti-NANB sont ensuite revêtus d'une couche de PBS contenant 0,1 % environ de BSA et 0,1 % environ de Tween 20. 11.- Procédé de détection d'anticorps dans le sang de patients ou dans des produits dérivés de sang caractérisé (a) en ce que l'on met en contact le sang ou le produit dérivé de sang avec un réactif constitué par un agent viral selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 du Brevet principal, et (b) en ce que l'on identifie la présence d'anticorps de l'hépatite NANB virale dans ledit sang ou produit du sang. 12.- Procédé de diagnostic de l'hépatite virale NANB sporadique, épidémique ou post-transfusionnelle dans des extraits de fèces, caractérisé en ce que l'on incube les plaques revêtues d'anticorps IgM selon la revendication 5 ou la revendication 6, (a) tout d'abord avec des extraits de fèces pendant 1 heure environ à 37"C environ, puis (b) avec des fractions d'IgM ou d'IgG purifiées à partir de sérums de patients convalescents d'hépatite NANB épidémique et marquées par une enzyme, en présence d'un substrat révélateur convenable. 13.- Procédé de diagnostic selon la revendication 12, caractérisé en ce que les fractions d'IgG sont marquées par la bêta-galactosidase et le substrat révélateur convenable est de préférence constitué par l'orthonitrophényl-bêta-D-galactopyranoside. 14.- Procédé de diagnostic selon la revendication 12, caractérisé en ce que les fractions d'IgG marquées par une enzyme, sont obtenues à partir de sérums de patients convalescents d'hépatite NANB épidémique. 15.- Procédé de préparation des IgG mises en oeuvre selon la revendication 12, caractérisé en ce que les IgG sont isolées par purification, de sérums de patients convalescents d'hépatite NANB épidémique, par chromatographie sur une colonne de DEAE-Trisacryl, puis elles sont marquées par une enzyme convenable, de préférence la bêtagalactosidase. 16.- Kit, ou ensemble, prêt à l'emploi pour le diagnostic de l'hépatite virale NANB épidémique, sporadique ou post-transfusionnelle, caractérisé en ce qu'il comprend, outre les tampons, solvants et réactifs nécessaires à la mise en oeuvre du procédé de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 15 à 19 du Brevet principal ou selon l'une quelconque des revendications 12 à 14 de la présente Addition, au moins un réactif de diagnostic constitué par des IgM anti-NANB fixées sur un support solide, au moins un réactif constitué par des IgG marquées par une enzyme conformément à la revendication 13, et au moins un substrat convenable de révélation de la réaction enzymatique. 17.- Rit de diagnostic de l'hépatite virale NANB épidémique, sporadique ou post-transfusionnelle, caractérisé en ce qu'il comprend un extrait marqué de l'agent viral selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 du Brevet principal, des anti-immunoglobulines humaines, des tampons convenables et des réactifs de visualisation du marquage de l'agent viral. 18.- Agent thérapeutique pour le traitement de l'hépatite virale NANB épidémique, sporadique ou post-transfusionnelle, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement un anticorps purifié dirigé contre l'agent viral selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 du Brevet principal. 19.- Agent thérapeutique selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par les IgM isolées définies selon l'une quelconque des revendications 2 à 6. 20.- Agent thérapeutique selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il est essentiellement constitué par des anticorps monoclonaux produits par un hybridome résultant de la fusion de cellules de myélome et de cellules spléniques de souris auxquelles ont été inoculés des agents viraux de l'hépatite NANB selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 du Brevet principal. 21.- Souche d'un agent viral purifié isolé des fèces d'un malade atteint d'hépatite virale NANB post-transfusionnelle, dite "Souche H-SET" déposée le 5 Février 1987 sous le NO 87.02.05.02 auprès de la Collection ECACC (Grande-Bretagne).