FR 2602793 A1 19880219 FR 8611826 A 19860818 SEOUENCE D'ADN EXERCANT UNE FONCTION SE MANIFESTANT PAR UNE SURPRODUCTION DE PROTEINES EXOCELLULAIRES PAR DIVERSES SOUCHES DE BACILLUS. ET VECTEURS CONTENANT CETTE SEOUENCE. L'invention concerne, d'une façon générale, une séquence d'ADN exerçant une fonction se manifestant par une surproduction de protéines. exocellulaires par 10 diverses souches de Bacillus, ainsi que des vecteurs contenant cette séquence. L'invention concerne plus particulièrement une séquence d'ADN codant pour un polypeptide agissant sur la surproduction d'enzymes exocellulaires, notamment de 15 protéase alcaline, par B.subtilis. 15 En effet, l'interêt croissant porté ces derniers temps à l'utilisation de B.subtilis en tant qu'hàte pour le clonage, destiné notamment à la production de protéines exocellulaires, s'explique par les motifs sui20 vants. Tout d'abord, la caractérisation génétique de B.subtilis a été largement effectuée, et des méthodes efficaces d'introduction et d'extraction de fragments d'ADN ainsi que des marqueurs sélectifs de résistance à certains antibiotiques ont déjà été décrits. D'autre 25 part, grâce à ses propriétés de sporulation, B.subtilis représente un bon modèle de différenciation procaryotique. D'un point de vue pratique, une des propriétés interessantes de cet organisme est que l'on peut le ma30 nipuler en parfaite sécurité puisqu'il n'infecte ni les humains, ni les animaux. D'autre part, il possède la propriété de secréter un grand nombre d'enzymes (Bacteriological reviews; 41, 711-753,(1977), dont certaines, telles que l'a-amylase, les protéases ou les glucanases, sont particulièrement intéressantes au niveau industriel. En particu5 lier, la protéase alcaline est très utilisée dans la fabrication de détergents ainsi que dans l'industrie pharmaceutique et dans l'industrie agro-alimentaire. Les techniques de recombinaison de l'ADN ont également permis l'utilisation de B. subtilis comme hôte 10 permettant la sécrétion de protéines étrangères. Dans des constructions, le gène correspondant à la protéine en question est fusionné avec une séquence permettant son expression ainsi que sa sécrétion par B.subtilis, ladite séquence étant encore désignée par l'expression 1 "séquence signal" codant pour un peptide signal. De nombreux exemples ont été décrits qui utilisent les séquences régulatrices ainsi que les régions correspondant aux peptides signal de l'a-amylase, de la protéase alcaline ou de la protéase neutre de B. subtilis (J. Bacteriol., 165, 837-842, (1986)), B.' amvloliauefaciens 2O ou B. licheniformis. Toutefois, bien que B. subtilis semble être un hôte récepteur de choix par sa caractérisation bien établie, les niveaux de sécrétion de cet organisme sont beaucoup plus faibles si on les compare à ceux des souches de Bacillus utilisées dans l'industrie telles que B.licheniformis, B. amvloliquefaciens ou B.stearothermophilus qui sont capables de produire de grandes quantités d'enzymes sécrétées. Un exemple caractéristique est celui de la pro30 téase alcaline. La souche de B.subtilis 168 mise en culture dans - des conditions de laboratoire et dans un milieu de culture optimum peut produire 50 à 100 unités d'azocaséine par ml de surnageant d'activité du type de celle de la protéase alcaline. La souche industrielle B.licheniformis (déposée à la Collection Nationale des Cultures Micro-organismes à l'Institut Pasteur de Paris sous le numéro 71 I 001) cultivée dans le même milieu de culture optimum que précédemment peut produire plus de 100 000 unités d'azocaséine par ml, donc avec un rendement multiplié par un facteur de 1000. Il se peut que de telles souches aient accumulé 10 des mutations altérant les propriétés de l'enzyme sécrétée telles que la thermostabilité, et/ou des mutations augmentant les taux de sécrétion et de synthèse de protéines. Au cours de ces dernières années, des recherches 15 approfondies ont été réalisées afin d'augmenter la production de protéase alcaline chez la souche bien caractérisée de B.subtilis 168. C'est ainsi qu'un grand nombre de mutants permettant l'augmentation des niveaux de sécrétion d'enzymes protéolytiques ont été isolés. Premièrement, des mutants hr ont été caractérisés par leur surproduction de protéases alcalines et neutres (J. Bacteriol.; 112: 1026-1028, (1972)). Des mutants sac Uh (Biochimie; 56: 1481-1489, (1974)), identiques aux mutants Dap (J.Bacteriol.; 161 25: 1182-1187 (1985), et J.Bacteriol.; 124: 48-54, (1975)), ont également été décrits comme possédant un phénotype plélotropique de surproduction de lévanesaccharase, de protéase et d'aamylase. En outre, le locus régulateur nyrR2 a été décrit 30 comme étant responsable de la stimulation spécifique de la sécrétion de la protéase neutre (J.Bacteriol.; 139: 583-590,(1979), et J.Bacteriol.; 119: 82-91, (1974)). Toutefois, les bases moléculaires de ces mutations restent toujours inconues puisqu'aucune des formes al35 léliques mutées de ces gènes impliqués dans le phénotype observé n'a pu être clonée. C'est la raison pour laquelle le transfert de ces mutations aux autres espèces de Bacillus de façon à augmenter leur capacité de pro5 duction est très difficile. Plusieurs équipes de recherche ont récemment décrit le clonage de fragments d'ADN permettant l'hypersécrétion de protéase chez B.subtilis. Le brevet japonais déposé le 29/07/83 par Okada 10 et al sous le n' 60-30 685 décrit un ADN recombinant contenant une séquence d'insertion originaire du génome d'un B.licheniformis présenté comme codant pour une protéase de ce dernier type de micro-organisme. Les auteurs du brevet ont utilisé cet ADN recombinant pour 15 transformer des cultures de Bacillus subtilis en vue d'accroître leur capacité à produire des protéases alcalines et neutres. Okada et al (Appl.Microbiol.Biotechncl.; 20: 406-412, (1984)) ont cloné un fragment EcoRI de 3,6 kb à partir de B:licheniformis qui stimule aussi bien la 20 sécrétion de 'la protéase neutre que celle de la protéase alcaline (70x), mais n'a qu'un faible effet sur les enzymes du type aamylase (2x); le phénotype observé est conservé à l'occasion du clonage d'un fragment PvuII de 25 1,25 kb et même d'un fragment Sau 3A1 de 0,37 kb obtenu à partir du fragment EcoRI. Les auteurs n'excluent pas la possibilité que la séquence clonée appartenait à un gène régulateur, plutôt qu'à des gènes codant des protéases. Tomioka et al (J.Biotechnol., 3: 85-96, (1985)) ont aussi décrit la stimulation de la sécrétion des protéases neutres (10x) et alcalines (9x) avec un fragment EcoRI de 4 kb provenant de B.amvloliquefaciens; ce fragment a pu être réduit à 1,75 kb comprenant des phases ouvertes de lecture non identifiées; il ne permet pas la stimulation de sécrétion d'a-amylase. Un fragment d'ADN issu de Bacillus natto a été décrit comme permettant une hyperproduction de protéases alacalines et neutres et de lévanesaccharase (J. 5 Bacteriol., 166, 20-29, (1986)). Les auteurs ont envisagé qu'un polypeptide de 60 acides aminés pouvait intervenir dans la stimulation de cette hyperproduction. Enfin, l'identification du gène sacO, gène plelotropique affectant l'expression d'un grand nombre 10 de gènes codant pour des produits secrétés chez diverses souches de Bacillus ainsi que l'identification de polypeptides de 46 acides aminés codés par ce gène sac 0 ont récemment été décrites chez B. subtilis (J. Bacteriol., 166, 113-119, (1986)), et chez B. amvloliquefaciens (J. 15 Biotechnol., 3, 85-96, (1985)). C'est dans le but d'induire chez B. subtilis une surproduction supérieure à ce qui a été réalisé jusqu'à ce jour, non seulement de protéases alcalines, mais également d'un grand nombre d'enzymes exocellulaires, 20 que les auteurs de ce brevet ont utilisé une approche différente des précédentes. En effet, les inventeurs ont construit une banque de gènes à partir du chromosome de la souche surproductrice B.licheniformis, qu'ils ont transférés à B.sub25 tilis, après ligature dans des plasmides appropriés, et ont sélectionné les colonies de B.subtilis surproductrices de protéases. Ils ont ainsi isolé un plasmide ci-après dénomé pPR4 contenant un fragment d'insertion ou "insérat" ali3A1 dé 3,5 kb gui confère à la cellule 30 hôte la propriété de surproduire des enzymes secrétées, notamment de la protéase alcaline. La réduction de cet insérat par digestion partielle par Sau3A1 a conduit les inventeurs à isoler un fragment de 1,4 kb qui, lorsqu'inséré dans un plasmide 35 et introduit par l'intermédiaire de ce dernier dans une cellule hôte y induit la même propriété de surproduction que précédemment. Un plasmide caractéristique contenant ce fragment de 1,4 kb et qui a été utilisé dans l'étude approfondie de ce fragment, a été dénommé pPR41. La présence de ce fragment dans une souche de B.subtilis permet à cette dernière de produire 70 fois plus de protéase alcaline qu'elle ne le faisait auparavant, 4 fois plus de protéase neutre, et au moins 50 fois plus de lévane-saccharase. Elle confère également à la cel10 lule hôte la propriété de surproduire d'autres enzymes telles que la cellulase, ou la p-glucanase, la xylanase, et l'a-amylase. Au cours de cette description, il sera fait référence au dessin et aux reproductions photographiques 15 dans lesquels: - la figure 1 est représentative de la surproduction de protéase alcaline conférée par le plasmide pPR4 à une souche de B.subtilis, - la figure 2 représente le vecteur pPR41 por20 tant la séquence de 1,4 kb de l'invention, 20 - la figure 3 moitre-la séquence complète et la carte de restriction du fragment de 1,4 kb, - les figures 4a à 4f fournissent des résultats comparatifs des surproductions de différentes enzymes 25 par diverses souches porteuses d'un plasmide comprenant une séquence de l'invention ou non, - la figure 5 montre les étapes de sous-clonage du fragment de 1,4 kb, - la figure 6 représente les plasmides pQL1 et 30 pQS1 contenant respectivement les gènes sacOL et sacOS, sous contrôle du même promoteur inductible spac, et qui sont définis en page 8 de ce texte. - la figure 7 indique les différences entre les polypeptides codés respectivement à partir du gène sacQ de B. subtilis, de B. amvloliquefaciens, et de B. licheniformis, - la figure 8 représente les structures de promoteurs possibles dans les différentes souches de Bacillus.5 - la figure 9 représente la construction du géne de fusion sacR-aph3'. - la figure 10 représente la carte de restriction d'un fragment HindIIIEcoRI de B.' subtilis contenant la séquence signal de la lévanesaccharase. - la figure 11 représente le plasmide pBS610 contenant le fragment d'ADN de la figure 10. - la figure 12 représente le plasmide pBS620 contenant également le fragment d'ADN de la figure 10. Le phénotype d'hypersecrétion conféré à la 15 souche réceptrice de B. subtilis par le plasmide pPR41 sera désigné dans ce qui suit par le symbole Sesh (synthèse d'enzymes secrétées, haut niveau). L'étude de la séquence entière de ce fragment d'ADN de 1,4 kb montre qu'il n'existe aucune phase 20 ouverte de lecture supérieure à.101 acides aminés. Les inventeurs ont donc exclu que ce fragment d'ADN de 1,4 kb contienne le gène de structure d'une protéase du type subtilisine, qui est composé de 379 acides aminés sous sa forme précurseur, et de 274 résidus sous sa forme 25 mature (Nucl. Ac. Res., 13, 8913-8926, (1985)), et cherché à réduire la taille de ce fragment. Le phénotype Sesh est conservé lorsque l'on substitue au fragment 1,4 kb, des fragments plus petits qui en sont issus, dans les plasmides utilisés pour la 30 transformation de B. subtilis. De tels fragments plus petits peuvent être obtenus au terme de différentes délétions réalisées sur les extrémités 5' et 3' du fragment de 1,4 kb. C'est ainsi que les inventeurs ont constaté que la séquence responsable du phénotype Sesh est 3. comprise dans un fragment de 561 paires de base entre les positions 353 et 914 de la fig. 3. Dans ce fragment, les 109 derniers nucléotides, correspondant aux positions 805 à 914, sont essentiels mais non suffisants pour produire l'hypersecrétion chez B. subtilis. Par contre, les 228 derniers nucléotides, correspondant aux positions 686 à 914, sont suffisants pour induire le phénotype Sesh à condition de faire précéder ce fragment par un promoteur de transcription reconnu par B. subtilis. Ce fragment de 228 paires de bases contient 10 une phase ouverte de lecture qui code pour un polypeptide de 46 acides aminés, et qui est délimitée par les nucléotides situés aux positions 768 et 905. Cette phase ouverte de lecture est précédée par une séquence nucléotidique présumée fournir les signaux typiques de liai15 son au ribosome délimité par les nucléotides situés aux positions 751 et 762, et suivie d'un terminateur de transcription délimité par les nucléotides situés aux,positions 907 et 936. Les inventeurs ont également déterminé que le promoteur de transcription se trouve sur le fragment de 333 paires 'de bases délimité par les 20 nucléotides situés aux positions'353 et 686 de la figure 3. Le polypeptide de 46 résidus codé par ce fragment de 228 paires de base de B. licheniformis (encore 25 appelé polypeptide sacQL) présente une certaine homologie avec le produit du gène sacQ de B. subtilis (ou encore polypeptide sacQ5) et de B.amvloliauefaciens (ou encore polypeptide sacQA) qui produisent le même genre de phénotype Sesh chez B. subtilis. Toutefois, les inventeurs montrent que le polypeptide sacQL exprimé par la séquence nucléotidique correspondante incorporée dans B. subtilis induit le phénotype (Sesh) d'une façon bien plus efficace que ne le fait le polypeptide sacQ5, ou sacQA dans les mêmes 5 conditions. Un dosage précis montre que l'activation de l'expression du gène de la protéase alcaline est trois fois meilleure, alors que l'activation du gène sacB (lévane-saccharase) est 5 fois meilleure. Cette meilleure efficacité du polypeptide de B. licheniformis est probablement liée à sa structure primaire. Des expériences de délétion ont été réalisées par les inventeurs à partir du polypeptide sacQL de 46 acides aminés. Ils ont ainsi déterminé que la portion carboxyterminale dudit polypeptide, et plus particulièrement les 7 derniers acides aminés, peuvent être modifiés, voire supprimés, sans entrainer pour auh tant une perte totale de l'expression du phénotype Seshr et que le peptide constitué des seuls 12 premiers acides aminés est inactif. Il semble donc qu'une partie au moins des résidus compris entre le 12ème et le 39ème résidu du polypeptide sacQL et correspondant au fragment d'ADN délimité par les nucléotides situés aux positions 805 et 885 de la figure 3, soit essentielle pour l'expression h du phénotype Sesh. L'expression accrue du phénotype Ses lors de l'introduction dans une souche de B. subtilis d'un vecteur comprenant une séquence d'ADN codant pour le polypeptide sacQL pourrait être le résultat de l'action 25 sur une séquence cible, comprise dans le génome de B. subtilis, soit du polypeptide sacQL lui-même, soit d'un autre produit exprimé par une partie du génome de B. subtilis sous le contrôle de sacQ. Les séquences cibles sus-mentionnées sont géné30 ralement situées en amont des gènes de structure codant pour les enzymes secrétées par B. subtilis. Plus particulièrement, les inventeurs ont caractérisé une séquence cible comprise dans un fragment de 440 paires de bases, délimité par les sites de restric35 tion Sau3A1-Rsal et situé en amont du site de liaison aux ribosomes et de la séquence d'ADN codant pour la lévane-saccharase. Cette séquence cible est donc située en amont du gène sacB et comprend le gène sacR de B. subtilis. L'invention concerne un fragment d'ADN caractérisé par le fait qu'il code pour le polypeptide ayant la structure suivante: (Nterminal)Met-Glu-Lys-Gln-Gln-Ile-Glu-Glu-Leu-Lys-GlnLeu-Leu-Trp-Arg-LeuGlu-Asn-Glu-Ile-Arg-Glu-Thr-Lys-Asp10 Ser-Leu-Arg-Lys-Ile-Asn-Lys-Ser-IleAsp-Gln-Tyr-Asp-LysTyr-Thr-Tyr-Leu-Lys-Thr-Ser(Cterminal), ou pour tout fragment de ce peptide qui conserve la propriété du peptide susdit, d'activer l'expression du phénotype Sesh, notamment de stimuler la production des en15 zymes sus-mentionnées des souches de B. subtilis. Les conditions dans lesquelles des fragments actifs peuvent être identifies ont déjà été illustrées plus haut. De préférence, le fragment d'ADN selon l'inven20tion, est caractérisé par la structure nucléotidique 20. r s'étendant entre les positions 768 et 905 de la figure 3. L'invention concerne également des séquences d'ADN dans lesquelles les susdits fragments sont précé25 dés des séquences de régulation de l'expression de la séquence codant pour le susdit polypeptide et suivis des séquences nucléotidiques comprenant les éléments terminateurs de transcription. Ces éléments peuvent consister dans les séquences de régulation et/ou de 30 terminaison qui sont associés avec le fragment d'ADN sus-défini dans les gènes naturels de B. licheniformis. A ce titre, l'invention concerne toute séquence d'ADN de plus grande dimension issue du fragment Sau3A1 de 3,5 kb mentionné plus haut et ne contenant pas de séquence 35 nucléotidique codant pour tout ou partie d'une protéase alcaline, cette séquence contenant également la séquence ll codant pour le polypeptide capable d'induire le phénotype Sesh. En particulier, l'invention concerne des séquences d'ADN comprenant le fragment de 561 paires de bases délimité par les positions 353 et 914 de la séquence de 1,4 kb de la figure 3, susceptible d'être obtenue à partir du génome de B.licheniformis. L'invention concerne plus particulièrement tout fragment du génome d'un Bacillus licheniformis contenu 10 dans la séquence d'environ 1 400 nucléotides de l'acide hucléique de la figure 3 et comprenant la séquence coh dant pour le polypeptide activateur du phénotype Sesh. Le fragment d'acide nucléique du genre en question peut-être constitué par la totalité de la séquence de 1 400 nucléotides de l'acide nucléique de la figure 15 3. Cependant il a été observé que la totalité de la séquence n'est pas nécessaire. A titre d'exemples de fragments conformes à l'invention et satisfaisant à l'ensemble des conditions 20 qui ont été rappelées dans la définition susindiquée du fragment d'ADN selon l'invention,.on mentionnera: - le polynucléotide délimité par des nucléotides d'extrémités correspondant aux nucléotides situés aux positions 353 et 914 respectivement de la figure 3, qui 25 comprend le promoteur de transcription, le site de liaison ribosomique, le gène de structure du polypeptide sacQL de 46 acides aminés. - Le polynucléotide délimité par des nucléotides d'extrémités correspondant aux nucléotides situés aux 30 positions 353 et 1 012 respectivement de la figure 3, qui comprend en plus du polynucléotide précédent le terminateur de transcription, - le polynucléotide contenant le fragment délimité par des nucléotides d'extrémités correspondant aux 35 positions 686 à 914 respectivement de la figure 3, et comprenant, en outre, en amont dudit fragment, une séquence suffisamment longue pour également inclure le promoteur endogène permettant la transcription dans la cellule hâte, notamment par B. subtilis, - tout polynucléotide comprenant un fragment compris entre le nucléotide 353, d'une part, et le nucléotide 905, et comprenant, en outre, en aval dudit fragment, une séquence suffisamment longue pour inclure 10 les séquences de terminaison homologues du gène de B. licheniformis. - tout polynucléotide délimité d'une part par un nucléotide compris entre les positions 1 à 353 et, d'autre part, par un nucléotide compris entre les 15 positions 905 à 914 de la figure 3. - tout polynucléotide délimité d'une part par un nucléotide compris entre les positions 1 à 353 et, d'autre part, par un nucléotide compris entre les positions 1012 à 1400 de la figure 3-.20 - L''invention concerne aussi tout acide nucléique recombinant contenant tout fragment du type sus-indiqué h codant pour le phénotype Ses associé avec des fragments d'acide nucléique hétérologue vis-à-vis dudit fragment, c'est-à-dire des fragments d'acide nucléique ayant des séquences étrangères à celle des séquences d'acide 25 nucléique qui, dans le génome de B.licheniformis, entourent le fragment défini ci-dessus. A ce titre, l'invention concerne tout ADN recombinant contenant une séquence codant pour le phénotype Sesh respectivement associée avec un promoteur de trans3O cription reconnu par B. subtilis, et/ou un terminateur de transcription hétérologue par rapport à 1'ADN de B. licheniformis, ce promoteur et/ou ce terminateur étant néanmoins reconnu par les polymérases de B. subtilis. A cet égard, l'invention concerne plus particulièrement les ADN recombinants consistant en des vecteurs, notamment du type plasmide qui sont aptes à se répliquer dans B.subtilis et à y permettre l'expression de la séquence codant pour le phénotype Sesh. Avantageusement, le susdit promoteur de transcription hétérologue est choisi parmi ceux dont l'activité peut être induite. De tels promoteurs sont appelés 10 dans ce qui suit promoteurs inductibles. A titre d'exenple de promoteur inductible, on citera le promoteur spac (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 439-443, (1984)) inductible par l'IPTG (isopropyl p-D-thiogalactoside). Des vecteurs préférés selon l'invention sont des 15 vecteurs bifonctionnels capables de se répliquer aussi bien chez E.coli que chez B. subtilis, notamment du type pHV33 ou pMK4 décrits respectivement dans Plasmid; 6: 193-201 (1981) et Gene; 29: 21-26, (1984), la ligature des séquences de l'invention aux génomes de ces vecteurs 20 se faisant alors au niveau des sites Bam HI de ces derniers. pMK4 est illustratif des plasmides multicopies qui font également partie de l'invention, c'est-àdire des plasmides capables de se multiplier en un grand nombre de copies dans la cellule hôte. Les vecteurs selon l'invention sont donc préférentiellement choisis parmi ceux permettant d'induire un surproduction du polypeptide sacQL dans la cellule hâte, tels que les plasmides multicopies sus-mentionnés co. mprenant un promoteur inductible. L'invention concerne également le polypeptide sacQL de 46 acides aminés sus-défini et les fragments peptidiques actifs qui en découlent. Ce polypeptide selon l'invention est défini comme l'activateur de l'expression d'un, ou de plusieurs 35 gènes cibles dans un organisme donné. La structure primaire de l'activateur peut être modifiée dans sa partie carboxyterminale sans perte trop importante de son activité, notamment les sept derniers acides aminés peuvent être remplacés par d'autres résidus. L'invention concerne un procédé de production d'enzymes secrétées, qui comprend la transformation de B. subtilis au moyen des plasmides sus-indiqués, la mise 10 en culture des cellules de B. subtilis transformées dans un milieu approprié et la récupération desdites enzymes à partir du milieu de culture Un tel procédé selon l'invention permet la surproduction d'un grand nombre d'enzymes exocellulaires, 15 dont essentiellement la protéase alcaline, mais aussi la levansaccharase, la carboxymethylcellulase, la p-g.lucanase, la lichénase, la xylanase, l'aamylase par des souches de B.subtilis -, L'invention vise également un procédé de pro20 ductEon d'un polypeptide déterminé- par une souche de B. 20 Èubt'ilis dont le -génome a été modifié par insertion d'une séquence nucléotidique codant pour ledit polypeptide, qui comprend la transformation de la souche de B. subtilis sus-indiquée, au moyen de vecteurs permettant 25 la surproduction d'un activateur du phénotype Sesh dans 25 les cellules de B. subtilis, la mise en culture desdites cellules transformées dans un milieu approprié, et la récupération dudit polypeptide à partir du milieu de culture. Parmi les activateurs du phénotype Sesh sus-in30 diqués, on citera notamment les polypeptides sacQL, sacQS, sacQA, et le polypeptide de 60 acides aminés issu de B. natto sus-mentionnés. Préférentiellement, les vecteurs utilisés pour 35 la mise en oeuvre d'un tel procédé sont les plasmides sus-indiqués permettant la surproduction de sacQL chez B. subtilis. La modification du génome de B. subtilis, préalablement à la transformation de ce dernier selon le procédé de l'invention, est réalisée de manière à ce que le susdit génome comprenne une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide déterminé, précédé par une séquence nucléotidique, ci-après désignée par "séquence signal", codant pour un peptide signal, et dont le rôle 10 est de permettre la secrétion dudit polypeptide, ladite séquence signal étant elle-même précédée par une séquence nucléotidique comprenant une séquence cible précédemment définie et un promoteur de l'expression d'un tel fragment d'ADN. En effet, d'une manière générale, toute enzyme naturellement secrétée par B. subtilis est tout d'abord traduite sous forme d'un polypeptide précurseur dont la séquence en acides aminés correspond à celle d'un peptide signal suivie de celle de l'enzyme 20 secrétée. Au moment de la secrétion cellulaire, seule la forme mature correspondant à l'enzyme ellemême est secrétée hors de la cellule. Ainsi le remplacement d'un gène codant pour la sécrétion d'une enzyme par B. subtilis, par une séquen25 ce d'ADN codant pour un peptide signal lié au polypeptide déterminé, permet d'obtenir ledit polypeptide directement secrété sous sa forme définitive par la cellule hôte. La souche de B. subtilis utilisée pour la mise 30 en oeuvre d'un tel procédé est donc modifiée au moyen d'un vecteur, notamment plasmide, contenant la séquence d'ADN codant pour le polypeptide déterminé, précédée d'une séquence signal, qui est elle-même précédée par une séquence nucléotidique comprenant une séquence cible et les éléments nécessaires pour promouvoir 35l'expression de la séquence signal suivie de la séquence l'expression de la séquence signal suivie de la séquence codant pour le polypeptide déterminé. Parmi les séquences signal utilisées, on citera notamment celle permettant la secrétion de la protéase 5 alcaline, de la lévane-saccharase, de la cellulase et de l'a-amylase. D'une manière générale, toute séquence signal précédant la séquence d'ADN codant pour une enzyme par B. subtilis peut être utilisée. Préférentiellement dans le cas o le polypeptide déterminé risque d'être dégradé, sous l'action d'une ou plusieurs des enzymes naturellement secrétées par B. subtilis, notamment de la protéase alcaline, le gène codant pour une telle enzyme est modifié par délétion ou 15 par mutation, de manière à ce que ladite enzyme ne soit pas secrétée, ou secrétée, sous forme inactive vis-à-vis du pqlypeptile déterminé. Avantageusement, la séquence codant par le polypeptide déterminé est précédée par la séquence signal *2Q comprise dans le gène sacB codant pour la lévane-sac.charase -chez B. subtilis,_ et qui est décrite dans Biochem. Biophys. Res. Com., 119, 2, 795-800 (1984), ladite séquence signal étant elle-même précédée par un fragment d'ADN contenant d'une part la séquence25 nucléotidique endogène Sau3A1-Rsal de 440 paires de bases sus-définie comprenant le gène sacR de B. subtilis et dans laquelle se situe la séquence cible et, d'autre part, les éléments nécessaires pour l'expression des séquences codant pour le peptide signal et pour le 30 polypeptide déterminé. En effet, la lévane-saccharase est secrétée par B. subtilis lorsque ce dernier est en phase exponentielle de croissance alors que les autres enzymes sont secrétées par B. subtilis en phase stationnaire. Ainsi 35 l'insertion d'une séquence d'ADN codant pour un polypeptide déterminé en aval de la séquence signal endogène de la lévane-saccharase permet d'obtenir ledit polypeptide exempt des autres enzymes secrétées par B. subtilis lorsque la culture de ce dernier est arrêtée en fin de phase exponentielle de croissance. L'invention concerne donc un procédé de production d'un polypeptide déterminé pratiquement pur, qui comprend la mise en culture de cellules de B. sUbtilis modifiées à l'aide du plasmide sus-indiqué, l'arrêt de la culture en fin de phase exponentielle de croissance 10 dsdites cellules de B. ubtilis et la récupération du polypeptide déterminé à partir du milieu de culture pratiquement exempt des autres enzymes exocellulaires susceptibles d'être secrétées par les cellules de. subtili. Il est avantageux d'utiliser des souches de h Bsubtilis porteuses de la mutation sac Uh, connue comme conférant à ces dernières une capacité de production accrue d'enzymes. L'introduction d'une séquence de l'invention chez des mutants sacUh de B.subtilis, entraîne 20 un effet de synergie affectant la surproduction des enzymes secrétées, voire d'un polypeptide déterminé dans le cas o les génomes des susdits mutants ont été modifiés par insertion d'une séquence codant pour ledit polypeptide comme il l'a été précédemment décrit. 25 A titre d'exemple de polypeptide déterminé susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention, on citera les interférons humains, les interleukines et l'hormone de croissance. L'invention concerne également les cellules de 30 0B.subtilis transformées par les plasmides selon l'invention contenant la séquence codant pour l'activateur, ceux-ci étant capables de se répliquer dans ces cellules, plus particulièrement à l'occasion de leur division cellulaire. L'invention concerne également les cellules de B. subtilis qui sont transformées à la lois par un plasmide contenant une séquence codant pour l'activateur et par le plasmide contenant la séquence codant pour un 5 polypeptide déterminé et pour le peptide signal, telle qu'elle a été décrite plus haut. Ces cultures de cellules sont alors capables de produire des quantités accrues d'enzymes, et/ou du polypeptide déterminé. Il résulte naturellement de ce 10 qui précède que l'invention concerne tout particulièrement des cellules de B.subtilis sus-mentionnées et qui h comportent également au moins une mutation sacUh. Bien entendu, l'homme du métier appéciera que les polypeptides recherchés, plus particulièrement la 15 protéase alcaline, ou le polypeptide déterminé, peuvent être purifiés de toute façon en soi connue, par exemple par électrophorèse sur gel et récupération du polypeptide recherché. On peut également encore avoir recours à toute autre technique par exemple à la chromatographie 20 liquide sous haute pression. Dans ce-qui précède, n'a essentiellement été évoqué que la transformation de B.subtilis. L'invention n'est pas limitée à la transformation de ces cellules. Elle peut également être utilisée pour stimuler 1a 25 production de polypeptides chez d'autres souches déjà utilisées dans l'industrie. On mentionnera, par exemple, B.licheniformis, B.amyloliquefaciens, B.stearothermophilus ou encore des souches E.coli. Des caractéristiques supplémentaires de l'inven30 tion apparaitront encore au cours de la description q#i suit des vecteurs préférés et des conditions dans lesquelles ils peuvent être utilisés, étant entendu que cette description ne saurait être interprétée comme tendant à restreindre la portée des revendications. 35 Etude du clonage des différents fragments d'ADN de l'invention ainsi que de leurs propriétés de.surproduction enzymatique. 1) Matériel et méthodes - Souches bacteriennes et Plasmides: Les souches bacteriennes utilisées sont Bacillus licheniformis (déposé à la C.N.C.M à l'Institut Pasteur de Paris sous le numéro 71 I 001) qui possède une forte 10 activité de production de protéase extracellulaire, B. subtilis 512 qui est un mutant de la souche Marburg (J. Appl. Bacteriol., 33, 220-227,(1970)) déficient en protéase neutre, B. subtilis 512ts19 possédant une mutation soOA thermosensible supplémentaire (Biochimie, 58, 109-117, (1976)), B.subtilis 1A510 (leuA8, arq15, thr5, recE4, str) (J. Bacteriol., 156, 934-936, (1983)), B. subtilis QB881 (sacA321, leuS, araA), B. subtis QB136 (sacU32, leuS, trpC2) (Biochimie, 56, 1481-1489, (1983)), E.coli MC1061 (araD139, A(ara. leu), 7697, 20 AlacX74, qalU-, aalK-, hsr-, hsm + strA) (J. Mol. Biol., 138, 179-207,(1980)) et JM83 (aro, àlac, pro-, strA, fhi, 080, dlacZ, AM15) (Gene, 19, 259-268, (1982)). Les plasmides vecteurs sont le pHV33 et le pMK4 précedemment cités, tous les deux étant capables de se 25 répliquer chez E..oli et chez B. subtilis. Les modifications de structure d'E.coli et de. subtilis, nécesaires au transfert des génomes de plasmides sus-indiqués à ceux de ces bactéries, ont été réalisées, pour E.coli, par la procédure conventionnelle 30 au chlorure de calcium, et pour B. subtilis par la procédure d'ANAGNOSTOPOULOS et SPIZIZEN (J. Bacteriol., 81, 741-746, (1961)). - Milieux et tests aualitatifs E.coli, tout comme B. subtilis, ont été mis en culture dans un bouillon L (10 g de Difco Bacto Tryptone, 5 g d'extrait de levure Difco, 5 g de chlorure de sodium par litre); le milieu SP est composé de 8 g/l de bouillon nutritif Difco Bacto, 1 mM de MgS04 et 13 mM de KCl auxquels on ajoute après stérilisation 2,5 pM de FeS04, 500 pM CaC12 et 10 pM de MnCl2. Le chloramphénicol est additionné à 5 pg/ml et l'ampicilline à 100 pg/ml. Le milieu minéral (MM) est composé de 60 mM de K2HP04, 44'mM de KH2P04, 3 mM de citrate de sodium, 2 mM de MgS04, 10 VM de MnC12, 0,5 mM 10 de CaC12 et 10 mg/L de citrate d'ammonium ferrique (J. Bacteriol., 81, 741-746). L'activité saccharolytique est estimée par détection de l'apparition de glucose avec du Statzyme Glucose 50 (Worthington). Les hydrolyses de la carboxyméthylcellulose (Type II, Sigma), du lichénane (Sigma) et du xylane (Sigma) ont été détectées en recouvrant les boites de culture avec du rouge Congo 1 % pendant 1 heure et en lavant plusieurs fois avec du NaCl 1M jusqu'à ce que des zones claires apparaissent. 20 Les boites contenant des colonies qui ne se lient pas fermement à l'agar ont été recouvertes de 5 ml d'une solution d'agar mou à 7 g/l avant d'être colorées. La dégradation de l'amidon est détectée en 25 sublimant de l'iode sur les boîtes. - Mesures des activités de la protéase neutre et de la Protése alcaline: Des dilutions appropriées de surnageants de culture ont été préincubées en présence ou en l'absence de 30 6 mM de fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSt). Des échantillons de 200 p1 ont été ensuite additionnés à 1 ml d'une solution de Tris/HCl 100 mM (pH 8,0), 2 mM de CaCl2, et 5 mg/ml d'azocaséine (Calbiochem) et incubés à 40'C. Les réactions sont arrêtées à l'aide de 0,8 ml de TCA 15 % (acide trichloroacétique). Après centrifugation, 1 ml de surnageant est neutralisé avec 50 pl1 de NaOH 1ON et la densité optique est mesurée à 440 nm. Une unité azocaséine correspond à 1 pg d'azocaséine hydrolysée par minute, ou encore 0,406 unité Delft. L'activité protéasique sensible au PMSF est attribuée à la protéase alcaline, tandis que l'activité résistante au PMSF est due essentiellement à la protéase neutre. - Mesure de l'activité saccharolvtiqaue Une aliquote des surnageants de culture est incubée en présence de 8 % de saccharose, KH2PO4 50 mM (pH 6,0) dans un volume final de 0,6 ml à 37'C. Les réac-tions sont arrêtées par ébullition. La quantité de 15 glucose libérée est mesurée par incubation en présence d'orthodianisidine, glucose oxydase (dépourvue d'activité invertase) et péroxydase. Une unité enzymatique correspond à 1 pmole de glucose libérée par minute (Methods in Enzymol., 8, 500-505, (1966)). 20 2) Résultats - Isolement d'un Plasmide responsable de la surProduction de Protéase. L'ADN chromosomique de Bacillus licheniformis souche 71 I 001 a été partiellement coupé par Sau3A1 et 25 des fragments de 3 à 5 kb ont été purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose. Ces fragments de chromosone ont été ligaturés a ceux du vecteur bifonctionnel pHV33 (E.co]i - P.subtilis) au niveau du site déphosphoiylé BamHI et le mélange 30 de ligature a été utilisé pour transformer une souche d'E.coli MC 1061. Seize mille transformants contenant % de recombinants ont été sélectionnés sur ampicilline et chloramphénicol. L'ADN plasmidique a été extrait à partir de 8 35 groupes de 2 000 colonies chacun, purifié et utilisé pour transformer des cellules compétentes de B.subtilis 512. La souche 512 est déficiente en activité du type protéase neutre et ne produit pas de halo caracté5 ristique de précipitation de la caséine dû à l'activité de la protéase sécrétée. Six mille colonies résistantes au chloramphénicol ont été testées pour leur activité du type protéase sur boite de caséine à partir de chacun des 8 groupes. Deux clones positifs ont été trouvés dans un des groupes. L'ADN plasmidique a été extrait des 2 clones et utilisé pour transformer B.subtilis 512. Tous les transformants obtenus présentent le mê15 me halo caractéristique autour des colonies, montrant ainsi que la surproduction de protéase est liée à la présence du plasmide dans B.subtilis. Des analyses des 2 plasmides ont montré qu'ils étaient identiques et avaient inséré un fragment Sau3A1 20 du chromosome de 3,5 kb. 20 Un des' plasmides a été appelé pPR4 et a été étudié plus en détail. - Caractérisation de l'activité du tvpe Protéase Le plasmide pPR4 ainsi que le vecteur PHV33 ont 25 été introduits par transformation dans la souche 1A510 de B.subtilis qui est déficiente en fonctions de recombinaison mais qui porte les allèles sauvages des gènes protéases. Les deux types de transformants obtenus ont été 30 mis en culture sur des milieux SP contenant 1 %t de caséine et 5 pg/ml de chloramphénicol. L'activité protéase du surnageant de culture a été mesurée en présence ou en absence de PMSF qui inhibe spécifiquement la sérylprotéase (protéase alcaline). 35 L'activité PMSF résistante est due à la protéase neutre. Comme l'indique la figure 1, une très forte stimulation de l'activité protéase alcaline est obtenue en présence du plasmide pPR4, en comparaison à la souche de 5 référence portant le vecteur seul pHV33. Le maximum de stimulation qui est de 70 fois est obtenu après 17 heures de culture. Toutefois, l'activité du type protéase neutre est beaucoup moins stimulée. L'augmentation maximale ob10 tenue est d'un facteur de 4 après 17 heures de culture. Apres 22 heures de culture, il n'y a pas de différence d'activité protéase neutre entre les cellules contenant pPR4 ou pHV33. - Sous-clonace du fraament de 3 500 Paires de base Le plasmide pPR4 qui porte le fragment de 3,5 kb a été partiellement digéré avec Sau3Al. Les fragments obtenus ont été soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose et 6 zones de migration 20 correspondant aux tailles de fragment suivantes ont été découpées du gel: 1,2 à 1,4 kb; 1,4 à 1,6 kb; 1,6 à 1,8 kb; 1,8 à 2,0 kb; 2,0 à 2,3 kb et 2,3 à 2,8 kb. L'ADN de chaque tranche du gel a été purifié par 25 électroélution et ligaturé au niveau du site déphosphorylé BamHI du plasmide pMK4. Le vecteur pMK4 est un vecteur navette pour B.subti]is et E.coli obtenu par fusion de pC194 et pUC9. La souche E.coli JM83 a été transfcrmée avec le 30 mélange de ligature et l'ADN plasmidique a été extrait à partir de tous les transformants s'étant multipliés en présence d'ampicilline et de chloramphénicol. L'ADN extrait a été utilisé pour transformer B.subtilis 512ts19 (mutant de sporulation thermosensible de la souche 512), et les transformants ont été sélectionnés sur des boites de milieu minimum (MM) auquel est ajouté 2 % de lait écrémé et de chloramphénicol. Des colonies surproductrices de protéases ont été trouvées pour chacun des 6 fragments de tailles dif5 férentes sélectionnés. Une colonie de B.subtilis surproductrice de protéase correspondant à l'ADN issu de la tranche de gel comprise entre 1,2 à 1,4 kb ligaturée à pMK4 a été réisolée et son plasmide a été extrait et amplifié chez 10 E. coli JM83 (pPR41). Le plasmide pPR41 contient un fragment d'inser- tion de 1,4 kb comme l'indique la figure 2. La séquence de ce fragment de dé-terminée et est indiquée à la figure 3. 15 Cette séquence a été traduite dans de lecture possibles. Aucun des polypeptides traduction de'cette séquence ne dépasse 101 nés. Aucune homologie n'a été trouvée entre tides et les protéases alcalines et neutres ^ B. subtilis ou B. amvloliquefaciens. Nous 1,4 kb a été les 6 phases obtenus par acides amices polypepconnues chez pouvons donc ou exclure que lé fragment de 1 400 paires de base contienne le gène de structure d'une protéase du type subtilisine, qui est composé de 379 acides aminés sous sa forme précurseur, et de 274 résidus sous sa forme mature 25 (Nucl. Ac. Res., 13, 8913-8926, (1985)). - Caractérisation du Phénotvype d'hvypersécrétion f Sesh): Différents types d'activités ergymatiques secrétées testées sont augmentées en présence du plasmide 30 pPR41. ILe plasmnide pPR41 ou le ver+eur pMK4 ont été introduits par transformation dans différentes souches de B. subtilis présentées au tableau 1. Les souches portant le plasmide recombinant ont été comparées à celles portant le vecteur seul, ces-souches ayant été mises en culture sur des boites contenant di5 fférents substrats dégradables décrits dans les figures 4a à 4f. 10 Tableau 1 SOUCHE DESCRIPTION QB2.136 Mutant Sach. Mutation pléiotropique qui augmente simultanément Zes niveaux de lZévane10 saccharase et de protéase extraceZZllulaire. QB881 Mutant SacA-. Absence d'activité saccharolytique endoceZlluZaire. Incapacité d'utiliser le saccharose comme source de carbone. 15 512ts29 Absence d'activité protéase neutre exocellulaire. Mutation spoOA thermosensible. lA510 Rec, Stp (stable transformation phenotype). Une plus grande stabilité des plasmides est décrite pour cette souche. $A Mutation spoOA. Incapacité de sporuler. L'activité protéase a été testée sur des boites contenant du lait écrémé en tant que source de carbone et d'azote. Toutes les souches testées présentent des niveaux d'activité de protéase extracellulaire augmentés (figure 4a). Cette stimulation est indépendante de l'intégration chromosomique du fragment clone, puisqu'elle est également obtenue avec des souches Rec (B.subtilis 1A510), ou Rec+. On trouve même une augmentation de la sécrétion de protéase chez des mutants spoOA, (B.subtilis 5NA), bien que -cet effet ne soit pas aussi important qu'avec les autres souches. Les mutants spoOA sont bloqués au stade O (zéro) de la sporulation. Ils présentent norma15 lement de très faibles niveaux de sécrétion et sont incapables d'exprimer le jeu entier des gènes de sporulation. Toutefois, la présence de pPR41 ne restaure pas le processus de sporulation de B. subtilis et l'on peut par conséquent exclure la fonction de complémentation de 20 la mutation spoOA par pPR41. La souche 512ts19, porteuse d'une mutation au niveau du gène de structure de la protéase neutre, présente également une sécrétion accrue d'enzyme protéolytique, confirmant ainsi les résultats de la figure 1 qui 25 montrent que c'est essentiellement la sécrétion de 1protéase alcaline qui est stimulée. Une découverte plus interessante encore est il]ustrée sur la figure 4a: le plas'.de pPid. semrbh siue30{ sb la sécrétion de protéase chez un mutant CU (B.subtilis QB136). La mutation sacUh est connue comnie étant une mutation pléiotropique qui augmente la secrétion d'un grand nombre d'enzymes exocellulaires, dont les protéases. Le plasmide pPR41 produit ainsi un effet synergique avec la mutation sacUh sur la secrétion de 35 protéases chez B.subtilis. Le taux de dégradation exocellulaire de cinq autres substrats différents est augmenté par la présence du plasmide pPR41: hydrolyse du saccharose, dégradation de la carboxyméthylcellulose, du lichenane, du xylane et de l'amidon. L'activité saccharolytique a été testée en disposant les colonies sur un support à base d'agar mou et contenant du saccharose, et par détection de la présence 10 de glucose après 2 heures d'incubation à 37'C (figure 4t). L'augmentation de l'activite saccharolytique exocellulaire, présentée sur la figure 4b, est due à la levane-saccharase dont la synthèse est induite par le saccharose (Microbiology. Schlessinger, D.(Ed). American 15 Society for Microbiology, Washington D.C, pp 58-69, (1976)). L'activité cellulolytique (figure 4c et 4d) a été testée en cultivant les souches en présence soit de carboxyméthylcellulose (CMC), qui est un glucane B 1-4, (figure -4c) soit de lichenane, qui-est un mélange de 20 glucanes $ 1-3. et $ 1-4 (figure 4d). Puisque le rouge Congo se lie spécifiquement aux glucanes de hauts poids moléculaires, la dégradation de ces deux substrats est indiquée par la présence d'un halo clair autour des co25 lonies. L'hydrolyse de ces deux substrats en présence de pPR41, indique une augmentation de la sécrétion de B 1-4 glucanase (J. Bacteriol. , 165, 612-619, (1986) et/ou 0-1, 3-1,4-glucanase (Gene, 23, 211-219, ('983). Une augmentation comparable a été obtenue avec les souches h porteuses de mutation sacUh. La xylanase est la quatrième enzyme sécrétée et stimulée (figure 4e). Les colonies cultivées en présence de xylane (polymère 9 1-4) présentent des halos de dégradation plus larges en présence du plasmide pPR41. La sécrétion d'un cinquième type d'enzyme de dégradation exocellulaire est augmentée (figure 4f). Les souches cultivées en présence d'amidon en tant qu'unique source de carbone présentent de plus grands halos de dégradation quand pPR41 est présent. L'augmentation, 5 toutefois, n'est pas aussi importante qu'elle ne l'était pour les quatre autres activités exocellulaires. - sous-clonaee du fragment de 1 400 bp De manière à identifier le plus petit fragment d'ADN capable d'induire une hypersécrétion chez B.sub10 tilis, les fragments obtenus après délétion avec Bal31 utilisés pour le séquençage du phage M13 monobrin ont été transférés au plasmide bifonctionnel pMK4. Les plasmides contenant les fragments progressivement délétés à partir de l'extrémité 3'ont été intro15 duits dans la souche de B.subtilis 1A510 et l'activité de type protéase sécrétée a été visualisée sur des milieux solides à base de lait écrémé. Les résultats *sont indiqués sur la figure 5. Le phénotype de l'hypersécrétion est donné par 20 le fragment délété depuis l'extrémité 3'jusqu'en position 914 (fragment ayant perdu les 489 derniers nucléotides) et est perdu lorsque la délétion est étendue jusqu'à 109 paires de base plus loin vers l'extrémité ', à la position 805. Il peut ainsi en être conclu que le fragment de 109 paires base compris entre les deux points de délétion porte tout ou partie du fragment d'ADN qui produit le phénotype d'hypersécrétion chez B.sbt'is. Des sites de restriction appropriés ont alors 30 été utilisés pour réduire plus encore la taille du fragment d'ADN à partir de l'extrémité 5'. Un fragment de 353 paires de bases peut être délété du côté 5'puisque le fragment HaeIII-PstI (position 353-1400) continue d'induire l'hypersécrétion de protéase. Il en a été conclu que la séquence responsable de l'hypersécrétion est comprise entre la position 353 (site HaeII) et ia position 914 (délétion Bal31). Dans ce fragment de 561 paires de base, les 29 derniers nucléotides ne peuvent être délétés sans perte partielle du phénotype. En effet, le sous-clonage du fragment HaeIII-RsaI conduit à une hyperproduction de protéase légèrement diminuée par rapport au fragment initial. Par contre, les 109 derniers nucléotides sont essentiels, puisque leur délétion conduit à la perte totale du 10 phénotype Prth Ces 109 nucléotides, toutefois, ne semblent pas être suffisants puisque le fragment AhaIII (685)-PstI (1 400) ne contient pas l'information nécessaire pour induire une hypersecrétion. La conclusion est donc que la taille du fragment produisant le phénotype Sesh est inférieure à 561 bp (HaeIII,-- 353-délétion 914) mais supérieure à 228 bp (AhaIII, 686-délétion 914). Identification et caractérisation du DolvDeph tide restonsable du phénotvpe Ses: te fragment AhaIII (686) PstI (1 400) a-été cloné sous contrôle d'un promoteur reconnu par B. subtilis en phase végétative de croissance et inductible par l'IPTG (promoteur: spac., Proc. Natl. Acad. Sci. 25 U.S.A, 8_1, 439-443 (1984)). Les plasmides pQL1 et pQS1 contenant respectivement les gènes codant pour sacQL, sous contrôle du même promoteur inductible spac, sont illustrés à la fiaure, est leur construction est plus particulièrement détai lée dans la légende de cette 30 figure à la fin de ce jhapitre 2. Les résultats 'du tableau 2 montrent que la secrétion de protéase alcaline et de lévane-saccharase est induite spécifiquement par l'IPTG chez B subtilis 31 1A510. Ce résultat, combiné aux données de sous- clonage, montre qu'un produit de transcription et/ou de traduction provenant du fragment de 228 bp (AhaIII, 686 délé5 tion 914) suffit à produire le phénotype Sesh 10 15 20 25 30 w Ln w o LN tn o Ln o Ln Tabteau 2: Mesure de l'activitd exocellutaire de la tdvane-saccharase et de la protéase alcaline Souche Ldvane-saccharase Protdase alea ine Plasmide Description de la construction rdceptrice unitds/mg unités azocasdine/mI x 103 setnsibles au PMSF - IPTG + IPTG - IPTO + IPTG pMK4 Contrôle vecteur 0% o w Ceci suggère l'intervention d'un polypeptide codé à partir de ce fragment. Il contient en effet une phase ouverte de lecture codant pour un peptide de 46 résidus précédé par une séquence typique de liaison ribomique (AG = -20,4 Kcal/mole, figure 3) et se terminant par une séquence caractéristique de terminaison de transcription (AG = -24,2 Kcal/mole). Ce peptide présente une homologie significative avec le produit du gène sacO de B. subtilis (J. Bacteriol., 166, 113-119) et B. amvloliauefaciens (J. Bacteriol.,., 85-96). Le polypeptide SacQL de B. licheniformis a la même taille de 46 acides aminés que son homologue sacQS de B. subtilis (figure 7). Néan15 moins, 15 résidus sont différents chez B. licheformis dont une insertion et une délétion. Sept changements parmi ces 15, font intervenir une modification de la polarité de l'acide aminé. Le polypeptide sacQL se distingue donc, par sa structure primaire,du polypeptide 20 sacQs, mais aussi du polypeptide sacQA (B. amvloliquefaciens), qui ne contient que 4 acides aminés différents par rapport à sacQs dont 2 seulement font intervenir un changement de polarité. Cette distinction se marque aussi dans l'inten25 sité du phénotype d'hypersecrétion. Le tableau 2 montre les activités protéase et lévanesaccharase produites par B. subtilis 1A510 portant le gène sacOL ou sacOs sur un vecteur présent en multiples copies. Le gène sacO, de B. subtilis a été cloné de la mêmp façon que sacOL. Des 30 fragments supérieurs à 3 kb progenant d'une digestion partielle Sau3A1 du DNA chromosomique de B. subtilis 168 ont été liés au site BamHI de pMK4 et introduits dans B. subtilis 168 après amplification dans E. coli JM83. Un clone hyperproducteur de protéases contenait le plasmide 35 pBQ1. Ce plasmide contient une insertion de 2,9 kb au site BamHI et exprime le phénotype Sesh semblable à celui produit par pPR41. La taille de l'insertion a été réduite à 0,4 kb par une méthode semblable au sous-clonage de pPR4: digestion partielle Sau3A1 de pBQ1 et sé5 lection des tailles 0,2-0,5 kb. La séquence de ce fragment de 0,4 kb a été déterminée. Elle est strictement identique à la séquence publiée pour sacOs. Le tableau 2 montre que la présence du gène sacOL en multiples copies dans la souche 1A510 stimule 5 10 fois plus l'activité de la lévane- saccharase secrétée que le gène sacOs dans les mêmes conditions. Quant à l'activité protéase alcaline (sensible au PMSF), elle est deux fois plus stimulée par le gène de B. licheniformis que par le gène de B. subtilis. Cette stimulation devient jusqu'à trois fois meilleure pour des temps de culture plus longs (40 heures). Le gène sacOL produit donc le phénotype 4'hypersecrétion (Sesh) chez B. subtilis d'une façon plus efficace que le gène sacQ5. Cette efficacité accrue peut être due à la nature même du polypeptide ou à une augmentation de la quantité de 20 ce polypeptide produit-dans B. subtilis. Les résultats du tableau 2 montrent que la séquence primaire du polypeptide sacQL joue un rôle capiSsh tal -dans l'expression du phénotype Sesh. En effet, 25 lorsque les deux gènes sacOL et sacOS sont placés sous le contrôle du même promoteur spac inductible par l'IPTG (voir constructions figure 6), l'activité lévane-saccharase est 6 fois mieux stimulée par sacQ, qu'elle ne l'est par sacQ5. L'activité protéase alcaline est 30 environ 10 fois mieux stimulée par l'expression du gène de B. licheniformis. L'activité protéase alcaline est moins stimulée lorsque les gènes sacOL ou sacOS sont sous le contrôle du promoteur spac que sous contrôle de leur promoteur 35 propre (tableau 2). Il faut donc admettre que la régulation de l'expression du polypeptide sacQ est également importante dans l'expression du phénotype Sesh. Or nous savons d'une part par les résultats de sous-clonage de la figure 5 et ceux du tableau 2 que le promoteur de 5 transcription doit se trouver sur le fragment de 333 paires de bases délimité par les sites RaeIII (353) et AhaIII (386). D'autre part, le site de début de transcription a été déterminé par "S1 mapping" chez B. subtilis (J. Bacteriol., 166, 113-119 (1986)). Par ho10 mologie, la position supposée de début de transcription chez B. licheniformis est le nucléotide 695 (figure 3 et figure 8). La région "- 10" par rapport à ce début de transcription ainsi que la région "- 35" présente une séquence qui ressemble à celle d'un promoteur de trans15 cription. Un exemple d'un promoteur (P43) de phase végétativereconnu "in vitro" par la RNA polymérase contenant le facteur a43 est donné à titre comparatif (J. Biol. Chem., 259, 8619-8625, (1984)). La figure 8 montre la structure de ce promoteur potentiel comParée dans les 20 différentes souches de Bacillus. La séquence "- 35" est conservée dans toutes les souches alors que la séquence "- 10" est variable. Le premier nucléotide de la séquence "- 10" est important. En effet, la substitution d'un C par un T conduit au phénotype Sesh dans le mutant 25 SacQh de B. subtilis (J. Bacteriol., 166, 113-119, (1986)). Cette même mutation est conservée dans B. amvloliquefaciens et B. licheniformis, qui possèdent tous deux de meilleures capacités de secrétion que B. subtilis. Chez B. liiheniformis hyperproducteur de pro30 téases, on trouve une mutation supplémentaire de C en A au troisième nucléotide de la séquence "- 10". - Effet svneraique de sacO sur la mutation sacUh: Le tableau 2 compare les effets de la présence 35 des gènes sacoL et sacO en multiples copies dans une souche de B. subtl QB136 qui porte la mutation sacUh La présence du gène sacoS n'augmente pas le niveau d'activité lévane-saccharase et diminue celui de la protéase alcaline de la souche QB13G alors que la présence du gène sacOL augmente environ deux fois ces niveaux d'activité. Toutes les activités lévane-saccharase présentées dans le tableau 2 ont été effectuées en présence de saccharose. En absence de saccharose, l'activité est 10 inférieure à 0,02 U/mg (résultat non montré). En d'autres termes, l'induction de l'expression du gène sacB par le saccharose semble être un phénomène de sa surexpression provoquée par la présence de plusieurs copies du gène sacQ. - La portion carboxyterminale du polypDeDtide sacO est hyDervariable: Le fragment HaeIII (353)-RsaI (885) a été souscloné au site SmaI du vecteur pMK4 et un phénotype partiel d'hyperproduction de protéase a été obtenu 20 (figure 5). D'après les séquences connues du vecteur pMK4 et du gène sacOL, on peut prédire la synthèse d'un polypeptide hybride dans lequel les 7 derniers acides aminés de sacQL sont remplacés par Il résidus totalement différents provenant de la traduction d'une séquence de 25 pMK4. Ce polypeptide sacQ hybride contenant la partie carboxy-terminale modifiée exprime donc une activité diminuée par rapport au polypeptide intact. Ceci suggère que les sept derniers résidus contribuent à donner une structure optimale au polypeptide, mais ne sont pas 30 essentiels à son activité. Ce résultat est compatible avec le fait que les derniers résidus du polypeptide sacQ sont variables dans B. licheniformis (figure 7). Néanmoins, un polypeptide fusionné qui contient seulement les douze premiers acides aminés du polypeptide SacQ suivis par 19 acides aminés provenant de la lec-ture du vecteur pMK4 est totalement dépourvu d'activité (délétion 805). - Identification d'une cible du cène sacO Afin d'identifier une cible du gène sacO, les inventeurs ont réalisé une fusion de séquences nucléo10 tidique dans laquelle le site régulateur (sacR) du gène sacB codant pour la lévane-saccharase est utilisé pour contrôler l'expression du gène de structure d'une protéine cytoplasmique, la 3', 5"-aminoglycoside phosphotransférase (aDh3') de Strentococcus faecalis (Gene., 15 23, 331-341 (1983)). Ce gène confère une résistance à la kanamycine lorsqu'il est exprimé dans B. subtilis. La figure 9 montre la manière dont la souche QB4058 a été construite. Après intégration par recombinaison homologue, 20 les séquences chromosomiques demeurent théoriquement intactes jusqu'à la fin du locus sacR, au niveau du site Rsal 440 (nucléotide numéroté comme il l'a été décrit dans Mol. Gen. Genet., 200, 220-228 (1984)) qui est localisé juste avant le site de liaison aux ribosomes du 25 gène sacB. Ainsi sacR est directement suivi par le site de liaison aux ribosomes du gène aDph3', la séquence codant pour l'aph3' et les signaux de terminaison, la séquence pBR322 et finalement les séquences sacR et sacB situées 30 en aval du site Sau3A1 (position 1) de sacR. Le tableau 3 représente la mesure de la résistance à la kanamycine de la souche de B. subtilis QB4058. La concentration minimale de kanamycine nécessaire pour inhiber la croissance de la souche de B. 35 A ilis QB4058 portant les plasmides indiqués, a été déterminée selon la méthode décrite dans Antibiot. Chemother. 9, 307-311 (1959). Plusieurs dilutions 2 3 4 (1: 10 2, 1: 103 ou 1: 104) d'une culture de QB4058 en croissance exponentielle dans un bouillon PAB 5 (Penassay Broth commercialisé par DIFCO) contenant du chloramphénicol ont été placées sur de l'agar MuellerHinton contenant de la kamamycine et, lorsque cela est indiqué, 2 % de saccharose. Le phénotype de secrétion de lévane-saccharase (encore désigné par 10 l'abréviation Lvs) est estimé par détection sur plaque: Lvs correspond à l'absence d'halo d'activité saccharolytique; Lvs+ et Lvscorrespondent respectivement à la présence d'un petit et d'un grand halo d'activité saccharolytique. Le tableau 3 montre que la résistance à la kamamycine est conférée à la souche QB4058 par la présence simultanée de multiples copies de saco et de saccharose. sacOL confère une meilleure résistance à l'antibiotique que ne le fait sacOs confirmant les résultats pré20 liminaires concernant la meilleure efficacité du poly2O peptide issu de B. licheniformis. TABLEAU 3 Es 2f 3 QBA058 POUR L'INHBITION DE LEVANE-SACCHARASE CROISSANCE -SACCHAROSE *SACCHAROSE -.SACCHAROSE +SACCHAROSE pMy4 B 26 Lvs- L*s+ pBQl 8 32 Lvs- Lvsh (pGX4 + scQs) pPR4l 8 228 Lvs L, vsh (pMX4 + sacQZ) Ainsi, l'expression du gène aph 3' est activée par surproduction du polypeptide sacoQ. Il peut être également conclu de cette expérien5 ce que le site d'activation est un fragment d'ADN localisé en amont du site RsaI (440) qui comprend sacR. De manière à déterminer à quelle distance la cible de sacO est localisée en amont du site RsaI, l'activité de secrétion de lévane-saccharase par les souches résistantes 10 à la kamamycine a été testée. Le tableau 3 montre que le niveau de secrétion de lévane-saccharase est augmenté en présence de plasmides porteurs du gène sacO. La cible de sacO doit donc se située en aval du 15 site Sau3A1. Par conséquent, la cible sacO semble se trouver dans le fragment Sau3AI-EsaI localisé au voisinnage de la séquence codant pbur la lévane-saccharase. Exemples de construction d'un p1asmide contenant la séquence signal de la lévane-saccharase a) Construction du plasmide PBS610 L'ADN extrait à partir 'd'une souche de B.subtilis168 a été partiellement digéré avec HindIII. Après électrophorèse sur gel de polyacrylamide, les fragments de 4 kb ont été clones dans le plasmide 25 pUC8, décrit dans Gene, 19, 259-268 (1982), qui ne se réplique que chez E.coli. Le plasmide recombinant a été isolé à partir du clone synthétisant de la lévane-saccharase. Ce dernier a été détecté par son action sur le saccharose, qui est transformé en glucose et en polymè30 res de fructose sous l'action de la lévane-saccharase. Le plasmide isolé a été digéré avec EcoRI et BamHI. Le fragment BamHI-EcoRI qui a été isolé, comprend un fragment HindIIi-EcoRI d'environ 2 kb et dont la carte de restriction est indiquée à la figure 10. Ce 35 fragment contient la séquence signal de la lévanesaccharase. Le fragment BamHI-EcoRI sus-mentionné a été recombiné, à l'intérieur d'un nouveau plasmide, avec le fragment DBamHIEcoRI obtenu à partir de pBR322, après 5 digestion de ce dernier avec les enzymes BamHI et EcoRI, et contenant les éléments responsables pour la réplication du pBR322 chez E.coli. Un fragment HindIII-HindIII d'environ 2,9 kb, consistant en le plasmide pC194, et comprenant les élé10 ments permettant audit plasmide pC194 de se répliquer chez B.sutlis, a été inséré dans le plasmide recombinant précédemment obtenu, plus particulièrement au niveau du site -HindIII contenu dans le fragment BamHIEcoRI comprenant la séquence signal de la lévane-sac15 charase, pour finalement obtenir le plasmide pBS610 schématiquement représenté à la figure 11. Le plasmide pBS610, dont le génome est d'environ 8,9 kb, peut se répliquer chez E.coli et chez B. subtilis. Le plasmide pC194 peut être obtenu à partir du 20 plasmide pHV33. Une souche d'E.coli transformée par pHV33 a été déposée à la Collection Nationale des Cultures de Micro-organismes (C.N.C.M) à l'Institut Pasteur, France, sous le numéro 1-191. b) Construction du Plasmide pBS620 25 Un fragment HindIII-EcoRI, contenant la séquence signal de la lévane-saccharase, a été obtenu par digestion en présence des endonucléases EcoRI et HindIII du phage A modifié obtenu par insertion, au niveau des sites BamHI du phage A-EMBL3 décrit dans J. Mol. Biol., 30 170, 827-842 (1983), de produits de digestion partielle Sau3A1 de l'ADN de la souche de B. subtilis2010 porteuse d'une mutation sacR c et secrétant de la lévane-saccharase de façon permanente. Le phage modifié sus-mentionné comprend le promoteur sacRc susdit. Une souche d'E.coli 35 contenant ce phage modifié a été déposée à la C.N.C.M sous le numéro 1-314. Le fragment EcoRI-HindIII de 2 kb contenant la séquence signal de la lévane-saccharase et le locus sacRc ont été recombinés avec le fragment EcoRI-HindIII d'environ 4,3 kb isolé à partir de pBR322 et contenant les éléments permettant au plasmide pBR322 de se répliquer chez E.coli. Le plasmide obtenu a encore été digéré avec MindIII et recombiné avec le fragment de 2,9 kb sus-mentionné, provenant du plasmide pC194, afin d'obte10 nir le plasmide pBS620 schématisé à la figure 12. Le pBS620 peut également se répliquer chez B. subtilis et E.coli. Les plasmides pBS610 et pBS620 peuvent ensuite être modifiés par insertion d'une séquence d'ADN codant pour un polypeptide déterminé, de préférence à la suite de la séquence signal, et par insertion en amont de ladite séquence signal, d'une séquence d'ADN comprenant une séquence cible selon l'invention et les éléments permettant l'expression de la séquence signal et de la 20 séquence d'AnN codant pour le polypeptide déterminé par la cellule hôté. D'une manière générale la modification des plasmides comprenant une séquence signal de manière à ce qu'ils comportent une séquence d'ADN codant pour un 25 polypeptide déterminé, peut être réalisée par toute méthode susceptible d'être imaginée par l'homme de l'art en fonction notamment des divers enzymes et sites de restriction choisis. Les plasmides modifiés ainsi obtenus peuvent 30 être utilisés pour transformer B. subtilis de manière à ce que ce dernier produise et excrète le polypeptide déterminé. Cette transformation peut par exemple être réalisée selon la méthode décrite dans J. Bacteriol., 114, 273-286 (1973). Les cellules contenant des plas3 mides et résistant à l'antibiotique peuvent être sélectionnées sur des plaques d'agar SP additionnées de chloramphénicol (5 pg/ml). Les cellules de B. subtilis transformées peuvent être détectées par exemple en mettant en jeu des anti5 corps préalablement préparés et dirigés contre le polypeptide déterminé. Les cellules des colonies détectées peuvent alors être isolées, et utilisées pour preparer des cultures de cellules synthétisant et secrétant le polypeptide déterminé dans le milieu de culture. Le 10 polypeptide peut ensuite être isolé du milieu de culture Bar toute méthode appropriée. Les légendes correspondant aux figures illustrant les expériences et observations qui précèdent sont 15 Ies suivantes: - figure 1: Bacillus subtilis 1A510 contenant le vecteur pHV33 ou le plasmide pPR4 sont mis en culture à 37C en milieu SP supplémenté par du chloxamphénicol à 5 pg/ml 20 et de la caséine à 1 %. L'activité protéase des surnageants est mesurée en présence ou en absence de PMSF aux temps indiqués. - figure 2: Plasmide pPR41. AmpR et CmR indiquent les gènes 25 de résistance à l'ampicilline et au chloramphénicol, respectivement. Ce plasmide contient une origine de réplication de E. coli et une origine de réplication de B. subtilis. - figure 3: Séquence du fragment de 1 400 paires de bases. Les points de délétion Bal31 sont indiqués par t. Les sites reconnus par les enzymes de restriction sont soulignés ainsi qu'une séquence palindromique suggérant la structure d'un terminateur de transciption. Le début de 35 transcription probable est indiqué part-. La séquence complémentaire à l'extrémité 3' de l'ARN ribosomique 16s de B. subtilis est souligné d'un double trait. - figure 4a: Test qualitatif pour l'activité protéolytique sécrétée par B. subtilis. Les souches sont cultivées pendant 3 jours sur des boites de Pétri contenant du milieu MM supplémenté par du chloramphénicol à 5 pg/l et de la poudre de lait écrémé (Difco) à 2 %. - figure 4b: Tests qualitatifs de l'activité saccharolytique dans B. subtilis. Après une croissance de nuit en milieu SP contenant du chloramphénicol, les boites sont pulvérisées avec 1 ml de saccharose à 50 %. Après 1 heure 30 d'incubation à 37'C, le glucose libéré est visualisé par 15 révélation avec du Statzyme. - figure 4c: Tests qualitatifs de dégradation de la carboxyméthylcellulose, les colonies sont mises en culture de nuit en milieu L contenant du chloramphénicol. Après 20 recouvrement par de l'agar-.mou contenant 1 % de carboxyméthylcellulase, elles sont incubées pendant-4 heures à 37'C avant révélation avec du Rouge Congo. - figure 4d: Tests qualitatifs de dégradation de lichenane. 25 Les colonies sont mises en culture pendant 2 jours en milieu MM supplémenté par du (NH4)2SO4 à 2 %, de l'hydrolysat de caséine 0,01 %, du chloramphénicol à 5 pg/ml et du lichenane à 0,4 %, avant révélation au Rouge Congo. - figure 4e: Test qualitatif de dégradation de xylane. Les colonies sont mises en culture à 37'C pendant 2 jours sur milieu MVE supplémenté par du (NH4)2 S04 à 2 %, de l'hydrolysat de caséine à 0,01, du chloramphénicol à 5 35 Pg/ml et du xylane à 0,4 % avant révélation au Rouge Congo. - figure 4f: Tests qualitatifs de dégradation de 1' amidon. Les colonies sont mises en culture pendant 3 jours sur milieu MM supplémenté par du (NH4)2 SO4 à 2 %, de l'hydrolysat de caséine à 0,01 %, du chloramphénicol à 5 pg/ml et de l'amidon à 1 %. Les boîtes sont révélées à l'iode. - fiaure 5: ass Sous-clonage du fragment de 1 400 paires de bases. - fiaure 6: Construction de plasmides contenant sacQL et sacQs sous contrôle du même promoteur inductible spac. Les plasmides pQL1 et pQS1 sont construits par insertion de fragments portant les gènes sacQL et sacQ5 dépourvus de leur promoteur dans le plasmide pSI-1 au site HindIII après remplissage à la DNA polymérase (polI). Le plasmide pSI-1 contient le promoteur spac 20 introduit au site EcoRI de pIQ45 (Proc. Natl. Acad. U.S.A, 81, 439-443 (1984)). La position du site AhaIII et PstI indiquée pour pQL1 correspond aux positions de la séquence de la figure 3. Le plasmide pBQ102 provient du sous-clonage d'un fragment de 400 paires de bases au 25 site BamHI de pMK4. Ce fragment a été obtenu par digestion partielle par Sau3A1 du plasmide pBQ1. La séquence de ce fragment montre qu'il commence au site Sau3A1 correspondant à la position 47 de la séquence sacO de B. subtilis publiée (J. Bacteriol., 166, 113-119 30 (1986)). Le début de la séquence du fragment inséré dans pQS1 est donc G-G-G-G-A-T-C-T-T-T-C-A-A-A...: Le site Sau3A1 (G-A-T-C) souligné correspond au site Sau3A1 indiqué à la figure 3. 35 - figure 7: Comparaison des polypeptides sacO de B. subtilis (B. s.), B. amvloliauefaciens (B. a.) et B. licheniformis (B.a.) et B. licheniformis (B.1.). Une ligne continue indique des résidus identiques à ceux de B. subtilis. Les acides aminés différents sont indiqués pour B. amvloliauefaciens et B. lipueniformis. Une délétion est indiquée au XXX et une insertion par ---t. Les séquences pour B. s. et B. a. sont celles publiées (J. Bacteriol.,.166, 113-119, (1986)). 10 - fiqure 8: Comparaison des structures de promoteurs possibles dans les différentes souches de Bacillus. Les séb quences suivantes sont publiées: B. subtilis SacQh sacQ+ : J. Bacteriol., 166, 113-119, (1986); B. 15 amvloliquefaciens: J. Biotechnol., 3, 85-96, (1985); B. subtilisP43: J. Biol. Chem., 259, 8619-8625, (1984). Les abréviations- B. s, B. a et B. 1 correspondent respectivement à B. subtilis, B. amv1oliauefaciens et B. licheniformis. - figure 9 Construction du gène de fusion sacR-aph3'. Le plasmide utilisé pour l'intégration par recombinaison homologue a été construit par ligature in vitro des 3 fragments sacR, aph3' et sacB. La numérotation nucléo25 tidique est identique à celle publiée dans Mol. Gen. Genet., 200, 220-228 (1985) pour sacR, et dans Gene., 23, 331-341 (1983) pour aph3'. Le plasmide pBS413 a été cloné comme suit. Un produit de digestion partielle par HindIII de l'ADN chromosomique de B. subti!is 168 a été 30 ligaturé au niveau du site HindIII de pUC 8. Une souche d' E. coli transformée par pBS413, dans lequel a été inséré un fragment de 4,1 kb provenant d'une digestion partielle par HindIII contenant sacB, présente une activité saccharolytique. Un fragment EcoRI de 2,0 kb 35 contenant sacR et le début de sacB a été purifié à partir de pBS413 et utilisé pour isoler le fragment Sau3A1-Rsa1 de 440 paires de bases contenant sacR. Le plasmide pAT21 a été décrit dans Gene., 23, 331-341 (1983). Le dérivé pBR322 contenant le gène de fusion a été introduit dans le chromosone de B. subtilisl68 par intégration homologue. Une souche contenant le gène de fusion (QB4058) a été sélectionnée sur des plaques de kanamycine contenant 2 % de saccharose. Le site d'intégration, déterminé par des expériences de transduction 10 pBS1, correspond au locus sacB. - Fiaure 10: Carte de restriction du fragment HindIII-EcoRI issu de la souche de B.subtilis168. Ce fragment contient, au niveau du trait plus épais de la figure, la 15 séquence signal de la lévane-saccharase ainsi que les 112 premiers nucléotides du gène codant pour la lévane-saccharase. - FiQure 11: Plasmide pBS610. Les parties indiquées par les arcs de cercle a et b (d'environ 2 kb et 20 paires de base respectivement) proviennent du fragment BamHI-EcoRI comprenant le fragment HindIII-EcoRI de la figure 10, la partie indiquée par l'arc de cercle c (d'environ 2,9 kb) provient 25 du plasmide pC194 et la partie d (d'environ 4 kb) provient de pBR322. - Figure 12: Plasmide pBS620. Les différentes parties de pBS620 sont indiquées 30 sur la figure avec les références des plasmides ou des ADN à partir desquels elles ont été respectivement obtenues. La souche de B. subtilis QB4058 a été déposée à la C.N.C.M à l'Institut Pasteur à Paris sous le numéro I 587. La souche de B.subtilis transformée par le plasmide pPR41 a été déposée à la C.N.C. M à l'Institut Pasteur de Paris sous le numéro 1-579. Toute séquence présentant la capacité de s'hybrider avec les séquences actives décrites ci-dessus, et capable d'induire le même type d'activité, entre dans le cadre de la protection conférée à l'invention par les revendications qui suivent. Ainsi, toute séquence qui ne se distinguerait de celles qui ont été plus particulièrement décrites, que par un certain nombre de mutations ne modifiant pas les propriétés stimulantes du mutant, sont à considérer comme des équivalents des séquences plus spécifiquement identifiées dans les revendications. 15 REVENDICATIONS 1. Fragment d'ADN issu de B. licheniformis caractérisé en ce qu'il code pour le polypeptide ayant la structure suivante: (Nterminal)Met-Glu-LysGln-Gln-Ile-Glu-Glu-Leu-Lys-GlnLeu-Leu-Trp-Arg-Leu-Glu-Asn-Glu-Ile-ArgGlu-Thr-Lys-AspSer-Leu-Arg-Lys-Ile-Asn-Lys-Ser-Ile-Asp-Gln-Tyr-Asp-LysTyrThr-Tyr-Leu-Lys-Thr-Ser(Cterminal), ou pour tout fragment de ce polypeptide qui conserve la 10 propriété du polypeptide susdit d'activer l'expression du phénotype Sesh chez subtilis 2. Fragment d'ADN selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il consiste en un polynucléotide dé15 limité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 768 et 905 respectivement de la figure 3. 3. Fragment d'ADN issu d'un fragment Sau3A1 de 3,5 kb de B.licheniformis caractérisé en ce qu'il ne contient pas de séquence nucléotidique codant pour tout 20 ou partie d'une protéase alcaline, et en ce qu'il comprend un fragment d'ADN selon la revendication 1 ou 2, précédé par une séquence nucléotidique comprenant les éléments de régulation de l'expression de ce dernier. 4. Fragment d'ADN selon la revendication 3, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique comprenant les élements de régulation de l'expression du fragment d'ADN, selon la revendication 1 ou 2, est celle associée à ce dernier dans le génome naturel de B. licheniformis. 30 5. Fragment d'ADN selon la revendication 3 ou la revendication 4, caractérisé en ce qu'il consiste en tout polynucléotide délimité d'une part par un nucléotide compris entre les positions 1 à 353 et, d'autre part, par un nucléotide compris entre les positions 905 à 914 de la figure 3. 6. Fragment d'ADN selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que le fragment d'ADN selon la revendication 1 ou 2 est suivie par une séquence nucléotidique comprenant les éléments terminateurs de la transcription de ce dernier. 7. Fragment d'ADN selon la revendication 6, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique comprenant les éléments terminateurs de la transcription du frag10 ment d'ADN selon la revendication 1 ou 2, est celle associée à ce dernier dans le génome naturel de B. licheniformis. 8. Fragment d'ADN selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce qu'il consiste en tout polynucléotide 15 délimité d'une part par un nucléotide compris entre les positions 1 à 353 et, d'autre part, par un nucléotide compris entre les positions 1012 à 1400 de la figure 3. 9. Acide nucléique recombinant contenant le fragment selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 20 inséré dans un acide nucléique hétérologue vis-à-vis dudIt fragment-. 10. Acide nucléique recombinant selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'il consiste en un plasmide contenant ledit fragment en l'un de ses sites non 25 essentiels pour sa réplication. - 11. Plasmide selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide utilisable pour la transformation de B.subtilis. 12. Plasmide selon la revendication 11 carac30 térisé en ce qu'il consiste en un plasmide navette entre B.subtilis et E.coli. 13. Plasmide selon les revendications 10 à 12, caractérisé en ce qu'il possède une origine de réplication lui conférant la propriété de se diviser en multi35 copies dans la cellule hôte. 14. Plasmide selon les revendications 10 à 13, caractérisé en ce qu'il contient un promoteur inductible. 15. Cellules de B.subtilis, productrices de quantités accrues d'enzymes exocellulaires caractérisées en ce qu'elles contiennent un plasmide selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, capable de se répliquer dans lesdites cellules. 16. Cellules de B.subtilis selon la revendication 15, caractérisées en ce qu'elles comportent égaleh ment une mutation acUh. 17. Procédé de production d'enzymes exocellulaires, caractérisé par la mise en culture de cellules 15 d'une lignée de B. subtilis selon la revendication 15 ou 16 et par la récupération desdites enzymes, à partir du milieu de culture. 18. Vecteur caractérisé en ce qu'il contient en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, 20 une séquence d'ADN codant pour un polypeptide déterminé, précédée par une séquence nucléotidique comprenant une séquence cible d'un activateur de l'expression du phénotype Sesh, et les éléments nécessaires pour promouvoir l'expression de la séquence signal suivie de la 25 séquence codant pour le polypeptide déterminé. 19. Vecteur selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide utilisable pour la transformation de B. subtilis. 20. Plasmide selon la revendication 19, carac30 térisé en ce que la séquence d'ADN codant pour le polypeptide déterminé est précédée par la séquence signal comprise dans le gène sacB codant pour la lévanesaccharase chez B. subtilis, ladite séquence signal étant elle-même précédée par un fragment d'ADN contenant d'une 35 part la séquence nucléotidique endogène Sau3A1-Rsal de 440 paires de base comprenant le gène sacR de B. subtilis et dans laquelle se situe la séquence cible, et d'autre part les éléments nécessaires pour l'expression des séquences codant pour le peptide signal et pour le polypeptide déterminé. 21. Cellules de B. subtilis, caractérisées en ce qu'elles sont modifiées par l'intermédiaire d'un plasmide, selon l'une quelconque des revendications 18 à 20, 10 capable de se répliquer dans lesdites cellules. 22. Cellules de B. subtilis selon la revendication 21, caractérisées en ce qu'elles comportent également une mutation sacUh. 23. Cellules de B. subtilis selon la revendica15 tion 21 ou la revendication 22, caractérisées en ce qu'elles contiennent un plasmide contenant une séquence codant pour tout polypeptide activateur de l'expression Ssh du phénotype Ses chez B. subtilis et capable de se répliquer dans lesdites cellules. 24. Cellules de B. subtilis selon la revendica*tion 23; caractérisées en ce qu'elles contiennent un plasmide selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, capable de se répliquer dans lesdites cellules. 25. Procédé de production d'un polypeptide dé25 terminé, caractérisé par la mise en culture de cellules d'une souche de B. subtilis selon la revendication 23 ou la revendication 24, et par la récupération dudit polypeptide à partir du milieu de culture, 26. Procédé de production d'un polypeptide dé30 terminé pratiquement pur, caractérisé par la mise en culture de cellules de B. subtilis modifiées à l'aide d'un plasmide selon la revendication 20, et par l'arrêt de la culture en fin de phase exponentielle de croissance desdites cellules de B. subtilis, et récupération 35 du polypeptide déterminé à partir du milieu de culture pratiquement exempt des autres enzymes exocellulaires susceptibles d'être secrétées par les cellules de B. subtilis. 27. Polypeptide activateur de l'expression du phénotype Ses, caractérisé par la structure suivante: (Nterminal)Met-Glu-Lys-Gln-Gln-Ile-Glu-Glu-Leu-Lys-GlnLeu-Leu-Trp-Arg-LeuGlu-Asn-Glu-Ile-Arg-Glu-Thr-Lys-AspSer-Leu-Arg-Lys-Ile-Asn-Lys-Ser-IleAsp-Gln-Tyr-Asp-LysTyr-Thr-Tyr-Leu-Lys-Thr-Ser(Cterminal).