FR 2598915 A1 19871127 FR 8707188 A 19870522 La présente invention se rapporte à des compositions pharmaceutiques antimycosiques, utilisables comme agents antifongiques contre une large variété de champignons médicalement importants: les constituants actifs de ces compositions peuvent être isolés à partir des racines de la luzerne, et peuvent également, ainsi que leurs dérivés, être préparés par synthèse. Les principes actifs des compositions selon l'invention sont très efficaces à des faibles concentrations et peuvent être utilisés en médecine humaine 10 et vétérinaire pour inhiber la croissance de champignons et pour les tuer. La propagation de la mycose comme maladie primaire ou secondaire, s'étend rapidement, en raison de l'utilisation étendue des médicaments immunosuppresseurs et des antibiotiques à large spectre. C'est pourquoi le développement de nouveaux agents antifongiques devient nécessaire pour la médecine moderne. Ce développement, toutefois, est très lent, principalement parce que les champignons sont des eucaryotes et qu'il est difficile de trouver 20 des agents affectant spécifiquement le champignon, sans affecter les cellules hôtes. Seulement un nombre relativement petit de médicaments sont couramment disponibles pour le traitement des infections fongiques, et la plupart d'entre eux sont toxi25 ques. Les médicaments antimycosiques les plus avantageux sont les macrolides polyènes et, plus récemment découverts, des dérivés d'imidazole qui affectent tous deux la membrane cellulaire. D'autres agents antifongiques sont la fluoro-5 cytosine, qui affecte la synthèse de l'acide nucléique, et 30 la griseofulvine, qui inhibe la fonction microtubulaire et la division cellulaire. Les médicaments antimycosiques d'usage courant présentent de nombreux inconvénients. Parmi ceux-ci figurent les solubilités, stabilités et absorptions faibles des 35 antibiotiques polyènes et leur toxicité élevée, principale- ment pour le rein. Récemment a été mentionnée une résistance fongique à l'amphotericine B. Les imidazoles sont bien absorbés par le tractus gastro-intestinal, mais leur administration prolongée provoque des modifications au ni5 veau du foie et des glandes surrénales et un disfonctionnement de ces glandes; elles sont inefficaces dans le traitement des mycoses systémiques. L'utilisation thérapeutique de la fluorocytosine est limitée en raison de son spectre antimycosique étroit et du degré élevé de résistance fon10 gique à ce médicament. La griséofulvine, qui est très puissante contre les dermatophytes, a peu ou pas d'effet sur les autres champignons. Tous ces inconvénients, ajoutés à l'incidence croissante des infections fongiques systémiques, en particulier dans l'hôte mis en péril, donne de 15 l'impulsion à la recherche d'un nouveau groupe d'agents antimycosiques. Les saponines sont des glycosides que l'on trouve dans une grande variété de plantes et qui ont le pouvoir d'influer sur la résistance aux maladies de plantes. On a constaté que, dans la luzerne, les saponines présentent une toxicité sélective vis-à-vis de Sclerotium rolfsii, Alternaria solani et Sclerotinia sclerotiourum, qui sont des champignons connus pathogènes des plantes. Elles sont concentrées en majorité dans l'écorce des racines mûres, les 25 protégeant de l'invasion fongique. L'activité de l'acide médicagénique, constituant aglycone de quelques saponines de la luzerne, dans l'inhibition de la croissance fongique, a été démontrée. Il existe un rapport préliminaire (B. Gestetner, Y. Assa et M. Rotman, Experientia 29, 529-530, 1973) qui décrit l'activité de cet acide et de quelques-uns de ses dérivés glycosidiques vis-à-vis d'un seul agent pathogène des plantes, le Sclerotium rolfsii, à une concentration de 10 4M de la préparation. Aucune donnée n'a été publiée sur les maladies fongiques des mammifères. La présente invention permet de remédier aux in- convénients de l'art antérieur et d'obtenir des compositions antifongiques, pharmaceutiques et vétérinaires, utilisables pour le traitement d'un vaste domaine d'infections fongiques. Les nouvelles compositions antifongiques, selon l'invention, qui peuvent être administrées par voie orale ou par injection, ou qui peuvent être utilisées pour un usage topique ou local, sont caractérisées en ce que leur constituant actif est l'acide médicagénique ou ses dérivés, 10 de formule générale: 1 OOR3 R20 R20 COOR3 Dans cette formule R1 est hydrogène ou Ac, R2 est hydro25 gène, Ac, rGlcp ou --Glcp (1 - 4) f -Glcp, R3 est hydrogène ou alkyle inférieur; cette formule comprend leurs dérivés fonctionnels. L'acide médicagénique et les substances définies ici comme composés G, G2 et F, peuvent être purifiés à par30 tir de la luzerne. L'invention concerne également ces composés sous forme chimiquement pure, et leurs dérivés tels que mentionnés plus haut. Les nouvelles compositions ont un effet hémolytique faible et sont efficaces à de très petites concentra35 tions du constituant actif. Dans la suite de la présente description, on a désigné de la façon suivante six composés selon l'invention, cités à titre d'exemples non limitatifs: I R1=R =R3=H, acide médicagénique; II R1=R2=H, R3 =Me; III R1=R2=Ac, R = Me; IV R =R3=H, R2= Glcp, composé G2; V R1=H, R = 'Glcp, R3=Me; VI R=R3=H, R2=Glcp i (1---4)Glcpô, composé F. Trois de ces substances actives peuvent être purifiées à partir de la luzerne. Elles présentent une toxicité sélective vis-à-vis d'une large variété de levures cliniquement importantes. Ce sont des substances préparées, désignées par G, G2 et F, G2 étant la plus puissante. G2 est obtenu 15 par purification ultérieure de G. L'invention se rapporte à des compositions antimycosiques renfermant les composés définis plus haut. Les agents antifongiques G et G2 sont faiblement solubles dans l'eau et doivent donc être fournis dans un 20 solvant ou véhicule approprié en vue de concentrations adéquatement élevées. Des solutions dans du polyéthylène glycol (0,1%) avec de l'hydroxyde de sodium aqueux (2 mM) ont pour résultat leur solubilisation. Lorsqu'on les essaye contre 11 des levures les 25 plus importantes, qui ont une grande importance clinique, les compositions selon l'invention présentent un effet inhibiteur prononcé à de faibles concentrations. Les indices de MIC (concentration minimale d'inhibition) obtenus à la fois par des procédés de dilution de bouillon et d'agar, se situent entre 2 et 15 gg/ml lorsqu'on utilise G2. Cryptococcus neoformans est la levure la plus sensible et l'indice de MIC modal est de 2 gg/ml. G2 présente une activité fongicide à de faibles concentrations et l'on obtient avec lui les indices de CFM (concentration fongicide minimale) compris entre 4 et 24 gg/ml. Il s'agit d'un composé relativement stable et il peut donc être utilisé, par conséquent, comme constituant actif dans des préparations fongicides destinées à être employées contre une large variété d'affections fongiques. L'activité de G est environ 15 fois moindre, mais ce composé peut être également utilisé comme 5 constituant actif. Les autres substances ont également une activité antimycosique élevée. De ce qui précède, il ressort clairement que les nouvelles compositions ont un intérêt pharmaceutique considérable pour le traitement des infections mycosiques10 en médecine humaine et vétérinaire. La substance G2, pratiquement pure, est identifiée comme étant l'acide (-hydroxy-2 -O((-D-glucopyranosyl)-3 1 olé-anène diolque23,28, également désigné comme étant le 3-O-(-D-glucopyranoside de l'acide médicagénique, de formule suivante: 15 H 2Glc-0o COOH La purification de G, G2 et F à partir de la racine de luzerne, est exposée dans le schéma I ci-après. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention conviennent pour l'application topique dans un diluant ou véhicule approprié. Elles peuvent être également admi30 nistrées par voie orale, ou par injection. Parmi les formes de composition pharmaceutique appropriée, on peut mentionner comprimés oraux, lotions, crèmes, onguents, poudres, pour l'application topique; poudres lyophilisées pour dilution et injection, compositions de gel oral, suppositoi35 res vaginaux, poudre ou suspension pour aérosols. Dans les préparations topiques, le constituant actif correspond généralement à 0,2 à 2% environ en poids. Les formes de dosage unitaire fournissent généralement environ 0,1 à 2 mg de substance active par kg de patient et par jour. SUBSTANCES ET PROCEDE Souches, milieux et produits chimiques Les levures utilisées sont isolées à partir de spécimens cliniques soumis à différents sites du corps de patients avant traitement. On étudie une seule fraction 10 isolée par patient. Les levures sont identifiées à des espèces par des procédés courants classiques. Les produits isolés sont maintenus sur agar dextrose de Sabouraud (SDA) jusqu'à leur essai. Extraction et Purification de l'agent antimycosique Extraction et purification de l'acide f-hydroxy-2 -O-( -Dglucopyranosyl)-3 Z12-oléanènedioique-23,28 (O-(-D-glucopyranoside-3 de l'acide médicagénique), et du composé F. Les analyses de chromatographie en couche mince (CCM) sont réalisées sur des plaques de silice 60 F254 de 20 Merck, développées avec EtOAc-H20-AcOH (7/2/2, c/v). Des analyses de CCM à haute performance sont exécutées sur des plaques RP18 F254 de Merck, développées avec MeOH-H20 (4/1, v/v). Dans tous les cas, la production de tache implique la vaporisation de SO04H2 (5%, v/v dans 25 EtOH) et le chauffage pendant 10 minutes à 100 C. SCHEMA, I Farine de racine de luzerne (200g) i Extraction(80% éthanol) I filtration I _ l |filtratj I précipité (rejeté) 1 évaporation de l'éthanol e extraction (éther) I ! couche aqueuse (rejetée) |couche éthérée évaporation t lextrait de saponine f colonne de gel de silice acétate d'éthyle,eau-acide acétique (7:2:2) ou bien colonne de gel de silice acétate d'éthyle-méthanol (4:1) acétate d'éthyle-eauacide acétique (7:2:2) G (300mg) chromatographie éclair sur gel de silice acétate d'éthyleméthanol (4:1,2:1,1:1) F chromatographie éclair sur RP eauméthanol (45:55,50:50,55:45) I Préparation HPLC G2 jF 1(240mg) (50 mg)i g de farine de racine de luzerne (medicago sativa L. Gilboa, variété provenant du ranch RAM de Beersheva) sont extraits avec EtOH à 80% v/v 2,5 litres, dans l'eau pendant 16 heures à 60 C. Le solide est ensuite séparé par filtration et éthanol est enlevé sous pression réduite. La solution aqueuse résultante est extraite à 3 reprises avec de l'éther (portions de 400 ml) qui est ultérieurement éliminé sous pression réduite avec adsorption de l'extrait sur gel de silice (Merck, 0,063 à 0,210 mm, 6g), applica10 tion et chromatographie (portions de 2 g) sur le même adsorbant (150 g) avec EtOAc-H20-AcOH (7/2/2, v/v, 350 ml). Les fractions renfermant la tache bleue, caractéristique, sur CCM (Rf 0, 75) sont rassemblées, on fait évaporer les solvants et le résidu est remis en suspension dans l'eau 15 (5 ml) et est lyophilisé pour donner environ 300 mg de G. Ou bien, les fractions renfermant G et F, provenant du premier stade chromatographique (CI), sont adsorbées sur gel de silice (Merck, 0,063 à 0,210 mm, 2 g) et sont ensuite purifiées pour donner G2 et F par application de Cl sur une colonne de chromatographie éclair (Merck, gel de silice , 0,037 à 0,063 mm, 15 g), élué successivement avec EtOAc-MeOH. 4/1, 2/1 et 1/11 (v/v, chaque fraction de 250 ml) à une vitesse d'écoulement de 10 ml/minute. Les fractions renfermant G ou F (CMM, Rf 0,75) sont rassemblées et appliquées (échantillons de 20 à 40 mg) à une colonne de préparation HPLC éluée avec un gradient de MeOH-H20 allant de 70 à 85% sur 60 minutes. Les fractions (de 4 ml chacune) sont contrôlées par CCM, celles qui renferment G1 sont ensuite contrôlées par CMM à haute performance. Les fractions 30 renfermant une unique tache bleue à Rf 0,28 après coloration, sont rassemblées, concentrées sous pression et lyophilisées pour donner un solide amorphe blanc, G2;point de fusion 251-254 C; C]30 = +70,6 (EtOH), qui en fin de D compte s'avère être l'acide médicagénique O-P-D-glucopyra35 noside-3 (IV) (Littérature: point de fusion: 253 -254 C; [^D= +70 C). De manière similaire, les fractions renfermant F, (Rf = 0,60 (CMM); 0,42 (CMM à haute performance)), sont concentrées, et lyophilisées pour donner F amorphe, qui s'avère être l'acide médicagénique O- -D-maltoside-3 (VI). Les structures des composés G2 et F ont été définies en fonction de la dégradation chimique et de l'hydrolyse enzymatique des radicaux sucres. Le composé G2 est un substrat de la (>glucosidase mais non de 1' o -glucosidase, tandis que le composé F est un substrat de 1' -glucosi10 dase mais non de la C -glucosidase; la digestion du composé F avec les deux enzymes donne l'aglycone (tableau 1). L'aglycone, son ester diméthylique et le diacétate d'ester diméthylique sont co-chromatographiés et ont des spectres de RMN de 1H identiques à ceux de dérivés d'un échantil15 lon authentique d'acide médicagénique (respectivement I et III). En outre, dans le cas du composé G2, la RMN de 13C complète l'éclaircissement de la structure établissant entre autres la substitution glucosidique sur le C-3 plutôt que sur le C-2 de l'aglycone. TABLEAU 1. Détermination de la partie sucre dans les coposés G2 et F G2 F Sucre total 24% 42% Chromatographie sur papier Glucose Glucose Glucose (glucose 25% 40% oxydase) Analyse de la méthylation tétra-O-méthyl tétraO-méthyl2,3,4,6 2,3,4,6 acétoxy-1,5 diacétoxy-1,5 glucitol glucitol et tri-O-méthyl2,3,6 tri-acétoxy-1,4,5 glucitol Dégradation enzymatique -DGc -D-Glc2-7-D-Glc1 Il faut noter que bien que G2 soit isolé très facilement et avec un rendement acceptable (0,12%, schéma) à partir de la farine de racine de luzerne,la proportion de composé F est bien inférieure et est sujette à des variations. Il 5 y a des cas o on constate seulement des traces de F; en conséquence, on synthétise couramment le composé F à partir d'un dérivé de l'acide médicagénique par la synthèse de Koenigs-Knorr. Préparation du médicament L'agent antifongique est faiblement soluble dans l'eau. C'est pourquoi on utilise, pour solubiliser les composés G et G2, une solution de polyéthylène glycol (Poids moléculaire 20000, Sigma, St Louis, Mo) à 0,1% (poids/volume) dans de l'hydroxyde de sodium 2 mM. Des contrôles de solvant 15 exempt de médicament approprié sont compris dans chaque essai. La concentration du médicament dans la solution de réserve est de 2,5 mg/litre. Comme le médicament est résistant à la chaleur, il est stérilisé par passage à l'autoclave pendant 15 minutes à 121 C, et l'on prépare des dilu20 tions de ce médicament dans de l'eau stérile distillée. Essai d'hémoagglutination et d'hémolyse Des hématies provenant de différentes sources sont remises en suspension, avec du citrate comme anticoagulant, et sont lavées à 4 reprises avec une solution saline tampon 25 au phosphate (PBS) pH 7,2 dans une centrifugeuse clinique, et sont finalement remis en suspension dans le même tampon de manière à obtenir une concentration de 2% (v/v). L'agent antimycosique est dilué en série dans PBS au moyen d'un appareil de dilution automatique. Les dilutions sont 30 réalisées dans des plaques de microtitration. On ajoute ensuite dans chaque cavité,renfermant 50 microlitres de chaque dilution,un égal volume d'hématies. L'hémolyse et l'hémoagglutination sont enregistrées macroscopiquement après 1 heure d'incubation à 37 C, et après une incubation 35 supplémentaire pendant 24 heures au froid. On observe une hémolyse partielle à la fin. 1 1 Essai de sensibilité par le procédé de dilution de l'agar On prépare des suspensions de levure provenant d'une culture d'une nuit à 30 C sur SDA et l'on dilue dans de l'eau distillée stérile à une concentration de 10 cellules/ml mesurée par comptage à l'hématimètre. Des dilutions appropriées du médicament sont préparées dans de l'eau distillée, stérile, avec un volume final de 1 ml. Chaque ml de solution de médicament est additionné de 3 ml d'Agar Noble fondue, stérile, à 3% (Difco Laboratories) complété, après refroidis10 sement à 50 C, avec 0,5 ml de bouillon stérile de force 10x, YNB non tamponné (Difco) et 0,5 ml de glucose à 20%. Le pH final est de 5,1. Après brassage tourbillonnant, le milieu d'agar est réparti dans des boites de Pétri stériles de 60x15 mm. Les plaques sont séchées non recouvertes dans une hotte à régime laminaire, pendant 15 minutes, et peuvent être conservées à 4 C pendant 2 semaines. Au moyen d'une micro-pipette, 10 il de la suspension de levure sont ajoutés aux plaques d'agar renfermant différentes concentrations du médicament, de manière à avoir un ensemencement 20 de 103cellules par goutte de 10 il. Sept gouttes peuvent être ajoutées sur une unique plaque sans interférence. Les plaques ensemencées sont mises à incuber à 30 C. L'essai comprend une paire de témoins exempts de médicament, l'un renfermant la solution de solubilisation du médicament, et l'autre étant utilisé comme témoin de croissance. On doit obtenir des réponses positives de croissance pour les deux plaques témoins, pour que les résultats soient valables dans tous les cas. De plus, on inclut dans chaque plaque un organisme témoin approprié (Candida tropicalis 908) de sensibilité connue. La durée de l'incubation est réglée par l'aspect de la croissance. Les résultats sont enregistrés au bout de 24 et 48 heures d'incubation à 30 C. Chaque essai est réalisé au moins à deux reprises en des circonstances différentes. Le MIC est défini comme la concentration 35 la plus faible du médicament qui empêche la croissance ma- croscopique des colonies. Les réponses douteuses sont considérées comme négatives. Lors des expérimentations au cours desquelles on étudie l'action du pH, on ajoute au milieu YNB non tamponné les 5 tampons suivants: 20 mM de KH2PO4 pH 7 pour avoir un pH final de 7, 10 mM de KH2PO4 pH 7 pour avoir un pH de 6,5, et 20 mM de MES pH 6,1 pour avoir un pH de 6. Essai de sensibilité par le procédé de dilution du bouillon Des produits d'isolation de levure sont cultivés une nuit durant sur SDA à 30 C. Ces cultures sont remises en suspension et sont diluées de façon à donner une concentration 3 4 finale de 103, 104 et 105 cellules/ml, comme mesurée à l'hématomètre. Les dilutions sont préparées dans du bouillon YBN (Difco), additionné de glucose et tamponné à un pH final de 6,5 avec 10 mM de KH2PO4 pH 7. Après croissance une nuit durant à 30 C dans une secoueuse, les cultures en phase de croissance logarithmique (moins de 25% de transmission à 530 nm) sont utilisées pour l'essai de sensibilité. L'essai est réalisé dans des tubes à essai renfermant dif20 férentes concentrations de l'agent antimycosique dans 3 ml de bouillon YNB non tamponné (pH 5,1) additionné de 2% de glucose. L'inoculum varie de 103 à 105 cellules/ml, à partir d'une culture en phase logarithmique dépendant de la souche. Deux tubes renfermant du milieu exempt de médi25 cament et de l'inoculum sont utilisés comme témoins. Tous les tubes sont mis à incuber, faiblement bouchés, à 30 C dans une secoueuse. La sensibilité est déterminée après croissance une nuit durant, seulement si la culture dans les tubes témoins 30 ne donne pas moins de 25% de transmission à 530 nm. Le MIC est déterminé visuellement comme la concentration en médicament la plus faible qui demeure limpide. La concentration d'inhibition (CI50) est calculée spectrophotométriquement comme la concentration de médicament la plus faible 35 qui concorde avec le critère: %T a %T témoin + 0,5 (100% - %T témoin), dans lequel %T = pourcentage de transmission à 530 nm et le témoin = tube exempt de médicament. La concentration fongicide minimale (CFM) est déterminée par l'essai d'unités de formation de colonie (UFC) sur SDA. Trois portions de 50 gl, obtenuesimmédiatement après brassage tourbillonnant à partir de l'inoculum initial dans les tubes témoins, et juste après détermination du MIC à partir des tubes ne présentant pas de croissance, sont sous- cultivés sur SDA. Le CFM est établi à la concen10 tration la plus basse en médicament à partir de laquelle les sous-cultures sont négatives. Cinétique de nocivité Les études du temps létal sont réalisées dans 10 ml de bouillon YBN non tamponné, additionné de glucose et renfer15 mant la concentration appropriée du médicament. L'inoculum de levure est préparé comme décrit pour l'essai de sensibilité par le procédé de dilution du bouillon, de manière à donner une concentration finale de 105 cellules/ml. L'expérimentation s'effectue à 30 C dans un bain-marie à agita20 tion. Des échantillons de 0,4 ml sont prélevés périodiquement. Trois prélèvements de 50 il de dilutions convenables sont ensemencés sur SDA pour l'essai de UFC. Lors d'autres expérimentations, les échantillons, pour la détermination d'UFC, sont rincés à deux reprises avec du milieu de bouil25 lon YNB afin d'éliminer l'agent antimycosique, avant d'être repiqués pour la croissance résiduaire. TABLEAU 2 Comparaison de l'activité antimycosique des composés G et G2(a) Agent L v r Agent L e v u r e anti microbien Candida Torulopsis Cryptococcus Candida pseudo- glabrata neoformans tropicalis tropicalis Composé G 50 58 30 40 Composé G2 4 7 2 3 (a)Les données correspondent à la moyenne des MIC (Lg/ml) 35 mesurés par le procédé de dilution de l'agar. TABLEAU 3 hémolytiques et d' hémoaqqlutination Propriétés de l'agent antimycosique G2 (a) Conditions Source d'hématies d'incuba- -A B AB O mouton cheval poulet vache canard tion (huma i n) 1h, 37 C 200 200 250 250 300 250 250 300 250 1h, 37 C & 125 125 125 125 150 200 200 200 200 4h, 4 C (a) Les concentrations de médicament({g/ml)sont les plus basses qui présentent hémolyse et hémoagglutination. Propriétés TABLEAU 4 hémolytiques de quelques dérivés de l'acide médicagénique (a) 20 30 Composé 1h à 37 C 1h à 37 C et 24h à 4 C I 125 62,5 IV 250 125 V 250 250 VI 500 250 (a)valeurs en gg/ml TABLEAU 5 MIC de l'agent antifongique G2,contre différentes espèces de levures (a) Levure MIC n1 Mode( chaque espèce; n2, nombre d'isolats présentant mode MIC. 15 20 989 5 TABLEAU 6 CI50, MIC et CFM de l'agent antimycosique G2, contre différentes espèces de levures (a) Levure CI50(g/ml) IC(ig/ml) CFM(ig/ml) CryptococcYB) neoformans 0,8 2 4 Candida (c) tropicalis c); 4,0 6 12 Candida pseudotropicalisc) 2,0 4 6 Candida Krusei(d) 6,0 8 20 Candida albicans(c) 3,0 6 14 Torulopsis galbrata(c) 3,0 4 10 Candida parapsilosis(c) 6,0 10 20 Torulopsis candida(d) 8,0 12 24 Candida guilloermondii (d) 7,0 10 16 Geotrichum candidum(d) 8,0 10 20 (a)CI n, MIC et CFM sont déterminés di ution du bouillon après 17-22 par le procédé de heures (b) Inoculum initial de 105 cellules/ml, (c) II ni I. i. (d) le L'utilisation clinique des saponines peut être limitée en raison de leur activité hémolytique. Toutefois, le procédé de purification, utilisé au cours de la présente 30 étude, diminue nettement les activités hémolytiques et d'hémoagglutination à un niveau tel que l'on n'observe, in vitro, ni hémolyse ni hémoagglutination avec le composé IV, dans l'intervalle de concentrations nécessaire pour avoir une inhibition complète de la croissance des 11 levures médica35 lement les plus importantes, figurant dans le tableau 5. Le composé IV n'est pas toxique pour la souris à des concentrations allant jusqu'à 500 Lg/litre, et on n'observe aucune action hémolytique chez les souris traitées avec cette dose, ce qui montre la valeur pratique de ce composé. Des essais d'hémolyse supplémentaires conduisant à des résultats similaires (et même à des résultats améliorés dans le cas du composé F), sont obtenus avec d'autres dérivés de l'acide médicagénique (tableau 7). Les levures pathogènes de l'homme et des animaux 10 sont évidemment particulièrement intéressantes. Des expérimentations exploratoires,conduites surdes isolats simples de levures médicalement importantes, montrent des cas (C. tropicalis, C. albicans et C. parapsilosis, données non indiquées), o la conversion des composés 15 I et IV en leurs esters méthyliques (respectivement les composés Il et V) fait très peu de différence. Cependant, dans le cas de T. glabrata (la seconde levure la plus commune provenant d'isolats d'urine), le composé II est plus puissant que le composé I dans un intervalle de pH o la libé20 ration d'un proton de l'acide médicagénique a lieu. De plus, parmi les 4 composés utilisés,le composé IV est le plus efficace sur le pathogène le plus grave,C. neoformans, à pH inférieur (tableau 7). Le composé G2 est également examiné sur des iso25 lats cliniques de dermatophytes (pathogènes de l'homme et des animaux) sur agar dextrose pomme de terre (ADP). Les résultats (tableau 2) donnent une indication sur l'efficacité potentielle du composé G2 en tant que fongistatique possible, complémentaire de la griséofulvine, d'utilisation 30 régulière contre toutes les formes d'infections par les dermatophytes chez l'homme et les animaux. 15 20 TABLEAU 7 MIC de dérivés de l'acide médicagénique contre C. neoformans et T. glabrataa Levure Composé MIC (gg/mL) pH 6,5 pH 5,1 C. neoformans I 10-20 10-20 II >20 >20 IV 10-20 2-5 V >20 >20 T.glabrata I 5-10 >20 II 20 IV 2-5 10-20 V 10-20 >20 a)MIC déterminés sur des isolats uniques de levure, par dilution d'agar après 24 heures. TABLEAU 8 MIC de G2 contre différentes espèces de dermatophytes Dermatophyte Nombre de MIC ( Les MIC sont déterminés par le procédé de dilution de l'a30 gar après 7 jours à 26 C, avec inoculum de 104 cellules/ml. Les résultats initiaux d'application de l'acide médicagénique sur les dermatophytes sont obtenus avec utilisation à nouveau de milieu ADP (tableau 7). Le seul cas o l'acide médicagénique semble être plus actif que le com35 posé G2, est celui de T. violaceum (une souche seulement). TABLEAU 9 Activité antimycosique de l'acide médicagénique sur quelques dermatophytes. Dermatophyte Nombre de MIC (gg/mL) souches souches Après 6 Après 12 jours jours T. rubrum 3 10-30 30 T. mentagrophytes 3 20 30 T. tonsurans 2 30 30 T. violaceum 1 5 20 M. canis 3 5 5 E. floccosum 3 30 30 On a établi un modèle animal de cryptococcosis. 15 Le médicament utilisé est le composé désigné ici comme G2, qui présente une solubilité dans l'eau convenant à la concentration utilisé au cours de cette étude. Les solutions dans l'eaucorrespondent aux concentrations requises pour l'essai de dilution del'agar. Les valeurs minimales d'inhibition (MIC) sont déterminées avec utilisation de degrés de dilution de 1/2 sur levure base azotée agar (YNB). L'activité in vivo de G2 est établie dans le modèle pour la cryptococcosis murine. 8 x 106 cellules de cryptococcus neoformans sont injectées par voie intraveineuse à des sou25 ris mâles albinos pesant environ 20g. Les animaux témoins non traités meurent en l'espace d'une semaine. Dans l'animal modèle, une dose de 100 mg/kg donnée par voie intrapéritonéale en une seule fois, s'avère fortement toxique et tous les animaux meurent en l'espace de 24 heures. Un dosage 30 de 10 mg/kg s'avère être inactif. Un dosage de 20 mg/kg est efficace et entraîne une durée de prolongation de vie très marquée des animaux ainsi traités. Une autre étude est réalisée avec le composé F et l'on constate que le MIC dans le cas de Cryptococcus 35 neoformans est de 20 gg/ml. Revendications 1. Composition pharmaceutique antifongique, à usage en médecine humaine ou vétérinaire, caractérisée en ce qu'elle comprend, en combinaison avec un diluant ou véhicule approprié, une quantité antifogiquement active d'un composé de formule: H OOR3 Rio R20/ > R2. COOR3 dans laquelle R1 est hydrogène ou Ac, R est hydrogène, Ac, ou alkyle inférieur,ou de ses dérivés fonctionnels. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que dans la formule du composé actif R1, R2 20 et R3 sont des atomes d'hydrogène. 3. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que dans la formule du composé actif R1 et R2 sont chacun H et R3 est méthyle. 4. Composition selon la revendication 1, carac25 térisée en ce que dans la formule du composé actif R1 et R2 sont chacun Ac et R3 est méthyle. 5. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que dans la formule du composé actif, R1 et R3 sont de l'hydrogène et R2 est -Glcp. 6. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que dans la formule du composé actif, R1 est H, R2 est P-Glcp et R3 est méthyle. 7. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que dan'la formule du composé actif, R1 et 35 R3 sont de l'hydrogène et R2 est oGlcp (1- 4) > -Glcp. 8. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la substance active est une matière purifiée obtenue à partir de racines de luzerne, et désignée comme composé G, G2 ou F. 9. Composition selon une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme d'unités de dosage pour application orale ou par injection, ou sous forme applicable localement ou par aérosol. 10.Composition selon une des revendications pré10 cédentes, utilisable contre les levures suivantes Cryptococcus neoformans, Rhodotorula glutinis, Candida tropicalis, Candida pseudotropicalis, Candida krusei, Candida albicans, Torulopsis glabrata, Candida parapsilosis, Torulopsis candida, Candida guilliermondii, Greotrichum candidum, Trichophyton rubrum, Trichophyton metagrophytes, Microsporum canis.