FR 2603701 A2 19880311 FR 8612616 A 19860909 La présente Addition a pout objet une nouvelle application des sondes moléculaires d'ADN spécifique du génome male de mammifères, notamment du genre Bos, présentant des séquences d'ADN spécifiques du sexe mâle. La sonde moléculaire conforme au Brevet principal, pour laquelle a été adoptée la denomination b.c.1.2., se caractérise par le fait qu'elle présente un profil d'hybridation, déterminé par hybridation de ladite sonde avec de I'ADN génomique mâle digéré par une enzyme appropriée, notamment 10 l'enzyme Eco RI, qui fait apparaître la présence d'au moins une bande spécifique du génome mâle des mammifères considérés; cette bande de l'ordre de 7 Kb est absente de l'ADN génomique femelle. La sonde moléculaire conforme au Brevet principal comprend 49 bases dont la séquence en nucléotides 15 est la suivante: ' 3' rATCAGTGCAC(CCACCGAGATGTGCTCCAAGGAGTGTTTATCGGCTGCTTI ou "n fragment de cette séquence comportant au moins 11 nucléotides. Plusieurs techniques de tri des spermatozoïdes en vue de leur sexage ont été proposées: - des méthodes dites physiques de séparation des spermatozoïdes portant respectivement des chromosomes X et Y, par électrophorèse, gel-filtration, 25 passage dans un gradient d'albumine, centrifugation et plus particulièrement par centrifugation dans un gradient de densité en utilisant du Percoll, par ultracentrifugation sur un gradient de densité de saccharose, etc... - des méthodes de fractionnement du sperme en fractions riches en spermatozoïdes portant le chromosome Y et/ou en fractions riches en spermatozoïdes portant le chromosome X, en tirant parti des différences de mobilité des spermatozoïdes por35 teurs du chromosome Y par rapport à ceux porteurs - 2 du chromosome X, dans.différents milieux (gradients d'albumines par exemple); ainsi que des méthodes de séparation des spermatozoïdes propres A provoquer une séparation en fonction de la den5 site, en tirant parti du fait que la densité du chromosome Y est inférieure a celle du chromosome X, ces méthodes comprenant l'application de forces hydrostatiques, la centrifugation dans un gradient d'un milieu approprié tel que Percoll 10 par exemple. Au nombre de ces méthodes de séparation on peut également ranger les méthodes de tri cellulaire par cytométrie de flux, c'est-A-dire par déviation et séparation des cellules identifiées par leur quantité d'ADN, par un champ élec15 trique, suivie de l'étude des cellules triées par exemple par fixation d'autres ligands marqués, par microscopie optique ou 4!ectronique, par des tests fonctionnels in vitro, etc.... - des méthodes immunologiques dont certaines utili20 sent des anticorps sélectivement réactifs avec des spermatozoïdes portant soit le chromosome X, soit le chromosome Y, qui sont agglutinés et inactivés, libérant ainsi une fraction de spermatozoïdes portant de façon homogène le chromosome 25 de type opposé à celui qui a réagi avec l'anticorps susdit, la fraction fixée a l'anticorps pouvant également être libérée de celui-ci, le cas échéant, notamment dans le cas ou l'anticorps est fixé A une phase solide constituée par un ma30 tériau immunoabsorbant. Conformément au Brevet principal, la sonde moléculaire définie dans celuici est appliquée à la détermination du sexe (ou sexage) d'embryons ou de foetus de mammifères, notamment du genre Bos. Le processus de sexage consiste A hy35 brider la sonde A de l'ADN génomique de mammifères du genre -3 Bos, mâle et femelle, transféré sur un filtre approprié après avoir été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose; la sonde s'hybride alors à l'ADN génomique mâle et cette hybridation est mise en évidence par autoradiographie et/ou par son5 de froide par la présence de signaux d'hybridation sous la forme d'une bande de 7 Kb spécifique. Les méthodes de tri des spermatozoïdes proposées dans l'Art antérieur et brièvement décrites dans ce qui précède ont pour inconvénient commun de présenter une marge 10 d'incertitude relativement importante en ce qui concerne leur fiabilité: en effet, les procédés de tri ne donnent pas des fractions homogènes à 100% d'un chromosome ou de l'autre, en sorte que la qualité du tri ne peut être contrôlée dans la pratique qu'en procédant aux inséminations artificielles qui 15 sont le but final visé (les fécondations in vitro ne donnant dans les faits qu'un faible rendement). D'autre part, pour savoir si a déviation du "sexe ratio" a une valeur significative en Liéison avec une fraction de spermatozoïdes isolée par l'une quelconque des méthodes de tri préconisées dans 20 l'Art antérieur, il faut avoir procédé à un nombre important, statistiquement significatif, d'inséminations, ce qui peut s'avérer coûteux et long. Il serait donc indispensable de pouvoir disposer d'un moyen propre à permettre un contrôle immédiat des frac25 tions de spermatozoïdes obtenues par l'une quelconque des méthodes de tri proposées conformément à l'Art antérieur, afin de limiter ou même d'éliminer tout risque d'erreur au niveau de la réalisation des inséminations artificielles en utilisant les fractions triées en question. La présente invention a pour but de pourvoir à une méthode de contrôle immédiat de la proportion de spermatozoïdes portant le chromosome Y dans une fraction de population de spermatozoïdes séparée par une méthode de tri quelconque appropriée, en utilisant la sonde moléculaire conforme au 35 Brevet principal auquel la présente invention constitue une -4 Addition. La présente invention a pour objet un procédé de contrôle direct et immédiat de la proportion de spermatozoïdes portant le chromosome Y dans une population de spermato5 zoïdes de mammifères du genre Bos, caractérisé en ce que les spermatozoïdes de ladite population sont mis en contact avec la sonde moléculaire conforme au Brevet principal, pour réaliser le marquage desdits spermatozoïdes par hybridation avec ladite sonde, puis les spermatozoïdes hybridés sont révélés, 10 après incubation avec des anticorps de chèvre ou de lapinantibiotine, puis avec des anticorps antichèvre ou antilapin couplés à la peroxydase et avec la diaminobenzidine (DAB), puis amplification, par coloration à l'aide d'un colorant approprié. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé de contrôle conforme à la présente Addition, l'hybridation des spermatozoïdes avec la sonde moléculaire d'ADN spécifique est rtc-.lisée in situ directement avec les spermato_zoïdes. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé de contrôle conforme à la présente Addition, l'hybridation est réalisée entre la sonde moléculaire d'ADN spécifique et l'ADN isolé à partir de spermatozoïdes de mammifères du genre Bos. Selon une disposition avantageuse du mode de mise en oeuvre dans lequel l'hybridation est réalisée in situ, les spermatozoïdes sont soumis préalablement à l'étape d'hybridation, à un processus de décondensation chimique qui comprend essentiellement trois étapes, à savoir: un choc hypotonique, 30 une digestion protéolytique et une réduction des ponts disulfures. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé de contrôle conforme à la présente Addition, la sonde moléculaire d'ADN spécifique mise en oeuvre 35 est une sonde marquée au 32p ou une sonde froide telle qu'une _5 sonde biotinylée. La sonde marquée au 32p a été décrite dans le Brevet principal. Conformément & la présente Addition, la sonde d'ADN 5 spécifique biotinylée est obtenue en procédant comme décrit dans le Brevet principal, à partir de lymphocytes de sang de bovins mâles et femelles, purifiés, sans cependant procéder au marquage du plasmide au 32p, c'est-à-dire que la sonde est obtenue en mettant en oeuvre les trois premières étapes du 10 procédé de préparation de ladite sonde, selon le Brevet principal, par insertion d'ADN dans un plasmide tel que le plasmide pUC9, digestion dudit plasmide recombinant par l'endonucléase PVU II, puis purification par électrophorèse sur gel d'agarose et séparation d'un fragment de 350 pb du gel par 15 absorption sur membrane; la sonde de 350 pb obtenue est alors biotinylée par nick-translation à l'aide d'au moins un désoxyr! nucléotde triphosphate marqué par la biotine (qui peut, c me on le;ait, être révélée à l'aide d'une réaction enzymatique), la sonde biotinylée obtenue étant ensuite puri20 fiée par gel-filtration. Le procédé de contrôle de la proportion de spermatozoïdes portant le chromosome Y, dans une population de spermatozoïdes, conforme à la présente Addition, permet de mesurer la proportion de chromosomes Y présents dans cette 25 population. Conformément a la présente Addition, on tire parti de cette possibilité de déterminer la quantité d'ADN Y spécifique dans les spermatozoïdes, à l'aide de la sonde d'ADN spécifique conforme au Brevet principal, pour développer un 30 procédé de tri des spermatozoïdes X et Y selon leur teneur en ADN, dont les différentes étapes de séparation seront ellesmêmes contr8ôlées à l'aide de la sonde moléculaire spécifique du chromosome Y bovin conforme au Brevet principal. La présente Addition a en conséquence également 35 pour objet un procédé de tri des spermatozoïdes porteurs du -6 chromosome X et des spermatozoïdes porteurs du chromosome Y, dans une population de spermatozoïdes, qui est caractérisé par les étapes suivantes: - 1) marquage de 1'ADN contenu dans les spermatozoïdes par un colorant vital spécifique de 5 l'ADN (tel, par exemple, que le bromure d'éthidium, l'acridine, le colorant Hoechst 33342, le DAPI); - 2) tri par cytofluorométrie en deux fractions de spermatozoïdes X et Y en fonction de la quantité d'ADN qu'ils contiennent; - 3) contrôle de la qualité du tri opéré au cours de la 2ème étape du 10 procédé, en mettant en oeuvre le procédé de contrôle de la proportion de spermatozoïdes porteurs du chromosome Y dans la fraction de spermatozoïdes Y séparée par tri, conforme à la présente Addition; - 4) immunisation de mammifères rongeurs (souris ou rats) par les fractions contrôlées, éventuellement 15 soumises à un nouveau tri à la suite du contrôle, en vue de la production d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux; - 5) contrôle de la spécifi.cité desdits anticorps, par des tests. d'agglutination, de spermatotoxicité, d'immunofluorescence indirecte, de cytométrie de flux pour l'obtention de réactifs 20 itmmunologiques spécifiques reconnaissant des déterminants antigéniques contrôlés par le chromosome du sexe recherché et exprimés à la surface des spermatozoïdes, aptes à être utilisés pour la séparation de spermatozoïdes vivants porteurs du chromosome X ou du chromosome Y; - 6) séparation des 25 fractions de spermatozoïdes porteurs respectivement du chromosome X et du chromosome Y, dans une population de spermatozoïdes, à l'aide desdits réactifs immunologiques. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé de tri conforme à la présente Addition, l'immunisation 30 de mammifères qui constitue la 4ème étape du procédé de tri est suivie de la collecte des anticorps polyclonaux résultant de ladite immunisation et de l'absorption de ceuxci sur des spermatozoïdes de sexe opposé a celui ayant servi à l'immunisation; la spécificité de ces anticorps étant contrôlée sur 35 des spermatozoïdes du sexe recherché, et lesdits anticorps étant ensuite éventuellement purifiés. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé de tri conforme & la présente Addition, les spermatozoOdes X et Y séparés par cytofluorométrie sont utilisés pour 5 préparer des anticorps monoclonaux spécifiques des chromosomes X et Y. La présente Addition a en outre pour objet les réactifs immunologiques spécifiques reconnaissant des déterminants antigéniques contrôlés par' le chromosome X ou Y 10 ayant servi à l'obtention desdits réactifs et exprimés à la surface des spermatozoïdes, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les anticorps obtenus en mettant en oeuvre le procédé ci-dessus, testés pour leur spécificité et éventuellement purifiés. Outre les dispositions qui précèdent, l-'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la Description qui va suis-e. L'invention s.ra mieux comprise à l'aide du, complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exem20 ples d'application du procédé de contrôle de la proportion de spermatozoïdes porteurs du chromosome Y, dans une population de spermatozoïdes, conformément a la présente Addition. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples de mise en oeuvre, sont donnés uniquement à titre d'il25 lustration de l'objet de l'intention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLES Exemple 1 - Détermination de la bande ADN spécifique du chromosome Y dans une population donnée de spermato30 zoides A. Préparation d'ADN à partir de sperme bovin Chaque paillette d'environ 15 à 20 x 106 spermatozoïdes congelés est immédiatement plongée dans un bainmarie à 37eC pendant environ 30 secondes. Le contenu de 35 chaque paillette est ensuite dilué dans 1 à 2 ml de PBS - 8 stérile. Chaque tube est centrifugé A 500 g pendant 10 mn. Le surnageant est éliminé et le culot repris dans 1 à 2 ml de PBS stérile. Ce lavage est répété 4 fois. Après la dernière centrifugation, le culot de spermatozoïdes est 5 remis en suspension dans 10 ml de tampon de lyse contenant 0,01 M Tris-HCl pH 8,0; 0,1 M NaCl; 0,01 M EDTA; 1% SDS;' 2% Bmercaptoéthanol. Ce tampon est préchauffé A 50'C. Après 30 minutes d'incubation A 50C, 2 mg de protéinase K (concentration finale 200 Mg/ml) sont ajoutés dans chaque 10 tube et l'incubation est poursuivie pendant 2 heures sous agitation lente A 50C. Le mélange est ensuite extrait pendant 15 minutes à température ambiante avec 15 ml d'une solution de 50% de phénol saturé en Tris 0,2 M pH 7,5 et 50% de chloroforme: 15 alcool isoamylique (24:1). La phasé inférieure organique est éliminée et l'extraction est répétée 2 autres fois. La phase aqueuse.st ensuite extraite 2 A 3 fois pendant 15 minutes à te., Irature ambiante avec un mélange chloroforme: alcool isoamylique (24:1). Après la dernière 20 extraction la phase aqueuse est centrifugée à 2 000 g pendant 30 minutes pour éliminer totalement le chloroforme et les protéines précipitées. Le surnageant clarifié est alors mélangé à 2 1/2 volumes d'éthanol absolu préalablement refroidi pendant 15 minutes à 20 C. L'ADN préci25 pité, il est récupéré à l'aide d'une pipette stérile, lavé pendant 5 mn dans de l'éthanol 70%. L'excès d'alcool est évaporé et l'ADN dissous dans du tampon stérile 0,001 M Tris-HCl pH 8,0 et 0,0001 M EDTA. B. Digestion par les endonucléases de restriction Des échantillons de 15 mg d'ADN de spermatozoïdes bovin sont digérés à 37 C pendant 18 heures avec l'endonucléase de restriction Eco RI (Boehringer) dans le tampon d'incubation contenant 100 mM Tris-HCl, 50 nS NaCl, 10 mM MgC12, pH 7,5. La digestion complète est obtenue 35 avec un total de 6-10 unités par ig de l'ADN ajouté en - 9 3 fois. Les fragments de l'ADN digérés sont soumis A une séparation électrophorétique en gel d'agarose de 0,7% dans du tampon 0,04 M Tris-CH3COOH pH 8, 0,002 M EDTA. Le calibrage du gel est obtenu en incluant un échantillon de l'ADN de phage-Lambda digéré par Hind III. Transfert Les fragments de l'ADN contenu dans le gel sont dépurinés pendant 15 mn à température ambiante dans du 0,25 M HC1, dénaturés en 0,5 M NaOH + 1,5 M NaCl, puis 10 neutralisés par passages successifs dans du 1,5 M tampon phosphate pH 5,5 (3 x 15 mn) puis 0,15 M pH 5,5 (2 x 15 mn). Une membrane (Hybond-N Amersham ou PallBiodyne-A Flobio) en "Nylon" est ensuite placée sur le gel et par capillarité les fragments de l'ADN contenu dans le 15 gel sont transférés sur la membrane. Après 16 heures de transfert en 20 x SSC, la membrane est lavée dans du 2 x SSC, séchée à l'air puis placée pour 2 heures dans un four à 80 C. Marquage de la sonde au 32p 100 à 200 ng de sonde b.c.1.2. sous un volume de 1 a 5 pi sont ajoutés au mélange réactionnel suivant: 50 ptM de dATP (1 pil), 50 PM de dTTP (1 il), 50 PM de dCTP (1 mi), 50 uCi de &-32P-dGTP (5 p1), 2 1pl de tampon de réaction contenant 500 m{1 Tris-Hcl pH 7,5, 500 mM MgC12, 25 100 nm B-mercaptoéthanol. La réaction est effectuée à 16 C pendant 1 heure 30, puis arrêtée par addition de 200 pl de la solution contenant 10 mM Tris-HC1 pH 7,5, 80 mM EDTA, 0,5% dodécyl sulfate de sodium. La sonde radiomarquée est séparée des nucléotides 30 par passage sur une colonne (10 cm x 1 cm) de Sephadex G100 (Pharmacia) et éluée par du tampon 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA. Les fractions d'élution contenant le plus de radioactivité sont ensuite poolées. - 10 C. Préhybridation et hybridation Les filtres (blots) sont préhybridés à 42'C pendant 4-10 heures avec un mélange contenant 50% v/v de formamide désionisée, 1 M NaCl, 0,2% de solution de Denhart, 2,5% de 5 sulfate de dextran, 0,1% de dodécyl sulfate de sodium et 0,5 mg/ml d'ADN de sperme de saumon soniqué. L'hybridation est réalisée dans le même mélange excepté le sulfate de dextran qui est à 5% et le NaCl à 0,5 M La sonde radiomarquSe au 31P dénaturée à 100'C pen10 dant 10 mn est ajoutée dans le mélange d'hybridation i 1 x 106 cpm/ml, ce qui représente environ 10 ng de sonde par ml. L'hybridation est réalisée à 42 C pendant au moins 18 heures. Après l'hybridation, les filtres sont lavés une première fois à 650C pendant 30 mn dans du tampon 2 x SSC 15 (0,3 M NaCl et 0,03 M citrate de sodium) + 0,1% SDS puis encore 30 mn dans le même tampon dilué 10 fois (0, 2 x SSC). Les filtres sont e.-uite placés dans une cassette équipée des intensificateurs "Cronex" (DUPONT), mise - en contact avec un -film KODAK XAR-5 - pour l'autoradio20 graphie pendant 6 à 24 heures à - 70 C. D. Résultats L'ADN de spermatozoïdes bovins digéré par l'enzyme de restriction Eco RI puis hybridé avec la sonde b.c.l.2. radiomarquée, présente un profil d'hybridation analogue a 25 celui obtenu avec les autres types cellulaires bovins testés par les Inventeurs. Exemple 2 - Contrôle de la qualité du tri d'une population de spermatozoïdes par hybridation in situ sur spermatozoïdes avec une sonde d'ADN biotinylée A. Préparation des cellules Les cellules utilisées sont des spermatozoïdes de taureau congelés et stockés dans l'azote liquide. On décongèle une paillette, soit environ 13 000 000 de spermatozoïdes vivants. Les paillettes sont réchauffées pendant 35 30 secondes à 37"C puis le sperme dilué dans 1 ml de PBS stérile. - il -. On procède à une série de centrifugations dans le but d'éliminer au maximum le milieu de congélation. La suspension des spermatozoïdes en PBS est d'abord centrifugée pendant 10 mn à 500 g, le surnageant aspiré et les 5 spermatozoïdes repris en 1 ml de 0,11 M citrate de sodium. On centrifuge 10 mn à 500 g. On aspire le surnageant, on reprend en 1 ml de 0,11 M citrate de sodium + 5% DMSO, on centrifuge 10 mn à 500 g. On aspire le surnageant, on resuspend dans 1 ml -e 0,11 M citrate de 10 sodium + 15% DMSO. On centrifuge 10 mn a 500 g. On aspire le surnageant, on resuspend en 1 ml de 0,11 M citrate de sodium + 50% DMSO. On centrifuge 10 mn à 500 g. On aspire le surnageant; on resuspend dans 1 ml de 0,11 M citrate de sodium dans du Tris-HCl 0,1 M pH 7,4. On centrifuge 10 mn 15 A 500 g. On aspire le surnageant et on resuspend dans 250 pl de ce même tampon. Les frottis sont effectués en déposant 30 à 40 pil de suspension C spermatozoïdes par lame. Après séchage à l'air, on réalise la décondensation 20 des spermatozoïdes en procédant comme suit: 1) on procède A un choc hypotonique à l'aide d'une solution de chlorure de potassium 0,08 M pendant 5 mn à température ambiante. Les spermatozoïdes sont ensuite fixés dans un mélange méthanol: acide acétique (3:1) 25 pendant 30 mn. Afin d'éliminer l'activité de la peroxydase endogène, les lames sont traitées au méthanol + H202 3,3% pendant 30 mn, puis rincées dans l'éthanol absolu 10 mn, xylène 10 mn, éthanol absolu mn. 2) après séchage à l'air, une solution de 40 U de papaïne (activée avec 2 mM de sulfure de sodium dans du Tris 0,1 M pH 8,6) (ou de la protéinase K ou de la trypsine) est déposée sur chaque lame. 3) après 15 mn d'incubation A 37 C, les lames sont briève35 ment rincées dans du PBS puis incubées pendant 15 mn à -12 température ambiante dans une solution de Tris 0,1 M pH 8,6 contenant 1% de DMSO ou de SDS et 40 mM d'un réducteur des ponts disulfure tel que dithiothreitol, Bmercaptoéthanol ou analogues. Les lames sont ensuite lavées 3 fois 5 mn dans du PBS puis séchées à l'air. A ce stade les lames sont prêtes pour la dénaturation et l'hybridation in situ. B. Biotinylation de la sonde On utilise un fragment du plasmide pUC9 contenant 10 l'insert b.c.l.2., l'ensemble faisant 350 pb. Le fragment de 350 pb est obtenu par digestion par l'enzyme de restriction PVU II, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose et sorti du gel au moyen de l'absorption sur membrane DEAE NA45 (Schleicher and Schuell). La biotinylation de la sonde s'effectue par nicktranslation, en utilisant les constituants suivants, sous un volume final de 0,050 ml. dATP dGTP dCTP 0,2 m! zhacun BRL DNA Polymerase I 0,4 unité/ul DNase I 40 pg/ul DNA à marquer 1 pg d UTP biotiné 0,4 mM On laisse incuber 90 minutes à 15 C, on arrête la réaction avec 300 nS Na2 EDTA + 5% SDS (Protocole BRL). Après marquage, la -sonde est purifiée par gelfiltration sur colonne de Sephadex G-100. Les différentes fractions collectées sont analysées séparément A l'aide du système streptavidine-phosphatase alcaline (DNA Detection System BRL réf. B239 SA). Les fractions positives sont mélangées et l'activité du pool est mesurée par comparaison avec une quantité connue de DNA biotinylée. C. Technique d'hybridation sur lames Les lames sont incubées avec 90 à 100 pil de liquide 35 d'hybridation et recouvertes d'un film plastique (pour X3 éviter l'évaporation). Après dénaturation pendant 10 mn dans un four 'C, les lames sont mises en chambre humide et incubées à 42C pendant 16 heures. La composition finale du liquide d'hybridation est: 4 x SSC 1 mM EDTA mM Tris-HC1 pH 7,3 1 x Denhardt % Dextran % Formamide déionisée Sonde: 80 ng/ml de milieu d'hybridation (1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M citrate de Na) (i x Denhardt = 0,02% BSA, ou 0,02% lait écrémé en poudre; 0,02% polyvinylpyrrolidone 0,02% Ficoll). Après avoir ôté le film plastique, les lames sont lavées successivement en solution 2 x SSC (30 minutes à 20 température ambiante), puis en 0,1 x SSC (30 minutes à 42"C), 2 x SSC (15 minutes à température ambiante) et enfin en PBS pH 7,4 additionné de 0,1% v/v de Triton x - et 0,5% (p/v) de lait écrémé en poudre (Regilait). D. Révélation Les lames encore humides après avoir ôté l'excédent de fluide sont alors incubées 1 heure à 37 C avec un anticorps de chèvre antibiotine ou un anticorps de lapin antibiotine. Cet anticorps est vendu purifié par chromatographie d'affinité (Vector Laboratories ref. SP-3000) et 30 est utilisé dans nos tests dilué au 1:350 dans du PBS pH 7,4 + 0,1% (v/v) Triton x - 100 + 0,5% (p/u) lait écrémé en poudre. Après un lavage de 15 minutes a température ambiante dans PBS pH 7,4 + 0, 1% (v/v) Triton x- 100 + 0,5% (p/u) 35 lait écrémé en poudre, les lames sont alors incubées 1 heure à 37C avec un anticorps conventionnel de lapin anti-chèvre ou de chèvre anti-lapin couplé A la peroxydase (Biosys ref. BI 2403) dilu6 1:40 dans PBS pH 7,4 + Triton 0,1% + lait écrémé en poudre 0,5%. Les lames sont ensuites lavées deux fois 15 minutes dans PBS pH 7,4 contenant cette fois 0,1% (v/v) de Tween 20 et finalement dans du PBS pH 7,4 pendant 5 minutes. On procède A une incubation de 5 à 8 minutes A tem10 pérature ambiante avec une solution de diairtinobenzidine (DAB SIGMA ref. D 8001) à 0,5 mg/ml dans PBS PH 7,4 contenant 0,01% de H202. Le précipité formé par l'action de la peroxydase sur la DAB est amplifié par précipitation successive de 15 sels d'or et d'argent selon le procédé décrit par BURNS et al (Journal Clinical Pathology 1985, 35, 1085-1092): Dans un premier temps on dépose 50 à 10p1 par lame d'une solution 2.5 réM de chloroaurate de Ne (NaAuCl4 BDH ref. 30125 2R) et on incube 5 mn A température ambiante. 20 Après un lavage de 5 mn dans de l'eau distillée, les lames sont incubées 5 mn à température ambiante avec 50 à 100 pl d'une solution 0,1 MI de sulfure de Na (Na2S, SIGMA ref. S 2006), rincées 5 mn à l'eau distillée et incubées 4 A 8 minutes avec 100 à 300 il de réactif à l'argent. La composition du réactif A l'argent est la suivante: A Carbonate de Na 0, 24 M (SIGMA ref. S 4132) B1 Nitrate d'Ammonium 13 mM (SIGMA ref. A 9642) B2 Nitrate d'Argent 6 mM (BDH ref. 303873N) B3 Ac. Dodecatunstosilicique 1,5 mM (BDH ref. 305453R) B4 Formaldéhyde 37% 0,6 ul/ml (SIGMA ref. F 1635) Le réactif a l'argent est préparé en mélangeant successivement et sous agitation les solutions B1 - B2 35 B3 - B4. Le mélange obtenu est additionné 1:1 a la solu- - 15 tion A et le réactif ainsi préparé est utilisé immédiatement. Après le traitement au réactif à l'argent, les lames sont lavées à l'H20 distillée pendant 15 minutes, puis 5 dans l'acide acétique 1% (v/v) 2 fois 15 minutes et enfin colorées pendant 1 minute en Pyronin Y (SIGMA ref. P 7017) 1% en H20, rincées pendant quelques secondes A l'eau distillée, séchées à l'air chaud et montées en DPX. E. Résultats AprAs hybridation in situ la présence d'un marquage spécifique est détectable sur environ 10 A 15% des spermatozoïdes. Le bruit de fond est négligeable. L'augmentation du volume de la tête des spermatozoïdes témoigne d'une décondensation partielle de ceux-ci, réalisée sur environ 30 15 a 40% des sernmatozoïdes. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes e mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vienne t d'âtre. décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contrai20 re toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. - 16 REVENDICATIONS 1') Procédé de contrôle direct et immédiat de la proportion de spermatozoïdes portant le chromosome Y dans une population de spermatozoïdes de mammifères du genre Bos, ca5 ractérisé en ce que les spermatozoïdes de ladite population sont mis en contact avec une sonde d'ADN spécifique du génome mâle de mammifères, notamment du genre Bos, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 du Brevet principal, pour réaliser le marquage desdits spermatozoïdes par hybridation 10 avec ladite sonde, puis les spermatozoïdes hybridés sont révélés, après incubation avec des anticorps de chèvre ou de lapin-antibiotine, puis avec des anticorps anti-chèvre ou anti-lapin couplés A la peroxydase et avec la diaminobenzidine (DAB), puis amplification, par coloration A l'aide 15 d'un colorant approprie. 2 ) Procédé de contrôle selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'hybridation des spermatozoïd-. avec la sonde moléculaire d'ADN spécifique est réalisée situ -directement avec les spermatozoïdes. 3 ) Procédé de contrôle selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'hybridation est réalisée entre la sonde moléculaire d'ADN spécifique et l'ADN isolé A partir de spermatozoïdes de mammifères du genre Bos. 4-) Procédé de contrôle selon la revendication 2, 25 caractérisé en ce que les spermatozoïdes sont soumis préalablement A l'étape d'hybridation, à un processus de décondensation chimique qui comprend essentiellement trois étapes, à savoir: un choc hypotonique, une digestion protéolytique et une réduction des ponts disulfures. 5 ) Sonde moléculaire d'ADN spécifique du génome mâle de mammifères, notamment du genre Bos, selon l'une quelconque des revendications 1 A 3 du Brevet principal, caractérisée en ce qu'elle est marquée au 32p, conformément à l'une quelconque des revendications 7 ou 11 du Brevet principal. 6 ) Sonde moléculaire d'ADN spécifique du génome - 17 male de nmalmnife:.s, notamnent du genre Bos, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 du Brevet principal, caractérisée en ce qu'elle est marquée par une substance apte à être révélée A l'aide d'une réaction enzymatique, et notamment par la biotine. 7) Procédé de préparation d'une sonde moléculaire d'ADN spécifique biotinylée, selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite sonde est obtenue par insertion d'ADN dans un plasmide tel que le plasmide pUC9, digestion dudit 10 plasmide recombinant par l'endonucléase PVU II, puis purification par électrophorèse sur gel d'agarose et séparation d'un fragment de 350 pb du gel par absorption sur membrane, puis par biotinylation de la sonde de 350 pb obtenue, par nicktranslation à l'aide d'au moins un désoxyribonucléotide 15 triphosphate marqué p-ar la biotine, la sonde biotinylée obtenue étant ensuite purifiée par gel-filtration. 8 ) Procédé de tri des spermatozoïdes porteurs du chromosome X et des spermatozoïdes porteurs du chromosome Y, dans une population de spermatozoïdes, caractérisé par les 20 étapes suivantes: - 1) marquage de l'ADN contenu dans les spermatozoïdes par un colorant vital spécifique de l'ADN; - 2) tri par cytofluorométrie en deux fractions de spermatozoïdes X et Y en fonction de la quantité d'ADN qu'ils contiennent; - 3) contr8ôle de la qualité du tri opéré au cours 25 de la 2ème étape ci- dessus, en mettant en oeuvre le procédé de contr8ôle de la proportion de spermatozoïdes porteurs du chromosome Y dans la fraction de spermatozoïdes Y séparée par tri, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4; - 4) immunisation de mammifères rongeurs (souris ou rats) par 30 les fractions contrôlées, éventuellement soumises A un nouveau tri A la suite du contrôle, en.vue de la production d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux; - 5) contrôle de la spécificité desdits anticorps par des tests d'agglutination, de spermatotoxicité, d'immunofluorescence indirecte, de cyto35 métrie de flux pour l'obtention de réactifs immunologiques - 18 spécifiques reconnaissant des déterminants antigéniques contrôlés par les chromosomes X ou Y et exprimés A la surface des spermatozoïdes, aptes A être utilisés pour la séparation de spermatozoïdes vivants porteurs du chromosome X ou du 5 chromosome Y; - 6) séparation des fractions de spermatozoïdes porteurs respectivement du chromosome X et du chromosome Y, dans une population de spermatozoïdes, à l'aide desdits réactifs immunologiques. 9^) Procédé de tri selon la revendication 8, carac10 térisé en ce que l'immunisation de mammifères qui constitue la 4ème étape du procédé de tri est suivie de la collecte des anticorps polyclonaux résultant de ladite immunisation et de l'absorption de ceux-ci sur des spermatozoïdes de sexe opposé a celui ayant servi à l'immunisation; la spécificité de ces 15 anticorps étant contrôlée sur des spermatozoïdes du sexe recherché, et lesdits anticorps étant ensuite éventuellement purifies. ) Procédé de tri selon la revendication 8, caractérisé en ce que les spermatozoïdes X et Y séparés par 20 cytofluorométrie sont utilisés pour préparer des anticorps monoclonaux spécifiques des chromosomes X et Y. 11') Réactifs immunologiques spécifiques reconnaissants des déterminants antigéniques contr8ôlés par les chromosome X ou Y ayant servi à l'obtention desdits réactifs et ex25 primés à la surface des spermatozoïdes, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par les anticorps obtenus en mettant en oeuvre le procédé selon la revendication 8, testés pour leur spécificité et éventuellement purifiés.