FR 2600340 A1 19871224 FR 8608940 A 19860620 i o PROCEDE DE PRODUCTION D'UN COMPLEXE PROTEOLYTIQUE STIMULANT L'ACTIVITE DU PANCREAS, ET SES APPLICATIONS EN ZOOTECHNIE Dans son brevet français n 2 034 559, le demandeur a décrit un procédé de production de complexes protéolytiques à partir de Streptomyces fradiae, et les emplois possibles de ces complexes notamment en zootechnie. L'expérience a montré que les résultats donnés par la mise en application de ce brevet étaient en général positifs, mais irréguliers 10 ou insuffisants, de sorte que les emplois de ces complexes sont restés très limités. La présente demande a pour objet de décrire un procédé qui permet d'obtenir un complexe nouveau, particulier, ayant une composition plus précisément fixée, et de définir les conditions qui permettent à ce nouveau complexe de donner avec régularité des améliorations importantes en zootechnie. La présente demande concerne aussi le nouveau complexe protéolytique obtenu par application de ce procédé. Dans son brevet anglais n 1 133 579, la société SHIONOGI a indiqué que Streptomyces fradiae pouvait produire au moins 5 protéases, désignées par Ia' 'b' II, III, IV, et 2 peptidases. Le demandeur a également obtenu à partir de Streptomyces fradiae des enzymes qui, sans être apparemment identiques, sont cependant du même type que celles qui 25 sont décrites dans le brevet SHIONOGI. Dans la présente demande, par souci de clarté, on a adopté pour ces enzymes les mêmes désignations que dans ledit brevet. Le demandeur a constaté que les complexes composés exclusivement des protéases du type II, III, IV provoquent la réduction modérée de la 30 viscosité du mucus intestinal prescrite dans son brevet initial et donnent en général des résultats positifs en zootechnie, mais irréguliers ou insuffisants; parmi tous ces complexes, seul le complexe particulier, caractérisé par une plus grande abondance de la protéase du type II par rapport aux protéases du type III ou IV, peut donner avec régularité une amélioration importante des performances zootechniques. Le demandeur a également constaté que les complexes globaux, composés de 5 types de protéases et des 2 types de peptidases, provoquent une réduction excessive de la viscosité du mucus intestinal, et sont agressifs pour la muqueuse; ils sont donc inutilisables en zootechnie. C'est pourquoi on a cherché à obtenir le complexe particulier composé exclusivement des protéases du type II, III, IV, avec prépondérance de la protéase du type II. C'est ce nouveau complexe qui fait l'objet des revendications 5 à 7 de la présente demande. PROCEDE DE PRODUCTION Le complexe selon l'invention est obtenu dans les conditions 15 suivantes: Fermentation On utilise une souche de Streptomyces fradiae, par exemple la souche typique WAKSMAN 3535, déposée à l'American Type Culture Collection sous le n0 10.745. Cette souche peut être périodiquement régénérée par 20 les techniques classiques de dissociation sur milieu gélosé pour éliminer d'éventuels mutants spontanés à faible activité protéolytique. Cette souche peut être aussi améliorée par les techniques classiques de mutation provoquée en vue d'obtenir une augmentation de l'activité protéolytique. On prépare des précultures de cette souche, d'abord en fioles agitées, puis dans un fermenteur intermédiaire qu'on inocule ensuite dans le fermenteur de production industrielle. Le milieu de production peut avoir la composition suivante: farine de soja: 15 g/l; glucose: 30 g/l; phosphate bipotassique: 1 g/l; carbonate de calcium: 10 g/l; après stérilisation, son pH est voisin de 7, 0; on fixe la temp5rature de fermentation à 28 C, et l'aération à 0,3 volume d'air stérile par volume de milieu et par minute. Le pH du milieu, initialement voisin de 7,0, commence par baisser et atteint 6,5 après environ 10 heures de fermentation; il remonte ensuite rapidement et atteint 7,5 apres environ 20 heures de fermentation, puis il continue à remonter plus lentement pour atteindre finalement 8,2. On a constaté qu'il était très important-de maintenir ce pH entre 7,5 et 7,0 par addition automatique d'une solution acide, par exemple de l'acide chlorhydrique 3N, ce qui permet: - d'éviter la fragmentation du mycelium, et la libération dans le milieu de certains métabolites secondaires, des protéases du type Ia, Ib, et des peptidases; ces métabolites secondaires et ces enzymes demeurent ainsi endocellulaires; - d'augmenter la production des protéases du type II, III, IV qui sont des enzymes principalement exocellulaires; - d'obtenir une augmentation spécialement importante pour la production de la protéase du type II. La durée de fermentation peut varier de 72 à 96 heures, et le titre final du milieu est d'environ 15 000 Unités Anson par ml; il dépasse donc de beaucoup le titre de 3 000 Unités Anson par ml indiqué 15 dans le brevet francais n 2 034 559. Une unité Anson (en abrégé U.A.) est ici définie comme étant la quantité d'enzyme qui, incubée pendant 10 minutes à 25 C et à pH 7,5 en présence d'hémoglobine dénaturée, libère de ce substrat l'équivalent de 1 pg de tyrosine, déterminée par absorption spectrophotométrique à 20 280 nm sur le filtrat non précipitable à l'acide trichloracétique. Extraction - Le mycelium est séparé du milieu de production par une filtration clarifiante. * Le complexe, au lieu d'être extrait par les techniques classiques 25 de séparation des enzymes (précipitations successives, passages sur colonne), est extrait par une technique plus récente, l'ultrafiltration. On a recherché quelles étaient les membranes d'ultrafiltration pouvant conduire aux meilleurs rendements; les membranes qui ont un seuil de coupure correspondant à un poids moléculaire de 30 000 ne conviennent pas parce qu'elles laissent passer plus de 50% du complexe; les membranes qui ont un seuil de coupure correspondant à un poids moléculaire de 1 000 ne conviennent pas parce qu'elles ne permettent pas de séparer le complexe de certains métabolites secondaires à faible p.m. On a finalement constaté qu'il convenait d'utiliser des membranes qui 35 ont un seuil de coupure correspondant à un poids moléculaire compris entre 2 000 et 12 000; on peut par exemple utiliser la membrane de polysulfone vendue par la Société MILLIPORE sous la dénomination PTGC, qui a un seuil de coupure correspondant à un p.m. de 10 000. Le concentré obtenu par ultrafiltration est ensuite traité par atomisation. Le complexe est finalement obtenu sous forme d'une poudre beige clair, titrant au moins à 2 000 U.A./mg, compte non tenu des supports 5 inertes, par exemple amidon surséché, éventuellement ajoutés avant ou après l'atomisation. Le rendement global en activité protéolytique, qui est d'environ %, est supérieur à celui qui serait obtenu industriellement par précipitations successives ou passages sur colonne. 10 Caractéristiques du nouveau complexe présence (déterminée par enzymoélectrophorèse) des protéases du type II, III, IV, à l'exclusion des protéases du type I, Ib et des peptidases; prépondérance de la protéase du type II qui représente au moins 15 40% de l'activité protéolytique totale, les protéases du type III ou IV représentant au plus 30% de cette activité totale. APPLICATIONS EN ZOOTECHNIE Les applications en zootechnie du complexe selon l'invention conduisent aux résultats les meilleurs lorsqu'elles sont effectuées 20 conformément aux conditions suivantes: Utilisation d'aliments ayant une teneur élevée en protéines brutes *- On a constaté que le complexe stimulait la croissance des animaux en tendant à privilégier la protéinogenèse par rapport à la lipogenèse. Par exemple, on a observé que les carcasses des veaux et des porcs 25 traités éta4ent parfois mieux classées parce qu'elles étaient plus musclées et moins grasses, mais que ces améliorations étaient irrégulières. On a alors supposé que cette tendance du complexe à stimuler l'anabolisme protéique ne pouvait s'exprimer pleinement que si l'aliment 30 utilisé avait une teneur suffisante en protéines brutes. L'expérience a effectivement confirmé que, pour obtenir avec régularité une stimulation notable de l'anabolisme protéique, une des conditions à observer était d'utiliser un aliment relativement riche en protéines brutes, c'est-adire ayant un taux élevé de Matière Azotée Totale (en abrégé: M.A.T.). 35 Par exemple, ce taux de M.A.T. doit être: > 23% pour les aliments destinés au démarrage des poulets, > 22% pour les aliments d'allaitement destinés aux veaux ou aux agneaux; > 20% pour les-aliments de sevrage destinés aux porcelets; > 16% pour l'aliment unique destiné aux truies en gestation et en lactation. L'utilisation de tels aliments ne correspond pas, en général, à la pratique courante parce que: - les animaux ne sont pas toujours capables d'assimiler complètement un aliment ayant un taux de M. A.T. élevé; les protéines non digérées peuvent alors provoquer un déséquilibre de la flore intestinale par développement excessif des bactéries protéolytiques, et une augmentation de la fréquence des diarrhées. L'uti10 lisation du complexe permet précisément d'éliminer ces risques parce qu'elle confère aux animaux l'aptitude à assimiler efficacement les aliments ayant un taux de M.A.T. élevé; - les aliments ayant un taux de M.A.T. élevé ont un prix supérieur à celui des aliments ordinaires et leur supplémentation en complexe 15 augmente encore ce prix. Toutefois, cette augmentation peut être compensée par le fait que le complexe permet d'utiliser des aliments ayant une teneur en énergie inférieure aux normes courantes. De toute façon, en raison de l'amélioration importante des performances zootechniques obtenues, le bilan économique global de 20 l'opération demeure très avantageux. Utilisation d'aliments destinés aux mammifères en période de gestation, de lactation et de sevrage À On a observé que le complexe particulier, décrit dans la présente demande de brevet, stimule l'activité exocrine du pancréas, ce qui apparait nouveau eu égard au brevet français n 2 034 599. Cette stimulation se traduit notamment, au. cours d'expériences sur le rat, par une augmentation importante de la concentration intrapancréatique de toutes les enzymes qui seront excrétées par le canal pancréatique; cette augmentation peut atteindre 50% pour l'amylase, 70% pour le trypsinogène 30 et le chymotrypsinogène, 80% pour la lipase. C'est pourquoi le complexe particulier, décrit par la présente demande de brevet, doit être considéré comme une substance nouvelle, douée de propriétés nouvelles et inattendues. En raison de cette stimulation de l'activité exocrine'du pancréas, 35 on a supposé que le complexe était particulièrement efficace lorsque le pancréas risquait d'être deficient (cas des femelles en fin de gestation), et lorsqu'il devait fournir un travail exceptionnel de production (cas des femelles allaitant une portée nombreuse) ou d'adaptation (cas des jeunes mammifères en période de sevrage). Les exemples suivants sont en accord avec cette hypothèse de travail: a) Le pancréas des femelles en fin de gestation est souvent déficient parce que le développement important du volume de l'utérus compri5 me tous les organes digestifs. L'addition du complexe dans l'aliment distribué à ces femelles permet alors de rétablir-un bon fonctionnement du pancréas, et par suite d'obtenir une augmentation du poids des portées à la naissance. Par exemple, avec un aliment unique pour truies gestantes ou allaitantes ayant un taux de M.A.T. de 16%, l'addition du complexe à la dose de 120 U. A. par g d'aliments a permis d'obtenir une augmentation de 17% pour le poids des portées à la naissance: 15 kg au lieu de 12,8 kg (10,7 porcelets de 1,4 kg au lieu de ,2 porcelets de 1,25 kg). b) La consommation alimentaire quotidienne des femelles allaitant une portée nombreuse doit augmentée rapidement: entre la fin de la gestation et le huitième jour de la lactation, elle doit être multipliée par 2,5 (environ 45 g au lieu de 18 g pour les rates, 350 g au lieu de 140 g pour les lapines, 6 kg au lieu de 2,4 kg 20 pour les truies) . Le pancréas de ces femelles en lactation doit donc fournir un - travail supplémentaire considérable, et c'est précisément dans ces conditions que l'action du complexe se montre la plus nette. Par exemple, avec un aliment unique pour truies gestantes ou allaitantes ayant un taux de M.A.T. de 17%, l'addition du complexe à la dose de 120 U. A. par g d'aliments a permis d'obtenir une augmentation de 25% pour le poids des portées au sevrage à 21 jours: 54 kg au lieu de 43 kg. (9,4 porcelets de 5,7 kg au lieu de 9,1 porcelets-de 4,7 kg). Dans un autre essai effectué dans des conditions voisines, mais avec sevrage à 28 jours au lieu de 21 jours, l'augmentation du poids des portées a été également de l'ordre de 25%: 52 kg au lieu de 41 kg à'21 jours (9,7 porcelets de 5,4 kg au lieu de 8,5 porcelets de 4,8 kg) et 69 kg au lieu de 55 kg au sevrage à 28 jours 35 (9,7 porcelets de 7,1 kg au lieu de 8,5 porcelets de 6,5 kg). Cette augmentation du poids des portées va de pair avec une diminution de la consommation alimentaire nécessaire au maintien des truies en bon état, diminution qui, sur l'ensemble d'une année, est de l'ordre de 10% (environ 1 000 kg au lieu de 1 100 kg). c) En période de sevrage, les jeunes mammifères doivent passer de la consommation du lait maternel à celle des aliments composés, et leur pancréas doit s'adapter rapidement à ce changement important. L'addition du complexe dans ces aliments composés permet alors de faciliter cette adaptation. Par exemple, avec un aliment de sevrage pour porcelets entre 5 et 10 kg, ayant un taux de M.A.T. de 23%, l'addition du complexe à la 10 dose de 120 U.A. par g d'aliments a permis d'obtenir une augmentation de 15% du Gain de Poids Moyen Quotidien (216 g au lieu de 18 g) et une diminution de 15% à l'Indice de Consommation (1,59 au lieu de 1,83). Plus encore, dans le cas des porcelets, l'action du complexe au 15 moment du sevrage peut être importante dans le cas des lapereaux et des jeunes ruminants (chevreaux, agneaux, veaux). Pour ces animaux, l'augmentation du Gain de Poids Moyen Quotidien sous l'action du complexe peut atteindre 40% (47 g au lieu de 33 g pendant la semaine suivant le sevrage des lapereaux de 5 semaines, 20 797 g au lieu de 573 g pendant le mois suivant le sevrage des veaux de 2 mois). Définition des doses extrêmes utilisables On a constaté que, pour donner avec régularité des améliorations importantes, le complexe doit être utilisé à une dose se situant dans un 25 intervalle relativement étroit, c'est-à-dire à une dose comprise entre et 160 U.A. par g d'aliments.. Dans le cas de l'alimentation des truies allaitantes, la dose utilisée est de 120 U.A. par g d'aliments et l'augmentation du poids des portées de porcelets au sevrage à 21 jours est de 25%. Si cette dose est 30 fixée à 200 U.A./g, l'augmentation de ce poids n'est plus que de 4%: 49 kg au lieu de 47 kg, soit 8,2 porcelets de 6,0 kg au lieu de 8,4 porcelets de 5,6 kg. Dans ce cas de l'alimentation des porcelets, la dose utilisée est de 120 U.A./g et l'amélioration des performances zootechniques est de 35 15%. Si cette dose est fixée à 200 U.A./g, l'amélioration des performances devient irrégulière; au mieux, elle reste de 15% après 3 semaines d'essai, mais devient nulle après 5 semaines d'essai. REVENDICATIONS 1.- Un procéde de production d'un complexe proteolytique formé après fermentation sous l'action d'une souche de Streptomyces fradiae, caractérisé en ce que le pH du milieu de culture est maintenu entre 7,5 et 7,0 par addition d'une solution d'un acide minéral ou organique et en ce que l'extraction du complexe proteolytique est effectuée par filtration en présence d'un agent clarifiant, puis ultrafiltration sur une membrane ayant un seuil de coupure correspondant à un poids moléculaire compris entre 2 000 et 12 000, et enfin atomisation. 2.- Un procédé selon la revendication 1, dans lequel la souche de Streptomyces fradiae est la souche typique WAKSMAN 3535, déposée àl'ATCC sous le n0 10.745. 3.- Un procédé selon la revendication 1, dans lequel le pH du milieu de culture est ajuste par addition d'acide chlorhydrique. 4.- Un procéde selon la revendication 1, dans lequel la membrane d'ultrafiltration est celle à base de polysulfone vendue par la Société MILLIPORE sous la dénomination PTGC. 5.- Le complexe proteolytique obtenu à partir de Streptomyces fradiae par le procéde de la revendication 1. 6.- Le complexe proteolytique selon la revendication 5, dans lequel le titre est au moins égal à 2 000 Unités Anson/mg. - 7.- Le complexe proteolytique selon la revendication 5 ou la revendication 6, composé des proteases du type II, III, IV à l'exclusion des proteases du type Ia, Ib et des peptidases, dans lequel la protease 25 du type II représente au moins 40% de l'activité proteolytique totale et dans lequel les proteases du type III ou IV représentent au plus 30% de l'activité proteolytique totale. 8.- Application du complexe proteolytique selon l'une des revendications 5 à 7, à la supplémentation des aliments destinés aux animaux. 30 9.Aliments composés destinés aux animaux, présentant une quantité du complexe proteolytique selon l'une des revendications 5 à 7, correspondant à une activité protéolytique comprise entre 60 et Unités Anson'par g d'aliments. 10.- Aliments composés destinés au sevrage des jeunes miammifères, 35 présentant une quantité du complexe proteolytique selon l'une des revendications 5 à 7 correspondant à une activité proteolytique comprise entre 40 et 160 Unité Anson par g d'aliments. 9 =2600340 11.- Aliments composés destinés aux femelles en gestation ou en lactation, présentant une quantité du complexe protéolytique selon l'une des revendications 5 à 7 correspondant à une activité protéolytique comprise entre 40 et 160 Unités Anson par g d'aliments. 12.- Aliments composés destinés aux lapines ou aux truies en gestation ou en lactation, présentant un taux de Matière Azotée Totale au moins égal à 16%, et une quantité du complexe protéolytique selon l'une des revendications 5 à 7 correspondant à une activité protéolytique comprise entre 40 et 160 Unités Anson par g d'aliments. 1 l- Aliments composés destinés aux jeunes mammifères en cours de sevrage ou de post-sevrage présentant un taux de Matière Azotée Totale au moins égal à 20% et une quantité du complexe protéolytique selon l'une des revendications 5 à 7 correspondant à une activité protéolytique comprise entre 60 et 180 Unités Anson par g d'aliments.