FR 2604092 A1 19880325 FR 8613146 A 19860919 La présente invention concerne des immuno- réactifs destinés à cibler les cellules animales pour leur visualisation ou leur destruction in vivo. Elle concerne également un procédé de visualisation de tumeurs et de métastases chez l'homme ou l'animal, mettant en oeuvre ces immunoréactifs. On sait depuis la découverte des anticorps monoclonaux, (Kôhier G., Milstein C.: "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of pre-defined specificity" (1975), Nature, 256, 496-497), produire des anticorps capables de se fixer électivement sur un type cellulaire donné; ou de façon moins spécifique sur un petit nombre de types cellulaires. Ces anticorps monoclonaux sont maintenant largement utilisés pour l'identification de cellules sur coupe histologique et le diagnostic in vitro des cancers et métastases (Gatter K.C., Alcock C., Heryet A., Pulford K.A., Heyderman E., Taylor-Papadimitriou 3., Stein H., Mason D.Y., 'The Differential diagnosis of routinely processed anaplastic tumors using monoclonal antibodies" (1984), American 3ournal of Clin. Pathology, 82, (1) 33-43). Il était naturel de chercher à les utiliser aussi in vivo pour amener au contact des cellules cibles soit des traceurs permettant la visualisation par méthode physique, soit des molécules toxiques capables de détruire les cellules s'il s'agit de tumeurs. S'agissant des anticorps couplés i des traceurs, pour. l'imagerie, les investigations ont été nombreuses, utilisant comme marqueurs principalement: - l'iode 131 lié directement aux tyrosines de l'anticorps; - les métaux 111In, 99Tc liés à l'anticorps par l'intermédiaire d'un chélateur lui-méme lié de manière covalente à l'anticorps. On trouvera dans Bradwell A.R., Fairweather D.S., Dykes P.W., Keeling A., Vaughn A. and Taylor J. "Limiting factors in localization of tumours with radiolabelled antibodies" (1985), Immunol. Today,., 163-170 un résumé de l'état de la question. Le paramètre essentiel qui conditionne le succès de l'imagerie et encore plus du ciblage thérapeutique est celui du rapport de capture "uptake ratio", c'est-à-dire du rapport entre la concentration du traceur lié spécifiquement sur la cible, à la concentration environnante, libre ou liée non spécifiquement. En utilisant des anticorps directement marqués, les meilleurs rapports obtenus ne dépassent pas 4 à 5, mais le plus souvent on obtient 2 à 3. Ceci ne permet de détecter que des tumeurs d'un ou deux centimètres de diamètre. L'intérèt de l'immuno-imagerie ainsi conçue est donc réduit, puisque les méthodes conventionnelles atteignent déjà ces performances. Récemment l'utilisation de traceurs de faible masse moléculaire, comme les chélates d'indium, en conjonction avec des anticorps à double spécificité chelates" (1985), Nature 316J, 265-268) a été proposée. Cependant l'injection du traceur seul ne suffit pas à entrainer la clairance rapide de l'excès non lié à la cible. L'anticorps circulant piège le traceur et le stabilise i peu prés aussi bien que la fixation directe du traceur à l'anticorps habituellement utilisé. Pour rendre le schéma fonctionnel,.il faudra éliminer l'anticorps libre, ce qui est loin d'être acquis. La présente invention est fondée sur une approche complètement différente consistant a créer une différence marquée d'affinité du traceur pour les anticorps liés à la cible, par rapport aux anticorps circulants. Le principe de l'invention consiste à exploiter l'avantage d'affinité qu'apporte une fixation multiple par rapport à une fixation unique entre sites antigéniques et sites anticorps, ainsi qu'on l'observe dans certaines fixations naturelles (IgE et IgM sur cellules, C1q sur immuns complexes). A cet effet, la Demanderesse a mis au point des immunoréactifs consistant en deux types de produits, à savoir: a) un anticorps monoclonal ou un fragment d'anticorps reconnaissant un type cellulaire particulier conjugué à un second anticorps ou fragment d'anticorps reconnaissant un groupement hapténique déterminé; b) une molécule constituée d'au moins deux haptènes identiques ou différents reconnus par l'un des anticorps et associés à un motif connu pour pouvoir être marqué par un isotope radioactif. Suivant des caractéristiques particulières, l'anticorps monoclonal est spécifique d'un antigène associé à une tumeur (par exemple le mélanome) ou bien ledit anticorps pourra être dirigé contre des protéines sériques comme la. fibrine ou musculaires comme la myosine. Suivant encore une autre caractéristique, la molécule (b) telle que définie ci-dessus est constituée d'au moins deux haptènes identiques associés à un motif phénolique ou phényle pouvant être marqué par un isotope radioactif des halogènes 18F, 76Br 77Br, 123I, 125, 131[ 211At Suivant une variante. ladite molécule est associée à un chélate susceptible d'être marqué par un 57 111, 113m 99M cation métallique tel que Co, In, 1 In, 9Tc, 67Ga 68Ga. 67Cu. 97Ru 203pb 90y 212Bi Suivant une autre caractéristique et conformément à l'invention, on fait appel conjointement i deux immunoréactifs (a) différents en ce qu'ils reconnaissent chacun un motif antigénique et un groupement hapténique différents et dans ce cas, la molécule (b) est constituée d'un haptène de chaque type associé à un motif connu pour pouvoir être marqué par un isotope radioactif. Il en résulte que le système ne réagit qu'avec les cellules portant simultanément les deux motifs antigéniques et non avec celles qui n'en portent qu'un seul. Suivant encore d'autres caractéristiques avantageuses, le haptène est une molécule de synthèse appartenant a'la famille des dérivés du dinitrophényle. Suivant un mode de réalisation particulier, le dérivé du dinitrophényle répond à la formule NO CH2 NO2 2 02N- -NH-(CH -C-NHH-C-NHCH-COOH o O0 (CH2) NO NH-C-(CH2) 4-NH -i0o2 O Suivant une variante, ledit haptène répond à la formule 02 NO2 NH I ]02 (CHa2)4 02N 2 4-(C, -CHCH2()2-N-(CH).N COOH O I2 32 H2 o COOH COOR COOH COOB L'invention couvre comme indiqué précédemment, le procédé de visualisation de tumeurs et métastases in vivo mettant en oeuvre les produits tels que définis ci-dessus, ce procédé consistant à injecter successivement les immuno-réactifs (a) et une molécule (b) marquée par un isotope radioactif et à réaliser l'imagerie par un détecteur de type connu en soi. Pour les applications thérapeutiques, l'isotope radioactif utilisé est par exemple l'iode 131 ou l'astatine 211 ou bien le bismuth 212. D'autres caractéristiques et les avantages de l invention ressortiront plus clairement des exemples donnés ci-après, illustrant la portée et l'intérêt de ladite invention. Exemole 1 1) PréDaration de l'acide bis (N epsilon (2.4- dinitroohénvl)-L-lvsvl)-diéthvlènetriamine oenta acétioue(comDosé 1) Du N2,4-dinitrophényl-L-lysine chlorhydrate (100 mg) a été dissous dans 2 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO, déshydraté au préalable sur tamis moléculaire) avec addition de deux équivalents de triéthylamine fraichement distillée. Vingt milligrammes d'anhydride bicyclique de l'acide diéthylènetriamine penta acétique (DTPA) (Hnatowich D.3., Layne W.W., Chids R.L., Lanteigne D., Davis M.A. 'Radioactive labelling of antibody: a simple and efficient method" (1983), Science, 220. 613-615) dans 1 ml de DMSO ont été ajoutés et le mélange a été laissé 2 heures à la température ambiante avec agitation, puis évaporé à sec sous vide à 'C. Le résidu a été redissous dans 5 ml d'eau, le pH ajusté à neutralité et la solution chargée sur une colonne de QAE-A-25 Sephadex (de la société Pharmacia), éluée avec un gradient de pH descendant. Les fractions correspondant au composé (seul pic retenu ayant le spectre du dinitrophényle) sont réunies et lyophilisées. Marauage à l'indium 111 On prépare une solution iO- M du compose cidessus dans, un tampon 0.1M citrate pH 5. On mélange extemporanément lmCi d'indium 111 (préparation commer- ciale dans HCl 0.04N) avec 500 pJ1 de la solution du composé (I). On laisse incuber une heure, on ajoute 500pl d'une solution d'acide éthylènediamine tétracétique (EDTA) 105 M. Le composé est prêt à l'emploi (composé II). 2) Production d'un conjugué d'anticorDs à deux soécificités: CD5 et DNP Purification des anticorDs monoclonaux L'anti-CD5 (IgG2a de souris, clone BLla) et l'anti-dinitrophényle (DNP) (IgG2a de souris) sont purifiés à partir des liquides d'ascite par chromatographie d'affinité sur protéine A sépharose. Obtention des fragments Fab'2 de l'anti-DNP (d'après Lamoyi E. and Nisonoff A. "Preparation of F Journal-of Immunol. Methods, 56, 235-243). L'anti-DNP en solution concentré (10 mg/ml) dans un tampon acétate pH 4,2 0,1M est mis en présence de 4 Z en poids de pepsine deux fois cristallisée. La digestion dure 4 heures à 37'C et est stoppée en remontant le pH à 8,0 avec une solution de NaOH O,5M. Les fragments Fab'2 sont purifiés par échange d'ions sur système FPLC (Hono O Pharmacia) en solution de tri(éthanol)amine (TEA) 20mM. Obtention des Fab' anti-DNP Les Fab'2 sont réduits dans une solution 30mM de mercaptoéthanol pendant une heure à 37 C en tampon phosphate salin (P8S), pH 6,5. L'.excès de béta- mercaptoéthanol est éliminé par chromatographie sur colonne de G25 Séphadex (de la société Pharmacia) (tampon borate, pH 8,5). CouDlaae du succinimidvl 4-(N-maléimido- méthvl)cvclohexane-1-carboxvlate (SMCC) sur l anti CD5 Un excès molaire de 5 fois de SMCC dissous dans du diméthylformamide (DMF) anhydre est ajouté à une solution d'anti-CD5 10 mg/ml en borate pH 8,5, 0,1M. La réaction dure une heure à 30'C et le SMCC résiduel est éliminé par chromatographie sur Sephadex G25 (de la société Pharmacia) en PBS pH 6,5. Obtention du comoosé III Le Fab' et le CD5-SMCC sont mélangés dans un rapport molaire de 1:1. Le mélange est concentré sur système Amicon jusqu'à 10 mg/ml et est laissé réagir à 4'C pendant 24 heures. La purification par système de chromatographie liquide haute pression (HPLC) sur colonne TSK 3000 (de la société LKB) et PBS pH 6,5 permet de sép rer la population majoritaire BL1a-Fab (PM Kd) des composants minoritaires: Ig seule (150 Kd) Fab' 2 (100 Kd) Fab (50 Kd) et BLla-(Fab)2 (250 Kd) etc. Cette opération est suivie ou non d'une opération de contrôle dans laquelle, par exemple, le composé est iodé à l'iode 125 par la méthode de Hunter W.N. and Greenwood F.C. "Preparation of iodine labelled growth hormone of high specific activity (1984). Nature, 194, 495-496. Test du svstème Une suspension cellulaire (clone humain T HPBALL) est répartie dans les puits d'une plaque de microtitration (96 Puits Falcon) à raison de 105 cellules/puits dans 50 Pl de PBS sérum-albumine bovine (BSA) NaN3 (0,02 Z). On incube d'abord en ajoutant le conjugué anticorps i raison de 4 pg/ml (final). On laisse incuber une heure. i 4'C avec agitation douce. On ajoute le traceur, composé II, (10 cpm/ puits). On laisse incuber une heure à 4'C avec agitation douce. On compte la radioactivité portée par les cellules en utilisant la séparation par centrifugation sur phtalates. On note: - cellules marquées par les conjugues 20000; - témoins sans anticorps 1100. L'augmentation d'affinité due au caractère dimérique du traceur entraîne un accroissement important par rapport aux procédés antérieurs. Exemple 2 PréDaration de di (N, N- (2.4-dinitro- héml aminocaorovl)-L-tvrosvl-L-lvsine (composé IV) Svnthèse de l'ester de N-hvdroxvsuccinimide de l'acide DNP-aminocaproioue (composé V) L'acide DNP-aminocaproique (265mgl est dissous dans 2 ml de dioxanne fraîchement distillé. 120 mg de N-hydroxysuccinimide sont dissous dans 3 ml d'acétate d'éthyle puis ajouté à la solution précédente. On ajoute 280 mg de dicyclohexylcarbodiimide préalablement dissous dans 2 ml de dioxanne. On laisse trois heures à la température ambiante. Un précipité se forme, on filtre et l'on sèche la solution. On recristallise dans l'alcool absolu bouillant. On obtient ainsi le composé V. CouDlaae du comDosé V avec L. Tvr L.Lvs L.Tyr L.Lys (10 mg) est dissous dans 1 ml de tampon Hepes (50mM) NaCl (150mM) pH 8. Un excès molaire trois fois de composé V dissous dans 200 P1 de dioxanne est ajouté et laissé à réagir pendant 16 heures. Le composé IV se forme et est ensuite purifié par chromatographie liquide haute pression, avec phase inverse. Iodation du composé IV Le composé IV (2 nanomoles) est dissous dans Pl de POS, transféré dans un tube contenant 10/.g de iodogène. lmCi (10 /1l) de 131I-Na est ajouté. La réaction est laissée 10 minutes à 4'C. Le mélange réactionnel est chargé sur une colonne de 1,5 X 50 cm et éluée avec 0.1 M acétate de sodium pH 4, 5. Le pic correspondant au dérivé monoiodé est collecté (composé VI). Variante DotJr la svnthèse du composé VI L.Tyrosyl L.Lysine (2 nanomoles) est iodée au préalable exactement comme décrit pour le composé IV. A la fin de l'incubation, le mélange réactionnel est transféré dans un tube contenant 100 nanomoles du composé V dissous dans 100 Pl dioxanne. La réaction est laissée une heure puis le composé IV formé est purifié comme décrit ci-dessus. Composé VI OH 1 5 j'I NO2 CH2 ON NH-(CH2)4-C-NH-CH-C-NH-CH-COOH 0 O (CH2)4 NO2 NH-C-(CH2) NH 1702 O Test du comoosé VI On procède exactement comme pour le composé IXX. Résultats. - cellules marquées avec conjugué anticorps et composé VI 18 500 cellules marquées avec composé VI. 3 000 Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre illustratif et nullement limitatif et que toute modification notamment au niveau des équivalences techniques pourra y être apportée sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Immuno-réactifs destinés à cibler les cellules animales pour leur visualisation ou leur destruction in vivo, caractérisés en ce qu'ils consistent en deux types de produits, à savoir: a) un anticorps monoclonal ou un fragment d'anticorps reconnaissant un type cellulaire particulier conjugué à un second anticorps ou fragment d'anticdrps reconnaissant un groupement hapténique déterminé; b) une molécule constituée d'au moins deux haptènes identiques ou différents reconnus par l'un des anticorps et associés à un motif connu pour pouvoir être marqué par un isotope radioactif. 2. Immuno-réactifs selon la revendication 1. caractérisés en ce que l'anticorps monoclonal est spécifique d'un antigène associé à une tumeur. 3. Immuno-réactifs selon la revendication 1, caractérisés en ce que l'anticorps monoclonal est un anti-mélanome ou un anti-myosine. 4. Immuno-réactifs selon l'une des revendica- tions 1 à 3, caractérisés en ce que la molécule (b) est constituée d'au moins deux haptènes identiques associés à un motif phénolique pouvant être marqué par un isotope 18 76B 77B 123i 125f radioactif des halogènes 8F. 76Br 77Br, 123I 125I 131I, 211At 5. Immuno-réactifs selon l'une des revendica- tions 1 à 3, caractérisés en ce que la molécule (b) est associée à un chélate susceptible d'être marqué par un 57 111 113m 99m cation métallique tel que 7Co, 1In, 113i, 99Tc, 67Ga6 68Ga 67Cu 97Ru 203Pb 90Y, 212Bi 6. Immuno-réactifs selon l'une des revendica- tions 1 à 5, caractérisés en ce que l'on fait appel à deux immunoréactifs (a) différents en ce qu'ils reconnaissent chacun un motif antigénique et un groupement hapténique différent et dans ce cas, la molecule (b) est constituée d'un haptène de chaque type associé à un motif connu pour pouvoir etre marqué par un isotope radioactif, d'o il en résultera que le systeme ne réagira qu'avec les cellules portant simultanément les deux motifs antigeniques et non avec celles qui n'en portent qu'un seul. 7. Immuno-reactifs selon '1 une des revendica- tions 1 à 5, caractérisés en ce que le haptène est une molécule de synthèse appartenant à la famille du dinitrophényle. 8. Immuno-réactifs selon la revendication 7, caractérisés en ce que le dérivé du dinitrophényle répond à la formule: OH - NO2 CH2 O2N +O NH-(CH2)4-C-NH-CH-C-NH-CH-COOH -NO 2 0 (CH2)4 -N NH-C-(CH2)4- -I;2 ou à la formule: o2 NO24 NH -NO (CH2)4 02N NH-(CH2) 4-CH-NH-C-CH.-N- (CH2) N (CH2)-C-NH-cH 2 2 4-1 N 2_,_. 2,' 2,IH COOH CH2 CH2 CH2 o COOH COOH COOH COOH 9. Immuno-réactifs selon la revendication 8', caractérisés en ce que le cation métallique est l'indium 111. 10. Procédé de visualisation de tumeurs et métastases in vivo mettant en oeuvre les produits tels que définis selon l'une quelconque des revendications 1 9, caractérisé en ce qu'il consiste à injecter successivement les immunoréactifs (a) et une molécule (b) marquée par un isotope radioactif et à réaliser l'imagerie par un détecteur de type connu én soi. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'isotope radioactif utilisé pour détruire les cellules cibles est l'iode 131, l'astatine 211 ou le bismuth 212.