FR 2607517 A2 19880603 FR 8616723 A 19861201 Au moins 3 variants naturels de l'hirudine sont décrits dans la littérature (Markwardt 1970; Petersen et al. 1976; Markwardt et Walsmann 1976; Chang 1983; Dodt et al. 1984, 1985, 1986; Harvey et al. 1986; brevet français 84.04755). Les séquences comparées de ces 3 variants sont présentées dans la figure 1. Le premier variant, HV1, correspond & l'hirudine qu'on isole du corps de la sangsue; le deuxième, HV2 (Harvey et al. 1986) diffère du premier par 9 acides aminés; le troisième (Dodt et al. 1986) est identique à HV2 jusqu'& la sérine 32 mais diffère par 10 acides aminés dans la partie C- terminale, qui comprend, en outre, un acide aminé supplémen- taire (ala63). Ce troisième variant sera désigné ci-après HV3. Ces séquences comportent 65 ou 66 acides aminés et peuvent être considérées comme 2 domaines: une partie N- terminale globulaire qui contient 3 ponts disulfures et une partie Cterminale acide qui présente une homologie avec le site de clivage par la thrombine dans la molécule de proth- rombine. Cette homologie permet de penser que la région qui entoure la position 47 pourrait être le site de fixation de l'hirudine sur la thrombine. D'autre part, l'hirudine naturelle contient une tyrosine sulfatée, en position 63 (Chang, 1983). Cette tyrosine sulfa- tée se retrouve en position 64 dans le variant HV3. Elle sera désignée ciaprès comme "position 63" pour tous les variants, sa fonction étant la même quelle que soit sa position. L'analyse comparée des séquences des variants natu- rels de l'hirudine permet d'envisager, théoriquement, la création de nouveaux variants o sont combinées différemment les caractéristiques des molécules naturelles. HV1 et HV3 présentent une lysine en position 47, située entre 2 prolines, qui est probablement responsable du blocage du site actif de la thrombine (Dodt et al. 1984 et 1985). Comme HV2 ne présente pas de résidu basique à cette position mais une asparagine, il parait souhaitable d'y sub- stituer une lysine ou une arginine pour la rendre plus con- forme à ce qu'on attend d'un inhibiteur de la thrombine (Chang 1985) ou encore une histidine qui n'est pas conforme pour un bon substrat de la thrombine mais qui pourrait aug- menter le pouvoir inhibiteur de l'hirudine. D'autre part la sulfatation de la tyrosine 63 cons- titue une différence entre l'hirudine naturelle et l'hirudine obtenue par recombinaison génétique qui pourrait avoir des conséquences sur son activité, comme le suggèrent les études cinétiques de Stone et Hofsteenge (1986). On peut tenter de mimer la protéine native en remplaçant la tyrosine par un résidu acide comme glu ou asp. La présente invention concerne des variants de l'hirudi- ne, caractérisés en ce qu'ils comportent un acide aminé dif- férent de l'acide aminé existant dans la forme naturelle en position 47 ou 63. Parmi les variants en cause, il faut citer: - les variants dans lesquels l'acide aminé Tyr63 a été rem- placé par un résidu acide, en particulier Glu ou Asp; - les variants dans lesquels l'acide aminé en position 47 dans la forme naturelle est remplacé par une Arg ou His; - les variants dans lesquels l'Asn47 de la forme naturelle de HV2 est remplacé par une Lys. Il faut en particulier, citer les variants suivants: [Lys47] HV2 [Arg47] HV2 [His47] HV2 [Glu63] HV2 [Asp63] HV2 Les différents variants qui ont conservé la Tyr63 peuvent être utilisés sous forme sulfatée ou non. Cette sul- fatation peut être obtenue chimiquement ou bien par voie biologique. Le clonage et l'expression des différentes séquences codant pour HV1, HV2 et HV3, en particulier HV2, et l'obten- tion des hirudines correspondantes à partir de cultures de levures ont &té décrits dans le brevet principal. Les variants selon l'invention peuvent être obtenus par des techniques équivalentes après avoir modifié les sé- quences codantes mentionnées précédemment, par exemple par mutagénèse dirigée. En particulier, par mutagénèse dirigée in vitro, on a construit des variants o l'asparagine 47 est remplacée par une lysine, une arginine ou une histidine et o la tyrosine 63 est remplacée par un acide glutamique. En particulier, il est possible d'utiliser des blocs d'expression fonctionnels tels que décrits dans le brevet principal et dans lesquels la séquence de l'hirudine code pour les variants précédents; ces blocs fonctionnels d'ADN peuvent être portés par un plasmide vecteur. Pour diriger l'expression et la sécrétion par la levure des gènes correspondant aux différents variants, ceux- ci sont intégrés dans un vecteur de levure qui comprend, de préférence, les éléments suivants, qui ont été décrits dans le brevet principal: l'origine de réplication du plasmide de levure 2 - le gène ura3, - une origine de réplication dans E. coli et un marqueur de résistance à un antibiotique, - un promoteur de transcription, la séquence "leader" et la séquence pre-pro du précurseur du facteur alpha, fusionnée en phase, en amont de la séquence codante de l'hirudine, - le terminateur de transcription du gène PGK de la levure, qui sera placé en aval du gène de l'hirudine. L'invention concerne également les levures transfor- mées par ces vecteurs ou par ce bloc fonctionnel d'ADN et leur application à la préparation des variants de l'hirudine. En particulier, l'invention concerne un procédé de préparation d'un variant de l'hirudine par fermentation d'une levure selon l'invention et récupération de l'hirudine pro- duite dans le milieu de culture sous forme mature ou sous forme d'un précurseur maturable in vitro. Les techniques mises en oeuvre ont déjà été décrites plus en détail dans le brevet français ne 85 06672 et son addition né 86 10090 au nom de la Demanderesse. Les variants de l'hirudine ainsi obtenus peuvent être utilisés comme cela est décrit au brevet principal en tant qu'inhibiteur de la thrombine, tant in vivo que in vi- tro. En particulier, ces variants peuvent être utilis&s dans des compositions pharmaceutiques, seuls ou en combinai- son avec d'autres principes actifs, ou bien dans le cadre de tests ou de diagnostic, in vitro ou in vivo. Dans ce dernier cas, il peut être intéressant de marquer les variants, par exemple par un marquage radioactif, fluorescent, enzymatique ou autre. Exemple I Constructions des différents variants de HV-2 par mutagénèse in vitro. Pour effectuer une mutagénèse dirigée in vitro, le fragment d'ADN que l'on veut modifier est clone dans la forme réplicative d'un phage simple brin; le génome du phage re- combinant est isolé et mis à hybrider avec un oligonucléotide synthétique qui porte la séquence mutée. Cet oligonucléotide sert d'amorce à la synthèse du brin complémentaire et 1'ADN rendu ainsi double-brin est utilisé pour transformer une bactérie réceptrice qui va produire du phage portant la muta- tion recherchée (Zoller and Smith, 1983). Le plasmide pTG720, décrit dans le brevet français n 84.04755 est un vecteur d'expression de l'hirudine dans E. coli. Le plasmide pTG730 a été dérivé de pTG720 par l'ad- jonction d'un site EcoRI en aval de la séquence codante de l'hirudine. Le site EcoRI permet de récupérer la séquence codante de l'hirudine par digestion EcoRI d'une part, ClaI d'autre part. Le fragment ClaI-EcoRI couvre la totalité de la région codante de l'hirudine moins quelques codons 5'- terminaux. Ce fragment ClaI-EcoRI a été cloné entre les sites AccI et EcoRI d'un dérivé du phage M13, appelé M13TG131 (Kieny et al., 1983). Le phage dérivé de M13TG131 et qui comprend cette séquence d'hirudine est nommé M13TG1919. On a synthétisé trois oligonucléotides qui sont chacun capables de s'apparier avec la séquence '-GTACACCGAACCCTGAAAG-3' du M13TG1919 sauf pour leur région centrale qui correspond & la mutation désirée. Les séquences de ces oligonucléotides sont les suivantes s TG435 5'-CTTTCAGGGTGCGGTGTAC-3' TG436 5'-CTTTCAGGTTTCGGTGTAC-3' TG437 5'-CTTTCAGGGCGCGGTGTAC-3' Ces oligonucléotides ont été conçus pour permettre la substi- tution du codon AAC (Asn) du M13TG1919 par CAC (his) ou AAA (lys) ou CGC (arg) respectivement. picomoles de chaque oligonucléotide ont été phosphorylés dans 100 il de milieu réactionnel et environ 20 picomoles d'oligonucléotide phosphorylé ont été hybridés avec 1 picomole d'ADN simple brin du phage M13TG1919 dans 25 mi- crolitres de tampon d'hybridation. Après hybridation, le mélange d'ADNs a été soumis à l'action de la polymérase de Klenow et à la ligase du phage T4. Chaque mélange ainsi traité a servi à transfecter la souche de E. coli 71/18 (mut L) sur tapis de bactéries indi- catrices JM103 (Messing et al., 1981). Les cellules infectées sont repérables parce qu'elles forment des plages de crois- sance plus lente; les colonies ont été repiquées sur milieu complet puis transférées sur papier Whatman 540 en vue d'un criblage des cellules présentant les phages mutés. Ce criblage est réalisé par hybridation "in situ" avec l'oligonucléotide ayant servi précédemment comme amorce. On a ainsi obtenu trois nouveaux phages présentant la séquence mutée recherchée: M13TG1921 (asn47 * arg), M13TG1924 (asn47? - his), et M13TG1925 (asn47 * lys). D'autre part, le même type d'expérience a été mené avec un oligonucléotide TG434 de séquence 5'-ATTGTAACTCTTCTTCTG-3' Cet oligonucléotide s'hybride avec la séquence '-CAGAAGAATATTTACAAT localisée dans la région 3' de la sé- quence codant pour HV-2, avec un triplet non apparié destiné a substituer le codon TAT (tyr63) par GAG (glu). On a ainsi obtenu le phage muté correspondant M13TG1922 (tyrb3 * glu). Exemple 2 Substitution du fragment Pstl-HindIII (0.6 kb) de pTG1828 par le fragment muté. Le plasmide pTG1828 (décrit dans le ler certificat d'addition, 86.10090) porte la séquence codante de l'hirudi- ne, précédée des séquences pre-pro du gène de la phéromone sexuelle alpha de levure; l'ensemble est placé sous le con- trôle du promoteur PGK. Par cette fusion entre les séquences pre-pro de MFa et hirudine, la protéine exprimée suit le chemin normal de sécrétion et de maturation de la levure de sorte que l'hirudine processée et active se retrouve dans le milieu de culture. Ce plasmide a été repris pour exprimer les séquences d'hiru- dine mutée, A la place de l'hirudine native. La digestion par Pstl et HindIII de pTG1828 libère cinq fragments de tailles approximatives de 3.8, 1.9, 1.5, 1.1 et 0.6 kb respectivement. Le dernier fragment comprend la séquence fusionnée pre-pro-hirudine. Ce fragment ne comprend qu'un seul site AccI et un seul site EcoRI. La région délimi- tée par ces deux sites comprend l'intégralité de la séquence hirudine moins quelques codons 5'-terminaux. Le fragment HindIII-Pstl de 0.6 kb a été inséré entre les sites HindIII et Pstl d'un vecteur qui ne présente ni site EcoRI, ni site AccI. s 2607517 Le plasmide ainsi reconstitué (pTG1960) possède donc un site AccI unique et un site EcoRI unique localisés respec- tivement au début de la séquence hirudine et en aval de celle-ci. La digestion de pTG1960 par AccI et EcoRI libère un fragment qui comprend la quasi totalité de la séquence de l'hirudine et le reste du plasmide. Le grand fragment d'ADN délété de la séquence de l'hirudine est purifié sur gel et mélangé au produit de di- gestion AccI-EcoRI de la forme réplicative de chacun des phages mutés décrits dans l'exemple 1, en vue de reconstituer la fusion pre-prohirudine avec les nouveaux variants HV-2 obtenus par mutagénèse dirigée. Quatre nouveaux plasmides ont été sélectionnés: pTG1963 (asn47 + arg), pTG1964 (tyr63 + glu), pTG1965 (asn47 + his) et pTG1966 (asn47 ± lys) qui ne diffèrent de pTG1960 que par les codons mutés. Ces séquences portant les codons mutés peuvent être récupérées sous forme de fragments Pstl-HindIII pour être reclonées dans le vecteur pTG1828 à la place du fragment Pstl-HindIII original. On a ainsi obtenu 4 nouveaux plasmides: pTG1977 (asn47 + arg), pTG1978 (tyr63 * glu), pTG1979 (asn47 - his) et pTG1980 (asn47 + lys) qui ne diffèrent de pTG1828 décrit plus haut que par les mutations créées in vitro. Exemple 3 Transformation de TGYlsp4 par les ADNs de pTG1977, pTG1978, pTG1979 et pTG1980. Les cellules de S. cerevisiae TGYlsp4 (Mata ura3.- 251.373.382 his3.11.15) ont été transformées par les ADNs de pTG1977, pTG1978, pTG1979 et pTG1980. Des transformants ura+ ont été obtenus dans chaque cas. On a donc 4 souches TGYlsp4 pTG1977, TGYlsp4 pTG1978, TGYlsp4 pTG1979 et TGYlsp4 pTG1980. On a compar& les productions d'hirudine de ces 4 souches et de TGYlsp4 pTG1828. On a ensemenc& 20 ml de culture (YNBG + casaminoaci- des 0.5 %) à DO660 0.02 avec chaque souche. Après 48 h d'agi- tation & 30C, les cultures sont centrifugées (5000 rpm, 5 min) et les surnageants sont dosés. Une culture de TGYlsp4 pTG881 (plasmide ne portant pas de séquence codant pour HV-2) est utilisée comme contrôle. L'activité des surnageants bruts est mesurée par leur effet inhibiteur sur l'activité de la thrombine (activi- té protéolytique sur un substrat synthétique, le chromozyme TH Boehringer Mannheim). Le pourcentage d'inhibition en fonction des volumes de surnageant est donné dans la figure 2. On constate que l'effet inhibiteur produit par les variants arg47 et lys47 est au moins égal à celui de l'HV2 native. Les variants glu63 et his47 sont 1égèrement moins inhibiteurs que HV-2. Dépôt de souches représentatives de l'invention Les souches suivantes ont été déposées à la Collec- tion Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur, 28 Rue du Docteur Roux, Paris (15), le 6 novembre 1986: TGYlsp4 pTG1977 (HV2-Arg47) sous le no 1-621 TGYlsp4 pTG1980 (HV2-Lys47) sous le ne 1-622. La souche de référence avait été déposée le 6 juin 1986: TGYlsp4 pTG1828 sous le ne 1-569. REFERENCES Chang, J.Y. FEBS Letters 164, 307-313 (1983). Chang, J.Y. Eur. J. Biochem. 151, 217-224 (1985). Dodt, J., Mueller, H.P., SeemUller, U & Chang, J.Y. FEBS Letters 165, 180-184 (1984). Dodt, J., SeemUller, U., Maschler, R. & Fritz, H. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366, 379-385 (1985). Dodt, J., Machleidt, W., SeemUller, U., Maschler, R. & Fritz, H. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367, 803-811 (1986). Harvey, R.P., Degryse, E., Stefani, L., Schamber, F., Cazenave, J.P., Courtney, M., Tolstoshev, P. & Lecocq, J.P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1084-1088 (1986). Kieny, M.P., Lathe, R. & Lecocq, J.P. Gene 26, 91-99 (1983). Krajewski, T. & Blombâck, B. Acta Chemica Scandinavica 22, 1339-1346 (1968). Markwardt, F. Methods Enzymol. 19, 924-932 (1970). Messing, J., Crea, R., Seeburg, P.H. Nucl. Ac. Res. 9, 309 (1981). Petersen, T.E., Roberts, H.R., Sottrup-Jensen, L. & Magnusson, S. Protides, Biol., Fluids, Proc. Colloq. 23, -149 (1976). Stone, S.R. & Hofsteenge, J. Biochem. 25, 4622-4628 (1986). Zoller, M.J. & Smith M.N. Methods in Enzymol. 100, 469 (1983). REVENDICATIONS 1. Bloc fonctionnel d'ADN selon l'une des reven- dications 1 & 9 du brevet principal, caractérisé en ce que le gène codant pour le variant de l'hirudine code pour un vari- ant comportant un acide aminé différent de l'acide aminé de la forme naturelle en position 47 ou 63. 2. Plasmide comportant un bloc fonctionnel d'ADN selon la revendication 1. 3. Plasmide selon la revendication 2, caractéri- sé en ce qu'il comporte - l'origine de réplication du plasmide de levure 2 y, - le gène ura3, - une origine de réplication dans E. coli et un marqueur de résistance à un antibiotique, - un promoteur de transcription, la séquence "leader" et la séquence pre-pro du précurseur du facteur alpha, fusionnée en phase en amont de la séquence codante du variant de l'hirudine, - le terminateur de transcription du gène PGK de la levure, qui sera placé en aval du gène dudit variant. 4. Levure transformée par un plasmide selon l'une des revendications 2 et 3 ou par un bloc d'expression selon la revendication 1. 5. Procédé de préparation d'un variant de l'hi- rudine par fermentation d'une levure selon la revendication 4 et récupération de l'hirudine produite dans le milieu de culture sous forme mature ou sous forme d'un précurseur matu- rable in vitro. 6. Variant de l'hirudine obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 5. 7. Variant de l'hirudine, caractérisé en ce qu'il comporte un acide aminé différent de l'acide aminé de la forme naturelle en position 47 ou 63. 8. Variant selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'acide aminé Tyr, en position 63 dans la forme naturelle, est remplacé par un résidu acide Glu ou Asp. 12 26075 17 9. Variant selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce qu'il s'agit de l'hirudine HV1, HV2 ou HV3. 10. Variant selon l'une des revendications 7 & 9, caractérisé en ce que l'acide aminé en position 47 dans la forme naturelle est remplacé par une Arg ou His. 11. Variant selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que l'acide aminé 47 de la forme naturelle de HV2, Asn, est remplacé par une Lys. 12. Variant de l'hirudine choisi parmi: [Lys47] HV2 [Arg47] HV2 [His47] HV2 [Glu63] HV2 [Asp63] HV2 13. Variant selon l'une des revendications 7 à 12, caractérisé en ce qu'il est sulfaté ou non. 14. A titre d'inhibiteur de la thrombine, un variant selon l'une des revendications 7 à 13. 15. A titre d'agent anticoagulant, une compositi- on contenant à titre de principe actif au moins un variant selon l'une des revendications 7 à 13. 16. A titre de médicament, un variant selon l'une des revendications 7 à 13.