FR 2606151 A1 19880506 FR 8715004 A 19871029 La présente invention concerne un détecteur du type comportant une électrode à enzyme, une opération de préparation du détecteur en vue de son utilisation et une méthode analytique utilisant le détecteur. Les électrodes à enzyme sont de plus en plus utilisées dans les laboratoires médicaux et dans d'autres laboratoires, notamment pour le dosage de matières telles que le glucose et l'urée dans des échan- tillons de sang et dans d'autres liquides physiologiques. De telles électrodes sont décrites dans de nombreuses publications, notamment dans un article publié par Clark et Lyons (Annals of the New York Academy of Science, 102, 29-45, 1962) et dans les brevets des EtatsUnis d'Amérique N 3 539 455 et N 3 979 274, respectivement, déposés aux noms de Clark et Newman. Des électrodes à enzyme sont généralement utilisées pour doser des matières qui ne sont pas elles-mêmes douées d'activité électrochimique mais qui, en présence d'enzymes conve- nables, prennent part à des réactions qui produisent des substances qui peuvent être aisément détectées par les électrodes. Dans des électrodes à enzyme, les enzymes sont fréquemment situés dans des matières poly- mériques à proximité étroite de l'électrode sous-jacente. Des électrodes à enzyme proposées plus récemment compren- nent celles de la demande de brevet européen simultané- ment pendante N 863g3907.9 et des demandes de brevets britanniques N 8522834 et 8529300 simultanément pen- dantes, au nom de la Demanderesse. Le dosage du glucose peut être effectué, à titre d'exemple de dosage d'une substance, par une électrode à enzyme. En présence de l'enzyme glucose- oxydase, la réaction suivante a lieu: Glucose- Glucose + 02.... > Acide gluconique+H202. oxydase Le peroxyde d'hydrogène produit dans cette réaction traverse la première couche d'une membrane telle que celle du brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 979 274 et peut être dosé au moyen de l'électrode. Etant donné que le peroxyde d'hydrogène produit dépend du glucose présent dans un échantillon, la concentra- tion en glucose peut être déterminée en utilisant tout détecteur convenablement étalonné. Le contrôle continu in vivo de métabolites sanguins tels que le glucose peut offrir au médecin des informations immédiates sur l'état d'un patient et peut donc permettre d'établir un traitement plus efficace. Si un contrôle continu du glucose in vivo était possible pendant une période prolongée, il serait possible de réaliser pour des diabétiques un système portable en boucle fermée délivrant de l'insuline. Tous les composants d'un tel système ont été réalisés, excepté un détecteur à long terme comportant une élec- trode à enzyme, pouvant être utilisé in vivo. A l'heure actuelle, le système de ce type le plus efficace qui ait été rapporté est celui qui a été mis- au point par M. Shichiri et collaborateurs (Lancet, 1982, 2 (8308), 1129-31; Chem. Abs., 1984, 100, 144957g et Chem. Abs., 1985, 102, 2004956) qui sont parvenus à obtenir le contrôle tissulaire in vivo de chiens pancréatectomisés pendant des périodes.de 3 jours et le succès du contrôle à plus court terme du glucose dans les tissus de l'avant- bras de volontaires humains. On en a conclu que les réalisateurs d'un détecteur in vivo devraient orienter leurs recherches vers un instrument qui allie les propriétés suivan- tes: 1. stabilité à long terme; 2. réponse reproductible (de préférence linéai- re) à un substrat dans la plage cliniquement importante, à savoir de O à 40 mM; 260 6 151 3. sélectivité, c'est-à-dire absence d'inter- férence de la part d'autres substances chimiques; 4. indépendance de la performance de l'élec- trode à l'égard de variations dans la tension d'oxygène d'un échantillon (co-substrat pour la glucose-oxydase); 5. bref temps de réponse, de préférence moins de 2 minutes; 6. biocompatibilité, produisant le mini- mum de trauma, de formation de thrombus et de nécrose des tissus; 7. faibles dimensions; 8. insensibilité au mouvement et aux variations de viscosité de l'échantillon; 9. robustesse; et 10. Aptitude à la stérilisation. En outre, la réponse de l'électrode doit rester pratiquement non affectée par l'exposition à un environnement biologique essentiellement hostile. Conformément à la présente invention, il est proposé un détecteur du type à électrode à enzyme pour le dosage d'un analyte, ledit analyte pouvant être converti en la présence d'un enzyme en une substance qui peut être perçue par le détecteur, ce dernier com- prenant une électrode recouverte d'une membrane per- méable à des liquides et à des corps dissous, qui peut venir en contact avec un échantillon contenant l'analyte, ladite membrane comprenant une couche qui renferme un ou plusieurs enzymes et une couche externe de matière disposée entre la couche contenant l'enzyme et l'échan- tillon, caractérisé en ce que la couche externe a été traitée avec un réactif dénaturant les protéines. Selon une autre particularité de la présente invention, il est proposé une étape dans la préparation, en vue de son utilisation, d'un détecteur du type à à électrode à enzyme pour le dosage d'un analyte pouvant être converti en présence d'un enzyme en une substance qui peut être perçue par le détecteur, ce dernier com- prenant une électrode recouverte d'une membrane per- méable aux liquides et aux corps dissous et ayant une couche contenant un ou plusieurs enzymes et une couche externe de matière disposée entre la couche contenant l'enzyme et un échantillon contenant l'analyte, ladite étape étant caractérisée en ce que, pendant son accom- plissement, la couche externe est traitée avec un réac- tif dénaturant les protéines. Selon encore une autre particularité de l'invention, il' est proposé une méthode de dosage d'un analyte dans un échantillon, méthode qui consiste à faire entrer l'échantillon en contact avec une électrode d'un détecteur du type à électrode à enzyme, cette électrode étant recouverte d'une membrane perméable aux liquides et aux corps dissous et comprenant une couche renfermant un ou plusieurs enzymes, en présence desquels l'analyte peut être converti en une substance pouvant être perçue par le détecteur, et une couche externe de matière disposée entre la couche contenant l'enzyme et l'échantillon, et à mesurer la réponse du détecteur à l'égard de la substance, caractérisée en ce que la couche externe a été traitée avec un réac- tif dénaturant les protéines. L'électrode peut avoir une forme quelconque et elle peut être, par exemple, du type qui est mis en contact avec des gouttes d'un échantillon. Toutefois, de préférence, elle a la forme d'une tige présentant une pointe (facultativement effilée) qui est recouverte de la membrane. Dans la méthode analytique de l'inven- tion, la pointe d'une telle électrode recouverte de la membrane est insérée dans l'échantillon. Dans toute la suite du présent mémoire, le détecteur de l'invention sera appelé électrode en forme de barre ou électrode "aiguille". Dans sa forme la plus simple, la membrane du détecteur de l'invention consiste en une couche contenant un enzyme et en une autre couche de matière, de préférence une couche de perméabilité réduite comme décrit dans la demande de brevet européen N 86307011.6 au nom de la Demanderesse. L'autre couche est la couche externe dans cette forme simple de membrane et elle entre en contact direct avec l'échantillon dans la méthode de l'invention pour le dosage d'un analyte. Toutefois, il est préférable que la membrane soit une membrane stratifiée du type dont la membrane révélée dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 979 274 constitue un exemple. Une telle membrane comprend une première couche ou couche interne de ma- tière disposée entre la couche contenant l'enzyme et l'électrode, la couche contenant l'enzyme et une secon- de couche de matière de l'autre côté de la couche con- tenant l'enzyme, cette seconde couche étant de préfé- rence une couche de perméabilité limitée. Le présent mémoire donne ci-après la description du détecteur de l'invention qui contient une membrane stratifiée ayant une première et une secon- de couches, dont la seconde est de préférence la couche qui comprend la matière poreuse de perméabilité limitée. Il y a lieu de remarquer que les membranes dans le détecteur de l'invention peuvent contenir plus de deux couches de matière, en plus de la couche conte- nant l'enzyme. Par exemple, la seconde couche n'est pas nécessairement la couche externe de la membrane. Il peut y avoir une ou plusieurs autres couches de matière, c'est-à-dire une troisième couche, une quatriè- me' couche, etc., entre la deuxième couche ou couche de perméabilité limitée et l'échantillon. Toutefois, il est fréquent que la seconde couche constitue la couche externe et que sa face externe entre en contact avec l'échantillon. En général, la matière utilisée dans la seconde couche est une matière polymérique, mais d'au- tres matières convenables peuvent être utilisées. Ainsi, la seconde couche peut être formée d'un verre ou d'un métal qui présente des pores produits par lasers. La seconde couche de matière est avantageu- sement formée d'une matière dont la porosité effective ne dépasse pas 2 %. Des porosités effectives très fai- bles, par exemple dans l'intervalle de 0,001 ou de 0,005 % à-0,5 %, sont préférées. Dans le détecteur de l'invention, la seconde couche de la membrane agit comme une barrière de diffu- sion et empêche ou limite également le passage de com- posés de haut poids moléculaire. Des matières poreuses convenables pour la- seconde couche comprennent des matières poreuses telles que des polycarbonates, des polyuréthannes et une cellulose modifiée, notamment le nitrate de cellulose, l'acétate de cellulose et la cellulose régénérée. La seconde couche est de préfé- rence formée d'un polyuréthanne. Des polyuréthannes peuvent être appliqués sur la couche d'enzyme, soit comme précurseurs de polymère, soit comme polymère préformé pour constituer la seconde couche. Le détecteur de l'invention peut comprendre une membrane détachable, ou bien il peut s'agir d'un détecteur à usage unique auquel adhère une membrane. Les matières utilisSes dans la formation d'électrodes convenables pour les détecteurs comprennent des métaux inertes et/ou le carbone. Lorsque le détecteur comporte une membrane stratifiée du type révélé dans le brevet des Etats- Unis d'Amérique N 3 979 274 précité, la première couche qui doit être disposée entre la couche d'enzyme et 7 2606151 l'électrode est avantageusement formée de polyméthacry- late de méthyle, de polyuréthanne, d'acétate de cellu- lose ou d'autre matière perméable qui limite ou empêche le passage de composés interférents électro-actifs tels que l'acide ascorbique et la tyrosine. Il est particulièrement avantageux que la première couche soit formée d'une polyarylcétone sulfonée ou non sul- fonée ou bien, en particulier, d'une polyarylsulfone sulfonée ou non sulfonée du type décrit dans la demande de brevet britannique N 8529300 précitée. L'utilisation de polyarylsulfones sulfonées pour la première couche offre un avantage particulier lorsque le détecteur comprend une électrode en forme de tige. Avec des élec- trodes en forme de tige, on se heurte à certaines diffi- cultés pour obtenir trois couches physiquement distinc- tes à l'extrémité de la tige et la première couche et la couche d'enzyme ont souvent été associées. L'uti- lisation d'une polyarylsulfone sulfonée pour la première couche réduit la difficulté de revêtement de la pointe de la tige avec trois couches. Il y a lieu de remarquer que lorsque la pointe de la tige est revêtue des couches constitutives d'une membrane, les première et seconde couches sont avantageusement formées de matières solu- bles dans des solvants différents. La première couche a avantageusement une épaisseur comprise dans l'inter- valle de 0,2 à 1,0 micromètre. L'enzyme présent dans le détecteur de l'in- vention peut être inclus dans la membrane de toute manière convenable. Dans une membrane stratifiée, il est de préférence présent entre les première et seconde couches de matière poreuse et la couche contenant l'en- zyme forme le lien entre elles. Dans ce cas, et aussi d'une façon générale, l'enzyme est de préférence immo- bilisé par mélange avec une matière qui provoque une réticulation. Une matière très avantageuse à utiliser à cette fin est le glutaraldéhyde; des protéines telles que l'albumine et d'autres matières sont aussi avanta- geusement incluses. En vue de faciliter l'obtention de lectures stables et rapides à l'aide du détecteur, il est préférable que la couche contenant l'enzyme soit mince, c'est-à-dire que son épaisseur ne dépasse pas 5 micromètres. L'enzyme devant être utilisé dans le détec- teur de l'invention dépend de l'analyte dont on désire déterminer la concentration. Si l'analyte est le glucose, l'enzyme est alors, par exemple, la glucose-oxydase. D'autres enzymes qui peuvent être présents comprennent l'uricase et la lactate-oxydase pour le dosage, respec- tivement, de l'acide urique et de l'acide lactique. Des systèmes enzymatiques comprenant deux ou plus de deux enzymes peuvent aussi être présents. Le réactif dénaturant les protéines qui est utilisé pour traiter la couche externe de la mem- brane (habituellement la seconde couche) peut être tout réactif convenable. On apprécie des acides et des bases inorganiques, l'acide chlorhydrique, les hydroxydes de sodium et de potassium, notamment à une concentration comprise dans l'intervalle de 0,01 M à 0,5 M, étant particulièrement avantageux. Les condi- tions de traitement qui sont préconisées dépendent de l'enzyme et de la matrice protéinique dans laquelle il est placé. Avec des électrodes en forme de tige, la pointe est plongée dans le réactif pendant quelques secondes, comme moyen simple d'effectuer le traitement. L'utilisation de la méthode de l'invention offre l'avantage d'accroître l'intervalle de concen- trations dans lequel une représentation graphique de la concentration en fonction de la réponse du détecteur est linéaire. Avec les méthodes classiques, la linéarité ne s'étendait approximativement que jusqu'à une concen- tration de 3 mmoles par litre pour le glucose. En uti- lisant la méthode de l'invention, on accroît la linéa- rité et on peut étendre l'intervalle jusqu'à des concen- trations en glucose de 50 mmoles par litre et même plus. Ainsi, l'intervalle couvre les concentrations en glucose auxquelles on peut s'attendre dans des échan- tillons de sang, ce qui permet donc de déterminer plus aisément des taux de glycémie. Cela pourrait constituer un avantage considérable dans les cas o de grands nombres de dosages doivent être effectués régulièrement et avec un minimum de préparation (à savoir de dilution) des échantillons. Les utilisations potentielles de détecteurs de l'invention comportant des électrodes en forme de tige sont les suivantes: (1) Usages médicaux: Multiples dans l'analyse in vivo de méta- bolites. Système à boucle fermée du type d'un pancréas artificiel. Contrôle in vivo en cas de soins intensifs (par exemple chez des patients atteints de coma diabé- tique ou dans le cas de certains troubles génétiques chez les nourrissons, o le taux de glucose dans le sang peut chuter rapidement jusqu'à zéro avec éventuel- lement des conséquences fatales). Système à cellules d'écoulement simple avec électrode aiguille intégrée (préstérilisée), à usage extracorporel. Outil de recher- che stomatologique pour le contrôle des sucres, etc., dans la bouche. (2) Usages vétérinaires: (Essentiellement comme pour 1). Contrôle possible de taux d'hormones chez des animaux, lorsqu'ils s'accompagnent de modifications des taux habituels de métabolites. (3) Usages alimentaires: Contrôle de chaînes de production d'aliments (par exemple confitures, boissons, etc.). Production C 2 606151 de boissons alcooliques (bières, vins, etc.). Contrôle de qualité des aliments pour produits de boucherie, légumes, fruits, etc. Contrôle microbien. (4) Agriculture: Maturité des récoltes, qualité, etc. (comme pour 3). Production de fourrages ensilés. Production laitière. (5) Fermentation: (Comme pour 3). Contrôle continu de charges d'alimentation pour la production de protéines d'orga- nismes monocellulaires. (6) Pollution:. Contrôle de rejet des effluents, eaux usées, etc. dans les cours d'eau. L'invention est illustrée par les dessins annexés et par l'exemple suivant: Sur les dessins, les figures 1(A) et 1(B) représentent deux types d'électrodes en forme de tiges qui sont préparées et expérimentées de la manière décri- te dans les exemples. L'électrode de la figure 1(A) est une électrode de 0,5 mm et l'électrode de la figure 1(B) est une électrode de 0,25 nrm. La figure 1(C) repré- sente la membrane utilisée pour revêtir les pointes des électrodes. Les électrodes sont formées à partir de tubes 1 en acier inoxydable qui agissent comme électro- des de référence et comme contre-électrodes et dans lesquels des fils de platine 2 sont insérés. Les matiè- res isolantes présentes comprennent un manchon 3 en verre et une résine époxy 4 sur la figure 1(A) et un manchon 5 en "TEFLON" (marque commerciale enregistrée) et une résine époxy 6 sur la figure 1(B). Les connexions électriques sont soudées aux extrémités des électrodes et les pointes d'électrode 7 sont polies au moyen de papier émeri. Les pointes polies sont ensuite revêtues il 1 61 des couches formées par la membrane représentée sur la figure 1(C). Il s'agit d'une première couche 8 formée d'une polyaryléthersulfone sulfonée (PES), d'une couche 9 comprenant de la glucose-oxydase et d'une seconde couche 10 de polyuréthanne. La membrane entière a été traitée par immersion dans l'acide chlorhydrique. La couche de polyuréthanne est appliquée par revêtement simple ou multiple par immersion sur la couche d'enzyme, et le solvant est chassé par évapo- ration dans l'air. Les polyuréthannes utilisés étaient du type précurseur (polymérisation in situ donnant une couche insoluble dans les solvants) SC771, SC762, Trixane H35 (Baxenden Chemical Co Ltd) ou des caout- choucs de polyuréthanne dissous Estane 5701F1, 5707F1, 57111F1 (B. F. Goodrich Co, Belgique). Dans tous les cas, la linéarité peut être étendue. Les revêtements polymériques du type précurseur et du type caoutchouc (qui peuvent être appliqués comme feuilles précoulées physiquement distinctes d'une épaisseur de 0,2 à 1 pm) donnent une linéarité similaire, mais on observe des réponses plus lentes pour les produits "Estane". Le polyuréthanne étend la plage de linéarités de l'élec- trode en réduisant la diffusion du glucose dans la couche enzymatique. On considère que tous les polyuré- thannes utilisés agissent comme des barrières micro- poreuses limitant la diffusion, attendu que des couches complètes sont imperméables au glucose. On expose l'élec- trode à un traitement par un acide donné pour étendre davantage la linéarité. On y parvient en plongeant la pointe de l'électrode dans du HCl 0,1 M pendant à 50 secondes, puis en la lavant et en la plongeant de nouveau dans un tampon sous agitation jusqu'à ce qu'une ligne de base stable ait été atteinte. En l'absen- ce d'une membrane sous-jacente, la linéarité peut être étendue de 7 à 70 mM par traitement avec un acide, bien qu'après plusieurs heures, cette linéarité de l'électrode se stabilise à environ 35 mM. EXEMPLE Des électrodes ont été caractérisées dans un tampon au phosphate isotonique (pH 7,4). La perfor- mance des électrodes dépend à un haut degré de la struc- ture de la membrane et du prétraitement utilisé, et peut donc être adaptée au but recherché. La plage de linéarités de l'électrode à l'égard du glucose peut être étendue sans membrane sous-jacente comme repré- senté sur la figure 2 avec un temps de réponse de 20 à 60 secondes dans une solution sous agitation. Avec l'incorporation de la couche sousjacente de PES, la linéarité a été étendue à plus de 30 mM. Les temps de réponse en solution non agitée vont de 5 à 240 secon- des (normalement 30 secondes). Le temps de réponse T950, dans du sang entier non dilué et non agité va normalement de 10 à 90 secondes. La figure 3 illustre une courbe de réponse à l'addition de glucose; pour une électrode linéaire jusqu'à 30 mM (T95% de 15 secon- des, résolution de +/- 0,2 mM), le taux courant est resté inchangé à 40 mM pendant plus de 4 heures (sans membrane sous-jacente dans ce cas). Avec une membrane sous-jacente de PES, les électrodes ont montré une interférence négligeable de la part d'autres substances biologiques (acide ascorbique, glutathion, acide urique, etc.). Les électrodes ont été grandement indépendantes des effets de l'agitation. Dans du sang entier non dilué et non agité, la concordance avec un essai spectrophotométrique clas- sique a été bonne (voir figure 4), y = 1,006 x + 0,096, r = 0,996, n = 26. Toutefois, le temps de réponse pour cette électrode est passé de 30 secondes dans un tampon à 60-90 secondes dans le sang. Dans du sang dilué sous agitation (dilution à 1:3 dans du tampon isotonique à pH 7,4), on a obtenu la corrélation y = 0,971 x + 0,024, r = 0,987, n = 28. Dans le sang entier aussi bien dilué que non dilué, la réponse à des solutions de référence s'est abaissée de 1 à 4 % après la première exposition du sang, mais la répon- se de référence est ensuite restée inchangée. Dans du sang entier non dilué, des mesures intermittentes ont été effectuées sur une période de 10 jours sans modification notable des caractéristiques de l'électrode (maintien à l'état sec pendant une nuit). Dans du sang dilué, la performance de l'électrode s'est montrée inchangée après 200 mesures sur du sang sur une période de 8 semaines (maintien en tampon isotonique à la tempé- rature ambiante pendant une nuit). Légendes des figures 2 à 4 Figure 2: dépendance du courant d'électrode -2 (nA cm en ordonnées) envers la concentration (nM en abscisses) en glucose (solution tampon sous agitation. Figure 3: courbe de réponse courant d'élec- trode/temps (nA cm-2 en ordonnées/min en abscisses) vis-à-vis d'additions de glucose pour un détecteur de linéarité étendue. Figure 4: concordance pour du sang entier avec un essai spectrophotométrique classique (y = 1,006 x + 0,096, r = 0,996, n = 26). En abscisses: essai classique de labora- toire/glucose mM; en ordonnées: réponse de l'électrode/ glucose mM). 1 4 REVENDICATIONS 1. Détecteur du type à électrode à enzyme pour le dosage d'un analyte, ce dernier pouvant être transformé en présence d'un enzyme en une substance qui peut être perçue par le détecteur, qui comprend une électrode recouverte d'une membrane perméable aux liquides et aux corps dissous qui peut entrer en contact avec un échantillon contenant l'analyte, ladite membrane comprenant une couche contenant un ou plusieurs enzymes et une couche externe de matière disposée entre la couche contenant l'enzyme et l'échantillon, caractérisé en ce que la couche externe (10) a été traitée avec un réactif dénaturant les protéines. 2. Détecteur suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la membrane comprend une première couche ou couche interne de matière, disposée entre la couche contenant l'enzyme et l'électrode, et une seconde couche de matière sur le côté opposé de la couche contenant l'enzyme. 3. Détecteur suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la couche externe ou seconde couche est formée d'une matière poreuse de perméabilité limitée, ayant une porosité effective ne dépassant pas 5 %. 4. Détecteur suivant la revendication 3, caractérisé en ce que la couche externe ou seconde couche a une porosité effective ne dépassant pas 2 %. 5. Détecteur suivant la revendication 5, caractérisé en ce que la couche externe ou seconde couche a une porosité effective dans l'intervalle de 0,001 à 0,5 %. 6. Détecteur suivant la revendication 5, caractérisé en ce que la couche externe ou seconde couche a une porosité effective dans l'intervalle de 0,005 à 0,5 %. 7. Détecteur suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la couche externe ou seconde couche est formée de poly- uréthanne. 8. Détecteur suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'épais- seur de la couche contenant l'enzyme ne dépasse pas micromètres. 9. Procédé de préparation, en vue de son utilisation, d'un détecteur du type à électrode à enzyme pour le dosage d'un analyte pouvant être transformé en présence d'un enzyme en une substance qui peut être perçue par le détecteur, ce dernier comprenant une électrode recouverte d'une membrane perméable aux liqui- des et aux corps dissous et ayant une couche contenant un ou plusieurs enzymes et une couche externe de matière disposée entre la couche contenant l'enzyme et un échan- tillon contenant l'analyte, caractérisé en ce qu'il comporte une étape au cours de laquelle la couche exter- ne est traitée avec un réactif dénaturant les protéines. 10. Méthode de dosage d'un analyte dans un échantillon, qui consiste à faire entrer l'échan- tillon en contact avec une électrode d'un détecteur du type à électrode à enzyme, cette électrode étant recouverte d'une membrane perméable aux liquides et aux corps dissous et comprenant une couche renfermant un ou plusieurs enzymes, en présence desquels l'analyte peut être transformé en une substance pouvant être perçue par le déteuteur, et une couche externe de ma- tière disposée entre la couche contenant l'enzyme et l'échantillon, et à mesurer la réponse du détecteur à la substance, caractérisée en ce que la couche externe a été traitée avec un réactif dénaturant les protéines.