FR 2609291 A1 19880708 FR 8700052 A 19870106 Procédé de biodéqradation des stérols. La présente invention concerne un procédé microbiologique de dégradation des stérols dans les matières grasses alimentaires. L'invention trouve principalement son application dans la fabrication de matières grasses alimentaires à teneur réduite en stérols. On sait que,chez Les personnes ayant une alimentation riche en cholestérol, on constate une altération de la paroi des artères: l'athérosclérose due en partie à une déposition anormale de cholestérol dans la paroi (J.A.M.A., Vol, 253, 1985, pages 2080 à 2086). On sait également que le cholestérol est essentiellement apporté dans L'alimentation humaine par Les matières grasses d'ori- gine animale. Parmi celles-ci, l'une des plus couramment et régu- lièrement consommées est le beurre qui contient, pour 100 g, entre 220 et 340 mg de stérols dont 98 % sont représentés par le cholestérol. La gravité que peut revêtir l'athérosclérose a précisé- ment conduit à rechercher des techniques permettant la préparation de matières grasses alimentaires et notamment debeurreou de compo- sitions à base de matière grasse laitière dont la teneur en choles- térol est réduite. Les techniques connues pour La dégradation des stérols mettent en oeuvre des méthodes physico-chimiques. L'utilisation de solvants a par exemple été envisagée mais les solvants les plus adaptés, tels que l'acétone ou le méthanol,sont incompatibles avec un usage alimentaire. Des méthodes d'adsorption sur colonne, telles que par exemple une chromatographie sur une colonne contenant des triglycé- rides, ont été également proposées. Mais il s'agit de méthodes coûteuses et dont la mise en oeuvre s'accompagne d'une perte significative d'une partie de la matière grasse soumise au traitement. On peut encore citer une méthode de microdistillation décrite dans le brevet FR-A-2319300 dont l'utilisation s'est avérée peu adaptée à une production industrielle. La demanderesse apporte une solution aux inconvénients de l'art antérieur en proposant un procédé de dégradation des stérols mettant en oeuvre des bactéries. La présente invention concerne précisément selon un premier aspect un procédé microbiologique de dégradation des stérols contenus dans les matières grasses alimentaires. Ce procédé se caractérise en ce que l'on met à incuber au contact de la matière grasse des bactéries capables de dégrader au moins l'un des stérols qu'elle contient. Il vise donc selon les cas la dégradation du cholestérol lorsque la matière grasse est d'origine animale et la dégradation des stérols, tels que le sito- stérol, le stigmastérol ou l'ergostérolLorsque la matière grasse est d'origine végétale. Le procédé selon l'invention consiste essentiellement à mettre des bactéries apportées de préférence sous forme d'une suspension, éventuellement concentrée, au contact de la matière grasse. Ce contact s'effectue de préférence sous agitation, à l'aide par exemple d'un agitateur rotatif, de préférence à la température la plus favorable pour la souche mise en oeuvre. Cette incubation est en général inférieure à 24 h. Il est possible, en outre, dès la fin de l'incubation, soit de procéder à la séparation des corps bactériens et de la matière grasse, par exemple par décantation ou par centrifugation, soit d'inactiver les bactéries par exemple à l'aide d'un traitement thermique approprié appliqué à la matière grasse. Les bactéries, mises au contact de la matière grasse, sont apportées de préférence sous la forme d'une suspension. Cette suspension peut notamment résulter de l'incubation d'un milieu de culture liquide préalablement ensemencé à l'aide desdites bactéries. Selon une autre variante, les bactéries, après séparation des autres constituants du milieu de culture ayant servi à leur obtention, sont mises en suspension dans un liquide approprié à un usage alimentaire, tel que par exemple de l'eau déminéralisée additionnée de chlorure de sodium à raison de 9 g par litre. Toutes sortes de matières grasses, soit d'origine ani- male, soit d'origine végétale ou leurs mélanges peuvent être soumises au procédé selon l'invention. Il peut s'agir notamment de matières grasses dérivées du lait, telles que la matière grasse laitière anhydre ou MGLA, lebeurreou la crème laitière ainsi que d'autres matières grasses telles que la margarine, les huiles végétales ou les huiles animales. Il peut encore s'agir de suif ou par exemple de saindoux. Pour la mise en oeuvre du procédé, on peut utiliser toute souche bactérienne capable d'assurer la biodégradation du cholestérol ou d'un autre stérol d'intérêt. D'une manière préférée, on utilisera la souche du genre Nocardia dont le déposant a effectué, en date du 3 décembre 1986, le dépôt d'une culture auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes ou CNCM (Paris - France), qui lui a attribué la référence 1-636. L'invention concerne donc selon un aspect l'utilisa- tion d'une souche bactérienne présentant les caractéristiques de la souche CNCM 1-636. La souche CNCM 1-636 a été isolée à l'occasion d'un programme de screening réalisé à partir d'échantillons de sols dans la région de Labège (Toulouse - France). A partir des échantillons mis en suspension dans de l'eau contenant 9 g par litre de chlorure de sodium, des cultures ont été réalisées sur deux milieux solides d'enrichissement dont les caractéristiques sont données ci-dessous: Milieu 1 Composition Glycérol................. 20 g Larginine, HCl.......... 2,5 g NaCl.................... 10 g CaCO3......... ......... 0,1 g FeSO4,7H20............... 0,1 g MgSO4,7H20.............. .0,1 g Agar-agar............. 20 g Cycloheximide......... 50 g (Actidione)..DTD: pH--: 6,5 à 6,8. Stérilisation: 20 min à 120 C. Milieu 2 Milieu décrit par SCHAAL D.P. CZbL. Barteriol. Parasitenk Infektions Kv. Agg. 220 N 1-3,24 (1972)]. Composition NaH2PO4......................1 g MgSO4,7H20................... .0,5 g KNO3.2,5 g KN3...................... 2,5 g Acétate de sodium....... .... 5 g Propionate de sodium.......... 5 g Hydrolysat de caséine.........DTD: 10 g sans vitamine Agar-agar type E..............15 g pH: 7,5..DTD: Stérilisation: 20 min à 120 C. Parmi les souches isolées, la souche CNCM 1-636 a été sélectionnée en raison d'aptitude à dégrader les stérols et en par- ticulier le cholestérol. Afin d'assurer la conservation de la souche CNCM 1-636, il est possible de procéder de la manière suivante: Après 48 h de culture à 28 C sur milieu BHI (Brain Heart Infusion DIFCO référence 0418), la culture est reprise par 5 ml d'un milieu de conservation pour la congélation dont les caractéris- tiques sont données ci-dessous, répartie dans des tubes de Nunc, à raison de 1 ml par tube, et conservée à -80 C. Milieu de conservation Composition (par litre) Chlorure de sodium......... ..... 9 g Chlorure de potassium............. 0,42 g Chlorure de calcium...DTD: ............ 0,48 g Bicarbonate de sodium............. 0,2 g Glycérol.....DTD: ..................... 150 g MOPS (3-(n-morpholino)propane-.... 3 g sulfonique acide)..DTD: DH: 7,0 avant stérilisation. Stérilisation: 20 min à 120 C. La souche CNCM 1-636 a été caractérisée à l'aide des caractères morphologiques et biochimiques décrits dans les ouvrages et articles suivants: 1. M. Goodgellow, and K.P. ShaaL (1979) "Identification methods for Nocardia, Actinomadura, and Rhodococcus" in "Identification Methods for Microbiologists", F.A. Skinner and D.W. Loverlock (ed), Acad. Press., London, p. 261-276. 2. R.M. Kroppenstedt, (1985) "Fatty acid and menaquinone analysis of actinomycetes and related organisms" in "Chemical Methods in Bacterial Systematics", M. Goodfellow and D.E. Minnikin (ed) Acad. Press. London p. 173-179. 3. M. Daffé, M.A. Lanéelle, C. Asselineau, V. Lévy-Frébault et H. David (1983) "Intérêt taxonomique des acides gras des mycobactéries: proposition d'une méthode d'analyse". Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur), 134 B, p. 241-256. La souche CNCM 1-636 se caractérise notamment par - sa réaction positive à la coloration de Gram. - son acido-alcoolo-sensibilité mise en évidence par la coloration de Ziehl-Neelsen. - sa morpholoqie coloniale: des colonies blanc-crème, pâteuses, à mucoides, et légèrement expansives sont obtenues après 18 h de culture, sur le milieu gélosé BHI (Brain Heart Infusion agar, référence DIFCO référence 0418). - sa micromorpholopie: on observe sur le milieu BHI la formation de filaments blanc-crème, rampants et dépourvus d'hyphes aériennes sur des cultures de moins de 12 h et la fragmentation des filaments précoces en éléments allongés polymorphes ou coccoides. On note l'absence de sporulation. - ses caractères culturaux: qui sont présentés dans le tableau no 1 ciaprès. TABLEAU 1 Milieu de Croissance MycéLium Eléments Eléments Pigmenta- culture primaire séparés séparés tion (1) (2) allongés coccoldes (3) Extrait de ++ + + - - Levure Extrait de malt (ISP2) Farine + - - + - d'avoine (ISP3) Sels inor- + faible - - + - ganiques amidon (ISP4) Glycérol- + + + - - Aspara- gine (ISP5) Heptane- ++ + + I - Extrait de levure-fer (ISP6) Tyrosine + faible + + - - aqar (ISP7) * (1) ISP = International Streptomyces Procedure. * (2) La croissance est évaluée après 20 h d'incubation. * (3) La pigmentation est observée sur une période de 8 jours. - La constitution de l'enveloppe cellulaire Cette enveloppe a les propriétés suivantes: * Paroi de type IV (présence d'acide mésodiaminopimélique, d'arabinose et de galactose). * Présence d'acides mycoliques et de phosphatidyléthanolamine. * Présence d'acide gras: À en C14 saturé (acide myristique) À en C16 saturé (acide palmitique) À en C16 saturé méthyLé (acide 10-méthylpalmitique) en C16 mono-insaturé (acide patmitolèique) 40. en C18 saturé (acide stéarique) À en C18 saturé méthylé (acide 10-méthyl-stéarique) en C18 mono-insaturé (acide oléique). * Absence d'acides gras de longueur de chaîne supérieure à 18 atomes de carbone. L'ensemble des caractères ci-dessus présentés indique que la souche CNCM 1-636 appartient au genre Nocardia. D'autres caractères biochimiques présentés dans le tableau 2 ci-après ne permettent pas, considérés dans Leur ensemble, par contre de rattacher la souche CNCM 1-636 à L'unedesespèces de Nocardia possédant des acides mycoliques déjà décrites (M. GoodfeLlow and D.E. Minnikin 1981 "The genera Nocardia and Rhodococcus" in "The Procaryotes", P. Starr, H. StoLp, H.G. Tr pper, A. Balows and H.G. SchLegel (ed) Springer Verlag, Berlin p. 2016-2027). TABLEAU 2 DECOMPOSITION DE L'adénine + La caséine L'éLastine L'hypoxanthène Le testostérone + La tyrosine La xanthine RESISTANCE Au lysozyme A la rifampicine PRODUCTION D'uréase FORMATION D'ACIDE A PARTIR: D'adonitol De cellobiose De méso-érythrétol De lactose De maltose De méLèzitose D'a-méthyl-D-glycoside La demanderesse a proposé que La nouvelle espèce repré- sentée par la souche CNCM 1-636 soit nommée Nocardia labeqensis. La souche CNCM 1-636 est remarquable pour son aptitude à biodégrader les stérols contenus dans les matières grasses d'ori- gine animale ou d'origine végétale ainsi que leurs mélanges. Son utilisation permet d'éliminer, par exemple, le cholestérol libre contenu dans la Matière Grasse Laitière Anhydre (MGLA) en moins de 12 h. Il a été vérifié par chromatographie sur couche mince que la souche CNCM 1-636 dégrade les stérols en composés de faible poids moléculaire sans formation de produits intermédiaires tels que le 4-androstène-3,17-dione ou le 1,4-androstadi no-3,17-dione. Dans ce qui suit, des exemples non limitatifs de réali- sation de l'invention sont présentés: Exemples I - METHODOLOGIE 1.1 MATIERES GRASSES TESTEES Quatre matières grasses ont été testées: - de la MGLA (France-Beurre) * prise d'essai: 1,5 g - de la crème laitière (crème homogénéisée à 60 % de matière grasse ULPAC) * prise d'essai: 1 g - de l'huile d'arachide (Carrefour ) * prise d'essai: 2 g - une margarine (Astra) * prise d'essai: 1,5 g La MGLA et la margarine sont portées à environ 50 C pour être utilisées à l'état liquide. 1.2 SOUCHE BACTERIENNE MISE EN OEUVRE La souche CNCM 1-636 a été utilisée. 1.3 MODE OPERATOIRE a) Phase de production de biomasse 1 ml de la suspension de la souche CNCM 1-636 conservée à -80 C est mis en culture dans 40 mIl d'un milieu de culture. Deux milieux ont été utilisés: les milieux A et B dont les caractéristiques sont indiquées ci-après: - "?Li&U A " * CompositoDr sar litre: À (NH2)2S........ 2 g CaCl2,2........ 0,01 g 5. FeSO4,7H....... 0, 01 g K2P04...............2 g MgSO4,?H2........... 0,2 g Glycrol........... 10 g Extrait de tevure (DIFCO - référence 0127).... 20 g * pH: 6,7 * Stérilisation: 20 min à 120 C. - Milieu B * Composition par Litre: Glucose............................... ........... 10 g 15. Peptone (DIFtO - référence 0118)................ 4 g Extrait de viande (DIFCO - référence 0126)...... 4 g Extrait de Levure (DIFCO - référence 0127)......1 g NaCL.. ............................DTD: ...............2,5 g * pH: 7..DTD: * StériLisation: 20 min à 120 C. Après 24 h d'incubation à 28 C sur table rotative (220 rpm), on procède à un repiquage avec un taux d'incubation de 5 %: on préLève 2 ml de ta culture obtenue et on les ajoute à 40 ml de milieu neuf du type de celui déjà utilisé. Après une deuxième incubation de 24 h à 28 C sous agitation, on ajoute à la culture obtenue une prise d'essai de la matière grasse à tester à l'état liquide. b) Phase de bioconversion La culture ainsi complétée est soumise à une incubation de 12 h à 28 C sous agitation constante. c) Récupération de La matière grasse traitée On procède ensuite à une centrifugation (9 000 tours par minute pendant 15 min). Le surnageant, constitué par la matière grasse, est lavé deux fois av3c 10 ml d'aau jéminéralissa. On récupère ainsi sensiblement toute la matière grasse de la prise d'essai. 1.4 ANALYSE DES RESULTATS On soumet la matière grasse à une analyse qualitative (par chromatographie sur couche mince ou CCM) et à deux dosages (un dosage par chromatographie en phase gazeuse ou CPG et un dosage enzymatique). 1. Analyse par CCM Le milieu réactionnel contenant la matière grasse est acidifié par addition d'HCl (1N) jusqu'à ce que le pH atteigne la valeur de 2,5. On procède ensuite à une extraction à l'aide de dichloro- méthane (deux fois 10 ml). Puis la phase organique est séchée dans une enceinte contenant du sulfate de sodium anhydre et évaporée sous vide. Le résidu obtenu est soumis à une CCM. Le support chroma- tographique utilisé est une plaque de verre recouverte d'une mince couche de gel de silice (référence 60 F254 - Merk R). L'éluant est un mélange (70/30 v/v) d'hexane et d'acétate d'éthyle. La révéla- tion est réalisée par pulvérisation d'une solution d'acide sulfurique dans de l'éthanol (50/50 v/v) suivie d'un chauffage à 100 C. Quatre composés témoins sont déposés sur le support: du cholestérol, de l'ergostérol, et deux 17-cétostéroldes, du 4-androstène-3,17-dione ou AD et du 1,4-androstadiène-3,17-dione ou ADD. 2. Dosage enzymatique Un kit de dosage des stérols totaux, libres ou estérifiés dans les huiles et les graisses,commercialisé par la Société Boehringer,est utilisé. Ce kit met en oeuvre le mode opératoire décrit dans la REVUE FRANCAISEDES CORPS GRAS (Vol. n 4, avril 1986, M. NAUDET et al., p. 167-170). 3. Dosage par CPG Ce dosage est réalisé en suivant le mode opératoire de la Pharmacopée Européenne (Ph. Eur. 2 (I) v. 20.3) en utilisant du stigmastérol comme étalon interne et une solution témoin de choles- térol. Il permet de doser le cholestérol total. La limite de détec- tion est atteinte pour une quantité de cholestérol correspondant à 0,05 % de l'échantillon préparé pour la CPG. 2 - ESSAIS Sept essais ont été réalisés conformément au tableau 3. TABLEAU 3 Matière grasse MiLieu de Verification de testée cuLture L'efficacité de la souche Analyse Dosage Dosage CCM CPG enzymatique Essai 1 MGLA A X X Essai 2 MGLA B X X X Essai 3 Crème Laitière B X Essai 4 Margarine A X X Essai 5 Margarine B X X Essai 6 Huile d'arachide A X X Essai 7 Huile d'arachide B X X Chacun de ces essais est doubLé d'un essai-témoin pour lequel une prise d'essai de la matière grasse à tester à l'état liquide est ajoutée à 40 ml de milieu (A ou B selon le cas) non ensemencé, le mélange obtenu est soumis à une incubation de 12 h à 28 C sous agitation constante puis est traité selon Le mode opé- ratoire décrit au paragraphe 1.3 ci-dessus. 3 - RESULTATS 3.1 ANALYSES PAR CCM Examen du support après révélation: On note pour Les quatre composéstémoins les résultats suivants: - cholestérol: Rf = 0,60, couleur rose ergostérol: Rf = 0,30, couleur rose - AD: Rf = 0,30, couleur verte - ADD: Rf = 0,20, couleur violette. En ce qui concerne les extraits préparés à partir de la matière grasse traitée, on constate: 1. Pour les essais n 1, 2 et 7: L'absence de taches correspondant à des stérols, à l'AD ou à l'ADD. 2. Pour les essais n 4, 5 et 6 La présence résiduelle de stérols (les taches sont de moindre dimension et leur coloration est atténuée par rapport à celle des composés témoins). 3.2 DOSAGESENZYMATIQUES Les résultats sont présentés dans le tableau n 4 TABLEAU 4 Stérols dans Stérols après Pourcentage de le témoin traitement disparition des mg/100 g mg/100 g stérols Essai 1 234 25 89 % Essai 2 323, 6 45,4 86 % Essai 4 241 108 55 % Essai 6 221 64 71 % Essai 7 161,4 59 63 % On constate que le procédé mis en oeuvre a permis l'éli- mination, par dégradation, de 55 à 89 % des stérols initialement contenus dans la matière grasse. 3.3 DOSAGES PAR CPG Pour l'un et l'autre des essais 2 et 3, il n'a pas été détecté de cholestérol dans les échantillons préparés à partir de la matière grasse traitée. Compte-tenu de la sensibilité propre à la méthode utilisée, on peut conclure qu'au moins 80 % du choles- térol total initialement contenu dans la matière grasse ont été dégradés par l'action de la souche CNCM 1-636. REVENDICATIONS 1. Procédé de dégradation de stérol contenu dans une matière grasse alimentaire, caractérisé en ce que l'on met à incuber au contact de la matière grasse des bactéries capables de dégrader Ledit stérol. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les bactéries sont utilisées sous forme d'une suspension. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la suspension de bactéries résulte de l'incubation d'un milieu de culture liquide préalablement ensemencé à l'aide desdites bactéries. 4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les bactéries sont en suspension dans un liquide approprié à un usage alimentaire. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les bactéries appartiennent au genre Nocardia. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les bactéries ont les caractéristiques de la souche déposée auprès de la CNCM sous la référence 1-636. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une phase de sépara- tion des bactéries et de la matière grasse. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'après incubation les bactéries sont inac- tivées par un traitement thermique. 9. Souche bactérienne ayant les caractéristiques de la souche CNCM 1-636. 10. Matière grasse à teneur réduite en stérols obtenue selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 8. 11. Matière grasse laitière anhydre à teneur réduite en cholestérol selon la revendication 10.