FR 2607817 A1 19880610 FR 8717091 A 19871208 La présente invention concerne un procédé et une matière pour la séparation et La purification des cyclo- dextrines. Plus particulièrement, l'invention concerne la séparation et la purification des cyclodextrines à partir d'une solution, et notamment un procédé pour séparer et purifier les o-, A- et T-cyclodextrines d'une solution en utilisant une matrice à laquelle un composé d'inclusion a été uni. L'amidon est un polymère d'anhydroglucose présent naturellement dans diverses plantes, telles que le rrazs, la pomme de terre, le sorgho, le riz, etc. Lorsque le polymère a la forme physique d'une chane rectiligne, le polymère est appelé amylose, tandis que lorsque le polymère est ramifié, il est appelé arrylopectine. Généralement, l'amidon contient à la fors des molécules d'amylose et d'amylopectine-. L'action d'une enzyme appelée cyclodextrine glycosyl- transferase sur l'amidon produit des cyclodextrines. Les cyclodextrines, également appelées dextrines de Schardinger, cycloamylases, cyclomaltoses et cyclo- glucannes sont des polymères de motifs d'anhydroglucose sous forme d'une structure cyclisée. Un cycle de six motifs d'anhydroglucose est appelé xcyclodextrine, tandis que les cycles à sept et huit chatnons sont appe- Lés respectivement D- et 1-cyclodextrinres. Les cyclodextrines sont produites par traitement de l'amidon ou de l'amidon liquéfié avec une enzyme, la cyclocextrine glycosyltransférase (CGT) avec un pH, une température et une durée appropriés à la CGT choisie. L'amidon peut provenir d'une variété choisie quelconque de plantes. L'enzyme CGT provient de micro-organismes tels que B. macerans, B. megat;ium, B. circulans, B. stearothermophilus et Bacillus sp. (alcalinophile) ainsi que d'autres. Les paramètres de la réaction entre la CGT choisie et l'amidon choisi sont classiques et bien décrits dans la littérature. Classiquement, on met l'amidon en suspension dans une solution aqueuse à une concentration pouvant atteindre environ 35 % en poids de matières sèches. On soumet ensuite à une gélatinisation et une liquéfaction par une enzyme ou un acide jusqu'à obtention d'un équivalent en dextrose inférieur à envi- ron 2,0, de préférence avec une enzyme. L'enzyme préfé- rée pour la Liquéfaction est l'&-amylase bactérienne. Après désactivation de l'enzyme liquéfiante par la cha- leur ou un acide, on traite la solution avec une CGT cnoisie en utilisant le pH, la température et la durée de traitement qui sont optimaux pour la CGT choisie. Généralement, l'action de La CGT sur l'amidon pour pro- duire des cyclodextrines s'effectue à un ph entre envi- ron 4,5 et 8,5 à une température comprise entre le voi- sinage de la température ambiante et 75 C et pendant environ 10 heures à 7 jours. La quantité des Y-! - et T-cyclodextrines individuelles produites par l'action de la CGT sur l'amidon varie selon les conditions de trai- tement et la CGT choisie. Les cyclodextrines ont une grande diversité d'utilisation dans les médicaments, les produits chimi- ques agricoles, les cosmétiques et les aliments, ainsi que de nombreuses nouvelles applications restant à découvrir. Ces utilisations résultent de la.capacité naturelle que possède la cyclodextrine à agir comme une molécule hOte et à encapsuler d'autres composés chimi- ques. Le composé encapsulé est appelé ici molécule emprisonnée. A ce jour, les procédés de séparation des cyclo- aextrines à partir d'une solution en utilisant une matrice ont éte -Étés et généralement impropres à la séparation mutue. -ssive des cyclodextrines. Le brevet US n 4 303 787 décrit un procédé de séparation des cyclodextrines à partir d'une solution aqueuse contenant des cyclodextrines et un sucre réduc- teur en utilisant une matrice faite d'une résine hydro- pnobe poreuse sans les radicaux fonctionnels d'une résine échangeuse d'ions. Ces résines comprennent un copolymère de styrène-divinylbenzène, un copolymère d'éthylbenzène-vinylbenzène, des fluoroplastiques, des résines de silicone, des résines poLyoléfiniques et similaires. Aucune séparation successive des cyclodex- trines n'est décrite. Le brevet US n 4 384 898 décrit un procédé de séparation de cyclodextrines, à partir d'une solution aqueuse contenant des cyclodextrines et du glucose, par emploi d'une matrice faite d'un sel de métal alcalin ou alcalino-terreux d'une résine échangeuse de cations fortement acide, la résine échangeuse étant un copoly- rrer réticulé de styréne-divinyLbenzène ayant des grou- pes suLforyles. Aucune séparation successive des cyclo- dextrines n'est décrite. Le brevet US n 4 418 144 décrit un procédé de séearation en deux stades, dans lequel le premier stade utilise La matrice du brevet US n 4 384 898 précité pour séparer les cyclodextrines au glucose et un second stade ultérieur utilise une résine de gel pour séparer la 1-cyclodextrine de l'o- et de la P-cyclodextrines. C'est la seule référence mentionnant la possibilité de séparer une cyclodextrine d'une autre et, comme indiqué, elle est limitée à la T-cyclodextrine. On a utilisé de la diéthylaminoéthylcellulose complexée avec du borate de sodium; cependant, les résultats obtenus ne sont pas satisfaisants et n'entrent pas dans le cadre des revendications de l'invention. La demanderesse a découvert qu'en faisant passer une solution aqueuse contenant des cyclodextrines à travers une matrice à laquelle un composé d'inclusion a été uni, on peut non seulement séparer les cyclodextri- nes de la solution, mais égaler.e-.- effectuer une sépara- tion telle que les a-, A- et T-cyclodextrines sont éluées successivement, si bien que les a-, D- et T-cyclodextrines sont séparées les unes des autres. De façon générale, l'invention comprend les stades de passage d'une solution aqueuse contenant des cyclodextrines à travers une matrice à laquelle un composé d'inclusion est uni et d'élution ultérieure des cycLodextrines. La matrice à laqueLLe Le composé d'inclusion'est uni doit être insoluble dans L'eau et former des parti- cules stables capables de résister aux conditions d'écoulement dynamique. De plus, la matrice doit être très pure et pouvoir être stérilisée. Cette pureté et cette aptitude à la stérilisation sont particulièrement importantes dans le cas des cyclodextrines destinées à l'emplo, dans les aliments, les cosmétiques et les médi- caments. La matrice doit également être susceptible d'êtere modifiée pour que le composé d'inclusion puisse Lui être uni. Des exemples spécifiques des matrices compren- nent les silices, les celluloses, les gels de polyacryi- amide, Les perles de styrène-divivylbenzène, les perles de poiyacrylate, les perles de polystyrène et leurs dérivés ayant les caractéristiques précitées. Des mar- ques du commerce de ces matrices comprennent le DOWEX 1 et l'IrDION A3. Les composés d'inclusion sont des composés qui établissent une relation hôte-composé emprisonné entre une solution aqueuse de la cyclodextrine et le composé d'inclusion. On connatt différents composés ayant diffé- rentes affinités pour les cyclodextrines constituant des composés emprisonnés dans la cyclodextrine hôte. L'affi- nité entre le composé d'inclusion et une cyclodextrine quelconque ne doit pas être si importante qu'elle empêche l'élution de la cyclodextrine de la matrice. Grèce à l'emploi de a - affinités, on a établi que l'ordre selon lequel les cyclodextrines sont éluées peut être ajusté et que cette affinité variable permet l'élu- tion successive des A-, y- et T-cycLodextrines. Les composés d'inclusion spécifiques comprennent par exemple des structures cycliques aromatiques ou aLi- phatiques ayant par exemple 5, 6, 7 ou 8 cha+nons, 26078 1 7 telles que le cyclohexane, Le cyclopentadiène, Le benzène, le norbornane, le camphre et le 1,5-cycloocta- diène; des structures cycliques aromatiques multiples, telles que le naphtalène, l'anthracène, le 1,2,3-benzo- triazole et le pyrène; ainsi que des ions minéraux, tels que chlorure et iodure; de plus, des composés, tels que l'acide benzo;que, l'acide pnitrobenzoîque, l'acide naphtoique et l'acide phénylacétique, convien- nert également bien. Ces composés d'inclusion peuvent etre modifiés par exempLe par introduc:ior. d'un groupe méthyLe ou éthyle en position ortho, méta ou para, par exerple des composés d'inclusion à cycle aromatique. On préfère qu'un composé d'inclusion utilisé Dour séparer l'ocyclodextrine des autres cyclodextrines se présente à la cyclocextrine avec un diamètre exté- rieur maximaL comparable au aiamètre de la cavité de lYx-cyclodextrine, c'est-à-dire environ 0,5 x 0,6 nm. Pour Les -cyclodextrines, on préfère que le composé d'incLusior se présente à la cyclodextrine avec un diamètre extérieur maximal comparable au diamètre de la cavité de La 3-cyclodextrine d'environ 0,7 à 0,8 nm. Pour Les 7-cyclodextrines, on préfère que le composé d'incluslor se présente à la cyclodextrine avec un diamètre extérieur maximal comparable au diamètre de la cavité de la T-cyclodextrine d'environ 0,9 à 1,0 nm. On a découvert que tes phénomènes d'inclusion sont à la fois chimiques et physiques. La position exacte du composé d'inclusion modifie l'affinité entre la cyclodextrine et le composé d'inclusion. Pour faire varier la position du composé d'inclusion, on fait varier l'angle de la liaison ainsi que la longueur entre le composé d'inclusion et la matrice. Par exemple, lorsqu'on utilise le-naphtylsulfonate de sodium, si le groupe naphtylsulfonate est lié à la matrice en la posi- tion un, le composé d'inclusior présente une affinité semblable pour la Pcyclodextrine et la T-cyclodextrine, cependant lorsque le groupe naphtylsulfonate est Lié à la matrice en la position deux, le composé d'inclusion présente une affinité plus forte pour la P-cyclodextrine que pour la T-cyclodextrine. La longueur de La liaison est exposée ci-après. Lors de l'union du composé d'inclusion à la matrice, on préfère q-ue le composé d'inclusion soit placé à une certaine distance de la surface réelle de la matrice afin que la relation hôte-composé emprisonné entre le composé d'inclusion et la cyclodextrine n'en soit pas gênée. On préfère que la distance soit environ égale à 4 à 12 atomes de carbone à simple Liaison unis en une cha+ne typique des composés carbonés alipnatiques saturés. Les meilleurs résultats ont été obtenus lorsque La distance est égale à environ 6 atomes de carbones. Cette distance permet au composé d'inclusion d'agir sans être gêné par la matrice. En termes d'unités métriques, cette distance est d'environ 0,6 à 1,8 nm, les meilleurs résultats étant obtenus à environ 0,9 nm. Des distances plus importantes peuvent être utilisées sans avantage apparent et au prix de l'inconvénient du recourbement de la chatne sur elle-même. Le composé de pontage utilisé pour unir le composé d'inclusion à la matrice peut être un composé organique quelconque capable de s'unir à la matrice et au composé d'inclusion. Généralement, ces composés de pontage sont des composés bifonctionnels aliphatiques ou aromatiques. Ces composés de pontage comprennent Le glycidoxypropyltriméthoxysilane, le glycidoxypropyl- diméthylchlorosilane, le glycidoxypropyltriéthoxysilane, la butyldiéthanolamine, la butyltriéthylamine et le 3-phénylpropyldime-Lchlorosilane. On préfère les composés aliphatiques et aromatiques qui sont bifonc- tionnels et forment une liaison covalente avec à la fois la matrice et le composé d'inclusion. La liaison réelle entre Le composé d'inclusion et le composé de pontage ou la matrice peut être soit ionique soit, de préférence, covalence, et on préfère 26078 i 7 plus particulièrement une liaison qui ne s'hydrolyse pas dans les solutions aqueuses. Toutes les liaisons qui ne s'hydrolysent pas dans les solutions aqueuses sont des liaisons covalentes, mais toutes les liaisons covalentes ne sont pas des liaisons qui ne s'hydrolysent pas dans les solutions aqueuses. La liaison entre le composé de pontage et la matrice est covalente. La liaison avec le composé d'inclusion doit être telle que le composé d'inclusion ne soit ni dissous ni élué pendant le procédé de l'invention, si bien qu'elle résiste aux conditions d'écoulement dynamique. Si la matrice doit être régénérée par suite d'une perte du composé d'inclu- sion, ceLa peut être facilement réalisé selon des modes opératoires standards. La chimie de formation de la matrice avec le composé d'inclusion qui lui est uni est bien connue et varie selon la matrice, le composé de pontage et le composé d'inclusion choisis. Un procédé préféré d'union d'un silane à une matrice est décrit dans le brevet US nr 4 539 399. Il est important, qu'après formation de la matrice avec le composé d'inclusion qui lui est uni, la matrice soit lavée pour éliminer tout excès de composé d'inclusion ou de composé de pontage. Tout composé d'inclusion ou de pontage fixé de façon lâche peut tendre à agir avec les cyclodextrines et empêcher la récupération et la séparation des cyclodextrines. On préfère laver à l'eau. On a établi que les compositions suivantes de matrice de composé d'inclusion et de composé de pontage conviennent particulièrement bien dans l'invention: silice, glycidoxypropyltrimétnoxysilane et composés d'inclusion de type naphtol, phénylpropanol et alcool benzylique; silice, butyldiéthanolamine et composés d'inclusion de type acide naphto que, acide phénylacéti- que et acide cinnamique; silice, butyltriéthylamine et composés d'inclusion de type acide naphtoique et acide 260781 7 phénylpropyLacétique. Pour faire passer la solution contenant La cyclodextrine à travers la matrice, on préfère placer La matrice dans un récipient qui l'immobilise et permet à La solution contenant la cycLodextrine de passer à travers La matrice. De façon typique, on utiLise une colonne. D'autres procédés appropriés comprennent les procédés à Lit fixe, à lit mobile ou à lit mobile simulé. Lorsqu'on utilise un composé d'inclusion qui est spécifique d'une des cyclodextrines, on préfère utiliser dans une série de séparations des matrices multiples ayant chacune un composé d'inclusion différent qui lui est uni. De façon typique, on utilise trois colonnes ayant chacune un garnissage différent spécifique d'une cyclodextrine oarticulière. Cela permet la séparation oDormale, ern particulier lorsqu'on opère à grande échel Le. La solution obtenue par traitement de l'amidon avec la CGT contient non seulement des cyclodextrines mais également des granules d'amidon n'ayant pas réagi, des dextrines, des sucres réducteurs et similaires, de même que des cyclodextrines ramifiées et des cyclodex- trines. Les solutions aqueuses qui contiennent des cycLodextrines comprennent une solution contenant tous les composés précités qui est obtenue par traitement d'une solution aqueuse d'amidon avec de la CGT pour former des cyclodextrines. On préfère, lorsque la solution de cyclodextrine contient des granules d'amidon n'ayant pas réagi et des dextrines plus grosse, eew-er par filtration ces molécules plus grosses; cependant, cela n'est pas indispensable. Le but de la filtration est d'améliorer l'écoulement de la solution aqueuse contenant les cyclo- aextrines. Plus les molécules en solution sont grosses, plus l'écoulement à travers la matrice est lent. De façon typique, les solutions contenant des 26078 17 cyclodextrines qui traversent la matrice à laquelle le composé d'inclusion a été uni ont déjà été débarassées de la 3-cyclodextrine. Généralement, la 3-cyclodextrine est éliminée par précipitation. La précipitation de la 13-cyclodextrine dans une solution contenant des cyclo- dextrines est bien décrite dans la littérature. De plus, la solution contenant des cyclodextri- nes peut être traitée avec une glucoamylase pour trans- former en totalité ou en majorité les molécules acycli- ques en glucose. IL peut être avantageux de séparer tout d'abord Les cyclodextrines de la solution en utilisant le pro- cédé et l'appareil des brevets US n 4 303 787, n 4 384 898 et n 4 418 144 précités puis d'utiliser l'invention pour séparer successivement les cyclodex- trines Les unes des autres. Le procédé de l'invention est mis en pratique à la pression et la température ambiantes, le pH de la solution étant de préférence dans une gamme neutre. Dans le cas d'un composé d'inclusion lié par covalence, on emploie la gamme totale des pH. Pour un composé d'inclusion à liaison ionique, on préfère que le pH soit dans la gamme de 5 à 7, les meilleurs résultats étart obtenus au voisinage de 5,5. La température peut être dans la gamme d'environ O à 100 C, la température ambiante étant préférée. Le chauffage au-dessus de la température ambiante dans le procédé présente certains avantages. La chaleur réduit généralement la stabilité du complexe hôte-composé emprisonné et tend à accro+tre la vitesse d'élution des cyclodextrines de la colonne. Pour les o- et T-cyclodex- trines, la température éLevée que l'on préfère est voisine de 60 C tandis que pour la 6-cyclodextrine elle se situe entre environ 80 et 100 C. On peut apporter de la chaleur de nombreuses façons. Par exemple, lorsqu'on utilise une colonne pour immobiliser la matrice, la colonne peut être munie d'une enveloppe à travers 1 0 LaqueLLe circuLe un miLieu de chauffage pour que Le procédé soit effectué à chaud. Sinon, on peut chauffer L'eau de lavage ou la liqueur mère elLe-même. Le passage de la solution à travers La matrice à une température supérieure à La température ambiante présente un certain avantage et, de façon typique, La solution, juste après le traitement avec la CGT, est encore chaude. Généralement, on utiLise de l'eau après l'addi- tion de la Liqueur mère de cycLodextrines à la colonne. IL est avantageux d'utiliser un méLange d'alcool et d'eau pour séparer la cyclodextrine du composé d'inclu- sion. On peut utiliser un solvant lipophile quelconque, tel qu'un aLcooL, et on utilise de préférence l'éthanol, car iL est dépourvu de toxicité. On obtient de bon résuLtats en éLuant avec un méLange de 95 % d'eau et 5 % d'aLcool éthylique. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à La lecture de la description qui suit faite en regard des dessins annexés dans lesquels: La figure 1 est un profiL d'élution d'une colonne garnie de gel de silice qui a un composé de pontage et une fonction amine quaternaire à laquelle un composé d'incLusion de type benzoate est lié; la figure 2 est un profil d'éLution d'une colonne garnie de gel de silice qui a un composé de pontage et une fonction amine quaternaire à laquelle un composé d'inclusion de type iodure est lié; la figure 3 est un profil d'élution d'une colonne garnie de gel de silice qui a un composé de pontage et une fc- -:- a-ine quaternaire à laquelle un composé d'inclusion de type acetate de phényle est lié; les figures 4 et 5 sont des profils d'élution de colonnes garnies de gel de silice ayant un composé de pontage et une fonction amine quaternaire à laquelle un composé d'inclusion de type 1- naphtylsulfonate est lié La figure 4 correspond à un débit de 1,0 ml/min tandis que la figure 5 correspond à un débit de 0,5 ml/rin; la figure 6 est un profil d'élution d'une colonne garnie de gel de silice qui a un composé de pontage et une fonction amine quaternaire à laquelle un composé d'inclusion de type 2-naphtylsulfonate est lié; la figure 7 est un profil d'élution d'une colonne garnie de gel de silice à laquelle un composé d'inclusion de type 3-phénylpropyle est lié; la figure 8 est un profil d'élution d'une colonne garnie d'une cellulcse régénérée hydrophile réticulée contenant 1,1 milliéquivalent/gramme ce groupes fonctionnels diéthylaminoéthyles (DEAE) INDION A3 à laquelle un composé d'inclusion de type 2-naphtyl- sulfonate est uni par liaison ionique; et la figure 9 est un profil d'élution d'une colonne garnie de résine DOWEX 1 x 4 (38 tm) à laquelle un compose d'inclusion de type 3-phénylpropylacétate -est lié. EXEMPLE 1 Cet exemple illustre la préparation d'une solu- tion contenant des cyclodextrines. A 40 g d'amidon de pomme de terre préhyarolysé, on ajoute une petite quantité d'eau froide pour former une suspension fluide. L'amidon provient de J.T. Baker Co., Philipsburg, New Jersey. On ajoute cette suspension à 400 ml d'eau bouillante et on agite pendant une heure. Après une heure, on ajoute à la solution 200 mg de chlo- rure de calcium hydraté avec 1 ml de cyclodextrine glycosyltransférase purifiée (100 000 unités, CGT) et on maintient la solution à 55 C pendant 48 heures. La CGT provient de Diagnostic Chemicals Limited. Après le traitement de ta suspension d'amidon avec la CGT, on prélève 1 ml de la solution obtenue et on l'analyse par chromatographie liquide haute pression qui révèle typiquement une conversion de 30 à 50 %/ en cyclodextrines avec une proportion de 4 à 7 % d'o-cyclo- dextrine, 5 à 9 % de T-cyclodextrine et 35 à 50 %' de 3-cycLodextrine. On refrocit ensuite La solution à environ 10 C et on l'y maintient pendant environ 4 heures pendant lesquelles la majorité de la ó-cyclodextrine précipite dans la solution. Après précipitation et élimination de la ócyclodextrine, on concentre la solution restante par réduction du volume de 50 % pour former une liqueur mère riche en a- et en T-cyclodextrines et ne contenant qu'une petite quantité de 3-cyclodextrine. Typiquement, on effectue la concentration par évaporation. On prépare ainsi une liqueur mère typique conte- nant les pourcentages pondéraux suivants des composants: TABLEAU I Composant % relatif au poids total de la liqueur o-cyclodextrine 18 ecyclodextrine 5 T-cyclodextrine 24 EXEMPLE 2 Cet exemple ilLustre la préparation d'une matrice à laquelle un composé d'inclusion est lié ainsi que le garnissage d'une colonne pour retenir la matrice. On prépare une suspension de 10 g de gel de silice en particules sphériques de 8,0 nm dans 60 ml de toluène. On ajoute à cette suspension 6,0 ml de 3-bromo- propyltrichlorosilane et on agite la suspension pendant minutes en la maintenant à 70 C. Ensuite, on ajoute ml de 3-(3-diéthyl)aminopropylamine et 0,6 ml d'eau puis on porte à -_'!ux pendant 2 heures. On refroidit le- mélange, on filtre,: ve d'abord avec du méthanol puis avec un mélange 1/1 d'eau et de méthanol et enfin avec du méthanol pur. On sèche ensuite la matrice à l'étuve. On retire la matrice de L'étuve et on la méLange avec de l'iodure de méthyle pour quaterniser les groupes amino. Enfin, on lave la matrice avec du méthanol. Cela 26078 i7 achève la fixation du composé de pontage à la matrice. On garnit ensuite avec la matrice une colonne typique de chromatographie liquide haute pression haute de 250 mm et ayant un diamètre intérieur de 4,6 mm. Pour lier le composé d'inclusion à la matrice, on rince la colonne avec du chlorure de sodium 0,5 M et on lave à l'eau. On équilibre ensuite la colonne avec une solu- tion 0,1 M de la forme cationique du composé d'inclu- sion. On prépare cinq coLonnes différentes avec cinq composés d'inclusion différents unis par liaison ionique à la matrice. Le tableau II cidessous indique la forme cationique du composé d'inclusion utilisé dans chaque colonne et le composé d'inclusion lié qui demeure après le stade d'équilibrage. On lave soigneusement chaque cotonne à l'eau pour éliminer tous les composés Libres afin d'obtenir un fond stable comme l'indique la mesure avec un réfractomètre. TABLEAU II Colonne Composé d'inclusion Composé d'inclusion na cationique lié (radical) 1 benzoate de sodium benzoate 2 iodure de sodium iodure 3 phénylacétate de sodium phénylacétate 4 1-naphtylsulfonate 1naphtylsulfonate de sodium 2-naphtyLsuLfonate 2-naphtylsulfonate de sodium Les résultats de chacune de ces colonnes longues de 250 mm et de 4,6 mm de diamètre intérieur sont pré- sentés dans les exemples suivants. EXEMPLE 3 Cet exemple utilise la colonne n0 1 de l'exem- ple 2 pour la séparation successive des cyclodextrines d'une solution les contenant. La solution contenant les cyclodextrines est une liqueur mère typique préparée par combinaison d'a-, D- et T-cyclodextrines essentiellement pures avec de l'amidon et de l'eau. L'amidon est de l'amidon de pomme de terre préhydroLysé vendu par J.T. Backer Co. On prépare La solution à partir ce 3,6 9 d'o-cycLodextrine, 3, 0 g de 3-cycLodextrine, 3,3 9 de T-cycLodextrine et 0,1 g d'amidon dans un Litre d'eau. On injecte 20 microlitres de Liqueur mère au sommet de La coLonne et on fait s'écouler à travers la colonne de l'eau désionisée à un débit de 1,0 mL/min pour éLuer Les cyclodextrines. Lors de l'élution de la colonne, on constate que l'amidon appara1t dans le volume mort. Ensuite, une bande limpide de T-cyclodextrine apparatt et est suivie d'une bande limpide d'acycLodextrine et enfin d'une bande Limpide de P-cyclodextrine. Donc, le benzoate ne présente presque pas d'affinité pour La T-cyclodextrine, une affinité modérée pour l'a-cyclodextrine et une affinité forte pour la 1cyclodextrine. La quantité de chaque cycLodextrine récupérée en fonction de La Quan- tité de chaque cyclodextrine ayant traversé la coLonne est illustrée cidessous dans Le tableau III. Le tableau III présente également Les conditions d'utilisa- tion de la colonne. TABLEAU III Gel de silice + benzoate Conditions de la colonne: Température ambiante Pression 41,4 bars pH 5,5 Cycloextrines ENTREE (g) Cyclodextrines SORTIE (g) 7,2 x 10-5 7,2 x 10-5 D3 6,0 x 10-5 6,0 x 10 -5 Yz 6,6 x 10-5 6,6 x 10-5 Amidon 2,0 x -6 2,0 x 10-6 La figure 1 est un profil d'élution représenta- tif d'une analyse chromatographique de l'effluent de la colonne n 1. Le pic 1 est celui de L'a-cyclodextrine, le pic 2 celui de la Pcyclodextrine et le pic 3 celui de la T-cyclodextrine. Le pic 4 est celui de l'amidon. La chromatographie est réalisée selon des techniques chromatographiques standards avec un système à pompe double Shimadzu, un réfractomètre Knauer et un injecteur Rheodyne. On utilise des a-, p- et T- cyclodextrines caractérisées pour étalonner le chromatographe avant L'anaLyse. Cela iLLustre La séparation successive des cyclodextrines. EXEMPLE 4 Cet exemple utilise la colonne n 2 de L'exem- ple 2 pour la séparation successive des cyclodextrines d'une solution les contenant. La solution contenant ces cyclodextrines est une liqueur mère typique préparée comme dans l'exemple 3 ci-dessus, cependant, on n'uti- lise pas d'amidon et on combine 1,0 g d'o-cyclodextrine à 4,8 g de 3-cyclodextrine et 4,0 g de T-cyclodextrine dans un litre d'eau. On injecte 20 microlitres de liqueur mère au sommet de la colonne, puis on ajoute de l'eau désionisée à un débit de 1,0 ml/min. On ooserve que La T-cyclodextrine apparaft juste après le volume mort et est suivie de la P-cycLodextrine et enfin de l'*-cyclodextrine. Donc, le composé d'inclu- sion de type iodure présente son activité maximale pour l'cxcyclodextrine, son activité la plus faible pour la T-cyclodextrine et une activité intermédiaire pour La 3-cyclodextrine. La quantité de chaque cyclodextrine récupérée en fonction de La quantité de chaque cyclodex- trine ayant traversé la colonne est illustrée ci-dessous dans le tableau IV. Le tableau IV illustre également Les conditions d'utilisation de la colonne. TABLEAU IV Gel de silice + iodure Conditions de la colonne: Température ambiante Pression 41,4 bars pH 5,5 Cyclodextrines ENTREE (g) Cyclodextrines SORTIE (y) ci 2,0 x 10-5 2,0 x 105 - 3f 8,6 x 105 8,6 x 10-5 T 8,0 x 10-5 8,0 x 10-5 On obtient donc une séparation successive des cyclodextrines. La figure 2 est un profil d'élution représenta- tif d'une analyse chromatographique de l'effluent de la colonne n 2. Le pic 1 est constitué d'c-cyclodextrine, le pic 2 de 9-cyclodextrine et le pic 3 de T-cyclodex- trine. On utilise dans cet exemple la même technique chromatographique que celle de l'exemple 3. EXEMPLE 5 Cet exemple utilise la colonne n 3 de l'exem- ple 2 pour la séparation successive des cyclodeytrines d'une solution Les contenant. La solution contenant les cyclodextrines est une liqueur mère typique préparée comme dans l'exemp!e 3 ci-dessus. La constitution oe la solution est la même que celle de l'exemple 4 ci-dessus. On injecte 20 microlitres de la liqueur mère au sommet de la colonne, puis on fait passer de l'eau désiornisée à *1,0 ml/min. La séparation successive des cyclodextrines par la colonne s'effectue dans l'ordre T, î et A. La 9-cyclodextrine sort la première de la colonne et est suivie de l'a- puis de la 3-. L'acétate de phényle présente une forte affinité pour la 3-cyclodextrine, une affinité faible pour la Tcyclodextrine et une affinité modérée pour l'a-cyclodextrine. La quantité de cyclodex- trines récupérées en fonction de la quantité de chaque cyclodextrine ayant traversé la colonne est illustrée dans le tableau V ci-dessous. Le tableau V illustre éga- lement les conditions d'utilisation de la colonne. TABLEAU V Gel de silice t acétate de phényLe Conditions de la colonne Température ambiante Pression 41,4 bars pH 5,5 Cyclode>trines ENTREE () Cyclodextrines SORTIE (g) 2,0 x 10-5 1,5 x 10-5 î8,6 x 105 8,6 x 105 T 8, 0 x 10-5 8,0 x 10-5 La figure 3 est un profil d'éLution représenta- tif d'une analyse chromatographique de l'effluent de la colonne n 3. Le pic 1 est constitué de L'u-cyclodex- trire, le pic 2 de La 3-cyclodextrine et le pic 3 de la T-cyclodextrine. La technique chromatographique utilisée dans cet exemple est la méme que celle de l'exemple 3 1 5 ci-cessus. Cela illustre la séparation successive des a-, - et T-cyc'odextrines. EXEMPLE 6 Cet exemple utilise La colonne n 4 de l'exem- pLe 2 pour,a séparation successive des cyclodextrines d'une solution les contenant. La solution contenant les cyclodextrines est une liqueur mère typique préparée cor-,me dans l'exemple 3 ci-dessus. La composition de la solution est identique à celle de l'exemple 5 ci-dessus. Dans cet exemp.e, on utilise deux débits et dans les deux cas on injecte 20 microlitres de liqueur mère au sommet de la colonne, puis on fait passer de l'eau désionisée à un débit de 1,0 ml/min ou de 0,5 ml/min. Dans les deux cas, au voisinage du volume mort, l'c-cyclodextrine appara't et est suivie d'une bande de -cyclodextrine et enfin d'une bande de T-cyclodextrin.e. Le 1-naphtylsulfonate présente une forte affinité pour la 1-cyclodextrine, une affinité faible pour l'x-cyclo- dextrine et une affinité modérée pour la -cyclodex- trine. Le tableau VI illustre les conditions d'utilisa- tion de la colonne ainsi que Les résultats. TABLEAU VI Gel de silice + 1-naphtyLsuLfonate Conditions de la coLonne: Température ambiante Pression 41,4 bars pH 5,5 Cyclodextrines ENTREE Cg) CycLodextrines SORTIE Cg) 1,0 ml/min 0,5 ml/min 2,0 x 10-5 1,5 x 10-5 2,0 x 10-5 8,6 x 10-5 8,6 x 10-5 8,6 x 10-5 Y 8,0 x 10-5 8,0 x 10 5 8,0 x 10-5 La figure 4 est un profil d'éLution représenta- tif d'une analyse chromatographique de l'effluent de la colonne n 4 au débit de 1,0 ml/min tandis que la figure 5 est un profil d'élution représentatif d'une analyse chromatographique au débit de 0,5 ml/min. Le pic 1 est constitué d'a-cyclodextrine, le pic 2 de 3-cycLodextrine et le pic 3 de T-cyclodextrine sur les figures 4 et 5. La technique chromatographique emplcyée dans cet exemple est la même que celle employée dans l'exemple 3 ci-dessus. Il appara+t clàirement qu'au débit plus faible de 0,5 ml/min de la figure 5, les pics individuels des diverses cyclodextrines sont plus étalés. Il faudrait tenir compte de ce fait dans une opération à plus grande échelle. Les figures 4 et 5 illustrent la séparation successive des a-, A- et T-cyclodextrines. EXEMPLE 7 Cet exemple utilise la colonne n 5 de l'exem- pIe 2 pour la sévi 4on successive des cyclodextrines d'une solution les contenant. La solution contenant les cyclodextrines est une liqueur mère typique préparée comme dans l'exemple 3 ci-dessus. Cependant, on n'uti- lise pas d'amidon et on mélange 0,6 g d'o-cyclodextrine, 4,4 g de 3cyclodextrine et 4,8 g de Tr-cyclodextrine dans un Litre d'eau. On injecte 20 microlitres de la liqueur mère au sommet de la colonne et on fait passer de L'eau désionisée à un débit de 1,0 mL/min. On observe à partir de la coLonne que L'o-cycLo- dextrine suit le volume mort et est ensuite suivie d'une bande de T-cyclodextrine et d'une bande de -cycLodex- trine. IL faudra noter dans cet exempLe que la T- et La 3-cyclodextrines ont permuté leurs positions dans l'ordre d'élution de l'exempLe 6 cidessus. CeLa est dû à L'orientation du naphtylsulfonate dans la colonne qui permet l'optimalisation de la -cyclodextrine dans la colonne. Dans la colonne n 4, le groupe naphtyle du composa d'inclusion est lié à la position 1, tanois que dans la colonne n 5, le groupe naphtyle est lié à la position 2. Donc, la position physique du composé d'inclusion joue un rôLe important dans l'ordre d1élu- tion des cyclodextrines. La quantité de chaque cyclodextrine récupérée en fonction de la quantité de chaque cyclodextrine ayant traversé la colonne n 5 est illustrée dans le tableau VII ci-dessous. Le tableau VII indique également les conditions d'utilisation de la colonne. TABLEAU VII Gel de silice + 2-naphtylsulfonate Conditions de la colonne: Température ambiante Pression 41,4 bars pH 5,5 CycLodextrines ENTREE (g) Cyclodextrines SORTIE (g) 1,2 x 10-5 1,2 x 10-5 i8,8 x 105 8,8 x 10-5 T 9, 6 x 10-5 9,6 x 10-5 La figure 6 est un profil d'éLution représenta- tif d'une analyse chromatographique de L'effluent de la colonne n 5. Le pic 1 est constitué d'c-cyclodextrine, le pic 2 de 1-cyclodextrine et le pic 3 de T-cyclodex- trine. La technique chromatographique utilisée dans cet exemple est la même que oele de l'exemple 3 ci-dessus. La figure 6 illustre la séparation successive des a-, p- et T-cyclodextrines. EXEMPLE 8 Cet exemple iLLustre La préparation d'une colonne dans laqueLle le composé d'inclusion est Lié par covalence à La matrice. On met en suspension 7 g de gel de silice (ayant une taille de 5 km) dans 100 mL de toluène puis-on porte à reflux pour éLiminer L'eau sous forme d'un azéotrope. On refroidit la suspension à 85 C et on ajoute à la sus- pension 1,0 ml de 3-phénylpropyldiméthylchlorosilane puis 1,0 ml de pyridine. On porte la température de la suspension à 95 C pendant une heure. On garnit une colonne mesurant 4,6 mm x 250 mm de la matrice obtenue de gel de silice avec le composé d'inclusion et on la soumet à un essai avec une liqueur mère typique contenant des quantités égales d'a-, A- et Tcyclodextrines. On injecte 20 microlitres de liqueur mère au sommet de La colonne et on fait passer de l'eau désionisée à un débit de 1,0 ml/min. L'a-cyclodextrine apparatt à proximité du volume mort et est suivie de la T-cyclodextrine et enfin de la 13-cyclodexi rine. La figure 7 est un profil d'élution représenta- tif d'une analyse chromatographique de l'effluent. Le pic 1 est constitué d'a-cyclodextrine, le pic 2 de P-cyclodextrine et le pic 3 de T-cyclodextrine. La tech- nique chromatographique employée dans cet exemple est la même que celle employée dans l'exemple 3 ci-dessus. On notera que le composé d'inclusion lié par covalence assure: -_con générale une meilleure sépara- tion que le compose CLLul ' à liaison ionique. EXEMPLE 9 Cet exemple illustre l'utilisation du 2-naphtyl--- sulfonate uni par liaison ionique à une matrice de cellulose INDION A3. L'INDION A3 est une matrice du commerce vendue par Phoenix Chemicals Ltd. Le composé d'inclusion est le même que celui utilisé dans la coLonne n 5 de l'exempLe 7 ci-dessus. On garnit de La matrice à LaqueLLe Le composé d'inclusion est uni une colonne de 30 mm de diamètre et de 500 mm de Longueur. On charge la colonne garnie de 20 mL de liqueur mère puis on fait passer de l'eau désionisée à un débit de 20 ml/min. L'éLution de la colonne montre que l'a-cyclodex- trine est éluée en premier et est suivie de la T-cyclo- dextrine et enfin de la 13-cyclodextrine. Le tableau VIII ci-dessous présente les conditions et les résultats de trois opérations effectuées avec cette colonne. Toutes les opérations sont identiques, à L'exception de l'opé- ration n 3 dans laquelle on utilise 40 ml de Liqueur mère au lieu de 20 mi. TABLEAU VIII Cellulose + 2-napntylsulfonate Conc4ticns de la colonne: Température ambiante Pression 0,69 bar pH 5,5 joLurme Temos de CD* récupérée Pureté d'élution (mL) rétention (g (C:) (min) Opération n 1 î. 433 21 3,1 100 3 400 169 1,5 100 T 759 38 4,2 100 Opération n 2 î. 412 21 3,0 100 3 380 169 1,4 100 T 759 38 4,2 100 Opération n 3 î. 412 21 6,3 100 3 200 169 3,2 100 T 697 38 9,0 100 CD = cyclodextrine Cet exemple illustre non seulement la séparation mais égaLement La possibilité de purifier les cycLode>- tri nes. La figure 8 est un profiL d'éLution typique représentatif d'une analyse chromatographique correspon- dant aux trois opérations effectuées sur cette coLonne. Le pic 1 est constitué d'a-cyclodextrine, Le pic 2 de 3-cycLodextrine et le pic 3 de T-cycLodextrine. La tech- nique cr" -atographique employée dans cet exempLe est La même que ceLle employée dans L'exemple 3 ci-dessus. On peut voir que la T-cyclodextrine est retenue pendant presque 3 heures. Ce temps oe rétention peut étre réduit par chauffage de la colonne ou par addition d'un solvant, tel qu'une solution aqueuse à 5 %' d'étha- nol, pour réduire l'affinité entre la T-cyclodextrine et le composé d'inclusion. EXEMPLE 10 Cet exemple illustre l'emploi d'acide 3-phényl- prooylacétique lié par covalence à une matrice de DOWEX 1, 4. On garnit de la matrice à laquelle le composé d'inclusion est uni une colonne de 30 mm de diamètre intérieur et de 500 mm de longueur. On charge la colonne garnie d'une liqueur mère contenant 16,8 % en poids d'c-cyclodextrine, 7, 0 %/ en poids de i-cyclodextrine et 21,5. en poids de r-cyclodextrine. On injecte la charge dans la colonne. On fait suivre la charge d'un passage d'eau désionisée à un débit de 20 ml/min. L'éLution de la colonne montre que l'a-cyclodex- trine est éluée en premier et est suivie de la T-cyclo- dextrine suivie elle-même de la e-cyclodextrine. Le tableau IX prése-.es conditions et résultats de cet essai. TABLEAU!X DOW-vEX x 4 + 3-phénytpropyLacétate Conditions ce ra colonne T:-érature amniante Pression 0,69 ba- ph 5,5 Volume Temps de CC récupérée Pureté d'éLution (mL' rétention (min) (g) (_) (X 2200 8,5 3,1 100 0, 6 00O 300,0 1,0 100 -r 600 30,0 4,3 00 Le DOWEX i y 4 est une résine échangeuse a'ionr, faite c'une matrice ae polystyréne à laqueLLe est lié ou triréthylDer, 2 ar, !oriur. Le paLysty'rre est ret cu 4. a figure 9 est un profiL d'éLution rep-éserta- zif c'ure aayyse chroratograpnique de cet essai. Le p;c q es: constitué d'u-cycLocextrine, Le pic 2 ce :?-cycLocextrine et Le p;c 3 ee T-cycLocextr;ne. La tec-- r que ch-omatocraphiue empLcyée aans cet exeimpLe est s a me-e cue ce..e erîzLoyée dans l'exempLe 3 ci-dessus. Comme le montre Le tableau IX, la ^-cycLocex- trine est re:e'ue pendant 5 heures. Pour réduire ce 2C 2 emps ae rétention important, on peut utiliser de la chaLeur ou un soLvant, tel qu'un alcool. Biern entenau, diverses modifications peuvent etre apportées par l'homme de l'art aux dispositifs o. procédés qui viennent d'etre décrits uniquement a rt:re 2 d'exermpLes ncn. imi:tat+:s sans scrtî - d. caare ce L'invention. PEVENDICATIONS 1. Procéce pour la séparation successive des cyclodextrines d'une solution contenant de-s cyclodextri- nes, caractérisé en ce qu'il consiste à faire passer.'la solution contenant les cyclodextrines à travers une matrice à laquelle un composé d'inclusion a été uni et à éluer successivement lesdites cyclodextrines. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que Ledit composé d'inclusion est placé à une dis- tance d'environ 0,6 à 1,8 nm de la surface de la matrice. 3. Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce qu'il comprend de plus le stade de chauffage de ladite solution contenant les cyclodextrines avant son passage à travers ladite matrice. 4. Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce qu'il comprend de plus le stade de chauffage de ladite matrice et de maintien de ladite matrice à L'état chauffé pendant le passage de ladite solution de cyclodextrines à travers ladite matrice. 5. Procédé selon la revendication 3, caracté- risé en ce que ladite solution est chauffée à une tempé- rature supérieure à environ 60 C. 6. Procédé selon la revendication 4, caracté- risé en ce que ladite matrice est chauffée à une tempé- rature supérieure à environ 60 C. 7. Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que la solution contenant des cyclodextrines est une solutic;tueuse. 8. Pro- - la revendication 7, caracté- risé en ce qu'on ajoute de l'eau à ladite matrice après ladite solution de cyclodextrines. 9. Procédé selon la revendication 8, caracté- risé en ce que ladite eau contient un alcool. 10. Matière pour la séparation successive des cyclodextrines d'une solution, caractérisée en ce qu'elle comprend une matrice et un composé d'inclusio- uni à ladite matrice. 11. Matière selon la revendication 10, caracté- risée en ce qu'elle comprend de pus un composé de pontage, ledit composé de pontage formant la liaison entre ladite matrice et ledit composé d'inclusion. 12. Matière selon la revendication 11, caracté- risé en ce que la liaison entre ledit composé de pontage et ladite matrice est covalente et la liaison entre ledit composé d'inclusion et ledit composé de pontage est covalente. 13. Matiere selon la revendication 11, caracté- risée en ce que ledit composé de pontage place ledit composé d'inclusion à une distance d'environ 0,6 à 1,2 nn de ladite matrice. 14. Matière selon la revendication 13, caracté- risee en ce que ledit composé d'inclusion est placé à environ 0,9 nm de ladite matrice. 15. Matière selon la revendication 11, caracté- risée en ce cue Le composé d'inclusion est choisi dans le groupe constitué par les composés cyclisés aromati- ques ou aliphatiques et les ions minéraux. 16. Matière selon la revendication 11, caracté- risée en ce que la matrice est choisie dans le groupe constitué par les silicates, les celluloses, les gels de polyacrylamide, les perles de styrène-divinylbenzène, les perles de polyacrylate et les perles de polystyrène. 17. Matière pour l'élution successive des-cyclo- dextrines d'une solution aqueuse contenant des cyclodex- trines, ladite matière étant caractérisée en ce qu'elle comprend une matrice, un composé de pontage et un composé d'inclusion, cette matière étant choisie dans le groupe constitué par: silice, glycidoxypropyltriméthoxysilane, naphtol; silice, glycidoxypropyltriméthoxysilane, phénylpropanol; silice, glycidoxypropyltriméthoxysilane, alcool benzylique; siLice, butyldiéthanolamine, acide-naphtoique; silice, butyLdiét anolamine, acide phénylacétique; silice, butyldiéthanolamine, acide cinnamique; silice, butyltriéthylamine, acide naphtoîque; silice, butyltriéthylamine, acide phénylpropylacétique. 1 0