FR 2604526 A1 19880401 FR 8613782 A 19860930 PROCEDE ET DISPOSITIF DE DOSAGE DE SUBSTANCES D'INTERET CLINIQUE REACTIVES IMMUNOLOGIQUEMENT. La présente invention concerne un procédé de dosage de substances d'intérêt clinique réactives immunologi- quement. ELle concerne également un dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé. Par "substances réactives immunologiquement", on entend principalement tous les antigènes (incluant les haptènes), et les anticorps (monoclonaux ou polyclonaux) obtenus par fusion cellulaire, ou immunisation naturelle ou provoquée. Par "substances d'intérêt clinique réactives immu- nologiquement", on entend principalement toutes les mo- lécules antigéniques ou anticorps dont le dosage, dans un échantillon biologique d'origine humaine ou animale, - peut présenter un intérêt dans le diagnostic médical, la recherche clinique ou le suivi d'un processus pathologi- que, ou d'une thérapeutique mise en oeuvre. Le phénomène immunologique exploité dans ces procé- dés de dosage immunologique est représenté dans la figu- re 1. Les procédés de dosage les plus couramment utilisés basés sur l'exploitation de la courbe de la figure 1 sont: - l'immuno-diffusion radiale - la radio-immunologie, l'immuno-enzymologie, 1 'immunofluorescence - la néphélémétrie, -d'autre part, depuis quelques années, quelques essais de versions quantitatives du"latex immuno- -2- essai,' à savoir l'agglutination de microsphères synthétiques, ont été décrits. Jusque là, ces techniques largement employées et depuis long- temps (SINGER J.M., and PLOTZ C.M., The Latex fi- xation Test, American Journal of Medecine 21,888 (1 9 5 6)), à cause de leur simplicité et de leur faible coût ne présentaient qu'un aspect qualita- tif (lame) ou semi-quantitatif (cupule). Les for- mes qualitatives et semi-quantitatives (lame- carte-cupule) du latex immuno-essais restent d'ailleurs, à l'heure actuelle, très employées dans le diagnostic clinique, et font l'objet de nombreux brevets et publications, en particulier dans le domaine de la virologie et microbiologie (KHABBAZ R.F.,H.C. STANDFORD and ColI. 1985, Mea- surement of amikacin in serum by a Latex aggluti- nation inhibition test,Journal of Clinical Micro- biology, 22: 699-701).Dans ces techniques de tri ou de dépistage, l'antigène ou l'anticorps est fixé sur des microsphères synthétiques et l'absence ou la présence d'agglutination de l'antigène ou de l'anticorps correspondant est appréciée en tube, ou en cupule de manière visuelle ou turbidimétrique. Les quelques essais de latex immuno-essais quanti- tatifs proposés dans la littérature (par exemple, RIPOLL J.P., ROCH A.M., QUASH G.A. and J.GRANGE,1980,Journal of ImmunologicalMethods 33,159-173) présentent essentiellement trois phases: Phase I: phase de fixation de l'antigène ou de l'anticorps sur une microsphère de polymère synthétique de taille comprise entre 0,01 micromètre et 5 micromè- tres. La fixation est réalisée par tout moyen connu, identique à ceux décrits dans les techniques sur lame, (parexemple brevet américain US - A - 4,217,338). -3- Phase II: phase d'agglutination immunh,logiqu; des microsphères synthétiques porteuses de l'antigène ou de l'anticorps. Cette phase II du procédé,à savoir l'agglu- tination immunologique des microsphères synthétiques, doit tendre vers deux buts: la réduction maximum de l'agglutination non sp,- cifique des particules; par agglutination non spécifique, on entend l'agglutination des parti- cules due à des interactions faibles(du type liaison hydrogène, ionique, ou Van der Waals),entre les microspheres ou les protéines fixées sur cei- les-ci, l'augmentation maximum de l'agglutination spéci- fique (immunologique) des particules. Au cours de oette phase, des moyens essentiellement chimiques ou blochimiques sont mis en oeuvre pour stabiliser les particules, afin de minimiser l 'agglutination non spécifique. Pendant cette phase, des moyens sont également mis en oeuvre afin d'augmenter l'agglutination spécifique des particules, et donc la précision du dosage. Pour réduire l'agglutination non spécifique des particules, le brevet américain US-A-4,329,152 propose de les stabiliser par fixation d'albumine bovine rendue électro-négative à un pH sensiblement égal à 10. Le pH très basique,imposé de la sorte au réactif et aux gammes étalon est incompatible avec la survie des protéines, et en fait un réactif difficilement utilisable. D'autre part, la fiabilité du procédé en est réduite, car les solutions tampons à des pH si basiques sont très instables. D'autre part, l'albumine bovine fixée par liaison hydrophobe se détache progressivement des parti- cules à pH 10, et perd progressivement sa capacité de stabilisation. - 4 - Les agents chaotropiques utilisés quelquefois pour réduire l'agglutination non spécifique des particules présentent malheu- reusement l 'inconvénient d'affaiblir ou de rompre les liaisons antigènesanticorps. D'autres procédés de stabilisation très compliqués et inutilisables dans un réactif industriel, mettent en jeu des mélanges de particules légères et lourdes, et des centrifugations. Pour favoriser l'agglutination spécifique des par- ticules, c'est-à-dire l'agglutination immunologique, les procédés décrits utilisent une agitation traditionnelle, thermostatée dans un bain marie à 37tou 40 C,pendant des durées variant de 1/2 heure à 1 heure. De telles durées d'incubation à 37 C, outre qu'elles favorisent l'agglu- tlnatlon non specifique indésirable des particules, imposent un chronométrage rigoureux et fastidieux dans l'introduc- tion initiale du réactif dans chaque tube de la série, et dans le processus d'arrêt de la réaction de la série de tubes. L'augmentation de l'agglutination spécifique (immu- nologique desparticules), est quelquefois pratiquée en ajoutant, dans le milieu réactionnel, des additifs comme par exemple, de la dextrose connue sous la marque com- merciale "Dextran"' ou du polyéthylène glycol. L'inconvé- nient de ces substances est qu'elles sont souvent large- ment hydrophobes, et qu'elles se fixent donc sur les fragments Fc des anticorps fixés sur les microparticu- les, fragments eux-mêmes très hydrophobes, entraînant donc une agglutination non immunologique des particules, et induisant ainsi des interférences, et par la même des faux positifs aux réactions. C'est l'un des buts de la présente invention de supprimer l'agglutination non spécifique des particules, -5 et d'augmenter simultanément l'agglutination immunologi- que spécifique des particules, sans présenter tous les inconvénients décrits ci-dessus, et de surcroît, en diminuant considérablement la durée de l'opération. Phase III: phase de lecture du résultat. Actuellement, les techniques de lecture du résultat de l'agglutination dans les latex-immunoessais quanti- tatifs sont: 10. le comptage de particules l'opacimétrie, encore appelée turbidimétrie (prati- quée quelquefois dans le visible ou l'infra-rouge, le plus souvent dans le proche infra-rouge); la néphélémétrie laser, 15. l'analyse centrifuge. La néphélémétrie laser mesure la lumière diffusée par les agregats de particules de latex.Cette technique, décrite par exemple dans l'article suivant, GRANGE J., ROCH A.M., and G.A. QUASH, 1977, Journal of Immunologlcal Methods,18,326-375,présente l'inconvénient de nécessiter un appareillage de lecture coûteux et sophistiqué. Le comptage de particules, décrit par exemple dans l'article suivant, MAGNUSSON C.G., MASSON P.L. Journal of Allergy Clin. and ImmunoL, 70:326, 1982, nécessite également un appareillage complexe et coûteux, à la por- tée de peu de laboratoires. L'opacimétrie dans le visible, également dénommée turbidimétrie dans le visible,mesure la lumière trans- mise par la suspension de particules, c'est-à-dire la lumière qui n'est ni absorbée par les particules, ni diffusée par celles-ci. L'opacimétrie ou turbidimétrie des latex immuno-essais,qualitatifs ou quantitatifs,doit être pratiquée à une longueur d'onde assez proche de la -6- taille des particules. La validité de la mesure turbidimétrique impose des suspensions très diluées, afin de pouvoir visualiser l'effet écran souhaité et, comme il est indi- qué dans le Certificat d'Addition N 78 28250 du brevet français NO 77 25049, afin de minimiser l'absorption de lumière par les particules. Les mesures turbidimétriques (ou opacimétriques) dans le visible des latex immuno-essais décrites dans la littérature (exemple: BERNARD A.M., LAUWERYS R.R.,1982 Clinica Chemica Acta 119, 335-339) utilisent, selon la taille de la particule, différentes longueurs d'ondes du visible, par exemple 360, 400, 450 et beaucoup plus généralement entre 600 et 750 nanomètres. La précision des résultats turbidimétrique est médiocre, car les suspensions de particules doivent être très diluées, afin, comme on l'a dit, d'obtenir les variations d'effet-écran souhaitées, et afin de minimiser l'absorption des latex. D'ailleurs, il faut généralement dans ces techniques, pour augmenter la précision du résultat, utiliser des cuves de lecture dont le chemin optique est important, de l'ordre de deux à quatre centimètres. Afin d'utiliser des suspensions de latex plus con- centrées, et d'augmenter ainsi la précision des dosages, et afin de n'être pas gêné par l'absorption des latex dans le visible ou dans l'ultra-violet, le brevet fran- çais FR-A-77.25 049 et son certificat d'addition FR-A- 2 417 108, préconisent, pour la lecture des particules, l'opacimétrie infra-rouge. En effet,les latex n'absorbent plus la lumière dans l'infrarouge. L'inconvénient de cette technique est d'imposer un appareillage coûteux et sophistiqué pour la lecture opacimétrique infra-rouge. -7- C'est un autre but de la présente invention de pro- poser un procédé de lecture simple et nouveau du résul- tat de l'agglutination spécifique (immunologique) des microparticules. Le but essentiel de la présente invention est donc de remédier aux nombreux inconvénients (des phases II et III) soulignés précédemment, par la mise en oeuvre d'un procédé et d'un appareillage d'agglutination simple et nouveau, et par la mise en oeuvre d'un procédé de lecture du résultat également simple et nouveau, faisant ainsi de ce type de dosage un procédé très simple de mise en oeuvre, très rapide et à la portée de n'importe quel laboratoire. Le procédé selon l'invention de dosage de substan- ces d'intérêt clinique réactives immunologiquement est donc du type dans lequel: - on greffe préalablement une substance active immunologiquement, jouant le rôle de réactif doseur sur des microparticules; - on agglutine les dites microparticules par la substance d'intérêt clinique réactive immunologiquement; - on mesure par lecture le résultat issu de la réaction d'agglutination, que l'on compare à une gamme étalon. Le procédé de dosage selon l'invention se caracté- rise: - en ce que la phase d'agglutination s'effectue en soumettant lesdites microparticules greffées à un mouvement périodique de fréquence comprise entre 4 et 40 Hertz, et de préférence 20 Hertz, et d'amplitude variant de quelques millimètres à quelques centimètres, de pré- férence de l'ordre de 4 millimètres; en effet, on a -- 8-- constaté que si la fréquence était inférieure à 4 Hertz, cela diminuait l'intérêt de la méthode du fait que l'on augmente la durée de la phase d'agglutination afin d'obtenir un résultat utilisable, et du fait que l'effet recherché sur l'agglutination non spécifique devient médiocre; par contre, si la fréquence est supérieure à Hertz, on provoque la rupture des aggrégats (Immuns complexes) formes par les microparticules aggluti- nées; - en ce que la phase de lecture du résultat s'ef- fectue de la manière suivante: tout d'abord, on détermine, en en faisant le spectre d'absorption ultra-violet-visible, le maximum d'absorption "moléculaire" de la - lumière ultra-violet-visible, d'une suspen- sion aqueuse de m i c r o p a r t i c u 1 e s non agglutinées (monomères), la longueur d'on- de correspondant au dit maximum d'absorption étant appelée X max; 20. puis on procède, après la réaction d'agglu- tination immunologique,et après une dilution appropriée, à la lecture du résultat par spectrophotométrie d'absorption ultra-violet visible, en se plaçant au voisinage de la dite longueur d'onde t max précédemment determinée. Comme i 1 a p p a r a i td a n s 1 a description qui précède,dans la phase d'agglutination (phase II du procédé), afin de remédier à tous les inconvénients des procédés chimiques décrits cidessus visant à diminuer l'agglutination non spécifique des particules, ou aug- menter l'agglutination immunologique de celles-ci, le moyen d'agglutination mis en oeuvre selon l'invention utilise un procédé mécanique qui atteint simultané- ment ces deux buts. _ 9 - mécanique Ce procédélest basé sur l'observation que l'agglu- tination non spécifique, qui est liée à des interactions faibles entre les particules (liaisons de type ionique, hydrogène, Van der Waals) est rendue impossible ou est fortement inhibée par un mouvement périodique imprimé à celles-ci, de très faible amplitude et de très grande fréquence, quelle que soit la trajectoire du mouvement périodique ( par exemple et commodément rectiligne, circulaire ou ovalisée). On a également montré qu'un tel procédé favorise notablement l'agglutination spécifique (immunologique) des microparticules porteuses de l'anti- gène ou de l'anticorps, en présence de l'antigène ou de l'anticorps correspondant, et donc permet une réaction spécifique rapide et effectuée de surcroit à température ambiante. Concernant la phase de lecture du résultat (Phase III du procédé), il est surprenant de pouvoir procéder, notamment lorsque les microparticules sont des latex,à cette phase de lecture en utilisant l'absorption ultraviolet-visible des particules de latex,étant donné que le certificat d'addition précédemment cité FR-A- 2 417 108 décrit ce phénomène comme un inconvénient majeur. C'est pourtant bien, dans le procédé de lecture selon l'invention, la véritable absorption de la lumière ultra-violet-visible par les particules ellesmêmes qui est exploitée,et cela constitue un fait nouveau.En effet les méthodes turbidimétriques (opacimétriques) ne mesu- rent qu'une "absorption apparente" de la suspension des particules, c'est à dire, en réalité, un effet écran, ou encore, la lumière transmise par la suspension de parti- cules, c'est à dire, justement la lumière qui n'est pas absorbée par les particules. En effet, on a observé et c'est l'une des caracté- ristiques de l'invention, qu'une microparticule ca- pable d'absorber la lumière ultra-violet - visible, - 10 - d o n t 1 a t a i 1 1 e p e u t varier entre 0,01 et 5 micromètres de polymère synthétique présente, et ce quelles que soient sa taille et sa nature chimique (/Dar exemple; polystyrene, polyvinyl-toluène, acrylonitrile, styrène- butadiène, copolymères acrylonitrile - acide acrylique, ester-acrylique,polyvinyl-butadiène),un maximum caracté- ristique d'absorption de lumière ultra-violet-visible avec un coefficient d'extinction qui dépend de la longueur d'onde. De plus, on a montré, et cette observa- tion est utiliséedans le procédé de lecture selon l'in- vention, que si on effectue une mesure d'une suspension aqueuse de ces microparticules non agglutinées, par spectrophotométrie d'absorption à la longueur d'onde A max correspondant au maximum d'absorption de lumière ultra-violet-visible des microparticules non agglutinées ( A max étant caractéristique d'une microparticule don- née), le résultat n'est pas du tout,ou très faiblement influencé par la présence dans le milieu d'agrégats (ou agglutinats) de ces mêmes microparticules car les agrégats de ces microparticules, quelque soit leur taille, n'absorbent plus la lumière ultra-violet-visible à ce à max, leurs maxima d'absorption étant très éloignés du A max défini précédemment. D'autre part,on a montré qu'une mesure par spectro- photométrie d'absorption ultra-violet-visible d'une sus- pension aqueuse des dites microparticules non aggluti- nées (monomères) obéit à la loi de Beer-Lambert, et cela même pour des concentrations en particules très élevées, ce qui en fait un net avantage par rapport au principe des mesures turbidimétriques, qui impose des suspensions très diluées. Avantageusement, en pratique: - la trajectoire du mouvement périodique peut être - 1l - de toute nature, mais de préférence circulaire, rectili- gne, ou ovalisée; - la phase d'agglutination s'effectue à température ambiante - la durée du mouvement périodique imposée aux mi- croparticules, durant la phase d'agglutination, est fonction de la fréquence de la vibration de la trajectoire et de l'am- plitude du mouvement.Elle est avantageusement de 10 minutes pour une fréquence de 20 Hertz et un mouvement circulai- re périodique de 4 millimètres de diamètre; - les microparticules, aptes à la lecture spectro- photométriques d'absorption ultra-violet-visible, sont constituées de matériaux naturels ou synthétiques,de toute nature absorbante, notamment de polystyrène, polyvinyl- toluène, acrylonitrile, styrène-butadiène, copolymères acrylonitrile - acide acrylique, ester acrylique, poly- vinylbutadiène, et de préférence de polystyrène; - les microparticules sont de forme quelconque mais de préférence sous forme de microsphères; - le diamètre des microsphères naturelles ou syn- thétiques est compris entre 0,01 et 5 micromètres, et de préférence voisin de 0,8 micromètre, - les microparticules sont constituées d'un matériau absorbant mais non coloré; - les microparticules dasorbantes sont colorées, la lecture du résultat par spectrophotométrie d'absorption ultra-violet-visible étant effectuée soit à la longueur d'onde correspondant à l'absorption maximum de la matiè- re de la particule non agglutinée (N max),soit à la lon- gueur d'onde correspondant à l'absorption maximum de la couleur dela particule considérée. L'invention concerne également un dispositif pour la mise en oeuvre du procédé. Ce dispositif est carac- térisé en ce qu'il comporte: - un moyen, destiné à être solidarisé à un support, dont le but est de recevoir une pluralité de tubes élé- - 12 - mentaires parallèles, et apte à imposer audit support un mouvement périodique de fréquence comprise entre 4 et 40 Hertz et d'amplitude variant de quelques millimètres à quelques centimètres, - un boitier divisé en trois compartiments respec- tivement: un premier compartiment destiné à recevoir une première série de tubes renfermant au moins une gamme étalon lyophilisée de la substance à doser, un deuxième compartiment destiné à recevoir une seconde série de tubes renfermant une substance active immunologiquement et jouant le rôle de doseur, greffée sur des micro- particules, la suspension appelée "réactif", étant en phase aqueuse prête à l'emploi, un troisième compartiment destiné à recevoir une troisième série de tubes renfermant un échantillon lyophilisé de la solution de dilution de la gamme étalon, ledit boitier comportant en outre, au moins un flacon de liquide de dilution. Avantageusement, en pratique, le moyen apte à impo- ser au support des tubes élémentaires parallèles est constitué d'un moteur rotatif actionnant une came, pro- voquant un mouvement périodique, de haute fréquence et de faible amplitude, de trajectoire rectiligne, circulaire, ou ovalisée dudit support. La manière dont l'invention peut être réalisée et les avantages qui en découlent ressortiront mieux de l'exemple de réalisation qui suit, donné à titre indica- tif et non limitatif, à l'appui des figures annexées. - 13 - La figure 1 est un diagramme représentatif du phé- nomène immunologique exploité. La figure 2 est un diagramme représentatif du spec- tre d'absorption ultra-violet-visible d'une suspension aqueuse de microsphères (non agglutinées) de polystyrène (non coloré) de 0,8 micromètre de diamètre. La figure 3 est un diagramme représentatif des spectres d'absorption ultra-violet-visible de microsphè- anti orps res de polystyrene Ttnion coloré) de 0,8 micromètre de diamètre non agglutinées (courbe I), et agglutinées par des concentrations croissantes de 50 nanogrammes/milli- litres (courbe II), 100 nanogrammes/millilitres (courbe III),500 nanogrammes/millilitres (courbe IV) et 1 micro- gramme/ millilitres (courbe V) de l'antigène correspondant. La figure 4 est un diagramme représentatif d'un do- sage d'Immuno-gammaglobulines G humaines par le procédé selon l'invention. La figure 5 est une vue du boitier compartimenté relatif au procédé de mise en oeuvre de l'invention. L'exemple qui suit correspond au dosage d'antigènes au moyen d'anticorps greffés sur des microsphères. Il est bien entendu que l'on pourrait tout aussi bien pro- céder au dosage d'anticorps au moyen d'antigènes, en suivant le même processus mais en remplaçant les antigè- nes par les anticorps et réciproquement. Avant le dosage proprement dit, on procède tout d'abord au greffage des anticorps sur des microsphères synthétiques calibrées, dénommées également latex. Ceux- ci sont réalisés par exemple en polystyrène, polyvinyl- toluène, acrylonitrile, styrène-butadiène, copolymère acrylonitrile-acide acrylique, ester acrylique, polyvi- nyl butadiène, etc.Les particules de latex K 140, K 109, K 610, i 512, v 513, % 480, ' 502 (-COOH) ou 1169, S 181 - 14 - (-CONH2) vendus sous ces dénominations commerciales par Rhône-Poulenc, conviennent par exemple très bien au procédé. Le greffage des anticorps sur les microsphères syn- thétiques s'effectue de manière connue, c'est-àdire par fixation ionique, hydrophobe ou covalente. Lorsque l'on fait appel à des accrochages de type ionique ou hydrophobe d'anticorps sur des microsphères de latex, ces accrochages qui se font de manière connue par simple contact de la protéine et du support, condui- sent à des phénomènes de détachement (également dénommés relargages) des protéines du support. L'une des raisons des phénomènes de relargage est qu'il existe des échan- ges permanents entre la population d'anticorps du type immunogammaglobulines G ainsi fixée et la population desdites immunogammaglobulines G fréquemment présente dans l'échantillon à analyser. Avantageusement, les méthodes de fixation covalente sont plus fiables et préférables dans ce type de procédé de dosage immunologique. Les méthodes de fixation cova- lente d'anticorps ou d'antigène sur des microsphères synthétiques,ou latex, sont bien connues, de sorte qu'il n'y a pas lieu de les décrire ici plus en détail. * Dans le procédé selon l'invention, lorsque l'on met en jeu une fixation du type covalente, on fait appel avantageusement à un procédé de fixation qui n'a jamais été décrit dans ce type d'application et qui fournit de bons résultats. Selon ce procédé de couplage, les radicaux fonc- tionnels présents sur les microsphères et mobilisés sont principalement les suivants: COOH - CONH2, -CONH - NH2, -COOCH3. - 15- Ces radicaux sont transformés en acyl-azotures (CON3) par le procédé qui va être décrit, l'azoture réa- gissant avec des radicaux -NH2,-SH ou -OH des molécules biologiques (antigènes ou anticorps) que l'on veut greffer. Par exemple, les latex Y169 et 502 sont carboxyméthylés au méthano>acide,puis trai- tés à l'hydrazine en solution,puis aux vapeurs de nitri- te-acide de sodium dans des conditions douces, avant d'être greffés dans un rapport approprié avec un mélange poly-L-lysine-anticorps. Exemple: Greffage d'anticorps anti-immuno-gammaglobulines G humaines, et anti-béta 2 micro-globuline humaine sur microsphères de polystyrène de diamètre respectif 0,8 et 0,85 micromètre. Ce greffage se déroule suivant différentes phases résumées ci-dessous: méthylation des groupements carboxylés de latex: l'estérification des carboxyles libres des latex s'effectue dans un bain de méthanol acidifié, trois jours minimum, dix jours maximum,le plateau de saturation se trouvant en général à une moyen- ne de cinq jours; - rinçage aqueux énergique - traitement des latex carboxyméthylés à l'hydrazi- ne pendant 1 à 15 heures avec agitation à 20 C, - rinçage aqueux énergique à 0 C, - 16 - - traitement aux vapeurs de nitrite de sodium aci- difié par de l'acide chlorhydrique; les consti- tuants du mélange et le mélange étant réalisés extemporanément, et la réaction étant effectuée à 0 C; - rinçage énergique avec tampon de couplage, - greffage d u m é 1 a n g e a n t i c o r p s - pol y - L - 1 y s i n e; 1 a poly - L-lysine ainsi couplée au latex- anticorps a un effet de saturation des sites de greffage (CON3), et stabilise stériquement le réactif lors de sa conservation, Les proportions anticorps-poly-L- lysine varient selon l'enrichissement désiré en anticorps sur la microsphère synthétique,et selon que l'on désire utiliser la partie droite ou gau- che par rapport au point d'équivalence de la courbe représentée au sein de la figure 1; Il est à noter, que le procédé selon l'invention permet l'utilisation aussi bien de la partie droite que de la partie gauche de la dite courbe; - désorption des anticorps fixés par liaison ioni- que (KCl 3 M,pendant 15 minutes), - stockage. Il va de soi que si les groupes fonctionnels des particules sont CONH2 (exemple W169 et l181) ou COOCH3, la phase à l'hydrazine représente la première phase du procédé de greffage. La phase suivante correspond à la phase d'aggluti- nation des microsphères et c'est là l'une des caracté- ristiques importantes de l'invention. On soumet les mi- crosphères de latex à un mouvement circulaire périodique de fréquence égale à 20 Hertz et d'amplitude de 4 mm, et ce pendant une durée de dix minutes. Cette phase s'ef- - 17- fectue à température ambiante, d'o une diminution nota- ble de l'appareillage (pas de bain marie ou de tout autre type d'appareil de chauffage). Cette phase d'ag- glutination ainsi réalisée nermet, et c'est une caracté- ristique de l'invention, une forte diminution de l'ag- glutination non spécifique des particules. En effet, son efficacité sur l'agglutination non spécifique des parti- cules est très grande: l'agglutination non spécifique lorsque l'on utilise l'un des procédés précédemment décrits, c'est-à-dire à 37 C, pendant 1/2 heure au bain marie avec une agitation traditionnelle, est de l'ordre de 30 à 40 %. L'agglutination non spécifique selon le procédé décrit dans l'invention varie de 2 à 5 % seulement. De plus, ce procédé ne nécessite pas de stabilisa- tion de particules par de l'albumine bovine ou tout autre agent ionique rendu électro-négatif ou électo- positif à des pH très basiques, ou très acides, incompa- tibles avec la conservation des réactifs. Le procédé permet donc par voie de conséquence, le maintien du réactif et des gammes étalon à des pH phy- siologiques (voisin de 7), assurant donc une très bonne intégrité et une excellente conservation des constituants. Il est à noter qu'il existe un autre avan- tage en évitant l'utilisation de substances stabilisa- trices protéiques comme le permet le procédé. En effet, les substances stabilisatrices protéiques telles que l'albumine sont source de contamination bactérienne, ce qui est très gênant dans un réactif industriel devant être conservé plusieurs mois. De plus,le procédé ci-dessus permet, et c'est éga- lement une caractéristique de l'invention, simultanément avec une diminution très nette de l'agglutination non - 18 - spécifique des particules, une augmentation notable de l'agglutination spécifique immunologique des particules. Un plateau de saturation dans l'agglutination immu- nologique des microsphères est atteint rapidement en dix minutes environ. Une durée d'incubation si courte, outre qu'elle soit très intéressante pour l'utilisateur qui a un résultat de dosage extrêmement rapidement, n'implique, d' autre part, pas de chronométrage prtiulirent fastidieux, dans l'introduction initiale du réactif ou dans la phase d'arrêt de la réaction. De plus, l'efficacité du procédé selon l'invention sur l'agglutination spécifique est telle que l'agitation peut être effectuée à température ambiante, ce qui évite comme déjà dit précédemment, l'utilisation d'appareilla- ges chauffants ou de bains-marie, d'o un avantage certain et appréciable de commodité. Selon l'invention, on a donc vérifié expérimenta- lement que l'agglutination non spécifique, qui est liée à des inter-actions faibles entre les particules (liai- son de type ionique, hydrogène, Van der Waals) est ren- due impossible ou fortement inhibée par un mouvement pé- riodique imprimé à celle-ci, de très faible amplitude et de très grande fréquence, quel que soit la trajectoire du mouvement périodique (par exemple et commodément rec- tiligne, circulaire ou ovalisée). On a également vérifié qu'un tel procédé favorise notablement l'agglutination spécifique (immunologique) des microsphères synthétiques porteuses de l'antigène ou de l'anticorps, en présence de l'antigène ou de l'anticorps correspondant, et donc permet une réaction spécifique rapide et effectuée à temperature ambiante. - 19 - La phase d'agglutination étant réalisée, on provo- que une dilution aqueuse du milieu d'incubation conte- nant les dites microsphères jusqu'à un volume de 2 à 3 millilitres. Ce volume correspond en effet à celui d'une cuve traditionnelle de spectrophotométr;e de dimension 1 x 1 cm. On procède alors à la phase de lecture et de mesu- re. En fait, antérieurement à la phase d'agglutination proprement dite, on réalise le spectre d'absorption dans l'ultra-violet-visible d'une suspension acqueuse des microsphères de polystyrène non coloré non ag- glutinées afin de déterminer le maximum d'absorption "moléculaire" de la lumière ultra-violet-visible de ces particules, soit A max la longueur d'onde représentant ce maximum d'absorption.On a montré que le maximum d'ab- sorption Amax, caractéristique d'une microsphère natu- relle ou synthétique donnée est identique, que ladite microsphère soit ou non revêtue d'une molécule anti- corps ou antigène. A titre d'exemple, la figure 2 repré- sente le maximum d'absorption dans l'ultra-violet d'une suspension concentrée de microsphères de polystyrène non coloré d'un diamètre de 0,8 micromètre, le spectre étant identique,lorsque les microsphères sont revêtues ou non d'un anticorps ou d'un antigène. Cette longueur d'onde X max ainsi déterminée, on procède après la phase d'agglutination immunologique, à la lecture du résultat par spectrophotométrie d'absorp- tion ultra-violet en se plaçant u vîliinaq9eur d'on- de X max précédemment déterminée. Dans l'exemple décrit, max a une valeur de 380 nanomètres. L'expérience montre que les résultats ainsi obtenus selon l'invention, par spectrophotométrie d'absorption - 20 - ultra-violet-visible, indiquent uniquement l'absorption des monomères des microsphères,l'amplitude du pic (degré d'absorption-densité optiquepourcentage de transmission) étant proportionnelle à la concentration en microsphères monomères dans le milieu (loi de Beer-Lambert). Or il est par ailleurs connu dans ce type de dosage que, une fois la réaction d'agglutination immunologique achevée, la concentration en monomères résiduels non ag- glutinés est proportionnelle au logarithme de la concen- tration initiale en antigène dans le milieu. Le résultat de la lecture de la réaction par spec- au voisivnage du\ trophotométrie d'absorption ultra-violet-visible \ max d'absorption des monomères des microsphères non agglutinées,est dcrc ainsi proportionnel au logarithme de la concentration initiale à l'antigène dans le milieu. Il est à noter que ce procédé est utilisable quel que soit la nature du polymère (notamment ceux précisés précédemment), quelle que soit la taille des particules et leur coloration. Lorsque les particules de latex sont colorées,on peut se placer pour la lecture soit au À max de la particule, soit au Amax de la couleur de celle-ci (exemple: 560 nm pour des latex rouges). En effet, dans le cas des latex colorés, les spectres d'absorption ultra- violet-visible présentent deux pics, l'un correspondant à la matière (indépendante de la couleur), l'autre cor- respondant au colorant de cette matière Il va de soi, dans la mise en oeuvre pratique du procédé, qu'on a intérêt à choisir une microsphère de polymère synthétique dont la nature, la taille ou la couleur présente un maximum d'absorption ultra-violet- visible à des longueurs d'onde qui n'interfèrent pas - 21 - avec des longueurs gênantes, en particulier à 280 nano- mètres correspondant à l'absorption des protéines. Avan- tageusement, le procédé selon l'invention utilise par exemple des microsphères de polystyrène non coloré d'un diamètre de l'odre de 0,8 micromètre, dont le maximum d'absorption ultra-violet-visible est situé comme déjà dit vers 380 nanomètres. D'autre part, cette longueur d'onde n'interfère en effet donc pas avec le maximum d'absorption des protéines situées à 280 nanomètres. Cette longueur d'onde de 380 nanomètres peut être sélectionnée par n'importe quel spectrophotomètre ou photomètre, en utilisant indifféremment une lampe ultra-violet ou visible, compte-tenu que la valeur de 380 nanomètres se situe à la frontière de l'ultraviolet et du visible.De plus,la lecture à 380 nanomètres en visible est à la portée de n'importe quel appareillage photométrique ou spectrophotométrique de laboratoire, d'o une simplification importante de l'appareillage nécessaire au procédé de dosage. D'autre part, l'expérience montre que le maximum d'absorption X max est caractéristique d e s microsphères désagglutinées, et que des agglutinats de ces mêmes microsphères, même lorsqu'ils sont de très faible taille, n'absorbent plus à ce maximum. En effet, on a observé que les agrégats des microsphères synthéti- ques de polymères ont un maximum d'absorption caracté- ristique de leur taille. On a également observé que les agglutinats ont un maximum d'absorption situé d'autant plus vers les grandes longueurs d'onde que leur taille est importante. La figure 3 indique (flèches) le maximum d'absorption des microsphères non colorées de polysty- rène anticorps (de 0,8 micromètre de diamètre), non ag- glutinéep et les maxima d'absorption des agglutinats de taille croissante de ces mêmes microsphères. On observe: - 22- - d'une part, l'absorption des microsphères résidu- elles non agglutinées par l'antigène (à max), - d'autre part, l'absorption des agrégats de taille croissante, induits par des concentrations croissantes en antigène. Il ressort clairement de ce qui précède, que si par spectrophotométrie d'absorption ultra-violet-visible, en se plaçant à une longueur d'onde qui correspond au max d'ab- sorption des microsphères non agglutinées (monomères), on effectue la lecture d'une solution contenant un mélange de microsphères monomères et d'agglutinats de celles-ci, la mesure ainsi effectuée ne concernera et donc ne dé- tectera que les monomères des particules, car elles seules absorbent à ce maximum. Ce mode de lecture nouveau, selon l'invention, pré- sente par rapport à l'état de la technique précédemment décrit de nombreux avantages: - il ne nécessite pas d'utilisation d'appareillages très sophistiqués et coûteux, tels que les compteurs de particules, les néphélémètres laser, opacimètres infra- rouge, - à l'inverse des techniques turbidimétriques dans le visible, il peut être utilisé avec des concentrations très fortes de particules dans le milieu d'incubation, ce qui confère au dosage de très fortes précisions, im- possibles à atteindre en turbidimétrie (opacimétrie) visible ou proche infra-rouge. A titre d'exemple, le tableau I suivant donne les densités optiques obtenues par lecture spectophotométrique d'absorption ultra- violet-visible du résultat issu de l'agglutination des non colorées microsphères Ide polystyrène-anticorps de 0,8 micromè- tre de diamètre, et ce pour deux concentrations très basses de l'antigène correspondant. - 23 - 2 60453 TABLEAU I Concentration initiale en 10 ng/ml 1 yg/ml antigènes Densité Optique absorption UV-visible 1,3 0,5 à 380 nm La longueur d'onde de 380 nm, correspond au maximum de l'absorption de la lumière ultra-violet-visible par des microparticules monomères non-agglutinées; - le degré de précision permis par le mode de lec- ture selon l'invention, permet outre l'utilisation de n'importe quel spectrophotomètre, l'emploi de cuves de lecture d'un modèle courant ( 1 x 1 cm) Les résultats fournis dans le tableau précédent correspondent à une mesure effectuée au moyen d'une cuve de lecture traditionnelle de 1 cm de chemin optique. Il faudrait un chemin optique de 4 centimètres, difficile à réaliser sur le plan pratique, pour obtenir la même pré- cision en turbidimétrie. Le dispositif de mise en oeuvre du procédé décrit précédemment comprend, outre un spectrophotomètre d'ab- sorption de modèle courant, un boitier compartimenté et un moyen apte à imposer un mouvement vibratoire à la solution contenant les microsphères. Le boitier compartimenté, présenté en figure 5, en forme de parallélépipède rectangle a pour dimensions 12 x 18 x 4 cm et est réalisé en matière plastique ou en - 24 - carton rigide. Il présente trois compartiments: - le premier compartiment (1) renferme une plurali- té de tubes à hémolyse (4) horizontaux et parallèles, fermés et étiquetés (portant la concentration d'antigè- nes), et contenant 2 à 4 gammes étalon sous forme lyophilisée; - le deuxième compartiment (2) renferme également une pluralité de tubes à hemolyse (5), mais de taille plus importante, horizontaux et parallèles, et contenant le réactif prêt à l'emploi,en l'occurrence les anticorps greffés sur des microsphères, baignant dans un diluant approprié. En effet, le diluant doit assurer la conser- vation des anticorps, leur stabilité dans le temps et leur bonne intégrité. Ces tubes sont au nombre de quatre par gamme étalon, et renferment 2,5 millilitres de réactif; - le troisième compartiment (3) comporte une plura- lité de tubes fermés (6) de petit diamètre, renfermant un échantillon de la solution de dilution de la gamme étalon, sous forme lyophilisée. le boitier compartimenté comprend en outre deux flacons (7) de concentré du liquide de dilution. Le moyen apte à assurer le mouvement périodique de haute fréquence et de faible amplitude des microsphè- res comprend un moteur solidaire d'un axe vertical actionnant une came. Cette came communique à un plateau, lui-même solidaire d'un support de tubes parallèles, un mouvement périodique de haute fréquence et de faible amplitude, et de trajectoire circulaire. Le dit plateau de forme générale allongée, reste toujours parallèle à sa direction originale. Le moyen apte à assurer le mou- vement périodique comprend en outre un châssis sur lequel on règle l'affichage de la vitesse de rotation du - 25 - moteur et la mise en marche. L'amplitude du mouvement est limitée dans le cas présent à 4 mm et la fréquence affichée est de 20 Hertz. Ainsi, lorsque l'on désire pro- céder à un dosage en antigène d'une solution, par exemple au dosage de la beta 2 micro-globuline dans un sérum d'insuffisant rénal, on prélève tout d'abord 100 microli- tres du sérum à analyser auquel on ajoute 0,9 ml d'eau distillée. De cette solution ainsi réalisée, on prélève microlitres que l'on met dans un des tubes (6) du compartiment (3) préalablement reconstitué avec 0,9 ml d'eau distillée. On procède à une homogénéisation clas- sique. Puis on prélève 50 microlitres de ce tube, on les mélange avec 50 microlitres du réactif prêt à l'emploi, c'est à dire de l'anticorps correspondant, greffé sur les microsphères et présent dans l'un des tubes (5) du com- partiment (2), et qui a été préalablement homogénéisé.La nouvelle solution ainsi formée, est placée sur le support solidaire du plateau, des moyens assurant le mouvement périodique de haute fréquence et de faible amplitude. Il subit ce mouvement périodique pendant une durée de dix minutes, la fréquence de vibration étant de 20 Hertz et l'amplitude de 4 mm. Cette phase d'agglutination étant réalisée, on procède à la phase de dilution aqueuse. Le volume obtenu passe de 100 microlitres à 3 ml, c'est à dire au volume correspondant à la cellule d'analyse spectrophotométrique. On verse alors le contenu du tube dans la cellule de lecture de 1 x 1 cm et on procède à une analyse spectrophotométrique au maximum d'absorption dans l'ultra-violet-visible des microsphères non aggluti- nées en l'occurrence à 380 manomètres, c'est à dire à la frontière du visible et de l'ultra-violet. Au préalable, l'une des gammes étalon présente dans le compartiment (1) du boitier,a été utilisée afin de tracer la droite représentative de la relation entre la 'densité optique et le logarythme de la concentration en antigènes. Une - 26 - fois la densité optique de la solution obtenue détermi- née, on la compare à la courbe étalon et l'on en déduit de façon extrêmement rigoureuse la concentration d'anti- gènes du sérum initial. La Figure 4 est une illustration d'un dosage d'Immu- no-gammaglobulines G humaines au moyen du procédé et du dispositif conforme à l'invention. Dans cet exemple,c'est la partie droite par rapport au point d'équivalence de la courbe de la figure 1 qui est exploitée.Le coefficient de corrélation avec la néphélémétrie laser obtenu pour ce dosage sur cent sérums et liquides céphalo-rachidiens étant voisin de 1. Le tableau II suivant est un tableau comparatif en- tre le procédé selon l'invention et un radio-immuno- essai pour le dosage de la béta 2 microglobuline humaine dans des sérums normaux, d'insuffisants rénaux, et dans des liquides de dialyse. TABLEAU II Concentration en béta 2 micro-globuline en g/ml procédé selon _ '_ = l'invention 11,6 5,7 0,7 2,97 2,24 2,1 2,71 2,23 Radioimmunoessai 13,2 6, 7 0,41 2,06 2,12 2,051 2,60 2,30 De la présente invention, outre les avantages précé- demment soulignés, se dégagent d'autres avantages parmi lesquels on peut citer: - le dosage possible et in situ, c'est-à-dire au lit même du malade, chose qui était rendue très difficile - 27 - jusqu'à présent du fait de l'importance de l'appareillage à mettre en oeuvre; - une très grande rapidité de mise en oeuvre et de détermination des résultats et ce, avec une très grande fiabilité, ce qui rend possible ce procédé en biochimie ou en pharmacologie d'urgence: - l'analyse possible à température ambiante. Cette invention est donc particulièrement adaptée à de nombreux domaines de recherches et de la médecine, en particulier en cancérologie, hormonologie, endocrino- logie, biochimie clinique, hémodialyse, toxicologie, mi- crobiologie. De même, elle présente un grand intérêt dans le do- maine du contrôle pyrétogène de l'industrie pharmaceuti- que, et dans celui de l'hémodialyse. - 28 - REVENDICATIONS 1/ Procédé de dosage d'une substance d'intérêt cli- nique réactive immunologiquement par d'autres substances du même type ( d o s a g e d ' u n an t i g è n epar un anticorps et réciproquement) du type dans lequel: - on greffe préalablement une substance active im- munologiquement jouant le rôle de réactif doseur sur des microparticules naturelles ou synthétiques, - on agglutine les dites microparticules par la substance à doser d'interet clinique réactive immunologi- quement; - on mesure par lecture le résultat issu de la réac- tion d'agglutination,que l'on compare à une gamme étalon, caractérisé: en ce que la phase d'agglutination s'effectue en soumettant lesdites microparticules à un mouvement pério- dique de fréquence comprise entre 4 et 40 Hertz, et de préférence 20 Hertz, et d'amplitude variant de quelques millimètres à quelques centimètres, de préférence de l'ordre de 4 mm, - et en ce que la phase de lecture s'effectue: tout d'ab rd, dar.dé,ermination du maximum molecRaúalre d'absorption1de la lumière ultra-violet-visi- ble d'une suspension aqueuse de microparticu- les non agglutinées, la détermination étant effectuée en faisant le spectre d'absorption ultra-violet-visible de la dite suspension,la longueur d'onde correspondant au maximum d'absorption étant dénommée ? max, puis par lecture du résultat par spectropho- tométrie d'absorption ultra-violet-visible en se plaçant au voisinage de ladite longueur d' onde A max précédemment déterminée, après la réaction d'agglutination immunologique et une - 29 - dilution du milieu d'incubation effectuée de manière connue. 2/ Procédé de dosage selon la revendication l,carac- térisé en ce que la trajectoire du mouvement périodique peut être de toute nature, mais de préférence circulaire, rectiligne ou ovalisée. 3/ Procédé de dosage selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la phase d'agglutination s'effectue à température ambiante. 4/ Procédé de dosage selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la durée du mouvement périodique imposée aux microparticules durant la phase d'agglutination est fonction de la fréquence de la trajectoire et de l'amplitude du mouvement, mais est de préférence de 10 minutes pour une fréquence de 20 Hertz et un mouvement circulaire périodique de 4 millimètres de diamètre. / Procédé de dosage selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les microparticules aptes à la lecture spectrophotométrique d'absorption ultra-vio- let-visible sont des microparticules naturelles ou syn- thétiques de toute nature absorbante. 6/ Procédé de dosage selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les microparticules sont de forme quelconque, mais de préférence sous forme de micro- sphères. 7/ Procédé de dosage selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les microsphères sont choi- - 30 - sies dans le groupe constitué par des polymères syn- thétiques de vinyltoluène, acrylonitrile styrène- butadiène, d é r i v é s acrylonitrile-acide acrylique, e s t e r s acryliques,v i n y 1 b u t a d i è n e et de préférence du polystyrène. 8/ Procédé de dosage selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les microsphères sont cali- brées et ont un diamètre compris entre 0,01 et 5 micromè- tres, et de préférence de l'ordre de 0,8 micromètre. 9/ Procédé de dosage selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les microparticules sont non colorées. / Procédé de dosage selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les microparticules sont co- lorées, la lecture du résultat par spectrophotométrie d'absorption ultraviolet-visible étant effectuée soit à la longueur d'onde correspondant à l'absorption maximum de la matière constitutive de la microparticule non ag- glutinée (Amax), soit à la longueur d'onde correspondant à l'absorption maximum de la couleur de la microparticu- le considérée 11/ Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé se- lon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comporte: - un moyen, destiné à être solidarisé à un support dont le but est de recevoir une pluralité de tubes élé- mentaires parallèles, et aptes à imposer audit support un mouvement périodique à une fréquence comprise entre 4 et Hertz, de préférence 20 Hertz et une amplitude variant de quelques millimètres à quelques centimètres, et de préférence de l'ordre de 4 mm; - 31 - - un boitier divisé en trois compartiments, respec- tivement: un premier compartiment (1) destiné à rece- voir une première série de tubes (4) renfer- mant au moins deux gammes étalon lyophilisées de la substance réactive immunologiquement à doser, un deuxième compartiment (2) destiné à rece- voir une seconde série de tubes (5) renfer- mant la substance active immunologiquement et jouant le rôle de réactif doseur, greffée sur des microparticules naturelles ou synthé- tiques, un troisième compartiment (3) destiné à rece- voir une troisième série de tubes (6) renfer- mant un échantillon de la solution de dilution de la gamme étalon sous forme lyo- philisée, ledit boitier comportant en outre au moins un flacon (7) de liquide de dilution. 12/ Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé se- lon la revendication 11, caractérisé en ce que le moyen apte à imposer au support des tubes élémentaires parallè- les un mouvement périodique de haute fréquence et de faible amplitude est constitué d'un moteur actionnant une came, assurant un mouvement périodique de fréquence comprise entre 4 et 490 Hertz et d'amplitude variant de quelques millimètres à quelques centimètres.