FR 2604727 A1 19880408 FR 8713651 A 19871002 MILIEU SYNTHETIQUE POUR LA CULTURE D'HYBRIDOMES ET DE CELLULES DE MYELOME. L'invention concerne un milieu synthétique pour la cul- ture d'hybridomes et de cellules de myélome, On utilise à l'échelle industrielle, pour la production d'anticorps monoclonaux, des hybridomes réalisés par hybri- dation d'une cellule de myélome et d'un lymphocyte synthéti- sant un anticorps. Les cellules de myélome dans lesquelles on a introduit, par des méthodes de manipulation génétique, un gène pour une protéine biologiquement active, par exemple une enzyme, un inhibiteur enzymatique, une hormone, un immuno- régulateur, sont de même utilisées & l'échelle industrielle pour la production de ces protéines. Compte tenu de la demande croissante en différents anticorps monoclonaux, en particulier destinés à des applications thérapeutiques et à la chromatographie par immuno-affinité, applications dans lesquelles les quantités utilisées s'expriment en kilogrammes, et compte tenu de la demande en différentes protéines régu- latrices - pour des applications thérapeutiques - on recherche des procédés toujours plus efficaces et économiquement plus avantageux pour produire ces substances, A l'heure actuelle, les hybridomes et cellules de myélome sont cultivés de la manière suivante: on multiplie les cellules d'abord dans des récipients de laboratoire, par exemple des boites en matière plastique et des flacons, et on termine la culture, ainsi que la production des protéines, dans un fermenteur industriel. On obtient l'anticorps mono- clonal, ou une autre protéine qui se sépare dans le milieu de culture, par centrifugation ou filtration des cellules, à partir du milieu de culture, L'isolation de la protéine finie est d'autant plus difficile et plus chère que le milieu de culture initial contenait plus de protéines, La concentration de la protéine produite, par exemple de l'anticorps monoclonal, dans le milieu de culture est relativement faible, Un milieu de culture synthétique contient des composants de base servant à la culture, et un additif. Les composants de base servant à la culture sont des sels inorganiquesf par exemple le chlorure de sodium et le phosphate de sodium, des monosaccharides, par exemple le glucose ou le galactose, des acides aminés, par exemple le tryptophane, la méthionine, la thréonine et la glutamine, des vitamines, par exemple la thiamine et le nicotinamide, des substances tampon, par exemple l'acide N,2-hydroxyéthyl- pipérazine-N'-2-éthanesulfonique, éventuellement du pyruvate de sodium, un antibiotique et un indicateur de variation du pH. Ces composants de base servant à la culture sont, à eux seuls, insuffisants pour des hybridomes et cellules de myélome, de même que pour d'autres cellules animales, et on les complète donc par 10 % en volume de sérum sanguin, par exemple de sérum de boeuf, de cheval ou de foetus de veau. Le sérum sanguin introduit dans le milieu de culture des substances inconnues, dont certaines peuvent favoriser la croissance cellulaire, tandis que d'autres peuvent l'inhiber, Il est donc nécessaire de contrôler le sérum sanguin avant utilisa- tion, et de sélectionner des lots appropriés. Il en résulte une augmentation du coût de fabrication du milieu de culture. C'est la raison pour laquelle on a mis au point des formula- tions pour ce que l'on appelle des milieux de culture sans sérum, dans lesquels le sérum sanguin est remplacé par quelques protéines parfaitement définies, le plus souvent par de la transferrine, de l'albumine du sérum et de l'insuline et éventuellement par d'autres substances, comme des acides gras insaturés, des amines et des hormones à faible masse molécu- laire (Kovar J., Franek F., Methods in Enzymology 121: 277, 1986). Toutes les protéines qui, à ce jour, sont ajoutées aux milieux de culture destinés à la culture d'hybridomes ou de cellules de myélome doivent être exemptes de contaminations toxiques, ce qui augmente les exigences économiques auxquelles doit satisfaire le procédé de fabrication, Un autre inconvé- nient des milieux de culture actuels réside dans la difficulté qu'il y a à isoler du milieu de culture les produits de l'acti- vité vitale des hybridomes, et éventuellement des cellules de myélome, isolement qui se fonde sur une séparation multiple entre d'une part les produits recherchés, présentant le caractère de protéines, et d'autre part les protéines se trouvant en un fort excès dans le milieu de culture, On peut supprimer les inconvénients ci-dessus en utili- sant le milieu de culture selon l'invention, lequel, outre les composants de base, comme des sels inorganiques à une concen- tration de 5000 à 12 000 mg/l, des monosaccharides à une concentration de 300 à 5000 mg/l, des acides aminés à une concentration de 200 à 5000 mg/l, des vitamines à une concen- tration de 2 à 100 mg/l, des substances tampon à une concentra- tion de 200 à 20 000 mg/l, éventuellement du pyruvate de sodium, des antibiotiques, et un indicateur de variation du pH, contient un supplément qui forme au moins un composé du fer, soluble dans l'eau, à une concentration de 2.10 5 à 1.10-2 moles par litre du milieu de culture, de préférence du citrate de fer(III), du sulfate de fer(II), du chlorure de fer(III) ou du ferricyanure de potassium. Il est avantageux que le milieu contienne encore, en combinaison avec le supplément, des composés des oligo- éléments biogéniques, en particulier du sélénium et du zinc, de l'acide ascorbique, des composés stéroldiens, en particulier de la cortisone, et des amines, de préférence de l'éthanolamine, dont la présence renforce l'effet du supplément. Il s'est avéré que le seul composant protéique absolu- ment indispensable du milieu de culture sans sérum était la transferrine (Kovar J., Franek F., Methods in Enzymology, 121 277, 1986). Comme la transferrine sert à transférer le fer du milieu à l'intérieur de la cellule, cette fonction peut être remplacée par la présence de composés du fer solubles dans l'eau, et ce à des concentrations supérieures aux concentra- tions actuellement utilisées dans les milieux de culture. De nombreux auteurs (par exemple Phillips P,D,, Cris.tofalo V.J,, Exp. Cell Res,, 134; 297, 1981; Perez-Infante V,, Mather J,P,, Exp, Cell Res,, 142: 325, 1982; Taetle R., Rhyner K,, Castagnola J., To D., Mendelsohn J., J. Clin. Invest., 75 1061, 1985) ont utilisé comme succédané de la transferrine des composés du fer solubles dans l'eau, à des concentrations de 1,10-6 â 20,10- moles/l, A vrai direr ces concentrations sont insuffisantes dans le cas des hybridomes et des cellules de myélome, Il s'est avéré que les composés du fer n'étaient pas toxiques vis-à-vis des hybridomes et des cellules de myélome jusqu'à une concentration de 1.10 2 moles/l, et que, au contraire, des concentrations des composés du fer supé- rieures à 2,10 5 rendent possible la croissance d'hybridomes et de cellules de myélome dans un milieu de culture ne conte- nant aucune protéine, Parmi les composés du fer susceptibles de remplacer la transferrine, on peut citer à titre d'exemples le citrate de fer(III), le sulfate de fer(II), le chlorure de fer(III) et le ferricyanure de potassium, Les concentrations actives sont comprises dans l'intervalle allant de 2,10-5 à 1.10'2 moles/l. L'avantage du milieu de culture selon l'invention réside dans la facilité qu'il y a à isoler la protéine qui s'est séparée des cellules, par exemple les anticorps monoclonaux; en effet, la protéine excrétée par les cellules forme la seule protéine se trouvant dans le milieu de culture après la culture proprement dite, L'invention sera mieux comprise en regard des exemples ci-après. Exemple 1 Pour préparer un milieu de culture sans protéine, chimi- quement défini, on a utilisé un milieu de culture de base qui, outre le milieu RPMI 1640, contenait encore 300 pg/ml de L-glutamine, 110 ug/ml de pyruvate de sodium, 1,5.10-2 moles/l d'acide N-2-hydroxyéthylpipérazineN'-2-éthanesulfonique, UI/ml de pénicilline, 100 fg/ml de streptomycine et 40 ug/ml de gentamycine, On a ensuite ajouté au milieu de culture sans protéine, à titre de sérum artificiel, les addi- tifs suivants: 2,10-5 moles/l d'éthanolamine, 2.10-5 moles/1 d'acide ascorbique, 5.10- 9 moles/l d'hydrocortisone, 5.10-8 moles/l de sulfate de cadmium CdSO4.8/3H O, 1.108 moles/1 de chlorure de cobalt(II) CoC12,6H 0, 1.10 moles/1 de sulfate de cuivre(II) CuSO4.5H20, 5.10 moles/1 de molybdate d'ammonium (NH4)6Mo7024.4H20, 5.1010 moles/1 de chlorure de manganèse(II) MnC12,4H20, 2,5.10-10 moles/1 de sulfate de 2 -8 nickel(II) NiSO4.6H20, 4,10 moles/1 de sélénite (IV) de sodium Na2SeO3, 2,10 7 moles/1 de silicate de sodium Na2SiO3, 2,5.10-10 moles/1 de chlorure d'étain(II) SnC12.2H20, 2,5,10-9 moles/1 de métavanadate (1V d'ammonium NH4VO3, 1.106 moles/1 de sulfate de zinc ZnSO4.7H20, et 5.10-4 moles/1 de citrate de fer(III), On a inoculé & 6 1ml du milieu de culture sans protéine, ayant la composition donnée ci-dessus, se trouvant dans une boite de Pétri en matière plastique de diamètre 6 cm, des cellules de l'hybridome PLV-01, en une quantité telle que leur densité soit de 50.103 cellules/ml. Après 4 jours de culture en étuve thermostatée, dans une atmosphère humidifiée (air contenant 5 % en volume de dioxyde de carbone) à une tempéra- ture de 37 C, les cellules se sont multipliées jusqu'à une densité de 1, 53.106 cellules/ml. On peut donc dire que le nombre des cellules a été approximativement multiplié par trente pendant les 4 jours de culture. Dans un essai analogue utilisant des cellules de l'hybri- dome CMH-02, on est parti d'un inoculum à 25.103 cellules/ml, et les cellules se sont multipliées jusqu'à présenter après quatre jours une densité de 1,36.106 cellules/ml. Au cours de cet essai de quatre jours, le nombre des cellules a été approximativement multiplié par cinquante. On a inoculé séparément des cellules du myélome FO et des hybridomes PLV01, CMH-02 et T3-03 dans des milieux de culture sans protéine, chacun ayant un volume de 1 ml et la composition indiquée, dans les réservoirs d'une plaque de culture en matière plastique à 24 réservoirs. Après un jour de culture dans les conditions indiquées ci-dessus, on a déterminé le nombre des cellules dans un réservoir et# 24 heures plus tard, on a déterminé de nouveau le nombre des cellules, On a de cette manière déterminé, pour chaque hybridome ou myélome, le temps moyen de doublement au cours de la phase exponen- tielle, On a trouvé un temps moyen de doublement de 15,6 heures pour le myélome FO, de 14,8 heures pour l'hybridome PLV-01, de 14,6 heures pour l'hybridome CMH-02 et de 11,8 heures pour l'hybridome T3-03, On a.inoculé séparément des cellules des hybridomes PLV-01 et PGG-05, en une quantité de 60,103 cellules, dans des volumes de 1 ml du milieu de culture sans protéine ayant la composition indiquée ci-dessus, dans les réservoirs d'une plaque de culture en matière plastique à 24 réservoirs. A titre de comparaison, on a inoculé des cellules des mêmes hybridomes dans un milieu de culture sans sérum contenant mg/1 de transferrine et 10 mg/1 'a insuline (milieu SFH sans acide linoléique ni albumine, J. Kovar et F. Franek, Methods in Enzymol. 121: 277, 1986), Au bout de 4 jours de culture dans les conditions mentionnées ci-dessus, on a déter- miné le nombre des cellules et la concentration de l'anticorps monoclonal dans le milieu de culture, et ce en utilisant le test enzymoimmunologique se fondant sur la détermination de l'activité de peroxydase. Pour une croissance de l'hybridbme PLV-01 dans un milieu sans protéine, atteignant 819.103 cellules à partir d'un inoculum de 60,103 cellules, on a trouvé pour la concentration de l'anticorps monoclonal, exprimée en unités relatives d'absorbance, une valeur A490 = 0,298. Dans un essai comparatif utilisant le milieu SFH, on a trouvé les valeurs 706.103 cellules et A490 = 0,310. Pour une croissance de l'hybridome PGG-05 atteignant 675.10 cellules dans un milieu de culture sans protéine, la concentration de l'anti- corps monoclonal, exprimée en unités relatives d'absorbance, a été de A490 = 1,32. Un essai comparatif utilisant le milieu SFH a donné comme résultats 731.10 cellules et A490 = 1,26. Exemple 2 On a inoculé des cellules de l'hybridome PLV-01, en une quantité de 10, 103 cellules, dans 0,1 ml du milieu de culture sans protéines ayant la composition donnée dans l'Exemple 1, dans des réservoirs d'une plaque de culture en matière plasti- que à 96 réservoirs, A titre de comparaison, on a inoculé d'une manière analogue des cellules de cet hybridome dans un milieu de culture sans protéines dans lequel on avait remplacé le citrate de fer(III) par du chlorure de fer(III) en une concen- tration de 5,10'4 moles/l. Après 3 jours de culture dans les conditions données dans l'Exemple 1, les cellules de l'byhridome s'étaient multipliées jusqu'à 131.103 cellules dans le milieu de culture au citrate de fer(III) et à 82,103 cellules dans le milieu de culture au chlorure de fer(III). Exemple 3 On a inoculé des cellules de l'hybridome PLI-01, en une quantité de 10, 103 cellules, dans 0,1 ml des composants de base indiqués dans l'Exemple 1. On a ajouté au milieu de culture 5,10 4 moles/l de ferricyanure (III) de potassium. Après 3 jours de culture à 37 C et dans une atmosphère humidifiée contenant 4,5 % en volume de dioxyde de carbone, le pH du milieu étant de 7,4, les cellules se sont multipliées jusqu'à 62.103 cellules. Exemple 4 On a inoculé des cellules de l'hybridome PLV-01, en une quantité de 10, 103 cellules, dans 0,1 ml des composants de base indiqués dans l'Exemple 1. On a ajouté au milieu de culture 1.10-4 moles/1 de sulfate de fer(II). Après trois jours de culture à 37:C dans une atmosphère humidifiée conte- nant 4,5 % en volume de dioxyde de carbone le pH du milieu étant de 7,4, les cellules se sont multipliées jusqu'à 25.103 cellules, Exemple 5 On a inoculé des cellules de l'hybridome PLV-01, en une quantité de 10, 103 cellules, dans 0,1 ml du milieu de culture sans protéines ayant la composition indiquée dans l'Exemple 1, lequel milieu se trouvait dans les réservoirs d'une plaque de culture en matière plastique à 96 réservoirs. A titre de compa- raison, on a inoculé d'une manière analogue des cellules de cet hybridome dans un milieu de culture sans protéines conte- nant, outre le milieu de base comme dans l'Exemple 1, seulement 5.10 4 moles/1 de citrate de fer (III).Après 3 jours de culture dans les conditions de l'Exemple 1, les cellules d'hybridome se sont multipliées, dans le milieu de culture complet sans protéines, à 118,103 cellules, et à 103.103 cellules dans un milieu de culture sans protéines ne contenant que le citrate de fer(III). Revendications 1. Milieu synthétique pour la culture d'hybridomes et de cellules de myélome, contenant des sels inorganiques à une concentration de 5000 à 12 000 mg/l, des monosaccharides à une concentration de 300 à 5000 mg/l, des acides aminés à une concentration de 200 à 5000 mg/l, des vitamines à une concen- tration de 2 à 100 mg/1, des substances tampon à une concen- tration de 200 à 20 000 mg/l, éventuellement du pyruvate de sodium, des antibiotiques, un indicateur de variation du pH et un supplément, caractérisé en ce que le supplément forme au moins un composé du fer, soluble dans l'eau, à une concentration de 2.10-5 à 1.10-2 moles/l. 2, Milieu synthétique selon la revendication 1, caracté- risé en ce que le composé du fer soluble dans l'eau est le sulfate de fer(II), le citrate de fer(III), le chlorure de fer(III) ou le ferricyanure (III) de potassium. 3. Milieu synthétique selon l'une quelconque des revendi- cations 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il contient des composés des oligoéléments biogéniques, de préférence le sélénium et le 2G zinc, à une concentration de 0,002 à 2 mg/l. 4. Milieu selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il contient de l'acide ascorbique à une concentration de 1 à 100 mg/l. 5. Milieu synthétique selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 4, caractérisé en ce qu'il contient des composés stéroldiens, de préférence de l'hydrocortisone, à une concen- tration de 0,0001 à 0,01 mg/1. 6. Milieu synthétique selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 5, caractérisé en ce qu'il contient des amines, de préférence de l'éthanolamine, à une concentration de 0,1 à mg/l,