FR 2601383 A2 19880115 FR 8610090 A 19860710 La présente addition concerne des perfectionnements apportés aux vecteurs d'expression d'une protéine ayant l'activité de l'hirudine de sangsue (H. medicinalis). Le brevet principal décrit un procédé permettant de taire produire par des levures telles que S. cerevisiae de l'hirudine sécrétée dans le milieu de culture sous forme active. ta présente addition concerne de nouveaux vecteurs qui assurent la production de l'hirudine dans de meilleures conditions. Plus particulièrement, la présente addition concerne des blocs fonctionnels d'ADN permettant la préparation de l'hirudine à partir de levures, caractérisés en ce qu'ils comportent au moins la séquence Str ~ Lex - Scl - gène H . gène H étant le gène de l'hirudine ou l'un de ses variants ; . Str est une séquence d'ADN comportant les signaux assurant la transcription du gène H par la levure . lez est une séquence leader nécessaire pour obtenir l'excrétion du produit du gène Scl est une séquence d'ADN codant pour le site de clivage par la protéinase yscF, site de clivage qui est unique et situé dans le précurseur de l'hirudine immédiatement en amont du gène H. Ce type de bloc d'expression permet d'obtenir une protéine unique, mature et correcte. En effet, avec la construction décrite dans le brevet principal,S. cerevisiae produit l'hirudîne sous forme d'un précurseur présentant deux sites de coupure pour la protéinase yscF, produit du gène KEX2, (1). L'activité endo-peptidase de yscF est nécessaire à la maturation de ce précurseur de l'hirudine . Cependant, seuls les évènements de coupure au deuxième site, celui le plus éloigné de l'extrémité NH2 du précurseur, permet la libération de l'hirudine active ; par contre, lorsque la coupure a lieu au premier site et non au deuxième, c'est une forme plus longue qui est sécrétée et qui diffère de l'hirudine par une extension de résidus aminoacides à l'extrémité NH2. Cette dernière forme non désirable peut contaminer l'hirudine mature et correcte au cours de différentes étapes de purification et de ce fait compliquer le procédé de purification et entraîner une baisse de rendement dans la préparation d'hirudine pure. Par la présente invention, on fait synthétiser à la levure un précurseur de l'hirudine qui ne possède qu'un seul site de coupure pour yscF de façon à ce que sa maturation en hirudine ne conduise à sécréter que la forme recherchée. Parmi les séquences Lex' il faut citer en particulier la séquence dite "pre-pro" qui permet l'excrétion de la phéromone sexuelle alpha de levure. De façon préférentielle, il est intéressant que les levures hôtes des plasmides portant les blocs fonctionnels selon l'invention puissent être d'un type sexuel quelconque et puissent, en outre, être cultivées en absence de une pression de sélection. Dans ces conditions, les levures transformées peuvent être mises en oeuvre au stade industriel de façon particulièrement commode. Pour ce faire, la présente addition propose des blocs d'expression d'ADN tels que décrits précédemment mais dans lesquels la séquence Str comporte un promoteur d'un gène de levure différent du promoteur du gène MFalphal, il peut s'agir, par exemple, du promoteur du gène PGK de la levure. En éffet, dans les constructions décrites dans le brevet principal, le gène du précurseur de l'hirudîne est transcrit à partir du promoteur du gène MFalphal. Ce promoteur fonctionne au maximum de sa puissance dans les souches de type sexuel Matalpha. Le choix de l'hâte se restreint donc à ce type de souche, ce qui exclut les souches de type sexuel Mata ainsi que celles diploïdes ou polyplordes dépourvues de type sexuel. En particulier, cela exclut les souches de levure utilisées dans l'industrie qui rentrent le plus souvent dans cette dernière catégorie. En changeant de promoteur, on peut obtenir une expression de l'hirudine indépendante du signe sexuel de la souche hâte. De façon générale, comme cela est décrit au brevet principal, ces blocs d'ADN seront portés par des plasmides comportant, en outre, une origine de réplication dans les levures, par exemple l'origine de réplication du plasmide 2p. Pour faciliter la construction des vecteur, ces plasmides pourront être des "navettes coli-levure" et comporter des éléments qui permettent leur réplication dans E. coli, par exemple une origine de réplication telle que celle de pBR322 et un marqueur de sélection comme ampR. Ces plasmides comporteront également un marqueur de sélection pour la levure, par exemple un gène codant pour la résistance à certains composés chimiques toxiques ou un gène permettant de complémenter une auxotrophie ; on utilisera plus particulièrement le gène URA3. En effet, on a montré dans le brevet WO 86/01224 que l'introduction de certaines mutations conférant la résistance au 5-FU dans une souche ura3 transformée en ura+ par le biais d'un plasmide permettait un plus grand choix de milieux pour la culture de ces souches transfor meus ; on pourrait en particulier utiliser les milieux complexes industriels. C'est pourquoi la présente invention concerne les levures transformées par les plasmides selon l'invention, en particulier les souches de Saccharomyces et spécialement les souches de S. cerevisiae notamment de type sexuel Mata ou bien les souches diploïdes ou polyploides dépourvues de type sexuel, mais surtout les souches de levure ura transformées ura+ par un plasmide selon l'invention et devenues résistantes au 5-fluorouracile, ces souches pouvant être cultivées sur milieu industriel. Enfin, la présente invention concerne un procédé de préparation d'hirudine par fermentation d'une levure telle que décrite précédemment sur un milieu de culture et récupération de l'hirudine produite dans le milieu de culture sous forme mature ou sous forme d'un précurseur de l'hirudine maturable in vivo, ainsi que l'hirudine obtenue par ce procédé. L'hirudine ainsi obtenue peut être utilisée comme cela est décrit au brevet principal ou dans le brevet FR 84 04755, c'est-à-dire comme médicament anticoagulant, comme produit de laboratoire pour empêcher la coagulation et/ou comme agent de diagnostic en utilisant le produit marqué. Les exemples suivants illustreront d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. Sur les figures ci-annexées Ia figure 1 représente la construction et la structure de M 13TG897, . la figure 2 représente la mutagénèse in vitro de l'ADN phagique de M13TG897 en M13TG1827 :: a) séquence de l'oligonucléotide de la mutagénèse, b) séquence partielle de l'ADN de M13TG897 s'hybridant à l'oligonucléotide, c) séquence mutée, Ia figure 3 représente la construction de pTG883, . la figure 4 représente la construction de pTG892, . la figure 5 représente la construction de M13TG889, . la figure 6 représente la structure de pTG1828 et pTG1833, . la figure 7 représente la structure du précurseur de l'hirudine correspondant aux séquences portées par différents plasmides ; on a représenté la jonction entre a) le site de clivage (lys arg) le plus proche de l'extrémité NH2 du précurseur et b) la séquence mature de l'hirudine HV-2 (NH2-lle-Thr - etc.). EXEMPLE 1 Le plasmide pTGS97 porte l'information pour un précurseur de l'hirudine qui ne contient qu'un seul site de clivage pour la protéinase yscF. La maturation à ce site de clivage libère une hirudine inactive. La coupure par la protéinase yscF libère une molécule d'hirudine allongée en NH2 par 4 résidus Glu Ala Glu Ala. La délétion du fragment d'ADN codant pour cette séquence Glu Ala Glu Ala permettrait de libérer une chaîne d'hirudine correctement processée. Cette délétion a été réalisée par la technique de mutagénèse dirigée in vitro. Le plasmide pTG897 a été découpé par double digestions Pstl-BgIII ; le fragment d'ADN comprenant la séquence de l'hirudine a été cloné dans la forme réplicative du phage simple brin M13TG131 pour donner le phage M13TG897 (figure 1). On a hybridé un oligonucléotide de séquence : 5 '-TCTTTGGATAAAAGAATTACGTATACAGAC-3' à l'ADN génomique de ce phage M13TG897. Cet oligonucléotide s'hybride dans sa première moitié (15 paires de bases) avec la séquence de 15 paires de bases directement en amont de la séquence à déléter et dans sa seconde moitié avec la séquence de 15 paires de bases directement en aval (figure 2). Cet oligonucléotide a servi comme matrice pour la synthèse in vitro du brin complémentaire du génome du phage M13TG897.Après action de la T4 ADN ligase destinée à refermer de façon covalente le brin nouvellement formé, on transfecte une bactérie réceptrice, par exemple JM 103 ( A (Lac-Pro) SupE Thi EndlA sbcB1S strA rk- mk+/F' TraD36 ProAB+ LaclQ LacZ A MIS) et on analyse les phages issus de cette transfection par hybridation ADN-ADN en utilisant comme sonde l'oligonucléotide décrit précédemment et marqué au 32P par kination, suivant les techniques habituelles pratiquées par l'homme de l'art (2).Cet ADN phagique correctement muté forme avec l'oligonucléotide de la mutagénèse un complexe d'hybridation repérable par sa plus grande stabilité, sa plus grande résistance aux conditions de stringence alors que le complexe d'hybridation formé par l'ADN phagique non muté et l'oligonucléotide est déstabilisé par la présence d'une boucle d'ADN simple brin. EXEMPLE 2 Transfert du fragment muté dans un nouveau vecteur d'expression Le plasmide pTG883 dérive du plasmide pTG876, décrit dans le brevet principal, par simple suppression du site Bgill se trouvant près du terminateur de transcription du gène PGK. Pour ce faire, on a digéré partiellement ce plasmide pTG876 par Bill, puis on a fait agir le fragment Klenow de 1'ADN polymérase I de E. coli en présence des 4 nucléotides et on a lié covalemment les molécules d'ADN sur elles-mêmes grâce à l'action de l'ADN ligase du. phage T4. Le plasmide pTG883 ne possède plus qu'un seul site BglII, situé en amont du promoteur du gène de la phéromone (figure 3). Le plasmide pTG883 (20 pg) a été linéarisé par digestion Bglll puis soumis à une digestion ménagée par la nucléase Bal31 (1.4 unités, 10 minutes - Boehringer Mannheim) suivant les techniques habituelles. L'ADN ainsi traité a été purifié par extractions successives au phénol et chloroforme - alcool isoamylique, puis une fraction (5 pg) a été soumise à l'action de la polymérase Klenow afin d'obtenir un maximum d'extrémités franches. L'ADN ainsi traité a été mis à liguer avec des linkers BamHl non phosphorylés (5'-CGGATCCCG) en présence de la ligase du phage T4 suivant la technique décrite par Lathe et al. (3).Après transformation de E coli 1106 et sélection pour la résistance à l'ampicilline, on a isolé un plasmide pTG892 délété pour la région 5' flanquant le gène MFalphal (figure 4), le linker BamHI étant localisé une base en amont de l'ATG suivant le schéma 5' - CGGGATCCCC A ATG AGA TTT Linter BamHI partie codante MTalpha12 Le nouveau fragment BamHI-Sall ainsi obtenu a été cloné entre les sites BamHI-Sall du phage M13TG120 pour donner le phage M13TG889 (figure 4). A partir du phage M13TG889, le fragment BamFII-Bglli contenant toute la partie codante de la phéromone alpha a été isolé pour être ligué avec le grand fragment Bg1II du plasmide pTG848 décrit dans le brevet principal.Le plasmide obtenu après ligation, pTG892b, contient le fragment BamHI-BgIII correspondant à la partie codante de la phéromone insérée derrière le site Bill du promoteur du gène PGK. L'ADN de pTG892b comprend un site unique Bill, un site unique SalI, les deux sites enc adrent une courte séquence comprenant un site Pstl. Par double digestion BgIII et Sall, élution du grand fragment et ligation avec un polylinker synthétique, on a remplacé la courte séquence par le polylinker synthétique. Ce polylinker de séquence 5'-GATCCAGCTGACATCTGCATGCG GTCGACTGTAGACGTACGCAGCT-5' présente une extrémité cohésive avec les fragments libérés par BRIII, une extrémité cohésive avec les fragments -libérés par Sall, ainsi que des sites de reconnaissance pour, entre autres, les enzymes Pvul, Bglli et Sphr. Le nouveau vecteur ainsi obtenu a été appelé pTG1819. L'ADN de ce vecteur a été digéré par les enzymes Sphl et Pstl. Par cette double digestion, on obtient trois fragments : un Pstl-Pstl de 6,5 kb, un Pstl-Sphl de 1,9 kb et un autre Sphl-Pstl de 0,5 kb Les deux fragments les plus longs ont été purifiés et mélangés avec le fragment Sphl-Pstl correspondant à l'hirudine mutée et provenant du phage M13TG1827, on a ainsi obtenu un nouveau vecteur d'expression pTG1828 (figure 6). EXEMPLE 3 Transfert du fragment dans le vecteur pTG881: nouveau plasmide pTGl833 L'ADN de pTGg81 a été partiellement digéré par Pstl, de façon à libérer un fragment de 6,1 kb. Ce fragment a été isolé puis digéré totalement par BglII, ce qui libère 2 fragments Pstl-Pstl et Pstl-Bglll. Ces deux fragments ont été ligués avec le fragment Pstl-Bgill de 0,62 kb issu de pTGls28. On reconstitue ainsi un nouveau vecteur pTG1833 qui ne diffère du plasmide pTG897 que par la délétion des séquences codant pour Glu Ala Glu Ala.La structure du précurseur ainsi formé est présentée sur la figure 7.Ce plasmide pTG1833 possède une origine de réplication pour E. coli, un gène de résistance à l'ampicilline, le gène Leu2 de S. cerevisiae, un fragment du plasmide 2 qui permet la réplication dans S. cerevisiae, le -promoteur du gène MFalphal codant pour pré-pro et le gène de I'hirudine (figure 6). EXEMPLE 4 Transformation de la levure par les plasmides pTG1828 et pTG1833 On a transformé la souche S. cerevisiae TGYlsp4 (Matalpha ura3-251-373-328 his3-ll-15) par les plasmides pTG1818 (décrit dans le brevet principal), pTG1828 et pTG1833. Les résultats reportés dans le tableau 1 indiquent que pTGl8l8 et pTG1833 provoquent la sécrétion d'un même niveau d'activité hirudine. Par contre, TGYlsp4 pTGl828 sécrète deux fois moins d'activité hirudine que les deux autres souches.Comme contrôle, on a inclus une souche TGYlsp4 pTG881 qui ne possède pas l'information génétique pour l'hirudine. On a également comparé la production d'hirudine sécrétée par les souches de S. cerevisiae (Mat a) TGY14-1 transformée soit par pTG1828 soit par pTG1833 et TGY14-2 transformée par les mêmes plasmides (tableau 2). Là encore, on remarque que dans le cas de la souche TGY14-2 (type sexuel Matalpha), le plasmide pTG1833 induit une meilleure sécrétion d'hirudine que le plasmide pTG1828. Par contre, dans le cas de la souche TGY14-1 (type sexuel Mat a) pTG1833 n'induit pas de sécrétion d'hirudine, comme attendu, alors que TGY14-2 produit l'hirudine. TABLEAU 1 Activité antithrombine des surnageants de cultures de levure (10 ml) (48 h de culture, milieu YNBG et casaminoacides 0,5 %) Réceptrice Plasmide Activité totale TGYlsp4 pTG881 non détectable pTG1818 158 pTG1828 73 pTG1833 149 TABLEAU 2 Activité antithrombine des surnaReants de culture de levure (10 ml) t72 h de culture, milieu YNBG + casaminoacides 0,5 %} Réceptrice Plasmide Activité totale TGY14-1 pTG881 non détectable pTG1828 54 pTG1833 non détectable TGY14-2 pTG881 non détectable pTG1828 103 pTGl833 210 EXEMPLE 5 Isolement de souches pouvant être cultivées en milieu complet sans que le phénotype plasmidique soit perdu On a montré dans le brevet WO 86/01224 que l'introduction de certaines mutations conférant la résistance au 5-FU dans une souche ura3 transformée en ura+ par le biais d'un plasmide permettait un plus grand choix de milieux pour la culture de ces souches transformées ; on pourraît en particulier utiliser les milieux complexes industriels.A partir de la souche TGYlsp4 pTG1833 on a isolé des mutants spontanés capables de former des colonies sur milieu complet (YPG) supplémenté avec du 5-Fluorouracile I mg/ml suivant le protocole décrit dans le brevet WO 86/01224. 6 mutants ont été cultivés en milieu complet et on en a choisi un qui ne présentait aucune colonie guérie pour le plasmide après plus de 20 générations de croissance en conditions non sélectives. Le mutant, appelé TGYlsp4-3, peut être utilisé pour la production d'hirudine en milieu complet. Les souches suivantes ont été déposées à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cédex 15, le 6 juin 1986 . Saccharomyces cerevisiae TGYlsp4 pTG1828, sous le n" 1-569 . Saccharomyces cerevisiae TGYlsp4.3pTG1833, sous le n" 1-570. REFERENCES I) Achstetter, T. et Wolf, D.H. (1985) EMBO Journal 4, 173. 2) Zoller, M.J. et Smith M.H. (1983) Meths in Enzym. 100, 469. 3) Lathe, R. ; Kieny, M.P. ; Skory, S. et Lecocq J-P (1984)DNA 3, 173. REVENDICATIONS I ) Bloc fonctionnel d'ADN permettant la préparation de l'hirudine à partir de levure, caractérisé en ce qu'il comporte au moins la séquence -Str-Lex -Sc-gène gène H étant le gène de l'hirudîne ou l'un de ses variants, Str est une séquence d'ADN comportant les signaux assurant la transcription du gène H par la levure, . Lex est une séquence leader nécessaire pour obtenir l'excrétion du produit du gène, Stl est une séquence d'ADN codant pour le site de clivage par la protéinase yscF, site de clivage qui est unique et situé dans le précurseur de l'hirudine immédiatement en amont du gène H. 2) Bloc fonctionnel selon la revendication I, caractérisé en ce que la séquence L ex est celle qui permet la sécrétion de la phéromone sexuelle alpha de levure. 3) Bloc fonctionnel selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la séquence 5tr comporte un promoteur d'un gène de levure différent du promoteur du gène MFalphal. 4) Bloc fonctionnel selon la revendication 3, caractérisé en ce que la séquence 5tr comporte le promoteur du gène PGK de levure. 5) Plasmide comportant les éléments nécessaires à l'excrétion de l'hirudine dans une levure, caractérisé en ce qu'il comporte un bloc fonctionnel selon l'une des revendications I à 4 et au moins une origine de réplication dans la levure. 6) Plasmide selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'origine de réplication est celle du plasmide 2. 7) Plasmide selon l'une des revendications 5 et 6, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, le gène URA3. 8) Levure transformée par un plasmide selon l'une des revendications 5 et 6. 9) Levure selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un Saccharomyces. 10) Levure selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'il s'agit de S. cerevisiae. 11) Levure selon l'une des revendications 9 et 10, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de type sexuel Mata ou bien d'une souche diplolde ou polyplolde dépourvue de type sexuel. 12) Levure selon l'une des revendications 8 à 11, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche qui, après transformation, résiste au 5-fluorouracile. 13) Procédé de préparation d'hirudine par fermentation d'une levure selon l'une des revendications 8 à 12 et récupération de l'hirudine produite dans le milieu de culture sous forme mature. 14) Hirudine obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 13. 15) Application de l'hirudine selon la revendication 14 à titre d'agent anticoagulant. 16) Application selon la revendication 15 à titre de médicamenr.