FR 2602145 A1 19880205 FR 8710723 A 19870729 L'invention se rapporte à un nouveau milieu de contraste pour des images médicales de RMN. Entre autres, le amelioree nouveau milieu de contraste présente une stabilitépar comparaison avec des préparations de propriété similaire. Ils 5 conduisent à des taux augmentés de relaxation du proton de l'eau. Ce nouveau milieu de contraste se présente sous la forme d'ions paramagnétiques contenant des liposomes, liés à des macromolécules physiologiquement acceptables. Les images RMN (MRI) constituent une technique 10 relativement nouvelle, qui procure une image très dimensionnelle du corps humain ou de certains de ses organes d'une manière non envahissante. La valeur de diagnostic de 1H MRI est grandement renforcée, lorsque l'information de la densité de protons est superposée à l'information du temps de relaxation du proton. Il est établi que les temps de relaxation du proton de l'eau du tissu reflète non seulement la composition et la complexité structurale du tissu, mais également l'état physiologique ou pathologique de celuici. Les agents de contraste MRI sont très utiles pour perfec20 tionner la délimitation de structures d'organes, pour la caractérisation des fonctions physiologiques et pour la différenciation des tissus. On emploie généralement dans ce but des ions paramagnétiques ou des radicaux libres qui raccourcissent considérablement le 25 temps de relaxation de l'eau à des concentrations relativement faibles. Mais l'emploi de telles matières comme agents d'accentuation du contraste comporte deux inconvénients sérieux, notamment la toxicité de ces agents et la difficulté de leur acheminement vers les tissus visés. Certaines des 30 plus efficaces sondes paramagnétiques de relaxation telles que Mn2+ et Gd3+ ou des nitroxydes stables sont fort toxiques, meme à faible dose. De plus, leurs voies métaboliques n'ont pas été bien établies. La toxicité peut être surmontée, dans une certaine mesure, par la complexation des ions à l'aide de forts agents complexants, tels que DTPA ou EDTA, mais cela limite l'emploi des agents complexés au courant et aux vaisseaux sanguins. Récemment, l'utilisation de Mn2±DTPA piégé dans des liposomes multilaminaires a été étudiée par CARIDE et Col. "Mag. Resonance Imaging 2, 107 (1984)". On a trouvé que l'emprisonnement dans les liposomes altère la biodistribution du chelate métallique et que l'accumulation de 54Mn augmente nettement dans la rate et dans le foie avec quelques réductions dans le coeur et les reins, par rapport à Mn-DTPA libre. L'accumulation dans le foie semble indiquer 10 la fuite du complexe des liposomes et sa dissociation subsécante. Les activateurs de contraste des images de résonance magnétique nucléaire suivant l'invention comprennent des ions paramagnétiques liés à des macromolécules phy15 siologiquement acceptables, emprisonnés dans des liposomes. La fixation des ions paramagnétiques à des macromolécules exalte la vitesse de relaxation du proton de l'eau; ainsi des quantités plus petites de tels ions peuvent être employées. Cela est important étant donné la nette toxicité 20 de tels ions. Les ions liés à des macromolécules ont moins tendance à fuir des liposomes, d'o une durée de vie utile prolongée dans le corps. Les agents de contraste, suivant l'invention, grâce à l'emploi de liposomes spécifiques, permettent d'atteindre mieux des organes spécifiques, ainsi 25 que les tissus normaux ou tumoraux. Des liposomes types faits pour diriger un agent à certains organes du corps humain, peuvent être utilisés à cet effet; voir par exemple WEINSTEIN "UCLA Symp. Mol. Cell. Biol. 4,441 (1983)". Les ions paramagnétiques peuvent être liés à des macromolécules apropriées; des macromolécules de choix sont certaines protéines, spécialement celles de sérum humain qui réduisent la réaction immune..Les propriétés de liaison des protéines peuvent être utilisées pour la fixation des ions: le sérum albumine bovine (BSA) est connu pour lier le man35 ganèse et le gadolinium avec intensification de la relaxa- tion du proton: Biochem 2, 910 (1963) et Biochem 10 (1971), 2834. Les essais des inventeurs ont montré qu'on peut employer avantageusement l'albumine du sérum humain ainsi que les beta- et gamma-globulines; ces essais ont démontré qu'une solution d'une telle protéine à 10% (poids/poids), dialysée contre une mM Mn2 fixait 68% des Mn2 et 53% et 14% respectivement pour les globulines. Suivant un autre trait de l'invention les ions paramagnétiques sont complexés au moyen d'un agent complexant 10 énergique, tel que DTPA ou EDTA. Des ions de choix sont Mn2+ et Gd3+, mais le même système peut être employé avec d'autres ions métalliques,appropriés. Des complexes, ainsi obtenus, conduisent à une accentuation sensible de la relaxation et leur emprisonnement à l'intérieur des liposomes 15 ne réduit pas l'effet de relaxation; cela semble être dû à la diffusion rapide des molécules d'eau à travers le système de membrane du liposome, produisant un échange rapide,à l'échelle du temps de la RIN une moyenne améliorée des temps de relaxation. La préparation des protéines emprisonnant des li20 posomes est bien connue dans l'art et n'a donc pas besoin d'être décrite ici en détail. On peut voir par exemple l'ouvrage " Liposome Technology, Vol.1 to 3, BOCA BATON, FLORIDA, CRC PRESS, 1984". Dans les exemples qui suivent, les vésicules ont été préparées comme indiqué dans Biochemistry 20, 833 (1981). L'invention est illustrée non limitativement par les exemples suivants mais, bien entendu, on peut utiliser d'autres ions, protéines, agents chelatants differents et des modes de pré30 paration des complexes et des liposomes différents, sans sortir du cadre de l'invention. Ainsi, par exemple peut-on employer des polymères liposomes synthétiques. EXEMPLE 1 La matière de départ est constituée par 0,3 ml de 35 lécithine d'oeuf (phosphatidyl choline, marque SIGMA) dans du dioxane. Ce dernier est éliminé par évaporation dans un courant d'azote. On ajoute 0,5 ml de chloroforme, on évapore et lyophilise. On ajoute ensuite; 0,06 g de noctyl beta P-D-glucopyranoside avec 0,5 ml de CHCl3. Après agitation, le mélange est agité, évaporé et lyophilisé. On ajoute 1 ml d'albumine de sérum humain à 10% avec 2 mM de MnCl2, 20 mM de Hepes et 130 mM de NaCl, et la solution est dialysée contre deux charges de 250 ml de la même solution, sans les protéines de la première dialyse, pendant 24 heures, et une 10 seconde pendant 48 heures. Le contenu du sac de dialyse est lavé trois fois par ultracentrifugation à 5 C, pendant une heure chaque fois. Le précipité final consiste en les vésicules lavées qui contiennent du Mn-HSA (manganèse albumine de sérum humain). EXEMPLE 2 Les opérations de l'exemple 1 sont répétées, sauf que l'albumine du sérum humain est remplacée par une solution à 10% de beta globulines. Des vésicules ont été obtenues de la même manière que dans l'exemple précédent. 20 EXEMPLE 3 L'exemple 1 a été répété, mais avec une solution de 10% d'alpha globulines à la place de la sérum albumine humaine. Des vésicules similaires ont été obtenues. EXEMPLE 4 On a opéré comme dans les exemples 1 à 3 mais avec 1 mM de MnCl2 au lieu de 2 mM. Les vésicules obtenues contenaient une concentration correspondante de Mn2. EXEMPLE 5 En opérant comme dans les exemples 1 à 4 on a uti30 lisé le complexe IgGEDTA. On a obtenu des vésicules conte2+ nant ce complexe avec du Mn EXEMPLE 6 Le mode opératoire des exemples 1 à 4 est répété, avec le complexe HSA-EDTA (HSA = sérum albumine humaine). Les vsicules obtenues contenaient ce complexe avec du Mn2+ 35 Les vésicules obtenues contenaient ce complexe avec du Mn EXEMPLE 7 Une série d'essais ont été effectués comme dans les exemples 1 à 6, MnCl2 étant remplacé par GdC13. On a obtenu des vésicules contenant des cations Gd3+ liés. EXEMPLE 8 Des essais comme ceux des exemples 1, 4 et 7 ont été effectués avec remplacement de la HSA par le complexe IgG-DTPA. Des vésicules correspondantes étaient obtenues. EXEMPLE 9 Le mode opératoire des exemples 1, 4 et 7 a été utilisé avec le complexe HSA-DTPA au lieu de la HSA. Des vésicules correspondantes ont été obtenues. RESULTATS DE LA FIXATION DU MANGANESE ET LA 15 VITESSE DE RELAXATION DU PROTON POUR DES LIPOSOMES CONTENANT DU Mn2 ET DES PROTEINES DU SERUM. Voici quelques exemples des effets observés. Par l'absorption atomique on a mesuré les concentrations des ions manganèse dans des tampons (essais en blanc) et dans des suspensions de liposomes contenant 10% (poids/poids) de protéines de sérum humain. Le volume, occupé par les liposomes, représentait environ 20% de la suspension. L'excès de la concentration en manganèse dans la suspension, sur celui du tampon, indiquait la fixation du manganèse sur 25 les protéines des vésicules. On peut voir au tableau 1 donné plus loin, que la fixation la plus forte est obtenue avec de la sérum albumine. Les mesures étaient effectuées avec deux fréquences typiques, 21 MHz et 42 MHz qui sont utilisées pour les images 30 en RMN. Les résultats du temps de relaxation T1 montrent une très forte décroissance - jusqu'à 33 fois - par rapport aux essais en blanc qui contenaient du manganèse en équilibre avec les liposomes. Même si l'on normalise les résultats 35 à la concentration en manganèse on obtient des augmenta- tions de la relaxation jusqu'à un facteur de 16. Les meilleurs résultats ont été obtenus avec de l'albumine parce qu'elle fixe davantage le Mn2+ et produit ainsi une forte accentuation de la relaxation. Des résultats correspondants furent obtenus avec des liposomes contenant du Gd3+. Les résultats pour Mn2+ et Gd3+ liés à la protéine conjuguée avec EDTA et DTPA donnent moins de relaxation par -ion métallique, mais davantage d'ions fixés par protéine. Ainsi 10 le choix entre ces différents systèmes dépend de l'application-particulière et des résultats chimiques. Les T1 pour les suspensions de liposomes contenant de l'albumine de sérum humain et ions Mn2 à 21 et 42 MHz sont donnés au tableau 1. Les concentrations en ions manganèse libres étaient maintenues constantes tout au long de la préparation des liposomes, y compris durant l'élimination des protéines externes. Ainsi les concentrations ad2+ ditionnelles. en Mn, dans les suspensions de liposomes, sont dues à la fixation de Mn aux protéines dans les lipo20 somes. Dans des essais témoins on a mesuré les temps de relaxation T1 pour des vésicules vides c'est-à-dire des vé2+ 2 sicules contenant du tampon sans Mn2+, ainsi que des vésicules contenant du Mn2+ à la même concentration que les so25 - lutions externes. Bien que les T1 ont quelque peu diminué dans ces échantillons en comparaison avec les solutions des essais à blanc, l'effet des vésicules contenant de la HSA est beaucoup plus grand. La comparaison avec les solutions de sérum albumine, représentée au tableau 1, doivent faire 30 prendre en considération la faible quantité d'albumine et de Mn2 dans les suspensions des liposomes selon le tableau 2. En fait, l'effet normalisé du Mn2 lié, soit essa du22 T1p /AMn2+ est similaire dans les deux essais. Dans un essai complémentaire,les vésicules, chargées avec 10% HSA 35 et 3 mM, Mn2+ ont été lavées avec une solution tampon 2 + 2 exempte de Mn2+. Les résultats pour la concentration totale en Mn2 dans la suspension, mesurés par absorption atomique étaient [Mn23 = 0,31 mM et T1 = 46,3 ms à la fréquence de 42 MHz. La rela5 xation molaire T1 / [2+= 69,7 est comparable à celle des essais antérieurs. Ainsi le fait que le manganèse fixé était enfermé dans les liPosomes n'a pas affecté ses propriétés d' accentuation de la relaxation. On peut conclure que la relaxation obtenue dans 10 les systèmes selon l'invention est largement plus grande pour la même quantité d'ions de métal paramagnitique, toxique: de plus la toxicité est sensiblement réduite puisque les ions métalliques sont piégés dans les liposomes. TABLEAU 1 Fréquence 21 MHz Fréquence 42 MHz Mn2+ ms 1 Echantillon Mn2+,m T1 msS 2T1pTS- l - Tp /A Mn2 T1 ms Tlpls- 1 T r p/& Mn2 Tlm lp-,1 T lp-1M2 Essai à blanc 3000 3000 Albumine - 980 1020 - B-Globuline - 1020 1180 - r-Globuline - 1210 - 1720 - Essai à blanc 0,75 156 6,1 8,1 176 5,4 7,1 Albumine 2,34 4,7 206 130 6,1 158 99 t-Globuline 1,62 13,6 67 77 16,0 57 65 Y-Globuline 0,87 43,5 16,6 137 58,5 11,4 94 Essai à blanc 1,31 34 11,6 8,8 90 10,8 8,2 Albumine 3,12 4,2 226 125 5,0 189 104 -Globuline 2,65 7,4 123 92 8,6 105 78 Y-Globuline 1,51 25,5 27,3 136 30 22,2 111 Essai à blanc 2,64 44 22,4 8,5 52 18,9 7,2 lbumine 5,93 3,5 263 80 4,2 219 66 P-Globuline 4,99 4,7 190 81 5,1 179 76 Y-Globuline 3,07 15,0 44 102 19,5 32 74 o0 ro o _.i a) T = 1 -1 lp = T1. - T1(0) o T1(O) est la valeur de T1 d'une solution identique sans ion paramagnétique. TABLEAU 2 Temps de relaxation du réseau de spin du proton de l'eau dans les suspensions des vésicules avec et sans (ASH) albumine de sérum humain et Mn2+ b Vésicules contenant du 2+ Blanc Vésicules vides c Mn2+ d libre Vésicules contenant ASH et Mn e [Mn2j T1 [Mn2+] T [MHT IMn2+] M- /LVn2+ g (ra) (ms) (mM) s T1 [[HSA 1t T1 1 (mm) (ms(raM) (ms) (M) (MM) (mM) (ms) (s mM-} 0,455 244 0,545 168 0,455 120 0,758 0,222 36 64,2 0,93 123 1,09 85 0,93 75 1,213 0,195 25 97,8 1,86 67 2,18h 46 1,86i 44 2,52 0,248 15 66,6 (a) A la fréquence de RMN de 42 MHz (b) Toutes les solutions à 130 mM NaCl, 20 mM tampon de Hepes. pH 7 (c) Vésicules contenant du tampon suivant (b). Mn2+ ajouté aux solutions externes (d) Vésicules préparées par dialyse contre une solution identique à celle des essais en blanc (e) Vésicules préparées comme pour la solution d'essai; lavées avec solution de l'essai en blanc (f) T1 les temps de relaxation de la même solution, à la fréquence 21 MHz, étaient respectivement 33, 25,5 et 14 ms (g) Tlp est la différence entre Tlldes vésicules de la suspension avec HSA et Mn2+ et de lp 1 2+ ceux nui contiennent seulement Mn2+ Mn2+ est la différence de la concentration en Mn dans les mêmes deux suspensions dans. J Revendications 1. Agent de contraste pour les images de la résonance magnétique nucléaire, perfectionnées, comprenant un liposome, caractérisé en ce que ce dernier renferme une macromolécule à laquelle sont fixés des ions de métal parama5 gnétique. en ce que 2. Agent suivant la revendication 1, caractérisé 2+ 3+ les ions sont ceux de Mn ou Gd3+. 3. Agent suivant la revendication 1 ou 2, carac- térisé en ce que la macromolécule est une prot 10 logiquement acceptable. 4. Agent suivant la revendication 3, en ce que la protéine provient du sérum. 5. Agent suivant la revendication 4, en ce que la protéine du sérum est l'albumine, 15 globuline ou la gammaglobuline. 6. Agent suivant la revendication 5, en ce que les ions sont liés à la protéine par éine physio- caractérisé caractérisé la bétacaractérisé la force d' absorption de celle-ci. 7. Agent suivant une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les ions paramagnétiques sont complexés avec un agent complexant énergique, en particulier EDTA ou DTPA. 8. Agent suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le liposome (vésicules) es phos25 pholipidique. 9. Agent suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on utilise un polymère liposome synthétique. 10. Application de l'agent suivant une des revendi30 cations précédentes à l'obtention des images RMN médicales.