FR 2606029 A2 19880506 FR 8615106 A 19861029 La présente addition concerne des perfectionnements apportés aux vecteurs d'expression de la glycoprotéine env du virus LAV, décrits dans le brevet principal. En particulier, la présente addition concerne de nouvelles constructions apportant des modifications au gène codant pour la protéine env. Les nouveaux virus de la vaccine recombinants portant ces gènes modifiés pourraient assurer une meilleure présentation des déterminants antigéniques de env au système immunitaire de l'homme et donc constituer un vaccin plus efficace contre le SIDA. Il s'agit de nouveaux vecteurs viraux selon le bre- vet principal dans lesquels notamment le gène env a subi au moins deux mutations pour supprimer les sites de clivage par les protéases dans la région de la jonction gp120 et gp40. La suppression du site REKR a déjà été décrite dans le brevet principal pour les plasmides pTG1133 et 1134. Dans les plasmides selon l'invention, on effectue au moins une mutation supplémentaire dans un site correspondant à une séquence KRR située 8 aminoacides en aval de la séquen- ce REKR. La gpl60 ainsi obtenue n'est plus clivée. Les vecteurs selon la présente invention comportent également une séquence codant pour la gp40 dépourvue de la séquence correspondant à son peptide N-terminal hydrophobe dont on pense qu'il pourrait être responsable du pouvoir syncitial de la protéine env c'est-à-dire la capacité pour le virus de fair fusionner les cellules et d'obtenir une cellule géante ou syncitium. Enfin, la présente addition concerne des vecteurs viraux dans lesquels les régions extracytoplasmique et intra- cytoplasmique de la gpl60 sont fusionnées en phase après délétion du peptide hydrophobe C-terminal ce qui permet d'ob- tenir une sécrétion de la glycoprotéine. 2 2606029 De façon générale, les vecteurs viraux selon l'in- vention comportent une séquence codant pour l'une des proté- ines suivantes: J - S - gpl20 gp40 - (tm) - S est un peptide signal, gp120 est la glycoprotéine 120, À J schématise la partie de jonction entre la gp120 et la gp40 dépourvue de site de clivage par les protéases, 10. gp40 est la glycoprotéine 40, tm est un peptide transmembranaire ou bien encore pour une protéine de structure: - S - gp40 - tm ou - S- gpl20 - tm Le peptide signal et la séquence transmembranaire peuvent être ceux du virus responsable du SIDA ou bien être hétérologues, en particulier provenir du virus de la rage ou du VSV ou de tout virus à enveloppe. La gp40 peut éventuellement être dépourvue de son extrémité N-terminale hydrophobe. Comme dans le brevet principal, la présente addition concerne essentiellement l'utilisation de vecteurs viraux pour l'obtention des glycoprotéines codées par le gène env du virus LAV dans des cultures cellulaires. Il s'agit donc dans un premier temps de cellules de mammifères qui ont été infec- tees par un vecteur viral selon l'invention ou bien qui peu- vent contenir l'ADN recombinant correspondant; parmi ces cellules, il faut citer plus particulièrement les cellules diploides humaines, des cultures primaires ainsi que les cellules Vero. Bien entendu, il est possible de prévoir d'au- tres types de cellules. Les glycoprotéines ainsi obtenues peuvent être uti- lisées après purification pour la réalisation de vaccins. 3 2606029 Il est également possible de prévoir l'utilisation directe des vecteurs viraux selon l'invention afin d'effectu- er une vaccination, les glycoprotéines étant alors produites in situ et in vivo. Il est intéressant de prévoir l'utilisation associée de plusieurs agents vaccinants administrés conjointement ou séparément, en particulier les agents vaccinants correspon- dant aux vecteurs exprimant séparément la gpl20 et la gp40 ayant subi la modification décrite précédemment. Par exemple, il peut être intéressant d'utiliser conjointement les agents vaccinants issus des vecteurs 1136 et 1138. Enfin, la présente invention concerne également les anticorps dressés contre les glycoprotéines précédentes obte- nues par infection d'un organisme vivant avec un vecteur viral tel que décrit précédemment et récupération des anti- corps induits après un temps déterminé. Les techniques mises en oeuvre pour l'obtention des glycoprotéines, les cultures cellulaires et les techniques de vaccination sont identiques à celles qui sont pratiquées actuellement avec les vaccins connus et ne seront pas décri- tes en détail. La présente invention sera mieux comprise à la lec- ture des méthodes et exemples suivants. De façon générale, comme cela est décrit au brevet principal, le gène env est modifié par mutagénèse localisée dans un bactériophage M13. Le gène env modifié est ensuite cloné dans un plasmide (en général pTG186POLY) qui permet un transfert par recombinaison in vivo dans le virus de la vac- cine. Les exemples suivants illustreront d'autres caracté- ristiques et avantages de la présente invention. 4 2606029 Sur les figures ci-annexées: - la figure 1 représente une immunoprécipitation des proté- ines synthétisées par les virus recombinants VV.TG.eLAV 1135, 1136, 1137 et 1138. La technique employée est décrite dans le brevet princi- pal. Le virus 1135 synthétise une gp160 qui n'apparait pas dans le surnageant de culture. En ce qui concerne les virus 1136 et 1138, ils produisent des protéines gp120 et gp40 respectivement, associées au culot cellulaire. Le virus 1137 produit une protéine légèrement plus petite que le virus 1135, avec un PM en accord avec celui atten- du. - la figure 2 représente la structure des protéines env syn- thétisées par les virus recombinants décrits dans le brevet principal et dans la présente addition. S: peptide signal H: zone hydrophobe interne TM: zone d'ancrage transmembranaire +: site de clivage gpl20/gp40 -: séquence provenant de la glycoprotéine rabique Exemple 1 Construction du plasmide pTG1135. Les cinétiques de relargage effectuées sur le virus VV.TG.eLAV1133 et 1134 montrent que, bien que la cinétique de coupure entre la gpl20 et la gp40 soit plus lente, le clivage a encore lieu. L'examen de la séquence d'ADN du gène env révèle un autre site potentiel de clivage (KRR), 8 acides aminés eC, aval du premier site de clivage.II peut donc paraître important de muter ce deuxième site afin d'obtenir un virus de la vaccine recombinant qui n'exprime que de la gpl60. Par mutagénèse localisée sur M13TG166 grâce à l'oli- gonucléotide suivant: 'ATTCTGCACCACGTGATTCTGTGCCTTGGTGGGT 3' on obtient un phage dans lequel le deuxième site de clivage est modifié. Les séquences modifiées sont les suivantes: séquence originale: GCA AAG AGA AGA GTG A K R R V f site de clivage potentiel séquence mutée: GCA CAG AAT CAC GTG A Q N H V Le fragment PstI-PstI du phage obtenu (M13TG181) est cloné dans pTG186POLY au site PstI pour générer le plasmide pTG1135. Exemple 2 Construction du plasmide pTG1139. La partie C-terminale du gène env synthétisée par le vecteur de la vaccine recombinant VV.TG.eLAV1135 est une séquence dérivant de la glycoprotéine rabique. Il peut donc paraître utile de disposer également d'un autre recombinant o cette partie C-terminale serait remplacée par la partie C- terminale du gène env du virus LAV. Pour ce faire, on effectue sur le phage M13TG165 la même mutagénèse que celle effectuée (voir exemple 1) sur le phage M13TG166, pour générer le phage M13TG184. Le fragment PstI-PstI de M13TG184 est ensuite reclo- né dans le plasmide pTG186POLY pour générer le plasmide pTG1139. 6 2606029 Exemple 3 Construction du plasmide pTG1136. On voudrait encore disposer d'un virus de la vaccine recombinant exprimant la gpl20 seule. Cette gp120 sera, con- trairement au cas obtenu avec le virus VV.TG.eLAV1132, munie d'une zone d'ancrage C-terminale. Pour ce faire, on élimine par mutagénèse localisée les séquences correspondant à la gp40 dans le phage M13TG181 a l'aide de l'oligonucléotide suivant: 'TGCACTCAGTAATACATACACGTGATTCTGTGCCTT 3' Cet oligonucléotide permet de fusionner en phase les séquences gpl20 (avec les 2 sites de clivage modifiés) et les séquences de la zone transmembranaire de la glycoprotéine rabique K A Q N H V V F Y V L L AAG GCA CAG AAT CAC GTG GTG ±- TTC TAT GTA TTA CTG gpl120 TM rage On obtient ainsi le phage M13TG182. Le fragment PstI-PstI de M13TG182 est ensuite inséré au site PstI de pTG186POLY pour générer le plasmide pTG1136. Exemple 4 Construction du plasmide pTG1137. Le rôle de la zone hydrophobe située à la partie N- terminale de la gp40 est peu connu. Cette zone de la protéine env pourrait être responsable du pouvoir d'induction de formation des syncitia. I1 semble donc intéressant de produire une gpl60 qui ne contiendrait pas cette séquence. 7 2606029 Pour ce faire, on fusionne en phase les s6quences en amont et en aval de la partie codant pour ce peptide hydro- phobe dans le phage M13TG181 grâce à l'oligonucléotide sui- vant s 'CAATAATTGTCTGGCCTGCACGTGATTCTGTGCCTT 3' Ceci permet d'obtenir le phage M13TG183 en réalisant la fusi- on: AAG GCA CAG AAT CAC GTG GTG -- GTA CAG GCC AGA CAA K A Q N H V V Q A R Q gp120 partie hydrophile de la gp4O Le fragment PstI-PstI de M13TG183 est recloné dans le site PstI de pTG186POLY pour générer le plasmide pTG1137. Exemple 5 Construction du plasmide pTG1138. En plus de virus recombinants exprimant la gpl60 ou la gpl20, il peut être utile de générer un virus de la vacci- ne recombinant exprimant la gp40 seule. Pour ce faire, on fusionne les séquences codant pour le peptide signal avec les séquences codantes de la gp40 sur le phage M13TG16 grâce à l'oligonucléotide suivant: 'CAATAATTGTCTGGCCTGAATAGGGAATTTCCCAAA 3' 8 2606029 Ceci permet de générer le phage M13TG180, qui comporte la fusion S TGT TTT GGG AAA TTC j- CAG GCC AGA CAA C F| G K F Q A R Q signal gp40 (partie de la hydrophile) gp rabique Le fragment PstI-PstI de M13TG180 est inséré au site PstI de pTG186POLY pour donner le plasmide pTG1138. Exemple 6 Construction du plasmide pTG1162. Comme dans le cas de la gpl60 (plasmide pTG1139), il peut être important de disposer également d'un virus recombi- nant exprimant une gp40 dans laquelle la zone d'ancrage et la zone intracytoplasmique soient les séquences du gène env du virus LAV plutôt que les séquences correspondantes de la glycoprotéine rabique. Pour obtenir ceci, on remplace le fragment HindIII- BglI de M13TG180 par le fragment HindIII-BglI de M13TG165, en générant le phage M13TG190. Le plasmide pTGl162 est obtenu par clonage du frag- ment PstI-PstI du phage M13TG190 dans le site PstI du plasmi- de pTG186POLY. Exemple 7 Construction du plasmide pTG1163. I1 semble aussi important d'obtenir un virus de la vaccine recombinant qui synthétise une gpl60 non clivée et 9 2606029 sécrétée dans le milieu. En effet, cette protéine pourrait être utilisée comme vaccin tué, en association avec des adju- vants, ou incluse dans des liposomes ou des ISCOMS (Morein et al., Nature (1984) 308, 5958 p.457-60). On construit pour cela le bactériophage M13TG194, dans lequel les séquences codant pour les régions extracyto- plasmique et intracytoplasmique sont fusionnées en phase, grâce A l'oligonucléotide suivant: 5'TCCCTGCCTAACTCTATTTTTTATATACCACAGCCA 3' Le fragment PstI-PstI de M13TG194 est ensuite cloné au site PstI de pTG186POLY pour donner pTG1163. Les protéines recombinantes ainsi obtenues, et en particulier la gpl60 non clivable, peuvent être utilisées dans des kits de diagnostic pour détecter les anticorps potentiels présents dans le sang des malades ayant été en contact avec le virus. Ces tests peuvent être mis en oeuvre selon des processus connus de l'homme de l'art, par exemple par ELISA, RIPA, "W esthern Blot" (Immuno-empreinte). Ces protéines peuvent également être utilisées pour la réalisation d'hybridomes et d'anticorps monoclonaux destinés à détecter la présence de virus dans des échantillons. REVENDICATIONS 1. Vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 18 du brevet principal, caractérisé en ce que le gène env a subi au moins deux mutations pour supprimer les sites de clivage par les protéases dans la région de la jonction gpl20 et gp40. 2. Vecteur viral selon la revendication 1, caracté- risé en ce que les séquences codant pour les régions extracy- toplasmique et intracytoplasmique sont fusionnées en phase, après délétion du peptide hydrophobe C-terminal. 3. Vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 18 du brevet principal, caractérisé en ce que le gène codant pour la gp40 est dépourvu des séquences codant pour la partie N-terminale hydrophobe de cette gp. 4. Vecteur viral selon l'une des revendications 1 18 du brevet principal et la revendication 1 de la présente addition, caractérisé en ce que les régions extracytoplasmique et intracytoplasmique de la gpl60 sont fusionnées en phase, après délétion du peptide hydrophobe C- terminal. 5. Vecteur viral selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence codant pour l'une des protéines suivantes: J - S - gpl20 gp40 - (tm) - À S est un peptide signal. gpl20 est la glycoprotéine 120, J schématise la partie de jonction entre la gp120 et la gp40 dépourvue de site de clivage par les protéases, gp40 est la glycoprotéine 40, tm est un peptide transmembranaire. 6. Vecteur viral selon la revendication 5, caracté- risé en ce que la glycoprotéine 40 est dépourvue de son ex- trémité N-terminale hydrophobe. il 2606029 7. Vecteur viral selon l'une des revendications 1 A , caractérisé en ce qu'il comporte une séquence codant pour une protéine de structure s - S - gp40 - tm ou - S - gpl20 - tm dans laquelle gp40 est la glycoprotéine 40 dépourvue de son extrémité N-terminale hydrophobe, S, tm et gp120 ayant les significations données dans la revendication5. 8. Vecteur viral choisi parmi WVV.TG.eLAV1135 10. VV.TG.eLAV1136 VV.TG. eLAV1137 WVV.TG.eLAV1138. 9. Plasmide choisi parmi: pTG1139 15. pTG1162 pTG1163 10. ADN recombinant correspondant à un vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 9. 11. Culture de cellules de mammifères infectées par un vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 9 ou comportant un ADN selon la revendication 10. 12. Procédé de préparation de glycoprotéine d'enve- loppe de virus responsable du SIDA, caractérisé en ce qu'on cultive des cellules selon la revendication 11 et qu'on récu- père les glycoprotéines produites. 13. Glycoprotéines d'enveloppe de virus responsable du SIDA obtenues par mise en oeuvre du procédé selon la re- vendication 12. 14. Glycoprotéine selon la revendication 13, caracté- risée en ce qu'elle comporte, en outre, une partie de glyco- protéine de la rage. 15. Vaccin caractérisé en ce qu'il est constitué par un vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 9 et/ou par les les glycoprotéines selon l'une des revendications 13 ou 14. 12 2606029 16. Vaccin selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comporte plusieurs vecteurs viraux de structure différente et/ou plusieurs glycoprotéines de structure diffé- rente. 17. Vaccin selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comporte en association les virus VV.TG.eLAV1136 et VV.TG.eLAV1138 ou les glycoprotéines correspondantes. 18. Anticorps dressés contre les glycoprotéines d'en- veloppe du virus responsable du SIDA, caractérisés en ce qu'on inocule un organisme vivant avec un vecteur viral selon l'une des revendications 1 à 9 ou avec les glycoprotéines obtenues selon l'une des revendications 13 ou 14 et en ce qu'on récupère les anticorps formés après un temps déterminé.