FR 2599625 A1 19871211 FR 8707905 A 19870605 La présente invention a pour objet des procédés de production d'activateur du plasminogène de type tissulaire humain biologiquement actif et de ses dérivés, en particulier par cultures de cellules h6tes recombinantes en suspension. L'activateur du plasminogène de type tissulaire humain transforme le plasminogène en plasmine. La plasmine ainsi produite clive par protéolyse les matrices de fibrine qui forment le squelette des cail10 lots sanguins. L'activateur du plasminogène de type tissulaire humain intervient ainsi dans la dissolution des caillots- sanguins et est en conséquence utile dans le traitement de divers troubles liés aux thromboses. L'abréviation "t-PA" pour activateur du 15 plasminogène de type tissulaire humain a été adoptée après proposition à la XXVIIIeRéunion de l'International Committee on Thrombosis and Hemostatis, Bergame, Italie, 27 Juillet 1982. Telles qu'elles sont utilisées dans le présent mémoire, les expressions "activateur du 20 plasminogène de type tissulaire humain", "t-PA humain", "tPA", "activateur du plasminogène tissulaire humain" ou "activateur du plasminogène tissulaire" désignent l'activateur du plasminogène extrinsèque humain (de type tissulaire) produit, par exemple, par extraction 25 de sources naturelles et purification [voir Collen et collaborateurs, demande de brevet européen N 41766 (publiée le 16 Décembre 1981, sur la base d'un premier dépôt du 11 Juin 1980) et Rijken et collaborateurs, Journal of Biol. Chem. 256, 7035 (1981), cités en réfé30 rence dans le présent mémoire], et par des systèmes de cultures de cellules recombinantes, tels qu'ils sont décrits conjointement avec la séquence d'aminoacides et d'autres caractéristiques de la molécule, par exemple, dans la demande de brevet européen publiée 35 sous le N 93619 (publiée le 9 Novembre 1983, sur la base d'un premier dépôt du 5 Mai 1982) , citée en référence dans le présent mémoire. Les expressions concernent également des substances équivalentes à l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain biologi5 quement actif, différant par les motifs de glycosylation, qui sont considérés comme étant dépendants des conditions de culture particulières utilisées et de la nature de l'hôte à partir duquel l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain est obtenu, 10 et différant par un ou plusieurs amino-acides dans la séquence totale. Les chercheurs des laboratoires de la Demanderesse ont produit un activateur du plasminogène de type tissulaire humain, pratiquement dépourvu des pro15 téines avec lesquelles il est habituellement associé, par la technologique d'ADN recombinant dans des hôtes procaryotes et eucaryotes (voir la demande de brevet européen N 93619, ci-dessus). Plusieurs raisons sont liées à la production préférable d'activateur du plasmi20 nogène de type tissulaire humain dans des hôtes eucaryotes recombinants, comme des cellules de mammifères. En général, les hôtes eucaryotes sont efficaces par leur aptitude à reconnaútre et effectuer la glycosylation des résidus amino-acides particuliers dans la 25 molécule d'activateur du plasminogène de type tissulaire humain, qui sont habituellement glycosylés à l'état naturel, à produire les liaisons covalentes naturelles entre divers résidus cystéine de la molécule d'activateur du plasminogène de type tissulaire humain, et 30 à se rapprocher plus étroitement de la structure conformationnelle totale de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain natif. On considère que ces caractéristiques sont importantes pour la production d'un activateur du plasminogène de type tissulaire 35 humain biologiquement actif et sûr. Cependant, la production de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain à partir de cellules hôtes recombinantes n'est pas dépourvue de problèmes concomitants. Ainsi, il a été trouvé que 5 des difficultés, limitant le rendement, surgissent en raison de la culture habituelle des cellules produisant l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain en présence de sérum, de diverses fractions dérivées du sang ou d'autres tissus animaux, ou de 10 leurs hydrolysats. En conséquence, l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain sécrété par ces cellules est mis en contact avec de grandes quantités de protéines sériques et d'autres constituants sériques. Il a été trouvé que certains de ces consti15 tuants compliquent invariablement la purification d'un activateur du plasminogène de type tissulaire humain intact en une forme pharmaceutiquement acceptable car ils forment avec la molécule d'activateur du plasminogêne de type tissulaire humain des agrégats complexes 20 liés, difficiles à séparer. Ces agrégats interfèrent également avec l'activité biologique de la molécule d'activateur du plasminogène de type tissulaire humain, diminuant ainsi les rendements totaux habituellement escomptés en activateur du plasminogène de type tissu25 laire humain intact, biologiquement actif. L'addition de constituants du sérum augmente également la masse d'impuretés qui doit être éliminée au cours de la purification. En outre, la plupart de ces constituants dégradent par protéolyse l'activateur du plasminogène 30 de type tissulaire. La purification de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain désiré obtenu à partir de ces systèmes pose des problèmes techniques, nécessitant en conséquence des modes opératoires plus coûteux. Conformément à ces observations, des milieux dépourvus de sérum ont été proposés lors de tentatives pour éviter des problèmes dans la production et la purification des activateurs du plasminogène produits 5 de manière endogène, sécrétés par des cellules en culture. Voir, par exemple, 1) la demande de brevet européen publiée sous le N 113319 (publiée le 11 Juillet 1984, sur la base d'un premier dépôt du 30 Décembre.1982) qui décrit la préparation de lignées de cellules 10 humaines naturelles indépendantes du sérum, sécrétant de l'activateur du plasminogène de' type tissulaire humain produit de manière endogène, 2) le brevet des Etats-Unis d'Amérique 4 232 124, 3) le brevet des EtatsUnis d'Amérique N 4 328 314, 4) le brevet des Etats.15 Unis d'Amérique N 4 317 882 et 5) Gasser et collaborateurs, In Vitro Cellular and Developmental Biology 21, 588 (1985). Aucune de ces références ne concerne la croissance de cellules à forte densité, et en particulier des cultures de cellules hôtes recombinantes 20 en suspension. D'autre part, la demande de brevet européen publiée sous le N 112940 (publiée le 11 Juillet 1984, sur la base d'un premier dépôt du 30 Décembre 1982) concerne un procédé de production d'activateur du plasminogène de type tissulaire humain comprenant 25 l'addition d'albumine, un constituant protéique du sérum. Divers moyens pour le fractionnement des cultures cellulaires afin d'éliminer, par exemple, des constituants du sérum sont également connus. Voir, 30 par exemple, Van Reis et collaborateurs, The Journal of Immunology 133, 758 (1984), qui ont réduit les teneurs en protéines plasmatiques dans des cultures de leucocytes, diminuant ainsi les impuretés de l'interféron gamma humain brut produit de manière endogène. 35 (Voir également Van Reis et collaborateurs, Methods in Enzymology 119, 77). En Novembre 1982, au Third Annual International Congress for Interferon Research à Miami, Floride, Van Reis et collaborateurs ont décrit l'utilisation d'une filtration à courant transversal 5 pour diminuer les teneurs en protéines plasmatiques autologues dans la séparation d'une culture de cellules humaines de l'interféron gamma humain produit de manière endogène. Cependant, la quantité d'interféron recueillie ne pouvait être accrue sans autre séparation au 10 cours de la production. Un objectif de la présente invention consiste à proposer des procédés pour la production (à grande échelle) et la séparation d'activateur du plasminogène de type tissulaire humain biologiquement actif à partir 15 d'une culture de cellules h6tes produisant de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain. Un autre objectif de la -présente invention consiste à proposer de tels procédés pour la production d'activateur du plasminogène de type tissulaire humain biologi20 quement actif qui soit pratiquement dépourvu de dégradation protéolytique, de déglycosylation, d'inhibition par divers inhibiteurs du type protéase, et de contamination et d'agrégation avec des constituants du sérum. On fait croître des cellules h6tes produisant du t-PA, comme celles qui ont été soumises à une transfection avec des vecteurs recombinants portant de manière utilisable de l'ADN codant pour l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain, dans un 30 milieu de croissance contenant de préférence un ou plusieurs constituants qui, tout en facilitant la croissance des cellules, sont néfastes pour la séparation et l'activité de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain produit par expression. Pratiquement 35 la totalité de ces constituants sont éliminés avant culture ou bien éliminés du milieu de croissance par échange de milieu, de préférence par filtration à courant transversal, au cours de la culture. Après élimination, la culture de cellules hôtes conserve la capacité 5 d'expression avec ou sans la nécessité d'une autre réplication de cellules. L'activateur du plasminogène de type tissulaire humain biologiquement actif est produit ensuite par expression dans les cellules maintenues dans la 10 culture de cellules h6tes pratiquement dépourvue de constituants néfastes. L'activateur du plasminogène de type tissulaire humain biologiquement actif est alors isolé des cellules avant une autre purification le rendant propre à une administration pharmaceutique. 15 De manière inattendue, le procédé de la présente invention permet la production d'activateur du plasminogène de type tissulaire humain intact, purifié, en des rendements considérés comme étant impossibles à obtenir auparavant. En outre, les procédés de la 20 présente invention permettent d'obtenir de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain biologiquement actif ayant une composition comprenant au moins % de forme à une seule chaîne, par rapport au produit ayant une composition comprenant une proportion notable25 ment inférieure de forme à une seule chaîne, obtenu avant les procédés de l'invention. On considère que cela est important, tout en étant en outre inattendu, car cela indique que les procédés de l'invention permettent d'obtenir un produit pratiquement dépourvu de 30 dégradation protéolytique au niveau de divers sites de clivage. En outre, il se révèle que la matière qui est constituée essentiellement d'une forme à une seule chaîne possède au moins la même efficacité qu'une matière comprenant deux chaînes et entraîne une dégrada35 tion moindre du fibrinogène, résultats qui peuvent avoir une importance dans des applications médicales. Description détaillée A. Généralités Dans le cas des cultures de cellules hôtes 5 de mammifères, les constituants néfastes du milieu sont normalement des protéases dérivées du sang ou d'un autre tissu animal, des glycosidases comme la neuraminidase, des inhibiteurs de protéase, l'albumine, etc., qui sont initialement présents dans le milieu 10 permettant la croissance. L'expression "activateur du plasminogène de type tissulaire humain biologiquement actif" désigne l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain décrit ci-dessus qui est capable d'intervenir sur la 15 dissolution in vivo des caillots sanguins de fibrine. L'expression "culture de cellules hôtes" désigne une culture des cellules hôtes produisant du t-PA, comme celles qui ont été soumises à une transfection avec un vecteur d'expression portant de manière 20 utilisable de l'ADN codant pour l'activateur du plasminogène de type tissulaire. L'expression "culture de cellules hôtes recombinantes" désigne une "culture de cellules hôtes" ayant été soumise à une transfection avec un vecteur d'expression portant de manière utili25 sable de l'ADN codant pour l'activateur de plasminogène de type tissulaire. Des systèmes de "culture de cellules hôtes recombinantes en suspension" sont préférés. Des cellules hôtes très diverses peuvent être utilisées dans Ia présente invention.. Les cellules 30 hôtes convenables sont de préférence capables d'être transfectées avec des vecteurs recombinants portant de manière utilisable de l'ADN codant pour l'activateur de plasminogène de type tissulaire humain, produisant par expression de l'activateur du plasminogène 35 de type tissulaire humain biologiquement actif et étant susceptibles de croître et de se maintenir dans une culture en suspension. En conséquence, n'importe quelle cellule hôte qui produit du t-PA et/ou se prête à la technique de l'ADN recombinant pour produire de l'activa-5 teur du plasminogène dé type tissulaire humàin recombinant entre dans le cadre de la présente invention. Les cellules hôtes sont de préférence des cellules de mammifères et comprennent des cellules d'ovaires de hamster chinois (OHC) sécrétant de l'activateur du plasminogène 10 de type tissulaire humain recombinant (voir la demande de brevet européen N - 93619, ci-dessus) (ATCC N CCL61). Dans le procédé de la présente invention, on cultive tout d'abord des cellules hôtes capables de produire de l'activateur du plasminogène de type 15 tissulaire humain sous forme d'une culture en suspension dans un "milieu permettant la croissance". Ce milieu permettant la croissance peut être n'importe quel milieu classique connu dans la pratique, ou bien une de ses variantes, permettant une culture de la 20 lignée cellulaire particulière utilisée pour produire l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain. [voir, par exemple, ATCC Media Handbook, Ed: Cote et collaborateurs, American Type Culture Collection, Rockville, MD (1984)]. Un milieu permettant la crois25 sance de cellules de mammifères, par exemple, contient de préférence une supplémentation en sérum, comme du sérum de veau foetal ou un autre constituant de supplémentation couramment utilisé pour faciliter la croissance et la division des cellules, comme des hydrolysats 30 de viande ou de lait, d'extraits de tissus ou d'organes, de caillots macérés ou de leurs extraits, etc. Le milieu permettant la croissance initiale peut également être un milieu qui permet la croissance et le maintien des cellules hôtes et l'expression de l'activateur du plasmi35 nogène de type tissulaire humain. En outre, un milieu de croissance classique déficient en glycine et/ou hypoxanthine et/ou thymidine et/ou contenant du méthotrexate peut être utilisé pour maintenir une pression de sélection sur les celluleF d'OHC recombinantes conte5 nant un vecteur d'expression capable d'effectuer l'expression de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain, ainsi que de la dihydrofolate-réductase ayant une faible affinité de liaison pour le méthotrexate. D'autres marqueurs pouvant être sélectionnés 10 et/ou amplifiés peuvent également être utilisés. D'autres constituants de milieux convenables comprennent, par exemple, la transferrine, l'insuline et divers métaux. Dans une forme de réalisation, après culture 15 des cellules hôtes à une densité de cellules appropriée, par e x e m p 1 e d'environ 1 x 106/ml à 3 x 107/ml pour des cellules d'OHC, les constituants néfastes dans les milieux permettant la croissance sont éliminés par échange de milieu, de préférence par "filtration 20 à courant transversal". L'expression "filtration à courant transversal" désigne une méthode de filtration dans laquelle une suspension de cellules produisant de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain s'écoule pratiquement parallèlement à un filtre 25 qui est perméable à un constituant de la suspension, autre que des cellules. Le procédé de filtration à courant transversal est caractérisé par une série de paramètres de dynamique des fluides comprenant Re = nombre de 30 Feynolds, Yw = vitesse de cisaillement au niveau des parois, AP = chute de pression et PTM = pression transmembranaire. Re, yw et AP dépendent de la géométrie du système de filtration, des conditions d'écoulement et des propriétés du fluide. Par exemple, si un système 35 de filtration à fibres creuses est utilisé, on peut calculer ces paramètres de la manière suivante: Re = 2PQ /n snTrh s s h yw = 4Qs/nÂrh AP = 8QsLns /nrrh4 s s h équations dans lesquelles p = densité de la suspension cellulaire, Qs = débit de recirculation de la suspension, ns = viscosité dynamique de la suspension, n = nombre de fibres creuses, rh = rayon interne des fibres creuses et L = longueur des fibres creuses. 10 Des équations similaires peuvent être obtenues pour d'autres géométries de voies d'écoulement. La pression transmembranaire moyenne peut être calculée de la manière suivante: PTM = Pen-Pf-AP/2 = QfRnf/A équation dans laquelle Pen = pression d'entrée, Pf = pression du filtrat, Qf = vitesse de filtration, R = résistance de la membrane, A = surface de la membrane et lf = viscosité dynamique du filtrat. Dans une forme de réalisation préférée, la géométrie de la voie d'écou20 lement et les paramètres de fonctionnement sont choisis de manière à réduire au minimum le dép6t des cellules sur la membrane de filtration, augmentant ainsi l'efficacité du procédé de séparation et réduisant au minimum les dégâts cellulaires induits par le cisaille25 ment. Le dépôt des cellules peut être déterminé empiriquement de la manière suivante: PD = 1/2U 23/2 PD v UX/r y c équation dans laquelle PD = paramètre de dépôt ' = viscosité cinématique, U = vitesse de filtration, A = fonction 30 empirique de la concentration en cellules, C et r = c c rayon des cellules. En conséquence, le procédé de filtration à courant transversal est défini par la suspen- 2599625il sion de cellules (p, ns, f, vs Cc et rc), le choix de membrane et de géométrie d'écoulement (n, rh, L, R et A) et l'ajustement des paramètres de fonctionnement (Qs et Qf). Dans une forme de réalisation préférée, la géomé5 trie de la voie d'écoulement et les conditions de fonctionnement sont choisies de manière que Re soit inférieur à 2100 et que PD soit inférieur à 0,35. La concentration en constituants néfastes est réduite par un procédé de filtration à courant 10 transversal dans lequel la suspension cellulaire est remise en circulation par l'appareil de filtration et une partie de l'écoulement est éliminée sous forme d'un filtrat dépourvu de cellules. Un volume constant de suspension cellulaire peut etre maintenu par addition 15 de milieux qui ne contiennent pas de constituants néfastes. La proportion résiduelle finale de constituants néfastes peut être calculée de la manière suivante: ( Vm/Vx) C V e C = ox P V équation dans laquelle Cp =concentration en constituants néfas-. tes dans la suspension de production, Co = concentration initiale en constituants néfastes dans la culture de cellules en suspension, V = volume de suspension cellux laire pendant l'échange de milieu, e = base logarithmique naturelle, V = volume de milieux d'échange et m Vp = volume final de suspension de production. Le volume de milieux d'échange nécessaire pour réduire la concentration en constituants néfastes à un taux prédéterminé 30 peut être calculé de la manière suivante: Vm = Vxln(CoVx/CpVp) équation dans laquelle in = log. naturel. Il est évident d'après cette équation qu'une forme de réalisation préférée de la présente invention comprend une concentration initiale de la suspension cellulaire à une valeur minimale Vx avant l'échange de milieux à volume constant x mentionné ci-dessus. On parvient ainsi à une réduction de la concentration en constituants néfastes I) en 5 concentrant la suspension de cellules en culture de son volume initial V à V; II) en effectuant un échano x ge de milieux à volume constant et III) en effectuant une réduction ultérieure si V est inférieur à Vp x p' Ainsi, par exemple, si le volume de la 10 culture initiale de cellules avant l'échange de milieux est égal à 100 litres, on peut parvenir à une réduction globale de la concentration en constituants néfastes de 000 fois en concentrant la suspension cellulaire à 10 litres, en effectuant un échange de milieux en 15 utilisant 45 litres de milieux et en utilisant un volume de production de 1000 litres. Il est ainsi possible de déterminer quantitativement le facteur de dilution du milieu permettant la croissance initiale au cours de l'échange de 20 milieux de manière que la quantité des constituants néfastes dans la suspension de cellules hâtes résultante soit inférieure à une concentration prédéterminée, réduisant ainsi au minimum les effets défavorables de ces constituants. Ces facteurs de dilution peuvent 25 être déterminés pour chaque lot de milieu de croissance. Par exemple, des milieux de croissance de cellules de mammifères supplémentés avec différentes concentrations en sérum peuvent nécessiter différents facteurs de dilution pour réduire la quantité de constituants 30 indésirables à des concentrations fonctionnellement équivalentes permettant la production d'activateur du plasminogène de type tissulaire humain pharmaceutiquement acceptable. En conséquence, le facteur de dilution peut être choisi de manière que la quantité de 35 sérum dans le milieu final d'expression de cellules de mammif ères soit, par exemple, inférieure à environ 1 % de la quantité totale initiale utilisée. Les systèmes de membranes de filtration utilisés dans la présente invention peuvent être choisis 5 entre tous ceux connus dans la pratique 'ayant une membrane et une configuration convenables, de manière qu'ils soient capables de retenir les cellules productrices d'activateur du plasminogène de type tissulaire humain de la présente invention tout en permettant 10 aux divers constituants néfastes de passer à travers. Ainsi, on peut utiliser n'importe quelle membrane convenable qui permet de retenir des cellules dans les conditions de dynamique des fluides choisies, tout en laissant passer à travers les constituants néfastes afin de 15 les éliminer. Une limite supérieure des diamètres des pores d'environ 5 micromètres et une limite inférieure d'environ 0,1 micromètre sont convenables. Le milieu d'échange frais est pratiquement dépourvu des constituants néfastes. Par exemple, il 20 ne contient aucune quantité notable de constituants néfastes, par exemple de protéases, de neuraminidases, d'inhibiteurs de protéaseq etc. Bien sûr, ce milieu varie suivant le type de cellules utilisé pour produire l'activateur du plasminogêne de type tissulaire 25 humain, et peut être choisi, par exemple, entre ceux disponibles dans la pratique. Il peut être identique au milieu d'expression final (pour des raisons de commodité), ou bien être un milieu un peu moins riche, comme un milieu salin isotonique tamponné. Pour les cellules d'OHC productrices d'activateur du plasminogène de type tissulaire humain décrites dans le présent mémoire, par exemple, le milieu d'expression final peut être formé à partir d'un milieu standard destiné à la culture des cellules d'OHC, non 35 supplémenté avec du sérum de veau foetal. Un exemple du milieu d'expression final est un mélange à parties égales de milieu de Eagle - Dulbecco modifié (teneur élevée en glucose) et de milieu F-12 de Ham. Dans d'autres formes de réalisation, les 5 constituants néfastes peuvent être éliminés, ou pratiquement éliminés, du milieu avant culture ou bien ils peuvent être éliminés, par exemple, par des techniques de centrifugation ou de dépôt. L'activateur du plasminogéne de type tissu10 laire humain est isolé et est ensuite purifié par séparation du milieu d'expression et utilisé comme agent pharmaceutique pour le traitement de divers états ou troubles vasculaires. B. Forme de réalisation préférée 15 Dans une forme de réalisation préférée, des cellules d'OHC capables de produire de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain sont cultivées sous forme d'une suspension dans un milieu pour OHC supplémenté avec du sérum de veau foetal jus20 qu'à une densité de cellules prédéterminée. La suspension cellulaire est alors concentrée par filtration à courant transversal. Le sérum est ensuite éliminé de la suspension concentrée par filtration à écoulement transversal à volume constant tout en ajoutant continuel25 lement du milieu dépourvu de sérum, à la même vitesse que l'élimination du milieu contenant du sérum. L'activateur du plasminogène de type tissulaire humain actif est produit ensuite par les cellules d'OHC en suspension dans le milieu d'expression dépourvu de sérum. L'activa30 teur du plasminogêne de type tissulaire humain ainsi produit est sécrété par les cellules d'OHC dans le milieu d'expression et peut être séparé de celui-ci par des techniques classiques. Des récipients de culture de diverses capa35 cités sont utilisés pour la croissance des suspensions de cellules d'OHC. Chaque récipient de culture est relié par des orifices d'admission à une série de filtres poreux à écoulement tangentiel, qui sont à leur tour reliés par des orifices de sortie à la chambre 5 de culture. Après croissance, les suspensions de cellules d'OHC et le milieu contenant du sérum sont pompés à travers la série de filtres poreux à écoulement tangentiel, tout d'abord pour concentrer la suspension, puis pour permettre l'élimination de la suspension 10 des constituants sériques au cours de l'échange de milieux. La suspension- de cellules d'OHC est recyclée à travers les filtres et le récipient de culture, permettant l'élimination d'une partie du vieux milieu et des constituants sériques. Une quantité de milieu 15 d'expression stérile frais qui-ne contient pas de sérum est ajoutée à la suspension cellulaire pour maintenir un volume nominal dans le récipient de culture. Après diminution de cette manière de la concentration en sérum à une concentration prédéterminée par un échange 20 continu de milieux, les cellules sont transférées par des tubes stérilisés dans un autre récipient contenant un milieu d'expression dépourvu de sérum, dans lequel l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain est sécrété. Ensuite, l'activateur du plasminogène 25 de type tissulaire humain peut être recueilli par des techniques classiques. C. Exemples Croissance des cellules,.échange de milieux et phases de production. Des cellules d'ovaires de 30 hamster chinois (OHC) (ATCC N CCL61), soumises à une transfection avec le vecteur d'expression pETPFR (voir la demande de brevet européen N 93619, ci-dessus), puis permettant l'expressionde t- PA recombinant, ont été ranimées après entreposage en azote liquide et 35 cultivées dans un milieu consistant en mélange dans le rapport 1:1 de milieu F12 de Ham et de milieu de Eagle - Dulbecco modifié. Ce mélange ne contenait pas d'hypoxanthine ou de thymidine. Du sérum bovin foetal dialysé ou soumis à une diafiltration (7 % en 5 volume/volume) et du méthotrexate (à 500 nM) ont été ajoutés au milieu. Les cellules ont été cultivées en suspension dans des récipients en verre mis à incuber à environ 37 C. Une sous-culture des cellules a été effectuée et la population a été accrue dans ce milieu 10 tous les trois à cinq jours. Lorsqu'une quantité suffisante de cellules a été accumulée, ces cellules ont été transférées dans un fermenteur en acier inoxydable - de 10 litrespour une durée supplémentaire de croissance d'environ 3 jours. Pour cette phase de croissance, 15 la composition du milieu a été modifiée pour obtenir de meilleurs rendements en cellules, et contenait de l'hypoxanthine et de la thymidine, mais pas de méthotrexate. Du sérum bovin foetal non dialysé a été incorporé à ce milieu (2 % en volume/volume) et, au 20 cours de la phase de croissance de 3 jours, la densité de population cellulaire a augmenté d'environ 0,25 x 106 cellules/ml à environ 1,0 x 106 cellules/ml. Les cellules ont été alors soumises à un échange de milieux de la manière décrite précédemment, 25 étant remises en suspension dans un milieu de production dépourvu de sérum pendant environ 90 heures. L'échange de milieux a été effectué de la manière suivante: Un filtre à écoulement tangentiel à fibres creuses et un tube d'admission et de sortie an caout30 chouc siliconé associé ont été stérilisés dans un autoclave, puis reliés au récipient de production de litres par des connexions stérilisables à la vapeur d'eau. Le filtre utilisé était une unité de fibres creuses en polysulfone (fabricant: A.G. Technology, 35 Inc., filtre N 1BZE100801AL) contenant 280 fibres creuses ayant des diamètres internes de 0,75 mm et des pores nominaux de 0,1 im répartis le long de ces fibres. Cette unité possédait une surface de filtration de 26,8 cm2. Les cellules ont été remises en circulation 5 par les fibres creuses et renvoyées dans le récipient en utilisant une pompe bilobée Watson Marlow. Une vitesse de recirculation d'approximativement 3,5 litres par minute a été utilisée et, en même temps, une portion du liquide a été prélevée et rejetée sous forme d'un 10 filtrat limpide à une vitesse d'environ 211 ml/min. De cette manière, les cellules ont été retenues et le volume de culture réduit à approximativement ,2 litres. A ce moment, du milieu stérile frais dépourvu de sérum (ayant la même formulation que celle utili15 sée précédemment, mais ne contenant pas de sérum bovin ou de constituants dérivés de ce sérum) a été pompé dans le récipient de culture à une vitesse d'environ 211 ml/min, permettant ainsi de maintenir le volume tout en éliminant constamment par dilution le vieux 20 milieu. litres de milieu frais dépourvu de sérum ont été pompés à travers le système pour obtenir une réduction calculée de la concentration en sérum d'environ 190 000 fois (ou inférieure à 0,0001 % en volume) 25 u n e portion aliquote de la suspension cellulaire étant ajoutée à du milieu frais dépourvu de sérum dans un fermenteur séparé en acier inoxydable de 10 litres. Les cellules ont été alors mises à incuber pour la phase de production pendant environ 90 heures à 37 C. 30 Des échantillons ont été prélevés dans la culture, clarifiés par centrifugation et entreposés à -20 C pour une analyse ultérieure. Dans un second exemple, qui était un essai conduit en parallèle, toutes les conditions, cellules 35 et milieux utilisés étaient similaires, hormis le filtre à fibres creuses. Dans ce cas, le filtre contenait 290 fibres creuses et possédait une surface de filtration de 27,8 cm2, mais était par ailleurs similaire au filtre décrit ci-dessus (fabricant: A.G. Technology, Inc., filtre N 1810902 AL). Modes d'analyse Des échantillons ont été traités et analysés pour démontrer les effets néfastes du sérum bovin sur le t-PA produit par les cellules d'OHC utilisées dans 10 ces exemples. Des échantillons du liquide clarifié de culture cellulaire provenant de la phase de production dépourvue de sérum ont étédécongelés, réduits avec du g-mercapto-éthanol et soumis à une électrophorèse sur dodécylsulfate de sodium en utilisant le 15 système discontinu de Laemmli (Laemmli, Nature, 227, 680 (1970)). Les protéines séparées de cette manière ont été soumises à une coloration à l'argent (Morrissey, Anal. Biochem. 117, 307, (1981))ou ont été transférées sur une feuille de nitrocellulose (transfert pendant 20 4 heures à 80C et 0,5 ampère sur de la nitrocellulose à 0,45 im en utilisant le procédé de Towbin et collaborateurs, PNAS 76, 6350, (1979)).Les protéines t-PA, les fragments protéiques et les complexes de haut poids moléculaire contenant du t-PA ont été visualisés sur 25 la feuille de nitrocellulose par une technique d'immunoessai à liaison enzymatique indirecte décrite de la manière suivante:une réaction initiale avec les protéines t PA liées et un anticorps anti-t-PA a été suivie par traitement avec un second anticorps. Celui-ci était 30 une anti-IgG de lapin (produite chez la chèvre) liée à de la peroxydase de raifort. Après cette réaction, l'addition du 4-Cl-naphtol, servant de substance chromophore, dans H202 et de sérum physiologique tamponné par un phosphate (STP) a eu pour résultat=un développement 35 de coloration dans les régions d'anticorps lié, illus- trant ainsi les modèles électrophorétiques du t-PA et des protéines associées. Ainsi, en utilisant ces techniques, l'état du t-PA dans les liquides de culture bruts a pu être déterminé sans autre purification. Résultats Pour démontrer les effets néfastes du sérum bovin foetal sur le t-PA, des échantillons provenant de la phase de production ont été mis à incuber avec du sérum physiologique tamponné par un phosphate (STP) 10 ou avec 0,175 % en volume/volume ou 1,75 % en volume/ volume de sérum bovin foetal pendant 22 heures ou 46 heures avant d'être analysés de la manière décrite ci-dessus. Les résultats de cette analyse sont indiqués sur le gel coloré à l'argent de la figure 1 et l'ana15 lyse immunologique par tachescorrespondante de la figure 2. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre, faice en regard des dessins 20 annexés sur lesquels: la figure 1 est un gel coloré à l'argent d'échantillons de t-PA obtenus de la manière décrite ci-dessus; et la figure 2 est une analyse immunologique 25 par taches sur un gel identique à celui représenté sur la figure 1. Sur les figures, Bande N Echantillon 1 Poids moléculaires de référence [92,5 kilo daltons (K), 66,2 K, 45 K, 31 K, 21,5 K, 14,4 K] 2 Echantillons de référence contenant du t-PA authentique 3 Liquide de culture cellulaire contenant du t-PA (référence du laboratoire) Bande N Echantillon 4 Liquide de culture cellulaire provenant d'un echantillon obtenu en phase de production Echantillon obtenu en phase de production; incubé pendant 22 heures à 37 C avec du sérum physiologique tamponné par un phosphate (STP) 6 Echantillon obtenu en phase de production; incubé pendant 46 heures à 37 C avec du 10 STP 7 Bande correspondant à un essai à blanc 8 Echantillon obtenu en phase de production; incubé pendant 22 heures à-37 C avec 0,175% (en volume/volume) de sérum bovin foetal 15 (SBF) 9 Echantillon obtenu en phase de production; incubé pendant 46 heures à 37 C avec 0,175% (en volume/volume)de SBF 10 0,175 % (en volume/volume) de SBF seul; incubé pendant 22 heures à 37 C 11 0,175 % (en volume/volume) de SBF seul; incubé pendant 46 heures à 370C 12 Echantillon obtenu en phase de production; incubé pendant 22 heures à 37 C avec 1,75 % 25 (en volume/volume) de SBF 13 Echantillon obtenu en phase de production; incubé pendant 46 heures à 37 C avec 1,75 % (en volume/volume) de SBF 14 1,75 % (en volume/volume) de SBF seul; incubé pendant 22 heures à 37 C 1,75 % (en volume/volume) de SBF seul; incubé pendant 46 heures à 37 C. Sur les figures 1 et 2, les bandes 2 et 3 sont des échantillons de t-PA de référence (t-PA à une seule chaîne représentant la bande de poids moléculaire supérieur et t-PA à deux chaînes représentant les bandes de poids moléculaires inférieurs). Les effets néfastes observés de la présence de sérum bovin foetal (SBF) sont a) une disparition 5 du t-PA intact avec une accumulation concomitante de diverses formes clivées par protéolyse et de leurs fragments (voir les bandes 8 et 9 de la figure 2) et b) la formation d'une matière complexe de poids moléculaire supérieur compris entre 90 et 200 Kdaltons (voir 10 les bandes 12 et 13 de la figure 2). Les résultats montrent que, lorsque le liquide de culture cellulaire dépourvu de sérum, obtenu de la manière décrite ci-dessus sous le titre "croissance cellulaire, échange de milieux et phases de pro15 duction", a été mis à incuber en présence de STP pendant 22 ou 46 heures, il est resté pratiquement non modifié (voir les bandes 5 et 6, figures 1 et 2). Ainsi, une dégradation protéolytique du t-PA et une formation de complexes de t-PA de haut poids moléculaire survien20 nent si on laisse du sérum bovin foetal dans le milieu de culture cellulaire en phase de production. En conséquence, l'élimination du sérum par le procédé d'échange de milieux décrit dans le présent mémoire permet de supprimer pratiquement les effets néfastes de ce sérum. 25 Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Procédé de production d'activateur du plasminogène de type tissulaire humain biologiquement actif dans une culture de cellules hôtes, caractérisé 5 en ce qu'il consiste à éliminer du milieu de ladite culture pratiquement tous les constituants qui sont néfastes pour la séparation et l'activité dudit activateur du plasminogène de type tissulaire humain, tout en conservant la capacité d'expression des cellules 10 hôtes. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les constituants sont éliminés avant culture. 3. Procédé suivant la revendication 1, 15 caractérisé en ce que les constituants sont éliminés du milieu au cours de-la culture par échange de milieu. 4. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que les constituants sont éliminés du milieu au cours de la culture par filtration à cou20 rant transversal, avantageusement à travers une membrane filtrante plate, à travers la paroi d'une fibre creuse poreuse ou bien à travers une membrane enroulée en spirale. 5. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la culture de cellules hôtes est une culture de cellules hôtes recombinantes, avantageusement une culture de cellules hôtes recombinantes en suspension. 6. Procédé suivant la revendication 1, 30 caractérisé en ce que les constituants sont éliminés par développement de la culture de cellules hôtes dans un milieu permettant la croissance et la réplication des cellules, contenant un ou plusieurs constituants qui sont néfastes pour la séparation et l'activité 35 de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain, par élimination de pratiquement la totalité dudit ou desdits constituants de la culture de cellules hôtes par filtration à courant transversal, apport à la culture de cellules hôtes d'une quantité supplé5 mentaire de milieu qui est pratiquement dépourvu de constituants néfastes à la séparation et à l'activité de l'activateur du plasminogêne de type tissulaire humain et est capable de permettre l'expression de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain 10 par ladite culture de cellules hôtes sans qu'il soit nécessaire de favoriser une autre réplication des cellules. 7. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les constituants du milieu permet15 tant la croissance et la réplication des cellules sont obtenus à partir du sang, d'un tissu ou de leurs dérivés. 8. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la culture de cellules hôtes '20 est constituée de cellules de mammifères, avantageusement des cellules d'ovaires de hamster chinois (OHC) soumises à une transfection par recombinaison, capables de produire l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain, par expression de recombinants. 9. Culture de cellules hôtes, caractérisée en ce qu'elle comprend: a) des cellules capables de produire l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain, et b) un milieu i) pratiquement dépourvu de constituants néfastes pour la séparation et l'activité de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain; et ii) capable de permettre l'expression dans ladite culture de cellules hôtes d'activateur 35 du plasminogène de type tissulaire humain sans qu'il soit nécessaire de favoriser une autre réplication cellulaire.