FR 2610409 A1 19880805 FR 8800862 A 19880126 La présente invention a pour objet une méthode et un agent pour la détection de groupes thiol présents dans un milieu ou bien formés au cours d'une étape précé- dant la réaction de détection. Cette formation peut être effectuée par des réactions chimiques telles que, par exemple, la réduction de disulfures, ou bien par des réactions biochimiques. Les réactions biochimiques préfé- rées sont illustrées par l'équation suivante: Liponamide- déshydrogénase a) CONH2 _'_"_'_CCNH2 SH SH 43 de NADH+H NAD CHe [ 3 Cholinestérase b) CH3-1-CH2CH2-S-C-CH3 J i CH3 CH3 LCH3-N-CHZCH2-SH + CH3COOH CH3 De nombreuses méthodes sont connues pour la détection de composés contenant des groupes thiol. Une méthode particulièrement utile et fréquemment mentionnée est celle décrite par G.K. Ellman dans "Arch. Biochem. Biophys. 1959, 82, 70-77", qui est basée sur la formation de l'anion jaune de l'acide 3-mercapto-6-nitrobenzoaique, qui est formé par réaction entre un thiol et l'acide 3,3'-dithio-bis-6-nitrobenzoique (réactif d'Ellman). Un inconvénient important du réactif d'Ellman est la seule obtention de nuances de coloration jaune par 2610 4 0 9 les disulfures réduits. Cependant, des nuances de colo- ration allant du rouge au bleu seraient souhaitables pour le dosage visuel des groupes thiol. Précisément, ces nuances de coloration peuvent être développées par la méthode conforme à la présente invention. La présente invention est basée sur la réaction fondamentale suivante: - 2 R-SH + 2 Fe 3± R-S-S-R + 2 Fe2+ Le fer au degré d'oxydation 3 est réduit par des groupes thiol en fer au degré d'oxydation 2, les groupes thiol étant eux-mêmes oxydés en disulfures. L'ion Fe2+ formé est alors transformé par des ligands convenables en complexes, dont le coefficient d'extinction moléculaire est un multiple du coefficient d'extinction moléculaire 3+ 2+ des complexes Fa. En outre. Les complexes Fe présentent 3+ un décalage comparativement aux complexes Fe, de sorte qu'une variation nette de couleur peut être observée. La présente invention a pour objet un agent analytique destiné à la détection des groupes thiol, qui contient des ions Fe3 qui peuvent être réduits en ions 2+ Fe par les groupes thiol et un ligand complexe sui est capable de former un complexe coloré avec les ions Fe formes. La détection des ions Fe2 au moyen de ligands complexes convenables sous forme de complexes colorés est connue. Des exemples de ligands convenables à cet effet sont des composés choisis dans le groupe comprenant les ferroines, les cuproines et les terroines. Des ligands complexes tels que les hydrazones et leurs formes azoiques tautomères, les tétrazolylpyridines, les pyridylquinazolines, les bisisoquinolines, les imines, les phénanthrolines, les bipyridines, les terpyridines, les bidiazines, les pyridyldiazines, les pyridylbenzimid- azoles, les diazyltriazines, les orthonitro-anilines, les phénols, les tétrazines, les triazines, les pyridines, la phénazine, les quinoxalines, les benzimidazoles, les oximes de méthyl- ou phényl-2-pyridyl-cétones sub- stituées, conviennent particulièrement (Smith, Analyt. Chem., 26 (1954) 1534-1538; Schilt et collaborateurs, Talanta 15 (1968) 475-478; Schilt et collaborateurs, Talanta 15 (1968) 1055-1058; et Schilt et collaborateurs, Talanta 16 (1969) 448-452. Une description d'autres ligands complexes se trouve dans Blandamer et collaborateurs, J. Chem. Soc. Dalton (1978), 1001-1008, Case, J. Org. Chem., 31 (1966), 2398-2400, ainsi que dans la demande de brevet britannique N 701 843. Cependant, des ligands complexes autres que ceux qui y sont mentionnés peuvent également être utilisés. Pour l'utilisation de l'agent analytique et donc également des ligands complexes dans des bandelettes analytiques, il peut être avantageux que les ligands complexes portent également des radicaux hydrophobes ou des fonctions jouant le rôle d'échangeurs d'ions. La liaison des ligands complexes à la matrice est ainsi améliorée et "l'exsudation" de la bandelette analytique est ainsi évitée. Les radicaux hydrophobes qui peuvent être utilisés sont des radicaux alkyle ou aralkyle à chaînes longues. La liaison des ligands complexes à des polymères est également concevable. L'agent analytique conforme à la présente invention peut être utilisé pour la détection de thiols tels que l'amide de l'acide liponique, la thiocholine, le glutathion ou le coenzyme A, ou bien de thioglycosides. Le thiol peut également être présent à l'état de précurseur sous forme d'un thioester, d'un thioéther, d'un disulfure ou d'un thioacétal dansl'agent analytique. Ainsi, l'agent analytique conforme à la présente invention convient également, par exemple, pour la détection d'enzymes qui clivent des composés thio. Dans ce cas, on peut mentionner des thioéther-hydrolases, des thioestérases ou des thioglycosidases. Cependant, des estérases telles que la cholinestérase (CHE) peuvent également être détectées. Le substrat naturel de la CHE est l'acétylcholine. Cependant, cet enzyme est également capable de cliver l'acétyl- et la butyrylthiocholine. Le groupe thiol libre formé par le clivage est ensuite détecté au moyen de l'agent analytique. Des réactions biochimiques dans lesquelles des groupes thiol libres sont formés par l'intermédiaire de réactions redox sont en outre connues. On peut mentionner dans ce cas la réduction de l'acide liponique catalysée par la liponamide-déshydro- génase en présence de nicotinamide-adénine-dinucléotide réduit (NADH). En conséquence, il est possible également d'utiliser l'agent analytique conforme à la présente invention dans l'analyse concernant des réactions qui dépendent du NADH. Des exemples classiques d'enzymes dépendant du NADH qui peuvent être mentionnés sont: la lactate-déshydrogénase, l'alcool-déshydrogénase, la glucose- déshydrogénase, la glycérolaldéhyde-déshydrogénase, la glycérolphosphatedéshydrogénase, la malate-déshydrogénase, etc. Le NADH peut également être le produit final de réactions enzymatiques à plusieurs étapes, comme dans le cas de l'analyse de la glutamate-oxalo-acétate-transaminase (EC 2. 6.11), de la glutamate-pyruvate-transaminase (EC 2.6.12) ou de la créatine-quinase (EC 2.7.32). Le NADH peut être également le produit de réaction dans l'analyse de substrats tels qu'un lactate, -30 le glucose, un malate, l'urée, etc. Par l'utilisation de l'agent analytique conforme à la présente invention dans l'analyse de réactions dépendant du NADH, on parvient à une amélioration notable de sensibilité, en particulier en raison de la formation de deux moles de Fe2 par mole de NADH et de coefficients d'extinction très élevés présentés dans certains cas par les complexes colorés. Il s'est révélé avantageux de fournir le comulexe Fe3 lié au substrat du groupe thiol. Les agents complexants possibles sont l'EDTA, le HEDTA, l'acide citrique, l'acide malique, l'acide lactique, des amino- acides tels que, par exemple, l'alanine, la glycine et la glutamine, des éthers à configuration en couronne tels que, par exemple, un 18-couronne-6, le phénylaza-15- couronne-5, le benzo-15-couronne-5 et le dibenzopyridino-15-couronne-5, ou des triazinophanes et des cryptates, et des sucres oxydés tels que, par exemple, l'acide gluconique et l'acide glucuronique. Le rapport des concentrations thiol:Fe3 doit être au moins égal à 1:1 et, de préférence, à 1:5. Le rapport 1:20 est particulièrement apprécié pour la réaction la plus rapide possible, et le rapport 1:10 est particu- lièrement avantageux. Il doit être entendu que l'aaent analytique ou la composition analytique, dans le contexte de la présente invention, désigne, par exemple, ceux dont la mesure peut être effectuée dans une cuve. Outre les ions 3-i Fe et les ligands complexes, les agents analytiques contiennent tous les réactifs nécessaires pour l'analyse particulière d'une substance, tels que des enzymes, des substrats, des co-enzymes, des substances effectrices, des antigènes, des anticorps, etc. Ces agents analytiques peuvent en outre contenir également des substances ne réagissant pas, telles que, par exemple, des tampons, des agents mouillants et des stabilisants. Comme décrit ci- dessus, des enzymes qui forment des groupes thiol au moyen de NADH et de NADPH comme co-enzymes sont la liponamide- déshydrogénase et la glutathion-réductase. Des associations de réactifs peuvent être préparées à partir des enzymes, des réactifs et des substances mentionnés, en mélange sous forme d'une solution ou d'une poudre ou bien étant sous forme de comprimés ou d'un lyophilisat. L'asso- ciation de réactifs (si elle n'est pas déjà sous forme d'une solution) est mise dans de l'eau ou un autre solvant convenable et une solution de réactif est préparée. Si l'association de réactifs consiste en constituants distincts, ces derniers doivent être mélangés les uns aux autres. Après le mélange de l'échantillon (par exemple une solution de substrat, une solution d'enzyme, du sérum sanguin, du plasma ou de l'urine), à une portion aliquote du mélange de réactifs, la couleur formée est mesurée sur un photomètre et la concentration particulière ou la concentration en substrat est calculée au moyen du coefficient d'extinction moléculaire et des volumes de réactif ou d'échantillon ajoutés. Des mesures de cinétique et au point final sont possibles. Le mélange composition Fe 3+/ligand peut en outre être fixé par imprégnation, conjointement avec le' ou les réactifs ou autres enzymes nécessaires pour la détection d'un paramètre particulier, la composition de tampon, des agents mouillants et des activateurs lorsque cela est requis, ainsi que d'autres substances auxiliaires sur des supports de réactifs absorbants tels que des papiers, des voiles, etc. A cet effet, une ou plusieurs solutions d'imprégnation peuvent être préparées sous forme de solu- tions aqueuses, organiques ou mixtes, suivant la manière dont se dissolvent les réactifs ou les substances auxi- liaires. Des supports absorbants ou pouvant gonfler, de préférence du papier-filtre ou un voile absorbant de verre ou de matière plastique, sont imprégnés ou bien traités par pulvérisation avec ces solutions. Les supports sont ensuite déshydratés. Les supports de réactif ainsi préparés peuvent être utilisés sous forme de systèmes rapides de diagnostics pour la détermination directe des teneurs d'un liquide (par exemple dans des liquides biologiques, tels que le sang, l'urine ou la salive, ou bien dans des produits alimentaires, par exemple des jus de fruits, ie lait, etc. Le liquide est ensuite directement mis en contact arec le support de réactif ou bien ce dernier est brièvement immergé dans le liquide. Une détermination semi-auantitative est possible en plaçant une couleur de référence à côté de la couleur ainsi formée. Une évaluation quantitative peut être effectuée par photométrie-réflectométrie. Il est également possible d'introduire l'agent analytique conforme à la présente invention dans des matrices servant de supports, préparées à partir de solu- tions destinées à être coulées. Des exemples pouvant être mentionnés dans le présent mémoire sont la cellulose, des dérivés de cellulose, la gélatine, des dérivés de gélatine ou des matières plastiques, telles que des polyuréthannes et l'acrylamide. Dans ce cas, il est avantageux de pouvoir ajouter directement l'agent analytique et, lorsque cela est approprié, les autres réactifs nécessaires à la solution destinée à être coulée, ce qui signifie qu'il est possible de produire le dispositif analytique, consistant en le support et les réactifs, en une opération. En chassant par élution les réactifs précités au moyen d'eau, un tampon ou de sérum, du support absor- bant, une solution de réactif peut être préparée, au moyen de laquelle il est possible de doser des substrats ou des enzymes dans la cuve d'un photomètre, de la manière décrite ci-dessus. Des tampons convenables pour les agents ana- lytiques mentionnés sont les tampons au phosphates, citra- tes, borates et GOOD renfermant des ions complémentaires de métaux alcalins ou d'ammonium. Cependant, d'autres systèmes peuvent être également utilisés. Les valeurs de pH qui doivent être atteintes sont comprises dans l'inter- valle de 6 à 10, en particulier de 6,5 à 7,5. Les agents mouillants sont, en particulier, des agents mouillants anioniques et cationiques qui subissent des interactions ioniques avec les composés-conformes à la présente invention. Cependant, des agents mouillants non ioniques qui activent les enzymes peuvent également être utilisés. Le laurylsulfate de sodium, le dioctylsulfo- succinate de sodium et des alkylarylpolyétheralcools sont préférés. Les substances effectrices qui peuvent être utilisées sont celles connues pour la réaction enzymatique particulière. D'autres substances auxiliaires qui peuvent être appropriées sont les épaississants, les agents solubilisants, les émulsionnants, les azurants optiques, les milieux de contraste, etc., usuels tels qu'ils sont connus dans des tests correspondants en association avec d'autres substances chromogènes. Exemple Détection de groupes thiol au moyen de FeCl et de ligands complexes Pour détecter le NADH dans le système ana- lytique décrit, les constituants suivants servant de réactifs ont été introduits dans une cuve: Concentration dans le milieu analytique 1740 i1 de tampon à l'acétate 0,1 M/l pH = 5 87 mmoles/l il de liponamide 2,5 mmoles/l Al de solution de FeCl3 1 mmole/l il de dipyridyle 3 mmoles/l 1l de liponamide-déshydrogénase 12 kU/l Apres la mesure des valeurs-témoins des réactifs, la réaction a été déclenchée par l'addition de ul de solution de NADH. Le maximum d'extinction mesuré se situe à 515 nm. Des recherches de cinétique ont mis en évidence un point final stable (variation d'extinction en 20 minutes = 1 %) après un temps de réaction égal seulement à 1 minute. Pour tester la capacité fonctionnelle et la linéarité, des concentrations de NADH comprises dans l'intervalle de 1 à 10 ramoles/1 ont été mesurées dans l'échantillon analytique. Les différences d'extinction mesurées à 515 nm sont résumées sur le tableau 1. Tableau 1 NADH E51!5 nm (mmoles/1) 1 0,124 2 0,219 3 0,327 4 0,429 0,513 6 0,633 7 0,735 8 0,822 9 0,964 1,098 Les couleurs pouvant être obtenuesavec les différents ligands complexes et les maximums d'extinction correspondants sont résumés sur le tableau 2. 1 1 Tableau 2 Formule Couleur Max max H O r YH rouae 540 2 {"N=N bleu 615 N N---N 3 508 3N CH3 rouge 510 NOH OH s02 1 violet 556 NH2 OCH v 26 1 0 4 0 9 Tableau 2 (suite) Formule Couleur X N-OH O+f 6 HN-rH bleu 650 H3C CH3 7 Nô rouge 522 Nô\ 8 violet 552 SO3Na S0> Na tN" 9 violet 560 OC8H17 H03S N violet 583 26 104Q09 Tableau 2 (suite) Formule Couleur max (n) max (nm) l CIH3CH3 jaune 441 11 H3 CH3 H2N-N=C--- C=N-NH2 H15C7 C7H15 I I H2N-N=C---- C=N-NH2 12 jaune 443 I va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'a titre explicatif, mais nullement limitatif et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1. Agent analytique pour la détection des groupes thiol, caractérisé en ce qu'il contient des ions Fe3 qui peuvent être réduits en ions Fe2 par les groupes thiol et un ligand complexe qui est capable de former un complexe coloré avec les ions Fe2+ formés. 2. Agent analytique suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est destiné à la détection des groupes thiol présents dans l'amide de l'acide liponique, la thiocholine,le glutathion et des thioglycosides. 3. Agent analytique suivant les revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il renferme le groupe thiol à l'etat de précurseur sous forme d'un thio-ester, d'un thio-éther, d'un disulfure ou d'un thio-acétal. 4. Agent analytique suivant les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le ligand complexe destiné aux 2+ ions Fe est issu du groupe comprenant les ferroines, les cuproines et les terroines. 5. Agent analytique suivant les revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le ligand complexe destiné aux 2+ ions Fe est issu du groupe comprenant les hydrazones, les tétrazolylpyridines, les pyridylquinazolines, les bis-isoquinolines, lés imines, les phénanthrolines, les bipyridines, les terpyridines, les bidiazines, les pyridyl- diazines, les pyridylbenzimidazoles, les diazyltriazines, les orthonitroanilines, les phénols, les tétrazines, les quinoxalines, les benzimidazoles, les oximes de méthyl- ou phényl-2-pyridyl-cétones substituées. 6. Agent analytique suivant les revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le ligand complexe renferme en outre un radical hydrophobe. 7. Utilisation de l'agent analytique suivant les revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle est destinée à la détection d'enzymes qui clivent des composés thio. B. Utilisation suivant la revendication 7, caractérisée en ce que les enzymes sont des estérases, des thioglycosidases ou des thio-estérases. 9. Utilisation de l'agent analytique suivant les revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle est destinée à la détection de l'amide de l'acide liponique réduit. 10. Utilisation de l'agent analytique suivant les revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle est destinée à la détection de nucléotides pyridiniques réduits au moyen de liponamides et de liponamide-d:shydrogénase. 11. Méthode de détection d'enzymes, caractérisée en ce que des groupes thiol libres sont formés directement ou indirectement par la réaction enzymatique et ceux-ci sont détectés au moyen de l'agent analytique suivant les revendications 1 à 6. 12. Méthode de détection de substrats, carac- térisée en ce que des groupes thiol sont formés directement ou indirectement par la réaction des substrats et ceux-ci sont détectés au moyen de l'agent analytique suivant les revendications 1 à 6.