FR 2594845 A1 19870828 FR 8602380 A 19860221 La présente invention concerne un procédé de préparation par voie microbiologique d'une enzyme humaine et sa conversion en sa forme active. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé, mettant en oeuvre les techniques de manipulations génétiques in vitro, pour produire "l'activateur tissulaire humain du plasminogè- ne" ("t-PA") dans un microorganisme tel qu'Escherichia coli ainsi qu'un procédé, mettant en oeuvre des méthodes chimiques de dénatu- ration et renaturation, pour convertir l'enzyme ainsi obtenue en sa forme active. Une cause principale de mortalité humaine dans les pays développés est le blocage de vaisseaux sanguins par la formation de caillots (phénomène de thrombose). Dans le plasma des mammifères la synthèse et la dégradation des caillots sanguins relèvent de méca- nismes très finement controlés auxquels plusieurs enzymes partici- pent. La synthèse du caillot est un processus nécessaire pour éviter les hémorragies. Une fois une hémorragie stoppée, le caillot doit être ensuite dégradé pour revenir à une circulation sanguine norma- le. La dégradation des caillots, composés principalement de fibrine, est normalement effectuée par une puissante enzyme fibrirolytique, la plasmine qui dérive d'un précurseur inactif, le plasminogène. Le rôle du t-PA est la protéolyse limitée du zymogène (plasminogène) pour donner l'enzyme active (plasmine) [T. Astrup dans E. Reich, D.B. Rifkin et E. Shaw (ed), Proteases and Biological Control, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, p. 343 et suivantes (1975); J.K. Christman et coll. dans A.J. Barret (ed), Proteinases in Mammaliar. Cells and Tissues, Elsevier/North Holland Biomedical Press, NY, p. 91 et suivantes (1977), E. Reich dans R.D. Berlin, H. Herman, J.H. Lepow et J.M. et J.M. Tauzer (ed) , Molecular Basis of Biological Degradative Processes, Academic Press, NY, p. 155 et suivantes (1978); D. Collen, Thrombosis Haemostasis 43, p. 77 et suivantes (1980)]. On sait isoler du t-PA à partir de diverses sources telles le sang, l'utérus humain, le coeur du porc et des cultures de cellules tumorales [S.S. Husain et coll., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78, p. 4264 et suivantes (1981); D.C. Rijken et coll., Biochim. Biophys. Acta 580, p. 140 et suivantes (1979); E.R. Cole et F.W. Bachmann, J. Biol. Chem. 252, p. 3729 et suivantes (1977); D.C. Rijken et D. Collen, J. Biol. Chem. 256, p. 7035 et suivantes (1981)]. Le t-PA a été comparé à un autre activateur du plasmino- gène, l'urokinase: il possède des propriétés immunologiqueê diffé- rentes ainsi qu'une forte affinité pour la fibrine conduisant à une augmentation de son activité [D.C. Rijken et coll., J. Biol. Chem. 257, p. 2920 et suivantes (1982); M. Ranby et col]., Thromb. Res. 27, p. 175 et suivantes (1982)]. Ces caractéristiques du t-PA lui confèrent des avantages thérapeutiques considérables car la lyse générale du fibrinogène est improbable et les risques d'hémorragie sont limités. Plusieurs lignées cellulaires naturelles, productrices de t-PA, ont été décrites dans la littérature comme moyen d'accès au t-PA (D.C. Rijken et D. Collen, supra,; F.L. Wilson et coll., Cancer Res 40, p. 933 et suivantes (1980); M. Gronow et R. Bliem, Trends Biotech, 1, p. 26 et suivantes (1983); D. Vetterlein et coll., J. Biol. Chem. 255, p. 3665 et suivantes (1980); W. Weimar et coll., The Lancet 2, p. 1018 et suivantes (1981)), mais aucune d'entre elles ne conduit à un niveau de production de t-PA qui puisse répondre aux besoins d'un marché mondial potentiel. De plus, parmi ces sources naturelles, les meilleures lignées cellulaires productrices sont d'origine tumorale. Les techniques de recombinaison génétique in vitro offrent maintenant la possibilité de faire synthétiser par un microorganis- me, par exemple la bactérie Escherichia coli, n'importe quelle protéine ou n'importe quel polypeptide, et ce théoriquement en quantités illimitées (voir par exemple F. Gros et coll., Sciences de la Vie et Société, Documentation Francaise éd. 1979) On sait, depuis les expériences classiques de F. Jacob et J. Monod, que l'ADN contient d'une part un ensemble de gènes dits "de structure", c'est-à-dire codant pour une protéine donnée, et d'autre part des gènes dits "de régulation", c'est à dire capable de moduler l'expression des gènes de structure, l'association des deux types formant une entité dite "opéron". Les recherches en biologie moléculaire et la mise au point des techniques de séquençage de l'ADN (F. Sanger et A.R. Coulson, J. Mol. Biol., 94, p. 441 et suivantes (1975), A.M. Maxam et W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74., p. 560 et suivantes (1977)), ont permis de préciser l'organisation de l'opéron telle que l'avaient conçue F. Jacob et J. Monod (F. Jacob et J. Monod, Cold Spring Harbour Symp. Quant. Biol, 26, p. 193 et suivantes (1961), F. Jacob et J. Monod, J. Mol. Biol. 3, p. 318 et suivantes (1961)), et d'identifier les caractères particuliers de la structure primaire des deux types de gènes. Ainsi, tout gène de structure est encadré d'un codon dit "d'initiation de traduction"(ATG) et d'un codon "d'arrêt". Le codon d'initiation a pour fonction de fixer un ARN de transfert initiateur porteur d'une formylméthionine. La chaîne protéique s'allongera à partir de cette formylméthionine par attachements successifs des acides aminés codés par le gène de structure, le codon "d'arrêt" provoquera enfin un arrêt de l'allongement et la libération de la protéine néoformée. En ce qui concerne les gènes régulateurs (promoteurs, répresseurs), définissant par exemple un promoteur comme un fragment d'ADN sur lequel se fixe l'ARN polyvmérase, on a pu identifier les séquences d'ADN les plus conservées; de même on a pu définir les séquences d'ADN les plus conservées au niveau des sites de fixation de ribosomes (RBS) (J.Shine et L. Dalgarno, Nature, 254, p. 34 et suivantes (1975)), sites qui jouent un rôle dans la traduction en protéine de 'ARN messager. Les gènes régulateurs bactériens peuvent donc être définis par leur propriétés fonctionnelles ainsi que par leur séquence primaire, ce dont les techniques de recombinaisons génétiques in vitro tirent profit pour placer un gène de structure quelconque sous leur contr8le, ceci grâce à l'existence des "enzymes de restric- tion", qui coupent l'ADN en des points spécifiques (H.0. Smith et K.W. Wilcox, J. Mol. Biol. 51, p. 379 et suivantes (1970), M. Meselson et R. Yuan, Nature, 217, p. 1110 et suivantes (1968), R.J. Roberts, Nucleic Acids Res. 1, p. 135 et suivantes (1982)). Les techniques utilisées, mettent en oeuvre l'utilisation concertée de ces enzymes pour couper l'ADN en des points prédétermi- nés, et d'enzymes dites "ligases" pour lier les fragments entre eux (P.E. Loban et A.D. Kaiser, J. Mol. Biol. 78, p. 453 et suivantes (1973)). L'ensemble est porté par des "vecteurs" (plasmides ou bactériophages), susceptibles d'être introduits dans une bactérie telle que E. coli selon des procédés connus par ailleurs, et de s'y maintenir lors de la croissance de la bactérie-hSte (M. Mandel et A. Higa, J. Mol. Biol., 53, p. 154 et suivantes (1970)). L'expression à faible niveau du gène de l'activateur tissulaire humain du plasminogène chez E. Coli a déjà été décrite par D. Pennica et coll., Nature, 301, p. 214 et suivantes (1983). Avec les signaux d'expression utilisés, le t-PA est produit à un niveau correspondant à 50-80 microgrammes par litre de culture et par unité de densité optique. La présente invention concerne un prQcédé permettant l'expression du gène de l'activateur tissulaire humain du plasmino- gène chez E. Coli à un niveau environ 150 fois plus élevé que celui décrit par D. Pennica et coll. La présente invention concerne un procédé permettant d'abord d'induire la biosynthèse de l'activateur tissulaire humain du plasminogene dans un microorganisme et de convertir ensuite le t-PA produit sous une forme active. L'invention consiste à faire d'abord une construction qui place le gène de structure du t-PA humain à côté d'un codon d'ini- tiation, puis à lier le gène de structure ainsi modifié à un promo- teur inductible. Une bactérie-hSte, telle que E. coli, contenant le gène modifié, produit du t-PA à un niveau élevé (environ 5 % des protéines cellulaires) après induction dans des conditions définies. La présente invention comporte également un procédé permettant de modifier la conformation du t-PA par dénaturation et renaturation afin qu'il possède une activité fibrinolytique. Dans ce qui suit la signification des termes techniques employés en Biologie Moléculaire sera supposée connue (cf. par exemple "Biologie Moléculaire de Gène"', de J. Watson, édition française Interéditions 1978) . Dans ce qui suit seront décrits successivement la construction et les procédés d'expression du gène du t-PA et les procédés de dénaturation et renaturation sous une forme active du t-PA ainsi produit. A. Clonage du gène de l'activateur tissulaire humain du plasminogène. La lignée cellulaire de mélanome "Bowes" [D.C. Rijken et D. Collen, J. Biol. Chem., 256, p. 7035 et suivantes (1981)] a été utilisée pour la préparation de l'ARN messager spécifique de l'acti- vateur tissulaire humain du plasminogène. A partir de cellules Bowes, cultivées en monocouche en milieu Eagle modifié par Dulbecco, en présence de 10 % de sérum foetal de veau, on prépare l'ARN messager en utilisant la méthode "urée-LiCl" [C. Auffray et coll., Nucl. Acids Res., 8, p. 231 et suivantes (1980)]. On enrichit la préparation en ARN messager par plusieurs cycles de chromatographie d'affinité sur des colonnes d'oligo (dT)- cellulose, selon la technique décrite par H. Aviv et P. Leder, [Proc. Natl. Acad. Sci (USA), 69, p. 1408 et suivantes (197l2)]. La préparation de l'ARN messager, spécifique pour l'acti- vateur tissulaire humain du plasminogène, a été contrôlée en utili- sant la technique d'hybridation "Northern" [P.S. Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 77, p. 5201 et suivantes (1980)]. A cet effet, on utilise un oligonucléotide synthétique codant pour les acides aminés 11-17 selon la séquence publiée par D. Pennica et coll., Nature, 301, p. 214 et suivantes (1983). Après mesure de la radioactivité des bandes, on détermine, par le calcul, que la concentration de l'ARN spécifique pour l'activateur tissulaire humain du plasminogène représente 0,03 % de l'ARN total. L'ARN messager ainsi préparé est utilisé pour synthétiser in vitro l'ADN complémentaire (ADNc) en utilisant les techniques décrites par A. Efstratiadis et coll., J. Biol. Chem., 7, p. 279 et suivantes (1976) et par M.P. Wickens et coll., J. Biol. Chem., 253, p. 2483 et suivantes (1978). Pour l'amorce de l'ADNc on utilise un oligonucléotide spécifique pour les acides aminés 511-527 de l'activateur tissulaire humain du plasminogène (d'après la séquence publiée par D. Pennica et coll., Nature, 301, p. 214 et suivantes (1983) et un oligo-(dT). Après avoir digéré l'ADNc avec la nucléase Si (A. Efstra- tidis et coll., J. Biol. Chem., 7, p. 279 et suivantes (1976), on méthyle les sites potentiellement présents selon la technique décrite par T. Maniatis et coll., Cell., 15, p. 687 et suivantes (1978). Après addition des adaptateurs Ec-oRl, l'ADNc ainsi modifié est digéré par l'enzyme de restriction EcoRl puis est ensuite inséré dans le site EcoRl du vecteur Lambda-gtlO (T.V. Huynh et coll., DNA Cloning, D.M. Glover IRL Press ed., p. 49 et suivantes (1985). A partir de 0,6 microgrammes d'ADNc, double brin, on établit une banque d'environ 213000 clones (unités formant des plages). La recherche d'un clone portant le gène de l'activateur tissulaire humain du plasminogène est conduite à l'aide de 3 sondes oligonucléotidiques. La séquence de ces 3 sondes (D. Pennica et coll., Nature, 301, p. 214 et suivantes (1983) correspond à la spécificité suivante: Sonde Acides aminés codés 1 11-18 2 425-432 3 511-527 Par hybridation de ces sondes aux plages transférées sur des filtres de nitrocellulose (T. Maniatis et coll., Molécular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 309 et suivantes (1982), on isole plusieurs clones codant potentiellement pour l'activateur tissulaire humain du plasminogène. Les analyses de restriction permettent d'aboutir à un clone d'ADNc codant pour l'ensemble du gène dont la structure générale est donnée dans la figure 1. Pour confirmer l'authenticité du clone isolé, on détermine la séquence nucléotidique du gène. Le fragment d'insertion EcoR1- EcoR1 est séquencé par la technique de dégradation chimique par- tielle décrite par A. Maxam et W. Gilbert, [Proc. Natl. Acad. Sci. (UISA), 74, p. 560 et suivantes (1977)] et par la technique "dideoxy" décrite par F. Sanger et A.R. Coulson, J. Mol. Biol., 94, p. 441 et suivantes (1975). La séquence obtenue à partir de ces deux méthodes est indiquée dans la figure 2. La partie codante ne présente aucune différence avec la séquence publiée par D. Pennica et coll. Cepen- dant des différences sont constatées dans les régions non-codantes, mais elles ne concernent pas l'expression hétérologue du gène de l'activateur tissulaire humain du plasminogène chez E. Coli. Le produit de traduction, selon D. Pennica et coll., Nature, 301, p. 214 et suivantes (1983), est représenté sur la figure 3. B - Construction de plasmides recombinants en vue de l'expression du t-PA. 1) Isolement des signaux d'expression (Fig.4) les signaux d'expression décrits dans la présente inven- tion sont: - le promoteur gauche PL du bactériophage lambda qui permet une transcription efficace de l'ADN en ARP messager, - le site de fixation des ribosomes du gène CII du bacté- riophage lambda qui permet une traduction efficace du ARN messager. Le promoteur "PL" du bactériophage lambda est placé sur le chromosome du bactériophage entre un site BglII et un site BamHI (voir E. Szybalski et W. Szybalski, Gene 7, p. 217 et suivantes (1979)), dort la séquence nucleolidique est connue (F. Sanger et coll., J. Mcl. Biol, 162, p. 279 et suivantes (1982)). On peut cloner ce fragment et modifier ses sites de restriction selon des méthodes connues. On note que les plasmides portant PL doivent être propages dans des souches de E. coli portant le gène répresseur cl, afin d'éviter que ce promoteur ne s'exprime de façon constitutive. Dans une première construction, PL est disponible sous forme d'un fragment BamHI à partir du plasmide "pPL-lambda" (Phar- macia P.L. Biochemicals). A partir de ce plasmide, on peut isoler un fragment HaelII-HaelII contenant PL et insérer ce fragment dans le site SmaI de "pUC8", (J. Veira et J. Messing, Gene 79, p. 250 et suivantes (1982)) pour obtenir "pUC8-PL". La séquence du promoteur étant alors disposée de part et d'autre de nombreux sites de restriction, le fragment qui porte ce promoteur peut être excisé et combiné de manière adéquate à d'autres fragments d'ADN. Par exemple, on peut après avoir détruit le site BamHI de "pUC8-PL" par action de l'enzyme Sl (Boehringer) isoler un fragment L EcoRI-HinDIII contenant le promoteur PL et ensuite lier ce fragment avec le grand fragment EcoRI-HinDIII du plasmide "pDS20" (G. Duester et coll., Cell 30, p. 855 et suivantes (1982) pour obtenir le plasmide "pXL73". Le gène CII du bactériophage lambda, dont la séquence et le site d'initiation sont connus, peut être traduit avec efficacité [E. Schwarz et coll. Nature 272, p. 410 et suivantes (1978)]. En utilisant le RBS ("ribosome binding site" ou "site de fixation des ribosomes") de ce gène, on construit ur plasmide contenant le système d'expression "Promoteur PL-RBS cII-ATG-site de restriction". Le RBS du gène cII est extrait du plasmide "pPSI" (P. Sarmientos et coll., Cell, 32, p. 1337 et suivantes (1983). On digère ce plasmide par NdeI et on insère un adaptateur BamHI après formation d'extrémi- tes franches. On excise alors le RBS sous forme d'un fragment HinDIIIBamHI. On construit alors un plasmide "pXL88" dans lequel ce fragment HirDIII-BamHI est lié avec le grand fragment HinD III-BamHI du plasmide "pXL73". Dans le nouveau plasmide "pXL88" le RBS cII est inséré dans la bonne orientation par rapport au promoteur PL' le tout dans un système multisites de telle sorte que l'ensemble PL-RBS cII soit porté sur un seul fragment d'ADN. 2) Fusion du gêne "cDNA" du t-PA aux signaux d'expression (Fig. 5) Après avoir séquencé la partie codante du gène du t-PA, on prépare deux oligonucléotides synthétiques complémentaires codant pour les 7 premiers acides aminés du t-PA mature (Fig. 3, de posi- tion 140 à position 160). Ce petit fragment d'ADN synthétique peut être fabriqué de telle sorte qu'il soit clonable comme un fragment NdeI-BamHI, par exemple: ' TATGTCTTACCAAGTGATCTGCAGA 3' 3' ACAGAATGGTTCACTAGACGTCTCTAG 5' On réalise la ligation de ce fragment NdeI-BamHI avec les fragments d'ADN suivants: a) un fragment EcoRI-NdeI du plasmide "pXL88" portant le promoteur PL et le site d'initiation de la traduction (RBS) du gène cII. b) un fragment EcoRI-BamHI du plasmide "pMC1403" (M.J. Casadaban et coll., J. Bacteriol. 143, p. 971 et suivantes (1980)) portant un gène de résistance aux antibiotiques, l'origine de réplication et l'extrémité 3' du gène de la béta-galactosidase. On isole un plasmide, "pXL104", qui correspond à une fusion des 7 premiers acides aminés du t-PA mature avec la béta- galactosidase d'E.coli. Le plasmide "pXL104" porte en amont une fusion du RBS cII avec les codons correspondant aux 7 premiers acides aminés du t-PA mature. La présence d'un site PstI à l'emplacement du sixième acide aminé du t-PA mature permet l'excision d'un fragment HinDIII- PstI contenant le RBS cII suivi par le début du t-PA mature. On insère ce fragment entre les sites HinDIII et PstI du plasmide 9"pUC9" (J. Veira et J. Messing, supra) pour obtenir le plasmide "pXL99". Le gène "ADNc" du tPA ayant été cloné dans le génome du bactériophage lambda (Fig. 1), on digère l'ADN de ce bactériophage recombinart par l'enzyme BglII pour isoler un fragment de 1974 paires de bases contenant la séquence codant pour le t-PA mature. Tirant profit de la compatibilité entre les sites BglII et BamHI, on insère ce fragment BglII-BglII dans le site BamHI du plasmide "pBR322" (Pharmacicia, P.L. Biochemicals) pour obtenir le plasmide "pXL121". L'insertion du gène "ADNc" du t-PA dans un plasmide permet l'utilisation d'autres sites de restriction qui sont très fréquents dans le génome du bactériophage lambda. A partir du plasmide "pXL121" on peut, par exemple, î0 construire d'autres plasmides dans lesquels des fragments du gène, ou le gène complet, sont fusionnés aux signaux d'expression. Dans une première construction, on digère l'ADN du plasmi- de "pXL121" par les enzymes HinDIII et BalI et on obtient un frag- ment d'ADN contenant la totalité de la séquence codante. On effectue une ligation du fragment HinDIII-BalI ainsi obtenu avec le grand fragment HinDIII-HpaI de "pXL73". Cette ligation est possible car les enzymes BalI et HpaI donnent, après coupure, des extrémités franches. On aboutit alors au plasmide "pXL126" dans lequel le gène du t-PA est fusionné au promoteur PL mais le plasmide "pXL126" ne contient pas de RBS. Le plasmide "pXL99", décrit ci-dessus contient le RBS cII lié au codons correspondant aux 6 premiers acides aminés du t-PA. La présence d'un site PstI au sixième codon permet l'accrochage à la suite de la séquence du tPA. Plusieurs sites étant contenus dans le gène du t-PA il n'est pas possible de réaliser une construction simple. On peut isoler un fragment PstI-PstI de 414 paires de bases codant pour les acides aminés 7-144 du tPA, après coupure de plasmide "pXLi21" par l'enzyme PstI. On insère ce fragment d'ADN dans le site PstI du plasmide "pXL99" et, après avoir vérifié l'orientation de ce fragment, on obtient un nouveau plasmide "tpXL128" dans lequel de RBS cII est maintenant lié à la séquence codant pour les 144 premiers acides aminés du t-PA. Au 110ème codon du gène de t-PA un site NarI est présent. Par conséquent, en peut exciser hors du plasmide "pXL128" un frag- 1l ment HinDIII-NarI contenant le RBS cII et l'extrémité 5' du gène du tPA. On insère ce fragment dans "pXL126" à la place d'un fragment équivalent HinDIII-NarI mais qui ne porte pas le RBS cII. Cette construction conduit au plasmide "pXL130" qui contient le promoteur PL' le site de fixation des ribosomes RBS cII, un codon d'initiation ATG et le gène de structure du t-PA et qui permet d'exprimer le t-PA dans E. Coli. C - EXPRESSION DU GENE t-PA HUMAIN CHEZ E. COLI Dans le plasmide "pXL130" la transcription du gène du t-PA est dirigée par la promoteur PL' Pour éviter la transcription néfaste due à ce promoteur- lors de la propagation du plasmide, il est nécessaire d'utiliser des bactéries hôtes qui codent pour le répresseur cl du bactériophage lambda. De cette manière une souche contenant le plasmide "pXL130" peut être cultivée en conditions de répression du promoteur PL' Sans cette précaution, l'expression constitutive de t-PA rend les cellules malades, incapables de se reproduire et le taux de production de t-PA est peu élevé dans la culture. On peut utiliser, comme système d'induction conditionnel pour le plasmide "pXL130", une souche d'E.coli contenant un gène répresseur thermosensible (cl-ts). Lorsque la bactérie est en phase exponer.tielle, on induit le promoteur PL du plasmide en élevant très rapidement la température d'incubation à 42 C. Dans ces conditions, le t-PA est synthétisé à 42C et cette température doit être maintenue pour garder PL actif. Dans une souche d'E. ccli telle que N4830 (Pharmacia, P.L. Biochemicals), on effectue l'incubation pendant 90 minutes. On prélève un échantillon de la culture et on lyse les bactéries par sonication. Le tPA, présent dans la fraction insoluble, représente environ 1 a des protéines totales fabriquées par E. coli. Il a maintenant été trouvé, et c'est ce qui constitue un autre objet de la présente invention, que la production de l'activa- teur tissulaire humain du plasminogêne peut être considérablement amdliorée en utilisant une souche codant pour la protéine "cro" du bactériophage lambda. En particulier, il s'agit d'une souche cl-ts o le gène "cro" est exprimé après l'inactivation thermique du répresseur cl. Par exemple, dans le cas d'une souche comme 0R1319 (O. Reyes, Virology 123, p. 357 et suivantes (1982)), on fait pousser les bactéries à 30 C, température à laquelle ni t-PA, ni "cro", ne sont exprimés. Lorsque les bactéries sont en phase exponentielle, on élève très rapidement la température d'incubation à 42 C. Le répres- seur cl est maintenant inactivé et le gène "cro" peut être exprimé. Après 30 minutes d'incubation à 42 C, on fait revenir la température à 30 C. La présence de la protéine "cro" empêche la synthèse-de novo du répresseur cl et maintient PL actif (G.N. Gussin et coll., dans R.W. Hendrix, J.W. Roberts, F.W. Stahl et R.A. Weisberg (eds), Lambda II, Cold Spring Harbour Laboratory Press, p. 93 et suivantes (1983)). On continue l'incubation pendant 90 minutes. Dans ces conditions, le t-PA produit représente environ 5 % des protéines totales de E. coli et il peut être récupéré avec un rendement d'environ 10 mg par litre de culture et par unité de densité opti- que. D - RENATURATION DU t-PA FABRIQUE DANS E. COLI Les protéines hétérologues synthétisées à haut niveau chez E. coli se retrouvent souvent dans la cellule sous forme d'aggrégats insolubles (R.G. Schoner et coll., Biotechnology 3, p.151 et suivan- tes (1985)). Il a été trouvé que c'est le cas pour le t-PA exprimé à haut niveau. Avec ce procédé de production, la grande majorité du t-PA se retrouve dans le culot après centrifugation à basse vitesse alors que le t-PA est normalement soluble en solution aqueuse. Une explication possible de l'insolubilité du t-PA produit dans E. coli est que la protéine ne se trouve pas synthétisée dans la forme native. Il a été en effet montré dans d'autres systèmes que des protéines mal repliées ont tendance à s'aggréger et à précipiter (J. London et coll., Eur. J. Biochem. 47, p. 409 et suivantes (1974); G. Orsini et M.E. Goldberg, J. Biol. Chem. 252, p. 3453 et suivantes (1978)). Dans sa forme non native une protéine enzymatique n'est pas active et l'on peut donc raisonablement prévoir que le t-PA synthé- tisé chez E. coli n'est pas sous sa forme active. De nombreuses protéines peuvent revenir à leur forme native in vitro après dénaturation et réduction contr8lée. Cela a été vérifié notamment pour la tryptophanase d'E. coli, le chymotryp- sinogène, l'anhydrase carbonique, la ribonucléase, le lysozyme et l'inhibiteur trypsique de pancréas bovin (J. London et coll., supra G. Orsini et M.E. Goldberg, supra; U. Carisson et coll., Eur. J. Biochem, 52, p. 25 et suivantes (1975); R.F. Goldberger et coll., J. Biol. Chem. 239, p.1406 et suivantes (1964); V.P. Saxena et D.B. Wetlaufer, Biochemistry 9, p. 5015 et suivantes (1970); T.E. Creighton, J. Mol. Biol. 87, p. 563 et suivantes (1974)). Dans la majorité des cas, l'indicateur le plus sensible de renaturation complète est l'activité enzymatique. Lorsqu'une protéine donnée porte deux activités, les deux activités sont retrouvées à la fois ce qui semble exclure la possibilité qu'une fraction de la popula- tion de molécules puisse exister avec seulement une partie de structure correcte. Le t-PA humain a deux propriétés facilement mesurables: la capacité d'activer le plasminogène à un certain niveau et l'affi- nité pour la fibrine manifestée par l'activation du t-PA lui-même. Il a été trouvé, et c'est ce qui fait aussi l'objet de la présente invention, que le t-PA produit par E. Coli, peut être renaturé in vitro sous une conformation active après avoir complète- ment dénaturé et réduit la chaîne polypeptidique. Après la lyse des bactéries par sonication dans une solution isotonique telle que, par exemple, du P.B.S. (0,2g/l KCl; 0,2 g/l KH2P04; 8 g/l NaCl et 1,25 g/l NA2HP01), le t-PA se trouve dans la fraction insoluble. Il est donc possible d'obtenir à ce niveau une purification importante de cette enzyme en centrifugeant le lysat cellulaire et en récupérant uniquement le culot de centri- fugation. Le t-PA représente alors 20-25 % des protéines insolubles présentes dans le culot. Il a été trouvé qu'un réarrangement des structures secon- daire et tertiaire accompagné d'une réduction et d'une réoxydation de la chaîne polypeptidique est nécessaire pour obtenir la forme active et soluble du t-PA. Le t-PA est d'abord solubilisé en conditions dénaturantes et réductrices en traitant la fraction insoluble avec une solution: 7 M guanidine HCl 0, 1 M béta-mercaptoethanol 0,1 M KH2PO4pH7,5 (voir paragraphe E ci-dessous). Pour permettre ensuite à la molécule de se renaturer il est nécessaire d'éliminer ou de diminuer les concentrations des agents dénaturants et réducteurs. On peut, par exemple, éliminer les effets de ces agents par dilution de la fraction dénaturée/réduite dans des tampons permettant la renaturation. Plus particulièrement, la renaturation du t-PA peut être obtenue par dilution dans la solution suivante qui est un exemple obtenu après une série d'opti- misations: 2,5 M urée mM Tris HCl pH 8,75 mM NaCl mM EDTA lmM glutathion réduit 0,3mM glutathion oxydé mM lysine et selon la méthode décrite dans le paragraphe E ci-dessous. On a quantifié l'efficacité de la renaturation en mesurant l'activité du t-PA sur des plaques de fibrine-agarose selon la méthode décrite par A. Granelli-Piperno et E. Reich, J. Exp. Med. 148, p.223 et suivantes (1978). Après avoir comparé cette activité à celle obtenue avec un t-PA simplechaine standard (Biopool, Suède), on peut mesurer un rendement d'environ 3 mg de t-PA actif par litre et par unité de densité optique de la culture bactérienne. L'activité du t-PA peut être aussi mesurée par l'hydrolyse d'un substrat synthétique (J.H. Verheijet et coll., Thromb Haemostas (Stuttgart) 48, p. 256 et suivantes (1982)). En particulier, on mesure la vitesse de conversion du plasminogène en plasmine par le t-PA. Des incubations en présence de plasminogène humain purifié et d'un substrat synthétique de la plasmine (S-2251: Val-leu-Lys- Paranitroaniline, Kabi Vitrum, Suède) permettent de mettre en évidence des cinétiques de type exponentiel caractéristiques de l'activateur du plasminogène (fig.6). Des incubations témoins en absence de plasminogène permettent de constater que les extraits ne contiennent pas d'activités protéolytiques pouvant donner de fausses réponses positives. Les extraits protéiques obtenus à partir de bactéries ne contenant pas le gène de l'activateur du plasminogène et ayant subi le même traitement de renaturation se sont révélés totalement inactifs après incubation en présence de plasminogène et de substrat synthétique S-2251. Seuls les extraits obtenus à partir de bactéries porteuses du gène de t-PA manifestent une activité enzymatique du type activateur du plasminogène. La même technique permet de tester le r8le potentiel de la fibrine sur la catalyse du plasminogène en plasmine. L'activateur tissulaire du plasminogène synthétisé par les cellules mammifères est fortement stimulé par la fibrine ou ses dérivés. Cette propriété est responsable de son intérêt thérapeutique. En effet, en absence de fibrine, l'affinité de l'enzyme pour son substrat est faible. Au contraire, en présence de fibrine, l'affinité de l'enzyme pour son substrat est augmentée. Il en résulte un enzyme pleinement actif qui coupe le plasminogène en plasmine, cette dernière dégradant le caillot de fibrine. Cette propriété de stimulation de la fibrine sur les molécules obtenues par recombinaison génétique et renaturation peut être mise en évidence en déterminant des cinétiques enzymatiques en présence du plasminogène humain purifié, de substrat synthétique S-2251 et de fibrine ou de ses dérivés (fibrinopeptides). On observe une stimulation très importante de la vitesse de catalyse qui se trouve multipliée par un facteur d'environ 40 (fig. 6). Par ailleurs, le t-PA recombinant, issu de E. Coli, et renaturé selon le procédé de la présente invention, peut être reconnu par des anticorps spécifiques de l'activateur du plasminogè- ne synthétisé par les cellules mammifères. A cet effet, des quantités croissantes d'immunoglobulines purifiées spécifiques de l'activateur tissulaire humain du plasmino- gène (Biopool, Suède) sont incubées en présence de t-PA bactérien et l'effet sur l'activité enzymatique est analysé. Les résultats donnés dans la figure 7 montrent que l'activité du t-PA bactérien est inhibée par les anticorps spécifiques de l'activateur humain. Cette inhibition est spécifique puisque l'activateur du plasminogène d'origine bactérienne, comme l'activateur du plasminogène d'origine humaine, n'est inhibé ni par des immunoglobulines d'animal non immunisé, ni par des immunoglobulines spécifiques de l'urokinase (Bispool, Suède). L'ensemble de ces résultats montre que les bactéries porteuses du gène de l'activateur tissulaire humain du plasminogène synthétisent la protéine correspondante. Cette protéine n'est pas soluble dans les tampons conventionnels et n'est probablement pas dans sa conformation native. Cependant, après extraction, dénatura- tion et renaturation ménagée, il est possible de redonner à la protéine les sites stéréochimiques responsables de l'activité catalytique vis-àvis du plasminogène et de l'affinité pour la fibrine. De plus, la molécule renaturée est reconnue par les anti- corps anti-activateur humain. Il en résulte que la structure secon- daire et tertiaire de la protéine obtenue est voisine de celle de la protéine naturelle. E - DESCRIPTION DES METHODES EMPLOYEES Les enzymes de restriction sont employées selon les suggestions du fournisseur (New England Biolabs). Les ligations des fragment d'ADN sont réalisées dans des tampons contenant 50 mM Tris HCl pE 7,4 lOmM MgCl2, lmM ATP and 15 mM DTT. La transformation des souches d'Escherichia coli est effectuée selon la méthode décrite par T. Maniatis et coll. (Molecu- lar Cloning Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982). La nucléase "Si" est employée selon la suggestion du *fournisseur (Boehringer). Le remp/issage des extrémités cohésives d'ADN pour les rendre franches est réalise avec l'enzyme "ADN polymérase (large fragment)"(Boehringer) dans un tampon 50 mM NaCl, 10 mM Tris, HC1 pH7,5, 1 mM MgS04, 1 mM DTT et en présence de quatre deoxypucléo- tides triphosphates à une concentration de 1 nf. Les oligonucléotides sont préparés selon la technique décrite par M.J. Gait et coll. dans H.G. Gassen et A. Lang (eds), Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments, Verlag Chemie Press, p.1 et suivantes (1982). La sonication des bactéries est réalisée avec un Sonica- teur Branson (Proscience, France, Modèle B30), après avoir concentré fois les bactéries dans le tampons P.B.S.(0,2g/1 KCl, 0,2g/1 KH2PO4, 8g/1 NaCl et 1,25g/l Na2HP04). Le temps de sonication est de 6 minutes. La fraction insoluble est solubilisée dans 2,3 % SDS, 5 % béta-mercaptoéthanol, 10 % glycérol et 0,06 M Tris, HC1 pH6,8 et analysée par éJectrophorèse sur gel d'acrylamide-SDS selon U.K. Laemli, Nature 227, p. 680 et suivantes (1970). La dénaturation/réduction du t-PA est effectuée par traitement de la fraction insoluble, correspondant à un litre de culture à une densité optique ce l(A610) avec 5 cm3 d'une solution: 7 M guan-dine HC1, 0,1 M bêta-mercaptoéthanol et 0,1M KH2PO4 pH7,5 pendant 24 heures à 4 C scus agitation. La concentration de béta- mercaptoéthanol est ensuite abaissée par dialyse contre 1 litre de solution contenant 7 M guanidine HC1l, 0,05 M béta-mercaptoéthanol et 0,1 M KHFPO4 pH 7,5. La renaturation est alors obtenue par dilution (1/100) de cette solution dans un tampon contenant 2,5 M urée, 50mM Tris HCl pH 8, 75, lOmM NaCl, 5m! EDTA, lmM glutathion réduit, 0,3 me glutathion oxydé et lOmN lysine. Après cette dilution, la solution est incubée à 4 C pendant 24 heures, puis centrifugée. L'activité du t-PA est mesurée après dilution du surnageant (1/100) dans un tampon P.B.S. contenant 0,01 % de Tween 80. REVENDICATIONS i - Procédé de préparation microbiologique de l'activateur tissulaire humain du plasminogène ou t-PA caractérisé en ce que l'on cultive une bactérie capable d'assurer le maintien stable d'un plasmide contenant le promoteur PL du bactériophage lambda, le site de fixation des ribosomes du gène cII du bactériophage lambda et le gène du t-PA humain contenant en 5' un codon d'initiation ATG. 2 - Procédé de préparation de la forme active de l'activa- teur tissulaire humain du plasminogène caractérisé en ce que l'on convertit le produit inactif et insoluble obtenu selon la revendica- tion 1 en produit actif et soluble en utilisant une méthode de dénaturation et renaturation qui permet un réarrangement des struc- tures secondaire et tertiaire de la chaîne polypeptidique. 3 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la bactérie capable d'assurer le maintien stable du plasmide est choisie parmi les souches d'E. coli. 4 - Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que l'orn utilise une souche d'E. coli contenant le gène "cro" du bacté- riophage lanbda. - Le plasmide "pXL!30" caractérisé en ce qu'il contient le promoteur PL du bactériophage lambda, le site de fixation des ribosomes du gène cII du bactériophage lambda, le codon d'initiation ATG fusionnés avec le gène de structure de l'activateur tissulaire humain du plasminogène. 6 - L'activateur tissulaire humain du plasminogcne lors- qu'il est obtenu par le procédé de la revendication 1. 7 - La forme active de l'activateur tissulaire humain du plasminogène lorsqu'elle est obtenue selon le procédé de la revendi- cation 2.