FR 2597106 A1 19871016 FR 8705020 A 19870409 La présente invention concerne un tripeptide doué d'une activité immunostimulante. Plus précisément, la présente invention a pour objet un tripeptide constitué de L-Arg (arginine), L-Lys (lysine) 5 et L-Glu (acide glutamique) et ayant la structure suivante: Arg-Lys-Glu Le tripeptide ArgLys-Glu, synthétisé par des méthodes en solution classique, et ses sels, exercent une activité immunostimulante tant sur la maturation des cellules T im10 matures que sur la fonction des cellules T. La présente invention a donc également pour objet une composition pharmaceutique comportant notamment un tripeptide. Plus particulièrement, la présente invention a pour 15 objet une composition pharmaceutique à activité immunostimulante notamment sur la maturation et la fonction des cellules T utile notamment en cas de déficiences du système immunitaire. La présente invention a aussi pour objet une composi20 tion pharmaceutique comportant un sel pharmaceutiquement acceptable du tripeptide notamment choisi parmi un acétate, trifluoracétate, chlorhydrate, sulfate. La présente invention a aussi pour objet une composition pharmaceutique administrable par voie parentérale. La présente invention a également pour objet une application d'un tripeptide ou d'un de ses sels pharmaceutiquement acceptable pour la préparation de la composition pharmaceutique. CARACTERISTIQUES CHIMIQUES Masse moléculaire 431,52 20 Pouvoir rotatoire Id 2D0= 5,13 (c = 1, acide acétique) Analyse par HPLC Le tripeptide a été analysé par HPLC par appariement d'ions, dans les conditions de séparation ci-après: Eluant NaH2PO4 0,05M pH 4,3 + SDS 5 x 10-4 M, MeOH :50. Débit 1 ml/min. Détection: 225 nm. Volume d'injection: 20 mcl Echantillon: 20 mcg. Colonne: u Bondapack C18 (Waters), 300 x 3,9 mm 15 L'appareillage suivant a été utilisé Chromatographe en phase liquide: série 4 (Perkin Elmer) Soupape d'injection Reodyne mod. 7125-075, avec une boucle de 20 1. Détecteur: Spectrophomètre LC 95 (Perkin Elmer) Intégrateur de calcul: Data Station 3600 (Perkin Elmer). La figure montre le profil de HPLC du tripeptide. RESISTANCE A L'AMBIANCE GASTRIQUE SIMULEE IN VITRO Le tripeptide est résistant à l'ambiance gastrique simulée in vitro. Dans cette étude, on a utilisé le suc gastrique simulé USP XXI (HC1 + pepsine) à 37 C pendant heures. SYNTHESE sZ(Cl)COBe Boc-Lys-Glu-OBe (1) Z(CCl) De la Boc-Lys (0,1 mole) dissoute dans du chlorure de méthylène et refroidie à 0 C est ajoutée à de la Nméthylmorpholine (0, 1 mole). La solution est refroidie à -15 C 1 C. Du chloroformiate d'isobutyle (0, 1 mole) est ajouté en agitant tout 10 en maintenant la température à 15 C. Après avoir agité le mélange réactionnel pendant 15 min. à cette température, on ajoute lentement une solution refroidie à l'avance de ptosylate du glutamate de dibenzyle (0,1 mole) et de N-méthylmorpholine (NMM) (0,1 mole) dans du diméthyl15 formamide, et on agite le mélange réactionnel pendant une nuit. On élimine les solvants sous pression réduite et on reprend le résidu dans de l'acétate d'éthyle. On lave l'acétate d'éthyle avec de l'eau, de l'acide chlorhydrique 1N, une solution aqueuse de bicarbonate de sodium 20 à 5 % et de l'eau. On le sèche sur sulfate de sodium et on élimine le solvant sous pression réduite. Le produit obtenu est un sirop. Système de chromatographie sur couche mince CHC13:MeOH:HOAc (90:8:2). Pureté 95 %: Rendement %. On débloque (1) avec un mélange acide trifluoracétique à 50 %-chlorure de méthylène (1:1), 10 ml par gramme, pendant une demi-heure. On le fait évaporer sous pression réduite, on le triture à l'éther, on le filtre, on le lave à l'éther et on le sèche sous vide. Rendement 98 %. 30 úZ(Cl)COBe Le TFA-Lys--Glu--OBe est neutralisé avec de la NMM et couplé à de la Z3-Arg dans un mélange diméthylformamide- tétrahydrofuranne, en utilisant de la NM- et du chloroformiate d'isobutyle, et en poursuivant le traitement comme en (1). Rendement 60 %. Système de chromatographie sur couche mince (TLC), CC13:MeOH (92:8). Une tache principale. 5 Le tripeptide ci-dessus est hydrogéné dans un mélange acide acétique-eau-méthanol en présence de Pd/C jusqu'à ce que la réaction soit complète. On le débarrasse du catalyseur par filtration et on fait évaporer le filtrat sous vide. Le produit obtenu, le tripeptide, est purifié par partage à contrecourant en utilisant un système N-butanol: acide acétique:eau (4:1:5). Rendement 50 %. Système de chromatographie sur couche mince (TLC) butanol:acide acétique: eau:pyridine (32:6:22:20). Une tache principale. HPLC 15 97 %. ACTIVITES BIOLOGIQUES 1.1. INDUCTION IN VITRO DE L'ANTIGENE THY 1.2 La capacité du Arg-Lys-Glu d'induire in vitro la différenciation des précurseurs des cellules T de la souris 20 dans des lymphocytes exprimant les marqueurs cellulaires T a été essayée en mettant en évidence l'inducation de l'antigène de membrane Thy 1.2. MATERIEL ET METHODES Souris: On a utilisé des souris athymiques (nu/nu) 25 âgées de 8 semaines, élevées sans consanguinité sur un substratum C3H/He, maintenues dans des conditions exemptes de germes pathogènes particuliers PREPARATION DES CELLULES: Les souris ont été sacrifiées par dislocation cervicale. Les rates ont été prélevées 30 aseptiquement et hachées finement avec des pinces dans une solution de sel équilibrée de Hank (HBSS) (Gibco Ltd, Paisley, Ecosse). Les splénocytes, lavés et remis en suspension dans du milieu 199 (Gibco Ltd) complétés avec 1 % de BSA (Boehringer Mannheim) et de la gentamycine 35 (100 iig/ml) ont été incubés pendant 45 min. dans des colonnes de laine de nylon équilibrées conformément à la méthode de Julius et coll. (Eur. J. Immunol. 3, 645, 1973). Les populations de cellules sortantes enrichies de lymphocytes T précurseurs, ont été utilisées dans la recherche de l'activité biologique. ESSAI BIOLOGIQUE D'INDUCTION: 0,5 x 106 cellules sortantes dans 0,1 ml de milieu, ont été incubées à 37 C pendant 18 heures avec 0,1 ml de tripeptides ou de milieu seul. Les cultures ont été effectuées en double. A la 10 fin de l'incubation, les cellules ont été lavées avec du chlorure d'ammonium à 0, 87 % pour lyser les érythrocytes, puis avec de la HBSS. L'induction de l'antigène Thy 1.2 de membrane a été déterminée par un essai d'immunofluorescence directe. IMMUNOFLUORESCENCE DIRECTE: Les cellules ont été incubées à 4 C pendant 20 min. avec de l'anticorps monoclonal conjugué avec de la fluorescéine (BioYeda) à une dilution de 1:200. Le mélange a été centrifugé à 300 g pendant 5 min., lavé deux fois dans de la HBSS, puis mis 20 en suspension pour le comptage sous le microscope à fluorescence (Orthoplan Leitz). La différence en pourcentage des cellules émettant une fluorescence entre les cultures avec et sans tripeptide a donné l'activité inductrice du produit. RESULTATS Comme le montre le tableau, le tripeptide induit l'apparition du marqueur Thy 1.2 sur des lymphocytes T immatures avec une réponse optimale à 1 mcg/ml. La courbe des relations dose-réponse est en forme de cloche, car 30les concentrations plus faibles et plus élevées du peptide provoquent une induction plus faible. % THY 1.2 + CELLULES CONCENTRATION DU PEPTIDE (mcg/ml) MOY.+/- ECART-TYPE DIFFERENCE o 0>0001 0>001 0 01 0)1 11 +/- 1,6 19 +/- 1,2 34 +/- 3>3 44 +/- 3>1 50 +/- 1X2 54 +/- 5,0 45 +/4>9 40 +/- 1,2 20 25 30 + 8 + 23 + 33 + 39 + 43 + 34 + 29 + 17 + 10 + 5 28 +/- 4,5 21 +/- 1>7 +/- 2 4 1.B. INDUCTION IN VIVO DE L'ANTIGENE THY 1.2 Du ELSI, dans la présente demande ELS 1 désigne le tripeptide Arg-Lys-Glu a été administré 4 jours consécutifs, après quoi les souris se sont reposées pendant 24 heures, puis les rates ont été prélevées et les cellules ont été examinées en ce qui concerne l'expression de l'antigène Thy 1.2 par fluorescence. Les souris témoins ont reçu du Milieu 199 (M199) le milieu dans lequel le médicament était dissous. Les souris avaient un poids moyen d'environ 24 g. RESULTATS CELLULES THY 1.2+ (%) Voie orale Voie i.p. Témoin 3% 5% ELS1 42 pg/kg 3% 6% ELS1 420 pg/kg 5% 8% ELS1 1055 pg/kg 7% 12% ELS1 2110,g/kg 15% 18% ELS1 4220 pg/kg 14% 17% ELS1 8440 yg/kg 15% 16% Les résultats montrent que le ELSl est capable d'induire la maturation des splénocytes tant par adminis15 tration orale qu'intrapéritonéale. La posologie optimale est de 2110 Pig/kg, tandis que pour des doses plus élevées, on observe une réponse en paliers. 2. STIMULATION IN VITRO DE LA PRODUCTION DE LYMPHOKINE MATERIEL ET METHODES PREPARATION DE CELLULES MONONUCLEES DU SANG PERIPHERIQUE HUMAIN (PBMC) Du sang périphérique est prélevé sur des volontaires sains par ponctions veineuses. Les érythrocytes sont séparés 25 des leucocytes sur des gradients Ficoll-Hipaque. La couche leucocytaires (PBMC) est éliminée et lavée, et les cellules sont remises en suspension à raison de 1 x 106 cellules/ml dans du RPMI 1640, complétées avec 1 % de pénicilline/streptomycine, 1 % de glutamine et 1 % de sérum de veau foetal 30 inactivé par la chaleur (FCS, 56 C, 30 min.). PREPARATION DU FACTEUR DE CROISSANCE Des PBMC, à raison de 1 x 106 cellules/ml dans du FCS inactivé par la chaleur à 1 % sont incubés avec ou sans Phytohemmagglutinine (PHA) à une concentration de 35 0,75 % v/v. Le peptide à essayer est ajouté à la concen- tration de 1 lig/ml à des cultures appropriées. La durée d'incubation est de 18-24 heures à 37 C dans une atmosphère humidifiée. Les cultures sont ensuite filtrées à travers des filtres 0,22 mM et les liquides surnageants sont exami5 nés pour y rechercher la présence de facteurs de croissance. MESURE DES FACTEURS DE CROISSANCE DANS LES LIQUIDES SURNAGEANTS A. Cellules d'essai Les lymphocytes B utilisés pour rechercher la présence 10du facteur de croissance des lymphocytes B (BCGF) sont des lignées cellulaires cultivées sur une durée prolongée, maintenues sur BCGF, et elles sont négatives à i'EBV. Ces cellules sont cultivées dans un milieu exempt de sérum en utilisant du Nutridoma (Boehringer Mannheim Biochemi15cals), et ne répondent pas à i'IL-2. Les lymphocytes T utilisés pour rechercher la présence d'IL-2 sont fraîchement isolés. Ils sont initialement stimulés avec du PHA (0,75 %) et sont maintenus en culture pendant au moins 10 jours avant l'utilisation (pour réduire 201e substratum et établir leur dépendance de I'IL-2). B. Préparation de cellules d'essai pour l'utilisation dans la recherche d'activité 1. Les lymphocytes B sont habituellement utilisées 4 jours après leur dernière alimentation avec du BCGF. 25Ils sont lavés 4 fois dans du RPMI 1640 pour éliminer le BCGF restant éventuellement, et ajustés à 15 x 104 cellules/ml dans du RPMI 1640 et du Nutridome (à une concentration finale de 1 %). 2. Les lymphocytes T sont utilisés 4 jours après 301a dernière alimentation avec de l'IL-2. Ils sont lavés 4 fois et ajustés à 50 x 104 cellules/ml dans du RPMI 1640 avec 5 % de FCS. C. Modes opératoires de l'essai 1. Des lymphocytes B cultivés sur une longue durée 35sont incubés avec diverses concentrations de liquide surna- geant de cultures de PBMC, dans 96 plaques de microtitrage à fond plat. Chaque puits a un volume total de 200 pl, constitué de 100 ul de lymphocytes B (15 x 103 cellules) et de 100 pl de liquide surnageant. La demanderesse a 5 examiné l'efficacité de ces lymphocytes B d'essai en les incubant avec diverses concentrations de BCGF purifié (Cellular Products, Inc. Buffalo, N.Y.). Les cultures sont incubées pendant 24 heures, après quoi on ajoute 1 uCi de [3H-Tdrl, puis on les incube encore 10 pendant 12 heures. On récolte ensuite les cultures et on les compte dans un compteur à scintillation. 2. Les lymphocytes T sont incubés dans des puits à fond plat. Le volume dans chaque puits est de 200 pl, comprenant 50 x 103 lymphocytes T/puits. La durée d'incu15 bation est de 72 heures, y compris 12 heures de marquage par le 13H-Tdr 1. RESULTATS 1) PRODUCTION DE FACTEURS DE CROISSANCE EXPERIENCE 1 ACTIVITE DE LA BCGF (C.P.M.) % SuP. (%) surnageant) Supt. de 3,05 6,25 12 5 25 50 PBL + PHA 424 1026 1674 3172 8392 PBL + PHA + ELS1 684 1658 2863 5600 7838 ACTIVITE DU TCGF (C.P.M.) % de Sup. PBL + PHA 542 192 224 564 1144 PBL + PHA + ELS1 624 438 1062 1926 3296 EXPERIENCE 2 Activité du BCGF (C.P.M.) % de Sup. 15 20 25 30 Sup.tL PBL + de PHA 6 t 25 2187 2837 12,5894 8104 10886 PBL + PHA + ELS1 1586 3994 7728 ACTIVITE DU TCGF (C.P.M.) % de Sup. PBL + PHA 3146 4424 4322 6480 7184 9012 -PBL + PHA + ELS1 1908 3. EFFET SUR LA SYNTHESE D'ARN EFFET DU ELS1 SUR LA SYNTHESE D'ARN DANS LES LYMPHOCYTES T HUMAINS, TEL QU'OBSERVE PAR INCORPORATION DE 3H-URIDINE. COUPS PAR MINUTE (CPM). RESULTATS OBTENUS AU BOUT DE 24 HEURES D'INCUBATION. T 3732 T + PHA 20752 Concentration de 1'ELS1 (ug/ml) T + ELS1 4868 34966 5104 34497 T + ELS1 + PHA 32729 5272 31764 4. EFFET SUR LA SYNTHESE D'ADN EFFET DE L'ELS1 SUR LA SYNTHESE D'ADN DANS DES LYMPHOCYTES T HUMAINS, TEL QU'OBSERVE PAR INCORPORATION DE 3H-THYMIDINE COUPS PAR MINUTE (CPM). RESULTATS OBTENUS AU BOUT DE 3 JOURS D'INCUBATION T 154 T + PHA 6076 T + ELS1 35 T + ELS1 + PHA Concentration de 1'ELS1 (uig/ml) 2621 0, 19 262 242 196 240 9560 5. AUGMENTATION IN VITRO DU NOMBRE DES CELLULES Le tripeptide, ajouté à des cultures soit de lymphocytes T, soit de mélanges de lymphocytes T et B tous les 4 jours à une concentration de 5 iig/ml pendant une durée 5 de 30 jours, est capable d'augmenter le nombre de cellules avec un maximum de +50 % par rapport aux cultures témoins, l'observation étant effectuée entre le 10ème et le 15ème jour de l'expérience. ETUDES TOXICOLOGIQUES TOXICITE AIGUE Des études de toxicité aiguë effectuées sur des souris et des rats ont montré que jusqu'à une dose de 1000 mg/kg i.m., le tripeptide était totalement dépourvu d'effets toxiques. TOLERANCE Des études sur des lapins et des souris ont montré que le produit, à la dose de 100 mg/kg respectivement i.v. et i.p., ne provoquait aucune modification hémodynamique et aucun effet de comportement. En particulier, 20 la durée du sommeil provoqué par le pentobarbital ne présente qu'une légère augmentation. ACTIVITE D'INDUCTION DE L'ALLERGIE Le produit, à la dose de 100 mg/kg i.m. n'induit aucun phénomène de sensibilisation chez le cobaye. 25 SELS DU TRIPEPTIDE Les recherches cidessus ont été effectuées avec un acétate du tripeptide, cependant il est bien connu dans l'état de la technique que l'on peut obtenir des résultats similaires en utilisant d'autres sels, par exemple 30 le trifluoracétate, le chlorhydrate, le sulfate. REVENDICATIONS e 1.- Tripeptide constitué de L-Arg (arginine), L-Lys (lysine) et L-Glu (acide glutamique) et ayant la structure suivante: Arg-Lys-Gly 2.Composition pharmaceutique comportant notamment un tripeptide selon la revendication 1. 3.- Composition pharmaceutique selon la revendication 2 à activité immunostimulante notamment sur la maturation et la fonction des cellules T utile 10 notamment en cas de déficiences du système immunitaire. 4.- Composition pharmaceutique selon l'une des revendications I et 2 comportant un sel pharmaceutiquement acceptable du tripeptide notamment choisi parmi un acétate, trifluoracétate, chlorhydrate, sulfate. 5.- Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 2 à 4 administrable par voie orale. 6.- Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 2 à 4 administrable par voie parentérale. 0 7.- Application d'un tripeptide d'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables pour la préparation d'une composition pharmaceutique selon l'une des revendications 2 à 6.