FR 2594846 A1 19870828 FR 8602379 A 19860221 La présente invention concerne un procédé de préparation de la sérum albumine humaine mature à partir d'une sérum albumine humaine produite par voie microbiologique sous forme de protéine fusionnée. Il existe un grand choix d'organismes hôtes, tels que les cellules mammifères modifiées ou les micro-organismes qui peuvent potentiellement être utilisés en vue de la production en quantités importantes de protéines humaines d'une grande valeur thérapeutique. L'utilisation de cellules mammifères modifiées par les techniques de l'ADN recombinant présente l'avantage de conduire à des produits très proches de ceux d'origine naturelle; cependant la culture de ces cellules est délicate et ne peut être conduite que dans des volumes limités. L'emploi de micro-organismes, tels que les bactéries, permet une fabrication à une échelle plus importante mais présente l'inconvénient de conduire à des produits qui diffèrent sensiblement des produits d'origine naturelle. Ainsi les protéines normalement glycosylées chez l'homme ne sont pas, en général, glycosylées par les bactéries [P. Berman et L.A. Laskey, Trends Biochem. Sci., (1985) 10, p.51 et suivantes]. Par ailleurs, les protéines humaines exprimées à haut niveau dans des bactéries telles que E.coli acquièrent souvent une conformation non native qui s'accompagne d'une précipitation intracellulaire [R.G. Schoner et coll., Bio. Technol. (1985), 3, p.151 et suivantes; J.M. Schoemaker et coll., EMBO J. (1985), 4, p.775 et suivantes]. Enfin pour qu'un gène puisse s'exprimer dans une bactérie, telle que E.coli, il est indispensable de positionner un codon initiateur méthionine devant la séquence codante de la protéine. Généralement, ce résidu n'est pas excisé par la méthionyl aminopeptidase de E.coli [P.H. Seeburg et coll., 1985, 2, p.37 et suivantes; J.M. Schoner et coil., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981), 81,p. 5403]. La protéine obtenue présente donc un acide aminé anormal comme premier résidu qui peut provoquer l'inhibition stérique d'une activité biologique si le début de la protéine est impliqué dans cette activité. Le résidu peut également présenter un caractère immunogène néfaste à l'administration ultérieure de la protéine. Il résulte que le choix d'une cellule-hôte dépend de la protéine spécifique que l'on veut obtenir. Dans le cas d'une pro- téine de valeur marchande élevée et nécessaire en quantité limitée, les cellules mammifères peuvent constituer une source particu- lièrement bien adaptée. Par contre dans le cas d'un produit de valeur marchande plus faible et nécessaire en quantité importante, de l'ordre de plusieurs dizaines de tonnes, telle que la sérum albumine humaine (SAH), il parait indispensable d'utiliser des micro organismes tout en remédiant aux inconvénients liés à leur emploi. Lorsque la SAH est exprimée à partir d'une construction génétique du type "Promoteur-Site de démarrage de traduction-ATG- Gène de la SAH mature", la protéine obtenue conserve généralement une méthionine comme résidu N-terminal. Pour éliminer la méthionine Nterminale de protéines hétérologues exprimées chez E.coli, plusieurs méthodes peuvent être envisagées, telles que le clivage enzymatique in vivo; l'excision protéolytique pendant ou immédiatement après le transport à travers la membrane ou bien des digestions protéolytiques ou chimiques in vivo. Il est connu, en particulier d'après J.P. Waller, J. Mol. Biol., (1963), 7, p.483 et suivantes, que E.coli possède une méthionyl aminopeptidase qui excise la méthionine N-terminale d'un certain nombre de protéines. Cependant la spécificité du mécanisme est mal connue et il est supposé que ce mécanisme dépend du ou des résidus suivant la méthionine [V.M. Vogt, J. Biol. Chem. (1970), 245, p.4760 et suivantes; H.J. George et coll., (1985) DNA, 4, p.273]. En les protéines secrétées sont généralement initialement synthétisées sous forme d'une préprotéine comportant une "séquence- signal" qui -inclut le premier résidu. Cette séquence subit une excision protéolytique pendant ou immédiatement après le transport à travers la membrane [R. Scheckman, Trends Biochem (1985), 10, p.177]. Cependant ce système ne convient généralement pas dans le cas de protéines cytoplasmiques ou hétérologues du fait des problèmes de transport dGs soit à certaines parties de la séquence primaire de la protéine [J. Tommassen et coll, EMBO J. (1985), 4 p.1041] soit à une précipitation intra-cytoplasmique trop rapide de la protéine. Par ailleurs les mécanismes impliqués dans la sécrétion de protéines par les cellules encaryotes, telles que la SAH sécrétée par les cellules hépatiques, sont vraisemblablement asser différents des mécanismes de sécrétion mis en jeu dans des microorganismes tels que les bactéries gram-négatives [N.Wickner et H. Lodish, Science (1985), 230 p.400]. Il a été également proposé d'employer des digestions chimiques ou enzymatiques afin de convertir in vitro la protéine synthétisée par la bactérie sous la forme d'une protéine fusionnée. Cette conversion a pour but l'excision spécifique d'une séquence peptidique étrangère à la protéine désirée, située en position Nterminale et contenant la méthionine comme premier résidu. Un exemple simple est celui d'une protéine qui ne possède pas naturellement de résidus méthionine [R.E. Chance et coll., "Peptides: Synthèses-StructureFonction", D.H. Rich et E. Gross, ed., Pierce Chem. Co, Rocford, Ill., (1981) p.721 et suivantes]. Dans ce cas, un traitement in vitro par le bromure de cyanogène permet l'excision de la méthionine N-terminale. Cependant ce cas ne se présente que très rarement dans le cas de protéines de poids moléculaire élevé. Certaines protéases, comme la collagénase et le facteur X, reconnaissent une séquence de plusieurs acides aminés, ce qui les rend relatfvement spécifiques. [K. Nagai et H.C. Thogerson, Mature (1984), 309, p.810 et suivantes; J.Germino et D. Bastia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984), 81, p.4692 et suivantes]. Une construction génétique permet donc de positionner la séquence reconnue par la protéase en question devant le premier acide aminé de la protéine désirée. Cette protéine fusionnée devient ainsi un substrat de la protéase, le produit principal de la réaction étant la protéine possédant en position N-terminale le même acide aminé que la protéine mature. Cependant, l'inconvénient majeur de cette méthode réside dans le prix de la protéase surtout lorsqu'il s'agit de produire une protéine en grande quantité. La SAH est synthétisée par les cellules humaines d'abord sous forme de prépro-SAH (figure 1). Une séquence signal de 18 acides aminés est enlevée pendant le transport de la SAH à travers le lumen du réticulum endoplasmique et il reste encore 6 acides aminés à l'extrémité Nterminale (Arg- Gly- Val- Phe- Arg- Arg-) qui ne sont pas présents dans la SAH circulante. Selon S.0. Brennan et R.W. Carrell, Biochim. Biophvs. Acta (1980), 621, p.83 et suivantes, ce propeptide ne semble jouer aucun r8le dans la sécrétion de la SAH. Il est possible qu'une deuxième protéolyse spécifique s'ef- fectue au niveau de l'appareil de Golgi ou dans la circulation sanguine, les deux résidus arginine formant le site de reconnais- sance d'une protéase de spécificité analogue à celle de la trypsine. En effet, un variant, appelé "Albumine Christchurch", dû à une mutation qui transforme le dernier résidu arginine du propeptide en glutamine n'est pas converti in vivo en albumine mature mais est transformé in vitro en Glu-SAH en traitant le propeptide par une faible concentration de trypsine. Par ailleurs, la SAH mature sous forme native est résistante à la trypsine dans les même conditions [S.O. Brennan et coll., Biochim. Biophys. Acta, (1984) 802, p.24 et suivantes]. Il a maintenant été trouvé, et c'est ce qui fait l'objet de la présente invention, un procédé permettant de transformer en SAH mature une SAE produite par voie microbiologique sous forme de protéine fusionnée. Le procédé selon la présente invention consiste: - à modifier in vitro le gène de structure de la SAH de telle sorte qu'il possède 6 codons supplémentaires codant pour les 6 premiers acides aminés de la protéine cII du bactériophage lambda, puis à lier le gène de structure ainsi modifié à la séquence nucléo- tidique qui précède naturellement le gène cII dans le gènome du bactériophage lambda et à un promoteur qui assure un niveau élevé de transcription, - à produire, dans des conditions définies, au moyen d'une bactérie hSte contenant le gène modifié, une protéine hybride ("pseudo-pro-SAH") constituée par les 6 premiers acides aminés du gène cII suivis de la séquence de la SAH mature, - à dénaturer et réduire puis renaturer la protéine hybride de façon à obtenir une protéine soluble dont la conformation est semblable à celle de la SAH d'origine naturelle, puis - à modifier in vitro, au moyen de trypsine, la protéine ainsi obtenue afin d'exciser la pseudo-pro-peptide et obtenir la SAH mature. Dans ce qui suit, la signification des termes techniques utilisés en biologie moléculaire est supposée connue (cf. par exemple J. Watson, "Biologie Moléculaire du Gène", édition française, Interéditions, 1978). Les méthodes couramment employées en biologie moléculaire du gène sont décrites, par exemple, par T. Maniatis et coll., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New-York, 1982). Dans ce qui suit seront décrits succes- sivement la construction, les procédés d'expression du gène, la renaturation et la conversion par la trypsine de la "pseudo-pro-SAH". A-CONSTRUCTION DU GENE "pseudo-pro-SAH". 1. Préparation d'ARN messager de foie __________________________________ On utilise des cellules hépatiques, obtenues par exemple par biopsie, et on en extrait 'ARN messager selon la méthode décrite par exemple par V. Glisin et coll., Biochemistry (1974), 13, p. 2633 et suivantes; et par R. Deeley et coll., J. Biol. Chem. (1977), 252, p. 8310 et suivantes. On traite la biopsie par une solution de thiocyanate de guanidine 6M, et l'on purifie l'ARN total par plusieurs cycles de précipitation dans l'éthanol à -20 C, centrifugation et redissolution des culots de centrifugation. On enrichit la préparation en ARN messager par plusieurs cycles de chromatographie d'affinité sur des colonnes d'oligo (dT)-cellulose, selon la technique décrite par H. Aviv et P. Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1972), 69, p. 1408 et suivantes. L'ARN messager ainsi isolé, contenant 1 à 2 % de l'ARN total, est conservé en solution aqueuse à -70 C. On peut déterminer la proportion d'ARN messager spécifique de la sérumalbumine humaine au sein de la population totale (par exemple par traduction in vitro d'un aliquot de la solution d'ARN dans des lysats de réticulocytes de lapin). Une méthode consiste à utiliser Je lysat de réticulocytes fournis par la société Amersham, suivant le protocole préconisé par ce fournisseur. Onr peut ainsi déterminer la fraction de protéine néoformée immunoprécipitable par des anticorps anti-albumine au sein de l'ensemble des protéines néoformées. On obtient par exemple une fraction de l'ordre de 6 %. 2. Synthèse de cDYA et clonage dans E.coli ________________________________________ a. Synthèse du premier brin A partir de la technique de G.N. Buell et coll., J. Biol. Chem. (1978), 253, p. 2471 et suivantes, modifiée, on utilise par exemple 5 mg d'ARN messager total dans un volume final de 50 micro- litres d'une solution contenant: 100 mM Tris-HCI pH 8.3, 10 mN MgCl1, 0,4 mM DIT, 20 mM KC1, 0,4mM Na pyrophosphate, lmM de chaque nucléotide triphosphate (dNTP), 100 mg/ml de oligo(dT)1218 0,5 U/mI. d'inhibiteur de ribonucléases, 50 picomoles de traceur radioactif et 40 unités de Transcriptase réverse (Société Life Science, Inc.). La réaction de transcription réverse de l'ARN messager en ADN complémentaire (ADNc) se poursuit pendant 1 heure à 42 C. Le taux de synthèse de ADNc est calculé par mesure du taux d'incorporation du traceur radioactif en molécules acido-précipi- tables, selon une technique connue. Après 1 heure, on arrête la réaction par addition d'EDTA (20 mM), et l'on détruit l'ARN messager par digestion alcaline dans mM de NaOH, à 42 C, pendant 3 heures. On sépare l'ADNc néoformé des dNTPs non-incorporés et des produits de dégradation alcaline des ARNs par chromatographie, par exemple, sur une colonne de Sephadex G100 (Pharmacia Fine Chemicals). On obtient 1,5 pg d'ADNc simple brin à partir de 5 pg d'ARN messager total. b. Synthèse du deuxième brin L'ADNc simple brin est converti en ADN double brin par action du fragment "Klenow" de l'ADN polymérase I. Les conditions de réaction sont: 100 mM Hepes pH 7, 10 IM MgCl2, 2,5 mM DTT, 70 mM KC1, 0,5 mn4 de chaque dNTP, et 50 unités du fragment "Klenow" de l'ADN polymérase I (commercialisée par exemple par la Société New England Biolabs Inc.). La réaction est poursuivie pendant 15 heures, à 15 C, et l'on sépare l'ADN double brin des dNTPs non incorporés à nouveau par chromatographie sur colonne de Sephadex G100. c. Clonage de l'ADN double brin Pour supprimer les molécules d'ADN simple brin et obtenir un ADN double brin à extrémités franches, on traite les séquences non appariées par la nucléase S1 selon la technique décrite par A. Efstradiatis et coll., Cell (1976), 7, p. 279 et suivantes. On sépare les ADNs néoformés double brin selon leur taille par centri- fugation dans un gradient de saccharose. On utilise généralement un gradient de 5 % - 20 Z de saccharose en 50 mM Tris-HC1l pH 8,5, 10 mM EDTA, 800 mM NaCl, centrifugé à 210000 g pendant 15 heures, à 20 C, et on effectue un fractionnement du gradient en aliquots après centrifugation. On contr8le la taille des molécules dans chaque fraction par électrophorèse d'échantillons faite en parallèle avec des étalons d'ADN de tailles connues, et l'on regroupe les fractions contenant un ADN constitué par l'enchaînement de plus de 500 paires de bases. Pour permettre le clonage de cet ADN on allonge d'abord ses extrémités 3' avec de l'oligo(dC), et on allonge parallèlement les extrémités 3' du site PstI du plasmide vecteur pBR322 avec de l'oligo(dG) selon la technique de F. Rougeon et coll., J. Biol. Chem. (1977), 252, p. 2209 et suivantes. On hybride alors l'ADN double brin décrit ci-dessus au plasmide vecteur, selon par exemple la technique de L. Villa- Komaroff et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1978), 75, p. 3727 et suivantes. On crée une "banque" de clones d'ADNcs de foie par transformation de la bactérie E.coli avec l'ADN ainsi décrit selon la méthode décrite par M. Mandel et A. Higa, J. Mol. Biol. (1970), 53, p. 154 et suivantes et M. Dagert et S.D. Erlich., Gene (1979), 6, p. 23 et suivantes. d. Repérage des clones d'ADNc albumine On utilise une technique d'hybridation sur colonies à l'aide d'oligonucléotides synthétiques dont les séquences sont déduites de la séquence protéique de l'albumine humaine (B. Meloun et coll., FEBS Letters (1975), 58, p. 134 et suivantes; M. Grunstein et D. Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1975), 72, p. 3961 et suivantes; R.B. Wallace et coll., Nucleic Acids Res. (1981), 9, p. 879 et suivantes). Les clones sont cultivés par séries de 96 sur milieu de Luria contenant 25 mg/ml de tétracycline, en boîtes carrées, direc- tement sur des filtres de nitrocellulose. Après croissance à 370C puis amplification en présence de 250 pg/ml de chloramphénicol, les colonies sont lysées par la soude puis hybridées avec les oligonu- cléotides radioactives en 5' par kination, dans une solution contenant: 5 X SSC, 0, 5 Z NP 40, 100 pg/ml ADN de sperme de saumon dénaturé par ébullition et refroidi rapidement dans la glace, 0,5 ng/ml d'oligonucléotide kinasé. L'hybridation est effectuée à 37 C pendant 18 heures. On lave ensuite les filtres en 5 X SSC, à C, puis 37 C, puis 45 C et ce pendant quatre fois 15 minutes à chaque étape. Les filtres sont alors exposés sur films Kodak X-OMAT, à -70 C, avec un écran amplificateur pendant 15 à 24 heures. Les clones hybridants avec les sondes sont réisolés puis lysés. L'ADN plasmidique est purifié par centrifugation en milieu chlorure de césium-bromure d'éthidium selon une technique connue. On séquence l'ADN de l'insertion par la technique de Maxam-Gilbert (A. Maxam et W. Gilbert, Methods Enzymol. (1980), 65, p. 499 et suivantes) pour comparer la séquence protéique dérivée de la séquence nucléotidique et celle de la sérum-albumine humaine. On identifie ainsi une série de clones dont les insertions correspondent à l'ensemble du gène de la sérum-albumine humaine. Dans la figure 2 est représentée la carte de restriction du gène de la sérum-albumine, ainsi que la position de trois des insertions les plus représentatives, désignées par "pT1Bll", "pAA38", "p6D8". e. Incorporation au gène de structure d'un codon d'initiation (figure 3) a) On digère l'ADN du plasmide "pT1Bll" par les enzymes PstI et PvuII, et on isole un fragment d'ADN de 125 paires de bases, correspondant à la séquence de l'extrémité 5' du gène de la sérum- albumine (acides aminés n 1 à 62). On fixe à l'extrémité PvuII une séquence de jonction constituée du site de reconnaissance de l'enzyme BamHI. On obtient ainsi un fragment PstI-BamHI. On prépare d'autre part un oligonucléotide synthétique ayant 21 bases de long, possédant un triplet "ATG" devant les nucleotides codant pour les acides aminés de la sérum-albumine humaine ainsi qu'un site de restriction NcoI, et dont la séquence est la suivante: 5'GAATCCATGGATGCACACAAG 3'. On dénature le fragment d'ADN PstI-BamHI, et on l'hybride avec l'oligonucléotide synthétique. L'hybridation se fait par la séquence 5'...GATGCACACAAG 3', l'extrémité 3' du brin d'ADN complé- mentaire étant désappariée. On digère les extrémités désappariées, puis on polymérise dans le sens 5'...3' avec le fragment "Klenow" de l'ADN polymérase I, d'après les techniques de H. Jacobsen et coll., Eur. J. Biochem. (1974), 45, p. 623 et suivantes. On obtient ainsi un fragment contenant en 5' une extrémité franche, un site NcoI puis le triplet ATG et en 3' un site BamHiI. b) On réalise la ligation de trois fragments d'ADN: 1) un fragment EcoRIBamHI du plasmide "pLG200" (L. Guarente et coll., Cell (1980) 20, p. 543 et suivantes) portant un gène de résistance aux antibiotiques, l'origine de réplication et l'extré- mité 3' du gène de la 0-galactosidase, 2) un fragment EcoRI-PvuII du plasmide "pGL101" (G. Lauer et coll., J. Mol. Appl. Genet. (1981), 1, p. 139 et suivantes) portant le promoteur Plac et le site de fixation de ribosome (RBS) du gène lacZ d'E.coli, 3) le fragment d'ADN mutagénisé codant pour les 62 premiers acides aminés de l'albumine humaine. On isole un plasmide (pXL52) qui réalise une fusion de l'extrémité 5' du gène de la sérum-albumine humaine avec le gène de la 0-galactosidase d'E.coli. f. Construction du gène complet (figure 3) On digère l'ADN du plasmide "p6D8" par EcoRI, et partiel- lement par BglII, selon une technique déjà décrite. On isole le grand fragment EcoRI-BglII contenant la séquence codant pour les 405 derniers acides aminés de la sérum-albumine humaine puis l'origine de replication du plasmide et le gène de résistance à la tétracy- cline. On digère l'ADN du plasmide "pXL52" décrit ci-dessus par EcoRI et Sau3A, et on isole un fragment contenant 200 paires de bases. On digère l'ADN du plasmide "pAA38" par Sau3A et on isole un fragment contenant 540 paires de bases. On ligature les trois fragments (dans l'ordre [pXL52 EcoRI-Sau3A] - [pAA38 Sau3A] - [p6D8 BglII-EcoRI]) en tirant profit de la compatibilité entre les sites Sau3A et BglII. On obtient un plasmide appelé "pXL53", dont la qualité de la construction est contr8lée par un séquençage complet du fragment compris entre le site EcoRI et le site PstI correspondant à la jonction de l'insertion et du plasmide vecteur. La séquence nucléotidique complète, ainsi que la séquence protéique dérivée, sont représentées dans les figures 4 et 5. Les variations observées entre cette séquence et la séquence protéique publiée (B. Melcun et coll, FEBS Letters (1975), 58, p. 134 et suivantes; M. Dayhoff, Atlas of Protein sequence and structure (1978), 5, supplément 3, p. 306) sont les suivantes: Position Meloun et coll. Sérum albumine humaine déduite de la séquence de "pXL53" 131 Glutamine Acide glutamique 364 Histidine Alanine 367 Tyrosine Histidine 370 Alanine Tyrosine Position Meloun et col]. Sérum albumine humaine déduite de la séquence de "pXL53" 381 Valine Méthionine 464 Acide glutamique Histidine 465 Histidine Acide glutamique 501 Glutamine Acide glutamique 3. Construction de systèmes d'expression de la méthionyl-sérum-albumine humaine a) Utilisation du promoteur "PL" du bactériophage lambda On linéarise le plasmide "pXL53" par digestion partielle par l'enzyme NcoI, en ne considérant que le site NcoI en 5' du codon d'initiation et on forme des bords francs par remplissage selon la technique de R.M. Wartell et W.S. Reznikoff, Gene (1980), 9, p. 307 et suivantes). On synthétise un "adaptateur" contenant en 5' une séquence correspondant au site de reconnaissance d'une enzyme de restriction telle que BamHI, puis une séquence correspondant à un site de fixation de ribosomes (RBS "consensus" ou "théorique"). La séquence de l'adaptateur est: 5'GGATCCTAGGAGGAAC 3'. La ligation de l'adaptateur en 5' d'un ADN à bords francs a gté décrite, par exemple, par C.P. Bahl et coil., Gene (1976), 1, p. 81 et suivantes. La méthode consiste à effectuer la réaction sur 20 micro- litres d'une solution contenant 50 mN Tris, HC1 pH = 7,5, 10 mn MgCl2, 15 mM DTT, lmM ATP, 50 ig/ml d'adaptateur, 20 Pg/ml d'ADN et 1 unité d'ADNligase (New England Biolabs Inc.). La réaction est poursuivie pendant 10 heures à 15 C. Cette ligation crée un site BamnHI sans supprimer le site NcoI. On digère le produit de ligation par BamHI et par HinDIII. Du fait de la présence d'un site HinDIII en 3' du gène de la sérum- albumine humaine, on obtient un fragment d'ADN contenant la totalité de la séquence codante. On sous-clone le fragment HinDIII-BamHI ainsi obtenu par exemple dans le plasmide "pBR322" en transformant E.coli selon la méthode déjà décrite cidessus pour obtenir le plasmide "pXL61". Le plasmide "pXL61" ne contient pas de promoteur. Le promoteur "PL" du bactériophage lambda est placé sur le chromosome du bactériophage entre un site BglII et un site BamHI (voir E. Szybalski et W. Szybalski, Gene (1979) 7, p. 217 et suivantes), et dont la séquence nucléotidique est connue (F. Sanger et coll., J. Mol. Biol. (1982), 162, p. 279 et suivantes). On peut cloner ce fragment et modifier ses sites de restriction selon des méthodes connues. On note que les plasmides portant PL doivent être propagés dans des souches de E.coli portant le gène répresseur cI, ceci afin d'éviter que ce promoteur ne s'exprime de façon constitutive. Dans une première construction, PL est disponible sous forme d'un fragment BamHI à partir du plasmide "pPL-lambda" (Pharmacia P.L. Biochemicals). L'insertion de ce fragment BamHI dans le site BamHiJ du plasmide "pXL61" permet d'obtenir le plasmide "pXL65", dans lequel on a vérifié que l'orientation du promoteur par rapport au gène de structure de la sérum-albumine humaine est correcte. D'autres constructions peuvent être réalisées à partir de plasmides disponibles. On peut, par exemple, exciser du plasmide "pPL-lambda" un fragment HaeIII-HaeIII contenant le promoteur P et L L l'insérer dans le site SmaI d'une séquence de clonage multisite portée sur un plasmide, tel que le plasmide "pUC8" (J. Vieira et J. Messing, Gene, (1982), 79, p. 259 et suivantes) pour obtenir "pUC8-PL"" dans lequel le site EcoRI est en 5' du promoteur. L A partir du p]asmide "pPS1" (P. Sarmientos et coll., Cell (1983), 32, p. 1337 et suivantes), on peut d'abord détruire le site HinDIII le plus proche du site NdeI (figure 3) puis remplacer le petit fragment EcoRI-HirDIII par, d'une part, le fragment EcoRI- BamHI du plasmide "pUC8-PL" contenant le promoteur PL, et, d'autre part, le fragment BamHI-HinDIII du plasmide "pXL61" contenant le gène de la sérum-albumine. On obtient ainsi le plasmide "pXL70" dans lequel l'ensemble PL-RBS "consensus"-ATG-gène de la sérum-albumine humaine est porté sur un fragment d'ADN EcoRI-HinDIII. b) Remplacement du RBS "consensus" par celui du gène cII du bacté riophage lambda Le gène cII du bactériophage lambda dont la séquence et le site d'initiation sont connus peut être traduit avec efficacité (E. Schwarz et coll., Nature (1978), 272, p. 410 et suivantes). On construit un plasmide contenant le système d'expression "Promoteur "PL" - RBS cII - ATG - gène sérum-albumine". Par exemple, on peut après avoir détruit le site BamHlI de "pUC8-PL" par action de l'enzyme SI (A.J. Berk et P.A. Sharp, Cell (1977), 12, p. 72) isoler un fragment EcoRI-HinDIII contenant le promoteur PL et ensuite lier ce fragment avec le grand fragment EcoRI- HinDIII du plasmide "pDS20" (G. Duester et coll., Cell (1982), 30, p. 855 et suivantes), pour obtenir le plasmide "pXL73". Le RBS du gène cII est extrait du plasmide "pPSl". On digère ce plasmide par NdeI et on insère un adaptateur BamHI après formation d'extrémités franches. On excise alors le RBS sous forme d'un fragment HinDIII-BamHI. On construit d'abord un plasmide "pXL88" dans lequel ce fragment HinDIIIBamHI est lié au grand fragment HinDIII-BamHI du plasmide "pXL73". Dans le nouveau plasmide "pXL88", le RBS cII est inséré dans la bonne orientation par rapport au promoteur PL, le tout dans un système multisites de telle sorte que l'ensemble PL-RBS cII soit porté sur un fragment d'ADN EcoRI-BamHI de 578 paires de bases. Le fragment EcoRI-BamHI de 578 paires de bases est sous- cloné entre les sites EcoRI et BamHI du plasmide "pMC1403" (M.J. Casadaban et coll., J. Bacteriol. (1980), 143, p. 971 et suivantes) qui porte le gène de la e-galactosidase (lacZ) après le site BamHI. Cette construction conduit au plasmide "pXL91" dans lequel le gène de la $galactosidase est exprimé sous contr8le du système "PL-RBS cII". On sous-clone le fragment BamHI-BglII du plasmide "pXL61" décrit précédemment dans le site BamHI du plasmide "pMC1403". (La ligation d'un site BglII dans un site BamHI est possible, mais l'excision par BamHI en BglII ne l'est plus; il ne reste donc qu'un site BamHI). Cette construction ("pXL71") aboutit à l'insertion d'un fragment d'ADN de 700 paires de bases comportant la séquence "BamHI-[RBS "consensus"-ATGNcoI-gène partiel de la sérum-albumine (codant pour les acides aminés 1 à 218)-gène de la 0-galactosidase]. On coupe ce plasmide par BamHI et SacI (le site SacI est présent dans le gène de la 0-galactosidase) et on l'insère dans le plasmide "pXL91" décrit précédemment à la place du fragment préexis- tant BamHI-SacI. On aboutit alors au plasmide "pXL97" dont l'insertion a la structure suivante: "Site EcoRI - PL - RBS cII - site BamHI - RBS "consensus"- site NcoRI - ATG - gène partiel de la sérum-albumine - gène de la bgalactosidase". On digère le plasmide "pXL97" par BamHI et partiellement par NcoI en ne considérant que le site NcoI proche du codon d'initiation et on forme les bords francs par action de la nucléase S1, puis on le referme sur lui-même. Cette manipulation, d'une part, supprime la séquence d'ADN du RBS "consensus" et, d'autre part, met en phase un ATG du RBS cII avec la séquence de la sérum-albumine. On obtient ainsi le plasmide "pXL136" qui comporte la séquence "site EcoRI-PL-RBS cII-ATG-gène partiel de la sérum- albumine-gène de la 0-galactosidase". Le gène partiel de la sérum-albumine possédant un site PvuII, on digère le plasmide "pXL136" par EcoRI et PvuII et on extrait un fragment de 760 paires de bases qui est inséré entre les sites EcoRI et PvuII du plasmide "pXL70" décrit précédemment. On obtient ainsi le plasmide "pXL139" qui porte la structure "PL-RBS cII-gène sérum-albumine complet" sur un fragment EcoRI-HinDIII, comme le plasmide "pXL70" et qui porte la substitution RBS "consensus" par celui du gène cII. On coupe le plasmide "pXL139" décrit précédemment au site unique Sall, entre le promoteur PL et le RBS cII. On digère l'ADN par l'enzyme Ba131, de telle sorte que le site de fin de trans- cription tRlen 5' du RBS cII soit digéré puis on ajoute un adaptateur HindIII et on isole le fragment HindIII-Xbal contenant le RBS cII amputé de tR1 et les 357 premiers codons du gène de la sérum albumine humaine. On combine ce fragment HindIII-XbaI avec d'une part le fragment XbaIEcoRl du plasmide pXL139 contenant la fin du gène de la sérum-albumine humaine et d'autre part le fragment EcoR1-HindIII portant le promoteur PL obtenu à partir du plasmide pUC8-PL après destruction du site BamH1. On obtient ainsi le plasmide pXL324. 4. Construction d'un plasmide d'expression pour la "pseudo-pro-SAH" Un fragment d'ADN est construit par hybridation de deux oligonucléotides synthétiques ayant la structure donnée dans la figure 6A. La- séquence contient un codon de démarrage 'ATG" suivi par les 6 premiers codons du gène cII du bactériophage lambda. Ce fragment possède une extrémité cohésive de type HinDIII et une autre extrémité cohésive de type SalI. Ce fragment synthétique est cloné entre les sites HinDIII et SalI du vecteur M13mplO (J. Messing, Methods Enzymol., (1984), 101, p.20 et suivantes). Le DNA en forme réplicative purifié à partir de cellules infectées par le bactériophage résultant est utilisé dans l'étape suivante de construction. Un fragment SalI-BglII de 765 paires de bases provenant du plasmide pXL324 contenant le début du gène (ADNc) codant pour la SAH est cloné dans ce bactériophage recombinant. La souche de E.coli JM101 est infectée par ce nouveau bactériophage et le surnageant d'une culture de 5 heures est utilisé comme source de particules phagiques contenant l'ADN simple brin caractéristique des phages filamenteux de type M13. Ce simple brin sert ensuite de matrice pour une mutagénèse dirigée par oligonucléotide permettant de supprimer la séquence comprise entre le sixième codon du gène cII et le premier codon de la SAH mature (GAT) selon les méthodes décrites, par exemple, par J.P. Adelman et coll., DNA (1983), 2,.p.183. L'oligonucliotide utilisé dans cette mutagénèse dirigée est décrit dans la figure 6B. Le phage résultant contient le début d'un nouveau gêne fusionné. La structure de fragment d'ADN utilisé dans les constructions ultérieures est vérifiée par la méthode de séquençage enzymatique (F. Sanger et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1977), 74, p.5463). Une reconstruction du gène complet codant pour la fusion "pseudo-pro-SAH" est ensuite effectuée. Un vecteur contenant un gène de résistance à l'ampicilline, une origine de réplication, un terminateur de transcription et une partie de l'ADNc codant pour la SAH est préparé à partir du plasmide pXL70 en traitant ce plasmide par les enzymes de restriction EcoRI et PvuII. Le fragment de 7200 paires de bases environ est purifié par électrophorèse en gel d'agarose et électroélution. Un fragment de 430 paires de bases contenant le promoteur PL et le site d'accrochage sur le ribosome (RBS) modif é du gène cII est purifié à partir d'une digestion du plasmide "pXL324" par les enzymes EcoRI et NdeI par électrophorèse en gel de polyacrylamide et électroélution. Un fragment de 200 paires de bases contenant le début du gène hydride cII- SAH est purifié à partir de la forme réplicative du bactériophage M13 recombiné modifié par mutagénèse in vitro décrite ci-dessus. Une réaction de ligation à trois partenaires a été effectuée. Le plasmide résultant est appelé "pXL462" (figure 7). Le plasmide "pXL462" a été introduit dans la souche G819 par transformation. Cette souche est dérivée de la souche E103S (L. SIMON, Waksman Institute for Microbiology, Rutgers-The State University, Piscataway, N.J.,USA) par transformation avec le plasmide pRK248clts (H-U. Bernard et coll., Gene (1979), p.59 et suivantes). Ce plasmide est compatible avec "pXL462" et porte le gène cl du bactériophage lambda qui code pour un répresseur thermo- sensible du promoteur PL' Ce répresseur devient en effet inactif au dessus de 38,5cC. La souche obtenue porte le numéro G1398. A partir du plasmide pXL462, d'autres plasmides ont été construits o le promoteur PL contenu sur un fragment de restriction EcoRI-HindIII a été remplacé par différents promoteurs bactériens inductibles. La constuction de ces plasmides a utilisé le site XbaI unique de pXL462 et une réaction de ligation à trois partenaires du type de celle décrite ci-dessus (voir figure 7). La présente invention ne dépendant par du type de promoteur bactérien utilisé, seul le cas du plasmide pXL462 portant le promoteur PL sera évoqué dans ce qui suit. B. PRODUCTION DE cII-SAH PAR VOIE MICROBIOLOGIQUE 1. Culture et Induction A partir d'un réisolement de la souche G1398 sur une boite de pétri gélosée à base de milieu LB contenant 50 microgrammes/ml d'ampicilline (LBAp) préalablement incubée à 30 C, une préculture est diluée 100 fois dans le même milieu et la culture est incubée à C avec agitation. Lorsque la densité optique lue à 610 nanomètres atteint 1,0 la culture est alors portée à 420C pendant 90 minutes 16 avec agitation. 2. Sonication, récupération de la cII-SAH Le culot cellulaire collecté par centrifugation est resuspendu dans 1/30 de volumes de PBS (0,2g/lKD1, 0,2 g/1KH2PO4, 8g/1NAC1 et 1,25g/1NA2HPO4). Après incubation pendant 15 minutes à une température voisine de 20 C en présence de lysozyme de blanc d'oeuf à 1 mg/ml, la sonication des bactéries est effectuée à 0 C, par exemple, avec un sonicateur Branson (Modèle B30) en mode continu pendant deux fois six minutes avec refroidissement. La fraction insoluble est collectée par centrifugation à 12000g à 4 C pendant minutes puis lavée par du PBS et séchée sous vide à 30 C pendant minutes. 3. Dénaturation, réduction et renaturation Le culot de sonication contenant les produits insolubles provenant de 1 litre de culture est repris dans 4 ml de solution dénaturante et réductrice (6M guanidine-HCl, 0,1 MKG2PO4 PH7,5, 0,1 M 0-mercaptoéthanol). La suspension ainsi obtenue est agitée doucement en tube fermé à 4 C pendant 16 heures. Une solution presque limpide est alors obtenue.Un léger précipité insoluble est éliminé par centrifugation. Une dilution au 1/100 du surnageant est effectuée dans une solution de renaturation (50 mM Tris-HCl pH8,5, 100mM NaCl, ImM EDTA) et ce mélange est laissé à 4 C pendant 24 heures. La solution est ensuite centrifugée pour éliminer une opalescence blanchâtre. Le surnageant obtenu est concentré environ fois par ultrafiltration (membrane à "cut-off" de 30.000 daltons par exemple en utilisant les unités d'ultrafiltration à usage unique Millipore CS-30), de nouveau clarifié par centrifugation puis dialysé contre un tampon phosphate (Na) 20 mM pH 7,5. La protéine fusion cII-SAH (pseudo-pro-HSA) ainsi obtenue est homogène à plus de % d'après une analyse par électrophorèse sur gel de polyacry- lamideSDS. 4. Conversion de la cII-SAH en SAH mature Une solution de trypsine (préparée par exemple à partir de trypsine lyophilisée pour usage analytique commercialisée par Boehringer Mannheim) est préparée dans la solution de réaction. La cII-SAH est traitée à une concentration, par exemple de l'ordre de 1 mg/ml, avec une quantité de trypsine comprise entre 1/5000 et 1/1000 (rapport massique à la SAH) à 37 C pendant 30 à 60 minutes dans un tampon phosphate (Na) 50 mM pH 7,5,50mM CaCl2. 5. Vérification de la coupure Il est possible de suivre la réaction de conversion par la trypsine sur un gel de polyacrylamide non dénaturant (figure 8). A cause de la présence de plusieurs acides aminés chargés positivement dans l'hexapeptide N-terminal, la migration électrophorétique de la cII-SAH est plus lente sur ce type de gel que celle de la SAH native. Sur la figure 4, on peut voir que la SAH commerciale n'est pas modifiée de façon appréciable par la trypsine dans la gamme de concentrations utilisée. Par contre, la cII-SAH est convertie par l'action de la trypsine en une molécule qui co-migre avec la SAH commerciale. La séquence N-terminale de cette protéine modifiée par la trypsine a été examinée par dégradation de Edman et les résultats obtenus confirment bien que le site de protéolyse est situé après le dipeptide Lys-Arg, à la fin de la partie cII de la protéine hydride. La protéine ainsi générée possède l'acide aspartique comme résidu N-terminal; elle est donc identique à la SAH d'origine naturelle. REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation par voie microbiologique de la protéine fusionnée cII-SAH caractérisé en ce que l'on cultive une souche d'E.coli, capable d'assurer le maintien d'un plasmide contenant les six premiers codons du gène cII du bactériophage lambda fusionnés à la séquence nucléotidique codant pour la sérum-albumine humaine mature, dont l'expression est contr8lée par un promoteur bactérien inductible. 2) Procédé de préparation de la protéine fusionnée cII-sérum-albumine humaine caractérisé en ce que l'on convertit la molécule dénaturée et insoluble obtenue selon la revendication 1 en une molécule renaturée et soluble en utilisant une méthode de dénaturation et renaturation permettant un réarrangement des structures secondaire et tertiaire de la chaîne polypeptidique. 3) Procédé selon les revendications 1 et 2 caractérisé en ce que la protéine hybride cII-SAH est convertie par la trypsine en une protéine identique en structure primaire à la sérum-albumine humaine mature. 4) Le plasmide "pXL462" caractérisé en ce qu'il contient le promoteur PL' le site de fixation des ribosomes du gène cII privé du signal de terminaison de la transcription tRl, le codon d'ini- tiation ATG et les six premiers codons du gène cII fusionnés avec le gène de structure de la sérum-albumine humaine mature. ) La protéine hybride comprenant à l'extrémité N-ter- minale les six premiers acides aminés de la protéine cII du coli- phage lambda, (Met)-Val-Arg-Ala-Asn-Lys-Arg fusionnés à fa séquence peptidique de la sérum-albumine humaine native.