FR 2589881 A1 19870515 FR 8615383 A 19861105 i La présente invention se rapporte à la production, par des bactéries, de substances polymères utilisables com- me agents de dispersion dans un milieu aqueux de produits solides finement divisés, en particulier de substances mi- nérales, insolubles dans l'eau. Elle concerne en outre des compositions renfermant ces agents de dispersion polymères, ainsi que des procédés de production et de purification de ces agents polymères. Des micro-organismes, présentant un rapport surface/volume élevé, produisent une variété d'agents tensio- actifs. Une grande quantité d'agents tensio-actifs,ayant un poids moléculaire inférieur à 2000 daltons, est produite par des microbes. Parmi ceux-ci on peut mentionner des sub- stances qui sont tensio-actives et qui sont produites par des espèces tel que Rhodococcus, Torulopsis, Pseudomonas, Corynebacterium, B. subtilis, et similaires. De nombreux agents tensio-actifs microbiens, qui sont en général des mélanges de protéines et de polysaccha- rides, sont produits par Acinetobacter calcoacéticus. D'au- tres agents tensio-actifs sont produits par Candida Tropi- calis, Pseudomonas aeruginosa, Phormidium J-1. Aucune des substances tensio-actives connues, produites par des bacté- ries, et par les micro-organismes susmentionnés, ne s'avère efficace comme agent de dispersion de substances finement divisées. Les agents de dispersion sont des substances ten- sio-actives spécifiques, aptes à faciliter la formation et la stabilisation de substances solides finement divisées dans un liquide, en général dans un système aqueux. Les agents de dispersion sont utilisés sur une grande échelle dans différents procédés de fabrication, com- me production de papier, d'encres, de peintures, de produits pharmaceutiques, de matières plastiques, de colorants, de produits alimentaires, de céramiques, de caoutchouc, de ciment et similaires. Les agents de dispersion sont large- ment utilisés dans les industries minières. Ils exercent leur action par adsorption sur les particules solides, leur conférant une charge électrique, qui sont ultérieu- rement entourées d'ions complémentaires, ce qui entralne une répulsion mutuelle des particules voisines, empêchant la floculation et maintenant ainsi en suspension les par- ticules finement dispersées. A ce jour, on ne connaît pas d'agents de disper- sion polymères pour substances minérales à l'état finement divisé, produits par des bactéries. La présente invention permet d'obtenir de nou- velles substances polymères, efficaces comme agents de dispersion à des concentrations relativement faibles. Les nouveaux produits polymères selon l'invention, utilisables comme agents de dispersion dans un milieu aqueux pour des solides insolubles dans l'eau, à l'état finement divisé, sont caractérisés en ce qu'ils sont les produits de fermentation purifiés d'une souche appropriée de bacté- ries. Ils peuvent être utilisés dans un grand nombre d'industries, indiquées plus hautjls s'avèrent efficaces pour la dispersion dans l'eau de substances finement divisées comme pierre à chaux, carbonate de calcium, phosphates (apatites), dioxyde de titane, et similaires. Dans une forme de réalisation préférée de l'in- vention, on utilise les substances polymères produites par certaines souches de Acinetobacter calcoaceticus. Ces sub- stances, produites par voie bactérienne, sont du type poly- saccharide à poids moléculaire élevé. Obtenues à l'état ho- mogène pratiquement pures, elles sont caractérisées par une activité spécifique élevée d'agent de dispersion. Les agents de dispersion selon l'invention sont gé- néralement des hétéro-polysaccharides renfermant des groupes carboxy, et leurs sels avec des cations, ainsi que des radi- caux amino- et/ou acylamino-monosaccharides, y compris les sels d'addition de ces groupes amino. Les cations sont par exemple des ions sodium, potassium ou ammonium; et les sels d'addition acides peuvent être chlorhydrate ou simi- laires. Ces produits polymères provenant de bactéries comprennent un mélange de composés de poids moléculaires individuels différents, L'invention s'étend aux hétéro-polysaccharides renfermant des carboxyle et des amino- (et/ou acylamino-) groupes, qui peuvent disperser des produits minéraux, et qui ont des poids moléculaires inférieurs ou supérieurs à ceux qui sont indiqués dans les exemples particuliers. On pense toutefois, sans que cela puisse être considéré comme étant une limitation de l'étendue de l'in- vention, que ces agents de dispersion possèdent habituel- lement un poids moléculaire moyen compris dans l'intervalle de 46 000 à 57 000, tel que déterminé par l'analyse de la vitesse de sédimentation, ou dans l'intervalle de 55 000 à 68 000, tel que déterminé par la viscosité intrinsèque. Le produit polymère est obtenu par fermentation d'une souche convenable de Acinetobacter calcoaceticus, et en particulier des souches A2 et HE5, qui sont décrites ci-après. Les produits selon l'invention possèdent également la propriété d'agir à certaines concentrations comme flocu- lant pour les substances minérales en milieu aqueux, et en particulier pour le calcaire, le carbonate de calcium pré- cipité, les phosphates insolubles dans l'eau et le dioxyde de titane. Ces produits n'ont pas besoin d'être isolés pour être actifs en tant qu'agents de dispersion des substances minérales. Ainsi, l'invention comprend-elle également un agent de dispersion, en milieux aqueux, de substances miné- rales, caractérisé en ce qu'il comprend le bouillon brut, produit par le procédé de fermentation bactérienne, ou bien un produit partiellement purifié. L'invention concerne en outre des dispersions aqueuses de substances minérales, et plus particulièrement de calcaire, carbonate de calcium précipité, phosphate insoluble 4ans l'eau (en particulier apatite) ou dioxyde de titane, dans lesquelles l'agent de dispersion est un produit polymère décrit plus haut. D'autre part, l'invention a pour objet un procédé de préparation de l'agent de dispersion selon l'invention, qui consiste à cultiver en aérobie en présence de produits nutritifs une bactérie (de préférence une souche d'Acine- tobacter calcoaceticus tel que A2 ou HE5, comme décrit plus haut), qui lors de sa croissance excrète les nouveaux poly- saccharides voulus. Le produit brut peut être, éventuelle- ment, séparé ensuite par centrifugation ou filtration, et, 15.si désiré, soumis à un traitement ultérieur comprenAnt.-(par exemple) précipitation par du sulfate d'ammonium, extrac- tion par un solvant pour éliminer les lipides non liés par co-valence, échange d'ions pour remplacer les ions com- plémentaires, dialyse pour éliminer les substances cellulai- res, et/outràitement avec des enzymes pour enlever les pro- téines. Dans une forme de réalisation préférée de l'inven- tion, le produit polymère est préparé par un procédé qui comprend; (a) la préparation de la substance brute par le procédé décrit plus haut, au cours duquel la séparation est réalisée de préférence par centrifugation; (b) la soumission de cette substance brute à une-précipi- tation par le sulfate d'ammonium, et/ou à une extraction par solvant, et/ou à un échange d'ions, et/ou à une dialyse, -et/ou à un traitement par enzymes; (c) l'extraction d'une solution aqueuse de la substance obtenue au stade (b) avec du phénol à température élevée, et de préférence la séparation des phases par décantation sui- vie de centrifugation; (d) la dialyse de la solution aqueuse ainsi extraite; et (e) l'élimination de l'eau de la solution ainsi dialysée, de préférence par séchage par congélation. Dans une forme de réalisation tout particulière- ment préférée, le stade de traitement (b) comprend la préci- pitation avec du sulfate d'ammonium, séparation du précipité par centrifugation, dialyse contre de l'eau distillée et lyophilisation. Lors de la préparation de dispersions aqueuses de substances minérales, on peut utiliser l'agent de dis- persion sous forme de solution aqueuse,de bouillie ou de subeance sèche. L'invention comprend en outre un mélange des sou- ces A2 et HE5 d'Acinetobacter calcoaceticus, dans de la gélose nutritive ou des géloses nutritives usées, pour la croissance de cette bactérie, et au moins une quantité ap- préciable de l'hétéro-saccharide excrété par cette bacté- rie. Le procédé de l'invention comprend, entre autres, la production de bio-agents de dispersion à partir de deux souches différentes d'Acinetobacter calcoaceticus, ces bio-agents de dispersion étant excrétés dans le milieu en- vironnant au cours de la culture de ces souches dans des milieux liquides aérés. Ces bio-agents de dispersion peu- vent être concentrés et purifiés à partir du milieu usé par dialyse, précipitation par le sulfate d'ammonium et extraction au phénol. La fraction la plus hautement puri- fiée est constituée par un hétéro-polysaccharide anionique (1,4 gmole de groupe carboxyle par mg de poids sec) ayant un poids moléculaire moyen de l'ordre de 50 000 daltons. Cet hétéro-polysaccharide renfermant du sucre aminé, qui est un agent de dispersion puissant, est dénommé ici "BIO- DISPERSAN". Les nouveaux bio-agents de dispersion peuvent être utilisés sous une forme partiellement purifiée ou purifiée. Les préparations de bio-agents de dispersion peuvent être extraites par un solvant, afin d'éliminer les lipides liés par non-covalence,peuvent subir un échange d'ions pour - remplacer les ions complémentaires, et peuvent être trai- tées avec des enzymes pour dégrader les protéines inacti- ves. Les bioagents de dispersion peuvent être appliqués sous forme de solutions liquides, de bouillies ou de pou- dres sèches; elles se sont révéées actives pour la dis- persion et/ou la floculation de différentes formes de car- bonate de calcium, de dioxyde de titane et de phosphates minéraux. 9 Les propriétés de dispersion des bio-agents de dispersion indiquent qu'ils sont également actifs sur plusieurs autres produits minéraux. Isolation et caractérisation d'Acinetobacter calcoaceticus le 4.11..1986) Souches HE5 et A2 (dép8ts DSM N 3895 et 3894 respectivement/: Les espèces d'Acinetobacter sont largement ré- pandues dans la nature. Les sources des deux Acinetobacter, utilisés dans la présente invention, sont la chevelure hu- maine (souche HE5) et le sol (souche A2). Ces souches ont été classées comme appartenant à A.calcoaceticus en raison des critères suivants: Les cellules sont gram-négatives, non- vivantes, oxydase-négative, aérobies en forme de bâtonnets coccordes qui croissent sur agar de Mc Conkey, mais ne font pas fer- menter le glucose. D'autres preuves de l'appartenance de A2 et HE5 aux souches de A. calcoaceticus sont obtenues par utilisation du procédé de transformation d'ADN interespêce de Juni (J. Bacteriol. 112: 917 (1972)). L'ADN extrait de HE5 ou de A2 a transformé le A.calcoaceticus BD.413 compé- tent Uxotrophe. D'autres caractéristiques biochimiques et de crois- sance des souches HE5 et A2 sont rassemblées dans les ta- bleaux 3 et 4. La souche A2 est capable de crottre sur, et d'oxyder, beaucoup plus de sources carbonées que la souche HE5. TABLEAU 3 Caractérisation biochimique de A. calcoaceticus, soudhes HE5 et.A2 Essai * A2 HE5 Fermentation du glucose - - Oxydation du glucose + - Hémolyse (5% RBC mouton) - Production de H2S(Kligler) - - Production acide + gaz (Kligler) - - Oxydation du galactose + - Oxydation du mannose + Oxydation du rhamnose - - Oxydation du xylose + Oxydation du lactose + * Ces milieux pour ces différents essais sont décrits par Mc Faddin (Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, second edition, Williams & Williams, Baltimore, 1980)et dans Manual of Clinical Microbiology, third edition, American Society for Microbiology. TABLEAU 4 Croissance des souches HE5 et A2 sur différentes sources carbonées Source cAebonée * HE5 A2 Glucose faible Glucose 0,5% + Sucrose - Sucrose 0,5% - faible Arginine + Alanine + Proline + + Tryptophane faible Tryptophane 0,01% + + Tyrosine faible + Ethanol, 2%, 429C + + * Voir à la page suivante. * La croissance est contrôlée a 30 C; la source de carbone est ajoutée à une concentration finale de 0,1% sauf indication contraire, En plus de la source de caboine, les milieux renferment 0,11% de trihydrate de phosphate di- potassique, 0,36% de phosphate monopotassique, 0,4% de sul- fate d'ammonium, 0,4% d'heptahydrate de sulfate de magnésium (pH final 7) et 2% d'agar. Dans les dessins annexés: la figure 1 représente un essai de dispersion classique. Le bio-agent de dispersion utilisé Au cours de cette expérimentation est le fluide de culture cellulaire de la souche A2, dialysé,non purifié; la figure 2 représente le spectre RMN 13C du bioagent de dispersion de A2; la figure 3 représente la dispersion de pierre à chaux au moyen de bio-agents de dispersion provenant de HE5:bouillon de culture dialysé exempt de cellule (O); bioagent de dispersion brut précipité par du sulfate d'am- monium (ô); bio-agent de dispersion purifié (0). Ces symboles sont également utilisés dans les figures 4 à 8; la figure 4 représente la dispersion du calcaire par des bio-agents de dispersion provenant de A2; la figure 5 représente la dispersion du dioxyde de titane par des bioagents de dispersion provenant de HE5; la figure 6 représente la dispersion du dioxyde de titane par des bio-agents provenant de A2; la figure 7 représente la dispersion de l'ApAtite par des bio-agents de dispersion provenant de HE5; la figure 8 représente la dispersion de l'apatite par des bio-agents de dispersion provenant de A2. EXEMPLE 1 Production de bio-agents de dispersion par A. cAlcoacetlcus souches HE5 et A2 Modes opératoires analytiques Sauf indication contraire, la substance solide, utilisée pour les essais de dispersion, est de la pierre à chaux pulvérisée provenant des-environs de Jérusalem, broyée et passée au tamis de 0,044 mm de maille. La substance renferme plus de 99% de carbonate de calcium. Le carbonate de calcium précipité est un pro- duit chimiquement pur de Merck, Art. 2006, échantillon 5204195. Le dioxyde de titane est un pigment du commerce provenant d'un distributeur local. La préparation d'apa- tite (phosphate) provient de l'extraction répétée au moyen de tampon citrate, de roche de phosphate. La préparation finale, rincée, exempte de calcaire, est séchée et pulvéri- sée de façon à passer par un tamis de 0,044 mm de maille. L'essai de dispersion du produit minéral habituel est réa- lisé comme suit. (1) On introduit, dans un tube conique gradué, de 12 ml, 400 mg de l'une des substances minérales en poudre (c'est-à-dire calcaire, apatite ou dioxyde de titane). (2) On ajoute à la poudre minérale 3,8 ml d'une solu- tion aqueuse renfermant différentes concentrations du bio- agent de dispersion, et l'on mélange la suspension par tourbillonnement pendant 30 secondes (temps zéro) et on abandonne le tube au repos. (3) Après 30 minutes à température ambiante pour pro- 9ression vers l'équilibre, la suspension est à nouveau sou- mise pendant 30 secondes (temps zéro) au même traitement que plus haut, avant de laisser le tube au repos. (4) Au bout de 30 minutes, les 2 ml supérieurs sont prélevés avec soin et sont analysés, quant à la substance minérale dispersée résiduaire, par opacité dans un photomè- tre de Klett-Summerson avec un filtre vert (les suspensions sont diluées dans l'eau de façon à ce que la lecture finale soit inférieure à 150 unités de Klett (K.U.); les données sont présentées sous la forme de K.U. final x dilution. Avec ce mode d'essai, on trace des courbes de 1 0 l'activité du bio-agent de dispersion en fonction de la concentration, en utilisant différentes préparations de bio-agent de dispersion. Un exemple est montré dans la fi- gure 1. L'unité d'activité de dispersion est définie comme 1000 K.U. dans ce mode d'essai standard. Par exemple, 0,065 mg/ml de bio-agent de dispersion dialysé de A2, uti- lisé selon la figure 1, donne 1 unité d'activité. En consé- quence, l'activité spécifique de cette préparation est de 1 unité/(0,65) (4 ml), ou 3,85 unités/mg. Sauf indication contraire, les expérimentations de croissance sont réalisées dans des flacons de 1 litre renfermant 100 ml du milieu suivant: mM de tampon phosphate, pH 7, 0,4% de sulfate d'ammonium, 0,04% d'heptahydrate de sulfate de magnésium et 2 ml d'éthanol. Les flacons sont mis à incuber avec agita- tion giratoire à 30 C après ensemencement avec 1 ml de cul- tures d'une nuit, de souche A2 ou HE5. Les cultures sont examinées au bout de 1, 2 et 3 jours pour leur opacité (K.U.) et leur pH. Les échantillons sont ensuite prélevés, centrifugés pour séparer les cellules, et le fluide extra- cellulaire est dialysé largement contre de l'eau distillée. EXEMPLE 2 Production de bio-agents de dispersion dans des flacons secoueurs de 4 litres et concentration par précipitation par du sulfate d'ammonium flacons de 4 litres, renfermant chacun 1 litre de milieu normal, sont ensemencés avec 7 ml d'une culture d'amorce de A2 (10 flacons) ou de HE5 (10 flacons).Les cul- tures d'amorce se sont développées pendant 1 jour sur un milieu identique à ceci près qu'il renfermait 1% d'éthanol au lieu de 2%. Les opacités des cultures d'amorce au moment de l'ensemencement sont respectivement de 425 et 134 unités de Klett, pour les souches A2 et HE5. Les cultures sont mi- ses à incuber à 30 C pendant 3 jours avec agitation giratoi- re (150 tours/minute).Les cellules sont récoltées par centri- 1 1 fugation, rincées, et leur poids sec est déterminé. Les fluides surnageants sont saturés a 55% de suIfate d'am- monium afin de précipiter le bio-agent de dispersion actif. Les précipités provenant de chacune des opérations de fer- mentation de 10 litres sont recueillis par centrifugation, puis dissous dans 450 ml d'eau. Après des dialyses pous- sées contre de l'eau distillée à 4 C, les solutions sont lyophilisées. Les rendements finals de substances extra- cellulaires sont de 3,7 g pour A2 et de 2,7 g pour HE5. Les activités spécifiques des bio-agents de disper- sion sont respectivement de 6,2 à 6,3 unités/mg pour A2 et HE5. Le tableau 7 résume les données sur les opérations de fermentation de 10 litres. TABLEAU 7 Production de bio-agents de dispersion de A2 et HE5 dans dés flacons de 4 litres Paramètres mesurés Cultures bactériennes A2 E5 Volume 10 litres 10 litres Opacité initiale 3 K.U. 1 à 2 K.U. Opacité finale 470 K.U. 335K.U. pH final 6,65 6,6 Rendement en cellules 9,2 g 9,4 g Bio-agent de dispersion-poids sec 3,7 g 2,7 g Protéines 55% 85% Activité de dispersion 2,3 x 104U 1,7 x 104U Dans les exemples décrits plus haut, les bio- agents de dispersion sont obtenus par application d'agita- tion giratoire à des cultures de A.calcoaceticus dans des flacons renfermant un milieu à sel minimal avec 2% en volume d'éthanol. De cette manière, on obtient à partir des souches HE5 et A2 de bons rendements en bio-agents de dispersion, mais l'homme de l'art sait que de nombreux autres moyens peuvent être utilisés pour réaliser cette production. Par exemple, on peut opérer par fermentations submergées classi- ques dans des récipients sois agitation. EXEMPLE 3 Isolation et caractérisation des hbio-agents de dispersion Dprotéinisation Les bio-agents de dispersion précipités par le sulfate d'ammonium, décrits dans l'exemple 1 ci-dessus, sont désignés comme bio- agent de dispersion brut de A2 et bio-agent de dispersion brut de HE5. Ces substances brutes sont ensuite purifiées par du phénol chaud, selon le procé- dé de Zuckerberg et coll. Appl. Environ Microbiol. 37: 414 (1979). Les extraits aqueux combinés obtenus & partir des bio-agents de dispersion bruts de A2 et de RE5, sent dialysés à fond contre de l'eau distillée et sont séchés par congélation pour donner des solides duveteux blancs, dénommés respectivement Biodispersan A2W et Biodispersan HE5W. Les rendements en A2W et HE5W sont respectivement de 0,72 g et 0,51 g. Les activités spécifiques de disper- sion de A2W et de HE5W sont toutes deux de 15 unités/mg, ce qui correspond à une purification de 2,4 fois, si on compare aux bio-agents de dispersion bruts. Pr-E-re-t--ct-u-es et Ph-ytuesdes |en-sge TJ Rersion de A2et HE5. Procédé anaitgMefniq: Les concentrations en protéines sont déterminges par le procédé de Lowry et coll. (J. Biol. Chem. 193; 265 (1951)) qui utilise comme étalon l'albwmine de serum de bovidé. Les carbohydrates sont déterminés par le procédé à l'acide phénolsulfurique (Dubois et col,, Anal. Chem. 28:350 (1956)), avec le glucose comme étalon. Les sucres réducteurs sont déterminés par le procédé à l'arsenomolyb- date (Spîro, Meth. in Znzymol. 8; 7 (1966)) avec le glucose comme étalon. Les acides hexauroniques sont déterminés par la réaction au carbazole (Dische, Metheds of Biochemical Analysis 2; 313 (1955)) avec l'acide glucuronique comme étalon. Les hexosamines sont déterminées par le procédé à l'indole-HCl, suivi de désamination selon Dische et Borenfreund (J. Biol. Chem. 192: 583 (1951)) Les titrages sont réalisés avec un pR mètre par un micromode opératoire au cours duquel des portions de 0,01 ml de solutions 0,1 de HClou NaOH, sont ajoutées avec mélange énergique et sous azote gazeux (pour exclure le dioxyde de carbone) à des solutions de 3 ml, à titrer. La viscosité est mesurée sur des échantillons de 1 ml dans un microviscosimètre de Ostwald-Fenske à C. Pour la mesure de la vitesse de sédimentation et de la constante de diffusion à 20 C, on utilise une ultra- centrifugeuse analytique de Beckman modèle E, munie d'un système optique de Schlieren. La capacité d'absorption * est lue sur un spectrophotomètre de Gilford modèle 240. Les spectres de RMN, réalisés par S. Carmeli, du Départe- ment Chimie de l'Université de Tel Aviv, sont enregistrés sur un Spectromètre AM-360 de Eruker avec un calculateur Aspect 3000 et en opérant à 360,1 MHz et 90,5 MHZ, respec- tivement pour 1H et 13C. La chromatographie en couche min- ce (CCM) est réalisée sur des plaques de cellulose pré- enduites (Merck) en utilisant le solvant X: acétate d'éthy- le/pyridine/acide acétique/eau dans des proportions volumé- triques de 5/5/3/1. Les sucreset les polyols sont décelés avec du nitrate d'argent alcalin (Gal, Anal. Biochem. 24: 452 (1968)), Les sucres aminés sont décelés par le réactif pulvérisé à la ninhydrine. Résultats; Les spectres de RMN de 13C et de 1H des Biodis- persans A2 et HE5 purifiés, sont pratiquement identiques. Ces deux substances donnent également des courbes de titrage et des diagrammes de CCM après hydrolyse acide, identiques. De plus, les Biodispersans A2 et HE5 présentent des activi- tés de dispersion similaires vis-à-vis de différents miné- raux (vide infra). Les biodispersans A2 et HE5, purifiés, semblent être identiques, bien qu'ils soient produits par des souches différentes d'Acinetobacter. Les données pré- sentées dans cette partie sont pour Biodispersan A2, bien qu'on obtienne des données équivalentes pour HES. Le Biodispersan A2 purifié, contenant moins de 2% de protéines, donne un essai négatif pour les acides hexuroniques et une faible réaction avec l'acide phénol- sulfurique. Après hydrolyse dans 0C1 3N, à 1000C pendant 4 heures, la substance présente des essais forts pour les sucres réducteurs et les sucres aminés. Ainsi, eio- dispersan A2 est un bio-polymère renfermant des sucres aminés.Ce biopolymère purifié (1 mg/ml) ne présente pas d'absorption marquée dans l' intervalle de 225 à 800 nm. Le titrage de Biodispersan A2 entre pH 2 et 12, présente un unique point d'inflection, correspondant à pK1 _ 3,2 (typique d'un acide uronique). La substance renferme 1,4 mole de groupes carboxyle par mg de polymère. Ainsi, le Biodispersan A2 est un biopolymère anionique.Les groupes amino titrables (pH 7 à 9) sont moins de 0,3 gmoles/ mg, ce qui indique que les sucres aminés sont essentielle- ment N-acylés, comme c'est généralement le cas avec les polysaccharides bactériens. Le spectre RMN de 13C de Biodispersan A2 pré- sente 27 signaux nets (figure 2). Les quatre signaux entre 99 ppm et 103 ppm se trouvent dans la région tautomère des carbohydrates (Gorin, Adv. Carbohydrate Chem. and Biochem. 38: 13 (1981)), ce qui suggère que A2 renferme 4 unités de monosaccharides différents. Les cinq signaux entre 176 ppm et 178 ppm indiquent la présence d'atomes de carbone carbonyle. Un de ces groupes carbonyle est probablement compris dans lion carboxyle, et les quatre restants sont sans doute les radicaux carbonyle des groupes acétyle. En conséquence, les multiples signaux entre 23 ppm et 25 ppm correspondent aux atomes de C méthyliques des groupes acé- tyle. Comme on obtient un spectre identique après traitement du polymère avec NaOH 0,5M A 100 C pendant 15minutes, le Polysaccharide ne renferme pas de groupes O-acétyle. Ainsi, les signaux acétyle proviennent très probablement de grou- pes N-acétyle. Le signal à 18 ppm est caractéristique du groupe méthyle des desoxy-6 hexoses. Le diagramme de CCM du Blodlspersan A2 hydrolysé à l'acide (HCl 3N, 100 C, 4 heures), développé dans le sol- vant I, est résumé dans le tableau 8. On observe trois constituants principaux ninhydrine-positif avec des mobile- tés relatives à la glucosamine de 1,38, 1,03 et 0,69. En plus, il y a une trace de substance réductrice et ninhydri- ne-positif de l'origine au constituant C. Les constituants A et B sont nettement des sucres aminés, dar ils donnent des réactions réductrices, et à la ninhydrine, fortes. Le composé C donne une réaction à la ni. nhydrine bleue et qn essai faible au nitrate d'argent. TABLEAU 8 CCM de Biodispersan A2a hydrolysd Constituant b R action R G AgNO3 Ninhydrine Glucose 1,50 - Galactose 1,33 + - Glucosamine 1,00 + pourpre Galactosamine 0,87 + Acide glucuronique 0,58 + - Acide galactosamine uronique 0,29 +(faible) havane Produits d'hydrolyse de Biodispersan A2: A 1,38 + pourpre B 1,02 + pourpre C 0,69 +(faible) bleu Trace 0 A 0,5 + brun-pourpre a: Obtenu après 3 heures d'hydrolyse a 100"C dans HCI 3N. b: Vitesse de mouvement relative de chaque sucre par rap- port à la glucosamine. L'analyse de l vi tesse de sédimentatIon rde 2 mg/ml de Biodispersan A2 indique une bande unique cor- respondant à un S20 de 1,39 x 10 13S ou 1,39 unités Svedberg. Le coefficient de diffusion, D, déterminé éga- lement dans la centrifugeuse analytique, est de 18,8 x -8 cm2sec 1 L'estimation du poids moléculaire de Biodispersan A2 à partir de l'équation; M = RTs D-1 (1-V)- 1 p dans laquelle R est la constante du gaz, T est la tempéra- ture absolue, p est la densité de la solution et V est le volume spécifique partiel de A2 (supposé être 0,65 cm3 g 1, caractéristique des polysaccharides), donne une valeur mo- yenne de 51 400. Autre possibilité, le poids moléculaire peut être estimé en utilisant les valeurs déterminées pour la viscosité intrinsèque, 440 cm3 g 1, et le coefficient de sédimentation selon l'équation de Scheraga et Mandelker% (J. Am.Chem.Soc. 75; 179 (1953)). Le poids moléculaire moyengtlculé à partir de la viscosité est de 61 800 pour Biodispersan A2. Bien que lastructure chimique de Blodls- persan A2 n'ait pas été élUcidée à ce jour, les dongées chimiques et physiques présentées dans cette partie défnis- sent la substance comme. u nomel hétéro-polysaccharide anionique, renfermant du sucre AmIné. EXEMPLE 4 Utilisation degbio-agentM de dispersZon Les bio-agents de dispersion selon l'in entiQn peuvent disperser et/ou stabiliser les dispersions de Certaî- nes poudres minérales dans l'eau. L'efficacité d'un agent de dispersion peut être facilement observée par mélange d'une bouillie à 10% de la poudre dans l'eau et Abandon de la suspension au repos. Selon la dimension dés parti- cules de poudre et leur densité, ces particules se déposent à une vitesse fixée, laissant une phase supérieure limpide d'eau. L'agent de dispersion ralentit la vitesse de dépôt, Une mesure quantitative de l'eff%çacité de l'agent de dis- persion peut être obtenue par mesure de la vitesse de sédi- mentation des particules (diminution de l'opacité de la phase supérieure) à différentes concentrations de l'agent de dispersion. La capacité de différentes préparations des bio-agents de dispersion provenant de A2 et RE5, à disperser la pierre à chaux, est indiquée dans les figures 3 et 4, à disperser le dioxyde de titane dans les figures 5 et 6, et à disperser l'apatite dans les figures 7 et 8. Les données montrent que les préparations les plus forte- ment purifiées, Biodispersans HE5 et A2, dispersent la pierre à chaux à des concentrations inférieures à 0,2 mg/ ml, ce qui correspond à un rapport pondéral pierre à chaux/ Biodispersan supérieur à 5000/1. Le plus faible pouvoir de dispersion des bio-agents de dispersion bruts peut être at- tribué à leur teneur plus faible en biopolymère actif. La dispersion efficace du pigment blanc de dioxyde de titane nécessite environ 10 fois plus de Biodispersan A2 et HE5. Finalement, les Biodispersans A2 et HE5 sont incapables de disperser l'apatite alors que les préparations brutes des bio-agents de dispersion A2 et HE5 sont très efficaces pour disperser la préparation d'apatite préparée artificiel- lement (extraction de la roche de phosphate au citrate). De faibles concentrations des bio-agents de dis- persion A2 et HE5 provoquent la floculation du carbonate de calcium (Tableau 9). La vitesse de dépôt du carbonate de calcium dans l'eau est augmentée respectivement de 20 et 75% par 5 et 15 gg/ml de bio-agent de dispersion brut A2. A 5 gg/ml le rapport pondéral bio-agent de floculation/ carbonate de calcium est de 1/20000. La préparation brute de bio-agent de dispersion HE5 est moins puissante pour floculer le carbonate de calcium, nécessitant 40 qg/ml (1/ 2500) pour augmenter la vitesse de dépôt de 75%. TALEAU 9 Floculation du carbonate de calcium * Bio-agent de dispersion Vitesse de dépet (Volume clair/10 minurtes) Néant (Témoin) 2,0 ml A2 - 5 gg/ml 2,4 ml 8 gg/ml 2,8 mi 12 gg/ml 3,2 ml gg/ml 3,5 ml HE5- 5 gg/ml 2,2 ml gg/ml 2,6 ml gg/ml 2,7 ml gg/ml 3,0 mil g/ml 3,5 ml * Des suspensions aqueuses à 10% de carbonate de calcium précipité renfermant différentes concentrations de bio-agent brut de dispersion, sont amenées à 10 ml dans des cylindres gradués, et on laisse reposer. Au bout de 10 minutes on en- registre le volume de la couchesupérieure limpide. EXEMPLE 5 Le Biodispersan est également efficace pour dis- perser les argiles kaolinite. Par exemple, sans agent de dispersion, 0,8 g de Kaolin (BDH, lourd) mis en suspension dans 10 ml d'eau dans un tube gradué, dépose à une vitesse telle qu'u bout de 30 minutes il se forme une cobhe supé- rieure limpide de 5,6 ml, En présence de 0,8 mg de Bio- dispersan (rapport Kaolin/eiodispersan de 1000/1), le Kaolin se dépose beaucoup plus lentement. Au bout de 30 mi- nutes, il ne s'est formé qu'un dépôt de 0,7 ml avec une, phase supérieure opaque de 11000 unités de Klett. Même après 16 heures de repos, la phase supérieure est encore opaque (K.U. de 4600). EXEMPLE 6 Le Biodispersan est également actif pour mettre en suspension certains composés organiques. PAr exemple, lorsque 65 mg de grandes particules "amphorous" de Oil Red (RDH) sont mélangées avec précaution avec 5 mI d'eau, les particules d'Oil Red flottent à l'interface air/eau au bout de 5 secondes. Toutefois, la même expérimentation réa, lisée en présence de 15 mg de Biodispersan, aboutit'à ce que les particules d'Oil Red demeurent en suspension dans l'eau pendant 20 à 30 minutes. Xl est bien entendu que la description détaillée et les exemples particuliers,indiquant des formes de réal- sation préférées de l'invention, ne sont donnas qu'a titre d'illustration; différents changements et modifications possibles apparaîtront à l'homme de l'art en partant de cette description détaillée, sans sortir du cadre de l'in- vention. Revendications 1. Substance polymère utilisable comme agent de dispersion, dans un milieu aqueux, de solides insolubles dansl'eau, à l'état finement divisé, caractérisé en ce qu'elle est le produit de fermentation d'une souche appro- priée de bactéries. 2. Substance polymère selon la revendication 1, caractérisée en ce que les bactéries sont des Acinetobacter calcoaceticus, en particulier souche A2 ou HES. 3. Substance polymère selon une des revencica- tions 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme de bouillon de fermentation brut, bouillon de fermen- tation partiellement purifié, ou sous forme pratiquement purifiée. 4. Substance polymère selon une des revendica- tions 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle est un polysaccha- ride renfermant des groupes carboxy, et leurs sels, ainsi que des radicaux amino- ou acylamino-monosaccharîde, et leurs sels d'addition d'acide, dont la molécule a un poids moléculaire moyen de 45 000 à 57 000, déterminé par l'ana- lyse de la sédimentation, et d'environ 55 000 à 68 000, dé- terminé par les mesures de viscosité intrinsèque. 5. Substance polymère, utilisable comme agent de dispersion selon les revendications 1 à 4 produite par une souche selon la revendication 2, caractérisée par le spec- tre de la figure 2. 6. Procédé pour la productiQn d'un agent de dAs- persion polymère selon une des revendications I A 5, carac- térisé en ce qu'on cultive en conditions aérobies une souche appropriée d'Acinetobacter calcoaceticus, jusqu'à obtention dans le milieu de culture d'une concentration adéquate de ce produit polymère, suivi éventuellement d'une purification. 7, Prcédé selon revendication 6, caractérisé en ce ue le produit brut est traité par sédimentation ou pAr centri- fugation, précipitation par du sulfate d'ammonium, extrac- tion au solvant, dialyse pour éliminer les substances cellu- -2589881 laires ou traitement avec une enzyme pour enlever les substances protéiniques. 8. Acinetobacter calcoaceticus A2. g54) 9. Acinetobacter calcoaceticus RE5,(D0't 195) 10. Agent de dispersion pour solides minéraux de faible dimension de particule, en particulier pierre à chaux, carbonate de calcium, phosphate insoluble dans l'eau, dioxyde de titane et argiles, caractérisé en ce qu'il renferme une quantité efficace d'une substance polymère selon une des revendications 1 à 5. 11. Agent de dispersion selon la revendication , caractérisé en ce que la concentration de la substance polymère varie de 1 à 500 à 1 à 5000 en poids, rapporté au système aqueux.