FR 2597114 A1 19871016 FR 8605133 A 19860410 Procédé microbioloqique pour L'obtention d'une protéine par culture d'une souche bactérienne mutante. La présente invention a pour objet un procédé microbiologique permettant l'obtention d'une protéine par culture de bac-5 téries gram-négatives portant une mutation d'un type particulier, dans lesquelles a été introduite une séquence d'ADN codant pour le précurseur de ladite protéine. L'invention trouve son application dans de nombreux domaines techniques et plus particulièrement dans la préparation 10 de médicaments dont le principe actif est une protéine. Il est connu que de nombreuses protéines n'acquièrent leur activité biologique qu'après avoir été l'objet d'une maturation posttraductionnelle. S'agissant de protéines biosynthétisées dans le cytoplasme cellulaire sous la forme d'un précurseur, puis 15 exportées hors du cytoplasme, la première étape de cette maturation est souvent l'élimination par voie enzymatique d'une séquence de l'extrémité N-terminale, appelée peptide-signal, de ce précurseur. De telles protéines biosynthétisées sous la forme d'un précurseur sont connues tant chez les organismes procaryotes que chez les organismes eucaryotes. A titre d'exemples de telles protéines, on peut citer notamment la bêta-lactamase TEM-1, la phosphatase alcaline, l'une et l'autre produites par exemple par l'espèce Escherichia coli, la protéine A produite par l'espèce Staphylococcus aureus l'alpha-amylase produite par exemple par l'espèce Bacillus 25 amyloliquefaciens protéines d'origine procaryote ainsi que l'hormone de croissance humaine, l'insuline humaine, l'activateur tissulaire du plasminogène et le facteur de croissance épidermique, protéines produites par des cellules eucaryotes. Il est également connu que l'on peut utiliser des bactéries gramnégatives, préalablement transformées par un plasmide portant une séquence d'ADN codant pourle précurseur naturel d'une protéine, en vue de l'obtention de ladite protéine (Gray G. L. et ai., Biotechnology 2 (1984) 161-165; Gray G. L. et al., Gene 39 (1985) 247-254). Dans pareil cas, la machinerie cellulaire assure 35 dans le compartiment cytoplasmique la transcription de la séquence d'ADN puis la traduction de l'ARN messager correspondant; le précurseur ainsi biosynthétisé subit ensuite lors du franchissement de la membrane cytoplasmique une coupure ou une dégradation 15 20 25 35 enzymatiques éliminant son peptide-signal; la protéine, correspondant ainsi au précurseur dépourvu de son peptide-signal, s'accumule dans le périplasme de la bactérie à partir duquel elle peut être recueillie. Des résultats analogues ont également été obtenus lorsque ladite séquence d'ADN code pour un précurseur différent du précurseur naturel (c'est-àdire tel qu'il est synthétisé dans les cellules qui en assurent habituellement la production) en ce qui concerne le peptide-signal; un précurseur correspondant à une protéine d'origine eucaryote associée au peptide-signal d'une protéine d'origine bactérienne a, par exemple, été synthétisé (Talmadge K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 (1980) 3988-3992; Gray G. L. et aI., Gene 39 (1985) 247-254). Il est également connu que les bactéries peuvent être l'objet de mutations limitant, voire supprimant,l'expression d'opérons dont la transcription ne peut être initiée qu'après fixation, au niveau des éléments de régulation desdits opérons, du complexe AMPc-CRP résultant de l'association de l'acide adénosine 3',5'-phosphorique cyclique (ou AMPc) et de la protéine CRP (pour Cyclic AMP Receptor Protein) encore appelée protéine CAP (pour Catabolite Activator Protein). Une description du fonctionnement de tels opérons est donnée au chapitre "The Lac Promoter REZNIKOFF W. S. and ABELSON J. N."de l'ouvrage "The Operon MILLER J. H. and REZNIKOFF W. S., Cold Spring Harbor Laboratory--1980". Il est clair que de telles bactéries dont les capacités de biosynthèse sont réduites (car les opérons ici inhibés gouvernent la synthèse de nombreuses enzymes) ne pouvaient pas-a priori constituer des hôtes de choix pour la production industrielle d'une protéine d'intérêt. Les travaux publiés par Gray G. L. et al. en 1984 et 1985 (voir ci-dessus) montrent que les recherches jusqu'à ce jour entreprises pour l'obtention d'une protéine,par culture de bactéries dans lesquelles a été introduite une séquence d'ADN codant pour un précurseur de ladite protéine, ont porté sur la construction de plasmides rendus plus efficaces par un choix particulier d'éléments de régulation (promoteursnotamment). La demanderesse a précisément choisi une autre voie de recherche en s'intéressant à l'hôte bactérien. C'est ainsi qu'elle a trouvé, de façon surprenante, que les bactéries gramnégatives portant une mutation limitant, voire supprimant,l'expres5 sion d'opérons dont la transcription dépend de la fixation du complexe AMPc-CRP, constituaient des hôtes de choix pour la production industrielle de protéines biosynthétisées sous la forme d'un précurseur. La présente invention concerne donc, selon un premier aspect, un procédé microbiologique pour l'obtention d'une protéine, par culture de bactéries gram-négatives, dans lesquelles a été introduite une séquence d'ADN codant pour un précurseur de cette protéine, caractérisé en ce que L'on met en oeuvre une souche bactérienne portant une mutation limitant, voir supprimant,l'expres15 sion des opérons dont la transcription dépend de la fixation du complexe AMPc-CRP. Les mutations concernées sont celles qui tendent à réduire la concentration intracellulaire de l'AMPc, celles qui limitent ou suppriment la synthèse de la protéine CRP sous une 20 forme fonctionnelle, celles qui conduisent à la synthèse de la protéine CRP sous une forme mutée et dont il résulte la formation de complexes AMPc-CRP tels que leur fixation sur l'ADN est empêchée ou est rendue peu efficace ainsi que celles qui modifient le site de fixation sur l'ADN du complexe AMPc-CRP, de telle sorte 25 que la fixation dudit complexe est empêchée ou est rendue peu efficace. Il peut s'agir de mutations conditionnelles dont l'expression dépend d'un paramètre tel que, par exemple, la température. Parmi ces mutations, celles qui affectent le locus du gène chromosomal cya, de telle manière que l'adénylate cyclase pour laquelle code ce gène n'est pas synthétisée ou est synthétisée sous une forme telle qu'elle est incapable d'exercer son activité spécifique - à savoir la transformation de l'adénosine triphosphate (ou ATP) en AMPc - sont bien caractérisées.Il en est de même pour les mutations qui affectent le locus du gène chromosomal crp de telle manière que la protéine CRP,pour laquelle code ce gène, n'est pas synthétisée ou est synthétisée sous une forme mutée telle qu'il ne peut pas y avoir formation de complexes AMPc-CRP suffisamment stabLes pour permettre Leur fixation efficace sur l'ADN. Ces mutations seront, par commodité, ci-après désignées mutation cya et mutation crp. Les mutations cya et crp peuvent être de tous genres iL peut s'agir notamment d'une modification ponctuelLe d'une paire de bases ou d'une dététion; il peut encore s'agir par exempte d'une mutation par insertion, d'une mutation par inversion ou encore de mutations ponctueLLes multipLes. Dans Le cas 10 d'une mutation cya L'AMPc n'est pas synthétisé et il ne peut y avoir formation du compLexe AMPc-CRP; L'addition d'AMPc exogène permet de paLLier ce défaut de synthèse et restaure Les fonctions ceLLulaires perturbées. Dans Le cas d'une mutation crp La protéine CRP n'est pLus synthétisée sous une forme fonctionnelLe et, de 15 même, iL ne peut pas y avoir formation du compLexe AMPc-CRP; L'addition d'AMPc exogène est ici impuissante à restaurer Les fonctions ceLLuLaires perturbées. L'invention concerne avantageusement Le procédé microbiologique défini cidessus, dans LequeL on met en oeuvre une souche 20 bactérienne portant une mutation affectant te Locus du gène cya ou une souche bactérienne portant une mutation affectant Le Locus du gène cro. Les souches bactériennes mises en oeuvre selon L'invention peuvent appartenir à toute espèce gram-négative dans laquelLe 25 L'AMPc, coupLé à La protéine CRP, exerce un contr8Le de L'expression de divers opérons. Le recours à de telLes souches bactériennes pour une production industrielLe est d'autant pLus intéressante qu'eLLes présentent une résistance remarquable à L'action de nombreux bactériophages (Sushil Kumar, J. Bact., 125 (1976) 545-555). L'espèce Escherichia coli est une espèce de choix. L'invention concerne selon un autre aspect Ledit procédé microbiologique caractérisé en ce que la souche bactérienne mutante mise en oeuvre est une souche de L'espèce Escherichia coti. La demanderesse a sélectionné pLus particulièrement deux -35 souches mutantes d'Escherichia coli déposées Le 17 février 1986, auprès de La Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M., Paris, France). L'une des souches porte une mutation crp ponctuelle (dépôt n 1528); l'autre souche porte une mutation cya par délétion (dépôt n 1-529). L'invention concerne de préférence ledit procédé micro5 biologique caractérisé en ce que la souche mutante présente les caractéristiques de l'une ou l'autre des souches déposées à la C.N.C.M. sous les n 1-528 et 1-529. Le procédé de l'invention permet l'obtention de nombreuses protéines. Il doit être compris qu'il importe peu que la protéine, 10 dont on désire l'obtention, soit naturellement biosynthétisée ou non sous la forme d'un précurseur. Le procédé peut également convenir à l'obtention d'une protéine non naturelle; il peut s'agir par exemple d'une protéine hybride dont la structure primaire a été choisie à partir de deux ou plusieurs protéines connues. Il 15 suffit dans tous les cas que soit préparée une séquence d'ADN codant pour ladite protéine associée au niveau de son extrémité N-terminale à un peptide jouant le rôle d'un peptide-signal. Le procédé selon l'invention est particulièrement avantageux pour l'obtention de l'hormone de croissance humaine (ci-après 20 désignée dans le texte par le symbole hGH). La figure 1 représente la séquence de l'ADN codant pour le précurseur de l'hGH ainsi que la séquence des acides aminés dudit précurseur: les 26 premiers acides aminés (comptés sur la figure à partir de l'acide aminé en position - 26 constitue le peptide-signal) et les 191 autres acides aminés (ici numérotés de 1 à 191) sont ceux de l'hGH proprement dite (appelée ci-après dans le texte et les exemples "hGH mature"). Le tableau n 1 ci-après est ici inséré pour permettre une meilleure compréhension de la figure 1 o chacun des acides 30 aminés est représenté par une seule lettre. Tableau n 1 Acides aminés Lettre Alanine A Arginine R Asparagine N Acide aspartique D Cystéine C Glutamine Q Acide-glutamique E Glycine G Histidine H Isoleucine I Leucine L Lysine K Méthionine M Phénylalanine F Proline P Sérine S Thréonine T Tryptophane W Tyrosine y Valine V Dans les codons de la séquence d'ADN représentée sur la figure 1, les lettres A, C, T et G ont la signification habituelle et désignent respectivement les bases: adénine, cytosine, thymine 20 et guanine. Pour sa mise en oeuvre, l'invention nécessite que les bactéries mutantes comportent une séquence d'ADN codant pour Le précurseur de la protéine d'intérêt. Par précurseur, on entend le précurseur naturel de la protéine lorsqu'il existe, tout dérivé de celui-ci obtenu par modification apportée à son peptide-signal, ainsi que tout précurseur qui associe à ladite protéine un peptide apte à jouer Le rôle d'un peptide-signal et qui peut notamment être choisi parmi les peptides-signaux procaryotes et eucaryotes connus ou parmi leurs dérivés. La séquence d'ADN codant pour le précurseur de ladite protéine peut être introduite dans la bactérie, portée par un vecteur d'expression susceptible de réplication, tel qu'un plasmide. Il est clair que les éléments de régulation (promoteur notamment) nécessaires à l'expression de ladite séquence doivent être placés 35 à son voisinage de telle manière qu'ils puissent jouer leur rôle. Les plasmides pouvant être utilisés sont par exemple ceux décrits dans l'art antérieur (Gray G. L. et at., Gene 39 (1985) 247-254) à la condition qu'ils soient susceptibles de se répliquer dans la souche bactérienne mise en oeuvre. Il a été vérifié, pour le choix de ces plasmides, qu'il n'était pas nécessaire que,dans la construction utilisée, la séquence d'ADN codant pour le précurseur de la protéine d'intérêt soit inductible. Il est également important que ladite séquence soit présente en plusieurs exemplaires. La demanderesse a précisément construit et sélectionné plusieurs plasmides susceptibles d'être présents, après réplication dans les cellules bactériennes, à raison de 50 à 300 copies par cellule; elle a procédé au dépôt le 17 février 1986 auprès de la C.N.C.M. de la souche E. Coli MC 1061 infectée par l'un 15 de ces plasmides; cette souche porte le n de dépôt 1-530. Par commodité, il sera fait référence dans la suite de la description au plasmide déposé à la C.N.C.M. sous le n 1-530. Ce plasmide, également désigné ci-après par sa référence interne p163,1, porte une séquence d'ADN codant pour le précurseur naturel de l'hGH. 20 Cette séquence, représentée sur la figure 1, est la séquence sauvage telle qu'identifiée à partir de cellules de l'hypophyse; elle a été placée sous le contrôle d'un promoteur-opérateur hybride associant 1) un fragment du promoteur tryptophane partant de son extrémité 5' et incluant son site de reconnaissance de l'ARN25 polymérase (site centré sur son nucleotide placé en position - 35 et tel que défini par Takanami M. et al. - Nature, 260 (1976) 297-302) et 2) le promoteur-opérateur lactose UV5 privé de sa partie comprise entre son extrémité 5' et la zone séparant ses sites de reconnaissance (site centré sur son nucléotide placé en 30 position - 35) et de fixation (site centré sur son nucléotide placé en position - 10 et tel que défini par Pribnow D. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 784-789) de l'ARN-polymérase. La figure n 2 présente, pour ledit plasmide, une carte fonctionnelle indiquant l'emplacement et l'orientation des 35 principales séquences d'ADN qui sont notées symboliquement comme suit: 2-597114 l Origine de réplication (ORI) Segment d'ADN issu du plasmide pBR322 Segment d'ADN contenant La séquence codant pour Le précurseur natureL de l'hGH --.'...:,'=,, Segment d'ADN du phage fd contenant un terminateur de transcription Segment d'ADN contenant le promoteur10,,," opérateur hybride tryptophaneLactose UV5 Segment d'ADN codant pour La 0-Lactamase (ApR: résistance à L'ampicilline) . Sur cette carte, sont également figurés -tes sites d'actions decertaines enzymes de restriction, à savoir les enzymes SalI, BamHI, Hind III, Pst T, EcoRI, XhoI et PvuI. La présence dans le plasmide p163,1 de La mutation UV5 (décrite au chapitre "The Lac Promoter, REZNIKOFF W. S. and 20 ABELSON J. N." de l'ouvrage "The Operon, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980") rend L'expression de La séquence d'ADN codant pour Le précurseur de l'hGH insensible à l'action combinée de LI'AMPc et de La protéine CRP. IL est clair qu'à partir de ce plasmide peuvent être construits d'autres plasmides lui empruntant 25 ses caractéristiques générales, par substitution à La séquence d'ADN codant pour Le précurseur de l'hGH d'une séquence codant pour un autre précurseur. L'invention concerne, selon un autre aspect, Ledit procédé microbiologique caractérisé en ce que La séquence d'ADN 30 codant pour te précurseur de la protéine d'intérêt, accompagnée des éléments de régulation permettant son expression, est portée par un plasmide; elle concerne en particulier ledit procédé microbiologique caractérisé en ce que Ladite séquence d'ADN est portée 2 5 9 7 1 1 4 par un plasmide ayant les caractéristiques générales du plasmide déposé à la C.N.C.M. sous le n 1-530. L'invention concerne,selon un autre aspect, ledit procédé microbiologique caractérisé en ce que ladite souche bactérienne contient une séquence d'ADN codant pour le précurseur de l'hGH. L'invention concerne selon un autre aspect les souches bactériennes déposées à la C.N.C.M. sous les n 1-528 et 1-529. L'invention concerne encore selon un autre aspect le 10 plasmide déposé à la C.N.C.M. sous le n 1-530. L'invention va être maintenant illustrée par des exemples. Elle ne se limite pas bien entendu aux modes d'application ici plus particulièrement envisagés mais elle en embrasse au contraire toutes les variantes dans le cadre des revendications. 15 Exemples I. Bactéries et plasmides mis en oeuvre Quatre souches bactériennes et quatre plasmides ont été mis en oeuvre. Outre les souches déposées à la C.N.C.M. sous les n 1-528 20 et 1-529, deux autres souches d'Escherichia coli sont citées dans les exemples. - Une souche portant à la fois une mutation cya par délétion et une mutation crp par délétion et ci-après désignée par la référence interne A; la souche C.N.C.M. 1-529 est dérivée de 25 cette souche. - Une souche ne portant aucune mutation susceptible de limiter ou de supprimer l'expression d'opérons dont la transcription ne peut être initiée qu'après fixation du complexe AMPc-CRP, connue sous la désignation MC1061 (E.coli Genetic Stock Center - New-Haven 30 Connecticut, U.S.A.); cette souche sera ci-après désignée par la référence interne T. La souche C.N.C.M. 1-528 est dérivée de cette souche. Outre le plasmide déposé à la C.N.C.M. sous le n 1-530, trois autres plasmides sont cités dans les exemples: il s'agit des 35 plasmides désignés par les références internes p164,1, p200,3 et p21 2,6. ::: 0 D:: : : ::: D: :: :: : :: 0: g:0: : f:::::' : : :: ::: A: 00:: :: D: À: : ::: 0 ::: :: 0 ' 10 : 0;: D: f:: ::S L à::: : : - 15 0:: es: :: :: :::::7 ::: D: : f 0 0 20 :0::: ::::::::: 0: : :: : :: V::: 0: :::: : :: 0:::: 0 X:: f::: 0:0:: 0: 0 Le plasmide p164,1 est très proche du plasmide p163,1; il en diffère essentiellement par l'absence de la mutation UV5. Le plasmide p212,6 est voisin du plasmide p163,1. La figure n 3 en donne une carte fonctionnelle présentant la localisation et l'orientation des principales séquences d'ADN qui sont notées symboliquement comme suit: +1_ - --f- - -4- - Origine de réplication (ORI) Segment d'ADN issu du plasmide pBR327 Segment d'ADN contenant la séquence codant pour le précurseur naturel de l'hGH :x2. -.Z - -C. X X X X X /Z//Zz///// Segment d'ADN du phage fd contenant un terminateur de transcription Segment d'ADN contenant le gène Lac i et son promoteur Segment d'ADN contenant le promoteuropérateur hybride tryptophaneLactose IJV5 Segment d'ADN codant pour la 9-lactamase (ApR = résistance à t'ampicilline). Comme pour le plasmide p163,1 représenté sur la figure 2, les sites d'action de certaines enzymes de restriction sont notés sur la figure 3. Le plasmide p200,3 est un plasmide équivalent au plasmide p212,6 choisi pour son caractère non répressible pour l'expression de la séquence d'ADN codant pour le précurseur de l'hGH. La séquence d'ADN codant pour le précurseur naturel de l'hGH portée par les plasmides p212,6 et p200,3 diffère de la séquence sauvage représentée sur la figure n 1 par deux substitutions: le codon ACC a été substitué au codon ACA codant pour L'acide aminé.placé en position-24 et de même le codon TCT a été substitué au codon TCC codant pour l'acide aminé placé en position - 22. II. Méthodoloaie aénérate Les essais réalisés ont consisté à cultiver les couples 10 hôte-vecteur concernés préalablement préparés (cf. 2.1) dans des conditions telles que l'hôte soit en mesure d'exprimer la séquence d'ADN codant pour le précurseur de l'hGH (cf. 2.2) l'expression étant si nécessaire induite (cf. 2.3), à recueillir les protéines contenues dans l'espace périplasmique (cf. 2.4) et à doser 15 l'hGH périplasmique (cf. 2.5). 2.1. Préparation des couples hôte-vecteur Les couples hôte-vecteur ont été préparés selon les techniques de transformation bactérienne connues de l'homme de l'art et qui scntdécritesnotamment dans les ouvrages ci-après. - Molecular cloning - A Laboratory Manual - T. Maniatis E.F., Fritsch and J. Sambrook - CoLd Spring Harbor Laboratory 1982. - Experiments in molecular genetics - J.H. MILLER - Cold Spring Harbor Laboratory - 1972. 2.2. Culture a) Ensemencement Une colonie isolée obtenue sur milieu solide, (milieu LB + agar-agar) est mise en suspension dans 5 ml d'un milieu (milieu LB), ayant les caractéristiques ci-après, additionné d'ampicilline à raison de 100 pg/ml: - composants de base introduits avant autoclavage Bactotryptone 10 g Extrait de levure 5 g Chlorure de sodium 5 g Eau distillée qsp 1 l - pH ajusté à 7,3 avant autoclavage. 15 20 30 35 b) Incubation primaire 18 h à 37 C, de façon que La culture arrive en phase de croissance stationnaire. c) Dilution La suspension bactérienne est diluée en milieu LB de manière à obtenir une valeur de Densité Optique Lue à 600 nm - DO 600 nm - (spectrophotomètre spectronic 20) Bausch-Lomb) proche de 0, 05. d) Incubation secondaire mL de la suspension bactérienne obtenue selon 2.2.c est mise en incubation à 370C jusqu'à obtention d'une DO 600 nm voisine de 0,2. 2.3. Induction A la suspension bactérienne obtenue selon 2.2.d, on ajoute de l'isopropyl0-D-thiogalactose (ou IPTG)) en quantité telle que sa concentration finale soit égale à 1 mM; L'IPTG est ici utilisé pour provoquer Le déclenchement et Le maintien de La synthèse du précurseur de l'hGH en neutralisant l'action du répresseur venant normalement se fixer sur l'opérateur-lactose. 2.4. Choc osmotique (On pourra se référer au protocole décrit par N.G. NOSSAL et L.A. HEPPEL dans "The Journal of Biological Chemistry 241 (1966) 3055-3062"). a) Préparation de la suspension bactérienne Un échantillon de la suspension, telle qu'obtenue en 2.2.d. (cas o une induction n'est pas requise) ou telle qu'obtenue après un temps d'induction déterminé, est prélevé et traité (centri- fugation de façon à 6000 g. ayant la Tampon à de 5 min à 6000 g, élimination d'une partie du surnageant) qu!il présente une DO 600 nm voisine de 10. b) Lavage de Tris et l'EDTA La suspension obtenu en 2.4.a. est centrifugée 5 min Le culot est repris à volume constant dans une solution A composition suivante: pH 7 préparé par addition dans de l'eau distillée de 2 5 9 7 114 tri(hydroxyméthyl)aminométhane-HCl ou Tris-HCl ajouté de façon à avoir une concentration finale de 30 mM. acide éthylènediaminetétraacétique ou EDTA ajouté de façon à avoir une concentration finale de 1 mM. c) Action du saccharose La suspension obtenue en 2.4.b. est centrifugée 5 min à 6000 g. Le culot est repris délicatement à volume constant dans une solution B correspondant à la solution A à laquelle est ajouté 10 du saccharose à raison de 15 g pour 100 ml et préparée extemporanément. La suspension est laissée 10 min à 20 C. Puis elle est centrifugée 5 min à 6000 g. Les tubes de centrifugation sont placés dans de la 15 glace fondante. On élimine avec soin le surnageant et on lui substitue (à volume constant) de l'eau désionisée et maintenue à la température de la glace fondante. La suspension ainsi préparée (dont la DO à 600 nm est 20 voisine de 10) est laissée 5 min à 0 C. d) Recueil des Drotéines à localisation péripDlasmique La suspension obtenue en 2.4.c. est centrifugée 10 min à 18 000 g. Le surnageant est recueilli, il contient les protéines 25 à localisation périplasmique. 2.5. Dosaqe de l'hGH périplasmique a) Méthodologie Le surnageant obtenu en 2.4.d. est soumis à un dosage radio-immunologique de l'hormone de croissance humaine (kit125 I-hGH 30 COATRIA - Biomérieux, France). Ce dosage consiste à réaliser: - une réaction de compétition entre de l'hGH marquée à l'iode 125 introduite en quantité prédéterminée et l'hGH contenue dans l'échantillon analysé à doser vis-à-vis d'un premier anticorps anti-hGH en 35 quantité prédéterminée, puis - 0:::2 :: :3:: 0 ::3 - une réaction de Liaison du premier anticorps avec un deuxième anticorps dirigé contre ledit premier anticorps et fixé sur un support solide. Après incubation, la proportion de I'hGH marquée à l'iode 125 est inversement proportionnelle à la quantité d'hGH dans l'échantillon à doser. 2.6. Vérification de la nature de L'hGH périplasmique 1) Méthodologie La nature de l'hGH, telle que recueillie dans le surnageant obtenu en 2.4. d., a été vérifiée. A cet effet, il a été procédé successivement aux opérations suivantes: séparation électrophorétique sur gel de polyacrylamide des différentes protéines contenues dans le surnageant (selon le protocole décrit par LAEMMLI - U.K. LAEMMLI, Nature 227 (1970) 680-685). C'est ainsi que l'hGH sous forme mature et le précurseur de L'hGH migrent en deux points distincts en fonction de leurs poids moléculaires apparents respectifs. - transfert desdites protéines contenues dans le gel sur un filtre de nitrocellulose (selon la technique de H. TOWBIN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 4350-4354). - Immunodétection, réalisée selon la technique de BURNETTE (W.W. BURNETTE Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203), elle implique successivement: le rinçage du filtre de nitrocellulose 10 min avec un tampon A (Tris - HCl 10 mM, NaCl 170 mM, KI 1 mM). la mise en contact du filtre de nitrocellulose pendant min à 37 C avec un tampon B (tampon A additionné de sérum albumine bovine à raison de 3 g pour 100 ml). la mise en contact du filtre de nitrocellulose pendant 18 h à 20 C avec un immunsérum (un anticorps polyclonal reconnaissant l'hGH mature et son précurseur). le rinçage du filtre de nitrocellulose avec le tampon B. la mise en contact du filtre de nitrocellulose pendant 6 h à 20 C avec une solution de protéine A marquée à l'iode 125 à 0,1 microcurie par ml. À le rinçage du filtre avec le tampon A, le séchage du filtre entre deux feuilles absorbantes, À La mise au contact d'un film radiographique, la révélation du film. 2) Résultats: Il a été noté quedans les conditions opératoires retenues, l'hGH périplasmique était présente pour environ 98 % des molécules sous sa forme mature quels que soient La souche bactérienne et le plasmide utilisés. 10 III. Résultats 3.1. Exemple A Comparaison des taux d'hGH périplasmique produite respectivement par les couples hôte-vecteur E.coli souche T/p212,6 et E.coli CNCM I-528/p212,6. Avec un temps d'induction de 3h 30, les résultats suivants ont été obtenus hGH périplasmique mesurée en microgrammes par ml de surnageant recueilli après choc osmotique et ramené à une 20 _____________ turbidité telle que DO 600 nm = I Souche T/p212,6 0,86 Souche CNCM I-528/p212,6 2, 00 Cesrésultats indiquent que la souche mutante (souche 20 CNCM 1-528) est capable de produire de l'hGH périplasmique avec une plus grande efficacité que la souche non mutante (souche T), la production étant plus que doublée. 3.2. Exemple B Comparaison des taux d'hGH périplasmique produite respec25 tivement par les couples hôte-vecteur E.coli souche T/p163,1, E.coli souche CNCM I528/p163,1, E.coli souche T/p164,1 et E.coli souche CNCM I-528/p164,1. Avec un temps d'induction de 3 h, les résultats suivants ont été obtenus: hGH périplasmique mesurée en nanogrammes par mL de surnageant recuei Li après choc osmotique et ramené à une turbidité teLLe que DO 600 nm= 1. pl 63,1 pl164,1 1 iD6. Souche T ,8 6,4 si i,, iche CNCM 1-528 7,8 10,8 --it78 -T1, 3.3. Souc 1 Souc 1-52 - IL apparaît que La souche mutante (souche CNCM 1-528) est capable d'une production d'hGH péripLasmique en quantité augmentée de façon significative (augmentation d'environ 30 % dans L'un des cas et augmentation d'environ 70 % dans L'autre cas) et ceci que la séquence d'ADN codant pour Le précurseur de L'hGH soit ou non, pour son expression, sous Le contrôLe de signaux réputés sensibles à L'action combinée de LI'AMPc et de La protéine CRP. Exemple C: Comparaison du taux d'hGH périptasmique produite par Les couples hôtevecteur E.coLi Souche T/p200,3 et E.coti Souche CNCM I-528/p200,3. Cet essai a été réaLisé sans induction. Les résultats suivants ont été obtenus: hGH péripLasmique en nanogrammes par mL de surnageant recueiLli après choc osmotique et ramené à une turbidité teLLe que: DO 600 nm = 1. he T/p200-3 200 he CNCM !8/p200-3 512 IL apparait que la souche mutante (souche CNCM 1-528) est capable de produire l'hGH péripLasmique avec une plus grande efficacité que La souche non mutante (souche T), La production étant plus que doublée. Cet essai montre qu'on obtient un effet du même ordre, que la synthèse du précurseur soit inductible ou non. 3.4. Exemple D: Comparaison du taux d'hGH périplasmique produite par le couple hôte-vecteur E.coLi souche CNCM I-529/p212,6 respectivement en présence et en absence d'AMPc. Avec un temps d'induction variant entre 30 et 120 min, les résultats suivants ont été obtenus: hGH mature en microgrammes par ml de surnageant recueilli après choc osmotique et ramené à une turbidité telle que DO 600 nm = 1. 20 25 30 Ars0minAprès 60 min Après 60min Après 120 min En absence d'AMPc 0,153 0, 670 1,650 phénotype [cya-] En présence d'AMPc phénotype [cya+]* 0,100 0, 243 0,975 * En présence d'A>1pc, les effets de la mutation cya ne s'expriment pas et la souche présente un phénotype sauvage [cya +]: elle a les caractéristiques d'une souche non mutée pour le caractère cya. Il apparaît que la souche mutante CNCM 1-529 a la capacité de produire de l'hGH périplasmique avec une plus grande efficacité qu'une souche parentale dont elle ne se différencie, dans les conditions opératoires choisies, que par l'expression d'une mutation cya. 3.5. Exemole E: Mesures comparatives du taux de l'hGH périplasmique et du taux de protéines totales périplasmiques produites par un couple hôte-vecteur donné. Cet essai a été réalisé avec un temps d'induction de 3 h. Les résultats suivants ont été obtenus: 15 20 30 Conditions expérimentales (1) (2) addition (+) ou non (-) hGH rotéinas otal s (1) d'Af.Pc et phénotype ()) périplasmique périplasmiqu.x 100 _g/ml mg/ml (2)x 103 + AMPc (cya+) (crp+) I 0,80 0,12 - AMPc (cya-) (Crp+) 3 0,37 0;81 *2+ AMPc (cya+) (crp-) 2,8 0,48 0,58 *1: souche CNCM I529/p212,6 *2: souche A/p212,6 Les valeurs d'hGH périplasmique sont exprimées en microgrammes par ml de surnageant recueilli après choc osmotique et ramené à une turbidité telle que DO 600 nm = 1. Les protéines totales périplasmiques sont mesurées par La méthode de BRADFORD (Bradford M.M., AnaLytical Biochemistry 72 (1976) 248-264) et sont exprimées en mg par ml de surnageant recueilli après choc osmotique et ramené à une turbidité telle que DO 600 nm = 1. Cet essai montre que la production des enzymes périplasmiques bactériennes sous leur forme mature, dont rend compte La mesure du taux de protéines présentes dans le périplasme, est diminuée au regard des valeurs obtenues en présence d'un contexte sauvage, de façon importante lorsqu'une mutation - ici une délétion - affecte soit le gène cya (souche CNCM-I-529 sans addition exogène d'AMPc) soit le gène crp (souche A avec addition exogène d'AMPc). Simultanément, la production d'hGH périplasmique est fortement augmentée lorsque L'une ou l'autre des mutations s'exprime. Ces exemples mettent en évidence l'intérêt manifeste résultant de la mise en oeuvre de souches présentant une mutation limitant voire supprimant l'expression des opérons dont la transcription ne peut être initiée qu'après fixation du complexe AMPc- crp: ces souches permettent en effet d'augmenter de façon importante la production de la protéine périplasmique visée (représentée dans ces exemples pour 98 % 9 7 114 pour la protéine sous sa forme mature). L'exemple E souligne de plus l'avantage de tout premier ordre apporté par la mise en oeuvre de pareilles bactéries: l'augmentation constatée n'est pas seulement absolue mais également relative, les souches mutantes restreignant la production de leurs propres protéines à localisation normalement périplasmique, ce qui rend plus aisée la purification de la protéine visée à partir du contenu du périplasme. REVENDICATIONS 1. Procédé microbiologique pour L'obtention d'une protéine par culture de bactéries gram-négatives dans tesquetles a été introduite une séquence d'ADN codant pour un précurseur de cette protéine, caractérisé en ce que L'on met en oeuvre une souche bactérienne portant une mutation Limitant, voire supprimant L'expression des opérons dont La transcription dépend de La fixation du compLexe AMPc-CRP. 2. Procédé microbiologique selon La revendication 1, 10 caractérisé en ce que Ladite souche bactérienne porte une mutation affectant te Locus du gêne cya. 3. Procédé microbiotogique seLon La revendication 1, caractérisé en ce que Ladite souche bactérienne porte une mutation affectant te Locus du gène ú.cr. 4. Procédé microbiotogique seLon L'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que La souche bactérienne mutante mise en oeuvre est une souche de L'espèce Escherichia coti. 5. Procédé microbiotogique selon ta revendication 4, caractérisé en ce que ta souche bactérienne mutante présente Les 20 caractéristiques de L'une ou L'autre des souches déposées à La C.N.C.M. sous Les n' 1-528 et 1-529. 6. Procédé microbioLogique selon L'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que La séquence d'ADN codant pour te précurseur de La protéine d'intérêt, accompagnée 25 des éLéments de régulation permettant son expression, est portée par un pLasmide. 7. Procédé microbiologique seLon La revendication 6, caractérisé en ce que Ladite séquence d'ADN est portée par un ptasmide ayant Les caractéristiques générales du plasmide déposé 30 à La C.N.C.M. sous Le n0 1-530. 8. Procécé microbiologique seLon L'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que Ladite souche bactérienne contient une séquence d'ADN codant pour un précurseur de t'hGH. 9. Souche bactérienne ayant les caractéristiques générales de l'une ou l'autre des souches déposées à la C.N.C.M. sous les n 1-528 et 1-529. 10. Plasmide ayant les caractéristiques générales du plasmide déposé à la C.N.C.M. sous le n 1-530.