FR 2598085 A1 19871106 FR 8702946 A 19870304 Nouvelle substance inhibitrice de l'aldose réductase et son procédé de préparation La présente invention se rapporte à une nouvelle substance physiologiquement active dite "aldostatine", qui est un inhibiteur de l'aldose réductase, et à ses sels, 5 ainsi qu'à un procédé de préparation de ces substances. L'aldostatine, que propose la présente invention, est utile pour le traitement de certaines complications chroniques provoquées par le diabetes renalis, telles que la cataracte diabétogène, la rétinopathie et la neuropathie. La réduction du taux de sucre dans le sang a été l'objet de la majorité des tentatives qui ont été faites Jusqu'ici pour obtenir des médicaments antidiabétiques. Cependant, en l'occurrence, presque aucun moyen n'est connu pour empêcher ou réduire les complications diabétogènes 15 chroniques, telles que la cataracte diabétogène, la rétinopathie et la neuropathie. Selon Sakamoto et al. ["Pharmacia" 19, 43, galactitol et de fructose, peut être évitée, et que la fonction cellulaire peut être maintenue normale si les 35tés de l'aldose réductase sont inhibées. activités de l'aldose réductase sont inhibées. En conséquence, il y avait depuis longtemps une demande pour la présentation d'un nouvel inhibiteur de l'aldose réductase, utile pour la prévention ou le traitement des complications diabétogènes chroniques. Avec l'idée d'obtenir un nouvel inhibiteur de l'aldose réductase, les présents inventeurs ont isolé du sol un certain nombre de microorganismes, et ils ont examiné les activités inhibitrices de l'aldose réductase de substances produites par les micro-organismes. Comme résul10 tat, il a été découvert que certains micro-organismes du genre Pseudeurotium produisent un nouvel inhibiteur de l'aldose réductase. On a également confirmé que cet inhibiteur était bien un nouvel inhibiteur de l'aldose réductase à partir de 15 ses diverses propriétés physiochimiques et biologiques, et on l'a alors appelé "aldostatine". En conséquence, la présente invention a pour but de proposer une nouvelle substance physiologiquement active dite "aldostatine", ayant les propriétés suivantes 20 Distinction entre acide, neutre ou basique substance acide (b) Analyse élémentaire 25 C = 57,20 2,0 H = 4,70 1,0 N = 6,97 1,5 Masse moléculaire mesurée ( Formule moléculaire estimée Co0 208 (e) Spectre d'absorption UV: (1) solution aqueuse neutre: X 285 2nm (FIGURE 1> (2) solution aqueuse acide: X 285 + 2 nm (E1% 135 20) MGax 1cm (FIGURE 2) (3) solution aqueuse alcaline: Xx 230 + 4 nm épaulement, 257! 4 nm épaulement, max 316 t 2 nm (Elcm 195 + 20) 1CM (FIGURE 3) -1 (f) Spectre d'absorption IR (KBr; cm): 15 3300, 3030, 2920, 1720, 1650, 1495, 1410, 1370, 1335, 1220. (FIGURE 4) (g) Spectre RMN 13C (d6-DMBO, 100 MHz, étalon interne DMSO=39,5 ppm; 6 ppm): 171,7 (s>), 160,1 (d), 152,1 (s), 131,7 (d), 128,2 (d), 127,1 (s), 125,1 (s), 115,3 (d), 52,1 (d), 35,9 positive: KXnO4 et FeCl3. négative: ninhydrine, Molisch et Fehling. La présente invention a également pour but de proposer un procédé pour la préparation d'une nouvelle substance physiologiquement active dite "aldostatine", qui consiste à cultiver un micro-organisme producteur d''aldostatine", du genre Pseudeurotium1dans un milieu de culture, et, ensuite, à recueillir l'"aldostatine" à partir du bouillon de culture. L'aldostatine de la présente invention inhibe l'activité de l'aldose réductase et, par voie de consé10 quence, évite l'accumulation anormale de sorbitol, de galactitol, etc. De ce fait, elle est efficace pour le traitement des complications chroniques, telles que la cataracte, la rétinopathie et la neuropathie qui sont provoquées par le diabetes renalis. Les buts, caractéristiques et avantages ci-dessus de la présente invention, ainsi que d'autres, se dégageront de la description ci-après, considérée en combinaison avec 25 30 35 le dessin annexé sur lequel: la Figure 1 représente un spectre d'absorption UV de la substance physiologiquement active de la présente invention, à savoir l'"aldostatine", dans une solution neutre; - la Figure 2 représente l'aldostatine dans une - la Figure 3 représente l'aldostatine dans une - la Figure 4 représente l'aldostatine; - la Figure 5 représente l'aldostatine; et - la Figure 6 représente P'aldostatine. un spectre d'absorption UV de solution acide; un spectre d'absorption UV de solution alcaline; un spectre d'absorption IR de un spectre RKN 13C de un spectre RMN H de Comme exemple pratique du micro- organisme utile pour la production de la substance physiologiquement active dite "aldostatine" de la présente invention, on peut mentionner la souche M4109 du genre Pseudeurotium que les présents inventeurs ont isolé du sol d'une terre arable a Kannami, Tagata-gun, Shizuoka, Japon. Ses caractéristiques mycologiques sont les suivantes: (A) Croissance dans divers milieux de culture: (1> Agar de Czapek: A 26 C, la croissance est assez lente. Le microorganisme se développe Jusqu'à un diamètre de 16-17 mm, en 10 l'espace de 7 Jours de culture, et Jusqu'à un diamètre de 28-29 mm, en l'espace de 14 Jours de culture. Le tissu est mince, plat et velouté. Seules des hyphes blanches se développent. Il ne se forme pas d'ascocarpes. Les contours sont unis. Il ne se présente ni exsudat ni pigment diffu15 sible. L'envers est blanc-blanc jaunâtre (iA2). Pas de croissance à 37'C. -gris moyen (lEl). Les contours sont unis. Il ne se présente ni exsudat ni pigment diffusible. L'envers est blanc jaunâtre 30 (4A1>-Jaune pâle (4A2) dans une zone portant des hyphes, et gris olive (1E2) dans une autre zone dans laquelle des ascocarpes se sont formés. Pas de croissance à 37 C. Eyre Methuen, Londres, 1978. (B) Diverses propriétés physiologiques: pH de croissance: 3,2-9,6 pH optimal pour la croissance: 3,6-6,4 Température de croissance: 19-30 C Température optimale pour la croissance: 22-26"C 20 extrémités dentiformes de cellules formant les conidies. Les conidies sont incolores, elles sont formées chacune par une cellule unique, elles mesurent 5-7,5 x 2,5-3,5 pm, elles présentent soit des formes ovales, soit des formes ovoïdes inversées, et elle sont légèrement plus minces dans leurs parties basales. Les parois sont unies. Des cellules formant des conidies apparaissent verticalement à partir des hyphes aériennes, elles mesurent 8-40 x 3-5 pm, elles ne sont pas ramifiées, elles sont légèrement gonflées dans leurs parties centrales, et elles sont effilées en direction de leurs extrémités libres. Les parties formant les conidies allongent de nouveaux points de croissance l'un après l'autre. Les caractéristiques mycologiques du microorganisme ci-dessus ont été décrites ci-dessus. Etant donné qu'il se développe à travers le stade ascigène numéro de dépôt FER> P-8614. Lors de la culture d'un tel micro-organisme du 15 genre Pseudeurotium, qui produit la substance physiologiquement active dite "aldostatine", une matière que le microorganisme peut métaboliser, telle que le glucose, l'amidon, le sucrose, la dextrine, les mélasses, le glycérol, les huiles ou les graisses, les acides organiques ou similaires, 20 peut être utilisée comme source de carbone pour le milieu de culture. Comme source d'azote, un composé organique ou minéral, contenant de l'azote, tel que farine de soja, farine de graine de coton, CSL, extrait de viande, peptone, levure nourricière, germes, urée, sulfate d'ammonium, nitrate d'ammonium, phosphate d'ammonium, chlorure d'ammonium ou similaires, peut être employé. En outre, des sels minéraux, tels que NaCl, KC1, CaCO3, MgSO4, KH2PO4, Na2HPO4, FeSO4,MnCl2, Cocl2, ZnSO4 et CaSO4, peuvent également être utilisés de façon convenable, soit seuls soit en combi30 naison. Des vitamines, telles que la vitamine B1 et la biotine, un agent de déformation, tel que l'huile de silicone et/ou un agent tensio-actif, tel qu'un polyalkylène glycol éther, peuvent également être ajoutés aux milieux de culture si besoin est. De plus, il est également faisable 35 d'ajouter une ou plusieurs substances organiques et/ou minérales, qui favorisent la croisrsanrce du I.icrn-c::-et stimulent la production d'aldostatine. Pour la culture du micro.-organis-e -eesu: n'importe lequel parmi les proc4des de cultures pour les micro-organismes peut être puisse utiliser à la fois une cu]_kre nr une culture en milieu liquide, un i -' agitation aérée. Une températu.l-e c micro-organisme peut se déve!oer_. statine, La température de cure. ?- 19-30 C, en particulier, de la culture en estimant le mu:ent.-' sa puissance maximale. Bien,.]e e. 1 5 nécessaires pour la culture vWcie iie= en fonction des conditions, c:r rjr'd:fëre une' c: 2-7 jours, en particulier, 3-.... Afin de recueillir la.sbtyc active dite "aldostatine", à partir dn il obtenu de la manière décrite ci---_e! su:s;.. suivre de façon appropriée n'impcrte iequ)e séparation qui sont utilisés crdin.irement -... recueille les produits intermddiaires, -produiL-t-- ?r lr microorganismes courants, à partir de leurs l;nu!o culture, Par exemple, les cellules sont Ctimlnées un bouillon de culture, soit par filtration, soit par cen-'.rfugation, étant donné que l'aldostatine présente des pr-c;1r. atés de substances acides solubles dans l'eau, et qu'e!.e esessentiellement contenue dans le filtrat du bouillon de culture. Le filtrat du bouillon de culture, qui est ainsi obtenu, est adsorbé sur un support approprié, et l'on fait suivre par une désorption sélective de la substance efficace avec un solvant approprié. Camme support de chromatographie employé pour la désorption, une matière faisant usage de 35 différences dans la capacité d'adsorption, telle que le charbon actif, le gel de silice, l'alumine, la poudre de il 2C 30 35 cellulose ou la résine synthbtique adsorbante, une matière utilisant des différences dans les groupes fonctionnels, telle qu'une résine échangeuse d'anions au la cellulose échangeuse d'anions, ou une matière uti1isa;t des différences dans la masse moléculaire, telle qu'un support de tamis moléculaire, peuvent érre avantaeusent utilisées. Afin d'éluer le composant cible, soit l"nldostalne", à partir d'un tel support, des solivants organiques contenant de l'eau, A savoir, de c6tc; contersest de l'eau, du o méthanol contenant de l'eau et de 1'acé%rnitrii contenant de l'eau, des acides, des. calis et des t,%.cpnns, des solutions aqueuses contenant des sels olnéra!x ques, etc. peuvent être utiitsó8 dans dea appropriées, bien que leur c;sblnais n vsre en fci> st on du type et des propriétés du support. L'inhibiteur de la pré'se-te invention, qui est obtenu à l'état brut par La chromatographiiîe xentioneée cidessus, peut être soumis enore & ne chruatcgrapre liquide de préparation haute performance, afin de le purifier. De façon détaillée, on ajuste le pH du filtrat à environ 4. Ensuite, on le fait passer à travers une colonne garnie d'une résine absorbante synthétique comme support, par exemple, "DIAION HP-20" (marque déposée; produit de la Société "Mitsubishi Chemical Industries, Ltd."), "Amberlite XAD-II" (marque déposée; produit de la Société "Rohm et Haas Company") ou similaires, d'o il résulte que l'inhibiteur de la présente invention contenu dans le filtrat est adsorbé. L'inhibiteur de la présente invention, ainsi adsorbé, est ensuite élué par un alcool contenant de l'eau ou de l'acétone contenant de l'eau. Les fractions contenant l'inhibiteur ainsi élué sont concentrées, et elles sont ensuite adsorbées sur alumine ou sur gel de silice. Il peut, par la suite, être élué par une solution d'ammoniaque dans l'acétonitrile ou par une solution d'un alcool contenant de l'eau. Les fractions de l'éluat ainsi frac- tionné sont transformées en poudre par des étapes, telles qu'une concentration et une lyophilisation. Si la pureté de la poudre ainsi obtenue est faible, une chromatographie liquide haute performance peut être avantageusement utilisée pour une purification supplémentaire. Comme support utile, on peut mentionner "Lichroprep RP-18 Gel" (marque déposée; produit de la Société "MERCK & Co Inc.") ou "Y{C Gel ODS 30/60" (marque déposée; produit de la Société "Yamamura Chemical Laboratories, Inc.") à titre d'exemple. Comme phase mobile, il est possible d'utiliser un mélange de mèthanol ou d'acétonitrile et d'une solution aqueuse d'un sel ou similaires. L'aldostatine obtenue de la manière ci-dessus contient habituellement un ou plusieurs des sels employés 15 pour sa purification. Pour la dessaler, il est avantageux d'utiliser une chromatographie qui emploie un adsorbant synthétique. Ainsi, une solution aqueuse d'aldostatine contenant les sels est ajustée à un pH d'environ 4,0 avec de l'acide chlorhydrique dilué, et l'on fait suivre par sa chromatographie sur "DIAION HP-20". Apres lavage du support avec de l'eau, les fractions actives sont éluées par un alcool contenant de l'eau. Lors de la concentration et de la lyophilisation de l'éluat, l'aldostatine est obtenue sous sa forme libre. L'aldostatine de la présente invention, qui est ainsi obtenue, présente les propriétés physiques et chimiques suivantes. A partir de ces propriétés, elle est considéré comme étant un composé représenté par la formule structurale estimée suivante: 30 OH OH CH H CH2 2 CH-NH-CHO CH-NH-CHO 1 I COOH COOH [N-f ormyl-L-bityros ine] 15 20 25 30 35 Propriétés physico-chimiques: Aspect extérieur: poudre blanche. (2) Distinction entre acide, neutre ou basique substance acide (3) Point de fusion: 144-146 C (4) Analyse élémentaire: C = 57,20 2,0 H = 4,70 1,0 N = 6,97 1,5 (5) Masse moléculaire mesurée: (M + H) 417 (par la méthode de FAB masse (6) Formule moléculaire estimée: C20H20N208 (7) Rotation spécifique [a]2 D + 59,0' 10' (C = 0,50, H20)> (8> Spectre d'absorption UV: (1> Solution aqueuse neutre: mx 285 2 nm (E1 135 20) Max 1cm (FIGURE 1) (2) Solution aqueuse acide: X 285 + 2 nm (E1% 135 + 20) max ltom (FIGURE 2) (3) Solution aqueuse alcaline: X 230 4 nm épaulement, 257 _ 4 nm épaulement, max 316 + 2 nm (E1% 195 + 20> (FIGURE 3) _ l (9> Spectre d'absorption IR (KBr; cm): 3300, 3030, 2920, 1720, 1650, 1495. 1410, 1370, 1335, 1220. (FIGURE 4) (10) Spectre RMN 13C (d6-DISO, 100 _Hz, êtaion interne DMSO = 39,5 ppm; 6 ppm): 171,7 (s>, 160,1 (d>, 152,1 , 131.7 id>, 128,2 (d), 127,1 (s>, 125,1 (s>, 11533 (d), 52,1 (d>, 35,9 : 8,02 (1H, s), 7,98 1îH,d), 7,05 15 2,96 (2H,m). (FIGURE 6) Chromatographie liquide haute performance (HPLC): support: "Hitachi Gel #3056" phase mobile: méthanol 8% avec de l'acétate d' ammonium 1%, 0,8 ml/mn, Rt: 4,2 (mn). 15 20 25 30 (15) Réaction colorée: positive: KMnO4 et FeCl3 négative: ninhydrine, Molisch et Fehling. Propriétés biologiques: (1) Activité inhibitrice de l'aldose réductase: La préparation d'une aldose réductase et l'analyse quantitative de son activité enzymatique ont été effectuées conformément au procédé décrit par Hayman et al. dans "Journal of Biological Chemistry" 24Q, 877 (1965). C'était une aldose réductase partiellement purifiée, dérivant de cristallins bovins, qui a été employée comme enzyme. Ont été placés,dans la cellule en quartz d'un spectrophotomètre, 2,4 ml d'une solution de NADPH 5 x 10 5 M dissoute dans un tampon phosphate 2/15 X (pH 6,0>, 0,4 ml d'une solution à 15 milli-unités/ml de l'enzyme et 0,1 ml d'une aldostatine aqueuse ayant l'une parmi diverses concentrations. Le contenu a été pré-incubé à 37 C, pendant 4 minutes. La réaction a démarré par l'addition de 0,1 ml de D,Lglycéraldéhyde 0,015 M dans la cellule en quartz. La réduction de l'absorbance à 340 nm a été suivie à 37'C pendant 4 minutes. A ce moment, la valeur (B) de tg e a été déterminée. De façon similaire, la réduction de l'absorbance à 340 nm sans addition de l'inhibiteur "aldostatine'" a été suivie. A ce moment, la valeur CA) de tg 8 a été déterminée. Le pourcentage d'inhibition (%) a été calculé comme suit. A - B Pourcentage d'inhibition % a été exprimée en tant que CI50. L'activité inhibitrice de l'aldose réductase de l'aldostatine, déterminée de la manière décrite ci-dessus, est la suivante: Substrat (concentration du substrat) CI50 ("g/ml) -4 glycéraldéhyde lorsqu'elle a été administrée i.v. à des souris, à une dose 15 de 200 mg/kg. L'aldostatine de la présente invention peut également être convertie en ses sels métalliques et en son sel d'ammonium si besoin est. Des sels métalliques typiques comprennent son sel de sodium, son sel de potassium, son sel 20 de lithium, son sel de calcium, etc. Un médicament contenant l'aldostatine de la présente invention peut être formulé en préparations dosables, telles que des injections, des gouttes nasales, des suppositoires et similaires, en plus de ses préparations administrables par voie orale et des gouttes oculaires. On peut préparer le médicament selon un procédé connu en tant que tel dans la technique, tout en incorporant l'aldostatine ou un sel de celle-ci, de façon appropriée en une quantité de 100 pg-500 mg par administration. 30 Exemple La présente invention va maintenant être décrite par l'Exemple suivant. On doit cependant garder à l'esprit que la présente invention n'est pas limitée par l'Exemple suivant. 10 15 20 25 30 35: Exemple 1: (i> La souche de Pseudeurotium zonatum N4109 (Dépôt auprès de FRI sous le numéro FERX P-8614), que l'on avait fait se développer par culture inclinée sur agar nutritif, a été inoculée dans un flacon Erlenmeyer de 500 ml, contenant 100 ml d'un milieu de culture stérilisé de glucose 2%, amidon 2%, farine de soja 2%, NaCl 0,25%, levure nourricière 0,5% et CaCO3 0,35% (pH 6,5>. Le contenu a été soumis à une culture à secousses, à 26'C, pendant 3 Jours. Le bouillon de culture résultant a été utilisé comme culture de semence. ) Ensuite, vingt litres d'un milieu de culture contenant glucose 2%, peptone 1%, CSL 1%, KH2PO4 0,2% et XgSO4.*7H20 0,1%. (pH 6,5) ont été versés, 100 ml par 100 ml, dans des flacons Erlenmeyer de 500 ml. Après stérilisation du contenu à 120'C pendant 20 minutes, chaque flacon a été inoculé avec 4 ml de la culture de semence, et l'on a fait suivre par une culture à secousses, à 26'C, pendant 4 Jours. (iii)Le bouillon de culture (20 1), obtenu selon le mode opératoire (ii) ci-dessus, a été ajusté à un pH 4, et l'on a fait suivre par une filtration/afin d'obtenir 17 1 d'un filtrat de bouillon de culture. La majorité de l'aldostatine était contenue dans le filtrat. Le filtrat de bouillon de culture a été soumis à une chromatographie sur "DIAION HP-20" (1,3 1>. (iv> Sous pression réduite, 2,3 1 de ces fractions actives ont été concentrés jusqu'à environ 20 ml, et l'on a fait suivre par une addition de 200 ml de méthanol. Le précipité résultant a été élimine par centrifugation, de façon à obtenir un surnageant de centrifugation. Le surnageant a été introduit dans une colonne d'alumine (200 ml>, laquelle avait été auparavant chargée avec du 10 méthanol. Après lavage de la colonne avec 1 1 de méthanol et 1 1 d'acétonitrile, la colonne a été développée par un solvant mixte 2:1 d'acêtonitrile et d'ammoniaque iN. L'éluat a été fractionné 18 g par 18 g, de sorte que la substance active de la présente invention a été éluée en Fractions n 61-190. Ces fractions ont été recueillies, puis concentrées sous pression réduite. Le résidu a été introduit dans une colonne Sephadex G-15 d'obtenir 350 mg de poudre blanche. (v) La poudre blanche, obtenue selon le mode opératoire Ayant maintenant décrit complètement l'invention, il sera évident pour l'homme du métier que de nombreux changements et modifications peuvent être apportés sans que l'on s'écarte pour autant de l'esprit ou du domaine de l'invention telle qu'elle vient d'être décrite. REVENDICATIONS 1 - Substance physiologiquement active dite "aldostatine", présentant les propriétés suivantes: (a> Distinction entre acide, neutre ou basique: substance acide (b) Analyse élémentaire: C = 57,20 2,0 10 H = 4,70 1,0 N = 6,97 1,5 (c) Masse moléculaire mesurée: + (M + H) 417 (par la méthode FAB) masse (d) Formule moléculaire estimée: 20 2 8 (e) Spectre d'absorption UV: (1) Solution aqueuse neutre: X 285 2nm (El 135 + 20) max lcm (FIGURE 1) (2) Solution aqueuse acide: X 285 2 nm (E1% 135 20> max lcm135 20) (3) Solution aqueuse alcaline: max 230 + 4 nm épaulement, 257 + 4 nm épaulement, Max 316 2 nm (E 195 20) lcm (FIGURE 3) -1 (f) Spectre d'absorption IR (KBr; cm >: 3300, 3030, 2920, 1720, 1650, 1495, 1410, 1370, 1335, 1220. (FIGURE 4) (g) Spectre RMN 13C (d6-DISQ, 100 MHz, étalon interne S DXSO=39,5 ppm; 6 ppm): 171,7 (s), 160,1 (d), 152,1 (s), 131,7 (d), 128,2 (d>, 127,1 (s>, 125,1 (s), 115,3 (d>, 52,1 (d), 35,9 (t) (FIGURE 5) (h) Solubilité: soluble dans: eau, méthanol, et diméthylsulfoxyde. légèrement soluble dans: acétone, acétate d'éthyle et chloroforme. insoluble dans: benzène, hexane et éther de pétrole. (i> Réaction colorée: positive: KMnO4 et FeC13. négative: ninhydrine, bolisch et Fehling. 2 - Procédé de préparation d'une nouvelle substance physiologiquement active dite "aldostatine#, caractérisé par le fait qu'il consiste à cultiver un microorganisme producteur d'"aldostatine" du genre Pseudeurotium, dans un milieu de culture et, ensuite, à recueillir l'"aldostatine" à partir du bouillon de culture. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé 25 par le fait que le micro-organisme producteur d'"aldostatine" est la souche Pseudeurotium zonatum X4109.