FR 2586681 A1 19870306 FR 8612129 A 19860827 Dérivés du méthvlène-dioxv-phénanthrène et du-stilbène. procédé pour leur pDréparation et médicaments les conte- nant. L'invention a pour objet des dérivés du méthylè- ne-dioxy-phénanthrène et du stilbène, un procédé pour leur préparation et des médicaments contenant ces com- posés. On connaît déjà en tant qu'agents immunostimu- lants utilisables dans la prophylaxie et la thérapie des maladies infectieuses les acides aristolochiques de formule Il H2 COOH cu" H2C' o NO 15. R =H, OCH3 qui activent la phagocytose et ont une activité anti- virale et qui améliorent les résultats du traitement des infections générales, et peuvent également être appli- qués avec de bons résultats pour le traitement des abcès et des ulcères. Toutefois dans des études pharmacologiques récentes à de fortes doses, on a constaté une dégéné- ration cellulaire de la partie antérieure de l'estomac chez les rats, de sorte qu'il est apparu nécessaire de faire preuve de réserve à l'administration de ces substances actives, en soi très intéressantes pour le traitement. On a maintenant trouvé avec surprise que les composés de formule générale I 0 N o COOH H2CoI. (I) R1 dans laquelle R1 représente un atome d'hydrogène, un groupe méthoxy ou éthoxy, et R2 et R3 représentent chacun un atome d'hydrogène ou, symbolisent ensemble une liaison C-C aromatique, auquel cas R1 peut également représenter un groupe hydroxy, même à la très forte posologie (comparativement à la dose de 1 à 10 pg/kg usuelle en thérapeutique humaine) de 10 mg/kg chez les rats, ne provoquaient ni indications macroscopiques ni indications histologiques d'une hyperplasie de l'hépi- thélium pavimenteux. On n'a pas constaté non plus d'effets mutagènes. Ces composés conviennent très bien à l'utili- sation pour la prophylaxie et la thérapie des maladies infectieuses car ils activent la phagocytose et ont une activité antivirale. L'invention a pour objet ces composés et leurs sels acceptables pour l'usage pharmaceutique. Parmi ces composés certes, on connaissait déjà par J.Nat. Products 46 (1983) page 507 et suivantes, le 1-carboxy-3,4-méthylènedioxy-8phénanthrène pour lequel 3 on a signalé une activité abortive à la dose de 90 mg/kg (chez le lapin) et des effets d'inhibition de l'implan- tation à la dose de 60 mg/kg (chez la souris). On ne pouvait pas en déduire que ce composé aurait une activité immuno-stimulante. On peut préparer les composés de formule généra- le I en faisant réagir le bromure de 6-bromopipéronyle de formule 0OC O Br H2C- H.,_CH2Br avec la triphénylphosphine dans un solvant anhydre, ce qui donne un sel de phosphonium de formule H2C,. JI- WC CH2p(Ph)3Br qu'on fait réagir avec le benzaldéhyde, l'o-méthoxy- benzaldéhyde ou l'ortho-éthoxy-benzaldéhyde en présence d'une base forte, pour donner un stilbène de formule H2C J R1 dans laquelle R1 représente H, OCH3 ou OC2H5, et en convertissant ce bromure de stilbène à l'aide d'un cya- nure métallique, en particulier le cyanure de cuivre, dans un solvant aprotique polaire, en particulier le diméthylformamide, en le nitrile correspondant et en transformant ce dernier, par hydrolyse, en un acide de formule I, ou en transformant ce bromure de stilbène au moyen de nbutyl-lithium et d'anhydride carbonique en un acide de formule I, ou en transformant ce bromure de stilbène par irradiation aux UV en le dérivé de phénan- thrène de formule %Br H2C'o4O R 1 et en transformant ce composé à l'aide d'un cyanure mé- tallique ou à l'aide du n-butyl-lithium et d'anhydride carbonique, comme décrit ci-dessus, en un acide de formule I, puis, si on le désire, en convertissant un composé de formule I dans laquelle R1 représente un groupe OCH3, par clivage de l'éther, en un composé dans lequel R1 représente un groupe hydroxy, ou bien en sou- mettant un composé nitré de formule O - COOH. H2Co_- NO2 ". R1 dans laquelle R1 représente H ou OCH3, à une dénitration I à l'aide d'un polysulfure, avec formation d'un composé de formule I, et, lorsque R1 représente un groupe OCH3, en transformant, si on le désire, le groupe OCH3 en un groupe par clivage de l'éther. A la bromuration de l'alcool pipéronylique, on utilise de préférence, en tant qu'acide alcanoique inférieur, l'acide acétique. A la préparation du sel de phosphonium, on utilise en tant que solvant anhydre par exemple le benzène ou un alcoylbenzène, de préférence le toluène ou le xylène. A la condensation du sel de phosphonium, on utilise en tant que base forte par exemple un alcoolate de métal alcalin, de préférence le méthylate de lithium. Le stilbèné que l'on peut ainsi obtenir est pour 85 % sous la forme cis et pour 15 % sous la forme trans. Les deux isomères peuvent être séparés par traitement à l'éther diéthylique. Le composé trans passe dans l'éther; le composé cis recherché reste non dissous. A l'exposition aux UV du bromure de stilbène, on opère par exemple dans un mélange de solvants consistant en tétrahydrofuranne absolu et cyclohexane absolu, dans des proportions relatives de 1:12 par exemple, avec adjonction d'iode et admission d'azote. Pour la dénitration, on utilise en tant que polysulfure préféré, le polysulfure d'ammonium en solu- tion aqueuse légèrement alcaline. Les composés 8-méthoxy- et 8-éthoxy-phénanthrène (R2 et R3 représentent ensemble une liaison C-C aroma- tique; R1 représente un groupe méthoxy ou éthoxy) peu- vent être convertis, par clivage de l'éther, en les dérivés correspondants 8-hydroxylés, par exemple par hydrolyse à l'aide de chlorhydrate de pyridine. Les agents selon l'invention servent à accroître la défense contre l'infection. Ainsi, ils provoquent une activation marquée de la phagocytose par les leucocytes. Les agents selon l'invention peuvent donc être utilisés pour le traitement des infections générales, par exemple par des mycobactéries ou des pneumocoques, et pour le traitement d'infections locales. Ils peuvent également être utilisés lorsqu'il y a affaiblissement de la phago- cytose, par exemple après utilisation de corticosté- roides ou d'agents cytostatiques. L'utilisation des agents selon l'invention, permet de ramener la phagocytose à son niveau normal. On a en outre constaté une activité antivirale des agents selon l'invention. On a étudié entre autres l'activation des macro- phages par les composés selon l'invention. On a utilisé comme paramètre la stimulation des monocytes et des macrophages dans la cavité abdominale des souris. Une administration intrapéritonéale de la subs- tance soumise aux essais convient pour provoquer une migration chimiotactique accrue des monocytes dans la cavité abdominale et la différenciation des monocytes en macrophages présentant une aptitude accrue à la phagocy- tose. La stimulation est un processus qui exige un certain temps. Par suite, l'étude de l'activité dans la phagocytose a été réalisée en tant que modèle pharmaco- logique usuel après un traitement préalable de trois jours des souris par les composés selon l'invention. Pour quelques groupes d'expérience, immédiatement après l'administration de la substance, on a prélevé la popu- lation cellulaire intrapéritonéale afin de montrer que la stimulation observée ne se produit qu'après une certaine durée d'incubation. Substances et Produits soutes diluées Les substances soumises aux essais ont été dis- dans l'eau à la concentration de 0,5 mg/ml et lorsque c'était nécessaire. Tampon NH Cl-tris NH4 Cl 8,3 g/l tris [tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane] : 4,119 g/200 ml, pH = 7,65 mélange 1 partie de tris + 9 parties de NH4Cl, réglage à pH 7,2 par HCl 2N PBS/BSA (Sérum albumine bovine) ,0 g de NaCl 1,0 g de KCl compléter à 5 1 par H20, 7,2 g de Na2HPO4 x 2H20 pH = 7,4 1, 0 g de KH2PO4 + 0,2 g de BSA = sérum-albumine de bovin (Sigma n'A-9647) pour 100 ml de PBS DMEM = "Dulbecco's Modified Eagle Medium" avec Lglutamine, sans rouge de phénol (Gibco, Cat n'041-1885) + 5% de FCS ou bien + 5% de FCS + 0,2% d'héparine FCS = sérum de veau foetal (Gibco, Cat n' 011-6290) Solution de Mav-GrUnwald modifiée (Merck, art. 1424) Sang de mouton n' 5, 30.08.84, MPI Fribourg Anti sérum Sérum de lapin antiérythrocytes de mouton, n' 308, IKA 468/6-11 jours; 18.07.78, MPI Fribourg. Animaux d'expérience Les essais sont effectués sur des souris hybri- des femelles (Balb/c x C57BL16) F1 âgées de 18 semaines. Avant le début des expériences, les animaux sont adaptés pendant 5 jours aux conditions du laboratoire. Ils re- çoivent une alimentation courante à l'état de granulés pour rats et souris (Altromin n' 1324) et de l'eau de ville à volonté. Ils sont soumis à des essais de stimu- labilité à des macrophages de trois types par un étalon de thioglycolate et donnent dans ces essais de bonnes réactions positives. Dosage et administration Les substances sont administrées en solution aqueuse (0,5 mg/ml) aux doses suivantes: administration intrapéritonéale: 20 pm/kg 500 pg/kg mg/kg La dilution de la solution mère pour l'adminis- tration des différentes doses est: pour 20 pg/kg, de 1 pg/ml 500 pg/kg, de 25 pg/ml mg/kg, de 250 mg/ml dont on administre 0,4 ml dans chaque cas. Proqramme d'administration 1 groupe = 5 souris traitement préalable: a) 3 administrations trois jours successifs; prélèvement des macrophages le 4ème jour. b) 1 administration immédiatement avant le prélèvement des ma- crophages. Obtention de la suspension cellulaire de macrophages et Phagocvtose Principe de l'essai Apres administration des substances à activité immulogique, les macrophages des animaux d'expérience sont stimulés et les monocytes sont amenés à se diffé- rencier en macrophages. Les macrophages différenciés, stimulés, sont capables, même après isolement, de phago- cyter in vitro des structures d'antigènes opsonisés par les anticorps correspondants, dans ce cas des érythro- cytes de mouton. Les érythrocytes phagocytés sont visi- bles au microscope. Mise en oeuvre Apres le traitement préalable voulu, les souris sont sacrifiées par fracture des vertèbres du cou. On libère le péritoine et on administre par voie intrapéri- tonéale 4 ml de DMEM (à 5% de sérum de veau foetal et 0,2% d'héparine). Après environ 30 s de massage, on pré- lève à l'aide d'une seringue 3 ml de suspension cellu- laire et on les introduit dans un petit tube de proly- propylène placé au bain réfrigérant (O'C). Dans chaque groupe d'expérience, on prélève une souris pour détermi- ner la concentration cellulaire dans l'exsudat; on règ- le à peu près à une concentration de 4 x 105 cellu- les/ml. Isolement des macrophages adhérents: On sélectionne les macrophages et les monocytes à partir de la population cellulaire isolée en les soumettant à incubation sur des couvre-objets; les macrophages et les monocytes adhèrent au verre, alors que les autres cellules n'adhèrent pas. Dans les plaques à culture de tissus à 24 godets ou trous (polystyrène de la firme Costar), on place des couvre-objets ronds et on recouvre de 0,5 ml de DMEM (à 5% de sérum de veau foe- tal). Pour une répartition uniforme des cellules, on place les plaques sur un appareil à secouer et on pipet- te dans chaque mélange, sous agitation (pendant 5 min, environ 200 tours/min) 0,25 ml de suspension cellulaire. On soumet ensuite les plaques de culture de tissus à incubation d'1 heure à 37C et sous 8% de C02 à l'étuve de culture. Après l'incubation, on élimine par "essora- ge" les cellules non adhérentes puis on lave à deux reprises avec 0,25 ml de DMEM (plus 5% de sérum de veau foetal). Opsonisation des érytrocytes de moutons: On lave 1 ml de sang de mouton à deux reprises avec 4 ml de PBS/BSA (centrifugation pendant 10 min à environ 500 x g). On dilue le sang lavé au rapport de 1:50 par le PBS/BSA. On dilue l'antisérum contre les érythrocytes de moutons par le PBS/BSA au rapport de 1:200. On mélange le sang de mouton dilué et l'antisérum dilué à parties égales et on soumet à incubation de 1,5 heure sous agitation ménagée (environ 80 tours/min). Phagocytose Dans chaque godet des plaques à culture de tissus avec des macrophages adhérents sur les couvre- objets, on pipette 0,5 ml de suspension d'érythrocytes opsonisée. Les plaques sont soumises à incubation de 20 min à 37'C et sous 8% de C02. On élimine ensuite par "essorage" les érythrocytes en excès et on lave les couvre-objets deux fois avec du DMEM (à 0,5 % de FCS). Pour lyser les érythrocytes non phagocytés, on les traite dans chaque cas par 1 ml de tampon NH4cl-tris (une durée d'action de 3,75 min s'est révélée convenir). Après essorage du tampon, on lave les couvre-objets à deux reprises avec du PBS/BSA. Mise en évidence de la phaqocytose (techniques de coloration) Après la phagocytose, les macrophages sont colo- rés selon Pappenheim par une méthode combinée May- Grunwald-Giemsa. La coloration est réalisée dans les godets des plaques à culture de tissus. - May-Griinwald concentrée, Smin, essorer - eau bidistillée, 3min, réglage à pH 7,0 par H3P04 à au moins 85%; essorer - solution de Giemsa diluée à 1:40 et filtrée avant uti- lisation 9 min; essorer - rincer par H20 distillée à la pissette. Après la coloration, les noyaux des cellules sont vio- let-rouge et le cytoplasme bleu clair. Les érythrocytes phagocytés se reconnaissent par une coloration rose pâle. Après séchage à l'air, les préparations pour le microscope sont collées sur les porte-objets par du "Eukittn (3 préparations par souris). Examen microscopique Sur les trois préparations pour le microscope par souris, on en choisit deux. On utilise un microscope Zeiss, au grossissement de 1000 fois avec immersion dans l'huile. On utilise la troisième préparation lorsque les résultats donnés par les premières ne sont pas nets. Pour chaque préparation, on compte 300 cellules et en fonction de l'activité dans la phagocytose, on les ré- partit en classes à nombre croissant d'érythrocytes macrophage. Classe Erythrocytes/macrophaqe 1 0 2 1 3 2 4 3 4 6 5 7 6 8 7 8 9 1il 10 12 11 - 20+ + Pour les comptes, on admet qu'à plus de 11 érythro- cytes/macrophage, la répartition dans la classe 12 pré- sente un centre de gravité aux environs de 12 érythro- cytes/macrophage. Les macrophages de la classe 12 sont relativement rares. Traitement des résultats et représentations graphiques Les calculs pour les préparations microscopiques sont faits sur un ordinateur Wang LVP 2200 avec program- me d'alimentation spécial permettant d'obtenir séparé- ment les résultats pour chaque classe numérique. L'établissement de la moyenne à partir des résultats individuels est fait avec le programme "MA 1", les représentations graphiques, avec le programme "NPL". L'effet de stimulation est mis en évidence pour chaque substance et chaque dose de deux manières: 1. Répartition des macrophages dans les classes (érythrocytes/macrophage) en %, 100% correspondant à 300 cellules. Inclus également le nombre des macrophages de la représentation graphique qui n'ont pas phagocyté des érythrocytes. erythrocytes. 2. Répartition des érythrocytes phagocytés (nom- bre des macrophages dans une classe x nombre des éry- throcytes/macrophage) dans les classes, en %, par rap- port au nombre total des érythrocytes phagocytés compté pour 100%. Dans ce cas, on ne tient pas compte du nombre des macrophages qui n'ont pas phagocyté des érythro- cytes. Paramètre On a pris comme paramètre de la stimulation des macrophages l'augmentation d'activité de phagocytose, exprimée par le nombre des érythrocytes phagocytés par macrophage (= classe). Une stimulation se manifeste par une diminution des macrophages qui n'ont pas phagocyté des érythrocytes ou qui n'ont phagocyté qu'un petit nombre d'érythrocytes et par une augmentation des ma- crophages à plusieurs érythrocytes. Résultats Stimulation des macrophages par le 1-carboxy-3,4-méthyl- ènedioxy-8-méthoxy-phénanthrène (i.p.) Figures la et lb: 3x 20 pg/kg i.p Stimulation des macrophages au bout de 3 jours ( t écart-type) La figure la annexée représente la répartition de 300 cellules dans les classes 1 à 12,en %. La figure 1 b annexée représente la répartition des éry- throcytes phagocytés dans les classes 1 à 12, en % Stimulation des macrophages au bout de 3 jours a) Répartition de 300 cellules classes 1 à 12, en % Tableau: 3 x 20 pg/kg i.p. clase souris sozis sors saris dviati' 1 2 3 4 %n w st:aiard dans les errzaeur diati stad&rd wiloe 1 1,o00 2 2, 00 3 3O00 4 4,00 5O0 d 6 6,00 7 7,00 8 Bo00 9 9100 10,t00 il 111 00 12 12,00 s 67 12,67 2,17 0,67 0>17 0,0o 71,33 6,17 3,33 1,67 or 17 0,33 0,00 00 Ot00 Ot 00 ,00 3,50 1 117 0,17 0,00 0,00 0,0* 0,00 0,00 o, x7 O1 O0 01.00 o0#0 72,17. t 67 i0 17 0,50 0r17 otso 0o00 Ot,0 Ol?7 o, oo 71,417 16t29e 7,333 2,875 1.,167 0,458 0,250 0,042 0,042 or 000 01 la 0,000 0,644 0!408 OI583 O 083 0,000 0,160 0,000 1,889 1,528 0;540 0,322 0,204 0o292 0,108 0,042 0,042 O? 040 0,000 0,080 0,000 16t250 2,917 1,167 0,167 0 000 0O 000 0,083 O, 000 b) Répartition des érythrocytes phagocytés dans les classes 1 à 12, en %. a classe scris surs s=-is saris ! 2 3 4 dMvation e&r rar dt % mn sta-dar sta-dazd mDre 1 1,00 2 2,00 3 3 00 4 4, 00 5 00 6 6,00 7 70t0 a 8,00 9 9t 00 10, t00 i. 11t00 12 12,00 0,0 26 5 28,6 13,6 t6 13,9 0,0 7t0 0,0 ,3 t5 13,? 1.7 4,1 0,0 0,0 4 j,,t. 0,0 0,0 0,0 37,5 32t5 19 t? 8t8 1,6 0,0 0,0 0t0 0o0o 0,0 0w0 31,2 ,9 ,1 9, 4 1,7 6t,0 2,3 0t0 3)4 0,0 32t50 29t30 17,21 4,72 3,06 0t59 0O70 0'00 2, 58 0,00 0,00 4,77 3, 14 3,39 3,32 6, 14 2t60 1,17 Io 17 1,39 LtoO 3j33 0, 00 0 00 2,38 1#57 1,69 3; 07 1;30 0,59 0o70 0,00 1,66 Figures 2a et 2 b: 3 x 500 Pg/kg i.p. * Stimulation des macrophages (x + écart-type) au bout de 3 jours La figure 2 a annexée représente la répartition de 300 cellules dans les classes 1 à 12, en % i 0 00 33 01 17,39 9 07 1,69 3t09 0G00 0,00 1,68 0o00 La figure 2 b annexée représente la répartition des érythrocytes phagocytés dans les classes 1 à 12, en % Tableau: 3 x 500 pg/kg i.p. Stimulation des macrophages au bout de 3 jours a) Répartition de 300 cellules dans les classes 1 & 12, en % clase, sms sours sanis soissaris 1 E 3 4 S didatian errer dviatin ITy _5Qstadatd sntmd nrwr[ 101 1t 00 2- 2,00 3 3t00 4- 4,00 5,00 6 6,00 7 7100 8 8900 9 9t 00 10, 00 il 11, 00 12 12,00 63,00 13,00 8,00 , 00 2j 83 1,17 0,83 1,17 0,00 0,67 0,00 852g3 19,67 11,;83 6,00 3,83 2,83 1,33 0,50 0,17 0,33 0,00 53,e3 ,50 13,33 ,83 3,00 1,33 0t83 À0,50 0, 17 0t33 o,17 0t17 47,33 17,83 16 00 ?,83 e,00 2,50 1,17 0, 83 0, 00 0,50 0,000 51,33 S67 12,17 8,67 ,50 2,67 2,17 0?50 0,67 0,00 t050 0,17 53,667 1.7;333 12,267 6,667 4,333 1,n33 0,633 0t733 0,100 0t433 0O067 ,775 3, 053 21 993 2t 893 1,523 0;9?9 0,979 0,630 0%500 or 183 0,384 o0 149 0,190 0.091 2, 583 1,365 1,294 0,681 0t438 0,282 0,224 0,082 0#172 0J 067 0,08s 0,041 52,833 17,8a33 12,167 6t000 4t333 2,667 1t 167 0,500 0#667 0,000 0,500 b) Répartition des érythrocytes phagocytés dans les classes 1 à 12, en % a ciasSe saris sari sans saris sris il 1 2 3 4 5 % m: 1 1,00 2 2,00 3 3s00 4 4)00 5) 00 6 6,00 ' 7 7,00 8 8,00 9 9o00 10>00 11 11 00 12 12;00 0)0 12>S 14,4 16,6 13,6 S6 8>9 0,0 6,4 0)0 0,0 17,5 21,0 16,0 13,6 7>1 3, 1 4,7 1>3 3t0 0,0 0,0 ,3 26?4 17,3 il, 9 6,6 4S9 1>3 3)0 1,6 3,3 0>0 13>5 24,3 17>8 >2 9,5 ,3 4)4 0,0 3,8 0>0 0,0 11., 19,5 19,9 16,7 >1 9,9 2,? 4j1 0,0 3t9 2*5 ôàdaticn eamzr déaticn stwTÉrd stadard m>rcroe 0,00 3G60 z,0 2tO7 Et75 2,79 2t'u 1,73 1:62 0,00 1,61 1,97 0,90 0t93 1,23 0,87 0, 52 1,25 0,59 0,77 Oa7z 0,00 13t,4 21t 04 17,30 1,1t9 ,14 6?71 0,00 Ot00 0, 00 ,13 2!411 ,48 6,79 3, ES ,03 3t72 1>17 Figures 3a et 3 b: 3 x 5 mg/kg Stimulation des macrophages au bout de 3 jours (x t écart-type) La figure 3qannexée représente la répartition de 300 cel- lules dans les classes 1 à 12,en % i.p. -------------- - - - ----- - - - ------------------------- - - ------- - - La figure 3 b annexée représente la répartition des érythro- cytes phagocytés dans les classes 1 à 12,en % Tableau: 3 x 5 mg/kg i.p. Stimulation des macrophages au bout de 3 jours a) Répartition de 300 cellules dans les classes 1 à 12, en % I cla ssris saris gxs sasrs sars 1 2 3 4 5 %mmn 1 1,00 a 2,00 3 3,00 4 4,00 5S00 1 6 6,00 7,00 1 8 8100 9 9,00 10>00 Il 11;00 e 12,00 69,33 9, 83 8s00 4,93 2,00 0,67 0,67 0,67 0>33 0;17 0O67 ,33 16)17 12,17 7t'17 6I00 2,33 2,67 1,00 l^17 0,67 0,17 52,17 11,50 SJ 83 ,17 4,17 1>33 0,00 0,50 0,17 0,33 49,50 23,33 14/67 6)50 2t67 1J83 0O50 0333- 0,17 0 17 0>17 0,:7 56,17 22,17 11,17 ,33 3,00 1,67 0,17 0, 00oo 0>17 0,'17 0O00 0,,00 ,500 ?17,900 ,933 3>933 2,400 1J067 0,400 0>600 0;267 0,233 0,267 éiàatin eroer diatn taà staxad y 8>149 >381 2à389 1;539 1; 018 0)990 0,435 0O435 0;149 0,253 0,253 OLPq 0?2.. 3,644 2,406 1,068 0>414 0; 688 0,455 0,443 01J94 0, 194 0,067 0,11.3 0,113 52 167 18,000 , 3 3,000 2Y 000 0,667 0;333 0 167 0,167 0,167 b) Répartition des érythrocytes phagocytés dans les classes 1 à 12, en % - ------------------- !8 Cl3e sxis suis -nris sais suris daticn err dimi u 1 2 3 4 5 %n: stdx:d 5st:dd m:r à------- à- --- - - --- ------à 1,00 0.0 0 0 010 0.0 0.0 0,00 Ot00 0,00 0100 2 2,00 10S5 1,,4 14)1 22,2 26J2 16189 6,94 3,10 14> 2 3 3,00 17?1 17J2 19,0 27 9 26?4 21132 5,35 239 1804 4 4;00 155 15 2 13,;7 185 18t9 16137 2,25 1,01 1548 p1 1 25.t. 012L.j461 S,00 12 1 17,0 16t2 10,1 1412 1392 2, 127 4,7 06 6, 00 107 8,2 16,3 887 9,9 10,76 3,26 1>)46 9684 7 7,00 4,3 11,3 6&13 2,9 1,2 5,18 3,90 1,75 4,27 8 8,00 5 0 4,9 OO 2,2 0,0 2>43 2049 1>11 2,22 9 9,00 5 7 6,6 S 2 1,3 1,6 407 2,4? 1,1l 5,23 1 40 204 1;L 5;22l 7 10,00 3,2 1,1 3,5 1,4 1t 220 10 49,77 il 11l00 L,8 4,7 1,3 1,6 0t0 188 1,73 0, 77 1,58 12 12,00 14e2 214 S,2 3,2 0,0 5,00 5,49 2,46 3,17 Dépendance de l'effet de stimulation vis-à-vis de la duse Les groupes témoins, après administration i.p. et p.o. respectivement d'une solution physiologique de NaCl, montrent que l'administration i.p. provoque elle- même déjà une légère activation des macrophages. Une torte proportion de macrophages a phagocyté deux éry- throcytes. Par conséquent, une augmentation du nombre des macrophages à plus de deux érythrocytes doit être inter- prétée comme un effet de la substance. On a donc établi la relation entre la somme % des érythrocytes à partir de la classe 4 (macrophages à 3 érythrocytes et plus) et la dose. Figure 4: relation entre la somme % des éry- throcytes à partir de la classe 4 et au-dessus et la dose après administration i.p. de 20 pg/kg, 500 pg/kg et mg/kg. Le témoin est à 45% + 6% (x + écart-type). Sur la figure, le domaine + écart-type autour de la valeur moyenne est indiqué par le trait interrompu Tableau Dépendance de la stimulation des macrophages vis-à-vis de la dose après administration i.p. et x = dose (pg/kg) y = somme % des érythrocytes phagocytés T = écart-type avec la moyenne n Valeurs de x Valeurs de y Valeurs de T N 1 20,0000 38,2000 2,7800 4 2 500,0000 63,7600 3,3200 5 3 5000,0000 61,8000 5,4200 5 Conclusions La substance provoque une augmentation de l'activa- tion des macrophages de 38% à 20 pg/kg jusqu'à 64% à 500 pg/kg. Une nouvelle augmentation de la dose, à 5 mg/kg, conduit à un léger affaiblissement de la stimu- lation. L'activation des macrophages, dans l'intervalle des doses utilisées, n'est pas linéaire. Le groupe d'expérience qui a subi une administra- tion intrapéritonéale unique immédiatement avant le pré- lèvement des macrophages montre que les effets observés ne se produisent qu'après une certaine durée d'incuba- tion. Cette observation indique que la substance, in vivo, induit chez les macrophages le mécanisme responsa- ble de l'activation de la phagocytose. Ceci confirme les effets suivants: 1. stimulaton de la vitesse d'internalisation mem- branaire 2. augmentation de la densité des récepteurs Fc etl/ou 3. augmentation de la mobilité des récepteurs C3b. Les autres composés selon l'invention ont une acti- vilé pharmacologique comparable. Cette activité a pu être confirmée avec d'autres modèles pharmacologiques et en clinique. Les exemples qui suivent illustrent la préparation dles composés selon l'invention. Exemple 1 Préparation du 1-carboxy-3,4-méthylènedioxy-2'-méthoxy- stilbène a) Préparation du bromure de 6-bromopipéronyle HOAc O N.Br2 H Br HC'o CH20H "CO CH2Br (PM - 152). -294 Réactits: alcool pipéronylique (EGA-Chemie ou Aldrich); g brome, 48 ml dans 120 ml d'acide acétique acide acétique, 240 ml Dans un ballon d'un litre à 3 cols équipé d'une ampoule à brome, d'un tube sécheur et d'un thermomètre intérieur, on introduit l'alcool pipéronylique dans l'acide acétique et on refroidit au bain de glace. On ajoute à cette solution, goutte à goutte, sous agita- tion, lentement, le brome en solution dans l'acide acé- tique, en veillant à ce que la température reste entre et 25'C. On abandonne le mélange de réaction au repos pendant la nuit, on essore les cristaux qui ont précipité, on les lave à l'eau et on recristallise dans le méthanol. F.: 92-93'C Rendement: 174 g, 75% b) Préparation du sel de triphénylphosphonium H.C.. OBr. H2CoO'IL r (Ph)3P (Pr=294) Réactifs: bromure de 6-bromopipéronyle, 294g triphénylphosphine, 262 g toluène Dans un ballon de 3 litres à 3 cols équipé d'un condensateur à reflux et d'un agitateur KPG, on intro- duit le bromure de 6-bromopipéronyle et la triphényl- phosphine et on dissout sous agitation dans le toluène absolu. On chauffe le mélange de réaction sous agitation pendant 2 heures et on l'agite pendant 24 heures à tem- pérature ambiante. On essore le sel de triphénylphos- phonium formé, on le lave avec un peu de toluène et on le sèche au dessicateur. Rendement: 500 g, 95% c) Préparation du dérivé de stilbène CH30 OHC (F Réactifs: lithium (en fils) méthanol (absolu) sel de triphénylphosphonium o-anisaldéhyde diméthylformamide (absolu) Mode opératoire: O NBr H21C'-o-t= 136) OCH3 (PI =333) c N-O Br H2C, + O H2 O_ CH2P(Ph)3Br - (PM=556) H2C O B OI0 -', CH2P On ajoute 0,98 g (0,14 atome-gramme) de lithium fi- nement découpé à 30 ml de méthanol absolu en atmosphère d'azote. Lorsque la réaction est terminée, on introduit goutte à goutte cette solution en 2,5 heures dans une solution agitée à 90'C de 76,96 g(0,14 mole) de sel de triphénylphosphonium et 17,68 g (0,13 mole) d'o-anisal- déhyde en solution dans 200 ml de diméthylformamide absolu. On agite la solution de réaction pendant encore 1 heure à 90'C. Après refroidssement à température am- biante, on coule le mélange de réaction dans 700 ml d'eau, on filtre le précipité et on le sèche. On extrait le produit séché au soxhlet par l'éther de pétrole (bouillant de 30 à 50'C) jusqu'à ce que le résidu contenu dans la cartouche ne contienne plus de stilbène (chromatographie sur couche mince; gel de silice; CH2C12). On évapore l'éther de pétrole sous vide et on recristallise le résidu (64,82 g de mélange) dans l'éthanol (la plus grande partie des impuretés et du produit non converti est ainsi séparée). On redisper- se le précipité (31,13 g) dans 300 ml d'éther et on fait bouillir pendant 2 heures (séparation du mélange du com- posé cis et du composé trans). Après refroidissement, on filtre la substance solide et on sèche. Rendement: 23,87 g (52%) de composé cis pur - contrôle par chromatographie sur couche mince et RMN Point de fusion: 112C. d) Préparation du 1-cyano-3,4-méthylènedioxy-2'- méthoxy-stilbène CN H2C BrO H2C. > OCH3 -OCH3 (PF= 277) (PM. 331) réactifs: cyanure de cuivre(II) N,N-diméthylformamide On fait bouillir au reflux pendant 8 à 12 heures un mélange de 3 g de bromure de stilbène séché au préala- - ble, 4 g de cyanure de cuivre(II) et 30 ml de diméthyl- formamide, jusqu'à ce qu'on ne retrouve plus le bromure à la chromatographie sur couche mince [dichlorométhane- éther de pétrole, (1:2)]. Après refroidissement, on coule le mélange de réaction dans une solution de 4 g de chlorure ferrique, 1 ml de HCL et 10 ml d'eau et on maintient le mélange de réaction pendant 20min à& 70'C (à la hotte: dégagement d'HCN!). On extrait ensuite le mélange de réaction, après le refroidissement, par 5 fois 40 ml de chloroforme, lave avec 2 fois 20 ml d'eau et sèche sur chlorure de calcium. Après élimination du solvant,. on recristallise le résidu dans l'éthanol. Rendement: 2,0 g (70%) e) Conversion du nitrile en le produit final par hydrolyse 0 CN H2C'O 0 NaOH Il)0 "OCNH3 CH3 O. COOH H2C0 2-o S i --OCH3 (PI= 277) (PM= 2 9 6) : nitrile formule NaOH dissout 1 quantité de l'acide ci-dessus stilbénique, g de nitrile stilbénique en minimale d'éthanol (30 à 50 selon la chauffant ml) et on Réactifs On dans la ajoute une solution d'hydroxyde de sodium (10 g dans 15 mi d'eau). On fait bouillir le mélange de réaction sous reflux énergique jusqu'à ce qu'on ne trouve plus de cyanure à la chromatographie sur couche mince (éther) (18 à 20 h). On élimine l'éthanol sous vide et on ajoute 50 à ml d'eau au résidu. On extrait la phase aqueuse par deux fois 30 ml d'éther et on neutralise par HCl 6N. Le précipité floconneux reste pour la plus grande partie à l'état colloidal dans la solution. On tiédit la solution pendant un court moment et on l'abandonne au repos pen- dant 24 heures. On essore le précipité qui a coagulé et on le re- cristallise dans l'éthanol. Rendement: 0,53 g (50%) Exemple 2 Préparation du 1-carboxy-3,4-méthylènedioxy-2'-méthoxy- stilbène par conversion du bromure de stilbène en l'acide stilbénique 1. n-BuLi/éther H2C ' B 2. CO2.H2CO COOH O C 3. HC1 " CH3 CH3 Réactifs: bromure de stilbène, selon la formule ci-dessus: 17,44 g (0,05 mole) n-BuLi (1,55 M) 40 ml (0,061 mole) éther 180 ml On dissout le bromure de stilbène dans l'éther absolu et on refroidit en atmosphère d'azote à -72'C. Dans cette solution de réaction, on introduit avec précaution le n-BuLi et on laisse revenir en 1 heure à la température ambiante, après l'addition. On coule alors la solution immédiatement sur du C02 solide, et on laisse réagir pendant la nuit. Après addition d'eau et séparation des phases, on extrait la phase aqueuse par deux fois 100 ml d'éther. On refroidit les phases aqueuses combinées au bain de glace et on acidifie par HCl concentré. On esso- re le précipité formé et on le lave abondamment à l'eau, jusqu'à neutralité. Après 2 ou 3 ébullitions avec de l'eau(pour élimi- ner l'acide butyrique provenant du n-BuLi), on recris- tallise le produit brut dans un mélange éthanol/eau. Rendement: 9,16 g (58,7%) F.: 199,5C Le bromure de stilbène correspondant peut être obtenu comme décrit dans l'exemple 1, stades opératoires a) à c). Exemple 3 Préparation du 1-carboxy-3,4-méthylènedioxy-8-méthoxy- phénanthrène a) Conversion photochimique du dérivé de stilbène en le dérivé de phénanthrène correspondant 0 BH- Br- H2C'o.H CH ={- OCH3 OCH3 (PM =333) PM 331) Réactifs: bromure de stilbène (isomère cis) 1,2,3,4-tétrahydro-9fluorénone cyclohexane iode On dissout 3,3 g (0,01 mole) de bromure de cis- stilbène dans 100 ml de 1,2,3,4-tétrahydro-9-fluorénone absolue. On dilue cette solution par 1200 ml de cyclo- hexane absolu on ajoute 1,7 g d'iode. On irradie pendant 12 à 14 jours la solution, sous injection d'azote, par une lampe de laboratoire immergée avec tube refroidis- seur du type TQ 150 de la firme Hanau. On suit la réac.- tion par chromatographie sur couche mince (CH2c12/éther de pétrole 30-50'C, 1:2). On extrait la phase organique avec une solution aqueuse de thiosulfate (trois fois 300ml) afin d'élimi- ner l'excès d'iode. Après séchage sur MgS04, on concen- tre la phase organique à l'évaporateur rotatif. On re- cristallise le produit brut dans l'éther de pétrole bouillant de 60 à 90C. Rendement: 1,55g (47% de la théorie) b) Préparation du 1-cvano-3,4-méthvlènedioxy-8-mé- thoxv-nhénanthrène à partir du bromure de Phénanthrène Conversion du bromure de phénanthrène en nitrile CN H2CO C0 2'O Cu(CN)IDMF/: n 2 OCH3 (Pi = 331) (PM = 277) J.D Réactifs: bromure de phénanthrène, selon formule ci- dessus cyanure de cuivre(II) -N,N-diméthylformamide On fait bouillir au reflux pendant 8 à 12 heures un mé- lange de 3 g de bromure de phénanthrène séché au préala- * ble, 4 g de cyanure de cuivre(II) et 30 ml de diméthyl- formamide jusqu'à ce qu'on ne trouve plus de bromure à la chromatographie sur couche mince [dichlorométhane/ éther de pétrole, (1:2)]. Après refroidissement, on coule le mélange de réaction dans une solution de 4g de chlorure ferrique, lml d'HCl et 10 ml d'eau et on main- tient le mélange de réaction pendant 20 min à 70'C (à la hotte: dégagement d'HCN!). On extrait ensuite Ie mé- lange de réaction refroidi par 5 fois 40 ml de chloro- forme, on lave par 2 fois 20 ml d'eau et on sèche sur chlorure de calcium. Après élimination du solvant, on recristallise le résidu dans l'éthanol. Rendement: 2,0 g (70%); pF: 215'C. c) Hydrolyse du nitrile de l'acide phénanthréniaue en acide Phénanthrénique 0 CN- COOH C NOH 2C H2C"O 2.- -',,.,,.OCH3- OCH3 OCH3 (PM = 277) (PM = 296) Réactifs: nitrile de l'acide phénanthrénique, selon la formule ci-dessus NaOH On dissout lg de nitrile de l'acide phénanthrénique dans la quantité minimale d'éthanol (30 à 50 ml) à chaud et on ajoute une solution d'hydroxyde de sodium (10 g dans ml d'eau). On fait bouillir le mélange de réaction sous reflux énergique jusqu'à ce qu'on ne trouve plus de cyanure à la chromatographie sur couche mince (éther) (18 à 20 heures). On élimine l'éthanol sous vide et on ajoute 50 à 100 ml d'eau au résidu. On extrait la phase aqueuse par deux fois 30 ml d'éther et on neutralise par HCl 6N. Le précipité floconneux qui se forme reste pour la plus grande partie à l'état colloidal dans la solu- tion. On chauffe celle-ci un court moment et on l'aban- donne au repos pendant 24 heures. On essore le précipité qui a coagulé et on le recristallise dans l'éthanol. Rendement: 0,53 g (50%). Exemple 4 Préparation du 1-carboxv-3.4-méthvlènedioxv-8-hydroxv- Phénanthrène On fond 1,0 g de 1-carboxy-3,4-méthylènedioxy-8- méthoxy-phénanthrène avec 2,0 g de chlorhydrate de pyridine au bain d'huile à 170'C et on maintient à cette température pendant 1 heure sous balayage d'azote. Après refroidissement, on reprend la masse solidifiée par 10 1 d'HCl à 5% et on extrait par 3 fois 10 litres de chloro- forme. On combine les extraits, on lave à l'eau jusqu'à neutralité et on sèche par filtration sur papier filtre silanisé (WHATMAN 1 PS). Après évaporation du solvant à l'évaporateur rotatif à 30'C, on estérifie pour sa sépa- ration le mélange du produit de départ et du produit d'hydrolyse en distillant au reflux avec un mélange de 2,5 1 de méthanol et 0,1 litre de H2 SO concentré pen- 2 4 dant 3 heures. On coule ensuite dans 10 1 d'eau et on extrait la phase aqueuse-méthanolique à trois reprises avec 10 litres à chaque fois d'éther diisopropylique. Après lavage à l'eau à plusieurs reprises, on extrait la phase organique par 10 litres de NaOH: l'ester méthyli- que du composé 8-méthoxylé reste dans la couche organi- que et le composé 8-hydroxylé passe dans la phase aqueu- se avec hydrolyse simultanée de l'ester. Après lavage avec de l'éther diisopropylique frais, on acidifie la phase alcaline et on l'extrait à plusieurs reprises avec du chloroforme, on sèche sur papier à séparation de phases WHATMAN 1 PS et on élimine le solvant à l'évapo- rateur rotatif. On obtient à l'état de résidu solide le 1-carboxy-3,4méthylènedioxy-8-hydroxy-phénanthrène, composé unique selon la chromatographie sur couche mince. Fluorescence: (MeOH;Amax,nm): exitation: 261, 302, 318, 329, 358, 377 émission: 386, 402 Rendement: O, 714 g (75%). Exemple 5 Préparation du 1-carboxv-3.,4-méthvlènedioxv-8-méthoxy- Phénanthrène Par réduction du croupe nitro On dissout 5 g d'acide aristolochique I dans 1500 ml d'une solution aqueuse de carbonate de sodium à 1 % et on filtre ensuite dans un ballon de 5 1. A cette solution limpide de sel on ajoute 1500 ml de solution de polysulfure d'ammonium du commerce. On agite le mélange de réaction pendant 2 heures à température ambiante (à la hotte!) et on conserve pendant la nuit après avoir bouché. On ajoute ensuite 1500 ml d'eau déminéralisée et on acidifie le mélange réactionnel goutte à goutte sous agitation par environ 550 ml d'acide chlorhydrique con- centré. On filtre le produit qui a précipité et on le lave à l'eau. On extrait la phase aqueuse par 1500 ml d'acétate d'éthyle. On utilise cette phase acétate d'éthyle pour laver en agitant le produit précipité et on répète ensuite deux fois ce lavage avec 1500 ml à chaque fois d'acétate d'éthyle. On combine les phases organiques et on lave à deux reprises avec 500 ml d'eau à chaque fois. On extrait ensuite la solution dans l'a- cétate d'éthyle à quatre reprises par 750 ml à chaque fois de lessive de soude à 2% On rejette la phase orga- nique, on règle la solution aqueuse alcaline à pH 4-3 par l'acide chlorhydrique concentré puis on extrait en secouant à nouveau à quatre reprises avec 1000 ml à chaque fois d'acétate d'éthyle. On lave les phases orga- niques combinées à trois reprises avec 750 ml d'eau à chaque fois. On sèche la phase organique lavée sur sul- fate de sodium et après filtration, on amène à sec sous vide (température de bain: environ 30'C). Rendement: 3,1 g; pF: 285'C (déc.). La substance est purifiée par recristallisation dans l'acétate d'éthyle. REVENDICATIONS 1. Composés de formule I c0 o COOH "1 (I) R1 dans laquelle R1 représente un atome d'hydrogène, un groupe méthoxy ou éthoxy et R et R représentent chacun 2 3 un atome d'hydrogène ou forment ensemble une liaison C-C aromatique, et R1 représente alors un atome d'hydrogène, un groupe hydroxy ou éthoxy, et leurs sels acceptables pour l'usage pharmaceutique. 2. Procédé de préparation des composés de formu- le générale I H2C'O COOH v (I) R1 dans laquelle R1 représente un atome d'hydrogène, un groupe méthoxy ou éthoxy et R2 et R3 représentent des atomes d'hydrogène ou forment ensemble une liaison C-C aromatique, auquel cas R1 peut également représenter un groupe hydroxy, et de leurs sels acceptables pour l'usa- ge pharmaceutique, caractérisé en ce que l'on fait réagir le bromure de 6bromopipéronyle de formule: "O Br H2C O.- CH2Br avec la triphénylphosphine dans un solvant anhydre, ce qui donne un sel de phosphonium de formule O C' -:Br H2c(I i' 3 qu'on fait réagir avec le benzaldéhyde, l'o-méthoxy- benzaldéhyde ou l'ortho-éthoxy-benzaldéhyde en présence d'une base forte, ce qui donne un stilbène de formule O A H2C '- R1 dans laquelle R1 représente H, OCH3 ou OC2H5, et ou bien on convertit ce bromure de stilbène à l'aide d'un cyanu- re métallique, en particulier le cyanure de cuivre, dans un solvant aprotique polaire, en particulier dans le di- méthylformamide, en le nitrile correspondant et l'on transforme ce dernier par hydrolyse en un acide de for- mule I,ou bien on convertit ce bromure de stilbène au moyen de n-butyllithium et d'anhydride carbonique en un acide de formule I, ou bien on transforme ce bromure de stilbène par irradiation aux UV en le dérivé de phé- nanthrène de formule et on transforme ce dernier, à l'aide d'un cyanure mé- tallique ou à l'aide de n-butyl-lithium et d'anhydride carbonique, comme décrit ci-dessus, en un acide de for- mule I, et si le on désire, on convertit un composé de formule I dans laquelle R1 représente un groupe OCH3, par clivage de l'éther, en un composé dans lequel R1 représente un groupe hydroxy, ou bien on soumet un composé nitré de formule O COOH H2C, I t)Ri dans laquelle R1 représente H ou OCH3, à une dénitration par un polysulfure, avec formation d'un composé de for- mule I, et dans le cas o R1 représente OCH3, on conver- tit, si on le désire, ce groupe OCH3 par clivage de l'éther en un groupe OH. 3. Médicament contenant au moins un composé de formule générale I H2Co-0 COOH t (I) R1 dans laquelle R1 représente l'hydrogène, un groupe méthoxy ou éthoxy, et R2 et R3 représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble une liaison C-C aromatique, auquel cas R1 peut également représenter un groupe hydroxy, ou ses sels acceptables pour l'usage pharmaceutique, éventuellement dans un véhicule accep- table pour l'usage pharmaceutique.