FR 2587216 A1 19870320 FR 8607946 A 19860603 La présente invention est relative à des compositions pharmaceutiques destinées à être adminis- trées par voie nasale pour le traitement de l'anémie. L'érythropolétine humaine (parfois désignée ci-dessous par l'abréviation EPO humaine) est une gly- coprotéine produite principalement dans le rein et est connue en tant que facteur hématopo!étique humoral agissant sur les cellules souches érythroblastiques présentes dans la moëlle osseuse pour favoriser leur différenciation en érythrocytes. On considère que l'é- rythropoiétine humaine a un potentiel important en vue de son utilisation comme thérapeutique pour le traitement de différents types d'anémie. La plupart des protéines sont, soit faible- ment absorbables, soit digérées et décomposées avant qu'elles ne soient absorbées dans l'estomac ou les intestins. Elles sont donc habituellement administrées par injection dans les vaisseaux sanguins ou les tis- sus. En revanche, les injections sont la cause de nom- breuses douleurs et de gênes chez les patients qui formulent en conséquence quelques plaintes à propos des traitements par injections. Comme variantes de l'administration par in- jection, des procédés ont été récemment proposés pour administrer les protéines dans le rectum, les bronches, les yeux ou la cavité nasale. Le fait que l'absorption efficace de l'insuline et de la calcitonine ait été obtenue par administration par voie nasale, suggère l'utilisation potentielle de cette voie d'administra- tion comme nouveau procédé de traitement avec des pro- téines. On pense que l'EPO humaine appartient à la même catégorie que celles des protéines et on souhaite vivement mettre au point un procédé d'administration de l'EPO humaine autrement que par injection. Dans ces conditions, on a réalisé des expé- riences dans lesquelles l'EPO humaine était adminis- trée dans la cavité nasale de modèles animaux anémiés. De manière inattendue, l'EPO humaine ainsi adminis- trée, a été absorbée à des doses importantes et s'est avérée efficace dans le traitement de l'anémie. La présente invention a été réalisée sur la base de cet- te découverte. La présente invention a ainsi pour objet de nouvelles compositions pharmaceutiques pour le traitement de l'anémie, destinées à être administrées lo par voie nasale. La présente invention est relative à de nouvelles compositions pharmaceutiques destinées à être administrées par voie nasale, contenant de 1'EPO humaine comme ingrédient actif pour le traitement de l'anémie. La présente invention se rapporte, plus particulièrement, à de nouvelles compositions pharma- ceutiques destinées à être administrées par voie na- sale, comprenant un milieu aqueux et/ou non aqueux contenant de l'EPO humaine et un agent tensio-actif, pour le traitement de l'anémie. L'EPO humaine incorporée dans la composi- tion pharmaceutique de la présente invention est dé- finie comme étant une substance physiologiquement active présente à l'état de trace, commandant la pro- lifération, la différenciation et la maturation des cellules souches érythroblastiques en érythrocytes. Toutefois, le terme "EPO humaine", tel qu'employé ici, comprend non seulement les formes naturelles de l'EPO humaine mais également les dérivés de cel- les-ci ainsi que les substances analogues qui ont des activités pharmacologiques. L'EPO humaine qui est incorporée dans la composition de la présente invention comme ingré- dient actif, peut être préparée de différentes fa- çons. Par exemple, l'EPO humaine peut être extraite de l'urine humaine normale, ou de l'urine ou du plas- ma (y compris le sérum) de patients atteints d'anémie aplasique (T. Miyake et al., J.B.C., 252, 5558 (1977), et J. P. Lewin et al., J. Lab. Clin. Med., 66, 987 (1965)). L'EPO peut être préparée, par exemple, à par- tir de cultures de tissu de cellules cancéreuses de rein humain (Demande de brevet japonais publié et non examiné NQ 55790/1979), à partir de lymphoblastes.hu- mains ayant la capacité de produire de l'EPO humaine (Demande de brevet japonais publiée et non examinée N 40411/1982) et à partir d'une culture de l'hybri- dome obtenu par fusion cellulaire d'une lignée de cellules humaines. L'EPO humaine peut également être préparée par des procédés de génie génétique, compre- nant l'obtention d'un ARN messager (ARNm) correspon- dant à la séquence d'acides aminés de l'EPO humaine, la préparation d'un ADN recombinant en utilisant l'ARNm et en exprimant le gène d'ADN dans une cellu- le-hôte appropriée, telle qu'une bactérie (par exem- ple E. coli), une levure ou une lignée de cellules animales ou végétales (voir, par exemple, Sylvia, L. H., Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 81, 2708 (1984)). Bien que diverses lignées de cellules ani- males soient disponibles pour faire office de cellu- les-hôtes, des lignées de cellules cultivées prove- nant de mammifères ou d'hommes, sont-préférées et comprennent les cellules COS, les cellules ovariennes de hamster chinois (OHC) et les cellules C-127 de souris. Chacun des types d'EPO humaine préparés selon ces procédés, est utile dans la présente invention dans la mesure o il permet la prolifération d'héma- tie matures ayant une capacité de transport d'oxygène suffisante pour être utile dans le traitement de l'a- némie dans les affections malignes. La quantité administrée d'EPO humaine va- rie suivant l'état du patient. Dans le cas d'une in- jection parentérale, des préparations contenant 0,1 à 500 microgrammes d'EPO humaine et de préférence de 5 à 100 microgrammes, peuvent être administrées de une à sept fois par semaine. Dans le cas d'une application intranasale, les quantités d'EP0 humaine administrées sont un peu plus importantes que celles des injections parentérales. Les agents tensio-actifs utilisés selon la présente invention peuvent être ceux qui favorisent l'absorption d'EP0 humaine à travers la membrane de la muqueuse nasale, c'est-à-dire ceux qui agissent comme promoteur d'absorption. De tels agents tensio-actifs comprennent: les sels biliaires tels que le cholate de sodium, le taurocholate de sodium et analogues; des composés cationiques tels que le chlorure de ben- zalkonium, le chlorure de benzéthonium et analogues; des composés anioniques tels que des polyoxyéthylène alkyl éther-sulfates (par exemple, le polyoxyéthylè- ne lauryl éther-sulfate de sodium) et des alkyl sul- fates (par exemple le lauryl sulfate de sodium); des composés non ioniques tels que les esters d'un acide gras avec le sorbitanne (par exemple, le monostéarate de sorbitanne, le monooléate de sorbitanne et le ses- quioléate de sorbitanne), les esters d'acides gras avec le glycérol (par exemple, le monostéarate de glycéryle et le monooléate de glycéryle), les esters d'acides gras avec un polyoxyéthylène sorbitanne (par exemple, un monooléate de polyoxyéthylène sorbitanne) et analogues; des composés amphotères tels que les imidazolinium bétalnes et analogues; et des phospho- lipides tels que la phosphatidylcholine et analogues. La quantité d'un tel agent tensio-actif peut ordinairement être comprise dans la plage allant de 0,001 à 10 % poids/volume et de préférence de 0, 01 à 1 % poids/volume, la quantité dépendant du surfactif spécifique utilisé. Cette quantité est généralement limitée à une valeur aussi faible que possible étant donné qu'au dessus d'un certain niveau, aucune augmentation supplé- mentaire de l'absorption ne peut être obtenue et des quantités trop élevées de surfactifs peuvent engendrer une irritation de la muqueuse nasale. Des exemples de milieux aqueux utilisés se- lon la présente invention comprennent l'eau, une solu- tion saline physiologique, un tampon et analogues. Des exemples de milieux non aqueux comprennent: des esters alkyliques supérieurs t e 1 que l'oléate d'éthyle; des alcools tels que l'éthanol, l'alcool benzylique, le propylène glycol, le polyethylene glycol, le glycé- rol et analogues; des huiles végétales telles que l'huile d'olive, l'huile de sésame, l'huile de soja, l'huile de camélia, l'huile de mals, l'huile de colza, l'huile d'arachide et analogues; des huiles minérales telles que la paraffine, la lanoline, la vaseline et analogues; la diméthylformamide (DMF), le diméthylsul- foxyde (DMSO) et analogues. De tels milieux aqueux et non aqueux peuvent être utilisés seuls ou en mélange sous la forme d'une solution, d'une suspension, d'une émulsion ou d'une pommade, si elle est applicable sur la muqueuse nasale. Les préparations de la présente invention peuvent également contenir d'autres additifs, tels que des stabilisants, des agents destinés à empêcher l'ad- sorption et des conservateurs. Des exemples de tels stabilisants et agents destinés a empêcher l'adsorp- tion comprennent: des protéines telles que des albu- mines, des gélatines et analogues; des monosacchari- des tels que des tétroses (par exemple l'érythrose, le thréose et analogues), des pentoses (par exemple l'arabinose, le xylose, le ribose, le lyxose, le ri- bulose, le xylulose et analogues), des hexoses (par exemple le glucose, le galactose, le mannose, le ta- lose, le fructose, le sorbose, le tagatose, le psico- se et analogues), des peptanoses, des octanoses et analogues; des oligosaccharides tels que des disac- charides (par exemple le maltulose, le maltose, le cellobiose, le gentiobiose, le mélibiose, le lactose, le turanose, le sophorose, le tréhalose, l'isotréhalose, le saccharose, le lactulose et analogues), des trioses (par exemple le maltatriose, le cellotriose, le manni- notriose, le panose, le plantéose, le raffinose et ana- loges) et des tétraoses (par exemple le stachyose, le cellotétraose, le scodorose et analogues); des désoxy- saccharides tels que le désoxyribose, le rhamnose, le fucose, le quinovose, le tyvélose, le colitose et ana- logues; des sucres aminés tels que la glucosamine, la galactosamine, la mannosamine, la gulosamine, la kano- samine et analogues-; des acides uroniques tels que l'acide gluconique, l'acide galacturonique, l'acide mannuronique, les lactones de ces acides uroniques; des cyclitols tels que l'inositol, le quercitol, le bornésitol et analogues; des alcools glucidiques tels que le glycérol, l'érythritol, l'adonitol, le manni- tol, le sorbitol, le galactitol, le sédoheptitol, le perséitol et leurs dérivés tels que les anhydrides; des polysaccharides tels que le dextranne, la cellulo- se et analogues; des sels inorganiques tels que le chlorure de sodium, le phosphate de potassium et ana- logues; des sels organiques tels que des citrates, des acétates et analogues; des aminoacides tels que la glycine, l'alanine et analogues; des agents réduc- teurs contenant du soufre tels que la glutathione, le thiosulfate de sodium et analogues; et des polyéthy- lèneglycols et analogues. Des exemples de conservateurs comprennent l'acide benzoïque, le benzoate de sodium, les esters de l'acide paraoxybenzoïque, le chlorobutanol, le cré- sol, le phénol et analogues. Si on le désire, les préparations de la présente invention peuvent être formulées sous la for- me d'un gel en ajoutant des produits de base gélifiants tels que des dérivés de la cellulose, des gommes natu- _ _ _ -re!!es. des eyq dl'a- cide acrylique et analogues. Les préparations de la présente invention peuvent être administrées au niveau de la cavité nasa- le par des procédés variés. Lorsqu'elles sont peu vis- queuses, les préparations de la présente invention peuvent être administrées au niveau de la cavité nasa- le par instillation ou pulvérisation. Lorsqu'elles sont très visqueuses, elles peuvent être administrées directement à partir de tubes ou par l'intermédiaire d'un dispositif d'application qui peut être inséré à l'intérieur de la cavité nasale et qui contient une quantité donnée de la préparation. Exemple de référence 1: Préparation d'EPO urinaire humaine Etape (1): Purification partielle à partir d'urine humaine De l'urine provenant de patients atteints d'anémie aplasique a été soumise aux étapes de traite- ment décrites par T. Mlyake et al. (J. B. C., 252, 5558 (1971)); à savoir 1) une désionisation sur une colonne de Séphadex G50, 2) une adsorption sur diéthyl amino éthyle (DEAE)-cellulose par charges successives, 3) une précipitation avec l'éthanol et 4) une chromatographie sur une colonne de DEAE-agarose. Avec ces étapes de traitement, on obtient une forme partiellement purifiée d'EPO urinaire humaine. On a dissous l'EPO urinaire humaine partiel- lement purifiée dans une solution d'acide trifluoroacé- tique à 0,1 % (ATF) (Aldrich Chemical Co., Inc.) conte- nant 24 % de propanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) et la solution a été soumise à une purification par chromatographie liquide haute performance avec le modèle Hitachi 638-50. On a utilisé comme indicateur, l'absorption dans le domaine ultraviolet à 280 nm et à 220 nm. Etape (2): Chromatographie à phase inverse L'échantillon ainsi préparé a été chargé sur une colonne YMC-C8 (6 mm x 30 cm, un produit de Yamamura Chemical Co., Ltd.) équilibrée avec une solution de ATF à 0,l % contenant 24 % de n-propanol et on a élué la colonne avec la même solution d'équilibrage. Apres que les fractions non adsorbées ont été éluées, la concen- tration du n-propanol a été élevée jusqu'à 26 % pour éluer les fractions actives. Les fractions contenant l'EPO active ont été recueillies et concentrées jus- qu'à un volume de 0,1-0,2 ml par ultrafiltration avec l'appareil Centricon-100 (marque de Amicon). Etape (3): Chromatographie haute performance sur tamis moléculaire L'échantillon concentré a été chargé sur une colonne TSK-G3000SW (7,8 mm x 60 cm, un produit de Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.) équilibrée avec une solu- tion de ATF à 0,1 % contenant 26 % de n-propanol et la colonne a été éluée avec la même solution d'équilibrage. Les pics dus à l'EPO active ont été obtenus à des posi- tions correspondant aux poids moléculaires de 25000- 30000. Ces fractions actives ont été recueillies et lyo- philisées. Les fractions ont une activité spécifique d'environ 9.10. unités/mg (U/mg). Les activités spécifiques des échantillons préparés dans les étapes respectives (1) à (3) sont mentionnées au Tableau 1. TABLEAU 1 Etape Activité spécifique (U/mg)) ) (1) purification partielle 600) ((2) chromatographie à phase) inverse 10000 ) ((3) chromatographie haute) () ( performance) (sur tamis moléculaire 90000) () 258.72 16 Procède de détermination: selon le procédé de N.N. Iscove et al., J. Cell. Physiol., 83, 309 (1974) Exeple de référence 2: Préparation d'EPO humaine à partir de cellules OHC Un plasmide comportant le gène codant pour la séquence d'aminoacides de l'EPO humaine a été ex- primé dans des cellules OHC pour produire de l'EPO hu- maine. Les étapes de traitement mises en oeuvre sont précisément décrites dans la demande de brevet japo- nais N 281862/1984 (déposée le 27 décembre 1984), intitulée "Vector harboringaccessory DNA for the trans- formation of eucaryotic cells". Un résumé de ces éta- pes de traitement est donné ci-dessous. L'ADN d'un clone lambda HEPOFL 13 compor- tant le gène codant pour la séquence d'aminoacides de l'EPO humaine et provenant de cellules de foie de foe- tus humain, a été digéré avec l'enzyme EcoRI et les petits fragments recueillis, issus de coupure avec EcoRI et comportant le gène codant pour la séquence d'aminoacides de l'EPO humaine, ont été insérés au ni- veau du site EcoRI du plasmide RKI-4. On a alors in- corporé le plasmide dans des cellules OHC déficientes en gène DHFR de façon à les transformer. Les cellules transformées ont été cultivés dans un milieu alpha déficient en acides nucléides. Les cellules compor- tant au moins un gène DHFR ont été sélectionnés et utilisées pour la production d'EPO humaine, la concen- tration de méthotréxate dans le milieu étant augmentée par incrément. L'EPO humaine présente dans le surna- geant de la culture finalement obtenue, avait une ac- tivité de 20 unités/ml. La solution de culture résul- tante contenant l'EPO humaine a été dyalisée contre une solution saline physiologique contenant 0,1 % d'albumine de sérum bovin (ASB) et soumise aux expé- riences suivantes. Les EPO humaines préparées suivant les exem- ples 1 et 2 ont été administrées par voie intranasale pendant une semaine à raison de plusieurs doses par jour à des rats atteints de néphrite de Shibata et à des souris porteuses du carcinome de Lewis du poumon. Les populations d'érythrocytes augmentaient et reve- naient à des niveaux normaux. Aucune toxicité signifi- cative n'est apparue chez les animaux sur l'ensemble de la période d'administration d'EPO humaine. L'invention sera mieux comprise à la lec- ture des exemples illustratifs suivants qui ne sont bien entendu pas limitatifs et dans lesquels les va- leurs numériques sont des pourcentages en poids par volume. Exemple 1 % p/v EPO humaine 0,001 Monostéarate de glycéryl 0,5 Dextranne 1 Eau purifiée q. s. p. 100 Exemple 2 % p/v EPO humaine 0,001 Cholate de sodium 0,5 Méthylcellulose 1 Eau purifiée q. s. p. 100 Exemple 3 % p/v EPO humaine 0,001 Polyoxyéthylène lauryl éther 0,5 Polyéthylène glycol 1 Eau purirfiée q. s.p. 100 Exemple 4 % p/v EPO humaine 0,001 Chlorure de benzalkonium 0,5 Polyethylène glycol 0,5 Eau purifiée q. s. p. 100 Exemple 5 % p/v EPO humaine 0,001 Phosphatidylcholidine 0,2 Eau purifiée q. s. p. 100 ExemDle 6 % p/v EPO humaine 0,001 Laurylsulfate de sodium 0,5 Paraoxybenzoate de méthyle 0,12 Paraoxybenzoate de propyle 0, 01 Méthyl cellulose 1 Eau purifiée q. s. p. 100 Exemple 7 p /v EPO humaine 0,01 Phosphatidylcholine 0,2 Acetate de sodium, trihydrate 1,36 Acide acétique 0,6 Chlorobutanol 0,1 Eau purifiée q. s. p. 100 Exemple 8 EPO humaine 0,01 Monooléate de sorbitanne 0,02 Propylène glycol q. s. p. 100 REVENDICATIONS 1. Composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie nasale, caractérisée en ce qu'elle contient de l'érythropolétine humaine comme ingrédient actif pour le traitement de l'anémie. 2. Composition pharmaceutique destiné à être administrée par voie nasale, caractérisée en ce qu'elle comprend un milieu aqueux et/ou non aqueux, contenant de l'érythropolétine humaine et un agent tensio-actif pour le traitement de l'anémie. 3. Composition pharmaceutique destinée à être administrée par voie nasale, caractérisée en ce qu'elle comprend un milieu aqueux et/ou non aqueux et un produit de base gélifiant, contenant de l'érythropo!étine humai- ne et un agent tensio-actif pour le traitement de l'ané- mie.