FR 2596774 A1 19871009 FR 8604914 A 19860404 SONDES OLIGONUCLEOTIDIQUES ET PROCEDES POUR LA DETECTION PAR HYBRIDATION DES ACIDES NUCLEIQUES DE BACTERIES ET AUTRES ETRES VIVANTS Les médecins, vétérinaires, phytopathologistes, et d'une manière générale les biologistes doivent souvent déterminer si un prélèvement (humain, animal, végétal, aliment ou autre) contient des bactéries ou éventuellement d'autres organismes. Actuellement, les seuls moyens utilisables pour détecter la présence de microorganismes vi10 vants sont la microscopie (optique ou électronique), la culture, la détection immunologique et la détection par sondes nucléiques spécifiques. La détection immunologique et la détection par sondes nucléiques spécifiques ne s'appliquent actuellement qu'à des organismes particuliers, par exemple Legionella pneumophila ou Salmonella. Un réactif permettant de détecter un ou plusieurs organismes est en général incapable de détecter les autres espèces ou genres (ce principe de spécificité est la raison d'être de ces 20 réactifs). L'examen microscopique est nécessairement limité à une petite partie de l'échantillon et les débris cellulaires ou autres particules peuvent rendre impossible la visualisation d'un organisme vivant identifiable comme 25 tel. La culture n'est possible que pour un certain nombre d'organismes (surtout bactériens) et sur certains milieux et dans des conditions propres à ces organismes (bactéries aérobies ou anaérobies, exigentes en tel ou tel facteur de croissance, etc.). Aucun milieu de culture ne peut à lui seul permettre la croissance de toutes les bactéries cultivables. Des bactéries peuvent être aujourd'hui inconnues et non détectables, parce qu'on ne sait pas comment les cultiver. Des exemples abondent o la présence de bactéries n'a pu être prouvée qu'après une ou plusieurs années de recherche: dans la maladie des légionnaires (épidémie de Philadelphie), les bactéries responsables que les prélèvements humains se sont révélés contenir par la suite n'étaient pas visibles après coloration usuelle au microscope et ne pouvaient pas être cultivées sur les milieux bactériologiques connus jusqu'alors. De même, des bactéries infectant le xylème 10 des plantes ont longtemps été ignorées. Elles devaient être découvertes à l'occasion d'observations délicates sous le microscope. Comme dans le cas précédent, ces bactéries n'étaient pas cultivables sur les milieux connus à l'époque. Il résulte des exemples qui précèdent que l'absence de détection d'une contamination bactérienne dans un milieu à l'étude par les moyens classiquement utilisés ne peut nécessairement conduire à la conclusion que ce milieu est dépourvu de toute contamination bactérienne. L'invention a pour but de remédier aux insuffi- sances des techniques classiques termes de fournir un procédé qui mer le caractère stérile d'un d'un prélèvement humain, soit 25 d'une contamination par exemplE de fiabilité inconnue à ce jour. On appréciera aisément tel procédé peut rendre dès déceler une contamination d'ur 30 ou autres cellules, avec mêmE de détection, en d'autres permette, soit de confirmilieu étudié, par exemple t en révélant l'existence bactérienne avec un degré les grands services qu'un lors qu'il permettrait de prélèvement par bactéries une possibilité de dénom- brement. Une telle détection ne pourrait, par exemple, que stimuler efficacement la recherche d'une bactérie dans des cas d'infections (humaine, animale, végétale) d'étiologie inconnue. L'invention découle de l'intérêt qu'ont porté les inventeurs à l'étude des ARNs ribosomaux. Parmi l'ensemble des constituants macromoléculaires des êtres vivants, les acides ribonucléiques (ARN) ribosomaux apparaissent a priori comme de fiables témoins d'une contamination 5 biologique (présence d'êtres vivants). Ceux-ci forment une part substantielle du matériel cellulaire. Ils sont nécessaires au fonctionnement de toutes les cellules vivantes connues. L'ARN de la petite sous-unité ribosomique (dit ARN 10 16S en référence à sa constante de sédimentation en ultracentrifugation avec gradient de saccharose) est maintenant connue à l'échelle nucléotidique pour une vingtaine d'organismes (des exemples de séquences nucléotidiques complètes sont donnés par Weisburg et coll. 1985, J. 15 Bacteriol. vol. 164, n' 1, p. 230-236; Frydenberg et Christiansen, 1985, DNA vol. 4, n' 2, p. 127-137). Les nucléotides sont conventionnellement numérotés de l'extrémité 5' de la molécule d'ARN 16S à l'extrémité 3'. L'ARN 165 de la bactérie Escherichia coli comprend 1542 20 nucléotides. Les molécules correspondantes chez les autres organismes vivants peuvent différer de celle d'E. coli dans leur nombre total de nucléotides et dans leur séquence nucléotidique. C'est de la comparaison des séquences nucléo25 tidiques des ARNs ribosomaux connus et la découverte de parties qui leur sont communes avec un degré d'identité, en tous les cas d'extrême similitude allant au-delà des niveaux de conservation de séquences auxquels ont pouvait s'attendre, qui ont conduit à l'invention. Il a ainsi été 30 constaté que les variations entre les différents organismes ne sont pas réparties tout le long des séquences d'ARN 16S, mais se concentrent en certains endroits (surtout dans les hélices de la structure), tandis que certaines régions (les boucles en particulier) apparais35 sent beaucoup plus conservées. D'autre part, ces variations s'accordent de manière cohérente avec les grandes divisions taxonomiques. On peut ainsi définir dans les séquences d' ARN 165 des motifs universels, des motifs spécifiquement eucaryotes, bactériens (procaryotes), et des motifs propres à des groupes bactériens plus restreints. Les ARNs 165 se sont ainsi révélés présenter une région universelle (c'est-à-dire commune aux Eucaryotes et aux Procaryotes) s'étendant du nucléotide 1492 au 10 nucléotide 1506 (suivant la numérotation en vigueur pour la séquence de l'ARN 165 de E. coli) et une région spécifique des bactéries (eubactéries, archébactéries méthanogènes et halophiles) s'étendant du nucléotide 1527 au nucléotide 1541. On peut à cet égard se reporter au tableau sur la page suivante, dans lequel A, T, C, G désignent les 4 nucléotides de base entrant dans la constitution des ADNs; il est entendu que le nucléotide désigné par un nombre de numérotation donné correspond à celui qui est placé sous le premier choffre du nombre. Par 20 exemple, le nombre 1490 correspond à l'uracyle (U) dans la séquence nucléotidique correspondant à l'ARN. Les ARNs de transfert d'un grand nombre de bactéries se sont également révélés comporter des séquences communes, notamment la suivante: UCAUAACCCGAAGGUC. Cette séquence parait cependant moins universelle que la région spécifique des bactéries mentionnées plus haut, qui s'étend du nucléotide 1527 au. nucléotide 1541. Les archébactéries se sont également révélées 30 posséder une séquence commune à l'ensemble de ce genre bactérien, séquence qui présente la structure suivante: UUCGACGAGRUGGGGCGC dans laquelle R est A ou G. L'invention découle donc des constatations qui 35 précèdent, et elle fournit des séquences nucléotidiques spécifiques complémentaires des précédentes, lesquelles constituent autant de sondes, applicables, pour certaines d'entres elles, de façon universelle à la détection d'une contamination cellulaire dans tout milieu, pour d'autres, au classement des cellules éventuellement détectées parmi les catégories suivantes: Sonde universelle Sonde eubactérienne EUBACTERIES E coli iB fragilts B suLbtills mycoplasme An nidulans CHLOROPLASTES ma is tabac.- ARCHAEBACTERIES M vaniellii H volcanii S acidocaldarius EUCARYOTES D discoideum S cerevisiae vertabrâs MITOCHONDRIES As nidutlans homme dTTICAGCAI'Tfg3T CCA 5' d-GACCTAGTGGAGGAA 5' 14' t')(, ' I 3( I1 4 1500 1510 1 I2 j 1535 ' j 1542 G[JGAAGUCGlJAAAtIJCAGG (ACGUAI(3GGAACC JGCGGUG([3AUCACCLJCCUIJA 3'... GCUAA[3LJCG( JAACAAGGUAGCCGUAL L[:GAAGt; UGCGGCUGGAACACCUCCUUUCU. ' ' GUGAAGLJCGLJACAA lAtiCCGLJALll. Gt'iAAGl3UGCt3GCUtiGAUCACCUCCUUUCUA.. G UGAAGUCGLI!,IAAG(3tIlA[j(, CGUACUGUÀÀACAGJ(3CjGAUGGAUCACCIJCCUUU À.. GUGAAIifIJCGIJ3ACJAtGGA. JÀGC[:GLIACC(3GAAIGGUJGlJGGCUGGAUJCACCUCCUUU *.* GusGÀA6(JCi(IA(%AGAAOGLGCCGUACLI6GAAG631J6CGGJUGGÀAUCACCUCUI... GU[GAA(UCGlJUMhCChAGGUACGLJACLJGGAAGGUGCGGCUGGAUCACCUCCU À..GUGAAGUCGUAACAAGGiJAGCCGlJAGGGGAACCIJGCGGCUGGAUCACCUCC... CUUAAGUCGUAACAA(GGUAGCCGUAGGGA ALICUCGCGGCUGGALCACCUCCUU... GAÀAA. IJCGlJ1ACArP1rritIAGCC(3UAGGGAACCIIGCGGCIJGGAIJCACCUCALJAUAIJUU.. 1I 1. GAGAAGUCGLJAACMqIUJAUCCGLJAGG(3UGAACCUGCGGAUGGAUCAUUUU... LIAAAAGlCGIîIAACAAt3).GlIJCCG JAGGI31 IGAACCLJGCGr3AAGGAtJCAUJIJA... UAAAAGUCGIJA CAAGGIJLJUCrCuLIAG(l3IJGAACflJGCGGAAfAGAIJCAUi IA GIJUAGIJCGAAAIJALIGGULICGIJGI IAALJGGAAAUUGCACGGGAUGAAUUA.. GtiJAAGIJGIJACIJI)GAAAGLJljCACIJIJGGACGAAC.. ARNs >ARNs ul -'I - en bactéries, y inclues certaines archaebactéries, plus particulièrement les archaebactéries méthanogènes et halophiles archaebactéries et dans toutes autres catégories d'organismes, dans le cas de réponse positive dans des essais d'hybridation avec la "sonde universelle" et de réponse négative avec les sondes autorisant le classement des micro-organismes détectés dans les catégories précédemment désignées. Les séquences du genre en question sont aisément accessibles par synthèse nucléotidique. L'invention concerne donc plus particulièrement un pentadécadésoxyribonucléotide (séquence d'acide désoxyribonucléique de 15 nucléotides ou en abrégé, 15-mère) complémentaire de la 15 région 14921506 des ARNs 165, ce 15-mère étant capable de s'hybrider avec le fragment homologue contenu dans l'ARN 16S de tous les êtres vivants ainsi qu'avec la partie de l'acide désoxyribonucléique (ADN) qui code pour cette partie d'ARN et qui est contenue dans le génome de tous 20 les êtres vivants. Elle concerne aussi - les sondes que constituent les oligonucléotides complémentaires de la séquence UCAUAACCCGAAGGUC déjà nommée pour la détection de micro-ozganismes susceptibles d'être classés parmi les bactéries et 25 - les sondes complémentaires de la séquence UUCGACGAGRUGGGGCGC susmentionnée, ces sondes étant ellesmêmes caractéristiques des archaebactéries. L'invention concerne enfin une séquence d'ADN de 30 15 nucléotides (15mère) complémentaire de la région 1527-1541 des ARNs 16S, ce 15-mère étant capable de s'hybrider avec le fragment homologue contenu dans 1' ARN 16S des bactéries et autres procaryotes ainsi qu'avec les gènes correspondants dans l'ADN de ces organismes, mais 35 pas ou très peu avec l'ARN correspondant des cellules eucaryotes (levures, champignons, protozoaires, tissus humains, animaux et végétaux) ou les gènes correspondants dans l'ADN de ces organismes. L'invention concerne par conséquent plus particu5 lièrement les compositions suivantes: 1V/ Sonde ci-après dite "Sonde universelle": La sonde réalisée par synthèse oligonucléotidique a la séquence suivante: (5')d - ACC TTG TTA CGA CTT (3') o (5') et (3') indiquent les extrémités 5' et 3' du polymère (et donc sa polarité) et o les lettres indiquent les---. désoxynucléotides suivants: A, résidu adénylique; C, résidu cytidylique; T, résidu thymidylique; et G, résidu guanidylique; les espaces ne servant qu'à la lisibilité 15 de la séquence qui contient 15 nucléotides. Cette sonde est parfaitement complémentaire de la portion 1492-1506 (selon la numérotation en vigueur pour Escherichia coli) de l'ARN 16S de ce micro-organisme et de portions correspondantes des ARNs publiés de toutes autres 20 bactéries, cellules procaryotes et eucaryotes, et, bien qu'à un degré moindre avec des ARNs de mitochondries. Le spécialiste en déduit la probabilité quasi-absolue que cette sonde doit s'apparier aussi à des ARNs de toutes cellules existant dans la nature. Cette sonde est aussi 25 capable de s'apparier avec la portion homologue de l'ADN des gènes qui codent pour ces ARNs 16S et ARNs eucaryotiques correspondants. L'invention concerne naturellement aussi la sonde complémentaire à ia "sonde universelle" susdite et ayant 30 la séquence nucléotidique suivante: (5')d - AAG TCG TAA CAA GGT (3') capable de s'apparier avec la même portion d'ADN génomique (gènes codant pour les ARNs 16S et ARN correspondants), en raison de sa nature bicaténaire, même si elle n'est plus 35 capable de s'apparier avec l'ARN 16S (qui ne comporte qu'une seule chaine). 2'/ Sonde ci-après dite "Composition spécifique des eubactéries et de certaines archaebactéries" ou "sonde eubactérienne' La sonde préférée réalisée par synthèse oligonucléotidique a la séquence suivante: (5')d AAG GAG GTG ATC CAG (3') o (5'), (3'), A, C, T et G ont les significations susindiquées. Cette séquence correspond au complément du consensus de la portion 15271541 (selon la numérotation en vigueur pour Escherichia Coli) des ARNs 16S des bactéries et plus précisément, des eubactéries. Cette séquence n'est pas parfaitement complémentaire de toutes les séquences d'ARN 165 publiées à ce jour pour les bactéries, mais elle n'en diffère au plus que par un ou deux nucléotides. Par contre, la séquence de cette composition ne peut s'apparier que faiblement à la région homologue des ARNs 18S des eucaryotes et 12S des mitochondries (ces ARNs corres20 pondent aux ARNs 16S des bactéries). 20 L'invention concerne naturellement aussi toute sonde susceptible de s'apparier avec les mêmes régions des ARNs et/ou ADN génomique, en particulier une séquence décalée d'un nucléotide vis-à-vis de la "sonde eubacté25 rienne" sus-indiquée, en ce qu'elle s'apparie avec la séquence UGGAUCACCUCCUUA (la sonde étant alors constituée par la séquence: (3') ACCTAGTGGAGGAAA (5') ou (si on inverse le sens de lecture) (5')d - AAAGGAGGTGATCCA (3') que l'on retrouve dans la plupart des bactéries. Elle concerne naturellement également toute sonde d'oligonucléotides plus petite, dont la séquence est néanmoins contenue dans la susdite "sonde spécifique des 35 eubactéries" (ou dans la sonde contenant la "séquence décalée"). Cette sonde contient néanmoins au moins la séquence TGGAGGAA (5') (complémentaire de la région de l'ARN 16S s'étendant entre les nucléotides 1534 et 1541), notamment (5')d - AAGGAGGT (3') (5')d AAAGGAGGT (3') (5')d - AAGGAGGTG (3') (5')d - AAGGAGGTGA (3') (5')d AAGGAGGTGAT (3') (5')d - AAGGAGGTGATC (3') 10 (5')d - AAGGAGGTGATC (3') (5')d - AAGGAGGTGATCC (3') (51)d - AAGGAGGTGATCCA (3'). Les séquences complémentaires des précédentes font également partie du groupe de sondes conformes à l'inven15 tion. Il convient néanmoins de souligner le fait que les sondes les plus longues sont préférées en raison de leur plus grande stabilité d'appariement. Par ailleurs, la substitution d'un nucléotide par un autre au sein d'une même 20 séquence les rendrait peut-être plus affines pour les ARNs 16S d'un groupe bactérien déterminé, mais affaiblirait leur complémentarité vis-à-vis de la majorité des autres. D'autre part, l'allongement s'effectuant en 3' par tout ou partie du motif CCGCA ne ferait pas gagner de spécificité, 25 le complément de son motif se trouvant représenté dans l'ARN 18S des vertébrés. 3'/ Sonde spécifique des archaebactéries L'invention concerne enfin plus particulièrement une sonde spécifique des archaebactéries, cette sonde présentant une séquence d'au moins 8 nucléotides contenus 30 dans la séquence suivante: AAGCTGCTCR'ACCCCGCG et au plus les 18 nucléotides de la séquence, dans laquelle R' est T ou C. CONDITIONS GENERALES D'UTILISATION DES SONDES Les sondes universelles et les sondes plus spécifiques des eubactéries, d'une part, et des archaebactéries, d'autre part (et les compositions complémentaires) sont avantageusement marquées. Tout marqueur classiquement envisagé peut être utilisé. Les compositions peuvent être marquées à l'aide de traceurs radio-actifs comme 32p, 35S, 125i, 3H, 14C pour ne citer que les traceurs les plus communément utilisés. Le marquage radioactif peut être réali10 se selon une méthode quelconque comme par exemple le marquage terminal en 3' ou 5' en utilisant un nucléotide radiomarqué, la polynucléotide kinase (avec ou sans déphosphorylation par une phosphatase) ou une ligase (selon l'extrémité à marquer). Dans ces cas, la composition mar15 quee aurait 16 nucléotides (le nucléotide radioactif ajouté en 3' ou 5' étant quelconque. Une des sondes de l'invention (y compris une composition complémentaire) peut servir de matrice pour la synthèse d'une courte chaîne (d'environ 15 nucléotides) constituée de nucléotides ra20 dioactifs ou d'un ensemble de nucléotides radioactifs et non-radioactifs. Les sondes de l'invention peuvent aussi être réalisées par une synthèse chimique utilisant un ou plusieurs nucléotides radioactifs. Une autre méthode de marquage radioactif est l'iodation chimique des sondes de 25 l'invention aboutissant à la fixation sur les oligo-mères de plusieurs atomes de 125I. Si l'une des sondes de l'invention (ou d'une sonde complémentaire) est rendue radioactive pour être utilisée en hybridation avec un ARN ou un ADN non radioactifs, la méthode de détection de l'hybrida30 tion dépendra du traceur radioactif utilisé et pourra 30 s'appuyer sur l'autoradiographie, la scintillation liquide, le comptage gamma ou toute autre technique permettant de détecter l'émission du rayonnement ionisant émis par le traceur radioactif. Un marquage non radioactif peut être aussi utilisé, associant aux sondes de l'invention des résidus ayant des propriétés immunologiques (antigènes, haptènes), une affinité spécifique pour certains réactifs (ligands), des propriétés permettant la complétion de réactions enzymatiques détectables (enzymes ou coenzymes, substrat d'enzyme, ou autre substance intervenant dans une réaction enzymatique), des propriétés physiques propres comme la fluorescence ou l'émission ou l'absorption de lumière à une longueur d'onde quelconque, pour ne citer que des 10 exemples. Des anticorps reconnaissant spécifiquement les hybrides ADN-ARN peuvent aussi être utilisés. Le marquage chimique qui vient d'être évoqué peut être réalisé lors de la synthèse chimique des sondes de l'invention, les résidus adénosine, guanosine, cytidine et thymidine pouvant être couplés à d'autres résidus chimiques permettant la détection de la composition ou les hybrides formés entre la composition et un fragment d'ADN ou d'ARN complémentaire. Cependant, la séquence de la composition utilisant des nucléotides modifiés par cou20 plage à d'autres résidus chimiques serait la même que la séquence nucléotidique d'une des sondes de l'invention. L'invention concerne aussi les procédés de détection par hybridation euxmêmes mettant en oeuvre des sondes conformes à l'invention, celles-ci ayant au préalable 25 été marquées ou rendues aptes à être détectées comme il a été dit plus haut. Le choix de l'une ou de l'autre des sondes de l'invention dépendra du but recherché: détection de cellules procaryotes et eucaryotes (composition universelle), 30 détection ou localisation d'ADN ou de fragments d'ADN portant des gènes codant pour les ARN de la série 16S et provenant indifféremment de cellules procaryotes ou eucaryotes (composition universelle ou sonde qui lui est complémentaire), détection exclusive de cellules bactériennes 3 (sonde spécifique des eubactéries), détection ou localisation d'ADN ou de fragments d'ADN portant les gènes codant pour les ARN 16S bactériens (sonde spécifique des eubactéries ou sonde qui lui est complémentaire). L'utilisation d'une ou plusieurs sondes de l'in5 vention ne peut être limitée à une technique particulière d'hybridation. S'il s'agit de détecter des cellules provenant de (ou étant elles-mêmes des) organismes vivants, les ARN et/ou l'ADN de ces cellules doivent être rendus accessi10 bles (par lyse partielle ou totale des cellules en utilisant des procédés chimiques ou physiques) et mis en contact avec une ou plusieurs des sondes de l'invention, elle(s)-même(s) rendue(s) détectable(s). Ce contact peut se faire sur un support approprié tel que filtre de nitro15 cellulose, de cellulose (modifiée ou non), de nylon (pour ne citer que les supports usuels) ou sur coupe histologique ou frottis de cellules ou, sans support, en milieu liquide. Ce contact a lieu dans des conditions optimales ou restrictives (c'est-à-dire ne permettant la formation 20 d'hybrides que si les séquences sont parfaitement homologues sur une longueur de molécule d'autant plus importante que les conditions sont plus "restrictives") de température, de concentration ionique, avec ou sans substances abaissant la température optimale d'appariement des 25 acides nucléiques (formamide, diméthylsulfoxyde, urée), avec ou sans substances diminuant apparemment le volume réactionnel (dextran, sulfate de dextran). L'élimination des molécules ou fragments de molécules de la sonde n'ayant pas réagi sur un support peut 30 être réalisée par lavage avec une solution tampon de force ionique appropriée et à une température appropriée, avec ou sans traitement par la nucléase Sl ou autre enryme digérant l'ADN ou l'ARN monocaténaires, mais ne digérant pas les hybrides ADN-ARN ou l'ADN bicaténaire. En milieu li35 quide, les molécules (ou fragments) de la sonde s'étant appariés avec des fragments d'ARN ou d'ADN peuvent être séparés de ceux qui n'ont pas réagit par chromatographie sur hydroxyapatite ou, après traitement à la nucléase Sl, par toutes méthodes séparant les fragments bicaténaires des nucléotides libres (chromatographie sur hydroxyapatite, sur DEAE-cellulose, ou d'exclusion; précipitation sélective; dialyse; pour ne citer que les moyens les plus usuels). Ensuite, les molécules (ou fragments) de la compo10 sition utilisée sont détectées par la méthode la plus avantageuse dépendant du type de marquage choisi._Les détails techniques décrits dans diverses publications (Maniatis et al. 1982, "Molecular cloning, A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory; Grimont et al. 1985, J. Clin. Microbiol. vol. 21, n' 3, pp. 431-437) ou brevets (francais: 84 12250, 78 10975, 81 24631; européens: 0133288, 0063879) pourront avantageusement être appliqués avec les compositions de l'invention. S'il s'agit de localiser les fragments d'ADN chromosomiques portant les gènes codant pour les ARN 16S (ou ARN correspondants) après traitement de l'ADN par une ou plusieurs enzymes de restriction, séparation des fragments par électrophorèse ou chromatographie, et dénaturation des 25 fragments d'ADN (c'est-à-dire séparation des deux chaines), une des sondes de l'invention est mise en contact avec les fragments d'ADN dans des conditions favorisant l'hybridation et, après le temps nécessaire à la complétion de l'hybridation, les fragments non hybridés de la 30 composition seront séparés des fragments hybridés et le marquage révélé comme il a été dit pour la détection des cellules. Les détails techniques décrits- dans le brevet européen 0120658 (John A. Webster Jr) ou dans l'ouvrage de Maniatis et al. ou dans l'article de Grimont et al. (cités 35 plus haut) peuvent être appliqués avec l'une ou l'autre des sondes de l'invention. Notons que, pour la localisation des fragments d'ADN chromosomiques portant les gènes codant pour les ARN 16S, une des sondes de l'invention et une sonde qui lui serait exactement complémentaire donnerait exactement les mêmes résultats. D'une façon générale, les différentes sondes de l'invention peuvent également être contenues dans des ADNs recombinants permettant leur clonage, dès lors que la pré10 sence d'un ADN hétérologue ne nuirait pas à la spécificité des sondes dans les applications envisagées. Enfin, il est entendu que font également partie de l'invention les sondes dans lesquelles les groupes thymidine sont remplacés par des groupes uracyle (ces sondes devant donc être considérées comme strictement équivalentes aux sondes plus particulièrement revendiquées) même si leur synthèse est plus difficile à effectuer. REVENDICATIONS 1. Sonde pour détecter la présence de bactéries dans un échantillon ou pour localiser parmi des fragments d'ADN séparés par électrophorèse ou chromatographie ceux 5 qui portent les gènes codant pour les ARNs 16S des bactéziies, caracterisée en ce qu'elle est constituée, soit d'un pentadécadésoxyribonucléotide de séquence (5')d - AAG GAG GTG ATC CAG (3') o (5') et (3') indiquent les extrémités 5' et 3' du poly10 mère et o les lettres indiquent les résidus (nucléotides) suivants: A, résidu adénylique; C, résidu cytidylique; T, résidu thymidylique; et G, résidu guanidylique; soit d'un pentadécadesoxyribonucléotide présentant la séquence complémentaire (5')d - CTG GAT CAC CTC CTT (3'). 2. Sondc pour détecter la présence de bactéries dans un échantillon ou pour localiser parmi des fragments d'ADN séparés par électrophorèse ou chromatographie ceux qui portent les gènes codant pour les ARNs 16S des bacté20 ries, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une sequence (3') ACCTAGTGGAGGAAA (5') ou par la séquence complémentaire correspondante. 3. Sonde pour détecter la présence de bactéries 25 dans un échantillon ou pour localiser parmi des fragments d'ADN séparés par électrophorèse ou chromatographie ceux qui portent les gènes codant pour les ARNs 16S des bactéries, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence sélectionnée dans le groupe des séquences 30 suivantes (5')d - AAGGAGGT (3'.) (5')d - AAAGGAGGT (3') (5')d - AAGGAGGTG (3') (5')d - AAGGAGGTGA (3') (5')d - AAGGAGGTGAT (3') (5')d - AAGGAGGTGATC (3') (5')d AAGGAGGTGATCC (3') (5')d - AAGGAGGTGATCCA (3') ou parmi les séquences complémentaires correspondantes. 4. Sonde pour détecter les cellules d'organismes eucaryotes ou procaryotes (y compris les bactéries) dans un échantillon ou pour localiser parmi des fragments d'ADN separés par electrophorèse ou chromatographie ceux qui portent les genes codant pour les ARNs de la série 16S de 10 ces cellules, caractérisée en ce qu'elle est constituée, soit d'un pentadecadésoxyrlbonucléotide de séquence (5')d - ACC TTG TTA CGA CTT (3') o (5') et (3') indiquent les extrémités 5' et 3' du polymère et o les lettres indiquent les résidus (nucléotides) 15 suivants: A, résidu adénylique; C, résidu cytidylique; T, résidu thymldylique; et G, résidu guanidylique, soit d'un pentadécadesoxyribonucléotide présentant la séquence complémentaire (5')d - AAG TCG TAA CAA GGT (3'). 5. Sonde pour détecter la présence d'archaebactéries dans un échantillon ou pour localiser parmi des fragments d'ADN séparés par électrophorèse ou chromatographie ceux qui portent les gènes codant pour les ARNs 16S des archaebactéries, caractérisée en ce qu'elle est 25 constituée par une séquence d'au moins 8 nucléotides contenus dans la séquence suivante AAGCTGCTCR'ACCCCGCG et au plus les 18 nucléotides de la séquence, dans laquelle R' est T ou C ou par une séquence complémentaire de 30 la précédente. 6. Sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la sonde oligonucléotidique ayant l'une des susdites séquences est marquée radioactivement, (notamment par un ou deux nucléotides radioactifs 35 de nature quelconque à l'une ou l'autre des extrémités ou aux deux) ou par des marqueurs, notamment enzymatiques, ligands, luminescents ou fluorescents. 7. Procédé pour détecter les bactéries dans un échantillon, caractérisé en ce que, après avoir rendu les 5 acides nucléiques de ces bactéries accessibles et monocaténaires, on les met en contact avec une sonde selon l'une quelconque des revendications 1, 2 et 3 dans des conditions favorables à l'hybridation et on détecte les hybrides éventuellement formés. 8. Procédé pour détecter les cellules d'organismes eucaryotes ou procaryotes (y compris les bactéries) dans un échantillon, caractérisé en ce que, après avoir rendu les acides nucléiques de ces cellules accessibles et monocaténaires, on les met en contact avec une sonde selon la 15 revendication 4 dans des conditions favorables à l'hybridation et on détecte les hybrides éventuellement formes. 9. Procédé pour détecter les archaebactéries dans un échantillon caractérisé en ce que, après avoir rendu les acides nucléiques de ces archaebactéries accessibles 20 et monocatenaires, on les met en contact avec une sonde selon la revendication 5, dans des conditions favorables à l'hybridation et on détecte les hybrides éventuellement formés. 10. Procédé pour localiser parmi des fragments 25 d'ADN séparés par électrophorèse ou chromatographie ceux qui portent des gènes codant pour les ARNs de la série 16S, caractérisé par la mise en contact de ces fragments d'ADN séparés et dénaturés avec une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans des con30 ditions autorisant une hybridation éventuelle et par la détection des hybrides éventuellement formés.