FR 2597484 A1 19871023 FR 8605546 A 19860417 GLYCOSAMINOGLYCANES DE TYPE HEPARINE OU HEPARANESULFATE DOTES D'UNE ACTIVITE SUR LA DIVISION ET LA DIFFERENTIATION CELLULAIRES, LEUR PREPARATION ET LEURS APPLICATIONS THERAPEUTIQUES. L'invention a pour objet des glycosaminoglycanes de type héparinique, héparine ou héparanesulfate, ainsi que leurs fragments, dotés d'une acti10 vité sur la division et la différentiation cellulaires, leur préparation et leurs applications thérapeutiques. On sait que l'héparine, comme l'héparanesulfate, sont des glycosaminoglycanes hautement hétérogènes. Ils sont ainsi constitués de chaines formées d'une alternance de motifs D-glucosamine-acide uronique (acide L-iduronique ou acide D-glucuronique), ou l'inverse, cette structure de base pouvant être irrégulière. De plus le poids moléculaire de ces chaines peut différer considérablement allant d'environ 2.000 à 20 50.000. En outre, la charge ionique varie, pour un motif de même structure, selon la teneur en groupes sulfates. Ce caractère hétérogène se traduit par des différences de propriétés des chaines selon les sé25 quences qu'elles renferment. Il est connu qu'environ un tiers des chaînes d'héparine présente un site de liaison à l'AT III (antithrombine III). De telles chaines sont dotées d'une activité plus spécifique vis-à-vis de certains facteurs 30 de la coagulation du sang. Les 2/3 des chaines d'héparine dépourvues du site de liaison à l'AT III sont en revanche dépourvues d'activité anticoagulante. On a également rapporté l'affinité de certains facteurs de croissance cellulaires pour l'hépa35rine. Cette affinité est utilisée pour purifier des rine. Cette affinité est utilisée pour purifier des facteurs de croissance cellulaires par chromatographie d'affinité sur des colonnes d'héparine-SépharoseD. Les facteurs de croissance cellulaire qui 5 présentent une affinité pour l'héparine sont des polypeptides anioniques ou cationiques, de poids moléculaire d'environ 12000 à 20000, ayant une activité principale sur la division et la différenciation cellulaire. Cette activité s'exerce en particulier sur certains types de cellules telles que les cellules fibroblastiques, les cellules endothéliales capillaires et certaines cellules musculaires. Ils sont impliqués également dans la diffé15 rentiation des cellules neuronales. Ces facteurs sont appelés FGF, abréviation pour "fibroblastic growth factor", ou encore ECGF, abréviation pour "endothelial cell growth factor" (voir les articles de J. Courty, Y. Courtois et D. Barritault dans Biochimie 1984, vol. 66, p.419-428 et de Roy R. Lobb et James W. Fett dans 20 Biochemistry. Vol. 23 n' 26, 1984, p. 6295-6299). On notera que, dans la suite de la description et dans les revendications, le terme "glycosaminoglycanes" recouvre les produits natifs et les frag25 ments obtenus par dépolymérisation des glycosaminoglycanes. Ces glycosaminoglycanes présentent l'alternance de motifs rencontrée dans l'héparine et l'héparane-sulfate, rapportée ci-dessus. De manière surprenante, les inventeurs ont 30 constaté que ces facteurs de croissance ne présentent une affinité élevée que pour certaines chaînes de glycosaminoglycanes. L'étude de cette affinité en vue de la séparation de telles chaines a permis de mettre en évidence que des familles d'oligosaccharides homo35 gènes au regard de leur poids moléculaire sont cons- tituées en fait d'un mélange de nombreuses espèces anioniques de charges différentes et que les espèces les plus anioniques possèdent des activités régulatrices sur la division et la différenciation cellu5 laire, de haut intérêt sur le plan pharmacologique. L'invention a donc pour but de fournir des glycosaminoglycanes de type héparine ou héparanesulfate présentant une affinité élevée pour les facteurs de croissance cellulaires capables de se fixer à 10 l'héparine. Elle vise également à fournir un procédé de préparation de ces glycosaminoglycanes. L'invention vise également les applications de ces glycosaminoglycanes ou, le cas échéant, des fragments tels qu'obtenus par dépolymérisation des 15 glycosaminoglycanes pour l'élaboration de médicaments actifs sur -la division et la différenciation cellulaire. Les glycosaminoglycanes de l'invention sont 20 caractérisés par le fait qu'il s'agit de produits formés de chaines - ayant une affinité spécifique pour les facteurs de croissance cellulaires cationiques ou anioniques reconnaissant l'héparine, - comprenant au moins une séquence de 6 motifs avec une forte anionicité, telle que caractérisée sur le spectre RMN représenté sur la figure 1, ainsi que les sels pharmacologiquement acceptables. D'une manière avantageuse, ces glycosamino30 glycanes sont actifs sur le mécanisme de la division cellulaire. Un groupe de glycosaminoglycanes avantageux est constitué par des oligosaccharides formés de chaines d'au plus 18 motifs saccharidiques de type héparine ou héparane-sulfate de préférence d'au plus 14 motifs. Un autre groupe avantageux est constitué par des glycosaminoglycanes hépariniques ou par des oligosaccharides de 18 motifs au plus, de préférence de 14 motifs au plus, essentiellement dépourvus du site de liaison à l'AT III. De tels produits présentent l'avantage d'être actifs sur la division et la différentiation cellulaires sans qu'intervienne une activité sur le système de la coagulation. Selon une disposition de l'invention, le mo10 tif à l'extrémité réductrice ou celui à l'extrémité non réductrice est modifié par rapport au motif correspondant d'une chaîne héparinique. Des glycosaminoglycanes ou des oligosaccharides de ce type possèdent, à l'extrémité réductrice, un motif D-glucosamine réarrangé en motif de structure 2,5-anhydro-manno, de préférence modifié en groupe de structure 2,5-anhydro-mannitol ou encore acide 2,5anhydro-mannonique. D'autres glycosaminoglycanes ou oligosac20 charides possèdent à l'extrémité non réductrice un motif acide uronique a, Y, éthyléniquement insaturé. Selon une disposition préférée de l'invention, les glycosaminoglycanes, plus spécialement les oligosaccharides, sont en outre homogènes au regard de 25 leur degré de polymérisation c'est-à-dire du nombre de motifs constitutifs de leurs chaînes. Un oligosaccharide particulièrement avantageux est constitué par un hexasaccharide. Un tel hexasaccharide est caractérisé par les 30 éléments suivants: - il est formé d'une alternance de motifs de glycosaminoglycanes de type héparine ou héparane-sulfate, - il présente une affinité pour les facteurs de croissance cellulaire reconnaissant l'héparine, - il possède un caractère fortement anionique, - sa structure et son anion;cité sont conformes au spectre RMN représenté sur la figure 1, - il est dépourvu du site de liaison à l'AT III. Selon un aspect de l'invention, le motif de 5 l'extrémité non réductrice possède une structure [acide L-iduronique 2-O-sulfate], ce motif étant suivi par une [D-glucosamine NH-sulfate, 6-O-sulfate]. Selon un autre aspect de l'invention, l'hexasaccharide est dépourvu de motifs acide D-glucuronique et de motifs D-glucosamine N-acétyle tels que présents dans l'héparine. Un tel hexasaccharide est formé d'une répétition de l'enchaînement disaccharidique de structure [acide L- iduronique 2-O-sulfate]-[D-glucosamine NH-sulfate, 6-O-sulfate]. Selon encore un autre aspect de l'invention, l'hexasaccharide comprend à l'extrémité non réductrice ou à l'extrémité réductrice, un motif modifié par rapport au motif correspondant présent dans l'héparine. Conformément à une variante, la modification 20 concerne le motif de début de chaîne. Il s'agit ainsi plus spécialement d'un motif acide uronique a, Y, insaturé tel qu'obtenu par dépolymérisation de l'héparine à l'aide d'héparinase ou d'héparitinase, ou par a, l élimination. Dans une autre variante, le motif terminal est une D-glucosamine réarrangée en groupe de structure 2,5-anhydromanno tel qu'obtenu par dépolymérisation d'héparine à l'aide d'acide nitreux. Selon encore un autre aspect, l'hexasaccha30 ride de l'invention correspond - à un produit contenu dans une fraction correspondant à celle éluée entre un volume de 32 à 36 1 dans un système de gel filtration o l'on dépose, en solution dans 500 ml de NaCl 0,5M, 60g de précipité, obtenu par pré35 cipitation alcoolique d'un mélange de dépolymérisation nitreuse de l'héparine, sur une colonne de 100cm x 25cm nitreuse de l'héparine, sur une colonne de 100cm x 25cm contenant 45 litres d'agaroseacrylamide, équilibrée avec un tampon de NaCl 0,5 M, pH 6,0 et o l'on effectue l'élution à un débit de 1500 ml/heure, - ce produit étant séparé par chromatographie d'affini5 té sur FGF anionique-Sépharose, en utilisant une colonne de 2,5 cm x 6,5 cm, équilibrée en tampon tris-HCl 0, 01 M, pH 7,4, 0,2 M NaCl renfermant 30 ml de FGF anionique-Sépharose@, sur laquelle on dépose 300 mg de 10 la fraction ci-dessus en solution dans 60 ml du même tampon, en éluant à l'aide de ce tampon ajusté à 1 M de NaCl et en précipitant l'oligosaccharide de la fraction recueillie à l'aide d'éthanol. Un autre oligosaccharide avantageux est cons15 titué par un octasaccharide. Il s'agit plus spécialement d'un octasaccharide renfermant une séquence hexasaccharidique telle que définie ci-dessus. Par rapport à la structure correspondante trouvée dans l'héparine, l'octasaccharide est constitué de motifs non modifiés 20 ou comporte à l'extrémité non réductrice ou à l'extrémité réductrice un motif modifié. Selon une variante le motif à l'extrémité non réductrice est un acide uronique a, 0, insaturé tel qu'obtenu par dépolymérisation d'héparine à l'aide 25 d'héparinase ou d'héparitinase, ou par a, p-élimination. Dans une autre variante, le motif à l'extrémité réductrice est un motif Dglucosamine réarrangé en motif de structure 2,5-anhydromanno, un motif préféré 30 étant constitué par un groupe de structure 2,5-anhydromannitol ou encore acide 2,5-anhydro-mannonique. Un octasaccharide préféré renferme une séquence hexasaccharidique telle que définie ci-dessus. Conformément à un autre aspect l'octasac35 charide de l'invention est caractérise: - en ce qu'il est contenu dans une fraction correspondant à un volume d'élution entre 28 et 32 1 dans un système de gel filtration o l'on dépose, en solution dans 500 ml de NaCl 0,5M, sur une colonne de 100 cm x cm contenant 45 litres d'agarose-acrylamide, équilibrée avec un tampon de NaCl 0,5 M, pH 6,0, 60 g de précipité, obtenu par précipitation alcoolique d'un mélange de dépolymérisation nitreuse de l'héparine, et o l'on effectue l'élution à un débit de 1500 ml/heure, 10 et - qu'il est séparé par chromatographie d'affinité sur FGF anionique-Sépharose , en utilisant une colonne de 2,5cm x 6,5cm, équilibrée en tampon tris-HC1 0, 01 M, pH 7,4, 0 2 M NaCl renfermant 30 ml de FGF anioniqueSépharose, sur laquelle on dépose 300 mg de la fraction ci-dessus en solution dans 60 mi du même tampon, en éluant à l'aide de ce tampon ajusté à 1 M de NaCl, et en précipitant l'oligosaccharide de la frac20 tion recueillie à l'aide d'éthanol. D'autres glycosaminoglycanes avantageux sont constitués par-des décasaccharides. De tels décasaccharides sont caractérisés: - en ce qu'ils sont contenus dans une fraction corres25 pondant à un volume d'élution entre 25 et 28 1 dans un système de gel-filtration tel que rapporté ci-dessus pour l'obtention de l'octasaccharide, et qu'ils sont séparés par chromatographie d'affinité sur FGF anionique-Sépharose selon les conditions indiquées pour l'octasaccharide. Les glycosaminoglycanes de l'invention peuvént se présenter sous forme de sels pharmacologiquement acceptables. On citera les sels de cuivre, de sodium, de potassium et de magnésium. L'invention vise également un procédé d'obtention des glycosaminoglycanes définis ci-dessus. Ce procédé est caractérisé par la mise en contact de préparations de glycosaminoglycanes de type héparine ou héparane-sulfate avec un facteur de crois5 sance cellulaire anionique ou cationique avantageusement fixé à un support et par l'utilisation d'un tampon avec un gradient de force ionique afin d'éliminer les chaines dépourvues d'affinité et celles d'affinité moyenne pour le facteur de croissance puis de récupérer 10 les chaînes saccharidiques fixées sur le facteur de croissance. Ces dispositions permettent de séparer, d'un mélange, les chaines de forte anionicité. Les préparations de glycosaminoglycanes de départ sont formées soit de mélanges de chaînes d'héparine native ou de fragments de dépolymérisation, soit de mélanges de chaînes ou de fragments renfermant au plus 18 motifs, de préférence 14 motifs, soit encore de l'un ou l'autre de ces mélanges, dont on a éliminé es20 sentiellement les chaînes ou les fragments ayant un site de liaison à l'AT III. La mise en contact des préparations de glycosaminoglycanes et du facteur de croissance est réalisée avantageusement dans une colonne de chromatographie 25 renfermant le facteur de croissance anionique ou cationique, ' e préférence fixé à un support, tel que du Sépharose, la colonne étant équilibrée à l'aide d'un tampon. Une séparation satisfaisante de chaînes sac30 charidiques de type glycosaminoglycane, de forte anionicité, telles que définies ci-dessus, est obtenue en faisant varier la force ionique du tampon d'équilibre d'une valeur correspondant à une concentration de 0,2M de NaCl à une valeur correspondant à une concentration de 1 à 2M le gradient étant adapté au type de glycosaminoglycanes à séparer, notamment à la longueur de leurs chaînes. Selon une disposition avantageuse de l'invention, l'opération de chromatographie d'affinité sur facteur de croissance est réalisée sur une fraction de 5 glycosaminoglycanes homogène au regard de son poids moléculaire afin de séparer d'une fraction donnée, un type de glycosaminoglycanes de caractéristiques déterminées. Une fraction de glycosaminoglycanes de ce 10 genre est obtenue avantageusement en soumettant une préparation de glycosaminoglycanes telle que définie ci-dessus à une opération de gel-filtration. Par élution, à l'aide d'un tampon approprié, du mélange déposé au sommet d'une colonne d'un gel, par exemple du type agarose-acrylamide, on récupère successivement, en fonction de leurs poids moléculaires, des fractions d'oligosaccharides homogènes. Une séparation satisfaisante de ces fractions est obtenue en éluant avec un tampon de force ionique 20 correspondant à celle d'un tampon de NaCl de 0,5 M environ. Les effluents de la colonne correspondant à la fraction de glycosaminoglycane souhaitée sont recueillis et la fraction est précipitée par un solvant 25 alcoolique, notamment l'éthanol. La fraction récupérée, homogène en ce qui concerne le poids moléculaire des chaines est en revanche très hétérogène au regard de la charge ionique. La préparation de glycosaminoglycanes, formée 30 du mélange de chaînes à fractionner puis à séparer par affinité pour les facteurs de croissance, ou à séparer directement à l'aide de ces facteurs sans effectuer de fractionnement, est plus spécialement obtenue par dépolymérisation de l'héparine, suivie d'un fractionnement afin de séparer les chaines possédant le site de liaison à l'AT III des chaines dépourvues de ce site. Les procédés de dépolymérisation connus sont basés notamment sur l'action de l'acide nitreux, de l'héparinase, de l'héparitinase ou du periodate sur 5 l'héparine, la dépolymérisation nitreuse ou celle au periodate étant la plus intéressante pour une exploitation industrielle. L'héparine utilisée est une héparine brute ou de qualité pharmaceutique. Les fragments de dépolymérisation peuvent 10 posséder un motif modifié par rapport à la structure correspondante trouvée dans l'héparine, à l'extrémité non réductrice ou à l'extrémité réductrice: il s'agit respectivement d'un motif uronique a- insaturé dans le cas d'une dépolymérisation à l'aide d'héparinase, d'hé15 paritinase ou d'une a,O élimination, ou d'un motif de structure 2,5 anhydro-manno dans le cas d'une dépolymérisation à l'aide de l'acide nitreux. Une technique de dépolymérisation nitreuse ménagée préférée correspond à celle faisant l'objet de 20 la demande FR n' 2 503 714 du 10/04/81 au nom de la demanderesse. Selon le procédé de cette demande, on fait réagir l'héparine et l'acide nitreux en milieu aqueux selon des concentrations respectives telles que tous les ions nitreux sont consommés lorsque le degré 25 de dépolymérisation souhaité est atteint. Avantageusement, les groupements réducteurs de structure 2,5-anhydromannose obtenus à l'issue de la déamination nitreuse sont réduits en groupes de structure 2,5-anhydromannitol par un agent réducteur tel que 30 le tétrahydruroborate de sodium. Le fractionnement des chaines affines et non affines consiste avantageusement en un fractionnement alcoolique, plus spécialement un fractionnement éthanolique, en présence d'un sel minéral, conduisant à: un sous-ensemble constitué des fragments de taille correspondant principalement à 10, 12, 14, 16, 18 unités saccharidiques de l'héparine, possédant le motif pentasaccharidique de liaison à l'antithrombine III, et doué d'une importante activité anti-facteur Xa, et d'une faible activité anticoagulante globale - un sous-ensemble constitué de fragments de taille correspondant principalement à 2, 4, 6, 8, 10 unités saccharidiques de l'héparine, pratiquement dépourvus 10 d'activité anticoagulante globale et présentant une très faible activité anti-facteur Xa. Selon une variante, les glycosaminoglycanes de l'invention sont obtenus par échange d'ions avec des échangeurs d'anions basiques forts tels que des am15 moniums quaternaires, en faisant varier selon un gradient la force ionique du tampon d'élution. L'utilisation d'un tampon d'équilibrage et de rinçage puis d'un tampon d'élution ayant respectivement des forces ioniques correspondant à celles d'un tampon 20 NaCl 0,5 M 0,1 M, puis à un tampon NaCl 1 à 2 M permet de séparer de manière satisfaisante les chaînes affines recherchées du mélange. L'étude pharmacologique des glycosaminoglycanes de l'invention a mis en évidence leurs propriétés 25 sur la division et la différenciation cellulaires. On sait que les facteurs de croissance à affinité pour l'héparine agissent en particulier en se fixant sur des récepteurs cellulaires de plusieurs catégories que l'on trouve dans différents types cellu30 laires. Comme l'ont constaté les inventeurs, les glycosaminoglycanes de l'invention modifient l'activité de ces facteurs de croissance. Certaines cellules peuvent être autocrines (au sens défini dans Sporn M. B., Todaro G. J., New Engl. J. Med., 303, 878-880, 1980) et permettent de mettre en évidence le potentiel modulateur, à savoir activateur ou inhibiteur (notamment selon le phénotype, l'état de différenciation des cellules considérées), des oligosaccharides de l'invention sur la division et la différenciation cellulaire, sans adjonction de facteur de croissance. Des essais ont été réalisés dans un modèle expérimental particulier utilisant des cultures de 10 cellules endothéliales de capillaires de souris. Ils ont montré une augmentation de la multiplication cellulaire par rapport à une culture témoin dépourvue de glycosaminoglycanes, ou par rapport à un hexasaccharide de référence dépourvu d'affinité pour le FGF anionique. 15 On connaiît également le rôle inhibiteur de la néoangiogénèse de certains stéroides en présence de fragments d'héparine. Des glycosaminoglycanes de l'invention, administrés avec des corticoides, ont avantageusement montré une action de ce type dans le modèle 20 expérimental de la membrane chorioallantoique de poulet décrit par J. Folkman et al dans Science, 221,719 (1983). Ces propriétés avantageuses s'accompagnent d'une grande innocuité. L'invention vise donc l'application des glycosaminoglycanes de l'invention en tant que stimulateurs de la division et de la différentiation de cellules en culture, notamment de cellules endothéliales et épithéliales. Elle vise aussi l'application de ces glycosaminoglycanes comme stimulateurs de la division de certains hybridomes en culture. L'invention vise également les compositions pharmaceutiques renfermant dans leur principe actif une 35 quantité efficace d'au moins un glycosaminoglycane tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutique. Des compositions pharmaceutiques avantageuses renferment l'hexasaccharide hautement anionique décrit plus haut, ou encore l'octasaccharide ou le décasaccharide, ou un mélange les renfermant, sous forme de leurs sels pharmacologiquement acceptables. Le principe actif de ces médicaments comprend 10 le glycosaminoglycane seul ou, en variante, associé à un facteur de croissance reconnaissant l'héparine. Selon une autre variante, le glycosaminoglycane et le facteur de croissance sont utilisés en même temps sans association préalable. Compte tenu de leurs propriétés sur la division et la différentiation cellulaires, ces compositions pharmaceutiques sont utilisables principalement dans les indications thérapeutiques suivantes: stimulation de la réparation soit directe, soit par 20 augmentation de la néoangiogénèse responsable d'une néovascularisation, des tissus suivants: tissus nerveux, particulièrement après des lésions d'origine vasculaire ou traumatique, tissus musculaires après des lésions en particulier d'origine traumatique ou congé25 nitale ou dans des pathologies de dégénerescence acquises, tissus cellulaires, particulièrement le tissu cardiaque après des lésions d'origine vasculaire, telles que des infarctus, tissus cutanés après des lésions notamment d'origine traumatique, - accélération de la cicatrisation après des lésions d'origine traumatique, - avec des corticoides, inhibition de l'angiogénèse dans le cas de croissance de tumeurs solides et inhibition des processus pathologiques de néoangiogénèse 35 d'origine congénitale ou dégénérative. Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont administrables sous différentes formes. Ces formes peuvent être hydratées lorsque le 5 glycosaminoglycane est utilisé seul pour la constitution du principe actif. Elles doivent être anhydres lorsque le principe actif comprend un facteur de croissance. Ce dernier est présent à raison de 1 à 100 ug par unité de prise, avantageusement de 25 à 100 pg. Pour l'administration par voie orale, on a recours en particulier à des gélules, tablettes, comprimés, pilules, liposomes, solutions buvables. Ces préparations renferment avantageusement de 50 mg à 5 g par unité de prise, de préférence 200 à 250 mg pour les gélules, tablettes et pilules, et de 0,5 à 5 g pour les solutés buvables. En conséquence, les formes d'administration dépendent essentiellement de la dose à administrer. Les gélules, tablettes et pilules seront d'une utilisation 20 pratique pour l'administration de faibles doses. Pour l'administration de doses plus élevées, les solutés buvables pourront être d'une utilisation plus pratique. D'autres formes d'aministration de l'invention sont constituées par des aérosols ou des pommades. 25 L'invention concerne également des compositions pharmaceutiques injectables, stériles ou stérilisables pour l'administration tant par voie intraveineuse qu'intramusculaire ou souscutanée. Ces solutions renferment avantageusement de 30 50 à 250 mg/ml de compositions de glycosaminoglycanes, de préférence de 100 à 150 mg/ml, par exemple, de 150 mg/ml, lorsque ces solutions sont destinées à l'injection par voie sous-cutanée. Elles peuvent contenir, par exemple, de 10 mg à 5 g, notamment 150 mg/ml de 35 glycosaminoglycanes, lorsqu'elles sont destinées à l'injection par voie intraveineuse ou par perfusion. Avantageusement, de telles préparations pharmaceutiques sont présentées sous la forme de seringues non récupérables, prêtes à l'emploi. Afin d'illustrer l'invention, on indique, ciaprès, un exemple de posologie utilisable chez l'homme: cette posologie comprend, par exemple, l'administration au patient d'environ 300 mg/prise, par voie sous-cutanée, deux à trois fois par jour. Par voie intravei10 neuse, on administre environ 150 mg/j, sachant que, par perfusion, les quantités injectées peuvent être de plusieurs dizaines de ml. Ces administrations sont effectuées de manière discontinue à intervalles réguliers, ou continues par perfusion. Ces doses peuvent être naturellement ajustées pour chaque patient en fonction des résultats et des analyses effectuées auparavant, la nature des affections dont il souffre, et, d'une manière générale, son état de santé. Les compositions pharmaceutiques décrites ci20 dessus peuvent comprendre, en outre, un composé de type corticoide selon des quantités permettant l'administration de doses tolérables au patient. En particulier, la quantité de corticoide peut être telle que la dose administrée au patient n'excède pas 5 mg/kg/jour. 25 Dans d'autres compositions, cette dose est supérieure. Ces doses peuvent toutefois être élevées lorsqu'il s'agit de dérivés de corticoides ayant perdu leur activité hormonale. L'invention concerne encore les réactifs bio30 logiques dont les principes actifs sont constitués par les compositions d'oligosaccharides telles que définies plus haut. Ces réactifs biologiques peuvent être utilisés comme références ou étalons dans des études des éventuelles propriétés antitumorales d'autres substances, notamment, dans des tests mettant en jeu les techniques qui ont été décrites dans les exemples précédents. Les glycosaminoglycanes de l'invention peuvent être fixés à des gels insolubles du type Sépharose V pour fournir des supports de chromatographie d'affinité permettant de retenir aisément des facteurs de croissance cellulaires anioniques ou cationiques, du type fixable par l'héparine, aux fins de purification 10 ou pour diminuer leur teneur dans un milieu biologique donné. Ces facteurs de croissance peuvent provenir soit directement de milieux biologiques, soit de préparations ayant subi des opérations de purification 15 préalables. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont rapportés dans les exemples qui suivent relatifs à la préparation de différents oligosaccharides et aux résultats d'essais pharmacologiques. On se référera également aux figures 1 à 13, qui représentent respectivement, - la figure 1, le spectre de RMN du 13C d'un hexasaccharide fortement anionique; - la figure 2, le profil d'élution correspondant à la 25 gel-filtration d'un mélange de dépolymérisation nitreuse; - la figure 3, le profil d'élution de la fraction hexasaccharidique recueillie lors de l'étape de gel filtration, en échange d'ions; - la figure 4, le profil d'élution en échange d'ions de l'hexasaccharide isolé par chromatographie sur FGF-Sépharose\ ; - la figure 5, le profil d'élution en chromatographie d'échange d'ions de l'hexasaccharide obtenu par chro35 matographie sur une colonne échangeused'anions - la figure 6, le profil d'élution en échange d'ions - la figure 6, le profil d'élution en échange d'ions d'un mélange d'octasaccharides; la figure 7, le spectre de RMN du 13C de ce mélange d'octasaccharides; la figure 8, le profil d'élution en échange d'ions d'un mélange de décasaccharides; - la figure 9, le spectre de RMN du 13C de ce mélange de décasaccharides; - les figures 10 à 13, les courbes de la radioactivité 10 en cpm en fonction de la dose de produit testé en ng obtenues respectivement avec le FGF anionique seul, un hexasaccharide seul ou avec FGF anionique, un autre hexasaccharide seul ou avec FGF anionique, un produit de contrôle dépourvu d'affinité pour le FGF anionique, utilisé seul ou avec du FGF anionique. EXEMPLE I: A - DEPOLYMERISATION. 500 g d'héparine injectable, sous forme de sel de sodium, sont mis en solution dans 4500 ml d'eau 20 déminéralisée, à une température de 18'C (concentration environ 11% P/V). La solution obtenue est mise sous agitation énergique, et son pH est abaissé à 2,5 par addition d'acide chlorhydrique concentré. On ajoute alors 15 g 25 de nitrite de sodium dissous dans 300 ml d'eau. (q.s.p.0,043 M final). Le pH de la réaction est ajusté à 2,5 par de l'acide chlorhydrique concentré, et le volume total de la solution est amené à 5000 ml afin d'avoir une concentration finale en héparine de 10% 30 P/V. On laisse la réaction s'effectuer pendant 45 minutes. Ce laps de temps écoulé, l'absence d'ions nitreux résiduels dans la solution réactionnelle est vérifié au moyen de papier indicateur imprégné d'iodure de potassium amidonné (développement d'une coloration 35 bleue-violacée en présence d'ions NO2). Si des ions nitreux sont détectés, on laisse la réaction se poursuivre encore, jusqu'à disparition totale de ces ions et absence de réaction au papier iodo-amidonné, en effectuant des contrôles toutes les 3 ou 4 minutes. Lorsque ces contrôles deviennent négatifs, la réaction est considérée comme étant achevée. Le pH de la solution est alors élevé à 10 à l'aide de soude concentrée, et l'on ajoute 5 g de tétrahydruroborate de 10 sodium. La solution est maintenue sous agitation pendant 15 heures. Le tétrahydruroborate de sodium n'ayant pas réagi est détruit par abaissement du pH à 3,0 à l'aide d'acide chlorhydrique concentré; la solution est soumise à agitation 15 minutes, puis on réajuste le pH à 7,0 au moyen de soude concentrée. Pour récupérer les produits de la réaction, on ajoute 10 1 d'éthanol, on laisse ensuite au repos 48 20 heures, on laisse décanter le mélange puis on élimine le surnageant. B - FRACTIONNEMENT. Le précipité est redissous dans 9 litres d'eau déminéralisée (concentration 5% P/V en se basant sur le poids d'héparine de départ). On ajoute 100 g de 25 chlorure de sodium, et l'on abaisse le pH de la solution à 3,8 à l'aide d'acide chlorhydrique concentré. Le volume est ajusté exactement à 10 litres à l'aide d'eau déminéralisée, et on ajoute sous agitation énergique 10 litres d'éthanol. On laisse reposer 48 heures. On siphonne le surnageant et on ajuste le pH à 7,0 à l'aide de soude 5 N. On ajoute 19 litres d'éthanol. On laisse reposer 48 heures. On siphonne le surnageant pour le séparer. Le précipité est récupéré, lavé à 35 l'éthanol, broyé et séché sous vide. On obtient ainsi g de mélange d'oligosaccharides. C - GEL-FILTRATION. g du mélange obtenus sont dissous dans 500 ml de NaCl 0,5 M déposés au sommet d'une colonne 5 d'Ultrogel AcA 202. La colonne est éluée à un débit de 1500 ml/heure par du tampon NaCl 0,5 M. L'absorption UV 214 nm de l'effluent est enregistrée en continu. On obtient le profil d'élution représenté sur la fig. 2. 7 fractions sont séparées et 10 précipitées par 2 volumes d'éthanol. Ces fractions ont les caractéristiques sui- vantes: N' frac-::: tion: 1 : 2: Volume::: (litre): 2,1: 2,2: ::: Interval-::: les du::: volume::: d'élution:: (litre):41-39:39-36: : -:: Poids:: produit::: sec *: 1,2g: 5,6g: ::: Nature: di-:tétra: :sac- :: :cha-::ride: ::: 3: 4,1: 36-32: 12 g: hexa: ::: ::: 4: 5: 6: ::: ::: 3,9: 3,3: 2,5: 32-28:28-25:25-22: ::: ::: 9,8g: 8 g: 6,2g: octa: déca:dodé-:::ca ::: ::: ::: 1,8 22-20 1,5 g tétradéca * Le produit obtenu par précipitation alcoolique est 30 centrifugé et séché sous vide à 60'C pendant environ heures. Le profil d'élution en échange d'ions de la fraction hexasaccharidique est représenté sur la figure 3 o l'on indique en abscisses le temps de rétention et en ordonnées les quantités de produits dans l'éluat. 35 Pour effectuer cette mesure, on utilise une colonne Mono-Q % commercialisée par Pharmacia avec un gradient en NaCl de 0,5 à 1,5 M, le débit étant de 1 ml/mn. La détection est effectuée par absorption à 214 nm. L'examen de ce profil d'élution montre l'hétérogénéité de la fraction. D - CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITE SUR FGFSEPHAROSE . Le FGF anionique est préparé à partir de cervelles de boeuf selon la technique de Roy R. Lobb et James W. Fett, Biochemistry vol. 23, N' 26, 1984 pp 6295-6299. m de FGF anionique sont fixés sur 30 ml de Sépharose 4 B. Selon la technique de P.M. Cuatrecasas, M. Wilchek et C.B.Anfinsen, Proc. Nat. Acad. Sci U.S. 61(1968).636. Les 30 ml de FGF-Sepharose ainsi obtenus sont placés dans une colonne (2, 5 cm x 6,5 cm), et 20 équilibrés en tampon tris-HCl 0,01M pH 7,4, 0,2M NaCl.(appelé ci-après tampon I). 300 mg de la fraction hexasaccharidique en solution dans 60 ml de tampon I sont déposés sur la colonne de FGF-Sepharose 0; cette dernière est lavée avec 25 600ml de tampon I à un débit de 60 ml par heure. La colonne est finalement éluée par du tampon I ajusté à 1 M NaCl. Les 18 ml d'éluat contenant des substances oligosaccharidiques sont recueillis et précipités par addition de 108 ml d'éthanol pur. On récupère ainsi 0,15 30 mg d'un hexasaccharide dont le profil d'élution en échange d'ions est représenté sur la figure 4. Ce produit est appelé ci-après IC 1696. On donne ci-après les caractéristiques du spectre RMN de 13C de l'hexasaccharide de la figure 1, les symboles suivants étant utilisés pour représenter les 6 motifs constitutifs: G1 H1G2H2 G3 AM3. La mesure spectrale est réalisée sur une solution de ce produit dissous dans l'eau deutériée, à 25 MHz (référence pour la mesure des déplacements) : TST sel de sodium de l'acide 3-(triméthylsilyl)propionique. ppm Signal Attribution Attribution d'une façon plus générale* ,5 5 63,3 9 C-2 de H1+H2 C-1 de AM3 C-6 de H1+H2 68, 9 1 1 ,7 13 C-6 de AM3 77,8 17 C3 de AM3 C-2 du groupe N-sulfate glucosamine C-1 du groupe anhydromannitol C-6 du groupe glucosamine N-sulfate-6-sulfate C-6 du groupe anhydromannitol 6-sulfate C-3 du groupe anhydromannitol C-5 du groupe anhydromannitol C-2 du groupe anhydromannitol C-4 du groupe anhydromannitol 82,0 19 C-5 de AM3 ,6 21 C-2 de AM3 87,5 23 C-4 de AM3 98,6) 99,2) 102,6) 101,8) 101,6) 27 C-1 de H1+H2 29 C-1 de G1+G2 C-1 du groupe glucosamine-N-sulfate C-1 du groupe iduronique2-sulfate + G3 * c'est-à-dire par rapport aux connaissances dans ce domaine sur l'héparine. EXEMPLE 2: On procède de manière similaire à l'exemple 1, en utilisant un autre lot d'héparine injectable. On récupère finalement 115 g de mélange d'oligosaccharides. 60 g de ce mélange sont traités par gelfiltration dans les mêmes conditions que celles décrites 10 dans l'exemple 1. Les caractéristiques des fractions récupérées sont regroupées dans le tableau ci-dessous: N' fraction: 1: 2: 3: 4: 5: 6: 7 : : ::::: Volume: :::::: (litre): 2,2: 2,2: 3,1: 2,0: 3,4: 3,1: 2 ::::::: Poids pro-:: :: ::: duit sec:4,6 g:1,9 g:11,8g:1,7 g:10,2g:7,9 g:6,0 g ::::::: Nature:tétra:inter:hexa-:inter:octa-:déca-:dodé20:sac- :mé- :sac-:mé-:sac:sac-:ca:chari:diaire:cha-:diaire:cha-:cha-:sac:de:tétra:ride:hexa:ride:ride:cha::hexa::octa ::: ::::::: 300 mg de la fraction 2 (intermédiaire tétra25 hexa) sont soumis à la chromatographie d'affinité sur FGF-Sépharose. On obtient finalement 0,11 mg de produit appelé IC 1697. 300 mg de la fraction hexasaccharidique sont soum s à une chromatographie d'affinité sur FGF-Sépha30 rose-. On obtient ainsi 0,22 mg d'un produit dont le profil d'élution en gradient d'échange d'ions correspond à celui de la figure 4. EXEMPLE 3: 1,5 g de la fraction hexasaccharidique 3 sont 35 déposés sur une colonne d'échangeur d'anions Q SépharosX (170 ml, 2,5 cm x 35 cm) équilibrée par du tampon NaCl 0,4 M. La colonne est rincée par du tampon NaCl 0,6 M jusqu'à absence de substances oligosaccharidiques dans l'effluent. (volume de rinçage 3,5 litres). Les oligosaccharides qui ne sont pas absorbés, récupérés lors du rinçage, correspondent au produit dépourvu d'affinité pour le FGF anionique appelé ci-après P38EXH13. Elle est alors éluée par du tampon NaCl 1 M, et les 120 ml d'éluat contenant des oligosaccharides sont recueillis et précipités par addition de 720 ml d'éthanol. On obtient ainsi 80 mg d'un produit dont le profil d'élution en chromatographie d'échange d'ions est représenté sur la figure 5. EXEMPLE 4: - Procédé de séparation d'un hexasaccharide fortement anionique par chromatographie d'affinité sur FGF ca20 tionique-Sépharose\: La préparation de FGF cationique de cervelle de boeuf et la fixation du FGF cationique sur la Sépharose s'effecutant selon les mêmes techniques que celles décrites pour le FGF anionique. Une colonne (1,6 cm x 5 cm) contenant 10 ml de FGF cationique-Sépharose (1,5 mg de FGF cationique par ml de Sepharose) est équilibrée en tampon I. mg d'hexasaccharide (obtenu selon l'exemple 1) en solution dans 20 ml de tampon I sont 30 déposés sur la colonne. La colonne est lavée à l'aide de ml de tampon ú, puis éluée par du tampon I ajusté à 2-M NaClLes 10 ml d'éluat contenant les substances oligosaccharidiques sont recueillis et précipités par addition de 50 ml d'éthanol pur. On récupère ainsi 0,050 mg d'un hexasaccharide dont le profil d'élution en échange d'ions correspond à celui de la figure 4. EXEMPLE 5: - Variantes de préparation d'un mélange de dépolymérisation renfermant les oligosaccharides de l'invention: - Préparation des oligosaccharides par dégradation périodique: 10 g d'héparine sont mis en solution dans 200 ml d'eau déminéralisée. On ajoute du métaperiodate de sodium en quantité suffisante pour avoir une molarité finale de 0,25 M soit 10,7 g, et le pH de la solution est abaissé 15 à 3,0 à l'aide d'HCl 5 N. La solution est laissée au repos, à 25'C, à l'obscurité pendant 48 heures. Le pH est amené à 7 à l'aide de soude 5N, et l'on ajoute 300 ml d'éthanol pur. Le précipité formé est 20 récupéré, broyé, lavé à l'éthanol et à l'acétone, puis finalement séché sous vide à 60'C. I1 est redissous dans 120 ml de soude 0,2 N contenant 2 mg de borohydrure de sodium par ml. La solution est agitée 15 heures à température ambiante. Le 25 pH est ajusté à 4 à l'aide d'HCl 5 N puis de nouveau à 7 par de la soude 5 N. On ajoute 200 ml d'éthanol pur. Le précipité formé est centrifugé, broyé, lavé * à l'éthanol et à l'acétone et séché sous vide à 60'C. On obtient ainsi 6,4 g d'un mélange 30 d'oligosaccharides. Ce mélange est soumis à l'étape de gel-filtration sur Ultrogel AcA 202 dans les conditions de l'exemple 1. - Préparation des oligosaccharides par action enzymatique de l'héparinase ou de l'héparitinase: 35 L'héparinase ou l'héparatinase sont extraites de Flavobacterium Heparinum et purifiées selon la technique décrite par P. HOVINGH et A.LINKER, J.Biol.Chem., vol 245 n'22, 1970, pp 6170-6175. - Dépolymérisation par l'héparinase: __________________________________10 g d'héparine sont mis en solution dans 500 ml de tampon acétate 0,1 M pH 7,0, CaCl2 0,01 M. La solution est mise au bain-marie à 30'C et 10 l'on ajoute 2,5 mg d'héparinase pure. On laisse incuber 24 heures à 30C. On ajoute 1200 ml d'éthanol pur. Le précipité formé est récupéré par centrifugation, lavé à l'éthanol et séché sous vide à 60'C. On obtient 7,1 g d'un mélange d'oligosaccharides qui est ultérieurement soumis à la gel-filtration sur Ultrogel AcA 202 dans les conditions de l'exemple 1. - Dépolymérisation par l'héparitinase: 20 g d'héparine sont mis en solution dans 500 ml de tampon acétate 0,1 M pH 7,0, CaCl2 0,01 M. La solution est mise au bain-marie à 40'C et l'on ajoute 5 mg d'héparitinase pure. On incube à 40'C 25 pendant 10 heures, puis on ajoute 3 mg d'héparitinase pure. On incube de nouveau 6 heures et I'on rajoute de nouveau 3 mg d'héparitinase. 10 heures après ce dernier ajout, on précipite les produits de la réaction par addition de 1200 ml d'éthanol. Le précipité formé est recueilli par centrifugation, lavé à l'éthanol et séché sous vide à 60'C. On obtient 6,8g d'un mélange d'oligosaccharides qui est ultérieurement soumis à la gel-filtration sur Ultrogel AcA 202 dans les conditions de l'exem35 ple 1. EXEMPLE 6: Préparation d'octasaccharides à haute affinité pour le FGF anionique par chromatographie d'affinité sur FGF-Sépharose La colonne de chromatographie est préparée comme décrit à l'exemple 1 D. 300 ml de la fraction octasaccharidique telle qu'obtenue à l'exemple 1 en solution dans 60 ml de tam10 pon I sont déposés sur la colonne de FGF-Sépharose @ cette dernière est lavée avec 600 ml de tampon I à un débit de 60 ml par heure. La colonne est finalement éluée par du tampon I ajusté à 1 M NaCl. Les 20 ml d'éluat contenant des substances oligosaccharidiques sont recueillis et précipités par addition de 120 ml d'éthanol pur. On récupère ainsi 0,26 mg d'un mélange d'octasaccharides ayant le profil d'élution en échange d'ions représenté sur la figure 6. Le spectre RMN du 13C dans l'eau deutériée, à 20 25 MHz, pour le mélange d'octosaccharides obtenu, est donné sur la figure 7. EXEMPLE 7: Préparation de décasaccharides à haute affinité pour le FGF anionique par chromatographie d'affinité sur FGF-Sépharose@ La colonne de chromatographie est préparée comme décrit à l'exemple 1 D. 300 mg de la fraction décasaccharidique telle qu'obtenue à l'exemple 1 en solution dans 60 ml de tam30 pon I sont déposés sur la colonne de FGF-Sépharose Q; cette dernière est lavée avec 600 ml de tampon I à un débit de 60 ml par heure. La colonne est finalement éluée par du tampon I ajusté à 1 M NaCl. Les 26 ml d'éluat contenant des substances 35 oligosaccharidiques sont recueillis par addition de ml d'éthanol pur. On récupère ainsi 0,38 mg d'un mélange de décasaccharides ayant le profil d'élution en échange d'ions représenté sur la figure 8. Le spectre RMN du 13C dans l'eau deutériée, à MHz, pour le mélange de décasaccharides obtenu, est donné à la figure 9. EXEMPLE 8q: Activité des produits de l'invention sur un modèle de culture cellulaire A - Description du modèle Des cellules LE II (endothéliales de poumon de souris) sont cultivées en présence de 10 % de sérum de veau foetal jusqu'aux 3/4 de la confluence. Elles sont ensuite arrêtées 48 heures en 0,2 % seulement de sérum. On ajoute ensuite au milieu soit le "fibroblast growth factor" (FGF), soit les fragments oligosaccharidiques à tester, soit les deux produits simultanément (FGF + produit à tester). La culture est encore maintenue pendant 24 heures et marquée par de la thymidine tritiée pendant les 4 dernières heures. La radioactivité est ensuite comptée; chaque mesure est faite en triplicate, les cellules étant cul25 tivées dans des plaques de 24 puits. B - Résultats Ils sont donnés dans les figures suivantes: - figure 10, courbe dose-réponse en présence du FGF anionique seul. Le plateau de stimulation se situe à 126 000 cpm pour une dose de 5 ng/ml. Dans les figures suivantes, la stimulation maximale en présence de FGF anionique seul est représentée par la ligne en pointillés, les courbes A _a représentant les résultats obtenus lorsque le glycosaminoglycane est utilisé seul et les courbes.. ceux obtenus lorsque le glycosaminoglycane est utilisé avec du FGF anionique. - Figure 11, courbe dose-réponse en présence de l'hexa5 saccharide IC 1696, seul ou avec du FGF anionique. On constate que IC 1696 a une activité dosedépendante de 0,08 à 50 pg/ml de milieu de culture. Associé au FGF anionique, on constate une augmentation par rapport à l'activité du FGF seul, à 10 partir de 10 pg/ml. Dans les conditions expérimentales et dans ce système cellulaire, IC 1696 potentialise l'activité du FGF anionique. - Figure 12, courbe dose-réponse en présence de l'hexa15 saccharide IC 1697, seul ou avec du FGF anionique. 15 IC 1697 utilisé seul montre une activité dosedépendante entre 0,04 et 50 pg/ml. Utilisé en association avec le EGF anionique, dans les conditions expérimentales du modèle, il est 20 nettement potentialisateur à partir de 0,4 pg/ml. - Figure 13, courbe dose-réponse en présence d'un produit de contrôle dépourvu d'affinité pour le FGF anionique: l'hexasaccharide P 38 EXH 13, seul ou avec du FGF anionique. Le fragment utilisé comme référence ne montre pas d'activité significative. EXEMPLE 9: Obtention d'un mélange de' fragments de glycosaminoglycanes affines pour le FGF anionique On opère comme dans l'exemple 1, mais sans effectuer l'étape de gel filtration C. La chromatographie d'affinité sur FGF-Sépharose 0 est alors effectuée sur un mélange renfermant les di-, tétra-, hexa-, octa-, déca-, dodéca35 et tétradécasaccharides du tableau de la page 19. 2597484 29 Cette opération de chromatographie permet d'isoler celles des chaînes du mélange qui sont dotées d'une affinité pour le FGF. 1 0 /, // / REVENDICATIONS 1. Glycosaminoglycanes de type héparine ou héparane-sulfate, caractérisés par le fait qu'il s'agit de produits formés de chaînes: - ayant une affinité spécifique pour les facteurs de croissance cellulaires cationiques ou anioniques reconnaissant l'héparine, - comprenant au moins une séquence de 6 motifs 10 avec une forte anionicité, telle que caractérisée sur le spectre RMN représenté sur la figure 1, ainsi que les sels pharmacologiquement acceptables. 2. Glycosaminoglycanes selon la revendication 1, caractérisés par le fait qu'ils sont formés de chaînes oligosaccharidiques d'au plus 18 motifs, de préférence d'au plus 14 motifs. 3. Glycosaminoglycanes selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils sont dépourvus du site de liaison à i'AT III. 4. Glycosaminoglycanes selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce qu'ils possèdent un motif modifié, à l'extrémité réductrice ou à l'extrémité non réductrice, par rapport au motif correspondant d'une chaîne héparinique. 5. Glycosaminoglycanes selon la revendication 4, caractérisés en ce qu'ils possèdent à l'extrémité réductrice un motif de structure 2,5 anhydromanno, de préférence un groupe de structure 2,5 - anhydromanitol ou encore acide 2,5 - anhydromannonique. 6. Glycosaminoglycanes selon la revendication 4, caractérisés en ce qu'ils possèdent à l'extrémité non réductrice un motif acide uronique a, Y, insaturé. 7. Hexasaccharide caractérisé par les éléments suivants: - il est formé d'une alternance de motifs de glycosaminoglycanes de type héparine ou héparane- sulfate; - il présente une affinité pour les facteurs de croissance cellulaire reconnaissant l'héparine, - il possède un caractère fortement anionique, - sa structure et son anionicité sont conformes au spectre RMN représenté sur la figure 1, - il est dépourvu du site de liaison à l'AT III. 8. Hexasaccharide selon la revendication 7, caractérisé en ce que le motif de l'extrémité non réductrice est un acide L-iduronique 2-0 sulfate, suivi par une D - glucosamine NH - sulfate, 6-0-sulfate. 9. Hexasaccharide selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce qu'il est dépourvu de motifs acide D-glucuronique et de motifs D-glucosamine N-acétyle tels que présents dans l'héparine. 10. Hexasaccharide selon l'une quelconque des 20 revendications 7 à 9, caractérisé en ce qu'il est formé d'une répétition de l'enchaînement disacharidique de structure [acide Liduronique 2-0-sulfate]-[D-glucosamino NH-sulfate, 6-0-sulfate]. 11. Hexasaccharide selon l'une quelconque des 25 revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend un motif modifié par rapport au motif correspondant d'une chaîne d'héparine, plus particulièrement un motif acide uronique a, g, insaturé à l'extrémité non réductrice, ou un motif de structure 2,5 - anhydromanno, de 30 préférence 2,5 - anhydromannitol ou encore acide 2,5 anhydro - mannonique à l'extrémité réductrice. 12. Hexasaccharide, caractérisé en ce qu'il correspond - à un produit contenu dans une fraction correspondant à celle éluée entre un volume de 32 à 36 1 dans un système de gel filtration o l'on dépose, en solution dans 500 ml de NaCl 0,5M, 60g de précipité, obtenu par précipitation alcoolique d'un mélange de dépolymérisation nitreuse de l'héparine, sur une colonne de 100cm x 25cm contenant 45 litres d'agarose-acrylamide, équilibrée avec un tampon de NaCl 0,5N, pH 6,0 et o l'on effectue l'élution à un débit de 1500 ml/heure, - ce produit étant séparé par chromatographie d'affinité sur FGF anioniqueSépharose, en utilisant une colonne 10 de 2,5 cm x 6,5 cm, équilibrée en tampon tris-HCl 0,01 M, pH 7, 4, 0 2 M NaCl renfermant 30 ml de FGF anionique-Sépharose À, sur laquelle on dépose 300 mg de la fraction ci-dessus en solution dans 60 ml du même tampon, en éluant à l'aide de ce tampon ajusté à 1 M de NaCl et en précipitant l'oligosaccharide de la fraction recueillie à l'aide d'éthanol. 13. Glycosaminoglycanes selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisés en ce qu'il s'agit d'un octasaccharide. 14. Octasaccharide selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il renferme une séquence hexasaccharidique selon l'une quelconque des revendications 7 à 12. 15. Octasaccharide, caractérisé en ce qu'il 25 correspond: - à un produit contenu dans une fraction correspondant à celle éluée entre un volume de 28 à 32 1 dans un système de gel filtration o l'on dépose, en solution dans 500 ml de NaCl 0,5M, 60g de précipité, obtenu par pré30 cipitation alcoolique d'un mélange de dépolymérisation nitreuse de l'héparine, sur une colonne de 100cm x 25cm contenant 45 litres d'agarose-acrylamide, équilibrée avec un tampon de NaCl 0,5N, pH 6,0 et o l'on effectue l'élution à un débit de 1500 ml/heure, - ce produit étant séparé par chromatographie d'affinité sur FGF anionique-Sépharose, en utilisant une colonne de 2,5 cm x 6,5 cm, équilibrée en tampon tris-HCl 0,01 M, pH 7,4, 0 2 M NaCl renfermant 30 ml de FGF anionique-Sépharose sur laquelle on dépose 300 mg de la fraction ci-dessus en solution dans 60 ml du même tampon, en éluant à l'aide de ce tampon ajusté à 1 M de NaCi et en précipitant l'oligosaccharide de la fraction recueillie à l'aide d'éthanol. 16. Glycosaminoglycanes selon l'une quelconque 10 des revendications 1 à 6, caractérisés en ce qu'il s'agit de décasaccharides. 17. Décasaccharides selon la revendication 16, caractérisés en ce qu'ils sont contenus dans une fraction correspondant à un volume d'élution entre 25 et 28 1 dans un système de gel filtration tel que décrit dans la revendication 15 et qu'ils sont séparés par chromatographie d'affinité sur FGF-SépharoseG selon les conditions données dans la revendication 15. 18. Procédé d'obtention de glycosaminoglycanes 20 selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisé par la mise en contact de préparations de glycosaminoglycanes de type héparinique avec un facteur de croissance anionique ou cationique et par l'utilisation d'un tampon avec un gradient de force ionique 25 afin d'éliminer les chaînes dépourvues d'affinité ou d'affinité moyenne pour le facteur de croissance, puis de récupérer les chaînes saccharidiques fixées sur le facteur de croissance. 19. Procédé selon la revendication 18, ca30 ractérisé en ce que le facteur de croissance anionique est fixé à un support. 20. Procédé selon l'une des revendications 18 ou 19, caractérisé en ce que les préparations de glycosaminoglycanes de départ sont formées soit de 35 mélanges de chaînes d'héparine native, soit de mélanges de chaînes renfermant au plus 18 motifs, de préférence 14 motifs, ou encore soit de l'un ou l'autre de ces mélanges dont on a éliminé les chaînes ayant un site de liaison à l'AT III. -21. Procédé selon la revendication 20, carac5 térisé en ce que les fragments possèdent un motif modifié à l'extrémité non réductrice, plus spécialement un motif uronique a-g insaturé, ou à l'extrémité réductrice, plus spécialement un motif de structure 2,5 anhydro 10 manno. 22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 21, caractérisé en ce qu'on dépose la préparation de glycosaminoglycanes au sommet d'une colonne de chromatographie renfermant le facteur de crois15 sance anionique ou cationique fixé de préférence à un support, tel que de Sépharose, cette colonne étant équilibrée à l'aide d'un tampon dont on fait varier la force ionique d'une valeur correspondant à une concentration de 0,2 M de NaCl à une valeur correspondant à 20 une concentration de 1 à 2 M. 23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 22, caractérisé en ce que l'opération de chromatographie d'affinité sur facteur de croissance est réalisée sur une fraction de glycosaminoglycanes homo25 gène au regard de son poids moléculaire, telle qu'obtenue par gel-filtration de la préparation de glycosaminoglycanes de départ et précipitation par un solvant alcoolique, notamment l'éthanol. 24. Procédé d'obtention de glycosaminoglycanes 30 selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce qu'on effectue une chromatographie d'échange d'ions sur une colonne échangeuse d'anions basiques forts tels que des ammoniums quaternaires, on fait varier la force ionique du tampon d'élution selon un 35 gradient correspondant à une variation de force ionique d'un tampon de NaCl de 0,5 0,1 M à 1-2 M, et on récupère les fractions les plus anioniques. 25. Procédé selon l'une quelconque des reven5 dications 18 à 24, caractérisé en ce que la préparation de glycosaminoglycanes de départ est une préparation telle qu'obtenue par dépolymérisation de l'héparine, suivie d'un fractionnement alcoolique, plus spécialement d'un fractionnement éthanolique pour séparer d'une part 10 les chaines dotées d'une activité antithrombique, d'autre part celles dépourvues d'une telle activité. 26. Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment comme leur principe actif une quantité efficace d'au moins un glycosaminoglycane selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, en association avec un véhicule pharmaceutique. 27. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 26, caractérisées en ce que le glycosaminoglycane est associé à un facteur de croissance cellu20 laire reconnaissant l'héparine. 28. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 26, caractérisées en ce que le glycosaminoglycane est utilisé séparément mais en même temps qu'un facteur de croissance cellulaire reconnaissant l'hépa25 rine. 29. Compositions pharmaceutiques selon l'une quelconque des revendications 26 à 28, caractérisées en ce qu'il s'agit de gélules, tablettes, comprimés, pilules, liposomes, solutions buvables, et renfermant de 30 50 mg à 5 g par unité de prise, de préférence 200 à 250 mg pour les gelules, tablettes et pilules et de 0,5 à 5 g pour les solutés buvables. 30. Compositions pharmaceutiques selon l'une quelconque des revendications 26 à 29, caractérisées en ce qu'elles sont anhydres et renferment un facteur de 35 croissance cellulaire, celui-ci étant lyophilisé et présent à raison de 1 à 100 pg. 31. Compositions pharmaceutiques selon l'une 5 quelconque des revendications 26 à-28, caractérisées en ce qu'il s'agit de solutions injectables, ces solutions renfermant avantageusement de 50 à 250 mg/ml de compositions de glycosaminoglycanes, de préférence de 100 à 150 mg/ml, par exemple, de 150 mg/ml, lorsque ces so10 lutions sont destinées à l'injection par voie sous-cutanée, par exemple, de 10 mg à 5 g, notamment 150 mg/ml de glycosaminoglycanes, lorsqu'elles sont destinées à l'injection par voie intraveineuse ou par perfusion. 32. Agent stimulateur de la croissance de cellules en culture, caractérisé en ce qu'il renferme un 15 glycosaminoglycane selon l'une quelconque des revendications 1 à 17.