FR 2587359 A1 19870320 FR 8507977 A 19850528 Dérivés non amidés de la somatocrinine et procédé de préparation par génie génétique. La présente invention concerne des dérivés non amides de la somatocrinine ainsi qu'un procédé de préparation desdits dérivés par génie génétique. Dans la présente description, on désigne par "somato- crinine" ou "GRF" aussi bien la somatocrinine humaine que les somato- crinines animales et par GRF (1-43)-X leurs dérivés non amides, X étant un acide aminé choisi parmi les acides aminés: leucine, glycine, - alanine et valine. Parmi ces dérivés, celui dans lequel X est la leucine est aussi dénommé GRF-OH. La somatocrinine humaine,ou hGRF, est un peptide constitué par l'enchaînement de 44 aminoacides. Sa séquence est la suivante: 1 5 10 H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg 20 -Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu- 30 35 Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn- 40 44 Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 Il a été récemment découvert par A. Guillemin et coll. (Science, 218, 585-587, 1982) à partir d'extraits d'une tumeur pancréatique humaine. Le GRF est particulièrement actif sur la stimulation de la libération de l'hormone de croissance (GH) aussi bien in vitro qu'in vivo. In vitro, en particulier, son efficacité se manifeste à des doses de quelques femto moles/ml (DE50 = 15 femto moles/ml). L'intérêt thérapeutique en médecine humaine de cette substance va donc se situer au niveau du traitement du nanisme et des retards à la croissance en pédiatrie. D'autres applications sont possibles dans les cas de déficience anabolique protéique (ulcères de stress, réparation de fractures ou d'atteintes du cartilage, brûlures étendues - pendant la phase anabolique -, réparations cutanées, ostéoporoses). Dans le domaine vétérinaire, ce composé présente un intérêt évident au niveau de la croissance pondérale des animaux d'élevage (bovins, ovins...). Le développement industriel du GRF nécessite la synthèse de quantités importantes de celui-ci. Les procédés classiques de synthèse en phase solide permettent l'obtention en des temps courts de faibles quantités de ce peptide (Science, 218, 585-587, 1982) à des coûts très élevés et incompatibles avec un développement pharma- ceutique à grande échelle. On sait que les polypeptides peuvent être prépares par des techniques de génie génétique en incorporant un ADN recombinant codant pour lesdits polypeptides dans une cellule hôte et en faisant expri- mer ledit ADN recombinant à l'intérieur de cette cellule hôte. Cette méthode directe ne peut cependant pas être appliquée dans l'expression du gène codant pour le GRF, notamment dans E. coli parce que le GRF est très sensible à l'action protéolytique intra- cellulaire. Dans le cas de la somatostatine, on a protégé cette hormone en la faisant exprimer avec une protéine porteuse, le gène de la somatostatine étant séparé du gène codant pour la protéine porteuse par un codon ATG (codant pour la méthionine) situé à l'extrémité du gène codant pour la somatostatine correspondant à la partie N terminale de celle-ci.(Itakura et al., Science 1977, 198, 1056-1063). La protéine hybride obtenue après l'expression peut être coupée au niveau de la méthionine, à l'aide du bromure de cyanogène, pour libérer la somatostatine. Ce procédé ne peut pas être appliqué au GRF parce que le bromure de cyanogène provoque aussi la coupure de la molécule du produit souhaité. Des coupures au niveau d'autres acides aminés dans des polypeptides ont été décrites, mais de telles méthodes n'ont pas la spécificité nécessaire pour l'obtention d'un produit de pureté satisfaisante avec un rendement satisfaisant. On a maintenant trouvé que les dérivés GRF(1-43)-X dans lesquels X est tel que défini précédemment peuvent être préparés à l'échelle industrielle par un procédé de génie génétique qui permet l'obtention desdits dérivés liés à une protéine porteuse par l'inter- médiaire d'un résidu tryptophane. La protéine hybride résultante est ensuite coupée au niveau du tryptophane pour fournir lesdits dérivés. Cette coupure est réalisée sélectivement au niveau du tryptophane par action d'un agent oxydant, tel que la 2-(2-nitro- phénylsulfényl)-3'-bromo-3-méthylindolénine, ci-après désigné BNPS- scatole. Ainsi, selon un de ses aspects, la présente invention concerne un procédé pour l'obtention du GRF-OH par génie génétique qui consiste à: 1) prparer le fragment d'ADN codant pour le Trp-GRF(1-43)-X; 2) insérer ledit fragment dans un vecteur contenant le gène codant pour la protéine porteuse avec les éléments génétiques nécessaires à son expression, l'insertion étant réalisée au niveau de la séquence codant pour la partie carboxylique terminale de ladite protéine porteuse; 3) transformer une cellule hOte avec le plasmide recombi- nant résultant; 4) faire exprimer le polypeptide de formule I: Protéine, porteuser Trp GRF-OH NH2-Prot-CQ NH-CH-COIGRF(1-43)-X 20. CH2 X = Leu, Ala, Val ou Gly. ) récupérer ledit polypeptide de formule I et à le couper au niveau du tryptophane à l'aide d'un agent oxydant pour obtenir le composé de formule GRF(1-43)-X dans laquelle X est tel 'ue défini ci-dessus. Le fragment d'ADN codant pour le Tr-GRF(1-43)-X mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention peut être obtenu par le procédé qui consiste a: - synthétiser chimiquement un oligonucléotide portant le codon du tryptophane; - unir ledit oligonucléotide au gène codant pour le GRF(i-43) -: Épté partunvecteur, à l'extrémité correspondant a la partie N terminale de celui-ci et - isoler ledit fragment d'ADN résultant par des méthodes classiques. L'oligonucléotide synthétisé est choisi pour permettre la fusion en phase de lecture du gène codant le TIp-eF(1-43)-X avec celui de la protéine porteuse. De préférence, le gène codant pour le GRF(1-43)-X dans lequel X = leucine ou GRF-OH est obtenu h partir du plasmide pUC9 (Messing and Vieira, Gene, 19, (1982) 259) disponible sur le marché, qui contient le gène codant pour la méthionine-GRF-OH de formule: CH -S-C5 -CH - H-CO-GRF-OH (II) 3 2 2, N4H2 La deuxième étape du procédé de l'invention consiste à insérer le fragment d'ADN obtenu dans un vecteur contenant le gène, codant pour la protéine porteuse avec les éléments génétiques néces- saires à son expression. La protéine porteuse est une protéine qui est exprimée efficacement par la cellule hôte. Cette protéine porteuse est de préférence la P-galactosidase lorsque la cellule hôte est E. coli. Selon un mode opératoire, le fragment d'ADN codant pour Trp-GRF(1-43)-X est inséré dans un vecteur contenant le gène de la protéine porteuse et les éléments génétiques nécessaires à l'expression. Suivant un autre mode opératoire, on insère ledit fragment d'ADN dans un vecteur contenant le gène codant pour la protéine porteuse; on isole le gène résultant et on l'insère dans un nouveau vecteur contenant les éléments génétiques nécessaires à l'expression. La cellule hôte utilisée dans le procédé de l'invention peut être une cellule procaryote ou eucaryote. Un procaryote préféré est l'espèce bactérienne Escherichia coli. A titre d'exemples de cellules appropriées, on peut citer les cellules de E.coli dénommées CAG 1139 (GROSSMAN A.D et al. Cell, 32, (1983) 151-159) et MC 1061 (CASADABAN M. et al.J. Bacteriol. (1980), 143, 971-980). Selon un autre aspect, l'invention a pour objet le vecteur recombinant codant pour la protéine hybride constituée par le GRF(1-43)-X lié pzr son extrémité N terminale à une protéine porteuse par l'intermédiaire d'un tryptophane. Un vecteur recombinant préféré inclut la séquence d'ADN codant la Pgalactosidase, un analogue, ou un fragment de ceux-ci, lié, du côté de son carboxyle terminal, au GRF(1-43)-X par l'inter- médiaire du tryptophane. Le vecteur recombinant est mis sous contrôle quant à son expression (transcription et traduction) d'éléments génétiques appropriés selon les techniques de génie génétique habituelles. De préférence, l'expression du gène est conditionnelle, à savoir elle est amorcée par un inducteur chimique, par exemple l'IPTG (isopropyl- thio-p-D-galactoside), ou par des conditions physiques, par exemple la température. Ensuite, le gène, avec ses éléments de régulation, est introduit dans un ADN vecteur permettant l'obtention et la sélection des cellules hôtes transformées, ledit ADN vecteur étant de préfé- rence un plasmide. Les cellules transformées sont isolées selon les techniques habituelles et cultivées dans des conditions qui permettent l'expres- sion du gène afin d'obtenir la protéine hybride souhaitée. L'invention concerne également les souches de cellules hôtes contenant le vecteur recombinant défini ci-dessus. A titre d'exemple de telles souches, on citera la souche de E.coli MC 1061 contenant le vecteur recombinant préféré (plasmide 202,17) déposée à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes à Paris, le 22 octobre 1984 sous le n 1-354. Selon un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet la protéine hybride de formule: Prot-NlH-CH-C0-GRF(1-43)-X CH (I)2 dans laquelle X représente un des acides aminés cités ci-dessus et Prot représente le résidu du côté de l'acide carboxylique terminal d'une protéine porteuse. Une protéine hybride préférée est un composé de formule I ci-dessus dans laquelle Prot représente un résidu du côté de l'acide carboxylique terminal de la 3-galactosidase, un analogue, ou un fragment de cette molécule. La protéine hybride est extraite du milieu de culture ou des cellules transformées et purifiée par exemple par chromatographie. La protéine hybride de formule I ainsi obtenue est coupée par le BNPSscatole selon les techniques habituelles (H.M. Steinmann, J. Biol. Chem. 1978, 251, 8708-8720) et le dérivé GRF(1-43)-X est purifié par extraction, gel filtration et HPLC selon les méthodes connues (R. Guillemin et al., Science 1982, 218, 185-187). Selon un autre de ces aspects, la présente invention concerne le polypeptide de formule GRF(1-43)-X (II) dans laquelle X est un acide aminé choisi parmi la leucine, la valine, l'alanine ou la glycine, qui représente un intermédiaire clé pour l'obtention du GRF. L'exemple suivant illustre l'invention sans toutefois la limiter. Les détails expérimentaux des techniques de génie génétique sont décrits dans Molecular Cloning par T. Maniatis, Ed. Cold Spring Harbor Labs. USA. 1982. - Exemple 1 1.a. Préparation du gène codant pour le Trp-hGRF-OH ou dérivé Trp-hGRF(143)-X-Leu Un oligonucléotide double brin est préparé en hybridant un premier oligonucléotide de séquence 5'-OH-ACCACAGCTGG phosphorylé à son extrémité 5' terminale, avec un second oligonucléotide de séquence 5'-OH-AATTCCAGCTGTGGT. Cet oligonucléotide est ensuite fusionné avec l'ADN double brin du plasmide pUC9 (CREATIVE BIOMOLECULES, San Francisco, Ca, 94080, USA) contenant le gène codant pour le Met-GRF-0H - ouvert par action préalable de l'enzyme de restriction RsaI (figure 1). Ledit oligonucléotide vient se positionner au niveau du deuxième nucléotide du gène codant pour le GRF-OH et du nucléotide qui lui est complémentaire (figure 2). La fusion est réalisée en-incubant ledit oligonuelêotide (en excès molaire de 50 fois par rapport aux extrémités RsaI du plasmide) et le plasmide pUC9 ouvert par l'enzyme, en présence de l'ADN-ligase du bactériophage T4. Le nouvel ADN double brin ainsi obtenu contient le gène codant pour le Trp-GRF-OH. L'action de l'enzyme de restriction SalI permet précisément de disposer, après purification par électrophorèse suar gel, du fragment d'ADN contenant ce gêne et représenté sur la figure 2. Ce fragment est ensuite cloné dans Escherichia coli (souche MC 1061) en utilisant comme vecteur le grand fragment !coRI-SalI du plasmide pBR322. 1.b. Fusion du gène codant pour le Trp-hGRF-OH avec un gène codant pour un fragment modifié de la 0- galactosidase placé sous le contrMleduprcnmteur PR Le plasmide pDIA5501 (P. Leplatois et A. Danchin, Bio- chimie, 1983, 65, 317-324) qui contient le gène codant pour la - galactosidase est modifié en restituant sur ledit gène un site EcoRI, par coupure par l'enzyme de restriction SacI puis fusion avec un fragment SacI-EcoRI issu du plasmide pMC1396 (M. Casadaban et al. J. Bacteriol. (1980) 143: 971-980). Le plasmide pDIA5501 modifié contient le gène codant pour la e-galactosidase tronquée-de son extrémité C-terminale. Le plasmide obtenu sous 1.a. est digéré par les enzymes d. re-triction EcoRI et SalI; le fragment d'ADN contenant le gène cotant pour le Trp-hGRF-OH est purifié par électrophorèse sur gel. Ce fragm:,nt est ensuite incubé en présence de l'ADN-ligase du bacté- riophage T4, avec le grand fragment EcoRI-SalI issu du plasmide pDIA3501 modifié, préalablement digéré totalement par l'enzyme SalI et partiellement par l'enzyme EcoRI. Un nouveau plasmide, le plas- mide 202,17, est obtenu. Le plasmide 202,17 contient le fragment d'ADN représenté sur la figure 2. La figure 3 en donne une représentation schématique; il comprend les éléments ci-après: - éléments apportés par le fragment EcoRI-SalI du plasmide pDIA5501 p.odifié: - un fragment issu du plasmide pBR322 portant: l'origine de réplication de pBR322, le gène codant pour la résistance à l'ampicilline. - un fragment EcoRT-SalI portant: 5.le gène codant pour le r4presseur thermosensible CI 857, À le promoteur PR du bactériophage X, À la partie du gène codant pour la P-galactosidase comprise entre les nucléotides codant pour l'extrémité N-terminale de la protéine et le site de coupure de l'enzyme SacI. - un fragment SacI-EcoRI issu du plasmide pMC1396. - élément apporté par le fragment EcoRI-SalI du plasmide obtenu sous 1.a., le gène codant pour le Trp-GRF-OH. Le plasmide 202,17 porte donc un gène codant pour une protéine hybride constituée par la 0-galactosidase modifiée unie au Trp-GRF-OH et dont l'expression dépend du promoteur PR lui-même placé sous le contr8le du répresseur CI 857. 1.c. Production de la protéine hybride e-galactosidase modifiée-Trp-hGRFOH La souche contenant le plasmide 202,17 est cultivée dans 15 1 de milieu L contenant 50 pg/ml d'ampicilline, à 30 C, jusqu'à l'obtention d'une densité correspondant à 10 000 000 bactéries/ml; la culture est alors poursuivie pendant 2 à 3 heures à 42 C. La synthèse de la protéine hybride est mise en évidence par l'apparition d'une bande spécifique correspondant à la taille de la 5-galactosidase lorsque les protéines cellulaires sont analysées par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium (SDS)-polyacrylamide suivie d'une coloration au bleu de Coomassie. 1.d. Extraction et purification de la protéine hybride 0-galactosidase modifiée-Trp-hGRF-OH 20 ml de la culture bactérienne sont centrifugés. Le culot est repris dans 3 ml de tampon phosphate 100 mM à pH 7,8. Les bactéries ainsi remises en suspension sont soumises à une soni-, cation. Le lysat bactérien obtenu est centrifugé: un premier sur- nageant S1 et un culot C1 sont obtenus. Le culot C1 est repris dans 1 ml d'un détergent de type ester alkylarylique (Triton) à 0,1%; - la suspension résultante est centrifugée; un second surnageant S2 et un culot C2 sont obtenus. Le culot C2 est repris dans 0,5 ml de SDS à 1 %; la suspension résultante est centrifugée: un troisième surnageant S3 et un culot C3 sont obtenus. Le culot C3 est repris dans 0,5 ml de SDS à 1 %; la suspension résultante est centrifugée: un quatrième surnageant S4 est obtenu. Les surnageants S2, S3 et S4 sont regroupés. Leur pool (pool A) est soumis à un gel-filtration sur gel Sephadex G25 équi- libré en acide acétique à 70 %. Les fractions d'élution sont re- cueillies; une mesure de la densité optique (DO) à 280 nm en continu est effectuée. Les fractions éluant dans le volume mort de la colonne et correspondant au pic protéique sont regroupées; leur pool (pool B) contient la protéine hybride. 1.e. Coupure de la protéine hybride P-galactosidase modifiée-Trp-hGRF-OH par le BNPS-scatole La concentration en protéines du pool B est déterminée par la méthode de Bradford (Kit BIO-RAD Protein Assay). Au pool B est ajouté du BNPS-scatole (PIERCE Chemical, Co., Rockford, Il, USA) à raison de 200 mg de BNPS-scatole pour 100 mg de protéines totales; après 24 heures de contact à température ambiante, à l'abri de la lumière et avec une agitation intermittente, le pool B est soumis à une extraction renouvelée ensuite cinq fois par l'éther diéthy- lique. La phase aqueuse finale résultant de cette extraction est chromatographiée sur une colonne PERKIN-ELMER/HS-5 C18. Deux tampons (tampon A: H20 99,9 % et acide trifluoroacétique (TFA) 0,1%; tampon B: acétonitrile 99,9 % et TFA 0,1 %) sont utilisés pour préparer un gradient linéaire (de 15 % de tampon B à 80 % de tampon B) obtenu en 15 minutes avec un débit de 2 ml/min. Les fractions d'élution sont recueillies et une mesure de DO à 220 nm (spécifique de la liaison peptidique) est effectuée en continu. La courbe d'élution des fractions obtenues est repré- sentée sur la figure 4, sur laquelle on a porté en abscisses le temps d'élution en minutes et en ordonnées la densité optique DO. La droite A représente le gradient d'élution défini ci-dessus. 1.f. Caractérisation de l'hGRF-OH Les fractions d'élution,dont certaines sont regroupées, sont lyophilisées (pour éliminer le TFA) reprises par 50 pl d'eau 2587359- distillée et soumises à un dosage radio-immunologique du type RIA (RadioImmuno-Assay). Ce test RIA se fonde sur la mise en compétition de l'hGRFOH obtenu selon l'invention et de l'hGRF-OH obtenu par voie de synthèse chimique et marqué à 1'125I, en présence d'une faible quantité d'anti-corps préparés contre de l'hGRF(1-40). Il a été constaté que l'hGRF-OH obtenu selon l'invention est contenu dans les fractions recueillies entre les temps d'élu- tion 3 et 7 minutes 30 secondes, comme cela apparaît sur la figure 4 sur laquelle on a également indiqué la teneur en GRF-OH des frac- tions recueillies entre les temps d'élution 3 et 8 minutes, l'ordon- née de droite étant l'échelle correspondante (GRF-OH en pg/ml déterminé par RIA). 1.g. Activité biologique Un test d'activité biologique a été réalisé sur l'une des fractions ci-dessus. Dans ce test, 3 rats ont reçu chacun, en injection intraveineuse, 0,5 pg d'hGRF-OH selon l'invention. 3 autres rats ont reçu chacun, par injection intraveineuse, 0,5 pg de hGRF obtenu par synthèse chimique. Aux temps to (moment de l'injection), to + 2 min, to + 5 min, to + 10 min, to + 15 min et to + 30 min, un dosage de l'hormone de croissance contenue dans le plasma (recueilli par prélèvement intracardiaque) de chaque rat a été réalisé. Les courbes d'activité obtenues à partir de ces mesures indiquent que l'hGRF-OH obtenu selon l'invention induit chez le rat une réponse similaire à celle qui est induite par l'hGRF. 1l REV E N D I C A T I 0 N S 1. Procédé d'obtention de dérivés non amidés de la soma- tocrinine de formule GRF(1-43)-X, dans laquelle X est la leucine,. la glycine, la valine ou l'alanine par génie génétique, caractérisé en ce qu'il consiste à: 1) préparer le fragment d'ADN codant pour le Trp-GRF(143)-X, dans lequel X est tel que défini ci-dessus 2) insérer ledit fragment dans un vecteur contenant le gène codant pour la protéine porteuse avec les éléments génétiques nécessaires à son expression, l'insertion étant réalisée au niveau de la séquence codant pour la partie carboxylique terminale de ladite protéine porteuse; 3) transformer une cellule h8te avec le vecteur recombinant résul- tant; 4) faire exprimer le polypeptide de formule I: NH2 - Prot - CO - NH - CH - CO - GR(1-43)-X CH2 (I) NF. X = Leu, Ala, Val ou Gly; Prot = résidu de la protéine porteuse; ) récupérer ledit polypeptide de formule I et le couper au niveau du tryptophane à l'aide d'un agent oxydant pour obtenir le composé de formule GRF(1-43)-X, dans laquelle X est tel que défini ci-dessus. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le fragment d'ADN codant pour le Trp-GRF(1-43)-X est obtenu par: 1) synthèse chimique d'un oligonucléotide portant le codon du tryptophane; 2) ligation dudit oligonucléotide au gène codant pour le GRF-OH porté par un vecteur, à l'extrémité correspondant à la partie N terminale de celui-ci. - 3. Procédé selon l'une des revendicationsl ou 2, carac- térisé en ce que la protéine porteuse est la g-galactosidase, un analogue otl un fragment de celle-ci et en ce. lue la cellule hôte est Escherichia coli. 4. Vecteur recombinant codant pour la protéine hybride constitué par le GRF-OH lié par son extrémité N terminale à une protéine porteuse par l'intermédiaire du tryptophane, ladite pretéine hybride répondant à la formule: 2 Prot - CO - NH - CH - CO - GRF(1-43)-X CH H2 dans laquelle Prot et X sont tels que définis dans la revendica- tion 1. 5. Vecteur recombinant selon la revendication 4, caracté- risé en ce que la protéine porteuse est la 0-galactosidase. 6. Vecteur recombinant selon la revendication 5, caracté- risé en ce qu'il est la plasmide 202,17. 7. Protéine hybride de formule: -12 - Prot - CO - NH -CH - CO - GRF(1-43)X 2 11 CH2 - X, H (I) dans laquelle X est tel que défini dans la revendication 1, Prot est le résidu de la protéine porteuse. 8. Protéine hybride selon la revendication 7, caractérisée en ce que Prot est un résidu de la e-galactosidase. 9. Polypeptide de formule GRF(1-43)-X, dans laquelle X est la leucine, l'alanine, la valine ou la glycine. 10. Souches d'Escherichia coli contenant le vecteur recom- binant selon l'une quelconque des revendications 4 à 6. 11. Souche selon la revendication 10, telle que déposée à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes à Paris le 22 octobre 1984 sous le n 1-354.