FR 2588565 A1 19870417 FR 8515289 A 19851011 258856S - 1 - L'invention est relative à un procédé de culture "in vitro", en particulier, mais pas exclusivement de cellu- les homeothermes, minimisant les interventions manuelles et l'instrumentation lourde habituelle à cette technique, notamment lors des observations microscopiques, des analyses chimiques du milieu, des passages de la culture développée dans de plus grandes enceintes. L'invention concerne également une installation pour la mise en oeuvre de ce procédé. Bien que principalement destinée aux cellules d'organismes homéothermes, ses applications peuvent s'étendre a toutes les cultures tissulaires ou cellulaires animales ou vegetales y compris en particulier aux cultures bactériologiques notamment celles des flores anaérobies. Les techniques actuelles de culture "in vitro", en particulier de cellules provenant d'organismes homéothermes, nécessitent une étuve et l'observation de la culture ne peut se faire qu'en dehors de l'étuve, au prix de manipulations multiples, délicates et dispendieuses augmentant en parti- culier leur cout de mise en oeuvre et les risques de pollu- tion bactériologique ou virale. Des installations ont été développées pour réali- ser une observation en continu de la culture; mais il s'agit là d'un matériel spécifique, lourd et surtout très onereux constitué notamment d'une étuve batie autour des moyens d'observation. Des travaux ont été menés pour établir une culture dans une chambre de petite dimension qui est conformée pour permettre l'observation simultanée. De telles chambres sont, par exemple, décrites dans l'ouvrage de John Paul, "CELL cf TISSUE CULTURE" 5ème édition, p. 341-343 et notamment dans la revue "PHYTOPATHOLOGY" 64, 903-905 ou il est question d'une chambre perfusable perfectionnée. Cette dernière, du type SYKES-MOORE, est consti- tuée d'un boitier cylindrique plat, en deux parties, qui renferme et bride deux parois circulaires en verre séparees par un joint annulaire épais. La culture est etablie entre les plaques de verre et alimentée par perfusion a travers le - 2 - boitier et le joint en silicone. Ces chambres permettent le développement de cultures en condition de perfusion et l'observation microscopique et microcinématographique simultanee mais cette observation ne peut pas se faire en continu pendant de longues périodes, hors d'une étuve. On a donc tenté d'améliorer la durée d'observation de la culture se développant dans une telle chambre au moyen d'un dispositif de thermo-régulation de la température de la chambre. Ce dispositif, adapté à la chambre SYKES-MOORE, consiste principalement en une enveloppe annulaire disposée autour du boitier cylindrique, et dans laquelle circule notamment un fluide caloporteur. Ce dispositif présente cependant l'inconvénient d'empêcher la perfusion et la thermostation simultanée car il masque les orifices d'introduction des seringues. Par ailleurs, ce dispositif ne permet pas d'assu- rer une thermostation suffisante pour réaliser une culture. Cette derniere se développe en effet le plus souvent sur la plaque du fond de la chambre ou du pot de culture; or cette plaque subit des variations de température selon l'ambiance et l'environnement immédiat. L'invention a pour but de pallier à ces inconve- nients et notamment de permettre une croissance cellulaire dans des enceintes closes autorisant son observation et sa photographie continue, en particulier sur un microscope inverse usuel, sans infliger aux cellules des risques de pollution et des variations d'environnement, principalement thermiques, néfastes à leur croissance et à leur multipli- cation. Un autre but de l'invention est de fournir une installation pour la mise en oeuvre du procédé, supprimant la nécessité d'appareillage lourd et donc particulièrement adapté à la culture de petites ou moyennes quantités cellulaires, tissulaires ou bactériennes telles que celles manipulees en particulier dans la recherche, notamment odontologique. Un autre but de l'invention est de fournir une installation adaptée aussi bien au laboratoire de recherche -3- qu'a l'industrie pour assurer leurs besoins en particulier en ce qui concerne par exemple le suivi de la qualité d'un biomatériau quant a sa cytotoxicité. L'invention se propose en complement, mais non exclusivement, de résoudre les problèmes spécifiques concernant en particulier la constitution de "banques" de lignées primaires de cellules, la survie et l'observation de cellules post-mitotiques, la culture, l'observation et l'isolement de prélèvements bactériologiques en particulier ceux comportant une flore anaérobie plus ou moins stricte sans recourir a la lourde installation usuelle. L'invention concerne a cet effet un procédé de culture "in vitro", en particulier de cellules homéothermes,- procédé caractérisé en ce qu'il consiste a établir la cul- ture dans un pot approprié placé dans une enceinte thermo- statée indépendante, à établir dans cette enceinte d'une part une circulation de fluide nutritif alimentant le pot de culture et d'autre part a établir dans cette enceinte, autour du ou des pots de culture une circulation d'un fluide caloporteur que l'on maintient à température adaptée à l'environnement et à l'experimentation. L'invention concerne également le fait d'établir une circulation de fluide caloporteur transparent dans la chambre de thermostation et de constituer les parois de l'enceinte et du pot, principalement les parois horizon- tales, en une matière transparente, permettant l'observation continue de l'évolution de la culture, en-dehors de toute etuve. L'invention se propose également de fournir une installation pour la mise en oeuvre d'un procédé de culture "in vitro" dans des conditions particulières de micro- gravité; c'est-a-dire pour des experimentations dans l'espace au sein d'une navette ou station orbitale par exemple. L'invention concerne le fait d'établir une circu- lation de fluide caloporteur pressurise dans la chambre de thermostation, permettant en particulier, le développement de la culture dans des conditions de micro-gravite. - 4 - L'invention concerne egalement l'installation pour la mise en oeuvre du procédé caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une part, d'au moins un pot de culture, ou enceinte de culture proprement dite, et d'autre part d'une chambre thermostatée définissant de toute part autour du volume du pot sauf éventuellement à leur face supérieure, un espace destiné à la circulation d'un fluide caloporteur, transparent. Au moins les faces horizontales de la chambre thermostatée et le fond du pot sont réalisés en matière transparente de manière à permettre l'observation, en particulier optique, de la culture. L'invention concerne encore une installation dont le ou les pots de culture et la chambre de thermostation sont pourvus d'orifices apairés susceptibles d'être mis en communication avec les réservoirs de fluide nécessaire au déroulement de la culture, notamment à l'aide d'un cathéter. L'invention concerne egalement la circulation du milieu de culture entre un reservoir oxygénateur et le pot de culture; cette circulation est assurée, pour certaines applications telle que la perfusion de la culture en circuit ouvert, a partir d'une reserve de gaz sous pression servant à la fois à l'oxygénation du milieu et à sa propulsion au travers du pot de culture en fonction des nécessités de celle-ci. ' L'ensemble de l'installation proposée et de son procédé de mise en oeuvre offre en particulier, la possibi- lité d'affranchir la culture de la nécessité d'une étuve à atmosphère controlée tout en permettant son observation continue ou discontinue et donc éventuellement l'automati- sation de son pilotage sans immobiliser pour cette observation un appareil d'observation comme par exemple un microscope dans une enceinte thermostatee. De plus le dispositif de perfusion ou de circum- fusion évite les nombreuses manipulations sources de pollution bactérienne ou autre et l'augmentation du prix de revient. Enfin, l'utilisation de chambres thermostatées homothétiques de dimension croissante et de culture sur - 5 - lamelles de dimensions adéquates et pré-fragmentées permet de minimiser les interventions humaines au strict minimum lors du développment de la culture et d'éliminer les arte- facts d'origine biochimique comme les digestions enzymati- ques modifiant les parois cellulaires lors des manipulations classiques de repiquage. L'invention concerne encore l'installation comportant, autour du ou des pots de culture, un espace destiné à la circulation en circuit fermé et pressurisé, d'un fluide caloporteur transparent. D'autres caractéristiques de l'invention seront encore mises en evidence au cours de la description qui suit, eu égard aux dessins annexés, bien entendu donnés à titre purement indicatif et de ce fait n'étant pas à l'échelle, ni cotés. La figure 1 montre l'organisation générale du procédé dans le cas d'une culture a circumfusion avec oxygénation fournie par le milieu de culture. La figure 2 montre l'organisation générale du procédé dans le cas d'une culture simplement perfusée, avec recueil du milieu de culture usagé et dans sa mise en oeuvre la plus simple sans pompe de perfusion, la seule pression du gaz d'oxygenation étant utilisée pour propulser le milieu au travers du pot de culture. La figure 3 montre la partie centrale du disposi- tif périphérique de culture dit "pots de culture" dans une de ses realisations possibles ou le gazage de la culture se fait, non par dissolution dans le milieu au niveau du reservoir central, mais au niveau meme de la culture comme c'est le cas dans les procédures classiques utilisant par exemple des flacons plats type CARREL. La figure 4 représente en perspective un exemple de chambre thermostatée ouverte contenant deux pots de culture tels que précedemment décrits sur la figure 3. Les figures 5 et 6 montrent en coupe transversale et longitudinale la même "chambre thermostatée" fermée et contenant deux "pots de culture" à perfusions gaz et milieu indépendantes ainsi que le dispositif de joint et de - 6- circulation du fluide caloporteur de thermostation. La figure 7 montre une vue du dessus du meme dispositif coupe au niveau des orifices de perfusion, la coupe A étant seule valable si le dispositif est utilisé avec un gazage du milieu dans l'unité centrale telle que décrite sur les figures 1 et 2, le pot de culture ne comportant qu'une seule paire d'orifices de cathétérisme. Le procédé de culture consiste donc à utiliser une unité centrale formée d'un bain thermostats 10 de labora- toire, de puissance adaptée, dont la fonction est d'une part de thermostater le milieu de culture 11 et le gaz nécessaire à cette culture 12 provenant d'une bouteille 13 de mélange approprié tel que air + C02. Cette unité centrale comporte de ce fait en son sein les réservoirs 9 et humidificateurs 14 nécessaires selon le procédé choisi et reliés entre eux de la façon convenable par des tubulures adaptées 15, 16, 17. Dautre part1!lunite centrale fournit aux unités périphériques de culture 19 un fluide caloporteur, tel que de l'eau, à température constante, propulsé par des pompes 18 de débit convenable, ce fluide caloporteur ayant pour objet de thermostater lesdites unités périphériques 19 quelle que soit leur situation, en particulier, sur la platine d'un microscope à contraste de phase (non représen- tée), ou sur tout autre appareil d'observation, mais aussi sur la platine supérieure 8 de l'unité centrale. Le captage du fluide de thermostation se fait de préférence en un point voisin du capteur de régulation de température du bain thermostatique (non représenté) et son retour est assure par une tubulure appropriée 21. Des pompes péristaltiques 22, pousse-seringues (non représenté), ou comme sur la figure 2 la simple pression du gaz d'oxygénation sont utilises pour la perfusion du milieu de culture 11 au travers des pots de culture 23 assurant ainsi aux cellules l'apport nutritif. Cette perfusion peut se faire en circuit ouvert, avec recueil éventuel du milieu de culture et son utilisa- tion, en particulier pour l'analyse (fig. 2). Dans ce cas la - 7 perfusion peut être continue ou discontinue selon la nécessité de l'expérience. De plus, le pilotage de cette perfusion peut être régulé de façon automatique en fonction de paramètres mesures par des capteurs appropriés (non représentés) placés au niveau des unités périphériques de culture 19 et asservissant les vannes 24, 25 et pompes 22 utilisées, par l'intermédiaire de circuits electroniques convenablement adaptés et programmes. Le dispositif périphérique de culture 19 fait appel a des unités dites "chambres de culture thermostatées à perfusion". Ces chambres dont un exemple de détail est montré sur les figures 3 a 7 sont constituées principalement de deux parties: le (ou les) "pots de culture perfusables" 23 d'une part et la chambre de thermostation a circulation de liquide caloporteur 19 d'autre part. Le "pot de culture perfusable" 23 est formé, d'une part d'un fond plat 23a optiquement correct pour l'observa- tion en transmission et servant de support a la culture en mono-couche ou a la lamelle pré-fragmentée 23f sur laquelle la culture est conduite dans le cas d'une culture cellulaire et d'un recipient cylindrique ou parallélépipédique 23b soudé à ce fond ou moulé d'une pièce avec lui. Ce récipient comporte des orifices diamétralement opposés par paire 23c, deux en cas d'oxygenation du milieu de culture dans l'unite centrale, quatre en cas d'oxygénation au niveau du pot de culture, deux en position supérieure en cas de cultures anaérobies. Ces orifices sont obstrués par paire par des joints bagues colles 23d en silicone pur ou tout autre - matériau approprie et permettant au travers des orifices 23c le cathétérisme 23e nécessaire aux perfusions de milieu et (ou) de gaz. Les cotes de ces pots de culture sont fonction de la dimension et des cotes des chambres de thermostation décrites plus bas; en particulier le fond 23a doit pouvoir s'inserer entre les parois latérales 19b de cette chambre et venir reposer sur les épaulements 19c de son fond entre les - 8 - entretoises 19n. Par ailleurs le diamètre de la partie cylindrique 23b est établi de telle sorte que puisse s'etablir entre sa paroi externe et les parois internes de la chambre de thermostation une chemise de liquide de thermostation 19d suffisante. Le ou les joints annulaires 23d circonscrivant le pot au niveau des paires d'orifices de perfusion 23c sont réalisés en matière souple, élastique et atoxique comme du silicone pur, et ont une épaisseur telle qu'ils soient insérables aisément entre les parois latérales de la chambre de thermostation 19b et qu'alors comprimes entre les parois verticales du pot 23b et celles de la chambre 19b une étanchéité soit assurée au niveau des orifices de perfusion du pot de culture 23c et de la chambre thermostatée 19e tout en permettant le cathétérisme 23e et la perfusion de ce pot au travers dudit joint annulaire 23d à l'aide d'aiguilles de type hypodermique. Le pot de culture peut être realisé en verre mais également en toute autre matiere dont l'état de surface et l'absence de toxicité sont compatibles avec la culture choisie et dont les qualités optiques sont celles requises pour son observation, en particulier en microscopie optique à contraste de phase. Le bord supérieur du pot 23b reçoit un profilage tel qu'il s'adapte parfaitement au joint prévu à cet effet sur le couvercle 19f de la chambre de thermostation, notamment joint torique, hémi-torique, plan ou a simple ou double lèvre, ou toute autre combinaison couvercle de "chambre-pot" assurant une rigoureuse herméticité. La chambre de thermostation de forme cubique ou parallélepipedique en général, mais eventuellement de toute autre forme compatible avec celle du ou des pots de culture utilises est caractérisee principalement par un fond optiquement plan et transparent 19g, par des parois latérales 19b comportant des orifices 19e placés de chaque c6té en opposition deux par deux, à des niveaux propres à être en regard de ceux du pot de culture correctement --9- insere. Une des parois frontales 19i comporte dans sa partie la plus basse et en son milieu, l'orifice d'admission 19j de l'eau ou de tout autre fluide caloporteur destiné à la thermostation, en correspondance avec le diffuseur 19k. La même paroi comporte dans sa partie la plus haute l'ori- fice de sortie pour retour du fluide caloporteur 191. A la jonction des parois latérales 19b et du fond 19g sont situées deux réglettes d'épaulement 19c destinées à recevoir les pots de culture maintenant entre le fond de ceux-ci 23a et le fond de la chambre de thermostation 19g un espace creux 19m destiné à être parcouru par une lame de fluide caloporteur transparent circulant à ce niveau en régime laminaire depuis le diffuseur 19k assurant ainsi le maintien à la température convenable de la surface de culture formée par le fond du pot 23a et éventuellement la lamelle pré-fragmentée 23f. Ces deux épaulements sont éventuellement reliés entre eux, à leur face supérieure, en particulier pour les chambres parallélépipédiques destinees à recevoir plusieurs pots de culture, par des entretoises 19n destinées a positionner les différents pots de culture. Le diffuseur 19k formant également, par sa partie supérieure, entretoise frontale, assure la diffusion du fluide caloporteur en une lame horizontale thermostatante. La derniere entretoise, placee en opposition au diffuseur et positionnant dans la chambre le dernier pot de culture est placee a une distance correcte de la paroi frontale la plus proche 19o ménageant ainsi un orifice l9p permettant à la lame d'eau ou de fluide caloporteur de remonter dans la chambre et de constituer autour des parois des pots des chemises humides assurant la thermostation de leur contenu liquide et gazeux; le liquide caloporteur, après avoir constitué ces chemises calovectrices s'échappe par l'orifice supérieur 191 de la paroi frontale dite d'admission 19i avant de retourner à l'unité centrale. L'ensemble de la chambre de thermostation et du ou des pots de culture est coiffé d'un couvercle 19f optique- ment plan et transparent assurant la fermeture supérieure - 10 - étanche des deux éléments. Il comporte pour ce faire un joint périphérique l'adaptant intimement aux parois verti- cales de la chambre et des joints correctement positionnes pour assurer la fermeture supérieure du ou des pots selon les dispositions précédemment enumerees. I1 comporte de plus, et en rapport avec les parois verticales de la chambre de thermostation, les dispositifs propres à sa fermeture et à son maintien en position lors de l'utilisation de l'unité périphérique. L'ensemble fermé de la chambre de thermostation, du ou des pots de culture et du couvercle forme donc une double enceinte caracterisee par un ou des volumes perfusa- bles centraux, destinés à la culture et une enceinte périphérique ou circule l'eau ou tout autre fluide calopor- teur, afin de maintenir, quelles que soient les circons- tances, une température adéquate dans les volumes centraux; le support de culture est thermostate par la lame fluide directement de l'unité centrale tandis que le milieu nutritif et (ou) les gaz nécessaires aux métabolismes sont maintenus en température par les chemises humides assurant autour des pots le retour du fluide caloporteur vers l'unite centrale. L'ensemble de ce dispositif ainsi fermé permet également la réalisation de culture dans des circonstances particulières de micro- gravité. L'enceinte périphérique autour du ou des pots de culture forme un espace étanche et la circulation du fluide caloporteur s'effectue dans un circuit fermé et pressurisé. L'ensemble de ce dispositif est également carac- térisé par ses propriétés optiques, permettant, au travers du couvercle, du milieu de culture, du fond du pot, de la lame d'eau ou de fluide caloporteur et du fond de la chambre de thermostation une observation, notamment optique, du processus de culture. Bien entendu l'invention n'est pas limitee aux exemples d'exécution cidessus décrits et représentés pour lesquels on pourra prévoir d'autres variantes sans pour cela sortir du cadre des revendications annexees, ainsi que par - il - exemple, la nature et la forme des pots de culture qui peut varier dans de larges proportions, de mime que leur organisation interne liée à la sorte d'utilisation que l'on en désire faire. - 12 - -REVENDICATIONS- 1.- Procédé de culture "in vitro", en particulier de cellules homéothermes, dans lequel on place des cellules dans une enceinte thermostatée avec une alimentation continue en fluides nutritifs, caractérisé en ce qu'il consiste a établir une culture dans une enceinte centrale dite "pot de culture" (23), cette enceinte étant elle-meme placée dans une enceinte externe thermostatée (19) indépendante, à établir d'une part, dans la double enceinte ainsi constituée une circulation des fluides nutritifs necessaires a la culture et, d'autre part, autour du pot (23) et à l'intérieur de la chambre de thermostation (19), une circulation de fluide caloporteur que l'on maintient à une température adaptée a l'environnement et à l'experi- mentation. 2.- Procédé de culture "in vitro" selon la revendication 1, caractrerise en ce qu'il consiste a établir une circulation d'un fluide caloporteur transparent dans la chambre de thermostation (19) et à constituer les parois horizontales (19f, 23a, 23f, 19g) de la chambre et du pot en une matiere transparente et pour certaines (23a, 23f) atoxiques, permettant l'observation continue de l'évolution de la culture en-dehors de toute étuve. 3.- Procédé de culture "in vitro" selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caracterise en ce qu'il consiste a établir une circulation de fluide calopor- teur pressurisé dans la chambre de thermostation (19) permettant, en particulier, le développement de la culture dans des conditions de micro-gravité. 4.- Installation pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une part d'au moins un pot de culture (23), d'autre part d'une chambre thermostatée (19) définissant de toute part, sauf éventuellement a leur surface supérieure, un espace destiné a la circulation d'un fluide caloporteur provenant de et retournant à une unité centrale de thermostation. 5.- Installation selon la revendication 4, - 13 - caractérisée en ce qu'au moins les faces horizontales de la chambre thermostatée: couvercle (19f) et socle (19g) et le fond du pot (23a), sont réalisées en matière transparente de manière a permettre l'observation, en particulier optique, de la culture. 6.- Installation selon l'une quelconque des revendications 4 et 5 caractérisée en ce que le pot de culture (23) et la chambre de thermostation (19) sont pourvus d'orifices apairés (23c et 19e) susceptibles d'être mis en communication avec les réservoirs de fluide nécessaire au déroulement de la culture, notamment a l'aide d'un cathéter, un joint étant interposé a chaque fois entre la paroi externe du pot (23b) et la paroi interne de la chambre (19), ce joint étant réalisé en toute matière élastique propre a assurer d'une part l'étanchéité entre pot et chambre thermostatée et d'autre part entre chambre thermostatée et l'extérieur. 7.- Installation selon l'une quelconque des revendications 4 a 6 caractérisée par un couvercle transpa- rent (19f) amovible assurant la fermeture étanche du pot après son inoculation et la fermeture, également étanche, de la chambre de thermostation permettant ainsi la circulation continue autour du pot du fluide caloporteur thermostatant. 8.- Installation selon la revendication 7, caractérisée en ce que la circulation du fluide caloporteur autour du ou des pots s'effectue au moyen d'un circuit fermé et pressurise. 9.- Installation selon l'une quelconque des revendications 4 a 8 caractérisée en ce que la circulation du milieu de culture entre un réservoir oxygénateur et le pot de culture est assurée, pour certaines applications, telle que la perfusion de la culture en circuit ouvert, à partir d'une réserve de gaz sous pression servant a la fois à l'oxygénation du milieu et à sa propulsion au travers du pot de culture en fonction des nécessités de celle-ci. 10.- Installation selon l'une quelconque des revendications 4 a 9 caractérisée en ce que le pot de culture (23) peut comporter un double fond amovible (23f) - 14 - formé d'une lamelle de verre ou de toute autre matiere compatible avec l'adhérence cellulaire, éventuellement pré-fragmentée par un réseau de rainures perpendiculaires, permettant le repiquage de cultures cellulaires confluentes, soit directement dans des pots de dimension homothétique multiple, soit après fragmentation, dans des pots de taille identique évitant de recourir pour ces repiquages à des digestions enzymatiques modifiant la composition de la paroi cellulaire. 11.- Installation selon l'une quelconque des revendications 4 à 9 adaptée à la culture des flores microbiennes anaérobies soit sous vide, soit sous atmosphère gazeuse appropriee, en milieu liquide ou sur gel. 12.- Installation selon l'une des revendications 4 a 10 caractérisée en ce que le pot de culture (23) peut être aménagé de façon a permettre des tests standard de biomaté- riaux mis en présence des cultures test par tout dispositif approprié (logettes, films d'Agar, ou de Collagene, filtres de type Milipore, etc...).