FR 2585724 A1 19870206 FR 8511795 A 19850801 La présente invention concerne un kit de synthèse enzymatique de nucléotides triphosphatE (NTP) et un procédé de préparation de ces NTP marqués en a, ou en y par des isotopes 32p ou 35S. Par NTP marqués en a, e ou y on entend des nucléosides triphosphates, ou leurs dérivés dont un des trois phosphates ( a, B ou y) ( cf. Figure)a été substitué par un groupement porteur d'un isotope radio- actif 32po4 ou 35SPo3. Les nucléotides triphosphates et leurs dérivés marqués sont utilisés pour de très nombreuses réactions de marquage, des acides nucléiques, ARN et ADN, ainsi que des protéines. Les analogues phosphorothioates des nucléosides ont été utilisées dans un grand nombre (soixantaine) de réactions de phosphorylation des acides nucléiques et des protéines (cf. Eckstein (1983) Angew. Chem., 22, 423439), ainsi le champ d'application des nucléotides marqués est extrêmement vaste; on prévoit son extension en médecine et dans la pratique clinique. La présente invention propose une prépara - tion générale pouvant satisfaire toutes les demandes en ( a _ 32p), (32p), et (Y - 32P)NTP ainsi qu'en ( a - 35S), ( B- 35S), et (Y-35S)'NVLP indé- pendamment de la nature du composé, c'est-à-dire indépen- damment de la base ( les bases A, C, G, T, U, les bases modifiées, les bases rares), qu'il s'agisse des dérivés méthylés, bromés, fluorés, par exemple, du sucre ou que le-nucléotide soit un ribo- ou un déoxyribonucléQtide. L'absence de spécificité permet d'utiliser le même nucléotide d'un bout à l'autre de la chaîne réac- tionnelle, ce qui distingue l'invention des approches enzy- matiques connues, dont la spécificité limitée exigeait la présence d'ATP comme donneur de phosphate; ainsi la préparation enzymatique selon l'invention permet d'éviter l'utilisation systématique d'ATP au cours de différentes étapes (cf. R.A. Johnson et Walseth F. (1979), Schendel et Wells, (1983) J.B.C. 248, 8319-21). La même préparation enzymatique permet l'incorpora- tion soit d'un 32p orthophosphate, soit d'un 35S thiophos- phate. Le marquage au 35S des NTP thiophosphates est particulièrement intéressant. En effet, l'isotope 35S possède un temps de 1/2 vie relativement long (90 jours) et une énergie beta dix fois plus faible (0, 167 MeV) par rapport à l'isotope 32p d'énergie beta (1,7 MeV) et de temps de 1/2 vie de 15 jours. Cette faible radioactivité des composés thiophosphoryles offre l'avantage d'une faible nocivité, ils sont donc d'un maniement plus aisé et place ce marquage dans une catégorie intermédiaire entre le matériel radioactif et non radioactif. A 3RVIATIOS ABREVIATIONiS Adenine f NH; I1 I I OH */3o( NS %tN(.. I ' I I* I O- O- O- o--P-o-P-o-P.-o- O 0 0 0 ' C H m c OH X Rlbose (X = OH) ou Deoxyribose (X = H) J Adenosine monophosphste oi---J deoxyadenosine monophosphale (AMP or dAMP) Adenosine diphosphate ou 1 deoxyaclenosine diphosphaie (ADP or dADP) Adenosine triphosphale oU! deoxyadenosine triphosphate (ATP or dATP) FORMULES DES NUCLEOSIDES MONODI- et TRIPHOSPHATE - NTP Adénosine w dnoxvadanosirin De plus les ADN et les ARN thiosubstitud présentent une relativement plus importante résistance aux enzymes de dégradation par rapport aux phosphates correspondants. La faible énergie dissipée par l'isotope 35S rendant les phénomènes de radiolyse pratiquement inexistants, ainsi que la résistance aux nucléases des acides nucléiques thio- substitués permet l'isolement d'ADN et d'ARN marqués, intact, in vivo comme in vitro (cf. Biggin et coll. (1983) PNAS USA , 3965; A. Radford (1983) Anal. Biochem. 134, 269-271). Le marquage des ARN synthétisés au cours de la transcription peut s'effectuer en position 5' terminal au moyen de ( y- 32P)NTP ou (-y -35S)NTP. Cependant, le pro- blame majeur concerne la détection des ARN nouvellement syn- thétisés à cause des réactions de transfert du phosphoryl en y du NTP sur les ARN préexistants, catalysés par des kinases (Washington L.D. et Stallcup M.R. (1982) Nucl. Ac. Res. 10, 8311-8322). Par contre l'utilisation de (y -35S)NTP permet d'effectuer le marquage 5' terminal des ARN nouvellement initiées en excluant le transfert du phosphate radioactif. De plus, la présence d'un atome de soufre rend possible l'isolement des ARN néosynthétisé par chromatographie d'affinité sur colonne organomercurial (Hg agarose ou Hg sépharose par exemple) (Stallcup M.R. et Washington L.D. (1983) J. Biol. Chem. 283, 2803-2807). La préparation des nucléotides (y -35S)NTP ouvre de larges perspectives dans l'étude de la synthèse des ARNs, en simplifiant une détection et leur purification. Enfin, dans la séparation de matériel marqué au 35S par les techniques électrophorétique ou chromatographiqu% la résolution des images d'autoradiographie est améliorée car le 35S produit une diffusion radioactive moins importante que le32P lors de sa désintégration. Par ailleurs, les résultats montrent que les prépara- tions des NTP marqués obtenues selon l'invention sont les plus appropriées pour les études biologiques de la transcrip- tion et de la réplication, nick translation, kination et pour les hybridations utilisant les protocoles de Southern, Norther, dot-blot ou cyto-blot (cf. Brahms J.G., Dargouge 0., Brahms S., Ohara Y., et Vagner V. , (1985) J. Mol. Biol. 181, 455-465). Le kit de préparation enzymatique de nucléotides triphosphates ou de leurs dérivés (NTP) marqués en a, ou y, selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comporte un ou plusieurs des moyens suivants: a) un moyen pour fixer en y sur un NDP 5' un phosphoryl déterminé, b) un moyen pour déplacer le phosphoryl déterminé du NTP 5', o ledit phosphoryl est en position y, sur un NMP 3' o ledit phosphoryl se fixe en 5', c) un moyen pour déphosphoryler en 3' le NDP 5' 3', d) un moyen pour fixer deux phosphoryls en 5' ( et y) du NMP 5', et e) un moyen pour déplacer le phosphoryl déterminé du NTP 5' (cf.a) o ledit phosphoryl est en y sur un NMP 5' o ledit phosphoryl se fixe en et phosphoryler le NDP 5' résultant en y. Par phosphate déterminé, on entend un phosphate porteur d'un isotope radioactif en particulier 32p ou 35S thiophosphate. Ce kit permet en particulier la synthèse des NTP marqués au 32p ou au 35S en y en une seule manipulation, dans un temps très court, de l'ordre de 90 minutes. Le marquage en a s'effectue avec trois étapes sup- plémentaires, soit en une journée et demie. Le marquage en e s'effectue en une étape supplé- mentaire, soit en 5 heures 10 minutes. On obtient ainsi en 90 minutes ( y), une journée et demie ( a) et 5 heures 10 minutes ( B), par des manipulations simples, un produit brut marqué avec une excellente activité spécifique. Le kit peut se présenter sous la forme d'un ensemble de réactifs enzymatiques indépendants nécessaire chacun à l'étape de marquage ou à une étape de la chaine réaction- nelle de marquage d'un NTP. Chaque réactif est congelé rapidement, par exemple dans l'azote liquide et conservé à environ -70 C. Il est décongelé au moment de l'emploi. La présente invention concerne également un procédé de préparation de nucléosides triphosphates ou de leurs dérivés marqués en a, B ou y, qui comporte une étape de phosphorylation enzymatique en y d'un NDP 5' par un agent de phosphorylation marqué, en donnant naissance au NTP 5' marqué en y et, éventuellement, une ou plusieurs étapes ultérieures permettant le marquage en a ou en. Sa mise en oeuvre peut être réalisée avec un kit selon l'invention. Ainsi, la présente invention concerne un procédé de préparation enzymatique de nucléoside triphosphate ou de leurs dérivés (NTP) marqués en y, caractérisé en ce que l'on traite à température ambiante un NDP 5' par un moyen pour fixer en y sur un NDP 5' un phosphoryl déterminé en présence d'un agent de phosphorylation marqué, ce qui donne naissance au NTP 5'marqué en y. Pour marquer en y un NTP, il suffit donc, pour réaliser l'étape NDP 5' RE1 (- P)NTP 5' (1) o P représente le marquage du résidu phosphoryl, de mettre en présence le réactif enzymatique capable de réaliser la phosphorylation en y d'un NDP 5' (nucléotide diphosphate en 5') avec le NDP 5' portant la base du nucléo- tide triphosphate voulu et l'agent de phosphorylation marqué. Comme réactif enzymatique selon l'invention, on utilise un réactif comportant, dans un tampon appro- prié, les enzymes: Glycérol-Phosphate Deshydrogénase Triose-Phosphateisomérase Glycéraldehyde-3-P-Deshydrogénase 3-P-glycérate kinase Lactate Deshydrogénase En particulier, on peut utiliser le réactif (RE 1) de composition: Tris-Cl pH 9 105 mM MgCl1 25 mM DTT 12,5 mM Spermine 4 mM Lglycérophosphate 0,25 mM NAD+ 1 mM Pyruvate (Na) 2 mM Glycérol-Phosphate-Deshy- drogénase 70 gg/ml Triose-P-isomérase 0,7 gg/ml G-3-PhosphateDeshydrogénase 70 gg/ml 3-Phosphate-glycérate kinase 34,5 gg/ml Lactate Deshydrogénase 34,5 gg/ml La réaction s'effectue à température ambiante et dure environ 1 heure 30 minutes. Comme agent de phosphorylation, on peut utiliser tout orthophosphate marqué ou un thiophosphate marqué, par exemple H3 32P04 Na3 P4, Na3 3 p04, Na 3 PO3 35S. La présente invention concerne également un procédé de préparation des NTP ou de leurs dérivés marqués en a caractérisé en ce que: a) dans une première étape, on traite à température ambiante un NDP 5' par un moyen pour fixer en y sur le NDP 5' un phosphoryl déterminé en présence d'un agent de phosphorylation marque, dans des proportions adéquates, ce qui donne naissance au NTP 5' marqué en y, b) on chauffe la solution résultante environ 2 minutes à environ 90 C, c) dans une seconde étape on traite une quantité adéquate du NMP 3' de même base que le NDP 5' de départ par un moyen pour déplacer le phosphoryl déterminé du NTP 5', o ledit phosphoryl est en position y, sur le NMP 3', o ledit phosphoryl se fixe en 5' en pré- sence de la solution résultante de b), ce qui donne naissance au NDP 3'5' marqué en 5', d) dans une troisième étape on traite la solution résultante de la seconde étape contenant le NDP 3'5' marqué en 5', par un moyen pour déphosphoryler en 3' un NDP 5' 31, dans des proportions adéquates, ce qui donne naissance au NMP 5' marqué en a, e) dans une quatrième étape, on traite la solution résultant de la troisième étape, contenant le NMP 5' marqué par un moyen pour fixer deux phosphoryls en B et y d'un NMP 5', dans des proportions adéquates, ce qui donne naissance au NTP 5' marqué en a.. Pour réaliser le marquage en a, on réalise donc tout d'abord le marquage en y (étape 1), puis trois étapes supplémentaires sont nécessaires, auxquelles corres- pondent trois réactifs enzymatiques. Après l'étape de marquage en y (étape 1), on réalise l'étape suivante: yP)NTP + NMP 3' RE2 ( P - 5')NDP 5', 3' (2) Le réactif enzymatique RE2 déplace le résidu phosphoryl marqué du ( y- P)NTP sur la position 5' d'un NTP 3' ce * qui donne naissance & un ( P - 5')NDP 3' 5' (nucléotide diphosphate en 3' et 5') marqué en 5', ceci en mélangeant à la solution résultant de l'étape 1 une quantité adéquate de RE2 et de NMP 3' (nucléotide monophosphate en 3') de même base que le NTP de départ. Il est préférable de désactiver la solution résultant de l'étape 1 par un chauffage, par exemple pen- dant environ 2 minutes à environ 90 C. Comme réactif RE2 selon l'invention, on utilise la polynucléotide kinase T4 ayant une activité de 5 à unités. Après avoir laissé agir le RE2, par exemple de 3 à 16 heures, on réalise l'étape * RE3 * ( P-5')NDP 3'5' - P NMP 5' (3) ou RE3' Le réactif enzymatique RE3 ou RE3' déphosphoryle le NDP 3'5' en 3', ceci en ajoutant à la solution résultant de l'étape 2 une quantité adéquate de réactif RE3. Comme réactif enzy- matique pour l'étape 3, selon l'invention, on utilise l'en- zyme nucléase P1 à pH acide ou alcalin suivant que le nu- cléoside est déoxy ou ribo-nucléoside. Cet enzyme est en solution dans les tampons suivants: - pour les ribonucléotides, la nucléase P1 se pré- sente en solution dans Tris-Cl ( 10 gg de nucléase dans Tris-Cl 50 mM pour 25 1 de réactif pH 9,0) (RE3), - pour les déoxyribonucléotides, la nucléase P1 est en solution dans de l'acide acétique et de l'acétate de so- dium, (10 Fg de nucléase P1 dans 280 mM d'acide acétique et 20 m" d'acétate de sodium pour 25 ml de réactif pH 5,0) (RE3'). On réalise alors l'étape P NMP 5' RE4 (= -*P)NTP (4) S Le réactif enzymatique permet la fixation de deux résidus phosphoryl sur le NMP 5' marque, ceci en ajoutant une quantité adéquate de RE4 à la solution résultant de l'étape 3. Comme réactif, pour l'étape 4, on utilise un réactif comportant, dans un tampon approprié, les enzymes: Pyruvate kinase NMP kinase (Nucléoside Monophosphate kinase) (NDP kinase (Nucléoside Diphosphate Kinase)) On utilise le réactif (RE4) ayant la composition suivante: Tris-Cl pH 8 50 mM MgCl 10 mM DTT 5 mM PEP 4 mM KCl 4 mM Pyruvate kinase 600 gg/ml NMP kinase 2,5 gg/ml (NDP kinase 500 gg/ml) La synthèse est réalisée environ 4 heures après addition du réactif RE4, pour tous les nucléotides, après 1 heure pour 1'ATP ou le dATP. La présente invention concerne également un procédé de préparation des NTP ou de leurs dérivés marqués en, caractérisé en ce que: a) dans une première étape, on traite à température ambiante un NDP 5' par un moyen pour fixer en y sur un NDP 5' un phosphoryl déterminé en présence d'un agent de phosphorylation marqué, dans des proportions adéquates, ce qui donne naissance au NTP 5' marqué en y, b) on chauffe la solution résultante 2 minutes à environ 90 C, c) dans une seconde étape, on traite en quantités adéquates, du NMP 5' de même base que le NDP 5' de départ par un moyen pour déplacer un phospho- ryl d'un NTP 5', o ledit phosphoryl est en y sur un NMP 5' o ledit phosphoryl se fixe en B et phosphoryler le NDP 5' résultant, en présence de la solution résultant de b) contenant du NTP 5' marqué en y, ce qui donne naissance au NTP 5' marqué en B. Pour réaliser le marquage en B d'un NTP, on réa- lise donc d'abord le marquage en y, puis une étape sup- plémentaire est nécessaire, que l'on réalise avec un réac- tif enzymatique RE4'. * RE4' * ( y- P)NTP + NMP-5' -RE4 ( - P)NTP (4') Comme réactif enzymatique,pour cette étape, on utilise un réactif comportant dans un tampon approprié, les enzymes: Nucléoside monophosphate kinase Pyruvate kinase. On utilise le réactif (RE4') ayant la composition suivante: Tris-Cl pH 8 25 mM MgCl 5 mM KCl 2 mM DTT 2,5 mM PEP 2 mM et, Nucléoside Monophosphate kinase 1,25 mg/ml Pyruvate kinase 300 gg/ml Cette étape comporte deux stades: (y - P)NTP + NMP 51 PKnae NDP 5' + - P)DP 5' PEP pyruvate kinase pyruvate (y- P)NTP + NTP et l'on a pu distinguer la réactivité des deux enzymes qui agissent successivement, comme cela apparaîtra dans les exemples. Pour déceler la fin de la réaction enzymatique, à chaque étape, et définir le temps de réaction adéquat, on peut faire des chromatographies sur PEI-cellulose. La synthèse des NTP marqués au 3 P se mène de la même façon que celle des NTP marqués au 35S, à l'agent de phosphorylation près. Ainsi, la synthèse des ( y- 35S)NTP, ( - 35S)NTP et ( a-3 S)NTP consiste à incorporer un ortho- phosphate dont une molécule d'oxygène a été remplacée par une molécule de soufre (S). HOi-O--O-LO Aie MOOO Ait o!to!!o*o , ATPS 5 OHO ADPaS OH OH HO-_ -OAd-OAid ATPp S OH OH 0 s o 1-01 fi Ade O ia Ade o-P-o-P-o---., O HO-P-o-P-O.o 0 0 AT PY S OH OH ADPA S OH OH FORMULES DE L'ATP ET L'ADP PHOSPHOROTHIOATES S-ATP, S-ADP. Les préparations sont identiques aux préparations effectuées pour le marquage au 32p. La différence est que l'agent phosphorylant marqué au 32p, par exemple H 32po4, normalement utilisé pour la première étape, est remplacé par une quantité équivalente de Na3PO35S: Na3PO 35S + NDP RE1 y - 35S)NTP. 3 3 Le produit final de chaque marquage, marqué en y, en B, ou en a, résultant de la dernière étape peut être purifie par chromatographie, liquide de haute performance sur une petite colonne jetable. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples ci-après et sur la figure annexée. EXEMPLE 1 Synthèse de ( y-32P)UTP On décongèle & température ambiante un aliquot du réactif enzymatique (RE1) (48 Al) et on ajoute 2 Il du nucléotide-5'diphosphate UDP (2,5 mM). On mélange soi- gneusement: Puis on ajoute:: 50 il (H3 32p 04 dilué dans : 501 (3 0 4 d dn H20) RE1 48 il UDP 2 il 32p 50 1 i correspondant à 5 mCi maximum (par TOTAL 100 il exemple de 50 gCi à 5 mCi). La réaction s'effectue à température ambiante pendant 1 heure 30 et est contr8ôlée par chromatographie sur PEI- cellulose (KH2PO4 0,5 M pH 4). Le produit final peut être soit purifié sur colonne - jetable C 18, équilibrée avec CH30H et TEAB O.1 M. Le produit est élué avec 1 ml TEAB 0. 1 M, -MeOH 80 %, après lavage avec 2 ml TEAB 0.1 M (durée de l'opération: 15 minutes), soit utilisé sans purification après avoir chauffé la solution résultant pendant 2 minutes à 90 C. EXEMPLE 2 On a réalisé ainsi, la synthèse de (y -32P)ATP et ( y- P32p) CTP, GTP dans les mêmes conditions que pour l'exem- ple 1, à partir de ATP, CDP ou GDP. On a contrôlé la réaction par chromatographie sur PEI-cellulose. La solution résultante peut être purifiée de la même façon qu'à l'exemple 1. EXEMPLE 3: Synthèse de ( -32P)UTP On ajoute 20 Al du réactif enzymatique (RE2) préalablement décongelé (Polynucléotide kinase T4, 5-10 unités d'après les unités de Richardson (1965) PNAS USA 54, 158-163) et 15 mM de l'UMP 3', après avoir chauffé la solution résultant de l'exemple 1 sans purifi- cation pendant 2 minutes à 90 C. On laisse agir 3 à 16 heures, puis on ajoute pendant 20 minutes 25 gl du réactif enzymatique (RE3) décongelé au dernier moment. La synthèse se termine 4 heures après l'additon de 150 Il du réactif enzymatique (RE4) préalablement décon- gelé. On a testé chaque étape par chromatographie sur PEI- cellulose. La solution résultante peut être purifiée comme décrit dans l'exemple 1. EXEMPLE 4 La synthèse se mène comme aux exemples 1 et 2, mais on utilise le réactif enzymatique 3' (25 4l) au lieu de 3 puisqu'il s'agit d'un déoxyribonucléotide. Pour ATP comme pour dATP, la synthèse est terminée 1 heure après l'addition du réactif enzymatique(RE4) 4, d'après une chromatographie sur PEI-cellulose. EXEMPLE 5 Synthèse de __i32P)ATP On procède de la même façon que dans l'exemple 1, la réaction se déroule à 23 C pendant 1 heure 30. Après avoir chauffé la solution obtenue à l'exemple 1 ( 2 minutes à 90 C) , le volume est doublé par addition du réactif enzymatique (RE4') et de nucléotide '-monophosphate AMP 5' (2 il d'une solution 2,5 mM). La réaction est complète au bout de 3 heures 30, à faible force ionique cosume le montre la chromographie sur PEI-cellulose. La deuxième étape a été séparée en deux parties pour montrer l'évolution des produits formes, et les produits décelés par chromatographie sur PEI- cellulose (tampon formiate pH 3.4): Avec la NMP kinase seulement, au bout de 1O minutes, on décèle la présence de ( -32p)ADP et de ( y -32p)ATP, au bout d'une heure, seule la présence de ( - 32 P)ADP est détectée. Avec les deux enzymes, au bout d'une heure, on décèle ( -32P)ATP seul. EXEMPLE 6: On a procédé de la même façon qu'à l'exemple 5, pour ( _-32P)UTP. La réaction a été vérifiée par chromato- graphie et dure 3 h 30. EXEMPLE 7: Préparation du chlorure de thiophosphoryl On a utilisé la méthode KNOTZ (1949 Osterr. Chem. Ztg 50, 128-129). PSCl3 le chlorure de thiophosphoryl peut être obtenu avec un excellent rendement par action directe de S et PC13 en présence du catalyseur AlCl3 sans application de pression suivant la réaction: PCl 3 AlC! 33 PCl3 + 3AlC3t PCl3. AlCl3 anhydre PC13.A1C13 composé d'association moléculaire, en présence du soufre, se combine exothermiquement en régé- nérant le catalyseur. PCl3 AiCl3 + S - PSC13 + AlC13 La réaction a lieu dans les conditions anhydre, dans un bain-marie d'huile o on peut chauffer d'abord à 40 50 C pour obtenir la dissolution du S. Ensuite, cette réaction exothermique atteint 120 C. La durée est de 5 à 10 minutes, AlC13 se dépose. Ensuite on distille le PSCl3. Nous avons réalisé la synthèse et l'appareil permettant la synthèse de PSC13 en microquantité et sa microdistillation. Comme proportions, on a utilisé 0,02 g AlCl3 ajouté à 1 g PCl3 + 0,24 g S en poudre. On chauffe. Après environ 10 minutes, la réaction est terminée. Les produits de réaction sont distillés à 124 C. EXEMPLE 8: Preparation du Monothiophosphate anhydre (Na 3P3O S) 3z--3- Selon la méthode décrite par S.K. YASUDA et J.L. LAMBERT (1954) J.Am. Chem. Soc. 76, 5356, on a réalisé la synthèse de Na3PO3S par la réaction: H20 PSC13 + 6 NaOH > Na3P03S + 3 NaCl + 3 H20 Les réactifs: NaOH PSC13 sont chauffés sous reflux à température constante 105 C pour 15 minutes ou plus. En fin de réaction, la couche de PSCl3 au fond du ballon disparaît, le produit est précipité en refroidissant le mélange dans un bain d'eau et de glace. Le précipité est filtré puis repris dans un volume minimum d'eau à 45 C. Le produit est recristallisé en ajoutant & tempéra- ture ambiante du méthanol. Apres la dernière recristallisation, le produit est séchéepuis mis sous agitation pendant un heure dans du méthanol anhydre, à la suite de quoi il est séché minutes au four à 100 C. Le produit thiophosphate anhydre est conservé à l'abri de l'humidité à -20 C. Analyse du Na3PO3 S Le spectre Raman du produit obtenu au laboratoire en solution dans Tris-Cl 50 mM pH 9.0 présente une bande à 434 cm1 que l'on retrouve dans le spectre du PSCl3 carac- téristique de la vibration P - S. EXEMPLE 9: Synthèse de ( y-35S), ( -35S), ( C- 35S)NTP On remplace, dans la première étape qui fait inter- venir le réactif enzymatique 1, l'acide ortophosphorique H3 PO marqué au 32p par une quantité équivalente de 3 4 35 Na3 PO3 S marqué au S, et on opère de la même façon qu'aux exemples 1 à 6. Afin de suivre l'évolution de la réaction, les essais ont été réalisés en présence d'ADP-14C, et de thio- phosphate synthétisé au laboratoire. 1) la figure 1 présente la cinétique comparée de la synthèse d'ATP à partir d'ADP-14 C en présence de Na3PO3S et de Na3PO4 dans différentes conditions. Sur cette figure, on a représenté en fonction du temps (en heures) ATP x 100 pour; ATP + ADP Na3PO4 dans H20 O Na3PO4 dans HCl pH 4,0 O Na3PO3S dans H20 O Na3PO3S dans HC1 pH 4,0. La vitesse initiale de la réaction est diminuée en présence de Na3P03S mais le maximum d'incorporation est la même dans les deux cas. 2) On a procédé à l'identification des produits synthétisés en fonction du temps par chromatographie sur HPLC et sur PEI cellulose dans différentes conditions. Les différents tampons utilisés pour diluer Na3P03S ne semblent pas influencer la synthèse et la proportion d'ATP(S) synthé- tisé au bout de 2 heures indique une bonne stabilité du Na3P3O S dans le milieu réactionnel. 3 3 REVENDICATIONS 1. Kit de préparation enzymatique de nucléosides tri- phosphates NTP et dNTP ou de leurs dérivés, non spécifique du nucléoside (base et sucre), pour le marquage en a, i, ou y, caractérisé en ce qu'il comporte un ou plusieurs des moyens suivants: a) un moyen pour fixer en y sur un NDP 5' un phosphate déterminé, b) un moyen pour déplacer le phosphoryl déterminé du NTP 5', o ledit phosphoryl est en position y, sur un NMP 3' o ledit phosphoryl se fixe en 5', c) un moyen pour déphosphoryler en 3' le NDP 5' 3', d) un moyen pour fixer deux phosphoryls en 5' du NMP 5', et e) un moyen pour déplacer le phosphoryl déterminé du NTP 5', o ledit phosphoryl est en y sur un NMP 5' o ledit phosphoryl se fixe en e et phosphoryler le NDP 5' résultant. 2. Kit de préparation enzymatique selon la revendica- tion 1, caractérisé en ce qu'il comporte, pour le marquage en y, le moyen défini en a). 3. Kit de préparation enzymatique selon la renvendica- tion 2, caractérisé en ce qu'il comporte en outre, pour le marquage en a, les moyens définis en b), c) et d). 4. Kit de préparation enzymatique selon la revendi- cation 2, caractérisé en ce qu'il comporte en outre pour le marquage en e, le moyen défini en e). 5. Kit de préparation enzymatique selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le moyen défini en a) comporte un réactif enzymatique incluant: Glycérol-3-Phosphate Deshydrogénase Triosephosphate isomérase Glycéraldéhyle-3-Phosphate Deshydrogénase 3-Phosphoglycérate kinase Lactate Deshydrogénase 6. Kit de préparation enzymatique selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le moyen défini en a) est un réactif enzymatique ayant la composition suivante: Glycérol3-Phosphate Deshydrogénase 70 gg/ml Triosephosphate isomérase 0,7 gg/ml Glycéraldehyle-3-Phosphate Deshydrogénase 70 gg/ml 3-Phosphoglycérate kinase 34,5 gg/ml Lactate deshydrogénase 34,5 gg/ml Tris HCl pH 9 105 mM MgCl2 25 mM DTT 12,5 mM Spermine 4 mM L-Glycérophosphate 0,3 mM NAD 1 mM Pyruvate (Na) 2 mM 7. Kit de préparation enzymatique selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le moyen défini en b) est un réactif enzymatique incluant: Polynucléotide kinase T4 (dépourvue d'activité 3' -phosphatase) 3' -Nucléotide monophosphate. 8. Kit de préparation enzymatique selon la revendi- cation 7, caractérisé en ce que le moyen défini en b) est un réactif enzymatique ayant la composition suivante: Polynucléotide kinase T4 0,250,5 u/gl (dépourvue d'activité 3' -phosphatase) 3' -Nucléotide monophosphate 15 mm 9. Kit de préparation enzymatique selon l'une des des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le moyen défini en c) est un réactif enzymatique comportant la nucléase P1 dans un tampon approprié. 10. Kit de préparation enzymatique selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le moyen défini en d) est un réactif enzymatique comportant, dans un tampon approprié les enzymes: Pyruvate kinase NMP kinase NDP kinase 11. Kit de préparation enzymatique selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le moyen défini en d) est un réactif enzymatique ayant la composi- tion suivante: Tris-Cl pH 8 50 mM MgCl2 10 mM MC2 DTT 5 mM PEP 4 mM KCl 4 mM Pyruvate kinase 600 gg/ml NMP kinase 2,5 mg/ml NDP kinase 500 gg/1 12. Kit de préparation enzymatique selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le moyen défini en e) est un réactif enzymatique comportant dans un tampon approprié, les enzymes: Nucléotidemonophosphate- kinase Pyruvate kinase 13. Kit de préparation enzymatique selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le moyen défini en e) est un réactif enzymatique ayant la composi- tion suivante: Pyruvate kinase 600 gg/ml NMP kinase 2500 gg/ml (NDP kinase 510 gg/ml) Tris HCl pH 8-7,8 50 mM MgCl2 10 mM DTT 5 mM KCl 4 mM PEP 4 mM 14. Procédé de préparation enzymatique de nucléoside triphosphate (NTP, d-NTP) ou de leurs dérivés marqués en y, caractérisé en ce que l'on traite à température ambiante un DNP 5' par le moyen défini à la revendication la) en présence d'un agent de phosphorylation marqué, ce qui donne naissance au NTP 5' marqué en y. 15. Procédé de préparation enzymatique de nucléotides triphosphates ou de leurs dérivés (NTP, d-NTP) marqués en a, caractérisé en ce que: a) dans une première étape, on traite à température ambiante un NDP 5' par le moyen défini à la revendication la) en présence d'un agent de phosphorylation marqué, ce qui donne naissance au NTP 5' marqué en y, b) on chauffe la solution résultante 2 minutes à C, c) dans une seconde étape on traite une quantité adéquate du NMP 3' de même base que le NDP 5' de départ par le moyen défini à la revendication lb) en présence de la solution résultante de b), ce qui donne naissance au NDP 3'5' marqué en 5', d) dans une troisième étape on traite la solution résultante de la seconde étape contenant le NDP 3'5' marqué en 5', par le moyen défini à la revendication lc), dans des proportions adéquates, ce qui donne naissance au NMP 5' marqué en a, e) dans une quatrième étape, on traite la solution résultante de la troisième étape, contenant le NMP 5' marqué par le moyen défini à la revendica- tion ld), dans des proportions adéquates, ce qui donne naissance au NTP 5' marqué en a. 16. Procédé de préparation enzymatique de nu- cléotides triphosphates (NTP-dNTP) ou de leurs dérivés marqués en f, caractérisé en ce que: a) dans une première étape, on traite à tempéra- ture ambiante un NDP 5' par le moyen défini à la reven- dication la) en présence d'un agent de phosphorylation marqué, ce qui donne naissance au NTP 5' marqué en y, b) on chauffe la solution résultante 2 minutes à 90 C, c) dans une seconde étape, on traite en quantités adéquates, du NMP 5', de même base que le NDP 5' de départ par le moyen défini à la revendication le), en présence de la solution résultante de b) contenant du NTP 5' marqué en y, ce qui donne naissance au NTP 5' marqué en S. 17. Procédé selon l'une des revendications 14 à 16, caractérisé en ce que l'agent de phosphorylation marqué est (32po4). 18. Procédé selon l'une des revendications 14 à 16, caractérisé en ce que l'agent de phosphorylation marqué est (P03 S35)-- 19. Procédé selon l'une des revendications 14 à 18, caractérisé en ce qu'en outre l'on purifie la solution ob- tenue par chromatographie. 20. Procédé selon l'une des revendications 14 à 19, caractérisé en ce que le produit obtenu peut être purifié sur une petite colonne de chromatographie liquide de haute performance jetable.