FR 2597871 A1 19871030 FR 8606212 A 19860429 Procédé de photoclivage des acides nucléiques à l'aide de dications 2,7- diazapyrénium, nouveaux dérivés diazapyréniques La présente invention concerne un procédé de photoclivage des acides nucléiques à l'aide de dications 2,7-diazapyrénium 2+ 4+ DAP ou de leurs espèces dimères bis-DAP. Elle a également pour objet des nouveaux dérivés diazapyréniques; il s'agit de sels qui,en solution,libèrent des dications 2+ 4+ DAP ou des tétracations bis-DAP. Enfin, les dications 2,7-diazapyrénium couplés à des oligonucléotides peuvent constituer des réactifs de photoexcision spécifiques pour les acides nucléiques. De nombreuses recherches ont été entreprises ces dernières années pour trouver desréactifs artificiels capables de cliver les acides nucléiques et plus particulièrement l'acide désoxyribonucléique ou l'acide ribonucléique, communément dénommés ADN et ARN. La plupart des études ont été réalisées avec des complexes métalliques qui clivent l'ADN par un procédé redox oxygène-dépendant ou par photo-activation.On a également utilisé des colorants 20 du type acridine pour la photodestruction de l'ADN. Parmi les complexes métalliques qui ont été utilisés, on peut citer notamment les composés portant des groupes EDTA-Fe(II) et les complexes l,10-phénanthroline-cuivre. Par exemple, BOUTORIN et al. dans FEBS LETTERS vol. 172, N1 Juin 1984 décrit des réactifs portant des groupes EDTA-Fe(II' qui conviennent pour le clivage direct des acides nucléiques simples brins. De même TULLIUS et al. dans SCIENCE vol. 230, 1985 p. 679-681 utilise l'EDTA-Fe(II) pour couper l'ADN. HERTZBERG et al. fJ. Am. Chem. Soc. 1982 104 p. 313-315] 30 préconise l'utilisation de (méthidiumpropyl-EDTA)-Fe(II) comme cofacteur dans la coupure de l'ADN pour un certain nombre d'antibiotiques antitumoraux. L'utilisation du complexe l,10-phénanthroline-cuivre pour le clivage de l'ADN est décrite notamment par REICH et al. dans J. Am. Chem. Soc. Vol. 103 No. 12, 1981 et par R. FAGGIANI et al. dans J. Am. Chem. Soc. Vol. 102 p.5419-5421. 1980. D'autre part, il est connu que les colorants du type acridine endommagent l'ADN. Par exemple FREIFELDER et al. LBiophysical Journal Vol. 1, 1961/ ont montré que de l'ADN irradié avec de la lumière visible en présence d'acridine orange se dépolymérise et se coupe. On notera par ailleurs que les ions de 4,4'-bipyridinium, et en particulier le méthyl-viologène ont été utilisés dans différents procédés redox et photo-redox L AMOUYAL et al. Israel Journal of Chemistry 22, 1982 p. 117-1237. Ces derniers ne peuvent être réalisés qu'en présence d'un photosensibilisateur ou sous une irradiation ultraviolette. Le méthyl-viologène, qui est le chlorure de 1,1'-diméthyl4,4'bipyridinium, couramment dénommé MV 2+, peut détériorer l'ADN dans ces conditions. On a maintenant trouvé que l'on peut utiliser des dérivés diazapyréniques et plus particulièrement les cations 2,7-diazapyrénium pour le photoclivage des acides nucléiques à la lumière visible sans qu'il soit nécessaire d'utiliser des photosensibilisateurs. Ainsi la présente invention concerne un procédé pour le photoclivage des acides nucléiques qui consiste à mettre en contact un acide nucléique avec une solution d'un dérivé du 2,7-diazapyrène tel que défini ci-après et à soumettre le mélange réactionnel obtenu: à une irradiation à la lumière visible. Les dérivés diazapyréniques qui conviennent aux fins de l'invention répondent à la formule (I) ci-après: R ' R 2X (I) dans laquelle: R et R', identiques ou différents, représentent: l'hydrogène; - un radical hydrocarboné aliphatique, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, éventuellement interrompu par un ou plusieurs 5 hétéroatomes, tel que par exemple l'oxygène, le soufre ou l'azote, ledit radical hydrocarboné pouvant de plus éventuellement être substitué par des groupes hydroxy, amino, thio, par un groupe aryle, par un groupe hétérocyclique; ou R et R' sont identiques et représentent un groupe de formu10 le RIY dans laquelle R1 est le groupe -(CH2)3- et Y est l'ion sulfonato S03; ou un groupe de formule -(CH2)ï 2NH- \,)-CH3; X est soit un anion ou bien X est o 'I rien lorsque l'un au moins des substitutants R et R' est de formule 15 RIY, auquel cas les dérivés sont alors des sels internes. Les composés de formule I ci-dessus dans laquelle R et R' sont identiques et représentent l'hydrogène ou un groupe méthyle, sont des composés connus et décrits par Hunlg et al. -Angew. Chem. 1980 N 19 (1968)7 On peut également utiliser dans le procédé de l'invention les dérivés bisdiazapyréniques qui répondent à la formule générale (II): + + + + R -N Y N -R' dans laquelle: - R, R' et X sont tels que définis ci-dessus et est un radical divalent qui représente une chaîne hydrocarbonée aliphatique droite ou ramifiée, saturée ou insaturée, éventuellement interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes et/ou éventuellement interrompue par 35 un ou plusieurs groupes aromatiques ou hétérocycliques divalents. Les chaînes hydrocarbonées qui constituent le radicalO peuvent contenir 2 atomes de carbone ou plus et être interrompues par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi les atomes d'oxygène, de soufre ou d'azote. Des exemples préférés de radicaux divalentsisont les radiecaux de formules III à V ci-après: i 0 (III); CH X 2 X CH2(IV) -CH2 X CH2- // CH3 (V) CH2. 0 CH2* 20 Dans les formules (I) et (II) ci-dessus, les radicaux hydrocarbonés aliphatiques ont de préférence 1 à 10 atomes de carbone. Les groupes alkyle linéaires ou ramifiésayant 1 à 6 atomes de carbone sont particulièrement préférés. Les dérivés diazapyréniques de formule (I) et (II) peuvent 25 tous être obtenus à partir du 2,7-diazapyrène ou DAP par l'un des procédés ci-après. Par commodité, on désignera dans la suite de la présente description les dérivés diazapyréniques de formule (I) par l'expression "dérivés DAP2+" et ceux de formule (II) par l'expression "dérivés bis-DAP". Synthèse des dérivés DAP2 Procédé A + DAP + RX1 >DAP -R X1 DAP-R X1 + R'X2 -DAP-R X2 X et X2, identiques ou différents, ont la même signification que X. Ce procédé comporte essentiellement deux étapes de Nsubstitution du DAP, respectivement par les radicaux R et R', le composé obtenu peut ensuite être éventuellement transformé,par échange d'ions,en le composé correspondant dans lequel X1 et X 5 sont identiques. On notera que lorsque R et R' sont identiques, les deux étapes de substitution sont réalisées simultanément. Ces étapes sont réalisées dans un solvant approprié, par exemple le diméthy]formamide (DMF), le chloroforme ou l'acétonitrile. Le DMF convient lorsqu'on souhaite obtenir les deux substitutions simultanément (R=R'=CH3 par exemple), la réaction étant effectuée à température ambiante, tandis qu'il convient d'utiliser le chloroforme pour la première étape de substitution et l'acétonitrile pour la seconde (R # R'), auquel cas on opère avantageusement à la température ambiante pour la première étape de substitution et au 15 reflux pour la seconde. Ce procédé convient notamment pour l'obtention des dérivés DAP2 dans lesquels R et R' sont un radical hydrocarboné aliphatique, tel que défini ci-dessus et en particulier pour l'obtention du dichlorure de N,N'diméthyl-2,7-diazapyrénium dénommé ci-après 2+ MDAP (Ci)2 qui est illustréepar le schéma ci-après: Cl X0 A CIi CH3/M i)g1/HO CH3 CH3 3DAP MDAP2+ (I-)2 MDAP2+ (CI-)2 2 2 Procédé B 2 DAP + NO2 -_Ts ? DAP- - NO2 Ts eCHC13/CH3CN JD NO2 DAP - NO2 Ts+ H2N -R. DAP- R, Ts CH OH DAP -R Ts +R'X1 R'-DAP-R Ts X -DAF Dchange d'ions L/ R' - +DAP+ -R, 2C1avec Ts = anion, par exemple le tosylate CH3 0 On notera que Ts peut être remplacé par un autre anion. Ce procédé convient pour l'obtention des dérivés DAP dans lesquels le radical R est un radical hydrocarboné aliphatique substitué par un groupe hydroxy, en particulier un groupe hydroxyalkyle et R' est un groupe alkyle, par exemple le méthyle. Ce procédé consiste 15 à fabriquer d'abord un sel de 2-dinitrophényl-2,7-diazapyrénium par exemple le tosylate, à titre d'intermédiaire de synthèse par réaction du DAP avec un sel de 2,4-dinitrophényle, tel que le tosylate, dans un solvant approprié, par exemple un mélange chloroforme/ méthanol à reflux, puis à faire réagir cet intermédiaire avec une 20 amine substituée par un radical R; la seconde étape est une étape de N-substitution avec un halogénure de formule R'X comme dans le procédé A. Procédé C 2+ Ce procédé convient pour l'obtention des dérivés DAP dans 25 lesquels R' est un groupe alkyle par exemple le méthyle et R est un reste hydrocarboné aliphatique substitué par un groupe amino. Ce procédé est semblable au procédé B ci- dessus à la seule différence que l'on utilise comme amine une diamine dont l'une des fonctions amine est protégée, laquelle est ensuite déprotégée avant la seconde étape de substitution. Ce procédé peut être schématisé comme suit NO2 /DAP + N2 Ts DAP +NO2- Ts NO2 + \ UAP- NO Ts > DAP-\ 2 CH3Cl/CH3CN NO2 DAP NO2, Ts + H2N - DAPR3, Ts DAP+ -R Ts- déprotection + Alk N Ts DAP 3 >DAP Alk - NH2 Ts DAP±Alk-NH2 Ts + R'X R'- +DAP+ - Alk NH2 Ts-X2 92' avec R3 = alk - NH2 (protégé). Le tosylate de 2-dinitrophényl-2,7-diazapyrénium est un nouveau composé utile comme intermédiaire de synthèse; il constitue un autre objet de l'invention. Procédé D Ce procédé convient pour l'obtention du dérivé DAP dans lequel R et R' sont identiques et représentent un radical R Y tel que défini précédemment; -O DAP+O = S = O -SO3 -(CH2)3- DAP -(CH2)ISO3 Ce procédé consiste à faire réagir ensemble du DAP partiellement dissous dans de l'acétone anhydre et du propansultone à la température ae reflux. Procédé E Ce procédé convient pour l'obtention du dérivé DAP2+ dans lequel R et R' sont identiques et représentent le groupe 'de formule: 1. - (CH2)2 -NH - S - CH3 O 259787 t Ts I N DAP + /_'_ - DAP- v 2C1 collidine chlorure de coilidinium Ce procédé consiste donc à faire réagir le DAP avec l'aziridine en présence de collidine et de chlorure de collidinium. Synthèse des dérivés bis-DAP4 4+ Le procédé d'obtention de ces dérivés bis-DAP consiste essentiellement à faire réagir deux molécules de DAP avec une molécuI 0 le d'un dihalogénure de formule X1- -X1 dans laquelle X1, X2 et Osont tels que définis ci-dessus et à procéder ensuite à la Nsubstitution des azotes restants dans les molécules de DAP. Chaque étape est avantageusement réalisée dans l'acétonitrile à la température de reflux. Ce procédé peut être schématisé comme suit: Xi-D -X2 + 2DAP DAP± - + DAP X1 X2 VRX2+R'X R'- DAP± @ - DAP -R 2X12X 1 2 Les dérivés diazapyréniques selon l'invention sont des 20 composis fluorescents. Le diazapyrène (DAP) utilisé comme produit de départ dans les synthèses ci-dessus peut être obtenu à partir de l'anhydride 1,4,5,8naphtalènetétracarboxylique de formule XI disponible dans le commerce selon le schéma réactionnel ci-après: NH2CH t3ambiante t0 ambiante CH3 LiAlH4/AlC13. THF reflux CH3 CH3 VI VII VIII Se e N /NDAP DAP Selon une adaptation du procédé de HUnig et al. Angew. Chem. 20 180 (1968) n 19, l'anhydride 1,4,6,8naphtalènetétracarboxylique de formule VI est tout d'abord transformé en le bis (N-méthylimide) correspondant de formule VII par réaction avec de la méthylamine à la température ambiante. L'imide VII est ensuite traité avec un mélange LiAlH4/AlCl1 dans le tétrahydrofuranne à reflux pour former le composé 25 de formule VIII, lequel est ensuite mis à réagir pendant 4 heures environ en présence de sélénium à une température comprise entre 265 et 300 C pour obtenir le DAP. Les composés particulièrement appropriés aux fins de l'invention sont: 1) les composés de formula (I) dans laquelle R et R' sont un groupe méthyle ou dérivé MDAP2+; 2) les composés de formule (1) dans laquelle l'un des substituants R ou R' est un alkyle inférieur, par exemple le méthyle et l'autre est un groupe alkyle substitué par un groupe hydroxythio ou un groupe amino, à savoir les groupes de formules -(CHn)-OH, -(CH2) -SH7-CH2) -NH, dans lesquels n est de nréfarence comiris entre Iet lO; 3) les composés de formule (II) dans laquelle ([ répond à tiune des formules III à V et R et R' sont un groupe alkyle inférieur, par exemple le méthyle. Les dérivés diazapyréniques de formules (I) ou (II) comportant un ou deux dicatiors2,7-diazapyrénium ont une structure plane. Ces composés, grâce à cette structure plane interagissent avec les nucléotides de l'ADN ou de l'ARN de la même manière que les médicaments d'intercalation, tels que l'actinomycine, la bléomycine. De plus, sous l'action d'un irridiation à la lumière visible, les dérivés selon l'invention peuvent couper l'ADN ou I'ARN en plusieurs brins. Il y a lieu de préciser que les dérivés de formule (II) ou 4+ dérivés bis-DAP sont plus réactifs que les dérivés de formule (I) 20 ou dérivés DAP2+ du fait de la présence dans leur molécule de deux cations 2,7-diazapyrénium. Ils présentent d'autre part une sélectivité et une stabilité plus grandes lors du photoclivage. D'autre part, les dérivés de formule (I) dans lesquels l'un des substituants R ou R' est un radical aliphatique hydrocarboné 25' substitué par un groupe hydroxy ou amino peuvent être couplés par liaison covalente à un oligonucléotide ou un oligodésoxynucléotide comportant un encha nement de nucléotides naturels, éventuellement modifiés ou synthétisés. Ce couplage peut être réalisé par des procédés connus de l'homme de l'art. Par exemple on peut utiliser les procédés de synthèse décrits dans le brevet FR 83 O! 223 cité dans la présente demande à titre de référence. Ces procédés consistent entre autre à coupler l'hydroxyle du dérivé DAP2+ avec un oligonucléotide 3'phosphodiester ou 5'-phosphodiester, avec un oligonucléotide-3',5'35 bis(phosphodiester), ou avec un oligodésoxynucléotide 2'-phosDhodiester, les oligonucléotides ou oligodésoxvnucléotides étant correctement protégés. Ainsi,on peut cbtenir des produits de couplage oligonucléotide Il (ou oligodésoxynucléotide) DAP2+ ou DAP 2±oligonucléotide (ou oligodésoxynucléotide) -DAP2+ qui peuvent constituer des réactifs de photoexcision très sélectifs. La chaîne d'oligonucléotide ou d'oligodésoxynucléotide du produit de couplage peut se lier de façon sélective à toute séquence complémentaire. Grace à la présence d'au moins un dication 2,7diazapyrénium dans ce produit de couplage, on peut aisément couper de façon sélective de l'ADN ou de 'ARN en des sites particuliers dont la position est déterminée par l'oligonucléotide qui se lie 10 à la séquence complémentaire. On notera que le produit de couplage oligonucléotide -DAP2+ peut ultérieurement être couplé avec un autre réactif, qui peut être un agent de révélation quelconque, par exemple un marqueur, tel que notamment un colorant de type acridine ou un agent interca15 lant, et fournir un produit de couplage bifonctionnel, l'une des fonctions étant le photoclivage, l'autre fonction étant apportée par le second réactif. Photoclivage de l'ADN Le procédé de l'invention va être maintenant décrit en no 2+ 4+ référence au MDAP ou à son espèce dimère bis-MDAP par simple commodité sans pour autant le limiter à ces seuls dérivés. Des essais réalisés sur l'ADN dans les conditions indiquées ci-après ont montré que le dication MDAP2+ ou son espèce dimère bis-MDAP4+ coupent l'ADN sous irradiation à la lumière visible. 25 Les essais ont été effectués par illumination pendant une heure à 3+ 10 C avec de la lumière visible (projecteur-fente de 250 W muni d'un filtre adéquat pour ne laisser passer que la lumière visible, > 395 nm) d'une solution aqueuse contenant de l'ADN circulaire double-brin surenroulé (2,6 10-8 M), un chlorure de 302+ MDAP4+ (2,6 10-4 M) dans du tampon tris pH 7,8. MDAP ou bis--MDAP (2,6 10 M) dans du tampon tris à pH 7,8. La réaction a été effectuée en présence ou en l'absence d'air (oxygène) ou d'EDTA. L'ADN circulaire double-brin surenroulé, ci-après dénommé ADNsca été préparé selon les modes opératoires connus en utilisant des bactéries E. coli infectées avec le plasmide pBR 322 et ultérieurement purifié par électroélution de manière à être pratiquement dépourvu d'ADNsc coupé. 15 25 30 Le plasmide pBR322 donne par incubation avec l'enzyme de restriction ECORl un plasmide linéaire ou DNA linéaire doublebrin qui a été utilisé comme marqueur dans l'analyse par électrophorèse réalisée après l'essai de photoclivage ci-dessus. A titre de comparaison on a réalisé le même essai en 2+ remplaçant le dérivé de l'invention par du méthyl-viologène MV2. On a également soumis au même traitement (illumination à la lumière visible, dans les conditions ci-dessus) une solution d'ADNsc seule, ou une solution d'ADNsc contenant de l'oxygêne ou une solution d'ADNc contenant de l'oxygène et de l'EDTA, à titre de contrôles. Les résultats obtenus apparaissent sur la figure I annexée qui est une photographie du gel d'électrophorèse des solutions des différents essais et sont commentés ci-après. Sur cette figure, on désigne par I l'ADNsc, II l'ADNsc coupé et III l'ADN linéaire; les abbréviations utilisées désignent respectivement: M = marqueur C = contrôle V = lumière visible O = oxygène A = EDTA. La mesure des densités optiques de chaque bande a donné les proportiois suivantes des formes I, II et III en % 10 N de bande : Forme I: Forme II: Forme III: _: -----------:....: 9 10 11 12 13 : 93: : 88: * 86 : - 6: : 53 : 16: 2 2 14 73 47 68 77 72 32 23 12 A) Essais avec le MDAP2 1) Comme le montrent les bandes 9 à 13 sur la figure 1, le MDAP 2+clive efficacement 1' ADNsC sous irradiation à la lumière visible dans les conditions utilisées, 15 principalement en donnant de l'ADNsccoupé par clivage d'un seul brin, mais également de l'ADN linéaire par clivage des deux brins lorsque la réaction se prolonge. Avec de plus faibles concentrations de MDAP2+ il se pr41it. moins de clivage, la transformation en la forme ADNsc coupé 20 étant presque complète à la concentration de 2 10-5 M et seulement faible à 2 10-6 M et au-dessous. 2) On notera qu'il n'y a pas eu de clivage significatif de l'ADNc en l'absence de lumière. 15 20 25 30 35 3) L'élimination de l'oxygène par dégazage par congélationdécongélation diminue un peu l'efficacité du photoclivage. 4) L'addition d'EDTA n'affecte pas la réaction en présence d'oxygène, mais semble la diminuer lorsque celle-ci est réalisée en l'absence d'oxygène. ) On notera que la migration de l'ADIc est quelque peu retardée par le réactif de photoclivage utilisé, ce qui laisse penser que celui-ci s'intercale dans l'ADNsc. B) Essais avec le bis-MDAP4 1) Dans les mêmes conditions le bis-MDAP4+ semble plus efficace que le MDAP2+ donnant des petits fragments d'ADN par coupures multiples des deux brins (bandes 14 à 18). 2) La réaction de clivage est tellement efficace que l'exclusion de la lumière devient difficile. Il est néanmoins possible d'observer que la migration de l'ADNscest notablement retardée, ce qui indique une interaction forte et probablement multiple du Bis4+ MDAP+ avec le plasmide pBR322. 3) Etant donné l'efficacité de la réaction,il n'est pas possible de noter un effet quelconque de l'oxygène ou de l'EDTA. L'effet de bis-MDAP4+ décroît à des concentrations plus faibles, le clivage étant encore complet à 10-5 M mais seulement faible à une concentration inférieure. C) Essais avec MV2 (Bandes 6 à 8) et essais de contrôle (bandes 2 à 5) Ces essais montrent que, dans les mêmes conditions, il ne se produit pas, ou pratiquement pas,de clivage avec MV 2+.D'autre part, il n'y a aucune réaction en l'absence de réactif de photoclivage. 2+ Etant donné que d'autres essais ont montré que le MDAP photo-oxyde différents substrats sous irradiation à la lumière visible, on peut considérer, sans toutefois vouloir se limiter à une quelconque théorie, que la réaction de clivage a lieu par l'intermédiaire d'unephotooxydation locale au site d'interaction 2+ par l'état excité de l'espèce MDAP. Le donneur d'électrons peut être le ribose, car on a trouvé que le ribose lui-même photorduit le MDAP2+ réduit le MDAP L'effet retardant de I'EDTA en l'absence d'oxygène indiquerait que l'oxydation du donneur extérieur entre en compétition avec l'oxydation du donneur interne. L'effet produit par l'élimination de l'oxygène, faible mais non négligeable, indique que la réaction de clivage peut aussi faire intervenir le système réactionnel comme avec les complexes métalliques + réduits photosensibles. Le cation DAP produit initialement par photoréduction pourrait alors réagir avec l'oxygène en générant du superoxide comme cela se produit avec MV+ lui-même (Biochim. Biophys. Acta 10 1973,314, 372. D'autres essais ont été réalisés dans les mêmes conditions que ci-dessus avec la proflavine, qui est un colorant de type acridine et on a trouvé que la proflavine est un réactif de photoclivage de l'ADN comparable au Bis-MDAP4+ et qu'il donne à la 15 concentration de 2 10-4 M un clivage extensif de l'ADN en ADN linéaire. A des concentrations plus faibles allant de 2 10-6 M à 2 10 M, l'efficacité diminue. On pense que le procédé de photoclivage avec la proflavine implique une photo-oxydation de l'ADN au site d'intercalation avec 2^ génération d'un colorant réduit. Les colorants de type acridine sont en effet bien connus pour subir une photoréduction avec une oxydation du substrat. Les dérivés de l'invention, étant des molécules plates,elles interagissent avec les nucléotides dans l'ADN ou 'ARN de lansme 25 manière que les médicaments d'intercalation, tels que l'actinomycine, la bléomycine, etc. On a d'autre part noté que la fluorescencedes drivésdisparaît lorsqu'ilya fixation sur l'ADN.Il est donc ioshlde suivre l'évolution dela éaction de photoclivage par fluorescence. D'autres essais ont été effectués avec de l'ADN simple brin 30 ou ADNss et sont reportés ci-après. Les solutions de MDAP2+ et bis-MDAP4+ à des concentrations allant jusqu'à 4.10 M ont été préparées avec de l'eau distillée deux fois et ajustées à pH 7,6 avec de l'acide chlorhydrique. De l'ADIccirculaire et de l'ADNss circulaire ont été obtenus 35 respectivement à partir des plasmides pBR 322 et M13mpl9 et purifiés par des procédés d'électroélution classiques. Dans des tubes à essai en verre on a mélangé soigneusement - le dérivé diazapyrénique 2+ 4+ MDAP ou bis-MDAP - l'ADNss ou l'ADNsc - du tampon Tris pH 7,6 en des quantités appropriées pour obtenir des concentrations en dérivés diazapyréniques de 5O-6 M et 10-5 M. Chaque tube a été maintenu sous une pression constante d'oxygène en utilisant des moyens connus et soumis à une irradiation à la lumière visible (projecteur 10 250 W; ? > 395 nm) pendant 1/2 heure, les tubes étant maintenus à 3C dans un bain d'eau glacée. Après l'irradiation les tubes ont été maintenus à l'obscurité et stockés à 3 C. Des échantillons de chaque tube ont été mélangés à du glycérol et soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose (Sigma Type II EEO) (6 heures à 120 V et 80 mA). Le gel d'agarose a coloré avec du bromure d'éthidium et photographié. La figure II annexée est une photographie de ce gel sur laquelle les'bandes correspondent aux différents essais réalisés,les concentrations étant indiquées ci-après , N'de bande ADN:drivé diazapyrnique concentration bande: DN dérive. dudit dérivé : 4 ADNsc MDAP2 +: : 5: ": ":5s6 ADNss ": 10 -: : 7: " : " 510 -6 12 ADNsc bis-MDAP4+ 0 13 " : " 51014 ADNss "10 ": " : 510-b les bandes 1 et 20 correspondant aux marqueurs et les bandes 2 et 3 sont représentatives des ADNscet ADNss soumis à l'irradiation en l'absence de dérivé diazapyrénique; ces ADN ont été obtenus respectivement par action de 35 l'enzyme ECoR1 et de la nucléase S1 de manière connue. Cette photographie montre que l'ADNcet t'ADNss circulaires sont clivés en présence des dérivés diazapyréniques de l'invention. L'invention va être maintenant décrite plus en détail par les exemples ci-après. EXEMPLE 1: Préparation du dichlorure de N-méthyl-N'-benzyl-2, 7diazapyrénium (formule I: R = CH3 et R' = CH2-O) On a dissous 1 g (0, 0049 mole) de DAP dans 20 ml de chloroforme. On a ensuite ajouté de l'iodure de méthyle en excès (3 ml; 0,048 mole). Le mélange réactionnel obtenu a été agité à la température ambiante pendant 24 heures. Un solide jaune a alors précipité. Ce solide jaune a été séparé du milieu réactionnel par filtration, lavé avec du chloroforme et séché sous vide. On a obtenu 1,61 g (0,0047 mole) d'iodure de N-méthyl-2,7-diazapyrène MDAP+I) 15 (rendement: 96 %). Ce produit brut étant partiellement protoné a été soumis à une déprotonation par traitement avec de l'eau légèrement alcaline (pH L 7,8; eau + traces de NH4OH). Le produit brut a ensuite été recristallisé dans du 20 méthanol bouillant et on a obtenu des cristaux jaunes. Ce produit présentait les caractéristiques physicochimiques ci-après: Analyse élémentaire: C15HllN2I; 0,25H20 M = 350,7 Calculé: C 51,37; H 3, 31; N 7,99 25 Trouvé: C 51,31; H 3,19; N 8,05 Spectre RMN H (solvant D20 / CF3COOD; référence TMPS) 2 3 ,05 ppm (s) ,03 ppm (s) go = 8,89 ppm (J = 9,19 Hz AB, q) 5,00 ppm (s) méthyle Le produit obtenu ci-dessus (1 g; 0, 0029 mole) a ensuite été mis en suspension dans 150ml d'acétonitrile anhydre et on y a ajouté du bromure de benzyle (3ml; 0,025 mole), préalablement filtré sur une colonne d'A12,01 neutre. Le mélange réactionnel résultant a été chauffé au reflux sous agitation pendant 12 heures. Le produit jaune obtenu a été filtré, lavé avec du chloroforme et séché sous vide. Rendement: 1,15 g (0,0022 mole) soit 77 Z. Le produit brut ainsi obtenu a été agité à l'obscurité 10 pendant 24 heures avec de l'eau (100 ml) et du chlorure d'argent (obtenu à partir de 3 g de AgNO3 et de NaCl, correctement lavé avec de l'eau). Le solide formé a été filtré, lavé avec de l'eau chaude, puis le filtrat a été concentré sous vide et dilué avec de l'acétone (90 ml) et un précipité jaune s'est formé. On a laissé ce mélange 15 pendant une nuit et on l'a filtré et séché sous vide. -Rendement: 0,81 g (0,00213 mole) 73 %. Le produit obtenu est le dichlorure de N-méthyl-N'-benzyl2,7-diazapyrène qui présente les caractéristiques physico-chimiques ci-après: Analyse C22H18N2C12 M = 381,3 Calculé: C 69,29; H 4,72; N 7,35 Trouvé: C 69,07; H 4,89; N 7,38 Spectre RMN H (solvant D20; Référence TMPS) 9,98 ppm (s) 9, 88 ppm (s) 8,675 ppm (AB -q) 7,41 ppm (m - benzyle) 6,24 ppm (s) 4,81 ppm (s, méthyle) _________ 4+ EXEMPLE 2: Préparation du dérivé diazapyrénique bis-MDAP (formule II: R = R' = CH3 = -CH2-C6H4-CH2-C6H4-CH2- On a fait réagir le 4,4-bis(bromométhyl)diphénylméthane (0,174 g) avec le2,7-diazapyrène (0,2 g) dans de l'acétonitrile anhydre (15 ml) au reflux et sous agitation pendant 4 heures. Le précipité jaune qui s'est formé a été sépare par filtration, lavé avec du chloroforme et séché sous vide. Rendement: 0,34 g; 85 % Le produit brut a été recristallisé dans de l'eau chaude et analysé. Il s'agit du produit de formule: + DAP 2Br DAP qui présente les caractéristiques physico-chimiques ci-après: Analyse élémentaire C43H30N4Br2 3H20 M = 816,6 Calculé: C 63,24 H 4,44 N 6,86 Trouvé: C 63,17 H 4,25 N 6,65 Spectre RMN H (solvant: D20 / CF3COOD; référence TMPS) ,09 ppm (s) ,00 ppm (s) c chloroforme et séché sous vide. Rendement: 0,37g; 90 %. On a procédé ensuite à un échange d'ion en mettant en suspension le disel ainsi obtenu (iodure/bromure) avec du chlorure d'argent dans de l'eau et en agitant à la température ambiante pendant 24 heures. Le solide formé a été séparé par filtration et lavé avec de l'eau chaude. Le produit brut (solide jaune, très soluble 35 dans l'eau) a été recristallisé plusieurs fois dans du méthanol ou un mélange méthanol/éther. Selon un autre mode opératoire, on peut effectuer l'étape de méthylation en mélangeant le produit de formule ci-dessus avec du bromure de méthyle à 40-50 C dans des flacons fermés pendant deux à trois jours. On obtient alors un produit jaune soluble dans l'eau. Le produit obtenu dans l'un ou l'autre des cas présentait les caractéristiques physiocochimiques ci-après: Analyse 10 Calculé Trouvé Spectre ! élémentaire: C45H36N4C14 9H20 M = 937 : C 57,70 H 5,81 N 5,98 : C 57,80 H 5,04 N 5,86 RMN H (solvant: D20; référence TMPS). 10,15 ppm (s) ,09 ppm (s) 8,87 ppm (AB-q; J = 9,47 Hz) 7,55 ppm (AB-q; J = 8,18 Hz) 6,39 ppm (s) ,20 ppm (s) méthyle 4,13 ppm (s) EXEMPLE 3: Préparation des dérivés bis-DAP4+ (formule II R = R' = CH3 CH = -CH2-C6H4 -C-C H4 -CH2 CH3 ou -CH 2-C H4-0-C6H4-CH2On a procédé selon le mode opératoire décrit à l'exemple 25 2 en remplaçant le 4,4'-bis(bromométhyl)diphénylméthane respectivmeent par: - le 4,4'-bis(bromométhyl)diphényl-2,2'-propane. - le 4,4'-bis(bromométhyl) diphényléther et on a obtenu respectivement:CH3 + + -CH 3 _ le composé de formule: DAP -CH2-C6H4-C-C6H4-CH2- DAP+ CH3 dont le spectre RMN est le suivant: ,28 ppm (s); 10,21 ppm (s); 9,00 ppm (q-AB) 7, 7 ppm (q-AB); 6,52 ppm(s); 5,14 ppm (s); 2,39 ppm(s) - et le composé de formule: DAP -CH2-C6H4-O-C6H4-CH2-+DAP+ dont le spectre RMN est le suivant v 10,27 ppm(s); 10,18 ppm(s); 8,97 ppm (q-AB); 7;82 ppm(d) 7,34 ppm(d); 6,51 ppm(s); 5,10 ppm (s). EXEMPLE 4: Préparation du tosylate de 2,4-dinitrophényl-2,7-diazapyrénium (intermédiaire de synthèse) NO D p -'NO2 Ts- dénommé ci-après DAP±DNP Ts 0,81 g (2,4 10-3 mole) de tosylate de 2,4 dinitrophényle (préparé par réaction du chlorure de tosyle et du 2,4-dinitrophényl) et 0,49 g 15 (4. 10-3 mole) de 2,7-diazapyrène ont été chauffés à reflux dans un mélange (50/50 V/V) de chloroforme et d'acétonitrile. Le précipité jaune formé a été filtré et redissous dans du méthanol; Le nouveau précipité formé a été lavé dans un excès d'éther. Le précipité jaune obtenu a ensuite été séché sous 20 vide. Rendement: 0,96 g 73 % Point de fusion: 252-254 C (décomposition) L'analyse élémentaire de ce produit était la suivante: Calculé: C 59,78 H 3,34 N 10,33 Trouvé: C 59,82 H 3,10 N 10,41 Spectre RMN H ,285 9,975 9,4 9,0 8,90 8,675 8,5 7,575 (solvant D20 ppm (s) ppm (s) ppm ppm ppm ppm ppm ppm (s) (d,d (d J (d J (d J (d J référence TMPS) J = 0,05 p) = 0,05 p) = 0,05 p) = 0, 05 p) = 0,041 p) EXEMPLE 5: Préparation du dérivé diazapyrénique de formule I avec R = H et R' = -(CH2)2-NH2 On a opéré selon le mode opératoire du procédé C en utilisant l'amine de formule H2N-(CH2)2NH2 dont une fonction amine a été protégée par le groupe carbobenzoxy C6H4- CH2-O-COOn a dissous 0,44 g de DAP -DNP Ts dans 40 ml de méthanol anhydre et on a mis la solution obtenue dans une ampoule a hrome. D'autre part, on a préparé l'amine à partir du sel d'ammonium correspondant et on l'a dissoute (1,6. 103 mole) dans 20 ml de méthanol anhydre sous agitation. On a ensuite ajouté quelques gouttes de collidine au mélange réactionnel toujours sous agitation. Puis, on aajouté goutte à goutte pendant une heure la solution de DAP -DNP Ts. La solution est passée du rouge profond au brun. L'agitation a été poursuivie pendant encore une heure après quoi le solvant a été éliminé sur bdchner. Ensuite, on a ajouté 300ml 15 d'éther anhydre et il s'est formé un précipité légèrement brun. La solution a été agitée pendant encore 1 h 30 minutes et filtrée. Le solide obtenu a été séché pendant une nuit dans un dessicateur. Rendement: 0,41 g; 94 %. Le composé obtenu a les caractéristiques physicochimiques ci-après: Analyse élémentaire M = 537 Calculé: C 64,53 H: 5,94 N:7,51 Trouvé: C 64,58 H 5,00 N:7,32. -5 RMN(ppm) 9,87(s); 8,53(d); 8,77(d); 9,92(s) 5,19(t); 3,98(t); 6,6 (s); 4,8(s) 7,1 (s); 7,2(d); 7,7 (d); 2,07(s) On a ensuite déprotégé la fonction amine en faisant réagir le produit obtenu avec un mélange d'acide acétique et d'acide 30 bromhydrique à la température ambiante. Le produit obtenu répondait à la formule -DAP -(CH2)2-NH3, 3Br dont l'analyse élémentaire est la suivante: Calculé: C 39,19 H: 3,28 N 8,57 Trouvé: 34,11 3,22 7,43 Le spectre RMN (D20, TMPS) de ce produit a revélé des pics à 9,93ppm, 8,80 ppm, 8,86 ppm, 10,09 ppm, 5,56 ppm et 4,00 ppm. Par action d'une base sur le produit obtenu on obtient le produit attendu. EXEMPLE 6: Préparation du dibromure de N-méthyl-N'-hydroxypentyl2,7diazapyrénium (formule I: R = CH3; R = -(CH2)5-OH) Du 5-amino-1-pentanol a été dissous dans du méthanol anhydre et mis dans un récipient sec de 100 ml sous argon et dans des conditions anhydres. NO Le DAP + -Z NO2 Ts a été dissous dans du méthanol anhydre et versé goutte à goutte par l'intermédiaire d'une ampoule à 15 brome dans la solution de 5-amino-1-pentanol sous agitation à 20 C. La solution est obtenue rouge, puis rouge foncé. L'agitation a été poursuivie encore pendant deux heures et le méthanol a été ensuite éliminé sous vide presque jusqu'à siccité. On a alors ajouté au résidu 250 ml d'éther et un précipité brun s'est formé; il a été 20 séparé par filtration, repris par du méthanol et séché. Par chromatographie couche mince sur gel de silice éluée par un mélange CHC13/CH30H (5% - 95%) on a noté une seule tache. Rendement 72 % - Point de fusion supérieur à 250 C RMN D20/TMPS. Z5 = 9.65 s = 9.3 s = 8.23q = 7.49 d 8 = 7.18 d - = 5.11 t b = 3.67 t 6 = 2.32 p & = 1.60 pi ) Systeme AB ) EXEMPLE 7: Préparation du dérivé diazapyrénique de formule I Ii r avec R = R' = -(CH2)2-NH- S - -CH3 1 2 On a dissous 25 mg (1,22.10-4 mole) de DAP dans 5 ml de collidine froide. On a ajouté à cette solution immédiatement l'un après l'autre: 48,2 mg (2, 44.10-4 mole) de tosyl-aziridine et 38;4 mg (2,44.10-4 mole) de chlorure de collidinium. L'ensemble a été chauffé de 20 C à 100 C sous agitation O pendant 2 heures.La solution est passée du brun foncé au jaune foncé et a été décantée, puis évaporée jusqu' à siccité par chauffage *à 50 C. [5 phie couche Rendement: EXEMPLE 8: avec R = R' Le produit obtenu a donné une seule tache en chromatogramince sur gel de silice (élution méthanol/CH2Ci2 2%/98%). 48 %. Le spectre RMN du produit est le suivant: =9.5 s =8.4 s S=7.8) = 7.75) = 7.43) système AB = 7.39) ) = 3.5 t = 3.2 t -2.4 s Préparation = R1Y du dérivé diazapyrénique de formule I 0"--l cétone+ + 2 OS = + DAP =acétone S03-(CH2)5- DAP -(CH2)5-SO3 reflux On a dissous partiellement 25 mg de DAP dans de l'acétone anhydre (Iml) et on a chauffé au reflux; le propanesultone a été ajouté (45 mg) et le mélange a été agité au reflux pendant une nuit. Le produit obtenu a donné une seule tache en chromatogra5 phie couche mince sur gel de silice (éluant: méthanol/CH3C13 10%/90%). L'acétone a été éliminée sous pression réduite. Le spectre RMN dans CF3 CO2 D a donné les pics suivants: = 8.26 s = 6.9 s = 3.44 t = 1.32 t = 0.77 t t::: 1:: 0:- 5 REVENDICATIONS 1. Procédé de photoclivage des acides nucléiques, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact un acide nucléique avec une solution d'un dérivé diazapyrénique et à soumettre le mélange réactionnel obtenu à une irradiation à la lumière visible, ledit dérivé diazapyrénique étant choisi parmi: 1) les composés de formule I: 15 20 25 30 i R' N-R 2X () dans laquelle: R et R', identiques ou différents, représentent: l'hydrogène; - un radical hydrocarboné aliphatique, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, éventuellement interrompu par un ou plusieurs hétéroatomes, tel que par exemple l'oxygène, le soufre ou l'azote, ledit radical hydrocarboné pouvant de plus éventuellement être substitué par des groupes hydroxy, amino, thio, par un groupe aryle, par un groupe hétérocyclique; ou R et R' sont identiques et représentent un groupe de formule R1Y dans laquelle Rlest le groupe -(CH2)3- et Y est l'ion sulfonato SO3; ou un groupe de formule -(CH2)2-NH-S -CH3; X est soit un anion ou bien X est rien lorsque l'un au moins des substitutants R et R' est de formule R1Y, auquel cas les dérivés sont alors des sels internes, 2) les composés de formule II: R 4X (II) dans laquelle: - R, R' et X sont tels que définis ci-dessus etQ est un radical divalent qui représente une chaîne hydrocarbonée aliphatique droite 10 ou ramifiée, saturée ou insaturée, éventuellement interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes et/ou éventuellement interrompue par un ou plusieurs groupes aromatiques ou hétérocycliques divalents. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide nucléique est l'ADN ou l'ARN. 15 3. A titre de nouveaux produits les dérivés diazapyréniques répondant à l'une des formules I ou II ci-après: R 2X (I) dans laquelle: R et R', identiques ou différents, représentent: l'hydrogène; - un radical hydrocarboné aliphatique, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, éventuellement interrompu par un ou plusieurs hétéroatomes, tel que par exemple l'oxygène, le soufre ou l'azote, 30 ledit radical hydrocarboné pouvant de plus éventuellement être substitué par des groupes hydroxy, amino,thio, par un groupe aryle, par un groupe hétérocyclique; ou 15 20 30 R et R' sont identiques et représentent un groupe de formule R1Y dans laquelle R1 est le groupe -(CH2)3- et Y est l'ion sulfonato SO3; ou un groupe de formule -(CH2)2-NH-S -CH3; X est soit un anion ou bien X est rien lorsque l'un au moins des substitutants R et R' est de formule R1Y, auquel cas les dérivés sont alors des sels internes, à la condition que R et R' ne soient pas simultanément l'hydrogène ou le groupe méthyle (Il) 4 X dans laquelle R, R' et X sont tels que définis ci-dessus etr est un radical divalent qui représente une cha ne hydrocarbonée aliphatique droite ou ramifiée,saturée ou insaturée, éventuellement interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes et/ou éventuellement interrompue par un ou plusieurs groupes aromatiques ou hétérocycliques divalents. 4. Dérivés selon la revendication 3, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule I et en ce que R est un groupe alkyle inférieur, par exemple le groupe méthyle et R' est un groupe alkyle substitué par un groupe thio, hydroxy ou amino, à savoir les groupes de formules -(CH2) n-SH, -(CH2) n-OH ou -(CH2) n-NH2 dans lesquelles n est compris entre 1 et 10. 5. Dérivés selon la revendication 3 caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule II dans laquelle R et R' sont un groupe alkyle inférieur, par exemple le méthyle et en ce queQest choisi parmi les radicaux divalents de formules: H2 (III) -cH2 CH2CH3 (IV) -CH2 C CH2- ou \= / = \ (V) - CH2 -O CH26. Dérivé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est le dichlorure de N-méthyl-N'-benzyl-2,7-diazapyrénium. 7. Dérivé selon l'une des revendications 3 ou 5, caractérisé en ce qu'il est le tétrachlorure de formule II dans laquelle R = R' = CH3 et - -CH2-C6H4-CH2-C6H4-CH2-. 8. A titre de produits intermédiaires nouveaux, les sels de 2-dinitrophényl-2,7-diazapyrénium. 9. Intermédiaire selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est le tosylate de 2-dinitrophényl-2,7-diazapyrénium de formule: NJ2 OTs