FR 2590902 A1 19870605 FR 8616885 A 19861203 - 1 - La présente invention a pour objet de nouveaux dérivés de la calcitonine, leur préparation et leur application en thérapeu- tique. L'invention concerne en particulier les composés de for- mule I Y R-(NH-CH-CO) A NH-CH-CO-A8-A9-Z-ProNH2 I dans laquelle R représente H ou un groupe R'CO, R'CO représentant le reste acyle d'un acide carboxylique, y1 représente le reste situé sur l'atome de carbone a d'un a-amino-acide, Y2 représente le reste situé sur l'atome de carbone a d'un a-amino-acide, ou un reste de formule -CH2-S-S-CH2-CH-COOH NH2 -CH2--S-SCH2-CH2-COOH, -(CH2)p-COOH ou -CH2-S-Y3, Y3 représente un groupe alkyle en C1-C4, un groupe benzyle éven- tuellement substitué par un groupe méthyle ou méthoxy, ou un groupe CH3CONH-CH2-, n signifie un nombre de 1 à 4, A6 représente un groupe Thr ou DThr, p signifie un nombre de 3 à 5, A8 représente le reste aminoacyle d'un L-a-amino-acide neutre et lipophile, Ag représente le reste aminoacyle d'un L- ou D-a-amino-acide neutre et lipophile, Z représente le reste polypeptidique correspondant à la sé- quence 10 à 31 d'une calcitonine naturelle ou d'un de ses dérivés ou analogues possédant une action hypocalcémiante, - 2 - les restes Y1, lorsque n est supérieur à 1, pouvant être identiques ou différents et tous les restes amino-acides, à l'exception du reste A8, pouvant avoir, indépendamment les uns des autres, la con- figuration L ou D, et le reste aminoacyle N-terminal ne pouvant signifier le groupe H-Cys lorsque Y2 représente un groupe -CH2SH et n signifie 4, et les sels et les complexes de ces composés. Dans la formule I, Z représente les restes peptidiques des séquences 10 à 31 présentes dans les différentes calcitonines con- nues, par exemple la calcitonine humaine, la calcitonine de saumon, d'anguille, des bovins, du mouton, de poulet, de rat ou de porc, ainsi que leurs dérivés et analogues qui ont une action hypocalcé- miante, par exemple comme décrit dans les essais ci-après ou qui présentent une activité semblable à celle de la calcitonine. Par dérivés et analogues des calcitonines mentionnées ci-dessus, on en- tend en particulier les calcitonines naturelles, dans lesquelles un ou plusieurs restes d'amino-acides sont remplacés par un ou plu- sieurs autres restes d'amino-acides, ou bien le pont S-S est rem- placé par un pont alkylène, ou dans lesquelles un ou plusieurs aminoacides ont été supprimés. Le reste peptidique Z représente avantageusement un reste de 22 amino-acides; il peut cependant con- tenir un plus petit nombre d'amino-acides lorsque un ou plusieurs restes amino-acides (dérivés désaminoacyle) sont supprimés. Les composés de formule I préférés sont ceux dans lesquels Z représente a) Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln- Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala b) Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg- Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr c) Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg- Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr. Les composés de formule I particulièrement préférés sont ceux dans lesquels Z a la signification donnée précédemment sous b) ou c), spécialement sous c). - 3- Le reste R'CO représente avantageusement un reste acyle d'un acide carboxylique aliphatique, cycloaliphatique, aromatique ou hétérocyclique. R' représente de préférence: a) un un groupe alkyle en C1-C17, en particulier un groupe alkyle en C3-C9, de préférence saturé, b') un groupe cycloalkyle en C5-C7 ou (cycloalkyl en C5-C7)-alkyle en C1-C2, c') un groupe adamantyle, adamantylméthyle ou adamantyléthyle, ou d') un groupe phényle, benzyle ou phényléthyle. Les restes alkyle, cycloalkyle ou phényle peuvent être substitués; comme substituants, on peut citer par exemple les halo- gènes ayant par exemple un nombre atomique compris entre 9 et 35 et les groupes nitro, OH, alcoxy, etc. De préférence, ces restes ne comportent qu'un seul substituant. Le reste R'CO peut par exemple signifier le reste a-désamino d'un a-amino-acide naturel. R' signifie de préférence a'), b') ou c'). L' a-amino-acide correspondant à Y1 et Y2 est de préfé- rence un a-amino-acide naturel. L'a-amino-acide peut également être par exemple la 3-cyclohéxylalanine ou l'acide a-aminoisobutyrique. Lorsque n signifie 4, a") le reste acylamino N-terminal (correspondant au second amino- acide de la calcitonine naturelle) représente de préférence un groupe Ser, Gly ou Ala, b") le second reste aminoacyle (correspondant au troisième amino- acide de la calcitonine naturelle) représente de préférence un groupe Asn ou Ser, c") le troisième reste aminoacyle (correspondant au quatrième amino-acide de la calcitonine naturelle) représente de préfé- rence un groupe Leu, Asn, Ser, Phe, D-Leu ou le reste de la cyclohéxylalanine, d") le quatrième reste aminoacyle (correspondant au cinquième amino-acide de la calcitonine naturelle) représente de préfé- rence un groupe Ser ou Ala. - 4 - Lorsque n signifie 3, le reste aminoacyle Nf-terminal ainsi que le deuxième et le troisième reste aminoacyle ont de préférence les significations b"), c") et d") respectivement. Lorsque n signifie 2, le reste aminoacyle N-terminal et le deuxième reste aminoacyle ont de préférence les significations c") et d") respectivement. Lorsque n signifie 1, le reste aminoacyle N-terminal re- présente de préférence un groupe Ser ou Ala. A6 représente de préférence un groupe Thr. Y2 Le reste -NH-CH-CO- signifie de préférence un groupe Cys, un dérivé de la cystéine tel que défini précédemment pour Y2 ou un reste a-aminoacyle neutre et lipophile, en particulier un groupe Ala ou un reste aaminoacyle neutre et lipophile, spécialement un groupe Ala. Le reste amino-acyle terminal se réfère à R ou au reste R-(NIH-CHY 1-CO)-. A8 représente de préférence le reste aminoacyle d'un a-amino-acide neutre et lipophile, en particulier un groupe Val ou Gly. Ag représente de préférence le reste aminoacyle d'un a-amino-acide neutre et lipophile, en particulier un groupe Leu ou Phe. n signifie de préférence 2 et R représente un groupe H ou R'CO, ou en particulier n signifie 1 et R représente un groupe R'CO. Tous les restes amino-acides ont de préférence la configu- r dition L. Jn groupe de composés correspond à la formule Ip *1 CH2-Y - COOH H-X -Asn-Leu-Ser-Thr-NH-CH-CO-Z -Pro-NH2 Ip dans laquelle x1 représente un groupe Gly ou Ser, y1 y représente un groupe (CH2)4 ou -S-S-CH2-CH-, NH2 -5- ce dernier reste étant lié par l'atome S terminal au groupe -CH2adjacent dans la formule Ip, et Z1 représente un reste polypeptidique constitué de 24 amino- acides correspondant à la séquence 8 à 31 d'une calcitonine naturelle ou d'un de ses dérivés ou analogues présentant une activité hypocalcémiante, et tous les restes amino-acides, y compris ceux qui se trouvent aux positions signalées par un astérisque, ont la configuration L. De préférence, X1 représente un reste Ser; ou Yl repré- sente un groupe -S-S-CH2-CH-, ou bien NH2 Zl signifie Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln- Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr. Sont également préférés les composés dans lesquels a) X = Gly, Z = Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr- Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala, b) X = Ser, Z = Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr- Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr. Un autre groupe de composés correspond à la formule Ipa y,, y,, y,' I 1 12 H-X' -(CH-CO)mt(NH-CH-CO)n Thr-NH-CH-C0-Z''-Pro-NH2 Ipa dans laquelle X" représente un groupe NH ou une liaison, toutefois uniquement une liaison lorsque m" = O, Y'I" représente le reste situé sur l'atome de carbone a d'un a-amino-acide naturel, Y2" représente le reste situé sur l'atome de carbone a d'un a-amino-acide, ou un groupe -CH2-S-S-CH2-CH-COOH, % NH2 CH2-S-S-CH2-CH2-COOH, -(CH2)p"-COOH ou -CH2-S-Y3", -6- Y3" représente un groupe alkyle en Cl-C4, m" signifie 0 ou 1, n" signifie un nombre de 0 à 3, p" signifie un nombre de 3 à 5, et Z" représente le reste polypeptidique constitué de 24 amino- acides correspondant à la séquence 8 à 31 d'une calcitonine naturelle ou d'un de ses dérivés ou analogues présentant une activité hypocalcémiante, les 1 à 4 restes Y1" dans la formule Ipa pouvant être identiques ou différents et tous les amino-acides de la formule Ipa pouvant indé- pendamment avoir la configuration L ou D. Dans un groupe de composés, Z" a les significations sui- vantes: a) Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe- Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala, b) Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr- Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr, ou c) Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-GLu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr- Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr. Dans la formule Ipa, le reste Yj ya,. il il H-X '' -(CH-CO)m.(NH-CH-CO)n" représente de préférence un groupe Y1i" YI i! H-X"-(CH-CO)m"-(NH-CH-CO)n"'-Ser- dans lequel n"' signifie de 0 à 2, ou un groupe Y1" Yi" H-X-(CH-CO)m"-(NHCH-CO)n""-Leu-Ser-, o n"" signifie 0 ou 1, et les restes YI" représentent de préférence un groupe CH20H, (CH3)2CH-CH2 ou CH2-CONH2. - 7 - Un composé de formule I sous forme libre peut être un com- posé sous forme de base libre ou, lorsqu'un groupe acide est pré- sent, sous forme d'acide libre. Les polypeptides de l'invention peuvent exister sous forme de sels ou sous forme de complexes. Les sels d'addition d'acides peuvent être ceux formés par exemple avec des acides organiques, y compris des acides polymères, et des acides minéraux. De tels sels d'addition d'acides comprennent notamment les chlorhydrates et les acétates. Par complexes, on entend des composés du type connu, for- més à partir des composés de formule I par addition de substances minérales, par exemple des sels ou des hydroxydes minéraux comme les sels de Ca et de Zn, et/ou par addition de substances orga- niques polymères. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation des composés de formule I. Ces composés peuvent être préparés selon les méthodes connues dans la chimie des peptides, par exemple selon un procédé comprenant: a) l'élimination d'au moins un groupe protecteur dans un poly- peptide ayant la séquence indiquée dans la formule I, sous forme protégée, b) le couplage de deux unités peptidiques par une liaison amide, chacune de ces unités contenant au moins un amino-acide tel que défini dans la formule I ou un de ses dérivés, sous forme protégée ou non protégée, les unités peptidiques étant telles qu'on obtient un polypeptide ayant la séquence indiquée dans la formule I, sous forme protégée ou non, et, si nécessaire, la mise en oeuvre du procédé décrit sous a), c) pour la préparation d'un composé de formule I ayant un groupe terminal R'CO-, la réaction d'un peptide-protégé ayant la sé- quence indiquée dans la formule I, sous forme protégée ou non, avec un acide de formule R'COOH ou l'un de ses dérivés réac- tifs et, si nécessaire, la mise en oeuvre du procédé décrit sous a), d) pour la préparation de composés de formule I, dans laquelle Y2 représente un groupe -CH2-S-S-CH2-CH-COOH ou NH2 259O0O2 - 8 - -CH2-S-S-CH2-CH2-COOHsoit la réaction d'un composé de for- mule II 1 a CH2-SH R-(NH-CH-CO)n-A6-NH-CH-CO-A -A9-Z-ProNH2 Il sous forme protégée ou non protégée, avec un composé de formule III CH2-S-R1 R2 -CH-COR3 III dans laquelle R1 représente un groupe qui facilite la formation d'un pont -S-S- avec l'atome de soufre du groupe CH2SH dans le poly- peptide de formule II, R2 représente l'hydrogène, un groupe amino ou un groupe amino protégé, et R3 représente un groupe OH ou un groupe protecteur du groupe. carboxy, soit la réaction d'un composé de formule IV Y1 CH2-SR1 j I R-(NH-CH-CO)n-A6-NH-CH-CO-A8-Ag-Z-ProNH2 IV sous forme protégée ou non protégée, formule dans laquelle Ri est tel que défini ci-dessus, avec un composé de formule V CH2-SH R2-CH-COR3 V et éventuellement la mise en oeuvre du procédé décrit sous a), et, si nécessaire, la transformation en forme libre, en sel d'addition d'acide ou en complexe du polypeptide résultant. -9 - Le procédé décrit ci-dessus peut par exemple être effectué de façon analogue aux procédés décrits dans les exemples ci-après. Lorsque la préparation des produits de départ n'est pas décrite en particulier, cela signifie que les composés sont connus ou qu'ils peuvent être préparés et purifiés selon les méthodes connues dans la technique. Les produits finals de formule I peuvent également être purifiés selon les méthodes classiques, de façon qu'ils contiennent moins de 5 % de polypeptides secondaires. Les polypeptides utilisés comme produits de départ pour les procédés a) et b) peuvent aussi être préparés selon les mé- thodes connues, en solution ou selon le procédé en phase solide. La préparation d'unités peptidiques contenant un groupe -CH2-S-S-CH2-CH2COOH ou CH2-S-S-CH2-CH(NH2)-COOH comme reste Y2, peut être effectuée de manière analogue au procédé d) décrit précé- demment. Dans ce procédé d), on peut utiliser des composés de for- mule III ou IV dans lesquels R1 représente des restes connus qui réagissent avec les thiols en formant une liaison S-S. R1 repré- sente en particulier un groupe S-alkyle, S-COO-alkyle, s ou -S-S03-. Dans ces restes, le groupe alkyle représente en parti- culier un groupe alkyle en Cl-C4. L'incorporation de ces restes dans les composés possédant des groupes SH libres a lieu de manière analogue aux méthodes connues dans la chimie du soufre. Les exemples suivants illustrent la présente invention sans aucunement en limiter la portée. Dans ces exemples, les tempé- ratures sont données en degrés Celsius et les valeurs [a]20 sont D non corrigées. On utilise les abréviations suivantes: CO- Aib = reste de l'acide a-aminoisobutyrique (CH3)2-CO NH- Boc = tert.-butoxycarbonyle But = tert.-butyle Fmoc = 9-fluorénylméthoxycarbonyle Scm = méthoxycarbonylsulfênyle - 10 - Trt = trityle Asu = acide a-aminosubérique Cys (Me) = S-méthylcystéine Acm = acétoamidométhyle CO- Cha = reste de la 3-cyclohéxylalanine C6H1lCH2-CH DCCI = dicyclohexylcarbodiimide NH- DMF = diméthylformamide DCM = dichlorométhane Sauf indication contraire, tous les peptides sont obtenus sous forme de polyacétates polyhydratés, avec une teneur en peptide comprise entre 70 et 90 %. L'analyse HPLC révèle que les poly- peptides contiennent moins de 5 % d'autres peptides. Le symbole "F" indique la proportion de polypeptides (= teneur en polypeptides) dans les produits obtenus (F = 1 correspond à 100%), la différence entre 1 et 100 % étant constituée par de l'acide acétique et de l'eau. Exemple 1: H-Leu-Ser-Thr-Cys (H-Cys-OH)-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser- Gln- Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn- Thr-Gly- Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 a) Fmoc-Leu-Ser(But)-Thr(But)-Cys(SBut)-Val-Leu-OCH2-phényl- (P)0çH2-co(polystyrène-l%-divinyl-benzène On laisse gonfler 1 g de p-hydroxyméthyl-phénoxyméthyl- co(polystyrène-1%-divinyl-benzène) dans un mélange 1:4 (vol./vol.) de diméthylformamide/chlorure de méthylène, puis on filtre et on mélange avec une solution constituée de 0,74 g de Fmoc-Leucine et de 0,19 g de 1-hydroxybenzotriazole dans 5 ml du mélange de sol- vants indiqué ci-dessus. On ajoute ensuite 0,43 g de dicyclohéxyl- carbodiimide et 85 mg de 4-diméthylaminopyridine, chaque produit étant dissous dans 5 ml du même mélange de solvants. On agite le mélange pendant 16 heures à 20 , on le filtre et on le lave avec le mélange de solvants, puis avec du diméthyl- formamide. On obtient le Fmoc-Leu-OCH2-phényl-(p)-OCH2-cO(poly- - 11 - styrène-1%-divinylbenzène). Après avoir éliminé le groupe Fmoc par traitement (10 minutes) avec le mélange pipéridine/diméthyl- formamide (1:4, vol./vol.) et avoir lavé le mélange avec du diméthylformamide, on ajoute les produits de réaction suivants, chacun dans 5 ml de diméthylformamide: 0,71 g de Fmoc-valine, 0,28 g de 1-hydroxy-benzotriazole et 0,32 ml de diisopropylcarbo- diimide, et on agite le mélange pendant trois quarts d'heure. On effectue les mêmes réactions (élimination du groupe Fmoc, couplage du Fmoc-aminoacide suivant) dans l'ordre:Fmoc-Cys(SBut)-OH (0,9 g), Fmoc-Thr(But)-OH (0,83 g), Fmoc-Ser(But)-OH (0,8 g) et Fmoc-Leu-OH (0,74 g). Après chaque couplage, on vérifie au moyen du test à la ninhydrine que le couplage a bien eu lieu. On obtient le composé du titre. b) Fmoc-Leu-Ser -Thr-Cs(SBut)-Val -Leu-H On agite 1,2 g de Fmoc-Leu-Ser(But)-Thr(But)-Cys(SBut)- Val-Leu-OCH2-phényl-OCH2-co(polystyrène-1%-divinylbenzène) (envi- ron 0,4 mmole peptide/g) pendant 1 heure dans 10 ml d'un mélange composé à parts égales en volume d'acide trifluoroacétique et de chlorure de méthylène. On filtre le mélange, on lave la résine rési- duelle avec un mélange à parts égales d'acide trifluoroacétique et de chlorure de méthylène, puis avec du chlorure de méthylène, on concentre le filtrat sous vide et on fait précipiter avec 25 ml d'éther. On lave le précipité avec de l'éther et on le sèche sous vide. On obtient le composé du titre. c) Fmoc-Leu-Ser-Thr-Cys(SBut)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser-Gln- Glu(OBut)-Leu-His-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn- Thr-Gly-Ser-Gly-ThrPro NH2_ ---------------------------- On dissout 1,0 g du produit de l'étape b) dans 15 ml de diméthylformamide, puis on ajoute 2,3 g de H-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser- Gln-Glu(OBut)-Leu-His-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn- Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2, 0,33 g de 3,4-dihydro-3-hydroxy-4- oxo-1,2,3-benzotriazine et 0,31 g de dicyclohéxylcarbodiimide, et - 12 - on agite le mélange pendant 16 heures à 25 . Ce dernier est filtré, le filtrat est évaporé à sec, le résidu est lavé avec de l'éther, du chloroforme, de l'acétone et séché sous vide. On obtient le com- posé du titre. d) H-Leu-Ser-Thr-Cys(SBut)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser-Gln- Glu(OBut)-Leu-His-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn- Ihr-Gly:Ser-Gly-hr-Pro-NH,. acétate On dissout 0,8 g du peptide protégé de l'étape c) dans un mélange 1:4 en volume de pipéridine et de diméthylformamide, et on agite pendant 10 minutes. Après évaporation sous pression ré- duite à 25', on dissout le résidu dans 4 ml de diméthylformamide. On ajoute 50 pl d'acide acétique glacial et on verse la solution dans 80 ml d'éther. On essore le produit qui a précipité, on le lave à l'éther et on le sèche sous vide à 20 . On obtient le compo- sé du titre. e) H-Leu-Ser-Thr-Cys(H)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser-Gln-Glu- (OBut)-Leu-His-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr- On dissout 0,46 g du peptide de l'étape d) dans 2,5 ml de trifluoroéthanol et on mélange sous argon avec 0,69 ml de tributyl- phosphine. On agite la solution pendant 30 minutes à 20 , puis on la verse, toujours sous argon, dans 50 ml d'acétate d'éthyle et on centrifuge. Le précipité est mis en suspension dans de l'acétate d'éthyle et à nouveau centrifugé. Le résidu humide (composé du titre) est utilisé immédiatement tel quel dans la réaction sui- vante. f) Boc-Cys(Scm)-OH, sel de dicycIohéxylannonium Une solution refroidie à -5' et composée de 1,39 g de Boc-Cys(Trt)-OH dissous dans 15 ml d'un mélange 2:1 en volume de chloroforme et de méthanol est mélangée avec 0,5 ml de chlorure de méthoxycarbonylsulfényle et 0,31 ml de diéthylamine, et agitée pen- dant 1 heure à la même température. On ajoute 0,33 ml de diéthyl- amine, on agite la solution pendant 5 minutes a 0 ', on la dilue - 13 - avec 50 ml de chloroforme, on la lave avec de l'acide phosphorique à 10% et de l'eau et on la sèche sur sulfate de magnésium. Après évaporation du solvant, on dissout l'huile jaune dans 3 ml d'éther et on mélange avec 0, 6 ml de dicyclohéxylamine à +4 . On essore la masse cristalline, on la lave avec de l'éther et on la sèche sous vide à 30 . On obtient le composé du titre. F = 142-1430. [ -] 0 = _31 (c = 1 dans le diméthylformamide). g) H-Leu-Ser-Thr-Cys (Boc-Cys-OH)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser- Gln-Glu(OBut)-Leu-His-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr- Asn-Thr-Gl y- Ser-Gly-.Thr-Pro- NH22 acétate On dissout sous argon le peptide de l'étape e) dans 6 ml de trifluoroéthanol et on mélange avec une solution composée de 0,16 g de sel de dicyclohéxylammonium du BocCys(Scm)-OH dans ml de trifluoroéthanol. La solution est agitée pendant 2 heures sous argon, concentrée sous vide à environ 7 ml, et versée dans ml d'éther. Le précipité est essoré, lavé avec de l'éther et séché sous vide à 25 . On obtient le composé du titre. h) H-Leu-Ser-Thr-Cys(H--ys-OH)-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu- Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly- !:_Pr_: __2 --------------- _ -----_................ On dissout 3,0 g du peptide protégé de l'étape g) sous atmosphère d'azote dans 100 ml d'acide trifluoroacétique, on laisse reposer pendant 15 minutes à 20 et on évapore. On purifie le pro- duit par chromatographie liquide à haute performance en phase in- verse (gradient d'acétonitrile dans de l'eau/acide trifluoro- acétique) sur octadécylsilane. Les fractions contenant le produit pur sont combinées et évaporées à sec. Le produit est filtré sur une résine échangeuse d'ions basique sous forme acétate et le fil- trat est lyophylisé. On obtient le composé du titre sous forme de polyacétate, polyhydraté. [a]2O = -42 (dans l'acide acétique à 95%, c = 0,3). F = 0,86. - 14 - Exemple 2: H-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys (H-Cys-OH)-Val-Leu-Gly-Lys- Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg- * Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 a) Boc-Cys(Acm)-Val-Leu-OMe On dissout 28,1 g de HCl.H-Val-Leu-OMe, 29,2 g de Boc- Cys(Acm)-OH et 13,6 g de 1-hydroxybenzotriazole dans 200 ml de chlorure de méthylène refroidi à 5 , puis on ajoute 21,0 g de dicyclohéxylcarbodiimide et 10,1 ml de Nméthylmorpholine, et on agite la solution pendant 2 heures, au cours desquelles on laisse monter la température à 20'. On filtre ensuite le mélange, on éva- pore le filtrat à sec, on reprend le résidu dans de l'acétate d'éthyle et on le lave avec de l'acide phosphorique à 10%, de l'eau, du NaHC03 1N et de l'eau. On sèche la phase organique sur sulfate de sodium et on l'évapore, ce qui donne le composé du titre. b) H-Thr-Cvs(Acm)-Val-Leu-OH On dissout 20,8 g de Boc-Cys(Acm)-Val-LeuOMe dans 120 ml d'acide trifluoroacétique. Après 40 minutes, la solution est éva- porée, le résidu est dissous dans du méthanol et la solution est filtrée sur une résine échangeuse d'ions légèrement basique. Après avoir évaporé le filtrat à sec, on dissout le résidu dans du tétra- hydrofuranne et on ajoute 8,8 9 de Boc-Thr-OH et 5,4 9 de 1- hydroxy-benzotriazole, puis après avoir refroidi à 0 , 8,4 g de dicyclohéxylcarbodiimide. On agite le mélange pendant 2 heures à 20 , on le filtre, on l'évapore à sec, on dissout le résidu dans de l'acétate d'éthyle, on lave avec de l'acide phosphorique à à 10%, de l'eau, du NaHCO3 1N et de l'eau, on sèche sur Na2S04 et on évapore. On dissout le résidu dans 150 ml d'acide trifluoro- acétique et après 40 minutes, on évapore sous pression réduite, on le triture avec de l'éther et on le sèche. On dissout le résidu dans 200 ml de méthanol et on le traite par 45 ml de NaOH 1N. Après 1 heure, on ajoute 100 ml d'eau, on élimine le méthanol sous pres- - 15 - sion réduite et on filtre la solution aqueuse sur une résine échan- geuse d'ions faiblement acide. Après évaporation du filtrat, on ob- tient le composé du titre. c) Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2 On dissout 17 g de Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe dans 200 ml d'hydrate d'hydrazine, on agite pendant2 heures à 20 et on éva- pore à sec à 25 . On lave le résidu avec de l'éther et on le sèche, ce qui donne le composé du titre. d) Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-OH On dissout 13,6 g de BocSer-Asn-Leu-Ser-NHNH2 dans 150 ml de diméthylformamide, on refroidit à 20 , et on ajoute 40 ml d'une solution anhydre de HCl (2N) dans du dioxanne, puis 3,6 ml de nitrite de tert.-butyle. Après 10 minutes à -20 , on ajoute 16 ml de triéthylamine et 13,0 g de H-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-OH et on agite la solution pendant 16 heures à 25 . On filtre le mélange, on éva- pore à sec le filtrat, on met le résidu en suspension à plusieurs reprises dans de l'acide acétique 1N et dans de l'eau, on filtre et on sèche, ce qui donne le composé du titre. e) Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser- Gln-Glu(OBut)-Leu-His-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr- Asn-Thr-G lY-Ser-Gly-Thr-úPro--NH2 On dissout 1,0 g du produit de l'étape d) dans 15 ml de diméthylformamide, on ajoute 2,3 g de H-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser-Gln- Glu-(OBut)-Leu-His-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr- Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2, 0,33 g de 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo- 1,2,3-benzotriazine et 0,31 g de dicyclohéxylcarbodiimide, et on agite pendant 16 heures à 25 . On filtre le mélange, on évapore à sec le filtrat et on lave le résidu avec de l'éther, du chloroforme et de l'acétone, ce qui donne le composé du titre. - 16 - f) Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys (Boc-Cys-OH)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)- Leu-Ser-Gln-Glu(OBut)-Leu-His-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro- I!- Th-Asn-Thr-Gl:S:r2Pro-NH2 On dissout le produit de l'étape e) dans 100 ml d'un mé- lange à parts égales de chloroforme et de méthanol. On ajoute à 0' 0,18 ml de chlorure de méthoxycarbonylsulfényle et on agite le mé- lange pendant 1 heure et demie à cette température. On ajoute en- suite 0,20 ml de diéthylamine. Après 5 minutes à O', on ajoute 0,3 g de Boc-cystéine et on agite pendant encore 2 heures à la tem- pérature ambiante. On concentre la solution sous pression réduite, on fait précipiter le produit avec de l'éther, on l'essore et on le sèche. On obtient ainsi le composé du titre. g) H-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys (H-Cys-OH)Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser- Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly- Ser-Gly-Thr::Pro-NH2 On dissout 3,0 g du produit de l'étape f) sous atmosphère d'azote dans 100 ml d'acide trifluoroacétique, on laisse reposer pendant 15 minutes à 20 et on évapore à sec. On purifie le produit par chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (gradient d'acétonitrile dans de l'eau/acidetrifluoroacétique). Les fractions contenant le produit pur sont combinées et évaporées à sec. On filtre le produit sur une résine échangeuse d'ions basique sous forme acétate et on lyophy- lise le filtrat. On obtient le composé du titre sous forme de poly- acétate, polyhydraté. [a2]0 = -62 (dans l'acide acétique à 50%, c = 0,19), ou [a] O = -64,2 (dans l'acide acétique à 50%, c = 0,31). F = 0,80. Exemple 3: -e-Isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln- Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly- Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 a) eN-Isocaproyl-Ser(But)-Thr(But)-Ala-Val-Leu-OCH2-phényl- PI(2pc9:polystyrène-1%-divinylbenzène) On êlimine le groupe protecteur N Fmoc - 17 - du Fmoc-Leu-OCH2-phényl-(p)OCH2-co(poly- styrène-l%-divinylbenzène) (1,56 g correspondant à 0,7 mMole) par traitement avec de la pipéridine (20% en volume) dans DMF pendant 10 minutes. On lave la résine avec du DMF et on ajoute, chaque fois dans 5 ml de DMF, 0,71 g de Fmoc-Val-OH, 0,28 g de 1-hydroxybenzotriazole et 0,32 ml de diisopropyl-carbodiimide. Après 45 minutes, on essore le mélange et on lave la résine avec du DMF. On répète l'élimination du groupe Fmoc et le couplage de l'amino-acide avec successivement: Fmoc-Ala-OH (0,65 g), Fmoc-Thr(But)-OH (0,38 g) et Fmoc-Ser(But)-OH (0,8 g). Dans la réaction suivante, on remplace le dérivé d'amino- acide par l'acide isocaproïque (0,41 g), et on utilise 0,53 g de 1hydroxybenzotriazole ainsi que 0,54 g de diisopropylcarbodiimide, le couplage étant effectué pendant 15 heures. On lave soigneusement la résine avec du DMF et du chlorure de méthylène, on la sèche sous vide à 40 pendant 15 heures, ce qui donne la résine peptidique protégée sous forme d'une poudre incolore. b) Nf-Isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-OH On ajoute 1,0 g de N a-Isocaproyl-Ser(But)-Thr(But)-Ala- Val-Leu-OCH2-phényl-(p)OCH2-co(polystyrène-1%-divinylbenzène) à un mélange d'acide trifluoroacétique (5 ml) et de chlorure de méthylène (5 ml). On filtre le mélange réactionnel, on lave la résine avec le même mélange (5 ml), puis avec du chlorure de méthylène, on concentre sous pression réduite et on fait précipiter complètement le produit avec de l'éther. On filtre le précipité, on le lave bien avec de l'éther et on le sèche sous pression réduite sur de l'hydroxyde de potassium solide. On obtient le composé du titre sous forme d'une poudre amorphe et incolore. c) 4 -Isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser-Gln- Glu(OBut)-Leu-His-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn- A une solution de Na-Isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-OH (0,165 g) dans du DMF (7 ml), on ajoute du chlorhydrate de H-Gly- - 18 - Lys(Boc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OBut)-Leu-His-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr- Tyr- Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 (0,59 g), de la 3,4- dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine (0,017 g), du dicyclo- héxylcarbodiimide (0,065 g), puis de la N-éthyl-N-N-diisopropyl- amine jusqu'à ce que le mélange présente un pH de 6 sur du papier pH mouillé. Après 16 heures, on fait précipiter le composé du titre par addition d'éther et on le sèche. d) Na-Isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu- His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr- ProH:b2....................................................... On dissout 0,5 g du produit obtenu à l'étape c) dans un mélange à parts égales en volume d'acide trifluoroacétique et de chlorure de méthylène. Après 1 heure, on ajoute 50 ml d'éther (contenant 0,6 mMole de HCl). Le produit est filtré, lavé avec de l'éther et séché sous vide. On le purifie par chromatographie HPLC enphase inverse dans un gradient d'acétonitrile dans de l'acide phosphorique (2%). Les fractions contenant la substance à l'état pur sont combinées et filtrées sur une colonne échangeuse d'ions basique sous forme acétate. Le composé du titre est lyophylisé et est obtenu sous forme de polyacétate, polyhydraté. [a]20 = -32,2 (c = 0,3 dans AcOH 95%). F = 0,87. En procédant de manière analogue à celle décrite aux exem- ples 1, 2 ou 3, on peut préparer les composés de formule I sui- vants: a) composés de formule A-Leu-Ser-Thr-A7-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser- Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly- Ser-Gly-Thr-Pro-NH2. - 19 - F [C]2 [1D H-Ser-Asn- H-Ser-Asn- H-Ser-Asn- H-Asn- H-Ser-Asn H-Ser-Asn- H-Ser-Asn- H-Gly-Asn- H-Ser-Asn- H-Ser- H- H-Ser-Asn- H-Ser-Asn- H-Ser-Asn- H - CH3CO- H - Cys 0,79 -40,0 Cys(-S-CH2-CH2-COOH7])-52,8o Asu 0,78 -20 !' À cys(H-Cys-OH) 0,77 -15l Glu 0,70 -2i,5 Ala 0,81 -25320 Ser 0,77 -266,3o Cys(H-Cys-OH) 0,83 -41,8o Cys(Me) 0,80 -27,7 Cys(H-Cys-OH) 0,85 -31,60 Ala 0,91 _30,49 Cys(Acm) 0,78 -21 Lys 0,78 -21,7 Arg 0,86 -24 2 D-Ala 0,90 -26,5 Ala 0,90 -34,7? Phe 0,83 -30,0 (c = (ó = (c- (c = (c = (c = (c = (c = (c = (c = (c = (c = (c = (c = (c = (c = (c = (C = 0,32 0,4 0,4 0,4 0,4 0,23 0,4 0,28 0,26 0,38 0,44 0,16 0)41 0,33 0,62 0,34 0,43 AcOH 50%) AcOH 50%) AcOH 95%) À AcOH 100%) ACOR 95%) AcOH 95%) ACOH 9S%) AcOH 95%) AcOH 95%) AcOH 85%) AcOH 95%) AcOH 95%) AcOH 95%) - AcOH 95%) AcOH 95%) AcOH 95%) AcOH 95%) = 0,77 b) composés de formule A-Thr-A7-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu- Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly- Thr-Pro-NH2. Ex. A A7 10 Il 15 20 1) F - 20 - A H-Ser-Asn-Ser H-Ser A7 C- Cys (H- r--- Cys I - r- H-Ser-Asn-Leu Cys(H- H-Ser-Leu Cys(H- H-Leu-DAla Ala H-DLeu-Ser Ala H-Phe-Ser Ala H-Leu-DSer Ala Adamantanacétyl-Ser H-Leu-Ala Ala H-Leu Ala H-Cha-Ser Ala CH3CO-Ser Ala HAla-Ser Ala H-Pro-Ser Ala Cyclohexylpropionyl-Ser Cyclopentyl-CO-Ser Pyrogl utamoyl -Ser Décanoyl -Ser -Cys-OR) -Cys-OH) Cys-OH) Ala Ala Ala Ala Ala [a3D] -36,8 (0,47) 0,79 -44,2 {0,59) 0,85 -34,9 (0,3) 0,82 -34,4 (0,27) 0,85 -27,7 (0,53).090 -31,3 (0,47) 0,83 -33,9 (0,52) 0,90 -26,4 -30,5 (0,4) 0,83 -317 (0,32) 0,90 -35,4 (0,35) 0,86 -26,2 (0,45) 0,85 -33,3O (0,37) 0,92 -32,0 (0,50) 0,90 -37,50 (0,44) 0,86 -28,3 {0f24) 0,83 -35,1 (0,37) 090 -34,6 (0,3) 0,87 -25,6 (0,25) 0,91 c) composés de formule H-Leu-Ser-A6-Ala-A8-A9-Gly-Lys-Leu-Ser- Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly- Ser-Gly-Thr-Pro-NH2. Ex. A6 A8 39 Thr Thr DThr Thr Thr Gly Val Val Val Aib A9 Leu DLeU Leu Ph- Leu -25,3 -26,90 -17,6 -28j6 -28,00 c Ac08 95% F (0,43) ( 0,51) (0,55) (0,44) (0,50) 0, 85 0,86 0,85 0,88 0,88 Ex. 24 3]. 33 37a 37b - 21 - Exemple 43: H-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(H-Cys-OH)-Nle-Leu-Gly-Thr- Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln- Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Al:a-P::ro-NH2 ------ On procède de manière analogue à celle décrite à l'exem- ple 2. [a]20 = -44O (c = 0,11 dans AcOH 95%). (F = 0,75). Exemple 44: NX-Isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser- Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr- Asp-Val- Glï-Al a-Gl:Y-Thr-Pro-NH2 Ce peptide est assemblé par étapes sur une résine à base de polystyrène. Le groupe Boc est utilisé pour protéger les groupes a-amino, et les groupes fonctionnels de la chaîne latérale sont protégés comme suit: Lys(2-chlorobenzyloxycarbonyl), Ser(benzyl), Thr(benzyl), Arg(tosyl), His(tosyl), Tyr(4-chlorobenzyloxy- carbonyl), Cys(4-méthylbenzyl) et Glu(benzyl). La résine amino-4-méthylphényl-méthyl-co(polystyrène- divinylbenzène) (0,7 mmole/g) est soumise au cycle suivant, étape (1) à (7) du traitement: (1) DCM (2) acide trifluoroacétique (50%) dans DCM (3) DCM (4) diisopropyléthylamine (10%) dans DMF (5) DMF (6) anhydride symétrique d'un Boc-amino-acide dans DMF (2,8 mmole/g de résine de départ)préparé au préalable (7) DMF Les volumes de lavage et des produits de réaction repré- sentent entre 5 et 20 ml par gramme de résine de départ. Chaque étape est répétée aussi souvent qu'il est néces- saire, que ce soit pour compléter la réaction de la résine (étapes 2, 4, 6) ou pour éliminer le produit de réaction précédent de la résine (étapes 1, 3, 5, 7). Des échantillons de résine sont préle- vés après chaque cycle et sont soumis au test à la ninhydrine pour vérifier si la réaction est terminée. - 22 - Les anhydrides symétriques des Boc-amino-acides sont pré- parés juste avant d'être utilisés, en faisant réagir les Boc- amino-acides (2,8 mmole par g de résine) et le DCCI (1,4 mmole par g de résine) dans DCM, contenant du diméthylformamide en quantité suffisante pour dissoudre complètement le Boc-amino-acide. On filtre le mélange, on rajoute du DMF au filtrat, on réduit le volume par évaporation du DMC à une température ne dépassant pas et on utilise la solution ainsi obtenue dans l'étape (6). Le cycle de réactions (1) à (7) est répété pour les restes d'amino-acides de manière à obtenir la séquence de formule I, excepté pour les restes Boc-Gln-OH et Boc-Arg(Tos)-OH qui sont cou- plés dans l'étape (6) sous forme de leurs esters 1-hydroxybenzo- triazoliques dans le DMFpréparés à l'avance. Dans le dernier cycle, à l'étape (6), on ajoute à la ré- sine de l'acide isocaproïque, du diisopropylcarbodiimide et du 1hydroxybenzotriazole (tous les trois à raison de 3,5 mmoles par g de résine de départ) dans du DMF. Après 15 heures, on lave la ré- sine avec du DMF et du DMC et on la sèche. A la résine peptidique (1 g), on ajoute du p-crésol (1 g), du sulfure de diméthyle (1 ml) et du HF (10 ml). Après 1 heure à 0 , les composantes volatiles sont distillées à 0 . Le résidu est lavé avec de l'acétate d'éthyle et extrait avec plusieurs portions d'acide acétique (10%) dans de l'eau et l'extrait aqueux est lyo- phylisé. Le produit lyophylisé est purifié par chromatographie HPLC en phase inverse, sur une colonne d'octadécylsilane éluée avec un gradient d'acétonitrile dans de l'acide phosphorique (2%). Les fractions contenant le composé à l'état pur sont combinées, fil- trées à travers une résine échangeuse d'ions faiblement basique sous forme acétate, lyophylisées et séchées. On obtient le composé du titre sous forme d'une poudre blanche et duveteuse. [a]0 -34 (c = 0,53 dans AcOH 95%). F = 0,93. Les composes de formule I et leurs sels et com- plexes pharmaceutiquement acceptables, possèdent d' intéressantes propriétés pharmacologiques comme il ressort des essais effectués sur les animaux. Ils peuvent donc être utilisés en thérapeutique comme médicaments. En particulier, ils diminuent les taux de calcium plasmatique et antagonisent laparathormone pour donner un bilan calcique positif en faveur de l'os. L'effet hypocalcémiant des composés peut être observé selon les méthodes classiques, par exemple selon la méthode de M. Azria et coll. rapportée au Symposium cal- citonine 1984 les 2 - 4 octobre 1984 à Milan, et publiée en 1986 sous forme de brève communication dans Current Clinical Practice Series No. 42, Excerpta Medica 1986, p. 104. Dans cette méthode, on utilise une électrode sélective pour l'ion calcium afin de mesurer en continu la teneur en ion calcium du sang de jeuneslapins. Les composés sont administrés par voie intraveineuse à une dose comprise entre 0,1 et environ 10 /ug/kg, par exemple correspondant à environ 1 unité internationale par kg. On effectue des essais sur une période de 5 heures et on calcule les aires sous la courbe. Les composés peuvent également être soumis à d'autres essais, par exemple à l'essai classique hypo- calcémiant chez le rat décrit par M. Kumar et coll. dans J. Endocrinology, (1965), 33, page 469, en utilisant les mêmes doses. Une activité hypocalcémiante de 300 à 6000 unités internationales par mg est observée dans cet essai. Les composés préférés, sont les composés des exemples 3, 29 et 36. Grâce à ces propriétés, les composes de formule I peuvent donc être utilisés en thérapeutique pour le traitement de tous les états dans lesquels il convient de réduire le taux de calcium plasmatique ou d'influencer le métabolisme de l'os, par exemple l'hypercalcémie résultant d'une déficience en thyrocalci- tonine endogène due à la perte de la fonction sécrétrice des cellules C de la tyrolde ou à l'hyperfonction de la parathyrolde. Ils sont également indiqués pour toutesles affections osseuses associées à une dégradation accrue ou dans lesquelles une fixation du calcium dans les os est désirée, par exemple l'osteoporose d'origine diverse (par exemple postclimatérique, post-traumatique, consécutive à la cortico-thérapie ou à l'immobilisation, d'origine maligne etc...), les fractures, l'osteomalacie, l'osteodystrophie rénale et provoquée par le rachitisme, les douleurs, par exemple les douleurs osseuses associées à l'osteoporose, les troubles neuro- dystrophiques, la maladie de Paget ainsi que, en parti- culier, pour la thérapie combinée avec le calcium ou lesphosphates. Les composés de formule I inhibent également la sécrétion du pancréas. Cette inhibition peut être mise en évidence chez les animaux, par exemple en utili- sant la méthode décrite par S.J. Konturek et coll, dans * Scand.J. Gastroint. (1975) 6. p. 423, après administra- tion aux mêmes doses que celles indiquées précédemment. Grâce à ces propriétés, les composés de formule I peuvent également être utilisés en thérapeutique pour le traitement de la pancréatique aiguë et des troubles gastro-intestinaux, tels que les ulcères. Pour les indications mentionnées ci-dessus, les composés de formule I seront administrés à une dose quotidienne comprise entre environ 5 et environ 1500 unités internationales, avantageusement sous forme de dose unitaire une fois par jour ou, si désire, une fois tous les deux ou trois jours à une dose quotidienne comprenant environ de 5 à environ 1500 unités internationales. Les composés peuvent être administrés sous forme libre ou sous forme de sels ou de complexes pharma- ceutiquement acceptables;de tels sels ou complexes ont le même ordre d'activité que les formes libres. L'invention comprend par conséquent un composé de formule I, sous forme libre ou sous forme de sel ou de complexe pharmaceutiquement accep- table, pour l'utilisation comme agent hypocalcémiant, pour le traitement de la maladie de Paget, de l'osteo- porose, des douleurs osseuses associées à l'ostéoporose, des troubles dystrophiques ou de la pancréatique. L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un composé de formule I, sous forme libre ou sous forme d'un sel ou complexe pharmaceutiquement acceptable, en association avec un diluant ou véhicule solide ou liquide pharmaceutiquement acceptable. Les compositions pharmaceutiques peuvent être préparées selon les méthodes connues et peuvent être utilisées par exemple pour l'injection intra- musculaire ou l'administration nasale. On peut également utiliser des compositions à libération prolongée. REVENDICATIONS 1.- Les composés répondant à la formule I 1 (I) R-(NH-CH-CO) -A6-NH-CH-CO-A -A9-Z-ProNH2 dans laquelle R représente H ou un groupe R'CO, R'CO représentant le reste acyle d'un acide carboxylique, Yî représente le reste situé sur l'atome de carbone a d'un a-amino-acide, Y2 représente le reste situé sur l'atome de carbone a d'un a-amino-acide, ou un reste de formule -CH2-S-S-CH2-CH-COOH NH2 -CH2-S-S-CH2-CH2-COOH, -(CH2)p-COOH OU -CH2-S-Y3, Y3 représente un groupe alkyle en C1-C4, un groupe benzyle éven- tuellement substitué par un groupe méthyle ou méthoxy, ou un groupe CH3C0NH-CH2-, n signifie un nombre de 1 à 4, A6 représente un groupe Thr ou DThr, p signifie un nombre de 3 à 5, A8 représente le reste aminoacyle d'un L-a-amino-acide neutre et lipophile, Ag représente le reste aminoacyle d'un L- ou D-a-amino-acide neutre et lipophile, Z représente le reste polypeptidique correspondant à la sé- quence 10 à 31 d'une calcitonine naturelle ou d'un de ses 33 dérivés ou analogues possédant une action hypocalcémiante, les restes Y1, lorsque n est supérieur à 1, pouvant être identiques ou différents et tous les restes amino-acides,à l'exception du reste A8, pouvant avoir, indépendamment les uns des autres, la con- 25909 02 figuration L ou D, et le reste aminoacyle N-terminal ne pouvant signifier le groupe H-Cys lorsque Y2 représente un groupe -CH2SH et n signifie 4, et les sels et les complexes de ces composés. 2.- Un composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que Z signifie Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln- Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr 3.- Un compose selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que -NH-CH(Y2)-CO représente le reste d'un a-amino acide neutre et lipophile. 4.- Un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que n signifie 2 et R signifie H ou R'CO. 5.- Un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que n signifie 1 et R signifie R'CO. 6.- Le composé répondant à la formule N -isocaproyL-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln- N - IsoarolSe- Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly- Ser-Gly-Thr-Pro-NH2- 7.- Le composé répondant à la formule Adamentanacétyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln- Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly- Ser-Gly-Thr-Pro-NH2. 8.- Le composé répondant à la formule Cyclchexylpropionyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln- Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly- Ser-Gly-Thr-Pro-NH. 2' 9.- Un procédé de préparation des composes de formule I spécifiés à la revendication 1, caracté- risé en ce qu'il comprend: a) l'élimination d'au moins un groupe protecteur dans un poly- peptide ayant la séquence indiquée dans la formule I, sous forme protégée, b) le couplage de deux unités peptidiques par une liaison amide, chacune de ces unités contenant au moins un amino-acide tel que défini dans la formule I ou un de ses dérivés, sous forme protégée ou non protégée, les unités peptidiques étant telles qu'on obtient un polypeptide ayant la séquence indiquée dans la formule I, sous forme protégée ou non, et, si nécessaire, la mise en oeuvre du procédé décrit sous a), c) pour la préparation d'un composé de formule I ayant un groupe terminal R'CO-, la réaction d'un peptide protégé ayant la sé- quence indiquée dans la formule I, sous forme protégée ou non, avec un acide de formule R'COOH ou l'un de ses dérivés réac- tifs et, si nécessaire, la mise en oeuvre du procédé décrit sous a), d) pour la préparation de composés de formule I, dans laquelle Y2 représente un groupe -CH2-S-S-CH2-CH-COOH ou ! NH2 -CH2-S-S-CH2-CH2-COOH,soit la réaction d'un composé de for- mule II y CH -SH 1, R-(NH-CH-CO) -A -NH-CH-CO-A -A -Z-ProNHt2 sous forme protégée ou non protégée, avec un composé de formule III CH2-S-R1 R2 -CH-COR3 III dans laquelle R1 représente un groupe qui facilite la formation d'un pont -S-S- avec l'atome de soufre du groupe CH2SH dans le poly- peptide de formule II, R2 représente l'hydrogène, un groupe amino ou un groupe amino protégé, et R3 représente un groupe OH ou un groupe protecteur du groupe carboxy, soit la réaction d'un composé de formule IV 1 Oy CH -SR R-(NH-CH-CO) -A-NH-CH-CO-A8-A 9-Z-PrONH2 IV sous forme protégée ou non protégée, formule dans laquelle R1 est tel que défini cidessus, avec un composé de formule V CH2-SH R2-CH-COR3 v et éventuellement la mise en oeuvre du procédé décrit sous a) , et, si nécessaire, la transformation en forme libre, en sel d'addition d'acide ou en complexe du polypeptide résultant. 10.- Un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, sous forme libre ou sous forme d'un sel ou complexe pharmaceutiquement acceptable, pour l'utilisation comme agent hypocal- cémiant ou pour le traitement de la maladie de Paget,de l'ostéoporose, des douleurs osseuses associées à l'ostéoporose, des troubles neurodystrophiques, de la pancréatite ou des troubles gastro-intestinaux. 11.- Une composition pharmaceutique, caracté- risée en ce qu'elle contient un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, sous forme libre 2S90902 ou sous forme d'un sel ou complexe pharmaceutiquement acceptable,en association avec des diluants ou véhicules liquides ou solides pharmaceutiquement acceptables.