FR 2593828 A2 19870807 FR 8601425 A 19860131 Sondes à Papillomavirus et procédé de diagnostic in vitro d'infections à papillomavirus L'invention concerne des ADNs de papillomavirus, et plus particulièrement des sondes dérivées de ces papillo- mavirus, ainsi que des procédés les mettant en oeuvre pour le diagnostic in vitro d'lnfections à papillomavirus. L'expression "papillomavirus" recouvre un grand nombre de virus ayant en commun d'eêtre tenus pour respon- sables de plusieurs formes d'infections virales s'étageant entre les verrues cutanées ou de muqueuses relativement bénignes et des hyperplasies susceptibles de dégénérer en neoplasles intra-épitheliales et en cancers cutanés. Parmi des infections à papillomavirus, on mentionnera également plus particulièrement l'epidermodysplasie verruciforme, qui sera quelquefois ci-après désignée sous l'expression "EV". Un certain nombre de types de papllomavirus a déjà eté décrit. Dans le cadre du brevet principal n 84.18369 et du premier certificat d'addition n 85.07073 ont été décrits un certain nombre de types et sous- types nouveaux de papillomavirus qui ont été isolés à partir de verrues ou lésions maculaires disséminées, susceptibles de donner lieu au développement précoce de cancers de la peau chez d'importantes proportions des malades qui en sont affec- tés. Des études récentes ont révélé l'importance de facteurs immunitaires et le rôle ma3eur de divers types de virus de papillomes humains IHPV), ces facteurs s'a3outant au rôle déjà décrit dans la littérature de facteurs géne- tiques divers et des rayonnements actiniques dans la pa- thogénése des infections aux papillomavirus. L'invention du brevet principal et du premier certifi- cat d'addition découlait des observations qui avaient été faites quant aux comportements relatifs d'un grand nombre de papillomavirus nouvel- lement isolés, dont les caractéristiques génomiques essentielles ont été définies. Plusieurs types et sous-types de papillomavirus nouveaux ont été décrits dans le brevet principal et le premier certificat d'addition. Il en a été de même de l'utilisation des ADNs de ces papillomavirus nouveaux, pris isolément ou en association, entre eux et/ou avec des ADNs d'HPV antérieurement connus, dans des techniques de diagnostic in vitro plus affinées. D'une façon générale, il a été remarqué dans le brevet principal que les papillomavirus. bien que très différents entre eux, avaient des tailles de l'ordre de 7000-8000 paires de bases. En outre, leurs génomes peuvent néanmoins présenter certains degrés d'homologie, évalués en pourcentages d'homologies entre types et sous-types de papillomavirus, dans des essais d'hybridation réalisés dans des conditions dites non stringentes ou non strictes ou encore dans des conditions d'hybridation stringente ou stricte. Il a été dit que les papillomavirus qui présentent des pourcentages d'homologie inférieurs à 50 Z dans des conditions strictes ou stringentes appartenaient à des types différents. Les virus pour lesquels on observe, dans ces conditions strictes ou stringentes, des pourcentages d'homologie supérieurs à 50 Z sont considérés comme appar- tenant au même type. Ils peuvent former des sous-types différents au sein de ce même type. Les essais d'hybridation dans les conditions non strictes ou non stringentes impliquent la mise en contact mutuelle d'ADNs provenant de deux lsolats de virus dans les conditions suivantes décrites par HEILMAN C.A. et al, 1980, J. Virol.. 3S, 395-407, et CROISSANT et al, 1982. C.R. Acad. Sc. Paris, 294, 581-586 (molécules hétérodu- plexes). Les essais d'hybridation dans les conditions strictes ou stringentes impliquent la mise en contact mutuelle d'ADNs provenant de deux isolats de virus dans les conditions décrites par KREMSDORF, D. et al. ((198Z). J. Virol. 43:436-447 et 1983, J. Virol. 48:340-351) et DAVIS R.W. et al., 1971, Methods Enzymol., 21, 413-418 (molécules hétéroduplexes). Partant de ces considérations, plusieurs virus nouveaux ont fait l'objet d'une description dans le brevet principal et le premier certificat-d'addition. De même ont été décrits des recombinants génétiques compre- nant tout ou partie des génomes (dénommés ADN-HPVs) de ces virus. L'invention du brevet principal et du premier certificat d'addition concernait par conséquent chacun des ADN-HPVs choisis parmi l'ensemble des ADNs qui pré- sentent des tailles qui s'étagent entre 7000 et 8000 paires de bases et sont caractérisés par les cartes de restriction qui apparaissent dans les dessins également reproduits dans cette demande, en ce qui concerne plus particulièrement les ADN-HPVs obtenus à partir des papillomavirus et qui répondent aux désignations HPV2d, HPV10b, HPV14a, HPV14b, HPVI5, HPV17a, HPV17b, HPV19, HPV20, HPV21, HPV22, HPV23, HPV24, HPV28, HPV29, HPV31, HPV32, HPVIP2 et-HPV-IP4. L'invention du brevet principal et du premier certificat d'addition concernit également des mélanges ou "cocktails" d'ADN-HPVs isolés à partir des papillo- mavirus nouveaux ou antérieurement connus, à la date de dépôt du brevet principal, ou des sondes d'hybridation les contenant susceptibles d'être mis en oeuvre plus efficacement pour le diagnostic de diverses catégories d'infections, voire des. niveaux de risques qu'accompa- gnent la découverte chez un patient de papillomavirus déterminés. Le nombre des sondes à papillomvirus dé- crites dans le brevet principal et dans le premier cer- tificat d'addition, auxquelles s'ajoutaient celles constituées à partir des ADNs génomiques de papilloma- virus déjà isolés précédemment et leurs associations dans des mélanges déterminés, permet donc la réalisation de diagnostics affinés, notamment une grande discrimination des diverses catégories d'infections imputables aux di- vers types de papillomavirus ou susceptibles de se déve- lopper sous l'effet de ces derniers types et, au sein d'une catégorie d'infections déterminées, de mieux pro- nostiquer le degré de risque que ces dernières se trans- forment en des maladies plus redoutables. En particu- lier, l'invention du brevet principal fournissait des moyens permettant, dans le cas des infections se mani- festant par des épidermodysplasies verruciformes, de mieux apprécier le degré de risque que ces dernières évoluent vers des cancers cutanés. A ce titre, l'invention du brevet principal et du premier certificat d'addition concernait plus par- ticulièrement des compositions de diagnostic; un groupe de compositions préférées était défini comme contenant: 1) au moins l'ADN de l'HPV2d, 2) au moins l'un des ADNs de HPV1Ob, 28 e 3) au moins l'un des ADNs de HPV17, 24, 4) au moins l'un des ADNs de HPV14, 15, 1 22, 23 et IP4, ) au moins l'un des ADNs de HPV15 et 17, 6) l'ADN de HPV24, 7) l'ADN de HPV14, 32 et IP4, 8) l'ADN de HPV31, 9) l'ADN de HPV32, )au moins l'un des ADNs de HPV16, 18 et étant entendu que les ADNs des neuf choisis de façon & être en toutes circoi t 29, 7, 19, 20, 21, IP2, groupes étaient nstances diffé- rents les uns des autres. Dans les figures 1 à 10 des dessins ci-annexés, sont représentées les cartes physiques de restriction des ADN-HPVs concernés. Les cartes physiques donnent la position de sites de coupure par diverses endonucléases de restric- tion. L'origine des cartes est généralement constituée par un site unique de coupure. Les distances à l'origine sont exprimées en pourcentage de longueur de génome. La présente invention concerne des papillomavi- rus nouvellement isolés, les ADNs génomiques qui peuvent en être extraits ou des fragments de ces ADNs génomi- ques, ainsi que de nouvelles sondes d'hybridation qui peuvent être formées & partir de ces ADN-HPVs ou frag- ments d'ADN-HPVs. L'invention concerne encore des "cocktails" nouveaux de sondes les contenant ou leur utilisation dans des "cocktails" de sondes déjà décrits dans le brevet principal, cependant complétés avec l'un ou l'autre des ADN-HPVs faisant l'objet de la présente demande et, par conséquent, des trousses ou "kits" de diagnostic encore davantage perfectionnés. Les ADN-HPVs selon la présente invention sont caractérisés par les cartes de restrictions faisant les objets des figures 11 et 12 et respectivement dénommés HPV-IP5 et HPV-IP6. Les sondes d'hybridation construites à partir du génome de HPV-IP5 ou du génome de HPV-IP6, ou de préfé- rence, les deux à la fois, sont particulièrement utiles, pour le diagnostic et/ou le dépistage in vitro. dans les conditions qui ont été décrites dans le brevet principal et dans le premier certificat d'addition et qui seront encore décrites plus loin, des types de papillomavirus qui constituent un risque pour le développement de néo- plasies génitales et, en particulier, de cancers du col de l'utérus. Ces sondes d'hybridation seront avantageusement incorporées aux-mélanges de diagnostic des affections du même type sur lesquels il sera revenu plus loin. L'invention concerne également des fragments des ADN-HPVs précédents ou capables de s'hybrider avec ceux- ci, notamment dans des conditions strictes. De même, elle concerne les ADNs recombinants contenant tout ou partie de chacun des ADN-HPVs sus-indiqués, et plus par- ticulièrement des ADNs recombinants contenant des frag- ments correspondant aux gènes El, E2, E6-E7, L1, L2 et & la région intergénique, NC, respectivement ou encore des fragments contenant des séquences correspondant aux ré- gions intergéniques desdits ADN-HPVs. Elle concerne en- fin les sondes qui peuvent être constituées à partir de ces ADN-HPVs respectifs ou à partir des fragments cor- respondants et les procédés de diagnostic in vitro met- tant en jeu lesdites sondes. Les préparations d'ADN viral ont été extraites selon les techniques qui seront décrites ci-après dans les exemples 1 et 2. Dans ce qui suit seront décrites de façon plus précise les conditions dans lesquelles les virus ont été isolés, puis les conditions dans lesquelles ont été ob- tenus les ADN-HPVs à partir de ces virus. Clonaae moléculaire et caractérisation d'un nouvau tyDe d'HPV associé à des néoplasies qénitales et à des can- cers du col de l'utérus (HPV-IP5) Un nouveau type d'HPV a été mis en évidence dans l'ADN de biopsies de néoplasies intraépithéliales (pa- pules bowenoides du pénis), par hybridation moléculaire sur réplique, dans des conditions non strictes, avec une sonde d'ADN radioactive spécifique du HPV6 ou du HPV10. L'étude de la sensibilité de l'ADN de cet HPV à plu- sieurs endonucléases de restriction a montré que l'en- zyme EcoRI coupe une fois l'ADN viral. Après digestion de l'ADN extrait des lésions par l'enzyme EcoRI, la fraction renfermant des molécules d'ADN de 8 kb a été purifiée pr centrifugation dans un gradient de saccha- rose. Les molécules d'ADN de 8 kb ont été insérées, par le site EcoRI, dans l'ADN du bactériophage A gt weX B. Après encapsidation de l'ADN recombinant et infection de bactéries Escherichia óoL1 K12 (souche LA101), les bactériophages recombinants ayant intégré l'ADN de HPV ont été sélectionnés par la technique d'hybridation sur plages de lyse (Benton et Davis), en utilisant une sonde d'ADN radioactive spécifique de l'ADN du HPV6, dans des conditions non strictes. Plusieurs bactériophages recom- binants, contenant la totalité-des séquences virales, ont été isolés. La coupure de l'ADN des bactériophages recombinants par l'enzyme d'insertion EcoRI engendre un fragment de 8 kb hybridant avec l'ADN du HPV6 dans des conditions non strictes. La coupure de l'ADN des bacté- riophages recombinants et de la préparation ADN extrait des lésions par le mélange des endonucléases EcoRI et PstI engendre les mêmes sept fragments, dont le poids moléculaire- total correspond à celui d'un génome de-HPV (8 kb). L'ADN du nouvel HPV a été excisé des séquences de l'ADN phagique et recloné dans le plasmide SP65. Une carte de restriction de l'ADN viral a été construite à partir de l'étude de la sensibilité de cet ADN à 16 endonucléases de restriction. 22 sites de coupure ont ainsi été localisés (fig. 11). La carte de restriction du nouvel HPV est différente de celle de tous les HPV identifiés à ce jour. Le degré d'homologie entre l'ADN du nouvel HPV et i'ADN des HPV identifiés à ce jour a été analysé par des expériences d'hybridation sur ré- plique, dans des conditions.strictes, en utilisant une sonde radioactive préparée à partir de l'ADN purifié du nouvel HPV. Une homologie partielle a été détectée avec l'ADN du HPV18 et, à un degré moindre, du HPV26 et une homologie faible a été détectée avc l'ADN des types 2, 6, 10, 13, 29, 31 et HPV-IP2. Le degré d'homologie entre l'ADN du nouvel HPV et l'ADN du HPV18 a été déterminé plus précisément par des expériences de réassociation ADN-ADN en milieu liquide, suivie par un traitement des hybrides par la nucléase S1. Un taux d'hybridation de 10 % a été détecté entre ces deux ADNs. Le nouveau virus caractérisé à partir de papules bowenoides du pénis constitue donc un nouveau type d'HPV, provisoirement dénommé HPV-IP5. L'analyse, au microscope électronique, de molé- cules hétéroduplexes formées, dans différentes condi- tions, entre l'ADN de HPV-IP5 et l'ADN du HPV-16 a per- mis d'alilgner les cartes physiques de ces deux génomes et de définir les positions théoriques de différents gènes portés par l'ADN d'HPV-IP5, comme indiqué ci- après: Localisation putative des principaux gènes et de la région intergénique (NC) du HPV-IP5 IP5 E6-E7 18-28 E1 28-53 E2 51,5-66 L2 69,5-89 L1 87-8 NC 7,5-18 L'utilisation de sondes radioatives préparées à partir de l'ADN du HPVIP5 purifié a permis de déterminer le pouvoir pathogène de ce virus. Au cours d'une étude de 1522 prélèvements de cellules cervico-vaginales, destinées à précier la fréquence de l'infection de l'épithélium du col de l'utérus par un HPV, HPV-IP5 a été mis en évidence dans 5 des 110 prélèvements contenant un HPV. D'autre part, HPV-IP5 a été détecté dans 3 des 93 biopsies de cancers invasifs du col de l'utérus analysées. Dans ces trois cas, l'intégration de la totalité des séquences d'ADN du HPV-IP5 dans l'ADN cellulaire a été observée. HPV-IP5 constitue donc un type d'HPV génital, présentant un potentiel oncogène. Il est donc souhai- table de l'incorporer à tous mélanges d'ADN de HPV des- tinés à la préparation de sondes moléculaires, en vue du diagnostic ou du dépistage des types d'HPV constituant un risque pour le développement de néoplasies génitales et, en particulier, de cancers du col de l'utérus. Clonage moléculaire et caractérisation d'un nouveau tyPe d'HPV associé à des néoplasies aénitales (HPV-IP6) Un autre nouveau type d'HPV a été mis en éviden- ce dans l'ADN extrait de lésions vulvaires décrites comme des papillomes bowenoides (ayant des caractères histologiques de néoplsies intraépithéliales), par hybridation, dans des conditions non strictes, avec une sonde d'ADN radioactive spécifique du HPV-31. Une étude de la sensibilité de l'ADN de cet HPV à plusieurs en- zymes de restriction a montré que l'enzyme BamHI coupe une fois l'ADN viral. Après digestion de l'ADN extrait des lésions par l'enzyme BamHI, les molécules d'ADN de 8 kb ont été purifiées par centrifugation dans un gradient de saccharose, puis insérées par le site BamHI dans l'ADN du bactériophage lambda L 47.1. Après encapsida- tion de l'ADN recombinant et infection de bactéries Escherichia coli K12 (souche LA 101), les bactériophages recombinants ayant intégré l'ADN du nouvel HPV ont été sélectionnés par la technique d'hybridation sur plages de lyse (Benton et Davis), en utilisant une sonde d'ADN radioactive spécifique du HPV31 dans des conditions non strictes. Plusieurs bactériophages recombinants conte- nant la totalité des séquences virales ont été isolés. La coupure de l'ADN des bactériophages recombinants par l'endonucléase BamHI engendre un fragment 8 kb hybridant avec l'ADN du HPV31 dans des conditions non strictes. La coupure de l'ADN des bactériophages recombinants et de la préparation d'ADN extrait des lésions, par le mélange des endonucléases BamHI et PstI, engendre les mêmes 7 fragments, dont le poids moléculaire total correspond à celui d'un génome de papillomavirus. L'ADN du nouvel HPV a été excisé des séquences d'ADN phagique et recloné dans le plasmide SP64. Une carte de restriction de l'ADN du nouvel HPV a été cons- truite à partir de l'étude de la sensibilité de cet ADN à 20 endonucléases de restriction. 26 sites de coupure ont ainsi été localisés (fig. 12). Cette carte est dif- férente de celle de tous les HPV isolés à ce jour. Le degré d'homologie entre l'ADN du nouvel HPV et l'ADN des HPV identifiés à ce jour a été analysé par des expérien- ces d'hybridation sur réplique, dans des conditions strictes, en utilisant une sonde d'ADN radioactive spé- cifique du nouvel HPV. Une hybridation partielle a été observée avec l'ADN du HPV31 et une hybridation croisée faible a été obtenue avec les ADNs des HPV6, 13 et HPV- IP2. Les homologies entre l'ADN du nouvel HPV et l'ADN du HPV31 ont été déterminées plus précisément par réas- sociation ADN-ADN en milieu liquide, suivie par un traitement des hybrides par la nucléase Sl. Une hybri- dation de 25 % a été détectée entre les deux ADNs. Le virus isolé à partir de papillomes bowenoides vulvaires constitue donc un nouveau type d'HPV, provisoirement dénommé HPV-IP6. L'analyse, au microscope électronique, de molé- cules hétéroduplexes formées dans différentes conditions entre l'ADN de HPV-IP6 et l'ADN du HPV31 a permis d'ali- gner les cartes physiques de ces deux génomes et de dé- finir la position théorique des différents gènes portés par l'ADN'de l'HPV-IP6, comme indiqué ci-après. Localisation putative des principaux gènes et de la région intergénique (NC) du HPV-IP6 IP6 E6-E7 11,5-21,5 E1l 21,5-46,5 E2 45-59,5 L2 63-82 r,5 L1 80,5-15 NC 1,5-11,5 L'utilisation de sondes radioactives préparées à partir de l'ADN HPV-IP6 purifié a permis de déterminer le pouvoir pathogène de ce virus. 100 prélèvements de lésions des organes génitaux externes et de la région périanale présentant des caractères histologiques bowe- noides, c'est-à-dire correspondant à une néoplasie in- traépithéliale, ont été analysés. L'ADN du HPV-IP6 a été détecté dans 8 de ces prélèvements. Au cours d'une étude de 1522 prélèvements de cellules cervico-vaginaIes, des- tinée à préciser la fréquence de l'infection de l'épi- thélium du col utérin par un HPV, l'ADN du HPV-IP6 a été mis en évidence dans 9 des 110 prélèvements contenant un ADN d'HPV. Le HPV-IP6 constitue donc un type additionnel d'HPV génital relativement fréquent, possédant vraisem- blablement un potentiel oncogène. Il est-donc souhaita- ble de l'incorporer à tous mélanges. d'ADNs de HPV desti- nés à la préparation de sondes moléculaires, en vue du diagnostic ou du dépistage des types d'HPV constituant un risque pour le développement de néoplasies génitales et, en particulier, de cancers du col de l'utérus. Etant donné la grande diversité des HPVs sus- ceptibles d'être isolés à partir des différentes formes de verrues ou autres lésions cutanées ou de muqueuses, il est cependant préféré d'utiliser, pour le diagnostic de chaque type d'affection mentionné dans le tableau, des mélanges comportant plus d'un ou deux ADN-HPVs, dès lors que d'autres ADN-HPVs ont été reconnus comme pou- vant également intervenir dans le développement du même type d'affection. Le diagnostic de la nature de l'infec- tion et de son évolution possible sera d'autant plus efficace que le nombre de sondes utilisées sera plus élevé. En outrer des essais d'hybridation réalisés avec ds mélanges différents de sondes permettra des diagnos- tics différentiels présentant un degré de probabilité également plus important de la nature du mal dont souffre le patient. L'invention concerne donc plus particulièrement encore des mélanges ou cocktails de différents ADNs-HPVs (ou sondes contenant ces ADNs-HPVs ou de séquences de ces derniers), susceptibles d'être utilisés en combinai- son pour réaliser des diagnostics globaux des différen- tes formes d'infections à papillomavirus, éventuellement aux fins de pronostiquer l'évolution possible de l'in- fection. Des mélanges préférés conformes à l'invention sont identifiés dans le tableau ci-après: TABLEAU CARACTERISTIQUES DES MELANGES D'ADN D'HPV UTILISABLES POUR LE DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE D'INFECTIONS A PAPILLOMAVIRUS Désignation des mélanges Constitution 1) Maladies à diagnostiquer 1 1,2d, 4 Verrues cutanées ou muqueuses (en particulier, verrues vulgaires et plantaires). Diagnostic différentiel de l'épidermodysplasie verruciforme. 2 3,10a,10b,28,29 Verrues planes ou intermédiaires cutanées ou mu- queuses. Néoplasies intraépithéliales et cancers cutanés. Diagnostic différentiel de l'épidermodys- plasie verruciforme. 3 5,17a, 24 Epidermodysplasie verruciforme. Néoplasies intra- épithéliales et cancers cutanés. H 4 5,8,12,14a,14b,19,20,21,22,23,IP4 Epidermodysplasie verruciforme. 9,15,17a,17b Epidermodysplasie verruciforme. 6 24 Epidermodysplasie verruciforme. 7 5,8,14b,32,IP4 Cancers cutanés de l'épidermodysplasie verruciforme. Néoplasies intraépithéliales et cancers cutanés. 8 13,31 Hyperplasie épithéliale focale orale; Diagnostic différentiel des néoplasies intraépithéliales orales. 9 32, IP4 Néoplasies intraépithéliales et cancers cutanés. 16, 18,, IP2, IP5 et IP6 Néoplasies générales et cancers ducol de l'utérus Co ro CD co Le tableau susdit indique également les natures des affections susceptibles d'être plus particulièrement diag- nostiquées par l'utilisation des mélanges figurant dans la partie gauche du tableau. Il est rappelé que les cartes de restriction des autres ADNHPVs identifiés dans le tableau qui précède sont contenues dans les figures I à 9. Il est à remarquer que les HPV-IP4 et HPV-IP6 peuvent être considérés comme particulièrement représentatifs de sondes utili- sables pour la détection des risques de développement de néoplasies gé- nitales et, en particulier, de cancers du col de il'utérus. L invention concerne donc plus particulièrement encore des trousses ou '"kits" de diagnostic comprenant au moins 10 groupes figurant dans les groupes numérotés de 1 à 10 dans le tableau sous la rubrique "Désignation des mélanges". Dans ce qui precède, on a surtout envisagé l'utili- sation, à titre de sondes, des ADN-HPVs entiers clones. Ceux-cl peuvent cependant être substitués par des fragments clones de ces différents ADNs, notamment par les gènes E1 ou L1 et par les gènes E6-E7. Le principe de base des détections in vitro d'ADN- * HPV mettra naturellement en jeu des hybridations opérées dans des conditions strictes ou moins strictes. On peut opérer par exemple comme suit, étant naturellement entendu que les essals de diagnostic décrits ne sauralent être considérés comme limitatifs des conditions d'emploi des- sondes ou mélanges de sondes selon L'invention. L objet des examens mettant en Deu des sondes pré- parées à partir de mélanges d'ADNs de HPVs clonés est de mettre en évidence un HPV et d'identifier le type d'HPV dans une biopsie, dans des cellules obtenues par grattage de lésions, ou dans des coupes de biopsies fixées par le mélange de Carnoy (éthanol, chloroforme, acide acétique 6:3:1) et incluses dans la paraffine. L'examen nécessite l'extraction préalable de l'ADN des prélèvements selon des méthodes dont le principe est connu et met en-jeu l'analy- se de cet ADN par des expériences d'hybridation molécu- laire. effectuées dans des conditions strictes ou moins strictes. a l'aide de sondes radioactives (marquées au 32p ou au S) préparées à partir de mélanges d'ADN-HPVs. Cha- que examen requiert, en général, l'utilisation de plu- sieurs mélanges de sondes. Plusieurs méthodes d'hybridation peuvent être uti- lisées. On peut, par exemple, mettre en oeuvre la méthode d'hybridation sur tache. Cette méthode comporte, après dénaturation de l'ADN, le dépôt d'une quantité aliquote d'ADN sur des membranes (nitrocellulose ou Genescreenplus). l'hybridation de chaque membrane. dans les conditions usuelles, avec un mélange de sondes et la détection des hybrides radioactifs par exposition des membranes au contact d'un film radiographique. On peut aussi utiliser une méthode d'hybridation sur réplique. Cette méthode comprend la séparation électrophorétique en gel d'agarose des fragments d'ADN engendrés apres traitement de l'ADN par des enzymesde restriction, le transfert des fragments, après dénaturation alcaline, sur des membranes (nitrocellulose, Genescreenplus) et leur hybridation, dans les conditions usuelles, avec différents mélanges de- sondes. La formation d'hybrides radioactifs est détectée après exposition des membranes au contact d'un film radiographique. On peut aussi avoir recours i une méthode d'hybri- dation in situ. par exemple sur des coupes de tissus fixés par le mélange de Carnoy et incluses dans la paraffine. Les sondes radioactives sont constituées soit par des ADNs d'HPVs marqués par la méthode de "nick-trans- lation". soit par des ARNs préparés par transcription d'ADNs viraux insérés dans un vecteur. par exemple de type SP6. L'utilisation de sondes radioactives présente l'avantage d'une grande sensibilité, mais ceci n'exclut pas l'utilisation de sondes non radioactives par exemple biotinylées et susceptibles d'être reconnues par des anticorps soit marqués eux-mèmes, soit eux-mémes reconnus par des anticorps portant un marqueur enzymatique, fluo- rescent, etc.. L'invention concerne donc encore des nécessaires ou "kits' contenant une pluralité des sondes sus-indi- quees, et comprennent: - HPV-IP5 et HPV-IP6 respectivement pris de façons iso- lées, - soit les sondes précédentes. en mélange avec d'autres, notamment celles définies plus haut, ces kits'" étant destinés à des études de diagnostic in vitro par hybridation entre des préparations virales ob- tenues a partir de patients et les divers groupes ou mélanges. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs- déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de sesmodes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisages; elle en embrasse au contraire toutes les variantes; notamment la référence dans les revendications à une désignation ADN-HPV suivie d'un nombre déterminé, et à laquelle correspond un ADN-HPV dont la carte de restriction a été fournie dans les des- sins, s'entend comme signifiant que ces revendications couvrent tous les ADN-HPVs qui ont en commun avec cet ADN-HPV particulier de pouvoir etre classés dans le meme type, selon la définition qui en a été donnée plus haut, et a fortiori aux ADN-HPV appartenant au même sous-type. On notera que les ADNs recombinants désignés ci-après ont été déposés le 21 janvier 1986 à la C.N.C.M. (Collection Nationale des Cultures de Micro-Organismes de l'INSTITUT PASTEUR de Paris), sous les numéros apparais- sant ci-après: pSP65/IP5 (plasmide dans E. coli): n 1-507 pSP64/IP6 (plasmide dans E. coli)no 1-508 j7 BIBLIOGRAPHIE (1) D rst, M. et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:3812-3815. (2) Coggin, J3.R., Jr. et al., 1979, Cancer Res., 39:545- 546. (3) Gissmann, L. et al., 1982, J. Virol. 44:393-400. (4) Green, M. et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79:4437-4441. (5) Heilman, C.A. et al., 1980, Virol. 36:395-407. (6) Jablonska, S. et al., 1972, Cancer Res., 32:583-589. (7) Jablonska, S. et al., 1982, Springer Semin. Immuno- pathol. 5:33-62. (8) Kremsdorf, D. et al., 1982, J. Virol. 4':436-447. (9) Kremsdorf, D. et al., 1983, J. Vlrol. 48:340-351. (10) Lutzner, M.A. et al., 1978, SulI. Canrcer, 65: 19- 82. (11) Lutzner, M.A. et al., 1983, Lancet ii:422-424. (12) Migozzi, M. et al., 1965, Bull. Soc. Franc. Derm. Syph. 72:747-748. 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REVENDICATIONS 1 - ADN-HPV ayant une taille comprise entre environ o00 et environ 8000 paires de bases ou un fragment de cet ADN-HPV, cet ADN-HPV consistant en une variante des ADN-HPVs définis dans le brevet principal, cet ADN-HPV étant obtenu à partir d'un des papillomavirus répondant aux désignations HPV-IP5 et HPV-IP6. 2 --Fragment d'ADN selon la revendication 1, carac- térisé en ce qu'il correspond aux gènes El. E6-E7. L1 ou L2 ou qu'll correspond encore à un fragment correspondant à une région intergénique dudit ADN-HPV. 3 - ADN recombinant contenant un ADN-HPV selon la rev'enlication 1 ou un fragment selon la revendication 2. 4 - ADN, fragment ou ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 3 pour l'utilisation en tant que sonde de détection d'ADN-HPVs. - Composition utilisable pour la détection de pa- pillomavirus dans un milieu biologique le contenant, ca- ractérisée en ce qu'elle contient un ADN-HPV conforme à la revendication 1 associé à un ou plusieurs ADN-HPVs dis- tincts. 6 - Nécessaire ou kit comportant une pluralité de sondes ou mélange de sondes distinctes, caractérisé par 9 groupes de sondes; chacune desquelles comporte: 1) au moins l'ADN de l'HPV2d, 2) au moins l'un des ADNs de HPV 1Ob, 28 et 29, 3) au moins l'un des ADNs de HPV 17, 24, 4) au moins l'un des ADNs de HPV 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23 et IP4, 5) au moins l'un des ADNs de HPV 15 et 17, 6) l'ADN de HPV 24. 7) l'ADN de l'un des ADNs de HPV 14, 32 et IP4, 8) l'ADN de HPV 31, 9) l'ADN de HPV 32, 1C)au moins l'un des ADNs de HPV 15, 18 IP2, IP5 et IP6, étant entendu que les' ADNs des neuf groupes sont choisis de façon a etre en toutes circonstances différents les uns des autres dans la mesure o chacun des neuf groupes se- rait réduit à un seul des ADNS qui le composent. 7 - Procédé -de détection et d'identification de papillomavirus contenus dans un échantillon biologique comprenant la réalisation d'essais d'hybridation avec un ou plusieurs ADN-HPVs, fragments d'ADN-HPVs ou ADNs re- combinants conformes à l'une quelconque des revendications 1 i 3 ou encore plusieurs compositions distinctes confor- mes A la revendication 4, et la détection de ceux des ADN-HPVs, fragments ou ADNs recombinants ou encore compo- sitions qui donnent lieu à hybridation préférentielle avec les ADN-HPVs préalablement obtenus à partir desdits echan- tillons biologiques. 8 - Papillomavirus purifiés biologiquement purs, caractérisés en ce qu'ils appartiennent au meme type que l'un de ces papillomavirus identifiés dans la revendica- - tion 1.