FR 2586703 A1 19870306 FR 8513004 A 19850902 La présente invention a trait a la préparation d'un gel ou d'une solution physiologique de collagéne natif, non modifié, transparent et hémocompatible à partir de pla- centa. De façon plus générale, elle concerne un procédé d'extraction de collagénes de placenta humain ou animal, permettant d'isoler un collagène enrichi en type IV et ex- ploitable industriellement. Elle se rapporte plus précisément à un procédé pour préparer des solutions ou des gels de collagène acides ou neutres, parfaitement transparents sur une grande épais- seur. On a, depuis un certain nombre d'années, cherché a mettre au point des gels de collagène transparents pour la fabrication de lentilles de contact. Plus récemment, leur utilisation a été -recherchée pour greffer ou insérer ces produits dans la cornée elle-même, voire même dans l'oeil. On comprend l'importance de disposer de collagène identique au,ou le plus proche possible, du collagène humain pour une utilisation chirurgicale dans l'espèdb humaine si l'on veut éviter toute réaction inflammatoire ou immunolo- giques.Or, aujourd'hui, les seules préparations de collagène disponibles commercialement en quantité suffisante et à un prix acceptable sont obtenues à partir de queues ou ten- dons de rat ou a partir de peaux de jeunes animaux (veau par exemple). Elles consistent presque uniquement en colla- gène de type I. Les autres types II, III, IV, V et autres sont uniquement préparés par des chercheurs spécialisés selon des méthodes très complexes et à des prix trop élevés pour permettre une exploitation à grande échelle. Il a été affirmé dans de nombreuses publications aue les molécules de collagène animal sont peu ou pas antigé- niques lorsqu'elles ont été obtenues par un procédé utilisant la pepsine qui élimine les peptides terminaux (télopeptides) non hélicoïdaux. La structure en triple hélice du collagène, résistante à l'action de la pepsine, étant voisine dans 25867O3 toutes espèces animales, serait peu antigénique. Or, il semble que ce caractère non anrtigénique du collagène ayant été soumis à l'action de la pepsine doit être remis en cause. Il est, en effet, connu maintenant que ces structures sont antigéniques dans une autre espèce, ceci ayant permis de' préparer des antisérums spécifiques de tel ou tel type de collagène bovin ou humain, chez le lapin par exemple. Il faut, en outre, tenir compte de la présence toujours possible d'impuretés protéiques animales antigéniques dans de telles préparations. Depuis quelques années, l'injection de collagène I d'origine bovine a été pratiquée de manière intensive aans l'espèce humaine, pour combler les cicatrices ou dans des techniques de chirurgie réparatrice. Ces essais ont permis de mettre en évidence un certain nombre d'inconvé- nients dont deux sont importants: - l'apparition de réactions immunologiques chez 1 à 3 % des sujets; - l'apparition de réactions de coagulation du sang localement lorsque le produit est injecté malencon- treusement dans un vaisseau ou un capillaire sanguin. Ces faits soulignent donc toute l'importance qu'il y aurait à obtenir des gels de collagène humain qui soient non seulement transparents pour être utilisés en ophtalmolo- gie dans l'espèce humaine sans risque de réactions immunolo- giques indésirables, mais encore hémocompatibles et physiolo- giques. Les collagènes de type I, II ou III humain ou animal, même après action de la pepsine, possèdent une struc- ture fibrillaire caractéristique en microscopie électro- nique qui en font de puissants agrégants plaquettaires. Mais comme ces collagènes ne sont pas hémocompatibles, il est préférable d'en éviter l'emploi chaque fois que le méde- cin utilisateur ne recherche pas l'effet coagulant de con- tact. Ces collagènes n'étant pratiquement pas solubles à pH neutre, ils ne permettent que l'obtention de suspensions opaques et il est impossible de les utiliser pour préparer des gels transparents et physiologiques (isotoniques et à pH neutre), sans recourir à une modification chimique des molécules de collagéne conduisant à l'apparition de nouveaux déterminants antigéniques. Les brevets américains n 4 223 984 et n 4 268 131 MIYATA sont les premiers brevets à traiter de la fabrication de lentilles de contact à partir d'un gel de collagène animal de type I et qui, pour être soluble à pH neutrrn, doit être modifié chimiquement. ne Les techniques décrites dans ces brevets/permettent d'obtenir des gels relativement transparents que sur de faibles épaisseurs, et peu résistants mécaniquement. Il n'apparait pas clairement à leur lecture si la transparence est obtenue grâce à une tranformation chimique ultérieure (succinylation ou méthylation). Le brevet am4ricain n 4 388 428 KUZMA décrit des gels o le collagène est mélangé avec des polymères chimiques pour en améliorer les propriétés mécaniques. Le recours à de tels produits n'est pas souhaitable en raison de la difficulté d'éliminer toute trace de produits toxiques à partir de gels visqueux ou solides. BRUNS R.R. et GROSS J. (Brevet américain n 4 505 855) confirment la difficulté d'obtenir des gels par- faitement transparents à partir de collagène animal, selon les techniques de l'art antérieur. Ils proposent une méthode d'ultracentrifugation pour réussir une telle préparation, mais cette technique est très onéreuse et difficilement compatible avec une exploitation industrielle. La présente invention vise à remédier à ces divers inconvénients en proposant un procédé industrialisable pour préparer des solutions ou des gels de collagène natif, non modifié, non antigénique, parfaitement transparent, physiologique et hémocompatible. Les solutions ou gels de collagène obtenus sont transparents sur de grandes épaisseurs pouvant atteindre facilement 20 mm, une épaisseur largement suffisante pour les besoins du marché (lentilles de contact, implants cor- néens irntraoculaires). Ce procédé a été mis au point par!e demandeur en partant de placentas humains, seule source envisageable pour permettre la préparation de collagène humain a l'é- chelle industrielle. La connaissance de cette nouvelle technique adap- tée au placenta humain a permis au demandeur de l'éten- dre aux placentas animaux. En effet, les collagènes animaux peuvent être utiles en médecine vétérinaire par exemple ou acceptables pour une utilisation comme dispositif exter- ne non implante chez l'homme tel que lentilles de contact. Le procédé conforme a l'invention consiste donc: - dans un premier temps, a extraire de placentas humain ou animal des collagénes, et à isoler un collagène enrichi en type IV; - puis dans un second temps, a préparer, a partir de ce collagène enrichi en type IV, des solutions ou gels présentant les propriétés précédemment décrites. Le procédé d'extraction des collagènes placentaires conforme a l'invention est caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: - a partir de placenta humain ou animal, sous forme congelée, que l'on broie; - à laver le tissu placentaire broyé, par exemple par une succession de lavages à pH neutre puis a pH acide; - à soumettre ledit tissu placentaire lave a une diges- tion enzymatique permettant l'extraction du collagOne de type IV, pratiquement non contaminé par les colla- gènes de type I ou III. La digestion s'effectue a l'ai- de d'un enzyme convenable (à l'exception de la colla- génase) et de préférence par la pepsine. Dans ce cas, de préférence, ladite digestion s'effectue à un pH acide, de préférence compris entre 2 et 3,5 à une température, de préférence, comprise entre 0 et 20 C et pendant une durée convenable, notamment de l'ordre de 8 à 24 H, la quantité de pepsine par kg de placenta congelé étant comprise entre 0,5 et 2 g et de préférence entre 0,5 et 1 g soit 0,5 et 1 ou 2 % S On peut éventuellement soumettre à une deuxième digestion enzymatique le résidu tissulaire ayant résisté au premier traitement par la pepsine, cette deuxième diges- tion s'effectuant dans les mêmes conditions que la première digestion et permettant de récupérer ultérieurement, selon des procédés connus, des collagènes de type I et de type III, pratiquement débarrassés de collagène de type IV. La suspension placentaire ayan.t subi la première digestion enzymatique est alors traitée par le procédé qui suit, consistant successivement: après avoir séparé le tissu résiduel de la suspension placentaire provenant de la digestion enzymatique, - à effectuer une précipitation à pH acide modéré pour éliminer un précipité d'impuretés, - à partir du surnageant, à précipiter le collagène par précipitation saline à pH neutre, - à redissoudre le collagène précipité et neutraliser la solution obtenue, - à éliminer les impuretés insolubles, et - à précipiter le collagène par précipitation saline acide. Ainsi, de façon avantageuse, la suspension placen- taire provenant de la digestion enzymatique peut être soumise aux étapes consistant: - à diluer ladite suspension notamment par un volume d'eau; à ajuster son pH à une valeur comprise entre 7 et 9 ou ; - à laisser reposer ladite suspension, par exemple pendant 1 a 24 h a une température comprise entre 0 et 20 C; - a séparer le tissu résiduel du surnageant de la pre- mière digestion; - à ajuster le surnageant à un pH acide modéré, par exemple compris entre 4,5 et 5,5; - à laisser reposer ledit surnageant, par exemple pen- dant 1 à 24 h à une température comprise entre 0 et 20 C; - à éliminer la partie insoluble contenant de nombreuses impuretés; - à ajuster le surnageant limpide a un pH voisin de la neutralité, de l'ordre de 7,5; - à additionner un sel, tel que par exemple NaCl, jus- qu'à l'obtention d'une concentration finale de l'ordre de 1,2 M;. - à laisser reposer la suspension obtenue pendant par exemple 1 à 24 h à une température comprise entre 10 et 25 C; - à récupérer le précipité de collagène formé; une - a dissoudre le précipité dans /solution faiblement acide; - a neutraliser la solution à pH 7,5; - à laisser reposer la suspension obtenue pendant 1 a 24 h à une température comprise entre 0 et 20 C; -à éliminer la partie insoluble, éliminant ainsi les impuretés susceptibles de troubler la transparence; - a acidifier le surnageant à un pH acide compris par exemple entre 2 et 3,5 ou 4; - a précipiter le collagène par un sel, tel que NaCl, jusqu'à l'obtention d'une concentration finale compri- se entre 0,4 et 0,8 M; - à laisser reposer la suspension obtenue pendant 1 à 24 h a une température comprise entre 0 et 20 C; - et à récupérer le précipité de collagène acide puri- fié. Le précipité de collagène purifié obtenu en fin d'opération est repris dans l'acétone ou un solvant organi- que volatil équivalent, ce qui entraîne la formation de fibres de collagène acide que l'on récupère par filtration sur tamis. Ces fibres sont séchées sous courant d'air tiède et stérile. Dans une variante de réalisation, le précipité de collagène purifié est redissous dans l'eau. Le pH de la solution est ajusté à 7,5, et on lui additionne un sel tel que NaCl, jusqu'à l'obtention d'une concentration finale de l'ordre de 1,2 M. On laisse reposer la suspension obtenue pendant 1 à 24 h et on récupère le précipité de collagène neutre. Le précipité de fibres de collagène neutre obtenu est repris dans l'acétone ou un solvant organique volatil équivalent, ce qui entraIne la formation de fibres de colla- gêne neutre que l'on - récupère par filtration sur tamis. Ces fibres sont séchées sous courant d'air tiède et stérile. Ce sont ces fibres de collagène acide ou neutre à l'état sec ((10 % d'eau) qui sont utilisées comme source de collagène pour la préparation des solutions ou gels con- formes à l'invention. La préparation de gels en partant des fibres de collagène acide ou neutre obtenues après le traitement à l'acétone peut s'effectuer comme suit: - on met les fibres en contact avec un volume d'eau déterminé de façon à obtenir une concentration en collagène comprise entre 2 et 30 %; - or laisse gonfler dans l'eau les fibres par exemple pendant environ 1 h; - on soumet l'ensemble à un chauffage modéré; - on filtre la solution visqueuse et transparente sur des membranes de porosité comprise entre 0, 8 et 8 - on laisse la solution refroidir. 25867I3 La préparation d'une solution de collagène en par- tant des fibres de collagène acide enrichi en type IV est réalisée par le procédé suivant: - on met en contact les fibres de collagène avec un volume d'eau déterminé; - on laisse gonfler les fibres de collagène dans l'eau par exemple pendant environ 1 h; - on additionne à l'ensemble une solution d'un sel tel que par exemple l'acétate de sodium, à une concen- tration inférieure ou égale à 0,1 -M pour amorcer la neutralisation du pH. Les volumes d'eau sont déterminés de façon à obte- nir une concentration en collagène au.plus égale a 2 %. environ - on ajuste la solution a pH 7,5/et on la rend éventuel- lement isotonique par addition de NaCl; - on soumet la solution à un chauffage modéré à une température comprise entre 40 et 80 C pendant 10 à 60 minutes et de préférence à une température aux environs de 60 C pendant une dizaine de minutes - on filtre la solution sur des membranes de porosité comprise entre 0,2 et 8p; - et on laisse refroidir la solution. On obtient à l'issue de ces opérations une solution qui présente ces caractéristiques: - elle est très visqueuse, - elle contient au plus 2 % de collagène natif, non dénaturé, - elle est parfaitement transparente, - elle est isotonique, physiologique et hémocompatible. Une telle solution est susceptible d'être utilisée comme implant en médecine humaine ou animale, dans les domai- nes de l'ophtalmologie, des articulations osseuses, du trai- tement des brûlés ou de la dermatologie. Lorsque l'on utilise comme source de collagène non plus les fibres de collagène acide nmais les fibres de colla-- neutre gène/enrichi en type IV obtenu selon la variante de réalisa- tion, on applique les mumes successions d'opérations que celles précédemment décrites pour l'obtention des solutions à partir des fibres de collagène, la neutralisation du pH nétant plus rnécessaire. Pour préparer une solution de collagène en partant des fibresde collagène neutre enrichi en type IV, on procède comme suit: - on met en solution les fibres de collagère neutre dans un volume d'eau déterminé de façon à obtenir une concentration en collagène au plus égale à 2 %; - on additionne à cette solution un sel tel que NaCl, jusau'à l'obtention d'une concentration de l'ordre de 0,15 M; - on soumet ladite solution à un chauffage modéré à une température comprise entre 40 et 80 C pendant à 60 minutes, et de préférence à une température aux environs de 60 C pendant une dizaine ' de minu- tes; - on filtre la solution sur des membranes de porosité comprise entre 0,2 et 8; - et on laisse refroidir la solution. On obtient une solution qui présente les mêmes caractéristiques que les solutions de collagène préparées en partant des fibres de collagène acide. D'autres avantages et particularités de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples de réalisation donnés, ci-après, à titre non limitatif. L'exemple 1 illustre le procédé d'extraction du collagène enrichi en type IV à partir de placentas humains et la préparation de fibres de collagène acide. L'exemple 2 se rapporte à la préparation de fi- bres de collagène reutre conforme à l'invention. L'exemple 3 illustre le procédé d'extraction du collagène enrichi en type IV à partir de placentas animaux. Les exemples 4 et 5 décrivent la préparation de gels à 15 % de collagène. Les exemples 6, 7 et 8 décrivent la préparation de solutions collagéniques. Exemple 1: 300 kg de placenta sont broyés sous forme congelée pour donner des morceaux de quelques cm3. Le broyat est ensuite mélangé à 300 1 d'une solution aqueuse contenant 8 % d'éthanol, 6 g/l de NaCl et 10 kg de cellulose. Apres agitation à 10 C, l'ensemble est soumis à une opération de pressage avec un pressoir MABILLE pour séparer le sang. du tissu placentaire. On obtient 102 kg de tissu placentaire contenant 65 % d'eau. Le tissu extrait du pressoir est agité dans 500 1 de citrate de sodium à 0,05 M pH 7,2 pendant 30 minutes à 10 C puis soumis au pressage pour éliminer la, solution de lavage et récupérer le tissu. Un second lavage est effec- tué avec 500 1 de citrate de sodium à 0,05 M pH 7,2 addition- né de 30 g/l de NaCl. Un troisième lavage est effectué avec 500 1 de citrate de sodium à 0,05 M pH 7,2. Le tissu ainsi lavé à pH neutre est ensuite soumis à trois séquences succes- sives de lavage à pH acide et à 10 C: - par 500 1 d'acide citrique 0,05 M et a pH final ajusté à 2,8 par addition deHC1,2N; l'agitation est de 30 minutes avant l'opéra- tion de pressage; - par 500 1 d'acide formique 0,5 M pendant h; - - par 500 1 d'acide citrique 0,05 M additionné de NaCl 20 g/l pendant 30 mn. Le tissu placentaire ainsi lavé à pH acide a un aspect blanc qui témoigne d'une bonne élimination des pig- ments rouges du sang placentaire initial. Le poids obtenu est de 82 kg. Il est soumis à une digestion enzymatique par la pepsine dans 500 1 d'acide citrique 0,05 M pH 2,8 conte- nant 300 g de pepsine, pendant 15 h à 10 C. La suspension est alors diluée par addition de 500 1 d'eau à 10 C. Le pH est ajusté à 7,5 par addition de NaOH 4N, pour dénatu- rer la pepsine et en supprimer l'action protéasique. Après h d'attente à 10 C, le résidu tissulaire qui contient l'essentiel des collagènes I et III non solubilisésest séparé par une centrifugeuse en continu (Westfalia KG 10006). Le poids de ce résidu est de 103 kg; il peut être soumis & une deuxième digestion enzymatique identique à la première, suivie de l'extraction et de la séparation de chacun des collagènes I et III selon des procédés décrits dans la litté- rature. Le surnageant correspondant à la première digestion enzymatique contient l'essentiel des collagènes et autres macromolécules solubles a pH neutre après l'action de la pepsine. Il contient en particulier du collagène de type IV. Le pH du surnageant est ajusté à 5 avec HC1 2N et, après 15 h d'attente a 10 C, le précipité formé est éliminé. par centrifugation en continu sur centrifugeuse "Bactofuge" Alfa Laval. Le surnageant recueilli, qui est très limpide, est ajusté a pH 7,5 par addition de NaOH 4N et à une con- centration finale de 1,2 M en NaCl. Après 15 h a 16 C, le précipité de collagène formé est récupéré par centrifugation en continu sur centrifugeuse "Bactofuge". Le précipité de 13 kg est ensuite dissous dans 600 1 d'HCl 0,01N puis le pH est ajusté a 7,5 par addition de NaOH 4N. Le précipité formé après 15 h d'attente a 4 C est éliminé sur centrifugeuse "Bactofuge" (poids obtenu kg). Le surnageant limpide est acidifié à pH 2,8 avec HCl 2N et additionné de NaCl jusqu'à une concentration'finale de 0,6 M à 4 C. Après 15 h. le précipité de collagène est recueilli sur centrifugeuse "Bactofuge". Le précipité dont le poids est de 6,5 kg a un aspect fluide. Il est additionné lentement de 7 1 d'acétone, ce qui entraîne la formation de fibres de collagène que l'on récupère par filtration sur tamis. Le lavage de ces fibres par plusieurs traitements à l'acétone permet, après séchage sous courant d'air tiède et stérile, d'obtenir 180 g de fibres sèches du produit final. L'analyse de la composition en acides aminés de ces fibres montre une structure proche du collagène de type IV et caractéristi- que de la famille des collagènes (absence de tryptophane, >30 % glycine, environ.10 %d'acide glutamique, de proline et d'hydroxyproline). Le tableau ci-après donne les résultats d'analyse quatre de la compositon en acides aminés de / -réparations différen- tes de collagène humain placentaire réalisées selon le pré- sent exemple (les résultats sont exprimés en nombre de molécules de chaque acide aminé pour 1000 résidus). In lots 1022 1023 1025 1027 j ASP 46 42 41 42 I i I I I I HYP 80 91 85 86 I I I I I.1 I THR I 19 18 18 18 SER 17 15 17 16 I A S N I 1 1 -|ASN | 28 30 31 25 I.1_ _ 1 1_ _I 1__ I _ _ _ I _ _ GLU 107 105 105 107 I _ _ 1 1._I 1_ _I1__ I _ _ GLN I traces 1 traces 1 1.__ _I '__ _ I _ _ _I_ _ _ _ I_ _ _ _ I PRO 92 91 96 98 I_ _ _ I.1_.. _ _ I.._ I. _. I GLY 317 327 313 324 I _ _ _ _ _I.. _ I_ _ _ _ I_ _ _ __ I ALA 41 I 39 39 43 I _ _ _ _ _ I _ _ _ _ I _ _ _ I _ _ _ _ I _ _ I _I IVAL 33 I 29 34 34 ICYSTA I _ _ _ _ _ I _ _ _ _ I _ _ _ _ I _ _ _ _ I _ _ _ I ICYS I 9 1 6 1 9 1 6 I 1. _ 1._I... I _ _ _ _I _ _ _ _I _ ___ I ICYSTA | 1 2 1 1 I_ _ _ _ _I_ _ _ _I _ _ _ _I_ _ _ _I_ __ I |MET S I 26 16 -16 |ILE | 36 I 36 1 37 | 36 1 ILEU I 57 | 56 | 57 | 56 1 1. 1_ _I _ I _ _ _ I_ _ _ I l_ _ |TYR J 10 | 7 | 12 | 10 1 I_ _ _ _ _I_ _ _ _I _ _ _ _I _ _ _ _I_ _ _ _ I J n lots1 1022 1023 1025 1027 I PHE | 33 | 31 I 39 34 ORN 3 1 1 1 ILYS 9 8 | 12 | 12 |TRY 0 O | O O 0 O I HIS 8 8 | 8 I _ _ II _ _ I _ _ _ I J__I __ I |ARG | 32 32 | 28 | 27 ITotal I 999 996 1000 | 1000 I . Exemple 2 Le procédé décrit dans l'exemple 1 a été appliqué de manière rigoureusement identique sur un deuxième lot de 300 kg de placentas humains. En fin d'opération, le précipité obtenu à pH 2,8 en présence de NaCl 0,6 M a 4 C représentait 6,5 kg. Ce précipité a été redissous dans 200 1 d'eau. La solution obtenue a été ajustée a pH 7,5 par addition de NaOH 4N, à +16 C, et additionnée de NaCl pour obtenir une concentra- tion finale de 1,2 M. Le précipité formé après 15 h a été récupéré par centrifugation sur "Bactofuge". Le poids obtenu était de 3450 g. Le précipité, séché a l'acétone, comme dans l'exemple 1, a permis d'obtenir 200 g de fibres sèches de collagènes neutre, enrichi essentiellement en type IV. Exemple 3: Le procédé décrit dans l'exemple 1 a été appli- qué de maniere rigoureusement identique sur 180 kg de placentas de vache. Les lavages successifs ont été réalisés avec des volumes de 300 litres. La première digestion à la pepsine a été effectuée par addition de 180 g de pepsine dans 300 1- d'acide citrique 0,05 M ajusté à pH 2,8. Les autres étapes de précipitation sélective du colla- gène étaient identiques à celles de l'exemple 1. Apres séchage final par l'acétone, on a récupéré g de fibres sèches de collagène bovin. L'analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de sodium dodécyl sulfate (SDS) et avec ou sans agent réduc- teur (dithiotréitol) permet de démontrer que cette prépara- tion est riche en collagène de type IV. l'eau La dissolution dans de/ de ces fibres de collagène bovin donne une solution acide due a la précipitation finale réalisée à pH acide. Exemple 4: 1,5 g de fibres sèches de collagène humain préparé selon l'exemple 1 sont mises en contact avec 10 ml d'eau distillée. Apres gonflement des fibres pendant 1 h. l'en- semble est mis au bain-marie à 70 C pendant 30 minutes. On obtient une solution très visqueuse et transparente qui peut être facilement filtrée sur des membranes de * porosité comprise entre 0,8 et 8 p à cette même températu- re. Apres refroidissement, le gel obtenu est incolore, acide et parfaitement transparent comme de l'eau filtrée. Les contrôles par électrophorèse en polyacrylamide en présence de sodium dode'cyl sulfate avec et sans dithio- thréitol démontrent la parfaite conservation des molécules de collagène IV pendant l'étape de chauffage. Ce gel peut être ensuite soumis à des opérations connues de mise en forme de lentille de contact ou de tout autre dispositif à propriétés optiques. Les procédés de moulage et de réticulation par des agents chimiques (aldéhydes) ou des agents physiques (rayonnements K,p, X ou U.V) s'appliquent parfaitement. Exemple 5: Les fibres de collagène bovin préparées dans l'exemple 3 sont dissoutes selon le, protocole- de l'exemple 4. On obtient un gel de propriétés physiques comparables à celui de l'exemple 4. Exemple 6: neutre 1 g de fibres de collagène/obtenu dans l'exem- pie 2 est mis en solution dans 90 ml d'eau distillée. La solution finale de pH 7,5 ajustée à-100 ml est ad4ition- née de chlorure de sodium pour obtenir une concentration finale de 0,15 M -en tenant compte du chlorure de sodium déjà présent dans le précipité initial. La solution obtenue contient environ 1 % de pro- téine, principalement du coilagène humain de type IV. Mise au bain-marie à 60 C pendant 10 minutes, cette solution peut être filtrée sur membranes de porosité comprise entre 0,45 p et 8 p. Apres refroidissement, on obtient ainsi une solution très visqueuse, physiologique, parfaitement transparente et stérile de collagène humain. Cette solution est hémocompatible. En effet, après dilution dans neuf volumes de sang humain prélevé sur citrate, elle n'entraîne aucune coagulation du sang, aucune agrégation plaquettaire, aucune activation de pro- thrombine en thrombine. Exemple 7: 1 g de fibres de collagène humain préparé selon l'exemple 1 sont mises à gonfler pendant 1 h dans 50 ml d'eau et additionnées de 50 ml d'acétate de sodium 0,1 M. La solution finale obtenue contient environ 1 % de protéines, principalement du collagène humain de type IV. Elle est ajustée a pH 7,5 et rendue éventuellement isotonique par addition de chlorure de sodium. Mise au bain-.aarie & 60 C pendant 10 minutes, cette solution peut être filtrée sur membranes de porosité comprise entre 0,45 et 8 P. On obtient une solution très visqueuse, physiologique, parfaitement transparente et stérile de collagène humain. Cette solution est hémocompatible comme la précé- dente. Exemple 8: Le procédé décrit à l'exemple 7 est répété à l'iden- tique à l'exception de l'adjonction de 50 ml d'acétate de sodium 0,1 M, qui est remplacée par l'adjonction de 50 ml de phosphate de sodium disodique 0,05 M. La solution obtenue est hémocompatible. REVENDICATIONS 1/ Procédé d'extraction des collagènes placentai- res, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes consistant: - à partir de placenta humain ou animal, sous forme congelé, que l'on broie, a laver le tissu placentaire broyé, et - à soumettre ledit tissu placentaire lavé a une digestion enzymatique permettant l'extraction du collagène dé type IV, pratiquement non contaminé par les collagènes de type I ou III. 2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue la digestion enzymatique à la pepsi- ne. 3/ Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on effectue la digestion enzymatique à un pH acide, notamment compris entre 2 et 3,5 à une température convenable, notamment comprise entre 0 C et 20 C, pendant une durée convenable, notamment de 8 à 24 h, la teneur en pepsine étant comprise entre 0,5 et 2 %. 4/ Procédé selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que l'on soumet a une deuxième diges- tion enzymatique le résidu tissulaire ayant résisté au premier traitement par la pepsine, cette deuxième digestion s'effectuant dans les mêmes conditions que la première digestion et permettant de récupérer ultérieurement des collagènes de type I et de type III, pratiquement débarras- sés de collagène de type IV. / Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 a 4, caractérisé en ce qu'après avoir séparé le tissu résiduel de la suspension provenant de la digestion enzymatique, on effectue une précipitation à pH acide modéré pour éliminer un précipité d'impuretés, on recueille le surnageant dont on précipite le collagène par précipitation saline a pH neutre, on redissout le collagène précipité en solution faiblement acide que l'on neutralise, on élimine les impuretés insolubles, et on précipité le collagène par précipitation saline acide. 6/ Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que pour la précipitation & pH acide modéré, - on dilue ladite suspension par un volume d'eau, - on ajuste son pH à une valeur comprise entre 7 et 10, - on laisse reposer ladite suspension pendant 1 à 24 h à une température comprise entre 0 et 20 C, - on sépare le tissu résiduel du surnageant de la première digestion, - on ajuste le surnageant à un pH compris entre 4, 5 et 5,5, - on laisse reposer ledit surnageant pendant 1 a 24 h à une température comprise entre 0 et 20 C, et - on élimine la partie insoluble. 7/ Procédé selon l'une des revendications 5 et 6, caractérisé en ce que, pour la précipitation saline & pH neutre, - on ajuste le surnageant a un pH de 7,5, - on additionne un sel, tel que NaCl, jusqu'à l'obtention d'une concentration de 1,2 M, - on laisse reposer ledit surnageant pendant 1 a 24 h et a une température comprise entre 10 et 25 C, - on récupère le précipité de collagène formé. 8/ Procédé selon l'une quelconque des revendications à 7, caractérisé en ce que, pour l'élimination des impure- tés, - on dissout le précipité dans une solution faiblement acids-, - on neutralise la solution a pH 7,5, - on laisse reposer ladite solution pendant 1 à 24 h à une température comprise entre 0 et 20 C, - on élimine la partie insoluble. 9/ Procédé selon l'une quelconque des revendications à 8, caractérisé en ce que, pour précipiter le collagène purifié, - on acidifie le surnageant à un pH comprise entre 2 et 3,5 a 4, - on précipité le collagène par un sel, tel que NaCi, jus- qu'à l'obtention d'ure corcentratior firale comprise entre 0,5 M et 0,8 M, - on laisse reposer la solution pendant 1 h a 24 h à une température comprise entre 0 et 20 C, - on récupère le précipité de collagère purifié. / Procédé selon l'une quelcorque des revendica- tions 5 à 9, caractérisé en ce qu'après avoir redissous le précipité de collagène purifié, - on effectue une précipitation saline à pH neutre du colla- gène. 11/ Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que: l'onr redissout dans l'eau le précipité final de collagène acide purifié, - l'on ajuste à pH neutre la solution, - l'on additionne a la solution un sel, tel que NaCl jusqu'à l'obtention d'une concentration de 1,2 M, - l'on laisse reposer la solution pendant 1 a 24 h. et - l'on récupère le précipité de collagène formé, ledit préci- pité étant utilisé comme source de collagène purifié pour la préparation des solutions ou gels. 12/ Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 5 a 11, caractérisé en ce que: - l'on reprend le précipité de collagène purifié acide ou neutre dans un solvant organique volatil, notamment l'acéto- ne, ce qui conduit a la formation de fibres de collagène, - l'on récupère et l'on sèche lesdites fibres, celles-ci étant utilisées comme source de collagène purifié pour la préparation des solutions ou gels. 13/ Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que les gels de collagène sont obtenus: - en mettant en contact les fibres de collagène avec un volume d'eau déterminé de façon à obtenir une concentra- tion en collagène comprise- entre 2 et 30 %, notamment - en laissant gonfler lesdits fibres /pendant environ 1 h, notamment - en soumettant lesdites fibres à un chauffage modéré, / à une température comprise entre 40 et 80 C pendant 10 à 60 minutes, et de préférence aux environs de 70 C pendant environ trente minutes, - en filtrant la solution transparente et visqueuse obtenue sur une membrane de porosité comprise entre 0,8 et 8, - et en laissant refroidir ladite solution. 14/ Procédé selon la revendication 12, prise en combiraisorn avec l'ure quelconque des revendications 5 à 9, caractérisé en ce que les solu- tiors de collagane sort obtenues: - en mettant en contact les fibres de collagène avec un volume d'eau déterminé, notamme.t - en laissant gonfler lesdites fibres dans l'eau pendant / environ 1 h, - en additionnant à l'ensemble une solution d'un sel tel que l'acétate de sodium, à une concentration de l'ordre de 0,1 M, les volumes d'eau étant déterminés defaçon à obtenir une concentration en collagène au plus égale à 2 %, à 2 %, environ - en ajustant le pH à/7,5, notamment - en soumettant ladite solution à un chauffage modéré,/ à une température comprise entre 40 et 80 C pendant 10 a 60 minutes, et de préférence aux environs de 60 C pendant environ 10 minutes, - en la filtrant sur des membranes de porosité comprise entre 0, 2 et 8p, -puis en refroidissant ladite solution. / Procédé selon la revendication 12, prise en combinaison avec l'ure des revendications 11 et 12, caractérisé en ce que les solu- tiors de collagène sont obtenues: - en mettant en solution le précipité de collagène dans un volume d"'au déterminé de façon à obtenir une concentra- tion en collagène au plus égale à 2 %, - en additionnant à la solution un sel, tel que NaCl, jusqu'à l'obtention d'une concentration de l'ordre de 0,15 M, - en soumettant ladite solution à un chauffage modéré, rotdrment à une température comprise entre 40 et 80 C perdant 10 a 60 minutes, et de préférence aux environs de 60 C perdart environ 10 minutes. - en filtrant la solution sur des membranes de porosité comprise entre 0,2 et 8 - en laissant refroidir ladite solution. 16/ Collagène acide humain ou animal, enrichi essen- tiellement en type IV,obteru par mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 et 12. 17/ Collagène neutre humain ou animal, enrichi essentiellement en type IV, obtenu par mise en oeuvre- du procédé selon l'une des revendications 10, 11 et 12. 18/ Solution ou gel de collagène obtenu par mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 13, 14 et 15. 19/ Solution ou gel de collagène, caractérisé en ce qu'il contient du collagène natif, non dénaturé, non modifié secondairement et en ce qu'il est parfaitement trans- parent, physiologique et hémocompatible. / Solution ou gel de collagène selon la revendi- cation 18, caractérisé en ce qu'il résiste à la dénatura- tion lorsqu'il subit un chauffage modéré, à une température comprise entre 40 et 80 C pendant 10 à 60 minutes, et en ce que le critère d'analyse repose sur l'absence de modification du poids moléculaire des différents consti- tuants, par électrophorèse en gel de polyacrylamide avec sodium dodécyl sulfate et avec ou sans agent réducteur. 21/ Application du collagène humain ou animal, l'une des 16 et 17, enrichi en type IV selon / revendication.- à la prépara- tion de gels: - contenant 2 à 30 % de collagène natif, non dénaturé,. non modifié secondairement, - dont le pH peut être indifféremment acide ou neutre, - d'une très grande transparence sur une épaisseur comprise entre 0,1 et 20 mm, comparable à celle d'un verre ou d'une solution aqueuse de même épaisseur. 22 / Application du collagène humain ou animal, l'ure des 16 et 17, enrichi en type IV selon / revendication / à Ia prépara- tion de solutions visqueuses, - contenant au plus 2 % de collagène natif, non dénaturé, non modifié secondairement, - dont le pH final peut être indifféremment acide ou neu- tre, - qui, à pH neutre, peuvent être rendues isotoniques, phy- siologiques et hémocompatibles. l'une des 23 / Application des gels de collagène selon / 19 et 20, revendication / à la fabrication de lentilles de con- tact ou -de tout autre dispositif de propriétés optiques particulières. 24 / Application des solutions de collagène selon l'une 19 et 20 des revendication / à la réalisation d'implants en médecine humaine ou animale, dans les domaines de l'ophtalmologie, des articulations osseuses, du traitement des brûlés ou de la dermatologie.