FR 2597107 A1 19871016 FR 8705021 A 19870409 La présente invention concerne un tripeptide doué d'une activité immunostimulante. Plus précisément, la présente invention a pour objet un tripeptide constitué de L-Ala (alanine) et de 2 L-Arg (arginine) et ayant la structure suivante: Arg-Ala-Arg. Le tripeptide Arg-Ala-Arg, synthétisé par des méthodes en solution classique, et ses sels, exercent une activité immunostimulante tant sur la maturation des cellules T immatures que sur la fonction des cellules T. La présente invention a donc également pour objet une composition pharmaceutique comportant notamment un tripeptide. Plus particulièrement, la présente invention a pour 15 objet une composition pharmaceutique à activité immunostimulante notamment sur la maturation et la fonction des cellules T utile notamment en cas de déficiences du système immunitaire. La présente invention a aussi pour objet une composi20 tion pharmaceutique comportant un sel pharmaceutiquement acceptable du tripeptide notamment choisi parmi un acétate, trifluoracétate, chlorhydrate, sulfate. La présente invention a aussi pour objet une composition pharmaceutique administrable par voie parentérale. La présente invention a également pour objet une application d'un tripeptide ou d'un de ses sels pharmaceutiquement acceptable pour la préparation de la composition pharmaceutique. Il est connu par les données de la littérature que la L-alanine est importante pour la fonction des lymphocytes T car elle est essentielle pour que ces cellules puissent répondre in-vitro à des stimulus mitogènes (Rotter V. et coll.: J. Immunol. 123, 1726, 1979); en outre, la L-alanine est également essentielle pour le développement in-vitro des lymphocytes (Nordlind K. et coll.: Int. Archs Allergy appl. Immunol. 59, 215, 1979). Les résultats des laboratoires de la demanderesse 15 n'établissent cependant qu'une très faible activité immuno-stimulante de cet aminoacide, comme le montre l'essai in-vitro de l'induction du Thy 1.2 sur les lymphocytes T immatures de souris normales. Il est également indiqué que la L-arginine est douée 20 d'une activité immuno-stimulante tant in-vitro qu'in-vivo, en particulier chez les animaux blessés ou stressés (Barbul A. et coll.: J. Surg. Res. 29, 228, 1980; J. Parenteral Enteral Nutr. 4,446, 1980; ibid. 5.492, 1981) et dans des tumeurs provoquées expérimentalement (Rettura 25 G.: J. Parenteral Enteral Nutrition 3.409, 1979. Dans l'essai de la demanderesse sur l'induction du Thy 1:2, la L-arginine présente elle-aussi une activité faible, bien que statistiquement significative. La demanderesse a synthétisé un tripeptide possédant la séquence Arg-AlaArg, et elle a comparé son activité dans l'essai ci-dessus avec celle d'un mélange des deux aminoacides isolés dans un rapport molaire 2Arg:lAla. Le tripeptide se révèle beaucoup plus actif que le mélange des deux aminoacides, car il induit 13 % des cellules (P non significatif) avec le mélange. La L-arginine a été choisie pour les deux positions terminales du tripeptide, compte tenu du fait que dans de 10 nombreux peptides immunostimulants connus, cet aminoacide occupe soit la position N-terminale (comme dans le cas de la thymopentine), soit la position C-terminale (par exemple dans la tuftsine, l'ubiquitine, la thymopoiétine). CARACTERISTIQUES CHIMIOUES MASSE MOLECULAIRE: 401,49 POUVOIR ROTATOIRE: [î]20 = 3,69 (c = 1, acide acétique) ANALYSE PAR HPLC: Le tripeptide a été analysé par HPLC par appariement 20 d'ions, conformément aux conditions de séparation ci-après: Eluent: NaH2 P04 0, 05M pH 4,3 + SDS 5x10'4 M: MeOH; :50. Débit de pointe: 1 ml/minute Détection: 225 nm Volume d'injection: 20 mcl Echantillon: 20 mcg Colonne: u Bondapack C18 (Waters), 300 x 3,9 mm On a utilisé l'appareillage suivant: Chromatographe en phase liquide: SERIE 4 (Perkin 30 Elmer) Soupape d'injection: Reodyne mod. 7125-075, avec une boucle de 20 pl Détecteur: spectrophotomètre LC 95 (Perkin Elmer) Intégrateur de calcul: Data Station 3600 (Perkin 35 Elmer) La figure montre le profil en HPLC du tripeptide. RESISTANCE A L'AMBIANCE GASTRIQUE SIMULEE IN-VITRO: Le tripeptide est résistant à l'ambiance gastrique simulée in-vitro. Dans cette étude, le suc gastrique simulé USP XXI (HCl + pepsine) a été utilisé à 37 C pendant 5 heures. SYNTHESE N02 Boc-Ala-Arg-OBe (1) A de la Boc-Ala (0,1 mole) dissoute dans du chlorure de méthylène et refroidie à 0oC+/-l, on ajoute du chloroformiate d'isobutyle (0,1 mole) tout en abaissant la température à - 51'C. Après avoir agité le mélange réactionnel pendant 15 minutes à cette température, on 15 ajoute lentement une solution refroidie à l'avance de -p-tosylate de l'ester benzylique de la NG-nitroarginine (0,1 mole) et de Nméthylmorpholine (NMM) (0,2 mole) dans du diméthylformamide, et on agite une nuit le mélange réactionnel. On élimine les solvants sous pression réduite et on reprend le résidu dans de l'acétate d'éthyle. On lave l'acétate d'éthyle avec de l'eau, de l'acide chlorhydrique 1N, une solution aqueuse à 5 % de bicarbonate de sodium et de l'eau. On le sèche sur sulfate de sodium et on élimine le solvant sous pression réduite. Le produit obtenu est un sirop. Système de chromatographie sur couche mince: CHC13:MeOH:HOAc (90:8:2). Pureté 95 %: Rendement 80 %. (1) est débloqué avec un mélange acide trichloracétique à 5 % - chlorure de méthylène (1:1), 10 ml par gramme pendant une demi-heure. On le fait évaporer sous pression réduite, on le triture avec de l'éther, on le filtre, on le lave avec de l'éther et on le sèche sous vide. Rendement 98 %. Le TFA-Ala-Arg-OBE est neutralisé avec de la NMM et couplé à du Z3-Aeg dans un mélange diméthylformamide- tétrahydrofurane en utilisant de la NMM et du chloroformiate d'isobutyle et en poursuivant le traitement comme en (1). Rendement 60 %. Système de chromatographie sur couche mince CHC13: MeOH (92:8). Une tâche prédominante. On hydrogène le tripeptide ci-dessus dans un mélange acide acétique-eauméthanol en présence de pd/c jusqu'à ce que la réaction soit complète. On le débarrasse du catalyseur par filtration et on fait évaporer le filtrat sous vide. On purifie le produit, le tripeptide, par partage à contre-courant en utilisant un système N-butanol:acide acétique:eau (4:1:5). Rendement 50 %. Système de chromatographie sur couche mince: butanol:acide acétique:eau: pyridine (32:6:22:20). Une tâche prédominante. HPLC 97 %. 15 ACTIVITES BIOLOGIQUES 1.A. INDUCTION IN-VITRO DE L'ANTIGENE THY 1.2 La capacité de L'Arg_ala-Arg d'induire in-vitro la différentiation des précurseurs des lymphocytes T de la souris dans des lymphocytes exprimant les marqueurs des 20 lymphocytes T, a été étudiée en mettant en évidence l'induction de l'antigène de membrane Thy 1.2. MATERIEL ET METHODES: SOURIS: On a utilisé des souris athymiques (nu/nu) âgées de 8 semaines, élevées sans consanguinité sur un 25 substratum de C3H/He, maintenues dans des conditions exemptes de germes pathogènes particuliers. PREPARATION DES CELLULES: La rate est prélevée aseptiquement, hâchée et passée à travers une toile d'acier inoxydable à mailles fines dans du HBSS. Les splénocytes, lavés et remis en suspension dans du milieu 199 (Gibco Ltd), complétés avec 1 % de BSA (Boehringer Mannheim) et de la gentamycine (100 gg/ml) sont incubés pendant 45 minutes dans des colonnes de laine équilibrées conformément à la méthode de Julius et Coll. (Eur. J. 35 Immunol. 3, 645, 1973. Les populations de cellules ::: 0 :: :: : D:::2 sortantes, enrichies en lymphocytes T précurseurs, sont utilisées dans la recherche biologique. ETUDE BIOLOGIQUE DE L'INDUCTION: 0,5 x 106 cellules sortantes dans 0,1 ml de milieu sont incubées à 37C pendant 18 heures avec 0,1 ml du tripeptide ou du milieu seul. Les cultures sont effectuées en double. A la fin de l'incubation, les cellules sont lavées avec du chlorure d'ammonium à 0,87 % pour lyser les érythrocytes, puis avec de la HBSS. L'induction de l'antigène de membrane Thy 1.2 a été déterminée par un essai d'immunofluorescence. ESSAI D'IMMUNOFLUORESCENCE DIRECTE: Les cellules sont incubées à 4'C pendant 20 minutes avec un anticorps monoclonal conjugué avec de la fluorescéine (Bio-Yeda) à une dilution de 1:200. Le mélange est centrifugé à 300 g pendant 5 minutes, il est lavé deux fois dans de la HBSS, puis mis en suspension pour le comptage sous le microscope à fluorescence (Orthoplan Leitz). La différence en pourcentage des cellules fluorescentes entre des cultures avec et sans tripeptides donne l'acitivité du produit. RESULTATS: Comme le montre le tableau, le tripeptide induit l'apparition du marqueur Thy 1.2 sur des lymphocytes T immatures avec une réponse optimale à 10 mcg/ml. La courbe des relations dose/réponse est en forme de cloche, et les concentrations inférieures et supérieures du tripeptide provoquent toutes deux une induction plus faible. CONCENTRATION CELLULES THY 1.2 (%) DU TRIPEPTIDE (mcg/ml) MOYENNE + ECART-TYPE DIFFFRENCE (mcg/ml) DIFFFREtICE O l +/- 1,6 0,0004 13 +/- 3,9 + 2 0t001 25 +/- 5 + 14 0,01 36 +/- 3#7 + 25 0,1 36 +/- 5,4 + 25 1 41 +/- 1,6 + 30 48 +/- 2t2 + 37 33 +/- 3,3 + 22 50 29 +/- 313 + 18 19 +/- 1,7 + 8 19 +/- 4;5 + 8 l.B. INDUCTION IN-VIVO DE L'ANTIGENE THY 1.2 MATERIEL ET METHODES De l'ELS2 (dans la présente demande ELS2 désigne le tripeptide Arg-AlaArg) est administré quatre jours consécutifs après quoi les souris sont mises au repos pendant 24 heures, puis les rates sont prélevées et les cellules sont examinées pour y rechercher l'expression de l'antigène Thy 1.2 par fluorescence. Les souris témoins reçoivent du Medium 199 (M 199), le milieu dans lequel le médicament était dissous. Les souris ont un poids moyen d'environ 30 24 g. RESULTATS 8 CELLULES THY 1.2 (%) Voie orale Voie i.p. Témoin 2% 4% ELS2 42 pg/kg 3% 4% ELS2 420 lig/kg 6% 7% ELS2 1055 sjg/kg 17% 19% ELS2 2110 pg/kg 16% 17% 1O ELS2 4220 pg/kg 18% 17% ELS2 8440 pg/kg 17% 20% Les résultats montrent que l'ELS2 est capable d'induire la maturation de splénocytes tant après 15 administration orale qu'après administration i.p. La posologie optimale est de 1055 M g/kg, tandis qu'avec des posologies plus élevées, on observe une réponse en palier. 2. STIMULATION IN-VITRO DE LA PRODUCTION DE 20 LYMPHOKINE MATERIEL ET METHODES PREPARATION DE CELLULES MONONUCLEAIRES DE SANG PERIPHERIQUE HUMAIN (PBMC). Du sang périphérique est prélevé sur des volontaires 25 sains par ponction veineuse. Les érythrocytes sont séparés des leucocytes sur des gradients Ficoll-Hipaque. La couche leucocytaire (PBMC) erst éliminée et lavée, et les cellules sont remises en suspension à raison de 1 x 106 cellules/ml dans du RPMI 1640, complétées avec 1 % de 30. pénicilline/streptomycine, 1 % de glutamine et 1 % de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur (FCS, 56 C, minutes). PREPARATION DU FACTEUR DE CROISSANCE Des PBMC, à raison de 1 x 106 cellules/ml dans du 35 -FCS inactivé par la chaleur, sont incubées avec ou sans phytohémagglutinine (PHA) à une concentration de 0,75 % (v/v). Le peptide à essayer est ajouté à la concentration de 1 jg/ml aux cultures appropriées. La durée d'incubation est de 18 à 24 heures, à 37 C dans une atmosphère humidifiée. Les cultures sont ensuite filtrées à travers des filtres de 0,22 mM et les liquides surnageants sont examinés pour y rechercher la présence de facteurs de croissance. MESURE DES FACTEURS DE CROISSANCE DANS LES LIQUIDES SURNAGEANTS A. Cellules d'essai. Les lymphocytes B utilisés pour rechercher la présence d'un facteur de croissance des lymphocytes B (BCGF) sont des lignées cellulaires cultivées sur une 15 longue durée, maintenues sur BCGF, et elles sont EBVnégatives. Ces cellules sont cultivées dans un milieu exempt de sérum, en utilisant du Nutridoma (Boehringer Mannheim Biochemicals, et elles ne répondent pas à 1'IL-2. Les lymphocytes T utilisés pour rechercher la 20 présence d'IL-2 sont fraîchement isolés. Elles sont initialement stimulées avec de la PHA (à 0, 75 %) et elles sont maintenues en culture pendant au moins 10 jours avant l'utilisation (pour réduire le fond et établir leur dépendance de 1'IL-2). B. Préparation de cellules d'essai pour l'utilisation dans la recherche. 1. Les lymphocytes B sont habituellement utilisés 4 jours après la dernière alimentation avec du BCGF. Ils sont lavés quatre fois dans du RPMI 1640 pour éliminer 30 le BCGF éventuellement restant, et ajuster à 15 x 104 cellules/ml dans RPMI 1640 et du Nutridoma (à une concentration finale de 1 %). 2. Les lymphocytes T sont utilisés quatre jours après leur dernière alimentation avec du IL-2. Ils sont 35 lavés quatre fois et ajustés à 50 x 104 cellules/ml dans du RPMI 1640 avec du FCS à 5 %. C. Modes opératoires de recherche. 1. Des lymphocytes B cultivés sur une longue durée sont incubés avec diverses concentrations de liquide surnageant de cultures de PBMC, dans 96 plaques à microtitration à fond plat. Chacun des puits a un volume total de 200 pl, constitué de 100 ojl de lymphocytes B (15 x 103 cellules) et de 100 pl de liquide surnageant. La demanderesse a examiné l'efficacité de ces lymphocytes B 10 d'essai en les faisant incuber avec diverses concentrations de BCGF purifié (Cellular Products, Inc. Buffalo, N.Y.). Les cultures sont incubées pendant 24 heures, après quoi on ajoute 1 pCi de [3H-Tdr], puis on les fait encore 15 incuber pendant 12 heurs. On récolte ensuite la culture et on la compte dans un compteur à scintillation. 2. Les lymphocytes T sont incubés dans des puits à fond plat. Le volume total dans chaque puits est de 200 iil, comprenant 50 x 103 lymphocytes T/puits. La durée d'incubation est de 72 heures, sur lesquelles 12 heures de marquage par le [3H-Tdr]. RESULTATS 1) PRODUCTIONS DE FACTEUR DE CROISSANCE EXPERIENCE 1 ACTIVITE DU BCGF (C.P.M.) % de Sup. (Surnageant) SuPt.- de 3,05 6,25 12,5 25 50 PBL + PHA 424 1026 1674 3172 8392 PBL + PHA + ELS2 2772 4616 6336 8186 9818 1 1 ACTIVITE DU TCGF % DE SUP. ______ _ (C.P.M.) PBL + PHA PBL + PHA + ELS2 542 384 192 718 224 1832 564 1144 4028 8338 EXPERIENCE 2 ____________ ACTIVITE DU BCGF (C.P.M.) % de Sup. Sut.PBL + PHAde PBL + PHA 3, 125 1369 6,25 12.5 25 2187 2894 4876 4214 7442 8730 8104 11754 PBL + PHA + ELS2 2690 ACTIVITE DU TCGF (C.P.M.) % de Sup. PBL + PHA 4322 7184 9012 12984 PBL + PHA + ELS2 2968 6220 9354 12014 3. EFFET SUR LA SYNTHESE DU RNA EFFET DU ELS2 SUR LA SYNTHESE DU RNA DANS DES LYMPHOCYTES T-HUMAINS, TELS QU'OBSERVES PAR INCORPORATION DE 3H-URIDINE. COUP PAR MINUTE (CPM). RESULTATS OBTENUS AU BOUT DE 24 HEURES D'INCUBATION. T T + PHA 20752 CONCENTRATION DE L'ELS2 (mLq/ml) 5086 5130 T + ELS2 T + ELS2 + PHA 31000 31413 32706 31494 4. EFFET SUR LA SYNTHESE DU DNA EFFET DU ELS2 SUR LA SYNTHESE DU DNA DANS DES LYMPHOCYTES T HUMAINS, TELS QU'OBSERVES PAR INCORPORATION DE 3H-THYMIDINE. COUPS PAR MINUTE (CPM). RESULTATS OBTENUS AU BOUT DE TROIS JOURS D'INCUBATION. T 154 T + PHA 6076 CONCENTRATION DE L'ELS2 Jng/ml) 10 iO 1 2.Ll 1 10 T + ELS2 152 166 190 234 T + ELS2 + PHA 5758 6477 7548 12317 5. AUGMENTATION IN-VITRO DU NOMBRE DES CELLULES Le tripeptide, ajouté aux cultures soit de lymphocytes T, soit de mélanges de lymphocytes T et B, tous les quatre jours & une concentration de 5 pg/ml pendant une durée de 300 jours, est capable d'augmenter le nombre des cellules avec un maximum de + 50 % par rapport aux cultures témoins, l'observation étant effectuée entre le 10ème et le 15ème jours de l'expérience. ETUDES TOXICOLOGIOUES TOXICITE AIGUE Des études de toxicité aiguë effectuées sur la souris et le rat ont montré que jusqu'à une dose de 1000 mg/kg i.m., le tripeptide était totalement dépourvu d'effets toxiques. TOLERANCE Des études sur les lapins et les souris ont montré que le produit, à la dose de 100 mg/kg, i.v. et i.p., ne provoquait aucune modification hémodynamique et aucun effet de comportement. En particulier, la durée de sommeil 35 ne présente qu'une légère augmentation. 1 3 ACTIVITE D'INDUCTION DE L'ALLERGIE Le produit, à la dose de 100 mg/kg i.m., ne provoque aucun phénomène de sensibilisation chez le cobaye. SELS DU TRIPEPTIDE Les recherches ci-dessus ont été effectuées avec un acétate du tripeptide, mais il est bien connu dans la technique que des résultats similaires peuvent être obtenus en utilisant d'autres sels, par exemple le trifluoracétate, le chlorhydrate, le sulfate. 15 20 REVENDICATIONS 1. Tripeptide constitué de L-Ala (alanine) et de 2 L-Arg (arginine) et ayant la structure suivante Arg-Ala-Arg 2.- Composition pharmaceutique comportant notamment un tripeptide selon la revendication 1. 3.- Composition pharmaceutique selon la revendication 2 à activité immunostimulante notamment sur la maturation et la fonction des cellules T utile notamment en cas de déficiences du système immunitaire. 4.- Composition pharmaceutique selon l'une des revendications Iet 2 comportant un sel pharmaceutiquement acceptable du tripeptide notamment choisi parmi un acétate, trifluoracétate, chlorhydrate, sulfate. 5.- Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 2 à 4 administrable par voie orale. 6.- Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 2 à 4 administrable par voie parentérale. 7.- Application d'un tripeptide d'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables pour la préparation d'une composition pharmaceutique selon l'une des revendications 2 à 6.