FR 2596756 A1 19871009 FR 8604832 A 19860404 L'invention concerne un nouveau procédé pour la purification de la carnitine, c'est-à-dire de l'acide triméthylamino-4 hydroxy-3 butyrique, et en particulier de la Lcarnitine obtenue par voie biochimique. La carnitine étant principalement employée pour des applications biologiques, notamment pharmacologiques, cosmétiques et alimentaires, sa pureté est une condition importante d'emploi. D'autre part, comme les méthodes chimiques de sa préparation conduisent à des mélanges racémi10 ques, alors que seul le stéréoisomère L est biologiquement actif, c'est surtout le procédé biochimique de préparation qui est intéressant, parce qu'il fournit l'isomère L. Il est donc important de disposer d'un procédé de purification permettant d'éliminer convenablement les impuretés qu'apportent les matières utilisées dans la voie biochimique, en particulier différentes protéines et substances minérales. C'est l'avantage intéressant qu'apporte le procédé suivant l'invention; il permet d'éviter la méthode classique de chromatographie qui n'élimine pas les compo20 sés minéraux. Ce nouveau procédé, suivant l'invention, rend possible l'obtention directe de la carnitine sous sa forme amphotère au lieu d'un sel d'acide fort, en particulier chlorhydrate, comme c'est le cas dans la technique antérieu25 re, par exemple dans le brevet FR- 2 398 046. D'autre part, il ne comporte qu'au maximum 5 étapes, alors qu'il y a au moins 10 opérations successives dans le procédé connu, utilisant une colonne à résine échangeuse d'ions. Le procédé de purification suivant l'invention 30 est caractérisé en ce que d'abord le milieu aqueux, renfermant la carnitine, est acidifié, de façon à faire précipiter les protéines présentes, et, après la séparation de celles-ci, l'eau du milieu est remplacée par un alcool inférieur, dissolvant au moins à chaud la carnitine, tan35 dis que les substances minérales se séparent. On obtient ainsi une solution alcoolique riche en sel de carnitine de bonne pureté. Lorsqu'un produit encore plus pur est désiré et, notamment, quand l'obtention de composé (CH3)3N-CH2CHCH2ODO OH amphotère, lui-même et non de son sel, est visée, on complète la purification de la façon suivante. Le solide, extrait de la solution alcoolique susmentionnée, est remis en solution aqueuse que l'on neutralise avec une base jus10 qu'à environ 7,2, et la solution neutralisée est traitée en sorte que l'eau y soit remplacée par un alcool inférieur, ce qui fait précipiter le sel de la base de neutralisation de l'acide qui a servi à l'acidification du milieu initial. La solution alcoolique restante contient la carnitine am15 photère d'excellente pureté, qui peut être récupérée à l'état solide, notamment par cristallisation à froid, par dessication de la solution ou par précipitation par addition d'un liquide non solvant. Voici, plus en détail, cinq étapes du procédé suivant l'invention, susceptibles de fournir une L-carnitine très pure à partir d'une solution aqueuse impure de ce composé, en particulier provenant du milieu issu de la bioconversion de déhydro-3 carnitine. 1 - ACIDIFICATION DU MILIEU Un acide, de préférence fort, est ajouté à la solution aqueuse,de façon à abaisser le pH de celle-ci vers une valeur d'environ 1 à 3, de préférence voisine ou égale à 2. Des acides tels que sulfurique, sulfureux, phosphorique, perchlorique, benzène-sulfonique etc. peuvent être 30 employés, le S04H2 convenant particulièrement bien. Cette opération a pour effet la précipitation des protéinres qui se trouvaient dans le milieu traité, et qui - ainsipeuvent être éliminées par filtration ou centrifugation du liquide acidifié. 2 - PRECIPITATION DE SELS MINEPRAUX Le filtrat provenant de l'opération précédente est traité de façon à remplacer son eau par un alcool inférieur, capable de dissoudre la carnitine. Cela peut être réalisé par l'évaporation de l'eau de la solution et addition de l'alcool, ou bien par évaporation avec entraînement à l'alcool. A la fin, la solution alcoolique est maintenue à la température à laquelle la carnitine est toute dissoute, alors que les composés minéraux précipitent et 10 on les sépare. L'alcool peut être tel que méthanol, éthaméthoxyéthanol nol,/isopropanol, n-propanol, n-butanol, tert-butanol ou iso-butanol, l'éthanol étant particulièrement approprié. Des mélanges d'alcools peuvent être employés. Selon la nature de l'alcool et la solubilité de la carnitine, on opère 15 à une température appropriée, qui est en général de 20 à 100 C. 3 - REMISE EN SOLUTION AQUEUSE A partir de la solution alcoolique, obtenue au stade précédent, 2 -, on peut récupérer la carnitine dis20 soute, sous la forme d'un sel de l'acide employé au stade 1 -, à l'état de bonne pureté. Mais si l'on cherche à pousser la purification encore plus loin, ou s'il s'agit de produire la carnitine amphotère au lieu de son sel, on procède comme suit. De la solution alcoolique ou extrait le sel de carnitine, notamment par évaporation de l'alcool ou par précipitation au moyen d'un non solvant, tel que par exemple - une cétone. Ce dernier moyen contribue encore à améliorer la pureté. On dissout ce sel dans l'eau, de préférence à raison de 100 à 500 g par litre, et on soumet 30 la solution au stade 4 - suivant. 4 - NEUTRALISATION La solution, issue de l'étape 3 - précédente, est neutralisée par l'adjonction d'une base, le plus souvent soude. Bien que le pH en fin de neutralisation puisse os35 ciller entre 6,9 et 7,4,il est de préférence très proche ou égal à 7,2. Cette neutralisation libère la carnitine amphotère suivant la réaction: HSO4. (CH3)3 NCH2CHCH2COOH + 2Na.OH OH --* (CH3)3 CH2CHCH2C0 + Na2SO4 + 2H20 OH en prenant, à titre d'exemple, l'acide sulfurique pour l'acidification suivant 1 -, et la soude en tant que base 10 de neutralisation. La solution, ainsi neutralisée, est traitée en vue du remplacement de son eau par un alcool inférieur, capable de dissoudre la carnitine. Cela peut être opéré comme sous 2 plus haut, c'est-à-dire par évaporation de l'eau, de préfé15 rence sous vide, et addition de l'alcool, ou bien par évaporation sous vide avec entraînement à l'alcool. La nouvelle solution alcoolique, obtenue de cette manière, est maintenue à la température à laquelle la carnitine reste dissoute, alors que le sel minéral (sulfate de Na dans 20 l'exemple ci-dessus), formé du fait de la neutralisation, précipite. On dispose donc d'une solution alcoolique de carnitine très pure. - RECUPERATION A L'ETAT SEC A partir de la solution alcoolique restant après 4 -, on peut récupérer la carnitine solide, sèche, par évaporation complète du solvant. Un autre moyen qui parfait encore la pureté consiste à précipiter la carnitine par l'adjonction d'un non solvant à sa solution alcoolique; ainsi l'addition d'un excès d'acétone permet-elle de faire déposer de la carnitine solide, très pure. Comme mentioné plus haut, bien que tout échantillon de carnitine, quelle que soit son origine, puisse être purifié par le procédé de la présente invention, celle-ci s'applique particulièrement bien aux milieux issus de la bioconversion de la déhydrocarnitine par réduction asymétrique de celle-ci à l'aide de NADH, avec réduction du NAD+ formé par l'ion formiate, en présence de formiate déshydrogénase (FDH). Les rendements en L-carnitine et la purification sont remarquables lorsque l'hydrogénase FDH provient des levures Candida bodiini ou Pichia pastoris. C'est à ces derniers types de solutions de carnitine qu'ont trait les exemples non limitatifs donnés ci-après. EXEMPLE 1 La préparation de la L-carnitine est effectuée par l'action du nicotinamide adénine dinucléotide réduit, NADH, sur la déhydrocarnitine, et réduction du NAD+ formé, au moyen du groupe formique avec de la formiate déshydrogé15 nase FDH comme catalyseur. Le schéma de synthèse est donc + l/ + NADH + H + O Me3N-C}2-C-CH2-CO2H NADH + H C02 CDH FDH À Me3N-CH2-CH-CH2-CO2H NAD HCO2H OH (L-Carnitine) CDH = carnitine déshydrogénase La CDH utilisée provenait d'un extrait de culture de Pseu30 domona putida. Elle était précipitée au sulfate d'ammonium à 250 g par litre d'extrait brut (55% de la saturation). Le culot, obtenu à partir de 20 ml d'extrait, était redissous dans 7 ml de tampon de Na2HPO4/KH2PO4 50mM de pH=7,0, la solution passée sur gel filtration (G200), puis chroma35 tographiée sur 5'AMP - Sépharose 4B (enzyme fixée par affi- nité puis éluée avec NAD 10.M) et enfin passée sur gel filtration ACA 44 pour récupérer l'enzyme dépourvue de NAD+ et du NaN3 (lequel avait été mis dans les tampons d'élution pour se protéger des contaminations). L'enzyme pure, ainsi obtenue, avait une activité spécifique de 55 U/mg; on en a introduit 40 U dans un réacteur de 50 ml. Ce réacteur contenait en outre: 2mM de NAD+, i50 mM de HCO2NH4, 6 mg de chloramphénicol et 40 U soit 60 mg de lyophilisat commercial de formiate déshydrogénase, FDH, provenant de la Candida bodiini (EC 1.2.1.2. -- commercialisée par BOEHRINGER MANNHEIM). Le réacteur était alimenté par une solution maintenue à 4 C, contenant du chlorhydrate de déhydrocarnitine cris15 tallisé, dissous à la concentration 0,8 M, ainsi que de l'acide formique à 0,8 M. Le débit d'injection était de 1,2 ml/h. La température dans le réacteur était réglée à C et le pH maintenu à 7,0 par addition d'ammoniaque 2 N contrôlée par un système de régulation de pH. Après 230 h on a atteint un volume final de 315 ml et une concentration en L-Carnitine de 477 mM correspondant à un rendement de 98%. La solution, ainsi obtenue, est soumise aux opérations de purification suivantes. Ce milieu de bioconversion est acidifié à pH: 2,0 par de l'acide sulfurique concentré. Les protéines précipitent. Après filtration, le filtrat est évaporé sous vide (70 C/ 15 mmHg) suivi d'un entraînement de l'eau à l'éthanol. Le milieu s'appauvrit en eau et s'enrichit en éthanol. La L-carnitine est soluble dans l'éthanol à chaud; les sels minéraux ne le sont pas, et ils précipitent. Après filtrations sur fritté, on récupère une solution éthanolique de sulfate de LCarnitine que l'on précipite à l'acétone à froid (rapport volumétrique: acétone/éthanol = 90/10). Le sulfate de L-Carnitine est dissous dans l'eau et neutra- lisé à pH=7,2 par de la soude concentréé. La solution aqueuse obtenue est évaporée sous vide avec entraînement à l'éthanol. Le milieu s'appauvrit en eau et le sulfate de sodium précipite dans l'éthanol. Après fil5 tration sur fritté, on récupère une solution éthanolique de L-Carnitine qui ne contient aucun sulfate (test au Ba2+). On évapore le solvant jusqu'à obtention d'un produit sec. Ce dernier est dissous dans un minimum d'éthanol à chaud (40 C) et précipité à froid à l'acétone. Le rendement global de la purification est de 80%. Le rendement de l'ensemble de la préparation en L-carnitine pure ressort donc à 80x98/100=78,4%. Les caractéristiques du produit obtenu sont: [o D0 = -30,2 (2,5, eau) 15. sulfates 4,4(quintuplet; J:5Hz; 1HT;3,251doublet) J:5Hz;2H); 3,05(singulet,9H);2, 25(aoubletdedoublet;2H). Dosage enzymatique: 100% L-carnitine. 20 EXEMPLE 2 (comparatif) Toutes les opérations de l'exemple 1 sont répétées avec la seule différence que la FDH employée provenait de la levure Torulopsis candida (GFP 206) comme décrit dans l'exemple 5, page 8, du brevet français 2398046. 25 Le rendement en L-carnitine purifiée était alors de 58% seulement, et la pureté du produit final n'était que de 92%. Cela montre l'intérêt de la FDH provenant de la Candida bodiini, correspondant à la forme préférée de la présente invention. EXEMPLE 3 Cherchant à limiter l'augmentation de volume au cours de la bioconversion, on a mis en oeuvre des réactifs en solutions plus concentréesen déhydrocarnitine, acide formique et ammoniaque. D'autre part, on a réduit +35 la concentration en NAD. la concentration en NAD. Ainsi a-t-on chargé dans le réacteur 50 ml de solution contenant: Na2HO4/KH2PO4 50 mM pH: 7,5 NAD+ 0,2 mM 6 mg chloramphénicol U de CDH sommairement purifiée comme décrit ci-après 25U de FDH BOEHRINGER-MANNHEIM provenant de la Candida bodiini. La CDH, extraite de P. Putida, avait été précipitée au sulfate d'ammonium (55% de la saturation), centrifugée et le culot redissous dans le tampon phosphate 50mM pH:7,5; la solution obtenue dialysée pendant 16 h contre ce même tampon. Le réacteur était alimenté avec une solution maintenue à 4 C, contenant la déhydrocarnitine et l'acide formique à la concentration, l'un et l'autre, de 1,6 M. Le débit était de 0,6 ml/h. La température du réacteur maintenue à 30 C et le pH 7,5 par addition contrôlée d'ammoniaque 8N. 20 Apres 48 heures, on atteint un volume final de 90 ml et une concentration en L-Carnitine de 500 mM soit un rendement de 98%. La purification, effectuée comme dans l'exemple 1, donne le même résultat. EXEMPLE 4 Le même essai que dans l'exemple 3 a été mené avec de la FDH de Pichia Pastoris avec les modifications suivantes: NAD+ 0,4 mM HCO2NH4 500 mM absence de chloramphénicol qui a été omis, parce que la forte salinité dûe à la concentration initiale élevée en formiate d'ammonium limite les risques de contamination. FDH extraite d'une culture de Pichia Pastoris précipitée 35 au sulfate d'ammonium (50% de la saturation), centrifugée et le culot redissous dans du tampon phosphate 50 mM pH 7,5, la solution obtenue dialysée 16 heures contre ce tampon. Les autres paramètres du réacteur étaient ceux de l'exem5 ple 3. Après 49 h le volume final est de 60 ml et la concentration en Lcarnitine de 700 mM ce qui correspond à un rendement de 93%. Le dosage des enzymes a montré une activité résiduelle de 10 90% en CDH et de 90% en FDH. La purification de la L-carnitine obtenue, effectuée de la même façon qu'à l'exemple 1, a donné le même résultat; il en résulte que la FDH de la Pichia pastoris donne des résultats équivalents à ceux de la FDH de Candida bodiini, 15 bien meilleurs des résultats obtenus avec la FDH de Torulopsis candida (exemple 2). Revendications 1. Procédé de purification de la carnitinecaractérisé en ce que d'abord le milieu aqueux, renfermant la carnitine, est acidifié, de façon à faire précipiter les protéines présentes, et,après la séparation de celles-ci, l'eau du milieu est remplacée par un alcool inférieur, dissolvant la carnitine, au moins à chaud, tandis que les substances minérales se séparent. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le solide, extrait de la solution alcoolique 10 obtenue, est remis en solution aqueuse que l'on neutralise avec une base jusqu'à environ 7,2, et la solution neutralisée est traitée en sorte que l'eau y soit remplacée par un alcool inférieur, de façon à précipiter le sel de la base de neutralisation avec l'acide qui a servi à l'acidi15 fication du milieu initial. 3. Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'acidification est effectuée de manière à amener le pH du milieu à une valeur de 1 à 3, de préférence à 2 ou au voisinage de 2. 4. Procédé suivant une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'acide, utilisé pour l'acidification, est sulfureux,phosphorique, perchlorique ou benzènesulfonique, et de préférence sulfurique. 5. Procédé suivant une des revendications précé25 dentes, caractérisé en ce que l'alcool inférieur, employé, est le méthanol, éthanol, isopropanol, n-propanol, nbutanol, iso-butanol, tert-butanol ou un mélange de tels alcools, l'éthanol étant préféré. 6. Procédé suivant une des revendications pré30 cédentes, caractérisé en ce que la séparation de composés minéraux au sein de l'alcool a lieu à une température comprise entre 20 et 100 C, à laquelle la carnitine est complètement dissoute. 1 1 7. Procédé suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'après la séparation des composés minéraux, la carnitine est remise en solution aqueuse, de préférence à raison de 100 a 500 g par litre. 8. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce qu'une base est ajoutée à la solution aqueuse, de façon à libérer la carnitine amphotère, après quoi l'eau de la solution est remplacée par un alcool inférieur, de façon à faire précipiter le sel minéral formé par l'ad10 dition de la base; et la solution alcoolique, renfermant la carnitine amphotère purifiée, est récupérée. 9. Application du procédé de purification suivant une des revendications 1 à 8 à une solution de carnitine obtenue par l'action du NADH sur la déhydrocarnitine, en 15 présence d'une carnitine shydrogénase, et réduction du + NAD formé, au moyen du groupe formique, avec de la formiate déshydrogénase FDH comme catalyseur, caractérisée en ce que cette FDH provient de la levure Candida bodiini. 10. Application analogue à celle de la revendi20 cation 9, caractérisée en ce que la FDH provient de la levure Pichia pastoris.