FR 2590568 A1 19870529 FR 8616706 A 19861127 - I - La présente invention a pour objet le pamoate de tiamu- line, un procédé de préparation de ce composé et son utilisation comme produit vétérinaire, en particulier comme agent antimicrobien et antiparasitaire et comme agent favorisant la croissance. Le pamoate de tiamuline, ou pamoate de 14-désoxy-14-[(2diéthylaminoéthyl)mercaptoacétoxy]mutiline, est obtenu en faisant réagir la tiamuline base avec l'acide embonique (acide pamoique) dans un solvant approprié, par exemple comme décrit ci-après. La tiamuline base peut être par exemple préparée comme in- diquedans le brevet britannique n 1 410 506 qui décrit également différents sels de la tiamuline. Le pamoate de tiamuline est un sel nouveau de la tiamuline. Le pamoate de tiamuline possède d'intéressantes propriétés biologiques, en particulier une activité antimicrobienne ainsi qu'une action inhibitrice contre les mycoplasmes. La substance exerce une activité inhibitrice contre les bactéries, comme il res- sort in vitro des essais de dilution en série et in vivo des essais effectués chez la souris avec différentes souches bactériennes. Contrairement aux autres sels de la tiamuline, le pamoate de tiamuline présente une plus grande biodisponibilité, c'est-à- dire une plus longue persistance des taux thérapeutiques dans le corps. C'est ainsi que les taux sériques peuvent être détectés par voie microbiologique jusqu'a 24 heures après administration par voie orale à des procelets sevrés d'une dose de 50 mg/kg de pamoate de tiamuline. Lorsqu'on compare l'évolution des taux sériques du pamoate de tiamuline avec ceux du fumarate de tiamuline, on observe que le pic du nouveau sel est plus faible et est atteint beaucoup plus tard, à savoir 8 heures après l'administration. L'augmentation croissante des taux sériques jusqu'à ce moment de détermination, indique que les valeurs du pic n'ont pas encore été atteintes mais se situent dans l'intervalle de 8 à 24 heures. Ce comportement est dû à une vitesse différente de libération de la substance active à partir du sel difficilement soluble dans l'eau, entraînant une vi- tesse de résorption différente. La courbe de biodisponibilité est donc plus aplatie et plus large. - 2 - La substance active est nettement biodisponible à partir de ce sel comme il ressort de l'évolution des taux sériques et de l'excrétion urinaire. Le pamoate de tiamuline est indiqué pour le traitement des maladies infectieuses chroniques, par exemple de la pneumonie enzootique du porc ou des maladies respiratoires chroniques des volailles, étant donné que la disponibilité prolongée en substance active a pour résultat le maintien de taux thérapeutiques malgré les prises irrégulières possibles de nourriture traitée. Le pamoate de tiamuline est également actif contre de nom- breuses espèces de coccidies. Cette activité peut être mise en évi- dence sous des conditions expérimentales, par exemple avec Emeria acervulina, l'une des coccidies les plus répandues chez les vo- lailles. Les essais sont effectués sur des poussins de 14 jours pendant une période allant jusqu'à 2 semaines. Les poussins sont nourris avec des aliments traités avec des concentrations diverses en pamoate de tiamuline et sont contaminés par voie orale immédia- tement après le début de l'alimentation à l'âge de 15 jours, avec 2 x 106 oocystes sporulés d'Emeria acervulina. L'essai est arrêté le 14ème jour après la contamination et l'activité est déterminée en prenant en considération le critère des lésions pathologiques dans la région de l'intestin grêle et l'absence de différentes formes de parasites dans la muqueuse intestinale par rapport à des poussins témoins contaminés non traités et des poussins témoins sains non traités. On a constaté qu'une concentration de 40 ppm de pamoate de tiamuline dans les aliments arrête ou ralentit l'évolu- tion de la contamination provoquée par Emeria acervulina dans l'in- testin grêle comme il ressort de la comparaison avec les animaux témoins du degré de lésion de l'épithélium de l'intestin grêle,de l'absence de diverses formes de parasites et d'une évolution favo- rable du poids. Le nouveau sel de tiamuline est actif contre la coccidiose lorsqu'il est ajouté à la nourriture des poussins. Des quantités - de 100 à 200 g de pamoate de tiamuline par tonne d'aliment permettent de combattre efficacement les infections. L'excrétion d'oocystes d'Emeria acervulina dans les excréments a 2590.568 - 3. - également été vérifiée les 5ème, 8ème et 12ème jours de l'essai, les résultats d'une série d'essais étant indiqués dans le ta- bleau I. TABLEAU I Effet, du pamoate de tiamuline sur l'excrétion d'oocystes d'Emeria acervulina chez des poussins contaminés expérimentalement. Moment de détemination après l'inoculation (en jours) Dose en ppm 5 8 12 3xlO6 7.5x105 2,5x105 2,5x106 3x105 3x1O5 30 7xlO6 6x105 lxlO5 4,2xO106 5x105 8x104 1.106 2.5xO106 245x104 3,5xO106 4xIO6 5 x104 2,5xO106 3,5x105 6x104 20200 6xlO6 1S5x105 7,5x105 Témoins 5,5x106 8x105 6x105 Limite de détection 2,5 x 103. Le pamoate de tiamuline inhibe en outre les inducteurs spécifiques de la mastite chez le bétail et les petits ruminants comme il ressort des essais in vitro de dilution en série. Ces essais ont été effectués au moyen de plaques de microtitration à une concentration finale de 5 x 105 unités de colonies par ml. Les milieux utilisés sont le bouillon de culture de Mueller-Hinton (Difco) pour le Staph. autireus et le bouillon de culture de Todd- Hewitt (Oxoid) + 1% de sérum chevalin pour les streptocoques. Les résultats figurent dans le tableau II. - 4 - TABLEAU II Concentration inhibitrice minimale en uq/nl Nombre de Souche soucs exami32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0,063 0,032 0,016 Souche souches exami- nees S.aureus 44 5 36 3 Strepto- coques 8 2 6 Galt Autres strepto- coques 20 2 4 12 2 Le pamoate de tiamuline peut être utilisé par conséquent pour le traitement des mastites aiguës et chroniques provoquées par exemple par les streptocoques et les staphylocoques. On a également constaté que l'addition de pamoate de tia- muline dans la nourriture de base de différentes espèces animales, en particulier les volailles et les porcs, favorise la croissance des animaux. Le pamoate de tiamuline est donc approprié comme produit vétérinaire, en particulier comme agent antimicrobien et anti- parasitaire ainsi que comme agent favorisant la croissance. Pour la prophylaxie ou la thérapeutique d'infections microorganiques et d'infestations de parasites et pour favoriser la croissance chez les animaux domestiques, la dose à administrer dé- pendra évidemment de la taille et de l'âge de l'animal ainsi que de l'effet désiré; pour le traitement prophylactique et pour favoriser la croissance par exemple, on administrera des doses relativement faibles pendant une durée prolongée. Les doses thérapeutiques pré- férées dans les aliments sont de l'ordre de 40 ppm et plus, en par- ticulier comprises entre 40 et 400 g/tonne, spécialement entre 40 et 200 g/tonne. - 5 - Détermination des taux sanguins 1. Moyens et méthodes Les essais ont été effectués sur 4 porcelets sevrés dont le poids était compris entre 19,2 et 27 kg. Les animaux sont placés dans des cages individuelles pour examen du métabolisme, à une tem- pérature ambiante de 24t 1 C et sous une humidité relative de O 5%. La substance à essayer a été administrée au moyen d'une sonde gastrique à une dose de 50 mg/kg de poids corporel en suspen- sion dans 50 ml de H20. On a utilisé 20 ml d'eau pour rincer la sonde. La substance a été administrée le matin juste avant l'ali- mentation des animaux. 2. Technique de prise d'échantillons de sang et d'urine Des échantillons de 5 ml de sang ont été prélevés avant administration de la substance active (valeur zéro) et 0,5, 1, 2, 4, 8 et 24 heures après son administration, par ponction de la veine cave. Après avoir laissé reposer les échantillons pendant 2 heures à la température ambiante (+22 C), le sérum est séparé du sang par centrifugation (2000 tours par minute pendant 10 minutes) et conservé à -20 C jusqu'à l'examen. Grâce au système de cages in- dividuelles, on obtient des échantillons d'urine sans risques de contamination par les excréments ou les aliments. L'urine excrétée au cours de la période de prise d'échantillons est recueillie dans des béchers et refroidie dans des récipients en polystyrène conte- nant de la neige carbonique en poudre. On effectue les prises d'échantillons aux intervalles suivants: 0-2, 2-4, 4-8 et 8-24 heures après administration de la substance à essayer. Des échan- tillons d'urine sont également prélevés avant l'administration afin de déterminer une valeur zéro. - 6- 3. Détermination de la concentration de substance active dans le sérum et dans l'urine La détermination est effectuée par analyse microbiologique (essai de diffusion microagar; volumes des échantillons individuels = 20 Pl). Essai sur la souche de Staph. aureus ATCC 29067, limite de sensibilité dans cet essai: à 0,6 pg/ml. Pour déterminer la courbe d'étalonnage, on utilise du sérum ou de l'urine non traités provenant d'animaux non traités. On a déterminé à trois reprises la concentration de subs- tance active dans les échantillons pour chaque moment de prise d'échantillons et pour chaque animal et on en a établi la moyenne. Le pourcentage de la quantité excrétée de pamoate de tiamuline dans l'urine a été déterminée selon la formule suivante: concentration déterminée x quantité totale d'urine provenant de toutes les prises d'échantillons = quantité de substance. (Quantité de substance x 100): dose %. 4. Résultats La moyenne arithmétique (3 lectures de 3 plaques d'essai différentes) des concentrations de substance active dans les échan- tillons de sérum et d'urine, séparément pour chaque moment de prise d'échantillon et pour chaque animal, est indiquée respectivement dans les tableaux III et IV. L'évolution des taux sériques au cours de la période d'essai est représentée graphiquement sur le diagram- me 1 (valeurs moyennes pour 4 animaux par moment de prise d'échan- tillon y compris les limites de confiance). Après administration par voie orale du pamoate de tiamuline à la dose de 50 mg/kg, une concentration de substance active supérieure aux limites de détec- tion n'est observée chez les 4 animaux que 1 heure plus tard. Après 24 heures (dernier prélèvement d'échantillon), on observe encore une concentration de substance active proche de la limite de détec- tion de 0,6 pg chez 3 animaux sur 4. L'excrétion totale de la substance dans les urines au cours de la période de 24 heures était comprise entre 6,32 et 16,18 mg, c'est-à-dire 0,34 à 1,22 %. - 7 - TABLEAU III Taux sériques (pg/ml) après administration par voie orale de 50 mg/kg de pamoate de tiamuline à des porcelets sevrés Moment de détermination (en heures) 0,5 1,0 2,0 4,0 8,0 24,0 0,0 0,7 0,0 0,0 Eval Moyenne 0,2 Erreur stat. 0,3 Erreur type 0,2 sur la moyenne (ETM) Coefficient 200,0 de variation Moyenne + 0,5 erreur stat. - - -0,2 Moyenne ETM 0,3 - "- 0,0 0,7 0,7 1,3 0,7 uation 0,8 0,3 0,2 1,2 1,4 1,3 1,9 1,6 2,2 1,2 2,5 statistique 1,3 2,0 0,2 0,5 0,1 0,2 38,4 14,9 22,8 20,2 66,7 1,1 0,5 1,0 0,7 1,5 2,5 2,9 0,8 1,1 1,4 1,2 1,5 2,2 1,8 Animal n 2,2 2,2 2,1 3,2 2,4 0,5 0,2 0,7 0,7 0,7 0,0 0,5 0,3 0,2 1,9 2,7 2,1 0,2 0,7 0,3 - 8 - TABLEAU IV Concentration de substance active (en Va/ml! dans les échantillons d'urine recueillis après l'administration par voie orale de 50 mg/kg de pamoate de tiamuline à des porcelets sevrés Intervalle de prélèvement - r 2heur.s4 4-8 8-24 Quantité excrétée Pourcent 1,8 0>7 5,5 10,1 9,86 mg 0, 53 2,8 4,4 2,2 4,4 6,32 mg 0,34 8,9 0,0 6,0 7,6 8,70 mg 0,48 6,0 7,3 11,4 14,9 16;18 mg 1,22 Quantité d'urine (en ml) par animal/intervalle Poids Intervalle de prélèvement Dose totale de en neures pamoate de tia- en kg- 0-2 2-4 4-8 8-24 muline administrée 19)5 300 220 220 380 - 200 170 17867 g 1,841 g 1,807 g 17334 g Préparation du pamoate de tiamuline On dissout 2,45 g de tiamuline base dans un mélange compo- sé de 100 ml de dichlorométhane et de 50 ml d'acétone. A cette so- lution, on ajoute peu à peu sous agitation et à une température comprise entre 30 et 400C, 1 g d'acide embonique. Après clarifica- tion par filtration (si nécessaire), on concentre la solution par évaporation, on la reprend dans une quantité minimale de dichloro- méthane, on la dilue avec 150 ml d'un mélange à parts égales d'éther de pétrole (point d'ébullition = 40-60 C) et d'éther, on la traite avec des germes de cristaux et on la laisse cristalliser jusqu'au lendemain dans un réfrigérateur. Après essorage, on fait digérer le produit dans de l'éther diisopropylique et on le sèche jusqu'au lendemain sous vide à 80 C. Animal No. 2 Animal No. 3 - 9 - La courbe dérivée du spectre RMN du proton indique la stoechiométrie du sel. Spectre IR (KBr): 2960, 2920, 2860, 1720, 1635, 1560, 1505, 1445, 1380, 1280, 1230, 1110, 1010, 975, 950, 910, 825, 810, 755 cm-1. L'invention concerne également un additif alimentaire pour animaux comprenant du pamoate de tiamuline en association avec un diluant ou véhiculephysiologiquement acceptable. - 10 - REVENDICATIONS 1.-Le pamoate de tiamuline. 2.- Un procédé de préparation du pamoate de tiamuline, caractérisé en ce qu'on fait réagir la tiamuline base avec l'acide embonique dans un solvant inerte. 3.- Le pamoate de tiamuline pour l'utilisation comme pro- duit vétérinaire. 4.- Le pamoate de tiamuline pour l'utilisation comme agent antimicrobien. 5.- Le pamoate de tiamuline pour l'utilisation comme agent antiparasitaire. 6.- Le pamoate de tiamuline pour l'utilisation comme agent favorisant la croissance des animaux. 7.- Le pamoate de tiamuline pour l'utilisation comme agent favorisant la croissance du porc et des volailles. 8.- Une composition chimiothérapeutique, caractérisée en ce qu'elle contient le pamoate de tiamuline en association avec un diluant ou véhicule acceptable du point de vue chimiothérapeutique. 9.- Un additif alimentaire pour animaux, caractérisé en ce qu'il comprend du pamoate de tiamuline en association avec un di- luant ou véhicule physiologiquement acceptable. 10.- Le pamoate de tiamuline pour l'utilisation dans le traitement de la pneumonie enzootique du porc, des maladies respi- ratoires des volailles, de la coccidiose des volailles et des mas- tites aiguës et chroniques du bétail et des petits ruminants.