FR 2596415 A1 19871002 FR 8604352 A 19860326 La présente invention se rapporte à des réactions enzymatiques réalisées au sein de liquides organiques, c'est-à-dire à des opérations o un substrat donné, en solution ou dispersion dans un solvant organique, est soumis à l'action d'une enzyme. Elle s'applique aux différénts types de réactions qui peuvent être réalisées à l'aide d'enzymes, en particulier hydrolyse, dont celle de liaisons ester, transestérifications, interestérifications, synthèses d'esters ou thioesters, amidations, etc. Jusqu'à présent, les nombreuses réactions enzymatiques connues avaient lieu en milieu aqueux, mais lorsque le substrat à traiter est insoluble dans l'eau, comme c'est par exemple le cas des corps gras, il y aurait un intérêt évident à opérer dans un milieu capable de dissou15 dre ce substrat. Ainsi a-t-on proposé d'effectuer l'interestérification de matières grasses au sein de l'éther de pétrole qui les dissout (Demande de Brevet Européen 0064855), mais ce solvant est inflammable et déflagrant. Or, le choix du solvant est délicat, parce que celui-ci doit être 20 bien compatible avec l'enzyme, dont il ne doit pas entraver l'action. Récemment, on a trouvé que certains mélanges d'éthers et de cétones conviennent bien, notamment à l'hydrolyse de triglycérides (demande de brevet en France 06 388); un progrès net est ainsi réalisé, mais on reste encore dans le domaine de matières inflammables et ces mélanges conviennent mal à d'autres réactions, notamment aux estérifications. La présente invention est basée sur la découverte d'une classe de composés organiques qui, non seulement n'en30 travent pas l'action de nombreuses enzymes, mais peuvent même exalter leur action; ces composés sont ininflammables et inexplosibles et capables de dissoudre différentes substances hydrophobes, en particulier matières grasses. Ainsi, le procédé pour la réalisation de réac35 tions enzymatiques au sein de solvants organiques, suivant t* - i 2 l'invention, est-il caractérisé en ce qu'on emploie un ou plusieurs hydrocarbures fluorés ou halogénofluorés comprenant des halogènes autres que le fluor. Dans la suite de la présente description, dans le but de simplification, les liquides organiques, employés suivant l'invention, pour servir de milieu réactionnel à l'enzyme, sont appelés hydrocarbures fluorés,mais ce terme recouvre tant les composés seulement fluorés que ceux qui contiennent également d'autres halogènes, en par10 ticulier du C1 ou/et du Br. Nombreux hydrocarbures fluorés, aliphatiques et aryliques, conviennent à la réalisation de l'invention. Cependant, comme il est préférable d'employer des composés relativement peu visqueux, convenant aux températures modé15 rées auxquelles ont lieu les réactions enzymatiques, les dérivés fluorés préférés sont ceux des hydrocarbures en C1 à C8. Dans la classe des hydrocarbures fluorés aliphatiques les plus appropriés sont en C1 à C4, tandis que les aromatiques ont de préférence 5 à 8 C. Parmi les hydrocarbures fluorés aliphatiques, particulièrement utiles sont ceux qui correspondent à la formule générale, globale: CnHmFpXt o n est 1 à 8, m = 0 à n, p étant 1 à 18 et t = 0 à 16, X étant Cl ou Br ou pouvant comprendre à la fois des atomes de Cl et Br. - Des composés fluorés bouillant au-dessous de C, dont certains audessous de 00C, correspondent à la même formule globale pour n = 1 à 4, m = O à n, p = 1 à 4 et t = 0 à 6. Parmi les hydrocarbures fluorés, utilisables dans l'invention, se trouve le groupe connu sous la dénomination.de "Fréons" ou "Foranes", comprenant des liquides frigoriques. Même.ceux dont la température d'ébullition se situe au-dessous de 0"C peuvent servir à la réalisation de l'invention, à condition d'opérer sous pression, ce qui 35 peut être parfaitement viable. Un Tableau 1 de caractéris- tiques de quelques uns des solvants fluorés utilisables est donné plus loin à titre d'exemples non limitatifs. On peut citer également les composés tels que: fluorodichlorométhane, fluoro-dibromométhane, fluoro-dibromo5 éthane, fluoro-tétrabromométhane, fluoro-tétrachloroéthane, fluoro-tribromométhane, fluoro-trichloroéthane, fluorobromodichloroéthane, difluoro-chloro-1 éthane, difluorodibromo-1,1 éthane, difluoro-1,2 éthane, trifluorodibromo-1,2 éthane, etc. Le trichloro-fluorométhane CFCl3 et le trichlorotrifluoro-éthane CClF2-CFCl2 méritent une mention spéciale pour leur utilité dans l'invention. Parmi les dérivés fluorés aryliques on peut choisir par exemple parmi les fluorobenzène, fluorochloroben15 zènes, fluorotoluènes, difluoro-chlorotoluènes, etc. La plupart des composés fluorés, proposés suivant l'invention, présentent, en plus des avantages de non inflammabilité et non explosibilité, celui de l'absence de toxicité, qualité très importante pour les préparations 20 touchant à l'alimentation, la pharmacie ou la cosmétique. On trouvera plus loin le Tableau 2 donnant le seuil des concentrations tolérables pour l'homme par voie respiratoire, exprimés en ppm et en mg/m3; ce tableau compare les seuils de toxicité de 14 différents composés volatils 25 avec ceux du trichlorotrifluoroéthane, produit type selon l'invention; il s'avère que l'organisme animal peut tolérer 100 fois plus de cet hydrocarbure chloro-fluoré que de benzène ou de chloroforme. Suivant une variante de l'invention, l'hydrocar30 bure fluoré est employé en association avec un autre liquide, pour former un solvant mixte, présentant un meilleur pouvoir dissolvant vis-à-vis du substrat à traiter, une température d'ébullition convenable, une certaine capacité d'absorption de l'eau ou/et autre caractéristique physique 35 ou physicochimique améliorée par rapport aux composants du mélange pris séparément. TABLEAU 1 Caractéristiques des solvants fluorés 10 15 20 30 35 Formule "Fréons" ou "Foranes" n0 14 13 12 11 CF4 CF3C1 CF2C12 CFC13 CF2ClBr CF3Br CHClF2 CHF3 1 2B1 1 3B1 22 23 0EB Ca -128,0 - 81,4 - 29,8 + 23,8 - 4,0 - 57,8 - 40,8 - 82,1 - 78,2 - 38,7 + 3,8 + 47,6 + 92,8 - 24,7 Pression de vapeur à 30 Ci bar 7,4 1,3 3,3 18,2 11,9 11 2,50 0,54 CF3CF3 CClF2CF3 CC1F2CClF2 CClF2CFC12 CC12FCC12F CH3CHF2 116 115 114 113 112 152 CF3 (CF2) 5CF3 +101 a pression absolue 1 bar b seuil de pression pour maintenir le solvant à liquide l'état Echelle des toxicités comp Solvant Bromure de méthyle Tétrachlorure de carbone Chloroforme Benzène Ammoniac Perchloréthylène Trichloréthylène White spirit Chlorure de méthylène 15 Hexane Trichloro-1,1,1 éthane Butane Ethanol Trichlorotrifluoroéthane Dioxyde de carbone TABLEAU 2 arées de quelques solvants (1982) Seuil de concentration tolérable dans l'air ppm mg/m 35 50 50 335 270 100 100 350 800 1000 1000 5000 350 360 1900 1900 7600 9000 Ainsi peut-on avoir à utiliser un mélange d'un ou de plusieurs hydrocarbures fluorés avec des liquides comme hydrocarbures aliphatiques ou aryliques, alcools, 25 cétones, éthers, esters, etc. Par exemple, les composés fluorés cités plus haut, ou ceux du Tableau 2, peuvent-ils être pris en mélanges avec de l'éther de pétrole, de l'hexane, de l'octane, du benzène, du toluène, du dioxane, de l'acétone,de la méthyl-éthyl cétone, de l'isopropanol, de 30 l'acétate d'éthyle, etc., ces composés n'étant cités qu'à titre d'exemples non limitatifs. Selon la compatibilité des solvants mélangés la proportion de composé fluoré est en général de l'ordre de 20 à 95% en poids. Il est à noter que, grâce à l'ininflammabilité de nombreux composés fluorés, les mélanges susindiqués peu- vent gagner considérablement en sécurité, même s'ils contiennent des composés inflammables à vapeurs explosives. Bien que les composes fluorés suivant l'invention puissent être employés dans différents cas d'enzymes li5 bres, celles-ci étant dispersées dans le liquide organique, le domaine particulièrement intéressant de leurs applications est celui o l'enzyme est fixée sur un support.Cela concerne tant les systèmes d'enzymes sur support minéral, sur échangeurs d'ions ou polymères, que sur tissus natu10 rels, tels que mycellium, support c1llulosique de plante ou autre. Les hydrocarbures fluorés, appliqués selon l'invention, conviennent dans les différentes techniques enzymatiques connues, notamment en discontinu, en continu dans 15 des colonnes ou réacteurs, sur lit fluidisé et autres. Le domaine d'application de l'invention est très vaste, puisqu'en général les hydrocarbures fluorés peuvent être employés avec toutes sortes d'enzymes et substrats. Lorsque ces derniers sont hydrosolubles, cette application ne s'impose pas car il est en général économique de travailler en milieu aqueux. Par contre, l'invention prend beaucoup d'intérêt dans les traitements enzymatiques de produits insolubles ou peu solubles dans l'eau; c'est le cas notamment des graisses, huiles, cires, phospholipides, no25 tamment lécithines, stéroides, lipo-protéines, etc. Ainsi, l'invention s'appliquet-elle à toutes les classes d'enzymes, protéases, oxydases, hydrolases, notamment estérases, lipases, phosphatases, transférases, etc. Des applications industrielles fort intéressantes résident dans le traitement de corps gras par des lipases en vue de l'hydrolyse ou de la synthèse de liaisons ester, de l'interestérification ou de la transestérification de matières grasses. Il en est de même pour des liaisons thioester 35 ou amide. Les conditions de température et de concentration, généralement connues dans le domaine des réactions enzymatiques, s'appliquent de même à la présente invention. Ainsi, le plus souvent conviennent des températures de 10 à 80 C, et surtout 30 à 50 C. Dans le cas des estérifications d'acides gras, les concentrations préférées en acide se situent vers 0,05 à 1,5 M ou mieux de 0,1 à 1 mole par litre. Les exemples non limitatifs, qui suivent, illus10trent l'invention sur différents cas de réactions enzymatiques d'intérêt industriel. La plupart des essais ayant 'été effectués avec la lipase produite par le champignon Rhizopus arrhizus (ATCC 24 563), voici le mode de préparation de cette enzyme. Le Rhizopus est cultivé en fermenteur dans le milieu suivant: - huile de colza 20 g/l - "Corn Steep Liquor" 50 - KH2PO4 2 - KC1 0,5 - NaNO3 0,5 - MgSO4.7H20 0,5 Le pH initial est de 4,6. La croissance a lieu pendant 3-5 jours à 25-30 C. Le mycélium est alors essoré, lavé à l'eau 25 distillée, et séché, soit à l'étuve sous vide à température modérée, soit par lyophilisation. Le mycélium sec est dégraissé par extraction, puis broyé, tamisé et conservé au sec. L'activité lipasique du mycélium ainsi préparé se situe en30 tre 0,9 et 4 unités/mg (sur trioléine en émulsion). Les exemples 1 à 42 montrent diverses préparations utilisant la lipase préparée comme indiqué ci-dessus, sauf l'exemple 17 portant sur l'enzyme produite par Geotrichum Candidum cultivé de la même façon. Les exemples 35 29 à 42 donnent les résultats d'une série d'essais compara- tifs, montrant l'avantage des hydrocarbures fluorés sur divers autres liquides organiques, dans l'estérification d'acides gras. EXEMPLES 1 à 15 Estérification de l'acid_ oléique avec différents alcools au sein de trichlorotrifluoro-éthane Dans chaque cas on opère sur 10 ml de solution d'un alcool et d'acide oléique, dans du C12FC-CF2C1 (Fréon ou Forane 113), dans lequel on a dispersé 0,1 ou 0,2 g de 10 mycélium dévitalisé, anhydre, de Rhizopus arrhizus préparé comme indiqué plus haut, ainsi que respectivement 0,1 ou 0,2 g de tamis moléculaire, pour absorber l'eau formée par l'estérification. Ainsi, selon les cas, la proportion de mycélium est de 10 ou de 20 g par litre de milieu réaction15 nel; elle est égale à celle de tamis moléculaire. La réaction a lieu à 30 C pendant la durée indiquée pour chaque cas, au Tableau des résultats ci-après. Le Tableau indique les concentrations en alcool et en Ex. n acide oléique en Alcool moles/litre. Concentr.en mol/litre: alcool acide ol 1 2 3 4 5 6 7 " 30 8 *. 9 10 1 1 12 35 13 14 15 méthanol éthanol II octanol 0,1 0,1 0,1 0,1 0,5 0,1 0,5 0,1 0,5 0,5 l i Il ni g de Durée mycélium h par 1 2,5 3 2,5 3 2,5 3 20 3 I. Il Conversion % de l'acide 86 62 91 70 83 73 76 76 83 75 79 77 78 67 62 butanol 1 alcool cinnamique " iso-amylique" " octa-décanol " " hexadécanol " " oléique " décanol-1 " propanol-1 " glycérol " I Il I '! I' II I' Il Il apparatt que la conversion est plus élevée pour des concentrations plus faibles, 0,1 mol/1, même après des temps un peu plus courts et avec moins de mycelium, que pour des concentrations de 1 mol/l. Toujours est-il que le procédé de l'invention permet de réaliser des estérifications de 62 à 91% de l'acide avec divers alcools, ce qui constitue un résultat industriel très intéressant. EXEMPLE 16 On opère comme dans les exemples 7 à 14 avec de l'isopropanol en tant qu'alcool et de l'acide myristique à la place de l'acide oléique. La conversion de l'acide est de 12%. EXEMPLE 17 Dans l'exemple 16 le mycélium de Rhizopus est remplacé par celui de Geotrichum candidum. La conversion de l'acide gras ressort à 7,6%. EXEMPLES 18 à 20 En procédant comme dans les exemples 1, 3 et 5 (concentrations 0,1 M, durée 2h 1/2) on a remplacé le Fréon ou Forane 113 par du Fréon ou Forane 11, c'est-à-dire du trichloro-fluoro-méthane CFCl3. Les conversions de l'acide oléique ont alors été: avec de l'octanol.......... 85,4% 25 " du décanol............ 88,3 " de l'octadécanol...... 86,9 EXEMPLE 21 Estérification en continu Le réacteur est constitué de deux colonnes conte30 nant chacune 5,5 g d'un mycélium de Rhizopus arrhizus dévitalisé pour 10 ml de silice, séparées par une colonne de tamis moléculaire servant de desséchant. Le volume mort des colonnes remplies de mycélium est de l'ordre de 15 ml pour un débit de l'ordre de 12 ml/h, ce 35 qui correspond à un temps de séjour de 75mn par colonne. Le mélange réactionnel a la composition: acide oléique 0,5 M/l, octanol 0,5 M/l, solvant trichlorotrifluoroéthane. Le taux de conversion de l'acide oléique set de 96,3% en continu. EXEMPLES 22 et 23 Thioestérification Le mode opératoire est le même qu'à l'exemple 15, c'est-à-dire comme pour les exemples 6 à 14, mais durant 18 heures, les alcools étant remplacés par des mercaptans. 10 On obtient alors les taux de conversion de l'acide oléique suivants: Ex. 22: avec du butane-thiol............. 24% Ex. 23: avec de l'hexane-thiol........... 23%. EXEMPLE 24 Transestérification Le mélange réactionnel est constitué de 10 ml de trichlorotrifluoroéthane (Fréon ou Forane 113) contenant 1 g de suif et 1 g d'acide laurique. A ce mélange on ajoute 0,2 g de mycélium de R.arrhizus et 20 on place sous agitation à 30 C pendant 20 heures. Après séparation du mycélium, le mélange est isolé et analysé par chromatographie gazeuse des dérivés triméthylsilyl des acides gras. La proportion d'acides gras libérés du suif par transesté25 rification est de 44,1%. EXEMPLES 25 à 27 Amidation : - e Le mode opératoire est de même que dans les exemples 6 à 14, plus haut, l'alcool y étant remplacé par des amines, soit 1 mol d'amine avec 0,5 mol d'acide oléique par litre; 20 g de mycélium enzymatique par litre et autant de tamis moléculaire. Le liqu'ide fluoré est le Cl2FC-CF2Cl. Les conversions de l'acide oléique sont: - Exemple 25: avec la dodécylamine............ 81% " 26: " l'éthanolamine............ 28 " 27: " l'hexaméthylène-diamine..... 14 1 1 EXEMPLE 28 Méthanolyse en continu Le réacteur est constitué par une colonne contenant 5,6 g de mycélium préparé comme précédemment et 10 ml de silice. La température est de 30 C et le temps de séjour de 75 mn. Le mélange réactionnel comprend du trichlorotrifluoroéthane (Fréon ou Forane 113), contenant en poids du mélange 11,4% de suif raffiné, 2,5% de méthanol et 86,1% de ce composé 10 fluoré. En régime continu, le taux d'acides gras libérés, sous la forme d'esters méthyliques,atteint 7,9%. EXEMPLES 29 à 42 Estérification avec différents solvants Aux fins de comparaison l'estérification du n-octanol par de l'acide oléique est effectuéedans les mêmes conditions, avec une série de différents solvants de cet acide gras. Les conditions sont celles des exemples 1, 3 et 5, c'est-à-dire teneurs par litre 0,1 mole pour l'acide 20 comme pour l'alcool, 10 g de mycélium R.arrhizus et 10 g de tamis moléculaire; 30 C, durée 2h30. Voici les conversions % d'acide oléique trouvées. Exemple Solvant Conversion % n 29 Trichloro-trifluoro-éthane(F113) 83 30 Trichloro-fluoro-mréthane (F11) 85,4 31 Tétrachloro-difluoro-éthane(F112) 85 32 Perfluoroheptane 81 33 Diphényléther 76 34 Phtalate de dibutyle 68 35 Méthyl-t-butyl-éther 56,6 36 Diméthoxy-propane 44,9 37 Phosphate de tributyle 44,2 38 1,2-diéthoxy-éthane 19,4 39 Dioxane 11,3 40 Méthyloctyl cétone 0 41 Diméthyl-formamide 0 42 Diméthyo-sulfoxyde 0 On peut voir que les hydrocarbures fluorés des exemples 29-32 donnent des résultats bien meilleurs que les autres solvants. Certains solvants (exemples 40-42) ne permettent pas du tout de réaliser l'estérification. Revendications 1. Procédé pour réaliser une réaction enzymatique, le substrat traité se trouvant au sein d'un liquide organique, caractérisé en ce que ce liquide est un hydrocarbure fluoré pouvant renfermer des halogènes autres que le fluor. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'hydrocarbure fluoré est aliphatique, pouvant renfermer des atomes Cl ou/et Br. 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que l'hydrocarbure fluoré répond à la composi10 tion générale CnHmFpXt o n est 1 à 8, m = 0 à n, p est 1 à 18 et t 0 à 16, X étant Cl ou Br ou pouvant comprendre à la fois des atomes de Cl et Br. 4. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que le composé fluoro bout au-dessous de 100 C 15 et, dans sa formule, n est 1 à 4, m = 0 à n, p = 1 à 4 et t = 0 à 6. 5. Procédé suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'hydrocarbure fluoré est le trichlorofluoro-méthane ou le trichloro-trifluoro-éthane. 20 6. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'hydrocarbure fluoré est arylique, en particulier en C5 à C8. 7. Procédé suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'hydrocarbure fluoré est 25 employé en mélange avec un autre liquide organique, en particulier hydrocarbure, alcool, ester, éther ou cétone, de préférence à raison de 20 à 95% en poids de composé fluoré dans le mélange. 8. Application du procédé suivant une des reven30 dications précédentes à diverses réactions enzymatiques, utilisant en particulier des hydrolases, oxydases, phosphatases, protéases, transférases, estérases, notamment lipases, caractérisée en ce que l'enzyme est immobilisée et en suspension dans l'hydrocarbure fluoré, le substrat étant dissous ou dispersé dans ce liquide. 9. Application suivant la revendication 8, caractérisée en ce que la réaction enzymatique porte sur une matière grasse en solution dans l'hydrocarbure fluoré.