FR 2585722 A1 19870206 FR 8511714 A 19850731 Les cultures primaires d'hépatocytes pris direc- tement à partir de foies normaux et intacts, représentent une approche attirante pour l'étude des fonctions hépatocellulaires spécifiques chez l'animal ou chez l'homme. Les hépatocytes du rat adultes, ou plus récemment de l'homme, peuvent être isolés facilement par des méthodes de perfusion du foie. Les cellules isolées doivent s'attacher dans le but de survivre pen- dant plus de quelques heures. Dans des conditions de culture conventionnelles, les cellules peuvent survivre pendant au maximum 1 à 2 semaines, mais elles perdent rapidement leurs fonctions hautement différenciées(Ref.1) par exemple: (a) la sécrétion de protéines sériques, incluant l'albumine, la transferrine, la glycoprotéine acide a1 et la globuline; (b) les biotransformatiQns complètes de médicaments et autres xenobiotiques en métabolites hydrosolubles par formation de sels biliaires; (c) les formes iso-enzymes adultes; (d) la réponse enzymatique à des hormones spécifiques; (e) les récepteurs membranaires spécifique pour la reconnaissance des protéines extracellulaires telles que les asialo- glycoprotéines. Par conséquent, la régulation des fonctions hépatiques, en particulier les activités enzymatiques, ne peut pas être étudiée pendant plus de quelques jours dans un système conventionnel de culture. Dans le but d'améliorer le maintien en cul- ture du phénotype des hépatocytes normaux, différentes approches ont été considérées. L'alimentation sélective du milieu en suppléments tels que les hormones (insuline, glucagon, glycocorticoides...) et tels que des facteurs de croissance, ont certains effets sur la viabilité et les fonctions des hépatocytes. Les composés de la matrice extracellulaire ont aussi été examines. La fixation cellulaire et la survivance ont été améliorées en étalant les cellules sur différents collagènes (Ref.2), de la fibronectine (Ref.3), sur une biomatrice connective du foie (Ref.4), sur un matériau extra- cellulaire secrété par les cellules endothéliales de cornée de boeuf (Ref. 5) ainsi que sur des fibroblastes (Ref.6), des cellules embryonnaires (Ref.7), ou des cellules endothéliales sinusoidales homologues (Ref.8). Cependant, indépendemment des conditions de culture, les changements phénotypiques des hépatocytes ont con- duit à une perte partielle ou complète des fonctions hautement différenciées après plusieurs jours de culture. La présente invention concerne un procédé de culture des hépatocytes, permettant de maintenir l'intégralité de leurs fonctions spécifiques, caracté- risé en ce que lesdits hépatocytes sont mis en co-culture avec des cellules de foie de type épithélial dont les capacités de division ont été définitivement inhibées par un traitement approprié. Il peut s'agir d'un traitement physique, tel que l'irra- diation ou la chaleur: en particulier, les radiations gamma peuvent être utilisées. Il peut s'agir d'un traitement chimique: des drogues antimitotiques peuvent être utilisées à ce titre, et en particulier, la mitomycine C. En effet, des observations récentes (Ref.8-12) ont démontré que les hépatocytes de rat ou d'homme mis en culture con- jointement avec une lignée cellulaire épithéliale de foie de rat, probablement dérivée de cellules de canalicules biliaires, maintien- nent, pendant plusieurs jours et à un niveau important, les fonctions hépatiques spécifiques, telles que la sécrétion de l'albumine ou la mrtabolisation de médicanents pardes voies variées typiques du processus de biotransformation. Une caractéristique importante du système de co-culture est sa grande spécificité, puisque les cellules épithéliales doivent avoir une origine hépa- tique (probablement issues du canal de Hering) et ne pourraient pas être remplacées par un milieu condition- né ou par un extrait cellulaire (13). Ce système n'est pas spécifique de l'espèce, puisque des résultats comparables sont obtenus lorsque des hépatocytes hu- mains sont mis en culture conjointement avec les cel- lules épithéliales de foie de rat (Ref.10), et ce système est corticostérolde-dépendant (Ref.14,15). Néanmoins, ce système présente un problème majeur qui est la lignée cellulaire épithéliale elle- même. Cette lignée cellulaire dérive d'un foie de rat nouveau-né, et est obtenue après une digestion du foie par la trypsine. Sous certaines conditions, cer- taines cellules se divisent, forment des colonies et peuvent être repiquées. Les cellules se développent lentement en culture. Cependant, après plusieurs passages, elles subissent une transformation progres- sive et présentent des caractéristiques de cellules cancéreuses. Les cellules épithéliales transformées de rat perdent leurs propriétés et avantages de co-culture sur les hépatocytes (Ref.13). C'est pourquoi, la présente invention concerne une méthodologie originale qui permet tous les avantages du système de co-culture mais utilise des cellules épithéliales transformées (à des degrés variés) disponibles commercialement à l'A.T.C.C. ou d'autres collections. De toutes les cellules de foie de type épithélial, les oellules de foie Chang ont été sélectionnées pour leurs caractéristiques de croissance: division rapide, croissance en monocouche, fixation oellulaire, etc.... Pour prévenir leurmultiplication, néfaste aux avantages de co-culture, les cellules de foie Chang ont été soumises à des radiations gamma et/ou à des drogues antimitotiques. Ce traitement spécial a permis de maintenir les cellules dans un état de non croissance et de les cultiver conjointement avec des hépatocytes de rat. De la m&oe façon, les cellules de foie Chang peuvent être cultivées conjointement avec des hépatocytes humains. Le procédé de co-culture selon la présente invention, comprend les étapes suivantes: (a) Préparation des milieux de cultures - milieu de culture des cellules de type épithélial, ou milieu épithélial, - milieu de culture des hépatocytes de rat. (b) Culture des cellules de foie Chang. (c) Préparation des cellules de foie Chang pour les expériences de coculture (d) Isolement des hépatocytes de rat. (e) Mono-culture des hépatocytes de rat (étape à visée comparative). (f) Co-culture des hépatocytes de rat avec les cellules de Chang. Les abréviations suivantes seront utilisées au cours de la description: HEPES = Acide 4-2-hydroxyéthyl-1-pipérazine-éthane sulfonique EG = Acide éthylère-glycol-bis- (-aminoéthyléther)-tétra acétique FCS = sérum de foetus de veau (inactivé par la chaleur à 56 C pendant 30 minutes). Les origines des différents matériaux utilisées sont répertoriées dans le tableau suivant: MATERIAUX ORIGINE Poudre du Milieu, Sérum, Laboratoires GIBCO Solution Trypine-EDTA, (Grand Island, N.Y.) antibiotiques. Solution de collagène Laboratoires FLOW (vitrogen 100). Produits chimiques, Sigma Chemical Co. insuline de boeuf, (St Louis, Mo) albumine de rat, mitomycine-C. ____________________________________________________________ Hemisuccinate d'hydrocortisone Roussel (Paris, France) Collagénase type IV Boehringer (Mannheim, FRG) Flacons de culture tissulaire Falcon (Becton Dickinson, Oxnard, Ca) ___________________________________________________________ Boîte de Petri en plastique Labo Miles (20cm) (Naperville, I1.) (Lux Contur) Boites Petriperm perméables Heraeus aux gaz (20cm2) (Hanau, FRG) (a) Les milieux de culture Le milieu épithélial a été constitué à par- tir d'un milieu minimum essentiel (sel Earl) contenant mM de NaHCO3, 20 mM de Hepes, 2 mM de glutamine, 100 gg/ml de streptomycine, 100 U/ml de penicilline et additionné de 1% d'une solution d'acides aminés non essentiels et de 10% de sérum de foetus de veau inacti- vé par la chaleur (FCS). Le milieu pour la culture des hépatocytes de rat (DE milieu) a consisté en un milieu de Dulbecco modifié par Eagle contenant 40 mM de NaHC03, 20 rM de Hepes, 4 mM de glutamine, 20 mM de glucose, 100.g/ml de strep- tomycine, 100 U/ml de pénicilline. Ce milieu a été additionné de 10% de FCS, 10 gg/ml d'insuline et 5x10-5 M d'hémisuccinate d'hydrocortisone (milieu de mono-culture) ou 3,5x106 M d'hémisuccinate d'hydro- cortisone (milieu de co-culture). (b) La culture des cellules de foie Chang: La lignée cellulaire hépatique Chang a été établie à partir de foie humain non malin en 1954 par R.S. Chang (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 87, 440, 1954) et a été soumise a l'A. T.C.C. sous le Nu ATCC CCL13. La lignée consiste en cellules de foie de type épithélial croissant en monocouche, Les cellules ont été cultivées à 37 C dans une atmosphère saturée en eau sous le rapport CO2/air (10:90, v/v) dans des flacons de culture tissulaire en plastique de 175 cm2 (T175) , et le milieu épithélial a été renouvelé 3 fois par semaine. Les cultures ont été repiquées dès confluence cellulaire tous les 7-9 jours. Les cultures repiquées ont été préparées par trypsinisation des monocouches de cellules, avec un mélange trypsine-EDTA comprenant 0,05% (poids/ volume) de trypsine et 0,02% (poids/volume) d'EDTA. Pour ce faire, le milieu de la culture a été enlevé, les cellules lavées avec une solution saline contenant le tanmpon de phosphate mM, pH 7,4 et incubées 10 minutes à 37 avec la solution trypsine-EDTA. Les cellules ont été remises en suspen- sion dans le milieu épithélial, et les agregats cellulai- res ont été décomposés par prélèvement vigoureux et répété à la pipette de la suspension cellulaire. La suspension cellulaire a été déposée dans de nouveaux flacons avec un rapport de repiquage de 1: 10. (c) Préparation des cellules de foie Chang pour les expériences de coculture Préalablement à la co-culture avec les hépatocytes de rat, les cellules de foie Chang ont été soumises à l'irradiation, aux antimitotiques (exemple mitomycine C) ou aux deux, dans le but d'inhiber leur prolifération et de les conserver en monocouche. Les cellules confluentes ont été remises en suspension par traitement de trvpsine-EDTA ainsi que décrit pour le repiquage. Les cellules ont été diluées avec du milieu épithélial, centrifugées 5 mi- nutes à 400xg et remises en suspension dans le milieu de co-culture. Après comptage, le nombre de cellules a été ajusté à 5 x 106 cellules/ml avec le même milieu. Les tubes contenant 2 ml de cette suspen- sion cellulaire ont été irradiés par une source de Cesium 237 à une dose variant entre 1.000 à 4.000 rads. Pour le traitement cellulaire avec les antimitotiques, 2 ml de la suspension cellulaire (107 cellules au total) ont été transférés dans des tubes de 15 ml et mélangés avec la mitomycine-C (Sigma) et le milieu de co-culture, pour obtenir une concentra- tion de 5 A 15 gg de médicament/ml darns un volume total de 5 ml par tube. La concentration finale de cellules a été ajustée à 2x1o6 par ml. Le mélange a été incubé minutes à 37 C avec des agitations fréquentes. Dans le cas d'un traitement mixte, les cel- lules ont été successivement irradiées à une dose de 500 ou 1000 rads et incubées avec 5 gg de mitomycine-C/ ml ainsi que décrit-ci-dessus. Apres chaque traitement, les cellules ont été lavées une fois dans le milieu et cultivées pendant 24 heures dans des flacons T 175 (un flacon par tube) avec le milieu de co-culture. Une heure avant la co-culture avec les hépa- tocytes de rat, les cellules ont été remises en suspen- sion dans le milieu de co-culture après trypsination et comptées dans un hémocytomètre. Le nombre de cellules via- bles a été déterminé par le test d'exclusion du bleu trypan. Les cellules ont été diluées dans le même milieu pour obtenir 0,6x10 cellules vivantes/ml. (d) Isolement des hépatocytes de rat Les hépatocytes de rat ont été isolés à partir de rats Wistar de 250 g par perfusion du foie avec une solution de collagénase, ainsi que décrit par Limet et al. (Eur. J. Biochem, 1982, 125, 437-443). Brièvement, le foie a été d'abord perfuséavec 300 ml d'une solution tampon née de Hanks ne contenant pas d'ions Ca2, additionnéede 0,5 nM EGTA, à un débit de ml/min et oxygénéede façon continue avec un mélange de 02/C02 (95:5;v/v). Le foie a alors été perfusé avec 300 ml de la solution de Hanks additionnée de 2,5 mM de calcium, mg de collagénase type IV (Boehringer, Mannheim, FRG) sous oxygénation. Après 30 minutes, les cellules ont été davantage dissociées pendant 15 minutes dans 100 ml de 0,1% (p/v) de collagénase dans la solution de Hanks à 37 C Bous oxygénation. La suspension cellulaire a été filtrée à travers des fil- tres de perlon successifs de taille de pore 100 Nm, 63 gm et 28 Nm, puis a été laissée sédimenter pendant 20 minutes sur de la glace. Après avoir éliminé le surnageant contenant les débris cellulaires ainsi-que les cellules sanguines et sinusoïdales, le culot a été lavé 3 fois par centrifugation 2 minutes à 50xg avec le milieu de culture complet (milieu DE additionné de % FCS) refroidi dans de la glace. La viabilité des cellules a été estimée par le test d'exclusion du bleu trypan sous microscopie par contraste de phase. Après comptage, les hépatocytes ont été mis en suspension à 106 cellules/ml dans le milieu de cul- ture complet. (e) Les hépatocytes de rat en mono-culture Pour les cultures conventionnelles (mono- cultures), les hépatocytes de rat ont été étalés dans des boîtes de Petriperm de 20 cm2 ou des boîtes de Petri en plastique, recouvertes de collagène, à une densité de 3-3,3x10 cellules par botte. Cette couverture a été obtenue en incubant les boites de Petriperm pen- dant 16 heures à 37 avec 2,5 ml de collagène de peau de veau soluble (Vitrogen 100) à 15 gg/ml dans unesolution saline tanponnée de phosphate 10 iM pH 7,4 et en les lavant posté- rieurement avec le même tampon. Pour les bottes en plas- tiques, 0,5 ml de solution de collagène (60 gg/ml dans une solution saline de HCl 0,013 "1 ont éte versées dans chaque boite, laissés sécher pendant la nuit à 37 C et rincés avec du milieu de culture une heure avant l'u' lisation. Les cellules ont été cultivées à 37 C dans une atmosphère saturée en eau sous le rapport C02/air (10:90; p/v). Après 3-4 heures, le temps néces- saire pour la fixation cellulaire, le milieu a été écarté (avec les cellules non attachées ou mortes) et remplacé par 2,5 ml de milieu mono-culture par boite. Pendant les heures suivantes, les hépatocytes ont continué de s'agréger pour former, après 20 heures, une monocouche avec des travées de type hépatique et des canalicules biliaires ainsi que l'a montré l'examen sous microscopie à contraste de phase et lumière. Le milieu de culture a été renouvelé quotidiennement et conservé congelé pour les analyses suivantes. (f) Les hépatocytes de rat en co-culture avec les cel- lules de foie Chang Pour la co-culture, 1,8 à 2x10 6 cellules parenc] mateuses isolées ont été ensemencées dans les mêmes conditions que les cultures conventionnelles. Apres 4 heures, le milieu a été remplacé par 1,5x106 cellules épithéliales de foie Chang (irradiées et/ou traitées par la mitomycine C) suspendues dans 2,5 ml du milieu de co-culture. Les hépatocytes ont continué de s'agréger, de s'étendre et de former des cordons de cellules pendant que les cellules épithéliales ont occupé toutes les surfaces libres. Les hépatocytes de rat ont été cultivés dans les mêmes conditions que pour les mono-cultures. En conclusion, dans les conditions de cul- ture conventionnelle, les hépatocytes ne survivent pas ti- hy- 2585722. pendant plus de deux semaines et perdent leur fonctions hautement différenciées. Les associations en co-culture des hépatocytes avec un autre type cellulaire de foie probablement dérivé des cellules de canalicules biliai- res, maintiennent à des forts pourcentages les fonc- tions différenciées des hépatocytes. L'association des hépatocytes avec une lignée cellulaire de type épi- thélial de foie humain, transformée lors de nombreux passages,mais soumise à un traitement spécial, donne une amélioration identique du maintien des activités spécifiques des hépatocytes. Ce système de co- culture original permettra des études scientifiques particu- lières telles que la physiologie hépatique, la toxicité des drogues et la carcinogénèse hépatique ou permettra la préparation d'un produit particulier tel qu'un sys- tème de culture in vitro pour des microorganismes(para- sites protozoaires ou virus). Ce système de co-culture pourrait aussi ser- vir de moyen de diagnostic. Enfin, ces co-cultures peuvent être conser- vées dans des conditions connues de l'homme du métier, telles que le froid, et sont ainsi, par conséquent, di- rectement utilisables. Ce système de co-culture peut être étendu à des hépatocytes humains. Les avantages et particularités du procédé selon la présente invention sont étudiés plus en détail dans les exemples suivants. EXEMPLE 1 Maintien des caractéristiques morphologiques et de la survivance cellulaire Toutes les perfusions de foie de rat ont produit des cultures réussies et ont donné des résultats similaires dans les cultures conventionnelles et mélan- gées. Une viabilité de 85 à 95% a été obtenue usuelle- ment par la technique de la dissociation à la colla- génase in situ. Toutes les observations morphologiques ont été faites sur des préparations vivantes sous microscopie à contraste de phase ou sur des cellules colorées à l'hématoxyline-éosine par microscopie lumineuse. En moins de trois heures, les hépatocytes isolés ont été attachés au substrat, ont été agrégés, et ont formé des monocouches de cellules. Les cellules ont adhéré, se sont disséminées et ont été cultivées de façon aussi efficace mais pendant plus longtemps sur des membranes en plastique que sur des membranes perméables au gaz (bottes Petriperm) à partir desquel- les le détachement cellulaire peut arriver après trois semaines de culture. Les concentrations d'hémisuccinate d'hydrocortisone,ajouté de façon routinière aux cultu- res conventionnelles et aux co-cultures, ont donné une survivance cellulaire maximum et une synthèse d'albumine maximum. Dans les expériences de co-culture, la concentration cellulaire la plus satisfaisante a été de 1,8x106 hépatocytes et de 1,5x106 cellules de foie Chang pour 20cm2de boîte de Petri. Dans les conditions de culture conven- tionnelle, la survie des hépatocytes n'a pas excédé 12 jours avec un milieu de culture complet et 20 jours avec un milieu de mono-culture (milieu contenant des hormones), bien que dans certaines pré- parations, certains cordons hépatocytaires développés autour de cellules contaminantes peuvent survivre plus longtemps. Les hépatocytes ont gardé leur structure typique, par exemple des cellules bien individualisées et polyédriques, avec un ou deux petits noyaux réfri- gérents, pendant seulement 5 & 6 jours. Plus tard, ils ont dégénérés progressivement, pour ne former que des cellules de taille plus petite avec un large noyau et de nombreuses cellules multinucléées, puis ont dis- paru complètement après deux à trois semaines. Quand les hépatocytes ont été cultivés en présence des cellules de foie Chang traitées (par les trois procédures), après ensemencement, une monocouche cellu- laire confluente a été observée en moins de 24 heures. Les cellules épithéliales ont occupé les espaces libres entre les trabécules des hépatocytes et ont établi des contacts étroits avec ces dernières. Pendant plu- sieurs semaines (au moins quatre), les hépatocytes ont été organisés en trabécules ou en petits îlots, et ontmaintenu leur morphologie typique cuboidale polyé- drique contenant 1 ou 2 petits noyaux ronds et réfri- gérents incluant un nucléole dense, et un cytoplasme granulaire. Les canalicules biliaires ont été présents dans toutes les trabécules entre les hépatocytes. Les goutelettes lipidiques ont été aussi trouvées et leur nombre a augmenté avec l'âge. Ce phénomène a été réver- sible lorsque le milieu a été renouvelé deux fois pendant une semaine au lieu de quotidiennement Les hépatocytes en co-culture ont été généralement bien visibles mais des cellules mortes, des précipités de protéines sériques et des cellules de foie Chang détachées peuvent apparaître en superficie après une semaine de culture. Cet inconvénient peut être surmonté si des précautions spéciales ont été prises pendant l'iso]ement des hépa- tocytes (décantation après filtration cellulaire pour enlever les fibroblastes et autres cellules contami- nantes) et les cultures cellulaires (filtration de FCS, agitation de chaque botte ou lavage soigneux préalable- ment à l'alimentation pour enlever les débris cellu- laires, alimentation du milieu à 37 C et réduction de la fréquence d'alimentation à deux fois par semaine). Les meilleurs essais comparatifs des cellules de foie Chang, sur les hépatocytes de rat en culture, ont été obtenus lorsque les cellules épithéliales hu- maines ont été soumises aux conditions suivantes: 1 irradiation à une dose de 3000 rads(I) 2 incubation avec la mitomycine C à une concentration finale de 10 ig de médicaments/ml de milieu de co-culture (II), 3 irradiation à une dose de 500 rads suivie par une incubation avec 5 gg de mitomycine C/ml (III). Ces conditions ont garanti le maintien des hépatocytes sains pendant au moins 4 semaines. Pour une période de culture plus longue, il est parfois nécessaire, après trois à quatre semaines de culture, d'additionner des cellules de foie Chang traitées fraîchement (pour les conditions I et II) ainsi que décrit préalablement mais à une densité plus basse (106 cellules/boite), pour recouvrir l'espace, entre les hépatocytes, laissé libre par les cellules épithé- liales mortes. L'aspect morphologique des cellules de foie Chang, irradiées (condition I) ou soumises à un traite- ment mixte (condition III) a changé de façon drastique pendant la coculture. Les cellules sont devenues larges avec deux noyaux ou plus pendant que le nombre de cellu- les a diminué avec le temps de culture. Moins de 30% des cellules initialement ajoutées aux hépatocytes sont restées présentes dans la culture après trois semaines. Lorsque les cellules de foie Chang ont été traitées par la mitomycine C, les cellules ont gardé un aspect plus similaire aux cellules non traitées et environ 20% des cellules sont restées viables trois semaines après l'étalement. Si les cellules de foie normales Chang ont été ajoutées aux hépatocytes, les cellules ont grandi de façon continue pour recouvrir finalement toutes les trabécules hépatocytaires après 7 jours. Des eifets similaires ont été fréquemment observés lorsque les cellules épithéliales ont été irradiées à des doses égales ou inférieures 2.500 rads ou à des concentra- tions en mitomycine-C inférieures i 8 gg/mlo EXEMPLE 2 Maintien de la sécrétion d'albumine et de transferrine actives 1) ESSAIS La quantité d'albumine et de transferrine, sécrétées par les hépatocytes dans le milieua été dé- terminée par immunonéphélométrie en utilisant un système auto-analyseur ABBOTT (Wiesbaden-Delkenheim, FRG). Les solutions standards d'albumine et de transfer- rine de rat et des milieux de culture ont été mélangésavec Ses dilutions appropriées d'anticorps de lapin anti- albumine de rat et anti-transferrine de rat dans un tampon phosphate de 0, 1 M contenant 4% de polyéthylène glycole-6000 et ont été incubés à 25 C pendant 12 minu- tes pour l'albumine et 30 minutes pour la transferrine avant une mesure par diffusion lumineuse. Les anticorps spécifiques étaient de la Corporation USB (Cleveland, Ohio). Les limite inférieure de sensibilité de l'essai a été de 2 à 3 zg d'albumine ou de transferrine par ml. 2) RESULTATS Lorsque les hépatocytes de rat adulte ont été cultivés dans les conditions conventionnelles avec un milieu complet, la sécrétion maximale d'albumine a été atteinte le jour suivant!'étaleent. Par la suite, la moyenne de sécrttorn a minu rapidement pour atteindre au jour 4 une raoy nne!u ese jusqu'à ce que les hépatocytes aiargn disparu la culture (environ 10 jours). Un crofil l.it re a la cr- tion de la transferrine a -t czer-vt c la différen- ce que la moyenne y restait extr me ent Casse. Les taux de sécrétion d'albumine et de transferrine ont été si- milaires indépendamment du fait que les h tpatocytes ont été étalés sur boite de Petri en plastique ou sur boite de Petriperm recouvertes de collaeene. Quand les hêpatocytes ont été cultivés avec un milieu de mono-culture, les sécrétions en albumine et transferrine ont été maintenues à un haut niveau pendant plus de 10 jours, puis la sécrétion a décliné progressivement et est restée stable jusqu'à la mort des hépatocytes environ au 18ème jour. La sécrétion d'albumine et de trans- ferrine a été parfois observée après deux semaines. * Dans ces préparations, peu d'hépatocytes sains ont pu être observés, encadrés par des cellules de type épi- thélial poussant abondamment en clones. Ces sécrétions de protéines peuvent être produites seulement par les hépatocytes ou en association avec les.autres cellules contaminantes qui se développent et sont connues pour être capables d'exprimer certaines fonctions hépatiques telles que les pro - ductions de protéines plasmatiques (ref. 16). En co-culture, la sécrétion optimale d'albu- mine a été obtenue après plusieurs jours de culture et atteint des niveaux plus élevés que ceux observes dans les cultures conventionnelles. Les moyennes de l'ordre de 25 Fg à 75 gg de protéines sécrétées par 106 hépato- cytes en 24 heures de culture (10 gg à 25 gg de protéi- nes/106 hépatocytes en 24 heures dans des cultures con- ventionnelles). Des vagues périodiques de sécrétion croissante de protéines ont été observées. Le taux de sécrétion tendait à décliner progressivement après 6 semaines de culture. Un profil similaire dans la sécré- tion de la transferrine a été observé. Aucun changement significatif n'a été observé quelles que soient les conditions de préparation des cellules de foie Chang. On a trouvé que ni l'albumine ni la transferrine n'ont été sécrétées dans le milieu de culture pure de cel- lules de foie Chang (traitées ou pas) pendant deux semaines de culture. EXEMPLE 3 Sécrétion des enzymes solubles et de l'urée en tant qu'indicateurs de laviabilité des hépatocytes 1) ESSAI Les enzymes solubles du cytosol tels que la lactate déhydrogénase (LDH), la gamma glutamyle transpep- tidase (gamma-GT), la glutamyle oxaloacétate transami- nase (GOT) et la glutamyle pyruvate transaminase (GPT), et l'urée présentes dans le milieu ont été déterminés en utilisant les kits de diagnostic spécifiques ABBOTT. 2) RESULTATS Le test utilisé pour la sécrétion des enzymes solubles présents dans le cytoplasme et en conséquence libérés à la mort des cellules, n'a pas été spéciale- ment fiable dans les expériences de co-culture. La production d'urée a été un paramètre plus sensible pour évaluer la viabilité cellulaire. La production d'urée et sa sécrétion dans les milieux de culture reflètent directement l'état des cellules. Cet- te excrétion a diminué parallèlement à la sécrétion d'albumine et à l'observation morphologique dans les cultures conventionnelles. En contraste, l'urée a été excrétée à un niveau plus élevé et pendant de lon- gues périodes dans le système de co-culture. EXEMPLE 4 Métabolisme médicamenteux 1) ESSAI Les activités de biotransformation des médi- caments exercées par les hépatocytes de rat dans les conditions conventionnelles ou de co-culture ont été déterminées en utilisant l'astémizole, un antihistami- nique H1 (Hiomanol de Janssen Pharmaceutica, Beerse, Belgique), en tant que médicament de référence. La métabolisation de ce médicament a été choisie pour l'étude du métabolisme rLmeaicam..enteux de ces hépatocytes en culture, du fait que ses différents métabolites chez le rat sont bien connus. Pratiquement, après différentes périodes de culture, les cellules ont été incubées pendant 24 heures à 37 C en présence d'un milieu de culture de 2,5 ml contenant 10.g/ml d'astémizole marqué au tritum. A la fin de la période d'incubation, le milieu de cul- ture a été centrifugé 10 minutes à 1000xg pour faire partir les dépÈts cellulaires et le surnageant restant a été traité pour une analyse HPLC. Lastêmizole et ses métabolites pre'sents dans les 4ilieux de culture ontdté déterminés par la technique 1-PLC utlisant un détecteur de radioas. ivit., 2) REU1TTS a c s (desf hp-aZtocyhe de r i- - ncubus avec lasc-mzl T e ue aps le n J eencame nt des cellula, a. ' e. b suin:s dans 1 les mi.i. e Ie edïr 0 i2, - yoyATD 6,-hydroxy. 3rrT- i'.h xy d6sm6-hhy'AST0 Aeur's gcluro= noconjugu{}2r et,!.as m6habo!ites mineuss %+ 17rue 'is que le 4-hyd b-rox ' 4.? hoyp6yacchény!acéturiCue Ces:- oes d i ffn cor sp ondlent à l'occurence deo;-ao! b OiuVéAueouv6es in -ivoo Les voies de r6ducto, hyio e g1ucuronidationI qui sont.es voe a jeures, ont té utilisées pour estimer l'activt S6Lbo!i que des hépatocytes dans la culture pure O-u allangée avec les cellules épithé liales. Aprs -14 jours de culture conventionnelle, % et 84% de la drogue ont été métabolisés et- la glucuronidation intervient pour seulement 20% et 50% de la drogue totale ajoutée lorsque les hépatocytes sont cultivés respectivement avec le milieu complet ou le milieu en mono-culture. Lorsque les hépatocytes ont été co-cultivés par les cellules de foie Chang irradiées à une dose de 3000 rads, plus de 90% de l'astémizole a encore été conjuguée en tant que glucuronide après deux semaines de culture. Dans la culture pure des cellules de foie Chang non traitées, moins de 23% de la drogue a été mé- tabolisée après 24 heures d'incubation mais les con- juguds glucuronés n'ont jamais été formés. EXEMPLE 5 Maintien de l'activité des récepteurs membranaires spécifiques des asialoglycoprotéines 1) ESSAI Apres différentes périodes de culture, les monocouches cellulaires ont été incubées avec 1 ml de milieu de mono-ou de co-culture contenant 20 gg/ml d'albumine sérique humaine marqueau tritium ou d'albumine humaine galactosylée. Le marquage et la galactosylation de l'albumine humaine ont été faits comme décrit préalablement (Schneider et al, 1984. dans: Ciblage des médicaments par l'intermédiaire des récepteurs, Grégoriadis G.,Poste G. Senior J. and Trouet A., eds, Plenum Press, pp. 1-25). Après 24 heures d'incubation à 37 C, les milieux de culture ont été testés pour la présence de produits de dégradation après précipitation des protéines par 25% (p/v) d'acide trichloroacétique (concentration finale) pendant 30 minutes à 4 C, centrifugation 30 minutes à 1000xg et essai du surna- geant pour la radioactivité. Parallèlement, les cellules ont été lavées à 4 C, deux fois avec 2,5 ml d'une solution saline tamponnée par du phosphate 10 mM pH 7,4, une fois avec 2,5 ml du milieu de culture complet, trois fois avec 2,5 ml de la même solution saline tamponnée par du phosphate, dissoutes dans 1 ml de 1% (p/v) de déoxycholate de sodium à un pH de 11,3 et testées pour, et la radioactivité, et la concentration en protéines cellulaires. La capture spécifique représente la somme de l'accumulation (protéines associées aux cellules) et de la digestion (produits de dégradations marqués présents dans le milieu). 2) RESULTATS Dans les organismes vivants, les glyco- protéines désyalylées ou les protéines galactosylées (néoglycoprotéines) sont sélectivement reconnues par les hépatocytes et captées par endocytose par l'in- termédiaire des récepteurs cellulaires (17). Ces récepteurs sont exprimés de façon spécifique par les hépatocytes. Le maintien de ces fonctions hautement spécifiques des hépatocytes a été testé dans des systèmes conventionnels et de co-culture utilisant l'albumine humaine native ou galactosylée marquée au tritium. Les résultats de trois expériences ont été exprimés sous forme du rapport de capture de l'albumine galactosylé sur le captage de l'albumine (rapport spécifique). Après 24 heures d'incubation en présence d'hépato- cytes vieux d'un jour, le rapport spécifique a été de 120 ou de 250 lorsque les hépatocytes ont été alimentés respectivement avec un milieu contenant ou pas des hormones. En culture conventionnelle avec les milieux complets et de mono- culture, le rapport spécifique tobe rapidement à des valeurs inférieures à 4 après huit jours de culture. A huit jours de culture, le rapport spécifique a été supérieur à dans le système de co-culture avec les cellules de foie Chang irradiées à 3000 rads et est resté élevé pendant au moins 2 semaines. Les cellules de foie Chang toutes seules (irradiées ou non) n'ont pas les récepteurs spécifiques. Dans certaines préparations d'hépatocytes, le rapport spécifique a été plus bas que celui décrit mais toujours supérieur pour le système de co- culture que pour la culture conventionnelle. Ceci a reflété des différences dans les préparations d'hépato- cytes et est probablement une conséquence du traitement à la collagénase. REFERENCES: (1) BISSELL, D.M. 1981. Fed. Proc.,40, 2469 (2) MICHALOPOULOS, G. & PITOT, H. 1975 Exp. Cell Res., 94, 70 (3) DESCHENES, J., VALET, J.P., MARCEAU, N. 1980.In vitro, 16,722 (4) ROJKIND, M., et al. 1980. J. Cell Biol., 87, 255 (5) GUGUEN - GUILLOUZO, C. et al. 1982, Biol. Cell, 46, (6) MICHALOPOULOS, G., RUSSEL, G. & BILES, C. 1979 In vitro, 15, 796 (7) LANGENBACH, R. et al.1979, Cancer Res., 39, 3509 (8) WANSON, J.C. et al., 1977. In: Kupffer cells-and other liver sinusoidal cells. Wisse, E. & KNOOK, D. L. eds. Elsevier North Holland Biomedical Press, Amsterdam, pp. 141-150 (9) GUGUEN-GUILLOUZO, C. et al. 1983, Exp. Cell res., 143, 47 (10) GUGUEN-GUILLOUZO, C. et al. 1983 In: Isolation, Characterization, end Use of Hepato- cytes R.A. Harris & M.W. Cornell, Eds. Elsevier Science Publishing Co, Amsterdam, Netherlands, p.p. 105- (11) BEGUE, J.M., et al. 1983. Biochem, Pharmacol, 32,1643 (12) BEGUE, J. M., et al. 1984. Hepatology, 4, 839 (13) GUGUEN-GUILLOUZO, C. & GUILLOUZO, A., 1983. Mol. Cellular Biochem., 5354, 35 (14) BAFFET G. et al., 1982. Biochem. Biophys. Res. comm., 109, 507 (15) GUGUEN-GUILLOUZO, C. et al., 1984. Developmental Biology, 105, 211 (16) GRISHAM, J.W. 1980. Ann. N.Y. Acad. Sci., 349, 128 (17) ASHWELL, G. and MORELL, A.G. 1974 Adv. Enzymol., 41, 99-128 REVENDICATIONS 1. Procédé de culture des hépatocytes, permettant de maintenir l'intégralité de leurs fonctions spécifiques, caractérisé en ce que lesdits hépatocytes sont mis en co-culture avec des cellules de foie de type épithélial dont les capacités de division ont été définitivement inhibées par un traitement approprié. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les hépatocytes sont des hépato- cytes de rongeurs. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les hépatocytes sont des hépato- cytes humains. 4. Procédé de culture des hépatocytes selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules hépatiques de type épithélial utilisées proviennent d'une lignée dérivée de cellules de canalicules biliaires. 5. Procédé selon les revendications 1 et 4, caractérisé en ce que les cellules de foie de type épithélial sont des cellules Chang. 6. Procédé selon la revendication 5, carac- térisé en ce que les cellules Chang sont cultivées en monocouche. 7. Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que le traitement approprié est de nature physique. 8. Procédé selon la revendication 7, carac- térisé en ce qu'il s'agit de radiations gamma. 9. Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que le traitement approprié est de nature chimique. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il s'agit de drogues anti-mitotiques telles que la mytomycine-C. 11. Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que le traitement approprié combine les radiations gamma et la mytomycine. 12. Co-cultures d'hépatocytes avec des cellules hépatiques de type épithélial, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 11.