FR 2590483 A1 19870529 FR 8517359 A 19851122 Ant-qenes purifies avant des propriétés vaccinantes contre B. pertussls, moyens notamment ADNs recombinants Pour les produire et compositions de vaccins les contenant L'invention concerne des polypeptides susceptibles de former des principes actifs de vaccins purifiés contre la coqueluche. Ces vaccins sont diriges contre des anti- genes distincts de l'agent pathogène. L'invention concerne plus partlculierement les associations qui peuvent être formees entre ces principes vaccinants. Ceux-cl sont sus- ceptibles d'être obtenus par les techniques du génie géné- tique. L'invention concerne donc aussi les séquences d'ADN codant pour les susdits polypeptides, ainsi que les vecteurs qui les contiennent. La coqueluche est une infection bactérienne, due a BordeteLla pertussis, qui provoque une trachéo-bronchite non septique, parfois mortelle chez l'enfant de moins de six mois, représentant la classe d'âge la plus exposée si- non exclusive. Cette infection, connue depuis plus de cinq siè- cles, sévit dans tous les pays et n'est contrôlée que par la vaccination préventive, systématiquement instaurée dans les pays développés depuis 1945. Une fois la maladie ins- tallée dans sa phase d'expression clinique, aucun recours thérapeutique spécifique n'est possible, les soins sont alors purement symptomatiques et visent à prévenir les phénomènes anoxiques et les complications infectieuses secondaires qui sont les causes de la mortalité. Les antibiotiques actifs de B. pertussis n'in- tfluencent pas l'évolution de la coqueluche dont les média- teurs de pathogénicité sont extra-bactériens. La vaccination est, par contre, le moyen efficace de contenir les flambées épidémiques. La preuve indirecte de l'efficacité de la vaccination est apportée par les exemples récents du Japon et de la Grande-Bretagne o la levée de ce mode de prévention a été santionnée par de violentes épidémies avec des cas mortels. Les vaccins actuellement employés dans le monde entier sont majoritairement composés de suspensions de B. Pertussis, simplement lavées par centrifugation puis tuées par chauffage a 56'C ou quelquefois par adjonction d'un antiseptique. Le chaufftage à 56'C a pour but essentiel d'inactiver la toxine dermonecrotique liberée par les bac- teries lysees. On reconnaît actuellement deux antigènes immuno- protecteurs chez B. pertussis: L'hémagglutinine filamenteuse (FHA), associée aux fimbriae (proteine de PM > 150 000), thermodenaturée à 56'C, dénuée d'effet pathogène mais facteur dominant dans l'adhésion aux cellules épithéliales respiratoires. Un autre antigene est connu sous les appellations "facteur promoteur d'une leucocytose" (LPF selon la dési- gnation qui sera utilisée dans la suite de cette description) ou encore toxine pertussique (Ptx) ou facteur sensibilisant à l'histamine (HSF) ou protéine activant les ilots l du pancrés endocine (IAP). Ces différentes appellations évoquent les multiples effets biologiques de cette protéine pentamérique (PM 95 000) qui sont dus en fait à la sous-unité î qui possède une fonction ADPribosyl-transférase, agissant sur la sous-unité inhibitrice du site de régulation de l'adényle cyclase des cellules eucaryotes, en bloquant ainsi la régulation inhibitrice de la synthèse d'AMP cyclique eucaryote. La fonction d'attachement de cette protéine serait portée par d'autres structures non encore identifiées de la molécule. L'intérêt de ces deux antigènes excrétés par B. pertussis en culture a conduit à l'exploitation de leur purification pour la mise au point du premier vaccin co- quelucheux acellulaire qui est actuellement en exploita- tion à l'échelle industrielle au Japon. Outre ces deux antigènes pour lesquels des études biochimiques, immunochimiques et phygiopathologiques etofrées ont apporté de solides arguments en faveur de leurs qualités lmmunogenes. Des études récentes des inventeurs les ont conduits a la presomption plus que sérieuse qu'un troisieme produit, synthétisé et excrété par. pertussls: l'adenyle cyclase (CYA) est susceptible d'intervenir comme un lmmunogène jouant un rôle important dans 1 'immunoprotection antlcoquelucheuse. D autres antiqenes, encore peu étudiés peuvent se reveéler comme participant également à l'immunogénicité de 8. pertussis: il s'agit du lipopolysaccharide (LPS) dont les eftets biologiques sont ceux de toute endotoxine bac- térienne, de la toxine dermonécrotique qui est une pro- téine cystopiasmique, responsable de nécroses cutanées, et de la cytotoxine trachéale dont l'existence et le rôle specifique sur l'epithelium sont suspectés, d'après les expériences in vitro de prélèvement de trachée de hamster. Bien que les trois immunogènes FHA, Ptx et CYA, soient extracellulaires, leur purification biochimique pose encore de nombreux problèmes: copurifications liées probablement à des mécanismes de relargage a partir de sites structurellement associés sur l'enveloppe cellulaire; - rendements de synthèse faibles et difficilement repro- ductibles à l'échelle industrielle et surtout - variations phénotypiques de B. Dertussis. en cultures en milieux synthétiques, liées vraisemblablement à la modula- tion de la synthèse notamment du LPF et de CYA par des constituants du milieu identifiés (nicotinamide, gluta- thion, ions Mg2+) ou les conditions de pression d'oxygène et de pH. L'invention a donc pour but de fournir des poly- peptides susceptibles d'être obtenus avec un haut degré de purification et de reproductibilité par des techniques du génie génétique. Ces polypeptides sont obtenus par expres- sion dans un hôte approprié de séquences d'acides nuclé- iques, qui ont été obtenues d'une banque de séquences nucleotidiques elles-mêmes préalablement obtenues à partir de l'ADN génomique de B. pertussis 8144 (selon la réfé- rence de l'Institut Pasteur de Paris) sérotype 1.3. Construction de la banque de B. Pertussis 30 ug de DNA de B. pertussis ont été incubés à 'C pendant 5 ou 10 minutes dans un volume final de 450 pi en tampon 50mM Tris HCl 7,5, MnCi2 10 mM, sérum albumine bovine (SIGMA) 20 ug/ml, en présence de 330 pg/ml de déoxyribonucléase pancréatique (DNAase I Boehringer Mannheim). On a ainsi obtenu des fragments ayant des tailles comprises entre environ 1 et environ 8 kb. La réaction a été. arrètée par addition d'EDTA 5mM final. Le DNA a été extrait par un volume égal du mélange phénol/ chloroforme/alcool isoamylique (25V/24V/1V), puis préci- pité par i'éthanol. pg de DNA ainsi obtenu ont été incubés pendant une heure a 15'C dans un volume de 60 pl en tampon 40 mM Tris HCl pH 7.9, 10 mM sulfate d'ammonium, 10 mM 0-mer- captoethanol, 0,5 mM EDTA, 200 pM de dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 100 MM 0-NAD) en présence de 25 U de T4 DNA-poly- mérase (P.L. Biochemicals) et de 60 U de D. coli DNA ligase (New England Biolabs). Après extraction au phénol et précipitation par l'éthanol comme ci-dessus, le DNA a été incubé dans un volume de 22,5 pl avec 0,25 ug de linkers EóoRI phospho- rylés (New Engiand Biolabs) en présence de 1000 U de T4 DNA ligase (New England Biolabs) dans le tampon adéquat (66 mM Tris HCl pH 7,5, 5 mM MgCl2, 5 mM DTT et 0,5 mM ATP). L'incubation a été effectuée à 4'C pendant 4 heures. 1000 U de T4 DNA ligase (New England Biolabs) ont été ra- joutées et l'incubation poursuivie 16 heures à 4C. Le mélange a été soumis à deux cycles successifs de congéla- tion à -80C, suivie de décongélation. Le volume a été amené à 50 pl avec de l'eau. Le DNA a été ensuite incubé dans un volume de 250 pl en présence de 50 unités d'EcoRI (New England Biolabs) pendant 3 heures à 37'C dans le tampon recommandé par le fournisseur. Après incubation 10 minutes à 60'C, le DNA a eté extrait au phénol comme ci-dessus. Après addition d'acetate d'ammonium 2,5 M final, le DNA a été précipité par 2 volumes d'éthanol pendant 16 heures à -20'C. 500 ng ou 1 ug de DNA digéré 5 minutes, ou 500 ng ou 1 mg de DNA digere 10 minutes ont été ligaturés indé- pendamment (dans le tampon de ligation recommandé par Promega Biotec) a 250 ng de DNA du vecteur Agt11 (Proto- clone TM GT System, Promega Biotec) dans un volume de 5 pl en présence de 200 unités de T4 DNA polymérase (New England Biolabs). La réaction a été effectuée à 4'C pen- dant 16 heures. Les produits obtenus ont été encapsidés dans des capsides du bactériophage A. Les extraits d'encapsidation ont été prepares selon le protocole décrit par Maniatis et Coil. (Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbour, p. 264-267, 1982). En bref, l'encapsidation est effectuée comme suit: 1 pl de DNA ligaturé (50 ng de vecteur) sont ajoutés à 7 pl de tampon A à 4'C (20 mM Tris HCl pH 8;3mM MgC12, 0,05 % 0-mercaptoéthanol, 1 mM EDTA), puis on ajoute 1 pl de tampon ML (6 mM Tris pH 7,4, 18 mM MgCl2, 30 mM spermidi- ne, 30 mM 0-mercaptoéthanol, 15 mM putrescine). 6 pl d'ex- trait d'encapsidation SE décongelé à 4'C sont ajoutés puis pl d'extrait d'encapsidation FTL décongelé à 4'C. Le mélange est incubé 1 heure à 25"C, puis dilué à 500 pl avec du tampon Tris 10 mM pH 7.4, 10 mM MgCl2, et étalé sur des bactéries indicatrices. Les extraits FTL et SE sont des extraits respecti- vement des souches bactériennes BHB 2688 et BHB 2690 ther- mo-induites. Le génotype de souches est décrit dans Ma- niatis et Coll. op.cit p. 504. Dans le cas présent, les extraits obtenus permettaient d'obtenir environ 109 bac- tériophages par pg de DNA de XCI857. Après l'encapsidation, les phages ont été criblés afin de déterminer le pourcentage des phages recombinants. Environ 60 % des phages recombinants ont été ob- tenus (d'apres un nombre de plages de lyse blanches par rapport aux bleues sur boites indicatrices contenant IPTG + X-gal). Le rendement final était de 300 000 phages recom- binants par microgramme de vecteur utilise. La banque ainsi obtenue contenant environ 300 fois le génome de B. Dertussis a été criblée en utilisant un melange de sérums humains de malades ayant contracté la coqueluche. Environ 30 % des plages de lyse ont donné une ré- ponse positive. Le criblage avec des antisérums spécifiques diri- ges contre les trois antigenes purifiés (LPF, FHA et CYA) a donné des résultats positifs; environ 0,3 à 0,5 % des phages recombinants contiennent les séquences indivi- duelles représentant ces antigènes. Ce criblage a été effectué à l'aide des anticorps préalablement formés chez le lapinou la souris contre le LPF, la FHA et la CYA (plus particulièrement contre la protéine de poids moléculaire d'environ 67 000, obtenue par le groupe auquel les inventeurs de la présente demande appartiennent, à partir de cette CYA, respectivement et, d'autre part, avec des anticorps contenus: - dans des sérums humains hyperimmunisés par vaccin coque- lucheux, - dans des sérums d'enfants malades non vaccinés. Pour le criblage, la technique et la souche RY1090 utilisées ont été décrites par R. YOUNG et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USDA, vol. 82 (1985), 2583-2587. La souche RY1090, cultivée jusqu'à saturation en milieu LB contenant du maltose (0,02 %) a été centrifugée et reprise dans MgSO4 10 mM. Environ 104 phages de la banque ont été incubés, avec environ 2.108 bactéries pen- dant 15 minutes à 37'C, puis étalés sur boite TRYPTONE. Apres 3 heures d incubation à 42'C,les boites ont ete amenees a 37'C et un filtre de nitrocellulose (SCHLEI- CHER & SCHULL) imprégné dans isopropoyl-0-D-thiogalacto- side (IPTG) 10 mM, a eété pose dessus. Après 3 heures d'incubation à 37'C, le premier filtre est retire puis, pour avoir une deuxième empreinte, un deuxèleme filtre, egalementimprégné par IPTG, a été pose dessus pour 3 heures supplémentaires. Les filtres ont été trempes dans un tampon TBS (Tris 50 mM NaCl 150 mM). On expose ci-après les principales étapes du pro- cede qui a ece utilise pour la détection des filtres par les anticorps: Incubation des filtres dans un tampon TBS contenant 5 % de lait écréme (marque REGILAIT) et 0,01 % d'azide de so-û dium (TBS lait) pendant 1 heure à température ambiante; - Incubation avec l'immunsérum de TBS lait, 1 heure à 37'C; - Lavage 3 fois en TBS lait 1 lavage TBS lait + 0,1 % NP40, 1 lavage TBS lait. - Incubation avec protéine A marquée à l'125I (0,5 micro- Curie par filtre), 1 heure à température ambiante; - Lavage 3 fois TBS lait; 1 lavage TBS lait, NP-40; 1 lavage TBS lait, 2 lavages TBS; Séchage des filtres - Autoradiographie à 80'C avec écran. A l'endroit des signaux positifs, l'agar contenant des particules de phages a été enlevé, incubé 1 heure dans un tampon phosphate 100 mM MgSO4 10 mM à 37'C. Les phages donnant des signaux positifs ont été repurifiés, le nombre de fois nécessaires pour obtenir autant de plages de lyse par boite que de signaux positifs en autoradiographie. La revelation des plages de lyse donnant des si- gnaux potifis a été, dans certains cas, réalisée par des anticorps anti-Ig lapln-sourLs ou homme marqués a la pero- xydase (BIOSYS). Ceci a été surtout nécessaire lors de l'utilisation de sérums de souris. Les plages de lyse donnant des signaux positifs avec des sérums monospecifiques, dirigés contre la CYA (sérum de lapin), contre le FHA (sérum de souris) et contre le LPH (serums de souris ou de lapin) ont été lysogénises dans la souche RY1090, par des techniques classiques. Les lysogenes ont été définis comme ayant une croissance a 30'C et pas de croissance à 42'C. Les clones lysogènes s'appellent respectivement: RY1090 Agtll lys CYA RY1090 Agtll lys LPF RY1090 Agtll lys FHA. Ces clones ont été déposés à la Collection Natio- nale des Cultures de Micro-organismes de l'Institut Pas- teur (C.N.C.M.) le 29 juillet 1985, sous les n' 1-474, I-475 et 1-476. Lorsque les phages de lyse donnant des signaux positifs avec les sérums monospécifiques (mentionnes ci- dessus) ont été criblés par les sérums humains hyper- immunisés ou provenant de malades, ils ont donné, dans la majorité des cas, également des signaux positifs. Les lysogènes obtenus dans la souche RY1090 per- mettent l'obtention et l'amplification des phAges recom- binants portant les insertions correspondantes aux anti- gènes LPF, FHA et CYA. Ils permettent également l'obten- tion, selon des techniques classiques, de l'ADN corres- pondant lequel, par marquage adéquat, peut servir de sonde spécifique. Afin d'obtenir les protéines-fusion contenues dans les phages recombinants, la lysogénisation est effectuée dans la souche RY1089 portant la mutation Hfl (décrite par YOUNG et al.). L'obtention des cultures bactériennes contenant les proteines-fusion recherchées est obtenue par la cul- ture de cette souche à 30'C, suivie par une induction de minutes à 42'C, puis par une induction de l'IPTG 10 mM, enfin par une incubation pendant 1 heure à 37'C. Les protéines peuvent ensuite être purifiees par des techniques classiques. La potentialité vaccinante et protectrice des protéines-fusion est mesurable par le test de Kendricke, préconisé par l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS), lequel permet l'étude de la pathogénicité et de l'immu- nogénicité de B. Pertussis observée à l'occasion de l'in- fection expérimentale de la souris. Il consiste en l'es- timation de la dose léthale: 50 % de la souche de réfé- rence internationale (OMS) 18323 (sérotypes 1, 2, 3, 4, 5, 7) pour des souris immunisées ou non. La mesure de tout immunogéne à potentialité "vaccinante" est effectuée par comparaison avec un vaccin d'efficacité connue. L'invention concerne donc plus particulièrement l'utilisation de la CYA ou de protéines purifiées qui peuvent être obtenues à partir de celles-ci pour la cons- titution de principes vaccinants contre la coqueluche. Un vaccin préféré selon l'invention contient une association d'antigènes ayant les caractéristiques de la FHA, du LPF et de la CYA. On peut ainsi bénéficier des effets caractéristiques simultanés de ces trois types d'antigènes. Des données expérimentales basées sur la séroneu- tralisation de l'infection par B. Pertussis de fibro- blastes 3T3, montrent que les anticorps anti-FHA protègent contre l'adhésion des bactéries aux membranes cellulaires, mais ne semblent pas neutraliser les effets cytotoxiques, que les anticorps anti-LPH, outre un faible pouvoir inhi- biteur de l'adhésion, protègent les cellules contre les phénomènes cytotoxiques et que cet effet est sensiblement potentialisé par les anticorps anti-CYA. Un tel vaccin parait capable d'immuniser contre chacun des principaux déterminants impliqués dans le pou- volr pathogene de E. Pertussis: le FHA en tant que res- ponsable majeur de l'adhésion et de la prolifération in situ de l'inoculum bactérien, et le LPH et CYA en tant que cytotoxines capables d'agir indépendamment du FHA. L'invention concerne au même titre les composi- tions de vaccin associant les produits d'expression des sequences d'insertion contenues dans les trois phages sus-indiqués (ou tout produit semblable doué de propriétés immunogènes semblables) et reconnues par des anticorps anti-FHA, anti-LPF et anti-CYA. Naturellement, l'invention concerne également les compositions de vaccin contenant des doses efficaces des principes actifs de vaccins susmentionnés, en association avec tout véhicule pharmaceutique approprié au mode d'ad- ministration choisi, par exemple par la voie orale, pa- rentérale, nasale ou rectale. L'invention concerne enfin les séquences d'acides nucléiques d'insertion elles-mêmes ou toute séquence co- dant pour des polypeptides semblables. Font notamment par- tie de l'invention les séquences d'acides nucléiques qui sont susceptibles de s'hybrider avec les séquences d'in- sertion contenues dans les vecteurs qui ont été déposés à la C.N.C.M. REVENDICATIONS 1 - Acide nucléique recombinant contenant une sé- quence d'insertion issue du génome de B. Dertussis, con- tenue dans le phage lui-même déposé à la C.N.C.M. sous le n' 1-474. 2 - Acide nucléique recombinant contenant une se- quence d'insertion issue du génome de B. pertussis, con- tenue dans le phage lul-mème depose à la C.N.C.M. sous le n' 1-475. 3 - Acide nucléique recombinant contenant une sé- quence d'insertion issue du génome de B. pertussis, con- tenue dans le phage lui-même déposé à la C.N.C.M. sous le n 1-476. 4 - Le produit d'expression, dans un hôte appro- prle, de la sequence d'insertion de l'acide nucléique selon la revendication 1. - Le produit d'expression, dans un hôte appro- prie, de la séquence d'insertion de l'acide nucléique selon la revendication 2. 6 - Le produit d'expression, dans un hôte appro- prié, de la séquence d'insertion de l'acide nucléique selon la revendication 3. 7 - Composition immunogène contenant le produit d'expression selon l'une quelconque des revendications 4, 5 et 6. 8 - Composition immunogène selon la revendication 7, caracérisée en ce qu'elle contient l'ensemble des pro- duits d'expression tels que définis dans les revendica- tions 4, 5 et 6. 9 - Composition vaccinante contre L. Pertussis, caractérisée en ce qu'elle contient les principes actifs de la composition immunogène selon la revendication 7 ou la revendication'8, en association avec un véhicule phar- maceutiquement acceptable.