FR 2589880 A1 19870515 FR 8615552 A 19861107 La présente invention concerne un procédé pour l'expres- sion de gènes par Bacillus brevis. Lorsqu'un certain gène doit être exprimé par une technique à ADN recombinant utilisant un procaryote, il semble que le choix d'un hôte ainsi que le choix d'un vecteur adapté à l'h8te soient très importants. Bacillus brevis secrète une grande quantité de protéine à l'extérieur de sa cellule et la protéine ainsi secrétée offre une très faible acti- vité de protéase, de sorte que Bacillus brevis convient à un emploi comme hôte. Cependant, Bacillus brevis n'a pas Jusqu'à présent été employé comme hôte du fait qu'il n'a pas encore été préparé de vecteur plasmidique approprié par une technique à ADN recombinant. La Demanderesse a concentré son attention sur le fait que Bacillus brevis présente, comme indiqué ci-dessus, d'ex- cellentes possibilités lorsqu'il est utilisé comme h8te, et elle s'est consacrée à des études approfondies pour exploiter des vecteurs propres & l'introduction dans Bacillus brevis. En résultat, la Demanderesse a découvert qu'un gène structural peut être bien exprimé par Bacillus brevis lorsque Bacillus brevis est transformé par un plas- mide qui peut se répliquer dans Bacillus brevis et qui inclut une séquence nucléotidique (a) représentée par la formule générale MNOACP, une séquence nucléotidique (b) située en aval de la séquence nucléotidique (a) et repré- sentée par la formule générale qRSWXY, une séquence nucléo- tidique (c) située en aval de la séquence nucléotidique (b) et agissant comme site de liaison au ribosome dans la cel- lule de Bacillus brevis, une séquence nucléotidique (d) située en aval de la séquence nucléotidique (c) et agissant comme un codon initiateur de translation dans la cellule de Bacillus brevis, et un gène relié directement à la séquence nucléotidique (d) et devant Otre exprimé dans la cellule de Bacillus brevis. Dans lesdites formules générales: M représente G ou T; N représente C, T ou A; O représente A, C ou T; P repré- sente T ou G; Q représente T ou A; R représente T ou A; S représente T, C ou A; W représente A ou G; X représente A ou C; et Y représente T ou G, étant entendu que A re- présente l'adénine, C la cytosine G la guanine et T la thymine. Par l'expression "en aval", on se réfère ici à l'aval d'une formule structurale dtADN lorsqu'elle est écrite consécutivement le long d'une ligne en tournant vers l'amont le c8té 5t du désoxyribose de l'ADN et son côté 3t vers l'aval. Chacune des séquences nucléotidiques (a) et (b)- joue un rôle en tant que promoteur de transcription. Des exemples préférables de la séquence nucléotidique (a) sont: (1) GCAACT, (2) TTCACG et (3) TATACT, et des exemples pré- férables de la séquence nucléotidique (b) sont: (1) TTTAAT, (2) TACACT et (3) AAAGCG. Il est préférable qu'il y ait 17 paires de bases entre les séquences nucléotidiques (a) et (b) dans le cas de ces exemples préférables; cependant, il peut y avoir 15 à 20 paires de bases entre ces deux séquences nucléotidiques. La séquence nucléo&idique (c) a le rôle d'une partie de liaison au ribosome et il s'agit de ce que l'on appelle la séquence de Shine-Dallarno. La séquence nucléotidique (d) a le rôle d'un codon initiateur de translation, et il s'agit normalement de la séquence nucléotidique de ATG ou TTG. 3o Afin d'exprimer un gène structural provenant de diverses espèces sous la commande des promoteurs ci-dessus, il faut que la ligature soit effectuée de manière à placer les séquences nucléotidiques (c) et (d) entre la séquence nucléotidique (b) agissant comme promoteur et le gène structural. Afin de placer les séquences nucléotidiques (c) et (d) entre la séquence de promoteur (b) et le gène structural, il est préférable que le gène structural soit inséré dans un vecteur plasmidique contenant initialement & la fois la partie de liaison au ribosome et le codon initiateur de translation. En variante, un gène structural contenant à la fois la partie de liaison au ribosome et le codon initiateur de translation peut être inséré dans un vecteur plasmidique. Dans le cas o l'on emploie un vec- teur plasmidique qui ne contient pas à la fois la partie de liaison au ribosome et le codon initiateur de transla- tion ni aucun d'eux séparément, il faut insérer dans le vecteur plasmidique soit & la fois la partie de liaison au ribosome et le codon initiateur de translation, soit celui d'entre eux qui ne se trouve pas dans le vecteur plasmidi- que, ou sinon il faut insérer en sus dans ce dernier soit la partie de liaison au ribosome, soit le codon initiateur de translation. On peut faire usage d'un vecteur contenant une séquence d'ADN correspondant au peptide transmetteur. Le gène structural peut comporter une autre séquence, naturelle, de promoteur. En outre, on peut faire usage d'un gène structural comportant une séquence d'ADN corres- pondant au peptide transmetteur. Il n'est pas nécessaire d'employer une souche particulière choisie parmi celles de Bacillus brevis. Des exemples pré- férables de Bacillus brevis sont Bacillus brevis 47 FERM- P7224 et 481 FERM-P7531. 3o Une fois que le vecteur plasmidique dans lequel a été inséré le gène structural est introduit dans une cellule de Bacillus brevis conformément à la présente invention, le microorganisme résultant a été transformé de façon A pou- voir produire une grande quantité de substances utiles telles que des protéines, etc. On peut employer des méthodes classiques pour insérer le gène structural dans le vecteur plasmidique et également pour opérer la transduction du plasmide ainsi obtenu dans Bacillus brevis en utilisant un ADN recombinant selon la présente invention. Pour ce qui est du gène structural, on peut faire usage non seulement d'un gène provenant d'un eucaryote, mais également de celui d'un procaryote. Par exemple, on peut faire usage d'un gène humain (c'est-à- dire dlinterféron, d'insuline, etc.), d'un gène de protéine enzviatique de microorganisme (tryptophanase, aspartate de lyase ammoniaeal, etc.) et autres. L'Exemple van limitatif suivant illustre plus particulière- ment la présente invention. Exemple (1) Clonage de la région des promoteurs du gène de protéine de paroi cellulaire de Bacillus brevis 47 s La figure 1 montre une carte de restriction du gène de protéine de paroi cellulaire et de son voisinage, qui est établie en analysant l'ADN chromosomique de Bacillus brevis 47 (FEIRM-P7224) selon la méthode des taches "Southern" (J. Mol. Biol., 98, 503-517 (1975)) en utilisant comme sonde un fragment d'ADN codant une partie de cette protéine de paroi cellulaire (protéine ayant un poids moléculaire d'environ 150 000, qui est dénommée ci-après "protéine 150K"). Ce fragment d'ADN a été cloné par Tsukagoshi et collabora- teurs sous forme dépourvue d'une région de promoteur du gène codant la protéine 150K (J. Bacteriol., 158, 1054- 1060 (1984)). De plus, les sites initiateurs de transcrip- tion et le sens de transcription de ce gène ont été déterminés comme le montre la figure 1, en utilisant un ARN extrait de Bacillus brevis 47 selon la Méthode de Car- tographie par S1 (J. Biol. Chem., 256, 11905-11910 (1981)). La zone hachurée ////// de la figure 1 indique la région d'un fragment d'ADN à 3100 paires de bases (1000 paires de bases sont désignées ciaprès par Kb), et les caractères écrits en haut et en bas de la ligne médiane indiquent les enzymes de restriction et les sites clivés par les enzymes de restriction respectifs. L'ADN chromosomique de Bacillus brevis 47 a été clivé par l'enzyme de restriction BclI, puis fractionné par électro- phorèse sur gel d'agarose. Les fragments de 9Kb clivés par BclI (presque toute la longueur d'ADN représentée sur la figure 1) ont été élués par voie électrophorétique à par- tir des fractions correspondantes. Les fragments d'ADN élués ont ensuite été clivés par l'enzyme de restriction BglII, et les fragments de 3,1 Kb résultants ont été recueil- lis de la même manière que décrit ci-dessus, ces fragments correspondant à la zone hachurée de la figure 1. Par ail- leurs, de l'ADN pHW I (J. Bacteriol., 150, 804-814 (1982)) a été clivé par l'enzyme de restriction HindIII, traité à l'ADN-polymérase pour avoir des extrémités tronquées, puis des molécules de jonction BamHI (5'CGGATCCG/3'GCCTAGGC5') ont été ajoutées, et le produit résultant a été raccordé audit fragment d'ADN de 3,1 Kb au moyen de ligase T4 pour former un ADN recombinant. L'ADN recombinant a été utilisé pour transformer Bacillus subtilis RM 141 (rM mM arg 15 leu B8 his AI rec E4) (Mol. Gen. Genet., 168, 111-115 (1979)). Les transformants ainsi obtenus ont été développés dans un milieu de gélose pour régénération contenant de i'érythro- mycine (10)g/ml), et un anticorps dirigé contre la protéi- ne 150K, préparé d'avance, a été ajouté aux transformants. En résultat, on a trouvé des colonies o les souches avaient réagi avec l'anticorps en les décelant par une méthode d'immunodosage enzymatique (Gene, 16, 149 (1981)), en utilisant de la peroxydase de raifort-protéine A conju- guée (E-Y Laboratories Inc.). Le plasmide pCWP I a été extrait des colonies ayant réagi et il a été confirmé que ledit fragment de 3,1 Kb avait été inséré, ce qui est indiqué par une ligne épaisse sur la figure 2 qui montre une carte de restriction du plasmide pCWP I. La figure 2 porte divers caractères tels que HindIII, qui indiquent les enzymes de restriction et les sites clivés par les enzymes de restriction, tout comme sur la figure 1. (2) Analyse du fragment d'ADN cloné et force de l'activité promotrice: La séquence des bases du fragment d'ADN cloné a été déter- minée par la méthode de Maxam-Gilbert (Methods Enzymol., 6_i 449-560 (1980)) et, en utilisant un ARN extrait de Bacillus brevis 47, la détermination des sites initiateurs de transcription a été effectuée par la méthode de carto- graphie par S1 (J. Biol. Chem., 256, 11905-11910 (1981)). En résultat, la Demanderesse a trouvé un cadre de lecture ouvert s'étendant à partir du site à une distance d'environ 2 Kb du site BclI en direction du site BglII, ainsi que quatre sites initiateurs de transcription P1, P2, P3 et P4, localisés en amont du cadre de lecture ouvert, comme repré- senté sur la figure 3. La figure 3 représente une séquence nucléotidique de la région 5' du gène de protéine de paroi cellulaire de Bacillus brevis 47, les sites initiateurs de transcription indiqués par une flèche, et une séquence d'amino-acides correspondant au cadre de lecture ouvert que la Demanderesse a maintenant découverts. Sur la figure 3, le signe indique une région de promoteur et le signe - indique un codon initiateur de translation, chacun d'eux ayant été maintenant découvert par la Demanderesse. Le Tableau 1 montre les séquences nucléotidiques trouvées dans le site s'étendant de la région -10 à la région -35 en amont de chacun desdits quatres sites initiateurs de transcription. En résultat de l'analyse par la méthode de cartographie par S1, il a été confirmé que la transcription est amorcée à chacun des sites P2, P3 et P4 à une fréquence plus éle- vée qu'au site P1 dont la séquence est similaire à la sé- quence de consensus et comparable au promoteur du gène dt'-amylase de Bacillus licheniformis (Paml). Le Tableau 2 montre la force d'activité promotrice déterminée par la méthode de cartographie par S1 et il ressort clairement du Tableau 2 que les promoteurs P2, P3 et P4 ont une plus forte activité que le promoteur P1 et Paml. Tableau 1 région -35 région -10 P1 GTGACAGCCCGCCATATGTCCCCTATAATA P2 GCAACTTTTGATTCGCTCAGGCGTTTAATA P3 TTCACGAATTCTAGCAGTTGTGTTACACTA P4 TATACTAGAGATTTTTAACACAAAAAGCGA Paml TTGTTA TACAAT Paml: séquence de promoteur du gène d'a-amylase de Bacillus licheniformis. Tableau 2 Force de l'activité promotrice par la méthode de cartographie par Si Type du promoteur Activité promotrice Pi + P2 ++ P3 +++ P4 ++ Paml + (3) Préparation d'un vecteur à utiliser pour déterminer l'activité promotrice dans Bacillus brevis 47: Le gène d'a-amylase a été cloné à partir de la souche Bacillus licheniformis 584 (Arch. Biochem.-Biophys., 155, 290-298 (1973)) et inséré dans le vecteur plasmidique pHY 481 qui pouvait *tre maintenu de façon stable dans Bacillus brevis (Appl. Env. Microbiol., M, 1076-1079 (1985)) pour former le plasmide pHY 483 tel que représenté sur la figure 4. Il a été confirmé que toutes les séquences nucléotidiques de ce gène d'amylase étaient sensiblement les m&mes que celles de la région 5' du gène d'a-amylase de la souche Bacillus licheniformis FD02 (J. Bacteriol., 158, 369-372 (1984)), et que le gène d'amylase était tout à fait identique audit gène d'a-amylase pour ce qui est de la séquence dans la région -10 et la région -35, de la séquence dans le site de liaison au ribosome (séquence de Shine-Dalgarno), de 1lexistence dtune séquence de répéti- tion inversée qui est sÉpposée avoir la fonction d'arrater la transcription depuis le gène situé en amont, etc. En utilisant ce gène, un vecteur à utiliser pour déterminer l'activité promotrice a été préparé de la manière décrite ci-dessous. Tout d'abord, le plasmide pHY 483 a été clivé par l'enzyme de restriction BamHI, puis une partie s'étendant depuis le site de clivage jusqu'au site immédiatement antérieur à la séquence de Shine-Dalgarno du gène d'c-amylase a été sup- primé par la nucléase Bal 31, ce à quoi ont été ajoutées des molécules de jonction BamHI, et les produits résul- tants ont été mis soUS forme circulaire pour obtenir le plasmide pHY 483AP. D'une part, le plasmide pHY 483 a été clivé par l'enzyme de restriction PstI, puis une partie s'étendant du site de clivage jusqu'au site situé à une distance de 270 paires de bases à partir du site BamHI vers l'aval (c'est-à-dire jusqu'au site précédant immédia- tement la séquence de répétition inversée) a été supprimée de la même manière, des molécules de jonction BglII (5tCAGATCTG3t/3'GTCTAGAC5') y ont été ajoutées, et ensuite le produit a été mis sous forme circulaire pour obtenir le plasmide pHY 483aN. D'autre part, ltADN du plasmide pHY 483AP a été clivé par l'enzyme de restriction BamHI, traité à l'ADN-polymérase pour avoir des extrémités tron- quées auxquelles ont été ajoutées des molécules de jonction BglII (5'CAGATCTG3t/3tGTCTAGAC5'), puis clivé par l'enzyme de restriction SalI, et ensuite séparé par électrophorèse sur gel d'agarose pour obtenir un fragment BglII-SalI ayant 1,1 Kb et contenant la région 5' du gène d'amylase. En outre, ltADN de pHY 4834N a été clivé par les enzymes de restriction BglII et SalI pour obtenir un fragment de gène d'amylase, qui était dépourvu de sa région 5' et comportait 4,7 Kb. Ces deux fragments ont été ligaturés par la ligase T4 pour obtenir le plasmide pHY 4833 qui était exactement le même que celui obtenu à partir d'une souche transformée de Bacillus brevis 47. Le plasmide pHY 4833 conservait les séquences de répétition inversée et de Shine-Dalgarno en amont du gène d'amylase, mais il lui manquait les régions -35 et -10, comme le montre la figure 5. La figure 5 est un diagramme servant à expliquer un procédé de préparation du vecteur plasmidique pHY 4833 à utiliser dans la détec- tion des promoteurs, et elle montre des régions de plas- mides correspondant à la région qui s'étend sur tous les sites à cliver par les enzymes de restriction BamHI et SalI, qui sont représentés sur la figure 4. Sur la figure , le signe 0 indique la séquence de répétition inversée, le signe //// indique la partie supprimée, et la ligne Là indique le site de la séquence de Shine-Dalgarno ainsi que le sens de transcription du gène d'a-amylase. (4-1) Activité promotrice de la région 5' du gène de protéine de paroi cellulaire, par utilisation du plasmide pHY 4833 dans Bacillus brevis 47 comme h8te: La région 5' du gène de protéine de paroi cellulaire a été clivée et séparée pour former un fragment AluI-AluI de 600 paires de bases, un fragment AluI-RsaI de 165 paires de bases et un fragment RsaI-AluI de 435 paires de bases. Plus particulièrement, le fragment AluI-AluI était composé des nucléotides 116 à 715 incluant les sites initiateurs de transcription Pl, P2, P3, P4 et leurs régions -10 et -35 respectives, comme représentés sur la figure 3; le fragment AluI-RsaI était composé des nucléotides 116 à 280 incluant le site initiateur de transcription P1 et ses régions -10 et -35; et le fragment AsaI-AluI était composé des nucléotides 281 à 715 incluant les sites initiateurs de transcription P2, P3, P4 et leurs régions -10 et -35 respectives. Après que des molécules de jonction BamHI (5'CGGATCCG3'/3'GCCTAGGC5t) eurent été ajoutées à chacun de ces fragments, chaque fragment résultant a été inséré dans le site BglII du plasmide pHY 4833 pour obtenir les plasmides pTAl, pTA3 et pTA2, comme représentés sur la figure 6. La figure 6 montre les fragments de la région 5' du gène de protéine de paroi cellulaire, qui ont été pré- parés en insérant chacun desdits fragments respectifs dans le vecteur plasmidique pHY 4833 en vue de les utiliser pour détecter l'activité promotrice. Par transduction de chacun dès plasmides pHY 4833, pTA3, pTA2 et pTAl dans Bacillus brevis 47, des transformants respectifs ont été formés et chacun des transformants résultants a été mis à incuber en conditions aérobies dans du milieu T3 (2 % d'amidon soluble, 0,1 % de MgC12.6H20, 0, 4 % d'extrait de levure, 2 % de polypeptone, 0,5 % d'extrait de viande, 0,01 % d'uracile, pH 7) à 370C pen- dant 1 et 3 jours respectivement, puis la quantité d'amylase extracellulaire a été déterminée par le méthode de Saito en utilisant de l'amidon soluble comme substrat (Arch. Biochem. Biophys., 155, 290-298 (1973)). Le Tableau 3 montre les activités respectives d'amylase extracellulaire ainsi déterminées. Tableau 3 Plasmide Activité d'amylase extracellulaire (x 103 unités/ml) 1 Jour de culture 3 jours de culture pHY 4833 0,24 0,24 pTA 3 0,17 0,16 pTA 2 9,2 9, 8 pTA 1 7,8 10,0 (4-2) Détermination de l'activité promotrice de la région 5' du gène de protéine de paroi cellulaire, par utilisation du plasmide plHY 4833 dans Bacillus brevis 47 comme hôte: Le gène de protéine de paroi cellulaire a tout d'abord été traité par divers enzymes de restriction ou la nucléase Bal 31 de façon à raccourcir la région 5' de ce gène, puis des molécules de jonction BamHI (5'CGGATeCG3'/3'GCCTAGGC5') ont été ajoutées aux extrémités raccourcies pour préparer des fragments. Cahcun de ces fragments a été inséré dans le site BglII du vecteur plasmidique pHY 4833, qui était destiné à être utilisé pour déterminer l'activité promo- trice et obtenu dans le paragraphe précédent. Les plas- mides pTAl à pTA8, tels que représentés sur la figure 7, ont ainsi été obtenus. Chacun des plasmides pTAl à pTA8 a été introduit dans Bacillus brevis 47, et chaque transfor- mant a été mis à incuber en conditions aérobies dans du milieu T3 (2 % d'amidon soluble, 0,1 % de MgC12.6H20, 0,4 % d'extrait de levure, 2 % de polypeptone, 0,5 % d'extrait de viande, 0,01 % d'uracile, pH 7), A 37eC, et la quantité d'amylase extracellulaire a été déterminée par la méthode de Saito en utilisant de l'amidon soluble comme substrat (Arch. Biochem. Biophys., 15I, 290-298 (1973)). Les résultats figurent sur le Tableau 4. La partie du haut de la figure 7 montre les sites des pro- moteurs Pl à P4, la séquence de Shine-Dalgarno et le codon initiateur de translation qui sont décrits sur la figure 3; et la partie du bas de la figure 7 montre, en rapport avec lesdits sites de la partie du haut, les fragments de la région 5' du gène de protéine de paroi cellulaire qui ont été insérés dans le vecteur plasmidique pHY 4833 pour être utilisés dans la détection des promoteurs. Les numéros des nucléotides portés sur la figure 7 sont conformes à ceux de la figure 3. Tableau 4 Plasmide Activité d'amylase extracellulaire ( x 10 unités/ml) Jours de culture 1 jour 2 jours 3 jours pHY 4833 0,4 0,4 0,4 pTA 1 12,7 12,8 11,1 pTA 2 7,8 7,8 9,8 pTA 3 0,2 0,2 0,2 pTA 4 5,7 5,1 6,0 pTA 5 0,3 1,0 0,7 pTA 6 8,0 8,6 8,0 pTA 7 25,7 24,4 19,1 pTA 8 1,2 1,5 1,5 D'après ces résultats, on a conclu que, dans Bacillus brevis 47, la fréquence d'initiation de transcription se présen- tant au site initiateur de transcription P1 est très faible, ce site ayant des séquences -10 et -35 similaires à la séquence de consensus, tandis que les fréquences d'initia- tion de transcription apparaissant à chacun des sites ini- tiateurs de transcription P2, P3 et P4 sont beaucoup plus élevées, ces sites ayant des séquences -10 et -35 différen- tes de la séquence de consensus. En particulier, la fréquen- ce d'initiation de transcription apparaissant au site P3 est très élevée, et un Bacillus brevis 47 transformé por- tant le plasmide pTA 7 qui inclut un fragment comportant P3 seul a produit de l'a-amylase en une quantité 50 fois plus grande que celle produite par l'un ou l'autre des Bacillus brevis 47 transformés portant le plasmide pHY 4833 n'ayant aucun fragment ou le plasmide pTA 3 incluant P1 seul. A ce propos, la quantité d'amylase intracellulaire représente moins de 10 % de celle d'amylase extracellulaire. La sé- quence de consensus désigne la séquence de nucléotides qui inclut la séquence TTGACA de la région -35 et la séquence TATAAT de la région -10, les paires de bases étant au nombre de 17 entre ces deux séquences. Bacillus brevis 47 portant le plasmide pTA 2 a été déposé à Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, sous la référence FERM P-8504. Revendication. Procédé pour l'expression de gènes par Bacillus brevis, caractérisé par le fait qu'on opère la transduction dans une cellule de Bacillus brevis d'un plasmide réplicable comprenant: (1) une séquence nucléotidique (a) représentée par la formule générale MNOACP; (2) une séquence nucléotidique (b) située en aval de la séquence nucléotidique (a) et représentée par la formule générale QRSWXY; (3) une séquence nucléotidique (c) située en aval de la séquence nucléotidique (b) et agissant comme un site de liaison au ribosome dans la cellule de Bacillus brevis; (4) une séquence nucléotidique (d) située en aval de la séquence nucléotidique (c) et agissant comme un codon initiateur de translation dans la cellule de Bacillus brevis; et (5) un gène relié directement à la séquence nucléotidique (d) et devant être exprimé dans la cellule de Bacillus brevis; ou M représente G ou T; N représente C, T ou A; O repré- sente A, C ou T; P représente T ou G; Q représente T ou A; R représente T ou A; S représente T, C ou A; W représente A ou G; X représente A ou C; et Y représente T ou G; et en outre, A représente ltadénine, C représente la cytosine, G représente la guanine et T représente la thymine.