FR 2597981 A1 19871030 FR 8605931 A 19860424 PROCEDE DE DOSAGE DES ANTIGENES La présente invention concerne le domaine de l'analyse immuno-enzymatique, et plus précisément un procédé de dosage des antigènes. Les procédés de dosage des antigènes sont indispensables pour le diagnostic des affections de l'homme, des animaux et des plantes, pour la sélection des plantes et des animaux, ainsi que pour l'analyse des impuretés de l'environnement. Pour doser les antigènes, on utilise largement des méthodes immunologiques basées sur la réaction des antigènes avec les anticorps. Pour augmenter lasensibilité de ces méthodes, on utilise des anticorps marqués avec des composés radio-actifs ou fluorescents 15 ou avec des enzymes. La méthode d'analyse immunologique utilisant des anticorps marqués par les enzymes (analyse immuno-enzymatique) est de plus en plus utilisée ces dernières années en raison de sa sensibilité élevée et parcequ'elle n'oblige pas à travailler avec des sub20 stances nocives pour l'organisme. On connatt plusieurs méthodes d'analyse immuno-enzymatique. La méthode d'analyse immuno-enzymatique hétérogène (ELISA), dans laquelle l'antigène à doser est lié à la phase solide, est bien connue. Cette 25 liaison (fixation) est le plus souvent réalisée après l'adsorption de l'antigène à partir de la solution à essayer directement sur la surface d'un matériau polymère ou après avoir revêtu celle-ci d'anticorps spécifiques. On effectue ensuite la réaction entre l'antigène 30 adsorbé et la solution d'anticorps indiqués marqués par une enzyme (conjugué), à la suite de laquelle le conjugué est fixé à la phase solide. On sépare ensuite les phases solide et liquide et on détermine dans une des phases l'activité de l'enzyme, dont on déduit la quantité d'antigène dans la solution à essayer (brevet 15. 30 des EUA n" 3720760). Cependant, le procédé exige la préparation du conjugué pour chaque antigène à doser. Pour rendre le conjugué universel, on le prépare en utilisant les antiespèces d'anticorps. Dans ce cas, on ajoute les anticorps spécifiques à l'antigène lié à la phase solide, puis le conjugué d'enzyme contenant les anticorps antispécifiques obtenus contre l'espèce utilisée pour l'obtention des anticorps spécifiques (brevet britannique no 1549069). Les méthodes concrètes dans lesquelles on utilise les principes généraux se distinguent par le type d'enzyme choisi pour l'obtention du conjugué. Les propriétés de l'enzyme déterminant dans ûne large mesure les possibilités de la méthode concrète d'ELISA sont tout d'abord la sensibilité et le coût de l'analyse. Les propriétés souhaitées pour l'en yme sont une activité spécifique élevée et la stabilité lors du stockage. A cet effet, on utilisait principalement la phosphatase alcaline, la peroxydase, la $-galactosidase, le lysozyme, la A5, 3cétostéroidisomérase, la p-amylase, la glucose-oxydase et certaines autres. La phosphatase alcaline, la peroxydase et la B-galactosidase sont les plus répandues. Une caractéristique importante de la mnthode ELSA est égalemnt le type du substrat utilisé pour la détermination de l'activité de l'enzyme. Dans une large roesure, 1'enzyme détermine le choix du substrat, toutefois la plupart des enzymes admettent certaines variations dans la structure du substrat. Il est souhaitable que le dosage du produit de l'hydrolyse du substrat ait une sensibilité élevée, que le substrat soit peut coûteux et stable au stockage. Lorsqu'on utilise des conjugués contenant de la phosphatase alcaline, on choisit le plus souvent caoie substrat, le phosphate de para-nitrophényle (brevet des EUA N 3879262). La phosphatase alcaline est douée d'une activité spécifigoe élevée, mais elle est insuffisanuent stable lors du stockage. La couleur du produit d'hydrolyse du phosphatase de paranitrophényle, jaune-clair, est difficilement perceptible visuellement. C'est pourquoi il est indispensable d'utiliser un appareil de mesure pour évaluer les résultats de l'analyse. La peroxydase est souvent utilisée pour obtenir les conjugués dans la méthode ELISA, en raison de son coût peu élevé (brevet des EUA n 3791932). Cependant elle possède une activité spécifique inférieure, c'est pourquoi la sensibilité de la méthode utilisant cette enzyme est faible. De plus, un certain nombre de ses substrats possèdent des propriétés cancérigènes. La e-galactosidase possède une activité élevée et elle est stable au stockage. Comme substrats 15 pour celle-ci, on utilise les éthers paranitrophényliques: après leur l'hydrolyse il se forme une coloration jauneclair, difficilement perceptible visuellement (brevet français n 2288312) . Les substrats de la phosphatase alcaline, de 20 la peroxydase et de la egalactosidase, utilisés dans l'analyse immuno-enzymatique, sont instables en solution aqueuse et sont très onéreux, et les substrats de la phosphatase alcaline et de la egalactosidase sont instables lors d'un stockage prolongé à l'état 25 sec. De ce fait, les procédés connus de dosage de l'antigène n'assurent pas une sensibilité élevée de l'analyse, ils exigent des réactifs et des appareils coûteux, c'est pourquoi ils ne peuvent être utilisés 30 que dans des laboratoires spécialisés. On s'est donc proposé de mettre au point un procédé de dosage des antigènes, procédé gui possèderait une sensibilité élevée, particulièrement lors du dosage visuel de l'antigène, dans lequel on utiliserait 35 des réactifs stables et qui pourrait être accessible à un plus grand nombre d'utilisateurs. 10 15 20 35 La solution consiste en un procédé de dosage de l'antigène comprenant la préparation du conjugué par réticulation de l'anticorps avec l'enzyme; la fixation de l'antigène à doser à la phase solide; la réalisation de la réaction entre le conjugué indiqué et l'antigène à doser lié à la phase solide, avec formation des phases solide et liquide; la séparation des phases solide et liquide; la mise en oeuvre de la réaction entre l'une des phases et le substrat et la détermination, à partir de la valeur de l'activité enzymatique, de la quantité d'antigène, procédé qui, suivant l'invention, est caractérisé en ce que lors de la préparation du conjugué, on utilise comme enzyme une pyrophosphatase minérale (pyrophosphatephosphohydrolase, EC 3.6.1.1.). L'invention permet d'augmenter la stabilité du cohjugué des anticorps avec l'enzyme à haute température, étant donné que la pyrophosphatase minérale possède une thermostabilité élevée et supporte un chauffage jusqu'à 80OC. Conformément à l'invention, on propose, après avoir effectué la réaction de l'une des phases avec le substrat, d'introduire dans le mélange réactionnel un réactif colorant à savoir un acide minéral fort 3-7,5N contenant les constituants suivants (% en poids): un sel de l'acide molybdique 0,75-4,5, une substance tensio-active-O,05-O,3, le colorant vert malachite -0,025-0,25. Grâce à celà, on assure une haute sensibilité de l'analyse lors de la détermination visuelle de la densité optique. Conformément à l'invention, il est souhaitable d'utiliser comme substrat un sel de l'acide pyrophosphorique. Ces sels sont dotés d'une solubilité suffisanteet peuvent être par exemple un sel de sodium, un sel de potassium, ou un sel d'ammonium. On utilise le sel de l'acide pyrophosphorique indiqué 259798'1 en faibles quantités, étant donné que la constante de Michaelis pour la pyrophosphatase minérale n'est que de quelques micromoles par litre. De plus, le sel d'acide pyrophosphorique, comparé aux substrats connus utilisés dans l'analyse immunoenzymatique, est plus stable au stockage prolongé. La concentration de ce sel dans le procédé indiqué est de 0,02-0,5 mM. Conformément à l'invention, on propose d'isoler la pyrophosphatase minérale d'Escherichia co10 li, en réalisant le traitement thermique du mélange homogène de cellules à une température de 83-93 C et la chromatographie sur une colonne remplie de 1,6-diaminohexylagarose. Ceci simplifie le processus d'isoler ment de l'enzyme. - On trouvera ci-dessous une description détaillée de l'invention. Dans un premier stade de réalisation de l'invention, on prépare le conjugué des anticorps avec l'enzyme; comme enzyme, on utilise la pyrophosphatase 20 minérale. Cette enzyme est bien connue et décrite en détail dans la littérature (Josse J., Wong S.C.K. The Enzymes,v.4,p.495-527 (1971); Butler L.G., p. 529-541). Dans la présente invention on utilise la pyrophosphatase minérale isolée d'Escerichia coli. Le 25 procédé d'isolement de cette enzyme est décrit dans la littérature (Wong S.C.K., Hall D.C., Josse J.J. Biol. Chem., v. 245, p. 4335 (1970)). Un avantage important de cette enzyme est sa thermostabilité exceptionnelle. Ainsi elle supporte un chauffage jusqu'à 30 la température de 80eC pendant une heure et elle est stable pendant un stockage de 2 ans à la température ambiante. La masse moléculaire de l'enzyme est de 120000 dalton, et elle est alors constituée de 6 sousunités égales, dont chacune est dotée d'un centre actif. 35 L'activité catalytique de l'enzyme est d'environ 2400 sec1 à la température de 25 C. Ces propriétés de l'enzyme la rendent très efficace pour le dosage de l'antigène dans l'analyse immuno-enzymatique. Pour préparer le conjugué, on ajoute à une solution aqueuse de mélange de pyrophosphatase minérale et d'anticorps un agent de réticulation bifonctionnel (aldéhyde glutarique) et on la fait incuber avec celui-ci pendant un temps déterminé. On sépare le conjugué formé des composés de départ par filtration sur gel. On réalise ensuite la fixation de l'anticorps spécifique de l'antigène à doser à la phase solide; comme phase solide, on peut utiliser la surface de microplaquettes polymères pour l'analyse immuno-enzymatique ou un autre dispositif analogue. Pour celà, 15 on met en contact la surface et la solution d'anticorps, celui-ci est absorbé à la surface. On peut réaliser la réaction du conjugué et de l'antigène à doser lié à la phase solide, par deux procédés suivant l'anticorps choisi pour l'obtention 20 du conjugué. Si l'anticorps est spécifique de l'antigène à doser, on met en contact la phase solide et la solution de conjugué, et il en résulte sa fixation à la phase solide dans une quantité proportionnelle à celle de l'antigène à doser. Si l'anticorps est anti25 spécifique vis-à-visde l'anticorps spécifique, on réalise la réaction du conjugué et de l'antigène en deux stades. On met en contact d'abord la phase solide avec l'antigène lié et une solution d'anticorps spécifique, et il en résulte une liaison de l'anticorps à l'an30 tigène. Puis on met en contact la phase solide et la solution de conjugué après quoi ce dernier est lié à l'anticorps spécifique dans une quantité proportionnelle à celle de l'antigène à doser. Lorsque la réaction entre le conjugué et 35 l'antigène à identifier est terminée, on sépare les phases liquide et solide et on met en contact une de celles-ci avec une solution de substrat; comme substrat, on utilise un sel de l'acide pyrophosphorique marqué au 132pl. Après un délai déterminé, on identifie le 32p-phosphate résultant de l'hydrolyse du subs5 trat par pyrophosphatase minérale. Enfin, on mesure la radio-activité du 32pphosphate et l'on en déduit la quantité d'antigène dans l'échantillon. Une variante de ce procédé est celle dans laquelle, après la réaction de l'une des phases et 10 du substrat, on ajoute au mélange réactionnel un réactif colorant qui est un acide minéral fort 3-7, 5N contenant les constituants suivants (%en poids): sel de l'acide molybdique -0,75-4,5; substance tensioactive - 0,05-0,3; colorant vert malachite - 0,02515 b0,25. Comme sel molybdique, on peut prendre n'importe quel sel possédant une solubilité suffisante, par exemple le sel d'ammonium. La concentration optimale de ce sel dans le procédé revendiqué est de 1,5% en 20 poids. A une conoentration inférieure à 0,75% an poids, la densité optique, et par conséquent la sensibilité de la méthode sont réduites. A une concentration supérieure à (,5% en poids, la densité optique en l'absence de l'antigène à identifier augmente considérablement, ce qui diminue la sensibilité de la mé25 thode, surtout lors de l'analyse des faibles quantités d'antigène à déterminer. Comme substance tensio-active, on peut utiliser le Tween-20, le Triton X305 et le Sterox. Sa concentrationoptimale est de 0,2% en poids, valeur 30 pour laquelle le système est transparent jusqu'à 5 unités lors de la mesure de la densité optique. Une concentration en substance tensioactive inférieure à 0,05% en poids abaisse la limite supérieure de la densité optique pour laquelle la transparence optique du 35 système est conservée, et l'élévation de la concentration au-delà de 0,3% en poids diminue la densité optique en présence de l'antigène à déterminer. La concentration optimale en vert malachite est de 0,085% en poids. L'abaissement de sa concentration de 0,025% en poids diminue la densité optique en présence de l'antigène à déterminer, et son élévation au-delà de 0,25% en poids diminue la densité optique en présence de l'antigène à déterminer, et son élévation au-delà de 0,25% en poids augmente considérablement la densité optique en l'absence de l'antigène à déterminer. Comme acide, on peut utiliser l'acide sulfurique, l'acide chlorhydrique et l'acide perchlorique. L'acide sulfurique 5N donne les meilleurs résultats. L'abaissement de la concentration à moins de 3N ou son élévation au-delà de 7,5N diminue la densité optique en présence de l'antigène à déterminer. L'action du réactif colorant est basée sur sa réaction avec le phosphate provenant du substrat. Grâce aux concentrations d'acide utilisées dans 20 la présente invention, on obtient une bonne solubilité du vert malachite et il ne se forme pas de précipité. Sous l'effet du réactif colorant indiqué, le mélange réactionnel devient bleu-vert. Le coefficient d'extinction du composé coloré qui se forme est d'au 25 moins 50000 M-lcm-1. En cas d'absence de l'antigène dans l'échantillon à analyser, la coloration est jaune-pâle, ce qui assure un fort contraste. Ce virage de la teinte garantit une sensibilité élevée de l'analyse lors de l'évaluation visuelle de ses résultats. 30 Comme substrat, on utilise le sel de l'acide prohosphorique à la cccentration de O,02-O, 5nt4. La concentration optimale est de 0,05 mrL Si la concentration en sel-de l'aciCe pyrophosphorique est inférieure à O,02r4, la densité optique diminue considérablement en présence de l'antigène à dé35 terminer, et si la concentration est supérieure à 0,5 mM, la densité optique s'élève considérablement en l'absence d'antigène. L'utilisation du sel de l'acide pyrophosphorique comme substrat est avantageuse car il est moins coûteux que d'autres substrats utilisés pour l'analyse immunoenzymatique. De plus, sa stabilité est illimitée à l'état sec, et elle est d'au moins un an en solution aqueuse. Comme il est indiqué plus haut, pour l'obtention du conjugué, on utilise la pyrophosphatase 10 minérale. Il est recommandé d'utiliser la pyrophosphatase obtenue à partir de cellules d'Escherichia coli par homogénéisation de celles-ci, traitement thermique du mélange homogène de cellules à une température de 83 à 93DC, et chromatographie dans une colonne remplie de 1,6-diaminohexylagarose. Ceci permet de simplifier considérablement l'isolement de l'enzyme. Le traitement thermique du mélange homogène de cellules d'Escherichia coli à la température indiquée permet à ce stade de séparer plus complètement 20 les protéines étrangères de la pyrophosphatase. Ceci s'explique par le fait que la pyrophosphatase minérale résiste mieux au traitement thermique à température élevée que les protéines étrangères. La durée du traitement thermique dans le procédé revendiqué est 25 de 2 minutes. La température optimale du traitement est de 83 -85 C. Aux températures inférieures à 83 il reste davantage de protéines étrangères, aux températures supérieures à 930C, la pyrophosphatase minérale peut être inactivée. La chromatographie sur 1,6-diaminohexylagarose permet d'assurer une purification effective de la pyrophosphatase minérale, grâce au fait que son affinité pour ce sorbant est très grande, et qu'elle se sépare de lui à une concentration d'environ 0,5 mnM. Le degré de pureté de l'enzyme 35 obtenue déterminé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide, dépasse 90%. 15 20 25 30 35 Le procédé revendiqué permet de doser des antigènes visuellement d'après la valeur de la densité optique. La coloration est observée facilement à l'oeil lorsque la valeur de densité optique est supérieure à 0,1 unité, et elle reste stable pendant une semaine. En l'absence de l'antigène, la coloration est jaune-pâle, et en présence de celui-ci, elle est bleu-vert vif. Le coefficient molaire d'extinction du produit de la réaction est d'environ 50000 -1 -1 M cm à 630 nm. Le procédé de l'invention n'exige pas que le conjugué et le substrat soient conservés à basse température ou qu'ils aient une stabilité élevée. La stabilité élevée de l'enzyme permet de réaliser le dosage de l'antigène à une température de 50-60"C. Ceci réduit considérablement la durée de l'analyse. La technique d'isolement de l'enzyme, (la pyrophosphatase minérale) est simple et utilise une matière première accessible, à savoir Escherichia coli. L'utilisation comme substrat du sel de l'acide pyrophosphorique permet a'abaisser le co t de l'analyse de l'antigène. Le procédé revendiqué est accessible à un grand nombre d'utilisateurs. On donnera ci-dessous le meilleur mode de réalisation du procédé de dosage des antigènes. Comme enzyme pour la préparation du conjugué, on utilise la pyrophosphatase minérale. On isole la pyrophosphatase des cellules d'Escherichia coli. On traite la suspension de la biomasse d'Escherichia coli dans une solution tampon, dans un dispositif pour la destruction des cellules et l'obtention d'un mélange homogène. On soumet le mélange homogène de cellules obtenu à un traitement thermique à la température de 85'C pendant 2 minutes, après quoi on précipite l'enzyme indiquée avec du sulfate d'ammonium. On dissout le précipité obtenu dans de l'eau, on dialyse la solution et on la chromatographie dans une colonne remplie de 1,6-diaminohexylagarose. On mélange la pyrophosphatase minérale ob5 tenue avec les anticorps en présence d'aldéhyde glutarique et on maintient le mélange environ une heure à la température ambiante. On chromatographie le mélange obtenu dans une solution tampon. On réunit les fractions de l'éluat contenant le conjugué. Dans les cavités de la microplaquette pour l'analyse immuno-enzymatique, on place la solution tampon contenant les anticorps spécifiques visà-vis de l'antigène à doser. On élimine ensuite la solution d'anticorps, on lave la microplaquette avec 15 la solution tampon contenant du chlorure de sodium et du Triton X-305, et on place dans les cavités de la microplaquette une solution ou une suspension d'antigène à doser dans du tampon tris contenant du Triton X-305 et de l'albumine à la température de 20 37"C pendant 3 heures. Au bout de 3 heures, on élimine la solution ou la suspension d'antigène, on lave la microplaquette avec la solution tampon contenant du chlorure de sodium et du Triton X-305, et on place dans la cavité de la microplaquette une solution de conjugué de la pyrophosphatase minérale avec les anticorps spécifiques vis-à-vis de l'antigène à doser en présence d'une substance tampon, du Triton X-305 et de l'albumine, à la température de 55DC pendant 20 minutes. On élimine la solution de conjugué, on lave 30 la microplaquette avec l'eau et on place dans la cavité de la microplaquette une solution 0,05 mM de pyrophosphate de sodium non radio-actif contenant une substance tampon et le chlorure de magnésium, à la température de 55 C pendant 10 minutes, on ajoute en35 suite 0,05 ml de réactif colorant contenant une solution :::: à 1,5% en poids de molybdate d'ammonium, 0,085% en poids de vert malachite et 0,2% en poids de Tween-20 dans de l'acide sulfurique 5N, et on mesure la densil optique du mélange réactionnel à 630 nm. a Cette variante présente les avantages suivants. L'utilisation de la pyrophosphatase isolée d'Escherichia coli confère au conjugué une grande sta bilité grace à la stabilité de cette enzyme. La réalisation du traitement thermique du mélange homogène 10 de cellules d'Esherichia coli permet d'atteindre un degré de pureté élevé de l'enzyme et un rendement élevé en cette enzyme. L'utilisation du réactif colorant dans cette variante assure une transition contrastée de la coloration suivant la teneur en anti15 gène à doser et par cela même permet un dosage visuel de l'antigène avec une sensibilité élevée. Les exemples ci-après permettent de mieux comprendre la présente invention; les exemples 1-5 il lustrent l'isolement de l'enzyme, l'exemple 6 illus-20 tre la préparation du conjugué, les exemples 7-23 illustrent le dosage de l'antigène. EXEMPLE I Isolement de la pyrophosphatase minérale. Une suspension de 2 kg de biomasse d'Esche25 richia coli dans 6 1 de tampon tris-HC1 0,05 M, pH 7,2, contenant 10 mM de MgC12, est traitée dans 2' un homogénéisateur pour la destruction des cellules de la bactérie. On fait passer successivement le mélange homogène de cellules obtenu à une vitesse de 30 3,6 l/h, à travers deux échangeurs de chaleur dans lesquels circule de l'eau, de sorte que la température du mélange homogène à la sortie du premier échangeur de chaleur soit de 850C, et à la sortie du deuxième échangeur de chaleur de -10C;-le temps de D 35 passage du mélange à travers le premier échangeur de chaleur est de 2 minutes. On centrifuge le mélange t- homogène, on sépare le précipité obtenu et on le jette. On ajoute du sulfate d'ammonium au liquide surnageant jusqu'à une concentration de 55%, on centrifuge, on jette le précipité; on ajoute du sulfate d'ammonium au liquide surnageant jusqu'à une concentration de 75% et on centrifuge. On dissout le précipité dans 200 ml d'eau, on dialyse la solution contre de l'eau et on la fait passer dans une colonne (4x50 cm) remplie de 1,6-diaminohexylagarose. On lave la 10 colonne avec du tampon tris-HCl 0,05M, contenant MgCl2 et NaCl, la concentration en MgCl2 étant alors constante (1 mM) on porte la concentration en NaCl de O à O,8M et on lave la colonne avec le tampon indiqué jusqu'à désorption de la pyrophosphatase. On obtient 0,38 g d'une pyrophosphatase minérale ayant une activité spécifique de 500 U/mg à partir de 2 kg de biomasse d'Escherichia coli à la température de 25"C. Les résultats obtenus à chaque stade d'isolement de la pyrophosphatase sont résumés dans le tableau I. TABLEAU I Isolement de la pyrophosphatase minérale 30 Activite'speci- Rendement,% Stade fique de l'en-zyme,u/ml Mélange homogène de cellules 1,66 100 Traitement thermique 13,3 92 Fractionnement par 53,3 74 le sulfate d'ammonium Chromatographie sur 500 56 1, 6-diaminohexylagarose EX] 1só On se minérale ó 5 mais on modij le premier é EMPLE 2-5 olement de la pyrophosphatase minérale réalise 1'isolement de la pyrophosphatacomme il est décrit dans l'exemple I, fie la température de l'eau circulant dans changeur de chaleur de telle sorte que la lu mélange homogène à la sortie de celui) à 93 C. s valeurs d'activité spécifique et de renzyme sont présentées dans le tableau 2. TABLEAU 2 Activt éei- Rendement,% cifique de l'0enzyme,u/ig 350 60 430 54 550 52 570 31 MPLE 6 paration du conjugué de la pyrophosphatase les anticorps. mélange de 8 mg d'anticorps isolés du du lapin par précipitation avec du pocol et chromatographie sur de la DEAE-cel8 mg de pyrophosphatase minérale est dis1l de tampon phosphate 0,01 M à pH 7,4 con1 0,15 M, on ajoute 0,02 ml de solution yde glutarique dans de l'eau et on fait température de 22 C pendant une heure. aphie ensuite le mélange à la température ne colonne (2r5 x 80 cm) remplie de Sé0O dans un tampon trisHCl 0,05 M à pH 7,5 contenant NaCl 0,1 M et MgC12 lm1. On réunit les fractions du premier pic de protéine et on les utilise pour le dosage de l'antigène. EXEMPLE 7 Détermination du virus du mouchetage de l'oeillet. Dans la cavité de la microplaquette de polystyrène pour l'analyse immuno-enzymatique, on place une solution d'anticorps (10 mg/ml) spécifiques du virus de mouchetage de l'oeillet dans un tampon carbonate à pH = 9,6, à la température de 4 C, pendant heures. Au bout de ce temps, on élimine la solution d'anticorps, on lave la microplaquette avec du tampon tris-HC1 0,01 M à pH = 7,5, contenant du NaCl 0,15 M 15 et 0,1% de Triton X-305, et on place dans les cavités de la microplaquette une suspension de virus de mouchetage d'oeillet à une concentration déterminée dans une solution O,01M de tampon-tris-HCl à pH = 7,4 contenant 0,1% de Triton X-305 et 0,1% de sérumalbumine de 20 bovin, à la température de 30 7C, pendant 3 heures. Au bout de 3 heures, on élimine la suspension de virus, on lave les microplaquettes avec du tampon tris-HCl 0,01 M à pH = 7,5 contenant du NaCl 0,15 M et 0,1% de Triton-X-305, et on glace dans les cavités de la micro25 plaquette une solution de conjugué de la pyrophosphatase minérale isolé comme dans l'exemple I avec les anticorps spécifiques du virus de mouchetage de l'oeillet,,à la température de 55 C pendant 20 minutes, obtenu par la méthode décrite dans l'exemple 6, à la concentration 0,5 U/ml dans le tampon tris-HC1 0,01 M à pH = 7,5 contenant 0,1% de Triton X305 et 0,1% de sérum albumine de bovin. On élimine la solution de conjugué, on lave la microplaquette à l'eau et dans les cavités de la microplaquette, on place à la tempé35 rature de 55 C, pendant 10 minutes, une solution 0,05 15 N 20 25 m de 32p-pyrophosphate de sodium dans le tampon tris-Hcl 0,1M à pH = 9,0 contenant 5 mM de MgCl2 puis on ajoute 60 ml de solution de molybdate d'amonium 0,25 M et 14 ml de HCl 6N. Après avoir agité, on fait passer 0, 3 ml du mélange obtenu dans une éprouvette, on ajoute 0,3 ml de mélange isobutanol: benzène Cet exemple illustre la possibilité de la réalisation de l'analyse à une température élevée (55 C), ce qui permet de réduire le temps d'incubation des microplaquettes avec les solutions de conjugué et de substrat par rapport à celles généralement utilisées. TABLEAU 3 Concentration en Radio-activit' de la phase virus, ng/ml Organique, coups/min o (témoin) 450 I 710 ?_ 995 4 1450 2810 - 4520 EXEMPLE 8 Détermination du virus de mouchetage de l'oeillet avec utilisation d'un réactif colorant. On procède comme dans l'exemple 7, mais on maintient la solution deconjugué et la solution de pyrophosphate de sodium dans les cavités de la microplaquette & la température de 37 C, pendant une heure; comme substrat, on utilise le pyrophosphate de sodium non radioactif aux concentrations de 0,02, 0,05 et 0,5 mM, après la réalisation de la réaction entre la phase solide de conjugué lié à la surface et le substrat, on ajoute 0,05 ml d'un réactif colorant qui est une solution de 1,5% en poids de molybdate d'ammonium, de 0,085 % en poids de vert malachite et 15 de 0,2% en poids de Tween-20 dans de l'acide sulfurique 5N, et on mesure la densité optique du mélange réactionnel à 630 nm. Les données pour une série de concentrations du virus sont résumées dans le tableau 4. L'analyse visuelle a révélé que la coloration du mélange réactionnel vire du jaune-pâle en l'absence du virus au bleu vif dans le cas d'une concentration élevée en virus. La coloration des échantillons dont la densité optique est supérieure à 0,16 est nettement 25 différente de la coloration du témoin. TABLEAU 4 Concentration en Densité optique aux concentrations vtius, ng/ml du substrat indiquées, m0,2 0,05 0,5 O (témoin) 0,052 0,069 0,201 1 0,121 0,160 0,308 2 0,193 0,251 0,401 4 0,317 0,416 0,582 0,583 0,761 0,989 EXEMPLE 9-20 Détermination du virus de mouchetage de l'oeillet. On procède comme dans l'exemple 8, en utilisant du pyrophosphate de sodium 0,05 mM et diverses concentrations du molybdate d'ammonium, de la substance tensio-active, du vert malachite et de l'acide. La concentration du virus est de 10 ng/ml. Les résultats sont résumés dans le tableau 5. 10 EXEMPLE 21 Détermination de la globuline-13 S des graines du sarrasin. On procède comme dans l'exemple 7, mais au lieu de la suspension du virus on utilise une solu15 tion de globuline - 13 S à la concentration indiquée ci-dessous dans du tampon tris-HCl 0,01 M à pH = 7,5, contenant 0,1% de Triton X-305 et 0,1% de sérumalbumine de bovin. Avant l'addition de la solution du conjugué, on place dans les cavités de la micropla20 quette une solution d'anticorps de la globuline-13 S des graines de sarrasin, isolés du sérum sanguin du lapin dans 0,1 M de tampon tris-HCl à pH = 7,4, contenant 0,1% de Triton X-305 et 0,1% de sérumalbumine de bovin, après quoi on lave les microplaquettes avec 0,01 M de tampon tris- HCl à pH = 7,5 contenant 0,15 M de NaCl et 0,1% de Triton X-305. On obtient le conjugué comme dans l'exemple 6, en utilisant les anticorps anti-immunoglobuline G de lapin isolés du sérum sanguin du bouc. Comme substrat, on utilise 30 le pyrophosphate de sodium non radio-actif à la concentration de 0,05 mM, et après la réalisation de la réaction du conjugué lié à la phase solide avec le substrat, on ajoute 0,05 ml d'un réactif colorant ayant la composition indiquée dans l'exemple 8. TABLEAU 5 Nde empleemple Iolybdate de ammonium, % en poids Substan- Vert maoe- tonlachite, aio-ao- I en ive,% poids en poids Nob dité I I4A-.:A Densité optique dL u=,= en l'abs. en préN) de vius visence de virus de virus il 11 12 0lo 13 16 17 18 19 20 4,5 0,75 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 T.ween-20 T ween-20 -Il -_ _n _n -w s térox T riton X-305 T ween-20 -w-. 0,2 0,2 0,2 0,2 0,05 0,3 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,085 0,085 0,25 0,025 0,085 0,085 0,085 0,085 0,085 0,085 0,085 0,085 H2S045 ' _n 5 -_n- 5 -fi- 5 -Il- 5 -ni- 5 _n_ 5 -_- 3 _n- 7,5 -n- 5 -_- 5 IC1 5 HC1014 5 0,089 0,058 0,148 0,050 0,086 0,028 0,069 0,041 0,049 0,128 0,054 0,098 0,782 0,561 0,881 0,557 0,851 0,502 0,516 0,591 0,682 0,780 0,811 1,01 Les valeurs de la densité optique à 630 nm pour certaines concentrations de la globuline-13 S des 20 graines du sarrasin sont résumées dans le tableau 6. TABLEAU 6 Concentration en globuline-13 S Densité optique -des graines du sarrasin, ag/1 0. 0,065 6,7 0,132 0,281 0,589 15 25 30 EXEMPLE 22 Dosage de l'immunoglobuline G de la souris On procède comme dans l'exemple 8, en utilisant du pyrophosphate de sodium O,05 mM. Pour la préparation du conjugué, on a utilisé les anticorps anti-immunoglobuline G de souris, isolés du sérum de lapin. Les données pour quelques concentrations en immunoglobuline G de la souris sont résumées dans le tableau 7. TABLEAU 7 Concentration en immnoglobuline G Densité optique de la souris, ng/ml 0 0,055 4 0,165 ,6 0,339 31 0,563 62 1,37 EXEMPLE 23 Détermination du virus de mouchetage de 'l'oeillet. On procède comme dans l'exemple 7, mais pour la préparation du conjugué, on utilise la pyrophosphatase minérale isolée des levures de boulanger; comme substrat on utilise le pyrophosphate de sodium non radioactif à la concentration de 0,05 mM, et après la réaction entre le conjugué lié à la surface de la phase solide et le substrat, on ajoute 0,05 ml d'un réactif colorant ayant la composition indiquée dans l'exemple 8. Les résultats pour une série de concentration du virus du mouchetage de l'oeillet sont résumées dans le tableau 8. TABLEAU 8 Densre' optique Concentration du virueng/àl D eite optique 0 0,075 0,256 0,485 0,751 s N \ REVENDICATIONS 1 . Procédé de dosage des antigènes consistant: - à préparer un conjugué par réticulation d l'anticorps avec l'enzyme; - à fixer (lier) l'antigène à doser sur la phase solide; - à effectuer la réaction entre le conjugué indiqué et l'antigène à doser lié à la phase solide avec formation des phases solide et liquide; - à séparer les phases solide et liquide ob tenues; - à effectuer la réaction entre l'une des phases et le substrat et à déterminer la quantité d'antigène à partir de la valeur de l'activité enzymatique, caractérisé en ce que lors de la préparation du conjugué on utilise comme enzyme la pyrophosphatase minérale. 2 . Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'après avoir effectué la réaction ent la phase et le substrat, on introduit dans le mélange réactionnel un réactif colorant qui est un acide minéri fort 3-7,5N, contenant les constituants suivants (% 25 en poids): un sel de l'acide molybdique - 0,75 - 4,5, une substance tensio-active - 0,05-0,3, le colorant vert malachite -0,025-0,25. 3 .' Procédé suivant les revendications 1-2, caractérisé en ce que pour la détermination de l'acti30; vité enzymatique, on utilise comme substrat un sel de l'acide pyrophosphorique à une concentration de 0,020,5 mM. 4 . Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise la pyrophosphatase minérale, isolée d'un mélange homogénéisé de cellules ::5: e n tre al d'Escherichia coli par traitement thermique de ces cellules à une température de 83-930C et chromatographie sur du 1,6-diaminohexylagarose. s