FR 2586705 A1 19870306 FR 8612189 A 19860828 PROCEDE POUR LOCALISER ET PURIFIER DE L'ADN CONTENANT DES FAUX APPARIEMENTS INDIVIDUELS DE BASES. Cette invention se rapporte au domaine de la génétique moléculaire. Plus spécifiquement, l'invention se rapporte a la modification chimique d'acides nucléiques et à la localisation et à la purification de séquences spécifiques d'ADN. La comparaison des séquences parmi des molécules d'ADN homologues,courtes, pour révéler des différences - aussi légères qu'une unique substitution d'une paire de bases est une étape importante vers la compréhension de la base génétique pour la variation phénotypique et la maladie héréditaire. Lorsqu'une séquence d'ADN provenant d'un individu A diffère de la séquence d'ADN d'un individu B par une unique substitution d'une paire de bases, une approche générale pour analyser de telles substitutions individuelles des paires de bases consiste à séparer les brins provenant des individus A et B, à mélanger et à recombiner un brin provenant de A et un brin provenant de B; parce que les séquences sont identiques excepté sur le site substitué, les brins complémentaires reformeront la structure d'ADN duplex . L'hétéroduplex sera une molécule d'ADN à bases parfaitement appariées, excepté sur le site de la substitution de la paire de bases. A ce moment, un faux appariement se produira. Autrement dit, plutôt que la paire de bases normale A-T ou G-C, un mauvais appariement A-C, A- G, T-C, T-G, A-A, G-G, T-T, C-C se présentera (voir, par exemple, page 12 infra). En détectant un tel événement, on peut mieux comprendre la nature de la variation phénotypique et la base héréditaire pour certaines maladies, de même que proposer un schéma rationnel de classification pour de telles maladies. Des efforts passes pour détecter des bases mal appariées comprennent: 1) Le clivage par les nucléases de la fève de mungo et S,, sur les bases mal appariées dans les molécules d'ADN hétéroduplex (Shenk, T.E., et al, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 72:989-993 (1975) et Kowalski, D. et al, Biochem 15:4457 (1976)) (ces enzymes, cependant, clivent des faux appariements individuels de bases avec un rendement relativement médiocre); (2) Des changements de mobilité électrophorétique dans des gels de polyacrylamide dénaturants en gradient de concentration (Fisher, S.G. et Lerman, L.S., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80:1579-83 (1983)) (à moins d'être modifiée, cette technique permet de détecter seulement une fraction des différences dans la séquence des bases de l'ADN); (3) Une hybridation différentielle avec des sondes d'oligonucléotides qui diffèrent par une seule base(Wallace, R.B. et al Nucl. Acid Res 9:3647-56 (1981)) (cette procédure est utile seulement si une information préalable sur les séquences est disponible>. Cette invention surmonte les défauts des tentatives de la technique antérieure pour résoudre des faux appariements individuels de paires de bases par un "marquage" spécifique des régions mal appariées et par une détection de ces dernières par électrophorèse. L'invention propose également un procédé pour purifier les segments de gènes spécifiques. Cette invention propose un procédé pour détecter l'ADN duplex contenant des faux appariements individuels de bases consistant à: - former une molécule d'ADN duplex contenant au moins un faux appariement individuel de bases; - - faire réagir ledit ADN duplex mal apparié avec un carbodiimide; identifier ledit ADN duplex mal apparié ayant réagi, par détection d'une différence de mobilité électrophorétique dudit ADN par comparaison avec la mobilité d'un ADN témoin duplex parfaitement apparié. Dans un autre mode de réalisation, cette invention propose un procédé pour purifier l'ADN hétéroduplex parfaitement apparié, consistant à: a) former un mélange d'un ADN hétéroduplex parfaitement apparié et d'un ADN hétéroduplex imparfaitement _ apparié; b) faire réagir le mélange avec un carbodiimide pour marquer les hétéroduplex imparfaitement appariés; c) séparer l'ADN hétéroduplex imparfaitement apparié marqué, de l'ADN hétéroduplex parfaitement apparié non marqué. La Figure 1 illustre un arbre généalogique typique démontrant la transmission héréditaire d'une maladie (cancer), comme trait dominant autosomal. La Figure 2 illustre divers types d'hybrides qui forment, lors de la réassociation d'ADN dénaturés mélangés, provenant de deux individus et deux stratégies pour leur discrimination. Dans la stratégie 1, on fait réagir l'ADN provenant de l'individu A avec la méthylase AluI et on fait réagir l'ADN provenant de l'individu B avec la méthylase Dam. Seul l'ADN hétéroduplex (A/B) sera résistant à la fois à l'enzyme de restriction AluI et à l'enzyme de restriction XKhI (sensible à la méthylase Dam). Le vecteur sera traité avec les deux méthylases. Seuls des recombinants avec des inserts A/B qui sont résistants à la digestion par à la fois AluI et MbI seront capables de former des plaques. Dans la stratégie 2, l'ADN provenant de l'individu A sera coordiné à des coupleurs avec les extrémités de l'enzyme de restriction BmHl et 1'ADN provenant de l'individu B sera coordiné à des coupleurs avec l'enzyme de restriction EcoR1. L'ADN hétéroduplex (A/B) aura une extrémité BmH1 et une extrémité E!,_R1 et formera seulement des colonies de recombinants dans des vecteurs contenant un site d'insertion composé d'une région EQR1 et d'une région jLmHI. La Figure 3 illustre la séquence des nucléotides du fragment Ft I de 371 paires de bases de l'oncogène pT24. T6 se rapporte au fragment ELt I inséré dans le site Pst I de M13mp8 dans la direction de transcription. T9 se rapporte au fragment inséré dans l'orientation opposée. Les séquences encadrées sont des différences entre l'oncogène et son pTPT homologue non transformant. Ainsi, la séquence encadrée en position 90 n'estpas présente dans pTPT. Les substitutions individuelles de bases dans l'oncogène sont montrées en position 220 (substitution glycine à valine de l'oncogène) et en position 266 (mutation muette dans le codon de l'hystidine). Un axe de symétrie est également indiqué. La Figure 4 illustre des Recombinants X13: H-ras. Les structures des recombinants M13mp8 sont montrées. La ligne en trait épais représente le fragment Pst I de 371 paires de bases provenant de pT24 et le fragment Fat I de 365 paires de bases provenant de pTPT qui a été inséré dans le polycoupleur M13mp8. La flèche en trait plein indique le site d'hybridation de l'amorceur pentadécamère X13 qui a été utilisé pour l'extension par l'amorceur. La ligne ondulée montre la direction 5'-3' de l'extension par l'amorceur. (voir Matériaux et Méthodes pour les détails). Des recombinants de l'oncogène sont appelés T6 et T9. Dans le recombinant T6 de l'oncogène, le site Sma I interne du fragment Pst I de 371 paires de bases est le plus rapproché du site Sma I du polycoupleur M13. Dans le recombinant T9 de l'oncogène, le fragment PJt I est inséré dans l'orientation opposée. Des recombinants homologues de type sauvage sont appelés P6 et P9. Dans le recombinant P6 de type sauvage, le fragment Pst I de 365 paires de bases est inséré dans la mâme orientation que T6. Dans le recombinant P9 de type sauvage, le fragment Pst I de 365 paires de bases se trouve dans la même orientation que T9. La Figure 5 illustre les paires hétéroduplex formées par hybridation mal appariée. La paire hétéroduplex (A) a été formée à partir du brin marqué de P6 prolongé par l'amorceur et son brin complémentaire à partir de T6RF non marqué. La paire hétéroduplex (B) a été formée à partir du 258 6 705 brin marque de T9 prolongé par l'amorceur et son brin complémentaire à partir de P9Rf. La paire hétéroduplex (C) a été formée à partir du brin marqué de T6 et son brin complémentaire, à partir de P6RF. La paire hétéroduplex (D) a été formée à partir du brin marqué de P9 et son brin complémentaire à partir de T9RF.La région non appariée de 6 bases et les faux appariements individuels des bases sont indiqués pour chaque hétéroduplex. Les sites des enzymes de restriction utilisés dans l'étude sont montrés, de même que les longueurs des fragments de restriction. La Figure 6 illustre la réaction du carbodiimide aux extrémités des fragments de restriction. A. Le fragment Pst I de S365 paires de bases, isolé, provenant de P6 prolongé par 1' amorceur a été traité comme indiqué et étendu sur un gel de polyacrylamide à 12%. Pistes 1, 2 et 3: incubé à 30'C, 37 C et 45 C sans carbodiimide. Pistes 4, 5 et 6: ayant réagi avec le carbodiimide (comme décrit dans "Matériaux et Méthodes") à 'C, 37 C et 45 C. B. Le fragment SmaI de 228 paires de bases, isolé, provenant de Pg prolongé par l'amorceur a été traité comme indiqué et étendu sur un gel de polyacrylamide à 12%. Pistes 1, 2, 3 et 4: incubé à 3O'C, 37 C, 45'C et 55 C sans carbodiimide. Pistes 5, 6, 7 et 8, ayant réagi avec le 2-5 carbodiimide à 3O'C, 37 C, 45'C et 55'C. La Figure 7 illustre l'effet de la région non appariée de 6 bases sur la mobilité de l'hétéroduplex. P6 prolongé par l'amorceur et l'ADN hétéroduplex A (Figure 3) ont eté clivés avec Sma I, séparés sur un gel à 5% et la bande de 167 paires de bases a été purifiée comme décrit dans "Matériaux et Méthodes". L'ADN purifié a ensuite été étendu sur un gel de polyacrylamide à 12%. Piste 1) fragment $ma I de 167 paires de bases provenant de P6 prolongé par l'amorceur. Piste 2) ADN dénaturé provenant du fragment Sma I de 167 paires de bases. Piste 3) fragment Sma I de 167 paires de bases,isolé à partir de 1' hétéroduplex A(voir Figure 5>. L'hétéroduplex A contient une région non appariée de six bases et présente une mobilité diminuée dans le gel. L'hêtéroduplex migre à la même position que des fragments de 650 paires de bases. Les marques des poids moléculaires de l'ADN à double brin sont indiquées. La Figure 8 illustre l'analyse de la modification par le carbodiimide de la région non appariée de six bases avec la séquence GGGGCT sur un gel de polyacrylamide à 12%. Piste 1) fragment Sma I de 167 paires de bases provenant de P6 prolongé par l'amorceur, purifié comme décrit dans "Matériaux et Méthodes". Piste 2) fragment Ema I après réaction avec le carbodiimine à 30'C. Piste 3) fragment Em I provenant de l'hétéroduplex A (voir Figure 5) qui présente une région non appariée de six bases (GGGGCT). Piste 4) fragment Ema I hétéroduplex ayant réagi avec le carbodiimide à 30'C. La Figure 9 illustre l'analyse de la modification par le carbodiimide de la région non appariée de six bases avec la séquence CCCCGA sur un gel de polyacrylamide à 12%. Piste 1) fragment Sma I de 167 paires de bases provenant de T6 prolongé par l'amorceur. Piste 2) fragment Sma I après réaction avec le carbodiimide à 30'C. L'ADN à double brin présent dans la piste 1 est quantitativement modifié. Piste 3) fragment de restriction de EmaI provenant de l'hétéroduplex C (voir Figure 5) qui présente une région non appariée de six bases (CCCCGA). Piste 4) fragment Ema I hétéroduplex ayant réagi avec le carbodiimide à 30'C. La Figure 10 illustre les déplacements de mobilité dus à la modification par le carbodiimide. A. Le fragment Sma I de 228 paires de bases a été mis à réagir comme indiqué, clivé avec Sau III AI et les fragments ont été séparés sur un gel de polyacrylmide à 15%. Piste 1) homoduplex non modifié-'(P9 prolongé par 1' amorceur); Piste 2) hétéroduplex B non modifié (voir Figure 5). Pistes 3, 5 et 7) homoduplex ayant réagi avec le carbodiimide à 30 C, 37 C et 45 C respectivement. Pistes 4, 6, et 8)hétéroduplex B ayant réagi avec le carbodiimide à 'C, 37'C et 45 C, respectivement. B. Le fragment Pt I de 365 paires de bases a été mis à réagir comme indiqué, doublement digéré avec Em I et E& IIIA1 et les fragments ont été séparés sur un gel de polyacrylamide à 15%. Sau IIIAI n'a pas digéré Jusqu'à achèvement, de sorte que des quantités différentes des produits de la digestion partielle des 365 et 213 paires de bases ressortent dans les pistes. Les longueurs des fragments sont indiquées sur la gauche et les déplacements de mobilité provoqués par la présence de la région non appariée de 6bases sont présentés entre parenthèses. Piste 1) homoduplex non modifié (P6 prolongé par l'amorceur); Piste 2> hétéroduplex A non modifié (voir Figure 5). Pistes 3, 5 et 7 >homoduplex ayant réagi avec le carbodiimide à 'C, 37'C et 45'C respectivement. Pistes 4, 6 et 8 ) hétéroduplex B ayant réagi avec le carbodiimine à 30'C, 37'C et 45'C, respectivement. La Figure 11 présente des illustrations schématiques d'enchevêtrements" qui peuvent être formés lorsqu'une séquence d'ADN répétée s'hybride avec son complément localisé ailleurs dans le génome. La Figure 12 illustre un arbre généalogique typique pour une forme de cancer héréditaire du sein. La Figure 13 illustre les résultats de l'analyse cite"Southern blot" de divers fragments d'ADN provenant d'individus identifiés sur la Figure 12 conformément à l'invention en objet. Cette invention propose un procédé pour la détection et la récupération de séquences d'ADN, qui contiennent de faux appariements individuels des bases par application d'une "marque", suivie par la dénaturation et la recombinaison d'un produit de digestion par une endonucléase de restriction d'un mélange des échantillons a comparer. La "marque" est spécifique pour les régions non appariées de l'ADN. La réassociation de brins uniques à partir de fragments identiques produit des homoduplex parfaitement appariés, alors que la réassociation de brins uniques provenant de fragments qui diffèrent sur une base unique engendrera des hétéroduplex contenant une paire non appariée. La "marque", lorsqu'elle est liée, modifie la mobilité électrophorétique de seulement l'hétéroduplex dans un gel de polyacrylamide et, de ce fait, facilite la détection et la récupération du fragment intéressant. La "marque' choisie est le carbodiimide, étant donné qu'il modifie seulement les résidus de guanine non appariées dans l'ADN. Ce fait est prévu, étant donné que Kelly & Naden (Nucleic Acid Res. 8:4521-34 (1980)) ont montré, en examinant la structure secondaire de l'ARN ribosomal, que le carbodiimide réagit avec les paires plus stables non appariées d'uracile (U) et d'amide G, comme il le fait avec les mêmes bases dans des séquences non appariées. Les extrémités d'une molécule d'ADN à extrémités aplaties sont déstabilisées par rapport aux parties intérieures et leur disponibilité pour la modification par le carbodiimide pourrait obscurcir les différences résultant de faux appariements internes. Cependant, Kelly et Naden supra) ont également montré qu'alors que les paires rG:rC à l'extrémité d'une région & double brin du r-ARN ont été sujettes & une modification par le bisulfite comme réactif spécifique des bases, elles sont non réactives vis-à-vis du carbodiimide, suggérant en outre les avantages du choix du carbodiimide. Enfin, la modification par le carbodiimide est réversible par incubation dans des conditions douces, légèrement alcalines (pH 10,5, 21 C), ce qui n'affecte pas l'ADN duplex (Ho, N.W.Y. et Gilham, P.T., Bioche. 6:3632-39 (1967)). Dans les Exemples qui suivent, un dosage mettant en jeu l'électrophorèse dans des gels de polyacrylamide à pourcentage élevé de molécules d'ADN hétéroduplex avec des modifications des séquences aussi petites qu'un unique faux appariement des bases est décrit. Le carbodiimide a modifié de façon quantitative les bases G et T dans ces faux appariements, conduisant à une réduction de la migration à travers le gel de polyacrylamide. La capacité pour modifier de façon sélective des faux appariements individuels de bases et ensuite à détecter ceux-ci présente une utilité immédiate dans plusieurs domaines de la génétique moléculaire. Dans un premier mode de réalisation, cette invention peut être utilisée comme système pour la détection des mutations. Ce mode de réalisation envisage l'usage d'une sonde oligonucléotide (soit isolée à partir d'une source naturelle, soit chimiquement synthétisée), qui peut être marquée avec un réactif analytiquement détectable. Les séquences d'ADN dans un échantillon sont alors testées à l'aide du procédé de la présente invention, afin d'identifier toutes les séquences différant de la séquence sonde par au moins une unique paire de bases. Des tentatives pour détecter des changements individuels de bases ont reposé sur des mutations qui modifiaient les sites de clivage de l'enzyme de restriction, $0 cependant, étant donné que-des mutations qui modifient les sites de restriction représentent seulement un petit sous- ensemble de la mutation totale possible,un tel système de détection ne présente donc qu'une utilité limitée. Comme cela a eté mentionné au préalable, un autre procédé met en jeu l'utilisation d'oligonucléotides qui franchissent la région dans laquelle la mutation du moment doit être detectée. La longueur de l'oligonuclêotide est choisie de telle sorte qu'un unique faux appariement des bases conduit à un hybride de stabilité diminuée (voir par exemple:Suggs, S.V. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78(11>:6613-17 (1981) Conner, B.J. et al.. Proc. Nat'l Acad. Sci.. USA (1> :278:82 278-82 (1983); et Schultze, D.H. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 80 (7):2007-11 ). Les limitations d'une telle approche comprennent une faible sensibilité, en raison de la contrainte placée sur les conditions d'hybridation posée par le besoin de distinguer les ADN parfaitement appariés et à faux appariements individuels des bases; une hybridation de fond substantielle par suite de la redondance inhérente à l'utilisation d'oligonucléotides de courte longueur, et le besoin d'une température - précisément contrôlée d'hybridation et d'élution de façon à distinguer entre un ADN duplex parfaitement apparié et un ADN duplex contenant un unique faux appariement des bases, Le procédé de la présente invention permet l'utilisation d'oligonuléotides plus longs, réduisant ainsi de façon substantielle le problème de l'hybridation de fond expérimenté dans la technique antérieure. En plus de modifier le faux appariement lui-même, des conditions de dosage peuvent être employées, lesquelles augmentent la sensibilité de la détection. Dans un autre mode de réalisation, le procédé de cette invention propose un moyen pour la purification de séquences de l'ADN unique. Le développement du procédé nécessite qu'il existe des arbres généalogiques qui démontrent l'héritage de la maladie dans un mode bien défini. Cette situation existe pour le cancer du colon, le cancer du sein et la fibrose kystique. De tels arbres généalogiques existent pour une diversité d'autres maladies. La Figure 1 propose un arbre généalogique hypothétique pour le cancer du colon. Dans l'arbre généalogique illustré sur la Figure 1, les enfants A et B ont tous les deux hérité du gène qui prédispose au cancer du colon, et ils l'ont hérité d'un arrière-grand parent commun. M>me si l'ADN que A et B partagent ensemble comprend le gène qui prédispose au cancer du colon qu'ils héritent de leur arrière-grand parent commun, la fraction d'ADN que A et B partagent ensemble est une petite fraction de leur ADN total. Avec chaque génération, la moitié de l'ADN apporté provenait d'un mâle ou d'une femelle non apparenté (symboles entourés de cercles en pointillés sur la Figure 1). Ainsi, si l'on était capable d'isoler l'ADN que A et B héritent en commun de C et D, on resterait (dans le cas de cette illustration), avec seulement 1/64 x 2 de l'ADN, mais comprenant la région qui contient le gène dont l'allèle de mutant prédispose au cancer du colon. En réalisant l'isolement de l'ADN hérité en commun, on a enrichi 32 fois le gène qui prédispose au cancer du colon. Le procédé de séparation de l'ADN hérité en commun de l'ADN non hérité en commun tire avantage du fait qu'environ 1 parmi 400 bases d'ADN est différente entre deux individus qui ne sont pas apparentés. Par conséquent, l'ADN qui n'est pas hérité en commun (non apparenté) aura des différences de séquence environ toutes les 400 bases d'ADN. L'ADN hérité en commun n'aura pas de (ou très, très peu) de différence de bases d'ADN. Voir les Exemples illustratifs ci-dessous. Hérité en commun Non hérité en commun Individu A Individu A A T G C T C G T A GAGTCT T A C G A G C A T C C T C A G A Individu B Individu B A T G C T C G T A G A G T C T T A C G A G C A T A C T C A G A On peut voir que les régions d'ADN non héritées en commun présentent des différences dans leurs séquences d'ADN. Lorsque ces séquences d'ADN sont chauffées de telle sorte que les deux brins d'ADN se séparent, se mélangent et qu'on les laisse ensuite refroidir de telle sorte que les brins d'ADN se recombinent, les structures suivantes sont parmi les structures qui seront engendrées si l'ADN provenant de A s'apparie avec l'ADN provenant de B. On peut voir que la base mal appariée (A) A T G C T C G T (A) A G G A G T C T (B) T A C G A G C A (I) (B) T A C T C A G A (II) A On peut voir que la base mal appariée (G/A> conduit au cas o l'ADN n'a pas été hérité en commun. Le but final est alors de purifier la structure I pour éliminer la structure II. Cependant, il y a deux obstacles techniques qui se dressent dans la voie de la tentative d'une telle purification. Ces obstacles sont: A) recombiner l'ADN dans le génome humain complexe et B) éliminer l'ADN autocombiné. A) Si les ADN provenant de l'individu A et de l'individu B sont chauffés et sont ensuite refroidis, ils s'apparieront suivant les bases. Cependant, la nature du génome humain (le complément d'ADN entier) est telle qu'il comprend des séquences d'ADN répétées. Autrement dit, la même ou pratiquement la même séquence d'ADN (à savoir une séquence de 300 paires de bases) se produit de nombreuses fois dans le génome. Alors qu'une grande partie de l'ADN est unique (autrement dit, s'il se produit deux fois - 1 copie maternelle et 1 copie paternelle), quelques séquences d'ADN répétées sont dispersées à l'intérieur de ces séquences uniques. Cette situation présente le risque de provoquer des problèmes si les séquences d'ADN répétées provenant d'une region s'hybrident aux mêmes séquences d'ADN répétées mais dans un contexte d'ADN unique différent. Des structures dites "enchevêtrées" peuvent être engendrées, lesquelles peuvent être visualisées au microscope électronique, comme cela est représenté sur la Figure 11. En modifiant une technique dite PERT (technique de réassociation en émulsion dans le phénol), telle que décrite par Kohne, D.E. et al. (1977")) et par Wieder, R et J.G. Wetmur (Biopolymers 21:655- 677 bases peuvent être recombiné à l'aide de cette procédure. B) Après que 1'ADN ait été chauffé (ou traité avec un alcali), ses deux brins se séparent. Le but en ce qui concerne la présente invention est d'obtenir des molécules d'ADN à double brin qui se reforment et consistent en un brin dérivé d'un individu A et en un brin dérivé d'un individu B (c'est-à-dire des molécules hétéroduplex). Cependant, la moitié de la masse de l'ADN à double brin qui est obtenue sera réellement composée de deux brins d'ADN provenant de l'individu A ou de deux brins provenant de l'individu B (Figure 2). Ces molécules doivent être eliminées. Les enzymes de restriction clivent l'ADN sur des séquences spécifiques. Les enzymes de restriction existent conjointement avec des enzymes dites méthylases. Une enzyme de restriction présente une méthylase apparentée. La méthylase protège la séquence spécifique du clivage qui est l'objectif normal pour son enzyme de restriction. La sélection d'une combinaison particulière enzyme de restriction / méthylase est de la compétence de l'homme de ap a4Ts aI.uvu9lduoo sapT$oilonUO2TIo,p aouanbps aun oaA2 UITijxa ua slnSbaum uos npTATpuT,I ap;uvueaoId NKVp %uatueij eI 'TsuTv enbTjTods apToglionuoRTio anealdnoo un,p uoTTppv,I T d qTuriqax9 ue senblm O& duos seTelde s x^ii.Txe sel 'uoTIs92Tp sQady IS assatIonu mI led uoTseSTp md aldurexe avd '%ueua.Anoo9J ep uoTSia ml ep uoT$uTuI Tl, d ssi$Td s9% sxa v> selnogIOu ue sTjiAuoo aSJa 4uaTviAep uoT4o-ai ap s9Tnpoid sla% ap 'eaasTjTin nz 4se uTiq saldTs 4uemaSJAnOoaI Sp uoTS2i aun 4Tulno$ inb esvglonuopua aun Ts '-umpuedseo 'siTvITmTs %a IJM I II=OZ 'IIl7CM I I Ibv ' IT ' In-V aUMmo 's T Isi'Qde a çQaax w uopsSTp @p s%4npold sep %quanoj Tnb @ssglonuopue sun zesTIn exQ;,ad uo 's Xoldme %sa 9es-lonuopue eun T 'uemieIsTo avd asidexe Iad 'enbTsú-qd uaeom un l.d no es!a, I:cnuopue aun a-ed uoTIseSTp jwd gsTIsag eu4g %nad oeo e'suS un,p IjTs -l 8p sUP uenTxoJddl s%:uem2vZl sep % $TnPga %a T ajngTq m @p 9IOST %se cEV, '(E) npTATpuT puooas un lad 9%oddi;se uTq I eznmn 4 '(V) npTATpuT un,p iVI avd,4odde %se xealdnp np uTJq un,nb js.xnsse inod ama qsús aS:In-P un suve * 4mJXsqns Iaq un vieinDoid Sv HrV. 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Ainsi les seules colonies dans lesquelles les segments parfaitement appariés sont contenus à l'intérieur de l'ADN plasmide survivront et se développeront. Cette procédure procure une méthode pour Z586705 la récupération préférentielle et l'enrichissement des duplex parfaitement appariés parmi lesquels est contenue l'information génétique intéressante et qui pourront être analysés directement ou sous-clonés. Parce que dans la stratégie PERT/méthylase discutée ci-dessus, des molécules hétéroduplex longues sont créées ou Charon 35, comme décrit par Loenen, WAX et F.R. Blattner (Gene 26: 171-179 (1983>). C'est est un vecteur acceptant EgRI avec une capacité d'insert de 7-20kb. Dans ce mode de réalisation, l'ADN autorecombiné est éliminé par traitement des bras du vecteur avec & la fois la méthylase AluI et la méthylase DAM. Les ADN qui sont hétéroduplexés sont traités séparément avec les méthylases telles que décrites ci-dessus. Après que l'insert ait été coordiné dans le vecteur, le mélange est traité avec des enzymes de restriction AluI et MboI. Seules les molécules hétéroduplex resteront intactes et formeront des plaques. Dans un autre mode de réalisation, les ADN modifiés par le carbodiimide et non modifiés peuvent être séparés par un procédé d'électrophorèse sur gel à deux dimensions. Conformément à ce procédé, l'échantillon contenant les espèces à la fois modifiée et non modifiée sont soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide dans une première dimension. Les fractions carbodiimide sont ensuite éliminées in situ par traitement du gel avec un alcali (pH 10,5). Les échantillons sont ensuite soumis à une électrophorèse dans une seconde dimension à angles droits par rapport à la première dimension. L'ADN qui ne modifie pas sa mobilité est récupéré pour le clonage. Dans un mode de réalisation fi.nal, les sondes engendrées par la procédure de comparaison A/B peuvent être utilisées dans un système de classification pour identifier des régions comparables dans d'autres éléments de la famille. La Figure 12 représente un arbre généalogique typique pour une forme héréditaire du cancer du sein. Lorsque la comparaison des ADN qui a été réalisée entre A et B est maintenant réalisée entre C et D, et entre E et F également, on engendre trois "bibliothèques" de fragments d'ADN clones. Les ADN provenant de ces "bibliothèques" ainsi engendrées sont immédiatement traités avec une enzyme de restriction,de telle sorte que la population des inserts d'ADN humain est enlevée. Ce mélange complexe est alors soumis à la technique de "Southern blotting". Des techniques existent pour effacer l'ADN vecteur (le plasmide ou phase ADN) et également toutes séquences répétées d'ADN dans les inserts d'ADN humain. Des résultats typiques du "Southern blotting"'l de l'ADN C contre D, et de l'ADN E contre F sondés avec l'ADN A contre B reproduit en se complétant génétiquement apparaîtraient comme représenté sur la Figure 13. En référence à la Figure O 13, on a fait figurer les lignes en pointillé qui relient les bandes qui migrent à la même vitesse dans les comparaisons C/D et E/F. Celles-ci représentent des séquences qui se produisent dans A/B (source de sondes d'ADN marquées par radioactivité), de même que dans les bibliothèques C/D et E/F. Ces séquences sont très susceptibles d'être reliées intimement au gène pour le cancer héréditairedu sein. Les bibliothèques doivent contenir seulement des séquences d'ADN co-héritées, identiques, de comparaisons entre l'ADN des individus A et B, ou C et D, ou E et F. Les plaques individuelles correspondant aux bandes peuvent être "pêchées" dans la bibliothèque par des dosages classiques sur plaques. Méthodes générales et matériaux Les méthodes et matériaux suivants sont utilisés en relation avec les Exemples qui suivent. en relation avec les Exemples qui suivent, Les enzymes de restriction ont été achetées & Bethesda Research Laboratories ou à New England Biolabs et utilisées selon les indications du fournisseur. Les produits radiochimiques ont été achetés & Amersham International. L'acrylamide et le bisacrylamide ont été achetés à Bio-Rad. L'amorceur pentadécamére M13 et le fragment Klenow de la polymérase I d'ADN ont été achetés à Bethesda-Research Laboratories. Le cyclohexyl-1 (morpholino-2 éthyl)-3 carbodiimide métho-p-toluène sulfonate a été acheté à Aldrich Chemical Co. Inc. et préparé sous la forme d'une solution aqueuse 0,5x. pT24, un plasmide contenant l'oncogène H-ras humain (Capon, D.J. et al. Nature 302:33-37 fragment Eg_ I inséré dans les deux orientations (Figure 4). Extension par l'amorceur L'ADN du phage M13 & brin unique contenant l'oncogène et le fragment Pst I du type sauvage a été marqué avec 3:p-dATP par une extension par un amorceur (Figure 4). Le mélange réactionnel a consisté en 400 ng d'ADN du phage à brin unique, 4 ng d'amorceur pentadécamère dans Tris-HC1 7,OmM (pH 7,5), MgCl 7,OmiX, NaCl 50,Om> dans 10 pl. Le mélange a été chauffé & 100'C pendant 2 minutes et incubé à 42'C pendant 1 heure. Le mélange réactionnel a été amené à gl avec 60 pCi 2p-dATP, 0,5 1il de chacun parmi dGTP, dCTP, dTTP 10 mX, 2 gl de DTT 0,1M et 5 unités du fragment Klenow et incubé à la température ambiante pendant une heure. La réaction a été poursuivie pendant 15 minutes avec 0,5 pl de dATP 10mM et on a extrait par du phénol. Cette molécule à double brin (avec un brin marqué) peut être clivée avec des endonucléases de restriction. Formation d'Hétéroduplex Les recombinants M13 prolongés par un amorceur ont été digérés avec Pst I ou Ema I. En présence d'un excès de fois de M13 RF non marqué, homologue, qui a été clivé de façon similaire (volume final de réaction 150 pl) les produits marqués résultant de la digestion par les enzymes de restriction ont été dénaturés par la chaleur (100'C pendant 15 minutes). De l'ADN non marqué en excès a été aJouté pour favoriser la formation de l'hétéroduplex. Les fragments ont été hybridés à 42'C pendant 60 minutes (Figure ). Les fragments homoduplex provenant de l'ADN prolongé par l'amorceur n'ont pas été dénaturés et renaturés. Purification des Fragments Du polyacrylamide a été préparé sous la forme d'une solution mère à 30% (30: 0,8, acrylamide: Bis). On a fait passer les fragments d'ADN à travers un gel de polyacrylamide à 5%, du Tris- borate 0,1' (pH 8,0), EDTA lmnX et on les a visualisés par autoradiographie. Les fragments ont été électroélués à partir d'une bande de gel dans un tampon Tris-borate 0,05M! pendant toute une nuit à 2 V/cm. L'ADN a été extrait par le phénol trois fois, extrait par le chloroforme, précipité dans l'acétate d'ammonium 0,35X et lavé avec 70% d'éthanol. Réaction avec le Carbodiimide Les fragments d'ADN ont été incubés avec du carbodiimide 0,1X, du borate de sodium O,11 (pH 8,5) pendant 4 heures à des températures variables. Les échantillons ont été dilués 10 fois avec de l'eau et précipités deux fois dans l'acétate d'ammonium 0,25M. Le précipité a été lavé trois fois avec de l'éthanol à 70%. L'ADN a été clivé comme cela est décrit à l'Exemple 1 pour séparer les fragments contenant des faux appariements. Electrophorèse sur Gel La séparation des fragments après la réaction avec le carbodiimine a été réalisée à l'aide de gels de polyacrylamide à 1215%. On a fait circuler les gels dans un tampon de recyclage de Tris 40mM, NaCl 20mX, EDTA lmN (pH 8,0), a 150 volts, pendant 7-10 heures à 30'C et on les a autoradiographiés. EXEMPT.E I Cet exemple démontre la capacité de la réaction du carbodiimide utilisé en liaison avec la présente invention pour résoudre les faux appariements individuels dans l'ADN duplex. Une courte région incluant la région codant pour la protéine initiale de l'oncogène H-ras sert de système modèle pour expérimenter la réaction du carbodiimide avec l'ADN mal apparié. Lorsque ce fragment est hybridé en l'ADN homologue non transformant, la molécule hétéroduplex contient une région non appariée de six bases et deux mauvais appariements individuels des bases (Figure 5) . Ces structures mal appariées à l'intérieur des segments d'ADN sont des sites potentielles pour la modification par le carbodiimide. (A>Réaction du Carbodiimide aux Extrémités des 10.Fragments L'effet de la modification par le carbodiimide sur la migration des segments d'ADN dans des gels de polyacrylamide à pourcentage élevé a été expérimenté. L'ADN digéré par l'enzyme de restriction, qui, soit était parfaitement à double brin résistants à la modification par le carbodiimide. Un fragment EPst I de 365 paires de bases a été isolé à partir de P6 prolongé par un amorceur (Figure 4). Le fragment purifié a été mis à réagir avec le carbodiimide à 'C, 37'C et 45 C et analysé par autoradiographie, suivie par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (Figure 6A). Après modification par le carbodiimide à 30'C, le fragment st I a migré sous forme d'une simple bande avec une mobilité décroissante par comparaison avec le fragment non modifié (Figure 6A, Pistes 4 et 1). Des températures de réaction supérieures (37 C et 'C) ont conduit à une diffusion progressive du motif de bande (Figure 6A, pistes 5 et 6). A la suite de la réaction avec le carbodiimide à 30' et 37VC, un fragment Ema I à extrémité aplatie de 228 paires de bases, isolé à partir de T9 prolongé par l'amorceur (Figure 4) n'a pas produit de déplacement de mobilité (Figure 6B, pistes 5 et 6).Des températures supérieures (45'C et 55'C) ont provoqué des changements dans les motifs de bande semblables à ceux décrits ci-dessus (Figure 6B, pistes 7 et 8). Réactivité du Carbodiimide avec une Région Non Appariée Interne de 6 Bases 10. Pour expérimenter la réactivité du carbodiimide avec les faux appariements d'ADN interne, des hétéroduplex ont été formés entre un fragment de l'oncogène H-ras et son homologue (Figure 5). La région non appariée de six bases qui se produit dans les molécules d'ADN hétéroduplex provoque une large diminution de la migration du fragment & travers un gel de polyacrylamide. Ce fait permet de purifier quantitativement les fragments hétéroduplex en éliminant tous les fragments parfaitement appariés, recombinés, Pour un fragment Sma I de 167 paires de bases, isolé & partir de l'hétéroduplex A (Figure 5), la région non appariée de siX bases provoque une diminution de la mobilité, de telle sorte que le fragment migre dans un gel & 12% avec une locngueur apparente de 650 paires de bases (Figure 7, piste 3). Les fragments d'ADN ont été électroélués à partir d'une tranche de gel et purifiés comme décrit dans "Matériaux et Méthodes avant la modification par le carbodiimide. La région non appariée de six bases dans le fragment Sma I de 167 paires de bases provenant de l'hétéroduplex A présente cinq sites potentiels de modification par le carbodiimide à l'intérieur de la séquence GGGGCT. Un changement de la mobilité du gel après la réaction avec le carbodiimide correspondrait avec la modification prévue de ces bases non appariées. Après réaction avec le carbodiimide à 30 C, l'hétéroduplex a migré à travers le gel de polyacrylamide à 12% plus rapidement, comme cela est démontré par l'aspect de plusieurs nouvelles bandes diffuses (Figure 8, piste 4). Dans les mêmes conditions de modification par le carbodiimide, l'homoduplex de 167 paires de bases n'a pas montré de changement de la modification électrophorétique (Figure 8, piste 2). Le fragment Ema I isolés à partir de l'hétéroduplex C (Figure 5) contient une région non appariée de six bases avec la séquence complémentaire (CCCCGA). Cet hétéroduplex a également migré avec des fragments de 650 paires de bases de longueur, mais contient seulement un site potentiel de modification par le carbodiimide. A la suite de la réaction avec le carbodiimide à 30'C, le fragment a montré une bande unique distincte de plus grande mobilité avec une longueur apparente de 580 paires de bases 9, piste 4). Réaction du Carbodiimide avec des Faux Appariements Individuels des Bases Les déplacements de mobilité provoqués par les modifications de petites régions non appariées d'ADN ont suggéré l'application de la technique à un fragment d'ADN contenant un unique faux appariement des bases. Un fragment Sma I de 228 paires de bases a été isolé à partir de l'hétéroduplex B (Figure 5). Quarante-cinq paires de bases séparent deux faux appariements individuels de bases dans ce fragment. On a fait réagir le fragment avec le carbodiimide à des températures variées. Après réaction avec le carbodiimide, un clivage sur un site unique Sau IIIAI entre les faux appariements a engendré un fragment de 91 paires de bases contenant un faux appariement T-C et un fragment de 137 paires de bases contenant un faux appariement T-G. Les fragments d'ADN ont été soumis à une électrophorèse & travers un gel de polyacrylamide de 15% (Figure O10A). Des fragments contenant un unique faux appariement des bases présentent la même mobilité que le fragment homoduplex correspondant, par conséquent,. un faux appariement unique des bases n'est pia suffisant pour la séparation de l'ADN. Après la réaction avec le carbodiimide à 30'C, l'hétéroduplex de 91 paires de bases contenant un faux appariement T-C a montré une diminution de sa mobilité par comparaison à l'homoduplex à 91 paires de bases ). La seconde était due à la réaction du faux appariement T-G à 37 C et a conduit à une réduction additionnelle de 9% de la mobilité par comparaison avec l'hétéroduplex modifié à 30 C (Figure lOB, pistes 6 et 4), L'hétéroduplex ma I/Pst I de 213 paires de bases a présenté un déplacement de mobilité semblable en deux étapes. La première, à 30 C, était due à la réactivité de l'extrémité Pst I et du faux appariement T-C (Figure lOB, pistes 2 et 4). La seconde, à 37 C, était due à la réactivité du faux appariement T-G 4, 6 et 8 par comparaison à la piste 2). Cet exemple a démontré l'aptitude du carbodiimide à se lier aux régions à brin unique d'ADN duplex (pour servir) la base du développement d'un système pour distinguer les fragments d'ADN basés sur des différences de séquence. Les faux appariements et les régions non appariées dans des fragments d'ADN autrement parfaitement appariés, ont été engendrés par formation d'hétéroduplex entre les brins dénaturés de fragments homologues contenant des substitutions et additions ou suppressions de bases. La mobilité modifiée sur un gel de polyacrylamide de pourcentage élevé a été utilisée pour détecter la réactivité de ces molécules hétéroduplex avec le carbodiimide. Des faux appariements individuels des bases et des régions non appariées ont réagi avec le carbodiimide à 30 C et 37 C, alors que l'ADN parfaitement apparié est resté non réactif. L'instabilite relative du faux appariement T-C lui a permis d'être modifié à une température inférieure à un faux appariement T-G (Crick, F. H.C., J. Nol. Biol. 19: 548:555 bases internes. Trois substrats ont provoqué une réduction de la mobilité électrophorétique après la modification par le carbodiimide. Les résidus T et G des extrémités marquées par Fst I ont provoqué une réduction de 3%; le T du faux appariement T-C dans un fragment autrement duplex provoque une réduction de 4% et une modification à la fois du T et du G d'un faux appariement T-G a provoqué une réduction de 9% de la mobilité du gel. Bien que ne désirant pas être liée par une quelconque théorie, la Déposante est d'avis que ces résultats sont en accord avec l'explication suivante: dans les gels d'acrylamide à 12-15%, le "pore" moyen est un petit multiple de la section transversale de l'ADN (Fisher SG et Lermen, L.S. supra (1983)). Avec l'extrémité en hélice de l'ADN à travers la matrice, une ou plusieurs molécules de carbodiimide liées aux extrémités Pst I à simple brin ont aJouté seulement un petit incrément à la section tranversale et ont conduit à une petite réduction de la mobilité du gel. On s'attendait à ce que le carbodiimine lié au T d'un faux appariement TC s'étende en dehors de l'hélice, ajoutant de façon significative à la section transversale et conduisant 3 à une plus grande réduction de la mobilité du gel. La réaction du carbodiimine avec un faux appariement G-T a conduit à une produit d'addition avec deux molécules de carbodiimide liées, les deux s'étendant à l'extérieur de l'hélice, réduisant encore la mobilité du gel par suite de 3 la section transversale locale encore plus grande. Le fragment _k I de 167 paires de bases isolé à partir de l'hétéroduplex A (Figure 5> a démontré un motif complètement différent de changement dans la mobilité du gel après la modification par le carbodiimide. Les brins uniques à partir desquels l'hétéroduplex a été formé diffèrent par seulement six paires de bases contiguës: malgré tout, ces molécules ont migré 55% plus lentement que l'un ou l'autre de l'homoduplex parent parfaitement apparié (Figure 7). Il est peu probable qu'une telle grande réduction de la mobilité électrophorétique a été causée par Juste six paires non appariées dans le duplex. Une autre explication est que les six bases non appariées ont provoqué une courbure dans la structure de la molécule d'ADN, réduisant fortement la mobilité électrophorétique. La modification par le carbodiimide allège partiellement la distorsion et conduit à une molécule migrant plus vite. La méthode décrite ici est utile pour élucider la base génétique à la fois de la variation phénotypique et de la maladie humaine héréditaire. Etant donné que beaucoup de changements individuels de bases de signification clinique ne se produisent pas nécessairement sur un site connu d'une enzyme de restriction (Kidd, U.J. et al. Nature 304: 230-34 (1983)), l'analyse de changements dans les motifs provenant de la digestion est d'utilité limitée. En outre, alors que la technologie courante des sondes oligonucléotides est capable de détecter n'importe quel changement de bases d'ADN, elle est coûteuse, techniquement difficile, et nécessite une information préalable sur les séquences. La modification par le carbodiimide procure une alternative utile aux méthodes courantes de détection des mutants. Egalement, en marquant les faux appariements avec du carbodiimide, les molécules qui comprennent des différences de séquences critiques peuvent être purifiées comme décrit ci-dessus. ci-dessus. REVENDICATIONS 1. Procédé pour détecter l'ADN duplex contenant des faux appariements individuels des bases, caractérisé par le fait qu'il consiste à: - formant une molécule d'ADN duplex contenant au moins un faux appariement individuel des bases; - faire réagir ledit ADN duplex mal apparié avec un carbodiimide; - identifier ledit ADN duplex mal apparié ayant réagi par par détection d'une différence dans la mobilité électrophorétique dudit ADN lors de la comparaison avec la mobilité d'un ADN témoin duplex parfaitement apparié. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'ADN duplex mal apparié est mis à réagir avec du carbodiimide 0,1M à pH 8,5, pendant environ 4 heures, à une température comprise entre 25 et 40 C. 3. Procédé selon l'une des revendications -1 et 2, caractérisé par le fait que le carbodiimide est le cyclohexyl-l(morpholino-2 éthyl>-3 carbodiimide. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 & 3, caractérisé par le fait que la mobilité électrophorétique est détectée dans des gels de polyamide à 12%-15% poids/volume à 150 volts, au bout de 7-10 heures à 30OC. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que l'ADN duplex mal apparié est formé par hybridation d'un premier brin unique d'ADN à un second brin unique d'ADN o la séquence des nucléotides dudit second brin est sensiblement complémentaire dudit premier brin et au moins une paire de bases formée ainsi n'est pas A-T ou G-C. 6. Procédé pour purifier parfaitement l'ADN hétéroduplex parfaitement apparié, caractérisé par le fait qu'il consiste a: a) former un mélange d'ADN hétéroduplex parfaitement apparié et d'ADN hetéroduplex imparfaitement apparie; b> faire réagir le mélange avec un carbodiimide ou un dérivé de celui-ci pour marquer les hétéroduplex imparfaitement impariés; c) séparer l'ADN hétéroduplex imparfaitement apparié marqué de l'ADN hétéroduplex parfaitement apparié non marqué. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que l'ADN duplex mal apparié est mis à réagir avec le carbodiimide 0,1X à pH 8,5, pendant environ 4 heures, à une température comprise entre 25 et 40 C. 8. Procédé selon l'une des revendications 6 et 7, caractérisé par le fait que le carbodiimide est le cyclohexyl-l(morpholino-2-éthyl)-3 carbodiimide. 9. Procédé selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé par le fait que l'hétéroduplex parfaitement apparié est séparé par clonage moléculaire dans un hôte UvrA, RecA, incapable de se réapparier à l'ADN modifié par le carbodiimide. 10. Procédé selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé par le fait que le duplex marqué par le carbodiimide est séparé du duplex non marqué par un système d'immuno-adsorption comprenant un anticorps anti- carbodiimide attaché à un support solide. 11. Procédé selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé par le fait que la séparation est effectuée par une électrophorèse sur gel à deux dimensions. 12. Procédé selon l'une des revendications 6 à 11, caracterisé par le fait que le mélange de l'étape a) est formé par hybridation de l'ADN provenant de deux individus, qui partagent ensemble une fraction dudit ADN. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que la fraction est d'environ 1/64. 14. Procédé selon l'une des revendications 12 ou i3, caractérisé par le fait que l'ADN partagé en commun comprend l'ADN prédisposant l'individu à une maladie génétique. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé par le fait que la maladie génétique est choisie dans le groupe constitué par le cancer du colon, le cancer du sein et la fibrose kystique. 16. Procédé pour la formation par réassociation en émulsion dans le phénol des ADN hétéroduplex allant jusqu'à environ 20.000 paires de bases, caractérisé par le fait qu'il consiste à additionner 5-10% de formamide, réduisant ainsi sensiblement la formation d'enchevêtrements. l 17. Procédé pour former l'ADN hétéroduplex consistant &: - méthyler l'ADN dans un premier échantillon avec une première méthylase; - méthyler l'ADN d'un second échantillon avec une seconde méthylase; - mélanger, dénaturer et recombiner les ADN méthyles; - soumettre les ADN recombinés à l'action des deux q? -., - enzymes de restriction apparentées de ladite première et de ladite seconde méthylase; et - récupérer les ADN hétéroduplex résistant à la dégradation par lesdites enzymes de restriction. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé par le fait que la première méthylase est la méthylase Alu I et son enzyme de restriction apparentée est AtL I et la seconde méthylase est la méthylase DAM et son enzyme de restriction apparentée est Mbo I.