FR 2596990 A1 19871016 FR 8705252 A 19870414 ADJUVANT IMMUNOLOGIQUE A BASE D'EMULSION DE LIPIDE ET D'UN ADJUVANT BACTERIEN La présente invention a généralement pour objet un adjuvant immunologique. Sous l'un de ses aspects, la présente invention a pour objet un système d'adjuvant immunologique qui améliore la réponse immunitaire aux antigènes et qui est donc utile dans les vaccins. Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un système d'adjuvant immunologique contenant un système d'émulsion de lipides associé à un adjuvant biologique et à un antigène. L'invention a également pour objet une méthode de préparation de l'adjuvant immunologique et son utilisation dans l'amélioration de la réponse immunitaire aux antigènes. Avant la présente invention, toute une série d'adjuvants ont été décrits dans la littérature comme susceptibles d'améliorer la réponse immunitaire à de nombreux antigènes et en particulier la réponde immunitaire aux vaccins. On sait que les adjuvants complets ou incomplets de Freund sont considérés 20 comme les adjuvants classiques auxquels on compare la plupart des autres adjuvants. Cependant, leur faculté de donner lieu à des réactions indésirables empêche l'utilisation clinique de ces adjuvants chez les animaux ou chez les êtres humains. D'autres produits tels que par exemple l'huile minérale et 25 l'hydroxyde d'aluminium ont été également utilisés comme adjuvants mais ils entraînent inévitablement quelques inconvénients. Par exemple, on sait que l'huile donne une irritation des tissus et que l'hydroxyde d'aluminium ne peut améliorer la réponse des anticorps que dans une très faible mesure. En 30 outre, la plupart des adjuvants actuellement disponibles contiennent des composants qui ne sont pas métabolisables par les êtres humains et ceci limite par conséquent énormément leur utilisation. En outre, la plupart des adjuvants que l'on utilise actuellement sont difficiles à préparer car ils nécessitent des modes opératoires longs et fastidieux et, dans quelques cas, l'utilisation d'un matériel compliqué et coûteux pour formuler un système de vaccin et d'adjuvant. Plus récemment, comme l'indique Reynolds et coll. dans Infection et Immunité, volume 28, n 3, pages 937-943, 1980, on a trouvé quelque activité d'adjuvant à une émulsion de lipides métabolisables en présence de vaccins viraux inactivés. Cette étude indique que cet adjuvant d'émulsion de lipides améliore de façon significative les réponses immunitaires de plusieurs espèces à sang chaud aux antigènes viraux inactivés. Il est également indiqué que cette émulsion de lipides, consti15 tuée d'une huile d'arachide fortement raffinée, émulsionnée dans des vaccins aqueux à l'aide de glycérdl et de lécithine, présente quelques avantages sur d'autres adjuvants à base d'huile. Par exemple, les composants lipides de l'émulsion sont métabolisables par les mécanismes normaux d'un hôte humain ou animal, et ils sont facilement émulsionnés par une agitation modérée et ils ne donnent lieu qu'à relativement peu de réactions indésirables. Dans le American Journal of Veterinary Research, volume 44, n l, pages 7274, 1983, il est donné une comparaison 25 de vaccins viraux inactivés contenant différents adjuvants d'émulsion. Cet article indique que les études d'immunisation révèlent des différences marquées dans l'efficacité des adjuvants à base d'huile minérale et de l'adjuvant d'émulsion de lipides, tel que décrit dans la référence de Reynolds et coll. 30 Cependant, bien que la littérature décrive l'utilisation comme adjuvant d'une émulsion de lipides métabolisables, avant la présente invention, il n'y a pas d'indication de l'utilisation d'une émulsion de lipides métabolisables en même temps que d'autres composants qui augmenteraient encore une réponse 35 immunitaire. Au sens large, la présente invention a pour objet un adjuvant immunologique, son procédé de préparation et son utilisation dans l'augmentation de la réponse immunitaire aux antigènes. Comme indiqué cidessus, la présente invention a pour objet un nouvel adjuvant immunologique, sa préparation et son utilisation. Le nouvel adjuvant immunologique selon la présente invention est constitué de: 1. un système d'émulsion de lipides (LES) contenant: 10 a) une huile métabolisable; b) un polyol de faible poids moléculaire; c) de la lécithine; et 2. un adjuvant biologique bactérien détoxifié et raffiné qui peut représenter, sans y être limité, une endotoxine 15 détoxifiée raffinée (RDE), du dimycolate de tréhalose (TDM), une protéine provenant du Salmonella typhimurium (STM), etc. On a constaté que l'adjuvant immunologique selon la présente invention améliorait énormément la réponse immuni20 taire à toute une série d'antigènes à la fois naturels et synthétiques, y compris des antigènes viraux, bactériens, fongiques ou protozoaires. La seule exigence posée à l'antigène employé dans le système d'adjuvant immunologique selon la présente invention est qu'il soit capable de déclencher une 25 réponse immunitaire chez un hôte et que cette réponse soit améliorée par l'adjuvant selon la présente invention avec lequel il est associé. L'adjuvant selon la présente invention est également utile pour l'amélioration de la réponse immunitaire aux antigènes qui sont des protéines créées par génie génétique aussi bien qu'aux antigènes qui sont des peptides synthétisés in vitro. Ceux-ci peuvent comprendre, mais sans y être limité, des antigènes apparentés aux virus suivants: virus de la polio, virus de la grippe, virus apparenté au SIDA, virus de 35 l'hépatite, virus de l'herpès, cytomégalo-virus, virus des maladies des voies buccales et du pied, virus de la leucémie féline, virus de la rage, virus de la rhinotrachéite bovine infectieuse, virus de la diarrhée bovine, virus de la maladie de Newcastle, hépatite du gibier, virus du choléra du porc, virus de la pseudorage, peptides malariaux, etc. Le système d'adjuvant selon la présente invention est également utile en présence de protéines naturelles telles que des toxoides suivants: diphtérie, tétanos, coli entérotoxogène et bactéria pertussis. Les réponses immunitaires aux vaccins de polysaccharide tels que ceux provenant des capsules de pneumocoque, méningo10 coque, Hemophilus influenzae, ou des champignons et/ou des polysaccharides provenant des parois cellules de bactéries soit gram-positives, soit gram-négatives, sont améliorées par le système d'adjuvant, selon l'invention. De même, des vaccins composés de virus, bactéries, champignons ou protozoaires entiers inactivés, présentent une puissance immunologique plus importante dans ce système d'adjuvant. Ils peuvent comprendre les agents cités ci-dessus et également des mycobactérie, clostridie, bacille entérique, virus de la vaccine, etc. On a constaté que les adjuvants selon la présente invention contenant à la fois le système d'émulsion de lipides et un adjuvant bactérien raffiné convenable, comme indiqué cidessus, étaient plus efficaces pour servir d'adjuvant d'antigènes que l'un ou l'autre des composants seuls. En fait, l'utilisation des deux composants à la fois procure un effet amélioré qui apparaît être plus important que la somme totale des effets des composants séparés. En outre, l'émulsion de lipides employée dans les adjuvants immunologiques selon la présente invention se distingue 30 en ce qu'elle est métabolisable et présente donc des propriétés recherchées que l'on ne trouve pas dans les adjuvants classiques, tels que par exemple l'huile minérale. Comme indiqué ci-dessus, on sait que les adjuvants non métabolisables tels que l'huile minérale induisent une réponse granulo35 mateuse chez les animaux et ne peuvent donc pas être utilisés dans le traitement des êtres humains. En outre, on a également observé que le coût de préparation d'une composition telle que par exemple d'un vaccin, contenant un antigène et l'adjuvant immunologique selon la présente invention, était notablement plus faible que celui des émulsions eau dans l'huile de l'art antérieur. Puisque l'on a besoin de moins de temps pour préparer les systèmes d'adjuvant selon la présente invention, on fait encore des économies supplémentaires. Comme indiqué ci-dessus, le premier composant de l'adjuvant immunologique selon la présente invention est un système 10 d'émulsion de lipides (LES) contenant une huile métabolisable, un polyol de bas poids moléculaire tel que par exemple la glycérine, et de la lécithine. En pratique, on a trouvé que l'huile métabolisable était de préférence une huile grasse constituée principalement de diglycérides et de triglycérides 15 des acides oléique et linoléique. On préfère particulièrement les huiles végétales grasses telles que celles contenues ou obtenues à partir de: huile d'arachide, huile de graines de tournesol, huile de graines de safran, huile de mals, etc. D'autres huiles, telles que par exemple: huile d'olive, huile 20 de graines de coton et squalène, peuvent également être utilisées dans les adjuvants selon la présente invention. Ainsi, le principal critère est que l'huile soit métabolisable, compatible avec les autres composants du système d'émulsion et l'adjuvant lui-même et qu'elle soit efficace en association 25 avec les autres composants pour augmenter la réponse immunitaire aux antigènes. En pratique, on peut utiliser toute une série de polyol dans le système d'émulsion de lipides. Les polyols employés sont des polyols de faible poids moléculaire, qui sont liqui30 des, miscibles à l'huile métabolisable et dans lesquels la lécithine est soluble. Les polyols convenables comprennent entre autres les suivants: éthylèneglycol, 1,2- propanediol, 1,3-propanediol, glycérine, 1,4-butanediol, 1,3-butanediol, 1,2,4-butanetriol, 1,5-pentanediol, etc. Comme on l'a indiqué, le troisième composant du système d'émulsion de lipides est la lécithine. Le terme "lécithine" tel qu'utilisé dans la présente demande et ses revendications entend comprendre tous les membres d'un groupe de phospholipides de formule générale: CH2OR1 2 1 CHOR2 CH2OPO2OHR3 dans laquelle: R1 et R2 sont des acides gras contenant jusqu'à 22 atomes de carbone; et R représente la choline. Ces phospholipides représentent habituellement un mélange de diglycérides d'acides stéarique, palmitique, linoléique ou linolénique, liés à l'ester de choline de l'acide phosphorique. Les trois composants du système d'émulsion de lipides, c'est-à-dire l'huile métabolisable, le polyol et la lécithine, sont des produits connus en soi et disponibles dans le commerce. Les trois composants employés dans le système d'émulsion de lipides sont naturellement extrêmement raffinés et d'une qualité pharmaceutiquement acceptable. En pratique, on a constaté que le système d'émulsion de lipides devait contenir de préférence d'environ 30 à environ % en poids d'huile métabolisable, d'environ 30 à environ 60% en poids d'un polyol de bas poids moléculaire et d'environ 1 à % en poids de lécithine. Pour illustrer la préparation du système d'émulsion de lipides, on dissout une partie (10 g) de lécithine stérile dans 10 parties (100 g) de glycérine blanche, tout en chauffant modérément à 600C sur une plaque chaude et en agitant à l'aide d'un barreau magnétique. Avant son utilisation, on 30 stérilise la glycérine en la faisant passer à travers une unité filtrante à ouverture de 0,2 gm. Apres cela, on place le mélange de glycérine et de lécithine dans une coupe de mélangeur stérile et 10 parties (100 g) d'huile d'arachide, que l'on a également stérilisées au moyen d'un filtre à ouverture 35 de 0,2 gm, sont lentement ajoutées au mélange de glycérine et de lécithine alors que l'on poursuit l'agitation à vitesse modérée. Le deuxième composant de l'adjuvant immunologique est un adjuvant bactérien détoxifié raffiné. On préfère particulièrement une endotoxine détoxifiée raffinée, ci-après désignée sous le nom de RDE que l'on obtient à partir de souches mutan5 tes Re de Salmonella. L'endotoxine détoxifiée peut également être obtenue à partir d'autres entérobactériacées, tel que ceci est décrit dans le brevet U.S. 4 436 728, incorporé ici à titre de référence. L'endotoxine détoxifiée peut également être préparée par voie synthétique et par des techniques de génie génétique. On peut également employer d'autres adjuvants bactériens détoxifiés raffinés soit seuls, soit en association avec la RDE et ils comprennent, sans y être limité, le dimycolate de tréhalose (TDM), une protéine de Salmonella typhimurium (STM), etc. Dans la préparation du système d'adjuvant immunologique selon la présente invention, l'antigène et le deuxième composant sont préparés séparément par addition de l'antigène en solution saline stérile à l'endotoxine détoxifiée raffinée également en solution saline stérile et dans lesquelles la 20 concentration de l'antigène est comprise entre environ 1 et environ 1 000 gm pour 0,2 ml et la concentration de l'endotoxine est comprise entre environ 25 et environ 200 Um pour 0,2 ml. Les adjuvants immunologiques selon la présente invention 25 contenant le système d'émulsion de lipides et l'adjuvant biologique et l'antigène se préparent commodément tout d'abord en mélangeant l'huile métabolisable, le polyol et la lécithine pour former le système d'émulsion de lipides. L'endotoxine détoxifiée raffinée comme indiquée ci-dessus est préparée 30 séparément en solution saline stérile à laquelle on ajoute l'antigène également en solution saline stérile. Après cela, la solution saline stérile contenant l'antigène et l'endotoxine détoxifiée raffinée est ajoutée au système d'émulsion de lipides et l'on poursuit le mélange dans une machine à vortex 35 ou un mélangeur jusqu'à ce que l'on obtienne une émulsion. En pratique, on ajoute trois volumes de la solution antigène-RDE à un volume du système d'émulsion de lipides et cette combinaison est mélangée ocmme indiquée pour obtenir une solution laiteuse blanche (émulsion). Le mélange des deux composants pour l'obtention de l'émulsion se fait habituellement en deux à cinq minutes. Bien que le rapport optimum des deux composants de l'adjuvant immunologique soit de trois volumes de la solution saline antigène-RDE pour un volume du système d'émulsion de lipides, on peut faire varier le rapport du mélange antigèneRDE au système d'émulsion de lipides d'environ 1/1 à environ 10 8/1, le rapport d'environ 3/1 étant celui que l'on préfère. Après le procédé ci-dessus, on obtient une émulsion de solution d'antigène aqueuse qui conduit à une libération lente de l'antigène, une prolongation de la stimulation antigène et une stimulation cellulaire proche de celle de l'antigène qui 15 est induite par les adjuvants bactériens détoxifiés. Cette combinaison d'activité augmente la réponse de l'hôte à l'antigène comme ceci est évident d'après le tableau 1 des exemples. Comme indiqué ci-dessus, les adjuvants immunologiques 20 selon la présente invention en mélange avec toute une série d'antigènes augmentent la réponse immunitaire à ces antigènes et ils sont donc utiles comme vaccins tant à usage vétérinaire qu'à usage humain. L'adjuvant de la présente invention est utile pour améliorer la réponse immunitaire aux antigènes que représentent les protéines préparées par génie génétique aussi bien qu'aux antigènes obtenus qui consistent en des peptides synthétisés in vitro. Ils peuvent comprendre, sans y être limité, les antigènes apparentés aux virus suivants: virus de la polio, virus de la grippe, virus apparenté au SIDA, virus de l'hépatite, virus de l'herpès, cytomégalo-virus, virus des maladies des voies buccales et du pied, virus de la leucémie féline, virus de la rage, virus de la rhinotrachéite bovine infectieuse, virus de la diarrhée bovine, virus de la maladie de Newcastle, 35 hépatite du gibier, virus du choléra du porc, virus de la pseudorage, peptides malariaux, etc. Le système d'adjuvant selon la présente invention est également utile en présence de protéines naturelles telles que des toxoldes provenant de la diphtérie, du tétanos, du coli entérotoxogène et de la bactéria pertussis. Les réponses immunitaires aux vaccins de polysaccharide tels que ceux provenant des capsules de pneumocoque, méningo5 coque, Hemophilus influenzae, ou de champignons ou de parois cellulaires de bactéries aussi bien gram-positives que gramnégatives, sont améliorées par ce système d'adjuvant. De même, des vaccins composés de virus, bactéries, champignons ou protozoaires inactivés présentent une puissance 10 immunologique plus grande avec ce système d'adjuvant. Ils peuvent inclure les agents cités ci-dessus mais également des mycobactérie, clostridie, bacille entérique, virus de la vaccine, etc. En pratique, on a trouvé que l'endotoxine détoxifiée 15 raffinée était utilisée à une concentration de 25 à environ dm par dose, une réponse immunitaire particulièrement améliorée étant déclenchée pour approximativement 100 pg par dose. Si on le souhaite, on peut employer d'autres composants ou additifs en conjonction avec les adjuvants selon la pré20 sente invention. L'invention sera illustrée par les exemples suivants. EXEMPLE 1 On détermine la réponse d'anticorps d'une souris immunisée à l'aide d'un peptide viral de maladie du pied et 25 des voies buccales (FMD) seul et à l'aide des adjuvants immunologiques selon la présente invention. A des souris BALB/C âgées de 6 à 8 semaines, on administre une injection souscutanée unique (0,2 ml) de peptide synthétique du virus de la maladie du pied et des voies buccales (FMD). La dose 30 administrée est de 200 Fg par souris. Dans d'autres injections, on associe le FMD avec la RDE et/ou le LES. La RDE est administrée à une dose de 100 Fg. Le LES est mélangé avec la solution aqueuse de FMD dans un rapport 1/1 v/v. On passe le mélange à la centrifugeuse à vortex pendant environ 2 minutes 35 à la température ambiante. On saigne les souris par le sinus rétro-orbital à différents moments après l'inoculation. Les résultats obtenus sont exposés dans le tableau I ci-dessous. TABLEAU I Réponse d'anticorps de souris BALB/C immunisées avec du peptide viral FMD associé à une émulsion de lipides RDE/LES !! Réciproque des titres EIA (IgG)! ! Produit! (nombre de jours après immunisation)! injecté ---------------------------------------------------------------!! 7 ! 14! 21! 40! 60! 73! !! t!! I!! !! ! ! ! ! ! ! 101! ! FMD**! 50 ! 50 200 100! 100! 100 !! ! !! !! ! F! MD + LES! 50! 50! 200! 200! 400! 200! ! I!!!!!! ! FMD + RDE + LES (100 pg)! 800! 1 600! 6 400! 25 600! 25 600 I 6 400! !! ! !! !! ! ! FMD + RDE + LES (50 ug)! 100! 400 400! 3 200! 3 200! 1 600! 15!! ! !!!! ** Le peptide de la maladie du pied et des voiestbuccales (FMD) a été fourni par le Dr. J. Bittie de la Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA. Il a été synthétisé par des savants de Scripps et il est désigné sous le nom de FMD peptide 65; on le couple au toxoIde du tétanos avant utilisation. Il est évident d'après les données obtenues que l'utili20 sation des adjuvants immunologiques à deux composants procure une amélioration inattendue et surprenante de la réponse immunitaire en même temps qu'une prolongation marquée de la stimulation antigène. Notamment, lorsque l'on emploie une dose de 100 Fg de RDE, on observe des réponses immunitaires encore 25 notablement plus élevées. EXEMPLE 2 Dans cette expérience, à des souris BALB/C (6 souris/groupe), on administre une injection sous-cutanée (0,2 mg/animal) de ce qui suit: groupe 1: 100 pg de dextrane dans une solution saline; groupe 2: 100 Fg de dextrane + 50 g de RDE dans une solution saline; groupe 3: 100 gg de dextrane + gg de RDE émulsionné dans un égal volume de LES; groupe 4: gg de dextrane émulsionné dans une fiole contenant une émulsion lyophilisée de 50 gg de RDE + 50 gg de dimycolate de 35 tréhalose (TDM); le groupe 5 ne reçoit pas d'antigène. Le jour n 20 après la première immunisation, toutes les souris de chaque groupe reçoivent une seconde injection qui Sú 0ú fsi sdiODol3usl V elqenqUiji2 asuodgi ul lueluas -9gdai siT ia 'çciO joueqlpoideaiawZ np asd sgilsil swnugs op sua om seizp sal auazuasadai sasQqluaied aaqua saiquou sai *01/I ap isa wnius ap uolItlueqag anbsqD ap aluillul uolinlp v'7 -adnoa2 anbeq minod ua oa anbo1dTgu ailll anb luel ua sguildxa luos sievllnsi sao * i i i i i (01) 0 i ( 01) OZ i (OZ) 0oT i (01) oZ i i i i i i (ú91) ú671 i (ú01) 181 c (88) OII i (01> ú9C i i i i i i i (ZúZ) 9I8Z i (OO0) OOZS i (099) 899Z i (9L) 896 i i i i i i i (991) 98ú1 i ú47Z) 89úZ i (9Z1) 89ZZI i (OS) 009 i i i i i i (09) 07Z i ({5) Zt9 i (ú) 01ú7 i (SI) ú91; i i 'i i i 8{ i 0 i 91 i 9 i (uolpsTunurT seide sanof ap aiqaou) i Y!V saelp sap anboadlpgX i i i i unDnv;i i i i saLu+ m+ auezlzxoa; zl; i i $R3 + au + aulaalxafl i ú i i i 3cn + auvaixe i l i i ausi:xa is i i i i i i i luawaiw.Il iadnoi!) i i i i i sl suo-rnlos ap sadAq saaATp suep qaw queAncpe,I ap DaAe uoiqeToosse ua no Inas aueaxap auQBTlur,l ap ied sagsTunuauT sTfnos op unags np (VIH) aATssd auTuT4nl6etafgp aaT.L II nValigLL II nealqeq S a, suep snossap--o sgsodxa quos snuaqqo sqevlnsgi soI uoTVsTunuuITi sQide saep sasl.aAp V eTaqs ua uaWlaTuBes ed unigs ap slanpTATpUT suoITT;ueqD9 sap aTITanDeZ uo UOoaCUT aaTWaJd el anb uoe;.eauw el ap agaedgid;sa Il 06696SZ REVENDICATIONS 1.- Un adjuvant immunologique comprenant: (1) un système d'émulsion de lipide contenant: (a) une huile métabolisable; (b) un polyol de faible poids moléculaire; (c) de la lécithine; et (2) un adjuvant bactérien détoxifié raffiné. 2.- L'adjuvant de la revendication 1, dans lequel l'huile métabolisable est une huile grasse constitué principalement de 10 diglycérides et de triglycérides des acides oléique et linoléique. 3.- L'adjuvant selon-la-reve ilcationd1ou 2, dans lequel-l'huile métabdclisable est une huile végétale ou une huile animale. 4.- L'adjuvant selon la revendication 3, dans lequel l'huile végétale est l'huile d'arachide, l'huile de graines de tournesol ou l'huile de graines de safran. 5.- L'adjuvant selon la revendication 3, dans lequel l'huile animale est le squalène. 6.- L'adjuvant selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel le système d'émulsion de lipides est constitué d'environ 30 à 60% en poids d'huile métabolisable, d'environ 30 à 60% en poids d'un polyol et d'environ 1 à environ 15% en poids de lécithine. 7.- Un système d'adjuvant contenant un antigène et l'adjuvant immunologique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 8.- Le système d'adjuvant selon la revendication 7, dans lequel l'antigène et l'adjuvant bactérien détoxifié raffiné se 30 trouvent en solution saline stérile. 9.- L'adjuvant selon la revendication 8, dans lequel la concentration de l'antigène dans la solution saline stérile est comprise entre environ 5 et environ 5 000 gg/ml et la concentration de l'adjuvant bactérien détoxifié raffiné dans 35 la solution saline stérile est comprise entre environ 235 et 1 000 gg/ml. 10.- L'adjuvant selon la revendication 7, dans lequel le système d'émulsion de lipides est constitué d'environ 30 A 60% en poids d'une huile métabolisable, d'environ 30 à 60% en poids d'un polyol et d'environ 1 à environ 15% en poids de lécithine, et la concentration de l'antigène dans la solution saline stérile est comprise entre environ 5 et environ 5 000 gg/ml et la concentration de l'adjuvant bactérien détoxifié raffiné dans la solution saline stérile est comprise entre environ 125 et 1 000 gg/ml. 11.- L'adjuvant selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'adjuvant bactérien détoxifié raf10 finé est une endotoxine détoxifiée raffinée, le dimycolate de tréhalose ou une protéine provenant du Salmonella typhimurium. T sans lqe 12.- L'adjuvant seionha rvnic -7,- lequel, l'adjuvant bactérien détoxifié raffiné est une endotoxine..CLMF: détoxifiée raffinée.