FR 2577237 A1 19860814 FR 8601699 A 19860207 La présente invention concerne une alpha- amylase nouvelle utile pour l'hydrolyse d'un amidon à un faible pH, et un procédé par lequel elle peut être produite par le micro-organisme Clostridium thermo- hydrosulfuricum dans une fermentation anaérobie. De grandes quantités de sirops contenant du glucose sont produites par l'hydrolyse enzymatique d'amidon de mais. Cette opération est en général condui- te en deux étapes. Dans la première étape, l'amidon O10 est liquéfié par traitement enzymatique avec une alpha-amylase à un pH compris entre 6 et 7. L'amidon liquéfié est ensuite saccharifié au moyen d'un enzyme appelé glucoamylase agissant à un pH compris entre 4 et 4,5. Les principales alpha-amylases utilisées à l'heure actuelle pour la première étape d'hydrolyse de l'amidon sont des alpha-amylases bactériennes produi- tes par Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, et Bacillus stearothermophilus. Bien que les alpha- amylases soient relativement thermostables en solutions au-dessus de pH 6, elles n'ont pas cette thermostabilité à des pH plus faibles. Les alpha-amylases en usage courant sont produites par des micro-organismes aérobies, c'est- à-dire ceux qui exigent de l'oxygène pour leur croissan- ce. Il existe quelques publications dispersées sur des alpha-amylases produites par des organismes anaéro- bies. Hobson et collaborateurs ont rapporté dans Biochem. J., 52, 671-679 (1952) l'isolement de ces amylases de deux anaérobies, Clostridium butyricum et une espèce du genre Streptococcus présents dans le rumen de mouton. Ces deux enzymes ont montré une activité optimale à une température de 48 + 1 C. Hockenhull et collabora- teurs, Biochem. J., 39, 102-106 (1945), ont trouvé que l'anaérobie Clostridium acetobutylicum, produisait également une alpha-amylase. Cet enzyme, qui a été partiellement purifié par l'auteur de cette publication, présentait un pH optimal de 4,8 et transformait totale- ment l'amidon en maltose. Plus tard, Ensley et collabo- rateurs ont publié dans J. Gen. Appl. Microbiol., 21, 51-59 (1975) une étude sur la production de cet enzyme et ils ont constaté que sa production était induite par la présence d'amidon dans le milieu de culture. Environ 40% de l'enzyme restaient associés aux cellules. Aucun de ces enzymes n'a montré une stabilité notable à des températures élevées. Il serait souhaitable d'hydrolyser de l'ami- don par la conduite simultanée des. étapes de liquéfac- tion et de saccharification dans le même mélange réac- tionnel. On pourrait y parvenir si l'on disposait d'alpha-amylases qui puissent hydrolyser l'amidon à des pH compris entre 4 et 4,5, o la glucoamylase est active. En outre, l'alpha-amylase devrait être suffisamment thermostable à ce pH pour permettre la conduite des réactions d'hydrolyse à une température à laquelle la vitesse de réaction est assez grande pour être utile. Une alpha-amylase produite par Clostridium thermoamylolyticum qui satisfait d'une façon générale à ces exigences est révélée dans la demande de brevet européen N O 131 253. La Demanderesse vient de décou- vrir une alpha-amylase élaborée dans une réaction de fermentation anaérobie par Clostridium thermohydro- sulfuricum, qui montre de meilleures propriétés de liquéfaction de l'amidon dans ces conditions. Conformément à la présente invention, il est proposé un enzyme qui est une alpha-amylase aciduri- que thermostable dérivée de Clostridium thermohydrosul- furicum. Cette alpha-amylase a un poids moléculaire d'environ 72 000 + 3000, tel que déterminé par électro- phorèse sur gel de DSS-polyacrylamide, montre une demi-vie d'environ 450 minutes lorsqu'elle est maintenue à 80 C et à pH 4,5 en présence de 5 mM de Ca +, elle a une activité maximale en alpha-amylase à un pH d'environ 5,5 lorsqu'elle est mesurée à-80 C et elle a une activi- té maximale en alpha-amylase à pH 5,0, à environ 60 C. Il est également proposé, conformément à la présente invention, un procédé de production d'une alpha-amylase ayant un poids moléculaire d'environ 72 000 + 3000, tel que déterminé par électrophorèse sur gel de DSS-polyacrylamide, montrant une demi- vie d'environ 450 minutes lorsqu'elle est maintenue à 800C et à pH 4,5 en présence de 5 mM de Ca ++, ayant une activité maximale en alpha-amylase à un pH d'environ 5,5 lorsqu'elle est mesurée à 80 C et ayant une activité maximale en alpha-amylase à pH 5,0 à environ 60OC, procédé qui consiste à cultiver des cellules de Clostri- dium thermohydrosulfuricum dans un milieu nutritif puis à isoler du milieu l'alpha-amylase. La présente invention concerne en outre un procédé d'hydrolyse de l'amidon. Ce procédé consiste à traiter une suspension ou solution aqueuse d'amidon avec l'alpha-amylase de la présente invention à un pH de 3,5 à 7,0 pendant une durée suffisante pour obtenir une solution d'hydrolysat d'amidon. L'alpha-amylase de la présente invention a été obtenue initialement d'une souche de Clostridium isolée de sources chaudes de boues à Rotorua, en Nou- velle Zélande. Le micro-organisme est un bâtonnet motile, anaérobie obligé, variable quant à la coloration de Gram. La sporulation a rarement lieu dans des cellu- les en phase logarithmique ou stationnaire, mais des spores terminales apparaissent couramment dans des cultures en bouillon conservées à la température ambian- te. La température optimale de développement est de 68-70 C. Le développement observé à 37 C est faible ou nul. Le pH optimal de croissance est d'environ 7,0, bien que l'organisme se développe dans un interval- le de pH de 4,5 à 8,0. Lorsque la culture de l'organis- me est effectuée sur amidon ou sur maltose, l'éthanol est le produit prédominant, avec formation d'acides acétique et lactique en plus faibles quantités. Lorsque l'organisme est cultivé sur plaques de gélose, il forme des colonies lisses opaques, d'un blanc légèrement sale. Les cellules sont des bâtonnets d'environ 0,6 mpm de largeur et d'environ 2 mpm à 14,5 mpm de longueur, avec une longueur moyenne des cellules d'envi- ron 4-5 mpm. Il produit du sulfure d'hydrogène à partir de thiosulfate mais non à partir de sulfate et sa croissance est inhibée par l'hydrogène. D'après ces caractéristiques, le micro-organisme est classé comme souche de Clostridium thermohydrosulfuricum. Cette souche a été déposée en vertu des dispositions du Traité de Budapest concernant les dépôts de micro- organismes en vue de l'obtention de brevets. On peut se la procurer sous la référence ATCC N 53016 auprès de l'American Type Culture Collection, à Rockville, Maryland. Le micro-organisme utilisé pour la préparation de l'alpha-amylase de la présente invention est cultivé dans des conditions anaérobies dans un milieu qui contient un amidon soluble ou une maltodextrine comme source de glucide, un extrait de levure plus des solu- tions de vitamines et de substances minérales. La présence de maltose dans le milieu de croissance accroît la quantité formée d'alpha-amylase, tandis que la présence de glucose dans le milieu inhibe la formation d'alpha-amylase. Le pH optimal du milieu de fermentation pour la production d'alpha-amylase est d'environ 6,5- 7,0. L'alpha-amylase est excrétée dans le milieu de fermentation. L'alphaamylase a été purifiée par élimination des cellules du milieu de fermentation, suivie d'une précipitation de la matière étrangère avec du chlorure de calcium. La solution de l'enzyme a été concentrée et elle a encore été purifiée par adsorption de l'amy- lase sur de l'amidon granulaire. L'amylase partiellement purifiée a été séparée de l'amidon et elle a encore été purifiée par chromatographie sur une colonne "Ultro- gel". L'enzyme purifié avait un poids moléculaire de 72 000 + 3000, comme déterminé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide contenant du dodécylsulfate de sodium (DSS). Dans la description suivante de la préparation et des propriétés de l'alpha-amylase, toutes mentions de parties et de pourcentages s'entendent en poids, sauf spécification contraire. Titrage de l'alpha-amylase La solution à analyser est diluée avec une solution de chlorure de calcium 0,0025 M afin d'obtenir une concentration finale d'environ 0,25 unité d'activité par ml. On ajoute 1 ml de la solution d'enzyme convena- blement diluée à 10 ml d'une solution à 1% d'amidon soluble contenant un tampon à l'acide acétique 0,03M (pH 6,0) et du chlorure de calcium 0,03 M. On conduit la réaction pendant 10 minutes à 60 C. On place 1 ml de la solution réactionnelle dans une fiole jaugée de 100 ml contenant 50 ml d'acide chlorhydrique 0,02N, et après addition de 3 ml de solution à 0, 05% d'iode, on complète le volume total à 100 ml par l'addition d'eau. On mesure à 620 nm l'absorbance de la couleur bleue qui se développe. La quantité de l'enzyme néces- saire pour décomposer 10 mg d'amidon en une minute représente 1 unité. D - D o s 50 1 unité = 10 x 10 x (facteur de dilution) o o, D = absorbance de la solution témoin (de o l'eau est ajoutée au lieu de la solu- tion d'enzyme) D = absorbance de la solution réactionnelle s Préparation de l'alpha-amylase Une préparation enzymatique d'alpha-amylase extracellulaire a été obtenue à partir de Clostridium thermohydrosulfuricum, ATTC N 53016. La préparation du milieu et la culture d'é- chantillons ont été effectuées selon des techniques anaérobies classiques comme décrit par R. E., Hungate, "A Roll Tube Method for Cultivation of Strict Anaerobes", in Methods in Microbiology, rédacteurs en chef J. R. Norris et D. W. Ribbons, volume 3B, Academic Press, New York, 1969, pages 117-132, et par Miller et Wolin, Appl. Microbiol., 27, 985 (1974). Le milieu utilisé pour produire la semence et pour entretenir la culturemère de l'organisme avait la composition suivante: Milieu d'ensemencement Ingrédients Concentration (g/l) Amidon (Lintner) 20 KH2PO4 1,5 NHCl 0,5 N4C Na2HP 4 12H20 4,2 MgCl2 0,18 Extrait de levure 2,0 Solution de vitamines 0,5 ml/l Solution de sels minéraux 50 ml/l Résazurine (0,1%) 1 ml/l Solution réductrice 40 ml/l1 Solution de vitamines Vitamines mg/l Biotine 2 Acide folique 2 Chlorhydrate de pyridoxine 10 Riboflavine 5 Chlorhydrate de thiamine 5 Acide nicotinique 5 Acide pantothénique 5 B12 0,1 Acide p-aminobenzoique 5 Acide thioctique 5 Solution réductrice Ingrédients Quantité NaOH (0,2 N) 200 ml Na2S.9H20 2,5 g Chlorhydrate de cystéine hydraté 2,5 g Solution de sels minéraux Ingrédients mg/100 ml Acide nitrilotriacétique 1500 MgS04.7H20 3000 MnSO4.H20 500 NaCl 1000 FeSO4. 7H20 100 Co(N03)2.6H20 100 CaCl2 100 ZnSO4.7H20 100 KAl(S04)2 10 H3B03 10 Na2Mo40 2H20 10 Na2SeO3 1 Des cellules viables ont pu être maintenues dans le milieu d'ensemencement à la température ambiante pendant au moins 6 mois. La souche a été préservée par mélange de 1 ml d'une culture en phase logarithmique de croissance avec 5 ml de solution à 50% de glycérol - pour culture anaérobie, puis congélation à -70 C. Pour faire proliférer les micro-organismes en vue de la production d'enzyme, du milieu d'ensemencement stérile a été inoculé avec des cellules et incubé à 60-68 C dans des conditions anaérobies pendant environ 24 heures. On a ainsi obtenu des cellules se développant rapidement qui ont été utilisées pour inoculer un fermenteur. Le volume d'inoculum était de 1 à 5% du volume du milieu de croissance dans le fermenteur. Ce milieu avait la composition suivante: Milieu de croissance g/100 ml Maltrine 100a) 1 PROFLOb) 5 PrymexC) 1 MgSO4.7H20 0,5 CaCl 2H20 -0,06 MnCl2.2H20 0,001 KH2PO4 0,13 (NH4)2HP04 1 a) Hydrolysat d'amidon d'équivalent de dextrose égal à 10, de la firme Grain Processing Company, de Muscatine, Iowa. b) Farine de graines de cotonnier de la firme Traders Oil Mill Company de Fort Worth, Texas. c) Extrait de levure de la firme Amber Laboratories de Milwaukee, Wisconsin. Le pH du milieu a été ajusté à 6,5. Des essais de production ont été effectués dans un fermen- teur de 14 litres en utilisant 10 litres de milieu. Le rendement en alpha-amylase extracellulaire a été de 0,1 à 1,5 unité par ml de bouillon de fermentation. Purification de l'enzyme L'alpha-amylase brute a été purifiée par le mode opératoire suivant. Le bouillon de fermentation a tout d'abord été filtré sur de la laine de verre pour éliminer une substance insoluble à consistance de gomme. Les cellules ont ensuite été séparées du filtrat au moyen d'une centrifugeuse à spirale continue Sharples, modèle 741-24/8R4 (Sharples Corp., Philadel- phie, Pa.), fonctionnant à une pression de 45 lb. On a ajouté à la liqueur surnageante claire une quantité suffisante de chlorure de calcium pour atteindre une concentration finale d'environ 1,5-3.0% en poids/volume et on a agité le mélange pendant 10 minutes., Le précipi- té volumineux a été séparé par filtration et jeté. Le filtrat clair de couleur ambrée a ensuite été concen- tré au moyen d'un concentrateur Amicon à fibres creuses (HP-10), type AC2, de la firme Amicon Corp. de Danvers, Mass. La concentration a été effectuée jusqu'à ce que le volume se situe entre 500 et 1000 ml avant d'ajouter de l'hydroxyde d'ammonium concentré pour ajuster le pH & 6. L'addition d'hydroxyde d'ammonium a provoqué la formation d'un second précipité qui a été enlevé par filtration. Pour parfaire la purifica- tion du filtrat concentré, on l'a traité avec de l'ami- don granulaire qui avait été équilibré avec une solution tampon à l'acétate de sodium contenant 50 mM d'acétate de sodium à pH 6 et 5 mM de Ca++. On a utilisé un gramme d'amidon pour 300 unités d'enzyme. Le mélange d'amidon et de solution d'enzyme a été agité modérément à la température -ambiante pendant 60 minutes avant que la matière solide ne soit recueillie par filtration sous vide. Le gâteau d'amidon contenant l'alpha-amylase liée a été remis en suspension dans un faible volume de solution tampon à l'acétate de sodium refroidi à la glace et il a été filtré de nouveau après une courte période d'agitation. Cette opération de lavage a été répétée trois fois avec du tampon à l'acétate de sodium froid. Le gâteau d'amidon lavé a été mis en suspension dans du tampon à l'acétate de sodium neuf et il a été incubé à 60 C pendant 60 minutes, avec agitation occasionnelle. Pendant cette période, l'alpha-amylase adsorbée hydrolyse suffisamment l'amidon pour être libérée dans la solution. Le mélange a ensuite été filtré et le filtrat incolore, contenant l'alpha- amylase, a été concentré à un volume d'environ 3 ml au moyen d'une cellule d'ultrafiltration Amicon (Amicon Corp., de Danvers, Mass.) équipée d'une membrane YM10 permettant la coupure à 10 000 Mr. Le mélange a été cla- rifié par centrifugation à 10 000 x g pendant 10 minutes avant que la liqueur surnageante ne soit chargée sur une colonne de 1,5 x 85 cm de gel d'acrylamide et d'agarose, Ultrogel AcA 54 (LKB Producter AB, Bromma, Suède) qui a été préalablement équilibrée avec un tampon à l'acétate de sodium 50 mM contenant 100 mM de NaCl et 5 mM de Ca. La colonne a été éluée avec le même tampon à une vitesse d'écoulement de 16 ml/h. On a recueilli des fractions de 3 ml dont on a contrôlé l'activité en alpha-amylase. Les fractions contenant une activité enzymatique ont été rassemblées et conser- vées dans un réfrigérateur. Leur teneur en protéines a été déterminée par la méthode de Lowry et collabora- teurs décrite dans J. Biol. Chem., 193,'265-275 (1951) en utilisant de la sérum-albumine de boeuf comme subs- tance de référence. Les résultats de l'opération de purification sont donnés sur le tableau I. Ils montrent que l'alpha-amylase purifiée a une activité spécifique d'environ 22 unités d'enzyme par mg de protéine. 1 1 TABLEAU I PURIFICATION D'ALPHA-AMYLASE PROVENANT D'ATCC N 53016 Volume Unités Unités par Rendement Mode opératoire (ml) par ml mg de pro(%) téine Bouillon de fer- mentation 350 0,36 0,011 100 Traitement au CaCl2 et ultra- filtration 315 0,34 0,015 86,0 Affinité pour - l'amidon 37 1,0 1,74 29,4 Colonne Ultrogel AcA 54 42 0,59 21,9 19,7 Poids moléculaire de l'enzyme L'homogénéité de l'alpha-amylase purifiée a été mise en évidence par sa migration formant une bande unique de protéine lorsqu'elle a été soumise à l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Le poids moléculaire de l'enzyme a été déterminé par êlectro- phorèse sur gel de DSS-polyacrylamide conformément àlaméthodede U. K. Laemmli décrite dans Nature, 227, 680-685 (1970). En comparant la mobilité de l'alpha- amylase avec celle de protéines de référence, on a estimé pour l'enzyme un poids moléculaire de 72 000 + 3000. Cette valeur est considérablement supérieure au poids moléculaire de 51 000 trouvée pour un échantil- lon purifié de Thermamyl 60L, alpha-amylase provenant de B. licheniformis. L'alpha-amylase Taka-Therm, dérivée d'une autre souche de B. licheniformis, a d'après la littérature un poids moléculaire de 62 000 (Chiang et collaborateurs, Die Starke, 31, 86-92 (1979)). Le poids moléculaire de l'alpha-anylase de l'invention est proche de celui de l'alpha-amylase élabo- rée par Clostridium thermoamylolyticum (75 000 + 3000, demande de brevet européen N 0 131 253). Toutefois, l'alpha-amylase de l'invention a une bien plus longue demi-vie à pH 4,5. Cela la rend mieux adaptée comme enzyme hydrolysant l'amidon dans la plage de pH o la glucoamylase est très active. - Thermostabilité de l'enzyme La thermostabilité de l'alpha-amylase purifiée a été comparée avec celle de trois autres alpha-amylases thermostables connues. Les enzymes ont été dilués avec du tampon à l'acétate 50 mM du pH désiré, contenant- mM de Ca++, pour former des solutions contenant une unité d'activité enzymatique par millilitre. Les solu- tions ont été incubées dans des fioles coniques à bou- chon vissé au bain-marie à 80 C et à 900C. A des inter- valles de temps appropriés (habituellement 15, 30, , 60 et 90 minutes), les fioles ont été retirées du bain-marie et immédiatement refroidies au bain de glace. L'activité enzymatique résiduelle a été titrée à 60 C par la méthode de titrage classique. La demi- vie de l'enzyme a été calculée par régression linéaire. Les résultats indiqués sur le tableau II montrent que l'enzyme de la présente invention a une bien plus grande thermostabilité que les enzymes élaborés par B. stearo- thermophilus, B. licheniformis, et Clostridium thermo- amylolyticum. Il a une demi-vie de plus de 7 heu- res à un pH de 4,5 et à 80 C. TABLEAU II THERMOSTABILITE DE L'ALPHA-AMYLASE Demi-vie (minutes) *C 800C Enzyme pH 6 pH 4,5 alpha-amylase de la présente invention 380 450 Thermamyla) 266 13 Alpha-amylase de b) B. stearothermophilus 108 22 Alphaamylase de C. thermoamylolyticumc) 115 66 a) Alpha-amylase de B. licheniformis, de la firme Novo Laboratories, Wilton, Connecticut. b) Brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 284 722 c) Demande de brevet européen N 0131 253. Effet du pH sur l'enzyme L'activité enzymatique de l'alpha-amylase a été analysée par la méthode classique, à cela prés que l'on a fait varier le pH du substrat de 3,5 à 7,0 en utilisant des solutions tampons 100 mM de la composition suivante: citrate (pH 3,5), acétate (pH 4 à 6) et HEPES (pH 6,5 à 7,0). Les activités relatives à divers pH indiqués ci-dessous montrent que l'enzyme présente son activité maximale à un pH de 5,0 à 60 C, et un pH de 5,5 à 80 C. Activité maximale, % pH 60 C 80 0C 3,5 23,6 0 4,0 70,9 48,4 4,5 99,3 93,0 ,0 100 98,2 ,5 97,5 100 6,0 88,1 97,4 6,5 79,0 95,0 7,0 72,1 82,6 Optimum de température pour l'enzyme On a déterminé l'effet de la température de réaction sur l'enzyme purifié en effectuant le titrage classique de l'activité en alpha-amylase après incubation d'une solution de l'enzyme à diverses tempé- ratures et dive-rses valeurs de pH pendant 10 minutes. A pH 6, l'optimum de température est supérieur ou égal à 90 C. A pH 4,5, la température correspondant à l'activité maximale a été de 80-85 C, avec observation de 75% de l'activité maximale à 70 C et observation de plus de 90% de l'activité maximale à 90 C. Les tests ci-dessus démontrent que la présente invention propose comme enzyme nouveau une alpha- amylase qui hydrolyse l'amidon à des valeurs de pH situées entre 4 et 4,5. En outre, l'amylase est suffi- samment thermostable à ce pH pour qu'on puisse l'utili- ser afin d'hydrolyser de l'amidon à une température o la vitesse de réaction est assez grande pour être utile. Bien que l'invention ait été illustrée par des exemples de réalisation particuliers, il y a lieu de remarquer qu'elle est susceptible d'autres modifica- tions et adaptations ou variations qui sont évidentes pour l'homme de l'art, en matière d'enzymes et d'hydro- lyse de l'amidon. REVENDICATIONS 1. Enzyme du type alpha-amylase, caractérisé en ce qu'il est dérivé de Clostridium thermohydrosul- furicum, ledit enzyme ayant un poids moléculaire d'envi- -5 ron 72 000 + 3000 comme déterminé par électrophorèse sur gel de DSS-polyacrylamide, présentant une demi- vie d'environ 450 minutes lorsqu'il est maintenu à C et à pH 4,5 en présence de 5 mM de Ca ++, ayant une activité maximale en alpha-amylase à un pH d'environ 5,5 lorsqu'elle est mesurée à 80 C et ayant une activité maximale en alpha-amylase à pH 5,0 à une température d'environ 60 C. 2. Enzyme du type alpha-amylase suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la souche de Clostridium thermohydrosulfuricum est la souche ATCC N 53016 ou un mutant ou variant de cette souche. 3. Procédé de production d'un enzyme du type alpha-amylase suivant la revendication 1, caracté- risé par les étapes consistant à cultiver des cellules de Clostridium thermohydrosulfuricum dans un milieu nutritif puis à isoler l'alpha-amylase du milieu. 4. Procédé suivant la revendication 3, carac- térisé en ce que les cellules de Clostridium thermo- hydrosulfuricum sont celles de la souche ATCC N 53016 ou d'un mutant ou variant de cette souche. 5. Procédé d'hydrolyse d'amidon comprenant le traitement d'une suspension ou solution aqueuse d'amidon avec un enzyme du type alpha-amylase pendant une durée suffisante pour obtenir une solution d'hydro- lysat d'amidon, caractérisé en ce que l'enzyme du type alpha-amylase est l'enzyme de la revendication 1 et l'hydrolyse est conduite à un pH de 3,5 à 7,0. 6. Procédé suivant la revendication 5, carac- térisé en ce que l'enzyme du type alpha-amylase est l'enzyme de la revendication 2. 7. Procédé suivant la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que l'amidon est traité avec un enzyme du type alpha-amylase à une température comprise dans l'intervalle d'environ 50 à environ 100 C à un pH d'environ 4,0 à environ 6,0.