FR 2574663 A1 19860620 FR 8420129 A 19841217 La présente invention concerne une composition thérapeutique possédant des activités antithrombotique et hypolipémiante, contenant, à titre de principe actif, une association de sulfates de xylanes et d'un acide organique. Les sulfates de xylanes sont constitués soit par le polysulfate de xylane, appelé SP 54 ou PZ 68 selon les auteurs, soit par une des différentes fractions isolées à partir du SP 54. Le SP 54 est un polysulfate de xylane obtenu par sulfatation ménagée de xylanes extraits de bois de hêtre. Ce produit est commercialisé depuis une vingtaine d'années pour utilisation par voie injectable, notamment dans la prévention des throm- boses veineuses post-opératoires, et par voie orale, notamment dans le traitement des dyslipémies athérogènes. Par ses effets sur les systèmes de coagulation (FISCHER A.M., BARROWCLIFFE T.W. THOMAS D.P. Thromb Haemost, 1982, 47, (2), 104) (FISCHER A.M., MERTON R.E., MARSH N.A., WILLIAMS S., GAFFNEY P.J., BARROWCLIFFE T.W. & THOMAS D.P. Thromb Haemost, 1982, 47, (2), 109) (SCULLY M.F., WEERASINGHE K.M., ELLIS V., DJAZAERI B. & KAKKAR V.V. Thromb Res, 1983, 31, 87) et de fibrinolyse (VINAZZER H., STEMBERGER A., HAAS S. & BLUMEL G., Thromb Res, 1982, 27, 341), sur le système complémentaire (WALB D., LOOS M. & HADDING U. 2 Natusforsch, 1971, 26, 403), sur la paroi des vaisseaux (PAUL R., HERBERT J.M., MAFFRAND J.P., LANSEN J. & RONCUCCI R., Symposium on Atheroma and Thrombosis, London, July 1983, et sur le métabolisme lipi- dique (ROUFFY J., Mises à jour Cardiol, 1983, 12 (8), 381, ce produit présente en effet des propriétés antithrombotique et antiathéromateuse intéressantes. Il se présente sous la forme d'un mélange de polymères (sulfates de xylanes) de différents poids moléculaires. La définition analytique de tels mélanges est toujours délicate et plusieurs expérimentateurs ont pu donner des résultats différents pour un même produit. - 2-2574663 Ainsi, VINAZZER et al. ont reporté pour le SP 54 un Poids molócu- laire de 2000 (Thromb. Res., 1980, 20, 57-68) puis de 3000 (Thromb. Res., 1982, 27, 341-352); C.D. ESQUIVEL et al. (Thromb. Res., 1982, 28,389-399) ont décrit un poids molé- culaire moyen de 4000; enfin C. SORIA et ai. (Thromb. Res., 1980, 19, 455463) ont signalé un poids moléculaire moyen de 6000 qui a été aussi publié très récemment par M.F. SCULLY et V.V. KAKKAR (Biochem. J., 1984, 218, 657). Cette disparité dans les poids moléculaires moyens, est sans doute due aux méthodes d'analyse et aux standards utilisés ainsi qu'à l'absence de précision sur la nature (apparente, en poids, en nombre) de la masse molaire publiée. A l'aide des techniques décrites plus loin, la demanderesse a trouvé que le SP 54 ou PZ 68,qui répond à la formule statistique développee suivante: Ro - OR OR dans laquelle R représente le groupe -S03 Na ou l'hydro- gène,peut être défini de la manière suivante: Il s'agit d'un mélange de polymères de masses molaires comprises entre 1000 et 40000 Daltons, présentant une distribution quasi-gaussienne. - 3 - Les mesures de paramètres de distributions moléculaires de ce produit par chromatographie d'exclusion haute performance font apparaitre pour différents lots de fa- brication des valeurs moyennes de: Masse moléculaire moyenne en nombre ou Mn: 5300 à 5500 Masse moléculaire moyenne en poids ou Mw: 7400 à 7600 Indice de polydispersité ou D n mesurant la largeur de la distribution moléculaire: 1,4 à 1,5. La masse moyenne apparente ou Ma qui correspond a la masse moléculaire de la population isomoléculaire majoritaire en concentration (c'est à dire le sommet du pic sur le chromatogramme) est comprise entre 6500 et 7200 Daltons. Le taux de sulfatation du produit c'est & dire le nombre de fonctions hydroxyle estérifiées par un groupement sulfurique est accessible par le dosage pondéral moyen du soufre: 15 a 20 %. On peut définir aussi le degré de sulfatation moyen de ce mélange de polymères ou D.S. comme le nombre moyen de groupes sulfuriques par unité xylose considéré comme élément monomére. Le degré de sulfatation moyen pour le produit, accessible par résonance magnétique nucléaire du proton ou par dosages centésimaux microanalytiques du carbone et du soufre est compris entre 1,5 et 2 et plus précisément proche de 1,8. Ce polysulfate de xylane est aussi caractérisé par les valeurs moyennes des dosages de pentoses et d'acides glucuroniques. Ainsi le pourcentage pondéral de pentoses exprime en équivalent xylose est de 30 à 40 Z. Le pourcentage pondéral d'acides uroniques (en fait principalement acide 4 MeO-glucuronique) exprime en acide glucuronique varie de 4 à 6 %. Ceci correspond à une proportion de 1 unité glucuronique pour 8 & 10 unités xyloses. -4- Différentes fractions isolées à partir du SP 54 ainsi que leur préparation, ont été décrites par la demanderesse dans les demandes de brevets N 83.05.170 du 24.03.1983 et N 84.17.460 du 07.11.1984. Ces fractions peuvent être définies par les caractéristiques suivantes degré de sulfatation moyen compris entre 1,S et 2 - masse moléculaires moyennes apparentes Ma comprises entre 2000 et 12000 Daltons. - - taux pondérai de pentoses exprimés en xylose compris entre 30 et 40 % taux pondérai d'acidesuroniques exprimé en acide glucuronique compris entre 0 et 10 % - les indices de polydispersité des distributions moléculaires pour les produits de l'invention sont inférieures ou égales a celles du produit Ces caractéristiques ont été déterminées selon les méthodes ci-après i - Spectre de resonance magnét i _nucléaire du carbone 13 Le spectre de résonance magnétique nucléaire du carbone 13 (80 MHz) est réalisé sur une solution a 10 % (m/V) dans l'eau deutériée. Les déplacements chimiques des pics correspondent aux atomes de carbone de l'unité xylose sulfatée, sont les suivants: Cl: 100,4 ppm; C2: 73,6 ppm; C3: 74,1 ppm; C4: 75,43 ppm et CS: 60,3 ppm. redersonanc ag gu éareduprotn Le spectre de résonance magnétique nucléaire du proton (250 MH2) est réalisé a la concentration de 20 % (m/V) dans l'eau deutériée. Le signal correspondant à l'eau est déplacé par ajout d'acide trifluoroacétique. Le degré de sulfatation peut être calculé sur la base de l'in- tégration des protons 1 et 3 (5,2 ppm et 4,8 ppm) de l'unité xylose sulfatée. - 5- 2574663 3 - Dosage des grouements mthoxy La méthode employée est celle décrite par LAVER M. et WOLFROM M.L. dans Methods in Carbohydrate Chemistry Vol. I, page 454, Edité par Ac. Press. 1962. - Dosage des acides uronigues La méthode employée est celle au carbazole de BITTER T. et MUIR H.M. (Anal Biochem, 1962, 4, 330-334). - Microdosage du soufre Après minéralisation en fiole de SHONIGER W. (Mikrochim Acta. 1956, 1, 869-876), le soufre est dose conductrimétriquement par le perchlorate de baryum. Les pourcentages centésimaux de soufre et de carbone (obtenu par microanalyse) permettent de calculer le degré de sulfata. tion ou D.S.: - nombre de moles de soufre pour 100 g de Produit: S nombre de moles de carbone pour 100 g de Produit: C T270TT % C - nombre de moles de xylose pour 100 g de Produit: 2 x - nombre moyen de ftnctionssulfates par xylose monomère ou D.S. =S x FS S 12,011 D. S. M 5 x-YT x 32,06 6 - Dosagedes._entoses La méthode employée est celle a l'orcinol et au chloru- re ferrique en milieu chlorhydrique (MEJBAUM W. - Z.Phy- siol.Chem., 1979,258, 117) en prenant le xylose comme étalon. 7 Dosagedusulfate de sodium' Il est réalisé par chromatographie liquide haute perfor- mance en utilisant une colonne IONOSPHER TmA de 25 cm de longueur (CHROMPACK ref. 28300) avec comme éluant de l'hydrogène phtalate de potassium a 0,7 % (m/V) dans l'eau distillée. L'étalonnage est réalisé avec du sulfate de sodium anhydre. - 6 - 8 - Détermination de la masse moléculaire Elle est réalisée par chromatographie d'exclusion à travers deux colonnes de silice de porosité 60 A et 500 A placées en série. L'appareil utilisé est celui de HEWLETT PACKARD 1081 B équipé d'un réfractomètre JOBIN et YVON IOTA et d'un injecteur HP 79841 A. L'ensemble est thermostaté à 30 C. La phase mobile contenant du sulfate de sodium est préparée selon BARTH H.G. et SMITH D.A. (J. Chromatogr. 1981,206, 410-415) et modifiéeen ajoutant 0,5 % de polyéthy lène glycol pour éviter les interactions de type pont hydrogène. La foce ionique de l'éluant est égale à 1. Les masses moléculaires moyennes en nombre (Mn), en poids (-w) et apparente (Ma) sont calculées à partir d'un étalonnage réalisé & l'aide d'oligosaccharides neutres (xylose, maltotriose) et de Dextranes (T40-T70 et T500) selon la méthode décrite par YAU W.W.; KIRKLAND J.J. et BLY D.D. dans Modern size-exclusion Liquid Chromatography page 315 Edite par J. WILEY et DONS (1979). L'indice de polydispersité est calculé selon le rapport Nw/Mn. - 7- 2574663 Parmi les fractions utilisables à titre de constituant du principe actif, dans la composition thérapeutique de l'in- vention, on citera: CARACTERISTIQUES ANALYTIQUES FRACTION MN MW D Ma 1 2794 3380 1,21 3346 2 2732 4183 1,53 -3518 3 3330 4480 1,34 3889 4 3307 4013 1,33 3939 !5 3133 4716 1,50 4066 6 3470 4570 1,30 4407 7 3648 4958 1,36 4674 8 4039 5058 1,25 4903 9 3680 5585 1,52 4921 6700 7850 1,17 7500 il _ 7180 9500 1,32 7890 _ _ _ _ _ -___ _ _ Le SP 54 ainsi que les fractions telles que definies ci-dessus, sont doués d'importantes activités anti-thrombotique et hypo- lipémiante. La demanderesse a maintenant trouvé que lorsqu'on administre le SP 54 ou une de ses fractions, en association avec un acide or- ganique pharmaceutiquement acceptable, de préférence un acide di-ou polycarboxylique et notamment l'acide citrique, isocitrique, tartrique, malique ou ascorbique, on obtient une augmentation considérable des activités anti-thrombotique et hypolipémiante. Ainsi,l'association constituant le principe actif de la compo- sition thérapeutique suivant l'invention, présente un effet de synergie qui va être mis en évidence dans l'étude pharmacologique suivante. -8- 2574663 -8- Cette étude a porté sur les actions anticoagulante, fibri- nolytique et lipolytique par les voies orale et intraduo- dénale, produites par l'association de l'invention par com- paraison avec le SP 54 et ses différentes fractions, utilisés seuls L'action anticoagulante est déterminée par le temps de cephaline actire(CAEN J., LARRIEU N.J., -SAMAMA M., In: L'hémostase: méthode d'exploration et diagnostic pratique. Ed.: l'Expansion Sctentifique Française, 1975, p.169). Le temps de céphaline activee (TCA)., mesure la recalci- fication du plasma déplaquetté en présence d'un optimum de lipides (cephaline) et de célite qui active de manière standardisée les facteurs de la phase de contact (les facteurs XII, XI, IX). I1 mesure donc la formation de prothmmbinase endogéne I l'exception des facteurs plaquettaires remplacés par la cephaline. - L'activité fibrinolytique est mesurée par le temps de lyse des euglobulines plasmatiques (KLUFT C. - Uaemos- tasis, 1976.5,136). Le temps de lyse des euglobulines plasmatiques est une méthode sensibiltsée permettant d'apprécier l'actton ft- brinolytique globale du SP 54 et de ses fractions en l'absence des Inhtibiteurs physiologiques de la ftbri- nolyse, éliminés par dilution et acidification du plasma. - L'action lipolytique est mesuréee par l'activité lipo- protéine lipase circulante (NIKKILA E.A., HUTTUNEN J.K., EHNHOLM C., - Metabolism, 1977, 26, 179). La détermination de l'activité lipoproteine lipase ctrculante est une mesure indirecte de l'impact du SP 54 et de ses fractions sur le catabolisme des triglycérides (pouvoir clarifiant) L'activité enzy- matique est déterminee par sa capacité d'hydrolyser le substrat 14C-trtoleine en 14C-acide oleique. Le SP 54 et ses différentes fractions sont administrés seuls, en une dose unique de 400 mg, puis en association avec l'acide citrique aux doses de 30 mg/kg pour la voie intraduodénale et mg/kg pour la voie orale. - Administration intraduodénale et orale des rats males (Sprague Dawley; Charles River; France) de 200 à 300 g sont utilisés. Les animaux sont soumis à une diète hydrique la veille des essais. Une anesthésie au pentobarbital (50 mg/Kg; 1.p.) est effectuée sur tous les animaux avant l'administration des différents produits a tester. Pour l'administration Intraduodénale, une incision est effectueée au niveau de l'abdomen. Le pylore et le i 5 duodénum sont isoles. Une incision est pratiquée à 1 cm du pylore et les produits sont introduits à l'aide d'une sonde dans le duodénum. Une ligature est effectuée en dessous de l'incision à l'aide de fil chirurgical. L'administration orale est effectuée par gavage à l'aide d'une sonde intragastrique. Les prélèvements sanguins pour l'analyse des divers paramètres pharmacologiques sont réalises 8 l'aorte abdominale respectivement 1 heure après l'administration intraduodénale et 2 heures après l'administration orale. Ils sont rendus incoagulables par une solution de citrate trisodique à 3, 8 p. 100 (1 volume d'anticoagulant pour 9 volumes de sang) ou de l'héparine (250 U/ml de sang) pour les mesures de lipoproteine lipase. Immédiatement après le prelèvement sanguin, les echantil- lons sont centrifuges à 2000 x g pendant 15 minutes & 4eC. pour la préparation du plasma citraté qui est utilisé pour les différents dosages. Les résultats sont rassemblés dans les tableaux 1 b 5; leur analyse statistique a été effectuée selon le testde STUDENT (groupe de comparaison: SP54). - lo - 2574663 rABL EAll] VOIE INIRADUODENALE - TEMPS de CEPHALINE ACTIVEE 400 9mg/kg9 400 i/kf itrique + 30 mo/kg d'ot de c ttrlque Produit Ma ---.............................. I+ -Es test et's FdZ [SMS et s M! SM Z test 't' vs sec (I)se *e) Teltyn SP54 sec (a) tem SPS4 TEMOINS 2D + 0,-- -- n.s. | 20 * 0,4- - p __ __ _ - 1o Fraction 13346 32 * 1,0 S 000 p _..... Fraction 64407 29 + 1,5 45p SP 54 6600 21 0.4 5 n.s. -- 32 * 1,2 60 p (&): Z prolongation - il - 2574663 TABL AU, 2 VOIE INTRADUODENALE - ACDIVITE ANII-Xa (TEMPS DE VIN) 400 mg/kg 400 g"/kg + 30 mg/kg d'ac de cttriqu Produit -.. t est;t; vs ' [SM _ % test mtt vs M*.[ú M % sec () SP4 sc () SP54 Tm SPS4 tem TEOINS 33 * 0. _... p - 12- 2574663 TABLEAU 3 VOIE INTRADUODESALE - TEMPS DE LYSE DES EUGLOBULINES _ 400 mg/kg 400 a/k + 30 mi/kg d ecde cttrique Produit Ma --------.---.--................--- I[ESN S test t - [Sm S test;t' VS sec (a) | sec)8) sec (a) Tem SP54 SC > tels SPS4 TEOINDS 134 * 6.134 * 2 _ pC, Fraction 1 3346 102 * 4 24 p Fraction 3518 97 * 4 28 p - Fraction 3 3889 10S + 4 22. p Fraction 5 4066 93 * 4 30 p Fraction 6 4407 72 * 2 46 p - - Fraction O 4903 94 8 30 p Fraction 10 7500 106+2 21 [0,01 p -. .-.- -. Fraction 1I 7890 95 + 9 29 SP 54 6600 124 + 8 7 n.s. - 84 2 37 p - 13- 2574663 TABSL'AU 4 VOIE INTRADUODENALE - L1POPRDTEINE LIPASE (L.P.L.) 400 mg/kg 400 m/ * 30 mg/kg d ecde citrlique Produit ma. - ------....- - --........................ #-*úS# #-_úHtest;tvs N ES S test et vs (-) tee SPS4 sec (a) Tes SP54 TENOINS *2 0.3 6 -- pCO,001 5 + 0,2 8 -- pe0,0D1 Fraction à 3346 14,1 1,6 26 p Fraction 2 8 Fraction 5 4066 15 - o5 28 pC0,001 P0,01 3,9 + 6,9 54 p Fraction 6 4407 3,9 +0,7 7.s. p Fraction 9 4923 5,1.1,S 28 p - s - -- - -à Fraction 10 7500 6.6 1,. Il p(0,001 n.s. 43,2+ 0R 71 pt(0,001 n.s. Fraction 11 7800 9,94 1. 16 p(0,001 n.s. 34.2+ 3,1 56 p SP 54 6600 7,6.0,6 14 p (a): S de. libération x mol acide oleique/ml/h - 14- 25?4663 AEBLEAU 5 VOIE ORALE - TEMPS DE CEPHALINE ACTIVEE 400 mg/kg 400 m e/kg À 120 Ig/kg dbclde c1tr1que Produit Na --- --. . . ... M-ES51 t test t vs N- úSM S test t vs sec () Tem sp54 sec (>) -e SP54 TEMOINS Z0 aO G,..... 19 0,4 -. - -- _ Fraction I 3346 29 O, 45 p Fraction S 4066 29 * 0. 45 p Fraction 6 4407 21 * 0.l 5 n.s. n.s. 22 * 0.4 16 pO.01 pO.001 Fraction 8 4903 21 * 0. 5 n.s. n.s. 22 * 0,1 16 pF,01 P Fraction 9 4921 29 + 0. 45 p Fraction 10 7500 21 + O 5 n.s. n.s. 30 + 06 58 P Fraction 1l 7890 22 10 (0.05 SP 54 6600 20 + 0, O.s. -- 27 * 0.5 42 p (): S prolongation Les résultats précédents montrent la nette potentialisation des propriétés antithrombotique et hypolipémiante de l'association de l'invention. Ainsi, la fraction de l'exemple 1 administrée seule, par la voie intraduodénale, à la dose de 400 ing/kg, provoque un allongement de 60 % du temps de céphaline activée (TCA). En association ave mg/Kg d'acide citrique, l'allongement du TCA est porté à 240 L'étude toxicologique a mis en évidence la bonne tolérance de la composition thérapeutique suivant l'invention. En effet, sur ce plan, il n'a été constaté aucun phénomène de potentialisation. Les différentes études effectuées sur la toxicité aigue, chroni- que et retardée ainsi que sur la tolérance locale et générale, n'ont mis en lumière aucune réaction anormale, aucune pertur- bation dans les contrôles biologiques, les courbes de croissance et les examens macroscopiques.et microscopiques effectués après sacrifice. Le médicament de l'invention peut être présenté sous les formes administrables par les voies orale, parentérale, rectale et local Chaque dose unitaire contient avantageusement de 0,030g à 0,250 de SP 54 ou une de ses fractions en association avec une quan- tité d'un acide organique allant de 0,050 g a 0,250 g. Ainsi, les proportions de l'acide organique dans le principe actif, peuvent varier, dans une large fourchette, de 20 % à 800 %, la proportion préférée étant comprise entre 80 % et 120 %. Les doses administrables journellement, exprimées en SP 54 ou ses fractions, peuvent varier de 0, 030 g à 1,000 g en fonction de la gravité et de l'affection traitée. On donnera ci-après, à titre d'exemple non limitatif, quelques formulations pharmaceutiques du médicament de l'invention. 1 - Comprimés couche inférieure (Principe actif) Fraction de l'exemple 1.. ................. 250 mg Lactose.................................... 50 mg Cellulose excipient........................ 60,1 mg Magnésium stearate...DTD: ...................... 9 mg Silicium dioxyde colloïdal................. 0,8 mg Indigotine, laque aluminique............... 0,1 mg..DTD: Pour une couche terminée à 370 mg. - 16 - 2574663 couche Intermédiaire (couche neutre) Lactose............................ 132 mg Cellulose excipient 9............. 0,7 mg Magnésium stéarate....... ........ 7,5 mg Silicium dioxyde colloidal......... 0,6 mg Jaune-orangé S, laque aluminique... 0,2 mg..DTD: Pour une couche terminée & 250 mg. 10.couche supérieure (couche acide citrique) Acide citrique cristallisé... .... 250 mg Cellulose excipient................ 84,8 mg Carboxymethylcellulose............. S mg Magnésium stearate.................DTD: 10 g Jaune de quinoléine, laque aluminique 0,2 mg..DTD: Pour une ceuche terminee à 350 mg.- Pour un com2rimé triele couche nu terminé à 970-au Pour chacune des formes précédemment citées, on peut réalisei un pelliculage gastrosoluble ou un pelliculage gastrorésistai dont les formules sont les suivantes: Pelliculagegas_ esoluble Polymethylacrylate de butyle et dimethylaminoéthyle, granulé...............QS - Isopropanol pharmaceutique industriel........QS Acétone............................... ....QS Phtalate de dibutyle.........................QS Acide silicique....DTD: .........................QS - Pelliculagegastoristant Polymethylacrylate anionique, type 1l poudre. QS * Isopropanol pharmaceutique pharmaceutique industriel........................ QS Acétone.................,................... QS Phatalate de dibut yle......DTD: .................QS..DTD: - 17 - 2574663 2 - Gélules Fraction de l'exemple 4................... 0,100 g Acide citrique cristallisé................. 0,100 g Excipient..............q.s. p.............. 1 gélule 3 - solutés injectables Fraction de l'exemple 7.. ............... 0,100 g Acide citrique cristallisé................ 0, 050 g Solvant isotonique.....q.s.p............... 1 ampoule c 4 - Pommade Fraction de l'exemple 11.................. 0,150 g Acide citrique cristallisé................ 0,050 g Excipient..............q.s.p............DTD: .. 1 tube de 3 Par leur action sur les différents stades de la coagulation sanguine et de la fibrinolyse, ces médicaments peuvent êtri utilisés avec profit, en cures prolongées et répéteées dans..DTD: le traitement préventif ou curatif d'accidents thromboembo. * liques veineux ou artériels dans les cas de phlébites, embolies pulmonaires et autres situations cliniques du émat type, angines de poitrine, infarctus du myocarde, artérite! chroniques des membres inférieurs, troubles circulatoires superficiels et ulcères des Jambes. Ils peuvent également tre utilisés pour prévenir les throu boses dans les circuits extra-corporels (hémodialyses rénal - 18 - 46 En outre, leur action sur la lipoprotéine-lipase (facteur clarifiant) les rend particulièrement utiles dans le trai- tement des dyslipémies ethérogènes. Enfin, ces médicaments peuvent également être utillEs avec profit dans le traitement de certaines maladies tnflamma- toires, telles que polyarthrite rhumatolde, arthroses et ostioarthrites. - 19 - 2574663 REVENDICATIONS 1 - Composition thérapeutique ayant notamment une activité antithrombotique et lipolytique caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif, une association de polysulfates de xylane et d'un acide organique. 2 - Compositon thérapeutique suivant la revendication 1 carac- térisée en ce que le polysulfate de xylane est le SP 54. 3 - Composition thérapeutique suivant la revendication 1 ou 2 caractérisee en ce que le polysulfate de xylane est une fraction du SP 54. 4 - Composition suivant la revendication 1 caractérisée en ce que l'acide organique est de préférence, un acide di-ou polycarboxylique choisi parmi les acides citrique, isoci- trique, tartrique, malique ou ascorbique. - Composition thérapeutique suivant l'une quelconque des re- vendications précédentes, caractérisée en ce-qu'elle est présentée sous forme de doses unitaires contenant chacune de 0,030 g à 0,250 g de polysulfate de xylane et de 0,050 g à 0,250 g de l'acide organique, le principe actif étant associé à un véhicule pharmaceutiquement acceptable.