FR 2577139 A1 19860814 FR 8601670 A 19860207 La présente invention se rapporte à une composi- tion de vaccin et à un procédé pour la vaccination par in- jection de mammifères, oiseaux et poissons. Les méthodes intensives d'élevage d'animaux pour l'alimentation (viandes oeufs et lait), dans les condi- tions de l'agriculture moderne, rendent impérative l'immu- nisation contre une grande variété de maladies. Les oiseaux et les mammifères sont sensibles à de nombreux organismes pathogènes qui font courir des ris- ques à tout élevage, même très éloigné et isolé. Comme exemples de telles maladies dévastatrices, on peut citer la maladie de Newcastle, la variole aviaire, la laryngo- trachéite infectieuse, la bronchite infectieuse des volail- les et la rhinotrachéite des bovins, la diarrhée virale des bovins, les infections clostridiales du bétail et des moutons, etc. Depuis les vaccins de Louis Pasteur contre le choléra des volailles et la rage, on a créé et appliqué avec succès de nombreux vaccins dans diverses conditions sur toute la planète. Ces différents types peuvent être divisés en deux catégories principales: les vaccins vi- vants et les vaccins inactivés ou tués. Les vaccins vi- vants utilisent des cultures vivantes de souches atté- nuées ou naturellement bénignes du microorganisme, tandis que les vaccins inactivés utilisent la forme naturelle ou une autre forme de l'agent pathogène dans un état biologi- quement inactif. Il y a plusieurs différences importantes entre ces deux catégories de préparations immunisantes. Les vac- cins vivants présentent les avantages suivants: - application massive à de grandes populations dans cer- taines circonstances (par l'intermédiaire de l'eau de bois- son, pulvérisation d'aérosol, etc.), - une quantité relativement petite de l'agent immuni- sant suffit pour induire l'immunité, car l'organisme vivant se multiplie dans le corps des animaux vaccinés, - les vaccins vivants sont habituellement plus écono- miques et d'application moins chère, - ils nécessitent un espace relativement petit de sto- ckage au froid. Par contre, les vaccins vivants présentent un inconvénient important, en ce que l'immunité,qui résulte de la vaccination d'animaux avec des vaccins vivants,est souvent de très-courte durée, ce qui nécessite des vacci- nations supplémentaires répétées. Les vaccins inactivés sont différents des vac- cins vivants. Leurs avantages sont les suivants: - la sécurité de l'utilisation d'un microorganisme inactivé (tué) est évidente et constitue le principal avan- tage par rapport aux vaccins vivants, - les vaccins inactivés sont souvent associés à un ad- juvant, une subtance chimique ou une entité biologique qui sert à améliorer la capacité d'immunisation du microorga- nisme inactive; par combinaison de l'antigène et de l'ad- juvant, le vaccin inactivé devient puissant et efficace; de tels vaccins ont une plus longue durée d'effet que les vaccins vivants. Leurs inconvénients sont également importants: - les vaccins inactivés sont plus coûteux à produire car ils doivent contenir une plus grande masse de l'antigè- ne pour induire une bonne immunité, - certains procédés d'inactivation altèrent la configu- ration de surface de l'antigène et la spécificité du vaccin est donc réduite; - les vaccins inactivés doivent être appliqués par in- jection individuelle à chaque animal et ils ne peuvent pas être appliqués par des méthodes de masse, - ils occupent des volumes et des poids importants né- cessitant un stockage au froid, - ils provoquent souvent des réactions à l'endroit de l'injection; dans le cas d'adjuvants huileux, ceux-ci peuvent devenir granuleux. Comme indiqué ci-dessus, les adjuvants sont de- venus des composants importants des vaccins inactivés. Il existe des adjuvants biologiques, tels que des endotoxines bactériennes; des extraits capsulaires de pneumococcus de type lipo-polysaccharide (LPS); des organismes Mycobacte- rium entiers et des composants fractionnaires de parois de cellules mycobactériennes. On a utilisé des irritants, comme la saponine, comme adjuvants dans divers vaccins. On a essayé des substances chimiques tensioactives, telles que détergents, polyols, substances polyanioniques, et on a également utilisé des polynucléotides. On a utilisé des adjuvants qui produisent des configurations physiques pour "présenter" l'antigène sous une forme protégée,avec un mécanisme de libération lente, par exemple des liposomes, ou bientsuivant un principe dif- férent,l'antigène est adsorbé sur des molécules de gel d'hydroxyde d'aluminium. L'un des adjuvants les plus couramment utilisés est l'émulsion d'eau dans l'huile,du type Adjuvant Incom- plet de Freund. Ce système comprend une phase aqueuse (ou eau) dans laquelle l'antigène est dissous ou suspendu, une phase d'huile dans laquelle la phase eau est suspendue en petites gouttelettes, et une interface entre les phases eau et huile, habituellement délimitée par des émulsifiants qui stabilisent l'émulsion. Les vaccins émulsifiés du type eau/huile sont des agents immunisants très puissants et efficaces. Le mécanisme exact du renforcement de l'immuni- té n'est pas très bien déterminé. On pense qu'il s'agit d'un mécanisme de présentation d'antigène, ou d'un dépôt d'antigène qui reste pendant une longue durée au point d'injection, ou d'une substance qui attire une grande quan- tité de macrophages,ce qui améliore alors la réponse d'im- munisation, ou une combinaison de ces mécanismes. Quel que soit le mécanisme réel, l'effet net est que les vaccins émulsifiés de fype eau/huile sont de très bons immunogè- nes. Les animaux ainsi vaccinés répondent généralement a- vec un niveau élevé d'immunité, à la fois humorale et cel- lulaire, l'immunité dure très longtemps et souvent plus d'un an ou deux, et les niveaux d'immunité,obtenus dans des populations animalessont habituellement très cons- tants. Dans certains cas et afin de diminuer la réac- tion au point d'injection, on utilise une émulsion double, c'est-à-dire l'émulsion d'eau dans l'huile dans l'eau. Ce type de vaccin est très semblable au type eau/huile. Les meilleurs résultats de la vaccination avec des vaccins du type eau/huile sont obtenus,avec des volail- les par exemple, lorsqu'on combine un vaccin vivant et un vaccin inactive. Cela peut être effectué-simultanément, sur des poulets d'un jour, des dindonneaux, etc. vaccinés contre la maladie de Newcastle à la couveuse. Les poulets sont vaccinés par pulvérisation, par aérosol ou par des gouttes oculaires ou nasales, avec un vaccin vivant de la maladie de Newcastle, tel que la souche Hitchner B1, et en même temps on leur injecte un petit volume (habi- tuellement 0,1 à 0,2 ml) de vaccin de maladie de Newcastle émulsifié eau/huile,inactivé. Cette vaccination combinée donne une immunisa- tion qui supprime l'immunité maternelle (passive) des poulets,qui interfère habituellement avec l'immunisation active des jeunes poulets (D. Warden, I.G.S. Furminger & W.W. Robertson, 1975; W.W. Robertson, et al. 1976). On a constaté ensuite que "l'amorçage" d'un animal avec un vaccin actif et le "renforcement" de l'im- munité avec un vaccin eau/huile inactivé donne des résul- tats d'immunité excellente et durable. C'est devenu une procédure normale dans les élevages de volailles de vac- ciner les poulets pendant leur croissance une ou plusieurs fois avec des vaccins vivants, puis de continuer avec un vaccin tué émulsifié eau/huile, avant la ponte. Ainsig les poules d'élevage et de ponte sont immunisées de manière à obtenir un niveau d'immunité élevé et uniforme qui dure pendant toute la période de ponte (10 à 12 mois environ) ou davantage. Cela est pratiqué dans les cas de maladie de Newcastle, maladie infectieuse de Bursal ("Maladie de Gumboro"), bronchite infectieuse, arthrite virale, etc. Dans tous ces cas, les vaccins vivants sont composés de souches atténuées ou naturellement bénignes des agents pathogènes, qui sont sans danger ou très modéréesdans les réactions secondaires apparaissant après leur utilisation. Suivant la présente invention, on obtient une composition de vaccination comprenant les composants à la fois des vaccins vivants et des vaccins inactivés émulsi- fiés de type eau/huile ou eau/huile/eau. On utilise un vaccin vivant à combiner,juste avant l'emploi,avec une émulsion eau/huile qui est stérile et ne contient pas du tout d'antigène. L'émulsion eau/huile est composée d'une phase aqueuse qui peut être de l'eau, une solution saline, un tampon (tel qu'une solution saline tamponnée au phos- phate) ou un autre type de solution sans danger; d'une phase huileuse constituée d'une huile minérale (telle que Draceol ou une autre huile comportant des chaînes d'hydrate de carbone de diverses longueurs) ou d'une huile végétale (telle qu'huile de sésame, d'arachide, de mais, etc.; et des émulsifiants pour la phase aqueuse,tels que Tween 40, 60, 80, etc. (monopalmitate de sorbitan POE, monostéarate, monooléate, etc.),et pour la phase huileuse, tels que Arlacel A,Arlacel 80, etc. (monostéarate de sorbi- tan, monooléate de sorbitan, monooléate de mannide, etc.). Le vaccin vivant est habituellement présenté sous la forme d'une culture vivante de virus, bactéries ou au- tre microorganisme, habituellement sous forme stabilisée, par exemple un "gâteau" séché par congélation (lyophilisé) ou une poudre. On reconstitue le vaccin vivant, juste avant l'utilisation, avec un petit volume d'eau. On verse ensuite le vaccin vivant reconstitué dans l'émulsion eau/huile et on mélange intimement par secouage. Cette procédure provoque la dispersion du vaccin vivant dans l'émulsion eau/huile et il trouve sa place dans la phase aqueuse. On injecte ensuite à l'animal ce mélange de vac- cin vivant et d'émulsion eau/huile. Le résultat est qu'une réaction immunisante intense et efficace se développe dans l'animal vacciné, cette réaction combinant les avantages des deux types de vaccins. L'immunité est très élevée, comme exprimé en niveaux d'anticorps en circulation, elle est uniforme dans la population vaccinée et elle est de longue durée. Les avantages de ces compositions de vaccina- tion sont: - On utilise un vaccin vivant, qui contient une quantité d'antigènes relativement petite, ce qui est un facteur d'é- conomie puisque les vaccins vivants sont beaucoup moins chers que les vaccins inactivés; le vaccin vivant se mul- tiplie dans le corps de l'animal vacciné. - Le vaccin vivant est emballé dans de très petites am- poules qui demandent peu d'espace de stockage au froid, tandis que le composant d'émulsion eau/huile est très sta- ble et ne nécessite pas de stockage au froid; il a une longue durée de conservation et il peut être conservé dans des conditions de stockage normales. - L'immunité résultante dépasse généralement celle qui est obtenue par une application unique de vaccin vivant. - Il n'est pas nécessaire de combiner deux applications de vaccin; la présente composition combine effectivement les vaccinations "d'amorçage" et de "renforcement" en une seule opération, de sorte que l'ensemble du traitement éco- nomise du temps et du travail. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs ci-après. EXEMPLE 1 On utilise des poulets croisés légers, de 32 jours (Leghorn blanc x Rhode Island rouge), précédemment non vac- cinés. On traite des groupes de 20 oiseaux, chacun comme suit: un groupe est vacciné avec un vaccin vivant de la maladie de Newcastle (souche V.H.) donné en injection sous- cutanée; un groupe est vacciné de la même façon avec la souche LaSota; un groupe est vacciné par injection sous- cutanée avec la souche V.H. mélangée à une émulsion eau/ huile, à un volume de 0,5 ml pour chaque poulet; et un groupe sert de témoins non vaccinés. Le tableau I récapi- tule les résultats des titres d'Inhibition d'Hemagglutina- tion (HI),en moyenne géométrique en Log2, à divers inter- valles après la vaccination. L'émulsion eau/huile conte- nait une solution saline + Tween 80 (phase aqueuse) et Draceol + Arlacel A (phase huileuse), comme décrit par D. Lombardi 1966; Z. Zakay - Rones & R. Levy 1973 TABLEAU I Vaccination Résultats HI après vaccination en jours 0 7 20 30 41 51 62 VH + eau/huile 1,0 1,0 3,0 4,2 4,1 3,9 3,9 VH seul 1,0 1,0 1,35 1,85 1,8 1,6 1,8 LaSota + eau/huile 1,0 1,0 2,6 4,0 4,6 4,0 4,0 LaSota seul 1,0 1, 9 2,0 2,0 2,0 1,8 2,4 Témoins non vaccinés 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,2 Ces résultats montrent bien que des poulets sen- sibles sont bien protégés par le vaccin vivant mélangé à l'émulsion eau/huile, par comparaison aux témoins non vac- cinés et aux poulets vaccinés avec le vaccin vivant seul. EXEMPLE 2 On utilise dans cet essai des poulets de 63 jours. On traite des groupes de 15 oiseaux chacun. On vaccine un groupe à l'aile, au moyen d'une aiguille de vaccination,avec un vaccin de variole aviaire à virus vivant du commerce, en utilisant comme diluant une solution saline glycérinée appropriée. On vaccine un groupe par injection sous-cuta- née d'un mélange du même vaccin vivant de variole,dilué dans l'eau distillée et mélangé intimement dans une émul- sion eau/huile, comme dans l'essai n 1. Un groupe n'est pas vacciné et sert de témoin. Le tableau II récapitule les résultats de l'essai. La vérification de l'immunité est effectuée par exposition des poulets par la voie cutanée à un virus de variole aviai- re et lecture du site d'exposition cutanée 6 à 10 jours plus tard. Des résultats positifs (lésions à pustules ou à croûtes) indiquent un défaut d'immunité lors de l'exposi- tion au virus. TABLEAU II Vaccination Résultats 21 jours après d'exposition vaccination ______ _ au virus Variole aviaire seul 0/15* Variole aviaire dans eau/huile 0/15 Témoins 15/15 * Nombre d'oiseaux positifs après exposition, sur 15 exposés. Ces résultats montrent que, bien que le vaccin de la variole aviaire donne habituellement satisfaction pour immuniser par vaccination transcutanée, le vaccin vivant mélangé dans l'émulsion eau/huile immunise les pou- lets contre l'exposition au virus. EXEMPLE 3 On utilise 60 poulets de 63 jours. 15 servent de témoins et 45 sont vaccinés avec une émulsion eau/huile comme décrit dans l'exemple 1 et dans laquelle on a mélan- gé deux vaccins vivants, à savoir une souche LaSota de virus vivant de maladie de Newcastle et un virus atténué de variole aviaire. Le mélange de double vaccin vivant eau/huile est injecté de façon sous-cutanée dans les 45 oiseaux, à un volume de 0,5 ml,dans la région du cou. 21 jours plus tard, on expose les oiseaux au virus de la va- riole aviaire, comme décrit dans l'exemple 2. On effectue les tests HI sur des échantillons de sang prélevés sur ces oiseaux, afin de vérifier l'immunité contre la maladie de Newcastle. Le tableau III récapitule les résultats. TABLEAU III Vaccination Exposition à la Résultats HI ________variole aviaire Newcastle 0 jour 21 jours Variole aviaire + Newcastle dans eau/huile 2/45 1l0 4,0 Témoins 15/15 1,1 1,0 Les résultats de cet essai montrent que la nou- velle combinaison est efficace dans le cas de microorga- nismes vivants multiplescomme dans le cas d'entités sim- ples. Ce qui précède montre que l'utilisation de vac- cins vivants,mélangés à une émulsion eau/huilepréalable- ment préparée, juste avant l'injection dans des animaux/ est une méthode efficace, simple et économique d'immunisa- tion des animaux. La combinaison améliore les capacités d'immunisation de vaccins vivants, avec des résultats si- milaires à ceux qu'on obtient avec des vaccins inactivés en émulsion huileuse mais avec des avantages d'économie de prix et de stockage très importants. Diverses combinaisons adjuvant-antigène fonc- tionnent effectivement sur une base analogue. Le mécanis- me exact suivant lequel ces combinaisons agissent n'est pas encore complètement compris. Le mélange de vaccins vivants avec une émulsion eau/huile n'est pas la seule combinaison possible. On peut obtenir des résultats ana- loguesllorsqu'on utilise d'autres adjuvants. 1 0 En outre, sachant que différentes entités anti- gènes agissent sur des composants identiques du système immun, tels que macrophages, cellules T d'aide, cellules T de précurseur, cellules B,ainsi qu'interleucines et au- tres facteurs (de prolifération ou de suppression), il est clair que beaucoup d'antigènes induisent le même type de riéponse renforcée lorsqu'ils sont mélangés avec un adjuvant. Le virus de la vario]eaviaire et le virus de la maladie de Newcastle, beaucoup d'autres virus, des bacté- ries et également des bactéries mycoplasmales, chlamydia- les et fongiques se comportent de façon similaire. D'une manière analogue, on peut préparer des compositions de vaccination comprenant divers types de bactéries et d'émulsion, comme indiqué ci-dessus: Pas- teurella multocida vivant,atténué, (souche Cleson Univer- sity - Souche CU ou M-3 G); Bacillus anthracis (vaccin de Stern), Brucella abortus (Souche Buck 19), Brucella melitensis (Souche Rev-1); de Mycoplasma Gallisepticum, et on obtient une immunité effective. On procède à des essais pour comparer l'effica- cité d'une émulsion d'eau dans l'huile par rapport à une émulsion d'huile dans l'eau lorsqu'on utilise les émul- sions dans des compositions pour la vaccination. On vaccine 20 poulets du type utilisé dans l'exemple 1 contre la maladie de Newcastle (souche de l'exemple 1),comme décrit dans cet exemple. Dans un essai, on utilise une émulsion &'huile dans l'eau, dans l'autre une émulsion d'eau dans l'huile. On vaccine les deux grou- pes d'oiseaux avec des vaccins préparés par mélange peu de temps avant l'injection. On évalue les résultats 14 jours plus tard, par détermination de la concentration dans le sang d'anticorps contre la maladie de Newcastle au moyen du test HI (inhibi- tion d'hémagglutination). On trouve que le groupe 1 (émul- sion d'huile dans l'eau) donne une valeur de Log2 1,9 tan- dis que le groupe 2 (eau dans l'huile) donne une valeur de 1 1 Log2 4,0. Ce résultat démontre la sensible supériorité de l'émulsion eau dans l'huile pour de telles vaccinations. L'essai effectué après 14 jours montre-la grande efficacité des compositions suivant l'invention, par rap- port aux résultats non satisfaisants de l'émulsion huile dans l'eau. On peut obtenir des résultats analogues par mé- lange d'autres types d'adjuvants avec un vaccin non viru- lent,peu de temps avant la vaccination. Comme adjuvants appropriés, on peut citer certains détergents, polymères, polyols et liposomes et, chaque fois qu'on utilise ici le terme "adjuvant", il englobe également ce type d'adjuvant. Il est entendu que des modifications de détail peuvent être apportées dans la mise en oeuvre et l'appli- cation du vaccin et du procédé de vaccination suivant l'invention, sans-sortir du cadre de celle-ci. Revendications 1. Composition de vaccination pour application par injection à des mammifères, des oiseaux et des pois- sons, caractérisée en ce qu'elle comprend: a. Un vaccin vivant non virulent de virus, bactéries, bac- téries mycoplasmales, bactéries chlamydiales ou microorga- nismes fongiques, ou un mélange de tels microorganismes, b. Un adjuvant approprié, le mélange final étant préparé peu de temps avant l'injec- tion. 2. Composition de vaccination suivant la revendi- cation 1, caractérisée en ce que l'adjuvant est une émul- sion d'eau dans l'huile ou une émulsion d'eau dans l'huile dans l'eau. 3. Composition de vaccination suivant la revendi- cation 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle est présentée sous forme de mélange à préparer, avec des récipients sépa- rés pour chacun des deux ingrédients. 4. Composition de vaccination suivant la revendi- cation 3, caractérisée en ce que le vaccin vivant est sous forme de dose unitaire et l'adjuvant est en masse dont on prend une certaine quantité pour mélanger au vaccin. 5. Composition de vaccination suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'adjuvant est du type Adjuvant Incomplet de Freund, comprenant une phase aqueuse d'eau, de solution saline ou de solution saline tamponnée, la phase huile comprenant une huile végétale ou une huile minérale, et l'émulsifi- cation étant engendrée au moyen d'un émulsifiant appro- prié. 6. Composition de vaccination suivant la revendi- cation 5, caractérisée en ce que l'huile est choisie parmi les huiles d'arachide, mais, sésame et soja, et l'émulsi- fiant est du type Tween 40, Tween 60, Tween 80, Arace160, Aracel 80 ou analogue. 7. Composition de vaccination suivant l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ceb que le vaccin comprend un microorganisme non virulent ou une souche atténuée d'un agent pathogène. 8. Composition de vaccination suivant la reven- dication 7, caractérisée en ce que le vaccin contient un mélange de plusieurs souches de microorganismes. 9. Procédé de préparation d'une composition sui- vant une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'on mélange un vaccin vivant, non virulent, avec un adjuvant, très peu de temps avant l'utilisation du vaccin. 10. Procédé suivant la revendication 9, caracté- risé en ce que l'adjuvant est une émulsion d'eau dans l'huile ou une émulsion double d'eau dans l'huile.