FR 2585366 A1 19870130 FR 8511221 A 19850723 L'invention concerne un procédé d'hydroxylation d'alca- loides du quinquina, et plus particulièrement un nouveau procédé d'hydroxylation de la quinine, de la quinidine, et de dérivés, par voie microbiologique. L'hydroxylation microsomale hépatique constitue souvent l'une des premières étapes du métabolisme d'un composé chi- mique étranger introduit dans l'alimentation ou la circu- lation sanguine des mammifères. Ces hydroxylations, suivies d'autres réactions, comme la 0-méthylation ou la conju- gaison, sont destinées à rendre ces substances plus hydroso- lubles, donc à accélérer leur élimination. Cependant dans certains cas, les dérivés hydroxylés se trouvent être plus actifs, ou plus toxiques, que la molécule originale, ce qui justifie l'intérêt de leur identification, et par suite de leur préparation pour l'étude de leur activité. Les méthodes de synthèse organique présentent des faci- lités évidentes pour les métabolites de substances simples, mais la préparation chimique de métabolites de molécules plus complexes (et optiquement actives) peut nécessiter une quantité d'efforts et de temps considérable. Les hydroxylations par voie microbiologique ont déjà été considérablement développées depuis de nombreuses années, dans le domaine des stéroides, o elles ont permis l'obtention, à l'échelle industrielle, de produits hydro- xylés régio- et stéréosélectivement, résultant de l'oxy- dation spécifique d'atomes de carbone non fonctionalisés. De telles molécules auraient demandé des efforts synthétiques considérables si des méthodes purement chimiques avaient dû être -employées. Cette méthode a depuis été appliquée à d'autres familles de molécules et constitue, dans certains cas, un mode privilégié d'obtention de composés nouveaux, transposable à grande échelle, en utilisant les techniques etles équipements classiques des fermentations. De plus, il apparalt que les hydroxylations microbiennes conduisent pour chaque espèce à un éventail de métabolites souvent beaucoup plus restreint que celui des systèmes de mammifères, ce qui élimine certains problèmes de séparation; il suffit alors de jouer sur la multiplicité des souches pour reconstituer la variété éventuelle des métabolites hépatiques. Toutefois, dans le domaine des alcaloides, assez peu de réactions de ce type ont été décrites, et elles portent pour la plupart sur la partie non azotée de la molécule, aroma- tique ou stéroidique. Il est pourtant souhaitable et inté- ressant de pouvoir effectuer dans de bonnes conditions l'hydroxylation de noyaux azotés d'alcaloides dont les pro- duits ont déjà été reconnus comme des métabolites actifs. En particulier, le brevet français 2.506.312 décrit des dérivés hydroxylés de la quinidine, tels que l'hydroxy-3 dihy- dro-10,11 quinidine et ses épimères 3R et 3S, utilisables en thérapeutique pour le traitement des arythmies cardiaques. On sait par ailleurs que la quinine, dont les propriétés pharmacologiques sont connues, et la quinidine sont deux isomères se différenciant par leurs configurations au niveau des atomes de carbone en positions 8 et 9. La préparation de ces composés actifs, optiquement purs, par une méthode microbiologique transposable à l'échelle industrielle représente donc un objectif d'un intérêt évident, par rapport aux hydroxylations de type chi- mique qui conduisent, avec un rendement médiocre, à un mélange diastéréoisomérique. La présente invention a donc pour objet un nouveau procédé d'hydroxylation microbiologique de la quinine, la quinidine, et leurs dérivés, en particulier leurs dérivés hydrogénés, de manière régio- et stérospécifique, pour obtenir des composés optiquement purs. L'invention a également pour objet un procédé d'hydro- xylation microbiologique de la quinine, la quinidine, et leurs dérivés, susceptible d'être mis en oeuvre industriel- lement et de procurer des composés optiquement purs avec un rendement satisfaisant au moyen d'un appareillage de type conventionnel. Le procédé d'hydroxylation microbiologique régiospé- cifique et stéréospécifique suivant l'invention, permet d'hydroxyler en position 3S la quinine, la quinidine et leurs dérivés représentés par la formule (I): R H CH 15.CH330 dans laquelle R représente un groupe éthyle ou un groupe vinyle pour former les dérivés 3S-hydroxylés correspondants, de formule (II): R OH HO R-.-_ N0 CHII CH3 dans laquelle R a la même signification que ci-dessus, en faisant agir sur les composés de formule (I) un microorga- nisme du type champignon inférieur choisi dans le groupe constitué par Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus, 25853'66 Aspergillus niger, Cunninghamella echinulata, Curvularia lunata, Mucor circinelloides, Mucor plumbeus, Penicillium purpurogenum, Rhizopus arrhizus ou du type bactérien tel que Streptomyces rimosus. Dans la formule (I) ci-dessus, R représente un groupe vinyle dans le cas de la quinine et de la quinidine, qui se différencient par leurs configurations au niveau des atomes de carbone en positions 8 et 9, et R représente un groupe éthyle dans le cas des dérivés hydrogénés, c'est-àdire la dihydroquinine et la dihydroquinidine. La même observation vaut pour les dérivés hydroxylés de formule (II). On utilise de préférence les souches identifiées ci-après: Aspergillus ochraceus (ATCC 1008), Aspergillus flavus (MMP 3249), Aspergillus niger (NRRL 599), Cunningha- mella echinulata (NRRL 3655, MMP 2203), Curvularia lunata (NRRL 2380), Mucor circindlloides (CBS 108-16), Mucor plumbeus (MMP 430, CBS 111-07), Rhizopus arrhizus (ATCC 11145), Streptomyces rimosus (NRRL 2234), et Penicillium purpurogenum (MMP 222 bis), et le procédé consiste à faire agir l'un des microorganismes ci-dessus sur le composé à hydroxyler. Les références ci-dessus ont les significations con- nues, c'est-à-dire, NRRL: Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Center, Peoria, Ill. (USA); ATCC: American Type Culture Collection, Rockville, Md. (USA); CBS: Centraal Bureau voor shimmelcultures, Baarn (Pays-Bas); MMP: Mycothèque du Museum d'Histoire Naturelle, Paris (France). Suivant le procédé d'hydroxylation de l'invention, il est préférable de faire croître le microorganisme dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de car- bone, d'azote et de sels minéraux, dans des conditions de fermentation aérobie, en culture immergée. Le composé à hydroxyler est ajouté, de préférence stérilement, au milieu, on laisse incuber jusqu'à obtenir une quantité suffisante de produit hydroxylé, et on extrait par les techniques usuelles. L'incubation peut s'effectuer dans un fermenteur de type usuel, à une température comprise entre 20 et 30 C environ, le pH du milieu étant voisin de 7. On peut le cas échéant utiliser un milieu dont le pH est compris entre 6 et 8 environ, sans modifier sensiblement les résultats. Le procédé utilisé consiste à faire pousser les micro- organismes dans le milieu de culture adéquat afin d'obtenir une biomasse bien développée; ce milieu peut contenir à côté d'une source de carbone assimilable (glucose, saccharose, amidon, mannitol, purs ou en mélange avec d'autres carbohy- drates) à une concentration de 1 à 10%, une source d'azote organique (peptones, asparagine, hydrolysats protéiques) ou minéral (sels d'ammonium, nitrates), et les sels minéraux nécessaires ainsi que des substances vitaminiques (telles que celles présentes dans le "corn steep", l'extrait de levure,...); la température peut varier de 20 à 30 C environ selon les souches, et la culture est effectuée en milieu agité. Lorsque la croissance est jugée satisfaisante et en général lorsque le carbohydrate substrat est épuisé, c'est- -à-dire au bout de 2 à 5 jours environ, on ajoute stéri- lement le composé à hydroxyler, solide ou en solution dans un petit volume de solvant organique miscible à l'eau (par exemple l'éthanol), à une concentration finale pouvant aller de 0,2 à plusieurs g./litre suivant la molécule ou la souche. L'incubation, qui peut s'accompagner d'une faible croissance résiduelle, est poursuivie, en agitant vigoureu- sement pour aérer le mélange, aux mêmes. températures, pen- dant un temps de 2 à 40 jours. Suivant une variante du procédé de l'invention, l'incu- bation du composé à hydroxyler est faite avec des cellules préalablement lavées et remises en suspension dans un milieu aqueux tamponné ne contenant pas de source de carbone ou d'azote. L'hydroxylation est alors effectuée après avoir fait croître le microorganisme et après avoir récolté le mycélium, en absence de croissance. L'extraction des produits de l'incubation ainsi que celle du substrat résiduel est effectuée à l'aide d'un sol- vant organique non miscible à l'eau (chlorure de méthylène, chloroforme, acétate d'éthyle, etc) après avoir éliminé le mycélium par filtration et saturé le filtrat en sels (NaCl, Na2SO04). La détection et l'identification des produits d'hydro- xylation peut être effectuée par chromatographie sur couche mince de gel de silice ou par chromatographie liquide haute pression sur phase inverse. La séparation du produit hydro- xylé du substrat de départ éventuellement restant et sa purification sont effectuées par les techniques classiques de cristallisation ou de chromatographie sur adsorbants minéraux. Les produits d'hydroxylation purifiés ont été iden- tifiés par comparaison aux produits (3S)-hydroxy authen- tiques (préparés par voie chimique ou décrits dans la litté- rature) dans divers systèmes chromatographiques, ainsi que par les techniques spectroscopiques (UV,1H- ou 13C-RMN) et polarimétriques usuelles. Les résultats obtenus sont rapportés dans les exemples suivants o plusieurs souches de microorganismes capables de réaliser ces hydroxylations d'une manière régio- et stéréo- sélective, à partir de plusieurs des substrats envisagés, avec un taux de conversion variable, ont été caractérisées. Outre cet avantage essentiel de la sélectivité de l'hydroxy- lation, un autre avantage est l'absence de formation d'autres métabolites en quantités significatives, ce qui simplifie la purification et permet le recyclage du substrat éventuellement non métabolisé. Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. EXEMPLE 1 Hydroxylation de la quinidine par M.plumbeus A lOOml de milieu A décrit ci-après, ajusté à pH7, dans un erlenmeyer de 250ml, sont ajoutés quelques gouttes d'une suspension de spores de M.plumbeus MMP 430. On incube 72 heures à 27 C dans un agitateur rotatif (327 trs/mn). On ajoute alors stérilement à la culture une solution de 50mg de quinidine dans lml d'éthanol et on continue à agiter 14 jours dans les mêmes conditions. La culture est filtrée sur célite, le filtrat saturé par NaCl amené à pH 1012 par NaOH 2N puis extrait G fois au chlorure de méthylène. Les frac- tions organiques séchées puis évaporées sont chromato- graphiées sur couche préparative de gel de silice en uti- lisant le solvant CHC12-MeOH-NH40H (85:14:1). La bande de (3S)-3-hydroxy quinidine, repérée par sa fluorescence à 254nm et sa migration inférieure à celle de la quinidine, est grattée et éluée par le méthanol. On obtient Img de (3S)-3-hydroxy quinidine identique sous tous rapports à un échantillon authentique. La quinidine non réagie est récu- pérée de la même manière presque quantitativement (42mg). Milieu A: corn steep 10 g MgSO4,7H20 0,5 g KC1 0,5 g NaNO3 2 9 FeSO4, 720 O,02g D-glucose 30 g KH2PO4 1 g K2HPO4 2 g eau distillée, pour compléter à 1 litre. EXEMPLE 2 Hydroxylation de la dihydroquinidine par M.plumbeus La même incubation, effectuée sur une culture analogue de M.plumbeus CBS 111-07 avec lg/litre en concentration finale de dihydroquinidine, fournit après 20 jours 6mg de (3S)-3-hydroxy dihydroquinidine identique à un échantillon authentique et 80mg de dihydroquinidine récupérée. EXEMPLE 3 Hydroxylation de la dihydroquinidine par S.rimosus A 10Oml de milieu B décrit ci-après, ajusté à pH7, dans un erlenmeyer de 250ml, sont ajoutés quelques ml d'une pré- culture de S.rimosus NRRL 2234. On cultive 72 heures à 27 C; on ajoute 10Omg de dihydroquinidine en solution dans lml d'éthanol et on continue à agiter pendant 25 jours dans les mêmes conditions. On obtient de la même manière 4mg de (3S)-3-hydroxy dihydroquinidine et 85mg de dihydroquinidine récupérée. Milieu B: Bacto Casamino acids Difco 5 g extrait de levure 3 g D-glucose 30 g eau distillée, pour compléter à 1 litre. EXEMPLE 4 Hydroxylation de la quinine par C.echinulata La même incubation, effectuée sur une culture analogue (milieu A) de C.echinulata NRRL 3655, avec lg/litre en con- centration finale de quinine, fournit après 30 jours 9,5mg de (3S)-3-hydroxy quinine identique à un échantillon authen- tique et 75mg de quinine récupérée. On constate également la formation de deux autres produits (fluorescents à 254nm) en faible quantité. EXEMPLE 5 Hydroxylation de la dihydroquinine par M.circinelloides La même incubation, effectuée sur une culture analogue (milieu A) de M. circinelloides CBS 108-16, avec lg/litre en concentration finale de dihydroquinine, fournit après 36 jours 17mg de (3S)-3-hydroxy dihydroquinine identique à un échantillon authentique et 70mg de dihydroquinine récupérée. EXEMPLE 6 Hydroxylation de la dihydroquinidine par M.plumbeus Deux cultures de lOO1ml de M.plumbeus MMP430 sur le même milieu A que dans l'exemple 1, sont réunis, centrifugées, et le mycélium, lavé stérilement avec un tampon phosphate con- tenant 2g de K2HPO4 et lg de KH2P04 par litre d'eau dis- tillée, est repris dans 100ml du même tampon et incubé avec 0,5g/litre en concentration finale de dihydroquinidine. Après 5 jours d'agitation à 27 C, on obtient 6,5mg de (35)-3-hydroxy dihydroquinidine, et 40mg de dihydroquinidine récupérée, par les techniques usuelles. R EV E N D I C A T I 0 N S 1. Procédé d'hydroxylation microbiologique régiospécifique et stéréospécifique, en position 3S, de la quinine, la quinidine et leur dérivés, caractérisé en ce qu'on fait agir un microorganisme du type champignon inférieur choisi dans le groupe constitué par Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger, Cunninghamella echinulata, Curvularia lunata, Mucor circinelloides, Mucor plumbeus, Penicillium purpurogenum, Rhizopus arrhizus ou du type bac- térien tel que Streptomyces rimosus, sur le composé à hydro- xyler. 2. Procédé d'hydroxylation selon la revendication 1, carac- térisé en ce qu'on fait croître le microorganisme dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de car- bone, d'azote et de sels minéraux, dans des conditions de fermentation aérobie, en culture immergée. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le composé à hydroxyler est ajouté directement au milieu de culture lorsque la croissance du microorganisme est suffisante. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'incubation du composé à hydro- xyler est faite avec des cellules préalablement lavées et remises en suspension dans un milieu en contenant pas de source de carbone ou d'azote. 5. Procédé d'hydroxylation selon la revendication 2, carac- térisé en ce que l'incubation s'effectue à une température comprise entre 20 et 30 C. 6. Procédé d'hydroxylation selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le pH du milieu de culture est compris entre 6 et 8 environ.