FR 2584420 A1 19870109 FR 8609175 A 19860625 La présente invention se rapporte à un procédé de dosage in vitro du galactitol présent dans les fluides corporels. On sait que le D-galactose, in vivo, est converti en D-glucose-1-phosphate, par le système enzymatique qui comprend la galactokinase (EC 2.7.1.6) et la galactose-1- phosphate transférase (EC 2.7.7.10), avant d'être utilisé. Dans le cas d'un dysbolisme, o ce système enzymatique est héréditairement defficient, le D-galactose s'accumule dans l'organisme, o il est réduit par une aldose réductase (EC 1.1.1.21) en galactitol que l'on retrouve dans les fluides corporels comme sang, urine, et similaires. aussi On sait/que lorsque le galactitol s'accumule en grandes quantités dans l'organisme, il cristallise dans le cristallin et devient un des principaux facteurs de la ca- taracte. C'est pourquoi il est intéressant de pouvoir dé- celer quantitativement et qualitativement dans les fluides corporels le galactitol, pour la prévention et le diagnos- tic de la cataracte. Les procédés,qénéralement utilisés pour doser le galactitol, sont ceux que l'on utilise pour les polyols, comme reporté par exemple par J.S. Dixon et coll., dans Analytical Chemistry, Vol.26, pp.1092-1093 (1954), dans les- quels les polyols sont oxydés au moyen de periodate, et le produit de réaction est développé avant d'être soumis à une colorimétrie. Ce procédé dose la totalité des polyols et non le niveau de chacun en particulier. De plus, les don- nées obtenues avec ces procédés doivent être compensées, car des substances réductrices comme le glucose ont tendance à interférer. Le galactitol est également dosable par chromato- graphie en phase gazeuse. Toutefois, la chromatographie en phase gazeuse du galactitol présente l'inconvénient de né- cessiter de manière défavorable, en plus de prétraitements compliqués comme la triméthylsilylation, une grande habileté expérimentale pour permettre le dosage fractionnel d'au- tres polyols comme D-mannitol, D-sorbitol, et similaires. La présente invention permet d'éviter ces incon- vénients de l'art antérieur, et fournit une méthode de do- sage sélectif du galactitol dans les fluides corporels. Le nouveau procédé de dosage du galactitol selon l'invention consiste à mettre en contact, in vitro, un fluide corporel avec une bactérie capable de produire du D-tagatose à partir de galactitol, et à doser ensuite ce D-tagatose. Dans les dessins annexés, la figure 1 représente les spectres d'absorption dans l'infra-rouge d'un échantil- lon authentique de D-tagatose (courbe a) et d'un D-tagatose cristallisé obtenu conformément à l'invention (courbe b).La figure 2 est une illustration de la corrélation existant en- tre la concentration du galactitol et la capacité d'absorp- tion. Conviennent avantageusement selon l'invention, des bactéries du genre Pseudomonas, par exemple comme re- porté dans Biochemical Journal,Vol.64, pp.394-405 (1956), et du genre Arthrobacter, comme reporté par exemple par la demanderesse dans Applied and Environmental Microbiology, Vol. 46, pp.1055-1057 (1984). Conviennent plus particulièrement Arthrobacter glo- biformis ST-48 et ses mutants, qui présentent une grande ap- titude à convertir le galactitol en D-tagatose. Arthrobac- ter globiformis ST-48 a été déposé le 1er Mai 1984 au Fer- mentation Research Institute sous le numéro FERM P-7592. Ses propriétés bactériologiques sont décrites ci-après. A. Source Isolé à partir d'un sol de Tsuyama-shi, Okayamaken, au Japon. B. Morphologie 1. Forme et dimension En forme de bâtonnet ou, plus rarement, sphérique ou ovale; 0,6-0,8 microns x 1-2 microns. 2. Polymorphisme Quelques cellules incurvées. 3. Motilité Aucune. 4. Flagelle Néant. 5. Spore Néant. 6. Souche Gram Négative. 7. Capsule Néant. 8. Souche résistant aux acides Négative. C. Croissance sur milieu de culture (11 Plaque de bouillon d'agar (à 28 C pendant 5 jours) La croissance de la cellule est relativement lente, et les colonies se forment après un intervalle de 5 jours. Elles ont une surface lisse mais convexe, sphérique, arrondie aux extrémités, avec un aspect brillant, jaune blanchâtre, et le contenu de ces colonies est translucide et homogène. Il n'y a pas de formation de pigment. (21 Bouillon incliné (à 28 C pendant 5 jours) La croissance de la cellule est relativement lente ou moyenne. Les colonies ont une surface filamen- teuse, lisse, platement convexe, avec un aspect translucide, gris, brillant. La culture est rela- tivement visqueuse, mais sans formation de pigment. (31 Milieu de culture en bouillon liquide (à 28 C pen- dant 3 jours) La culture de la cellule est relativement lente, et à mesure que le phénomène se déroule, l'ensemble de la culture devient légèrement trouble. La cellule crolt en forme de membrane épaisse à la surface de la culture, ce qui entrane la formation de sédi- ment. On observe ni formation de pigment, ni déga- gement de gaz. (4) Culture par piqûre sur bouillon (à 28 C pendant 5 jours) Les colonies se forment à la surface du milieu de culture, tandis qu'on observe une croissance en spiniforme à la couche supérieure des lignes de piqûre. Il ne se forme ni gaz, ni pigment. (5) Culture par piqûre sur bouillon de gélatine a) Croissance à 20 C pendant 40 jours: Les colo- nies se forment à la surface du milieu de culture, autour des points de piqûre, tandis qu'on note à la couche supérieure une croissance en spiniforme, mais avec liquéfaction. b) Croissance à 28 C pendant 40 jours: La cellule croit sur le milieu de culture. Apres refroidisse- ment du milieu de culture, il y a solidification de ' ses composants gélatineux. (6) Tournesol et lait (à 28 C pendant 40 jours) Le tournesol ne change pas, alors que le pourpre de bromocrésol vire au bleu, ce qui indique une al- calinisation du milieu de culture. On ne constate ni liquéfaction ni agrégation. D. Propriétés physiologiques (1) Réduction du nitrate Positive (2) Réaction de dénitrification Positive (3) Essai MR Négatif (4) Essai VP Négatif (5) Formation d'indole Négative (6) Formation de sulfure d'hydrogène Positive (7) Hydrolyse de l'amidon Positive mais très faible (8) Utilisation de l'acide citrique Positive (9) Utilisation de l'azote minéral Utilise nitrate et sel d'ammonium (10)Formation de pigment Non formé (11)Uréase Positive (12)Oxydase Positive (13)Catalase Positive (14) Intervalles de croissance pH: de 5 à 8; température: de 5 à 37 C; salinité: jusqu'à 3%. (15)Comportement vis-à-vis de l'oxygène Aérobique (16)Essai O-F Saccharide à peine dégradé (glucose) (17)Formation d'acide ou de gaz à partir de saccharide Acide GAZ L-Arabinose + D-Xylose + D-Glucose D- Fructose Sucrose Lactose - Mannitol Glycérol (18) pH de croissance Il est de 7,62 lorsqu'on cultive sur un milieu protéose-peptone-glucose. (19) Dégradation de la cellulose Négative (20) Résistance à la chaleur Aucune croissance après 10 minutes de chauffage à 80 C. (21) Exigence nutritive Néant. Par référence à Bergy's Manual of Determinative Bacteriology, 7ème édition (1957), et 8ème édition (1974), cette souche cellulaire est mise dans le groupe du genre Arthrobacter en se basant sur les faits de la forme en ba- tonnet, de la réaction gram-négative et du développement aérobique; sur le fait que la cellule ne forme pas de spore et n'est pas douée de motilité; qu'elle est catalase- et oxydase-positive, et légèrement polymorphe: enfin, que la souche est isolée à partir du sol. Plus précisément, la souche cellulaire forme, à partir des saccharides, une petite quantité d'acide, réduit les nitrates, ne forme pas d'indole, et utilise, comme source d'azote, les nitrates et les sels d'ammonium. En se référant aux autres proprié- tés de cette souche: qui utilise l'acide citrique sans for- mer de pigment;qui croSt même à 37 C; et qui dégrade fai- blement l'amidon; on l'identifie comme une bactérie de l'es- pèce Arthrobacter globiformis, et on la désigne sous l'ap- pellation de: Arthrobacter globiformis ST-48. Conformément à l'invention, conviennent avantageu- sement les bactéries ayant la plus forte capacité à conver- tir le galactitol en D-tagatose, et que l'on peut préparer par culture dans des conditions aérobiques avec un milieu renfermant comme source de carbone, en général, des alcools de sucre comme galactitol, sorbitol et similaires. Par exemple, une préparation de bactéries conge- lée-dégelée, lyophilisée, ou immobilisée, peut être avanta- geusement utilisée, selon l'invention, aussi longtemps qu'elle s'avère capable de convertir le galactitol en D- tagatose, et les bactéries ne doivent pas être limitées aux préparations intactes. On peut utiliser avantageusement,de manière répé- tée, une bactérie immobilisée en couche ou en feuille, pré- parée,par exemple, par traitement d'une cellule bactérienne intacte avec un dérivé de diisocyanate comme diisocyanate- 2,4 de toluène, ou un composé dialdéhydique comme le gluta- raldéhyde, dans des conditions légèrement acides ou neutres; par fixation dans une fibre creuse d'une membrane semi- perméable; ou par encapsulage d'une telle cellule avec de l'agar, de la gélatine ou du K-carraghénane. L'appellation "fluide corporel" désigne les flui- des corporels comme sang et urine, provenant de l'homme ou d'animaux à sang chaud. Le stade de mise en contact in vitro du fluide corporel avec une bactérie capable de produire le D-tagatose, à partir de galactitol, peut s'effectuer, par exemple, en plaçant un échantillon de ce fluide, intact ou après trai- tement tel que centrifugation, élimination des protéines, ou dialyse, dans un récipient convenable comme micro-creux, creux de porcelaine, tube à essai ou fiole; en y introdui- sant une bactérie capable de produire du D-tagatose à par- tir de galactitol; et en faisant incuber ce mélange, en général à environ 10 à 50 C pendant 6 minutes à 100 heures, sous aération, de manière à ce que s'effectue de façon sa- tisfaisante la conversion du galactitol en D-tagatose. Le procédé de détermination qualitative ou quan- titative du D-tagatose résultant peut être choisi librement. Ce peut être un procédé chimique comme celui de Fehling ou le procédé cystéine-carbazole, dans lesquels on utilise, respectivement, la propriété réductrice du D-tagatose ou ses propriétés de cétose; ou bien un procédé bio-chimique au cours duquel on utilise la réaction spécifique du D- tagatose avec la galactitol déshydrogénase (EC 1.1.1.16): c'est-à-dire la quantité de D-tagatose est proportionnelle à la diminution de la quantité de NADH2, mesuré photométri- quement à 340 nm. Le galactitol présent dans le fluide corporel peut être facilement dosé par mesure du D-tagatose de cette ma- nière, parce que selon l'invention le galactitol est con- verti en D-tagatose avec un rendement élevé. La présente invention peut être avantageusement utilisée pout la détection du dysbolisme du galactose, ainsi que pour sa prévention et son diagnostic. La présente invention est décrite plus en détail dans les expérimentations suivantes. Expérimentation 1 Des portions de 100 ml d'un milieu de culture liquide com- prenant en poids par volume 0,2% de sulfate d'ammonium, 0,24% de phosphate dipotassique, 0,01% d'heptahydrate de sulfate de magnésium, 0,5% d'extrait de levure, 2% de galac- titol et de l'eau désionisée sont placées dans 20 fioles à secousse, d'une capacité de 500 ml, qui sont mises à l'au- toclave à 120 C pendant 20 minutes, puis on y ensemence,à l'aide d'une boucle de fil de platine, une culture de germe d'Arthrobacter globiformis ST-48 FERM P-7592, et l'on soumet à une culture avec agitation à 30 C pendant 7 jours. La chromatographie en phase gazeuse du bouillon de culture ne révèle pas de présence de galactitol, et le rendement en D-tagatose est de l'ordre de 85%, rapporté au galacti- tol. Le bouillon est alors centrifugé pour séparer les cel- lules du liquide surnageant. Ce liquide est ajusté à pH 7,6 par addition de 0,1 volume de sulfate de zinc à 25% en poids/volume, puis on centrifu- ge. Le liquide surnageant nouvellement formé est alors dé- coloré avec du carbone active, désionisé avec "Diaion SK1B (forme H)" (une résine échangeuse d'anions) et "Diaion WA30 (forme OH)" (une résine échangeuse de cations), toutes deux commercialisées par Mitsubishi Chemical Tndustries Ltd, puis concentré sous vide pour obtenir un sirop transparent concentré à environ 95%. On mélange ce sirop avec trois fois son volume de méthanol anhydre, et on laisse reposer à température ambiante pour que s'effectue la cristallisa- tion. Les cristaux obtenus sont séparés par filtration, rincés avec du méthanol anhydre, dissous dans un minimum d'eau, additionnés de trois volumes de méthanol anhydre, recristallisés, filtrés, rincés et recueillis. Le rendement, rapporté au galactitol est de l'ordre de 70%. Afin d'identifier le cristal ainsi obtenu, on compare ses propriétés physico-chimiques avec celles d'un échantillon authentique de D-tagatose, fourni par Sigma Chemical Co. 1. Chromatographie sur papier La cristal et l'échantillon authentique de D-tagatose sont déposés sur le même "papier filtre N050", un produit de Toyo Roshi KK, on développe de manière ascendante avec le solvant I (un mélange de n-butanol, d'acide acétique et d'eau dans les proportions de 12/3/5), ou le solvant II (un mélange d'acétate d'é- thyle, de pyridine et d'eau dans les proportions de 12/5/4), et l'on développe avec du nitrate d'argent alcalin, puis on compare les valeurs de Rf. Valeur de Rf Solvant I Solvant II Echantillon authen- tique 0,72 0,84 Echantillon de l'invention 0,73 0,85 2. Point de fusion L'échantillon authentique présente un point de fusion à 130 -131 C; et le cristal selon l'invention à 131-132 C; et le mélange des deux à 130 -131 C. 3. Pouvoir rotatoire spécifique: E1]20 (C=10% dans H20) Celui de l'échantillon authentique est de -50, et celui du cristal selon l'invention de -4,98 . 4. Spectre dans l'infrarouge Les spectres dans l'infrarouge du cristal et de l'é- chantillon authentique, utilisant le procédé au com- primé de KBr, sont représentés dans la figure 1. Il ressort de cette figure que les deux spectres con- cordent bien. Ces données confirment que le cristal obtenu par le procédé selon l'invention est du D-tagatose cristallisé. Expérimentation 2 2-(1) Préparation de la bactérie immobilisée De la cellule bactérienne, obtenue par le procédé de l'expé- rimentation 1, est rincée avec du tampon phosphate 0,05 M (pH 7), est recueillie par centrifugation et mise en suspen- sion dans de l'eau de manière à obtenir une suspension de lg de cellule humide par ml. On dissout par chauffage 0,4 g de K-Carraghénane dans 12 ml de solution aqueuse de chlorure de sodium, on maintient & 45 C, on y introduit 2 ml de la suspension cellulaire et on solidifie par refroidissement. Le produit résultant est coupé, mis en forme et conservé dans une solution aqueuse 0,3 M de chlorure de potassium. 2-(2) Conversion en D-tagatose à l'aide de la bactérie immobilisée Des portions de 100 ml d'un milieu de culture liquide de même formule que celui de l'expérimentation 1, à ceci près qu'il comprend 0,1% d'extrait de levure au lieu de 0,5%, et 0,5% de D-sorbitol au lieu de 2% de galactitol, sont pla- cées dans des fioles à agitation, qui sont mises à l'auto- clave comme dans l'expérimentation 1, sont additibnnées de bactérie immobilisée préparée en 1-(2), sont secouées à C pendant 12 heures, puis sont filtrées. La capacité à convertir le galactitol en D-tagatose, de la bactérie immobilisée obtenue, est améliorée de 8 à 10 fois environ si l'on compare avec la bactérie immobilisée de 2-(1). Expérimentation 2-13), Dosage quantitatif du galactitol Un demi millilitre d'un échantillon liquide renfermant 0,5 ml de tampon phosphate 0,05 M (pH 7) et 0 à 100 microgram- mes de galactitol/ml et un morceau de 0,06 g de bactérie immobilisée préparée comme dans l'expérimentation 2-(2), sont placés dans un tube à essai, et secoués à 35 C pendant 1 heure. Puis on enlève la bactérie immobilisée du mélange réactionnel, et le liquide résiduel, solution de Dtagatose, est additionnée de 0,2 ml de solution aqueuse à 1,5% en poids/volume de chlorhydrate de cystéine, 6 ml de solution à 70% en poids/volume de sulfate de cystéine et 0,2 ml de solution à 0,12% en poids/volume de solution méthanolique de carbazole, par ml, conformément au procédé cystéine- carbazole reporté dans Journal of Biological Chemistry, Vol. 192, pp. 583587 (1951). La solution mélangée est alors développée à 50 C pendant 30 minutes, et l'on mesure la capacité d'absorption à 580 nm au moyen d'une cuvette de 1 cm. Les résultats sont reportés dans la figure 2. Il ressort de cette figure que la concentration en galactitol, dans l'intervalle de 20 à 100 microgrammes, correspond bien à la capacité d'absorption, et que donc ce procédé peut Etre utilisé de manière satisfaisante pour l'analyse de tra- ces de galactitol. Expérimentation 2-(4) Effet d'autres saccharides sur le dosage du galactitol On étudie les effets d'autres saccharides: D-glucose, Dgalactose, D-mannose, D-fructose, D-mannitol, D-sorbitol, D-arabitol, Larabitol, Xylitol, ribitol, myo-inositol, maltitol, lactitol, maltose, lactose et sucrose sur le do- sage du galactitol. Une solution aqueuse renfermant 50 microgrammes de galac- titol et 50 microgrammes de chaque autre saccharide,par ml, est utilisée comme échantillon liquide. Une solution aqueu- se ne renfermant que 50 microgrammes/ml de galactitol est utilisée comme témoin. Le galactitol est dosé comme dans l'expérimentation 2-(3). Les données obtenues concordent bien avec celles du témoin, et l'on n'observe pas d'interférence des autres saccharides. Plusieurs formes de réalisation, non limitatives, de l'invention sont décrites ci-après. EXEMPLE 1 Procédé qualitatif On recueille 1 ml d'urine, respectivement chez une personne bien portante et chez 2 personnes souffrant de dysbolisme du galactose, que l'on soumet à une dialyse au moyen de cellules de multidialyseur. Les liquides sortant de la cellule sont placés dans des creux de porcelaine blanche, additionnés chacun de 0,1 ml d'une suspension cellulaire préparée selon le procédé de l'expérimentation 1-(1) , et dilués 50 fois avec de l'eau, puis laissés à réagir à C pendant 1 heure, puis l'on développe par addition de réactif cystéine-carbazole. Le mélange réactionnel provenant des personnes souffrant de dysbolisme du galactose développent une coloration pourpre rougeâtre beaucoup plus intense que celui qui pro- vient de la personne bien portante; aussi ce procédé peut- il être avantageusement utilisé pour détecter les cas de dysbolisme du galactose. EXEMPLE 2 Procédé quantitatif On recueille 1 ml d'urine, respectivement chez une personne bien portante et chez deux personnes souffrant de dysbolisme du galactose, et on dialyse comme dans l'exemple 1, puis les liquides sortant du multidialyseur sont dosés quant à leur teneur en galactitol, conformément au procédé de l'expérimen- tation 2-(3). Le résultat est le suivant: les urines des personnes souf- frant de dysbolisme du galactose renferment respectivement et 220 microgrammes de galactitol parml, alors qu'on ne décèle pas de galactitol dans l'urine de la personne bien portante; aussi ce procédé peut-il être avantageg- sement utilisé pour déceler le dysbolisme du galactose, ainsi que comme procédé pour doser le galactitol urinaire dans l'essai de charge du galactose. EXEMPLE 3 Procédé quantitatif Des échantillons de serum obtenus par héparination, suivie de centrifugation, d'échantillons de sang provenant respec- tivement de deux personnes bien portantes et de deux per- sonnes souffrant de dysbolisme du galactose, sont dialysés comme dans l'exemple 1, et l'on dose le galactitol contenu dans les liquides sortant du multidialyseur selon le pro- cédé de l'expérimentation 2-(3). On constate l'absence de galactitol dans les serum des personnes bien portantes, alors que ses quantités, chez les personnes souffrant de dysbolisme du galactose, sont respectivement de 100 et 180 microgrammes par ml. Ce procédé peut être avantageuse- ment utilisé pour déceler le dysbolisme du galactose, aussi bien que pour doser le galactitol sanguin dans 1' essai de charge du galactose. Ainsi qu'il est décrit plus haut, le dosage qua- litatif ou quantitatif du galactitol dans les fluides cor- porels, qui était jugé très difficile, peut être facilement réalisé, et de manière spécifique selon la présente inven- tion, sans qu'interfèrent les autres saccharides. Il est bien entendu que la description détaillée et les exemples particuliers indiquant des formes de réa- lisation préférées de l'invention ne sont donnés qu'à titre d'illustration; différents changements et modifications possibles apparaîtront à l'homme de l'art en partant de cet- te description détaillée, sans sortir du cadre de l'inven- tion. Revendications 1. Procédé de dosage du galactitol dans les fluides corporels, caractérisé en ce qu'on laisse en contact, in vitro, ledit fluide avec une bactérie capable de trans- former le galactitol en P-tagatose, et en ce qu'on dose le D-tagatose formé. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la bactérie est du genre Arthrobacter, et est plus particulièrement Arthrobacter globiformis ST-48, FERM P-7592. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la bactérie est du genre Pseudomonas. 4. Procédé selon une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le galactitol est dosé quantitative- ment. 5. Procédé selon une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le galactitol est dosé quantitative- ment. 6. Procédé selon une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la bactérie est immobilisée. 7. Procédé selon une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le stade de dosage est réalisé selon le procédé de Fehling. 8. Procédé selon une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le stade de dosage est réalisé selon le procédé cystéine-carbazole. 9. Procédé selon une des revendications précé- dentes, caractérisé en ce que le fluide corporel est sang ou urine.