FR 2576909 A1 19860808 FR 8601498 A 19860204 BILIRUBINE OXYDASE THERMOSTABLE ET SON PROCEDE D'OBTENTION La présente invention se rapporte à une nouvelle bilirubine oxydase et à son procédé d'obtention. Plus par- ticulièrement, la présente invention se rapporte à une nou- velle bilirubine oxydase thermostable et à un procédé pour l'obtention de bilirubine oxydase qui consiste à cultiver un micro-organisme producteur de bilirubine oxydase, appar- tenant à l'espèce Bacillus et,ensuite,à préparer la bili- rubine oxydase résultante à partir du bouillon cultivé. La bilirubine oxydase a été connue, d'une façon classique, comme une enzyme qui présente une spécificité de substrat vis-à-vis de la bilirubine et qui catalyse une réaction dans laquelle de la biliverdine et de l'eau sont formées à partir de bilirubine et d'oxygène. En tant que micro-organismes capables de produire la bilirubine oxydase, ont été mentionnées dans la littérature une espèce..... Myrothecium LN. Tanaka et S. Murao, Agric. Biol. Chem., 46, 2499 (1982)], une espèce Schizophyllum (publication du brevet japonais n 135886/1984), et des espèces Coprinus, Trametes, Lenzites, Coriolus, Pholiota, Pleurotus et Fomitop- sis (publication de brevet japonais n 198971/1984). La bilirubine oxydase a présenté des avantages in- téressants ces dernières années, en tant que réactif pour déterminer la teneur en bilirubine et pour éliminer la bili- rubine qui est source d'erreurs dans l'analyse d'une autre substance biochimique (ou d'autres substances biochimiques) dans des échantillons de sérum, dans le domaine de la chi- mie clinique. Parmi les échantillons de bilirubine oxydase classiques,l'enzyme provenant de Myrothecium est stable pen- dant 15 minutes, à 370C, mais son activité résiduelle tombe à 20% environ, à 70 C. D'un autre côté, l'enzyme provenant de Schizphyll um est stable pendant 10 minutes jusqu'à 450C seulement. Les échantillons d'enzyme provenant d'autres micro-organismes producteurs, par exemple, l'enzyme prove- nant de Coprinusprésentent une activité résiduelle de 90-95%, 2 2576909 après avoir été maintent pendant 10 minutes à 600C et ne dnnentpas satisfaction du point de vue de la stabilité thermique. Ils exigent pas conséquent un contrôle strict de la température pendant leur production et leurs traite- ments. Lorsqu'ils sont immobilisés conformément à l'un de leurs modes d'application, ils peuvent être désactivés suivant les conditions de leur immobilisation. il en ré- sulte qu'ils ne sont pas totalement satisfaisants du point de vue de leur facilité de manipulation. Les présents inventeurs ont procédé à diverses re- cherches minutieuses. Ces recherches leur ont permis-de découvrir qu'une souche de micro-organismes, la souche - B-0891, isolée du sol de Owakidani, Hakone-machi, Ashigara- shimo-gun, Xanagawa-ken, Japon et appartenant à l'espèce Bacillus produitde la bilirubine oxydase capable de cataly- ser une réaction, dans laquelle de la biliverdine et de l'eau sont formées à partir de bilirubineet d'oxygène, et que la bilirubine oxydase ainsi produite est stable aux envi- rons de 70 C. La présente invention a été réalisée sur la base de la découverte cidessus, et se rapporte à une bilirubine oxydase qui présente des propriétés de thermostabilité et une spécificité de substrat vis-à-vis d'au moins la biliru- bine, et catalyse une réaction dans laquelle de la biliver- dine et de l'eau sont formées à partir de bilirubine et d'oxygène, ainsi qu'à un procédé d'obtention de la bilirubine oxydase, qui consiste à cultiver un micro-organisme produc- teur de bilirubine oxydase appartenant à l'espèce Bacillus et, ensuite,à préparer la bilirubine oxydase résultante à partir du bouillon cultivé. La bilirubine oxydase conforme à la présente inven- tion possède une thermostabilité excellente et, de ce fait, présente très peu de risque d'inactivation ou similaires, lors de son immobilisation en tant que mode d'application enzymatique, ou pendant sa manipulation en tant que mode de diag- nostic clinique.Par conséqouent, elle est très facile à manipuler. 3 2576909 La présente invention propose cette bilirubine oxydase qui est nouvelle et avantageuse. On obtiendra facilement une appréciation plus complète de la présente invention et de beaucoup parmi les avantages qui en découlent, de même qu'on en aura une meil- leure compréhension, en se référant à la description détail- lée suivante qui doit être considérée en liaison avec le dessin annexé, sur lequel: - la figure 1 montre la bonne thermostabilité pour la biliru- bine oxydase conforme à la présente invention; - la figure 2 illustre la température optimale de la bili- rubine oxydase conforme à la présente invention; - la figure 3 démontre la bonne stabilité aux pH de la bili- rubine oxydase conforme à la présente invention; et - la figure 4 montre le pH optimalpourla bilirubine oxydase conforme à la présente invention. Dans ce qui suit, on indique certaines caractéris- tiques taxonomiques du micro-organisme producteur de la nou- velle bilirubine oxydase conforme à la présente invention: (I) Caractéristiques morphologiques (,obtenues à la suite d'une culture à 30oC, pendant 24 heures, sur un milieu de culture classique d'agar): 1) Forme, taille et pléomorphisme des cellules: Un bacille discret ou à chaîne courte présentant des bords arrondis. Taille: 0,5 - 0,8 x 2,0 - 40 >m. Pas de pléomorphisme 2) Mobilité et flagelles: Sans 3) Spore (forme, taille, localisation, gonflement du corps du micro-organisme): Unespore ovale ou cylindrique de 0,5 x 1,0 pm est formé au centre ou à un endroit proche du centre. Le corps du micro-organisme n'est pas gonflé par la spore. 4) Coloration par le Gram 4 2576909 Positive ) Coloration à l'épreuve des acides: Négative (II) Essais de croissance: 1) Culture en plaques sur agar nutritif (28 - 30 C, 24 heures) : Une colonie circulaire, plate et uniforme est formée. La périphérie est irrégulière et la surface est quel- que peu sèche. La couleur est blanc grisâtre et au- 13 cune matière colorante soluble frest produite. - 2) Culture inclinée sur agar nutritif (28 - 30 C, 24 heures): Le microorganisme se développe en lignes et présente une bonne croissance. La couleur est blanc grisâtre et aucune matière colorante soluble n'est produite. 3) Culture sur liquide (solution de peptone, 28 - 300C, 24 heures): La croissance est faible et un précipité velu et uniforme se développe. 4) Lait BCP (28 - 300C, 24 heures): La solution est rendue alcaline et est peptonisée. (III) Propriétés physiologiques: 1) Réduction des sels de l'acide nitrique + 2) Dénitrification 3) Essai MR 4) Essai VP + ) Formation de sulfure d'hydrogène 6) Formation d'indole 7) Hydrolyse de l'amidon + 8) Métabolisation des sels de l'acide citrique + (milieu de Simmond) Métabolisation des sels de l'acide citrique + (milieu de Christensen) 9) Métabolisation des,sels de l'acide maléique + 10) Métabolisation des sels de l'acide propionique - 11) Formation de matière colorante soluble 2576909 12) Production d'uréase (SSR) - Production d'uréase (Christensen) 13) Production d'oxydase + 14) Production de lécithinase 15) Production de catalase + 16) Gamme de pH de croissance 5,0 - 9,0 17) Température de croissance 50 C + C + oC 18) Croissance dans des conditions anaérobiques + 19) Essai OF F ) Hydrolyse de la gélatine + 21) Hydrolyse de la caséine + 22) Hydrolyse de l'esculine + 23) Hydrolyse de la cellulose 24) Hydrolyse de la tyrosine - ) Résistance aux sels jusqu'à 4% 26) Croissance sur milieu de Sabourand + 27) % GC (méthode Tm) 44% IV) Production d'acides et/ou de gaz à partir de sucres (milieu de culture de base: milieu de culture exempt de peptone, NH4H2PO4 1,0 g, KCl 0,2 g, MgSO4.7H20 0,2 g, extrait de levure 1,0 g, agar 3,0 g, BTB (0,2%) 10,0 ml, eau distillée 1000 ml, pH 7,2): 6 2576909 Tableau 1 Sucre Acide Gaz S ucre Acide Gaz Adonitol - - D-Mannitol + - L-Arabinose + - D-Mannose + - Cellobiose + - Melezitose - - Dulcitol - - Mélibiose - - meso-Erythritol - Raffinose - - D-Fructose + - D-Rhamnose - - Fucose - D-Ribose + - D-Galactose (+) - Salicine - - D-Glucose + - L-Sorbose - - Glycerol + - Sorbitol - - Inositol + - Amidon + - Inuline + - Sucrose + - Lactose - Tréhalose + Maltose + - D-Xylose + - On déduit des caractéristiques principales décri- tes ci-dessus que la souche conforme à la présente inven- tion est un micro-organisme consistant en un bacille discret ou à chaîne courte, à bords arrondis, Gram positif et non mobile. Il est catalase positif et oxydase positif et pro- duit des acides par fermentation à partir du glucose. Il se développe à 50oC et la teneur en guanine et en cytosine (%GC) de son acide nucléique est de 44%. Si l'on se réfère au "Bargey's Manual of Determina- tive Bacteriology" 8ème édition (1974), la présente souche a été jugée être une souche appartenant à l'espèce Bacillus, compte tenu de ses caractéristiques-principales décrites 7 2576909 ci-dessus. A la suite d'une étude comparative entre les ca- ractéristiques principales de la présente souche et celles de Bacillus licheniformis. Bacillus cereus et Bacillus coa- pulans, qui sont des micro-organismes similaires, en réfé- rence au Manuel n 427 "The genus Bacillus", on a trouvé que diverses caractéristiques de Bacil].lus lChfiformn présentent une bonne correspondance avec celles du micro-organisme conforme à la présente invention. Cependant, on a observé des diffé- rences en ce qui concerne la mobilité et la résistance aux sels. A partir des résultats ci-dessus, la souche conforme à la présente invention a été estimée appartenir à Bacillus licheniformis et être sa souche variante. Par conséquent, la présente souche a été désignée comme étant la souche "Bacillus liheniformnis B-0891". A ce propos, la présente souche a été déposée auprès du Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japon, sous la référence Dépôt BP952 (FERM BP-952) [date de dépôt: 22 décembre 1984]. Pour obtenir la bilirubine oxydase conforme à la présente invention, on cultive le micro-organisme produc- teur de bilirubine oxydase ci-dessus, de la manièrequi est utilisée habituellement pourproduire des enzymes et simi- laires. La culture de ce micro-organisme peut être effec- tuée soit sur milieu liquide, soit sur milieu solide. En production industrielle, il est avantageux d'inoculer des cellules du micro-organisme producteur de bilirubine oxyda- se, sur un milieu de culture approprié pour être utilisé dans sa production, et de les soumettre à une culture en immersion et sous agitation avec aération.Lacomposition du milieu de culture pour la culture de bilirubine oxydase peut être choisie parmi une large variété de milieux de culture, qui sont utilisés de manière classique pour la culture de micro- organismes. Sa source d'azote peut être n'importe quel composé azoté métabolisable. Par exemple, on peut employer 8 2576909 de la liqueur de trempage du blé, de la peptone, de la caséine, de la farine de soja, de l'extrait de levure, divers extraits de viande et similaires. N'importe quel composé carboné méta- bolisable peut être employé comme source de carbone. Par exemple, on peut utiliser des mélasses, du glucose, du gly- cérol, du sucrose, de la dextrine et similaires. En outre,. on peut également utiliser, si besoin est, divers sels miné- raux comme le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le dihydrogénophosphate de potassium et l'hydrogénophosphate de potassium. On peut ajuster, d'une manière convenable, la température de la culture, à l'intérieur d'une gamme de tem- pératures, dans laquelle le micro-organisme peut se dé- velopper et produire la bilirubine oxydase. De préférence, cette température est de 25 - 300C. Le temps de culture peut varier quelque peu en fonction des conditions. Il est habituellement de 7 à 8 jours.environ. Il est inutile de dire qu'il est souhaitable de terminer la culture à un mo- ment approprié, en vérifiant le moment auquel la bilirubine oxydase atteint son activité maximale. Après achèvement de la culture, une méthode classique de préparation d'enzvme peut être utilisée pour purifier l'enzyme à partir du bouillon cultivé. Bien que l'on trouve l'enzyme à la fois dans les cellules et dans le surnageant du bouillon cultivé, on obtient ordinairement l'enzyme, du point de vue de l'efficacité de sa préparation et similaires, à partir du surnageant que l'on obtient en éliminant les cellules du bouillon cultivé. Il est cependant possible de préparer l'en- zyme à partir des cellules par une méthode classique et de l'utiliser en combinaison avec celle obtenue à partir du sur- nageant. La solution d'enzyme brut ainsi obtenue est puri- fiée par une méthode d'isolement et de purification classi- que qui est employée pour les protéines, les enzymes et si- milaires, permettant ainsi d'obtenir la bilirubine oxydase sous sa forme purifiée. Par exemple, une solution contenant de la bilirubine oxydase brute peut être soumise à une mé- thode de précipitation fractionnée, utilisant un solvant 9 2576909 organique tel que l'acétone, le méthanol ou l'éthanol, ou à une méthode de relargage employant le sulfate d'ammonium, le chlorure de sodium ou le sulfate d'aluminium, provoquant ainsi la précipitation de l'enzyme à partir de la solution et sa récupération sous une forme brute. En vue de la purification subséquente de l'enzyme brute qui peut être réalisée si nécessaire, le précipité est dis- sous dans un solvant tel qu'un tampon tris-HCl. On purifie ensuite la solution résultante en combinant d'une manière appropriée une chromatographie d'adsorption, qui utilise une résine échangeuse d' ions telle que la diéthylaminoéthyl- cellulose, un gel de diéthylaminoéthyldextrane ou un gel d'aminoéthyldextrane quaternaire, et une chromatographie d'adsorption qui utilise un adjuvant de filtration gélifié tel qu'un gel de dextrane ou ungel de polyacrylamide. Ensuite, elle est séchée par une technique telle que la lyophilisa- tion, pour obtenir la bilirubine oxydase sous sa forme puri- fiée. On indique dans ce qui suit les propriétés physi- ques et chimiques de la bilirubine oxydase ainsi obtenue: (I) Méthode de mesure de l'activité: Tampon tris-HC1 0,2 M 0,5 ml (pH 8,0, renfermant de l'EDTA 1 mM) Eau 0,94 ml Solution de bilirubine oxydase 0,05 ml On place un mélange réactionnel (1,40 ml) ayant la composition ci-dessus dans un petit tube à essai. Après avoir chauffé ledit mélange à 37 C, on ajoute 0, 01 ml d'une solution de bilirubine 10 mM, pour initier la réaction. On fait réagir à 37oC pendant 10 minutes. Après la réaction, on ajoute 1,5 ml de CPC (chlorure de N-cétylpyridinium) à 1%, pour achever la réaction, et on soumet le mélange réactionnel à une analyse colorimétrique, à 453 nm, pour déterminer son absorbance [S]. D'autre part, comme témoin, on a ajouté 0,01 ml d'une solution de bilirubine à un mélange réaction- nel (1,44 ml) du même type que le mélange réactionnel employé 2576909 ci-dessus, à ceci près qu'il ne contenait pas de solution d'en- zyme. On a fait incuber le mélange résultant à 370C pendant minutes précisément. Ensuite, on a ajouté successivement 1,5 ml de CPC à 1% et 0, 05 ml de la solution de bilirubine oxydase. On a soumis le mélange ainsi préparé à l'analyse colorimétrique, à 453 nm, pour déterminer son absorbance [B]. L'activité enzymatique est calculée conformément à l'équation suivante: - Activité enzymatique (U/ml) = (Bl- I[S])x 3,0 -60,7 x 10 x 0,05 dans laquelle 1 unité (U) de l'activité enzymatique est dé- finie comme étant la quantité d'enzyme qui oxyde 1 pmoe de bilirubine par minute dans Ies conditions décrites ci-dessus. (II) Spécificité de substrat: A l'aide d'électrodes à oxygène, on a recherché la spécificité par rapport à différents substrats, sur la base des taux de consommation d'oxygène. Les résultats sont résumts dans le Tableau 2. Chacun des substrats a été utili- sé en une quantité de 0,1 mM, tandis que l'enzyme a été uti- lisée en une quantité de 0,005 U. Tableau 2 Activité relative(%) Bilirubine 100 Biliverdine 0,51 Pyrogallol 92,9 ! Catechol 64,9 Chlorophyllioe 82,5 Phenol 0,0 kmino-4- antipyrine 0,0 Hemin e 0,0 Hemoglobine 0, 0 h11 2576909 (III) Réaction enzymatique: La réaction suivante est catalysée. Bilirubine + 1/2 O2--Biliverdine + H20 Cependant, l'oxydation de la biliverdine pour don- ner une substance pourpre clair, qui est montrée par l'équa- tion suivantea lieu dans une mesure extrêmement faible. Biliverdine + 1/2 02 - - - Substance pourpre clair + H20 (IV) Thermostabilité: Apres avoir traité des fractions de l'enzyme pen- dant 10 minutes, à diverses températures se situant respec- tivement dans la gamme de 30 C à 100 C, on refroidit lesdites fractions dans un mélange eau-glace. Ensuite, leurs activi- tés résiduelles sont mesurées par la méthode de l'essai de l'activité enzymatique. Les résultats sont présentés sur la FIGURE 1. L'activité de la bilirubine oxydase conforme à la présente invention reste stable jusqu'a environ 70 C, et plus de 50% de son activité subsiste même à 90 C. (V).Température optimale: A l'aide du mélange réactionnel et de la méthode de mesure employé dans la méthode d'essai (I) ci-dessus, on a recherché.l'influence de la temDératureà diverses tempé- ratures. Les résultats sont montrés sur la FIGURE 2. On a trcuvé que la température optimale pourla bilirubine oxydase conforme à la présente invention se situe autour de 800C. (VI) Stabilité aux pH: On a mis à incuber des fractions de la présente enzyme, à 37oC, pendant 1 heure, dans des tampons présentant respectivement différents niveaux de pH. Ensuite, leurs ac- tivités ont été mesurées par la méthode d'essai décrite ci- dessus, pour déterminer l'influence du pH. Les résultats sont montrés sur la FIGURE 3, sur laquelle G- , O-O, * - * et - correspondent respective- ment au tampon acétate (pH 4,0 - 6,0), au tampon acide 12 2576909 diméthylglutarique-NaOH (pH 7,5 - 9,0), au tampon phosphate (pH 6,5 - 8,0) et au tampon tris-HCl (pH 7,5 - 9,0). On a trouvé que la bilirubine oxydase conforme à la présente in- vention est stable aux environs des valeurs de pH de 7 à 9. (VII) pH optimal: On a recherché l'influence du pH sur l'activité de l'enzyme de la présente invention, en utilisant des tampons de différents niveaux de pH en tant que tampons dans la mé- thode d'essai décrite ci-dessus. Les résultats sont montrés sur la FIGURE 4, sur laquelle -G, O-O, * - * et O- correspondent respective- ment au tampon acétate (pH 4,0 - 6,0), au tampon acide dimé- thylglutarique-NaOH (pH 7,5 - 9,0), au tampon phosphate (pH 6,5 - 8,0) et au tampon tris-HCl (pH 7,5 - 9,0). On a trou- vé que le pH optimalpourla bilirubine oxydase de cette inven- tion se situe aux environs de la valeur de pH 8. (VIII) Inhibition et activation: La bilirubine oxydase conforme à la présente inven- tion est inhibée par les ions métalliques Cu2+, Zn2+ et Mn2+ par CPC et le Cation FB (marque déposée; produit de Nippon Oils and Fats Co., Ltd.) et activée par FAD. (IX) Poids moléculaire: 000 + 10 000 (mesuré par filtration de gel sur "Sephacryl S-300"). (X) Point isoélectrique: A la suite d'une mesure par électrolyse isoélectrique, on a trouvé que le point isoélectrique se situait aux environs de la valeur de pH 3,35. (XI) Valeur Km: 2,86 x 10 M (à pH 8,0). Dans le Tableau 3, on a comparé l'enzyme conforme à la présente invention avec des échantillons de bilirubine oxydase classiques. TableaU 3 Echantillon de la Echantillon nol de Ecnantillon nf2 de Echantillon n 3 d présente invention la techniqoe anté- la technique anté- la technique anté- Poids moléculaire 50 000 44 000 58 000 52 000 Point isoélectrique 3,35 3, 98 6,0 - 6,1 4.1 Thermostabilité 1 70 C 60 C 45 C 37 C Tneprature optinale 80 C 50 - 60 C 50OC 40 C a Stabilité aux pHE 7 - 9 5 - 11 7,5 - 8 5,0 9,7 pH optimal 8 6 - 9 5,5 - 6 8 -5 -4 Valeur Km 286 x M 1,9x10 M * Provenant de Coprinus ** Provenant de Schizophyllum *** Provenant de Myrothecium **m* La température maximale conduisant à une activité résiduelle de 90% ou plus dans le traitement à la chaleur pendant 10 minutes. Ln oC 14 2576909 Comme cela a été décrit, ci-dessus, l'enzyme confor- * me à la présente invention est différente de n'importe lequel des échantillons de bilirubine oxydase connus, en ce qui concerne ses diverses caractéristiques enzymochimiques et physiochimiques. En ce qui concerne la thermostabilité, l'activité résiduelle après un traitement à 600C pendant 10 minutes est de 90-95% même dans le cas de la bilirubine oxy- dase provenant de Coprinusr qui a la meilleure thermosta- bilité parmi les échantillons de bilirubine oxydase classi- ques, alors que la bilirubine oxydase conforme à la présente invention reste stable jusqu'à 70 C dans le même traitement de 10 minutes et montre encore une activité résiduelle aussi élevée que 50% même après avoir été traitée à 90 C pendant minutes. En conséquence, la bilirubine oxydase conforme à la présente invention est considérée comme étant une enzy- me hautement thermostable. En outre, l'enzyme conforme à la présente invention présente une très faible valeur Km, soit de 2,86 x 10-5M et, saréactivité est extrêmement bonne. Ayant maintenant décrit la présente invention d'une manière générale, on la comprendra encore mieux en se réfé- rant à un exemple spécifique qui est donné ici dans un but illustratif seulement et n'est pas destiné à limiter la por- tée de la présente invention, sauf indication contraire. Exemple: On a inoculé le micro-organisme Bacillus lichenifor- mis B-0891 (FERM BP-952), dans un flacon Erlenmeyer de 500 ml, qui contenait 100 ml d'un milieu de culture (stérilisé à 120 C pendant 20 minutes; pH: 7,5) contenant 1,0%(P/V) de sucrose, 1,0% (P/V) d'extrait de levure ("Meast-', produit de "Asahi Breweries, Ltd.", Tokyo, Japon), 0,3% (P/V) de NaCl, 0,05% (P/V) de MgSO4.7H20 et 0,1% (P/V)de K2HPO4, et on l'a ensuite cultivé en le soumettant à des secousses à 30 C pendant 24 heures, pour obtenir une culture de semence. Ensuite, on a inoculé la culture de semence dans un fermenteur, présentant une capacité de 30 1 et contenant 20 1 d'un milieu de culture (stérilisé à 120oC pendant 20 minutes; pH 7,5; 2576909 renfermant 0,1% d'un agent anti-mousse "Disfoam CB-442, marque déposée; produit de Nippon Oils & Fats Co., Ltd") présentant la même composition que le milieu de culture ci- dessus et on l'a cultivé sous agitation avecaération, à 30 C, et 300 tours par minute, pendant 8 jours, et dans des conditions d'aération de 20 1/minute. Après achèvement de la culture, on a centrifugé le bouillon cultivé (à 5000 tours par minute pendant 15 minutes), pour obtenir un surnageant (13,8 1, U). On a soumis le surnageant à une ultrafiltration (sur un appareil à module), pour le concentrer à 1,96 1. Ensuite, on a ajouté au concentré résultant de l'acétone réfrigérée, en un volume de 0,6 fois celui du concentré, et l'on a fait suivre par une centrifugation (à 5000 tours par minu- te pendant 15 minutes), pour éliminer les matières insolu- bles. Ensuite, on a ajouté au concentré ainsi préparé, de l'acétone refrigérée, en un volume de 1,6 fois celui du concentré, de façon à faire précipiter une fraction active de biliru- bine oxydase. La fraction active de bilirubine oxydase a été éliminée par centrifugation (à 5000 tours par minute pendant 15 minutes), et on a dissous le précipité dans un tampon tris-HCl 0,2 M, pour obtenir une solution enzymatique d'un volume de 205 ml (200 U). En utilisant un tube d'acé- tate de cellulose, on a dialysé la solution enzymatique, pen- dant toute une nuit, contre 15 litres de tampon tris-HCl lOmM (pH 7,5). Ensuite, on a fait adsorberle dialysat sur une colonne DEAE-Sepharose CL6B (5,0 x 14,5 cm) qui avait été tamponnéepar avance avec le tampon cidessus. Ensuite, la colonne a été soumise à une élution avec gradient de densité àl'aide de solutions 0-1,0 molaire en chlorure de po- tassium. On a récupéré les fractions actives enzymatiques éluées avec des concentrations en chlorure de potassium de 0,3-0,5 mole, pour recueillir l'enzyme conforme à la présente invention. Ensuite, on a concentré les fractions actives de bilirubine oxydase sur une membrane d'ultrafiltration "XM-50" (marque déposée; produit de Amicon, Corp.), et l'on a fait suivre par leur développement avec un tampon tris-HCl 10 mM 16 2576909 (pH 7,5) sur une colonne Sephacryl S-200 (3,6 x 80 cm). On a récupéré les fractions actives de bilirubine oxydase éluées lors du passage de 580 à 640 ml d'agent de développement et on les a ensuite lyophilisées, pour obtenir 350 mg (90,0 U) de bilirubine oxydase sous sa forme pulvérulente. Ayant maintenant décrit complètement la présente invention, il apparaîtra à l'homme de l'art que de nombreux changements et de nombreuses modifications peuvent y être apportés, sans que l'on s'écarte pour autant de l'esprit ou du domaine de la présente invention telle qu'elle a été dé- finie ici. 17 2576909 REVENDICATTONS 1 - Bilirubine oxydase présentant une spécificité de substrat vis-à-vis d'au moins la bilirubine et capable de catalyser une réaction dans laquelle de la biliverdine et de l'eau sont formées à partir de bilirubine et d'oxygène, caractérisée par le fait que ladite bilirubine oxydase est au moins thermostable. 2 - Bilirubine oxydase selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'elle est thermiquement stable pendant 10 minutes aux environs de 70 C. 3 - Bilirubine oxydase selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'elle présente les propriétés physiques et chimiques suivantes: (a) poids moléculaire: 50 000 + 10 000 (mesuré par filtration de gel sur "Sephacryl S-300"); (b) point isoélectrique: environ pH 3,35; (c) valeur Km: environ-2,86 x 10-5M; (d) pH optimal: environ pH 8; (e) stabilité aux pH:steble aux environs de pH 7 - 9; (f) température optimale: environ 800C; et (g) thermostabilité: stable jusqu'à environ 70 C. 4 - Procédé d'obtention de bilirubine oxydase, ca- ractérisé par le fait qu'il consiste à cultiver un micro- organisme producteur de bilirubine oxydase appartenant à l'espèce Bacillus et ensuite à préparer la bilirubine oxyda- se résultante à partir du bouillon cultivé. - Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'on utilise le micro-organisme Bacillus licheniformis, comme micro-organisme producteur de biliru- bine oxydase appartenant à l'espèce Bacillus. 6 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'on utilise la souche Bacillus licheniformis B-0891 (FERM BP-952), comme micro-organisme producteur de bilirubine oxydase appartenant à l'espèce Bacillus.