FR 2585022 A1 19870123 FR 8610258 A 19860715 i NOUVEL ANTIBIOTIQUE MACROLIDE M 119L La présente invention se rapporte à un nouvel antibiotique macrolide, le X 119. Les composés macrolides occupent une place importante en médecine divers composés macrolides ont été proposés Jusqu'ici. En règle générale, les activités physiologiques des substances chimiques dépendent fortement de leurs structures chimiques. Par conséquent, il y a eu une demande constante pour des composés macrolides qui diffèrent des composés macrolides classiques par la fraction aglycone et la fraction saccharide ou par les substituants. La présente invention contribue & répondre & la. demande mentionnée ci-dessus. Plus particulièrement, cette invention propose un nouvel antibiotique macrolide, le M 119, représenté par la formule (A): CHO N 0 OH /5\ * (A-O formule dans laquelle le substituant R désigne soit (a) soit (d) M 119-a et l'espèce M 119-d. Sur le dessin: - la Figure 1 est un diagramme montrant le spectre d'absorption du rayonnement ultraviolet de M 119-a; - le Figure 2 est un diagramme montrant le spectre d'absorption du rayonnement infrarouge de M 119-a; - la Figure 3 est un diagramme montrant le spectre de RIN sH de X 119-a; - la Figure 4 est un diagramme montrant le spectre de R[N lec de M 119-a; - la Figure 5 est un diagramme montrant le spectre d'absorption du rayonnement ultraviolet de X 119-d; - la Figure 6 est un diagramme montrant le spectre d'absorption du rayonnement infrarouge de X 119-d; la Figure 7 est un diagramme montrant le spectre de RKN 'H de X 119-d; et - la Figure 8 est un diagramme montrant le spectre de RIN 13C de M 119-d. Nouvel antibiotique macrolide x 119 I - Propriétés physico-chimiques. Les propriétés physico-chimiques de la substance X 119 sont énoncées ci-dessous. A. X 119-a ':' Calculé M 61,54 8,50 1,89 LL:g a:s-eInolou spToa ( 58 'IZ8g '8g 9a 'DT9ueg a u-U VLOM89HesD:a.zTginDauo aînuzJog _ - ajoloouT azpno: aaao; ea inalnoo - ((p) %sa '(y> aIlnumo- I 'sup 'l) P-611 - a nwal %a JaqI 'sauvxaq,l suvp alqnlosuT sPM 'amao;ooloo al %a louUq% w al suvp alqnlos : 9,%TITqnloS (Zl) -;Toa a9 oo auflTueA I oaAv aouTuo aqonoo ans aTqd1idoxoaqo avd ouo; naîa : agioloo uoo;,aj (TT) n O = *a (1:6) loUKeJ:o;o.oi : ('oUI 'o0 oD 3o a aoTITs ap Ta2 ap aouTuz aeonoo ans a'pdJ2onm tD (ZHH gZ 'eoGO suep 'SL uoDId> o'îI-D. (ZHK 001 'sIocro suxp 'SI uoIQR) 8 0'IJ-H : a. aioeds UrO 066 '9101 '0901 '9TII '0911 '09111 GLZI 'OIEI '091T o09I: Optn 'oZ91 'ozgI 'OZI '0O9Z '06z 'O16e '09bO8 (noo nQ apoa4S9m) Z '3I[ a2nojeajuT 1-uemeuuoúea np uoTdiosqe,p ea:qoadS (8) ZZOS85Z (8) Spectre d'absorption du rayonnement infrarouge: FIG.6 (méthode au KBr) 3430, 2970, 2930, 2880, 1720, 1685, 1620, 1450, 1405, 1375, 1330, 1315, 1280, 1180, 1160, 1115, 1080 1050, 1015, 990 cm-' (9) Spectre RMN: H-FIG.7 (Etalon TXS, dans CDCl3, 100 MHz> 3C-FIG.8 (Etalon TNS, dans CDCla, 25 MHz) (10) Chromatographie sur couche mince de gel de silice (Merck & Co., Inc.): Chloroforme: méthanol (9:1) Rf = 0,46 vanilline comme réactif. ( insoluble dans l'hexane, l'éther et l'eau. II - Structure chimique Compte tenu des propriétés physico-chimiques ci- dessus y compris le spectre RNK, on a trouvé que la substance X 119 présente une structure chimique telle que représentée par la formule Production de la substance X 119 I - Généralités Le nouvel antibiotique macrolide X 119 n'a été obtenu Jusqu'ici que par la culture de micro-organismes. Cependant, il peut être possible d'obtenir cet antibiotique par une modification microbiologique ou chimique de synthèse de composés apparentés- ou de l'obtenir par synthèse chimique totale. La technique de la culture utilise des souches capables de produire le X 119. Plus spécifiquement, les présents inventeurs ont découvert qu'un actinomycète alcalophile, la souche X 119, qu'ils ont isolé, produit le X 119. D'autres souches appropriées, qui produisent le M 119, peuvent être isolées & partir de l'environnement naturel par n'importe quelle méthode utilisée de façon classique pour l'isolement de micro-organismes producteurs d'antibiotiques. On pourrait également augmenter le rendement en M 119 en soumettant les micro-organismes producteurs de M 119, y compris l'actinomycète alcalophile, la souche M 119, à une irradiation par des rayons radioactifs ou à certains autres traitements. Il est également possible de faire naître des micro-organismes producteurs de N 119 par la procédure de manipulation génétique, par exemple, en incorporant le gène ADN de la souche M 119 qui porte les informations génétiques en ce qui concerne la production de M 119 dans d'autres micro-organismes par voie de transformation ou de fusion cellulaire. On doit comprendre que ces microorganismes issus de la souche ci-dessus sont également inclus dans le domaine de protection de la présente invention. II - Souche M 119 La souche X 119, un actinomycète producteur de l'antibiotique macrolide M 119, que les présents inventeurs ont découvert, sera décrite en détail ci-dessus. 1 - Origine et Numéro de dépôt. La souche M 119 est un actinomycète isolé à partir du sol recueilli dans un Jardin maraîcher à Okinawa-shi, Okinawa-ken, Japon. Cette souche a été déposée le 16 Juillet 1985 auprès de l'Institut de Recherche sur la Fermentation, Agence de la Science et de la Technologie Industrielle, Ministre du Commerce Extérieur et de l'Industrie du Japon, 1-3 Higashi 1 chome, Yatabe-machi, Tsukuba-gun, Ibaraki-ken 305, Japon, o elle a reçu le numéro de dépôt FERM-P n' 8351. Cette souche porte maintenant le numéro de dépôt FERM BP-1075 sous le bénéfice du Traité de Budapest sur la Reconnaissance Internationale du Dépôt des Xicro-organismes aux Fins de la Procédure sur les Brevets. Ce dépôt est totalement en accord avec les règles du Traité de Budapest. De façon spécifique, il est entièrement en accord avec la Règle 11.3 du Traité de Budapest, suivant laquelle le micro-organisme est accessible au public à la délivrance du brevet, et avec la Règle 9 du mème Traité qui requiert le maintien du microorganisme pendant une période d'au moins 30 ans après la date du dépôt. 2. Caractéristiques microbiologiques de la souche X 119 La souche X 119 présente les caractéristiques microbiologiques suivantes. Cette souche est alcalophile, elle se développe à peine à un pH d'environ 6,0 à 7,0, valeur à laquelle les actinomycetes ordinaires se développent, et elle se développe mieux à un pH de 10,0 à 10,5. Ainsi, tous les milieux de culture utilisés dans les essais sur les caractéristiques microbiologiques de la souche X 119 énoncés ci-après, ont été ajustés à un pH de 10,0 & 10,5. (1> Morphologie La souche X 119 se développe bien sur l'agar, et son mycélium de substrat bien ramifié étend des hyphes aériennes qui sont ramifiées de façon monopodiale et forment des chaînes de spores droites à légèrement recourbées (Rectus Flexibilis) consistant en 20 spores ou moins. Les spores présentent uneforme elliptique ou cylindrique (0,4 à 0,6 M x 0,6 à 0,8 p) et elles présentent une surface lisse. On n'observe pas de spores flagellaires, de sporanges ou de mycéliums de substrat fragmentés. (2) Caractéristiques de la culture Les caractéristiques de la culture de la souche M 119 cultivée sur divers milieux de culture sont telles que résumées dans le Tableau 1. (Des observations ont été faites après la culture & 27'C pendant 3 semaines, sauf indication contraire). (3) Propriétés physiologiques Les propriétés physiologiques de la souche M 119 sont énoncées dans le Tableau 2. (4) Utilisation du carbone (sur milieu d'agar Pridham- Gottlieb) L'utilisation de diverses sources de carbone est telle que représentée dans le Tableau 3. (5) Composition de la paroi cellulaire L'acide diaminopimélique contenu dans l'hydrolysat cellulaire est du type méso. TABLEAU 1 CarantérIet{iuie dA Culture Mycéliua Pigment Pigment Milieu Croissance aérien côté inverse soluble Sucrose- Modérée Modéré nitrate 6ris Friable Blanc jauntre Aucun agar olive clair Blanc jaunitre - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ----------m-----m- - m - M m - m - - - -- ----- --- m- mm--- -- -- - Gl61ucose- Faible asparagine 6ris Aucun Blanc jaunâtre Aucun agar olive clair Gl61ycérol- Modérée Modéré asparagine Blanc Friable Blanc jaunâtre Aucun agar jaunitre Blanc jaunâtre Sels einéraux Très faible 6ris olive amidon Blanc Aucun clair Aucun agar jaunâtre ---------------------------------------------------------------------------m-------- Tyrosine Modérée Modéré Blanc à agar Blanc Friable Blanc Aucun jaunitre Blanc jaunâtre jauntre Agar Modérée Faible, Friable Brun nutritif Brun jaunitre Blanc ú blanc jaunâtre Aucun pale jaunitre pâle Levure Bonne Modéré Jaune pile à nourricière - Brun jaunitre Friable Brun jaunitre Aucun extrait de malt pale Blanc jaunâtre pale agar Farine Hodérée Tris faible Blanc d'avoine Brun jaunâtre Friable jaunitre Aucun agar pale Blanc _m.tNmeN] _. _______ ---------------------------------------------------------------------- JTvDu = - pTTSoDC = +: BoN + ( + + + %o'oi > O'TT - O'Z 0.Z ?1 OZ asoInTleo e1 ap uoTf$modmoo; auggoapXCqtp ain;lns ap uoT4onpo.id se$j%.Tu sep uoT4onpqg gmgo, T, l np uoTiusTuod aop TwI np uoTuInSoo auTvl9g el ap, uoTp.ounbtTI uopTUrI ap SSXIO1pXHiC aaToTwinou inAnal ap uoIlTnoq- euoda&l oj nu ainsAlo uoTxnouondalEuopdec lvzu2u GtTSoJdCJ apj*ouvjam:uamITd ap uoTonpoij ( lOVN) GDuVJa, 1 lvH aouvssToio uI anod gTadouddv Hd ap eguvT aouvssToio QI ap sain;u..xdulra ap egiwl ZZOS8Z S Tableau 3 Utilisation du carbone D-Glucose L-Arabinose D-Xylose i-Inositol DMannitol + D-Fructose Rhamnose - - Sucrose + Raffinose Note: + = utilisation positive = utilisation incertaine - = pas d'utilisation. Compte tenu des données ci-dessus, la souche X 119 est classée dans la famille des actynomycètes. Plus particulièrement, cette souche se développe mieux dans la plage des pH alcalins et, de ce fait, appartient à la famille des actinomycètes alcalophiles. III - Culture pour la production de X 119 On peut préparer l'antibiotique macrolide, x 119, en cultivant un actinomycète producteur de X 119, de façon aérobie, dans un milieu approprié, et en récupérant le produit attendu à partir de la culture. Pour les milieux de culture, il est possible d'utiliser ceux qui contiennent toutes sources nutritives qui peuvent être utilisées par les souches productrices de X 119. Par exemple, le glucose, le sucrose, le maltose, l'amidon, la mélasse, les huiles et les graisses peuvent être utilisés comme sources de carbone. Des exemples de sources d'azote sont des substances organiques, telles que la farine de soja, le germe de blé, l'extrait de viande, la peptone, la levure sèche, la levure nourricière et la liqueur de trempage de grains, et des substances minérales telles que les sels d'ammonium ou les nitrates. Si nécessaire, les sels minéraux, tels que le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, les phosphates et les sels de métaux lourds peuvent également être ajoutés. Pour empêcher le moussage durant la fermentation, des agents anti-moussants appropriés peuvent être ajoutés par une méthode classique. La méthode de culture qui convient le plus est la culture liquide aérobie submergée, que l'on emploie largement pour la production d'antibiotiques. Une température de culture appropriée est comprise entre 20 et 37'C, de préférence entre 25 et 32 C. Le rendement de production de la substance X 119 atteint un maximum au bout de 3 & 7 Jours de culture avec secousses, et au bout de 2 à 6 Jours de culture sous aération et agitation. Une culture dans laquelle M 119 est accumulé peut également être obtenue. Le X 119 peut être récolté à partir de la culture par n'importe quelle méthode appropriée. L'une de ces méthodes est basée sur l'extraction. Par exemple, le X 119 du filtrat de la culture peut être récolté par extraction par un solvant non miscible à l'eau, tel que l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, le chloroforme, ou le butanol. ci-dessus sans isolement préalable des cellules. Une autre méthode pour récolter le K 119 & partir de la culture est basée sur l'adsorption. Une substance liquide contenant le N 119, telle qu'un filtrat de culture ou un extrait obtenu par le mode opératoire d'extraction 25.85022 décrit ci-dessus, est soumise, par exemple, à une chromatographie sur colonne utilisant un adsorbant convenable, tel que le charbon actif, l'alumine, le gel de silice ou le "DIAION HP 20" (fourni par la Société 'Mitsubishi Kasei K.K.", Japon). Le X 119 désiré adsorbé sur l'adsorbant est ensuite élué de celui-ci. La solution de X 119 résultante est concentrée à siccité sous pression réduite, ce qui permet d'obtenir le produit N 119 brut. On peut purifier le produit N 119 brut en effectuant, autant de fois que nécessaire, le mode opératoire d'extraction ou d'adsorption mentionné cidessus, si nécessaire, en combinaison. Par exemple, la purification peut être effectuée par une combinaison appropriée d'une chromatographie sur colonne utilisant un adsorbant, tel que le gel de silice ou l'alumine, ou un filtre de gel; une chromatographie liquide utilisant un solvant approprié; et une distribution & contre-courant. Un exemple spécifique de la métho4e de purification consiste 'à dissoudre le produit X 119 brut dans une petite quantité de chloroforme, à appliquer la solution sur une colonne de gel de silice, et à développer la colonne avec un solvant approprié pour éluer les composants actifs de la substance N 119. On a ainsi pu isoler, sous forme de substances uniques, le M 119-a et le X 119d, lesquels ont été concentrés et cristallisés dans un solvant approprié, ce qui a permis d'obtenir le N 119-a ou le X 119-d sous forme d'une poudre incolore. Activités physiologiques de la substance X 119 La substance X 119 présente une activité antimicrobienne contre divers micro-organismes, et la concentration inhibitrice minimale (CIX) de cette substance déterminée par la méthode de dilution sur agar est telle que réprésentée dans le Tableau 4 ci-dessous. Sont également représentées dans le même tableau les concentrations inhibitrices minimales obtenues pour la Josamycine 1'érythromycine (EN), utilisées comme témoins. TABLEAU 4-a CIM de M 119-a et de M 119-d (pg/ml) (à suivre) Microorganisme M 119-a M 119-d JM EM i u. Staphylococcus aureus FDA 209PJC-1 (MS-1) 0,20 o0,780,20 020 Staphvylococcuà aureus Terajima (MS-1) 0,78 3113 0,78 0t20 StapsDhvlococcus aureus MS 353 (MS-1). 078 3113 0t78 0/20 Strentococcus yvowenes Cook (MS-1) 0r20 0178 0t20 0720 Bacillus subtilis ATCC 6633 (MS1). 0,20 0,78 0,39 100 > 100 > 100 >100 StaDhvlococcus aureus MS 12917 Mac' >100 >100 > 100 > 100 _l >:_. t- LuJ rOj tn oo Co Ln CD r-O !'' TABLEAU 4-b Microorganism e M 119-a M 119-d JM EM EscherichiatoLi NIHJ-JC-2 (MS-1) > 100 >100 >100 100 Escherichia col K12 C600 (MS-1) 100 100 >100 50 Klebsiella uneumoniae PCI-602 (MS-lY 12t5 12,5 ' 12,5 6,25 Salmonella tvphimurium IID971 (MS-1) >100 >100 >100 100 Salmonella hi 901 (MS-1) 100 100 >100 50 Salmonella DaratyvDhi 1015 (MS-1) ' 50 25.100 ' 25 Salmonella schottmuelleri 8006 (MS-1) 100 25 >100 50 Salmonella enteritidis G 14 (MS1) >100 >100 >100 100 Serratis marcescens IAM 1184 (MS-1) >100 > 100 >100 100 Pseudomonas aeruçinosa IFO 3445 (MS-1) >100 >100 > 100 > 100 Pseudomonas aeruinosa NCTC 10490 (MS-1) > 100 > 100 > 100 > 100 Pseudomonas aeruinosa PAO 1 (MS-1) > 100 >100 >100 >100 (à suivre) I-Aà Vl rNI LnI oo Ln u1 o c, 1', TABLEAU 4-c Microorganisme M 119-a M 119-d JM EM Proteus morganii IFO 3848 (MS-1) 50 50 >100 25 Proteus vulearis OX-19 (MS-1) >100 > 100 >100 > 0 Proteus rettgeri IFO 3850 (M -1) > 100 >100 > 100 > 100 Enterobacter aeroeenes ATCC 13048 (MS-1l) > 0 100 >100 100 Enterobacter cloacae 963 (MS-l) > 100 > 100 >100 > 100 Haemophilusinfluenzae ' (cinq souches isolées cliniquement) 1,56 - 625 _- 3,13 - 6,25 - 1,56 - 3,13 Mvcoplasma pneumoniae 0,10 0,20 0,10 Note: "Macr" signifie une bactérie résistant aux macrolides constitutifs. O1 7' rlj Ln o Ln CD rO rla Comme il ressort du Tableau 4, la substance X 119 conforme à la présente invention présente une activité antimicrobienne, particulièrement contre les bactéries Gram- positives, de façon typique les bactéries pathogènes entrant dans la famille des bactéries Gram-négatives telles que Haemophilus influenzae, et les mycoplasmes, et, de ce fait, elle peut être utilisée comme antibiotique efficace contre les infections induites par de telles bactéries. Exemples expérimntaux Dans les exemples suivants, "%" signifie #p/v%". Evxe"pl 1 On charge dans un ballon Erlenmeyer de 500 ml, ml d'un milieu de pré-culture contenant 3% de glycérine, 1% de liqueur de trempage de grains, 0,3% de levure sèche, 0,35% de CaC03 et 1% de NaCGO3 préparer un inoculum. On charge, dans un fermenteur de 300 litres, 150 litres d'un milieu présentant la même composition que le milieu de pré-culture, et on y aJoute 3 litres de l'inoculum. La fermentation est effectuée pendant 3 Jours à 27' à 0,5 v.v.m. et 150 t.p.m. Une fois la fermentation achevée, de la CELITE est ajoutée à la pâte fermentée, qui est ensuite filtrée sous pression. A 150 litres du filtrat de culture incluant la liqueur de lavage, on ajoute un volume égal d'acétate de butyle, et le filtrat résultant est soumis à une extraction. La couche d'acétate de butyle est concentrée sous pression réduite, ce qui permet d'obtenir 14 g d'un produit brut composé de X 119-a et de K 119-d. Le produit brut X 119-a et X 119-d est dissous dans le chloroforme, lavé avec de l'eau, déshydraté par du sulfate de sodium anhydre, et ensuite concentré. Le concentré est appliqué sur une colonne de gel de silice (3cm de diamètre x 25 cm de hauteur) équilibrée avec du chloroforme, et développé avec un mélange chloroforme- méthanol, ce qui permet d'éluer une fraction M 119-a avec un mélange chloroforme-méthanol 50:1, alors qu'une fraction N 119-d est éluée avec un mélange chloroforme-méthanol 20:1. La fraction X 119-a est concentrée et soumise à nouveau à une chromatographie sur gel de silice qui permet d'obtenir 100 mg de N 119-a. D'autre part, la fraction X 119-d est concentrée et ensuite soumise à une filtration sur gel (colonne dg,5 cm de diamètre x 31 cm de hauteur) avec du "TOYOPEARL HW 40" (fourni par la Société "Toyo Soda Mfg. Co., Ltd", Japon). La fraction N 119-d purifiée est concentrée à siccité, ce qui permet d'obtenir 420 mg de N 119-d. REVENDICATIONS 1 - Un antibiotique macrolide, le X 119, représenté par la formule (A>: (A) formule dans (d): laquelle le substituant R désigne soit (a) soit R: H (d> R: OH. 2 - L'antibiotique x 119 selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il consiste en le x 119-a o le substituant R dans la formule substituant R dans la formule 4 - Procédé de production d'un antibiotique macrolide, le x 119, représenté par la formule C U HO N O5 g S _ 9 O ú O (A) formule dans laquelle le substituant R désigne soit partir de la culture. - Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'on utilise la souche x 119 ou un micro- organisme dérivé de celle-ci.