FR 2583641 A1 19861226 FR 8608926 A 19860620 PROCEDE DE PREPARATION D'UN VACCIN VIVANT CONTRE LA LISTERIOSE DES MOUTONS ET DES CHEVRES La présente invention se rapporte & un procédé pour la préparation d'un vaccin vivant contre la listériose des moutons et des chèvres, pour la prophylaxie de la listériose qui sera utilisée dans le domaine de la médecine vétérinaire. On connaît un procédé de préparation d'un vaccin contre la listériose des moutons et des chèvres, dans lequel sont utilisées les souches Listeria monocitogenes 1/2a Nr.326 et 4B Nr.125 déposées auprès du "NBPMKK" sous les Nr.251 et Nr.252, lesquelles sont cultivées statiquement dans un bouillon de peptone de viande ou dans un agar de peptone de viande. La biomasse obtenue à partir des deux souches est utilisée pour un vaccin natif ou lyophilisé (Ivanov I. "Etude de l'immunoprophylaxie active de la listériose des moutons. Travaux du VII*nm' Symposium International sur les problèmes de la listériose, 1979). Les inconvénientsde ce procédé pour la préparation d'un vaccin sont les suivants: La suspension bactérienne obtenue par une culture statique du bouillon présente une faible densité qui rend difficile la préparation d'un vaccin lyophilisé. La culture surl'agar est laborieuse, avec un pourcentage élevé de reJets dus à la contamination par d'autres bactéries, et il n'y a pas de possibilité de production industrielle du vaccin. En outre, dans une culture statique, une partie des cellules bactériennes meurt durant la culture. Apres la lyophilisation, la survie des cellules de listeriosis s'élève à 30-50%. La présente invention a pour but de proposer un procédé pour la préparation d'un vaccin bivalent vivant contre la listériose des moutons et des chèvres, suivant lequel la biomasse préparée est uniforme, avec une densité élevée, avec un pourcentage élevé en cellules vivantes, sans risque de contamination par la microflore secondaire, et 258364 1 Après achèvement du séchage, le vide est éliminé par un gaz neutre, avec lequel les emballages sont remplis. Les avantages de ce procédé conforme à la présente invention sont les suivants: Il permet d'automatiser les procédés de fabrication. La biomasse obtenue est uniforme, sans contamination par la microflore secondaire, et elle présente une densité élevée. La méthode utilisée pour lyophiliser le vaccin assure une survie des cellules des deux sérotypes non inférieure à 80% et elle garantit une période de validité d'l an. Ceci permet d'obtenir un produit stable en ce qui concerne les cellules vivantes, l'immunogénicité, l'innocuité et la pureté, de même que la conservation des deux souches introduites dans le vaccin en quantités égales. Le procédé ainsi développé permet de fabriquer le vaccin sur une échelle industrielle. Les exemples suivants permettent de mieux comprendre l'invention: Exemple 1 Culture, dans un fermenteur, des souches 1/2a et 4B de L.monocitogenes pour un volume de travail de 7 1. Le contenu d'ampoules lyophilisées des souches vaccinales est mis en suspension et cultivé dans un bouillon de peptone de viande avec 1% de glucose. On fait incuber pendant 24 heures et ensuite on prépare des souscultures qui sont introduites dans le fermenteur en une quantité de 1/20 du volume de travail du fermenteur. La culture est effectuée dans les conditions suivantes: - air: 3 à 5 1/min.; - agitation: 300 révolutions/min.; - température: 37'C; et - pH: 7,2. A chaque étape du processus, on vérifie la pureté au moyen d'une préparation, colorée d'après la méthode de "Gram" et de culture en boîtes de Pétri avec du bouillon de peptone de viande (inoculation). conservant les propriétés initiales de souches atténuées vaccinales après la lyophilisation. Ce but est atteint par un procédé selon lequel on obtient la biomasse en cultivant, dans un fermenteur, les deux souches vaccinales Listeria monocitogenes. On effectue la culture des souches, dans un fermenteur, en observant les paramètres suivants: - air: 3 à 5 1/min.; - agitation: 300 à 1000révolutions/min.; _ température: 35-37'C; et - pH: de 7 à 7,6. La quantité d'inoculum est avantageusement 1:20 à 1:100 par rapport au volume de travail du fermenteur. Après achèvement de la culture déterminé suivant la densité de la biomasse obtenue, cette dernière est diluée avec un milieu. protecteur, elle est homogénéisée et lyophilisée. Le procédé de culture en fermentation est le suivant: L'inoculum nécessaire est obtenu à partir des souches vaccinales Listeria monocitogenes 1/2a et 4B et il est introduit dans le fermenteur. Un bouillon de peptone de viande renfermant 8 à 20 g/1 de glucose est cultivé à une température allant de 35 à 37'C. La biomasse ainsi obtenue présente une densité de 12 milliards/cm3 de cellules bactériennes vivantes. Four la lyophilisation du vaccin, on utilise un milieu protecteur contenant 2 à 17% de glutamate de sodium, à 20% de saccharose et 0,5 & 5% de gélatine détruite, qui est aJouté à la biomasse, et cette dernière est lyophilisée. Pendant le procédé de lyophilisation, la température du produitpendantla période de sublimation est maintenue au-dessous de moins 30'C. Après achèvement de ce procédé, on élève la température à 40'C. Le vide dans la chambre est de 13,33Pa à 6,66Pa . La température du condenseur se situe au-dessous de moins 45 C. A la fin de la culture en fermentation qui est interrompue en fin de phase pour ralentir la vitesse de multiplication, on obtient une biomasse dont la densité atteint 12 milliards/cm': de cellules bactériennes vivantes. La densité de la suspension bactérienne des sous-cultures et de la biomasse de fermentation est déterminée également sur "Specol" d'après une courbe élaborée sur la base de la Cinquième Norme Optique Internationale pour la turbidité. En fonction de la densité de la biomasse obtenue dans laquelle le rapport des deux souches vaccinales est de l:l, la biomasse est diluée avec un milieu protecteur contenant 2 à 17% de glutamate de sodium, 5 à 20% de saccharose et 0,5 à 5% de gélatine détruite. Après homogénéisation de la biomasse avec le milieu protecteur, le vaccin est versé dans des bouteilles (flacons> ou des baltes, suivant les besoins du consommateur. Exemple 2 Lyophilisation du vaccin; Le vaccin est congelé à l'avance de façon statique ou rotative en fonction de l'emballage. Pour le séchage du vaccin, on utilise un appareil à chambre spéciale pour la lyophilisation. Pendant le processus, la température du produit pendantlapériode de sublimation est maintenue au- dessous de moins 30'C. Apres achèvement de ce processus, on élève la température Jusqu'à 40'C. Le vide dans la chambre est de 13,33Pa à 6,66Pa (0,1 à 0,05 Torr). La température du condenseur est au-dessous de moins 45'C. Apres achèvement du séchage, le vide est supprimé à l'aided'ungaz neutre (azote) avec lequel on remplit les emballages. Ceux- ci sont stockés dans un endroit sec et obscur à une température de 4 à 8 C. Comme solvant, on utilise une solution physiologique contenant 0, 1g/l de saponine avec un piH de 7,2. Après remise en suspension, le vaccin ne contient pas moins de 1 milliard/cm3de cellules bactériennes o3641 vivantes provenant des deux sérotypes en des quantités approximativement égales. Apres la lyophilisation, le vaccin est vérifié en ce qui concerne: le nombre de cellules bactériennes vivantes au moyen de culture (inoculation) en boîtes de P6tri, l'innocuité pour des cobayes, et l'immunogénicité. Aucune conjonctivite n'est apparue dans le traitement conJonctival de cobayes selon la méthode d'Anton, avec une instillation initiale du vaccin dans les yeux, suivie d'une instillation après au moins 12 jours, de cultures provenant des souches pathogènes de L.monocitogenes 1/2a et 4B, alors que les yeux d'un témoin non traité initialement par le vaccin bivalent ont été atteints d'une conjonctivite purulente clairement exprimée.- Exemple 3 Le vaccin est appliqué une fois sur des moutons, des chèvres, des agneaux et des brebis Agés de 6 semaines, & une dose de 2 ml. Les animaux ont reçu des injections hypodermiques derrière l'articulation du coude. L'immunité est obtenue 12 Jours après la vaccination et elle dure 10 mois. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la préparation d'un vaccin bivalent vivant contre la listériose des moutons et des chevres, suivant lequel des souches atténuées de Listeria monocitogenes, dépo- sées auprès du "NBPMKK", pour la souche 1/2a sous le Nr.251, et pour la souche 4B sous le Nr.252, sont cultivées sur un bouillon de peptone de viande avec 8-20 g/l de glucose, carac- térisé par le fait que l'on effectue la culture des souches dans un fermenteur en observant les paramètres suivants: - air: 3-5 1/min., - agitation: 300-1000 révolutions/min. - température: 35-37 C; et - pH: de 7 à 7,6. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la quantité d'inoculum est de 1:20 à l:100par rap- port au volume de travail du fermenteur. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait qu'après achèvement de la culture déterminé sUiValt la densité de la biomasse obtenue, cette dernière est diluée avec un milieu protecteur, homogénéisée, puis lyophilisée. 4. Procédé selon la revendication 3, caractériséepar- le fait que l'on effectue la lyophilisation dans un milieu pro- tecteur contenant de 2 à 17 % de glutamate de sodium, 5 à 20 % de saccharose, et 0,5 à 5 % de gélatine détruite.