FR 2575164 A1 19860627 FR 8419545 A 19841220 2575 1 6 4 Esters de tri- et tétrapeptides inhibiteurs de la sécrétion gastrique, procédé d'obtention et compositions pharmaceutiques les contenant. La présente invention concerne de nouveaux peptides inhibiteurs de la sécrétion gastrique. Elle concerne également un procédé pour leur obtention et les compositions pharmaceutiques les contenant. La gastrine est une hormone gastro- intestinale qui possède, à un degré élevé, le pouvoir de stimuler la sécrétion gastrique. Par ailleurs, la pentagastrine et la tétragastrine sont des peptides synthétiques proches de la séquence C-terminale des ou 4 derniers aminoacides de la gastrine et répondent respectivement aux formules: Boc - Bêta Ala - Trp - Met - Asp - Phe - NH2 H - Trp - Met - Asp - Phe - NH2 utilisant pour désigner les alpha-aminoacides et les groupes protecteurs les abréviations à 3 lettres recom- mandées par la Commission de Nomenclature de i'IUPAC - IUB. Ces composés sont également des stimu- lants de la sécrétion gastrique. Selon la présente invention, il a été trouvé que,de façon surprenante, des dérivés peptidiques dérivés de ces séquences, par suppression du phényl- alaninamide terminal et estérification convenable de la fonction carboxyle en alpha de l'acide aspartique, de- viennent de puissants inhibiteurs de la sécrétion gastrique. Les composés selon l'invention répondent à la formule générale: y R - X TRP - X - L-AsD - OCH-CH2 (I) 1dans laquelle: 2 dans laquelle - R représente l'hydrogène ou un groupe protecteur de la fonction amine terminale, tel que t.but- oxycarbonyle (Boc), beuzyloxycarbonyle (Z) et alcanoyle inférieur; XlreprAsente soit bêta-Ala, soit une liaison directe entre R et le groupe amine terminal de l'aminoacide TRP; - TRP désigne soit l'isomère L, soit l'isomère D du tryptophane; - X2 représente la L-leucine, la L- méthionine ou la L-norleucine; - Y désigne l'hydrogène, un atome d'halogène (de préférence le fluor ou le chlore), un groupe trifluorométhyle, un groupe cyano ou un groupe nitro. Les composés selon l'invention peuvent être préparés selon les techniques habituelles de synthèse peptidique soit en phase solide selon Merrifield, soit en phase liquide. A partir de l'acide aspartique alpha- ester, on introduit successivement les différents amino- acides présents dans la séquence. Les réactions de couplage sont effectuées soit avMec un ester activé de l'acide aminé à introduireau sein du diméthylformamide et en présence de diisopropylgthylanine et d'hydroxy-1 benzo- triazole, soit avec l'acide aminé lui-même, et dans ce cas on opère au sein du diméthylformamide en présence de diiso- propyl9thylamine et d'hexafluorophosphate de benzotria- zolyloxy-tris-diméthylamino-phosphonium (BOP). Tous les aminoacides sont incorporés sous la forme du dérivé protégé sur l'amine en alpha, le groupe protecteur choisi étant le groupe t-butyloxy- carbonyle. Lorsque l'aminoacide utilisé présente dans sa chaîne latérale des fonctions susceptibles de réagir, celles-ci doivent être bloquées au préalable. Ainsi les fonctions acides en bêta de l'acide aspartique doivent être bloquées sous forme d'ester en particulier d'ester benzylique. Après chaque réaction de couplagela déprotection de l'amine en alpha est effectuée par hydrolyse acide. Finalement, les peptides, protégés dans leurs fonctions des chaînes latérales, sont par- tiellement ou entièrement déprotegés pour conduire aux composes de formule (I). L'acide aspartique alpha ester de départ est préparé à partir de l'acide aspartique protegé sur l'amine par un groupe tertiobutoxycarbonyle et sur la fonction acide en bêta par un ester benzylique. L'estérification en alpha peut être effectuée soit par action d'un halogénure de phénéthyle éventuellement substitue, soit par action de l'alcool phgnéthylique correspondant en présence de dicyclohexyl- carbodiimide et de paradiméthylaminopyridine. Les exemples suivants, non limitatifs, permettront de mieux comprendre l'invention. Dans ces exemples, on utilisera les abréviations suivantes: Acides aminés et groupes protecteurs: Asp:Acide L-aspartique Bêta Ala: Bêta-alanine Leu: L-leucine L-Trp: L-tryptophane D-Trp: D-tryptophane Boc: tertiobutyloxycarbonyle Bzl: benzyle O-Np 02N - Autres abréviations: DMF:diméthylformamide DCC: dicyclohexylcarbodiimide DIEA: diisopropyléthylamine TFA:acide trifluoracétique HOBt: hydroxy-l benzotriazole 2575 164 O - P - N - (CH3)3 I 3 BOP' XN. 0 PF6G EXEMPLE 1: Boc-L-Trp-Leu-Asp-OCH2-CE-(: a) Boc-Asp(Bêta OBzl)-OCH2-CH2 On dissout 4, 55 g du sel de césium de l'acide Boc-Asp(Bêta OBzl)-OH dans 100 ml de DMF puis on ajoute 2,22 g de bromure de phéngthyle et agite pendant 12 heures à température ambiante. On concentre sous vide à une température inférieure à 40eC puis on dissout le résidu dans 250 ml d'acétate d'éthyle. On lave la solu- tion avec une solution saturée de bicarbonate de sodium, avec de l'eau, avec une solution d'acide citrique à 10% puis à nouveau avec de l'eau. On sèche la solution sur sulfate de sodium et évapore le solvant sous vide. Le résidu cristallise dans un mélange éther-hexane. Rendement 85%; F = 5860eC; (alpha)D=-20,7e (c = 1,06, DMF). b) Boc-Leu-Asp(Bêta OBzl)-OCH2-CH2 > On dissout 4,27 g du produit obtenu cidessus dans 20 ml de TFA et laisse 1/2 heure à tempg- rature ambiante. On évapore sous vide en ajoutant de l'éther et en maintenant la température inférieure à 40 C. On répète plusieurs fois l'opération. Le résidu huileux est trituré avec de l'éther puis séché sous vide sur potasse. On dissout 2,32 g du trifluorac9tate ainsi obtenu dans 10 ml de DMF avec 1,21 g de Boc-Leu, 2,2 g de BOP et 1,8 ml de DIEA. On laisse 8 heures à température ambiante puis on concentre sous vide à température infé- rieure à 40C. On dissout le résidu dans 200 ml d'acétate d'éthyle et on lave successivement avec une solution saturée de bicarbonate de sodium, avec de l'eau, avec une solution d'acide citrique à 10% et à nouveau avec de l'eau. On sèche la solution sur sulfate de sodium puis concentre sous vide. On chromatographie le résidu sur gel de silice. En éluant avec le mélange acétate d'éthyle-hexane 1/1, vol/vol, on obtient une huile in- colore (2,48 g). Rendement 92%; (alpha)D = 19,9* (c = 0,93, DMF). Chromatographie sur couche mince. Rf = 0,95 (acetate d'éthyle-hexane 8/2, vol/vol) Rf = 0,91 (acétone-hexane 7/3 vol/vol). c) Boc-L-Trp-Leu-Asp(bêta OBzl)-OCH CH2- de Boc-L Trp-ONp, 0,63 g de HOBt et 1,6 ml de DIEA. On laisse une nuit à température am- biante puis traite le mélange comme indiqué au para- graphe b). Par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec le mélange hexaneacétaté d'éthyle 3/7 vol/vol, on obtient le produit attendu (2,36 g) qui cristallise dans l'éther: F = 135-138 C;(alpha)D= - 24 (c = 1,3 DMF): rendement 88%. d) Boc-L-Trp-Leu-Asp-OCH CH2 2 575 1 6 4 On dissout 0,73 g du produit obtenu en c) dans 50ml d'9thanol à 95 et on hydrogène, à-température et pression ordinaires, la solution en présence de 0,07 g de palladium sur charbon à 10% - Après 4 heures la réaction est terminée. On filtre le cata- lyseur et concentre sous vide à température inférieure à 40 C. Le résidu trituré avec un mélange 9ther-hexane donne ure poudre incolore (0,483 g): F = 95-100 C; (alpha)D = 22,7 (c = 1,3,DMF); rendement 76%. EXEMPLE 2: Boc-bêta Ala-L-Trp-Leu-Asp-OCH2-CH2 a) Boc-bêta Ala-L-Trp-Leu-Asp(bêta OBzl)-OCH2-CH2 e On traite 0,73 g du produit obtenu à l'exemple le) par 3 ml de TFA comme indiqué précédemment. Après s9chage>le trifluoracétate ainsi obtenu est dissous dans 10 ml de DMF avec 0,189 g de Boc-bêta Ala, 0,398 g de BOP et 0,4 ml de DIEA. On laisse une nuit à température ambiante et traite comme à l'exemple 1 b) . Par chromatographie sur gel de silice, en gluant par le mélange acetate d'éthyle-hexane 7/3 vol/vol, on obtient le produit attendu (0,595 g) qui cristallise pour trituration avec de l'éther: F= 163-166 C; (alpha)D=-18,9 (c = 1,2 DMF); rendement 83%. b) Boc-bêta Ala-L-Trp-Leu-Asp-OCH2-CH2- incolore: F=100-103 C; (alpha)D = -17,7 (c=1,7 DMF); rendement 79%. EXEMPLE 3: Boc-D-Trp-Leu-Asp-OCH2-CH2> a) Boc-D-Trp-Leu-Asp(bêta OBzl)-OCH2-CH2- On dissout 1,36 g de trifluorac9tate de H-Leu-Asp(bêta OBzl)- 0-CH2-CH2 1,06 g de BOP, 0,76 g de Boc-D-Trp et 0,86 ml de DIEA. Après 8 heures à température ambiante, on traite comme indiqué à l'exemple lb). On chromatographie sur gel de silice et, par élution avec un mélange acetate d'éthyle-hexane 5/5 vol/vol, on isole le pro- duit attendu qui cristallise par trituration avec un mélange 2575 1 64 éther-hexane: F = 67-70 C; (alpha)D = -14,1 (c = 1,DMF) rendement 91%. b) Boc-D-Trp-Leu-Asp-OCH2-CH2 On hydrogène 0,242 g du produit ob- tenu ci-dessus comme indiqué à l'exemple 1 d). On isole de la même façon une poudre incolore: F = 108-110 C (alpha)D = -15,8Q (c = 1, DMF); rendement 78%. EXEMPLE 4 Boc-bêta Ala-D-Trp-Leu-Asp-OCH2-C2 (alpha)D =-27,8 (c = 1,4 DMP); rendement 79%. b) Boc-bêta Ala-D-Trp-Leu-Asp-OCH2-CH2 \ Selon le procédé décrit à l'exemple 1 d), on hydrogène le produit précèdent. On obtient une poudre incolore: F = 105-110 C; (alpha)D = -20,4 (c = 1,2 DMF); rendement 84%. - EXEMPLE 5: Boc-L-Trp-Leu-Asp-OCH2-CH20 3 F a) Boc-Asp(bêta OBzl)-OCH2-CH2 F 2575'164 On dissout 2,2 g de Boc-Asp(b.ta OBzl)- OH dans 70 ml de dichlorométhane avec 0,924 g de para- fluorophénéthyl alcool, 1,24 g de DCC et 0,732 g de diméthylamino-4 pyridine. On laisse une nuit à tempe- rature ambiante puis on filtre la dicyclohexylurée et concentre sous vide. On reprend le résidu dans l'acétate d'éthyle. On lave la solution successivement avec une solution saturée de bicarbonate de sodium, avec de l'eau, avec une solution d'acide citrique à 10% et à nouveau avec de l'eau. On sèche la solution sur sulfate de sodium et évapore le solvant sous vide. On chromatographie le résidu sur colonne de gel de silice. En gluant avec un mélange hexane-acétate d'éthyle 8/2 vol/vol, on obtient une huile incolore (1,82 g): (alpha)D = - 16 (c = 1,9 DMF); rendement 68%. Chromatographie sur couche mince: Rf = 0,64 (chloroforme) Rf = 0,85 (acétate d'gthyle-hexane 1/1 vol/vol) b) Boc-Leu-Asp(bêta OBzl)-OCH2-CH2F On opère comme dans l'exemple lb3en remplaçant Boc-Asp(bêta OBzl)- OCH2CH2- par une quantité équivalente de Boc-Asp(bêta OBzl)-OCH2-CH2 2F. On traite de la même façon, et, apres chromatographie sur gel de silice en gluant avec le mélange hexane-acétate d'éthyle 8/2 vol/vol, on obtient avec un rendement de 89% une huile incolore: (alpha)D = - 18,5 (c = 0,9 DMF). 2575 1 64 Chromatographie sur couche mince Rf = 0,66 (chloroforme) Rf = 0,59 (acétate d'éthyle-hexane 1/1 vol/vol). c) Boc-L-Trp-Leu-Asp(bêta OBzl)-OCH2-CH2- SF On opère comme dans l'exemple 1 c) à partir du produit obtenu ci-dessus. On traite de la même façon puis chromatographie sur gel de silice pour obtenir un produit cristallisé: F = 90-92"C; (alpha)D =-23 (c = 1,2 DMF); rendement 77%. d) Boc-L-Trp-Leu-Asp-OCH2-CH2. _ F Comme indiqué précédemment, on hydro- gène en présence de palladium sur charbon le produit. obtenu ci-dessus. Par le même traitement, on obtient un solide: F = 103107 C; (alpha)D = - 19 (c = 1 DMF); rendement 72%. EXEMPLE 6: Boc-bêta Ala-L-Trp-Leu-AspOCH2-CH2 - F a) Boc-bêta Ala-L-Trp-LeuAsp(bêta OBzl)-OCH2-CH2 F On opère comme dans l'exemple 2 a) à partir du peptide protdgé de l'exemple 5 c). De la même façon, on obtient le produit attendu: F = 80-85 C (décomposi- tion). Chromatographie sur couche mince: Rf = 0,5 (acétate d'éthyle-hexane 7/3 vol/vol). b) Boc-bêta Ala-L-Trp-Leu-Asp-OCH2-CH2 / \F 2575 1 64 On déprotège le peptide obtenu ci-dessus par hydrogénation catalytique comme indiqué dans l'exemple 1 d). On obtient un solide: F = 110-115 C (décomposition). Chromatographie s-ur couche mince: Rf = 0,82 (acétate d'gthyle, pyridine, acide acétique, eau /20/3/3 vol/vol). EXEMPLE 7 CF C3 Boc-L-Trp-Leu-Asp-OCH2-CH2 2 CF3 a) Boc-Asp(bàta OBzl)-OCH2-CH2 On opère comme dans l'exemple 5 a) en remplaçant le parafluorophgnéthylalcool par une quantité équivalente de mgtatrifluoromgthylphénéthyl-alcool. Apres chromatographie sur gel de silice en gluant avec le mélange hexaneacétate d'éthyle 2/8 vol/vol, on obtient une huile: (alpha)D = -12,9 (c = 0,8 DMF); rendement 71%. Chromatographie sur couche mince: Rf = 0,67 (chloroforme) Rf = 0,69 (acétate d'gthyle-hexane 1/1 vol/vol). CF, c3 b) Boc-Leu-Asp(bêta OBzl)-OCH2-CH2 A partir de l'ester préparé cidessus, on opère comme dans l'exemple 1 b). Après chromatographie sur colonne de gel de silice en gluant avec le mélange acétate d'éthylehexane 1/1 vol/vol, on obtient un produit cristallisé: F = 72-75 C; (alpha)D = - 18 (c = 1,1 DMF); rendement 78%. CF3 c) Boc-L-Trp-Leu-Asp(bêta OBzl)-OCH2-CH2 A partir du produit obtenu en b), on opère comme dans l'exemple lc). Apres chromatographie sur colonne de gel de silice en éluant avec le mélange acetate d'éthyle-hexane 1/1 vol/vol, on obtient une poudre incolore; F = 55-60 C; (alpha)D = -5,6 (c = 1,9 DMF); rendement 81%. CF3 d) Boc-L-Trp-Leu-Asp-OCH2-CH2 On déprotège le produit obtenu au paragraphe c) par hydrogénation catalytique comme indi- qué à l'exemple 1 d). On obtient dans un mélange éther- hexane, un solide: F = 95-100C; (alpha)D = 19,6 (c = 0,9 DMF); rendement 79%. Les composés selon l'invention ont été étudiés en ce qui concerne leurs propriétés thérapeutiques. Plus particulièrement, ces composés ont été étudiés in vivo en ce qui concerne leur effet sécrétoire gastrique chez le rat. Le modèle choisi pour la mesure de l'effet sécrétoire est celui de l'estomac de rat anesthésié reperfusé. Le protocole suivi est une modification de celui décrit préalablement par Ghosh et Schild. Un rat mâle de souche Wistar de 300 g, à jeun de 18 h, est anesthésié à l'uréthane (solution à 10%, 1,5 ml/100 g, i.p.). On pratique ensuite une trachéotomie et un cathétérisme de la veine du pénis qui permettra l'administration i.v. des peptides. On place ensuite une canule dans l'oesophage jusqu'au cardia 2575 1 64 et une seconde dans le duodénum (par une duodênotomie e effectuée à 3 cm environ du pylore) jusque dans la zone antrale gastrique. Un soluté propionique-succinique (pH 5,5)> qui donne une variation lindaire du pH en fonction de la concentration en ions H+, est utilisé pour perfuser l'estomac en circuit ouvert ou fermé avec un débit de 3 ml/min. La température corporelle ainsi que celle du soluté sont contrôléeset maintenue à 30C. La sécrétion acide de l'estomac va entraîner une variation de pH détectée par l'électrode de verre et enregistrée en fonction du temps. Apres stabilisation de la sécrétion basale, on injecte la gastrine par voie intraveineuse soit en perfusion, soit en injection unique. La réponse est enregistrée en fonction du temps et la quantité d'acide sécrété est mesurée sur l'enregistrement par différence avec la sécrétion basale. La même expérience est réalisée soit en injectant le peptide à étudier i. v. sur un plateau de sécrétion acide stimulée par la gastrine, soit en associant le peptide avec le stimulant dans des rapports de concentration variables. En faisant varier la dose du produit à étudier et en mesurant Ies effets correspondants, il est possible pour chaque produit de déterminer la Dose Efficace 50% ou dose qui inhibe de 50% la sécrétion * gastrique induite par la gastrine. Les résultats obtenus avec différents produits de l'invention sont les suivants: 2575 1 64 Peptide DE 5.0 (mg/kg) Exemple 1.0,1 Exemple 2 0,04 Exemple 4., Exemple 5.0,08 Exemple 6 0,02 Exemple 7 0,5 Ces résultats montrent que les composés selon l'invention présentent un effet inhibiteur très important sur la sécrétion gastrique. Par ailleurs, ces composés sont peu toxiques. Par suite, les composés selon l'inven- tion pourront être utilisés en thérapeutique humaine dans tous les cas o il est utile de diminuer la sécrétion gastrique et en particulier pour le traitement des ul- cères gastro-duodgnaux. Les composés de la présente invention peuvent être utilisés de préférence par voie injectable, intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée. Ils sont utilisés dans un solvant tel que le sérum physiologique (solution saline isotonique). La posologie peut varier suivant l'in- tensité de l'effet thérapeutique recherchée, la gravité de l'affection à traiter et la voie d'administration uti- lisée. Elle doit don c-être déterminée pour chaque patient en fonction de ces divers critères. Le plus souvent elle est comprise entre 0,1 et 10 mg de principe actif par kg de poids corporel. L'invention concerne donc également les compositions pharmaceutiques contenant à titre d'ingrédient actif un peptide selon l'invention en com- binaison avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, tel que le sérum physiologique. 7 5 1 6 4 REVENDICATIONS 1. A titre de nouveaux produits, les peptides de formule: Y R- X1- TRPX2- L-Asp- OCH2-CH2 (I) dans laquelle: - R représente l'hydrogène ou un groupe protecteur de la fonction amine terminale, tel que t. butoxycarbonyle (Boc), benzyloxycarbonyle (Z) et alcanoyle inférieur; - X1 représente soit bêtaAla, soit une liaison directe entre R et le groupe amine terminal de l'amino acide TRP; -TRP désigne soit l'isomère L, soit l'isomère D du tryptophane; - X2 représente la L-leucine, la L- méthionine ou la L-norleucine; - Y désigne l'hydrogène, un atome d'halogène (de préférence le fluor ou le chlore), un groupe trifluorométhyle, un groupe cyano ou un groupe - nitro. 2. Peptides selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont l'un des peptides ci-après: Boc-L-Trp-Leu-Asp-OC2CH2-CO2: Boc-bêta Ala-L-T-rpLeu-Asp-OCH2-C-H2 Boc-D-Trp-Leu-Asp-OCH2-CH2 O Boc-beta Ala-D-Trp-Leu-AspOCH2-CH2 O Boc-L-Trp-Leu-Asp-0CH2-CH2 F Boc-bêta Ala-L-Trp-Leu-Asp-OCH2CH2F F Boc-L-Trp-Leu-Asp-OCH2-CH2 ou les peptides déproteggs correspondants. 3. Procédé pour l'obtention des peptides selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il consiste,à partir de l'acide aspartiqueç ou en phase liquide. 4. Composition pharmaceutique inhibitrice de la sécrétion gastrique, caractérisée en ce qu'elle contient à titre d'ingrédient actif un peptide selon l'une des revendications 1 ou 2, en association avec un véhi- cule pharmaceutiquement acceptable.