FR 2580503 A1 19861024 FR 8506124 A 19850423 PERFECTIONNEMENTS APPORTES A LA PREPARATION DES INHIBITEURS DE L'ADHESION CELLULAIRE, ANTI-ADHESINES AINSI OBTENUES ET MEDICAMENTS ET ALIMENTS LES CONTENANT. La présente invention est relative à des perfection- nements apportés à la préparation des inhibiteurs de l'adhé- sion cellulaire, aux anti-adhésines ainsi obtenues et aux édicaments et aliments les contenant. I1 est actuellement universellement reconnu qu'une très grande proportion de microorganismes et notamment de microorganismes pathogènes, a la propriété de se fixer sur la surface du milieu environnant (corps solide quelconque, cellules humaines, animales, végétales). Les microorganismes infectieux adhèrent aux cellules cibles grâce à des structures moléculaires organisées en capsides, membranes externes et/ou pili, fimbriae, flagelles ou autres, appelées d'une façon générale adhésines. Dans de nombreux cas, le mécanisme d'infection néces- site d'une manière absolue une adhésion préalable du micro- organisme sur le milieu environnant ou directement sur un des récepteurs membranaires parfois spécifiques, préalable indispensable à toute colonisation bactérienne. La nature de ces structures microbiennes ou adhésines et celle des récep- teurs responsables des phénomènes d'adhésion, n'est pas encore complètement élucidée, mais de nombreux travaux publiés par différents auteurs, cernent de mieux en mieux ce phé- nomène (Cf. notamment, les travaux de G. Chabanon dans "Revue de l'Inst. Pasteur de Lyon", 1984, t. 18, p. 85-105, de G.W. Jones dans "Microbia 1 Interactions" Série B, Vol. 3, p. 141- 176 (1977); de A. Gunnarsson et collab. dans "Infection and Immunity", Juillet 1984, p. 41-46, etc...). Il en résulte que les adhésines agissent grâce à des interactions parfois spé- cifiques qui s'établissent entre certains de leurs sites ou de leurs motifs structuraux et de groupements chimiques présents dans l'environnement proche de la membrane externe de la cellule ou structure cible et/ou à sa surface elle- même. Parmi les différents moyens actuellement employés destinés à lutter contre les agents infectieux, les deux suivants sont particulièrement utilisés: - la vaccination (action préventive), - l'antibiothérapie (action curative). Toutefois, depuis un certain temps (Cf. Sharon et coll. dans "Adhésion and Microorganism Pathogenicity" Ciba Foundation Symposium 80, p. 119-135; OLD D.C. dans J. gen. Microbiol. 1972,71, p. 149-157; et JONES G.W. dans la publication précitée) on a préconisé une méthode de lutte anti-infectieuse consistant à inhiber la propriété de l'adhé- sion du microorganisme. Cette inhibition par compétition met en oeuvre des sucres simples de structure bien définie comme les monosaccharides. Les résultats obtenus, tout en étant encourageants, n'ont toutefois pas permis de résoudre le pro- blème de manière satisfaisante. La Demanderesse, en étudiant à fond le phénomène d'adhérence bactérienne, notamment chez les animaux, s'est fixée pour but de perfectionner la méthode d'inhibition par compétition et de développer des agents thérapeutiques nou- veauxdesanti-adhésines, capables d'empêcher l'adhérence des bactéries pathogènes; elle s'est fixée pour but de pourvoir à un procédé de préparation des anti-adhésines dont l'action sera à la fois curative et préventive: - curative, lorsque l'agent infectieux sera déjà présent à proximité ou au contact de la structure ou de la cellule cible, en provoquant son détachement, - préventive, lorsque le risque d'une infection sera élevé et que l'administration de l'anti-adhésine empêchera l'agent pathogène d'atteindre la cible. La Demanderesse a constaté que les interactions chimiques impliquées dans le phénomène de l'adhésion cellu- laire appartiennent à de nombreux modèles. Certains sont spé- cifiques et sont basés sur un phénomène de reconnaissance moléculaire entre une macromolécule, en général protéique (lectine ou autre), et un récepteur nembranaire; d'autres sont non spécifiques et mettent en jeu des phénomènes de charge de type hydrophobe, électrostatique ou ionique ou de liaisons hydrogène. En général, ces derniers ne sont pas suffisants pour assurer une adhésion durable, mais ils parti- cipent souvent à la stabilisation des interactions spéci- fiques. Dans ce dernier cas, les motifs moléculaires mis en jeu au niveau des récepteurs, sont en général de nature gluci- dique, et appartiennent à la classe des oligosaccharidess La présente invention a précisément pour but de pourvoir à un procédé de préparation de substances qui peuvent être considérées du point de vue chimique, comme desstruc- tures mimétiques des récepteurs engages dans le phénomène de reconnaissance. La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'inhibiteurs de l'adhésion cellulaire ou antiadhbésines, lequel procédé est caractérisé en ce que l'cn lyse enzymatiquement et chimiquoenet les glyco- protéines et/ou les glycopeptides, les structures lipidiques et/ou les glycolipides contenus ou provenant de différents substrats organiques li- quides ou solides, en ce que l'on recueille les oligosaccharides obtenus greffés ou non et en ce que l'on procède à leur stérilisation. Les oligosaccharides ainsi obtenus qui peuvent être, si on le désire, greffés sur différents supports, s'op- posent à l'adhérence de nombreux microorganismes et consti- tuent un médicament de choix pour combattre ou prévenir l'infection. Suivant un mode de réalisation avantageux du procé- dé objet de la présente invention, les glycoprotéines et/ou les glycolipides sont traités sans les avoir extraits du substrat organique. Suivant un autre mode de réalisation avantageux du procédé, objet de la présente invention, on procède à l'hydro- lyse des glycoprotéines et/ou glycopeptides et/ou glycolipides après leur extraction du milieu biologique les contenant. Suivant une modalité de ce mode de réalisation, les glycoprotéines sont extraites par: a) traitement en milieu organique par de l'éthanol en présence du caprylate de Na suivi de, b) traitement thermique (60 à 70 C) et séparation des glycoprotéines précipitées, et enfin c) protéolyse suivie éventuellement par une hydrazinolyse. Suivant une autre modalité de ce mode de réalisation, les glycolipides sont extraits par action d'un mélange de solvants puis soumis à l'hydrolyse. les solvants utilisés pour l'extraction des glycolipides peuvent être constitués par un mélange binaire chorofozmae-méthanol ou le mâlange ternaire chloroforme-éthanol-acétone. Confoniument à l'invention, l'hydrolyse est effectuée: 1. dans le cas des glycoprotéines, à l'aide d'une protéase et de manière préférentielle à l'aide de la thermolysine en présence d'ions calcium à un pH compris entre 5 et 7 et à une te iature inférieure ou égale à 80'C suivie d'une'hydrazinolyse ou traitement chimique analogue penmettant de libérer les oligosaccharides constitutifs. 2. dans le cas de glycolipides par une hydrolyse alca- line douce, suivie d'une acétolyse ou traitement analogue afi] d'isoler les structures oligosaccharidiques. Selon un mode de réalisation avantageux du procédé obj4 de la présente invention, on procèdei à la purification.des espèces oligosaccharidiques et notamment on procède après l'hydrolyse en- zymatique à l'inactivation de l'activité enzymatique ou à une neutralisa- tion dans le cas d'une lyse chimique, puis après la clarification du filtrat on stérilise sur membrane filtrante. Suivant un mode de réalisation particulièrement avantageux on pro cède avant la stérilisation à la concentration de la solution d'oligo- saccharides. Cette concentration peut être effectuée par des nyens classiques, tels que l'ultrafiltration, la précipitation, la chromato- graphie d'exclusion moléculaire, par les résines échangeuses d'ions ou la s chromatographie d'affinité. La présente invention a également pour objet des antiadhésines obtenues à l'aide du procédé conforme à l'invention, lesquelles anti- adhésines sont caractérisées en ce qu'elles sont du type oligosaccha- ridique et comprennent au minimum 3 oses simples ou substitués, l'un des oses étant obligatoirement le galactose ou le glucose. Ces oligosaccharides constituent des excellents inhibiteurs d'adhérence et peuvent être administrés sous formes galéniques diverses et peuvent être également mélangés à des aliments. Ces oligosaccharides peuvent être de configurations très variées. Ils pré- sentent dans leurs structures des noyaux, ou core ou squelette et des séquences périphériques, terminales et/ou antennaires. Ils possèdent au moins gal et glc simples ou substitués. Les figures 1 à 3 représentent quelqu'unes de ces structures à titre d'exemple non limitatif. Ainsi: - la figure 1 représente une structure de glycannes de type oligomanno._. sidique d'origine animale, - la figure 2 représente une structure de glycannes de type oligomanno._sidique d'origine végétale, et - les figures 3 et 4 représentent le type de structure de n glycannes contenant des unités N-acetyl lactosaminiques répétées ou non substituées ou non. Les figures 5 à 7 représentent quelques exemples de séquences internes des noyaux greffés à des supports: - glycopeptide d'origine animale sur des supports protéiques ou pepti- diques (figure 5), - glycopeptide d'origine végétale sur des supports protéiques ou pepti- diques (figure 6) - oligosaccharide greffé sûr des supports lipidiques (fig. 7). Les abréviations qui y figurent sont les suivantes: Man = mannose X = résidu glucidique glc = glucose Ser = sérine gal = galactose Asn = asparagine glc Nac = N acétyl-glucosamine Thr = Threonine gal Nac = N acétyl-galactosamine A.g. = acide gras Fuc = Fucose xyl = xylose NANA = acide N acétyl-neuraminique Pratiquement tous les substrats organiques con- viennent pour préparer les antiadhésines conformes à la pré- sente invention. La Demanderesse a ainsi utilisé: - parmi les liquides biologiques: le plasma sanguin, le plasma sanguin foetal, les erythrocytes, l'urine, la lymphe, le liquide céphalorachidien, le liquide amniotique, le liquide synovial; - parmi les secrétions de différentes espèces humaine et animale: le lait, le colostrum, la. mcine gastrique, la salive, le mucus; - les secrétions végétales; - parmi les sources procaryotes et eucaryotes, extraits cel- lulaires totaux de cellules normales ou transformées par infection: lesvirus, les phages, les bactéries, les cham- pignons, les levures, les algues, les mousses, les lichens, les fougères, les cellules animales supérieures, les cellules végétales supérieures; parmi les différents extraits: les extraits cellulaires embryonnaires, glandulaires, tissulaires, la cervelle et les tissus nerveux, les yeux, le thymus, la thyroïde, le pan- créas, les poumons, les reins, le foie, la rate, les intes- tins, les os, les muscles, le placenta. L'invention sera mieux comprise à l'aide de compléments de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation de produits conformes à la présente invention ainsi qu'à des compte-rendus pharmacologiques et cliniques relatifs à l'activité de médicaments conformes à la présente invention. Les exemples de préparation qui suivent, ainsi que les tests de mise en évidence de l'activité inhibitrice des antiadhésines sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière, une limitation. EXEMPLES DE PREPARATION A. OLIGOSACCHARIDES DE PLASMA SANGUIN DE DIFFERENTES ESPECES Exemple 1 Le sang recueilli sous anticoagulant est centri- fuge et séparé en deux phases: le plasma et le cruor (sus- pension d'érythrocytes). Le plasma est hydrolyse par une protéase bactérienne thermostable telle que la thermolysine qui se trouve sous forme d'un lyophilisat contenant % de sels de tampon acétate de Na et de Ca (Cf Brevet français 83 21033). Apres inactivaticn de l'activité enzymatique par traitement thermique (à 75 C au moins) ou par précipitation chimique, l'hydrolysat est clarifié, délipidé sur filtre presse par des adjuvants de filtration et stérilisé sur membrane écran de 0,22 i. Les oligosaocharides scnt ou peuvent être obtenus par des traitements chimiques particuliers, hydrazi- nolyse et/ou par des endoglycosidases spécifiques. Le rendement en oligo- saccharides est d'environ 5% par rapport à la matière protéique de départ. Exemple 2 Le plasma est traité par l'éthanol (8 %) et le caprylate de sodium (4.10 3M). Après un traitement thermique pendant 15 min à 68 C, les glycoprotéines précipitées sont séparées de l'albumine par filtration sur filtre presse en présence d'adjuvants. Le "gateau" de glycoprotéines lavé constitue le substrat de! protéolyse. Le rendement en oligosaccharides est d'environ 10 %. Exemple 3 Les oligosaccharides obtenus par hydrolyse selon les exemples 1 et 2, sont concentrés par des méthodes physico-chimiques: ultrafiltration, précipitations sélec- tives, chromatographies d'exclusion moléculaire, d'échanges d'ions, d'affinité. Cette dernière technique est utilisée pour séparer les-espèces individuelles spécifiques. B. OLIGOSACCHARIDES DE MEMBRANES D'ERYTHROCYTES DE DIFFERENTES ESPECES. Exemple 4 Les globules rouges obtenus par centrifugation d'un sang récolté sous anticoagulant sont lavés et les membra- nes cellulaires sont préparées suivant un procédé modifié de celui présenté par A. FAURE, J. DEBRIEUX et M. CARON (Red. Cell. Ghosts: a tool for purification of lectins in lectins, 1983, vol. 3, pp. 661-665, ed. Walter de Gruyter, Berlin). Le rendement en membranes lyophylisées est environ de 4 g par litre de sang. Exemple 5 Les membranes d'érythrocyte obtenues selon l'exem- ple 4 sont soumises à un traitement protéolytique similaire à celui décrit dans l'exemple 1, ce qui permet d'obtenir les oligosaccharides portés par des structures de nature protéique. Exemple 6 Les membranes d'érythrocyte obtenues selon l'exem- pla 4 sont soumises à un procédé d'extraction des fractions glycolipidiques. Les fractions lipidiques sont obtenues par action d'un mélange de chloroforme et de méthanol en propor- tion 2:1 et une deuxième extraction par le même mélange en proportion 1:9 ou par un mélange ternaire chloroforme - éthanol- acetone dans les proportions 2:1:30. Les extraits obtenus sont soumis à une hydrolyse alcaline douce suivie d'une nouvelle partition et fractionnement par chromatographie sur gel de silice. L'élution est faite par des mélanges méthanol (x vol) chloroforme (y vol) tel que x/y augmente de 1:9 à 20:1. Apres une hydrolyse chimique ou un traitement d'acétolyse, des méthodes chromatographiques suivant un pro- cédé modifié présenté par A. GUNNARSON et al. dans "Infection and Immunity" Juillet 1984, p. 41-46 permettent d4isoler les structures oligosaccharidiques individuelles. Le rendement est d'environ 1 %. Toutes les fractions obtenues possèdent au moins Gal et Glc simples ou substitués. C. OLIGOSACCHARIDES ISSUS DE LIQUIDES BIOLOGIQUES AUTRES QUE LE SANG Exemple 7 Apres concentration, les matières premières subissent un traitement protéolytique selon l'exemple 1 ou un procédé d'extraction des glycolipides selon l'exemple 6. Le rendement est de l'ordre de 0,5 - 1 %. D. OLIGOSACCHARIDES OBTENUS A PARTIR DE SECRETIONS MAMMAIRES DE DIFFERENTES ESPECES ANIMALES ET/OU HUMAINE. Exemple 8 Le colostrum ou le lait subit un traitement pro- téolytique et une purification selon l'exemple 1 et/ou un traitement extractif des structures lipidiques selon l'exem- ple 6. E. OLIGOSACCHARIDES OBTENUS A PARTIR DE MUCUS D'ESPECES ANIMALES, EXEMPLE DU MUCUS INTESTINAL Exemple 9 Le mucus du duodénum, jejunum et iléon est recueil- li par grattage. Le matériel biologique mis en suspension est débarrassé des contaminants et débris cellulaires par centri- fugation à 20 000 g. Après dialyse, la solution de glycopro- téines mucosales, filtrée stérilement, constitue le substrat de protéolyse selon l'exemple 1. F. OLIGOSACCHARIDES ISSUS DE GLYCOPEPTIDES ET DE GLYCOLIPIDES INTESTINAUX Exemple 10 Les villosités et les cellules épithéliales sont récupérées par grattage du duodénum, jéjunum et iléon de l'animal sacrifié et sont lavées par centrifugation. Apres homogénéisation au Potter ou hydrolyse partielle à la trypsine (15 minutes à 37 C), les lipides sont extraits par un mélange chloroforme - méthanol - eau (4:8:3 v/v). Deux fractions sont ainsi obtenues, les lipides et glycolipides et les cellules délipidées. Les extraits glycolipidiques sont traités selon le procédé de l'exemple 6. Les cellules épithéliales délipidées sont hydrolysées selon la méthode décrite dans l'exemple 1. G. OLIGOSACCHARIDES ISSUS DE SECRETIONS VEGETALES Exemple 11 Les sécrétions mises en suspension dans une solu- tion tamponnée aqueuse ou organique selon le cas subissent un traitement protéolytique et une purification selon les exemples 1 et 3 et/ou un traitement selon l'exemple 6. H. OLIGOSACCHARIDES ISSUS DE VIRUS Exemple 12 Les virus obtenus à partir de fluides ou de cel- lules infectés sont purifies par ultracentrifugation en gradient de densité. Les glycoprotéines porteuses des structures oli- gosaccharidiques sont extraites après traitement par des détergents membranaires par le butanol selon une méthode dérivée de L.A. HUNT (Glycosidase analysis of Large acidic - type glycopeptides from viral and cellular membrane glyco- proteins, Biochem. J., 1983, 209, 659-667). Les oligosaccharides sont obtenus par digestion enzymatique et purifiés selon les exemples 1 et 3. I. OLIGOSACCHARIDES ISSUS DE PHAGES Exemple 13 Les phages sont isolés à partir de différents lisiers, d'épandages de fermes... selon la méthode de SMITH et Huggins, 1982 (Successful treatment of experimental E. coli infections in Mice using phage: its general superiorly over antibiotics, J. of General Bacteriology, 128, 307-318. Les oligosaccharides sont obtenus par protéolyse selon l'exemple 1. J. OLIGOSACCHARIDES OBTENUS A PARTIR DE BACTERIES Exemple 14 Les bactéries sont cultivées généralement à 37 C pendant 24 heures sur un milieu approprié à leur développe- ment (exemples E. coli K88 sur bouillon trypticase-soja, E. coli K99 sur milieu Minca, les lactobacilles sur milieu de Rogosa...). Les extraits bactériens sont obtenus par désin- tégration aux ultrasons, concentrés et soumis à l'hydrolyse selon les exemples 1 -et 3 ou à l'extraction des structures lipidiques selon l'exemple 6. K. OLIGOSACCHARIDES DE CHAMPIGNONS, LEVURES Exemple 15 Les organismes sont isolés, à partir d'extraits industriels ou des milieux de culture utilisés pour leur mul- tiplication par centrifugation. Les extraits sont soumis à la protéolyse selon les exemples 1, 2, 3 ou 6. - L. OLIGOSACCHARIDES ISSUS DES ALGUES, MOUSSES, LICHENS, FOUGERES. Exemple 16 Les végétaux sont broyés, les glycoprotéines solu- bilisées dans une solution tamponnée et soumises à l'hydro- lyse selon l'exemple 1, les oligosaccharides purifiés selon l'exemple 3 ou 6. M. OLIGOSACCHARIDES EXTRAITS DES VEGETAUX SUPERIEURS Exemple 17 Les végétaux accessibles à l'état de broyat total sec ou humide et susceptibles d'être fractionnés en deux composantes protéique et lipidique, sont soumis aux procédés décrits dans les exemples 1, 3 ou 6, après mise en solution ou mise en suspension si nécessaire. N. OLIGOSACCHARIDES ISOLES DE TISSUS OU ORGANES Exemple 18 Les glycolipides et les glycopeptides sont obtenus par broyage des organes totaux tels que les cerveaux, reins, foies, poumons... Les glycolipides sont extraits selon l'Exemple 6. Les glycopeptides sont obtenus par une hydrolyse selon les Exemples 1, 2. Ils peuvent être séparés des glycosaminoglyca- nes par précipitation de ces derniers par le chlorure de cétyl- pyridinium et sont alors traités selon l'Exemple 3. O. OLIGOSACCHARIDES ISOLES D'OEUFS Exemple 19 Les glycoprotéines de l'oeuf (telles que l'ovo- mucolde, l'avidine, l'ovalbumine), récupérées après préci- * pitation sélective du lysozyme et séparations chromatogra- phiques, sont soumises à une protéolyse selon l'exemple 1, les oligosaccharides sont concentres et purifiés selon l'exemple 3. MISE EN EVIDENCE DE L'ACTIVITE INHIBITRICE DE L'ADHERENCE BACTERIENNE Pour mettre en évidence l'activité des anti- adhésines conforme à la présente invention, on a réalisé: - des expérimentations in vitro sur des cibles auxquelles s'attachent les microorganismes étudiés, - des expérimentations in vivo sur des animaux infectés volontairement par des microorganismes pathogènes, - des essais cliniques. Dans le cas des expérimentations in vitro, on a procédé de la façon suivante: 1. Méthodologie du test d'activité du produit inhibant l'adhésion des microorganismes sur les cellules cibles. Le test d'adhérence est réalisé par la mise en contact, grâce à une incubation, des microorganismes et des cibles libres ou immobilisées. Les paramètres de concentra- tions respectives, de pH, de force ionique, de nature d'ions, de température et de durée de l'essai étant définis, le test d'inhibition de l'adhérence est réalisé soit par préincuba- tion des antiadhésines, conforme à la présente invention, avec les microorganismes, soit par introduction des adhésines dans le milieu contenant l'agent microbien et la structure cible libre ou immobilisée sur un support. L'observation et/ou la quantification de l'adhé- sion et de l'anti-adhésion sont faites: - de visu, si cela est possible, selon le système considéré, - en microscopie optique, soit en lecture directe après (ou sans) coloration, soit en contraste de phase, par spectrophotométrie, - par mesure de la radioactivité ou de la fluo- rescence des microorganismes attachés aux cibles. Cette dernière méthode assure une meilleure quantification du phénomène. 2. Description d'un test général d'adhésion et d'antiadhésion basé sur la mesure de la radioactivité des microorqanismes attachés aux cellules cibles. Princie- Le microorganisme examiné est mis en culture et marqué radioactivement grâce à l'incorporation de précurseurs dans son matériel constitutif. La concentration finale du microorganisme est ajustée selon les conditions du test. Les structures cibles cellules et/ou leur mucus sont préparées selon les diffé- rentes techniques d'obtention de cellules décrites dans la littérature scientifique. Le critère de qualité recherché est l'aptitude de l'adhésion des microorganismes étudiés. Test Les cellules et/ou leur mucus sont immobilisées sur un support approprié permettant la mise à leur contact des microorganismes radioactifs en présence ou en l'absence des antiadhésines. Apres des lavages successifs le matériel biologique (cibles plus bactéries radioactives adhérentes) est décroché du support par un traitement approprié et la radioactivité du milieu est comptée par scintillation liquide. Dans chaque expérimentation, les témoins expri- ment le 100 % d'adhésion. Les essais permettent de quantifier l'activité biologique des antiadhésines rapportée à l'unité de masse de celles-ci. 3. Application de ce test général au cas de l'adhésion de E. coli K99 à des cellules cibles et/ou à leur mucus. - E. coli K99 est cultivé sur un milieu approprié contenant du glucose et des vitamines comme par exemple le milieu de Minca (Guinée P.A.M. Jansen W.H. Agterberg C.M., 1976), auquel est ajouté une espèce chimique radioactive (acide aminé, nucléoside purique ou pyrimidique, acétate de sodium, etc...) précurseur susceptible d'être incorporé dans le matériel constitutif du microorganisme. Après 18 h de culture, à 37 C afin que la synthé- se du pili K99 ait lieu, ou à 18 C dans le cas contraire, les bactéries sont récupérées, lavées et mises en suspension dans une solution tamponnée pH 7,2 habituellement utilisée (HEPES-Hanks, tampon phosphate salin,...). La numération bactérienne est faite par la mesu- re de la densité optique (DO) entre 420 et 662 nm (la DO étant fonction linéaire du nombre de colonies, DO = f(C)), et la concentration est ajustée à 108-109 bactéries/ml. Des contrôles sont effectués sur la présence de pili K99 par séroagglutination avec des anticorps anti K99 et la viabilité des cellules bactériennes par dilution d'une prise aliquote et culture sur un milieu approprié. - Préparation des cellules cibles et/ou des mucus et techniques d'immobilisation (d'après C.D. LAUX et al, 1984). Le mucus est préparé à partir de l'intestin grêle de l'animal sacrifié (souris, lapereau, porcelet, agneau, veau...) par grattage et récupéré dans une solution tamponnée à pH 7,2. Une centrifugation à 28 000 g pendant minutes permet l'élimination totale des débris et matériels cellulaires. La concentration en protéines de chaque prépa- ration est contrôlée et ajustée au minimum à 3,5 mg/ml. Les cellules sont préparées à partir de l'intes- tin grêle de l'animal (souris âgées de 5 à 8 semaines, lape- reau d'une semaine, porcelet, agneau, veau âgé de moins de 5 jours) par grattage et récupération dans une solution tampon- née utilisée pour la conservation des cellules. Une centrifugation à 1 000 g élimine les débris tissulaires, une filtration et une centrifugation à 2 000 g éliminent les contaminants. Les cellules des villosités intestinales sont isolées par trypsinisation (tryp- sine 0,1 %) ou dilacération (Potter n 18) et la concentration ajustée entre 106-108 cellules/ml. Les préparations de cellules ou de mucus (0,25 ml) sont introduites dans les puits de plaques pour culture de tissus, incubées une nuit à 4 C, lavées deux fois par une solution tamponnée pH 7,2 pour enlever les protéines ou les cellules non fixées. Les cellules d'espèces animales (lignées cellulaires établies ou cultures primaires) sont cultivées dans un milieu de culture cellulaire en présence de 10 % de sérum de veau foetal, de pénicilline et de streptomycine. Elles sont incubées pendant 24 à 48 h à 37 C, en atmosphère contrôlée, afin d'obtenir une couche monocellulaire con- fluente dans les puits de plaque de culture. Avant utilisation les cellules sont lavées pour enlever toute trace de milieu de culture. - Adhésion et inhibition de l'adhésion. Les bactéries (0,25 ml, soit 50 000 dpm minimum incorporés) et 50 pl de tampon sont introduits dans les puits et incubés à 37 C avec les cellules et/ou le mucus immobilisés. Apres lavages, les bactéries adhérentes sont décrochées par l'action de 0, 5 ml de SDS 0,5 % ou de tout autre agent détersif ou chélateur, pendant 2 heures à 37 C. Les échantillons prélevés (0,25 ml) sont ensuite analysés par comptage de la radioactivité en scintillation liquide. Dans le test d'inhibition de l'adhérence, le médicament conforme à l'invention est introduit au milieu ci-dessus décrit dans pl du tampon accompagnant les bactéries. 31 - Expression des résultats Les résultats sont exprimés en quantité de radioactivité récupérée dans les puits, dans les conditions définies cidessus, et comparativement aux témoins avec lesquels est établi le 100,% d'adhérence. Une courbe type des résultats habituellement obtenus est représentée sur les figures 8a et 8b à titre d'exemple et sans que cela soit limitatif. L'hinibition est une fonction linéaire du logarithme de la concentration en médicament. 4. Test d'inhibition de l'héaglutination résis- tante au mannose. Autre modèle d'étude de l'adhésion des microorga- nismes sur une cellule cible. a) Princie - Les bactéries (107-109 bactéries/ml) en concen- tration égale à 10 unités d'hémagglutination,(une unité cor- respondant à la plus grande dilution de la suspension bacté- rienne capable d'agglutiner les globules rouges de l'espèce choisie en présence de mannos, sont mises en suspension dans pl de solution isotonique tamponnée (pH 6,8 - 7,2) et incubées en présence de 50 p1 ou en l'absence de médicaments conforme à la présente invention pendant 10 minutes à 4 C ou à température ambiante. Les érythrocytes à 3 % (v/v) sont ensuite ajoutés dans 25 pl au milieu d'incubation. La lecture (oeil, microscope ou turbidimètre ou spectrophotomètre) est faite après 30 minutes de contact. b)_Aplications aux colibacilles Les systèmes utilisés sont décrits dans le Tableau I. TABLEAU I E. coli pathogène pili origine des globules pour principal rouges Veau, agneau, porcelet K99 homme, mouton,cheval ______________________________________________________________ porcelet K88 cobaye ______________________________________________________________ Homme CFA I/II bovin, poulet c) Aêplication à E. coli K99 La capacité inhibitrice du médicament à savoir l'inverse de la concentration minimale capable d'inhiber l'agglutination des globules rouges de mouton par les E. coli K99, est proportionnelle à la quantité des substances confor- mes& la présente invention (cf. fig. 9). 5. Test d'adhérence et d'activité des antiadhésines réalisées sur des cellules ou des villosités par observation microscopique. Application à l'adhérence d'E. coli K99 sur les entérocytes de veau. Les villosités ou les cellules obtenues selon la technique décrite cidessus sont utilisées soit immédiatement, soit après congélation à -20 C dans un milieu de HANKS ou tout milieu adapté à la conservation des cellules. Dans le cas d'utilisation de préparations congelées, les additifs sont éliminés par lavages successifs. Les bactéries (107-1011 /ml) sont mises en contact avec la préparation cellulaire (107 cellules/ml) pendant minutes à 20 C ou 37 C selon les systèmes dans un inter- valle de pH allant de 5,5 à 8,5, en présence ou en l'ab- sence du (ou des) médicament(s) conforme (s) à l'invention. L'adhérence est positive lorsque plus de15 bactéries sont fixées à la surface de la cellule. L'inhibition s'exprime par la formule: nombre de cellules sans bactéries x 100 nombre de cellules avec bactéries + cellules sans bactéries Avec 2 x 105 cellules (200 pl) mises en contact avec 2 x 107 bactéries (200 Pl) pendant 40 minutes à 37 C en présence de 0,25 mg de produits conforme à la présente invention. L'inhibition observée est de 60-65 % comparativement au témoin. Dans le cas des expérimentations in vivo, on procè- de de la façon suivante: 1) Inoculation exprimentale de souriceaux par E. coli K99 Des lots de souriceaux de même race (SWISS, OFI, CD...) agés de moins de 48 heures sont infectés oralement par 5.104, 105 E. coli K99. L'évoluticn de la population est suivie perndaent 3 jours (J) après une seule administration orale du médicament conforme à la présente invention, dans les 30 minutes qui suivent l'infection ou en l'absence de traitement. Dans le cas d'une infection DL 100 dans les 3 jours qui suivent l'inoculation(5.104- 105 E. coli K99/individu) la protection de la population est montrée dans le Tableau II suivant: ' TABLEAU II Evolution des populations exprimée en % de survivants Inoculum Experiees 5.104 o Mdicament Tmoins Traités Tmins Traités g/kkq 0,6 0 0,6 7,2 12 J1 100 100 40 68 83 100 _______________________________________________ J2 20 40 0 12 66 67 _______________________________________________ J 3 0 20 0 0 39 39 -------------------------- lonkage 12 14 24 14 18 18 2) Inoculation e-x-rimentale de veaux nouveaunés par E.coli K99 La diarrhée est reproduite selon la technique dériv de celle décrite par SMITH H.W. et HALL,S.S. (1967). Le veau, Agé de moins de 8 heures, dépourvu de colostrum, est infecté oralement par une dose mortelle de 1010 E. coli K99. Le lot témoin, non traité, meurt en moins de 48 heures après déshydratation. Les veaux essais sont traités par adminis- tration orale des antiadhésines conforme à la présente inven- tion. Plusieurs modes de traitement se sont révélés efficaces, après administration dans les deux heures qui sui- vent l'inoculation ou dès le déclenchement de la diarrhée. Tous les animaux traités ont guéri. L'amélioration clinique a été rapide et la guérison observée en moins de 48 heures. L'efficacité du produit se traduit par un retour à la normale des paramètres biochimiques tels l'ionogramme sérique ou d'excrétion, le pH des fécès, un arrêt de la fuite hydrique. Des veaux traités et gardés en observation pendant 90 jours, n'ont plus présenté de troubles de gastroentérites et ont poursuivi une croissance normale. L'activité d'antiadhésine est prouvée par l'étude de la flore adhérente à la paroi intestinale. Des numérations bactériennes au niveau du duodénum, du jéjunum et de l'iléon ont été effectuées après grattage de la paroi intestinale d'animaux témoins et d'animaux traités. Pour ce faire, et afin de distinguer la flore pathogène d'une flore intestinale colibacillaire adhérente éventuellement présente, l'inoculum possède un caractère d'antibio-résistance. Ainsi la résistance à l'acide nalidixique XNakr) constitue le marqueur de la souche E. coli K99. ". Chez les veaux traités, la flore pathogène E.coli K99 Nakr adhérente diminue d'au-moins deux logarithmes par rapport à la flore des veaux témoins non traités. Les résul- tats obtenus sont présentés dans le Tableau III. Z580503 2.0 TABLEAU III Flore pathogène NaZr adhérente sur la paroi intestinale, en lo, Duodénum Jéjunum Iléon Moyen- Ecart Va- Moyen- Eart Va- Moyen- Ecart Va- ne type riance ne type riance ne type riaix Essais 4,36 1,10 1,21 5,20 1, 58 2,50 5,61 1,08 0,97 (7) Témoins (4) 5,95 0,64 0,41 8,07 0,92 0,84 8,15 1,17 0,9! t = 2,61 t= 3,28 t= 3,87 différence signifi- différence hauteent hauteent cative significative significative t: 0,05 = 2,26 t: 0,01 = 3,25 3) Essais cliniques Dans la présente invention, des essais de ter- rain ont permis d'établir un diagnostic étiologique de la diarrhée infectieuse d'origine colibacillaire, virale ou parasitaire par un contrôle systématique effectué à partir dei selles prélevées avant la thérapeutique. L'efficacité du médicament est mise en regard du diagnostic. Les veaux diarrhéiques âgés de moins de 5 jours sujets aux attaques colibacillaires K99 positive et les veaux plus âgés sont guéris par les antiadhésines à un fort pour- centage comme l'indiquent les résultats des Tableaux IV et V, résultats obtenus sur deux campagnes et sur 219 veaux. Lefficacité est d'autant plus grande que l'admi- nistration des adhésines est précoce et menée dès les premiers symptômes du trouble d'entérogastrite. Il est à noter que l'alimentation maternelle n'a pas été supprimée. Les antiadhésines sont efficaces en curatif dans les conditions normales d'utilisation. Un à deux jours d'administration du médicament (1 à 10 x 60 mg) a été la durée nécessaire pour traiter efficacement les diarrhées d'origine colibacillaire, virale ou parasitaire. TABLEAU IV Veaux agés de moins de 5 jours. E. coti K99" E.coti K99 Analyes Anatyses Rota- - seu-s ou en o seuts ou en néga- Incom- TOTAL association association tives pLètes tésuttats des_ 1 natyses de s 5 ci E fêécs fi >t>;>oa l; tt i 5 8 -1 13: 00 4 4* m. -0. . O VeX o ec Mam Veaux traités 15 8 8 2 18 il il 3 99 Veaux guéris 13 6 4 18 18 a 11 - Nombre de doses adminis-32 2 7 10 2 10 10 594 très/aniMsal Nombre d'ani23 18 26 il 78 eaux guéris X d'animaux guéris avec 6 doses en moyenne 78 4) Innocuité du médicament En laboratoire, aucune mortalité n'a été enre- gistrée lors de l'ingestion du médicament conforme à la présente invention tant sur des souriceaux que sur des veaux recevant quotidiennement 120 mg et ce pendant 90 jours. La croissance des animaux n'est pas altérée. Aucun.effet secondaire n'a été observé pendant l'expérimentation. Ce médicament d'origine biologique, de la classe des antiadhérents, présente une innocuité totale, tant par os que par voie intrapéritonéale. xneuTue suTv4a[D zaqD ag6uoload uoTeqasTuTuiPe aun anbTldxa Tnb ao asnjoad agiazeTp aunp uoTqu4usuoD sQade o uanos 'naAaig,l ap apueWuap.ns so9.4sTuTMpe sp9 quo sauTsgqpeTgue sa-: 7uaeura:Tua np aTBoosoS Ln ' anaAalg,I no aiTeuuTa9gael aed saITIn sgbn squauITduoo- no stuOauiTeasaatne sno; Co Ln asap uOT4dGDxG, V uOTluAUTI suvP s:T2op sauTsgqpevTue saT na5a:ueve xneuTue saGT sTanB c auaWoo sgO lsTba8u:uos sTlnaS sanbTgq ueTP xnveA 61Z ans gl:od e uoT:e;:uatwugdxa,q auu*Aow ua sasop 9 oAe skJfnf xnewuu,p X sk.gnl xnew 199 -ue,p êJqWON /Sa;.9J4SUa g& '/ S ú 59 _ a 9 - p - 9 asopp uaXoa a JqwON slJnô 0 ' 9 9Z 0 ú O 9 xnleaA Z a,g. ,. 021,a a -.; */ 7 9 Z; 97 7 I L Z xneaA Xf X:n 7c aiwaêia, w ai O" e 1 la; 1,g. la présente invention. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'inhibiteurs de l'adhésion cellulaire ou antiadhésines, lequel procédé est caractérisé en ce que l'on lyse enzyma- tiquement et chimiquement les glycoprotéines et/ou les glycopeptides, les structures lipidiques et/ou les glycolipides contenus ou provenant de différents substrats organiques liquides ou solides, en ce que l'on recueille les oligosaccharides obtenus greffés ou non et en ce que l'on procède à leur stérilisation. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les glycoprotéines et/ou les glycolipides sont traités sans les avoir extraits du substrat organique. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on procède a la lyse des glycoprotéines et/ou des glycolipides après leur extraction du milieu biologique les contenant. 4. Procédé selon les revendications 1 et 3 caractérisé en ce que les glycoprotéines plasmatiques sont extraites par: a) traitement en milieu organique par de l'éthanol en présence de caprylate de sodium suivi de b) traitement thermique (60 à 70 C) et séparation des glycoprotéi précipitées et c) soumission à l'action de protéolyse et traitement chimique supplémentaire permettant d'obtenir les structures oligosaccharidiques. 5. Procédé selon les revendications 1 et 3 caractérisé en ce que les glycolipides sont extraits par action d'un mélange de solvants organiques puis soumis a une lyse chimique permettant d'obtenir-les oligosaccharides. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la lyse e$t effectuée: 1) dans le cas des glycoproteines, à l'aide d'une protéase et de manière preférentielle à l'aide de la thermolysine en présence d'ions calcium a un pH compris entre 5 et 7 et à une température inférieure ou /gale à 80 C suivie d'une hydrazinolyse ou traitemnt chidmique analogue permettant de libérer les oligosacâharides coCnstititifs. 2) dans le cas des glycolipides par une hydrolyse acaline douce suivie d'une acétolyse cu traiteent analogue permettant de libérer les oligosaccharides constitutifs. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 carac- térisé en ce que l'on procède à la purification des espèces oligosaccha- ridiques par l'une des quelconques méthodes séparatives puis à leur concentration et stérilisation. 8. Antiadhésines obtenues selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisées en ce qu'elles sont du type oligosaccharidique et comprennent au minimum 3 oses simples ou substitués, l'un des oses étant obligatoirement le galactose ou le glucose. 9. Antiadhésines selon la revendication 8, caractérisées en ce qu'elles sont greffées sur un support protéique ou lipidique. 10. Médicament constitué par ou contenant les antiadhésines selon les revendications 8 et/ou 9. 11. Aliment et additif pour aliment contenant les antiadhésines selon la revendication 8 et/ou 9.