FR 2582312 A1 19861128 FR 8607380 A 19860523 La présente invention concerne la production et l'utilisation d'un colorant naturel rouge très intense préparé à partir d'un anthocyane naturel synthétisé par des cellules dans la culture d'une lignée cellulaire de Daucus carota (carotte). Ce colorant naturel rouge très intense est utile comme agent colorant dans des produits alimentaires, cosmétiques et pharmaceutiques, et il est stable sur un large intervalle de pH et dans diverses con- ditions. Les anthocyanes sont un groupe important et très étendu d'agents colorants qui se trouvent dans la nature. Les anthocyanes sont des pigments colorés hydrosolubles que l'on rencontre principalement dans les plantes à fleurs supérieures, les fruits et les légumes. L'antho- cyane utilisé pour produire le colorant naturel de la présente invention provient de la lignée cellulaire Daucua carota. La lignée cellulaire de Daucus carota produit un excès d'un seul anthocyane qui est un métaboli- te secondaire. L'anthocyane provenant de la lignée cel- lulaire de Daucus carota est un pigment hydrosoluble intensément coloré dont la coloration varie des rouges sombres aux pourpres et aux bleus en fonction du pH. Le brevet des E.U.A. N 4 172 902 indique qu'il est connu que la plupart des anthocyanes naturels sont intensément colorés aux pH inférieurs à 3 mais qu'ils sont pratiquement incolores dans un milieu dent le pH est supérieur à 3. Ce brevet décrit également un antho- cyane, le péonidine-3-(dicaféylsophoroside)-5-glucoside provenant du volubilis "Heavenly Blue", qui, selon ce brevet, est utile pour donner des couleurs stables aux aliments et boissons à des pH d'environ 2,0 à environ 8,0. En outre, il est connu d'une façon générale que les cellules de Daucus carota peuvent être développées dans des cultures de cellules en suspension..dans des mi- lieux liquides déterminés ainsi que dans des cultures en cals développées sur des plaques contenant les mêmes milieux liquides déterminés que ceux utilisés pour les cultures en suspension en y ajoutant 1,0 % de gélose. En général, cependant, l'isolement de couleurs naturelles de fleurs, fruits ou légumes nécessite l'emploi de la plante entière plutôt que de cellules développées dans une culture tissulaire. Il résulte de l'emploi d'une plante entière que le développement de la plante est plus lent, moins souple et limité par les contraintes géographiques naturelles telles que le climat, le sol, l'eau, les nuisibles,la croissance saisonnière, le transport, etc. Un agent colorant produit de façon naturelle présente une importance considérable et un intérêt com- mercial en raison du besoin actuel de remplacer les colo- rants artificiels (de type azolque) dérivés de goudron de houille qui sont utilisés comme additifs dans les pro- duits alimentaires. On pense actuellement que les colorants artificiels dérivés de goudron de houille sont des agents cancérigènes. En tant qu'agents colorants produits de fa" çon naturelle, les anthocyanes ont plusieurs avantages du fait qu'ils sont présents depuis des générations dans les chaenes alimentaires humaines et animalea sans effets préjudiciables apparents sur la santé. De plus, les anthocyanes donnent des teintes ouges brillamment colorées et sont hydrosolubles. Cependant, les anthocyanes ne sont pas stables en général sur un intervalle étendu de pH, ce qui est nécessaire pour qu'un colorant naturel soit uti- le comme agent colorant dans des produits alimentaires. Un but de la présente invention est de produire un colorant naturel rouge très intense préparé à partir d'un anthocyane provenant de la lignée cellulaire de Daucus carota (carotte). Un autre but de la présente invention est de pro- duire un colorant naturel qui est stable sur un large intervalle de pH allant d'environ 2,0 à 7,0 et dans diverses conditions. Un autre but de la présente invention est d'utiliser un milieu modifié de culture de tissu cellulaire afin de produire de façon optimale de grandes quantités d'anthocyane à partir de la lignée cellulaire de Daucus carota. Un autre but de la présente invention est de fournir un agent colorant de façon naturelle qui est utile en tant qu'agent colorant pour les produits alimentaires, cosmétiques et pharmaceutiques. Les buts ci-dessus sont atteints par la présen- te invention qui possède les avantages supplémentaires, dus à la culture des cellules de carotte dans une culture de tissu cellulaire, de permettre aux cellules de Dautus carota d'être plus facilement et plus rapidement manipu- lées afin d'aqgmenter le rendement en composé désiré et d'éviter les contraintes géographiques naturelles telles que le climat, le sol, l'eau, les nuisibles, la croissance saisonnière, le transport, etc.. Conformément à la pré- sente invention, la première étape de la production d'un colorant naturel rouge très intense est la culture de la lignée cellulaire de Daucus carota (carotte) qui pro- duit un anthocyane hydrosoluble. La culture de Daucus carota se fait dans une culture de tissu cellulaire qui peut être soit une culture de cals, soit une culture de cellules en suspension. Le milieu préféré utilisé dans la culture de tissu cellulaire est un milieu Gambourg B5 modifié. A la suite de la culture initiale des cellules de carotte, celles-ci sont repiquées périodiquement avec un inocula dans du milieu frais. Les cellules sont récol- tées après sous-culture en éliminant le milieu par fil- tration, puis soit en extrayant immédiatement les cellules, soit en extrayant les cellules après les avoir congelées. On procède ensuite à la purification de l'extrait cellulai- re afin d'isoler l'anthocyane. Le concentré d'anthocyane est de préférence lyophilisé pour donner une poudre. L'extrait cellulaire de Daucus carota est intensément co- loré en rouge à pourpre et bleu aux pH acides allant jusqu'à 7,0. Le colorant produit par la présente inven- tion est stable aux pH se situant de 2,0 à 7,0 dans diverses conditions. La présente invention sera exposée plus en dé- tail dans la description suivante faite en regard des dessins annexés sur lesquels: la figure 1 représente l'intensité relative de couleur de la préparation d'anthocyane de Daucus carota comparativement à l'intensité relative de couleur du colo- rant Natural Red Standard Powder d'Overseal Foods, Ltd. (OV-RSP), à des pH allant de 2,0 à 7,0 au Jour 0, en prenant la densité optique de l'anthocyane de Daucus carota à pH 2,0 comme référence 100 %; la figure 2 représente le pourcentage de rétention de la densité optique au Jour 0 après un mois pour des pH de 2,0 à 5,0, présenté par la préparation d'anthocyane de Daucus carota comparativement à la couleur rouge OV-RSP dans diverses conditions de traitement comprenant la congélation, la-réfrigération, le maitien à la tem- pérature ambiante dans l'obscurité, le maintien à la tem- pérature ambiante à la lumière, le chauffage à 90 C pen- dant cinq minutes suivi par un maintien à la température ambiante à la lumière, et l'autoclavage à 1200C sous 1,4 bar pendant 20 minutes suivi par un maintien à la température ambiante à la lumière; la figure 3 représente le pourcentage de rétention de la densité optique au Jour 0 après trois mois pour des pH de 2,0 à 5,0, que présente la préparation d'anthocyane de Daucus carota dans diverses conditions de traitement comprenant la congélation, la réfrigération, le maintien à la température ambiante dans l'obscurité, le maintien à la température ambiante à la lumière, le chauffage à 900C pendant cinq minutes suivi par un maintien à la tem- pérature ambiante à la lumière, et l'autoclavage à 120eC sous 1,4 bar pendant 20 minutes suivi par un maintien à la température ambiante à la lumière; et la figure 4 représente le pourcentage de réten- tion de la densité optique au Jour O après six mois pour des pH de 2,0 à 5,0, que présente la préparation d'antho- cyane de Daucus carota dans diverses conditions de traite- ment comprenant la congélation, la réfrigération, le main- tien à la température ambiante dans l'obscurité, le main- tien à la température ambiante à la lumière, le chauffage à 90 0C pendant cinq minutes suivi par un maintien à la température ambiante à la lumière, et l'autoclavage à C sous 1,4 bar pendant 20 minutes suivi par un main- tien à la température ambiante à la lumière. Il est connu de faire croître Daucus carota dans des cultures de cellules en suspension dans des milieux liquides déterminés ainsi que dans des cultures de cals développées sur des plaques contenant les mêmes mi- lieux liquides déterminés additionnés de 1 % de gélose. On peut utiliser des milieux standards de-culture de tissus cellulaires pour cultiver la lignée cellulaire de Dautus carota, par exemple le milieu Gambourg B5. Le milieu Gambourg B5 contient les éléments suivants dont les quantités sont données par litre: Elément Quantité (NH4)2S04 134 mg NaH2PO4.H20 150 mg KNO3 2,5 gm MgSo4.3H20 250 mg CaCl2.2H20 150 mg MnS04.H20 10 mg H BO 3 mg 3 3 ZnSO4.7H20 2 mg Na2MoO4.2H20 2,5 x 10- mg CaSO4.5H20 2,5 x 10-2 mg CoCl2.6H20 2,5 x 10-2 mg KI 7,5 x 10- mg mésoinositol 100 mg acide nicotinique 1 mg thiamine 10 mg pyridoxine 1 mg saccharose 20 gm NaFe EDTA 30 mg acide 2,4-dichlorophé- noxyacétique 1 mg Le milieu que l'on préfère utiliser dans la présente invention est un milieu Gambourg B5 modifié qui permet la production optimale de grandes quantités d'anthocyane. La modification du milieu Gambourg B5 consiste à changer les quantités d'hormone et de phosphate, le type de sucre utilisé com-me source de carbone et à ajouter un anti-précipitant. Le milieu Gambourg B5 modifié utilisé dans la culture de tissu cellulaire selon la présente invention contient, par litre, les éléments suivants: Elément Quantité (NH4)2S04 134 mg NaH2P04.H20 75 mg KNO3 2,5 gm MgSO4.3H20 250 mg CaC12.2H20 150 mg MnSO4.H20 10 mg H3B03 3 mg ZnSO4.7H20 2 mg Na2MoO4.2H20 2,5 x 10-1 mg CaS04.5H20 2,5 x 10-2 g CoC12.6H20 2,5 x 10-2 mg KI 7,5 x 10-1 mg mésoinositol 100 mg acide nicotinique 1 mg thiamine 10 mg pyridoxine 1 mg Galactose 20 gm NaFe EDTA 30 mg acide 2,4-dichilorophé- noxyacsétique 0,1 mg acide nitrilotriacétique 15 mg Dans le mode actuellement préféré de production d'un colorant naturel rouge très intense, la première étape consiste à mettre des cellules de carotte dans une culture de tissu cellulaire contenant un milieu Gambourg B5 modifié comme décrit ci-dessus et à laisser les cellules de carotte se développer. Aux fins de la présente description, on traitera de la production du colorant naturel sous l'aspect o les cellules de carotte sont cultivées dans une culture de cellules en suspension. Il est à remarquer qu'on peut également employer une culture de cals. Les cellules de carotte en suspension sont en- suite repiquées tous les quinze jours avec un inoculum à 10 % dans un milieu frais. La fiole contenant la cul- ture cellulaire est maintenue à 25-29 C sur une secoueuse rotative actionnée à 100 tr/min, sous un cycle lumière:obscurité de 16:8 heures, c'est-à-dire que la culture de cellules en suspension est exposée à la lu- mière pendant 16 heures puis mise dans l'obscurité pen- dant 8 heures. Les cellules de culture sont récoltées 12 à 14 jours après le repiquage en éliminant le milieu par filtra- tion, puis soit (1) en extrayant immédiatement les cellules avec du méthanol acide ou de l'éthanol acide (0,1 % de HCl), soit (2) en extrayant les cellules avec du méthanol acide ou de l'éthanol acide (0,1 % de HCl) après avoir congelé les cellules, soit (3) en extrayant les cellules à l'eau chaude après avoir congelé les cellules. Le premier stade de la purification des cellules et de l'isolement de l'anthocyane présent dans les cellules de carotte est la concentration de l'extrait jusqu'à siccité sur un évaporateur rotatif, suivie par la résolu- bilisatior de l'extrait dans de l'eau bidistillée. Ensuite, l'extrait concentré brut est traité par une petite quantité d'une résine échangeuse d'ions, telle que la résine échangeuse d'ions DE- 52 de Whatman, pour éliminer les composés fortement liants. La matière est centrifugée à 210 X g pour former un culot de résine. Le produit surnageant est neutralisé Jusqu'à pH 7,30 et appliqué à une colonne de résine échangeuse d'ions DE-52 ayant été équilibrée avec de l'acétate de sodium 15mM ayant un pH de 7,30. La colonne est éluée, tout d'abord avec de l'acétate de sodium 15àm ayant un pH de 7,30 pour éliminer les impuretés faiblement liées, puis avec de l'acide acétique à 1 % pour libérer l'anthocyane plus fortement lié. Des échantillons des fractions contenant l'anthocyane sont dilués avec de l'acide acétique à 1 % et analysés dans un spectrophotomètre UV-visible, tel que le Spectronic 2000 de Bausch & Lomb, pour confirmer la présence d'anthocyane. Les fractions sont ensuite rassemblées et lyophilisées pour donner une poudre non hygroscopique qui représente 2-3 % du poids sec des cellules et présente une densité optique/milligramme de 20 à 25 lorsqu'elle est dissoute dans de-l'acide acétique à 1 %. Un colorant naturel rouge est obtenu lorsque le concentré est lyophilisé en une poudre. Pour mettre en évidence la forte intensité du colorant naturel rouge produit, on détermine l'intensité de couleur ou densité optique (DO) et la longueur d'onde maximale À (lambda) pour le colorant anthocyanique rouge à des pH de 2,0 à 7,0 et les compare à la densité optique et la longueur dtonde maximale À (lambda) à des pH de 2,0 à 7,0 d'une préparation d'anthocyane disponible dans le commerce, à savoir Natural Red Standard Powder d'Overseal Foods Ltd. (OV-RSP), fabriqué par Overseal Foods Ltd., Angleterre. On prépare des solutions dans du tampon au citrate 0,1M stérile du colorant'anthocyanique rouge pro- venant de Daucus carota selon la présente invention et de OV-RSP. On divise ensuite les deux solutions préparées en échantillons dont on ajuste le pH en ajoutant de l'acide chlorhydrique ou de l'hydroxyde de sodium de façon à obtenir un échantillon pour chaque pH de 2,0 à 7*0. Après cela, on dilue les solutions de façon que la concen- tration de chaque solution soit de 1,0 gramme par litre. On mesure la longueur d'onde maximale A (lambda) en nanomètres (nm) et la densité optique dans un spectropho- tomètre Spectronic 2000 de Bausch & Lomb. Les résultats de la comparaison sont énumérés sur le Tableau 1 et pré- sentes graphiquement sur la figure 1. TABLEAU 1 Daucus carota OV-RSP intensité intensité max relative max relative pH (nm) DO (%) (nm) DO (%) 2,0 525,1 1,135 100,0 522,9 0,693 61,1 3,0 525,7 1,146 101,0 523,9 0,493 43,4 4,0o 528,1 0,956 84,0o 530,3 0,289 25,5 ,0 537,7 0,659 58,0 535,5 0,213 18,8 6,0 545,9 0,620 55,0 560,3 0,261 23,0 7,0 584,1 0,785 69,0 571,1 0,274 24,1 Les résultats des essais de comparaison entre la prépara; tion d'anthocyane de Daucus carota et la préparation de OV-RSP montrent que la préparation d'anthocyane de Daucus carota possède une intensité de couleur, c'est-à-dire une densité optique, 1,6 à 3,3 fois plus forte que celle de OV-RSP à tous les pH d'essai. De plus, comme représenté sur la figure 1, l'intensité relative de couleur de la préparation de Daucus carota est notablement plus élevée que l'intensité relative de couleur de la préparation de OV-RSP. On examine et compare également les stabilités de l'anthocyane de Daucus carota et de OV-RSP pour des pH de 2,0 à 5,0 dans diverses conditions de traitement com- prenant la congélation, la réfrigération, le maintien à température ambiante à la lumière, le maintien à tempéra- ture ambiante dans l'obscurité, le chauffage de la pré- paration à 90 C pendant cinq minutes suivi par un maintien à la température ambiante à la lumière, et l'autoclavage à 120 C sous 1,4 bar pendant 10 minutes suivi par un main- tien à la température ambiante et à la lumière. Les Ph de 6,0 à 7,0 sont omis de ces essais étant donné qu'aucun produit n'est stable à ces pH à moins d'être maintenu à l'état congelé. Au bout d'un mois, on retire les échantillons du colorant anthocyanique provenant de Daucus carota et de OV-RSP des conditions de traitement décrites ci-des- sus afin de mesurer la longueur d'onde maximale A (lambda) et la densité optique. Les résultats obtenus après avoir soumis les échantillons aux diverses conditions mentionnées ci-dessus sont présentés graphiquement sur la figure 2 pour le colorant anthocyanique provenant de Daucus carota et pour le colorant OV-RSP. Le produit de Daucus carota conserve davantage de son intensité initiale de couleur que ne le fait OV-RSP à n'importe lequel des pH d'essai. Les résultats d'essai tels que représentés sur la figure 2 montrent que le produit de Daucus carota conserve 75-100 % de son intensité initiale de couleur aux pH de 2,0-3,0 dans toutes les conditions de traitement. Aux pH de 4,0-5,0 le produit de Daucus carota conserve 15-80 % de son intensité initiale de couleur selon le traitement. En comparaison, OV-RSP conserve 0-60 % de son intensité initiale de couleur aux pH de 2,0-3,0 après un mois selon le traitement subi par l'échantillon. Aux pH de 4,0-5,0, 0V-RSP perd toute sa couleur après un mois dans les condi- tions de maintien à la température ambiante à la lumière ou dans l'obscurité, après chauffage à 90 C et après auto- clavage. Afin de mettre encore en évidence la stabilité 1 1 du colorant anthocyanique cultivé provenant de Daucus carota, on effectue des essais sur une période de trois mois et une période de six mois en utilisant le colorant anthocyanique naturel rouge dans diverses conditions comprenant la congélation, la réfrigération, le maintien à la température ambiante à la lumière et dans l'obscuri- té, le chauffage à 90 C pendant cinq minutes suivi par un maintien à la température ambiante à la lumière, et l'au- toclavage à 120 C sous 1,4 bar pendant 20 minutes suivi par un maintien à la température ambiante et à la lumière. Les résultats d'essai obtenus après la période de trois mois avec le produit de Daucus carota sont représentés graphiquement sur la figure 3. Après trois mois de conservation dans le congélateur, le réfrigérateur ou à la température ambiante dans l'obscurité, le produit de Daucus carota conserve plus de 80 % de son intensité initiale de couleur à un pH de 2,03,0. Aux pH de 4,0-5,0, la congélation et la réfrigération permettent de retenir % de la couleur. La conservation à la température ambiante dans l'obscurité aboutit à une perte un peu plus grande de couleur qu'après la période d'un mois, aux pH de 4,0-5,0. La conservation à la température ambiante sous exposition à la lumière aboutit à une perte totale de couleur aux pH de 4,0-5,0. Les résultats d'essai obtenus après la période de six mois avec le produit de Daucus carota sont repre- sentés graphiquement sur la figure 4. Après six mois de conservation dans le congélateur, le réfrigérateur ou à la température ambiante dans l'obscurité, les résultats sont à peu près les mêmes qu'après trois mois. La seule différence perceptible après la période de six mois com- parativement aux résultats obtenus après la période de trois mois se trouve au pH 3,0 dans les conditions du chauffage à 900C suivi par un maitien à la température ambiante et à la lumière et après autoclavage. Dans ces conditions, à pH 3,0, le produit de Dauaus carota perd complètement sa couleur apres six mois, tandis qu'après trois mois il conservait plus de 50 % de sa couleur. La lignée cellulaire de Daucus carota produit approximativement 300 mg d'anthocyane par litre de culture de cellules en suspension en 10 à 12 jours, quantité qui représente 2-3 % du poids sec des cellules. L'extrait cellulaire est intensément coloré en rouge à pourpre et bleu aux pH acides allant jusqu'tà 7,0. PREVENDICATI ONS 1. Procédé de production d'un colorant préparé à partir d'un anthocyane synthétisé par des cellules dans la culture d'une lignée cellulaire de Daucus carota, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver des cellules de Daucus carota dans une culture de tissu cellulaire; repiquer les cellules de Daucus carota cultivées; récol- ter les cellules cultivées; purifier les cellules extraites pour isoler l'anthocyane; et lyophiliser l'anthocyane isolé pour obtenir une poudre anthocyanique hydrosoluble. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de la culture de tissu cellulaire contient, par litre, les élements suivants: Elément Quantité (NH4)2S04 134 mg NaH2PO4.H20 75 mg KN03 2,5 gm MgS04.3H20 250 mg CaCl2. 2H20 150 mg MnS04.H20 10 mg H BO3 3 mg ZnS04. 7H20 2 mg Na2MoO4.2H20 2,5 x 10-1 mg CaSO4.5H20 2,5 x 10-2 mg CoC12.6H20 2,5 x 10-2 mg KI 7,5 x 10-1 mg mésoinositol 100 mg acide nicotinique 1 mg thiamine 10 mg pyridoxine 1 mg Galactose 20 gm NaFe EDTA 30 mg acide 2,4-dichlorophénoxy- acétique 0,1 mg acide nitrilotriacêtique 15 mg 2582312 - 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la culture est une culture de cals et le milieu comprend de la gélose. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules de Daucus carota en suspension sont repiquées tous les quinze jours avec un inoculum à % dans un milieu liquide frais en maintenant la culture cellulaire à 25-29 C dans une secoueuse rotative fonction- nant à 100 tr/min et sous un cycle lumière:obscurité de 16:8 heures. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules cultivées sont récoltées 12-14 jours après le repiquage en éliminant le milieu par fil- tratien, puis soit (1) en extrayant immédiatement les cel- lules avec du méthanol acide ou de l'éthanol acide (0,1 % de HCl), soit (2) en extrayant les cellules avec du méthanol acide ou de l'éthanol acide (0,1 % de HCl) après congélation des cellules, soit (3) en extrayant les cellules à l'eau chaude après congélation des cellules. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la purification des cellules extraites pour iso- ler l'anthocyane consiste à concentrer l'extrait à siccité sur un évaporateur rotatif, puis resolubiliser l'extrait dans de l'eau bidistillée; traiter l'extrait concentré par une résine échangeuse d'ions; centrifuger l'extrait traité à 210 x g; neutraliser le produit surnageant de l'extrait centrifugé jusqu'à un pH de 7,30 et appliquer le produit surnageant neutralisé à une colonne de résine échangeuse d'ions ayant été équilibrée avec de l'acétate de sodium 15mM ayant un pH de 7,30; et éluer la colonne avec, d'abord, de l'acétate de sodium 15mM ayant un pH de 7,30, puis avec de l'acide acétique à 1 %. 7. Composition colorée comprenant un produit alimentaire et un colorant, caractérisée en ce que ledit colorant est l'anthocyane provenant de la lignée cellulaire de Daucus carota. 8. Composition colorée comprenant un produit cosmétique et un colorant, caractérisée en ce que ledit colorant est l'anthocyane provenant de la lignée cellulaire de Daucus carota. 9. Composition colorée comprenant un produit pharmaceutique et un colorant, caractérisée en ce. que ledit colorant est l'anthocyane provenant de la lignée cellulaire de Daucus carota. 10. Composition selon la revendication 7, 8 ou 9, caractérisée en ce que le colorant est stable à un pH situé dans l'intervalle de 2,0 à 7,0. 11. Procédé pour donner une couleur stable à un produit alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique, caractérisé en ce qu'il consiste à ajouter audit produit alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique une quantité efficace d'un colorant anthocyanique provenant de la lignée cellulaire de Daucus carota,