FR 2577321 A1 19860814 FR 8502010 A 19850208 1 2 257732.1 DISPOSITIF ET PROCEDE DE MISE EN EVIDENCE D'AGGLUTINATS ERYTHROCYTAIRES. et un dispositif La présente invention concerne un procédé1pour la mise en évidence d'agglutinats érythrocytaires, fréquemment utilisée en biologie, notamment en immuno-hématologie et transfusion. 5.On connaît les techniques classiques de mise en évidence de la réaction antigène-anticorps en immuno-hématologie érythrocytaire. Les plus courantes font appel à l'agglutination: Agglutination spontanée en milieu salin Agglutination en milieu macromoléculaire ? o. Agglutination d'hématies traitées par des enzymes Test de Coombs Mourant Race (agglutination, après lavages, d'hématies revêtues par des anticorps ou du complément, au moyen d'antiglobuline humaine) Maintien d'une agglutination non spécifique (telle celle induite !:_ par l'hexadimethrine bromide ou polybrènei, par exemple) Méthodes dérivées des procédés cités ci-dessus, ou associant plusieurs d'entre eux (test de Coombs sur hématies trypsinées, test manuel polybrène- antiglobuline, en deux phases...). Ces techniques peuvent généralement être réalisées sur plaque, en tube, ou dans des dispositifs automatiques. Dans des applications comme la recherche d'anticorps, plusieurs sont associées. On connaît des développements récents à ces techniques: Graham décrit en 1982 une méthode originale de séparation sérum-globules, évitant les lavages du test de Coombs classique. Pour celà il utilise, dans un tube particulier, un milieu composé d'albumine et de dextran, de densité intermédiaire entre sérum et globules ( Mollison P.L., Blood transfusion in clinical medicine, Blackwell. Oxford. 1983. p 512). Ortho Diagnostic Systems a commercialisé, sous forme de kit, ce procédé (Simwash ). Il est original, mais, d'après l'auteur, pas plus sensible que le test classique dont il ne diffère pas fondamentalement, dans sa phase finale. Des techniques dites "en phase solide" voient le jour, avec des méthodologies variables. La synthèse des deux procédés exposés ci-desssus (séparation sérumglobules sans lavage et phase solide) aurait abouti à la technique suivante: le mélange sérum-globules est centrifugé à travers un liquide de séparation, dans un puits dont le fond est revêtu d'antiglobuline. La lecture est faite automatiquement. Cette méthode, présentée au symposium transfusionnel de Munich (1984) par une équipe parisienne (Muller A., Beige 4C D., Richard D., Matte C., CNTS Paris/Orsay), donnerait d'excellents résultats, en tous cas nettement supérieurs à ceux obtenus par les tests manuels. La présente invention vise à supprimer certains des inconvénients des méthodes connues, en utilisant un procédé original de mise en évidence de l'agglutination, pour obtenir des tests répondant aux critères suivants: Praticabilité: Les tests manuels les plus couramment utilisés en immunohématologie, s'ils nécessitent des précautions de manipulation et d'interprétation, restent, pour des personnes entraînées, simples et rapides. Le test proposé doit donc répondre aux mêmes exigences de praticabilité. Ceci n'exclut d'ailleurs pas son utilisation dans des systèmes plus ou moins automatisés, pour des applications en séries. 1. Fiabilité: l'interprétation de la réaction, d'une très grande simplicité doit améliorer la fiabilité de la réponse dans un certain nombre de situations difficiles ( réaction faible, urgence, utilisateurs occasionnels...). D'autre part, les précautions à apporter à la manipulation concernant surtout la phase de préparation du milieu, peuvent, dans une certaine mesure, être dissociées, dans le temps, de ces situations difficiles. Sensibilité: l'amélioration de la sensibilité des tests, du fait des conditions particulières, et du mode de lecture, est primordiale. Reproductibilité: L'absence, dans la dernière phase, d'intervention humaine difficilement quantifiable (selon les tests: lavages manuels, agitation, ajout d'un réactif, temps de lecture...), en réalisant une relative standardisation, doit permettre une meilleure reproductibilité, notamment des titrages. Dans la phase finale des tests en tubes couramment utilisés en immunohématologie, on peut trouver les manipulations suivantes lavages (Coombs et phase "antiglobuline" du test polybrène-Coombs). ajout de réactifs (citrate dans le test manuel au polybrène, antiglobuline dans le test de Coombs ou la phase "antiglobuline" du test polybrène-Coombs). Agitation pour remise en suspension des hématies Lecture immédiate, par une personne entraînée. (ces deux derniers actes sont communs à tous les tests d'agglutination en tube, quand la lecture est macroscopique). Le procédé que nous allons décrire agit sur cette phase. En effet, l'incubation ne diffère pas fondamentalement de celle des tests classiques. Cette technique permet toutefois l'utilisation de quantités de réactifs qui sont en moyenne plus faibles que celles utilisées habituellement, notamment pour les hématies-tests, ce qui améliore le rapport sérum/globules pendant l'incubation. Les lavages, quand ceux-ci sont nécessaires, sont remplacés par une centrifugation douce du mélange sérum-globules à travers un filtre (dans la technique détaillée décrite plus loin, ce filtre est un gel). Les globules, qui sédimentent rapidement, sont alors séparés du sérum. Cet aspect de la technique, s'il est intéressant, n'est pas à proprement parler nouveau, comme - signalé précédemment (sauf par le fait que le milieu utilisé est un gel) . L'ajout de réactifs, quand il est nécessaire, est remplacé par leur incorporation au milieu de séparation sérum-globules: c'est le cas de l'antiglobuline, ou de la solution citratée de resuspension utilisée dans le test manuel au polybrène. Lors de la centrifugation, on a donc une séparation o5 globules-sérum, mais aussi une réaction avec les molécules incluses dans le filtre. La taille des pores du filtre est telle que celui-ci laisse passer les globules libres plus facilement que les agglutinats, ceci lors d'une centrifugation douce, répondant à des critères précis. Une forme particulière, - -_conique, du fond du tube de réaction, en ralentissant la progression des globules lors de la centrifugation, majore le phénomène. La lecture est alors particulièrement aisée: dans les réactions négatives, les globules ont sédimenté complbtement, dans les réactions positives, ils restent pris, au moins en partie, dans le filtre. Cette lecture peut sans inconvénient être 2o différée de plusieurs heures, effectuée par plusieurs personnes successivement, photographiée... Cet aspect du procédé, nouveau, constitue la base de la demande de brevet. 4 2577321 A titre d'exemple non limitatif, on trouvera ci-dessous une description détaillée d'une application: le test à l'antigiobuline. - Préparation du gel. Dans cette application, le filtre est constitué par un gel obtenu de la façon suivante: 5. MP.louiller du Séphadex G 00 Superfine (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) avec une solution basse force ionique, à raison de 18 ml de solution par gramme de Séphadex. Dans l'application, la solution basse force ionique utilisée était celle du Centre de Transfusion Sanguine de Lyon, préparée en accord avec la formule de Low et Mlesseter (Low B., Messeter L., 1 o Antiglobulin test in low-ionic strength salt solution for rapid antibody screening and cross-matching, Vox Sang. 1974; 26:53-61). Ajouter une antiglobuline contenant g/l de sulfate de dextran (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden), à raison dl I volume pour 10 volumes du mélange Séphadex-solution basse force ionique. 1 5. Le gel est préparé simplement, par ajout de la solution basse force ionique au Séphadex ou l'inverse, agitation douce, ajout de l'antiglobuline, nouvelle agitation. il n'est pas impératif d'utiliser une solution basse force Ionique, et des essais concluants ont été réalisés avec d'autres solutions (saline, tampons phosphate, tampons carbonate, solution de 2 C resuspension citrate-dextrose de Lalezari ( Lalezari P., Jiang AF., The manual polybrene test: A simple and rapid procedure for detection of red cell antibodies, Transfusion 1980; 20:206-21 1)). Il convient par contre d'observer un certain équilibre entre les différents constituants de 'antiglobuline (sérum animal ou albumine ajoutée, sulfate de dextran). En l'absence de cet équilibre, les globules sont incapables de sédimenter à travers le gel, même si le sérum avec lequel ils ont été incubés ne contient pas d'anticorps. L'antiglobuline utilisée dans l'application était une antiglobuline anti-IgG de chèvre ou de lapin, fabriquée par le Centre de Transfusion Sanguine de Lyon (sérum animal dilué 20 à 50 fois en saline auquel est ajouté du sulfate de dextran pour obtenir une concentration de 1 g/l). Le mélange gel-antiglobuline a été utilisé dans la journée suivant sa préparation, chacun des constituants pouvant être conservé beaucoup plus longtemps, individuellement (la conservation du mélange est également possible, pour une durée d'au moins 2 semaines, mais un ajout d'albumine est alors nécessaire). - Préparation des tubes à réaction. Les tubes utilisés (tubes pour extraction des micro sédiments réf. 72702 Starstedt, Romnelsdorf, West Germany) sont de petite taille (diamètre intérieur 4 mm, longueur 45mm) et terminés par une partie conique, prolongée par une pointe (cf. figure 1). Leur faible capacité permet de travailler avec de petites quantités de réactifs, assure une sédimentation correcte et rend la lecture possible à 2577321 travers le plastique (légèrement opaque), et le gel. La partie terminale conique, en ralentissant la sédimentation des hématies, d'autant plus qu'elles sont agglutinées, améliore la sensibilité du test. D'autres tubes ont pu être utilisés, mais celui-ci est particulièrement bien adapté, et donne les meilleurs résultats. Chaque tube reçoit, à la pipette automatique, 200 microlitres de gel, et est ensuite centrifugé brièvement à environ 1000 g (5 secondes, mais cette centrifugation peut sans inconvénient être beaucoup plus longue), pour tasser ce gel. C - Réaction. Dans un autre récipient (tube, puits de microplaque...), on mélange microlitres de sérum à 120 microlitres d'une suspension érythrocytaire à 0,25% en solution basse force ionique (Low et Messeter). Après une incubation de 10 minutes à 37'C, on transfère ce mélange à la pipette (Pasteur, par exemple) dans la partie supérieure du tube, au dessus du gel. Peu importe que le contact entre gel et mélange soit immédiat ou non, pourvu que le mode de dépôt n'ait pas fait pénétrer profondément les globules dans le gel. Le tube est alors centrifugé 10 minutes à 200 unités RCF (radial centrifugation force). 1 unité RCF = (rayon de centrifugation)(vitesse angulaire) 219,8 2c 9,8 est la constante de Newton La vitesse angulaire est exprimée en radian/seconde Le rayon de centrifugation, exprimé-en mètres, est mesuré entre l'axe de la centrifugeuse et le fond du tube. En cours de centrifugation, la force centrifuge doit être dans l'axe du tube. -La lecture est effectuée directement à la fin de la centrifugation, et reste possible plusieurs heures: les réactions positives sont caractérisées par la rétention d'hématies dans le gel. Cette rétention est haute et totale pour les réactions fortement positives (figure 2, tubes 3 à 5), plus basse, et parfois incomplète pour les réactions 3c faiblement positives (figure 2, tubes 1 et 2). Dans les réactions négatives ( figure 2, tube 0), tous les globules ont sédimenté dans la pointe. Résultats -Titrage d'anticorps immuns irréguliers. Des sérums (donneurs ou malades) correspondant aux principales spécificités anticorpales des systèmes à anticorps irréguliers immuns, ont été titrés par cette technique et par un test de Coombs basse force ionique classique (Low B., Messeter L., Antiglobulin test in low-ionic strength salt solution for rapid antibody screening and cross-matching, Vox Sang. 1974; 26:53-61). Les dilutions des sérums ont été préparées à l'avance, séparées en 2 fractions, numérotées au hasard, et congelées. Les tests ont été réalisés le même jour, après décongélation, par des techniciens différents, travaillant à l'aveugle. 6 2577321 Les résultats étaient exprimés en terme de positivité ou négativité, avec essai de cotation de 1 à 5 pour les positifs. La figure 3 montre les titres obtenus par chacune des méthodes et la supériorité du test sur gel. Il faut noter également qu'aux dernières dilutions positives en test classique correspondaient des réactions extrêmement faibles, visibles seulement par un technicien confirmé effectuant immédiatement la lecture, alors que les dernières positivités, avec le test sur gel, pouvaient être interprétées le lendemain, par une personne n'ayant jamais utilisé cette technique. Quelques anticorps de nature habituellement IgM (anti-Lewis, anti-M antiN...) ont été testés, avec des résultats variables, superposables à ceux du test de Coombs, comme on pouvait s'y attendre, du fait de l'identité des conditions d'incubation. -Recherche de la quantité minimale détectable d'anti-D par titrage d'un sérum étalon. La quantité minimale d'anti-D détectable par cette technique est de 0,4 à 0,8 ng/ml, ce qui correspond à une sensibilité nettement supérieure à celle du test de Coombs, et pratiquement équivalente à celle du test au polybrène en appareil automatique (Mollison P.L., Blood transfusion in clinical medicine, Blackwell. Oxford. 1983. pp 481-557). -Groupage érythrocytaire, pour les antigènes C,c,D,E,e,K,k,Fya,Fyb, Jka, Jkb,S,s. Les sérums utilisés sont des sérums tests homologués par le CNRGS, purs ou dilués au 1/2 ou au 1/4. Ces sérums étant suffisamment forts, les réactions sont particulièrement faciles à lire: dans les réactions positives les globules sont tous retenus dans la partie haute du gel. Dans ces conditions, la présence simultanée de globules retenus dans le gel et de globules ayant bien sédimenté, correspond évidemment à une double population. Les hématies minoritaires sont détectables à condition de représenter: à 5% des hématies totales, quand elles ne portent pas l'antigène cherché. 30.1,5 à 3% des hématies totales, quand elles portent l'antigène cherché. Pour les deux dernières applications présentées (groupage et estimation de la sensibilité), les résultats cités ne correspondent pas aux meilleurs résultats, mais à des résultats habituels. Dans les conditions d'utilisation décrites ci-dessus, il n'a pas été noté de fausse réaction positive sur plus de 100 sérums testés. L'utilisation de témoins reste tout de même indispensable. 7 2577321 On peut, à titre d'exemple, citer d'autres applications du procédé décrit: -Test de Coombs direct. Le procédé est exactement le même: préparation d'une suspension globulaire à 1% en saline, par exemple, dépôt à la surface du gel, centrifugation, lecture. -Agglutination en milieu salin, ou albumineux. On peut remplacer, dans le gel, le sérum d'animal immunisé par un sérum neutre. Les conditions (temps, température) d'incubation sont alors modifiées en fonction de la nature de l'anticorps mis en jeu. -Test au polybrène et, surtout, test mixte polybrène-antiglobuline. La i c solution de resuspension remplace alors la solution basse force ionique dans le gel. Le polybrène est, comme dans la technique de Lalezari, ajouté dans le mélange sérum-globules, et la centrifugation induit d'abord une agglutination, puis une désagglutination (sauf réaction positive) quand les globules rencontrent la solution citratée. Dans les cas (anti-Kell) o la désagglutination a lieu malgré la présence d'anticorps, l'antiglobuline contenue dans le gel agit comme il a été décrit précédemment. L'avantage est la relative standardisation des opérations d'agglutination et désagglutination, toujours délicates dans le test manuel au polybrène. -Séparation immunologique des doubles populations. Il est simple, dans 2c ce système, de récupérer, d'une part les globules libres, d'autre part les globules agglutinés. On peut également citer des modifications possibles de la procédure: Utilisation d'autres gels (Séphacryl par exemple), en ne perdant pas de vue que, compte tenu de l'utilisation prévue, le coût doit rester modéré. 2-5 - Simplification de la procédure. En l'état actuel, le test n'est ni complexe, ni long, mais certaines étapes peuvent être supprimées, notamment le transfert du mélange sérum-globules si ce mélange est incubé directement dans le tube réaction. - Modalités différentes de préparation et conservation du gel, ou de ses o constituants. - Intégration dans des systèmes semi-automatiques. Ce procédé est susceptible d'intéresser tous les laboratoires ayant une activité d'immuno-hématologie. REVENDtCATfONS 2 5 7 ? 321 I1) Procédé pour la mise en évidence d'une agglutination érythrocytaire. caractérisé en ce qu'il utilise, après une phase d'incubation dont les modalités varient comme celles des tests classiques correspondants, le passage des globules rouges à travers un milieu spécial pour réaliser en un seul temps: -Le lavage des hématies par ce milieu, comme dans le procédé Simwash . -L'ajout d'éventuels réactifs, incorporés au milieu. -La séparation, dans le milieu, par centrifugation douce, des globules libres et des globules agglutinés, pour une lecture directe et facile de la réaction. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu utilisé est le mélange d'un gel, reconstitué dans un tampon physiologique, avec une solution contenant des molécules permettant la sédimentation des globules libres, et, éventuellement,les réactifs nécessaires à la phase finale du test classique correspondant. 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le gel utilisé est un gel à base de dextran ou d'agarose. 4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le gel utilisé appartient à la série des Séphadex ou Séphacryl . ) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la seédimentation des globules libres est rendue possible, dans le gel, par un mélange de sérum animal, ou d'albumine avec des dextrans, notamment sulfatés ou de la polyvinylpyrrolidone. 6) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les réactifs éventuellement ajoutés au mélange de base sont les mêmes que ceux utilisés dans la phase finale du test classique correspondant: solution de resuspension citrate-dextrose pour test au Polybrène , antiglobuline pour test de Coombs, mélange des deux pour test mixte... 7) Dispositif permettant la réalisation des tests selon la revendication 1, sans transfert du milieu réactionnel entre incubation et agglutination, - caractérisé en ce qu'il comprend: -Une partie contenant le milieu selon les revendications 2 à 6. -Une partie permettant l'incubation du milieu réactionnel. 8) Disposltif permettant la réalisation de plusieurs tests dans un même ensemble, caractérisé en ce qu'il réunit dans un même bloc plusieurs dispositifs selon la revendication 7.