FR 2575475 A1 19860704 FR 8519382 A 19851230 La présente invention concerne un procédé de pro- duction d'interféron-gamma spécifiquement humain (désigné ci-après en abrégé par "HuIFN" gamma), à partir de sang hu- main entier, ainsi qu'un procédé de dosage de l'aptitude du sang humain à produire de l'HuIFN-gamma. Ces derniers temps,on a largement utilisé des essais cliniques, au cours desquels était chimiquement dosé le taux d'une enzyme du sang, ou de son métabolite. Puisque HuIFN-gamma, un composé du sang, pré- sente des activités antivirale et antitumorale, on a pro- posé d'inclure la mesure du taux de HuIFN-gamma du sérum dans les essais cliniques. Cependant on n'a pu répondre à cette suggestion du fait que l'HuIFN-gamma du sérum n'e- xiste qu'en faible quantité. Le sang est constitué par un fluide, le plasma, dans lequel se trouvent en suspension des éléments tels qu'érythrocytes, leucocytes et plaquettes. Un mm3 de sang humain renferme en général, en plus des 4000 à 10000 leuco- cytes et 1,5 à 4x105 plaquettes, chez l'adulte, 4 à 5,5 x106 érythrocytes. Il est bien connu que HuIFN-gamma est produit par le leucocyte humain. - Dans les procédés classiques de production d'HuIFN-gamma, on utilise des leucocytes viables, séparés du sang humain. Comme il est décrit, par exemple, par Y.K. Yip et coll., Infection and Immunity, Vol.34, pp.131-139 (1981), et T. Kasahara et coll., the Journal of Immunology, Vol. 130,N 4, pp.1784-1789 (1983), des leucocytes sont sé- parés des autres éléments présents dans le sang entier, puis sont laissés afin de produire HuIFN-gamma. Toutefois, des études détaillées de ces procédés classiques confirment qu'ils ne donnent qu'un faible taux de récupération des leucocytes à partir du sang, c'est-à-dire 30 à 50%, et qu'ils lèsent les leucocytes au cours de la séparation, ce qui entraîne un abaissement de leur vitalité de 40 à 60%, avec éventuellement un rendement total de la récupération compris entre 10 et 30%, et une production en HuIFN-gamma irrégulière à partir des leucocytes séparés; ces faits rendent très difficile l'estimation de l'aptitude du sang à produire de l'HpIFN-gamma, et sont un obstacle à la pro- duction à l'échelle industrielle de ce produit. La présente invention permet d'éviter ces in- convénients de l'art antérieur, et d'obtenir facilement, à l'échelle industrielle, de l'HuIFN-gamma à partir de sang humain; elle permet également un dosage facile et hautement reproductible, de la capacité de production d'un sang entier. Le nouveau procédé selon l'invention consiste en une mise en incubation du sang entier, dans un réci- pient, en présence d'un anticoagulant et d'un inducteur d'IFN-=amma. Des études détaillées confirment l'action avan- tageuse, exercée sur du sang entier, par un inducteur d'IFN-gamma à raison de 10 à 10000 micro-grammes/ml de sang. Le terme "sang entier" comprend des préparations de sang frais recueilli chez des donneurs, ainsi que des suspensions obtenues par élimination du liquide plasmati- que de ces préparations sanguines et mise en suspension des éléments résiduaires dans un liquide non plasmatique approprié, comme sérum physiologique, solution tampon ou milieu de culture nutritif. Conformément à l'invention, on peut utiliser tout anticoagulant capable d'empêcher la coagulation de ce sang entier, et n'affectant pas la production d'HuIFN- gamma. S'avèrent par exemple avantageux l'héparine, le citrate-dextrose acide (ACD) et le citrate-phosphate-dex-- trose (CPD). Conviennent, conformément à l'invention, les inducteurs d'IFN-gamma capables de provoquer la production dHu!IFN-\amma dans le sang entier. Ainsi. peuvent être utl- lisés par exemple des mitogènes comme phyto-hémagglutinine; zoncanaIa.ine A; phytolaque mitogane; enterotoxine sta- phylococcique (SEA); lipopolysaccharide; endotoxine; po1ysaccharide comprenant ? -glucane et arabinogalactane; et des bactéries comprenant celles du genre Pseudomonas et Corynebacteriumo. On a constaté plus particulièrement que la phyto- hémaggluti.nine induisait un titre élevé d'HuIFN-gamma, généralement dans le temps relativement court de 10 à 13 heures. L'intervalle convenable pour le germe d'induc- teur d'IFN-gamma est de 10 à 10000 microgrammes par ml. de sang entier. On peut utiliser conjointement avec l'inducteur d'HluIFN-gamma, un ou plusieurs inducteurs d'interferon-al- pha (inducteurs d'HIuIFN-alpha), afin d'augmenter la pro- duction d'HuIFN-gamma et/ou d'induire simultanément la pro- duction di-luIFN-alpha. Le stade de mise en incubation du sang entier dans un récipient, en présence de l'anticoagulant et de l'inducteur d'iFN-gamma, s'effectue de manière à ce qu'il y ait production d'HuIFN-gamma. Par exemple, aux quanti- tés prescrites d'anticoagulant et d'inducteur d'IFN-gamma, dans le récipient, on ajoute une quantité convenable de sang entier, et on fait incuber ce mélange. Ou bien, on place dans un récipient un mélange d'anticoagulant et de sang entier, puis on y ajoute l'inducteur d'IFNgamma, et on fait incuber. Au cours de ce stade d'incubation, on peut utiliser en outre un milieu approprié comme sérum physiologique, solution tampon isotonique ou milieu de culture nutritif. Conformément à l'invention, peuvent être utilisés comme récipient, cuve, fiole, ballon, tube à essai, ampou- le et creux de micro-plaque, de tous volumes et formes. 2575475- Les conditions de mise en incubation sont cel- ies qui permettent la production d'HuIFN-gamma; par exem- ple un intervalle de tenmpérature de 30' à 40 C; une durée ir cubation de 10 à 9C heures. Dans ce cas, on peut, si necessaire, effectuer - aziorgage ou une superinduction. Apres incubation, en vue de la productiorn d'HulFN-gamnia, et une dilution éventuelle à l'aide de sérum physiologique ou de solution tampon isotonique, le sang entier est alors séparé au moyen de modes opératoi- res appropriés, comme centrifugation ou filtration, afin d'éliminer des éléments formés tels que cellules sanguines; la partie surnageante, ou le filtrat, renfermant l'HuIFN- gamma, est soumis à une purification ou à un titrage. L'HuIFN-gamma peut être facilement purifié, en vue de l'obtention d'une préparation d'HuIFN-gamma ayant une pureté ia plus grande possible, par combinaison de mo- des opératoires classiques, par exemple, relargage, dia- lyse, filtration, concentration, adsorption et désorption par échange d'ions, filtration sur gel, chromatographie par affinité utilisant un coordinat approprié comme anti- corps, fractionnement au point isoélectrique ou électro- phorèse. L'HuIFN-gamma obtenu peut être avantageusement utilisé sous forme d'injection ou de médicament à usage externe ou interne, en vue de la prévention et du traite- ment de maladies humaines, seul ou en combinaison avec une ou plusieurs substances, par exemple agent antiviral, im- muno-activateur, antioncotique, etc. Conformément à l'invention, on peut utiliser tou- te forme de dosage, pourvu que la production d'HuIFN-gamma par le sang entier se trouve titrée, par exemple dosage biologique, dosage radioimmunologique et dosage d'immuno- sorbant lié à l'enzyme. Ces dernières années, le dosage immunosorbant lié à l'enzyme a été pratiqué en tant que dosage rapide, approprié et très sûr. Conformément à l'invention, on peut utiliser tout dosage d'immunosorbant lié à l'enzyme, capable de doser l'HuIFN-gamrma en tant qu'antigène. S'a- vèrent, par exemple, avantageuses la technique d'introduc- tion d'anticorps double (technique sandwich) et la tech- nique modifiée d'introduction d'anticorps double. Il se confirme que les capacités de production d'HuIFN-gamma, dosées de cette manière, sont très intéressantes pour l'évaluation clinique d'un donneur individuel. Le procédé selon l'invention confirme que le sang recueilli chez un cancéreux a une capacité de pro- duction d'HuIFN-gamma bien moindre que celui qui est re- cueilli chez des patients bien portants. Les expérimentations suivantes permettent de mieux comprendre l'invention. EXPERIMENTATION 1 Effet du prétraitement sur la capacité de production d'HuIFN-gamma du sang On étudie de la façon suivante, au cours de cet- te expérimentation, l'effet du sang prétraité sur la capa- cité de production d'HuIFN-gamma: à des échantillons de sang frais, provenant de 3 volontaires bien portants, on ajoute de l'héparine. Les sangs traités, utilisés, se pré- sentent comme suit: une suspension exempte de plasma, ob- tenue par centrifugation du sang, pour éliminer le liqui- de plasmatique, et mise en suspension des éléments formés, résiduaires, dans du milieu RPMI 1640, de manière à donner une densité d'éléments identique à celle du sang; et une suspension traitée au chlorure d'ammonium, obtenue par traitement du sang avec du tampon Tris-HCl (pH 7,2),renfer- mant 0,75%O de chlorure d'ammonium, de manière habituelle, afin de réaliser l'hémolyse des érythrocytes, centrifuga- tion du mélange et mise en suspension des éléments formés résultants, exempts d'érythrocytes, dans du milieu RPMI 1640 de manière à donner une densité d'éléments identique à celle du sang. Des portions de 1 ml de sang hépariné ou traité sont placées dans différents tubes à essai en matière plas- tique, qui sont ensuite additionnés de portions de-0,1 ml de sérum physiologique renfermant de la.phytohémagglutini- ne-P,en quantités respectivement de 0, 50 et 500 microgram- mes, puis on met à incuber pendant 24 heures-à 37 C. Les parties surnageantes, obtenues par centrifugation des mé- langes mis à incuber, sont alors dosées pour déterminer leurs titres en HuIFN-gamma par ml de sang entier. Ces titres sont déterminés grâce à l'utilisation de "GAMMA INTERFERON IRMA KIT", un ensemble pour dosage radioimmu- nologique d'HuIFN-gamma, commercialisé par Celltech,Ltd. les résultats sont reportés dans le tableau 1. 1511 resss --- de ces résultats que le sang entier, et la suspensic exempte de plasma, renfermant la totalité des éiémeoes formés du sang, sont avantageux pour le dosage de la capacité de production d'HuIFN-gamma, en raison d'un titre en HuIFN-gamma élevé et constant. Il se confirme éga- flement que la suspension traitée au chlorure d'ammonium, dans laquelle les érythrocytes sont hémolysés et éliminés, donne un titre d'HuIFN-gamma faible et inconstant. TABLEAU 1 Traitement Phyto- Donneurs en bonne santé haemagglu- tinine A B C (micro- grammes) Pas de trai- 0 0 0 0 tement 50 230 200 280 500 540 600 620 Suspension 0 0 10 0 exempte de OO1 exempte de 50 220 230 240 plasma plasma 500 570 640 670 Suspension traitée au 0 0 10 0 chlorure 50 0 30 20 d'ammonium 500 0 40 10 E PERiNMETATION 2 ffj de' 'i noculu dinucur d'IFN-gamma sur la capa- c- dcie production d'HuIFN-gamma du sang L'étude de cet effet est réalisée sur des échan- Ci ions de sangc frais de 3 volontaires en bonne santé et de 2 cancéreux souffrant l'un d'un cancer du foie et l'au- tre d'un cancer de l'estomac. après héparinisation. ions de 1 ml chaque de l'un des échantillons de sang hé- painé, sont placés dans différents tubes à essai addition- nés avec des portions de 0,1 ml de serum physiologique ren- fermant de la phytohémagg!utinine-P en quantités respecti- ves de 0, 1, 10, 1000 et O10000 microgrammes, rmis à incuber, puis l'on dose leurs titres en HuIFN-gamma par mi de sang. Il avait été prévu une série d'expérimentations avec 100 000 microgrammes de phytohémagglutinine-P par ml de sang, mais on ne l'a pas réalisée, car il fut impossi- ble de dissoudre cette quantité de phytohémagglutinine, Les résultats sont reportés dans le tableau 2. TABLEAU 2 Phytohemagglu- Donneur en bonne Cancéreux Phytohemagg!u- sat tinine (micro- santé gramme) D E F -G H 0 0 0 0 0 0 1 O- 0 0 0 0 130 100 120 0 0 410 380 430 0 10 1000 680 620 760 0 20 10000 670 660 710 0 20 Note: G désigne un patient souffrant d'un carcinome du foie, et H un patient souffrant d'un cancer de l'estomac. Il ressort clairement de ce tableau que des quantités d'inducteur d'IFN-GAhIA de 10 à 10000 micro- grammes/ml de sang, savèrent avantageuses. Il se confir- me que le sang recueilli chez un cancéreux a une capacité dc production de Hu!FN-garma bien inférieure à celle du sanga recueilli chez des donneurs bien portants. Après dco- sage de la capacité de production cd;uIFN-gamma de spec - mens de sang entier recueillis chez 20 donneurs en bonne santé et 20 cancéreux, en utilisant 100 micrograi-ame d'in- ducteur d' IFN-gamma par mt de sang entier, on a constaté que la capacité de production des donneurs en bonne santé est de 420 - 100 unités/ml de sang, alors qu'elle n'est que de 10' 10 unités/ml de sang chez les cancéreux. Cela suggère que le dosage de la capacité de production d'HuIFN- gamma du sang donné, pourrait aider à la détection du can- cer au stade précoce. Plusieurs formes de réalisation préférées, mais non limitatives, de l'invention sont décrites ci-dessous. EXEMPLE A DOSAGE DE L'APTITUDE DU SANG A PRODUIRE DE L'HuIFN-gamma Exemple A-1 Un spécimen de 1 ml de sang frais, hépariné, pro- venant d'un homme/ageé de 28 ans, est placé dans un tube à essai en matière plastique, est additionné de 250 micro- grammes de phytohémagglutinine-P, et est mis à incuber à 37 C pendant 24 heures. La partie surnageante, obtenue par centrifugation du mélange incubé, est dosée quant à - son titre en HuIFN-gamma avec l'ensemble pour dosage radio- immunologique indiqué dans l'expérimentation 1. La production d'HuIFN-gamma est de l'ordre de 420 unités/ ml de sang. Exemple A-2 - Un spécimen de 1 ml de sang frais, hépariné, pro- venant d'une femme en bonne santé âgée de 33 ans, est ad- ditionné de 500 microgrammes de concanavaline A, et est mis à incuber à 37 C pendant 64 heures. On dose alors le titre en HuIFN-gamma comme dans l'exemple A-1. La production d'HuIFN-gamma est de l'ordre de 380 unités/ ml de sang. ExemDle A-3 Un spécimen hépariné de sang frais, provenant d'un homme en bonne santé, âgé de 61 ans,est centrifugé afin d'en1ever le plasma. Les éléments formés, ainsi ob- tenus, sont alors rincés à la centrifugeuse avec du sérum physiologique, et mis en suspension dans du milieu RPMI 1640 de manière à obtenir la même densité d'éléments que dans le sang. On place, dans un tube à essai en matière plastique, 1 ml de la suspension résultante, on y ajoute 300 microgrammes de phytolaque mitogène, et l'on met à incuber à 37 C pen- dant 48 heures. Puis l'on dose le titre d'HuIFN-gamma du spécimen résultant avec la technique d'anticorps dou- ble (technique sandwich), un dosage d'immunosorbant lié à l'enzyme. La production d'HuIFN-gamma est de l'ordre de 200 unités/ ml de sang. La valeur déterminée par le dosage d'immuno- sorbant lié à l'enzyme, concorde bien avec la valeur du dosage radio-immunologique. Exemples A-4 Un spécimen hépariné. de sang frais provenant d'un porteur de cancer du poumon, mâle, âgé de 58 ans, est traité comme dans l'exemple A-1; on obtient une pro- duction d'HuIFN-gamma de l'ordre de 20 unités/ml de sang. Exemple A-5 Un spécimen hépariné de sang frais, provenant d'une femme âgée de 55 ans, souffrant d'un carcinome de l'utérus, est traité comme dans l'exemple A-1, et l'on obtient une production d'HuIFN-gamma de l'ordre de 10 uni- tés/ml de sang. EXEMPLE B PRODUCTION D 'HuIFN-gamma Exemple B-1 Un spécimen hépariné de 1 ml de sang frais, provenant d'un donneur sain, est placé dans un tube en matière plastique, est additionné de 250 microgrammes de phytohémagglutinine-P, et est mis à incuber à 37 C pen- dant 24 heures. La partie surnageante, obtenue par centri- fugation du mélange incubé, est dosée quant à son titre en HuIFN-gamma. La production d'HuIFN-ganma est de l'ordre de 420 unités/ mi de sang. Exemple B-2 1 ml de spécimen hépariné de sang frais, pro- venant du'n donneur sain, est additionné de 500 microgram- mes d. crincanavaline A, mis à incuber à 37 C pendant 64 heures, et est dosé quant à son titre en HuIFN-gamma. La production d'HuIFN-gaarta est de l'ordre de 380 unités/ml de sang. Exemple B-3 Un spécimen hépariné de sang frais,provenant de donneurs sains, est centrifugé pour éliminer le plasma sanguin, et les éléments formés résiduaires sont rincés par centrifugation avec du sérum physiologique. Puis ces éléments formés sont mis en suspension dans du milieu RPMI 1640 de manière à avoir une densité identique à celle de ces éléments dans le sang. La suspension est alors placée dans une mini-cuve, addi- tionnée de phytolaque mitogène à raison de 200 microgram- mes/ml de suspension, et mise à incuber à 37 C pendant 64 heures, avant d'être dosée quant à son titre en HuIFN- gamma, comme dans l'exemple B-1. La production d'HuIFN-gamnma est de l'ordre de 240 unités/ ml de sang. Exemple --4 On prépare, comme dans l'exemple B-3, une sus- pension d'éléments formés de sang. On place cette suspen- sion dans une mini-cuve et y ajoute 500 microgrammes/ml de phytohémagglutinine-P, puis on met à incuber à 37 C pen- dant 2'& heeures, ec l'on dose quant au titre en HuIFN- ganmna cormme dans 'exemple B-1. La production d'HuIFN-gamma est de'l'ordre de 600 unités/ ml de sang' Il est bien entendu que la description détail- lée et les exemples particuliers indiquant des formes de réalisation préférées de l'invention, ne sont données qu'à titre d'illustration; différents changements et mo-difica- tions possibles apparaîtront à l'homme de l'art en partant de cette description détaillée, sans sortir du cadre de 1' invention. Revendications 1. Procédé de production d'interféron-gammua hu- main, spécifique HuIFN--gamma),à partir de sang humain, caractérisé en ce qu'on met à incuber dans un récipient du sang humain entier, en présence d'un. anticoagulant et d' un inducteur d'interferon-gamma inducteur d'IFNgarma) puis on recueille lt'EuIFN-garmma ainsi obtenu. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la quantité d'inducteur d'IFN-ganmma est comprise dans l'intervalle de 10 à 10000 microgrammes/ml de sang entier. 3. Procédé selon une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'anticoagulant est de l'héparine, du citrate-dextrose acide ou du citrate-phosphate-dextrose.- 4. Procédé selon une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'inducteur d'IFN-gamma est un mi- togène. 5. Procédé selon une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'inducteur d'IFN-gamma est phyto- hémagglutinine, concanavaline A, phytolaque mitogène, en- terotoxine staphylococcique, lipopolysaccharide, endoto- xine, polysaccharide, bactérie,ou leurs mélanges. 6. Procédé selon une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la mise à incuber s'effectue à une température comprise entre 30 et 400C pendant 10 à 90 heures. 7. Procédé selon une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le-sang entier, utilisé, est obtenu par élimination du liquide plasmatique provenant du sang d'un donneur, et mise en suspension des éléments formés résiduaires dans-un liquide approprié, notamment dans du sérum physiologique, de la solution tampon isotonique ou du milieu de culture nutritif. 8. Procédé de dosage de la capacité de produc- tion d'HuIFN-gamma d'un sang humain complet, caractérisé en ce qu'on utilise le procédé selon une des revendica- tions 1 à 7, puis on titre l'HuIFN-gamma accumulé.