FR 2573757 A1 19860530 FR 8517467 A 19851126 La présente invention se rapporte à la purifica- tion et à la récupération de L-phénylalanine (ci-après "phénylalanine") d'une solution aqueuse, typiquement d'un bouillon de fermentation microbienne. Par la méthode révélée ici, de la phénylalanine sensiblement pure peut être sélectivement récupérée de la solution en une seule étape de cristallisation, malgré la présence d'autres acides aminés, de corps colorés, de glucose, de sels inorganiques, de protéines extracellulaires, d'acides organiques etc., dans la solution d'origine. La phénylalanine a traditionnellement été diffi- cile à purifier de bouillons de fermentation. La présence de sels inorganiques, en particulier ceux caractéristiques des bouillons à base de précurseurs, rend la séparation par échange d'ions inefficace. Des sels alcalins seront typiquement présents, qui ne peuvent être retirés par des méthodes conventionnelles d'échange d'ions sans subir une perte de 20 à 30% de la phénylalanine à moins d'uti- liser une cristallisation fractionnée à plusieurs étapes ou des techniques inefficaces de déplacement par élution. Dans certaines conditions, du charbon de bois activé a été utilisé pour adsorber la phénylalanine ou une phénylalanine substituée d'un bouillon de culture. Des exemples de ces utilisations sont trouvés dans les brevets US 3 759 790 et 3 917 511 (Nakayama et autres), qui révèlent un mélange avec du charbon activé et une élution, suivis d'un passage à travers une colonne d'une résine échangeuse de cations fortement acide. Le brevet US 3 767 528 (Nagasaki et autres) révèle l'adsorption de 3,4-diméthoxy-phényl-Lalanine sur du charbon de bois activé et l'élution avec de l'eau à la première étape d'une récupération à quatre cristallisations. Greenstein et autres, "Chromatography", Chemistry of Amino Acids, page 1459 (1961), décrit une séquence d'évènements employés pour la séparation d'acides aminés d'un hydrolysat de protéine, o les acides aminés aromatiques ont été adsorbés sur du charbon de bois et l'on a fait passer l'effluent résultant à travers une série d'échanges d'ions pour donner des acides aminés individuels. Une méthode simplifiée pour obtenir des cristaux purs de phénylalanine d'une solution aqueuse a été découverte. Lorsqu'une solution contenant de la phényl- alanine est ultrafiltrée pour l'enlèvement de la masse des cellules, des grandes protéines et autres, et est mise en contact avec du charbon activé, le charbon adsorbe sélectivement la phénylalanine, les corps colorés et le glucose et rejette les sels inorganiques et les acides aminés non aromatiques. Des changements du pH de l'effluent indiquent le moment o la capacité de charge du charbon activé a été atteinte. La phénylalanine peut être sélectivement éluée du charbon avec des solvants appropriés. On fait passer l'éluat contenant la phénylalanine à travers un échangeur d'ions pour éliminer les impuretés restantes et/ou pour concentrer l'éluat de l'étape d'adsorption au carbone. L'application de cette série d'étapes à une solution de phénylalanine très contaminée permet d'atteindre des cristaux de phénylalanine d'une haute pureté à des rendements élevés en utilisant une seule étape conventionnelle de cristallisation. La présente invention a pour premier objet de simplifier sensiblement la purification générale de la phénylalanine ainsi que le procédé de récupération en évitant une cristallisation fractionnée à plusieurs étages. Par ailleurs, il est souhaitable d'obtenir un produit d'une pureté considérable en utilisant une seule étape de cristallisation. La présente invention a pour autre objet de produire un moyen économique de récupération de phényl- alanine qui autrement pourrait être perdue dans les cou- rants résiduaires du procédé. La méthode simplifiée de séparation et de récupération décrite ici trouvera sa plus grande utilité dans l'enlèvement de la phénylalanine de solutions aqueuses qui contiennent des composés précurseurs de phénylalanine sous la forme de sels. La méthode sera de plus utile pour la récupération de la phénylalanine d'une variété d'autres solutions aqueusesqui contiennent des impuretés. Le procédé peut par exemple être utilisé comme procédé primaire pour la récupération de la phénylalanine de bouillons de fermentation ou autres liquides de traitement. Alternativement, on peut l'utiliser comme adjonction à un procédé conventionnel de purification de phénylalanine pour la récupération de la phénylalanine des courants résiduaires du procédé. En bref, une méthode de séparation de phénylalanine d'une solution aqueuse qui comprend de la phénylalanine, une matière cellulaire, de sels inorganiques et des composés organiques, est révélée o la matière cellulaire et les protéines, si elles sont présentes, sont retirées de la solution aqueuse. Cela peut être fait par ultra- filtration et/ou centrifugation. La solution résultante est alors mise en contact avec du charbon activé, le charbon activé est séparé de la solution et -la phénylalanine est élué du charbon activé. On fait passer l'éluat conte- nant la phénylaianine à travers un échangeur d'ions et la phénylalanine est éluée de la résine échangeuse d'ions. On récupère de la phénylalanine sensiblement pure, de l'éluat, par une seule cristallisation. Le mode de réalisation préféré décrit ici, est pour la récupération de la phénylalanine d'un bouillon de fermentation microbienne. Le bouillon est de préférence clarifié par ultrafiltration pour retirer les micro- organismes et les protéines, bien qu'une centrifugation puisse être employée dans ce but- si on le souhaite. Si l'on utilise l'ultrafiltration, la limite de poids moléculaire doit être de 5.000 à 1. 000.000, de préférence d'environ 100.100, selon le type des impuretés présentes. Il ne sera normalement pas nécessaire d'utiliser un filtre ayant une plus faible coupure de poids moléculaire car le bouillon comprendra typiquement de grandes particules qui seront filtrées et des particules bien plus petites, des peptides par exemple, qui ne peuvent être efficacement retirées du bouillon de cette manière. Dans ce mode de réalisation préféré, l'ultrafiltre est couplé à la centrifugation en une opération en circuit fermé pour une clarification optimale du bouillon. Pour la facilité, la solution contenant la phénylalanine résultant de cette étape sera appelée le bouillon "filtré" ou solution, quelle que soit la méthode réelle de clarification utilisée. Le bouillon filtré contiendra une variété d'im- puretés d'o la phénylalanine doit être séparée. Les contaminants principaux seront les composants des milieux de fermentation eux-mêmes, le précurseur de phénylalanine n'ayant pas réagi, d'autres acides aminés qui peuvent avoir été produits et des corps colorés. Les corps colorés, qui comprennent les lipides, les peptides et autres protéines suffisamment petites pour passer à travers l'étape d'ultrafiltration ou de centrifugation, sont excrétés par des micro-organismes pendant la fermentation. Les composants des milieux comprendront une source de carbone (comme le glucose, de la liqueur de trempage de mais, etc.), une source d'azote (comme des sels d'ammonium d'acides organiques ou inorganiques), divers éléments inorganiques (comme le phosphate de potassium ou le sulfate de magnésium) et des vitamines (comme la biotine ou la thiamine). De plus, le bouillon de fermentation peut contenir un précurseur de phényl- alanine n'ayant pas réagi (l'acide phénylpyruvique, par exemple) qui peut être présent sous la forme d'un sel alcalin ou de sodium. La solution filtrée contenant de la phénylalanine est mise en contact avec le charbon activé pour l'adsorp- tion sélective de la phénylalanine de l'environnement qui vient d'être décrit. Le glucose, le précurseur de phénylalanine (comme l'acide phénylpyruvique) et les corps colorés entrent en compétition avec la phénylalanine pour les sites d'adsorption sur le charbon activé. D'autres acides aminés aromatiques, le tryptophane, par exemple, sont également adsorbés s'ils sont présents dans la solution. Cependant, les impuretés restantes soit ne sont pas adsorbées du tout ou sont adsorbées à un degré très mineur. Par conséquent, cette étape d'adsorption au carbone servira à séparer la phénylalanine d'impuretés telles que les acides aminés non aromatiques, les sels et autres composés qui peuvent avoir été présents dans les milieux ou la solution. L'étape d'adsorption au carbone est particuliè- rement avantageuse si la solution comprend un niveau élevé de sels. Les sels peuvent être présents en tant que constituants des milieux de croissance, comme le phosphate de potassium ou en tant que sels précurseurs, comme l'acide potassium ou sodium phénylpyruvique. La présence de ces sels rendra une séparation directe par échange d'ions inefficace ou inactive, du fait de la compétition pour les sites sur la résine. L'adsorption sélective de la phénylalanine sur le charbon activé offre un moyen simple et efficace pour dessaler la solution de phénylalanine. Cette étape est de même avantageuse si la solution comprend des niveaux élevés d'acides aminés non souhaités. La plupart des qualités commerciales de charbon activé ou de charbon de bois seront appropriées pour une utilisation dans cette méthode de séparation. Le carbone de différentes sources comme le bois, le charbon, les cosses de riz, auront des propriétés légèrement diffé- rentes et certaines peuvent être souhaitables dans certaines situations. Une caractéristique principale se rapportant à la convenance de ce procédé sera une aire superficielle élevée, avec des aires superficielles d'environ 1.000 à environ 1.500 mètres carrés par gramme de carbone préférées. De plus, des nombres de moles d'environ 400 ou plus peuvent être préférés. La dimension préférée des particules de charbon activé dépendra partiellement de la conception et du mode de fonctionnement du système d'adsorption. A ce point, le choix de la granulométrie appropriée sera dans la compétence de la personne concevant le système de récupération. Cependant, en termes d'efficacité d'adsorption, il est préférable que les particules soient aussi petites que possible. La réduction de la granulo- métrie, créant ainsi une aire superficielle plus impor- tante par poids unitaire du charbon, augmente la capacité d'adsorption du charbon. Ainsi, bien que du charbon granulaire activé (charbon ayant une granulométrie dans la gamme d'environ 12 x 40 ou même plus) soit approprié pour une utilisation dans ce procédé, du charbon activé pulvérisé (maille US environ 80) a une plus forte capacité d'adsorption par poids unitaire du charbon. Quelle que soit l'efficacité accrue d'adsorption avec le charon activé pulvérisé,cependant, son utilisation peut imposer certains inconvénients pour le procédé général de récupération. Par exemple, la poussière de charbon peut boucher les écrans de rinçage de retour De plus, les pertes par attrition peuvent provoquer une perte de la phénylalanine adsorbée et une contamination en aval de la phénylalanine produite éluée, ou bien les deux, selon le stade du procédé pendant lequel la perte par attrition s'est produite. Tout charbon déplacé doit être filtré avant cristallisation. Ces problèmes possibles peuvent être allégés en lavant le charbon activé avant de l'utiliser dans ce procédé et/ou en utilisant des filtres pour éliminer les pertes par attrition. Il est préférable de prétraiter le charbon activé avec un acide avant de l'employer pour l'adsorption de la phénylalanine. Dans le cas d'un charbon nouvellement activé, le traitement avec un acide fort nettoiera le charbon et aura tendance à lixivier une partie de la teneur en cendres pouvant être présente. Cela évitera la contamination de la phénylalanine par une lente J: -2573757 lixiviation de la cendre pendant les cycles d'adsorption et d'élution. Dans le cas de charbon qui a déjà subi un ou plusieurs cycles d'adsorption-élution, le prétraitement à l'acide peut être utilisé pour mieux régénérer le charbon. Pour la facilité et l'efficacité, l'acide sulfurique sera préféré; de l'acide sulfurique à 1,5 N est approprié. D'autres acides, comme chlorhydrique, phosphorique, nitrique peuvent être utilisés. Le pré- traitement comprend très avantageusement le passage d'environ deux volumes de lit de l'acide (pH environ 3 à environ 4) sur le charbon. Le prétraitement à l'acide doit de préférence être suivi d'un rinçage à l'eau ou avec une solution modérément basique avant utilisation dans l'étape d'adsorption au charbon de ce procédé de façon que la surface du charbon soit presque neutre à légèrement basique. En élévant le pH de la surface du charbon de cette manière, une co-adsorption d'autres impuretés d'acide carboxylique présentes dans-le bouillon peut être minimisée. Le pH de la solution contenant la phénylalanine affectera la sélectivité de l'adsorption, bien qu'il ne semble pas qu'une variation du pH ait un effet sensible sur les niveaux de phénylalanine adsorbée. Cependant, à un très faible pH de la solution, c'est-à-dire inférieur à environ 2 à 3, des quantités sensibles d'acide glutamique, de glycine, de valine et de leucine peuvent également être adsorbées. A des pH d'environ 3,5 à 4,5, les sels sont adsorbés. Ainsi, pour augmenter l'adsorption préférentielle de la phénylalanine par rapport aux autres acides aminés et sels, le pH doit être d'environ 5,0 à 6,0 ou plus. Un pH d'environ 5,5 à environ 6,5 est optimal pour la séparation sélective de la phénylalanine en comparaison à d'autres acides aminés et sels. A des pH élevés, au delà d'environ 10 à environ 11, il est possible de séparer les corps colorés de la phénylalanine souhaitée par une opération semi-chromatographique des colonnes de charbon car l'adsorption des corps colorés est fortement diminuée à ces pH élevés. L'étape d'adsorption au charbon du procédé de récupération de phénylalanine de cette invention peut être effectuée dans un réacteur à procédé discontinu ou continu. Pour la facilité commerciale, une colonne garnie fonctionnant avec un débit continu est préférée. Comme la phénylalanine est sélectivement adsorbée, le lit de charbon de ce procédé peut être très compact. La capacité d'adsorption du charbon activé est d'environ 0,05 à environ 0, 25 gramme de phénylalanine par gramme de charbon, de préférence d'au moins environ 0,15 à environ 0,2 gramme de phénylalanine par gramme de charbon. Quand la capacité d'adsorption du charbon choisi est déterminée, la forme précise, la dimension et le temps de résidence du réacteur d'adsorption au charbon seront dans la compétence et la connaissance du projeteur. On peut prévoir l'enlèvement périodique du charbon activé saturé de la partie en amont de la colonne, si des unités à lit mobile sont utilisées au lieu des tours garnies. La capacité d'adsorption du charbon activé saturé peut être au moins partiellement-régénérée en éluant comme décrit ci-dessous et le charbon activé régénéré ramené à la partie en aval de la colonne. Dans un procédé à colonne garnie ou en discontinu, la totalité du complément du charbon activé peut être régénérée pour une réutilisation par élution de la même manière. Si un éluant sélectif de la phénylalanine, comme l'acétate d'éthyle,est utilisé, la régénération du charbon par lavage avec un produit caustique fort comme de la soude ou de la potasse, peut être requise. Le prétraitement acide décrit ci-dessus peut également être utilisé pour améliorer la régénération de l'activité d'adsorption du charbon. Le procédé de purification et de récupération révélé ici peut être entrepris à toute température pratique compatible avec le maintien de l'intégrité de la phénylalanine. Des températures dans la gamme de 25 à sont appropriées. Dans la plupart des cas, la charge alimentaire contenant la phénylalanine sera à ou près des températures de fermentation, c'est-à-dire environ 20 C à environ 45 C. Il n'est pas nécessaire de maintenir cette température élevée, et l'adsorption peut être entreprise à ou près de la température ambiante car un changement de température provoque simplement un déca- lage de la courbe d'adsorption, plutôt qu'une altération de la capacité d'adsorption. La solution contenant la phénylalanine et le charbon activé sont mis en contact dans le récipient réactionnel, de préférence pendant un temps suffisant pour que la réaction d'adsorption atteigne l'équilibre ou la saturation. Le point d'équilibre peut être déterminé en examinant la solution ou l'effluent à la recherche de la phénylalanine libre. Alternativement, on peut utiliser le pH en tant qu'indicateur de l'équilibre. Il y a une augmentation initiale sensible du pH d'environ 1,5 à 2,5 unités de pH tandis que les acides sont adsorbés sur le charbon activé. Le pH baisse alors graduellement environ jusqu'au pH initial ou d'entrée. La chute gra- duelle du pH indique un certain écoulement de phénylalanine tandis que les sites d'adsorption sur le charbon commen- cent à se remplir. L'arrêt du pH à peu près au niveau initial indique l'équilibre ou la saturation du charbon. Du fait de l'écoulement de phénylalanine avant la satura- tion, il est préférable d'utiliser des colonnes multiples ou de recycler l'effluent à travers des passes multiples jusqu'à ce que le point de saturation soit atteint. Une surveillance continue du pH de cette manière offrira un moyen d'anticipation pour déterminer le moment o la colonne s'approche de la saturation. Pour détecter la charge de pointe, ou la satura- tion, de la phénylalanine sur le charbon activé, le "pH initial" est défini comme le pH de la solution aqueuse à ou immédiatement avant mise en contact du charbon activé et de la solution aqueuse. Une diminution " à peu près au pH initial" signifie une diminution des niveaux du pH à ou près du pH de départ ou avant contact. La phénylalanine peut être éluée du charbon activé en tout moment, de préférence lorsque le charbon est devenu saturé. Dans un mode de réalisation utilisant un réacteur discontinu, l'étape d'élution peut être accomplie après qu'un ou plusieurs lots ont été traités. Dans un mode de réalisation utilisant un réacteur en colonne continue, l'ensemble de la colonne peut être rincé de l'éluant. Alternativement, du charbon activé saturé ou sensiblement saturé peut être retiré périodi- quement de la partie en amont de la colonne, lavé avec l'éluant et ramené à la colonne. L'élution peut être entreprise à toute tempéra- ture souhaitée entre environ 25 et 70 C. Des températures légèrement élevées,d'environ 50 à environ 60 C peuvent être souhaitées pour la solubilité accrue de la phénylalanine qu'elles donnent. Ce choix dépendra de l'économie rela- tive de chaque situation car la température n'est pas critique dans cette étape. Une grande variété de solvants sont appropriés pour une utilisation dans l'étape d'élution au charbon de ce procédé. Par exemple, l'eau, de l'ammoniaque aqueuse, du tétrahydrofurane et des acétates, alcools et cétones de faible poids moléculaire (comme l'acide acétique, l'acétate d'éthyle, le méthanol, l'éthanol, l'isopropanol, l'acétone) sont tous appropriés pour l'élution de la phénylalanine adsorbée du charbon activé. Le choix du solvant pour cette élution est un choix de procédé qui dépendra de la conception générale du procédé. Des solvants tels que ceux indiqués ci-dessus présentent une certaine variabilité en termes de la concentration du courant résultant contenant la phényl- alanine et en termes de la sélectivité de l'élution. Par exemple, l'utilisation d'eau, de préférence désionisée, ou d'ammoniaque aqueuse aura pour résultat un courant relativement dilué de phénylalanine qui n'est pas contaminé par la co-élution des corps colorés. Si l'on utilise l'ammoniaque aqueuse, elle peut être à des pH d'environ 9 à environ 13, de préférence d'environ pH 12 pour l'élution la plus efficace de la phénylalanine. Alternativement, l'étape d'adsorption au charbon elle-même peut être utilisée pour la concentration ainsi que pour la séparation. Si cela est souhaité, un solvant tel que du tétrahydrofurane ou des acétates, alcools ou cétones de faible poids moléculaire est préféré, en préférant tout à fait l'acétate d'éthyle. L'élution de la phénylalanine se produira dans une bande concentrée lorsque l'un de ces solvants est utilisé, éliminant la nécessité d'un plus ample traitement de grandsvolumes de la solution. Cependant, certaines impuretés organiques se co-élueront avec la phénylalanine et celles-ci doivent être retirées avant cristallisation. On peut ensuite faire passer la solution phénylalanine-éluant à travers un système d'échange d'ions pour un plus ample polissage. L'échangedd'ions est très efficace lorsqu'il est entrepris après le traitement au charbon activé car les sels présents dans la solution initiale contenant la phénylalanine sont retirés dans l'étape d'adsorption au charbon. Lorsque l'on souhaite une phénylalanine produite de haute pureté, cette étape d'échange d'ions peut être utilisée pour retirer les impuretés organiques qui peuvent rester après l'élution de la phénylalanine du charbon. Ces impuretés peuvent impartir une certaine couleur au produit final et peuvent servir d'inhibiteurs de nucléation dans le procédé de cristallisation. La fonction de polissage est importante si l'éluant du charbon activé est un éluant qui co-élue les corps colorés en même temps que la phénylalanine. De plus, le glucose présent dans la solution initiale contenant la phénylalanine sera séparé de la phénylalanine lorsque la solution passera à travers le syst-ème d'échange d'ions. Lorsque le solvant d'élution du charbon est de l'eau ou de l' ammoniaque, le courant dilué de phénylalanine peut être concentré (par exemple par évaporation ou osmose inverse) avant cristallisation ou bien on peut provoquer l'évaporation de l'ammoniaque afin d'envoyer un courant aqueux à un échangeur d'ions pour un plus ample polissage. Une autre option, selon le degré de contamination du bouillon et la nature et la concentration du solvant utilisé dans l'étape d'élution du charbon, consistera à faire passer l'éluant redilué à travers un échangeur d'ions contenant une résine cationique sous forme d'hydrogène ou d'ammoniaque. Cette dernière option, en plus d'éliminer les impuretés, produira un courant concentré allant au cristalliseur. Il faut noter que l'enlèvement du solvant utilisé dans l'étape d'élution du charbon avant l'échangeur d'ions est facultative. Une résine échangeuse d'ions doit être choisie qui est compatible avec l'éluant du charbon activé. En effet, la résine doit être insoluble dans le solvant d'élution au charbon. Par ailleurs, la résine doit avoir une bonne intégrité de structure. En effet, elle doit résister à une dilatation et à un gonflement à l'exposition au solvant, qui pourraient conduire à une rupture de la résine. Pour une résistance maximum, une résine très réticulée, c'est-à-dire une résine avec environ 10 à 20% de réticulation doit être utilisée. Un exemple approprié est 20% de divinyl benzène. On a trouvé qu'Amberlite 200 (marque de fabrique) (Rohm et Haas), une résine microporeuse fortement acide, était particu- lièrement appropriée lorsque l'on utilise de l'acétate d'éthyle ou de l'ammoniaque comme solvant dans l'étape d'élution au charbon. Le choix de la résine échangeuse d'ions sera dans la compétence et la connaissance de toute personne compétente. Le procédé d'échange 4'ions nécessite que l'alimentation contenant la phénylalanine, c'est-à-dire l'éluat de l'étape d'adsorption au charbon soit acidifiée. Cela provoque une protonation de la phénylalanine, donc l'échange d'ions sera efficace. Le pH de l'alimentation vers la ou les colonnes d'échange d'ions doit être ajusté à environ 1,0 à environ 4,0, de préférence à environ 1,5 à environ 2,5. Le pH réellement choisi dépendra de la résine échangeuse d'ions choisie dans la ou les colonnes. Avant l'élution, la colonne échangeuse d'ions saturée de phénylalanine est lavée avec de l'eau ou, de préférence, avec un solvant frais comme de l'acétate d'éthyle, pour déplacer toutes impuretés adsorbées. Un simple lavage à l'eau peut ne pas être suffisant pour déplacer les impuretés des pores de la résine. Le lavage au solvant peut être suivi d'un lavage à l'eau. L'élution de la phénylalanine de la ou des colonnes échangeuses d'ions peut être avec toute base. Du fait de sa volatilité, on préférera une solution d'ammoniaque. La concentration de la solution d'ammoniaque peut être modifiée. Par exemple, un courant d'éluant concentré est très efficace pour déplacer la phénylalanine de la colonne. Cependant, il peut y avoir certaines difficultés pour séparer l'ammoniaque de la phénylalanine produite après élution et pour cette raison, il est préférable d'utiliser une solution diluée d'ammoniaque qui peut plus facilement être retirée. On a trouvé qu'en élevant la température de l'éluant à environ 30 à 60 C, l'ammoniaque diluée est un éluant aussi efficace que l'ammoniaque concentré. En utilisant l'éluant à ces températures élevées, des concentrations d'environ 0,3 à environ 3,0 % en poids d'ammoniaque seront satisfaisantes. La phénylalanine est récupérée de la solution purifiée, typiquement par des processus conventionnels de cristallisation. En utilisant le procédé de purification et de récupération décrit ci-dessus, on peut obtenir un produit de phénylalanine de haute pureté, comme pureà 90 à 100%, avec une seule étape de cristallisation. En vertu des sélectivités complémentaires des étapes décrites ci-dessus, un produit de la pureté indiquée est possible sans recourir à une cristallisation multiple. En résumé, en utilisant l'ultrafiltration et/ou la centrifugation, de grandes molécules organiques et des matières cellulaires peuvent être extraites du bouillon ou de la solution contenant la phénylalanine. Le bouillon filtré est alors mis en contact avec du charbon activé, o la sélectivité de l'adsorption de la phénylalanine sur le charbon permet sa séparation efficace des sels, des acides aminés non souhaités et autres contaminants. On peut alors faire passer l'éluat dessalé contenant la phénylalanine à travers un échangeur d'ions pour une purification et/ou une concentration finale sans contamination ou "ensablement" par les sels. Le courant du produit concentré à la sortie de l'échangeur d'ions comprendra la phénylalanine sensiblement pure, d'o des cristaux sensiblement purs de phénylalanine peuvent être produits en une seule cristallisation. Le procédé de cette invention peut être utilisé comme purification et récupération primaires de phényl- alanine, par exemple, de bouillons de fermentation. Alternativement, il peut être souhaitable d'utiliser des techniques conventionnelles pour la récupération primaire et d'utiliser ce procédé pour récupérer la phénylalanine restant dans la liqueur-mère du procédé conventionnel. Les exemples qui suivent sont donnés pour illustrer l'invention et ne doivent en aucun cas en limiter le cadre. Les abréviations suivantes ont été utilisées dans toute la description: C - degré(s) centigrade(s) DI - désionisée g - gramme (s) HPLC chromatographie liquide haute pression h - heure kg - kilogramme (s) 1 litre (s) m - molaire 2- m2 - mètre carré meq - milliéquivalents mg milligramme (s) mn - minute (s) ml -: millilitre (s) MW - poids moléculaire N - normal % - pourcent t/mn - tours par minute TLC chromatographie en couche mince EXEMPLE I (Procédé de purification complète) La phénylalanine a été récupérée par le procédé suivant d'un bouillon de fermentation contenant 22,6 9/1 de phénylalanine, 1,13 g/1 de phénylpyruvate, 15,0 g/1 de glucose et 10,0% de solides sur une base en volume. Le bouillon a été ultrafiltré par passage à travers une unité d'ultrafiltration à fibre creuse Amicon H5P100-43 (coupure MW 100.000) (Amicon Corporation). Le taux de recirculation dans l'unité était de 20,6 1/mn avec une chute de pression moyenne de 0,7 bar. On a observé un taux moyen de perméation de 285,2 1/m2 par jour. Une colonne a été remplie de 500,0 g de charbon activé Westvaco Nuchar WVG 12 x 40 (marque de fabrique) (Westvaco Corporation) qui avait au préalable été activé par contact avec 259,0 g d'acide sulfurique concentré avec ensuite un lavage à l'eau pour élever le pH de l'effluent à 3,6. Le bouillon ultrafiltré a été introduit dans la colonne de charbon à 57,0 ml/mn. Après passage de 6,0 litres du bouillon à travers la colonne, on a observé un affleurement de la phénylalanine et l'on a arrêté l'écoulement. La colonne a été lavée avec 1,0 litre d'eau DI et éluée avec 9,0% d'acétate d'éthyle à 60 C et 50,0 ml/mn. On a récupéré un total de 88,0 g de phénylanaline (mesurée par HPLC) dans 6,0 litres de l'éluat. Deux litres de cet effluent contenant de la phénylalanine ont été traités plus amplement par échange d'ions. Une colonne d'échange d'ions a été préparée en plaçant 220, 0 mi d'Amberlite 200 (marque de fabrique) (Rohm et Haas) comme résine échangeuse d'ions dans une colonne. La résine a été convertie à la forme NH+ par lavage avec 500,0 ml d'hydroxyde d'ammonium à 30 %0. La couleur s'est libérée de la résine. La résine a alors été lavée avec de l'eau DI pour abaisser le pH de l'effluent à 9,1. Le pH des deux litres de l'éluat contenant la phényl- alanine à la sortie de la colonne de charbon ci-dessus a été ajusté à 1,8 avec de l'acide sulfurique concentré. On a alors fait passer l'éluat contenant la phénylalanine à travers la colonne d'échange d'ions à un débit de ,0 ml/mn. Un affleurement de phénylanaline a été observé après passage de 1.750,0 ml de la solution à travers le lit et l'écoulement a été arrêté à ce point. La colonne a été lavée avec 280,0 mi d'eau DI et a été éluée avec-1,0 litre d'hydroxyde d'ammonium à 29 %. L'éluat a été analysé par HPLC et s'est révélé contenir un total de 20,0 g. Le pH de l'éluat contenant-de -la phênylalanine à la sortie de l'étape d'échange d'ions a été ajusté à 7,0 avec de l'acide sulfurique concentréet l'éluat a été introduit dans un cristalliseur chauffé à 601C et un vide a été appliqué par un aspirateur. On a obtenu un total de 16,0 g de cristaux. Le produit cristallin a été analysé par titration et s'est révélé-être de la phénylalanine à 98%. Une rotation optique de -33,1 a été mesurée. EXEMPLE II (Variation de granulométrie du charbon activé) Six échantillons granulaires et un échantillon pulvérisé de charbon activé ont étéexaminés. On a lavé grammes de chaque charbon avec 50,0 mi d'eau et on les a ajoutés à 50,0 ml d'un bouillon alimentaire contenant de la phénylalanine dont la composition en acides aminés et englucose est indiquée au tableau A. On a agité chaque échantillon pendant 3,0 heures à la température ambiante. Le charbon a été retiré par filtration et les échantillons du bouillon restant ont été analysés par HPLC. Les résultats sont montrés au tableau A. TABLEAU A (Variation de granulométrie du charbon activé) GLU1 GLY2 ALA3 PRO4 VAL5 PHE6 ILE7 LEU8 LYS Gl 10 Alimentation 1,701l 0,76 4,60 0,52 0,43 12,30 0, 46 0,23 0,46 6,50 Granulo- Charbon métrie Calgon CAL12 12 x 40 1,60 0,73 4,50 0,52 0,48 1,23 0,13 0, 22 0,49 4,10 Calgon CPG12 12 x 40 1,58 0,71 4,30 0,53 0,47 1,32 0,13 0,22 0,49 4,18 Calgon APC12 12 x 40 1,40 0,73 5,60 0,52 0,60 1,40 0,16 0,22 0, 50 4,12 Nuchar (TM)WV-B13 1,50 0,71 4,20 0,52 0,45 1,78 0,14 0,23 0,46 4, 09 Nuchar (TM)WV-G13 12 x 40 1,60 0,74 4,40 0,54 0,47 1,34 0,13 0,23 0,48 3,91 Calgon NAP12 1,70 0,73 5,50 0,60 0,60 1,04 0,17 0,23 0,56 4,20 Calgon BL12 Puivérisé 1,63 0,72 4,54, 0,51 0,49 0,58 0,13 0,22 0,49 3,75 I acide glutamique 7 - isoleucine 2 - glycine 8 - leucine 3 - alanine 9 lysine 4 - proline 10 - glucose - valine 11 - Toutes les entrées sont en grammes par litre. 6 - phénylalanine 12 - Calgon Corporation 13 - Westvaco Corporation TM = Marque de Fabrique 25737-57 EXEMPLE III (Variation de l'éluant pour l'étape d'adsorption au charbon) Des colonnes ont été remplies de Calgon APC 12 x 40 (marque de fabrique) (Calgon Corporation) comme indiqué au tableau B et chargées (pas toujours à la capacité) de 1,0 litre du bouillon alimentaire utilisé à l'exemple II. A la suite du chargement, les colonnes ont été lavées avec un volume d'un lit d'eau pour retirer la solution en excès. La phénylalanine a été éluée du charbon activé avec 1,0 litre des éluants indiqués au tableau B. L'éluat a été analysé par HPLC à la recherche de la phénylalanine. Les résultats sont montrés au tableau B. TABLEAU B (Variation de l'éluant) Dimen- sion de PHE1 PHE1 la co2 charge2 n 2 RcpHE1 la Co-charge2 en- 2 RécupéConcen- Concentration Eluant lonne 2levé ration 3 tration 4 maximale NH3/H20 (pH 11) 82 12,00 7,50 62,00 3,75 4,50 NH /H20 (pH 12) 82 12,00 6, 90 60,00 6,90 9,50 3 20, 10,60 90,00 4,30 9,50 NH3/H20 (pH 13) 42 5,20 3,50 70,00 3,50 12,50 H20 désionisée 43 7,50 4,00 53,00 4,00 8,50 (80 C) 6,80 90,00 1,50 8,50 Ethanol à 30% 45 6,70 5,25 81,00 5,25 10,00 Méthanol à 50% 78 11,00 5,73 52,00 7,20 10,00 Méthanol à 70% 80 12,10 8,08 73,50 10,10 16,20 ,80 90,00 7,10 16,20 Isopropanol à 75% 82 11,25 7,40 66,00 7,40 12,20 ,10 90,00 5,00 12,20 THF à 10% 48 7,00 5,50 75,00 16,00 21,70 6,50 90,00 10,10 21,70 Acétate d'éthyle à 9% 47 6,90 5,20 75,00 17,30 24,20 6,22 90,00 12,50 24,20 1 - phénylalanine 4 - concentration de phénylalanine 2 - grammes 5 - THF: tétrahydrofurane 3 - pourcent (grammes/grammes) EXEMPLE IV (Motif d'adsorption et d'élution de la phénylalanine à l'étape du charbon activé) Une colonne de charbon de 500 g a été établie, contenant du charbon activé Nuchar (marque de fabrique) WV-G (Westvaco Corporation). La colonne de charbon a été préparée par lavage avec de l'acide sulfurique concentré et ensuite lavage à l'eau pour élever le pH à 3,0. Un bouillon de fermentation contenant 22,3 g/l de phénylalanine (89 g de phénylalanine au total) a été choisi qui comprenait également les acides aminés glutamine, glycine, alanine, praline, leucine et lysine, ainsi que le milieu de culture et une matière cellulaire. Le bouillon a été ultrafiltré par passage à travers une membrane d'ultrafiltration de MW 100.000 (Amicon Corporation) et le pH a été ajusté à 4,85 avec de l'acide sulfurique concentré. Le bouillon filtré a été chargé sur la colonne à 50 ml/mn, avec ensuite I litre d'eau pour laver la colonne. L'effluent a été recueilli en coupes de 500 ml et analysé par chromatographie en couche mince (TLC) pour détecter les acides aminés. L'on n'a pas observé de phénylalanine dans l'effluent jusqu'à ce que 3,0 litres aient traversé la colonne. Même après 4,5 litres, l'effluent avait une concentration en phénylalanine qui n'atteignait que 4,2 g/l, indiquant que la plus grande partie de la phénylalanine était adsorbée sur le charbon. Pendant tout le cycle de chargement, aucun des autres acides aminés n'a été adsorbé à un point important, comme cela est indiqué par les niveaux assez constants d'effluent s'approchant des niveaux initiaux respectifs de chaque acide aminé dans le bouillon. De l'analyse de l'effluent, on a déterminé qu'il y avait adsorption de 82 grammes de phénylalanine sur le charbon. Cela correspond à environ 92% de la phénylalanine totale présente dans le bouillon et à un chargement de 0,16 g de phénylalanine par gramme de charbon. A la suite du chargement, le charbon a été élué avec 5,5 litres d'acétate d'éthyle à 9% à 50,0 ml/mn et l'effluent recueilli en coupes de 500 ml. La colonne a été lavée avec 1.000,0 ml d'eau DI pour déplacer l'éluant restant. La phénylalanine a traversé en une bande serrée d'environ 4,0 litres avec une concentration maximum de 29 9/1l et une concentration moyenne (à 93% de récupération) de 19 g/l. Cette bande contenait plus de 76 g de phénylalanine, ou 85,4% de la phénylalanine totale présente dans le bouillon. On a pu noter que des corps colorés se sont co- élués avec la phénylalanine. A travers les deux premiers litres d'élution, l'éluant avait une couleur jaune clair. Cette couleur a augmenté jusqu'au tan à environ 4,0 litres et a diminué presque jusqu'à l'incolore à la fin de l'élution. Des coupes de l'éluant qui contenaient plus de 3,0 g/l ont été cristallisées sous vide en trois lots. Les cristaux ont été lavés avec 5 ml d'acétone par g de cristaux humides et séchés. La liqueur-mère de chaque lot a été ajoutée au lot suivant. On a recueilli un total de 66,2 g de phénylalanine brute sèche. Le produit était de couleur blanc cassé et a été déterminé par titration et s'est révélé être à 94% de la phénylalanine. EXEMPLE V (Variation des résines échangeuses d'ions) Des colonnes d'échange d'ions ont été établies (volume nominal 72,0 à 200,0 ml) contenant l'une des quatre résines dont la liste est donnée au tableau C. Toutes les résines ont été converties à la forme H+ par lavage de chaque colonne avec un litre d'acide sulfurique à 1,0 M suivi de plusieurs litres d'eau. Dans chaque colonne on a introduit, à un débit de 5,0 ml/mn, l'effluent des colonnes de charbon contenant de'l'acétate d'éthyle comme cela est décrit à l'exemple 1 (pH ajusté à 1,5 avec de l'acide sulfurique). Les colonnes ont alors été lavées avec 150,0 à 500,0 ml d'eau DI et éluées avec une solution à 2,0 M d'hydroxyde d'ammonium à 5,0 ml/mn. Les résultats, montrés au tableau C, indiquent que les résines faiblement acides (IRC-84 et IRC-50) n'ont pas capté la phénylalanine et ont montré des signes de détérioration. Les résines fortement acides (IRC-120 et Amberlite 200 (marque de fabrique)) ont montré une prise considérable, bien qu'IRC 120 ait présenté des signes de détérioration. TABLEAU C (Variation de résine échangeuse d'ions) Résine1 Capacité de PHE2 Condition IRC-84 0,00 Décoloration grise IRC-50 0,00 Décoloration jaune vert IRC-120 0,40 Décoloration jaune et gonflement Amberlite 200 0,44 Blanche i Toutes les résines de Rohm et Haas 2 - phénylalanine mesurée en meq/ml. R EV END I C A T I ON S 1.- Procédé de séparation de L-phénylalanine d'une solution aqueuse contenant de la L-phénylalanine, une matière cellulaire, des sels inorganiques et des composés organiques, caractérisé en ce qu'il consiste à: (a) retirer la matière cellulaire et les protéines de ladite solution aqueuse, - (b) mettre la solution résultante en contact avec du charbon activé, (c) séparer ledit charbon activé de la solution, (d) éluer la L-phényalaanine dudit charbon activé, (e) faire passer l'éluat contenant la Lphénylalanine à travers un échangeur d'ions et (f) éluer la Lphénylalanine de la résine échangeuse d'ions. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que de la Lphénylalanine sensiblement pure est récupérée de l'éluat de l'étape (f) par une seule cristallisation. 3.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la matière cellulaire et les protéines sont retirées par ultrafiltration en une opération en circuit *fermé avec centrifugation. 4.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution aqueuse précitée et le charbon activé précité sont mis en contact pendant un temps suffisant pour permettre au pH de la solution d'augmenter sensiblement puis de chuter à peu près au pH initial. 5.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le solvant dans l'étape d'élution (c) précitée est choisi dans le groupe consistant en eau, ammoniaque aqueuse, tétrahydrofurane et acétates, alcools et cétones de faible poids moléculaire. 6.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la résine de l'échangeur d'ions de l'étape (e) précitée est une résine cationique fortement acide avec une réticulation d'environ 10 à environ 20%. 7.- Procédé selon la revendication 1 du type o l'éluant utilisé à l'étape (d) précitée est de l'eau désionisée ou de l'ammoniaque aqueuse, ladite ammoniaque, si elle est présente, est retirée de l'éluat contenant la phénylalanine et on fait passer la solution aqueuse résultante contenant de la phénylalanine à travers un échangeur d'ions caractérisé en ce qu'il force la solution contenant la phénylalanine en aval dudit échangeur à être sensiblement plus concentrée que la solution contenant la phénylalanine en amont dudit échangeur. 8.- Procédé selon la revendication 1 du type o l'éluant utilisé à l'étape (d) précitée est choisi dans le groupe consistant en tétrahydrofurane et acétates, alcools et cétones de faible poids moléculaire et l'on fait passer l'éluat contenant la phénylalanine à travers un échangeur d'ions caractérisé en ce que (1) la résine est compatible avec l'éluant choisi à ladite étape (d) et (2) ladite résine est capable d'adsorber sélectivement la phénylalanine sans co-adsorption impor- tante des corps colorés ou autres impuretés. 9.- Procédé de détection d'une charge de L-phénylalanine de pointe dans un procédé d'adsorption de L-phénylalanine sur du charbon activé d'une solution aqueuse par mise en contact de ladite solution avec ledit charbon activé, caractérisé en ce qu'il consiste à surveiller le niveau du pH de ladite solution aqueuse et à déterminer le point auquel le pH, ayant sensiblement aug- menté au delà du niveau initial du pH, diminue à peu près audit pH initial, laquelle diminution du pH signale le chargement de pointe. 10.- Procédé pour contrôler un processus dans lequel de la Lphénylalanine est retirée d'une solution aqueuse par mise en contact de ladite solution avec du charbon activé, caractérisé en ce qu'il consiste à: (a) surveiller le pH de ladite solution pour détecter: (i) le pH initial, (ii) une augmentation sensible du pH, et (iii) une diminution du pH à peu près audit pH initial, (b) mettre les niveaux de pH en corrélation avec la charge de L-phénylalanine sur le charbon activé comme suit: (i) le niveau initial du pH indique une charge nulle ou sensiblement nulle de L-phénylalanine, (ii) une augmentation sensible du pH indique une charge de L-phénylalanine et une diminution à peu près au pH initial indi- que que la charge de L-phénylalanine - de pointe a été atteinte, et (c) contrôler la durée du contact de ladite solution aqueuse et dudit charbon activé de façon que: (i) aux niveaux de pH initial, ladite solution et ledit charbon activé soient mis en contact, (ii) à des niveaux croissants et élevés de pH, ladite solution et ledit charbon activé soient maintenus en contact,et (iii) à ou après une diminution du pH à peu près au pH initial, la période du contact solution aqueuse-charbon activé soit terminée.