FR 2583772 A1 19861226 FR 8509382 A 19850620 L'invention concerne de nouveaux supports, la préparation de ces supports, les intermédiaires nouveaux ainsi obtenus, leur application à la synthèse d'oligonucléotides et les nouveaux nucléosides et oligonucléotides reliés aux supports ainsi obtenus. De nombreux supports ont déjà été décrits dans la littérature pour la synthèse en phase solide d'oligonucléotides. Ces supports sont par exemple uniquement constitués de polymères, tels que le polystyrène (Nucleic. Ac. Res. 1980, volume 8), le polyacrylamide acryloylmorpholide, le polydimethylacrylamide polymérisé sur kieselguhr /Nucleic Ac. Res. 9 (7) 1691 (1981)/ de formule kieselguhr polyacrylamide -N -CH2 C -NH-CH2-CH2-NH-C-CH2-NH-C-CH2-NH2. I If CH3 0 0 0 Ces supports se sont révélés insuffisants, car ils ont tendance à gonfler excessivement et à retenir certains réactifs. D'autres supports déjà décrits sont de nature inorganique. On peut citer, par exemple, le support: -Si-(CH2)3- -CH2-CH-CH2C-NH(CH2) 6NH2 OCOCH3 0 /J.Am.Chem.Soc.,105, 661 (1983) / ou le support à base de silice fonctionnalisée par un groupement 3-aminopropyltriéthoxysilane, dont l'utilisation en synthèse phosphite et phosphoramidite pour la préparation d'oligo-nucléotides a été décrite pour la première fois dans le brevet européen N 0035719. Cependant, ce support utilisé en synthèse phosphotriester donne de mauvais rendements, notamment lors des premiers couplages. L'invention a pour objet des supports de formule (I): _iH c -(A)-(P O) _ À-S-c>HH Et 1 N H (I) 2 - 2583772 dans laquelle P est un matériau constitué de microbilles de verre ou de silice, ou de kieselguhr, ou de polytétrafluoroéthylène ou d'oxydes métalliques ou de cellulose. - m est un nombre entier pouvant varier de i à 20. - A représente soit une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée renfermant de i à 20 atomes de carbone, soit un radical cyclique saturé renfermant de 3 à 12 atomes de carbone, soit un radical phényle ou un radical hétérocyclique renfermant 5 ou 6 chaînons, - x est un nombre entier pouvant varier de O à 20, - x1 est un nombre entier pouvant varier de O à 10, les fonctions amines sur les noyaux phényls pouvant être en para, méta ou en ortho. Dans la formule (I), lorsque A est une chaîne alkyle linéaire, A est représenté par le groupement -(CH2)-n. Lorsque A est une chaîne alkyle ramifiée, il s'agit de préférence d'une chaîne substituée par un ou plusieurs radicaux méthyle ou éthyle. Il s'agit, par exemple, de la chaîne méthyl-1, méthane diyl; méthyl-1, éthane diyl-1,2; méthyl-1 ou -2 propane diyl-1,3; méthyl-1,2, propane diyl-1,3; éthyl-1, éthane diyl-1,2. Lorsque A représente un radical cyclique saturé, il s'agit de préférence du radical cyclopropane, cyclobutane, cyclopentane cyclohexane, cyclopheptane, cyclooctane, cyclononane, cyclodécane, cyclocindécane, cyclododécane. Lorsque A représente un radical hétérocyclique renfermant ou 6 chaînons, il s'agit de préférence du radical thiazolyle, pyridinyle, 4,5dihydrothiazolyle, oxazolyle, isoxazolyle, imidazolyle, pyrimidyle, thiényle. L'invention concerne notamment les supports de formule (I) pour lesquels t est un matériau constitué de silice ayant une granulométrie homogène et pour lesquels les fonctions aminées sur les noyaux phényl sont soit en méta, soit en para. On peut utiliser une silice commerciale, par exemple la silice YYDAC AMI ayant des grains dont le diamètre est de 20 et des pores de 300 A. Toute autre silice comparable à la silice VYDAC A peut être utilisée. On peut employer également une silice pour chromotagraphie, Que, silice H&C.mrar exemple la silice commercialisée sous le nbe de perosil S dent le diamètre des grains est compris entre 37 et 75 I. L'invention concerne notamment des nouveaux supports de formule (I), pour lesquels m est un nombre entier pouvant varier de 1 à 5 et pour lesquels A est un radical CH2 et plus particulièrement de nouveaux supports de formule (I) pour lesquels x est un nombre entier pouvant varier de 0 à 10 et x1 un nombre entier pouvant varier de 0 à 5 et pour lesquels m = 3. L'invention a tout particulièrement pour objet des supports dont les formules suivent: - 23 -s _O - St..((Ho) C1 C l-O-NH _ So_ S-( (HS)-tH-lcO-MH-C _> H Q - i 3? Ste -H t- cN H C- - --NHz 2o - --o--S-ócHl--'"H H,, cH o _ o s0 SI._) --.H---- 2_- JN - -o--S (CH2 1H-C -CH--/> o 2.2 le matériau ( étant une silice VYDAC A ou une silice équivalente. 4 2583772 L'invention concerne aussi un procédé de préparation des supports de formule (I) caractérisé en ce que l'on fait réagir un support de formule II: 0 0 P-- Si (CH2)m NH2 o P et m ayant les significations déjà indiquées avec un composé de formule III NR HOOC-(A)x -- H (III) H R étant un groupement protecteur de la fonction amine et les pointillés signifiant la présence éventuelle d'un atome d'hydrogène lié à l'azote, et A et x1 ayant les significations précédentes, en présence d'un agent d'activation et d'une base tertiaire, pour obtenir un support intermédiaire de formule: rn fu @) I_ 0.;C)nH A 0 que l'on traite selon la nature de R par un acide ou une base pour libérer son groupement -NH2 terminal et ainsi obtenir un support de formule I dans laquelle P, m, A et xI ont les significations données précédemment et dans laquelle x = o, support de formule (I), que l'on traite de nouveau, le cas échant, par le composé de formule III dans les mêmes conditions que précédemment pour obtenir un support intermédiaire de formule: @) _ 5; _ (C)n -aCO( intermédiaire que l'on traite de nouveau par un acide ou une base pour obtenir un support de formule I dans laquelle x = 1, procédé que l'on continue ainsi de suite en passant par des supports intermédiaires de formule: P) - 0 C> _ ^CH^^)^^- n H Eozcin Co- _(A)- dans laquelle R, Q, m, x1 ont les significations précédentes et dans laquelle x est un nombre entier pouvant varier de O à 20, jusqu'à obtention d'un support de formule (I), dans laquelle x = 20. Le groupement protecteur de la fonction amino R est par exemple un radical acyle dérivant d'un acide carbonique, tel que le radical éthoxycarbonyle, benzyloxy-carbonyle, ter-butyloxy-carbonyle (= Boc), paraméthyloxy-benzyl oxy-carbonyle, fluorenyl méthoxy carbonyle (= FMOC). On peut aussi utiliser d'autres radicaux tels que des radicaux aryle ou aralkyle substitués ou non, par exemple les radicaux benzyle ou triphénylméthyle ou o-nitrophényl sulfényle. Lorsque R a toutes les valeurs citées ci-dessus, la fonction amine est une amine secondaire, R est avantageusement une imine stable et notamment le groupement: Le HO Dans ce cas, il n'y a pas d'atome d'hydrogène lié à l'azote. L'invention concerne donc particulièrement un procédé caractérisé en ce que R est le groupement /c :c- HO dans le composé de formule III. r, Dans les conditions préférentielles de mise en oeuvre du procédé de l'invention: - - L'agent d'activation utilisé pour obtenir les supports intermédiaires est soit le phényl phosphoramido chloridate de phényle de formule: H ci o NH soit le dicyclohexylcarbodiimide. - La base tertiaire est de préférence la triéthyl amine ou la pyridine. La réaction s'effectue éventuellement au sein d'un solvant tel que le chlorure de méthylène, le diméthyl formamide, le tétrahydrofuranne, la pyridine. - Les conditions de déblocage de la fonction amine terminale des supports intermédiaires sont variables suivant les groupes protecteurs utilisés. Lorsque R est un groupement: ci on utilise avantageusement l'acide chlorhydrique. D'autres acides tels que l'acide sulfurique, l'acide dichloroacétique ou trichloroacétique peuvent aussi être utilisés. L'invention concerne aussi à titre de supports intermédiaires nécessaires à la mise en oeuvre du procédé de l'invention, les supports de formule: MR _ _ -( -c---- C o bi2 dans laquelle R est un groupement protecteur de la fonction amine et les pointillés signifient la présence éventuelle d'un atome d'hydrogène lié à l'azote et dans laquelle P est un matériau constitué de microbilles de verre ou de silice ou de kieselguhr, ou de polytétrafluoroéthylène, ou d'oxydes métalliques ou de cellulose. - m est un nombre entier pouvant varier de t à 20. - A représente soit une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée renfermant de 1 à 20 atomes de carbone, soit un radical cyclique saturé renfermant de 3 à 12 atomes de carbone, soit un radical phényle ou un radical hétérocyclique renfermant 5 ou 6 chaînons. - x est un nombre entiEr pouvant varier de 0 à 20, - x1 est un nombre entier pouvant varier de 0 à 10, les fonctions amines sur les noyaux phényls pouvant être en para, méta ou en ortho. Les supports de formule II utilisés comme produits de départ dans le procédé de l'invention sQnt préparés comme indiqué dans le brevet européen n 0035719. Lorsque R représente le groupement: ce QI-t oH les produits de formule III sont préparés comme indiqué dans J.C. Sheemar et U.S. Grenida Am. Soc. 84 2457 1982 selon le schéma suivant: ' c\ / >HOOClA)_ HA I-o Les supports de formule (I) de l'invention permettent de réaliser, sans inconvénient, la synthèse d'oligonucléotides. L'invention a donc pour objet l'application des supports de formule (I) dans la synthèse en phase solide d'oligonucléotides par la méthode aux phosphoramidites, aux phosphites, aux phosphodiesters et aux phosphotriesters. Ils permettent notamment d'obtenir un titre élevé en premiers 8 2583772 nucléosides et des intermédiaires stables. Ils peuvent être utilisés facilement dans les deux méthodes les plus classiques de synthèse solide d'oligonucléotides (méthode au phosphoramidite, au phosphite, au phosphodiester, au phosphotriester), aussi bien en 3'-> 5' qu'en 5'- >3 et pour toutes les bases puriques ou pyrimidiques usuelles. Par ailleurs, l'hydrolyse finale séparant le support du polynucléotide est réalisée facilement et en même temps que la déprotection des liaisons phosphates et des groupements protecteurs des bases puriques et pyrimidiques. L'invention concerne tout particulièrement l'application des supports de formule (I) dans la synthèse solide par la méthode au phosphotriester. L'invention a donc aussi pour objet les désoxyribonucléosides ou ribonucléosides obtenus lors de la synthèse d'oligonucléotides mettant en jeu les support de formule (I). L'invention a pour objet de nouveaux désoxyribonucléosides ou ribonucléosides sur supports de formule: )isAL (_C ^%aR^I^. CI) dans laquelle le support de formule (I) est relié à un ribonucléoside ou à un désoxyribonucléoside, soit en 3', soit en 5', par l'intermédiaire d'un groupement -C-Z-C-, dans lequel Z..DTD: 0 0 est un groupement hydrocarboné renfermant de 2 à 20 atomes de carbone, ou un groupement phényle, la fonction hydroxyle étant éventuellement protégée soit en 3', soit en 5' et dans laquelle A' est soit un atome d'hydrogène si le support de formule (I) est relié à un désoxyribonucléoside, soit OR1 si le support de formule (I) est relié à un ribonucléoside, R1 étant soit un atome d'hydrogène, soit un groupement protecteur usuel de la fonction hydroxyle, B1 est une base purique ou pyrimidique dont la fonction amine est éventuellement protégée et plus particulièrement de nouveaux désoxyribonucléosides sur supports de formule: 9 2583772 R O- >' Il -c-Rl dans laquelle le support de formule (I) est relié à un désoxyribonucléoside en 3' par l'intermédiaire d'un groupement -C-Z-C-, dans lequel Z est un groupement hydrocarboné, renfermant de 2 0 0 à 20 atomes de carbone ou un groupement phényle et la fonction hydroxyle en 5' est éventuellement protégée par un groupement protecteur R2 usuel, B1 est une base purique ou pyrimidique, dont la fonction amine est éventuellement protégée. L'invention concerne aussi les nucléotides obtenus par application des supports de formule (I) à leur synthèse. L'invention a donc pour objet de nouveaux oligo désoxyribonucléotides ou oligoribonucléotides sur supports pour lesquels le nucléoside attaché soit en 3', soit en 5' au support de formule (I), ayant la formule suivante: 0A ô)s5-CI)I-_ 4)_ KZ Béât oR.-o je CI) est lui-même relié par des liaisons phosphodiesters ou triesters du type: Po R93 an 3 J du 2583772 dans lesquelles R3 est soit un atome hydrogène, soit un groupement protecteur à d'autres nucléotides portant les bases B2,....,B(y-l) jusqu'au dernier nucléoside de formule: b étant la dernière base de l'oligodésoxy ou oligoribunucléotide, la fonction hydroxyle du dernier nucléoside en 5' ou en 3' étant éventuellement protégée et les différentes bases puriques ou pyrimidiques ont leurs fonctions amines éventuellement protégées et plus particulièrement de nouveaux oligodésoxyribonucléotides sur supports de formule: joR e eV CI) dans laquelle le support de formule (I) est relié en 3' à un oligo- désoxyribonucléotide portant des bases B1, B2-----By et dans laquelle R2 est soit un atome d'hydrogène, soit un groupement protecteur, R3 est soit un atome d'hydrogêne,.soit un groupement protecteur, les bases puriques ou pyrimidiques ayant leurs fonctions amines éventuellement protégées. Dans les nucléosides ou oligonucléotides définis précédemment Z est de préférence un radical phényle ou un radical -(CH2)n, n étant un nombre entier pouvant varier entre 2 et 20. L'invention concerne tout particulièrement des nucléosides ou oligonucléotides de formule (I), tels que définis ci-dessous pour lesquels Z est de préférence un radical -(CH2)2. Dans les ribonucléosides ou oligoribonucléosides, tels que définis cidessus, R1 est un groupement protecteur usuel de la fonction hydroxyle, tel que les groupements pyranyle, silyle, benzyle. Dans les nucléosides ou nucléotides définis précédemment, les bases B1, B2 --- By représentent l'adénine, la guanine, (bases puriques) la cytosine, l'uracile ou la thymine (bases pyrimidiques). Ces bases peuvent aussi être des bases puriques ou pyrimidiques substituées telles que par exemple la 6-méthylaminopurine ou la 6diméthyl-aminopurine, la 1-méthyl-guanine, la 5-méthyl-cytosine, la hydroxyméthyl-cytosine, la dihydro-uracide. Toutes les bases dites rares ou mineures que l'on trouve dans certains acides nucléiques peuvent être utilisées. Les groupements protecteurs des fonctions amines de ces bases sont par exemple des groupements benzoyle ou isobutyryle. Le groupement protecteur R2 de la fonction hydroxyle en 5' est par exemple un radical trityle, monométhoxytrityle diméthoxytrityle, pixyle. Le groupement protecteur R3 des fonctions hydroxyle des groupements phosphate est par exemple le radical ortho ou para chlorophényle. Les méthodes de synthèse d'oligonucléotides mentionnées précédemment sont très usuelles et parfaitement connues de l'homme de l'art. On peut les trouver résumées par exemple dans l'article The Chemical Synthesis of DNA Aldrichimica Acta, vol. 16, N 3-1983. Il est rappellé briévement ci-après les différentes étapes de la synthèse 3'->5' d'oligo désoxyribonucléotides par la méthode aux il 12 2583772 phosphotriesters. Il va de soi que les étapes sont strictement les mêmes pour la synthèse d'oligo ribonucléotides et/ou si la synthèse se fait en 5' 3', le groupement protecteur de l'hydroxyle en 3' devant être dans ce cas convenablement choisi. 1. Préparation d'un désoxynucléoside activé: Rué X0 4 anhydride |, succinique) diméthylamino CH pyridine _ c" -C o H o On peut utiliser l'acide libre ou activé par un groupement pentachloro phényle (Itakura et al. Nucl. Ac. Res. 8, 22, 5473, 1980) ou paranitro phényle: MH Caruthers, Chemical and Enzymatic Synthesis of gene fragments H.Cr Gassen et A. Lang, Verlag Chemie (1982) p. 71. - 2. Condensation du désoxynucléoside préparé précédemment sur un support de formule (1) dénommé schématiquement ci-après: o t cL ___nHz{I) Cette condensation s'effectue en solution dans le diméthylformamide en utilisant comme catalyseur soit la triéthylamine pendant 20 à 24 heures, soit le dicyclohexylcarbodi-imide dans la pyridine (1 nuit à 3 jours), soit la diméthylamino-pyridine dans la pyridine. On obtient: RO vo C,-CHZ- CH2 COKH e o o On déprotège la fonction hydroxyle en 5' par traitement avec un acide de Lewis, par exemple avec le bromure de zinc ou avec un acide 13 2583772 di ou trichloroacétique. 3. Allongement de la chaine désoxyoligonucléotidique: On utilise soit des nucléotides monomères, soit des nucléotides dimères sous forme de leurs sels de triéthylanmmnonium. Les dimères sont stockés sous forme de dérivés cyanoéthylés. On prépare le sel de triéthylammonium juste avant la synthèse. Apres avoir éliminé le groupement protecteur de l'hydroxyle 5' du premier nucléoside fixé sur le support, on condense ce dimère en présence de mésithyl sulfonyl, 3-nitro, 1, 2, 4-triazole ou MSNT ou du mélange chlorure de mésithyl sulfonyl-méthyl imidazole dans la pyridine. -rt HiCOt' 0-- 2. 07 --- -- --; i -1 R. 14 2583772 Avant chaque couplage, on élimine le groupement protecteur en 5' du dernier nucléotide accroché sur la chaîne. 4. Séparation du support et de la chaîne oligonucléotidique On utilise, par exemple, le mélange para-nitrobenzaldoxime et N,N,N',N'tétraméthylguanidine dans le mélange dioxane et eau (1/1) qui coupe l'oligonucléotide du support. Ce réactif très doux permet aussi de cliver sélectivement les liaisons phosphates aryliques par rapport aux phosphates aliphatiques réalisant ainsi le déblocage des phosphates sans casser la chaîne synthétisée. Il faut ensuite traiter l'oligonucléotide ainsi obtenu, de façon à libérer toutes les fonctions protégées lors de la synthèse. Plusieurs traitements de purification (électrophorèse HPLC) sont alors nécessaires pour obtenir le polynucléotide désiré. Seule, une ultime étape de séquençage permet de connaître de façon certaine, si cela s'avère nécessaire, la structure de l'oligonucléotide. Les exemples donnés ci-dessous illustrent l'invention, sans toutefois la limiter. Exemple 1: Préparation du support: Silice - 0O- Si-(CH2) NH-Ci -.NH2 1- O 0/ 3 il 1 0 NH2 STADE A: Préparation du support de départ: _- O -.--. Silice -O0- Si(2)NH On opère comme indiqué au début de l'exemple 1 du brevet européen n 0035719 à partir de 10 g de silice VYDAC Aw (granulométrie 20 p--Pores 300 A) et de 11,5 g de 3-amino propyltriéthoxy silane. On obtient le support attendu présentant un titre en NH2 de 3.10-4 équivalent/gramme (dosage par la méthode à l'acide picrique). STADE B: Préparation du support. On agite pendant une nuit: - 600 mg de support obtenu au stade A, 2583772 - 550 mg d'acide 4 /(5-chloro, 2-hydroxy benzylidène)-amino/benzoique (préparation donnée à la fin de l'exemple 1). - 534 mg de phényl phosphoramido chloridate de phényle (.préparation donnée à la fin de l'exemple 1), - 10 cm3 de chlorure de méthylène, - 0,54 cm3 de triéthylamine. On essore le précipité obtenu, empâte avec du diméthylformamide chaud (100 C), jusqu'à absence de coloration du filtrat. On effectue sur la silice un test à la ninhydrine qui est négatif (absence de groupement -NH2 libre). On obtient un support pesant 583 mg que l'on met en suspension dans 5 cm3 de méthanol à 50% dans l'eau. On ajoute de l'acide chlorhydrique 0,1 N pour maintenir le pH à 1, agite i heure, essore, lave successivement avec: - 20 cm3 d'un mélange méthanol-eau (1-1), - 100 cm3 de méthanol anhydre, - 100 cm3 de chlorure de méthylène. On sèche sous pression réduite, à température ambiante pendant une nuit et obtient 563,5 mg de support attendu. 1/.Préparation de l'acide 4 -/(5-chloro, 2-hydroxy benzylidène) amino/benzoique. On opère comme indiqué dans J.C. Sheenam et U.S. Grenda Am. Soc. 84 2457 (1982) à partir de 1,37 g d'acide para-amino benzoTque de 2,35 g de 5 chloro-salicylaldéhyde, de 240 cm3 d'éthanol et de 17 cm3 de méthanol anhydre. On obtient 2,59 g de produit attendu. 2/.Préparation du phényl phosphoramido chloridate de phényle. On opère comme indiqué dans Synthésis 288 (1982) à partir de 22,2 cm3 de phosphorodichloridate de phényle, de 175 cm3 de benzène anhydre, d'une solution renfermant 12,5 cm3 d'aniline dans 75 cm3 de benzène anhydre. On obtient 24,8 g de produit attendu. Exemple 2: Préparation du support: - c úiH-C _ IH 0 0 00 On opère comme au stade B de l'exemple 1, à partir du support obtenu à l'exemple 1 et obtient 490 mg de support attendu ayant un titre en NH2 de 2.10-4 équivalent/gramme (dosage à l'acide picrique). Exemple 3: Preparation de support. j o s(CH2)3-rqH-C- _ g-C _"HC_ -_0 0 0-0 0 O On opère commrne au stade B de l'exemple 1, à partir du support obtenu à l'exemple 2. On obtient 462 mg de support attendu ayant un titre en NH2 de 1,5-10-4 équivalent/gramme (dosage à l'acide picrique). Exemple 4: Préparation du support. Slic e _ SIL 4C^)3N--Hc Ha _-(CH3 F- I- H On agite pendant 48 heures à température ambiante: - 200 mg de support obtenu au stade A de l'exemple 1, - 5 cm3 de pyridine anhydre, - 275 mg d'acide 3 /(5-chloro 2-hydroxy benzylidène) amino/ phényl acétique, (préparation donnée à la fin de l'exemple 4), - 200 mg de dicyclohexyl carbodiimide. On essore, puis lave successivement avec du dioxane, du méthanol, du diméthylformamide chaud, du méthanol. On sèche sous pression réduite à température ambiante et obtient 195 mg de support attendu. Le test à la ninhydrine est négatif. La silice précédemment obtenue est mise en suspension dans - 2 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1 N, 5 cm3 de méthanol, 3 cm3 d'eau. On agite 1 heure à température ambiante, essore, lave avec le mélange méthanol-eau (1-1). On obtient 190 mg de support attendu ayant un titre en -NH2 de 1,95.10-4 équivalent/gramme (titre obtenu par dosage photométrique en UV du 2hydroxy, 5-chloro benzaldihyde libéré contenu dans le filtrat). - Préparation de l'acide 3-/(5-chloro, 2-hydroxybenzylidène) amino/ phényl acétique. On opère comme indiqué dans J.C. Sheemann Am. Soc. 84 2457 (1982) à partir de 1,5 g d'acide 3-aminophényl acétique, de 1,72 g de -chloro, 2- hydroxy benzaldéhyde, de 480 cm3 d'éthanol 100 et de cm3 de méthanol. On obtient 2 g de produit attendu. Exemple 5: Préparation du support I -Z o On agite pendant 72 heures le support obtenu à l'exemple 4 avec 5 cm3 de pyridine anhydre, 200 mg d'acide 3-/(5-chloro 2-hydroxy benzylidène) amino/ phényl acétique et 200 mg de dicyclohexyl carbodiimide. On essore et lave successivement avec du diméthylformamide, du méthanol, du chlorure de méthylène, de l'oxyde d'éthyle éthylique. On sèche sous pression réduite. On reprend le produit obtenu avec 2 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1 N, 5 cm3 de méthanol, 3 cm3 d'eau, agite 1 heure, essore, lave avec un mélange méthanol-eau (1-1). On obtient 180 mg de support attendu et ayant un titre en NH2 de 1,97.104 équivalent/gromme (titre obtenu par dosage photométrique en UV du 2hydroxy, 5-chloro benzaldéhyde libéré contenu dans le filtrat). Synthèse d'oligonucléotides par la méthode au phosphotriester Le support de formule (I) est disposé dans une minicolonne entre deux filtres en polyfluoroéthylène. Les deux filtres sont maintenus dans une position fixe par deux pistons creux. L'ensemble est fermé en haut par un bouchon à vis muni d'un septum par lequel on introduit à la seringue le mélange de couplage. L'appareil utilisé est semblable à celui décrit dans Chemical and Enzymatic Synthésis of fragments H.Cr Gassen A. Lang Verlag Chemie 82, p. 14. Toutes les opérations répétitives de lavage et d'introduction de réactifs sont automatisées. Le nombre de nucléotides à introduire pour la totalité de la synthèse peut être programmé. L'introduction du nucleotide est la seule opération manuelle à effectuer à la seringue. On place dans le réacteur la quantité de support de formule (I) condensé avec le premier nucléoside portant la première base B1 nécessaire pour la synthèse envisagée (25 à 150 mg). On programme convenablement les paramètres souhaités, en particulier le nombre de nucléotides à accrocher, puis on commence le cycle automatique suivant: Etape 1: Solvant: Type d'introduction: Temps Isocyanate de phényle à 10 % dans la pyridine : Pyridine : : Chlorure de méthylène : Flux continu : lcm3/mn Fractions programmées Flux continu 1 cm3/mn Flux continu environ 2 cm3/mn mn mn mn 3 mn : acide dichloro :acétique à 10 % :le chlorure de : méthylène :DMF :Pyridine dans: Flux continu environ 2 cm3/mn : Flux continu : environ 1 cm3/mn : Flux continu : environ 1 cm3/mn : : Couplage : à la seringue mn à 1 h Etape 2: On effectue autant de cycles identiques au premier, qu'il est nécessaire pour obtenir le nucléotide souhaité. Les solvants utilisés dans ce cycle de synthèse doivent être très purs et anhydres. Le dosage U de la quantité des ions tritylium effectué après dêtritylation permet de connaître le rendement de chaque couplage. : Pyridine : 4,5 mn mn mn 19 2583772 Le mélange de couplage est préparé juste au moment de l'emploi, il comprend: - 10 équivalents de sels de triéthylammonium du nucleotide monomère ou dimère (par rapport à la quantité du premier nucléoside présent sur le support solide). - 30 équivalents de mésithyl sulfonyl, 3nitro, 1,2,4-triazole ou MSNT dans la pyridine anhydre (0,3 cm3 pour 50 mg de dimère environ). Ce mélange est transféré dans une seringue sous atmosphère d'argon anhydre, on l'ajoute en trois fois à intervalles réguliers. Pour obtenir l'oligonucléotide totalement déprotégé, il est ensuite nécessaire: - d'effectuer un certain nombre de traitements qui sont très usuels et décrits, par exemple, dans Chemical and Enzymatic Synthesis of gene fragments H. Cr. Gassen and A. Lang Verlag Chemie 82, pages 2 à 42. Ces traitements sont les suivants: 1/. Cliver le nucléotide de son support solide. On effectue un traitement par une solution 0,3 M d'o-nitro- benzaldoximate de 1, 1, 3, 3 tétraméthyl guanidinium dans un mélange dioxane-eau 1-1. On procède de manière très usuelle, comme indiqué dans Nucleic. Acides. Research. Vol. 9 n 18 1981, p. 4611. Ce réactif très doux permet aussi de cliver sélectivement les liaisons phosphates aryliques par rapport aux phosphates aliphatiques réalisant ainsi le déblocage des phosphates sans casser la chaÂne synthétisée. 2/. Débloquer les fonctions amines des bases azotées. On effectue un traitement par NH40H saturé (.__37%) et libère ainsi toutes les amines des bases azotées. 3/. Débloquer la fonction en 5' du dernier nucléotide. On effectue un traitement par un mélange CH3COOH-eau (4-1). Après concentration à sec, sous pression réduite, on reprend avec de l'eauet extrait à l'éther pour éliminer tous les réactifs et les produits de clivage. L'oligonucléotide à y maillons ainsi obtenu, contient de nombreuses impuretés (nucléotides à y-2, y-4--- maillons, produits de diverses dégradations). L'obtention du produit recherché nécessite plusieurs étapes successives de purification: - chromatoraphie sur gels, - HPLC, * - Electrophorèse, - Siquençage: Cette dernière méthode donne sans ambiguité, dans l'ordre, la suite des nucléotides monomères. -Ces méthodes sont très usuelles. La demanderesse ne fait donc que les citer. Exemple 6: Oligodésoxyribonucléotides synthétisés en utilisant le support de l'exemple 2. 1/. Préparation du 5'-diméthoxytrityl, 2'-déoxy thymidine, 3'-paranitro phinyl succinate On utilise la méthode décrite par MH Caruthers, Chemical and Enzymatic Synthetis of gene fragments, H.Cr. Gassen et A Lang Verlag Chemie (1982) p. 71, à partir de 1,557 g d'acide 5'-diméthoxytrityle, 2'déoxy thymidine, 3'-succinique de 10 cm3 de dioxane anhydre, de 0,5 cm3 de pyridine anhydre, de 369 mg de para nitrophénol, de 585 mg de dicyclohexyl carbodiimide en solution dans 2,5 cm3 de dioxane anhydre. On obtient 1,150 g de produit attendu. 2/. Condensation entre le support de l'exemple 2 et le succinate de thymidine activé préparé ci-dessus. On agite à l'obscurité, pendant 72 heures, 99 mg de support de l'exemple 2 titrant en NH2 2.10-4 eq/g, 80 mg de succinate de thymidine activé préparé ci-dessus, soit environ 6,3 équivalents, 80 mg de dicyclohexyl carbodiimide, 2 cm3 de pyridine. On essore et lave successivement avec de la pyridine un mélange chlorure de méthylène- méthanol, chlorure de méthylène, puis sèche sous pression réduite. On obtient 95 mg de support condensé attendu, ayant un titre en diméthoxytrityl de 8,8 10-5 eq/g. 3/. On obtient, à partir du support condensé avec le succinate de thymidine, en utilisant trois monomères, l'oligo-désoxyribonucléotide 5'd (T C T A) et en utilisant trois dimèresl'oligo-désoxyribonucléotide '-d (TCC TT AC). Exemple 7: oligo-désoxyribonucléotide synthétisé en utilisant le support de l'exemple 3. 1/. Préparation du 5'-diméthoxytrltyl, 2'-N benzoyl désoxycytidine, 3'-para nitro phényl succinate. On utilise la méthode décrite par MH Caruthers, Chemical and Enzymatic Synthesis of gene fragments, H-Cr Gassen et A. Lang, Verag Chemie (1982) p. 71 à partir de 4,16 g d'acide 5'-diméthoxytrétyl, 2'-déoxy, N-benzoyl cytidine 3'-succinique, 25 cm3 de dioxane anhydre, 0,8 cm3 de pyridine, 1,16 g de paranitrophénol, 1,83 g de dicyclohexyl- 21 2583772 carbodiimide dans 8,33 cm3 de pyridine. On obtient 3,6 g de produit attendu. 2/. Condensation entre le support de l'exemple 3 et le succinate de cytosine activé préparé ci-dessus. On mélange pendant deux jours à l'obscurité 100 mg de support de l'exemple 3 titrant en NH2 1,5 10-4 eq/g, 110 mg de succinate de cytosine activé préparé ci-dessus, soit environ 10 équivalents et 87 mg de dicyclohexylcarbodiimide. On lave et sèche comme à l'exemple précédent et obtient 95 mg de support condensé attendu ayant un titre en diméthoxytrityle de 7-105 eq/g. 3/. On obtient, à partir du support condensé, avec le succinate de cytosine en utilisant 3 dimères l'oligodésoxynibonucléotide '-d (CCC TTAC) . Exemple 8: oligo désoxyribonucléotides synthétisés en utilisant le support de l'exemple 5. On condense 145 mg de support de l'exemple 5 avec 220 mg de succinate de cytosine activé en présence de 150 mg de dicyclohexylcarbodiimide et de 2 cm3 de pyridine de la même façon qu'à l'exemple 7. On obtient 140 mg de support condensé attendu titrant 5,55 10-5 eq/g en diméthoxytrityle. On obtient à partir de ce support condensé en utilisant 3 dimères l'oligodésoxyribonucléotide suivant 5'-d (CCC TTAC) et en utilisant deux dimères l'oligo-désoxyribonucléotide de '-d (CCCTT). REVENDICATIONS 1/. Supports de formule (I): (I) dans laquelle P est un matériau constitué de microbilles de verre ou de silice ou de kieselguhr, ou de polytétrafluoroéthylène ou d'oxydes métalliques ou de cellulose. - m est un nombre entier pouvant varier de 1 à 20. - A représente soit une chalne alkyle linéaire ou ramifiée renfermant de i à 20 atomes de carbone, soit un radical cyclique saturé renfermant de 3 à 12 atomes de carbone, soit un radical phényle ou un radical hétérocyclique renfermant 5 ou 6 chaînons, - x est un nombre entier pouvant varier de 0 à 20, - x1 est un nombre entier pouvant varier de 0 à 10, les fonctions amines sur les noyaux phényl pouvant être en para, méta ou en ortho. 2/. Supports de formule (I) tels que définis à la revendication 1 pour lesquels (t est un matériau constitué de silice ayant une granulométrie homogène et pour lesquels les fonctions aminées sur les noyaux phényls sont soit en méta, soit en para. 3/. Supports de formule (I) tels que définis aux revendications 1 et 2, pour lesquels m est un nombre entier pouvant varier de 1 à 5. 4/. Supports de formule (I), tels que définis aux revendications 1 à 3, pour lesquels A est un radical -CH2-. 5/. Supports de formule (1) tels que définis aux revendications i à 4, pour lesquels x est un nombre entier pouvant-varier de 0 à 10 et x1 un nombre entier pouvant varier de 0 à 5. 6/. Supports de formule (I) tels que définis aux revendications i à 5, pour lesquels m = 3. 7/. Support dont les formules suivent: - o "s( _(CH)3 - ""-,,NX- -"" _, mi. _ O __(cH3 -H- oH - 5 - o _ S -(CH2)3 _NH k c _N H]$ ij- -HL --- o -_ _oi _( _NH-CIl- H z- Q _- S o _o_ i_(CH --I".H--C -CH- H_ __CH le matériau étant une silice VYDAC A ou une silice équivalente. 8/. Procédé de préparation des supports tels que définis à la revendication 1, caractérisé en ce que l'on fait réagir un support de formule II: N- O @@ 0 - Si (CH2)m NH2 0/ P et m ayant les significations déjà indiquées avec un composé de formule III: NR HOOC-(A)xl " HjII H R étant un groupement protecteur de la fonction amino et les pointillés signifiant la présence éventuelle d'un atome d'hydrogène lié à l'azote, et A et x1 ayant les significations précédentes, en présence d'un agent d'activation et d'une base tertiaire, pour obtenir un support intermédiaire de formule: )-0 S (cHz) "- _ (A) _ 0 d que l'on traite selon la nature de R par un acide ou une base pour libérer son groupement -NH2 terminal et ainsi obtenir un support de formule I dans laquelle Q., m, A et X1 ont les significations données précédemment et dans laquelle X = O, support de formule (I), que l'on traite de nouveau, le cas échéant, par le composé de formule III dans les mêmes conditions que précédemment pour obtenir un support interriédiaire de formule: ) \ -o /5-- _ (C.z) -.._coO H_(A) - @ Ah dico-(A)H_ -- ' intermédiaire que l'on traite de nouveau par un acide ou une base pour obtenir un support de formule I dans laquelle x = 1, procédé que l'on continue ainsi de suite en passant par des supports intermédiaires de formule: MR P) "' C- -*- - (c H 2) CO-(A)U si > r1H _CO- (A) - X dans laquelle R, O, m, x1 ont les significations précédentes et dans laquelle x est un nombre entier pouvant varier de 0 à 20, jusqu'à obtention d'un support de formule (I), dans laquelle x = 20. 9/. A titre de supports intermédiaires nécessaires à la mise en oeuvre du procédé de l'invention, les supports de formule mR - O -"-(CH2 fl-] -lR) o- -X ) \o / 'i - cH lH -v dans laquelle R est un groupement protecteur de la fonction amine et les pointillés signifient la présence éventuelle d'un atome d'hydrogène lié à l'azote et dans laquelle P est un matériau constitué de microbilles de verre ou de silice ou de kieselguhr, ou de polytétrafluoro éthylène ou d'oxydes métalliques ou de cellulose. - m est un nombre entier pouvant varier de 1 à 20. - A représente soit une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée renfermant de 1 à 20 atomes de carbone, soit un radical cyclique saturé renfermant de 3 à 12 atomes de carbone, soit un radical phényle ou un radical hétérocyclique renfermant 5 ou 6 chaînons, - x est un nombre entier pouvant varier de 0 à 20, - x1 est un nombre entier pouvant varier de 0 à 10, les fonctions amines sur les noyaux phényls pouvant être en para, méta ou en ortho. /. Procédé de préparation tel que défini à la revendication 8, caractérisé en ce que R est le groupement: dans le composé de formule III. LU -2583772 11/. Application des supports de formule (I), tels que définis à l'une quelconque des revendications I à 7 à la synthèse en phase solide d'oligonucléoitides par la méthode aux phosphoramidites, aux phosphites, aux phosphodiesters et aux phosphotriesters. 512/. Application des supports de formule (I), tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 7 à la synthèse en phase solide d'oligonucléotides par la méthode aux phosphotriesters. 13/. Nouveaux désoxyribonucléosides ou ribonucléosides sur supports de formule: oie CI dans laquelle le support de formule (I) est relié à un ribonucléoside ou à un désoxyribonucléoside, soit en 3', soit en 5', par l'intermédiaire d'un groupement -C-Z-C-, dans lequel Z Il Il 0 0 est un groupement hydrocarboné renfermant de 2 à 20 atomes de carbone, ou un groupement phényl, la fonction hydroxyle étant éventuellement protégée, soit en 3', soit en 5' et dans laquelle A' est soit un atome d'hydrogène H si le support de formule (I) est relié à un désoxyribonucléoside, soit OR1 si le support de formule (I) est relié a un ribonucléoside, R1 étant soit un atome d'hydrogène, soit un groupement protecteur usuel de la fonction hydroxyle B1 est une base purique ou pyrimidique dont la fonction amine est éventuellement protégée. 14/. Nouveaux désoxyribo nucléosides sur supports, tels que définis à la revendication 13 de formule: 35.... . _ RO, A Il o0 ( PoRnet ( i) vC)M t 1 oc dans laquelle le support de formule (I) est relié à un désoxyribonucléoside en 3' par l'intermédiaire d'un groupement -C-Z-C-, dans lequel Z est un groupement hydrocarboné, renfermant de 2 II Il 0 0 à 20 atomes de carbone ou un groupement phényle et la fonction hydroxyle en 5' est éventuellement protégée par un groupement protecteur R2 usuel, B 1 est une base purique ou pyrimidique, dont la fonction amine est éventuellement protégée. /. Nouveaux oligo désoxyribonucléotides ou oligoribonucléotides sur supports pour lesquels le nucléoside attaché soit en 3', soit en 5' au support de formule (I), ayant la formule suivante: O 0S ( LFstH2?f1)_ t "ii NH _iÂ _ / LJ...! J ORrU le CI) est lui-même relié par des liaisons phosphodiesters ou triesters du type: & 7 ?ep y.... 0 t3 .. B(y-1) jusqu'au dernier nucléoside de formule: étant la dernière base de l'oligodésoxy ou oligoribonucléotide, la fonction hydroxyle du dernier nucléoside en 5' ou en 3' étant éventuellement protégée et les différentes bases puriques ou..CLMF: pyrimidiques ont leurs fonctions amines éventuellement protégées. 16/. Nouveaux oligodésoxyribonucléotides sur supports, tels que définis à la revendication 15 de formule: C-Z- I JO ROIe CI) !S- dans laquelle le support de formule (I) est relié en 3' à un oligo- désoxyribonucléotide portant des bases B1, B2 ----- By et dans laquelle R2 est soit de l'hydrogène, soit un groupement protecteur, R3 est soit de l'hydrogène, soit un groupement protecteur, les bases puriques ou pyrimidiques ayant leurs fonctions amines éventuellement protégées. 17/. Nouveaux désoxyribonucléosides, ribonucléosides oligodésoxy- ribonucléotides ou oligoribonucléotides sur supports tels que définis aux revendications 13 à 16 pour lesquels Z est le radical -(CH2)2.