FR 2573436 A1 19860523 FR 8417674 A 19841120 ADN recombinant comportant une séquence nucléotidioue co- dant pour un polypeptide déterminé sous le contrôle d'un promoteur d'adénovirus. vecteurs contenant cet ADN recom- binant, cellules eucarvotes transformées par cet ADN re- combinant, produits d'excrétion de ces cellules transfor- mées et leurs applications, notamment à la constitution de vaccins. L'invention concerne un ADN recombinant comportant une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide déterminé sous le contrôle d'un promoteur d'adénovirus, des vecteurs contenant cet ADN recombinant et des cellules eucaryotes transformées par cet ADN recombinant, les pro- duits d'excrétion de ces cellules transformées et leurs applications, notamment à la constitution de vaccins. Les adénovirus humains possèdent un long génome (environ 36.000 pb) linéaire et double brin qui code pour au moins 30 protéines. Le cycle viral, au cours de l'in- fection de cellules permissives, est divisé en deux pha- ses, précoce et tardive. Il est connu que les quatre ré- gions du génome viral exprimées en phase précoce sont appelées régions. El, E2, E3 et E4, dont les positions respectives dans le génome viral entier sont schématique- ment représentées dans la fig. 1. La région El, située à l'extrémité gauche du génome, est elle-même divisée en deux régions ElA et ElB. Le passage de la phase précoce à la phase tardive, marqué par la réplication du DNA viral, est caractérisé par un changement brutal du programme génétique du virus. L'expression de certains gènes pré- coces est réprimée alors que la transcription des gènes tardifs s'effectue principalement à partir d'un seul promoteur, le promoteur majeur tardif (fig. 1). De plus, on observe une forte répression de la synthèse des pro- téines de la cellule hôte (1). L'organisation génétique des adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad2, Ad5) est suffisamment connue pour que l'on puisse manipuler leur génome in vitro et son utilisation comme vecteur d'expression d'un gène étranger dans une cellule animale en culture a déjà été envisagée. Il est en effet connu que la région E3, qui représente 6 Z du génome, n'est pas essentielle in vitro et peut donc être substituée dans sa totalité (2). La taille du fragment de DNA étranger qu'il est possible d'insérer dans le génome de ces virus est grande. En effet, le virus peut encapsider un génome dont la longueur excède de 5 Z celle du génome sauvage. Différents vecteurs dérivés des adénovirus de type 2 ou 5 ont donc été construits. Dans ces recombinants, le gène étranger était exprimé sous le contrôle du promoteur majeur tardif. Ceci a permis d'obtenir dans certains cas une -synthèse de la protéine codée par un gène étranger à un niveau comparable à celui des protéines virales tardives (4, 5, 6, 7). Ceci étant, il résulte de ce qui précède, que l'expression du gène étranger sous le contrôle du promoteur tardif ne peut se manifester que dans la phase tardive du cycle viral. L'invention découle de la constatation que le pro- moteur de la région précoce ElA du génome d'un adénovirus (ci-après désigné simplement par "promoteur ElA") pouvait contrôler de façon particulièrement efficace l'expression d'un gène hétérologue (c'est-àdire étranger vis-à-vis des gènes qui lui sont normalement associés dans l'adénovirus) ou plus généralement d'une séquence nucléotidique hétéro- logue codant pour une séquence polypeptidique dont l'ex- pression est recherchée. En d'autres termes, le promoteur ElA se comporte comme un promoteur fort, et ce plus parti- culièrement lorsque l'ensemble promoteur ElA-séquence co- dante hétérologue est inséré dans un vecteur viral. L'invention concerne donc de façon générale un ADN recombinant pour la transformation de lignées cellulaires eucaryotes, notamment humaines ou animales, choisies parmi celles qui sont infectables par des adénovirus ou dont les polymérases endogénes sont susceptibles de reconnaitre les promoteurs des adénovirus, cet ADN recombinant étant en outre modifié par un acide nucléique d'insertion contenant une séquence nucléotidique codant pour une séquence poly- peptidique dont l'expression dans lesdites lignées cellu- laires est recherchée. Cet ADN recombinant est plus parti- culièrement caractérisée par le fait que ladite séquence d'insertion est placée sous le contrôle direct du promo- teur précoce de la région E1A du génome d'un adénovirus. De préférence, cet ADN recombinant est incorporé dans un vecteur réplicable dans lesdites lignées cellulai- res ou associé par recombinaison génétique avec un tel vecteur. S'agissant d'un vecteur viral, notamment'de celui dérivé d'un adénovirus, on peut alors également bénéficier de l'avantage s'attachant à la région ElA des adénovirus, à savoir que son expression est constitutive et permanente tout au long du cycle viral (8, 9). Une forme particulière préférée de l'ADN recombi- nant selon l'invention est caractérisée par le -fait qu'elle comporte, en aval de l'acide nucléique d'inser- tion, dans le sens de la transcription, un génome défectif d'adénovirus comprenant néanmoins l'ensemble de celles des séquences essentielles nécessaires à la réplication de l'adénovirus correspondant, qui sont normalement situées en aval des gènes normalement sous le contrôle direct du promoteur précoce ElA dans ledit génome. Avantageusement, le génome défectif d'adénovirus avec lequel l'ADN recombinant conforme à l'invention est associé, est constitué par un génome complet d'adénovirus, cependant dépourvu de la partie antérieure de la région ElA du génome viral, notamment de son fragment 0-2,6 Z (pourcentage exprimé par rapport à la taille totale du gé- nome de l'adénovirus). Les ADNs recombinants de l'invention, associés avec des éléments de vecteurs tels que ceux qui ont été 2-573436 mentionnés ci-dessus. constituent en fait des vecteurs contenant lesdits ADNs recombinants. Il sera encore en ce qui les concerne fait référence à des "virus recombinants défectifs", lorsque les éléments de vecteurs associés à l'ADN-recombinant selon l'invention seront dérivés d'un génome défectif d'adénovirus. Ces virus recombinants défectifs sont avantageusement utilisés pour la transfor- mation de lignées cellulaires transformables d'eucaryotes supérieurs (notamment d'origine humaine ou animale) comportant elles-mêmes -une séquence distincte de nucléotides apte à complémenter la partie du génome de l'adénovirus dont le susdit vecteur est dépourvu, ladite séquence distincte étant de préférence incorporée au génome des cellules de ladite lignée cellulaire. A titre d'exemple préféré de telles lignées cellu- laires, on mentionnera la lignée 293, lignée de rein em- bryonnaire humain qui contient, intégrés dans son génome, les onze premiers pourcents de l'extrémité gauche du génome d'un Ad5. Ceux-ci permettent de complémenter des virus recombinants défectifs qui portent des délétions de cette région (10). L'utilisation de ces systèmes vecteur virus défec- tif recombinant - cellules contenant une séquence capable de complémenter les virus recombinants défectifs, est d'un. intérêt tout particulier, lorsque -la séquence nucléotidique contenue dans l'acide nucléique d'insertion de l'ADN recombinant code pour une protéine qui, lors- qu'elle est exprimée dans un hôte cellulaire naturel sous le contrôle de son promoteur naturel, est excrétée dans le milieu d'une culture de cet hôte cellulaire naturel. Le gène S du génome du virus de l'hépatite B cons- titue à cet égard une séquence nucléotidique d'un intérêt particulier, et ce pour plusieurs raisons. D'une part, le produit d'expression du gêne S dans les cellules qui l'ex- priment, l'HBsAg (11, 12), est secrété dans le surnageant cellulaire sous forme de particules faciles à détecter et à quantifier par dosage radioimmunologique, ce qui permet une évaluation précise de la capacité d'expression du vec- teur viral. D'autre part, l'invention fournit un vecteur viral recombinant permettant l'étude de l'expression des gènes de l'HBV tant au niveau de la transcription que de la traduction, ce qui est d'autant plus intéressant qu'il n'existait pas jusqu'à ce jour de système de culture cellulaire capable de propager le virus de l'hépatite B (HBV). Enfin, l'infection cellulaire par le virus recom- binant adènovirus-HBV illustre de façon particulièrement avantageuse la base méthodologique d'un procédé de fabri- cation d'un vaccin contre un agent pathogène déterminé (en l'occurrence le virus de l'hépatite B dans l'exemple con- sidéré). Il va de soi que l'on peut substituer dans l'ADN recombinant le gène S par toute autre séquence nucléoti- dique codant pour un antigène protecteur distinct contre un autre agent pathogène déterminé, surtout lorsque cet antigène protecteur distinct est lui-même normalement susceptible d'être secrété par les cellules transformées par l'ADN recombinant. La séquence nucléotidique codant pour cet antigène protecteur distinct peut d'ailleurs éventuellement être insérée dans l'ADN recombinant en phase avec un autre gène, par exemple l'antigène HBsAg, dès lors que cet autre gène peut être utilisé comme "lo- comotive" pour promouvoir l'excrétion également de cet antigène distinct, notamment sous forme de protéine hy- bride. Au titre des antigènes distincts susceptibles d'être ainsi produits (le cas échéant sous forme de protéine hybride), on mentionne par exemple des glyco- protéines de structure du virus d'Epsteim-Barr. Les premiers nucléotides de la séquence nucléo- tidique codant pour un polypeptide déterminé (protéine "simple" ou hybride) sont placés, notamment par construc- tion aussi près que possible de ce promoteur, notamment de la "boite TATA" (TATA box), caractéristique du promoteur, étant cependant entendu que la séquence nucléotidique entre le promoteur et 1'ATG initiateur de la séquence nu- cléotidique codant pour ledit polypeptide déterminé devra en général contenir les triplets codant pour l'extrémité ' non traduite de l'ARN messager correspondant norma- lement à la séquence codante et contenant les séquences d'appariement aux ribosomes nécessaires à une traduction efficace. Cette extrémité 5' non traduite de l'ARN mes- sager peut d'ailleurs être remplacée par l'extrémité 5' non traduite d'un ARN messager distinct de celui norma- 0 lement associé à une séquence codante déterminée. Par exemple, on peut, dans le cas du gène S. remplacer l'ex- trémité 5' non traduite contenant le gène pré-S ou joux- tant celui-ci par l'extrémité 5' non traduite de l'ARN messager de l'antigène T de SV40. Toute autre extrémité 5' non traduite d'ARN messager peut être utilisée, dès lors qu'elle est compatible avec l'autre extrémité similaire choisie. Il est avantageux que la distance entre la boite TATA du promoteur et le site d'initiation de l'ARN mes- sager soit d'environ 30 nucléotides. Le promoteur E1A de l'ADN recombinant selon l'in- vention et encore plus généralement le vecteur selon l'in- vention mettant en oeuvre des parties plus importantes du génome d'un adénovirus sont de préférence issus d'un adé- novirus appartenant à la catégorie C, telle qu'elle a été définie par TOOZE. Ces adénovirus ont la propriété connue de n'être pas oncogènes. Les sous-types Ad2 ou Ad5 de cette catégorie d'adénovirus se caractérisent par un pouvoir transformant important. L'utilisation de ce dernier type d'ADN recombinant est donc particulièrement recommandée, lorsque le produit d'expression recherché est destiné à la production d'antigènes protecteurs, notamment de principes actifs de vaccins. Cela sera encore d'autant plus vrai dans le cas o des adénovirus entiers, et même infectieux, seront utilisés comme principes actifs de vaccins vivants, notamment dans les conditions qui seront encore explicitées plus loin. L'invention concerne naturellement également les lignées cellulaires, notamment d'origine humaine ou ani- male, qui sont transformées par des ADN recombinants tels que définis ci-dessus et qui ont été rendues capables de synthétiser un polypeptide codé par-la séquence nucléoti- dique (ou lesdites séquences nucléotidiques) contenues dans ces ADNs recombinants et placées sous le contrôle direct dudit promoteur. L'invention concerne plus particulièrement encore les lignées cellulaires transformées avec un ADN recom- binant conforme à l'invention et en outre caractérisées en ce que les cellules de ces lignées cellulaires contiennent elles-mêmes une séquence distincte de nucléotides antes à complémenter la partie du génome de l'adénovirus dont le susdit vecteur est dépourvu, ladite séquence distincte étant de préférence incorporée au génome des cellules de ladite lignée cellulaire. A ce titre, la lignée 293 déjà mentionnée plus haut, après avoir été transformée par les ADNs recombi- nants, constitue une culture cellulaire préférée selon l'invention. Grâce à la séquence de complémentation que contiennent les cellulles de cette lignée, on observe une multiplication virale importante à l'intérieur de ces cellules et, par voie de conséquence, une expression également multiplie de la séquence codante pour le polypeptide prédéterminé. Dans le cas o cette séquence codante est le gène S, on obtient une production impor- tante d'antigènes HBsAg excrétés dans le milieu de culture de ces cellules. Les mêmes vecteurs peuvent être utilisés pour la transformation de cellules Vero dans des condi- tions analogues. Les vecteurs contenant l'ADN recombinant selon l'invention peuvent également être utilisés pour la trans- formation de cellules ne possédant pas elle-même la séquence de complémentation dans les conditions qui ont 4, été indiquées ci-dessus. Il pourra alors être nécessaire de procéder à une co-transformation de ces derniers types de cellules, d'une part, avec un vecteur contenant l'ADN recombinant selon l'invention, d'autre part, avec un adénovirus non défectif ou un ADN recombinant distinct contenant les séquences d'adénovirus dont est dépourvu le vecteur recombinant conforme à l'invention. Il pourra certes être observé dans ce dernier cas une production simultanée d'antigènes HBsAg (lorsque la séquence codante contient le gène S) et de l'adénovirus répliqué et libéré par les cellules ainsi transformées. L'antigène protecteur formé peut cependant, le cas échéant, être séparé de la suspension virale, par exemple par mise en contact du milieu de culture avec des anticorps anti-adénovirus, de préférence immobilisés sur un support solide, tel que l'agarose réticulée, commercialisée sous la désignation SEPHAROSE. De toute façon, la présence de quantités ré- siduelles de virus dans la préparation vaccinante n'est que d'une importance relativement mineure. En effet, l'adénovirus n'a qu'un pouvoir pathogène faible chez l'homme. Il n'entraîne que des infections respiratoires bénignes. La faible importance du pouvoir pathogène des adé- novirus, -plus particulièrement de ceux qui appartiennent au groupe C des adénovirus humains, permet d'envisager la constitution de "vaccins vivants". Ceux-ci peuvent être constitués par des adénovirus infectieux modifiés au ni- veau de la région E3 par l'insertion de l'ADN recombinant selon l'invention dans la partie non essentielle de l'adé- novirus. A cet égard, il faut souligner le fait que les adénovirus humains du groupe C ne se sont jamais révélés tumorigènes chez l'animal (3). Ces vecteurs ou virus seront d'un intérêt tout particulier pour la transformation de cellules Vero, dont le caractère non tumorigène est maintenant solidement établi. De ce fait elles constituent une lignée d'origine animale particulièrement favorable à la production de produits à usage humain. Des caractéristiques supplémentaires de l'invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit de constructions préférées de vecteurs contenant l'ADN recom- binant selon l'invention et des conditions dans lesquelles ces vecteurs sont utilisables. Il sera fait référence à cette occasion aux dessins dans lesquels: - la fig. 1 représente schématiquement les positions rela- tives des différentes régions du génome d'un adénovirus du sous-type Ad5, d'une part, et à échelle agrandie, de la région E1A de ce génome; - la fig. 2 est un schéma désormais classique du génome du virus de l'hépatite B; - les fig. 3 à 6 montrent les constructions successives qui ont conduit à la réalisation d'un plasmide contenant un premier ADN recombinant conforme à l'invention (fig. 6) et - la fig. 7 représente schématiquement la construction d'un "virus recombinant défectif" à partir du plasmide modifié de la fig. 5 et de génomes défectifs de Ad5. On fera d'abord les observations suivantes à propos des figures, avant de décrire la réalisation de construc- tions d'ADNs recombinants selon l'invention. Dans les fig. 3 à 6, les parties en trait fin cor- respondent à des séquences du plasmide pML2. Les nombres apparaissant dans les fig. 1 à 5 in- diquent les positions des sites de restriction dans les séquences virales Ad5, SV40 et HBV. Les numérotations des positions des sites de restriction de Ad5 et du SV450 sont celles de J. TOOZE (1), celles de l'HBV sont celles de P. TIOLLAIS et al. (11). Les raturations des désignations de sites dans les dessins témoignent de la présence antérieure des mêmes si- tes dans les parties correspondantes des ADNs qui seront décrits ci-après. Ces sites ont cependant été délétés, supprimés par réparation des extrémités cohésives des fragments ouverts ou fragmentés à l'aide des enzymes de restriction correspondasntes, ou par tout autre moyen tel qu'envisagé dans la description qui suit des constructions qui ont été faites. 1. Rappel des principaux éléments de la structure et de l'organisation du génome de l'adénovirus Ad5 (ci-après souvent simplement désigné par la désignation Ad5): Ils résultent des parties 1A et 1B de la fig. 1. 1A: Le génome est une molécule de DNA linéaire double brin longue d'environ 36.000 pb. Les flèches in- diquent la position et le sens des transcriptions des régions précoces Ela, Elb, E2, E3 et E4. Le promoteur majeur tardif PMt et l'unité de transcription qui lui est associée sont également montrés. Les numérotations de 10 en 10, de 0 à 100, correspondent à des tailles exprimées en Z de la taille du génome total. 1B: La région E1A. Les transcripts de cette région ont tous des extrémités 5'P (position 499) et 3'OH (posi- tion 1632) identiques. Le premier T de l'élément TATA du promoteur est situé à la position 468. Les sites de res- triction utilisés dans les constrructions des plasmides sont indiqués. Les tailles sont exprimées par des nombres de paires de bases. 2. Origine du fragment et contenant le gène S utilisé dans les constructions gui suivent. Il est issu du génome du virus de l'hépatite B (fig. 2). Il est rappelé que le génome du virus de l'hépatite B est une molécule de DNA circulaire partiellement simple brin. Sa longueur est d'environ 3.200 pb. Il est constitué par l'appariement de deux brins de longueur inégale appelés brins L(-) et S(+). Le gène S représente la séquence codante du polypeptide majeur de l'enveloppe virale qui porte l'HBsAg. Le fragment d'ADN utilisé dans les constructions ci-après est le fragment- f11 Xh I127-BglII1984. Le site de polyadénylation du messager de l'HBsAg a été localisé à la position 1916. 3. Construction du plasmide pE1A(TaaI) (fia. 3). Le plasmide pE1A(TaqI) contient les 632 premiers nucléotides de l'extrémité gauche du génome de l'Ad5. Ce fragment a été obtenu par coupure du fragment de restric- tion purifié SacI E (0 - 5,0 Z) de l'Ad5 par TaqI (fig. 1). Ce fragment a été inséré entre les sites de restriction EcoRI et ClaI du plasmide pML2 (fig. 3) Le plasmide pML2 a été ouvert par EcoRI et ClaI. Le fragment de Ad5 a été lié au plasmide linéarisé au niveau de l'extrémité TaqI. La jonction des extrémités TaqI-ClaI recrée un site de restriction Clal. L'extrémité EcoRI du recombinant a été réparée avec la DNA-polymérase I de E. coli (fragment de Klenow) et le plasmide recircularisé au moyen de la ligase T4. Le site EcoR! a donc été reconsti- tué. 4. Fabrication du plasmide pDAB1 (fig. 4). Le plasmide pAB1 a été construit à partir du plas- mide pEIA(TaqI), de façon à éliminer la partie codante de la région ElA. Ceci a été effectué par isolement du frag- ment PvuII-PvuII (positions 452-623), coupure de ce frag- ment par l'enzyme HaeIII (position 495), réinsertion du fragment PvuII 452-HaeIII495 au niveau du site PvuII623 du plasmide pE1A(TaqI).- En d'autres termes, le fragment HaeIII495-Pvu623 a été délété. Le plasmide pAB1 contient un site HindIII proche du site d'initiation de trans- cription de la région E1A et un site BamHI (de pML2) situé à distance. Ces deux sites de restriction peuvent être utilisés pour cloner des gènes étrangers sans qu'il y ait fusion génétique. 5. Production du plasmide pK4 (fig. 5). pAB1 a été coupé par HindIII et BamHI et le frag- ment contenant le promoteur de ElA, issu de pAB1, a été lié, au niveau de son extrémité BamHI au fragment BglI-BamHI (positions 5235-2533 du génome du virus SV40) ci-après dénommé A(SV40) contenant le gène codant pour les antigènes T et t du virus SV40. Après réparation des extrémités BglI et HindIII du reconstituant par le fragment de Kleenow, le plasmide est recircularisé au moyen de la ligase T4. La construction. présente dans le plasmide pK4 a été testée en mettant en jeu l'expression transitoire du gène T. Introduit dans des cellules HeLa par transfection selon la technique- au phosphate de calcium (19), le plasmide pK4 dirige la synthèse de l' antigène T de SV40 qui a été détectée par immunofluorescence. Environ i Z des cellules transfectées présentaient une fluorescence nette. L'absence de fluorescence après transfection cellulaire par un plasmide contenant le fragment de SV40 inséré dans la mauvaise- orientation montre que le gène des antigènes T et t est bien placé sous le contrôle du promoteur E1A-de l'Ad5. C'est le site HindIlII, à la position 5171 du frag- ment A(SV40) qui est ensuite utilisé pour substituer le susdit fragment contenant le gène S à la majeure partie de A(SV40). 6. Production du plasmide DK4(S)(fiR. 6). Le plasmide pK4 a été digéré par HindII et BamHI. Le fragment XhoI-BglII (positions 125 à 1982) du génome du virus de l'hépatite B (HBV) (fig. 2) a été inséré., en lieu et place de la majeure partie de A(SV40) entre les sites de restriction HindIII et BamHI du plasmide pK4, après ré- paration de leurs extrémités respectives par la DNA poly- mérase I d'E. coli (fragment de Kleenow) (fig. 3). Les sites de restriction XhoI, HindIII, BamHI et BglII sont perdus après ligature. Le site HindIII était situé à 8 nucléotides en amont de l'ATG initiateur des antigènes T et t. L'inser- tion du gène S dans ce site permet donc de conserver l'ex- trémité 5 du mRNA précoce de SV40 contenant le site de "capping-" et les séquences d'appariement du messager aux ribosomes. Le fragment de DNA HBV contient la séquence codant.e ou gène S (position 155 à 833) du polypeptide majeur de l'enveloppe virale porteur de l'HBsAg ainsi que la séquence située en 3' du gène S et qui inclut le site de polyadénylation de l'ARN messager de l-'HBsAg à la position 1916 (20, 21, 22). Deux plasmides pK4S et pK4S porteurs du fragment HBV inséré dans les deux sens ont été isolés. Des cellules 293 ont été transfectées par ces deux plasmides et la synthèse d'HBsAg a été recherchée daas le surnageant cellulaire 3 jours après la transfection. Seul le plasmide pK4S+ qui possède le promoteur E1A à l'extré- mité 5' du gène S est capable de diriger la synthèse d'HBsAg. Ceci montre que l'expression du gène S est bien sous le contrôle du promoteur E1A de l'Ad5. Finalement, un site de restriction ClaI non méthylé dans E. coli a été introduit dans le plasmide pK4S au niveau du site NruI de la séquence pML2. Le site est nécessaire à la construction du virus recombinant. C'est finalement le fragment délimité par des ex- trémités PstI et ClaI, et obtenu à partir de pK4(S), qui a été utilisé pour la fabrication d'un "virus recombinant défectif" conforme à l'invention. 7. Construction du virus recombinant défectif (fig. 7). 3 microgrammes du fragment de restriction Pstl-ClaI purifié à partir du plasmide pK4S ont été ligaturés à 20 microgrammes du fragment de restriction ClaI (2,6 Z - 100 Z) de l'Ad5 purifié par ultracentrifugation en gradient de saccharose pour fournir le "virus défectif recombinant" AdS. 8. Propagation du virus recombinant. Les cellules 293 ont été cultivées dans des boites de 6 cm de diamètre. 4 heures avant la transfection le surnageant de culture a été remplacé par du milieu. 5 boites de cellules 293 à 70 7 de confluence ont alors été transfectées avec le mélange de ligation selon la techni- que au phosphate de calcium puis incubées pendant 4 heures à 37'C. Après adsorption, les cellules contenues dans chaque boite ont été lavées avec 2 ml de tampon TS (NaCi 8000,0 mg/l, KCl 380,0 mg/l, Na2 HP04 100,0 mg/1, CaCl2 ,0 mg/l, MgCl2, 6H20 100,0 mg/l, Tris 3000,0 mg/l pH 7,4), traitées avec 400 microlitres d'une solution TS contenant 20 Z de glycérol pendant 1 minute à température ordinaire, lavées deux fois avec 2 ml de tampon TS, puis recouverte avec 4 ml de milieu MEM contenant 1 Z d'agar noble, 1 Z de sérum de veau foetal. Aux jours 4 et 7, les cellules ont été recouvertes avec 4 ml du mélange nutritif. Aujour 10, les cellules ont été colorées avec 4 ml du milieu nutritif supplémenté avec 0,01 Z de rouge neutre. Les plages ont été observées au jour 11. Les virus ont été resuspendus dans 1 ml de TS et amplifié sur cellules 293. La présence de HBsAG dans le milieu de culture a été testée par RIA (Austria II, laboratoire ABBOTT). Après amplification, la présence de séquences HBV dans le recombinant a été testée par hybridation. Cinq plages ont été analysées. Une seule contrenait un virus recombinant HBsAg. Ce clone Ad5(S) ainsi qu'un autre clone étaient positifs pour la détection de séquences HBV. La taille du génome' viral recombinant excède celle du virus sauvage de 2100 pb. Aucune délétion n'a pu être détectée par analyse de fragments de restriction du génome recombinant. Par ailleurs, cette analyse a montréque les séquences du pML2 situées entre le site de restriction PstI et la séquence d'Ad5 ont été correctement excisées au cours de la propagation du génome recombinant dans la lignée 293. 9. La svnthèse d'HBsAq dirigée par le vecteur Ad5. Des cellules 293 et des cellules Vero ont été in- fectées par le virus Ad5(S). Des échantillons du surna- geant cellulaire ont été prélevés 3 jours après l'infec- tion et l'HBsAg a été recherché par essai radioimmunologique ("radioimmunoassay: RIA). Les résultats montrent que le vecteur Ad5(S) est capable de diriger la synthèse d'HBsAg dans ces deux lignées cellulaires, et l'excrétion d'HBsAg par les lignées cellulaires dans leurs milieux de culture respectifs. L'HBsAg synthétisé a été purifié par ultracentrifu- gation en CsCl. Il a une densité de 1,20. Des particules typiques de 22 nm ont été observées par microscopie élec- tronique. L'invention fournit donc une base méthodologique pour la fabrication d'un vaccin contre l'hépatite B (ou contre d'autres types d'affections) dans des cultures cellulaires. L'intérêt de l'utilisation de l'adénovirus de type comme vecteur est double. D'une part, ce virus est un virus dont le pouvoir pathogène chez l'homme est faible. Il n'entraîne que des infections respiratoires bénignes. D'autre part, ce sérotype qui appartient au groupe C des adénovirus humains n'est pas tumorigène chez l'animal. D'autre part, le taux de production d'HBsAg obtenu sur cellules Vero (environ 1 microgramme/10 6/par cycle in- * fectieux) est a priori suffisant pour une exploitation industrielle. Or cette lignée cellulaire est non tumori- gène et pour cette raison, elle constitue la lignée d'origine animale a priori la plus favorable à la pro- duction d'un produit à usage humain. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés; elle en embrasse au contraire toutes les variantes; parmi ces variantes, il y a lieu de mentionner les autres formes de vecteurs con- tenant l'ADN recombinant selon l'invention, notamment des plasmides. Ceux-ci peuvent être, soit utilisés pour fabri- quer des vecteurs viraux du genre de ceux qui ont été dé- crits, soit être utilisés eux-mêmes en tant que véhicules d'incorporation de l'ADN recombinant dans le-génome des cellules d'eucaryotes supérieurs, notamment des cultures de cellules humaines ou de primates. Il va également de soi que peuvent être substitués aux cellules 293 qui ont -été mentionnées plus haut toutes autres cellules d'eucaryotes supérieurs infectables par des adénovirus ou susceptibles de reconnaitre le promoteur EIA des adénovirus, ces cellules ayant été modifiées, par incorporation au préalable dans leurs propres génomes, d'une séquence contenant les parties manquantes au virus recombinant défectif selon l'invention du génome d'un adénovirus, notamment sous le contrâile d'un promoteur fort reconnu par ces cellules, par exemple d'un promoteur de la thymidine kinase ou d'un promoteur de virus SV40. La séquence originaire de l'adénovirus, alors intégrée dans le génome de ces cellules d'eucaryotes supérieurs, pourra donc complémenter les virus défectifs conformes à l'invention, dans des conditions analogues à celles per- mises par les cellules 293. Ces méthodes sont applicables avec un avantage particulier à des cellules Vero. L'adénovirus AdS mis en oeuvre a été déposé le 3 août 1984 sous le n' 1322 à la C.N.C.M. ("Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes de l'INSTITUT PASTEUR de Paris. La lignée 293 a été déposée à la C.N.C.M. le 3 août 1984 sous le n' 1-323. REFERENCES (1) Edited by Tooze, DNA Tumor Viruses (part II), Cold Spring Harbor Laboratory, 1980. (2) Berkner, K. and Sharp, P. (1983) Nucleic Acids Res. 5.11, 6003-6020. (3) Jones, N. and Shenk, T. (1978) Cell 13, 181-188. (4) Solnick, D. (1983) The Embo Journal 2, 845-851. (5) Thummel, C., Tjian, R. and Grodzicker, T. (1981) Cell 23, 825-836. (6) Berkner, K. and Sharp, P. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 1925-1941. (7) Thummel, C., Tjian, R., Shiu-Lok Hu and Grodzicker, T. (1983) Cell 33, 455-464. (8) Spector, D., Mc Grogan, M. and Raskas, H. (1978) 3. Mol. Biol. 126, 395-414. (9) Shan, A. R. and Ziff, E. B. (1980) Cell 22, 905-916. (10) Graham, F.L., Smiley, 3., Russel, W.C. and Nairn, R. (1977) 3. Gen. Virol. 36, 59-72. (11) Tiollais, P., Charnay, P. and Vyas, G. (1981) Science 213, 406-411. (12) Peterson, D.L. (1981) 3. Biol. Chem. 256, 6975-6983. (13) Lusky, M. and Botchan, M. (1981) Nature 293, 79-81. (14) Enns, R., Challberg, M., Ahern, K., Chow, K., Mathews, C., Astell, R. and Pearson, G. (1983) Gene, 23, 307-313. (15) Tibbetts, C. (1977) Cell 12, 243-249. (16) Hammarskjold, M.L. and Winberg, G. (1980) Cell 20, 787-795. (17) Stow, N. (1981) 3. Virol. 37, 171-180. (18) D'Halluin, J.C., Milleville, M. and Boulanger, P. (1983) Gene 21, 165-169. (19) Graham, F.L. and Van Der Eb, A.3. (1973) Virology 52, 456-467. (20) Charnay, P., Mandart, E., Hampe, A., Fitoussi, F., Tiollais, P., and Galibert, F. (1979) Nucl. Acids Res. 7, 335-346. (21) Valenzuela, P., Gray, P., Quiroga, M., Zaldivar, 3., Goodman, H.M., Rotter. W.J. (1979) Nature 280, 815- 819. (22) Pourcel, C., Louise, A., Gervais, M., Chensiner, N., Dubois, M. F., Tiollais, P. (1982), 3. Virol. 42, 100- 105. (23) Stenlund, A., Lamy, D., Moreno-Lopez, S., Ahola, H., Petterson, U. and Tiollais, P. (1982) EMBO J2, 669- 673. (24) Moriarty, A.M., Hoyer, B.H., Shih, 3.W.K., Guérin, J.L. and Hamer, D.H. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 2606-2610. 19' REVENDICATIONS 1 - ADN recombinant pour la transformation de li- gnées cellulaires eucaryotes, notamment humaines ou ani- males, choisies parmi celles qui sont infectables par des adénovirus ou dont les polymérases endogènes sont sus- ceptibles de reconnaître les promoteurs des adénovirus, cet ADN recombinant étant en outre modifié par un acide nucléique d'insertion contenant une séquence nucléotidique codant pour une séquence polypeptidique dont l'expression dans lesdites lignées cellulaires est recherchée, carac- térisé par le fait que ladite séquence d'insertion est placée sous le contrôle direct du promoteur précoce-de la région ElA du génome d'un adénovirus. 2 - ADN recombinant selon la revendication 1, caractérisé- en ce qu'il est incorporé dans un vecteur ré- plicable dans lesdites lignées cellulaires ou associé par recombinaison génétique avec un tel vecteur., 3 - ADN recombinant selon la revendication 1. ca- ractérisé en ce qu'il comporte en aval de l'acide nuclé- ique d'insertion un génome défectif d'adénovirus compre- nant néanmoins l'ensemble de celles des séquences essen- tielles nécessaires à la réplication de l'adénovirus cor- respondant, qui sont normalement situées en aval des gènes normalement sous le contrôle direct du promoteur précoce ElA dans ledit génome. 4 - ADN recombinant selon la revendication 3, ca- ractérisé en ce que le génome de l'adénovirus avec lequel il est associé est défectif, en ce qu'il est dépourvu de la partie antérieure de la région EIA du génome viral. notamment de son fragment 0-2,6 Z. - ADN recombinant selon la revendication 2, ca- ractérisé en ce qu'il est incorporé dans une région non essentielle d'un adénovirus, notamment dans la partie non essentielle de la région E3 de cet adénovirus. 6 - ADN recombinant selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 5, caractérisé en ce que son promoteur est originaire d'un adénovirus de catégorie C, appartenant au sous-type Ad2 ou Ad5. 7 - ADN recombinant selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 6, caractérisé en ce que la séquence nu- cléotidique contenue dans le susdit acide nucléique d'in- sertion code pour une protéine qui, lorsqu'elle est ex- primée dans un hôte cellulaire naturel sous le contrôle de son promoteur naturel, est excrétée dans le milieu d'une culture de cet hôte cellulaire naturel. 8 - ADN recombinant selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 7, caractérisé en ce que la susdite sé- quence nucléotique code pour un antigène protecteur contre un agent pathogène déterminé, notamment pour l'antigène HBsAg. 9 - Lignée cellulaire d'origine humaine ou animale, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un ADN- recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, et en ce qu'elle synthétise le polypeptide codé par la susdite séquence nucléotidique. 10 - Lignée cellulaire selon la revendication 9 considérée en combinaison avec la revendication 3 ou la revendication 4, ou les deux à la fois, et, le cas échéant, avec l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisée en ce qu'elle contient elle-même une séquence distincte de nucléotides apte à complémenter la partie du génome de l'adénovirus dont le susdit vecteur est dépour- vu, ladite séquence distincte étant de préférence incor- porée au génome des cellules de ladite lignée cellulaire. 11 - Procédé de production d'un polypeptide déter- miné comprenant la transformation par un ADN recombinant contenant une séquence nucléotidique codant pour ledit polypeptide d'une lignée de cellules eucaryotes, notamment animale ou humaine, choisie parmi celles qui sont infec- tables par des adénovirus ou dont les polymérases endo- gènes sont aptes à reconnaître les promoteurs des adéno- virus, caractérisé par le fait que l'ADN transformant est conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 8 et en ce que l'on recueille les produits d'expression de ces cellules, y inclus ledit polypeptide déterminé. 12 - Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l ADN recombinant est conforme à l'une quelcon- que des revendications 4 à 6. 13 - Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que les cellules eucaryotes transformées sont conformes à la revendication 10. 14 - Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que les susdites cellules eucaryotes sont si- multanément transformées avec l'adénovirus infectieux cor- respondant. - Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 11 à 14, caractérisé en ce que la séquence nucléo- tidique déterminée est conforme à celle définie dans la revendication 7. 16 - Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 11 à 14, caractérisé en ce que la séquence nucléoti- dique déterminée code pour un antigène protecteur contre un agent pathogène déterminé, notamment pour HBsAg. 17 - Composition de vaccin contenant les produits excrétés ou libérés dans le milieu par les cellules eu- caryotes transformées par le procédé selon la revendica- tion 16, en tant que principe actif d'un vaccin actif contre le susdit agent pathogène, notamment contre le vi- rus de l'hépatite B.