FR 2583983 A1 19870102 FR 8508648 A 19850607 - 1- 2583983 La présente invention a pour objet de nouvelles prodrogues macromoléculaires hydrosolubles, leur préparation et leur utilisation comme médicament. On sait que l'on peut obtenir des prodrogues, permettant de conférer notamment un effet retard ou de faciliter le transport de la drogue in vivo, en liant la drogue, c'est-à-dire le principe actif, à un peptide, mais la faible solubilité dans l'eau de ces derniers constitue souvent un handicap pour la préparation et l'efficacité de ces prodrogues. La présente invention a pour objet de nouvelles prodrogues caractérisées par le fait qu'elles comprennent essentiellement une drogue ou substance active liée par une liaison covalente à un polymère polyhydroxylé par l'intermédiaire d'un groupement peptidyle, et en particulier celles caractérisées par le fait que le rapport du nombre moyen de molécules de substance active fixée sur une molécule de polymère au nombre moyen de groupements hydroxyle présents sur une molécule du polymère peut varier de -2 à 10-4 environ. Autrement dit, les prodrogues macromoléculaires de la présente demande répondent à la formule I: M-(P-D) (I) dans laquelle M est le reste d'une molécule polymérique polyhydroxylée, P est un groupement peptidyle, D est le reste de la molécule de drogue et n représente le nombre de molécules de drogue D fixées sur la molécule polymérique M. De préférence, la drogue est une drogue aminée liée au groupement peptidique P par l'extrémité C-terminale de celui-ci, et dans ce cas le peptide P est lié à la molécule polymérique M par l'intermédiaire d'une liaison covalente (par exemple une liaison amide); cette liaison covalente provient de la réaction de l'extrémité Nterminale du peptide avec un groupement réactif (par exemple un groupement carboxylique) porté par la molécule polymérique (correspondant à M) utilisée dans la préparation de la prodrogue. Parmi les composés de formule I on citera en particulier: A) ceux pour lesquels M représente le reste d'un polymère d'acrylamide substitué à l'azote par un groupement alkyle hydroxylé. Parmi les polymères de ce type on citera notamment ceux qui sont décrits dans le brevet français n 77.23223 (n de publication 2.398.762); B) ceux pour lesquels M est le reste d'un homopolymère d'aminoacide diaminé dont le groupement aminé non impliqué dans la liaison polymérique est substitué par un groupement polyhydroxyalcanoyle; - 2 - 2583983 Parmi les dérivés de ce type on citera en particulier les molécules polymériques à base de polylysine dont les groupements -NH2 non impliqués danE la liaison polymérique sont acylés par un agent d'acylation dérivé d'un acide polyhydroxyalcanolque; C) ceux pour lesquels M est le reste d'un homopolymère d'acide amin4 dicarboxylique dont une partie des groupements acide carboxylique non impliqués dans la liaison polymérique sont amidifiés par une hydroxyalkylamini ou une polyhydroxyalkylamine dont l'amine est primaire ou secondaire. Dans ce cas, les groupements carboxyliques restants de la molécule correspondant à M permettent d'établir les liaisons covalentes avec les groupements -(P-D) indiqués dans la formule I. Parmi les dérivés de ce type, on mentionnera en particulier les dérivés d'acide polyglutamique ou d'acide polyaspartique. Autrement dit, les polymères de formule I sont en particulier: a) les polymères IA constitués essentiellement de motifs de formules: -CH(R1)-C(R2)(X 1)- et -CH(R1)-C(R2)(X2)- (IIA) (IIIA) dans lesquelles: R et R2 représentent -H ou un groupement alkyle inférieur, X représente un groupement -CO-NH-R3, X représente un groupement -CO-NH-X-CO-P-D, R3 est un groupement hydrocarboné hydroxylé ou polyhydroxylé, X représente un groupement hydrocarboné ayant 1 à 8 atomes de carbone, éventuellement interrompu par 1 ou plusieurs hétéroatomes d'oxygène, de soufre ou d'azote, et P et D sont définis comme précédement; b) les polymères IB constitués essentiellement de motifs de formules: -CO-CH(X3)-NH- et -CO-CH(X4)-NH- (IIB) (IIITB) dans lesquelles: X représente -(CH2)x-NH-CO-R, X4 représente -(CH2) -NHCO-P-D, x est un nombre entier pouvant varier de 1 à 4, R4 est un groupemeni hydrocarboné hydroxylé ou polyhydroxylé, et P et D sont définis comme précédemment; - 3 2583983 c) les polymères IC constitués essentiellement de motifs de formules: -CO-CH(X)-NH- et -CO-CH(X6)-NH- (IIC) (IIIC) dans lesquelles: 5 X représente -(CH2) -CO-NH-R, X6 représente -(CH2) -CO-P-D, y est un nombre entier pouvant varier de 1 à 4, R5 est un groupement hydrocarboné hydroxylé ou polyhydroxylé, et P et D sont définis comme précédemment. Bien entendu, l'invention s'étend à l'utilisation de copolymères contenant, outre les motifs mentionnés ci-dessus, des motifs dérivés de co-monomères permettant de faire varier, de façon connue, les propriétés du polymère. Généralement, la masse moléculaire, déterminée par exemple par la méthode de diffusion de la lumière du polymère correspondant à M, est supérieure à 5000. Elle est comprise par exemple entre 10 000 et 500 000. Parmi les peptides représentés par P, on citera en particulier ceux qui comprennent une séquence peptidique hydrolysable par une protéase spécifique, en particulier une protéase sécrétée par les cellules cibles de la drogue active, par exemple par les cellules tumorales, par un microorganisme pathogène, ou par des cellules associées àa une tumeur, ou encore après endocytose, par les protéase des lysosomes. L'intérêt de l'utilisation de telles séquences peptidiques est que, dans ce cas, la drogue active n'est libérée que dans l'environnement de la cible ou, après endocytose, à l'intérieur même des cellules cibles, ce qui a pour effet de favoriser l'efficacité de la drogue. D'une façon générale, les séquences peptidiques représentées par P doivent être considérées comme connues. Parmi les dérivés de formule I, on citera en particulier ceux pour lesquels les groupements -P-D sont ceux qui comportent les séquences énumérées ci-après (sans que cette liste soit limitative) étant entendu que les séquences indiquées sont les séquences minimales et qu'il est possible d'insérer 1 à 3 autres acides aminés entre la molécule M et la séquence peptidique indiquée: ov 0-nal-5- -x --4d-5-o-l- a - V -l-.qd-'- od-'- _ nl_-'_6aV-'-.a4d -'- od-T-- SE n-6.1V-5-1 4d-1-od-i- :o-nll-5-j V-'-j.d-d-1t9- Q- ú.-i- /CLg-1-d1- - L-i-L--- (| -na-i-- V--Lg-/9- l. a(-6-zV--/L9-'9 [SZ | _nal_-i_6ta--eV_-/L-,_4dL1 er-na'l-'i-S'l-l- LV-l--aqd-5- a-s,l-- tV-5-.atd-'5- (:-hal-5-6.xV-'l-teA-l-.aqd-5- d_.._._ 1, A__ad_- a--na -l-q' v- LleA-i-o,4d-]'- L -'L-- tl-Le -ad-]l-l- l A-l-'e -'1- O -nal-- [V-5-o d--u LV-l- [V-l- 01 a -e L A--oad-5-e LV-l- LV-1- a-na'l-'-e lV,;--Oad--u L --e L -"' a -'B L -'-o d--'e L t-l-' IV-l- ú86ú85sZ -5 - 2583983 La drogue D est par exemple la daunorubicine, l'adriamycine, la puromycine, qui sont des drogues antitumorales; la primaquine et la chloroquine qui sont des drogues antiparasitaires, etc... L'invention concerne également l'utilisation, dans la réalisation d'une prodrogue, d'un polymère polyhydroxylé auquel la drogue est reliée par l'intermédiaire d'un groupement peptidyle. Le polymère et le bras peptidyle sont notamment ceux qui sont définis ci-dessus. L'invention a également pour objet un procédé de préparation des prodrogues macromoléculaires définies ci-dessus. Ce procédé est principalement caractérisé par le fait: a) soit que l'on utilise comme produit de départ une macromolécule polyhydroxylée que l'on éthérifie avec un groupement hydrocarboné comportant un groupement carboxylique protégé, que l'on soumet l'éther obtenu à une réaction de déprotection du groupe carboxylique et que l'on fait agir le composé obtenu avec un composé peptidyl-drogue tel qu'un composé de formule: H - P - D dans laquelle P et D sont définis comme précédemment; b) soit que l'on utilise comme produit de départ une macromolécule polycarboxylée dont le groupement carboxylique est activé et que l'on fait réagir lesdits groupements carboxyliques activés, partiellement avec un composé peptidyldrogue tel qu'un composé de formule: H - P - D P étant défini comme précédemment, et partiellement avec une amine primaire ou secondaire hydroxylée ou polyhydroxylée telle qu'une amine de formule: R5-NH2 R5 étant défini comme précédemment; c) soit que l'on utilise comme produit de départ une macromolécule polyaminée, que l'on fait réagir avec un agent d'acylation dérivé d'un acide carboxylique polyhydroxylé pour obtenir, par réaction d'amidification, une molécule polyhydroxylée sur laquelle on poursuit la synthèse comme en a) ci-dessus. Dans des modes d'exécution particuliers, le procédé de l'invention peut encore présenter les caractéristiques suivantes, prises isolément ou en combinaison: Procédé a): - On éthérifie la macromolécule polyhydroxylée par formation d'un alcoolate alcalin et réaction de celui-ci avec un dérivé halogéné du groupement hydrocarboné comportant un groupemenlt carboxylique protégé; - 6 - 2583983 - Le groupement carboxylique est protégé par exemple sous forme d'ui ester, en particulier d'un ester d'alkyle inférieur et, dans ce cas, le groupement carboxylique est déprotégé par saponification; - On fait réagir le groupement carboxylique déprotégé avec le dérivi peptidique H-P- D en présence d'un agent d'activation; l'agent d'activation est par exemple un carbodiimide tel que le dicyclohexyl carbodiimide en présence d'hydroxybenzotriazole ou tout autre agent d'activation classique dans la synthèse peptidique. Procédé b): - Le groupement carboxylique de la macromolécule polycarboxylée est activé dans les conditions analogues à celles utilisées dans le procédé a. Procédé c): - L'agent d'acylation avec lequel on fait réagir la macromolécule polyaminée est par exemple une lactone telle que la gluconodelta-lactone, L ribono-lactone, la lactone des acides heptaglyconoique ou octaglyconolque, etc... Les produits de formule: H - P - D sont obtenus par couplage de la séquence peptidique P, protégée du côté N- terminal selon les méthodes connues (par exemple par formation du dérivé N-tritylé) sur la drogue D présentant une fonction aminée, en présence d'un agent d'activation tel que par exemple l'hydroxybenzotriazole, puis déprotection du groupement N-terminal. Les conditions de déprotection de ce produit de couplage doivent évidemment être compatibles avec la stabilité de la drogue. Les peptides de départ, correspondant à la séquence P dans la formule I, peuvent être soit achetés dans le commerce, soit synthétisés selo, les méthodes classiques de la synthèse peptidique (voir par exemple E. CROSS et J. MEIENHOFFER (1979) "The peptides: Analysis, synthesis, biology" Academic Press, New York, Volumes I, II, III et suivants). L'invention a également pour objet des compositions pharmaceutique. caractérisées par le fait qu'elles renferment, comme ingrédient actif, au moins une prodrogue I, IA, IB ou IC, telle que définie ci-dessus, éventuellement en association avec un excipient approprié. L'invention a également pour objet l'utilisation des prodrogues telles que définies ci-dessus, dans la préparation industrielle de médicaments. Les prodrogues de l'invention sont utilisées comme médicaments à de doses correspondant aux doses usuelles de la drogue active qu'elles renferment, ou même à des doses supérieures, car.l'expérience a montré que cE prodrogues ont une toxicité inférieure à celle d'vre quantité équivalente dE la drogue qu'elles renferment. - 7 - 2583983 Les prodrogues de l'invention ont, bien entendu, les mêmes propriétés thérapeutiques que les drogues qu'elles renferment. Les drogues présentes dans les prodrogues de l'invention sont notamment des agents antitumoraux, des agents antibactériens, ou des agents antiparasitaires. Lorsque ces drogues sont des agents tumoraux, les médicaments de l'invention sont utilisés notamment comme agents d'inhition de la prolifération des tumeurs ou comme agents de prévention de la formation de métastases. Les doses efficaces varient généralement de 1 à 20 mg/kg de principe actif. Lorsque les drogues présentes dans les médicaments de l'invention sont des agents antiparasitaires, ces médicaments sont utilisés notamment comme agents de traitement ou de prévention dans le domaine de la lutte contre les parasites responsables des diverses maladies dites "tropicales". Les médicaments de l'invention sont administrés par toutes voies convenables. Il faut noter toutefois que la voie orale ne convient généralement pas. Il peuvent être présentés notamment sous forme de solutions injectables, de poudres lyophilisées à diluer dans le sérum physiologique, de solutions ou d'émulsions à appliquer sur la peau ou les muqueuses, de solutions en conditionnement pressurisé pour aérosols, etc... Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. Exemple 1: Préparation d'un polymère linéaire de N-acryloylamino-2-hydroxy- méthyl-2-propanediol-1,3-polycarboxylé substitué par la séquence -Gly-GlyL-Tyr-Daunorubicine. Stade 1 A un polymère linéaire de N-acryloyl-amino-2-hydroxyméthyl- 2-propanediol-1,3 de masse moléculaire moyenne 200 000 (lg; 5 micromoles) obtenu selon le procédé du brevet français 77.23223 (2.398.762) en solution dans le N,N-diméthylformamide anhydre (20ml), on ajoute de l'hydrure de sodium (0,8 mmoles). Après 12 heures d'agitation à température ambiante, on additionne à la solution visqueuse de polyalcoolate du méthylbromoacétate (0,4 mmoles). La réaction est maintenue sous agitation 4 heures à température ambiante. Le mélange réactionnel est ensuite neutralisé par une résine de marque commerciale Dowex AG-50 W X S (4 ml) puis dialysé contre de l'eau. La solution aqueuse est ensuite 2yophilisée (0,98g). Les fonctions méthylester ainsi introduites sont caracterisées en infrarouge par une bande de vbration à 40 cm-1 de vibration A 1740 cm _ ?2 _ 2583983 Stade Le polymère obtenu au stade 1 est saponifié par la soude, et, après neutralisation par une résine de marque commerciale Dowex AG 50 W X 8, on obtient un polymère substitué par 75 groupements carboxyliques avec un rendement de 81% après lyophilisation. Stade 3 Le polymère obtenu au stade 2 (400 mg, soit sensiblement 2 micromoles) est mis en solution dans le M, N diméthylformamide (2ml) en présence de Gly-Gly-L-Tyr-Daunorubicine, HC1 (34 mg, 40 micromoles) et de triéthylamine (28 microlitres, soit 200 micromoles). Après addition d'hydroxybenzotriazole (7,7 mg, 50 micromoles) et de dicyclohexyl carbodiimide (10,3 mg, 50 micromoles), le mélange réactionnel est agité pendant 48 heures à température ambiante à l'abri de la lumière. A ce stade les fonctions carboxyliques résiduelles sont modifiées sous forme d'amide par addition de tris (hydroxyméthyl) aminoéthane (24 mg, 200 micromoles) en présence d'hydroxybenzotriazole (30,6mg) et de dicyclohexyl carbodiimide (41,2 mg). Après dilution, dialyse contre de l'eau et centrifugation du résidu insoluble, le polymère est lyophilisé (392 mg). La mesure de l'absorption à 495 nm permet de préciser qu'une molécule de polymère contient en moyenne 15 résidus de Gly-Gly-L-Tyr-Daunorubicine. Le rendement de fixation est de 73%. EXEMPLE 2: Préparation d'un polymère linéaire de '-acryloylamino-2-hydroxy- méthyl-2-propanediol-1,3 polycarboxylé substitué par la séquence -Gly-GlyL-Tyr-L-Leu-Daunorubicine. Le polymère obtenu au stade 2 de l'exemple 1 est couplé, dans les conditions utilisées au stade 3 de l'exemple 1, pour la séquence -Gly-Gly-L-Tyr-L-Leu-Daunorubicine, hormis l'utilisation de 18 équivalents de ce dérivé, étant donné le caractère hydrophobe de la séquence peptidique. Ainsi, 13 résidus de peptidyl Daunorubicine ont été fixés par molécule de polymère avec un rendement de 69%. De façon analogue, on a préparé le meme polymère, mais marqué au 14C sur la daunorubicine en position 14. EXEMPLE 3: Préparation d'un polymère linéaire de N-acryloylamino-2-hydroxy- méthyl-2-propanédiol-1,3 polycarboxylé, substitué par la séquence Gly-LPhé-L-Ala-L-Leu-Daunorubicine. On opère conmme décrit dans l'exemple 1 lu, acde 3, 16 équivalents du composé Gly-L-Phé-L-Aia-L-Leu-Daunorubiciie -tant,t> Usés peur la réaction. Dans ces conditions, l résidus cie peptidy]-]aunoruxir:ha sont couplés par moleécule de polymrère avec un rendement se.. - 9 - 2583983 EXEMPLE 4: Préparation d'un polymère linéaire polygluconoyle polylysine polycarboxylé substitué par la séquence Gly-Gly-L-Tyr-L-Leu-Daunorubicine. Stade 1 De la poly-L-lysine commerciale (origine BACHEM-500 mg) de masse moléculaire moyenne 50 000, est mise en solution dans le système-solvant N,N-diméthylformamide/diméthylsulfoxyde (3: 1) (20 ml) puis déprotonée par addition de triéthylamine (335 microlitres). Cette solution est portée à 50 C et on ajoute toutes les 6 heures de la glucono-delta- lactone pendant 24 heures (4 fois 425 mg). Après refroidissement, le mélange réactionnel est dilué par l'eau (40 ml) dialysé, puis lyophilisé (470 mg). Après dosage, la poly-L-lysine ainsi modifiée ne possède plus de fonction amine libre. Stade 2 Le polymère polygluconoyle polylysine préparé ci-dessus est modifié selon le protocole décrit dans les stades 1 et 2 de l'exemple 1, et mène à un polymère substitué par 20 groupements carboxyliques. Stade 3 Le polymère obtenu au stade 2 de l'exemple 4 (470 mg; 9 micromoles) est mis en solution dans le N,N diméthylformamide en présence de Gly-Gly-L-Tyr-L-Leu-Daunorubicine (86 mg; 90 micromoles) et de triéthylamine (28 microlitres, soit sensiblement 200 micromoles). Après addition d'hydroxybenzotriazole (14,4 mg, 0,1 millimole) et de dicyclohexyl carbodiimide (20,6 mg, 0,1 millimole) le mélange réactionnel est agité 48 heures à température ambiante à l'abri de la lumière. Les fonctions carboxyliques résidueiles sont substituées sous forme d'amide par addition de tris(hydroxyméthyl)aminométhane. Après dilution et dialyse contre de l'eau, le polymère est lyophilisé (460 mg). Par mesure de l'absorption à 495 nm, 9 résidus de Gly-Gly-L-Tyr-L-Leu-Daunorubicine par molécule de polymère sont calculés. Le rendement de fixation est de 75%. EXEMPLE 5: Préparation d'un poly-L-glutamate polyhydroxylé conjugué à la séquence Gly-Gly-L-Tyr-L-Leu-Daunorubicine. Stade 1 De l'acide poly-L-glutamique commercial (origine BACHEM 500 mg, 10 mmoles) de masse moléculaire moyenne 50 000, est mis en solution dans du N,N-d4iméthyl-formamide (40 ml) anhydre en présence dce triéthylamine (550 microlitres, 3,9 mmoles) et de Gly-Giy-l-Tyr-l-Leu-Daunorubicine (86 mg, 90 micromoles). Après addition d'hydroxybenzotriazol.e (14,4 mg, 0,1 mmole) et de dicyc]ohexyl carbodiimide (20,6 mg, 0,1 rmmole), e e'élange réactionnel est agité 48 heures à température ambiante à:zabri (e 1a lumière. Le mélange - l- 2583983 --6actionnel est dilué cans un tamonr. phosphate, après une heure à 4 C, la matériel insoluble est éliminé par centrifugation, puis dialysé contre de eau et enfin lyophilisé. Par mesure de l'absorption à 495 nm, 8 molécules d 1y-Glv-L-Tvyr-L-Leu-Dauncribicine par molécule de polymère sont appréciées. Stade Le polymère isolé au stade I (300 mg, 5,2 micromoles) est repris dans le 1,N diméthylformamide (30 ml) en présence de tris(hydroxyméthyl)- aminométhane (242 mg, 2 mmoles). Après addition d'hydroxybenzotriazole (283 mg, 2,1 vmoles) et de dicyclohexyl carbodiimide (432 mg, 2,1 mmoles) le mélange réactionnel est agité 48 heures à température ambiante. Le polymère ainsi substitué est dialysé contre de l'eau, le résidu solide est éliminé pa: centrifugation, et le surnageant est lyophilisé. De cette facon, toutes les fonctions carboxyliques présentes sur 1 polymère sont modifiées quantitativement sous forme d'amide du tris(hydroxyméthyl)aminométhane. L'absence des fonctions carboxyliques est montrée par dosage pH-métrique. EXEMPLE 6 Préparation d'un polymère linéaire de N-acryloylamino-2-hydroxy- méthyl-2-propanediol-1,3 polycarboxylé, substitué par la séquence Gly-L-Pro-L-Arg-L-Leu-Daunorubicine. On opère comme décrit dans l'exemple I au stade 3, 20 équivalents d composé Gly-L-Pro-L-Arg-L-Leu-Daunorubicine étant utilisés pour la réaction. Dans ces conditions, 13 résidus de peptidyl-Daunorubicine sont couplés par molécule de polymère, avec un rendement de 65%. EXEMPLE 7 Protéolyse in vitro L'hydrolyse chymotrypsique est réalisée dans un tampon Tris-HCl 0,05M, CaC12 lO1mM à p 8,0. On analyse les dérivés de la daur.orubicine libérés après hydrolyse enzymatique, en chromatographie sur couche mince. Par exemple: - le polymère de l'exemple 2 libère la leucyl-Daunorubicine: Rf: 0,4 dans le système-solvant CHClJ/CHiOH (9: 2). - le polymère de l'exemple 1 libère la Daunorubicine: Rf 0,56 dan: le système-solvant CHCl3/CH.3o0H/HO/acide acétique (i5:5:1:1). - Le polymère de l'exemple 3 fbère l'alaninvi-leucyl-Daunorubicine Rf 0,32 dans le système-solvant CHCi/CI-CHO::. LT.'hydrolyse trypsique est r---aiiée dans une Solution de bicarbonate de soai:um 0,1 M, CaCli!0 rI à pH 8,7. Le poiymère de l'exemple r 'st n-,r2::e *ar a trypslne en libéran -a leucyvi-aunorubi.cine: Rf 0,4 i:ms /st$me-- oLvanr. iiCl]/CH,0H (9:2). - il- 2583983 rFOPRIETES PHARMACOLOGIQUES 1) Les cellules du carcinome pulmonaire de I.awis.(3LL) proviennent d'une tumeur maligne métastasante, se développant spontanément chez les souris C 57 BL/6;Mayo J.C. (1972) Cancer Chem. Rep. Vol.3, 325. D5 a) Culture in vitro Ces cellules sont cultivées en monocouches (ensemencées à 2 x 104 cellules/ml) dans un milieu MEM contenant 20% de sérum de veau foetal à 37 C et sous atmosphère de 5% CO2 - 95% air. A confluence (après 3 jours) elles sont récupérées par un bref traitement (2 minutes) par une solution d'EDTA 0,02% dans du PBS 0,1% glucose. Les cellules sont lavées avec un milieu MEI, puis reprises dans le milieu complet. Viabilité >95%. b) Tumeur solide in vivo L'obtention de cellules isolées à partir d'une tumeur solide nécessite l'utilisation de protéases et d'agents chélatants. La tumeur est prélevée et débarrassée des zones nécrosées. Elle est ensuite découpée en petits fragments d'environ 1 mm3 et mise en suspension dans du PBS contenant 0,1% de glucose, pendant 10 minutes sous agitation à 4 C. Le surnageant est éliminé et les fragments sont mis en présence de trypsine (Trypsine Enzar T pour culture cellulaire, Reheis Chemical Company, Armour Pharmaceutical, South Plainfield, USA), et 0,02% d'EDTA (Merck) dans le PBS glucose, à la température ambiante. Les cellules se détachent peu à peu et sont collectées, après 30 minutes dans un tube à centrifuger après filtration sur toile à bluter de nylon (Monyl Ny25 HC, mailles de 25 micromètres, Polylabo, Strasbourg, France). Après deux lavages dans du PBS glucose, les cellules vivantes sont comptées et leur concentration ajustée. 2) Activité cytotoxique in vitro L'activité cytotoxique est mesurée par l'inhibition de l'incorporation de la thymidine tritiée. Dans les puits d'une plaque Limbro, on introduit 1 ml d'une suspension cellulaire de cellules 3 LL à 10 cellules/ml dans un milieu MEM contenant 20% de sérum de veau foetal. Les cellules sont ainsi mises en culture pendant 24 heures. Le milieu de culture est éliminé par aspiration et on dispose ensuite dans chaque puits, 1 ml de diverses dilutions de drogue réalisées avec le milieu de culture. Les plaques sont disposées dans l'étuve durant 43 heures. On additionne ensuite 20 microlitres d'une solution de thymidine tritiée (0,5 microCurie, 18,5 KBOc. Après 4 heures d'incubation les cellules sont décollées avec une raclette d(le securité, puis récupérées sur filtre en fibre de verre et lavées. On mesure la raaioactivité des cellules dans un compteur a scintillations beta apres dissolut2cn dans un liquide scintillant. -12- L'activité cytotoxique des drogues et conjugués suivants a été déterminée sur les cellules 3 LL selon le protocole décrit ci-dessus: - Daunorubicine libre - leucylDaunorubicine - Gly-Gly-L-Tyr-L-Leu-Daunorubicine - Polymère de l'exemple 1 - Polymère de l'exemple 2 - Polymère de l'exemple 3 Sur la base des résultats obtenus en incorporation de 3H thymidine réunis dans la figure 1, on voit que la substitution de la Daunorubicine par un peptide, ou mieux, son greffage sur un polymère linéaire, entralne une diminution plus importante de la cytotoxicité de cette drogue in vitro. L'activité cytotoxique est modulée selon la séquence peptidique. 3) Expériences in vivo Afin d'étudier la distribution d'un polymère macromoléculaire dans l'organisme de la souris, après injection intraveineuse, ou intrapéritonéale, et sa durée de vie plasmatique, on utilise le polymère marqué au 14C sur la Daunorubicine en position 14 préparé à l'exemple 2. a) Clairance plasmatique Le polymère marqué au 14C en solution dans du sérum physiologique à la concentration 15 mg/ml est injecté (200 microlitres, 3 mg de polymère correspondant à 100 microgrammes de Daunorubicine), soit par voie - intraveineuse dans une veine latérale de la queue, soit par injection intrapéritonéale. La clairance de ce polymère dans le flux sanguin est mesurée par prélèvement de 50 microlitres de sang à divers temps après l'injection. Le sang est prélevé dans le plexus veineux de l'oeil à l'aide d'une micropipette calibrée prétraitée avec un anticoagulant. L'activité présente dans chaque échantillon est comptée après dilution dans un liquide scintillant (2,5 ml). Les résultats sont représentés à la figure 2 et sont résumés ci-après: La décroissance de la concentration plasmatique du polymère est relativement faible, en effet au bout de 48 heures on retrouve 20% de la radioactivité initiale. Ce résultat tout à fait remarquable, compte tenu du fait que l'adriamycine disparaît du plasma en 20 minutes. - L'analyse chromatographique sur couche mince révèle en outre que le matériel radioactif dans le plasma se trouve toujours sous une forme macromoléculaire. Le tétrapeptide intercalé entre le polymère et la drogue est donc relativement résistant aux protéases sériques. - La drogue macromoléculaire peut passer de la cavité péritonéale dans la circulation sanguine. Trois heures après l'injection, le taux - 13 - 2583983 plasmatique du polymère injecté par voie intrapéritonéale est semblable à celui du polymère injecté par voie intraveineuse. L'analyse chromatographique sur couche mince de silice montre ici encore que le matériel radioactif dans le plasma se trouve encore sous forme macromoléculaire. Mais des injection intrapéritonéales répétéespeuvent ralentir le transfert de la macromolécule de la cavité péritonéale vers le flux sanguin. b) Localisation Les drogues radiomarquées sur la (14-14C) Daunorubicinesont - 1 5 injectées par voie intraveineuse 14 jours après l'implantation de 10 cellules 3 LL. On injecte soit 100 microgrammes de Daunorubicine libre (5 x 105 c.p.m.), soit 100 microgrammes de Daunorubicine sous forme macromoléculaire (5 x 105 c.p.m.); la localisation est mesurée après l'injection intraveineuse des différents produits. Les souris sont sacrifiées par élongation cervicale 48 heures ou 72 heures après l'injection. Les organes sont prélevés, dissous par un agent solubilisant de tissus (NCS Amersham) à raison de 200 mg à 300 mg d'organe/ml de solubilisant, puis comptés dans un liquide scintillant. Les expériences sont réalisées sur des lots de 3 souris avec le polymère de l'exemple 2 et la Daunorubicine libre. Les résultats sont réunis dans la figure 3. Une persistance générale de la Daunorubicine dans l'organisme est observée lorsque celle-ci se trouve sous forme macromoléculaire, notamment au niveau de la tumeur. L'examen des organes au moment de leur prélèvement, puis de leur pesée montre une atrophie sévère de la rate sous l'effet de la Daunorubicine libre. Cette atrophie coincide avec une accumulation importante de la radioactivité, alors que les rates des souris traitées avec le polymère peptidyl drogue ont une faible radioactivité et une masse comparable à celle des animaux sains. c) Activité antitumorale L'activité antitumorale in vivo des prodrogues macromoléculaires est évaluée sur des souris mâles C 57 BL/6 agées d'une dizaine de semaines. On implante 105 cellules 3 LL à chaque souris par injection intramusculaire de microlitres d'une suspension cellulaire à 106 cellules/ml dans la patte postérieure droite. - Un lot de 10 souris servant de témoins est injecté avec 7 x 100 microlitres de sérum physiologique. - Un lot de 10 souris est traité avec 7 x 100 microgrammes de Daunorubicine libre (dose limite due à la toxicité de la drogue libre). - Un lot de 10 souris est traité avec le polymère de l'exemple 2 à raison de 8 x 200 microgrammes équivalents en Daunorubicine. - il, - 2583983 Après injection intramusculaire des cellules tumorales, la prodrogu -acromoléculaire est infectée par voie intraveineuse aux jours 2, 6 et 10 pui! par voie intrapéritonéale aux jours 14, 18, 22, 26 et 30. Deux paramètres sont enregistrés pour évaluer l'activité antitrmoraie ln *,,vc: l'inhibition de croissance de la tumeur et la survie. L'xamen de la courbe ac croissance (figure 4) ue -a tumeur montre que la Daunorubicine rême à la dose employée (dose maximale eu eard - sa toxicité) n'influe pas de façon significative sur la croissance tumorale. Le polymère de *exemple 2 par contre montre une inhibition de croissance significative en chaque point par rapport au lot témoin. Le second paramètre enregistré, survie des animaux traités par rapport aux animaux témoins, confirme l'activité antitumorale du polymère de l'exemple 2 (figure 5). Le T/C mesuré est de 145. Il est à noter que la fixation de la Daunorubicine sur le polymère par l'intermediaire d'un peptide diminue notamment sa toxicité secondaire, CE qui permet l'cmploi de ooses importantes en équivalent de Daunorubicine. - 1- 2583983 REVENDICATI(NS Prodrogues caractérisées par je fait qu'elles comprennent essentiellement une drogue ou substance active liée;ar une liaison covalente à In polymère polyhydroxylé par l'intermédiaire d'un groupement peptidyle. 2. Prodrogues selon la revendication 1, caractérisées par le fait quele rapport du nombre moyen de molécules de substance active fixée sur une molécule de polymère au nombre moyen de groupements hydroxyle préserts sur une molécule du polymère peut varier de 10- à 10. 3. Prodrogues macromoléculaires caractérisées par le fait qu'elles répondent à la formule I M-(P-D) (1) dans laquelle M est le reste d'une molécule polymérique polyhydroxylée, P est un groupement peptidyle, D est le reste de la molécule de drogue et n représente le nombre de molécules de drogue D fixées sur la molécule polymérique M. 4. Prodrogues selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisées par le fait que ladite drogue est une drogue aminée liée au groupement peptidyle P par l'extrémité C-terminale de celui-ci, et dans laquelle le groupement peptidyle est lié la molécule polymérique par l'intermédiaire d'une liaison covalente. 5. Prodrogues selon la revendication 4, caractérisées par le fait que ladite liaison covalente entre la molécule M et le peptide P est une liaison amide. 6. Prodrogues selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisées par le fait que ledit polymère est un polymère d'acrylamide substitué à l'azote Far un groupement alkyle hydroxylé. 7. Prodrogues selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisées par le fait que ledit polymère est un homopolymère d'aminoacide diaminé dont le groupement aminé non impliqué dans la liaison polymérique est substitué par un groupement polyhydroxyalcanoyle. 8. Prodrogues selon la revendication 7, caractérisées par le fait que ledit homopolymère est un polymère à base de polylysine dont les groupements -NH. libres sont acylés par un agent d'acylation dérivé d'un acide polyhydroxyalcanoique. 9. Frodrogues selon l'une cuelconque des revendications 1 à 5, :aractérisées Far le tait cue ledit -iy&mre 'st un]]omopoiymère d'acide aminé dicarboxylique dont une partie ces -rl;pemnents acide carboxylique non implicugs dans ia liascn oolvmeriaue surt;aidifiîs par une hyvrcxyalk'v]amine ou tire olvyhydroxyalkyviamnirc. 16 -2583983 I;3. Prodrogues selon la revendication 3, caractérisées pT-ar le fait que représente le reste d'un polymère IA constitue esentiellement de motifs de formules: -CH(R)-C(R2) ()- et -CH(R )-C(R) (X')- (IiA) (IIIA) dans lesquelles: et R, représentent -H ou un groupement alkvle inférieur, T - q X représente un groupement-CO-NH-R-, X représente un groupement-CO-NH-X-CO-P-D, R, est un groupement hydrocarboné hydroxylé ou polyhydroxylé, X représente un groupement hydrocarboné ayant l 8 atomes de carbone, éventuellement interrompu par 1 ou plusieurs hétéroatomes d'oxygène de soufre ou d'azote, et P et D sont définis comme pr(:ceaement; 11. Predrogues selon la revencacation 3, caractérisées par le fait que M représente le reste d'un polymère 13 constitué essentiellement de motifs de formules: -CO-CH(X3)-NH- et -c(O-C! (:') -,H- dans lesquelles X; représente un groupement -(CH,) -:H-CO-kR, X' représente un groupement -(CH) -..-I-CO-P-, x est un nombre entier pouvant varier de 1 i à -, est un groupement hydrocarboné hydroxylé ou polvhydroxylé, et P et D sont définis comme précédemment; 12. Prodrogues selon la revendication 3, caractérisées par le fait que M représente le reste d'un polymère IC constitué essentiellement de motifs de formules: -CO-CH (X;)-NH- ?t -CO-CH(X6)-NH- (IvC' ' ViC) dans lesquelles: : représente un groupement - -;-, A:enresente un ruroui)iment -. - -CO-P-, y est un nombre entfer -:',u"nt v.r:'r:e: x e.nr tr: roupement:.dr;e.- nt ?_I-.-o:,. -.lyhydroxvie, et L' et)D aoit u-i. is,?ut-ne Drec!;rrent. - 17 - 2583983 13. Prodrogues selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisées por le fait que le groupement peptidyle comporte i'une des séquences énumérées ci-après, étant entendu qu'il est possible d'insérer 1 à 3 autres acides aminés entre la molécule peolymérique et la séquence peptidique indiquée: -L-Ala-L-Al a-L-Pro-L-A1 a-D 4L-Al a-L-A1 a-L-Pro-L-A1 a-L-Leu-D -L-A1 a-L-Ala-L-Pro-L-A1 a-D -LAla-L-A1 a-L-Pro-L-A1 a-L-Leu-D -L-A1la-L-A1la-L-Pro-L-Val-D -L-A1 a-L-A1 a-L-Pro-L-Val-L-Leu-D -L-A1a-L-A1a-L-Pro-L-Val- D - - -L-Al a-L-Al a-L-Pro-L-Val-L-Leu-D -L-Phé-L-Val-L-Arg-D -L-Phé-L-Val-LArg-L-Leu-D -L-Phé-L-Val-L-Arg-D -L-Phé-L-Val-L-Arg-L-Leu-D -L-Phé-L-A1 aL-Lys-D -L-Phé-L-Al a-L-Lys-L-Leu-D -L-Phé-L-A1 a-L-Lys-D -L-Phé-L-Al a-LLys-L-Leu-.D -Gly-Gly-L-Arg-D -Gly-Gly-L-Arg-L-Leu-D -Gly-Gly-L-Arg-D Gly-Gly-L-Arg-L-Leu-D -GI1y-Gly-L-Tyr-D -Gly-Gly-L-Tyr-L-Leu-D -Gly-Gly-LTyr-D -Gly-L- hé-L-Al a-L-Leu-D. -Gly-L-rPro-L-Arg-L-Leu-O -L-Pro-L-Phé-L-Arg-D _ -6 2583983 ---Pro-L-Phé-L-Arg-L-Leu-D -L-?ro-L- Ph-L-Arg- D -L- Pro-=?hé-L--Arg-LLeu-D -5 -Vai-Tl-Leu-Glv-L-ArZ-D 2. -% ' -z - A. Prodrogues selon l'une quelconque des r-eendicati-ons recédentes, caractérisees par le fait cue ladite drogue D est une drogue -ntitumorale, antibactérienne cu antirarasitaire. 15. Prodrogues selon la revendication.A, caractérisées par le ftit que ladite drogue est choisie parmi la daunorubicine,]'adriamycine, la puromvcine, la primaquine et la chloroquine. 16. Utilisation, dar.s la réalisation d'une prodrogue, d'un polymèrE polhydroxylé auquel la drogue est reliée par l'intermédiaire d'un groupement peptidvle. l,7. Utilisation selon la tevendication 16, caraczérisée nar le fait rue ledit rc.l-mire hydroxylé est tel que défini dans l'une rueiconaue des revendications 6 à [2. 18. Procédé de préparation d'une prodrogue te!o e cue définie dans l'une quelconque des revendications précédentes, caract6risé par i fait: a) soit que l'on utilise comme produit de départ ',ne macromolécule polyhydroxylée que l'on éthérifie avec un groupement hydrocarboné comportant un groupement carboxylique protégé, que l'on soumet.'éther obtenu à une réaction de déprotection du groupe carboxylique et que!''n fait agir le composé obtenu avec un composé peptidyl-drogue tel au'un comDose de formule: 1 D dans laqueile P et D sont définis comnne précédemmert; b) soit que l'on utilise comme produit de départ une macromolécule polycarboxylée dont le grcupement carboxyliqute cst activé et que l'on fait réagir lesdits groupements carboxyliques activés partieliement avec un compos peptidyldrogue tel qu'un comnosé de formule: H - P - D P étant défini comme précédemment, et partiellement avec une amine primaire c seconca're hvdroxylée ou polyhydroxxvlée telle au'une -mi-ne de formule: taul fni ecmme prmc.e tent: c- soit eue l'on uciies me -cre cduJt.l c:;art une macromoleculE o1i.vai ne.ue]':n fait r&-agr a!ec un. :nc. i'zcy_.tThn érivé d'un aclde carboz:'lJque:cl-,1yvroxvié pour obD':n, -r.-ic Ct-- I'eml.Lif-Ccacio.n, une -oi,.ue jo'.'.v;:rexi e.:ur.;qcuel_-, --,ur-:,- t ':: -'nth2s.- e-o::ze n a) -19 - 2583983 19. Utilisation des procrogues telles que df('-uies dans i'une quelconque des revendications 1 à 15, dans la préparation industrielle de médicaments. 20. Médicament caractérisé par 'e faIt qu'il comprend comme ngrédient actif au moins une prodrogue tel]e que définie dans l'une quelconque des revendications I à 15.