FR 2576792 A1 19860808 FR 8601641 A 19860206 La présente invention concerne une composition pharma ceutique pour le traitement de l'anémie de l'arthrite rhuiaa- tode qui comprend une quantité efficace du point de i;Me thérapeutique d'érythropolétine humaine (désignée.ci-aprrs par "EPO humaine" dans un véhicule acceptable n are t.&e Le terme "EPO humaine" tel qu'on l'utîl:: r désigne un polypeptide possédant la séquence d.i minés inhérente aux êtres humains, avec ou sans cha.ri c'[lques Des exemples de i'EPO humaine comprennent une EPC y. o- !O vient d'urine humaine (dénommée ci-après 'EPO urinair humaine"), une EPO obtenue par expression dans une cellula hôte du gène codant pour la séquence d'acides minés de i'EPO humaine (ce type d'EPO humaine est déioxieé ci-aprés "EPOr humaine"), une EPO obtenue à partir d'une culture de tissu de cellules rénales cancéreuses humaines, et une EPO obtenue par culture d'un hybridome résultant de la fas on cellulaire d'une lignée de cellules humaines ayant la capa- cité de produire de l'EPO humaine. Le terme "érythro- polétine" (dénomméeci-après "EPO") désigne une Eubstance 2D physiologiquement active à l'état de trace qui agit sur les cellulessouches érythroblastiques présentes non seulement chez l'homme mais également chez d'autres animaux, de manière a accélérer la différentiation de ces cellules- souches en cellules érythrocytaires mûres, et la proliféra- tion de ces dernières. Bien que de nombreuses études sur i'EPO urinaire humaine aient été rapportées, l'utilisation pharmaceutique de i'EPO humaine reste encore inconnue sous de nombreux aspects. On connaît depuis longtemps l'incidence élevée de l'anémie constituant l'une des complications chez des patients souffrant d'arthrite rhumatoïde (voir par exemple F. Nilsson, Acta Med. Scand. Suppl., 201 193 (1948) et F.Do Roberts -2- et coll., Blood, 21, 470 [1983)), et l'anémie grave associée à l'arthrite rhumatoide a une importance clinique particulière dans le traitement de la maladie. On a avancé de nombreuses hypothèses pour expliquer le mécanisme responsable du développement de l'anémie, et celles-ci comprennent le blocage du fer dans le système réticulo- endothélial dû à un métabolisme anormal du fer, la libération défectueuse du fer, des lésions de la rate, la production défectueuse d'EPO, l'hémolyse et des désordres dans les cellules- souches hémopolétiques. On pense que l'anémie de l'arthrite rhumato!de se développe à la suite d'une déficience en fer dans les globules rouges due à un métabolisme anormal du fer car la plupart des causes de l'anémie dans l'arthrite rhumatoïde sont du type de l'hypochromie normocytaire, les taux moyens d'hémoglobine érythrocytaire sont diminués, il y a une diminution du nombre des érythroblastes dans la moelle osseuse et une augmentation de la quantité de protoporphyrine libre dans les érythrocytes (voir par exemple M.M. Wintrobe, Clinical Hematoloqy, 671, Lea & Febiger, Londres C1974)). Toutefois, certains chercheurs ont signalé qu'il n'y avait pas de corrélation entre l'augmentation des taux d'EPO plasma- tique chez des patients souffrant d'arthrite rhumatoïde et le degré d'anémie (voir par exemple H.P. Ward et coll., J. Lab. Clin. Med., 74, 93 (1969) et V. Pavlovic-Kentera et coll., Scand. J. Haematol., 23, 141 (1979)]. Cette obser- vation suggère que la production défectueuse d'EPO peut aussi être impliquée dans l'anémie de l'arthrite rhumatoide. Toutefois, en l'absence de toute observation démontrant que des patients atteints d'arthrite rhumatoide souffrent de troubles du rein, du corps thyrolde ou d'autres tissus pro- ducteurs d'EPO, il reste à établir que la production défec- tueuse d'EPO accompagne réellement l'arthrite rhumatoide. D'autres causes qui ont été proposées pour expliquer le fait que les taux plasmatiques d'EPO chez des patients atteints d'arthrite rhumatoide ne sont pas augmentés comprennent la -3- faculté de réponse insuffisante de la moelle osseuse à l'EPO et la possibilité de la production d'un inhibiteur d'EPO. On a par conséquent fort douté que l'administration d'EPO humaine à des patients atteints d'anémie de l'arthrite rhuma- to'de soit efficace aux fins de traitement de la maladie. Comme on l'a déjà mentionné, il existe de nombreux articles qui décrivent les diverses fonctions de l'EPO urinaire humaine, mais personne n'a démontré par expérimentation in vivo avec des sujets humains ou des animaux que l'EPO urinaire humaine et d'autres types d'EPO humaine sont efficaces en tant qu'agents thérapeutiques pour le traitement de l'anémie associée à l'arthrite rhumatoïde. Les auteurs de la présente invention ont préparé une forme extrêmement pure d'EPO urinaire humaine et ils ont aussi obtenu de l'EPOr humaine par expression dans une cellule hôte du gène codant pour la séquence d'acides aminés de l'EPO humaine. En utilisant ces deux types d'EPO humaine, les auteurs de la présente invention ont étudié leurs effets thérapeutiques sur l'anémie dans des modèles animaux atteints d'affections de type arthrite rhumatoïde. Ils ont eu la grande surprise de constater que ces types d'EPO humaine se sont révélés très efficaces contre l'anémie et par conséquent les auteurs de la présente invention ont conclu que ceux-ci étaient utilisables en tant qu'agents thérapeutiques pour le traitement de l'anémie de l'arthrite rhumatoide. La présente invention a été réalisée sur la base de cette découverte. En conséquence, l'objet principal de la présente inven- tion est de fournir une nouvelle composition pharmaceutique pour le traitement de l'anémie de l'arthrite rhumatoide qui comprend une quantité efficace du point de vue thérapeu- tique d'EPO humaine dans un véhicule acceptable par voie parentérale. Les types d'EPO humaine qui sont incorporés dans la composition de la présente invention en tant que composant actif peuvent être préparés par divers moyens. Par exemple, -4- de l'EPO urinaire humaine peut être extraite d'urine humaine normale ou de l'urine de patients souffrant d'anémie hypo- plastique IT. Miyake et coll., J. B. C., 252, 5558 (1977) et J.P. Lewin et coll., J. Lab. Clin. Med., 66, 987 (1965)]. On peut préparer de l'EPOr humaine par des techniques de génie génétique comprenant l'obtentiond'UriV messager (ARNm) correspondant à la séquence d'acides aminés d'EPO humaine, la préparation d'un ADN recombinant en utilisant l'ARNm, et l'expression du gène d'ADN dans une cellule-hôte appro- priée telle qu'une bactérie (E. coli par exemple), une levure, ou une lignée cellulaire animale ou végétale (voir par exemple L.H. Sylvia, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 2708 (1984)). Bien que diverses lignées cellulaires animales soient disponibles en tant que cellules-hôtes, on préfère les lignées cellulaires cultivées provenant d'êtres humains ou d'autres mammifères, et celles-ci comprennent les cel- lules COS, les cellules ovariennes d'hamster de Chine (CHO) et les cellules C-127 de souris. On peut également préparer l'EPO humaine par exemple à partir de cultures de tissu de cellules rénales cancéreuses humaines (demande de brevet japonais publiée non examinée N 55790/1979), à partir de cellules lymphoblastiques humaines ayant la capacité de produire de l'EPO humaine (demande de brevet japonais publiée non examinée N 40411/1982), et à partir d'une cul- ture de l'hybridome obtenu par fusion cellulaire d'une lignée cellulaire humaine. Tous les types d'EPO humaine qui sont préparés par ces procédés sont utilisables dans la pré- sente invention, dans la mesure o ils permettent la proli- fération de globules rouges mûrs manifestant suffisamment de transport d'oxygène pour être utiles dans le traitement de l'anémie de l'arthrite rhumatoide. L'EPO humaine présente dans l'urine ou dans le surna- geant de culture obtenu par les procédés précités peut être encore concentrée et purifiée par des techniques courantes d'isolement et de purification telles que, par exemple, -5- précipitation avec un solvant organique (par exemple, acide benzoique, éthanol, acétone ou acide tannique), relargage avec du sulfate d'ammonium, etc, dialyse par exemple par concentration sous vide, des techniques chromatographiques, (par exemple chromatographie par perméation sur gel, chroma- tographie d'échange ionique et chromatographie par affinité) et des techniques d'électrophorèse (par exemple électro- phorèse iso-électrique et électrophorèse sur gel). On peut utiliser ces techniques d'isolement et de purification soit individuellement, soit en combinaison. On peut conserver l'EPO humaine ainsi préparée soit congelée soit sous une forme déshydratée obtenue par lyophili- sation, séchage sous vide ou d'autres méthodes appropriées. Ou encore, on peut mélanger une solution aqueuse contenant lb l'EPO humaine avec un sel soluble dans l'eau ou un solvant organique hydrophile pour précipiter le composant actif qui est ensuite déshydraté aux fins de stockage. Si on le désire, l'EPO humaine peut être dissoute dans une solution tampon appropriée et filtrée aseptiquement, par exemple à travers 23 un filtre MiIipore, pour préparer une solution injectable. La composition pharmaceutique de la présente invention pour le traitement de l'anémie de l'arthrite rhumatoïde peut être mélangée à des agents de traitement de l'anémie traditionnels tels que des composés chalybés, de la vitamine B12 et des androgènes, soit dans une forme pharmaceutique, soit juste avant l'utilisation. Des exemples de composés chalybés comprennent le sulfate de fer séché, le fumarate de fer, le dextraneúerrugineux, le gluconate de fer, le glucuronate de fer et l'orotate de fer. On peut déterminer la posologie et-la fréquence de l'administration de l'EPO humaine incorporée dans la compo- sition thérapeutique de la présente invention en fonction de l'état du patient sous régime thérapeutique. Dans les -6- 2576792 cas normaux, on peut administrer à un adulte une préparation contenant 0, 1-500 pg, de préférence 5-100 pg d'EPO humaine, en 1-7 doses pendant une semaine, sur la base d'une activité de l'érythropoiétine humaine égaleà 9 x 10 unités par mg. La composition pharmaceutique de la présente invention pour le traitement de l'anémie de l'arthrite rhumatoide peut contenir un stabilisant choisi parmi le polyéthylène- glycol, des protéines, des sucres, des acides aminés, des sels minéraux, des sels organiques et des réducteurs sulfurés. On peut utiliser ces stabilisants soit individuellement, soit en combinaison. On les introduit de préférence dans la combinaison de la présente invention en une quantité allant de 0,11 à 10 000 parties en poids par partie en poids d'EPO humaine. Si l'on utilise deux stabilisants ou plus, il suffit que la somme de leurs quantités se trouve dans les limites spécifiées plus haut. On utilise ces stabilisants sous forme d'une solution aqueuse contenant une quantité correspondante d'un stabilisant déterminé pour donner la concentration et le pH appropriés. On ajuste cette solution aqueuse pour obtenir un rapport de pression osmotique allant de 0,1 à 3,0, de préférence de 0,8 à 1,2. On ajuste le pH de la solution aqueuse à une valeur comprise entre 5,0 et 9,0, de préference entre 6 et 8. On peut préparer la composition de-la présente invention sous une forme pharmaceutique es présence d'un agent empêchant l'adsorption. -7- Exemple de référence 1: Préparation d'EPO urinaire humaine Etape (1): Purification partielle à partir d'urine humaine On a traité de l'urine provenant de patients souffrant d'anémie hypoplastique par la technique de T. Miyake et coll. (J. B. C., 52, 5558 (1977]), à savoir par 1) désionisation sur une colonne de Sephadex G-50, 2) adsorption sur de la DEAE-cellulose dans un système discontinu, 3) précipitation avec de l'éthanol et 4) chromatographie sur une colonne de DEAE-agarose. On a obtenu par cette technique une forme par- tiellement purifiée d'EPO urinaire humaine. Etape (2): Chromatoqraphie en phase inversée On a dissous l'EPO urinaire humaine partiellement purifiée dans une solution d'acide trifluoroacétique (TFA) à 0,1% (Aldrich Chemical Co, Inc.,) contenant 24% de propanol (Wako Pure Chemical Industries Ltd.) et on a soumis la solu- tion à une purification par HPLC sur une colonne Hitachi type 638-50. On a utilisé comme indicateur l'absorption dans l'ultraviolet à 280 nm et 220 nm. On a appliqué l'échantillon ainsi préparé sur une colonne YMC-C8 (6 mm x 30 cm, fournie par Yamamura Chemical Co Ltd.) équilibrée avec Ane solution d'acide trifluoro-acétique à 0,13 contenant 24% de n-propanol, puis on a élué la colonne avec la même solution d'équilibrage. Une fois éluées les fractions non adsorbées, on a fait passer la concentration du n-propanol à 26% pour éluer les fractions actives. On a recueilli les fractions contenant l'activité EPO et on les a concentrées à un volume de 0,1-0,2 ml par ultrafiltration en utilisant Centricon-100 (nom commercial d'Amicon). Etape (3): Chromatoqraphie sur tamis moléculaire à haute performance On a appliqué l'échantillon concentré sur une colonne TSK-G300 SW (7,8 mm x 60 cm, fournie par Toyo Soda Manufactu- ring Co Ltd.) équilibrée avec une solution de'TFA à 0,1% contenant 26% de n-propanol, et on a élue la colonne avec la même solution d'équilibrage. On a obtenu des pics pour -s - les fractions à activité EPO à des positions correspondant aux poids moléculaires allant de 25 000 à 30 000. On a recueilli ces fractions actives et on les a lyophilisées& Les fractions avaient une activité spécifique d'environ 9 x 104 unités/mg. Les activités spécifiques des échantillons préparés dans les étapes respectives 1 à 3 sont indiquées dans le tableau I. Tableau I Etape Activité spécifique (U/mng) (1) Purification partielle 600 (2) Chromatographie en phase inversée 10 000 (3) Chromatographie sur tamis moléculaire à haute performance 90 000 Méthode d'évaluation: selon la méthode de N.N. Isqove et coll., J. Cell Physiology, 83, 309 (1974). Exemple de référence 2: Préparation d'EPOr humaine provenant de cellules CHO Un plasmide contenant le gène codant pour la séquence d'acides aminés pour l'EPO humaine a été exprimé-dans des cellules ovariennes d'hamster de Chine (cellules CHO) pour la production d'EPOr humaine. Les techniques utilisées sont décrites spécifiquement dans la demande de brevet japonais N 281862/1984 (date de dépôt: 27 décembre 1984), intitulée "Vector haboring accessory DNA for the transformation of eucaryotic cells" (Vecteur hébergeant de l'ADN complémentaire pour la transformation de cellules eucaryotes). On donne ci-dessous un résumé des modes opératoires. On a fait digérer avec EcoRI l'ADN provenant d'un clone lambda HEPOFL 13 contenant le gène codant pour la séquence d'acides aminés d'EPO humaine provenant de cellules hépatiques de foetus humain, et le court fragment EcoRI recueilli héber- geant le gène codant pour la séquence d'acides aminés de l'EPO humaine a été inséré dans le site EcoRI du plasmide RKI-4. Le plasmide a été ensuite incorporé dans des cellules CHO déficientes en DHFR de manière à les transformer. _ 9_ On a cultivé les cellules CHO transformées dans un milieu alpha carencé en acides nucléiques. On a sélectionné les cellules hébergeant au moins un gène DHFR et on- les a utili- sées dans la production d'EPOr humaine en augmentant progres- S sivement la concentration de méthotrexate dans le milieu. L'EPQr humaine dans le surnageant de la culture finalement obtenue avait une activité de 20 unités/ml. On a cultivé les cellules CHO pendant 3 jours dans un milieu de culture liquide exempt de sérum et on a isolé de l'EPOr humaine pure par les techniques utilisées dans la préparation d'EPO urinaire humaine pure. L'EPOr humaine ainsi obtenue s'est révélée posséder une activité de 6600 unités/ml, telle que déterminée par la méthode de Krystal et coll. (J. Lab. Clin. Med., 97, 144 C198J]). L'électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide a montré que cette EPOr humaine était constituée d'une seule bande protéique. On a mélangé l'EPOr humaine avec 0,1% d'ASB (albumine de sérum bovin) et on l'a dialysée contre une solution saline physiologique pour préparer des échantillons à utiliser dans des expériences ultérieures. Expériences: Effets thérapeutiques de l'EPOr humaine pour le traitement de l'anémie chez des rats atteints d'arthrite déclenchée par injection d'adjuvant 1. Préparation de rats atteints d'arthrite déclenchée par injection d'adjuvant On a administré par injection sous-cutanée au niveau de la queue à des rats LEW/Crj femelles âgés de 8 semaines (fournis par Japan Charles River Co. Ltd.) 0,05 ml d'un adjuvant (50 mg/ml de la souche Aoyama B). 27 jours après l'injection, le développement d'arthrite a été confirmé chez les rats traités par l'adjuvant, pour lesquels on a ensuite mesuré les paramètres érythrocytaires suivants: - l0 - 2576792 Paramètres 1) Hémoglobine: On a soumis des échantillons de sang prélevé au niveau de l'oeil à une spectrophotométrie à l'aide d'un photomètre RaBa Super fourni par Chugai Pharmaceutical Co. Ltd. 2) Hématocrite: On a prélevé des échantillons de sang au niveau de l'oeil dans un tube à hématocrite et on a mesuré l'hématocrite par la méthode courante. 3) Numération érythrocytaire: On a dilué des échantillons de sang prélevés au niveau de l'oeil avec de i'ISOTON0 (nom commercial de Coulter Electronics Inc.) et on a effectué la numéra- tion érythrocytaire à l'aide d'un compteur Coulter type ZBI. Les paramètres érythrocytaires chez les rats traités par l'adjuvant, comparés aux valeurs normales, sont indiqués dans le tableau II. Tableau II Paramètre Rats normaux Rats traités Hématocrite (%) 46,4 0,74 41,9 0, 46** Hémoglobine (g/dl) 14,9 0,27 12,2 + 0,40** Numération érythrocytaire (x104/mm3) 860 7 736 10** **: P (Déterminations effectuées 27 jours après la sensibilisation par l'adjuvant, chaque groupe étant constitué de 4 rats). Comme l'indique le tableau II, tous les paramètres érythrocytaires des rats traités par l'adjuvant différaient notablement de ceux constatés chez les rats normaux, et les rats se sont révélés être dans une condition anémique. 2. Effets thérapeutiques de l'EPO urinaire humaine pour le traitement de l'anémie chez les rats traités par l'adjuvant On a injecté par voie intrapéritonéale à chacun des rats traités par l'adjuvant préparés en 1 de l'EPO humaine (25 unités/rat/jour) pendant 7 jours consécutifs à partir du dix-huitième jour après le traitement par l'adjuvant. Comme indiqué dans le tableau III, on a comparé les groupes traités au groupe témoin en considérant les paramètres érythro- cytaires. - hi - 2576792 Tableau III Paramètres Témoin Rats traités par l'EPO Hématocrite (%> 43,2 0,51 51,1 0, 54** Hémoglobine (g/dl) 11,8 0,27 14,4 0,40** Numération érythrocytaire (x104/nm3) 705 18,6 829 20,0** **: P 3. Effets thérapeutiques de l'EPOr humaine provenant de cellules CHO pour le traitement de l'anémie chez des rats traités par l'adjuvant On a injecté par voie intrapéritonéale à chacun des rats traités par l'adjuvant préparés en 1 de l'EPOr humaine provenant de cellules CHO (10 unités/rat/jour) pendant 7 jours consécutifs à partir du dix-huitième jour après le traitement par l'adjuvant. On a comparé les groupes traités au groupe témoin en considérant les paramètres érythrocytaires et les résultats sont indiqués dans le tableau IV. Tableau IV Paramètres Témoin Rats traités par l'EPO Hématocrite (%) 41,9 0,28 46,8 0, 53** Hémoglobine (g/dl) 11,9 0,33 14,7 0,16** Numération érythrocytaire (x104/mM3) 715 6,7 837 17,0** **:P (7 rats par groupe). Comme l'indiquent les tableaux III et IV, tous les paramètres érythrocytaires dans le groupe de rats traités avec l'EPO humaine étaient nettement améliorés par comparaison avec le groupe témoin. On a conclu par conséquent que l'EPO humaine préparée selon la présente invention était efficace pour le traitement de l'anémie associée a l'arthrite rhuma- toide. Les deux types d'EPO humaine n'avaient pas de toxicité dans les-conditions expérimentales utilisées. On illustre la présente invention plus en détail à l'aide des exemples ci-après qui ne sont pas limitatifs. _12 Exemple 1 - On a préparé aseptiquement une solution à partir de la formulation indiquée ci-dessous. Composants Quantités (parties en poids) EPOr humaine provenant de cellules CHO 1 Albumine de sérum humain 100 Eau distillée pour injections jusqu'à 100 000 On a réparti la solution dans de petits flacons et on l'a lyophilisée,.puis on a scellé les flacons. Exemple 2 On a obtenu des préparations lyophilisées comme dans l'exemple 1, mis à part que l'on a remplacé l'albumine de sérum-humain par 100 parties en poids de dextrane40. Exemple 3 On a préparé aseptiquement une solution aqueuse contenant, pour 100 ml, du mannitol (5 g), de l'EPO urinaire humaine (1 mg), de l'albumine de sérum humain (100 g), de l'acétyl- tryptophane sodique (2,154 mg) et du caprylate de sodium (1,33 mg). On a mis de petites portions (1 ml) de la solution dans des flacons et on les a lyophilisées, puis on a scellé les flacons. Exemple 4 On a préparé aseptiquement une solution aqueuse conte- nant de l'EPO urinaire humaine (1 mg), du polyéthylèneglycol 4000 (500 mg) , un copolymère oxyde d'éthylène/oxyde de propylène (30 mg) et du chlorure de sodium (800 mg) dans 100 ml d'une solution de tampon phosphate 0,05M (pH 7,0). On a placé de petites portions (1 ml) de la solution dans des ampoules, qui ont été ensuite scellées par fusion. Exemple 5 On a préparé aseptiquement une solution aqueuse contenant de l'EPOr humaine provenant de cellules CHO (0,5 mg), de la glycine (1 g) et du sorbitol (1 g) dans 50 ml de solution de tampon phosphate 0,05M (pH 7,0). On a mis de petites portions (0,5 ml) de la solution dans des flacons et on les a lyophilisées -13- puis on a scellé les flacons. On a aussi préparé aseptiquement une solution aqueuse de méthylcellulose à 0,1% et on a mis des portions de 1 ml de la solution dans des ampoules pour la préparation de milieux de solubilisation. Exemple 6 On a préparé aseptiquement une solution aqueuse conte- nant, pour 100 ml, de l'EPO urinaire humaine (1 mg), de l'albumine de sérum humain (50 mg) et du mannitol (500 mg). On a mis de petites portions (1 ml) de la solution dans des flacons et on les a lyophilisées, puis on a scellé les flacons. On a aussi préparé aseptiquement une solution aqueuse conte- nant du gluconate ferrique (3 g) et du chlorure de sodium (2,7 g) dans 300 ml, et on a mis des portions de 3 ml de cette solution dans des ampoules qui ont été ensuite scellées par fusion. On a transféré le contenu d'un flacon dans une ampoule et on a obtenu une solution complète par mélange intime. On a injecté lentement (2-3 minutes) la solution par voie intraveineuse. -14 - REVENDICATIONS 1. Composition pharmaceutique pour le traitement de l'anémie de l'arthrite rhumato:de comprenant une quantité efficace du point de vue thérapeutique d'érythropoiétine humaine dans un véhicule acceptable par voie parentérale. 2. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée par le fait que l'érythropolétine humaine provient d'urine humaine. 3. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée par le fait que l'érythropolétine humaine est obtenue par expression dans une cellule-hôte du gène codant pour la séquence d'acides aminés de l'érythropolétine humaine. 4. Composition pharmaceutique selon la revendication 3, caractérisée par le fait que la cellule-hôte est une cellule d'E. coli, une cellule de levure, une lignée de cellules végétales, ou une lignée de cellules animales. 5. Composition pharmaceutique selon la revendication 3, caractérisée par le fait que la cellule-hôte est une cellule ovarienne d'hamster de Chine. 6. Composition pharmaceutique selon la revendication 3, caractérisée par le fait que la cellule-hôte est une cellule COS.