FR 2582315 A1 19861128 FR 8507682 A 19850522 La présente invention se rapporte à un procédé de culture prolongée de cellules épithéliales normales, d'o- rigine animale. Les récents progrès concernant les techniques et les milieux de culture ont eu pour résultat de donner de l'importance aux cultures de tissus animaux, non seulement dans le domaine de la recherche fondamentale, mais également dans celui de la production à l'échelle industrielle. Des traitements particuliers permettent de culti- ver in vivo des cellules cancéreuses possédant des fonc- tions biologiques. D'autre part, il reste à résoudre le pro- blème des cultures prolongées, en particulier des cultures primaires de cellules épithéliales normales, possédant des fonctions normales. Les cultures prolongées de cellules animales peu- vent fréquemment entraîner la manifestation de propriétés différentes de celles des cellules mères, par exemple une tumorigénèse provoquée par la transformation. L'établisse- ment d'une culture, qui puisse résister à la longue, tout en maintenant ses fonctions normales, apporterait une nette contribution à l'analyse cellulaire des processus biologi- ques in vivo, aux études sur la carcinogénèse, et à la pro- duction de substances physiologiquement actives. Le fait de pouvoir déterminer si une substance physiologiquement ac- tive, produite par une cellule cancéreuse, est identique à ou différente de celle qui est produite par la cellule mère, interviendrait dans l'utilisation de cette substance, et servirait comme moyen de diagnostic pour discerner les cel- lules cancéreuses des cellules normales. En conséquence, la culture de cellules épithéliales normales, possédant des fonctions normales, mérite une remarque. Les cultures primaires de cellules épithéliales normales, in vitro, ne présentent généralement qu'une très courte période de survie des cellules, ce qui constitue un sérieux obstacle à l'examen de leurs fonctions physiologi- ques,ou à la production de substances physiologiquement ac- tives. La période de survie des hépatocytes mûrs, qui pos- sèdent le plus grand nombre de fonctions parmi les cellules épithéliales, en culture primaire, est de l'ordre de 1 se- maine. En ce qui concerne les cellules non épithéliales, Hayflick et Moorhead ont mentionné en 1961 une durée de culture d'environ 10 mois pour des fibroblastes pulmonai- res. A ce jour, on a essayé différents procédés améliorés pour la culture en monocouche des cellules épithéliales. Par exemple, G. Michalopoulos et H.C. Pitot décrivent un procédé de culture en monocouche d'hépatocytes mûrs possé- dant les fonctions spécifiques du foie,dans lequel ces cel- lules sont cultivées sur une membrane de collagène en sus- pension (cf. exp. Cell. Res. 94, 70 (1975). Comme ce pro- cédé présente l'inconvénient que la contraction de la mem- brane de collagène flétrit les cellules, on a développé des procédés améliorés qui comprennent l'utilisation, à la pla- ce de cette membrane de collagène, d'un filtre de nitrocel- lulose [cf. C.R. Savage Jr et R.J.Bonney, Exp. Cell. Res., 114, 307 (1978) ], et la culture des cellules sur un tamis de nylon au gel de collagène [cf. A.E. Sirica et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 283 (1979); Cancer Res., , 3259 (1980)]. En outre, d'autres procédés comprenant la culture sur une biomatrice [cf. M.Rojkind et coll., J.Cell. Biol., 87, 255 (1980)7, et l'utilisation d'un fibroblaste comme couche nourricière f[cf. G. Michalopoulos et coll., In Vitro, 15, 796 (1979), et R. Langenbach et coll. Cancer Res., 39, 3509(1979)Jont été rapportés. Cependant, ces améliorations entraînent des opéra- tions pénibles, ou des observations morphologiques diffici- les. De plus, les facteurs compliqués ainsi ajoutés ne sont pas facilement analysés. Enfin, il n'existe aucun rapport présentant un effet remarquable, obtenu par addition de sub- stances chimiques dans la culture primaire en monocouche, en dépit des différents perfectionnements de la technique de culture, reportés plus haut. La présente invention est basée sur la constata- tion que l'addition de dérivés de l'acide barbiturique, qui sont connus en tant qu'agents hypnotiques et antiépilepti- ques, s'avère efficace pour la conservation des cellules épithéliales normales, pendant une longue durée; on a cons- taté plus particulièrement que l'addition de phénobarbital en forte concentration, au milieu, au cours d'un essai d'accélération de la carcinogénèse, avec utilisation d'hé- patocytes mûrs de rat en culture primaire, entrainait la survie des cellules, qui pouvaient mourir en l'espace d'une semaine en l'absence de ces dérivés de l'acide barbituri- que, 49 jours après le début de la culture primaire in vi- tro. Le nouveau procédé pour prolonger la culture des cellules épithéliales normales consite à cultiver ces cel- lules dans un milieu renfermant un dérivé de l'acide bar- biturique. Dans les dessins ci-après annexés: la figure 1 représente un graphique qui montre les modifications des taux de survie des hépatocytes (en ordonnée le nombre de cellules hépatiques), en fonction de la durée de la culture (portée en nombre de jours en ab- cisse). les figures 2 à 5 sont des photographies micros- copiques en contraste de phase d'hépatocytes, en la présen- ce ou l'absence de PB (phénobarbital); la figure 6 est un graphique qui montre l'effet cytotoxique de 3'-Me-DAB (méthyl-3' diméthylamino-4 azoben- zène)sur la culture d'hépatocytes; en ordonnée le taux % de cellules vivantes et en abcisse le nombre de jours de culture; la figure 7 est une photographie microscopique en contraste de phase d'hépatocytes traités par MC (méthyl- cholanthrne) La présente invention permet la culture prolongée et la survie des cellules épithéliales normales d'origine animale, homme compris, par addition au milieu d'un dérivé de l'acide barbiturique. Les cellules épithéliales norma- les à cultiver peuvent être des hépatocytes mûrs de rat. On peut employer tout milieu généralement utili- sé pour les cultures cellulaires, convenant à la croissan- ce des cellules épithéliales normales. Les dérivés de l'acide barbiturique, pouvant être ajoutés au milieu, sont représentés par la formule générale suivante: O R3 iR Y N R R N O R4 dans laquelle R1 et R2 représentent chacun un atome d'hydro- gène, un groupe alkyle, un groupe alkyle lindaire ou rami- fié, éventuellement substitué et ayant 1 à 6 atomes de car- bone; un groupe hydrocarboné cyclique, saturé ou non sa- turé;ou un groupe amino substitué; R3 et R4 représentent chacun un atome d'hydrogène; un groupe alkyle; ou un groupe alkyle substitué, ayant tu 2 atomes de carbone. Des exemples de ces composés sont énumérés ci- après. phénobarbital méphobarbital O O C H NH NH NH3' N 0 o CH3 pentobarbital acide diméthyl-1,3 barbituri- que O O0 CH3 C2 H5')" Nil H N / r- O CH3CH2CH2CH amobarbital CH3 0% C2H5 (CH3)2CHHCH2CH2 N NH o0 cyclobarbital C2H5 NHXu Go acide uramil N,N-diacétique O H NH HOOCCH2 / N NH H HOOCCH2 / 2 o héxobartital CH N /3 CHO NO OH N-méthylphénobarbital CH O /c3 C H N OH N O" (hydroxy-l'éthyl)-5 trioxohexahydropyrimidine CH3 H CH HO \-- HX 0 (amino-l'éthyl)-5 trioxohexahydropyrimidine O CH3. C H NH2 C NH \-O H H NH (hydroxy-1'éthyl)-5 carboxyméthyl-3 trioxohegahydro- pyrimidine COO-I I CH2 o I I -o HO N H (hydroxy-l'éthyl)-5 hydroxyéthyl-3 trioxohexahydropyri- midine CH2OH : CH2 o! CH3_CH N I v HO F H NH H / (amino-1'éthyl)-5 aminoéthyl-3 trioxohexahydropyrimidine CH2NH2 CH2 CH3- CH N.. N2 H -N O On peut utiliser différents procédés de culture, com]ne la culture sur plaque,la culture en rotation, culture en flacon tournant ou tube rotatif etc. On peut opérer à 37 C, en atmosphere humide à te- neur de 5% en anhydride carbonique. Conformément au procédé selon l'invention, l'addition d'un dérivé de l'acide barbiturique permet,aux cellules épithéliales normales, qui autrement mourraient en l'espace d'une semaine, de survivre pendant au moins un mois. On a constaté, en conclusion d'une expérimenta- tion, au cours de laquelle on avait ajouté de l'indométha- cine qui est un stabilisant de la membrane de l'érythrocyte, à la place du dérivé de l'acide barbiturique, que le pre- mier composé s'avérait efficace, non pour la conservation des hépatocytes sur une longue période, mais pour empêcher leur dégénérescence morphologique, stabilisant ainsi les fonctions des membranes cellulaires. L'exemple suivant est donné afin de mieux illus- trer la présente invention EXEMPLE I.Culture expérimentale d'hépatocytes mQrs de rat en cul- ture primaire 1) Préparation d'hépatocytes isolés Le foie d'un rat Donryu mâle, âgé de 3 mois, est perfusé avec de la collagénase, afin d'isoler les hépatocytes à essayer. 2) Milieu et culture Le milieu de culture de base, utilisé au cours de cette é- tude, est le milieu de Eagle MEM additionné de 20% de sérum de bovin inactivé par la chaleur, 100 U/ml de pénicilline, gg/ml de streptomycine, 60 gg/ml de kanamycine, et 1 gg/ml de fungizone. A ce milieu de base, on ajoute de la dexaméthasone et de l'insuline, à des concentrations fina- les respectives de 10 gM et 10 gg/ml. Ce milieu,complété en hormones, est dénommé par/a suite comme le milieu DI.Sauf indication contraire, PB (le phénobarbital) est dissous dans le milieu de base et le milieu DI à une concentration finale de 3 mM. Le milieu de base et ce milieu DI renfermant le PB, sont respectivement désignés par la suite comme milieu PB et milieu PBDI. Les hépatocytes isolés sont finalement mis en suspension à une concentration de 3,5 x 105 cellules/ml dans du milieu DI.Des portions de 4 et10 ml des suspensions cellulaires sont ensemencées respectivement dans des boites en matière plastique de Falcon de 60 et 100 mm, et sont cultivées en atmosphère humide, à 37 C, à 5% de CO2 et 95% d'air. Après une période de fixation d'un jour, les milieux de culture sont remplacés par du milieu de base, du milieu PB ou du milieu PBDI, et ensuite ces milieux de culture sont renou- velés tous les 2 à 3 jours. On continue à conserver quel- ques cultures en milieu DI de la même manière. 3) Essai d'addition de phénobarbital 1. Procédés d'essai Après la période de fixation dans les conditions définies en I-2 pendant 24 heures, le milieu est échangé contre les quatre milieux suivants: (1) milieu de base (Eagle MEM) (2) milieu PB préparé par addition de 3mM de phénobarbital au milieu de base (3) milieu PBDI préparé par addition de 3 mM de PB au milieu DI, et (4) milieu DI. Ces milieux sont remplacés tous les deux ou trois jours. Les essais suivants sont effectués périodiquement jusqu'au ème jour de la culture: (a) détermination du nombre de cellules survivan- tes; (b) Observation microscopique; (c) détermination de la quantité d'albumine dans un milieu, par radioimmunodosage; (d) dosage de l'activité de la glucose-6 phos- phatase (G6Pase) dans les cellules, (e) dosage de l'activité de la tyrosine amino- transférase (TAT) dans les cellules, (f) effet d'induction de la dexaméthasone sur les activités décrites en (d) et (e), (g) dosage des teneurs en cytochrome P-450 (P-450), (h) dosage des teneurs en P-450 induites par PB (P-450pB), et (i) dosage des teneurs en P-450 induites par le méthylcholanthrène (P-450MC). Résultats (1) Effet de conservation sur la survie des cellules La figure 1 montre les variations du nombre des cellules vivantes dans les quatre milieux, en fonction du temps écoulé. Les nombres (1), (2), (3) et (4), sur cette figure, se rapportent aux milieux respectifs, définis plus haut. Les figures 2 à 5 sont des photographies microscopiques en contraste de phase, qui montrent les modifications morpho- logiques des cellules en fonction du temps. Les nombres (1), (2), (3) et (4) correspondent respectivement aux mi- lieux (1), (2), (3) et (4) indiqués plus haut. La figure 2 montre l'aspect des hépatocytes cultivés dans les milieux en question pendant 7 jours ( x 200). La figure 3 illustre l'aspect des hépatocytes cultivés dans ces milieux pendant 14 jours ( x 100). La figure 4 se rapporte à des hépatocytes cultivés dans le milieu PB (2) pendant 35 jours ( x 200). La figure 5 montre l'effet de la présence de PB sur la survie des hépatocytes mûrs en culture primaire; A montre l'aspect des cellules qui ont été continuellement traitées dans le milieu PB (2) pendant 7 jours, tandis que B corres- pond aux cellules qui ont été cultivées dans le milieu PB (2) pendant 6 jours, puis en l'absence de PB pendant un jour, C montre l'état des cellules traitées continuellement dans le milieu PB (2) pendant 14 jours, et D celui des cellules cultivées dans le milieu PB (2) pendant 6 jours, suivis de la culture en absence de PB pendant 7 jours ( x 100). 1 1 Les figures 1 et 2 indiquent clairement que les hépatocytes mûrs peuvent rapidement dégénérer et mourir une semaine après le début de la culture dans le système ne renfermant pas de PB (c'est-à-dire dans le milieu de base et le milieu DI). A partir du 14ème jour de la culture, on observe la croissance de cellules non pigmentées, du type épithélial (cf. Figure 3). D'autre part, les hépatocytes mûrs diminuent graduellement en nombre à mesure que le temps s'écoule, mais on peut les observer au moins jusqu'au 49ème jour de la culture avec peu de dégénérescence morphologique, sauf que les noyaux sont plus prononcés qu'au stade initial dans le système renfermant 3 mM de PB (c'est-à-dire les milieux PB et PBDI) (cf. les figures 1 à 4). Le milieu PBDI apparaît comme étant le plus approprié à la conserva- tion des hépatocytes mûrs (cf. figure 1). En présence de PB, la croissance des cellules non pigmentées de type épi- thélial, mentionnées plus haut, n'est guère observée (cf. figures 2 à 4). Le Tableau 1 représente les nombres d'hépatocy- tes survivants traités avec PB à diverses concentrations pendant 6 jours. TABLEAU 1 Effet de la concentration en PB sur les hépatocytes survi- vants dans la culture primaire. PB PB durée du Culture: Nombre d'hépatocytes * conc. traitement âge en 4 (mM) (jours) jours (x 104/boite) 0,75 6 7 43,3 + 1,3 1,5 6 7 48,1 + 0,6 3,0 6 7 92,4 3,5 * Dimension de l'ensemencement: 140 x 104 cellules/boite de 60 mm/ 4ml de milieu DI moyenne + SD de 3 boites différentes. Afin d'étudier l'effet de la concentration en PB sur la survie des hépatocytes dans la culture primaire, les cultures sont traitées avec 0, 75, 1,5 et 3 mM de PB dans le milieu de base pendant 6 jours, après une période de fixation de 1 jour dans le milieu DI. Les milieux renfer- mant PB sont remplacés tous les deux jours. Les nombres d'hépatocytes survivants en présence de 0,75 et de 1,5 mM de PB sont environ la moitié de ceux qui survivent en pré- sence de 3 mM de PB (Tableau 1). En outre, les hépatocytes survivants dans les milieux renfermant 0,75 et 1,5 mM de PB présentent des dégénérescences morphologiques qui sont très semblables à celles que l'on observe en l'absence de PB. De plus, on ne peut obtenir aucun effet de conser- vation,sauAorsque PB est présent de manière persistante (cf. figure 5). (2) Effet de conservation des fonctions cellu- lai-res Secrétion d'albumine Les hépatocytes survivants, en présence de 3 mM de PB,pré- sentent une secrétion d'albumine remarquable dans les mi- lieux de culture, pendant au moins 35 jours, lors de la cul- ture primaire. Bien que ces secrétions par les hépatocytes diminuent à mesure que le temps s'écoule dans les milieux, de base DI, PB et PBDI, celles des milieux PB et PBDI ne changent guère pendant au moins 28 jours après le 7ème jour de la culture primaire, montrant un taux relativement élevé de plusieurs gg/ml/2 jours (Tableau 2). En l'absence de PB, l'apport combiné de dexamethasone et d'insuline augmente notablement la sécrétion d'albumine, tandis qu'en présence de 3 mM de PB ces hormones n'affectent guère la sécrétion d'albumine par les hépatocytes. - TABLEAU 2 Durées de la production d'albumine des hépatocytes en cul- ture primaire, en presence ou absence de PB. jours Albumine secrétée (gg/ml) de culture de base DI PB PBDI 0 - 1 15,6 + 2,3 * 1 - 3 17,0 + 1,3 23,9 + 0,7 35,0 + 1,1 32,3 + 1,6 3 - 5 5,6 + 0,5 10,2 + 0,3 10,4 + 0,7 11,5 + 0,6 - 7 0,8 + 0,2 2,0 + 0,7 4,7 + 0,3 6,6 + 0,7 12 - 14 0,2 + 0,03 0,4 + 0,2 3,0 + 0,5 3,9 + 0,2 19 - 21 3,1 + 0,3 5,1 + 0,6 26 - 28 5,1 + 0,6 4,8 + 0,1 33 - 35 6,0 0,1 4,2 0,5 Moyenne + SD à partir de trois déterminations différentes. Les hépatocytes franchement isolés sont ensemencés à 1,4 x 106 cellules/boite de 60 mm renfermant 4 ml de milieu DI, sont mis à incuber pendant 24 heures, puis sont conser- vés dans le milieu de base, milieu DI, milieu PB ou milieu PBDI. La sécrétion d'albumine est exprimée en gg/ml de mi- lieu/2 jours de culture, et les valeurs sont exprimées comme la moyenne + SD de trois boites différentes. Activités de G6 Pase et de TAT Les activités G6Pase, dans les cultures conservées dans les quatre différents milieux ci-dessus, ne diffèrent guère les unes des autres (Tableau 3), et elles diminuent rapi- dement dans tous les cas à mesure que le temps passe. Dans tous ces cas, on n'observe au 7ème jour de culture primaire qu'environ 15% d'activité G6Pase dans l'homogénat de foie de rat (53 + 5 mU/mg de protéine). Le Tableau 3 (à la page 14) indique le résultat. TABLEAU 3 Durée des activités G6Pase dans les hépatocytes en culture primaire, en présence ou en absence de PB. Jours G6Pase (mU/mg protéine) de culture de base DI PB PBDI 1 53,2 + 7,2 2 38,1 + 5,8 31,3 + 9,2 40,7 + 5,6 44,1 + 3,4 3 28,8 + 1,6 19,4 + 4,3 30,6 + 3,1 31,3 + 3,6 14,2 + 2,7 12,6 + 0,7 14,3 + 2,4 14,9 + 3,0 7 8,1 + 0,9 7,0 + 1,7 8,3 + 0,6 9,8 + 1,4 10 4,4 + 2,1 3,7 + 2,6 5,0 + 0,7 5,3 + 1,0 14 2,5 + 1,4 2,6 + 1,9 5,1 + 1,2 4,9 + 1,0 21 4,1 + 1,6 3,3 + 0,4 28 4,7 + 1,5 3,1 + 0,6 35 5,5 2,2 2,0 0,1 Moyenne + SD de troisecpérimentations différentes. Homogénat de foie: 53 + 5 mU/mg protéine. Les hépatocytes fraîchement isolés sont ensemencés à 3,5 x 106 cellules/botte de 100 mm renfermant 10 ml de milieu DI, sont mis à incuber pendant 24 heures, puis sont conser- vés comme indiqué dans le milieu de base ou du milieu DI, PB, ou PBDI. Les cellules cultivées sont recueillies à par- tir des 4 bottes et sont homogénéisées. Les résultats sont exprimés en tant que moyenne + SD à partir de trois expé- rimentations différentes. Les activités TAT dans les cultures,conservées dans le milieu de base et le milieu DI, ne diminuent qu'à mesure que la culture dure, et ces cultures, au 7ème jour de culture primaire, indiquent respectivement 10 et 15% de l'activité TAT dans la partie surnageante de foie de rat (44 + 7 mU/mg de protéine) (Tableau 4). D'autre part, les activités TAT dans les cultures conservées dans les milieux PB et PBDI, diminuent aussi peu à peu, à mesure que dure la culture, mais elles ne changent guère apres le 7ème jour de culture primaire. Les cultures conservées dans les milieux PB et PBDI présentent respectivement 27 et 57% de l'activité TAT dans la partie surnageante de foie de rat, meme au 35ème jour de la culture primaire (Tableau 4) Le Tableau 4 montre le résultat. TABLEAU 4 Durée des activités TAT dans les hépatocytes en culture primaire, en présence et en absence de PB jours TAT (mU/mg de protéine) de culture de base DI PB PBDI 1 165,3 + 35,0: 2 48,4 + 4,5 90,2 + 32,1 96,0 + 16,5 92,9 + 20,1 3 16,9 + 4,0 21,6 4 3,4 34,5 + 8,3 51,3 + 6,4 6,7 + 1,6 15,3 + 3,6 22,7 + 2,8 32,3 + 5,9 7 4,3 + 0,2 6,9 + 1,4 13,3 + 3,0 25,7 + 1,2 1,9 + 0,7 3,5 + 0,3 9,5 + 0,6 20,2 + 0,8 2514 1,1 + 0,2 3,1 + 1,0 10,1 + 0,7 19,0 + 2,3 21 10,5 + 0,4 18,8 + 2,1 28 9,4 + 0,2 20,1 + 8,4 11,9 + 1,9 25,1 + 12,9 Moyenne + SD de trois expérimentations différentes. Partie surnageante de foie: 44 + 7 mU/mg de protéine. Les hépatocytes fratchement isolés sont ensemen- cés à 3,5 x 106 cellules/botte de lOO1mm, renfermant 10 mi de rti!ieu DI, sont mis à incuber pendant 24 heures, puis sont conservés comme indiqué dans du milieu de base ou du milieu DI, PB ou PBDI. Les cellules cultivées sont recueil- lies à partir des4 boites et sont homogénéisées. Les résul- tats sont exprimés en tant que moyenne + SD à partir de 3 expérimentations différentes. Une expression bien acceptée de fonction diffé- renciée de cellule hépatique est l'aptitude des hépatocytes à induire des enzymes spécifiques du foie en réponse aux hormones. En conséquence, on utilise aussi ce paramètre comme marqueur pour la conservation de fonction différen- ciée dans les hépatocytes survivants en présence de PB à 3 mM. Les cultures conservées dans le milieu PB sont mises à incuber avec de la dexaméthasone (10 gM) pendant 18 heu- res avant la récolte des cellules. L'addition de dexamétha- sone entraîne une induction triple à quintuple de l'activité TAT, mais n'entraîne pas d'induction de l'activité G6Pase (Tableau 5). Les hépatocytes survivants dans le milieu PB sont capables de répondre à la dexaméthazone de cette ma- nière, au moins jusqu'au 28ème jour de la culture primaire. Le Tableau 5 montre le résultat. TABLEAU 5 Induction par la dexaméthasone des activités TAT et G6Pase dans des hépatocytes en culture primaire dans le milieu PB Jours G6Pase (mU/mg TAT (mU/mg de protéine) de protéine) de culture PB PB + Dex* PB PB + Dex* 3 30,6 + 3,1 25,5 + 6,5 34,5 + 8,3 61,6 + 8,2 7 8,3 + 0,6 7,6 + 2,3 13,3 + 3,0 39,5 + 7,8 5,0 + 0,7 2,9 + 0,9 9,5 + 0,6 35,2 + 1,5 14 5,1 + 1,2 5,1 + 0,7 10,1 + 0,7 44,0 + 9,2 21 4,1 + 1,6 3,7 + 0,3 10,5 + 0,4 55,2 + 9,5 28 4,7 + 1,5 6,6 + 2,3 9,4 + 0,2 51,6 + 1,0 Moyenne + SD à partir de trois expérimentations différentes. *Dexaméthasone (10 kM) est ajoutée 18 heures avant la récol- te des cellules. Action cytotoxique du méthyl-3' diméthylamino-4 azobenzbne (3'-Me-DAB) sur les hépatocytes cultivés en présence ou en absence de PB Il est bien connu que PB induit, chez les animaux, des enzymes hépatiques métabolisant les médicaments microso- matiques [R. Synder et coll. "Hepatic Cytochrome P-45 Mono- oxygenase System", p. 227, Pergamon Press, Oxford (1982)j. Aussi, a-t-on mené des études sur l'effet du traitement par PB sur la cytotoxicité de 3'-Me-DAB sur les hépatocytes en culture primaire. Des hépatocytes fraîchement isolés sont fixés dans des bot- tes dans le milieu DI, pendant 24 heures. Ensuite, les cul- tures sont poursuivies, conservées dans le même milieu, ou dans un milieu PBDI, pendant 2 à 10'jours supplémentaires. Ces cultures sont exposées à 3'-Me-DAB à 0,24 mM, à partir du jour 1, 2 ou 3 de la culture primaire. Le nombre d'hépa- tocytes survivants est bien supérieur dans le milieu PBDI que dans le milieu DI (figure 6). Autrement dit, la sensi- bilité des hépatocytes à 3'-Me-DAB est remarquablement ré- duite par le traitement avec PB. En outre, plus la période de traitement par PB avant l'exposition à 3'-Me-DAB devient longue, plus les hépatocytes deviennent insensibles à 3'-Me-DAB. La figure 6 représente l'effet citotoxique de 3'-Me-DAB sur des hépatocytes en culture primaire, en présence ou ab- sence de PB. Teneurs en cytochrome P-450 Les déterminations biochimiques des teneurs totales en cyto- chrome P-450, et les déterminations immunochimiques des te- neurs en P-450pB et P-450MC sont réalisées avec utilisation d'homogénats d'hépatocytes en culture primaire, traités avec ou sans 3 mM de PB, ou 10 AM de MC. La teneur totale en cytochrome P-450, dans les hépatocytes cultivés en milieu DI pendant 24 heures après l'ensemence- ment, représente 67,8% de celle des hépatocytes fraîchement isolés (Tableaux 6 et 7). A ce moment de la culture, on y ajoute PB etMC. Le milieu renfermant PB est renouvelé tous les deux jours. Bien que le traitement par PB diminue effectivement la vitesse de chute de la teneur totale en cytochrome P-450 des hépatocytes en culture primaire, il n'a pu induire P-450pB dans les cellules (Tableau 6). PB D'autre part, du fait du traitement par MC, la teneur en cytochrome total P-450 tend à augmenter dans les hépatocy- tes en culture primaire (Tableau 7). En outre, le traite- ment par MC, induit à l'évidence P-450MC dans les cellules (Tableau 7). TABLEAU 6 Effet de PB sur les teneurs en cytochrome P-450 dans les hépatocytes en culture primaire. jours Teneur totale en P-450 (pmol/mg homogénat de de protéine) culture Néant de base DI PB PBDI 0 146 (7,2) 1 99(3,0) 3 40 (0,07) 50 (0) 70 (3,0) 69 (1,9) nd nd 49 56 7 nd nd 46 36 Les nombres entre parenthèses indiquent les teneurs spéci- fiques en P-450pB en pmol/mg d'homogénat de protéine. nd = non décelable. Les hépatocytes fraîchement isolés sont ensemencés à 3,5 x 106 cellules/boite de 100 mm renfermant 10 ml de milieu DI,sont mis à incuber pendant 24 heures, puis sont conser- vés comme indiqué dans le milieu de base ou le milieu DI, PB ou PBDI. Les nombres entre parenthèses indiquent les te- neurs en P-450pB dans pmol/mg d'homogénat de protéine. TABLEAU 7 Effet MC sur les teneurs en cytochrome P-450 dans les hépatocytes en culture primaire. jours Teneur totale en P-450 (pmol/mg d'homogénat de de protéine) de base culture Néant de base* u ueéat4C* DI-MC* PB+MC* PBDI+MC* 0 146 (8,0) 1 99 (7,0)** 3 93 (40,1) -106 (38,8) 115(30,5) 146(12,9) Les nombres entre parenthèses indiquent les teneurs spéci- fiques en P-450MC, en pmol/mg d'homogénat de protéine. *MC (104M) est ajouté aux cultures 24 heures après l'ense- mencement. ** -MC. MC est dissous dans DMSO, et est ajouté aux milieux de cul- ture pour donner une concentration finale de 10 lM, donnant ainsi une concentration finale en DMSO de 0,5% Les hépa- tocytes fraîchement isolés sont ensemencés à 3,5 x 106 cel- lules /bofte de 100 mm renfermant 10 ml de milieu DI, et sont mis à incuber pendant 24 heures, puis ils sont conser- vés dans du milieu, de base ou du milieu DI, PB ou PBDI, ad- ditionné de 10 gM de MC, comme indiqué. Les nombres entre parenthèses indiquent les teneurs en P-450MC en pmol/mg d'homogénat de protéine. Effet de MC sur la survie des hépatocytes On ajoute 1, 10 ou 100 IM de MC à des cultures primaires d'hépatocytes, après une période de 1 jour de fixation, afin d'examiner si MC peut être actif ou non pour conser- ver les hépatocytes en culture primaire. Les nombres d'hé- patocytes survivants, qui sont cultivés pendant 6 jours dans le milieu de base renfermant 1 et 10 RM de MC, repré- sentent respectivement 53,7 et 50,8% du nombre de ceux qui sont cultivés pendant la même période en milieu PB (Tableau 8). Dans le milieu de base, MC à_100 gM s'avère très toxique vis-à-vis des hépatocytes. Similairement, dans le milieu DI renfermant MC à 1, 10 et 100 gM, les nombres d'hépatocytes survivants au 7ème jour de la culture primaire représentent environ la moitié du nombre de ceux qui sont dans le milieu PBDI (Tableau 8). Au cours de la semaine de culture qui suit, le nombre des hépatocytes diminue encore, à la fois dans le milieu de base et le milieu DI, renfermant MC. En outre, les hépatocytes survivants dans ces deux cas res- semblent morphologiquement à ceux que l'ontrouve dans le milieu de base et le milieu DI exempts de MC, présentant des caractéristiques de dégénérescence tels que dégranula- tion du cytoplasme et multinucléation. Des cellules non pigmentées, de type épithélial et des cellules de type fi- broblaste, prolifèrent dans les milieux renfermant MC, mais ne prolifèrent guère dans le milieu PB et le milieu PBDI. TABLEAU 8 Effet de MC sur la survie des hépatocytes en culture primaire. PB MC Nombre d'hépatocytes (x 104/botte) conc. conc. de base DI (mM) (gM) jour 7 jour 14 jour 7 jour 14 250 0 38,2+2,3* 6,6+4,3* 46,0+ 1,9* 7,1+0,3* 0 1 48,2+6,7 10,8+0,8 42,8+ 1,0 5,3+0,2 0 10 45,6+1,5 6,1+0,9 54,6+ 2,8 8,8+0,6 0 100 5,4+2,5 0,6+0,3 44,2+ 1,9 10,0+0,9 3 0 89,8+2,0 65,8+4,7 92,3+ 5,0 68,2+2,3 -1 4 c Dimension de l'ensemencement: 140 x 10 cellules/boîte de 60 mm renfermant 4 ml de milieu DI. Moyenne + SD de 3 bottes différentes. *0,5% DMSO. Les hépatocytes fraîchement isolés sont ensemencés à 1,4 x 106 cellules/botte de 60 mm, renfermant 4 ml de milieu DI, sont mis à incuber pendant 24 heures, puis sont conservés dans du milieu de base ou du milieu DI, additionnés avec MC à 1, 10 ou 100 FM. Des cultures témoin sont conservées dans du milieu de base renfermant 0,5% de DMSO, ou du mi- lieu PB, après la période de fixationde 24 heures. Au 7ème et au 14ème jour de la culture primaire, le nombre d'hépa- tocytes survivants est déterminé par élimination au bleu de trypan, dans un hémocytomètre. Les résultats sont exprimés comme la moyenne + SD de 3 bottes différentes. La figure 7 représente la condition des hépatocytes en culture primaire, au 7ème jour de la culture ( x 100); dans cette figure E se réfère à ceux qui sont traités avec 10 gM de MC un jour après l'ensemencement, tandis que F se réfère à ceux qui sont traités avec 3 mM de PB pendant 6 jours. Ces données suggèrent que l'effet de conservation de PB, sur les hépatocytes mers, peut ne pas être provoqué par une augmentation de la désintoxication. 4) Effets de conservation sur les cellules d'ini- tiateurs hépatocarcinogènes autres gque PB PB est connu en tant qu'initiateur hépatocarcinogène.En con- séquence, on a examiné BHT et DD, qui sont bien connus com- me initiateurs hépatocarcinogènes, ainsi que DDE, qui est un analogue du DDT, pour savoir s'ils présentent des effets si- milaires à celui de PB. Or, ainsi qu'on le constate dans le Tableau 9 suivant, cha- cun de ces composés présente une cytotoxicité, mais n'a pas d'effet de conservation sur les hépatocytes mars. TABLEAU 9 Effet de différents produits chimiques sur la survie des hépatocytes en culture primaire Réactif Concentra- Nombre d'hépatocytes Albumine secrétée tion4 ton (x104/boite) (g/ml) (nM) 7 jours 14 jours 5-7 jours 12- 14 jours BHT 3 0 +0 0 +0 1,5 0 + 0 0 + 0 0,75 0 + 0 0 + 0 0,1 25,7 + 1,9 2,7 + 0,7 0,01 27,2 + 1,3 2,6 + 0,2 0,001 26,7 + 0,5 3,2 + 1,3 DDT 1 0 + 0 +0 0,5 12,2 + 2,1 0 +. 0 0,1 26,2 + 2,0 1,8 T 0,8 0,01 24,2 + 2,7 1,9 + 0,4 0,001 23,8 + 2,9 1,7 + 0,5 DDE 1 0 +0 0 + 0 0,1 38,3 + 5,9 3,3 + 0,5 0,01 39,3 + 2,9 3,8 + 0,7 0,001 41,9 + 3,8 3,9 + 0,4 Pento 3 ô + 0 O + 0 1,5 2,8 T 0,8 0 O 0 1 68,4 + 7,3 39,3 + 1,6 2,74 + 0,22 1,82 + 0,06 0,75 82,1 + 1,6 63,4 + 4,3 3,29 + 0,1.9 3,18 + 0,38 0,5 49,7 + 5,9 26,7 + 4,1 1,51 + 0,12 1,59 + 0,07 0,1 30,8 + 5,7 9,2 + 3,3 ut CO TABLEAU 9 (suite) Réactif Concentration Nombre d'hépatocytes Albumine secrétée (x104/boîte) (ggml) 7 jours 14 jours 5-7 jours 12-14 jours Indo 2 0 + 0 O + 0 1 76,4 + 6,7 22,5 + 1,1 4,06 + 0,08 2,40 + 0,05 0,75 41,1 + 2,9 14,7 + 0,7 3,70 + 0,61 0,80 + 0,08 0,5 43,3 + 2,4 8,4 + 1,2 2,61 + 0,28 0,41 + 0,03 0,05 45,7 + 1,2 6,9 + 1,1 Chlor 1 0 + 0 O + 0 0,5 1,0 + 0,5 O O 0,1 3,4 + 1,0 0 O 0,05 2,2 + 0,3 0 + O0 0,01 32,5 + 4,2 6,2 + 0,7 PB 3 101,7 +21,0 71,5 + 5,4 3,95 + 0,18 3,53 + 0,28 DMSO 70,4 57,1 + 2,7 3,7 + 0,5 1,25 + 0,04 0,52 + 0,03 Néant - 47,4 + 4,1 4,9 + 0,4 0,85 + 0,23 0,21 + 0,03 Dimension de l'ensemencement: 140 x 104 cellules/bote de 60 mm remplie de 4 ml de milieu DI. Chaque réactif est ajouté 24 heures après le début-de la culture. Moyenne + SD de 3 boites différentes. N ut w Ainsi qu'il a été dit antérieurement, l'amobarbital, qui est un dérivé de PB, ne favorise pas la carcinogénèse fC. Peraino et coll. Cancer Res., 35 2884 (1977. Lors d'une étude sur l'effet de conservation de la cellule, de l'amobarbital, on a constaté qu'il présente un effet de conservation des hépatocytes mûrs, semblable à celui de PB, à une concentration de 0,75 mM. Le Tableau 10 montre ce résultat TABLEAU 10 Effet de conservation de la cellule de l'amobarbital Réactif ConcentraPourcentage de cellules vivantes tion au 7ème jour au 14ème jour de la culture de la culture amobarbital 0,75 mm 80,2 + 4,0 36,3 + 5,7 PB 3 77,5 + 4,7 50,3 + 8,7 (essai témoin) - 38,2 + 3,7 4,3 0,4 Dimension de l'ensemencement: 140 x 104 cellules/botte de 60 mm/4ml. Ces données suggèrenet que l'effet de conservation sur les hépatocytes mûrs n'est pas commun à tous les initiateurs hé- patocarcinogènes. D'autre part, le pentobarbital, qui est-un dérivé de PB et est désigné par "Pento" dans le Tableau 9, présente, à une concentration de 0,75 mM, un effet de conservation des hépa- tocytes mûrs (cf. Tableau 9). ) Effet de conservation des cellulesL _ar des stabilisants d'érythromembrane L'indométhacine et la chlorpromazine, qui sont connus comme stabilisants d'érythromembrane, sont étudiés de manière si- milaire. La chlorpromazine est fortement cytotoxique, et n'a pas d'effet de conservation sur les hépatocytes mûrs, alors que l'indométhacine inhibe effectivement la dégéné- descence morphologique des hépatocytes mûrs à une concentra- * tion de 1 mM, tout en étant cytotoxique. En conséquence, la chlorpromazine ne peut conserver les cellules pendant une longue période, au contraire de PB (cf. Tableau 9). Ces données suggèrent que la stabilisation des fonctions des membranes cellulaires peuvent entra1ner une conserva- tion prolongée des hépatocytes mûrs par PB. II.Effet de conservation de la cellule par des dérivés de l'acide barbiturique: Comme l'amobarbital et le pentobarbital se sont avérés posséder un effet de conservation des cellules, si- milaire à celui de PB, on a recherché si d'autres dérivés de l'acide barbiturique présentaient également cet effet. Chaque réactif a été utilisé aux concentrations de 3 mM, 1,5 mM et 0,75 mM. Chaque milieu est introduit dans une boîte de Petri (0 60 mm) et on ensemence avec 140 x 104 hépatocytes mûrs de rat. Après 24 heures de culture, amenant la concen- tration cellulaire à i106 + 13,6 x 104 cellules/boite, on ajoute à ce milieu chaque réactif à l'une des concentra- tions indiquées plus haut. L'hexobarbital et le méphobar- bital sont ajoutés sous forme de solutions de DMSO à 0,5%, tandis que les autres réactifs sont ajoutés directement à chaque milieu. Les taux de cellules vivantes sont dosés 7 et 14 jours a- près l'ensemencement. Le Tableau 11 montre les résultats. TABLEAU 11 Réactif Concen- Pourcentage de cellules vivantes tration (n=3) (MM) 7 jours après 14 jours après l'ensemencement l'ensemencement amobarbital 3 0,3 + 0,3 0 + 0 1,5 3,4 + 1,4 2,6 + 0,6 0,75 80,2 T 4,0 36,3 + 5,7 hexobarbital 3 88,1 + 2,4 43,8 + 1,3 1,5 53,8 + 4,3 30,2 + 5,0 0,75 40,7 T 1,2 12,6 T 1,7 méphobarbital 3 45,5 + 4,5 4,7 + 1,0 1,5 70,2 T 1,8 23,1 T 2,3 0,75 51,9 T 6,8 19,1 + 4,6 TABLEAU 11 (suite) Réactif Concen- Pourcentage de cellules vivantes tration (n=3) (mM) (5 7 jours après 14 jours après l'ensemencement l'ensemencement pentobarbital 3 0,1 + 0,1 0 + 0 1,5 2,4 + 0,6 1,6 + 0,8 0,75 72,3 + 4,2 40,8 - 4,2 cyclobarbital 3 24,5 + 0,6 12,2 + 0,6 1,5 62,2 + 5,3 31,3 + 4,8 0,75 32,3 + 1,5 6,5 + 1,5 acide diméthyl 3 65,5 + 4,0 16,7 + 1,4 -1,3 barbituri- 1,5 56,5 + 3,6 3,8 + 0,8 que 0,75 43,1 + 5,6 3,5 + 0,8 acide uramil N,N-diacétique 3 0 + 0 0 + 0 1,5 69,8 + 7,8 36,6 + 4,4 0,75 52,5 + 3,3 25,2 T 1,1 acide barbitu- rique 3 38,0 + 1,8 5,5 + 1,4 1,5 37,8 + 2,6 4,4 + 1,1 0,75 35,8 + 2,2 3,5 + 0,7 phénobarbital 3 77,5 + 4,7 50,3 + 8,7 milieu renfer- mant DMSO 7Q,4 38,8 + 11,5 3,2 + 0,5 milieu ne ren- fermant pas de DMSO - 38,2 + 3,7 4,3 + 0,4 On constate, d'après ce tableau, que l'acide barbiturique n'a pas d'effet, alors que l'amobarbital, l'hexobarbital, le méphobarbital, le cyclobarbital, l'a- cide diméthyl-1,3 barbiturique, le pentobarbital, l'acide uramil N,Ndiacétique,et le phénobarbital, présentent un effet de conservation des cellules, bien que la concentra- tion optimale varie selon le réactif. Il se confirme donc que les dérivés de l'acide barbiturique s'avèrent effica- ces pour la conservation des cellules. Revendications 1. Procédé pour prolonger la culture de cellules épi- théliales normales, caractérisé en ce qu'on ajoute au mi- lieu de culture un dérivé de l'acide barbiturique. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules épithéliales normales sont des cellu- les primaires provenant du foie. 3. Procédé selon une des revendications 1 ou 2, carac- térisé en ce que le dérivé de l'acide barbiturique est un composé de formule générale: R3 RI/R R1 t N R2 N R dans laquelle R1 et R2 représentent chacun un atome d'hydro- gène; un groupe alkyle; un groupe alkyle linéaire ou ra- mifié, éventuellement substitué et ayant 1 à 6 atomes de carbone; un groupe hydrocarboné cyclique, saturé ou non saturé; ou un groupe amino substitué; et R3 et R4 repré- sentent chacun un atome d'hydrogène; un groupe alkyle; ou un groupe alkyle substitué ayant 1 ou 2 atomes de car- bone.