FR 2584728 A1 19870116 FR 8510787 A 19850712 Procédé de sulfatation de qlycosaminoql canes et de leurs fraqments. L'invention est relative à un procédé de sulfatation de glycosaminoglycanes et de fragments de glycosaminoglycanes. Elle vise également de nouveaux glycosaminogly- canes et des fragments de ces produits de degré de sulfatation variable et les applications biologiques des glycosaminoglycanes ou de leurs fragments obtenus. Dans la description qui suit et les revendica- tions, le terme GAG sera utilisé pour désigner indiffé- remment un glycosaminoglycane ou un fragment de glyco- saminoglycane, ou encore un de leurs sels physiologique- ment acceptables. On sait que les GAGS sont essentiellement formés de motifs alternés acide uronique-sucre aminé (ou l'in- verse), du type de ceux rencontrés dans les chaines oligo- et poly-saccharidiques de GAGS naturels biologi- quement actifs comme l'héparine, l'héparane-sulfate, le dermatane-sulfate, les chondroitines, les chondroitines- sulfates, ou l'acide hyaluronique. Les motifs acide uronique répondent plus spécia- lement à la structure acide D-glucuronique ou L-iduro- nique et les motifs sucre aminé à celle de la D-glucosa- mine ou de la D-galactosamine. On connait l'importance des applications théra- peutiques des GAGS naturels ci-dessus, en particulier, pour la prévention et pour le traitement des troubles de la coagulation et des maladies liées aux désordres de la paroi vasculaire, plus spécialement des thromboses, des athéroscléroses et artérioscléroses, ou pour lutter contre le vieillissement des tissus ou des manifesta- tions de type dégénératif telles que les alopécies. On sait également que, par extraction, ou par dépolymérisation chimique ou enzymatique des GAGS naturels, il est possible d'obtenir des GAGS de plus faible degré de polymérisation que les produits natu- rels, dotés notamment d'une activité spécifique élevée vis-à-vis du facteur Xa de la coagulation sanguine. Par degré de polymérisation (ou dp en abrégé), on entend le nombre de motifs saccharidiques, acide uronique ou sucre aminé, de la chaine glycosidique. Les travaux des inventeurs dans ce domaine les ont conduits à constater qu'en effectuant un traitement de sulfatation donné, dans certaines conditions, il est possible de modifier le degré de sulfatation de GAGS avec un rendement élevé généralement pratiquement quan- titatif, sans altérer leur structure ni leur degré de dépolymérisation. D'une manière avantageuse, il s'avère que la modification du taux de charge des produits considérés permet d'améliorer leur spécificité d'action, notamment en augmentant certaines de leurs propriétés alors que d'autres sont diminuées. L'invention a donc pour but de fournir un procédé de sulfatation donnant accès à des produits définis, dont le taux de charge peut être modifié comme souhaité. Elle vise également à fournir de nouveaux GAGS à taux de charge variable, en particulier des GAGS de caractéristiques définies, notamment de degré de poly- mérisation homogène. Le procédé selon l'invention de préparation de GAGS de taux de sulfatation variable est caractérisé en ce qu'on soumet un GAG donné, mis en oeuvre sous forme d'un sel soluble en milieu organique, à l'action d'un agent de sulfatation choisi parmi les agents capables de transformer une fonction hydroxyle en un groupe -OS03 et qu'on récupère le produit sulfaté formé. Ces dispositions s'appliquent à tout GAG et permettent d'introduire, selon le degré souhaité, des groupes esters sulfuriques -SO3- à la place des groupes -OH primaires sur les motifs saccharidiques du GAG de départ sans modifier son degré de polymérisation, ni son homogénéité. Le produit obtenu ne diffère du produit de départ que par son taux de charge différent et par une répartition différente des groupes sulfate sur le sque- lette hydrocarboné. Ses autres caractéristiques structu- rales sont par ailleurs connues, en particulier son degré de polymérisation. En fonction du produit souhaité, il suffit donc d'opérer le choix au départ d'un GAG donné. Le sel de GAG soumis à l'opération de sulfata- tion est avantageusement dissous dans un solvant, en particulier un solvant organique, plus spécialement du diméthylformamide ou de la pyridine. Comme sel de GAG, on a avantageusement recours à un sel d'une amine telle que la triéthylamine, ou d'un ammonium quaternaire tel que le tri- ou le tétraéthyl- ammonium, ou encore le tétrabutylammonium quaternaire. Il peut encore s'agir d'un sel d'hyamine ou de tout autre sel de base organique permettant de solubiliser le polyanion, étant entendu que la nature du sel peut in- fluencer la réaction de sulfatation compte tenu par exemple de l'encombrement stérique, ce qui permet de sulfater préférentiellement certaines positions. Le produit est récupéré du mélange réactionnel par une opération telle qu'une filtration sur un gel, ou une opération d'ultrafiltration suivie d'une mise sous la forme cationique désirée à l'aide d'une résine échangeuse de cations. Le produit est ensuite précipité par un solvant miscible à l'eau ou lyophilisé. L'obtention du sel de GAG est avantageusement effectuée en soumettant le GAG sous forme acide, tel qu'obtenu par exemple par passage sur une résine acide du type DOWEX, à l'action d'une amine correspondant au sel qu'on souhaite former. D'une manière avantageuse, l'agent de sulfata- tion est un complexe d'anhydride sulfurique SO3 avec une base organique telle que la triméthylamine (TMA) ou la pyridine. L'étude des conditions de la réaction montre qu'un taux de sulfatation satisfaisant est obtenu en utilisant d'environ 1 à 5 équivalents de complexe par équivalent de OH du GAG. La réaction de sulfatation est effectuée avanta- geusement à une température de l'ordre de l'ambiante ou supérieure, notamment de 50 à 100'C, pendant environ 10 à 14 heures, dans certains cas des températures infé- rieures à l'ambiante peuvent être utilisées. Le choix des conditions de réaction, notamment du solvant de réaction de la température et de la durée, peut permettre d'effectuer des réactions sélectives. Pour l'obtention d'un produit désiré, ces conditions seront aisément appréciées par l'homme de l'art au vu des données figurant dans la demande. Selon un mode de réalisation de l'invention, le GAG de départ est à base des motifs alternés D-glucosa- mine-acide uronique (acide L-iduronique ou D-glucuro- nique) tels que rencontrés dans l'héparine ou l'hépa- rane-sulfate. Dans un mode préféré de mise en oeuvre, il s'agit d'heparine. Dans un autre mode de mise en oeuvre préféré, le GAG de départ est constitué par de l'heparane-sulfate. Dans un autre mode préféré encore, le GAG de départ possède un poids moléculaire inférieur à celui de l'héparine ou de l'héparane-sulfate. En particulier, le poids moléculaire (PM) est inférieur à 10 000 daltons environ. Ces GAGS de bas poids moléculaire ou bas PM comprennent, notamment, les produits suivants, à savoir: - Les mucopolysaccharides tels qu'obtenus par extraction alcoolique, à partir d'héparine, selon le brevet FR 78 31357 du 6.11.1978 et le premier certificat d'addition 79 18873 du 20.07. 1979. Ces produits, selon l'un des aspects envisagés dans le brevet principal, sont formés d'un mélange de chaînes de poids moléculaire d'environ 2000 à 8000 et des rapports des titres Yin- Wessler/USP d'au moins 2. Parmi les produits décrits, on citera ceux possédant un rapport YW/USP de l'ordre de 3 à 5 et des poids moléculaires moyens de 3000 à 5500 appelés ci-après CY 216. - Les mucopolysaccharides tels qu'obtenus par dépolymérisation ménagée de l'héparine à l'aide d'acide nitreux, selon notamment le deuxième certificat d'addi- tion 80 06282 du 20.03.1980 au brevet FR 78 31357 ci- dessus ou la demande de brevet FR 81 07283 du 10.04.- 1981. Ces produits répondent d'une manière générale aux caractéristiques ci-dessus, mais sont terminés par des groupes de structure 2,5-anhydro-manno. On citera notamment les mucopolysaccharides du type possédant une extrémité 2,5-anhydro-mannitol, appelés ci-après CY 222, ou encore une extrémité acide 2,5-anhydro-mannonique. Les poids moléculaires des chaînes glycosidiques majoritaires sont plus spéciale- ment de l'ordre de 2000 à 3000, notamment d'environ 2000 à 2600. Les rapports des titres Yin-Wessler/USP sont notamment d'au moins 10 avec des titres Yin-Wessler d'au moins environ 200 u/mg. - Les mucopolysaccharides essentiellement formés de chaînes (1) d'un poids moléculaire moyen de 3000 à 6000 daltons, notamment de 4000 à 5000 environ (2) pos- sédant un titre YW/USP inférieur à 10, notamment d'environ 6 à 3, (3) terminées par des motifs de struc- ture 2,5-anhydromanno, tels qu'obtenus par exemple selon la demande de brevet FR 84 15978 du 18.10.1984. - Les oligosaccharides formés de 8 motifs sucre au plus, de titre Yinwessler élevé pouvant atteindre 2000 u/mg et de titre USP faible, pratiquement nul, dotés d'une forte affinité pour l'AT-III, tels que dé- crits notamment dans la demande EU 80 401 425 du 6.10.- 1980. Selon une variante, ces oligosaccharides sont obtenus par dépolymérisation nitreuse ménagée et sont terminés par un groupe de structure 2,5-anhydro-manno. Selon une autre variante, le motif de début de chaine corresppnd à un motif uronique insaturé, tel que formé en soumettant l'héparine à une dépolymérisation ménagée à l'aide d'une héparinase. En particulier, ces oligosaccharides sont formés des octosaccharides de structure ABCDEFGH répondant à la formule ci-dessous: OQ COOQ COo OR OR COO OR OR LO O O H o o f /L. OH OSO N S3 OH NHAc OH NHSO OS0O NHSO 3 3 3 3 3 A B C D E F G H - Des compositions homogènes d'hexasaccharides, telles qu'obtenues selon la demande FR 81 08604 du 29.04.1981, en soumettant les octosaccharides ci-dessus à l'action ménagée d'une héparinase. En particulier, ces compositions répondent à la formule ci-dessous: OR COO OR)R Co. 0, ol oi.o îiHso o$o il OH NHAc 011 HIHSO 0S03 NHS03 - 3 3 3 C' D E F G H - Des oligo- ou poly-saccharides de degré de polymerlsation homogène, notamment ceux obtenus par filtration, sur un matériau tel que du Séphadex, des -produits CY 222, CY 216, héparines, ou d'autres GAGS, ou par chromatographie par gradient de force ionique. - Des GAGS tels qu'obtenus par action de perio- date sur l'héparine, suivie de traitement en milieu baslque. - Des GAGS dits totaux, correspondant aux compo- sitions de GAGS obtenus par traitement d'organes ani- maux. - Des GAGS tels qu'obtenus par dépolymérisation de l'héparine avec de l'héparinase ou de l'acide ni- treux, séparation des fractions possédant la séquence de fixation à l'ATIII et gel filtration de ces fractions afin d'obtenir d'une part des fragments de GAGS de degré de polymérisation varie. Il peut s'agit, par exemple, de fragments de dp supérieur à 12 d'une part et d'autre part de fragments GAGS de degré de dépolymérisation inférieur, notamment de dp 12, 10, 8, 6 et 4. - Des GAGS tels qu'évoqués ci-dessus, mais pra- tiquement totalement dépourvus de la séquence capable de reconnaitre spécifiquement l'AT-III et de titre YW fai- ble a nul. Il s'agit, en particulier, d'oligosaccharides qui ne se fixent pas sur l'AT-III dans les procédés com- portant une étape de mise en contact d'héparine ou de GAGS avec de l'ATIII, suivie de gel filtration pour obtenir des fragments homogènes de dp varié. Des oligo- saccharides de ce type sont décrits, notamment, dans la demande FR 84 15979 du 18.10.1984. - Des GAGS et fragments de GAGS ci-dessus dans lesquels une partie des groupes -NHSO3 en position 2 des motifs glucosamine, voire la majorité et même la totalité, sont remplacés par des groupes -NH-acyle, en particulier -NH-acétyle. Ces différents GAGS ne sont cités qu'à titre d'exemples, étant entendu qu'ils correspondent à des produits particulièrement bien connus de la demanderesse qui les a mis au point et décrits dans les différents brevets et demandes de brevets ci-dessus, déposés à son nom. Mais, comme déjà indiqué, le procédé de l'inven- tion présente l'avantage de pouvoir être mis en oeuvre avec n'importe quel type de GAG. Ainsi, selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, le GAG mis en oeuvre comme produit de départ est à base de motifs alternés D-galactosamine- acide uronique, tels que rencontrés par exemple dans le dermatane-sulfate, les chondroitines, les chondroitines- sulfates ou encore l'acide hyaluronique. Dans une variante, il s'agit avantageusement de dermatane-sulfate. Selon une autre variante, le GAG mis en oeuvre est formé de chondroitines ou de chondroitines-sulfates. Dans une autre variante encore, le GAG est constitué par de l'acide hyaluronique. Selon une disposition de l'invention, un ou plu- sieurs groupes -OH primaires des motifs saccharidiques de la chaine glycosidique des GAGS ci-dessus sont blo- qués par des groupements protecteurs, ce qui permet de sulfater les autres positions comme souhaité, puis d'introduire un groupe donné à la place du groupement protecteur, puis de régénérer la fonction -OH protégée. Selon une autre disposition, les GAGS de départ sont homogènes au regard de leur degré de polymérisa- tion. Ces GAGS sont obtenus, par exemple, par filtration sur un gel d'un mélange de dépolymérisation d'héparine. Cette séparation est facilitée par l'utilisation de mélanges de dépolymérisation formés de chaines de degré de polymérisation pair. Selon une variante, dont la mise en oeuvre est également facilitée par l'utilisation de mélanges de dépolymérisation formés de chaînes de degré de polyméri- sation pair, on soumet le GAG sursulfaté obtenu à une opération de gel filtration afin d'obtenir des GAGS homogènes au regard de leur degré de polymérisation. Les dispositions qui précèdent permettent une sulfatation contrôlée selon le taux de sulfatation souhaité, avec un rendement élevé sur des produits définis sans dégrader leur structure osidique ni altérer leur homogénéité. On notera également que le procédé de l'inven- tion permet de disposer d'oligosacchharides formés essentiellement de chaines de dp pair, ce qui facilite l'obtention, au cours d'une étape supplémentaire, avant ou apres la sulfatation, de GAGS homogènes au regard de leur dp. Il est ainsi possible de préparer directement le produit qui convient pour une application donnée. Les GAGS obtenus par mise en oeuvre du procédé de l'invention répondent à la formule: (ab)m (cd)n (ef) dans laquelle: a représente un motif uronique 4,5-insaturé ou un atome d'hydrogène; b et d représentent des sucres aminés de structure identique, à savoir un motif D-glucosamine ou un motif D-galactosamine; _ et q représentent un motif uronique acide D-glucuroni- que ou L-iduronique et représente un atome d'hydrogène ou un motif de struc- ture 2,5-anhydromanno. m = o ou 1, p = 0 ou 1, n = 1 à 50 environ, étant entendu que le taux de charge des GAGS est diffé- rent de celui des produits naturels correspondants ou de leurs fragments et que lorsque n+m+P = 4 à 15, et que b et d représentent des motifs Dglucosamine. a et b ne représentant pas tous deux un atome d'hydrogène, a et I ne représentent pas tous deux un atome d'hydrogène. Une famille préférée de produits obtenus répond & la formule II: -OA, CO _ OA COO 0h Qo}) il OO A QIO (II) a-Q X m OA X OA A b c d e dans laquelle h et d représentent des motifs D-glucosa- mine, - A représente un qroupe -S03, un atome d'hydrogène, ou un qroupement protecteur de groupes -OH primaires, étant entendu que le taux de charge résultant des significa- tions de A est différent de celui des GAGS naturels correspondants, - X représente un groupe -NH2, -NH-acyle, notamment -NH-acétyle, ou -NHS03, m, . n et p, et a et f présentant les significations données ci-dessus. Un qroupe préféré de produits de cette famille comprend les GAGS dans lesquels la somme m+n+P représente un nombre supérieur à 15. Il s'agit avantageusement de GAGS dans lesquels a et f représentent respectivement un motif uronique 4,5-insaturé et un motif de structure 2, 5-anhydro-manno, en particulier des groupes de grande stabilité tels que le groupe 2,5-anhydro-mannitol ou acide 2,5-anhydroman- nonlque. En variante, dans les GAGS de ce groupe préféré, un seul des motifs a ou f correspond à l'un des motifs modifiés qui précèdent, l'autre motif représentant un atome d'hydrogène. Selon une autre variante, A et ú représentent tous deux un atome d'hydrogène. Un autre groupe préféré comprend les GAGS dans lesquels la somme m+n+p est un nombre de 1 à 15. Dans des GAGS avantageux de ce groupe, m et R sont égaux à 0 et n est égal à 1. Dans d'autres GAGS avantageux de ce groupe, la somme m+n+p est un nombre supérieur à 5. Dans d'autres GAGS encore, la somme m+n+p est un nombre supérieur à 6. D'autres GAGS préférés obtenus répondent à la formule II ci-dessus dans laquelle la somme m+n+p est un nombre de 1 à 6. Pour d'autres GAGS, cette somme est plus spécia- lement un nombre de 1 à 5. En particulier, des produits de ce type possè- dent un titre supérieur Yin-Wessler supérieur à 100. La somme m+n+p est un nombre de 4 à 15 chez des GAGS de ce groupe correspondant à des produits homogènes au regard de leur dp et/ou dans lesquels a et f sont différents de l'hydrogène. Des GAGS avantageux de la famille envisagée ci-dessus possèdent une partie, voire la majorité ou même la totalité, des motifs D-glucosamine sous forme N- acylée, notamment N-acétylée. Une autre famille préférée de produits répond à la formule III CO0 CO0 QOA A AO O O AO 0 O 0,_0- a O O QA O OA O-f (III) NX{ OA X n OA b c d e dans laquelle les substituants présentent les significa- tions données ci-dessus. Des GAGS avantageux de ces familles présentent essentiellement un degré de polymérisation pair. D'autres GAGS encore sont homogènes au regard de leur degré de polymérisation, en particulier les GAGS de' bas PM. Il s'agit notamment de compositions octa-, he- xa-, tétra- ou di-saccharidiques. Comme déjà indiqué, le degré de sulfatation des GAGS de l'invention est modifié par rapport à celui des GAGS naturels correspondants. Ce degré varie d'environ 2 jusqu'à des valeurs supérieures à 4. D'une manière avantageuse, les GAGS obtenus selon l'invention permettent de moduler de manière spécifique une propriété biologique donnée. Ces propriétés de modulation de l'activité biologique en fonction de la modification du profil de sulfatation ont été vérifiées sur divers types d'essai biologique, en particulier: - sur l'inhibition de la thrombine en présence d'antithrombine III et du cofacteur II de l'héparine par mesure de la concentration de l'oligosaccharide à tester susceptible d'inhiber à 50 % la thrombine en présence soit d'AT-III, soit d'HC II, l'inhibition de la throm- * bine étant mesurée à l'aide d'un substrat, le chromo- gène, par exemple, celui connu sous la désignation 3447 STAGO; - sur l'inhibition de la convertase amplifica- trice alterne du complément, notamment selon la techni- que décrite dans Kazatchkine et al. dans J. Clin. Invet. Vol. 67; Janvier 81, p. 223-228; - sur la fixation de ces produits aux cellules endothéliales mesurées dans des essais de compétition vis-à-vis de l'héparine marquée, les résultats étant exprimés par la concentration d'oligosaccharide qui inhibe à 50 % (IC50) la fixation de l'héparine marquée; - sur des tests de coagulation in vitro acti- vité anti-Xa (Yin-Wessler), activité anti-IIa (APTT). On constate que la masse moléculaire influence les comportements de ces produits dans ces différents tests. D'une façon générale, l'activité décroît parallè- lement à la masse moléculaire. De façon remarquable, la modulation du degré de sulfatation de certains oligo- saccharides leur confère un pouvoir inhibiteur dans certains tests nettement supérieur à celui que l'on observe dans les produits non sulfatés correspondants. Par la sursulfatation de l'héparine totale, on augmente l'IC50 dans tous les essais ci-dessus mention- nés, excepté dans les tests de coagulation globale (anti-Xa, anti IIa). En revanche, la sursulfatation d'une fraction d'héparine de bas PM, par exemple, un octosaccharide, ne permet pas d'augmenter de façon significative sa fixa- tion aux cellules endothéliales alors que son activité sur la thrombine en présence d'HC II ou son activité sur le C3 convertase est augmentée de manière importante. Ces résultats illustrent que le choix d'oligosaccharides de dp bien défini et de profil de sulfatation déterminé permet de moduler, voire de sélectionner, de façon spécifique, les effets biologiques de ces produits. D'autres caractéristiques et avantages de l'in- vention apparaîtront dans les exemples qui suivent. EXEMPLE 1: Préparation d'héparine à profil de sulfata- tion modifié. On prépare tout d'abord l'héparinate de tri- éthylammonium (TEA), puis on soumet ce produit à un traitement de sulfatation. a. Préparation de l'héparinate de triéthvlammonium (TEA). 1 g d'héparinate de sodium dissous dans 50 ml d'eau est converti en acide héparinique au moyen d'une résine échangeuse d'ions (Dowex 50, H+). Après neutrali- sation par la triéthylamine et concentration à sec, on obtient 1,3 g de sel de TEA. b. Sulfatation. A 0,97 g du sel ci-dessus, dissous dans le dimé- thylformamide (DMF), on ajoute le complexe sulfatant TMA/SO3. Après 24 heures à 50C, on dilue le mélange réactionnel, puis on récupère le produit par passage sur une colonne de gel Sephadex G-25. Le sel de sodium est obtenu par neutralisation de l'acide issu d'un échange sur résine Dowex 50 H+. Après lyophilisation, on récu- père 774 mg de produit. c. Caractérisation. L'héparine obtenue possède un degré de sulfata- tion (sulfate/carboxylate; S03 /COO) de 3,01 contre 2,16 pour le produit de départ. En limitant le temps de réaction à une heure, on obtient: SO3 /COO = 2,70. En présence de 0,68 g de complexe sulfatant et avec un traitement d'une heure, on obtient: SO3 /COO = 2,40. Les spectres RMN de l'héparine et de l'héparine sursulfatée sont rapportés sur les figures 1 et 2. EXEMPLE 2: Préparation d'héparine N-acétylée-sursulfa- tée. a. Préparation du sel de triéthvlamine de l'héparine N-acétylée. L'héparine est N-désulfatée de façon classique (Inoue S. et Nagasawa K., Carbohyd, Res., 46 (1976), 87-95), puis acétylée par l'anhydride acétique en milieu aqueux basique. Le sel de TEA est ensuite préparé de façon identique à celle décrite dans l'exemple la. b. Sulfatation. Le sel de TEA obtenu à partir d'un gramme d'hé- parine N-acétylée est dissous dans le DMF (25 ml) puis chauffé à 10OO'C en présence de TMA/S03 (0,84 g) pendant une nuit. Le produit sulfaté est récupéré après gel filtration sur Sephadex G 25. Il est converti en sel de sodium après passage transitoire sous la forme acide. On obtient après lyophilisation 1,14 g de sel de sodium légèrement beige. Sur les figures 4 et 5, on a repré- senté les spectres RMN pour l'héparine N-acétylée et pour le produit correspondant sursulfaté. EXEMPLE 3: Préparation d'héparine de bas poids molécu- laire N-acétylée et sursulfatée. a. Préparation du sel de tétrabutylammonium (TAB) de l'héparine de bas PM N-acétylée. On opère comme dans l'exemple 2a, mais en uti- lisant de l'hydroxyde de tétrabutylammonium comme base et une héparine de bas poids moléculaire. b. Sulfatation. Le sel obtenu (1 g) est sulfaté par le complexe pyridine/S03 (1 g) dans la pyridine (10 ml à température ambiante pendant 24 heures). On obtient après gel fil- tration puis conversion en sel de sodium 0,5 g de sel de sodium d'héparine de bas poids moléculaire N-acétylée. c. Caractérisation. Le procédé ci-dessus appliqué par exemple au produit CY 216 tel qu'obtenu selon l'exemple 1 du brevet principal 78 31357 mentionné plus haut (dp moyen de l'ordre de 14) conduit à un produit sursulfaté ayant un rapport SO3 /COO de 2,85/2,12. EXEMPLE 4: Préparation d'héparine de bas poids molécu- laire sursulfatée. a. Préparation du sel de tétrabutylammonium de l'hépa- rine de bas PM. Le PM CY 216 est dissous dans l'eau (10 g dans 0,5 1) puis converti en acide par passage sur une co- lonne de résine Dowex 50 WX4 sous forme H+. Après neu- tralisation, l'héparine de tétrabutylammonium obtenue est lyophilisée. On obtient 19,34 g de sel de tétrabu- tylammonium. b. Sulfatation. 1 g du sel ci-dessus est dissous dans de la pyridine anhydre et on ajoute du complexe sulfatant (pyridine/SO3). On procède à 3 essais avec des quantités différentes de complexe. A la fin de la réaction, 24 heures à température ambiante, on verse le mélange réactionnel dans une solution de soude (2 g) dans de l'éthanol à 95 %. Le précipité formé est filtré, dissous dans l'eau, chromatographié sur Sephadex G 25 et lyophi- lisé. On obtient les sels de sodium. c. Caractérisation. En faisant varier la masse de complexe sulfa- tant, on fait varier le degré de sulfatation du produit formé. Ainsi, en utilisant respectivement des masses de complexe sulfatant de 0,16 g, 0,32 g et 0,48 g, on ob- tient des degrés de sulfatation de 2,21, 2,75 et 3,41. Le spectre RMS du CY 215 sursulfaté est repré- senté sur la figure 3. EXEMPLE 5: Préparation d'oliqosaccharides de degré de dépolvmérisation, homogène à profil de sulfatation mo- difié. a. Préparation des oligosaccharides. Ils sont obtenus par fractionnement par gel filtration du mélange résultant de la dépolymérisation de l'héparine dans des conditions ménagées, par l'hépa- rinase, ou par l'acide nitreux. Des procédés de dépoly- mérisation à l'aide d'acide nitreux sont décrits notam- ment dans le deuxième certificat d'addition 80 06282 du 20.03.1980 et la demande FR 81 07283 du 10.04.1981, dé- polymérisation à l'aide d'héparinase est décrit dans la demande FR. Cesbrevets et demandes de brevets, au nom de la demanderesse, sont évoqués plus haut. Le mélange de dépolymérisation (1 g) est déposé au sommet d'une colonne de gel de Sephadex G 50 (2,5 x 300 cm) éluée par une solution de chlorure de sodium 0,2M. Les fractions correspondant à des oligosaccharides bien définis (di-, tétra-, hexa-, octa-,... jusqu'à icosasaccharides) sont regroupées, concentrées, dessalées. Ces produits sont obtenus après lyophilisation. b. Préparation des sels de tétrabutylammonium. Ils sont préparés comme décrit pour la prépara- tion du sel en 4a. Les sels de tétra-, hexa-, octa-, dodéca- et hexadécasaccharides de produits terminés par des résidus d'acides uroniques insaturés situés à l'ex- trémité non réductrice ont été obtenus. c. Sulfatation des oligosaccharides. Le sel de tétrabutylammonium de l'oligosaccha- ride à sulfater est dissous dans du DMF (250 mg/5 ml) puis du complexe sulfatant (triméthylamine/SO03; 250 mg) est ajouté. On porte le mélange réactionnel à 50'C pendant 24 heures. après dilution avec de l'eau (5 ml), l'oligosaccharide sulfaté est obtenu à la suite d'une chromatographie du mélange réactionnel sur Sephadex G 25 suivie d'une lyophilisation. ________________________________________________________ Oligosaccharide dp SQ3 /COO Disaccharide 2 3 Disaccharide sursulfaté 2 4, 1 ________________________________________________________ Tétrasaccharide 4 2,46 Tétrasaccharide sursulfaté 4 3,20 _ _ _ _ _ _ _ _ _ Hexasaccharide 6 2,22 Hexasaccharide sursulfaté 6 3,00 ________________________________________________________ Octasaccharide 8 2,43 Octasaccharide sursulfaté 8 3,08 EXEMPLE 6: Préparation de dermatane-sulfate sursulfaté. a. Préparation du sel de tétrabutvlammonium. mg de dermatane-sulfate sont convertis en acide (résine échangeuse de cations) puis sont neutrali- sés par de l'hydroxyde de tétrabutylammonium. Apres lyophilisation, on obtient 46 mg de sel. b. Sursulfatation du dermatane-sulfate. Le sel obtenu ci-dessus (15 mg) est sursulfaté dans le DMF (1 ml) par addition de complexe triméthyl- amine/SO3 (15 mg). Le produit est obtenu après dilution par l'eau, chromatographie sur gel de Sephadex G 25 et enfin échange du cation organique pour du sodium au moyen d'une résine échangeuse d'ions. EXEMPLE 7: Préparation d'héparine-sulfate sursulfaté. a. Préparation du sel de triéthylamine. Le produit de départ 0,8 g est dissous dans l'eau, converti en acide et neutralisé par la triéthyl- amine. On obtient ainsi après lyophilisation, 0,91 g de sel de triéthylamine. b. Sursulfatation. Le sel ci-dessus (0,24 g) est dissous à chaud dans du DMF (8 ml). Après addition de complexe sulfatant (TMA/S03; 1,68 g), on maintient à 50C pendant 24 heures. On obtient après gel filtration et conversion en sel de sodium, 238 mg d'héparine sursulfaté. EXEMPLE 8: Préparation d'héparine sursulfatée sur les positions 2 et 3 des monosaccharides constitutifs. Cet exemple permet d'illustrer la souplesse du o10 procédé. On prépare d'abord une héparine N,O-désulfatée selon la technique de NAGASAWA et al., Carbohyd. Res., 58 (1977) 47-55. Cette héparine est ensuite N-resulfatée sélecti- vement par le complexe pyridine/S03 à pH basique. Elle est enfin convertie en sel de tétrabutylammonium par passage sous la forme acide et neutralisation par l'hy- droxyde de tétrabutylammonium. Le sel ainsi obtenu est desséché à 50'C sous vide pendant 24 heures. Le sel de tétrabutylammonium (0,92 g) est en- suite dissous dans de la pyridine anhydre (10 ml). On ajoute de l'anhydride acétique (0,1 ml) et laisse une nuit à température ambiante. Après addition de complexe sulfatant (pyridine/S03; 0,72 g), on chauffe le mélange réactionnel pendant 4 heures à 100'C. Après refroidisse- ment, il est versé lentement dans de l'éthanol (100 ml) contenant de la soude (2 g). Après une nuit à 4'C, le précipité formé est essoré, dissous dans l'eau puis chromatographié sur Sephadex G 25. Après lyophilisation, on obtient 0,67 g d'une poudre dont l'analyse révèle qu'environ 60 % des fonctions alcool primaires sont libres. EXEMPLE 9: Prénaration d'hexasaccharides N-acétylés- sursulfatés. La fraction hexasaccharidique décrite dans l'exemple 5a est convertie en sel de pyridinium puis N-désulfatée par chauffage pendant 90 minutes à 50C dans un mélange DMSO/H20 (95/5; v/v). Après addition de soude, le mélange réactionnel est chromatographié sur colonne de Sephadex G 25. On récupère après lyophilisa- tion, le produit sous forme d'amine libre. Il est N-acé- tylé de façon classique par l'anhydride acétique en milieu basique. Le dérivé N-acétylé (0,5 g) est converti en sel de tétrabutylammonium. Il est ensuite dissous dans le DMF (10 ml) puis sulfaté à 10OO'C pendant 4 heures en présence de complexe triméthylamine/S03 (0,5 g). Après refroidissement, le mélange réactionnel est versé len- tement dans une solution de soude 0,5 M dans l'éthanol (90 ml). Après centrifugation, le culot est récupéré. Il est dissous dans l'eau et lyophilisé. On obtient ainsi 0,61 g d'hexasaccharides N-acétylés sursulfatés sous forme sel de sodium. EXEMPLE 10: Préparation de fraaments de dermatane- sulfate sursulfatés. Des fragments de dermatane-sulfate sont obtenus de façon classique (par oxydation périodique suivie d'hydrolyse ménagée acide: TOLLEFSEN, Nouvelle Revue Française d'Hématologie; 26 (1984) 233-237 ou bien par hydrazinolyse suivie de dégradation par l'acide nitreux, ou encore de la façon décrite ci-dessous). Du dermatane-sulfate (produit Sigma), 50 mg, sont dissous dans une solution 0,5 M d'acide chlorhy- drique (2 ml). Après chauffage à 100'C pendant 5 minu- tes, le mélange est refroidi. On ajoute alors une solu- tion de nitrite de sodium dans l'eau (2,5 %; 1 ml). Après 1 minute, de la soude est ajoutée pour neutraliser l'acide. Le mélange est dessalé sur une colonne de Sephadex G 25. Après lyophilisation, le produit obtenu est converti en sel de triéthylamine, puis il est sulfaté à 'C dans le DMF (5 ml) en présence de complexe trimé- thylamine/S03 (50 mg). Après 4 heures, le mélange est refroidi puis déposé au sommet d'une colonne de Sephadex G 50 éluée par l'eau. Le sel de sodium est obtenu par. passage intermédiaire sous la forme acide et neutralisa- tion par de la soude. Cette neutralisation, suivie par conductimétrie, indique un rapport sulfate/carboxyle de 2,4. Le temps d'hydrolyse, ou la température, ou encore la molarité de l'acide, peuvent être modifiés pour obtenir des fragments de taille différente. On peut également moduler le degré de sulfatation en changeant les conditions de cette réaction. Cette réaction s'applique intégralement aux chondroitines sulfates. REVENDICATIONS 1. Procédé de sulfatation de glycosaminoglyca- nes ou de fragments de glycosaminoglycanes, ou GAGS, caractérisé en ce qu'on soumet un GAG donné, mis en oeuvre sous forme d'un sel soluble en milieu organique, à l'action d'un agent de sulfatation choisi parmi les agents capables de transformer une fonction hydroxyle en un groupe -OSO3 et qu'on récupère le produit sul- faté formé. 2. Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que le sel de GAG est un sel d'amine. 3. Procédé selon la revendication 2, caracté- risé en ce que le sel de GAG est un sel d'une amine, telle que la triéthylamine, ou d'un ammonium quater- naire tel que le tri- ou le tétraéthylammonium quater- naire, ou le tétrabutylammonium quaternaire, ou encore un sel d'hyamine ou d'une base oragnique permettant de solubiliser le polyanion. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 3, caractérisé en ce que le sel de GAG est dissous dans un solvant, en particulier un solvant orga- nique tel que le diméthyl formamide ou la pyridine. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 4, caractérisé en ce que l'agent de sulfa- tation est un complexe d'anhydride sulfurique SO3 avec une base organique telle que la triméthylamine (TMA) ou la pyridine. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on utilise environ 1 à 5 équivalents de complexe par équivalent de OH du GAG. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 6 caractérisé en ce que la réaction de sulfa- tation est effectuée à une température de l'ordre de l'ambiante ou supérieure, notamment, de 50 à 100 C, pendant environ 10 à 14 heures. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 7 caractérisé en ce que le produit sulfaté obtenu est récupéré du mélange réactionnel par une opé- ration telle qu'une filtration sur un gel, ou une opéra- tion d'ultrafiltration suivie d'une mise sous la forme cationique désirée à l'aide d'une résine échangeuse de cations, puis précipité par un solvant miscible à l'eau ou lyophilisé. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 8, caractérisé en ce que le GAG de départ est à base des motifs alternés D-glucosamine-acide uronique (acide L-iduronique ou D-glucuronique) tels que rencon- trés dans l'héparine ou l'héparane-sulfate. 10. Procédé selon la revendication 9, caracté- risé en ce qu'il s'agit d'héeparine ou d'héparane-sulfate. 11. Procédé selon la revendication 9, caracté- risé en ce que le GAG de départ possède un poids molé- culaire inférieur à celui de l'héparine ou de l'hépa- rane-sulfate, en particulier un poids moléculaire (PM) inférieur à 10.000 daltons environ. 12. Procédé selon la revendication 11, caracté- risé en ce que des GAGS de bas PM utilisables comme produits de départ comprennent: - Les mucopolysaccharides tels qu'obtenus par extraction alcoolique à partir d'héparine, en particulier les mucopolysaccharides formés d'un mélange de chaînes de poids moléculaires d'environ 2000 à 8000 et possédant des rapports des titres Yin Wessler/USP d'au moins 2, plus spécialement les produits possédant un rapport YW/ USP de l'ordre de 3 à 5 et des poids moléculaires moyens de 3000 à 5500 appelés ci-après CY 216. - Les mucopolysaccharides tels qu'obtenus par dépolymérisation ménagée de l'héparine à l'aide d'acide nitreux, ces produits répondant d'une manière générale aux caractéristiques ci-dessus mais étant terminés par des groupes de structure 2,5-anhydro-manno, en particu- lier les mucopolysaccharides possédant une extrémité 2,5-anhydro-mannitol appelés CY 222, ou encore une extrémité acide 2,5-anhydro-mannonique, formés de chaînes dont la majorité possède des poids moléculaires de l'ordre de 2000 à 3000, notamment d'environ 2000 à 2600, les rapports des titres Yin-Wessler/USP étant notamment d'au moins 10 avec des titres YinWessler d'au moins environ 200 u/mg. - Les mucopolysaccharides essentiellement for- més de chaînes (1) d'un poids moléculaire moyen de 3000 à 6000 daltons, notamment de 4000 à 5000 environ (2) possédant un titre YW/USP inférieur à 10, notamment d'environ 6 à 3, (3) terminées par des motifs de struc- ture 2,5-anhydromanno. - Les oligosaccharides formés de 8 motifs sucre au plus, de titre YinWessler élevé pouvant atteindre 2000 u/mg et de titre USP faible, pratiquement nul, dotés d'une forte affinité pour l'AT-III, ces oligo- saccharides étant terminés par un groupe de structure 2,5-anhydro-manno ou comportant un motif de début de chaine correspondant à un motif uronique insaturé, tel que formé en soumettant l'héparine à une dépolymérisa- tion ménagée à l'aide d'une héparinase, en particulier, les octasaccharides de structure ABCDEFGH répondant à la formule: co o -zcoo Coc R COR OR OR O'-ivq;AO 1-a-'O : H, ' o /, - /, Z V'o J 0- OSO3 NHSO3 OH NHAc OH NHSO 0 S0 NHSO 3 3 3 3 3 A B C D E F H - Des compositions homogènes d'hexasaccharides, en particulier les compositions répondant à la formule ci-dessous: uOc. C.o OR nOt 1 OASOH Il OH NliAC Oli I:HSC, OSOZ NHSO5 -j 5.5 E F G C' D H - Des oligo ou polysaccharides de degré de polymérisation homogène, notamment ceux obtenus par filtration, sur un matériau tel que du Séphadex, des produits CY222, CY216, héparines, ou d'autres GAGS, ou par chromatographie par gradient de force ionique. - Des GAGS tels qu'obtenus par action de périodate sur l'héparine, suivie de traitement en milieu basique. - Des GAGS dits totaux, correspondant aux compositions de GAGS obtenus par traitement d'organes animaux. - Des GAGS tels qu'obtenus par dépolymérisation de l'héparine avec de l'héparinase ou de l'acide nitreux, séparation des fractions possédant la séquence de fixa- tion à l'AT-III et gel filtration de ces fractions afin d'obtenir d'une part des fragments de GAGS de degré de polymérisation varié, par exemple de fragments de dp supérieur à 12 d'une part, et d'autre part de fragments GAGS de degré de dépolymérisation inférieur, notamment de dp 12, 10, 8, 6 et 4. - Des GAGS tels qu'évoqués ci-dessus mais pratiquement totalement dépourvus de la séquence capable de reconnaître spécifiquement i'AT-III et de titre YW faible à nul, en particulier les oligosaccharides qui ne se fixent pas sur l'AT-III dans les procédés comportant une étape de mise en contact d'héparine ou de GAGS avec de i'AT-III, suivie de gel filtration pour obtenir des fragments homogènes de dp varié. - Des GAGS et fragments de GAGS ci-dessus dans lesquels une partie des groupes -NHSO3 en position 2 des motifs glucosamine, voire la majorité et même la to- talité, sont remplacés par des groupes -NH-acyle, en par- ticulier, -NH-acétyle. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 8, caractérisé en ce que le GAG mis en oeuvre comme produit de départ est à base de motifs alternés D-galactosamine-acide uronique, tels que rencontrés par exemple dans le dermatane-sulfate, les chondroitines, les chondroitines-sulfates ou encore l'acide hyaluronique, et avantageusement est constitué par l'un de ces produits. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 13 caractérisé en ce qu'un ou plusieurs groupes -OH primaires des motifs saccharidiques de la chaîne glycosidique des GAGS mis en oeuvre sont bloqués par des groupements protecteurs, ce qui permet de sulfa- ter les autres positions comme souhaité, puis d'introduire un groupe donné à la place du groupement protecteur, puis de régénérer la fonction -OH protégée. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 14, caractérisé en ce que les GAGS de départ sont homogènes au regard de leur degré de polymérisation, ces GAGS étant obtenus, par exemple, par filtration sur un gel d'un mélange de dépolymérisation d'héparine. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 14, caractérisé en ce que le GAG sulfaté obtenu est soumis à une opération de gel filtration afin d'obte- nir des GAGS homogènes au regard de leur degré de poly- mérisation. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 16, caractérisé en ce que le sel de GAG mis en oeuvre est obtenu en soumettant le GAG sous forme acide, tel qu'obtenu par exemple par passage sur une résine acide du type DOWEX, à l'action d'une amine correspondant au sel qu'on souhaite former.