FR 2582670 A2 19861205 FR 8508027 A 19850529 PRfCEDE ET INSTALLATION DE CULTURE DE MICROORGNISMES La présente invention concerne la culture de microorganismes. Les fermentations industrielles aérobies conduites dans des fermenteurs sont généraleent aérées par de l'air, issu de ccmpresseurs, avec des débits variant de 0,5 à 1 volume d'air par volume de milieu de culture et par minute. las rendements de transfert de l'oxygène dans les réacteurs biologiques sont assez faibles. Ils sont généralerrent compris dans une fourchette de 3 à 40 % et, pour la majorité des cas, avoisinent 10 %. Certains cas particuliers présentent des rendements supérieurs pouvant aller jusqu'à 70 %. Lorsque les cinétiques de croissance microbienne ou de production de métabolites sont limitées par une faible teneur en oxygène dissous dans le milieu de culture, un dopage de l'air avec de l'oxygène pur peut être effectué en régulant la teneur en oxygène dissous au-dessus de la concentration critique pendant une partie de la fermentation. lorsque la phase critique est longue, et lorsque la demande en oxygène des microerganismes est élevée, la quantité d'oxygène pur nécessaire au maintien d'une concentration en oxygène dissous au moins égale à la concentration critique est très importante. Ccrrpte tenu du faible rendement de transfert d'oxygène dans les réacteurs industriels, une partie importante de l'oxygène non utilisée est perdue dans les gaz effluents rendant ainsi le procédé peu économique. C'est pourquoi un recyclage des gaz effluents riches en oxygène constitue une solution d'amélioration de l'économie du procédé.Les procédés de recyclage de gaz déjà proposés mettent principalement l'accent sur la possibilité de contrôle de la concentration en gaz carbonique dissous par épuration du gaz carbonique, en équilibre dans la phase gazeuse effluente, produit au cours de la réaction métabolique, l'accumulation progressive du gaz carbonique dissous devenant rapidement toxique pour la culture microbienne. Ces procédés d'épuration fonctionnent généralement sur le principe de fractionnement par liquéfaction, absorption ou adsorption du mélange gazeux.Ils ne sont toutefois pas compatibles avec une recirculation permanente de la totalité du débit de gaz effluent durant toute la phase de régulation de la teneur en oxygène dissous car nécessitant imperativement une interruption temporaire de fonctionnement, afin de permettre la régénération obligatoire du dispositif d'élimination du gaz carbonique. Une telle interruption ne permet donc qu'une recirculation partielle des gaz effluents. En fait, ces procédés répondent d'abord au problème d'inhibition et de toxicité causés par la présence du dioxide de carbone dans un milieu de fermentation.Ils constituent des dispositifs de contrôle et de régulation du gaz carbonique dissous plutôt qu'une solution d'utilisation optimale et continue de 1 'oxygène ayant servi à ltenrichissement des gaz d'aération des fermenteurs. Généralement la phase de régulation de 1 'oxygène dissous et de dopage à 1 'oxygène des gaz d'aération des fermenteurs peut excéder plusieurs heures. la but de l'invention est de prévoir - des modalités optimales d'oxygénation combinant au cours de la fermentation 1 'oxygénation simple par de 1 'air, et l'oxygénation avec apport d'oxygène industriellement pur ; - une recirculation totale du volume du gaz d ' aération ; - une épuration permanente et continue des gaz effluents de fermentation jusqu'à des teneurs très basses en gaz carbonique (0 à 1 %); - une regénération continue du système d'épuration des gaz par élimination du gaz carbonique retenu, et ce pour des durées pouvant excéder plusieurs heures. Selon une proposition du brevet principal, on combine les mesures suivantes a ) une phase initiale de la culture est assurée exclusivement par oxygénation avec de l'air atmosphèrique, tandis qu'une phase subséquente à celle-ci est assurée exclusivement par circulation en recyclage d'une charge gazeuse constituée initiallement essentiellement par de l'air, auquel on adjoint, de façon régulée, de l'oxygène industriellement pur destiné à caenser substantiellement celui consommé par les microorganismes et à maintenir le niveau d'oxygène dissous au minimum à sa valeur critique. b ) la commutation de la phase initiale à oxygénation exclusive par de l'air à la phase subséquente à oxygénation par adjonction exclusive d' oxygène industriellement pur s'effectue lorsque la teneur en oxygène dissous avoisine la valeur critique spécifique aux microerganismes cultivés. De façon plus particulière c ) l'épuration en dioxide de carbone de la charge gazeuse recyclée s'effectue par passage continu sur un adsorbant ; par exemple du charbon actif. Et dans un tel cas d ) la pression d'épuration dans un adsorbeur et la pression de regénération dans un autre adsorbeur sont sensiblement voisines de la pression atmosphèrique. Avantageusement, la durée des phases d'épuration, ou de regénération, des adsorbeurs est de l'ordre de la minute. La présente addition vise à appliquer ce procédé aux fermentations à haute densité cellulaire utilisant soit des systèmes d'immobilisation ou de floculation cellulaire, soit des systèmes à ultra-filtration ou micro-filtration éliminant les inhibiteurs de croissance, avec rétention et recyclage des microorganismes dans le fermenteur. Le brevet principal décrit également une installation de culture de microorganismes aérobies dans un substrat nutritif, du genre comprenant un fermenteur équipe d'une rampe de diffusion d'un gaz d'aération et d'une sonde de mesure de la teneur en oxygène dissous, d'une conduite d'alimentation en gaz d'oxygénation aboutissant à ladite rampe et d'une conduite d'évacuation des gaz effluents hors du fermenteur aboutissant à une boucle de recyclage incorporant un épurateur en eau et en gaz carbonique et un compresseur, qui est caractérisée en ce que : a la conduite d'évacuation des effluents comporte, en amont de la boucle de recyclage, une dérivation à vanne vers l'atmosphère b ) la sonde de mesure de teneur en oxygène dissous agit sur un circuit de commutation incorporant d'une part des vannes de communication à un ccmpresseur d'air du côté de la conduite d'alimentation en gaz d'oxygénation et à une vanne de mise à 1' air en aval du fermenteur, et d'autre part au moins une vanne de raccordement à une source d'oxygène industriellement pur et une vanne de recyclage, ainsi que sur un mécanisme de commande de la mise en route ou de l'arrêt d'un compresseur de recyclage. Selon une forme préférée de réalisation, l'installation comporte un jeu de deux adsorbeurs dont les entrées et les sorties sont reliées par des vannes au circuit de recyclage d'une part, et d'autre part par d'autres vannes à l'atmosphère et à un circulateur ; et de préférence 1 'adsorbeur est un charbon actif. Avantageusement un moyen de commutation périodique de deux adsorbeurs en vue d'assurer successivement une phase d'épuration du gaz effluent pour l'un et une phase de regénération par l'air pour l'autre et vice-versa.Selon l'addition le fermenteur est associé à un dispositif d'ultrafiltration ou de microfiltration par des conduites de soutirage et de recyclage du milieu de culture aboutissant aux extrémités d'un ccupartiment amant d'une cellule d'ultrafiltration ou de microfiltration, dont un aval est raccordé à une conduite de décharge à vanne régulée. Les caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront d'ailleurs de la description qui suit à titre d'exemple en référence à la figure unique qui représente schfimatiquement une installation conforme à l'invention. Un fermenteur 1 est équipé d'une rampe 3 d'injection d'un gaz d' aération véhiculé par une conduite 4 provenant d'une capacité-tampon 5. Le fermenteur I présente en partie haute une conduite d'évacuation 6 aboutissant d'une part à une vanne de mise à l'atmosphère 7 d'autre part à une vanne de recyclage 8 d'un circuit de recyclage 9 incorporant un éch:nsgtr-condenseur d'eau 10, une batterie de deux adsorbeurs 11, 12, avant d'aboutir à l'entrée d'un compresseur spécial oxygène 15 dont la sortie est raccordée par une conduite 16 à la capacité tampon 5. En outre, la capacité-tampon 5 est raccordée par une conduite 20 à vanne 46 à un compresseur d'air 22 d'une part, par une conduite 26 à vanne 27 et via une vanne d'arrêt 28 à une source d'oxygene industriellement pur 29. Le fermenteur 1 est équipé d'une sonde de mesure d'oxygène dissous 30 qui commande, par l'intermédiaire d'un régulateur 31 et d'un ccIparateur 40 l'ouverture ou la fermeture des vannes 46 et 27 et cela de la façon suivante : lorsque la teneur en oxygène dissous est élevée, le régulateur 31 commande la fermeture de la vanne 27 et le comparateur 40, par l'intermédiaire du transmetteur 42, l'ouverture de la vanne 46. Lorsque la teneur en oxygène dissous descend à une valeur voisine du seuil critique, le régulateur 31 provoque l'ceverture de la vanne 27 et le comparateur 40, via le transmetteur 42, la fermeture de la vanne 46. La sonde 30 agit également par l'intermSdiaire du comparateur 40 sur un organe de commande 41 du fonctionnement du ccmpresseur 15 d'une part, et d'autre part, via le transmetteur 42 d'une part sur les vannes 7, 8 (pour ouvrir la vanne 7 et fermer la vanne 8 lorsque la teneur en oxygène dissous est élevée, pour fermer la vanne 7 et pourrir la vanne 8 lorsque la teneur en oxygène dissous descend au voisinage de son seuil critique), sur un circulateur de régénération 43 pour les adsorbeurs 11 et 12. la transmetteur 42 asservi à la sonde 30 contrôle également via 50, un organe temporisé 51 commandant d'une part des vannes de sortie 52, 53 à la sortie des adsorbeurs 11 et 12, d'autre part des vannes'd'entrée 54, 55 à l'entrée des adsorbeurs 11 et 12. Ce même organe temporisé commande également des vannes 56 et 57 respectivement branchées entre les sorties des adsorbeurs 11 et 12 et une conduite de mise à l'air 58 d'une part, d'autre part les vannes 59 et 60 reliant respectivement les entrées des adsorbeurs 11 et 12 au circulateur d'aspiration 43 vers l'atmosphère. Le fonctionnement de l'installation qui vient d'être décrit est le suivant : on place dans le fermenteur 1 un substrat nutritif 70 que l'on ensemence avec le microerganisme de culture. La phase initiale de culture, pendant laquelle la teneur en oxygène dissous mesurée par la sonde 30 est relativement élevée, est assurée par une circulation d'air provenant du compresseur 22 et introduit dans la capacité 5 (vannes 21 et 46 ouvertes) puis dirigé par la conduite 4 vers la rampe d'injection 3. L'effluent gazeux sous-oxygéné et chargé en dioxide de carbone et vapeur d'eau évacué par la conduite 6 est mis à l'atmosphère par la vanne 7 en position d'ouverture, tandis que les vannes de recyclage 8 et d'alimentation en oxygène pur 27. Cette phase initiale de culture de microorganismes se poursuit avec développement exponentiel de ceux-ci. Après un laps de temps, la teneur en oxygène dissous descend au voisinage imuediat d'un seuil critique et, à ce moment, la sonde 30 provoque la succession des opérations suivantes : la vanne 46 se ferme, tandis que la vanne 27 s'ouvre ; la vanne 7 se ferme, tandis que la vanne 8 s'ouvre ; l'organe de commande 41 met en route le compresseur 15, tandis que le transmetteur 42 ferme la vanne 46 et provoque la mise en service de l'organe temporisé 51. A la suite de cette commutation, le gaz, qui est injecté dans la rampe 3 est constitué d'une charge gazeuse formée initialement d'air, occupant les circuits et le ciel du fermenteur, c'est-à-dire ayant une importante proportion d'azote qui est donc recyclée en circuit ferme via les conduites 6, 9, 16, 5 et 4. La sonde 30 provoque l'admission d'oxygène dans la capacitétampon 5 en provenance de la source 29, de façon à maintenir la valeur de l'oxygène dissous légèrement au-dessus du seuil critique, tandis que le gaz effluent issu est amené d'abord par la conduite 9 vers le condenseur d'eau 10, où la vapeur d'eau contenue dans le gaz recyclé est condensée, après quoi ce meme gaz effluent est amené dans l'un ou l'autre des deux adsorbeurs 11 (ou 12) en fonctionnement en phase d'épuration, tandis que l'autre adsorbeur 12, (11) respectivement est en phase de regénération ; la charge gazeuse ainsi traitée est débarassée de son dioxyde de carbone, qui est piégé par le charbon actif de l'adsorbeur 11 (12) et le gaz ainsi épuré est transféré de nouveau à l'entrée du coepresseur 15 et de là vers la capacité-tempon 5. De façon périodique et avec une période de l'ordre de la minutie, l'organe temporisé 51 provoque la commutation de toutes les vannes (52,53) (54,55) (56,57) (59,60), ce qui fait permuter les phases d'épuration et de regénération des adsorbeurs 11 et 12. Ainsi, commue on le constate, la phase de regénération d'un adsorbeur 11 ou 12 du début est assurée par simple passage à contre-courant d'air prélevé en 58 et aspiré par le circulateur 43 et rejeté à l'air. On précise que lors d'une permutation, l'adsorbeur 11 (12) qui commence sa phase d'épuration du gaz effluent n'est pas isolé immédiatement de l'air extérieur par la fermeture immédiate de la vanne 56 (ou 57), mais que cette vanne 56 (ou 57) voit sa fermeture différée quelque peu, de façon à assurer, pendant ce laps de tempo, la mise à 1 'atmosphère de l'air contenant une forte proportion d'azote dans l'adsorbeur 11 (ou 12) en fin de regénération, évitant ainsi un accroissement inadmissible de la charge d'azote circulant en cours de recyclage. A titre d'exemple de réalisation, une unité d'épuration et de recirculation des gaz de fermentation et installée sur un fermenteur servant à la production d'un antibiotique aéré par un gaz circulant avec un débit de 3000 Ehn3/h qui, en phase d'enrichissement en oxygène, a la composition suivante : 50 % 02, 50 % N2. Ce gaz traverse le fermenteur où une partie de l'oxygène est consommée par le métabolisne des microorganismes et ressort de ce inême fermenteur en ayant les coepositions suivantes: 45 % 02, 50 % N2, 5 % C02. La recirculation de ce gaz implique au préalable une étape de déshydratation et une étape d'élimination du CO2. Le gaz effluent ayant un débit de 3000 Nm3/h est dirigé vers la batterie d'adsorbeurs et passe sur une colonne remplie avec 2,5 à 3 m3 de charbon actif dont les caractéristiques sont voisines du "CECI AC 40". Le gaz est alors épuré et sa teneur en C02 en sortie d'adsorbeur est abaissée à 1 % maximum. Par passage au travers d'un compresseur, le gaz épuré est recomprimé à 4 - 5 bars et réenrichi en oxygène pur avant réinjection à la base du fermenteur. Le rendement en oxygène recyclé de cet épurateur est proche de 90 %. Comme autre exemple de réalisation, on signale une unité d'epuration et de recirculation des gaz de fermentation installée sur un fermenteur servant à la production de levures. Ce fermenteur est oxygéné par un gaz ayant un débit de 3000 Nm3/h qui, en phase d'enrichissement en oxygène a la composition suivante : 50 % 02, 50 % N2. A la sortie du fermenteur, ce meme gaz a la composition suivante : 30 % 02, 20 % C02, 50 % N2. Ce gaz effluent ayant un débit de 3000 Mn3/h est dirigé vers la batterie d'adsorbeurs et passe sur une colonne remplie avec 5 3 de charbon actif dont les caractéristiques sontvoisines du "CECA AC 40". Le gaz est alors épuré et sa teneur en C02 en sortie d'adsorbeur est abaissé à 3%. la rendement en oxygène recyclé de cet épurateur est proche de 90 %. A titre de troisième exemple de réalisation, une unité d'épuration et de recirculation des gaz de fermentation est installée sur un fermenteur servant à la production d'un acide aminé. Ce fermenteur est oxygéné par un gaz ayant un débit de 3000 Mn3/h qui, en phase d'enrichissement en oxygène a la composition suivante . 40 % 02, 60 % N2; à la sortie du fermenteur, ce même gaz a la composition suivante : 20 % 02, 20 % C02, 60 % N2. Ce gaz effluent ayant un débit de 3000 Nm3/h est dirigé vers la batterie d'adsorbeurs et passe sur une colonne remplie avec 2,5 à 3 m3 de charbon actif. Le gaz est alors épuré et sa teneur en C02 en sortie d'adsorbeur est abaissée à 1 %. Le rendement en oxygène recyclé de cet épurateur est proche de 90 %. Selon la variante de la figure 2, on retrouve certains éléments de la figure 1, désignés par les mêmes chiffres de référence, notamment le fermenteur 1, avec la rampe injectrice 3, la sonde de mesure de la teneur en oxygène dissous 30, la capacité-tampon 5 alimenté soit en air comprimé 22 via la conduite 20 et 1' électrovanne 46, soit en oxygène industriel provenant d'une source 29 via l'electrovanne 27, la conduite de soutirage d'effluent gazeux 6 vers soit une électrovanne de mise à l'air 7, soit une électrovanne de recyclage 8 vers des adsorbeurs 11 et 12 de piégeage du gaz carbonique, dont la sortie est raccordé par une conduite 16 à compresseur 15 au réservoir-ta:'p 5. A la différence de la réalisation précédente, on a affaire ici à un fermenteur 1 avec dispositif d'élimination des inhibiteurs métaboliques par circulation du milieu de culture prélevé en 101 et dirigé vers l'entrée d'un dispositif 102 à membrane d'ultrafiltration 103 ou de microfiltration éliminant par pentéation les inhibiteurs et une partie minimale du substrat, sans laisser passer les microorganismes. Une conduite 104 à électrovanne 105 dirige le peméat vers une évacuation 106, tandis qu'un conduit 107 recycle le milieu de culture epuré des inhibiteurs dans le fermenteur 1.Pour assurer un niveau sensiblement constant au moins dans une phase de culture mettant en oeuvre une ultrafiltration, le fermenteur est équipé d'une sonde double de niveau 110 (valeur basse) et 111 (valeur haute) commandant via un régulateur 112 l'électrovanne de perméat 105 de façon à limiter le débit de peeréation si le niveau baisse en dessous de N et au contraire de l'accroitre si le niveau tend à s'élever au-dessus de N'. Ici, en outre, est prévue une alimentation en substrat nutritif à partir d'une réserve 113 et une conduite 114 à pompe 115. L'apport de substrat est régulé en fonction des exigences nutritives de la souche microbienne cultivée de façon à avoir en permanence une utilisation optimalisée dudit substrat.Afin de minimalisar à l'extrême les partes de substrats au travers du dispositif de perméation, l'apport de ceux-ci se fait sous forme diluée. De cette manière, le substrat est consommé avant d'avoir la possibilité de traverser la membrane de penréation du fait du faible gradient de concentration régnant de part et d'autre de la rnttrane. La mise en route de 1' apport de substrat est automatique et peut être asservie au signal donné par différents capteurs présents sur le réacteur comme le pH, le rH, ou l'oxygène dissous. D'une façon plus particulière, on décrit l'asservissement à la concentration en oxygène dissous.Dans ce cas, la sonde d'oxygène dissous 30 commande via un régulateur 120 non seulement l'électrovanne d'alimentation en oxygène 27 via 121, mais également un nultirégulateur 122 à affichage bas 123 et haut 124 commandant via 125 l'ouverture ou la fermenture de la palpe d'apport du substrat nutritif 115, l'affichage bas 123 cammanlant via un programmeur pricipal 126 l'électrovanne de mise à l'air 7 (via 127), l'électrovanne de recyclage 8 (via 128), le ventilateur de régénération 11 (via 129), l'électrovanne d'air comprime 46 (via 130), selon le merde opératoire décrit précéaemnent . la programmeur principal 126 commande également via 131 un second programmeur 132 qui assure - d'une part la comande du fonctionnement du compresseur de recyclage 15 (via 133) - d'autre part la commande des électrovannes 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 60 du dispositif adsorbeur 11, 12 (via 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140 et 141). Le fonctionnement du dispositif d'alimentation du fermenteur 5 en gaz oxygéné est du type décrit précédemnent, mais ici la- sonde de mesure d'oxygène dissous 30 carimande en outre via 122, 124, 135, la mise en route de la pompe 115 d'alimentation en substrat, de façon à maintenir l'activité métabolique dans le réacteur provoquant ainsi une chute de la concentration en oxygène dissous en dessous de la valeur maximale affichée en 124. La source d'oxygène industriel 29 est soit fournie par un dispositif adsorbeur enrichissant l'air en oxygène, soit par un dispositif de peeréation, soit par un réservoir d'oxygène liquide. Dans ce dernier cas, on utilise une partie de 1 'énergie frigorifique de réchauffement de cet oxygène pour refroidir l'effluent gazeux issu du fermenteur 5 dans un échangeur 144. Dans le cas où les caractéristiques du milieu de culture ne permettent pas une mesure correcte de l'oxygène dissous au moyen d'un capteur directement incorporé dans ce milieu, il convient de piloter 1' apport de substrat à partir de mesures indirectes faites sur les fluides effluents provenant du fermenteur. Le procédé ccobine ainsi un dispositif d'aération avec utilisation optimale de l'oxygène avec un dispositif assurant une productivité maximale pour lequel l'apport et l'utilisation du substrat ont été optimalisés et adoptés aux exigences métaboliques du microorganisme cultivé. REVENDICATIONS 1. Procédé de culture de microerganismes en aérobiose dans un milieu nutritif liquide soumis à une oxygénation maintenant la teneur en oxygène dissous dans ledit milieu au-dessus d'un seuil critique selon lequel : a) une phase initiale de la culture est assurée exclusivement par oxygenation avec de l'air atmospherique tandis qu'une phase subséquente à celle-ci est assurée exclusivement par circulation en recyclage d'une charge gazeuse consitutée initiallement essentiellement par de l'air, auquel on adjoint, de façon régulée, de l'oxygène industriellement pur destiné à compenser substantiellement celui consommé. b) la commutation de la phase initiale à oxygènation exclusive par de l'air à la phase subséquente à oxygènation par adjonction exclusive d' oxygène industriellement pur s'effectue lorsque la teneur en oxygène dissous avoisine la valeur critique spécifique aux mlicroorganismes cultivés, caractérisé en ce qu'il est appliqué plus particulièrement aux fermentations à haute densité cellulaire notamment aux fermentations à ultrafiltration ou microfiltration permettant d'éliminer des inhibiteurs de croissance, avec rétention et recyclage dans le fermenteur des microorganismes. 2. Installation de culture de microorganismes en aérobiose dans un substrat nutritif, du genre comprenant un fermenteur équipé d'une rampe de diffusion d'un gaz d'aération et d'une sonde de mesure de la teneur en oxygène dissous, d'une conduite d'alimentation en gaz d'oxygénation aboutissant à ladite rampe et d'une conduite d'évacuation des effluents hors du fermenteur aboutissant à une boucle de recyclage incorporant un dispositif d'épuration en vapeur d'eau et gaz carbonique, du genre où a) la conduite d'évacuation des gaz effluents comporte, en amont de la boucle de recyclage, une dérivation à vanne vers l'atmosphère b) la sonde de mesure de teneur en oxygène dissous agit sur un circuit de ccmmutation incorporant d'une part des vannes de ccmmunication à un catpresseur d'air du côté de la conduite d'alimentation et à une vanne de mise à l'air en aval du fermenteur, et d'autre part au moins une vanne de raccordement à une source d'oxygène industriellement pur et une vanne de recyclage, ainsi que sur un mécanisme de ccmmande de la mise en route ou de l'arrêt d'un ccmpresseur de recyclage ;; caractérisée en ce que le fermenteur est associé à un dispositif d'ultrafiltration ou de microfiltration par des conduites de soutirage et de recyclage du milieu de culture aboutissant aux extrémités d'un co"'piment amont d'une cellule d'ultrafiltration ou de microfiltration, dont un carpartiment aval est raccordé à une conduite de décharge à vanne régulée. 3. Installation de culture de microorganismes selon la revendication 2, caractérisée en ce que la vanne de réglage de débit de filtrat est asservie à une sonde de niveau du milieu de culture dans le fermenteur. 4; Installation selon la revendication 2, caractérisée en ce que le fermenteur est raccordé à une conduite d'alimentation en substrat nutritif incorporant une pompe de débit asservie au signal d'un capteur installé sur l'unité de fermentation ou sur les canalisations des fluides effluents provenant du fermenteur. 5. Installation selon la revendication 2, caractérisée en ce que le capteur est une sonde à oxygène dissous ou une sonde pH ou une sonde de mesure de concentration de substrat 6. Installation selon la revendication 2, caractérisée en ce que le substrat est apporté sous forme diluée en fonction des besoins métaboliques des microorganismes et intégralement consarme par ces microorganismes.