FR 2581652 A1 19861114 FR 8605756 A 19860421 Nouveaux mutants de l'activateur tissulaire du Plasminoaène humain La présente invention concerne de nouveaux mutants particuliers de l'activateur tissulaire du plasminogène humain (t-PA). Ces mutants, bien qu'ils soient de façon générale couverts par la description antérieure, comme noté ci-dessous, sont de nouveaux dérivés spécifiques qui présentent des activités impos- sibles à prévoir à partir des travaux des chercheurs antérieurs effectués sur la molécule fondamentale de l'activateur tissulaire du plasminogène humain ou des protéases à sérine modèles que sont la trypsine et la chymotrypsine. Domaine de l'invention L'activateur tissulaire du plasminogène humain a été pour la première fois identifié sous forme d'un isolat essentiellement pur à partir d'une source natu- relle et étudié en ce qui concerne l'activité requise d'activateur du plasminogène par Collen et coll., de- mande de brevet européen N' 041766 publiée le 16 Dé- cembre 1981, reposant sur un premier dépôt du 11 Juin 1980. Ensuite, des chercheurs des laboratoires du cessionnaire ont produit l'activateur tisulaire du plasminogène humain essentiellement dépourvu des pro- téines avec lesquelles il est ordinairement associé, selon une technologie d'ADN recombinant. Ce travail a été rapporté dans la littérature scientifique et dans la demande de brevet européen N' 093619 publiée le 9 No- vembre 1983, reposant sur un premier dépôt du 5 Mai 1982. La demande de brevet ci-dessus (publication EPO N' 093619) concerne la production de divers dérivés de l'activateur du plasminogène humain, présentant diverses modifications par substitutions, suppressions, additions ou remplacements d'amino-acides préparés par exemple par mutagenèse dirigée vers un site de l'ADN sous-jacent. Comme décrit ici, l'activateur tissulaire du plasminogène humain (t-PA) existe à la fois sous une forme à chaîne unique et une forme à deux chaînes. Cette dernière est un dérivé protéolytique de la première. On a montré qu'une conversion protéolytique de la forme à chaine unique en la forme à deux chaînes se produit lors de la lyse d'un caillot de fibrine. Rijken et coll., J. Biol. Chem. 257, 2920 (1982). Il semble que la forme à deux chaines soit l'agent responsable de l'activité d'activation du plasminogêne, bien que certaines publi- cations initiales indiquent que la forme à chaîne unique du t-PA humain, Rijken, Ibid. et la forme à chaine unique du t-PA porcin, Ranby et coll., Thromb. Res. 27, 176 (1982) puissent avoir une certaine activité. Voir également Rijken et coll., Biochim. Biophv. Acta, 580, 140 (1979). Cependant, les chercheurs ultérieurs n'ont pas tenu compte de ces mentions d'une activité de la forme à chaine unique considérant qu'elle résulte de la contami- nation de ces préparations par de petites quantités de la forme à deux chaines. Andreasen et coll., EMBO J., , 151 (1984); Ichinose et coll., FEBS. Letters 175, 412 (1984). Ces publications ultérieures ont réaffirmé l'opinion générale selon laquelle les protéases à sé- rine, y compris le t-PA, sont exprimées sous forme de zymogènes à chaîne unique inactifs qui ne deviennent actifs que par hydrolyse de la protéine en un site spécifique, par exemple l'arginine en position 275 dans le cas du t-PA. Des comparaisons in vivo de la capacité de lyse des caillots de fibrine de l'activateur du plasminogène 258 1 652 à chaîne unique par rapport à celui à deux chaînes ont été effectuées sur des lapins et des chiens. Chez le lapin, des activités approximativement égales ont été observées pour les deux formes de cette enzyme. Collen et coll., J. Clin. Invest. 71, 368 (1983). Cependant, lors d'une évaluation avec un modèle semblable sur le chien, la forme à chaîne unique de l'activateur du plasminogène a été reconnue comme légèrement moins active que la forme à deux chaînes. Korninger et coll., J. Clin. Invest., 69, 573 (1982). Ces études indiquent donc que l'activateur du plasminogène à une chaîne n'est pas meilleur et en fait peut être moins actif que la forme à deux chaînes de l'activateur du plasminogène dans la capacité de dissolution in vivo des caillots de fibrine. Résumé de l'invention La présente demande concerne de nouveaux mutants du t-PA humain qui présentent une activité surprenante égale ou supérieure à celle du t-PA humain précédemment isolé par Collen et coll., (Publication EPO N' 041766) ainsi que des molécules de t-PA décrites dans la demande de brevet précitée concernant une recombinaison (Publi- cation EPO N' 093619). Selon un mode de réalisation particulier, les mutants spécifiques couverts par la présente invention comprennent ceux ayant certaines substitutions des amino-acides dans le site environnant les positions 275 et 276 de la séquence des amino-acides du t-PA humain occupées respectivement par l'arginine et l'isoleucine. Certaines molécules à activité enzymatique reconnaissent ce ou ces sites (peut-être avec un ou plu- sieurs amino-acides adjacents) et réalisent une hydro- lyse fonctionnelle des liaisons après les amino-acides basiques, en particulier entre l'arginine et l'isoleu- cine et la lysine et la glycine, ce qui fournit une matière à deux chaînes. Les deux chaînes demeurent associées par liaison disulfure par l'intermédiaire de restes de cytéine. Selon ce mode de réalisation de la présente invention, par exemple, la substitution de ces positions avec des amino-acides autres que par exemple l'arginine et la lysine sert à produire des mutants dans lesquels les sites de clivage respectifs sont modifiés, si bien que le t-PA humain à deux chaines ne se forme pas in vitro ou in vivo ou se forme à un taux réduit. Donc, cet aspect de la présente invention fournit du t-PA humain à chaîne unique ayant subi une mutagenèse pour les essais de l'activité biologique. On a découvert que ces mutants sont immunisés ou du moins rendus résis- tants à l'hydrolyse du site 275/276 et que les mutants de t-PA humain à chaîne unique détenus ont de facon inattendue une activité égale à celle des molécules de t-PA de Collen et coll. et/ou recombinantes décrites cidessus dans certaines déterminations biologiques. De plus, il existe des indices selon lesquels ces mutants sont moins réactifs avec les inhibiteurs naturels du t-PA. Description succincte des dessins La figure 1 est une carte de restriction de l'ADN du t-PA humain et comprend les régions 5' et 3' non traduites ainsi que les séquences codant pour le pré-t-PA. Les zones ombrées représentent le gène de structure du t-PA. Les figures 2a, b et c représentent l'ADN et les séquences d'amino-acides 12H et klOH du pré-t-PA, y compris les régions 5' et 3' non traduites. La figure 3 est le schéma global utilisé pour produire les clones individuels contenant des substitu- tions en position 275. Les figures 4 à 8 illustrent la construction de pXAPPA18 3'AX1OtrpR. La figure 9 illustre le plasmide pPADHFR-6 avec les sites de restriction correspondants. La figure 10 illustre les complexes avec un inhibiteur plasmatique des protéases formés avec du t-PA radiomarqué (partie de gauche) et de l'EIKGG t-PA radio- marqué (partie de droite) comme détecté par autoradio- graphie sur un gel de SDS-PAGE. La figure 11 illustre les propriétés de fixation de la fibrine du t-PA à chaîne unique, du t-PA à deux chaînes et du t-PA à une chaîne mutant (EIKGG). La figure 12 illustre une courbe dose-effet de lyse in vivo d'un caillot (l'EIK est le t-PA à chaîne unique mutant le rt-PA est le t-PA non mutant). Description détaillée Tels qu'on les emploie ici, les termes "activa- teur tissulaire du plasminogène humain", "t-PA humain" ou "t-PA" désignent l'activateur extrinsèque (de type tissulaire) du plasminogène humain tel qu'il est pro- duit, par exemple, selon des systèmes de culture de cellules recombinantes, sous des formes à activité biologique comprenant une portion de protéase et cor- respondant à l'activateur du plasminogène naturellement présent dans les tissus humains. Il convient de noter que des variations alléliques naturelles existent et se manifestent d'un individu à l'autre comme le montrent une ou plusieurs différences des amino-acides dans la séquence globale. De plus, les profils de glycosylation dépendent de la nature de l'environnement des cellules hôtes. L'activateur tissulaire du plasminogène humain est un polypeptide qui a deux régions fonctionnelles constituées d'une région de protéase qui est capable de transformer le plasminogène en plasmine et d'une région contenant des chaînes de Kringle qui semble être res- ponsable de la liaison à la fibrine. Le t-PA comprend donc des polypeptides contenant ces deux régions fonctionnelles comme partie de la séquence globale. Un "site de clivage en deux chaînes" du t-PA comprend au moins un résidu d'arginine en position 275. Cependant, divers amino-acides adjacents à ou dans plusieurs résidus de la position 275 semblent également faire partie de la région reconnue par les enzymes qui transforment l'activateur du plasminogène en sa forme à deux chaines. Donc, le remplacement d'amino-acides de positions autres que la position 275 dans le domaine pourrait produire des mutants de l'activateur du plas- minogène résistant à la conversion en la forme à deux chaînes. Dans le mode de réalisation particulier, le "mutant de l'activateur du plasminogène à chaîne unique" est un activateur du plasminogène qui résiste à la con- version en la forme à deux chaînes. Il est caractérisé par une ou plusieurs substitutions d'amino-acides au site d'activation en deux chaînes. Lorsqu'il est modi- fié, ce site d'activation n'est pas reconnu par les enzymes et par conséquent il n'est pas hydrolysé par les enzymes qui transforment normalement l'activateur du plasminogène en-sa forme à deux chaines. Par analogie avec la trypsine et la chymotryp- sine, il semble que l'importance de la formation de la forme à deux chaînes de toute protéase à sérine soit la conséquence de la présence du groupe a-amino libre du t-PA en position 276. Dans cette comparaison, lors du clivage sur arg-275, le groupe a-amino en 276 est libéré pour présenter une interaction avec la chaîne polypep- tidique dans la région du site actif de la sérine du t-PA. La présente invention couvre donc toute mutation qui intervient dans l'interaction d'un tel groupe a-amino avec le site actif d'une protéase sans réduire l'activité globale de la molécule dans son ensemble. Divers procédés peuvent être utilisés pour provoquer des mutations de l'ADN ci-dessus afin d'en préparer les mutants. Un de ces procédés, illustré ici comme un mode de réalisation particulièrement préféré, comprend tout d'abord l'insertion d'un fragment du gène du t-PA natif contenant les séquences codant pour la région devant subir la mutation, dans la forme réplica- tive du phage M13mp8 pour former M13mp8PA. Un oligo- nucléotide synthétique complémentaire des séquences insérées de t-PA, mais contenant un ou plusieurs tri- plets nucléotidiques qui codent pour l'amino-acide à substituer, est ensuite fixé par hybridation à la forme à brin unique de M13mp8PA pour former une région à double brin. Cette région sert d'amorce pour la synthèse par l'ADN-polymérase I du brin complémentaire restant. après réplication et identification, la séquence du t-PA mutant peut être encore modifiée ou utilisée pour cons- truire un vecteur procaryotique ou eucaryotique pour l'expression du polypeptide t-PA muté. Le procédé général décrit ci-dessus peut égale- ment être utilisé pour réaliser des mutations du t-PA en des positions autres que les sites de clivage en deux chaînes 275/276 et/ou 277/278 pour produire des dérivés mutants de t-PA entrant dans la présente invention. Ces autres positions sont des séquences polypeptidiques qui sont sensibles à l'hydrolyse enzymatique telles que les sites de clivage du type trypsine qui comprennent de façon typique de l'arginine ou de la lysine suivies d'isoleucine, de sérine ou d'alanine. La substitution d'un ou plusieurs amino-acides dans un tel site de clivage du type trypsine fournit des t-PA mutants qui résistent à l'hydrolyse par les protéases du type trypsine. Cette résistance à la dégradation enzymatique pendant l'expression et la purification, ainsi que pendant une administration in vivo comme agent pharma- ceutique, produit un t-PA qui ne perd pas son activité biologique par rapport au t-PA n'ayant pas muté. Des exemples de tels sites de clivage du type trypsine dans la molécule de t-PA humain comprennent les sites argi- nine-alanine (positions 40-41), arginine-sérine (posi- tions 27-28) et arginine-sérine-(positions (462-463). A. Généralités. On prépare ici des dérivés mutants du t-PA 1) ayant de la méthionine comme premier amino-acide (présent par suite de l'insertion d'un codon de signal de départ ATG en avant du gène de structure ou 2) o la méthionine est clivée de façon intra- ou extra-cellu- laire, ayant son premier amino-acide normal, 3) ensemble ou avec soit son polypeptide de signal soit une protéine conjuguée autre que son polypeptide de signal classique, le polypeptide de signal ou un conjugué étant spécifi- quement clivables dans un environnement intra- ou extra- cellulaire ou 4) par expression directe sous la forme mâture sans nécessiter d'élimination par clivage d'un polypeptide étranger superflu. Dans tous les cas, le t-PA humain mutant ainsi produit, sous ses diverses formes, est récupéré et purifié à un taux approprié pour le traitement de diverses affections et états vascu- laires, tels que l'infarctus du myocarde, l'ictus, l'embolie pulmonaire, une thrombose veineuse profonde, une occlusion artérielle périphérique et d'autres états thrombotiques. Le t-PA humain mutant a également une définition fonctionnelle en ce qu'il est capable de se fixer à la fibrine et de constituer in vivo et in vitro un inter- médiaire de la conversion du plasminogène en plasmine qui, à son tour, solubilise les caillots de fibrine. Le "vecteur d'expression" comprend les vecteurs qui sont capables d'exprimer les séquences d'ADN qui y sont contenues, o ces séquences peuvent être unies de façon exploitable à d'autres séquences capables d'effectuer leur expression et qui sont réplicables dans les organismes hôtes soit sous forme d'épisomes soit comme partie intégrante de l'ADN chromosomique. Les "cellules hôtes recombinantes" sont des cellules qui ont été transformées avec des vecteurs d'expression construits par emploi des techniques d'ADN recombinant. B. Cultures cellulaires hôtes et vecteurs. Les vecteurs et le procédé décrit ici convien- nent à l'emploi dans les cellules hôtes dans une gamme étendue d'organismes procaryotiques et eucaryotiques. Par exemple E. coli K12 souche 294 (ATCC N' 31446) est particulièrement utile. D'autres souches microbiennes que l'on peut utiliser sont E. coli B et E. coli X1776 (ATCC N' 31537). Ces exemples ont bien sur un caractère illustratif et non limitatif. En plus des procaryotes, des organismes euca- ryotiques, tels que des cultures de levures r peuvent être utilisés. Les cultures cellulaires dérivant d'organismes multicellulaires sont actuellement les hôtes de choix. En principe, l'une quelconque de ces cultures cellulaires est utilisable; cependant, l'intérêt a été maximal pour les cellules des vertébrés et la propagation de ces cellules en culture (culture tissulaire) est devenue une opération reproductible - voir Tissue Culture, Academic Press, Kruse et Patter- son, éditeurs (1973). Des exemples de telles lignées de cellules hôtes utiles sont les cellules VERO et HeLa, les lignées cellulaires Chinese Hamster Ovary (CHO), et les lignées cellulaires W138, BHK, COS-7 et MDCK. Les exemples qui figurent ci-après décrivent l'emploi de E. coli avec utilisation du système promo- teur trp et l'emploi des cellules CHO avec des vecteurs d'expression qui comprennent l'origine de réplication de SV40 comme promoteur. Cependant, il serait très possible pour l'homme du métier d'utiliser d'autres cultures de cellules hôtes procaryotiques ou eucaryotiques. C. Procédés employés. 1. Transfection. Si l'on utilise comme cellules hôtes des cel- lules n'ayant pas des parois cellulaires constituant des barrières considérables, une transfection peut être effectuée selon le procédé de précipitation par le phosphate de calcium comme décrit par Graham et coll., Viroloq 52, 546 (1978). Cependant, l'injection nu- cléaire ou la fusion protoplastique peuvent également être utilisées. Si l'on utilise des cellules procaryotiques ou des cellules dont la paroi cellulaire est fortement structurée, le procédé préféré de transfection utilise le chlorure de calcium comme décrit par Cohen et coll. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69, 2110 (1972). 2. Construction d'un vecteur. La construction des vecteurs appropriés conte- nant la séquence désirée de codage et de régulation emploie des techniques standard de ligation connues en soi. Les plasmides ou fragments d'ADN isolés sont clivés, ajustés et ligués sous la forme désirée pour former les plasmides requis. D. Exemples. 1. Construction de M13mp8PABqlII pour la muta- qenèse de t-PA. On obtient de l'ADN de t-PA humain à partir des plasmides pPADHFR-6 (également appelé pETPFR) et pA25EO10. La préparation de ces deux plasmides de t-PA est décrite dans la demande de brevet EPO publiée avec le N' 093619, précitée et incorporée ici & titre de référence. Le plasmide pA25E10 contient des séquences codant pour les 508 derniers amino-acides du gène du t-PA et 772 paires de bases de la région 3' non tra- duite. On soumet ce plasmide à une digestion avec SacI ou BqlII pour produire un fragment de 744 paires de bases que l'on isole selon des méthodes standard comme précédemment décrit. Comme le montre la séquence connue et la carte de restriction du t-PA de la figure 1, ce fragment contient les codons correspondant aux amino- acides 411 à 527 du t-PA et comprend une partie de la région 3' non traduite. Le plasmide pPADHFR-6 contient la totalité du gène de structure pour t-PA et une partie de la région 3' non traduite. On soumet ce plasmide à une digestion avec SacI et Bl1II pour produire un fragment de 1230 paires de bases que l'on isole. Ce fragment contient les codons correspondant aux 410 premiers amino-acides de la forme mâture du t-PA. On réalise une ligation de ces fragments selon les méthodes standard et on les soumet à une digestion avec BqlII. On isole un fragment de 1974 paires de bases contenant les codons correspondant à la totalité de la séquence du t-PA mâture plus une partie de la région 3' non traduite. On soumet le M13mp8 à double brin (Messing et coll. Third Cleveland Symposium on Macromolecules Recombinant DNA, éditeur A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), p. 143) à une digestion avec BamHI et on fu- sionne au t-PA soumis à une digestion avec BqlII pour former M13mp8PABglII. On transforme des cellules d'E. coli JM 101 (ATCC N' 33876) avec la forme réplicative à double brin de M13mp8PABglII. Les formes à simple brin et à double brin (RF) de M13mp8PABglII peuvent être isolées des cellules d'E. coli JM 101 infectées par ce phage. La forme à simple brin a été utilisée pour la mutagenèse spécifique de site du t-PA. 2. Synthèse des amorces pour la mutagenèse spécifique de site. Le gène de structure du t-PA humain a été modi- fié par mutagenèse spécifique de site pour exprimer des t-PA ayant des substitutions des amino-acides en di- verses positions. Des oligonucléotides synthétiques ont été préparés selon la méthode en phase solide au phos- photriester de Crea et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75, 5765 (1978). Les amorces synthétiques sui- vantes ont été préparées et utilisées pour cette mutagenèse spécifique de site. Séquence native 275 279 des amino-acides Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Séquence native de l'ADN G CCT CAG TTT CGC ATC AAA GGA G Séquence d'ADN Gly de l'amorce 1B8 G CCT CAG TTT GGT ATC AAA GGA G Séquence d'ADN Glu de l'amorce 2C9 G CCT CAG TTT GAA ATC AAA GGA G Séquence d'ADN Gly Ile de l'amorce 4A10 G TTT GGT ATC ATC GGA GGG CTC Séquence d'ADN Gly Ile de l'amorce 3A7 G CCT CAG TTT GGT ATC ATC GGA G Séquence d'ADN Glu Ile de l'amorce 4B3 G CCT CAG TTT GAA ATC ATC GGA G La séquence des amino-acides et la séquence génique du t-PA natif sont indiquées aux deux premières lignes. Les amorces ont des triplés qui diffèrent de la séquence du gène natif sur le résidu indiqué. La substi- tution correspondante des amino-acides est illustrée au-dessus du triplé codant pour cet amino-acide. 3. Mutagenèse spécifique de site. Le mode opératoire décrit ci-après est utilisé pour produires des clones différents de t-PA contenant la séquence mutée des amorces synthétiques. Le procédé général utilisé est celui d'Adelman et coll. DNA 2 (1983), incorporé ici à titre de référence. Le schéma général pour la production de chacun de ces clones est illustré par la figure 3. M13RF1B8, M13RF2C9 et M13RF4A10 ont été produits par l'emploi d'amorces con- tenant des mutations pour les amino-acides uniques in- diqués. Un M13RF4A10 standard unique contenant une mu- tation en position 277 a été fixé à l'amorce 3A7 ou 4B3 pour produire respectivement M13RF3A7 et M13RP4B3. L'ADN M13 RF purifié de chacun de ces gènes de t-PA mutant a été préparé à partir des cellules d'E. coli JM 101. En- suite, des fragments d'ADN contenant la séquence d'ADN du t-PA mutant ont été utilisés pour construire des vec- teurs d'expression pour le t-PA mutant. On phosphoryle 50 ng d'un oligonucléotide syn- thétique pendant 30 minutes à 37'C dans 10 pi de Tris- HCl 50 mM à pH 7,5, MgCl2 à 10 mM, dithiothréitol à 10 mM et ATP à 1 mM contenant 8 U de polynucléotide-kinase T4. Pour l'emploi comme sonde, on phosphoryle 400 ng de l'oligonucléotide synthétique comme ci-dessus, si ce 257 5 d n'est que l'on remplace l'ATP par 222.107 1 de [Y32-P]-ATP (111.106g, /mmol) pour obtenir environ 50 à x 106 coups par minute/400 ng de produit à 24 motifs. Pour la formation de l'hétéroduplex, on chauffe 10 ng de M13mp8PABglII à brin unique à 95'C (10 min) et on re- froidit lentement à la température ordinaire (30 min) dans 40 pl de TrisHCl 10 mM & pH 7,5, MgCl2 10 mM et dithiothréitol 1 mM contenant 10 ng de l'amorce phos- phorylée et 50 ng du gros fragment M13mp8PABglIIRF ayant subi une digestion par EcoRI. L'extension de l'amorce commence par l'addition de 10 pl de tampon ligase contenant 2 mM d'AT 0,25 mM de chacun de dGTP, dTTP, dCTP et dATP, 5 U du grand fragment d'ADN-polymérase I de E. coli et 400 U d'ADN-ligase T4. Après une heure à 12'C, on utilise le mélange réactionnel pour transformer des cellules d'E. coli JM 101. On effectue la transformation par mélange de pl du mélange de ligation avec 200 pl de cellules JM 101 compétentes puis incubation pendant 30 minutes sur de la glace et pendant 5 minutes à 37'C. On mélange ensuite 3,5 ml de gélose de recouvrement 2YT à 55'C avec 300 pl de cellules JM 101 saturées, 10 pl d'IPTG (200 mM) et 50 pl de Xgal et, après addition des cel- lules transformées, on coule sur des boites de Pétri de 9 cm contenant de la gélose LB sans médicament. On prélève les plages non colorées et on les transfère dans une boite de microtitrage contenant pl de milieu 2YT. On applique les liquides de microtitrage ensemencés sur des boîtes de 15 cm de diamètre contenant de la gélose LB'recouverte d'un tapis de 600 pl de cellules JM 101 dans 8 ml de gélose de recouvrement 2YT et on incube pendant une nuit à 37'C. On transfère les plages formées sur un disque de nitro- cellulose par contact physique pendant une minute. On traite le disque de nitrocellulose avec NaQH 0,5 M et NaCI 1,5 M pendant 3 min et on lave deux fois avec du NaCl 3 M-Tris.HCt 0,5 M à pH 7,5 pendant 15 min puis avec du 2X SSC pendant 15 min. Le mélange de préhybri- dation contient du Tris 10 mM à pH 7,5, EDTA 5 mM, NaCl 0,9 M, du 1X Denhardt à 0,5 % de NP40, ATP à 100 pm, pyrophosphate de sodium 1 mM, phosphate de sodium 1 mM et tARN à 50 pg d'E. coli. Le 1X Denhardt contient par litre 200 mg de Ficoll, 200 mg de polyvinylpyrrolidone, mg de sérum-albumine bovine (SAB; fraction V). On cuit le disque à 80'C sous vide pendant 90 min. On incube ensuite le disque pendant 3 heures avec 6 ml de liquide de préhybridation dans une boite de Pétri puis on ajoute l'amorce marquée à 5 x 106 coups/minute et on hybride pendant une nuit. On effectue le lavage sélectif du disque avec du O,4X SSC à 49' et, après séchage à l'air, on met le disque en contact avec une pellicule radiographique. On analyse de plus les clones à hybri- dation positive par détermination des séquences didé- soxy, voir Aldeman, Ibid. 4. Construction de vecteurs Dour l'expression du t-PA mutant dans pXAPPA18 3'AxlOtrpR d'E. coli. On construit le plasmide pXAPPA18 3'AxlOtrpR pour l'utiliser comme vecteur d'expression pour les di- verses séquences d'ADN de t-PA mutant. Le schéma global utilisé pour la construction de ce plasmide est illustré par les figures 4 à 8. Le plasmide obtenu est illustré par la figure 8. Il contient le gène répresseur trpR et présente une délétion des séquences d'ADN de pBR322 qui inhibent l'amplification plasmidique. Cette délétion, connue sous le nom de délétion XAP, con-siste en l'éli- mination de 641 paires de bases des séquences d'ADN de pBR322 entre les sites de restriction AvaI et PvuII du pBR322 comme décrit par Sutcliff, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, Vol. 43, 77 (1979) Cold Spring Harbor Press, incorporé ici à titre de ré- férence. Le gène répresseur trpR compense la dérépres- sion prématurée de l'expression du t-PA provoquée par l'accroissement du nombre des copies de plasmide. Le plasmide pPA18, construit comme illustré par la figure 4, constitue un intermédiaire de la construction de pXAPPA18 3'AxlOtrpR. Ce plasmide contient la totalité du gène de structure de pré-t-PA ainsi que les régions 5' et 3' non traduites. Un promoteur trp associé au gène du t-PA et des séquences conférant une résistance à l'ampi- cilline et à la tétracycline sont également caractéris- tiques de ce plasmide. Pour construire pPA18, on utilise quatre plasmides, à savoir pFIFtrp69, pHKY10, ptPAtrp12 et pPA25E10. Le plasmide pFIFtrp69 est décrit par Goeddel et coll., Nucleic Acids Res., 8, 4057 (1980). Le plas- mide pHKY10 est décrit dans la demande de brevet US N' 685 521 déposée le 25 Décembre 1984 qui est une "continuation" de l'US N' 307 473 déposé le1' Octobre 1981 qui est une "continuation" de l'US N' 133 296 déposé le 24 Mars 1980 (demande de Brevet Européen N' 0036776). Les plasmides ptPAtrpl2 et pPA25ElO sont décrits par Pennica et coll., dans Nature 301, 214 (1983) et dans la demande de Brevet Européen publiée avec le N' 093 619 ci-dessus. De façon générale, on soumet le plasmide pFIFtrp69 à une digestion avec PstI et XbaI pour pro- duire le fragment de 950 paires de bases appelé fragment i sur la figure 4. On soumet le plasmide ptPAtrp12 à une digestion avec XbaI et NarI. On en isole la séquence de 340 paires de bases appelée fragment 4 sur la figure 4. On soumet le plasmide pPA25E10 à une digestion avec NarI et BqlII. On en isole le fragment de 1604 paires de bases appelé fragment 3 sur la figure 4. On soumet le plasmide pHKY10 à une digestion avec PstI et BqlII pour produire un fragment de 2900 paires de bases appelé fragment 2 sur la figure 4. On fait une ligation de ces quatre fragments et on utilise cet ADN pour transformer les cellules d'E. coli pour obtenir pPA18. On isole le plasmide pPA18 et on le soumet à une digestion avec Sau3A puis on traite avec le fragment de Klenow de l'ADN-polymérase I pour remplir le site de restriction. On traite le plasmide non circulaire avec SacI et on isole une séquence de 389 paires de bases appelée fragment 5 sur la figure 5. On soumet également le plasmide pPA18 à une digestion avec SacI et BamHI. A partir de ce vecteur, on isole le fragment 6. On soumet le plasmide pBR322, Boyer et coll., Gene 2., 95 (1977) à 258 1652 une digestion avec EcoRI puis on traite avec le fragment de Klenow de l'ADN-polymérase I. On traite cette sé- quence d'ADN à extrémité ouverte avec BamHI pour pro- duire la séquence de 375 paires de bases appelée frag- ment 7 sur la figure 5. On fait une ligation des frag- ments 5, 6 et 7 et on utilise cette préparation pour transformer E. coli à partir duquel on a obtenu le plasmide pPA183'A. Ce plasmide est équivalent à pPA18 si ce n'est que la partie de la région 3' non traduite du gène du t-PA a été éliminée. On soumet le plasmide pPA183'A à une digestion avec PstI et NarI pour produire un fragment de 313 paires de bases appelé fragment 8 sur la figure 6. Ce fragment code pour les amino-acides 8 à 109. Le fragment d'oligonucléotide synthétique 9 a la séquence suivante: ' CTAGAATTATGTCTTATCAAGTTATTTGCA *TTAATACAGAATAGTTCAATAA 5' On fait une ligation de cet ADN synthétique au site PstI du fragment 8 pour régénérer le codon arginine en position 7 et les codons des six premiers amino- acides de la molécule de t-PA mâture. De plus, on place en 5' un site de fixation de ribosome sur le codon méthionine N-terminale synthétique placé immédiatement en 5' du résidu 1 de la séquence de codage des amino- acides du t-PA mâture. L'extrémité 5' de cet oligonu- cléotide contient un site de restriction XbaI. On fait donc une ligation du fragment 8 en présence de ce frag- ment d'oligonucléotide synthétique.9 et on traite le mélange avec XbaI et NarI pour obtenir le fragment 10 (voir la figure 6). On soumet le plasmide pPA183'A à une digestion avec NarI et SacI pour produire la séquence de 900 paires de bas appelée fragment 11 sur la figure 7. On soumet également ce plasmide à une digestion avec SacI et XbaI pour produire le fragment de vecteur 12 de la figure 7. On épisse les fragments 10, 11 et 12 et on les utilise pour transformer l'E. coli dont on a isolé pPA183'AX10. On prépare une séquence d'ADN contenant la délétion XAP et le gène répresseur trpR à partir du pFMBtrpR qui est décrit dans la demande de brevet US N' 538 730 déposée le 3 Octobre 1983 (publication EPO N" 136 907). De façon succincte, on construit ce plas- mide à partir de trois plasmides connus du spécialiste de l'art: phGH107, décrit dans la publication EPO N' 022 242, publiée le 14 janvier 1981, est utilisé comme source du promoteur inductible lac; ptrpR3, décrit par Roeder et coll. dans Molecular Genetics 176, 361 (1979), est utilisé comme source de la séquence codante du répresseur trp; et pFMB1, décrit dans la publication EPO N' 0068693 publiée le 5 Janvier 1983, est utilisé comme source de la séquence codante pour l'antigène FMD dérivant de la souche A24. Pour obtenir la séquence du répresseur trp, on traite ptrpR3 avec HaeIII et on isole le fragment de 334 paires de bases à partir d'un gel d'acrylamide à 6 % et on fait une ligation du fragment isolé avec des frag- ments de liaison à 16 motifs obtenu avec EcoRI ayant pour séquence: ' CCATAGAATTCTATGG. Pour obtenir le squelette du vecteur et le promoteur lac, on soumet tout d'abord phGH107 à une digestion avec EcoRI et on traite avec une phosphatase alcaline bactérienne. On fait ensuite une ligation avec le gros fragment de vecteur contenant le promoteur lacUV5 au plasmide trpR ajusté en utilisant la ligase T4 et on transforme le mélange d'épissage dans E. coli. On isole l'ADN de plasmide des transformants et on confirme la présence du plasmide désiré appelé ptrpR/hGH107. Messing et coll. Nucleic Acids Res., 9, 309 (1981). On soumet ptrpR/hGH107 à une digestion partielle 258 1 652 avec EcoRI, on forme des extrémités cohésives (de l'an- glais:"bluntend") avec le fragment de Klenow et on traite avec PvuII pour obtenir l'opéron promoteur lac/répresseur trp (le fragment de 530 paires de bases). Une digestion partielle avec PvuII de pFMB1 et un iso- lement du fragment de vecteur sur du polyacrylamide à 6 % fournissent le squelette du vecteur d'expression contenant la séquence codant pour FMB sous contrôle du promoteur trp. On mélange le fragment ptrpR/hGH107 avec le produit de digestion de pFMB1 par PvuII et on fait une ligation avec la ligase T4. On utilise ensuite le mélange d'épissage pour transformer la souche E. coli 294 et on utilise les transformants comme source d'ADN plasmidique. On vérifie le plasmide obtenu pFMB/trpR selon un minitest de sélection et on vérifie l'orien- tation du fragment inséré par digestion avec AvaI-Pvu. On soumet le plasmide pFMB/trpR à une digestion avec NdeI et BamHI. On isole le fragment contenant le ré- presseur trpR. On soumet le plasmide pPA183'AX10 à une digestion avec NdeI et BamHI. On isole le fragment de vecteur principal. On fait une ligation de ce fragment de vecteur et le fragment répresseur trpR de pFMB/trpR et on utilise le mélange d'ADN pour transformer E. coli dont le plasmide pXAPPA183'AxlOtrpR a été isolé comme illustré par la figure 8. 5. Vecteurs d'expression d'E. coli pour les mutants de t-PA. La figure 8 illustre le vecteur pXAPPA183'AxlO trpR utilisé pour exprimer t-PA et les mutants de t-PA dans E. coli. Comme on le voit, l'expression du gène de structure du t-PA natif est contrôlée par le promoteur trp. L'attention est attirée sur les sites de restric- tion XbaI, NarI et SacI. On.soumet le plasmide pXAPPA 183'AxlOtrpR à une digestion avec NarI et XbaI. On isole un fragment de 340 paires de bases appelé fragment 1 sur la figure 8. On obtient un fragment de vecteur appelé fragment 2 sur la figure 8 par isolement du gros frag- ment obtenu par digestion de pXAPPA183'AxlOtrpR avec XbaI et SacI. On obtient le fragment 3 (900 paires de bases) par digestion avec NarI-et SacI avec l'ADN RF de chacun des clones M13 de t-PA mutant, obtenus par muta- genèse spécifique de site (figure 3). On obtient des vecteurs exprimant les différents t-PA mutants par ligation des fragments 1 et 2 avec les fragments 3 respectifs et on les utilise pour transformer E. coli dont on a isolé chacun des vecteurs d'expression de t-PA mutant dans E. coli. pXAPPA18 3'Ax10trpR 1B8 pXAPPA18 3'AxlOtrpR 2C9 pXAPPA18 3'Ax1OtrpR 4A10 pXAPPA18 3'AxlOtrpR 3A7 pXAPPA18 3'AxlOtrpR 4B3 On utilise ces plasmides ainsi que le vecteur d'expression du t-PA de type sauvage pXAPPA183'AxlOtrpR pour transformer E. coli W3110 fhuA-. E. coli W3110 fhuA est une bactérie résistant au phage Tl caractérisée par une délétion ou une inver- sion des séquences d'ADN associées au gène fhuA comme décrit dans la demande de brevet US en coinstance N 06/673 955, déposée le 21 Novembre 1984. En résumé, E. coli W3110 (ATCC 27325) est soumis à une transduction avec le bactériophage lambda contenant l'élément trans- posable Tn10 qui confère une résistance à la tétracy- cline. On sélectionne les souches de W3110 présentant la transduction Tn10 résistant à l'infection phagique. On regroupe les souches à résistance phagique et on les infecte avec le bactériophage P1. On utilise le lysat obtenu pour la transduction d'E. coli AT 982 (Bekhari et coll., J. Bacterioloqv 105, 844 (1971). La souche AT 982 porte une mutation DAP proche du gène fhuA. Par 258 1652 conséquent, la transduction de la souche AT 982 par le lysat P1 et la sélection des colonies ayant subi la transduction qui résistent à la tétracycline et qui présentent une régénération de la fonction DAP indiquent que le transposon Tn10 est situé dans le gène fhuA. Les souches qui résistent à la tétracycline et qui pré- sentent une régénération de la fonction DAP constituent une source d'ADN pour la transduction par le bactério- phage P1 de E. coli W3110. On sélectionne les souches W3110 ayant subi une transduction exprimant la résis- tance à la tétracycline et la résistance phagique. On sélectionne ensuite ces souches à partir de la résis- tance à l'infection phagique et à la réversion à la sensibilité à la tétracycline. Naloy et coll. J. Bacterioloqv 145, 1110 (1981). La réversion à la sensi- bilité à la tétracycline, couplée à la conservation de la résistance à l'infection par le phage T1, indique que la séquence d'ADN associée au gène fhuA a fait soit l'objet d'une délétion soit d'une inversion irréver- sible. Les souches ainsi construites sont appelées E. coli W3110 fhuA. Le phage contenant l'élément transposable Tn10 qui a été utilisé pour insérer Tn10 dans W3110 est construit comme suit. La matière de départ est lambda c1857b 2210am29. Ce phage est connu des spécialistes de l'art, Kleckner, J. Mol. Biol. 116, 125 (1977) et a été construit à partir de trois mutants bien connus de lambda selon des' modes opératoires standard. On prépare un lysat de ce phage lambda sur le suppresseur amber d'E. coli C600 (ATCC N' 23724) qui a été manipulé selon des modes opératoires connus du spécialiste de l'art pour qu'il porte également le transposon TnlO. Kleckner et coll., J. Mol. Biol. 116, 125 (1977). On utilise ce lysat pour infecter E. coli C600 (lambda c1857) qui contient un suppresseur amber et un prophage lambda portant le génotype c1857. On prépare des lysats des colonies résistantes à la tétracycline par induction thermique par culture des colonies résistantes à la tétracycline, d'abord dans un bouillon à 32'C, puis à 42'C pendant 90 minutes. On applique le. lysat à des boltes de E. coli C600 et on transfère selon la méthode des répliques. On transfère les plages apparaissant sur E. coli C600 selon la méthode des répliques à 32'C sur E. coli C600 et E. coli W3102 sup+ (lambda imm434) contenant le prophage hétéro-immun lambda imm434. Kleckner, N. et coll. Genetics 90, 427 (1978). On transfère les plages apparaissant sur la souche hétéro- immune sur des boites de tétracycline. Les plages apparaissant sur ces boîtes permettent la transduction t5 de la résistance à la tétracycline et sont utilisées dans le procédé décrit ci-dessus pour produire E. coli W3110 fhuA-. On obtient le t-PA natif et le t-PA mutant à partir de cultures de 10 litres de ces cellules trans- formées avec le plasmide approprié de t-PA ou de t-PA mutant. On induit l'expression avec des milieux carencés en tryptophane. 6. Vecteurs de l'expression de mutants de t-PA dans des cellules de mammifères. Le plasmide pPADHFR-6 (également appelé pETPFR - vair la demande de Brevet Européen publiée sous le Ne 93619 supra) est illustré par la figure 9. L'expres- son du gène de structure du t-PA natif est sous le con- trêle du promoteur précoce de l'antigène T de SV40. Ce ' promoteur contrôle également l'expression du gène DHFR. L'attention est attirée sur les sites de restriction BqlII, BstXI et BstEII. Un fragment de vecteur appelé fragment 1 sur la figure 9 est obtenu par isolement du grand fragment produit par la digestion de pPADHFR-6 BtEII Ce fragment appelé fragent 2 sur avec BalII et BstEII. Ce fragment appelé fragment 2 sur la figure 9 est obtenu par isolement du fragment de t-PA de 400 paires de bases obtenu par la digestion de pPADHFR-6 avec BqlII et BstXl. Un fragment de t-PA de 1141 paires de bases contenant les mutations désirées et correspondant au fragment 3 de la figure 9 est obtenu par digestion d'ADN RF de chacun des clones de t- PA mutant avec BstXl et BstEII. On fait une ligation des fragments 1 et 2 avec chaque fragment 3. On utilise les mélanges d'ADN pour transformer E. coli. A partir de chacun de ces produits de transformation, on obtient les vecteurs d'expression eucaryotique respectifs: pPADHFR-6 1B8 pPADHFR- 6 2C9 pPADHFR-6 4A10 pPADHFR-6 3A7 pPADHFR-6 4B3 Ces plasmides, ainsi que le vecteur d'expression du t-PA n'ayant pas subi de mutation pPADHFR-6, sont utilisés pour la transfection de cellules CHO défi- cientes en DHFR comme décrit ci-dessus (Graham et coll., Virology 52,456 (1973); voir également la demande de Brevet Européen publiée sous le N' 093619). L'expression du t-PA natif et mutant est amplifiée par exposition des cultures à des concentrations croissantes de méthotre- xate. Par exemple, on utilise les plasmides pPADHFR-6 2C9 et pPADHFR-6 1B8 pour la transfection de cellules CHO déficientes en DHFR [Urlab & Chasin (PNAS 77, 4216 (1980)] en utilisant le procédé de précipitation par le phosphate de calcium de Graham et coll., Viroloqv 52, 456 (1973). Dans chaque cas, on regroupe les colonies apparaissant sur le milieu sélectif (milieu dépourvu d'hypoxanthine, de glycine et de thymidine (HGT)) et on les cultive à nouveau dans du milieu -HGT. On étale ces cellules à raison de 2 x 105 cellules par boite de mm dans du méthotrexate (MTX) 250 nM pour effectuer la sélection de l'amplification des séquences plasmi- diques. On extrait de la boîte cinq clones qui poussent dans le MTX 250 nM et on constate qu'ils secrètent tous du t-PA dans le milieu. On utilise ces clones pour l'étude ultérieure. E. Méthodes d'analyse. 1. Purification du t-PA mutant et du t-PA. Les divers t-PA exprimés dans les cellules de mammifère comme décrit cidessus sont secrétés dans le milieu de culture cellulaire. On utilise le milieu contenant de tels t-PA directement dans diverses ana- lyses décrites ci-après ou on les soumet à un ou plu- sieurs des stades de purification suivants pour ac- croître la pureté du t-PA ou du t-PA mutant avant ces analyses. On soumet les milieux des cultures des cellules CHO contenant le t-PA mutant à une extraction disconti- nue avec du Sepharose chélatant (Pharmacia) (10-20 ml de résine/l de milieu) activé avec du chlorure de zinc comme décrit par Rijken et coll., Biochim. & Bioph s. Acta, 580, 140 (1979) et on recueille sur un filtre. On verse la résine dans une colonne, on lave avec un tampon contenant 0,02 M de phosphate de sodium à pH 8,0, NaCl 0,25 M, TWEEN 80 à 0,01 % et aprotinine 10 mg/l. On élue le t-PA avec le même tampon contenant de l'imidazole mM. On dialyse l'ensemble de t-PA dans du phosphate de sodium 0,02 M, pH 8, NaCl 0,25 M et TWEEN 80 à 0,01 % et on charge sur une résine de lysine-Sepharose, Radcliffe et coll., Arch. Biochem. Biophys. 189, 185 (1978) et Allen et coll. Thrombosis Heamostasis 45, 43 (1981), ou une résine de benzamidineSepharose, Bykowska et coll., Biochim. & Biophys. Acta, 703, 113 (1982). On lave le complexe zinc-résine rapidement avec du phosphate de sodium 0, 02 M à pH 8 contenant du NaCl 1 M et du TWEEN 80 à 0,01 % et on élue le tPA ou le t-PA mutant avec le même tampon contenant de l'arginine 0,5 %. On lave le benzamidine-Sepharose avec le tampon de dialyse et on élue avec le tampon de dialyse conte- nant de la guanidine 1 M. L'analyse par SDS-PAGE des protéines obtenues indique qu'elles sont pures à plus de %. en plus de l'emploi des techniques de purification précédentes, on peut utiliser des anticorps monoclonaux immobilisés (voir Nielsen et coll. EMBO J. 2, 115 (1983). 2. Electrophorèse sur gel de polvacrylamide avec SDS (SDS-PAGE). On concentre sous vide des échantillons de mi- lieux contenant la protéine t-PA ou les protéines t-PA mutantes et on dilue dans du tampon échantillon conte- nant du dodécylsulfate de sodium (SDS). Lorsqu'il con- vient, on ajoute du dithiothréitol 10 mM (DTT) pour réduire les liaisons disulfures des protéines. On ef- fectue une électrophorèse discontinue avec du SDS en utilisant des gels de séparation à 10 % ou à 7 à 17 % de polyacrylamide selon le mode opératoire de Laemmli [Laemmli, Nature, 227, 680 (1970)]. Pour l'analyse des échantillons de plasma, on utilise avec le système tampon de Laemmli des gels de séparation par gradient de SDS-polyacrylamide entre 4 % et 10 %. On obtient les poids moléculaires estimés (Mr) par l'analyse SDS-PAGE par comparaison de la mobilité avec des protéines de poids moléculaire connu. 3. Lyse d'un caillot avec libération de bulles. On analyse la capacité du t-PA recombinant (non mutant) et des t-PA mutants correspondants (t-PA mu- tants) à solubiliser des caillots de fibrine selon l'analyse par lyse d'un caillot avec libération de bulles. En résumé, on dissout de la thrombine (Sigma Chemical Co.) dans de l'eau distillée à environ 1000 unités/ml. On dilue cette solution mère au 1/30 avec un tampon d'analyse contenant du phosphate de sodium mono- basique 0,06 M, du phosphate de sodium dibasique 0,06 M, de l'azide de sodium à 200 mg/l et du TWEEN 80 à 0,01. On prépare une série de tubes à essai contenant 0,5 ml de thrombine diluée (30-40 unités/ml) et 0,5 ml de di- verses concentrations de t-PA (16 ng/ml à 1 x 106 ng/ml); des témoins appropriés ou l'échantillon inconnu à des dilutions approriées. On prépare également une seconde série de tubes à essai contenant 20 pl de plasminogène (1,0 mg/ml) et 1,0 ml de fibrinogène (1 mg/ml) et 10 pl de microsphères creuses de verre passant au tamis de 350 pm d'ouverture de maille (3M Company). On maintient les réactifs ci-dessus et les tubes à essai dans la glace jusqu'au stade final de l'analyse. On ajoute successivement à un tube à essai contenant le plasminogène, le fibrinogène et les microsphères, 200 pl soit de solution thrombine-t-PA soit de solution de thrombine-t-PA mutant, on agite par formation d'un tourbillon pendant 15 secondes et on place dans un bain- marie à 37'C. Des caillots se forment dans chaque tube en 30 secondes. On mesure le temps entre l'addition du t-PA et le point final de la réaction. Le point final est par définition le moment o les microsphères au cours de l'analyse s'élèvent à la surface. On détermine la valeur de l'activité thromboly- tique d'un échantillon particulier par référence à une courbe obtenue avec du t-PA standard. On calcule l'ac- tivité spécifique à partir de la quantité de t-PA ou de t-PA mutant présente déterminée par analyse radio- immunologique. 4. Analyse par lyse de caillot in vitro. On analyse également le t-PA recombinant et le t-PA mutant selon un système de lyse de caillot in vitro. En résumé, on recueille du sang humain avec du citrate de sodium à 3,13 % comme anticoagulant et on élimine la fraction cellulaire par centrifugation. On ajoute à chaque ml de plasma 50 pl de CaC12 0,5 M, 25 pl de thrombine bovine (100 unités/ml) et 10 pl de 125I- fibrinogène humain (100 000 coups/min/10 pi). On aspire ce mélange de plasma dans un tube de silicone ayant un diamètre intérieur de 4 mm et on incube à 37C pendant une heure. On découpe des segments (1 cm) de tube et on prélève le caillot. On place les caillots dans du tampon constitué de NaCl 0,3 M, de citrate de sodium 0,02 M à pH 5 et de TWEEN 80 0,01 %. On rince quatre fois les caillots en une heure avec du tampon frais. L'importance de la radioactivité du dernier liquide de rinçage ne doit pas dépasser environ 10 % de la radioactivité du caillot. On place chaque caillot dans 2,5 ml de plasma. On prélève un échantillon de 250 pl de plasma comme point zéro. On ajoute un échantillon de t-PA ou de t-PA mutant sous un volume de 100 pl. On prélève des échan- tillons (250 pl) à 1, 2, 3 et 4 heures et on en déter- mine la radioactivité. On traite en parallèle des standards contenant 5, 10, 20 et 40 unités d'activité de t-PA/ml. On calcule le pourcentage de lyse après cor- rection de la variation de volume de chaque échantillon. 5. Analyses chromoqènes. S-2288: On mesure directement le t-PA en uti- lisant le substrat chromogène tripeptidique synthétique de Kabi, S-2288 (Helena Laboratories, Beaumont, Texas). Pour cette analyse, on incube à 37C pendant 10 minutes le t-PA et S-2288 à 1 mM (concentration finale) dans du Tris 0,05 M à pH 7,4 contenant NaCl 0,012 M et TWEEN 80 0,01 %. On arrête la réaction par addition de 50 pl d'a- cide acétique glacial à 0,5 ml de mélange réactionnel. On calcule l'activité à partir de la densité optique à 405 nm en utilisant l'équation suivante standardisée par le fabricant: UI-min Activité dans 0,5 ml de mélange ADO x 793,65 DO réactionnel (UI, unités inter- nationales) temps d'incubation S-2251: On mesure l'activation du plasminogène par le t-PA en utilisant le substrat chromogène tripep- tidique spécifique de Kabi de la plasmine, S-2251 (Helena Laboratories). On mélange une portion de l'é- chantillon avec o,10 ml de plasminogène à 0,7 mg/ml (Tris 0,05 M à pH 7,4 contenant NaCl 0,012 M et 0,02 ml de fibrinogène humain à 20 mg/ml (Tris. HCl 0,05 M, pH 7,4 contenant NaCl 0,012 M et on ajuste le volume à 0,15 ml. On incube le mélange à 37C pendant 10 minutes, on ajoute 0,35 ml de S2251 (solution 1,0 mM dans le tampon ci-dessus) et on poursuit la réaction pendant 5 ou 10 minutes à 37'C. On ajoute 50 pl d'acide acétique glacial pour arrêter la réaction et on mesure la densité optique à 405 nm. On mesure l'activité par comparaison des résultats obtenus avec un échantillon de t-PA natif recombinant qui a été standardisé par l'analyse avec le S-2288. Cela est principalement nécessaire du fait que la densité optique à 405 nm varie d'un jour à l'autre lorsque le plasminogène vieillit et varie également si l'on utilise des préparations différentes de plasmino- gène et de fibrinogène. Cette variabilité est finalement réduite par la' préparation soigneuse de grandes quan- tités de plasminogène humain (glu-plasminogène) suivie d'une lyophilisation de portions de la matière. On conserve les portions à -20'C. Avant l'emploi, on con- serve les préparations de plasminogène redissous à OC pendant pas plus de 4 heures. On mesure la stimulation de l'activité du t-PA par le fibrinogène par comparaison de l'activité de solutions contenant des concentrations élevées de fibrinogène à celle de mélanges réactionnels semblables ne contenant pas de fibrinogène. Par suite de l'insolubilité de la fibrine, on utilise le fibrinogène dans cette analyse. La stimulation par des concentra- tions élevées de fibrinogène semble reproduire la sti- mulation prévue par la fibrine insoluble. 6. Analyse in vitro par formation d'un complexe avec un inhibiteur. On a analysé in vitro le t-PA recombinant et le t-PA muté pour déterminer leur réactivité avec des inhi- biteurs naturels de l'activité du t-PA. De façon géné- rale, on iode le't-PA mutant avec 125I en utilisant des Iodobeads (Pierce Chemical Co.) pour obtenir du t-PA ou du t-PA mutant ayant des radioactivités spécifiques d'environ 2 x 106 coups par minute/pg. Pour la formation in vitro d'un complexe, on ajoute le t-PA radiomarqué (1 pg) à du sang entier humain citraté fraîchement prélevé (500 pl). On incube les échantillons à la tem- pérature ordinaire et on arrête la réaction par dilution d'une portion dans du SDS à 2 %. On analyse les échan- tillons par SDS-PAGE avec un gradient de polyacrylamide entre 4 et 10 %. On détecte les complexes par autoradio- graphie. 7. Analyse Par fixation par la fibrine. Le procédé de fixation de la fibrine est une modification de la méthode décrite par Rijken et coll., J. Biol. Chem. 257, 2920 (1982). On ajoute l'échantillon de t-PA à étudier (500 ng) à une solution contenant du Tris 0,05 M à pH 7,4, NaCl 0,12 M, TWEEN 80 0,01 %, de la sérum-albumine humaine à 1 mg/ml et diverses concen- trations de fibrinogène sans plasminogène (O, 0,1, 0,5 et 1,0 mg/ml). Le volume final du mélange réactionnel est de 1 ml. On incube l'échantillon à 37C pendant 5 minutes puis on ajoute une unité de thrombine. On incube ' les échantillons pendant une heure à 37'C. On retire le caillot avec une tige de verre et on détermine la quan- tité de t-PA restant non fixé dans le surnageant. On reporte les valeurs en pourcentage de t-PA fixé en fonction de la concentration dufibrinogène (figure 11). 8. Lyse in vivo d'un caillot. On utilise le modèle de lyse in vivo de Collen et coll., J. Clin. Invest. 71, 368 (1983). On anesthésie avec de la kétamine des lapins blancs males néo-zélan- dais pesant entre 2,5 et 3 kg, on cathétérise la veine jugulaire et on ligature les petits vaisseaux communi- cants de la région. On isole environ 2 cm de la jugu- laire avec des ligatures réversibles et on passe un fil de l'extrémité proximale à l'extrémité distale du seg- ment, on purge le segment avec une solution salée de thrombine et on remplit de sang frais de lapin contenant du 125I-figrinogène humain. après 30 minutes, on réta- blit la circulation sanguine à travers le caillot. On commence la perfusion intraveineuse de t-PA avec un embol initial de 10 % de la dose totale. On administre la perfusion en 4 heures. Trente minutes après la fin de la perfusion, on recueille le caillot et on le soumet à un comptage. On utilise la radioactivité recueillie comme contrôle de qualité; on soumet à un comptage des échantillons de sang, l'urine, les tampons et les se- ringues pour vérifier que l'évaluation de la radio- activité présente dans le caillot initial était précise. F. Résultats des analyses. Les t-PA mutants ayant les séquence suivantes sur les résidus 270 à 279 du site d'activation en deux cha nes ont été exprimés dans les cellules d'E. coli et les cellules Chines Hamster Ovary (cellules CHO): 275 279 Natif -Arg-Ile-Lys-Gly-Gly- (RIKGG) 1B8 -Glv-Ile-Lys-Gly-Gly- (GIKGG) 2C9 -Glu-Ile-Lys-Gly-Gly- (EIKGG) 1. Transferts de type Western et zvmoqraphie. Les mutants EIKGG et GIKGG exprimés dans les cellules CH0 ontété analysés avec des transferts de type Western provenant de gels de SDS-PAGE réduits et non réduits. Le t-PA à chaîne unique natif apparaît sous forme de deux bandes ayant des poids moléculaires de 52 000 et 50 000 daltons par suite d'une différence dans l'importance de la glycosylation. Le mutant EIKGG d'un gel non réduit de SDS-PAGE présente une bande immuno- réactive majeure à un poids moléculaire d'environ 50 000 daltons. Un transfert de type Western du mutant GIKGG à partir d'un gel non réduit de SDS-PAGE présente cepen- dant un poids moléculaire de 55 000 daltons. La diffé- rence du poids moléculaire apparent du mutant GIKGG par rapport au t-PA natif peut indiquer une légère diffé- rence de conformation ou de structure carbohydratée par rapport au t-PA natif. Le clivage de la protéine en arg 275 peut être détecté par un poids molécuaire plus bas du t-PA lorsqu'on l'analyse après réduction (ce qui sépare la protéase et les chaînes de Kringle). Les zymographes des gels réduits de SDS-PAGE montrent que l'activité de l'activateur du plasminogène dans ces échantillons correspond au poids moléculaire de la bande immunoréactive de la forme à chaîne unique du t-PA (environ 60 000). La forme à deux chaînes du t-PA a une mobilité électrophorétique compatible avec un poids moléculaire d'environ 30 000 daltons. Ce mode opératoire démontre que les formes à chaîne unique des protéines de t-PA mutant sont présentes dans les milieux des cellules transformées. Analyse Par S-2251. L'analyse du t-PA natif et d'un t-PA mutant EIKGG avec le 5-2251 est illustrée par le tableau I. Les valeurs sont obtenues avant l'emploi du glu-plasminogène dans l'analyse pour réduire la variabilité de l'analyse. Une activité spécifique arbitraire en présence de fibri- nogène a été attribuée à la séquence naturelle de t-PA RIKGG en fonction de l'analyse avec le S-2288. Ce t-PA standard a été analysé avec chacun des t-PAmutants EIKGG pour normaliser les résultats. On peut voir que le t-PA mutant EIKGG, quel que soit le degré de purification, a une activité spécifique dans l'analyse avec du S-2251 et du fibrinogène supé- rieure à celle du t-PA recombinant. TABLEAU I S-2251 + S-2251 - Stimulation Mutation Mutant fibrinogène fibrinogène par le fibrinogène RIKGG1 natif (250 000)4 25 000 10,0 EIKGG1 2C9 1 000 000 3 400 290,0 EIKGG2 2C9 420 000 3 100 134,0 EIKGG 2C9 520 000 7 000 74,0 1purifié par emploi de chélate de zinc et de lysine- agarose purifié par emploi de chélate de zinc et de benzami- dine-agarose 3analysé sans purification 4activité attribuée Les valeurs du tableau IA ont été obtenues par emploi de glu-plasminogène lyophilisé de qualité supé- rieure. Avec une analyse plus reproductible, le mutant EIKGG s'est révélé avoir une activité égale dans l'analyse avec le S-2251 en présence de fibrinogène. En l'absence de fibrinogène, le mutant est moins actif que la forme native (tableaux I et IA), ce qui révèle une spécificité supérieure. TABLEAU IA S-2251 + S-2251 - Stimulation Mutation Mutant fibrinogène fibrinogène par le fibrinogène RIKGG natif (250 000)2 17 600 14 EIKGG 2C9 248 000 500 500 1purifié par emploi de chélate de zinc et de lysine- agarose 2. Analyse par lyse d'un caillot avec libération * de bulles et lyse d'un caillot in vitro. L'analyse par lyse d'un caillot avec libération de bulles a été utilisée pour déterminer l'activité spécifique du t-PA recombinant et du t-PA EIKGG mutant purifié. L'activité de chacun de ces t-PA a été détermi- née selon les modes opératoires décrits ci-dessus. La concentration du tPA et du t-PA mutant EIKGG a été déterminée par radio-immunologie. Les résultats de cette analyse, y compris l'activité spécifique, figurent dans le tableau II. TABLEAU II Echantillon D.I. Activité Concentration Activité U/ml des protéines spécifique mqI/ml 1 EIKGG* 8440 0,088 95 909 2 EIKGG* 7698 0,088 87 477 3 t-PA** 5640 0,088 64 090 1) congelé-décongelé une fois 2) congelédécongelé quatre fois * purifié par emploi de chélate de zinc et de benzami- dine-agarose ** purifié par emploi de chélate de zinc et de lysine- agarose L'analyse par lyse de caillot avec libération de bulles démonte qu'un mutant à chaîne unique du t-PA, à savoir le mutant EIKGG du t-PA a une activité spécifique supérieure de 50 % à celle du t-PA recombinant. Comme on peut le voir, des congélations et décongélations répé- tées provoquent une légère diminution de l'activité spécifique du mutant EIKGG du t-PA. Cependant, le mutant t-PA conserve une activité supérieure à celle du t-PA recombinant. 3. Analyse Par formation in vivo d'un complexe avec un inhibiteur. L'inactivation des protéases par les inhibiteurs plasmatiques des protéases est un mécanisme bien étudié d'inactivation des protéases sériques. Les complexes obtenus sont stables vis-à-vis de la dénaturation et peuvent être évalués par électrophorèse sur SDS-PAGE. Selon ce mode opératoire, on ajoute du t-PA radiomarqué à du plasma ou à du sang entier et on incube l'échan- tillon à 37'C. On soumet l'échantillon à une électro- phorèse sur SDS-PAGE puis à une autoradiographie. La détection du marqueur radioactif en des positions de Mr supérieur à celui du t-PA libre constitue une indication de la quantité de complexe t-PA-inhibiteur des protéases qui a été formée. Lorsqu'on l'analyse dans le sang de rat, le t-PA se révèle former lentement des complexes ayant des Mr supérieurs à 200 000. Après plusieurs heures d'incubation, plus de 70 % du marqueur radioactif peuvent être détectés dans ces complexes. En revanche, le t-PA ayant subi une mutation ne forme pas ces com- plexes; la majeure partie du marqueur radioactif dé- tecté par autoradiographie demeure dans la position de l'enzyme non inactivée libre. Lorsqu'on effectue une analyse semblable sur du sang humain (figure 10), le t-PA forme également de tels complexes et de plus forme des complexes de Mr compris entre 100 000 et 200 000. Comme avec le sang de rat, le t-PA mutant forme nette- ment moins de complexes avec un inhibiteur ayant un Mr supérieur à 200 000. Les complexes avec un inhibiteur des protéases ayant des Mr entre 100 000 et 200 000 demeurent présents. Ces résultats indiquent que le mutant n'est pas inactivé par un ou plusieurs inhibi- teurs protéinases formant des complexes ayant des Mr supérieurs à 200 000. On observe des différences d'espèce dans la réactiité du t-PA et du t-PA ayant subi une mutation en ce qui concerne la formation de com- plexes entre 100 000 et 200 000. 4. Fixation Par la fibrine. On a précédemment mentionné que les formes à chaîne unique et à deux chaînes du t-PA avaient une affinité approximativement égale pour la fibrine (Rijken et coll., J. Biol. Chem., 257, 2920 (1982). Dans l'ana- lyse décrite ici, en revanche, une affinité nettement supérieure pour la fibrine a été observée pour la forme à chaîne unique du t-PA par rapport à la forme à deux chaînes (figure 11). 5. Lyse in vivo d'un caillot. La figure 12 présente les courbes relatives dose-effet pour le t-PA (o) et le mutant EIK (a). Les valeurs sont représentées par la moyenne l'erreur type de la moyenne avec cinq lapins dans chaque groupe. On mesure la distance entre les deux courbes au point correspondant à une lyse de 50 % et on estime que l'ac- tivité de la forme EIK du t-PA est 2,4 fois supérieure à celle de la forme non mutée (RIK). On obtient une dif- férence statistiquement significative pour la dose de 0,25 mg/kg (p G. Conclusion. Les résultats ci-dessus démontrent que la muta- tion sur le reste 275 du t-PA peut être plus efficace que la forme naturelle pour deux raisons distinctes: 1. Un accroissement de la spécificité: les analyses de la fonction du t-PA indiquent que cette protéine est plus active et plus spécifique. 2. Une baisse in vivo de la fixation par un inhibiteur plasmatique: l'inhibition in vivo de tels mutants indique une baisse de l'inactivation par cer- tains inhibiteurs des protéases. Cela permettrait la circulation de la forme active non complexée du t-PA pour permettre la dissolution d'un caillot par un t-PA ayant une activité fonctionnelle accrue. La littérature scientifique présente des dis- cordances sur les propriétés enzymatiques de la forme à chaîne unique du t-PA. Pour mieux comprendre la fonction du t-PA, on peut examiner les protéines homologues. Des recherches poussées ont été effectuées sur les protéases à sérine que sont la trypsine et la chymotrypsine. Le domaine de la protéase t-PA est très semblable à celui de ces protéines et on peut s'attendre à ce que son fonctionnement soit semblable. A partir des mécanismes fonctionnels déterminés pour la trypsine et la chymo- trypsine, on peut s'attendre à ce que l'inhibition du clivage sur l'arginine 275 du t-PA n'influe que sur les caractéristiques fonctionnelles du domaine protéase. L'accroissement de l'affinité pour la fibrine des mutants est donc surprenante. Quel(s) que soit (soient) le(s) mécanisme(s) mis en jeu (accroissement de la spécificité, absence de fixation par un inhibiteur des protéases, accroissement de l'affinité pour la fibrine, ou leurs combinaisons), lorsqu'on analyse la capacité de lyse in vivo d'une veine obturée d'un mutant, on constate que celui-ci est d'environ 2,5 fois plus actif que le t-PA présentant la séquence naturelle. Comme précédemment exposé, la forme à une seule chaine du t-PA s'est révélée se transformer en la forme à deux chaînes au site d'un caillot. Cette conversion supprimerait tout avantage associé à la forme à une seule chaine. Seule une forme mutée du t-PA peut être transformée en la forme à deux chaines par les protéases physiologiques, ce qui lui permet de conserver ses avantages au site d'un caillot. Après la description du mode de réalisation préféré de la présente invention, il est évident pour le spécialiste de l'art que diverses modifications peuvent être apportées aux modes de réalisation décrits et que ces modifications entrent dans le cadre de la présente inventi6n. REVENDICATIONS 1. Un mutant de l'activateur tissulaire du plas- minogène humain (t-PA) produit par des cellules hôtes recombinantes et résistant au clivage enzymatique spéci- fique. 2. Un mutant selon la revendication 1 essentiel- lement dépourvu de la forme à deux chaines. 3. Un mutant à chaîne unique selon la revendica- tion 1. 4. Un mutant à chaine unique selon la revendica- tion 3 stabilisé dans la forme à chaine unique par muta- genèse à spécificité de site sur un site de clivage en deux chaînes. 5. Un mutant selon la revendication 4 dans le- quel la position 275 est occupée par un amino-acide autre que l'arginine. 6. Un mutant selon la revendication 5 dans le- quel ledit amino-acide est choisi dans le groupe cons- titué par la glycine et l'acide glutamique. 7. Un mutant selon la revendication 4 dans le- quel ledit site d'activation en deux chaînes est disposé dans l'intervalle des résidus 270 à 279 du t-PA et la- dite mutagenèse à spécificité de site est effectuée par remplacement d'au moins un reste d'amino-acide dans ledit site d'activation en deux chaînes. 8. Un mutant selon la revendication 7 dans le- quel ledit remplacement est effectué par remplacement de l'isoleucine du résidu 276. 9. Un mutant selon la revendication 7 dans le- quel ledit remplacement est effectué par remplacement de l'arginine du résidu 275. 10. Un mutant d'activateur tissulaire du plas- minogène à chaîne unique produit par des cellules hôtes recombinantes ayant une affinité réduite pour les inhi- biteurs des protéases. 11. Un mutant d'activateur tissulaire du plas- minogène à chaîne unique produit par des cellules hôtes recombinantes ayant une activité spécifique pour la conversion du plasminogène supérieure à celle de l'ac- tivateur tissulaire du plasminogène n'ayant pas subi de mutation. 12. Un mutant selon la revendication 1 stabilisé contre l'hydrolyse enzymatique en un site de clivage de type trypsine, ledit site de clivage étant caractérisé par l'arginine ou la lysine, o un ou plusieurs amino- acides dudit site de clivage est ou sont remplacés par un amino-acide différent. 13. Une séquence d'ADN codant pour les mutants selon les revendications 1 à 4. 14. Un vecteur d'expression réplicable capable dans une cellule hôte transformante d'exprimer la séquence d'ADN de la revendication 13. 15. Un micro-organisme transformé avec le vec- teur de la revendication 14. 16. Une culture cellulaire transformée avec le vecteur de la revendication 14. 17. Une culture de cellules de mammifère trans- formées avec le vecteur de la revendication 14. 18. Une culture cellulaire selon la revendica- tion 17 obtenue par transformation d'une lignée de cellules Chinese Hamster Ovary. 19. Une composition comprenant une quantité thérapeutique efficace d'un mutant d'activateur du plasminogène selon les revendications 1 à 12 en mélange avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 20. Procédé de fabrication de médicament appli- cable au traitement de maladies ou infections vasculai- res, ce médicament comprenant la composition selon la revendication 19.