FR 2574412 A1 19860613 FR 8518129 A 19851206 25744 1 2 La présente invention concerne un nouveau procédé pour la fabrication de dérivés de nucléosides de formule (I) D B C. H (I) X^ X,*R' HO C K O R dans laquelle, B représente l'adénine, la cytosine, le 5-fluorouracile, la 5- azacytosine, la 6-mercaptopurine ou la 7-désazaadénine; Aet C représentent chacun indépendamment L'hydrogène ou un groupe hydroxy; K représente une liaison simple ou une liaison double; X représente l'oxygène ou un groupe hydroxy; Y représente l'hydrogène ou un groupe hydroxy; Z représente l'hydrogène ou le fluor; R représente L'hydrogène, le fluor ou un groupe méthyle; R' représente l'hydrogène ou un groupe méthyle, ou bien Yet R' représentent - 0 CH3 c -0 CH3, et leurs sels qui sont utiles comme médicaments anticancéreux et antiviraux. Dans la structure moléculaire représentée- dans la formule (I) , le reste corticostéroide est choisi parmi les suivants: cortisol, cortisone, corticostérone, cortexolone, 11- désoxycorticostérone, fludrocortisone, prednisolone, prednisone, 6mméthylprednisolone, dexaméthasone, flucocinolone-acétonide et les analogues. 2574 4 1 2 Et le nucléoside est la 9-0-D-arabinofurannosyladénine (ci-après ara-A), La 1-0-D-arabinofurannosylcytosine (ci-après ara-C), la 5-fluoro-2'désoxyuridine ou un autre nucléoside qui peut être utilisé comme médicament anticancéreux et antiviral. La présente invention concerne un procédé nouveau et à rendement élevé pour fabriquer les composés de formule (I) par réaction (condensation) du nucléoside-5'-monophosphate avec le 21-hydroxy-stéroîde en utilisant le TPS(chlorure de 2,4,6-triisopro- pylbenzènesulfonyle) comme agent de condensation. Latechnique antérieure concernant les procédés de fabrication des composés de formule (I) comprend le brevet des EUA 4 283 394 et le brevet canadien I 145 742 au nom de la demanderesse et également les publications de la demanderesse Journal of Medicinal Chemistry 22, p 1 428 (1979) et 23, p 1 343 (1980); et Journal of Pharm. Sciences 73, p 278 (1984). Dans ces procédés connus, les groupements fonctionnels tels que le groupe hydroxy et le groupe amino du nucléoside-5'- monophosphate sont protégés par acétylation et ensuite le 21-hydroxy- stéro5de et les phosphates sont condensés en utilisant le N,N'- dicyclohexylcarbodiimide (DCC),ou bien on fait réagir le nucléoside avec POCI3 pour préparer l'ester nucléoside-5'-O-dichlorophosphate et ensuite, on fait réagir l'ester avec le 21-hydroxystéroide pour obtenir le composé recherché. Mais le premier procédé atteint d'abord un équilibre de réaction et le second procédé a les inconvénients d'une vitesse de réaction et d'un rendement plus faibles. La présente invention résout les inconvénients des procédés connus et propose un procédé nouveau et perfectionné pour la fabrication des composés recherchés. La présente invention est expliquée plus en détail ci- après. 2 5 7 4 4 1 2 L'objet de la présente invention est de proposer un procédé de fabrication d'agents anticancéreux et antiviraux importants et efficaces ayant des -caractéristiques physio- chimiques spécifiques. Un autre objet de la présente invention est de proposer un nouveau produit conjugué de stéroide pour l'utilisation comme médicament anticancéreux et antiviral et un nouveau procédé de fabrication dudit conjugué de stéroide. Un autre objet de l'invention est de proposer un mécanisme théorique par lequel un conjugué de stéroïde agit comme un nouveau système pour la distribution de médicaments anticancéreux et antiviraux sur des cellules tumorales ou des cellules infectées par un virus. Dès que le conjugué de la présente invention atteint la cellule tumorale, il sépare et libère en plus grande quantité une forme phosphorylée de nucléosides à partir du conjugué de nucléotides, il est donc très efficace pour les cellules résistantes dépourvues de nucléoside-kinase. Et le corticostéroÂde luimême possède une action pharmaceutique, spécialement une activité anti- cancéreuse ou d'immunomodulation, conjointement avec l'effet du nucléoside et cet effet a l'avantage d'actions additifs ou synergiques. Egalement, le corticostéroide n'a pas seulement une activité anti- inflammatoire mais conjointement avec d'autres agents anticancéreux, il a la thérapie combinée et est utilisé pour combattre la leucémie et le lymphome chez l'homme et présente sur ceux-ci un effet synergique. (Voir Cancer Research 26, p 2 272, (1-962): ibid, 35, p 700, 1975). Un autre objet est montré clairement par le fait que, - dans la mesure o ils restent sous forme conjuguée, le groupe amino du reste ara-C ou ara-A ne subit pas la désamination par la cytidine-désaminase ou l'adénosinedésaminase et comme le conjugué est lipophile, il agit comme une sorte de précurseur de médicament 257 4 412 à Libération retardée et Lorsqu'il atteint La cellule cibLe, il s'hydrolyse dans la cellule en corticostéroïde et nucleotide. Ceci est en fait le même effet que lorsque L'on administre simulta- nément deux médicaments et l'on peut attendre deux effets des médicaments. Donc, ceci conduit à une augmentation de l'indice thérapeutique anticancéreux. Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'on protège le nucléoside 5'-monophosphate de. formule (III) O B HO-P 0O I)0 Io T C III) HO HO C dans taqueltle A, B. C sont comme définis cidessus pour obtenir te composé de formule (IV) O B' Il HO- PO,ON OH (' AcO C' dans taquelle B' représente en forme protégée de B, A'et C' représentent L'hydrogène ou un groupe hydroxy protégé et Ac représente te groupe CH3CO, que l'on fait ensuite réagir avec un corticostéroide de formule (V) 2 5 7 4 4 1 2 À Cl 20H Coj y X. ' fR' (V) K R dans laquelle K, X, Y, Z, R et R' sont comme définis ci-dessus, en présence de chlorure de 2,4,6triisopropylbenzènefulsonyle (TPS) comme agent de condensation et en conditions anhydres, puis on élimine les groupements protecteurs. Un procédé détaillé de fabrication des composés de formule (I) est représenté dans le schéma réactionnel (I) ci-après. Lesgroupeshydroxy en positiors2' et 3' et le groupe amino 1$ en position 6 de l'adénosine-5'-monophosphate (III a, ara-AMP) sont protégés par acétylation et le N, 2', 3'-triacétyl-ara- AMP (IVa) est condensé avec le corticostéroide (V) en a a présence de chlorure de 2,4,6-triisopropylbenzènesulfonyle (TPS) et ensuite les groupements protecteurs sont éliminés par le solvant ammoniac-méthanol pour obtenir lesconjugués (Ia) et (Ib). On trouve également selon l'invention que le meilleur rendement de production du composé recherché est obtenu en utilisant des proportions de deux moles de corticostéro5de et deux moles de TPS pour une mole de nucleotide. Les composés de la présente invention et leurs sels peuvent être utilisés en mélange avec des supports organiques et inorganiques classiques acceptables en pharmacie. Le composé de la présente invention peut être sous une forme acceptable classique telle qu'émul- sion, suspension, ampoules,poudre, granules, capsules, comprimés et autres.Ellepeut également contenir une charge, un conservateur, un stabilisant, un dispersant, un fumigant, un tampon et un colorant. 7 4 4 12 Schéma de réaction (I) NH2 N HO-P-O0 O HO Hb (Iiia) \ Anhydride acétique Pyridine C.._ mè. C-i. OH 1 * NYN HO Cxo A-cO OH,0 Pyridine (IVa) Ac = CH3CO- ' Y = H, OH K =liaison'simple ou--'Y NH2 double. - y q ol N ctH2-o-,-o -., r.O HO OH H HO" H00 Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. Exemple 1 '-(prednisone-21-phosphoryl)-9-(5-D-arabinofurannosyl) adénine (Ia, araAMP-prednisone). On dissout 347 mg (1 millimole) de 9-(P-D-arabinofuran- nosyl)adénine 5'-monophosphate (IIIa, ara-AMP) dans la pyridine et on sèche par coévaporation. On ajoute au résidu 5 ml d'anhydride acétique et 10 ml de pyridine que l'on agite et l'on fait réagir à la température ambiante pendant une nuit. On ajoute goutte à goutte ml d'eau au mélange de réaction refroidi au préalable à -10 C et on agite pendant I h à la température ambiante. Ensuite, on éLimine le solvant par-évaporation sous vide et on élimine une faible quantité d'eau restant dans le résidu de distillation (sirop) par coévaporation avec la pyridine. Au N6,2'-O,3'-Otriacétyladénosine '-monophosphate (IVa) séché, on ajoute 717 mg (2 millimoles) de prednisone et 606 mg (2 millimoles) de chlorure de triisopropyl- benzènesulfonyle (TPS) et on dissout ensuite tout le mélange dans mg de pyridine anhydre et on agite pendant 24 h à la température ambiante. Au mélange de réaction ainsi produit, on ajoute 5 ml d'eau tout en maintenant la température entre O et 5 C, puis on agite pendant 24 h à la température ambiante, on élimine le solvant par concentration sous vide et on désacétyle le résidu ainsi obtenu par addition de 30 ml de NH3 2N- CH30H et on agite pendant une nuit à la température ambiante. On filtre un précipité blanc et on concentre le filtrat sous vide et on dissout le résidu dans 50 ml d'éthanol 50 %, et ensuite on sépare avec un gradient linéaire d'acide acétique 0-2,0N dans l'éthanol à 50 % et on soumet ensuite à la chromatographie sur couche mince (CCM, Silicagel GF 254, éluant: isopropanol-NH40H concentrée -H20, 7:1:2) et ensuite on recueille et on concentre la portion de Rf 0,75. On dissout le résidu concentré dans l'acétone et on recristaLlise, on filtre pour obtenir 275 mg (40 %) du produit recherché sous forme d'une poudre cristalline blanche. 7 4 412 Pour L'analyse élémentaire, on adsorbe (100 mg) sur une colonne de cellulose et on sépare en utilisant l'éluant ci- dessus pour obtenir un échantillon sous forme de sel d'ammonium. 1) Point de fusion: 205-215 C (décomposition) 2) UVmax, ne (Ex 103): H20: 253 (22,8) HCL 0,1N: 252 (21,9) NaOH 0,1N: 254 (20,9) 3) IR Kr8 cm:-1 3300 - 3200 large, 2940, 1720, max -' ^1690, 1650, 1600, 1400, 1230, 1080, 1040. 4) RMN (90MHz): ppm 0,49 (3H, S), 1,34 (3H, S) 1,00-3,00 (13H, m), 3,98 (1H, d), 4,12 (2H, d), 4,30-5,10 (7H, m), ,99 (1H, d), 6,08 (1H, d), 6,28 *(2H, d), 7,58 (1H, d), 7,74 (2H, large, m), 8,19 (1H, S), 8,25 (1H, S). ) Analyse élémentaire pour C31H37N5011PNH4,2,5H20 Eléments C (%) H (%) N (%) P (%) Calculé 49,66 6,19 11,21 4,13 Trouvé 49,57 6,28 10,81 3,92 Exemple 2 '-(Cortisol-21-phosphoryt)-9-(e-D-arabinofurannosyL) adénine (Ibt ara-AMPcortisol) On acétyle 347 mg (1 millimole) diara-AMP (IIIa) par La technique indiquée précédemment en utilisant l'anhydride acétique et la pyridine anhydre. On ajoute le N,2r-0,3'-0-triacétyl- ara-AMP (IVa) ainsi obtenu à 725 mg (2 millimoles) de TPS. On dissout à nouveau ce mélange dans 50 ml de pyridine anhydre et on agite pendant 24 h à la température ambiante. Apres la réaction, on suit le même mode opératoire que décrit ci-dessus en utilisant une colonne d'acétate de cellullose DE-52 pour obtenir 200 mg (20 %) d'une poudre cristalline blanche. 1) Point de fusion: 200-205 C (décomposition) -3 2) UVmax nm (úx 10): Eau 252(22,5): HCI 0,1N 252 (21,9): NaOH 0,1N 254 (20,9) 3) Analyse élémentaire pour C31H41011N50P,NH4,3H20 Eléments C (%) H (%) N (%) P (%) Calculé 48,81 6,73 11,01 4,06 Trouvé 48, 47 6,83 11,18 4,12 Exemple 3 Propriétés anticancéreuses et antivirales Activité bioloqique in vitro (A) L'activité anticancéreuse (anti-prolifération) de l'ara-A et ses conjugués(Ia) et (Ib) est déterminée par la mesure de leurs effets contre les cellules de leucémie L-1210 de la souris en culture. L'essai est effectué dans un tube à essaissans agitation - selon la technique décrite par la demanderesse dans Journal of Medicinal Chemistry 16, p 139 (1973. Après 24 h, 48 h et 72 h, respectivement, on effectue des comptages de cellules viables sur les cultures qui ont été incubées avec des composés à diverses concentrations et on détermine la concentration de chaque composé nécessaire pour produire une inhibition à 50 % de la croissance (DE50) après 72 h par interpolation en utilisant la méthode décrite dans la littérature (Cancer Biochem. BioPhYs. 2, p 87 1977). Le tableau I représente les résultats des essais. La DE50 de l'ara- AMP-prednisone (Ia) est de 30 pM au lieu de 4,1 et 4,3 pM pour l'ara-AMPprednisone (Ia) et l'ara-AMP-cortisol (Ib), respectivement, ce qui indique une efficacité huit fois plus grande. (B) Activité antivirale L'activité antiviral de l'ara-A et de ses conjugués (Ia) et (Ib) est déterminée selon la technique décrite dans la littérature (Infection and Immunity 10, p 655 (1977))au moyen d'une souche de virus d'Herpes simplex KOS sur une couche monocellulaire de reins de singes africains (singes verts). On effectue l'examen de la plaque et la mesure. Comme-indiqué dans le tableau I, la formation de la plaque est inhibée à 65 % à une concentration en ara-A de 30 SM, tandis que l'ara-AMP-cortisol (Ib) et l'ara-AMP- prednisone (Ia) ont des valeurs d'inhibition de 86 % et 72 %, respectivement,à une concentration de 7 iM. Autrement dit, ces conjugués ont un effet encore meilleur'à 1/5 de la concentration de l'ara-A. L'avantage de la présente invention est montré plus nettement ici par le fait que le conjugué ara-A-corticostéroide a une activité antiviraleaméliorée et un caractère lipophile amélioré de l'ara-A, évitant l'hydrolyse par l'adénosine désaminase et,lorsque le conjugué est hydrolysé, on peut s'attendre à l'effet pharmaceutique supplémentaire du corticostéroide. Il se confirme que ce conjugué est un médicament plus nouveau que le précurseur d'ara-A. Tableau I Activité biologique in vitro Acitivité antivirale Activité anti- cancéreuse Concentra- % d'inhibi- Concentration tion du tion de (MM) pour une médicament la forma- perte de viabi- (PM) tion de la lité de 50 % à plaque 72 h. ara-A 30 65 30 ara-AMPprednisone (Ia) 7 72 4,1 ara-AMP-cortisol (Ib) 7 84 4,3 a utilisant une souche de virus d'herpès simplex KOS sur une couche monocellulaire de cellules de rein de singe africain. b Utilisant la leucémie lymphoide L1210 en culture. Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustration et que l'homme de l'art pourra y apporter des modifications sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé de fabrication d'un nucLéoside de formule (I) tIl B CH2 -O- P-O-- O- H CO -t.-' Y HO C (I) R dans laquelle, B représente l'adénine, La cytosine, le 5-fluorouracile, la 5- azacytosine, la 6-mercaptopurine ou la 7-désazaadénine; A et C représentent chacun indépendamment l'hydrogène ou un groupe hydroxy; K représente une liaison simple ou une liaison double; X représente l'oxygène ou un groupe hydroxy; Y représente l'hydrogène ou un groupe hydroxy; Z représente l'hydrogène ou Le fluor; R représente l'hydrogène, le fluor ou un groupe méthyle; R' représente l'hydrogène ou un groupe méthyle, ou bien Y et R' représentent -O CH3 - 0 C H3, et ses sels et dérivés, caractérisé en ce que l'on protège convenablement le nucléoside 5'-monophosphate dé formule (III) 0 B HO 'P " 0 i {III) HO HO C dans laquelle A, B, C sont comme définis ci-dessuspour obtenir le composé de formule (IV) 0 B HO P 0 (IV) UY -, OH AcO C' dans laquelle B' représente-en forme protégée de B, A' et C' repré- sentent l'hydrogène ou un groupe hydroxy protégé et Ac représente Le groupe CH3CO, que L'on fait-ensuite réagir avec un corticostéroÂde de formule (V) CH20H I CO y o R (V) dans laquelle K, X, Y, Z, R et R' sont comme définis cidessusen présence de chlorure de 2,4,6-triisopropylbenzènesuLfonyle (TPS) comme agent de condensation et en conditions anhydres, puis on éLimine les groupements protecteurs. -2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le groupement protecteur pour le nucléoside monophosphate est le groupe acétyle. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on fait réagir 2 moles du corticostéroÂde et 2 moles de TPS avec I mole du nucléotide. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on prépare la 5'-(prednisone-21-phosphoryl)-9-(1-D-arabinofuran- nosyl) adénine. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on prépare la 5'-(cortisone-21-phosphoryl)-9-(3-D-arabino- furannosyl) adénine. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le corticostéroide est choisi parmi le cortisol, la cortisone, la corticostérone, la cortexolone, la 11-désoxycorticostérone, la fludrocortisone, la prednisolone, la prednisone, la 6a-méthyl- prednisolone, la dexaméthasone et le flucosinolone-acétonide et le nucléoside est choisi parmi la 9-i-D-arabinofurannosyladénine, la 1-0-Darabinofurannosylcytosine, la 5-fluoro-2'-désoxyuridine et d'autres nucléosides anticancéreux et antiviraux. 7. Nouveaux médicaments utiles notamment comme antican- céreux, caractérisés en ce qu'ils contiennent comme ingrédient actif un composé de formule (I) selon la revendication 1 ou un de ses sels et dérivés.