FR 2581394 A1 19861107 FR 8506708 A 19850502 Particules avant les propriétés immunogènes de l'anti- gène HBs et Portant un site antiqénique étranger aux épitopes portés Par l'antigène HBs. vecteurs et cellules animales pour la production de telles particules et com- positions contenant de telles particules pour la pro- duction de vaccins mixtes L'invention concerne des particules polypep- tidiques le plus souvent sensiblement sphériques, au moins en ce qui concerne la plupart d'entre elles, ces particules ayant les propriétés immunogéniques et immu- nologiques caractéristiques de l'antigène de surface (souvent désigné par l'abréviation HBsAg ou encore plus simplement HBs) du virus de l'hépatite virale B et por- tant en outre au moins une séquence peptidique étrangère au polypeptide normalement codé par le gène S du virus de l'hépatite B. L'invention concerne également des ADNs recombinants et des lignées cellulaires eucaryotes, de préférence d'origine animale, capables d'excréter dans leur milieu de culture des particules polypeptidiques du genre sus-indiqué. On rappellera tout d'abord que le sérum des porteurs chroniques du virus de l'hépatite B (HBV) con- tient des enveloppes virales vides sous formes de par- ticules ou filaments de 22 nm de diamètre et parfois des virions complets infectieux, particules sphériques de 42 nm. Les enveloppes vides, une fois purifiées à partir de sérum de porteurs chroniques du virus, sont utilisées pour la fabrication de vaccins contre l'hépa- tite B. On sait qu'il est maintenant également possible d'obtenir des particules de 22 nm en grande quantité, par d'autres procédés. Les manipulations génétiques du gène codant pour la protéine majeure des particules (Gène S) ont permis leur production dans des lignées cellulaires en culture (M.F. DUBOIS et al., (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4549-4553), dans des levures (P. VALENZUELA et al., (1982), Nature, 298, 347-350) ou par l'intermédiaire de virus recombinants (G.L. SMITH et al. (1983), Nature, 302. 490-495). Une méthodologie pour produire ces particules comprend la transformation de cellules eucaryotes par un vecteur approprié, contenant le gène S sous la dépendance d'un promoteur efficace, la culture des cellules transfor- mées et la récupération des particules produites, soit à partir des cellules préalablement lysées, soit à partir du milieu de culture, lorsque les particules y ont été excrétées par les lignées cellulaires utilisées (notam- ment dans le cas de l'utilisation de cellules de singe, par exemple du type VERO). Le polypeptide majeur codé par le gêne S, en- trant dans la constitution de ces particules, est cons- titué de 226 acides aminés et possède un poids molécu- laire de 25.400 daltons. Il a été montré également que dans le polypeptide constitutif, certaines particules naturelles pouvaient également être constituées d'un polypeptide de poids moléculaire plus élevé, de l'ordre de 34.000 daltons, contenant la séquence polypeptidique du susdit polypeptide majeur, ayant la même extrémité C-terminale que le polypeptide majeur et en outre une séquence supplémentaire de 55 acides aminés en position N-terminale (STIBBE X. et GERLICH W.H., (1983), J. Viro- logy, 46, 626-628). codée par la région pré-S du génome de l'hépatite B. Cette séquence supplémentaire-en posi- tion N-terminale n'est apparemment pas très stable dans les particules naturelles, et ne semble donc pas jouer un rôle important dans la constitution et la cohésion des particules d'HBs. Celles-ci, on le sait, sont cons- tituées en aggrégats organisés, peu sensibles aux proté- ases, et impliquant une centaine desdits polypeptides majeurs et d'autres constituants, plus particulièrement lipidiques. Un procédé permettant l'obtention de compo- sitions contenant une proportion notable, pouvant at- teindre 35 % du total des polypeptides formés, de par- ticules plus stables contenant ladite séquence supplé- mentaire a récemment été décrit (MICHEL, M.L. et al., (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 7708-7712). Il met en oeuvre des lignées cellulaires eucaryotes, plus particulièrement de cellules humaines ou animales en culture, transformées au préalable par des vecteurs, contenant une séquence d'ADN codant pour les régions S et pré-S du génome du virus de l'hépatite virale B, placée à l'intérieur de ce vecteur, sous le contrôle direct d'un promoteur exogène dont est connue la capa- cité de permettre l'initiation efficace de la trans- cription des gènes directement sous son contrôle dans les cellules eucaryotes, notamment humaines ou animales, auxquelles lesdits vecteurs sont destinés. On se repor- tera par exemple à l'article de GALIBERT et Col., (1979), Nature, vol. 281, p. 646-650, pour ce qui est de ladite séquence d'ADN. Lorque les lignées cellulaires utilisées sont originaires du singe, il est avantageux d'avoir recours à un promoteur issu du virus SV40, dont est connue la capacité de permettre l'initiation efficace de la trans- cription de gènes adjacents dans des cellules de singe. Avantageusement, ce promoteur correspond au promoteur "précoce" du virus SV40, lequel contrôle normalement l'expression de l'antigène "petit T" ("small T antigen") et également de l'antigène "grand T" ("large T anti- gen"). La variabilité naturelle de l'extrémité N-ter- minale des polypeptides de l'enveloppe du virus de l'hé- patite B a déjà donné à penser que des fragments de pro- téines distincts de la susdite séquence supplémentaire pouvaient lui être substitués et fusionnés avec le sus- dit polypeptide majeur. C'est ce qu'ont réalisé VALEN- ZUELA et al., qui ont obtenu dans des levures transfor- mées des particules formées à patir de protéines hybri- des consistant essentiellement en le susdit polypeptide majeur modifié à son extrémité N-terminale par un poly- peptide supplémentaire comportant une centaine d'acides aminés issus de la glycoprotéine D du virus de l'Herpès. P. VALENZUELA et al. rapportent que ces particules transformées étaient capables d'induire des anticorps contre à la fois le virus de l'hépatite B et le virus de l'Herpès (P. VALENZUELA et al (1982), Nature, 298. 347-350 et P. VALENZUELA (1984) "In Proceedings of the Twelwth International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology" (Travaux de la douzième Conférence Internationale sur la Génétique des levures et de la biologie moléculaire), Edimbourg, (1984), 16). La présente invention a pour but de fournir des particules polypeptidiques, ayant les propriétés immunogènes de base de l'antigène HBs et contenant en outre au moins une autre séquence peptidique, de pré- férence également immunogène, en d'autres termes des particules polypeptidiques susceptibles d'être utilisées pour la constitution de vaccins mixtes, ayant une stabi- lité optimum, l'autre séquence peptidique devant être présente chaque fois que le polypeptide majeur, lui-même ou de préférence la glycoprotéine majeure elle-même de l'antigène HBs, se trouve être synthétisé, et ce sans que soit sensiblement affectée l'architecture particu- laire caractéristique des antigènes d'enveloppe du virus de l'hépatite B. Elle a encore pour but l'obtention de particu- les de ce type qui peuvent, le cas échéant, contenir en outre la séquence supplémentaire normalement codée par la région pré-S du génome du virus de l'hépatite B, à l'état intact, étant cependant entendu que celle-ci pourrait aussi être modifiée, par exemple selon les modalités envisagées par VALENZUELA et al. Mais la préservation du caractère intact de ladite séquence supplémentaire réside dans l'immunogénicité accrue qui peut en résulter pour les polypeptides modifiés con- formes à l'invention. Les particules selon l'invention qui con- tiennent une proportion suffisante des séquences d'ami- noacides caractéristiques du polypeptide majeur de l'an- tigène HBs, pour conserver à ces particules la structure caractéristique de l'antigène HBs, sont caractérisées par l'incorporation à ce polypeptide majeur d'au moins une séquence d'aminoacides étrangère à ce polypeptide majeur, de préférence elles-mêmes porteuses d'un site immunogène, à l'intérieur même de ce polypeptide majeur, notamment en l'une de ses régions hydrophiles normale- ment exposées à la surface extérieure desdites parti- cules ou, en variante, par la substitution de un ou plusieurs aminocides appartenant à ces régions hydro- philes par ladite séquence étrangère d'aminoacides. En particulier la séquence étrangère d'ami- noacides est insérable dans l'une des régions s'étendant entre les acides aminés 32 à 74 ou entre les acides aminés 110 à 156 du polypeptide majeur dont des formules générales ont été présentées dans l'article de P. TIOLLAIS et al. (1981) SCIENCE, vol. 213, pp. 406-411, formules qui sont rappelées ci-après: A I Met Glu Asn le Thr Ser Gly Phe Leu Cly Pro Leu Leu Vil Leu Gin Al Cly Ph. Ph* 21 Leu Leu Thr ArgI lie Leu Thr li. Pro Gin Se; reu ÀsAp Set Trp Trp Thr Set Leu Asa Ser Pro Thr 41 Phe Leu C1y Cly Thr Thr Val Cys Leu GIy Gin Asn Ser Gin Ser Pro Thr Set rln HIs Thr Thr le - _I.... le À, 61 Pro Thr Serr tys Pro Pro Thr tys Pro GCly Tyr Arg Trp het Cys Leu Arg Arg Ph. Thr -. 81 lie lie Phe Leu Phe lie Leu Leu Leu Cys Leu lie Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Thr. Pro 101 Gin GCly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu'I le Pro Ciy Ser Set Thr Thr Ser Thr Cly' Pro -- -..Set Sur Lys Thr Pro Asn Phe 121 tys Arg Thr tys Met Thr Thr Ala Gin Ily Thr Ser met- Tyr Pro Ser Cys Cys Ctsy Thr - Arq Thr Pro I le. Tyr Thr Ah 141 Lys Pro Ser Asp GClysn Cy$ ThtrCys lie Pro lie Pro Ser Set Trp AI Phe GCi Lys À - Ser - Gly tyr Val 6I&l Phe Leu lrp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Phe Alai Thr Ala !11 Gin Trp Phe Val GiCl Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val lie Irp met met Trp Tyr li e Val Val' Il 201 Trp Cly Pro Ser Leu lyr Ser lie Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro lie Phe Phe Leu Leu Vol 221 Cys Leau trp Val lyr lle Ala Il est rappelé que la formule du peptide ma- jeur est sujet à variations. En particulier les diffé- rences au niveau des acides aminés constitutifs observés par VALENZUELA et al. (1980) "Animal Virus Genetics" (Génétique des virus d'animaux), B. FIELDS, R. JAENISCH, C.F. FOX, Ed: Academic Press, New York, p. 57, apparais- sent au-dessus des lignes principales de ladite formule, celles observées au-dessous desdites lignes principales. L'invention concerne donc en plus particuliè- rement des compositions utiles pour la fabrication de vaccins qui contiennent des particules polypeptidiques sensiblement sphériques (ou qui est formée par ces par- ticules), au moins en ce qui concerne la plupart d'entre elles (sinon toutes), qui ont les propriétés immunogé- niques et immunologiques caractéristiques de l'antigène HBsAg, qui ont des tailles de 18 à 25 nm, notamment de à 22 nm, et des densités permettant leur isolement dans une zone de densité de 1,20-1,22 g/ml dans un gradient de densité à base de CsC1, et un niveau de pureté totale pour ce qui est de l'absence de toute particule de Dane et d'antigène HBe, y inclus HBc, ces particules étant plus particulièrement caractérisées par la présence desdites séquences étrangères dans les con- ditions sus-indiquées. La taille des séquences étrangères suscepti- bles d'être insérées à l'intérieur du polypeptide ma- jeur, tel qu'il vient d'être défini, peut être modifiée dans de grandes proportions. Il est possible d'intro- duire des séquences d'aminoacides pouvant comporter par exemple jusqu'à 100 aminoacides, voire davantage. Il est cependant avantageux que la séquence peptidique étran- gère ait une taille ne dépassant pas 16 aminoacides, notamment de 5 à 16, par exemple de 6 à 13, surtout dans le cas o elle est insérée dans le polypeptide majeur, sans suppression d'un nombre sensiblement équivalent des aminoacides que celui-ci pouvait comprendre auparavant. En effet, l'invention permet le résultat remarquable que constitue la possibilité de produire dans ceux des sys- tèmes cellulaires qui le permettent, l'excrétion des particules modifiées conformes à l'invention par les cellules concernées, lorsque celles-ci ont été trans- formées au préalable par un vecteur approprié contenant une séquence d'ADN codant pour le polypeptide modifié conforme à l'invention. L'invention concerne naturellement également les ADNs recombinants codant pour lesdits polypeptides modifiés entrant dans la composition des particules sus-indiquées. A cet égard, ces ADNs recombinants, et de préférence des vecteurs les contenant, qui contiennent une séquence d'ADN codant pour la région S et, le cas échéant, pré-S du génome du virus de l'hépatite virale B, sont caractérisés en ce que ladite séquence d'ADN est localement modifiée par au moins une séquence nucléoti- dique codant pour la susdite séquence étrangère, en une au moins de celles des zones de la région S correspon- dant aux régions hydrophiles du polypeptide majeur sus- dit, et en ce que la région S et, le cas échéant, la région pré-S, sont à l'intérieur de l'ADN recombinant, placé sous le contrôle direct d'un promoteur exogène dont est connue la capacité de permettre l'initiation efficace de la transcription des gènes directement sous son contrôle dans les cellules eucaryotes, notamment humaines ou animales, ou encore aux levures auxquelles lesdits vecteurs sont destinés. Le promoteur exogène mis en oeuvre est dis- tinct ou étranger vis-à-vis du promoteur tendogène", normalement associé aux gènes S et pré-S dans le génome du virus de l'hépatite B. Lorsque ces cellules sont ori- ginaires du singe, il est avantageux d'avoir recours à l'un des promoteurs issus du virus SV40, qui ont été rappelés plus haut. L'invention ne se limite cependant pas à l'utilisation de ce promoteur particulier, bien que ce- lui-ci donne des résultats particulièrement favorables, eu égard à la production par les cellules transformées de polypeptides hybrides conformes à l'invention, ca- ractéristiques de l'antigène HBs et d'un récepteur de la pHSA, et à leur excrétion dans le milieu de culture utilisé. On peut également avoir recours par exemple au promoteur tardif de SV40 (qui contrôle l'expression des protéines VP1, VP2 et VP3). On peut se reporter à la carte de restriction du virus SV40 (J. TOOZE, Ed. DNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1980, chaps. 2-5), pour apprécier les positions relatives de ces promoteurs et des gènes codant pour les différents antigènes qui leur sont associés. Il va de soi que l'on peut substituer aux promoteurs de SV40 tout autre type de promoteur connu comme possédant ou dont pourrait être découverte la capacité de promouvoir la transcription dans les lignées cellulaires mises en oeuvre desdites séquences codant pour les susdites régions S et, le cas échéant, pré-S, dès lors qu'elles seraient placées sous leur contrôle, avec pour résultat l'incorporation de ces séquences avec ce promoteur dans le génome des cellules réceptrices et/ou la capacité conférée aux cellules réceptrices ainsi transformées de synthétiser et d'excréter des quantités substantielles du polypeptide hybride selon l'invention, la capacité ainsi acquise étant ensuite transmissible aux générations successives issues de ces cellules. Lesdites lignées transformées seront dites "stables" lorsque le caractère acquis par les lignées cellulaires selon l'invention de synthétiser les susdits polypeptides se transmet d'une génération de cellules à l'autre, sur au moins 10 générations. A titre d'autres promoteurs susceptibles d'être utilisés, on mentionnera par exemple le promoteur précoce du polyome ou des promoteurs LTR de différents rétrovirus ou encore le promoteur EA de l'adénovirus, ainsi que de promoteurs efficaces de gènes d'origine cellulaire. Comme il est bien connu, les promoteurs préle- vés sur les génomes des virus dont ils sont originaires sont de préférence accompagnés des "séquences" activa- trices qui normalement les précèdent (par rapport au sens de la transcription des séquences géniques normale- ment placées sous leur contrôle). A titre d'exemple de séquences activatrices, on peut se référer à l'article de Science, 1983, vol. 219, pages 626 à 631, et Nature, 1982, vol. 295, pages 568 à 572. Avantageusement, la susdite séquence d'ADN codant pour les susdites régions pré-S et S est placée, immédiatement derrière un fragment d'ADN constitué par le promoteur et la séquence activatrice permettant la transcription normale de la séquence pré-S ou S. Le susdit fragment comprend notamment de 300 à 400 paires de bases selon le type de promoteur et de séquences activatrices utilisées. L'invention concerne encore les lignées cel- lulaires transformées par des vecteurs tels qu'ils ont été définis cidessus et qui sont aptes à excréter dans leur milieu de culture les particules immunogènes éga- lement définies ci-dessus. Des lignées préférées selon l'invention sont formées de cellules de mammifères, notamment de cellules CHO ou VERO. L'invention concerne encore un procédé de pro- duction de telles lignées cellulaires susceptibles d'être maintenues en cultures ce procédé comportant la transformation de ces lignées avec un vecteur tel que défini ci-dessus et l'isolement de celles des cultures qui expriment les séquences codant pour la protéine hybride de l'invention. Des caractéristiques supplémentaires de l'in- vention apparaîtront encore au cours de la description qui suit d'exemples de constructions qui illustrent le principe de base de l'invention. Il sera dans ce qui suit, fait référence au dessin dans lequel est schéma- tisée la structure du plasmide pLAS,utilisé dans les constructions selon l'invention. - Construction des plasmides transfectés: Le Plasmide PLAS - Ce plasmide comprend (fi- gure 1): - la partie codante du gène S (P. Charnay et al. 1979) avec son site naturel de polyadénylation (fragment StuI (43) BglII (1984)) dont le site BamHI (1400) est supprimé par réparation par l'enzyme de Klenow; - ce gène sans promoteur est mis sous la dépendance du promoteur précoce du virus SV40 (fragment du virus SV40 compris entre le site PvuII (250) - et le site HindIII (5154); - le grand fragment BamHl (375)-SalI (650) du pML2 (Lusky, M. and Botchan, M. 1981). Le fragment du gène S a été ligné, au niveau de son extrémité BglII à l'extrémité BamHI du plasmide pML2 (les extrémités BglII et BamHI étant mutuellement compatibles). Le fragment de gène S a par contre été modifié au niveau de son extrémité StuI par une séquence de liaison nucléotidique (linker) obtenue par synthèse chimique et contenant un site Hind III, pour réaliser une ligation avec l'extrémité Hind III, du fragment de virus SV40 contenant le promoteur susdit. Enfin, l'ex- trémité SalI du fragment issu du plasmide pML2 avait été réparée avant sa ligation avec l'extrémité PvuII (extré- mité franche) du fragment de virus SV40. Les plasmides pLASi, PLASii. Ces deux plasmides sont dérivés du plasmide pLAS décrit ci-dessus par introduction au site unique BamHI (488) d'un ou deux fragments BamH1, d'ADN de 24 paires de bases dérivés du pSKS104 (Shapiro et al. 1983). Ce fragment de 24 nucléotides codant pour 8 aci- des aminés dont l'insertion dans le gène S ne modifie pas la phase de lecture, porte un site de coupure pour les enzymes de restriction PstI, et deux sites pour les enzymes Hind II (Sall, AccI). EXEMPLE I. Obtention des liqnées cellulaires de souris Produisant la protéine HBs après transfection puis sélection des clones producteurs. Des cellules LMTK (clone 1D; cellules de souris dérivées du clone L929 déficientes en thymidine kinase, poussant dans le milieu Eagle modifié par Dulbecco, supplémenté par 10 % de sérum de veau) ont été cotransfectées (techniques de Graham et Van der Eb, 1973) par de l'ADN d'un des trois vecteurs (pLAS, pLASI, pLASII) et par l'ADN du plasmide pW portant le gène de l'aminoglycoside-3'-phosphotransférase APH3' (Colbère- Garapin et al. 1981). Les cellules transfectées expri- mant l'enzyme APH3' sont sélectionnées en présence de 400 microgrammes/millilitre d'aminoglycoside G418 (Colbère-Garapin et al. 1981). Les clones issus de cette sélection sont alors testés pour la production de la protéine HBs. 5.105 cellules LTK ont été cotransfectées par 10 microgrammes d'ADN du premier plasmide et par 2 microgrammes d'ADN du plasmide pW. Quatre jours après la transfection, le milieu sélectif était appliqué. Les clones viables apparaissant sont isolés, mis en culture et testés quant à leur capacité de pro- duction de l'antigène HBs dans le milieu. La présence d'HBsAg est détectée à l'aide des tests radioimmunologiques Aus-RIAII (Abbott Laborato- ries). Parmi les clones cellulaires donnant une réponse positive, trois clones (LAS, LASI, LASII) correspondant aux plasmides pLAS, pLASI, pLASII sont sélectionnés pour être caractérisés. Caractérisation des particules détectées dans le milieu des clones cellulaires. Les clones amenés à confluence, le milieu nu- tritif des cellules est changé et mis à accumuler pen- dant 48 heures. Le surnageant est ensuite clarifié à 2000 rpm et centrifugé pour sédimenter les particules (Smith et al. 1983). Le culot est repris dans du tampon, déposé sur un gradient de CsCl, centrifugé, collecté et les fractions sont testées en R.I.A. (Moriarty et al. 1981). L'activité HBsAg des protéines modifiées et non modifiées se retrouve concentrée en un seul pic (Figure 2) compris entre les densités 1,18 et 1,24 g/cm3, densi- té similaire aux particules purifiées du sérum (Pillot et al. 1984). Un aliquote est alors déposé sur un gra- dient de sucrose (Moriarty et al. 1981). Après collecte des fractions, l'activité HBsAg sédimente en un seul pic de coefficient de sédimentation apparemment identique entre les trois types de polypeptides. Caractérisation des séquences du gène S intégrées dans le génome des clones cellulaires LAS. LASI, LASII. L'ADN cellulaire des clones LAS, LASI, LASII est préparé par la méthode de Gross-Bellard et al. (1973) et digéré par les enzymes de restriction HindIII et PstI. Après électrophorèse sur gel d'agarose, les ADN sont transférés sur une feuille de nitrocellulose (Southern 1975) qui est hybridée avec une sonde radio- active fabriquée à partir d'un fragment d'ADN contenant le gène S selon la méthode de translation de coupure (Rigby et al. 1977). Après autoradiographie des répliques sur ni- trocellulose, on met en évidence qu'un ou plusieurs gè- nes ont été intégrés dans les trois clones. De plus, un site PstI existe uniquement au niveau du gène S modifié des clones cellulaires LASI et LASII. Ce site PstI n'existe pas dans la séquence naturelle du gène S utili- sé (P. Charnay et al. 1979) mais bien dans les fragments d'ADN étrangers insérés dans les plasmides pLASI et pLASII utilisés (figure 3). Immunoprécipitation par un sérum anti-HBsAq des protéi- nes excrétées par les clones LAS, LASI et LASII. Les clones cellulaires à confluence sont mar- qués avec de la méthionine [ 35S] pendant 48 heures et les surnageants immunoprécipités par des anticorps de lapin anti-HBsAg (Behring) puis par de la protéine A Sépharose (Pharmacia) en présence de NP40 0,5 %. Après lavage, les immunoprécipités sont déposés sur un gel de polyacrylamide 15 % d'après la technique décrite par Laemmli (1970) en présence de marqueurs de poids molé- culaires (Pharmacia). Les gels traités et séchés sont alors exposés en autoradiographie (figure 4). Deux bandes majeures apparaissent pour chaque surnageant. Leur poids moléculaire est respectivement de 23000 et 27000 pour le clone LAS, 24750 et 28500 pour le clone LASI, 26000 et 29000 pour le clone LASII. Le plasmide pLAS se révèle efficace pour pro- mouvoir l'expression d'HBsAg dans les cellules L. De plus, le plasmide pLASI porte des sites de restriction supplémentaires dans la région codante du gène S, ce qui peut faciliter l'introduction de séquences nouvelles. Le fait de pouvoir détecter en R.I.A. des structures semblables aux particules d'HBsAg dans les surnageants cellulaires nous permet de dire que les structures induites par les plasmides pLASI et pLASII conservent, au moins, une antigénicité partiellement similaire à celle des particules de sérum humain. L'in- sertion des 8 ou 16 acides aminés utilisés n'empêche pas l'excrétion des protéines d'HBsAg modifiées du cyto- plasme vers le milieu extérieur des cellules L. Le choix du site BamHl pour effectuer des insertions dans le gène S se révèle judicieux. En effet, il correspond au début de la région hydrophile majeure de la protéine (P. Tiollais et coll. 1981) et respecte le fait que les sé- quences hydrophobes doivent être au contact de la mem- brane lipidique des particules. Le domaine intermembra- naire d'HBsAg responsable de la structure des particules de 22 nm ne subit vraisemblablement que des transitions conformationnelles mineures. Les analyses sur gradient de chlorure de cé- sium et de sucrose des surnageants des clones cellulai- res ne permettent pas, dans les limites expérimentales employées, de mettre en évidence des différences entre les structures modifiées et non modifiées. - L'analyse des ADN cellulaires montre que les gènes S intégrés portent toujours les modifications ap- portées sur les plasmides utilisés. - Les protéines mises en évidence après immu- noprécipitation montrent des différences de poids molé- culaires attendues. Cependant, le poids moléculaire me- suré des protéines modifiées parait supérieur au poids moléculaire réel (le poids moléculaire d'un fragment de 8aa est en effet de 957). D'autre part, les modifica- * tions permettent toujours la glycosylation partielle de la protéine HBsAg. Les deux bandes apparaissant en gel de polyacrylamide sont caractéristiques d'un polypeptide glycosylé et non glycosylé. Le résidu le plus suscepti- ble d'être glycosylé, l'Asparagine 146 (Machida et coll. 1983) intervient dans la séquence participant au déter- minant antigénique majeur a (Pillot et coll. 1984). La conformation de cette partie de la protéine doit donc être relativement similaire dans les protéines modifiées ou natives. EXEMPLE II. Production de Particules Portant l'antigène de surface de l'hépatite B modifiées Par l'insertion de séquences de la toxine diphtériaue. L'ADN du plasmide pTD134 contenant le gène de la toxine diphtérique (M. Kaczorek et coll., 1983) est coupé par l'enzyme HaeIII, traité par la nucléase BAL31 puis ligué, en présence de T4 DNA ligase avec des adap- tateursBamHl. Après coupure avec l'enzyme BamHl, les fragments sont mis à liguer avec l'ADN du plasmide pSKS105 (Shapira et coll., 1983) coupé par la même en- zyme. Cet ADN est alors utilisé pour transformer une souche d'E. coli. Les colonies sont transférées et ly- sées sur des feuilles de nitrocellulose. Ces dernières sont mises à hybrider avec une sonde radioactive fabri- quée par translation de coupure à partir d'un fragment purifié sur gel d'acrylamide après digestion du plasmide pTD134 par l'endonucléase HaeIII (fragment HaeIII 597- HaeIII 746). Les plasmides des colonies hybridant avec cette sonde ont été partiellement séquences grâce à la méthode de Maxam et Gilbert (Maxam et coll., 1980). Un d'entre eux, contenant l'insertion d'un fragment BamHl- BamHl codant pour les acides aminés 201-231 du gène de la toxine diphtérique (Kaczorek et coll., 1983) a été sélectionné. Ce fragment a ensuite été réintroduit dans le site BamHl du plasmide pLAS (Delpeyroux et coll., projet de brevet, 1984, p. 2, figure 1). Le nouveau plasmide pTAS a été purifié et transfecté dans des cellules L de souris (projet 1984, p. 2-3). Après sélection des clones cellulaires résis- tant au G418, la présence d'HBsAg est testée dans les surnageants. Sur 20 clones examinés, aucun n'est posi- tif. Les cellules de 10 clones sont trypsinées, lavées 2 fois au P.B.S. et lysées par 3 cycles de con- gélation-décongélation dans 250 pl de Tris 10 mM pH 7,4, EDTA 1 mM. Le lysat est clarifié à 2000 rpm et testé. Tous les lysats des clones contenaient de l'HBsAg. Un clone a été lysé dans les mêmes conditions. Des aliquotes ont été déposés sur des gradients de chlo- rure de césium ou de sucrose (Projet 1984, p. 3-4) en parallèle avec des particules d'HBsAg purifiées à partir de sérum humain (I.P.P.) et un lysat de clone transfecté par le plasmide pLAS produisant des particules non modi- fiées. Aucune différence n'a pu être détectée entre les particules du sérum humain et les signaux d'HBsAg des lysats étudiés. Cela tendrait à prouver que, même non excrétées, les protéines modifiées sont, après lyse des cellules, dans une conformation relativement similaire à celles des particules "naturelles". EXEMPLE III. Production de Particules portant l'antiqène de surface de l'hépatite B modifiées Par l'insertion de séquences du virus polio. Les 2 brins d'un fragment d'ADN de 47 paires de bases codant pour 11 acides aminés de la protéine VPl du poliovirus type I, (acides aminés 93 à 103) et pour 2 sites reconnus par l'enzyme BamHl ont été synthétisés par voie chimique grâce à un synthétiseur automatique (Applied Biosystem). Les 2 brins ont été purifiés sépa- rément sur un gel dénaturant de polyacrylamide, puis hy- bridés. Le fragment a été coupé par l'endonucléase BamHl et inséré au site BamHl du plasmide pLAS. Le nouveau plasmide pPAP a été séquencé partiellement (Maxam et Gilbert, 1980), amplifié et introduit dans des cellules L. Les clones résistant au G418 ont été isolés, leur surnageant testé pour la présence d'HBsAg; 14 clones sur 20 ont été trouvés positifs. Un clone a été marqué à la méthionine [S 35] et son surnageant immunoprécipité, soit avec des anticorps anti HBsAg soit avec un surna- geant d'ascite contenant un anticorps monoclonal spéci- fique de la séquence du poliovirus insérée dans l'HBsAg (Van Der Werf et coll. 1983; Emini et coll. 1983). Les anticorps anti HBsAg immunoprécipitent bien une protéine hybride de poids moléculaire attendu, sous sa forme glycosylée et non glycosylée. L'anticorps monoclonal spécifique du polio- virus précipite une bande apparaissant seulement après une longue exposition du film, et qui correspondrait à la protéine HBsAg modifiée non glycosylée. Les séquences du poliovirus nie montrent donc qu'une faible affinité pour l'anticorps monoclonal mais doivent donc se trouver dans un site exposé. Cette hypothèse est confirmée par le fait que si l'on traite à la trypsine les immunopré- cipités avant dénaturation et migration-sur gel, des bandes apparaissent qui montrent que, au moins l'un des deux résidus lysine du déterminant poliovirus est acces- sible et coupé par l'enzyme. - L'insertion au niveau du site BamHl (aall2- 113) de l'HBsAg de 32 acides aminés codant pour une par- tie de la toxine diphtérique ne permet plus l'excrétion de la protéine lorsqu'elle est traduite dans des cellu- les L. C'est ce que montrent les expériences avec le plasmide pTAS. Cependant, le fait de retrouver la pro- téine modifiée sous forme de particules non excrétées permet de penser qu'il est possible de modifier l'HBsAg et de l'exprimer dans un système non excréteur (la levure par exemple). La persistance de structures parti- culaires confère une grande stabilité à la protéine, ce qui facilite sa purification. - Les expériences avec le gène modifié du plasmide pPAP montrent que les séquences étrangères in- sérées dans la protéine peuvent se trouver exposées à la surface des particules. Si la conformation initiale des séquences exogènes est modifiée, il est raisonnable de penser que l'insertion de structures plus grandes ou la délétion de certaines parties de la protéine HBsAg peu- vent résoudre ce problème. La recherche d'autres sites d'insertion est aussi possible. Une insertion de 8 aci- des aminés au niveau du résidu 50 de l'HBsAg (au site Bal I du gène S) permet la production de particules et leur excrétion. L'invention permet par conséquent la produc- tion de vaccins mixtes. Si l'on insère la séquence de déterminants antigéniques étrangers à ceux de l'HBsAg, il devient possible, si ces derniers son exposés en surface, de fabriquer des vaccins mixtes contre un autre sous-type du virus HBV, contre de déterminants du core du virus (HBcAg, HBeAg) (A.M. Prince et al. 1983, S. Iwarson et AL. 1984) contre les déterminants antigéniques de virus touchant les mêmes populations que l'hépatite B (SIDA, Herpès) et contre les déterminants antigéniques d'autres virus (T.M. Shinnick et al. 1983). Les huit acides ami- nés intervenant dans le déterminant antigénique majeur de la protéine VP1 du poliovirus type 3 (D.M.A. (Evans et al. 1983) peuvent être insérés dans la protéine HBsAg par l'intermédiaire d'un fragment d'ADN synthétisé par voie chimique. Ce type de manipulation peut aussi permettre l'expression de séquences biologiquement actives ayant un intérêt pharmaceutique. Les particules produites par les Hépadna virus animaux (P.L. Marion et al. 1983) peuvent être utilisées dans les mêmes conditions. A ce titre, l'invention concerne toute compo- sition de vaccin contre l'hépatite virale B contenant une dose efficace de particules conformes à l'invention, notamment de 3 à 6 microgrammes de protéine/ml, par exemple 5 microgrammes de protéine/ml (dose unitaire), en association avec un véhicule pharmaceutique approprié au mode d'administration choisi, notamment par voie pa- rentérale. Les pages qui suivent renvoient à la documen- tation antérieure à laquelle il a été fait référence dans ce qui précède. REFERENCES - Cattaneo, R., Will, H., Hernandez, N., Schaller, H. (1983) Nature, 305, 336-338. - Colbère-Garapin, F., Horodniceanu, F., Kourilsky, P., Garapin, A.C. (1981) J. Mol. Biol., 150, 1-14. - Dubois, M.F., Pourcel, C., Rousset, S., Chany, C. et Tiollais, P. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4549- 4553. - Evans, D.M.A., Minor, P.D., Schild, G.S., Almond, J.W. 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Particules contenant une proportion suffi- sante des séquences d'aminoacides caractéristiques du polypeptide majeur de l'antigène HBs, pour conserver a ces particules la structure caractéristique de l'anti- gène HBs, caractérisées par l'incorporation à ce poly- peptide majeur d'au moins une séquence d'aminoacides étrangère à ce polypeptide majeure, de préférence elles-mêmes porteuses d'un site immunogène, à l'inté- rieur même de ce polypeptide majeur, notamment en l'une de ses régions hydrophiles normalement exposées à la surface extérieure desdites particules ou, en variante, par la substitution d'un ou plusieurs aminoacides ap- partenant à ces régions hydrophiles par ladite séquence étrangère d'aminoacides. 2. Particules selon la revendication 1, carac- térisées en ce que la séquence étrangère d'aminoacides est insérée dans la région s'étendant entre les acides aminés 32 et 74 du polypeptide majeur. 3. Particules selon la revendication 1, carac- térisées en ce que la séquence étrangère d'aminoacides est insérée dans la région s'étendant entre les acides aminés 110 et 156 du polypeptide majeur. 4. Particules selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 3, caractérisées en ce que la séquence polypeptidique étrangère a une taille ne dépassant pas 16 aminoacides, notamment une taille de 5 à 16, ou même de 6 à 13, aminoacides. 5. Particules selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 4, caractérisées en ce qu'elles con- tiennent également ta séquence polypeptidique codée par la région pré-S du génome du virus de l'hépatite virale B. 6. ADN recombinant contenant une séquence d'ADN codant pour la région S et, le cas échéant, pré-S du génome du virus de l'hépatite virale B, caractérisé en ce que ladite séquence d'ADN est localement modifiée par au moins une séquence nucléotidique codant pour la susdite séquence étrangère, en une au moins de celles des zones de la région S correspondant aux régions hy- drophiles du polypeptide majeur susdit, et en ce que la région S et, le cas échéant, la région pré-S, sont à l'intérieur de l'ADN recombinant, placé sous le contrôle direct d'un promoteur exogène dont est connue la capaci- té de permettre l'initiation efficace de la transcrip- tion des gènes directement sous son contrôle dans les cellules eucaryotes, notamment humaines ou animales, ou encore aux levures auxquelles lesdits vecteurs sont des- tinés. 7. ADN recombinant selon la revendication 6, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique codant pour la susdite séquence étrangère est localisée dans la région du gène S qui code pour le polypeptide qui s'é- tend entre les acides aminés 32 et 74 du polypeptide ma- jeur entrant dans la constitution de l'antigène HBs. 8. ADN recombinant selon la revendication 6, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique codant pour la susdite séquence étrangère est localisée dans la région du gène S qui code pour le polypeptide qui s'é- tend entre les acides aminés 110 et 156 du polypeptide majeur entrant dans la constitution de l'antigène HBs. 9. ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que la susdite séquence nucléotidique étrangère code pour un polypep- tide ne dépassant pas 16 aminoacides et plus particu- lièrement de 6 à 13 aminoacides. 10. ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisé en ce que le susdit promoteur exogène est constitué par l'un des promoteurs du virus SV40. 11. Lignée cellulaire provenant d'un hôte, no- tamment humain ou animal, ou encore de levure capable de reconnaitre le promoteur exogène de l'ADN recombinant selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, carac- térisée en ce qu'elle comporte, incorporé dans le géno- me, un ADN recombinant conforme à l'une quelconque des revendications 6 à 10. 12. Lignée cellulaire selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est formée de cellule* reconnaissant le promoteur du virus SV40. 13. Procédé de production de particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par la transformation d'une lignée cellulaire, notamment humaine ou animale, par un ADN recombinant conforme à l'une quelconque des revendications 6 à 10, le promoteur de l'ADN recombinant étant choisi en conformité avec la nature de l'hôte cellulaire utilisé, en ce que l'on cul- tive le micro-organisme ainsi transformé et en ce que l'on recueille les particules produites. 14. Procédé selon la revendication 13, carac- térisé en ce que la séquence étrangère incorporée dans le polypeptide majeur comprend au plus 16 aminoacides et en ce que l'on récupère les particules produites excré- tées dans le milieu de culture du susdit hôte cellu- laire.