FR 2581647 A1 19861114 FR 8505805 A 19850417 L'invention concerne un procédé de purifica- tion poussée de l'insuline avec utilisation d'échangeurs d'ions à gangue hydrophobe. Un procédé appliqué techniquement sur une gran- de échelle pour l'obtention d'insuline en partant de ma- tière première animale et humaine est l'extraction du pancréas par des mélanges contenant du solvant. On peut débarrasser les extraits d'une grande partie des subs- tances inertes présentes par addition de sels et change- ments de pH ainsi que par refroidissement à des tempéra- tures basses. Apres la séparation avec ménagement des solvants utilisés pour l'extraction, on obtient des solutions aqueuses contenant de l'insuline, desquelles on peut séparer l'insuline sous forme impure, par exemple par relargage sous forme solide. Par précipitation frac- tionnée avec le chlorure de sodium ou le sulfate d'ammo- nium et/ou par précipitation de l'insuline au voisinage de son point isoélectrique, on obtient des précipités desquels on peut tirer l'insuline sous forme relative- ment pure par cristallisation. Si l'on analyse le pro- duit ainsi obtenu, par des méthodes sensibles telles que l'électophorèse sur disque ou la chromatographie liquide à haute pression, il apparaît qu'à côté d'un ou deux constituants principaux, il existe une série de consti- tuants secondaires. Ainsi, on a pu démontrer que des constituants qui sont des progéniteurs biochimiques de l'insuline sont toujours présents en quantité apprécia- ble dans l'insuline obtenue par le procédé décrit ci- dessus. Des recherches biologiques, pharmacologiques et médicales étendues ont montré que de tels constituants secondaires ayant une masse moléculaire notablement supé- rieure à celle de l'insuline sont responsables d'effets secondaires perturbateurs des spécialités pharmaceutiques préparées en partant de telles insulines. Pour la préparation de spécialités d'insuline de qualité particulièrement élevée, on a mis au point des procédés pour la séparation de telles impuretés. Dans le brevet GB 1 285 024, on propose un procédé de purification chromatographique de l'insuline sur des échangeurs d'anions en présence de solvants organiques miscibles à l'eau, dans une gamme de pH de 6 à 10. Des inconvénients de ce procédé sont le besoin relativement grand d'échangeurs (rapport échangeur/insu- line au moins 30/1) ainsi que les faibles rendements d'insuline (au maximum 60%). Comme alternative, dans les brevets DD 119 216 et 119 217, correspondant aux brevets DE-PS 2 505 306 et 2 505 307, on propose la purification de l'insuline ammoniacale ou alcaline par filtration sur gel. Outre la grande dépense de gel (1000 ml/4,5 g d'insuline), l'instabilité mécanique et chimique de la couche de gel, spécialement dans la gamme de pH supérieure à 7,0, un inconvénient de ce procédé est la teneur relativement élevée en pro-insuline. Un autre point gênant est qu'on ne peut obtenir, après la chromatographie, que des solu- tions peu concentrées d'insuline. Dans le DE-OS 2 701 092, on propose un procédé de préparation d'insuline pure qui, pendant tout le pro- cessus d'obtention, maintient l'insuline à l'état dissous sans changement de phase. Des inconvénients sont ici l'utilisation de techniques coûteuses comme par exemple l'osmose inverse et l'application de très basses tempé- ratures. En outre, ce document ne donne aucun enseigne- ment pour la purification d'insuline cristalline impure. Le DE-OS 2 757 377 préfère inclure déjà dans les étapes d'extraction du pancréas le procédé de puri- fication sur des échangeurs de cations et d'anions pour l'obtention d'insuline pure. Les inconvénients sont ici entre autres le très grand besoin d'échangeurs d'ions ainsi que l'utilisation d'échangeurs de cations et d'anions. Malgré cette dépense, une purification finale poussée par chromatographie sur gel est nécessaire. Dans le DE-OS 2 629 568, on propose la purifi- cation de peptides, en partulier d'insuline, par chro- matographie d'échange d'ions en présence de détergents non ioniques. Les inconvénients sont ici, outre l'uti- lisation d'adjuvants relativement coteux et difficile- ment accessibles, la basse concentration de l'insuline dans les fractions obtenues après la chromatographie (par exemple 0,35%) ainsi que les faibles rendements d'insuline. Le but de l'invention est d'indiquer un pro- cédé de purification de l'insuline qui évite dans une large mesure les inconvénients décrits ci-dessus. L'invention vise à indiquer un procédé nouveau qui per- mette la purification de l'insuline sans qu'il se pro- duise de grandes pertes d'insuline et sans que l'on utilise des systèmes coûteux ou instables mécaniquement et/ou chimiquement. En outre, il faut que les buts de l'invention soient atteints avec des adjuvants facile- ment accessibles. Le problème de l'invention est d'indiquer un procédé qui permette, avec des échangeurs d'ions large- ment stables mécaniquement et chimiquement, avec une grande capacité de charge, une purification simple et efficace de l'insuline avec des rendements élevés. En outre, il faut que la solution selon l'invention per- mette une cristallisation directe en partant des solu- tions d'insuline obtenues lors de la purification. Bien que les matières premières utilisées soient peu coûteu- ses, il est possible de les récupérer avec des moyens réduits. Selon l'invention, ce problème est résolu par le fait que l'on fractionne l'insuline et ses impuretés sur un échangeur d'ions faiblement acide à gangue hydro- phobe, dans la gamme de pH acide, à différentes concen- trations de solvant, éventuellement avec addition de substances aromatiques ainsi que de sels. Le point surprenant est ici qu'outre un fractionnement selon la charge, on obtient aussi un fractionnement selon la grosseur moléculaire. Des échangeurs d'ions appropriés sont des copolymères macroporeux que l'on obtient en partant de dérivés d'acide acrylique avec le divinylbenzène et par fonctionnalisation (par exemple les Wofatites, marque déposée, de CKB). Des solvants organiques appropriés sont des alcools aliphatiques liquides comme par exemple le mé- thanol, l'éthanol, le n-propanol, l'isopropanol, des cétones aliphatiques liquides à bas point d'ébullition comme par exemple l'acétone, des hémiacétals comme par exemple le méthylal et des esters au moins partielle- ment miscibles à l'eau comme par exemple l'acétate d'éthyle ainsi que leurs mélanges. Des acides appropriés pour le réglage des pH sont des acides organiques comme par exemple les acides formique, acétique, propionique, tartrique, citrique, des acides minéraux comme par exemple les acides chlo- rhydrique, sulfurique, phosphorique, ainsi que les sels acides de ces acides. Des sels appropriés sont des sels alcalins et d'ammonium des acides indiqués ci-dessus, comme par exemple l'acétate de sodium, le phosphate d'ammonium, pour le réglage du pH. Des substances aromatiques appropriées sont le benzène et ses dérivés. La séparation des impuretés de l'insuline peut s'effectuer aussi bien par le procédé discontinu que par le procédé en colonne. Le procédé discontinu s'utilise avantageusement pour la prépurification, le procédé en colonne pour une purification poussée. Tandis que des procédés connus de purification de l'insuline reposent sur une modification de la force ionique et/ou du pH, dans la solution proposée on évite les inconvénients inhérents à ces procédés comme par exemple le passage de sels comme impuretés dans les éluats et un renversement de charges de l'échangeur d'ions, grâce au fait que l'on obtient le fractionne- ment par modification échelonnée ou continue de la con- centration de solvant lors de l'élution. En général, on conduit le procédé de façon telle qu'en partant de solutions appropriées, de l'insu- line de pureté suffisante, par exemple de l'insuline cristalline impure ayant la structure des insulines humaines ou animales ou des progéniteurs technologiques tels que des précipités de relargage ou des précipités isoêlectriques se fixent à l'échangeur d'ions dans un réacteur de passage. Ensuite s'effectue, comme étape de purification proprement dite, l'élution au moyen de mé- langes acides d'eau et de solvant ayant des pH de 1,3 à 5,0, à des températures de 0,27 à 0,32 K, avec une con- centration croissante de solvant. On peut éluer l'insu- line à l'état exempt d'impuretés à poids moléculaire élevé. En faisant varier la charge de l'échangeur et la vitesse d'écoulement, on peut en outre obtenir un frac- tionnement à l'insuline en un constituant insuline pra- tiquement homogène à l'électrophorèse sur disque ainsi qu'en fractions qui sont enrichies en constituants aci- des d'insuline comme les formes désamidées, et en frac- tions qui sont enrichies en constituants basiques d'in- suline comme les dérivés d'arginine ou les esters d'in- suline. Outre cette forme de fractionnement par un pro- cessus de désorption, la forme analogue de l'adsorption d'impuretés sur l'échangeur, de façon discontinue, à des concentrations de solvant qui suffisent tout juste à empêcher l'adsorption de l'insuline, conduit aussi à un effet de purification. Exemples d'exécution 1. Sur une colonne de 300 mm de hauteur et 80 mm de largeur, ayant un volume de 1,5 litre, dans laquelle se trouvent 900 ml de Wofatite, on verse 90 g d'insu- line de porc dissoute dans 1800 ml d'acide acétique 1N, à une vitesse de 600 ml/h. Ensuite, on élue la colonne avec un gradient de solvant de O à 60% d'iso- propanol, 1N en acide acétique. L'insuline isolée est exempte de proinsuline (PAAGE, pH 8,4; bleu Coomassie). Le rendement est de 72 g. 2. Sur une colonne de 300 mm de hauteur et 80 mm de largeur, on verse, sur 900 ml de Wofatite CA 20, 90 g d'insuline dissoute dans 1800 ml d'acide chlorhy- drique 0,02 N, à une vitesse de 600 ml/h. On élue l'insuline avec 9 litres d'acide chlorhydrique 0,02 N, saturé de mélange acétate d'éthyle/benzène. 3. Sur une colonne de 150 mm de longueur et 9 mm de largeur (volume 9,5 ml), on verse 500 mg d'insuline dissoute dans 10 ml d'acide acétique, à une vitesse de ml/h et on élue avec un gradient de chlorure de so- dium de O & 0,2 N, 25% de méthylal, IN en acide acéti- que. On recueille l'éluat par fractions, on mesure l'extinction et on traite les différents constituants. 4. Sur une colonne de 150 mm de longueur, 9 mm de largeur (volume 9,5 ml), on verse 500 mg d'insuline dissoute dans 10 ml d'acide acétique 1N, à une vitesse de 10 ml/h et on élue avec 250 ml d'acide acétique 1N, 25% d'éthanol, 0,05 N en chlorure de sodium. Apres cristallisation, on obtient 400 mg d'insuline purifiée. 5. Sur une colonne de 300 mm de hauteur, 80 mm de largeur (volume 1,5 litre), on verse 90 g d'insuline dissoute dans 1800 ml d'acide phosphorique 0,03 N et on élue avec un gradient d'acide phosphorique 0,03 N, % d'acétone, à raison de chaque fois 12 litres. On règle à une concentration de 0,5% au moyen d'acide citrique l'éluat contenant de l'insuline et on le cris- tallise directement en présence de sels de zinc. Le rendement est de 85%. 6. Sur une colonne de 150 mm de longueur et 9 mm de largeur (volume 9,5 ml, Wofatite CP), on verse 500 mg d'insuline humaine dissoute dans 10 ml d'acide acétique MN. Apres lavage de la colonne, on élue l'insuline avec de l'éthanol à 60%, 1N en acide acétique et O,lN en chlorure de sodium, à une vitesse de 5 ml/h. 7. On dissout 1 g d'insuline de porc dans 100 ml d'éthanol à 45%, 1N en acide acétique et on adsorbe sur 10 ml d'Amberlite IRC-50 équilibrée dans l'éthanol à 45%, 1N en acide acétique. Au bout de 3 heures d'agi- tation à 40 C, l'état d'équilibre est atteint. On sé- pare l'échangeur d'ions par filtration et on le lave. Le filtrat contient le constituant C de l'insuline, exempt des constituants à poids moléculaire élevé. Le traitement de l'insuline s'effectue par distillation et ensuite cristallisation. REVENDICATIONS 1 - Procédé de purification d'insuline sur des échangeurs de cations faiblement acides en présence de solvants organiques miscibles à l'eau, caractérisé par le fait que l'on effectue un fractionnement par variation de la concentration de solvant, dans le gamme de pH acide. 2 - Procédé selon la revendication 1, carac- térisé par le fait que l'on utilise des échangeurs d'ions macroporeux à gangue hydrophobe à base d'acrylate et de divinylbenzène, de dérivés de celui-ci ou d'autres agents de réticulation. 3 - Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que l'on utilise comme solvants des alcools aliphatiques, des cétones alipha- tiques, des hémiacétals ainsi que des esters d'acides carboxyliques aliphatiques et d'alcools aliphatiques, ou des mélanges de ces corps. 4 - Procédé selon la revendication 3, carac- térisé en ce que l'on ajoute aux solvants des substan- ces aromatiques. - Procédé selon la revendication 3, carac- térisé en ce que l'on utilise comme alcool le méthanol. 6 - Procédé selon la revendication 3, carac- térisé en ce que l'on utilise comme alcool l'éthanol. 7 - Procédé selon la revendication 3, carac- térisé en ce que l'on utilise comme alcool le n-pro- panol. 8 - Procédé selon la revendication 3, carac- térisé en ce que l'on utilise comme alcool l'isopropanol. 9 - Procédé selon la revendication 3, carac- térisé en ce que l'on utilise comme cétone l'acétone. - Procédé selon la revendication 3, carac- térisé en ce que l'on utilise comme ester l'acétate d'éthyle. 11 - Procédé selon l'une des revendications 1 a 10, caractérisé en ce que la concentration de solvant est de 3 à 70%. 12 - Procédé selon l'une des revendications 1 à. 11, caractérisé en ce que l'on fait varier de façon continue la concentration de solvant. 13 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'on fait varier la concen- tration de solvant de façon échelonnée. 14 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que les mélanges de solvant et d'eau contiennent des sels. - Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que les sels sont des substances tampons. 16 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé enfce que comme sels, on utilise les sels alcalins ou sels d'ammonium des acides servant à régler le pH. 17 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que par le fractionnement, on élimine les impuretés à poids moléculaire élevé de l'in- suline. 18 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que l'on obtient de l'insuline exempte de constituants secondaires. 19 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que le fractionnement s'effectue par chromatographie sur colonne. 20 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que le fractionnement s'effectueen un processus discontinue 21 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé en ce que le fractionnement s'effectue dans la gamme de pH de 1,5 à 5,5. 22 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 21, caractérisé en ce que le fractionnement s'effec- tue de préférence dans la gamme de pH de 1,7 à 3,0. 23 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 22, caractérisé en ce que pour le réglage du pH on utilise l'acide formique, l'acide acétique, l'acide tartrique, l'acide citrique, l'acide chlorhydrique, l'acide phosphorique. 24 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 23, caractérisé en ce que l'on cristallise directe- ment l'insuline dans l'éluat, sans autre isolement.