FR 2585365 A1 19870130 FR 8506388 A 19850426 L'invention se rapporte à un procédé et un appa- reil pour l'hydrolyse enzymatique de corps gras; elle s'applique plus particulièrement à la production d'acides gras à partir de leurs esters et plus spécialement des triglycérides. La production industrielle des acides gras s'opè- re généralement par l'hydrolyse thermique de graisses ou huiles, en présence de la vapeur d'eau à une température assez élevée. C'est un procédé qui permet une fabrication rapide de fortes quantités d'acides désirés, mais il con- somme beaucoup d'énergie et requiert des investissements coûteux; de plus, l'application d'une température élevée favorise la dégradation des matières traitées, sensible sur- tout en ce qui concerne les acides insaturés. Or, comme on le sait, il est possible de produire l'hydrolyse des es- ters gras, notamment des triglycérides, par l'action de certaines enzymes; c'est ainsi que l'action des lipases extracellulaires, secrétées par des microorganismes, est connue depuis longtemps. Dans certaines conditions de cul- tures, des microorganismes et enzparticulier certains cham- pignons filamenteux ont la propriété d'exprimer une acti- vité lipasique intracellulaire qui reste liée aux parois du mycélium. Le système enzyme/paroi se comporte alors comme une enzyme purifiée, immobilisée sur un support solide; le mycélium à activité enzymatique présente en fait les mêmes stabilité et commodité d'emploi que les systèmes d'enzymes immobilisées sur support, mais il est plus économique, puis- qu'il est produit par voie naturelle. On a donc essayé d'ap- pliquer un tel système à la production des acides gras. Ce- pendant, pour obtenir des résultats viables, il a fallu em- ployer un solvant pour dissoudre la matière grasse de dé- part. De telles tentatives sont décrites par BELL C, TODD J.R., BLAIN J.A., PATTERSON J D E, SHAW C.E.L., Bioteh. Bioeng (1981) 23(7) 1703-19. Ces auteurs ont utilisé le my- célium du champignon Rhizopus arrhizus en tant que source de lipase, et ont employé l'huile en solution dans l'éther diisopropylique. Toutefois, ces travaux n'ont conduit qu'à des rendements assez faibles, en moyenne de 20 à 50% en acides gras recherchés; d'autre part, dans ces conditions opératoires, la perte de l'activité de l'enzyme est assez sensible, d'environ 0,6 à 1% par heure. Il apparaît nette- ment que la proportion d'eau à introduire dans le milieu réactionnel joue un grand r8le, et les auteurs ont trouvé que l'optimum de cette concentration se situait aux envi- rons de 0,17% en poids par rapport au volume du mélange réactionnel, et que de part et d'autre de cette valeur la conversion de la matière grasse baisse fortement. Il résul- te de cet art antérieur que la quantité d'eau tolérée doit même être inférieure à la proportion stoechiométrique cor- respondant aux esters traités. En définitive, bien que le principe décrit paraisse intéressant, sa réalisation indus- trielle ne pourrait pas être envisagée à cause des incon- vénients susmentionnés. La présente invention apporte un perfectionnement sensible au principe de l'hydrolyse des matières grasses en présence d'un mycélium porteur de lipase, au sein d'un solvant organique, par des modifications inattendues qui permettent l'obtention de résultats vraiment industriels. En effet, perfectionné suivant l'invention, le procédé pré- cité est susceptible de fournir des acides gras avec des rendements dépassant 80% et même 90% sur la matière grasse mise en oeuvre, alors que la désactivation de l'enzyme est extrêmement lente, ne dépassant généralement pas 0,01% par heure. Bien entendu, le procédé de l'invention comme tous ceux qui utilisent les enzymes, bénéficie des conditions o- pératoires très douces, puisqu'on opère en général à des températures ne dépassant pas 50 C et, le plus souvent, en- tre 15 et 35 C. Cela évite toute dégradation des acides gras formés et fournit par conséquent un produit plus pur que la technique industrielle classique. Le procédé suivant l'invention, qui consiste à hydrolyser une matière grasse dissoute dans un solvant or- ganique, additionné d'une faible quantité d'eau, en présen- ce du mycélium porteur de lipase, est caractérisé en ce que le milieu réactionnel, comprenant l'eau, est rendu homogène par l'adjonction d'un agent susceptible d'y dissoudre ou microémulsionner l'eau nécessaire à l'hydrolyse. Dans une première forme d'exécution, l'agent d'ho- mogénéisation est constitué par un solvant tiers, capable de former une phase unique entre le solvant contenant la ma- tière grasse et l'eau. De tels solvants tiers peuvent être choisis par exemple parmi des cétones, des amides, des sol- vants azotés cycliques, etc. Ainsi, peut-on employer des liquides tels que: acétone, méthyl-éthylcétone, di-éthyl- cétone, acétophénone, glycérol-formal, diméthyl-acétamide, N-méthyl-pyrrolidone, etc. Ce solvant tiers doit être na- turellement présent en une proportion adéquate pour pro- duire la dissolution de l'eau dans la solution du corps gras employé dans le solvant organique; cette porportion dépend de la nature des autres matières en présence, mais elle est généralement de l'ordre de 5 à 30% du total. En tant qu'exemples non limitatifs de cette forme d'exécution, voici les proportions particulières des constituants du mélange réactionnel: Corps gras 10 à 30% en poids Acétone 15 à 20 " Eau 1 à 3 " Solvant organique du corps gras 58 à 74 " Un tel mélange est parfaitement limpide à la température d'opération de 30 C, et ne donne lieu à aucune démixtion au cours de la réaction. Dans la variante de l'invention, qui consiste à microémulsionner l'eau dans la solution de la matière gras- se, un solvant tiers peut ne pas être nécessaire, lorsque le solvant organique de la matière grasse, lui-même, peut servir de cotensioactif à l'émulsifiant que l'on ajoute au milieu, dans cette variante. Ici il est important d'in- corporer, au mélange réactionnel, un agent tensioactif convenable. La préparation de microémulsions de l'eau dans des solvants hydrophobes étant connue dans l'art, il n'y a pas lieu d'en donner ici des détails. On notera cependant que des agents tensioactifs tels que sulfates d'alcools gras, sulfosuccinates, esters oxyéthylénés de sorbitol, alcools, acides ou huiles oxyéthylénés, esters de saccha- rose, polyglycols, phosphates d'alkyle lourds, etc., con- viennent particulièrement bien à la réalisation de l'in- vention. Comme on le sait, dans une microémulsion de l'eau au sein d'un solvant hydrophobe, l'eau se trouve générale- ment à l'intérieur des micelles inverses, constituées par un composé tensioactif accompagné d'un co-tensioactif. Ce dernier peut être le solvant tiers indiqué plus haut, ou bien le solvant organique lui-même, du corps gras. Cette forme d'exécution de l'invention présente-,entre autre, l'avantage de permettre d'élever jusqu'à environ 30% la te- neur en corps gras du solvant organique utilisé, sans que le tout cesse de présenter l'aspect d'une véritable solu- tion. A titre d'exemple non limitatif, la composition d'un milieu, soumise à l'action enzymatique d'un mycélium, peut se compo- ser en poids de Corps gras 10 à 45% Tensioactif (plus éventuelle- ment co-tensioactif) 1 à 5% Eau 1 à 3% Solvant organique 47 à 88% Une autre particularité tout à fait nouvelle, de l'invention, réside en ce que l'eau, nécessaire à l'hy- drolyse de la matière grasse, est introduite à différents moments de l'avancement de la réaction. On compense ainsi la quantité d'eau consommée par la réaction qui peut être schématisée de la façon suivante dans le cas des triglycé- rides correspondant à des acides gras des groupes R1, R2 et R OCO R1 OH R1COOH - OCO R2 + 3H20 -OH + R2COOH R 22 _OCO R 3 -OH R3COOH Cette eau peut être introduite en continu ou en discontinu, selon la technique adoptée pour l'exécution du procédé. La caractéristique de l'invention, qui consiste à dissoudre ou microémulsionner l'eau dans le milieu réaction- nel, rend possible l'utilisation d'un certain excès en H20 par rapport à la proportion stoechiométrique; cela s'ac- compagne d'un accroissement très sensible du rendement en acides gras obtenus. Alors que dans la technique antérieu- re, citée plus haut, la quantité d'eau permise n'atteint pas celle qui serait nécessaire au point de vue stoechio- métrique, le procédé suivant l'invention utilise des quan- tités de H20 nettement supérieures à la théorie; cette quantité est généralement comprise entre 1 à 2 fois la quantité théorique, et,de préférence, 1,1 à 1,6. Dans le procédé de l'art antérieur cité plus haut, le choix des solvants organiques pour la matière grasse de départ est fortement limité, parce que la plupart des sol- vants, compatibles avec les enzymes utilisées, ne permet- tent pas la mise en solution de la quantité d'eau nécessai- re à la réaction. Par contre, le perfectionnement suivant l'invention élargit grandement le domaine des solvants uti- lisables, puisque l'eau y est dissoute à l'aide d'un sol- vant tiers ou de la microémulsion. C'est ainsi qu'à titre d'exemple, les solvants de la liste qui suit peuvent être utilisés dans le procédé de l'invention. SOLVANT ACTIVITE RELATIVE (%) Di-éthyl-éther (DEE) 125 Di-isopropyl-éther (DIPE) 100 Méthyl-t-butyléther (MTBE) 94,6 Di-isobutyl-éther (DIBE- 89,2 Di-n-butyl-éther 78,4 Diméthoxy-propane (DMP) 75,0 Phényl éthyl éther (Phénétole) 35,1 Phényl éthyl éther (Anisole) 27,0 1,2-diéthoxy-éthane 32,4 1,2-diméthoxy-éthane 24,3 Diméthyl éther du diéthylène glycol (diglyme) 24,0 Dioxane 18,9 Diméthyl formamide (DMF) 0 Diméthyl sulfoxyde (DMSO) 0 Les activités relatives pour ces différents solvants ont été déterminées par l'hydrolyse de l'huile d'olive dans les conditions suivantes: huile d'olive % en poids 10 eau 0,5 acétone 5 solvant 84,5 0,1 g de mycélium par gramme d'huile, réaction discontinue à 30 C pendant 60 minutes. Le diéthyl-éther ne peut pas être employé prati- quement à cause de sa forte volatilité. Parmi les autres solvants, les demandeurs ont sélectionné le méthyl-t-butyl- éther (MTBE) comme solvant particulièrement intéressant, parce qu'il est beaucoup moins toxique que le di-isopropyl- éther de l'art antérieur et qu'il présente, par rapport à tous les autres solvants viables, la tendance la plus fai- ble à former des dérivés peroxydes dangereux. L'application de ce solvant fait donc partie de la nouveauté de l'inven- tion. Etant donné que la culture des microorganismes, la récolte et traitement ultérieur de mycélium obtenu, pour servir d'enzyme immobilisée, sont connus, il n'y a pas lieu de les décrire ici. On doit cependant noter que l'invention s'applique à des mycélia provenant de différents microorganismes, dont on cite ci-après quelques-uns, seulement à titre d'exemples non limitatifs Les Rhizopus stolonifer, arrhizus, delemar et japonicus; Geotrichum candidum; Mucor javanicus, hiemalis et miehei Aspergillus oryzae et niger. L'invention comprend également un appareillage pour la réalisation du procédé décrit plus haut. L'instal- lation comprend au moins une capacité de stockage du mélan- ge réactionnel, au moins une colonne garnie de matières de remplissage appropriées supportant l'enzyme et des moyens de transport du mélange réactionnel du stockage à la colon- ne. La nouveauté de l'appareil suivant l'invention réside en ce que celui-ci est également muni de moyens d'introduc- tion de l'eau à différents stades d'avancement du mélange réactionnel. A titre d'exemple, on décrit, ci-après, une ins- tallation qui a donné les bons résultats décrits dans les exemples qui suivent. Le dessin unique, annexé, représente schématique- ment une installation suivant l'invention, comportant trois colonnes à réaction enzymatique. Bien entendu,le nombre de colonnes ou réacteurs peut varier selon les besoins. La cuve 1 constitue la capacité nécessaire au mé- lange et au stockage des matières de départ. Elle est munie d'un agitateur 2 et de quatre admissions de liquides: re- père 3 pour le solvant du corps gras, 4 pour ce dernier lui-même, 5 pour le solvant tiers, ou/et pour un agent ten- sioactif, et 6 pour l'eau. Le mélange, homogénéisé dans 1, est repris par la pompe P1 pour être envoyé au bas de la colonne de réaction 7. Celle-ci contient le mycélium enzy- matique. De préférence, celui-ci est mélangé avec des grains d'un support minéral, en particulier silice, alu- mine, silico-aluminate, verre etc. Le dessin représente le cas o le mélange réac- tionnel chemine de bas en haut, dans la colonne 7, mais il est bien entendu que l'invention peut être également réalisée avec la disposition connue de circulation de haut en bas. Elle peut d'ailleurs être mise en oeuvre avec un lit fluidisé. La colonne 7 est entourée d'une chemise 8 pour la circulation d'un fluide thermostatique. Le liquide qui sort de la colonne 7 par la cana- lisation 9, en vue de son passage dans une seconde colonne 12, est d'abord reçu dans un mélangeur intermédiaire 11, o ilest agité avec une portion d'eau d'ajustement, intro- duite par 10. La proportion d'eau, ainsi rajoutée, est tel- le qu'il y ait toujours, dans le milieu réactionnel, suffi- samment d'eau, notamment 1 à 2 fois la quantité stoechiomé- trique correspondant à la matière grasse présente en une zone de réaction donnée. Ainsi, le mélange 11 intermédiaire, entre les colonnes 7 et 12, qui n'existe pas dans les installations classiques d'hydrolyse enzymatique, constitue-t-il un élé- ment nouveau, caractéristique de l'appareillage suivant l'invention. Du mélangeur 11, par la pompe P2, le mélange à teneur en eau ajustée est transférée dans la colonne 12 entourée d'un chemisage thermostatique 13. L'hydrolysat passe ensuite,par une canalisation 14,dans un second mé- langeur intermédiaire 16,alimenté en eau d'appoint par 15, et fonctionnant comme le précédent (11). De 16 le mélange est envoyé, au moyen de la pompe P3, dans une 3ème colonne (17), et ainsi de suite s'il le faut. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs, suivants. EXEMPLE 1 L'hydrolyse du suif est effectuée au moyen des lipases d'un mycelium de Rhizopus arrhizus (ATCC 24563), dans un appareil de laboratoire constitué comme décrit plus haut avec référence au dessin. On fait passer un mélange initial, homogène, ayant la com- position suivante: suif................ 20 (corpsgras) méthyl t.butyl éther (MTBE)............. 58 (solvant organique) eau................ 2 (environ 1,6 fois stoechiométrique) acétone............. 20 (solvant tiers) successivement par les trois colonnes, à 30 C. Chaque colonne contient 5,5g de mycelium en poudre mélangée avec 10 ml de silice en grains de 0,05 mm de moyenne, en tout un volume de 35 ml. Le volume mort par colonne est d'environ 15 ml pour un débit de l'ordre de 12 ml/h, ce qui correspond à un temps de sé- jour du mélange liquide de 75 minutes environ dans chaque colonne. Le taux de conversion du suif, après la première colonne (repère 7 sur le dessin), atteint 60%. On ajuste alors la teneur en eau du mélange traité, par l'addition de 0,8% d'eau dans le premier mélangeur intermédiaire (11 éur le dessin). A la sortie de la 2ème colonne (12) la conver- sion du suif est de 83% et l'on ajoute 0,7% d'eau dans le mélangeur intermédiaire (16) qui la suit. A la suite de la troisième colonne (17) la conversion du suif ressort à 91%. Après l'évaporation des solvants on recueille 71,8g d'hydro- lysat ayant la composition suivante en acides gras (en poids): myristique (C14)........... 2,6 palmitique (C16)............ 30,4 palmitoléique (C16:1)....... 3,3 stéarique (C18)............. 21,3 oléique (C18:1)...... ....( linoléi Ue) 42,0..DTD: linoléique (C18:2)......... ( déterminée par chromatogaphie en phase gazeuse des dérivés triméthyl-silylés d'échantillons d'hydrolysats. EXEMPLE 2 Comparatif avec la technique antérieure. On opère comme dans l'exemple 1, dans le même appareil, mais sans adjonction d'acétone, donc sans tiers solvant et sans ajustement de l'eau dans les mélangeurs intermédiaires. La composition des 100g de mélange initial est ici: suif. ........... 20 g méthyl t.butyl éther... 79 g eau.................. 1 g(limite de solubilité) La conversion du suif après la 3ème colonne est alors seule- ment de 27%. Cela prouve le remarquable avantage du mode opératoire de l'exemple 1. EXEMPLE 3 Dans une hydrolyse, menée avec le tiers solvant (acétone) comme dans l'exemple 1, mais sans addition d'eau dans les mélangeurs intermédiaires (11 et 16), la conver- sion après la 3ème colonne (17) est de 65% donc moindre que dans l'exemple 1, tout en restant encore bien supérieure à celle de la technique antérieure, illustrée par l'exemple 2. La teneur en eau au départ étant de 10% par rapport au suif, soit environ 1,6 fois la quantité théorique, néces- saire, elle n'a pas pu baisser au dessous de la valeur stoe- chiométrique au cours de la réaction. L'amélioration de la conversion du fait de l'ajustement de la proportion d'eau entre colonnes successives est donc un résultat tout-à-fait imprévu, s'ajoutant à celui qu'apporte l'emploi d'un sol- vant tiers. EXEMPLE 4 L'appareil et les opérations sont identiques à ceux de l'exemple 1, mais appliqués à de l'huile de colza en tant que substrat. Le mélange de départ se composait de: (pour 100 g) g d'huile de colza 63, 5 g MTBE 1,5 g d'eau g d'acétone Le poids d'eau, introduit au départ, représente ainsi 7,5% de celle de l'huile, soit environ 1,25 fois la proportion théoriquement nécessaire. On a alors: Conversion % g H20 ajoutée après la 1ère colonne 55 1,1 " " 2ème colonne 63 0,7 " " 3ème colonne 70 - La masse d'hydrolysat, recueilli après l'élimination des solvants, est de 95,5 g et sa composition en acides gras est la suivante: palmitique....... ..... 7,8 stéarique................ 2,8 oléique) linoléique............ 85,3 linolénique ( C20 et C22.............4,1..DTD: EXEMPLE 5 Hydrolyse du suif en microémulsion. Dans les mêmes conditions qu'à l'exemple 1, on effectue l'hydrolyse du suif en solution dans du méthyl tert-butyl éther (MTBE), l'eau étant microémulsionnée dans cette solution par l'addition d'un agent tensioactif. Le mélange de départ est constitué par: ,6 g de suif 66 g de solvant MTBE 2,1 g d'eau (soit 6,8% par rapport au suif) 1,3 g de dioctyl-sulfosuccinate de Na (tensioactif) Ce mélange est bien homogène tout au long de son passage dans les colonnes de réaction. Apres la 1ère colonne, la conversion est de 60,8%, et l'on ajoute 1,8 g d'eau, ce qui fait porter la proportion d'eau par rapport au suif restant à environ 10%. A la sortie de la seconde colonne la conversion s'est éle- vée à 83,5%. On recueille 120 g d'hydrolysat dont les acides gras se répartissent comme suit: myristique................ 3,3 palmitique...............27,5 palmitoléique............. 4,1 stéarique.................20,0 oléique) (............ 45,2 linoléique) On voit qu'en microémulsion les résultats sont pratiquement les mêmes qu'avec le tiers solvant de l'exemple 1, mais avec l'avantage supplémentaire de permettre l'utilisation d'une plus forte charge de corps gras au départ, notamment 30,6 g au lieu de 20. Revendications 1. Procédé d'hydrolyse enzymatique d'une matière gras- se en vue de la libération des acides gras qu'elle contient, par contact d'une solution de cette matière, dans un sol- vant organique, avec de l'eau, en présence d'un mycelium porteur de lipase, caractérisé en ce que cette eau est ho- mogénéisée avec le solvant organique à l'aide d'un tiers solvant ou d'un agent tensioactif. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le tiers solvant est une cétone, ou un amide. 3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que le tiers solvant est l'acétone. 4. Procédé suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la proportion de tiers solvant est d'environ 5 à 30% du mélange soumis à l'hydrolyse. 5. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'eau est microémulsionnée avec la solution du corps gras dans le solvant organique, par l'adjonction d'environ 1 à 5% d'un agent tensioactif. 6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que le tensioactif est accompagné d'un co-tensioactif, lorsque le solvant organique du corps gras ne joue pas lui- même le rôle de ce dernier. 7. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que le mélange à traiter contient 10 à 30% de corps gras. 8. Procédé suivant la revendication 5 ou 6, caractéri- sé en ce que le mélange à traiter contient 10 à 45% de corps gras. 9. Procédé suivant une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la teneur en eau du mélange à traiter est supérieure à la proportion stoechiométrique par rapport aux corps gras, et elle est en particulier 1 à 2 fois la quantité théorique. 10. Procédé suivant une des revendications précéden- tes, caractérisé en ce que le solvant organique pour la ma- tière grasse est le méthyl-tert.butyle éther. 11. Procédé suivant une des revendications précéden- tes, caractérisé en ce qu'une addition d'eau est effectuée à différents stades de la réaction, en continu ou en dis- continu. 12. Appareillage pour la réalisation du procédé sui- vant une des revendications 1 à 11, comprenant un premier mélangeur (1) et une série de colonnes successives (7,12, 16) renfermant du mycelium porteur de lipase, ainsi que des moyens (P1, P2, P3) pour faire circuler le mélange li- quide à traiter dans les colonnes, caractérisé en ce qu'en- tre chaque colonne et la colonne suivante est branché un mélangeur intermédiaire (11, 16) équipé pour l'addition de l'eau au mélange circulant.