FR 2575163 A1 19860627 FR 8419544 A 19841220 2575 1 63 Tri-et tétrapeptides réduits inhibiteurs de la sécrétion gastrique, procédé d'obtention et compositions pharma- ceutiques les contenant. La présente invention concerne de nou- veaux peptides inhibiteurs de la sécrétion gastrique. Elle concerne également un procédé pour leur obtention et les compositions pharmaceutiques les contenant. La gastrine est une hormone gastro- intestinale qui possède à un degré élevé le pouvoir de stimuler la sécrétion gastrique. Par ailleurs, la pentagastrine et la tétragastrine sont des peptides synthétiques proches de la séquence C-terminale des 5 ou 4 derniers amino- acides de la gastrine et répondent respectivement aux formules: Boc-béta. Ala-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 et H-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 utilisant, pour désigner les alpha-aminoacides et les groupes protecteurs, les abréviations à 3 lettres re- commandées par la Commission de Nomenclature de l'IUPAC- IUB. Ces composés sont également des stimu- lants de la sécrétion gastrique. Selon la présente invention, il a été trouvé que, de façon surprenante, des dérivés peptidiques, dérivés de ces séquences par remplacement de la liaison amide -CO-NH entre la méthionine et l'acide aspartique par une liaison réduite CH2-NH, et remplacement éventuel de la méthionine par la leucine et la norleucine, deviennent de puissants inhibiteurs de la sécrétion gastrique. Les composés selon l'invention répondent a la formule générale: H R -X-N-CH-A -CH-CH NH-CH-A -CH-CONH 1 1 1 2 2 1 2 CH2 R2 CH2 CH2 W COOHt r H (I) dans laquelle: - R1 représente l'hydrogène ou un groupe protecteur de la fonction amine, tel que les groupes t-butyloxycar- bonyle, benzyloxycarbonyle ou alcanoyle inférieur; - X représente la bOtaalanine ou une liaison directe entre R1 et le groupe amine; -Rr 1 - R2 représente un groupe choisi parmi: CH -3 -CH2 CH, CH2CH2 S-CH ou -(CH2)3CH; '15 CH3 correspondant aux chaînes latérales des aminoacides na- turels: leucine, méthionine, norleucine. - A1 et A2 désignent chacun indépendamment soit un groupe amide -CO-NH-, soit un groupe réduit -CH2-NH-. La présente invention concerne également un procèdé de préparation des composés de formule (I). Le remplacement, dans une séquence pepti- - dique, d'une liaison amide par une liaison -CH2NH- peut âtre obtenu par action d'un alpha-aminoaldéhyde convenable- ment substitué par un alpha-aminoacide en présence d'un agent de réduction, tel qu'un borohydrure. La réaction peut-être schématisde par: H B-NH-CH-CHO + NH2-CH-COOH 2 l l Y1 Y2 1 2 2575 163 BNH - CH-CH2-NH-CH-COOH 1 2 1 Y1 t2 B représente un groupe protecteur, de la fonction amine et notamment le groupe tertiobutoxycarbonyle ou un peptide protégé sur l'amine N-terminal. Y1 et Y2 re- présentent les chaînes latérales correspondant aux aipha-aminoacides naturels: leucine, norleucine, méthio- nine, acide aspartique. 10. L'imine qui se forme intermédiairement est réduite au fur et à mesure par action de l'hydrure utilisé, de préférence le cyanoborohydrure de sodium. On opère dans un solvant convenable, le plus souvent un alcool, et on opère à une température comprise entre 20 et 50 C. Lorsque les produits de départ comporttent dans leurs chaînes latérales des substituants suscep- tibles de réagir avec l'aldéhyde ou avec le borohydrure, il convient de les bloquer avant réaction. - Ainsi, les groupes carboxyliques seront bloqués sous forme d'ester, de préférence d'ester benzy- lique. Les composés aldéhydiques 1 sont eux- mêmes préparés à partir des alpha-aminoacides corres- pondants. Toutefois ces composés sont des composés chi- raux et il convient de conserver pour l'aldéhyde l'iso- mérie optique du produit de départ. Pour ce faire on pourra utiliser la méthode décrite dans le brevet français No. 82-13385 au nom de la demanderesse. Cette méthode peut être représentée par le schéma: B-NH-CH-COOH > B-NH-CH-CO-N-OCH [ I 3 Y1 Y1 CH3 4 5 Al Li H4 4> B-NH-CH-CHO y Y1- A partir de l'acide 4 l'action de la N, O-diméthylhydroxylamine conduit au N,0-diméthyl- hydroxamate 5. Celui-ci, par réduction par l'hydrure de lithium-aluminium, conduit à l'aldéhyde 1 qui conserve la stéréochimie de l'acide 4. Lorsque A1 ou A2 ou A1 et A2 repré- sentent un groupe amide les fragments des composés (I), qui sont des fragments peptidiques, peuvent être pré- parés selon les méthodes habituelles de synthèse pepti- dique en phase liquide. A partir de l'aminoacide C-terminal, on introduit successivement les aminoacides présents dans la séquence. Les réactions de couplage sont effectuées soit avec un ester activé de l'acide aminé à introduire au sein du diméthylformamide et en présence de diiso- propyléthylamine et d'hydroxy-1 benzotriazole, soit avec l'acide aminé au sein du dim9thylformamide en présence d'hexafluorophosphate de benzotriazolyloxy-tris-(di- méthylamino)-phosphonium et de diisopropyléthylamine. Tous les aminoacides sont incorporés sous la forme du dérivé protégé sur l'amine en alpha, le groupe protecteur choisi étant le groupe t-butyloxy- carbonyle. Lorsque l'aminoacide utilisé présente dans sa chaîne latérale des fonctions susceptibles de réagir, celles-ci doivent être bloquées au préalable. Ainsi les fonctions acides en beta de l'acide aspartique doivent être bloquées sous forme d'ester,en particulier l'ester benzylique. 2575 1 63 Après chaque réaction de couplage, la déprotection de l'amine en alpha est effectuée par hydrolyse acide. Finalement, les produits protégés sur les fonctions figurant dans leurs chaînes latérales sont partiellement ou entièrement déprotégés pour conduire aux composés de formule (I). Les exemples suivants permettront de mieux comprendre l'invention. Dans ces exemples on utilisera les abréviations suivantes: Acides aminés et groupes protecteurs: Phe: L - phénylalanine Asp: L - acide aspartique Leu: L - Leucine Bzl: benzyle Boc: t.butyloxycarbonyle ONp -O NO2 Autres abréviations: TFA: acide trifluoracétique DMF: diméthylformamide DIEA: diisopropyléthylamine P- N - (CH3)3 BOP: N PF6 N HOBt hydroxy-1 beuzotriazole EXEMPLE: ?CH H3C-C-O C-NH - -CH N-CH-CONH- C H-CONH2 L t 21 A H3OCH2 CH2 CH2 CH2 CH COOH H- ou Boc-Trp-NH-CH-CH2-Asp-Phe-NH2 CH- CH 103 CH3 CH3 A) Boc-Asp(bêta OBzl)-Phe-NH2 On dissout 2,88 g de phénylalaninamide, 6, 63 g de BOP et 4,85 g de Boc-Asp(bêta OBzl) dans 20ml de DMF. On ajoute 3 ml de DIEA et laisse 10 heures sous agitation à température ambiante. On évapore le DMF sous vide à température inférieure à 40 C. On dissout le résidu dans 250 ml d'acétate d'éthyle et lave la solution 2 fois avec 50 ml de solution à 10% d'acide citrique et 1 fois avec 100 ml d'eau. On sèche sur sul- fate de sodium et concentre sous vide. Le résidu cristallise par trituration avec de l'éther: F = 86-89 C; (alpha)D =-22,5 (c = 1,1 DMF); rendement 6,5 g soit 92%. B) Boc-Trp-NH-CH-CHO CH2 CH CH3 CH3 3 3 1 - Boc-Leu-N-OCH3 CH3 On dissout 4,98 g de Boc-Leu mono- hydrate,8,84 g de BOP et 2,1 g de chlilorhydrate de N, O-diméthylhydroxylamine dans 150 ml de dichlorométhane. On ajoute 6,9 ml de DIEA et laisse 5 heures à tempé- rature ambiante. On évapore le solvant sous vide et reprend le résidu dans l'acétate.d'éthyle. On lave la solution 2 fois avec une solution saturée de bicarbonate de sodium, 2 fois avec une solution à 10% d'acide citrique et 1 fois avec de l'eau. On sèche la solution sur sulfate de sodium et évapore sous vide. On chromatographie le résidu sur une colonne de gel de silice. En éluant avec un mélange acétate d'éthyle-hexane 1/1 vol/vol, on obtient une huile incolore (4,5 g): rendement 82%. Chromatographie sur couche mince: Rf = 0,6 (acétate d'éthyle-hexane 1/1 vol/vol). 2 - Boc-Trp-Leu-N-OCH3 CH3 On traite 2,74 g du produit préparé ci-dessus par 10 ml de TFA pendant 30 minutes à tempé- rature ambiante. On évapore le TFA en presence d'éther plusieurs fois sous vide. Le résidu huileux incolore est séché au dessiccateur sur potasse. On dissout le trifluorac6tate ainsi obtenu dans 20 ml de DMF avec 4,06 g de Boc-Trp-ONp, 1,4 g d'HOBt et 3,75 ml de DIEA. On agite pendant heures à température ambiante puis on évapore le solvant sous vide, à température inférieure à 40 C. On dissout le résidu dans l'acétate d'éthyle et lave la solution, successivement, 2 fois avec une solution saturée de bicarbonate de sodium, 2 fois avec une solution d'acide citrique à 10% et 1 fois avec de l'eau. On sèche sur sulfate de sodium et concentre sous vide. On chromatographie le résidu sur une colonne de gel de 2575 163 silice.. En gluant avec le mélange acetate d'éthyle- hexane 1/1 vol/vol, on obtient une poudre incolore (3,5 g): F = 75-80 C (décomposition); rendement 85%. O 3 - Boc-Trp-NH-CH-C ou Boc-Trp-leucinal CH2 H CH CH3 CH3 On dissout 2,30 g du produit obtenu ci-dessus dans 10 ml de t6trahydrofuranne anhydre puis on ajoute 50 ml d'éther anhydre. On ajoute ensuite par fractions 0,76 g d'hydrure de lithium-aluminium. Apres la fin de l'addition, on laisse réagir 45 minutes, puis on verse lentement le mélange réactionnel dans 150 ml d'une solution refroidie d'acide citrique à 10%. On laisse 40 minutes sous agitation puis on dilue avec 150 ml d'éther et décante la phase organique. On la lave successivement avec une solution d'acide citrique à 10%, avec de l'eau, avec une solution saturée de bicarbonate de sodium et avec de l'eau. On sèche sur sulfate de sodium puis concentre sous vide à température inférieure à 40 C. Il reste une huile incolore qui doit être utilisée rapidement pour la suite des opérations. On peut toutefois la conserver quelques heures au réfri- gérateur. C) Boc-Trp-NH-CH-CH2-Asp-Phe-NH2 CH2 CH3 CH3 1) -Boc-Trp-NH-YH-CH2-Asp(bêta OBzl)-Phe-NH2 CH2 CH CH3 CH3 On traite 1,64 g du peptide protégé préparé au paragraphe A par 10 ml de TFA pendant minutes à température ambiante. On ajoute 150 ml d'éther et essore le précipité qui s'est formé. On le lave plusieurs fois avec de l'éther puis on le sèche sous vide. On dissout le trifluoracétate ainsi obtenu dans 100 ml de méthanol avec l'aldéhyde obtenu au paragraphe B-3, provenant de la réduction de 2,3 g de N,O-diméthylhydroxamate. On amène le pH à 9 par addition de DIEA. On ajoute une solution de 0,225 g de cyanoboro- hydrure de sodium dans 2 ml de méthanol et ajuste le pH à 6 par addition d'une solution aqueuse de bisulfate de potassium à 10%. Pendant toute la durée de l'opé- ration le pH est maintenu entre 6 et 6,5 par addition de solution de bisulfate de potassium à 10%. Après une heure, on ajoute à nouveau une solution de 0,225 g de cyanoborohydrure de sodium dans 2 ml de méthanol et après 6 heures on effectue une nouvelle addition (même quantité). Après 20 heures, le pH n'évolue plus. On concentre sous vide à température inférieure à 40 C. On reprend le résidu dans l'acétate d'éthyle et lave la solution avec une solution saturée de bicarbonate de sodium puis avec de l'eau. On sèche sur sulfate de sodium puis concentre sous vide. Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice. On élue avec le mélange acétate d'éthyle-hexane 7/3 vol/vol. En triturant le produit obtenu avec de l'éther, on obtient une poudre incolore(0,43 g): F = 199-201 C; (alpha)D = -10,5 (c = 0,2 DMF). Selon une variante du procédé, on peut opérer à chaud. On opère sur les mêmes quantités de réactif,dissoutes dans 20 ml de méthanol contenant 0, 3ml d'acide acétique. Après 30 minutes d'agitation, on ajoute par fractions en 35 minutes la solution de 0,65 g de cyanoborohydrure de sodium dans 5 ml de méthanol. On chauffe ensuite à 40 C pendant 2 heures puis traite comme indique ci-dessus. Apres chromato- graphie sur gel de silice, on obtient 0,52 g de produit identique à celui obtenu préc6demment. 2 - Boc-Trp-NH-CH-CH2-Asp-Phe-NH2 CH2 H CH3 CH3 On dissout 0,3 g du composé obtenu au paragraphe 1 ci-dessus dans 20 ml d'éthanol à 95 et hydrogène à température et pression ordinaires en présence de 0,03 g de palladium sur charbon à 10%. Apres 3 heures, on filtre le catalyseur et évapore le solvant sous vide à température inférieure à 40 C. Le résidu est trituré avec de l'éther. On essore le solide, et lave plusieurs fois avec de l'éther. On obtient une poudre incolore (0,21 g): F = 180 C (décomposition); (alpha)D = - 20 (c = 0,32 DMF). Les composés selon l'invention ont été étudies en ce qui concerne leurs propriétés théra- peutiques. Plus particulièrement ces composés ont été étudiés in vivo en ce qui concerne leur effet sécrétoire gastrique chez le rat. Le modèle choisi pour la mesure de l'effet sécrétoire est celui de l'estomac de rat anesthé- sié reperfusE. Le protocole suivi est une modification de celui décrit préalablement par Ghosh et Schild. Un rat mâle de souche Wistar de 300 g, à jeun de 18 h, est anesthésié à l'uréthane (solution à 10%, 1,5 ml/100 g i.p.). On pratique ensuite une traché- il otomie et un cathétérisme de la veine du pénis qui permettra l'administration i.v. des peptides. On place ensuite une canule dans l'oesophage jusqu'au cardia et une seconde dans le duodénum (par une duodénotomie effectuée à 3 cm environ du pylore) jusque dans la zone antrale gastrique. Un soluté propionique-succinique (pH 5,5) qui donne une variation linéaire du pH en fonction de la concentration en ions H+ est utilisé pour perfuser l'estomac en circuit ouvert ou fermé avec un débit de 3 ml/min. La température corporelle ainsi que celle du soluté sont contrôlées et maintenues à 30C. La sécrétion acide de l'estomac va entraîner une variation du pH détectée par l'électrode de verre I5 et enregistrée en fonction du temps. Apres stabilisation de la sécrétion basale, on injecte la gastrine par voie intraveineuse soit en perfusion, soit en injection unique. La réponse est enregistrée en fonction du temps et la quantité d'acide sécrété est mesurée sur l'enregistrement par différence avec la sécrétion basale. La même expérience est réalisée soit en injectant le peptide à étudier i. v. sur le plateau de sécrétion acide, soit en associant le peptide avec le stimulant dans des rapports de concentration variables. Enfin, le peptide est administré seul à différentes doses pour examiner son effet agoniste. Les expériences réalisées avec le composé de l'exemple ont donné les résultats suivants: Effet agoniste: Le -produit de l'exemple n'a montré aucun effet agoniste jusqu'à la dose de 1 mg/kg. Effet antagoniste: Le composé a été étudié à différentes doses en ce qui concerne son activité antagoniste. 12- Les résultats obtenus ont permis de déterminer la dose efficace 50 (DE 50) ou dose qui inhibe de 50% la sécrétion gastrique stimulée par la gastrine. Pour le composé de l'exemple, la DE 50 est de 0,3 mg/kg. D'après ces résultats, on constate que: - Les composés selon l'invention présentent un effet agoniste pratiquement nul vis-à-vis de la gastrine et ce malgré la valeur élevée des doses utilisées. - Les composés selon l'invention présentent un effet inhibiteur important sur la sécrétion gastrique dans les conditions expérimentales utilisées. - Par ailleurs, ces composes sont peu toxiques. Par suite, les composés selon l'in- vention pourront être utilisés en thérapeutique humaine dans tous les cas on il est utile de diminuer la sécré- tion gastrique et en particulier pour le traitement des ulcères gastro-duodénaux. Les composés de la présente invention peuvent être utilisés de préférence par voie injectable: intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée. Ils sont utilisés dans un solvant tel que le sérum physio- logique (solution saline isotonique). La posologie peut varier suivant l'intensité de l'effet thérapeutique recherche, la gravité de l'affection à traiter et la voie d'administra- tion utilisée. Elle doit donc être déterminée, pour chaque patient, en fonction de ces divers critères. Le plus souvent elle est comprise entre 0,1 et 10 mg de principe actif par kg de poids corporel. L'invention concerne donc également les compositions pharmaceutiques contenant à titre d'ingrédient actif un peptide selon l'invention en combinaison avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable tel que le sérum physiologique. REVENDICATIONS 1. A titre de produits nouveaux, les tri- et tétra-peptides répondent à la formule générale: R1- X-N--CH- A1-CH-CH2NH-CH-A2- CH-GCONH2 p CHt H CH2 2 IC2 CH2 COOH N 2{C I H (I) dans laquelle - R1 représente l'hydrogène ou un groupe protecteur de la fonction amine, tel que les groupes t-butyloxycarbonyle, benzyloxycarbonyle ou alcanoyle inférieur; - X représente la bêta-alanine ou une liaison directe entre R1 et le groupe amine. - R2 représente un groupe choisi parmi: CH3 -CHf--cH, -CH2CH2-S-CH3 ou (CH2)3-C3; CH3 correspondant aux chaînes latérales des aminoacides naturels: leucine, méthionine, norleucine. J -A1 et A2 désignent chacun indépendamment soit un groupe amide -CO-NH-/soit un groupe r9duit-CH2-NH-. 2. Peptide selon la revendication 1, carac- térisé en ce qu'il répond à la formule: CH3 H3C-C- OC- NH- CH- CONH- CH- CH2NH-CH- CONH- CH -CONH2 CH3 0 C2 CH2 H2 CH2 /X KfIICH3 CH 3 o N 3 3 H 2575 1 63 3. Procédé pour l'obtention des peptides selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir, en présence d'un agent de réduction, un"-aminoaldéhyde convenablement substitua de formule: B - NH - CH - CHO I.- Y1 avec un oi-aminoacide de formule NH2 - CH - COOH Y2 formules dans lesquelles: B représente un groupe protecteur de la fonction amine ou un peptide protégé sur l'amine N-terminal, Y1 et Y2 représentent les chaines latérales correspondant aux noacides naturels leucine, norleucine, méthionine et acide aspartique. 4. Composition pharmaceutique inhibitrice de la sécrétion gastrique, caractérisée en ce qu'elle contient.à titre d'ingrédient actif,un peptide selon l'une des revendications 1 ou 2, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.