FR 2576910 A1 19860808 FR 8601314 A 19860130 2 5 76910 La présente invention concerne un procédé pour effectuer des déterminations enzymatiques et des compositions chimiques stables comme substrats pour la mise en oeuvre dudit procédé. Les essais ci-dessus exploitent l'activité de diverses enzymes vis-à-vis des peroxydes, selon les réactions générales suivantes: Enzyme + ROOH) C + ROH (I) C + AH2 > Enzyme + H20 + A (II) o C représente le composé enzyme-radical oxygène et A est une substance chromogène qui change de couleur par perte des atomes d'hydrogène. L'enzyme peut être n'importe quelle enzyme qui est active vis-à-vis du peroxyde, comme défini précédemment, y compris, mais sans limitation: peroxydase, catalase et myélo- oeroxydase. Dans la description qui va suivre, on utilisera pour simplifier la peroxydase comme exemple d'enzyme. Des exemples de substances chromogènes sont les suivants: chloronaphtol, benzidine, tétraméthylbenzidine, 3-amino- 9-éthylcarbazole, dichloronaphtol, dibromonaphtol, dichlorhydrate de 3,3', 5,5'-tétraméthylbenzidine, 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine (ou dichlorhydrate dihydraté), 3-méthylbenzothiazole-2,1-hydrazone, acide parahydroxyphénylacétique, acide 2,2'-azino-bis(3-éthyl- benzothiazolinesulfonique), 4-aminoantipyrine/phénol, o-dianisidine, otoluidine, acide 5-amino-salicylique, galacol, o-tolidine, pyrogallol. Des exemples de tests couramment utilisés sont décrits brièvement ciaprès: Détermination immuno-enzymatique (E.I.A.) Dans cet essai, à un milieu dans lequel on recherche la présence d'un certain antigène, on ajoute l'anticorps insolubilisé approprié, un conjugué peroxydaseanticorps. Après lavage, on ajoute un substrat contenant H202 et une substance chromogéne. En présence de l'antigène recherché, le conjugué peroxydase-anticorps est fixé à l'antigène. L'addition du substrat provoque la décom- position de H202 par la peroxydase avec développement de couleur. Détermination immunolopique de oeroxydase (I.P.A.) Cette technique utilise un antigène, un anti- antigène et un produit conjugué composé d'un conjugué peroxydase- anticorps-anti-anticorps-anti-antigène. La peroxydase est liée et il y a développement de couleur comme ci-dessus à l'addition du substrat. Technique à la peroxydase-anti-peroxydase (P.A.P.) Cette technique utilise couramment la fixation mutuelle des agents suivants: antigène, anti-antigène (produit chez le lapin), Ig.G de chèvre anti-lapin et peroxydase-anti- peroxydase (anti-peroxydase produite chez le lapin). La liaison ou fixation de la peroxydase est à nouveau obtenue à l'addition du substrat, conduisant au développement de couleur. Outre les tests ci-dessus, on met habituellement en oeuvre d'autres tests extracellulaires,par exemple pour déceler l'activité enzymatique dans un milieu donné. Dans ces cas, le substrat est ajouté directement au milieu contenant l'enzyme et on obtient la concentration d'activité d'enzyme à partir de l'intensité de la couleur produite. Les tests ci-dessus et des tests semblables sont largement utilisés actuellement pour divers tests cliniques. L'uti- lisation desdites techniques est cependant fortement gênée par la nécessité de préparer des solutions fraîches de substrat peu de temps avant l'emploi, car les substances chromogènes et les peroxydes. ne peuvent pas coexister pendant de longues durées, à cause du développement de couleur spontané qui se produit en raison de la décomposition du peroxyde pour donner un radical oxygène, qui a lieu très facilement sous l'influence de la lumière, des ions métalliques, des impuretés, etc. Un substrat qui a spontanément réagi de cette manière ne peut pas être employé pour obtenir des résultats fiables et doit être remplacé. Comme il sera évident pour l'homme de l'art, il serait très souhaitable de pouvoir obtenir une technique pour la mise en oeuvre de déterminations enzymatiques qui utilise des substrats pouvant être stockés prêts à l'emploi sans détérioration, de manière à rendre plus simple et plus rapide tous les tests les utilisant. 2 5 76910 La demanderesse a décrit dans une demande de brevet antérieure un procédé et des compositions chimiques pour stabiliser des mélanges de substances chromogènes et de peroxydes et des solu- tions stables ainsi obtenues. La demanderesse a découvert selon l'invention qu'il est possible de proposer une technique pour mettre en oeuvre des déterminations enzymatiques utilisant des solutions stables de cetype. On a également découvert selon l'invention que lorsque ces solutions sont à utiliser comme dans la technique de l'invention comme substrats dans des tests biologiques, il existe des conditions particulières à respecter quant à la composition et aux conditions, selon qu'elles sont à utiliser dans des tests intracellulaires ou extracellulaires. En particulier, la demanderesse a découvert que lorsque l'on met en oeuvre des tests intracellulaires, les proportions entre le solvant organique et la solution aqueuse doivent être comprises dans une gamme prédéterminée, afin d'obtenir des réactions de coloration utiles, cette gamme étant différente pour le cas o l'on souhaite effectuer un test intracellulaire, et beaucoup plus limitée dans ce cas qu'avec les tests extracellulaires. La technique des tests de déterminations enzyma- tiques selon L'invention consiste à mettre en contact le milieu dans lequel on recherche la présence d'enzyme avec une composition contenant: a) un composé chromogène; b) un peroxyde; c) un solvant organique miscible avec l'eau; d) un solvant aqueux ou une solution tampon; et e) un composé de formule générale: R 1 (I) R32 R3 2 5 76910 dans laquelle R1, R2, R3 et R4 peuvent être indépendamment un atome d'hydrogène ou d'halogène ou un groupe hydroxy, CF3, nitro, S020H, NHCH2CH2NH2 ou alkyle inférieur et X est un atome d'azote, d'oxygène, de soufre ou de carbone-;et _ est une liaison simple ou double; ou un composé de formule R ' ((II) R. R6 dans laquelle R5, R5', R6 et R6' peuvent être chacun un atome d'hydrogène ou d'halogène ou un groupe alcényle inférieur, NH2, phényle facultativement substitué, NO2, OCH3, hydroxy, COOC6H5, COOH, CH2COOH ou S020H; ou un composé de formule R7 - A R8 _ (III) _/ R9R10 dans laquelle R7 et R8 peuvent être chacun un groupe hydroxy ou alcényle inférieur, R9 est un groupe aLcényle et R10 est un groupe azulène facultativement substitué par un ou plusieurs groupes alkyles en C1-C10 à chaîne droite ou ramifiée; ou un composé de formule y I R* (IV) Z dans laquelle Y et Z peuvent être chacun un atome d'oxygène, de soufre ou d'azote (-) et R1l est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyphényle; et.... est une liaison simple ou double; ou un composé de formule o (V) R15 R12 14 0 13 dans laquelle R12 R13, R14 et R15 peuvent être chacun un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy ou alkyle inférieur; ou un sel d'un des composés (I), (II), (III), (IV) ou (V); et à examiner s'il y a eu développement de couleur. Le solvant organique miscible avec l'eau a de préférence un moment dipolaire en phase gazeuse égal ou supérieur à 1,60 D. Selon le mode de mise en oeuvre préféré de L'invention, l'enzyme est choisie parmi la peroxydase, la catalase et la myéloperoxydase. Le procédé selon L'invention peut être utilisé utilement dans des tests intracellulaires, par exemple dans la dernière étape d'un test IPA ou PAP. Selon un mode de mise en oeuvre préféré, le procédé de l'invention est encore intéressant lorsque le test est une recherche d'activité enzymatique extracellulaire, par exemple dans la dernière étape d'un test EIA. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, lorsque l'essai est un essai intracellulaire, le rapport entre le solvant organique et la solution aqueuse est compris entre 40: 55 et 25: 75 en volume, de préférence il est d'environ 35: 65 en volume. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, lorsque l'essai est un essai extracellulaire, le rapport en volume entre le solvant organique et la solution aqueuse est compris entre 80: 20 et 20: 80. On a trouvé que le diméthylsulfoxyde est un solvant organique particulièrement approprié, à la fois dans les tests intracellulaires et extracellulaires. La composition chimique pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle contient: 2 5 76910 a) un composé chromogène; b) un peroxyde; c) un solvant organique miscible avec l'eau; d) un solvant aqueux ou une solution tampon; et e) un composé de formule générale (I), (II), (III) (IV) ou (V), telle que définie ci-dessus, ou un sel d'un de ces composés. Ladite composition peut en outre contenir dans la solution aqueuse de 0 à 0,5 % (5 000 ppm) d'agents chélatants. Les agents chélatants sont choisis de préférence parmi les pyro- phosphates, l'acétanilide, les citrates et la 8-hydroxyquinoléine, soit seuls, soit en mélangesde deux ou plusieurs d'entre eux. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, ladite composition contient: 0 à 0,02 % de pyrophosphate, 0 à 0,02 % d'acétanilide, 0 à 0,1 % de citrate, 0 à 0,2 % de 8-hydroxyquinoléine ou de son sel hémisulfate. Le solvant organique miscible avec t'eau a de préférence un moment dipolaire égal ou supérieur à 1,60 D. Le solvant organique est choisi de préférence parmi les suivants: méthanol, éthanol, dioxanne, diméthylsulfoxyde, sulfolane, diméthylsulfone, hexaméthylphosphorotriamide et diméthyl- formamide. Le composé de formule (I) est de préférence choisi parmi les suivants: 8hydroxyquinoléine ou son sel de cuivre ou son sel hémisulfate, 4-chloro-7(trifluorométhyl)-quinotéine, -chloro-7-iodo-8-hydroxyquinoléine et 5chloro-8-hydroxyquinoléine. Le composé de formule (II) est de préférence l'acide 4-anilinesulfonique et le composé de formule (III) est de préférence le cholécalciférol. Le tampon est choisi de préférence parmi les suivants: tampon au phosphate (PB), tampon Tris (trishydroxyméthyl- aminométhane), tampon au borate et tampon à la glycine. La substance chromogène est de préférence choisie parmi Les composés suivants: chLoronaphtol, benzidine, tétraméthyt- benzidine, 3-amino-9-éthylcarbazole, dichloronaphtoL, dibromonaphtol, dichlorhydrate de 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine, 3,3',5,5'-tétra- méthylbenzidine (ou dichlorhydrate dihydraté) 3-méthylbenzo- thiazole-2,1hydrazone, acide parahydroxyphénylacétique, 2,2'-acide azino-bis(3éthylbenzothiazoline-sulfonique), 4-aminoantipyrine/ phénol, odianisidine, o-toluidine, acide 5-amino-salicylique, galacol, o-tolidine et pyrogallol. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, le rapport en volume entre le solvant organique et la solution aqueuse est compris entre 45: 55 et 25: 75, de préférence il est d'environ 35: 65 en volume. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, le rapport entre Le solvant organique et la solution aqueuse est compris entre 80: 20 et 20: 80 en volume. Le pH desdites compositions doit être de 7 à 8, de préférence environ 7,6. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. Exemples 1 à 15 Les exemples suivants illustrent l'action intra- cellulaire ou extracellulaire des compositions de l'invention. On prépare plusieurs compositions en utilisant le diméthylsulfoxyde (DMSO) comme solvant organique et un tampon Tris et en faisant varier leur rapport en volume. Toutes les compositions contiennent les substances suivantes: 100 mg de sel hémisulfate de 8-hydroxyquinoléine, 500 mg de 4-chloro-l- naphtol, de l'eau distillée, 80 mg d'acétanilide, 80 mg de pyro- phosphate et 800 mg de citrate. Le volume total de l'eau et du DMSO est de 1 l. On stocke les compositions résultantes pendant un mois sur l'étagère et on les utilise pour effectuer des tests comparatifs de recherche de la présence de peroxydase,à la fois sous forme fixée intracellulaire et sous forme libre en solution (raifort). Les résultats de ces essais, exprimés en coloration relative, sont indiqués en détail dans le tableau suivant. TABLEAU Coloration N DMSO d'essai % en volume Enzyme fixée Enzyme libre 1 10 faible faible 2 20 faible bonne 3 25 bonne forte 4 30 forte forte 35 forte forte 6 40 forte forte 7 45 bonne forte 8 50 faible forte 9 55 - forte 60 - forte 11 65 forte 12 70 - forte 13 75 - bonne 14 80 - bonne 85 - faible Exemple 16 On effectue un test EIA pour la détermination de la gonadotropine chorionique humaine en utilisant le système 4-aminoantipyrine/phénol comme chromogène, avec une composition semblable à celle des exemples précédents, d'une teneur en DMSO de 35 %. Par application du substrat, il y a développement d'une couleur rose. On estime la teneur en peroxydase fixée par spectrophotométrie à 510 nm. Exemple 17 On répète le test de l'exemple 16 en utilisant la o-dianisidine mais avec une teneur en DMSO de 30 %. Il y a développement de couleur que l'on lit à 400 nm. Exemple 18 On répète le test de l'exemptéle 16 en utilisant l'acide 5-aminosalicylique comme chromogène. On estime la concen- tration par lecture de l'absorption à 540 nm. Exemple 19 On effectue un test IPA pour la détermination de Chlamydia Trachomatis, dans une composition semblable à celle des exemples 1 à 15, avec une teneur en DMF de 35 %. Le chromogène utilisé est le 4-chloro-1-naphtol. Par addition du substrat, on obtient un complexe de couleur outremer insoluble. Exemple 20 On effectue un test PAP avec une teneur en DMSO de 25 % en utilisant le 4chloro-1-naphtol comme chromogène pour la détermination du virus d'Epstein-Barr. A l'addition du substrat, on obtient un complexe insoluble de couleur outremer. Exemples 21 à 23 On essaye une solution pour estimer les teneurs en peroxydase produites à partir de raifort. On met en oeuvre trois tests différents utilisant l'éthanol comme solvant avec une teneur de 65 % par rapport au tampon, en utilisant comme chromogènes différents le 4-chloro-1-naphtol, la o-dianisidine et le galacol. Les trois tests donnent tous des résultats comparables. Tests comparatifs On met en oeuvre tous les exemples ci-dessus avec des substrats fraîchement préparés et avec des substrats stockés plusieurs semaines sur l'étagère. On ne trouve pas de différence décelable entre Les résultats obtenus avec les compositions fraîchement prépareeset avec les compositions préparées plusieurs semaines auparavant. Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustration et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la mise en oeuvre de déterminations enzy- matiques, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact le milieu dans lequel on recherche la présence d'enzyme avec une compo- sition contenant: a) un composé chromogène; b) un peroxyde; c) un solvant organique miscible avec l'eau; d) un solvant aqueux ou une solution tampon; et e) un composé de formule générale: R R10 R1 R2 - R4 I) dans laquelle R1, R2, R3 et R4 peuvent être indépendamment un atome d'hydrogène ou d'halogène ou un groupe hydroxy, CF3, nitro, S020H,. NHCH2CW2NH2 ou.lkyle inférieur et X est un atome d'azote, d'oxygène, de soufre ou de carbone -; et est une liaison simple ou double; ou un composé de formule R5 R Rt5 (II) R5 R6, dans laquelle R5, R5', R6 et R6' peuvent être chacun un atome d'hydrogène ou d'halogène ou un groupe alcényle inférieur, NH2, phényle facultativement substitué, NO2, OCH3, hydroxy, COOC6H5, COOH, CH2COOH ou S020H; ou un composé, de formule R7 R 8 (III) R9R10 9 10 dans laquelle R7 et R8 peuvent être chacun un groupe hydroxy ou alcényle inférieur, R9 est un groupe alcényle et R10 est un groupe azulène facultativement substitué par un ou plusieurs groupes alkyles en C1-C10 à chaîne droite ou ramifiée; ou un composé de formule > R 1 1R(IV) N z dans Laquelle X et Z peuvent être chacun un atome d'oxygène, de soufre ou d'azote (-) et Rl est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyphényle; ou un composé de formule 0 R15 12 11 11 C(v) R14 R13 o0 dans laquelle R12, R13, R14 et R15 peuvent être chacun un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy ou alkyle inférieur; ou un sel d'un des composés (I), (I, III), (II), (IV) ou (V); et à examiner s'il y a eu développement de couleur. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le solvant organique miscible avec l'eau a un moment dipo- taire en phase gazeuse égal ou supérieur à 1,60 D. 3. Procédé selon La revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le test est une détermination intracellulaire. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le test est la dernière étape d'une détermination immunologique de peroxydase (I.P.A.). 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le test est la dernière étape d'une détermination à la peroxydase-anti-peroxydase (P.A.P.). 6. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le test est une détermination d'activité enzymatique extracellulaire. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 6, caractérisé en ce que le test est la dernière étape d'une détermination immuno-enzymatique (E.I.A.). 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le rapport entre le solvant organique et la solution aqueuse est compris entre 40: 50 et 25: 75 en volume, de préférence d'environ 35: 65 en volume. 9. Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que le rapport en volume entre le solvant organique et la solution aqueuse est compris entre 80: 20 et 20: 80. 10. Procédé selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que le solvant organique est le diméthylsulfoxyde. 11. Composition chimique pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, carac- térisée en ce qu'elle contient: a) un composé chromogène; b) un peroxyde; c) un solvant organique miscible avec l'eau; d) un solvant aqueux ou une solution tampon; et e) un composé de formule générale (I), (II), (III), (IV) ou (V) définie à la revendication 1, ou un sel d'un de ces composés. 12. Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce que le solvant organique miscible avec l'eau à un moment dipolaire égal ou supérieur à 1,60 D. 13. Composition selon la revendication 11 ou 12, carac- térisée en ce que la solution aqueuse contient en outre de 0 à 0,5 % (5 000 ppm) d'agents chélatants. 14. Composition selon la revendication 13, caractérisée en ce que les agents chélatants sont choisis parmi les pyrophosphates, l'acétanilide, les citrates et la 8-hydroxyquinoléine, soit seuls, soit en mélanges de deux ou plusieurs d'entre eux. 15. Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle contient: 0 à 0,02 % de pyrophosphate, 0 à 0,02 % d'acétanilide, 0 à 0,1 % de citrate, 0 à 0,2 % de 8-hydroxyquinoléine ou de son sel hémisulfate. 16. Composition selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 15, caractérisée en ce que le solvant organique est choisi parmi les suivants: méthanol, éthanol, dioxanne, diméthyl- sulfoxyde, sulfolane, diméthylsulfone, hexaméthylphosphorotriamide et diméthylformamide. 17. Composition selon l'une quelconque des revendi- cations 11 à 16, caractérisée en ce que le composé de formule (I) est choisi parmi les suivants: 8-hydroxyquinoléine ou son sel de cuivre ou son sel hémisulfate, 4-chloro-7-(trifluorométhyl)- quinoléine, 5-chloro-7-iodo-8-hydroxyquinoléine et 5-chloro-8- hydroxyquinoléine. 18. Composition selon l'une quelconque des revendi- cations 11i à 16, caractérisée en ce que le composé de formule (II) est l'acide 4-anilinesulfonique. 19. Composition selon l'une quelconque des revendi- cations 11 à 16, caractérisée en ce que le composé de formule (III) est le cholécalciféroi. 20. Composition selon l'une quelconque des revendi- cations 11 à 19, caractérisée en ce que le tampon est choisi parmi les suivants: tampon au phosphate (PB), tampon Tris (trishydroxy- méthylaminométhane), tampon au borate et tampon à la glycine. 21. - Composition selon l'une quelconque des revendi- cations 11 à 20, caractérisée en ce que la substance chromogène est choisie parmi les composés suivants: chloronaphtol, benzidine, tétraméthylbenzidine, 3-amino-9-éthylcarbazole, dichloronaphtol, 2576910 dibromonaphtol, dichlorhydrate de 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine, 3,3',5, 5'-tétraméthylbenzidine (ou dichlorhydrate dihydraté), 3méthylbenzothiazole-2,1-hydrazone, acide parahydroxyphénylacétique, acide 2,2'-azino-bis(3-éthylbenzothiazoline-sulfonique), 4-amino- antipyrine/phénol, o-dianisidine, o-toluidine, acide 5-amino- salicylique, gaîacol, o-tolidine et pyrogallol. 22. Composition pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisée en ce que le rapport en volume entre le solvant organique et la solution aqueuse est compris entre 45: 55 et 25: 75. 23. Composition selon la revendication 22, caractérisée en ce que le rapport en volume entre le solvant organique et la solution aqueuse est d'environ 35: 65 en volume. 24. Composition pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 6, caractérisée en ce que le rapport entre le solvant organique et la solution aqueuse est compris entre : 20 et 20: 80 en volume. 25. Composition selon l'une quelconque des revendi- cations 22 à 24, caractérisée en ce qu'elle a un pH de 7 à 8. 26. Composition selon la revendication 25, caractérisée en ce qu'elle a un pH d'environ 7,6. 27. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'enzyme est choisie parmi La perokydase, la catalase et la myéLoperoxydase.