FR 2584606 A1 19870116 FR 8510788 A 19850712 Utilisation de polv- et oliaosaccharides pour l'obten- tion de médicaments actifs dans les patholoqies du tissu conjonctif. L'invention a pour objet l'utilisation de poly- et oligosaccharides pour l'obtention de médicaments actifs dans les pathologies du tissu conjonctif. Parmi ces pathologies, les maladies cardio- vasculaires, ostéo-articulaires et pulmonaires et autres maladies du vieillissement et également les processus inflammatoires de façon générale, ainsi que de nom- breuses tumeurs malignes, entraînent des incapacités dont la fréquence et la gravité augmentent souvent exponentiellement avec l'âge. Les mécanismes exacts de ces maladies ne sont pas complètement élucidés. Il est cependant admis qu'il existe un certain nombre de mécanismes cellulaires et moléculaires connus impliquant, notamment des déséqui- libres de rapports protéases/antiprotéases à activité élastinolytique, plus spécialement des rapports élas- tases (en particulier élastase leucocytaire)/anti- élastases. On sait, par exemple, que certaines maladies pulmonaires, telles que l'emphysème, ou des maladies artérielles, telles que l'artériosclérose, impliquent des systèmes élastase/élastine et leurs inhibiteurs. Il est généralement admis que l'élastolyse pulmonaire est une étape initiale et fondamentale dans le développement de l'emphysème. Cette élastolyse serait due à une diminution du taux des inhibiteurs d'élastases ou à leur inactivation, ou encore à une augmentation de l'activité élastolytique locale tissulaire. Le rapport élastases/inhibiteurs d'élastases constitue donc un facteur capital dans le développement de cette pathologie. Les élastases le plus souvent impliquées à cet égard correspondent à l'élastase leucocytaire et à l'élastase des monocytes-macrophages. Il s'agit respec- tivement d'une sérine-protéase et d'une métallo-pro- téase. Dans les autres maladies évoquées, on note également une augmentation de l'activité de certaines protéases, souvent de protéases de type élastase. Une augmentation exponentielle de la biosynthèse d'une protéase de type élastase (sérine-protéase) ancrée dans la membrane cellulaire des cellules musculaires lisses vasculaires, l'existence d'une élastase de type métallo- protéase dans les fibroblastes pouvant être excrétée dans le milieu et augmentant également avec le nombre de doublements de population cellulaire, c'est-à-dire avec le vieillissement in vitro, ont été démontrées récem- ment. Le rapport de ces élastases et de leurs inhibi- teurs est en déséquilibre soit parce que l'élastase est secrétée en quantité trop importante, soit parce qu'il existe un défaut en inhibiteurs d'élastase, et notamment une déficience en alpha-1 protéinase inhibiteur, ou al- pha 1 anti-trypsine, désignée ci-après par alpha 1PI. Ce déséquilibre peut encore résulter de l'adsorption rapide de l'élastase sur les fibres élastiques et de son inac- cessibilité aux inhibiteurs. Jusqu'à présent, ces maladies n'ont pas trouvé de médication valable universellement acceptée et appli- quée. Pour traiter par exemple l'emphysème, on utilise généralement des inhibiteurs naturels ou de synthèse. Comme inhibiteur naturel, il s'agit principalement de l'alpha-1 PI provenant d'un donneur. Cet inhibiteur est perfusé chez un receveur emphysémateux. Etant donné la faible période biologique de l'alpha 1 PI, il est néces- saire d'effectuer ce traitement de façon répétitive, ce qui le rend difficilement applicable sur le plan cli- nique. Les inhibiteurs synthétiques des élastases effi- caces in vitro, tels que les peptides chlorométhylcéto- nes ou les fluorures de sulfonyle, présentent des incon- vénients majeurs in vivo. Leur taux de sélectivité est en effet peu élevé, leur toxicité est loin d'être négli- geable et, en outre, ils ne sont efficaces que s'ils sont injectés très peu de temps avant ou après l'injec- tion intratrachéale d'élastase induisant l'emphysème (leur efficacité dépend, en effet, de la rapidité du contact avec le site actif de l'enzyme). Les travaux effectués par les inventeurs dans ce domaine les ont amenés à constater qu'en utilisant cer- tains poly- et oligosaccharides déjà connus pour leurs propriétés régulatrices vis-à-vis de la coagulation sanguine, il est possible d'obtenir des médicaments actifs sur les protéases à activité élastinolytique, de sélectivité élevée, de grande efficacité et pratiquement dépourvus d'effets secondaires. L'invention a donc pour but de fournir de nou- veaux médicaments utilisables dans les pathologies du tissu conjonctif impliquant des déséquilibres protéases anti-protéases. Elle vise également leur utilisation sous différentes formes d'administration pour prévenir et traiter les facteurs responsables des déséquilibres de ces systèmes. Conformément à l'invention, on utilise, pour l'obtention d'un médicament actif vis-à-vis des patholo- gies du tissu conjonctif, un glycosaminoglycane ou un fragment de glycosaminoglycane, le cas échéant sous forme de sel pharmacologiquement acceptable. On rappelle que les glycosaminoglycanes ou GAGS sont essentiellement formés de motifs alternés acide uronique-sucre aminé (ou l'inverse), du type de ceux rencontrés dans les chaînes oligo- et polysaccharidiques de GAGS naturels biologiquement actifs comme l'héparine, ou l'héparine-sulfate, les chondroitines, les chondroi- tines-sulfates ou l'acide hyaluronique. Dans ces chaî- nes, les motifs acide uronique répondent plus spéciale- ment à la structure acide D-glucuronique ou L-iduronique et les motifs sucre aminé à celle de la D-glucosamine (dans l'héparine ou l'héparanesulfate par exemple), ou de la D-galactosamine dans les autres produits cités. Dans la description et les revendications, le terme GAG est utilisé aussi bien pour désigner les glycosaminoglycanes naturels, leurs fragments ou chaînes de bas poids moléculaires, ou leurs sels pharmacologi- quement acceptables. On sait que certains produits naturels renfer- ment des chaines possédant une affinité élevée pour l'antithrombine III (AT-III) ou le co-facteur II de l'héparine (HCII). Par extraction alcoolique ou par dépolymérisa- tion nitreuse ou enzymatique, il est possible d'augmen- ter le taux de ces chaines et d'élaborer des GAGS ayant une activité plus spécifique vis-à-vis du facteur Xa de la coagulation. Ces compositions sont caractérisées par des rapports du titre Yin-Wessler (mesure de l'activité anti-Xa qui exprime l'activité antithrombotique) et du titre USP (mesure de l'activité anticoagulante globale) plus élevé que l'héparine, c'est-à-dire supérieur à 1. Le titre USP peut devenir pratiquement nul chez certains GAGS et le titre YW dépasser des valeurs de 2000 u/mg. D'une manière surprenante, l'étude in vitro et in vivo de ces GAGS a montré leur efficacité sur diffé- rentes élastases purifiées. Plus spécialement, ces produits exercent une forte inhibition, de grande sélectivité, de l'élastase leucocytaire, enzyme principalement impliquée dans les pathologies du tissu conjonctif liées à des déséqui- libres du rapport élastase/anti-élastase. D'une manière avantageuse, cette inhibition s'étend à la cathepsine G, qui se trouve avec l'élastase leucocytaire dans les leucocytes polymorphonucléaires et qui potentialise son activité au niveau des lésions tissulaires, inflammatoires aiguës ou chroniques. Selon un autre aspect de grand intérêt, ces produits sont capables d'augmenter le taux sérique des inhibiteurs d'élastase. Selon un mode de réalisation de l'invention, le GAG utilisé pour l'élaboration de médicaments selon l'invention est à base des motifs alternés D-glucos- amine-acide uronique (acide L-iduronique ou D-glucuro- nique) tels que rencontrés dans l'héparine ou l'hépa- rane-sulfate. Dans un mode préféré de mise en oeuvre, il s'agit d'héparine. Dans un autre mode de mise en oeuvre préféré, le GAG utilisé est constitué par de l'héparan sulfate. Dans un autre mode préféré encore, le GAG de départ possède un poids moléculaire inférieur à celui de l'héparine ou de l'héparan sulfate. En particulier, le poids moléculaire (PM) est inférieur à 10 000 daltons environ. Ces GAGS de bas poids moléculaire ou bas PM comprennent, notamment, les produits suivants, à sa- voir: - Les mucopolysaccharides tels qu'obtenus par extraction alcoolique, à partir d'héparine, selon le brevet FR 78 31357 du 6.11.1978 et le premier certificat d'addition 79 18873 du 20.07.1979. Ces produits, selon l'un des aspects envisagés dans le brevet principal, sont formés d'un mélange de chaines de poids moléculaires d'environ 2000 à 8000 et des rapports des titres Yin Wessler/USP d'au moins 2. Parmi les produits décrits, on citera ceux possédant un rapport YW/USP de l'ordre de 3 à 5 et des poids molécu- laires moyens de 3000 à 5500 appelés ci-après CY 216. - Les mucopolysaccharides tels qu'obtenus par dépolymérisation ménagée de l'héparine à l'aide d'acide nitreux, selon notamment le deuxième certificat d'addi- tion 80 06 282 du 20.03.1980 au brevet FR 78 31357 ci- dessus ou la demande de brevet FR 81 07283 du 10.04.- 1981. Ces produits répondent d'une manière générale aux caractéristiques ci-dessus mais sont terminés par des groupes de structure 2,5-anhydro-manno. On citera notamment les mucopolysaccharides du type possédant une extrémité 2,5-anhydro-mannitol, appelés ci-après CY 222, ou encore une extrémité acide 2,5-anhydro-mannonique. Les poids moléculaires des chaînes glycosidiques majoritaires sont plus spéciale- ment de l'ordre de 2000 à 3000, notamment d'environ 2000 à 2600. Les rapports des titres Yin-Wessler/USP sont notamment d'au moins 10 avec des titres Yin-Wessler d'au moins environ 200 u/mg. - Les mucopolysaccharides essentiellement formés de chaînes (1) d'un poids moléculaire moyen de 3000 à 6000 daltons, notamment de 4000 à 5000 environ (2) pos- sédant un titre YW/USP inférieur à 10, notamment d'envi- ron 6 à 3, (3) terminées par des motifs de structure 2,5-anhydromanno, tels qu'obtenus par exemple selon la demande de brevet FR 84 15978 du 18.10.1984. - Les oligosaccharides formés de 8 motifs sucre au plus, de titre YinWessler élevé pouvant atteindre 2000 u/mg et de titre USP faible, pratiquement nul, dotés d'une forte affinité pour l'AT-III, tels que décrits notamment dans la demande EU 80 401 425 du 6.10.1980. Selon une variante, ces oligosaccharides sont obtenus par dépolymérisation nitreuse ménagée et sont terminées par des groupes de structure 2,5-anhydromanno. Selon une autre variante, le motif de début de chaîne correspond à un motif uronique insaturé, tel que formé en soumettant l'héparine à une dépolymérisation ménagée à l'aide d'une héparinase. En particulier, ces oligosaccharides sont formés des octosaccharides de structure ABCDEFGH répondant à la formule ci-dessous: CoO OR -OR COO OR -OR o o 0 OH H O 4XO H '- H O O oS03 NHSO3 OH NHAC OH NHSO3 OSO3 NHSO3 A B C D E F G H - Des compositions homogènes d'hexasaccharides, telles qu'obtenues selon la demande FR 81 08604 du 29.04.1981 en soumettant les octasaccharides cidessus à l'action ménagée d'une héparinase. En particulier, ces compositions répondent à la formule ci-dessous: OR COO OR OR " o. Do Do o eto COO- 3) 0o t H H H O-O O OH H H OH NHAc OH NHSO3 OSO3 NHSO3 C' D E F G H - Des oligo- ou polysaccharides de degré de polymérisation homogène, notamment ceux obtenus par filtration, sur un matériau tel que du Séphadex, des produits CY 222, CY 216 héparine, ou d'autres GAGS, ou par chromatographie par gradient de force ionique. - Des GAGS tels qu'obtenus par action de perio- date sur l'héparine, suivie de traitement en milieu basique. - Des GAGS dits totaux, correspondant aux compo- sitions de GAGS obtenues par traitement d'organes ani- maux. - Des GAGS tels qu'obtenus par dépolymérisation de l'héparine avec de l'héparinase ou de l'acide nitreux par séparation des fractions la séquence de fixation à l'AT-III et gel filtration de ces fractions afin d'obte- nir d'une part des fragments de GAGS de degré de polymé- risation varié. Il peut s'agir, par exemple, de fragments de dp supérieur à 12, d'une part, et d'autre part de fragments de GAGS de degré de dépolymérisation inférieur, notam- ment de dp 12, 10, 8, 6 et 4. Ces différents GAGS ne sont cités qu'à titre d'exemples, étant entendu qu'ils correspondent à des produits particulièrement bien connus de la Demanderesse qui les a mis au point et décrits dans les différents brevets et demandes de brevets ci-dessus déposés à son nom. Tout autre glycosaminoglycane peut être mis en oeuvre pour l'élaboration des médicaments de l'inven- tion. Ainsi, selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, le GAG mis en oeuvre est à base de mo- tifs alternés D-galactosamine-acide uronique, tels que rencontrés par exemple dans le dermanatane sulfate, les chondroitines, les chondroitinessulfates ou encore l'acide hyaluronique. Dans une variante, il s'agit avantageusement de dermatane-sulfate. Selon une autre variante, le GAG mis en oeuvre est formé de chondroitines ou de chondro tines-sulfates. Dans une autre variante encore, le GAG est constitué par de l'acide hyaluronique. Selon une autre disposition, les GAGS de départ sont homogènes au regard de leur degré de polymérisa- tion. Ces GAGS sont obtenus, par exemple, par filtration sur un gel d'un mélange de dépolymérisation d'héparine. Cette séparation est facilitée par l'utilisation de mé- langes de dépolymérisation formés de chaînes de degré de polymérisation pair. Selon une variante, dont la mise en oeuvre est également facilitée par l'utilisation de mélanges de dépolymérisation formés de chaînes de degré de polyméri- sation pair, on soumet le mélange de GAGS à une opéra- tion de gel filtration afin d'obtenir des GAGS homogènes au regard de leur degré de polymérisation. Selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, on utilise un GAG dont le profil de sulfa- tation est modifié. Il s'agit de produits tels que définis ci-dessus dans lesquels une partie, voire la majorité et même la totalité des groupes -OH sont remplacés par des groupes esters sulfuriques S03 Des produits de ce type sont notamment décrits dans la demande FR déposée ce jour au nom de la demande- resse et sont avantageusement obtenus, selon le procédé décrit dans cette demande de brevet, par sulfatation d'un GAG donné, mis en oeuvre sous forme d'un sel so- luble en milieu organique. Le degré de sulfatation varie d'environ 2 jus- qu'à des valeurs d'environ 4. Ces GAGS comprennent les produits dans lesquels une partie ou encore la majorité ou même la totalité des groupes -NHSO en position 2 des motifs sucre aminé est remplacée par des groupes -NH-acyle, notamment -NH-acé- tyle. L'étude de l'action des GAGS ci-dessus dans des réactions modèles in vitro ou dans des modèles animaux in vivo a mis en évidence leur grande efficacité. Les travaux effectués à cet égard ont permis de mettre en évidence une forte inhibition, hautement sé- lective, et à faible concentration (0,5 ng/ml) de l'é- lastase leucocytaire ainsi que de la cathepsine G (ca- pable de potentialiser l'activité de l'élastase). Une autre constatation importante concerne la bonne corré- lation entre l'inhibition exercée par ces produits sur l'élastase leucocytaire et la cathepsine G. Les essais in vivo effectués sur le hamster, décrits dans les exemples qui suivent, ont montré qu'ils inhibent fortement l'activité élastasique du sérum et selon un aspect de grande importance qu'ils conduisent à une augmentation progressive du taux sérique des inhibi- teurs d'élastase, en particulier de l'alpha 1PI. Le spectre d'efficacité de ces GAGS s'étend à l'inhibition de la biosynthèse de la fibronectine qui constitue un facteur d'adhésion celulaire intervenant dans l'athérogénèse. Ces GAGS agissent également sur l'inhibition de la synthèse du collagène, en particulier du collagène de type I + III. Une autre propriété des GAGS est d'interférer avec la précipitation des lipoprotéines légères (LDL) par des protéoglycanes artériels. Il est généralement admis que la formation de complexes insolubles libres LDL-protéoglycanes artériels intervient après la forma- tion des dépôts athéromateux. Les phénomènes énumérés ci-dessus sont considérés dans leur ensemble comme importants dans le développement de l'artériosclérose et l'obstruction des vaisseaux. L'intérêt de ces propriétés s'ajoute à la non toxicité connue de ces produits, ce qui les rend parti- culièrement précieux pour l'élaboration de médicaments utilisables dans des pathologies du tissu conjonctif, en particulier en pathologie pulmonaire, vasculaire et ar- ticulaire. Les préparations pharmaceutiques selon l'inven- tion sont caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace des GAGS définis ci-dessus en associa- tion avec des excipients pharmaceutiques. Ces prépara- tions pharmaceutiques sont dépourvues de substances pyrogènes. Des compositions préférées comprennent un véhi- cule pharmaceutique approprié pour l'administration par voie orale. Des formes d'administration de l'invention correspondantes comprennent avantageusement des gélules gastrorésistantes, des comprimés ou tablettes, des pi- lules, ou encore se présentent sous forme de liposomes. D'autres compositions pharmaceutiques compren- nent ces GAGS en association avec les excipients appro- priés pour l'administration par voie rectale. Des formes d'administration correspondantes sont constituées par des suppositoires. Dans d'autres compositions pharmaceutiques, les GAGS se présentent sous forme d'aérosols ou de pommades. L'invention concerne également des compositions pharmaceutiques injectables, stériles ou stérilisables pour l'administration tant par voie intraveineuse qu'in- tramusculaire ou sous-cutanée. Ces solutions renferment avantageusement de 1 à mg/ml de GAGS, de préférence de 20 à 150 mg/ml lors- que ces solutions sont destinées à l'injection par voie sous-cutanée. Elles peuvent contenir, par exemple, de notamment 30 à 100 mg/ml, notamment de 40 à 50 mg/ml de GAGS lorsqu'elles sont destinées à l'injection par voie intraveineuse ou par perfusion. Avantageusement, de telles préparations pharma- ceutiques sont présentées sous la forme de seringues non récupérables, prêtes à l'emploi. Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont particulièrement adaptées pour prévenir ou traiter les maladies cardio-vasculaires, ostéoarticulaires, pulmonaires ou autres maladies du vieillissement impli- quant des lésions du tissu conjonctif. Ces compositions sont plus spécialement appro- priées pour prévenir ou traiter les déséquilibres élastase, en particulier élastase leucocytaire-anti- *élastase. Elles revêtent également un grand intérêt dans l'athérogénèse étant donné également leur effet inhibi- teur vis-à-vis de la fibronectine, du collagène ainsi que de l'interaction avec les LDL. Elles permettent en outre de réduire le taux de collagène dans les tissus dont la quantité augmente, par exemple, dans les artérioscléroses, en particulier dans les parois vasculaires, dans les fibroses pulmonaires (dans les poumons) et dans les cirrhoses (dans le foie). Leur activité antiélastasique les rend également appropriés pour traiter le développement des maladies vasculaires, dans lesquelles l'attaque des lames basales des capillaires est à la base des accidents vasculaires et cérébraux, ou encore des maladies ostéoarticulaires. Afin d'illustrer l'invention, on indique un exemple de posologie utilisable chez l'homme: cette posologie comprend l'administration d'environ 1 mg à 1,5 g/24 heures selon la voie d'administration, de pré- férence de 5 à 500 mg/jour environ, par exemple de l'or- dre de 200 mg/24 heures par voie intraveineuse ou encore à 500 mg/jour par voie orale. Ces doses peuvent être naturellement ajustées pour chaque patient en fonction des résultats et des analyses de sang effectuées auparavant, la nature des affections dont il souffre et, d'une manière générale, de son état de santé. L'invention concerne également encore l'applica- tion des GAGS selon l'invention à la constitution de réactifs biologiques utilisables au laboratoire, notam- ment à titre de référence de comparaison pour l'étude d'autres produits dont est testée l'activité inhibitrice de protéases. D'autres caractéristiques et avantages de l'in- vention apparaîtront dans les exemples qui suivent. EXEMPLE 1: Etude in vitro sur l'activité élastolytique et la capacité d'inhibition des anti-protéases sériques. a) Dosage de l'activité élastolytique sérique: Le principe du dosage est le suivant: après rupture protéolytique de la liaison amidique entre l'acide aminé et le composé paranitroanilide, ce dernier est libéré. Le paranitroanilide, instable, se cyclise pour donner un composé plus stable présentant un maximum d'absorption à 410 nm: la paranitroaniline. L'activité élastasique est alors estimée colori- métriquement à 410 nm, et est proportionnelle à la quan- tité de moles de substrat hydrolysé. On prépare une solution 125 mM de substrat syn- thétique, le succinoyl-trialanyl-paranitroanilide ou STANA, dans la Nméthyl-2-pyrrolidone, à raison de 79 mg pour 1 ml. On ajoute des quantités croissantes d'élastase et de tampon (Tris/HCl 0, 1M pH 8, Na N3 0,02 % détergent de Brij 0,1 %, NaClO,1 M). On incube les préparations pendant une heure à 37'C, puis on arrête la réaction en ajoutant 20 pl de PMSF. On détermine l'activité enzymatique en mesurant la densité optique en fonction de la concentration en élastase (les quantités d'enzymes sont de l'ordre du nanogramme). b) Dosage de la capacité d'inhibition sérique vis-à-vis de l'élastase. - Principe du dosage. On titre l'activité élastosique résiduelle après avoir ajouté des quantités d'inhibiteurs croissantes contenus dans le sérum de hamster. A cet effet, des quantités variables de sérum contenant l'alpha 1 protéinase inhibiteur et l'alpha 2 - macroglobuline, sont préincubées avec une dose connue d'élastase pancréatique de porc. Puis, après cette pré- icubation, on dose l'activité enzymatique résiduelle sur substrat synthétique, le STANA. La récupération est arrêtée par addition d'acide acétique pur (100 pl). - Mode opératoire. On préincube à température ambiante pendant 30 minutes 80 ng d'enzyme (correspondant à une densité optique de 0,8 pour une heure d'incubation avec le substrat avec des quantités de sérum variant de O à 30 p1.. Le sérum de hamster est dilué au 1/20ème, ce qui permet d'obtenir une inhibition quantifiable mais pas trop importante, au bout d'une heure d'incubation avec l'élastase, après que l'enzyme et le sérum aient été mis en présence pendant 30 minutes, il y a formation d'un complexe enzymeinhibiteur. On rajoute ensuite 20 pl de substrat et du tampon en quantité suffisante pour 1 ml de solution finale. On incube les préparations pendant une heure, puis on arrête la réaction en diminuant le pH par addition de 100 pl d'acide acétique pur. L'activité élastasique résiduelle est déterminée par la densité optique à 410 nm. La courbe observée présente deux phases majeures. - une phase de décroissance régulière de l'acti- vité enzymatique en fonction de la quantité de sérum ajoutée, - un plateau correspondant à un excès d'inhibi- teurs sériques, laissant une partie de l'enzyme active. En effet, l'alpha 2 macroglobuline n'inhibe que partiellement l'activité élastolytique, car elle laisse le centre actif de l'enzyme accessible aux petits substrats, tel celui utilisé, le STANA. Lorsqu'on compare les capacités d'inhibition de protéases de sérums témoins et de sérums traités par les dérivés glycosaminoglycaniques, on se place dans la par- tie décroissante de la courbe pour avoir une comparaison valable et quantifiable des différents pouvoirs inhi- biteurs sériques. On rapporte ci-après les résultats obtenus avec l'héparine, le CY 216, le CY 222 et la fraction dp>12 sur différentes élastases, à savoir: 1) l'élastase leucocytaire de rat. On mesure l'activité élastasique en % en fonc- tion de la concentration en mg/ml un produit testé. Les résultats sont reproduits sur la figure 1 o l'on rap- porte les courbes de ces variations, respectivement avec l'héparine courbe-O-O, le CY 216 courbe -X-X, le CY 222, courbe -.-.- et la fraction dp>112, courbe A-A. L'examen de ces courbes montre que les produits testés inhibent environ 80 % de l'activité-de l'élastase à une concentration aussi faible que 0,05 mg/ml. - Sur la cathepsine G. On mesure l'activité enzymatique résiduelle en fonction du produit testé. Sur la figure 2, on rapporte les résultats ob- tenus avec l'héparine (a), CY 216 (b), CY 222 (c), la fraction dp12 (d), la fraction dp>12 (e) pour l'élastase et pour la cathepsine G L'examen de ces courbes montre la bonne corréla- tion entre l'inhibition exercée par ces produits sur l'élastase leucocytaire et sur la cathepsine G. On constate que l'héparine, le CY 216 et le CY 222 inhibent plus fortement la cathepsine G que l'élas- tase leucocytaire alors que la fraction dp12 inhibe davantage l'élastase que la cathepsine: - Sur l'élastase pancréatique de porc on opère comme suit: On coule dans une boite de Petri un gel d'aga- rose contenant de l'élastine fibreuse et l'on dépose dans des petits godets des quantités connues d'élastase avec ou sans inhibiteurs. On observe ensuite le déve- loppement des plages de lyse. On constate une forte inhibition de l'action de l'élastase pancréatique à une forte concentration de 10 mg/ml des composés testés. 3) Protéase de type élastase (cellules muscu- laires lisses d'aortes de porc)(sérine protéase) et fibroblastes de l'adventice d'aorte de porcs (métallo protease). A des concentrations supérieures à 10 mg/ml, on obtient une inhibition de ces élastases avec les pro- duits testés. EXEMPLE 2: Effet sur l'activité élastasique et inhibi- trice du sérum de hamster. Inhibition de l'activité élastasique du sérum en fonction de la concentration en produits testés. On effectue le dosage sur substrat synthétique, le Suc(Ala)3-pNA et les résultats sont exprimés en . 2584606 pourcentages d'activité par rapport à 100 % de l'activi- té en référence du sérum seul sans addition des pro- duits. Ces résultats mettent en évidence une inactiva- tion de l'activité élastolytique sérique en présence des molécules CY 216 et CY 222; ils montrent que même une concentration en ces produits aussi faible que 0,2 ng/ml est capable d'inactiver 20 % de l'activité élastolytique contenue dans 1 ml de sérum. Il existe une relation dose-effet de type exponentiel, surtout en ce qui con- cerne le produit CY 216. Aucune inactivation par l'hépa- rine n'a été mise en évidence aux mêmes doses. EXEMPLE 3: Etude in vivo de l'action des médicaments de l'invention sur l'équilibre élastase/anti-élastase dans le sérum de hamster normal ou traité. On rapporte les résultats des expériences réali- sées sur les trois groupes de hamsters se répartissant comme suit: - 1er groupe = 10 témoins, - 2ème groupe = 10 hamsters traités avec les molécules CY 216 pendant 6 semaines, - 3ème groupe = 10 hamsters traités avec les molécules CY 222 pendant 6 semaines. Ce traitement comporte une injection quotidienne de 2 mg de molécule, cette dose est considérée comme thérapeutique, pour un hamster de 100 g pendant 6 se- maines. a) Mesure de l'activité élastasique sérique cir- culante. Pendant le traitement, on effectue des prélève- ments sanguins chaque semaine au niveau de la jugulaire pour suivre les variations d'activité élastasique circu- lante. Les prélèvements sont réalisés 1, 2, 4, 7 et 24 heures après injection sous-cutanée des produits. ainsi, la cinétique d'évolution de la réponse enzymatique suite à l'administration des produits peut être suivie. Comme chaque groupe d'animaux est composé de 10 hamsters, 600 pl de sang sont prélevés sur deux hamsters de chaque groupe, 1 heure après l'injection sous-cutanée des pro- duits à tester, puis 600 pl sont prélevés successivement aux temps 2 heures, 4 heures, 7 heures et 24 heures après l'injection sur 2 autres hamsters. Les activités élastasiques des sérums obtenus sont rapportées sur l'histogramme de la figure 3 (le temps de prélèvement du sang, après l'injection des produits à tester est indi- qué en bas de colonne ainsi que la durée totale du trai- tement avant l'expérience (1,2 et 3 semaines). Les résultats montrent que, dès la première semaine de traitement, on peut mettre en évidence une diminution de l'activité élastasique; cette diminution est maximale au bout de 2 heures après injection des molécules de PM inférieur à l'héparine. Puis, on observe une tendance à revenir aux valeurs normales (données par celles des sérums de hamsters non traités) au bout de 24 heures. Cet effet est mis en évidence pendant les 6 se- maines de traitement, de manière comparable au fur et à mesure que se déroule le traitement. Ces résultats permettent de conclure que l'effet des substances CY vis-àvis de l'activité élastolytique sérique des animaux traités s'exerce dans le sens d'une inactivation comme celui observé sur l'activité élasto- lytique du sérum "in vitro" dans lequel les molécules CY ont été directement rajoutées au sérum. De plus, ces résultats observés "in vivo" suggèrent que l'effet di-t minue en fonction de la concentration décroissante en CY dans le sang circulant, ce qui confirme également les résultats obtenus in vitro. b) Mesure de la capacité d'inhibition sérique vis-à-vis de l'1élastase pancréatique. - Le protocole suivi est le même que celui décrit précédemment. Pendant les trois semaines de traitement, on note une augmentation du taux sérique des inhibiteurs d'élastases. Après quatre semaines de traitement, on peut mettre en évidence une tendance à l'augmentation du pouvoir inhibiteur vis-à-vis de l'élastase pancréatique (voir histogramme de la figure 4). EXEMPLE 4: Etude de l'effet des GAGS sur l'inhibition de la biosynthèse des collagènes. On utilise des cellules musculaires lisses d'aortes de porc, 4ème passage, à raison de 2,5 x 106 cellules par boîte. On ajoute comme traceur de proline traitée (50 pCi/boîte). On incube 24 heures. On utilise les séries suivantes: témoin (4 boites), héparine, CY 216 et CY 222 chacun à une dose de 20 pg et de 100 pg. Après l'incubation, on prélève la couche cellu- laire, on effectue une décantation du milieu, une opéra- tion de lavage, on dialyse contre H20 puis de l'acide acétique 0,5 M, puis on effectue une pepsinisation pour solubiliser le collagène (100 pg/ml, 2 x 24n, 4'C). La fraction pepsine soluble contient 95 % de l'hydroxyproline radioactive totale. On précipite à l'aide de (NH4)2 SO4 (172 mg/ml), puis on détermine la radioactivité de l'hydroxy (3H) proline et de la (3H) proline selon la méthode de Roj kind. On effectue une électrophorèse en SDS-Page (Laemli à 7,5 %). On découpe les zones correspondant aux chaînes alpha 1 et alpha 2 et on détermine la radioactivité de chaque chaîne. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau ci-après. L'examen de ces résultats montre l'effet inhi- biteur important des GAGS vis-à-vis de la biosynthèse du collagène. On note un effet dose avec l'héparine et le CY 216, l'inhibition étant plus importante & une dose de pg que de 20 pg. En revanche, on observe une inhibi- tion puissante avec le CY 222 dès l'utilisation de 20 pg. / ,' / / / % hydroxy (3H) proline/total de la radioactivité % de Type Type type collagène III synthétisé Type I+ III Témoin 2400 1,3 % 47 % Héparine 20 pg 67 % 1,1 % 7 % Héparine 100 Pg 18 % 0,4 % 10 % CY 216 20 pg 77 % 1, 3 % 28 % pg 23 % 0,4 % 24 % CY 222 20 pg 0 à 1 % O à 0,05 % 44 % faible Gg O à 1 % O à 0,05 % 37 % volume % du témoin N) ro ce os CD 0% Les GAGS utilisés pour l'élaboration des médica- ments selon l'invention exercent en outre un effet qua- litatif, inhibant sélectivement le type III de collagène par rapport aux types I+II. EXEMPLE S: Effet des GAGS sur la biosynthèse de la fibronectine par les cellules musculaires lisses. On utilise des cellules musculaires lisses d'aorte de porc, 4ème passage, 2,5 x 106 cellules par boîte. On ajoute à chaque boite utilisée en triple ou en quadruple pour chaque expérience, soit rien (témoin), soit 20 pm/ml de CY 216 ou 222, et à d'autres boîtes 100 pg/ml, c'est-à-dire 300 pg par boite de CY 216 et 222 ainsi d'ailleurs que d'héparine. Le traceur utilisé est la méthionine 3 S, 5 pCi/boîte. On utilise deux temps d'incubation: 3 heures et 6 heures à cause de la rapidité de la biosynthèse de la fibronectine. Après l'incubation et décantation du milieu et lavage, on effectue une extraction avec le deoxycholate pour obtenir la fraction membranaire et intracellulaire et on détermine par immunoprécipitation la fraction de radioactivité incorporée spécifiquement dans la fibro- nectine. Le tableau ci-joint montre l'incorporation à 3 heures et 6 heures dans l'extrait deoxycholate de la méthionine 35S et le pourcentage de radioactivité re- trouvée dans la bande de la fibronectine isolée de l'immunoprécipité par électrophorèse sur gel d'acryl- amide. On peut constater une inhibition de l'ordre de % de la fraction de l'isotope incorporé dans la fibronectine en présence des héparinoides. EXEMPLE 6: Inhibition de la biosynthèse de la fibro- nectine par les GAGS. 2,5 x 106 cellules musculaires lisses d'aorte de porc par boîte - 20 pg/ml et 100 1pl de CY 216, CY 222 et d'héparine, 3 h et 6 h d'incubation. Dosage de la radioactivité dans l'extrait deoxy- cholate (fraction membranaire) et dans l'immunoprécipité de la fibronectine, après séparation de sa bande sur gel de polyacrylamide, découpage et comptage de la radio- activité. ________________________________________________________ % de radioactivité incorporée, retrouvée dans la fibronectine 3 h % inhib. 6 h % inhib. Témoin 70,6 31,7 Radioactivité totale dans l'extrait dpm/106 cellules: 45. 800 x 3,5 = 160 300,00 5 600 (s.d.) ________________________________________________________ CY 216 20 Pg/ml 39,2 44 25,0 21 CY 216 100 pg/ml 38,4 46 24,1 24 CY 222 20 Pg/ml 36,1 49 21,0 34 CY 222 100 pg/ml 37,3 47 20,2 36 Héparine 20 pg/ml 35,1 50 20,2 36 Héparine 100 pg/ml 33,7 52 14,8 47 ________________________________________________________ Ces résultats font apparaître l'effet inhibiteur des GAGS à l'égard de la biosynthèse de la fibronectine dans les conditions de l'essai. EXEMPLE 7: Etude in vitro de l'activité de GAGS s.s. sur l'élastase leucocytaire et la cathepsine G. ("s.s." désigne les GAGS à profil de sulfatation modifié). L'élastase leucocytaire est préparée à partir de polymorphonucléaires de rats obtenus à partir d'un exsu- dat pleural. Le substrat est constitué par le N-succinyl trialanine paranitroanilide et l'activité enzymatique est déerminée après incubation de l'enzyme avec le pro- duit à tester 1 heure à température ambiante (20'C). On ajoute ensuite le substrat, on incube 20 heures à 37C et on effectue une lecture à 410 nm. Pour la cathepsine G humaine obtenue à partir de leucocytes polymorphonucléaires humains, le dosage est effectué sur un substrat d'azocaséine. Dans ce cas également, l'enzyme est incubée avec le produit à tester pendant 1 heure à température ambiante. On ajoute en-- suite l'azocaséine et on incube le mélange pendant 5 heures à 37'C. On précipite l'acide trichloracétique à 5 % (concentration finale), on centrifuge et on effectue une lecture à 366 nm. Les produits testés sont énumérés dans le ta- bleau ci-après avec leur activité inhibitrice exercée sur l'élastase et la cathepsine G. Les produits à profil de sulfatation non modifié sont également mentionnés. Les essais rapportés dans la partie B' ont été réalisés en présence d'une concentration en NaCl de 0,18 M. On note une bonne préservation de l'activité inhibitrice pour les différents dérivés testés. L'hypersulfatation renforce l'inhibition (élastase inhibée à 100 % par le CY 216 hypersulfaté, cathepsine G inhibée à 59 % par l'héparine hypersulfatée et à 65 % par le CY 216 hypersulfaté). Pour une taille moléculaire donnée, l'inhibition est plus forte pour les produits hypersulfatés. Ce phénomène est bien entendu le plus visible pour les plus petits poids moléculaires qui n'ont quasiment aucune activité inhibitrice et qui sont fortement inhibiteurs lorsqu'ils sont hypersulfatés. Produit testé A) Héparine (sel de sodium) B) Oligosaccharides obtenus par fractionnement de CE222 sur Sépharose: dp: 12 B') dp % inhibition Elastase Cathepsine G a. b. c. d. 100 49 59 00 40 97 46 34 91 8 4 28 87 7 42 C) CY 216, CY 216D et dérivés - CY 216 (sel de sodium) 90 55 - CY 216D (sel de tétrabutyl ammonium) 78 100 52 - CYD216 (0-acétylé) 98 49 a et c correspondent aux mesures avec les produits ayant le taux de sulfatation de produits naturels ou de leurs fragments et b et d aux mesures avec les produits à profil de sulfatation modifié. REVENDICATIONS 1. Utilisation pour l'obtention d'un medicament actif vis-à-vis des pathologies du tissu conjonctif d'un glycosaminoglycane (ou GAG) et/ou d'un fragment de GAG, le cas echéant, sous forme de sel pharmacologiquement acceptable. 2. Utilisation selon la revendication 1, carac- terisée en ce que le GAG utilisé est à base des motifs alternés D-glucosamine-acide uronique (acide L-iduroni- que ou D-glucuronique) tels que rencontres dans l'hépa- rine ou l'héparane-sulfate. 3. Utilisation selon la revendication 2, carac- terisée en ce que le GAG est de l'heparine ou de l'hépa- rane-sulfate. 4. Utilisation selon la revendication 2, carac- terisée en ce que le GAG possède un poids moléculaire inférieur à celui de l'héparine ou de l'héparane- sulfate, en particulier un poids moléculaire (PM) infé- rieur à 10 000 daltons environ. 5. Utilisation selon la revendication 4, carac- térisée en ce que le GAG est choisi parmi: - les mucopolysaccharides tels qu'obtenus par extraction alcoolique à partir d'héparine, formés d'un melange de chaines de poids moléculaires d'environ 2000 à 8000 et présentant des rapports des titres Yin-Wessler/USP d'au moins 2, en particulier les produits possédant un rap- port YW/USP de l'ordre de 3 à 5 et des poids molécu- laires moyens de 3000 à 5500 environ, désignés par l'expression CY 216; - les mucopolysaccharides tels qu'obtenus par dépolymé- risation ménagée de l'héparine à l'aide d'acide nitreux, ces produits présentant d'une manière générale les caractéristiques ci-dessus, mais étant terminés par des groupes de structure 2,5-anhydromanno, en particulier les mucopolysaccharides possédant une extremité 2,5-anhydromannitol désignés par l'expression CY 222, ou encore une extrémité acide 2,5-anhydro-mannonique, ces produits étant formés de chaînes glycosidiques dont la majorité possède des PM de l'ordre de 2000 à 3000, notamment d'environ 2000 à 2600, et des rapports des titres Yin- Wessler/USP notamment d'au moins 10 avec des titres Yin-Wessler d'au moins 200 u/mg; les mucopolysaccharides essentiellement formés de chaines 1) ayant un poids moléculaire moyen de 3000 à 6000 daltons, notamment de 4000 à 5000 environ, 2) pos- sédant un titre YW/USP inférieur à 10, notamment d'en- viron 6 à 3, 3) terminées par des motifs de structure 2,5-anhydromanno; les oligosaccharides formés de 8 motifs sucre ou plus, de titre YinWessler élevé pouvant atteindre 2000 u/mg et de titre USP plus faible, pratiquement nul, dotés d'une forte affinité pour l'AT-III, ces oligosaccharides pouvant être obtenus par dépolymérisation nitreuse ménagée et étant terminés par-des groupes de structure 2,5-anhydromanno pouvant être obtenus en soumettant l'héparine à une dépolymérisation ménagée à l'aide d'une héparinase et comportant un motif de début de chaine correspondant à un motif uronique insaturé, en particu- lier les octasaccharides de structure ABCDEFGH répondant à la formule cidessous: COO- CO0 CoO _ OR OR OR -OR Lo OH > OH O g4.. H A B C D E F G H - des compositions homogènes d'hexasaccharides telles qu'obtenues en soumettant les octasaccharides ci-dessus à l'action ménagée d'une héparinase, en particulier les compositions répondant à la formule cidessous: OR COO OR OR o ô t O OC O H H 0 - H H OH NHAc OH NHSO OSO NHSO 3 3 3 C' D E F G H - des oligo- ou poly-saccharides de degré de polymérisa- tion homogène, notamment, ceux obtenus par filtration, sur un matériau tel que du Sephadex, des mucopolysaccha- rides à activité antithrombotique tels qu'obtenus par extraction alcoolique, par exemple le CY 216, ou dépoly- mérisation nitreuse de l'héparine, par exemple le-CY 222, ou par chromatographie par gradient de force ionique; - des GAGS tels qu'obtenus par action de periodate sur l'héparine, suivie de traitement en milieu basique; - des GAGS dits totaux, correspondant aux compositions de GAGS obtenues par traitement d'organes animaux; - des GAGS tels qu'obtenus par dépolymérisation de l'héparine avec de l'héparinase ou de l'acide nitreux, par séparation des fractions possédant la séquence de fixation à l'AT- III et gel filtration de ces fractions afin d'obtenir des fragments de GAGS de degré de poly- merisation varié, par exemple d'une part des fragments de degré de polymérisation supérieur à 12 et d'autre part des fragments de GAGS de degré de polymérisation inférieur à 12, notamment de dp 12, 10, 8, 6 ou 4. 6. Utilisation selon la revendication 1, carac- térisée en ce que le GAG mis en oeuvre est à base de motifs alternés Dgalactosamine-acide uronique, tels que rencontrés par exemple dans le dermatane-sulfate, les chondroitines, les chondroitines-sulfates ou encore l'acide hyaluronique, et en particulier est constitué par ces produits eux-mêmes. 7. Utilisation selon l'une quelconque des reven- dications précédentes, caractérisée en ce que le GAG mis en oeuvre est homogène au regard de son degré de polymé- risation et notamment est formé de chaînes de degré de polymérisation pair. 8. Utilisation selon l'une quelconque des reven- dications précédentes, caractérisée en ce que le GAG mis en oeuvre possède un profil de sulfatation modifié, ce GAG étant constitué par exemple par l'un des produits définis ci-dessus dans lequel une partie, voire la majorité et même la totalité des groupes -OH sont rem- placés par des groupes ester sulfurique S03 9. Utilisation selon la revendication 8, carac- térisée en ce que le degré de sulfatation du GAG varie de 2 à 4. 10. Utilisation selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 9, caractérisée en ce que le GAG se présente sous forme d'une composition pharmaceutique appropriée pour l'administration par voie orale, injec- table, rectale, de pommade, d'aérosols ou de liposomes. 11. Utilisation selon la revendication 10, ca- ractérisée en ce que les solutions injectables renfer- ment de 1 à 200 mg/ml de GAG, de préférence de 20 à 150 mg/ml lorsque ces solutions sont destinées à l'injection par voie sous-cutanée et de 30 à 100 mg/ml, notamment, de 40 à 50 mg/ml de GAG lorsqu'elles sont destinées à l'injection par voie intraveineuse ou par perfusion.