FR 2577135 A1 19860814 FR 8502068 A 19850213 Immunotoxines à longue durée d'action comportant un constituant glycopeptidique inactivant les ribosomes modifié sur ses motifs - polysaccharidiques. La présente invention concerne de nouvelles molécules médicamenteuses comportant au moins un anticorps lié de façon cova- lente à un constituant de nature polypeptidique, inhibiteur de la synthèse protéique et issu d'une glycoprotéine (ou d'un glycopeptide) dont les motifs polysaccharidiques ont été modifies. Dans le brevet US 4 340 535 et dans les demandes de brevet français n 81/07596 et n 81/21836 on a décrit la préparation de produits anti-cancéreux dits conjugués obtenus par couplage, par liaison covalente, de la chaîne A de ricine avec des anticorps ou fragments d'anticorps dirigés contre des antigènes portés par la cellule à détruire. Les produits de ce type ont été désignés et sont désignés dans la présente demande sous le nom générique d'Immuno- toxines. On connaît aussi desc onjugués analogues aux immunotoxines à chaîne A de ricine précédemment décrites, ayant aussi vocation de médicaments anti-cancéreux et résultant du couplage par liaison cova- lente d'anticorps ou fragments d'anticorps à d'autres glycoprotéines inactivant les ribosomes tels que notamment la gglonine extraite de Gelonium multiflorum (Eur. J. Biochem. 1981, 116, 447-454, Cancer Res. 1984, 44, 129-133) ou l'inhibiteur extrait de Momordica charantia (MOM) (brevet US 4 368 149). Ces glycoprotéines inactivant les ribosomes (abrégé GPIR) qui ont des propriétés semblables à celles de la chaine A de ricine sont des substances de poids moléculaire d'un ordre de grandeur de 20 000 et 30 000 (Cancer Survey, 1982, 1, 489-520). Le terme "glycoprotéine inactivant les ribosomes", tel qu'utilisé dans la présente description ainsi que dans les revendi- cations, désigne toute substance portant des motifs saccharidiques appartenant à la classe des macromolécules inactivant les ribosomes et, par consequent,inhibant la synthèse protéique de cellules euca- ryotes, ainsi que tout fragment de ladite substance possédant la même propriété inactivante, ladite glycoprotéine inactivant les ribosomes pouvant être d'origine naturelle ou biosynthétique prove- nant d'une cellule dont le patrimoine génétique a été modifié dans ce but. On sait également que l'activité cytotoxique de ces immunotoxines peut être potentialisée par diverses substances adju- vantes telles que les sels d'ammonium, diverses amines ou certains ionophores carboxyliques tels que la monensine ou la nigéricine. Toutefois, les effets thérapeutiques des immunotoxines, activées ou non, ne peuvent se manifester pleinement que dans la mesure o l'immunotoxine peut, par sa partie anticorps, se localiser in vivo, sous forme active, sur la cible cellulaire à détruire (condition sine qua non à toute expression d'activité des immuno- toxines). La capacité de l'immunotoxine à se localiser sur la cible dépend en tout premier lieu de l'aptitude de l'immunotoxine à demeurer dans la circulation sanguine et les fluides extra-cellulaires sous forme active pendant des temps suffisants pour qu'elle atteigne sa cible cellulaire et à des concentrations suffisamment fortes pour que le taux d'occupation des sites antigéniques correspondants soit élevé. De nombreuses études ont permis d'établir la cinétique d'élimination plasmatique des immunotoxines après injection intra- veineuse dans différents modèles animaux. Il est apparu qu'après l'injection le taux plasmatique d'immunotoxine biologiquement active décroît-très rapidement et de façon très importante. Ainsi, typiquement, chez le lapin, dans un modèle utilisant une immuno- toxine construite en couplant, à l'aide d'un bras à pont disulfure, la chaîne A de ricine à un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène T65 des lymphocytes T humains (anticorps T101), il apparaît que 97 % de l'immunotoxine présente dans le sang circulant au temps O de l'injection disparaissent en 30 min et 99,9 % en 17 h. Cette rapide disparition de l'immunotoxine est bien évidemment préju- diciable à l'expression de sa capacité cytotoxique complète, en empêchant que l'immunotoxine ne sature de façon durable une propor- tion élevée des antigènes-cibles portés par les cellules à détruire. En outre, la comparaison des cinétiques d'élimination plasmatique des immunotoxines avec celles des anticorps non conjugués corres- pondants montre qu'à l'inverse les anticorps - comme cela est bien connu se maintiennent dans le plasma à un haut niveau pendant des temps relativement longs. Or il existe toujours, même dans les préparations d'immunotoxines les plus purifiées, un certain taux résiduel d'anticorps non conjugués. Par le jeu des vitesses diffé- rentielles d'élimination des immunotoxines et des anticorps,progres- sivement les anticorps non conjugués, initialement très minoritaires, deviennent majoritaires au bout de quelques heures et donc, progres- sivement, ces anticorps deviennent par compétition de puissants antagonistes pour la fixation des immunotoxines sur leurs cibles. Il apparaît donc clairement l'intérêt d'accroître la persistance plasmatique des immunotoxines, sous forme active, afin d'augmenter à la fois la durée et le taux d'occupation des antigènes- cibles et par conséquent d'améliorer les effets thérapeutiques des immunotoxines. Par ailleurs, des expériences de localisation in vivo de l'immunotoxine à chaîne A de ricine, radiomarquée puis injectée chez des animaux sans cible spécifique,ont montré que, dans les premières minutes après l'injection, le conjugué se localise préfé- rentiellement dans le foie. Il en est de même pour la chaîne A de ricine qui présente le même devenir lorsqu'elle est injectée sous forme non couplée. Cela suggère fortement que l'immunotoxine se fixe dans le foie par l'intermédiaire de la sous-unité cytotoxique qu'elle contient. Il est connu que la chaîne A de ricine est une glyco- protéine dont les groupements polyosidiques comprennent notamment des résidus de mannose et de N-acétylglucosamine, certains résidus de mannose étant en positions terminales (Agri. Biol. Chem., 1978, 42, 501). Il a été également établi l'existence au niveau du foie de récepteurs capables de reconnaître des glycoprotéines ayant de tels résidus de mannose terminaux. Il a été aussi montré que les glycoprotéines reconnues par ces récepteurs - présents essentiel- lement sur les cellules de Kupffer - sont rapidement éliminées de la circulation sanguine par fixation sur ces cellules qui les méta- bolisent. Ceci est bien documenté notamment dans le cas de la b&ta- glucuronidase, ainsi que dans le cas de la ribonucléase B (Arch. Biochem. Biophys., 1978, 188, 418; Advances in Enzymology, Meister A. Ed., New York, 1974; Pediat. Res., 1977, 11, 816). De l'ensemble de ces données, il apparaît que la rapide élimination des immunotoxines à chaîne A de ricine peut s'expliquer par la reconnaissance des résidus mannose de la chaîne A de ricine par les cellules hépatiques et en particulier les cellules de Kupffer. Les études de cinétique d'élimination plasmatique d'autres GPIR, par exemple la gélonine ou le MOM, après injection intra- veineuse chez l'animal, ont montré que, comme dans le cas de la chaîne A de ricine, le taux plasmatique de GPIR décroît très rapi- dement et de façon très importante après l'injection. Ainsi typique- ment chez le lapin après injection de gélonine purifiée selon la méthode décrite (J. Biol. Chem., 1980, 255, 6947-6953) il apparaît que 93 % de la gélonine présente dans le sang circulant au temps O de l'injection disparaissent en 1 h et 99,99 % en 24 h. Il est connu que par oxydation par les ions periodate des structures osidiques, y compris celles qui sont contenues dans les glycoprotéines, on provoque la rupture de la chaîne carbonée chaque fois que deux atomes de carbone adjacents portent des hydroxyles primaires ou secondaires. Si les deux hydroxyles contigus sont secon- daires, comme cela est généralement le cas dans les oses cycliques présents dans les GPIR, l'oxydation conduit à deux fonctions aldéhyde sur les carbones entre lesquels la rupture a eu lieu. Dans la description le terme "periodate" désigne l'ion I0-4 que l'on trouve également indiqué dans la littérature sous le nom de "métaperiodate". On a maintenant trouvé, d'une façon absolument inattendue, que, si on modifie les motifs glucidiques d'une glycoprotéine inac- tivant les ribosomes par une oxydation par les ions periodate, on obtient une nouvelle glycoprotéine inactivant les ribosomes ayant la double propriété de conserver ses activités biologiques et d'être éliminée très lentement de la circulation sanguine in vivo. On a également trouvé que lorsque ces nouvelles glyco- protéines inactivant les ribosomes et à longue durée d'action sont couplées à des anticorps, les conjugués obtenus conservent les propriétés biologiques connues des immunotoxines et présentent une cinétique d'élimination plasmatique lente. La présente invention a donc pour objet des produits appartenant à la classe des immunotoxines, obtenus par couplage cova- lent entre d'une part un anticorps ou fragment d'anticorps, utilisé sous forme naturelle ou correctement modifié,et d'autre part une glycoprotéine inactivant les ribosomes et à longue durée d'action. Pour des raisons de clarté, on précise ci-après la signi- fication des symboles utilisés pour désigner les protéines différentes ou leurs radicaux et des expressions utilisées pour désigner les différents symboles. Le symbole P représente une protéine choisie parmi tout anticorps ou fragment d'anticorps, ou toute immunoglobuline ou fragment d'immunoglobuline ou toute molécule dérivant des précédentes par modification artificielle de l'un quelconque de leurs groupements fonctionnels, y compris des structures glucidiques qu'elles portent, sous réserve que la protéine ainsi choisie reste capable de reconnaître sélectivement un antigène donné à la surface des cellules porteuses de cet antigène et notamment des cellules cibles. La protéine P de départ peut être d'origine naturelle ou biosynthétique provenant d'une cellule dont le patrimoine génétique a été modifié dans ce but. Le symbole GPIR-la représente une protéine qui est une glycoprotéine inactivant les ribosomes et à longue durée d'action, obtenue par traitement d'une glycoprotéine inactivant les ribosomes, dont les groupes thiol sont éventuellement protégés, avec une solu- tion aqueuse d'un periodate alcalin pendant une période de temps de 0,2 à 24 h à la température de 0 à 15 C et à l'abri de la lumière et par déblocage éventuel des groupes thiol, ou toute molécule dérivant de celle-ci par modification artificielle de tout groupement fonc- tionnel porté par cette protéine, sous réserve que la protéine ainsi choisie présente encore la propriété d'inhiber la synthèse protéique ribosomale des cellules eucaryotes telle que l'on peut la mettre en évidence dans un modèle d'étude acellulaire. Dans l'immunotoxine, la partie GPIR-la est également indiquée comme "sous-unité cytotoxique". Le symbole A-la représente une glycoprotéine inactivant les ribosomes et à longue durée d'action, obtenue par traitement de la chaîne A de ricine, dont au moins un des groupes thiol de ses cystéines 171 et 257 est éventuellement protégé, avec une solution aqueuse d'un periodate alcalin pendant une période de temps de 0,2 à 24 h à la température de O à 15 C et à l'abri de la lumière et par déprotection éventuelle dudit groupe thiol. Le symbole P' représente un radical dérivé de la protéine P ci-dessus telle quelle ou chimiquement convenablement modifiée, privée d'une ou plusieurs fonctions propres et dont d'autres groupes fonc- tionnels sont éventuellement bloqués. Le symbole GPIR-la' représente un radical dérivé de la protéine GPIR-la ci-dessus telle quelle ou chimiquement convenablement modifiée, privée d'une ou plusieurs fonctions propres et dont d'autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués. Le symbole A-la' représente un radical dérivé de la protéine A-la privé d'au moins une des fonctions thiol de ses cystéines 171 et 257. Le symbole P1 représente une des protéines GPIR-la et P telles que définies ci-dessus qui porte des fonctions thiol libres, attachées à ladite protéine directement ou par l'intermédiaire d'une structure d'espacement. Le symbole P2, différent de P1, représente une des protéines GPIR-la et P telles que définies ci-dessus, qui porte un ou plusieurs groupements fonctionnels capables de réagir avec les thiols libres. Le symbole P1i, représente le radical de la protéine P1 lié aux fonctions propres de la protéine P1 notamment les fonctions SH (de la cystéine), NH2 (terminal de la protéine ou dans la pbsition epsilon des lysines), OH (des tyrosines), COOH (des acides aspartiques et glutamiques) ou, seulement dans le cas o P1 est un anticorps ou fragment d'anticorps, le radical de la protéine P1 provenant de l'ouverture des.structures glucidiques par action de l'acide perio- dique selon des méthodes connues. Le symbole P2, représente le radical de la protéine P2 lié aux groupes fonctionnels caractéristiques NH2 (terminal de la protéine ou dans la position epsilon des lysines), OH (des tyrosines), COOH (des acides aspartiques et glutamiques). Par exemple, P1,-SH représente la protéine P1 (qui peut être indifféremment l'anticorps ou fragment d'anticorps P ou la GPIR-la) dans laquelle les groupes SH des cystéines sont libres et les autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués. 2 5 7 7 135 De la même façon, P1,-Co- représente la protéine P1, dans laquelle son groupe carboxylique terminal ou les groupes carboxyliques de ses acides glutamiques et aspartiques sont couples avec un groupe- ment qui apporte un groupe SH introduit artificiellement. Encore P2,-NH- représente la protéine P2 (qui peut être indifféremment l'anticorps ou fragment d'anticorps P ou la GPIR-la) dans laquelle son groupe amino terminal ou les groupes amino de ses lysines sont attachés à un groupement susceptible de couplage avec le thiol de la protéine P1. Le terme "structure d'espacement inerte" tel qu'utilisé ici pour E et E' désigne un radical organique bivalent inerte vis-a- vis des réactifs utilisés dans le procédé, tel qu'un groupe alkylène à chaine droite ou ramifiée contenant de 1 à 15 atomes de carbone, qui peut contenir une ou plusieurs doubles liaisons ou qui peut être interrompupar des atomes d'oxygène ou qui peut être substitué par un ou plusieurs groupes fonctionnels inertes, tels que des groupes m9thoxy, des groupes carboxyles libres ou estérifiés, des groupes dialkylamino, des groupes carbamates. Le même terme désigne également un groupe arylène contenant de 6 à 15 atomes de carbone qui peut être substitué par un ou plusieurs groupes fonctionnels inertes comme indiqué ci-dessus pour le groupe alkylène. L'expression "groupe fonctionnel capable de se lier d'une façon covalente" telle qu'utilisée ici pour Y et Y' désigne tous les groupes susceptibles de réagir avec les fonctions propres des protéines P1 et P2 pour donner une liaison covalente. Ainsi, les groupes -CO- et -(C=NH)- sont des groupes fonctionnels, convenables susceptibles de se lier aux amines libres, les thil61s et les hydroxyles phénoliques des protéines. De même, le groupe -NH- est un groupe fonctionnel convenable, susceptible de se lier aux groupes carboxyli- ques libres des protéines. Le groupe =N- est un groupe fonctionnel convenable, susceptible de se lier aux deux atomes de carbone des structures glucidiques des protéines P1 et P2 après oxydation avec les ions periodate, mais seulement dans le cas o P1 et P2 sont un anticorps ou un fragment d'anticorps. L'expression "fonction propre des protgines",telle qu'uti- lisée ici pour Z et Z', désigne les radicaux provenant des groupes caractéristiques des acides aminés formant les protéines P1 et P2, telles que l'atome d'oxygène provenant des hydroxyles des acides aminés tyrosine et éventuellement sérine, le groupe carbonyle prove- nant du carboxyle terminal ou des carboxyles libres des acides aspartique et glutamique, le groupe -NH- provenant de l'amine termi- nale des protéines par exemple de la lysine, l'atome de soufre provenant du thiol de la cystéine. La même expression désigne égale- ment le groupe provenant de la structure dialdéhydique obtenue après oxydation d'une des structures glucidiques des protéines P1 et P2 par traitement avec les ions periodate, mais seulement dans le cas o les P1 et P2 sont un anticorps ou fragment d'anticorps. Le terme "radical activateur", tel qu'utilisé ici pour X, désigne un groupement lié à un pont -S-S- capable de réagir avec un thiol libre pour former un disulfure avec libération de X-SH. Des radicaux activateurs convenables sont les groupes pyridyl-2 et pyridyl-4, non substitués ou substitués par un ou des halogènes ou des radicaux alkyle, carboxyle, alcoxycarbonyle; le groupe phényle non substitué ou, de préférence, substitué par un ou des halogènes ou des groupes nitro, alcoxy, carboxyle ou alcoxycarbonyle; ou un groupe alcoxycarbonyle tel que méthoxycarbonyle. Les termes "alkyle" et "alcoxy" désignent des groupes contenant jusqu'à 5 atomes de carbone. Le terme "alkylène" désigne des groupements aliphatiques saturés, à chaîne droite ou ramifiée, contenant jusqu'à 10 atomes de carbone pouvant être substitues par un ou plusieurs groupes fonc- tionnels inertes tels que les groupes alcoxycarbonyle. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet des produits, appartenant à la classe des Immunotoxines, obtenus par couplage covalent entre, d'une part un anticorps ou fragment d'anticorps, utilisé sous sa forme naturelle ou correctement modifié (symbole P), possédant la capacité de reconnattre sélectivement un antigène porté par les cellules- cibles visées et, d'autre part, une glycoprotéine inactivant les ribosomes et à longue durée d'action, obtenue par traitement d'une glycoprotéine inactivant les ribosomes, dont les groupes thiol sont éventuellement protégés avec une solution aqueuse d'un periodate alcalin pendant une période de temps de 0,2 à 24 h à la température de 0 à 15 C et à l'abri de la lumière et par déblocage éventuel des groupes thiol (symbole GPIR-la), le couplage entre les 2 protéines étant réalisé soit par l'intermédiaire d'une liaison disulfure soit par l'intermédiaire d'une liaison thio- éther. Une immunotoxine formée par couplage d'un anticorps P avec une glycoprotéine inactivant les ribosomes et à longue durée d'action GPIR-la peut être représente par la formule statistique suivante: P'-W-GPIR-la' dans laquelle P' représente le radical d'une protéine qui est un anticorps ou un fragment d'anticorps P tel quel ou chimiquement convenablement modifié et dans lequel d'autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués, GPIR-la' représente le radical d'une protéine qui est la GPIR-la telle quelle ou chimiquement convena- blement modifiée et dans lequel d'autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués et W représente une structure covalente bivalente contenant un groupe thioéther ou un groupe disulfure dont les atomes de soufre soit sont ceux des cystéines de P et GPIR-la soit sont liés aux fonctions propres de P et/ou de GPIR-la par des structures d'espacement portant un groupe fonctionnel lié auxdites fonctions propres de P et/ou de GPIR-la. Par liaison thioéther entre deux protéines on entend une liaison du type: 0 -S --S N-E-Y-Z- o0 dans laquelle Z, Y et E sont tels que définis ci-dessous. D'une façon préférentielle, la présente invention concerne une immunotoxine de formule statistique P'-W'-GPIR-la' dans laquelle P' et GPRI-la' sont tels que définis ci-dessus et W' représente une structure covalente choisie parmi: (a) un groupement de formule -(Z'-Y'-E') -S N-E-Y-Z o (b) un groupement de formule 0. Z-Y-E-N S- (E'-Y'-Z)n - o (c) un groupement de formule -Z-Y-E-S-S-(E'-Y'-Z')n- (d) un groupement de formule -(Z'-Y'-E') -S-S-E-Y-Z- n o - Z et Z' représentent les fonctions propres des protéines GPIR-la et P, choisies parmi l'atome d'oxygène provenant de l'hydroxyle de l'un des résidus de tyrosine; le groupe carbonyle provenant de l'un des carboxyles terminaux ou des carboxyles libres des acides aspartiques et/ou glutamiques de GPIR-la et de P; le groupe -NH- provenant de l'une des amines terminales de GPIR-la et de P ou de l'une des amines en position epsilon de l'un des résidus de lysine; et seulement pour Z dans les structures covalentes (b) et (c), le groupe provenant de la structure dialdéhydique obtenue après oxydation d'une des structures glucidiques de P par l'acide periodique selon les méthodes connues. Il - Y et Y' représentent des groupes fonctionnels capables de se lier d'une façon covalente avec l'une quelconque des fonctions Z et Z' des protéines GPIR-la et P; - E et E' représentent des structures d'espacement inertes; et - n représente zéro ou 1. Les immunotoxines telles que représentées par les for- mules I et II ci-dessus le sont, en forme simplifiée, mais il est entendu que la structure covalente bivalente -W- ou -W'- est lige à au moins une molécule P et au moins une molécule GPIR-la. Le nombre de liaisons avec les protéines P-et GPIR-la dépend du nombre des fonctions propres desdites protéines intervenant dans l'opéra- tion de couplage. Par exemple, si une immunotoxine est formée par couplage de la sous-unité A de la ricine native avec l'anticorps P (par exemple l'anticorps T10]) par l'intermédiaire d'une structure cova- lente bivalente ayant un groupe disulfure dont un soufre est celui de la cystéine 257 de la chaîne A de la ricine à longue durée d'action et l'autre est lié aux oxygènes phénoliques des tyrosines de l'anti- corps P par un groupe oxopropylique, elle aura la formule statis- tique P'(0-CO-CH2-CH2-S-S-A-la')t dans laquelle t représente le nombre des tyrosines de l'anticorps (par exemple de l'anticorps T]Ol) intervenues dans le couplage. L'immunotoxine ainsi obtenue correspond ainsi à un produit de formule II, o: - P' est tel que défini ci-dessus, notamment le radical de l'anti- corps TiOl privé des fonctions phénoliques des tyrosines, inter- venant dans le couplage; - A-la' le radical de la chaîne A de la ricine à longue durée d'action, privée de la fonction thiol de sa cystéine 257; W' est le groupement (c): -Z-Y-E-S-S-(E'-Y'-Z')n o Z est l'oxygène des hydroxyles phénoliques intervenus dans le couplage, Y est -CO-; E est la structure d'espacement inerte -CH2-CH- et n est zéro. Particulièrement préférées sont les immunotoxines formées par une ou plusieurs structures contenant la sous-unité A de la ricine à longue durée d'action et un seul anticorps P, représentées par la formule statistique P'(W'-A-la')m III - dans laquelle P', W' et A-la' sont tels que définis ci-dessus et m représente le nombre de fonctions propres de la protéine P inter- venues dans le couplage. Le nombre m varie de 0,3 à 12, de préfé- rence de 0,5 à 10. L'expression "m varie de 0,3 à 12, de préférence de 0,5 à 10" signifie que la valeur de m est statistique car dans la popu- lation des molécules d'anticorps le couplage ne se produit pas d'une façon homogène. Le nombre m peut donc ne pas être entier. La valeur de m dépend notamment des anticorps utilisés, plus particulièrement de leur poids moléculaire. Ainsi, si comme anticorps P de départ on utilise un fragment Fab ou Fab', la valeur de m pourra varier entre 0,3 et environ 2; si l'on utilise un fragment F(ab')2, m pourra varier entre 0,5 et environ 4; pour un anticorps du type IgG, la valeur de m sera entre 0,5 et environ 6; enfin, pour un anticorps IgM, la valeur de m pourra varier entre 1 et environ 12. Il est cependant préférable que le degré de substitution sur l'anticorps P soit tel qu'il conduise à une valeur de m non infé- rieure à 0,5 et non supérieure à 10. Plus généralement, les structures I et II ci-dessus représentent des formules statistiques écrites de façon simplifiée, comme il a été spécifié ci-dessus. D'une façon analogue, les formules IV, V et IX ci-dessous sont également statistiques - lorsque, le cas échéant, n est 1 - car les réactifs de couplage sont préparés à partir de populations de protéines P1 et P2 qui ont toutes exactement les mêmes propriétés que celles prises en compte ci-dessus pour l'anticorps P, que ces protéines P1 et P2 soient elles-mêmes l'anticorps P ou la GPIR-la. Selon un autre de ses aspects, la présente invention concerne un procédé pour la préparation d'une immunotoxine à longue durée d'action ayant une liaison covalente du type disulfure ou thioéther entre un anticorps et une glycoprotéine inactivant les ribosomes, caractérisé en ce que l'on forme une liaison disulfure ou thioéther entre un anticorps et une glycoprotéine inactivantles ribosomes à longue durée d'action obtenue par traitement d'une glyco- protéine inactivant les ribosomes, dont les groupes thiol sont éventuellement protégés avec une solution aqueuse d'une periodate alcalin pendant une période de temps de 0,2 à 24 h à la température de 0 à 15 C et à l'abri de la lumière et par déblocage éventuel du groupe thiol. Selon un aspect préférentiel, la présente invention concerne un procédé pour la préparation d'une immunotoxine ayant la structure I ci-dessus, caractérisé en ce qu'on fait réagir en solu- tion aqueuse et à la température ambiante une protéine P1 qui est indifféremment soit la glycoprotéine inactivant les ribosomes à longue durée d'action GPIR-la, soit un anticorps ou fragment d'anti- corps, porteuse d'au moins un groupe thiol libre attaché à ladite protéine P1 directement ou parl'intermédiaire d'une structure d'espacement, avec une protéine P2, différente de P1, qui est indif- féremment soit la glycoprotéine inactivant les ribosomes à longue durée d'action GPIR-la, soit un anticorps ou fragment d'anticorps, porteuse d'un groupement capable de couplage avec le thiol libre de la protéine PI, de façon à former une liaison thioéther ou disulfure. Selon un aspect particulièrement avantageux, la présente invention concerne un procédé pour la préparation d'une immunotoxine ayant la structure II, dans laquelle P', W' et GPIR-la' sont tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce qu'on fait réagir en solu- tion aqueuse et à la température ambiante une protéine de formule Pl,-(ZY-E)n-SH avec une protéine de formule statistique P2,-Z'-Y'-E'-G o P1, et P2, représentent les radicaux des protéines P1 et P2 liés auxfonctions propres desdites protéines ou, seulement lorsque P1 et P2 sont un anticorps ou fraction d'anticorps, les radicaux des protéines P1 et P2 provenant de l'ouverture des structures glucidiques par action de l'acide periodique, Z, Z', Y, Y', E et E' sont tels que définis ci-dessus et G représente un groupe -N 0 ou un groupe -S-S-X, o X est un groupe activateur. Tant P que GPIR-la sont donc des protéines qui présentent indifféremment (1) la ou les fonctions thiol qui participent au couplage et (2) un ou plusieurs groupements fonctionnels capables de réagir avec les fonctions thiol ci-dessus pour former une liaison disulfure ou thioéther. Selon la présente invention lesdites fonctions thiol et groupements fonctionnels sont ceux des protéines P ou GPIR-la natives, ou bien ils y sont introduits artificiellement. Les glycoprotéines inactivant les ribosomes utilisés comme produit de départ pour l'oxydation periodique selon l'inven- tion sont toutes les GPIR comme la chaîne A de ricine, qui sont par ellesmêmes très faiblement cytotoxiques car elles ne peuvent se fixer sur les cellules, mais qui, par contre, couplées à un anticorps, reconnaissant des cellules particulières, deviennent hautement cyto- toxiques pour ces cellules une fois que l'anticorps a reconnu sa cible. Des composés de départ représentatifs sont la chaîne A de ricine, la gélonine et la substance extraite de Momordica charantia (MOM) telles qu'elles sont obtenues par la voie extractive. D'autres GPIR utiles comme produit de départ pour l'oxyda- tion par les ions periodates sont les suivantes: Liste Dianthin 30 de Dianthus caryophyllus Dianthin 32 de " " Agrostin A de Agrostemma githago Agrostin B de " " Agrostin C de " HCI de Hura crepitans Asparagus officinalis inhibitor de Asparagus officinalis Les mêmes substances, produites par voie biosynthétique par des cellules dont le patrimoine génétique a été modifié dans ce but sont des composés également convenables. Des fragments des GPIR ci-dessus, à condition que de tels fragments retiennent tout ou partie de la propridté d'inactivation des ribosomes qui caractérise la GPIR dont ils sont issus, peuvent également être utilisés comme produits de départ. La chaÂne A de ricine native, dont au moins l'un des groupements thiol est protége, est un composé de départ préférentiel. L'obtention de la chaîne A de ricine pure est décrite dans le brevet US 4 340 535. La gélonine et le MOM sont également décrits. La protection des groupes thiol des GPIR de départ n'est nécessaire que lorsque lesdits groupes thiol sont ceux qui seront utilisés pour le couplage avec l'anticorps. Si pour le couplage on utilise d'autres groupes fonctionnels, par exemple l'hydroxyle phdno- lique des tyrosines, la protectionn'est pas effectuée. Le blocage est effectué par réaction avec un agent susceptible de substituer les fonctions SH à l'aide d'un radical qui peut être ensuite éliminé par réduction ou échange thiol/disulfure, par exemple l'acide dinitro-2,2' dithio-5,5' dibenzo que (DTNB) ou bien par l'acide (pyridyl2 disulfanyl)-3 propionique. -En l'absence * d'un tel traitement les thiols libres de la chaîne A peuvent dispa- raître pendant la réaction d'oxydation et dans ce cas ne peuvent être totalement régénérés par l'action d'un agent réducteur tel que le mercapto-2 éthanol. L'excès de l'agent bloquant est éliminé par dialyse. La glycoprotéine inactivant les ribosomes dont les thiols sont bloqués est alors soumise à l'oxydation par les ions periodate. Si par contre la sous-unité cytotoxique ne présente pas de thiol, ou bien si le ou les thiols ne servent pas au couplage, le blocage indiqué ci-dessus n'est pas mis en oeuvre. La réaction d'oxydation periodique est effectuée à un pH acide, compris entre 3 et 7, de préférence entre 5 et 6,5, Le periodate est utilisé en excès; plus particulièrement, la concen- tration en periodate alcalin est supérieure à la concentration des diols vicinaux susceptibles d'être oxydés: des concentrations de à 50 mM en periodate de sodium pour des concentrations de I à 10 mg/ml de sous-unité cytotoxique sont convenables. La durée du traitement, réalisé à une température comprise entre 0 et 15 C et de préférence entre 1 et 5 C et à l'obscurité,est comprise entre 0,2 et 24 h. La réaction est arrêtée par addition d'un réactif qui consomme le periodate restant, par exemple un excès d'éthylène- glycol,et les sous-produits sont éliminés par dialyse. Le produit obtenu à la fin de la réaction est isolé selon les techniques conven- tionnelles. Si les groupes thiol du produit de départ étaient bloqués, le déblocage est effectué selon les méthodes connues, par exemple par action d'un agent réducteur apte à libérer la fonction thiol préalablement bloquée tel que le mercapto-2 éthanol, ce qui conduit à l'obtention de la nouvelle glycoprotéine inactivant les ribosomes et à longue durée d'action prête à être utilisée pour le couplage avec un anticorps pour obtenir une immunotoxine. Dans le cas de la chaîne A de ricine, la nouvelle molé- cule ainsi obtenue (symbolisée A-la) possède les propriétés princi- pales suivantes: - un poids moléculaire non significativement différent de celui de la chaîne A native. Ce procédé de modification ne fait apparaître de façon visible par électrophorèse en gradient de polyacrylamide des polymères de la protéine qu'en très faible quantité et pas de produits de dégradation, - un taux de groupements thiol libres supérieur à 0,7 par mole, - une immunoréactivité envers des anticorps de lapin anti-chaîne A de ricine que'l'on ne peut distinguer de celle de la chaîne A native, une activité inhibitrice de la synthèse protéique dans un modèle acellulaire supérieure à 50 % de celle provoquée par une égale quantité de chaîne A native, - enfin, après administration intraveineuse unique chez le lapin à une dose voisine de 0,4 mg/kg de poids corporel, le taux plasma- tique de la chaîne A à longue durée d'action (A-la) présent dans le sang circulant au temps 23 h après l'injection est supérieur à 10 % du taux présent au temps zéro (contre 0,015 % pour la chaîne A native à ce même temps, soit un accroissement du taux plasmatique par un facteur largement supérieur à 500). De même, dans le cas de la gélonine, la molécule obtenue par oxydation periodique, possède les propriétés principales suivantes: - un poids moléculaire non significativement différentde celui de la gélonine native, - une immunoréactivité envers les anticorps de lapin anti-gglonine que l'on ne peut distinguer de celle de la g9lonine native, - enfin, après administration intraveineuse unique chez le lapin à une dose voisine de 0,3 mg/kg de poids corporel, le taux plasma- tique de la gélonine modifiée, au temps 24 h après l'injection,est supérieur à 3 %-du taux présent au temps zéro (contre 0,01 % pour la gélonine native à ce même temps, soit un accroissement du taux plasmatique par un facteur supérieur à 200). La préparation des conjugues ou immunotoxines à partir des glycoprotéines inactivant les ribosomes et à longue durée d'action est réalisée par n'importe quel procédé convenablement choisi dans la gamme de ceux qui sont décrits dans le brevet US 4 340 535. Si la sous-unité cytotoxique choisie présente naturellement au moins un thiol la rendant apte au couplage, cette fonction sera preférentiel- lement mise en oeuvre par réaction avec l'anticorps ou fragment d'anticorps porteur d'un groupement disulfure active. Si la sous- unité cytotoxique choisie ne possède pas naturellement de groupe thiol la rendant apte au-couplage on pourra préférentiellement intro- duire artificiellement sur ladite sous-unité,après l'étape d'oxy- dation par les ions periodate, au moins un groupement fonctionnel porteur d'un thiol libre, selon tout procédé connu, et poursuivre le couplage comme indiqué ci-dessus. L'introduction dudit groupement fonctionnel peut avoir lieu soit avant l'étape d'oxydation par les ions periodate mais il sera alors nécessaire que le radical thiol soit bloqué pendant l'étape d'oxydation puis débloqué après cette étape, soit après l'étape d'oxydation. La préparation d'anticorps monoclonaux dirigés contre des cellules cancéreuses humaines a été largement mentionnée dans la littérature scientifique et beaucoup de ces anticorps sont maintenant disponibles commercialement. Le couplage chimique entre la GPIR-la et l'anticorps (ou fragment d'anticorps) peut être réalisé selon le procédé de la présente invention par des modes opératoires qui: - préservent les activités biologiques respectives des deux composants du conjugué: l'anticorps et la GPIR-la, assurent au procédé une reproductibilité satisfaisante et un bon rendement de couplage, - permettent de maîtriser la valeur du rapport GPIR-la/anticorps dans le conjugué obtenu, -conduisent à un produit stable et soluble dans l'eau. Parmi les modes opératoires répondant à ces caractéristi- ques, il faut privilégier ceux qui mettent en oeuvre une ou plusieurs fonctions thiol pour l'établissement de la liaison entre les 2 proté- ines. En effet, ces fonctions thiol se prêtent particulièrement bien à l'établissement soit de liaisons disulfure, soit de liaisons thio- éther qui satisfont les unes comme les autres aux conditions générales cidessus. La préparation d'immunotoxines ayant en même temps les caractéristiques suivantes: - la liaison covalente entre la chaîne A de la ricine et l'anticorps contient un radical disulfure, - l'un des atomes de soufre constituant la liaison disulfure est toujours l'atome de soufre appartenant au résidu de cystéine en position 257 de la chaîne A de ricine, - le bras de liaison réunissant la chaîne A de ricine et l'anticorps est fixé sur ce dernier au niveau de groupementsNH2 latéraux ou terminaux d'une chaîne peptidique, et formées par couplage d'un anticorps avec la chaîne A de la ricine est décrite en détail dans le brevet US 4 340 535. La même méthode peut être appliquée à la préparation d'immunotoxines ayant les mêmes caractéristiques et formées par couplage d'un anticorps ou fragment d'anticorps avec une GPIR-la. La préparation d'immunotoxines formées par couplage d'un anticorps ou fragment d'anticorps avec une GPIR-la et par une liaison covalente du type disulfure ou thio6ther au niveau de diffé- rents groupes fonctionnels est décrite en détail ci-après. D'une façon générale, pour la bonne conduite des réactions de couplage entre protéines et en vue d'éliminer notamment les réti- culations anarchiques, il importe que l'une des protéines à coupler et elle seule porte la ou les fonctions thiol à mettre en oeuvre, alors que l'autre protéine et elle seule porte une ou plusieurs fonc- tions susceptibles de réagir avec les thioIs en milieu aqueux de pH compris entre 5 et 9 et à une température ne dépassant pas 30 C, pour fournir une liaison covalente stable et définie. Les caractéristiques des protéines P1 et P2 utilisées comme produits de départ sont illustrées en détail ci-après. La structure d'espacement E peut être remplacée par les structures préfé- rentielles R à R8 qui ne sont données qu'à titre d'exemple. I - CAS DE LA PROTEINE Pi Cette protéine étant dans tous les cas celle qui porte la ou les fonctions thiol qui participeront au couplage, la situation se présente de façon diverse selon la nature de cette protéine Pi. A) La protéine P1 porte naturellement un ou plusieurs radicaux thiol utilisables pour permettre le couplage à la protéine P2: c'est notamment le cas si la protéine P1 est le fragment d'anticorps connu sous la dénomination de F(ab)', tel qu'il est classiquement obtenu par protéolyse limitée de l'anticorps en présence de pepsine, suivie d'une réduction du (ou des) pont(s) disulfure entre chaînes lourdes. C'est également le cas si la protéine P1 est une GPIR-la, par exemple la chaîne A de la ricine modifiée (A-la), ou un dérivé de cette dernière,o l'un au moins des groupements thiol portés par les résidus de cystéine 171 et 257 de la chaîne A de ricine native est libre et accessible au couplage chimique. Dans tous ces cas, la protéine P1 porteuse de son (ou ses) grou- pement(s) thiol naturel(s) peut être utilisée dans cet état pour l'étape de couplage. B) La protéine P1 ne porte naturellement pas de radicaux thiol uti- lisables pour permettre le couplage à la protéine P2: - c'est notamment le cas si la protéine P1 est une immunoglobuline native, un anticorps entier ou un fragment d'anticorps et notam- ment l'un des fragments conventionnellement dénommés F(ab)'2 ou F(ab), un autre cas o la protéine P1 ne porte pas naturellement de fonction thioi utilisable pour le couplage est celui ou cette protéine P1 est une GPIR-la, par exemple la chaîne A de ricine à longue durée d'action o chacun des deux résidus de cystéine est soit bloqué par alkylation, soit inaccessible à la modifi- cation chimique. Dans tous les cas, il conviendra alors d'introduire artificielle- ment sur de telles molécules une ou plusieurs fonctions thiol aptes à permettre le couplage. Trois types de réaction peuvent être utilisés de préference pour l'introduction de fonctions thiol: 1- Le premier type de réaction est l'action de l'anhydride S-acétylmercapto succinique qui est capable d'acyler des fonctions aminées de la protéine. On pourra ensuite libérer les fonctions thiol par élimination du radical acétyl protec- teur, par action de l'hydroxylamine, ainsi que cela a été décrit (Archives of Biochemistry and Biophysics, 119, 41-49, 1967). On pourra même, dans le cas o la (ou les) fonction(s) thiol ainsi introduites sous forme protégée doivent réagir ultérieurement avec un radical disulfure mixte activé, se dispenser de la déprotection préalable par l'hydroxylamine; en effet, la réaction de formation de la liaison disulfure utili- sant les réactifs objets de la présente invention se produit aussi bien avec le radical S-acetyl qu'avec le thiol libre. D'autres méthodes décrites dans la littérature scientifique peuvent aussi être utilisées pour l'introduction de fonctions thiol sur la protéine à modifier. 2- Le deuxième type de réaction consiste à faire réagir la protéine par ses groupements carboxyliques avec une molécule diaminée symétrique présentant un pont disulfure, de formule: H2N-R1-S-S-R1-NH2 dans laquelle R1 est un groupe aliphatique comportant de 2 à 5 atomes de carbone. La réaction se fait de préférence avec la cystamine/R1 = -(CH2)2-/ en présence d'un agent de couplage tel qu'un carbodiimide et notam- ment un dérivé soluble dans l'eau comme l'éthyl-1 (diméthylamino-3 propyl) -3 carbodiimide, et conduit à la formation, selon les stoechiométries mises en oeuvre, de l'un des dérivés suivants ou du mélange des deux: Pl1C0-NH-R1-S-S-R1-NH2 (Ia) Pl,-CO-NH-R1-S-S-R1-NH-CO-P! (Ib). Un tel produit de réaction peut être alors utilisé de deux manières: a) Si,dans les formules Ia ou Ib, la protéine P1 est une GPIR-la, par exemple la chaîne A de ricine à longue durée d'action ou l'un de ses dérivés,le milieu réactionnel obtenu est soumis sans fractionnement à l'action d'un réducteur tel que le mercapto-2-éthanol, ce qui conduit à l'obtention d'un dérivé protéique unique de formule générale: Pl,-CONH-R1- SH Le produit ainsi obtenu est alors purifié par dialyse ou filtration sur gel. b) Si,dans les formules Ia et Ib, la protéine P1 est un anticorps ou l'un de ses fragments,le milieu réactionnel obtenu sera utilisé tel quel pour le couplage en utilisant alors une méthode d'échange thiol/disulfure par exemple celle décrite par Gilliland et Collier (Cancer Research, 40, 3564, 1980). 3- Le troisième type de réaction consiste à utiliser des motifs glucidiques naturellement présents sur les anticorps pour fixer le radical porteur du thiol que l'on se propose d'introduire. La 2.577135 protéine P est alors soumise à une oxydation par les ions periodate selon les méthodes connues afin de faire apparaître des fonctions aldéhyde sur'les motifs glucidiques. Après arrêt de la réaction par addition d'un excès d'éthylèneglycol et élimi- nation des sous-produits et excès de réactifs par dialyse, le produit obtenu est traité par une molécule diaminée symétrique présentant un pont disulfure, de formule générale: H2N-R-S-S-R1-NH2 dans laquelle R1 est un groupe aliphatique comportant de 2 à 5 atomes de carbone. Les produits d'addition formés sont alors réduits en amines secondaires ou tertiaires par action d'un hydrure métallique convenable, notamment le borohydrure de sodium. La réaction se fait de préférence avec la cystamine /R1 = -(CH2)2-/ et conduit à la formation, selon les stoechiométries mises en oeuvre de l'un des dérivés suivants ou du mélange des deux: OH Pl N-R1-S-S-R1-NH2 Ia IH OH OH OH I l CH CH I I Pl N-R1- -9S-R N / Pl I OH OH Le milieu réactionnel obtenu pourra alors être traité exactement comme indiqué ci-dessus pour les produits caractérisés par les structures Ia ou Ib. Dans les deux derniers types de réaction d'introduction artifi- cielle de groupements thiol décrits ci-dessus (ceux utilisant un réactif disulfure diaming symétrique), il est préférable que la protéine Pl mise en oeuvre ne possède ni groupes SH libres, ni groupes aminés libres. Dans le cas de la GPIR-la cela peut toujours être réalise par alkylation du ou des SH naturels obtenue par réaction avec un réactif usuel des thiols tel que le N-gthylmalgiimide ou l'acide iodacdtique ou l'un de ses dérivés et par mnthylation des NH2 naturels selon le procédé de m9thylation réductive décrit par MEANS et FEENEY (Biochemistry 7, 2192 (1968)). Par exemple, la chaîne A de ricine native modifiée peut présenter jusqu'à 6 radi- caux méthyle par mole préalablement introduits. Une telle protéine conserve l'intégralité de ses propriétés biologiques et notamment sa capacité à inhiber la synthèse protéique ribosomale dans les cellules eucaryotes. Dans les cas des anticorps ou fragments d'anticorps et plus géné- ralement de toutes les substances du premier groupe tel que défini précédemment qui ne possedent pas de groupements SH naturellement libres, il conviendra de procéder à une m9thylation r9ductive, par exemple selon la méthode de MEANS et FEENEY: on peut ainsi habi- tuellement introduire plusieurs dizaines de radicaux méthyle par mole d'anticorps sans modifier sa capacité à reconnaître sélecti- vement un antigène à la surface des cellules porteuses de cet antigène. II - CAS DE LA PROTEINE P2 Cette protéine est dans tous les cas celle qui porte un ou plusieurs groupements fonctionnels capables de réagir avec les thiols de la protéine Pl pour former une liaison soit disulfure soit thioéther. Ces groupements fonctionnels, toujours artificiellement introduits sur la protéine P2, différent selon que l'on cherche à obtenir un couplage par liaison disulfure ou par liaison thiogther et sont choisis comme indiqué ci-après. 1) Cas de la liaison disulfure La préparation du conjugué peut alors être représentée par le schéma: P,-(Z-Y-E)n-SH + P2,-Z'-Y'-E'-S-S-X-- Pl,-(Z-Y-E) -S-S-E'-Y'-Z'-P2, + XSH La protéine P2 substituée par un atome de soufre activé est obtenue à partir de la protéine P2 elle-même ou de la protéine P2 correctement protégée, par substitution à l'aide d'un réactif lui- même porteur d'un atome de soufre activé selon le schéma: P P2 + L-Y'-R-S-S-X - P2,-Z'-Y'-R'-S-S-X dans lequel: - P2 désigne la protéine à substituer - L-Y' représente une fonction permettant la fixation covalente du réactif sur la protéine. Le groupement fonctionnel L-Y' est une fonction capable de se lier de façon covalente avec l'une quelconque des fonctions portées par les chaînes latérales des aminoacides constitutifs de la protéine à substituer. Parmi celles-ci, on retiendra particulièrement: a) Les fonctions aminées terminales des chaînes peptidiques ou les fonctions aminées latérales des radicaux lysyle contenus dans la protéine. Dans ce cas, L-Y' pourra notamment représenter: - un groupe carboxylique qui pourra se lier aux fonctions aminées de la protéine en présence d'un agent de couplage tel qu'un carbo- diimide et notamment un dérivé soluble dans l'eau comme l'éthyl-1 (diméthylamino-3 propyl)-3 carbodiimide - un chlorure d'acide carboxylique qui est susceptible de réagir directement avec les fonctions aminées pour les acyler - un ester dit "activé" tel qu'un ester d'ortho- ou para-, nitro- ou dinitro-phényle ou encore un ester de N-hydroxy succinimide qui peut réagir directement avec les fonctions aminées pour les acyler - un anhydride interne d'un diacide carboxylique tel, par exemple, l'anhydrique succinique qui réagit spontanément avec les fonctions amines pour créer des liaisons amides NH - un groupemnt imidoester - C (L = OR2, Y' = -(C=NH)-) OR2 o R est un groupe alkyle, réagissant avec les groupes aminés de la protéine P2 selon la réaction: H I HN N P2 -NH2 + C - R3'-" P2, NH - - R3 + R20H R20 o R3 représente le groupe -R-S-SX; b) les fonctions phénol des radicaux tyrosyle contenus dans la protéine. Dans ce cas L-Y' pourra notamment représenter un groupe- ment imidazolyl-1-carbonyle, réagissant avec les groupes phénol de la protéine selon la réaction: =P2,OH +rpN-CO-R4 - > P2 -OCO-R4 + _NH N N = o le 1-imidazolyle est L, le groupe CO est Y' et R4 est le groupe -R-S-S-X. Le radical -S-S-X désigne un disulfure mixte activé capable de réagir avec un radical thiol libre. En particulier, dans ce disul- fure mixte, X pourra désigner un groupe pyridyl-2 ou pyridyl-4, éventuellement substitué par un ou des radicaux alkyle, halogène ou carboxylique. X peut aussi désigner un groupe phényle de préférence substitué par un ou des groupes nitro- ou carboxylique. X peut encore représenter un groupe alcoxycarbonyle tel que le groupe méthoxycarbonyle. Le radical R désigne la structure d'espacement (indiquée comme E dans la formule générale Il ci-dessus) capable de porter simul- tanément les substituants Y' et S - S - X. Il devra être choisi de façon à ne pas comporter de fonctions susceptibles d'interférer au cours des réactions ultérieures avec les réactifs utilisés et les produits synthétisés. En particulier, le groupe R peut être un groupe -(CH2)n- avec n compris entre 1 et 10, ou encore un groupe: R5 - CH - CH - R6 dans lequel R6 désigne l'hydrogène ou un groupe alkyle ayant de 1 à 8 atomes de carbone et R5 désigne un substituant inerte vis-à-vis des réactifs utilisés ultérieurement tel qu'un groupe carbamate - NH - C - OR7 Il o R7 désigne un groupe alkyle droit ou ramifié ayant de 1 à 5 atomes de carbone et notamment le groupe tertiobutyle. La réaction du composé L-Y'-R-S-S-X avec la protéine P2 est effectuée en phase liquide homogène le plus souvent dans l'eau ou une solution tampon. Lorsque la solubilité des réactifs l'exige, il est possible d'ajouter au milieu réactionnel un solvant orga- nique miscible à l'eau à une concentration finale pouvant atteindre % en volume lorsqu'il s'agit d'un alcool tertiaire tel que le butanol tertiaire ou'10 % en volume lorsqu'il s'agit du diméthyl- formamide ou du tétrahydrofuranne. La réaction est effectuée à température ambiante pendant un temps variant de quelques minutes à quelques heures. Après quoi, une dialyse ou une filtration sur gel permet d'éliminer les produits de faible masse moléculaire et, en particulier, les excès de réactifs. Ce procédé permet d'introduire un nombre de groupements substituants par mole de protéine habituellement compris entre 1 et 15. En utilisant de tels composés, le couplage avec la protéine P1 est réalisé par mise en présence des deux protéines en solution aqueuse de pH compris entre 6 et 8, à une température ne dépassant pas 30 C, pendant un temps variant de 1 h à 24 h. La solution aqueuse obtenue est éventuellement dialysée pour éliminer les produits de faible masse moléculaire, puis le conjugué peut être purifié par diverses méthodes connues. 2) Cas de la liaison thioéther La préparation du conjugué consiste alors à faire réagir P1,-(Z-Y-E)n-SH avec la protéine P2 sur laquelle auront préalable- ment été introduits un ou plusieurs radicaux maléiimide. La réaction est alors représentée par le schéma suivant cité comme exemple: P1-(Z-Y-E)n-SH + P2 -Z-CO-R8-N /O' p2,_ZCOR8_-P1 dans lequel: - R8 représente une structure d'espacement, aliphatique ou aromatique, comportant de 1 à 15 atomes de carbone, inerte vis-a-vis des réactifs utilisés ultérieurement - Z représente des groupes variables selon le type de groupement fonctionnel substitué sur la protéine P2. Ainsi Z = oxygène dans le cas d'un ester sur le phénol d'un résidu tyrosyle Z = NH dans le cas du couplage d'un groupement carboxylique activé sur un groupement aminé de la protéine Z = NH-CH2 dans le cas de la réaction d'une chloromgthylcgtone sur un groupement aminé de la protéine. La protéine P2 substituée par le ou les groupes malgiimide est obtenue à partir de la protéine P2 elle-même ou de la protine P2 correctement protégée, par substitution de fonctions convenables de la protéine à l'aide d'un réactif lui-même porteur du groupement maléiimide. Parmi ces fonctions convenables, on retiendra particu- librement: a) Les fonctions aminées terminales des chaînes peptidiques ou les' fonctions aminées latérales des résidus lysyle contenus dans la protéine. Dans ce cas, le réactif porteur du radical maléiimide pourra être: - soit un réactif de formule générale o L-CO-Rs-N 2 5 7 7 135 dans laquelle L-CO- représente: - soit un groupe carboxylique, la réaction étant alors effectuée après activation de la fonction carboxylique en présence d'un agent de couplage tel qu'un carbodiimide et notamment un dérivé soluble dans l'eau tel que l'dthyl-1 (diméthylamino-3 propyl)-3 carbodiimide, - soit un ester dit "active" tel qu'un ester d'ortho- ou para-, nitro ou dinitrophényle, ou encore un ester de Nhydroxysuccinimide qui réagit directement avec les fonctions aminées pour les acyler. La préparation de tels réactifs est notamment décrite dans Helvetica Chimica Acta 58, 531-541 (1975). D'autres réactifs de la même classe sont commercialement disponibles. - soit un réactif de formule générale: o ClCH2-CO-R8-Nh O o capable de réagir avec les groupements aminés de la protéine P2 selon le schéma: P2'NH2 + ClCH2-CO-R8-N 2 P2NH-CH2-cO-R8-NN 0 0 b) Les fonctions phénol des radicaux tyrosyle contenus dans la protdine. Dans ce cas, le réactif porteur du radical maléiimide pourra être un réactif de formule générale: fIN N-CO-R -Nt o réagissant avec les groupes phénol de la protéine selon la réaction: 0 0 N N F N-C0-R8-N[I + P2,OH P21-0-CO-Rs- + D o o La réaction des réactifs porteurs de maléiimide avec la protéine P2 est effectuée en phase liquide homogène le plus souvent dans l'eau ou une solution tampon. Lorsque la solubilité des réactifs l'exige, il est possible d'ajouter au milieu réactionnel un solvant organique miscible à l'eau à une concentration finale pouvant attein- dre 20 % en volume lorsqu'il s'agit d'un alcool tertiaire tel que le butanol tertiaire ou 10 % en volume lorsqu'il s'agit du diméthyl- formamide ou du tétrahydrofuranne. La réaction est effectuée à température ambiante pendant un temps variant de quelques minutes à quelques heures. Après quoi, une dialyse ou une filtration sur gel permet d'éliminer les produits de faible masse moléculaire et, en particulier, Ies excès de réac- tifs. Ce procédé permet d'introduire un nombre de groupements substi- tuants par mole de protéine habituellement compris entre 1 et 15. En utilisant de tels composés, le couplage avec la protéine P1 est réalisé par mise en présence des deux protéines en solution aqueuse de pH compris entre 6 et 8, à une température ne dépassant pas 30 C, pendant un temps variant de I h à 24 h. La solution obtenue est éventuellement dialysée pour éliminer les produits de faible masse moléculaire, puis le conjugué peut être purifié par diverses méthodes connues. Les composés de formule N N-CO-E-G VI N:i dans laquelle E et G sont tels que définis ci-dessus, sont préparés par un procédé caractérisé en ce qu'on fait réagir un composé de formule G-E-COOH VII dans laquelle G et E sont tels que définis ci-dessus, avec le. carbonyldiimidazole de formule F=IzN-CO-N VIII N N dans un solvant organique à la température de 10 à 40 C. Les composés de formule VI sont particulièrement utiles comme agents de couplage sur les hydroxyles des tyrosines des protéines GPIR-la et P. Selon un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet de nouveaux produits ayant la formule statistique suivante GPIR-la"-O-CO-E-G IX dans laquelle - GPIR-la" représente le radical de la protéine GPIR-la ou toute molécule dérivant de ladite GPIR-la par modification artificielle de l'un quelconque de ses groupements fonctionnels, privée d'un ou plusieurs groupes hydroxyles phénoliques des tyrosines - l'atome d'oxygène est celui des groupes hydroxyles phgnoliques manquant dans le radical GPIR-la"; - E et G sont tels que définis ci-dessus. Particulièrement préférés sont les composés de formule IX dans laquelle E représente un groupe -(CH2)p- o p est un nombre entier de 2 à 7 ou un groupe -CH- CH2COOH et G est un groupement de structure -S-S-X, o X est un radical activateur choisi parmi les groupes 2-pyridyle et 4-pyridyle non substitués ou substitués par un ou des halogènes ou des radicaux alkyle, carboxyle, alcoxycarbonyle, le groupe phényle non substitué ou substitué par un ou des halogènes ou des groupes nitro, alcoxy, carboxyle ou alcoxycarboxyle, ou un groupe alcoxycarbonyle. Les produits de formule IX sont préparés en faisant réagir un produit de formule GPIR-la"-OH dans laquelle GPIR-la" est tel que défini ci-dessus et le groupe hydroxyle est l'hydroxyle phénolique manquant dans les tyrosines du radical GPIR-la", avec un composé de formule VI ci-dessus à une tempé- rature de 10 à 40 C dans un solvant aqueux contenant éventuellement un solvant organique miscible à l'eau, tel que par exemple un solvant éthéré comme le dioxanne ou le tétrahydrofuranne. Dans le cas oi GPIR-la est la chaîne A de ricine à longue durée d'action, les propriétés des immunotoxines IT (A-la) ainsi obtenues sont les suivantes: -le taux de couplage moyen exprimé en nombre de moles de chaîne A modifiée par mole d'anticorps est habituellement compris entre 0, 5 et 5 et en particulier entre I et 3, - la séparation électrophorétique en gel de polyacrylamide de l'IT (A-la) conduit à une répartition du produit en une série de bandes correspondant à des produits dont les poids moléculaires diffèrent de celui de l'anticorps par incréments successifs de 30 000 daltons, - les études effectuées par cytofluorométrie permettent de montrer que l'anticorps n'a subi aucune altération importante au cours des réactions d'activation et de couplage auxquelles il a été soumis et qu'il reste capable au sein même du conjugue de reconnaître l'antigène contre lequel il est dirigé, - l'activité inhibitrice de la synthèse protéique de la chaîne A, modifiée et couplée à un anticorps, déterminée dans un modèle acellulaire en présence de mercapto-2-éthanol est totalement conserve. L'activité cytotoxique des IT (A-la) mesurée en présence d'activateur dans un test de synthèse protéique en modèle cellulaire sur les cellules présentant l'antigène-cible est plus de 1000 fois supérieure à celle mesurée dans les mêmes conditions sur des cellules ne présentant pas l'antigène-cible. Par exemple, l'immunotoxine (désignée IT (A-la) T01O), construite en couplant à l'aide d'un bras à pont disulfure la chaîne A de ricine modifiée à un anticorps mono- clonal (désigné anticorps Tio0) dirigé contre l'antigène T65 présent à la surface de certaines cellules leucémiques humaines, est environ 10 fois plus cytotoxique vis-à-vis des cellules T65 positives que des cellules T65 négatives, - l'efficacité cytotoxique des IT (A-la) mesurée en test clonogé- nique est aussi élevée que celle obtenue avec les IT convention- nelles correspondantes. Par exemple l'IT (A-la) TIOl à une dose aussi faible que 10- M, en'présence de 10 mM de chlorure d'ammo- nium,conduit à une cytoréduction spécifique de l'ordre de 99,999 % de la valeur initiale. Ce résultat est identique à ceux obtenus avec l'IT-TIOI, construite avec le même anticorps et la chaîne A de ricine non modifiée, enfin, après administration intraveineuse de l'IT (A-la) chez le lapin à une dose voisine de 0,4 mg/kg de poids corporel exprimé en chaîne A, le taux plasmatique de l'IT (A-la) présent dans le sang circulant au temps 23 h après l'injection est de 10 à 200 fois supérieur au taux plasmatique de l'IT conventionnelle mesurée dans les mimes conditions. Ainsi typiquement-chez le lapin il apparaît que le taux plasmatique de l'IT (Ala) T101 dans le sang circulant au temps 23 h après l'injection est de 7 % du produit présent au temps zéro contre 0,05 % pour l'IT TIol conventionnelle correspon- dante, au même temps, soit un accroissement de l'ordre d'un facteur 140. On obtient ainsi des immunotoxines modifiées qui ont acquis un caractère nouveau quant à leurs propriétés pharmacocinétiques. Plus particulièrement, par modification appropriée de la sous-unité cytotoxique,on a pu ajouter aux propriétés de cytotoxicité spécifique des immunotoxines, sans qu'il leur soit porté atteinte, une nouvelle propriété tout aussi intrinsèque: la capacité à mani- fester une lente cinétique d'élimination plasmatique. Les exemples suivants permettent de mieux comprendre l'invention sans en limiter.la portée. Exemple 1 Cet exemple démontre, après injection intraveineuse chez l'animal, l'élimination lente de la chaîne A de ricine modifiée par le periodate de sodium. * Modification de la chaîne A de ricine par le periodate de sodium. 1) Blocage du SH naturel par le DTNB. La chaîne A de ricine a été préparée et purifiée ainsi qu'il a été indiqué dans le brevet US 4 340 535. A 10 ml d'une solution de chaîne A de ricine à 5,6 mg/ml (à 0,84 groupement thiol par chaîne A) dans le tampon PBS (tampon phosphate 20 nM, NaCI 150 mM, pH 7) on ajoute 20 équivalents d'une solution d'acide dinitro-2,2' dithio-5,5' dibenzoique (DTNB) soit 385 microlitres d'une solu- tion 0,1 M de DTNB dans un tampon phosphate 125 mM pH 7 (cette solution est amenée à pH 7 à l'aide d'hydroxyde de sodium). On laisse l'incubation se poursuivre pendant 20 min à 20 C. On dialyse ensuite la solution contre du tampon PBS à 4 C, on obtient ainsi 53 mg de chaîne A bloquée sur la fonction thiol, en solution à 5 mg/ml. 2) Oxydation périodique de la chaîne A bloquée A 6 ml de solution à 5 mg/ml de chaîne A bloquée, amenée à pH 6 à l'aide d'acide acétique I M, on ajoute 120 microlitres d'une solution de periodate de sodium 0,5 M dans l'eau. On laisse l'incubation se poursuivre pendant 16 h à 4 C dans l'obscurité. La réaction d'oxydation est arrêtée par addition de 620 microlitres d'une solution aqueuse d'éthylàneglycol I M. Après 15 min d'incu- bation à 20 C, le milieu réactionnel est dialysé à 4 C contre du tampon PBS. L'oxydation periodique fait apparaître un léger préci- pité protéique qui est éliminé par centrifugation à 10 000 x g pendant 30 min. On obtient ainsi 24 mg de chaîne A bloquée et oxydée à une concentration de 3,4 mg/ml. 3) Déblocage des groupements thiol: A 6 ml de chaîne A bloquée et oxydée à 3,4 mg/ml dans le tampon A on ajoute comme agent réducteur du mercapto-2 éthanol à la concen- tration finale de I %. On laisse l'incubation se poursuivre pendant 1 h à 20 C. On dialyse ensuite la solution contre le tampon PBS à 4 C. On obtient ainsi 19 mg de chaîne A oxydée à une concentra- tion de 2,8 mg/ml. En utilisant la technique au DTNB (Methods in Enzymology, 1972, 25 457 (Academic Press) on détermine que la chaîne A modifiée obtenue présente 0, 70 groupement thiol libre par mole. Le poids moléculaire de la chaîne A modifiée est de 30 000 +/- 3000, déterminé par électrophorèse en gradient de polyacrylamide en présence de dodé- cyl-sulfate de sodium. 2 5 7 7 135 La préparation de chaîne A dont les motifs polysaccharidiques ont été oxydés, obtenue précédemment, a été étudiée en ce qui concerne ses activités enzymatiques d'inhibition de la synthèse protéique et ses propriétés pharmacocinétiques. II- Activité enzymatique de la chaîne A à longue durée d'action, mesurée sur un modèle acellulaire. La propriété biologique fondamentale de la chatne A de ricine est d'inhiber la synthèse protéique cellulaire par altération de la sous-unité ribosomale 60S. Le protocole in vitro utilisé comporte l'emploi de fractions subcellulaires de foie de rat convenablement-complémentées et capables d'incorporer la 14C-phénylalanine en présence d'un ARN messager artificiel, l'acide polyuridylique. Le mode opératoire employé pour préparer les fractions subcellulaires et pour mesurer l'incorporation de 14C-phénylalanine est une adaptation de la méthode décrite dans Biochemica Biophysica Acta, 1973, 312, 608-615, mettant en oeuvre à la fois une fraction microsomale et une fraction de cytosol des hépatocytes de rat. L'échan- tillon contenant la chaîne A est introduit sous la forme d'une solu- tion convenablement diluée dans un tampon Tris HCl 50 mM, pH 7,6 contenant du mercapto-2 éthanol à 0,2 % et de la sérum-albumine bovine à 15 microgrammes/mi. A partir des données de comptage, on calcule par rapport à un milieu témoin sans inhibiteur le pourcentage d'inhibition de l'incorporation de 14C-phénylalanine dans les protéines pour chaque milieu réactionnel contenant de la chaîne A de ricine. - L'activité inhibitrice a été déterminée. On observe une CI50 égale à 7,8. 10-9 mole/1 pour la chaîne A oxydée. La CI50 de -9 5 la chaîne A témoin de l'expérience est de 13.10 mole/l: la modification n'entraîne donc pas de perte d'activité de la chaîne A. III- Propriétés pharmacocinétiques de la chaîne A à longue durée d'action modifiée sur ses motifspolvsaccharidiques. La chaîne A est administrée chez le lapin par injection unique dans une veine de l'oreille. La quantité de chaîne A injectée correspond à 0,415 mg/kg. Les échantillons de sang sont prélevés au cours du temps sur héparine. Les plasmas sont analysés à l'aide d'un test immunoradiométrique ci-après désigné par l'abréviation IRM-l. Cette technique a l'avantage de doser la chaîne A sans modification de celle-ci. Ce dosage est réalisé dans des plaques à microtitrations (par exemple: "NUNC-TSP screening system" Poly Labo Block France) dont le couvercle est muni de pointes hyperabsor- bantes qui plongent dans les puits du socle. Ces pointes consti- tuent les phases solides. Des anticorps de brebis anti-chaîne A de ricine (ci-après désignés sous l'abréviation Acl), purifiés par chromatographie d'affinité, sont absorbés sur les phases solides. Pour cela 200 microlitres d'une solution d'Acl à 10 microgrammes/ml dans le tampon phosphate PBS sont distribués dans les puits. Les pointes sont mises en contact d'abord avec la solution d'Acl pendant 24 h à 4 C puis avec du sérum de veau foetal pendant 3 h à 20 C pour saturer tous les sites de fixation. L'immunoabsorbant saturé est alors mis en contact pendant 3 h à 20 C avec les échantillons plasma- tiques à doser à différentes dilutions ou avec des solutions de chaîne A de concentrations connues pour l'établissement de la courbe d'étalonnage. Un lavage est effectué par un tampon PBS, puis l'immunoabsorbant est mis en contact pendant 2 h à 20 C avec les anticorps de brebis anti-chaîne A de ricine purifiés par chromato- graphie d'affinité et radiomarqués (ci-après désignés par l'abrévia- tion Ac2). Le radiomarquage de l'Ac2 est réalisé avec l'iode 125 en présence de chloramine T selon la méthode de Greenwood et Hunter (Biochem. J., 1963, 89, 114); l'activité spécifique des Ac2 radio- marqués est de 5 à 10 microCuries/microgramme. 10 cpm d'Ac2 radio- marqués sont introduits sous 200 microlitres dans le tampon PBS, contenant 0,1 % de sérum-albumine bovine. Après lavage, dans le tampon PBS, les pointes sont détachées et la quantité d'Ac2 lié est mesurée par comptage de la radioactivité. La mesure de la concen- tration en chaîne A dans les échantillons à doser se fait par réfé- rence à la courbe d'étalonnage réalisée avec la chaîne A introduite à différentes concentrations connues. Lorsque de la chaîne A à longue durée d'action est injectée chez l'animal, cette même chaîne A à longue durée d'action est utilisée pour l'établissement de la courbe d'étalonnage correspondante. Les valeurs de concentration en chaîne A dans le plasma sanguin mesuré par cette technique sont reproductibles et fiables. Le seuil de détection est de 1 nanogramme/ml. L'étude de la reproduc- tibilité intra- et inter-essais donne des coefficients de variation inférieurs à 10 % pour les valeurs de concentration comprises dans la gamme de 1 à 200 nanogrammes/ml. Les résultats de ces expériences sont représentés sous la forme de courbes présentant en abscisse le temps, exprimé en heure, et en ordonnée, sur échelle logarithmique, la concentration plasmatique du produit mesuré, rapportée en pourcent de la concen- tration plasmatique théorique au temps zéro. Cette valeur appelée "concentration plasmatique relative" (CPR) est calculée à l'aide de l'expression suivante: Concentration mesurée au temps t CPR = x 100 quantité injectée/volume plasmatique Le volume plasmatique est considéré égal à 36 ml/kg de poids corporel de l'animal. La figure 1 montre la courbe d'élimination plasmatique, en fonction du temps, de la chaîne A de ricine native injectée par voie intraveineuse. Cette courbe (courbe 1) présente deux phases: dans la première phase, le produit disparaît très rapidement de la circulation puisque trois heures après l'injection il ne reste plus dans le plasma que 0,1 % de la dose administrée. Dans la deuxième phase, la décroissance est plus lente. Lorsque la chaîne A a été oxydée sur ses motifs poly- saccharidiques, le profil d'élimination est profondément modifié: la première phase d'élimination --responsable de la disparition de la plus grande partie du produit - est pratiquement abolie, ce qui conduit à un accroissement considérable des taux plasmatiques de chaîne A. Vingt heures après l'injection, la concentration de la chaîne A oxydée est 600 fois supérieure à ce qu'elle est quand la chaîne A n'est pas modifiée (courbe 2). Exemple 2 Cet exemple démontre l'importance de la durée du traite- ment oxydatif sur les propriétés pharmacocinétiques de la chaîne A oxydée. Six préparations de chaîne A oxydée sont réalisées en utilisant la procédure indiquée dans l'exemple 1 excepté pour la durée du traitement au periodate de sodium. Les temps de traitement sont les suivants: zéro: (arrêt immédiat par l'éthylèneglycol), 20 min, 40 min, 2,5 h, 4 h et 18 h. Ces différentes préparations sont injectées chez le lapin et la concentration plasmatique relative de la chaîne A est mesurée au temps 23 h selon la même procédure que dans l'exemple 1. Les résultats sont représentés sur la figure II. Ces résultats indiquent que 1) l'accroissement du taux plasmatique de la chaîne A est bien dû à l'oxydation periodique puisque lorsque la réaction est immédiatement arrêtée la concentration plasmatique de chaîne A est identique à celle obtenue pour la chaîne A native, 2) il est nécessaire que la durée de cette réaction soit relativement longue pour obtenir des effets optimaux. Exemple 3 Cet exemple démontre, après injection intraveineuse chez l'animal, 1) l'élimination rapide de la gélonine native et 2) l'éli- mination lente de la gélonine modifiée par le periodate de sodium. Modification de la 1élonine par le periodate de sodium. La gélonine a été préparée et purifiée à partir de Gélonium multiflorum selon la méthode décrite (J. Biol. Chem. (1980), 255, 6947-6953). La réaction d'oxydation est réalisée dans les mêmes condi- tions que celles décrites pour la chaîne A de ricine dans l'exemple 1 excepté que l'étape de blocage des thiols par le DTNB n'est pas pratiquée. En effet, le couplage de la gélonine à l'anticorps n'étant pas généralement pratiqué à partir des groupements thiols naturels de la gélonine, les groupements thiols seront introduits artificiel- lement après l'étape d'oxydation, selon la technique décrite dans Cancer Res. 1984, 44, 129-133. A 1 ml de solution à 3 mg/ml de gélo- nine dans le tampon PBS, amenée à pH 6 à l'aide d'acide acétique IM, on ajoute 21 microlitres d'une solution de periodate de sodium 0,5 M dans l'eau. On laisse l'incubation se poursuivre pendant 16 h à 40C dans l'obscurité. La réaction est arrêtée par addition de 105 micro- litres d'une solution aqueuse d'éthylèneglycol 1 M. Après 15 min d'incubation à 20 C, le milieu réactionnel est dialysé à 4 C contre du tampon PBS. On obtient ainsi après centrifugation à 10 000 x g pendant 30 min 2,9 mg de gélonine oxydée à une concentration de 2,5 mg/ml. Comme la chaîne A de ricine, la propriété fondamentale de la gélonine est d'inhiber la synthèse protéique de cellules euca- ryotes par altération de la sous-unité ribosomale 60 S (Biochem. J., 1982, 207, 505-509). Dans le cas de la gélonine aussi, la modifica- tion due à l'oxydation periodique n'entraîne pas de perte d'activité. II- Proúpiéts pharmacocinétiques de la gélonine à longue durée d'action. La gélonine native ou modifiée selon les procédures déve- loppées ci-dessus est administrée chez le lapin par injection unique dans une veine de l'oreille. La quantité de gélonine injectée est comprise entre 0,3 et 0,4 mg/kg. Les échantillons de sang sont préle- vés au cours du temps sur héparine. Les plasmas sont analysés à l'aide d'un test immunoradiométrique ci-après désigné par l'abrévia- tion IRM-2. Cet essai est réalisé selon la même technique que pour le test IRM-1 excepté que la solution Acl est ici une solution d'anti- corps de lapin anti-gélonine purifies par chromatographie d'affinité, les anticorps Ac2 étant les mêmes anticorps radiomarqués. La procé- dure de radiomarquage est identique à celle décrite pourla technique IRM1. La mesure de la concentration en gélonine native ou gélonine modifiée dans les échantillons à doser se fait par référence à une courbe d'étalonnage réalisée avec la gélonine native ou modifiée introduite à différentes concentrations connues. L'essai IRM-2 répond aux mêmes caractéristiques de fiabilité et reproductibilité que celles décrites pour la technique IRM-I. Les résultats de ces expériences sont représentés de la même façon que pour la chaîne A de ricine dans l'exemple 1. La figure 3 montre les courbes d'élimination plasmatique, en fonction du temps, de la gélonine native et de la gélonine oxydée injectées par voie intraveineuse. La gélonine native, comme la chaîneA 2 5 77135 de ricine native, disparaît très rapidement de la circulation puisque 99, 99 % de la gélonine présente dans le sang circulant disparaissent en 24 h (courbe 1). Lorsque la gglonine a été oxydée sur ses motifs polysaccharidiques, le profil d'élimination est profondément modifié: 24 h apres l'injectionla concentration de la gélonine oxydée est 300 fois supérieure à celle de la gélonine native (courbe 2). Ainsi, comme pour la chaîne A de ricine, ces résultats prouvent que l'oxydation periodique a modifié les sucres impliqués dans le processus de reconnaissance responsable de l'élimination de la gélonine au point d'empêcher cette reconnaissance. Exemple 4 Conjugué obtenu par réaction entre un anticorps anti- cellules T humaines (anticorps dirigé contre l'antigène T65) substitué par des groupements disulfure activé et la chaîne A de ricine oxydée. a) Anticorps anticellules T humaines (ou anticorps TIOI): Cet anticorps a été obtenu selon la méthode décrite dans Journal of Iimunology, 1980, 125 (2), 725-737. b) Chaîne A de ricine oxydée: La chaîne A de ricine a été préparée ainsi qu'il a été indiqué dans l'exemple 1. II) AnticorEs activés anticellules T humaines A 100 microlitres d'une solution à 20 mg/ml d'acide (pyridyl 2 disulfanyl)-3 propionique dans le tertiobutanol, on ajoute microlitres d'une solution à 60,3 mg/ml d'éthyl1 (diméthylamino-3 propyl)-3 carbodiimide et on laisse 3 min à température ambiante. On ajoute 68 microlitres de la solution ainsi obtenue à 2 ml d'une solution d'anticorps à 8,9 mg/ml dans le tampon PBS. Le mélange est agité 15 min à 30 C puis dialysé contre du tampon PBS à 4 C. Après dialyse la solution protéique est centrifugée et l'on obtient ainsi 15 mg d'anticorps activé à une concentration de 7,9 mg/ml. Par dosage spectrophotométrique à 343 nm de la pyridine thione-2 libérée par échange avec le mercapto-2 éthanol, on constate que l'on a obtenu un anticorps portant 3,8 groupements disulfure mixte activé par mole d'anticorps. III) PEparation de l'immunotoxine à chaîne de ricine à longue durée d'action. A 1,5 ml de la solution d'anticorps activé précédemment obtenue (concentration 7,9 mg/ml, soit 11,8 mg d'anticorps activés), on ajoute 2, 46 ml de chaîne A modifiée à 2,87 mg/ml et on incube h à 20 C. La solution est centrifugée puis purifiée par filtration sur colonne de Séphadex G100 avec mesure de la densité optique de l'effluent à 280 nm. Le regroupement des fractions contenant à la fois l'anticorps et la chaîne A conduit à 15 ml de solution d'immuno- toxine à 0,7 mg/ml soit 10,5 mg. Cette solution contient 0,14 mg de chaîne A oxydée couplée à l'anticorps par ml. Le taux de couplage moyen de cette préparation est donc de 1,2 mole de chaîne A oxydée par mole d'anticorps. L'immunotoxine à chaîne A de ricine oxydée, IT (A-la) TIOI obtenue comme indiqué ci-dessus a été étudiée en ce qui concerne ses propriétés pharmacocinétiques et ses propriétés de cytotoxicité spécifique vis-à-vis des cellules-cibles. Exemple 5 Cet exemple démontre l'acquisition de la propriété de lente élimination plasmatique des immunotoxines à chaîne A de ricine à longue durée d'action désignées en abrégé IT (A-la). I-Mode opératoire Le conjugué préparé selon la procédure développée dans l'exemple 3 est administré chez le lapin par injection unique dans une veine de l'oreille. La quantité injectée correspond à 0,415 mg/kg exprimé en chaîne A. Les échantillons de sang sont prélevés au cours du temps sur héparine. Les plasmas sont analysés à l'aide d'un test immunoradiométrique à deux sites ci-après désigné par l'abrévia- tion IRM-3. Cet essai est réalisé selon la même technique que pour le test IRM-1 excepté que la solution Ac2 est ici une solution d'anticorps de chèvres anti-IgG de souris purifiés par chromatographie d'affinité et radiomarqués comme décrit pour la technique IRM-1. La mesure de la concentration en immunotoxine modifiée dans les échantillons à doser se fait par référence à une courbe d'étalonnage réalisée avec l'immunotoxine modifiée introduite à différentes concentrations 25.77135 connues. L'essai IRM-3 répond aux mêmes caractéristiques de fiabi- lité et de reproductibilité que celles décrites pour la technique IRM-1. Pour comparaison une étude contrôle est réalisée dans les mêmes conditions avec le conjugué appelé IT-TIO] obtenu par réaction entre le même anticorps T101 substitué par des groupements disulfure activé et la chaîne A native de ricine. La préparation et les propriétés cytotoxiques de ce conjugué ont été décrites dans la demande de brevet français n 81/21836. Les résultats de ces expé- riences sont représentés de la même façon que pour la chaîne A de ricine non couplée dans l'exemple 1. II-Résultats La figure 4 montre les courbes d'élimination plasmatique en fonction du temps de l'IT-TIOI et de VIT (A-la) TiO1 injectées par voie intraveineuse. 24 h après l'injection, la concentration d'immuno- toxine active est 140 fois supérieure pour l'IT (A-la) T101 que pour l'ITTIOI. Ce fait démontre que les nouvelles propriétés pharmacocinétiques de la chatise A oxydée sont conservées après couplage à un anticorps. Exemple 6 Cet exemple démontre le maintien des propriétés de cyto- toxicité spécifique de!'IT (A-la) TO1I vis-à-vis des cellules- cibles. La propriété biologique fondamentale de la chaîne A de ricine est d'inhiber la synthèse protéique cellulaire par altération de la sousunité ribosomale 60S. La technique utilisée met en oeuvre un modèle cellulaire dans lequel on mesure l'effet des substances étudiées sur l'incorporation de 14C-leucine dans les cellules cancé- reuses en culture. Les cellules utilisées appartiennent à la lignée cellu- laire CEM issue d'une leucémie T humaine qui porte l'antigène 165. Les cellules sont incubées en présence de la substance à étudier puis, en fin d'incubation, on procède à la mesure du taux d'incor- poration de 14C-leucine par les cellules ainsi traitées. Cette mesure est effectuée selon une technique adaptée de la technique décrite dans Journal of Biological Chemistry 1974, 249 (11), 3557-3562 utilisant le traceur 14C-leucine pour la déter- mination du taux de synthèse protéique. La détermination de la radio- activité incorporée est effectuée ici sur les cellules entières isolées par filtration. A partir de ces déterminations, on peut tracer les courbes effets/doses présentant en abscisse la concentration molaire en chaîne A des substances étudiées et en ordonnée l'incorporation de 14C-leucine exprimée en pourcentage de l'incorporation des cellules témoins en l'absence de toute substance affectant la synthèse protéique. On peut ainsi déterminer pour chaque substance étudiée la concentration qui inhibe 50 % de l'incorporation de 14C-leucine ou "concentration inhibitrice 50" (CI50). La figure 5 représente les courbes obtenues dans la même expérience avec l'IT-(A-la)-T101 et la chaîne A oxydée non couplée en présence de chlorure d'ammonium 10 mM dans le milieu d'incubation. On peut constater sur cette figure que l'IT-(A-la)-TIOI a une très -12 - forte activité cytotoxique (CI50 = 5,5 x 10 M) environ 80 000 fois supérieure à celle de la chaîne A oxydée non couplée mesurée dans les mêmes conditions. Exemple 7 Cet exemple démontre l'efficacité cytotoxique comparée de l'IT-(A-la)TIOI et de l'IT-TIOI vis-à-vis des cellules-cibles CEM, mesurée dans un test clonogénique. La vocation des immunotoxines est l'éradication des cellules-cibles jusqu'à la dernière. Cette performance ne peut être évaluée qu'avec une technique d'une grande sensibilité: les tests d'inhibition de formation de colonies offrent cette possibilité puisqu'une seule cellule survivante peut être visualisée parmi plusieurs millions de cellules mortes. Ceci est rendu possible par des conditions de culture optimales en milieu gélifié, appliquées à la lignée lympho!de humaine CEM. I- Technique de mesure de la cXtotoxicité par inhibition de la formation de colonies. Le milieu utilisé pour le clonage est le milieu RPMI 1640 auquel on ajoute 1 mM d'alpha-cétoglutarate de sodium, 1 mM de oxalo- acétate de sodium, 5 % de sérum de veau foetal inactivé et 10 % de sérum de cheval inactive. Une première solution dtagar à 0,3 % (Agarose type VII, laboratoires SIGMA) est préparée dans ce milieu, disposée en couche mince dans de petites boîtes de Pétri et soli- difiée à ± 4 C. Les cellules sont mélangées à une seconde solution d'agar à 0,275 % maintenue à 37 C, déposée ensuite sur la première couche et solidifieo Ces concentrations d'agar ont été choisies apres une étude préliminaire visant à optimiser à la fois l'effi- cacité de clonage, la dimension des colonies et la consistance du milieuo Après 15 jours en incubateur, les colonies sont dénombrées à l'aide d'un compteur automatique de colonies ("ARTEK", DYNATECH, US.A.).o L'établissement d'une droite d'étalonnage o sont portés le nombre-de cellules ensemencées en fonction du nombre de colonies formées est indispensable pour déterminer l'efficacité du clonage et ainsi le nombre exact de cellules survivantes au traitement par l'immunotoxine. Nous avons vérifié que l'efficacité du clonage reflétée par cette droite étalon n'est pratiquement pas influencée par la présence d'une proportion élevée de cellules mortes, situa- tion naturellement rencontrée quand les cellules sont traitées par l'immunotoxine. Le traitement à l'immunotoxine est réalisé par incubation des cellules en phase de croissance exponentielle et à la concentration de 106 /ml avec l'immunotoxine IT-(A-la)-TIOI ou IT-T101 à diffé- rentes concentrations, sous un volume total de 1 ml de milieu RPMI-1640 contenant 10 % de sérum de veau foetal inactivé,et 10 mM de chlorure d'ammonium. L'incubation a lieu à 37 C, sous atmosphère contenant 5 % de gaz carbonique et avec agitation horizontale des tubes tests (2 500 tr/min avec agitateur "GIRATORY G-2", NEW- BRUNSWICK). Les cellules sont ensuite lavées et différentes dilu- tions sont réalisées avant mélange à la solution d'agar, de façon que la lecture du nombre de cellules survivantes puisse être faite dans la zone de sensibilité maximale donnée par la droite étalon. Les résultats sont exprimés par le nombre absolu de cellules survi- vantes extrapolé à partir de l'efficacité de clonage, en utilisant la relation suivante: 2 5 7 7 135 Cxd nombre absolu de cellules survivantes: E o C est le nombre de clones par boite de Pétri, d est le facteur de dilution de la préparation cellulaire examinée, et E est l'efficacité de clonage établie à partir de la pente de la droite d'étalonnage. Chaque point correspond à la-moyenne de trois essais. II- Résultats La figure 6 montre les courbes d'activité cytotoxique sur les cellules CEM des immunotoxines IT-(A-la)-TIOI et IT-TIOI en présence de chlorure d'nmmonium à 10 mM en fonction de la concentration en immunotoxine (exprimée en molaritd de chaîne A). Il apparaît que les efficacités de ces deux produits sont du même ordre de grandeur. La cytoréduction obtenue est extrêmement importante dans les deux À-11 M cas puisque pour des concentrations aussi faibles que 10I M le taux de cellules survivantes résiduelles est de l'ordre de 0,001 Z de la valeur initiale. Cet effet est hautement spécifique puisque, à ces concentrations, il a été vérifié que la chaîne A non couplée ou une immunotoxine non spécifique sont sans effet sur ces cellules. Cet exemple démontre que l'IT-(A-la)-T101 a des propriétés de cytotoxicité spécifique pratiquement identiques à celles de V'IT-T 101Oconventionnelle. Exemple 8 Toxicité de la chaîne A à longue durée d'action injectée chez la souris. Il était important de vérifier quel était l'impact toxi- cologique global sur l'animal entier de la chaîne A oxydée (la toxicité des immunotoxines dtant du même ordre de grandeur que celle de la chaîne A à doses molaires égales). Pour cela, nous avons déterminé la dose létale 50 % de la chaîne A oxydée, administrée par voie intraveineuse chez la souris Charles River France CDI en comparaison avec celle de la chaîne A native. Les valeurs trouvées sont indiquées dans le tableau I. Tableau I - DL 50 ---------:* (microgrammes/souris) chaîne A native 550 *chaîne A oxydée 800 ::: Ces résultats montrent que la toxicité de la chaîne A oxydée est inférieure à celle de la chaîne A native. Ceci signifie qu'en dépit d'un accroissement considérable du taux plasmatique de la chaîne A lorsque celle-ci a été modifiée par oxydation la toxicité du produit n'est non seulement pas accrue, mais qu'au contraire elle est sensiblement diminuée. On peut donc utiliser en tant que médicament en thérapeu- tique humaine les immunotoxines à sous-unités cytotoxiques modifiées. Ces immunotoxines modifiées peuvent être utilisées pour le traitement des affections cancéreuses ou non dont les cellules-cibles seraient reconnues par l'anticorps utilisé pour la préparation de l'immuno- toxine. Les modalités optimales d'administration ainsi que la durée du traitement devront être déterminées dans chaque cas en fonction du sujet et de la nature de l'affection à traiter. Les nouveaux médicaments selon l'invention sont condi- tionnés pour être utilisés par voie injectable et de préférence par voie intraveineuse. REVENDICATIONS 1. Une immunotoxine à longue durée d'action constituée par un conjugué dans lequel un anticorps ou fragment d'anticorps est couplé, par une structure covalente divalente contenant un groupe disulfure ou thioéther, à une glycoprotéine inactivant les ribosomes dont les motifs glucidiques sont modifiés par oxydation par l'ion periodate. 2. Une immunotoxine à longue durée d'action constituée par un conjugué dans lequel un anticorps ou fragment d'anticorps est couplé, par une structure covalente contenant un groupe disulfure ou thioéther, à une glycoprotéine inactivant les ribosomes à longue durée d'action cette dernière étant obtenue par traitement d'une glycoprotéine inactivant les ribosomes, dont les groupes thiol sont éventuellement protégés, avec une solution aqueuse d'un periodate alcalin pendant une période de temps de 0,2 à 24 h à la température de O à 15 C et à l'abri de la lumière et par déblocage éventuel des groupes thiol. 3. Une immunotoxine ayant la formule statistique suivante: P'-W-GPIR-la' dans laquelle P' représente le radical d'une protéine P qui est un anticorps ou un fragment d'anticorps et dans lequel d'autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués, GPIR-la' représente le radical d'une protéine GPIR-la qui est une glycoprotéine inactivant les ribosomes / dont les motifs glucidiques sont modifiés par oxy- dation par 1.'ion periodate et W représente une structure covalente divalente contenant un groupe thioéther ou un groupe disulfure dont les atomes de sbufre sont soit ceux des cystéines de P et de GPIR-la, soit sont liés aux fonctions propres de P et/ou de GPIR-la par des structures d'espacement portant un groupe fonctionnel lié auxdites fonctions propres de P et/ou de GPIR-la. 4. Une immunotoxine ayant la formule statistique suivante: P'-W-GPIR-la' dans laquelle P' représente le radical d'une protéine P qui est un anticorps ou un fragment d'anticorps et dans lequel d'autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués, GPIR-la' représente le radical d'une protéine qui est une glycoprotgine inactivant les ribosomes GPIR-la, obtenue par traitement d'une glycoprotgine inac- tivant les ribosomes, dont les groupes thiol sont éventuellement protéges, avec une solution aqueuse d'un periodate alcalin pendant une période de temps de 0,2 à 24 h à la température ambiante et a l'abri de la lumière et par déblocage éventuel des groupes thiol, et dans lequel d'autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués et W représente une structure covalente divalente contenant un groupe thiogther ou un groupe disulfure dont les atomes de soufre sont soit ceux des cystéines de P et GPIR-la, soit sont liés aux fonctions propres de P et/ou de GPIR-la par des structures d'espacement portant un groupe fonctionnel lié auxdites fonctions propres de P et/ou de GPIR-la. 5. Une immunotoxine ayant la formule statistique suivante: P'-W-GPIR-la' dans laquelle P' et GPIR-la' sont tels que définis dans la revendi- cation 3, et W' représente une structure bivalente choisie parmi (a) un groupement de formule O -(Z'-Y'-E') -S- N-E-Y-Z- n O (b) un groupement de formule o -Z-Y-E-N S-(E'-Y_-Z') - o (c) un groupement de formule -Z-Y-E-S-S-(E'-Y'-Z')n- (d) un groupement de formule -(Z'-Y'-E')n-S-S-E-Y-Z- o - Z et Z' représentent les fonctions propres des protéines GPIR-la et P. choisies parmi l'atome d'oxygène provenant de l'hydroxyle de l'un des résidus de tyrosine; le groupe carbonyle provenant de l'un des carboxyles terminaux ou de l'un des carboxyles libres des acides aspartiques et/ou glutamiques de GPIR-la et de P; et le groupe -NH- provenant de l'une des amines terminales de GPIR-la et de P ou de l'une des amines en position epsilon de l'un des résidus de lysine; et, seulement pour Z dans les structures covalentes (b) et (c), le groupe provenant de la structure dialdéhydique obtenue après oxydation d'une des structures glucidiques de P par l'acide periodique selon les méthodes connues; - Y et Y' représentent des groupes fonctionnels capables de se lier d'une façon covalente avec l'une quelconque des fonctions Z et Z' des protéines GPIRla et P; - E et E' représentent des structures d'espacement inertes; - n représente zéro ou 1. 6. Une immunotoxine ayant la formule statistique suivante: P'(W'-A-la')m dans laquelle m varie de 0,3 à 12, P' représente le radical d'une protéine P qui est un anticorps ou un fragment d'anticorps et dans lequel d'autres groupes fonctionnels sont éventuellement bloqués, A-la' représente le radical d'une glycoprotéine inactivant les ribo- somes obtenue par traitement de la chaîne A de ricine, dont au moins un des groupes thiol de ses cystéines 171 et 257 est protégé, avec une solution aqueuse d'un periodate alcalin pendant une période de temps de 0, 2 à 24 h à la température de O à 15 C et à l'abri de la lumière et par déprotection du groupe thiol ou des groupes thiol, dans ledit radical d'autres groupes fonctionnels étant éventuellement bloqués et W' représente une structure bivalente choisie parmi (a) un groupement de formule -(Z'-Y'-E') n-S- N-E-Y-Z- o 49 2577135 (b) un groupement de formule -Z-Y-E-N -S-(E'-Y'-Z')n- n o (c) un groupement de formule -Z-Y-E-S-S-(E'-Y'-Z')n (d) un groupement de formule -(Z'-Y'-E')n-S-S-E-Y-Z- o - Z, Z', Y, Y' E, E' et n sont tels que définis dans la revendi- cation 3. 7. Une immunotoxine selon la revendication 6 de formule statistique: P'(W'-A-la')m dans laquelle W' et A-la' sont.tels que définis dans la revendica- tion 6, P' est un fragment d'anticorps Fab ou Fab' et m varie de 0,3 à 2. 8. Une immunotoxine selon la revendication 6 de-formule statistique: P'(W'-A-la') dans laquelle W' et A-la' sont tels que définis dans la revendica- tion 6, P' est un fragment d'anticorps F(ab')2 et m varie de 0,5 à 4. 9. Une immunotoxine selon la revendication 6 de formule statistique: P'(W'-A-la')m dans laquelle W' et A-la' sont tels que définis dans la revendica- tion 6, P' est un anticorps du type IgG et m varie de 0,5 à 6. 10. Une immunotoxine selon la revendication 6 de formule statistique: P'(W'-A-la')m dans laquelle W' et A-la' sont tels que définis dans la revendica- tion 6, P' est un anticorps du type IgM et m varie de 1 à 12. 11. Procédé pour la préparation d'une immunotoxine selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on forme, directement ou par l'intermédiaire d'une structure d'espacement, une liaison disul- fure ou thioéther entre un anticorps ou fraction d'anticorps et une glycoprotéine inactivant les ribosomes dont les'motifs glucidiques sont modifiés par oxydation par l'ion periodate. 12. Procédé pour la préparation d'une immunotoxine à longue durée d'action ayant une liaison covalente du type disulfure ou thioéther entre un anticorps et une glycoprotéine inactivant les ribosomes, caractérisé en ce que l'on forme une liaison disulfure ou thioéther entre un anticorps et une glycoprotéine inactivant les ribosomes à longue durée d'action obtenue par traitement d'une glyco- protéine inactivant les ribosomes, dont les groupes thiol sont éven- tuellement protégés, avec une solution aqueuse d'un periodate alcalin pendant une période de temps de 0,2 à 24 h à une température de 0 à C et à l'abri de la lumière et par déblocage éventuel des groupes thiol. 13. Procédé pour la préparation d'une immunotoxine selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on fait réagir en solution aqueuse et à la température ambiante une protéine P1, qui est indif- féremment soit la glycoprotéine inactivant les ribosomes à longue durée d'action GPIR-la soit un anticorps ou fragment d'anticorps P. porteuse d'au moins un groupe thiol libre attaché à ladite protéine P1 directement ou par l'intermédiaire d'une structure d'espacement, avec une protéine P2, différente de P1, qui est indifféremment soit la glycoprotéine inactivant les ribosomes à longue durée d'action GPIR-la soit un anticorps ou fragment d'anticorps, porteuse d'un groupement capable de couplage avec le thiol libre de la protéine P1, de façon à former une liaison thioéther ou disulfure. 14. Procédé pour la préparation d'une immunotoxine selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on fait réagir en solution aqueuse et à la température ambiante une protéine de formule: P1,-(Z-Y-E)nSH III avec une protéine de formule P2t-Z'-Y'-E'-G IV o Pli et P2, représentent les radicaux des protdines Pl et P2 liés aux fonctions propres desdites protéines ou, seulement lorsque P1 et P2 sont un anticorps ou fragment d'anticorps, les radicaux des protéines P1 et P2 provenant de l'ouverture des noyaux glucidiques par action de l'acide periodique, Z, Z', Y, Y': E et E' sont tels que définis ci-dessus et G représente un groupe ou un groupe -S-S-X, o X est un groupe activateur. 15. Un produit de formule statistique: GPIR-la"-0-CO-E-G VIII dans laquelle GPIR-la" représente le radical d'une GPIR-la ou toute molécule dérivant de ladite GPIR-la par modification artificielle de l'un quelconque de ses groupements fonctionnels, privée d'un ou plusieurs groupes hydroxyles phgnoliques des tyrosines; - l'atome d'oxygène est celui des groupes hydroxyles phgnoliques manquant dans le radical P2"; - E représente une structure d'espacement inerte; et - G représente un groupe -N ou un groupe -S-S-X o X est un groupe activateur.