FR 2567524 A1 19860117 FR 8410965 A 19840710 Procédé de synthèse de la Somatocrinine en phase liquide et peptides intermédiaires. Le hGRF (Human Growth Hormone releasing Factor) ou Somatocrinine est un peptide constitué par l'enchaînement de 44 amino acides. Sa séquence est la suivante: 1 5 10 H - Tyr - Ala - Asp - Ala - Ile - Phe - Thr -Asn - Set - Tyr - Arg - 20 Lys - Val - Leu - Gly - Gin- Leu - Ser - Ala - Arg - Lys - Leu - Leu - 30 35 Gln - Asp - Ile - Met - Ser - Arg - Gln - Gln - Gly - Glu - Ser -As - 44 Gln - Glu - Arg - Gly - Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2 Il a été récemment découvert par A. Guillemin et coll. (Science, 218, 585-587 (1982)) à partir d'extraits d'une tumeur pancréatique humaine. Ce peptide est particulièrement actif sur la stimulation de la libération de l'hormone de croissance (GH) aussi bien in vitro qu'in vivo. In vitro, en particulier son efficacité se mani- feste à des doses de quelques femtomoles/ml. (ED50 = 15 femtomoles/ml). L'intérêt thérapeutique en médecine humaine de cette substance va donc se situer au niveau du traitement du nanisme et des retards à la croissance en pédiatrie. D'autres applications sont possibles dans les cas de déficience anabolique protéique (ulcères de stress, réparation de fractures ou d'atteintes du cartilage, brGlures étendues (pendant la phase anabolique), réparations cutanées, ostéoporoses). Dans le domaine vétérinaire, ce composé présente un intérêt évident au niveau de la croissance pondérale des animaux d'élevage (bovins, ovins, porcins, poulets, etc.) et de l'augmenta- tion de la lactation (bovins, ovins, etc.) - Le développement industriel de ce composé polypeptidique nécessite la synthèse de quantités importantes de cette substance. Les procédés classiques de la synthèse en phase solide permettent la préparation en des temps courts de faibles quantités de ce prin- cipe actif (Science, 218, 585-587 (1982) à des coûts très élevés et incompatibles avec un développement pharmaceutique à grande échelle. Dans ses demandes antérieures (FR 83.02781 et FR 83.19058, la demanderesse a déjà décrit un procédé de synthèse en phase liquide de la somatocrinine permettant d'obtenir des quantités importantes de ce produit. La présente demande a pour objet un nouveau procédé de - synthèse permettant d'améliorer considérablement la pureté des pep- tides intermédiaires formés et par voie de conséquence de faciliter les phases de purification finale et d'améliorer nettement les ren- dements en somatocrinine pure. Le procédé suivant la présente invention fait intervenir les fragments suivants: H-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 Fragment A hGRF (40-44) H-Gln-Glu-ArgGly-OH " B' hGRF (36-39) ! H-Glu-Ser-Asn-OH " B' hGRF (33-35) H-Ser-ArgGln-Gln-Gly-OH " C hGRF (28-32) H-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-OH " D' hGRF (23-27) H-Arg-Lys-Leu-OH " E' hGRF (20-22) H-Gln-Leu-Ser-Ala " F hGRF (16-19) HTyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-OH " G hGRF (10-15) H-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-OH " H1 hGRF (5- 9) H-Tyr-Ala-Asp-Ala-OH " I hGRF ( 1- 4) On couple ensuite les fragments A, B' B'2 C, D', E' 1' B!, ' dans l'ordre de la séquence du hGRF pour obtenir le peptide K1 [(hGRF (2044)] et les fragments F1, G1, H1 également dans l'ordre de la séquence du GRF pour obtenir le peptide J [hGRF (5-19)]. Finalement, on couple dans l'ordre: 5-19 + 20-44 > 5-44 1- 4 + 5-44 > 1-44 Le procédé de la présente invention est caractérisé,en outre, en ce que l'on couple, l'un après l'autre et dans l'ordre de la séquence, les fragments dans lesquels: a) les fonctions acides latérales des acides aspartique et gluta- mique et la fonction amine latérale de la lysine sont protégées par des groupes protecteurs stables dans les conditions de dé- protection du groupement Boc (tertiobutyloxycarbonyle) b) la fonction guanidine de l'arginine est protégée par protona- tion, et c) l'acide aminé N-terminal est protégé sur l'amine par le groupe- ment Boc d) en éliminant sélectivement le groupement Boc de l'amine N-ter- minale du peptide en phase d'élongation par hydrolyse à l'acide trifluoroacétique, ledit couplage étant effectué dans un solvant polaire aprotique et on élimine en fin de séquence tous les grou- pes protecteurs par hydrolyse à l'aide d'une solution 0,1 à I M d'acide méthanesulfonique ou trifluorométhanesulfonique dans l'acide trifluoroacétique. Le procédé de synthèse du GRF se caractérise en outre par les aspects suivants: - Application du principe de la protection minimale au niveau des chaînes latérales fonctionnalisées. - A l'exception de l'arginine en position 20, on effectue une pro- tection temporaire de la fonction guanidine latérale de l'arginine par le groupement nitro. L'arginine est introduite en séquence sous forme nitro guanidîne. La fonction nitro est ensuite élimi- née le plus tôt possible (voir synthèse des fragments) par hydro- génation catalytique à l'aide de Pd/charbon, ou bien en utilisant un générateur d'hydrogène comme l'acide formique ou le formiate d'ammonium. Ainsi, excepté la position 20, tous les fragments synthétisés possédant de l'arginine dans leur séquence ont en fin - de synthèse les fonctions guanidine, simplement protégées par protonation à l'aide d'un acide fort (acide chlorhydrique par exemple). - La fonction guanidine de l'arginine en position 20 est protégée par le groupement MTS (triméthyl-2,4,6 phénylsulfonyle ou mésityl- sulfonyle). - Les fonctions acides carboxyliques des chaînes latérales des acides glutamique et aspartique sont protégées par des groupements cliva- bles par hydrogénation catalytique (H2/Pd/charbon) ou bien en milieu acide fort comme les mélanges acide méthanesulfonique (0,5 M) - acide trifluoroacétique, ou acide trifluorométhane- sulfonique (0,5 M) - acide trifluoroacétique. Nous préconisons comme protecteurs l'ester benzylique (O Bzl) ou 2,6-dichlorobenzy- lique. Ces groupements protecteurs sont stables dans les conditions des déprotections intermittentes des amines en a (élimination des groupements t-butyloxy-carbonyle: Boc par l'acide trifluoroacétique) - les fonctions amines des chaînes latérales des lysines sont proté- gées par des groupements clivables dans les mêmes conditions que précédemment. Nous préconisons les groupements benzyloxycarbonyle (Z), 2chloro ou 2-bromo-benzyloxycarbonyle (2 - Cl ou 2 - Br Z) stables dans les conditions de déprotection intermittente par l'acide trifluoroacétique. Les fonctions hydroxyle présentes dans la thréonine, la sérine et la tyrosine ne sont pas protégées. L'élongation du peptide à partir des fragments synthé- tisés est réalisée en utilisant comme agent de couplage l'hexafluoro- phosphate de benzotriazolyl-oxyphosphonium (BOP), ou le dicyclohexyl- carbodiimide en présence d'hydroxy-l benzotriazole, ou selon la méthode aux carboxyàzides (Curtius) dans un solvant approprié comme le diméthylformamidé ou le diméthylsulfoxyde. L'isolement du produit du milieu réactionnel est effectué par introduction d'un tiers solvant insolubilisant (éther, acétate d'éthyle...) qui précipite le peptide. On se limite pendant les étapes de couplage à des purifications sommaires du type lavages en phase solide à l'aide de solvants appropriés afin d'éliminer le léger excès du dernier fragment couplé, ainsi que les impuretés apportées par les agents de couplage. Chaque opération de couplage d'un fragment est suivie d'une phase de déprotection intermittente du groupement protecteur Boc (tertiobutyloxycarbonyle) au niveau de l'amine sur laquelle va être effectué le couplage suivant. Cette déprotection est assurée par l'acide trifluoroacétique dans le chlorure de méthylène (50/50 en volume). Les déprotections des chaînes latérales en fin d'élon- gation du peptide peuvent être effectuées par hydrogénation en présence d'un catalyseur (comme le Pd/C) à l'aide d'hydrogène gazeux sous légère pression (1 a 5 kg) ou bien avec un généra- teur d'hydrogène comme l'acide formique ou le formiate d'ammonium. Il est également possible d'éliminer ce type de groupements protec- teurs par un acide fort comme les mélanges d'acide méthanesulfonique dans l'acide trifluoroacétique (0,5 M) ou bien d'acide trifluoro- méthanesulfonique dans l'acide trifluoroacétique (0,5 M). Le produit, après les déprotections terminales, est purifié par filtration sur gel de Sephadex G 50 à l'aide de l'acide acétique à 30%. Les fractions enrichies en GRF 1-44 sont réunies et soumises à une chromatographie sur échangeurs d'ions (cations) du type carboxy et à l'aide dtun gradient à force ionique crois- sante adapté au type de résine échangeuse d'ions utilisée. Les fractions de plus haute pureté sont réunies et purifiées soit par chromatographie de partition sur un support approprié du type Sephadex G 50 ou Biogel P 10, soit par la distribution à contre- courant. Les fractions dont le titre de pureté est jugé satis- faisant par HPLC analytique sont réunies. Les autres sont recyclées. Une variante du procédé consiste à remplacer la chro- matographie de partition ou la distribution à contre-courant par la HPLC préparative. Le procédé de la présente invention peut aussi s'appli- quer à la synthèse du GRF 1-40, produit naturel isolé également par R. GUILLEMIN, presque aussiréactifque le GRF 1-44 et utilisable dans les mêmes indications thérapeutiques, auquel cas le fragment A [hGRF (40-44)] est remplacé dans la synthèse ci-dessus par l'alani- namide (H-Ala-NH2). L'invention concerne également les peptides ou fragments intermédiaires répondant aux formules ci-après: Boc - Gln - Glu-(O Bzl) - Arg - Gly - OH; X - Gln - Glu - Arg - Gly - OH; 35. Boc - Glu - (O Bzl) - Ser - Asn - OH; X - Glu - Ser - Asn - OH; Boc - Leu - Gln - Asp (O Bzl) - Ile - Met - OH; X - Leu - Gln - Asp - Ile - Met - OH; Boc - Arg (MTS) - Lys (Z) - Leu - O CH3; 5.X - Arg (MTS)- Lys (Z) - Leu - NH - NH2; X - Gln - Glu (O Bzl) - Arg - Gly - Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2; X - Glu (O Bzl) - Ser -Asn -Gln - Glu (O Bzl) - Arg - Gly - Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2; 10. X - Ser - Arg -Gln -Gln - Gly - Glu (O Bzl) - Ser -Asn -Gln - Glu (O Bzl) - Arg - Gly - Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2; X - Leu - Gln - Asp (O Bzl) - Ile - Met - Ser - Arg - Gln - Gln - Gly - Glu (O Bzl) - Ser - Asn - Gln - Glu (O Bzl) - Arg - Gly - Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2; 15. X - Arg (MTS) - Lys (Z) - Leu - Leu - Gln - Asp (O Bzl) - Ile - Met - Set - Arg - Gln - Gln - Gly - Glu (O Bzl) - Ser - Asn -Gln - Glu (O Bzl) - Arg - Gly - Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2; X - Ile - Phe - Thr - sn - Ser - Tyr - Arg - Lys (Z) - Val - Leu - Gly - Gln - Leu - Ser - Ala - Arg (MTS) - Lys (Z) - Leu - Leu - Gln- Asp (O Bzl) -Ile - Met - Ser - Arg -Gln -Gln - Gly - Glu (O Bzl) -Ser -Asn -Gln - Glu (O Bzl) - Arg - Gly - Ala - Arg- Ala - Arg - Leu - NH2, dans lquellesX représente H ou Boc. L'invention a également pour objet le hGRF 1-44 protégé répondant à la formule ci-après: Y - Tyr - Ala - Asp (O Bzl) - Ala - Ile - Phe - Thr - Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys (Z) - Val - Leu - Gly -Gln - Leu - Ser - Ala - Arg (MTS) - Lys (Z) - Leu - Leu - Gln - Asp (O Bzl) - Ile - Met - Ser - Arg - Gln - Gln - Gly - Glu (O Bzl) - Ser - Asn -Gln - Glu (O Bzl) - Arg - Gly - Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2, dans laquelle Y est H, Z ou Boc, ainsi que le hGRF 1-40 également protégé. La stratgie de synthèse qui caractérise ia présente invention se trouve résumée dans 'es schémas I, I et IIIr ci-après. Les tableaux I à X donnent les schémas de synthèse des fragments de base: A3 a Arg Aa Arg L-eu NH2 tt- - * /No 2 I oc ' OHH _H I S BOP NH2 . BOP, N ,aOCi/ OHH.'kBO NM02 Boc- '/ ' 'H NH2 i lt v BOPNO2 /It t/, NH2 Bac OHH lH+ _ _ + NH; t ala I - (rget A)2 t! t t,o N L2 2 _ __ _ S oc-.fNH2 NO NO 2 2 z H H-VNi2 Bop BoP NO -02 2 2H NH23 HCI Tableau I - (fraImet A) (I,] 8;uawGe-J) IlI nV312VI HO DOS. ViL H LZSo, +1 HO I, H0j A /' n H dN07. 0dD09 t+,I iZj ç+HiLZS0j j H./ H Vú +,H, I I I I CON,'' 6.IV lZ 0 aI HO' ' n /9 Hul 't I II * I I I I I * I I X;1 6. I n I L NOO LZoO HG,, Ad// bo o 0 ' LzBO' HO;D09 Ji LZS0 pd/ H LZE0H q 0---:o LZSO D O o UI n L i I I * v, lI ç IZS I I o Lzso-t DO9 I I I I I I [Za-j-; H qNo,,-DO9 , t, I I I I I I usvla n L9 ]o Ser Arg Gl n Gl n Gly l j iiZ i ZOH H. OCH3 jI II 02I Bop i Z,) OCH3 NO 2 H2/Pd BoBoc!,, OC3 i j H+ ' * H2/Pdl *a- 0C Boc' g, -' -, OCH3 NO2 Bop BOC ' t j H+' t, O OCH3 Tableau IV - (fragment C) I I IO2 102 TFA! Bac' ONb OC ( NO2 Z BOCH3 H "+ Hz/Pd Boc- - 0 Bac OCH 3 OH Bor / OH Tableau IV (fragment C} nN. j; oB (HN-HN; , og/ /Y1T jLZ;OOjj lZ8 0 DO iLzg, DoJI-HN-HN,H n oj Yl il L t i [zBo * I I t t DoJú-HN-HN-,o H -O Oo k1 I. j - i io Ja-HN-HN d' -- ------- d "-o n tzBo oI-HN-HN 't H HODO n oto8 I tIt I t! Ia a Id s u[ t (.,3 j wu,,6e.) - IA filV3lGVI úN,,DO J s ' A /1 Z Z Slh i t rh' i I 4 n&01;It' | 5 ng ON HN-HN ' / DOB zzz. Z SIW, 0 H/ HN.- HN e I -g I oZ/2_,,z sd:o H/-O, H DO j ç Z gi5n O zls Z dD Dos i' ti It I I úls:Z o; /l..... r Z '!L I, /ID I II nal s H. i t Z. t t,t nei sk naL9S 6Z G1 n Leu Ser Ala l Boc OtIbH! -CH B 'c O-CH TFA l l g,BocO '!O-CH3 Boc, ! O-CH TFA I oclNp Hl, O-CH i g! 3 l l l I g I g g gBi I g loBoc, ' CH3 Tableau VII (fragment F1) g g- gI gI !, ' TFA g T 8oc'O Np14',,_ ___ ___ __O-CH3 g g g g g ________________ _ BOC ' O-P, gala g I frgmn g1 Tyr,r9 Lys Vpl Lçu Gly a! *. a *. . I jI a' a8 Z OH H O-CH J BoP I, I,.t , Z a O-CH3 a a a a a, j 2|j a a a Eoc4._OHH.O-CH3 ! ' ' Boc '' t O-CH3 l ' TFA | i 80Bc VOTcpH O-CH3 i | Bocal/, * ' O-CHO I + BacgOHH [/ - ' Bo:0-CH3 aTF ITA a a ' + a 20p i Z IB IaBoc rT 0-CH3 I H H Z aC a BOVTC. Uî,____a __ _ _ D-CH3 a j o o 'r i 2555c. ' -.c'.OH Tableau \IIII (fragment G.) a a a a a a ao a/ ' / a-CHa I TAB c _ _ _ : _______ _______ 9ocJ OTa c p H y7a a:Z aQ: a a TFA+ I. a:/ ______ 4. 4.....0-CH3 a aH+ aZ _________Ta le a VII _f ra Gmen __ _ __ _ __ I- (tés:,u;w6ef I XI neLql ZHN-HN;;;;; D2 {l ZH tz HN' zHN 1{ t B BHn N- O "H::O DOS t D -HO, - 't, H nSO | ti nSNO;; i B t L B'; zI| I,, *Oi -,- B;O,D 5,' EH30',,05,S,o (H30-' ^O^ ' o0 BH30. '- ---0i'o'B CO.too9t )ZSZ9SZ Tyr Al a Asp Ala I IOZ ! OBzl I I' Boc./Su H 'O But Bzl , | Boc /,_ ,.OBut I I - IOBzl TFA IBZ Boc,OTc p H, o II *, 10' OBzl No ': ' OBzl TFA' Z --IONp H H, I I I g, B oc T.. T._ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ I I lO0 OBzlTA z-IONp H.'.......' !' ' I OBzl i t ' _ OH Tableau X - (fragment I) SYNTHESE DU PEPTIDE K1 (hGRF 20-44) OBzi H H+ H+ BOP / -/' / Z BOP Boc-Gln-Glu-Arg-Gly-OH + H-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 LB'l] [A] puis H+ OBz'. H H+ H+ H / H-Gl n-Glu- mrg-Gly-Al a-Arg-Al a-Arg-Leu-NH2 OBzl BOP BocGlu-Ser-Asn-OH puis H+ tB'2] OBzl Cgzl H+ H H+ H-Glu-Ser-Asn-Gln-G, u-ArgGly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-MH2 BOP H+ puis HP+ Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH H+ OB0zl [c] OBz + + H-Ser-Arg-GlnGln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH, Curtius OBzl /OBz puis H o-e-iZ puis H+ tBoc-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-N3 ûBzIl H+ /"Bzl /OBzl H-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-GGln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg- H+ H+ Z- / -Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 Curtius MITS Z puis H+ / / puis H+ |Boc-Arg-Lys-Leu-N3 MTS z [E1] H+ OBz+ "OzH H-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-GluArg- K1 /H I/H /+ Gl y-Al a-Arg-Al a -Arg-Leu-NH2 SCHEMA I SYNTHESE 9U PEPTigE J hGRF (5-19) H Z / / soc-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-G5y-OH 4 H-Gln-Leu-Ser-Ala-OCH3 BOP puis H+ Z H-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-OCH3 Curtius |Soc-Ile-Phe-4snThr-Ser-'NH-NH2 puis OH l! H+ Z ! i %oc-Ile-Phe-Asn-Thr-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Le'j-Ser-Ala-OH Peptide 3 SCHEMA II PASSAGE A LA SEQUENCE DU GRF 1-44 Peptide J + peptide K BOP + puis H H Z MTS Z Bzl I / / / Ile-Phe-Asn-Thr-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-LeuLeu-Gln-AsD-Ile- H+ 8zl Bzl H+ H+ H+ / I l l /I I et-Ser-Arg-Gln-Glny-Gly-lu-Ser-Asn-GlnGliu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 OBzl BOP puis H+ fort Z-Tyr-Ala-AspAla-OH (peptide I) GRF - 1-44 protegé SCHEM-A III Les exemples suivants permettront de mieux comprendre la portée de l'invention. * Les abréviations suivantes seront utilisées. Les acides aminés sont représentés par les symboles recommandés par la commission de nomenclature de 1'IUPAC-IUB section biochimie. Ala: Alanine Arg: Arginine Asn: Asparagine Asp: Acide aspartique Gin Glutamine Glu: Acide glutamique Gly: Glycine Ile: Isoleucine Leu: Leucine Lys: Lysine Met: Méthionine Phe: Phénylalanine Ser: Sérine Thr: Thréonine Tyr: Tyrosine Val: Valine A l'exception de la glycine, ils ont tous la configuration L. HPLC: chromatographie liquide haute performance CCM: chromatographie sur couches minces O0 OBzl: ester benzylique -C- OHCH22 Z: benzyloxycarbonyle CH 2-O-C- (carbamate) O CH Boc: tertiobutyloxycarbonyl CH -C-O-C- 3 1 It (carbamate) CH3 0 DMF: diméthylformamide NEM: N-éthylmorpholine TFA: acide trifluoroacétique MA: méthode de couplage aux anhydrides mixtes AcOEt: acétate d'éthyle OMe: OCH3 0 ONSu: ester activé avec la N- hydroxy r CO tg succinimide CO / NO ONp: ester activé avec l'ortho O! nitrophénol O il Troc: trichloroéthoxycarbonyl.e CCi3-CH2-0-C- (carbamate) O CH t.ti, 3 OBu: ester avec le tertiobutanol -C-O-C-CH y 3 MTS: 2,4,6triméthyl-benzène-sulfonyle CH3 (mésityl-sulfonyle) OTcp: ester activé avec le 2,3,5- trichlorophénol OHBT: N-hydroxybenzotriazole O ONb: ester activé avec le N-hydroxy C,, norbornène-5 dicarboximide-2,3 C N-0-C- O- P [N(CH3)j 3 N BOP: hexafluorophosphate de benzo-, /N triazolyloxyphosphonium PF6) DCHa: dicyclohexylamine DCU: dicyclohexylurée DCC ou: dicyclohexylcarbodiimide DCCI TA: température ambiante DIPEA: diisopropyléthylamine EPP: pureté polypeptidique TFMSA: acide trifluorométhane sulfonique AAA: analyse d'amino acides Milieuxde chromatographie exprimés en volumes: BEW: butanol, AcOH, H20 72/7/21 BEW2: butanol AcOH, H20 67/10/23 2 '2 BPEWI: butanol, pyridine, AcOH, H20 50/12/12/25 EPAWI;: AcOEt, pyridine, HCO2H, H20 63/21/10/6 BPEW: butanol, pyridine, AcOH, H20 42/24/4/30 Exemple I Synthèse de H -Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2 (fragment A) NO 1. H-ArgLeu-NH2 Dissoudre à la température ambiante 130 g de leucine amide (H-LeuNH2) dans 1,5 1 de DMF. Ajouter 333 g de Boc-Arg (NO2)-OH puis 500 g de BOP. Ajuster le pH à 7 au papier pH (sur de petits prélèvements dilués à l'eau) et à l'aide de N-éthyl- morpholine (NEM). Le milieu est agité et on suit l'évolution de la réaction par CCM. La réaction est terminée au bout de 4 h. Le milieu est évaporé à sec sous vide à 25 C. Le résidu est repris par 1 litre d'eau et on obtient un solide qui est lavé à l'eau, puis avec une solution aqueuse de NaHCO3 à 5 % à l'eau, à l'acé- tate d'éthyle et, finalement, on sèche le solide à l'air. On contrôle par CCM. Le solide précédent est introduit dans 2 1 d'un mélange -50 en volume d'acide trifluoroacétique-chloure de méthylène. le milieu est agité 10 min à la température ambiante et évaporé à sec sous vide à la température ambiante. Le résidu d'évaporation est repris dans l'éther, essoré, séché et contrôlé par CCM et RMN. Rendement: 339 g (90 %) en trifluoroacétate d'un solide blanc. 2. H-Ala-Arg(NO2)Leu-NH 443 g de trifluoroacétate de H-Arg(N02)Leu-NH2 sont dissous dans 2 1 de DMF. On ajoute 200 g de Boc-Ala-OH et ensuite 500 g de BOP. On ajuste le pH à 7 au papier pH (sur de petits pré- lèvements du milieu réactionnel) à l'aide de NEM. Le milieu est agité et l'évolution de la réaction est suivie par CCM. La réaction est terminée au bout de 4 h. Le milieu est évaporé a sec sous vide à 25 . Le résidu est repris par 2 1 d'eau et 2 1 d'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée par une solution aqueuse de NaHCO3 à 5 %, à l'eau, séchée et évaporée. Le tripeptide est recristallisé dans l'acétate d'éthyléther, et finalement séché sous vide. Il est contrôlé par CCM et RMN. Le précédent produit séché est traité par un mélange -50 (volume) de TFACH2C12 dans les conditions de l'exemple précédent (I-1). L'isolement est effectué également dans les mêmes conditions. Rendement: 412 g (80 %) exprimé en trifluoroacétate d'un produit pulvérulent blanc (contrôlé en CCM et RMN). 3. Arg(NO2)-Ala-Arg(NO)-Leu-NH A partir de 515 g de H-Ala-Arg(NO 2)LeuNH2 dans 2,5 1 de DMF et 333 g de Boc-Arg(N02)-OH et 500 g de BOP, on obtient en utilisant les conditions opératoires décrites dans l'exemple 1, 1, après traitement au mélange TFA-CH2Ci2, 607 g (85 %) d'un solide blanc contrôlé par CCM et RMN. 4. Z-Ala-Arg(N02)-Ala-Arg-Leu-NH2 A partir de 715 g de trifluoroacétate de H-Arg(NO2)Ala- Arg(NO 2)-Leu-NH2 en solution dans 4 1 de DMF et 233 g de Z-Ala-OH et 500 g de BOP en utilisant la même technique que celle décrite en I-2 (et sans traitement dans ce cas par TFA-CH2C12), on obtient après recristallisation dans le mélange DMF-éther, 612 g de Z-Ala- Arg(N02)-Ala-Arg(NO2)Leu-NH2 (76 %) sous forme d'un solide pulvéru- lent blanc, contrôlé par CCM et RMN. 5. Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2J 3HC1 g de Z-Ala-Arg(NO)Ala-Arg(NO)-Leu-NH (0, 25 mole) 2 2 2 sont mis en suspension dans 2 1 de méthanol contenant 0,8 mole de HC1. On ajoute 40 g de Pd/C à 10 % de Pd, et le milieu est agité sous atmosphère d'hydrogène sous 1,2 bar de pression, pendant 24 h. Après cet intervalle de temps, on contrôle la fin de la réaction par CCM. Le catalyseur est éliminé par filtration et le solvant évaporé sous vide à la température ambiante. Le résidu solide est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisaat comme milieu d'élution le mélange butanol, pyridine, HO2CCH3 OH2 (50-12-12-25 en volume). Les fractions contenant le produit pur sont réunies, évaporées et lyophilisées. Rendement: 119 g (69 %) d'un solide pulvérulent blanc. Contrôles R:1N, CCM. Analyse d'aminoacides Leu 1,03 (1) Arg 1,92 (2) Ala 1,95 (2) Exemple II:synthèse de Boc-GlrrGlu(OBzl)-Arg-Gly-OH, HCl (fragment Bt) 1 ) ZArg(NO 2)-Gly-OBzl On dissout 3,37 g (0,01 mole) de tosylate de H-GlyOBzl dans 15 ml de DMF, puis on ajoute 1 équivalent de NEM (1,3 ml). Cette solution est ajoutée à une solution de 3,53 g (0,01 mole) de ZArg(NO 2)-OH dans 15 ml de DMF contenant un équivalent de NEM (1,3 ml). On ajoute alors 4,5 g (0,01 mole) de BOP au mélange réactionnel dont le pH est ensuite amené à 7 par addition de NEM et qui est agité à TA pendant 2 h 30 (la fin de la réaction est déterminée par CCM: chloroforme-méthanol(3/1). Le mélange réac- tionnel est évaporé à sec sous pression réduite (O;]mmdeEgsoit 1333Pa) à température inférieure à 30 C. Le résidu est repris dans 100 ml d'acétate d'éthyle. Cette solution est versée dans 120 ml d'eau glacée vigoureusement agitée. Après quelques instants d'agitation, un précipité se forme qui est abandonné une nuit au réfrigérateur. Le solide est essoré et lavé successivement à l'état solide avec: - 2 x 100 ml d'une solution aqueuse de bicarbonate de soude - 2 x 100 ml d'une solution aqueuse de SO4HK-SO4K2 à 5 % - 2 x 100 ml d'eau - 2 x 100 ml d'éther puis séché sous vide (13,33 Pa) jusqu'à poids constant. Rendement: 4 g (80 %). Point de fusion Koffler: 149 C CCM: chloroforme-méthanol (3/1) Rf: 0,73 Contrôle: RMN 2 ) HCl-H-Arg-Glv-OH On met en suspension 100 g-(0,2 mole) de Z-Arg(N02)-Gly- OBzl dans un mélange de 600 ml d'eau, 600 ml d'acide chlorhydrique N et 100 ml de tétrahydrofuranne. On ajoute 60 g de Pd/C à 10 % contenant 50 % d'humidité. Ce mélange est hydrogéné pendant 48 h à température ambiante et sous une pression de 2 kPa. Le catalyseur est ensuite filtré et la solution aqueuse est amenée à pH 6, 5 par addition de résine Amberlite IR 45 (forme OH). La résine est essorée. La solution est ensuite amenée à pH 8,5 par addition d'une nouvelle quantité de résine et l'ensemble est agité pendant 20 min au rotavapor sous vide (3,33 kPa). On essore la résine et on vérifie l'absence de chlorure d'ammonium dans la solution aqueuse par le test de Nesler, puis on évapore à sec cette solution sous pression réduite (13,33 Pa) à température inférieure à 30 C, On obtient un résidu gommeux qui est séché une nuit dans un dessiccateur avec de l'anhydride phosphorique. Rendement: 43,19 g (80,6 %). CCM: acétate d'éthyle-pyridine-acide formique-eau 40-21-10-6 Rf: 0,1 test de SaKaguchi positif (spot rouge) Contrôle RMN 3 ) Boc-Glu(OBzl)-Arg(HC1)Gly-OH On dissout 41,5 g de HCl-H-Arg-Gly-OH (0,155 mole) dans un mélange de 400 ml de DMF et de 130 ml d'eau. Le pH est ajusté à 7 par addition d'acide chlohydrique N. A cette solution, on ajoute simultanément: - une solution de 68,8 g de Boc-Glu(OBzl)-ONP (0,150 ml) dans un mélange de 100 ml de DMF et de 40 ml d'eau - une solution de 22,7 g d'hydroxybenzothiazole (O,150mole) dans un mélange de 100 ml de DMF et de 40 ml d'eau -une solution de 37,8 ml de NEM (2 x 0,150 mole) dans 100 ml de DMF. Le mélange réactionnel est agité à TA et la réaction est suivie en CCM (chloroforme-méthanol-acide acétique 95-5-9 et pyridine- acétate d'éthyle-acide formique-eau 21-40-10-6). Au bout de 1 h de réaction,on rajoute 13,76 g de Boc-Glu(OBzl)-ONP. Au bout de 2 h de réaction, on rajoute 13,76 g de Boc-Glu(OBzl)-ONP. Au bout de 3 h de réaction, on rajoute 7 g de Boc-Glu(OBzl)-ONP et on poursuit la réaction pendant 1 h. Le mélange réactionnel est alors évaporé à sec sous pression réduite (13,33 Pa) et à température inférieure à 30 C. On obtient une huile épaisse qui est dissoute dans 500 ml d'acétate d'éthyle. Par addition de 1 litre d'éther, une huile épaisse se forme. On abandonne au repos 24 h au réfrigérateur, puis on décante la phase liquide. L'huile résiduelle est reprise dans 500 ml de méthanol. A cette solution on ajoute 500 g de silice (70-230 mesh soit 62-210 pm), et on évapore le solvant au rotavapor. La poudre obtenue est mélangée avec un mélange chloroforme-méthanol 80-20 et le gel formé est introduit au sommetLd'une colonne de gel de silice (hauteur 200 cm, diamètre 85 mm) montée dans le mélange chloroforme- méthanol 80-20. Le produit est élué avec: - mélange de chloroformeméthanol 80-20: 25 litres - mélange de chloroforme-méthanol (50-50): 10 litres - méthanol: 30 litres. La purification est suivie par CCM (pyridine-acgtate d'gthyle-acide formique-eau 21-40-10-6). On recueille 2 fractions: - fraction A 29,80 g CCM: pyridine-acétate d'éthyle-acide formique-eau 21-40-10-6 Rf: 0,75 Contr8le: RMN HPLC - EPP: 96,98 % AAA: Glu 1,01-Gly 1,01 - Arg 0,98 - fraction B 36,82 g CCM: pyridine- acétate d'éthyle-acide formique-eau 21-40-10-6 Rf: 0,75 lH RMN spectre conforme Contr8le: HPLC - EPP: 99,61 % AAA: Glu 0,93-Gly 0,99-Arg 1,08. 4 ) Boc-Gln-Glu(OBzl)-Arg(HC1)-Gly-OH 52,78 g (0,09 mole) du précédent produit sont mis en suspension dans 300 ml de chlorure de méthylène. On ajoute à la température ambiante 300 ml de TFA. Le milieu est conservé 1 h à cette température et finalement le solvant et l'excès de TFA sont évaporés sous vide au rotavapor sans chauffage. Le rendu d'évapora- tion est repris dans l'éther (300 ml). Il s'organise en donnant un produit pulvérulent blanc. Il est soigneusement lavé à l'éther et séché sous vide dans un dessiccateur. Le rendement est quantitatif et le produit est utilisé tel quel pour la mise en place de la glutamine. On le dissout dans 300 ml de DMF. On ajoute 60 ml d'eau et on ramène le pH à 7 par le NEM (contrôles effectués sur de petits prélèvements). 36,39 g de Boc-Gln-ONp (0,1 mole) sont dissous à part dans 150 ml de DMF. On dissout également à part 22,7 ml de NEM (0,2 mole) dans 150 ml de DMF et 15,4 g de HOBT (0,1 mole) dans 150ml de DMF. Ces 3 dernières solutions sont ajoutées simultanément pen- dant 1 h à la première solution du peptide dans le DMF/H20 en s'as- surant que le pH se maintient entre 6 et 7. Le milieu est agité à la température ambiante pendant 4 heures et évaporé à sec sous vide à la température ambiante. Le résidu d'évaporation est repris 3 fois par 150 ml d'éther. L'huile obtenue est dissoute dans la phase supé- rieure du mélange butanol -H20 à 50 %. On lave 2 fois la phase supé- rieure avec 200 ml de la phase inférieure. Les phases inférieures sont extraites avec 50 ml de phase supérieure. Les phases supérieures réunies sont évaporées à sec sous vide. Le résidu d'évaporation est repris dans 150 ml d'isopropanol chaud et le produit est précipité par addition d'éther. On obtient 61,13 g (94,9 %) d'un produit ca- ractérisé par: AAA Gln(Glu): 2,01 - Gly: 1,01 - Arg: 0,98 - HPLC: EPP = 96,5 % H RMN: conforme CCM (EPAW) Rf = 0,58 Exemple III: Boc-Glu(OBzl)-Ser-AsnOH (fragment B'2) 1 ) Boc-Ser-Asn-OBzl 17,65 g (0,0525 mole) du sel de TFA de H-Asn-OBzl sont dissous dans 100 ml de DMF. Le pH est amené à 7 par addition de NEM (5,5 ml environ). On ajoute ensuite 19,2 g (0,0525 mole) de Boc-Ser- ONb. Le pH est ramené à 7 par addition de NEM. Le mélange est agité à la température ambiante avec contrôles intermittents de pH. Au bout de 4 h la réaction est terminée (CCM). On évapore à sec sous vide le milieu réactionnel en maintenant à une température infé- rieure à 30 C. Le résidu d'évaporation est dissous dans 150 ml d'acé- tate d'éthyle et la solution obtenue lavée successivement avec 2 x 120 ml d'une solution aqueuse saturée de NaCl, 3 x 120 ml d'une solution aqueuse saturée de NaHC03, 3 x 120 ml d'une solution aqueuse de KHSO4-K2S04 et finalement 1 x 120 ml d'une solution aqueuse saturée en NaCl. La phase organique séchée sur MgSO4 anhydre est évaporée à sec sous vide. Le résidu est repris dans l'éther o il s'organise pour donner une poudre blanche qui est sé- chée sous vide. RENDEMENT: 16,64 g (78 %) H RMN: conforme CCM- CHCl 3-méthanol 3-1 - Rf-: 0,6 - 2 ) Ser-Asn-OBzl,TFA 143,5 g (0,35 mole) du produit préparé selon la technique ex. III n 1 sont dissous dans 700 ml de TFA. Un léger insoluble est filtré et on conserve le milieu 30 min àla température ambiante. Le milieu réactionnel est ensuite évaporé à sec sous vide à la tempéra- ture ambiante. Le résidu est repris par 50 ml d'éther et évaporé à nouveau. Le résidu s'organise en une poudre blanche dans l'hexane- éther. Le rendement est quantitatif - CCM: ClCl3-méthanol 3-1 - Rf: 0,1. 3 ) Ser-Asn-OH, TFA 116 g (0,35 ml) du précédent produit sont dissous dans 1,6 1 d'eau. On ajoute 35 g de Pd/C à 10 % en Pd et à 50 % d'humidité. Le milieu est agité 24 h à la température ambiante sous atmosphère d'hydrogène. Apres cet intervalle de temps, on recharge avec 20 g du même catalyseur et poursuit la réaction 24 h de plus. Le catalyseur est éliminé par filtration et l'eau évaporée sous vide à 30 C. Le résidu est repris par 200 ml de méthanol et évaporé pour finir d'éli- miner l'eau. Apres cette dernière évaporation, on reprend par l'éther et un solide s'organise dans ces conditions. Il est essoré et séché sous vide. Rendement quantitatif: CCM: EPAW - Rf: 0,13. 4 ) Boc-Glu-Ser-Asn-OH 0,35 mole du précédent produit (environ 117 g) sont dissous dans 300 mld'eau. On ajoute ensuite 0,7 mole de triéthyla- mine. Le pH est alors de 9 et on dilue avec 1,5 1 de DMF. Ensuite, on introduit rapidement 0,35 mole (152 g) de Boc-Glu(OBzl)-ONSu en solution dans 200 ml de DMF. Le pH est maintenu à 7,2 par addition de triéthylamine. La réaction est terminée au bout de 3 h. Le milieu est évaporé à sec sous vide à 30 C. Le résidu est repris dans 3 fois I 1 d'éther et finalement dissous dans 1,5 1 de la phase supérieure du mélange butanol-eau 50-50. On lave par 600 ml d'une solution à 5 % de KHSO4-K2SO4 puis 3 fois par 300 ml de phase infé- rieure du même mélange butanol-eau et,enfin, par 300 ml d'une so- lution saturée en NaCl. On sèche sur MgSO4 anhydre et on évapore à sec. Le résidu est organisé en une poudre blanche dans l'éther et l'hexane. Après séchage sous vide, on obtient 120 g (63,8 Z) d'un produit pulvérulent blanc. 1H RMN conforme - AAA: Asp: 1,02 - Ser: 0,90 - Glu: 1,09 - CCM (PBEW1) - Rf: 0,55 - EPP: 96 % Exemple IV: synthèse de Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH,HCl (fragment C) 1 ) ZGln-Gly-OMe Une suspension refroidie sur bain de glace de 75,36 g de HC1, H-Gly-OMe (0,6 M) dans 1 litre de DMF est additionnée de 168,2 g de Z-GinOH (0,6 M), de 256,41 g de BOP (0J7 M) et de 165,4 ml de Néthylmorpholine (1,3 M). Après 20 h de réaction à TA, la solution est concentrée sous pression réduite et le résidu repris avec de l'acétate d'éthyle. La solution organique est Iavée par: - une solution de bicarbonate de sodium - une solution de chlorure de sodium - une solution de KHSO4/K2SO4 - une solution de chlorure de sodium La solution organique est séchée sur MgSO et filtrée. Après 20 h de repos, il y a cristallisation dans chacune des solutions. Après filtration, les fractions provenant d'une cristallisation en milieu aqueux sont regroupées et lavées dans AcOEt saturé en eau pour donner après filtration et séchage sous vide 7,78 g de produit (F. 158-1590C). La fraction provenant de la cristallisation dans AcOEt est lavée dans AcOEt saturé en eau pour donner, après filtra- tion et séchage sous vide 61,8 g de produit (F. 150-154 C). La phase aqueuse et la phase organique donnent une cristallisation supplémentaire. Ces deux derniers produits sont regroupés et lavés comme précédemment pour fournir 38,05 g supplémentaires de qualité comparable. Rendement global:107,63 g ContrôlesR^ et CCM 2 ) HIC1, H-Gln-Glv-OMe Une solution de 61,8 g de Z-Gln-Gly-OMe (175,9 mM) dans 704 ml de DMF, 880 ml de méthanol est additionnée sous refroidisse- ment par bain de glace de 176 ml d'une solution d'HCl N, puis de 3,1 g de Pd/C à 10 %. Après 3 h 30 d'hydrogénation sous surpression de 46,6 kPa, le catalyseur est filtré sur célite et la solution est concentrée sous pression réduite. Le résidu est utili- sé directement dans l'étape suivante. 3 ) Boc-Gln-Gln-Gly-OMe Une solution du résidu obtenu à l'étape précédente (théo- riquement 175,9 mM) dans 500 ml de DMF, refroidie sur bain de glace est additionnée de 77,6 g de Boc-Gln-ONp (211,1 mM), 26,4 g d'hydroxy- benzotiazole (211,1 m\M) et de N-éthylmorpholine jusqu'à obtenir un pH de 7. Après 20 h de réaction à TA, la solution est prise en masse. Par addition d'acétate d'éthyle, on obtient un précipité qui est essoré, lavé à AcOEt et séché sous vide. On obtient 64,27 g de produit, soit un rendement de 82%. ContrôlesR1N et CCM 4 ) TFA, H-Gln-Gln-Glv-OMe Une suspension refroidie sur bain de glace de 98,83 g de Boc-Gln-Gln-Gly-OMe (221,8 mM) dans 300 ml de dichlorométhane est additionnée de 400 ml de TFA. Après 30 min de réaction sur bain de glace et 1 h a TA, la solution est concentrée sous pression réduite jusqu'à la moitié de son volume initial et le résidu est versé sur de l'éther en agitation. Après filtration, lavage et séchage sous vide, on obtient 119 g de produit. ) Boc-Arg(NO)-Gln-Gln-Gly-OMe Une solution des 119 g du produit précédent dans 1190 ml de DMF refroidie sur bain de glace est additionnée de 77,91 g de Boc-Arg(NO2)-OH (244 mM), de 97,51 g de BOP (266,2 mL) et de N-éthylmorpholine jusqu'à obtention de pH 7. Après 20 h de réaction à TA, la solution est versée sur 8 1 d'acétate d'éthyle. Le précipité obtenu est filtré, lavé à AcOEt, puis séché sous vide. On obtient 153,7 g de produit. ContrôlesRMN et CCM. 6 ) TFA, H-Arg(NO)-Gln-Gln-Gly-OMe -2 Une suspension refroidie sur bain de glace de 153,7 g de Boc-Arg(N02)-GlnGln-Gly-OMe (théoriquement 221,8 mM) dans 600 ml de dichlorométhane est additionnée de 750 ml de TFA. Après 1 h à TA, on ajoute encore 250 ml de TFA et,30 min plus tard, 250 ml de TFA. Après 1 h supplémentaire de réaction, on concentre la solution jusqu'au tiers du volume initial et verse le résidu sur 3 1 d'àther en agitation. Le précipité formé est essoré, lavé à l'éther et séché sous vide. On obtient 167 g de produit. 7 ) Boc-Ser-Arg(N 02)-Gln-Gln-Gly-OMe Une solution refroidie sur bain de glace de 167 g de TFA, H-Arg(NO2)-Gln-Gln-Gly-OMe (théoriquement 221,8 mM) dans 1,5 1 de DMF est additionnée de 97,52 g de Boc-Ser-ONb (266,2 mM), 33,31 g d'hydroxybenzotriazole (266,2 mM) et de N-éthylmorpholine jusqu'à obtenir un pH de 7. Après 3 h de réaction à TA, on évapore une partie du DMF et l'on verse la solution résiduelle sur de l'acétate d'éthyle sous agitation. Le précipité est filtré, lavé à l'acétate d'éthyle et séché sous vide. On obtient 153,3 g de produit, soit un rendement de 94,2 % sur 4 étapes. Contrôl1 RN et CCM. 8 ) Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OMe, AcOH Une solution de 153,3 g de Boc-Ser-Arg(NO2)-Gln-Gln- Gly-OMe (208,9 mM) dans 1 litre de méthanol, 1 litre d'eau et 500 ml d'acide acétique est hydrogénée pendant 20 h en présence de 10 g de Pd/C à 10 %. Après filtration du catalyseur et concentration de la solution, le résidu repris à l'eau est lyophilisé. On obtient 153 g de produit, soit 97,8 7'% de rendement. 9 ) Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH, HCl Une solution de 104,4 g de Boc-SerArg-Gln-Gln-Gly-OMe (139,4 mM) dans 2 1 de DM est additionnée sous refroidissement par bain de glace de 1 litre d'eau, puis de 27,88 g de NaOH (697 mM) dans 50 ml d'eau. Après 15 min de réaction à température voisine de 15 C, on neutralise par une solution d'acide chlorhydrique N jusqu'à obtenir un pH de 6,5. Après évaporation, on triture le résidu dans le l'acétate d'éthyle. Le précipité formé est essoré, lavé à AcOEt et séché sous vide, puis à l'air. On obtient 132,7 g de produit. - Purification: 109 g de Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH, HC1 sont purifiés par distribution à contre-courant dans le mélange n-butanol- méthanol-eau (4-1-5). Après 700 transferts, on fractionne en trois parties qui, après évaporation et lyophilisation,donnent: - une fraction de 27,5 g et - deux fractions à repurifier de 23,79 g et 16,90 g Contrôles RMN et CCM AAA: Ser:0,91 Arg: ,97 - Gln(Glu):2,05 Gly:1,01 Exemple V: Boc-Leu-Gln-Asp-IleMet-NH-NH2 (fragment D') 1 ) Boc-Met-NH-NH-Troc 4,31 g (10 mM) de Boc-MetOH, DCHa en solution dans ml acétate d'éthyle sont traités en présence de 20 ml d'eauparune solution saturée de bisulfate de potassium jusqu'à pH = 3; la phase aqueuse est extraite plusieurs fois à l'acétate d'éthyle et les extraits séchés sur sulfate de magnésium. A cette solution, on ajoute 2,28 g (llmM\) de H2N-NH-Troc (Troc = trichloro-2,2,2, éthoxycarbonyle, ce réactif etant prépare selon YAJITMA, Chem. Pharm. Bull. 1971, 19, 420). Après refroidissement au bain de glace, on ajoute 2,37 g (llmM) de DCC à 97 % en solution dans 10 ml d'acétate dt'éthyle. Après une nuit pendant laquelle le produit revient progressivement à TA, la dicyclohexyluree est filtrée et séchée (2,04 g) et la solution orga- nique est lavée successivement par les solutions aqueuses suivantes: gulfate-bisulfate 5 % 2 fois C1Na 2 M 2X bicarbonate de sodium 5 %, 2 fois ClNa M 2 fois et enfin à l'eau 2 fois. Après séchage sur sul- fate de magnésium et concentration du solvant presque à sec, on ajoute de l'hexane jusqu'à début de trouble et garde à + 4 une nuit après quoi ie précipité formé est filtré, lavé par un mélange d'hexane et d'acétate d'éthyle 4/1 et séché sous vide, on obtient ainsi 3,46 g (79 %) Fc = 92-4 alpha D 25 = -32 - C = 1, dioxane. CCM dans chloroforme-méthanol-AcOH 95/5/3 - Rf = 0,45 2 ) TFA, H-'Iet-NHNH-Troc 43,9 g (0,1M) de Boc-Met-NH-NH-Troc en solution dans ml de dichlorométhane et 20 ml d'éthanedithiol sont traités au bain de glace sous azote et avec agitation par 200 ml d'acide trifluo- roacétique, on ôte le bain froid et laisse sous agitation pendant une heure. Le produit est isole par élimination des réactifs volatils d'abord sous 2,6 kPa puis 13,33 Pa de pression, l'huile résiduelle est reprise 2 fois par 75 ml d'isopropanol en évaporant sous vide puis lavee 2 fois par 75 ml d'hexane par décantation après quoi elle est séchée sous vide en présence de potasse une nuit, après quoi elle commence à se solidifier et est utilisée telle quelle dans l'opération suivante. 3 ) Boc-Ile-Met-NHNH-Troc L'huile ci-dessus (environ 0,1 M) de TFA, H-Met-NH-NH-Troc en solution dans 6500 ml d'acétate dtethyle et refroidie au bain de glace esttraitée par 12,7 ml (0,1 M) de N-éthylmorpholine puis 14,85 g (0,1 M) d'HOBt, lh20 puis par 34,35 g (0,08 M) de Boc-Ile-OSu suivis de 12,7 ml (O, 1M) de N-ethylmorpholine (NEM), Après 1/2 h, le bain froid est ôté et par la suite de la NEM est ajoutée périodiquement de manière à maintenir le pH apparent vers 7. Après 20 h, la réaction est complète et l'isolement se fait par lavages successifs par les solutions aqueuses suivantes: sulfate-bisulfate de potassium 5 % 3 fois, de l'eau 3 fois, du bicar- bonate de sodium 5 % 3 fois et enfin, à l'eau jusqu'à neutralité. Après séchage sur sulfate de magnésium et évaporation du solvant sous vide, on obtient 64 g de gomme qui est chromatographie sur une colonne de silice avec du dichlorométhane contenant de O à 1,5 % de methanol. On obtient ainsi 30 g (68 %) de produit ayant une pureteé HPLC de 98,9 % et un spectre RMN en accord- avec la structure attendue. Fc: 88-92 C. ) TFA, H-Ile-Met-NH-NH-Troc 27,6 g (50 mM) de Boc-Ile-Met-NH-NH-Troc en solution dans ml de dichloromethane et 14 ml d'ethanedithiol sont refroidis au bain de glace et agites sous azote puis on leur ajoute en 5- 6 min, ml d'acide trifluoroacetique. Le bain froid est Oté etaprès min, le produit est isole par évaporation au maximum des reactifs, reprise de l'huile résiduelle par 2 x 60 ml d'isopropanol suivie d'évaporation et enfin par 2 lavages par 60 ml de pentane. Après séchage une nuit sur potasse sous vide, on obtient une huile d'aspect vitreux qui est utilisée dans l'opération suivante (30 g). ) Boc-Asp(OBzl)-lle-Met-NH-NH-Troc -30 Les 30 g d'huile precedente en solution dans 250 ml de THF sont traites par 6,4 ml (50 mM) de NEM et 18, 9 (45m.1) de Boc-Asp (OBzl)0 Su. Le pH apparent est ajuste entre 6 et 7 par additions successives de NEM. Après 4 h, le produit est isolé par évaporation du THF, reprise dans 400 ml d'acétate d'ethyle, suivie des mêmes lavages que l'homologue précédent (3). Le résidu, après séchage et évaporation (36,5 g), est purifié par chromatographie sur une colonne de silice avec du dichlorométhane comme solvant contenant de O à 1,5 % de méthanol. On obtient ainsi 25 g (66 %) de produit présentant un spectre RMN conforme à la structure attendue. Fc = 96-100 C. 6 ) Boc-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-NH-NH-Troc 42 g (55 mM) de Boc-Asp(OBzl)-Ile-Met-NH-NH-Troc sont dissous dans un mélange de 300 ml de chlorure de méthylène anhydre et 30 ml d'éthane-dithiol, puis traités en 15-20 min par 300 ml de TFA à TA sous agitation. 45 minaprès la fin de l'addition, le mélange est évaporé à sec, repris plusieurs fois dans l'éther an- hydre et décanté, puis séché sous vide en présence de potasse. Le sel de TFA ci-dessus est dissous dans 270 ml de DMF et refroidi à +5 - + 10 C. Le pH est amené à 7 (papier pH) par de la N-éthyl- morpholine. 8,4 g (55 mM) de HOBT hydraté, puis 21 g de Boc-Gln-ONp (57 mM) sont ajoutés et le pH réajusté à 7. La température est rame- née à 20 C et la réaction est maintenue à cette température 4 h. sous agitation et à un pH de 7 maintenu par de la N-éthyl-morpholine. Le solvant est évaporé sous vide, le résidu repris dans H20, essoré, lavé au tampon sulfate-bisulfate, lavé plusieurs fois à l'eau et séché à l'air. Le solide est broyé et lavé à l'acétate d'éthyle, essoré, relavé à l'eau et séché sous vide en présence de P205. RENDEMENT: 80 % (39 g) CCM: chloroforme/acétone/AcOH 75/18/7 7 ) Boc-LeuGln-Asp(OBzl)-Ile-Met-NH4fH-Troc 39 g (44 mi) Boc-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-NH-NH-Troc ci- dessus sont introduits dans un mélange bien agité de 400 ml TFA glacé et 40 ml d'éthane-dithiol puis agités 45 min à TA. Le solvant est évaporé, le résidu est repris dans l'isopropanol et évaporé en terminant à la pompe à palettes. Par addition d'éther anhydre, le sel de TFA cristallise; il est essoré, lavé à l'éther et séché au dessiecateuren présence de potasse. Le sel de TFA ci-dessus est dissous dans 250 ml de DMF, le pH est ajusté à 7 (papier pH) par de la N-éthyl-morpholine, 15 g (45,7 mM) de Boc-Leu-ONsu sont ajoutés et le pH est maintenu à 7 par de la N-éthyl- morpholine. Après 3h30, le DMF est évaporé sous vide et le résidu est repris dans l'eau. Le pH est amené à 2 par HCl 6 N. Le solide est homogénéisé, essoré, lavé à l'eau, séché, lavé 3 fois à l'acétate d'éthyle. RENDEMENT: 77 % (34 g) 1H-RMN: conforme CCM: chloroforme-acétone-AcOH 75/18/7 tache unique 8 ) Boc-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-NH-NH2 17,9 g (17, 5 mM) Boc-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-NH-NH-Troc sont dissous dans un mélange de 200 ml de DMF et 50 ml d'acide acé- tique et agités énergiquement avec un agitateur mécanique. 11,5 g de zinc en poudre (300 mesh = 47 pm) sont ajoutés en une fois et l'agitation est poursuivie lh40 à TA. Le solide est essoré, lavé au DMF et Le filtrat est introduit dans 750 g de glace. L'ensemble est laissé au repos une nuit, puis essoré. Le précipité est lavé abondamment à l'eau et séché à l'air, puis au dessiccateur + P205. RENDEMENT: 78 % (11,3 g) 1H-RMN: conforme Le produit obtenu est suffisamment pur (80-90%) pour l'étape sui- vante. Dans le cas contraire, il est purifié par dissolution dans le DMF et précipité par un égal volume de n-butanol. Exemple VI: Boc-Arg(MTS)-Lys(Z)-Leu-NH-NH2 1 ) Boc-Lys(Z)-Leu-OCH3 A 1600 ml d'acétated'éthyle refroidis à + 10 C par un bain extérieur de glace et sous agitation, on ajoute successivement 53,88 g (0,297 mole) de H-LeuOCH3, HC1, 126 ml de N-éthyl-morpholine (1 mole), 44,5 g d'OHBT (0,33 mole) et finalement 166 g de Boc-Lys(Z)- OTcp (0,297 mole). Le pH est maintenu à 6-7 par addition supplémen- taire de N-éthyl-morpholine. Le milieu est agité 1 h à + 100 C, puis une nuit à la température ambiante. La réaction est alors terminée (CCM) et un léger insoluble est éliminé par filtration. La solution est lavée successivement avec 300 ml d'une solution aqueuse à 5 % de K2SO4-KHSO4, avec 300 ml d'une solution saturée de NaHCO3 et finalement avec 300 ml d'une solution aqueuse de NaCI. La solution d'acétate d'éthyle est séchée sur MgSO4anhydre et le solvant évaporé sous vide à 30 C. On obtient une huile qui est purifiée par chroma- tographie sur 4 kg de silice Fine Merck (230-400 mesh, soit 37-62 pm) dans une colonne de 7 x 210 cm. On élue d'abord avec le CHCl3 pur jusqu'à élimination d'une impureté de tête. Lé produit est glué par le mélange CHCl3 à 2 % de CH30H. Les fractions contenant le produit pur sont réunies et le solvant évaporé sous vide. Le.résidu huileux est cristallisé dans le mélange pentane-éther 50-50. Le solide est essoré et séché. Le rendement en produit pur est de 119 g (79 %). IH RMN: conforme. 2 ) Lys(Z)-Leu-O-CH, TFA, ,15 g-(20 mM) de Boc-Lys(Z)-Leu-O-CH3 sont mis en suspension dans 50 ml de chlorure de méthylène. Le mélange est re- froidi à + 5 -+ 10 C et on ajoute 50 ml de TFA. On obtient ainsi une solution homogène qui est conservée 50 min à la température ambiante sous agitation. Le milieu est évaporé à sec sous vide sans chauffer (30 C) et l'huile résiduelle lavée à l'éther et ce dernier évaporé à son tour. RENDEMENT: 18,1 g en un produit huileux utilisé tel quel dans l'étape suivante. 3 ) Boc-Arg(MTS)-Lys(Z)-Leu-OCH 9,14 g (0,02 mole) de Boc-Arg(MTS)-OH sont dissous dans 150 ml de THF. On refroidit au bain de glace et on ajoute 2,82 g de OHNSu (N-hydroxy succinimide) et 5,02 g de DCCI. Apres 1 h, le pré- cipité formé de dicyclohexylurée est essoré et on ajoute alors la solution dans 150 ml de THF du produit obtenu dans l'exemple précé- dent (Exemple n VI-2 ). Le pH du milieu est maintenu à 7 par addi- tion de NEM. Le milieu est maintenu sous agitation à la température ambiante pendant une nuit. La réaction est terminée (CCM) et le solvant évaporé sous vide à 30 C. Le résidu est repris dans 200 ml d'acétate d'éthyle et lavé successivement avec 100 ml d'une solution aqueuse à 5 % de K2S04-HKSO4, 100 ml d'une solution aqueuse saturée en HNaCO3, 100 ml d'une solution aqueuse saturée en NaCl et finale- ment la phase organique est séchée sur MgSO4 anhydre et le solvant évaporé sous vide. Le résidu huileux obtenu est purifié par chroma- tographie sur 600 g de silice Merck Fine (230-400 mesh, soit 37-62vm) dans une colonne de 4 x 95 cm. On élue d'abord les impuretés avec le CHCl3. Les fractions contenant le produit pur sont réunies et éva- porées. Le produit s'organise en solide dans le pentane. RENDEMENT: 9 g (53 %) 1H RMN conforme - CCM: CHC1390, CH30H 10) - Rf: 0,5 - 4 ) Boc-Arg(MTS)-Lys(Z)-Leu-NH-NH2 7,1 g (0,0084 mole) de Boc-Arg(MTS)Lys(Z)-Leu-OCH3 sont dissous dans 110 ml de méthanol. Sous agitation magnétique et à la température ambiante, on ajoute 20 ml d'hydrate d'hydrazine. La réaction est complète en 3h et le milieu réactionnel est versé sur de la glace pilée sous agitation. On laisse au repos une nuit et le solide est essoré et séché dans un dessiccateur sous vide en présence de P205. On obtient dans ces conditions 6,1 g (86 %) d'un solide blanc. H RIMN: conforme - CCM: CHC13-CH30H 90-10 - Rf: 0,25 - Exemple VII: Boc-Gln-Leu-Ser-Ala-OMe (fragment F1) j) Boc-Ser-Ala-OMe Dissoudre 25 g de H-Ala-OMe, HC1 et 66 g de Boc-Ser-ONb dans 500 ml de DMF. Refroidir au bain de glace et ajouter sous agi- tation magnétique 25 ml de NEM, 24 g de N-hydroxybenzotriazole et * maintenir le pH a 6,5 ou 7 par addition de NEM. Agiter 18 h à TA. Après contrôle CCM, évaporer le milieu à 90 % (0,1 mm Hg - 35 C). L'huile obtenue est dissoute dans 1 500 ml de chloroforme. Laver avec une solution de chlorure de sodium saturée (2 fois), solution sulfate/bisulfate de potassium 5 % 3 fois, bicarbonate de sodium saturée 5 fois. La solution est séchee sur Na2SO4 et évaporée à sec. On obtient une huile qui est sechée à poids constant (30 C-13,33Pa). RENDEMENT: 53,78 g - Contrôle CCM - 2 ) H-Ser-Ala-OMe, TFA Dissoudre 52,8 g de Boc-Ser-Ala-OMe dans 100 ml de chlorure de méthylène sous agitation magnétique en refroidissant au bain de glace. Ajouter 250 ml de TFA refroidi et agiter 20 min à TA. Filtrer. Evaporer le filtrat à sec (35 trompe à eau). Par addition de 2 1 d'éther, un solide blanc précipite. Il est essore, lavé à l'éther 3 fois. Sécher à poids constant (30 C - 13,33 Pa). RENDEMENT: 40,82 g 3 ) Boc-Leu-Ser-Ala-OMe Dissoudre 40 g de H-Ser-Ala-OMle, TFA et 32,9 g de Boc- Leu-OH, H20 dans 400 ml de DMF. Refroidir au bain de glace sous agi- tation magnétique et ajouter 14,4 ml de NEM puis 65,8 g de BOP et assez de NEM pour maintenir le pH à 6,5-7. Agiter 2h à TA. Après contrôle CCM, évaporer à sec (0,1 mm-35 C)et dissoudre l'huile obtenue dans 1 500 ml de chloroforme. Laver 2 fois avec une solution NaCl saturée, 3 fois avec sulfate/bisulfate de potassium 5 %,3 fois au bicarbonate de sodium saturé. Secher/Na2So4. Evaporer à sec (30 - trompe à eau). L'huile obtenue est solidifiée dans l'éther: Fraction A = 29 g. Un deuxième jet B est obtenu par addition d'hexane, iden- tique en CCM: B = 13,7 g. RENDEMENT: 42,7 g - Contrôles RPN et CCM. 4 ) H-Leu-Ser-Ala-OMie, TFA Mettre en suspension 29 g de Boc-Leu-Ser-AlaOMe dans ml de chlorure de méthylène sous agitation magnetique en refroi- dissant au bain de glace. Ajouter 100 ml de TFA refroidi et après dissolution, agiter 30 min à TA. Filtrer. Evaporer le filtrat a sec (35 trompe à eau). L'huile obtenue est solidifiée dans l'éther (changer le solvant plusieurs fois). Sécher à poids constant (30 C 13,33 Pa). RENDEMENT: 30,2 g. ) Boc-Gln-Leu-Ser-Ala-OMe Dissoudre sous agitation magnétique 30 g de H-Leu-Ser- Ala-OMe, TFA et 25,5 g de Boc-Gln-ONp dans 300 ml de DIF. Neutraliser par 9,7 ml de NEM. Ajouter 10 g d'OHBt et agiter 2 h à TA en mainte- nant le pH à 6,5-7 par addition de NEM. Après contrôle CCM, le milieu est concentre à 90 % (0,1 mm Hg - 35 ), repris dans 1 000 ml de chlo- roforme: un produit précipite en gel. Essorer. Laver en reprenant dans 500 ml de chloroforme 2 fois, puis dans l'éther 3 fois. Secher à poids constant (13,33 Pa - 30 C). RENDEMENT: 32,1 g CCM: chloroforme/MeOH/AcOH: 9/2/0,5 - Rf = 0,81 - HPLC- EPP = 91 % AAA: Ser: 0,86 - Glu: 1,02 - Ala: 0,99 -Leu: 0,99 - Exemple VIII: Boc-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OH, HCl (fragment G1) 1 ) ZLeu-Gly-OCH3 On dissout 0,22 mole de Z-Leu-OH dans 500 ml de DMF. A cette solution, on ajoute successivement: - 25,11 g de HCl-H-Gly-OCH3 (0,2 mole) - 28 ml de NEM - 96 g de Bop (0,22 mole) puis on ajuste le pH à 7 par addition de NEl. On agite le mélange reactionnel à TA en maintenant le pH à 7 par addition de NEM si nécessaire. La réaction est suivie en CCM (chloroforme-methanolacide acetique 95/5/9). Au bout de 2 h, la réaction est terminee. Le mélange réactionnel est évaporé à sec sous pression réduite (26,66 Pa) et à température inférieure à C. Le résidu est repris dans l'acétate d'éthyle (1 litre). La solution est lavee successivement avec: - solution aqueuse de bicarbonate (4 x 200 ml) - solution aqueuse de SO4HK-SO4K2 (4 x 200 ml) - solution aqueuse saturée de chlorure de sodium (2 x 200 ml) puis, elle est séchee sur sulfate de magnésium et évaporée à sec souspression réduite. Le résidu est repris dans de l'éther (500 ml), triture, essore, séché. RENDEMENT: 56,7 g (84.28 %) CCM chloroforme-méthanol-acide acétique 95/5/3 - Rf: 0,44 - 20) HCl-H-Leu-Gly-OCH3 On dissout 56 g (0,166 mole) de Z-Leu-Gly-OCH3 dans 900 ml de methanol chlorhydrique 0,23 N. A cette solution, on ajoute 6 g de Pd/C à 10 % contenant 50 % d'humidité. On hydrogène pendant 24 h;- à TA et sous pression atmosphérique. On filtre le catalyseur et la solution est évaporée à sec sous pression résuite à température inférieure à 30 C. On reprend le résidu par de l'éther (2 x 50 ml), on décante et on sèche le produit au dessiccateur en présence d'anhy- dride phosphorique. On obtient une poudre blanche. RENDEMENT: 33,53 g (84,4 %) COCM chloroforme-méthanol-acide acétique 90/20/9 - Rf:0,15 - Contrôle RIMN 3 ) Boc-Val-Leu-Gly-OCH3 28,24 g de Boc-Val-OH (0,13 mole) sont dissous dans 400 ml de tétrahydrofuranne refroidi à -10 C. On ajoute ensuite 14,45 ml (0.13 mole) de chloroformiate d'isobutyle. Le mélange est vigoureusement agité à -10 C pendant 15 min. A ce mélange, on ajoute une solution tétrahydrofurannique refroidie à -10 C contenant 31,5 g du chlorhydrate de H-Leu-Gly-OCH (0,13 mole) préalablement neu- tralisé par 14,45 ml de N-méthylmorpholine. On poursuit l'agitation en refroidissant le mélange réactionnel dans un bain de glace (2 h) puis à TA pendant 2 h. Le mélange réactionnel est évaporé à sec sous pression réduite i température inférieure 'i 30 C. Le résidu est repris dans un mélange acétate d'éthyle-eau (500 ml-500 ml). La phase aqueuse est décantée et la phase organique lavée successivement avec: - une solution aqueuse de bicarbonate de soude (2 x 50 ml) - une solution aqueuse de S04HK-S04K2 (pH 2) (2 x 50 ml) - une solution aqueuse de chlorure de sodium (50 ml), puis sechee sur sulfate de magnésium et eyaporee à sec sous pression réduite à température inférieure à 30 C. Le résidu est repris avec le pentane (50 ml), essoré et séché sous vide (0,1 mm de mercure). RENDEMENT: 39,7 g (76 %) CCM chloroforme-acétone 75/25 - Rf: 0,46 Contrôle RIN 4 ) TFA H-Val-Leu-Gly-OCH3 On dissout 39 g de Boc-Val-Leu- Gly-OCH3 (0,097 mole) dans 190 ml de TFA refroidi dans un bain de glace. Après dissolution, on enlve le bain de glace et on agite le melange pendant 30 min à TA. On évapore à sec sous pression réduite et le résidu est repris dans l'éther (100 ml), trituré et l'éther décante. Cette opération est repétée 2 fois et les dernières traces de solvants sont éliminees sous pression réduite (13,33 Pa). RENDEMENT: 44,8 g CCM chloroforme-méthanol-acide acetique 90/20/3 - Rf: 0,36. ) Boc-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3 On dissout 25,55 g de TFA H-Val-Leu-GlyOCH3 (0,0615 mole) dans 200 ml de DMF. La solution est amenée à pH 7 par addition de NEM. On ajoute alors à cette solution 32,47 g de Boc-Lys(Z)OTCP (0,058 mole) et 9 g de HOBT (0,059 mole). Le pH du mélange reactior,nel est ramené à 7 par addition de NEM. On agite à TA en maintenant le pH à 7 par addition de NEM si nécessaire. La réaction est suivie en CCM: chloroforme-méthanol 90/10; chloroforme-méthanol-acide acetique 90/20/3 (2 milieux). Au bout de 1 beure, on rajoute 1,96 g de Boc-Lys(Z) OTCP (0,0035 mole) et 0,61 g de HOBT. Le pH de la solution est ramene à 7 par addition de NEM. 2 h après, la réaction est terminée en CCM. Le mélange réactionnel est alors évapore à sec sous pression réduite (0,1 mm de mercure) à température inférieure à 30 C. Le residu est repris avec 500 ml d'eau, trituré. Le solide formé est essore puis lave avec - 500 ml de solution aqueuse de HKSO4-K2S04 (pH 2) - 500 ml d'une solution aqueuse saturée de bicarbonate de soude - 200 ml d'eau puis à l'éther (200 ml x 2) et seche. Le produit impur est chromatographie sur une colonne de gel de silice (5cm x 150 cm). Il est élue avec le mélange chloroforme- acetate d'éthyle 80/20 (débit 600 ml/h). Les bonnes fractions déter- minées en CC}I sont réunies, évaporees à sec-sous pression réduite. Le résidu est repris dans l'éther, triture et le solide obtenu essoré. Poudre blanche 35,14 g (86 %) CCM chloroforme-méthanol 90/10 - Rf: 0,62 Chloroforme-méthanol-acide acétique 87,7-9,4-2,8 Rf 0,52 Contrôle RMI AAA: AC Gly 1,00-Val 0,96-Leu 1,06-Lys 0,98. 6 ) TFA H-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3 On dissout 15 g de Boc-Lys(Z)-Val-LeuGly-OCH3 (22,6 mnel) dans un mélange de TFA-chlorure de méthylène (75 ml/75 ml). On agite min à TA, puis on évapore a sec sous pression réduite à tempéra- ture inférieure à 30 C. Le résidu est repris par de l'éther contenant % d'hexane (100 ml). Le solide formé est essoré et séché. On obtient un solide blanc de 14,51 g. RENDEMNT: 94,7 % CCM chloroforme/méthanol/acide acetique 95/5/3 - Rf: 0,12 - 7 ) Boc-Arg(HCl)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3 On dissout 14,1 g de TFA H-Lys(Z) -Val-Leu-Gly-OCH3 (21 mM) dans 50 ml de DMF. La solution est amenée à pH par addition de NEM. On ajoute alors à cette solution 6,57 g de Boc-Arg (HCl)-OH.l H20 (20 mN) et 10,6 g de BOP (24 me). Le pH du mélange réactionnel est ramené à 6-7 par addition de NEM, On agite A TA en maintenant le pH à 6-7 par addition de NEM si nécessaire. La réaction est suivie en CCM: chloroforme/méthanol (80/20). Au bout de 5 h, la réaction est terminée. On évapore à sec le mélange réactionnel sous pression réduite (13,33 Pa) et à température inférieure à 30 C. L'huile obtenue est reprise dans 300 ml d'acetate d'éthyle. Le solide formé est essoré et lévé à l'éther (ler jet). On rajoute de l'éther au filtrat précédent; un solide précipite qui est essore (2ème jet): les 2 jets sont inden- tiques en CCM. Ils sont lavés à l'état solide par agitation pendant 1 h avec un mélange de 200 ml d'eau saturée en acétate d'éthyle et ml d'eau. Le solide est essoré puis lavé avec 60 ml d'eau et 300 ml d'éther et séché. RENDEMENT: 78,7 % (13,49 g) CCM chloroforme/méthanol 20/20 - Rf = 0,32 - Contrle RMN 8 ) TFA H-Arg(HCl)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3 13,3 g de BocArg(HCl)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OCH3 (15,5 mn) sont dissous dans un mélange TFA-chlorure de méthylène (60 ml/60 ml). On agite 40 min à TA, puis on évapore à sec sous pression réduite à température inférieure à 30 C. Le résidu est repris par un mélange étherhexane (80/20: 100 ml). Le solide formé est essore, lavé à l'hexane et séché (poids: 15,13 g). CCM: chloroforme/ méthanol (3/1) - Rf: 0,35 - 9') 1ioc-Tvr- Arj(lICl)-Lvs(Z)-Val-Leu-GClv-OCH3 On dissout 15,5 lmM de TFA Il-Arg(HCl)-Lys(Z)-Val-Leu-Gly- OCI3 dans 50 ml de DIMF. La solution est amenée à pH 6 par addition de NEM. On ajoute alors à cette solution 8,20 g de Boc-Tyr-OTCP (15,5 x 10 mIM) et 2,41 g de IOBT (15,5 x 10 mM). On ramène le pHi à 6 par addition de NEM. Le mélange réactiontel est agité à TA en maintenant le pli à 6 par addition de NEM si nécessaire. La réaction est suivie en CCI: chloroforme/mthanol (3/1). Au bout de 3 h, la réaction est terminée. On évapore à sec le mélange réactionnel sous pression réduite (13,33 Pa) et àl température inférieure à C. L'huile résiduelle est reprise dans de l'acétate d'éthyle (300 ml). Le solide gélatineux forme est essore, lavé avec de l'acé- tate d'ethyle (100 ml), avec de l'acetate d'éthyle-éther (1/1; 100 ml), puis à l'éther (100 ml), enfin à l'hexane (100 ml). Le pro- duit est séché sous pression réduite jusqu'à poids constant. RENDEIINT: 96 Zf (15,14 g) CCM chloroforme'méthanol (3/1) - Rf: 0,47- Contrôle RMN AAA AC: Gly: 0,95 - Val: 0,98 - Leu: 1,02 - Lys: 1,01 - Arg 1,01 - Tyr: 1,05 - IlPLC: 93,81 Z EPP. ) Boc-Tvr-Arg(H1Cl) -Lys(Z)-Val-Leu-Gly-OH 7 g de Boc-Tyr-Art(HCl)-Lys(Z) -Val-Leu-Gly-OCH3 (6,86 mN) sont dissous dans un mélange de 70 ml de dioxane et 35 ml d'eau. On ajoute à cette solution 6,4 ml de soude 4N (25, 6 m1i) 3,7 dquivalents) et on agite pendant 30 min à TA. On dilue avec 200 ml d'eau et 800 ml d'acétate d'éthyle. Le mélange est alors acidifié à pH 3 par addition de HIC1 (N). On décante l'acétate d'éthyle et on essore le solide (ler jet). L'acetate d'éthyle est évapore à sec; on obtient un 2ème jet. Les 2 jets identiques en CCMI sont reunis, laves à l'éther et séches, RENDEENT: 74,7 %$ (5,16 g) CCM: chloroforme/méthanol (2/1) - Rf 0,45 111 Contrôle RMN AAA Ac: Gly: 1,00 - Val: 0,97 - Leu 1,04 - Tyr 0,95 - Lys 0,_99 -Arg: 1,05 - IPLC - EPP 91,52 7. Exemple IX: Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-NH-NH2(fragment H) 1 ) Boc-Asn-SerOle Une solution de 23,32 g de Boc-Asn-OH (O, 1 M) et 19,7 g de NbOH (0, 11 M) dans 250 ml de DEF, refroidie sur bain de glace est additionnée de 22,69 g de DCC. Après 3 h de réaction à TA, on filtre la DCU, on refroidit sur bain de glace et ajoute 15,56 g de HC1, H- Ser-OMe (chlorhydrate de H-Ser-OMe). Le pH est amene, puis maintenu à 7 par addition de NEM. Après 4 h à TA et 20 h à +4 , la solution est concentrée sous pression réduite. Le résidu est repris par le melange AcOEt/n-butanol (50/50). La solution organique est lavee successivement par: - une solution saturée de bicarbonate de sodium - une solution saturée de chlorure de sodium - une solution de KHSO4/K2S04 à 5 % - une solution saturée de chlorure de sodium. Après séchage sur MgSO4 et évaporation sous pression réduite, le résidu est cristallisé dans le mélange ether-hexane. Fil- tration, lavage à ether/hexane et séchage sous vide donnent 26,9 g de produit. RENDEMENT: 80,8 % ContrôlesRN et CCN 2 ) TFA, H-Asn-Ser-O01e Une solution refroidie sur bain de glace de 13,5 g de Boc- Asn-Ser-OMe (40,5 mI) dans 54 ml de dichloromethane est additionnée de 81 ml de TFA. Après 1 h de réaction à TA, la solution est concen- tree sous pression réduite, le résidu est repris à l'éther. On obtient une huile épaisse qui est utilisée dans la réaction suivante. ) Boc-Thr-Asn-Ser-OlMe Une solution refroidie sur bain de glace du produit brut précédemment obtenu dans 300 ml de DMF est additionnée de 14, 09 g de Boc-THr-ONSu (44,55 mM) 5,58 g d'HOBt (41,3 mM) et de NEM jusqu'à obtenir un pH de 7. Après 20 h de réaction à TA, la solution est concentrée sous pression réduite et le résidu est repris dans le mélange AcOEt/n butanol. La solution organique est lavée successi- vement par: - une solution saturée de bicarbonate de sodium - une solution saturée de chlorure de sodium - une solution de KHSO 4/K2S04 à 5 % - une solution saturée de chlorure de sodium. Après séchage sur MgSO4, la solution est concentrée sous pression reduite et le residu cristallise dans le mélange ether/hexane. On obtient 8,28 g de produit. RENDEMENT: 47 %' ContrôlesRbLN et CCM 4 ) TFA, H-Thr-Asn-Ser-OMe Une solution refroidie sur bain de glace 8 g de Boc-Thr- Asn-Ser-OMle dans 32 ml de dichlorométhane est additionnée de 54 ml de TFA. Après 1 h de reaction à TA, la solution est concentrée sous pression réduite et le résidu précipité à l'éther. Après filtration, il est utilisé tel quel dans la réaction suivante. 50 ) Boc-Phe-Thr-Asn-Ser-OMe Une solution du précipite obtenu a l'étape precedente dans ml de DMF est additionnée sous refroidissement par bain de glace de 7,82 g de Boc-Phe-ONp (20,24 mM), 2,53 g d'HOBt (18,71 mNI) et de la N-éthylmorpholine jusqu'à obtenir un pH de 7. Après 4 h, la solution est concentrée sous pression reduite et le résidu est repris dans AcOEt. La solution organique est lavee par: - une:solution saturée de bicarbonate de sodium - une solution saturee de chlorure de sodium - une solution de KHSO 4/K2S 4 à 5 % - une solution saturée de chlorure de sodium. Après séchage sur MgSO4, concentration de la phase orga- e 4 nique le résidu est cristallisé dans l'éther. On obtient 10 g de pro- duit. RENDEMENT: 93,5 % ContrôlesCCM et R.=S. 6 ) TFA. H-Phe-Thr-Asn-Ser-ONe Une solution de 10 g de Boc-Phe-Thr-AsnSer-OMe (17,19 mM) dans 40 ml de dichlorométhane est additionnée sous refroidissement par bain de glace de 60 ml de TFA. Après 1 h de réaction à TA, le produit 3 pour donner 5,14 g de produit. RENDEMENT: 48,5 % 7 ) Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-OMe Une solution refroidie sur bain de glace de 5,14 g de TFA, H-Phe-Thr-Asn-Ser-OMIe (8,78 mI) dans 100 ml de D}MF est additionnée de 3,17 g de Boc-Ile-OSu (9,66 mN), 1,30 g d'HOBt (9,62 mni) et de N-ethyl- morpholine jusqu'à obtenir un pH de 7. Après 20 h de reaction à TA, la solution est concentrée sous pression reduite et le résidu repris à l'éther donne un précipité qui est filtre et seche sous vide. On obtient 5,24 g de produit. RENDEMENT: 85,9 % ContrôlesR1N et HPLC. 8 ) Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-NH-NH2 Une solution de 5 g de Boc-Ile-Phe-ThrAsn-Ser-OMe (7,2 mMI) dans 40 ml de D}E et 200 ml de methanol refroidie sur bain de glace est additionnée de 3,6 ml d'une solution à 80 % d'hydrate d'hydrazine. Après 21 h de réaction à TA, on ajoute 0,9 ml de la même solution d'hydrate d'hydrazine. Après 3 h supplémentaires, le gel obtenu est filtre, lavé au methanol et séche sous vide. On obtient 3,94 g de produit. RENDEMENT: 78,8 % Contrôles RIN et CCM. Exemple X: Boc-Tyr-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH (fragment I) 1 ) Boc-Asp(OBzl)Ala-OBut 3,62 g (0,02 mole) de chlorhydrate d'alaninate de tertio- butyle sont mis en suspension dans 30 ml d'acetonitrile. 2,52 ml de NEM sont ajoutes puis 8,4 g (0,02 mole) de Boc-Asp(OBzl) ONSU. Le pH est maintenu à 6-6,5 par addition de NEM. L'agitation est poursuivie 18 h. Après contrôle CCM le milieu est évapore à sec, l'huile est reprise dans 50 ml AcOET, la solution lavee 2 fois par une solution KHSO4/K2S04, puis à l'eau salée, séchee sur Na2SO4 et évaporée à sec. L'huile obtenue est dissoute dans l'hexane, un peu de solide est filtré et le filtrat est évaporé à sec. L'huile obtenue est utilisée telle quelle. CCM: CHC13/Acetone/ACOH 80/15/5 - Rf = 0,8 - 2 ) Boc-Ala-Asp(OBzl)Ala-OH L'huile brute obtenue précédemment est dissoute dans ml TFA glace et agitée lh30 à TA. Le TFA est évaporé au maximum et l'huile résiduelle est reprise 3 fois dans l'éther anhydre et décantée. Elle est ensuite sechee au dessiccateur sous vide en pre- sence de pentane. Il se forme une mousse solide qui est ecrasee et remise à sécher. On obtient 9,4 g de produit brut utilise tel quel pour le couplage. Le sel de TFA ci-dessus est dissous dans un mélange de ml DES et 18 ml d'eau distillée. Le NEM est ajoutée jusqu'à pH 7 (utilisation du pimètre). 4 g (0,014 mole) de Boc-Ala-ONSu en solution dans 16 ml de D}F sont introduits. Le pH est maintenu à 6,5-7 par addition de NEM. Après 5h30, la réaction est terminée (contrôle CCM). Le solvant est évaporé au maximum et le résidu est repris dans un mélange d'eau et d'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée par une solution de NaHCO3, à l'eau salée, séchee sur NA2SO4 et évaporée à sec. Le résidu est dissous dans l'éther et précipite par l'hexane pour donner une gomme qui cristallise après triturage. Le solide est essore et séché à lVair. RENDEMENT: 5,05 g. CCM CHC13-acétone-ACOH 80/15/5 - Rf = 0,28 3 ) Z-Tyr-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH 1 g (2mmoles) de Boc-Ala-Asp(OBzl)-Ala-OH est introduit dans 10 ml TFA glacé agité. Après 30 min d'agitation à TA, le TFA est évapore au maximum, le résidu repris 2 fois dans l'éther anhydre et décanté, puis séche au dessiccateur sous vide en présence de potasse. Il se forme une mousse solide. Le produit brut est mis en solution dans un mélange de 4 ml DAF et 2 ml d'eau distillée. NEM est ajouté jusqu'à pH 7-7,5;1 g (2,4 mmoles) de Z-Tyr-ONSu est alors ajouté et le pH est maintenu à 7-7,5 par NEM (pHmètre). Au bout de 2h30, après contrôle CCM, le solvant est évaporé au maximum à 40 C. Le résidu est repris dans l'acétate d'éthyle et lave à l'eau, un peu de solide est élimine et l'acétate d'éthyle est lave au mélange sulfate/bisulfate et à l'eau salée. Après abandon quelques heures, il se forme un précipité qui est essoré, lavé à l'éther et séché à l'air. 500 mg sont ainsi obtenus. Un 2ème jet de 350 mg légèrement moins pur est obtenu par concentration de l'acétate d'éthyle. CCM chloroforme-ACOH 3/1 Rf: 0,4 butanol-ACOH-H20 72/7/2 Rf: 0,85 chloroforme-acétone-ACOH 80/15/5 Rf: 0,1 HPLC 90,9 % pureté polypeptidique Contr81e RMN Exemple XI: Synthèse de H-Arg(MTS)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile- Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala- Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 TFA, HCl (Peptide K1) ) Boc-Gln-Glu(OBzl)Arg-Gly-AlaArg-Ala-Arg-Leu-NH2, HCl 6,53 g de H-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, HCl (fragment A), soit 10-2 mole et 7,5 g de Boc-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-OH (1, 05 x 10-2 mole) sont dissous dans 100 ml de DMF. Le pH est ramené à 7 par addi- tion de NEM et ensuite on ajoute 5,2 g de BOP (10-2 mole + 20 %) sous agitation et à température ambiante. Le pH est maintenu à 7 par addi- tions intermittentes de NEM. La réaction est terminée au bout de 4 h. Le milieu est concentré sous vide à 35 C et,au résidu d'évaporation, on ajoute de l'acétate d'éthyle. Un solide s'organise. Il est essoré, lavé à l'acétate d'éthyle (3 fois), lavé à l'acétonitrile (3 fois), à l'éther et séché sous vide jusqu'à poids constant. On obtient 11,6 g (87 %) d'un produit blanc. CCM: Butanol-pyridine- AcOH-eau (50/12/12/25) - Rf: 0,81 AcOEt-pyridine H-CO2H-eau (40/20/10/6) - Rf: 0,89 AAA: Glu (Gln): 2,02 - Arg: 3,02 - Leu: 0,95 - Gly: 0,91 -Ala:2,1- 2 ) H-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, TFA, HCl 11 g du précédent peptide (Exemple XI n 1) sont mis en suspension dans 50 ml de chlorure de méthylène froid. On ajoute sous agitation magnétique 60 ml de TFA préalablement refroidis au bain de glace. Apres dissolution, le milieu est agité 30 min. à la température ambiante. On ajoute ensuite 500 ml d'éther, et un solide pulvérulent blanc précipite instantanément. Il est essoré, lavé 4 fois avec 200 ml d'éther et séché jusqu'à poids constant. On obtient dans ces condi- tions un rendement quantitatif (11 g) d'un produit blanc. CCM: Butanol-pyridine-AcOH-eau (50/12/12/25) - Rf: 0,29 AcOEt-Pyridine-HCO2H-eau (63/21/10/6) - Rf: 0,11 3 ) Boc-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala- Arg-Ala-Arg-Leu-;H2, HCl On dissout sous agitation magnétique 10,9 g (8,1 x 103 mole) du précédent produit (Exemple XI, 2 ) dans 120 ml de DMF. Le pli est amené à 7 par addition de NEM. On ajoute 6,49 g de Boc- Glu(OBzl)-Ser-Asn-OH et 4,35 g de BOP (20 % d'excès) sous agitation et à la température ambiante. Le pH est maintenu à 7 par addition de NEM. La réaction est terminée au bout de 3 h. On concentre sous vide à 35 C et le résidu est précipite par l'acétate d'éthyle. Le solide formé est essoré et lavé 3 fois à l'acétate d'éthyle (3 x ml), 3 fois à l'acétonitrile (3 x 100 ml), à l'éther et séché jusqu'à poids constant. On obtient 12,6 g (90 %) d'un solide blanc. Contrôles HPLC CCM: butanol- pyridine- AcOH-eau (60/12/12/25) - Rf: 0,49 - AcOEt- pyridine- H-CO2H -eau (63/21/10/60) - Rf: 0,40 - AAA: Glu(Gln): 3,2 - Ser: 0,92 - Arg: 2,93 - Leu: 0,98 - Asp(Asn): 0,98 - Gly: 0,96 - Ala: 2,00 - 40) H-Glu(OBzi)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg- Ala-Arg-Leu-NH2, TFA, HCl On met en suspension sous agitation magnétique, dans ml de chlorure de méthylène refroidis extérieurement par un bain de glace, 12,4 g du précédent peptide (Exemple XI, 3 ). On introduit 50 ml de TFA préalablement refroidi à 0 C. Le produit se dissout et on maintient l'agitation 30 min à T.A. On ajoute alors 500 ml d'éther. Un solide blanc précipite. Il est essoré, lavé quatre fois avec 100 ml d'éther et séché sous vide jusqu'à poids constant. On obtient ainsi 12,5 g (Rendement quantitatif) d'un produit blanc. CCM: butanol-pyridine-AcOh-eau (4/2/1/2/) - Rf: 0,08 - ) Boc-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln- Glu(OBzl)-Arg-Gly-AlaArg-Ala-Arg-Leu-NH2, HC -3 2 On dissout 1,74 g (10 mole) du précédent produit (Exemple XI, 4 ) dans 100 ml de DMF. On amène le pH à 7 par de la NEM. On porte le milieu sous agitation magnétique à 35 C et on ajoute 0,48 g de BOP et 0,783 g de BocSer-Arg-Gln-Glu-Gly-OH -3 (103 mole + 10 %) par petites portions pendant 1/2 h. On rajoute ensuite 0,9 g de BOP en maintenant la température à 35 C et le pH à 6,5 par addition de NEM. L'état d'avancement de la réaction est suivi par HPLC. La réaction est terminée en 1 h et le milieu est versé dans 200 ml d'acétate d'éthyle et laissé une nuit au repos. Un solide s'organise. Il est essoré, lavé à l'acétate d'éthyle (3 x 50 ml) , à l'éther et séché jusqu'à poids constant. Le rendement est de 2 g en un produit pulvérulent blanc. CCM: Butanol-pyridine-AcOH-eau (4/2/1/2) - Rf: 0,44 AAA: Ser: 1,91 - Arg: 3,88 - Glu(Gln): 4,82 - Gly: 2,01 - Asp(Asn): 0,91 - Ala: 2,00 - Leu: 0,98 - 6 ) H-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln- Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, TFA, HCl 25 g du peptide décrit dans l'exemple XI, 5 , sont mis en suspension dans 100 ml de chlorure de méthylène refroidis à 0oC. On ajoute 50 ml de TFA à 0 C et,après la fin de la dissolution, on conserve le milieu à la température ambiante 30 min. On ajoute alors 500 ml d'éther. Un solide blanc précipite. Il est essoré; lavé 4 fois avec 200 ml d'éther et séché sous vide jusqu'à poids constant. On obtient 25 g (rendement quantitatif) d'un solide pulvérulent blanc. CCM: Butanol-pyridine-AcOH-eau (4/2/1/2) - Rf: 0,05 ) Boc-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly- Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, HCl a) Boc-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-NH-NH2 13,64 g de Boc-Leu-Gln-Asp(OBzl)-IleMet-NH-NH2 (0,0166 mole) sont dissous dans 100 ml de DMSO anhydre et 200 ml de DME anhydre. La solution est refroidie entre -15 et -20 C sous agi- tation et sous atmosphère inerte (azote). On ajoute 8 ml d'une solu- tion 8,25 N de HCl dans le dioxanne et immédiatement après 2,5 ml de nitrite de t.-butyle (soit 1,2 équivalent). La solution obtenue est agitée sous atmosphère inerte (N2) 50 min entre -15 et -20 C. Le pH du milieu est amené à 6,3 - 6,6 par addition de DIPEA. 1/4 de la solution obtenue est prélevé et conservé au congélateur à -25 C. Le reste est engagé dans la phase suivante. b) Couplage de l'azide ,06 g de peptide obtenu dans l'exemple XI, 6 (8, 28 x I-310 mole) sont dissous dans 70 ml de DbiMSO, on ajoute ensuite 100 ml de DES. Le milieu est refroidi à -10 C et le pH est amené à 6,8 par addition de DIPEA. Cette solution refroidie est coulée ensuite en min dans les 3/4 de la précédente solution d'azide obtenue dans l'exemple XI, 6 (a), en maintenant la température entre -20 et -15 C. Le pH est ajusté à 7 par addition de DIPEA. Le milieu est conservé 12 h à -15 C pendant 24 h. Après cet intervalle de temps, le pH qui était tombé à 6 est ramené à 7 par la DIPEA et on rajoute le reste de la solution d'azide (le 1/4 qui avait été conservé). Le pH est ramené à 7 par addition de DIPEA. Après 24 h de conservation supplémentaire à cette température (-20 -15 C) le milieu est versé sur 2 1 d'acétate déthyle refroidi et sous agitation. L'agitation est poursuivie 30 min et le solide formé essoré est lavé par 5 fois 300 ml d'acétate d'éthyle et 3 fois 300 ml d'éther et séché une nuit au dessiccateur sous vide jusqu'à poids constant. On obtient ainsi un produit pulvérulent blanc pesant 22,08 g (Rendement: 87,16 %). CCM: BPEW1 - Rf: 0,5 AAA: Leu: 1,98 - Glu(Gln): 5,92 - Asp(Asn): 1,98 - Ile: 0,92 - Met: 0,89 - Ser: 1,86 - Arg: 3,92 - Gly: 2,02 - Ala: 2,02 - 8 ) H-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg-Glu-Gln-Gly- Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, TFA, IIHC1 On met en suspension 10,25 g du peptide obtenu dans l'exemple précédent (XI, 7 ) dans 80 ml de chlorure de méthylène con- tenant 4 ml d'éthane dithiol. La suspension est agitée à température ambiante sous courant d'azote. On ajoute 80 ml de TFA. On obtient une solution bien homogène qui est conservée 40min. Le milieu est concentré au 1/3 de son volume initial sous vide à 25 C et coulé dans 400 ml d'éther refroidi à 0 C sous agitation. On obtient un précipité qui est essoré et lavé 3 fois avec 100 ml d'éther et séché sous vide jusqu'à poids constant. On obtient 9,89g(96,1 %) d'un produit pulvérulent blanc. CCM: BPEW1 - Rf: 0,5 9 ) Boc-Arg(MTS)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met- Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Cln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg- Ala-Arg-Leu,NH2, HCl a) Boc-Arg(MTS)-Lys(Z)-Leu-N3 4,8 g de Boc-Arg(MTS)Lys(Z)-Leu-NH-NH2 (5,6 x 10 mole) sont dissous dans 100 ml de DMP. La solution obtenue est portée entre -15 et -20 C sous agitation. On ajoute alors 2,9 ml d'une solution 7,75 N d'HCl dans le dioxanne, ettout de suite après 0,85 ml de nitrite de t-butyle. Le milieu est agité 40 min entre -15 et -20 C sous atmos- * phère d'azote. On neutralise à pH 6,5-6,9 par la DIPEA. On prélève ml de cette solution (0,2 équivalent) que l'on conserve à -20 C sous azote. Le reste est engagé dans l'étape suivante. b) Couplage de l'azide 9,83 g du peptide obtenu dans l'exemple XI, 8 , sont dissous dans 40 ml de DMSO anhydre. On ajoute ensuite 60 ml de DMF. La solution est refroidie à -10 C et le pH amené à 6,6 par addition de DIPEA. Cette solution est ensuite coulée en 15 minde la précédente solution d'azide du tripeptide tout en maintenant la température entre -15 et -200C. Apres fin de l'addition, le pH est amené à 7 par addi- tion de DIPEA et conservé 24 h entre -15 et -20 C. Apres cet inter- valle de temps, on rajoute le reste de la solution d'azide sur (15 ml) et le pH est ramené à 7 par addition de DIPEA et on conserve 24 h de plus entre -15 et -20 C. Le milieu est ensuite versé sur 500 ml d'acé- tate d'éthyle refroidi et bien agité. Un solide blanc s'organise len- tement. Il est essoré et lavé 3 fois avec 150 ml d'acétate d'éthyle, puis à l'éther (150 ml x2) et séché sous vide jusqu'à poids constant. On obtient ainsi 9,65 g (80,4 %) d'une poudre blanche. CCM: BPEW1 - Rf: 0,54 AAA: Leu: 2,96 - Glu(Gln): 5,86: Asp(Asn): 1,96 - Ile: 0,90 - Met: 0,91 - Ser: 1,86 - Arg: 4,86 - Gly: 2,06 - Lys- 0,93 - Ala: 2,00 - ) H-Arg(MTS)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser- Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala- Arg-Leu-NH2 TFA, HC1 8 & du produit précédent (Exemple XI, 9 ) sont mis en suspension dans 50 ml de chlorure de méthylène froid. On ajoute sous agitation 7 ml d'éthane dithiol et,.en dernier, 70 ml de TFA. Le milieu est conservé 40min à T.A., concentré sous vide de moitié et versé sur 500 ml d'éther. Le précipité obtenu est essoré, lavé 3 fois avec 200 ml d'éther et séché sous vide jusqu'à poids constant. Il est utilisé tel quel pour le couplage suivant. Exemple XII: Synthèse de: Boc-Ile-Phe-Asn-Thr-Ser-Tyr-Arg-Lys(Z)- Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-OH, HCI (peptide J) 1 ) H-Gln-Leu-Ser-Ala-OCH3, TFA ,3 g (18,8 mM) de Boc-Gln-Leu-Ser-Ala-OCH3 sont agités 35min dans 100 ml de dichlorométhane contenant 100 ml de TFA. Le milieu réactionnel est concentré sous vide à environ 50 ml et versé sur 300 ml d'éther. Le précipité obtenu est essoré et lavé avec 3 fois ml d'éther. Il est ensuite séché sous vide jusqu'à poids constant. Le rendement est quantitatif (10,4 g) et le produit est utilisé tel quel dans le couplage suivant. 2 ) Boc-Tyr-Arg(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-OCH3, HCi Au sel de TFA obtenu ci-dessus, dissous dans 200 ml de diméthylformamide et neutralisé par de la N-éthylmorpholine, on ajoute 18,9 g (18,8 mM) de Boc-Tyr-ArgLys(Z)-Val-Leu-Gly-OH, HC1 puis 9,2 g de BOP (21 mM) puis de la NEM pour amener le pH du milieu réactionnel vers 6. Apres 4 h d'agitation, le milieu réactionnel est versé sur un litre d'AcOEt. Le précipité obtenu est filtré, lavé 3 fois par ml d'AcOEt, puis 3 fois par 100 ml d'EO2.0 puis il est séché sous vide. On obtient 24,16 g de produit. RENDEMENT: 90 % CCM rf: 0,20 (BEW1) - alpha D: - 17,6 - (Cc: I - DMF à 5 % d'AcOH) Produit identifié par 1H RMN et AAA: Ser: 1,01 - Glu:0,99 Gly: 1,06 -Ala: 1,01 - Val: 0,98 - Leu: 1,97 - Tyr: 1,00 - Lys: 0,98 - Arg: 0,99 - HPLC en phase reverse (EPP: 92 %) - 30) H-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Arg-OCH3, HCl, TFA 8,66 g (6, 1 mM) du produit ci-dessus sont agités 35 min dans 37 ml de dichlorométhane plus 3,5 ml d'anisole plus 40 ml de TFA. Après concentration sous vide de moitié, le résidu est versé sur 300 ml d'éther glacé; le précipité blanc obtenu est filtré, lavé à l'éther puis séché sous vide sur potasse. Poids: 8,68 g RENDEMENT: 100 %. 4 ) Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-N __3 5,94 g (8,55 mM) de Boc-Ile-Phe-Thr-AsnSer-NH-NH2 sont dissous dans 27 ml de DMSO plus 37 ml de DMF. Après refroidissement à -25 C, on ajoute 6,1 ml d'une solution HCl/dioxanne 5,6 N puis 1,23 ml de nitrite de tertiobutyle. (1,2 équivalent) prédilué dans ml de DMF prérefroidi à -20 C. Après lhl5mind'agitation entre -20 et 25 C on ajoute 6,1 ml de diisopropyléthylamine (DIPEA) pour amener le pH vers 6, puis on ajoute 3 ml de D>P pour amener le volume à ml et on conserve cette solution à -25 C. ) Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly- Gln-Leu-Ser-AlaOCH3, HCl Le sel de TFA obtenu à l'exemple XI, 3 est dissous dans ml de DMF et neutralisé par de la DIPEA puis ajouté en 15 min à ml de la solution d'azide obtenue ci-dessus à -20 C. Puis on ajoute de la DIPEA pour amener le pH vers 7, on agite une heure à -20 C, puis on conserve le milieu à -12 C. Après 22 h, on ajoute 5 ml de la solution d'azide et remonte le pH vers 7 par DIPEA. Après 45 h, on rajoute le restant de la solution d'azide et remonte le pH vers 7 par DIPEA. Apres 74 h, le milieu réactionnel est versé sur 1200 ml d'acétate d'éthyle. Le précipité blanc obtenu est filtré, lavé à l'acétate d'éthyle puis à l'éther, puis séché sous vide. Poids: 10,46 g - RENDEMENT: 86 % - Par concentration des eaux-mères et reprécipitation par un mélange acetate d'éthyle-éther, on obtient un deuxième jet qui permet d'avoir un rendement global de 95 %. Le produit de couplage est identifié par H RMN et AAA: Asp: 1,02 - Thr: 1,03 - Ser: 1,91- Glu: 0,97 - Gly: 1,06 - Ala: 1,06 - Val: 1,00 - Ile: 0,94 - Leu: 1,98 - Tyr: 1,04 - Phe: 1,02 - Lys: 0,94 - Arg: 1,02 - CCM Rf: 0,20 (BEW1) - HPLC en phase reverse (EPP: 90 %) - 6 ) Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly Gln-Leu-Ser-Ala-OH, HCl 5,3 g (2,7 rmM) du produit obtenu ci-dessus sont dissous dans 40 ml de DMSO plus 6 ml d'eau; on ajoute goutte à goutte 10 ml de soude IN, on agite 30 min puis neutralise par 10 ml d'acide chlo- rhydrique IN. Le milieu réactionnel est versé sur un litre d'acétate d'éthyle. Le précipité obtenu est filtré, lavé 4 fois à l'acétate d'éthyle puis 2 fois à l'eau, puis 4 fois à l'éther, puis il est séché sous vide sur P205. Poids: 4,56 g RENDEMENT: 86 % Produit identifié par H RMN et AAA - CCM: Rf: 0,5 BEW1 - Exemple XIII: Synthèse de Z-Tyr-Ala-Asp(OBz)-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser- Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg(MTS)-Lys(Z)-Leu-Leu- Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln- Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2,HCl (GRF 1-44 protégé) 1 ) Boc-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly- Gln-Leu-Ser-Ala-Arg(MTS)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser- Arg-Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala- Arg-Leu-NH2, HC1 6,6 g du sel de TFA du penta ecosa peptide obtenu dans 3 l'exemple XI, 10 (1,9x10- mole) sont dissous dans 36 ml de DMSO. On ajoute 90 ml de DMF et le pH du milieu est ramené à 7 par addition de NEM. On ajoute ensuite 1,0 g de BOP, puis 3,8 g (1,9 x 103 mole) du pep- tide de l'exemple XII, 6 . Le ph du milieu est ramené à 6 par addi- tion de NEM. Après 20 h d'agitation à la T.A. et sous atmosphère inerte (N2), on rajoute 0,5 g de BOP. 12 h plus tard la réaction est terminée et le milieu réactionnel versé sur 600 ml d'acétate d'éthyle. Le précipité obtenu est filtré et lavé avec l'acétate d'éthyle (3 fois ml) et séché sous vide jusqu'à poids constant. Le rendement est de 9,5 g (90 %). Le produit est identifié par HPLC et AAA 2 ) H-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-TyrArg-Lys(Z)-Val-Leu-Gly-Gln Leu-Serl-Ala-Arg(MTS)-Lys(Z)-Leu-Leu-Gln-Asp(OBzl)-Ile-Met-Ser-Arg- Gln-Gln-Gly-Glu(OBzl)-Ser-Asn-Gln-Glu(OBzl)-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg- Leu-NH 2, HCl, TFA 9,1 g du produit ci-dessus sont agités35min dans 100 ml de TFA plus 5 ml d'éthane dithiol. Puis le milieu réactionnel est versé sur 500 ml d'éther glacé. Le précipité obtenu est filtré, lavé par Et20, puis séché sous vide sur potasse. RENDEMENT: 100 %. 3 ) GRF-1-44 protégé A 9,10 g du précédent sel de TFA (1,66 mM)en solution dans 50 ml de DMF et 50 ml de DMSO et neutralisé par la NEM, on ajoute 1,18 g du peptide décrit dans l'exempleX, 3 (1,78 mM) et 0,79 g de BOP (1,78 mM); le pH est maintenu vers 6 par de la NEM. Après 23 h à TA, le milieu réactionnel est versé sur 600 ml d'AcOEt. Le précipité formé est filtré, lavé à l'acétate d'éthyle, puis à l'éther et finalement séch& sous vide. RENDEMENT: 8,54 g (84 %) Contrôles RMN et CCM: AAA: Asp: 4,2 - Thr: 0,92 - Ser: 4,02 - Glu: 7,37 (pour 7) - Gly: 3,14 (pour 3) - Ala: 5,11 - Val:1,01 - Met: 0,61 - Ile: 1,84 - Leu: 4,98 - Tyr: 1,87 - Phe: 0,95 - Arg: 5,90 - Exemple XIV: Déprotection du GRF 1-44: 4,5 g du produit obtenu selon l'exemple XIII, 4 , sont agités une heure à 0 C dans 180 ml de TFA contenant 19,8 ml de TFMSA, 27 ml de thioanisole et Il ml de métacrésol. On ajoute ensuite 1 1 d'éther. Le précipité obtenu est filtre, lavé à l'éther puis séché une heure sous vide en présence de potasse. Le produit est redis- sous dans 200 ml d'eau et on ajoute de la résine échangeuse d'ions Amberlite IR 45 (sous forme acétate) afin de ramener le pH à 4,5. On agite le milieu 30min à TA. La résine est filtrée, lavée à l'eau et les filtrats concentrés à 50 ml puis lyophilisés. Rendement: 3,85g Contrôle par RMN de la disparition des groupements protecteurs Z et OBzl. CCM (BPEW1): tache majoritaire Rf 0,38 Pureté polypeptidique déterminée par HPLC: 65 %. Exemple XV:-Purification du GRF 1-44 Le peptide déprotégé obtenu dans l'exemple précédent (XIV) est soumis à une chromatographie sur gel de Séphadex G 50 (fine) en utilisant l'acide acétique à 30 % comme éluant. Les- frac- tions contenant le peptide attendu sont réunies, évaporées et lyophilisées. Le lyophilisat ainsi obtenu est purifié à son tour par une chromatographie sur un échangeur de cations du type CM-32 carboxyméthylcellulose (Whatman) en utilisant un gradient linéaire d'acétate d'ammonium compris entre 0,1 M (pH 4,5) et 0,4 M (pH 6,5). Par exemple pour 1 charge de 1 g de peptide à purifier, on utilisera une colonne à chromatographie ayant un volume de lit de 50 ml en- viron pour une hauteur de 20 cm. Les fractions contenant le peptide avec un degré de pureté >, à 80 % (HPLC) sont réunies et lyophili- sées jusqu'à poids constant (afin d'éliminer le tampoh CH3CO2NH4). Enfin, le précédent lyophilisat est soumis à une chromatographie de partition en utilisant comme support de la phase liquide sta- tionnaire, le Séphadex G 50 fine et à l'aide du système de solvants suivant: n-butanol/éthanol/pyridine/acide acétique 0,2N dans la proportion de 4/1/1/7 (en volumes). Les fractions de chromatographie sont contrô6lées par HPLC et celles dont le titre de pureté est >/ à 95 % sont réunies et lyophilisées. Le rendement en produit isolé est de 35 %. Le produit est finalement contr8ôlé par analyse des amino acides: Tyr: 1, 91 (2) Ser: 3,88 (4) Ala: 4,88 (5) Arg: 5,89 (6) Asn, Asp: 3,86 (4) Lys: 1,98 (2) Gln, Glu: 6,82 (7) Ile: 1,96 (2) Val: 1,01 (1) Met: 0,91 (1) Phe: 0,93 (1) Leu: 5,10 (5) Thr: 1,02 (1) Gly: 2,98 (3) REVENDICATIONS 1. Procédé de synthèse, en phase liquide et par fragments, des hGRF 1-44 et hGRF 1-40, caractérisé en ce qu'il consiste à coupler, l'un après l'autre et dans l'ordre de la séquence du GRF, I) d'une part, les fragments ci-après: H-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 dit Fragment A hGRF (40-44) ou l'alani- namide (40) H-Gln-Glu-Arg-Gly-OH dit Fragment B'1 hGRF (36-39) H-Glu-Ser-Asn-OH " " B'2 hGRF (33-35) H-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-OH " " C hGRF (28-32) H-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-OH " " D' hGRF (23-27) H-Arg-Lys-Leu- OH " " E'l hGRF (20-22) pour obtenir le peptide K1 [(hGRF (20-44)1 ou le peptide corres- pondant ayant la séquence (20-40) et - 2) d'autre part, les fragments ciaprès: H-Gln-Leu-Ser-Ala dit Fragment F1 hGRF (16-19) H-Tyr-Arg-Lys-ValLeu-Gly-OH " " G hGRF (10-15) H-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-OH " " H1 hGRF ( 5- 9) pour obtenir le peptide J [hGRF (5-19)] et à coupler ensuite ensemble les peptides J et Klpour former le peptide ayant la séquence hGRF (5-44) ou hGRF (5-40) et finalement à coupler le peptide ainsi obtenu avec le peptide H-Tyr-Ala-Asp-Ala-OH dit fragment I hGRF (1-4), ledit procédé étant caractérisé en outre en ce que, dans lesdits fragments ci-dessus: a) les fonctions acides latérales des acides aspartique et glutamique et la fonction amine latérale de la lysine sont protégées par des groupes protecteurs stables dans les conditions de déprotection du groupement Boc (tertiobutyloxycarbonyle); b) la fonction guanidine de l'arginine en position 20 est protégée par le groupement MTS (triméthyl-2,4,6 phénylsulfonyle) et la fonction guanidine des autres arginines est protégée par proto- nation; et c) l'acide aminé N-terminal est protégé sur l'amine par le groupement Boc, le groupement Boc de l'amine N-terminale du peptide en phase d'élongation étant éliminé sélectivement par hydrolyse à l'acide trifluoroacétique, ledit couplage étant effectué dans un solvant polaire aprotique et en fin de séquence tous les groupes protec- teurs sont éliminés par hydrolyse à l'aide d'une solution 0,1 à I M d'acide méthanesulfonique ou trifluorométhanesulfonique dans l'acide trifluoroacétique. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'après chaque couplage le produit obtenu est isolé du milieu réac- tionnel par précipitation à l'aide d'un tiers solvant insolubilisant. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit brut de réaction est purifié par la distribution à con- tre-courant et la chromatographie de perméation sur gel. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 3, caractérisé en ce que le couplage est réalisé à l'aide de l'hexa- fluorophosphate de benzotriazolyloxyphosphonium (BOP) ou la dicyclo- hexyl-carbodiimide en présence d'hydroxy-1 benzotriazole (agent de couplage) ou par activation aux carboxyazides, dans un solvant appro- prié, tel que le diméthylformamide ou le diméthylsulfoxyde. 5. A titre de produits nouveaux, les peptides intermé- diaires ou fragments peptidiques mis en oeuvre dans le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 6. Peptides intermédiaires selon la revendication 5, caractérisés en ce qu'ils sont l'un des peptides ci-après: Boc - Gln - Glu(O Bzl) - Arg - Gly - OH X -Gln- Glu - Arg - Gly - OH Boc - Glu - (O Bzl) - Ser - Asn - OH 25.X - Glu - Ser -Asn - OH Boc - Leu - Gln - Asp (O Bzl) - Ile - Met - OH X - Leu - Gln - Asp - Ile - Met - OH Boc - Arg (MTS) - Lys (Z) - Leu - O CH3 X - Arg (MTS) - Lys (Z) - Leu - NH - NH2 30.X -Gln - Glu (O Bzl) - Arg - Gly - Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2 X - Glu (O Bzl) - Ser - Asn - Gln - Glu (O Bzl) - Arg - Gly - Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2 X - Ser - Arg - Gln - Gln - Gly - Glu (0 Bzl) - Ser - Asn - Gln - Glu (O Bzl) - Arg - Gly - Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2 X - Leu - Gln - Asp (O Bzl) - Ile - Met - Ser - Arg -Gln - Gln - Gly - Glu (O Bzl) - Ser - Asn -Gln - Glu (O Bzl) -Arg - Gly - Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2 X - Arg (MTS) - Lys (Z) - Leu - Leu - Gln - Asp (0 Bzl) - Ile - Met - Ser - Arg - Gln - Gln - Gly - Glu (0 Bzl) - Set - Asn - Gln - Glu (O Bzl) - Arg - Gly - Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2 5.X - Ile - Phe - Thr - Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys (Z) - Val - Leu - Gly - Gln - Leu - Ser - Ala - Arg (MTS) - Lys (Z) - Leu - Leu - Gln - Asp (0 Bzl) - Ile - Met - Ser - Arg - Gln - Gln - Gly - Glu (0 Bzl) - Ser - Asn - Gln - Glu (0 Bzl) - Arg - Gly - Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2 dans lesquellesXreprésente H ou Boc. 7. A-titre de produit nouveau, lehGRF protégé répondant à la formule: Y - Tyr - Ala - Asp (0 Bzl) - Ala - Ile - Phe - Thr - Asn - Ser - Tyr - Arg - Lys (Z) - Val - Leu - Gly - Gin - Leu - Set - Ala - Arg (MTS) - Lys (Z) - Leu - Leu - Gin - Asp (0 Bzl) - Ile - Met - Ser - Arg - Gln - Gln - Gly - Gly (0 Bzl) - Ser - Asn - Gin - Glu (0 Bzl) - Arg - Gly - Ala - Arg - Ala - Arg - Leu - NH2, dans laquelle Y représente H, Z ou Boc. -