FR 2567540 A1 19860117 FR 8510816 A 19850715 1 c 25675540 La présente invention concerne l'industrie microbio- logique, et plus précisément, l'obtention d'un interféron leucocytaire humain alpha-2, doué d'une activité anti- -virale et trouvant des applications en médecine pour la prévention et le traitement d'un certain nombre de mala- dies courantes d'étiologie virale. Les interférons sont des protéines synthétisées par certaines cellules de l'organisme humain en cas d'infec- tion virale. Suivant le type de cellule productrice et les particularités structurales et fonctionnelles des interférons, ces protéines sont divisées en trois groupes principaux: alpha ou leucocytaire (produit par les leu- cocytes) bêta ou fibroblastique (produit par les fibro- blastes) et gamma ou immunitaire (produit par les lympho- cytes T). Outre l'activité anti-virale, les interférons présen- tent également une activité anti-proliférative et influent sur les réactions immunitaires. C'est ce qui permet de considérer les produits médicamenteux à base d'interféron comme pouvant être efficaces contre certaines Décforma- tions malignes. On a obtenu ces derniers temps des inter- férons humains à haut degré de pureté, qui sont une fa- mille de 13 à 15 protéines apparentées, dont chacune est codée par son propre gène dans le chromosome 9. Toutefois, l'extraction de l'interféron leucocytaire dans le sang des donneurs ne peut assurer sa fabrication en quantités suffisantes pour son utilisation massive en clinique, car le taux d'interféron ne dépasse pas, en règle générale, unités par litre de sang, alors que sa dose unique efficace qu'on injecte par voie intraveineuse doit constituer d'après les données cliniques disponibles, au moins 106 unités de l'activité. On connait déjà différents procédés de préparation d'interférons leucocytaires humains, reposant sur l'uti- lisation de diverses souches productrices, dans lesquelles on incorpore, a l'aide de molécules vecteurs, des gènes individuels de l'interfér n humain. On utilise notamment - 2 - 2567540 comme souches productrices celles des bactéries Escheri- chia coli, Bacillus subtilis, Methylophilus methylotrophus, etc. (brevet européen EP n O 062 971 A2, publié en 1982, Cl. C 12N 15/00. Les micro-organismes contenant un plasmide avec un gène incorporé d'interféron leucocytaire humain produisent de l'interféron en les faisant incuber dans les conditions d'une culture immergée en aérobie, en contact des milieux nutritifs aqueux contenant des sources assimilables de car- bone et d'azote, des sels minéraux et des agents de crois- sance. On connaît un procédé d'obtention d'un interféron leucocytaire humain alpha-2 (brevet de la Grande-Bretagne n 20792191A, publié en 1982, C 12N 15/00 souche-294, ob- tenue par incorporation d'un plasmide recombinant pLe IFA trp 2,5, dans lequel le gène d'interféron alpha-3 est placé sous le contrôle des régions régulatrices de l'opéron try- ptophanique de E.coli. On fait incuber la souche précitée dans les condi- tions d'une culture immergée, sur des milieux nutritifs aqueux contenant des sources de carbone et d'azote, des sels minéraux et des agents de croissance, en présence d'un antibiotique. Pour ladite souche productrice, le rendement en inter- féron atteint 2,5x108 unités de l'activité par litre de liqueur de culture. L'utilisation de E. coli comme souche productrice industrielle présente un certain nombre d'inconvénients. E. coli est un micro-organisme virtuellement pathogène et différentes souches de cette bactérie sont présentes en permanence dans la flore intestinale de l'homme. D'o les exigences particulièrement sévères imposées à la purifica- tion des produits obtenus à base de E.coli et la nécessité d'une séparation complète des protéines et endotoxines associées, ce qui rend beaucoup plus cher le procédé de fabrication de l'interféron et réduit le rendement en pro- duit pur. En outre, toutes les souches de E. coli connues dans la pratique des laboratoires sont sujettes A la pha- golyse; le nombre de phages spécifiques identifiée pour E.coli se chiffre à plusieurs centaines. Le procédé précité est caractérisé par une productivité relativement peu élevée de la culture, ce qui fait que l'isolement de l'interféron dans la biomasse cellulaire et sa purification ultérieure jusqu'à un état homogène sont des opérations laborieuses. On s'est proposé d'accroître le rendement en interfé- ton leucocytaire humain alpha-2 et de simplifier son iso- lement par la mise en oeuvre d'une nouvelle souche pro- ductrice. La solution consiste en ce que dans le procédé d'ob- tention de l'interféron leucocytaire humain.alpha-2 par culture immergée d'une souche productrice contenant un plasmide porteur de gène d'interféron leucocytaire humain alpha-2 sur un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azotes des sels mi- néraux et des agents de croissance, milieu soumis à une aération en présence d'un antibiotique, avec isolement et purification subséquents du produit visé on utilise, conformément, à l'invention, comme souche productrice la souche Pseudomonas species VG-84 porteuse d'un plas- mide pVG-3 souche déposée dans la collection de cultures- de micro-organismes de l'Institut pansoviétique de re- cherche scientifique des-antibiotiques sous le numéro 1742, et que la culture de la souche productrice est cons duite en présence de streptomycine ou de tétracycline ou d'un mélange de ces antibiotiques. La tétracycline est utilisée de préférence à raison de 30 à 50 mg par litre, et la streptomycine, de 50 à 150 mg par litho Le procédé revendiqtué pelmet, grce à la mise en oeuvre de la souche hautement productive Pseudomonas spe- cies VG-84, d'accroltre le rendement ean poduit visé et de simplifier le procédé d'isolement de celui-ci. Le pro- cédé en question met en oeuvre une nouveslle souche Pseudo- monas species VG-84, dans laquelle le gène d'intexféon leucocytaire humain alpha-2 est cloné dans la composition d'un plasmide polycopié pVG 3, et placé sous le contrôle - 4 - 2567540 des régions régulatrices du gène D du bactériophage X1 74. Le plasmide pVG 3 est un hybride moléculaire d'un plasmide vecteur polycopié pAYC34 ayant un large. spectre d'hôtes et d'un plasmide pIFN-d2P2 contenant un répli- con pBR 322 et un gène d'interféron alpha-2 et détermi- nant la résistance des cellules à la tétracycline et à l'am- picilline. Dans le plasmide pIFN-42-P2, le gène d'inter- féron alpha-2 est placé sous le contrôle des régions ré- gulatrices du gène D du bactériophage qX174. Le plasmide vecteur pAYC34, d'une taille de 9 400 paires de nucléo- tides, appartient au groupe d'incompatibilité Inc p-4/Q et détermine la résistance des cellules à la streptomycine. L'IADN desplasmidespAYC34 et pIFN-d2-P2 a été traitê-par de la restrictase Pst 1 et on a transformé-les cellules compétentes de la souche E.coli C600 par un mélange allié. On a sélectionné les transformants sur un milieu nutritif contenant tous les constituants nécessaires et des anti- biotiques: ampicilline (504g/ml), streptomycine (100kg/ml) et tétracycline (25 Ag/ml). Dans les clones-transformants on a mis en évidence l'ADN de plasmide nommé pVG 3, qui, par sa taille et sa carte de restriction, correspond à un hybride des plasmides pAYC34 et PIFN-c42-P2. Le plas- mide pVG3 détermine la résistance des cellules à la strép- tomycine, comme le fait le plasmide pAYC34, et à la té- tracycline et à l'ampicilline, comme le fait le plasmide pIFN-(2-P2. La taille du plasmide pVG3 - 14 800 paires de nucléotides - est égale à la somme de tailles des plas- mides pIPN-o2-P2 (5 400 paires de nucléotides) et pAYC34 (9 400 paires de nucléotides). Dans une souche E.coli C600 contenant un plasmide hybride pVG3 on a incorporé un plasmide de conjugaison R 751 ayant un large spectre d'hôtes. Dans une série de croisements de conjugaison, le plasmide pVG3 a été incorporé dans des bactéries du genre Pseudomonas et d'autres bactéries gram-négatives. Les bactéries trans- conjugantes ont été prélevées sur un milieu sélectionné spécial contenant les antibiotiques précités et on a vérifié leur aptitude à synthétiser l'interféron. - 5 - Les cultures obtenues par le procédé décrit ont été incubées pendant 6 à 10 h dans les conditions d'aérobiose à une température de 300C, sur L-bouillon, jusqu'à l'ob- tention d'un titre de 2 à 5x109 cellules/ml. Les bacté- ries ont été prélevées par centrifugation, détruites à 1' ultra-son et on a dosé l'interféron contenu dans les extraits cellulaires par la méthode radio-immunologique. On a ainsi testé 18 souches de bactéries gram-négatives des genres Escherichia, Salmonella, Pseudomonas, Methylo- monas, Erwinia et Phizobium. La plupart des souches tes- tees ont produit de l'interféron actif. La souche Pseudo- monas sp. VG-84 s'est montrée la plus productive. Dans les- conditions sus-indiquées, cette souche a produit x109 à 1x1010 unités d'interféron par litre de liqueur de culture. La présence dans la souche p.roductive d'un plasmid.à lar- ge spectre d'hôtes R751 détermine la synthèse des villosités specifiques de plasmide qui constituent au collage des cellu- les et à leur agrdgation rapide. La morphologie des cellules au cours de la fermentation et de la production d'interferon se modifie en donnant des cellules filifonnes. La souche Pseudomonas sp.VG-84 est déposée dans la collection de cultures de micro-organismes de l'Institut Pansoviétique de recherche scientifique des antibioti- ques sous le numéro 1742. Les caractéristiques culturales et morphologiques de la souche Pseudomonas sp. VG-84 por- teuse de plasmide pVG3 sont les suivantes: Aspect visuel au microscope Bâtonnets mobiles gram-néga- tifs longs de 3 à 5,/m Morphologie sur divers mi- lieux: Gélose aux peptones Au bout de 24 heures de crois- sance à une température de ' à 30 C, forme des colonies aux bords sinueux de 3 a 4mm de diamètre, à surface fu- gueuse, d'une couleur vert clair. Bouillon aux peptones Au point de l'impact, 67540 croissance est modérée, essen- tiellement sur la surface du milieu.Sans aération, la crois- sance est faible. Milieu minimal M9 au glucose Au deuxième jour de la crois- sance, forme des colonies rondes de 2 à 3 mm de dia- mètre, rugueuses, d'une cou- leur grise. Caractères physiologiques La croissance est observée et biochimiques aux températures comprises entre 25 et 35 C (l'optimum se situe à 30 C), pH =7,0. Le glucose et l'arabinose servent de sources de car- bone. Assimile parfaite- ment l'azote. Nécessite une addition d'adénine. Résiste A la streptcmycine et à la tétracyline. Fbore un oignent fluorescent. Le procédé revendiqué s'effectue de la manière sui- vante. On fait incuber la souche Pseudomonas sp. VG-84 pendant 8 à 12 heures et à une température de 28 à 3000 C sur un milieu gélosé, après quoi on réencemence sur un milieu nutritif aqueux et on cultive la semence pen- dant 3 à 6 heures à une température de 280 C sous une agitation et une aération poussées. La fermentation est opérée dans un fermenteur sur un milieu nutritif aqueux quelconque contenant des sources de carbone et d'azote assimilables, des sels minéraux et des agents de crois- sance, notamment un milieu nutritif contenant du glucose, un extrait ou un autolysat de levure, ou de la tryptone,. ou de la peptone, ou des hydrolysats de la caséine ou e levure, ou leur mélange. La fermentation est réali- sée en présence de streptomycine ou de tétracycline ou d'un mélange de ces antibiotiques. On utilise de préfé- rence la tétracycline à raison de 30 à 50 mg/litre, et la streptomycine, de 50 à 150 mg/litre. La fermentation s'effectue pendant 6 à 10 heures, à une température de 28 à 32 C et à pH de 6,7 à 7,1,sous une aération poussée. Lors de la fermentation, on mesure la densité optique -7 - A550 de la suspension bactérienne, dont la valeur atteint à 7 unités vers la fin de la fermentation. Pour leprocédé décrit, le rendement en interféron reprisente d'après les données d'analyse radio-imrunolo- gique ou de la détermination de l'activité anti-virale dans des cultures de fibroblastes humains, 5x109 à 1,5x10 unités par litre de liqueur de culture. A l'issue de la fermentation, et la densité optique indiquée étant atteinte, les cellules bactériennes sont prélevées par centrifugation, remises en suspension dans une solution tampon convenable et détruites à l'ultra-son ou par n'importe quelle autre méthode entraînant la des- truction des cellules ou la perturbation de la continuité des membranes cellulaires, telle que la traitement par du lysozyme, des billes de verre ou de métal, paz compres- sion, etc. Les fragments de cellules sont séparés par centrifugation et on isole dans le liquide surnageant, pré- sentant un extrait de cellules, l'interféron qu'il con- tient, par des méthodes connues de fractionnement et de purification des protéines. Le rendement en interféron homogène quant à ses caractéristiques physico-chimiques différentes va de 20 à 60%, le degré de purification étant compris entre 200 et 500 et l'activité spécifique du produit résultant de la purification étant de 4x108 unités de l'activité. L'opération de purification est contrôlée en déterminant l'activité anti-virale de l'in- terféron sur des cultures de fibroblastes humains infectés du virus de la stomatite vésiculaire et par analyse radio- -immunologique ou immuno-etzymatique. La pureté des préparations d'interféron est contrôlée par des méthodes immunologiques, électrophorétiques, de filtration sur gel et de sédimentation, ainsi qu'en identifiant les acides aminés qui le composent et en déterminant la séquence des acides aminés en bout N de la molécule. L'intetféron leucocytaire humain alpha-2 obtenu est homogène et présente tous les caractères structuraux et fonctionnels propres à ce type d'interféron. -8 - L'avantage du procédé revendiqué par rapport au pro- cédé connu consiste en ce que, grâce à la mise en oeuvre d'une souche hautement productive, on obtient une activi- té élevée au stade de fermentation, ce qui fait qu'une même quantité d'interféron peut être obtenue à partir d'un moindre volume de biomasse, d'o une réduction des frais pour l'isolement de la biomasse, de sa désintégration et de toutes les opérations subséquentes visant à obtenir un produit homogène. D'après les données d'une séquence automatique selon Edmann, l'interféron homogène isolé dans la biomasse de la souche productrice Pseudomonas sp. VG-84 présente une séquence des acides aminés en bout N Cys-Asp-Leu-Pro-Glu- -Thr-His-Sér-... et ne contient pas en bout N de résidu de méthionine, ce qui le fait, du point de vue structural, parfaitement identique à l'interféron alpha-2 produit par les leucocytes de l'homme.. Pour mieux faire comprendre la présente invention, on donne les exemples suivants d'exécution du procédé d'obten- tion de l'interféron leucocytaire humain alpha-2. Exemple 1 On fait croitre la souche Pseudomonas sp. VG-84 pen- dant 12 heures à 280C sur une gélose inclinée de la com- position suivante par litre: 10 g de tryptone, 5 g d'ex- trait de levure, 80 mg d'adénine, 10 g de glucose, 150 mg de streptomycine, 50 mg de tétracycline, 15 g de gélose, le reste étant de l'eau distillée (jusqu'à un litre). La biomasse obtenue sur le milieu incliné sert de matériel de semence. On la transvase dans des flacons Erlenmeyer de 750 ml contenant 100 ml du milieu indiqué (sans gélose) et on cultive pendant 6 heures sur une secoueuse rotative sous une agitation poussée (240 tr/mn) et à une tempéra- ture de 2800 C. La densité optique de la culture d'ensemencement est de 2 unités. La culture s'effectue dans un fermenteur doté de sys- tèmes de régulation de la-température, du pH, de la vitesse d'agitation et de l'aération, d'un capteur pour mesurer -9 - la pression partielle de l'oxygène dissous. A cet effet, on introduit la semence, à raison de 5%, dans le fermenteur contenant un milieu nutritif aqueux de la composition sus- -indiquée (sans gélose) et on fait incuber pendant 6 heures à une température de 28+0,5 C et à un pH de 6,7 à 6,9 sous une aération et une agitation poussées. Le régime d'aération et d'agitation est choisi de fa- çon que la croissance de la culture ne soit pas limitée par la concentration d'oxygène dissous. A cette fin, la pression partielle de l'oxygène est maintenue à un niveau de 5 à 10% de la saturation. Pour la stabilisation du pH, on utilise de l'eau ammoniacale. La propagation de la biomasse est contrôlée enme- surant toute une heure la densité optique de la liqueur de culture. On arrête la fermentation lorsque la densité optique A550 atteint 5 unités. A l'issue de la fermentation, la concentration d'in- terféron leucocytaire humain alpha-2 constitue 1,5x101 unités de l'activité par litre de liqueur de culture. Pour déterminer la concentration de l'interféron obtenu, on fait appel à une modification de phase solide dé l'ana- lyse radio-immunologique avec utilisation d'anticorps po- lyclonaux anti-interféron du lapin et d'anticorps mono- clonaux de la souris, marqués à l'iode-125, et on déter- mine aussi l'activité anti-virale de l'interféron d'après l'effet protecteur qu'il exerce contre l'action cytopathi- que du virus de la stomatite vésiculaire dans les cultures de fibroblastes humains diploïdes. Comme produit de ré- férence, on utilise de l'interféron normalisé MRC B69/19 (Grande-Bretagne). Les cellules récoltées par centrifugation à l'issue de la fermentation sont utilisées comme source d'inter- féron. Les cellules sont mises en suspension dans une so- lution tampon tris 0,1 M à un pH = 7,5, à raison de 1 g de cellules par 5 à 10 ml de solution tampon puis on brise les cellules dans un désintégrateur ultrasonique. Les fragments des cellules sont séparés par centrifugation à - 10 - 000 g et on isole dans le liquide surnageant (extrait cellulaire) l'interféron leucocytaire humain alpha-2. On obtient par purification un interféron leucocy- taire humain alpha-2 électrophorétiquement homogène, le degré de purification étant de 210 et le rendement, en calculant en activité, de 41%. Le produit final a une ac- tivité unitaire de 4,0x108 unités. Les résultats de l'a- nalyse électrophorétique de l'interféron leucocytaire hu- main alpha-2 sont présentés sur le dessin, o a A est l'interféron avant la purification, B, l'interféron après la purification, la masse moléculaire des protéines stan- dards en kD figurant à droite (ltélectrophorèse est effec- tuée dans un gel de polyacrylamide à 12,5% en présence de dodécylsulfate de sodium). En ce qui concerne l'activité spécifique, la masse moléculaire (18,4 kD), la composi- tion en acides aminés et d'autres indices, l'interféron leucocytaire humain alpha-2 ainsi isolé ne diffère pas de l'interféron leucocytaire humain alpha-2 extrait d'au- tres souches bactériennes productrices. Exemple 2 Le procédé est réalisé comme dans l'exemple 1. La culture est effectuée en présence de streptomycine (50 mg/litre) et de tétracycline (30 mg/litre). Au bout de 6 heures de fermentation, la densité optique de la suspension bactérienne est égale à 4,2 unités et la teneur en interféron leucocytaire humain alpha-2 represente 7,5x109 unités par litre de liqueur de culture. Exemple 3 Le procédé est réalisé comme dans l'exemple 1. La culture est effectuée en présence de tétracycline (-50 mg/litre). Au bout de 5,5, heures de fermentation, la densité optique de la suspension bactérienne est égale à 5,5, uni- tés et la teneur en interféron d'un litre de liqueur de culture représente 9,5x109 unités. - I1 - REVENDICATIONS 1 Procédé d'obtention d'un interféron leucocytaire humain alpha-2 par culture immergée d'une souche pro- ductrice contenant un plasmide avec un gène incorporé d'in- terféron leucocytaire humain alpha-2, sur un milieu nu- tritif contenant des sources assimilables de carbone et d'azote, des sels minéraux et des agents de-croissance, milieu soumis à l'aération et en présence d'un atiibio- tique, avec isolement et purification subséquents du produit visé, procédé c a r a c t é r i s é en ce qu'à titre de souche productrice on utilise la souche Pseudo- moonas species VG-84 porteuse d'un plasmide pVG 3, déposée dans la collection de cultures de micro-organismes de l'In- stitut pansovLétique de recherche scientifique des anti- biotiques sous le numéro 1742, et que la culture est réa- lisée en présence de streptomycine ou de tétracyclúne ou de leur mélange. 2 Procédé selon la revendication 10, c a r a c- t é r i s é en ce qu'on utilise de la tétracycline à raison de 30 à 50 mg par litre et de la streptomycine à raison de 50 à 150 mg par litre.