FR 2571739 A1 19860418 FR 8515104 A 19851011 257 1739 La présente invention concerne un procédé pour la produc- tion de gomme xanthane,et plus particulièrement un procédé pour la production de gomme xanthane par culture de microorganismesdans un milieu de culture spécifique. Les polysaccharides visqueux solubles dans l'eau,ou gommes,comprennent la gomme arabique, la gomme xanthane, la gomme guar et la gomme adragante. Ces gommes sont largement utilisées dans diverses industries comprenant les industries alimentaires, les peintures, la fabrication du papier et du pétrole et la demande de ces gommes augmente. Parmi ces gommes, la gomme xanthane obtenue par fermentation microbiologique a d'excellents effets d'augmentation de la viscosité, d'émulsification/stabilisation, de dispersion des particules/cellules et de stabilisation aux variations de températures, auxselset au pH. Au vu de ces propriétés, les domaines d'applications industriellesdela gomme xanthane comme additif efficace augmente. La gomme xanthane est produite de manière classique par culture aérobie d'un microorganisme du genre Xanthomonas, par exemple Xanthomonas campestris, X. carotae ou X. phaseoli,dans un milieu de culture consistant en une source de carbone (par exemple glucose, saccharose, mélasse ou amidon), peptone, azote, magnésium et autres oligo-éléments. Apres la culture, le milieu de culture est stérilisé et on fait précipiter la gomme xanthane par addition d'un alcool (par exemple éthanol ou isopropanol). On sèche le précipité. Des exemples spécifiques de microorganismes utilisés dans la production de la gomme xanthane comprennent X. campestris "NRRL B-1459" (description de brevet japonais n 58-165798) et "ATCC 13951" (description de brevet japonais n 58-146290). Cependant,la gomme xanthane obtenue par culture de microorganismes classiques du genre Xanthomonas utilisant des mlilieux de culture classiques est fortement colorée et doit être blanchie avant l'application industrielle. Le procédé de blanchiment rend plus complexe le procédé de culture. En outre, ce procédé de blanchiment doit être énergique, compliquant ainsi le procédé de culture et augmentant son coût. 257 1739 La présente invention a donc pour objet de proposer un procédé de production de gomme xanthane de faible couleur (Gardner) utilisant un microorganisme du genre Xanthomonas. Selon la présente invention, on propose un procédé de production de gomme xanthane consistant: - à cultiver un microorganisme producteur de gomme xanthane du genre Xanthomonas en conditions aérobies dans un milieu de culture aqueux comprenant une source de carbone assimilable et au moins un additif choisi parmi l'acide pantothénique, la thiamine et leurs dérivés (comprenant les sels et esters), de manière à produire la gomme xanthane; et à récupérer la gomme xanthane. Selon Le procédé de la présente-invention, on peut produire une gomme xanthane de couleur très claire, c'est-à-dire de faible chrominance. L'étape de blanchiment qui est nécessaire de manière classique peut.être soit supprimée, soit remplacée par un procédé de blanchiment Léger, donnant ainsi une technique avantageuse. L'invention sera mieux comprise à la Lecture de la description qui va suivre, en référence aux dessins annexés dans lesquels: la figure I représente le spectre infrarouge d'un produit de fermentation obtenu par le procédé de t'invention; et la figure 2 représente le spectre infrarouge d'une gomme xanthane du commerce. A la suite de recherches poussées sur la production de gomme xanthane de faible chrominance utilisant un microorganisme du genre Xanthomonas, la demanderesse a découvert que cet objet peut être atteint par addition d'acide panthothénique, de thiamine et/ou de leurs dérivés à un milieu de culture contenant une source de carbone assimilable et culture du microorganisme choisi en utilisant le milieu de culture. Des exemples de microorganismes producteurs de gomme xanthane du genre Xanthomonas comprennent X. campestris, X. carotae, X. phaseoli, X. begoniae et X. incanae. Parmi ces microorganismes, on préfère X. campestris, "NRRL B-1459", "ATCC 13951" et "IFO 13551". 7 1739 La souche "IFO 13551" a été déposée le 31 mai 1973 à la collection publique de culturede l'Institut de Fermentation d'Osaka au Japon. La demanderesse a découvert pour la première fois que X. campestris "IFO 13551" produit la gomme xanthane. Le milieu aqueux de culture utilisé pour la fermentation par un microorganisme du genre Xanthomonas selon la présente invention contient une source de carbone et un ou des additifs prédéterminés. Le milieu de culture contient de préférence une source d'azote, un phosphate, un sel de magnésium et d'autres oligo-éléments qui sont contenus de manière classique dans les milieuxde culture. On peut utiliser une source de carbone classique connue. Des exemples de ces sources de carbone comprennent les sucres (par exemple glucose, saccharose, xylose, mélasse, amidon, maltose ou dextrine) et/ou les polyalcools (par exemple glycérol, mannitol ou sorbitol). On peut utiliser une ou plusieurs de ces sources de carbone. La source de carbone est contenue dans le milieu de culture en quantité de I à 5 % en poidset de préférence de 2 à 4 % en poids. La source d'azote peut être une source d'azote connue, par exemple nitrate d'ammonium, nitrate de sodium, urée, glutamate de sodium, alanine, peptone, extrait de levure et extrait de malt. On peut utiliser une ou plusieurs de ces sources d'azote. La source d'azote est contenue dans le milieu de culture en quantité de 0,01 à 5 % en poids, de préférence deO,1 à 1 % en poids. Des exemples de phosphate comprennent Le phosphate monopotassique, le phosphate dipotassique, le phosphate monosodique et le phosphate disodique. Le phosphate est contenu dans le milieu de culture en quantité de 0,01 à 5 % en poids, de préférence de 0,1 à 1 % en poids. Des exemples de sels de magnésium comprennent le phosphate de magnésium, le nitrate de magnésium et le sulfate de magnésium. Le sel de magnésium est contenu dans le milieu de culture en quantité de 0,01 à 1 % en poids et de préférence de 0,01 à 0,5 % en poids. Les composés d'oligo-éléments peuvent être un ou plusieurs choisis parmi le chlorure ferreux, le chlorure ferrique, le nitrate ferreux, Le nitrate ferrique, le phosphate ferreux, le phosphate ferrique, le sulfate de zinc, le chtorure de zinc, le nitrate de zinc et Le phosphate de zinc. La teneur en composants d'oligo- éLéments dans le milieu de culture est avantageusement de 0,01 à 0,01 % en poids, de préférence de 0,001 à 0,005 % en poids. Le composant caractéristique de la présente invention, c'est-à-dire L'acide pantothénique, La thiamine et/ou leurs sels esters ou dérivés,peut être contenu dans le milieu de culture en quantité de 0,0001 à 0,1 % en poids, de préférence de 0,001!à 0,05 X. Lorsque la teneur de ce composant est inférieure à 0,0001 %, on ne peut pas obtenir d'effet de L'addition sur la viscosité, la concentration de gomme xanthane et la couleur Gardner de La solution de fermentation (voir tableau 2 ci-après). Lorsque la teneur de ce composant dépasse 0,1 %, la couleur de la solution de fermentation n'est pas très améliorée et La viscosité est Légèrement abaissée. Des exemples d'acide pantothénique et de ces dérivés comprennent L'acide pantothénique, le pantothénate de sodium, le pantothénatede potassium, le pantothénate de calcium, le panto- thénate de méthyle, Le pantothénate d'éthyle, le pantothénate de butyLe et l'amide pantothénique. Des exemptes de thiamine et de ses dérivés comprennent la thiamine, Le chlorhydrate de thiamine, Le monophosphate de thiamine, le diphosphate de thiamine et Le disulfure de thiamine. Le composant restant du milieu aqueux de culture est de l'eau. Après avoir ajusté le milieu de culture de composition ci-dessus à un pH de 7 - 7,2, on inocute dans Le milieu de culture un microorganisme choisi parmi ceux énumérés ci-dessus. On effectue La culture à 25-30 C sous courant d'air et avec agitation pendant 75 à 100 h. Après la culture, on effectue la stérilisation à 121 C et 1 bar pendant 10 à 15 min. Ensuite, on ajoute du chlorure de potassium et de l'éthanol ou de l'alcool isopropylique pour précipiter La gomme xanthane. On sèche le précipité et on le réduit en poudre pour obtenir une gomme xanthane en poudre. 7 1739 Les conditions de culture ci-dessus illustrent seulement l'invention et ne sont pas limitatives. La substance de culture obtenue de cette manière est identifiée comme étant la gomme xanthane à partir des faits suivants: la composition chimique obtenue par hydro- lyse acide révèle une proportion glucose/mannose/acide glucuronique de 2: 2: 1, le spectre infrarouge coïncide avec celui de la gomme xanthane (figures 1 et 2) et la viscosité (mPa.s à 25 C) d'une solution aqueuse de concen- tration prédéterminée a une allure semblable à celle d'une solution aqueuse de gomme xanthane. Tableau I ,' ' ' ** Concentration Produit de fermentation gomme xanthane de la présente invention 0,1 82 98 0,5 330 420 1,0 1 100 950 Produit de fermentation obtenu à l'exemple 1 ** Produit de fermentation de Xanthomonas campestris "NRRL B-1459" obtenu dans les mêmes conditions. Lorsque l'on cultive Xanthomonas campestris "IFO 13551" en utilisant le milieu de culture selon la présente invention, la solution de fermentation obtenue après stéri- lisation présente la couleur Gardner indiquée au tableau 2, c'est-à-dire une couleur très claire par rapport à celle obtenue avec te milieu de culture. Tableau 2 __-_ Type de [Type de Propriétés de la solution de miLieu de microfermentation après stériLisation culture organisme 1) (2) (3) Viscosité Concentration de Couleur (mPa.s/25 C) gomme xanthane Gardner (%) IFO 9000 1,8- G4 MiLieu de 13551 culture (4) cuture NRRL 9500 1,8 G4 classique B-1459 ATCC 9000 1,8 G4 IFO 9800 1,8- Gi Milieu de 13551 culture de la présent NRRL 10000 1,9 G2 invention B-1459 (5) ATCC 10300 1,9 G2 13951 Milieu de culture IFO 10000 1,9 G5 classique 13551 (4) + acide malique NRRL 10500 1,9 G6 (0,2 %) B-1459 Remarques (1) Viscosité: La mesure est effectuée sur 200 mL de la solution de fermentation en utilisant un viscosimètre rotatif type B et un rotor n 3 à 12 trs/min. (2) Concentration de gomme xanthane: on ajoute 10 gouttes d'une solution aqueuse saturée de KCl à 40 g de La solution de fermentation et on ajoute 80 ml d'éthanoL à 95 % pour provoquer La précipitation. On Lave Le précipité deux fois à L'éthanol et on Le sèche à L'air pour obtenir La gomme xanthane. La concen- tration de gomme xanthane est calculée par La formule: concentration de xanthane = [(rendement en gomme xanthane, g)/(quantité de solution de fermentation, g)] x 100 7 1739 (3) Couleur: la mesure est effectuée avec un chromoscope Gardner. (4) Composition du milieu de culture classique glucose 2,5 % Peptone 0,2 % K2HPO4 0,5 % MgSO47H2d 0,1 % FeC27H20 0,001 % Eau qsp 100 % (5) Composition du milieu de culture de la présente invention Glucose 2,5 % glutamate de sodium 0,2 % K2HPO4 0,5 % MgSO47H20 0,1 % FeC127H20 0,001 % Acide pantothénique 0,001 % Chlorhydrate de thiamine 0,001 % Eau qsp 100 % Le brevet japonais n 58- 165798 décrit l'addition d'acide fumarique ou d'acide malique comme composant spécifique d'un milieu de culture de fermentation. Cependant, comme on peut le voir d'après le tableau 2, lorsque l'on ajoute de l'acide malique (0,2 %), la couleur de la solution de fermentation augmente forte- ment. Lorsque l'on ajoute de l'acide fumarique (0,2 %), la couleur augmente fortement aussi. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. _Exemle 1 On prépare un milieu de culture consistant en 2,5 % de glucose, 0,2 % d'extrait de levure, 0,5 % de K2HP04, 0,1 % de MgSO4 7H20, 0,001 % de FeC127H20, 0,001 % d'acide panthothénique et de l'eau pour faire 100 %. On charge une fiole d'Erlenmeyer munie d'un bouchon de coton avec 50 ml du milieu de culture. Après réglage du pkl à 7,0, on effectue la stérilisation à 121 C sous 1 bar pendant min et on ajoute 0,5 ml d'une suspension de Xanthomonas campestris IFO 13551 (concentration du microorganisme: 2.108 cellules/ml) 7 1739 à une autre portion du même milieu de culture. On effectue la culture à 28 C sur secoueuse à 250 trs/min pendant 96 h. Après la fermentation, on effectue La stérilisation dans les mêmes conditions et on dilue La solution quatre fois par l'eau distillée. On centrifuge La solution diluée pour séparer les microorganismes. On ajoute à la solution 15 ml de solution aqueuse saturée de KCL et 350 ml d'éthanol à 95 % pour provoquer la précipitation. On lave le précipité 2 fois avec une égale quantité d'éthanol et ensuite on lave trois fois avec 200 mL d'acétone et on sèche à l'air les cristaux pour obtenir 0,98 g de cristaux blancs fibreux. La solution de fermentation a une viscosité de 9 900 mPa.s/25 C, une concentration de cristaux de 1,8 % et une couleur Gardner G1. Les cristaux blancs raffinés ont une température de brunissement de 160 C, une proportion de sucres (par hydrolyse acide) glucose /mannose/acide glucuronique de 2: 2: 1 et un spectre d'absorption infrarouge (figure 1) coïncidant avec celui (figure 2) de la gomme xanthane vendue par Kelco Inc., EUA sous le nom de"KeltroL".Une solution aqueuse à 0,5 % des cristaux a une viscosité de 380 mPa.s/25 C et une solution aqueuse à 1,0 % a une viscosité de 980 mPa.s/25 C. Exemple 2 On prépare un milieu de culture consistant en 3,5 % de glucose, 0,06 % de NH4N03, 0,5 % de K2HP04, 0,1 % de MgSO47H20, 0,001 % de FeCL27H20, 0,001 % de ZnS047H20, 0,001 % de pantothénate de sodium, 0,001 % de thiamine et de l'eau pour faire 100 %. En utilisant 20 ml de ce milieu de culture et I l d'une suspension de Xanthomonas campestris "IFO 13551" dans une autre portion du même milieu de culture (concentration de microorganismes 5.106 cellules/ml), on effectue la culture dans un fermenteur ayant un volume de 50 l à 27 C avec un courant d'air de 0,5 volume d'air/ volume de milieu de culture.min. et agitation à 500 trs/min pendant 80 h. Le produit de culture est traité de la même manière qu'à l'exemple 1. 2 571 7 39 Après stérilisation, la solution de fermentation a une viscosité de 9 800 mPa.s à 25 C, une concentration en polysaccharide de 1,8 % et une couleur Gardner de G1. Les cristaux raffinés ont les mêmes propriétés que ceux de l'exemple 1. Exemple 3 On prépare un milieu de culture consistant en 2,2 % de saccharose, 0,6 % d'alanine, 0,5 % de Na2HP04, 0,3 % de MgS047H20, 0,003 % de Fe(N03)2, 0, 001% de ZnCl2, 0,03 % de pantothénate de méthyle, 0,001 % de chlorhydrate de thiamine et de l'eau pour faire %. On effectue la fermentation de la même manière qu'à l'exemple 2 en utilisant la culture ainsi préparée et Xanthomonas campestris "NRRL B-1459" pour donner 395 g de cristaux blancs. La solution de fermentation a une viscosité de 10 500 mPa.s à 250C, une concentration de polysaccharide de 1,9 % et une couleur Gardner de G2. Les cristaux raffinés ont les mêmes propriétés que ceux de l'exemple 1. Exemple 4 On prépare un milieu de culture consistant en 3,0 % de maltose, 0,5 % d'urée, 0,2 % de-K2HP04, 0,1 % de Mg(N03)2, 0,003 % de FeCl27H20, 0,005 % d'acide pantothénique, 0,02 % de monophosphate de thiamine et de l'eau pour faire 100 %. On effectue la fermentation de la même manière qu'à l'exemple 1 en utilisant le milieu de culture ainsi préparé et Xanthomonas campestris "ATCC 13951" pour donner des cristaux blancs. La solution de fermentation a une viscosité de 9 700 mPa.s à 25 C, une concentration de polysaccharide de 1,8 % et une couleur Gardner de G1. Les cristaux raffinés ont les mêmes propriétés qu'à l'exemple 1. Comme décrit ci-dessus, on ne savait pas que Xanthomonas campestris "IFO 13551" produit de la gomme Xanthane. Cependant, lorsque l'on cultive Xanthomonas campestris "IFO 13551" dans un milieu de culture classique, c'est-à-dire un milieu de culture qui ne contient pas d'acide pantothéniquede thiamine ou leurs 7 1739 dérivés, il peut y avoir production de gomme xanthane bien qu'elle soit beaucoup plus fortement colorée. On décrit ci-dessous un exemple de culture de Xanthomonas campestris "IFO 13551" utilisant un milieu de culture classique. Exemple 5 On prépare un milieu de culture consistant en 2,5 % de glucose, 0,2 X de peptone, 0,5 % de K2HP04, 0,1 % de MgSO47H20, 0,001 % de FeC127H20 et de l'eau pour faire 100 %. On charge un Erlenmeyer muni d'un bouchon de coton avec 50 ml de ce milieu de culture. Apres réglage du pH du milieu à 7,0, on stérilise à 121 C sous 1 bar pendant 15 min. On ajoute 0,5 ml d'une suspension de Xanthomonas campestris "IFO 13551" dans une autre portion du même milieu de culture et on effectue la culture à 28 C avec agitation à 250 trs/min pendant 96 h. Après la fermentation, on effectue la stérilisation dans les mêmes conditions, on dilue la solution quatre fois par l'eau distittllée et on sépare les microorganismes par centrifugation. On ajoute 15 mt d'une solution aqueuse saturée de KCl et 350 ml d'éthanol à 95 % pour provoquer la précipitation. On lave le précipité deux fois avec son poids d'éthanol et ensuite on lave trois fois avec 200 ml d'acétone et on sèche sous courant d'air pour donner 0,97 g de cristaux jaunes fibreux. La solution de fermentation a une viscosité de 900 mPa.s à 250C, une concentration de cristaux de 1,8 % et une couleur Gardner de G4. Les cristaux jaunes fibreux raffinés ont une tempé- rature de brunissement de 160 C, une proportion de sucres (hydrolyse acide) glucose/mannose/acide glucuronique de 2: 2: 1 et un spectre infrarouge coïncidant avec celui de la gomme xanthane- (figure 2). Une solution aqueuse à 0,5 % des cristaux a une visco- sité de 380 mPa.s à 25 C et une solution aqueuse à 1,0 % des cristaux a une viscosité de 980 mPa.s à 25 C. Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustration et que l'homme de l'art pourra y apporter des modifications sans sortir du cadre de l'invention. 7 1739 REVENDICATIONS 1. Procédé pour la production de gomme xanthane, caracté- risé en ce qu'il consiste à cultiver un microorganisme producteur de gomme xanthane du genre Xanthomonas en conditions aérobies dans un milieu de culture aqueux comprenant une source de carbone assimi- lable et au moinsun additif choisi parmi l'acide pantothénique, la thiamine et leurs dérivés comprenant les sels et esters, de manière à produire la gomme xanthane; et à récupérer la gomme xanthane. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de culture contient de 1 à 5 % en poids de la source de carbone. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la source de carbone est choisie parmi le glucose, le saccharose, le xylose, la mélasse, l'amidon, le maitose, la dextrine, le glycérol, le mannitol, le sorbitol et leurs mélanges. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de culture contient 0,0001 à 0,1 % en poids de l'additif. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'acide pantothénique et ses dérivés sont choisis parmi l'acide pantothénique, le pantothénate de sodium, le pantothénate de potas- sium, le pantothénate de calcium, le pantothénate de méthyle, le pantothénate d'éthyle, le pantothénate de butyle, l'amide pantothénique et leurs mélanges. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la thiamine et ses dérivés sont choisis parmi la thiamine, le chlorhydrate de thiamine, le monophosphate de thiamine, le diphosphate de thiamine, le sulfure de thiamine et leurs mélanges. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu de culture contient en outre une source d'azote. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la source d'azote est présente en quantité de 0,01 à 5 % en poids. 257 1739 9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que La source d'azote est choisie parmi le nitrate d'ammonium, Le nitrate de sodium, l'urée, le glutamate de sodium, l'alanine, la peptone, L'extrait de levure, l'extrait de malt et Leurs méLanges. 10. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le milieu de culture contient en outre un phosphate. 11. Procédé selon La revendication 10, caractérisé en ce que le phosphate est présent en quantité de 0,01à 5 % en poids. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le phosphate est choisi parmi le phosphate monopotassique, le phosphate dipotassique, le phosphate monosodique, le phosphate dissodique et leurs mélanges. 13. Procédé selon La revendication 10, caractérisé en ce que le milieu de culture contient en outre un sel de magnésium. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le sel de magnésium est présent en quantité de 0,01 à 1 % en poids. - 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le sel de magnésium est choisi parmi le phosphate de magnésium, le nitrate de magnésium, le sulfate de magnésium et leurs mélanges. 16. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le milieu de culture contient en outre un composant d'oligo- éléments. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que le composant d'oligo-éléments est présent en quantité de 0,001 à 0,01 % en poids. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que le composant d'oligo-éléments est choisi parmi le chlorure ferreux, le chlorure ferrique, le nitrate ferreux, le nitrate ferrique, le phosphate ferreux, le phosphate ferrique, le sulfate de zinc, le chlorure de zinc, le nitrate de zinc, le phosphate de zinc et leurs mélanges. 19. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la culture est effecutée à un pH de 7 à 7,2. -25 7 1739 20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que la culture est effectuée à une température de 25 à 30 C. 21. Procédé de production de gomme xanthane, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver Xanthomonas campestris "IFO 13551" dans une solution aqueuse contenant une source de carbone assimilable en conditions aérobies pour produire la gomme xanthane; et à récupérer la gomme xanthane.