FR 2570081 A1 19860314 FR 8413844 A 19840910 La présente invention concerne un polysaccharide de faible poids moléculaire (environ 90 000) obtenu à partir de protéoglycanes membranaires d'origine bactérienne ainsi qu'un procédé pour sa préparation et son utilisation $ à titre de médicament, en particulier comme immunostimulant, notamment pour l'activation des cellules NK (Natural Killer), et comme adjuvant dans les vaccins. Le brevet français n 78 35649 déposé le 19 décembre 1978 décrit un protéoglycane membranaire détoxifié, isolé d'une souche mutante non capsulée et non pathogène de Klebsiella pneumoniae biotype a. Ce protéo- glycane possède un poids moléculaire supérieur à 2 000 000 de daltons et exerce des propriétés adjuvantes caractéris- tiques vis-à-vis de la production d'anticorps contre les antigènes qui lui sont associés. Il ne possède par contre pas d'activité stimulante notable des cellules NK. Des exemples sont donnés de son utilisation comme adjuvant dans des formules de vaccins. a Le brevet français n 82 03921 déposé le 9 mars 998Z décrit l'obtention, à partir du protéoglycane précéent. et par action du lysozyme, d'une fraction protéoglycanique de poids moléculaire compris entre 200 000 et 400 000 daltons. Cette fraction protéoglycanique possède une propriété nouvelle: celle de stimuler très fortement l'activité des cellules NK via une induction d'interféron endogène. Cette fraction, par contre, ne possède plus les propriétés adjuvantes du protéoglycane détoxifié décrit précédemment. La présente invention concerne un nouveau composé provenant, en particulier, de membranes bactériennes; il s'agit d'un polysaccharide ayant un poids moléculaire compris entre 80 000 et 100 000 daltons et ayant la composition suivante sous forme lyophilisée: teneur en galactose, 66 6 % teneur en hexoses autres que le galactose, pu être déterminée. L'étude de la structure du polysaccharide au moyen des méthodes classiques telles que oxydation périodique, méthylation, chromatographie gazeuse couplée à la spectro- métrie de masse, RMN, etc., a permis de définir de façon précise la séquence d'enchaînement de ses constituants. Les résultats obtenus montrent que ce poly- saccharide est formé de l'enchaînement répété d'unités monomériques ayant la structure suivante: (3-Galf-(1 -- 3)-Galp-(1-- 3)-Galp-(l-- 3)-Galp-(1-' 3)-Galp -(1 3)-Gal-(1- 3) t- Galp(l t Galpe o Galf = galacto furanose, Gal = galacto pyranose (sous formes a et t), p ce qui correspond à la formule développée suivante: (y) CH OH r (x) r CHaH 2 r *2 0 | CHzOHC t J I, L.o-- oH) I - 0 OCH o x =1, y =6.OH ox=1, y=6. Ce polysaccharide peut être préparé par différents procédés. Le procédé préféré selon la présente invention, qui permet de préparer le polysaccharide membranaire d'origine bactérienne est caractérisé en ce que: a) à partir d'une souche de bactérie gram négatif, on extrait des membranes les protéoglycanes solubles dans l'eau; b) à partir desdits protéoglycanes solubles, on isole des polysaccharides de poids moléculaire compris entre 80 000 et 100 000; et c) on purifie, si nécessaire, les polysaccharides isolés en éliminant les protéines présentes dans la fraction isolée. Parmi les bactéries gram négatif susceptibles d'être mises en oeuvre, on peut citer Klebsiella pneumoniae, Serratia %arcescens et Escherichia -coli; en particulier Klebsiella pneumoniae qui fait l'objet d'un dépôt à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM) sous le n 145-I-IP. Les--protéoglycanes solubles sont préparés, de préférence, par solubilisation de protéoglycanes membranaires bruts obtenus par la mise en oeuvre de procédés décrits dans la technique antérieure, en particulier par les procédés décrits dans le brevet français n 78 35649. Il s'agit, essentiellement, d'un procédé qui, à partir d'un broyat cellulaire, sépare les membranes par plusieurs centrifuga- tions. Les protéoglycanes bruts obtenus sont traités par une base, en particulier un hydroxyde alcalin, de préférence la soude, à une molarité comprise entre 0,3 et 1 M, de préférence 0,5 M, le traitement étant poursuivi quelques heures, par exemple 1 heure, à une température comprise entre 50 et 600C, par exemple 56 C, de préférence sous agitation. Par rapport au procédé décrit dans le brevet français n 78 35649, le milieu utilisé est plus basique pour assurer une hydrolyse plus complète des protéoglycanes bruts. Afin d'éliminer l'excès de réactif, après refroidissement, on neutralise la suspension par un acide, par exemple l'acide chlorhydrique, puis on la clarifie en éliminant le résidu insoluble par précipitation, en particulier par centrifugation, par exemple 60 minutes à 000 g. Le surnageant, qui constitue les protéoglycanes solubles, est recueilli et peut être lyophilisé. Le polysaccharide membranaire d'origine bacté- rienne ayant le poids moléculaire désiré est alors isolé du surnageant par un procédé de fractionnement, de préférence un fractionnement chromatographique. On recueille la fraction d'élution de la colonne contenant le poly- saccharide de poids moléculaire compris entre 80 000 et 000. Ce fractionnement chromatographique peut être effectué en utilisant une résine d'agarose telle que la Sépharose CL2B, mais d'autres techniques de fractionnement peuvent être mises en oeuvre. Le polysaccharide peut, alors, être purifié, dans un mode de réalisation de l'invention, en éliminant en particulier les protéines de poids moléculaire proche de celui du polysaccharide isolé, par exemple par hydrolyse enzymatique desdites protéines, en particulier par action de protéinase, suivie d'une séparation des polysaccharides purifiés par un procédé de fractionnement, de préférence un fractionnement chromatographique. La fraction contenant le polysaccharide peut -être alors recueillie et éventuellement lyophilisée. Le lyophilisat ainsi obtenu constitue le polysaccharide faisant l'objet de la présente invention. La présente invention concerne également l'utilisation de ces protéoglycanes à titre de médicament, soit seuls, soit en association avec un agent vaccinant- En effet, le poiysaccharide selon l'invention possède des propriétés immunostimulantes dont les principes sont: un pouvoir adjuvant, notamment à des doses très faibles, des vaccins, en particulier ribosomaux; une capacité élevée de stimulation des cellules NK, in vitro et in vivo. Ainsi, il a été mis en évidence pour ces produits une forte activation des cellules NK in vivo sur des souris visà-vis du lymphome de Moloney (cellule YAC.1). En outre, on a mis en évidence des propriétés adjuvantes vis-à-vis des vaccins, notamment des vaccins ribosomaux, c'est-à-dire les vaccins dans lesquels l'agent vaccinant est constitué par des ribosomes, mais d'autres agents vaccinants peuvent être utilisés. Il est clair, compte tenu des activités mises en évidence, que la nature des compositions pharmaceutiques ainsi que les posologies à mettre en oeuvre, pourront varier dans une très large gamme. En effet, l'activation des cellules NK pourra dépendre grandement des cellules cibles visées et de l'état du patient. De même, dans le cas des adjuvants, seule une étude d'optimisation pourra permettre de fixer le rapport entre l'adjuvant et l'agent vaccinant ainsi que les posologies. Les exemples ci-après permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. Les figures ci-annexées illustrent certains aspects particuliers de l'invention. Sur ces figures: À la figure 1 est une courbe chromatographique sur CL2B Sépharose du protéoglycane hydrolysé par NaOH 0,5 N, la figure 2 est,une courbe chromatographique sur Séphacryl S 200 du polysaccharide traité par la protéinase, 15. la figure 3 représente les courbes d'activation des cellules NK in vitro (exemple 6), la figure 4 représente les courbes d'activation des cellules NK in vivo (exemple 7), la figure 5 représente un histogramme du dosage ELISA obtenu dans l'exemple 8. EXEMPLE 1 -Isolement des protéoglycaries membranaires bruts La biomasse de la souche de Klebsiella pneumoniae -I-IP est dispersée dans du tampon Tris HCl 0,01 M, pH 7, contenant NaCI O,15 M glacé puis soumise à un broyage mécanique destiné à rompre les parois cellulaires. Le lysat bactérien est clarifié par une centri- fugation de 10 minutes à 7 500 g puis le surnageant est centrifugé pendant 60 minutes à 30 000 g. Le culot est dispersé dans une solution aqueuse de NaCl 0,15 M. La suspension obtenue est à nouveau clarifiée minutes à 7 500 g puis centrifugée 45 minutes à 30 000 g. Le culot est repris dans l'eau distillée puis à nouveau soumis à un cycle de centrifugation à 7 500 g puis à 30 000 g. Le culot de protéoglycanes membranaires bruts est alors repris dans 1/4 du volume initial d'eau distillée stérile, la suspension est clarifiée 10 minutes à 7 500 g et le surnageant est lyophilisé. EXEMPLE 2 Préparation de protéoglycanes membranaires solubles Les protêoglycanes membranaires bruts lyophilisés sont dispersés dans NaOH (0,5 M) puis hydrolysés pendant 1 heure à 56 C. Apres refroidissement, la suspension est neutralisée par HC1. La suspension est alors clarifiée par centrifugation 60 minutes à 30 000 g puis le surnageant est recueilli. Le filtrat est lyophilisé. EXEMPLE 3 TIsolement -du po-lysaccharide par fractionnement chromatographique Le lyophilisat précédent est dissous dans du tampon Tris HCl O,01 M, pH 7, puis soumis à un premier fractionnement chromatographique sur une colonne (60 x 2,6 cm) de Sépharose CL2B Pharmacia, Suede (gel d'agarose de porosité déterminée) équilibrée dans le même tampon. La figure ldonne un exemple de la séparation chromatographique obtenue à ce stade avec indication de la localisation précise du pic de polysaccharide représenté en pointillé. On remarque sur ce chromatogramme que le pic de polysaccharide est complètement séparé d'un pic de -poids moléculaire très supérieur élué en tête de la colonne et incomplètement séparé d'un ensemble de fractions protéiques d'un poids moléculaire inférieur proche de celui du polysaccharide, éluées à la suite de ce dernier. La fraction d'élution de la colonne contenant le polysaccharide est recueillie, dialysée contre de l'eau distillée puis lyophilisée. Cette fraction est encore légèrement contaminée par des protéines de poids moléculaire très proche de celui du polysaccharide (70 000 à 100 000). Ces protéines vont donc être hydrolysées par l'action d'une enzyme avant une ultime étape de fractionnement chromatographique. EXEMPLE 4 Hydrolyse enzymatique des protéines résiduelles Le lyophilisat précédent est dissous dans du tampon Tris HCl 0,01 M, pH 7,3, contenant 1 mM d'EDTA à raison de 20 mg/ml. On ajoute alors à cette solution mg/ml de protéinase K (enzyme protéolytique de Tritirachium album) puis on incube pendant 2 heures à 37 C sous agitation. EXEMPLE 5 Purification des polysaccharides par fractionnement chromatographique Les protéinescontaminantes dont le poids moléculaire a été réduit par protéolyse sont séparées du polysaccharide par chromatographie sur Séphacryl S 200 Pharmacia Suède (gel de polyacrylamide de porosité définie). La figure 2 donne un exemple de la séparation chromatographique obtenue à ce stade. On remarque sur ce chromatogramme que le pic de polysaccharide représenté en pointillé se trouve cette fois complètement séparé de celui des protéines hydrolysées représentées en trait plein, dont l'élution de la colonne se trouve ainsi fortement retardée par rapport au polysaccharide. La fraction contenant le polysaccharide pur est alors recueillie, concentrée et dialysée en continu contre de l'eau distillée sur une membrane dont le seuil de coupure se situe a 10 000 daltons, stérilisée par filtration sur membrane 0,2 v puis lyophilisée. Le lyophilisat ainsi obtenu constitue le polysaccharide de Ktebsi:ella pTeumoniae faisant l'objet du présent brevet. EXEMPLE 6 Activation des cellules NK in vitro Protocole 107 cellules spléniques des souris normales par ml de milieu RPLI 1640 additionné de 5 % de sérum foetal de veau. Incubation à 37 C dans une.étuve à C02 avec des quantités variables de polysaccharide. Les cellules cibles sont des cellules YAC-1 (lymphome de Moloney) sensibles aux cellules NK, marquées au 51Cr. La mesure de la lyse est faite par comptage du 51Cr libéré pour des rapports cellules effectrices/cellules cibles de 200/1, 100/1, 50/1, pendant 4 heures d'incubation. Résultats Ils sont extrêmement nets et font apparaître une augmentation hautement significative du pourcentage de cellules cibles lysées (P La figure 3 donne un exemple des résultats obtenus au cours de cette étude. EXEMPLE 7 Activation des cellules NK in Vivo par voie intrapéritonéale chez la souris Protocole _________ Animaux: souris CBA/J, Agêes de 4 à 5 mois. Cellules cibles: YAC-1 (lymphome de Moloney) sensibles aux cellules NK. Le polysaccharide est injecté par voie intra- péritonéale a la dose de 15 vg dans 0,2 ml de sérum physiologique tamponné 3 jours avant la mesure de l'activité NK. Des souris témoins ne reçoivent que du sérum physiologique dans les mêmes conditions. Les cellules spléniques sont ensuite prélevées et incubées comme précédemment avec des cellules cibles marquées au 51Cr dans des rapports cellules effectrices/ cellules cibles de 200/1, 100/1, 50/1, 25/1 pendant 4 heures. Le 51Cr libéré est mesuré pour déterminer le pourcentage de cellules'cibles lysées. Résultats On observe une augmentation hautement signifi- cative de l'activité NK chez les-animaux traités par le polysaccharide comparativement aux animaux témoins. La figure 4 donne un exemple des résultats obtenus au cours de cette étude. EXEMPLE 8 Propriétés adjuvantes du polysaccharide Exemple d'étude des propriétés adjuvantes du polysaccharide vis-à-vis d'un antigène ribosomal de Streptococcus pyogenes groupe A. Principt- Des souris sont immunisées avec une dose constante de ribosomes de Streptococcus pyogènes additionnés de doses variables de polysaccharide. La réponse anticorps spécifiques contre les ribosomes est ensuite mesurée par la technique ELISA. Des groupes témoins sont traités l'un par du sérum physiologique, l'autre par la dose standard de protéoglycane membranaire brut de Klebsiella pneumiae (PGM brut). Protocole 9 lots de 10 souris NMRI femelles âgées de 8 semaines. Chaque animal reçoit 5 injections en 15 jours. lot 1: sérum physiologique 15. lot 2: 10 pg de ribosomes + 0,05 pg de polysaccharide lot 3: 10 pg " + 0,1 ig lot 4: 10 g " + 0,5 pg lot 5: 10 pg " + 1,0 pg lot 6: 10 pg " + 2,5 ig - 20. lot 7: 10 pg " + 5,0 ig lot 8: 10 pg " +10,0-r pg lot 9: 10 pg " +15, 0 pg de PGM bruts Les animaux sont ponctionnés le 21ème jour et les titres en anticorps anti-ribosomes de Streptococcus pyogènes sont déterminés par la technique ELISA. Les résultats indiquent la dernière dilution du sérum donnant une réponse positive en ELISA, et sont représentés sous forme d'histogramme ci-après. Résultats La figure 5 est une représentation sous forme d'histogramme du dosage ELISA de la réponse anticorps spécifique en fonction de la dose de polysaccharide associée a l'antigène. Antigène: 10 pg de ribosomes de S. pyogenes par injection. Ces résultats montrent qu'une dose de 2,5 pg de polysaccharide à le même effet adjuvant qu'une dose de 15 pg de PGM bruts, soit une activité spécifique 6 fois supérieure dans ces conditions. REVENDICATIONS 1) Polysaccharide membranaire d'origine bactérienne ayant pour composition analytique quantitative: teneur en galactose, 66 6 % teneur en hexoses autres que le galactose, et pour poids moléculaire: 90 000 10 000. 2) Polysaccharide de structure polymère définie par le monomère: (3-Gal(1--* 3)-Galp-( --* 3)-Gal-(i-- 3)-Galp-(I--> 3)-Galp -1 3)-Gall,-(1--* 3) Ga(lp (1- t Galp o GaIf = galacto furanose, Galp = galacto pyranose (sous forme a et). 3) Polysaccharide selon la revendication 2 o le mnomère est représenté par la formule développée: 2570081 I O I O0h o OH o x = 1; y = 6. 4) Procédé de préparation de polysaccharide membranaire d'origine bactérienne caractérisé en ce que: a) à partir d'une souche de bactérie gram négatif, on extrait des protéoglycanes membranaires solubles dans l'eau; b) des protéoglycanes solubles, on isole des polysaccharides de poids moléculaire compris entre 80 000 et 100 000; et c) on purifie, sL nécessaire, les polysaccharides isolés-en éliminant les protéines présentes dans la fraction isolée. ) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la bactérie gram négatif est un Klebsiella pneumoniae. 6) Procédé selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que dans l'étape. a) d'obtention des protéoglycanes solubles dans l'eau, on traite des protéoglycanes bruts membranaires par une base, on récupère les protéoglycanes solubles qui se trouvent dans la solution aqueuse. 7) Procédé selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que dans l'étape a) la base utilisée est un hydroxyde alcalin de molarité 0,3 M à 1 M. 8) Procédé selon l'une des revendications 4 à 7, caractérisé en ce que dans l'étape b) on isole les polyr saccharides par fractionnement chromatographique en recueillant la fraction d'élution contenant les poly- saccharides de poids moléculaire compris entre 80 000 et 000. 9) Procédé selon l'une des revendications 4 à 8, caractérisé en ce que dans l'étape c) on élimine les protéines présentes dans la fraction isolée par l'action d'une protéinase, suivie d'un fractionnement chromatogra- phique après lequel on recueille la fraction d'élution contenant les polysaccharides de poids moléculaire compris entre 80 000 et 100 000. ) Polysaccharide d'origine bactérienne obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 9. 11) Médicament caractérisé en ce qu'il contient un polysaccharide selon l'une des revendications 1, 2, 3 ou 10. 12) Médicament selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il contient, en outre, un agent vaccinant. 13) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comporte au moins un médicament selon l'une des revendications 11 et 12 ainsi qu'un support pharmaceutiquement acceptable.