FR 2565985 A1 19851220 FR 8409561 A 19840619 1 vD2565985 La présente invention concerne des substances biologi- quement actives obtenues par fractionnement d'hydrolysats enzyma- tiques de la caséine bovine et les compositions qui les contien- nent. Les substances selon la présente invention sont des agents immunologiques qui favorisent en particulier la production d'anticorps' Selon la présente invention, les nouvelles substances sont obtenues par traitement, à l'aide d'au moins une enzyme protéolytique, de la caséine bovine totalement délipidée suivi du fractionnement des produits hydrosolubles en fonction de leur poids moléculaire moyen par filtration et purification sur des supports appropriés. Les nouvelles substances selon l'invention ont un poids moléculaire moyen compris entre 300 et 2500 et présentent des propriétés particulièrement intéressantes. A titre d'enzymes protéolytiques, on utilise avanta- geusement dans le procédé selon l'invention la trypsine, la chymo- trypsine ou autre enzyme analogue ou leurs mélanges. Par exemple, le fractionnement de la fraction hydro- soluble provenant du traitement de la caséine bovine délipidée par un mélange chloroforme-méthanol, digérée par la trypsine non prétraitée fournit trois fractions biologiquement actives IV, V et VI. L'ensemble des fractions "IV + V", après purification sur une colonne d'échangeur d'ions puis par chromatographie liquide à haute performance dans des conditions déterminées, fournit les substances appelées "MJH-320", "MJH 324", "MJH 328" et "MJH 329" dont les propriétés immunologiques sont améliorées par rapport à celles des substances IV et V elles-mêmes. Les nouvelles substances selon la présente invention sont des agents immunologiques qui favorisent la production d'anticorps et qui accélèrent le phénomène de phagocytose. In vitro, elles se sont montrées particulièrement actives à des concentrations comprises entre 0,1 et 10pg/ml dans le test de sécrétion d'anticorps (hémolytiques) anti-globules rouges de moutons par des cellules spléniques de souris immunisées in vivo et dans le test de phagocytose de globules rouges de moutons opsonisés par les macrophages péritonéaux de souris. Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, montrent comment l'inv'ention peut être mise en pratique. EXEMPLE La caséine bovine (500 mg) est délipidée par traitement au moyen de 25 cm3 d'un mélange chloroforme-méthanol (2/1 en volumes). La caséine est solubilisée par traitement au moyen d'une solution d'hydroxyde de sodium 0,05 M de telle manière que la concentration finale en caséine soit voisine de 2 mg/cm3. La solution obtenue est soumise à une dialyse contre 2 litres de tampon phosphate 0,033 M à pH 8 pendant 2 jours en renouvelant 5 fois la solution tampon. On obtient ainsi une solution à pH 8 contenant la caséine soluble. Cette solution est soumise à l'action de la trypsine de telle manière que le rapport enzyme/substrat soit voisin de 1/100. L'hydrolyse enzymatique est poursuivie pendant 24 heures à 37 C, la moitié de la quantité d'enzyme étant introduite au départ de la réaction et le reste 4 heures après le début de la digestion. Le mélange réactionnel est amené à sec puis repris par 16 cm3 d'une solution d'acide acétique à 30%. Le mélange est soumis à une centrifugation à 15000 tours/minute, pendant 45 minutes. Le liquide clair surnageant (16 cm3) est filtré sur une colonne de Sephadex G 50 (hauteur: 117 cm, diamètre 4,5 cm) en éluant avec de l'acide acétique à 30% et en recueillant des frac- tions de 3 cm3. En opérant de cette manière et en suivant la chroma- tographie par absorption U.V. à 280 nm, on obtient des zones qui permettent de définir 6 fractions pour lesquelles le poids molé- culaire moyen est établi. Le diagramme de la filtration est repré- senté à la figure 1. Les fractions biologiquement actives sont les suivantes: - substance IV (MJH 274): fractions 1248 cm3 à 1419 cm3; poids moléculaire moyen 1000 + 250 - substance V (MJH 275): fractions 1420 cm3 à 1554 cm3; poids moléculaire moyen 600 + 200 - substance VI (MJH 276): fractions 1555 cm3 à 1695 cm3; poids moléculaire moyen 400 + 100 Les substances IV et V réunies (1,5 g provenant de 3 opérations successives) sont filtrées sur une colonne de CM Trisacryl (nom déposé I B F) (hauteur 110 cm, diamètre 2,2 cm) en éluant par une solution de tampon Tris, HC1 Vris (hydroxyméthyl- aminométhane) HC1J 0,01 M à pH 4,5 1090 cm3) puis par une solution tampon Tris, HC1 0,01 M pH 4,5, ClNa 0,1 M (1040 cm3), les fractions recueillies étant de 3,35 cm3. Le diagramme de filtration est représenté par la figure 2 dans laquelle figurent en abscisses le volume d'élution et en ordonnées les densités optiques. On recueille 11 fractions parmi lesquelles les fractions éluées de 335 à 435 cm3 (MJH 310),de 435 cm3 à 570 cm3 (MJH 311), de 570 cm3 à 787 cm3 (MJH 312) de 787 cm3 à 1010 cm3 (MJH 313) et de 1306 cm3 à 1374 cm3 (MJH 314) se sont révélées actives. Les fractions MJH 311 et MJH 313 ont été purifiées successivement par HPLC en phase reverse sur une colonne semi- - préparative (colonne C 18-p-bondapak, Waters) dont la longueur est de 30 cm et le diamètre de 7,8 mm. On recueille des fractions de 1 cm3. La vitesse d'élution étant de 1 cm3/minute. Au départ la colonne est tamponnée par de l'acide trifluoroacétique (TFA) à 0,1% (éluant A). On prépare un éluant contenant du TFA (0,1% en volume) et de l'acétonitrile (70%) (éluant B). La fraction MJH 311 est dissoute dans 1 cm3 de TFA 0,1%. L'élution est effectuée en utilisant un gradient linéaire d'élution et en opérant selon le tableau suivant: Temps Eluant A Eluant B (minutes) - 100 0 O 100 Le diagramme d'élution est représenté par la figure 3. L'élution est suivie en mesurant l'absorption à 280 nm. Le diagramme d'élution contient 7 zones dont les frac- tions les plus importantes sont les fractions éluées de 74 à 79 mn (MJH 328) et de 79 à 86 mn (MJH 329). La fraction MJH 313 est dissoute dans 1 cm3 de TFA 0,1%.L'élution est effectuée en utilisant le gradient d'élution décrit dans le tableau suivant: Temps Eluant A Eluant B Gradient (minutes) 25 100 0 isocratique 65 35 linéaire 65 35 isocratique 0 100 linéaire Le diagramme d'élution est représenté par la figure 4. L'élution est suivie en mesurant l'absorption à 280 nm. Le diagramme d'élution contient 12 zones. Des substances actives ont été mises en évidence dans les zones éluées de 67 à 69 mn (MJH-320) et de 89 à 98 mn (MJH 324) La présente invention concerne également les compositions utilisables en thérapeutique qui contiennent une substance, selon la présente invention en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et pharmaceutiquement acceptables. Ces compositions peuvent être utilisées comme adjuvants de vaccins (par exemple vaccin anti-grippal composé de sous-unités hémagglutinantes, vaccin antipoliomyélitique à virus inactive, vaccin antimalarique) en injection simultanée avec l'antigène (viral, bactérien, parasitaire, fongique, tumoral) à l'égard duquel on souhaite augmenter la production d'anticorps ou la réactivité cellulaire spécifique. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être également employées comme immunostimulants non spécifiques en vue d'augmenter la résistance de l'h6te (homme ou animal domestique) vis-à-vis des infections ou en immunothérapie antitumorale. En tant qu'adjuvants, les produits peuvent être adminis- trés soit en solution aqueuse, soit en émulsion huileuse, soit encore sous forme de liposomes avec l'antigène à l'égard duquel on souhaite obtenir une réponse immunitaire augmentée ou améliorée par la voie utilisée pour cet antigène et dans des proportions variant entre 0,01 et 10 fois la quantité d'antigène avec lequel ils sont mélangés avant d'être injectés. Pour l'application comme immunostimulant non spécifique, ces produits peuvent être utilisés par voie intraveineuse, intra- musculaire, sous-cutanée, intra-nasale, éventuellement orale ou rectale, soit en solution aqueuse soit en émulsion huileuse, soit encore sous forme de liposomes. Dans ce cas, la dose de composés selon l'invention qui est administrée est généralement comprise entre 0,01 et 25 mg/kg. En thérapeutique humaine, les doses journa- lières dépendent de l'effet recherché. Elles peuvent être comprises entre 0,1 et 10 mg pour un adulte. Les compositions solides pour administration orale peuvent être des comprimés, des pilules, des poudres ou des granu- lés. Comme compositions liquides pour administration orale, on peut utiliser des émulsions pharmaceutiquement acceptables, des solutions, des suspensions, des sirops et des élixirs. Les compositions pour administration parentérale ou intra-nasale peuvent être des solutions stériles aqueuses, des suspensions ou des émulsions. La stérilisation peut se faire de plusieurs façons, par exemple à l'aide d'un filtre bactériologique ou en incorporant des agents stérilisants. Les compositions solides rendues stériles par irradiation (rayons 8) peuvent tre dissoutes dans de l'eau stérile ou tout autre milieu stérile injectable éventuellement au moment de l'emploi. Les compositions pour administration rectale sont des suppositoires. L'exemple suivant, donné à titre non limitatif, illustre une composition selon l'invention. EXEMPLE On prépare selon la technique habituelle une composition liquide administrable par voie intraveineuse ayant la composition suivante: substance MJH-320.................. 50 mg - soluté injectable............. ... 5 cm3..DTD: R E V E N D I C A T I 0 N S i - Procédé de préparation de nouvelles substances biologiquement actives caractérisé en ce que l'on traite la caséine bovine déli- pidée par au moins une enzyme protéolytique puis fractionne les produits hydrosolubles en fonction de leur poids moléculaire moyen, par filtration sur un ou plusieurs supports appropriés et isole les substances actives. 2 - Procédé selon la revendication 1 en ce que l'enzyme protéo- lytique est choisie parmi la trypsine, la chymotrypsine ou leurs mélanges. 3 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on traite la caséine bovine délipidée par un mélange chloroforme- méthanol soluble dans l'eau, par une enzyme protéolytique, le rapport enzyme/substrat étant voisin de 1/100, pendant 24 heures à 37 C, puis, après centrifugation, fractionne les produits hydro- solubles par filtration sur Sephadex G 50 en éluant avec de l'acide acétique à 30%, puis isole les substances actives après purifi- cation par chromatographie liquide à haute performance. 4 - Nouvelles substances biologiquement actives lorsqu'elles sont obtenues selon le procédé de l'une des revendications 1, 2 ou 3. - Nouvelles substances actives selon la revendication 4 caracté- risées en ce que leur poids moléculaire est compris entre 300 et 2500. 6 Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient au moins une substance active selon les revendications 4 ou 5 en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles.