FR 2567150 A1 19860110 FR 8510247 A 19850704 La présente invention se rapporte généralement à un procédé perfectionné de production de L-aminoacides (ci-après "aminoacides") à partir de leurs " -cétoacides précurseurs par transamination biologique en utilisant l'acide aspartique comme donneur amino. Plus particuliè- rement, le procédé révélé ici est conçu pour améliorer l'allure et le rendement de la transamination en augmen- tant l'allure de décomposition de l'acide oxalacétique, l'un des sousproduits réactionnels. Cela a pour résultat une augmentation sensible de l'allure de réaction de façon que sensiblement tout le précurseur est consommé dans la transamination. En éliminant la contrainte d'équilibre lors de la transamination et en permettant de convertir plus de précurseur, des rendements d'amino- acide dépassant 90% peuvent être obtenus. La réaction est catalysée de cette manière par l'addition d'ions métalliques au système réactionnel de transamination. On sait que les précurseurs d'aminoacides peuvent être convertis par voie enzymatique en leurs L-aminoacides correspondants. Par exemple, le brevet US 3 183 170 (Kitai et autres) révèle la transamination de l'acide phényl- pyruvique en présence d'un système à plusieurs enzymes obtenu de diverses sources, comprenant des cellules bactériennes, des cellules séchées, des macérats de cellules ou des solutions d'enzymes. La demande de brevet US No 520 632 (Fusee) déposée le 5 Août 1983, révèle la transamination microbienne d' 0 -cétoacides en aminoacides dans des fermentations à alimentation discontinue en utilisant des précurseurs conventionnels pour convertir, -par exemple, l'acide phénylpyruvique en L-phénylalanine, l'acide 0 -cétoisocaproique en L-leucine, l'acide o,-cétoisovalérique en L-valine etc. La biotransformation de 1' o se forme. Dans les procédés conventionnels de transamina- tion, un certain nombre de composés ont été utilisés comme donneur amino. Oishi, aux pages 435-52 du texte de Yamada et autres, indique que les meilleurs donneurs amino sont l'acide L-aspartique, la L-leucine, la Lisoleucine et l'acide L-glutamique et que de meilleurs résultats sont obtenus lorsque ces aminoacides sont utilisés en combinaison que quand ils sont utilisés seuls. La demande de brevet US N 568 300 (Walter), déposée le Janvier 1984, révèle un procédé pour entreprendre une réaction de transamination microbienne jusqu'à l'abou- tissement en utilisant une solution comprenant des quantités approximativement équimolaires d'acide aspar- tique et de phénylanaline comme précurseur, en faisant croître au préalable les micro-organismes en présence du précurseur, en employant le catalyseur biologique sous la forme de cellules séchées et/ou en augmentant la charge du catalyseur biologique du système. L'acide oxalacétique- (également connu sous le nom d'acide oxaloacétique, acide oxosuccinique ou acide cétosuccinique) est un sous-produit de la transamination enzymatique lorsque l'on utilise l'acide aspartique comme donneur amino. L'acide oxalacétique a été étudié dans d'autres contextes et s'est révélé se décomposer par divers mécanismes. Bessman, "Preparation and Assay of Oxalacetic Acid", Arch. Biochem., volume 26, pages 418-21 (1950) rapporte la décomposition spontanée de l'acide oxalacétique, qui est catalysée par un certain nombre de substances. Krebs, "The Effect of Inorganic Salts on the Ketone Decomposition of Oxaloacetie Acid", 3. Biochem., Volume 36, pages 303-05 (1942), rapporte que divers sels inorganiques augmentent l'allure de la décomposition de l'acide oxaloacétique en acide pyruvique et bioxyde de carbone. On a trouvé que, dans les conditions révélées ici, la transamination d'un précurseur d'aminoacide en son aminoacide correspondant, si l'acide aspartique est choisi comme donneur amine primaire et que le précurseur est un " -cétoacide, pouvait être considérablement améliorée en catalysant la décomposition de l'oxyde oxalacétique sous-produit de la transamination. La décomposition est catalysée par l'addition de certains ions de métaux multivalents ou leurs sels au système réactionnel. Le Laminoacide peut être accumulé et recueilli. En décomposant l'acide oxalacétique de cette façon, l'équilibre du système est décalé dramatiquement vers la droite, menant sensiblement la réaction à son aboutissement. Cette catalyse à l'ion métallique a pour résultat d'augmenter les allures de transamination à plus d'environ 7,0 moles par litre-heure et les rendements d'aminoacide à environ 90 à 100%. L'un des buts de l'invention est d'améliorer une réaction de transamination biologique en augmentant dramatiquement l'allure de réaction et le rendement total d'un aminoacide basé à la fois sur l'acide aspartique et le précurseur. Il est par conséquent possible de diminuer les quantités proportionnelles du précurseur nécessaires pour atteindre le rendement du produit souhaité. En augmentant sensiblement l'allure de la transamination, le temps requis pour que le système conver- tisse une quantité donnée du précurseur diminuera. Par ailleurs, l'allure accrue de réaction diminue sensible- ment la perte de rendement du produit du fait de la décomposition du précurseur. De plus, cela conduit à une diminution de la contamination avec le précurseur n'ayant pas réagi, rendant la purification du produit et sa récupération moins fastidieuses. La présente invention a pour autre objet de produire une réaction dans laquelle 1' 0-cétoacide précurseur ne doit pas être pur et pouvant surmonter l'effet d'inhibition des impuretés pouvant être présentes. Un objet général de l'invention est de réduire de manière significative les prix associés à la production des aminoacides par transamination. L'invention révélée ici offre un moyen unique pour produire la transamination d'un précurseur d'aminoacide en son L-aminoacide correspondant, en utilisant l'acide aspartique comme donneur amino et un 0 -cétoacide précurseur approprié, en choisissant une transaminase intra- ou extracellulaire appropriée et en couplant la réaction de transamination à la décomposition catalysée de l'acide oxalacétique sous- produit de transamination dans des conditions favorables à l'activité de la transaminase. La décomposition catalysée est effectuée par addition d'ions métalliques multivalents ou leurs sels, au système réactionnel et en laissant la transamination se passer de manière significative au delà de l'équilibre. La transamination peut être accomplie en mettant une solution comprenant 1' l'acide aspartique en contact avec la transaminase intra- ou extracellulaire, c'est-à-dire avec une préparation de cellules ou d'enzymes pouvant intervenir dans la réaction. Le terme "transaminase" tel qu'utilisé ici indique un enzyme ou un système d'enzymes pouvant intervenir dans la conversion précurseur-aminoacide qui vient d'être décrite. Les micro-organismes qui se sont déjà révélés utiles dans ce type de procédé de transamination sont Pseudomonas pseudoalcaligenes, Brevibacterium thiogenitalis, Pseudomonas aeriginosa, Bacillus subtillus et Escherichia coli, dont chacun favorise la transamination de la phénylalanine comme précurseur en L-phénylalanine. De plus, on a pu démontrer que ces quatre dernières espèces de bactéries avaient une activité pour la production d'autres aminoacides (L-tyrosine (Exemple IV), L-leucine, L-isoleucine et L-valine ont été démontrées) par trans- amination avec l'acide aspartique comme donneur. Le groupe des microorganismes qui sera utile dans l'invention sera bien entendu bien plus large. Des organismes apparte- nant au genre Aerobacter, des organismes halophiles, et des levures telles que celles appartenant au genre Candida se sont révélés appropriés. On peut s'attendre à ce que tout micro-organisme qui est connu comme démon- trant une activité de transaminase pour la production d'aminoacides et pouvant utiliser l'acide aspartique comme donneur amino soit utile dans cette méthode. De plus, il est envisagé que des cultures mélangées de souches appropriées puissent être utilisées. Les conditions de croissance doivent être choisies sur la base du microorganisme particulier utilisé et seront dans la connaissance et l'adresse de toute personne ayant une compétence dans ce domaine. Il est préférable que les conditions favorisent la croissance rapide des cellules saines. Par exemple, si l'on utilise Pseudomonas pseudoalcaligenes, la température est de préférence maintenue à environ 35 à environ 39 C avec pH à environ 7,5. On utilise une agitation et/ou une aération afin de produire un environnement aérobie. Des sources appropriées d'énergie et nutritives doivent être prévues. On fait croître les micro-organismes à une certaine densité prédéterminée de cellules ou phase de croissance. La période précise de croissance et la densité des cellules ne sont pas critiques parce que la densité peut être accrue après la croissance, si on le souhaite, par des moyens conventionnels comme une centrifugation ou une filtration. Une période typique de croissance d'environ 12 à environ 48 heures produira usuellement un nombre utile de cellules. Les cellules sont alors recueillies et peuvent être traitées pour perméabiliser la membrane de la cellule. Ce traitement peut être par séchage, sonication, incubation avec du toluène ou des agents tensio-actifs non ioniques etc. Il peut également être souhaitable d'immobiliser les cellules sur un substrat approprié. Si des micro-organismes viables sont utilisés dans la méthode de l'invention, il est préférable qu'ils soient capables d'excréter l'aminoacide produit dans le milieu pour une récupération facile et économique. Dans des préparations de cellules comme on l'a décrit ci-dessus, des quantités suffisantes de transaminase seront présentes en association avec les cellules ou matières cellulaire pour effectuer la réaction. On utilise au moins environ 2,0 à environ 200,0 grammes de cellules (poids sec)par litre de la solution du substrat, de préférence au moins environ 4,0 à environ 80,0 grammes par litre. Quelle que soit la forme dans laquelle les cellules sont réellement utilisées dans le procédé, les indications des poids de catalyseur des cellules utilisés ici sont sur une base sèche. Des niveaux inférieurs du catalyseur permettront à des quantités significatives du précurseur de se décomposer avant de subir la transamination. L'étendue du problème de décomposition du précurseur dans des transaminations conventionnelles variera, selon 1' t -cétoacide précurseur et les conditions de réaction. Par exemple, la décomposi- tion sera accélérée quelque peu par la présence de sels de métaux multivalents, ainsi que par des conditions de pH acide, la lumière ultraviolette ou bien la présence d'oxygène. Alternativement, on peut utiliser un système exempt de cellule. La transamination est enzymatique et peut se passer dans une solution comprenant les enzymes ou transaminases appropriés. Par conséquent, il sera possible d'utiliser une préparation d'enzyme, c'est-à- dire un extrait brut ou un enzyme isolé et purifié, pour la réaction de transamination. Dans un autre mode de réalisation, on peut immobiliser l'enzyme sur un substrat approprié. Le précurseur d'aminoacide est l'acide oC-céto- carboxylique ou son sel. L' "'-cétoacide choisi pour une utilisation avec ce procédé dépendra de l'aminoacide qui est le produit souhaité de transamination. Par exemple, l'acide phénylpyruvique est converti en Lphénylalanine, l'acide O(-cétoisocaproique en L-leucine, l'acide 0 d'ammonium ou bien un précipité d'acide sulfurique. Dans le mode de réalisation préféré de l'invention, une solution du substrat comprenant des rapports molaires de l'acide aspartique et du précurseur d'aminoacide d'environ 1:2 à environ 2:1 dans un tampon biocompatible est préparée. Tout solvant ou tampon biocompatible qui n'interfère pas avec le processus de réaction et qui maintiendra le système réactionnel à la gamme préférée de pi d'environ 6,5 à environ 10, 0 peut être utilisé. Par exemple, environ 0,1 à 0,5 M de tampon de phosphate se sont révélés appropriés0 Alternativement, le pH peut être contrôlé en ajoutant un contrôleur du pH dans le système pour ajouter une base selon la nécessité. Il y aura une tendance à ce que le pH baisse tandis que la transamination se passe. 2567150 - Le donneur amino pour la transamination améliorée selon l'invention doit être l'acide aspartique ou doit comprendre sensiblement de l'acide aspartique. On a trouvé que le rendement très élevé en aminoacide était obtenu lorsque l'acide aspartique était le seul donneur amino présent dans le système réactionnel. En utilisant l'acide aspartique comme donneur amino, de l'acide oxalacétique se forme comme sous-produit de la trans- amination. L'acide oxalacétique est décomposé, à la fois spontanément et par voie catalytique, pour donner du gaz carbonique et de l'acide pyruvique. Bien entendu, il sera possible d'avoir d'autres donneurs amino présents dans le système et pour que ceux-ci soient utilisés par la transaminase. Cependant, au point que dans la réaction de transamination ne sont pas incorporés de donneurs d'amino d'acide aspartique, ce procédé perfectionné ne fonctionnera pas, et il n'y a pas d'acide oxalacétique sous-produit pour se décomposer. La présence du co-facteur pyridoxal-5-phosphate (P-5-P) est requise pour faciliter la transamination. Ce co-facteur se mélange avec l'enzyme, se convertit de manière transitoire en phosphate de pyridoxamine (PMP) et est régénéré dans la réaction générale. Il peut être souhaitable d'ajouter de faibles quantités de P-5-P pour améliorer la transamination. Par exemple, l'addition de P-5-P à des concentrations d'environ 0,1 y.M, peut être souhaitée, bien que de faibles quantités du co-facteur soient présentes avec la matière cellulaire ajoutée au système réactionnel. Il y a trois réactions potentielles limitant l'allure dans ce procédé perfectionné de transamination: (1) la bioconversion du précurseur en amirinoacide, (2) la décomposition de 1' 0 -cétoacide précurseur en produit sans valeur et (3) la décomposition de l'acide oxalacétique sousproduit. La première réaction, la bioconversion, peut facilement être produite en augmentant la charge du catalyseur de transamination, le catalyseur étant contenu dans la matière cellulaire. En entraînant la première réaction, l'étendue de la décomposition du précurseur (la seconde réaction) diminue. Par conséquent l'étape critique limitant l'allure devient alors la décomposition de l'acide oxalacétique. On peut voir que l'augmentation de la disponibilité du catalyseur de transamination sera très avantageuse uniquement si l'allure de décomposition de l'acide oxalacétique augmente simultanément. La décomposition de l'acide oxalacétique est une réaction de premier ordre, c'est-à-dire que l'allure de décomposition est proportionnelle à la concentration de l'acide oxalacétique dans le système. A de hautes concen- trations, il y a une décomposition plus rapide mais l'allure se ralentit tandis que la décomposition baisse la concen- tration. L'allure de décomposition spontanée pour une concentration de 0, 1 mole par litre est d'environ 6,7 x 10 3 mole par litre par heure. L'enlèvement de l'acide oxalacétique du système réactionnel par décomposi- tion spontanée aura tendance à entraîner la conversion du précurseur en aminoacide vers l'aboutissement. Cependant, dans les stades initiaux d'une transamination biologique- ment catalysée, l'acide oxalacétique peut être produit à une allure pouvant être 5 à 10 fois plus rapide que son allure de décomposition spontanée, ou même plus, si le système de transamination le permet. Ainsi, même avec une décomposition spontanée, il y a une tendance marquée à ce que l'acide oxalacétique s'accumule dans le système, en particulier aux stades précoces de la réaction, car l'allure de décomposition spontanée n'est plus suffisamment rapide pour éliminer les effets de l'équilibre sur la réaction de transamination. La décomposition de l'acide oxalacétique peut être catalysée par la présence d'ions métalliques multi- valents et inorganiques comme A 1+3, A1 +4, Ni+2, Mn+2 +2 +2 +2 +3 +2 +2 +2 3 +2 +3 Mg, Pb, Ag, Fe+, Fe+2, Zn,+2 Cr,+2 Cr+ C+2 Co+ p+2 A+3 Pd, Au,+3 etc., ou leurs sels.Par exemple, les ions métalliques peuvent être ajoutés sous forme soluble, comme les sels de sulfate, sulfure ou chlorure de ces métaux. Alternativement, des particules de métaux comme de l'alumine, du plomb ou du fer peuvent être ajoutées comme catalyseur. Des pièces solides de métal seront avantageuses du point de vue procédé, car le catalyseur ne sera pas perdu dans le courant du produit. Les ions métalliques multivalents utiles pour catalyser la décomposition de l'acide oxalacétique sont également responsables d'une certaine décomposition de 1' "-cétoacide précurseur. Cependant, l'allure de la décomposition catalysée de l'acide oxalacétique est suffisamment élevée pour que les quantités relatives du précurseur qui se décompose soient sans importance dans la réaction générale. En effet, la transamination se passe à une allure qui permet à relativement peu de précurseur de se décomposer. Le choix des ions de métal, ou leurs sels, sera spécifique du système. I1 sera usuellement préférable, pour la facilité et l'économie, de choisir ceux qui sont déjà présents dans les courants du précurseur de l'acide aspartique utilisé dans la transamination. Les ions métalliques préférés sont ceux de magnésium, fer, aluminium et zinc. Le fer, l'aluminium et le zinc donnent générale- ment des allures et des rendements supérieurs. Le magnésium, bien que donnant une allure et un rendement quelque peu plus faibles, est néanmoins l'un des cataly- seurs métalliques préférés du fait de sa solubilité et de son faible prix. Des considérations de prix peuvent jouer un rôle, l'argent et le plomb étant plus coûteux et le fer et le nickel moins coûteux. Le cuivre peut provoquer la formation de couleur, qui ne sera pas souhaitée dans certaines applications et on pense qu'il dénature la transaminase et qu'il chélate les aminoacides. Certains ions métalliques, le cuivre et le fer par exemple, peuvent être des co-facteurs ou accentuer d'autres produits produisant l'activité de l'enzyme qui devront Z56715O être retirés. Des ions de calcium ne sont pas souhaitables dans ce procédé du fait de leur tendance à précipiter le précurseur de la solution. Le manganèse est toxique pour les êtres humains et ne sera pas un choix préféré du fait des problèmes pour éviter l'exposition des êtres humains au procédé et aux courants résiduels, bien que les sels de manganèse aient été démontrés comme étant utiles dans ce procédé. Les ions métalliques augmenteront l'allure de la réaction de décomposition d'au moins deux ordres de gran- deur par rapport à l'allure spontanée d'environ 6,7 x10- 3 mole par litre par jour, même à de très faibles concentrations. Par exemple-, à de hautes concentrations de 1 'acide oxalacétique,environ 0,1 mole par litre, l'allure de décomposition catalysée peut être d'environ 0,1 à 2,0 moles par litre par heure. A des concentrations plus faibles de l'acide oxalacétique, environ 0,02 mole par litre, l'allure de décomposition catalysée peut être d'environ 0,01 à 0,2 mole par litre par heure. Cette variation de l'allure est due à des variations de l'effi- cacité et de la concentration du catalyseur métallique utilisé, ainsi que la température et le pH de la réaction. Dans ces gammes, 1'inhibition de l'allure de transamination par la présence de l'acide oxalacétique dans le système est efficacement éliminéeo En présence de ces ions métal- liques multivalents, des allures de transamination volumé- trique jusqu'à environ 10,0 moles par litre par heure aux stades précoces de la conversion et d'environ 0,05 à 0,2 mole par litre par heure en général peuvent être obtenues sans indication d'inhibition de l'acide oxalacétique. La concentration des ions métalliques utilisés pour catalyser la décomposition correspond de préférence à l'allure de transamination, c'est-à-dire à l'allure à laquelle l'acide oxalacétique se forme via transamination La présence d'au moins environ 1,0 x 10-4 mole par litre de l'ion commence à provoquer une catalyse déltectable de la décomposition de l'acide oxalacétique. A des concen- trations en ions métalliques au delà d'environ 1,0 x 101, il y aura peu ou pas d'augmentation sensible de l'allure de décomposition. La gamme sera typiquement d'environ 1,0 x 10- 3 à environ 1,0 x 10-1 mole par litre. Il faut garder à l'esprit que lorsque l'on détermine la quantité des sels à ajouter au système, les solubilités des divers sels varient. Pour l'utilisation de métaux insolubles o)ur cette catalyse, on peut utiliser des quantités jusqu'à environ 20 g/e. La préparation de cellules ou d'enzymes est mise en contact par une solution de l'acide aspartique précur- seur dans un récipient réactionnel approprié. Les conditions réactionnelles pour le procédé de l'invention doivent être choisies pour améliorer la stabilité de l'enzyme et seront déterminées selon le système général de la réaction de transamination choisi. La gamme de température peut être d'environ 20 à environ 50 C, de préférence d'environ à environ 40 C. Le pH peut être d'environ 6,5 à environ 10,0, de préférence d'environ 7,5 à environ 8,5. L'ajuste- ment du pH peut être fait par toute base compatible avec système d'enzymes, de préférence avec de l'ammoniaque ou de la potasse, dont chacune aidera à solubiliser l'aminoacide précurseur et l'acide aspartique. La réaction ne nécessite pas d'aération, à moins que l'on utilise des cellules vivantes en croissance, mais il doit y avoir une certaine agitation ou mouvement des cellules relativement au substrat afin de maximiser l'interaction biocatalyseur- substrat. On peut s'attendre à ce que la réaction de transamination soit terminée en moins d'environ 40 heures, de préférence moins d'environ 4 heures lorsque l'on emploie des concentrations élevées du biocatalyseur. Un autre indicateur sera l'allure spécifique de réaction, c'est-à-dire les moles de l'aminoacide produit par gramme du poids de cellules sèches par heure. Dans le procédé de l'invention, cet indicateur peut être compris entre environ 0,0001 et environ 0,1, de préférence environ 0,002 et environ 0,05 mole d'aminoacide produit par gramme de poids de cellules sèches par jour. Typiquement cependant, l'allure spécifique sera d'environ 0,0005 à environ 0,01 mole d'aminoacide par gramme de poids de cellules sèches par heure. Les produits de décomposition de l'acide oxalacétique sont le gaz carbonique et l'acide pyruvique. Le gaz carbonique se dissipera si la réaction est entreprise dans un récipient ouvert et que le pH est proche du neutre ou bien s'il peut être recueilli soit pour une évacuation ou pour une utilisation dans d'autres procédés. Si le pH est au delà d'environ 7,5, le gaz carbonique restera dissous dans la solution. On pense qu'au moins une partie minuscule de l'acide pyruvique se convertit en alanine par transamination ou par décarboxy- lation avec l'acide aspartique. La quantité relative d'alanine formée variera avec le biocatalyseur utilisé dans la transamination. Ainsi, aussi bien de l'acide pyruvique que des petites quantités d'alanine seront présents, mais les deux peuvent facilement être retirés par des méthodes conventionnelles de séparation. La transamination biologique améliorée de l'invention peut avoir pour résultat des rendements extrêmement élevés en aminoacide relativement à la fois à l'acide aspartique et ou précurseurs d'aminoacide. En effet, il peut y avoir transamination de 90% de l'acide aspartique ou plus dans la réaction et il peut y avoir conversion de 90% ou plus du précurseur en aminoacide Par ailleurs, l'allure de transamination est fortement accrue, ce qui conduit à la fois à des rendements accrus et à des durées dilinuées de réaction. Quand la réaction est terminée, l'aminoacide produit peut être récupéré par des méthodes conventionnelles. Les méthodes typiques de récupération de produit souhaité peuvent comprendre des procédés d'échange d'ions et/ou de cristallisation fractionnée. Les exemples qui suivent sont donnés pour illustrer l'invention et ne doivent pas en limiter le cadre. Les abréviations suivantes ont été utilisées dans toute la description de l'invention: Ag - argent A1 - aluminium Au - or C: degrés Celsius Co - cobalt Cr chrome Cu - cuivre SD: solution de développement Fe - fer g: gramme :litre M - molaire Mg - magnésium vu>- micro m: millilitre Mn - manganèse Na sodium Ni - nickel DO: densité optique P-5-P - pyridoxal-5-phosphate Pb plomb Pd - palladium %: pourcent PPA - acide phénylpyruvique ppm: parties par million TYR tyrosine Zn - zinc Dans les tableaux qui illustrent les résultats obtenus dans les exemples, le taux spécifique, le taux volumétrique et le rendement sont calculés comme suit: . moles produites Taux spécifique moles produites grammes cellules-heure moles produites Taux volumétrique m litre-heure Rendement moles produites Rendement= limites théoriques des moles La limite théorique est basée sur les moles du précurseur ou de l'acide spartique dont on dispose. EXEMPLE I (Effet des ions manganèse sur l'activité de la transaminase) Une solution de synthèse a été préparée comprenant 17,4 g/. d'acide phénylpyruvique-sodium (Na-PPA) (monohydraté) (Sigma Chemical Co) et 11,09 g/1_ d'acide aspartique (Sigma Chemical Co) dans un tampon à 0,1 M de phosphate avec 0, 1 jp.M de pyridoxal-5-phosphate (P-5-P), pH ajusté à 7,5 avec de 1' ammoniac aqueux et de l'acide sulfurique. On a préparé six échantillons de 100 m -o A trois échantillons, on a ajouté 1,0 x 10 3 M MnSO4 les échantillons restants ont été utilisés comme témoins. Les solutions ont été ajoutées à des coupes sous agitation chemisées de 150 mi que l'on a maintenues à 37 C et sous une légère agitation. Une préparation de cellules sèches a été formée à la façon qui suit: on a fait croître Pseudomonas pseudo- alcaligenes ATCC 12815 dans 14 litres d'un bouillon de soja de Trypticase pendant 24 heures à 35 Co Les cellules ont été récoltées par centrifugation et séchées dans un four à vide à 37 C pendant 12 heures. Les cellules séchées ont été ajoutées en quantités de 10, 5 et 2 grammes par litre aux solutions expérimentales et témoins. Les solutions ont été maintenues à environ 37 C sous une légère agitation. Les échantillons ont été prélevés à 5 et 24 heures pour l'analyse, par détermination calorimétrique au chlorure ferrique pour PPA (processus décrits ci-dessous) et par HPLC pour la phénylalanine et l'acide aspartique. Les résultats sont montrés au tableau I. Il est apparent que pour les échantillons témoins, c'est-à-dire sans l'addition du sel de métal, le taux ou l'allure de transamination volumétrique reste constant malgré une charge plus importante du catalyseur. L'addition de MnSO4 conduit à une augmentation dramatique des taux volumé- triques et spécifiques de transamination en comparaison au témoin, en plus des rendements supérieurs de L-phénylalanine. Tableau I (Addition de Mn +2) Témoin (pas de Mn+2) Temps: 5 heures 24 heures Charge du catalyseur: 10 g/t. 5 g/t 2 g/z 10 g/Z 5 g/. 2 g/L PPA (g/-L) 4,70 3, 80 4,60 0,70 0,80 0,50 ASP (g/) 3,77 2,20 2,93 2,28 4,50 1,60 PHE (g/f) 8, 61 8,20 7,68 11,55 10,55 10,20 ALA (g/.) -- -- -- -- -- -- Taux spécifique 0,00104 0,002 0,0046 0,0003 0,0005 0,0012 Taux volumétrique 0,0104 0,01 0,01 0,003 0,0027 0,0025 Rendement (PHE/PPA) 62% 62% 57% 84% 76% 75% sOO Rendement (PHE/ASP) 62% 62% 57% 95%0 120% 89a% Expérimental (1,0 x 10 3 M Mn+2 ajouté) Temps: 5 heures 24 heures Charge du catalyseur: 10 g/k 5 q/. 2 q/e. 10 q/ 5.g/-_ 2 g/ PPA (g/L-) 0,30 1,25 3,89 0,05 0,40 0,30 ASP (g/2) 2,84 2,77 5,08 0,69 1,00 1,34 PHE (g/,P-) 12,69 10,67 7,67 13,95 12,47 12,16 ALA (g/-) 0,62 0,27 -- 0,84 0,79 0,43 Taux spécifique 0,0015 0,0026 0,0046 0,00035 0,0006 0,0015 Taux volumétrique 0,015 0,013 0,01 0,0035 0,0031 0,003 Rendement (PHE/PPA) 93% 78% 57% 101% 90% 88% o> Rendement (PHE/ASP) 93% 78% 57% 106% 99,6% 101% 1 - Erreur analytique apparente. o 256 15 v EXEMPLE II (Effet des ions magnésium sur l'activité de la transaminase) On a préparé une solution de synthèse comprenant 17,71 g/L de Na-PPA (monohydraté) (Sigma Chemical Co) et 12,35 g/L- d'acide aspartique (Sigma Chemical Co) 2 dans 0,05 M de tampon de phosphate avec 1,0 x 102 M de MgS04 et 0,1 >>M de P-5-P, pH ajusté à 7,5 avec de 1' ammoniac aqueux et de l'acide sulfurique. Des portions de 100 ml ont été placées dans cinq coupes sous agitation chemisées de 150 m - chauffées à 37 C et maintenues sous agitation modérée. On a préparé des cellules sèches de Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC 12815 comme à l'exemple I. Les cellules ont été ajoutées auc coupes aux quantités suivantes: 15, 10, 5,0, 2,0 et 1,0 grammes par litre respectivement. Des échantillons ont été prélevés à 1 et 24 heures et analysés comme à l'exemple I. Les résultats, montrés au tableau II, indiquent qu'avec l'addition de MgS04, l'on n'observe aucune répression de la transamination par l'acide oxaloacétique, et que les taux réactionnels volumétriques ainsi que les rendements généraux augmentent. Tableau II (Addition de Mg+2) Temps: i heure 24 heures Charge du catalyseur: 15 g/L 10 g/2- 5 g/t i g/i. 15 g/L 10 g/n 5 g/i i g/ PPA (g/L)* 8,81 9,76 11,00 13,84 0,00 0,15 0,15 0,95 ASP (g/a) 9,44 10,29 10,13 11,75 0,92 0,93 1,18 2,08 PHE (g/) 7,96 4,60 2,99 0,57 14,18 13,87 13,52 11,47 ALA (g/) -- -- - 0,52 '0,35 0,19 0,79 Taux spécifique 0,0032 0,0028 0,0036 0,0035 0, 00024 0,00035 0,00068 0,0029 Taux volumétrique 0,048 0,028 0,018 0,0035 0, 0036 0,0035 0,0034 0,0029 Rendement (PHE/PPA) 56% 32% 21, 4% lO100 98% 96% 81 % * sous forme d'acide phénylpyruvique Ul EXEMPLE III (Effet de la concentration en ions magnésium sur l'activité de la transaminase) On a préparé une solution de synthèse comprenant 17,0 g/t de Na-PPA (monohydraté) (Sigma Chemical Co) (sel de sodium) et 11,0 g/Ld'acide aspartique (Sigma Chemical Co) dans 0,1 M de tampon de phosphate avec 1,0 x -104 M de P-5-P, pH ajusté à 7,5 avec de l'ammoniac aqueux et de l'acide sulfurique. Des portions de 100 m0 ont été placées dans des coupes chemisées sous agitation avec des quantités variables de sulfate de magnésium +2 pour obtenir les concentrations en Mg2 indiquées au tableau III. Les solutions ont été maintenues à 37 C et sous agitation modérée. Des cellules séchées de Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC 12815 ont été préparées comme à l'exemple I. A chaque solution, on a ajouté 0,5 g de cellules séchées. Des échantillons ont été analysés comme à l'exemple I à 0,2 et 5 heures. Les résultats, montrés au tableau III, indiquent que des concentrations croissantes des ions Mg+2 correspondent à une augmenta- tion des taux de transamination et des rendements totaux. Tableau III (Concentrations variables de Mg) Concentration de Mg 0 3 x 10-4 X 10 3 x 1 0-33 x 10-32 3 x 102 (moles/litre) 0 heure PPA (g/.) 17,20 17,00 16,70 16,90 17,20 17,10 ASP (g/L) 13,00 13,30 13,20 13,40 13,30 13,90 2 heures PPA (g/Q) 9,96 7,82 7,03 6,40 8,02 9,01 ASP (g/L) 5,92 3,00 2,50 3,30 3, 44 3,45 PHE (g/1) 8,93 11,73 12,80 11,52 11,07 11,60 Taux spécifique 0, 0054 0,007 0,0078 0,007 0,0067 0,007 Taux volumétrique 0,027 0,036 0,039 0,035 0,034 0,035 heures PPA (g/ ) 6,50 2,40 2,21 2,63 2,12 2,70 ASP (g/Q) 2,70 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 PHE (g/P) 12,70 15,20 15,40 15,60 16,00 15, 90 Taux spécifique 0,003 0,0037 0,0037 0,0038 0,0039 0,0039 Rendement (PHE/PPA) 74,0% 80,4% 92,0% 92,0% 93,0% 93,0%O sous forme d'acide phénylpyruvique EXEMPLE IV (Effet des divers sels sur l'activité de la transaminase) Une solution de synthèse a été préparée comprenant 20,6 g/4, de Na-PPA (monohydraté) (Sigma Chemical Co) et 13,5 g/2- d'acide aspartique (Sigma Chemical Co) dans 0,1 M de tampon de phoshate avec 0,1 / M de P-5-P. Des échantillons de 100 m Q de cette solution ont été préparés et on a ajouté, à chaque échantillon, -3 1,0 x 103 mole par litre de l'un des sels suivants: sulfate de magnésium, sulfate de manganèse, sulfate de cuivre, chlorure de calcium, sulfate d'aluminium et sulfate de fer. Un échantillon a été maintenu comme témoin, sans sels ajoutés. Le pH de chaque solution a été ajusté à 8,5 et on l'a doucement agitée. On a préparé des cellules séchées de Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC 12815 comme à l'exemple I. A chaque solution on a ajouté 0,5 g de cellules séchées. Les solutions ont été maintenues à 37 C sous agitation modérée. Des échantillons ont été prélevés à 0, 5 et 24 heures et analysés comme à l'exemple I. Les résultats, montrés au tableau IV, +2-i-2 +3 +2 indiquent que les sels de Mg+2, Mn+2, Al +3et Fe+2 sont efficaces pour augmenter le taux de transamination et le rendement. Tableau IV (Comparaison de divers sels) MnS Il4 12542 FeSO4 MgS04 MnSO4 CuSO4 CaC12 A12(504)2 Témoin 0 heure PPA (g/ú) 16,30 16,04 16,30 16,20 16,55 15,90 16, 40 ASP (g/.) 13,10 15,50 13,74 14,40 12,74 14,34 14,32 heures PPA (g/A)) 8,33 6,33 9,00 8,10 8,30 9,30 6,20 ASP (g/) 4,47 5,47 9,00 16,80 4,90 6, 93 8,20 PHE (g/) 8,44 8,59 3,09 2,75 8,85 7,10 6,20 Taux volumétrique 0, 011 0,011 0,0037 0,0033 0,011 0,009 0,007 Taux spécifique 0,002 0,0021 0, 00075 0,00067 0,0021 0,0018 0,0017 24 heures PPA (g/Z) 0,00 0,00 2,20 1, 70 0,00 0,00 0,00 ASP (g/.L) 0,97 1,27 8,90 5,74 1,68 3,20 4,10 PHE (g/) 15,50 14,90 6,86 4,95 14,95 14,00 13,20 Rendement (PHE/ PPA) 94,9,% 93>0% 45,0% 30,0,% 90,0%' 88,090 80 0% Rendement (PHE/ ASP) 95,0% 78,0,% 60,0% 36,0,% 95,0% 80,0,% 74,0,% * sous forme d'aecide phénylpyruvique r4 *sous forme d'acide phénylpyruvique EXEMPLE V (Comparaison des métaux solubles et insolubles) Une solution de synthèse a été préparée comprenant 30,0 g/k- de Na-PPA (monohydraté) (Sigma Chemical Co) et 24,0 g/2 d'acide aspartique (Sigma Chemical Co) dans 0,1 M de tampon de phosphate avec 0,1 %M de P-5-P et 100 ppm de Barquat MB-SO (Marque) (Lonza Inc) en tant qu'agent désinfectant. L'un de ce qui suit a été ajouté àdes portions respectives de 100 mL de la solution: 1,0 x 10- M de MgS04, 1,0 xlO-2 M de MgS04, 1,0 x 10-2 M de A12(S04)3,et 100 g/L de boulettes d'alumine (maille US environ 40). Le pH des solutions a été ajusté à 8,5 avec de 1' ammoniac aqueux et de l'acide sulfurique. A chaque solution on a ajouté 5,0 g de cellules humides de Pseudomonas pseudoalcaliienes ATCC 12815 (72%o d'humidité). Les solutions ont été chauffées à 35 C et maintenues sous une agitation modérée. Des échantillons ont été prélevés à 0, 1, 5 et 24 heures et analysés comme à l'exemple 1. Les résultats, montrés au tableau V, indiquent que l'utilisation des boulettes d'alumine est à peu près aussi efficace que le sulfate de magnésium ou le sulfate d'aluminium pour augmenter le taux réactionnel volumétrique et le rendement total pour la transamination. Tableau V (Boulettes d'alumine en fonction des sels de métal) 1 x 10- 3 M 1 x 10- 2 M 1 x 102 M 10 g/9 îo2 -2 Boulettes Métal catalyseur MgSO4 MgS04 Al2(S04) 3 d'alumine 4 4 A2(S4)3d'alumine 0 heure PPA (g/t) 23,54 23,07 23,82 23, 83 ASP (g/e) 23,20 24,07 24,00 24,03 1 heure PPA (g/Q)* 16,52 15,31 17,40 15,17 ASP (g/) 18,49 17,73 20,20 16,04 PHE (g/Q) 7,18 9,18 6,40 8,59 Taux volumétrique 0,44 0,053 0,038 0,052 Taux spécifique 0,0031 0,0038 0,0028 0,0037 heures PPA (g/Q) 2,84 2,10 4,57 2,07 ASP (g/Q-) 7,73 6,22 7,73 6, 02 PHE (g/L) 19,05 19,74 19,05 21,95 Taux volumétrique 0,025 0,024 0,023 0,027 Taux spécifique 0,0016 0,0017 0,0016 0,0019 24 heures PPA (g/,-) 0, 00 0,00 0,00 0,00 ASP (g/L) 4,69 3,47 4,80 3,46 PHE (g/t) 23,45 22,79 22, 20 22,75 Rendement (PHE/PPA) 99,6% 98,9% 93,0% 95,5,% N - * sous forme d'acide phénylpyruvique Ln Z567150 EXEMPLE VI (Production de tyrosine) Une solution de synthèse a été préparée en dissolvant 1,25 g d'acide p-hydroxyphénylpyruvique (pH-PPA) (Sigma Chemical Co) dans 50 mû de 0,1 M de tampon de phosphate en même temps que 1,0 g d'acide aspartique (Sigma Chemical Co), 0,1 y-M de P-5-P et 1,0 x 10-3 M/-Q- de sulfate de zinc. Le pH de la solution a été ajusté à 8,0. Des cellules de E. coli ATCC 11303 ont été immobilisées dans une mousse de polyuréthane Hypol (marque déposée) (HFP 3000, W. R. Grace & Co) préparée en mélangeant 50,0 g d'une pâte de cellules à 75% d'humidité avec 50,0 g du prépolymère Hypol (marque déposée). On a laissé le mélange durcir environ 15 minutes et la mousse durcie a été coupée en petits morceaux d'environ 6,35 mm de dimension. On a ajouté un total de 4,0 g de mousse durcie à la solution préparée de pH-PPA. La solution a été maintenue à 37 C sous une légère agitation. - Des échantillons ont été prélevés à 0, 3 et 18 heures et analysés par chromatographie en couche mince (TLC) et HPLC pour la tyrosine et l'acide aspartique. Au bout de 3 heures, les solutions sont devenues troubles avec précipité produit sous forme de tyrosine. Pour récupérer le produit, la bouillie et la mousse ont été lavées avec un volume égal d'acétone et la mousse filtrée avec un entonnoir de Buchner. La solution qui comprenait environ 12 g/t de tyrosine en solution, a été centrifugée à 3.000 t/mn. La boulette résultante de l'aminoacide a été recueillie et séchée. On a recueilli 1,lg du produit sec au total que l'on a identifié par TLC et HPLC comme étant de la tyrosine. Le produit s'est révélé avoir une pureté > 90% par titrage non aqueux. Les résultats, montrés au tableau VI, indiquent que la méthode décrite ici est appropriée pour la production rapide de tyrosine à des rendements élevés. Tableau VI (Production de tyrosine) Temps: 0 heure 3 heures 18 heures pH-PPA (g/.) 25,0 --. ASP (g/L) 18,5 16,2 1,2 TYR1 0,0 1,2 1,2 TYR2 0,0 --, l'o' k- - Rendement (TYR/pH-PPA) -- -- 85% Rendement (TYR/ASP) -- -- 80% lg g/jL tyrosine en solution au moment de l'échantillon 2 9g tyrosine en rendement total dans la boulette sèche f uI Ln C> Z567150 Détermination colorimétrique au chlorure ferrique pour l'acide pyruvique, le sel de sodium Principe: L'acide phénylpyruvique (PPA) forme un complexe vert avec les ions ferriques. L'intensité de la couleur verte est proportionnelle à la quantité de PPA présent. Réactifs: 1. Solution de Développement (SD) (1.000 m') - Mélanger les ingrédients qui suivent et refroidir à la température ambiante dans un bain de glace. Ajouter le contenu à un ballon volumétrique de 1 litre et amener au volume avec de l'eau désionisée. Ingrédients: 0,5 g de FeC1 3.6H20; 20 m-L d'acide acétique glacial; 600 me de diméthylsulfoxyde; 200 mt d'eau désionisée. 2. Solution standard de Na-PPA (10 q/) - Ajouter 500 mg de Na-PPA.H20(Aldrich Chemical Co, Inc., 98,%-100%, pur) à 40 mQ de 0,1 M de tampon Tris/HC1 (pH 8,0) à 34 C. Agiter jusqu'à dissolution. PLacer la solution dans un ballon volumétrique de 50 m-- et amener au volume avec le tampon Tris-HCl. Stocker à l'état réfrigéré. Pour 0,1 M de tampon Tris/HCl: ajouter 900 mL d'eau désionisée à 12,11 g de tampon Tris; ajuster le pH à 8,0 avec HC1; verser dans le ballon volumétrique; ajouter de l'eau désionisée jusqu'à 1.000 mi. Courbe de Calibrage: Ajouter la Solution Standard Na-PPA et 4,95 m de la Solution de Développement à des tubes de spectro- photomètre en verre. Mélanger au tourbillon. Laisser au repos pendant exactement 10 minutes (en commençant à compter le temps avec l'addition de SD au premier tube). Lire la densité optique (DO) à 640 nm. Préparer la courbe de Calibrage Standard de Na-PPA.H20 (l'axe vertical est l'absorbance; l'axe horizontal est mg de Na-PPA.H20/mQ SD). Mg Na-PPA.H20 Na-PPA Standard par mt SD - 0,01 0,02 15x' 0,03 0,04 ) 0,05 302-L 0,06 Calcul DO x 100 x dilution Na-PPA.H20= (mg/mL) pente de courbe standard ou DO x 100 x dilution x 164,4 PPA (g/t) pente de courbe standard 204,16 R E V E N D I C A T I 0 N S 1.- Procédé pour entreprendre la transamination d'un précurseur d'aminoacide en son L-aminoacide correspon- dant, caractérisé en ce qu'il consiste à (a) choisir l'acide aspartique comme donneur amino, (b) choisir 1' oQ-cétoacide approprié comme précurseur d'aminoacide, (c) choisir une transaminase intra- ou extra- cellulaire appropriée, (d) coupler la réaction de transamination à la décomposition catalysée de l'acide oxalacétique sous- produit de la transamination, dans des conditions favo- rables à l'activité de-la transaminase, ladite décomposi- tion catalysée étant effectuée en ajoutant, au système réactionnel, des ions métalliques multivalents ou leurs sels et (e) laisser la transamination se passer. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les ions métalliques multivalents précités sont choisis dans le groupe consistant en Al 3, Al +4, Mg+2 Mn2 +2 p+2 A+2 F+2 Fe +3 +2 +2 C+3 Ni'N Pb, Ag, Fe, Fe, Zn+, Cr+, Cr Co +2 Co3 Pd+2 et Au+3. 3.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les ions métalliques multivalents sont présents en quantité d'au moins environ 1,0 x 10-4 mole par litre. 4.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les ions précités sont présents en une quantité d'environ 5,0 x 10-3 à environ 1,0 x 10-1 mole par litre. 5.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les ions métalliques multivalents sont produits sous la forme de particules de métal ou de sels solubles. 6.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide oxalacétique, produit de la trans- amination, se décompose à une allure d'environ 0,02 à environ 2,0 moles par litre par heure. 7.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que des taux de transamination volumé- trique d'environ 0,05 à environ 10,0 moles par litre par heure sont obtenus. 8.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'o(cétoacide précurseur et le L-aminoacide sont choisis dans le groupe comprenant les paires qui suivent: acide phénylpyruvique pour produire de la L-phénylalanine, acide c pour produire de la L-thréonine, acide p-hydroxyphényl- pyruvique pour produire de la L-tyrosine, acide indole pyruvique pour produire du L-tryptophane, acide c histidinal pour produire de la L-histidine et acide 0(-céto-"/méthylvalérique pour produire de la L-isoleucine. 9.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les rapports molaires de l'acide aspartique et du précurseur d'aminoacide sont d'environ 1:2 à environ 2:1. 10.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la transaminase précitée est présente en association avec des microorganismes choisis dans le groupe consistant en Pseudomonas, Brevibacterium, Bacillus, Aerobacter, Escherichia coli, Candida et micro-organismes halophiles. 11.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on accumule et on recueille le L-aminoacide.