FR 2571724 A1 19860418 FR 8515254 A 19851015 2 5 7 1 7 2 4 COMPLEXES METALLIQUES DE DERIVES DU BIS-INDOLE ET COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES AQUEUSES LES CONTENANT L'invention a pour objet de nouvelles compositions pharmaceutiques contenant un composé comportant le squelette du bis-indole ou un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables sous une forme stable en milieu aqueux. L'invention a plus particulièrement pour objet des compositions pharmaceutiques qui contiennent un dérivé du bis-indole sous la forme de son complexe métallique, ce composé présentant une stabilité accrue en milieu aqueux par comparaison avec les compositions qui contiennent le dérivé du bis-indole seul. L'invention a également pour objet un procédé de préparation de ces compositions. L'invention a encore pour objet les nouveaux complexes métalliques pharmaceutiquement acceptables des dérivés du bis-indole aussi bien qu'un procédé pour leur préparation. Les premiers dérivés connus comportant le squelette du bis-indole sont des alcaloïdes présents dans la plante Vinca rosea L, à partir de laquelle on a isolé tout d'abord la vinblastine (VLB) (voir le brevet US n 3 097 137) et ensuite la vincristine (VCR) et la leurosine (Leu; voir brevets US n 3 205 220 et 3 370 570). Puisque quelques-uns de ces alcaloïdes présentent une excellente activité anti-tumorale, on a préparé plusieurs dérivés modifiés par synthèse. Les dérivés connus indole-dihydroindole appliqués avec succès dans la thérapie des tumeurs sont représentés par la formule générale (I): 2 2571724 X uN t/,19 n, 6' 5'. 21t _ 1] CH3013 N'H,6 R4 (1I) R1 COR5 La formule générale (I) couvre deux groupes d'agents anti-tumoraux connus dans l'un des groupes, R1 représente un méthyle et dans l'autre groupe R1 représente un groupe formyle. Dans le premier cas, la signification des substituants est donc la suivante: R1 représente un groupe méthyle; R2 représente un atome d'hydrogène; R3 représente un groupe hydroxyle; ou R2 et R3 forment ensemble une liaison de valence; R4 représente un groupe hydroxyle ou un groupe acétoxy; et R5 représente un groupe méthoxy ou un groupe amino. Dans l'autre cas, la définition des substituants est la suivante: R1 représente un groupe formyle; R2 représente un atome d'hydrogène; et R3 représente un groupe hydroxyle; ou R2 et R3 forment ensemble un groupe époxy; R4 représente un atome d'hydrogène ou un groupe acétoxy; et R5 représente un méthoxy. Les composés préférés couverts par la formule générale (I), dans lesquels R1 représente un groupe méthyle sont les suivants: 35. la vinblastine (VLB), correspondant à la formule générale (I), lorsque: R2 représente un atome d'hydrogène; R3 représente un groupe hydroxyle; R4 représente un acétoxy; 257 1724 R5 représente un méthoxy et, dans la position 20' du squelette, l'hydroxyle présente une configuration e et le groupe éthyle présente une configuration a; la leurosidine correspondant à la formule générale (I), lorsque: R2, R3, R4 et R5 ont la même signification que dans le cas de la VLB, mais dans la position 20' du squelette, l'hydroxyle présente une configuration a et le groupe éthyle présente une configuration À; À la 15',20'-anhydro-vinblastine, correspondant à la formule générale (I), lorsque: R2 et R3 forment ensemble une liaison de valence; R4 représente un acétoxy; et R5 représente un groupe méthoxy; et la vindesine correspondant à la formule générale (I) lorsque: R2 représente un hydrogène; R3 représente un hydroxyle; R4 représente un hydroxyle; et R5 représente un groupe amino et, dans la position 20', l'hydroxyle a une configuration 8 et le groupe éthyle a une configuration a. Les composés préférés couverts par la formule générale (I) dans lesquels R1 représente un groupe formyle sont les suivants: la vincristine (VCR) correspondant à la formule générale (I) lorsque: R2 représente un hydrogène; R3 représente un hydroxyle; R4 représente un acétoxy; et- R5 représente un groupe méthoxy et, dans la position 20', le groupe hydroxy présente une configuration 8 et le groupe éthyle a une configuration a. la N-desméthyl-N-formyl-leurosine, correspondant à la formule géné- rale (I), lorsque: R2 et R3 forment ensemble un pont a-a-époxy, R4 représente un acétoxy; et R5 représente un groupe méthoxy, et le groupe éthyle en position 20' présente une configuration 8; la 17-désacétoxyvincristine, correspondant à la formule générale (I), lorsque: R4 représente un hydrogène et les autres substituants sont les mêmes que dans le cas de la VCR; et 7 1724 la 15'-20'-anhydro-vincristine, correspondant à la formule générale (I), lorsque: R2 et R3 forment ensemble une liaison de valence; R4 représente un acétoxy; et R5 représente un groupe méthoxy. Les dérivés du bis-indole sont généralement administrés par voie intra-veineuse aux patients souffrant d'une affection néoplasique. A cette fin, les composés actifs doivent être mis sous la forme d'une solution stable (c'est-à-dire solution ou infusion injectable), que l'on peut directement injecter aux patients. Cependant, par suite de la stabilité insuffisante des dérivés de l'indole dimère en solutions aqueuses, il y avait jusqu'à tout récemment peu d'espérance d'obtenir une formulation directement utilisable. Les trois dérivés du bis-indole, c'est-à-dire la vincristine, la vinblastine et la vindésine, classiquement utilisés dans la pratique clinique sont disponibles dans deux ampoules séparées, l'une contenant l'ingrédient actif lyophilisé (ampoule de poudre) et l'autre contenant le solvant stérile (ampoule de solvant) destinée à la dissolution du composant actif avant utilisation. Cette présentation en deux ampoules entraîne cependant plusieurs inconvénients. Tout d'abord, la lyophilisa- tion est coûteuse et ensuite la dissolution de chaque échantillon lyophilisé doit être effectuée selon des normes approuvées de stérilité et d'apyrogénicité pour éviter des risques lors de l'administration. Un procédé amélioré de formulation des diméres de vinca est décrite dans le brevet belge n 897 280. Dans ce procédé, des composi- tions médicales aqueuses contenant un dimère de vinca sont préparées par dissolution d'un sel pharmaceutiquement acceptable d'un dimére de vinca et par addition à la solution d'un polyol et d'un tampon d'acétate pour maintenir le pH de la solution à une valeur comprise entre 3 et 5 et un agent bactériostatique. Aucun test de stabilité au stockage n'est décrit, mais il est simplement exposé que 94 à 99% de la teneur en ingrédient actif original sont encore présents après une période de stockage de neuf mois si les échantillons sont stockés à 5 C. Entre temps, une composition de vincristine en une seule ampoule a été mise sur le marché pour laquelle était garantie une stabilité au stockage d'un an à une température de stockage de 5 C. 7 17 24 Le but de la présente invention est de procurer une formulation de dérivés d'indole dimères supérieure à celle que l'on connaît, c'est-à- dire qui soit stable au stockage même à la température ambiante pendant une longue période de temps. On a trouvé que les dérivés du bis-indole et leurs sels d'addition d'acide, respectivement, forment facilement des complexes métalliques avec des ions métalliques bivalents ou multivalents susceptibles de donner lieu à la formation de complexes et les complexes obtenus pré- sentent d'excellentes propriétés de stabilité dans un milieu aqueux à un pH compris entre 3,0 et 6,0. La présente invention a donc pour objet un procédé de préparation d'un complexe métallique pharmaceutiquement acceptable d'un dérivé du bisindole et éventuellement de compositions pharmaceutiques aqueuses stables contenant ce complexe métallique dans lequel on fait réagir une solution d'un dérivé de bis-indole ou d'un de ses sels pharmaceutique- ment acceptables en milieu aqueux avec un sel soluble dans l'eau, non toxique, d'un métal bivalent ou multivalent capable de donner lieu à la formation d'un complexe à un pH de 3,0 à 6,0, un support pharmaceutique classique étant éventuellement présent ou y étant ajouté ensuite, et/ou un autre additif, ou si on le souhaite on isole le complexe métallique ainsi obtenu. Les nouveaux complexes aussi bien que les nouvelles formulations entrent également dans la cadre de la présente invention. Deux types de complexes formés par des alcaloïdes du bis-indole ont été décrits jusqu'à maintenant. Dans C.A. 99:140214s (1983) décri- vent le complexe de N-2'-borane de la 20'-déoxy-vinblastine en même temps que son analyse structurelle. Des complexes de tubuline des alcaloïdes du type vinblastine, plus actifs que les alcaloïdes libres, sont décrits dans le brevet belge n0 854 053. Selon la description de ce brevet, la tubuline, protéine de poids moléculaire élevée, forme un complexe avec la vinblastine et ses analogues à une valeur de pH de 6,6 à 7,6. Cependant, il n'est pas fait mention de la stabilité de l'un quelconque des complexes connus dans des solutions aqueuses. Selon la présente invention, la formation d'un complexe a lieu entre un dérivé du bis-indole ou d'un de ses sels et un sel soluble dans l'eau d'un métal bivalent ou multivalent capable de se complexer. La formation du complexe s'obtient dans l'eau à un pH de 3 à 6 et si on le 7 1724 souhaite, on récupère le complexe obtenu à partir de sa solution d'une façon connue en soi. Les ions métalliques considérés comme convenables pour la torma- tion de complexes pharmaceutiquement acceptables sont par exemple les ions de zinc(II), magnésium(II), calcium(II), cobalt(II), fer(II) ou nickel(II). On peut les appliquer sous la forme de leurs sels formés par exemple avec les anions carboxyliques monovalents saturés, par exemple le formiate et l'acétate ou avec un anion oxycarboxylique comportant 6 atomes de carbone, par exemple de gluconate, de lévulinate, de lacto- bionate, avec un disaccharide tel que le sucrose et avec des anions minéraux tels que le sulfate ou le chlorure. Les métaux que l'on préfère surtout sont le zinc(II), magnésium(II) et le calcium(II), surtout lorsqu'on les applique sous la forme d'un gluconate ou d'un acetate. On peut ajuster la valeur du pH comprise entre 3,0 et 6,0 à l'aide d'un tampon convenable, de préférence avec un tampon à l'acétate, formé d'un mélange d'acétate de sodium et d'acide acétique, qui maintient la valeur de pH requise au cours de la formation du complexe. Lorsque l'on doit préparer des solutions prêtes à l'emploi pour injections, on utilise le dérivé de bis-indole sous la forme d'un sel pharmaceutiquement acceptable en concentration thérapeutiquement effi- cace. Cette concentration varie d'un ingrédient actif à l'autre selon la dose efficace et le spectre thérapeutique des dérivés individuels du bisindole. On doit généralement appliquer à des concentrations de 0,01 à 10 mg/ml, de préférence de 0,01 à 10 mg/ml, notamment de 0,5 à 1,0 mg/ml. Un groupe de dérivés de bis-indole couvert par la formule générale (I) dans laquelle R1 représente un groupe formyle, par exemple la vincristine ou analogue est efficace dans un intervalle de doses inférieur à celui des autres groupes de composés tombant sous la formule générale (I) dans laquelle R1 représente un groupe méthyle, par exemple la vinblastine et analogue. Ainsi, des dérivés du type vincristine doivent généralement être appliqués à un niveau de concentration plus faible que les alcaloTdes du type de la vinblastine. Une analyse à l'équilibre des systèmes indique que dans les condi- tions ci-dessus, le composant bis-indole et les ions métalliques sont surtout présents dans le complexe dans un rapport molaire 1/1. Sur la base d'une formation constante du complexe, le composant métallique doit être appliqué avec un léger excès molaire par comparaison au dérivé de bis-indole pour éviter une formation incomplète du complexe. Ainsi, par 7 1724 exemple, à i mg de sulfate de vincristine, on doit ajouter 41 à 100 pg de Ca2+, de préférence 50 Pg d'ion calcium, ou 24 à 55 p9 de M92, de préférence de 25 à 28 pg d'ior magnésium ou de 56 a 140 p9 de Zn2, de préférence 70 pg d'ion zinc. Les solutions injectables sont rendues isotoniques par action d'hexose ou d'hexitol, par exemple de glucose, de mannitol ou de mal- tose. La quantité effective d'agent nécessaire pour rendre les solutions isotoniques peut se déterminer par osmométrie. La solution peut contenir un solvant auxiliaire, par exemple de l'éthanol ou un éther glycolique (polyakylèneglycol) de poids molécu- laire plus élevé. Dans la composition, les quantités que l'on préfère de l'éthanol ou de l'éther glycolique sont respectivement de 4 à 8% et de 5 à 15%. Les solutions injectables stables prêtes à l'emploi peuvent également contenir un agent de préservation, généralement utilisé à cette fin, tel que l'alcool benzylique, la Nipagine A, la Nipagine M, le nipasol (propylparabène) ou leur mélange (nipacombine) en concentration convenable pour l'utilisation. Comme antioxydant, on peut utiliser par exemple du pyrosulfite de sodium ou de potassium en concentration de 0,02 à 0,15%, de préférence de 0,05%- Le pH des solutions stables doit être ajusté à une valeur de pH comprise entre 3,0 et 6,0, de préférence 3,5 et 5,0. Dans le cas de la vincristine, la valeur de pH que l'on préfère est de 4,5 ainsi qu'ap- prouvé par la USP XX. En présence des sels métalliques employés, la - valeur de pH recherchée est facile à maintenir. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, on dissout une quantité suffisante du sel métallique utilisé pour la formation du complexe dans une eau distillée exempte de pyrogène et stérile, éventuellement en même temps que les additifs convenants à l'utilisation, tel qu'un agent pour rendre la solution isotonique, un solvant auxiliaire, un tampon, un agent de préservation et un antioxy- dant, et, à la solution obtenue, on ajoute la solution aqueuse du dérivé de bis-indole souhaité. La solution est complétée à son volume final par de l'eau bactériostatique pour injection; on l'homogénéise, on la soumet à une filtration stérile et on la distribue dans des fioles stériles sous une atmosphère de gaz inerte. L'interaction entre la vincristine et certains ions métalliques tels que le zinc, le calcium et le manésium, a été étudiée par des mesures d'équilibre polarographiques Pt poter:tiométriques. Pour étudier l'interaction VCR-zinc, on a préparé toute une série d'échantillons contenant chacun une quantité constante d'ions zinc (10-4 moles/dm3) et des quantités variables de vincristine sous la forme de son sulfate comprise entre 10-3 et 10-5 moles de VCR/dm3. Le pH de ces solutions aqueuses est ajusté à 5,5 avec un tampon acide acéti- que/acétate de sodium à une concentration de 0,15 mole/dm3 (mentionné dans ce qui suit sous le nom de solution tampon). Les échantillons sont soumis à une analyse polarographique. Ces polarogrammes caractéristiques sont représentés sur la figure 1. Le polarogramme A est obtenu à partir de la solution tampon contenant 10 4 moles de chlorure de zinc/dm3. Le polarogramme B est obtenu à partir de la solution tampon contenant 104 moles de chlorure de zinc/dm3 et 5 x 10-4 moles de VCR/dm3. Le polarogramme C est obtenu à partir de la solution tampon contenant à la fois le chlorure de zinc et la VCR en concentration de 10'4 moles/dm3, Les courbes sont interprétées de la façon suivante: lorsque de la VCR en excès est présente, aucune onde du zinc n'apparaît dans le polarogramme. Ceci indique la formation d'un complexe de zinc de stabi- lité élevée. Une oscillation indiquant l'apparition de l'onde polaro- graphique du zinc est enregistrée pour un rapport molaire VCR/zinc d'environ 1/1, juste avant la dépolarisation occasionnée par l'onde catalytique de l'hydrogène. Une diminution supplémentaire de la concen- tration en VCR conduit au développement de l'onde du zinc et, lorsque la concentration en VCR est abaissée à 2,5 x 105 moles/dm3 ou en-dessous de cette valeur, la forme et le potentiel de demi-onae de l'onde ne présentent pas d'autres changements et sont les mêmes que le cas des ions du zinc libre. Les résultats ci-dessus confirment qu'un complexe stable s'est formé entre les ions zinc et la VCR même pour leur rapport molaire 1/1. Une interaction entre la VCR et les ions calcium ou magnésium est étudiée indirectement, c'est-à-dire que l'on étudie l'effet de ces ions métalliques sur les propriétés polarographiques du système VCR/zinc. Plus particulièrement, à une solution contenant de la VCR et des ions 71724 zinc dans un rapport molaire 1/1 (le signal indiquant la présence de zinc apparaît tout juste dans le polôrogramme), on ajoute des quantités de chlorure de calcium ou de magnésium augmentant progressivement. L'effet des ions calcium est indiqué sur la figure 2 dans lequel le polarogramme A est obtenu à partir de la solution tampon contenant -4 moles/dm3 de chlorure de zinc et 10-4 mole/dm3 de VCR. Le polarogramme B est obtenu à partir de la solution tampon dans laquelle sont dissous 10-4 moles/dm3 de chlorure de zinc et 5 moles/dm3 de chlorure de calcium et le polarogramme C est enregistré à partir de la solution tampon contenant 5 moles/dm3 de chlorure de calcium, -4 moles/dm3 de chlorure de zinc et 10'4 mole/dm3 de VCR. L'effet des ions magnésium est représenté sur la figure 3, dans laquelle le polarogramme A est le même que celui de la figure 2, et les polarogrammes B et C sont enregistrés pour les solutions tampons conte- nant 5 moles/dm3 de chlorure de magnésium au lieu de chlorure de cal- cium; les autres constituants étant les mêmes que dans le cas de la figure 2. Ces figures montrent toutes les deux que l'augmentation de concen- tration soit des ions calcium, soit des ions magnésium, conduit au développement d'une onde polarographique caractéristique des ions zinc libres. Lorsque l'on atteint le niveau de concentration de 5 moles/dm3 d'ions calcium ou magnésium dans tous les polarogrammes, on enregistre la même onde du zinc complètement développée (qui est identique à celle des ions zinc libres à la fois en termes de potentiel de demi-onde et de courant de limitationEdiffusion]), montrant que les ions zinc sont libérés du complexe par les ions calcium ou les ions magnésium. Puis- qu'une quantité d'environ 50.000 fois celle des ions calcium ou magné- sium est nécessaire pour la substitution totale du zinc, la stabilité estimée du complexe zinc-VCR est de 4,5 à 5 ordres de grandeur supé- rieure à celle des complexes formés soit avec le calcium, soit avec le magnésium. La constante de stabilité du complexe formé dans la réaction des ions calcium avec le liguant vincristine est déterminée par des mesures d'équilibre potentiométriques. Le sulfate de la substance apparentée au sulfate de vincristine est remplacé par des ions chlorures, Le chlorure de vincristine préparé de cette façon est utilisé pour les études ultérieures d'équilibre. 7 1724 On prépare des solutions aqueuses de pH 5,5 à partir du chlorure de vincristine, les concentrations en VCR étant comprises entre x 10-4 moles/dm3 et 2 x 10 moles/dm3. La concentration en VCR dans tous les essais individuels de mesure, est maintenue à un niveau cons- tant. La force ionique des solutions est ajustée à 1,0 par addition de nitrate de sodium aux solutions pour maintenir les coefficients d'acti- vité à un niveau constant. Ces solutions de VCR sont dosées dans un appareil de dosage potentiométrique contrôlé par-un ordinateur à 25 C avec des solutions standard de chlorure de calcium à 0,1 mole/dm3 en utilisant une électrode à membrane spéciale sélective de l'ion calcium (voir DD 146 101) et une électrode de référence Ag/AgCl (modèle Radelkis OP0820P). La concentration de la solution standard de chlorure de calcium est contrôlée par dosage complexométrique. Un relevé typique des valeurs de potentiel d'électrode en fonction des concentrations en ions calcium est indiqué sur la figure 4 (pCa = log[Ca2] dans laquelle la courbe i représente la courbe de calibrage de l'électrode et la courbe 2 représente la courbe de dosage obtenue pour une solution de vincristine à 10-3 moles/dm3. Ce dernier donne la preuve de la formation d'un complexe entre les ions calcium et la VCR en montrant la diminution dans la concentration en ions calcium libres occasionnée par la présence de la vincristine. Sur la base des résultats potentiométriques, on calcule le nombre d'ions calcium liés par une seule molécule de vincristine (ni). La valeur maximum obtenue pour n est égale à 1, ce qui indique la formation d'un complexe avec un rapport de concentration Ca/VCR = 1/1. La constante de stabilité (e) calculée pour ce complexe à partir des données d'équilibre répond à la formule log B = 3,27 + 0,1. La figure 5 montre les valeurs de n calculées à partir des données potentiométriques (points) et calculées par ordinateur sur la base de la constante d'équilibre (ligne continue). Le bon agrément entre les valeurs de n déterminées expérimentalement et simulées-par ordinateur donnent la preuve de l'exactitude des résultats. La dépendance du pH des réactions de formation de complexe men- tionnées à fait l'objet de recherches basées sur des mesures d'équilibre de déprotonation du type Calvin avec étude de la dépendance entre le pH et le compartiment polarographique du système Zn-VCR et études de coordinations potentiométriques de l'ion calcium dans des solutions à différents pH. Aucune de ces études n'a indiqué la dépendance avec le pH 257 1724 des processus de formation de complexes dans un intervalle de pH compris entre 3,5 et 5,5. Ceci prouve que les ions mentionnés (Zn2, Ca2+, Mg2) sont coordonnés par les atomes donneurs d'oxygène de vincristine qui ne sont pas protonés dans l'intervalle de pH mentionné. Les complexes métalliques peuvent être séparés et analysés à l'état solide. Les tests de stabilité, dans lesquels on contrôle la teneur effective en ingrédient actif sont réalisés par une méthode HPLC (USP XXI. p.1118). Par exemple, dans le cas de VCR, on fait passer les échantillons par une colonne (250 x 4,6 mm) garnie de Nucléosil 5 C8 (Chrompack) à un débit de 2 ml/mn. On effectue l'élution avec un mélange méthanol, eau et diéthylamine (pH 7,5) et l'on détermine la teneur en VCR pour une longueur d'onde de 297 nm à l'aide d'échantillons externes standards contenant-du sulfate de vincristine, de référence USP, en solution aqueuse. On mène des tests accélérés de stabilité à partir de trois groupes d'échantillons de différentes origines, c'est-à-dire l'échantillon 1, préparé selon l'exemple 1 de la présente demande, l'échantillon 3 selon l'exemple 1 du brevet belge n 897 280 et l'échantillon 2 qui est de l'oncovine (Eli Lilly) disponible dans le commerce. On maintient les échantillons à 75 C pendant 5 et 10 jours respectivement. Les résultats du test sont indiqués sur le tableau 1. TABLEAU 1 N de Teneur en VCR Teneur en VCR Couleur* l'échantillon en % au départ en % à 75 C après après j 10 j 5 j 10 j 1 100 82,9 69,6 2 3 2y 3 y 2 100 67,9 43,3 4 5 4y -y 3 100 80,6 59,6 2 4 2y 4 y * Voir Colorimetric Matching Fluids, VIth Hugarian Pharmacopeia, English Edition, vol. I, p. 328. De ce tableau, il est clair que l'échantillon 1, préparé selon la présente demande (complexe VCR-Ca2+) présente une stabilité bien meilleure que les deux autres échantillons contenant la VCR sous sa forme libre. Pour des tests de stabilité à lor1gs termes, on emploie une solu- tion d'un complexe VCR-Ca2+ préparé selon l'exemple 1. Dans trois ampoules, on introduit 5 M1 de la solution ci-dessus. Les ampoules sont scellées dans des conditions stériles et on les maintient à 5 C pendant 12 mois. La teneur en VCR déterminée par HPLC est celle indiquée sur le tableau 2/A. A partir des résultats, il est clair qu'il ne se produit pratiquement pas de décomposition. - TABLEAU 2/A Teneur en VCR en % au après départ 3 mois 6 mois 9 mois 12 mois ,8 100,9 100,2 100,5 98,7 En suivant essentiellement la méthode ci-dessus mais en utilisant des fioles (dimension normale pour lot), on obtient les résultats suivants (stockage: au réfrigérateur à 2 à 8 C): TABLEAU 2/B Teneur en VCR en % au après départ 3 mois 6 mois 9 mois 12 mois teneur en VCR en % 97,5 96,9 95,4 96,3 95,1 alcaloïdes apparentés en % 1,9 2,5 3,0 2,8 3,1 Des portions de I ml d'un lot de solutions préparées selon l'exem- ple 1 sont distribuées dans 200 fioles. Les fioles sont scellées dans des conditions stériles et 100 d'entre-elles sont stockées à 5 C, tandis que les 100 autres fioles sont maintenues à la température ambiante 2 5 7 1 7 2 4 pendant quinze mois. Les données de stabilité sont indiquées sur le tableau 3. TABLEAU 3 Teneur en VCR en % temps de stockage à 5 C stockage à la température ambiante au temps zéro 100,0 100,0 10. 1 mois 98,0 98,4 2 mois 100,4 96,4 3 mois 100,4 98,4 4 mois 100,4 97,6 mois 98,7 102,8 15. 6 mois 99,4 100,3 7 mois 100,3 98,3 8 mois 100,2 96,7 À 10 mois 99,2 94,3 12 mois 98,3 91,7 20. 15 mois 98,1 85,5 Les données recueillies sur le tableau 3 montrent qu'aucune décomposition n'a lieu à 5 C et que l'on peut observer une légère diminution de la teneur en VCR à la température ambiante. Les données expérimentales confirment sans ambiguïté que les complexes formés entre un dérivé de bis-indole et un ion métallique présentent d'excellentes propriétés de stabilité. A une température de stockage de 5 C, il n'y a pas de changement dans la teneur en ingrédient même sur une période de deux ans. En outre, des solutions contenant ce complexe peuvent être stérilisées à 100 C sans décomposition de l'ingré- dient actif. L'invention est élucidée en détail à l'aide des exemples non limitatifs suivants. Exemple 1 35. sulfate de vincristine............... 0,1 g p-hydroxybenzoate de propyle......... 0,02 g acide acétique (98%)................. 0,025 g gluconate de calcium, H20............ 0,05 g 257 1 7 2 4 acétate de sodium, 3H20.............. 0,06 g p-hydroxybenzoate de méthyle. ...... 0,13 9 éthanol (96%)........................ 5,0 g mannitol........DTD: ..................... 10,0 9..DTD: 5. eau distillée pour injection, quantité- suffisante pour...................... 100,0 ml Les quantités ci-dessus de mannitol, de gluconate de calcium et d'acétate de sodium sont dissoutes dans une partie aliquote d'eau distillée injectable que l'on a préalablement dégazée et purgée à l'azote. A cette solution, on ajoute de l'acide acétique. On dissout le p-hydroxybenzoate de propyle et le phydroxybenzoate de méthyle dans l'éthanol à 96% et on le mélange ensuite avec la solution aqueuse. On dissout finalement dans une portion d'eaudistillée le sulfate de vincristine et on l'ajoute aux autres constituants. Le volume de la solution est complété à 100 ml. On homogénéise la solution, on filtre dans des conditions stériles et on distribue dans des fioles stériles sous une atmosphère de gaz protecteur interne et on scelle les fioles. Exemple 2 sulfate de vincristine............... 0,1 9 20. p-hydroxybenzoate de propyle......... 0,005 g gluconate de magnésium............... 0,045 g acide acétique (98%)................. 0,025 9 acetate de sodium, 3H20..... ....... 0,0256 g p-hydroxybenzoate de méthyle......... 0,05 g 25. mannitol............................. 5,0 g éthanol (96%)...................DTD: ..... 5,0 g eau distillée pour injection, quantité suffisante pour........DTD: .............. 100,0 ml En utilisant les constituants ci-dessus et suivant une procédure..DTD: semblable à celle de l'exemple 1 on obtient la formulation aqueuse. Exemple 3 sulfate de vincristine............... 0,1 g acide acétique (98%).......... ..... 0,025 g acetate de sodium, 3H20.............. 0,06 g 35. gluconate de zinc.................... 0,049 g alcool benzylique.............DTD: ....... 0,9 g éthanol (96%)........................ 5,0 9 À mannitol......DTD: ....................... 15,0 9 eau distillée pour injection, quantité suffisante pour....................... 100,0 ml Dans une partie aliquote d'eau distillée qui a été fraîchement dégazée et purgée à l'azote, on dissout le mannitol et le gluconate de zinc. A cette solution, on ajoute de l'acide acétique et le mélange d'éthanol et d'alcool benzylique. Finalement, le sulfate de vincristine dissous dans une quantité minimum d'eau distillée est ajouté à la solution dont on complète le volume à 100 ml. On soumet la solution homogénéisée à une filtration stérile, on la distribue dans les fioles stériles sous une atmosphère de gaz protecteur inerte et on scelle les fioles...DTD: Exemple 4 sulfate de vincristine............... 0,1 g p-hydroxybenzoate de propyle.. ..... 0,005 g 15. acétate de calcium, H20.............. 0,0222 g acide acétique (98%)................. 0,025 g acétate de sodium, 3H20.............DTD: . 0,0256 g p-hydroxybenzoate de méthyle......... 0,05 g éthanol (96%).....DTD: ................... 5,0 g 20. mannitol.......................... 5,0 g eau distillée pour injection, quantité suffisante pour......................DTD: 100,0 ml Avec les composants ci-dessus, on conduit un mode opératoire..DTD: semblable à celui de l'exemple 1 pour obtenir une formulation aqueuse. Exemple 5 sulfate de vincristine............... 0,1 g acide acétique (98%).......... ..... 0,025 g acétate de sodium, 3H20.............. 0,026 g gluconate de calcium......... 0,056 g 30. alcool benzylique.................... 0,9 g sorbitol............................. 5,0 g polyéthylène glycol...........DTD: ....... 10,0 g eau distillée pour injection, quantité suffisante pour.....DTD: ................. 100,0 ml Dans une partie aliquote d'eau distillée qui a été fraîchement dégazée et purgée à l'azote injectable, on dissout dans l'ordre du sorbitol et le gluconate de calcium. A cette solution, on ajoute de l'acide acétique et le mélange d'alcool benzylique et de polyéthylène..DTD: 16 2571724 glycol 400. Ensuite, le sulfate de vincristine dissous dans une quantité minimum d'eau distillée est ajouté à la solution qui est complétée à son volume finale, homogénéisée et filtrée dans des conditions stériles. La solution stérile est distribuée dans les fioles stériles sous une atmosphère de gaz protecteur inerte et on scelle les fioles. Exemple 6 À sulfate de vinblastine............... 0,1 g À p-hydroxybenzoate de propyle......... 0,005 g À acétate de calcium, H20.............. 0,023 g 10. acide acétique (98%)................. 0,049 g acétate de sodium, 3H20. ........... 0,049 g p-hydroxybenzoate de méthyle 0,05 g éthanol (96%).....DTD: ................... 5,0 g mannitol............................. 5,0 g 15. eau distillée pour injection, quantité suffisante pour..................DTD: .. 100,0 mI Avec les composants ci-dessus, on observe le même mode opératoire..DTD: que dans l'exemple I et obtient une formulation aqueuse. Exemple 7 20. sulfate de vincristine............... 0,1 g p-hydroxybenzoate de propyle......... 0,02 g Àacide acétique (98%)................. 0,025 g Àsulfate de zinc...................... 0,033 g Àacétate de sodium, 3Ho0... .......... 0,06 g 25. p-hydroxybenzoate de méthyle......... 0,13 g Àéthanol (96%)........................ 5,0 g À mannitol.....................DTD: ..... 10,0 g * eau distillée pour injection, quantité suffisante pour.....DTD: .......... 100,0 ml Avec les composants-ci-dessus, on observe le même mode opératoire..DTD: que dans l'exemple i et arrive à une formulation aqueuse. 17 25 7 1724 REVENDICATIONS 1.- Procédé de préparation d'un complexe métallique pharmaceu- tiquement acceptable d'un dérivé du bis-indole et éventuellement de compositions pharmaceutiques aqueuses stables contenant ce complexe métallique dans lequel on fait réagir une solution d'un dérivé de bisindole ou d'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables en milieu aqueux avec un sel non toxique soluble dans l'eau d'un métal bivalent ou multivalent capable de donner lieu à la formation d'un complexe à un pH de 3,0 à 6,0, un support pharmaceutique et/ou un autre additif classique étant éventuellement présent ou éventuellement ajouté par la suite ou, si on le désire, on isole le complexe métallique obtenu. 2.- Procédé selon la revendication 1, dans laquelle la quantité de métal non toxique bivalent ou multivalent est suffisante pour procurer un rapport molaire du métal au dérivé de bis-indole d'environ 1/1. 3.- Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle le dérivé de bisindole appliqué est un dérivé de formule générale (I): 10 N la, 2s 1 CH30,16 R ( I) R1 CoR5 dans laquelle: R1 représente un groupe méthyle; R2 représente un atome d'hydrogène; R3 représente un groupe hydroxyle; ou R2 et R3 forment ensemble une liaison de valence; R4 représente un groupe hydroxyle ou un groupe acétoxy; et R5 représente un groupe méthoxy ou un groupe amino, ou R1 représente un groupe formyle; R2 représente un atome d'hydrogène; R3 représente un groupe hydroxyle; ou R2 et R3 forment ensemble un groupe époxy; R4 représente un atome d'hydrogène ou un groupe acétoxy; et R5 représente un groupe méthoxy. 4.- Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le dérivé de bis-indole de formule générale (I) est la vincris- tine ou la vinblastine ou un de leurs sels pharmaceutiquement accepta- bles. 5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans le lequel le métal bivalent ou multivalent non toxique capable de donner lieu à la formation d'un complexe est l'ion zinc(II), calcium(II) ou magnésium(II). 6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à5, dans lequel l'ion zinc(II), calcium(II) ou magnésium(II) est appliqué sous la forme de son acétate ou de son gluconate. 7.- Procédé de préparation d'un complexe métallique d'un dérivé de bisindole dans lequel on fait réagir un dérivé de bis-indole ou un de ses sels avec un sel solide dans l'eau d'un métal bi- ou multivalent capable de former un complexe dans un milieu aqueux à un pH de 3,0 à 6,0 et le complexe obtenu est séparé d'une façon connue en soi. 8.- Complexes formés entre un dérivé de bis-indole et un ion métallique bivalent ou multivalent. 9.- Complexe de vincristine de vincristine avec l'ion zinc(II), calcium(II) ou magnésium(II). 10.- Complexe de vinblastine de vincristine avec l'ion zinc(II), calcium(II) ou magnésium(II). 11.- Compositions pharmaceutiques aqueuses stables contenant en quantité thérapeutiquement efficace comme ingrédient actif, un complexe pharmaceutiquement acceptable d'un dérivé de bis-indole avec un métal bivalent ou multivalent. 12.- Complexe métallique d'un dérivé de bis-indole, tel que préparé selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 7. 13.- Compositions pharmaceutiques aqueuses stables, telles que préparées selon le procédé de l'une quelconque des revendications I à 6.