FR 2569984 A1 19860314 FR 8413989 A 19840912 MOLECULE SYNTHETIQUE CONTENANT UNE PLURALITE D'EPITOPES DISTINCTS, PROCEDE POUR SON OBTENTION ET APPLICATION A LA PRODUCTION DE POLYVACCINS. L'invention est relative à une molécule synthé- tique contenant plusieurs épitopes distincts et à l'appli- cation de cette molécule à la constitution de polyvaccins. On sait qu'un certain nombre de vaccins synthéti- ques ou semi-synthétiques ont déjà été proposés ou même réalisés. D'une façon générale, il a déjà été proposé de substituer à des antigènes naturels utilisés en vaccina- tion humaine ou vétérinaire des antigènes de synthèse possédant des éléments de structure en commun avec ces antigènes naturels ou "natifs". Ces éléments de structure contiennent en général un ou plusieurs sites antigéniques ou "épitopes" de l'antigène naturel. Par exemple cet antigène synthétique contient une séquence peptidique que l'on retrouve également dans l'antigène naturel ou "natif", lorsque celui-ci consiste en une protéine; ou il peut consister en un oligosaccharide lorsque l'antigène naturel possède une structure polysaccharidique. Cepen- dant, sauf exception, ces peptides ou oligosaccharides de synthèse, qui sont effectivement susceptibles d'être re- connus par des anticorps à l'égard de l'antigène naturel, ne présentent eux-mêmes, in vivo, qu'une activité immuno- gène extrêmement faible, voire non décelable par les techniques immunologiques courantes. En d'autres termes, ils se comportent comme des haptènes. Cette dernière ex- pression sera effectivement utilisée dans ce qui suit pour désigner tout produit de synthèse, tel qu'il a été défini plus haut, qui en particulier comporte au moins un épitope caractéristique d'un antigène naturel. Diverses méthodes ont été proposées dans la litté- rature pour renforcer cette immunogénicité. Il a par exemple été proposé de les "oligoméri- ser". Cette dernière opération entraîne en effet dans cer- tains cas un certain accroissement du pouvoir immunogène. Les anticorps formés ne présentent cependant pas toujours un pouvoir protecteur prononcé à l'égard des antigènes natifs correspondants. Une autre méthode couramment étudiée consiste dans la conjugaison covalente de l'haptène ou du polymère de l'haptène avec une molécule porteuse physiologiquement ac- ceptable et de poids moléculaire suffisamment élevé. Cette conjugaison peut effectivement conduire à un accroissement sensible de l'immunogénicité susceptible d'être induite in vivo. Le plus souvent, les molécules porteuses sont constituées par une molécule de haut poids moléculaire, possédant elle-même une activité immunogène marquée. Il s'agit par exemple de l'anatoxine tétanique ou de l'ana- toxine diphtérique. De telles molécules porteuses ne semblent pas devoir être utilisables pour des vaccinations répétées, soit qu'elles soient causes de chocs anaphylac- tiques, soit qu'elles entraînent une immunosuppression irréversible, comme on a pu l'observer dans certains cas. Il a également été proposé de mettre en oeuvre des molécules porteuses entièrement synthétiques. La plupart des supports entièrement synthétiques qui ont été proposés risquent de présenter un niveau de toxicité qui les ren- draient impropres à la constitution de principes actifs de vaccins. A l'heure actuelle, un seul support synthétique connu s'est montré à peu près dépourvu de toxicité. Il s'agit de la multi-DL-alanyl-poly-L-lysine (A--L) ayant un poids moléculaire de l'ordre de 80.000. Mais l'utilisation de ce support n'est vraiment efficace que si des groupes muramylpeptide sont également greffés, sur ses chaînes, par l'intermédiaire de liaisons covalentes. A l'action immunogène alors importante susceptible d'être induite par l'haptène s'ajoute alors aussi une immunogénicité marquée à l'égard des groupes muramyl- peptide et de A--L. On se trouve en définitive ramené à des difficultés semblables à celles qui sont observées avec les molécules porteuses "non synthétiques". Plus récemment une autre approche des problèmes de la vaccination a été présentée. Dans l'article de "Bioche- mical and Biophysical Research Communications" (Vol. 117, No. 3, 1983, 28 décembre 1983, pages 908-915), intitulé "Antibody responses elicited by a polyvalent vaccine con- taining synthetic diphteric, streptococcal and hepatitis peptides coupled to the same carrier", L. CHEDID et Coll., ont proposé la constitution d'un polyvaccin porteur des trois peptides synthétiques comportant respectivement des épitopes de la toxine diphtérique, de la protéine M du streptococcus type 24 et de l'antigène de surface du virus de l'hépatite B (HBs), tous trois conjugués à une molécule porteuse constituée par l'anatoxine tétanique. Ce "poly- vaccin" s'est avéré induire chez l'animal la production d'anticorps respectivement dirigés contre les différents épitopes, sans que l'on observe une domination marquée de l'un des épitopes sur les autres, au niveau des réactions immunogènes de chacun d'entre eux. Ce premier vaccin n'en présente pas moins les inconvénients susmentionnés tenant à la présence d'une molécule porteuse de haut poids molé- culaire. L'invention a pour but de remédier, au moins en grande partie, à ces difficultés, plus particulièrement de fournir des molécules entièrement synthétiques, utilisa- bles pour la production de polyvaccins susceptibles de conférer des protections simultanées contre une protection contre une pluralité d'agents pathogènes distincts, dans des conditions qui peuvent être plus aisément contrôlées au niveau de l'administration à l'hôte. La molécule synthétique conforme à l'invention est caractérisée par la réunion dans une seule molécule d'une pluralité d'haptènes distincts conjugués deux à deux ou les uns à d'autres par l'intermédiaire de liaisons co- valentes, ces haptènes distincts étant respectivement por- teurs d'épitopes ou de sites antigéniques également dis- tincts. La molécule synthétique ainsi obtenue présente alors - en l'absence de toute molélcule porteuse de haut poids moléculaire - des propriétés immunogènes suffisan- tes, le cas échéant après amplification à l'aide d'un adjuvant immunologique du type muramylpeptide associé à cette molécule, pour induire in vivo des. réactions immuni- taires à l'égard des haptènes considérés, mais également une action protectrice à l'égard des antigènes de masses moléculaires plus importantes et porteurs des mêmes épitopes, notamment d'agents pathogènes contre lesquels une protection est recherchée. Dans ce qui précède, on donne au terme "haptène" un sens très large. Il s'étend à tout haptène ou fragment hapténique de faible poids moléculaire, indépendamment de son mode d'obtention, que ce soit par exemple par frac- tionnements, dépolymérisation, synthèse ou recombinaison génétique. Egalement dans ce qui précède, l'expression "site antigénique" ou "épitope" signifie toute configuration, notamment de surface, de l'haptène susceptible d'être reconnue par un anticorps préalablement formé à l'égard d'un antigène ayant une séquence en commun avec cet hapt- ène. L'haptène dont la conformation peut être modifiée par la conjugaison à d'autres haptènes,-conformément à l'in- vention, induit in vivo des anticorps ou une réaction spécifique à médiation cellulaire, non seulement contre lui-même, mais en outre - dans le cas o l'haptène a un élément de structure en commun avec un antigène natif - contre l'antigène natif lui-même ou l'antigène que l'on peut éventuellement former par couplage de l'haptène avec un support macromoléculaire ou encore avec un muramyl- peptide. Par exemple, un premier haptène consistant en une séquence comprenant un nombre réduit d'acides aminés peut, quand il est couplé à un second haptène, induire in vivo la formation d'anticorps actifs contre le polypeptide ou la protéine antigénique ayant en commun avec le premier haptène la même séquence d'acides aminés, et vice versa. Il en est naturellement de même en ce qui concerne des haptènes non exclusivement peptidiques. A cet égarsd, un ou plusieurs des haptènes consistent par exemple en une ou plusieurs structures osidiques de poids moléculaires ré- duits. Ils sont par exemple constitués d'un monosaccharide ou de plusieurs monosaccharides liés entre eux par exemple par une liaison de type glycosidique. Ces oligosaccharides peuvent être soit linéaires, soit ramifiés. Ils peuvent appartenir à la famille des hexoses ou des pentoses; ils peuvent être neutres ou aminés, contenir un acide uronique ou un acide sialique. Ils peuvent porter des substituants usuellement contenus dans les structures naturelles, tels que acétyle, sulfate ou phosphate. Ces indications sont données à titre d'exemples mais ne sont pas limitatives et l'on envisage d'une manière générale toutes les molécules synthétiques résultant de la conjugaison entre eux de tous hapténes peptidiques et/ou osidiques dont on retrouve les équivalents à l'intérieur des structures des antigènes correspondants de masses moléculaires élevées. Il est entendu que, lorsque dans la suite il sera fait référence à des "polyvaccins", il s'agit de toute molécule synthétique conforme à l'invention et susceptible d'induire la production d'anticorps distincts, reconnais- sant spécifiquement les structures hapténiques ou antigé- niques correspondantes. De façon générale, le langage qui précède s'étendra à toute réaction immunitaire induite, y compris les réactions à médiation cellulaire. D'une façon générale, tout haptène ayant un élément de strucutre en commun avec un antigène connu à l'égard duquel une protection peut être recherchée, peut être utilisé dans la fabriction - par conugaison avec des haptènes distincts - de polyvaccins conformes à l'inven- tion. On mentionnera, à titre d'exemple des antigènes en question, des principes actifs extraits de micro-organis- mes infectieux ou les micro-organismes infectieux eux- mêmes (vaccins atténués ou tués). Plus particulièrement, les haptènes susceptibles d'être mis en oeuvre dans le cadre de l'invention peuvent avoir en commun des éléments de structure avec des constituants de ces agents patho- gènes (tels que bactéries, virus parasites, rickettsies, protozoaires, etc.). A titre d'exemple, on mentionnera les haptènes ayant des éléments de structure en commun avec des protéines antigéniques appartenant aux enveloppes des virus de l'hépatite virale B. de la grippe, des virus herpétiques, ou encore des protéines de parois bactériennes, par exemple streptococciques, etc.. Au titre des haptènes ayant des éléments de structure communs avec des antigènes non exclusivement peptidiques ou non pepti- diques, on peut mentionner des oligosaccharides, glyco- peptides, lipopeptides, glycolipides, lipides, stéroides, etc.. De façon plus générale, on peut aussi se reporter aux indications fournies dans les demandes de brevets européens n* 0 003 833 et n* 0 089 290. L'invention s'étend plus particulièrement aux po- lyvaccins mettant en oeuvre une pluralité d'hapténes ou de fragments hapténiques de faibles poids moléculaires qui peuvent être obtenus par synthèse chimique. En particulier, l'invention concerne des polyvac- cins mettant en jeu des haptènes distincts dont les poids moléculaires respectifs ne dépassent pas environ 5.000 et avantageusement sont inférieurs à 3.000. Il est tout à fait remarquable que chaque haptène joue le rôle de molécule porteuse vis-à-vis des autres haptènes inclus dans le même polyvaccin. Et cela est d'au- tant plus remarquable que, de préférence, le polyvaccin synthétique présentera en général dans son ensemble un poids moléculaire total inférieur- à celui des seules molécules porteuses utilisées jusqu'à ce jour. On mentionnera, sans que cela soit limitatif, que les poly- vaccins selon l'invention présenteront en général des poids moléculaires se situant entre environ 6.000 et environ 60.000, de préférence entre environ 10.000 et environ 40.000. Des polyvaccins préférés comprennent de 2 à 10 sé- quences hapténiques portant des épitopes distincts. Plus avantageusement encore, ils en comportent de 4 à 6. Il va de soi que fait également partie de l'invention tout poly- vaccin dans lequel un ou plusieurs épitopes seraient pré- sents en plusieurs exemplaires, les nombres d'exemplaires variant d'un épitope à l'autre. Bien entendu, les polyvaccins selon l'invention peuvent comporter, outre les séquences d'haptEnes choi- sies, des éléments de liaison chimique entre chacun des haptènes distincts. Il va naturellement de soi que ces éléments de liaison ne présentent alors que des poids moléculaires réduits les rendant sans rapport aucun avec des molécules porteuses classiques. D'une façon générale, les éléments de liaison ne contribuent que dans une pro- portion mineure aux poids moléculaires moyens des poly- vaccins formes: leur proportion pondérale relative ne dépassera en général pas 30 ô en poids du poids molécu- laire total moyen du polyvaccin. Ces éléments de liaison sont en général choisis parmi des éléments inertes et dépendent du choix des réac- tifs qui sont mis en oeuvre pour réaliser la conjugaison des divers haptènes entre eux. L'invention ne saurait être limitée à aucune structure particulière du polyvaccin. A titre d'exemple, les différents haptènes entrant dans la constitution de ces polyvaccins peuvent être reliés deux à deux pour former une chaîne. Dans une autre forme de réalisation, des haptènes distincts peuvent être greffés sur un haptène différent commun, notamment lorsque celui- ci comprenait en divers points de sa chaine, des groupements fonctionnels libres, susceptibles d'être mis en jeu dans les réactions de conjugaison avec les groupements fonctionnels portés par d'autres haptènes. Par exemple, lorsque les différents haptènes sont de natures peptidiques, les groupes fonctionnels du genre en question étaient constitués par des groupes -NH2, -COOH-, SH, etc.. Par exemple, le peptide SCB7 dont question plus loin peut jouer ce rôle d'haptène porteur à l'égard d'autres haptènes, ne serait-ce que parce qu'il porte lui-même 6 groupes -NH2 susceptibles d'être mis en oeuvre dans des réactions de conjugaison avec d'autres haptènes. Il va de soi aussi que dans ce qui précède, tout haptène entrant dans la constitution du polyvaccin selon l'invention peut lui-même être constitué par un formé à partir de plusieurs motifs monomères qui répondaient euxmêmes à la définition qi a été donnée plus haut de l'haptène. Par exemple, cet oligomère peut contenir de 2 à de ces motifs. L'invention concerne aussi un procédé pour fabri- quer des polyvaccins synthétiques conformes à l'invention, ce procédé consistant à faire réagir un premier haptêne comprenant une première fonction réactive avec un second haptène (ou plusieurs haptènes) pourvu d'une seconde fonc- tion réactive (ou de plusieurs fonctions réactives) complémentaires de celle du premier haptène, les fonctions réactives distinctes éventuellement présentes sur certains de ces haptènes et n'intervenant pas dans la réaction (ou les réactions) étant si besoin protégées. Il est entendu que dans ce qui précède "complémentarité" signifie la ca- pacité des fonctions réactives de deux haptènes distincts de conduire à une réaction de couplage covalent, directe ou indirecte, si besoin en présence d'un agent également bifonctionnel ou simplement d'un agent chimique favorisant la réaction de couplage covalent. De préférence, le premier haptène comprend au moins une fonction amine, carboxyle libre, ester ou alcool susceptible d'être mise en jeu dans la réaction de coupla- ge avec une fonction correspondante portée par le second haptène. Conformément à une première variante du procédé selon l'invention, on réalise la condensation entre un premier haptène portant au moins une fonction amine libre et un second haptène portant également au moins une fonc- tion amine libre et l'on procède à la condensation de ces deux haptènes, en présence d'un réactif difonctionnel tel que, par exemple, la glutaraldéhyde ou la benzoquinone. Selon une autre variante du procédé de l'invention, on fait réagir le premier haptène portant une fonction réactive amine, carboxyle, hydroxyle ou sulfhy- dryle selon l'une des techniques couramment utilisées en synthèse peptidique, avec le second haptène qui porte alors lui-même une fonction réactive complémentaire amine, carboxyle, hydroxyle, alcool ou sulfhydryle. Lorsque l'on réalise le couplage entre une fonc- tion carboxyle portée par l'un des partenaires avec une fonction amine portée par l'autre partenaire de la réaction, on réalise avantageusement la réaction en phase aqueuse en présence d'un carbodiimide hydrosoluble ou d'un carbodiimide liposoluble au sein d'un solvant organique inerte, tel que le diméthyl-formamide (DMF) ou le tétrahy- drofuranne (THF), acétate d'éthyle, chlorure de méthylène, etc.. Des carbodiimides hydrosolubles avantageux sont constitués par le N-cyclohexyl-N'(bêta-(N-méthyl-morpho- lino)-éthyl)-carbodiimide p-toluène sulfonate, le chlo- rhydrate de (3-méthyl)-aminopropyl-carbodiimide. Des carbodiimides appropriés pour des réactions au sein d'un solvant organique sont par exemple constitués par le N,N'-dicyclohexyl-carbodiimide. Selon une autre variante du procédé selon l'inven- tion, on fait réagir la fonction carboxyle portée par l'un des partenaires avec un chlorocarbonate d'alkyle (C2 à C;), puis l'on fait agir l'anhydride mixte obtenu à partir de ce premier partenaire avec le second partenaire portant la fonction amine devant intervenir dans le couplage au sein d'un solvant organique inerte, tel que ci-dessus dé- fini, ou d'une phase aqueuse. La première étape de la réaction est effectuée par exemple dans le diméthylformamide, en présence d'une amine tertiaire, par exemple la N-méthyl-morpholine, en utili- sant par exemple le chlorocarbonate d'isobutyle. Après trois minutes à 15'C, on ajoute au mélange réactionnel le partenaire porteur d'une fonction amine déprotonée, par exemple avec de la N-méthyl-morpholine. Selon une troisième variante du procédé selon l'invention, on fait réagir un ester activé préalablement formé de celui des partenaires portant le groupe carboxy- lique devant intervenir dans la réaction de couplage, avec l'autre partenaire portant une fonction amine. Des esters activés avantageux sont l'ester p-nitrophénylique ou l'es- ter N-hydroxysuccinimidique. Ces réactions sont conduites dans un solvant orga- nique inerte, tel que le diméthyl-formamide. Selon une autre variante encore du procédé selon l'invention, on fait réagir l'un des partenaires portant une fonction sulfhydryle avec l'autre partenaire, lequel porte alors un groupe maléimide. On peut encore faire réagir avec le partenaire portant le groupe sulfhydryle l'autre partenaire portant un groupe 6-maléimido-caproique-acide ou un groupe 3-(2- pyridyl-dithio)propionate. Les fonctions réactives ne devant pas intervenir dans la réaction peuvent être protégées par des groupes de blocage classiques. Les groupes carboxyliques peuvent notamment être protégés par des groupes benzylique, benzylidène ou anizi- lidène. Ces groupes esters peuvent ensuite être éliminés notamment par hydrogénolyse. Celle-ci permet d'ailleurs également l'élimination simultanée d'autres groupes pro- tecteurs tels que les groupes N-carbobenzoxy. Les fonctions amine sont avantageusement protégées par des groupes benzyloxycarbonyle, t-butyl-oxycarbonyle ou toluène sulfonyle. Ces groupes peuvent ensuite être éliminés par hydrogénation catalytique ménagée, par exem- ple en présence de palladium, ou par acidolyse ou encore par action du sodium dans l'ammoniac liquide. Les fonctions sulfhydryle n'intervenant pas dans la réaction de couplage peuvent être protégées par des groupes acétamidométhyle ou formamidométhyle. Bien entendu, on peut avoir recours à tout autre type de liaison, mettant en jeu les combinaisons pouvant intervenir entre une fonction sulfhydrile portée par l'un des partenaires et un groupe maléimide porté par l'autre partenaire, par exemple en faisant usage de la technique décrite par T. KITAGAWA et T. AIKAGAWA dans "3. Biochem." 79 (1976), 233. La conjugaison peut également se faire en utili- sant les modes classiques de diazotisation ou de réaction mettant en jeu un isothiocyanate, notamment lorsque l'un des haptènes porte une fonction aromatique aminée (notam- ment au niveau des groupes Z ou R 1), et lorsque l'autre haptène porte une fonction amine susceptible d'intervenir dans cette réaction. De telles techniques de réalisation sont décrites par exemple par B.F. ERLANGER dans "Pharma- col. Rev.", 25 51973, p. 271. Le couplage peut également être réalisé par la ré- duction d'une base de Schiff réalisée entre une fonction aldéhyde portée par l'un des haptènes et une fonction amine portée par l'autre haptène (par exemple selon la technique de G.R. GRAY, "Arch. Biochem. Biophys.", 163 (1974), p. 425). Toutes ces réactions sont en soi bien connues et le spécialiste appréciera que de nombreuses variantes peuvent être aménagées pour aboutir aux mêmes résultats. On remarquera aussi que les conjugaisons entre hapténes peuvent s'effectuer au moyen d un pontage, l'agent de pontage consistant par exemple en un réactif bifonction- nel. En l'occurrence, le groupe de pontage entre deux haptènes dans le conjugué final de préférence n excédera pas la longueur d'un enchainement correspondant à celle d'une chaine hydrocarbonée p-décylique. De tels agents de pontage sont par exemple men- tionnés dans le brevet France n' 78 16792 déposé le 5 juin 1979. Dans ce qui précède, il a surtout été évoqué le cas du couplage entre des haptènes de natures peptidiques. Lorsque les haptènes sont constitués par des oligosac- charides. les mêmes types de réactions peuvent être mis en oeuvre, dès lors que l'un des haptènes possède une fonc- tion carboxylique libre ou une fonction amine, ou encore une fonction alcool pouvant alors former des liaisons amide ou ester avec des fonctions adéquates portées par l'autre haptène. Dans toutes les réactions qui précédent, les proportions relatives des haptènes mis en jeu peuvent être variées selon les proportions finales désirées de chaque haptène dans le polyvaccin final. En particulier, ces pro- portions relatives seront ajustées en fonction du nombre de groupes fonctionnels portés par chacun d'eux et suscep- tibles d'entrer dans la réaction de conjugaison avec des groupes fonctionnels complémentaires portés par d'autres haptènes. Des caractéristiques supplémentaires de l'inven- tion appraitront encore au cours de la description qui suit d'exemples de production de polyvaccins synthétiques et de leurs propriétés immunogènes. EXEMPLE I: Production d'un oolvvaccin mettant en -jeu quatre haptènes distincts. Les haptènes mis en jeu ont été les suivants: 1') SODP: octodécapeptide contenant une séquence de la "boucle diphtérique" et de formule: H2N-Ala-Ala-Cys-Ala-Gly-Asn-Arg-Val-Arg- Arg-Ser-Val-Gly-Ser-Ser-Leu-Lys-Cys. 2') SCB7: peptide contenant un épitope caracté- ristique du streptococcus type M24 contenant la sé- l0 quence: Asn-Phe-Ser-Thr-Ala-Asp-Ser-Ala-Lys- Ile-Lys-Thr-Leu-Glu-AlaGlu-Lys-Ala-Ala- Leu-Ala-Ala-Arg-Lys-Ala-Asp-Leu-Glu-Lys- Ala-Leu-Glu-Gly-Ala 3') HBs (peptide 99-121): peptide comprenant un site antigénique de l'enveloppe du virus contenant la sé- quence: Asp-Tyr-Gln-Gly-Met-Leu-Pro-Val-Cys-Pro-Leu-Ile- 110 Pro-Gly-Ser-Ser-Thr-Thr-Ser-Thr-Gly-Pro-Cys. 4-) DDP Mal: peptide portant un épitope caracté- ristique d'un antigène protecteur contre Plasmodium Know- lesi, agent de la malaria du singe, décrit par GODSON G.N. et Coll. (1983), Nature, 305, 29-33, constitué par la sé- *quence: Tyr-Gln-Ala-Gln-Gly-Asp-Gly-Ala-Asn-Ala- Gly-Gln-Pro-Gln-Ala-Gln-Gly-Asp-Gly-Ala-Asn- Ala-Gly-Gln-Pro-Cys 1') Préparation du polyvaccin: équivalents NH2, soit 12,5 mg de HBs 99-121, 5 équivalents NH2, soit 14,5 mg de DDP Mal, 10 équivalents NH2, soit 9 mg de SODP et 20 équivalents NH2, soit 26 mg 2' 2 de SCB7, sont dissous dans une solution de bicarbonate de sodium 0,1 M (10 ml), mélangée avec une solution aqueuse de 4 microlitres de glutaraldêhyde à 25 Z pour obtenir une concentration finale de 0,1 Z en glutaraldéhyde. La réaction s'effectue à température ambiante, à l'obscurité et sous agitation. On laisse la réaction se poursuivre pendant 3 jours. La solution est ensuite dialysée contre un tampon approprié, tel que le PBS, dans des conditions permettant de séparer tous les constituants ayant des poids moléculaires inférieurs à 12.000 daltons. La solu- tion retenant les poids moléculaires plus élevés est en- suite soumise à une opération de chromatographie liquide, sous haute pression, dans une colonne LK13 selon les pres- criptions du fabricant. La lecture a été faite à 295 nm. Le diagramme d'élution fait apparaître un pic uni- que homogène qui a été recueilli en six fractions d'élu- tion successives. Les poids moléculaires moyens de ces fractions s'échelonnent entre 12 000 et 40 000. L'analyse immunochimique du contenu de chacune de ces fractions fait apparaitre la présence de molécules contenant des séquen- ces peptidiques correspondant à chacun des haptènes ini- tialement mis en jeu. Le rendement de conjugaison a été de Z. Le contenu de ces fractions a été réuni et la so- lution obtenue lyophilisée. 2') Propriétés biologiques du polvvaccin: a) Induction d'anticorps in vivo. Des souris Swiss ont été réparties en trois grou- pes. Ces groupes ont reçu par voie sous-cutanée 100 micro- grammes du polyvaccin avec respectivement: - de l'eau physiologique (groupe a), - de l'adjuvant complet de Freund (ACF) (groupe >), - 100 microgrammes de l'alpha-butyl-ester de la N-acétyl- muramyl-L-alanyl-D-glutamine (murabutide) (groupe c). Un mois plus tard, les souris reçoivent toutes un rappel de polyvaccin (100 microgrammes par souris), puis au 70ème jour après la première injection, un second rappel de 100 microgrammes du polyvaccin. Au jour 78, les animaux sont saignés et leurs taux d'anticorps sont titrés contre chacun des quatre peptides dans des systémes ELISA, dans des conditions identiques à celles décrites dans l'article mentionné plus haut de L. CHEDID et al. Les résultats figurent dans le tableau ci-après. Ils sont fournis souris par souris. Dans la colonne de gauche sont indiqués les constituants utilisés pour les injections primaires. Dans les quatre colonnes de droite figurent les réponses individuelles enregistrées pour chaque souris à l'égard des quatre haptènes individuels définis plus haut. TABLEAU I Injection N' Réponses individuelles anti: primaire souris SODP SCB7 H8s(99-121) DDP Mal Témoin 1 250 150 150 6 7 8 Polyvaccin 9 52 000 140 000 110 000 290 000 + 10 93 000 60 000 68 000 220 000 ACF 11 15 000 305 000 140 000 300 000 12 7 500 80 000 100 000 250 000 Polyvaccin 13 105 000 100 000 80 000 105 000 + 14 130 000 14 000 15 000 110 000 murabutide 15 6 200 400 000 1 700 5 000 /Ug 16 7 500 8 000 1 740 3 500 Les résultats permettent de faire les observations suivantes: - tous les haptènes s'expriment immunologiquement, même si les niveaux de réponse observés au niveau des différentes souris ne sont pas toujours semblables; on remarquera né- anmoins que dans l'ensemble les niveaux d'immunogénicité sont élevés; - il n'y a pas de compétition antigénique entre les quatre constituants du polyvaccin. b) Mise en évidence d'une immunité protectrice contre le streptococcus pvogenes type M24: Un certain nombre de souris ont été immunisées dans les mêmes conditions que les souris du groupe c (deux rappels aux moments indiqués ci-dessus avec la combinaison polyvaccin + murabutide). Elles ont été éprouvées au jour 78 par une dose, mortelle pour des témoins, de streptococ- cus ovoqenes de type M24. Une proportion substantielle des souris ainsi éprouvées ont survécu. Cet essai témoigne que l'immunisation préalable des souris éprouvées s'est mani- festée par la production d'anticorps capables de reconnai- tre la structure naturelle de l'agent pathogène. Au sur- plus, la survie d'un certain nombre des animaux a manifes- té l'activité biologique de protection des anticorps induits par le polyvaccin. EXEMPLE II: D'autres polyvaccins peuvent être constitués de la même manière, par exemple en groupant des séquences por- tant des épitopes obtenus à partir des antigènes identi- fiés ci-après ou correspondant aux maladies ci-après. Il s'agit par exemple des 4 polyvaccins suivants qui regrou- pent respectivement des hapténes portant des épitopes correspondant: a) choléra-poliomyélite-influenza, b) Plasmodium falciparum-HBs, c) colibacille-choléra-rotavirus, d) LHRH-fièvre aphteuse-leucose bovine. d'autres polyvaccins peuvent être orientés plus généralement vers le même type d'affections, surtout lorsque celles-ci sont induites par des antigènes de types différents; par exemple les divers types de virus de la poliomyélite ou de la griffe. L'invention concerne enfin également les composi- tions préparées sous forme de vaccins contenant des doses efficaces des molécules selon l'invention, en association 2569984' avec un véhicule approprié. Par exemple pour un polyvaccin du type de celui de l'exemple I, une dose unitaire compor- te de 0,1 à 1 mg du polyvaccin tel que décrit. Des compositions pharmaceutiques avantageuses sont constituées par des solutions, suspensions ou liposomes injectables, contenant une dose efficace d'au moins un polyvaccin selon l'invention. De préférence, ces solu- tions, suspensions ou formes liposomes sont réalisées dans une phase aqueuse stérilisée isotonique, de préférence saline ou glucosée. L'invention concerne plus particulièrement de telles suspensions, solutions ou formes liposomes qui sont aptes à être administrées par injections intradermiques, intramusculaires ou sous-cutanées, ou encore par scari- fications. Elle concerne également des compositions pharma- ceutiques administrables par d'autres voies, notamment par voie orale ou rectale, ou encore sous forme d'aérosols destinés à venir en contact avec des muqueuses, notamment les muqueuses oculaires, nasales, pulmonaires ou vaginales. En conséquence, elle concerne des compositions pharmaceutiques dans lesquelles un polyvaccin selon l'in- vention se trouve associé à des excipients pharmaceuti- quement acceptables, solides ou liquides, adaptés à la constitution de formes orale, oculaire ou nasale, ou avec des excipients adaptés à la constitution de formes d'ad- ministration rectales, ou encore avec des excipients gé- latineux pour l'administration vaginale. Elle concerne aussi des compositions liquides isotoniques contenant un polyvaccin selon l'invention, adaptées à l'administration sur les muqueuses, notamment oculaire ou nasale. Elle concerne enfin des compositions formées de gaz liquéfiés pharmaceutiquement acceptables, dans lesquels le polyvac- cin selon l'invention est dissous ou maintenu en suspen- sion, et dont la détente provoque la dispersion en un 2569984' aérosol. Avantageusement, les compositions vaccinales selon l'invention contiennent en outre un véhicule, tel que la polyvinyl-pyrrolidone, facilitant l'administration du vac- cin. A la place de la polyvinyl-pyrrolidone, on peut uti- liser tout autre type d adjuvant au sens classique que l'on donnait autrefois à cette expression, c'est-à-dire d'une substance permettant l'absorption plus aisée d'un médicament ou -facilitant son action dans l'organisme. A titre d'exemples d'autres adjuvants de ce dernier type, on mentionnera encore la carboxyméthylcellulose, les hydro- xydes et phosphates d'aluminium ou tous autres adjuvants de ce type, bien connus de l'homme de l'art. On peut éga- lement - surtout pour l'application vétérinaire - utiliser également des adjuvants huileux, de préférence métabolisa- bles comme le squalane, le squaléne et des huiles végétales et même des huiles minérales. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont donc essentiellement destinées à induire chez l'hôte des réactions immunitaires se manifestant par des produc- tions simultanées d'anticorps distincts susceptibles de le protéger simultanément contre plusieurs antigènes dis- tincts. Avantageusement, ces compositions pharmaceutiques contiennent en outre un muramylpeptide jouant le rôle d'adjuvant immunologique. Un muramylpeptide particulière- ment préféré est constitué par le murabutide. La littéra- ture technique concernant les muramylpeptides est cepen- dant suffisamment développée pour qu'il soit inutile de souligner que l'homme de métier serait à méme de sélec- tionner d'autres muramylpeptides susceptibles de produire des effets semblables au sein des compositions polyvaccinantes conformes à la présente invention. Un intérêt majeur des associations de polyvaccins avec un muramylpeptide réside dans la possibilité de con- trôler l'immunogénicité des compositions de vaccins. Il est observé que le caractère protecteur du polyvaccin peut être élevé, même lorsque les titres en anticorps suscepti- bles d'être induits in vivo contre les différentes séquen- ces hapténiques contenues dans le polyvaccin ne sont pas très élevés. Un autre avantage de la composition de vaccins selon l'invention, même lorsque celle-ci comprenait égale- ment un muramylpeptide associé avec le polyvaccin (l'ex- pression "associé" impliquant l'absence de conjugaison covalente entre le polyvaccin et le muramylpeptide), est l'absence de risque de choc anaphylactique chez le sujet la recevant, même lorsque ce sujet a auparavant déjà été vacciné soit avec un vaccin classique, soit avec un autre polyvaccin, ce vaccin classique ou cet autre polyvaccin ayant en commun une ou plusieurs séquences hapténiques avec ladite composition. Ceci étant, il convient de mentionner que font également partie de l'invention les polyvaccins sur les- quels pourraient être greffées une ou plusieurs molécules de muramylpeptide, notamment dans les conditions décrites dans la demande de brevet européen n 83 400525. Le mura- mylpeptide peut d'ailleurs lui-même constituer un groupe pontant entre deux haptènes distincts, notamment par l'in- termédiaire d'une fonction carboxyle ou amine portée par son groupe glutaminyle, d'une part, et par l'intermédiaire d'une liaison au niveau de la position 6 sur son groupe saccharidique, d'autre part. Font encore partie de l'invention, les polyvaccins dans lesquels certains des haptènes seraient constitués d'un peptide naturel ou d'un fragment de peptide naturel, tel qu'une hormone, dont on veut pallier les effets. Ces derniers types de compositions pharmaceutiques peuvent être particulièrement utiles en thérapeutique humaine ou vétérinaire, chaque fois que sera recherchée une modifi- cation de l'évolution ou du comportement de l'organisme humain ou animal, par exemple au niveau du contrôle de la fécondité d'une espèce animale ou de l'orientation dirigée du métabolisme de l'organisme de l'hôte humain ou animal vers la suppression de certaines hormones, conjointement avec un ou plusieurs effets de vaccination contre un ou plusieurs antigènes distincts. Dans le domaine vétérinaire, on citera aussi la production accrue de certains constituants, au détriment d'autres constituants, ou la castration immunologique dans le but d'accroitre chez l'animal la production de viande. L'invention a donc encore pour objet des polyvac- cins dans lesquels l'une des séquences d'haptène est cons- tituée soit par une hormone, soit par une séquence pepti- dique ayant une partie commune avec l'hormone, l'hormone appartenant à la classe des hormones peptidiques ou glyco- peptidiques. Une hormone particulièrement intéressante à cet égard est constituée par le facteur de libération de l'hormone lutéostimulante LH-RH. L'invention concerne également encore des réactifs biologiques essentiellement formés à partir de ces poly- vaccins pour former in vivo des "cocktails" d'anticorps. Ces anticorps peuvent à leur tour être utiles pour la constitution de réactifs permettant par exemple l'étude de l'action de médicaments à l'étude à l'égard d'un hôte vi- vant. En particulier, ces anticorps peuvent permettre la détection de récepteurs cellulaires, ou encore l'étude du métabolisme et du mode d'action des médicaments en cause. L'invention concerne donc encore, et ce d'une façon géné- rale, les anticorps eux-memes et leur préparation, notam- ment par administration à un hôte vivant des polyvaccins selon l'invention. 2569984' REVENDICATIONS 1 - Molécule synthétique caractérisée par la réu- nion dans une seule molécule d'une pluralité d'hapténes distincts conjugués deux à deux ou les uns à d'autres par l'intermédiaire de liaisons covalentes, ces haptènes dis- tincts étant respectivement porteurs d'épitopes ou de si- tes antigéniques également distincts. 2 - Molécule selon la revendication 1, caractéri- sée en ce qu'elle contient de 2 à 10, et notamment de 4 à 6, séquences hapténiques portant des épitopes distincts. 3 - Molécule selon la revendication 1 ou la re- vendication 2, caractérisée en ce qu'elle a un poids mo- léculaire se situant entre environ 6 000 et environ 000, de préférence entre environ 10 000 et environ 000. 4 - Molécule selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 3, caractérisée en ce que les séquences hap- téniques contribuent, à raison de plus de 70 7., au poids moléculaire total de ladite molécule. - Molécule selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 4, caractérisée en ce que l'un des haptènes entrant dans la constitution de ladite molécule est dérivé de la protéine M de la surface de streptococcus pvoqenes. 6 - Molécule selon la revendication 5, caractéri- sée en ce qu'elle contient des haptènes comportant respec- tivement des épitopes de la toxine diphtérique, de l'anti- gène de surface du virus de l'hépatite B et d'un antigène protecteur contre la malaria. 7 - Composition vaccinante. de façon simultanée contre plusieurs agents pathogènes, caractérisée par l'as- sociation d'une molécule synthétique conforme à l'une quelconque des revendications I à 6, dans laquelle sont réunis des haptènes possédant des épitopes respectivement distincts, en commun avec lesdits agents pathogènes, avec un véhicule pharmaceutiquement approprié à l'administra- tion de ladite molécule à un hôte vivant. 8 - Composition selon la revendication 7, égale- ment caractérisée par l'association avec un muramylpep- tide, celui-ci devant être administré simultanément ou avec ladite molécule ou de façon décalée, dans des condi- tions permettant la manifestation de l'activité adjuvante immunologique dudit muramylpeptide vis-à-vis de la susdite molécule. 9 - Composition selon la revendication 8, caracté- risée en ce que le muramylpeptide est constitué par le mu- rabutide.