FR 2572094 A1 19860425 FR 8515496 A 19851018 L'invention concerne un procédé pour La préparation continue de l'éthanol à partir de substrats contenant des sucres par fermentation des sucres sous l'action d'une souche floculante de Zymomonas mobilis dans des conditions anaérobies et à un pH de 4,5 à 7. Un procédé de ce type est décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique 4 413 058. Dans ce procédé, on utilise un réacteur tubulaire incliné à l'extrémité inférieure duquel on amène le substrat sucré, et d'o l'on évacue, dans la région de l'extrémité supérieure, le substrat fermenté contenant de l'éthanol. La vitesse de passage est réglée de manière à assurer la conversion des sucres en éthanol mais également de manière que la culture d'une souche floculante de Zymomonas mobilis, à savoir Zymomonas mobilis "f" NRRLB-12526 ne soit en aucun cas évacuée du réacteur. Le réacteur tubulaire porte sur presque toute sa longueur une série d'orifices d'évacuation du C02 d'o partent dans chaque cas des conduits. Les extrémités libres de ces conduits débouchent, à peu près à la hauteur de l'extrémité supérieure du réacteur tubulaire ou légèrement au-dessus, dans l'air ambiant. A leurs extrémités, ces conduits sont fermés par exemple par des tampons d'ouate. Du fait que l'on ne doit pas évacuer la culture de micro-organismes, ce procédé connu exige une surveillance très attentive des taux de conversion du substrat. La construction du réacteur tubulaire en question est difficile au point qu'une transposition à l'échelle industrielle est impossible ou offre de très grosses difficultés. En outre, il faut remplacer totalement les installations existantes comprenant des fermenteurs classiques, d'o des investissements très coûteux. Dans le brevet de la RFA 3 148 329, on utilise également une souche floculante, à savoir Zymomonas mobilis ATCC 31822, obtenue par sélection à partir de la souche ATCC 31821, pour la préparation de l'éthanol à partir d'un substrat contenant des hydrates de carbone. Toutefois, le procédé décrit n'est que semi- continu. Dans ce procédé, on agite d'abord un milieu de fermentation ensemencé dans un fermenteur. Lorsque le dégagement de gaz carbonique est terminé, on Laisse déposer les colonies de cellules de bactéries, on évacue Le Liquide surnageant contenant de l'éthanol et on le remplace par du milieu de fermentation frais. D'autre part, dans Le brevet européen 0 047 641, on décrit un procédé de fermentation en deux stades pour la pré- paration de l'éthanoL avec utilisation de souches de Zimomonas mobilis, à savoir ATCC 29191 et ATCC 10988, procédé dans lequel, au premier stade, on produit une suspension de cellulesbactériennes et au deuxième stade, on prépare L'éthanol par addition d'un sucre fermentescible à cette suspension. Au deuxième stade, il ne doit se produire qu'une Légère prolifération des cellules bactériennes. On n'envisage pas l'utilisation de souches floculantes de Zimomonas mobilis, de sorte qu'il n'est pas possible dans la pratique indus- trielle de séparer par sédimentation la culture bactérienne mise en oeuvre du milieu de fermentation: il faut faire appel à cet effet à des techniques de centrifugation ou de filtration qui consomment de l'énergie et demandent du temps. Un grave inconvénient commun à tous Les procédés connus mentionnés ci-dessus réside dans la nécessité absolue d'uti- liser des substrats stérilisés. Les frais accompagnant une fermenta- tion stérile diminuent dans une mesure très considérable la renta- bilité d'un tel procédé, comme le montre clairement l'article "Ethanol production by Zymomonas and Saccharomyces, Advantages and Disadvantages" dans Eur. Journ. Of Applied Microbiology and Biotechnology, 18, 1983, pages 387-391. En effet, si, dans les procédés connus, on opère sans stérilisation, il y a un risque important d'infection, en particulier par des bactéries lactiques ou par des levures qui - comme Zymomonas mobilis - mais dans une mesure encore plus grande, tolèrent l'éthanoi jusqu'à des concentrations d'environ 15 % en volume. Zymomonas mobilis donne des taux spécifiques de production d'éthanol représentant deux à trois fois ceux de la levure pour des rendements identiques et, d'autre part, il n'exige pas d'oxygène pour sa croissance alors que la levure doit être aérée, au moins légèrement, pour une production suffisante de la biomasse. L'invention vise à l'exploitation de ces avantages intéressants de Zymomonas mobilis dans la production industrielle de l'éthanol et, par conséquent, à la -suppression des inconvénients et difficultés mentionnés ci-dessus des procédés connus et à la mise au point d'un procédé d'application sûre opérant sans stéri- lisation des substrats et convenant à la mise en oeuvre dans des installations de fermentation existantes après de légères adaptations. D'autres buts et avantages de l'invention apparai- tront à la lecture de la description ci-après. Ces buts ont été atteints dans un procédé du type défini en introduction et qui se caractérise par la combinaison de mesures suivantes: - on envoie le substrat, sans stérilisation préalable, avec des ceL- lules de Zymomonas mobilis, dans plusieurs stades de fermentation, à savoir au moins trois, - dans chaque stade de fermentation, on maintient une concentration d'au moins 4 % en volume d'éthanol, - la durée de passage du milieu de fermentation consistant en le substrat et les cellules de Zymomonas mobilis dans l'installation totale est réglée à un maximum de trois heures un tiers, de pré- férence de 0,8 à 2,5 heures, et/ou le taux de dilution du milieu de fermentation dans l'installation totale est régléà 0,3 heure 1, de préférence à un niveau de 0,4 à 1,25 h-1, - après le dernier stade de fermentation, les cellules de Zymomonas mobilis sont séparées par sédimentation et recyclées au premier stade de fermentation, et - on évacue le substrat contenant de l'éthanol débarassé des cellules de Zymomonas mobilis. Pour les divers stades de fermentation, on utilise des fermenteurs disposes en série, de préférence 3 à 6 fermenteurs. On peut donc régler séparément pour les stades individuels les concentrations en alcool ou en substrat. De même, on peut régler séparément la température dans chaque stade. Le substrat contenant des sucres traverse en continu tous les stades de fermentation, de sorte que Les sucres fermentent peu à peu. Lorsque c'est néces- saire, on peut introduire séparément dans chaque fermenteur ou chaque stade de fermentation un complément de substrat et un agent servant à régler le pH, par exemple une lessive alcaline, de sorte qu'on peut parvenir dans chaque stade à la productivité maximale par un réglage exact du rapport entre la population de micro-organismes et la concentration d'alcool et de sucre. Dans tous Les fermenteurs, on peut maintenir à cet effet un excès déterminé du substrat. On notera déjà que lors d'une fermentation en un seul stade, cela n'est pas possible car - pour éviter des pertes - il faut provoquer une fermentation aussi complète que possible des sucres contenus dans le substrat. Les substrats sont introduits dans l'installation de préférence à une forte teneur en sucres, ce qui offre l'avantage de pouvoir conserver ces substrats pendant des durées prolongées sans risque de contamination microbienne. Le milieu de dilution aqueux n'est ajouté qu'au premier stade de fermentation. Après cette dilution, une concentration d'environ 15 % de sucres dans le substrat a donné des résultats particulièrement favorables. Zymomonas mobilis peut fermenter des sucres tels que le glucose, le fructose et le saccharose, contenus par exemple dans des mélasses, des hydrolysats d'amidon et de cellulose. D'autre part, il y a dans le substrat, selon la pratique habituelle et aux quantités habituelles, des sels nutri- tifs tels que le sulfate d'ammonium, et des vitamines. A cet égard, on a constaté un autre avantage secondaire du procédé selon l'inven- tion: l'addition habituelle d'extrait de levure très coûteux, peut être pratiquement supprimée; on le remplace par de la liqueur de macération de mais. Les meilleures conditions de croissance pour Zymomonas mobilis se situent à des pH de 4,5 à 7 (cf "'Ethanol production by Zymomonas mobilis" in Advances in Biochemical Engineering, vol. 23 page 37). Au-dessous de pH 4, on constate déjà une nette inhibition de la croissance et à un pH d'environ 3, il n'y a plus du tout de croissance de la bactérie. Par conséquent, l'intervalle de pH le plus favorable pour une fermentation par Zymomonas mobilis se situe entre 4,5 et 6,0; un pH d'environ 5,0 constitue le pH optimal. Dans un milieu aussi légèrement acide, il n'y a pratique- ment que les bactéries lactiques et les levures qui trouvent des conditions de vie favorables. Une infection par d'autres micro- organismes, si l'on évite des pH de 7 ou légèrement au-dessous - est très peu vraisemblable. Toutefois, dans le cas des bactéries lactiques, bien que des espèces hétérofermentatives excrètent elles-mêmes de l'éthanol en tant que produit de métabolisme, ces bactéries sont déjà nettement affectées à une concentration en éthanol d'environ 4 % en volume. Les levures croissent principalement à des pH de 4 à 6, et pour ce qui concerne leur tolérance pour l'éthanol et leur sensibilité aux températures, elles se comportent presque de la même manière que Zymomonas mobilis. Toutefois, Zymomonas est strictement anaérobie et est détruit par l'oxygène. Certes, la levure peut croître et fermenter en l'absence totale d'oxygène mais elle se comporte autrement à l'égard de l'oxygène et sous l'action de cet élément, elle est portée à une formation accrue de cellules. Cela ressort nettement des taux de croissance spécifiques de levurescultivéesrespectivement dans des conditions aérobies et dans des conditions anaérobies. Alors qu'une levure du type Saccharomyces cultivée sans oxygène présente -1. un taux de croissance spécifique d'environ 0,15 h, La même levure, sous aération, présente un taux de croissance de 0,25 h-1, c'est-à- dire qu'elle croit presque deux fois plus vite. Dans des conditions anaérobies, Zymomonas mobilis croit à peu près aussi rapidement qu'une levure aérée mais avec un apport prolongé d'oxygène, la bactérie meurt. Afin d'exploiter les plus faibles taux de croissance des levures dans des conditions strictrement anaérobies comparative- ment à ceux de Zymomonas mobilis pour éviter une infection, on prévoit, en tant qu'autre caractéristique de la combinaison selon l'invention, de régler à une courte durée de passage ou à un fort taux de dilution du milieu de fermentation dans l'installation globale des stades de. fermentation ou fermenteurs. En raison des fortes vitesses de passage, on empêche l'apparition des levures par L'évacuation des cellules infectantes. Ainsi par exemple, à une durée de passage de 2 heures dans le système global, la vitesse d'écoulement est déjà plus que trois fois trop forte pour l'appari- tion des levures. En outre, cette mesure conduit à une production d'éthanol particulièrment forte. Même lorsque le système global a atteint l'état d'équilibre avec écoulement continu constant, une partie des flocons de Zymomonas mobilis reste dans les stades de fermentation indi- viduels. Une petite-partie des flocons, qui est fonction de la durée de passage observée, est évacuée des divers stades et transférée dans le stade qui suit immédiatement. Après le dernier stade de fermentation, les flocons entraînés par le substrat sont séparés, la manière la plus simple de les séparer du substrat étant la sédi- mentation. Dans cette séparation rendue possible par l'utilisation de souches floculantes de Zymomonas mobilis, une grande partie des microorganismes étrangers éventuellement contenus dans le milieu de fermentation est évacuée du système avec le substrat surnageant, contenant de l'éthanol, alors que dans le cas d'une séparation par centrifugation ou filtration, tous les micro-organismes étrangers seraient recyclés avec Zymomonas mobilis. Dans un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, une partie au moins du C02 formé dans les divers stades de fermentation est recyclée dans chaque stade. A cet effet, le C02 est évacué de l'espace des gaz des fermenteurs et envoyé, de préférence à l'état de fine division, par le bas, à nouveau dans les fermenteurs dans lesquels le gaz traverse le milieu de fermentation et provoque ainsi une répartition uniforme des flocons de Zymomonas miobilis. En outre, on évite ainsi des dépôts éventuels au fond des fermenteurs. Pour assurer une répartition aussi uniforme que possible des flocons dans toute la chambre de fermentation, il s'est également révélé avantageux d'évacuer dans chaque cas le milieu de fermentation à partir du fond des fermenteurs individuels et de L'envoyer en tête du fermenteur suivant. Un autre mode de réalisation préféré du procédé selon L'invention consiste à recycler au premier stade de fermenta- tion une partie au moins du résidu subsistant après récupération de l'éthanol contenu dans Le substrat évacué. Pour isoler l'éthanol, on rectifie par exemple le substrat fermenté qui a été évacué, dont la teneur est dans la plupart des cas d'environ 9 à 10 % en volume d'éthanol. Le résidu à peu près stérile en raison du chauffage de la rectification, contient encore des résidus de substances nutritives qu'on peut faire utiliser par les micro-organismes si L'on recycle ce résidu. En outre, on diminue ainsi la consommation d'eau fraîche. Toutefois, le recyclage est limité car la teneur du substrat en substances non valorisables amenées par le résidu ne doit pas augmenter trop fortement. Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée; dans ces exemptes, les indications de parties et de pourcentage s'entendent en poids sauf mention contraire. Exemple L'opération de fermentation est réalisée en trois stades opératoires dans une installation telle que représentée schématiquement dans la figure unique du dessin annexé. Dans cette figure, l'installation comprend trois fermenteurs cylindriques fermés disposés en série, la, lb et lc. Peu au-dessus du fond des fermenteurs, on trouve un organe de dis- tribution de gaz, par exemple un verre fritté 2a, 2b et 2e. Le troisième fermenteur!c est suivi d'un récipient de sédimentation 3 de même construction que les fermenteurs mais avec un fond conique. Le conduit 4 permet d'envoyer le substrat concentré en sucres dans les fermenteurs la, lb et lc; dans chacune des déri- vations correspondantes, on a placé des organes de fermeture res- pectifs 5a, 5b et 5c. En outre, on a prévu un conduit 6 d'alimentation en lessive caustique,-également avec dérivations vers les fermenteurs la, lb et lc. - Dans ces dérivations, on a placé des régulateurs -de débit 7a, 7b et 7c. On peut utiliser à cet effet par exemple des vannes magnétiques, qui peuvent être commandées par des sondes de mesure du pH introduites dans les fermenteurs mais non représentées dans la figure. Le premier fermenteur la est en outre équipé d'un conduit d'amenée 8 pour de l'eau.fraîche ou du résidu de fermenta- tion recyclé. De l'espace des gaz de chacun des fermenteurs la, lb et lc, un conduit de gaz mène, par l'intermédiaire de compresseurs respectifs 9a, 9b et 9c, aux organes de distribution de gaz 2a, 2b et 2c respectivement placés au fond de chacun des fermenteurs. Pour l'évacuation du gaz en excès, on a également installé dans la partie de tête de chacun des fermenteurs la à lc et du récipient de sédimentation 3 un conduit de gaz avec organe de fermeture 10a, 0lob, 10c et 10d. La biomasse qui s'accumule dans le fond conique du récipient de sédimentation 3 est recyclée à l'aide d'une pompe 11, par l'internédiaire du conduit de matière épaisse 12, en tête du premier fermenteur la. Le milieu de fermen- tation est évacué dans chaque cas par le fond des fermenteurs la et lb, envoyé par les conduits 13 et 13' en tête du fermenteur suivant immédiatement-lb ou lc puis, du fond du fermenteur lc, par le-conduit 13", en tête du récipient de sédimentation 3. Du récipient de sédimentation 3, le substrat éthanolique est évacué par le conduit de débordement 14. Pour le réglage de température des fermenteurs et du récipient de sédimentation, on peut prévoir des doubles enveloppes non représentées sur la figure et qui sont parcourues par un agent de transfert de chaleur. Les fermenteurs et le récipient de sédimentation de l'installation utilisée ont un diamètre intérieur d'environ 12 cm et une hauteur d'environ 55 cm; leur capacité est de 5 l pour chacun d'eux. L'organe de distribution de gaz placé peu au-dessus du pied des fermenteurs est un verre fritté, et tous Les fermenteurs, comme le récipient de sédimentation, ont une double enveloppe. Au début de l'opération de fermentation, on introduit dans tous les fermenteurs et dans le récipient de sédimentation un substrat à 15 % de sucre contenant des substances nutritives et des vitamines; pour la préparation du substrat, on a utilisé avec des 2 5 71 2- 0 9 4 résuLtats identiques du glucose, du saccharose inverti ou un hydrolysat d'amidon. L'air contenu dans les récipients est refoulé par balayage de C02 ou d'azote et toute l'installation est ensemencée par environ 70 g de floconsde Zymomonas mobilis. La culture bacté- rienne en question est préparée dans une fermentation préalable qui dure d'après l'expérience quelques jours, jusqu'à ce que, après un ensemencement du substrat par une souche floculante de Zymomonas mobilis, il y ait effectivement formation de flocons. Après l'ensemencement, on abandonne l'installation pendant 6 heures sans alimentation, jusqu'à ce qu'il se produise un dégagement intense de gaz et que la concentration enéthanol de chaque fermenteur ait atteint environ 4 % en volume. Le C02 formé dans les stades de fermentation est recyclé dans chaque stade ou chaque fermenteur par l'intermédiaire des compresseurs 9a, 9b et 9c. On commence alors à introduire du substrat concentré et du liquide de dilution. Les réglages initiaux sont de 150 ml de substrat à 60 % de sucre/h et 750 ml d'eau fraîche/h dans le premier fermenteur la, et 100 ml de substrat à 60 % de sucre/h dans le deuxième fermenteur lb, de sorte qu'on règle à une concen- tration en sucre de 15 % à un débit total de 1 l/h. Bien que le substrat ait été réglé à l'origine à pH 5,0, il faut ajouter en permanence de la lessive caustique pour maintenir ce pH, car en raison de l'absorption de NH4+ provenant du sulfate d'ammonium contenu dans le substrat par le micro-organisme, il se produit une acidification du milieu de fermentation. Par recyclage intensif des flocons de bactéries qui se rassemblent au fond du récipient de sédimentation 3, il y a augmentation continue de la concentration de la biomasse, de sorte que finalement, à l'équilibre, cette concentration est de à 25 g de matière sèche/litre. En raison de la haute productivité spécifique de Zymomonas mobilis, on peut alors porter la quantité totale introduite de 1 l/h à 6 l/h sans trouver de sucre non fermenté dans le milieu de fermentation après le troisième fermenteur lc. Dans le substrat fermenté évacué par le conduit de débordement 14, on trouve 9,0 à 9,2 % en volume d'éthanol, ce qui correspond à un rendement de 93 à 95 % de la théorie. Avec une alimentation de 6 l/h et un volume de fermentation efficace de 15 l (3 x 5 l; par conséquent, durée de passage de 2,5 9 dans L'installation totale), il y a donc une pro- ductivité en volume d'environ 36 l d'éthanol/m3.h. On peut parvenir à des productivités encore plusfortes avec l'installation décrite. Toutefois, si l'on tient compte des ordres de grandeur industriels, l'évacuation de la chaleur de fer- mentation apparaissant dans des récipients de grande dimension à une productivité encore plus forte constituerait un problème dif- ficile à résoudre. On a poursuivi la fermentation dans l'installation d'essai décrite en continu pendant 3 semaines. On n'a pas constaté de problème d'infection bien que ni le substrat concentré ni le liquide de dilution n'aient été stérilisés. Exemple comDaratif 1 On a fait fonctionner l'installation comme décrit dans l'exemple précédent au débit le plus fort et à une alimentation totaLede6 lh, mais on a supprimé le réglage de pH. En raison de l'aci- dification mentionnée ci-dessus par absorption de NH4+ par Zymomonas mobilis, le pH du milieu de fermentation diminue peu à peu pour atteindre finalement un niveau de 2,8. La première réaction de l'installation a consisté en la présence de sucre non fermenté au conduit de débordement 14, de sorte qu'il a fallu diminuer les vitesses de passage. Apres 30 h environ, on a pu observer les première cellules de levure au microscope, elles se sont multipliées en continu et finalement on les a retrouvées dans les flocons de bactéries. Après avoir diminué les débits de passage à 0,6 L/h, on a interrompu la fermentation. Exemple comparatif 2 On a fait fonctionner l'installation comme décrit cidessus à la production optimale et on a ensuite injecté par les verres frittés 2a, 2b et 2c de l'air à la place du C02 formé. Le premier effet observable a été une diminution nette du rendement en éthanol, au-dessous de 90 %, probablement en raison d'une formation accrue de produits secondaires comme t'acide acétique ou l'acétaL- déhyde. Comme autre conséquence, il a fallu diminuer Les débits de passage,ce qui a eu finalement pour conséquence L'apparition de cellules de levure - favorisée en outre par l'apport d'oxygène - dans le milieu de fermentation. Contrairement au cas de L'exemple comparatif 1, on a pu rétablir l'état de fonctionnement optimal deL'instatLation en coupant l'alimentation en air et en injectant à nouveau du C02. Cela a été possible car, contrairement au mode opératoire de L'exemple comparatif 1, La bactérie Zymomonas mobitis n'a pas subi des dommages durables; elle a seulement été exposée à des condi- tions défavorabLes. Après coupure de l'alimentation en air, on a d'abord constaté une nouvelle amélioration des rendements, on a pu accroître Les débits de passage et au bout de 40 heures environ, toutes les levures avaient été évacuées de L'instaLlation. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la préparation continue de l'éthanol à partir de substrats contenant des sucres par fermentation des sucres sous l'action d'une souche floculante de Zymomonas mobilis dans des conditions anaérobies et à un pH de 4,5 à 7, caractérisé par la combinaison de mesures suivantes: on envoie le substrat, sans stérilisation préalable, avec des cellules de Zymomonas mobilis, dans plusieurs stades de fermen- tation, à savoir au moins trois stades de fermentation, - dans chaque stade de fermentation, on maintient une concentration en éthanol d'au moins 4 % en volume, - la durée de passage du milieu de fermentation consistant en te substrat et les cellules de Zymomonas mobilis dans l'installation totale est réglée à un maximum de 3 h 1/3, de préférence de 0,8 à 2,5 h, ou bien le taux de dilution du milieu de fermentation dans l'installation totale est réglé à au moins 0,3 h 1, de préférence à un niveau de 0,4 à 1,25 h1, - après le dernier stade de fermentation, les cellules de Zymomonas mobilis sont séparées par sédimentation et recyclées au premier stade de fermentation, et - le substrat contenant de l'éthanol, débarrassé des cellules de Zymomonas mobilis, est évacué. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en-ce que l'on recycle à chaque stade une partie du C02 formé dans les divers stades de fermentation. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on recycle au premier stade de fermentation une partie au moins du résidu subsistant après récupération de L'éthanol à partir du substrat éthanolique évacué.