FR 2572731 A1 19860509 FR 8417460 A 19841107 - 1 - La présente invention est relative à de nouveaux sulfates de xylanes, à leur procéde de préparation et à leur appli- cation en médecine humaine et vétérinaire pour leur acti- vité antithrombotique et hypolipémiante. Dans ce domaine d'activité, l'héparine est un mucopoly- saccharide d'origine animale largement utilisé en thérapeu- tique humaine, notamment dans la prévention et le traitement des thromboses veineuses et des embolies pulmonaires. Les héparines commerciales sont constituées en fait d'un mélange de polysaccharides dont les masses molaires varient entre 3000 et 50000 Daltons. Environ 80 % de ces polymères ont une masse molaire comprise entre 5000 et 25000 D et la masse molaire moyenne du mélange se situe autour de 16000 D. Ces polymères, en raison de leur masse molaire élevée présen- tent une biodisponibilité quasi-nulle par voie orale et, de ce fait, les heparines standards ne sont efficaces qu'après admi- nistration parentérale. Plus récemment, diverses équipes ont fractionné ou fragmenté ces héparines standards pour obtenir des héparines de bas poids moléculaires (masse molaire moyenne comprise entre 4000 et 8000 D) qui semblent présenter moins de risques hemor- ragiques et thrombocytopémiants que les héparines standards. D'autres polysaccharides sulfatés ont présenté, en pharmacolo- gie animale et en clinique humaine, des propriétés antithrom- botiques comparables à celles de l'héparine. L'un de ces pro- duits, appelé SP 54 ou PZ 68 selon les auteurs est un polysul- fate de xylane obtenu par sulfatation ménagée de xylanes extraits de bois de Hêtre, à un coût très inférieur à celui de l'héparine. Ce produit est commercialisé depuis une vingtaine d'années pour utilisation par voie injectable, notamment dans la prévention des thromboses veineuses postopératoires, et par voie orale, notamment dans le traitement des dyslipémies athérogènes. - 2 - Par ses effets sur les systèmes de coagulation (FISCHER A.M., BARROWCLIFFE T.W.&THOMAS D.P. Thromb Haemost, 1982, 47, (2), 104) (FISCHER A.M., MERTON R.E., MARSH N.A., WILLIAMS S., GAFFNEY P.J., BARROWCLIFFE T.W. & THOMAS D.P. Thromb Haemost, 1982, 47, (2), 109) (SCULLY M.F., WEERASINGHE K.M., ELLIS V., DJAZAERI B. & KAKKAR V.V. Thromb Res, 1983, 31, 87) et de fibrinolyse (VINAZZER H., STEMBERGER A., HAAS S. & BLUMEL G., Thromb Res, 1982, 27, 341), sur le système complémentaire (WALB D., LOOS M. & HADDING U. Z Natusforsch, 1971, 26, 403), sur la paroi des vaisseaux (PAUL R., HERBERT J.M., MAFFRAND J.P., LANSEN J. & RONCUCCI R., Symposium on Atheroma and Thrombosis, London, July 1983, et sur le métabolisme lipi- dique (ROUFFY J., Mises à jour Cardiol, 1983, 12 (8), 381, ce produit présente en effet des propriétés antithrombotique et antiathéromateuse intéressantes. Comme l'héparine, il se présente sous la forme d'un mélange de polymères (sulfates de xylanes) de différents poids molécu- laires. La définition analytique de tels mélanges est toujours délicate et plusieurs expérimentateursont pu donner des résul- tats différents pour un même produit. Ainsi, VINAZZER et al. ont reporté le SP 54 un poids molécu- laire de 2000 (Thromb. Res., 1980, 20, 57-68)puis de 3000 (Thromb. Res., 1982, 27, 341-352); C.D. ESQUIVEL et al. (Thromb. Res., 1982, 28,389-399) ont décrit un poids molé- culaire moyen de 4000; enfin C. SORIA et al. (Thromb. Res., 1980, 19, 455463) ont signalé un poids moléculaire moyen de 6000 qui a été aussi publié très récemment par M.F. SCULLY et V.V. KAKKAR (Biochem. J., 1984, 218, 657). - 3- Cette disparité dans les poids moléculaires moyens, est sans doute due aux méthodes d'analyse et aux standards utilisés ainsi qu'a l'absence de précision sur la - nature (apparente, en poids, en nombre) de la masse molaire publiée. A l'aide des techniques décrites plus loin, la demanderesse a trouvé que le SP 54 ou PZ 68 qui répond a la formule statistique développée suivante: R OR ". I O R -= dans laquelle R représente le groupe -SO03 Na ou l'hydro- gène peut être défini de la manière suivante: Il s'agit d'un mélange de polymères de masses molaires comprises entre 1000 et 40000 Daltons, présentant une distribution quasi-gaussienne. Les mesures de paramètres de distributions moléculaires de ce produit par chromatographie d'exclusion haute performance font apparaitre pour différents lots de fa- brication des valeurs moyennes de: Masse moléculaire moyenne en nombre ou Mn: 5300 à 5500 Masse moléculaire moyenne en poids ou Mw: 7400 a 7600 Indice de polydispersité ou D -g mesurant la largeur de la distribution moléculaire: 1,4 a 1,5. 4 2572731 -4- La masse moyenne apparente ou Ma qui correspond à la masse moléculaire de la population isomoléculaire majoritaire en concentration (c'est a dire le sommet du pic sur le chromatogramme) est comprise entre 6500 et 7200 D. Le taux de sulfatation du produit c'est & dire le nombre de fonctions hydroxyle estérifiees par un groupement sulfurique est accessible par le dosage pondéral moyen du soufre: 15 a 20 %. On peut définir aussi le degré de sulfatation moyen de ce mélange de polymères ou D.S. comme le nombre moyen de groupes sulfuriques par unité xylose considéré comme élément monomère. Le degré de sulfatation moyen pour le produit, accessible par résonance magnétique nucléaire du proton ou par dosages centésimaux micrôanalytiques du carbone et du soufre est compris entre 1,5 et 2 et plus précisément proche de 1,8. Ce polysulfate de xylane est aussi caractérisé par les valeurs moyennes des dosages de pentoses et d'acides glucuroniques. Ainsi le pourcentage pondérai de pentoses exprimé en équivalent xylose est de 30 a 40 %. Le pourcentage pondéral d'acides uroniques (en fait principalement acide 4 MeO-glucuronique) exprimé en acide glucuronique varie de 4 à 6 %. Ceci correspond a une proportion de 1 unité glucuronique pour 8 a 10 unités xyloses. La demanderesse a maintenant trouve que de nouveaux sulfates de xylane, ayant un faible poids moléculaire et des carac- téristiques physicochimiques bien déterminées, possèdent une bonne activité par voie orale, avec une excellente absorption duodénale. > - 5 - 2572731 Ainsi, la présente invention a pour objet des polysulfates de xylane ayant les caractéristiques suivantes: - degré de sulfatation moyen est compris entre 1,5 et 2 - masse moléculaires moyennes apparentes Ma comprises entre 2000 et 5000 Daltons. - taux pondérai de pentoses exprimés en xylose compris entre 30 et 40 % taux pondérai d'acides uroniques exprimé en acide glucuronique compris entre 0 et 10 % - les indices de polydispersité des distributions moléculaires pour les produits de l'invention sont inférieures ou égales a celles du produit 15. Ces produits ne contiennent que des quantités négligeables de polymères de masse unitaire supérieure a 10000 Daltons. Ces sulfates de xylanes de bas poids moléculaire présentent une biodisponibilité par voie orale net- tement supérieure à celle du SP 54 et leur absorption duodénale est plus importante que l'absorption gastrique. Toutes ces observations ont conduit à la mise au point de formes galéniques permettant une bonne absorption par voie orale, chez l'homme. La demanderesse a enfin trouvé que ces nouveaux produits de la présente invention, présentaient, d'une façon sur- prenante une activité pro-agrégante vis à vis de I'ADP nettement inférieure à celle du SP 54 et surtout de l'Héparine, laissant ainsi espérer moins de risques thrombocytopémiants qu'avec ces produits. Ces nouveaux polysulfates de xylane peuvent être pré- parés par un procédé caractérisé en ce que le produit SP 54 est directement soumis à un fractionnement par ultra-filtration sur des membranes ou des fibres creuses de différentes porosités. Les caractéristiques analytiques du SP 54 décrites plus haut et celles des produits finaux ont été déterminées selon les méthodes ci-après: - 6 - 2572731 1 - Seectre de résonnance magnétigue nucçlaire du carbone 13 Le spectre de resonnance magnétique nucléaire du carbone 13 (80 MHz) est réalisé sur une solution a 10 % (m/V) dans l'eau deutériée. Les déplacements chimiques des pics correspondent aux atomes de carbone de l'unité xylose sulfatée, sont les suivants: C1: 100,4 ppm; C2: 73,6 pp C3: 74,1 ppm; C4: 75,43 ppm et C5: 60,3 ppm. 2- Spct[e.de résonnance magnétigue _nuclaire du proton lC Le spectre de resonnance magnétique nucléaire du proton (250 MH2) est réalisé a la concentration de 20 % (m/V) dans l'eau deutériee. Le signal correspondant a l'eau est déplacé par ajout d'acide trifluoroacétique. Le degré de sulfatation peut être calculé sur la base de l'in- tégration des protons 1 et 3 (5,2 ppm et 4,8 ppm) de l'unité xylose sulfatée. 3 - Dosage _desgr2Qp2n3t _méthoxy La méthode employée est celle décrite par LAVER M. et WOLFROM M.L. dans Methods in Carbohydrate Chemistry Vol. I page 454, Edité par Ac. Press. 1962. 4 - posage.ges acides uronigues La méthode employée est celle au carbazole de BITTER T. et MUIR H.M. (Anal Biochem, 1962, 4, 330-334). -7- - Microdosage du soufre Après minéralisation en fiole de SHONIGER W. (Mikrochim Ac 1956, 1, 869-876), le soufre est dosé conductrimétriquemen par le perchlorate de baryum. Les pourcentages centésimaux de soufre et de carbone (obtei par microanalyse) permettent de calculer le degré de sulfa tion ou D.S.: nombre de moles de soufre pour 100 g de Produit: s Tr' U - nombre de moles de carbone pour 100 g de Produit:CT - nombre de moles de xylose pour 100 g de Produit: %C x 5 1Z,O11 x 5 - nombre moyen de finctionssulfates par xylose monomère ou D.S. = S 12,011 D. S. = 5 x-Y- -x 32,06 6 -Dosage des _entoses La méthode employée est celle a l'orcinol et au chloru- re ferrique en milteu chlorhydrique (MEJBAUM W. - Z.Phy- -siol.Chem., 1979,258, 117) en prenant le xylose comme étalon. 7 - Dosage du sulfate de sodium' Il est réalisé par chromatographie liquide haute perfor- mance en utilisant une colonne IONOSPHER TmA de 25 cm de longueur (CHROMPACK ref. 28300) avec comme éluant de l'hydrogène phtalate de potassium a 0,7 % (m/V) dans l'eau distillée. L'étalonnage est réalisé avec du sulfatE de sodium anhydre. 8 - Détermination de la masse moléculaire Elle est réalisée par chromatographie d'exclusion à 0 c travers deux colonnes de silice de porosité 60 A et 500 1 placées en série. L'appareil utilisé est celui de HEWLETI PACKARD 1081 B équipé d'un réfractomètre JOBIN et YVON I( et d'un injecteur HP 79841 A. L'ensemble est thermostaté a 30 C. La phase mobile contenant du sulfate de sodium est préparée selon BARTH H.G. et SMITH D.A. (J. Chromatogr, 1981,206, 410-415) et modifié en ajoutant 0,5 % de polyéthj lène glycol pour éviter les interactions de type pont hydrogène. La forceionique de l'éluant est égale I 1. Les masses moléculaires moyennes en nombre (Mn), en - poids (Mw) et apparente (Ma) sont calculées & partir d'un étalonnage réalisé a l'aide d'oligosaccharides neutres (xylose, maltotriose) et de Dextranes (T40-T70 et T500) selon la méthode décrite par YAU W.W.; KIRKLAND J.J. et BLY 0.0. dans Modern size-exclusion Liquid Chromatography page 315 Edité par J. WILEY et SONS (1979). L'indice de polydispersité est calculé selon le rapport Mw/Mn. Les exemples non limitatifs suivants illustrent l'invention: gExepleq_: Fraction de polysulfate de xylan ou SP 54 de masse apparente 3346 Daltons. Une solution de 1800 g de polysulfate de xylane dans 24 litres d'eau déminéralisée (concentration poids volume 7,5 %) est ultrafiltree dans un système équipé d'une cartouche de fibres creuses ROMICON 22-20 PM 5 (Longueur 63 cm surface de membrane 2,4 m2, seuil de coupure 5000), et d'une admission d'eau déminêralisée permettant d'ultrafiltrer la solution mère en conservant son volume constant. La pression moyenne de travail en amont de la cartouche est réglée à 1,5 Bar et le debit moyen d'ultrafiltrat obtenu est de l'ordre de 130 ml/mn. Lorsque 60 litres de perméat ont été soutirés du système, la solution mère retenue est retirée du système que l'on rince alors à l'eau déminéralisée. On remplace la cartouche utilisée par une ROMICON 15-43 PM 2 (Longueur 63 cm, surface de mem- brane 1,4 m2, seuil de coupure 2000). On concentre alors la solution d'ultrafiltrat obtenue précédemment sous une pression de 1,5 Bar Jusqu'à un volume de 19 litres. Les 41 litres de solution de perméat de concentration - recueillies hors du système sont alors lyophilisés dans un appareil industriel. On recueille 189 g de cristaux blancs (10,5 % de rende- ment par rapport a la quantité initiale de sulfate de xylane). Ces cristaux, contenant les fractions de plus petits poids moléculaire du produit initial et ses impuretés minérales (principalement du sulfate de sodium) qui s'y trouvent ainsi concentrées, sont alors dessales par quantités de 3 g sur une colonne de gel Trisacryl GF 05 (Longueur 90 cm, diamètre 44 cm, débit d'eau distillée 3 ml/mm, détection réfractométrique). Les fractions d'éluant de colonne correspondant aux petits poids moléculaires de polysulfate de xylane séparées des parties d'éluat contenant les impuretés.minérales sont alors lyophilisées. En 10 opérations identiques de dessalage, on recueille: 14,2 g de sulfate de xylane de petits poids moléculaires exempts de sulfate de sodium. Rendement par rapport à la quantité initiale de sulfate de xylane: 5 %. Caracteristigues ana! 1 gy Distribution moléculaire Mn = 2794 Mw = 3380 D = 1,21 Ma = 3346 COnR2sition chimigue - Degré de sulfatation 1,88 par microanalyse Soufre/Carbo - Pourcentage de Pentoses exprimés en xylose: 31,4 % - Pourcentage d'acide uronique exprimés en acidesglucuroniques: 6 % - Teneur en sulfate de sodium: - 10 - 2572731 Exempe2: Fraction de polysulfate de xylane de poids moléculaire moyen 3518 Daltons Une solution de 1,5 Kg de polysulfate de xylane dans 60 litres d'eau permutée, est ultrafiltrée dans un système tel que celui décrit dans l'exemple 1 équipé d'une membrane ROMICON 15-43 PM 2 (Longueur 63 cm, surface de membrane 1,4 m2, seuil de coupure 2000); sous 1 Bar de pression, à volume constant. Lorsque 60 litres d'ultrafiltrat ont été recueillis l'opération est stoppée et le sytème est nettoyé pour une opération identique. Les solutions perméat de trois opérations successives soit litres obtenues de 3 fois 1,5 Kg de polysulfate de xylane sont alors concentrées à 45 litres sur le même sys- tème équipé cette fois d'un modèle spiral millipore PCAC 1000, de seuil de coupure 1000 en acétate de cellu- lose. Lorsque le volume de solution rétentat de 45 litres a été obtenue (135 litres d'ultrafiltrat de concentration soutirés du sustème), l'admission d'eau permutée est ouverte pour opérer une ultrafiltration à volume constant. On soutire ainsi: 70 litres de solution d'ultrafiltrat. Puis la solution de rétentat est soutirée du système et concentrée dans un évaporateur sous vide Jusqu'à un volu- me de 7 litres. On opère alors une lyophilisation qui permet d'isoler 402 g de cristaux blancs. Rendement par rapport à la quantité initiale de poly- sulfate de xylane (4,5 Kg): 9 %. Caractéristigues analtjigue Distribution moléculaire: Mn = 2732 Mw = 4183 O = 1,53 Ma = 3518 - ll - z2572731 Cú2p22iition-chimigyt - Degré de sulfatation: 1,8 par RMN - Pourcentage de pentoses exprimé en xylose: 30 % - Pourcentage d'acides uroniques exprimé en acide glucuronique: 4,3 % - Teneur en sulfate de sodium: 2,2 %. Exe.3: Fraction de polysulfate de xylane de poids moléculaire moyen apparent 3889 Daltons. Une solution de 60 g de polysulfate de xylane dans 1000 ml d'eau est ultrafiltrée sur fibres creuses AMICON H1P 10-8 dans un système, à volume de rétentat constant. On recueille 1100 ml d'ultrafiltrat que l'on concentre a 800 ml, sur le même système équipé de fibres creuses H1P 5-20 (seuil de coupure 5000), puis on ultrafiltre a volume constant en utilisant 4000 ml d'eau distillée. Les 4300 ml d'ultrafiltrat recueillis lors de cette dernière opération sont concentres a 800 ml sur le même système équipé d'un faisceau de fibres creuses HIP-2-43 (seuil de coupure 2000), puis l'on ultrafiltre & volume de rétentat constant en utilisant 1600 mi d'eau distillée. Le rétentat est alors soutiré du système, et lyophilisé. On recueille 11,3 g de poudre blanche (19 X) de rendement. Caractéris t'1 a Distribution moléculaire Mn = 3330 mw = 4480 D = 1,34 Ma 3889 C2mgostion chimige- - Degré de sulfatation: 1,93 par microanalyse carbon soufre - Pourcentage de pentoses exprimé en xylose: 38 % - Pourcentage d'acides uroniques exprime en acide glucuronique: 4,9 % - 12 - 2572731 Ex e.: Fraction de polysulfate de xylane de poids moléculaire 3939 Daltons. Une solution de 10 g de polysulfate de xylane dans 500 ml d'eau distillée (concentration poids/volume 2 %) est ultrafiltrée à volume constant sur un système équipé d'une cartouche de fibres creuses AMICON H1P-2-43 de seuil de coupure 2000. Lorsque 1250 ml d'ultrafiltrat ont été recueillis l'opé- ration est arrêtés. Le teneur en sulfate de sodium de cette solution est ramenée a 1 % par concentration et ultrafiltration a volu- me constant sur un système équipé de membranes planes AMICON 5 YM 2 de seuil de coupure 1000. On lyophilise la solution finale et on obtient. 1.2 g de cristaux blancs (Rendement: 12 %). Caractéristiques analytiques Distribution moléculaire Mn = 3007 Mw = 4013 D = 1,33 Ma = 6939 om9osition chimigue - Degré de sulfatation: 1,85 par RMN - Pourcentage de pentoses exprimé en xylose: 34,3 % - Pourcentage d'acides uroniques exprimé en acide glucuronique: 5,1 % - Teneur en sulfate de sodium: 1,8 % Exemple5: Fraction de polysulfate de xylane de poids moléculaire moyen 4066 Daltons. Une solution de 1 Kg de polysulfate de xylane dans 33 li- tres d'eau permutée (concentration poids/volume 3 %) est ultrafiltrée dans un système équipé d'une car- touche de fibres creuses ROMICON 15-43 PM -2 (Longueur 63 cm, surface de membrane 1,4 m2 seuil de coupure 2000) surface de membrane 1,4 m2, seuil de coupure 2000) o - 13 - 2572731 et permettant de travailler l volume de rêtentat cons- tant sous une pression de 1,2 Bar. Lorsque 50 litres d'ultrafiltrat ont été obtenus la solution de rétentat est soutirée. Le système est équipé d'un module spiral Millipore PCAC 10 (acétate de cellulose, seuil de coupure 1000) pour traiter la solution d'ultrafiltrat obtenue précédemment. Cette solution est concentrée & 42 litres sous une pression de 0,8 Bar, puis l'admission d'eau permettant de garder le volume de solution traitée constant est ouverte. Lorsque 63 litres d'ultrafiltrat ont été recueillis, la solution rétentat est soutirée du système, son volume est ramené de 42 litres & 8 litres dans un concentrateur sous vide, puis lyophilisee. On obtient 109 g de cristaux blancs (Rendement: 1 %). Caractéristiguesanalytigues Distribution moléculaires Mn = 3133 Mw = 4716 D = 1,50 Ma = 4066 Cm20sition-chimigue - Degré de sulfatation: 1,82 par RMN - Pourcentage de pentoses exprimé en xylose: 34,5 % - Pourcentage d'acides uroniques exprimé en acide glucuronique: 4,3 % - Teneur en sulfate de sodium: 0,3 % Exemle6_ : Fraction de polysulfate de poids moléculaire moyen 4407 Daltons Une solution de 30 g de polysulfate de xylane (SP 54) dans 1000 ml d'eau distillée est ultrafiltree dans un système équipé d'un faisceau de fibres creuses H1 P 5-20, - 14 - 2572751 & volume de rétentat constant en utilisant 5000 ml d'eau distillée en apport continu dans le rétentat. On recueille 5000 ml d'ultrafiltrat que l'on concen- tre 8 l'aide du même système équipé de fibres H1P 2-43, à 1000 ml. On ultrafiltre ensuite & volume de rétentat constant avec apport continu d'eau distillée (5000 ml). Le rétentat est alors retiré du système et lyophilisé. On recueille 9 g de poudre blanche (30 % de rendement). Caractéristig-ues ana_ liyt19 s Distribution-moléculaire Mn = 3470 Mw = 4570 O - 1,3 a - 4407 gm2si2tion chimigqy - Degré de sulfatation: 1,90 par microanalyse carbone soufre - Pourcentage de pentoses exprimé en xylose: 35,8 - pourcentage d'acides uroniques exprime en acide glucuronique: 4,7 % - Teneur en sulfate de sodium: 1,6 % Exemple7: Fraction de polysulfate de xylane de poids moléculaire moyen 4674 Daltons Une solution de 10 g de polysulfate de xylane dans 500 ml d'eau distillée (concentration poids/volume 2 %) est ultrafiltrée dans un système permettant de travailler à volume de rétentat constant, équipé d'une cartouche de fibres creuses AMICON H1P 3-20 (seuil de coupure 3000 daltons, sous une pression de 0,9 Bars). Lorque 1250 ml d'ultrafiltrat ont été soutirés du sys- tème, cette dernière solution est concentrée sur un système équipé d'une membrane plane Millipore PCAC 1000 (seuil de coupure 1000 Daltons) jusqu'à un volume de 400 ml puis ultrafiltrée à volume constant. Lorsque 800 ml d'ultrafiltrat ont été recueillis, la solution rétentat est lyophilisée. - 15 - 2572731 On recueille 2,7 9 de cristaux blancs, rendement 27 %). Caractér istigue s analyl i gues Distribution moléculaire M-n a 3648 Mw 4958 D - 1,36 Ma r 4674 Composition Chimigue - Degré de sulfatation: 1,80 par RMN - Pourcentage de pentoses exprimé en xylose: 35,2 % - Pourcentage d'acides uroniques exprimé en acide glucuronique: 5,3 % - Teneur en sulfate de sodium 2,1 % Exenple8: Fraction de polysulfate de xylane de poids moléculaire moyen 4903 Daltons Une solution de 30 g de polysulfate de xylane dans 450 ml d'eau distillée (concentration poids/volume 6,66 %) est ultrafiltree a volume de rêtentat constant dans un système équipé d'une cartouche de fibres 2 0 creusesAMICON H1P 5-20 (seuil de coupure 5000 Daltons) sous une pression de 0,9 Bar. On recueille 1200 ml d'ultrafiltrat que l'on retraite sur un système éequipé d't embrane plane Millipore PCAC 1000. Après concentration a 400 ml, on ultrafiltre à volume 2 5 constant,. Après avoir recueilli 600 ml d'ultrafiltrat, le rétentat est lyophilisé. On obtient 8,5 g de cristaux blancs (Rendement 28 Z) Caractéristiguesanalytigues Distribution moléculaire Mn = 4039 Mw = 5058 D = 1,25 Ma = 4903 CnLD2%i ti on -chi migut - Degré de sulfatation: 1,98 par microanalyse carbone-soufre. - Pourcentage de pentoses exprimé en xylose: 30,8 % - Pourcentage d'acides uroniques exprimé en acide glucuronique: 4,6 % - Teneur en sulfate de sodium: 2,3 % -16- - 16 - 2572731 Exemnle 9: Fraction de polysulfate de xylane de poids moléculaire moyen 4921 Daltons Une solution de 2,5 Kg de polysulfate de xylane dans 50 litres d'eau permutée (concentration poids volume 2 %) est ultrafiltrêe dans un système Equipê d'une cartouche ROMICON 15-43 PM2 (Longueur 63 cm, surface de membrane 1,4 m2 seuil de coupure 2000 Daltons), et d'un système d'admission d'eau permutée permettant de travailler & volume de rétentat constant, sous une pression de 850 mBars. - On soutire ainsi du système 31 litres d'ultrafiltrat que l'on dessale ensuite à volume constant, sous une pression de 1,2 Bar sur un système équipé d'un modèle spiral Millipore PCAC 1000 (acétate de cellulose seuil de coupure 1000 Daltons). Apres avoir éliminé 49,5 litres d'ultra- filtrat, la solution rétentat est concentrée sous vide jusqu'& un volume de 9,2 litres, puis lyophilisée. On recueille 658 9 (rendement 26 %) de cristaux blancs. Caractéristiques analytiques Distribution moléculaire Mn - 3680 Mw = 5585 D = 1,52 Ma = 4921 gomp9osition chimigue - Degré de sulfatation: 2,0 parRMN - Pourcentage de pentoses exprimé en xylose: 34,7 % - Pourcentage d'acides uroniques exprime en acide glucuronique: 5,7 % - Teneur en sulfate de sodium: 2,3 % Les résultats des essais toxicologiques et pharmacologiques ont permis de mettre en évidence les interessantes pro- priétés des produits de l'invention. - 17- 2572731 C'est-a-dire des différentes fractions qui ont été obtenues à partir du SP 54. L'invention a donc pour objet un médicament ayant en parti- culier des propriétés anti-thrombotique et hypolipemiante caractérisé en ce qu'il contient, à titre de principe actif, au moins une des fractions préparées par le procéde de l'in- vention et répondant à la formule (I). L'étude toxicologique a montre la faible toxicité et la par- * faite tolérance des différentes fractions de l'invention. En effet, les essais effectués sur la toxicité aigUe, chro- nique, subchronique et retardée, chez différentes espèces animales, n'ont mis en évidence aucune anomalie d'aucune sorte. L'étude pharmacologique a porté sur les actions anticoagu- lante, fibrinolytique et lipolytique par les voies orale et intraduodénale et sur l'activité proagrégante plaquettaire vis à vis de l'ADP, in vitro; ces études ont été effectuées comparativement au SP 54. - L'action anticoagulante est déterminee par le temps de céphaline active(CAEN J., LARRIEU M.J., SAMAMA M., In: L'hémostase: méthode d'exploration et diagnostic pratique. Ed.: l'Expansion Scientifique Française, 1975, p.169). Le temps de cephaline activée (TCA)., mesure la recalci- fication du plasma déplaquetté en présence d'un optimum de lipides (cephaline) et de célite qui active de manière standardisée les facteurs de la phase de contact (les facteurs XII, XI, IX). Il mesure donc la formation de pmrothmmbinase endogène à l'exception des facteurs plaquettaires remplacés par la céphaline. - 18 - 2572731 - L'activité fibrinolytique est mesurée par le temps de lyse des euglobulines plasmatiques (KLUFT C. - Haemos- tasis, 1976,5,136). Le temps de lyse des euglobulines plasmatiques est une méthode sensibilisée permettant d'apprécier l'action fi- brinolytique globale du SP 54 et de ses fractions en l'absence des Inhibiteurs physiologiques de la fibri- nolyse, éliminés par dilution et acidification du plasma. - L'action lipolytique est mesurée par l'activité lipo- protéine lipase circulante (NIKKILA E.A., HUTTUNEN J.K., EHNHOLM C.. - Metabolism, 1977, 26, 179). La détermination de l'activité lipoproteine lipase circulante est une mesure indirecte de l'impact du SP 54 et de ses fractions sur le catabolisme des triglycérides (pouvoir clarifiant). L'activité enzy- matique est déterminée par sa capacité d'hydrolyser le substrat 14C-trioleine en 14C-acide oléique. - Activité proagrégante plaquettaire L'activité proagrégante des sulfates de xylane a été éva- luée par leur capacité éventuelle de potentialiser de ma- nière irréversibles l'agrégation plaquettaire réversibl induite par de faibles concentration d'ADP. Ces études ont été effectuées selon la technique de Born sur du PRP d'origine humaine. Les divers produits à tester sont incubes pendant 1 mn a 37 C en présence de PRP. Des concentrations croissantes de 2 à 125yug/ml sont utilisées.Après cette période d'incubation, l'agrégation plaquettaire a été induit par de faibles concentrations d'ADP (0,5 a 21uM) provoquant du moins pour lescontrôles un phénomène réversible d'agrégation. Les résultats sont exprimés en concentration minima- le de sulfate de xylane permettant l'obtention d'un phénomène irréversible d'agrégation. Référence: G.U.R. Born and J. Cross: The aggregation of blood platelets J. Physiol., 168,178,186). - 19 - 19 2572731 - Administration intraduodanale et orale des rats males (Sprague Dawley; Charles-River; France) de 200 t 300 g sont utilisés. Les animaux sont soumis 8 une diète hydrique la veille des essais. Une anesthésie au pentobarbital (50 mg/Kg; i.p.) est effectuée sur tous les animaux avant l'administration des différentes fractions de sulfates de xylane. Ceux-ci sont administrés à une dose unique de 400 mg/Kg. Pour l'administration intraduodanale, une incision est effectuée au niveau de l'abdomen. Le pylore et le duodénum sont isolés. Une Incision est pratiquée a 1 cm du pylore et les produits sont introduits a l'aide d'une sonde dans le duodénum. Une ligature est effectuée en dessous de l'incision à l'aide de fil chirurgical. L'administration orale est effectuée par gavage a l'aide d'une sonde intragastrique. Les prélèvements sanguins pour l'analyse des divers paramètres pharmacologiques sont réalisés a l'aorte abdominale respectivement 1 heure après l'administration _. intraduodénale et 2 heures après l'administration orale. Ils sont rendus incoagulables par une solution de citrate trisodique a 3, 8 p. 100 (1 volume d'anticoagulant pour 9 volumes de sang) ou de l'héparine (250 U/ml de sang) pour les mesures de lipoprotéine lipase. Immédiatement après le prélèvement sanguin, les échantil- lons sont centrifugés a 2000 x g pendant 15 minutes & 40C. pour la préparation du plasma citraté qui est utilisé pour les différents dosages. Les résultats sont rassemblés dans les tableaux 1 à 6; leur analyse statistique a été effectuée selon le testde STUDúNT (groupe de comparaison: SP54). 2- 20 -572731 TABLEAU 1 VOIE INTRADUODENALE TEMPS de CEPHALINE ACTIVEE t- 400 mg/kg Produi t Ma _ _ - - M+ESM * test "t" vs sec (a) SP :e SP54 TEMOINS 20 + 0,6 __ - n.s. - I Exemple! 3346 32 + 1,5 60 p SP 54 6600 21 + O4 5 n.s. -- () prl35ngto (a) % prolongation - 21 - 2572731 TABLEAU 2 VOIE INTRADUODENALE ACTIVITE ANTI--Xa (TEMPS DE YIN) 400 mg/kg Produit Ma --- - M+ESM % test t Vi sec (a) aTem ' SP54 TEMOINS 33+ 0,6 --, n.s. I Exemple 1 3346 36 "pO5,Q5p Exemple 3 3889 33 + 0.3 0 n.s. * n.s. p Exemple 5 4066 38 +0,0 15 p Exemple 6 4407 35. 1,9 6 n.s. 'n.s. Exemple 8 4903 33 + 0,7 0 n.s. n.s. _ Exemple 9 4921 37 +0,4 12 p 3SP 54 6600 34 + 1 3 n.s. ' -- úea35 ___.. prOga1 'n (a): prolongation - 22 - 2572731 TABLEAU 3 VOIE INTRADUODENALE TEMPS -DE LYSE DES EUGLOBULINES 400 mg/kg Produit Ma M ESM S test "t' vs H+ESM % sec (a) SP54 Tern: SP54 TEMOINS 134 + 6 -- 'n.s. 1-... _ /.S ' ! I Exemple 1 3346 102 + 4 24 p SP 54 6600 124 + 8 7 n.s. a -- _ (a): % d'activation - 23 - 2572731 TABLEAU 4 VOIE INTRADUODENALE LIPOPROTEINE LIPASE (L.P.L.) 400 mg/kg Produit Ma _ _.. .. M+ESM S test "t' vs (a) Tem SP54 TEMOINS 3,2+ 0,3 6 -- ' I Exemple 1 3346 14,1 +1,6 26 p I -I Exemple 6 4407 3,9 +0,7 7 n.s., p Exemple 8 4903 8,7+1,1 16 p Exemple 9 4921 5,1+19,5 28 p SP 54 6600 7,6 +0,6 14 p (a): % de. libération x mol acide oléique/ml/h - 24- 2572731 TABLEAU 5 VOlIE ORALE TEMPS DE CEPHALINE ACTIVEE _roui -400 mg/kg Ma ItMafESN S test "t" VS sec (a) Tem 'p54 (') isP54 TEMOINS 20+ 0.4 _ -- I Exemple 1 3346 29 + 0, 45 p Exemple 3 3889 21 + 0, 5 n.s. n.s. I Exemple 5 4066 29 + 0, 45 p Exemple 6 4407 21 + O, 5 n.s. n.s. I Exemple 8 4903 21 + 0. 5 n.s. n.s. ,' Exemple 9 4921 29 + 0, 45 p SP 54 6600 20 + 0,4 O n.s.,-- pong, Io (a): % prolongation - 25 - 2572731 TABLEAU 6 ACTIVITE PROAGREGANTE VIS-A-VIS ADP Concentration critique en Produit Ma polysaccharides sulfatés (a) en ug/ml Exemple 1 3346 > 125 Exemple 2 3518 125 Exemple 3 3889 > 125 Exemple 5 4066 > 125 Exemple 6 4407 > 125 Exemple 8 4903 > 125 Exemple 9 4921 > 125 SP 54 6600 30 Héparine 19800 (a) Cncentration critig9ue = concentration minimale en polysaccharides sulfatés permettant l'obtention d'un phénomène irréversible d'agré- gation à l'ADP sur PRP humain. - 26 - 2572731 Les résultats précédents montrent les intéressantes propriétés antithrombotiques et hypolipémiante des produl de l'invention. En raison de leur bas poids moléculaire, ceux-ci présenten en effet, par vole orale et surtout Intraduodénale, des activités supérieures à celles du SP 54 dont ils sont issu Pour chaque voie et chaque produit, ces effets sont d'autai plus nets que la masse molaire est plus faible dans la zone revendiquée. Ainsi, le produit décrit dans l'exemple 1 provoque, & la dose de 400 mg/kg par voie Intraduodénale, un allongement de 60 % du temps de céphaline activée (TCA) alors que le SP 54, dans les mimes conditions, ne manifeste aucune acti- vité significative. Enfin, à l'inverse du SP 54 et surtout de l'héparine, les produits de l'invention ne potentialisent pratiquement pas l'agrégation in vitro des plaquettes humaines stimulées à l'ADP. Ces résultats laissent donc espérer moins de risques thrombocytopéniants qu'avec les produits de référence. Le médicament de l'invention peut être présenté sous les formes administrables par les voies orale, parentérale, rectale et locale. Chaque dose unitaire contient avantageusement de 0,030 g à 0,250 g de principe actif, les doses administrables journellement pouvant varier de 0,030 g à 1,000 g en fonc- tion de la gravité de l'affection traitée et de la voie d'administration. On donnera ci-après, à titre d'exemple non limitatif, quelques formulations pharmaceutiques du médicament de l'invention. - Z7 - 2572731 1 - Comprimés - doses à 250 mg de _rincipe actif Principe actif (fraction de l'exemple 1) 250 mg Lactose........................5....... 50 mg Cellulose excipient.................... 60,1 mg Magnésium stéarate........ ........... 9 mg Silicium dioxyde colloïdal............. 0,8 mg Indigotine laque aluminique............ 0,1 mg..DTD: Pour un comprime nu terminé à 370 mg. Pour la forme précédemment citée, on peut réaliser un pelliculage gastrosoluble ou un pelliculage gastro- résistant dont les formules sont les suivantes: - Pellicula.gastrosoluble Polymethylacrylate de butyle et dimethylaminoéthyle, granulé.............. . QS Isopropanol pharmaceutique industriel........QS Acétone.............. .....................QS Phtalate de dibutyle.........................QS Acide silicique............................. QS Pelliculageaastrorésistant Polymethylacrylate anionique, type 1, poudre. QS IXsopropanol pharmaceutique pharmaceutique industriel....................DTD: ............ QS Acétone................................. QS Phatalate de dibutyle.................. QS 2 Gélules Principe actif (fraction de l'exemple 6) 0,075 g Excipient............ q.s.p........1 gélule..DTD: 28 - 3 - Solutés. injectables Principe actif (fraction de l'exemple 5)0,100 g Solvant isotonique.... q.s.p........ 1 ampoule de 2 ml 4 - Pommade Principe actif (fraction de l'exemple 9) 0,150 g Excipient............ q. s.p......... 1 tube de 30 g Par leur action sur les différents stades de la coagulation sanguine et de la.fibrinolyse, ces médicaments peuvent être utilisés avec profit, en cures prolongées et répétées dans -le traitement préventif ou curatif d'accidents thromboembo- liques veineux ou artériels dans les cas de phlébites, embolies pulmonaires et autres situations cliniques du même type, angines de poitrine, infarctus du myocarde, artérites chroniques des membres Inférieurs, troubles circulatoires superficiels et ulcères des Jambes. Ils peuvent également être utilisés pour prévenir les throm- boses dans les circuits extra-corporels (hémodialyses rénales: En outre, leur action sur la lipoprotéine-lipase (facteur clarifiant) les rend particulièrement utiles dans le trai- tement des dyslipémies athérogènes. Enfin, ces médicaments peuvent également être utiliés avec profit dans le traitement de certaines maladies Inflamma- toires, telles que polyarthrite rhumatolde, arthroses et ostéoarthrites. 2 57273 1 REVENDICATIONS 1. Sulfates de xylane ayant un degré de sulfatation moyen compris entre 1,5 et 2, un pourcentage en acides uroni- ques compris entre O et 10, un pourcentage en pentoses compris entre 30 et 40, caractérisés par une masse molé- culaire moyenne apparente comprise entre 2000 et 5000 Daltons. 2. Procédé de préparation des composés selon la revendica- tion 1 caractérisé en ce que le polysulfate de xylane SP 54 est soumis à un fractionnement. 3. Procédé de préparation des composés selon la revendi- cation 1 caractérisé en ce que le fractionnement est obtenu par ultra-filtration. 4. Médicament ayant notamment des activités antithromboti- que et lipolytique, caractérisé en ce qu'il contient à titre de principe actif un composé tel que défini à la revendication 1. 5. Médicament selon la revendication 4 caractérisé en ce qu'il est présenté sous forme appropriée à l'administra- tion orale, parentérale, rectale ou locale associé à des véhicules ou excipients thérapeutiquement acceptables. 6. Médicament selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il est présenté sous forme de doses unitaires conte- nant chacune de 0,030 g à 1,00 g de principe actif.