FR 2564859 A1 19851129 FR 8507542 A 19850520 PROCEDE DE PREPARATION D'ACIDE HYALURONIQUE PAR FERMENTATION La présente invention a pour objet une méthode de préparation d'acide hyaluronique par fermentation. Elle a plus particulièrement pour objet une méthode de préparation d'acide hyaluronique exempt de strepto- lysine par fermentation, par culture (ou par incubation) d'un micro- organisme appartenant au genre Streptococcus. L'acide hyaluronique a été isolé jusqu'à maintenant, dans le liquide hyaloTde des yeux de bovins, des crêtes de coqs, des coquillages at du liquide articulaire des poulets et on sait que l'on peut l'utili- ser comme une substance qui maintient un état gélatineux par liaison avec des protéines ou d'autres mucopolysaccharides et de l'eau et ainsi agir comme lubrifiant pour empêcher l'invasion des bactéries et retenir l'eau. Cependant, la méthode ci-dessus est désavantageuse, car le coût d'obtention de l'acide hyaluronique est trop élevé. Il a été indiqué par exemple dans B. Holmstroëm, Appl. Microbial, (6), 1409-1413, 1967, J.B. Woolcock, J. Gem. Microbial, 85, 372-375, 1974, et E. Kjem, Acta Pathol. Microbial. Scand, 84(3), 162-164, 1976 que l'acide hyaluronique pouvait être produit à relativement bon marché en utilisant des souches de bactéries appartenant aux genres Strepto- coccus tels que Streptococcus pyogenes, Streptococcus equi, Strepto- coccus equisimilis, Streptococcus dysgalactiae et Streptococcus zooe- pidemicus. Cependant, selon le "Manual of Determinative Bacteriology" de Bergey's (8ème édition 1974), les souches mentionnées ci-dessus appar- tiennent toutes à des groupes biogénétiques du genre Streptococcus, tel que des bactéries du type A ou C, productrices d'acide lactique, d'un groupe de sérum de Lancefield. C'est-a-dire que ces souches sont des bactéries généralement connues comme des streptocoques hémolytiques qui donnent lieu à une 8-hémolyse a cause d'une hémolysine soluble, c'est- à-dire la streptolysine. Bien que la corrélation entre la capacité de produire de la streptolysine et le caractère pathogénique ne soit pas clairement comprise, il est vraisemblable que l'acide hyaluronique produit soit malencontreusement contaminé par les protéines mentionnées ci-dessus lorsque l'on produit de l'acide hyaluronique industriellement par culture des souches mentionnées ci-dessus. Notamment, lorsque l'on souhaite incorporer de l'acide hyaluronique dans des compositions médicales a usage externe ou dans des compositions cosmétiques, il est préférable d'éliminer complètement la streptolysine de l'acide hyalu- ronique produit puisque ces compositions doivent être appliquées à la peau. Lorsque l'on entreprend une suite de culture des souches' mention- nées ci-dessus, non seulement l'hémolyse diminue progressivement, mais aussi la capacité de production d'acide hyaluronique diminue et les colonies mucoTdes disparaissent. En outre, le caractère hémolytique des souches persiste encore après une suite répétée de culture. Par consé- quent, il est très difficile, ou presque impossible, de produire effica- cement de l'acide hyaluronique qui ne soit pas contaminé par de la streptolysine. Par conséquent, les buts de la présente invention sont d'éliminer les inconvénients mentionnés ci-dessus et de procurer une méthode de préparation par fermentation d'acide hyaluronique qui ne contienne pas de streptolysine. Un autre but de la présente invention est de trouver un micro- organisme qui soit non-hémolytique et qui soit capable de produire efficacement de l'acide hyaluronique. D'autres buts et avantages de la présente invention apparaTtront à partir de la description qui va suivre. Selon lR présente invention, a été mis au point un procédé de préparation par fermentation d'acide hyaluronique exempt de strepto- lysine qui comprend les étapes de: i.- culture d'un micro-organisme appartenant à un genre streptocoque qui soit non-hémolytique et qui soit capable de produire de l'acide hyaluronique dans un milieu de culture; et ii.- isolation de l'acide hyaluronique exempt de streptolysine dans le produit cultivé. La présente invention sera mieux comprise à partir de la descrip- tion ci-dessous en se référant aux dessins joints dans lesquels: - la figure 1 est un graphique qui illustre la corrélation entre la quantité produite (en g/l) d'acide hyaluronique, la quantité de glucose (en %) ou la croissance des cellules (OD660) et le temps de culture (en h) pendant la culture dans l'exemple 2; et - la figure 2 donne un spectre d'absorption infrarouge de l'acide hyaluronique obtenu dans l'exemple 2. Les micro-organismes que l'on peut utiliser dans la fermentation selon la présente invention sont des mutants appartenant aux genres Streptococcus qui sont non-hémolytiques et capables de produire de l'acide hyaluronique. Un exemple typique d'un tel mutant est le Streptococcus zooepidemicus NH131 qui est un mutant non-hémolytique d'une souche appartenant à l'espèce Streptococcus zooepidemicus et qui a été déposée le 7 avril 1984 au Fermentation Research Institute (FRI) au Japon sous la désignation FERM P7580 et transférée au Fermentation Research Institute (FRI) (c'est-à-dire, Autorité de Dépôt International sous le traité de Budapest à Tsukuba au Japon) sous la désignation FERM BP-784 conformément au traité de Budapest. La souche Streptococcus zooepidemicus NH-131 a été isolée de la souche Streptococcus zooepidemicus obtenue à partir des bulbes de la tunique conjonctive d'un cobaye comme indiqué dans l'exemple 1. Les mutants nonhémolytiques du Streptococcus zooepidemicus peuvent être isolés sélectivement de la façon suivante. Les cellules de la souche Streptococcus zooepidemicus sont cultivées pour sélectionner les cel- lules de la souche dont l'hémolyse est diminuée ou réduite. Les souches sélectionnées sont soumises à un traitement classique de mutation par utilisation de lumière ultraviolette (UV) ou de N-méthyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidine (c'est-a-dire NTG). Les cellules ainsi traitées sont étendues sur un milieu à base d'agar-agar et de sang et, après crois- sance, les mutants qui présentent un caractère non-hémolytiques et sont capables de former des colonies visqueuses sont recueillis sélectivement. On peut ainsi obtenir les mutants recherchés. Les caractéristiques morphologiques du Streptococcus zooepidemicus NH-13] sont indiquées ci-dessous. Le mutant Streptococcus zooepidemicus NH-131 présente sensiblement les mêmes caractéristiques morphologiques que celles de la souche mère Streptococcus zooepidemicus telles qu'elles sont exposées dans le Manual of Determinative Bacteriology de Bergey's, 8ème édition, page 498 (1974), sauf que la souche NH-131 est un Streptocoque gram-positif et $-hémolytique(-) qui forme des colonies visqueuses transparentes sur un milieu à base d'agar-agar de sang de mouton. (1) taches gram....................... + (2) e-hémolyse....................... . - (3) résistance thermique à 60 C pendant minutes........................ - (4) résistance vis-à-vis de la bile a 40%............................ - (5) résistance vis-à-vis du sel à 6,5% - (6) résistance aux bases à pH 9,6..... - (7) décomposition par l'hippurate de sodium............................ - (8) décomposition par l'esculine...... - (9) solubilité dans la gélatine....... - (10) sensibilité sur la bacitracine..... + (11) décomposition des sucres: glucose.............. + maltose................. + 20. lactose . ............... - sucrose................ + sorbitol im............ - À salicine................ - glycérol................ - 25. mannitol ................ - trehalose............... - Remarques: +: positif : pseudopositif -: négatif Les mutants Streptococcus zooepidemicus selon la présente inven- tion peuvent être cultives sur un milieu de culture contenant, de préférence, des sources de carbone, des sels minéraux et, éventuelle- ment, des traces de nutrients organiques. Ces sources de carbone sont, par exemple, des acides organiques et des alcools aliphatiques. Selon la présente invention, on peut utiliser, de préférence, des sources de carbone contenant des sucres tels que des hydrolysats d'amidon, glucose, sucrose, galactose et fructose. Des sources d'azote typiques sont, par exemple, sulfate d'ammonium, nitrate de sodium, phosphate d'ammonium secondaire (c'est-à-dire phosphate acide diammonique), extraits de viande, peptone, mélanges de divers aminoacides et extraits de levure. Outre ces composants, on peut éventuellement ajouter, si on le souhaite, du chlorure de sodium, des sels de magnésium, de potassium, de fer, de calcium et d'autres métaux de l'acide phosphorique, de l'acide sulfu- rique ou de l'acide carbonique et des vitamines. On peut ajouter tous les sucres à la fois à un milieu de culture. Cependant, les sucres peuvent s'ajouter de façon plus avantageuse à un milieu de culture par petites portions pour augmenter ainsi le rendement en acide hyaluronique. La culture selon la présente invention peut s'effectuer, de préférence, dans des conditions aérobiques c'est-à-dire, par exemple, par agitation de la culture ou par utilisation d'un dispositif d'aération à une température, par exemple, de 30 C à 37 C. Lorsque l'on met la culture en oeuvre en ajustant le pH du milieu à 5,5 à 9,0 avec une solution alcaline aqueuse, l'acide hyaluronique recherché peut être produit de façon stable en grandes quantités. Les solutions aqueuses alcalines sont, par exemple, des solutions des dérivés alcalins les plus classiques tels que, par exemple, hydroxyde de sodium, hydroxyde de potassium, aminoacides basiques et amines inférieures. Apres la culture, on peut récupérer l'acide hyaluronique accumulé dans le mélange cultivé par des méthodes classiques de séparation et de purification des polysaccharides. Cependant, il est préférable de procéder à l'acidification du mélange cultivé avant la récupération parce que l'on augmente ainsi la pureté de l'acide hyaluronique que l'on récupère. On peut, par exemple, isoler l'acide hyaluronique du mélange cultivé de la façon suivante. Les cellules et les autres composants insolubles dans le mélange cultivé sont tout d'abord enlevés par filtra- tion ou par séparation centrifuge. Ensuite, on enlève les protéines contenues dans le filtrat qui en résulte, par exemple, à l'aide d'acide trichloroacétique ou d'un mélange de chloroforme et d'alcool isoamyli- que, d'un adsorbant tel que charbon actif ou argile activée ou d'une enzyme de décomposition de protéines telle que pepsine, papaine ou pronase. Les contaminants de faible poids moléculaire qui restent dans le mélange de culture sont enlevés par des méthodes, par exemple d'ultra- filtration, de dialyse, de précipitation par addition de solvants orga- niques, d'un agent tensio-actif cationique ou une méthode d'adsorption utilisant une résine échangeuse d'ion. L'acide hyaluronique recherché peut être récupéré dans le mélange cultivé qui en résulte, par exemple, par lyophilisation, séchage par pulvérisation ou précipitation par un solvant organique. Selon la présente invention, on peut produire l'acide hyaluronique exempt de streptolysine recherchée avec un rendement élevé. Par consé- quent, l'acide hyaluronique produit selon la présente invention peut être incorporé avantageusement dans des compositions médicales à usage externes et dans des compositions cosmétiques qui sont appliquées sur la peau. Exemples La présente invention sera maintenant illustrée plus en détail mais sans y être, toutefois, limitée par les exemples suivants dans lesquels les pourcentages sont tous indiques en poids à moins que cela ne soit spécifié autrement. Exemple 1 Les cellules du Streptococcus zooepidemicus isolé à partir des bulbes de la tunique conjonctive des cobayes sont cultivées à une température-de 37 C dans un milieu de culture consistant en une infusion dite coeurcervelle (disponible chez Eiken Kagaku Co., Japon). Pendant la phase de croissance logarithmique, on recueille les cellules, on répète la séparation centrifuge à basse température et on stérilise les cellules séparées par lavage, deux fois de suite, avec une solution tampon de phosphate 1/20 M. Les cellules ainsi obtenues sont secouées à une température de 37 C pendant 20 minu- tes dans des solutions de phosphate tampon 1/20 M contenant de 100 à 500 pg/ml et on les refroidit sur de la glace. Les cellules sont lavées à deux reprises avec du tampon de phosphate 1/20 M à basse température et on les inocule ensuite dans le milieu de culture consistant en une infusion dite coeur-cervelle. La culture est mise en oeuvre à une température de 37 C pendant 24 heures. On obtient, ainsi, un mutant qui ne présente pas de propriété hémolytique et qui forme des colonies visqueuses lorsqu'on l'étale sur un milieu à base d'agar-agar et de sang (disponible chez Eiken Kagaku Co., Japon). Ce mutant, le Streptococcus zooepidemicus NH-131 a été déposé au Fermentation Research Institute (Japon) ainsi qu'indiqué ci-dessus. Le Streptococcus zooepidemicus NH-131 (c'est-a-dire le FERM BP-784) est soumis à une culture secouée dans un tube a essai contenant un milieu de culture à base d' une infusion coeur-cervelle. Lorsque du sang équin est ajouté au mélange cultivé qui en résulte et lorsqu'on le laisse reposer à la température de 37 C pendant 2 heures, les érythrocytes se précipitent au fond du tube à essai et ceux qui surnagent présentent la couleur du milieu de culture lui-même. Il se confirme, ainsi, que ce mutant n'a pas de propriété hémolytique. Exemple 2 On utilise un milieu de culture composé de 6% de glucose, 0,05% d'extrait de levure (disponible chez OrientalYeast Co., Japon), 1,0% de polypeptone (disponible chez Daigo Eiyo Kagaku Co., Japon) et 0,005% d'adékanol LG-805 (c'est-à-dire, anti-mousse de type polyéther dispo- nible chez Asahi Denka Kogyo Co., Japon). 10 litres du milieu de cul- ture, sauf le glucose, sont charges dans une cuve de fermentation de litres. Apres stérilisation à une température de 121 C pendant 20 minutes, le Streptococcus zooepidemicus NH-131 cultivé au préalable est inoculé dans le milieu de culture. La culture sous aération méca- nique est mise en oeuvre à une température de 35 C pendant 2 jours, tandis que l'on contrôle le pH du milieu à 7,0 avec de l'hydroxyde de sodium. Le glucose est stérilisé séparément du milieu de culture et une portion de 0,2% des 6% de glucose est ajoutée à la cuve de fermentation au démarrage de la culture et les 5,8% restants sont ajoutés au moment du démarrage de la croissance logarithmique (c'est-à-dire 5 à 7 heures après le début de la culture). Les conditions deprogression de la culture sont celles indiquées sur la figure 1 sur laquelle sont graphi- quement représentés les changements dans la quantité produite (en g/l) d'acide hyaluronique (x-x), la quantité de glucose en % (e-e), et la croissance des cellules (OD660) (o-o), en fonction du temps de culture écoulé. La détermination de ces changements est mise en oeuvre de la façon suivante: 1.- la quantité d'acide hyaluronique produite est déterminée par pesée de l'acide hyaluronique purifié isolé dans un échantillon. 2.- la quantité de glucose est déterminée à l'aide d'un analyseur de sucre YSI modèle 27 (fabriqué par Yellow Springs Instrument Co., Etats- Unis). 3.- la croissance des cellules est déterminée par mesure du coeffi- cient d'adsorption d'un échantillon à 660 nm dans un spectropho- tomètre. La quantité d'acide hyaluronique recherché produite augmente au cours du temps et la viscosité du milieu de culture-augmente. Ainsi, on stoppe la culture lorsque la viscosité du mélange de culture atteint presque son maximum (c'est-à-dire après un ou deux jours à partir du début de la culture). Le mélange de culture est traité sur centrifugeuse pour en séparer et en éliminer les composants insolubles. Les composants protéiniques présents dans le mélange qui en résulte sont enlevés à l'aide d'un mélange de chloroforme et d'alcool isoamylique (5/1) et les substances de faible poids moléculaire contenues dans le mélange qui en résulte sont ensuite éliminées par ultrafiltration. Finalement 3,6 g d'acide hyaluronique recherché sont récupérés par lyophilisation dans un litre- du liquide cultivé. L'acide hyaluronique ainsi obtenu sous la forme d'une fibre blanche est soluble dans l'eau mais insoluble dans les solvants organi- ques tels que méthanol, éthanol, acétone, chloroforme et éther et il n'a ni goût, ni odeur. Il se confirme que ce produit est l'acide hyaluroni- que par son spectre d'absorption infrarouge et par électrophorèse et par un test de décomposition par une hyaluronidase fongique. Le spectre d'absorption infrarouge de l'acide hyaluronique qui en résulte est celui indiqué sur la figure 2. REVENDICATIONS 1.- Méthode de préparation d'acide hyaluronique par fermentation qui comprend les étapes de: i.- culture d'un micro-organisme appartenant au genre streptocoque qui soit non-hémolytique et qui soit capable de produire de l'acide hyaluronique dans un milieu de culture; et ii.isolation de l'acide hyaluronique exempt de streptolysine dans le produit cultivé. 2.- Procédé de fermentation selon la revendication 1, dans lequel ce micro-organisme est une souche appartenant au Streptococcus zooepi- demicus. 3.- Procédé de fermentation selon la revendication 2, dans lequel cette souche est le Streptococcus zooepidemicus déposé le 7 Avril 1984 auprès du Fermentation Research Institute au Japon et enregistré sous le N FERM BP-784.