FR 2570703 A1 19860328 FR 8414799 A 19840926 Complexes macropolycycliques de terres rares et application à titre de marqueurs fluorescents. La présente invention, qui résulte de travaux effectués en collaboration avec le Professeur J.M. LEHN et son équipe de re- cherche de l'Université Louis Pasteur de Strasbourg, concerne le domaine de la fluorescence et plus particulièrement des complexes macropolycycliques fluorescents, qui conviennent notamment comme marqueurs dans les dosages immunologiques. Il est connu que les méthodes de détection utilisant la fluorescence sont intrinsèquement très sensibles et pourraient permettre des limites de détection inférieures à celles atteintes par des mesures de radioactivité, en particulier par l'utilisation de sources Laser (I. Wieder Immunofluorescence and related staining techniques, 1978, Elsevier). Cependant, dans la pratique, ces limites de détection ne sont pas atteintes car la mesure s'effectue dans une matrice qui ne présente pas les qualités requises pour atteindre cet optimum. En général, Le milieu de mesure est trouble et favorise la diffusion, et d'autres molécules fluorescentes à la même longueur d'ondes peu- vent être présentes dans le milieu de mesure. Dans certains cas, les améliorations apportées à l'ap- pareillage de mesure ne suffisent pas à améliorer de façon sensible cette limite de détection ou sont très coûteuses (Laser, monochro- mateurs, etc.). Cet état de fait est encore plus gênant dans le domaine de la biochimie et de l'immunologie o la mesure de très petites quantités de mriolécules actives doit s'effectuer dans des milieux biologiques qui peuvent présenter un trouble ou contenir des pro- téines ou autres molécules elles-mêmes fluorescentes (trouble et fluorescence intrinsèque du sérum). Dans les dosages immunologiques utilisant un-traceur fluorescent, et lorsque l'on marque l'antigène ou l'anticorps avec la molécule fluorescente, celle-ci doit posséder les propriétés suivantes: - elle doit posséder une fonction chimique permettant un couplage avec la molécule biologique sans la dénaturer ni modifier ses propriétés immunologiques; le coefficient d'absorption molaire de la molécule fluorescente doit ftre le plus élevé possible; - le rendement quantique de fluorescence doit être le plus élevé; - le déplacement de Stokes doit être le plus important possible; - la longueur d'onde d'émission doit être si possible supérieure à 500 nm; - elle doit être soluble dans l'eau ou les solutions tampon. Ces conditions sont précisées par exemple dans l'article de E. SOINI dans Clin. Chem. 25, 353 (1979). Or les molécules connues jusqu'à présent sont loin de posséder toutes ces qualités. La fluorescence de certains chélates de terres rares est connue depuis de nombreuses années grâce aux travaux con- cernant leur application dans le domaine des lasers (A.P.B. SINHA Spectroscop Inorg Chem. 2, 255 (1971)). Ces complexes sont formés: - d'une part d'une molécule ch&latante possédant un système électronique capable de peupler l'état triplet T1 par conversion inter-système après excitation de l'état singulet S1 suite à l'absorption d'énergie lumineuse; - d'autre part d'un ion de terre rare, qui dans le cas des applications de fluorescence possède une forte intensité de fluorescence d'ion (Eu, Tb) ou une intensité moyenne (Sm, Dy) et dont le niveau résonant est peuplé par transfert d'énergie non radiative à partir de l'état triplet du complexant. Pour obtenir une forte fluorescence du chélate de terre rare il faut que l'énergie triplet de la molécule complexante soit supérieure à celle du niveau résonant de l'ion et que sa durée de vie soit suffisante (prépondérance de ce type de désactivation vis-à-vis d'autres processus, tels que phosphorescence et désactivation non radiative, par exemple thermique). Dans ce cas après excitation dans la bande d'absorption du chélate on observé une fluorescence caractéristique de l'ion de terre rare. Ces composés possèdent de grands avantages dans le domaine de la détection par mesure de fluorescence; par exemple ils sont caractérisés par: - un déplacement de Stokes important i - un coefficient d'absorption molaire e élevé par rapport à celui de la terre tare - une possibilité de détection simultanée de plusieurs chélates en changeant la terre rare, - un spectre d'émission caractéristique de la terre rare (spectre de raie, X d'émission maximale > 500 nm), - durée de vie longue (de la microseconde à la milliseconde). Le brevet US 4 058 732 décrit une méthode de spectroscopie analytique par fluorescence mettant en oeuvre des molécules fluorescentes (chélates de terres rares) ayant une durée de vie relativement longue. Etant donné que la diffusion due aux particules de la matrice et que la fluorescence de la plupart des molécules organiques qui la composent sont des phénomènes de courte durée de vie (généralement inférieurs à I sec.) on préconise dans ce brevet une excitation pulsée et un chélate de terre rare fonctionnalisépour marquer les molécules biologiques à identifier, la détection s'effectuant entre chaque pulsation et après un temps suffisamment long pour que les phénomènes non souhaités aient diminué de façon substantielle. Selon l'art antérieur cité ci-après, les chélates de terres rares présentent théoriquement toutes les conditions pour constituer une classe de molécules fluorescentes idéales, en particulier à titre de marqueurs pour les molécules biologiques dans les dosages immunologiques, en cytologie et pour les trieurs de cellules: - brevet US 4 058 732 - SOINI Clin. Chem. 25 353 (1979) - LM VALLARINO et al. in Automation of Uterine Cancer Cytology 2 Proceeding of 2nd Int. Conf., GL WIED, G.F. GAHR, PH. BARTEL Editors Tutorials of Cytology Chicago LL 1977. Or, dans-la pratique on constate que les chélates utilisés jusqu'à présent ne présentent pas toutes les qualités suivantes exigées par ces applications, qui sont principa- lement: - un rendement quantique de fluorescence et un coefficient d'absorption molaire élevés, - une énergie Triplet du chélatant adaptée, - une non-inhibition par le solvant (eau ou autre) ou par des molécules présentes dans le milieu o s'effectue la mesure, - une facilité de la fonctionnalisation en vue d'un couplage sur des molécules d'intérêt biologique ou autres, - une sélectivité de la chélation en faveur de la terre rare et aux dépens d'autres cations qui peuvent se trouver en quantité importante dans le milieu de mesure, - une solubilité dans l'eau dans les conditions d'application des dosages immunologiques, - une grande stabilité en particulier à faible dilution. Les chélates de 6-dicétones décrits dans le brevet US 4 048 732 ne sont que peu ou pas solubles dans l'eau et les milieux biologiques et leur fluorescence est inhibée en grande partie par l'eau. D'autres chélates ont été proposés commne marqueurs dans des dosages immunologiques; on peut citer notamment les chalates'derivés d'EDTA, REDTA et DTPA, d'imidodiacgtate et similaires décrits par exemple dans: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72 4764 (1975), le brevet US 4 374 120 et dans les demandes de brevetsEP-A-0068875 et DE-OS 3 033 691. Leur efficacité est supposée provenir de la valeur élevée de leur constante de stabilité en général supérieure à 101. Un tel critère, basé uniquement sur des considérations thermodynamiques, n'est certainement pas suffisant puisqu'il a été montré qu'il se produit une augmentation de la durée de vie d'un complexe Tb (III) EDTA par addition d'apotrans- férine (Biochem. 19, 5057, 1980), caractéristique d'une liaison protéine - chélate. Récemment, il a été conseillé, lors de l'utilisation de marqueurs du type EU(III) EDTA, tels que ceux décrits dans le brevet US 4 374 120, d'utiliser un tampon contenant du DTPA pour éliminer l'europium libre qui s'est dissocié du chélate, ce qui prouve bien l'instabilité de tels chélates (Clin. Chem. 29, 60, 1983). Cet état de l'art antérieur montre que les chélates de terres rares mis en oeuvre jusqu'a présent ne sont pas utilisables à faible dilution dans des milieux aqueux contenant d'autres cations ou dans des milieux biologiques et en particulier dans les dosages immunologiques et qu'il convient de tenir compte des critères, tels que la stabilité cinétique (vitesse de dissociation du complexe) et la sélectivité de la complexation de la terre rare. On notera d'ailleurs que la plupart des chélates de l'art antérieur ont trouvé, grâce à leur constante de formation élevée (en général > à 101) une application en imagerie Y technique dans laquelle on utilise des ions lourds émetteurs Y de durée de vie relativement faible, obtenus en solutions aqueuses diluées. La fixation de l'ion doit alors s'effectuer rapidement sur la molécule d'intérêt biologique portant le chélatant; en particulier la vi- tesse de formation du chélate doit être élevée: k1 L + n EDTA = L (EDTA)n k-I k et k-1 étant respectivement les constantes de vitesse de for- mation et de dissociation; à l'équilibre on a: k1 L (EDTA)n K = - k-1 [L] EDTA] n Pour les complexes utilisés jusqu'à présent, et pour les raisons évoquées ci-dessus, on a toujours utilisé des chélates permettant d'obtenir une valeur de k1 élevée E=1,9 o1022 M1 min 1 pour EU3+ EDTA voir J. inorg. nucl. Chem. 1971, 33 p.127]. Il en résulte que pour une valeur donnée de K la constante de vitesse de dissociation est relativement importante, ce qui signifie que la vitesse d'échange de l'ion entre le ch6late et la solution est relativement rapide. On a maintenant trouvé des complexes macropolycycli- ques de terres rares qui possèdent d'excellentes propriétés de sélectivité et de stabilité, notamment de stabilité cinétique dans les milieux aqueux et les milieux biologiques. Ces complexes macro- polycycliques conviennent particulièrement bien comme marqueurs fluorescents de substances biologiques dans des techniques de détec- tion ou de détermination immunologiques par fluorescence. Ils sont également appropriés comme réactifs dans des réactions de luminescence. On a en effet trouvé qu'il était possible d'exalter la fluorescence d'un ion de terre rare en solution aqueuse en com- plexant celui-ci à l'aide d'un composé macropolycyclique possédant un motif donneur d'énergie triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare et à exciter le motif donneur. Alors que l'excitation d'un ion de terre rare produit une très faible fluorescence étant donné que les terres rares possè- dent en général des coefficients d'absorption molaires C faibles, l'excitation du motif donneur du composé macropolycyclique défini ci-après permet d'obtenir une exaltation de la fluorescence carac- téristique de l'ion de terre rare. Les complexes de terres rares ainsi formés sont d'excellents marqueurs fluorescents, qui de plus sont des composés stables en milieu aqueux, doués d'une très grande sélectivité vis-à-vis des ions terres rares. Contrairement aux chélates de l'art antérieur, caractérisés par une constante de formation élevée, les complexes de terres rares selon l'invention possèdent, comme caractéristique essentielle, une stabilité cinétique élevée (faible vitesse de dissociation). Cette caractéristique est d'autant plus importante que les solutions biologiques utilisées dans les méthodes de détection et de détermination immunologiques contiennent en général des protéines capables elles aussi de fixer l'ion terre rare. Par contre la vitesse de formation des complexes de l'invention n'est pas critique. La complexation de l'ion terre rare d'une part et le couplage du complexe obtenu sur la molécule biologique d'autre part peuvent être réalisés séparément. Il en résulte que la complexation de l'ion terre rare selon l'invention peut être réalisée dans des conditions non biologiques (utilisation de solvants orga- niques, apports d'énergie possibles, temps, etc.) Sous un premier aspect, la présente invention concerne donc l'utilisation, à titre de marqueurs fluorescents, notamment dans les méthodes de détection et de détermination immunologiques, de complexes macropolycycliques de terres rares qui sont constitués d'au moins un sel de terre rare complexé par un composé macropoly- cyclique de formule générale: R - Z Z - R I dans laquelle Z est un atome ayant trois ou quatre valences, tel que l'azote, le carbone ou le phosphore, R est rien ou représente l'hydrogène, le groupe hydroxy, un groupe amino ou un radical hydro- carboné, les radicaux bivalents Q_, Q et Q sont indépen- damment l'un de l'autre des chaînes hydrocarbonées qui contiennent éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes et sont éventuellement interrompues par un hétéromacrocycle, au moins l'un des radicaux Q, ou G comportant de plus au moins un motif moléculaire ou étant essentiellement constitué par un motif moléculaire, ledit motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé. Selon un autre aspect, l'invention concerne égale- ment un procédé d'exaltation de fluorescence d'un ion de terre rare, qui consiste à complexer au moins un ion de terre rare avec un composé macropolycyclique, tel que défini ci-dessus possédant un motif donneur d'énergie triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare et à exciter le complexe ainsi formé à la longueur d'onde d'absorption dudit motif donneur. Les complexes de terres rares définis ci-dessus sont des composés nouveaux à l'exception des complexes d'europium et de terbium obtenus avec le composé macropolycyclique de formule ci-après: o / o o N O Ainsi la présente invention concerne également à titre de composés nouveaux les complexes de terres rares cons- titués d'au moins un sel de terre rare complexe par composé macro- polycyclique de formule I ci-dessus à la condition que,lorsque le sel de terre rare est un sel d'europium ou de terbium, Z est l'azote est -(CH2)0-C6H4-0-(CH2)2- Q et Q ne sont pas simultanément l'un le radical -(CH2)2O-(CH2)2-0-(CH2)2- et l'autre le radical -(CH2)2-0-(CH2)2- Les chaînes hydrocarbonées qui constituent les radicaux, et peuvent contenir 2 atomes de carbone ou plus et être éventuellement interrompues par un ou plusieurs hét6ro- atomes choisis parmi les atomes d'oxygène, de soufre ou d'azote. Les chaines hydrocarbonges préférées aux fins de l'invention sont les chaînes de poly9thers. en particulier les chaînes oxyéthylénées ou polyoxygthyldnges. Le motif moléculaire, qui constitue un élément essentiel du composé macropolycyclique selon l'invention, est compose de molécules ou de groupes de molcules possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau emissif de l'ion de terre rare complexé. Le transfert d'énergie s'effectue depuis le niveau triplet du motif donneur vers l'un des niveaux émissifs de la terre rare complexêePar exemple l'europium possède les niveaux émissifs D à 17270 cm; 5D1 à 19030 cm et éventuellement 5D2 et le 0 1 la -1 terbium le niveau émissif 5D4 à 20480 cm Les motifs donneurs d'énergie triplet qui con- viennent aux fins de l'invention doivent posséder une énergie-tri- plet supérieure ou égale à celle des niveaux émissifs de l'ion de terre rare. Par exemple, dans le cas des complexes d'europium et de terbium selon l'invention, le niveau triplet du motif donneur doit -1 être supérieur à 17270 cm. Le phénomène de phosphorescence étant dû à la désactivation radiative d'un état triplet, un critère de choix des motifs donneurs peut être la longueur d'onde d'émission de phos- phorescence de ces motifs. On choisira par exemple les motifs qui émettent une phosphorescence à des longueurs d'ondes inférieures (énergies supérieures) aux longueurs d'ondes correspondant au peu- plement des niveaux émissifs de la terre rare. Dans le cas présent la longueur d'onde de phosphorescence du motif donneur devra être inférieure à 580 nm. On notera que les complexes selon l'invention peuvent avoir un ou plusieurs motifs donneurs, lesdits motifs donneurs constituant soit une partie, soit la totalité des radicaux , et O. A titre de motifs moléculaires on peut utiliser de façon non limitative tous les sensibilisateurs de triplet ayant l'énergie triplet requise, par exemple ceux décrits dans la demande de brevet EP-A-0068875 ou dans Spectroscop. Inorg. Chem. 2, 255, 1971, ces documents étant cités dans la présente description à titre de référence. Des motifs moléculaires particulièrement préférés aux fins de l'invention sont la phénanthroline, l'anthracène, le benzène, le naphtalène, les biet ter-phényle, les bipyridines, par exemple la 2,2-bipyridine, l'azobenzène, l'azopyridine, la pyridine. A titre d'exemples de radicaux , Q et O comportant un motif donneur d'énergie, on peut citer notamment les chaînes ci-après: - C2H4 - X - C6H4 - X2 2H4 - -C2H4 - X! - C6H4 - CH2 - C2H4 - - C2H4 - Xi - CH2 - C6H4 - CH2 - X2 - C2H4 Xl et X2 pouvant être identiques ou différents désignent l'oxygène, l'azote ou le soufre; Il Il o w C CH- _ 1_; jo CH2 C H2-- X X -C-CH2-0 0-CH2-C- X étant l'oxygène ou l'hydrogène. Les complexes macropolycycliques de terres rares selon l'invention peuvent être obtenus par les procédés classiques de préparation de complexes métalliques, qui consistent à faire réagir le composé complexant avec un composé donneur du cation à complexer. Des procédés de ce type sont décrits notamment dans les brevets US 3 888 377, 3 966 766 et 4 156 683, cités dans la présente description à titre de référence. Par exemple, les complexes macropolycycliques peuvent être obtenus par réaction d'un composé donneur de cation de terre rare avec le composé macropolycyclique ayant les caractéris- tiques définies ci-dessus, chaque composé étant avantageusement en solution, de préférence dans le même solvant ou dans des solvants compatibles inertes vis-à-vis de la complexation. En général on Il utilise comme solvant l'acétonitrile, le DMSO, l'éthanol. A titre de composé donneur de cation de terre rare on peut utiliser un sel quelconque de terre rare, avantageusement un chlorure ou un acétylacétonate. On opère avantageusement à la température d'ébul- lition du solvant. Lorsque le complexe macropolycyclique formé est soluble dans le solvant réactionnel, il est isolé de la solution par évaporation à siccité. Si le complexe macropolycyclique formé cristallise dans le solvant réactionnel, il est séparé par filtra- tion ou tout autre moyen classique approprié. Les complexes ainsi obtenus peuvent être purifiés par cristallisation. On peut également effectuer la réaction ci-dessus en utilisant une solution du composé macropolycyclique et le composé donneur de cation sous la forme cristalline. Un agent syner- gique protecteur de désactivation peut également être introduit dans la sphère de coordination du cation, comme cela est décrit dans J. Chem. Phys. 40, 2790 (1964) et 41, 157 (1964). Dans la suite de la présente description on désigne également par "cryptates" les complexes macropolycycliques selon l'invention et par "cryptand" le composé macropolycyclique seul. On adoptera ci-après la nomenclature telle que définie par LEHN pour désigner les cryptates et les cryptands. A cet effet on peut se référer notamment aux articles de J.M. LEHN dans Struct. Bonding (Berlin) 16,1 1973 et Acc. Chem. Res. Il. 49 (1978). Tous les ions de terres rares conviennent aux fins de la présente invention. Toutefois, on préférera ceux qui pré- sentent la fluorescence d'ion la plus intense, soit Terbium et Europium, et, à un degré moindre, Samarium et Dysprosium. A titre de composés macropolycycliques qui con- viennent aux fins de l'invention on peut utiliser les agents cryptands connus, par exemple: - 1) les benzo-cryptands de formule générale: N N dans laquelle, et Q représentent indépendamment les uns des autres les groupes 2B, 2, I ayant les significations ci-après: 2B = -C24 -X - c64 - X2 C2H4- ou -C2H4 - XI - CH2 - C6H4 - CH2 - X2- C2H4 - 2 = -C24 - Y1 - C2R4 -Y2 C24 - I = - C24 - Z - C2H4 - dans lesquels X1,2 Y1 2 et Z représentent chacun un htéroatomechoisi parmi l'oxygène, le soufre et l'azote, X1X2 et Y1Y2 pouvant être identiques ou différents. A titre d'exemples de tels cryptands, on peut citer ceux dans lesquels les motifs, , Q sont composés'. res- pectivement comme suit: A (Q Q = (2BI); (2 B21); (2B22) (2B2B2); et le composé de formule: N)-N 2) les agents cryptands comportant des hétérocycles azotés, tels que ceux décrits dans JACS 99 4583 (1977) de formule I dans laquelle: - Q et, identiques, représentent la chaîne polyoxyéthylénée de formule - (CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2 - - Q est une chaîne hydrocarbonée comportant un hétérocycle azoté comme motif donneur d'énergie. A titre d'exemples de tels composés, on peut citer notamment les composés ci-après: - (22) pyridine amide \"0 /\ N\ O\_ I-N - (22) pyridine amine 0_, CH2 i2 - (22) bipyridine o - (22) azopyridine \ 3) les agents cryptands, comportant plusieurs hétérocycles azotés comme motifs donneurs, tels que le composé de formule ci-après: o o 0 N"iN J A.o.0 N décrit dans J. Am. Chem. Soc. 1979, 101 p. 1047. 4) Les agents cryptands polycycliques contenant des motifs aroma- tiques, par exemple les composés rpondant à la formule ci-après x C-. N X =O, H X ou les composés de formule I dans lesquels la cha ne hydrocarbonée portant le ou les motifs donneurs est interrompue par un hdtgro- îc macrocycle tels que les composés de formules ci-après x I CH C /\/Nf' O/ x X=H x =, H \ x 0\ / __ R De tels composas sont décrits notamment dans - Angew. Chemie 86 443 (1974) Tet. letters 21941 (1980) et Chem. Com833, 1981. On peut également utiliser comme agents cryptands les nouveaux composés macropolycycliques de formule I ci-dessus dans laquelle le ou les motifs moléculaires possédant une énergie triplet supérieure à l'énergie de la terre rare à crypter sont choisis parmi la phénanthroline,l'anthracène et les bipyridines. Dans ces nouveaux composés macropolycycliques, au moins l'un des radicaux Q, Q ou Q répond de préférence à l'une des formules ciaprès: o>o Go o o the classe particulire de ces composés macro- polycycliques est constituée par les composés de formule I dans laquelle Zest l'azote, Q et G sont deux chaînes polyoxyéthy- lnées et G répond à l'une des formules ci-dessus. Parmi ces composés macropolycycliques nouveaux figurent galement les composs de formule I dans laquelle et G représentent chacun le groupe 2f 12 0 o o i Il _-C -CH 2 CH2- C-- -CHi-CH 2 (J CHi-CH2- HOC CH2 Une classe particuliàre de ces composes macro- polycycliques est constituée par les composés de formule I dans laquelle Z est l'azote, QD et ( -sont deux chaînes polyoxyéthy- lénées et Q répond à l'une des formules ci-dessus. Parmi ces composés M'acropolycycliques -nouveaux figurent également les composés de formule I dans laquelle (r et (D représentent chacun le groupe ?CH 2 CH2 / H2 \2 et Q est l'un des groupes suivants: ouN. 1HCH2 C C12 Les composés macropolycycliques de formule I peuvent être obtenus par des procédés chimiques connus, mettant principalement en oeuvre des réactions de condensation et/ou d'addition. A titre d'exemples de tels procédés, on peut citer notamment les procédés décrits dans le brevet FR 70 21079 (2052947) et les brevet US 3 888 877, 3 966 766 et 4 156 683. Ces procédés conviennent notamment pour l'obtention de composés de formule I dans laquelle Z est l'azote ou le phosphore. - Pour l'obtention de composés de formule I dans laquelle Z est le carbone et R-est tel que défini précédemment, on utilisera des procédés de condensation par analogie. Dans tous les cas il suffit d'utiliser comme pro- duits de départ des composés chimiques comportant chacun un des radicaux Q, ou Q et des groupes terminaux capables d'être substitués ou comportant des radicaux facilement éliminables. A titre d'exemple on indiquera que le composé de formule I dans laquelle Z est le carbone, R est le groupe hydroxy et, Q et Q représentent chacun la 2,2'-bipyridine peut être obtenu par condensation de la 6,6'dilithiobipyridine avec la 6,6'-dicyano-2,2'-bipyridine, hydrolyse du groupe cyano du macro- cycle ainsi obtenu et condensation du produit résultant avec la 6,6'dilithiobipyridine. Selon un mode opératoire préféré les nouveaux composés macropolycycliques de formule I,dans laquelle Z est l'azote, Q et Q sont des chaînes polyoxyéthylénées,peuvent être obtenus par réaction: - du macrocycle azoté constitué par les deux chaînes polyoxy- éthylénées avec - la chaîne hydrocarbonée comportant ledit motif moléculaire, ladite chaîne ayant des groupes terminaux clivables, tels que par exemple des groupes halogéno. Cette réaction de couplage est avantageusement réalisée dans un solvant anhydre, par exemple le diméthylsulfoxyde (DMSO), l'acétonitrile, éventuellement en présence d'un agent ré- ducteur, tel que l'hydrure de sodium ou le carbonate de sodium. On opère de préférence à une température inférieure au point d'ébullition du solvant, par exemple entre 60 et 100 C. Dans le procédé ci-dessus on peut utiliser avanta- geusement comme macrocycle l'un quelconque des composés macrocycles monocycliques azotés décrits dans le brevet US 3 966 766, les com- posés préférés étant: le 1,7,10,16-tétraoxa-4,13-diazacycloocta- décane de formule générale ou le 1l7,16-trioxa-4,13-diazacyclodécane de formule générale H NH On notera que les complexes préférés selon l'in- vention, obtenus à partir des macrocycles ci-dessus, peuvent être considérés comme des dérivés de cryptates de type 222 ou 221, dans lesquels les motifs éther sur au moins l'une des chaînes hydrocar- bonées ont été substitués par des motifs donneurs d'énergie (en général aromatiques ou polyaromatiques pouvant contenir des hétéro- atomes). Les cryptates d'europium de types 222 ou 221 possèdent des vitesses de dissociation très faibles en solutions aqueuses bien que leur constante de formation soit relativement basse (K = 106' et '9 respectivement pour les cryptates 221 et 222 - Inorganic Chem. 1981, 20 p. 616 et J.A.C.S. 1980 102 p. 22 78). De tels cryptates ne répondent pas aux critères de stabilité définis dans l'art antérieur. Par contre, la substitution des motifs éther par des motifs donneurs d'énergie, qui fournit les complexes préférés selon l'invention, ne modifie pas la caractéristique de dissociation de ces cryptates, mais permet par l'excitation du motif donneur d'énergie dans sa bande d'absorption d'obtenir une fluorescence fortement exaltée et caractéristique de la terre rare cryptée. Lorsque les cryptates de terres rares, objet de la présente invention, sont utilisés pour marquer spécifiquement des molécules biologiquement actives à l'aide d'une liaison cova- lente, ils peuvent être substitués sur l'un ou plusieurs de leurs atomes constitutifs par un ou plusieurs substituants suffisamment accessibles et possédant un ou plusieurs motifs moléculaires permettant le couplage covalent avec la molécule biologique dans des conditions opératoires compatibles avec son intégrité biologique. Parmi ces motifs moléculaires on peut citer, à titre d'exemples non limitatifs, les radicaux alkylamino, arylamino, isothiocyano, cyano, isocyano, thiocyano, carboxyle, hydroxyle, mercapto, phénol, imidazole, aldéhyde, époxyde, halogénure: de thionyle, de sulfonyle, de nitrobenzoyle, de carbonyle; triazo, succinimido, anhydride, halogénoacétate, hydrazino dihalogéno- triazinyle etc. (Biol. Chem. 245, 3059 (1970)). La longueur du bras liant le complexe macrocyclique à la molécule d'intérêt biologique peut varier par exemple de 1 à 20 atomes et contenir des atomes de carbone mais aussi des hétéroatomes tels que N, O, S, P. L'inven- * tion concerne donc également les complexes biologiques constitués d'une molécule biologique associée par couplage ou adsorption à un complexe macropolycyclique selon l'invention. Pour réaliser le couplage on peut utiliser tous les réactifs décrits à cet effet dans la littérature et séparer la molé- cule marquée du complexe macropolycyclique n'ayant pas réagi par tout moyen de séparation adapté (filtration sur gel par exemple). Parmi les molécules d'intérêt biologique présentant un intérêt pour le marquage avec l'objet de la présente invention on pourra citer de façon non limitative les antigènes, les anti- corps, les anticorps monoclonaux, les fragments et combinaisons Acfragments, les drogues, les récepteurs, les hormones, les récepteurs hormonaux, les bactéries, les stéroides, les amino- acides, les peptides, les vitamines, les virus, les nucléotides ou polynucléotides dans les méthodes d'hybridation et les enzymes et leurs substrats, les lectines, les acides nucléiques, l'ADN et l'ARN. Les complexes macropolycycliques de terres rares selon la présente invention trouvent une application importante à titre de marqueurs fluorescents dans les dosages immunologiques, aussi bien dans les méthodes de dosage dites par compétition ou par excès, en phase homogène ou hétérogène, décrits dans l'art antérieur (LANDON, Ann. Clin. Biochem. 1981, 18, p. 253 et SOINI Clin. Chem. 25, 353, 1979). Dans les méthodes hétérogènes on peut utiliser avantageusement: - des tubes revêtus d'anticorps spécifiques de la substance à doser et réaliser la lecture de la fluorescence par les méthodes dé- crites plus haut, directement au travers du tube (Clin. Chem. 29, , 1983), - ou une phase solide autre, en particulier une bandelette ou un film gélatineux sur lequel on a déposé préalablement un milieu contenant un anticorps spécifique, la lecture de la fluorescence étant réalisée à un angle différent de l'excitation et de la réflexion de l'onde excitatrice ou directement au travers du su-- port, si celui-ci est transparent. Il est également possible en raison du spectre de raie de ces marqueurs de détecter simultanément plusieurs antigènes soit en utilisant des cryptates de différentes terres rares dont les raies de fluorescence ne se recouvrent pas (par exemple Tb et Eu),soit en utilisant des marqueurs fluorescents classiques (fluo- rescéine ou rhodamine) et des marqueurs selon la présente invention. Une autre application concerne l'immunochimie o la fluorescence de la cellule marquée est détectée par microscopie comme décrit par R.C. NAIRN dans "Fluorescent Protein Tracing Longman Group Ltd" 1976, avec également la possibilité de faire de la multidétection. Une autre application des complexes de terres rares selon l'invention concerne la cytologie et les trieurs de cellules o l'utilisation d'un marqueur présentant un spectre de raie à longueur d'onde élevée couplée à celle de marqueurs classiques permet de réaliser des analyses multiparamétriques. De plus, avec un agent cryptand donné et des ions de terres rares différentes il est possible avec une seule lon- gueur d'onde d'excitation qui est celle du motif moléculaire qui transfère l'énergie et qui peut être générée avec une seule source (Laser par exemple) d'obtenir deux spectres de fluorescence de raies caractéristiques des deux ions cryptés (par exemple Tb et Eu) et révélant ainsi les molécules biologiques respectives sur les- quelles les cryptates sont fixés. Une autre-application concerne l'utilisation des cryptates de terres rares selon la présente invention dans le domaine du génie génétique par exemple à titre d'indicateur dans les réactions d'hybridation, telles que celles décrites dans les demandes de brevets EP-A-0 070 685 et 0 070 687. L'invention va être maintenant décrite plus en détail par les exemples illustratifs non limitatifs ci-après. La nomenclature adoptée pour désigner les agents cryptands selon l'invention est la suivante: Exemple 1 A- Préparation du (22)phénanthroline (dénommé ci-après: (22)phèn) E t l + Ing Na H Q N -100 C / U J Br Br 0 di CH Br phèn macrocycle N204 (22)phèn 2 2)ph4 Le solvant utilisé dans cette synthèse est le DMSO qui a été séché plusieurs jours sur tamis moléculaire 4 A , et éven- tuellement distillé sous vide. 1 mmol (366 mg) de composé dibromométhylphénanthroline (di CH2 Br Phèn) sec et fraîchement chromatographié a été dissous dans 10 à 20 ml de DMSO. Il a été transféré dans une ampoule à addi- tion sèche; le volume a été complété à 100 ml avec du DMSO sec. On a placé 100 à 200 mg de NaH dans de l'huile (FLUKA) dans un ballon sec; on a ajouté 5 ml de toluène sec (ou hexane) au mélange et on a laissé décanter. La solution a été évapor4e sous vide (1 Torr) pendant I h. On a redissous NaH dans 20 ml de DMSO sec (dégagement H2). On peut éventuellement chauffer à 50 C. On a séché 1 mmol du macrocycle N204 (262 mg) et on a ajouté 10 à 20 ml de DMSO sec. Las solutions de NaH et N204 macrocycle ont été chacune introduites dans une ampoule à addition et le volume a été complété à 100 ml par du DMSO sec. Dans un ballon tricol on a placé 100 ml de DMSO sec. On a équipé ce ballon avec les deux ampoules à addition, un réfri- gérant à reflux et un système désséchant (Silicagel). Le ballon a été chauffé à 60-100 C avec une agitation magnétique. Pendant 1 à 2 h on a ajouté goutte à goutte et simultanément le contenu des deux ampoules. Le mélange réactionnel a été chauffé I h après l'addition des réactifs. Le mélange a ensuite été distillé sous vide pour éliminer le solvant. Il est possible d'ajouter une petite quantité d'eau pour éliminer les hydrures et les bases. Le mélange réactionnel a été amené à sec; on a obtenu un résidu rouge sec ou pâteux. On a ajouté 100 à 200 ml de CH2C12; la pâte a été triturée à température ambiante pendant au moins 30 min. Le résidu a été filtré et lavé. La phase liquide organique a été conservée et évaporée sous vide. Le résidu obtenu a été séché sous vide (1 Torr, au moins 30 min). On a ajouté 100 ml d'éther éthylique au résidu, on a mélangé, on a laissé décanter; cette opération a été répétée 3 à 4 fois. Pour éliminer de façon plus complète le reste du monocycle N204 on a ajouté au résidu 50 ml d'hexane et 1 ml de CH3OH; la solution a été évaporée sous vide (chauffage léger) jusqu'à l'apparition d'un trouble; la solution a été décantée et on a répété l'opération plusieurs fois. Le résidu rouge a été testé par chromatographie sur plaque (Polygram Alox N/V 254 de Macherey-Nagel), la migration en milieu CH2C12/CH3OH 9/1 a donné les valeurs suivantes: (22) Phèn Rf = 0,4 - 0,8 Monocycle N204 Rf = 0,2 - 0,5 Le résidu a été chromatographié sur colonne (20 cm 0 15 cm) garnie d'oxyde d'aluminium 90 activé Neutre, 70-230 mesh (Merck), l'éluant étant constitué des mélanges: CH2C12:CH3OH (5 %), CHC13/C2H5OH (5 %), CH3OH/hexane 9: 1 Rendements de 12 à 35 % suivant les conditions opératoires. On a ainsi obtenu le sel de sodium du (22)phèn de formule [Na +C(22 phèn) Br; H20] dont l'analyse élémentaire était la suivante: trouvé: C 53,00 H 6,21 N 9,44 calculé: C 53,16 H 6,18 N 9,55 B - Formation du complexe EEu3 C(22)phàn] 0,07 mol(19,4 mg) de EuC13 anhydre ont été mis en solution dans 4 ml de CH3CN sec et on a chauffé à reflux pendant 1 h 30. On a ajouté 35 mg du sel de sodium du (22)phàn obtenu précédemment dans 2,5 ml CH3CN. On a chauffé à reflux pendant 2 h 30. Apres avoir laissé le mélange reposer une nuit à 4 C on a filtré le pré- cipité jaune. Le précipité recueilli (11 mg) présente une forte fluorescence de même quand il est en solution dans H20 et CH3OH (UV 254 nm). On n'a pas noté de modification des spectres d'exci- tation et d'émission après trois mois en solution aqueuse à une concentration inférieure à 10-4 mol/1. Exemple 2 A - Préparation du (22)phénanthroline amide (dénommé ci-après (22)phèn amide) c OA Oo O N N N-' + HM M'R - 2= o \/ DiCoCl phân (22) (22)phèn amide Le solvant utilisé dans cette synthèse est l'acé- tonitrile distillé sur P205. On a opéré dans un appareillage en verre anhydre. 305 mg de di COC1 phàn (1 mmol) recristallisg et sec ont été dissous dans 50 ml de CH3CN; après une nuit, la solution a été filtrée et transférée dans une ampoule à addition;le volume a été complété à 90 ml par CH3CN. 524 mg de (22) (2 mmol) ont été séchés sous vide ( de CH3CN et transféré dans une ampoule à addition. Les deux ampoules ont été montées sur un ballon de 2 à 3 1 contenamt I litrede CH3CN. L'addition simultanée des deux réactifs s'est effectuée en 2 h à 2 h 30 sous agitation rapide (magnétique). L'agitation a été poursuivie 30 min après l'addition. Le solvant a été éliminé sous vide à 50 C. Le résidu a été séché I h au moins à P de CH2C12 et filtré. Le filtrat a été évaporé à sec. Il a été chro- matographié sur Alox activé 90 neutre (colonne 30 cm 0 1,5 cm), l'éluant étant CH2C12 contenant 1 % CH30H. On a récupéré le premier produit élué. On a récupéré 310 mg de (22)phèn amide avec un rendement de 63 %. Le produit a été recristallisé dans le mélange toluène/hexane 1: 1. T.fusion 300 - 302 C -1 I R bande amide à 1630 cm + Spectre de masse M à 494 pour PM = 494,55 Analyse élémentaire: C26 H30 N4 06 C H N Calculé 63, 15 6,11 11,33 Trouvé( 59,8 5,7 10,5 ( 59,9 5,9 10,6 B - Formation du complexe EEu3C(22)phàn amide] mg (0,17 mmol) de EuCl3 anhydre ont été dissous dans 10 ml CH3CN sec. On a chauffé à reflux pendant 3 h 80 mg (0,16 mmol) de (22)phèn amide dissous dans 2 ml de CH2C12; on a ajouté 50 ml CH3CN; on a chauffé à ébullition du CH3CN (CH2Cl2 est éliminé par évaporation). La solution chaude de Eu3+ a été décantée et ajoutée. On a chauffé à reflux pendant 2 h puis on a laissé reposer à tem- pérature ambiante. Le précipité blanc a été récupéré par filtra- tion (50 mg). Il presentait une forte fluorescence rouge (À exci- tation: 254 nm) ainsi qu'en solution dans H20, CH30HR et DMSO. Analyse élémentaire pour Eu C (22)phàn amide (OH) CI2. 3H20 C26H37N40IoC12Eu PM = 788,47 C H N Calculé 39,61 4,73 7,11 _ ( 40,1 4,9 7,2 Trouve C 40,3 4,8 7,1 On n'a pas note de modifications des spectres d'exci- tation et d'émission de ce complexe après trois mois en solution -4 aqueuse à une concentration inférieure à 104 mol/1. Exemple 3 - Préparation du (22)anthracène amide COCl CI CH2 + HN NH fH2 COCl 1 2 N- o 0 Nï O=\ X C 1H2 CIH2 Dans cet exemple, on fait appel à la méthode de haute dilution. - 0,564 g du dichlorure d'acide 1 (1,7 mmol) ont été dissous dans 70 ml de CH2C12 anhydre et introduits dans une ampoule à addition de 100 ml, - 0,446 g du macrocycle (22), soit 1,7 mmol,et 0,47 ml de triéthyl- amine (2 x 1,7 mmol) ont été également dissous dans 70 ml de CH2C12 anhydre et introduits dans une ampoule à addition de 100 ml. Dans un tricol de 3 1, on a introduit 0,4 ml de toluène et 0,15 1 de chlorure de méthylène anhydre. L'introduction simultanée dans le tricol des deux réactifs préparés ci-dessus dans les ampoules à addition s'est effectué en 5 h (14 ml/h). On a recueilli la phase organique, que l'on a con- centrée jusqu'à quelques millilitres, puis passée sur une colonne de SiO2 sous pression (diamètre de la colonne 3,5 cm; hauteur = 17 cm; éluant CH2C12 - I % méthanol). On a obtenu un produit fluorescent jaune pâle cristallisé. Rendement: 45 % Chromatographie en couche mince (CCM) solvant CH2C12 / 2 % méthanol; SiO2; Rf = 0,6 RMN H: solvant CDC13/CD2C12 5/5 à 200 MHz ppm 2,53 (m) 2, 93 (m) 3,18 (m) 24 H, HCHC2 + OCH2 couronne 3,42 (m) 4,02 (d) 6A = 4,62 JAB 16 Hz 4H OCCH2N 6 = 5,03 B 7,6 (m) 4H 8,43 (d) 2H1 aromatique 8,82 (d) 2H) microanalyse: C30H3606N2 Calculé C 69,20 Il 6,97 N 5,38 Trouvé C 69,07 H 7,00 N 5,22 Poids moléculaire 520,55 Le dichlorure d'acide I utilisé comme produit de départ dans cet exemple peut être obtenu par les procédés décrits par M.W. Miller et al. dans R.W. Amidon, P.O. TAWNEY J.A.C.S. 77 2845 (1955) ou par B.M. MIKHAILOV Izvest. Akad. Nank. SS. Osdel Khim. Nank. 1948, 420-6; CA 42, 6350. Exemple 4 - Préparation du (22)anthracène 0C C= C CO H2 /---\O- 3 4_- 380 mg du diamide 3 (0,73 mmol) ont ét6 partiellement dissous dans 20 ml de THF anhydre contenus dans un ballon.- On a mis le ballon avec un reflux sous atmosphère d'argon et on a ajouté à temp6rature ambiante 8 ml de B2H6 1,1 M dans du THF anhydre. On a maintenu le tout sous reflux pendant une nuit puis on a détruit à 0 C l'excès de diborane par quelques gouttes d'eau distillée. On a évaporé les solvants et on a ajouté au solide blanc résiduel 40 ml d'une solution 6 N d'HCl. On a chauffé à reflux pendant 30 h sous atmosphère d'argon, la solution est devenue vert foncé. On a laissé refroidir, puis on a évaporé l'eau et on a essoré le solide résultant à la pompe à palette pendant I h, puis on l'a dissous dans 50 ml d'eau distillée; on a ajouté 50 ml de CH2C12 et on a agité les deux phases, puis on a séparé la phase aqueuse que l'on a basifige à 0 C par une solution aqueuse de LiOH jusqu'à pH 13; un solide a précipité. On a ajoute encore 50 ml de CH2C12, on a agité les deux phases et on a laissé décanter. On a.récupéré la phase organique que l'on a séchée sur MgSO4. On a passé le brut sur une colonne d'alumine et on a élu6 avec CH2C12 1 % méthanal. On a récupéré un produit cristallin pur sur plaque. Rendement: 62 - 70 % CCM: A1203; éluant CH2C12 6 % MeOH Rf: 0,33 Point de fusion: > 260 C RMN 13C: solvant CDC13 ppm 25,2 (CH2 aromatique) 54,3) 56,'3) NCH2 macrocycle + branche 69,3) 760,) OCH2 macrocycle ,0 2) 123,9 (1) 125,5 (2) 3 129,9 (3) 1 131,9 (4) RMN H: solvant CDC13 ppm 2,39 (t) 8H NCH macrocycle 2 41 2,55 et 2,76 (m)-2 x 41 OCH2 N 0 2,89 et 3,19 (m)- 2 x 4H OCH2 00 3,03 et 3,82 (t) - 2 x 4 - CH2 - CH2 7,47 et 8,31 (AB) - 4H) aromatiques 7,50 et 8,36 (AB) - 4H) microanalyse: C30 H40 04 N2 (poids moléculaire 492,6) Calculé: C 73,13 -H 8,18 N 5,6 Trouvé: C 73,06 H 8,04 N 5,2 En opérant selon le mode opératoire décrit à l'exemple I on a préparé le complexe [Eu3+ C(22)anthracène]. Exemple 5 - Préparation du composé macropolycyclique de formule (7) et du complexe d'europium correspondant N N. No'' / Na2 Co3 N 23 N N 7 A - Préparation du 6,6'-bis-bromométhyl-2,2'-bipyridine NBS CC14 _ CH3 CH3(B Br Br poids moléculaire 184 poids moléculaire 342 C12H12N2 C12H1oN 2Br2 Un mélange de 6,6'-diméthyl-2,2'-bipyridine (2,76 g, mmol) et de Nbromosuccinimide (5,10 g, 28,6 mmol) dans CC14 (150 ml) est porté au reflux pendant 30 min. Puis on a alors ajouté au mélange du peroxyde de benzoyle (30 mg) et le mélange a été à nouveau porté à reflux pendant 2 h, puis le succinimide a été filtré. La solution a été refroidie jusqu'à 0 C et le solide filtré et lavé avec du méthanol pour donner du bis- dibromure sous la forme d'un solide blanc cristallin (1,65 g). Rendement 32 %; point de fusion 180-181 C. La solution de CC14 a été concentrée et chromatogra- phiée sur colonne (gel de silice) par élution avec un mélange dichlorométhane/méthanol 98: I pour donner: - 6,6'-bis-dibromométhyl-2,2'bipyridine 0,9 g 12 % - 6,6'-bis-bromométhyl-2,2'-bipyridine 1,38 g 27 % 6-méthyl-6'-bromométhyl-2,2'-bipyridine 0,55 g 14 % B - Préparation du composé macropolycyclique Un mélange du macrocycle bis-bipyridine de for- mule (5) (0,15 g, 0,38 mmol) (décrit dans J. Org. Chem. 1983, 48, 4848), et de Na2CO3 (0,4 g) dans l'acétonitrile (200 ml) a été chauffé au reflux et ensuite une solution de 6,6'-bis-bromométhyl- 2,2'-bipyridine (0,12 g, 0,38 mmol) a été ajoutée pendant une pé- riode de 3 h. Ensuite, le mélange a été porté au reflux pendant 20 h. Le Na2CO3 a été filtré et le filtrat évaporé. Le résidu a été filtré sur une courte colonne d'alumine en éluant avec CH2C12/MeOH 98: 2 pour obtenir le macrobicycle tris-bipyridine sous la forme d'un solide blanc (0,16 g; 73 %; point de fusion supérieur à 270 C). A partir du composé macropolycyclique obtenu, on a préparé le complexe [Eu C(macropolycycle tris-bipyridine)] en opérant selon le mode opératoire décrit à l'exemple I. Les longueurs d'ondes d'excitation et d'omission caractéristiques de ce complexe figurent dans le tableau ci-après. Exemple 6 - Préparation du composé macropolycyclique bis-bipyridine- phénanthroline de formule (9) et du complexe d'europium correspondant Q N N N N/ N \ \ /CH3CN reflux ) EHN NH b N N - Na2Co3 Brr 3 N Br NBr N N0/ 14HloB10 N2 2 8 C24H22N6 5 C38H30N8 Dans un ballon bicol de 500 ml, on a pesé 0,158 mmol du macrocycle bispyridine (5). On a ajouté 0,75 mmol de Na2CO3 (excès 5 fois environ) et 105 ml de CH3CN fraîchement distille. On a chauffé à reflux et sous agitation magnétique pendant 30 min. On a ajouté alors goutte à goutte la solution de dibromophénanthroline équimoléculaire dans 100 ml d'acétonitrile. L'addition assez lente (2 h 10 min) a eu lieu tout en maintenant le reflux et l'agitation magnétique. On a chauffé alors encore 18 h sous les mêmes con- ditions. La solution obtenue a été évaporde à sec. Le produit 2570703- brut en solution dans CH2C12 a été lavé à l'eau. (chromatographie couche mince sur alumine: gluant: CH2C12/MeOH: /10). Ce produit brut a été purifié sur colonne d'alumine standardisée (Activité II-III). L'éluant est CH2C12/MeOH:.98/2. A partir du composé macropolycyclique ainsi obtenu 3+C on a préparé le complexe rEu C(macropolycycle bis-bipyridine- phénanthroline)] en opérant selon le mode opératoire décrit à l'exemple 1. Les longueurs d'ondes d'excitation et d'émission' caractéristiques de ce complexe figurent dans le tableau ci-après. Exemple 7 En opérant selon le mode opératoire de l'exemple I avec les composés macropolycycliques (22) pyridine amide et (222B) on a obtenu respectivement les complexes macropolycycliques ci- après: [ Eu3+ C(22) pyridine amide] [ Tb3+ C(222B)] Caractérisation des complexes obtenus selon les exemples 1 à 6 Pour chaque complexe on a déterminé, pour une lon- gueur d'onde d'émission donnée, caractéristique de l'ion de terre rare du complexe, les longueurs d'ondes d'excitation; les pics d'excitation enregistres ne correspondent pas à ceux de l'ion de terre rare seul. Par ailleurs, on a constaté qu'en excitant le complexe à la longueur d'onde correspondant au pic d'excitation déterminé ci-dessus le maximum de fluorescence était caractéris- tique de l'ion de terre rare. Les déterminations ci-dessus ont été effectuées avec un spectromètre PERKIN-ELMER LS 5 dans les conditions opg- ratoires indiquées dans le tableau ci-après. TABLEAU CARACTERISTIQUES D'EXCITATION ET D'EMISSION DES COMPLEXES DE L'INVENTION (Perkin Elmer LS 5) EXCITATION EMISSION largeur facteur larger faceur d'émis- d'excitation % d'exci- maximum de Complexe Concentration des d'e- À d'émis- X d a d'exci- maximum de (solvaentratioes pansi sion enregistrée tation fluorescence (solvant) fentes pansion donnée donnée observé à: 3+ -6 nm (pic) $615 nm (pic) [Eu C(22)phèn] 3,7.106 mol/l 2,5/20 nm 10 615 nm 312 nm (épau- 290 nm 593 (second (eau) lement) c 330 nm pic) 3+ -4 290 rum (pic)613 nm jEu3 C(22) phèn 2,5.10 mol/l 2,5/10 nm 3 613 nm 323 nm (pic) 290 nm amide] (eau) 333 nm (épau- 590 nm lement) 345 nm (épau- lement) [Eu 3+C(macropoly- 7.10 mol/l1 cycle tris-bipy- ( h 2,5/10 nm 15 620 nm maximum à 300 nm maximum à (tampon phos-3062 ridine)]p ho 300 n 620 nm phate 0,1 M r pH 7,5) Ln 3+ 5 --j [Eu3 C(phénan- 2,8.10 mol/l 2, 5/10 nm 2 280 nm 590 nm throline bis-bi- (eau) 613 n pyridine _ _ TABLEAU (suite) EXCITATION EHISSION largeur facteur X d'émis- À d'excitation À d'exci- maximum de Complexe Concentration des d'ex- sion enregistrée tation fluorescence fentes pansion donnée donnée observé à: EE3+C(2 nha [Eu 3C(22) anthra- 0,2 mg dans 2,5/10 nm 0,2 613 nm 287 nm (pic) 287 nm 590 nm (pic) cène] 3 ml d'eau 317 nm (épau- 613 nm (pic) lement) [Eu3+C(22) pyridine 2.10-4 mol/1 2,5/5 nm 40 - 290 nm 613 nm amide j (DMSO) 590 nm [Tb3+ -3 [Tb C 222 B 10' mol/i 2,5/20 nm 15 541 nm 290 nm (épau- 290 nm 541 nm (DMSO) lement) 333 nm (pic) 485 nm X mesure faite en mode phosphorescence; délai td = 0, 1 milliseconde tg = 2 millisecondes. mesure faite en mode phosphorescence; délai td = 0,2 milliseconde tg = 5 millisecondes. REVENDICATIONS 1. Application, à titre de marqueurs de produits biolo- giques dans les méthodes de détection et de détermination immuno- logiques par fluorescence, des complexes macropolycycliques de terres rares constitués d'au moins un sel de terre rare complexé par un composé macropolycyclique de formule générale: A R -Z Z Z- R I dans laquelle Z est un atome ayant 3 ou 4 valences, R est rien ou représente l'hydrogène, le groupe hydroxy, un groupe amino ou un radical hydrocarboné, les radicaux bivalents Q, et Q, sont indépendamment l'un de l'autre des chaînes hydrocarbonées qui contiennent éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes et sont éventuellement interrompues par un hétéromacrocycle, au moins l'un des radicaux oA, Qou comportant de plus au moins un motif moléculaire ou étant essentiellement constitué par un motif moléculaire, ledit motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé. 2. Application selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdits complexes de terres rares sont substitués par un bras liant choisi parmi les radicaux alkylamino, arylamino, isothiocyano, cyano, isocyano, thiocyano, carboxyle, hydroxyle, mercapto, phénol, imidazole, aldéhyde, époxyde, halogénure: de thionyle, de sulfonyle, de nitrobenzoyle, de carbonyle; triazo, succinimido, anhydride, halogénoacétate, hydrazino dihalogêno- triazinyle. 3. A titre de produits nouveaux, les complexes macro- polycycliques de terres rares constitués d'au moins un sel de tette rare complexé par un. composé macropolycyclique de formule: R -Z Z - R I dans laquelle Z est un atome ayant 3 ou 4 valences, R est rien ou représente l'hydrogène, le groupe hydroxy, un groupe amino ou un radical hydrocarboné, les radicaux bivalents, et, sont indépendamment l'un de l'autre des chaînes hydrocarbonées qui contiennent éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes et sont éventuellement interrompues par un hétéromacrocycle, au moins l'un des radicaux, ou Q comportant de plus au moins un motif moléculaire ou étant essentiellement constitué par un motif mol4cu- laire, ledit motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé, à la condition que, lorsque le sel de terre rare est un sel d'eu- ropium ou de terbium, Z est l'azote, A est (CH2)2-0-C6H4-0-(CH2)2 ( et G ne sont pas simultanément l'un le radical-(CH2)2-0- (CH2)2-, l'autre le radical -(CH2)2-0-(CH2)2-0-(CH2)2-. 4. Complexe selon la revendication 3, caractérisé en ce que les chaînes hydrocarbonées sont des chaînes oxyéthylénées ou polyoxyéthylénées. 5. Complexe macropolycyclique selon l'une des revendi- cations 3 ou 4, caractérisé en ce que l'ion de terre rare est choisi parmi l'europium, le terbium, le samarium et le dysprosium. 6. Complexe macropolycyclique selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que le motif donneur d'énergie a une longueur d'onde de phosphorescence inférieure à 580 nm. 7. Complexe macropolycyclique selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisé en ce que le motif molécu- laire est choisi parmi la phénanthroline, l'anthracène, le benzène, le naphtalène, les bi- et ter-phényle, l'azobenzène, l'azopyridine, la pyridine, les bipyridines et les composés de formules ci-après: - C2H4 - xi - C6H4 - X C2H4 - C2H4 - X1 - CH2 - C6H4 - CH2 -X2 - C2H4 - Xi et X2 pouvant être identiques ou différents désignent l'oxygène, l'azote ou le soufre N o o N - 0 CH2 CH2 X X i0 I!1E Il!g 2-C- O0-CH2-C- o o X étant l'oxygène ou l'hydrogène. 8. Complexe macropolycyclique selon l'une quelconque des revendications 3 à 8, caractérisé en ce qu'il est constitué de l'ion terbium ou europium complexé par l'un des composés macro- cycliques ci-après: - (22)phénanthroline; (22)phénanthroline amide; (22)anthracène; (22) anthracène amide; le macropolycycle tris-bipyridine et le macropolycycle ph&nanthroline-bis-bipyridine. 9. Composé macropolycyclique répondant à la formule: A R - Z Z- R I dans laquelle Z est un atome ayant 3 ou 4 valences, R est rien ou représente l'hydrogène, le groupe hydroxy, un groupe amino ou un radical hydrocarboné, les radicaux bivalents G' Q et Q ' sont indépendamment l'un de l'autre des chaînes hydrocarbonées qui contiennent éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes et sont éventuellement interrompues par un hétéromacrocycle, au moins l'un des radicaux Q, Q ou Q comportant de plus au moins un motif moléculaire ou êtant essentiellement constitué par un motif moléculaire, ledit motif moléculaire possédant une énergie de triplet supérieure à celle du niveau émissif de l'ion de terre rare complexé et étant choisi parmi la phénanthroline, l'anthracène et les bipyridines. 10. Composé selon la revendication 9, caractérisé en ce que Z est l'azote et (D et Q sont des chaînes polyoxy6thylénées. 11. Composé selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce qu'il est l'un des composés ci-après: (22)phé- nanthroline; (22)phénanthroline amide; (22)anthracene et (22)anthracène amide. 12. Composé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est le macropolycycle(tris-bipyridine) ou le macropolycycle (phénanthroline-bisbipyridine). 13. Complexe biologique, caractérisé en ce qu'il est constitué d'une molécule biologiquement active associée par couplage avec, ou adsorption sur, un complexe macropolycyclique de terre rare tel que défini dans les revendications 1, 3 à 8. 14. Complexe biologique selon la revendication 13, caractérisé en ce que la molécule biologiquement active est choisie parmi les antigènes, les anticorps, les anticorps mono- clonaux, les fragments et combinaisons Ac-fragments, les drogues, les récepteurs, les hormones, les récepteurs hormonaux, les bactéries, les stéroides, les aminoacides, les peptides, les virus, les vitamines, les nucleotides ou polynucléotides, les enzymes, leurs substrats, les lectines, les acides nucliques, l'ADN et 'ARN. 15. Procédé d'exaltation de la fluorescence d'ions de terres rares, caractérisé en ce qu'il consiste à complexer au moins un ion de terre rare avec un complexe macropolycyclique tel que défini dans les revendications 1, 3 à 8, et à exciter le motif donneur dudit complexe.