FR 2567268 A1 19860110 FR 8507425 A 19850515 l La présente invention concerne un procédé et une élec- trode pour mesurer des concentrations enzymatiques et un procédé de préparation d'une telle électrode. Plus particulièrement l'in- vention concerne un procédé et un appareil pour déterminer les concentrations de populations actives d'enzymes ou de populations contenant des enzymes, telles que des bactéries, des levures ou similaires. Classiquement on dénombre ces populations selon des techniques microscopiques ou selon des techniques plus élaborées, telles que la mesure de la turbidité optique de liquides contenant les populations. Le brevet des Etats-Unis d'Am4rique n 3 506 544 décrit une technique pour mesurer la concentration de certains constituants de réactions à catalyse enzymatique, par emploi d'un couple redox électrochimiquement réversible. L'enzyme, un couple redox tel que le bleu de méthylène, un substrat tel que le glucose et un milieu conducteur compatibletel qu'une solution aqueuse tamponnée, sont mélangés dans une cellule étectrolytique à travers laquelle on fait passer un courant par application d'une tension entre une paire d'électrodes. Les électrodes sont de façon typique faites d'un métal noble. L'activité de l'enzyme réduit le couple redox oxydé à une vitesse qui correspond à la concentration de l'enzyme. Le couple redox réduit est soumis à une réoxydation à l'anode de la cellule, ce qui produit un courant de cellule propor- tionnel à la concentration du couple redox réduit. La vitesse d'accroissement du courant se révèle ainsi proportionnelle à la concentration de l'enzyme dans la solution. Les diverses techniques de l'art antérieur, pour mesurer les populations d'enzymes ou de bactéries, présentent certaines insuffisances. Certaines ne sont pas suffisamment sensibles pour détecter les concentrations très faibles, ou sont très lentes, ou nécessitent des stades trop nombreux pour permettre des déterminations efficaces. Certaines sont également très coûteuses, en particulier lorsqu'elles utilisent des électrodes en métaux nobles ou similaires. Egalement on a constaté que des erreurs inexplicables apparaissent parfois dans l'analyse d'un échantillon particulier. Un autre problème apparait avec les dispositifs de l'art antérieur lorsqu'on utilise le même appareil de façon consé- cutive avec- des échantillons multiples. On constate que le dépla- cement des électrodes, d'une cellule d'échantillon à une autre, contamine la seconde cellule ou le second échantillon avec des enzymes- ou d'autres composants qui ont été absorbés par les élec- trodes. Egalement il faut veiller soigneusement à ce que la cellule soit remplie à un niveau très précis, identique à celui utilisé pour son étalonnage, afin que la surface de l'électrode plongée dans l'électrolyte demeure constante. Cependant,même lorsqu'on prend de grandes précautions à cet égard, des erreurs inexplicables des mesures se produisent. Un autre problème rencontré dans l'art antérieur est la nécessité de désaérer la solution avant d'effectuer l'analyse. On a constaté que, dans certaines circonstances, des quantités imprévisibles de bactéries aérobiespeuvent êtredésactivéesparsuite du stade de désaération. D'autre part, si la solution n'est pas désaérée, l'oxygène restant nuit à la précision de la mesure, car il contribue à la réaction au niveau de l'anode sur laquelle repose la mesure. Ces problèmesdestechniques de'l'art antérieur, ainsi que d'autres, peuvent être fortement réduits ou supprimés selon l'invention. L'invention concerne un procédé et un dispositif pour mesurer la concentration d'un agent enzymatique dans une solution dans laquelle on fait passer un courant électrique entre une contre- - électrode et une électrode de graphite très dense, cylindrique, allongée et de faible porosité. L'électrode de graphite tourne autour de son axe longitudinal dans la solution qui contient également un couple redox et un substrat qui sont catalysés par l'agent enzyma- tique pour réagir et modifier le couple redox pour le faire passer d'un état d'oxydation à l'autre. Les variations de l'état d'oxydation provoquent un changement de courant dans l'électrode tournante, ce changement étant lié à la vitesse de variation de l'état d'oxydation du couple redox qui elle-même est liée à la concentration de l'agent enzymatique. La portion submergée de l'électrode de graphite est revêtue sur toute sa surface, à l'exception de- la surface terminale, d'une couche protectrice isolante, telle qu'une couche de résine époxy qui n'est pas conductrice et est inerte et imperméable vis-à-vis des constituants de la solution. Ceci permet des mesures très précises et reproductibles et également l'emploi de la même électrode pour une série de mesures consécutives de concentrations d'agents enzymatiques dans des solutions-différentes, par simple élimination d'une portion de l'extrémité apparente de l'électrode entre les mesures successives. Le procédé envisage également la désaération de la solution pour éliminer l'oxygène avant la mesure de l'intensité du courant. Pour certains agents enzymatiques, tels que les bactéries aérobies, on a constaté que la précision est fortement accrue par introduction du couple redox et du substrat dans la solution avant le stade de désaération. Dans ses modes de réalisation préférés, l'invention comprend l'emploi d'EDTA disodique pour-améliorer notablement la précision de l'analyse. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront compris à la lecture de la description qui va suivre et ense référant aux dessins annexés, sur lesquels: la figure 1 illustre un appareil pour mesurer des concentrations d'agents enzymatiques selon l'invention; la figure 2.illustre graphiquement un exemple de l'intensité du courant à travers le circuit de détection en fonction du temps; la figure 3 illustre graphiquement la relation entre la vitesse de réaction et la concentration en bactéries, au cours de-l'analyse d'une solution; et la figure 4 est une coupe transversale de l'électrode de graphite, effectuée selon-les lignes 4-4 de la figure 1.: L'invention va maintenant être décrite de façon détailtée. La figurer illustre un récipient 10 en verre actinique contenant une solution 12,-dont la concentration en agent enzymatique doit être déterminée. L'agent enzymatique peut consister en-une enzyme ou une levure; cependant l'invention est particulièrement utile dans le cas des solutions contenant des bactéries. - 2567268. La solution 12 contient de L'eau qui est tamponnée par emploi d'agents tampons appropriés, tels que le dihydrogénophosphate de potassium (K2HPO4) et l'hydrogénophosphate dipotassique (K2HPO4) à un pH de 7,0. Le pH optimal dépend de l'agent enzymatique parti- culier à analyser, mais de façon typique, un pH neutre de 7,0 est satisfaisant. On ajoute le sel disodique de l'acide éthylènediamine- tétraacétique (édétate disodique ou EDTA disodique) en une quantité suffisante pour que sa concentration soit d'environ 0,01 M dans la solution 12. Cela s'est révélé réduire les interférences dues aux ions métalliques qui peuvent être présents dans la solution sous forme d'impuretés et qui tendraient sinon à modifier l'activité enzymatique ou l'intensité du courant dans la solution 12 et à produire des résultats erronés. Il semble que l'EDTA disodique forme des complexes avec les ions métalliques en évitant leur précipitation dans les conditions opératoires (cette précipitation pourrait sinon enrober les bactéries ou l'autre agent enzymatique à analyser). -Donc les quantités efficaces et optimales d'EDTA disodique dépendent des ions métalliques présents et peuvent être déterminées par des expériences simples. On ajoute un substrat et un couple redox à la solution. Le substrat et le couple redox choisis doivent appartenir à un type sensible à l'action catatytique de l'agent enzymatique particulier à analyser.. De façon typique, pour la plupart des bactéries, on obtient d'excellents résultats en utilisant une solution 12 qui contient une concentration en glucose, d'environ 0,01 M et une concentration en bleu de méthylène (chlerure de méthylthionine) d'environ 0,0001 M. L'accès à l'intérieur du récipient 10 s'effectue par les çols 14, 16, 18 et 20. Lorsque tous les contenus sont en place, on injecte un gaz inerte, tel que l'argon par la canalisation 30 et le tube distributeur 32, pour qu'il s'échappe par les ouvertures 34 et s'élève en barbotant dans la solution 12. Cette opération dure de façon typique environ 5 minutes pour purger la majeure - partie de l'oxygène libre de la solution 12. L'argon qui barbote et toute matière volatile telle que l'oxygène, s'élèvent à travers l'espace de vapeur 35 et sont éliminés du récipient 10 par la canali- sation de sortie 36. La canalisation d'entrée 30 et La canalisation de sortie 36 sont assujetties de façon étanche à travers un bouchon à deux trous 38 placé sur le col d'accès 14. Un récipient en verre séparé 11 contenant une solution 13 est raccordé électrolytiquement au système du récipient 10, au moyen d'un pont salin 100, constitué de gélose et de chlorure de potassium. La solution 13 contient un électrolyte approprié, de façon typique une solution-0,1 M d'EDTA ferrique, ou sinon une solution aqueuse de chlorure de potassium. L'accès à l'intérieur du récipient 11 s'effectue par les cols 15, 17 et 19. La solution 13 peut également être désaérée, si on le désire, par injection d'un gaz inerte tel que l'argon, par la canalisation d'entrée 31 et le tube distributeur 33, pour qu'il sorte par les ouvertures 37 et barbote en s'élevant dans la solution 13. L'argon qui barbote et l'oxygèneainsi que toute autre matière volatile, s'élèvent à travers l'espace de vapeur 39 et sont éliminés du récipient 1l par la canalisation de sortie 41. La canalisation d'entrée 31 et la canalisation de sortie 41 sont toutes deux assu- jetties de façon étanche dans un bouchon à deux trous 43, placé dans le col d'accès 15. Une batterie ou une alimentation en courant continu 40 est munie d'un potentiomètre 42 ayant un curseur 44 et une résistance 46. Le curseur 44 est raccordé par un conducteur 50 à la contre-élec- trode 52. La contre-électrode 52 peut être faite d'un matériau pour électrode approprié quelconque. Pour la plupart des utilisations, une électrode de fer s'est révélée satisfaisante. La contre-électrode 52 est assujettie de façon étanche dans le col d'accès 17, au moyen du bouchon 54. Une électrode 56 en graphite de faible porosité et de forte densité est assujettie dans le col d'accès 20 du récipient 10, au moyen du bouchon 57, et est raccordée par le fil conducteur 58, l'ampèremètre 60 et le conducteur 62, au côté positif de la batterie 40. Une électrode de référence 70 telle qu'une électrode saturée au calomel est assujettie à travers le bouchon 72 dans un col d'accès 18 du récipient 11 et est raccordée par les conducteurs 74 et 76 et le voltmètre 78 au conducteur 58 de L'électrode de graphite. Pour mettre l'appareil en marche, il est important de faire tourner l'électrode de graphite 56 afin d'assurer un contact efficace de L'électrode avec les constituants de La solution 12, avec remplacement du couple redox consommé à la surface de l'électrode. Cela est obtenu grâce à un dispositif d'entraînement 80 et d'un méca- nisme à engrenages 82, représentés schématiquement sur la figure 1. On peut employer avec succès une gamme de vitesses de rotation; cependant il est préférable de faire tourner l'éLectrode à des vitesses d'environ 100 à 2 000 tr/min. Des vitesses plus faibles peuvent être utilisées; cependant aux vitesses trop faibles, l'élec- trode devient plus sensible aux vibrations externes et moins sensible pour la détection de faibles concentrations de bactéries. i5 Pour démarrer l'opération d'analyse, on ajuste le cur- seur 44 du potentiomètre le long de la résistance 46, jusqu'à ce oue la valeur indiquée par le volmètre 78 soit essentiellement de 0,0. Après, ou en même temps, que l'on purge l'oxygène dissous dans la solution 12 avec de l'argon, on élimine de préférence toute trace restante d'oxygène par addition par exemple de suffisamment d'EDTA ferreux pour réduire pratiquement à zéro l'intensité du courant mesurée par l'ampèremètre 60. On trace un graphique de l'intensité du courant mesurée par l'ampèremètre 60 dans le circuit d'analyse c'est-à-dire entre l'électrode de graphite 56 et la contre-électrode 52) comme illustré par la figure 2. De façon typique la variation de l'intensité du courant avec le temps est initialement non linéaire, maisaprès une période brève, une relation linéaire s'établit. La pente de la portion linéaire de la courbe (indiquée par la tangente sur la figure 2) est proportionnelle à la vitesse de réaction du couple rédox au niveau de l'électrode 56, sous l'effet de l'action catalytique de l'agent enzy- matique. Une relation typique entre la vitesse de réaction et la concentration des bactéries dans une solution saturée de glucose et de bleu de méthyLène (relativement à la quantité de bactéries dispo- nibles) est illustrée par la figure 3. Cet exemple est réalisé par emploi d'un échantillon de 300 ml d'eau de crue, prélevé d'un égout pluvial ou autre fossé d'écou- lement, dans le récipient 10 avec 0,112 g d'EDTA disodique pour que la concentration en EDTA disodique de la solution soit de 0,001 M. On ajoute à cette solution 1,633 g de KH2PO4 et 3,136 g de K2HPO4 pour que la concentration en phosphate de la solution soit de 0,1 M. On ajuste le pH à 7 en utilisant du NaOH 0,5 N et on ajoute à la solution 0,5 g de glucose (0,01 M) et 15 ml de bleu de méthylène 0,01 M (5 x 104 M). On met ensuite la solution en contact avec les électrodes; l'électrode tournante ayant été préalablement nettoyée par polissage avec du papier de verre fin, puis polie sur une plaque de verre. L'électrode de carbone a une surface inférieure-apparente de 0,30 cm2 et tourne à 1 000 tr/min. -. On règle la tension pour que L'électrode tournante soit à 0,00 volt par rapport à l'électrode saturée au calomel. On mesure le courant en fonction du temps. Lorsque la pente de la variation du courant en. fonction du temps devient constante-on-détermine la pente et on calcule le nombredesbactéries à partir de-la courbe d'étalon- nage. Dans cet exemple, on utiliseles vitesses de réaction déter- minées à partir de La pente de la-tangente de-la figure 2, comme représenté par les traits discontinus de la figure 3,-pour établir 6 7 que la concentration des bactéries se situe entre 10 et 107 celtluies par millilitre de solution, lorsque La vitesse de réaction est d'-en- viron 6,25 x 109. On peut préparer des graphiques semblables à ta figure 3 en utilisant des concentrations standards de bactéries:ou d'autres agents enzymatiques dans des conditions d'essai standard. Apres prépa- ration de cette courbe d'étalonnage, on peut L'utiliser de façon-répétée pour des analyses d'échantillons différents de solutions contenant les mêmes bactéries ou agents enzymatiques ou des bactéries ou agents enzymatiques semblables. La figure 4 est une coupe-selon les Lignes-4-4 de l'élec- trode en graphite de faible porosité et très dense-56 illustrée par- la figure 1. L'électrode 56 est constituée d'une partie centrale de graphite 96, qui, de façon typique, est un éLément cylindrique imper- méable, très pur, ayant un diamètre d'environ 0,1 cm à environ 10 cm, de préférence d'environ 0,3 cm à environ 1,0 cm. Le graphite doit avoir une porosité inférieure à environ 10 %. Cela est important pour - réduire au minimum- l'absorption de la solution qui pourrait être entraînée dans un échantillon ultérieur à analyser. Egalement toute absorption dans les interstices des pores d'une électrode a un effet électrique analogue à l'accroissement de la surface de l'étectrode, c'est-à-dire accroit la vitesse d'oxydation du couple redox et peut produire des lectures erronées, en particulier, pour de faibles vitesses de rotation de l'électrôde. Le revêtement 98 autour de la surface extérieure de la tige cylindrique 96 peut être fait d'une matière imperméable appro- priée quelconque. On utilise de préférence une matière polymère (telle qu'une résine époxy, un polyuréthanne, ou similaires) car les tiges de graphite peuvent être plongées dans de telles matières et le revê- tement adhérant peut être durci relativement rapidement pour former une couche protectrice dure et dense. It n'est pas nécessaire que la couche ait une épaisseur excessive,: tant qu'elle est imperméable au liquide et agit comme un isolant, empêchant le passage d'un courant notable par rapport à la conductivité du graphite. De façon générale, des revêtements de résines époxy épais d'environ 1 mm se sont révélés acceptables. Après application du revêtement 98, on enlève la portion terminale pour faire apparaître une surface de graphite non revêtue (voir la figure 1) à l'extrémité de l'électrode. La surface 110 constitue donc la seule surface de contact entre le graphite et la solution 12, le revêtement protecteur 98 atteignant au moins l'espace de vapeur 35 du récipient 10 et de préférence couvrant la totalité de la portion en graphite de l'électrode. - La surface terminale 10 doit être meulée ou poncée, par exemple avec du papier de verre très fin, pour éliminer toutes les rayures et former une surface plane. Il est ensuite préférable de la polir en utilisant un papier fin et dur sur une surface plane et dure, telle qu'une plaque de verre, jusqu'à ce que la totalité de la surface présente un éclat métallique. L'électrode est ensuite rincée avec du méthanol et de l'eau distillée pour éliminer toutes les huiles et autres impuretés juste avant l'emploi. Grâce à la surface imperméable très lisse et brillante 110, on peut obtenir une grande précision dans la corrélation des mesures consécutives, car on peut obtenir des circuits électriques très reproductibles avec des surfaces apparentes très précises de l'électrode de graphite. Une caractéristique particulièrement intéressante de l'électrode de graphite enrobée de l'invention est son emploi pour effectuer des analyses consécutives sur des échantillons différents de solution 12. Par exemple, on peut changer la solution ou retirer l'électrode du col d'accès 20 et l'utiliser dans un récipient 10 différent avec une solution différente. Avant d'insérer l'électrode de graphite 56 dans une nouvelle solution, on élimine (par exemple par meulage) la portion terminale inférieure, pour assurer l'étlimi- nation des quantités même minimes de solution absorbée de l'analyse précédente. On a constaté qu'après élimination par meulage d'environ 6,35 mm ou plus de la partie inférieure de l'électrode, puis ponçage et polissage de la surface inférieure, l'électrode convient à l'emploi en fournissant des résultats qu'il est impossible de distinguer de ceux d'une électrode neuve. De plus, contrairement aux électrodes de l'art antérieur qui utilisent par exemple des métaux nobles, on a constaté que tout dépôt ou toute contamination du revêtement extérieur 98 de l'électrode n'influe pas sur la précision de l'analyse. Il est donc inutile de jeter l'électrode lorsque sa surface extérieure est corrodée ou revêtue-d'agents étrangers. Bien entendu diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui vien- nent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. 10. REVENDICATIONS 1. Procédé pour mesurer La concentration d'un agent enzy- matique dans une première solution (12) dans laquelLe une première électrode (56) est au moins partiellement plongée, dans lequel une seconde électrode (52) est au.moins partiellement plongée dans une seconde solution (13) qui est en communication électrolytique (100) avec la première solution, un potentiel étectrique est créé entre la première et la seconde électrode et l'intensité du courant produit entre lesdites électrodes est en relation avec la concentration dudit agent enzymatique dans ladite première solution, caractérisé en ce que l'on emploie comme dite première électrode un conducteur de graphite (96) ayant une porosité suffisamment faible pour empêcher uneabsorp- tion notable de solution au-deLà d'environ 6,35 mm en dessous de sa surface. 2. Procédé selon la revendication I dans lequel ledit conducteur de graphite a une porosité inférieure à environ 10 %. 3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit conducteur (96) est cylindrique et tourne autour de son axe longitudinal à une vitesse suffisante pour assurer son contact efficace avec les constituants de ladite première sotlution. 4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que ladite vitesse est dans la gamme d'environ 100 tr/mn à environ 2000 tr/min. 5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que la portion submergée dudit conducteur cylindrique (96) est revêtue sur la totalité de sa surface, à l'exception de la surface terminale submergée, d'une couche d'isolation électrique (98) qui est impermé- able à ladite première solution. 6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que ledit conducteur cylindrique (96) a un diamètre compris entre environ 0,1 et environ 10 centimètres. - - 7. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que ledit conducteur (96) a un diamètre compris entre environ 0,3 et environ 1,0 centimètre. 8. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ladite première solution (12) est constituée d'une solution aqueuse contenant un agent enzymatique, un couple redox et un substrat = 2567268 et en ce qu'il comprend de plus le stade d'!addition d'une quantité suffisante d'EDTA disodique pour améliorer notablement La précision de la mesure de la concentration dudit agent enzymatique. 9. Procédé pour préparer une électrode (56) destinéeà être au moins partiellement submergée dans une solution et à effectuer des mesures précises de l'intensité du courant qui la traverse caractérisé en ce qu'il consiste à: se munir d'un conducteur cylindrique en graphite-(96) ayant un dia- mètre dans la gamme d'environ 0,1 à environ 10 cm et une porosité inférieure à environ 10 %, revêtir la surface latérale dudit conducteur cylindrique d'une ma- tière polymère (98) imperméable à ladite solution et, aplanir, égaliser et polir la surface terminale (110) dudit conduc- teur cylindrique pour lui conférer un éclat métalLiqueo 10. Electrode caractérisée en ce qu'on l'a préparée selon leprocédé de la revendication 9. 11. Procédé pour mesurer la concentration d'une enzyme dans une solution aqueuse (12) contenant ladite enzyme et de l'oxygène dissous comprenant: l'introduction d'un échantillon de ladite solution dans un récipient (10), le tamponnage de ladite solution à un pH essentiellement neutre, l'addition d'un substrat et d'un couple redox à ladite solution, ledit substrat et ledit couple redox pouvant passer d'un état d'oxy- dation à un autre sous l'effet catalytique de ladite enzyme, l'élimination dudit oxygène dissous de ladite solution aqueuse après l'addition dudit substrat et dudit couple redox, l'emploi d'une solution électrolytique (13) contenue dans un réci- pient séparé (11), le raccordement électrolytique (100) de ladite solution aqueuse (12) et de ladite solution électrolytique (13), l'immersion au moins partielle d'une contre-électrode-(52) dans - ladite solution électrolytique, l'immersion au moins partielle d'une électrode de graphite (56) dans ladite solution aqueuse, ladite électrode de graphite étant consti- tuée d'un conducteur cylindrique de graphite (96) ayant un diamètre compris entre environ 0,1 et environ 10 centimètres et une porosité inférieure à environ 10 %, Ledit conducteur étant revêtu sur sa surface Latérale d'un revêtement isolant (98) Ledit revêtement étant imperméable à Ladite.solution aqueuse et la surface terminaLe (110) dudit conducteur cylindrique ne comportant pas ledit revêtement et étant plane, lisse et polie pour qu'elle ait un éclat métallique, la rotation de ladite éLectrode'de graphite autour de son axe longi- tudinaL à une vitesse comprise entre environ 100 et environ 2-000 tri min avec application d'un potentiel électrique entre ladite électrode de graphite et ladite contre-éLectrode, la mesure (60) de l'intensité du courant entre Ladite contre-élec- trode (52) et ladite électrode de graphite (56)-, et - La détermination de la concentration de l'enzyme dans ladite solution aqueuse, à partir de la vitesse de variation de ladite intensité du courant. 12. Procédé seLon la revendication 11 caractérisé en ce que Ladite contre-électrode (52) est constituée de fer. 13. Procédé selon la revendication 11 caractérisé en ce que ladite enzyme est constituée de bactéries et ledit substrat et ledit coupLe redox sont constitués de glucose et de bleu de méthyCène. 14. Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que-des ions métalliques sont présents dans ladite solution aqueuse (1) comme impuretés et en ce qu'il comprend de plus le stade d'addition d'une quantité suffisante d'EDTA disodique pour réduire au minimum les interférences desdits ions metalliques gênant la précision des mesures de Ladite enzyme. 15. Procédé selon la revendication 14 comprenant de plus l'élimination d'au moins environ 6,35 mm de l'extrémité submergée de Ladite électrode de graphite (56) après la mesure de l'intensité du courant qui la traverse; l'aplanissement, l'égalisation et le polissage de la surface terminale (110) nouvellement mise à nu jusqu'à obtention d'un éclat métallique et le réemploi de ladite électrode de graphite. 16. Procédé selon la revendication 11 caractérisé en ce que ledit oxygène dissous est éliminé de ladite solution aqueuse par barbotage d'un gaz inerte ne contenant pas d'oxygène dans cette solution.