FR 2565995 A1 19851220 FR 8403565 A 19840307 Cellules hybrides productrices d'un polypeptide déterminé et obtenu à partir de cellules primaires naturellement capables d'exprimer ce polypeptide ou un polypeptide équi- valent, procédé pour l'obtention de ces cellules hybrides et application de celles-ci à la production dudit poly- peptide. L'invention est relative à des hybrides cellu- laires efficaces pour la production d'un polypeptide déterminé codé par une séquence d'ADN clone ou clonable dans cet hybride cellulaire, à un procédé de production de ces hybrides cellulaires et à l'application de ces der- niers à la production dudit polypeptide. La production d'hybrides cellulaires a déjà été envisagée, notamment dans des études sur les expressions des fonctions constitutives et différenciées des cellules à partir desquelles ils avaient été obtenus. Par exemple BERTOLOTTI et al ((1973), J. Cell. Physiol. 79, 211-224) ont réalisé des hybrides cellulaires, par fusion de cel- lules d'hépatome de rat avec des fibroblastes de souris ou des cellules épithéliales de rat, en vue de l'étude de l'expression ou de la nonexpression de certaines des fonctions spécifiques exprimées par les cellules initia- les. Ces auteurs devaient constater que la capacité des cellules d'hépatome de rat de produire l'aldolase était atteinte dans l'hybride formé. D'autres auteurs, par exemple KLEBE et al ((1970), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66, 1220-1227) ont également étudié les capacités de cellules hybrides à exprimer ou à réexprimer des fonctions spécifiques propres à l'un au moins des constituants cellulaires mis en jeu dans la formation de l'hybride. Ces auteurs ont notamment formation de l'hybride. Ces auteurs ont notamment observé que dans les hybrides entre des cellules d'adénocarcinome rénal de souris produisant l'estérase ES-2 et des fibro- blastes diploïdes humains, ES2 n'était pas produit si les chromosomes humains étaient maintenus, mais que la perte de ceux-ci entraînait une réexpression de ES2. On men- tionnera également des études analogues de FOUGERE et al (1972), P.N.A.S. 69, 330-334, qui rapportèrent la capacité de certains clones hybrides entre des cellules de mélanome de hamster Syrien et de fibroblastes de souris d'exprimer la mélanine avec un taux de production accru. Celle-ci a pu être corrélée à la présence dans l'hybride, révélée par leur caryotype de deux génomes de cellules mélanome et d'un génome de fibroblaste de souris. La présente invention découle d'une recherche met- tant également en jeu des hybrides cellulaires, recherche néanmoins toute différente, dont la démarche a essentiel- lement été de combiner les avantages des techniques du génie génétique et de la production des hybrides cellu- laires. Il est bien connu à ce jour que l'on peut trans- former des micro-organismes par des séquences d'ADN clo- nées, dans des conditions les rendant propres à synthéti- ser une protéine ou un polypeptide étranger. Cette pro- duction imposée à ces micro-organismes s'effectue cepen- dant dans un environnement génétique qui n'est pas tou- jours favorable, de sorte que le rendement de production de cette protéine ou de ce polypeptide, ou même simplement les conditions de survie ou de développement des micro- organismes concernés, peuvent s'en trouver considéra- blement affectés. L'invention a pour but de fournir des micro- organismes modifiés transformés ou transformables par des séquences d'ADN clonées par la mise en oeuvre des tech- niques du génie génétique, ces micro-organismes modifiés étant cependant tels que la séquence d'ADN clonée se trouve en fait replacée dans un environnement génétique (intervenant par exemple au niveau de la différenciation ou de la programmation des génomes contenant une séquence d'ADN identique ou équivalente) proche des conditions naturelles qui s'avèrent en général particulièrement favorable à son expression. Le but de l'invention est encore de fournir des hybrides cellulaires capables d'exprimer une séquence d'ADN clonée, avec des rendements de production en poly- peptide correspondant, rarement sinon jamais atteints, dans les microorganismes rendus producteurs d'un tel polypeptide grâce aux techniques du génie génétique. Le procédé selon l'invention d'un hybride cellu- laire exprimant ou susceptible d'être rendu capable d'ex- primer une séquence d'ADN cloné déterminée est caractéri- sé: - en ce que l'on réalise une coculture, dans des condi- tions propres à permettre leur hybridation, d'une part, de cellules eucaryotes établies, dans lesquelles la susdite séquence d'ADN clonée est exprimable ou exprimée et, d'au- tre part, de cellules primaires naturellement favorables à l'expression de gènes naturels codant pour une protéine constituée par le polypeptide codé par la susdite séquence d'ADN clonée ou contenant dans sa propre structure une sé- quence polypeptidique identique ou analogue à celle de ce polypeptide, cette coculture étant réalisée dans un milieu qui n'autorise pas le développement desdites cellules éta- blies, lorsqu'elles ne sont pas complémentées par une sé- quence génétique appropriée, - en ce que les cellules primaires mises en jeu dans l'hy- bridation cellulaire sont aptes ou ont été rendues aptes au préalable à fournir ladite séquence génétique appro- priée à au moins une partie des hybrides cellulaires for- més dans ledit milieu de culture et en ce que l'on re- cueille les hybrides cellulaires formes. Le procédé selon l'invention peut permettre l'ob- tention d'hybrides cellulaires directement producteurs du polypeptide déterminé-recherché si, soit les cellules éta- blies, soit les cellules primaires, voire même les deux à la fois, avaient été transformées préalablement à la co- culture susdite avec la susdite séquence d'ADN clonée. Dans un tel cas, le procédé selon l'invention pourra com- prendre l'étape supplémentaire que constitue la sélection, après ladite coculture de ceux desdits hybrides cellu- laires formés, qui se révèlent aussi être producteurs du polypeptide codé par le susdit ADN cloné. En variante, les hybrides cellulaires obtenus à l'issue de la susdite coculture des cellules eucaryotes établies et des cellules primaires naturellement favo- rables, respectivement non transformées, peuvent être eux-mêmes transformés par la susdite séquence d'ADN clo- née, le procédé selon l'invention devant alors, dans ce mode de mise en oeuvre préféré, comprendre la sélection après ladite coculture de ceux des hybrides cellulaires qui ont ainsi été rendus producteurs du polypeptide codé par le susdit ADN cloné. La compréhension des définitions qui précèdent se trouvera facilitée par l'exposé immédiat, à - titre d'exemple, des conditions d'obtention d'hybrides cellulaires préférés capables ou susceptibles d'être rendus capables de produire des quantités importantes d'un polypeptide vaccinant contre l'hépatite virale B. Dans le cadre de cette application préférée, le procédé selon l'invention peut être défini comme un pro- cédé de fabrication d'un hybride cellulaire exprimant ou susceptible d'être rendu capable d'exprimer une séquence d'ADN clonée contenant tout ou partie d'un gène déterminé contenu dans le génome du virus de l'hépatite B ou codant pour un peptide immunogène ayant des propriétés immunolo- giques équivalentes à celles du polypeptide codé par ce gène, ce procédé étant caractérisé: - en ce que l'on réalise une coculture, dans des condi- tions propres à- permettre leur hybridation, d'une part, de cellules eucaryotes établies dans lesquelles la susdite séquence d'ADN clonée est exprimable ou exprimée et, d'au- tre part, d'hépatocytes, de préférence humains, cette co- culture étant réalisée dans un milieu qui n'autorise pas le développement desdites cellules établies, lorsque celles-ci ne sont pas complémentées par une séquence géné- tique appropriée, - en ce que les hépatocytes mis en jeu dans l'hybridation cellulaire, sont aptes ou ont au préalable été rendus aptes à fournir ladite séquence génétique appropriée à au moins une partie des hybrides cellulaires formés dans le- dit milieu de culture et en ce que l'on recueille les hy- brides cellulaires formés. Selon une première alternative de ce procédé pré- féré, soit les cellules établies, soit les hépatocytes, soit les deux à la fois, avaient été transformés préala- blement à la coculture susdite avec la susdite séquence d'ADN clonée. Le procédé selon l'invention comprend alors une sélection, après la susdite coculture, des susdits hybrides cellulaires formés qui se révèlent aussi pro- ducteurs du peptide immunogène ou de l'antigène codé par la susdite séquence d'ADN clonée. En variante, ce sont les hybrides cellulaires obtenus, bien que non secréteurs, qui sont transformés par la susdite séquence d'ADN, le procédé selon l'invention comprenant alors encore la sélection, après la susdite coculture, de ceux des hybrides cellulai- res formés qui se révèlent aussi être producteurs de l'an- tigène ou du polypeptide immunogène codé par la séquence d'ADN déterminée. Dans ce qui précède, l'hybride non se- créteur pouvait aussi bien être constitué par l'hybride obtenu à partir de cellules primaires et de cellules éta- blies qui n'avaient pas elles-mêmes été transformées au préalable. Cellesci pouvaient cependant l'avoir également été. Dans ce cas, l'hybride utilisé pour la transformation pouvait être l'un de ceux qui n'avait pas été retenu dans le cadre de la sélection des hybrides cellulaires envisa- gée dans la variante précédente. L'expression "cellules primaires" telle qu'utili- sée plus haut désigne toute cellule prélevée sur un mam- mifère et connue par sa capacité -à être le siège de la production de la protéine ou du polypeptide correspondant à cette protéine dont la production est recherchée. Ces cellules primaires sont caractérisées par le fait qu'elles ne se multiplient guère in vitro, que leur prolifération est tout au plus limitée à la production de monocouches, le développement étant ensuite interrompu par "inhibition de contact" ou analogue. Ceci étant, ces cellules peuvent. tout de même, en tout état de cause, être maintenues un certain temps en survie dans des milieux appropriés. Ces cellules primaires sont notamment constituées par des hépatocytes, plus particulièrement des hépatocytes humains, dans le cas préféré qui a été évoqué plus haut. Les cellules primaires utilisées pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention seront toujours choisies en fonction de leur capacité à exprimer dans la nature une séquence génique codant pour la protéine ou le polypeptide recherché. Il peut s'agir de cellules primaires qui spontanément produisent la protéine ou le polypeptide du genre en question, ou encore de cellules primaires dont est connue la capacité de transformation naturelle, par exemple par un virus, d'exprimer le gène en question. A cet égard, et toujours encore dans le cas de l'exemple préféré sus-indiqué, les hépatocytes, notamment humains, sont particulièrement préférés pour l'expression des séquences d'ADN issues du génome du virus de l'hépatite B (DNA-HBV) ou de séquences codant pour les mêmes polypep- tides. En effet, le hépatocytes; notamment humains ou de certaines lignées de chimpanzés, constituent des cibles préférées du virus de l'hépatite B. On pourrait de la même façon utiliser à titre de cellules primaires des cellules d'hypohyse lorsque la protéine dont la synthèse est recherchée est constituée par l'hormone de croissance ou de lignées de lymphocytes lorsque la protéine est constituée par l'interféron lym- phocytaire. L'expression "cellules eucaryotes établies" dési- gne des cellules eucaryotes, plus particulièrement de mammifères qui peuvent être cultivées in vitro et qui sont capables de se multiplier à travers plusieurs générations. Tout type de cellules établies, également dérivées de cellules de mammifères, peut être utilisé. Il s'agit par exemple de cellules tumorales ou non, de mutants de cellules naturelles ou primaires, mais auxquelles la muta- tion a conféré la capacité de multiplication propre aux cellules établies. Ces mutants peuvent être naturels ou induits. Il s'agit encore de toutes catégories de cellules pouvant être maintenue en culture, telles que des lignées cellulaires dépourvues de caracère oncogène, comme par exemple des lignées cellulaires hétéroploides Vero de pri- mates non humains, telles que celles décrites par PETRIC- CIANI, 3.C., KIRSCHSTEIN, R.L., HINES, 3.E., WALLACE, R.E. et MARTIN, D.P. (1973), "3. Natl. Cancer Inst.", 51, 191- 196, ces dernières cellules s'étant révélées non tumori- gènes, même lorsque testées dans des singes soumis à un traitement immunosuppresseur. On peut encore mentionner des lignées cellulaires Hela humaines ou des singes. Le procédé selon l'invention a donc pour objet de réunir dans un même organisme l'environnement génétique le plus favorable à la production de la protéine ou du poly- peptide recherché, et en tous les cas aussi proche que possible de l'environnement génétique naturel, d'une part, et la capacité de multiplication sur plusieurs générations des lignées cellulaires cultivables in vitro, d'autre part. Le milieu de culture, aussi bien que les cellules établies mises en oeuvre, sont choisis de façon à satis- faire aux conditions qui ont été définies plus haut. Le milieu est tel et les cellules établies sont telles que celles-ci ne peuvent pas se développer dans le milieu choisi, sauf à être complémentées par une séquence génétique appropriée, susceptible d'être apportée par les cellules primaires avec lesquelles elles sont cocultivées. Les cellules établies sont par exemple constituées par des cellules présentant une déficience naturelle ou induites au niveau d'un de leurs gènes, cette déficience leur interdisant de se développer dans un milieu détermi- né, cette déficience pouvant cependant être compensée par l'incorporation d'un gène homologue exprimable sous la forme d'une protéine homologue à celle qui aurait été spécifiée par le gène correspondant, s'il n'avait été déficient. Les cellules ayant incorporé le gène homologue sont alors à même de se développer dans le milieu considéré. C'est à cette possibilité de- compensation que se réfère l'expression "complémentation" qui a été utili- sée dans la définition la plus générale indiquée plus haut du procédé selon l'invention. Divers exemples de gènes ou de séquences d'ADN complémentables ont été mentionnés par exemple dans la demande de brevet France n ' 81 01137 dé- posée le 2 mars 1981. A ce type d'ADN appartiennent notam- ment ceux du virus dit "Herpès simplex Virus" du type 1 (HSVI), le gène de la thymidine-kinase (TK), le gène de l'adénine phosphoribosyl-transférase (APRT) et de la dihy- drofolate réductase (DHFR), etc. de l'enzyme xanthine- guanine phosphoribosyl-transférase (XGPRT), ou de l'hypo- xanthine guanine phosphoribosyl transférase (HGPRT). A chacun de ces "ADN de complémentation" corres- pondent des milieux répondant aux conditions sus-indi- quées. Partant par exemple de cellules établies consti- tuées par des cellules de souris du type L dont les gènes codant pour la thymidine-kinase endogène sont affectés par une mutation induite ou provoquée (cellules- L-TK-) ou par des cellules HGPRT-, on aura avantageusement recours au milieu connu sous le nom de "milieu HAT" (contenant de l'hypoxanthine et de l'amino-ptérine en sus de la thymi- dine). Ce milieu est connu pour n'autoriser l'éventuelle synthèse de thymidine phosphate que oar l'intermédiaire d'une voie métabolique dite "voie de sauvetage" (salvatior pathway), cette voie impliquant cependant que soit pré- servée l'intégrité du gène TK des cellules susceptibles de s'y développer. Dans la mesure o le gène ou la séquence nucléique de complémentation leur est apporté par les cellules primaires (par exemple cellules primaires TK+ ou HGPRT+), on conçoit que seuls les hybrides auxquels ont été transmis le gène homologue susdit au cours de la fusion cellulaire peuvent se développer dans le milieu de culture choisi. Les cellules établies non engagées dans la constitution de l'hybride et non complémentées ne peuvent s'y développer, tout comme les cellules primaires elles-mêmes qui, par nature, n'ont qu'une durée de survie limitée. L'ADN de complémentation peut être constitué par une séquence naturelle, appartenant au génome de la cel- lule primaire. Il peut éventuellement avoir été fourni au préalable aux cellules primaires, dans la mesure o celles-ci en étaient initialement dépourvues, notamment par transformation préalable avec la séquence d'ADN appro- priée. Dans un mode de mise en oeuvre équivalent du pro- cédé selon l'invention, on aura recours à l'introduction dans le milieu d'une substance susceptible d'interdire la prolifération, voire de tuer rapidement les deux types de cellules, dans la mesure o à cette substance correspond une deuxième substance, notamment une enzyme, susceptible d'inactiver la première, la seconde étant codée par une séquence d'ADN déterminée, susceptible d'être introduite préalablement dans les cellules primaires. La première substance est par exemple constituée par un antibiotique, tel que celui connu sous la désignation G418, la seconde substance étant alors constituée par un aminoglycoside 3'-phosphotransférase. On pourra encore se référer pour l'illustration de ce principe à la demande de brevet déjà mentionnée plus haut n 81 0437. Comme dans le cas précé- dent, seul survivra l'hybride, qui aura "reçu en héritage" de la cellule primaire la séquence d'ADN codant pour la- dite aminoglycoside 3'-phosphotransférase. La séquence d'ADN clonée, dont l'expression est recherchée, peut être constituée par tout fragment de gène naturel ou toute séquence résultant d'une transcription réverse d'un brin d'acide nucléique monocaténaire, par exemple d'un mARN, par voie enzymatique, voire par tout ADN obtenu par synthèse chimique. Par exemple, cette sé- quence est constituée par un cADN codant pour un poly- peptide identique à celui exprimé par le gène naturel correspondant ou un polypeptide équivalent, l'équivalence résultant notamment de l'analogie immunologique suscep- tible d'être reconnue entre ces deux polypeptides dans des réactions croisées correspondantes avec des anticorps pré- alablement formés contre le polypeptide naturel et le po- lypeptide équivalent. Quelle que soit la séquence d'ADN utilisée, le choix des lignées de cellules primaires sera fait en fonction du gène naturel correspondant. Pour réaliser la transformation ou la transfection des cellules établies ou des cellules primaires, avant hybridation de celles-ci, soit encore des hybrides préala- blement formés, on peut avoir recours à tout vecteur, no- tamment plasmide approprié. Les conditions auxquelles ce vecteur doit satisfaire sont uniquement qu'elles permet- tent la transformation effective et l'expression de la sé- quence d'ADN clonée dans les cellules utilisées. L'homme du métier sera parfaitement à même de choisir les types de plasmide à mettre en oeuvre, compte tenu de la nature des cellules à mettre en oeuvre dans l'hybridation et le cas échéant de la séquence d'ADN à cloner. Lorsque la séquence à cloner ne se trouve pas déjà placée sous le contrôle du promoteur qui permettra l'expression de cette séquence au sein de la cellule transformée, il sera avantageux de la mettre sous le contrôle direct d'un promoteur choisi parmi ceux qui permettent non seulement l'expression, mais l'ex- crétion du polypeptide exprimé dans le milieu de culture. Des promoteurs avantageux seront par exemple ceux sous le contrôle desquels se trouvent les gènes S et les séquences pré-S de DNA-HBV, ou des promoteurs forts tels que ceux obtenus à partir du virus SV40 ou du virus MMTV. Bien entendu, les vecteurs en question devront encore comprendre tous les éléments génétiques suscepti- bles d'assurer la transcription et la traduction de la séquence d'ADN clonée dans une cellule eucaryote, plus particulièrement de mammifère, par exemple les sites de polyadénylation, et de préférence aussi de la terminaison de la transcription de la séquence d'ADN concernée. Ceci étant, il n'est pas nécessaire d'insister sur la consti- tution des plasmides susceptibles d'être utilisés. Un grand nombre de ces plasmides ont été décrits dans la littérature technique. Ils peuvent tous être mis en oeuvre dès lors qu'ils sont reconnus capables de transformer des cellules de mammifère et d'apporter à ces dernières le gène ou la séquence d'ADN clonée susceptible d'être transcrite et exprimée dans ces cellules. Enfin l'hybridation proprement dite des cellules primaires et établies peut être réalisée dans des condi- tions classiques. Elle met en oeuvre de façon en soi con- nue tout agent caipable de fragiliser les parois cellu- laires, au point de rendre la fusion possible. On peut classiquement utiliser le virus de Sendai ou plus avan- tageusement encore des polyalcoylène-polyols (PEG 100O0), notamment le polyéthylène-glycol, par exemple à raison de 500 mg/ml ou à raison d'une solution de 40 % poids/volume de milieu de culture sans sérum du milieu de culture pen- dant 1 minute. D'autres caractéristiques préférées de l'invention apparaîtront encore au cours de la description de modes de mise en oeuvre préférés du procédé selon l'invention dans les exemples qui suivent. EXEMPLE I: Des lignées cellulaires de fibroblastes de souris (cellules L TK-) produisant l'antigène HBs après trans- fection du gène HBs du virus HBV ont été fusionnées avec des hépatocytes de rat en culture primaire. Avec l'une des lignées de départ, il a été possible d'obtenir des clones hybrides dont le taux de production de l'antigène HBs a été multiplié par plus de 20. Les techniques d'obtention des clones hybrides secréteurs et les résultats obtenus sont décrits dans les exemples qui suivent. l ) Oriqine des plasmides contenant les ADN clonés et uti- lisés pour des ADN transfections. Le plasmide pACF10 est dérivé du plasmide pAC2 dé- crit par POURCEL et al (1982), J. of Virology, 42, 100, portant le gène codant pour la région pré-S et S du virus HBY. Le plasmide pACFIO se distingue de pAC2 par l'intro- duction dans le site HindIII de ce plasmide du fragment BamHI-EcoRI (39181656) de l'ADN du virus polyome codant pour une partie des protéines précoces et par la délétion du gène codant pour la thymidine kinase. Une souche de E. coli K12 transformée par pACF10 a été déposée à la C.N.C.M. le 5 mars 1984 sous le n 1-284. ADN du plasmide pNY4. Ce plasmide porte le frag- ment 8glII de DNA-HBV contenant la séquence d'ADN codant pour la région pré-S et S placée derrière le fragment Hae du virus polyome (fragment portant l'origine de réplica- tion du virus polyome et le promoteur précoce), le frag- ment de DNA-HBV ayant été inséré par génie génétique dans le site HaeII dudit promoteur précoce. - ADN du plasmide pW. Ce plasmide porte le gène co- dant pour l'aminoglycoside-3'-phosphotransférase conférant la résistance à l'aminoglycoside G418 aux cellules l'ex- primant (Colbère-Garapin et Garapin, 1981 et brevet no 81 04137). 2 ) Obtention des ligqnées cellulaires de souris produisant la protéine HBs, après transfection puis sélection des clones producteurs. Des cellules LMTK- (clone 1D) (cellules de souris dérivées du clone L929 déficientes en thymidine kinase, poussant dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco, supplémenté par 10 % de sérum de veau et déposées le 5 mars 1984 à la Collection Nationale des Cultures de Micro-organismes de l'INSTITUT PASTEUR de Paris (C.N.C.M.) sous le n 1-283) ont été cotransfectées selon la tech- nique décrite par GRAHAM, F.L. et VAN DER EB, A.J. (1973), Virology 52, p. 456, par de l'ADN de deux vecteurs, l'un portant la région codante pour la protéine HBs (plasmide pACF10 ou plasmide pNY4 sous-type ayw), l'autre (plasmide pW) portant le gène de l'aminoglycoside-3'-phosphotrans- férase (APH 3'). Les cellules transfectées exprimant l'enzyme APH 3' sont sélectionnées en présence de 400 microG/ml d'aminoglycoside G418, selon la méthode de Colbère-Garapin décrite dans l'article mentionné plus haut. Les clones issus de cette sélection sont alors tes- tés pour la production de la protéine HBs. 5.105 cellules L TK- ont été cotransfectées par 10 microgrammes du plas- mide pACF10 ou pNY4 et par 2 microgrammes d'ADN du plas- mide pW. Quatre jours après la transfection, le milieu sélectif était appliqué. Trois lignées cellulaires (L1, L2, L3), obtenues après cotransfection des cellules LMTK-, et dont avait été reconnue la capacité à produire un antigène correspondant à l'antigène HBsAg de l'enveloppé du virus de l'hépatite B, ont été prélevées au hasard et utilisées pour les essais de fusion avec les hépatocytes de rat (H A). La présence d'AgHBs fut détectée à l'aide des tests radio- immunologiques AUS-RIAII (Abbott). La quantité d'AgHBs excrétée dans le milieu fut déterminée par rapport à une courbe étalon établie par dilution d'un standard d'AgHBs *de L'INSTITUT PASTEUR PRODUCTION. Ll et L3 étaient dérivées de cellules LTK- trans- fectées par l'ADN du plasmide PACF10 et L2 de cellules transfectées par l'ADN du plasmide pNY4. La lignée Li a été déposée le 5.03.84 à la C.N.C.M. sous le na 1-281. Les niveaux de production de l'antigène HBs dans ces trois lignées étaient les suivants: L1 50-75 ng L2 60 ng par 106 cellules et par 24 heures L3 68 ng. 30) Mise en culture des hépatocytes de rat en culture primaire. Des hépatocytes de rat Wistar ont été isolés après perfusion du foie par la collagénase, selon la méthode de Seglen (1973), avec quelques modifications, GUGUEN- GUILLOUZO et al, 1980, In vitro 16, 3. F. HOUSSAIS et al, 1983, C.R. Acad. Sci. Paris, tome 297, série III, 497-500. 4 ) Hybridation des cellules L (HBs+) avec les hépatocytes en culture primaire. Les hybridations ont été effectuées sur les hépa- tocytes après leur attachement dans les flacons Falcon, 6 heures ou 20 heures après la mise en culture. 106 cellules L ont été ajoutées dans lescultures d'hépatocytes (2.5.106 à 3.106 cellules). Le processus de fusion est in- duit par un court contact avec le polyéthylène glycol, selon les modalités décrites par R.L. DAVIDSON et al (1976), Somatic Cell Genetics Vol. 2, n 2, 165-176. 24 à 28 heures plus tard, les cultures sont passées dans le milieu sélectif HAT (Littlefield 1964). Dans ces condi- tions, les cellules parentes de souris (cellules L TK-) sont éliminées. Il en est de même spontanément des hépato- cytes fragilisés par la mise en culture et le contact avec le polyéthylène glycol. Les clones hybrides viables appa- raissant dans le milieu de culture, sont isolés, mis en culture et testés quant à leur capacité de production de l'antigène HBs. Des niveaux de production importants de l'antigène HBs (détecté et dosé comme indiqué ci-dessus) dans les clones hybrides se sont manifestés plus particulièrement dans les hybrides LI x HA. a) Sur 29 clones isolés: - 2 ont été négatifs, c'est-à-dire n'ont pas produit d'HBsAg détectable, - 27 ont eu une production supérieure aux cellules L1, selon la répartition suivante: - 11 ont eu une production multipliée par 2 à 5 fois, - 5" " " " " " 6 à 10 fois, - 8 " " " " " " 10 à 20 fois, - 2 " " " " " " 20 à 40 fois, - 1 " " " " " " plus de 50 fois. b) Sur 4 cultures comprenant les ensembles de clones non isolés, on a observé: - pour l'une une production x 2, - pour les 3 autres cultures, une production multipliée par un facteur compris entre 10 et 30. Les hybrides obtenus à partir de L2 et L3, c'est- à-dire L2 x HA (8 clones isolés) et L3 x HA (12 clones isolés) n'ont pas produit d'HBs détectable. EXEMPLE II: On réalise une hybridation préalable entre les mêmes hépatocytes que ceux indiqués dans l'exemple I et ?0 des lignées cellulaires d'hépatome BWTG3 (HGPRT-) dans le milieu de HAT. L'hybridation est réalisée dans les mêmes conditions que celles décrites dans l'exemple I. Les hy- brides cellulaires qui se sont développés dans ce milieu sont recueillis. La souche d'hybrides formée, utilisée dans la transformation complémentaire qui suit a été déposée à la C.N.C.M. le 5 mars 1984 sous le n 1-282. Dans une deuxième étape, ladite lignée cellulaire hybride est alors cotransformée avec le plasmide pNY4 et le plasmide pW dans les conditions décrites par GARAPIN et al déjà mentionnées, dans un milieu de culturecontenant l'antibiotique G418. On recueille les cellules qui se sont développées dans ce milieu et qui, au surplus, témoignent d'une pro- duction de HBs révélable par le test immunologique mis en oeuvre dans l'exemple précédent. On recueille ainsi des souches dont la production de HBs est du même ordre de grandeur que ceux indiqués dans l'exemple I. En particulier on a isolé dans une première expé- rience 4 clones qui secrètent (pour 106 cellules par 24 heures) respectivement: 800; 117; 20 et 625 ng de HBsAg et, dans une seconde expérience (toujours pour 106 cel- lules par 24 heures) respectivement: 1781; 365; 548; 2810; 773; 863 ng de HBsAg. Il est significatif que des essais de cotransfor- mation réalisés dans des conditions semblables non pas sur l'hybride, mais sur la lignée cellulaire d'hépatome initiale n'ont pas conduit à des lignées secrétant des quantités plus que négligeables d'HBs. Le plasmide pNY4 a été déposé à la C.N.C.M. le mars 1984 sous le no 1-285 (dans E. coli K12). On remarquera certes, au vu de l'exemple I, que certains clones d'hybrides se sont révélés ne pas exprimer la séquence d'ADN codant pour l'antigène HBs. Mais on remarquera en même temps que sur 3 clones prélevés au hasard, l'un d'entre eux s'est révélé secréter des pro- portions importantes d'HBs. Il est tout -à fait naturel dans cette technique que l'on puisse, au hasard des essais, isoler un certain nombre de clone.s hybrides non opérationnels. L'exemple I montre cependant que le nombre d'essais de cultures à réaliser pour en sélectionner certains qui sont actifs, est suffisamment réduit pour être statistiquement reproductibles. Dans les exemples qui précèdent, la séquence d'ADN déterminée était constituée pour l'essentiel par le gène S de DNA-HBV. Il va de soi que cette séquence aurait pu être remplacée par d'autres séquences, par exemple le gène codant pour l'antigène HBc ou pour tout autre gène ou séquence d'acide nucléique codant pour le même antigène.On remarquera aussi que la même méthode peut être étendue à l'utilisation de toute cellule primaire autorisant des expressions transitoires de séquences d'ADN déterminées ayant servi à leur transformation, à l'étude de l'expres- sion de tout gène cloné postérieurement à l'hybridation des cellules de mammifère le contenant, avec le type cellulaire normal primaire différencié correspondant. D'une façon générale, la méthode selon l'invention peut être appliquée à l'obtention de tous clones hybrides hautement producteurs d'une protéine susceptible d'applications médicales ou industrielles, ou encore pour étudier les mécanismes qui contrôlent les gènes dans les cellules. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus particulièrement envisagés; elle en em- brasse, au contraire, toutes les variantes. REVENDICATIONS 1 - Procédé de fabrication d'un hybride cellu- laire exprimant ou susceptible d'être rendu capable d'exprimer une séquence d'ADN clonée, caractérisé: - en ce que l'on réalise une coculture, dans des condi- tions propres à permettre leur hybridation, d'une part, de cellules eucaryotes établies, dans lesquelles la susdite séquence d'ADN clonée est exprimable ou exprimée et, d'autre part, de cellules primaires naturellement favorables à l'expression de gènes naturels codant pour une protéine constituée par le polypeptide codé par la susdite séquence d'ADN clonée ou contenant dans sa propre structure une séquence polypeptidique identique ou analogue à celle de ce polypeptide, cette coculture étant réalisée dans un milieu qui n'autorise pas le développement desdites cellules établies, lorsqu'elles ne sont pas complémentées par une séquence génétique appropriée, - en ce que les cellules primaires mises en jeu dans l'hybridation cellulaire sont aptes ou ont été rendues aptes au préalable à fournir ladite séquence génétique appropriée à au moins une partie des hybrides cellu- laires formées dans ledit milieu de culture et en ce que l'on recueille les hybrides cellulaires formés. 2 - Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que, soit les cellules établies, soit les cellules primaires, soit les deux à la fois, avaient été transformées, préalablement à la coculture susdite, avec la séquence d'ADN clonée susdite et en ce que l'on sélectionne, après ladite coculture, ceux des hybrides cellulaires formés, qui se révèlent ainsi être produc- teurs du polypeptide codé par le susdit ADN clone. 3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les hybrides cellulaires obtenus à l'issue de la susdite coculture sont eux-mêmes trans- formés avec ladite séquence d'ADN clonée et en ce que l'on sélectionne, après ladite coculture, ceux des hybrides cellulaires formés, qui se révèlent aussi être producteurs du polypeptide codé par le susdit ADN cloné. 4 - Procédé de fabrication d'un hybride cellulaire exprimant ou susceptible d'être rendu capable d'exprimer une séquence d'ADN clonée contenant tout ou partie d'un gène déterminé contenu dans le génome du virus de l'hépatite B ou codant pour un peptide immunogène ayant des propriétés immunologiques équivalentes à celles du polypeptide codé-par ce gène, caractérisé: - en ce que l'on réalise une coculture, dans des condi- tions propres à permettre leur hybridation, d'une part de cellules eucaryotes établies dans lesquelles la susdite séquence d'ADN clonée est exprimable ou exprimée et, d'autre part, d'hépatocytes, de préférence humains, cette coeulture étant réalisée dans un milieu qui n'autorise pas le développement desdites cellules établies, lorsque celles-ci ne sont pas complémentées par une séquence génétique appropriée, - en ce que les hépatocytes mis en jeu dans l'hybrida- tion cellulaire, sont aptes ou ont au préalable été rendus aptes à fournir ladite séquence génétique appro- priée à au moins une partie des hybrides cellulaires formés dans ledit milieu de culture et en ce que l'on recueille les hybrides cellulaires formés. - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que, soit les cellules établies, soit les hépatocytes, soit les deux à la fois avaient été transformées, préalablement à la coculture susdite, avec la susdite séquence d'ADN clonée et en ce que l'on sélectionne, après la susdite coculture, ceux des hybrides cellulaires formés qui se révèlent aussi être producteurs de l'antigène codé par la susdite séquence d'ADN clonée. 6 - Procédé selon la revendication 4, caracté- risé en ce que les hybrides cellulaires obtenus après la co-culture sont eux-mêmes transformés avec la susdite séquence d'ADN clonée et en ce que l'on sélectionne, après la susdite coculture, ceux des hybrides cellulaires formés qui se révèlent aussi être producteurs de l'antigène codé par la susdite séquence d'ADN clonée. - 7 - Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 6, caractérisé en ce que les cellules euca- ryotes établies comportent une déficience au niveau de l'un dé leurs gènes et. que le milieu de culture est un milieu sélectif dans lequel lesdites cellules établies ne sont pas capables de se développer en raison,de cette déficience. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractéri- sé en ce que les cellules eucaryotes sont des cellules de souris L TK- ou HGPRT- et en ce que le milieu de cul- ture est un milieu sélectif HAT. 9 - Procédé selon la revendication 7, caractéri- sé en ce que les cellules eucaryotes établies sont cons- tituées par des lignées d'hépatomes HGPRT- et en ce que le milieu de culture est constitué par un milieu sélec- tif HAT. - Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 6, caractérisé' en ce que le milieu de culture contient un antibiotique, notamment du type aminoglycoside, capable de pénétrer dans des cellules eucaryotes, et en ce que les cellules primaires, notamment les hépatocytes, ont au préalable été transformées avec une séquence d'ADN codant pour une enzyme capable d'inactiver l'antibiotique. il - Procédé selon la revendication 10, caracté- risé en ce que l'antibiotique est constitué par le G418 et en ce que la séquence d'ADN code pour une aminoglycoside 3'-phosphotransférase. 12 - Procédé selon la revendication 4 prise seule ou en combinaison avec l'une quelconque des revendications 5 à 11, caractérisé en ce que la susdite séquence d'ADN clonée contient au moins une partie du gène 5 du virus de l'hépatite virale B et, de préférence aussi, le gène correspondant à la région pré-S du génome du virus de l'hépatite virale B. 13 - Cellules hybrides transformées ou transfor- mables par une séquence d'ADN clonée, caractérisées en ce qu'elles contiennent, d'une part, une partie au moins du patrimoine génétique d'une lignée de cellules primaires naturellement favorables à l'expression de gènes naturels codant pour une protéine constituée par le polypeptide codé par la susdite séquence d'ADN clonée ou contenant dans sa structure une séquence polypepti- dique identique ou analogue à celle de ce polypeptide et, d'autre part, un marqueur génétique leur permettant de pousser dans un milieu sélectif ou contenant un principe actif normalement léthal pour les cellules dont l'hybride est issu, mais inactivable par le polypeptide exprimé par ledit marqueur génétique. 14 - Cellules hybrides selon la revendication 13, caractérisées en ce qu'elles contiennent une partie du patrimoine génétique des hépatocytes primaires et en ce qu'elles sont capables ou peuvent être rendues ca- pables de secréter un polypeptide immunogène présentant des propriétés vaccinantes à l'égard de l'hépatite vi- rale B, avec un taux de production de polypeptide immu- nogène d'au moins 150 ng par 106 cellules et par 24 heures.