FR 2563431 A1 19851031 FR 8406559 A 19840426 1i 2 52563431 La présente invention concerne de nouvelles compositions cosmétiques renfermant des extraits lysés d'Hafniâ. L'invention a pour objet de nouvelles compositions cosmétiques pour les soins de la peau, caractérisées en ce qu'elles renferment des glycoprotéines extraites de corps microbiens lysés de l'expèce ou souche Hafnia préparés selon les étapes successives suivantes a) mise en culture d'une souche microbienne d'Hafnia; b) lyse après complet développement des corps microbiens; c) délipidation et dépigmentation du lysat obtenu par traitement avec un ou plusieurs solvants; d) mise en solution du produit brut obtenu précédemment, centrifugation et ultrafiltration de la solution obtenue. Ce procédé de lyse de la souche bactérienne d'Hafnia et les glycoprotéines ainsi obtenues ont fait l'objet du brevet français n 2378855. La souche d'Hafnia utilisée préférentiellement est celle déposée à l'Institut Pasteur à Paris sous le n 5731. Dans ce brevet, les glycoprotéines obtenues après lyse des corps Hafnia subissent une ultrafiltration avec une menbrane ne retenant que les glycoprotéines ayant un poids moléculaire égal ou supérieur à 300 000. Ce brevet décrit aussi la très bonne tolérance et l'application comme médicaments anti-inflammatoires et immunostimulants des glycoprotéines isolées d'Hafnia ayant un poids moléculaire apparent égal ou supérieur à 300 000. Cependant jamais encore n'avait été décrite l'utilisation en cosmétologie des propriétés topiques réelles de ces extraits bactériens. En effet, il vient d'être démontré que ces extraits bactériens possèdent un remarquable pouvoir anti-irritant cutané et qu'ils sont doués d'un effet stimulant sur la croissance cellulaire. Par ailleurs, les glycoprotéines extraites de corps lysés d'Hafnia ont un pouvoir protecteur contre les agressions extérieures: soleil, chaleur, froid, détergents, pollution... Ces différentes propriétés illustrées plus loin dans la partie expérimentale, peuvent être avantageusement mises à profit en cosmétologie. Les compositions de l'invention peuvent notamment être utilisées pour apaiser les peaux irritées, qu'elle qu'en soit la cause. Par exemple, les compositions de l'invention peuvent être appliquées pour apaiser les peaux à tendance acnéique. En particulier, appliquées le matin, elles calment les sensations de picotement et de brûlures does aux traitements médicaux locaux de l'acné, 2 2563431 appliqués le soir, qui sont souvent très irritants. Elles peuvent aussi être utilisées pour calmer les rougeurs, érythèmes solaires. Comme il a déjà été dit plus-haut, elles protègent aussi efficacement la peau contre les agressions extérieures et sont donc avantageusement utilisées pour protéger les peaux fragilisées à problèmes (couperosée, rosacée...). Par ailleurs, les propriétés régénératrices cutanées par stimulation de la croissance cellulaire des compositions selon l'invention leur confèrent une efficacité dans la lutte contre le vieillissement de la peau. Les compositions de l'invention renferment des glycoprotéines obtenues par lyse des corps d'Hafnia ayant subi ou non une ultrafiltration finale. L'ultrafiltration finale décrite dans le brevet français N 2378855 est une dialfiltration utilisant une membrane poreuse présentant un seuil de rétention de substances dont le poids moléculaire est égal ou supérieur à 300 000. En fait, la membrane utilisée peut présenter un autre seuil de rétention, le choix de celui-ci dépendant des substances que l'on veut séparer. L'invention concerne notamment des compositions cosmétiques, caractérisées en ce qu'elles renferment des glycoprotéines extraites de corps microbiens lysés d'Hafnia n'ayant pas subi d'ultrafiltration finale. Ces glycoprotéines correspondent aux produits intermédiaires obtenus à la fin du stade C des exemples 1 et 2 du brevet français n 2378855. Les caractéristiques physico-chimiques de ces glycoprotéines sont données plus loin à l'exemple 1 de la partie expérimentale. Dans les compositions de l'invention, l'extrait d'Hafnia peut être utilisé sous forme pulvérulente ou sous forme de solution aqueuse. L'invention concerne notamment des compositions cosmétiques, caractérisées en ce qu'elles renferment 5.10-5% à 1% en poids de glycoprotéines extraites de corps microbiens lysés d'Hafnia. Les compositions de l'invention peuvent renfermer en plus des extraits lysés d'Hafnia, d'autres composés actifs ayant des propriétés cutanées particulières. Ainsi, les compositions de l'invention peuvent contenir également l'acétate d'oléyle. Ce produit a des propriétés anti-lipasique et prévient directement la formation de comédons et de points noir. Les compositions ainsi obtenues renferment deux constituants qui par leur action combinée constituent un produit bien adapté aux peaux à tendance acnéique. Les compositions de l'invention peuvent aussi renfermer un compose 3 2563431 favorisant la cicatrisation des lésions de l'acné, tel que par exeiple, un extrait de Centella Asiatica et plus particulièrement un extrait glycolique de Centella Asiatica. D'autres substances telles que l'huile d'onagre, les acides aminés peuvent aussi y être incorporés. L'invention a donc plus particulièrement pour objet des compositions, caractérisées en ce qu'elles renferment un ou plusieurs des produits suivants: acétate d'oléyle, extrait glycolique de Centella d'Asiatica, huile d'onagre, acides aminés. Les compositions cosmétiques selon l'invention peuvent se présenter sous toutes les formes utilisées en cosmétologie: crème ou gel en pots ou en tubes, lait, huile, ou lotion en flacons de verre ou de matière plastique et éventuellement en flacon-doseur, ampoule, aérosol. L'invention concerne donc des compositions cosmétiques, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous forme de crème, gel, lait, lotion ou huile pour la peau. Pour chaque forme, on a recours à des excipients appropriés. Ces excipients doivent avoir toutes les qualités habituellement demandées. Ils doivent être doués d'une grande affinité pour la peau, être parfaitement bien tolérés, stables, présenter une consistance adéquate, permettant une utilisation facile et agréable. A titre d'exemples d'excipients, on peut citer les dérivés palmitates, stéarates, les triglycérides d'acides gras, la lanoline, la glycérine, le propylène glycol (crème), l'alcool éthylique (lotion), les huiles végétales, animales ou minérales, les cires, les mouillants, les épaississants, les stabilisants, les émulsionnants couramment utilisés. Eventuellement, les compositions selon l'invention peuvent contenir des filtres, des écrans aux radiations solaires, des extraits vitaminés, des parfums, des conservateurs, des anti-oxydants, des colorants. Les différentes formes cosmétiques mentionnées ci-dessus peuvent être obtenues selon les méthodes usuelles utilisées dans ce domaine. Les exemples donnés ci-dessous illustrent l'invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE 1 L'extrait bactérien d'Hafnia (souche de l'Institut Pasteur N 5731) obtenu à la fin du stade C des exemples 1 et 2 du brevet français N 2378855 présente les caractéristiques suivantes: a) Aspect: poudre beige clair hydrosoluble. b) Analyse élémentaire: Carbone 31,6 % + 3 4 2563431 hydrogène 4,9 % + 0,6 azote 6,6 % + 0,4 c) Nature et proportion des divers constituants. Les résultats sont exprimés en moyenne + écart type *): protéines: 26,4 % (t_ 5,2*) glucides: hexoses neutres 18,3 % (+ 3,7*) acides uroniques 0,6 % (+ 0,9*) osamines 8,7 % (+ 2,4*) acides ribonucléiques 17,4 % (+ 2,35*) acides désoxyribonucléiques 5,4 % (+ 2,1*) humidité 8 % d) Spectre ultra violet Le spectre ultraviolet tracé entre 190 nm et 350 nm à 125 mcg/ml est classique d'un produit contenant des protéines (Do 0,73 + 0,2) et des acides nucléiques (1,4 +t 0,4). e) Chromatographie de gel filtration La chromatographie de gel filtration sur Sephacryl S 300 dans un tampon carbonate d'ammonium 0,1 M révèle la présence de 3 familles moléculaires: - 1 famille de haut poids moléculaire> 300 000 de nature glycoprotéique, - 2 familles de poids moléculaires voisins de 12 000 de nature acides nucléiques. EXEMPLE 2: crème pour le visage. - extrait "Hafnia"........................................ 0,5 g - acetate d'oléyle.................................. 2,0 g - alcoyle phosphate de diéthanolamine...................... 2,0 g -palmitate d'éthyl hexyle................................. 8,0 g - lanoli ne hydrogénée......................................5,0 9g - triglycérides d'acides gras.. ............................ 4,0 g - stearate de sorbitan. .................................. 1,0 g - polymère carboxyvinylique......DTD: .......................... 0,4 g conservateurs..........................DTD: .................. 0,4 g composition aromatique.........................DTD: ......... 0,4 g - eau purifiée q.s.p. 100 g..DTD: EXEMPLE 3: gel pour le visage. - extrait "Hafnia"........................... 0,5 g - extrait glycolique Centella Asiatica..................... 5,0 g - propylène glycol.. ........ ............................ 5,0 g - polymère carboxyvinylique............DTD: .................... 0,8 g conservateurs. ................. 0,35 g - composition aromatique................ 0,1 g..DTD: 5......2563431 - eau purifiée q.s.p. 100 g EXEMPLE 4: crème pour le corps. - extrait "Hafnia".................................. 0,2 g - stéarate de glycérol.............................. 4,0 g - palmitate de sorbitan...... ..................... 6,0 g perhydrosqualene............................DTD: ...... 5,0 g - palmitate d'isopropyle............................ 7,0 g - triglycérides d'acides gras....................... 9,0 g - glycérine......DTD: ................................... 5,0 g conservateurs.................DTD: .................... 0,35 g composition aromatique......................DTD: ...... 1,0 g - eau purifiée q.s.p................................100 g..DTD: EXEMPLE 5: lotion tonique pour le visage. - extrait "Hafnia".................................. 0,05 g - propylène glycol.................................. 5,0 g - conservateurs............ ....................... 0,3 g - composition aromatique....................DTD: ........ 0,1 g - alcool éthylique.................................. 10, 0 g - eau purifiée q.s.p................................ 100 ml..DTD: EXEMPLE 6 lait solaire. - extrait "Hafnia".................................. 0,1 g - filtres solaires.................................. 5,0 g - huile de vaseline...... ......................... 10,0 g - palmitate d'isopropyle.................DTD: ........... 9,0 g - huile de silicone................................. 2,5 g - éther cétylique P.O.E............................. 2,0 g - stéarate de sorbitan.............................. 1,0 g - conservateurs....DTD: ................................. 0,35 g - composition aromatique.........DTD: ................... 0,5 g - eau purifiée q.s.p............................DTD: .... 100 ml..DTD: ETUDE PHARMACOLOGIQUE a) Tolérance cutanée Six lapins albinos de souche RIVER ont été tondus au niveau du dos sur une surface d'environ 14 X 14 cm. De chaque c6té de l'axe vertébral sont pratiquées trois incisions parallèles par scarification. On dépose ensuite sur la peau (zone scarifiée et non scarifiée), du côté droit, 0,5 ml d'une crème dosée à 0,05 % d'extrait lysé d'Hafnia décrit à l'exemple 1, le côté gauche servant de zone témoin. On apprécie l'irritation cutanée respectivement 24 et 72 heures après l'application du produit. 6 2563431 Les observations sont faites sur les deux zones scarifiées et non scarifiées, selon l'échelle numérique, d'après les indications du Journal Officiel du 21 Février 1982. Erythème et formation d'escarres: - pas d'érythème........................ .................... 0 - léger érythème, à peine visible..................DTD: ............ 1 - érythème bien visible....................................DTD: ... 2 - érythème modéré à important.................................. 3 - érythème grave (rouge pourpre), avec formation de légères escarres, lésions profondes......................... 4 Formation d'oedème: - pas d'oedème................................................. 0 - très léger oedéme, à peine visible........................... 1 - léger oedéme (contours bien définis, gonflement apparent).... 2 - oedème moyen (épaisseur environ 1 mm)........................ 3 - oedéme grave (épaisseur supérieure à i mm et surface supérieure à celle du carré)........DTD: ........................... 4 La détermination de l'indice d'irritation primaire est calculée en additionnant les chiffres obtenus pour l'érythème et pour l'oedème, après 24 heures et 72 heures, d'une part sur les six zones non scarifiées,..DTD: d'autre part sur les six zones scarifiées. Ensuite, il faut calculer la moyenne en divisant le total par 24. Cette moyenne représente l'indice d'irritation primaire cutanée (IP): - non irritant IP CONCLUSION L'ensemble de ces résultats permet de constater, qu'en utilisant la cotation officielle, la crème dosée à 0,05 % d'extrait lysé d'Hafnia possède un indice d'irritation cutanée IP b) Action sur la croissance cellulaire des fibroblastes en culture On teste une solution contenant des glycoprotéines d'Hafnia de l'exemple 1 à la dose de 5.10-6 g/ml sur une culture de fibroblastes de prépuce d'embryon humain. Le milieu de culture utilisé est un milieu contenant divers acides aminés, des vitamines, des sels inorganiques, du glucose, du sérum de veau foetal, des antibiotiques (Pénicilline, Streptomycine, Fungizone, Kanamycine), de la biotine. Le milieu est tamponné par du bicarbonate de sodium et le pH est 7 2563431 ajusté à 7,2. Les cultures sont ensemencées à la concentration de 40 X 103 cellules par ml en flacons pour culture de tissu de différentes surfaces. Les cultures sont placées dans une étuve thermostatée à 37 C dont l'atmosphère est régulée en C02 (5 %). 25634-31 Pour effectuer une numération et une évaluation de la croissance cellulaire, les fibroblastes doivent être détachés du support de culture par action d'une solution de trypsine. La numération est effectuée au microscope à contraste de phase. Les cellules vivantes apparaissent réfringentes. La figure I représente l'ensemble des expériences effectuées avec la dose de 5 X 10-6 g/ml en comparaison avec les cultures témoins. Dans toutes les expériences, l'adjonction de la solution à base d'extraits lysés d'Hafnia stimule la croissance cellulaire. c) Recherche d'un effet sur l'érythème cutané chez le cobaye exposé aux radiations ultra-violettes On utilise 20 cobayes mâles de souche HARTLEY, pesant entre 350 et 400 grammes dont la région costale a été rasée et épilée sur une surface de 6 cm X 3 cm. L'érythème solaire est réalisé par irradiation d'U.V. au moyen d'une lampe à usage thérapeutique, à tube à quartz. Pour empêcher l'irradiation U.V. de tout l'animal, celui-ci est habillé d'un corset de tissu épais présentant quatre perforations circulaires de 8 mm de diamètre chacune (-spots d'irridiation). On applique au niveau de 2 spots (les 2 autres spots servant de témoins) immédiatement après l'exposition, 0,25 ml d'une crème contenant l'extrait lysé d'Hafnia décrit à l'exemple 1. Les concentrations étudiées sont 0,01 % et 0,05 %. Deux heures après l'irradiation, on note l'intensité de l'érythème obtenu au niveau des spots, selon une échelle de O à 3. Cotation 0...................... pas d'érythème 1....................... spot Juste discernable 2.;. ............. érythème plus accusé 3.......... .... érythème très visible On établit la moyenne du degré d'érythème pour chaque groupe et on l'exprime ensuite en pourcentage de protection par rapport aux spots témoins. Moyenne de la cotation Moyenne de la cotation des témoins - des traités X 100 Moyenne de la cotation des témoins Résultats: Les pourcentages d'activité inhibitrice sur le développement..DTD: 9 2563431 de l'érythème cutané expérimental sont les suivants: - crème dosée à 0,01 % d'extrait lysé d'Hafnia............ 32,2 % - crème dosée à 0,05 % d'extrait lysé d'Hafnia............ 44 % d) Action sur la dénaturation des protéines (sérum albumine) par la chaleur: test de Mizuschima Principe du test de Mizuschima Les substances antiinflammatoires protègent les protéines (sérum albumine) de la dénaturation par la chaleur en milieu tamponné acide. Résultats du dosage néphélométrique Produit Densité optique à 650 mm DO moyenne ler essai 2è essai 3è essai Témoin avec sérum albumine bovine à 0, 71 0,66 0,69 0,68Z 0,1 % Extrait lysé d'Hafnia de 0,415- 0,40 0,48 0,435 l'exemple 1:lmg/ml 2mg/ml 0,295 0,28 0,32 0,30 2,Smg/ml 0,235 0,20 0,225 0,22 _ 3mg/ml 0,20 0,19 0,21 0,20 Smg/ml 0,02 0,03 0,025 0,025- 10mg/ml 0,01 0,015 0,015 0,01 L'extrait à base de glycoprotéines lysées d'Hafnia exerce un effet protecteur contre la dénaturation de la sérum albumine par la chaleur. 10. 2 5 2563431 REVENDICATIONS 1) Compositions cosmétiques pour les soins de la peau, caractérisées en ce qu'elles renferment des glycoprotéines extraites de corps microbiens lysés de l'expèce ou souche Hafnia préparés selon les étapes successives suivantes: a) mise en culture d'une souche microbienne d'Hafnia; b) lyse après complet développement des corps microbiens; c) délipidation et dépigmentation du lysat obtenu par traitement avec un ou plusieurs solvants; d) mise en solution du produit brut obtenu précédemment, centrifugation et ultrafiltration de la solution obtenue. 2) Compositions selon la revendication 1 caractérisées en ce qu'elles renferment des glycoprotéines extraites de crops microbiens lysés d'Hafnia n'ayant pas subi d'ultrafiltration finale. 3) Compositions selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce qu'elles renferment 5.10-5 % à 1 % en poids de glycoprotéines extraites de corps microbiens lysés d'Hafnia. 4) Compositions selon les revendications i à 3, caractérisées en ce qu'elles renferment un ou plusieurs des produits suivants: acétate d'oléyle, extrait glycolique de Centella Asiatica, huile d'onagre, acides aminés. ) Compositions selon les revendications i à 4, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous forme de crème, gel, lait, lotion ou huile pour la peau.