FR 2564468 A2 19851122 FR 8407589 A 19840516 -- i -- "Nouveaux oligosaccharides, leur préparation par voie de synthèse et leurs applications biologiques" L'invention a pour objet de nouveaux oligosaccharides, leur préparation par voie de synthèse et leurs applications biologiques. Il s'agit d'un développement de l'invention faisant l'objet de la demande de brevet principal No 82 18003 du 27 octobre 1982. Dans cette demande, de brevet, on a décrit un procédé d'obtention par syn- thèse organique d'oligosaccharides possédant la struc- ture de fragments de chaînes de mucopolysaccharides acides naturels, et de dérivés de ces oligosaccharides. On rappelle que l'expression "mucopolysaccharide acide" désigne des dérivés également courramment appelés glycosaminoglycuronoglycanes. Ces dérivés sont formés d'oligosaccharides et de polysaccharides constituant plus spécialement les chaînes de dérivés biologiquement actifs tels que ceux du type héparine ou héparane-sulfate. Ces chaînes sont essentiellement formées de motifs alternés sucre aminéacide uronique, ou inversement. Dans ces motifs, le sucre aminé a présente plus spécialement une structure D-glucosamine (ou a) et l'acide uronique,une structure acide-D-glucuroniqueÀ (ou b) ou acide L-iduro- nique (ou c). La grande souplesse du procédé décrit dans la demande de brevet principal permet de préparer l'enchaî- nement des motifs souhaité, selon la stéréochimie désirée et avec des substitutions déterminées. Il est ainsi possi- ble d'obtenir notamment des oligosaccharides constituant des analogues de structure de fragments de chaînes d' héparine. - 2 - Ces fragments peuvent comprendre avantageusement l'enchaînement octasaccharidique ABCDEFGH,obtenu jusqu'alors par la Demanderesse par dépolymérisation enzymatique de trict1re T COO OR CO - OR OR O O. cCl oso0 NlisO OH 11i-lAc OH N5iiso 003' NHSO0 3 3 3 *3 3 A B C D E F H Tues oligosaccharides obtenus par voie de syn-- thèse peuvent également comprendre seulement une partie de cet enchaînement o être constitués par cet enchaînement. Les lettres A à H indiquées sous la formule, désignent, telles qu'utilisées dans la description, un type de structure, les substitutions pouvant être identiques ou différentes de celles de la formule. Comme décrit dans cette demande de brevet principal, les oligosaccharides élaborés constituent des réactifs biologiques et des substances de référence par- ticulièrement intéressants. Ils sont, de plus, dotés de propriétés pharmacologiques leur conférant une utilité de grande importance en tant que principe actif de médicaments. Certains de ces oligosaccharides se sont révélés plus spécialement actifs dans le domaine de la coagulation sanguine. -3- Ainsi, si une activité anti-Xa (mesurée par le titre Yin-Wessler) a pu être décelée chez un tri- saccharide de structure DEF, c'est avec un pentasaccharide de structure DEFGH qu'il a été possible de mettre en évidence une affinité très élevée pour l'antithrombine III ou ATIII et une activité anti-Xa (Yin-Wezîlnr? t - clivée d'v u moins 2000 lnitts Yin-Wcsser/mn. ie o-luit rnond à la formule suivante: osa; Cao- osOSO /o OSa ? o)o CH5 Co OH5 0503\ HO X3 HOH OH NHSO- OH NH50 OSO; NHSO On a pu mettre en évidence une activité anti-Xa d'au moins 2000 unités Yin-Wessler/mg. En poursuivant leurs travaux, les inventeurs ont à présent constaté d'une manière surprenante, une activité suffisamment élevée pour permettre une exploi- tation en tant que principe actif de médicament antithrom- botique chez un groupe d'oligosaccharides inférieurs (ce terme "inférieur" étant entendu par rapport aux pentasaccha- rides). 1-5 Le prolongement de ces recherches a alors conduit à élaborer un groupe spécifique d'oligosaccharides qui s'est révélé doté d'une manière avantageuse d'un large spectre thérapeutique. L'invention a donc pour but de fournir un nouveau groupe d'oligosaccharides à chaînes courtes dont la struc- ture correspond à celle de fragments de chaînes de mucopoly- saccharides acides, ou comprend de tels fragments. -4- Elle a également pour but les applications bio- logiques de ces oligosaccharides comme réactifs de labora- toire et comme principe actif de médicaments. Les oligosaccharides de l'invention sont caractérisés en ce qu'ils comprennent de 4. à 12 motifs choisis Darmi les motifs sucre aminé et acide uronique, ou l'inverse, et qu'ils contiennent un enchaînement tétrasaccharidique de structure DEFG répondant à la formule II: ORoO R1 _0X ' ALf 4L0 -cOO OR OR N2 OR! N2OR dans laquelle: - les radicaux R1, identiques ou différents les uns des autres, représentent un anion minéral, en particulier, un groupe sulfate ou un groupe phosphate, - R2 présente l'une des significations données pour R1 ou représente un atome d'hydrogène, - Nlet N2,- identiques ou différents l'un de l'autre, représentent un groupe fonctionnel amine, en particulier, sous forme de sel avec un anion minéral tel que défini ci-dessus, ou substitué par un groupe acyle -COR3 o R3 représente un radical alcoyle. Les travaux effectués par les inventeurs dans ce domaine ont montré l'importance de la séquence DEFG qui correspond au bloc dit irrégulier présent dans la - molécule naturelle d'héparine. Cette séquence confère aux oligosaccharides et d'une manière surprenante et avanta- geuse aux tétrasaccharides DEFG per se, des propriétés pharmacologiques exploitables dans un large domaine thé- rapeutique. Selon un mode de réalisation de l'invention, les oligosaccharides définis ci-dessus sont du type a - b, a-c, ou l'inverse (étant entendu qu'ils comportent la séquence DEFG). Dans un groupe d'oligosaccharides, la chaîne glycosidique est constituée en dehors de la séquence DEFG par un seul type de ces enchaînements binaires. Dans un autre groupe, plusieurs de ces types d'enchaînements binaires sont présents. Selon une variante, ces oligosaccharides ren- ferment un ou plusieurs motifs consécutifs a ou encore b ou c. Selon une autre variante, ces oligosaccharides renferment un ou plusieurs motifs de sucres neutres et/ou plusieurs désoxy-sucres dans leur structure. Les motifs constitutifs ci-dessus sont reliés entre eux par des liaisons de type 1-2, 1-3, 1-4 ou 1-6, et, dans le cas d'oligosaccharides possédant la structure de fragments d'héparine ou d'héparane-sulfate, comportent OL - des liaisons c 1 -- 4a, a 1 -4 4b, a 1 - 4c et b 1 4. D'une manière inattendue, les tétrasaccharides de structure DEFG per se se sont révélés dotés de propriétés pharmacologiques suffisamment importantes pour 39 permettre une utilisation de ces produits en tant que principe actifs de médicaments. - 6 - L'invention vise donc, selon un mode de réali- sation préférée, les tétrasaccharides de structure DEFG, de formule II ci-dessus, en tant que tels. On mesurera l'intérêt économique de ces produits par rapport aux oligosaccharides supérieurs dans la mesure o ils n'impliquent pour leur synthèse que la mise en oeuvre de quatre motifs. Une famille x de tétrasaccharides préférés en raison de leur activité anti-Xa élevée et de leur forte affinité pourl'ATIII répondent à la formule II ci-dessus dans laquelle R2 représente un anion minéral. Des tétrasaccharides de cette famille dans lesquels R2 représente un anion sulfate sont plus spécialement préférés étant donné leur analogie avec les produits naturels. A cet égard, des tétrasaccharides particuliè- rement intéressants renferment également des groupes sulfate pour au moins certaines de leurs autres substi- tutions ou ol',s sopécialement pour toutes les subrtitu- tions Ri1 et/ou N1 et No. Un tétrasaccharide préféré de ce tvoe correspond au produit 12 dans l'exemple 3 de formule III 0S03 COO OSO3 (O X O o O H 0 N\SO3 OH NHSO3 OSO3 -7- A la place des groupes sulfate, d'autres anions minéraux peuvent être présent tels que le groupe phosphate. Une autre famille y de tétrasaccharides préféré, en particulier en raison de son activité fibrinolytique comprend un substituant R2 représentant un groupe -OH. Des tétrasaccharides de ce type comportent avantageusement des groupes sulfate pour au moins certaines de leurs autres substitutions R et/ou N et N2. 1 1 N2. 1e Un tétrasaccharide de ce groupe répond à la formule IV: 0SOoo. 3-OSO3 0 O OH QH, \ o OH oe L\OH NHSO, OH N1SO30 OSO S3 Comme dans la famille x, des produits avantageux renferment à la place d'un ou de plusieurs groupes sulfate, ou encore de la totalité de ces groupes, d'autres anions minéraux, tels que des anions phosphate. Dans les différents types de tétrasaccharides évoqués ci-dessus, les différents anions minéraux et les groupes carboxyle se présentent avantageusement sous forme de sels avec un cation minéral en particulier un cation métallique, notamment, un cation alcalin tel que le sodium, le magnésium ou le calcium, ou encore un cation dérivé d'une base organique azotée, tel que du triéthylammonium. Les dispositions qui précèdent concernant l'enchaînement DEFG s'appliquent également dans le cas o la séquence est impliquée dans une chaîne plus longue d'oligosaccharides pouvant comporter jusqu'à 12 motifs, comme défini ci-dessus. Dans ces oligosaccharides, la séquence DEFG peut se trouver en début, incorporée, ou en fin de chaîne. Ainsi, la séquence DEFG se trouve dans certains de ces oligosaccharides en début de chaîne, étant entendu que le pentasaccharide DEFGH No 50 dont question ci-dessus, qui est expressément décrit dans la demande de brevet principal, est exclu de la portée de la présente invention. Les motifs qui s'enchaînent à la suite de la séquence DEFG sont tels que définis ci-dessus. Parmi les oligosaccharides de ce type préférés en raison de l'intérêt de leur activité fibrinolytique, on citera les tétrasaccharides de la famille y (dans laquelle le motif F comporte un groupe -OH en position 3) dans laquelle la séquence DEFG est suivie d'un motif D-glucosamine. Des pentasaccharides préférés de ce groupe comprennent ceux de structure DEFGH répondant à la formule V: O? CO... OR, C OR1 A Ol O OH vo. X dans laquelle les substituants présentent les signifi- cations données ci-dessus et N3 présente les significations données pour N1 et N2. - 9 - dans laquelle: - les radicaux R1, identiques ou différents les uns des autres, représentent un anion minéral, en particulier, un groupe sulfate ou un groupe phosphate, - R2 présente l'une des significations données pour R1 ou représente un atome d'hydrogène, - N1 et N2, identiques ou différents l'un de l'autre,représentent un groupe fonctionnel amine, en particulier, sous forme de sel avec un anion minéral tel que défini ci-dessus, ou substitué par un groupe acyle -COR3 o R3 représente un radical alcoyle. Un pentasaccharide préféré qui correspond au produit 25 de l'exemple 4 répond à la formule VI suivante: COso; COO- rOSO 0, -o O o HH O \ O OH isH o 1 HO' OH / OH/ NHSO OH NHSO 0S07 NHSOO Dans d'autres oligosaccharides, l'enchaînement tétrasaccharidique DEFG se trouve incorporé dans la chaîne oligosaccharidique. Pour d'autres oligosaccharides, cette séquence se trouve, au contraire, en bout de chaîne. les dispositions t qui précèdent s'appliquent à ces deux autres groupes. Les oligosaccharides de l'invention sont avanta- geusement préparés selon le procédé de synthèse décrit dans la -. 10 - demande de brevet principal. Selon la définition la plus générale de ce procédé, on fait réagir deux composés constitués ou terminés respectivement par des motifs de structure glucosa- mine, en particulier D-glucosamine,et des motifs de struc- ture acide glucuronique, en particulier D-glucuronique, ou acide iduronique, en particulier L-iduronique. L'un des motifs sucre aminé ou acide uronique est constitué par un alcool dans lequel le groupe -OH de la fonction alcool occupe l'une quelconque des positions 3,4 ou 6 dans le cas d'un motif sucre aminé et 2,3 ou 4 dans le cas d'un motif acide uronique. L'autre motif possède alors un carbone anomère activé, c'est-à-dire comportant un groupement réactif capable d'établir avec le groupe -OH de l'alcool la liaison de glycosylation -Orecherchée, selon la stéréochimie souhaitée, pour former une séquence sucre aminé-acide uronique ou l'inverse. Les groupements présents sur les motifs mis en oeuvre pour constituer la chaîne oligosaccharidique doivent répondre notamment aux exigences suivantes: - le groupement réactif du motif sucre aminé ou acide uronique doit être compatible avec les groupements protecteurs et/ou fonctionnels présents sur les motifs; - les groupements protecteurs des fonctions -OH et éventuellement des fonctions amino ou carboxyle, doivent être compatibles entre eux et avec les groupes pré- curseurs des fonctions amino ou carboxyle lorsqu'ils sont présents - les groupes protecteurs et précurseurs doivent être inertes vis-à-vis de la réaction de glycosylation et avec les groupes réactifs, autorisant la mise en place, au cours d'opérations ultérieures, de substituants donnés - 1i - aux diverses positions et ce, le cas échéant, de manière séquentielle. La réaction de glycosylation est réalisée de manière à ne pas altérer la structure des motifs de ces produits et la nature des divers substituants presents. L'étape de glycosylation ci-dessus est répétée de manière à obtenir la longueur de chaîne désirée. Pour pouvoir effectuer cet allongement du squelette glucidique, on met alors en oeuvre des motifs sucre aminé ou acide uronique comportant des groupements protecteurs temporairesc'est-à-dire des groupements capa- bles de bloquer sélectivement une position du motif sucre aminé ou acide uronique destinée à intervenir dans une nouvelle réaction de glycosylation. Il s'agit de groupe- ments éliminables en présence des autres groupements présents sur les motifs en recréant un alcool. Après élaboration du squelette glucidique recher- ché, on soumet la chaîne formée à une ou plusieurs réac- tions chimiques afin d'introduire un type de groupements fonctionnels donnés ou successivement, plusieurs types de groupements puis de former, si on le désire, des dé- rivés de ces groupements fonctionnels. Pour introduire des substitutions spécifiques, c'est-à-dire des substitutions déterminées en des positions données, on utilise avec avantage des produits de départ renfermant plusieurs types de groupements protecteurs, à savoir (1) un ou plusieurs groupements semi-permanents et (2) un ou plusieurs groupements permanents. - 12 - Les groupements semi-permanents sont éliminables en premier lieu et permettent d'introduire les groupements fonctionnels souhaités aux positions qu'ils occupent. Les groupements permanents sont au contraire capables de maintenir la protection des radicaux -OH durant l'intro- duction des groupements fonctionnels à la place des groupes semi-permanents. Les produits de départ du type sucre aminé renferment en outre en position 2, un groupe azoté auto- risant le maintien de la présence d'une fonction azotée durant les opérations mises en oeuvre dans le procédé. Ce groupe azoté est avantageusement constitué par des groupes tels que N3 ou -NHCOO-CH2-C6H5, ou tout autre groupe constituant un précurseur de fonction amine ou d'un-dérivé d'amine, en particulier de -NHSO3 ou de -NH-acyle, plus spécialement de -NH-COCH3. Quant aux fonctions carboxyle des motifs acide uronique, elles sont bloquées par des groupes inertes vis-à-vis des réactions mises en jeu pour le remplacement des groupes protecteurs et éliminables en fin de synthèse pour libérer les groupes carboxyle, éventuellement aux fins de salification. Ces groupes protecteurs de fonction carboxyle sont choisis avantageusement parmi les radicaux alcoyle, ou les radicaux aryle. Ces dispositions sont mises en oeuvre pour préparer les oligosaccharides de l'invention. - 13 - En ce qui concerne plus particulièrement l'obtention de la séquence DEFG, on fait réagir avantageusement un halogénure, plus spécialement le bromure d'un disaccharide de structure EF dont la synthèse est décrite dans la demande de brevet principal avec un alcool d'un motif de structure G. Le disaccharide EF comporte un groupe temporaire en position 4 du motif E. Ce groupe est avantageusement choisi parmi les groupes acyle, en particulier, acétyle ou chloroacétyle. La réaction de condensation est réalisée en milieu solvant, plus spécialement dans un solvant organique, notamment du type dichlorométhane ou dichloroéthane. Avantageusement, on utilise unc atalyseur, en général un sel d'argent ou de mercure, par exemple, le trifluorométhane sulfonate d'argent, communément appelé triflate d'argent, le carbonate d'argent, l'oxyde d'argent, le bromure mercurique ou le cyanure mercurique. On utilise également un accepteur de protons tel que la sym-collidine de même qu'un capteur pour l'eau éventuellement présente et/ou pour l'acide halogénohydrique formé, par exemple des tamis moléculaires 4 A. L'étude des conditions de réaction montre qu'il est approprié d'opérer à température ambiante ou encore à une température inférieure pouvant atteindre 0 C ou moins, sous atmosphère d'un gaz inerte tel que l'azote ou l'argon. Après formation de la chaîne trisaccharidique de structure EFG, le groupe temporaire du motif E est éliminé selon les techniques classiques pour recréer le groupe -OH. Ce dernier est alors engagé dans une réaction - 14 - de glvcosy]ation avec l'halogénure, plus spécialement]e bromure du motif de structure D. En ce qui concerne l'élaboration de la structure DEFGH de formule V, on a avantageusement recours, selon une variante de réalisation, à une réaction de condensation d'un halogènure d'un motif E, comportant un groupe temporaire en position 4, tel que le groupe lévinoyle ou analogue, et d'un alcool d'un motif de structure F. Les positions 1 et 6 de cet alcool sont avantageusement bloquées par un pont 1,6-anhydro, qui sera ouvert après la réaction de glycosy- lation. La séquence disaccharidique de structure EF formée, après traitement afin d'activer le carbone anomère du motif F, en introduisant, par exemple, un halogénure, notamment un bromure est mise en jeu dans une réaction de condensation avec un alcool de structure GH, le tétrasaccharide formé est alors traité de manière à recréer un groupe alcool en position 4 du motif E, puis condensé avec und érivé réactif d'un motif D, notamment un halogénure, en particulier, un bromure. Pour préparer plus spécialement, les tétra- saccharides de formule II et les pentasaccharides de formule V dans lesquelles R1 représente un groupe sulfate, R2 un groupe hydroxyle et N etN2 sont identiques et représentent des groupes sulfate, on met en oeuvre des produits de départ comportant les groupements suivants. - 15 - Les groupements protecteurs des radicaux -OH de ces différents motifs destinés à être sulfatés sont protégés par des groupes acyle, en particulier, acétyle, tandis que les radicaux -OH destinés à être libérés en fin de synthèse sont protégés par un groupe permanent tel que le groupe benzyle. Les positions 2 des motifs sucre aminé sont substituées par des groupes tels que N3 ou NH-COO-CH2- C6H5 et les positions 6 des motifs acide uronique sont occupées par des groupes carboxyle protégés par un radical alcoyle, en particulier méthyle. L'étape de fonctionnalisation de la chaîne tétrasaccharidique formée, c'est-à-dire d'introduction séquentiellement de substitutions spécifiques, est alors réalisée selon les dispositions données dans la demande de brevet princinal. Ce Jeu de conditions permet de réaliser l'étape de fonctionnalisation, par exemple comme suit: On introduit tout d'abord sélectivem2nt les cr c s sulfate après avoir éliminé les groupes -O-acétyle >.,blocage. Cette réacticn est réalisée de à;aniAre a ne pas affecter les groupes benzyle et les groupes azotés et carboxyle présents. A cet égard, cn effectue avantameuserjent une réaction de saponification à l'aide d'une base forte telle quc i soude. Cette réaction est réalisée de pr-férence à une temDerature inférieure à l'ambiante et plus spécialement voisine de OoC. - 16 - On soumet le produit résultant de l'hy1rolyse l'action d'un agent d'alcoylation afin d'introduire, sur le groupe carboxyle, les croupes alcoyle protecteurs qui se sont trouvés élimrinés lors de l'hydrolyse. Par réaction avec un acent de Sulfatation, on obtient alors l'introduction de groupes sulfate aux posi- tions libérées oar l'hydrolyse et laissees libres apres l'action de l'agent d'alcoylation. Des conditions de réaction satisfaisantes pour la conduite de la sulfatation comprennent la mise en oeuvre d'un agent de sulfatation, tel qu'un complexe triméthylamine/SO3. Cette réaction est avantageusement réalisée en milieu solvant, plus spécialement dans un solvant tel que le diméthylformamide. De préférence, on opère à une température supérieure à l'ambiante, a néralement voisine de 50 C, ce qui correspond à une durée de réaction d'environ 12 heures. Après l'introduction des groupes sulfate sur les fonctions alcool, o n procède à la libération des groupes -OH bloqués par les radicaux benzyle. j' élimination dé groupes benzyle est avantageu- sement réalisée par hydrogénation catalyticque dans des conditions comoatibles avec le maintien des groupes sul- fate et la transformation des groupes azotés en groupes fonctionnels amine. On opère de préférence sous pression d'hydrogène en présence d'un catalyseur du type Pd/C. Cette réaction est avantageusement réalisée en milieu solvant organique, en particulier alcoolique, addi- tionné d'eau. - 17 - Pour obtenir l'hydrogénation des groupes azotés précurseurs et l'élimination des radicaux protecteurs des groupes -OH, la réaction est avantageusement réalisée sur une durée d'environ 3 à 4 jours. Comme déjà indiqué, les groupes fonctionnels amine se orésentent sous forme de dérivés de type N-acé- tyle ou l-sulfate dans les molécules biologiquement actives consi3erees. Pour former des groupes N-acétyle, on soumet le produit résultant de la réaction d'hydrogénation à l'ac- tion d'iun aqent d'acétylation. A cet égard, l'anhydride acétique constitue un agent particulièrement approprié. Pour réaliser cette réaction d'acétylation sé- lective sans affecter les autres substituants présents sur les motifs, il convient, notamment, d'op.érer à pH basique, en particulier voisin dc 8 en milieu aqueux. On peut e.ale;:ent souhaiter forlrer des groupes N-sulfate, ce qui peut útre réalisé à l'aide d'un agent de sulfatation du type indiqué ci-dessus. Des pH supérieurs à 9, avantageusement de l'ordre de 9-10, sont utilisés pour la sulfatation. Après la réaction de sulfatation, l'addition d'une base forte permet de libérer les groupes carboxyle. Les produits formés peuvent être aisément sali- fiés à l'aide de résines échangeuses d'un cation approprié. Dans les produits naturels, le cation en particulier est constitué par du sodium. On utilise donc avantageusement des résines échangeuses de cations sodium. *- 18 - On peut également former des sels de potassium, lithium, magnésium, calcium. On utilise alors une resine échangeuse de protons, puis on neutralise l'acide formé avec la base du cation. L'invention vise également les oligosaccharides constituant des intermédiaires dans les différentes étapes du procédé de synthèse défini ci-dessus. L'étude des actions pharmacologiques des oligosaccharides de formule I renfermant la séquence DEFG ou constitués par cette séquence a permis de mettre en évidence leur intérêt en thérapeutique. Ils exercent, en particulier, une activité sur la fibrinolyse en augmentant le taux d'activateur de plasminogène circulant et en sensibilisant le caillot à la lyse. Les études réalisées ont été effectuées sur différents modèles expérimentaux selon la technique décrite par Vairel et al dans Ann. Pharmaceutiques françaises, 1983, 41,No 4, p.339-353. Ainsi, 15 mn. après l'injection par voie intraveineuse chez le lapin (anesthésie 20 mn avant l'ad- ministration) de 0,25 mg d'oligosaccharides par kg, on observe une augmentation du taux d'activateur de plasmi- nogène dans le sang circulant. Avec, par exemple, le tétrasaccharide DEFG de formule III, on observe une augmentation moyenne des aires de lyse de 17,80 alors qu'avec du sérum physiologique utilisé à titre de témoin, on note une diminution de 0,5. Une augmentation analogue a celle du tétrasaccharide est obtenue avec le pentasaccharide de structure VI. Les travaux effectués sur les oligosaccharides - 19 - 1( I.' nvent ion dans lesquels lfe motif de structure F comporte un gqoupe -SO3 en position 3 ont révélé une actitivé anti-Xa nettement supérieure à celle de l'héparine et une forte affinité pour 1'AT-III. Dans le cas,par exemple, du tétrasaccharide de formule III(produit N ll) l'activité anti-Xa mesurée avec un substrat chromogène est de 600 unités anti-Xa/mg (méthode de Teien A.M. et Lie modifiée, Thrombosis Research No 10,1937,388- 410). L'efficacité thérapeutique de ces produits a été étudiée avec des modèles d'animaux bien définis afin de déterminer leur pouvoir antithrombotique dans des conditions pathologiques connues. Avec le modèle de stase modifiée du lapin (voir Thromb. and Hemost. 46, (1) 117,1981 par Andersen et al), les résultats suivants ont été obtenus. On a administré aux lapins par voie intra- veineuse 50 uq/kg de produit dissous dans une solution saline (à raison de 100 uq/kq). 5 minutes avant l'addition d'un agent thrombogène. T,'aqent thromboeène est constitue soit par du sérum de l1;iin, soit par l'agent PCC/RVV (concentré d'un complexeprothrombine et venin de vipère Rupper). Les stases des veines jugulaires droite et gauche ont été graduées sur une échelle de O à 10. On observe une protection complète (cotation O) contre les effets thrombogènes induits par le sérum de lapin et une protection partielle vis-à-vis de l'agent thrombogène PCC/RVV (cotation 5), le contrôle ayant une cotation de 10. - 20 - Les oligosaccharides de l'invention dans lesquels le rmtif de structure F comporte, en positien ?, uin qroupe -H n ' aDparaissfnt pas dotés d ' activité vis-à-vis du facteur Xa et présentent donc une plus grande spécificité que le groupe d'oligosaccharides avec un groupe -SO3 enposition 3 du motif de structure F vis-à-vis de l'activité fibrinolytique. Les études toxicologiques des produits de l'invention ont montré leurinnocuité ce qui les rend précieux pour l'élaboration de médicaments. L'invention est donc également relative à des préparations pharmaceutiques qui renferment lesdits oligosaccharides. Elle concerne plus particulièrement des préparations pharmaceutiques dépourvues de substances py- rogènes, contenant une quantité efficace de principes actifs en association avec des excipients pharmaceutiques. Elle vise notamment les compositions dans lesquelles le véhicule pharmaceutique est aporoprié pour l:administration par voie orale. Des formes d'administraticn de l'invention appropriées pour l'administration par voie orale meuvent être avantageusement des gélules gastrorsis- tantes, des comprimés ou tablettes, des pilules, ou encore présentées sous forme de lioosomes. D'autres compositions pharmaceutiques corpren- nent ces oligosaccharides en association avec les excJipents appropriés pour l'administration par voie rectale. Des for- mes d'administration correspondantes sont coinstitues car des suoppositoires. - 21 - D'autres formes d'administration de l'invention sont constituées par des a3rosols ou des pommades. L'invention concerne également des compositions pharmaceutiques injectables, stériles ou stérilisables pour l'administration tant par voie intraveineuse qu'intranuscu- laire ou sous-cutanée. Ces solutions renferment avantageuse- ment les produits de la famille x à raison de 1000 à 000o u ('in-:essler) /ml d'oligosaccharides, de préférence de 5000 à 5D 00O, par exemple de 25 OOO u/ml, lorsque ces solutions sont destinées a l'injection par voie sous-cutanée. Elles peuvent contenir, par exemple, de 500 à 10 O0O, notam- ment 5000 u/ml d'oligosaccharides lorsqu'elles sont desti- nees à l'injection par voie intraveineuse ou par perfusion. Avantageusement, de telles préparations pharma- ceutiques sont présentées sous 'la forme de seringues non recuperables, prêtes à l'emploi. L'inve.ntion concerne également les compositions pharmaceutiques contenant lesdits oligosaccharides en asso- ciation avec un autre Drincipe actif. Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont particulièrement adaptées pour le contrôle (préventif ou curatif) de certaines étapes de la coagulation du sang chez l'homme ou l'animale notamment dans le cas oó! le pa- tient est soumis à des risques d'hypercoagulilbilité résul- tant notamment d'opérations chirurgicales, de processus athéromateux, de développement de tumeurs et de troubles de la coagulation par des activateurs bactériens ou enzyrma- tiques, etc. - 22 - Afin d'illustrer l'invention, on indique, ci-après un exemple de posologie utilisable chez l'homme avec les produits de la famille x: cette posologie comprend, par exemple, l'administration au patient de 1000 à 25 000 u (Yin et Wessler) par voie sous-cutanée, une à trois fois par jour, selon le niveau des risques d'hypercoagulabilité ou la condition thrombotique du patient, ou de 1000 à 25000 u/24 heures, par voie intraveineuse, en administrations discontinues à intervalles réguliers, ou continues par perfusion, ou encore de 1000 à 25000 u (trois fois par semaine) par voie intramusculaire ou sous-cutanée (ces titres sont exprimés en unités Yin-Wessler). Ces doses peuvent être naturellement ajustées pour chaque patient en fonction des résultats et des analyses de sang effec- tuées auparavant, la nature des affections dont il souffre et, d'une manière générale, son état de santé. Dans le cas des produits de la famille y, notamment des pentasaccharides de formule VI, on administre 1 à mg/jour selon l'état du patient et la forme pharmaceu- tique utilisée. Outre les compositions pharmaceutiques renfermant les oligosaccharides tels quels, l'invention vise également les compositions pharmaceutiques renfermant au moins un oligosaccharide tel que défini ci-dessus, conjugué, par liai- son covalente, à un support soluble ou à un support insoluble avantageusement au moyen du sucre terminal réducteur. Des conjugués fixés à des supports solubles préférés sont constitués plus spécialement d'oligosaccharides AT-III conjugués comportant une séquence DEFG de formule II, plus spécialement un groupe sulfate. De tels produits constituent des médicaments particulièrement intéressants dans la préven- tion de thromboses, en cas de déficits en AT-III. - 23 - D'autres conjugués oréférés avec supports solu- bles sont formés d'un oligosaccharide de formule générale II, fixé à un véhicule tel qu'une protéine, notamment, la polylysine,ou le sérum albumine bovine. Ces oroduits scnt utilisables corrme immunogènes eux-memes sources d'anticorps circulants produits in vivo ou d'anticoros monoclonaux, cloneés in vitro selon les tech- niques appropriées. Dans d'autres conjuguas prrf=_rs, les oligo- saccharides de l'invention sont conjugué. s à des supports insolubles. On utilisera avantageusement les supports clas- siques. Ces conjugués,lorsqu'ils renferment une séquence DEFG selon la famille x ci-dessus sont utilisables comme immunoab- sorbants, par exemple pour une ourification de haute spci- ficité de iAT III et pour son dosage ou pour l'élaboration, par fixation sur des polymères biocompatibles, de nouveaux polymères hémocompatibles athrombotiques. n outre, les complexes résultant de l'affinité de l'AT III pour les oligosaccharides de l'invention renfermant la séquence DEFG de la famille x entrent également dans le cadre de l'invention. L'invention vise également l'apolication des oligosaccharides consiedérés en médecine nucléaire, en tant que produits radiooharmaceutiques. Ces prcduits sont alors marqués -ar des traceurs choisis parmi ceux couramment uti- lisés dans ce domaine, et nota-ment à l'aide de technétium 99 m. A cet effet, on transforme le technétium 99 m obtenu à partir de générateurs du commerce, sous forme de - 24 -- oertechnétate de sodium de valence 7 non réactif, ern tech- nétilun réduit de valence 4 qui serait la forme la plus réactive du technétium. Cette transformation est effectuce grâce à un système réducteur réalisé à partir de sels d'e- tain (chlorure stanneux), de sels de fer (sulfate ferreux), de sels de titane (trichlorure de titane) ou autres sls. La oluoart du temps, cette simole réduction du technétium suffit, dans des conditions de oH donnees, à rêa- liser la fixation du technétium sur la molécule considérne. On peut utiliser les produits de l'invention, qui constituent en quelque sorte un support, à des doses de l'ordre de 100 à 200 u Yin-Wessler. Pour l'élaboration de ces réactifs radiopharri-- ceutiques, on peut opérer conformément à la méthode de P.'.. KULKARNI et al. dans The Journal of lNuclear!.edecine 21, N 2, o. 117-121. Les produits ainsi marqués sont a:antageuserrent utilisés dans des tests in vivo our la détectiorn et le diagnostic d'extension des thromboses et des états thrombo- ZI) tiques. Les oligosaccharides de l'invenrticn peuvent être également utilises pour la détermination e la spéci- ficité des nombreuses enzynes impliquées dans le rnmitabo- lisme des glycosaïninoglucuronoglycanes. D'autres caractéristiques avantageuses de l'invention apparaitront dans les exemples qui suivent et en se reoortant aux figures 1 à 5 illustrant les produits mis en oeuvre dans les synthèses décrites. - Z5 - Dans ces figures, les références numériques des formules sont utilisées également dans les exemples pour désigner les memes preduits. Les abréviations utilisées dans ces formules présentent les significations suivantes: Ac: un groupe acétyle; I-Ne: méthyle; Bn: benzyle; rJev: levinoyle; MCAO: monochloroacétyle et Z un groupe benzyloxycarbonyle. - 26 - EXEMPLE 1 - Préparation du trisaccharide 3 de structure EFG, à savoir du benzyl-O-/méthyl-2,3-di-O-benzyl-4-O- chloroacétyl-B-D-glucopyranosyluronate-(1--- 4)-0-(3,6-di-O- acétyl-2-azido-2-désoxy- a -D-glucopyranosyl)-(1-- 4)-O- /méthyl - 2-O-acétyl-3-O-benzyl- a-L-idopyranosiduronatg. On effectue la synthèse du trisaccharide 3 par condensation d'un halogenure de structure EF et d'un alcool de structure G. Ces réactifs numérotés respectivement 1 et 2 dans la description correspondent respectivement aux pro- duits 20 et 147 décrits dans la demande de brevet FR 82 18003 du 27 octobre 1982 au nom de la demanderesse. Cette étape de condensation est réalisée comme suit: Une solution de l'halogénure 1 (738 mg; 0, 92 mmole) et de l'alcool 2 (428 mg; 1 mmole). dans le dichloro- éthane anhydre (15 ml) est agitée à-20 C en présence de ta- mis moléculaires 4 A en poudre. On ajoute ensuite de la collidine (150)l) puis du triflate d'argent (262 mg; 10 mmole). Après une heur3 à -20 C le mélange réactionnel est dilué avec du dichlorométhane puis filtré. La phase or- ganique est lavée (KHSO4) 10%; eau), séchée (Na2SO4) puis concentrée à sec. La mousse obtenue (1,07 g) est chromato- graphiée sur gel de silice (toluène/acetate d'éthyle; 4/1; v/v) livrant ainsi le trisaccharide 3 pur (699 mg; 63%) sous forme de mousse blanche. /a-D: + 25 (c 1,4; chloroforme). EXEMPLE 2 - Préparation d'un tétrasaccharide 6 de structure DEFG, à savoir le benzyl O-(6-O-acétyl-2-azido-3,4-di-O- benzyl-2-désoxy-a-D-glucopyranosyl)-(1-> 4)-O-/méthyl 2,3- di-O-benzyl- -D-glucopyranosyluronate7-(1-> 4)-O-(3,6-di- O-acétyl-2-azido-2-désoxy-a-D-glucopyranosyl)-(1-> 4)-O- (méthyl 2-O-acétyl-3-O-benzyl-a-L-idopyranosiduronate). Cette synthèse est réalisée par condensation d'un halogénure 5 de structure D avec un alcool 4 correspondant au trisaccharide 3 dont le groupe -OH en position 4 du motif E a été débloqué. On décrit donc successivement: - 27 - a) l'obtention du trisaccharide 4 à partir du trisac- charide 3, b) la condensation de 4 avec l'halogénure 5. Etape a: Le trisaccharide 3 (669 mg; 0,55 mmole) est dis- sous dans un mélange de lutidine (3,8 ml) et d'acide acéti- que (1,25 ml). Du méthanol est ensuite ajouté suivi d'une solution d'hydrazine dithiocarbonate obtenue selon la mé- thode décrite par van Boeckel et Beetz dans Tetrahedron letters 24 (1983) 3775-3778. Après deux heures à températu- re ambiante la solution est diluée par addition de dichlo- rométhane (200 ml) puis lavée (NaHCO3 saturé, eau; KHSO4 %, eau), séchée (Na2SO4) et concentrée à sec. Le produit pur (530 mg; 83%) est obtenu après chromatographie sur gel de silice (toluène/acétate d'éthyle; 2/1; v/v). 7 lD: + 29 (c 1,29; chloroforme). Analyse: Calculé pour C54HO20N3 Trouvé 3 Trouvé C 60,50 60,46 H 5,74 5,74 N 3,92 4,i1 Etape b: Une solution d'alcool 4 (494 mg; 0,455 mmole) dans le dichlorométhane et de l'halogénure 5 (1,096 g; 2,2 mmoles) est traitée par le triflate d'argent (632 mg) en présence de symcollidine (360 pl) comme il est décrit pour la synthèse du composé 3. Après purification sur colonne de gel de silice (gradient chloroforme -- chloroforme acéta- te d'éthyle; 20/1; v/v) on obtient le dérivé 6 pur (595 mg; 89%). ---D: + 43 (1,27; chloroforme). Analyse: Calculé pour C76H84024N6 Trouvé 24 6 Trouvé C 61,61 61,57 H 5,71 5,76 N 5,67 5,61 - 28 - EXEMPLE 3 - Préparation du tétrasaccharide Il de structu- re DEFG, à savoir le O-(2-désoxy-6-O-sulfo-2-sulfamido-a- D-glucopyranosyl)-(1--- 4)-0- (-D-glucopyranosyluronate) - (1--9 4)-0-(2-désoxy-3,6-di-O-sulfo-2-sulfamido-a-D-gluco- pyranosyl) - (1- >'4) -O-2-O-sulfo-a-L-idopyranuronate, octa sel de sodium. On obtient le tétrasaccharide par déblocages - séquentiels des groupes -OH et introduction des groupes désirés sur le tétrasaccharide 6. Les étapes successives mises en oeuvre sont les suivantes: 1 - libération des groupes -OH bloqués par des groupes acétyle; 2 - formation des sels de sodium des groupes sul- fates; 3 - formation des sels de sodium des groupes car- boXyle; 4 - libération des groupes -OH bloqués par des groupes benzyle et transformation des groupes azido en groupes amino, - estérification des fonctions aminés. Ces étapes sont réalisées comme suit: 1 - Passage de -OAc à -OH conduisant au tétra- saccharide de 7. Le dérivé 6 (0,340 g) est dissous dans un mélange de méthanol (30,6 ml) de chloroforme (3,5 ml) et d'eau (4,25 ml). De la soude 5N est alors ajoutée (4,25 ml). Après 4 heures à température ambiante, on ajoute du chlo- roforme (90 ml) puis de l'acide chlorhydrique (8N; 8 ml). Après décantation la phase chloroformique est séparée. La phase aqueuse est lavée par le chloroforme (3 x 10 ml). Les phases chloroformiques sont regroupées et séchées (Na2SO4). Le résidu obtenu après concentration à sec est méthylé par le diazométhane, puis il est chromatographié sur colonne de gel de silice éluée par un gradient (dichlorométhane -- di- chlorométhane/acétate d'éthyle; 1/1; v/v). On obtient le - 29 - composé 7 (0,173 g; 57%). /a-_7 D:14 (c 1; chloroforme). Analyse: Calculé pour C68 H76021N6' 0,5 H20 Trouvé C 61,68 61,62 H 5,93 5,84 N 6,34 6,31 2 - Passage de -OH à -O-SO3Na conduisant au tétrasaccharide 8. La composé 7 (117 mg; 0,068 mmoles) est dissous dans du diméthylformamide anhydre (3 ml) puis il est sulfaté pendant une nuit à 50 C en présence de triméthylamine/SO3 (123 mg). Le mélange réactionnel est alors dilué par addi- tion d'un mélange méthanol chloroforme-(1/1; v/v; 3 ml) puis il est chromatographié sur une colonne de Séphadex LH 20 équilibrée dans chloroforme/méthanol (1/1; v/v). Le produit obtenu est utilisé directement pour la préparation de 9. 3 - Passage de COOMe à COONa, conduisant au té- trasaccharide 9. Le composé 8 (357 mg; 0,207 mmole) est dissous dans un mélange de méthanol (8 ml) et d'eau (2 ml), puis on ajoute de la soude (5N; 1,2 ml). Après 3 heures de réaction le mélange réactionnel est passé au travers d'une colonne de résine Dowex 50 - H+ équilibrée dans un mélange méthanol/eau (8/2; v/v). L'éluat est passé au travers d'une colonne Dowex 50 - Na' équilibrée dans le même solvant. Après évaporation à sec le produit 9 est obtenu pur(0,267 g; %) à la suite d'une chromatographie sur un gel de silice (30 g; acetate d'éthyW/pyridine/acide acétique/eau; /77/19/42; v/v/v/v), suivie d'un passage sur l'échangeur d'ions Séphadex SPC 25 (18 g) équilibrée sous fonrme Na+ dans un mélange méthanol/eau (8/2; v/v). -a-/ D: 5,50 ( 1,025; méthanol). 4 - Passage de -OBn à -OH et de -N3 à -NH2 condui- sant au tétrasaccharide 10. - 30 - Le composé 9 (256 mg; 0,147 mmole) est dissous dans un mélange méthanol/eau (9/1; v/v; 10 ml) puis hy- drogéné en présence d'un catalyseur (Pd/C 10%); 130 mg) pen- dant 5 jours. Le catalyseur est remplacé par du catalyseur frais puis la réaction est continuée pendant 4 jours. Le spectre U.V. du produit montre alors l'absence de dérivés benzylés. Le produit obtenu (0,17 g) est envoyé directement *dans la préparation de 11. - Passage de -NH2 à -NHSO3Na conduisant au té- trasaccharide 11. A une solution de 10 (0,17 g; 0,152 mmoles) dans l'eau (10 ml) on ajoute peu à peu le complexe pyridine/SO3 (14C mg; 0,75 mmole): tout en maintenant le pH à 9,5 par addition de soude 2M. Une nouvelle addition de complexe sulfatant est faite après 1 heure (70 mg) et 1 nuit (70 mg). Le mélange réactionnel est alors déposé au sommet d'une colonne de séphadex G 50 (300 x 2,5 cm) éluée par du chlorure de sodium 0,2 M. Le produit est ensuite absorbé au sommet d'une colonne de résine Biore AG lx2 (1,6 x 10 cm) sous forme Na+ éluée par un gradient de chlorure de sodium (0,5 M -- 3M). Les fractions contenant le produit sont regroupées. Les sels sont éliminés par chromatographie sur séphadex G-25 (100 mg). Le produit est ensuite lyophi- lisé (111 mg; 54 %). a/D: + 46 (c 0,85; eau). En mettant en oeuvre dans les étapes qui pre- cèdent un motif G comportant un groupe -OCH3 à la place du groupe -OBn sur le carbone anomère, on obtient le tétrasaccharide 12. On indique dans le tableau ci-après les significations des substituants A1 à A5 de formule bis donnée sur la planche I pour les composés 6 à 12. - 31 - A1 A3 A A 6 Ac Bn N3 j e En 7 l Bn N3 Me Bn 8 So3Na Bn N3 Me Bn 3 3 9 So Na Bn N Na 3 So3,Na Pl NH2 Na+ i3 ll So3Na H NHSO3Na Na+ H 3 3. 1l2 So3Na H NHSO3Na Na+ CH-3 EXEMPLE 4: Préparation du pentasaccharide 27 de structure DEFGH, comportant un motif F avec en position3 un groupe -OH, ou O-(2-désoxy-6-O-sulfo-2-sulfo-amino-_-D-glucopyra- nosyl)-(1- > 4)-O-(f-D-glucopyranosyluronate)- (1 -, 4)-O-(2-désoxy-6-O0-sulfo-2-sulfo-amino-a-D- glucopyranosyl)-(1,-- 4)-O-(2-O-sulfo- pyranosyluronate)-(1--4 4)-2-désoxy-6-sulfo- 2-sulfo-amino-D-glucopyranose- Pour la préparation de ce pentasaccharide, on a recours aux étapes a) à j) suivantes: - 32 - a - Préparation du disaccharide 15 de structure EF à savoir le 1,6-anhydro-2-azido-3-O-benzyl-2-désoxy-4-O- (méthyl 2,3 di-O-benzyl-4-O-lévulinyl-1-D- glucopyranosyluronate)- -D-glucopyranose - On soumet à agitation une solution de l'alcool 14 (4,7g - 17mmoles) dans le dichlorométhane anhydre (40 ml), à l'abri de la lumière et de l'humidité, en presence de carbonate d'argent (4,3 g; 15mmoles), de tamis moléculaire 4 A en poudre et dedriérite Après 1 heure d'agitation, on ajoute goutte à goutte à O C une solution de l'halogénure 13 (5,7 g; 10,3 mmoles) dans le dichlorométhane (20ml). Après cinq jours de réaction, on dilue le mélange réactionnel par du dichlo- rométhane, on le filtre et on concentre à sec. Par chromatographie sur gel de silice, on récupère l'alcool n'ayant pas réagi (élué par un mélangehexane /acétate d'éthyle; 2/1; v/v) et le disaccharide 15 (élué par un mélange hexane/acétate d'éthyle; 1/1; v/v) on cristallise le disaccharide 15 à l'aide d'un mélange acétate d'éthyle/hexane (4,1 g; 53%). PF: 93-94 C []D: +5 (c 1; chloroforme) b - Ouverture du pont 1,6-anhydro du motif de structure F' On soumet à agitation un mélange du disaccharide 15 (4,5g), d'anhydride acétique (42ml) et d'acide trifluoroacétique (12ml) à température ambiante pendant 14 heures environ. Après évaporation à sec, le résidu obtenu est chromatogra- phié sur gel de silice à l'aide d'un mélange hexane/acétate d'éthyle: 6/5 (v/v). On obtient le dérivé 17 (2,7 g; 52%) ainsi que le dérivé 3-O-acétylé 16 (1,4 g). []D: + 15. (c 1,1; chloroforme) - 33 - C - Transformation du groupe -OAc en position 1 du motif de structure F en groupe -OH On soumet à agitation un mélange du composé 17 (2,46 g; 2,9 mmoles), d'éther (120 ml) et de benzylamine (12ml), à température ambiante, pendant 6 heures. Après dilution avec de l'éther (700 ml), la solution obtenue est lavée avec HC1 1 M froid puis de l'eau et concentrée à sec. Le sirop obtenu est chromatographié sur gel de silice à l'aide d'un mélange chloroforme/acétate d'éthyle: 2/1 (v/v). On obtient ainsi le dérivé 18 (2,047 g; 84,5%) sous forme de mousse blanche. []D: + 21,30(c 1,6; chloroforme) d - Bromuration de la position 1 du motif de structure F: A une solution du dérivé 18 (162 mg; 0,2 mmole) dans le dichlorométhane (5ml), on ajoute à O C de la sym-collidine (320 pl) puis du bromure de N,N-diméthyl f.rmiminium fraîchement préparé (réactif de Vilsmeier). Après 6 heures de réaction, on procède à une nouvelle addition de réactif de Vilsmeier,puis on laisse environ 14 heures à 4 C. Après dilution par du dichlorométhane, lavage à l'eau froide, séchage et évaporation, le résidu est chromatographié rapidement sur gel de silice à l'aide d'un mélange dichlorométhane/acétate d'éthyle: 5/1 (v/v). On obtient le composé 19 (83 mg; 4 7,5 %) qui est immé- diatement engagé dans la réaction de glycosylation. e - réaction de glycosylation conduisant à un enchaînement tétrasaccharidique: On soumet à agitation une solution de l'halogénure 19 (360mg; 0,414mmole) et de l'alcool 20 (710 mg; 0,82 mmole) dans le dichloroéthane (10 ml), à -20 C en présence de tamis o moléculaire 4 A en poudre. On ajoute de la sym-collidine (66jil) puis du triflate d'argent (117 mg;O,45 mmole). - 34 - Les mêmes quantités de sym-collidine et de triflate d'argent sont ajoutées après 2 heures de réaction, puis on laisse le mélange revenir à O C. Après 14 heures environ, on procède à une nouvelle addition de triflate et de collidine. La réaction est terminée au bout de 48 heures. Après dilution par le dichlorométhane, le mélange réactionnel est filtré. La solution est lavée (KHSO4 10%, eau), séchée (Na2SO4) et concentréeà sec. Le sirop obtenu (1 g) est chromatographié sur gel de silice (dichlorométhane/acétate d'éthyle 4,5/1; v/v) donnant le dérivé 21 attendu (287 mg; 42,5%) ainsi que l'alcool 20 n'ayant pas réagi (990 mg; 55%). []D: +45,600(c 1,78;chloroforme). f - Transformation du qroupe -OLev en position 4 du motif E en groupe OH: A une solution du composé 21 (272 mg; O,165mmole) dans la pyridine (0, 9ml), on ajoute une solution 1M d'hydrate d'hydrazine dans un mélange pyridine/acide acétique (3/2; v/v). Après 5 minutes, le mélange est dilué par du dichlorométhane puis la solution est lavée (KHSO4 %, eau, NaHCO3 saturé, eau),séchée (Na2SO4) et concentrée à sec. Le résidu solide obtenu (269mg) est soumis à une chromatographie sur colonne de gel de silice. On utilise un mélange hexane/acétate d'éthyle: 1/1 (v/v). On obtient ainsi le dérivé 22 (219 mg; 86%). [ g - Réaction de glycosylation avec le tétrasaccharide 21 et le monosaccharide 5 de structure D. On soumet à agitation, à température ambiante, pendant 30 mn, en présence de tamis moléculaire 4 A en poudre, une solution du composé 22 (208 mg; 0,134 mmole) et de l'halogénure 5 (350mg; 0,67 mmoles) dans le - 35 - dichloroéthane (8ml). Après refroidissement à -20 C, on ajoute de la sym-collidine (114 yl) puis du triflate d'argent (201 mg; 0,74 mmoles). Après une heure le mélange réactionnel est dilué par du dichlorométhane et filtré. La solution est lavée (KHSO4 10%, eau), séchée (Na2SO4) et concentrée à sec. Le résidu obtenu (410mg) est chromatographié sur gel de si- lice donnant le pentasaccharide 23 (203 mg; 77,5%) sous forme de mousse. []D: + 57 (c 1; chloroforme). h - Libération des groupes -OH bloqués par des groupes acétyle! Le composé 23 (193 mg; O,O98mmole) est dissous dans un mélange de chloroforme (5ml), de méthanol (18ml) et d'eau (2,5ml). On ajoute alors goutte à goutte une solution de soude 5N (2,5ml). Après 7 heures de réaction, le mélange réactionnel est dilué le chloroforme (50ml) puis aci- difié par addition d'acide chlorhydrique aqueux. Le produit est extrait par le chloroforme. La phase chloroformique est lavée à l'eau jusqu'à pH neutre. Le produit est alors méthylé par addition de diazométhane. Le sirop obtenu après évaporation à sec est purifié sur une colonne de gel de silice (Lobas Merck, type A) éluée par un gradient (chloroforme -4 méthanol/chloroforme; 1/40; v/v). On obtient ainsi le composé 24 pur (96 mg; 55%). ["]D; + 45 (c 1; chloroforme). i - Sulfatation des groupes -OH libérés.- Le composé 24 (88 mg; O,O49mmole), dissous dans du DMF anhydre (1,5 ml) est sulfaté pendant environ 14 heures à 50 C par le complexe triméthylamine /SO3 (72mg,0,5mmole). - 36 - Le mélange est alors dilué par addition de chloroforme (O,75ml) et de méthanol (0,75ml),puis chromatographié sur une colonne de gel Séphadex LHLO éluée par un mélange chloroforme/méthanol (1/1; v/v). Les fractions contenant le dérivé 25 sont regroupées, concentrées et le produit est purifié sur gel de silice (acétate d'éthyle/ pyridine/acide acétique/eau; 160/77/19/42; v/v/v/v). On obtient ainsi le dérivé 25 après passage sur échangeur d'ions Séphadex SP25 Na+. Ce produit se présente sous forme d'une poudre blanche (97mg; 89%). [ j - Libération des groupes -OH bloqués par les groupes benzyle, transformation des groupes -N3 en groupes -NHSO3 et des groupes -COOMe en groupes -COO. Le composé 25 (55 mg; O,O25mmole) est hydrogéné dans un mélange méthanol/eau (9/1) en présence de catalyseur (Pd/C, 5%; 50 mg). Après 8 jours l'hydrogénation est complète. Après filtration et concentration à sec, le produit obtenu est dissous dans l'eau, le pH est amené à 9,5,puis maintenu à cette valeur pendant toute la durée de la réaction. On ajoute alors du complexe pyridine/S03 aux temps O (54mg), 30 minutes (27mg) et 1 heure (27mg). Après une nuit, le mélange réactionnel est déssalé au moyen d'une colonne de gel de Séphadex G 50 (1,8x4Ocm) équilibrée dans l'eau. Les fractions contenant le produit 26 sont concentrées puis le résidu est déposé sur une colonne (1,25x145cm) de Séphadex G 25 éluée par du chlo- rurede sodium 0,2M. Les fractions contenant le penta- saccharide 26 sont passées au travers d'un échangeur d'anions (Biorex AG lx2 C-1; 1,6 x 15 cm). Le dérivé 26 est ensuite élué par un gradient de chlorure de sodium (0,5-- 3M) - 37 - I1 est obtenu pur après dessalage (Séphadex G 25) et lyophilisation. C'est une poudre légère blanche (10mg; 30%). [ç]: +40 (c 1; eau). Les caractéristiques spectrales en RMN sont les suivantes: 1H-RMN:-dans D O par rapport au TSP interne- Unité D: 5,64(R-1); 3,30 (H-2); 3,63 (H-3); 3,57 (H-4); 3,90 (H-5); 4-4,5 (H-6,6); Unité E: 4,62 (H-l); 3,40 (H-2); 3,87 (H-3); Unité F: 5,45 (H-l); 3,25-3, 30 (H-2); Unité G: 5,24 (H-l), 4,33 (H-2);4,20 (H-3) 4,11 (H-4); 4,81 (H-5); Unité H: 5,44 (H-]); 4,70 (H-lt); 3,25 (H-2d); 3,05 (H-2); 3,69 (H-3), 3,79 (H-4). Le spectre RMN H de ce tétrasaccharide est rapporté sur la figure 5, dans la partie inférieure. A titre de compa- raison, on a indiqué dans la partie supérieure le spectre de RMN du pentasaccharide correspondant comportant un groupe -OSO3 en position 3 du motif F. On attribue le signal à 5,51 ppm observé avec DEFGH comportant le groupe -OSO3 sur le motif F en position 3 au proton anomère du motif glucosamine 3-O-sulfate. Ce signal est déplacé à environ 5,45 ppm pour le motif F correspond non sulfaté et se superpose au signal correspondant du motif H. - 38 - REVENDICATIONS 1. Oligosaccharides selon la revendication 31 de la demande de brevet principal, caractérisés en ce qu'ils comprennent de 4 à 12 motifs choisis parmi les motifs sucre aminé et acide uronique, ou l'inverse, et qu'ils contiennent un enchaînement tétrasaccharidique de structure DEFG répondant à la formule II: OOR1 COO OR1 O4t0. O. R NO O ORO NO OR N1 2 2 dans laquelle lsusds- les radicaux R1, identiques ou différents les uns des autres, représentent un anion minéral, en particulier, un groupe sulfate ou un ytoupe phosphate, - R2 présente l'une des significations données pour R1 ou représente un atome d'hydrogène, - Nlet N2, identiques ou différents l'un de l'autre,représentent- un groupe fonctionnel amine, en particulier, sous forme de sel avec un anion minéral tel que défini cidessus, ou substitué par un groupe acyle -COR3 o R3 représente un radical alcoyle et leurs sels. 2. Oligosaccharides selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont constitués, en dehors de la séquence DEFG, par des motifs binaires a-b, a-c, ou l'inver-- se, par un seul type de ces enchaînements binaires, par - 39 - plusieurs de ces types d'enchaînements, ou qu'en variante ils renferment un ou plusieurs motifs consécutifs a, b, ou c, ou encore qu'ils renverment un ou plusieurs motifs de sucres neutres et/ou plusieurs désoxy-sucres dans leur structure, ces motifs étant reliés entre eux par des liaisons de type 1-2, 1-3, 1-4 ou 1-6 et, dans le cas d'oligosaccharides possédant la structure de fragments d'héparine ou d'héparane-sulfate, par des liaisons c 1 - 4a, a 1 -4 4b, a 1 -_; 4c et b 1 -, 4. 3.- Les tétrasaccharides DEFG de formule II per se. 4.- - Tétrasaccharides selon la revendication 3, caractérisés en ce que le substituant R2 en position 3 du motif F représente un anion minéral, plus spécialement un anion sulfate, au moins certaines des autres substitu- tions ou plus spécialement toutes les substitutions R1 ou N1 et N2 comportant également avantageusement un groupe sulfate. 5.- Tétrasaccharide selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il répond à la formule III: rOSO3 COO oso3- Oo O OH OH O - \ OH 3 QSi0 OH NI iS 03 o:i NHSO3 Oso3 - 3 - 40 - 6.- Tétrasaccharides selon la revendication 3, caractérisés en ce que le substituant R2 en position 3 du motif F représente un groupe -OH, au moins certaines des autres substitutions R1 et/ou N1 et N2 comportant un groupe sulfate. 7.- Les oligosaccharides renfermant un tétrasaccharide selon l'une quelconque des revendications 4 à 6. 8.- Oligosaccharides selon la revendication 7, caractérisés en ce que la séquence DEFG est suivie d'un motif D-glucosamine. 9.- Oligosaccharides selon la revendication 8, caractérisés en ce qu'il s'agit de pentasaccharides de structure DEFG répondant à la formule V: O-'COO_ OR1 OR1 'R \ OH 4 /. OH 1 0 22OR N2 OR1 3 dans laquelle les substituants présentent les signifi- cations données ci-dessus et N3 présente les significations données pour N1 et N2 de préférence de formule VI: o00H ooo- cOOSO- cOO- /-o f tir, 3 HO4\ OH0 OH OH N.HSO; OH N;HSO7 OS030 - 41 - 10.- Les sels des oligosaccharides selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, en particulier les sels de métaux, notamment, de métaux alcalins tels que le so- dium, ou les sels de magnésium, de calcium ou d'une base organique azotée tel que du triéthylammonium. 11.- Procédé de préparation de la structure DEFG de formule II selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend: - la réaction d'un halogénure, plus spécialement du bromure d'un disaccharide de structure EF, comportant un groupe temporaire en position 4 du motif E, avec un alcool d'un motif de structure G; - l'élimination du groupe temporaire de E pour recréer le groupe -OH; - la réaction de ce dernier avec 1' halogénure plus spécialement le bromure, du motif de structure D; la structure DEFGH de formule V étant plus spécialement préparée par: - condensation d'un halogénure d'un motif E comprenant un groupe temporaire en position 4, et d'un alcool d'un motif F dont les positions 1 et 6 sont avan- tageusement bloquées par une fonction anhydro, - introduction d'un halogénure, notamment, d'un bromure en position 1 du motif F, condensation avec un alcool de structure GH, - élimination du groupe temporaire de E pour former un alcool, puis - condensation avec un dérivé réactif d'un motif D, notamment un halogénure,en particulier, un - 42 - bromure, les éliminations séquentielles des groupes protecteurs et l'introduction des substitutions spécifiques souhaitées étant effectuées avantageusement selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 17 de la demande de brevet principale. 12.- Médicaments caractérisés en ce qu'ils renferment une quantité efficace d'au moins un oligo- saccharide selon l'une quelconque des revendications 1 à 10. 13.- Médicaments caractérisés en ce qu'ils renferment une quantité efficace du tétrasaccharide de formule III. 14..- Médicaments caractérisés en ce qu'ils renferment une quantité efficace du tétrasaccharide de formule IV.