FR 2569407 A1 19860228 FR 8413095 A 19840822 Sondescomportant des groupements adénine modifiée, leur preparation et leurs utilisations L'invention concerne des sondes constituées de polynucléotides. plus précisément de fragments d'oligonu- cléotides, comportant. en tant que basespuriques, des groupements adénine modifiés de telle sorte qu'ils soient suscepti- bles de former trois liaisons hydrogène avec les groupes réactifs de la thymine, un procédé pour leur obtention ainsi que leurs applications. Il est maintenant bien connu des spécialistes d'avoir recours pour certaines analyses. notamment pour la détection de séquences nucléotidiques particulières, telles que des séquences d'ADN ou d'ARN et l'isolement de telles séquences, à des techniques basées sur l'hybrida- tion entre une séquence déterminée de nucléotides utili- sée en tant que sonde et une séquence de nucléotides complémentaires de ceux de la sonde, éventuellement con- tenue dans une composition renfermant des acides nucléiques. La mise en oeuvre de ces techniques. en particulier l'ob- tention de sondes sensibles et s'hybridant de façon stable avec les séquences complémentaires. pose encore des pro- blèmes. Ainsi, l'un des problèmes les plus fréquents posés en génie génétique est celui de la "péche"d'ARN messagers par des oligodésoxynucléotides synthétiques. c'est-à-dire la détection, l'isolement et l'analyse de séquences d'ARN messagers par hybridation avec des fragments d'ADN complé- mentaires (cADN). Cette technique est basée sur l'appariement des paires A-T (2 liaisons hydrogène) et G-C (3 liaisons hydrogène). La conception et la synthèse de ces sondes sont rendues compliquées par la dégénérescence du code généti- que: à part la méthionine (AUG) et le tryptophane (UGG) -2- qui nécessitent un seul codon. tous les autres acides ami- nés sont traduits à partir de 2 à 6 codons. Jusqu'à maintenant. à partir d'une séquence protéi- que déterminée, pour obtenir des sondes, on a utilisé plusieurs stratégies: a) choisir dans une séquence G de préférence à A.et T de préférence à C. ce qui donne à l'hybridation soit une paire stable, soit un mauvais appariement G-T appelé de façon générale et dans ce qui suit "mismatch" G-T. Cette méthode a été appliquée avec succès pour la synthèse de cADN codant la relaxine de rat [P.Hudson et coll., Nature. (1981). 291.127] mais est difficilement gé- néralisable en raison de son manque de sensibilité notam- ment. b) préparer toutes les séquences possibles avec les ambiguités correspondantes [B.E. Noyes et coll., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, (1979), 76, 1770 et M. Mevarech et coll., J. Biol. Chem., (1979),254. 7472]. ce qui peut né- cessiter un énorme travail de synthèse. c) synthétiser des "sondes mixtes" ("mixed probes") avec toutes les ambiguités sur la même séquence. Cette technique a donné de bons résultats pour la $-globine[R.B. Wallace et coll.. Nucleic Acids Research. (1981). 9.879,], par exemple, mais représente pour le chimiste organicien un côté "frustrant" vu la complexité du mélange obtenu et le nombre de trimères mis en jeu et au surplus ne donne pas toujours des résultats satisfaisants en raison notamment des réactivités différentes des différents tÉimères mis en jeu au niveau de chaque ambiguité, ce qui a pour conséquen- ce pratique que l'on n'a pas de certitude quant à la com- position exacte du mélange obtenu. L'invention remédie. au moins en partie. aux incon- vénients des techniques antérieures en fournissant une sonde qui: --3- - peut à elle seule remplacer des mélanges com- plexes de séquences, ce qui correspond à un important gain de temps et d'argent - présente une composition bien définie - présente, par rapport notamment aux sondes défi- nies sous a) ci-dessus,une meilleure sensibilité dans la détection après hybridation avec des séquences complémen- taires et une meilleure stabilité de l'hybrideainsi formé (température de fusion plus élévée); et au surplus, comme il sera vu plus loin. - offre la possibilité d'être utilisée avec des méthodes d'identification faisant intervenir des réactions immunologiques voire immuno-enzymatiques à la place des détections radioactives relativement peu sensibles et présentant les inconvénients bien connus, utiliséesjusqu'à présent. On savait que lorsqu'on remplace dans une séquence nucléotidique une désoxy-2' adénosine (A) par une amino-2 désoxy-2' adénosine (A*). cela conduit, dans l'hybride formé par cette séquence. à la transformation d'une paire AT présentant deux liaisons hydrogène. en une paireA*T présentant trois liaisons hydrogène et qui a une stabilité équivalente à celle d'une paire CG [R.C. Comtor et P.R. Schimmel. Biophysical Chemistry. W.H. Freeman. San Francis- co, (1980)]. Des séquences autocomplémentaires (hexamères et oc- tamères) comportant des groupes amino-2 désoxy-2' adénosi- ne ont déjà été synthétisées pour des études spectrosco- piques (dichroisme circulaire), dans le but d'étudier la stabilité et la conformation (sous forme B ou Z) de modè- les d'ADN [B.L. Gaffney et coll., Nucleic Acids Research. (1982). 10. 4351 et Tetrahedron. (1984). 40, 3]. I1 n'avait cependant pas encore été propose, ni même suggéré, de préparer des séquences d'oligonucléotides comportant des groupes adénine modifiés de telle sorte -4- qu'ils soient susceptibles de former trois liaisons hydro- gène avec les groupes réactifs de lathymine et utilisables en tant que sondes présentant les avantages de la sonde selon l'invention,décrits plus haut. La sonde selon l'invention qui est constituée d'un fragment d'oligonucléotide de structure prédéterminée par l'application envisagée, est caractérisée en ce qu'une partie au moins des groupes adénine y est remplacée par des groupes adénine modifiés de telle sorte qu'ils soient susceptibles de former trois liaisons hydrogène avec les groupes réactifs de la thymine ou de l'uracile. Les groupes adénine sont avantageusement modifiés par introduction, sur le sommet C-2 du cycle pyrimidine, d'un groupement susceptible de donner une liaison hydrogè- ne avec l'atome d'oxygène fixé sur le sommet C-2 de la thymine ou de l'uracile. L'invention a plus particulièrement pour objet une sonde constituée d'un fragment d'oligonucléotide de structure prédéterminée par l'application envisagée. ca- ractérisée en ce qu'une partie au moins des groupes adéni- ne y est remplacée par des groupes adénine modifiés par introduction, sur le sommet C-2 du cycle pyrimidine. d'un groupement susceptible de donner une liaison hydrogène avec l'atome d'oxygène fixé sur le sommet C-2 de la thy- mine ou de l'uracile. - Pour qu'une liaison hydrogène relativement stable de ce type puisse s'établir, il convient que le groupement introduit sur le groupe adénine soit le plus court possible. Des groupements préférés de ce type sont les groupements -NH2, -OH et -SH. Le groupement -NH2 est particulièrement preferé. Selon un mode préféré de réalisation. l'invention a pour objet une sonde constituée d'un fragment d'oligo- nucléotide de structure prédéterminée par l'application envisagée, caractérisée en ce qu'une partie au moins -5- des groupes adénine y est remplacée par des groupes adé- nine modifiés par introduction, sur le sommet C-2 du cycle pyrimidine d'une groupement -NH2. -OH ou -SH, de préféren- ce -NH2. c'est-à-dire des groupes représentés par la formu- le générale NH2 N dans laquelle R représente -NH2.-OH ou -SH. La sonde selon l'invention peut, de façon particu- lièrement avantageuse, remplacer une "sonde mixte" telle que définie plus haut qui est déduited'une séquence parti- culière d'aminoacides et comporte des ambiguités. On a en effet découvert qu'on pouvait obtenir une sonde donnant une hybridation analogue à celle d'une sonde mixte et conférant une sensibilité analogue dans la détec- tion après hybridation avec des séquences complémentaires, en réalisant une séquence déduite d'une séquence particu- lière d'aminoacides dans laquelle chaque dégénérescence est remplacée par l'un des nucléotides de la dégénérescen- ce. notamment T pour une dégénérescence C/T et G pour une dégénérescence G/A,et au moins une partie des groupes adé- nine est remplacée par des groupes adénine modifiés tels que définis plus haut. Cette découverte est surprenante, notamment dans la mesure o. comme indiqué plus haut et comme il résulte clairement des essais comparatifs décrits plus loin, le choix de nucléotides particulieisdans les cas de dégénérescence peut conduire à des "mismatchs" qui ont pour conséquence un manque de sensibilité dans la dé- tection, voire même une quasi-impossibilité d'utiliser la sonde obtenue. Selon un mode particulièrement avantageux de réali- sation, l'invention a donc pour objet une sonde telle que définie plus haut, caractérisée en ce qu'elle est consti- tuée d'une séquence déduite d'une séquence particulière -6 - d'aminoacides et dans laquelle chaque dégénérescence est remplacée par l'un des nucléotides de la dégénérescence, notamment T pour une dégénérescence C/T et G pour une dé- générescence G/A. Bien que cela ne soit pas indispensable, il est préférable dans tous les cas, et en particulier dans ce dernier mode de réalisation de l'invention, pour obtenir une meilleure sensibilité de détection, de remplacer tous les groupes adénine du fragment d'oligonucléotide par des groupes adénine modifiés tels que définis plus haut. Pour la plupart des applications. la sonde selon l'invention comporte moins de 20 nucléotideso Toutefois. pour certaines applications particulières. il peut être souhaitable de disposer d'un fragment plus "long" d'oli- gonucléotide. Compte tenu de 1' absence d'ambiguités, il n'existe en principe aucune limitation "technique" à la préparation de fragments plus longs. Ainsi. on a montré qu'il était possible d'obtenir des séquences comportant plus de 40 nucléotides. La sonde selon l'invention peut être préparée selon tout procédé classique de préparation de fragments d'oligonucléotides en remplaçant une partie au moins des groupes acide adénylique ou acide désoxyadénylique. selon que l'on prépare un fragment d'ARN ou respectivement d'ADN. par des groupes acide adénylique ou respectivement désoxyadénylique comportant -chacun un groupe adénine mo- difié tel que défini plus haut. Avantageusement, la préparation est effectuée en phase solide essentiellement par fixation d'un mono- mère, dimère ou trimère par son extrémité 3' sur l'extré- mité 5' du nucléotide terminal 3' de la séquence désirée, f i x é sur un support solide, puis fixations successives de monomères, dimères et/ou trimères, à chaque fois sur le nu- cléotide terminal 5' de la chaîne obtenue, jusqu'à obtention de la fraction d'oligonucléotide désirée, avec séparation subséquen- -7- te éventuelle du support. Une telle préparation peut être effectuée selon les indications données par B.L. Gaffney et coll. dans les ar- ticles cités plus haut. On entend ici par "monomère". "dimère" ou "trimè- re" des groupes constitués respectivement de 1,2 ou 3 acides nucléiques. identiques ou différents. devant entrer dans la constitution de la sonde. Il va de soi qu'au moment de la synthèse, les fonc- tions réactives de ces groupes dont la participation à la réaction envisagée n'est pas souhaitée, doivent être pro- tégées au moyen de groupes protecteurs pouvant être ensui- te éliminés dans des conditions non dégradantes pour la sonde obtenue. A titre d'exemple non limitatif, la préparation de - monomères. dimères et trimères portant des groupes protec- teurs de ce type peut être effectuée selon les indications de K. Itakura et coll. dans Nucleic Acids Research, (1980),8, 5507. Le déblocage des groupes protégés et la purification de l'oligonucléotide obtenu peuverit'être effectués selon les indications de S. Tran Dinh et coll. dans Eur, J, Biochem. (1983). 133. 579-589 ou de R.W. Barnett et coll. dans Tetrahedron Lett. (1981). 22. 991-994. Pour la préparation des monomères. dimères et tri- mères contenant un groupe adénine modifié. on utilise avantageusement un nucléotide préparé par phosphorylation du nucléotide correspondant. à savoir no- tamment. dans la série des ADN: - lorsque le groupe adénine doit être modifié sur le somment C-2 de la pyrimidine par un groupe -NH2. la Odiméthoxytrityl-5' NtN'diisobutyryl amino-2 désoxy-2' adénosine préparée à partir de la désoxy-2' guanosine, par ana- logie avec la technique décrite par W.L. Sung dans J.C.S. (Comm), 1089 (1981) en relation avec la thymidine; -8- - lorsque le groupe adénine doit être modifié sur le som- met C-2 de la pyrimidine par un groupe -OH, la O-diméthoxy- trityl-5' N-isobutyryl hydroxy-2 désoxy-2' adénosine qui peut être préparée également par analogie avec la méthode de W.C. Sung, à partir du nucléoside dérivé de la xanthine correspondant et - lorsque le groupe adénine doit être modifié sur le som- met C-2 de la pyrimidine par un groupe SH. la O-diméthoxy- trityl-5' N-isobutyryl mercapto-2 désoxy-2' adénosine qui peut être préparée de la même manière quele dérivé hydroxy-2 correspondant, en remplaçant, selon une méthode connue, le groupe OH par un groupe SH. Dans la série des ARN. on peut avantageusement utiliser les adénosines modifiées correspondantes. Pour son utilisation, la sonde ainsi obtenue est avantageusement marquée. en vue de son repérage après hy- bridation, selon une technique usuelle dans le domaine des analyses biologiques. Ainsi. elle peut être marquée radioactivement. notamment au 2p. au moyen de [-2- P]ATP en présence de polynucléotide kinasecomme décrit dans les exemples qui suivent. Par ailleurs, et c'est là un des avantages particu- liers des sondes selon l'invention. les demandeurs ont établi que la présence de groupes adénine modifiés. notam- ment par des groupes -NH2 sur le sommet C-2 du cycle pyri- midine. favorise la configuration gauche, appelée configu- ration Z,des hybrides5. formés à partir des séquences de ce type, par rapport à la configuration usuelle B, et que dans la configuration Z, les groupes adénine modifiée sont plus accessibles à des réactifs extérieurs. -9- Ceci permet leur repérage, notamment par des anticorps spécifiques de ces bases,de préférence monoclonaux, alors que la configuration B ne permet que difficilement, voire même empêche, l'accession des réactifs aux bases. L'invention vise également une sonde telle que définie plus haut, marquée radioactivement, notamment par 32P. L'invention vise encore les oligonucléotides com- prenant des groupes protecteurs et correspondant aux son- des selon l'invention, éventuellement liés à des supports solides. Elle comprend également les oligonucléotides du type susmentionné comprenant outre les groupes adénine modifiée utilisés selon la présente invention et les bases utilisées habituellement dans la synthèse d'oligonucléoti- des, d'autres bases dont la présence pourrait être jugée nécessaire, notamment des bases modifiées X et/ou Y, dont l'utilisation fait l'objet de la demande de brevet dépo- sée le même jour par les mêmes demandeurs et ayant pour titre "sonde mixte et ses applications, son précurseur, leur prépa- ration et dérivés comportant une base modifiée pour cette préparation". Ces bases modifiées donnent au déblocage un mélange, notam- ment équimoléculaire selon les conditions de la réaction, d'uracyle et de cytosine ou de thymine et de méthyl-5 cytosine d'une part, et de guanine et d'amlno-2 adénine d'autre part, selon le schema: R R R C X R =H U Mec R= CH3 T 9407 -10- f4H2 4 mf4 IHR t 2 r H2 Y G NH - N2 A L'invention comprend également les sondes obtenues au déblocage des oligonucléotides contenant les bases X et/ou Y. La sonde selon l'invention peut donc être avanta- geusement utilisée dans des techniques d'analyse ou d'extraction, notamment d'ARN messagers ou d'ADN complé- mentaires, faisant appel à des mises en évidence compor- tant la formation de complexes immuns, notamment des réactions immuno-enzymatiques. I1 sera décrit ci-après, à titre d'exemple, l'ap- plication de l'invention à la résolution du problème posé par l'isolement de l'ADN complémentaire (cADN) de l'anti- thrombine III. La séquence d'aminoacides prise en considération est -11- 251Met - Met Tyr -Gln -Glu - G2y256 ce qui correspond à la séquence d'acides ribonucléiques: OH U A A ' AUG AUG UAC CAG GAG G G.3'... OH et à un cADN pouvant s'écrire: OH'TA' ' ATG-ATG TA CAA CA G 3' C G G OH et qui comprend 3 ambiguités. On a préparé trois sondes destinées à s'hybrider avec ce cADN, à savoir: 1 une sonde mixte comportant les trois ambiguités corres- pondantes (mélange de 8 hexadécameres): SOH T T A 'O C CTCcTGGTACATCAT 3OH C C G OH, cette sonde a été construite à partir de triplets en phase solide selon la technique de R.B. Wallace et coll. décrite dans Nucleic Acids Research (1981). 9. 8793 2 la séquence spécifique ' OH CTTCTTGGTACATCAT 3'OH qui a été préparée à l'aide de dimères et trimères en phase solide selon la technique de H. Ito et coll., décrite dans Nucleic Acids Research (1982), 10, 1755. dans cette séquence lorsqu'il y avait dégénérescence C/T on a choisi T. et en G/A on a choisi G. pour les raisons indiquées plus haut; dans ce choix.on a lntroduit un "mismatch" sur seize nucléotides (voir plus loin la struc- ture réelle du cADN)' la séquence spécifique OH * * * ' CTTCTTGGTA CA TCA T 3' -- -- -- OH selon l'invention qui a été préparée à l'aide de monomères, dimères et trimères en phase solide selon les techniques indiquées plus haut en référence à ce type de séquençage; dans cette séquence. le choix de la dégénérescence est le meme que sur la séquence n" 2 et on a remplacé l'adénosine -12- A par l'amino-2 adénosine A*; on a montré que cette sé- quence forme. avec le cADN. un hybride plus stable que la séquence n 2 (augmentation de la température de fusion de l'hybride)et donne une hybridation analogue à celle de la sonde mixte n 1. Ces trois sondes ont été marquées au 32p et ont servi à analyser une "banque" contenant le cADN de l'anti- thrombine III. Les sondes n' 1 et 3 ont permis d'isoler le cADN dont la structure a été prouvée par séquençage être: ' OH ATGATGTACCAGGAAG 3' OH Dans cette formule. on a souligné d'un trait les nu- cléotides pour lesquels il y avait ambiguité. mais sans "mismatch" pour les sondes n s 2 et 3 et de deux traits celui pour lequel il y a "mismatch" des sondes n s 2 et 3. PARTIE EXPERIMENTALE Exemple préliminaire: Préparation du dérivéprotégé d'acide désoxyadénylique modifié: O-diméthoxytrityl-5' 0-(chloro-2 phényl cyanoéthyl) phos- phate-3' NN'diisobutyryl amino-2 désoxy-2' adénosine (DMT A2-NHiBu P) _iBu Dans un ballon séché à l'étuve. 312 mg (4.52 mmoles) de triazole sublimé sont dissous dans 4.5 ml de dioxanne anhydre. On ajoute 372 mg (1, 50'mmoles) de 2-chlorophényl phosphorodichloridate et, à 0 C, 445 pl de triéthylamine anhydre. On obtient un épais précipité blanc qui est laissé sous agitation à température ambiante pendant une heure et demie. On filtre ce précipité qui est lavé avec du dioxan- * ne directement sur 620 mg (0,94 mM) de O-diméthoxytrityl- ' NN'diisobutyryl amino-2- désoxy-2' adénosine (TA2 -NHiBu (DMT A -iBu) coévaporé 2 fois à la pyridine. On laisse i Bu sous agitation pendant une heure, puis on ajoute 160 pl de cyanoéthanol et 233 p1 de N-méthyl imidazole. Deux heures -13- après, la réaction est terminée, le produit est évaporé à sec, repris avec du dichlorométhane, lavé deux fois avec du NaH2PO4 à 5 %. une fois avec du NaHCO3 à 5 % et une fois avec l'eau. La phase organique est séchée sur sulfa- te de sodium, filtrée et évaporée à sec. La mousse obtenue est précipitée à l'éther de pétrole, puis chromatographiée sur colonne de silice éluée au dichlorométhane enrichi progressivement en méthanol. On obtient 470 mg (rendement 2-NHiBu 47 %) de nucléotide DMT A iBu P. [CCM: 0.70 CH2C1 2MeOH (90-10)] Exemple 1: Synthèse de la sonde mixte n 1 La sonde mixte a été"montée"à partir de 19 mg de résine T (résine portant le nucléotide T et préparée selon la technique de K. Itakura et coll. décrite dans Nucleic Acids Research (1980)j 8). 5473) avec les trimères sui- vants préparés selon la technique de K. Itakura et colle indiquée plus haut. CTT CTT GAT + + + ACA TCA T CCT CCT GGT CCT CCT GGT Support solide Rendements: 86 % 83 % 79 % 50 % Après le dernier couplage, la résine est traitée par 5001il d'un mélange molaire de pyridine aldoxime (PAO)dans la tétramé- thyl guanidine (TMG) additionné de 500 j1 de TMG pendant une nuit. Après évaporation à sec et chauffage avec l'am- moniaque concentréeà 50 C pendant 3 heures, le milieu réactionnel est purifié par chromatographie sur une colon- ne de Sephadex G-10 (dénomination commerciale de la socié- té Pharmacia pour une colonne de polysaccharide réticulé) suivie d;une chromatographie liquide haute performance (HPLC) sur colonne en phase inverse. Le mélange d'oligonu- cléotides est ensuite détritylé avec l'acide acétique à 80 % pendant 5 mn. évaporé à sec (9 D.O) (1 D.O. = une -14- unité de densité optique, c o r r e s p o n d a n t à - 40 jug de séquence) et purifié par électrophorèse préparative sur gel d'acry- lamide. Exemple 2: synthèse de la séquence n 2 De même, la séquence n 2 est synthétisée en phase solide à partir de 20 mg de résine T avec le trii- sopropyl-benzène sulfonyl nitro-triazole (TPSNT) comme agent de couplage CTT CTT GGT AC AT CA T Ir I i IrT Rendements: 61% 82% 74% 78% 96% La séquende est purifiée comme décrit auparavant,en rela- tion avec l'exemple 1 (6,6 D.O.). Exemple 3: synthèse de la séquence n 3 selon l'inven- tion (avec A*) La séquence contenant A* est synthétisée à partir de 30 mg de résine T CTT CTT GGT A* C A* TC A* T t t t 'r T Rendements:-63% 98% 76 heures apres le chauffage avec l'ammoniaque concen- trée. Après purification par HPLC et électrophorèse, on obtient 2 D.O. de l'oligonucléotide. Exemple 4: marquage des sondes n s 1,2 et 3 au 32p On ajoute 50,Uxi de [ Y-32P]ATP sur 100 pmolesde la sonde dans un volume de 4.1l de mix et O0.5>.1 de poly- nucléotide kinase [activité 5-20 103 unités/ml, Boehrin- ger Mannheim]. On laisse une demi-heure à 37 C [T. Mania- tis et coll. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Lab. (1982)]. La réaction est stoppée par addition de 1t3/1 de tampon au bleu de bromophénol 100 mM d:EDTA. 50 % de glycérol. Le produit marqué est purifié sur gel (0.4 x 69407 -15- x 40 cm) contenant 19 g de bisacrylamide, 19 g d'acry- lamide et 10 ml de tris borate 1 M pour un volume total de 100 ml. L'électrophorèse sous programmation: 2000OV, 43 W. 40 mA, est arrêtée quant le bleu de bromophénol atteint le tiers de la longueur de la plaque. La bande radioacti- ve est découpée et extraite pendant une nuit dans 2 ml d'eau. Exemple 5: hybridation 3 colonies contenant un cADN complet de l'AT Ii et 3 colonies contenant un cADN non relaté à 1'ATIII on été repiquées en 3 exemplaires sur boîtes de milieu complet avec 50 pg/ml d'ampicilline.-Les colonies ont été trans- férées sur 3 filtres de type Whatman 541, amplifiées 20 heures sur boîtes contenant 250 pg/ml de chloramphénicol et préparées pour l'hybridation. selon la technique dé- crite par J.P. Gergen et coll. dans Nucleic Acids Research. (1979). 7. 2115. Les filtres ont été préhybridés 2 heures à 42 C en 6 NET (1 NET = 0,15 M NaCl.. 0.015 M tris HC1. pH = 7,5. 0,001 M EDTA). 0.5. Monidet P40 (dénomination commerciale pour un détergent), 100,ug/ml de tRNA de le- vure et 100 ig/ml d'ADN soniqué de sperme de saumon [technique de T. Maniatris et coll. dans l'article cité plus haut]. L'hybridation a été effectuée à 42 C pendant 20 heures dans la même solution en présence de 106 cpm d'oligonucléotide marqué en 5' au [_2 P]ATP, chaque filtre ayant été hybridé avec une des 3 sondes. Les fil- tres ont été lavés 4 fois 15 minutes à 40 C en 6 SSC (1 SSC = 0.15 M NaCl, 0,015 M citrate de sodium, pH = 7.2), 0.1 % de dodécyl sulfate de sodium (SDS). Les filtres ont été soumis à une autoradiographie. L'hybridation est visible sur la sonde mixte 1 (1 séquence sur 8 est complémentaire du cADN) et sur la sé- quence spécifique 3 comportant 3 A* (l"mismatch" et 9/16 paires de type GC) alors que la séquence 2 (l"mismatch" et 6/16 -16- paires de type GC) ne s'hybride pas. La différence de température de fusion des hybrides avec les sondes n s 2 et 3 est de l'ordre de 7 C (1'hybride formé avec la sonde n 3 ayant le point de fusion le plus élevé). o o o Il est rappelé que le "mix" est un mélange de: - tris(hydroxyméthyl) aminométhane (500 mM, pH 8); - MgC12 (100 mM); et - dithiotréitol (50 mM). -17- Revendications 1. Sonde constituée d'un fragment d'oligonucléotide de structure prédéterminée par l'application envisagée, caractérisée en ce qu'une partie au moins des groupes adénine y est remplacée par des groupes adénine modifiés de telle sorte qu'ils soient susceptibles de former trois liaisons hydrogène avec les groupes réactifs de la thymi- ne ou de l'uracile. 2. Sonde constituée d'un fragment d'oligonucléoti- de de structure prédéterminée par l'application envisagée, caractérisée en ce qu'une partie au moins des groupes adé- nine y est remplacée par des groupes adénine modifiés par introduction. sur le sommet C-2 du cycle pyrimidine, d'un groupement susceptible de donner une liaison hydrogène avec l'atome d'oxygène fixé sur le sommet C-2 de la thy- mine ou de l'uracile. 3. Sonde constituée d'un fragmentd'oligonucléotide de structure prédéterminée par l'application envisagée, caractérisée en ce qu'une partie au moins des groupes adénine y est remplacée par des groupes adénine modifiés, représentés par la formule générale NH2 NN tNX AR dans laquelle R représente -NH2. -OH ou -SH, de préféren- ce -NH2. 4. Sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une séquence déduite d'une séquence particulière d'aminoacides et dans laquelle chaque dégénérescence est remplacée par l'un des nucléotides de la dégénérescence. notamment T pour une dégénérescence C/T et G pour une dégénérescence G/A. 5. Sonde selon l'une quelconque des revendications -18- 1 à 4. caractérisée en ce que tous les groupes adénine y sont remplacés par des groupes adénine modifiés, de préfé- rence par des groupes amino-2 adénine. 6. Sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. caractérisée en ce qu'elle est marquée en vue de son repérage après hybridation. notamment radioactivement, ou par une protéine. notamment un anticorps ou une enzyme. 7. Oligonucléotide éventuellement lié à un support solide et portant éventuellement des groupes protecteurs sur ses fonctions réactives. pour la préparation d'une son- de selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 8. Procédé pour la préparation de la sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou de l'oligo- nucléotide selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à effectuer, en phase so- lide, la fixation d'un monomère, dimère ou trimère par son extrémité 3' sur l'extrémité 5' du nucléotide terminal 3' de la séquence désirée, fixé sur un support solide puis à fixer successivement des monomères, dimères et/ou trimères, à chaque fois sur le nucléotide terminal 5' de la chaîne obtenue, jusqu'à obtention de la fraction d'oli- gonucléotide désirée, avec séparation subséquente éven- tuelle du support. 9. Utilisation de la sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 dans le domaine des analyses et extractions biologiques, notamment de détection et d'ex- traction d'ARN messagers et d'ADN complémentaires, au moyen d'une hybridation. 10. Utilisation selon la revendication 9, caractéri- sée en ce que la mise en évidence est faite au moyen de réactions immunologiques ou immunoenzymatiques et/ou par marquage radioactif.