FR 2572093 A1 19860425 FR 8416136 A 19841022 La présente invention concerne un nouveau milieu de culture cellulaire contenant des cellules de rate humaine un procédé de culture utilisant ce milieu de culture, des lignées de cellule lymphoblas- toides, une application à la production d'interféron, un procédé de préparation d'interféron et interférons ainsi produits. L'interféron est une molécule protéinique secrétée par des types cellulaires divers. Il est sensé bloquer les multiplications de certains'virus et de cellules cancéreuses. Il existe plusieurs types d'interférons. L'interféron alpha est secrété par les lymphocytes et présumé bénéfique dans le traitement du rhume de la grippe et de certains cancers. L'interféron est spéci- fique de l'espèce, ce qui signifie que seul l'interféron humain est efficace pour le traitement de maladies dans l'espèce humaine. La production d'interfëron adapté au traite- ment de maladies humaines est dépendant de gênes localisés dans les cellules d'origine humaine. Une ligne de recherche destinée à la production de l'interféron réside dans l'excision du gêne et sa réinsertion dans une bactérie. Le présent inventeur estime cependant que cette technique de production séduisante en soi, n'est pas une panacée car la technique d'excision et de réinser- tion du gêne est ardue étant donné que les bactéries transformées ne produisent pas nécessairement une molécule d'interféron active, la production d'interféron par unité bactérienne et le passage de cette production du stade laboratoire aux stades pilote et industriel est plus qu'aléatoire. Le présent inventeur s'est attaché un mode de production de l'interféron alpha qui repose sur la culture de cellules humaines. En règle générale, l'inter- féron alpha s'obtient par une inoculation de lymphocytes humainsau moyen de virus Sendai, mais cette technique est laborieuse et fournit un produit qui nécessite des étapes subséquentes de purification importantes. Le présent inventeur s'est donc posé le nouveau problème technique consistant en d'une part l'élaboration d'un système de multiplication cellulaire amenable à des développements industriels, et, d'autre part,la mise au point d'un nouveau milieu de culture qui n'entraîne qu'un minimum de contamination sérique de façon à éviter des étapes laborieuses de purification du produit obtenu. Ce nouveau problème technique est résolu pour la première fois par la présente invention de manière satis- faisante, d'une manière particulièrement simple et repro- ductible, même au niveau industriel. Ainsi,la présente invention, selon un premier de ses aspects, concerne un nouveau milieu de culture cellu- laire, caractérisé en ce qu'il comprend des cellules de rate humaine sous une forme prête à la culture, et un support de culture adéquat pour la culture desdites cellu- les de rate humaine, de préférence contenant des protéines sériques, encore de préférence préparées au moins en partie à partir de sérum purifié ou traité de manière connue en soi pour rendre ce support de culture apyrogène et atoxique. Selon une caractéristique particulière de ce milieu de culture cellulaire selon l'invention, celui-ci est caractérisé en ce que les cellules de rate humaine sont obtenues à partir de rate humaine émincée stérile- ment, sans perfusion préalable, dans une solution de Hank's glacée ed passée sur un tamis stérile. D'autre part, selon un mode de réalisation particulier, avantageux, le support de culture est supplé- menté par une fraction sérique humaine pauvre en gamma globuline et en pré-albumine, non toxique pour la souris et apyrogène. Selon un mode de réalisation préféré, la fraction sérique humaine est diluée à 5 % de protéines, traitée à - 3 C et PH =7,2 par de lTéthanol en quantité nécessaire et suffisante pour précipiter le fibrinogène, puis portée à moins 6 C et pH 5,85 et une concentration en éthanol comprise entre 10 % et 20 %, le précipité obtenu étant écarté et le surnageant étant collecté et utilisé comme supplément protéinique dudit milieu de culture. Selon une autre caractéristique du milieu cellu- laire selon l'invention, celui-ci est amené à une concen- tration de 5.10 leucocytes viables par millilitre. Selon une autre caractéristique particulière de l'invention, ce nouveau milieu de culture cellulaire est caractérisé en ce qu'il se trouve sous formeresuspendue dans un milieu RPMI, enrichi de 2 à 10 % de la fraction sérique suivante: 80 % en poids d'albumine, 3 % en poids d'alpha 1globuline; 6 % en poids d'alpha 2-globuline; et 9 % de béta-globuline, ne contenant pas de pré-albumine ni de gamma globuline détectables. La présente invention concerne également un procédé de culture caractérisé en ce qu'il comprend la culture du milieu de culture cellulaire précité, avanta- geusement comprenant les étapes suivantes: - une incubation à 37 C dans une atmosphère enrichie en C02; une maintenance de la culture à cette concen- tration cellulaire durant 3 à 5 semaines, avec de préférence contrôle de la concentration cellulaire; et - isolement des lignées cellulaires lymphoblas- toides en suspension dans le milieu de culture, de préférence lorsque la densité cellulaire est comprise entre 2.105 et 5.105 cellules par millilitre de milieu de culture. Selon une caractéristique préférée de ce procédé, les lignées de cellules lymphoblastoldes en suspension isolées, sensiblement sans cellules adhérentes nourricières, sont multipliées en suspension dans des fermenteurs. La présente invention concerne également, selon un autre deses aspects,des lignées de cellules lymphoblas- toides obtenues par ce procédé de culture. D'autre part, la présente invention concerne également l'application du nouveau milieu de culture et des lignées de cellules lymphoblastoides à la production d'interféron. La présente invention concerne également,selon encore un autre de ses aspects'un procédé de préparation d'interféron, en particulier d'interféron alpha, caracté- risé en ce qu'il comprend l'ajout d'un inducteur d'inter- féron aux lignées de cellules lymphoblastoides précitées; et de préférence la séparation de l'interféron. Selon une caractéristique préférée de ce procédé de préparation d'interféron, l'inducteur d'interféron est choisi parmi le (poly I: C) (poly acide inosinique: acide cytidylique) additionné de protamine, en particulier pour les lignées ST 1 et ST 2; et le virus Sendai, en particulier pour les lignées ST 3, CA et CB. - La présente invention concerne enfin l'interféron, en particulier l'interféron alpha produit par le procédé de production précité. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à la lumière de la description explicative de l'invention qui va suivre, donnée simplement à titre d'illustration et qui ne saurait donc en aucune façon limiter la portée de l'invention. - I. MILIEU DE CULTURE CELLULAIRE SELON L'INVENTION Le milieu de culture cellulaire selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend des cellules de rate humaine sous une forme prête à la culture, et un support de culture adéquat pour la culture desdites cellules de rate humaine, de préférence contenant des protéines sériques, encore de préférence préparées au moins en partie à partir de sérum purifié ou traité de manière connue en soi pour rendre ce support de culture apyrogène et atoxique. Les cellules de rate humaine sont par exemple obtenues par découpage denorceauxde rate humaine obtenue à l'autopsie de donneurs sains. Ces morceaux de rate humaine sont passés à travers un tamis (0,075 mm), les cellules étant recueillies dans une solution glacée de Hank's. Après lavage, les cellules de rate humaine sont transférées dans un milieu RPMI. De préférence, comme précédemment indiqué, le sup- port de culture contient des protéines sériques ou est supplémenté d'une fraction sérique qui est de preférence humaine. Ainsi, de préférence, le milieu RPMI dans lequel sont transférées les cellules de rate humaine, est supplémenté respectivement avec 4 %(poids/volume) des deux préparations suivantes, en comparaison d'un milieu additionné de 10 % de sérum de veau foetal servant de contrôle. 1). Une fraction sérique appauvrie en gamma- globulines (dénommée AFF). La composition obtenue après lyophilisation est donnée au tableau I: TABLEAU I (: :) (: AFF : EPF (: :) (: :) ( Préalbumine: 1 % : 0 (: :) ( Albumine: 74 % : 82% (: :) ( alpha 1-globuline: 9 %: 3 % (: :) ( alpha 2-globuline: 2,5 %: 6 % (: :) ( -globuline: 12,5 % : 9 % (: : ( gamma-globuline: 1 %: 0 (: :) () (: 100 % : 100 % ____________________) Ce matériel a été préparé d'après Goose et al. (Applied Microbiology: (1973), 25, 325-326), qui l'avait mis au point pour l'obtention d'interféronL induit dans des cellules cultivées in vitro. 21. Une fraction sérique dénommée EPF, obtenue de la façon suivante: - le plasma dilué dans une solution isotonique phosphatée à une concentration protéique de 5 % est traité à -30C, pH 7,2 par de l'éthanol à 1 %. Un précipité de fibrinogène apparaît qui est écarté par centrifugation ou filtration. - Le surnageant est complété par de l'éthanol jusqu'à une concentration de 19 %, le pH abais- sé à 5,85 par HCl 1N la température abaissée à -6 C.. Un gros précipité apparaît, qui est écarté par centrifugation ou filtration. - Le surnageant est recueilli, dialysé à 4 C contre une solution 0,15 M NaCl pour écarter l'éthanol et ensuite lyophilisée. Dans un autre mode de production, nous avons immédiatement lyophilisé le surnageant, sans dialyse préalable. Dans ce cas, le processus de lyophilisation est plus délicat. Ce procédé de purification du plasma est connu de longue date (Nischmann et al.; Helv. Chim. Acta: (1954) 37, 866-873). Le contenu en protéines de l'EPF est donné dans le tableau I. Une analyse plus détaillée des composants respectifs de ces deux préparations a été effectuée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et a révélé que l'AFF contenait des quanti- tés encore importantes de IgG, IgA, C3, orosomucolde et des traces de IgM et de ceruloplasmine. Par ailleurs, les concen- trations en IgG, IgA et IgM-de la solution de EPF analysée se sont révélées inférieures à 0,02 %. L'intérêt de cette préparation EPF réside essentiellement dans son apyrogénicité et sa non-toxicité chez la souris. 3). Du sérum de veau foetal: Il s'agit d'un ingré- dient usuel des milieux de culture cellulaire. Ces trois préparationssont ensuite utilisées pour établir des lignées lymphoblastoides à partir de la rate humaine. Etant donné que le milieu de culture EPF précédem- ment énoncé est le plus intéressant, l'établissement de lignées cellulaires à partir de cet agent nutritif sera principalement décrit, dans le but d'obtenir des souches cellulaires aptes à produire par la suite de l'interféron après culture dans un milieu de croissance contenant ce produit. I. CULTURE CELLULAIRE DE LYMPHOBLASTE Pour ce faire, on utilise le procédé de culture prédédemment mentionné, et qui est caractérisé en ce qu'il comprend la culture des milieux de culture cellulaire précédemment décrits, avantageusement comprenant les étapes -suivantes: - - une incubation à 37 C dans une atmosphère enrichie en C02; - - un maintien en culture pendant 3 à 5 semaines,avec de préférence contrôle de la concentration cellulaire; et - isolement des lignées de cellules lymphoblastoldes en suspension dans le milieu'de culture, de préférence lorsque la densité cellulaire est comprise entre 2.105 et 5. 105 cellules viables par ml de milieu de culture. A ce sujet, la culture primaire de cellules de rate humaine exige des fournitures en un organe d'origine humaine qu'il faut pouvoir éviter. Le présent inventeur a réussi à cultiver "in vitro" de façon permanente des leucocytes de rate originaire de donneurs sains, dans un milieu RPMI 1640 additionné de EPF, précédemment mentionné, et qui se sont révélés d'excellents producteurs d'interféron alpha. Comme indiqué précédemment, les rates humaines prélevées à-l'autopsie sont émincées stérilement, sans perfusion préalable, dans une solution de Hank's glacée et passées sur un tamis stérile. Les cellules lavées dans une solution de Hank's sont re- suspendues dans un milieu RPMI 1640 contenant 2mK de L-glutamine ainsi que des antibiotiques, et enrichies de 2 à 10%, selon les cultures, en poids, en milieu EPF précité. 2572O93 La concentration cellulaire est de préférence amenee à 5.105 leucocytes viables par ml de milieu de culture. Ensuite 10 ml de cette concentration cellulaire sont ensemencés dans des bouteilles Falcon de 75 cm2. Les cellules sont incubées à 37 C dans une atmosphère contenant 5% de C02, le reste étant constitué par de l'air et maintenues en culture avec ajustement régulier à une densité cellulaire de 5.105 cellules viables par ml de milieu de culture. Après une semaine de culture dans ces conditions, les cellules adhérentes au plastique se multiplient activement, pour devenir confluentes après trois semaines de culture. Simultanément, le nombre de petits lymphocytes croissant librement en suspension diminue pour finalement disparaître tandis que des cellules lymphoblastoïdes se multipliant à la surface des cellules adhérentes qui leur servent de nourrice, apparaissent. Leur nombre augmente au cours du temps, pour, après environ un mois de culture dans ces conditions, passer en suspension. Les lignées de cellules lymphoblastoïdes (LyCL libérées de la dépendance des cellules nourricières adhérentes continuent à se multiplier en suspension. Après obtention d'une densité cellulaire critique, qui s'est révélée à l'étude différente pour chaque lignée cultivée mais qui est en général comprise entre 2.105 et 5.105 cellules par ml de milieu, les LyCL peuvent être transférées et multipliées dans une autre bouteille ou fermenteur, en l'absence de cellules adhérentes nourricières - Elles se multiplient alors sous un mode logarithmique et peuvent, une fois ce stade atteint, être transférées dans des fermenteurs et cultivées industriellement. Les lignées qui ont été isolées par le- présent inventeur selon cette méthode ne sont pas toutes identiques. Les cellules qui les composent varient d'aspect selon leur apparent degré de maturité. Les cellules les plus matures sont les petits lymphocytes. Ils ne sont pas présents le plus fréquemment, la forme la plus commune étant le lymphoblaste immature. Cependant, une évaluation de volume moyen des cel- lules effectuée au milieu de la phase logarithmique de croissance de chaque lignée a montré que ce volume pouvait varier de 350,um3 à 950 pm3 en fonction de la lignée. Le caractère lymphocitaire B de ces lignées fut analysé pour cinq d'entre elles, toutes les cinq montrant la présence de gamma-globuline de surface. Les cinq lignées analysées montrèrent également la présence d'antigène de virus Epstein-Barr (EBV). Ceci n'est pas étonnant puisque la majorité de la population adulte saine est porteuse de ces antigènes. La plupart des lignées lymphoblastoides analysées se sont révélées diploïdes, une seule lignée étant hypoté- traploide. Toutes avaient un cytoplasme basophile. Cinq lignées Ly CL obtenues par la technique décrite ci-dessus, o l'EPF a été utilisé dans les milieux de culture, furent cultivées une dernière fois dans trois mi- lieux de culture différents par le composé d'origine sérique utilisé dans la préparation. Les cing lignées sont ensuite testées pour la capa- cité de production d'interféron. III. APPLICATION A LA PRODUCTION D'INTERFERON Les lignées de cellules lymphoblastoides, selon un autre des aspects de l'invention, sont utilisées ou appli- quées à la production d'interféron. Le procédé de préparation d'interféron est, comme précédemment mentionné, caractérisé en ce qu'il comprend l'ajout d'un inducteur d'interféron aux lignées de cellules lympho- blastodes précédentes, et de préférence la séparation de l'interféron. L'invention concerne également l'interféron produit par ce procédé. ll De préférence, l'inducteur d'interféron utilisé est choisi parmi le groupe consistant de poly (I: C) (poly (acideinosinique: acide cytidylique))additionné de protamine pour les lignées ST 1 et ST 2; et du virus Sendai pour les lignées ST 3, CA et CB. Les résultats qui ont été obtenus sont réperto- riés dans le tableau II. TABLEAU II ( Lignées lymphoblas-: TITRE D'INTERFERON EN UNITES/nl) ( tondes humainesB () : Sérum de veau) EPF: AFF foetal (: ::) ( ST 1: 16000 8 000: 2 000) (: ::) ( ST 2: 4 000:000 4 000) (:: :) ( ST 3: 2 000:4 000: 8 000) (: : ::) ( C A: 32 000:8 000: 64 000) (: ::) ( C B: 1: 2 0002000: 2 000) (:::) On peut donc constater à partir du tableau II que l'interféron est obtenu, en quantités variables, par les deux techniques d'induction appliquées. D'autres inducteurs peuvent bien entendu-être utilisés. Comme on peut le voir au tableau II, on a égale- ment réalisé une croissance de cellules lymphoblastoides sur les deux autres adjuvants sériques AFF et le sérum de veau foetal. On peut constater ainsi que les 3 adjuvants sériques utilisés pour la croissance de cellules Iympho- blastoides sont adéquats pour cette production, celui conte- nant un minimum de matériel contaminant (c'est-à-dire le EPF) étant préféré pour l'obtention d'interféron destiné à un usage thérapeutique. D'autres formulations peuvent bien entendu être développées pour laculture des cellules, telles l'albumine humaine ou bovine ou encore un extrait purifié des facteurs de croissance contenus dans le sérum, sans pour autant sortir du cadre ou de la portée de l'invention. 2572 093 R E V E N D ICAT I 0 N S 1.- Nouveau milieu de culture cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend des cellules de rate humaine sous une forme prête à la culture, e t un support de culture adéquat pour la culture desdits cellules de rate humaine, de préférence contenant des protéines sériques, encore de préférence préparé au moins en partie à partir de sérum purifié ou traité de manière connue en soi pour rendre ce support de culture apyrogène et atoxique. 2.- Milieu de culture cellulaire selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules de rate humaine sont obtenues à partir de rate humaine, émincée stérilement, sans perfusion préalable, dans une solution de Hank's glacée et passée sur un tamis stérile. 3.- Milieu de culture cellulaire selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le support de culture est supplémenté par une fraction sérique humaine pauvre en gamma-globuline et en pré-albulmine, non toxique pour la souris et apyrogène. 4.- Nouveau milieu de culture cellulaire selon la revendication 3, caractérisé en ce que la fraction sérique comprend 82 % en poids d'albumine; 3 % en poids d'alpha 1-globuline; 6 % en poids d'alpha 2- globuline et 9 % en poids de béta-globuline, sans gamma- globuline et sans pré-albumine. 5.- Milieu de culture cellulaire selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est amené à une concentration cellulaire de 5.105 leuco- cytesviablespar millilitre. 6.- Milieu de culture selon l'une des revendica- tions 1 à 3, 5, caractérisé en ce que la fraction sérique précitée est une fraction sérique humaine diluée à 5 % de protéine, traitée à - 3 C et pH 7,2 par de l'éthanol en quantité nécessaire et suffisante pour précipiter le fibrinogène, puis porté à - 6 C et à pH 5,85 et une con- centration en éthanol comprise entre 10 % et 20 %, le précipité obtenu étant écarté et le surnageant étant collecté et utilisé comme supplément protéinique précité dans ledit milieu de culture. 7.- Procédé de culture, caractérisé en ce qu'il comprend la culture du milieu de culture cellulaire tel que précédemment défini selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 6, avantageusement comprenant les étapes suivantes: - une incubation à 37 C dans une atmosphère enrichie en C02; - un maintien en culture pendant 3 à 5 semaines, avec de préférence un contrôle de la concentration cellu- laire; et - un isolement des lignées de cellules lympho- bl-astoides en suspension dans le milieu de culture, de préfé- rence lorsque la densité cellulaire est comprise entre 2.105 et 5.10 cellules par millilitre de milieu. 8.- Procédé selon la revendication 7, caracté- risé en ce que les lignées de cellules lymphoblastoides en suspension isolées, et sensiblement sans cellule adhérente * nourricière, sont multipliées en suspension dans des fermen- teurs. 9.- Lignées de cellules lymphoblastoïdes obtenues par le procédé selon la revendication 7 ou 8. 10.- Application du milieu de culture ou des lignées de cellules lymphoblastoides à la production d'interféron, tels que définis selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou 9, respectivement. 25720 93 11.- Procédé de préparation d'interféron, en particulier d'interféron alpha, caractérisé en ce qu'il comprend l'ajout d'un inducteurd'interféron aux lignées de cellules lymphoblastoides selon la revendication 9 ou obtenues par le procédé selon la revendication 7 ou 8 et avantageusement la séparation de l'interféron. 12.- Procédé selon la revendication 11, carac- térisé en ce que l'inducteur d'interféron est du virus Sendai. 13.Interféron, en particulier interféron alpha, caractérisé en ce qu'il est produit par le procédé selon la revendication 11i ou 12.