FR 2567538 A1 19860117 FR 8411073 A 19840712 - 1 - Cette invention est relative à un automate pour l'analyse et le clonage de cultures cellulaires, ainsi que pour l'analyse bactériologique, à savoir à un appareil intégrant les phases d'entretien, d'expérimentation de substances, notanient pharmacologiques, d'analyse optique de la densité et de la forme des cellules, ainsi que de leurs associations, et de repiquage des cellules adhérentes en vue de leur clonage. Actuellement, la culture cellulaire sur support est pratiquée dans des récipients standardisés tels que boîtes de Petri, boîtes multitrous, ou flacons. L'analyse morpholo- gique des cellules vivantes, pratiquée généralement sur microscope inversé en contraste de phase, a pour but de dénombrer les cellules, de repérer la présence de colonies, d'étudier la différenciation spontanée ou provoquée des cellules, ou encore de suivre l'évolution de leur forme et de leur mouvement par micro-cinéma (time-lapse cinematogra- phy). Ces observations sont d'un très grand intérêt pour étudier la croissance et la différenciation normale ou expé- rimentale de cellules, en particulier pour suivre les effets de drogues, hormones, produits toxiques. L'utilisation des récipients actuels implique l'exécution de phases consti- tuant une séquence d'opérations dissociées,avec le passage dans des dispositifs variés, tels que: étuves humides à CO2 pour le stockage, hottes à flux laminaires pour le renouvellement des milieux ou les manipulations de cellules, microscope inversé couplé ou non à un dispositif d'imagerie (caméra vidéo ou caméra photographique). Plusieurs constructeurs de microscope proposent des enceintes thermostatées comprenant un microscope inversé. Il existe, par ailleurs, des platines motorisées et des dispositifs d'analyse d'image. Le Déposant a, pour sa part, montré en 1980 (MIKROSCOPIE) l'utilisation de l'analyse d'image vidéo, - associée à une enceinte thermostatée et à des platines 2- motorisées, pour suivre la cinétique cellulaire. De tels dispositifs de grand volume, associant des composants classiques, peuvent comporter une régulation de la teneur en C02, mais il n'est pas opportun de créer une saturation en eau qui provoquerait inévitablement des zones de condensation et serait source de contamination, mais surtout de détérioration rapide des optiques et de la micromécanique. Ainsi, l'évaporation rapide qui en résulte limite la durée des séquences d'analyse à quelques heures et 48 heures au maximum. De plus, les formes complexes des dispositifs inclus dans l'enceinte ne sont pas appropriées au maintien de la stérilité. Actuellement, ces enceintes, qui incluent un mi- croscope, permettent de suivre l'évolution de cultures maintenues dans les puits d'une boite, mais le passage à l'analyse en temps limité de plusieurs boîtes, et à fortiori l'analyse à long terme, c'est-à-dire incluant des opérations de changement du milieu nutritif, ne sont pas possibles d'une façon automatisée. L'auteur a proposé par ailleurs une solution originale autorisant l'entretien et l'analyse à long terme de boîtes de cultures de formes classiques (Cf. la Demande de Brevet en France n 84 08839). Lorsque les opérations d'entretien, de prélèvement et d'analyse cellulaire ne sont pas à très long terme, ne mettent pas en oeuvre un très grand nombre d'échantillons et ne présentent pas de grands risques de contamination pour l'homme, il est intéressant de concevoir un appareil stricte- ment adapté et optimisé dans tous ses composants. Le but premier de l'invention est d'éliminer ces inconvénients, en particulier en ce qui concerne la durée limitée d'analyse, le nombre restreint de logettes qu'on peut traiter et des champs d'observation qu'on peut examiner, ainsi que les risques de contamination. - 3 - Un autre but de l'invention est de fournir un appareil original qui intègre des opérations qui jusqu'à présent sont dissociées, notamment en ce qui concerne le clonage automatique. Un autre but de l'invention est de fournir un appareil unique et autonome relativement peu coûteux qui n'exige pas l'investissement en salles et en équipements spécialisés. Un autre but de l'invention est de se rapprocher des conditions optimales en supprimant totalement les chocs thermiques et mécaniques, et en réalisant des conditions de culture uniformes indépendamment de l'opérateur. Un autre but de l'invention est de permettre d'asservir, par des logiciels, les conditions d'environnement des cellules, y compris le milieu nutritif, à des paramètres mesurés fréquemment ou même en continu. La présente invention a pour objet un automate-très compact pour l'analyse et le clonage de cultures cellulaires, ainsi que pour l'analyse bactériologique, à savoir un appareil intégrant les phases d'entretien, d'expérimentation de substances notamment pharmacologiques, d'analyse optique de la densité et de la forme, ainsi.que de leurs associations, et de repiquage de cellules en vue de leur clonage, caracté- risé en ce qu'il comprend, en combinaison: - une enceinte à parois isolantes, assurant l'homéothermie et certaines conditions d'am]iance, notamment en termes d'hygrométrie, pourcentage de CO2 et/ou autre, à l'intérieur de cette enceinte, qui est divisée en deux compartiments, dont le premier compartiment est à faible volume et contient: un plateau, de préférence circulaire, comprenant plusieurs micro-puits disposés suivant une ou plusieurs rangées circulaires concentriques, le plateau et les micro- puits étant réalisés en une matière transparente ayant de bonnes qualités optiques, - 4 - au moins un dispositif spécial d'observation microscopique, notamment du type à contraste de phase, un dispositif d'aspiration/injection de milieu cellulaire ou de cellules, garantissant la non contamination, 5. un bloc moteur assurant l'entraînement en rota- tion ainsi que les déplacements vertical et horizontal du plateau, avec positionnement très précis dans les trois directions de mouvement, tandis que le deuxième compartiment de l'enceinte, qui enveloppe le premier compartiment sauf au niveau de la face avant de l'enceinte, contient un dispositifde régulation de la température et de brassage de l'air chaud et, éventuel- lement, un dispositif de stérilisation du premier comparti- ment par flux d'air laminaire, filtré et en circuit fermé, connu en soi, lesdits premier et deuxième compartiments étant séparés par une paroi, éventuellement filtrante,pour permettre la circulation entre ces deux compartiments de 1 'éventuel flux laminaire, et - un bloc réfrigérateur disposé à l'extérieur de l'enceinte ainsi équipée, contenant en particulier les ré- servoirs d'alimentation en milieux nutritifs et différents produits. Selon un mode de réalisation avantageux de l'auto- mate conforme à l'invention, ledit plateau est pourvu d'une ouverture centrale d'accès dudit dispositif d'aspiration/ injection, qui est fixé à la paroi supérieure du premier compartiment, dans un puits d'évacuation et de stérilisation fixé à la paroi inférieure de ce compartiment. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'automate conforme à l'invention, ledit plateau circulaire est placé dans une cassette, notamment métallique et de forme sensiblement carrée qui, lorsqu'elle est équipée d'un couvercle, réalise une configuration proche de la boîte de Petri propre à réduire les risques de contamination et qui comporte un évidement circulaire central de logement du plateau qui, en position de repos, est tenu en place par - 5 - des moyens de support constitués, de préférence, par quatre billes logées dans la paroi dudit évidement et dépassant de cette dernière pour s'encliqueter dans une gorge annulaire ménagée dans la paroi extérieure du plateau, tandis que l'entraînement en rotation du plateau est réalisé à l'aide d'un galet moteur, faisant saillie dudit bloc moteur, par engagement sous l'action de moyens appropriés et par frot- tement dans la gorge du plateau, à cet effet une fenêtre d'accès du galet à cette gorge étant ménagée à la partie médiane, du côté de la cassette adjacent au bloc moteur. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, deux desdites billes sont fixes tandis que les deux autres billes sont sur support élastique, notamment à ressort, les quatre billes étant disposées aux sommets d'un carré inscrit dans la circonférence délimitant ledit évide- ment circulaire, de manière qu'un côté de ce carré,parallèle et contigu à ladite fenêtre d'accès du galet moteur, est défini par les deux billes fixes, tandis que le côté opposé du carré est défini par lesdites deux billes sur support élastique, en sorte que, lors de l'engagement du galet dans ladite gorge, ces deux dernière billes seulement participent au guidage en rotation du plateau, les deux billes fixes venant se dégager de la gorge de ce dernier. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, lesdits moyens permettant l'engagement du galet moteur dans la gorge du plateau sont constitués par un électro-aimant réalisant l'accouplement souple entre les parois métalliques opposées du bloc moteur et de la cassette. Selon encore une autre disposition avantageuse de -6- ce mode de réalisation, la cassette de support est pourvue d'un couvercle transparent, de bonne qualité optique, s'adaptant à ladite ouverture centrale du plateau et pourvue d'une fenêtre radiale d'accès dudit dispositif d'aspiration/ injection aux micro-puits du plateau. Egalement conformément à l'invention, des billes disposées sur les parois latérales et sur les parois infé- rieure et supérieure de la cassette permettent le libre glissement de cette cassette de support. Encore également conformément à l'invention, la cassette de support est stérilisable, de même que le plateau et le couvercle. Selon un mode de réalisation préféré de l'automate conforme à l'invention, celui-ci coopère avec une pluralité de plateaux, chacun contenu dans une cassette du type susdit, de manière à stocker les cassettes dans une étuve à part et à n'introduire dans ledit premier compartiment que la cas- sette correspondant à un certain protocole d'expérience. Selon encore un autre mode de réalisation avanta- geux de l'automate conforme à l'invention, ledit bloc moteur comprend en combinaison: - un premier moteur pas-à-pas d'entraînement en rotation dudit plateau, qui agit sur ledit galet moteur par l'intermédiaire d'un système réducteur, - un deuxième moteur pas-à-pas qui assure le déplacement horizontal du plateau en agissant sur un système d'engrenage qui fait saillie du bloc moteur et qui agit à son tour sur au moins une crémaillère fixée à la paroi inférieure du premier compartiment, et - un troisième moteur pas-à-pas de réglage unila- téral de la hauteur du plateau, qui agit sur une vis micro- métrique disposée latéralement par rapport audit galet moteur et pourvue à son extrémité inférieure d'une bille de roulement glissant sur la paroi inférieure dudit premier compartiment, de manière à permettre les déplacementshorizon- taux commandés par ledit deuxième moteur pas-à-pas. -7- Selon un mode de réalisation avantageux de l'auto- mate conforme à l'invention, ledit dispositif d'observation microscopique comporte deux couples objectif/condenseur pré- réglés, qui sont associés entre eux et qui sont destinés à fonctionner alternativement, les premier et deuxième con- denseurs et les premier et deuxième objectifs étant soli- daires du plafond et du plancher, respectivement, de la paroi de séparation entre lesdits deux compartiments de l'enceinte, lequel premier objectif est à faible grossissement, tandis que le deuxième objectif assure un grossissement moyen ou fort en fonction des besoins, l'arrivée de lumière dans les deux condenseurs se faisant par un système à fibres optiques. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, chaque objectif coopère avec un miroir et un capteur d'images constitué par une caméra TV ou par une barrette CCD couplé ou non à un analyseur d'images automati- que. Selon encore une autre modalité avantageuse de cette disposition, le miroir intermédiaire, qui est interposé entre ledit capteur d'images et le miroir le plus éloigné de ce dernier, est semi-transparent. Selon une variante avantageuse de cette modalité, ledit miroir intermédiaire est escamotable, notamment sous l'action d'un système à électro-aimant, lorsque le couple objectif/condenseur le plus éloigné du capteur d'images est activé. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'automate conforme à l'invention, le dispositif d'aspira- tion/injection est disposé dans un logement vertical ménagé dans la paroi supérieure du premier compartiment, et coopère avec un dispositif de réglage à trois positions de la hau- teur de l'embout d'aspiration/injection, notamment constitué par un moteur pas-à-pas ou par un vérin télescopique, permet- tant: -8 - - en position haute, de faire déplacer librement la cassette de support ainsi que le plateau, - en position intermédiaire, d'aspirer du milieu cellulaire appauvri, ou-des cellules, ou d'injecter du milieu enrichi ou des cellules dans un puits du plateau, l'éventuel contact entre la pointe dudit embout et le fond du puits étant obtenu par l'action dudit troisième moteur pas-à-pas de réglage de la hauteur du plateau, et - en position basse, d'évacuer dans ledit puits d'évacuation, fixé à la paroi inférieure du premier compar- timent, le milieu appauvri aspiré et de procéder aux rinçages et à la stérilisation. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, l'embout d'aspiration/injection est pourvu d'une collerette faisant saillie de sa paroi externe qui, dans ladite position basse du dispositif d'aspiration/injec- tion, s'applique par pression sur le bord supérieur dudit puits d'évacuation pour assurer l'étanchéité vis-à-vis des opérations de rinçage et de stérilisation de la partie externe de l'embout. Selon une variante avantageuse de ce mode de réa- lisation, lorsque le dispositif de réglage de la hauteur de l'embout d'aspiration/injection est en position intermédiaire, ce dernier s'applique, au moyen de ladite collerette, sur le puits d'évacuation qui est contenu dans le même logement du dispositif d'aspiration/injection, le puits d'évacuation étant porté par pivotement ou par glissement audessous de l'embout ainsi positionné par tous moyens appropriés, tandis que les opération d'aspiration/injection s'effectuent en position basse. Selon encore un autre mode de réalisation avanta- geux de l'automate conforme à l'invention, un dispositif d'injection séparé est supporté par la collerette d'étanchéi- té, solidaire de l'embout dudit dispositif d'aspiration, et comprend une arrivée d'air stérile et chaud qui crée une -9- colonne d'air laminaire autour de l'arrivée de milieu nutri- tif injecté par des clapets et qui empêche le reflux de particules contaminantes, à savoir les risques de contamination rétrograde. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, le dispositif d'injection coopère avec un dis- positif de contrôle de niveau du milieu liquide injecté dans chaque micro-puits,comportant une fibre optique portée par ladite collerette et, en-dessous de chaque micro-puits, une diode. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'automate conforme à l'invention, il coopère avec un micro- ordinateur de pilotage de tous les dispositifs et de toutes les opérations qu'ils doivent accomplir suivant le protocole d'expérience prédéterminé, et qui assure également le trai- tement éventuel des données. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère aux dessins annexés dans lesquels: - la figure 1 montre une vue schématique en coupe de l'appareil conforme à l'invention; - la figure 2 est une vue en perspective de la cassette selon l'invention destinée à supporter le plateau conforme à l'invention; - la figure 3 montre le détail de la liaison entre la cassette représentée à la figure 2 et le plateau selon l'invention; - la figure 4 montre en perspective la cassette avec le plateau et son couvercle et le bloc moteur con- formes à l'invention, disposés dans le compartiment qui les contient ainsi que l'emplacement des dispositifs d'aspiration/ injection et d'observation microscopique également conformes à l'invention; - 10 - - la figure 5a montre également en perspective le bloc moteur selon l'invention; - la figure 5b montre une vue en coupe et en élé- vation du bloc moteur de la figure 5a, avec le galet moteur d'entraînement en rotation du plateau, selon l'invention, engagé dans la gorge annulaire de ce dernier; - la figure 6 représente le dispositif d'observa- tion microscopique selon l'invention; - la figure 7 montre le dispositif d'injection couplé au dispositif d'aspiration selon l'invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces dessins et les parties descriptives correspondantes sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. L'automate selon l'invention comporte deux blocs principaux (Cf. la figure 1): l'enceinte 1 proprement dite,et - un bloc refroidi 2 qui contient en particulier les milieux nutritifs. L'enceinte 1, à parois isolantes, est divisée en deux compartiments: - le compartiment 3a, qui contient un plateau 4, un bloc moteur 5, le dispositif d'observation microscopique 6 et un dispositif d'aspiration/injection 7, et - le compartiment 3b, qui enveloppe complètement le précédent, sauf au niveau de la porte d'accès 8 ménagée dans la face avant de l'enceinte 1, ces compartiments étant séparés par une paroi métallique 9 en acier ou en aluminium anodisé, par exemple. Dans la configuration représentée à la figure 1, une circulation d'air forcée est établie entre les deux compartiments 3a et 3b,et un filtre (non représenté) est interposé afin de retenir les particules et les germes de contamination. - 11 - Le flux d'air stérile et chaud, ainsi obtenu, traverse des orifices (non représentés) qui peuvent être ménagés sur le fond du compartiment 3a. Ce flux peut être repris par des orifices (non représentés) qui communiquent avec ledit filtre. Le plateau 4 est réalisé en matériau transpa- rent de bonne qualité optique, tel que le polymétacrylate ou le verre. D'un diamètre extérieur de 25 centimères, le pla- teau 4 peut contenir, sur sa rangée externe, par exemple, 16 micro-puits ayant chacun un diamètre de 35 mm ou encore 48 micro-puits de 12 mm de diamètre. Le plateau 4 est avantageusement pourvu d'une ouverture centrale d'accès dudit dispositif d'aspiration/in- jection dans un puits d'évacuation 10 fixé à -la paroi inférieure du premier compartiment 3a. Le plateau est disposé à l'intérieur d'une cassette stérilisable 11, notamment métallique, (Cf. la figure 2), de forme carrée et à angles arrondis, qui comporte un évidement circulaire central 12 de logement du plateau 4. En position de repos, ce plateau est maintenu par des moyens de support constitués de préférence par quatre billes 21a et 21b, logées-dans la paroi dudit évidement 12 et dépassant de cette dernière pour s'encliqueter dans une gorge annulaire 13 (Cf. la figure 3) ménagée dans la paroi latérale du plateau 4. Ces quatre billes sont disposées aux sommets d'un carré inscrit dans la circonférence délimi- tant ledit évidement circulaire 12: les deux billes 21a définissant le côté du carré qui se trouve à proximité du bloc moteur 5 sont fixes, tandis que les deux billes 21b définissant le côté opposé de ce carré sont reliées à un support élastique à ressort. - L'entraînement en rotation du plateau 4 est obtenu par frottement d'un galet moteur 14 (Cf. la figure 5b) dans la gorge 13 à profil triangulaire ou trapézoidale du plateau 4, dans laquelle il est engagé sous l'action d'un électro-aimant (non représenté) qui réalise l'accouplement - 12 - souple entre les parois métalliques opposées du bloc Nr. et de la cassette 11: à cet effet, une fenêtre 15 d'accès du galet 14 dans la gorge 13 est ménagée à la partie médiane du côté de la cassette 11 adjacent au bloc moteur 5. Lors de cet accouplement, l'engagement du galet moteur 14 dans la gorge 13 du plateau 4, pousse ce dernier contre les deux billes de support 21b, qui sont disposées à l'opposé de la fenêtre 15 et de part et d'autre par rapport à l'axe trans- versal de cette dernière et participent, ainsi, également au guidage en rotation du plateau, tandis que les deux billes de support fixes 21a se dégagent de sa gorge 13. La cassette 11 est pourvue d'un couvercle 16 trans- parent et de bonne qualité optique, s'adaptant à ladite ouverture centrale du plateau 4 permettant l'accès au dispo- sitif d'aspiration/injection dans ledit puits d'évacuation 10. Ce couvercle 16 est pourvu d'une fenêtre radiale 17 d'accès de ce dispositif d'aspiration/injection aux micro- puits ménagés dans le plateau 4 et alignés radialement. Il va de soi qu'on peut prévoir une pluralité de cassettes 11, chacune comportant son propre plateau 4, de manière à faciliter le stockage, notamment dans une étuve séparée, et à n'introduire dans le premier compartiment 3a, par la porte isotherme 8 de fermeture de la face avant de l'enceinte 1, que la cassette correspondant au protocole d'ex- périence prédéterminé ou la cassette désirée. De toutes façons, il faut également tenir compte de l'avantage qui découle de la possibilité de réutiliser chaque plateau après un premier emploi. Le glissement de la cassette.11 à l'intérieur du compartiment 3a se fait à l'aide de billes 20 disposées sur la paroi inférieure de la cassette, ainsi que sur ses parois laté- rales et supérieure. La figure 4 montre, en perspective, la configuration du compartiment 3a, qui est conçu de façon à rendre possibles en particulier les déplacements horizon- taux de la cassette 11,avec son plateau 4,à l'aide du bloc - 13 - moteur 5., comme il est décrit plus loin: cette figure 4 montre les parois latérales et inférieure du compartiment 3a, la paroi supérieure étant enlevée pour rendre le dessin plus clair et montrer les composants qui y sont contenus à l'intérieur; toutefois, on peut voir dans cette figure 4 également l'emplacement du dispositif d'aspiration/injection 7 et du dispositif optique 6 qui sont solidaires de la paroi supérieure du compartiment 3a. Le galet 14 est actionné par un moteur pas-à-pas 22 (Cf. la figure 5b) par l'intermédiaire d'un système réducteur 22a. La précision de positionnement en rotation du plateau 4 est de l'ordre de 10 gm, soit de l'ordre de la taille d'une cellule. La fréquence du moteur 22 est, par exemple, de l'ordre de 500 Hz s1 et la vitesse de rotation du plateau 4 est d'environ 5 mm.s 1, soit une rotation com- plète en deux minutes et trente-secondes. La rotation est possible dans les deux sens. Il est parfois nécessaire de faire varier la hau- teur du plateau 4, par exemple pour mettre en contact l'ai- guille 23 du dispositif d'aspiration 7 avec les cellules 24 adhérant au fond d'un micro-puits 25 ou,également,pour par- faire la mise au point optique sachant que le dispositif microscopique (Cf. la figure 6) est fixe et préréglé. Dans ces cas, l'amplitude des mouvements verticaux est au maximum de 2 millimètres: à cet effet, on peut utiliser un moteur 26 pas-à-pas de réglage unilatéral de la hauteur du plateau 4, qui agit sur une vis micrométrique 27 disposée latéralement par rapport audit galet moteur 14 et pourvue à son extrémité inférieure d'une bille de roulement 29 glissant sur le plan- cher interne 35 de séparation entre lesdits deux comparti- ments 3a et 3b. De même, il est prévu encore un autre moteur pas- à-pas 30 pour les déplacements horizontaux. Ces trois moteurs sont réunis entre eux et consti- tuent ledit bloc moteur 5. - 14 - Pour obtenir le déplacement horizontal du plateau 4 pris entre le galet moteur 14 et les billes 21b enfoncées en butée, on fait agir le moteur pas-à-pas 30 sur un engrenage (non représenté) faisant saillie du bloc moteur 5 et agissant à son tour sur une crémaillère 18 fixée à la paroi inférieure du logement 19 dans lequel se déplace le bloc moteur 5 en glissant à frottement doux contre les parois latérales de ce logement 19. Un évidement 32 entaille le bloc moteur 5 dans sa partie intérieure. Des billes 31 assurent le glissement contre la face supérieure du logement 19. Avantageusement, les trois moteurs 22, 26 et 30 du bloc moteur 5 sont du type étanche de manière à résister à l'humidité qui règne dans le premier compartiment 3a. Grâce au bloc moteur 5 selon l'invention, diffé- rents types de balayage des micro-puits 25 sont possibles, par exemple: - un balayage selon un tracé continu à fable grossissement, ou - un balayage selon un tracé continu à fortgrossisse- ment, ou encore - un balayage selon un tracé en zig-zag quelconque. Alors que les balayages en continu permettent d'obtenir des profils densitométriques, les balayages en zig- zag consistent dans une suite d'analyses de champs préprogram- més en aléatoire ou correspondant à des repérages individuels. On comprend aisément que le principe même de l'automate permet de repérer automatiquement les micro-puits par l'alternance de zones sombres dans les profils densito- métriques obtenus selon le tracé choisi pour le balayage des micro-puits: ainsi, un recalage précis peut être fait en cas d'erreur de programme ou de panne momentanée. Par ailleurs, on peut faire le zéro des mesures en obscurcissant le fond d'un micro-puits ou en plaçant des repères optiques. L'analyse optique des cellules contenues dans les micro-puits 25 et adhérant au fond de ces derniers est réali- 2567538' - 15 - sée par des couples objectif/condenseur à contraste de phase pré-réglés. Dans un grand nombre d'applications, un seul couple objectif/condenseur est nécessaire. Dans l'exemple choisi, deux couples sont associés et placés tangentielle- ment par rapport à l'axe circulaire passant par les points milieux des micro-puits de la rangée à analyser, comme le montre la figure 4. L'objectif 33 à faible grossissement (10 x) est placé.en alignement d'un condenseur 34 qui con- tient les anneaux de phase correspondants 36 et 37. L'arrivée de lumière dans les condenseurs se fait par un système à fibres optiques 38. De la même façon, l'objectif 39 de grossissement moyen ou fort (32 x ou 50 x) est en aligne- ment du condenseur 40. Les deux couples 33 - 34 et 39 - 40 fonctionnent en alternance. Lorsque l'observation se fait à faible gros- sissement avec l'objectif 33, un prisme extérieur (non repré- senté) envoie un faisceau de lumière sur la fibre optique correspondante. Le plan focal correspond au fond d'un micro-puits 25. La mise au point peut être modifiée, comme expliqué précédem- ment, par les déplacements verticaux du plateau 4. En sor- tant de l'objectif 36, l'image est renvoyée par un miroir 41 vers la caméra de télévision CT placée soit dans le com- partiment 36, soit à l'extérieur en rallongeant le guide de lumière g. Au passage, les rayons lumineux traversent le miroir 42 semi-transparent. Pour l'observation-à fort gros- sissement du même champ cellulaire, le galet 14 fait tourner le plateau 4 d'une quantité équivalente à un secteur angu- laire correspondant au pas fixé. Avec la disposition tangen- * tielle susdite des couples optiques, on peut aisément ali- gner un, deux ou trois couples, voire plus, et disposer d'un dispositif d'observation d'une grande polyvalence puisqu'il n'est pas nécessaire de faire tourner la tourelle d'un micros- cope pour changer de grossissement. Au lieu d'utiliser un miroir intermédiaire semi-transparent 42, on peut avantageusement disposer un miroir escamotable (non repré- -16- senté), notamment sous l'action d'un système à électro-aimant, lorsque le couple objectif/condenseur 33 - 34 est activé. L'analyse optique peut se faire visuellement sans caméra, ou avec caméra TV, ou avec barrette CCD, ou en automatique par un ana- lyseur d'image couplé à un quelconque de ces capteurs d'images. Le dispositif d'observation optique 6, ainsi que la camera CT, sont disposés à l'extérieur du premier coEmpartimnt 3a qui peut être rendu humide sans inconvénients, en protégeant les condenseurs et les objectifs par des plaques en verre (non représentées) encastrées dans le plafond et le plancher du compartiment 3a au niveau des ouver- tures ménagées dans ces parois en correspondance de l'emplacement desdits condenseurs et objectifs; à cet effet, il y a lieu de considérer que le faible volume de ce compartiment 3a assure une humidification auto- matique et constante par évaporation du milieu cellulaire contenu dans les micro-puits 25. Le dispositif d'aspiration 7 est du type décrit dans la Demande de Brevet du Déposant n 84 08839, et se coupose d'un système à piston comprenant un moteur pas-à-pas et un système réducteur, con- tenus dans le bloc 43, lequel système réducteur agit sur un piston contenu dans un cylindre 44. Le dispositif d'aspiration/injection 7 est disposé dans un logement vertical 45 (Cf. les figures 1 et 4), ména- gé dans la paroi supérieure du premier compartiment 3a, et coopère avec un dispositif 46 de réglage de la hauteur de l'embout 47, à trois positions. Ce dispositif 46 peut être constitué par un moteur pas-à-pas ou par un vérin du type télescopique et permet d'effectuer les opérations suivantes: - en position haute, de faire déplacer librement ladite cassette de support 11, ainsi que son plateau 4; - en position intermédiaire, de pourvoir à l'aspi- ration ou à l'injection, et - en position basse, d'évacuer dans ledit puits d'évacuation le ou les produits aspirés. L'opération d'évacuation peut avantageusement être suivie par une opération de rinçage et de stérilisation - 17 - de la surface externe de l'embout 47: à cet effet, ce dernier est pourvu d'une collerette 48 qui permet son application par pression, en position basse, sur le puits d'évacuation 10 fixé à la paroi inférieure du compartiment 3a. Dans certains cas, il peut être avantageux de monter le puits d'évacuation dans le logement 45 qui contient le dispositif d'aspiration/injection 7, et de le porter au- dessous de l'embout 47, par pivotement ou glissement, à l'aide de tous moyens appropriés à cet effet, lorsque cet embout est en position intermédiaire, tandis que les opéra- tions d'aspiration/injection s'effectuent en positionbasse cette variante est intéressante parce qu'elle réduit les mouvements de la cassette 11 qui sont nécessaires, lorsque le puits est fixé sur le fond du compartiment 3a, toutes les fois que l'on veut évacuer le ou les produits aspirés pour aligner l'ouverture centrale du plateau 4 avec le dispositif d'aspi- ration/injection et le puits d'évacuation. Lorsque l'embout 47, qui est réalisé en métal, en verre ou en matière plastique (transparente ou non), et qui est à la fois un réservoir et une aiguille, vient se placer au-dessus d'une logette 25, il est descendu par le disposi- tif 46 qui est en position intermédiaire (ou basse selon la variante précédente). L'extrémité de l'embout s'arrête à environ 2mm du fond de la logette 25. L'aspiration a lieu par retrait du piston 49 (Cf. la figure 7) qui aspire la membrane 50 par l'intermédiaire de l'espace 51 qui, suivant le type de manipulation, peut être rempli d'air ou d'un liquide inerte comme l'eau ou l'huile. La variation de l'espace 51 permet de régler l'aspirationet de la rendre plus ou moins énergique. La dépression ainsi créée par la membrane 50 se transmet à l'espace 52 et aspire le liquide contenu dans le micro-puits 25. Lorsque le puits d'évacuation 10 est ménagé dans la paroi inférieure du compartiment 3a, la cassette 11 est déplacée horizontale- ment pour aligner avec l'embout 47 et le puits 10 l'ouver- - 18 - ture centrale du plateau 4. Le dispositif 46 est alors porté en position basse et la collerette 48 vient s'appliquer contre la surface supérieure du puits 10 pour créer l'étan- chéité. Le piston 49 est alors repoussé pour chasser le li- quide contenu dans 52. Par l'intermédiaire de la prise 53, de l'eau distillée stérile est injectée pour nettoyer l'in- térieur de l'embout. Des perforations 54 placées à l'inté- rieur du puits 10 permettent d'injecter de l'eau pour net- toyer l'extérieur de l'embout 46. Ce rinçage peut être plus énergique et faire appel à de la vapeur d'eau, de l'alcool, etc... Apres l'évacuation et le rinçage, le dispositif 46 est porté en position haute pour laisser toute liberté de mouvement à la cassette 11 et au plateau 4. On comprend aisément qu'il est possible de préle- ver, par ce dispositif, des quantités variables de liquide et de les replacer dans des micro-puits après avoir fait tour- ner le plateau 4. Pour éviter les pertes de gaz et maintenir les conditions stables dans le compartiment 3a, un clapet (non représenté) peut fermer la base du puits 10 et s'ouvrir par l'action même de l'embout 47, de longueur appropriée. La forme de l'extrémité de l'embout est biseautée.Le dia- mntre externe est d'environ 2 mn et le conduit central d'environ 0,05 mm. En élevant le plateau 4 en position haute à l'aide dudit bloc moteur 5, on amène au contact l'embout 47 et la culture cellulaire. Un mouvement alternatif très réduit du plateau permet de décoller les cellules et de les aspirer en vue de leur analyse et surtout de leur repiquage dans des micro- puits libres. La figure 7 montre également comment une colle- rette 48a, de forme spéciale, enfilée sur l'embout 47 et collée supporte un dispositif d'injection 55 séparé dudit dispositif d'aspiration (qui peut en fait être également utilisé pour l'injection). Il comprend une arrivée d'air stérile et chaud 56 prélevée après le ventilateur du compar- - 19 - timent 3b. Une arrivée 57 permet l'injection de liquide nutritif. La canalisation d'air concentriquement à la base 57 évite le reflux de particules contaminantes. Une fibre optique 58 éclaire le micro-puits 25 en infra-rouge et une diode 60 mesure la lumière transmise, ce qui permet le con- trôle du niveau. Un tuyau 59 isolant évite les condensations sur le tuyau froid qui arrive à la base 57. Après aspiration du milieu nutritif et avant son évacuation dans le puits 10, les liquides neufs contenus dans le réservoir refroidi par l'enceinte réfrigéréee 2 (Cf. la figure -1) s'écoulent directement lorsque des clapets étrangleurs 61 (cf. la figure 1) placés sous le réservoir, s'ouvrent. Le jet est dirigé contre l'embout 47, ce qui réalise à la fois un rinçage et évite l'impact direct du jet contre les cellules contenues au fond du micro-puits 25. L'écoulement du flacon est arrêté lorsque le signal arrivant à la diode réceptrice 56 indique une certaine valeur qui, en réalité, tient compte de la valeur initiale avant aspiration, de la valeur après aspiration, puis de l'évolution des mesures en cours de remplissage. La séquence de vidange et de nettoyage se dé- roule comme décrit précédemment. En ce qui concerne les applications principales de l'automate selon l'invention, celles-ci concernent: - le clonage: dans ce cas, le plateau 4 est disposé dans la cassette 11 après avoir ensemencé un seul micro- puits 25; à partir de l'identification des colonies, on repique et on garnit progressivement les autres micro- puits du plateau à l'aide dudit dispositif d'aspiration/injection; l'analyse de l'action de substances toxiques, pharmacologiques ou autres: la rapidité du système selon l'invention permet de pratiquer des mesures à intervalles très rapprochés (du nombre, de la forme, de la cinétique cellulaire, etc...), et - l'analyse de bactéries par réactions colori- métriques. 2567538- - 20 - Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'inven- tion ne se limite nullement à ceux de ses modes de réalisa- tion et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre ni de la portée de la présente invention. - 21 - REVENDICATIONS 1. Automate très compact pour l'analyse et le clonage de cultures cellulaires, ainsi que pour l'analyse bactériologique, à savoir intégrant les phases d'entretien, d'expérimentation de substances notamment pharmacologiques, d'analyse optique de la densité et de la forme, ainsi que de leurs associations, et de repiquage de cellules en vue de leur clonage, caractérisé en ce qu'il comprend, en combinaison: - une enceinte (1) à parois isolantes, assurant l'homéothermie et certaines conditions d'ambiance, notamment en termes d'hygrométrie, de pourcentage de CO2 et/ou autre, à l'intérieur de cette enceinte, qui est divisée en deux compartiments (3a, 3b), dont le premier compartiment (3a) est à faible volume et contient un plateau (4),de préférence circulaire, compre- nant plusieurs micro-puits (25) disposés suivant une ou plusieurs rangées circulaires concentriques, le plateau (4) et les micro-puits (25) étant réalisés en une matière trans- parente ayant de bonnes qualités optiques, au moins un dispositif spécial (6) d'observation microscopique, notamment du type à contraste de phase, un dispositif (7) d'aspiration/injection de milieu cellulaire ou de cellules garantissant la non conta- mination, un bloc moteur (5) assurant'l'entraînement en rotation ainsi que les déplacements vertical et horizontal du plateau (4), avec positionnement très précis dans les trois directions de mouvement, tandis que le deuxième compartiment (3b) de l'enceinte (1), qui enveloppe le premier compartiment (3a), sauf au niveau de la face avant de l'enceinte, contient un dispositif de régulation de la température et de brassage de l'air chaud et, éventuellement, un dispositif de stérilisation du pre- mier compartiment par flux d'air laminaire, filtré et en - 22 - circuit fermé, connu en soi, lesdits premier et deuxième compartiments étant séparés par une paroi (9),éventuelle- ment filtrante,pour permettre la circulation entre ces deux compartiments de l'éventuel flux laminaire, et - un bloc réfrigérateur (2) disposé à l'extérieur de l'enceinte (1) ainsi équipée, contenant en particulier les réservoirs d'alimentation en milieux nutritifs et diffé- rents produits. 2. Automate selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit plateau (4) est pourvu d'une ouverture centrale d'accès dudit dispositif (7) d'aspiration/injection, qui est fixé à la paroi supérieure du premier compartiment (3a), dans un puits d'évacuation et de stérilisation (10) fixé à la paroi inférieure de ce compartiment (3a). 3. Automate selon l'une quelconque des revendica- tions 1 et 2, caractérisé en ce que ledit plateau circulai- re (4) est placé dans une cassette (11), notamment métalli- que et de forme sensiblement carrée qui, lorsqu'elle est équipée d'un couvercle, réalise une configuration proche de la boîte de Petri propre à réduire les risques de contami- nation et qui comporte un évidement circulaire central (12) de logement du plateau (4) qui, en position de repos, est tenu en place par des moyens de support constitués, de préférence, par quatre billes (21a, 21b) logées dans la paroi dudit évidement (12) et dépassant de cette dernière pour s'encliqueter dans une gorge annulaire (13) ménagée dans la paroiextérieure du pla- teau (4), tandis que l'entraînement en rotation du plateau (4) est réalisé à l'aide d'un galet moteur (14), faisant saillie dudit bloc moteur (5) par engagement, sous l'action de moyens appropriés, et par frottement dans la gorge (13) du plateau (4), à cet effet, une fenêtre (15) d'accès du galet (14) à cette gorge (13) est ménagée à la partie médiane du côté de la cassette (11) adjacent au bloc moteur (5). 4. Automate selon la revendication 3, caractérisé en ce que deux desdites billes (21a) sont fixes, tandis que - 23 - les deux autres billes (21b) sont sur support élastique, notamment à ressort, les quatre billes (21a, 21b) étant dis- posées aux sommets d'un carré inscrit dans la circonférence délimitant ledit évidement circulaire (12), de manière à ce qu'un côté de ce carré, parallèle et'contigu à ladite fenêtre (15) d'accès du galet moteur (14), est défini par les deux billes fixes (21a), tandis que le côté opposé du carré est défini par lesdites deux billes (21b) sur support élastique, en sorte que,lors de l'engagement du galet.(14) dans ladite gorge (13), ces deux-dernières billes (21b) seule- ment participent au guidage en rotation du plateau (4), les deux billes fixes (21a) venant se dégager de la gorge (13) de ce dernier. 5. Automate selon la revendication 3, caractérisé en ce que lesdits moyens permettant l'engagement du galet moteur (14) dans la gorge (13) du plateau (4) sont consti- tués par un électro-aimant réalisant l'accouplement souple entre les parois métalliques opposées du bloc moteur (5) et de la cassette (11). 6. Automate selon la revendication 3, caractérisé en ce que la cassette de support (11) est pourvue d'un cou- vercle transparent (16), de bonne qualité optique, s'adap- tant à ladite ouverture centrale du plateau (4) et pourvue d'une fenêtre radiale (17) d'accès dudit dispositif (7) d'aspiration/injection aux micro-puits (25) du plateau (4). 7. Automate selon la revendication 3, caractérisé en ce que des billes (20), disposées sur les parois latérales et sur les parois inférieure et supérieure de la cassette (11) permettent le libre glissement de cette cassette de support (11). 8. Automate selon la revendication 3, caractérisé en ce que la cassette de support (11) est stérilisable, de même que le plateau (4) et le couvercle (16). 9. Automate selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 8, caractérisé en ce que celui-ci coopère avec une pluralité de plateaux (4), chacun contenu dans une cassette - 24 - (11), du type susdit, de manière à stocker les cassettes dans une étuve à part et à n'introduire dans ledit premier compartiment (3a) que la cassette (11) correspondant à un certain protocole d'expérience. 10. Automate selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit bloc moteur (5) comprend, en combinaison: - un premier moteur pas-à-pas (22) d'entraînement en rotation dudit plateau (4), qui agit sur ledit galet moteur (14) par l'intermédiaire d'un système réducteur (22a), - un deuxième moteur pas-à-pas (30) qui assure le déplacement horizontal du plateau (4) en agissant sur un systé- oe d'engrenage qui fait saillie du bloc moteur (5) et qui agit à son tour sur au moins une crémaillère fixée à la paroi inférieure du premier compartiment (3a), et - un troisième moteur pas-à-pas (26) de réglage unilatéral de la hauteur du plateau (4), qui agit sur une vis micrométrique (27) disposée latéralement par rapport audit galet moteur (14) et pourvue à son extrémité inférieure - d'une bille de roulement (29) glissant sur la paroi infé- rieure (35) dudit premier compartiment (3a), de manière à permettre les déplacements horizontaux commandés par ledit deuxième moteur pas-à-pas (30). 11il. Automate selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit dispositif d'observation microscopique - comporte deux couples objectif/condenseur (33-34, 39-40) pré-réglés qui sont associés entre eux et qui sont destinés à fonctionner alternativement, les premier et deuxième con- denseurs (34, 40) et les premier et deuxième objectifs (33, 39) étant solidaires du plafond et du plancher, respec- tivement, de la paroi de séparation entre lesdits deux compartiments (3a, 3b) de l'enceinte (1), lequel premier objectif (33) est à faible grossissement, tandis que le deuxième objectif (39) assure un grossissement moyen ou fort en fonction des besoins, l'arrivée de lumière dans les deux condenseurs (34, 40) se faisant par un système à fibres optiques (38). - 25 - 12. Automate selon la revendication 11, caractérisé en ce que chaque objectif (33, 39) coopère avec un miroir (41, 42) et un capteur d'images constitué par une caméra de télévision (CT) ou par une barrette CCD couplé ou non à un analyseur d'images automatique. 13. Automate selon la revendication 12, caractérisé en ce que le miroir intermédiaire (42), qui est interposé entre ledit capteur d'images (CT) et le miroir (41) le plus éloigné de ce dernier, est semi-transparent. 14. Automate selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit miroir intermédiaire est escamotable, notam- ment sous l'action d'un système à électro-aimant, lorsque le couple objectif/condenseur (36, 39) le plus éloigné du cap- teur d'images (CT) est activé. 15. Automate selon la revendication 1, caractérisé en ce que le dispositif (7) d'aspiration/injection est disposé dans un logement vertical (45) ménagé dans la paroi supérieure du premier compartiment (3a) et coopère avec un dispositif (46) de réglage, à trois positions, de la hauteur de l'embout d'aspiration/injection (47), notamment constitué par un moteur pas-à-pas ou par un vérin télescopique, permettant: - en position haute, de faire déplacer librement la cassette de support (11) ainsi que le plateau (4), - en position intermédiaire, d'aspirer du milieu cellulaire appauvri ou des cellules, ou d'injecter du milieu enrichi ou des cellules dans un puits du plateau (10), l'éven- tuel contact entre la pointe dudit embout (47) et le fond du puits (10), étant obtenu par l'action dudit troisième moteur pas-à-pas (26) de réglage de la hauteur du plateau (4), et - en position basse, d'évacuer dans ledit puits (10) d'évacuation, fixé à la paroi inférieure du premier compartiment (3a), le milieu appauvri aspiré et de procéder aux rinçages et à la stérilisation. 16. Automate selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'embout (47) d'aspiration/injection est pourvu d'une - 26 - collerette (48) faisant saillie de sa paroi externe qui, dans ladite position basse du dispositif (7) d'aspiration/injection, s'applique par pression sur le bord supérieur dudit puits (10) d'évacuation pour assurer l'étanchéité vis-à-vis des opéra- tions de rinçage et de stérilisation de la partie externe de l'embout (47). 17. Automate selon la revendication 15, caractérisé en ce que, lorsque le dispositif (46) de réglage de la hauteur de l'embout (47) d'aspiration/injection est en positon intermú- diaire, ce dernier s'applique, au moyen de ladite collerette (48), sur le puits d'évacuation qui est contenu dans le mme logement du dispositif d'aspiration/injection, le puits d'évacuation étant porté par pivotement ou par glissement au-dessous de l'embout (47) ainsi positionné par tous moyens appropriés, tandis que les opérations d'aspiration/injection s'effectuent en position basse. - 18. Automate selon l'une quelconque des revendica- tions 15 et16 ou 15 et 17, caractérisé en ce que le dispo- sitif d'injection est supporté par la collerette (48a) d'étanchéité, solidaire de l'embout (47) dudit dispositif d'aspiration, et comprend une arrivée d'air stérile et chaud (56) qui crée une colonne d'air laminaire autour de l'arrivée (57) de milieu nutritif injecté par des clapets (61), et qui empêche le reflux de particules contaminantes, à savoir les risques de contamination rétrograde. 19. Automate selon la revendication 18, caractérisé en ce que le dispositif d'injection coopère avec un disposi- tif de contrôle de niveau du milieu liquide injecté dans cha- que micro-puits comportant une fibre optique (58) portée par ladite collerette (48a) et, en dessous de chaque micro-puits (25), une diode (60). , Automate selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 19, caractérisé en ce qu'il coopère avec un micro- ordinateur de pilotage de tous les dispositifs et de toutes les opérations qu'ils doivent accomplir suivant le protocole - 27 - d'expérience prédéterminé, et qui assure également le traite- ment éventuel des données.