FR 2568891 A1 19860214 FR 8412598 A 19840809 1i 2568891 La présente invention se rapporte au domaine des biotechnologies, en particulier à l'utilisation de cellules, notamment des levures telles que Saccharomyces cerevisiae, comme hôte d'expression de gènes à intérêt commercial. Plus particulièrement, la présente invention concerne un moyen de cultiver et de maintenir des souches de levure à plasmide hybride sur n'importe quel type de milieu compatible avec la croissance des cellules non transformées, sans qu'il y ait perte du plasmide ou du phénotype allié. Pour obtenir une expression maximale d'un gène, étranger ou non, cloné dans une levure telle que Saccharomyces cerevisiae, on cherche à ce que ce gène soit présent à un nombre d'exemplaires le plus élevé possible. Le moyen le plus évident et de fait généralement utilisé est de perpétuer le gène en l'intégrant dans un plasmide présent en multiples copies dans la cellule. Cependant, la transmission de ces plasmides hybrides de génération en génération n'est pas toujours assurée et divers systèmes de sélection ont été développés dans le but de ne permettre la prolifération que des cellules contenant le plasmide. 2S66891 La plus courante de ces sélections, et la moins conteuse car elle ne nécessite l'adjonction d'aucune drogue ou antibiotique dans le milieu de culture, consiste à prendre comme organisme hôte une souche présentant une auxotrophie consécutive à la mutation d'un gène donné et à intégrer dans le plasmide hybride un gène capable d'assurer la fonction déficiente. Sur milieu minimum, seules les cellules contenant du plasmide hybride peuvent pousser alors que sur milieu complet toutes les cellules peuvent pousser y compris celles dépourvues de plasmide. L'inconvénient de ce système de sélection est qu'il restreint le choix du milieu de culture puisque celui-ci doit être dépourvu de toute molécule susceptible de complémenter l'exigence auxotrophique. En pratique, le milieu de culture le plus largement utilisé est un milieu synthétique de laboratoire, de prix assez coûteux. La présente invention concerne un procédé pour rendre les souches de levure telles que Saccharomyces cerevisiae totalement dépendantes de la présence du plasmide pour leur survie, et ce quelle que soit la composition du milieu de culture. On peut par cette invention faire pousser les cellules sur un milieu riche, ce qui présente de nombreux avantages: temps de génération plus court (croissance plus rapide d'environ 25 %), phase exponentielle de croissance beaucoup plus longue, masse totale de cellules en poids sec plus importante, etc. Cette invention permet, d'autre part, d'utiliser tout autre milieu que ceux utilisés en laboratoire, en particulier des milieux utilisés en industrie tels que moutsd'origine variée, mélasse, etc., de coût beaucoup moins élevé. On peut envisager de modifier les souches pour pouvoir les cultiver sur une variété de milieux non-définis et de coût minimal dans l'optique de leur faire produire des substances à intérêt industriel. C'est pourquoi la présente invention concerne un procédé de préparation d'une souche transformée par un vecteur de clonage ou d'expression d'un gène codant pour une protéine déterminée qui peut être cultivée sur un milieu complet sans pression de sélection, procédé caracté- risé en ce que: (a) on identifie un métabolite dont l'absence est léthale pour la souche et qui est synthétisé par au moins deux voies métaboliques, (b) on bloque une première desdites voies métaboliques en altérant au moins l'un des gènes impliqués dans ladite voie, (c) on transforme la souche par lé vecteur qui comporte, en outre, l'allèle fonctionnel du gène altéré, (d) on bloque les autres voies métaboliques. Il est bien entendu que la présente description sera effectuée essentiellement en se référant à des souches de levure mais d'autres souches peuvent être mises en oeuvre, en particulier des bactéries. Les levures telles que S. cerevisiae ont deux voies métaboliques conduisant à la synthèse de l'uridine ' monophosphate (UMP). La première est une voie dite de novo qui débute par la synthèse de carbamylphosphate et aboutit à l'UMP par transformation en 5 étapes dont les intermédiaires sont dans l'ordre l'acide uréidosuccinique, l'acide dihydroorotique, l'acide orotique et l'orotidine- '-monophosphate (OMP) (Lacroute, 1968; Jund et Lacroute, 1972). La décarboxylation de l'OMP en UMP, dernière étape de la voie métabolique, est catalysée par une OMP décarboxylase dont le gène correspondant est appelé URA3 chez S. cerevisiae. Les souches ura3 dépourvues de cette activité OMP décarboxylase ne peuvent plus synthétiser l'UMP par la voie de novo, il leur faut une source de pyrimidine exogène, soit de l'uracile, soit de la cytosine, qui pourra être transformée en UMP grâce à la deuxième voie métabolique. L'uracile et/ou la cytosine présents dans le milieu de culture peuvent rentrer dans la cellule grâce à une perméase spécifique pour chacune des deux molécules. Une fois dans la cellule, la cytosine est directement transformée en uracile, l'uracile est transformé en UMP grâce à une UMP pyrophosphorylase (appelée aussi uracile ribosyl phosphotransférase) (Jund et Lacroute, 1970). Il n'existe pas d'autre voie métabolique importante qui conduise à l'UMP sans passer par i'OMP ou l'uracile, si bien que la cellule de levure ne peut survivre que si l'une au moins des deux voies décrites plus haut et résumées sur le schéma 1 fonctionne. Le principe du procédé dans ce cas est le suivant: On bloque la première voie métabolique en altérant un gène impliqué dans la synthèse d'une OMP décarboxylase active, c'est-à-dire en général le gène URA3, et on trans- forme la souche par un vecteur plasmidique comportant un gène codant pour une OMP décarboxylase active, c'est-à-dire en général le gène URA3. De façon simple, on transforme un mutant ura3 par le plasmide approprié et on sélectionne les transformants ura+ ura SCHEMA 1 s LES DEUX VOIES DE BIOSYNTHESE DE L'URIDINE-5'-MDNOPHO$PHATE CHEZ LA LEVURE S. cerevisiae glutamine +C02+ATP carbamnylphosphate acide uréidosuccinique orotate voie de orotidine-5 'monophosphate NOVO (OMP) étape catalysée par _1 'OMP décarboxylase, codée par le gène URA3 URIDINE-5 ' -MONOPHOSPHATE (UMP) étape catalysée par 1'UMP pyrophosphorylase oodée par le gène FUR1 voie cytosine - uraetle de secours membrane cellulaire cytosine du uracile du milieu extérieur milieu extérieur 6 2568891 On altère ensuite un gène impliqué dans la synthèse d'une UMP pyrophosphorylase active, c'est-à-dire un gène situé dans le locus FUR1. Le gène codant pour 1'UMP pyrophosphorylase de S. cerevisiae est appelé FUR1 (Jund et Lacroute, 1970), c'est un locus complexe dont certaines mutations résultent dans la résistance des cellules à toute une gamme d'analogues fluorés des bases pyrimidiques ou des nucléosides et nucléotides correspondants. L'effet de résistance le plus marqué résulte de l'absence de l'activité UMP pyrophospho- rylase, le phénotype correspondant est récessif. L'altération du gène FUR1 peut se faire par croisement avec un mutant caractérisé furl, soit par mutation spontanée avec sélection des mutants sur un milieu approprié décrit dans un des exemples qui suit. Il est bien entendu que le procédé de la présente invention est utile de façon générale pour préparer ou cloner une protéine quelconque qui est codée par le plasmide vecteur. Dans le cas d'une expression le plasmide comportera en outre les éléments nécessaires à l'expression du gène, en particulier un promoteur de levure. A titre d'exemple, on peut exprimer le gène xylE de Pseudomonas putidae, mais il est bien entendu possible d'exprimer un gène quelconque. EXEMPLE 1: INTRODUCTION DE LA MUTATION furl DANS LE GENOME D'UNE SOUCHE DE LEVURE ura3 RENDUE ura+ PAR LA PRESENCE D'UN PLASMIDE a) ConIstruction du plasmide pTG807 Dans cet exemple, on a utilisé le plasmide pTG807 pour complémenter la déficience en activité OMP décase d'une souche ura3. Le plasmide pTG807 est un plas- mide dérivé de pBR322 contenant au site HindIII un fragment (1,1 kilopaire de base) de DNA chromosomique de S. cerevisiae qui renferme le gène URA3 (allèle de type sauvage, Bach et al, 1979). A environ 80 paires de bases en aval de la fin (côté 3') du gène URA3, soit à environ 100 paires de base d'une extrémité du morceau clone, se trouve un site unique SmaI. Ce site a servi à cloner un fragment de DNA d'environ 1 kilopaire de base délimité par les sites AvaII et HindIII de part et d'autre de l'origine de réplication du plasmide 2 microns (2 p) - forme B de levure (Broach, 1981). Le frag- ment AvaIi - HindIII a été obtenu par double digestion du DNA plasmidique de pFL1 (Chevallier et al., 1979) séparation des différents fragments par électrophorèse en gel d'agarose, élution du fragment recherché par la technique décrite par Girvitz et al. (1980). Ce fragment à été ensuite traité à la DNA-polymérase 1 Klenow de E. coli en présence de dNTPs, puis à la DNA-ligase du phage T4 en présence d'ATP et du DNA de pTG802 préalablement linéarisé au site SmaI. On a pu ainsi obtenir deux nouveaux types de plasmide (pTG806 et pTG807) résultant de l'intégration du fragment AvaII-HindIII du 2 p au site SmaI de pTG802 et ne différant entre eux que par l'orientation de fragment. Le plasmide pTG807 (schéma 2) possède donc: - une origine de réplication procaryotique fonc- tionnant dans E. coli, - une origine de réplication eucaryotique fonc- tionnant dans S. cerevisiae, - un gène (ApR) de résistance à l'ampicilline per- mettant la sélection dans E. coli et la détection des trans- formés de S. cerevisiae (test de Chevallier et Aigle, 1979), - le gène URA3 codant pour l'OMP décase et per- mettant la sélection du plasmide à la fois sans S. cerevisiae (mutant ura3 et dans E. coli (mutant pyrF) (Bach et al, 1979). Le fait que l'on ait cloné l'origine de réplica- tion du plasmide 2 p de levure sans le locus REP3 (Broach, 1983) dans le plasmide pTG807 rend très instable la présence de ce plasmide dans les cellules de levure qui en se divi- sant génèrent des cellules pouvant ne plus contenir le plas- mide hybride (ségrégation mitotique). Lors d'une culture liquide en milieu sélectif, on observe un état d'équilibre entre les cellules qui renferment le plasmide - capables, par conséquent, de former des colonies après étalement sur milieu sélectif solide - et celles qui ne le renferment plus - inca- pables de former des clones sur milieu sélectif solide. La très grande fréquence de perte et le fait que les cellules venant de perdre le plasmide gardent la capacité à se diviser un nombre restreint de fois, font que cet état d'équilibre, même dans une culture en phase exponentielle de croissance en milieu sélectif, reste en faveur des cellules ayant perdu le plasmide (60 % dans ce cas environ). Pour d'autres plas- mides hybrides ayant à la fois l'origine de réplication et le locus REP3 du 2 y, ce rapport peut varier de moins de % (cas de pJDB207 - Beggs, 1981) à 25 % ou plus. Dans cet exemple, on a choisi le cas extrême d'une grande instabilité phénotypique liée à la ségrégation mitotique du plasmide pour faciliter l'étude. On verra au cours d'autres exemples le cas o la ségrégation est moins importante (cas plus favorable o le plasmide sert à exprimer des gènes étrangers à intérêt industriel). SCHEMA 2 - STRUCTURE DU PLASMIDE pTG807 Sanai /HindIIIo AvaII /SmaIo oriS o HindIII HindIII IE-EE séquence de DNA chramoscmique de S. cerevisiae séquence de DNA de pBR322 séquence de DNA du plasmide 2p11 _._ région contenant l'origine de réplication foncticanelle dans E. coli (oriE) ô _--. région contenant l'origine de réplication fonctionnelle dans S. cerevisiae (oriS) 1 Kb échelle b) Etude de l'effet de la mutation furI sur le h2not2yeiasmidigue des souches transformées On possède une souche de laboratoire S. cerevisiae ura TGY10-1 (Mata ura3-251-273-328). Toute autre souche de génotype ura3- peut être utilisée. Cette souche a été rendue ura+ par transformation avec le DNA de pTG807 selon la tech- nique décrite par Innen et al. (1978). La souche transformée TGY101/pTG807 a été croisée avec la souche isogénique FE 25-3 (Mata furl-8) pour former le diploide TGY7 (cf. Mortimer et Hawthorne 1966). Au bout de 8 heures sur milieu complet YPG, le mélange de copulation a été transféré 24 heures sur milieu de présporulation (Glucose 0,1 %, acétate de potassium 1,1M; Yeast extract Difco 0,25 %, sulfate d'ammonium 5 g/l, Agar Difco 2 %) puis 48 heures sur.milieu de sporulation (acétate de potassium 1 %, agar Difco 2 %). La formation des asques étant jugée suffisante après observation au microscope, on a traité le mélange de copulation à l'éther qui tue préfé- rentiellement les cellules et au moins 75 % des spores. Le traitement à l'éther se fait de la façon suivante: Le contenu d'une anse de platine en mélange de copu- lation est resuspendu dans 1 ml d'eau. Après addition d'l ml d'éther, on agite vigoureusement pendant 5 min et cela deux ou trois fois en l'espace d'une demi-heure. On étale 0,1 ml de la phase aqueuse pure et 0,1 ml diluée 10 fois chaque fois sur une boite de milieu complet (YPG). On sélectionne ainsi les souches haploides ségrégeant du croisement. Dix-sept colonies ainsi obtenues ont été reprises, cultivées sur milieu complet solide, et testées pour leur capacité à produire la e-lactamase selon la technique de Che- valier et Aigle (1979) (figure). Sur 17 colonies, 4 seule- ment produisaient la e-lactamase. On a testé les signes sexuels de ces 4 souches productrices, on a conservé une de ces souches de signe a, pour la poursuite de l'étude. Cette souche est appelée TGY7-11. L'analyse de la résistance des cellules TGY7-11 à différents analogues de l'uracile tels que 6-aza Uracile et 5-Fluorouracile a permis de montrer que cette souche pré- sentait la mutation furl-8 (tableau I.ci-après). La souche TGY7-11/pTG807 a été repiquée en milieu complet liquide (YPG) de la façon suivante: le soir on a ensemencé 25 ml de milieu avec 104 cellules/ml, laissé pous- ser la nuit jusqu'à obtenir environ 107 cellules/ml (10 géné- rations) puis on a recommencé un ensemencement identique à partir de cette culture et cela deux fois de suite de façon à obtenir entre 30 et 40 générations cellulaires en milieu complet. Les cellules ont alors été diluées et étalées sur boite de milieu complet de façon à obtenir environ 200 colo- nies isolées par boite. La perte du plasmide a été testée sur une trentaine de colonies par la technique de Chevallier et Aigle (1979) (figure) en guise de contrôle, l'expérience a été réalisée en parallèle avec la souche parentale TGY101/pTG807 cultivée dans les mêmes conditions. Une trentaine de colonies ont été repiquées en petits dépôts sur une boite de Pétri contenant un milieu ren- fermant de l'amidon (Yeast nitrogen base DIFCO 6,5 g/l; glucose 1 g/l; amidon soluble 2 g/l, uracile 30 mg/l; agar 20 g/l tamponné à pH6 par du tampon phosphate 0,02 M). Apres 24 heures d'incubation à 30 C, on coule une couche du même milieu en surfusion (44 C, 10 g/1 d'agar) dans lequel on a ajouté 1,5 ml de réactif (3 mg/ml I2; 150 mg/ml IK, 3 mg/ml ampicilline). Les boites sont incubées une nuit au réfrigérateur puis à l'obscurité à température ambiante. Autour des souches productrices se développe un halo de déco- loration.Sur le cliché 4a (figure), on observe la culture de colonies issues de la souche TGY-10-1 transformée par - pTG807. La première rangée,en haut, concerne deux contrôles; l'un négatif à gauche, il s'agit d'une colonie TGY 10-1 non transformée; l'autre positif, à droite, représente TGY 10-1/pTG807 maintenu en milieu sélectif. De même sur le cliché 4$, on observe la culture de colonies issues de la souche TGY 7-11 (ura3. furl) transformée par pTG807. De façon identique qu'en 4a, deux contrôles ont été effectués sur la première rangée en haut. Toutes ces colonies de la souche TGY7-11 ainsi cultivées présentent le plasmide pTG807, alors qu'aucune de la souche TGY10-1 ne présente ce plasmide. Les deux souches TGY10-1 et TGY7-11 étant isogé- niques, elles ne diffèrent que par la mutation furl-8 pré- sente dans TGY7-11. On peut donc conclure que la présence de cette mutation rend la souche TGY7-11 incapable de sur- vivre sans plasmide sur milieu complet. RESISTANCE DE DIFFERENTES SOUCHES DE S. cerevisiae A L'EFFET TOXIQUE DU -FLUORO-URACILE Souche Concentration maximale de 5-fluoro- uracile tolérée par les cellules -5 TGY10-1 FE25-3 10-2 M TGY7-11 pTG807 10- M Le seuil de résistance à l'effet toxique du 5fluorouracile a été déterminé sur boite de Pétri contenant du milieu minimum supplémenté avec de l'uracile (30 pg/ml) et des quantités croissantes de l'analogue fluoré (10 6 M et plus). Les concentrations maximales reportées plus haut sont celles au dessus desquelles les cellules ne poussent plus. TABLEAU I EXEMPLE II: EXPRESSION D'UN GENE ETRANGER DANS UNE SOUCHE DE LEVURE ura3 furl. Dans cet exemple on montre: - qu'il est possible de cultiver sur milieu complet une souche S. cerevisiae ura3 furl transformée par un plas- mide hybride sans risquer la perte du phénotype lié au plasmide, - qu'une telle souche cultivée dans ces conditions est capable d'exprimer un gène étranger porté par le plas- mide, - que la mutation furl ne gène pas le niveau d'expression du gène étranger. a) Construction d'une souche diploide comme réceptrice de transformation Les souches S. cerevisiae ura3 furl dépourvues à la fois des activités OMP décarboxylase et UMP pyrophos- phorylase ne sont pas viables. On ne peut donc les utiliser comme réceptrices de transformation. Il faut donc transformer + en un premier temps une souche ura3 en ura par le biais d'un plasmide puis rendre cette souche furl soit par croisement comme décrit dans l'exemple I, soit par sélection (exemple III). Une alternative à la première de ces possibilités est de transformer une souche diploïde homozygote pour l'allèle muté ura3 et hétérozygote pour furl. Une fois rendue ura+ par transformation plasmidique, on peut soit faire sporuler la souche et sélectionner les ségrégeants haploïdes furl, ou alors sélectionner directement des dérivés homozygotes pour furl (par conversion génique) de la souche diploide et utiliser cette souche diploïde comme hôte d'expression. Il est très facile de sélectionner des convertis diploides furl sur milieu contenant du 5-fluorouracile ou du 6-azauracile du fait de la résistance accrue de ces souches à l'effet toxique de ces drogues. 2568891 La souche haploïde S. cerevisiae TGY7-11 (Mata ura3 furl-8/pTG807), dont la construction a été décrite dans l'exemple précédent, a été croisée avec une souche haplolde non apparentée, dérivé ura3 isogénique de TGY100- 1 (Mata, his3, leu2). On a isolé par micromanipulation un zygote diploïde résultant de ce croisement dont le génotype est (ura3 his3 leu2 furi /pTG807) (ura3 + + + / et le phénotype sauvage. En cultivant cette souche sur mi- lieu complet, il a été facile d'obtenir des colonies ayant perdu le plasmide pTG807 et donc devenues ura. Une telle colonie a été isolée et la souche correspondante, appelée TGY8, a été stockée comme réceptrice de transformation. La souche TGY8 a fait l'objet d'un dépôt auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur, portant le numéro d'ordre 1-327. b) Transformation de la souche TGY8 par un plasmide hybride portant le gne URA3 de S. cerevisiae et le Une XYLE de Pseudomonas putida Le plasmide pTG843 est un dérivé du vecteur d'expression pTG833 dont la construction a été détaillée dans la demande de brevet français n 83 08 292. En résumé, pTG843 a la structure suivante: la séquence de base est celle de pBR322. A la place du site EcoRI se trouve intégré le fragment qui comprend le gène URA3 et l'origine de répli- cation du plasmide 2p et dont la construction a été expli- quée à propos de pTG807 (exemple 2). Les séquences de pBR322 entre les sites HindIII et PvuII ont été remplacées par le gène XYLE de pseudomonas (brevets n 16016/83 et n 83 08 292) placé en sandwich entre le promoteur et le terminateur du gène PGK de levure, de façon à ce que l'expression de XYLE dans la levure se fasse sous le contrôle des signaux normalement utilisés pour exprimer le gène PGK (demande de brevet fran- çaise n 84 02 350). Les levures transformées par le plasmide pTG843 synthétisent la catéchol 2.3-oxygénase qui oxyde le catéchol (produit incolore) en produit jaune. Les colonies de levure transformées par ce plasmide, lorsqu'on les vaporise avec du catéchol, prennent une coloration jaune. La souche TGY8 a été transformée par pTG843 en ura+ selon la technique déjà décrite (Hinnen et al, 1978). c) Expression du _&ne XYLE dans les souches ura3 furl 1TG843 cultiv&es en milieu complet La souche TGY8/pTG843 a été mise à sporuler comme décrit dans l'exemple I pour TGY7. Des ségrégeants haploïdes ont été isolés par le traitement éther comme dé- crit plus haut. Parmi ces ségrégeants haploïdes, 5 souches furl-8 ont été sélectionnées sur la base de leur résistance à l'effet toxique du 5-fluorouracide 5 10-3M. Comme la souche TGY8 est issue de deux parents non isogéniques, sa descendance est constituée de souches haploides toutes génétiquement différentes les unes des autres. De fait, les 5 ségrégeants haploides furl-8 présen- tent tous la coloration jaune après la vaporisation au caté- chol, mais l'intensité et la rapidité de la réponse varient énormément d'une souche à l'autre, ce qui trahit la diversité génétique de ces souches. Ces 5 souches appelées respectivement TGY8-2, TGY8-3, TGY8-7, TGY8-9 et TGY8-10 ont été cultivées pendant plus de trente générations en milieu complet comme décrit dans l'exemple I pour TGY7-11. En parallèle, une souche de labo- ratoire TGYlspl (ura3-his3) transformée par pTG843 a été cul- tivée dans les mêmes conditions. Les cultures ont ensuite été diluées puis étalées sur milieu complet de façon à obte- nir une centaine de colonies isolées par boîte. Apres trois jours de croissance les cellules ont été vaporisées au caté- chol et répliquées sur milieu minimum complémenté en casamino- acides. Dans le cas des souches ura3 furl, toutes les colonies ont répondu au catéchol en jaunissant, et toutes se sont avérées capables de pousser sur milieu minimum plus amino- acides. Dans le cas de la souche TGYlsp1, aucune coloration n'était observable; aucune colonie n'était capable de pous- ser sur milieu minimum plus aminoacides. Ces résultats confir- ment ceux exposés dans l'exemple I, à savoir que même sur mi- lieu complet la mutation furl-8 permet de contresélectionner les cellules ayant perdu le plasmide. Les 5 souches ura3 furl pTG843 et la souche TGYlsp1 pTG843 ont été cultivées une nuit en milieu liquide, complet pour les cinq premières, minimum plus histidine pour la dernière. Les cellules ont été recueil- liesle matin en phase exponentielle de croissance, broyées et testées pour leur contenu en catéchol-2-3-oxygénase. Le résultat du dosage est reporté sur le tableau II (test 1). L'activité spécifique de la catéchol-2-3-oxygénase de TGYlsp1 pMG843 étant arbitrairement fixée à 1, on voit que l'activité des souches ségrégeant de TGY8 varie de 6 à 19. Cette surpro- duction par rapport à l'expression dans TGY1 spl peut s'expliquer ou bien par une différence génétique entre les souches, ou bien par un effet des conditions de culture. Pour tester cette seconde hypothèse nous avons recommencé l'expérience avec la souche TGY8-3 cultivée en parallèle en milieu complet et milieu minimum. Le résultat, reporté dans le tableau II (test 2). montre que l'activité en catéchol-2-3-oxygénase est nettement meilleure de presque un facteur huit - lorsqu'on cultive les cellules sur milieu complet. La souche TGY8-3 pTG843 a fait l'objet d'un dépôt auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorga- nismes de l'Institut Pasteur, portant le numéro d'ordre 1-326. EXEMPLE III: SELECTION DE MUTANTS furl SPONTANES A PARTIR D'UNE SOUCHE Ura3 TRANS- FORMEE PAR UN PLASMIDE HYBRIDE Un des paramètres impliqués dans le niveau d'expres- sion d'un gène cloné dans la levure peut être le génome de la souche réceptrice. En supposant que l'on ait réussi à sélec- tionner une souche ura3 capable d'exprimer à un très haut ni- veau un gène étranger donné, il peut être désavantageux de la croiser avec une souche furl non-isogénique au risque de perdre le caractère de très bonne expression dans le diploïde ou dans la descendance. Il est en revanche possible de sélec- tionner directement des mutants furl spontanés à partir de la souche ura3 transformée. Cette deuxième stratégie a comme avantage de permettre la comparaison entre le mutant furl et la souche dont il dérive et de pouvoir ainsi étudier l'effet spécifique éventuel de la mutation furl sur la physiologie de la souche. Dans cet exemple on a choisi la souche déjà men- tionnée TGYlsp1 (Mata ura3 his3), cette fois-ci transformée par le plasmide pTG856. La structure de pTG856 a été décrite dans -la demande de brevet français no 8315716.Ce plasmide contient la séquence du gène URA3; l'origine de réplication du plas- mide 2 p avec le locus REP3 qui diminue fortement la ségré- gation mitotique des plasmides hybrides (Jayaran et al., 1983); Kikuchi, 1983; ce dernier auteur désigne ce locus sous le nom de STB); la séquence codante du gène de la gly- coprotéine rabique flanquée du promoteur, en amont, et du terminateur, en aval, du gène PGK de levure;et des séquences de pBR322 dont l'origine de réplication et le gène de résis- tance à l'ampicilline. La souche TGYlsp1 pTG856 doit être cultivée sur milieu minimum supplémenté en histidine, mais pas sur milieu complet o les cellules tendent à perdre leur capacité à produire la glycoprotêine rabique. Pour permettre la culture de la souche sur milieu riche, on peut sélectionner des mu- tants furl sur la base de leur résistance à l'effet toxique d'analogues des bases pyrimidiques, tels que le 6-Azauracile, le 5-Fluorouracile, la 5-fluorocytosine, etc.. Environ 107 cellules de la souche TGY1 spl pTG856 ont été étalées sur milieu complet additionné de 5-Fluoro- uracile 5 mM. Après 8 jours d'incubation à 30 C, douze sur- colonies ont été repiquées et subclonées sur milieu complet additionné de 5-Fluorouracile 1 mM. Apres subclonage, les douze souches ont été mises àcultiver dans du milieu complet (1 ml), puis reprises en fin de phase exponentielle et diluées 1000 fois dans le milieu complet (1 ml) pour des cultures la nuit. Le lendemain les cellules ont été diluées et étalées sur bolte de milieu complet de façon à obtenir de chaque sou- che cent à deux cents colonies isolées. En paralèle, on a réalisé la même série de cultures avec la souche originelle TGYspl/pTG856. La proportion de colonies ayant gardé la capa- cité à pousser sur milieu minimum plus histidine a été testée par replique en velours. Cette proportion est comprise entre et 30 % pour la souche TG-Ylspl pTG856 et 8 dérivés ré- sistant au 5-Fu, et est de 100 % pour 4 autres souches résis- tantes au 5-Fu. On a donc obtenu 4 souches sur 12 capables de pousser sur milieu complet sans perte du phénotype lié à la présence du plasmide, on a vérifié par un test de complémen- tation allélique que ces 4 souches présentaient une mutation de type furl, alors que les 8 autres souches présentaient une ou des mutations à d'autre(s) locus que Furl. Cet exemple montre qu'on peut aisément obtenir des mutants furl à partir d'une souche ura3 transformée par un plasmide, et que de tels mutants peuvent être utilisés en culture dans du milieu riche. TABLEAU II: DOSAGE DE LA CATECHOL-OXYGENASE DANS DIFFERENTES SOUCHES DE LEVURE Test 1: Souche TGY8-2 TGY8-3 TGY8-7 TGY8-9 TGY8-10 TGY1 spl milieu complet complet complet complet complet min. + his. Activité spécifique *catéchol- oxygtéhnasel 39(5.6) 95(13.5) 69(9.8) 45(6.4) 131(18.7) 7(1) (mU/mg pro- o téine) Test 2: Souche TGY8-3 TGY8-3 milieu complet minimum Activité spéci- fique catéchol- 79 10 oxygénase (mU/mg protéine) Les chiffres indiqués entre parenthèses indiquent les rapports de surproduction par rapport à une souche FUR1+ cultivée en milieu minimum+ histidine. 256889 1 REFERENCES Bach, M.L., Lacroute, F., Botstein, D. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76,386-390. Beggs, J.D. (1981) in Genetic Engineering vol. 2, p.175-203, Ed. R. Williamson, Acad. Press. Bolivar, F., Rodriguez, F.L., Greene, P.J., Betlach, M.C., Heynecker, H.L., Boyer, H.M. (1977) Gene 2, 95-113. Broach, J.R. (1981) in the Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces Eds. J. Strathern, E. Jones & J. Broach C.S.H. New York. Girwitz, S.C., Boschetti, S., Rainbow, A.J., Graham, F.L. (1980) Annal Biochem. 106, p. 492. Hinnen, A., Hicks, J.B., Finck, G.R. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929-1933. Chevallier, M.R., Aigle, M. (1979) FEBS Lett. 108, 179-180 Chevallier, M.R., Bbch, J.C., Lacroute, F. (1980) Gene 11, 11-19. Jayaran, M., Li, Y.Y., Broach, J.R. (1983) Cell 34, 95-104o Jund, R., Lacroute, F. (1970) J. Bacteriol. 102, 607-615 Jund, R., Lacroute, F. (1972) J. Bacteriol. 109, 196-202. Kikuchi, Y. (1983) Cell 35, 487-493. Mortimer, R.K., Hawthorne, D.C. (1966) Genetics 53, 165-173. REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation d'une souche transformée par un vecteur de clonage ou d'expression d'un gène codant pour une protéine déterminée qui peut être cultivée sur un milieu complet sans pression de sélection, caractérisé en ce que: (a) on identifie un métabolite dont l'absence est léthale pour la souche et qui est synthétisé par au moins deux voies métaboliques, (b) on bloque une première desdites voies métabo- ligues en altérant au moins l'un des gènes impliqués dans ladite voie, (c) on transforme la souche par le vecteur qui comporte, en outre, l'allèle fonctionnel du gène altéré, (d) on bloque les autres voies métaboliques. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le métabolite considéré est l'uridine 5'-mono- phosphate. 3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le gène impliqué dans la première voie métabolique est un gène impliqué dans la synthèse d'ureOMP décarboxylase active et en ce que le vecteur comporte un gène codant pour une OMP décarboxylase active. 4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le gène altéré dans la première voie métabolique est le gène URA3 et la souche est une souche de levure et en ce que le vecteur comporte l'allèle fonctionnel du gène URA3. ) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que pour bloquer les autres voies métabo- ligues on altère un gène impliqué dans la synthèse d'une UMP pyrophosphorylase active. 23 2568891 6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le gène altéré et impliqué dans la synthèse d'une UMP pyrophosphorylase active est situé dans le locus FUR1. 7) Procédé selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que l'allèle fonctionnel du gène URA3 provient de l'ADN d'une souche de levure appartenant au genre Saccharomyces. 8) Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le vecteur comporte au moins: - un fragment d'ADN codant pour une protéine déterminée sous la promotion - d'un promoteur de levure, - l'allèle fonctionnel du gène altéré. 9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le vecteur comporte en outre une origine de réplication dans les levures. ) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'origine de réplication est celle du plasmide 2p de levure. 11) Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le vecteur est un plasmide choisi parmi PTG806 et pTG807. 12) Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le gène codant pour une protéine déterminée est le gène xylEo 13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le plasmide vecteur est p*G843. 14) Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'on transforme une souche de levure ura3 par un vecteur complémentant l'auxotrophie et on + sélectionne les souches ura puis on bloque les autres voies +métaboliques des souches ura métaboliques des souches ura ) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que pour bloquer les autres voies métaboliques des + souches ura on croise ces souches avec un mutant furl et on sélectionne les produits de croisement ura,furl. 16) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que pour bloquer les autres voies métaboliques des souches ura+ on sélectionne les mutants spontanés ura,furl. 17) Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'on transforme une souche diploïde homozygote pour ura3 et hétérozygote pour furl. 18) Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'on sélectionne les ségrégants haploïdes furl après sporulation d'une souche diploïde selon la revendication 17. 19) Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'on sélectionne après conversion génique d'une souche diploïde selon la revendication 17, les dérivés homozygotes pour furl. ) Cellule procaryote ou eucaryote préparée par un procédé selon l'une des revendications 1 à 19. 21) Cellule eucaryote selon la revendication 20, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure. 22) Cellule eucaryote selon la revendication 20, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de levure appartenant au genre Saccharomyces, notamment Saccharomyces cerevisiae. 23) Souche de Saccharomyces caractérisée en ce que: - elle est incapable de synthétiser une OMP décarboxylase active, - elle est incapable de synthétiser une UMP pyrophosphorylase active, et - elle est transformée par un plasmide d'expression d'une protéine déterminée portant en outre un gène codant pour une OMP décarboxylase active. 24) Procédé de préparation d'une protéine déterminée, caractérisé en ce que l'on cultive sur un milieu complet une souche de cellule selon l'une des revendications 20 à 23 et en ce que l'on récupère la protéine obtenue.