FR 2550224 A1 19850208 FR 8412353 A 19840803 I 2550224 La présente invention se rapporte généralement à la production biologique de L-aminoacides Dans la demande de brevet Amériain en cours N 520 632 intitulée "Production of L-amino Acids from alpha-Keto Acids" (Murray C Fusee) 5 déposée le 5 Août 1983, il est relevé qu'un L-aminoacide peut être préparé à partir de son alpha-cétoacide précurseur correspondant en introduisant l'alpha-cétoacide dans une culture activement logarithmiquement croissante d'un microorganisme approprié dans un milieu nutritif Il y a de nombreux microorganismes permettant la biotransformation des alpha-cétoacides en L-aminoacides. On a maintenant découvert que le taux optimal de l'alimentation en alphacétoacides pouvait être directement mis en corrélation avec les changements du p H de la culture provoqués par les changements du taux de croissance de la culture L'addition d'un alpha-cétoacide de cette façon peut avoir pour résultat une plus forte conversion du précurseur en Laminoacide Par ailleurs, ce procédé permet également de contrôler le milieu de culture pour donner, aux microorganismes, un environnement optimal pour la continuation de la phase de croissance logarithmique. On sait que les alpha-cétoacides peuvent être convertis par voie enzymatique en L-aminoacides correspondants Par exemple, le brevet US N 2 749 279 révèle un procédé dans lequel on traite de l'acide alphacétoglutarique et de l'ammoniac avec un catalyseur biologique d'enzymecoenzyme Les catalyseurs biologiques appropriés peuvent être obtenus des tissus animaux, de plantes à croissance rapide ou de bactéries sous la forme d'auto30 lysats ou extraits de la culture des cellules De même, le brevet US N 4 304 858 révèle la conversion d'acides alphacétocarboxyliques solubles dans l'eau en aminoacides correspondants en présence d'une déshydrogénase spécifique au substrat, d'ions ammonium et de nicotinamide-adénine35 dinucléotide (NAD+/NADG) La transformation d'alphacétoacides en aminoacides en utilisant des suspensions de cellules au repos a été rapportée par Yamada et autres, 2 2550224 The Production of Amino Acids, pages 440-46 ( 1972). Il y a de nombreux microorganismes permettant la biotransformation d'alpha-cétoacides en L-aminoacides. Le procédé de la demande de brevet en cours de Fusee utilise avantageusement les systèmes d'enzymes couplés que l'on trouve dans ces microorganismes pour produire la réaction de transamination dans laquelle l'alphacétoacide se transforme en L-aminoacide En utilisant la culture activement en croissance de cette façon, Fusee a 10 trouvé que la réaction était entraînée sensiblement vers l'aboutissement et qu'il y a un recyclage continu du donneur amino (L-glutamate) et du coenzyme (NADPH ou NADH). L'acide L-amino peut être récupéré du bouillon de culture. Le procédé ci-dessus décrit de Fusee a été amélioré en liant le taux d'alimentation en alpha-cétoacide au taux de croissance de la culture Des microorganismes ont été identifiés qui produisent divers acides lorsqu'ils sont dans la phase de croissance active La chute résultante du p H du bouillon de culture sert de retenue natu20 relle sur la croissance des cellules et peut affecter de manière négative la croissance et le métabolisme si elle n'est pas contrôlée L'amélioration révélée ici consiste à ajouter une solution basique de l'alpha-cétoacide en quantités suffisantes pour corriger cettechute naturelle 25 du p H Ainsi, l'alphacétoacide précurseur est introduit dans la culture à un taux à peu près proportionnel au taux de croissance Ce taux est simultanément à peu près proportionnel à l'étendue à laquelle le système d'enzymes couplés des microorganismes en croissance est disponible 30 pour la biotransformation On a également trouvé qu'en contrôlant les limites supérieures du p H du bouillon de culture, cela maintenait un environnement optimal pour le métabolisme actif. Ce procédé perfectionné est destiné-à permettre 35 à la culture de croissance d'autoréguler la cadence et le taux d'alimentation en alpha-cétoacide. La présente invention a pour autre objet un procédé maintenant des conditions optimales de l'environnement pour la croissance et le métabolisme des microorganismes. La présente invention a pour autre objet supplé5 mentaire l'élimination d'une étape de procédé dans la biotransformation en permettant l'utilisation de la solution de l'alpha-cétoacide pour l'alimentation de la culture sans devoir d'abord la neutraliser. La présente invention a pour autre objet d'empêcher 10 une perte possible des ingrédients actifs par élimination de cette étape de neutralisation. Par ailleurs, il est prévu que le procédé de l'invention soit utile avec une large plage de microorganismes et pour la production d'une large plage de 15 L-aminoacides. La présente invention a également pour objet un procédé o une seule souche d'un microorganisme peut produire des quantités suffisantes de tous les enzymes requis pour convertir un alpha-cétoacide donné en un 20 L-aminoacide. La présente invention a pour autre objet d'obtenir un taux élevé de conversion de l'alpha-cétoacide en L-aminoacide en une courte période de réaction. La présente invention a pour autre objet un 25 procédé produisant un rendement élevé de L-aminoacides en présence d'une faible concentration du donneur d'amine. La croissance bactérienne peut généralement être subdivisée en trois phases séquentielles La phase de croissance ralentie est une période pendant laquelle il 30 y a peu ou pas d'augmentation du nombre des microorganismes dans la culture Pendant la phase de croissance logarithmique ou exponentielle, le nombre des cellules augmente exponentiellement avec le temps Dans la phase stationnaire, il y a peu ou pas de croissance ou de division 35 des cellules. On a trouvé que la transamination microbienne d'un alpha-cétoacide en un L-aminoacide pouvait être entreprise 4 2550224 avec une efficacité accrue en ajoutant l'alpha cétoacide à une culture en croissance logarithmique de microorganismes appropriés Le procédé utilise avantageusement les systèmes d'enzymes couplés présents dans les microorganismes en 5 croissance pour entraîner la réaction de transamination jusqu'à son aboutissement. La présente invention révélée ici permet d'améliorer ce procédé de transamination biologique en ajustant le taux de l'alimentation en alphacétoacide pour qu'il corresponde directement au taux de production d'acide qui, à son tour, correspond sensiblement au taux de croissance de la culture L'alpha-cétoacide est introduit dans la culture sous forme d'une solution basique aqueuse Cette base est ajoutée en quantités équilibrant 15 les acides produits par les microorganismes pendant les phases de croissance Cela a pour résultat que le p H du bouillon de culture est maintenu à un état sensiblement stable Ce procédé de "alimentation sur demande" utilise avantageusement les capacités métaboliques croissantes 20 de la culture tandis qu'elle entre dans la phase de croissance logarithmique De plus, le p H stable produit un environnement optimisé pour une meilleure croissance bactérienne et un meilleur métabolisme Lorsque la fermentation est terminée, le L-aminoacide produit peut 25 être récupéré du bouillon de culture. On décrira maintenant la réaction de transamination. La biotransformation de l'alpha cétoacide en L-aminoacide est une réaction de transamination enzymatique. 50 La biotransformation est rendue possible par un système couplé enzyme-coenzyme comprenant une transaminase, un glutamate déshydrogénase, le coenzyme NADP+/NADPH (ou NAD+/NADH), et une déshydrogénase Alternativement, ce dernier composant du système d'enzymes peut être une 35 hydrogénase pour le recyclage de NADP+ (ou NAD+) vers NADPH (ou NADH). Le système réactionnel couplé peut être représenté graphiquement comme suit: (NADPH) ou L(NADH) "-céto amino5 Xiglutarate acide ( hydre génase +H 4 + oudas ou g-nas e / gluta aminase /dés-\ mate hydro déshydrogénase génase (NADP+) Lglutamate o cétoou acide (NAD+) ( 3) ( 2) ( 1) La réaction souhaitée de transamination (étape ( 1)), alpha-cétoacide en L-amninoacide, est normalement réver20 sible et atteindrait simplement l'équilibre, limitant ainsi l'efficacité de la conversion en aminoacide En couplant la réaction de transamination à d'autres réactions enzymatiques, la réaction de transamination peut théoriquement être amenée à l'aboutissement, bien que 25 des réactions chimiques de dégradation puissent être présentes, pouvant diminuer le rendement réel. Dans la réaction enzymatique couplée désignée par l'étape ( 2) ci-dessus, on recycle l'un des produits de transamination, l'alpha-cétoglutarate, vers le L-glutamate Cette étape, une amination réductrice, est rendue possible par le glutamate déshydrogénase et nécessite la présence d'ions ammonium Le L-glutamate disponible pour la transamination de l'alphacétoacide en L-aminoacide est continuellement remplacé par cette étape de recyclage. Dans l'étape ( 2), on utilise l'un des coenzymes NADPH ou NADH, qui se convertit en NADP+ ou NAD+ Une troisième réaction enzymatique, l'étape ( 3), reconvertit 6 2550224 ce NADP+ (NAD+) produit en NADPH (NADH) soit par réaction de déshydrogénase ou réaction d'hydrogénase. Ainsi, le NADPH (NADH) requis pour l'étape ( 2) est également continuellement réapprovisionné Le NH 4 + requis pour l'étape ( 2) est introduit dans le milieu nutritif. Le système réactionnel enzymatique est connu en lui-même Cependant, les usages antérieurs de ce système ont nécessité l'addition de trois microorganismes différents pour introduire les composants réactionnels des trois étapes représentées ci-dessus, brevet US N 3 183170 (Kitai et autres) ou l'addition de microorganismes, donneurs d'amine et cofacteur (Yamada et autres The Microbial Production of Amino Acids, pages 440-46 ( 1972). Par ailleurs, dans ces procédés selon l'art antérieur, 15 on utilise des suspensions de cellules au repos. Le procédé de transamination biologique révélé par Fusee utilise une seule souche de microorganismes pour produire tout le système réactionnel enzymatique couplé Une culture en croissance logarithmique de micro20 organismes appropriés, en prévoyant des ions ammonium dans le milieu de culture, permettra les trois étapes de biotransformation des alphacétoacides en L-aminoacides respectifs L'étape ( 3) dans le système d'enzymes couplés du procédé de Fusee utilise une réaction de déshydrogénase 25 pour convertir NADP+ (NAD+) en NADPH (NADH). Les réactifs seront maintenant décrits Le système réactionnel enzymatique couplé décrit ci-dessus est présent dans des microorganismes en croissance active. Ce système naturel peut maintenant être utilisé pour la 30 conversion efficace d'alpha-cétoacides en L-aminoacides. En donnant aux microorganismes appropriés, le substrat approprié, la conversion est effectuée à de hauts rendements par les microorganismes eux-mêmes. Les types de microorganismes appropriés à une 35 utilisation dans ce processus de bioconversion sont considérablement variés Par exemple, il a été rapporté dans la demande de Fusee en cours que les souches bactériennes connues comme étant des producteurs de l'acide glutamique pouvaient être utilisées Elles comprennent l'espèce Brevibacterium, l'espèce Corynebacteria et E Coli HB 101 On a pu démontrer (voir exemples) que le procédé perfectionné selon l'invention pouvait être utilisé avec Brevibacterium thiogenitalis (ATCC N 31723), Brevibacterium lactofermentum (ATCC NO 21420) et Brevibacterium flavum (ATCC N 13826) Le N indiqué d'ATCC est le numéro de désignation donné à 10 chaque culture par American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 30852, o chacune des cultures ci-dessus a été déposée On peut s'attendre à ce que d'autres microorganismes capables d'entreprendre la bioconversion basique et sécrétant des 15 quantités importantes d'acide pendant la phase de croissance logarithmique soient également appropriés à une utilisation dans le procédé perfectionné. Il est apparent qu'il y a une grande variété de microorganismes utiles dans ce procédé de bioconversion. 20 La première condition est que le microorganisme soit capable d'absorber et de convertir un alpha-cétoacide en L-aminoacide correspondant Afin d'effectuer très efficacement la bioconversion, le microorganisme doit pouvoir produire des quantités suffisantes des enzymes mis en 25 cause dans les étapes ( 1) à ( 3) du système d'enzymes couplés pour entraîner la réaction de transamination au delà du point d'équilibre, sensiblement vers l'aboutissement Enfin, le microorganisme doit de préférence être capable de sécréter le Laminoacide dans le milieu de 30 culture pour une récupération facile et économique. La seconde condition est que le microorganisme produise et sécrète des quantités sensibles d'acides pendant la phase de croissance logarithmique ou exponentielle Des exemples d'acides tout à fait typiquement 35 sécrétés sont l'acide lactique, l'acide glutamique et l'acide succinique, bien que la sécrétion d'autres acides soit appropriée dans le cadre du présent procédé Les 8 2550224 quantités sécrétées doivent être suffisantes pour ramener le p H du bouillon de culture à une plage d'environ 4 à 6 s'il n'est pas contrôlé extérieurement par l'addition d'une base. L'alpha-cétoacide choisi pour une utilisation avec ce procédé dépendra du L-aminoacide qui est le produit souhaité Par exemple, l'acide phénylpyruvique se convertit en L-phénylalanine, l'acide alphaisocaproîque en L-leucine, l'acide alpha-cétoisovalérique en L-valine, 10 l'acide pyruvique en L-alanine, l'acide oxaloacétique en acide Laspartique, l'acide -3 -hydroxy-alpha-cétobutyrique en L-thréonine, l'acide p-oxyphényl pyruvique en L-tyrosine, l'acide indole pyruvique en L-tryptophane, l'acide alpha-céto-j 3-méthylvalérique en L-isoleucine, etc. 15 Comme on peut le voir, les L-aminoacides précurseurs conventionnels sont utilisés dans ce procédé. L'alpha-cétoacide utilisé dans ce procédé est de préférence une solution basique aqueuse Par exemple, l'alpha-cétoacide peut avantageusement se dissoudre dans 20 0,1 M à O i 6 M d'une solution aqueuse de potasse La soude, l'ammoniaque ou l'urée peuvent également être utilisées comme toute autre base compatible avec la culture de croissance et la réaction de transamination On a trouvé que KOH était préférable lors de l'utilisation de l'acide 25 phénylpyruvique (PPA) comme précurseur parce que PPA est très soluble dans KOH On peut s'attendre à ce que, dans des buts de solubilité, certaines bases soient préférées pour une utilisation avec certains alpha-cétoacides La concentration peut varier afin de maintenir le p H souhaité 30 dans le fermenteur le taux d'alimentation étant ajusté en conséquence Cependant, typiquement, la concentration de la base sera comprise entre environ 0,1 % (poids/volume) et environ 20 % (poids/volume). Si l'on utilise l'alpha-cétoacide sous la forme 35 d'un hydrolysat de sodium ou de potassium, il ne sera normalement pas nécessaire de dissoudre l'alpha-cétoacide dans une base Par exemple, un hydrolysat de sodium (acide Na phénylpyruvique) de 5-benzylidènehydantoine ( 5-BH) produit en faisant bouillir 5-BH avec de l'eau et Na OH puis en refroidissant dans un bain de glace (voir exemple 3), donnera une solution à un p H d'environ 13,5. 5 De même, l'acide Na alpha-céto- isocaproîque hydrolysé de 1 'isobutylidènehydantoine à un p H d'environ 13,5 et l'acide Na alpha-cétoisovalérique hydrolysé de l'isopropylidènehydantoine a un p H d'environ 13,8 Ils seront appropriés à une utilisation comme régulateur du p H dans 10 le procédé de l'invention. Il est préférable que l'alpha-cétoacide soit ajouté à la culture en solution aqueuse comprenant une base appropriée car cette forme facilite le pompage du précurseur dans le bouillon de culture Cependant, si on 15 le souhaite, l'alpha-cétoacide peut être utilisé dans une bouillie qui comprend une base appropriée. La concentration de l'alpha-cétoacide dans la solution aqueuse, si c'est la forme de son introduction dans la culture, peut considérablement varier Par exemple, 20 si l'on utilise la présente invention dans une fermentation continue, la solution sera plus diluée que pour une fermentation discontinue La limite supérieure de la concentration peut dépendre principalement de la solubilité de l'alpha-cétoacide dans le solvant souhaité On 25 peut s'attendre à ce que des niveaux d'environ 1,0 à environ 200 g/l soient appropriés, la concentration dépendant de l'alpha-cétoacide particulier, ainsi que des facteurs décrits ci-dessus Le solvant le plus pratique et le plus économique sera l'eau, et d'autres 30 solvants compatibles avec le système, le milieu de culture, par exemple, peuvent être utilisés si on le souhaite. Le milieu nutritif peut être choisi pour produire des conditions de croissance optimale du microorganisme 35 utilisé Le choix, la variation et l'ajustement des milieux sont bien dans les capacités de toute personne compétente en la matière, et n'ont pas à être décrits ici en détail. Cependant, en plus des conditions nutritionnelles basiques, le milieu doit contenir une source de NH 4 +. Les ions ammonium sont utilisés par les microorganismes 5 à la fois pour augmenter la masse des cellules et pour l'étape ( 2) du système des réactions enzymatiques couplées. Ainsi, les niveaux d'ions ammonium dans le milieu de culture doivent être déterminés par la production souhaitée de l'aminoacide et la masse des cellules Cet ajustement 10 du niveau de NH 4 + est également bien connu des personnes compétentes en la matière Par exemple, les ions peuvent être avantageusement fournis en ajoutant, au milieu nutritif, du sulfate d'ammonium à une concentration d'environ 10 à environ 50 g/l Alternativement, on peut 15 utiliser, comme donneur de NH 4 +, de l'urée, du chlorure d'ammonium, du nitrate d'ammonium, de l'acétate d'arrmonium etc. Le procédé de bioconversion de la présente invention nécessite une culture de microorganismes en 20 croissance active Cette culture peut être préparée en inoculant une quantité de substance nutritive stérile au milieu de croissance d'une culture de semence de la souche souhaitée La culture de semence utilisée pour inoculer le milieu nutritif peut de préférence croître 25 pendant 6 à 40 heures avant son utilisation comme inoculum Le temps de croissance de la culture de semence avant l'inoculation variera selon la souche bactérienne utilisée Il est souhaitable que la culture d'ensemencement comprenne une masse saine de cellules en croissance suffisante pour former une bonne base pour l'établissement et la croissance de la culture de fermentation. La dimension du réacteur de fermentation dépendra de l'application spécifique de ce procédé L'ajustement des quantités du milieu et de la culture d'ensemencement 35 aux conditions d'un réacteur spécifique ou d'un rendement souhaité sont bien dans la connaissance de toute personne compétente en la matière. il 2550224 On laisse la culture croître dans le réacteur de fermentation jusqu'à ce qu'elle se soit acclimatée à l'environnement du réacteur et qu'elle ait atteint une masse de cellules suffisante pour résister à l'addition de l'alpha-cétoacide Cela est particulièrement important lorsque l'on utilise un précurseur impur La densité optique peut être une mesure pratique de croissance des cellules Une densité optique ("D O ") ( 640 nm) d'environ indique généralement que la culture est prête pour 10 l'addition de l'alpha-cétoacide Cela correspond à une durée de croissance d'environ 6-40 heures, selon l'organisme et les conditions de croissance Cependant, cela peut être quelque peu variable et ne doit pas être considéré comme une condition stricte, mais plutôt laissé à l'expérience et à la discrétion de l'opérateur. On fait croitre la culture à une température compatible avec une croissance maximale de la souche bactérienne utilisée La plage générale sera comprise entre les températures ambiantes et environ 37 C Pour 20 les espèces Corynebacteria et Brevibacterium, la température préférée est d'environ 30 C Le p H de la culture doit de préférence être d'environ 78 avant la chute du p H associée au début de la croissance logarithmique Une aération peut être prévue si elle est 25 nécessaire à la souche bactérienne choisie. Pendant la croissance ralentie et la croissance logarithmique, de nombreux microorganismes, les espèces Brevibacterium et Corynebacterium par exemple, produisent et sécrètent divers acides Ces acides peuvent comprendre 30 l'acide glutamique, l'acide lactique, l'acide succinique et d'autres L'addition de ces acides au milieu de culture abaissera le p H à environ 4-6 s'il n'est pas contrôlé par l'addition d'une base Cette plage abaissée du p H aura un effet néfaste important sur la croissance bactérienne 35 et les taux métaboliques. Inversement, on a pu observer que la croissance commence à atteindre la phase stationnaire, la production 12 2550224 d'acide par les microorganismes ralentissait et cessait presque Tandis que des portions de la population de cellules mourraient, des composants basiques, comme les amines, se trouvaient libérés dans le bouillon de fermentation Non contrôlée, cette libération de base peut augmenter le p H au delà d'environ 8 Des niveaux élevés du p H sont également néfastes pour la culture et en même temps inhiberont le métabolisme et tueront au moins des portions de la population restante des cellules 10 viables. C'est la culture de cellules en croissance et en métabolisme actifs qui forme le système d'enzymes couplés qui entra Ine la réaction de transamination de ce procédé On a maintenant trouvé qu'en introduisant une solution de base du précurseur de l'alpha-cétoacide dans la culture en réponse à la demande du p H, le précurseur était -donné aux microorganismes à un taux qui égalait sensiblement leur capacité à le convertir en L-aminoacide produit Tandis que la culture entre dans la phase de croissance logarithmique et que le p H commence à baisser, une solution basique de l'alpha-cétoacide est introduite à un taux pouvant maintenir le p H à ou au delà d'un niveau prédéterminé, de préférence compris entre environ 6,5 et environ 7,5. De plus, il peut être souhaitable d'établir une limite supérieure du p H entre environ 7,5 et environ 8. Cela servira à aider à maintenir la santé et l'activité métabolique des microorganismes même après ralentissement de la croissance active Cette limite supérieure du p H 30 peut être maintenue en alimentant la culture de tout acide compatible avec la fermentation Les acides appropriés comprennent l'acide sulfurique, l'acide citrique, l'acide phosphorique, l'acide acétique glacial à l'état concentré, etc Tout acide peut être utilisé compatible 55 avec la croissance ou le métabolisme des microorganismes et avec la réaction de transamination. Tout moyen approprié peut être utilisé pour 13 2550224 surveiller continuellement le p H du bouillon de culture et ajouter la base ou l'acide nécessaire pour contrôler le p H dans certaines limites préétablies Il est préférable, pour la facilité et la précision, d'utiliser un capteur ou contrôleur automatisé du p H pouvant signaler à une ou plusieurs pompes d'expulser la base ou l'acide dans le fermenteur à un taux prédéterminé De cette façon, on peut obtenir une réponse immédiate et appropriée aux changements ou fluctuations du p H du bouillon Cela est 10 équivalent à une réponse sensiblement immédiate à des changements de la croissance des cellules et des taux métaboliques. Le taux de l'alimentation de la base ou de l'acide dépendra bien entendu du p H et de la concentration 15 de la solution à ajouter, ainsi que de la demande en p H du bouillon de culture De plus, il est envisagé que la base ou l'acide puissent être introduits soit continuellement ou par charges introduites jusqu'à ce que le niveau souhaité du p H soit atteint On a trouvé que des taux d'alimentation d'environ I à 3 ml/mn étaient appropriés pour un fermenteur de 700 ml, avec des durées d'alimentation comprises entre 1,0 seconde et environ 10 minutes en se basant sur la demande. Pendant la phase de croissance initiale (ralentie), 25 c'est-à-dire après inoculation par la culture d'ensemencement, les limites inférieures du p H peuvent 8 tre contrôlées par l'addition de toute base compatible avec la culture en croissance Pendant cette période initiale, la culture n'aura pas atteint la phase de croissance logarithmique pendant laquelle l'alpha-cétoacide précurseur se convertit activement en L-aminoacide Bien que la solution basique de l'alpha-cétoacide puisse 8 tre divisée pour le contrôle du p H pendant la phase de croissance ralentie, cela peut être néfaste à la santé de la culture, en particulier si 35 l'on utilise un précurseur impur Dans tous les cas, la pleine utilisation du précurseur ne se produit pas jusqu'à ce que la croissance logarithmique soit atteinte. 14 2550224 Pour cette raison, il est préférable, pendant la phase de croissance initiale, d'utiliser une base appropriée, telle qu'une base compatible avec la culture en croissance, ne contenant pas le précurseur Les bases appropriées comprennent, par exemple, l'ammoniaque, l'urée, la soude, la potasse et le gaz ammoniac. En commençant à environ 6 à 10 heures, lorsque le D O ( 640 nm) a atteint environ 10 et que le p H a baissé à environ 6,8 à 7,0, de plus amples diminutions du p H sont contrôlées par l'addition de l'alpha-cétoacide en solution basique comme on l'a décrit dans la section qui précède Le taux d'alimentation pendant cette phase de croissance logarithmique (ou production d'acide) est essentiellement déterminé par la demande du p H, mais il 15 est également souhaitable de maintenir la concentration en alpha-cétoacide dans le bouillon en dessous d'environ g/l Des concentrations supérieures à cela peuvent être néfastes à la culture en croissance, en particulier lorsque l'on utilise un précurseur impur. On introduit, dans le bouillon de culture, en réponse à la demande du p H, autant de solution du précurseur que possible Lorsque la production bactérienne des acides diminue à un point qui n'est pas suffisant pour amener le p H du milieu en dessous d'environ 6,8 à 25 environ 7,5, et de préférence d'environ 7,2, la limite du p H peut être élevée afin d'introduire du précurseur supplémentaire sur une base de demande de p H Par exemple, la limite inférieure du p H peut être élevée à environ 7,8. Après avoir terminé l'alimentation par demande 30 en p H, le restant du volume total de l'alpha-cétoacide que l'on cherche à convertir en Laminoacide est introduit dans le bouillon On a trouvé que si le restant de l'alpha-cétoacide pouvait être introduit sur une période pouvant atteindre environ 24 heures ou plus, de 35 préférence de 2 à 8 heures, il se convertissait en L-aminoacide en quantités sensibles Par exemple, si l'on souhaite introduire 300-400 cm 3 d'une solution à 80 g/l 1 5 2550224 du précurseur pour un volume de 700 cm 3 du bouillon, on peut introduireenviron un tiers à la moitié du précurseur en réponse à la demande du p H pendant la phase de croissance logarithmique Le restant est introduit pendant les 2 à 8 heures qui suivent ou plus. La limite supérieure du p H est établie à un point prédéterminé entre environ 7,5 et 8,0, de préférence à environ 7,8 Comme on l'a décrit ci-dessus, cette limite est également contrôlée pour la santé optimale et 10 la meilleure activité métabolique de la culture Comme avec le contrôle de la limite inférieure du p H, il est préférable d'avoir un capteur automatique du p H qui déclenche l'addition de l'acide dans le bouillon de culture L'acide est ajouté à un taux suffisant pour 15 maintenir le p H du bouillon en dessous de la limite supérieure désignée La concentration de l'acide peut varier, par exemple d'environ 1 % (poids/volume) à environ 30 % (poids/volume) Cependant, on préfère des solutions concentrées, en particulier dans des procédés 20 discontinus, car elles ajoutent moins au volume total des milieux de fermentation. Dans un procédé discontinu, le L-aminoacide produit peut être récupéré du bouillon de culture après que la culture a atteint la phase de croissance station25 naire, mise en évidence par les niveaux de D O entre environ 20 et 70 Lorsque l'on utilise un processus continu avec le procédé selon l'invention, il peut y avoir une récupération continue du produit Le Laminoacide peut être récupéré du bouillon de culture par un moyen conventionnel Les exemples qui suivent sont donnés pour illustrer l'invention et ne doivent en aucun cas en limiter le cadre Dans les exemples, on utilise les abréviations qui suivent: C: degrés centigrades cc: centimètre cube g: gramme h: heure 15 1: litre LPM: litre par minute : micron M: molaire mn: minute ml: millilitre mm: millimètre mmole(s): millimoles N: normal nm: nanomètre % 6:9 % t/mn: tours par minute vol: volume EXEMPLE 1 Des milieux d'ensemencement et de croissance ont été préparés par litre d'eau désionisée comme suit: Semence: ,0 g 20 2,5 g 2,5 g 1,0 g 0,25 g 10, 0 g 25 1,0 ml 1,0 ml Ingrédient I Glucose 1 Liqueur de trempage de mals NZ amine B 2 K 2 HP 04 Mg 504 7 H 20 (NH 4) 2504 Solution d'approvi 3 sionnement en biotine Solution d'approvisionnement en 4 thiamine-H Cl Ca C 03 5 Croissance ,0 g 2,5 2,5 1,0 0,25 40,00 1,0 1,0 g g g g g ml ml ,0 g 1 solution à 70 % (poids/volume) d'approvisionnement en glucose 2 Sheffield Co. 3 100 mg de d-biotine par litre d'eau désionisée 4 1,0 g de thiamine-H Cl par litre d'eau désionisée ajouté aux milieux d'ensemencement en tant que tampons. Tous les ingrédients ont été combinés et passés 17 2550224 à l'autoclave à 110 O C pendant 10 minutes dans des buts de stérilité Après passage à l'autoclave, le p H des milieux a été ajusté à 7,4 avec Na OH. Des portions de 50 cc du milieu d'ensemencement dans des ballons secoueurs de 250 oc ont été inoculées de Brevibacterium thiogenitalis ATCC N 31723 On a laissé les cultures croître à 30 C tout en secouant à 300 t/mn pendant 17 heures avant utilisation comme inoculum pour le fermenteur. On a utilisé un fermenteur Multigen (New Brunswick Co) commandé par instruments de 2 litres ( 1 litre de volume utile) Avant utilisation, on a ajouté, dans le fermenteur, pour empocher la formation de mousse, environ 0,2 ml de polyéthylène glycol 2000. On a alors fait passer le fermenteur à l'autoclave à 110 C pendant 10 minutes On a placé un volume de départ de 700 ml du milieu de croissance dans le fermenteur On a ajouté environ 500 ml de semence (D O ( 640 rnm) = 22). On a fait fonctionner le fermenteur à 30 C, 600 t/mn, 1,0-1,25 litres par minute (LPM) d'air dans le fermenteur pour l'aération. Le p H du fermenteur a été contrôlé à la main avec une solution concentrée de NH 40 H ( 29 %) pendant la période initiale de croissance de 8 heures Pendant les 25 4 premières heures, il y a peu ou pas de changement du p H Pendant les 4 heures suivantes, l'appareil de mesure du p H a été maintenu sous une observation visuelle constante On a ajouté NH 40 H selon la nécessité, le volume total ajouté pendant cette période étant d'environ 30 2,0 cc. Après les 8 heures initiales, le p H a été contrôlé automatiquement en utilisant le contrôleur du p H modèle 5997 (Horizon Ecology Co) et une électrode du p H ( 200 mm) (Ingold) Le système a été programmé pour contrôler le p H du bouillon de culture de façon qu'il reste au delà de 6, 8 et en dessous de 7,8 Lorsque le p H du milieu a baissé à 6; 8, le contrôleur du p H a été préprogrammé pour signaler à une pompe péristaltique (Cole Parmer Co) d'ajouter de'la base à environ 1-3 ml/mn afin de maintenir le p H au-dessus de 6,8. La base comprenait du phénylpyruvate dans de la potasse aqueuse L'on a obtenu du phénylpyruvate (PPA) purifié de Aldrich Chemical Co sous la forme de Na.PPA-H 20 ( 98 %, poids moléculaire 204,16) On l'a dissous dans KOH aqueuse à 0,6 M pour donner une solution à une concentration de 98 g/l ou 0,144 M dans un volume total 10 de 300 cc. La solution aqueuse de PPA a commencé à être utilisée par le système sous forme d'un régulateur du p H à environ 8 heures dans la fermentation pour se terminer à environ 24 heures On a introduit automatiquement un 15 total de 175 cc de cette solution dans le fermenteur, pendant la croissance logarithmique L'alimentation totale en Na PPA H 20 pendant cette période était de 17,15 g ( 84 mmoles). A ce point, au bout de 24 heures de fermentation, 20 la production d'acide par les microorganismes n'était plus suffisante pour amener le p H du milieu à 6,8 ou moins Par conséquent, les 125 cc restants du PPA aqueux, contenant 12,25 g ( 60 mmoles) a été pompé dans le fermenteur sur une période de 2 heures ( 62,5 cc/h) On 25 a laissé la fermentation continuer pendant 24 heures, pour une durée totale de fermentation de 48 heures. Pendant les 17 dernières heures, on a utilisé, comme base régulatrice, 25 cc de KOH à 5 N. Le régulateur du p H a également été préprogrammé 30 pour empêcher le p H de passer au delà de 7,8 en signalant à une seconde pacmpe péristaltique (Cole Parmer Co) d'ajouter de l'acide acétique glacial concentré On a ajouté 15 cc au total. Du glucose (solution d'approvisionnement à 70 % 35 (poids/volume)) a été ajouté selon la nécessité pour empêcher la concentration du glucose dans le bouillon de fermentation de baisser à zéro Cela a été fait pour 19 2550224 garantir que le glucose, plutôt que le précurseur ou le produit, serait utilisé comme source de carbone. Le volume récolté final était de 1 029 cc Le volume calculé final était: milieu initial 700 cc inoculum 50 cc Na.PPA aqueux 300 cc acide acétique 15 cc NH 40 H 2 cc glucose 100 cc KOH à 5 N 25 cc Semi-total = 1 192 cc 7 échantillons x 10 cc retirés= 70 cc Total = 1 122 cc La perte par évaporation pendant la période de fermentation de 48 heures était d'environ 8,30/o%. Des échantillons du bouillon de fermentation ont été analysés à la recherche de la L-phénylalanine en 20 utilisant un système de chromatographie liquide haute pression (HPLC) Des échantillons du bouillon filtrés sur des millipores ( 0,22) ' de dimension des pores) ont été dérivés en utilisant une technique de Dansylchlorure avant injection sur HPLC Les résultats étaient comme suit: 25 24 heures 13,20 g/l Lphénylalanine 28 heures 17,06 g/l L-phénylalanine 31 heures 19,20 g/l L-phénylalanine 48 heures 18,69 g/l L-phénylalanine. Le plus faible rendement à 48 heures était dû à 30 la dégradation du produit. Sur un total de 144 mmoles de Na PPA H 20 ( 29,4 g), un total de 115,93 mmoles de L-phénylalanine ( 19,15 g) s'est produit pendant la fermentation Le rapport molaire était le suivant: 2550224 m M L-phénylalanine x 100 m M Na PPA-H 20 ,94 x 100 = 80,5 % 144,00 (m M = millimole). EXEMPLE 2 On a utilisé les milieux, la souche de microorganismes et les processus de base de l'exemple I avec 10 les différences qui suivent de quantité et de régulateur du p H La solution aqueuse de Na PPA a été utilisée comme régulateur de base en commençant à environ 7 heures après inoculation du fermenteur Les points établis préprogrammés du réglage du p H étaient à 7,2 et 7,8. La solution aqueuse de Na PPA H 20 contenait 168 mmoles ( 34,3 g) dans un volume total de 350 cc. Le volume de Na PPA aqueux utilisé comme base régulatrice pendant la période commençant à environ 7 heures et se terminant à environ 24 heures était d'environ 175 cc. De l'acide acétique a été ajouté pour contrôler la limite supérieure du p H comme à l'exemple 1, en ajoutant 41 cc au total dans le fermenteur A la fin des 24 heures, le point inférieur établi du régulateur du p H a été élevé à 7,5 pendant le restant de la fermentation Le restant 25 de la solution de Na PPA ( 175 cc) a été pompé dans le réacteur sur une période de 2 heures commençant à ce moment On a laissé la fermentation continuer pendant 24 heures supplémentaires, pendant un temps total de fermentation de 48 heures. Le volume récolté final était de 1 025 cc Le volume calculé final était: Milieu initial 700 cc inoculum 50 cc Na.PPA 350 cc acide acétique 41 cc glucose 100 cc NH 40 H (conc, 29 % NH 3) 2 cc Semi-total= 1 243 cc 11 échantillons x 15 cc retirés= 165 cc Total = 1 078 cc 20 La perte par évaporation pendant la période de fermentation de 48 heures était d'environ 4,92 %. Des échantillons du bouillon ont été analysés comme à l'exemple 1. Les résultats de HPLC étaient comme suit: 24 heures 16,7 g/l Lphénylalanine 26 " 17,4 g/l 29 " 19,5 g/l " 32 " 20,1 g/l " 48 " 21,8 g/l " Sur un total de 168,00 mmoles de Na PPA H 20 ( 34,3 g), on a produit un total de 145,77 mmoles de L-phénylalanine ( 24,08 g) pendant la fermentation Le 30 rendement molaire était de 86,8 %. EXEMPLE 3 Le milieu d'ensemencement a Ingrédient Glucose Bacto-peptone (Difco) Extrait de levure Na Cl été préparé, comme suit: Quantité g 10 g 10 g 3 g Les ingrédients ont été combinés et le p H ajusté à 7,2 avec Na OH à 5 N Le milieu a été passé à l'autoclave 35 à 110 C pendant 10 minutes. On a préparé le milieu de croissance qui suit: 22 2550224 Ingrédient Quantité Mélasses de canne ( 10 % sous forme de glucose) 100, 00 g K 2 HPO 4 0,50 g KH 2 P 04,5 g Mg 504 7 H 20 0,25 g NH 4 SO 4 20,00 g Liqueur de trempage de mals 5,00 g Ca CO 3 20,00 g a C 3 Les ingrédients ont été combinés et le p H ajusté à 7,2 avec Na OH à 5 N On a passé le milieu à l'autoclave à 110 C-pendant 10 minutes. La culture d'ensemencement a été inoculée d'une gélose inclinée Auxo-Sy (Difco) de 18 heures de Brevibacterium lactofermentum ATCC N 21 420 selon le processus de l'exemple 1 On a laissé la culture d'ensemencement croître pendant 7 heures, moment o D O ( 640 nm) a atteint 25 Le p H du milieu du fermenteur a été ajusté entre 6,5 et 7,0 avec NH 40 H On a utilisé un volume de ml du bouillon de culture d'ensemencement pour inoculer le fermenteur, également selon le processus de l'exemple 1. Le fermenteur fonctionnait à 30 C, 400 t/mn et 1,0 LPM. 25 Le point établi le plus faible du p H était de 6,8 et le point établi supérieur du p H était de 7,8 pendant les premières 24 heures. On a utilisé, comme précurseur d'alpha cétoacide, une solution aqueuse d'acide phénylpyruvique-potassium (K-PPA) La solution était un hydrolysat non purifié dans la soude de 5-benzylidènehydantoine La préparation de l'hydrolysat de 5-benzylidènehydantolne (Hamsphire Chemical Co) était selon le processus qui suit: on a combiné 1 598,85 g d'eau désionisée et 168,3 g de KOH 35 dans un bécher en acier inoxydable de 3 litres et on a chauffé à l'ébullition Tout en continuant à faire bouillir, on a ajouté 188,2 g de 5-benzylidènehydantoine 23 2550224 et on a mélangé jusqu'à la dissolution On a continué l'ébullition pendant 2 heures On a Eouté de l'eau selon la nécessité pour maintenir le volume d'origine Après ébullition, le mélange a été rapidement refroidi dans un bain d'eau et de glace Une solution à 1 molaire de l'hydrolysat de phénylpyruvate de potassium contenait environ 1,2 M de KOH, 0,5 M de carbonate de potassium et 0,5 M d'urée L'hydrolysat a alors été stérilisé en utilisant un filtre Millipore ( 0,22,M de diamètre 10 des pores). Cet hydrolysat, ayant un p H d'environ 13, a été utilisé pour le contrôle par une base à partir du début de la fermentation On a ajouté 225 ml, au total, en 48 heures. On a utilisé de l'acide acétique glacial concentré pour abaisser le p H On a ajouté un volume de 5 ml pendant les premières 17 heures Le p H du bouillon aux derniers stades de la fermentation n'a pas dépassé 7,8 et ainsi il n'a pas été besoin d'ajouter plus 20 amplement de l'acide. Après fermentation de 24 heures, les points établis du p H ont été ajustés à 7,8 et 8,0 On a ajouté ml de glucose à ce point pour amener la concentration dans le bouillon à 10 % On a ajouté un volume de 20 ml 25 de glucose à 65 heures. Des échantillons du bouillon ont été analysés comme à l'exemple 1 Les résultats de HPLC étaient comme suit: heures 6,8 g/l L-phénylalanine 30 43 " 7,8 g/l " " 8,4 g/l " 48 " 9,4 g/l " " 10,2 g/l " Sur un total de 111,23 mmoles d'acide K-phényl35 pyruvique introduit,on a produit, pendant la fermentation, un total de 75,67 mmoles de L-phénylalanine Le rendement molaire était de 68,0 % L'on n'a pas tenu compte des 24 2550224 pertes par évaporation dans cette expérience. EXEMPLE 4 On a utilisé les milieux d'ensemencement et de croissance de l'exemple 1, à l'exception que dans les deux milieux, on a utilisé 30 g de (NH 4)2504 et l'on a utilisé 20,9 g de MOPS (acide morpholinopropanesulfonique) comme tampon au lieu de Ca C 03 Les processus de mise en culture et d'inoculation de l'exemple 1 ont été suivis en utilisant Brevibacterium flavum ATCC N 13626 Le fermenteur de cette expérience fonctionnait à 500600 t/mn pendant les 18 premières heures et ensuite à 650 t/mn La base utilisée pour le contrôle du p H était l'hydrolysat de K-phénylpyruvate décrit à l'exemple 3. Le p H a été ajusté à 10 avec C 02 Le point inférieur établi du p H était de 7,2 et le point supérieur établi était de 7,8 On a utilisé l'hydrolysat comme contrôle de la base à partir du début de la fermentation On a introduit un total de 400 ml dans le fermenteur en réponse à la demande en p H Au bout d'environ 25 heures de fermen20 tation, on a ajouté 50 ml de glucose à la solution restante de 60 ml base- hydrolysat, que l'on a continué à ajouter pour contrôler la basicité On a ajouté un supplément de 25 ml de glucose à environ 48 heures. On a utilisé de l'acide acétique glacial concentré 25 pour maintenir le niveau supérieur du p H et permettre d'introduire, dans la culture, une solution supplémentaire base-hydrolysat On a ajouté un total de 42 ml dans le fermenteur. Des échantillons du bouillon ont été analysés 30 comme à l'exemple 1 Les résultats de HPLC étaient comme suit: 17 heures 3, 33 g/l L-phénylalanine 19 " 3,96 g/l " 22 " 6,19 g/l " 24 " 7,60 g/l " 42 " 11,60 g/l " " 14,10 g/l " " 11,90 g/1 " Le plus faible rendement à 65 heures était dé à la dégradation du produit. Sur un total de 176,33 mmoles de K-phénylpyruvate introduit, on a produit, en 48 heures, un total de 111,99 mmoles de L-phénylalanine Le rendement molaire à 45 heures était de 63,5 % L'on n'a pas tenu compte des pertes par évaporation dans cette expérience. R E V E N D I C A T I O N S 1. Procédé de préparation de L-aminoacides, caractérisé en ce qu'il comprend: (a) la croissance, dans un milieu nutritif, de microorganismes qui transforment les alpha-cétoacides en leurs L-aminoacides correspondants et qui produisent et sécrètent des acides pendant les phases de croissance; (b) l'introduction de l'alpha cétoacide souhaité dans la culture en croissance des microorganismes 10 à un taux correspondant sensiblement au taux de culture de croissance et (c) la conversion, par les microorganismes, de l'alpha-cétoacide en L-aminoacide correspondant. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé 15 en ce que le Laminoacide est récupéré du bouillon de fermentation. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le taux d'alimentation de l'alpha cétoacide à l'étape (b) est déterminé par le p H du bouillon de 20 culture, l'alimentation en alpha-cétoacide commence environ 6 à 10 heures après l'inoculation du milieu nutritif par les microorganismes, et l'alimentation en alpha-cétoacide commence lorsque la densité optique ( 640 nm) de la culture de croissance a atteint environ 10. 4 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le p H de la culture avant le début de l'alimentation en alpha-cétoacide est contrôlé par addition d'une base compatible avec la fermentation, ladite base devant être exempte ou sensiblement exempte de l'alpha30 cétoacide, et le p H de la culture avant le début de l'alimentation en alpha-cétoacide est maintenu entre environ 6,8 et 7,2. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la base est choisie dans le groupe consistant 35 en ammoniaque, potasse, soude, urée et gaz ammoniac. 27 2550224 6. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'alphacétoacide est ajouté dans une solution comprenant une base compatible avec la fermentation, ladite base étant choisie dans le groupe consistant en ammoniaque, potasse et urée. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'alimentation en alpha cétoacide commence lorsque le p H du bouillon de culture baisse entre environ 7,2 et environ 7,5. 8 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'alphacétoacide est ajouté selon la nécessité pour maintenir le p H du bouillon de culture à ou au delà d'un niveau prédéterminé entre environ 6,8 et environ 7,5. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé 15 en ce que la solution basique de l'alpha-cétoacide est pompée dans le bouillon de culture lors d'un signal d'un contrôleur automatisé du p H, ledit contrôleur signalant automatiquement à une pompe de commencer l'addition de la solution basique lorsque le p H du bouillon baisse en dessous d'une limite préétablie dans ladite plage. 10. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'addition d'un acide compatible avec la fermentation commence lorsque le p H du bouillon de 25 culture atteint environ 7,5 à environ 7, 8. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'acide est ajouté, selon la nécessité, pour maintenir le p H du bouillon de culture à ou en dessous d'environ 8,0. 12 Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le p H du bouillon de culture est contrôlé par un contrôleur automatisé du p H. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le contrôleur du p H signale automatiquement à une pompe d'ajouter l'acide au bouillon de culture lorsque le p H du bouillon passe au-delà d'une limite préétablie dans ladite plage. 14. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'une première portion de la quantité totale d'alpha-cétoacide que l'on souhaite introduire dans la culture en croissance pour la bioconversion est 5 introduite dans ladite culture sur la base de la demande en p H et une seconde portion de lalpha-cétoacide est introduite dans la culture sur une période pouvant atteindre 24 heures à la suite de l'arrêt de l'alimentaisr. par demande du p H. 15 Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la première portion forme un tiers à la moitié de la quantité totale. 16. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que-la seconde portion de l'alpha15 cétoacide est introduite dans la culture sur une période pouvant atteindre 8 heures. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que la seconde portion est introduite dans la culture en une ou plusieurs charges ou continuel20 lement. 18. Procédé pour la conversion biologique d'alpha-cétoacides précurseurs en L-aminoacides par introduction desdits précurseurs dans une culture en croissance logarithmique de microorganismes permettant 25 la bioconversion et qui sécrètent des acides pendant les phases de croissance actives, caractérisé en ce qu'il consiste à: (a) surveiler les changements du p H du bouillo n ou de ladite culture en croissance, (b) ajouter ledit alpha-cétoacide précurseur dans une solution basique en quantités équilibrant les acides sécrétés par les microorganismes. 19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'addition de l'alpha-cétoacide 35 commence lorsque le p H du bouillon de culture baisse à un niveau prédéterminé entre environ 7,2 et environ 5 29 2550224 20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'alphacétoacide est ajouté selon la nécessité pour maintenir le p H du bouillon de culture à ou au délà d'un niveau prédéterminé compris entre environ 6, 8 et environ 7,5.