FR 2550204 A1 19850208 FR 8412303 A 19840803 255 tol* La présente invention concerne des dérivés nouveaux peptidiques d'hormones parathyroidiermnnes humaines (h-PTH). Plus particulièrement, l'invention concerne lNle 8, Nle 18 Tyr 34 l-hPTH( 1-34)NH 2 et lNle 8, Nle 18 l-h-PTH( 1-34)NH 2 5 qui sont des médicaments efficaces pour le traitement des maladies impliquant l'hypoparathyroidisme ou PTH, et lesdits composés sont représentés par la formule suivante: 1 2 3 4 5 6 H S er -Val S er -G lu Ile G In7 2 9 10 *l 12 Leu N le H is A sn Leu G ly 1 3 14 15 16 17 18 Lys H is Leu Asn Ser -N le 19 20 21 22 23 24 -Gl u A rg V a G lu Trp Leu 26 27 28 29 50 A rg -Lys Lys L eu G In Asp 31 32 33 3 4 -Val -H is -Asn A -NH 2 C I dans laquelle A représente Tyr ou Phe, ou un sel de celui-ci. La présente invention englobe également un composé radioactif marqué iode-125 du peptide lIl dans lequel A représente Tyr, en raison de son utilité pour les dia20 gnostiques de la fonction de la glande parathyroidienne. L'hormone parathyroidienne humaine est une hormone peptidique consistant en 84 amino-acides et son activité biologique est révélée par le résidu de 34 amino-addes de son résidu N-terminal à savoir h-PTH( 1-34)lProc Nat. 5 Acad Sci, U S A, 68, 63-67 ( 1971)l Cependant, h-PTH est instable en raison de la L-méthionine existante (Met) et elle perd son activité hormonale quand elle est marquée avec iode-125 ( Recent Prog Hormone Res, 18, 269-295, 1962). Pour rémédier à cet inconvénient, on a créé les dérivés peptidiques de hPTH ayant une activité PTH;tels 8 18 que lNle 8, Nle l-h-PTH (demande non examinée de brevet japonais 55113753) et h-PTH( 1-34)NH 2 (demande non examinée de brevet japonais 5896052) dans lesquelles la 15 L-méthionine dans les positions 8 et 18 est remplacée par la L-norleucine Il est cependant fâcheux que l'activité PTH de lNle 8, Nle 18 l-h-PTH( 1-34) soit approximati vement égale mais pas supérieure à celle de h-PTH naturelle, et aussi h-PTH ( 1-34) est instable à l'oxy20 dation par suite de la méthionine dans sa molécule. La Demanderesse a fait des recherches sur les dérivés peptidiques de hPTH ayant une activité et une stabilité supérieures On a constaté que le peptide ci-dessus (I), à savoir lNle 8, Nle 18, Tyr 34 l-h-PTH( 1-34)NH 2 et lNle 8, Nle 18 l-h-PTH( 1-34)NH 2 ne possède pas seulement une plus forte affinité pour le récepteur de PTH par comparaison avec h-PTH( 1-34) et lNle 8, Nle 18 l-h-PTH( 1-34) 2550204 i connues et une activité environ 1,5 à 2 fois plus forte h-PTH, mais aussi une activité immune et une stabilité. Le composé lIl de la présente invention est un médicament efficace pour le traitement des maladies osseuses impli5 quant l'hypoparathyroidisme ou PTH. D'autre part, selon le procédé de titrage antérieur de h-PTH, pour titrer le fragment peptidique ayant une activité h-PTH, on a préparé un anticorps particulier contre l'antigène de h-PTH ( 1-34) Cependant, comme expliqué 10 précédemment, il existe des inconvénients en ce que h-PTH( 1- 34))est instable par suite de la présence de la L-méthionine et,par conséquent, quand on marque avec l'iode-125, la méthionine dans les positions 8 et 18 est oxydée et perd son activité hormonale Le dérivé h- PTH 15 ayant une activité h-PTH, une activité immune contre l'antigened'anti-PTH, une activité hormonale stable lors du marquage avec iode-125 et une radioactivité stable, lNle 8, Nle 18, Tyr 34 l-h-PTH( 1- 34) dans laquelle la-méthionine dans les positions 8 et 18 est remplacée par la L-norleucine et la L-phénylalanine et en position 34 est remplacée par la L-tyrosine, a été trouvé (Demande non examinée et publiée de brevet japonais 55-113753) Ledit peptide ne perd pas-son activité lors du marquage avec l'iode-125 car il ne contient pas de méthionine dans sa 25 molécule, mais son activité hormonale est seulement à peu près égale à celle de la h-PTH( 1-34) naturelle. On a trouvé que le peptide I de la présente invention lNle, Nle,18 Tyr 34 l-h-PTH( 1-34)NH 2 dans lequel A dans le peptide I ci-dessus est Tyr, n'a pas perdu son activité PTH, possède une radioactivité deux fois plus forte par comparaison avec celle de lNle 8, Nle 18, Tyr 34 l-h-PTH( 1-34) et n'a pas perdu son activité biologique lors d'un stockage prolongé et constitue donc un peptide efficace d'un composé de marquage pour diagnostic de la fonction paralyroldienne. On peut synthétiser comme suit le peptide I de 10 l'invention. On convertit un groupe carboxylique de tyrosyle ou phénylalanine Cterminal en amide et on fait réagir l'amino-acide protégé et/ou le peptide inférieur par condensation en phase liquide dans l'ordre de la séquence d'amino-acides de formule I, et on libère le groupe protecteur du groupe amino N-terminal et le groupe réactif de la cha Sne latérale au stade final de la réaction par décomposition acide. On peut effectuer la réaction de condensation par une synthèse de peptide classique en répétant la fixation et l'enlèvement des groupes protecteurs et la condensation. Les groupes protecteurs pour la synthèse des matières de départ ou des intermédiaires sont classiques pour la synthèse des peptides et sont faciles à enlever par hydro25 lyse, décomposition de l'acide, réduction, aminolyse ou hydrazinolyse. Par exemple, on peut protéger le groupe amino de façon classique par un groupe acyle tel que formyle, trifluoracétyle, phtaloyle, p-toluènesulfonyle ou onitrophényl-sulfonyle; un groupe benzyloxycarbonyle, tel que benzyloxyca'onyle, o-bromobenzyloxycarbonyle, pbromobenzyloxycarbonyle, o (ou p-) chlorobenzyloxycarbonyle, pnitrobenzyloxycarbonyle ou p-méthoxybenzyloxycarbonyle, un groupe oxycarbonyle aliphatique tel que trichloréthyloxycarbonyle, tamyloxycarbonyle, t-butoxy10 carbonyle ou diisopropylméthoxycarbonyle; ou un groupe aralkyloxycarbonyle tel que 2-phéhylisopropoxycarbonyle, 2tolylisopropoxycarbonyle ou 2-p-diphénylisopropoxycarbonyle On peut protéger ces groupes amino en formant une énamine qu'on fait réagir avec 1,3-dicétone telle que 15 benzoylacétone ou acétylacétone. On peut protéger le groupe carboxyle par formation d'amides, formation d'hydrazides ou estérification On substitue le groupe amide par un groupe 3,4-diméthoxybenzyle ou bis-(p-méthoxyphényl)-méthyle On substitue 20 le groupe hydrazide par un groupe benzyloxycarbonyle, trichloréthyloxycarbonyle, trifluoracétyle, t-butoxycarbonyle, trityle ou 2-p-diphényl-isopropoxycarbonyle. On substitue le groupe ester par un alcanol comme le méthanol, éthanol, t-butanol ou alcool cyanométhylique; 25 un aralcanol tel qu'alcool benzylique, alcool p-bromobenzylique, alcool pchlorobenzylique, alcool p-méthoxybenzylique, alcool p-nitrobenzylique, alcool 2,6-di- 255020 ó 4 chlorobenzylique, alcool benzhydrylique, alcool benzoylméthylique, alcool p-bromobenzoylméthylique ou alcool p-chlorobenzoylméthylique; un phénol tel que 2,4,6trichlorophénol, 2,4,5-trichlorophénol, pentachlorophénol, 5 p-nitrophénol ou 2,4-dinitrophénol; ou un thiophénol tel que thiophénol ou p-nitrothiophénol Le groupe hydroxy est la sérine, ou bien on peut facultativement protéger la tyrosine par estérification ou éthérification Un groupe protégé par estérification est, par exemple, un groupe acétyle;un groupe benzoyle, benzyloxycarbonyle ou éthyloxycarbonyle Un groupe protégé par éthérification est, par exemple, un groupe benzyle, 2,6dichlorobenzyle, tétrahydropyranyle ou t-butyle La protection du groupe hydroxy peut se faire par un groupe 2,2,2-trifluor-115 tbutyloiycarbonylaminoéthyle ou 2,2,2-trifluor-1benzyloxycarbonylaminoéthyle Il n'est cependant pas toujours nécessaire de protéger ces groupes hydroxy. Le groupe amino dans le groupe guanidino dans l'arginine peut être protégé par un groupe nitro, tosyle, 20 benzyloxycarbonyle ou méthylène-2sulfonyle Il n'est cependant pas toujours nécessaire de protéger ce groupe guanidino. Le groupe imino dans l'histidine peut être protégé par un groupe benzyle, trityle, benzyloxycarbonyle, tosyle, 2,2,2-trifluor-1benzyloxycarbonylaminoéthyle, bien que le groupe imino n'exige pas toujours de protection. Dans la présente invention, les groupes protecteurs préférés sont tbutyloxycarbonyle et t-amyloxycarbonyle pour le groupe a-amino; Ochlorobenzyloxycarbonyle pour le groupe amino de la chaîne latérale, c'est-à-dire E-amino dans la lysine; l'ester benzylique, éthylique ou phénacylique pour un groupe a-carboxyle; l'ester benzylique pour un groupe carboxyle de la châine latérale, c'est à dire glutamate et aspartate; un groupe benzylique pour hydroxyle dans la sérine; 2,6- dichlorobenzyle pour 10 l'hydroxyle dans la tyrosine; et le groupe tosyle ou méthylène-2-sulfonyle pour le groupe amino dans guanidino de l'arginine. On synthétise le peptide (I)par condensation d'amino acides ou de peptide inférieur Par exemples on fait réa15 gir un amino-acide ou peptide ayant un groupe a-amino protégé et un groupe carboxylique terminal activé avec un amino-acide ou un peptide ayant un groupe a-amino libre et un groupe carboxylique terminal protégé D'autre part, on fait réagir un amino-acide ou peptide ayant un 20 groupe a-amino-activé et un groupe carboxylique terninal protégé avec un amino-acide ou peptide ayant un groupe carboxylique terminal libre et un groupe a-amino protégé. On peut activer le groupe carboxyliqué par un azide d'acide, un anhydride d'acide, un imidazolide d'acide ou un ester actif, par exemple, en convertissant en ester cyanométhylique, thiophénylique, p-nitrophénylique, = 2550204 p-nitrothiophénylique, 2,4-dinitrophénylique, 2,4,5-tri- chlorophénylique, 2,4,6-trichlorophénylique, pentachlorophénylique ainsi qu'un ester de Nhydroxysuccinimide, un ester N-hydroxyphtalimido, un carbodiimide tel que N,N'5 dicyclohexylcarbodiimide, N-éthyl-N'-3diméthylaminopropylcarbodiimide, N,N'-carbobyldiimidazole ou un sel d'isoxazolium tel qu'un réactif de Woodward. Les réactions préférées de condensation sont les procédés par l'azide, l'ester actif et le carbodiimide. 10 Dans la réaction de condensation, on doit soigneusement éviter la racémisation, et les procédés préférés sont le procédé à l'azide, le procédé à l'ester actif ou procédé de -Minsch lrz Naturforsch, 216, 426 ( 1966)l ou le procédé de Geiger lChem Ber, 103 ^ 788 ( 1970)l surtout 15 en utilisant le N-éthyl-N'-3-diméthylaminopropyl-carbodiimide (WSCI) à titre d'agent de condensation. On fait précéder le procédé de l'invention d'une réaction de condensation dans la séquence d'amino-acides de formule I et on préfère synthétiser à partir du ter20 minal C. Par exemple, on préfère synthétiser le fragment terminal C de la séquence d'amino-acides 29-34 avec la séquence 23-28 des fragments de peptide La condensation préférée du fragement terminal C avec l'hexapeptide 2325 28 se fait par un procédé modifié de Geiger en utilisant WSC On effectue avantageusement la condensation du fragment terminal C obtenu 23-24 avec le fragment peptide de la séquence d'aminoacides 18 à 22 par un procédé modifié de Geiger utilisant WSC Le fragment terminal C 18-34 ainsi obtenu est relié un par un avec un fragment peptidique de la séquence 13-17, un fragment peptidique 8-12 et un fragment peptidique 1-7. Dans la réaction de condensation ci-dessus, un groupe protecteur pour le groupe a-amino, par exemple t-butyloxy carbonyle et t-amyloxycarbonyle, est enlevé par l'acide trifluoracétique Un groupe protecteur pour o-carboxyle, 10 par exemple l'ester éthylique, est hydrolysé par une solution diluée d'hydroxyde de sodium ou est converti en un hydratide protégé tel que l'hydratide ou le trichloréthoxycarbonyl-hydratide On décompose l'ester phénacylique par une poudre de Zn en acide acétique et on enlève l'ester 15 benzylique par l'acide fluorhydrique anhydre ou par hydrogénation ou on le convertit en hydratide. Ainsi, on peut obtenir un tétratriacontapeptide ayant un groupe a-amino Nterminal protégé, un groupe E amino, un carboxyle de chaîne latérale, guanidino et/ou hydroxyle. 20 Ces groupes protecteurs sont avantageusement séparés par décomposition acide, par exemple l'enlèvement en un stade par l'acide fluorhydrique anhydre ou le sulfonate de trifluorométhane pour obtenir le composé correspondant de formule I. On peut purifier le peptide ainsi obtenu I par des procédés bien connus de purification de peptides ou de protéines Par exemple, on peut purifier par filtration sur 255 Q 204 gel en utilisant "Sephadex" G-25, G-50 ou LH-20 (marques déposées), la chromatographie sur colonne en utilisant une carboxyméthylcellulose ou; une résine échangeuse d'ions, ou la chromatographie liquide à haute performance. On peut obtenir le peptide I de l'invention sous forme d'une base libre ou de son sel, par exemple son sel avec un sel minéral ou organique tel que le formiate, acétate, propionate, glycolate, succinate, malate, tartrate ou citrate. Le peptide I peut former un complexe par addition d'une substance minérale ou organique Il s'agit d'un complexe qu'on obtient en ajoutant une substance d'un certain type et c'est un complexe inconnu qui peut participer à l'effet de retard sur le peptide On peut mentionner par exemple un composé minéral dérivé du calcium, magnésium, aluminium, cobalt ou zinc, surtout un sel légèrement soluble d'un tel métal, comme le phosphate, le pyrophosphate ou le polyphosphate ou encore un hydroxyde ou polyphosphate d'un métal alcalin. Le peptide I, c'est-à-dire lNle 8, Nle 18, Tyr 34 _hPTH(I-34)NH 2 est utile comme un composé marqué pour un immunotitrage radioactif Par exemple, on ajoute ce peptide I et une chloramine T à une aliquote radioactive d'iode-125 dans un tampon phosphaté (p H 7,1), on agite le 25 mélange, on ajoute du disulfure de sodium et on ajoute également une petite quantité d'iodure de potassium et d'albumine sérique Les fractions marquées à l'iode-125 sont 2550204 i 1 1 recueillies par chromatographie pour obtenir un composé conjugué d'iode-125. On ajoute une solution ( 10 pl) de h-PTH( 1-34)( 2 Fg), h-PTH( 1-34)NH 2 ( 2 pg),'lNle 8, Nle 18, Tyr 34 l-h-PTH( 1-34) 5 ( 2 pg) ou lNle 8, Nle 18 Tyr 4 l-h-PTH( 1-34)NH 2 ( 2 pg) et une solution ( 20 pl) de chloramine T ( 3,5 mg/ml) à un tampon phosphaté O,5 M (p H 7,1, 50 pl) contenant iode125-Na I (radioactivité: 2 m Ci), on agite le mélange pendant 30 secondes et on ajoute 4,5 mg/ml de bisulfure 10 de sodium en solution ( 50 1 l) pour arrêter la réaction. On ajoute une solution 0,1 N d'acide acétique ( 0,5 ml) contenant 5 % d'albumine sérique humaine et on charge le mélange sur une colonne ( 1 x 50 cm) de Sephadex G-10, puis on élue avec une solution au dixième d'acide acétique 15 pour obtenir des composés marqués. Titrage de l'activité de PTH ( 1) préparation d'un récepteur de PTH On saigne par décollation des rats mâles de la souche SD pesant 200 à 250 g, on leur fait une laparoto20 mie et on excise les reins On enlève une membrane super ficielle, on découpe le cortex rénal et on refroidit à la glace Les opérations suivantes doivent se dérouler à une température aussi basse que possible (O à 4 C). On immerge le cortex rénal dans une solution (qu'on 25 appellera solution A) de 10 mmoles de tampon tris-H Cl (p H 7,5) contenant 0,25 mole de saccharose et I mmole de EDTA On ajoute trois fois le volume de la solution A (ml) 2550204, sur le cortex rénal (poids mouillé) à un cortex rénal dans un tube de verre avec un pilon en Tefron (marque déposée) et on homogénéise. On soumet un homogénat à une centrifugation pendant 10 minutes à 150 x G et on soumet la solution surnageante à une autre centrifugation pendant 15 minutes à 2200 x G. On met au rebut la solution surnageante et on met en suspension dans la solution A une partie supérieure de l'émulsionduprécipité On soumet cette émulsion à une 10 centrifugation pendant 15 minutes à 2200 x G On met de nouveau le précipité en suspension et on congèle à -70 C dans une bouteille emmagasinée à -20 C. ( 2) Réaction avec PTH et récepteur de PTH On dissout l'échantillon dans 100 mmoles de tampon 15 tris-H Cl ( p H 7,5) contenant 2 mmoles de ATP-Mg, 10 mmoles de Mg C 12, 60 mmoles de KC 1, 20 pmoles de GTP, 1 mmole de butylméthylxanthine, 8 mmoles de phosphate de créatine et 0,2 % d'albumine de sérum bovin (ASB) pour préparer une solution à 2 Fg/ml et 10 Fg/ml On prépare 20 également par la même technique une solution bovine normalisée PTH( 1-34). On place ces solutions l 2 yg/ml et 10 ig/ml, échantillon et PTH(I-34) bovinel ( 50 F 1) dans des tubes d'essai en verre, chacune pour huit tubes et on conserve 25 dans l'eau glacée afin d'empêcher ATP et d'autres de former des solutions d'essai. Une solution de référence du récepteur de PTH em- magasinée à -20 C est décongelée à température ambiante. On ajoute la kinase de créatine préalablement dissoute dans la solution A pour préparer la kinase de créatine à 0,1 mg/ml et on prépare un récepteur de PTH à 1,4 mg/ml sous forme d'une protéine en ajoutant la solution A et en maintenant cette solution avec refroidissement à la glace Après la préincubation à 370 C pendant plusieurs minutes des solutions de test ci-dessus, on ajoute la solution de récepteur de PTH et la solution de kinase de créatine à raison de 50 pl chacune et on incube à 370 C pendant 10 minutes On ajoute un tampon d'acétate 0,1 M ( 100 ul, p H 4,0), puis on place immédiatement dans l'eau glacée et ensuite on chauffe le tube dans l'eau bouillante pour arrêter la réaction. ( 3) Titrage de c-AMP engendré. On ajoute de l'eau distillée à la solution ci-dessus (réaction arrêtée) avec une dilution de 10 à 30 fois et on déprotéinise par centrifugation pendant 15 minutes à 2000 x G On titre une certaine quantité de c-AMP dans 20 une solution surnageante à l'aide d'une trousse RIA (YAMASA SHOYU CO) ( 4) Détermination de l'activité de PTH. On convertit les valeurs mesurées de c-AMP en une unité de p M (pico mole) /mg récepteur de PTH (protéine)/ 25 minute comme désignation de la valeur mesurée On teste de façon comparative la valeur mesurée par rapport à une norme selon une ligne de titrage parallèle deux par deux. ( 5) Activité de PTH (U/mg): ACTIVITE DE PTH APRES ECHANTILLON ACTIVITE MARQUAGE AVEC DE PTH IODE -125 h-PTH 3000 > 100 h-PTH( 1-34)NH 2 5100 > 150 8 18 34 lNle 8, Nle 8, Tyr 34 lh-PTH( 1-34) 2930 2480 8 18 34 lNle 8, Nle 8, Tyr 1 h-PTH( 1-34)NH 2 5030 5000 lNle, Nle l-h-PTH( 1-34) NH 2 5000 _ 50 Les abréviations utilisées ont les significations suivantes: Boc: t-butyloxycarbonyle 5 OPAC: ester ph 6 nacylique Bzl: benzyle Val: L-valine O Et: ester éthylique O Bzl: ester benzylique 10 Trp: L-tryptophane Ser: L-sérine Leu: L-leucine Bzl-C 12: 2,6dichlorobenzyle Arg: L-arginine DCHA: dicyclohexylamine Lys: L-lysine Na OH: hydroxyde de sodium. 25502-04 Tyr: L-tyrosine Toso H: acide p-toluènesulfonique TFA: acide trifluoracétique THF: tétrahydrofuranne NNM: N'-méthylmorpholine WSC: Néthyl-N'-diméthylaminopropyl-carbodiimide Aoc: t-amyloxycarbonyle Z-Cl: ochlorobenzyloxycarbonyle Tos: tosyle Ile:L-isoleucine ONP: ester pnitrophénylique Nle: L-norleucine Phe: L-phénylalanine Glu:acide Lglutamique Z(O Me): p-méthoxyberizyloxycarbonyle Asp: acide L-aspartique Gly: glycine Gln: L-glutamine His: L-histidine DMSO: dicyclohexylamine DCC: N,N'-dicyclohexylcarbodiimide Et 3 N: triéthylamine éther: éther diéthylique DMF: diméthylformamide 25 TBA: t-butylamine HO Bt: 1hydroxybenzotriazole PF () : PF désigne un fragment protégé d'amino-acide ou de peptides Les nombres entre parenthèses désignent les séries de la séquence des amino-acides dans la formule I. Les-exemples suivants servent à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée Dans ces exemples, on utilise les supports et les éluants suivants pour la chromatographie en couche mince (ccm): Support: gel de silice G 10 Eluant: 1 Chloroforme/méthanol/acide acétique ( 95:5:3) 2 Chloroforme/méthanol/acide acétique ( 85:15:5) 3 Chloroforme/méthanol/acide acétique ( 80:25:2) 4 Chloroforme/éthanol/acétate d'éthyle ( 5:2:5) 15 5 Hexane/acétate d'éthyle ( 1:1) Support: cellulose Merck (DC-Alufolien) Eluant: 6 Butanol/pyridine/acide acétique/eau ( 2:2:2:3) (couche supérieure) lAnalyse de l'amino-acidel Sauf stipulation contraire, on hydrolyse l'échantillon dans HC 1 hexanormal à 110 C pendant 24-48 heures dans un tube hermétiquement fermé. Exemple 1 Préparation de lNle 8, Nle 18, Tyr 34 l-h-PTH( 1-34)li H 2 1) PF( 34): Boc-Tyr(Bzl-C 12)-NH 2 l 1 l On ajoute goutte à goutte 24,76 g ( 0,12 M) de DCC dans THF sec à -5 C dans 52,84 g ( 0,12 M) de Boc-Tyr(BzlC 12)-OH et 16,6 g ( 0,12 M) de p-nitrophénol dissous dans THF sec, puis on agite pendant 16 heures, on ó lève les précipités, on sature avec NH 3 gazeux dans la solution de 5 filtrat et on agite pendant 5 heures On dissout les précipités suivants en ajoutant DMF et on concentre sous vide. On cristallise le résidu dans l'éther, on filtre et on sèche pour obtenir le produit l 1 l. Production: 44,77 g (rendement 84,9 %) 10 P F: 214-216 C ccm: Rf 1 = 0, 62 Analyse élémentaire (C 21 H 2404 N 2 C 12): -c% r N% Calculé 57,41 5, 51 6,38 Trouvé 57,42 5,59 6,51 lal 25: -5,54 (c = 1, DMF) D 2)PF( 33-34) : Boc-Asn-Tyr(Bzl-C 12)-NH 2 l 2 l On ajoute 100 ml de TFA avec refroidissement à la glace au composé (I) ( 26,36 g) ( 60 mmoles) dissous dans 20 du chlorure de méthylène et on agite à température ambiante pendant 30 minutes On élimine sous vide le chlorure de méthylène et le TFA, on cristallise le résidu dans l'éther, on filtre et on sèche On ajoute 10,98 ml ( 60 mmoles) de WSC à -15 C aux cristaux ainsi obtenus, 13,93 g ( 60 mmoles) de Boc-Asn-OH et HO Bt ( 8,1 g, 60 mmoles) dissous dans DMF et on agite pendant 16 heures On recueille les précipités par filtration, on lave avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5 %, de l'eau (deux fois) et du méthanol, dans cet ordre et on sèche pour obtenir le produit l 2 l On distille sous vide la liqueur-mère pour éliminer DMF et on lave les cristaux obtenus avec de l'eau et du méthanol, puis on sèche pour obtenir le produit l 2 l qu'on combine avec le produit ci-dessus Production 28,64 g (rendement 86,25 %) P.F: 240-242 C lrl 25: -24,060 (c = 1, DMF) Analyse élémentaire (C 25 H 3006 N 4 C 12) C% H% N% Calculé 54,25 5,46 10,13 Trouvé 54,46 5,38 10,31 3) PF( 32-34): Boc-His(Tos)-Asn-Tyr(Bzl-C 12)-NH 2 l 3 l 15 On ajoute 100 ml de TFA avec refroidissement à la glace à 22,14 g ( 40 mmoles) du composé ( 2) dissous dans une petite quantité de chlorure de méthylène, on agite à température ambiante pendant 30 minutes et on élimine TFA sous vide pour obtenir le composé de-Boc. On lave 28,36 g ( 48 mmoles) de Boc His(Tos)-O Hc DCHA en suspension dans 500 ml d'acétate d'éthyle avec de l'acidesulfurique normal (deux fois) et de l'eau (deux fois), on sèche sur du sulfate de sodium anhydre et on élimine l'acétate d'éthyle sous vide On ajoute le composé précité de-Boc dissous dans le DMF sec et 6,48 g ( 48 mmoles) de HO Bt au résidu dissous dans DMF, puis on ajoute 8,78 ml ( 48 mmoles) de WSC à -15 C et on agite à température ambiante pendant 16 heures Une fois la réaction terminée, on élimine DMF sous vide et on lave le résidu avec du bicarbonate de sodium aqueux à % et deux fois avec de l'eau, puis on sèche pour obtenir le produit brut qu'on recristallise dans un mélange de méthanol et d'éther pour obtenir le produit l 3 l On concentre la liqueur-mère sous vide, on cristallise le résidu dans un mélange de méthanol et d'hexane pour ob10 tenir le composé l 3 l qu'on combine avec le produit l 3 l ci- dessus. Production: 28,81 g (rendement: 85,1 %) P.F: 170-175 C ccm: Rf 3 = 0,68, O,42 (Tos partiellement éliminé) 15 Analyse élémentaire (C 38 H 4409 N 7 C 125) c O % N% Calculé 53,96 5,24 11,59 Trouvé 53,03 5, 65 12,04 4) PF( 31-34): Boc-Val-His-Asn-Tyr(Bzl-C 12)-NH 2 l 4 l On ajoute 120 ml de TFA avec refroidissement à la glace à 28,81 g ( 34,06 mmoles) du composé l 3 l dissous dans une petite quantité de chlorure de méthylène, on agite à température ambiante pendant 10 minutes et on élimine TFA sous vide On ajoute de l'éther au résidu 25 et on recueille par filtration les cristaux précipités, on sèche et on dissout dans 140 ml de DM Fo On neutralise la solution avec NMM On ajoute une solution de 8,14 g 2550204. ( 37,47 mmoles) et 5,06 g ( 37,47 mmoles) de HO Bt dissous dans 60 ml de DMF, puis on ajoute 6,86 mm ( 37,47 mmoles) de WSC à -15 C et on agite pendant 16 heures à température ambiante On élimine DMF sous vide et on lave le résidu avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5 % et trois fois avec de l'eau pour obtenir le produit l 4 l. Production 27,76 g (rendement 103,2 %) P.F: 164-166 C ccm: Rf 3 = 0,65 la 25: -28,380 (c = 1, DMF) Analyse Elémentaire (C 36 H 4608 C 12) C%,s R% N% Calculé 54,75 5,87 14,19 Trouvé 53,37 5,78 13,43 5) PF( 30-34): Boc-Asp(O Bzl)-Val-His-Asn-Tyr(Bzl-C 12)NH 2 l 5 l On ajoute 110 ml de TFA avec refroidissement à la glace à 27,76 g ( 35,15 mmoles) du composé l 4 l suspendu dans une petite quantité de chlorure de méthylène, on agite à température ambiante pendant 30 minutes et on élimine TFA sous vide On ajoute de l'éther au résidu et on recu eille par filtration les cristaux précipités, on sèche et on dissout dans 120 ml de DMF On neutralise la solution en ajoutant 10 ml de NMM On ajoute 12,5 g ( 38,67 mmoles) de Boc-Asp(O Bzl)-OH et 5,22 g ( 38,67 25 mmoles) de HO Bt dissous dans 80 ml de DMF sec et on agite à température ambiante pendaht 16 heures. On enlève DMF sous vide et on lave le résidu avec du bicarbonate de sodium aqueux et deux fois avec de l'eau, puis on met en suspension dans le méthanol et on ajoute du méthanol pour la recristallisation afin d'obtenir le produit l 5 l Production: 31,42 g (rendement 89,8 %) P.F 214-215 C ccm: Rf 3 = 0,6 lcl 25: -23,28 (c = 1, DMF) Analyse élémentaire (C 47 H 57011 N 9 C 12) C% H% N% Calculé 56,74 5,78 12,67 Trouvé 56,19 5,79 12,07 6) PF( 29-34): Boc-GlnAsp(O Bzl)-Val-His-Asn-Tyr(Bzl-C 12)NH 2 15 l 6 l On ajoute 120 ml de TFA au composé l 5 l ( 31,11 g, 31,27 mmoles) en suspension dans le chlorure de méthylène, on agite à température ambiante pendant 30 minutes et on enlève TFA et le chlorure de méthylène sous vide On ajoute de l'éther au résidu, on recueille par filtration les cristaux précipités, on sèche et on dissout dans DMF sec ( 100 ml) On neutralise la solution avec 8 ml de NMM On ajoute une solution de 12,64 g ( 34,4 mmoles) de Boc-Gln-ONP et 0, 42 g ( 3,13 mmoles) de HO Bt dissous dans 25 DMF sec, on ajoute 3,78 ml de NMM avec refroidissement à la glace, on agite pendant 16 heures et après -l'achèvement de la réaction, on soutire DMF sous vide, on lave le Z 550204 résidu avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5 % et deux fois à l'eau, on met en suspension dans le méthanol et on recristallise dans le méthanol pour obtenir le produit l 6 l. Production: 33,19 g (rendement 94,5 %) P.F: 81-83 C ccm: Rf 3 = 0,47 lrl 24: -23,98 (c= 1, DMF) Analyse élémentaire (C 52 H 65013 N 1 Cl C 2) C% N% Calculé 55,61 5,83 13,72 Trouvé 54,81 5,96 13,07 Analyse d'amino-acides: Asp 2,19 ( 2), Glu 1,05 ( 1), Val 1 ( 1), Tyr 0,73 ( 1), His 0,85 ( 1). 15 7) PF( 27-28): Boc-Lys(Z-C 1)-Leu-Oet l 7 l On lave 97,6 g ( 0,2 M) deBoc-Lys(Z-Cl)-OH TBA en suspension dans 500 ml d'acétate d'éthyle avec du H Cl normal et de l'eau, on sèche sur du sulfate de sodium anhydre et on concentre sous vide pour obtenir une 20 matière huileuse On la dissout dans 500 ml de THF sec et on ajoute 39,14 g ( 0,2 M) de H-Leu-Oet-Hcl et 27,0 g ( 0,2 M) de HO Bt On ajoute également 36,6 ml ( 0,2 M) de WSC à 15 C et on agite à température ambiante pendant 16 heures On enlève THF sous vide, on dissout le résidu 25 dans 600 ml d'acétate d'éthyle, on lave avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5 %, de l'eau, H Cl normal et de l'eau, dans cet ordre, on sèche sur du sulfate de sodium anhydre, on concentre sous vide, on refroidit le résidu pour cristalliser la substance, on ajoute de l'hexane, on filtre et on obtient le produit l 7 l. Production: 110,62 g (rendement: 99,5 %) P.F: 77,80 C ccm: Rf 5 = 0,48 lc 29: -9,083 o (c 1, DMF) $) PF( 26-28): Boc-Lys(Z-Cl)Lys(Z-Cl)-Leu-O Et l 8 l On ajoute 110,62 g ( 0,199 M) du composé l 7 l à 50 ml de chlorure de méthylène On ajoute 250 ml de TFA avec refroidissement à la glace et on agite à température ambiante pendant 1 heure On élimine sous vide TFA et le chlorure de méthylène et on obtient un composé huileux 15 de-Boc. On lave 97,1 g ( 0,199 M) de Boc-Lys(Z-C 1)-OH TBA en suspension dans 500 ml d'acétate d'éthyle avec 300 ml de H Cl normal et de l'eau, on sèche sur du sulfate de sodium anhydre et on concentre sous vide pour obtenir une 20 substance huileuse On ajoute à cette substance huileuse dissoute dans 150 ml de THF sec le composé de-Boc et HO Bt ( 26,9 g, 0,199 M) dissous dans le THF sec ( 250 ml) On ajoute goutte à goutte 36,4 ml ( 0, 199 M) de WSC à -15 C et on agite à température ambiante pendant 16 heures On 25 élimine THF sous vide pour précipiter des cristaux analogues à l'agar-agar, qu'on dissout dans l'acétate d'éthyle, qu'on lave avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5 %, de l'eau, du H Cl normal et de l'eau dans cet ordre, on sèche sur du sulfate de sodium anhydre et on concentre sous vide. On traite le précipité avec l'hexane, on filtre, on recristallise dans un mélange acétate d'éthyle/éther/hexane et on obtient le produit l 8 l. Production: 156,52 g (rendement 92,2 %) P.F 114-1160 C ccm: Rf 2 = 0,78 ll 29: -20,72 (c = 1, DMF) 9) PF( 25-28): Aoc-Arg(Tos)Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-Leu-O Et l 9 l On ajoute 2500 ml de TFA avec refroidissement à la glace à 156,5 g ( 184 mmoles) du composé l 8 l dissous dans ml de chlorure de méthylène et on agite pendant 1 heure à température ambiante, puis on concentre sous vide le mé15 lange de réac:ion et on neutralise le résidu dissous dans 300 ml de DMF sec avec NMM On ajoute 86,0 g ( 202 mmoles) de Aoc-Arg(Tos)-OH dissous dans 100 ml de DMF sec et 27,3 g ( 202 mmoles)de HO Bt, puis on ajoute 37,0 ml ( 202 mmoles) de WSC goutte à goutte à -15 C, on agite à température 20 ambiante pendant 16 heures, on soutire DMF sous vide et on dissout le résidu dans 1 litre d'acétate d'éthyle On lave la solution avec du bicarbonate de sodium aqueux à %, une solution satureé de Na Cl, deux foisavec H Cl normal et une solution saturée de chlorure de 25 sodium, on sèche sur du sulfate de sodium anhydre, on concentre sous vide, on ajoute de l'éther au résidu et on filtre pour obtenir le produit l 9 l. Production: 217,91 g (rendement: 100,6 %) ccm: Rf 1 = 0,09, Rf 2 = 0,67 P.F: 75-78 C -14,02 o (c = 1, DMF) 10) PF( 24-28) Boc-Leu-Arg(Tos)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)Leu-O Et l 1 o On ajoute 100 ml de chlorure de méthylène et 250 ml de TFA au composé l 9 l ( 217,9 g, 0,185 M), on agite à température ambiante pendant 80 minutes et on élimine sous 10 vide le chlorure de méthylène et TFA On dissout la matière huileuse obtenue dans 300 ml de DMF sec et on neutralise en ajoutant NMM On ajoute 50,9 g ( 0,204 M) de Boc-Leu-OH-H 20 et 27,6 g ( 0,204 M) de HO Bt dissous dans ml de DMF sec et on ajoute goutte à goutte 37,3 ml 15 ( 0,204 M) de WSC à -15 C, puis on agite à température ambiante pendant 16 heures, on élimine DMF sous vide et on ajoute le résidu à l'eau On filtre le produit précipité et on recristallise deux fois dans un mélange de méthanol/éther/hexane pour obtenir le produit l 10 l 20 Production: 213,63 g (rendement: 90,5 %) P.F: 157-160 C ccm: Rf 1 = 0,28, Rf 2 = 0,77 lDl 7 = -18,68 o (c = 1, DMF) 11) PF( 23-28) : Boc-Trp-Leu-Arg(Tos)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl) 25 -Leu-O Et f 11 l On ajoute 100 ml de chlorure de méthylène et 250 ml de TFA à 153,17 g ( 0,12 M) du composé l 10 l, on agite à température ambiante pendant 80 minutes et on élimine le chlorure de méthylène et TFA sous vide On dissout le résidu dans 250 ml de DMF sec et on neutralise à p H 7,0 en ajoutant NMM On ajoute 17,84 g ( 0,132 M) de HO Bt et 40,17 g ( 0,132 M) de Boc-Tr-p-OH et ensuite on ajoute 24,2 ml ( 0,132 M) de WSC goutte à goutte à -15 C, on agite à température ambiante pendant 16 heures, on élimine DMF sous vide et on verse le résidu dans 5 litres de bicarbonate de sodium aqueux à 5 % On filtre la sub10 stance précipitée et on la met en suspension dans l'eau pour filtration, puis on recristallise deux fois dans un mélange de méthanol et d'éther et on obtient le produit li 1 l. Production: 142,57 g (rendement: 81,2 %) 15 P F: 168-170 C ccm: Rf 1 = 0, 31, Rf 2 = 0,82 l 2 l 8:-18,64 (c = 1, DMF) 12) PF( 23-28): Boc-Trp-LeuArg(Tos)-Lys(Z-C 1)-Lys(Z-Cl)Leu-OH l 12 l On dissout 140,64 g ( 96,16 mmoles) du composé l 11 l dans 1200 ml d'éthanol chaud Après refroidissement, on filtre une petite quantité du précipité, on ajoute 288 ml ( 3 équivalents molaires) de Na OH aqueux normal et on agite à température ambiante pendant I heure On 25 ajoute 192 ml ( 2 équivalents molaires)d'une solution normale de Tos OH, on filtre et on élimine l'éthanol sous vide, on ajoute 96 ml ( 1 équivalent molaire) d'une solution normale de Tos OH, on ajoute 2 litres d'eau, on filtre le précipité, on sèche et on obtient le produit l 12 l. Production: 142,98 g (rendement: 101,1 %) ccm: Rf 2 = 0,71 P.F: 125-130 C lal 27: -37,24 o (c = 1, DMF) Analyse élémentaire (C 69 H 94015 N 12 SC 122 H 2 O) C% B/0 N% Calculé 56,35 6,72 11,43 Trouvé 56,03 6,62 11,85 Analyse d'amino-acides: Leu: 2 ( 2), Lys 2,08 ( 2), Arg 1,10 ( 1), Trp 0,83 ( 1). 13) PF( 23-34): Boc-Trp-Leu-Arg(Tos)-Lys(Z-Cl)-Leu-Gln15 Asp(O Bzl)-ValHis-Asn-Tyr(Bzl-C 12)-NH 2 l 13 l On ajoute 7 ml de TFA avec refroidissement à la glace à 1,68 g ( 1,5 mmole) du composé l 6 l dissous dans un peu de chlorure de méthylène et on agite à température ambiante pendant 30 minutes On élimine TFA sous vide, 20 on ajoute de l'éther au résidu, on filtre les cristaux précipités, on sèche, on dissout les cristaux dans 30 ml de DMF sec et on neutralise avec un peu de NMM On ajoute 2,43 g ( 1,65 mmole) du composé l 12 l, 0,22 g ( 1,65 mmole) de HO Bt et 20 ml de DMF sec On ajoute ensuite 0,3 ml ( 1,1 eq molaire) de WSC à -15 C et on agite pendant 16 heures à température ambiante On élimine DMF sous vide, -on lave le résidu avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5 % et deux fois avec de l'eau, on met en suspension dans du méthanol, on ajoute de l'éther, on filtre et on sèche pour obtenir le produit ú 3 l. Production: 3,62 g (rendement: 99,1 %) P.F: 260-2700 C ri 5: -46,6 (c = 0,3, DMF) Analyse d'amino-acides: Asp 1,94 ( 2), Glu 0, 96 ( 1), Val 0,71 ( 1), Leu 2,00 ( 2), Try 0,98 ( 1), Lys 2,09 ( 2), 10 His 0,58 ( 1), Arg 0,91 ( 1), Trp 0,78 ( 1). 14) PF( 22): Boc-Glu(O Bzl)-OPAC l 14 l On ajoute 113,5 g ( 0,57 mole) de bromure de phénacyle avec refroidissement à la glace à 128,2 g ( 0,38 M) de Boc-Glu(O Bzl)-OH dissous dans 600 ml de DMF et 79,3 ml 15 ( 0,57 M) de Et 3 N sont ajoutés goutte à goutte, puis on agite à 30 CC pendant 4 heures On ajoute 30 g d'acétate de potassium, on agite pendant 45 minutes et on élimine DMF sous vide On ajoute 600 ml d'acétate d'éthyle au résidu, on lave deux fois avec du bicarbonate de sodium 20 aqueux à 5 % et deux fois avec de l'eau On sèche la couche d'acétate d'éthyle sur du sulfate de sodium anhydre, on élimine le solvant sous vide pour précipiter les cristaux, on ajoute de l'hexane, on filtre et on obtient le produit l 14 l Production: 156,19 g (rendement: 90,2 %) ccm: Rf 5 = 0,73 ) PF( 21-22): Boc-Val-Glu(O Bzl)-OPAC l 15 l On ajoute 50 ml de chlorure de méthylène à 147,88 g ( 0,325 M) du composé l 14 l On ajoute sous refroidissement 300 ml de TFA, on agite à température ambiante pendant 1 heure et on enlève sous vide le chlorure de méthylène et TFA On ajoute de l'éther au résidu, on filtre les cristaux précipités et on sèche On neutralise les cristaux dissous dans DMF sec ( 300 ml) avec NMM à p H 7. On ajoute à la solution 35,14 g ( 0,26 M) de HO Bt et 10 56,49 g (-,26 M) de Boc-Val-OH et on ajoute 47,6 ml ( 0,26 M) de WSC à -15 C, puis on agite à température ambiante pendant 2 jours On soutire DMF sous vide, et on lave le résidu dissous dans 500 ml de chloroforme avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5 %, de l'eau, 15 du H Cl normal et de l'eau On déshydrate la couche chloroformée en ajoutant du sulfate de sodium anhydre on élimine le solvant sous vide, on filtre les cristaux obtenus avec addition d'hexane et on recristallise dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther pour obtenir le 20 produit l 15 l. Production: 106,97 g (rendement: 74,2 %) ccm: Rf 3 = 0,63 P.F: 139-141 C lD: -18,92 (C: 1, DMF) 16) PF( 20-22): Aoc-Arg(Tos)-Val-Glu(O Bzl)-OPAC l 16 l On ajoute 50 ml de chlorure de méthylène à 99,93 g ( 0,18 M) du produit l 15 l On ajoute 200 ml de TFA avec refroidissement à la glace, on agite à température ambiante pendant 1 heure et on soutire sous vide le chlorure de méthylène et TFA, On ajoute de l'hexane au résidu, on enlève le solvant par décantation, on ajoute de l'éther, puis on élimine l'éther sous vide On neutralise la matière huileuse obtenue dissoute dans 200 ml de DMF sec avec NM Mb 10 On ajoute 24,33 g ( 0,18 M) de HO Bt, 66, 60 g ( 0,18 M) de Aoc-Arg(Tos)-OH et 200 ml de DMF sec et ensuite on ajoute 32,94 ml ( 0,18 mole) de WSC à -15 C, on agite à température ambiante pendant 16 heures, on soutire le DMF sous vide et on dissout le résidu dans 1 litre d' acétate d'éthyle On lave la solution avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5 %, de l'eau, du H Cl normal et de l'eau, dans cet ordre, on sèche sur du sulfate de sodium anhydre, puis on élimine sous vide l'acétate d'éthyle On recristallise la substance huileuse obtenue dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther et on met les cristaux en suspension. On répète la même opération trois fois pour obtenir le produit l 16 l. Production: 149,75 g (rendement: 94,6 %) ccm: Rf 1 = 0,74, Rf 4 = 0,81 25 P F: 110-114 C la 29:11,5 (c = 1, DMF) 17) PF( 19-22): Boc-Glu(O Bzl)Arg(Tos)-Val-Glu(O Bzl)-OPAC l 17 l On ajoute 50 ml de chlorure de méthylène à 149,40 g ( 0,170 mole) du composé l 16 l On ajoute 300 ml de TFA avec refroidissement à la glace, on agite à température ambiante pendant 1 heure et on élimine sous vide le chlorure de méthylène et TFA On ajoute de l'éther au résidu, on élimine l'éther sous vide et on dissout la matière huileuse obtenue dans 200 ml de DMF sec On ajoute 25, 27 g ( 0,187 M) 10 de HO Bt et 63,09 g ( 0,187 M) de Boc-Glu(O Bzl)-OH, puis on ajoute 100 ml de DM 4 F sec et 34,22 ml de WSC ( 0,187 M) à -15 C, puis on agite à température ambiante pendant 16 heures, on élimine les solvants et on verse le résidu dans 6 litres d'eau, puis on recueille par filtration les cristaux précipités On filtre les cristaux suspendus dans le méthanol et l'éther et on dissout dans du méthanol chaud On filtre le précipité après refroidissement et on met de nouveau en suspension dans le méthanolo On répète les mêmes opérations trois fois et on obtient le composé 20 l 17 l On élimine le solvant de la liqueur-mère et on recristallise dans un mélange de méthanol et d'éther pour obtenir 25,02 g du produit. Production: 141,44 g (rendement: 76,7/o) ccm: Rf 1 = 0,56, Rf 4 = 0,82 25 P F: 119-121 C rl,I 9 -12,90 (c = 1, DMF) 18) PF( 18-22): Boc-Nle-Glu(O Bzl)-Arg(Tos)-Val-Glu(O Bzl)OPAC l 18 l On ajoute du chlorure de méthylène et TFA ( 24 ml) à 6,51 g ( 6 mmoles) du composé l 17 l avec refroidissement à la glace, on agite à température ambiante pendant 40 minutes, on élimine sous vide le chlorure de méthylène et TFA, on ajoute de l'éther au résidu pour cristallisation et on sèche On dissout les cristaux dans DMF sec et on neutralise à p H 7 par addition de NMM avec refroi10 dissement à la glace On ajoute 1,67 g ( 7,2 mmoles) de Boc-NleOH et 0,97 g ( 7,2 mmoles) de HO Bt dissous dans 40 ml de DMF sec, puis on ajoute 1,3 ml ( 7,2 mmoles) de VISC à -15 C, on agite pendant 16 heures, on élimine DMF sous vide, on ajoute de l'eau au résidu, on filtre le 15 précipité, et on lave avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5 %, trois fois avec de l'eau, trois fois avec HC 1 normal et du méthanol On recristallise le produit l 18 l dans un mélange de méthanol et d'éther. Production: 5,61 g (rendement: 785 %) 20 ccm: Rf 1 = 0,56 19) PF( 18-22): Boc-Nle-Glu(O Bzl)-Arg(Tos)-Val-Glu(O Bzl)-OH l 19 l On ajoute 8 g de poudre de zinc à 5,03 g ( 4,2 mmoles) du composé 18 ldissous dans 30 ml d'acide acétique et on agite à température ambiante pendant 5,5 heures On filtre la poudre de zinc et on élimine sous vide l'acide acétique. On mélange à l'éther les cristaux précipités, on filtre pour obtenir le produit l 19 l Production: 4,42 g ccm: Rf 1 = 0,18, Rf 2 = 0,67 P F: 210 C (déc) Analysed'amino-acides: Nle 1,01 ( 1), Glu 2,05 ( 2), Arg 0,98 ( 1), Val 1 ( 1) ) PF( 18-34): Boc-Nle-Glu(O Bzl)-Arg(Tos)-Val-Glu(O Bzl) Trp-Leu-Arg(Tos)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-Leu-Gln-Asp(O Bzl)Val-His-AsnTyr(Bzl-C 12)NH 12 l 20 l On ajoute 0,5 g ( 3,5 mmoles) de Skatole, 25 ml de sulfure de diméthyle, 2,5 ml d'éthanedithiol et 25 ml de TFA au composé l 19 l ( 8,9 g, 3,5 mmoles), on agite à O C pendant 10 minutes et à température ambiante pendant 45 minutes, puis on concentre sous vide le mélange de réaction, 15 on ajoute de l'éther au résidu, on filtre le précipité, on sèche, on dissout dans DMF sec ( 100 ml) et on neutralise avec NMM à p H 7 On ajoute 0,54 g ( 4 mmoles) de HO Bt et 4,3 g ( 4 mmoles) du composé l 19 l On ajoute 0,73 ml de WSC à -15 C et on agite à température ambiante pendant 20 2 jours On distille DMF sous vide et on ajoute du bicarbonate de sodium aqueux à 5 % On filtre le précipité et on lave à l'eau On dissout le produit dans l'éthanol et on précipite par addition d'éther On répète deux fois les mêmes opérations pour obtenir le produit l 20 l. 25 Production: 11,12 g (rendement 94 %) ccm: Rf 3 = 0,72 P.F: 250 C (déc) lO 8: -4,730 (c = 0,53, DMF) Analyse d'amino-acides: Asp 1,98 ( 2); Glu 3,04 ( 3); Val 1,69 ( 2); Leu 2 ( 2); Tyr 1,07 ( 1); Lys 1,93 ( 2); His 0,59 ( 1); Arg 1,97 ( 2); Trp 0,35 ( 1); Nle 1,07 ( 1). 21) PF( 17): Bos-Ser(Bzl)-OPAC l 21 l On ajoute 89,6 g ( 0,45 M) de bromure de phénacyle à 88,6 g ( 0,3 M) de Boc-Ser(Bzl)-OH dissous dans 400 ml de DMF et on ajoute goutte à goutte avec refroidissement à la glace 62,6 ml ( 0,45 M) de Et 3 N, puis on agite à 30 C 10 pendant 3,5 heures, on ajoute 22,1 g ( 0,225 M) d'acétate de potassium et on agite à température ambiante pendant 1 heure On distille DMF sous vide et on dissout le résidu dans 500 ml d'acétate d'éthyle, puis on lave la solution avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5 % et de l'eau. Après séchage de la couche d'acétate d'éthyle sur du sulfate de sodium anhydre, on élimine le solvant sous vide. On place le résidu dans un réfrigérateur pour cristalliser et on ajoute de l'hexane pour obtenir le produit l 21 l. Production:122,97 g (rendement 99,1) 20 ccm: Rf 5 = 0,82 llD 95: 11,88 o (c = 1,0, DMF) P.F: 45-47 O C. 22) PF( 16-17): Boc-Asn-Ser(Bzl)-OPAC l 22 l On ajoute 50 ml de chlorure de méthylène à 119,9 g ( 0,29 M) du composé 21 J, on ajoute 250 ml de TFA avec refroidissement à la glace et on agite à température ambiante pendant 1 heure Une fois la réaction terminée, on concentre le mélange de réaction sous vide, on ajoute de l'éther et on recueille par filtration et on sèche les cristaux précipités On dissout les cristaux dans 400 ml de DMF sec et on neutralise à p H 7 avec 114 MM On ajoute 31,35 g ( 0,232 M) de HO Bt et 53,88 g ( 0,232 M) de Boc-Asn-OH et ensuite on ajoute goutte à goutte 42,46 ml ( 0,232 M) de WSC, on agite à température ambiante pendant 16 heures, puis on élimine sous vide DMF On lave le résidu dissous dans 500 ml d'acétate d'éthyle avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5 % On lave les cristaux précipités avec de l'eau et de l'éther pour obtenir 41,79 g des cristaux I du produit l 22 l On concentre la couche d'acétate d'éthyle du filtrat sous vide et on obtient une matière huileuse résiduelle qu'on recristallise dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther pour obtenir 6,22 g de cristaux II du produit l 22 l. Production: 48,01 g (rendement: 39,2 %) ccm: Rf 2 = 0,61, Rf 4 = 0,62 P.F: 174-176 C lal 29 '5: -5,54 (c = 1,0, DMF) D Analyse des amino-acides: Asp 1,22 ( 1), Ser 1,00 ( 1) 23) PF( 15-17): Boc-Leu-Asn-Ser(Bzl)-OPAC l 23 l On ajoute 50 ml de chlorure de méthylène à 80,91 g ( 0,153 M) du composéL 22 jet 150 ml de TFA avec refroidissement à la glace, puis on agite à température ambiante pendant 1 heure On concentre sous vide le mélange de réaction, on ajoute de l'éther au résidu, on sépare par décantation la matière huileuse formée, on dissout dans ml de DMF sec et on neutralise avec N àI à p H 7. On ajoute 22,7 g ( 0,168 M) de HO Bt, 41,9 g ( 0,168 M) de 10 Boc-Leu-OH H 20 et 00 O ml de DMF, puis on ajoute goutte à goutte 30,7 ml ( 0,168 M) de WSC à -15 C, on agite à température ambiante et quand le mélange de réaction est gélifié, on le place pendant 3 jours dans un caisson à glace et on ajoute de l'eau On recueille le précipité 15 par filtration et on lave avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5 % et de l'eau, puis on sèche pour obtenir le produit l 23 l. Production 88,52 g (rendement 90,3 %) ccm: Rf 2 = 0,80, Rf 3 = 0,88 20 P F: 192-193 C Analyse'élémentaire (C 33 H 4409 N 4) C% % N^o% Calculé 61,86 6,92 8,75 Trouvé 61,81 7,05 8,56 24) PF( 14-17): Boc-His(Tos)-LeuAsn-Ser(Bzl)-OPAC l 24 j On ajoute 100 ml de chlorure de méthylène à 87, 55 g ( 0,137 M) du composé l 23 l On ajoute 200 ml de TFA avec refroidissement à la glace et on agite à température ambiante pendant 70 minutes On concentre sous vide le mélange de réaction, on ajoute de l'éther au résidu, on filtre le précipité, on sèche, on dissout dans 200 ml de 5 DMF sec et on neutralise à p H 7 en ajoutant NM 4 pour obtenir une solution du composé de-Boc. On met en suspension dans 1 litre d'acétate d'éthyle 89,2 g ( 0,151 M) de Boc-His(Tos)-OH DCHA et on lave avec 500 ml d'acide sulfurique normal puis on filtre les cristaux 10 précipités On lave à l'eau la couche d'acétate d'éthyle, on sèche sur du sulfate de sodium anhydre et on distille le solvant sous vide On ajoute les matières huileuses obtenues dissoutes dans 150 ml de DMF sec et 20,4 g ( 0,151 M) de HO Bt à la solution du composé de-Boc On ajoute 27,6 ml ( 0,151 M) de WSC goutte à goutte à -15 C et on agite à température ambiante pendant 3 jours On distille le solvant sous vide On ajoute de l'eau au résidu, on filtre le précipité, on lave avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5 % et de l'eau, on sèche et on obtient 20 le produit l 24 l. Production 108,63 g (rendement: 85,1 %) ccm: Rf 2 = 0,20, 0,79, Rf 3 = 0, 55, 0,87 (on obtient partiellement le composé de-Tos) P.F: 154-1560 C lxl 29,5: -18,58 o (c = 1,0, DMF) D ) PF( 13-17): Boc-Lys(Z-Cl)-His-LeuAsn-Ser(Bzl)-OPAC f 25 l On ajoute 100 ml de chlorure de méthylène à 107, 96 g ( 0,116 mole) du composé l 24 l, on ajoute 100 ml de TFA avec refroidissement à la glace et on agite à température ambiante pendant 70 minutes On concentre sous vide le mélange de réaction, on ajoute de l'éther au résidu, on filtre le précipité, on sèche, on dissout dans 200 ml de DMF sec et on neutralise à p E 7 avec NMM pour obtenir une solution de-Boc. On lave 62,46 g ( 0,128 M) de Boc-Lys(Z-Cl)-OH TBA en suspension dans 600 ml d'acétate d'éthyle avec du HC 1 normal et de l'eau On sèche la couche d'acétate d'éthyle avec du sulfate de sodium anhydre et on distille le solvant sous vide On dissout dans 100 ml de DMF sec la substance 15 huileuse obtenue et 17,30 g ( 0,128 M) de HO Bt On ajoute une solution de celui-ci à la solution de-Boc ci-dessus. On ajoute goutte à goutte 24,42 ml ( 0,128 M) de WSC et on agite pendant 16 heures à température ambiante On élimine le solvant sous vide et on ajoute le résidu à 5 litres de 20 bicarbonate de sodium aqueux à 3 %, puis on lave les cristaux précipités avec de l'eau et on sèche On ajoute de l'éther à la solution méthanolique des cristaux pour précipiter et on met en suspension le précipité dans l'acétate d'éthyle et on filtre On répète les mêmes opérations 25 à trois reprises pour obtenir le produit l 25 l. Production: 114,42 g (rendement: 91,8 %) ccm: Rf 2 = 0,34, Rf 3 = 0,68 255 sÈ 20 o 4 P.F: 200-202 C l 2 lD: -26,94 (c = 1,0, DMF) 26) PF( 13-17): Boc-Lys(Z-Cl)-His-Leu-AsnSer(Bzl)-OH l 26 l On ajoute 150 g de poudre de zinc à 86,0 g ( 80 mmoles) du composé l 25 l dissous dans 500 ml d'acide acétique, on agite à température ambiante pendant 5 heures, on filtre pour enlever la poudre de zinc, on concentre le filtrat sous vide, on ajoute de l'éther au résidu et on filtre les cristaux précipités pour obtenir le produit l 26 l. 10 Production: 84,70 g (rendement 95,2 %) ccm: Rf 2 = 0,47 P.F: 240- 250 C lKl 3 D 0: -19,16 (c = 1,0, DMF) Analyse élémentaire (C 45 H 52012 N T 9 C 1 2 CH 3 COOH 2 H 20): C% Hi% N% Calculé 53,76 6,63 11,52 Trouvé 52,83 6,36 11,35 Analyse des amino-acides: Asp 1,01 ( 1),Ser 0,83 ( 1) Leu 1 ( 1), Lys 0,93 ( 1) His 0,97 ( 1) 27) PF( 13-34): B o c -Lv S (Z-C I) -Hi s-Le u-As n-S e r (B z I) -NI eG I u ( O B z I) -A r g (T o S) -Va I -G I u ( O B z I) -T r p -Le u-Ar g ( To S)-Lys ( Z-C I) -Ly S (Z- CI) -Le u-G I n-As p ( O Bz I)-Va I -Hi s-As n-Ty r (B z 1C 1 2)-NH 2 C 27 l On ajoute 0,46 g ( 3,2 mmoles) de Skatole, 25 ml de sulfure de diméthyle, 2,5 ml d'éthanedithiol et 25 ml de TFA à 10,77 g ( 3,2 mmoles) du composé l 20 l, on agite à O C pendant 10 minutes et à température ambiante pendant 560 minutes, on concentre le mélange de réaction sous vide, on ajoute de l'éther au résidu, on-filtre le précipité, on sèche, on dissout dans 100 ml de DMF sec et on neutralise à p H 7 avec NI 214 On ajoute 0,51 g ( 3,8 mmoles) de HO Bt et 4,23 g ( 3,8 mmoles) du composé l 26 l On ajoute 0,70 ml de WSC à -15 C et on agite à température ambiante. On élimine DMF sous vide, on ajoute de l'eau au résidu, on filtre le précipité, on lave à l'eau et on sèche pour obtenir le produit l 27 l. Production: 13,60 g (rendement 100 ') P.F: 138-t 60,5 C Analyse des amino-acides: Asp 2,96 ( 3), Ser 0,62 ( 1), Glu 3,02 ( 3), Val 1,72 ( 2), Leu 3 ( 3), Tyr 1,06 ( 1), Lys 3,01 ( 3), His 1,43 ( 2), Arg 1,98 ( 2), Trp 0,60 ( 1), 20 Nle 1,06 ( 1). 28) PF( 11-12): Boc-Leu-Gly-O Bzl l 28 l On ajoute 50 ml de benzène sec à 4,99 g ( 20 mmoles) de Boc-Leu-OH H 20 dissous dans 30 ml de THF sec et on distille le solvant par voie azéotropique On dissout la 25 matière huileuse obtenue dans 70 ml de THF sec On ajoute mmoles de H-Gly-O Bzl Tos OH et 2,7 g ( 20 mmoles) de HO Bt et on ajoute 5 ml de WSG à -5 C puis on agite à tempé- rature ambiante pendant 16 heures On distille le solvant sous vide et on dissout le résidu dans 100 ml d'acétate d'éthyle, on lave la solution deux fois avec du H Cl normal, deux fois avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5 % et deux fois à l'eau On sèche la couche d'acétate d'éthyle en ajoutant du sulfate de sodium anhydre et on concentre sous vide pour obtenir un produit huileux l 28 l. 29) PF( 10-12): Boc-Asn-Leu-Gly-O Bzl l 29 l On ajoute 40 ml d'une solution d'acide chlorhydrique 10 ( 4,39 N) et de dioxane au produit huileux l 28 l à -15 C, on agite pendant 90 minutes, on concentre sous vide, on ajoute de l'éther au résidu, on recueille par filtration le précipité, on sèche et on dissout dans 30 ml de DMF sec. On ajoute Et 3 N à -5 C pour régler le p H à 7 et on ajoute 15 0,3 g ( 2, 2 mmoles) de HO Bt et 7,77 g ( 22 mmoles) de BocAsn-ONP, puis on agite à température ambiante pendant 3 jours On ajoute de l'eau au mélange de réaction, on extrait le précipité avec 200 ml de chloroforme, on lave la couche chloroformée avec du HC 1 normal, du bicarbonate de sodium 20 aqueux à 5 % et de l'eau, on sèche sur du sulfate de sodium anhydre, on concentre sous vide pour chasser le solvant, on recristallise le résidu dans un mélange d'acétated'éthyle et d'hexane et on obtient le produit l 29 l. Production: 8,0 g (rendement 73,8 %) 25 P F 152-156 C rali D 36,1 (c = 1,0, DMF) ) PF( 9-12): Boc-His-Asn-Leu-Gly-O Bzl l 30 l On ajoute 5 ml de chlorure de méthylène à 7,36 g ( 15,5 mmoles) du composé l 29 l, on ajoute 32 ml de TFA avec refroidissement à la glace et on agite à température ambiante pendant 60 minutes On concentre le mélange de réaction sous vide, on ajoute de léther au résidu, on recueille le précipité par filtration, on sèche, on dissout dans 40 ml de DMF sec et on neutralise à p H 7 avec NIM pour obtenir une solution de-Boc. On ajoute 150 ml d'acétate d'éthyle et 90 ml d'acide sulfurique 0,5 N à 10,99 g ( 18,6 mmoles) de Boc-His(Tos)OH.DCHA et on secoue On lave à trois reprises la couche d'acétate d'éthyle avec de l'eau, on sèche sur du sulfate de sodium anhydre, on distille l'acétate d'éthyle sous vide 15 et on obtient une substance huileuse On dissout cette substance et 2,5 g ( 18,6 mmoles) de HO Bt dans 60 ml de DMF sec On ajoute la solution à la solution de de-Boc, on ajoute 5,4 ml ( 18,6 mmoles) de WSC à -15 C et on agite à température ambiante pendant 16 heures On distille le 20 solvant sous vide, on dissout le résidu dans l'acétate d'éthyle, on lave trois fois avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5 % et deux fois avec de l'eau, on sèche sur du sulfate de sodium anhydre et on distille le solvant sous vide On ajoute de l'éther au résidu et on recueille par 25 filtration les cristaux précipités Dans ces cristaux, Tos de His est partiellement éliminé et pour éliminer entièrement Tos on doit dissoudre les cristaux dans 100 ml de DMF, ajouter 7,05 g de HO Bt et agiter le mélange à température ambiante pendant 3 jours On élimine DMF sous vide, on dissout le résidu dans l'acétate d'éthyle, on lave deux fois avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5 % et de l'eau, on sèche sur du sulfate de sodium anhydre puis on distille le solvant sous vide On ajoute de l'éther * aux cristaux et on filtre pour obtenir le produit l 30 l. Production: 7,32 g (rendement 74,8 %) ccm: Pf = 0,1 31) PF( 8-12): BocNle-His-Asn-Leu-Gly-O Bzl l 31 l On ajoute 5 ml de chlorure de méthylène à 7,32 g ( 11,6 mmoles) du composé l 30 l on ajoute 30 ml de TFA avec refroidissement à la glace et on agite à température ambiante pendant 40 minutes On concentre le mélange de 15 réaction sous vide, on ajoute de l'éther au résidu, on filtre le précipité, on sèche, on dissout dans 40 ml de DMF sec et on règle à p H 7 en ajoutant Ns MI On ajoute 1,9 g ( 13, 92 mmoles) de HO Bt et 3,23 g ( 13,92 mmoles) de Boc-Nle-OH dissous dans le DMF sec, et on ajoute 2,5 ml ( 13,92 mmoles) de WSC, puis on agite le mélange de réaction à température ambiante pendant 16 heures, on chasse lesolvant sous vide, on ajoute de l'eau au résidu, on filtre le précipité, on lave avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5 %, deux fois avec H Cl normal et trois fois à l'eau et 25 on sèche pour obtenir le produit l 31 l Production: 3,70 g (rendement 42,9 %) ccm: Pf 2 = 0,20 32) PF( 8-12) Boc-Nle-His-Asn-Leu-Gly-OH r 32 l On ajoute 300 mg de 10 % Pd/C à 2,8 g ( 3,8 mmoles) du composé l 31 l dissous dans 100 ml d'éthanol et on fait passer pendant 3 heures de l'hydrogène gazeux à température ambiante On filtre les matières insolubles précipitées dans le mélange de réaction, on lave avec DMF et on concentre le filtrat sous vide On ajoute au résidu un mélange d'éthanol et d'éther et on recueille le précipité par filtration et on sèche pour obtenir le produit l 32 l. 10 Production: 1,76 g (rendement 71,1 %) P.F 112,50 C ccm: Rf 2 = 0,05 Analyse d'amino-acides: Asp 0,96 ( 1), Gly 0,98 ( 1), Leu 1 ( 1), Lys 0,95 ( 1), Nle 0,94 ( 1). 33) PF( 8-34): B O -Ni e-Hi S -As n -Le u-G I y-L ' S ( Z-C 1)-Hi S Le ut As n-Se r (B z I) -NI e-GI u ( O B z I) Ar g (T o S)-Va I -GI u ( O B z I) -T r p Le u -A r g (To S)-L y S (Z-C I)-Ly S ( Z-C 1)-Leu-G I n-As p ( O Bz I)-Va I -Hi S -A S N -Ty v r ( B z I -C 12) NH z ( 33) On ajoute 0,33 g ( 2,5 mmoles) de Skatole, P 5 ml de sulfure de diméthyle, 2,5 ml d'éthanedithiol et 25 ml de TFA à 10,60 g ( 2,5 mmoles) du composé l 27 l, on agite à OCPC pendant 10 minutes et à la température ambiante pendant 50 minutes et on concentre sous vide On ajoute de l'éther au résidu, on filtre le précipité, on sèche, on dissout dans 100 ml de DMF et on ajoute NIM avec refroidissement à la glace pour régler le p H à 7 On ajoute 0,36 g ( 2,7 mmoles) de HO Bt et 1,76 g ( 2,7 mmoles) du composé l 32 l à la solution et on ajoute 0,5 ml de WSC à -15 C et on agite à température ambiante pendant 16 heures On filtre le précipité, on lave à l'eau, on sèche et on reprécipite dans un mélange d'éthanol et d'éther pour obtenir le produit l 33 l. Production: 10,94 g (rendement 91,7 %) P.F: 140,5-162 C. a 28} 9 44 ( C = 0, 2 D M, F) DMF Analyse d'amino-acides: As p 3, 7 ( 4) Se r O 7 ( 1) Glu 3 3 3 ( 3) Gly 0, 7 7 (l): Val /} 4 ó( 2), Leu L ( 4) Tvr /, O 4 ( 1), Ly S 3, 2 & ( 3) I Hi s 2,3 7 3), Arg 2/ 4 ( 2), T rp O, 7 3 ( 1), Nle 2 0 7 ( 2. 34) PF( 7): Boc-Leu-OPAC l 34 l On ajoute goutte à goutte 12,5 ml ( 90 mmoles) de Et 3 à 15,0 g ( 70 mmoles) de Boc-Leu-OH H 20 et 17,9 g ( 90 mmoles) de bromure de phénacyle dissous dans 100 ml de DMF, on agite à 300 C pendant 2 heures, on ajoute 4,42 g ( 45 mmoles) d'acétate de potassium, on agite à température ambiante pendant 45 minutes et on distille DMF On lave le résidu dissous dans l'acétate d'éthyle à deux reprises avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5 % et à deux re10 prises avec de l'eau, on sèche la couche d'acétate d'éthyle sur du sulfate de sodium anhydre et on distille le solvant sous vide On place le résidu dans un caisson à glace et on sèche les cristaux précipités pour obtenir le produit l 34 l. Productien: 21,23 g (rendement 100 %) ccm: Rfl= 0,89 ) PF( 6-7): Boc-GlnLeu-OPAC l 35 l On ajoute 20 ml de chlorure de méthylène à 20,96 g ( 60 mmoles) du-composé l 34 l, on ajoute 80 ml de TFA avec refroidissement à la glace, on agite à température ambiante pendant 40 minutes et on concentre le mélange de réaction sous vide On ajoute de l'éther au-résidu, on filtre le précipité, on sèche, on dissout dans 70 ml de DMF sec et on règle le p H à 7 en ajoutant NMM avec refroidissement à 25 la glace On ajoute à la solution 8,1 g ( 60 mmoles) de HO Bt et 14,78 g ( 60 mmoles) de Boc-Gln-OH dissous dans 90 ml de DMF sec, puis on ajoute 10,9 ml ( 60 mmoles) de WSC à -15 C et on agite à température ambiante pendant 16 heures On élimine DMF sous vide, on dissout le résidu dans l'acétate d'éthyle et on lave deux fois avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5 %, deux fois avec du H Cl normal et trois fois avec de l'eau On sèche la couche d'acétate d'éthyle sur du sulfate de sodium anhydre, on distille le solvant sous vide, on ajoute de l'hexane aux cristaux précipités, on filtre et on sèche pour obtenir le produit F 35 l. Production: 17,25 g (rendement 60,2 %) ccm: Rf 1 = 0,38 36) PF( 5-7) BocIle-Gln-Leu-OPAC l 36 l On ajoute 10 ml de chlorure de méthyl&ne au composé l 35 l ( 17,19 g, 36 mmoles), on ajoute 70 ml de TFA avec refroidissement à la glace, on agite à température ambiante pendant 60 minutes et on concentre le mélange sous vide. On sèche le résidu sous vide, on dissout dans 130 ml de DMF sec et on règle le p H à 7 avec refroidissement à la glace en ajoutant Ni 4 On ajoute goutte à goutte à la solution 5,3 g ( 39,6 mmoles) de HO Bt et 9,5 g ( 39,6 mmoles) de Boc-Ile-OH O,5 H 2 O et on agite à température ambiante pendant 16 heures On distille DMF sous vide, on ajoute au résidu du bicarbonate de sodium aqueux à 5 %, on filtre le précipité, on lave avec du bicarbonate de sodium à 5 % 25 deux fois avec H Cl normal et trois fois avec de l'eau et on sèche Le précipité est resédimenté à partir d'un mélange d'éthanol et d'éther pour obtenir le produit l 36 l. Production: 16,35 g (rendement: 76,9 %) ccm: Rf 1 = 0,41, Rf 2 = 0,68 37) Pr F( 4-7): Boc-Glu(O Bzl)-Ile-Gln-Leu-OPAC l 37 l On ajoute 10 ml de chlorure de méthylène à 16,24 g ( 27,5 mmoles) du composé l 36 l On ajoute à la solution 70 ml de CFA, on agite à température ambiante pendant 60 minutes et on concentre le mélange de réaction sous vide. On ajoute de l'éther au résidu, on filtre le précipité, on sèche, on dissout dans 100 ml de DMF et on règle le 10 p H à 7 en ajoutant NMM sous refroidissement à la glace. On ajoute à la solution 4,09 g ( 30,25 mmoles) de HO Bt et ,2 g ( 30,25 mmoles) de Boc-Glu(O Bzl)-OH-dissous dans ml de DMF sec, on ajoute goutte à goutte 5,5 ml de WSC à -15 C et on agite à température ambiante pendant 15 16 heures On distille le DMF sous vide et on ajoute au résidu du bicarbonate de sodium aqueux à 5 % On filtre le précipité formé, on lave avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5 %, deux fois avec H Cl normal et quatre fois avec de l'eau,puis on sèche On obtient le produit l 37 l 20 par reprécipitation dans un mélange d'éthanol et d'éther. Production: 21,68 g (rendement 97,1 %) ccm: Rf 1 = 0,52 38) PF( 3-7): BocSer(Bzl)-Glu(O Bzl)-Ile-Gln-Leu-OPAC l 38 l Onajoute 10 ml de chlorure de méthylène à 21,46 g 25 ( 26,5 mmoles) du composé l 37 l, on ajoute 90 ml de TFA sous refroidissement à la glace, on agite à température ambiante et on concentre le mélange de réaction sous vide. On ajoute de l'éther au résidu, on filtre le précipité, on sèche, on dissout dans 150 ml de DMF sec et on règle le p H à 7 en ajoutant NMM sous refroidissement à la glace. On ajoute à la solution 3,9 g ( 29,15 mmoles) de HO Bt et 5 8,6 g ( 29,15 mmoles) de Boc-Ser(Bzl)-OH dissous dans 50 ml de DMF sec On ajoute 5,3 ml ( 29,15 mmoles) de WSC et on agite à température ambiante pendant 16 heures On distille le DMF sous vide et on ajoute au résidu du bicarbonate de sodium aqueux à 5 %, puis on filtre le précipité. 10 On lave le précipité avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5 %, deux fois avec H Cl normal et quatre fois avec de l'eau, on met en suspension dans l'éther et on filtre pour obtenir le produit l 38 l. Production: 24,8 g (rendement: 94,7 %) 15 ccm: Rf 1 = 0,53 39) PF( 2-7): Boc-Val-Ser(Bzl)-Glu(O Bzl)-Ile-Gln-Leu-OPAC l 39 l On ajoute 20 ml de chlorure de méthylène à 24,68 g ( 25 mmoles) du composé l 38 l, on ajoute 100 ml de TFA sous 20 refroidissement à la glace et on agite à température ambiante pendant 50 minutes On concentre le mélange de réaction sous vide, on ajoute de l'éther au résidu, on filtre le précipité et on sèche On dissout le précipité séché dans 120 ml de DMF sec et on règle la solution à p H 7 25 en ajoutant du NMM sous refroidissement à la glace On ajoute à la solution 4,05 g ( 30 mmoles) de HO Bt et 6,5 g ( 30 mmoles) de Boc-Val-OH dissous dans 80 ml de DMF sec, on ajoute goutte à goutte 5,5 ml ( 30 mmioles) de WSC à -15 C et on agite à température ambiante pendant 16 heures On filtre le précipité formé après avoir ajouté de l'eau et on lave deux fois avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5 %, 5 deux fois avec H Cl normal et quatre fois avec de l'eau, on met en suspension dans l'éther et on filtre pour obtenir le produit l 39 l. Production: 26,32 g (rendement 96,8 %) ccm: Rf = 0,49 40) PF( 1-7): BocSer(Bzl)-Val-Ser(Bzl)-Glu(O Bzl)-Ile-GlnLeu-OPAC l 40 l On ajoute 20 ml de chlorure de méthylène à 26,07 g ( 24 mmoles) du composé l 39 l On ajoute 100 ml de TFA et on agite à température ambiante pendant 40 minutes On concentre le mélange de réaction sous vide, on ajoute de l'éther au résidu, on filtre le précipité, on sèche, et on dissout dans 100 ml de DMF sec On règle le p H à 7 en ajoutant NMM On ajoute 3,9 g ( 28,8 mmoles) de HO Bt et 8,5 g ( 28,8 mmoles) de Boc-Ser(Bzl)-OH dissous dans 50 ml 20 de DMF sec, puis on ajoute 5,3 ml ( 28,8 mmoles) de WSC à -15 C et on agite à température ambiante pendant 16 heures. Le précipité se forme dans le mélange de réaction et on lui ajoute de l'eau On filtre le précipité, on lave avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5 %, du H Cl normal et de 25 l'eau,on met en suspension dans l'éther et on filtre On répète la même opération deux fois pour obtenir le produit l 40 l. Production: 28,0 g (rendement: 92,3 %) ccm: Rf 1 = 0,53 41) PF( 1-7): BocSer(Bzl)-Val-Ser(Bzl)-Glu(O Bzl)-IleGln-Leu-Oh l 41 l On ajoute 15 g de poudre de zinc à 12,6 g ( 10 mmoles) du composé l 40 O dissous dans l'acide acétique ( 300 ml) et on agite à 50 C pendant 4 heures, on filtre ensuite la poudre de zinc On distille l'acide acétique sous vide, on ajoute de l'éther au résidu, on recueille les cristaux 10 précipités et on lave pour obtenir le produit l 41 jl. Production: 11,15 g (rendement: 97,4 %) P.F: 260 C (déc) ccm: Rf 1 = 0, 14, Rf 2 = 0,64 Analyse des amino-acides: Ser 1,81 ( 2), Glu 2,02 ( 2) 15 Val 0,95 ( 1), Leu 1 ( 1), Ile 0,92 ( 1). 42) Protégé -S -L -Z -N G I Ly r V. -A Bz Nle, N Ie, Tyr -h 3)NH 2; B oc S r(B z I er(Bzl)-Glu(O Bz I) t I e u-Nl e-Hi s-As n-Leu -G -C I) -Hi sLe u -As n-S e r I e-G I u ( O B z I)-A r g( To s u ( O B z I)-T rp -Le'u A r g ( s (Z-C 1)-Lys (Z-C I)-Le s p(O Bz I)-Va I -H S -As n I-Cl) N Hz 2 ( 42) P TH ()-Va I e n r y-Lv (B z 1))-Va I T o-s) u-G in -Ty r ( s On ajoute 0,30 g ( 2,28 mmoles) de Skatole, 25 ml de sulfure de diméthyle, 2, 5 ml d'éthanedithiol et 25 ml de TFA, à 10,86 g ( 2,28 mmoles) du composé l 33 l sous refroidissement à la glace, on agite à température ambiante pendant 60 minutes et on concentre sous vide On ajoute de l'éther au résidu, on filtre le précipité, on sèche et on dissout dans un mélange de 1 OO ml de DMF sec et 10 ml de DMSO et on règle à p H 7 en ajoutant NMM sous refroidissement à la glace On ajoute 0,37 g ( 2,74 mmoles) et 3,14 g 10 ( 2,74 mmoles) du composé l 41 l, on ajoute 0,50 ml ( 2,74 mmoles) de ESC à -15 C et on agite à température a- iante pendant 16 heures On ajoute de l'eau au mélange de réaction, on filtre le précipité et on lave avec de l'eau et un mélange é:hanol-éther pour obtenir le produit l 42 l. 15 Production: 12,87 g (rendement: 97,3 %) P.F: 139,5-175 C ) 2-8 _ 9 7 ( C = 0, S /, D M) Analyse d'amnino-acides: Asp 3 7 2 ( 4) Se r 2 7 ( 3), Glu S ( 5)s G 1 y 0, 9 (i), Val 2 g ( 3), Ite, / (i), Leu S( 5), Ty r 09 9 (I) Lys 2 g 7 ( 3) His 2/ 9 _( 3) l Arg O z T p 0,, 6 e (I) X NI e & 9 2) 43) lNle 8, Nle 18, Tyr 4 l-h-PTH( 1-34)NH 2 On ajoute 3,5 ml d'anisole, 0,35 ml d'éthanedithiol, 3,5 ml de sulfure de diméthyle et 35 ml de HF anhydre à 2,9 g ( 0,5 mmole) du composé l 42 l et on agite pendant 60 minutes On distille HF sous vide, on ajoute de l'éther au résidu, on recueille le précipité et on dissout dans l'acide acétique au dixième On fait passer la solution à travers une colonne ( 3,5 x 12 cm) de Dowex Xl (tyre acétate, marque déposée) et on recueille les 10 fractiols positives à la ninhydrine et on lyophilise pour obtenir 1,87 g de produit brut Ce produit dissous dans 50 ml d'acide acétique au dixième est alors chargé sur une colonne ( 2 x 33 cm) de CM-cellulose et on élue par une élution à gradient linéaire d'acétate d'ammonium 15 0,05 M (p H 5,1, 1 litre) - acétate d'ammonium O,4 M (p H 6,0, 1 litre) Chaque fraction de 9,0 ml donnant environ Rf 6 = 0,30, on recueille les fractions n 74 à 84 et on lyophilise On dissout la matière lyophilisée dans une petite quantité de H Cl au dixième et on charge la solution sur une colonne ( 3 x 115 cm) de Sephadex G-25 et on élue avec l'acide acétique au dixième On contrôle chaque fraction par son pouvoir absorbant à 280 nm et on recueille les fractions ayant un pic majeur et on lyophilise pour obtenir lNle 8, le 8, Tyr 34 l-h-PTH( 1-34)NH 2. 25 Production: 140 mg ccm: Rf 6 = 0,30 Analyse des amino-acides (hydrolysés par H Cl hexanormal contenant 3 % d'acide thioglycolique): Asp 3,98 ( 4), Ser 2,10 ( 3), Glu 4,93 ( 5), Gly 0,97 ( 1), Val 2,66 ( 3), Ile 0,87 ( 1), Leu 5,00 ( 5),Tyr 1,11 ( 1), Lys,,26 ( 3), His 2,30 ( 2), Arg 2,03 ( 2), Trp 0,62 ( 1), Nle 2,22 ( 2). CLHP: colonne; nucléosile 5 C 18 ( 4 mm DI x 150 mm) tampon: acétonitrile à 0,1 % d'acide acétique contenant un phosphate 0,1 M (le rapport d'acétonitrile est le gradient linéaire déterminé à 20 %o pour les cinq premières 10 minutes et de 20 à 40 % pour les vingt minutes suivantes) débit: 1 ml /min. détection: 225 nm résultat: pic unique à 19,07 min. Exemple 2 lNle 8, Nle 118 l-h-PTH( 1-34)NH 2 44) PF( 23-34): Boc-Trp-Leu-Arg(Tos)Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)Leu-Gln-Asp(O Bzl)-Val-His-Asn-Phe-1 H 2 l 43 l On met en suspension 1,68 g de Z(O Me)-Gln-Asp(O Bzl)Val-His-Asn-Phe-NH 2 préparé selon un procédé d'un brevet 20 japonais non examiné et publié n 55-113753 dans une petite quantité de chlorure de méthylène On ajoute 7 ml de TFA avec refroidissement à la glace et on agite à température ambiante pendant 30 minutes On -distille TFA sous vide, on ajoute de l'éther au résidu, on filtre 25 les cristaux précipités et on sèche On neutralise les cristaux dissous dans 30 ml de DMF sec avec une petite quantité de NYIM On ajoute le composé l 12 l de l'exemple 1 ( 2,43 g), HO Bt ( 0,22 g) et DMF sec ( 20 ml) ainsi que WSC ( 0,3 ml, 1,1 eq molaire) à -15 C et on agite à température ambiante pendant 16 heures On distille DMF sous vide On lave le résidu avec du bicarbonate de sodium aqueux à 5 C% et deux fois avec de l'eau, on met en 5 suspension dans du méthanol, on ajoute de l'éther, on filtre et on sèche pour obtenir le produit l 43 l. Production 3,62 g P.F: 262-271 C r Fl:2 -4,51 (c = 0,3, DMF) D Analyse des amino-acides: Asp 1,94 ( 2), Glu 0,96 ( 1), Val 0,71 ( 1), Leu 2,00 ( 2), Phe 0,98 ( 1), Lys 2,09 ( 2), H-is 0,58 ( 1), Arg 0,91 ( 1), Trp 0,78 ( 1). ) PF( 18-34): Boc-Nle-Glu(O Bzl)-Arg(Tos)-Val-Glu(O Bzl)Trp-Leu-Arg(Tos)Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-Leu-Gln-Asp(O Bzl)15 Val-His-Asn-Phe-NH 2 l 44 l On ajoute 0,5 g ( 3,5 mmoles) de Skatole, 25 ml de sulfure de diméthyle, 2,5 ml d'éthanedithiol et 25 ml de TFA au composé l 13 l préparé comme dans l'exemple 1 ( 3,9 g 3,5 mmoles), on agite à Oe C pendant 10 minutes et à tempé20 rature ambiante pendant 45 minutes et on concentre le mélange de réaction sous vide On ajoute de l'éther au résidu, on filtre le précipité, on sèche, on dissout dans 100 ml de DMF et on neutralise à p H 7 avec NMM On ajoute 0,54 g de HO Btet 4,3 g du composé l 43 lpuis 0,73 ml de 25 WSC à -15 C et on agite à température ambiante pendant 2 jours On distille DMF sous vide On ajoute au résidu du bicarbonate de sodium aqueux à 5 %, on filtre le précipité et on lave à l'eau On dissout le produit dans l'éthanol et on ajoute de l'éther pour la précipitation On répète la même opération deux fois pour obtenir le produit l 44 l. Production: 11,12 g (rendement 95,5 %) ccm: Pf = 0,7 P.F: 252 C (déc) rul 8:4,81 o (c: 0,53, DMF) Analyse des amino-acides: Asp 1,98 ( 2), Glu 3,04 ( 3), Val 1,69 ( 2), Leu 2 ( 2), Phe 1,07 ( 1), Lys 1,93 ( 2), His 0,59 ( 1), Arg 1,97 ( 2), Trp 0,35 ( 1), Nile 1,07 ( 1). 46) PF( 13-34): Boc-Lys(Z-Cl)-His-Leu-Asn-Ser(Bzl)-NleGlu(O Bzl)-Arg(Tos)Val-Glu(O Bzl)-Trp-Leu-Arg(Tos)-Lys(Z-Cl) Lys(Z-Cl)-Leu-Gln-Asp(O Bzl)Val-His-Asn-Phe-NH 2 l 45 l On ajoute 0,46 g de Skat Ole, 25 ml de sulfure de 15 diméthyle, 2,5 ml d'éthanedithiol et 25 ml de TFA au composé l 20 l préparé dans l'exemple 1 ( 10,77-g) On agite à O C pendant 10 minutes et à température ambiante pendant 60 minutes et on concentre sous vide On ajoute de l'éther eu résidu, on filtre le précipité, on sèche, on dissout la matière sèche dans le DMIF sec ( 100 ml) et on neutralise à p H 7 par addition de NMR 4 On ajoute 0,51 g de HO Bt et 4, 23 g du composé l 44 l, puis 0,70 ml de WSC à -15 C et on agite à température ambiante On distille DMF sous vide, on ajoute de l'eau, on filtre l précipité, 25 on lave à l'eau, on sèche et on obtient le produit l 45 l. Production: 13,60 g P.F: 140-155 C lal 28: -2,00 (c = 056, DMF) Analyse des amino-acides: Asp 2,96 ( 3), Ser O 62 ( 1), Glu 3,02 ( 3), Val 1,72 ( 2), Leu 3 ( 3), Phe 1,06 ( 1), Lys 3, 01 ( 3), His 1,43 ( 2), Arg 1,98 ( 2), Trp 0,60 ( 1), Nie 1,06 ( 1). 47) PF( 8-34): Boc-Nle-His-Asn-Leu-Gly-Lys(Z-Cl)-His-Leu-AsnSer(Bzl)-NleGlu(O Bzl)-Arg(Tos)-Val-Glu(O Bzl)-TrpLeu-Arg(Tos)-Lys (Z-Cl)-Lys(Z-Cl)Leu-Gln-Asp(O Bzl)Val-His-Asn-Phe-NH 2 l 46 l On ajoute 0,33 g de Skatole, 25 ml de sulfure de diméthyle, 2,5 d'éthanedithiol et 25 ml de TFA au composé l 45 l ( 10,60 g), On agite à O C pendant 10 minutes et à température ambiante pendant 50 minutes et on concentre 5 sous vide On ajoute de l'éther au résidu, on filtre le précipité, on sèche, on dissout dans 100 ml de DMF sec et on règle à p H 7 en ajoutant Nc Ié avec refroidissement à la glace On ajoute 0,36 g ( 2,7 mmoles) de HO Bt et 1, 76 g ( 2,7 mmoles) du composé 32 de l'exemple 1, on 10 ajoute à la solution 0,5 ml de WISC à -15 C et on agite à température ambiante pendant 16 heures On filtre-la matière précipitée, on lave à l'eau, on sache et on précipite de nouveau dans un mélange d'éthanol et d'éther pour obtenir le produit l 46 l. Production 10,94 g P.F: 143-161 C al 28: -2,01 (c = 0,52, DMF) Analyse d'amino-acides: Asp 3,87 ( 4), Ser 0, 76 ( 1), Glu 3,34 ( 3), Gly 0,77 ( 1), Val 1,84 ( 2), Leu 4 ( 4), Phe 1, 04 ( 1), Lys 3 > 28 ( 3), Hls 2,37 ( 4, Arg 2,14 ( 2), Trp 0,73 ( 1), Nle 2,07 ( 2). 48) Protégé lNle 8, Nle 8 l-h-PTH( 1-34)NH 2: Boc-Ser(Bzl)Val-Ser(Bzl)Glu(O Bzl)-Ile-Gln-Leu-Nle-His-AsnLeu-Gly-Lys(Z-Cl)-His-Leu-Asn-Ser(Bzl)NleGlu(O Bzl) -Arg(Tos)-Val-Glu(O Bzl)-Trp-Leu-Arg(Tos)Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl) -Leu-Gln-Asp(O Bzl)-Val-HisAsn-Phe-NH 2 l 47 l On ajoute 0,30 g de Skatole, 25 ml de sulfure de diméthyle, 2,5 ml d'éthanedithiol et 25 ml de TFA au composé l 46 l ( 10,86 g) avec refroidissement à la glace, on agite à température ambiante pendant 60 minutes et on concentre sous vide On ajoute de l'éther au résidu, on filtre le précipité et on sèche On dissout la matière séchée dans un mélange de 100 ml de DMF sec et 10 ml de DMSO et onrègle à p H 7 en ajoutant NPM avec refroidissement à la glace On ajoute 0,37 g de HO Bt et 3,14 g 10 du composé l 41 l de l'exemple 1, puis on ajoute 0,51 ml de WSC à -15 C, on agite à température ambiante pendant 16 heures, on ajoute de l'eau au mélange de réaction, on filtre le précipité, on lave à l'eau puis on lave avec un mélange d'éthanol et d'éther et on obtient le produit l 47 l. Production: 12,87 g P.F: 141-171 C lal 28: -1,97 (c = 0,71, DMF) lD Analyse des amino-acides: Asp 3,72 ( 4), Ser 2,76 ( 3), Glu 5,58 ( 5), Gly 0,69 ( 1), Val 2,86 ( 3), Ile 1,1-1 ( 1) , Leu 5 ( 5), Phe 1,C 4 ( 1), Lys 2,87 ( 3), His 2,19 ( 3), Arg 2,06 ( 2), Trp 0,65 ( 1), Nle 1,96 ( 2). 48) lNle 8, 1 ile 18 l-h-PTH( 1-34)NH 2 On ajoute 3,5 ml d'anisole, 0,35 ml d'éthanedithiol, 10 3,5 ml de sulfure de diméthyle et 35 ml de Hi F anhydre au composé l 47 l ( 2,9 g) à O C et on agite pendant 60 minutes. On distille HF sous vide, on ajoute de l'éther au résidu, on recueille le précipité et on dissout dans l'acide acétique au dixième On fait passer la solution par une colonne ( 3,5 x 12 cm) de Dowex X 1 du type acétate, on recueille les fractions positives à la ninhydrine et on lyophilise pour obtenir 1,87 g de produit brut On dissout dans 50 ml d'acide acétique au dixième et on charge sur une colonne ( 2 x 33 cm) de CM- cellulose, puis an élue 20 avec un gradient linéaire d'acétate d'ammonium 0,05 M (p H 5,1, 1 litre) à l'acétate d'ammonium 0,4 M (p H 6,0, 1 litre) On fractionne chaque fraction de 9,0 ml et on recueille et on lyophilise les fractions no 74 à 84 pré sentant environ Rf 8 = 0,28 On dissout la poudre lyophi25 lisée dans un peu d'acide chlorhydrique au dixième et on charge sur une colonne ( 3 x 115 cm) de Sephadex G-25 et on élue avec l'acide acétique au dixième On recueille les fractions possédant un pouvoir absorbant à 280 nm dans un pic majeur et on lyophilise pour obtenir le composé du titre. Production: 140 mg ccm: Rf 8 = 0,28 Analyse des amino-acides (hydrolysés par HC 1 hexanormal contenant 3 % d'acide thioglycolique): Asp 3,98 ( 4), Ser 2,10 ( 3), Glu 4,93 ( 5), Gly 0,97 ( 1), Val 2,66 ( 3), Ile 0,87 ( 1), Leu 5,00 ( 5), Phe 1,01 ( 1), 10 Lys 3,26 ( 3), Xis 2,30 ( 3), Arg 2,03 ( 2), Trp 0,62 ( 1), Nle 2,22 ( 2). CLHP: colonne; Nucléosile 5 C 18 ( 4 mm DI x 150 mm) tampon: O,1 % d'acide acétique-acétonitrile contenant du phosphate 0,1 M (rapport de l'acétonitrile: 5 premières 15 minutes 20 %, 20 minutes suivantes 20 à 40 %/, gradient linéaire) débit: 1 ml/min détection: 225 nm résultat: pic unique à 18,96 min. REVENDICATIONS 1 Peptide, caractérisé en ce qu'il répond à la formule: H-Ser-Val-Ser-GluIle-Gln-Leu-Nle-His-Asn-Leu-Gly-LysHis-Leu-Asn-Ser-Nle-Glu-Arg-Val-GluTrp-Leu-Arg-Lys-Lys5 Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-A-NH 2, dans laquelle A représente Tyr ou Phe, ou un sel de celui-ci. 2 Composé lNle 8, Nle 18, Tyr 34 l-h-PTH( 1-34)NH 2, caractérisé en ce qu'il est marqué à l'iode-125.