FR 2559781 A1 19850823 FR 8412097 A 19840730 - 1 - Nouveau vecteur plasmidique hybride de E. coli conférant le pouvoir de faire fermenter le saccharose, et son pro- cédé de préparation On sait que les souches d'Escherichia coli K12 re- présentent l'un des micro-organismes préférés pour effec- tuer des expériences de génie génétique. La technologie de l'ADN recombinant a été mise au point industriellement pour fabriquer des substances industriellement intéres- santes en utilisant le système hôte-vecteur de l'Escheri- chia coli K12, principalement pour deux raisons, d'une part la génétique de ces micro-organismes est la plus con- nue actuellement, et d'autre part, les règles directrices de 1l'ADN recombinant provenant de plusieurs pays insiste sur l'utilisation de cette souche pour effectuer des expé- riences de recombinant. Mais ces souches n'ont pas le pou- voir de faire fermenter le saccharose que possèdent d'au- tres micro-organismes utilisés industriellement tels que Bacillus, Corynebacterium, Actinomyces, et les levures. Par conséquent, les souches d'Escherichia coli K12 ne peu- vent pas se développer efficacement en utilisant des ma- tières premières, telles que les mélasses, contenant du saccharose comme source de carbone principale. Donc, il devient souhaitable d'obtenir un vecteur plasmidique de E. coli qui pourrait être utilisé afin de conférer à ces bactéries la propriété de faire fermenter le saccharose en même temps qu'il pourrait être utilisé pour transporter une information génétique industriellement profitable. Ce vecteur plasmidique devra présenter un autre avantage par rapport à d'autres vecteurs classiques, dû au fait que le phénotype de la fermentation du saccharose peut contribuer à assurer la stabilité d'une culture de micro-organismes contenant ce vecteur quand un milieu de culture est utilisé avec le saccharose comme source de carbone. Dans un tel milieu, seules les cellules portant le plasmide se développeront étant donné qu'elles possè- dent seules l'aptitude à faire fermenter le saccharose. -2- Si les cellules perdent leur plasmide contenant les gênes utiles du point de vue industriel, elles perdent également leur pouvoir de faire fermenter le saccharose et seront in- capables de se développer. Ceci évite l'addition de gran- des quantités d'antibiotiques dans le milieu de culture pour assurer la stabilité du plasmide, addition qui, du point de vue économique est onéreuse. Par conséquent, un objet de la présente invention est l'élaboration d'un vecteur plasmidique qui fournisse un micro-organisme ayant des aptitudes utilisables dans l'industrie. Un autre objet est la fourniture d'une culture de micro-organisme dans laquelle les micro-organismes conte- nant un plasmide utile industriellement peuvent se déve- lopper tandis que ceux des micro-organismes qui ne contien- nent pas ce plasmide ne se développeront pas. L'auteur de la présente invention a réussi à élabo- rer génétiquement un micro-organisme du genre Escherichia en introduisant par transformation dans une souche de E. coli K12 un vecteur plasmidique contenant un fragment d'ADN qui confère aux cellules le pouvoir de faire fermen- ter le saccharose. Les micro-organismes nouvellement obte- nus peuvent se développer dans un milieu de culture conte- nant du saccharose comme seule source de carbone. Si le plasmide est éliminé des cellules, le micro-organisme ne peut pas utiliser le saccharose et ne se développera pas dans ce milieu. Par conséquent les souches de E. coli K12 portant ce vecteur plasmidique peuvent se développer ef- ficacement dans des matières premières telles que les mé- lasses, qui contiennent du saccharose comme source prin- cipale de carbone. Ces nouveaux vecteurs plasmidiques peuvent être utilisés pour incorporer d'autres gênes d'intérêt indus- triel. Dans ce cas, le pouvoir à faire fermenter le sac- charose conféré par le vecteur plasmidique peut être uti- lisable non seulement pour permettre la croissance du mi- -3- cro-organisme dans les milieux contenant du saccharose, mais également pour augmenter la stabilité du plasmide quand la fermentation est effectuée dans ces milieux même sans ajouter d'antibiotiques à la culture. En outre, si la présence d'autres micro-organismes doit être supprimée, on peut ajouter au milieu un antibiotique vis-à-vis du- quel le vecteur plasmidique pourrait conférer la résis- tance, augmentant par cette variante la stabilité du plas- mide. Par conséquent, les micro-organismes et le procédé par lequel cette bactérie transformée est obtenue, ont une grande utilité dans les procédés industriels de fer- mentation. Le micro-organisme utilisé dans la présente inven- tion est la souche bien connue d'Escherichia coli K12 DH1 décrite dans (Molecular cloning, Cold Spring Harbor (1982)) qui est une des souches préférées de E. coli K12 pour ré- aliser les effets de clonage à cause de ses bonnes pro- priétés de transformation. Mais d'autres souches de E. coli peuvent être utilisées avec de bons résultats. Pour obtenir les gênes faisant fermenter le saccha- rose, (saccharose operon), l'ADN de la souche de E. coli AB1281 (scr53) est utilisé. Cette souche fournie généreu- sement par le Dr. W.A. Wohlhieter, porte le plasmide de conjugaison scr53 (53 Mdal) qu'on a trouvé conférant à une souche de Salmonella cliniquement isolée la propriétés in- habituelle de faire fermenter le saccharose (J. Bacteriol 122, 401 (1975)). Le plasmide scr53 qui contient le sac- charose operon peut être utilisé pour transférer à d'au- tres souches de Salmonella ou d'Escherichia coli le pou- voir de faire fermenter le saccharose, par conjugaison ou transduction (J. Bacteriol. 122, 401 (1975), mais il ne peut pas être utilisé comme vecteur plasmidique de clonage pour les essais génétiques. Donc, le saccharose operon con- tenu dans le plasmide scr53 est sous-cloné dans les vec- teurs plasmidiques appropriés pour permettre de nouvelles manipulations génétiques de cet operon. -4- Après extraction de l'ADN du plasmide scr53 par un procédé classique, l'ADN est traité avec une endonucléase de restriction. Comme vecteur d'ADN, on peut utiliser tout plasmide ou phage qui peut se propager dans les cellules mi- crobiennes de l'Escherichia. Après la digestion du vecteur d'ADN avec une endonucléase de restriction, il est inutile d'utiliser un procédé particulier pour insérer le fragment d'ADN scr53 dans le vecteur; toute technique classique utilisée dans la préparation de l'ADN recombinant peut être utilisée. Le plasmide hybride ainsi obtenu peut être incor- poré dans un micro-organisme du genre Escherichia par les techniques classiques de transformation, bien que le rende- ment puisse être différent selon ces techniques. Les transformants sont choisis facilement puisque ces colonies peuvent se développer dans un milieu contenant du saccharose comme seule source de carbone et possèdent des marqueurs dans le vecteur utilisé telles que les résis- tances aux antibiotiques. Quand le plasmide dans un transformant ainsi obtenu porte une information génétique utile pour un procédé de fer- mentation en même temps que les gênes faisant fermenter le saccharose, les transformants peuvent se développer parfai- tement dans les milieux contenant du saccharose, tels que les mélasses, contribuant au maintien de la stabilité du plasmide par le saccharose operon. Le saccharose operon ainsi cloné peut être sous- cloné dans d'autres vecteurs plasmidiques ayant une gamme d'hôte étendue, tels que le plasmide RSF1010, qui, par transformation, peut être utilisé, pour conférer à d'autres bactéries gram-négatives le pouvoir de faire fermenter le saccharose. La présente invention est illustrée par les exemples descriptifs et non limitatifs ci-après. EXEMPLE A.- Préparation de l'ADN du plasmide scr53 possédant l'in- formation génétique responsable du caractère faisant fermen- -5- ter le saccharose. L'Escherichia coli AB1 281 (scr53) portant le plas- mide de conjugaison scr53; exconjugant de la souche E. coli AB1281 (CGSC 1281), a été largement fournie par le Dr. J.A. Wohlhieter (J. Bacteriol. 122, 401 (1975)). Cette souche est cultivée à 37 C pendant 16 heures tout en secouant dans 500 ml de milieu L contenant 1 % de peptone, 0,5 % d'extrait de levure, 0,5 % de NaCl et 0,1 % de saccharose, réglé à pH 7,2. Les cellules bactériennes sont recueillies et l'ADN du plasmide est extrait selon le mode opératoire de Hansen et Olsen (J. Bacteriol. 135, 227 (1978)). Le plasmide scr53 est encore purifié par centrifugation isopycnique dans le CsCl en présence de bromure d'éthidium. On obtient 10 ig d'ADN pure. B.- Préparation du vecteur d'ADN. L'ADN du plasmide pBR325, un vecteur contenant des gênes résistant à 1' ampicilline, à la tétracycline et au chloramphénicol comme marqueurs (Gene 4, 121 (1978)) est préparé de la façon suivante: des cellules d'Escherichia coli K12 DH1 contenant le plasmide pBR325 sont mises en incubation à 370C dans 500 ml de bouillon L (peptone 1%, extrait de levure 0,5 %, NaCi 0,5 %, réglé à pH 7,2), con- tenant 100 mg/ml d'ampicilline. Les cultures à la phase ex- ponentielle sont développées avec 300 pg/ml de spectinomy- cine. Après 16 heures d'incubation, les cellules sont récol- tées et soumises à une lyse par traitement avec la lysozyme et SDS (Biochim. Biophys. Acat 299, 516 (1973)). Après pu- rification par centrifugation, par gradient de densité à l'équilibre de CsCl-bromure d'éthidium, on obtient 500 ug d'ADN du plasmide. C.- Insertion du fragment d'ADN du plasmide scr53 dans le vecteur d'ADN. Un microgramme de l'ADN du plasmide scr53 et deux microgramme du vecteur d'ADN sont traités chacun avec l'en- donucléase de restriction Pstl, à 37 C, pendant une heure pour cliver les chaines d'ADN, puis chauffés à 65 C pendant - 6 - minutes. Les solutions d'ADN du plasmide scr53 et de vecteur d'ADN, digérées, sont mélangées et soumises à la réaction de fixation des fragments d'ADN par le système ligase d'ADN- phage T4 en présence de TPA, (triphosphate d'adénosine), MgCl2 et dithiothréitol, à 14 C, pendant 24 heures. L'ADN recombinant est récupéré par précipitation par l'éthanol. D.- Transformation génétique avec le plasmide hybride con- tenant l'information génétique responsable du caractère faisant fermenter le saccharose. Les cellules appropriées d'Escherichia coli DHI sont préparées par la méthode RbCl décrite par Hanahan (J. Mol. Biol. 166, 557 (1983)). L'ADN obtenu dans le sta- de (C) contenant les plasmides hybrides est ajouté à la suspension de cellules appropriées. La suspension est main- tenue dans la glace pendant 20 minutes, chauffée à 37 C pendant 2 minutes, et laissée de nouveau au repos dans la glace pendant 60 secondes. Les cellules, contenant alors l'ADN, sont introdui- tes dans le bouillon L et le milieu est secoué à 37 C pen- dant 1 heure, temps au bout duquel la réaction de transfor- mation est terminée. Les cellules sont recueillies et la- vées avec une solution saline (NaCi 8,5 g/l); et appliquées sur un milieu d'agar-agar en plaque (K2HPO4 9 g, KH2PO4 4,5 g, (NH4)2S04 2 g, MgSo47H20 0,1 g, FeSO47H20 0,01 g, chlorhydrate de thiamine 1 mg, saccharose 5 g, agar-agar g par litre et tétracycline 12,5 pg/ml). Les plaques sont mises en incubation à 37 C. Après 2 jours d'incubation, on compte 8000 colonies sur les plaques. On prélève 100 co- lonies, on les purifie et on les isole. Chaque transformant ainsi obtenu est séléctionné pour son pouvoir defaire fermenter le saccharose (phéno- type scr+) en utilisant un milieu contenant 10 g de peptone, g de NaCl, 10 g de saccharose, 0,02 g de pourpre de bro- mocrésol et 15 g d'agar- agar par litre. Les transformants faisant fermenter le saccharose apparaissent dans ce milieu -7- sous forme de colonies jaunes. Les transformants sont éga- lement classés par leur résistance à la tétracycline et au chloramphénicol et leur sensibilité à l'ampicilline. Les plasmides des -cellules présentant le phénotype approprié (scr+, CmR, TcR, ApS) sont analysées par un pro- cédé de minipréparation (clonage moléculaire). Cold Spring Harbor Laboratory (1982)). Les plasmides hybrides sont di- gérés par l'endonucléase PstI et un clone portant un plas- mide avec de l'endonucléase PastI insérée de 4,85 Kb est sélectionné. Le plasmide hybride pBR325 contenant ladite enzyme insérée est désigné par pSPI ayant une taille de ,8 Kb. E.- Préparation du plasmide pSPI Les cellules faisant fermenter le saccharose (pSPI) (AM512) d'Escherichia coli DH1 portant le plasmide pSPI sont utilisées pour extraire l'ADN du plasmide pSPI par le même procédé que celui décrit dans le stade (B). Escherichia coli DH1 (pSPI) a été déposé sous le numéro d'admission 11940 à NCIB (National Collection of Industrial and Marine Bacteria,Aberdeen, Scotland, United Kingdom). F.- Sites de clivage pour diverses endonucléases de restric- tion du plasmide pSPI. Dans ce stade, 0,5 pg d'ADN du plasmide pSPI prépa- ré ci-dessus est mis à digéreravec les endonucléases de restriction telles que: EcoRI Escherichia coli HindIIlI Haemophillus influenzae PstI Providencia stuartii SalI Streptomyces albus BamHI Bacillus amyloliquefaciens XbaI Xanthomonas badrii PvulI Proteus vulgaris ClaI Caryophanum latum XhoI Xanthomonas holicola HincII Haemophilus influenzae SphI Streptomyces phaechromogenes SmaI Xanthomonas malvacearum BgIII Bacillus globigii Les endonuclêases de restriction proviennent de - 8 Biolab New England Inc. and Boehringer Mannheim GmbH, et sont utilisées dans des conditions appropriées pour chaque enzyme. Des fragments d'ADN résultants sont analysés par électrophorèse horizontale de gel d'agarose à 0,7 %. Le poids moléculaire de chaque fragment est déterminé d'après la mobilité électrophorétique. Le poids moléculaire est déterminé en se basant sur une courbe étalon établie en fonction de la mobilité électrophorétique de fragments d'ADN de poids moléculaire connu, provenant de la digestion de HindIII des ADN des phages A et 029. Les résultats sont rassemblés dans le tableau 1. Le diagramme de restriction du plasmide pSPI est établi par des digestions simples et doubles de l'ADN du plasmide avec les endonucléases de restriction, en analysant les fragments d'ADN par électrophorèse de gel d'agarose. Le diagramme d'endonucléase de restriction connu du plasmide pBR325 (Gène 14, 289 (1981)) est également utilisé pour dé- terminer le diagramme de restriction de pSPI qui est indi- qué sur la figure unique. G.- Analyse de l'enzyme clivant le saccharose. L'activité du saccharose est déterminée par un pro- cédé basé sur l'apparition de sucres réducteurs après scis- sion du saccharose de la façon suivante: des cellules de E. coli DH1 contenant le plasmide pBR325 ou le nouveau vec- teur hybride plasmidique pSPI, sont développés dans le bouillon L et dans le bouillon L contenant 10 mM de saccha- rose. Les cellules sont récoltées et les granulés bacté- riens sont lavés avec un tampon phosphate de potassium mM, pH 6,5, contenant 200 mM de KCl, 1 mM de 2-mercap- toéthanol. Après lavage, les cellules sont remises en sus- pension dans le même tampon et soumises aux ultrasons. La suspension ayant subi les ultrasons est centrifugée à 000 x g pendant 20 minutes à 4 C. Le liquide surnageant est extrait et est utilisé sans subir d'autres traitements. Un mélange constitué par 0,5 ml de la préparation d'enzyme et 2,5 ml de saccharose IM est mis en incubation pendant - 9 - minutes à 37 C. La réaction est arrêtée en ajoutant 1 ml de réactif dinitrosalicylique (Procédés dans Enzymol. 1, 149 (1955)). Des échantillons sont placés dans un bain d'eau bouillante pendant 5 minutes, refroidis dans la gla- ce et dilués avec 20 ml d'eau distillée. Les densités opti- ques des échantillons sont déterminées à 540 nm. Des solu- tions étalons de glucose sont utilisées comme témoins. La concentration en protéines est déterminée par un procédé classique. Comme montré dans le tableau 2, on voit que l'acti- vité de la saccharase se révèle dans les cellules contenant le pSPI de E. coli DH1. Tableau 1 Enzyme endonucléase Nbmbre de sites de clivage de restriction du plasmide pSPI BgIII XbaI 0 XhoI 0 SmaI 1 HindIII 1 ClaI 2 BamHI 2 EcoRI 2 SaII 2 PstI 2 SphI 2 HincII 5 PvuII 5 Tableau 2 Dévloeme- Activité de la sac- Développementcare dans le mi- cre lieu salin Phénotype teur/30 min.rduc minimal faisant eur/30 min. M53 + thia- fermenter mg de protéine mine + 0, 5 % le sac- ouionL+ Souche Plasmide saccharose charose Bouillon 10 mM de L saccharose E. coli DH1 pBR325 - scr ' 0,0 0,0 E-.-coli DH1 pSP1 + scr+ 1,4 1,4 - 10 - REFERENCES CITEES Maniatis T. et ai. Molecular cloning, a laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982). Wohlhieter, J.A. et al., J. Bacteriol. 122, 401-406 (1975). Bolivar F., Gene 4, 121-136 (1978). Godson, G.N. and Vapnek, D., Biochim. Biophys. Acta 299, 516-520 (1973). Hanahan D., J. Mol. Biol.166, 557-567 ( 1983). Bernfeld P., Methods in Enzymol. 1, 149-158 (1955). Hansen, J.B. and Olsen, R.H., J.Bacteriol. 135, 227-238 (1978). Prentki, P. et ai., Gene 14, 289-299 (1981). - 11 - REVENDICATIONS 1.- Escherichia coli DH1 (pSP1) ayant le numéro d'ad- mission de dépôt NCIB 11940. 2.- Vecteur plasmidique hybride (pSPI) caractérisé par le fait que: a) c'est un plasmide hybride qui a la séquence com- plète de nucléotide du plasmide pBR325 et une insertion étrangère d'ADN sur le site PstI de pBR325, b) ce plasmide a un poids moléculaire d'environ ,8 Kb et les sites de clivage suivants pour les endonu- cléases de restriction: Enzyme de restriction Nombre de sites de clivage BglII 0 XbaI 0 XhoI O SmaI 1 HindIII 1 ClaI 2 BamHl 2 EcoRI 2 SalI 2 PstI 2 SphI 2 HincII 5 PvuII 5 c) ladite insertion d'ADN est le fragment 4,85 Kb de plasmide pSP1 montré sur le dessin. 3.- Vecteurs plasmidiques appropriés pour la transformation du plasmide pSP1 contenant les séquences de nucléotide de ladite insertion d'ADN.