FR 2551455 A1 19850308 FR 8413514 A 19840831 La présente invention concerne l'encapsulation d'une matière centrale ou de noyau au sein d'une membrane semi-perméable Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé pour encapsuler au sein d'une microcapsule une 5 matière centrale sensible au p H, à la température ou à la force ionique, ce qui comprend des cellules viables Le procédé d'encapsulation ici décrit permet la formation d'une membrane semi-perméable sans endommager la matière centrale. L'invention concerne aussi une capsule comportant une couche interne polymère aminée liée ioniquement à une couche externe polymère anionique. Orn a déjà développé un certain nombre de procédés pour encapsuler une matière centralemais la plupart de ces procédés antérieurs ne peuvent servir pour une matière sen15 sible au p H, à la température ou à la force ionique, comme des cellules viables, en raison des dures conditions nécessaires pour une encapsulation Le brevet US-A-4 352 883 décrit ce que l'on pense être le premier procédé permettant d'encapsuler avec succhs du tissu viable ou des cellules au sein d'une membrane semi-perméable Dans le procédé ainsi breveté, on forme une capsule temporaire d'une matière gélifiable, de préférence une gomme anionique comme de l'alginate de sodium, autour du tissu ou des cellules, et l'on forme une membrane semiperméable permanente en réticulant des couches 2 C superficielles de la capsule temporaire Plus particulièrement, on soumet un mélange de la gomme et de la matière centrale à l'action d'une solution à rôle de gélification, de préférence une solution contenant l'ion calcium, pour produire une capsule temporaire On fait réagir la capsule 30 temporaire résultante avec une solution d'une matière polycationique pour former une membrane permanente On peut reliquéfier l'intérieur de la capsule en rétablissant les conditions dans lesquelles la gomme anionique est liquide, par exemple en modifiant l'environnement ionique en pla35 çgant les capsules dans une solution saline tamponnée par des phosphates La reliquéfaction de l'intérieur de la capsule facilite le transport des substances nutritives à travers la membrane, ce qui favorise la croissance des cel- lules Le procédé n'est pas obligé d'endommager la matière centrale ou de nuire à la viabilité des cellulescar les gammes de température, de force ionique et de p H que l'on utilise dans le procédé d'encapsulation n'ont pas besoin d'être dures. Un objet de la présente invention consiste donc à fournir un procédé pour encapsuler des cellules viables, ou une autre matière fragile, dans des membranes semiperméables Un autre objet consiste à fournir un procédé pour encapsuler des matières centrales qui sont difficiles à encapsuler à l'aide des modes opératoires connus, en raison de leur sensibilité au p H, à la force ionique, à la charge ou à la température Un autre objet de l'invention consiste à fournir une capsule perfectionnée comprenant une membrane semi-perméable Ces objets, buts et caractéristiques de l'invention ressortiront de la description détaillée suivante, faite à titre illustratif et nullement limitatif de l'invention. Dans un aspect, l'invention a la forme d'un procédé pour encapsuler, au sein d'une membrane semi-perméable, une matière centrale ou de noyau comme des enzymes, des anticorps, des hormones, ou des cellules viables, par exemple une culture de tissus ou des cellules génétiquement modifiées. On met la matière centrale en suspension dans un milieu liquide dans lequel est dissous un polysaccharide contenant des groupes cationiques, de préférence un polysaccharide aminé comme de la poly-D-glucosamine (chitosane) On gélifie une gouttelette de la suspension en soumettant la gouttelette à l'action d'une solution d'un anion divalent ou multivalent, yo par exemple un ou des sels de type P 04; HP 04 ou SO 4 On forme une membrane permanente en réticulant les couches superficielles de la matrice temporaire à l'aide d'un polymère contenant des groupes anioniques, de préférence des groupes carboxyles capables de réagir avec les groupes cationiques de la matrice De l'acide poly-L-glutamique et de l'acide poly-L-aspartique, sous forme d'acides libres ou de sels, constituent des polymères anioniques préférés On peut resolubiliser l'intérieur de la capsule en soumettant cette capsule à l'action d'une solution de polycations à bas poids moléculaire, par exemple de la spermadine, de la spermine ou de l'urée Une reliquéfaction de l'intérieur favorise un transport de masse entre le fluide extracapsulaire et le volume intracapsulaire. Dans un autre aspect, l'invention a la forme d'un procédé pour encapsulerune cellule viable au sein d'une membrane semi-perméable On met la cellule en suspension dans un milieu aqueux compatible avec sa viabilité et contenant un glucopolysaccharide aminé On soumet une 10 gouttelette de la suspension à l'action d'une solution gélifiante, ce qui forme une matrice temporaire conservant sa forme et qui est insoluble dans l'eau La solution gélifiante est une solution aqueuse d'un anion divalent ou multivalent, par exemple un ou des sels du type phosphate, 15 monohydrogénophosphate ou sulfate On réticule de façon permanente les couches superficielles de la matrice temporaire en soumettant la capsule à l'action d'un polymère contenant plusieurs groupes carboxyles, par exemple de l'acide polyglutamique ou de l'acide polyaspartique On reliquéfie, dans une réaction ne faisant essentiellement pas appel à un agent de précipitation, l'intérieur de la capsule en soumettant la capsule à 'action d'une solution d'un polycation à bas poids moléculaire, par exemple la spermadine, la spermine ou l'urée Il se produit une re25 liquéfaction par enlèvement, du gel intérieur, d'anions multivalents On peut encapsuler par ce procédé des cellules de tissus de mammifères dans un milieu de croissance de tissus, et des cellules eucaryotes ou procaryotes, génétiquement modifiées, dans un milieu de croissance Le mode opératoire d'encapsulation est doux, de sorte que la cellule encapsulée, n'est pas endommagée et peut subir des processus métaboliques normaux, y compris une croissance et une reproduction au sein de la capsule. Dans un autre aspect, l'invention concerne une capsule ayant une membrane délimitant un volume intracapsulaire enfermé La membrane comporte une couche interne d'un polymère polyaminé, de préférence un polysaccharide aminé, encore mieux un glucopolysaccharide aminé, couche ioniquement réticulée sur une couche externe d'un polymère polyanionique, de préférence un polymère polycarboxylé comme de l'acide polyglutamique ou de l'acide polyaspartique, pour former une capsule permanente insoluble dans l'eau. On peut disposer au sein du volume intracellulaire une cellule, de préférence une cellule eucaryote, bactérienne ou génétiquement modifiée Si l'on dispose une cellule au sein du volume intracellulaire, il convient que les polymères polyanionique et polyaminé soient physiologiquement compati10 bles avec la cellule. Voici une description plus détaillée, fournie à titre illustratif et nullement limitatif, d'un mode (préféré) de mise en oeuvre de l'invention. La présente invention fournit donc un procédé 15 pour encapsuler, au sein d'une membrane semi-perméable, des matières centrales ou de noyau, comme des cellules eucaryotes ou procaryotes fiables, naturelles ou génétiquement modifiées, ou bien une culture de tissus de telles cellules. L'invention propose également un nouveau type de capsules 20 à plusieurs couches. On forme un gel ou une matrice temporaire autour de-la matière centrale ou de la cellule viable, en faisant réagir un polysaccharide ou un glucopolysaccharide, contenant des groupes cationiques, avec un anion multivaient. 25 On réticule ioniquement les couches superficielles de la matrice temporaire résultante, à l'aide d'un polymère contenant des groupes anioniques, de préférence carboxyles, en formant une membrane permanente encapsulant la matière centrale On peut reliquéfier l'intérieur de la capsule 30 en soumettant la capsule à l'action d'une solution de polycations à bas poids moléculaire. On met de la matière centrale, par exemple des enzymes, des hormones, des anticorps ou bien des cellules viables, en suspension dans un milieu aqueux contenant un polymère gélifiable contenant-des groupes cationiques. Le polymère gélifiable préféré est un glucopolysaccharide aminé, encore mieux du chitosane (poly-D-glucosamine) Le chitosane est formé par hydrolyse acide de la chitine l 551455 (poly-D-N-acétylglucosamine), qui est la matière de formation primaire des exosquelettes des invertébrés Le chitosane est un polymère aminé b longue chaîne qui est physiologiquement compatible avec la plupart des cellules. Il n'est que légèrement soluble dans l'eau, mais peut se dissoudre facilement dans de l'acide acétique dilué. On prépare des solutions de réserve de chitosane en dissolvant le chitosane dans de l'acide acétique 0,5 molaire On enlève de la solution l'acide acétique 10 par dialyse répétée contre une solution saline tamponnée par du phosphate Le chitosane ne précipite pas de cette solution si celle-ci est maintenue au-dessous de 37 C. La solution de réserve préférée, à 1,4 % de chitosane dans une solution saline tamponnée par du phosphate, a été conservée avec succès à 40 C pendant des périodes prolongées. On mélange le chitosane, préparé comme décrit ci-dessus, avec la matière à encapsuler, en formant une solution ou une suspension, avant de donner à celle-ci la 20 forme de gouttelettes ou d'autres formes Si des solutions ayant une concentration finale en chitosane de 0,4 %O (poids/volume) vont se gélifier, on obtient une gélification optimale avec du chitosane à 0,8 à l,2 'O (en poids/ volume) dans une solution isotonique 125 m M en Na 2 HPO 4. On peut former, à l'aide de n'importe quel appareil classique de formation de gouttelettes, des gouttelettes de la suspension de chitosane/matière centrale Un tel appareil de formation de gouttelettes est décrit ci-après. On munit un tube, contenant la suspension, 30 d'un bouchon maintenant un appareil de formation de gouttelettes L'appareil ou dispositif consiste en une enveloppe ayant une buse supérieure d'admission d'air et un corps creux allongé introduit avec frottement dans le bouchon On monte au sommet de l'enveloppe une seringue de 10 cm 3, équipée d'une pompe doseuse et comportant une aiguille, par exemple une aiguille de 0,254 mm de diamètre intérieur, revêtue de "Teflon", traversant sur toute sa longueur l'enveloppe L'intérieur de l'enveloppe est conçu de manière que l'extrémité de l'aiguille soit soumise à un courant d'air laminaire constant jouant le rôle de lame d'air En service, on fait fonctionner la pompe doseuse ou à gradins, de manière à refouler par incréments 5 des gouttelettes de solution de l'extrémité de l'aiguille. Chaque goutte est "découpée" par le courant d'air et elle tombe d'environ 2,5 cm dans la solution gélifiante, de préférence, une solution d'hydrogénophosphate disodique, dans laquelle elle se gélifie immédiatement par réaction l O avec les ions négatifs La distance entre l'extrémité de l'aiguille et la surface de la solution gélifiante est de préférence assez grande pour permettre à la suspension de chitosane/matière centrale de prendre la forme physiquement la plus favorable: une sphère (volume maximal pour une 15 aire de surface minimale) De l'air provenant du tube pénètre par un orifice dans le bouchon Ce mode opératoire aboutit à une "réticulation" du gel et à la formation d'une matrice temporaire protectrice à haute viscosité, conservant sa forme et contenant la matière centrale en suspension et son milieu Les matrices temporaires se rassemblent dans la solution sous forme d'une phase séparée, et elles peuvent être séparées par aspiration. La solution gélifiante préférée, contenant de l'anion multivalent, est une solution de Na 2 HPO 4 125 m M; cependant, des solutions de phosphate de sodium monobasique et de sulfate de sodium produisent également des matrices temporaires acceptables Le citrate de sodium peut gélifier la suspension, mais l'on obtient les meilleurs résultats avec des solutions de phosphate et de sulfate mono30 basique ou dibasique Si la concentration de l'anion est trop basse (par exemple inférieure à environ 100 m M), une gélification risque de ne pas se produire. On collecte les matrices temporaires, formées par ce processus, et on les lave pour en enlever l'excès 35 de solution gélifiante On soumet ensuite les matrices à l'action d'une solution de revêtement ou de réticulation contenant un polymère polyanionique, de préférence polycarboxylé Une solution préférée pour la réticulation est :551455 une solution à 1 % d'acide poly-L-aspartique ou d'acide poly-L-glutamique, diluée à 1:15 par une solution de chlorure de sodium 150 m M, ce qui donne une concentration -4 finale en polymère de 6,6 x 10 g/100 mi Le poids molé5 culaire de l'acide poly-L-aspartique ou de l'acide poly- Lglutamique peut se situer entre 3000 et 100 000 daltons ou être encore plus élevé, mais l'on préfère la gamme de 000 à 60 000 daltons Un temps de réaction de 3 à 6 minutes à la température ambiante s'est avéré satisfaisant. Les exemples non limitatifs suivants montrent des modes opératoires présentés comme exemples pour la mise en pratique de l'invention. Exemple 1 On utilise dans la présente expérience une solu15 tion de réserve contenant 1,4 % de chitosane (CSN; Sigma Chemical Co) dans une solution saline isotonique tampon contenant du phosphate à 14-17 m M(en poids/volume), préparée comme décrit antérieurement On soumet différentes concentrations de CSN à des essais pour déterminer la concentra20 tion optimale en CSN pour une formation de matrices temporaires Dans chaque cas, on forme des échantillons de 1 ml à partir de la solution de réserve de CSN et de sérum de foetus de veau (SFV-Flow Laboratories) On produit des gouttelettes que l'on introduit dans des solutions, comme 25 décrit ci-après, en utilisant un dispositif ou appareil de formation de gouttelettes, tel qu'antérieurement décrit. Le tableau ci-après illustre trois concentrations différentes en CSN (poids/volume) essayées dans cette expérience, à savoir 0,6 %, 0,8 % et 1 %. TABLEAU Echantillon CSN, ml SFV, ml Concentration de CSN NO (poids/volume) 1 0,57 0,43 0,8 % 2 0,42 0,58 0,6 % 3 0,72 0,28 1,0 % On prépare deux tampons gélifiants, du citrate de sodium 110 m M (Sigma) et de l'hydrogénophosphate disodique 125 m M (Sigma) Dans tous les cas, les matrices tempo- raires fo Imées à l'aide de ces solutions tamponnées sont acceptables, mais le tampon de citrate de sodium donne une gélification inadéquate de l'échantillon n 1 Si tous les échantillons donnent des matrices temporaires acceptables dans le tampon d'hydrogénophophate disodique, l'échantillon n 3 donne la meilleure gélification. On dilue à 1:15 une solution à 1 % d'acide polyL-aspartique (poids moléculaire: 40 000 daltons; Sigma) avec du chlorure de sodium 150 m M (Sigma) pour former une 10 solution contenant 6,6 x 10-4 g pour 100 ml de solution. On enlève du tampon gélifiant les matrices temporaires formées à partir de l'échantillon n 3, on les lave de façon répétée avec une solution isotonique saline tamponnée par du phosphate, et on les remet en suspension dans la solution 15 d'acide poly-L-aspartique Après 6 minutes à la température ambiante dans la solution d'acide poly-L-aspartique, la réaction de réticulation est complète et a formé les membranes permanentes Les capsules obtenues sont sensiblement sphériques et ont un diamètre d'environ 380 à 480 mic ro20 mètres Certaines capsules ont de petites queues Les capsules formées ainsi ne sont pas collantes et n'ont pas de tendance à s'agglomérer On détermine empiriquement la porosité des capsules, et l'on constate qu'elle correspond à des molécules ayant un poids moléculaire d'environ 80 000 daltons Cet exemple illustre la possibilité de former, par la mise en oeuvre du procédé de la présente invention, des capsules acceptables. Exemple 2 On conduit le présent exemple pour montrer que le procédé d'encapsulation ne nuit pas à la viabilité des cellules La culture de cellules utilisée dans cette expérience est la lignée de cellules érythroleucémiques de Friend (FEL 745), une lignée érythroleucémique de souris qui se développe rapidement dans une culture en suspension. 35 On centrifuge durant 5 minutes une culture de cellules FEL 745, et l'on remet en suspension le culot de centrifugation résultant dans du sérum de foetus de veau (Flow Labs) On prépare, comme antérieurement décrit, une solution de réserve contenant 1,4 % de chitosane et on la mélange à la solution de culture de cellules, ce qui donne une concentration finale en chitosane de 1 %O (en poids/ volume) et une concentration en cellules d'environ 5 x 106 cellules/ml On produit des matrices temporaires en refoulant le mélange de chitosane/cellules à travers un appareil de formation de gouttelettes (antérieurement décrit) et l'on met les microsphères liquides résultantes au contact de la solution, antérieurement décrite, à 125 m M d'ions phosphate (poids/volume) On lave de façon répétée les matrices tempo10 raires résultantes par une solution saline isotonique tamponnée par du phosphate et on les remet en suspension dans une solution contenant, pour 100 ml, 6,6 x 10 4 g d'acide poly-L-aspartique (poids moléculaire: 40 000 daltons) dans du chlorure de sodium 150 m M Après 6 minutes de séjour des 15 capsules à la température ambiante dans la solution d'acide poly-Laspartique, on lave les capsules résultantes deux fois avec le milieu de culture RPMI-1640 (Flow Labs) contenant 10 % de sérum de foetus de veau et des antibiotiques. On place les microcapsules dans des flacons pour culture 20 de tissus comportant le milieu de culture, et on fait incuber à 37 C dans une atmosphère comportant 5 %O de C 02. On retire à divers intervalles des échantillons de la culture des cellules Un examen au microscope montre que les cellules manifestent de la croissance et de la repro25 duction, ce qui illustre la viabilité des cellules après leur encapsulation Comme on peut le noter, il n'y a pas eu d'étape de reliquéfaction puisque les cellules de Friend peuvent croître dans une culture sur gel aussi bien que sous forme d'une culture en suspension Cependant, de nombreux 30 types de cellules nécessitent une culture fluide pour pouvoir se reproduire La viabilité des cellules n'est pas et ne doit pas être affectée par la resolubilisation de l'intérieur des capsules La capsule fournit un microenvironnement exempt de toute contamination externe. Il va de soi que, sans sortir du cadre de l'invention, de nombreuses modifications peuvent être apportées au procédé pour encapsuler une matière centrale, notamment des cellules viables, et aux capsules obtenues, décrits cidessus. REVENDICATIONS 1 Procédé pour encapsuler une matière centrale au sein d'une membrane semi-perméable, procédé caractérisé en ce qu'il comporte les étapes consistant à: A) mettre la matière centrale en suspension dans un milieu liquide contenant en dissolution un polysaccharide comprenant des groupes cationiques; B) mettre la suspension en forme de gouttelettes contenant ladite matière centrale; C) soumettre les gouttelettes à l'action d'une solution d'anions pour gélifier les gouttelettes sous forme d'une matrice temporaire séparée conservant sa forme, et D) réticuler les couches superficielles de cette matrice temporaire pour produire autour de la gouttelette une capsule, en soumettant la matrice temporaire à l'action d'un polymère contenant des groupes anioniques pouvant réagir avec lesdits groupes cationiques. 2 Procédé selon la revendication 1, caracté20 risé en ce que le polysaccharide contenant les groupes cationiques est un polysaccharide aminé. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le polysaccharide aminé est le chitosane. 4 Procédé selon la revendication 2, caracté25 risé en ce que les anions sont choisis parmi des anions phosphate, phosphate dibasique, sulfate et leurs mélanges. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on prépare la solution des anions en dissolvant le sel de cet anion dans une solution aqueuse. 6 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le polymère contenant des groupes anrioniques comprend des groupes carboxyles. 7 Procédé selon la revendication* 6, caractérisé en ce que le polymère comprenant des groupes carboxy35 les est choisi parmi de l'acide polyaspartique, de l'acide polyglutamique, leurs sels et leurs mélanges. 8 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape supplémentaire consistant à resolubiliser le gel au sein de la capsule. 9 Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on resolubilise le gel en soumettant la capsule à l'action d'une solution contenant un polycation à bas poids moléculaire. Procédé selon la revendication 9, earactérisé en ce que le polycation à bas poids moléculaire est choisi parmi les cations de la spermadine, de la spermine, de l'Urée, et Ieurs mélanges. 11 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la matière centrale est choisie parmi des enzymes, des anticorps, des hormones et des cellules viables. 12 Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que les cellules viables comprennent une culture 15 de tissu, ou leurs cellules individuellesjet ledit milieu aqueux comprend un milieu pour culture de tissus. 13 Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que les cellules viables sont ou comprennent des cellules génétiquement modifiées. 14 Procédé pour encapsuler une cellule viable au sein d'une membrane semiperméable, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: a) mettre la cellule en suspension dans un milieu aqueux compatible avec la viabilité de cette cellule, ce 25 milieu contenant un glucopolysaccharide aminé; b) donner à la suspension la forme d'une gouttelette contenant ladite cellule; c) soumettre la gouttelette à l'action d'une solution gélifiante, pour gélifier la gouttelette et former 30 une matrice temporaire conservant sa forme, insoluble dans l'eau, ladite solution gélifiante comprenant une solution aqueuse d'anions; et d) réticuler de façon permanente une couche superficielle de la matrice temporaire, pour produire autour 35 de cette gouttelette une membrane en soumettant la matrice temporaire à l'action d'un polymère contenant plusieurs groupes carboxyles. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape supplémentaire consistant z 551455 à reliquéfier l'intérieur de la membrane en soumettant le produit de l'étape (d) à l'action d'une solution d'un polycation à bas poids moléculaire qui enlève les anions du gel en une réaction s'effectuant sensiblement sans agent de précipitation. 16 Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la solution gélifiante est une solution aqueuse du sel d'un anion choisi parmi les anions phosphate, phosphate dibasique, sulfate et leurs mélanges. 17 Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que le polymère contenant plusieurs groupes carboxyles est choisi parmi de l'acide polyaspartique, de l'acide polyglutamique, leurs sels et leurs mélanges. 18 Procédé selon la revendication 17, caracté15 risé en ce que le polycation à bas poids moléculaire est choisi parmi les cations de spermadine, de spermine et leurs mélanges. 19 Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que la cellule viable comprend une cellule de tissu de mammifère, et le milieur aqueux comprend un milieu de culture et de croissance de tissus. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que la cellule viable comprend une cellule génétiquement modifiée, et le milieu aqueux comprend un milieu 25 de croissance de cellules. 21 Capsule comprenant une membrane délimitant un volume intracapsulaire enfermé, cette capsule étant caractérisée en ce que la membrane consiste essentiellement en une couche interne comprenant un polymère polyaminé et 30 une couche externe comprenant un polymère polyanionique, les polymères polyaminé et polyanionique étant réticulés par interaction ionique entre des groupes amines cationiquesdu polymère polyaminé et des groupes anioniques du polymère polyanionique pour former une capsule perméable et insoluble dans l'eau. 22 Capsule selon la revendication 21, caractérisée en ce que le polymère polyaminé est un polysaccharide aminé. 23 Capsule selon la revendication 22, caracté- risé en ce que le polymère polysaccharide aminé est un glucopolysaccharide polyaminé. 24 Capsule selon la revendication 21, caractérisée en ce que le polymère polyanionique comprend un polymère polycarboxylé. Capsule selon la revendication 24, caractérisée en ce que le polymère polyanionique est de l'acide polyaspartique ou un de ses sels. 26 Capsule selon la revendication 24, caracté10 risée en ce que le polymère polyanionique est de l'acide polyglutamique ou un de ses sels. 27 Capsule selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'elle comporte également une cellule disposée dans un milieu de culture pour cette cellule, au sein du 15 volume intracapsulaire. 28 Capsule selon la revendication 27, caractérisée en ce que le polymère polyaminé et le polymère polyanionique sont physiologiquement compatibles avec ladite cellule. 29 Capsule selon la revendication 27, caractérisée en ce que la cellule est ou comprend une cellule eucaryote. Capsule selon la revendication 27, caractérisée en ce que ladite cellule est ou comprend une cellule 25 génétiquement modifiée.