FR 2559157 A1 19850809 FR 8401816 A 19840207 1 25 5 9 1 57 La présente invention concerne l'héxapeptide de formule: Val-Glu-Pro-IlePro-Tyr (I) son procédé d'obtention et les compositions qui le contiennent. Dans la formule (I), Val représente la L-valine, Glu repré- sente l'acide L-glutamique, Pro représente la L-proline, Ile représente la L-isoleucine et Tyr représente la L-tyrosine. Dans le brevet européen 49 666 ont été décrites les substances désignées par MJH-24, MJH-63 et MJH-65 et leur préparation à partir de la caséine humaine délipidée traitée par la trypsine. Les substances MJH-24, MJH-63 et MJH-65 qui sont des substances purifiées présentent des propriétés remarquables: ce sont des agents immuno- logiques qui favorisent la production d'anticorps et qui accélèrent le phéno- mène de phagocytose. Il a maintenant été trouvé et c'est ce qui fait l'objet de la présente invention, que le fractionnement et la purification de la substance MJH63 dans des conditions déterminées permettent d'isoler l'hexapeptide de formule (I) qui possède à un degré plus élevé les propriétés immunologiques de la substance MJH-63. Pour obtenir l'hexapeptide de formule (I), il est nécessaire d'effectuer la succession des opérations suivantes: a) filtration sur une membrane d'ultra-filtration de préférence une membrane Diaflo-Amicon UM-05 pour enlever la plus grande partie du chlo- rure de sodium, chromatographie b) filtration sur une colonne de Sephadex G-15 puis/sur une colonne de Dowex 50-X-4 pour éliminer totalement le chlorure de sodium, et le Tris c) purification par chromatographie liquide à haute performance (HFIPLC). Chaque étape de filtration et de purification est effectuée dans des conditions déterminées et est suivie en mesurant l'absorption à 220 et 20S nm des fractions recueillies. La composition et la structure de l'hexapeptide de formule (I) sont déterminées: - par hydrolyse totale par l'acide chlorhydrique 6N à 1100C pendant 18 heures - par dansylation, pour déterminer la nature de l'aminoacide N-terminal - par dégradation automatique avec un séquenceur Beckmann, modèle 890 C. L'hexapeptide de formule (I) peut être synthétisé par voie chimique par application des méthodes habituelles utilisées en chimie pepti- dique. Par exemple, l'hexapeptide de formule (I) peut être préparé par application des méthodes d'allongement de chaîne par condensation d'amino- acides ou de peptides appropriés convenablement protégés suivie de l'élimina- tion des groupements protecteurs. Le dipeptide de formule: Z-Pro-Tyr-OMe (II) dans laquelle Z représente un groupement protecteur de la fonction amine, de préférence le groupement t. butyloxycarbonyle (Boc), après élimination du groupement protecteur Z, peut être condensé successivement avec l'isoleucine et la proline dont la fonction amine a été préalablement protégée pour donner le tétrapeptide de formule: H-Pro-Ile-Pro-Tyr-OMe (III) qui est lui-même condensé avec le dipeptide de formule: Z-Val-Glu(Z1)-OH (IV) dans laquelle Z est défini comme précédemment et Z1 représente un groupement protecteur de la fonction acide, de préférence le groupement t.butyloxy (0 But), pour donner l'hexapeptide de formule: Z-Val-Glu(Z1)-Pro-Ile-Pro-Tyr-OMe (V) dont les groupements protecteurs des fonctions acides peuvent être éliminés par saponification en présence de nargase issue de Bacillus Subtilis et dont le groupement protecteur de la fonction amine peut être éliminé, par exemple, au moyen d'acide trifluoroacétique dans un solvant organique tel que l'anisole, pour donner l'hexapeptide de formule (I). 2559 1 5 7 Le dipeptide de formule (II) peut être obtenu par condensation de Z-Pro sur Tyr-OMe. Le dipeptide de formule (IV) peut être obtenu par condensation de Z-Val sur Glu(Z1)-OH. La condensation des aminoacides ou des peptides dont les fonc- tions amines sont convenablement protégées peut être effectuée en présence d'un agent de condensation tel que le dicyclohexylcarbodiimide ou bien en utilisant un anhydride mixte de l'amino acide ou du peptide obtenu par exemple à partir d'un halogénoformiate d'alcoyle ou de N-hydroxysuccinimide (ONSu) . L'hexapeptide de formule (I) ainsi obtenu peut être purifié par chromatographie sur un support convenable. Il est particulièrement avanta- geux d'effectuer une chromatographie sur une colonne échangeuse d'ions. L'hexapeptidedeformule (I) obtenu par synthèse chimique présente les mêmes propriétés que le produit obtenu par purification du produit natu- rel. L'hexapeptide de formule (I) est un agent immunologique qui favorise la production d'anticorps et qui accélère le phénomène de phago- cytose. In vitro, il s'est montré particulièrement actif à des concen- trations comprises entre 0,1 et 10/g/cm3 dans le test de secrétion d'anti- trtoscopie ete01 tlfg/c asl etd erto 'ni corps (hémolytiques) antiglobules rouges de mouton-par des cellules spléniques de souris immunisées in vivo et dans le test de phagocytose de globules rouges de moutons opsonisés par les macrophages péritoneaux de souris. In vivo, l'hexapeptide de formule (I) fait preuve, chez la souris, d'une activité remarquable dès la dose de 0,05 mg/kg i.v. vis-à-vis de l'in- fection expérimentale à Klebsiella pneumoniae. Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, illustrent l'obtention de l'hexapeptide selon l'invention. EXEMPLE 1 Le produit MHH-63, dont l'obtention est décrite dans l'exemple 3 du brevet européen 49 666, après filtration sur membrane Diaflo-Amicon UM-05, est filtré sur une colonne de Sephadex G-15 (hauteur 120 cm; diamètre 1, 2 cm) en éluant avec de l'acide acétique à 10 % avec une vitesse d'élution 4 255915 7 de 9 cm3/heure et en recueillant des fractions de 0,6 cm3. Les fractions éluées entre 72 et 84 cm3 sont réunies puis chromatographiées sur une colonne de Dowex 50-X-4 (hauteur 14 cm; diamètre 1,4 cm) en receuillant des fractions de 4,3 cm3. L'élution est effectuée à la vitesse de 24 cm3/heure en utilisant successivement les éluants suivants: 1) acide chlorhydrique 0,05 N (100 cm3) 2) eau (100 cm3) 3) ammoniaque 2N Le diagramme d'élution est représenté par la figure 1. Les fractions qui correspondent à l'élution entre 12 et 36 cm3 d'ammoniaque 2N sont réunies (fraction 3, MDH-72). La poursuite de l'élution par le même solvant fournit une seconde fraction active (fraction 4, M3H-73). La fraction 3, M3H-72, est purifiée par HPLC en phase "reverse" sur une colonne semi-préparative (colonne C18 -ct-bondapack, WATERS) dont la longueur est de 30 cm et le diamètre de 7,8 mm. On recueille des fraction de 0,5 cm3, la vitesse d'élution étant de 1 cm3/minute. Au départ, la colonne est tamponnée par de l'acide phos- phorique à 0,1 % (éluant A). On prépare un éluant contenant de l'acide phosphorique (0,1 % en volume) et de l'acétonitrile (70 % en volume), dans l'eau (éluant B). La fraction 3, MJH-72, est dissoute dans 250 1 d'acide phos- phorique 0,1 %. L'élution est effectuée en utilisant un gradient linéaire d'élution et en opérant selon le tableau suivant: Temps Eluant A Eluant B (minutes)....... . O 100 O 100 O 110 50 50 O 100 2 559157 Le diagramme d'élution est représenté par la figure 2. L'élution est suivie en mesurant l'absorption à 280 nm et 220 nrm ainsi que par lecture à 490 nm de la fluorescence après réaction à la fluorescamine. Le diagramme d'élution contient 49 zones dont les plus impor- tantes quant à l'activité biologique sont les zones 41 à 47 (MJH-153) et la zone 49 (MJH-155); leurs temps de rétention sont respectivement 80 89 minutes et 91 à 93 minutes. La fraction 49 (M3H-155) est à nouveau purifiée par HPLC sur une colonne de même nature quecelleutilisée précédemment dont la longueur est de 30 cm et le diamètre de 3,9 mm. On recueille des fractions de 0,5 3 t e1c3/iue cm3, la vitesse d'élution étant de 1 cm3/minute. On prépare les éluants suivants: - éluant A: acide trifluoroacétique à 0, 1 % - éluant B: acide trifluoroacétique (0,1 % en volume) et acétonitrile (70 % en volume) dans l'eau L'élution est effectuée en utilisant un gradient linéaire d'élution et en opérant selon le tableau suivant: (iTemps Eluant A Eluant B (minutes) O 80 20 80 20 70 30 Le diagramme d'élution est représenté par la figure 3. Le diagramme d'élution contient 4 pics, le pic n 4, élué entre 11,5 minutes et 13,5 minutes, concernant la fraction contenant l'hexa- peptide de formule (I) pur. La structure de l'hexapeptide est déterminée: 6 2 5 52559157 - par l'hydrolyse totale par l'acide chlorhydrique 6N à 110 C pendant 18 heures qui montre la présence d'acide glutamique (Glu) = 1, de proline (Pro) = 2, de valine (Val) = 1, d'isoleucine (Ile) = 1 et de tyro- sine (Tyr) = 1 - par dansylation, afin de déterminer la nature de l'aminoacide N-terminal, qui est la valine - par analyse par le séquenceur Beckmann, Modèle 890 C, pro- gramme Quadrol 0,1 M avec détermination des différentes étapes grace à la caractérisation des phénylthiohydantoine-acides aminés (détermination par HPLC et révélation sur plaques). EXEMPLE 2 Dans ce qui suit, la pureté des produits est déterminée par chromatographie en couche mince en utilisant les systèmes de solvants sui- vants: - chloroforme-méthanol-acide acétique (95-5-5 en volumes): Rf 1 butanol-2-acide formique (90 %)-eau (75-13,5-11,5 en volumes): Rf 2 méthanol-acétate d'éthyle-eau (30-80-5 en volumes): Rf 3 - n.butanolacide acétique-pyridine-eau (15-3-10-12 en volumes): Rf 4 L'analyse des aminoacides est effectuée après hydrolyse dans l'acide chlorhydrique 6N à 110 C pendant 24 heures. La synthèse de l'hexapeptide est réalisée de la manière sui- vante: 1) On dissout 6,45 g de Boc-Pro (30 m.moles) dans 20 cm3 de diméthylformamide. Après refroidissement à -15 C on neutralise par addition de 3,3 cm3 de N-méthylmorpholine (30 m.moles) puis on ajoute 3, 93 cm3 de chloroformiate d'isobutyle (30 m.moles). Après 2 minutes, on ajoute une solution de 6,95 g de chlorhy- drate de Tyr-OMe (30 m.moles) et de 3,3 cm3 de N-méthylmorpholine (30 m. moles) dans 10 cm3 de diméthylformamide. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure à -15 C et pendant 2 heures à 20 C. Le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est dissout dans l'acétate d'éthyle et la solution obtenue est lavée successivement par une solution d'acide citrique 1M, une solution de bicarbonate de sodium et une solution de chlorure de sodium. La couche organique est séchée sur sulfate de sodium. Après élimination du solvant sous pression réduite, l'huile obtenue est reprise plusieurs fois par de l'éther éthylique pour donner 11,3 g de Boc-Pro-Tyr- OMe sous forme d'une mousse amorphe dont les caractéristiques sont les suivantes: - point de fusion 57-59 C - [j2 =. 34,2 (C = 1, méthanol) - Rf 1 = 0,96; Rf 3 = 0,95 Le rendement est de 96 %. 2) On traite 6,4 g de Boc-Pro-Tyr-OMe par 10 cm3 d'une solu- tion d'acide trifluoroacétique dans l'anisole pendant 30 minutes à 20 C. L'acide est éliminé sous pression réduite. Le résidu est dissous dans du diméthylformamide et la solution est neutralisée par addition de 1,8 cm3 de N-méthylmorpholine (16 m.moles). On fait réagir une solution de 3,5 g de Boc-Ile (16 m.moles) avec 3,8 g de hydroxy-1 benzotriazole (2,4 m.moles) et 3,7 g de N,N'-dicy- clohexylcarbodiimide (18 m.moles) pendant 1 heure à 0 C puis on ajoute la solution de Pro-Tyr-OMe dans 15 cm3 de diméthylformamide préparée cidessus. Après agitation pendant 1 heure à 0 C puis pendant 10 heures à 20 C, le pré- cipité de dicyclohexylurée est séparé par filtration et le filtrat est con- centré. Le résidu obtenu est dissous dans l'acétate d'éthyle et la solution obtenue est lavée successivement par une solution d'acide citrique 1M, une solution de bicarbonate de sodium et une solution de chlorure de sodium. La couche organique est séchée sur sulfate de sodium. Après élimination du solvant, le produit brut est purifié par chromatographie sur une colonne de silicagel (hauteur 45 cm, diamètre 2,5 cm) en éluant avec de l'acétate d'éthyle et des mélanges acétate d'éthyle-hexane. On obtient 3,8 g de Boc- Ile-Pro-Tyr-OMe dont les caractéristiques sont les suivantes: - point de fusion: 68 C _ -_I2 =. 55,90 (C = 1, méthanol) - Rf 1 = 0,85; Rf 3 = 0,91 analyse des aminoacides: Ile 1,00 (1) Pro 1,00 (1),.Tyr 0,95 (1) Le rendement est de 50,1 %. 8 2559157 3) On traite 2,4 g de Boc-Ile-Pro-Tyr-OMe (4,8 m.moles) par une solution d'acide trifluoroacétique dans l'anisole de la manière habi- tuelle. L'acide est éliminé sous pression réduite. Le résidu est dissous dans du diméthylformamide et la solution obtenue est neutralisée par addi- tion de 0,55 cm de N-méthylmorpholine (4,8 m.moles). On dissout 1,05 g de Boc-Pro (4,8 m.moles) dans 10 cm3 de tétrahydrofuranne refroidi à -15 C. On ajoute alors successivement 0,55 cm3 de N-méthylmorpholine (4,8 m.moles) et 0,64 cm3 de chloroformiate d'iso- butyle (4,8 m.moles). Après 2 minutes, on ajoute la solution de Ile-Pro- Tyr-OMe dans 5 cm3 de diméthylformamide préparée ci-dessus. Après agita- tion pendant 1 heure à -15 C et pendant 2 heures à 20 C, le mélange réactionnel est traité de la manière habituelle. On obtient ainsi 2,6 g de produit brut qui est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange acétate d'éthyle-éther de pétrole (1-1 en volumes) puis par un mélange acétate d'éthyle-méthanol (95-5 en volumes) et enfin par une nouvelle chromatographie en éluant avec un mélange acétate d'éthyle-méthanol (98-2 en volumes). On obtient ainsi 1,9 g de Boc-ProIle-Pro-Tyr-OMe dont les caractéristiques sont les suivantes: - point de fusion: 70-71 C - 5o(2D = _100,40 (c = 1, méthanol) - Rf 1 = 0,9; Rf 2 = 0,84 - analyse des aminoacides après 48 heures d'hydrolyse: Pro 1,99 (2) Ile 1,00 (1) Tyr 0,99 (1). Le rendement est de 65,7 %. 4) On ajoute 4,5 g de Boc-Val-ONSu (15 m.moles)(ONSu = N- hydroxysuccinimide) à une solution de 3,65 g de H-Glu-(OBut)-OH (18 m. moles) et de 3,0 g de bicarbonate de sodium (36 m.moles) dans 40 cm3 d'un mélange dioxanne-eau (2-1 en volumes). Le mélange réactionnel est agité pendant 2 heures à 20 C. Le dioxanne est éliminé sous pression réduite. Le résidu est extrait par l'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée par une solution d'acide citrique 1M et par de l'eau. La purification est complétée par dis- tribution à contre-courant à 160 passages dans un mélange n-butanol-eau. On obtient ainsi 4,8 g de Boc-Val-Glu(OBut)-OH sous forme d'une huile. Le rendement est de 79,5 %. 2559 1 5 7 ) On traite 1,0 g de Boc-Pro-Ile-Tyr-OMe (1,66 m.moles) par ure solution d'acide trifluoroacétique dans l'anisole de la manière habi- tuelle. On neutralise par addition de 0,19 cm de N-méthylmorpholine. On dissout 0,8 g de Boc-Val-Glu(OBut)-OH (1,9 m.mole) dans 5 cm de tétrahydrofuranne réfroidi à -15 C. On ajoute successivement 0,21 cm3 de N-méthylmorpholine (1,9 m.mole) et 0,25 cm3 de chloroformiate d'iso- butyle. Après 2 minutes, on ajoute la solution de Pro-Ile-Pro-Tyr-OMle dans cm3 de diméthylformamide préparée ci-dessus. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure à -15 C puis pendant 2 heures à 20 C. Les solvantssont éliminés sous pression réduite. On obtient 1,2 g de produit brut qui est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec des mélanges acétate d'éthyle-éther de pétrole (1-1; 7-2 et 8-2 en volumes). La fraction principale est purifiée par chromatographie sur gel de silice en éluant avec du chlorure de méthylène à 3% de méthanol (en volumes). On obtient ainsi 0,6 g de Boc-Val-Glu(OBut)-Pro-Ile-Pro-Tyr-OMe dont les caractéristiques sont les suivantes: - point de fusion: 1001020C - 22 _ DJ2 = -101,9 (c = 1, méthanol) - Rf 1 = 0,92; Rf 4 = 0,4 analyse des aminoacides: Val 1,00 (1), Glu 1,02 (1), Pro 1,84 (2), Ile 0,93 (1), Tyr 1,00 (1). Le rendement est de 40,7 %. 6) La saponification de 100 mg de Boc-Val-Glu(OBut)-Pro-Ile- Pro-Tyr-OMe (1,1 m.mole) dissous dans 10 cm3 de doxanne/0,1 N en acétate de sodium (pH = 7,5) est catalysée par 1 mg de nargase issue de Bacillus subtilis. Après 3 heures, le mélange réactionnel est extrait à l'éther. La phase aqueuse est acidifiée à pH 3 puis extraite à l'acétate d'éthyle. On obtient ainsi 70,1 mg de produit brut-qui est traité pendant 30 minutes par cm3 d'une solution d'acide trifluoroacétique dans l'anisole. L'acide est éliminé sous pression réduite et le résidu est trituré dans de l'éther éthy- lique, dissous dans l'acide acétique à 10 % puis désalifié par filtration sur Sephadex G 25. 2559 1 57 Le lyophylisat est purifié par chromatographie par échange d'ions sur une colonne de DEAE Sephadex A 25 en éluant avec un gradient de bicarbonate d'ammonium 0,1-0,5 M. On obtient ainsi 48,3 mg de H-Val-Glu-Pro-Ile-ProTyr-OH dont les caractéristiques sont les suivantes: - Rf 4 = 0,66 Analyse des aminoacides: Val 1,04 (1), Glu 1,00 (1), Ile 0,96 (1), Pro 1, 87 (2), Tyr 0,97 (1) - teneur en protéine: 98,2 % - test de racémisation: Glu 2,44 %; Tyr 1,2 %; Ile 1,41 %; Val 1 %. La présente invention concerne également les compositions utilisables en thérapeutique humaine ou vétérinaire qui contiennent l'hexa- peptide selon la présente invention en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et pharmaceutiquement acceptables. Ces compositions peuvent être utilisées comme adjuvants de vaccins (par exemple vaccin antigrippal composé de sous-unités hémaggluti- nantes, vaccin antipolyomyélitique à virus inactive, vaccin antimalarique) en injection simultanée avec l'antigène (viral, bactérien, parasitaire, fongique,. tumoral) à l'égard duquel on souhaite augmenter la production d'anticorps ou la réactivité cellulaire spécifique. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être également employées comme immunostimulants non spécifiques en vue d'augmenter la résistance de l'hôte (homme ou animal domestique) vis-à-vis des infections ou en immunothérapie antitumorale. En tant qu'adjuvant, le produit peut être administré soit eni solution aqueuse, soit en émulsion huileuse, soit encore sous forme de liposomes avec l'antigène à l'égard duquel on souhaite obtenir une réponse immunitaire augmentée ou améliorée par la voie utilisée pour cet antigène et dans des proportions variant entre 0,01 et 10 fois la quantité d'antigène avec lequel ils sont mélangés avant d'être injectés. Pour l'application comme immunostimulant non spécifique l'hexa- peptide de formule (I) peut être utilisé par voie intraveineuse, intramus- culaire, sous-cutanée, intranasale, éventuellement orale ou rectale, soit en solution aqueuse, soit en émulsion huileuse, soit encore sous forme de lipo- somes. 11 255 9 1 5 7 Dans ce cas, la dose d'hexapeptide selon l'invention est généralement comprise entre 0,01 et 25 mg/kg. En thérapeutique humaine, les doses journalières dépendent de l'effet recherché. Elles peuvent être comprises entre 0,1 et 10 mg pour un adulte. Les compositions solides pour administration orale peuvent être des comprimés, des pillules, des poudres ou des granulés. Comme compositions liquides pour administration orale, on peut utiliser des émulsions pharmaceutiquement acceptables, des solutions, des suspensions, des sirops ou des élixirs. Les compositions pour administration parentérale ou intra- nasale peuvent être des solutions stériles aqueuses, des suspensions ou des émulsions. La stérilisation peut se faire de plusieurs façons, par exemple à l'aide d'un filtre bactériologique ou en incorporant des agents stérili- sants. Les compositions solides rendues stériles par irradiation (rayon3) peuvent être dissoutes dans de l'eau stérile ou tout autre milieu stérile injectable éventuellement au moment de l'emploi. Les compositions pour administration rectale sont des sup- positoires. L'exemple suivant, donné à titre non limitatif, illustre une composition selon la présente invention. EXEMPLE On prépare selon la technique habituelle une composition liquide administrable par voie intraveineuse ayant la composition suivante: hexapeptide de formule (I)....... 50 mg - soluté injectable............... . 5 cm3 2559 1 5 7 R E V E N D I C A T I ONS 1 - L'hexapeptide de formule: Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr dans lequel les aminoacides sont sous forme L. 2 - Procédé d'obtention de l'hexapeptide selon la revendication 1 à partir d'une fraction hydrosoluble de caractère acide, appelée MJH-63, obtenue par traitement de la caséine humaine délipidée et solubilisée par au moins une enzyme protéolytique puis fractionnement des produits hydrosolubles par filtration sur une colonne de Sephadex G-50 en éluant avec de l'acide acétique à 30 % des substances hydrosolubles éluées au niveau des produits de poids moléculaire moyen 2200 puis fractionnement de la substance hydrosoluble de poids moléculaire moyen 2200 sur une colone de DEAE-Sephadex A-25 en éluant avec une solution tamponnée dont le pH va en décroissant, caractérisé en ce que la fraction MJH-63 est filtrée sur une membrane d'ultra- filtration Diaflo-Amicon UM-05 puis sur une colonne de Sephadex G-15 en éluant avec de l'acide acétique à 10 % puis sur une colonne de Dowex 50-X- 4 en éluant successivement par de l'acide chlorhydrique 0,05N, de l'eau et de l'ammoniaque 2N puis purification de la fraction éluée par l'ammoniaque 2N par chromatographie liquide à haute performance et isolement de l'hexa- peptide. 3 - Procédé de préparation de l'hexapeptide selon la revendication 1 carac- térisé en ce que l'on fait réagir le dipeptide de formule Boc-ValClu(OBut) OH sur le tétrapeptide de formule H-Pro-Ile-Pro-Tyr-OMe, obtenu par appli- cation des méthodes d'allongement de chaînes par condensations successives avec des aminoacides convenables à partir du dipeptide de formule Boc-Pro- Tyr-OMe, pour obtenir l'hexapeptide de formule Boc-Val-Glu(OBut)-Pro-Ile- Pro-Tyr-OMe dont les groupements protecteurs des fonctions acides peuvent être éliminés par saponification catalysée par une enzyme extraite de Bacil- lus subtilis et dont le groupement protecteur de la fonction amine est éli- miné au moyen d'acide trifluoroacétique pour obtenir l'hexapeptide selon la revendication 1. 13 2559 157 4 - Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient l'hexa- peptide selon la revendication 1 en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et pharmaceutiquement acceptables.