FR 2560214 A1 19850830 FR 8502843 A 19850227 Procédé de mesure du nombre de cellules de Méthanogènes ou de leur activité de production du méthane La présente invention se rapporte à un procédé de mesure du nombre de cellules de Méthanogènes ou de leur activité de production de méthane dans un objet à examiner contenant des Méthanogènes. Plus particuliè- rement, elle concerne un procédé applicable à la mesure du nombre de cel- lules de Méthanogènes ou de l'activité de production de méthane d'un tel microorganisme existant, en présence d'une multitude de groupes de micro- organismes et de substances étrangères, dans une boue digestée par exemple, maintenue dans une cuve de fermentation de méthane d'un système de traitement d'eaux résiduaires, etc. En ce qui concerne un tel procédé de mesure, on connaît déjà celui représenté sur la figure 1 des dessins annexes. Sur cette figure, la référence 1 désigne un objet à examiner; la référence 2 désigne une source lumineuse; 3 est une source de courant permettant d'appliquer un potentiel électrique à la source lumineuse 2; 4 représente un tube multiplicateur de photoélectrons; 5 est une source de courant permettant d'appliquer un potentiel électrique au tube multiplicateur de photoélectrons 4; et 6 est un détecteur permettant de mesurer le courant photoélectrique du tube multi- plicateur de photoélectrons 4. Dans ce qui suit, des explications seront donnéesau sujet du procédé de mesure en question. La lumière émise par la source lumineuse 2 traverse l'objet à examiner 1 contenant le microorganisme. La lumière trans- mise est reçue par le tube multiplicateur de photoélectrons 4 et son inten- sité est mesurée par le détecteur 6 comme la valeur du courant photoélectri- que du tube multiplicateur 4. Etant donné qu'une relation bien définie est établie entre l'absorbance et la concentration en microorganisme présent dans l'objet précité 1, quand on utilise une lumière visible comme source lumineuse, on peut estimer la concentration en microorganisme en mesurant l'absorbance de l'objet examiné. Il est ainsi également possible d'estimer le nombre de cellules. En ce qui concerne une autre technique de mesure de l'activité des microorganismes, on connaît un procédé de mesure optique d'une quantité de substance biologique relative au métabolisme énergétique que l'on appelle "ATP" (Adénosine Triphosphate) ou "NAD(P)H" [Nicotinamide Adénine Dinucléotide (phosphate)] et qui est contenu dans le microorganisme. Comme il est mentionné dans ce qui précède, le procédé classique de mesure du nombre de cellules ou de l'activité du microorganisme consiste à mesurer l'absorbance d'un objet à examiner 1, ce procédé étant efficace pour autant que l'objet 1 est composé d'un type de microorganisme et qu'il ne contient aucune substance étrangère telle qu'une boue, etc. Toutefois, si l'objet 1 est composé de nombreux types de microorganismes et qu'en outre il contient des substances étrangères, il est impossible de mesurer sélectivement le nombre de cellules ou l'activité d'un type particulier de microorganismes présents dans l'objet à examiner. D'autre part, étant don- né que ATP et NAD(P)H sont des substances biologiques qui existent dans tous les types de microorganismes, le procédé ne convient pas pour mesurer le nombre de cellules ou l'activité de production du méthane des seuls Méthanogènes. La présente invention vise à mesurer le nombre de cellules ou l'activité de production de méthane des Méthanogènes précités, en exposant à une lumière d'excitation ayant une longueur d'onde située dans une plage particulière, un objet à examiner contenant des Méthanogènes et en mesurant l'intensité de la fluorescence ayant une longueur d'onde particulière et émise par l'objet précité à examiner. Plus particulièrement, l'invention vise à fournir un procédé capable de mesurer le nombre de cellules ou l'acti- vité de production de méthane des Méthanogènes précités, même à partir d'un système mixte de microorganismes contenant des substances étrangères tel que de la boue digestée, etc., présent par exemple dans une cuve de fermenta- tion de méthane. Conformément à la présente invention, on peut déterminer avec une haute précision le nombre de cellules ou l'activité de production de méthane de Méthanogènes, par l'emploi d'une lumière ayant une longueur d'onde située dans la plage de 380 à 440 nm, en tant que lumière d'excitation ayant une longueur d'onde située dans une plage particulière et à laquelle doit être exposé l'objet à examiner contenant des Méthanogènes. Grâce à la présente invention, on peut mesurer avec précision le nombre de cellules ou l'activité de production de méthane de Méthanogènes en mesurant l'intensité de la fluorescence ayant une longueur d'onde de 450 à 490 nm et émise par l'objet sous examen. Par la présente invention, il est possible d'augmenter la sensi- bilité de mesure en rendant alcalin l'objet sous examen, en soumettant cet objet à un traitement thermique, en remplaçant le composant liquide de l'objet sous examen par une solution qui n'émet pas de fluorescence ayant une longueur d'onde située dans la plage de mesure quand on met en oeuvre une lumière d'excitation ayant une longueur d'onde située dans la plage particulière définie ci-dessus, ou encore en diluant l'objet à examiner. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention res- sortiront de la description qui va suivre en regard des dessins annexés sur lesquels: - la figure 1 est un schéma fonctionnel servant à expliquer le procédé classique de mesure du nombre de cellules de microorganismes; - la figure 2 est un schéma fonctionnel pour expliquer le procédé de mesure du nombre de cellules ou de l'activité de production de méthane de Méthanogènes selon un mode de mise en oeuvre de l'invention; - - la figure 3 est une représentation graphique montrant les propriétés de fluorescence d'un composant typique autre qu'un Méthanogène dans de la boue digestée; - la figure 4 est une représentation graphique montrant les propriétés de fluorescence des Méthanogènes; - la figure 5 est une représentation graphique montrant les propriétés de fluorescence d'une boue digestée contenant des Méthanogènes; - la figure 6 est une courbe caractéristique montrant les variations des propriétés de fluorescence des Méthanogènes et de Escherichia coli avec la valeur du pH; et - les figures 7 et 8 sont respectivement des représentations graphiques montrant l'interrelation existant entre le nombre de cellules des Méthanogènes et l'intensité du spectre d'excitation du fluorescence, ainsi qu'entre la quantité de méthane produit et l'intensité de spectre d'excitation de fluorescence. On va maintenant décrire un mode de réalisation de l'invention en regard des dessins. Sur la figure 2, la référence 8 désigne l'intérieur d'une cuve de fermentation de méthane contenant un objet à examiner; 9 désigne des fibres optiques servant à introduire-et à extraire de la lumière dans et hors de la cuve de fermentation 8; 10 est un dispositif collecteur de lumière servant à amener la lumière émise par une source lumineuse 13 dans l'une des fibres optiques 9; 11 désigne un sélecteur permettant de régler l'intensité de la lumière émise par la source lumineuse 13; 12 désigne un filtre optique pour limiter la longueur d'onde de la lumière émise par la source lumineuse 13; 14 désigne une source de courant alimen- tant la source lumineuse; 15 est un dispositif collecteur de lumière servant à collecter la lumière émise par l'autre fibre optique 9; 16 désigne un filtre optique pour limiter la longueur d'onde de la lumière du côté de la réception de la lumière; 17 désigne un tube multiplicateur de photôélec- trons; 18 est une source de courant alimentant le tube multiplicateur de photoélectrons et 19 est un détecteur pour mesurer le courant photoélectri- que produit dans le tube multiplicateur de photoélectrons 17. Dans ce qui suit, on va expliquer le concept fondamental de la présente invention et les fonctions mises en jeu dans cette dernière. On sait que les propriétés physiologiques des Méthanogènes diffèrent de celles des microorganismes ordinaires et que ces propriétés leur sont spécifiques bien que le mécanisme de transport d'électrons qui participe au métabolisme énergétique des Méthanogènes n'ait pas encore été entièrement élucidé. On sait déjà que dans ce mécanisme de transport d'électrons qui intervient dans le métabolisme énergétique des Méthanogènes, une substance appelée "Facteur420 (F420)" agit comme porteur d'électrons, cette substance étant propre aux Méthanogènes et n' existant pas dans d'autres corps biologiques. En conséquence, si la substance qui contient cette substance F420 comme com- posant principal et qui participe au mécanisme de transport des électrons des Méthanogènes, possède des propriétés physiologiques qui lui sont propres et mesurables et qui sont différentes de celles des groupes de microorganismxes autres que les Méthanogènes et les substances étrangères présents dans l'objet sous examen, substances étrangères telles que la boue digestée,par exmple, et si en outre ces propriétés sont mesurables dans un état o les cellules sont viables (c'est-à-dire que les microorganimes sont vivants), on peut employer une telle-substance comme paramètre pour mesurer le nombre de cellules ou l'acti- vité de production de méthane de Méthanogènes. En particulier, étant donné que la substance F420 est le composant principal du mécanisme de transport d'électrons des Méthanogènes, celle-ci est en rapport direct avec le mécanisme de production de méthane dans sa fonction physiologique. Elle peut donc cons- tituer un élément efficace lors de la mesure de l'activité de production de méthane. A la suite d'efforts considérables d'étude et de recherche ef- fectués par la Demanderesse sur la base du concept général ci-dessus, il a été démontré que la propriété de fluorescence considérée comme étant due la substance F420 dans les Méthanogènes diffère dans l'état cellulaire des propriétés de fluorescence que l'on peut attribuer à des microorganis- mes autres que les Méthanogènes et aux substances étrangères dans la boue digestée. Cette démonstration est à la base de la présente invention. La figure 3 montre le spectre d'excitation de fluorescence et le spectre de fluorescence d'Escherichia coli en suspension dans un milieu nutritif (comprenant, par litre, 10 g de trypton, 10 g de chlorure de sodium et 5 g d'extrait de levure). Dans la représentation graphique, le spectre d'excitation de fluorescence donne l'intensité de fluorescence à la longueur d'onde de 470 nm par rapport aux changements de la longueur d'onde d'excita- tion alors que le spectre de fluorescence est celui obtenu avec une longueur d'onde d'excitation de 380 nm. Parmi les substances qui émettent de la fluo-- rescence dans diverses substances biologiques, les acides aminés tels que, le tryptophane, la tyrosine, la phénylalanine et ainsi de suite sont repré- sentatifs. Cependant, les échantillons utilisés dans l'invention en qualité d'objets à examiner sont tous des mélanges de ces substances fluorescentes et on peut donc les considérer comme un modèle d'échantillons biologiques autres que les Méthanogènes. La figure 4 représente le spectre d'excitation de fluorescence et le spectre de fluorescence de Méthanogènes (en l'occurence: Méthanosarcina barkeri) en suspension dans un minimum de milieu de culture (milieu de cul- ture qui ne contient pas de source de carbone organique)o A titre de comparai- son, on a également représenté le spectre d'excitation de fluorescence et le spectre de fluorescence de Escherichia coli en suspension dans un minimum de milieu. Il convient de remarquer que le spectre d'excitation de fluores- cence des Méthanogènes donne l'intensité de fluorescence à une longueur d'onde de 470 nm par rapport aux changements de la longueur d'onde d'excita- tion, alors que le spectre de fluorescence est celui obtenu à la longueur d'onde d'excitation de 400 nm. En outre, le spectre d'excitation de fluores- cence de Escherichia coli donne l'intensité de fluorescence à une longueur d'onde de 470 nm par rapport aux changements de la longueur d'onde d'excita- tion, tandis que le spectre de fluorescence est celui obtenu à la longueur d'onde d'excitation de 400 nm. Dans ce cas, étant donné qu'on utilise le minimum de milieu de culture, les propriétés de fluorescence indiquées sur la figure 4 proviennent du microorganisme seul, de sorte qu'on constate qeu les propriétés de fluorescence des Méthanogènes ont un comportement très différent de celles de Escherichia coli. En outre, par une comparaison avec la figure 3, on comprend que les propriétés de fluorescence des Méthanogènes ont un comportement différent de celles de l'échantillon modèle des micro- organismesautres que les Méthanogènes et des substances étrangères. La figure 5 montre le spectre d'excitation de fluorescence et le spectre de fluorescence de la boue digestée prélevée dans une cuve de fermentation de méthane. Dans ce cas, le spectre d'excitation de fluores- cence donne l'intensité de fluorescence à la longueur d'onde de 470 nm par rapport aux changements de la longueur d'onde d'excitation, alors que le spectre de fluorescence est celui obtenu à la longueur d'onde d'excitation de 420 nm. Quand on compare la figure 4 à la figure 5, on constate qu'il existe une bonne concordance pour le spectre d'excitation de fluorescence dans la plage de longueurs d'ondes de 380 à 440 nm et pour le spectre de fluorescence dans la plage de longueurs d'ondes de 450 à 490 nm, si bien que les propriétés de fluorescence de la boue digestée dans les plages de longueurs d'ondes indiquées ci-dessus sont le fait des Méthanogènes. La figure 6 montre un spectre d'excitation de fluorescence des Méthanogènes et de Escherichia coli dans le milieu nutritif à des valeurs respectives de pH. Le spectre d'excitation de fluorescence donne l'inten- sité de fluorescence à la longueur d'onde de 470 nm par rapport aux change- ments de la longueur d'onded'excitation. De cette figure 6, il ressort que pratiquement aucune modification n'a lieu pour le spectre d'excitation de fluorescence avec Escherichia coli à des pH situés dans la plage allant de 7 à 11, alors que dans le cas des Méthanogènes la longueur d'ondes du pic d'excitation de fluorescence et son intensité varient selon la valeur du pH, la longueur d'onde du pic se déplaçant d'environ 20 nm vers le côté des plus grandes longueurs d'ondes à un pH de 11 par opposition au pH de 7, et l'intensité du pic augmentant également pour atteindre une valeur pratiquement égale au triple de l'intensité obtenue à pH7. De cette façon, en ajoutant une solution basique ou un solide basique tel que, par exemple, l'hydroxyde de sodium, de l'hydroxyde de potassium, de l'hydroxyde d'ammonium, etc., il devient possible d'alcaliniser l'objet à examiner à un pH de 7 à 14, afin d'augmenter l'intensité du signal de fluorescence dû aux Méthanogènes, de déplacer la plage des longueurs d'ondes de fluorescence d'excitation vers le cSté des plus grandes longueurs d'ondes d'une valeur de 0 à 30 nm et d'augmenter le rapport S/B (signal/bruit) par rapport à une fluorescence de fond provenant de composants autres que les Méthanogènes. Il ressort en particulier des figures 4 à 6, que lorsqu'on utilise une lumière d'une longueur d'ondes de 410 à 430 nm en qualité de lumière d'excitation et une fluorescence d'une longueur d'onde de 460 à 480 nm, on peut déterminer les spectres aussi bien d'excitation de fluores- cence que de fluorescence au voisinage de leurs pics. Il est également possible d'augmenter le rapport S/B du signal de fluorescence d& aux Méthanogènes en soumettant l'objet à examiner à un traitement thermique à une température de 60 à 120 C, en séparant le com- posant liquide du solide et en le remplaçant par une solution telle que l'eau, etc. qui n'émet pas de fluorescence ayant une longueur d'onde située dans la plage de mesure, pour la plage considérée des longueurs d'ondes d'excitation, cette séparation et ce remplacement étant réalisés par une opération de centrifugation ou une opération de filtration, etc., ou encore en diluant l'objet à examiner avec une solution telle que l'eau etc., qui n'émet pas de fluorescence ayant une longueur d'onde située dans la plage de mesure pour la plage considérée de longueurs d'ondes d'excitation. En outre, dans ce cas, si l'on emploie une solution basique telle quelle, par exemple, l'hydroxyde de sodium ou de potassium, à titre de solution qui n'émet pas de fluorescence ayant une longueur d'onde située dans la plage de mesure pour la plage considérée de longueurs d'ondes d'excitation, l'ef- fet de l'alcalinité précité augmente encore. En résultat des études et des recherches décrites, il a été trouvé que l'on pouvait adopter les procédés suivants pour mesurer le nombre de cellules ou l'activité de production de méthane de Méthanogènes existant en présence d'une multitude de groupes de microorganismes et de substances étrangères, par exemple dans la boue digestée, présente dans une cuve de fermentation de méthane. (1) Comme lumière d'excitation de fluorescence, on utilise une lumière ayant une longueur d'onde située dans la plage de 380 à 440 nm et on détermine le nombre de cellules ou l'activité de production de méthane de Méthanogènes à partir de la relation existant entre l'intensité du spectre d'excitation et le nombre de cellules ou l'activité de produc- tion de méthane des Méthanogènes. (2) Pour la fluorescence, on utilise une lumière ayant une longueur d'onde située dans la plage de 450 à 490 nm et on détermine le nombre de cellules ou l'activité de production de méthane de Méthanogènes à partir de la relation existant entre l'intensité du spectre de fluorescence et le nombre de cellules ou l'activité de production de méthane des Méthanogènes. (3) A titre de procédé permettant d'augmenter le rapport S/B de la fluorescence due aux Méthanogènes par rapport à la fluorescence de fond due à des composants autres que les Méthanogènes, on adopte les quatre techniques suivantes: a) on alcalinise l'objet à examiner; b) on soumet à un traitement thermique l'objet à examiner; c) on remplace le composant liquide de l'objet à examiner par une autre solution; et d) on dilue l'objet à examiner. La relation existant entre l'intensité du spectre d'excitation de fluorescence ou le spectre de fluorescence et le nombre de cellules ou l'activité de production de méthane peut être établi à partir des Méthanomonas isolés de la boue digestée, tels que Methanosarcine barkeri utilisés comme échantillons de référence. A titre d'exemples, les figures 7 et 8 montrent respectivement la relation existant entre le nombre de cellules et l'inten- sité du spectre d'excitation ainsi que la relation existant entre la quan- tité produite de méthane et l'intensité du spectre d'excitation. A ce pro- pos, les figures 7 et 8 montrent les caractéristiques obtenues quand on utilise une lumière d'excitation avant une longueur d'onde de 420 nm et une fluorescence de 470 nm. Dans ce procédé de mesure, on peut mesurer le nombre de cellules ou l'activité de production de méthane de Méthanogènes en temps réel pen- dant l'opération de la cuve de fermentation de méthane de sorte qu'un ré- glage particulièrement efficace des opérations de la cuve de fermentation de méthane est possible. En outre, on peut disposer d'un procédé particulièrement commode quand on construit le système de mesure comme indiqué sur la figure 2. En d'autres termes, quand un régulateur du système est prévu et est connecté par des fils au détecteur 19, aux filtres optiques 12, 16 et ainsi de suite, on peut faire varier automatiquement grace à ce régulateur, le potentiel électrique à appliquer au tube multiplicateur de photoélectrons 17 ou l'in- tensité de l'excitation de fluorescence suivant l'intensité de la lumière à introduire dans le tube multiplicateur de photoélectrons 17 en vue de maintenir la valeur du courant photoélectrique passant dans le tube multi- plicateur de photoélectrons 17 dans une plage convenable pour le tube mulptiplicateur 17 et, en même temps, la valeur du courant photoélectrique fonction de chaque intensité d'excitation de fluorescence ou de chaque ten- sion appliquée peut être convertie en une valeur correspondant à une inten- sité déterminée d'excitation de fluorescence ou à une tension appliquée déterminée. D'autre part, dans le mode de réalisation décrit ci-dessus, des explications ont été données au sujet d'un procédé de mesure dans lequel la fibre optique 9 est introduite directement à l'intérieur de la cuve 8 de fermentation de méthane, alors qu'il est également possible de prélever un échantillon de l'objet à examiner de la cuve de fermentation de méthane et d'effectuer la mesure hors de la cuve de fermentation. Quand l'objet à examiner subit un traitement alcalin, un traitement thermique ou une dilution ou quand le composant liquide de l'objet est remplacé par une autre solution, un tel prélèvement d'échantillons de l'objet peut faciliter le traitement. Par ailleurs, quand les Méthanogènes sont immobilisés sur un support d'immobilisation, on peut également soumettre à la mesure l'objet à examiner à l'aide de la fibre optique 9. Dans ce qui précède, on a principalement décrit la mesure du nombre de cellules ou de l'activité de production de méthane de Méthanogènes- existant en présence d'une multitude de groupes de microorganismes et de substances étrangères comme la boue digestée par exemple, dans une cuve de fermentation de méthane mais l'invention n'est nullement limitée à l'examen d'un tel objet. Comme mentionné dans ce qui précède, l'invention permet de mesurer le nombre de cellules ou l'activité de production de méthane de Méthanogènes en se basant sur une mesure de l'intensité d'une fluorescence ayant une longueur d'onde située dans une plage particulière de longueurs d'ondes et émise par l'objet précité à examiner qui-est par ailleurs exposé à une lumière d'excitation d'une longueur d'onde-donnée. En particulier, même à partir d'un système mixte de microorganismes contenant des substances étrangères, tel qu'une boue digestée par exemple présente notamment dans une cuve de fermentation de méthane, on peut effectuer efficacement la mesure du nombre de cellules ou de l'activité de production de méthane des Méthanogènes. L'invention est applicable à la mesure du nombre de cellules ou de l'activité de production de méthane de Méthanogènes existant en présence d'une multitude de groupes de microorganismes et de substances étrangèresdans une boue digestée par exemple présente notamment dans une cuve de fermentation de méthane mise en oeuvre dans une installation de traitement d'eaux résiduaires, en employant une lumière d'une longueur d'onde de 380 à 440 nm à titre de lumière d'excitation ayant une longueur d'onde donnée et à laquelle l'objet à examiner contenantdes Méthanogènes doit être exposé. REVENDICATIONS 1. Procédé de mesure du nombre de cellules ou de l'activité de production de méthane de Méthanogènes, caractérisé en ce que l'on expose à une lumière ayant une longueur d'ondes située dans la gamme de 380 à 440 nm, un objet à examiner contenant des Méthanogènes, puis mesure l'in- tensité de la fluorescence émise par l'objet examiné et ayant une longueur d'onde située dans une plage particulière, pour obtenir ainsi le nombre de cellules ou l'activité de production de méthane desdits Méthanogènes. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on alcalinise ledit objet à examiner. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on remplace le composant liquide dudit objet par une solution qui n'émet pas de fluorescence ayant une longueur d'onde située dans laplage de mesure, pour la plage considérée de longueurs d'ondes d'excitation. 14. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on dilue ledit objet à examiner avec une solution qui n'émet pas de fluorescence ayant une longueur d'onde située dans la plage de mesure, pour la plage considérée de longueurs d'ondes d'excitation. 5. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on soumet l'objet à examiner à un traitement thermique à une température de 60 à 120 C. 6. Procédé de mesure du nombre de cellules ou de l'activité de production de méthane de Méthanogènes, caractérisé en ce que l'on expose à une lumière d'excitation ayant une longueur d'onde donnée, un objet à examiner contenant des Méthanogènes, puis mesure l'intensité de la fluores- cence ayant une longueur d'onde située dans la plage de 450-à490 nm, pour obtenir ainsi le nombre de cellules et l'activité de production de méthane desdits Méthanogènes. 7.Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on alcalinise ledit objet à examiner. 8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que l'on remplace le composant liquide dudit objet par une solution qui n'émet pas de fluorescence ayant une longueur d'onde située dans la plage de mesure, pour la plage considérée de longueurs d'ondes d'excitation. 9. Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que l'on dilue ledit objet examiné avec une solution qui n'émet pas de fluores- cence ayant une longueur d'onde située dans la plage de mesure, pour la plage considérée de longueurs d'ondes d'excitation. 10. Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que l'on soumet l'objet à examiner à un traitement thermique à une tempera- ture de 60 à 120 C.