FR 2559646 A1 19850823 FR 8402582 A 19840221 L'invention est relative à un procédé de réduction du taux de lignine dans les végétaux et à de nouvelles compositions utilisables pour la mise en oeuvre de ce prodédé. La lignine est un polymère phénolique,élaboré par les végétaux,formé de motifs monomères de trois types, à savoir d'alcools p-coumarylique, coniférylique et sinapylique. La biosynthèse de ces motifs monomères est réalisée dans la plante, à partir de phénylalanine selon un processus comportant plusieurs étapes dans lesquelles interviennent de nombreuses enzymeso Les deux.dernières étapes de'la biosynthèse des monomères qui sont spécifiques de la liqnification,correspon- dent à des étapes de réduction et sont catalysésrespectivement par la cinnamoyl:CoA réductase(dési.qnée ci-après par CCR) et l'alcool cinnamy- lique déshydrogénase (désignée par CAD). La teneur en lignine et les proportions rela- tives des trois monomères ainsi que leur mode de liaison sont variables d'une espèce à l'autre et selon l'âge et la nature du tissu et des cellules considérées. D'une manière générale, la lignine est syn- thétisée dans les parois des cellules telles que le xylème et le sclérenchyme. assurant par là des fonctions importantes de soutien et de conduction. Elle constitue cependant un obstacle à l'utilisation optimale des végétaux dans divers domaines. Ainsi, dans la nutrition animale, on cons- tate que des taux de lignine importants, par exemple, dans les plantes fourragères nuisent à la digestibilité des plantes par les animaux. -2 En outre, on observe dans certaines produc- tions *végétales une lignification intense, après la récolte, qui les rend rapidement impropres à la consommation. Ainsi, des tubercules tropicaux tels que les ignames,utilisés pour 1' alimentation humaine,ne peuvent plus être consommés au bout de quelques semaines après leur récolte en raison d'une nouvelle synthèse de parois secondaires lignifiées. De plus, dans certaines plantes, par exemple, chez les plants de tomates, on constate un antagonisme entre la production de lignine et la croissancede la plante, une lignification rapide réduisant les possibilités de croissance cellulaire. Diverses solutions ont été alors recherchées pour réduire les taux de lignine. Par mutagénèse,ou par croisement, on a pu ainsi obtenir une hypolignification des plantes fourragères conduisant à une meilleure ingestibilité et digestibilité par les animaux.Toutefois, leur faible productivité indus- trielle ne permet pas une exploitation de telle àariétéàs. On a également proposé d'inhiber spécifiquement, par voie chimique,des enzymes impliquées dans la biosyn- thèse de la lignine. Ainsi, différents inhibiteurs de la,phénylala- nine ammonia lyase ou PAL, enzyme qui intervient dans le premier stade de synthèse de la lignine conduisant à des acides cinnamiques, ont été élaborés. L'inhibiteur le plus efficace décrit à cet égard, à savoir l'acide D,L-c -aminoxy- -phényl-propionique permet effectivement une réduction de la synthèse des lignines, mais son action in vivo se traduit également par un effet inhibiteur vis-à-vis notamment de la synthèse des phénols simples et des flavonoides.Cet acide inhibe également les - 3 - enzymes à pyridoxdl phosphates qui interviennent dans diffé- rentes voies métaboliques et,en particulier dans la synthèse de l'éthylène. Il s'est avéré également que le traitement de cultures de tabac par cet inhibiteur entraîne en même temps qu'une baisse de taux de lignine, une réduc- tion d'environ 30% des phénols totaux. On conçoit l'intérêt de disposer d'inhibiteurs spécifiques vis-à-vis de la synthèse de la lignine afin de ne pas perturber le métabolisme général de la plante. Or, les inventeurs ont constaté qu'il était possible sans altérer de manière significative les fonctions métaboliques essentielles de la plante, d'obtenir une réduction de la teneur en lignine en utilisant une famille déterminée de dérivés chimiques agissant spécifiquement sur les enzymes de réduction CCR ou CAD mentionnées ci-dessus. L'invention a donc pour but de fournir un nouveau procédé pour la réduction du taux de lignines dans les végétaux permettant d'abaisser la teneur en lignine d'au moins 40% sans modifier de manière significative les fonctions essentielles de la plante. Elle a également pour but d-efournir une famille d'inhibiteurs de synthèse de la lignine dont l'utili- sation permet notamment d'améliorer la digestibilité des végétaux destinés à l'alimentation humaine et animale et leur conservation. Le procédé de réduction du taux de lignine de végétaux selon l'invention est caractérisé en ce qu'on met en oeuvre au moins un dérivé de formule I Ar-NH-A-C(H)R1-C-OR il o dans laquelle - Ar représente au moins un cycle aromatique - 4 - en particulier, un groupe phényle ou un hétérocycle, en particulier un hétérocycle azoté tel qu'un radical pyridyle ou pyrymidyie, le groupe aromatique ou hétéro- cyclique étant, le cas échéant, substitué par au moins un radical Z en position ortho, méta ou para, choisi de préférence parmi le groupe -OH, alcoxy renfermant notamment de 1 à 4 atomes ecarbone,-NH2,-NH(alc.ouAr.).-N-(alc.)2,alc. représentant un grouoe alcoyle,notamment, de 1 à 4 atomes de carbone, et Ar représentant un radical aromatique tel qu'un groupe phénvle, - C - A représente un groupe -S- ou __Il I _ o O - R1 représente un radical alcoyle, en particulier, méthyle ou éthyle, ou un atome d'hydrogène, et Rreprésente un radical alcoyle linéaire ou ramifié, de préférence de 1 à 4 atomes de carbone, ou un atome d'hydrogène. D'une manière surprenante, les dérivés répondant à ce type de structure, à savoir, compor- tant (1) un noyau aromatique, (2) une fonction sulfinamoyle (-NH-SO-)ou sulfamoyle (-NH-SO2), et, conjointement C3) un groupement carbonyle ens du groupe -$=O ou -S-, ainsi qu'au moins (4) un O atome d'hydrogène libre sur le groupe carboné entre A et -C=O,possèdent in vivo une action spé- -5- cifique élevée vis-à-vis de la synthèse de lignine et n'affectent pas de manière significative le métabolisme général de la plante traitée. On peut considérer que ces composés se comportent comme des inhibiteursappelés commu- nément inhibiteurs suicides c'est-à-dire qu'ils possèdent une structure voisine du substrat physiolo- gique de l'enzyme avec une fonction réactive masquée qui est libérée au voisinage du site catalytique et se lie irréversiblennntà des groupements indispen- sables à la catalyse enzymatique. e Un groupe préféré d'inhibiteurs, selon l'invention comprend au moins un dérivé de sulfinamoyle de formule I ci-dessus dans laquelle A représente le groupe S = O. Ce groupe comprend des dérivés de formu]l IT -_NH-S - CH (R1) - C-O R (II) il Il O O dans laquelle ZR1 et R présentent les significations données ci-dessus. Des dérivés particulièrement avantageux en raison de leur efficacité inhibitrice de lignine supérieure in vivo par rapport aux effets observés in vitro, correspondent aux produits de formule II dans laquelle Z représente un substituant en position ortho, en particulier, un groupe -OH ou -NH2. Des résultats particulièrement satisfaisants in vivo sont obtenus avec les dérivés de formule II ci-dessus dans laquelle Z représente un substituant en position ortho, de préférence un groupe -OH ou -NH2, et R représente un atome d'hydrogène. Le groupe préféré considéré comprend également des dérivés de formule IIA ou IIB MiH- C(H)R!I-OR Z NH-c (H)Ri-C-OR (IIA) ou (IIB dans lequelles les substituants Z, R1 et R présentent avantageusement des significations préférées indiquées en rapport avec la formule II. Les inhibiteurs mis en oeuvre dans l'invention, dans un autre groupe préféré, comprennent au moins un dérivé de sulfam'oyle de formule III / V 2 z il O O Les dérivés de ce groupe dans lesquels Z occupe une position ortho sont plus spécialement préférés, notamment -7 ceux dans lesquels Z représente un groupe -OH ou -NH2. Dans d'autres dérivés de ce groupe les produits répondant aux formules IIIA et IIIB O iNH- -CH (R1)-S-OR (IIIA) z il O O NH- CH(R >c-oR CluIB) permettent d'obtenir une réduction efficace du taux de lignine. De manière surprenante, l'étude in vivo de l'action de ces inhibiteurs sur diverses espèces végé- tales a montré une augmentation de leur effet inhibiteur par rapport aux essais réalisés in vitro et ce sans altération significative du métabolisme primaire de la plante. Les travaux effectués par les inventeurs ont également montré que ces inhibiteurs sont aisément absorbables par la plante et transportés ainsi avantageu- sement par la plante jusqu'aux sites de synthèse de lignine. L'utilisation de ces inhibiteurs selon des concentrations pouvant être aussi faibles que50VM permet d'obtenir les résultats souhaités. Des concentrations de 50 à 100M sont habituel- lement suffisantes pour inhiber la formation de lignine. L'invention vise donc des compositions pour la réduction du taux de lignine dans les végétaux comprenant une quantité efficace d'au moins un dérivé de formule I ci-dessus. - 8 - Ces compositions d'inhibiteurs,selon l'invention, se présentent avantageusement sous forme de poudre à diluer au moment de l'emploi, ou de solutions, de préférence de solutions aqueuses renfermant ces inhi- biteurs. Les préparations sous forme de solutions auqeuses renferment avantageusement les inhibiteurs en question à raison d'au moins 50uM. Des préparations J préférées renferment de 50 à 200 yM,avantageusement de 50 à 100 juM. Ces préparations peuvent, en outre, renfermer d'autres ingrédients utiles à la plante,notam- ment, des éléments nutritifs et/ou des agents de traite- ment. L'application est réalisée de préférence dans la phase ou les phases de lignification intense du végétal. On opère par pulvérisations, arrosage ou autre mode approprié au type de végétal traité. Une pulvérisation, à deux reprises,à environ 15 jours d'intervalle, sur la production végétale au moment de la phase de croissance du végétal, permet de réduire le taux de lignine de manière satisfaisante. Ce traitement est utilisable sur des espèces végétales variées telles que, par exemple, le peuplier, le mais, les plantes à tubercules et autres productions végétales. Dans le cas de plantes fourragères, il en résulte une ingestibilité et une digestibilité accrues de ces dernières par les ruminants,permettant ainsi une augmentation de la productivité. Le procédé de l'invention revêt également un intérêt essentiel dans l'alimentation humaine en permettant de réduire le taux de lignines dans les pro- ductions végétales comme évoqué ci-dessus. Une pulvérisation -9 au moment du stockage des végétaux s'avère généralement suffisante. Les produits mis en oeuvre selon l'inven- tion sont avantageusement préparés selon le procédé décrit par De BLIC et al dans Synthesis.1982,No 4. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent donnés à titre illustratif. Exemple 1: Préparation de N-sulfinylamines de formule Ar.N = S = O avec Ar représentant un groupe phényle,o-p-ou p-hydroxyphényle,o-aminophényle ou p-hydroxy m-méthoxyphényle. Ces dérivés sont préparés par réaction d'une amine primaire avec du chlorure de thionyle selon le schéma réactionnel suivant: ArNH2 + SOC12 _ ArN = S =0+2HC1 Ces réactions sont réalisées comme suit: a) réaction d'une amine primaire avec le chlorure de thionyle: On porte à reflux pendant 4 heures (Ar = solvant on procède à unedistillationsous pression réduite (Ar = 49 C/2,4 mm Hg,Ar =- 70 C/5.10-3 nmm Hg) OH Les rendements respectifs pour les différents produits sont de 80,50,65,60, 55 et 60 %. - Les spectres RMN (dans CDC13) et IR (dans CHC13) de ces dérivés confirment les structures attendues. Exemple 2: Préparation de sulfinamoyl acétates de tert-butyle de formule ArH-S C(H)RCOOtB ArNH-S- C'(H)R1COOtBu. On prépare les acétates suivants composé 1 2 3 4 5 6 15 17 Ar 0 HO t Q O R1 H H H H H C H CH3 H On opère selon les deux étapes a et b suivantes: a) - préparation des dérivés qr axfe, raqs à Ptir des esters axorrsedts. Br-C-bOtBu + Zn -3 Zn-Br- C - COOtBu b) -àction du dérivé ArN=S=O déjà formé sur le dérivé bromozincique correspondant 4 R H 1 ArNS0 + ZnBr - CC00tBu > ArNH-S- C - COOtBu i o On porte à reflux, dans 70 ml de diméthoxyméthane (méthylal), 0,069 mole de bromoacétate de tert-butyle ou de bromo-2 isobutyrate de tert-butyle et 0,077 mole de zinc en copeaux activés par quelques cristaux d'iode. Après heure de chauffage, le milieu réactionnel devient trouble. On laisse encore - ll - 4 heures à reflux. Le rendement est de l'ordre de %. On porte ensuite le mélange à 0 C et, sous agita- tion magnétique, on verse goutte à goutte une solution de ArN=S=O dans le méthylal (pour Ar = phényle) on met 0,06 mole, dans les autres cas on met 0,03 mole de ArNSO). Après la fin de l'addition, on laisse la réaction pendant 30 mn. à O C, puis on hydrolyse par une solution aqueuse de NH4Cl à 20%, à la même tem- pérature. Après extraction à l'éther et évaporation, on obtient les sulfinamoyl esters correspondants. Les composés 1 et 5 ont été purifiés par recristalli- sations successives dans un mélange éther-éther de pétrole (50:50) tandis que les autres composés ont été purifiés par chromatographie liquide (HPLC). On a commencé l'élution par un mélange éther-étherde pétrole (20:80) et on est arrivé jusqu'à 100% d'éther. Les deux dernières élutions ont été faites par un mélange acétate d'éthyle- éther (25:75)..Les rendements dans tous les cas sont de l'ordre de 55-65%. On indique ci-après les rendements et les points de fusion des dérivés obtenus. i f composés 1 2 3 4 5 6 15 17 Rdt (%) 65 57 55 55 60 65 60 61 F ( C) 102 118 100 136 87 o05 122 67 Les spectres RMN et IR de ces composés confirment les structures attendues. - 12 - EXEMPLE 3: Préparation de sulfamoyl acétates de tert-butyle de formule OH Ar NH-S - C -COOtBu Les composés préparés sont les suivants: ée 7a 7b 7c 8 9 10 il 12 13 14 Ar 1- 1 Ar H@9 @ @ OH H CH. H H H H CH3 H H H H H R13 i R tBu Et Me Et tBu tBu tBu tBu tBu tBu Les composés 7a,9 à 14 sont synthétisés par oxy- dation des sulfinamoyl esters correspondants selon le schéma suivant: HRi c > COOOH 0 H HAr NH-C -COOtBuC ArNHS - C -COOtBu C OOH Ar-NH-S-i -COOtBu a C0B 0 0 Cl On ajoute goutte à goutte sous agitation magnétique et à 0 C une solution de sulfinamoyl ester dansle chloroforme, à une solution d'acide m-chloroperbenzoique (50% en excès) dans CHCl3. On laisse tourner la réac- tion pendant 2 heures à 0 C puis on hydrolyse avec du bicarbonate dé sodium (5% dans l'eau). On extrait et on évapore le solvant. L'oxydation est totale. On recristallise dans l'éther (Rdt 75-80%).On rapporte ciaprès les points de fusion (F) de ces composés - 13 - composés 7a 9 10 11 12 13 14 - F ( C) 88 61 105 103 128 122 ill Pour la synthèse des composés 7b, 7c, et 8, on utilise la méthode de OLIVER J.E. et DE MILO A.B. décrite dans Synthesis tome V.p. 321,1975. Cette synthèse comprend trois étapes à savoir la préparation - des sulfonates esters de sodium - des esters o(-chlorosulfoniques - des sulfanoyle acétates d'alcoyle selon le schéma réactionnel suivant:R' R Na2SO3 + - PC15 lère étape. A une solution de sulfite de sodium (0.3 mole) dans 250 ml d'eau on ajoute sous agitation et à 0 C une solution de bromoacétate d'alcoyle (0. 3 mole) (R = Me ou Et). On chauffe ensuite à 50 C pendant 30mn jusqu'à dissolution du précipité blanc formé et puis on évapore à sec. Le solide est extrait avec une solution bouillante d'acide acétique: acétate d'éthyle (2: 1) rapidement filtrée sur célite et refroidie. Les sulfo- nates de sodium correspondants précipitent et on les filtre. Le rendement est de 70-80%. Les points de fusion sont identiques à ceux rapportés dans la littérature (192 et 160 C respectivement). - 14 - 2ème étape. On ajoute lentement 0,06 mole de pentachlorure de phos- phore sec sous forme de poudre fine à 0.05 mole de sulfonate ester de sodium préalablement broyé. On chauffe ensuite à 100 C pendant 1 heure/ on évapore sous vide et on reprend avec du benzène. Le précipité est éliminé par fil- tration à travers de la célite. Le filtrat est évaporé. On obtient une huile jaunâtre qui est l'ester -chlorosulfonique. 3ème étape. A une solution de 0,03 mole de l'ester X-chlorosulfonique dans le benzène,on ajoute à O Cgoutte à goutte,une solu- tion d'aniline (0,03 mole) ou de N-méthylaniline (0,03 mole) et de triéthylamine (0,03 mole) dans le benzène. On chauffe légèrement pendant 10 mn, on refroidit et filtre. Le filtrat est lavé avec de l'eau, du bicarbo- nate de sodium et une solution saturée de NaCl/H20. On sèche sur sulfate de magnésium, on évapore et on obtient les produits 7b (R' = H,R = Et), 7c (R'=H,R =Me) ou 8 (R' = Me,R = Et). La recristallisation de ces composés a été faite dans l'éther: éther de pétrole (50:50) rendement total de la réaction 50-55% (F: 7c 78 C, 7b 164 C). L'acide 7d a été obtenu par reflux pendant 3h d'une solution de 7c et de KOH (50% en excès) dans H20/EtOH (1:2). Après acidification, on extrait à l'éther et on évapore le mélange réactionnel. L'acide obtenu est recristallisé dans le benzène (F: 109 C), rendement %. - 15 - Les caractéristiques RMN H dans CDCI.3 de ces composés confirment les structures attendues. EXEMPLE 4 Action in vitro d'inhibiteurs selon l'invention sur la lignificationde végétaux. Les études dont les résultats sont rapportés ci-après ont été effectuées sur de jeunes plants de peuplie'- et de mais, variété INRA 400, obtenus en salle conditionnée (température maintenue à 22 C, humidité de 60 à 80% de saturation, éclairement de 10 000 lux, héméropériode de 12 heures). Les plants de peuplier sont obtenus à partir de boutures de l'année (segments de tiges de 15 cm), placées dans des bacs contenant de la vermiculite et arrosées quoti- diennement par une solution nutritive riche en azote présentant la composition suivante Concentrations Composés g/1 KNO3 o,303 KH2 PO 4 0,102 K2HPO4 0,043. NaCl 0,011 Ca(NO3)2 0,410 Ca(NO3)2 0,455_ Ca(NO3)2,4H20 0,590 MgSO4, 7H20 0,184 NH 4 NO03 0,160 Séquestrène de fer 0,59xl03 M'4nSO 41 HO0 1,69 x CuSO4, 5H 0 0,25 x 103 ZnSO4, 7H20 0,29 x H B04 1,86 x 10-3 NH4)6024Mo7,4H2O 0,035 x - 16 - Les échantillonnages ont été effectués à partir de jeunes plants de peuplier âgés de 3 mois et comportant entre et 25 entrenoeuds. Les fractions tissulaires ont été obtenues par grattages successifs au scalpel selon la méthodologie décrite par GRAND thèse de 3ème cycle,1979,Université de Toulouse. Dans tous les cas, le végétal est stabilisé dans l'azote liquide, puis lyophilisé pendant 48 h et conservé à -20 C dans des flacons colorés et bouchés. Les semences de mais sont mises à imbiber pendant 14 heures dans l'eau distillée, à la température ambiante, puis enfouies à 1 cm de profondeur dans la vermiculite répartie dans des bacs en polyéthylène. Les bacs sont arrosés quotidiennement par une solution nutritive présentant la composition suivante: Composés Concentrations p/! KNC3 1,.01 KH2P04 0.27 Mg504, 7 H20 0.96 Ca(NO3)2. 4 H20 2,36 FeCI3 0,97 x 10-3 EDTA(Na2) 1,12 x 10-a H3803 0,35 MS04, H20 0,35 CuS04, 5 H20 0,.07 - 17 - En vue du dosage des lignines, le matériel végétal est préparé selon la méthode décrite par ALIBERT et BOUDET dans Physiol.vég.17. 75-82. 1979. à 500 mg de végétal lyophilisé, réduit en poudre au broyeur àbilles Dangoumeau (Prolabo) est extrait par 10 ml d'eau distillée (3 fois), soumis à agita- tion 5 mn, puis à une opération de centrifugation durant 5 mn à 3000 g. On récupère le culot de centrifugation puis on l'ex- trait à l'aide de 10 ml de NaCl M, 2% en Triton X 100 (3 fois) et on soumet le mélange à agitation 5 mn. Après une centrifugation de 5 mn, à 3000 g, on récu- père le culot qu'on extrait en continu par un mélange alcool-benzène (; v/v) avec un débit de lml,mn1 (1 1/g de matériel végétal). Le résidu obtenu est rincé avec de l'éthanol absolu et séché sous vide. La préparation obtenue, appelée "poudre alcool-benzène" correspond à une fraction pariétale enrichie en lignines et polysaccharides (cellulose, hémicelluloses). Les acides cinnamiques, liés aux lignines sous formes d'esters, sont libérés par hydrolyse des "poudres alcool-benzène" par de la soude 2N pendant 1 heure sous atmosphère d'azote. Après réacidification à pH2 par de l'acide chlorhydri- que 3N et centrifugation, le surnageant contenant les acides cinnamiques est séparé du résidu. Les "poudres alcool-benzène" ainsi hydrolysées sont lavées par de l'eau distillée jusqu'à pH neutre et séchées, sous vide dans un dessiccateur en présence de silica.-gel. Les teneurs en lignines sont estimées par la méthode - 18 - gravimétriques de KLASON (Tappi Standard method T12m) modifiée par EFFLAND, Tappi. 60, p 143-144, 1977. On rapporte dans le tableau 1) suivant les résultats obtenus concernant l'effet mesuré in vitro d'inhibiteurs selon l'invention à une concentration de 2mM vis-à-vis de la CAD de peuplier isolée selon la méthode deSARNI et al,1984,EUROP JOURNAL OF BIOCHEMISTRY,sous presse. On indique également dans ce tableau les résultats obtenus avec des composés portant des substitutions différentes de ceux mis enoe uvre dans l'invention. Les chiffres indiqués entre parenthèses a côté des for- mules correspondent aux composés identifiés dans les exemples de préparation 2 et 3. - 19 - *TABLEAU 1 Composés Composés Inhibition à 2mM % NH-S CH -COOH 45 NH-S2-c2-OO N-(phènyl) sulfam.oyl (NPS) :'-S N H.$O0-2CH2-2-O-C-CH3(7a) 50 O CH N- (phéyl) sulfau oyl 3 acétate de;tertiobutyle (NPST) CH 0 ()9 N-(Ophéylroxy phnaMyl)ufiH olctaed aUrae de tertiobuttle (PAS) ---NH-S-CH -C-O-C.-CH ( 2 90 C9 H3 O O 3 N-(O-hydroxy phényl)sulfinamoyl acétate de tertiobutyle / CH 3 (_ NH- -CH2 --O-C-CH 3 ( 5)0 %=..5 5 \CH3 (o-Ami o phényl)Sulfinamoyl Acétate de - 20 - TABLEAU I (suite) _,, ,,,,, --NH-SO2-CH2-C-O-C-CH3 (14) 0 N-(Cyclohexyl)sulfamoyl acétate de tertiobutyle (NCAT) cWCH3 (17) -/J.H-SCH--g-O-C-CH (17) O N-(Cyclohexyl)sulfinamoyl acétate de tertiobutyle (NCST) :-..- CH3 _ NH-.-CH2-cO-C-cH3O & 2o CH 3 0 0 3 0 Phényl(carbamoy]) acétate de tertiobutyle (PCAD) N. C,---CH;CH O\-NH- S-C-C-0-C-CH (15) 1 CH3 o N-(Phényl) sulfinamoyl isobutyrate de tertiobutyle (NPSI) -t NHg-CHH3 o C3 N-(phényl)-sulfinamoyl d' isopropyle (NPSP) - 21 - Les résultats obtenus montrent que la substitution des groupes de la chaîne latérale par NH-SO2ou NHSO ne modifie pasde manière significative le taux d'inhibition. Il en est de même en ce qui concerne le remplacement de la fonction acide libre par un groupe tertiobutyle. En revanche, une perte totale de l'activité inhibitrice est observée lorsque le noyau aromatique est remplacé par une structure cyclohexyle. En outre, la substitution de l'atome de soufre par un atome de carbone s'accompagne d'une perte du caractère inhibiteur de la molécule. Enfin, les molécules possédant une fonction isopropyle (-CH-(CH3)) sur la chaîne latérale (NPSI) ou en bout de chaîne (NPSP) sont également inefficaces. Ces résultats révèlent donc que le caractère inhibiteur des molécules est intimement lié à la présence d'une part d'un noyau susceptible de constituer un élément de reconnaissance avec le substrat et d'autre part, d'un atome de soufre au niveau de la chaîne latérale. En revanche, le remplacement de la fonction acide, très réac- tive, par un groupe alcoyle tel qu'un groupe tertiobutyle plus stable ne s'accompagne pas d'une perte d'inhibition. On constate également qu'une hydroxylation ou une amination (NH2PAS) en position ortho, permet une augmentation très significative de l'inhibition de l'activité CAD (90% d'inhibition à 2mM). Des études chimiques (cinétique par spectrophotométrie en lumière ultraviolette, RMN et IR) permettent d'émettre des hypothèses sur les mécanismes d'action possible de ces composés sur l'activité alcool cinnamylique déshydrogénase. - 22 - L'inhibition résulterait, notamment, de la complexation du zinc par un produit de l'hydrolyse du cQmposé initial. En effet, les produit de l'hydrolyse du composé initial. En effet, les composés NPSI et NPSP non hydrolysables, n'inhibent pas l'activité CAD. On observe, par ailleurs, que les composés substitués en position ortho constituent de meilleurs tché- lateurs du bromure de zinc et d emeilleurs inhibiteurs de l'activité enzymatique que les composés substitués en position méta ou para. Ces données suggèrent une inhibition du type "suicide, 1 'activation de la fonction réactive s'effectuant par hydrolyse de l'inhibiteur au niveau du site actif de l'enzyme. L'étude des modalités d'action des composés 2 et 5 savoir respectivement le N-(o-hydroxyphényl)sulfinamoyl acétate de tertiobutyle et le N-(o-aminophényl)sulfamoyl acétate de t-butyle inhibent la CAD de manière faiblement réversible, révélant ainsi une dissociation partielle et lente du complexe enzyme-inhibiteur. Le composé 2 se caractérise en regard des enzymes testées par une spécificité stricte vis-à-vis de la CAD. Le composé 5, en revanche, inhibe également la CCR. EXEMPLE 5: Etude in vitro de l'activité inhibitrice vis-à-vis de la CAD de divers composes. On rapporte dans le tableau 2 suivant les pourcentages d'inhibition de la CAD obtenus en utilisant, à raison de 2 mM, différents composés capables de complexer Zn. iABLEAU 2 i111112 imaX COMPOSES INHIBITION à 2mM % AN-CH2-S-CH -COOH O O.40 Acide oxo-5-phényl-5-thia-3 2,.. - 40 HO >j HCH2OQS M3C-O OH O.' (Hydroxy-4-methoxy-3-phényl)-3- Hydroxy-3-propanethiate de 5- phényle (HMHP) { - o/CH CH-N-C-CH3 \CH3 50 N-tert-butyl-methoxy-2 (Iminomethyl) - 4 phénol (BIP) 0 O-NH-VQ5N-(Thiazolyl-2) Sulfanilamide (NTS) ....,.___..DTD: On constate une activité inhibitrice satisfaisante de ces produits, mais, ils ne sont pas, en tant que {els, hydrosolubles. Les dispositions données dans la description concernant les inhibiteurs de formule I s'appliquent pour ces produits.- 59646 - 24 - EXEMPLE 6: Action in vivo d'inhibiteurs selon l'inven- tion sur la lignification. On rapporte ci-après les résultats obtenus avec les composés 2 et 5 désignés respectivement ci-après par OHPAS et NH2PAS. Pour évaleur l'effet de ces inhibiteurs sur le processus de lignification, on a étudié notamment leur action: 1) sur le taux d'incorporation d'un traceur radioactif correspondant à un précurseur des lignines, à savoir l'acide cinnamique (14C3), dans des fractions de xylème de peuplier isolées à partir de tiges de peuplier (ce qui représente un moyen rapide d'évaluer le flux de synthèse des lignines sur un système simplifié) et dans les parties aériennes du peuplier (ces expériences de plus longue durée conservent un caractère de mesure dynamique, se rapprochant des conditions physiologiques). 2) sur les quantités de lignines formées par des cultures de plusieurs semaines de plants de mais, réalisées en présence d'inhibiteurs. Dans ce cas, l'effet est observé sur l'accumulation du polymère dans des conditions naturelles. - 25 - 1)- Etude de l'effet des inhibiteurs sur la synthèse des lignines radioactives à partir d'acide cinnamique (14C3). a) dans des fractions de xylème isolées à partir de tiges de peuplier. L'acide cinnamique (149mCi/mmole,CEA) est apporté aux fractions tissulaires isolées à partir de jeunes tiges de peuplier selon la technique de GRAND décrite dans la thèse de 3ème cycle mentionnée ci-dessus. Les tissus de xylème isolés (300 mg par essai) sont mis en suspension dans des fioles d'erlenmeyer (25m1), bouchées par du coton cardé contenant: du tampon Tris/HCl, O,1M, pH 7,5 (qsp 5ml) maintenant le pH entre 7 et 8, - du Dextran T40 (25 g/l) utilisé comme agent osmotique, ne constituant pas une source de carbone pour la cellule végétale, - due mercaptoéthanol (O,lmM), antioxydant qui empêche un brunissement très rapide des tissus, de l'éther monométhylique de l'éthylène glycol (EMMEG) (50 pl) ou des inhibiteurs solubilisés dans ce polyol (50 11), - de l'acide cinnamique (14C3) (2,5 PCi). Les fioles sont palcées à 26 C, sous agitation orbitale (agitateur New Brunswick modèle G 10,100 rpm) et sous un éclairement de 4000 lux pendant 30 h. La radioactivité incorporée par les lignines est alors estimée à partir de "poudre alcool-benzène" obtenu par extraction à l'alcoolbenzène des fractions tissulaires lyophilisées et réduites en poudre. Afin de mesurer l'absorption de l'acide cinnamique par les fractions tissulaires et de corriger d'éventuelles - 26 - différences d'absorption selon les essais, une fraction aliquote du milieu d'incubation (50 p1) est prélevée à différents temps et la radioactivité estimée au compteur à scintillation liquide. La mesure de la radioactivité libérée sous forme de 14C2CO après combustion totale des "poudres alcool-benzène" révèle qu'en présence du OHPAS ou du NH2PAS, on observe une baisse de la radioactivité retrouvée dans les lignines. Ainsi, ces inhibiteurs entraînent à la concentration de lmM, une inhibition de 40 à 70% de la synthèse des lignines radioactives. Ces résultats sont rapportés dans le tableau 3 ci-après: TABLEAU 3 Effet du OHPAS et du NH2 PAS sur l'absorption de l'acide cinnamique (14C3) et son irorporatio dans les lignines par des fractions isolées de xyle. Inhibiteurs Radioactivité Radioactivité Taux de radio- Inhibition absorbée incorporée dans activité incorporé (%)b (iCi/essai)a les lignines dans les lignines (yCi/essai)a (%) Témoin 1.05 0,35 33 0 OHPAS 0, 2mM 0,75 0,18 24 17 lmM 0,75 0,075 10 70 . _,,...._.. --. NH2PAS 0,2 mM 0,80 0,26 32 4 1 mM 0,80 0,16 20 40 -(a) Les résultats sont exprimes par essai, les rapports masse de végétal/radioactivité fournis étant identiques. - (b) Le pourcentage d'inhibition a été calculé en prenant conme valeur 100 le pourcentage de radioactivité incorporé dans le témoin. - Les valeurs correspondent à une moyenne de 3 déterminations. - 27 - b) dans les tiges de peuplier - Afin de vérifier chez des tiges de peuplier l'action de 1'OHPAS et du NH2PAS, on réalise des incorporations d'acide cinnamique (5 yCi) à des rameaux comportant 12 entrenoeuds selon la technique de la tige sectionnée décrite par BOUDET,dans C.R. Acad. Sci.Paris, p. 1966-1968, 269, 1969. La radioactivité des lignines est mesurée après 96 heures de métabolisation. Lorsque la métabolisation est effectuée en présence du OHPAS et du NH2PAS, on observe une diminution de la radioactivité incorporée dans les lignines. Ainsi, 1'OHPAS, à la concentration de 160 yM inhibe de 46% l'incorporation de l'acide cinnamique dans le polymère. Bien que les concentrations en inhibiteurs soient plus faibles, l'effet des inhibiteurs apparaîtiemanifester de façon plus nette pour une métabolisation de plus longue durée. 2- Effet des inhibiteurs sur des plants de mais - Des plants de maïs ont été traités pendant 10, 20 ou 30 jours par 1'OHPAS et le NH2PAS à deux concentrations (80 et 160 JM). Les inhibiteurs sont ajoutés au milieu nutritifo Les cultures sur vermiculite (20 plants) sont arrosées quotidiennement par 250 ml de milieu (avec ou sans inhibiteurs). Les semis constituent le temps 0 de la culture, l'addition des inhibiteurs au milieu nutritif - 28 - est réalisée dès l'émergence de la partie aérienne (2 à 3 jours). Les différentes caractéristiques des plants sont estimées après 10, 20 ou 30 jours. al) - Influence du traitement sur la croissance des plants de mais - Le traitement par les deux inhibiteurs conduit à des plants de mais dont les caractéristiques pondérales et les teneurs en eau sont données dans le tableau 4. L'analyse des résultats ne montre aucune différence signi- ficative entre les plants traités et les plants témoins. De même, les tailles et l'aspect morphologique des diffé- rents lots sont similaires. Toutefois, on constate que le port dressé des mais est légèrement affecté. TABLEAU 4 Caractéristiques pondérales des plants de mais témoins et traités par 1'OHPAS ou le NH2PAS. Les valeurs mentionnées correspondent à une moyenne de 20 plants. TPoids matériel frais g/plant Poids materiel-sec g/plant Teneur en eau g/g de poids sec de cul ture.n Témoin O IPAS NIIPA S Témoin OlIPAS N PA S Témoin 11APASS d cul Lure j dlI2P NI2P I 1I2PAS Individus traités par une concentration de 80JM en inh. 1,90 2,uo 1,80 0,103 0,103 0,108 17,40 18,40 15,70 3,12 3,20 3,00 0.301 0,318 0,298 9,36 9,06 9,07 4,58 4,65 4.,40 0,4110,4200.,438 9,38 10,07 9,04 - 29 - INDIVIDUS TRAITES PAR 160 pm en INHIBITEURS 1,10 0,98 1,00 0,091 0,083 0,088 11,08 10,81 13,36 3,05 2,98 3,25 0,306 0,300 0,321 8,96 8,93 9,12 4,75 4,52 4,80 0,419 0,429 0,458 10,34 9,53 9,48 a2)' - Influence du traitement sur les teneurs en lignines Après hydrolyse par la soude des "poudres alcool-benzène" dans des conditions qui éliminent les acides cinnamiques estérifiés à la paroi,on estime les teneurs en lignines par la méthode de KLASON Les résultats obtenus montrent que les traitement des plants par l'OHPAS ou le NH2PAS conduit à une baisse sigoine- tive des teneurs en lignines. Ainsi pour une concentration de 80yM et 30 jours de culture, les deux composés entraînent une inhibition de 40 à 50%. En outre, l'augmentation de la concentration des inhibi- teurs de 80 à 160 yM ne s'accompagne pas de modification des taux d'inhibition. Les données obtenues confirment l'action de l'OHPAS et du NH2PAS sur le processus de la lignification déjà notée lors des études d'incorporation d'acide cinnamique (14C3) dans les lignines à partir des tiges de peuplier. a3) - Etude de la spécificité d'action des inhibiteurs in vivo - Les différentes études dont les résultats sont rapportés ci-après ont été réalisées à partir de plants de mals - 30 âgés de 30 jours et traités par 1'OHPAS et le NH2PAS à la concentration de 80 ulM. - Influence des inhibiteurs sur le mé- tabolisme primaire - .,......1........,........ _...DTD: Afin d'estimer l'action de i'OHPAS et du NH2PAS sur le métabolisme primaire, les teneurs de trois classes de composés ont été estimées: les protéines solubles, les chlorophyllles et les acides nucléiques. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau 5 suivant: TABLEAU 5 Protéines Chlorophylles ARN ADN solubles (mg/g PS) (mg/g PS) (mg/g PS) (g/g PS) Témoin. 49,40 + 2 7,45 - 0,4 19,54 + 0,3 1,40 0,8 OHPAS 49,50 t 1 7,80 + 0,3 21,08 t 0,3 1,35 0,6 NH2PAS 49,30 + 2 7.69 - 0,3 19,81 + 0,2 1,38 0,7 - + 0,38,0,7 L':examen de ce tableau montre que le traitement des plantules de maïs par les inhibiteurs ne s'accompagne pas de modification des teneurs en ces composés suggérant ainsi que le mé'tabolisme primaire n'est pas, globalement affecté. - 31 - Influence sur les teneurs en Do].ysaccnarides pariétaux - Le dosage de l'ensemble des polysaccharides pariétaux mais écalement de la fraction cellulosique n'a révélé aucune différence significative entre les plants témoins et les plants traités. Ainsi, le traitement de plants de mais par 1'OHPAS et le NH2PAS n'apparaissent pas affecter la synthèse de la fraction polysaccharidique de la paroi. vInfluence des inhibiteurs sur les teneurs en composés phénoliques solubles - Le traitement des plants par les inhibiteurs ne modifie pas les teneurs en ces composés comme le montrent les ô* résultats rapportés dans le tableau 6 ci-après. Cependant, on constate une baisse importante (40% avec 1'OHPAS) des quantités de flavonoides. Ces résultats suggèrent que 1'OHPAS et le NH2PAS affectent, outre le processus de lignification,la synthèse des flavonoides. TABLEAU 6 _ _* ____ __.,... ESSAIS |PIIENOLS SIMPLES % PERTE FLAVONOIDES % PERTE Témoin 102 + 8 0 48 10 O Traités par OHPAS 107 - 8 O 28 11l 42 Traites par NH2PAS i 11 1)0 25 + 14 48 * - Les résultats sont exprimés en mg d'acide gallique par g de matériel et - les valeurs correspondent à une moyenne de 3 déterminations. Des résultats analogues ont été obtenus avec les inhibiteurs de formule 1 dans laquelle Ar représente un hétérocycle, en particulier, un hétéro- cycle azoté pyridyle ou pyrimidyle. Les composés dans lesquels z représente un atome d'halogène ou un groupe alcoxy ont également donné des résultats satisfaisants. De même, l'utilisation de divers groupes esters sur la chaîne latérale permet d'obtenir des inhibiteurs efficaces. L'ensemble des résultats ci-dessus met en évidence les propriétés avantageuses des inhibiteurs de l'inven- tion. En particulier, ces inhibiteurs possèdent in vivo une activité nettement supérieure à celle observée in vitro. Une inhibition d'au moins 40%, pouvant dépasser 70%, est obtenue à des concentrations de seulement 80 tM,alors que de tels effets ne sont obtenus qu'à des concentrations de 2mM in vitro. L'étude de cette famille d'inhibiteurs a également montré qu'ils n'affectaient pas sensiblement les autres constituants biochimiques de la plante, ce qui ne pouvait être prévisible sur la base des résultats in vitro. L'efficacité de ces inhibiteurs qui se sont révélés de plus dépourvus de toxicité pour les plantes est donc avan- tageusement mise à profit, selon l'invention,pour moduler en baisse la lignificaiton des végétaux, en vue de leur utilisation dans divers domaines; L'étude de la digestibilité par les animaux de plantes fourragères telles que fétuques, luzerne hypolignifiées montre une meilleure assimilation du végétal, ce qui permet d'augmenter la productivité. On a également augmenté la conservation de divers végétaux traités pendant leur culture à l'aide des inhibiteurs de l'invention. Des productions végétales utilisables pour l'alimentation humaine, qui habituellement deviennent impropres à la consommation deux ou trois semaines après leur récolte, peuvent être ainsi conservée plusieurs mois. D'une manière générale l'invention fournit donc les moyens de valoriser la biom asse végétale, en réduisant le taux de lignine qui constitue quantitativement dans les végétaux le second polymère après la cellulose. 2559646 ' REVENDICATIONS 1.- Procédé de réduction du taux de lignine de végétaux, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre au moins un dérivé de formule I: Ar-NH-A-C(H)R -C- OR 1 t dans laquelle - Ar représente au mains un cycle aromatigue en particulier, un groupe phényle ou un hêtérocycle, en particulier un hétérocycle azoté tel qu'un radical pyridyle ou pyrymidyle, le groupe aromatique ou hétéro- cyclique étant, le cas échéant, substitué par au moins un radical Z en position ortho, méta ou para, choisi de préférence parmi le groupe -OH,un radical alcoxy renfer- mant 1 à 4 atomes de carbone, -NH2, -NH(alc. ou Ar.) -N-(alc.)2, alc. représentant ulin aroupe alcoyle,.rbnt,del a 4 atomes de carbone et R représentant un radical aromatique, tel qu'un qrouDe phényle, - O - A représente un groupe -U ou O o - R1 représente un radical alcoyle, en particulier, méthyle ou éthyle, ou un atome d'hydrogène, et - R représente un radical alcoyle linéaire ou ramifié, de préférence de 1 à 4 atomes de carbone, ou un Atome d'hydrogène. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre au moins un dérivé de Z H'-)Ri-j-OR dans laquelle Z,R1 et R présentent les significations données ci-dessus. 3.- Procédé selon la revendication 2,caracté- risé en ce qu'on met en oeuvre au moins un dérivé de formule IIA ou IIB. NH. NHSC(H)RlCOOR (I) XNYH-S-C(H>)R -COOR (IIA) cu NHS (HR R (IIB) O darslefUeL s les substituants Z, R1 et R présentent les significations indiquées en rapport avec la formule II. 4.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre au moins un dérivé de formule III Ar.-NH-S-CH(R1)-C-OR (III) 1 1 I1 O O dans lquelle Ar, R1 et R présentent les significations données en rapport avec la formule I. 5.- Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on met en qeuvre au moins un dérivé de formule IIIA ou IIIB: O X -NH-S-CH (R1)-C-OR(IIIA-) ZO o o NH-S-CH(R1)-C-OR (IIIB) Z O0 dans laquelle les substituants Z, R1 et R présentent les significations indiquées en rapport avec la formule III. 6.- Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 5, caractérisé en ce que le substituant Z représente un groupe en position ortho. 7.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que Z représente un groupe -OH ou -NH2. 8.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre le dérivé à raison d'au moins 50yM. 9.- Composition pour la réduction du taux de lignine dans les végétaux caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité efficace d'au moins un dérivé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, le cas échéant en combinaison avec des agents nutritifs ou de traitement des végétaux. 10.- Composition selon la revendication 9 sous forme de solution aqueuse. 11.- Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 au traitement des plantes fourragères et des productions végétales.