FR 2557455 A1 19850705 FR 8408539 A 19840530 - 1 - La présente invention se rapporte à un anti- biotique 81-484 nouveau antitumeur et à un procédé de sa production et elle concerne, plus particulièrement, l'antibiotique 81-484 qu'on produit en cultivant un micro- organisme producteur d'antibiotique 81-484 appartenant au genre Streptomyces, n'ayant pas d'activités antibiotiques contre les bactéries Gram-positives et négatives, possé- dant une activité antimicrobienne contre certains types de mycètes et possédant des activités anhibitrices de croissance contre les cellules P388 de leucémie des sou- ris et les cellules de sarcome 180, ou un sel de celui-ci et un procédé de production de l'antibiotique. La Demanderesse a trouvé qu'une souche 81-484 isolée d'un échantillon de sol collecté dans la Préfecture de Chiba (Japon) produit une substance antibiotique faisant preuve d'activité antimicrobienne contre les cellules de leucémie P388 de souris et les cellules 180 de sarcome. On a isolé cette substance antibiotique de la masse cultivée et on l'a purifié pour obtenir un produit ayant des pro- priétés physico-chimiques nouvelles. Cette substance est appelée antibiotique 81-484. La présente invention a pour objet un anti- biotique nouveau 81-484 ou un sel de celui-ci. L'invention a encore pour objet un procédé de production de l'antibiotique 81-484 ou d'un sel de celui- ci, qui consiste à cultiver un microorganisme producteur d'antibiotique 81-484 appartenant au genre Streptomyces dans un milieu pour accumuler l'antibiotique 81-484 et pour l'isoler du milieu et, si nécessaire, à convertir ledit antibiotique en son sel non toxique. Le microorganisme producteur de l'antibiotique 81-484 appartient au genre Streptomyces et la souche 81-484 appartenant au genre Streptomyces isolée par l'un des Demandeurs ne constitue qu'un exemple non limitatif. Les propriétés taxinomiques de cette souche 81-484 sont comme suit: - 2 (a) Propriétés morphologiques Une souche 81-484 pousse sous une forme abondamment fila- menteuse sur de nombreux milieux en plaquettes d'agar-agar. On ne constate pas de dissection de mycéliums de substrat. Quand des mycéliums aériens sont formés, le sporangiophore est droit ou formé de spirales incomplètes lâches ayant au sommet des chaînes de plus de 20 spores et on n'observe pas de sporanges. La surface des spores est lisse et elliptique ayant 0,8 micron de grand diamètre et 0,4 micron de petit diamètre. -3- (b) Les conditions de croissance sur divers milieux à 27 C pendant 3 semaines de culture sont comme suit Couleur de Couleur surface Pigment Milieu Croissance du des slnt verso mycéliums soluble aériens Agar- Agar Jaune Ivoire Blé Levure- malt bonne pastel v e b (ISP M2) (1,5fb) (2db) 2fb) Agar- agar de farine presque d'avoine pas (ISP M3) Agar- agar de sel de sel Ivoire Ivoire Ivoire minéral restreinte (2db) (2db) (2db) d'amidon (ISP M4) Agar - agar Agar -gagar Gris Blanc Blanc de gbonne jaunâtre brunâtre brunâtre asparagine (2ca) (3ca) (3ba) (ISP M5) Agar- agar Jaune Jaune de peptone restreinte orange orange (2hb) levurefer pâle pâle (ISP M6) (3ea) (3ea) Agar- agar Grisbrunâtre Jaune brun Gris brunâtre de tyrosine bonne clair grisâtre clair (ISP M7) (3ec) clair (2ie) (2ec) On effectue les opérations selon le procédé ISP (International Streptomyces Project). On détermine la couleur en consultant: Color Harmony Manual (4ème édition) de Wilhelm Ostwald. -4- (c) Propriétés physiologiques 1.- Température de croissance: entre 20 et 37 C et, pour croissance optimale, 27 C. 2.- Liquéfaction de gélatine (milieu glucose-peptone- gélatine): négative. 3.- Hydrolyse d'amidon (milieu amidon-agar-agar minéral): négative. 4.- Coagulation et peptonisation de lait écrémé (milieu à % de lait écrémé): négative pour coagulation, posi- tive pour peptonisation. 5.- Formation de pigment de mélanine (milieu d'agar-agar de tyrosine et milieu d'agar-agar de peptone-levure-fer): négative. 6.- Formation de H2S (milieu d'agar-agar de peptone-levure- fer): négative. 7.- Formation de sulfite (milieu de sulfate): positive. (d) Assimilation des sources de carbone (observée sur milieu agar-agar de Pridham-Gottlieb à 27 C pendant 1-mois): (++: bonne utilisation; +: utilisation, - = non utili- sation): L-arabinose - D-xylose - D-glucose ++ D-fructose - saccharose - inositol + L-rhamnose + raffinose - D-mannitol - -5- (e) Composition des parois des cellules (Procédé selon Becker et al. (Appli. Microbiol., 13, 236- 243 (1965)) acide diaminopimérique du type LL. Selon les propriétés taxinomiques ci-dessus, la souche 81-484 appartient au genre Streptomyces. L'espèce exacte de cette souche n'a pas été élucidée et c'est pour cela qu'on l'appellera Streptomyces 81-484. Cette souche a été déposée au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, M.I.T.I., Japon sous le n FERM-P 7371. En général, les propriétés taxinomiques de Streptomyces sont faciles à muter si bien qu'on peut appliquer facilement une mutation naturelle ou artifi- cielle découlant des techniques classiques de mutation, par exemple l'irradiation aux rayons U.V. ou X, ou encore un traitement avec un mutagène tel que N-méthyl-N-nitro-N- nitrosoguanidine ou le sulfonate d'éthylméthane. Ces mu- tants naturels et artificiels appartenant au genre Streptomyces et possédant une activité productrice d'antibiotiques 81-484 peuvent servir dans la présente invention. Dans le procédé de la présente invention, on cultive le microorganisme producteur d'antibiotique 81-484 appartenant au genre Streptomyces, de préférence Streptomyces 81-484 FERM-P 7371, dans un milieu approprié pour Streptomyces. On peut utiliser un milieu nutritif contenant des sources assimilables de carbone et d'azote et, le cas échéant, un sel minéral. Comme exemples de sources assi- milables de carbone, on peut citer le glucose, la mélasse, l'amidon, la dextrine, la cellulose, la glycérine et les sels organiques. On utilise ces agents séparément ou en combinaison. Comme exemple de sources assimilables d'azote, on peut citer l'azote organique tel qu'une peptone, un - - 6 5 -6- extrait de viande, un extrait de levure, la levure sèche, la poudre de soja, la liqueur de macération du mais, l'huile de graines de coton, la caséine, l'hydrolysat de protéines de soja, les amino-acides et l'urée ou l'azote minéral tel qu'un nitrate et un sel d'ammonium. Eventuel- lement, on peut utiliser un sel minéral de sodium, potas- sium, calcium ou magnésium dans un phosphate ou dans d'autres sels. D'autre part, on peut éventuellement ajouter à ce milieu des traces d'un agent nutritif, un stimulant ou un précurseur de croissance de l'antibiotique 81-484 etc. On effectue la culture, en général par la tech- nique de culture secouée ou de culture à agitation par aération. On préfère dans une production industrielle la culture à aération submergée. De préférence, le pH du milieu est un pH neutre. La température de culture est de à 37 C, le plus souvent de 24 à 30 C et, mieux encore, de 27 C. La durée de la culture est habituellement de 4 à 6 jours pour une culture liquide. De préférence, on peut arrêter la culture à la production maximale d'antibiotique dans un milieu. En ce qui concerne les conditions de cul- ture, on doit naturellement régler la température, l'agita- tion, l'aération et d'autres paramètres de culture selon la nature des souches individuelles. Pour empêcher le moussage, on peut ajouter un agent d'antimoussage tel qu'une huile siliconique, une huile végétale et un agent tensio-actif. L'antibiotique 81-484 est principalement accu- mulé dans un filtrat de culture et par conséquent on filtre la masse cultivée à l'aide d'un adjuvant de filtrage tel que "Celite" ou "Hyflosupercel" (marques déposées), ou bien on effectue une centrifugation pour séparer les mycé- liums et le filtrat d'o l'antibiotique est avantageuse- ment isolé. L'antibiotique 81-484 est aussi incorporé dans les mycéliums et on l'isole par extraction avec le méthanol 2557?455 -7- ou l'acétone, la concentration sous vide de cet extrait et la purification de la même façon que l'isolement à partir du filtrat. Etant donné que l'antibiotique 81-484 est inso- lubie dans l'hexane et l'eau et est soluble dans de nom- breux solvants organiques, par exemple un alcool solvant tel que le méthanol ou l'éthanol, un solvant du type chloroforme tel que le dichlorométhane ou le chloroforme, ou un solvant du type cétone tel que l'acétone, ou la méthylisobutylcétone et puisque l'antibiotique est de nature acide on effectue la purification en appliquant des produits de caractère acide. En général, on extrait le filtrat de culture avec un solvant organique non mis- cible à l'eau, comme le chloroforme, la méthylisobutyl- cétone, l'acétate d'éthyle ou l'acétate de butyle pour le transférer dans le solvant organique. Au stade d'extrac- tion, on règle, de préférence, au préalable le filtrat de culture à pH 3,0 à 5,0. On lave facultativement la couche de solvant organique avec une solution aqueuse de tétraacétate d'éthylènediamine pour éliminer les ions métalliques et on déshydrate en ajoutant par exemple un sulfate de sodium anhydre, un sulfate de magnésium anhydre ou un gel de perles. On concentre la couche déshydratée de solvant organique sous vide. Bien que l'antibiotique 81-484 soit stable pour le chauffage, on le concentre avantageusement au-dessous de 60 C. On ajoute de l'hexane ou de l'éther de pétrole aux concentrés afin de précipiter l'antibiotique 81-484. On lave le précipité ainsi obtenu avec de l'hexane et on purifie par filtration et centrifugation, après quoi on peut obtenir l'antibiotique 81-484 sous forme d'une substance brute de couleur brunâtre. On effectue une purification supplémentaire en tirant parti de la différence de solubilité entre -8- l'antibiotique 81-484 et les agents de contamination, de la différence du rapport des distributions de deux liquides non miscibles ou la différence d'adsorption des agents d'adsorption. Les moyens préférés sont la chromatographie, par exemple la chromatographie par adsorption utilisant une résine d'adsorption telle que le gel de silice, l'alumine, la cellulose activée ou l'hydroxyappatite HP-20, la chromatographie par cloisonnement des phases inversées utilisant un gel de silice traité au silane ou à l'octadécylsilane, la chromatographie par filtration de gel avec tamis moléculaire utilisant "Sephadex LH-20" ou "Toyopearl" (marques déposées) ou la chromatographie par échange d'ions utilisant DEAE-cellulose, DEAE- Sephadex ou DEAE-Toyopearl (marques déposées). On peut purifier l'antibiotique 81-484 en appli- quant les moyens indiqués de chromatographie, d'électro- phorèse, de distribution à contre-courant, d'ultra- filtration ou de distillation ou d'autres moyens encore individuellement ou en combinaison avec leurs séries facultatives. Par exemple, on adsorbe la substance brute dissoute dans une petite quantité de chloroforme ou de benzène sur une colonne tassée de gel de silice et on chromatographie à l'aide d'un mélange d'hexane et d'acétone. On recueille les fractions actives et on les concentre sous vide. On adsorbe le concentré dissous dans une petite quantité de chloroforme sur une colonne de gel de silice et on chromatographie à l'aide d'un solvant mixte de chloroforme et de méthanol. On recueille les fractions actives et on les concentre sous vide. On chro- matographie de nouveau les concentrés dissous dans une petite quantité de méthanol en adsorbant avec une colonne de gel de silice à phase inversée et en éluant avec un mélange de méthanol et d'eau pour purifier l'antibiotique 81-484. -9- L'antibiotique 81-484 est une substance acide et on peut le préparer sous forme d'un sel par un procédé connu. Un exemple d'un sel est un sel non toxique pharma- cologiquement acceptable, par exemple un sel de métal alcalin tel que le sodium ou le potassium, un sel de métal alcalino-terreux tel que le calcium ou le magné- sium ou un sel connu avec une amine organique. Les propriétés physico-chimiques et biologiques de l'antibiotique 81-484 sont comme suit: I. Propriétés physico-chimiques 1.- Propriétés: matière huileuse visqueuse incolore ou jaune pâle; 2.- Formule élémentaire: C33H4807 (spectre de masse à haute résolution); 3.- Poids moléculaire: 556 (spectre de masse à désorp- tion de champ); 4.- Point de fusion: pas de point de fusion net (huileux à 10-100 C); -5 (,,mtao) 5.- Rotation spécifique: [a] D = _151 (c = 0,1,méthanol); 6.Spectre d'absorption UV: représenté sur la Figure 1 (dans méthanol); 7.Spectre d'absorption I.R.: représenté sur la Figure 2 (pastille de KBr); 8.- Solubilité: insoluble dans hexane et eau; soluble dans: éther diéthylique, méthanol, dichloro- méthane, chloroforme, acétate d'éthyle, acétate de butyle, acétone et benzène; 9.- Spectre RMN: représenté sur la Figure 3 (400 Hz, CDCl3, TMS); 10.-Nature: substance acide; - 10 - 11.- Réaction de couleur: - négative: nihydrine, anthrone-H2SO4, chlorure ferrique; - positive: iodure, trichlorure d'antimoine; - faiblement positive: réaction de Zatkis; 12.- Chromatographie sur couche mince de gel de silice (support: gel de silice 60); Merck: Rf = 0,33 (acétate d'éthyle::méthanol =40:1) Rf = 0,28 (chloroforme: méthanol = 10:1) II. Propriétés biologiques 1. Spectre antimicrobien CIM Organismes testés (g/ml) Staphylococcus aureus FDA 209P >50 Bacillus subtilis PCI 219 >50 Sarcina lutea PCI 1001 >50 Escherichia coli NIHJ >50 Shigella sonnai >50 Saccharomyces sake >50* Candida albicans >50* Schizosaccharomyces pomb IAM 4803 0,1** Trichophyton ferginium >50** CIM: concentration inhibitrice minimale Titrage par le procédé au disque de papier en utilisant un disque "ToYo", de 8 mm de diamètre (marque déposée) sur un agar-agar nutritif (agar-agar: 1,0 %, ** 0,5 %) exepté sur l'agar-agar de pomme de terre*. L'antibiotique 81-484 fait preuve d'activité antimicrobienne contre certains types de mycètes mais d'aucune activité antibactérienne contre les bactéries Gram-positives. 2557455' - 1i - 2. Activité antitumeur 1) Effet sur la leucémie de souris P-388 On inocule 1 x 105 cellules de leucémie de souris P-388 par voie I.P. à cinq souris d'un groupe, CDF1, femelles, agées de 5 semaines et on administre l'antibiotique comme indiqué dans le Tableau I. TABLEAU I Survie Rapport de Administration Administration jours prolongement (mg/ kg /jour) (jour) Valeur moyenne (%) de la vie moyenne Témoin - 12 0 0,016 1 - 5 19 58 0,008 1 - 5 16 33 La date d'administration est réglée au jour 0, le jour de l'inoculation de la tumeur. Les chiffres de survie sont exprimés par la moyenne sur cinq souris d'un groupe. On calcule le rapport de prolongement de la vie par l'équation suivante: moyenne de jours de survie, traitées Rapport de prolongement de la vie (%) = x 100-100 moyenne de jours de survie, témoins 2) Effet sur sarcome 180 On inocule 1 x 106 cellules de sarcome 180 par voie I.P. à des souris, souche ICR, femelles, âgées de 5 semaines et traitées comme indiqué dans le Tableau II. - 12 - TABLEAU II Administration Administration Jours de Rapport de (mg/kg/jour) (jour) survie (valeur prolongement moyenne) de la vie (%) Témoin - 12 0 0,031 1 - 5 20 67 0,016 1 - 5 28 133 0,008 1 - 5 22 83 On règle la date d'administration au jour 0, c'est-à-dire le jour de l'inoculation de la tumeur. Les jours de survie sont indiqués par une valeur moyenne pour souris d'un groupe alors qu'on calcule le rapport de prolongement de la vie par l'équation donnée dans le pa- ragraphe 1) ci-dessus. Comme on le voit sur les Tableaux I et II, l'antibiotique 81-484 possède une activité antitumeur contre la leucémie P-388 et le carcinome d'ascite de sarcome 180. Jusqu'à présent, on a déjà présenté des anti- biotiques ayant des propriétés ressemblantes à celles de l'antibiotique 81-484, sous le nom d'antibiotique ATS- 1287 (demande non examinée de brevet japonais 55-118499) et Leptomycines A et B (J. Antibiotics, 36 [6], 639-650 [1983]). Cependant, l'antibiotique ATS 1287 diffère des points de vue de rotation spécifique et de spectre RMN. Les Leptomycines A et B diffèrent des points de vue de la formule moléculaire, de la rotation spécifique et du spectre RMN. En conséquence, on peut déduire que l'anti- biotique 81-484 est un antibiotique nouveau. Les exemples suivants servent à illustrer l'in- vention sans aucunement en limiter la portée: - 13 - EXEMPLE 1 CULTURE DE LA SOUCHE 81-484 On stérilise un milieu de culture liquide (milieu A) à pH 7 (100 ml x 30) dans un ballon Erlenmeyer de 500 ml consistant en 2,0 % de glucose, 0,5 % de peptone, 0,5 % d'extrait de viande, 0,3 % de levure sèche, 0,5 % de NaCl et 0,3 % de carbonate de calcium. On inocule une souche de Streptomyces 81-484 FERM-P 7371 cultivée sur un milieu penché d'agar-agar comprenant 1 % de glucose, 0,5 % de peptone, 0,5 % d'extrait de viande, 0, 3 % de NaCl et 1,2 % d'agar-agar et on cultive par agitation à 27 C pendant 72 heures avec une amplitude de 17 cm, 120 courses alter- natives à la minute et on prépare ainsi une culture d'en- semencement. On inocule de façon aseptique 2,5 litres de culture d'ensemencement dans 120 litres du milieu A au sein d'une cuve de fermentation de 200 litres et on cultive par voie aérobie pour obtenir une culture liquide d'environ litres. EXEMPLE 2 EXTRACTION DE L'ANTIBIOTIQUE 81-484 On filtre la culture liquide obtenue dans l'exem- ple 1 après addition d'un adjuvant de filtrage. On fait passer le filtrat et le liquide lavé des mycéliums (120 litres) à travers une colonne d'Amberlite XAD-7 (marque déposée) d'une capacité de 5 litres pour adsorber le prin- cipe actif. On lave la colonne avec de l'eau et une solu- tion aqueuse à 20 % d'éthanol pour éluer les agents de contamination et on élue le principe actif avec une solu- tion aqueuse à 40 % d'éthanol. On concentre l'éluat (25 litres) sous vide en 300 ml environ et on élimine le préci- pité par filtration. On agite soigneusement le concentré - 14 - additionné d'acétate d'éthyle. On déshydrate la couche d'acétate d'éthyle séparée en ajoutant du sulfate de sodium anhydre et on concentre sous vide pour obtenir un antibiotique huileux 81-484 (20 g). EXEMPLE 3 PURIFICATION PAR CHROMATOGRAPHIE SUR GEL DE SILICE On charge la matière huileuse obtenue dans l'exemple 2 sur une colonne (46 x 600 mm) de gel de silice (Merck) préalablement garnie avec de l'hexane et on élue avec un changement progressif de l'hexane en acétone. On concentre les fractions actives sous vide et on absorbe de nouveau sur une colonne de gel de silice précédemment garnie d'hexane et on élue avec changement progressif de l'hexane en acétate d'éthyle. On concentre les fractions actives sous vide et on obtient l'antibiotique brut 81-484 (100 mg, pureté 50 %). EXEMPLE 4 ISOLEMENT PAR CLHP On applique pour continuer la purification la chromatographie liquide à hautes performances (CLHP) (Japan Spectrophot. TRIROTAR-V, UVIDE-100-V, VL-613, GP-A40). On garnit une colonne d'acier inoxydable (10 x 250 mm, Showa Denko Co.) avec du gel de silice octadécylsilanique (Showa Denko Co. Fine SIL C18-10). On injecte dans une colonne l'antibiotique brut 81-484 (1 mg) provenant de l'exemple 3 en dissolution dans 100 microlitres de méthanol, on développe avec un mélange d'eau et de méthanol (30:70, moyen pour CLHP) et on chromatographie. On recueille le pic qui correspond à l'antibiotique 81-484 en détectant l'absorption U.V. à 220 nm. On distille le méthanol sous vide et on ajoute au - 15 - résidu de l'acétate d'éthyle. On agite le mélange à un pH acide pour transférer l'antibiotique dans la couche d'acé- tate d'éthyle. On lave la couche d'acétate d'éthyle avec de l'eau purifiée et on sèche sous vide pour obtenir 400 microgrammes d'antibiotique purifié 81-484. On répète les mêmes opérations de très nombreuses fois et on obtient à chaque fois un antibiotique 81-484 (environ 200 mg). Sur les dessins annexés: La Figure 1 représente un spectre U.V. de l'antibiotique 81-484; -. La Figure 2 représente un spectre I.R. de l'antibiotique 81-484; et La Figure 3 représente le spectre RMN de l'antibiotique 81-484. REVENDICATIONS 1 - Antibiotique 81-484 ou son sel, caractérisé en ce qu'il possède les propriétés physico-chimiques suivantes: (a) analyse élémentaire: C33H4807 (spectre de masse à haute résolution); (b) poids moléculaire: 556 (spectre de masse à désorption de champ úFD7); (c) point de fusion: pas net (huileux à 10-1OO C); (d) rotation spécifique: Zc = - 151 (c = 0,1, méthanol) (e) spectre d'absorption U.V. comme sur figure 1 (dans méthanol) ; (f) spectre d'absorption I.R comme sur figure 2 (pastille de KBr); (g) solubilité: insoluble dans hexane et eau, soluble dans éther diéthylique, méthanol, - éthanol, dichlorométhane, chloroforme, acétate d'éthyle, acétate de butyle, acétone, et benzène; (h) spectre de RMN: comme sur la figure 3 (CDC13, TMS); (i) nature: substance acide; (j) réaction de couleur: négative pour nihydrine, anthrone-H2SO4 et chlorure ferrique positive pour iode et trichlorure d'antimoine; faiblement positive pour le réactif de Zatkis. 2 - Procédé de production de l'antibiotique 81-484 ou de son sel, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver le micro-organisme producteur de l'anti- biotique 81-484 appartenant au genre Streptomyces dans un milieu, à isoler l'antibiotique de ce milieu et, si nécessaire, à le convertir en un sel non toxique. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit microorganisme producteur de l'antibiotique 81-484 appartenant au genre Streptomyces est l'organisme Streptomyces 81-484 FERM-P 7371.