FR 2550549 A1 19850215 FR 8412593 A 19840809 La présente invention est relative à un nouveau procédé microbiologique pour la production d'alcaloïdes de la clavine représentés par la formule générale (I) ciaprès R K- dans laquelle R est un groupe hydroxyméthyle ou méthyle, ainsi qu'à une culture biologiquement pure de la souche variante No 00211 de Claviceps fusiformis produisant ces alcaloïdes et à un procédé pour obtenir et entretenir cette 20 culture biologiquement pure. L'élymoclavine (R = hydroxyméthyle) est parmi les alcaloïdes produits, d'un très grand intérêt, car c'est un produit pharmaceutique possédant des effets analeptiques et antiparkinsoniens et inhibant la sécrétion de la prolactine 25 LB Berde et O Schild: alcaloïdes de l'ergot et composés apparentés; Handb Exp Pharm, 49, Springer Verlag, Berlin ( 197817 De plus, l'élymoclavine constitue une matière de départ possible pour la synthèse du lysergol et un intermédiaire dans la préparation de la Nicergoline L'agroclavine 30 (R = méthyle) est un précurseur de l'élymoclavine. On sait que des souches de champignon Claviceps sont capables de biosynthétiser des alcaloïdes de l'ergot sur le seigle, dans une interrelation h 6 te-parasite On sait également à propos des souches de Claviceps produisant de la clavine, qu'elles produisent les alcaloïdes en question aussi dans des conditions saprophytiques L- Abe et al: J Agric Chem Soc (Japan) 25, 458 ( 1952)7 bien que la dernière voie ne soit pas utilisée pour une fabrication à l'échelle industrielle, elle fournit une base convenable pour la recherche de la biosynthèse du squelette JL C. Vining: Can J Microbiol 12, 915 ( 1966) et H G FLOSS: Tetrahedron 32, 873 ( 197617. Le premier procédé utilis& dans l'industrie a été mis au point par G T BANKS et al CJ Gen Microbiol. 10 82, 345 ( 197417 Selon ce procédé, on isole une souche de Claviceps fusiformis à partir du Pennisetum typhoideum sclerotium, puis on l'améliore par une sélection répétée pour obtenir une souche offrant un rendement supérieur La nouvelle souche a produit l'agroclavine. Ensuite, Z Rehacek et al ont préparé de nouveaux mutants de la souche Claviceps purpurea Un mutant a produit principalement l'agroclavine, tandis que deux autres ont principalement fourni l'élymoclavine Cependant, dans le cas des deux mutants produisant l'élymoclavine, le taux 20 d'alcaloïde n'était que de 300 à 600 pg/ml dans le bouillon de fermentation /J Nat Prod 44, 225 ( 198117. Le Brevet soviétique N 735 010 ainsi que Prikl. Biok Microbiol 16, 569 ( 1980) décrivent une souche naturelle de Claviceps fusiformis produisant six alcaloides différents avec un taux d'alcaloides total de 1 220 pg/ml, dans lesquels la proportion d'élymoclavine s'élève à 70-75 %. S.H Aimbiket et al L Phytochem 9, 1953-58 ( 1970)7 ont constaté que des souches produisant de la clavine du type Claviceps purpurea, contiennent du cytochrome P-450 et 30 que le taux de ce dernier peut etre augmenté avec la phénobarbitone, ce qui se traduit par une augmentation simultanée du taux d'alcaloïdes produit par cette souche. La présente invention a pour but d'obtenir une souche capable de produire des alcaloïdes de la clavine, 35 principalement l'élymoclavine avec un rendement élevé, éventuellement avec des alcaloïdes à partir desquels l'élymoclavine peut être facilement séparée. Des expériences modèles ont été réalisées avec une souche du type Claviceps fusiformis, qui a produit sur un milieu de culture de glycérinepeptone, de l'agroclavine comme alcaloïde majeur et de l'élmoclavine carne alcaloide mineur L Toholo and E Udvargv,-Nagy: Acta Microbiol Acan Sci. Hung 15, 29 ( 1968)7 Cette souche a été déposée le 2 irai 1977 à la Collection Nationale de Microorganismes, Institut National de la Santé 10 Publique (Orszagos Kbzegészség Ugyi Intézet, Budapest) sous le Ne 00164. Des études ont montré que cette souche modèle contenait une oxydase enzyme alternative, à savoir le cytochrome P-450 et que des additifs de type barbiturate 15 stimulaient à la fois la teneur en cytochrome P-450 et la production totale d'alcaloïdes. On a constaté que,dans le cas o l'on fait croître la culture de la souche 00164 en présence de barbiturates, la morphologie et la pigmentation des colonies deviennent nota20 blement différentesde celles des souches initiales Après une sélection répétée, ces nouveaux aspects sont devenus stables et ils étaient caractéristiques de la souche nouvellement choisie, même en l'absence de barbiturates. Les propriétés biochimiques de la nouvelle variété 25 différent de celles de la souche mère, c'est-à-dire de la souche N O 00164, La vitesse de croissance et l'aptitude à former des polysaccharides sont plus faibles, alors que l'aptitude à former des alcaloïdes ou un pigment est plus forte dans le cas de la nouvelle variété On a été réellement 30 surpris de constater que la part d'élymoclavine dans la quantité totale d'alcaloïdes était prédominante, tandis que la souche mère produisait principalement de l'agroclavine. Cette nouvelle souche a été déposée le 15 octobre 1981 à la Collection Nationale de Microorganismes, Institut 35 National de la Santé Publique (Orszagos K 5 zegészség Ugyi Intézet, Budapest) sous le NK 00211. A partir de ce qui est indiqué plus haut, la présente invention fournit un nouveau procédé microbiologique pour la préparation d'alcaloïdes de la clavine de formule générale (I) dans laquelle R représente un groupe méthyle ou hydroxyméthyle, par la culture d'une souche de Claviceps fusiformis dans un milieu de culture submergée, contenant des sources de carbone,d'azote, de sels minéraux et éventuellement d'autres additifs dans des conditions 10 aérobi s, dans laquelle une souche variante de Claviceps fusiformis déposée sous le N 00211 est utilisée en tant que souche produisant des alcaloïdes, puis la récupération des alcaloldes ainsi obtenus. La présente invention a pour autre objet de four15 nir une culture biologiquement pure d'une souche variante de Claviceps fusiformis NO 00211, qui peut être fermentée pour produire des alcaloïdes de la clavine représentés par la formule générale ( 1). La présente invention est aussi relative à un pro20 cédé pour la production d'une culture biologiquement pure d'une souche -variante de Claviceps fusiformis N 00211, selon lequel on cultive une souche de Claviceps fusiformis N 00 164 dans un milieu de culture solide contenant des sources de carbone, d'azote, de sels minéraux et de la gélose ainsi qu'un additif favorisant la formation du cytochrome P-450, puis l'on procède à l'isolation sélective de la nouvelle souche N 00211. La nouvelle souche est obtenue en présence d'un additif favorisant la formation de cytochrome P-450 Cet additif est du type barbiturate et il est appliqué à raison de 1 à 10 mmole/litre de bouillon de fermentation La culture est incubée à 20-28 C pendant 7 à 21 jours et les colonies de couleur violette, déployées à plat de la nouvelle souche, qui sont faciles à distinguer des colonies 35 de la souche mère, sont sélectionnées;éventuellement la sélection est répétée en présence ou en l'absence de barbiturates et la nouvelle souche variante produisant au moins % d'élymoclavine est alors isolée, Conformément à la présente invention, on fait croître la souche mère N 00164 dans un milieu de culture solidifié par de la gélose. Des milieux de culture convenables pour le développement de la souche mère, présentent les compositions suivantes: Milieu de culture "A" 20 25 30 saccharose 1-asparagine nitrate de calcium phosphate diacide monopotassique sulfate de magnesium chlorure de potassium sulfate ferreux sulfate de zinc chlorhydrate de 1-cystéine extrait de levure (Difco) gélose (Difco) ,0 g 10,0 g 1,O g 0,25 g 0,25 g 0,125 g 0,033 g 0,027 g 0, 010 g 0,100 g 30,0 g Le p H de la solution des composants ci-dessus est ajusté à 5,2 avec de l'hydroxyde de sodium, le liquide est dilué avec de l'eau à un volume de 1 000 ml, puis stérilisé à 110 C pendant 30 minutes Le milieu de culture se solidifie en refroidissant. Milieu de culture "B" On prépare 1 000 ml de milieu de culture à partir de 39 g de glucose de pomme de terre gélosé (Difco) selon la technique qui est décrite pour le milieu "A". Milieu de culture "Cu saccharose 100,0 g acide succinique 10,0 g nitrate de calcium 1,0 g nitrate d'ammonium 1,0 g phosphate monopotassique 0,25 g sulfate de magnésium 0,25 g chlorure de potassium 0,125 g sulfate ferreux 0,009 g sulfate de zinc 0,003 g gélose (Difco) 30,0 g Le p H du mélange ci-dessus est ajusté à 5,5 5,6 avec de l'hydroxyde d'ammonium, puis 1 litre de milieu de culture est préparé selon la procédure qui est indiquée pour 15 le milieu "A". Milieu de culture "D" glycérine 100 g peptone (Difco) 20 g gélose (Difco) 30 g Les composants ci-dessus sont dilués avec de l'eau à 1 000 ml, le p H de la solution est ajusté à 6,5 6,8, puis la solution est stérilisée à 110 C pendant 30 minutes. La culture est effectuée dans l'un quelconque des milieux de culture cidessus dans des conditions aérobies 25 stériles, à 20-28 C, en présence d'un additif favorisant la formation de cytochrome P-450, de préférence en présence de barbiturates On peut prendre en considération, comme additif du type barbiturate, des N-phénylbarbiturates, par exemple le phénobarbital ou le méthylphénobarbital La culture est effectuée pendant 7 à 21 jours et ensuite, les colonies de la nouvelle souche sont isolées La nouvelle souche peut être maintenue sur une culture inclinée gélosée ou sous forme lyophilisée. Les principaux aspects morphologiques et biochi35 miques distinguant la nouvelle souche de la souche mère, 15 20 25 30 sornt indiqués dans le tableau suivant: Aspects morphologiques Souche Nc 00164 Souche N 00211 et biochimiques Morphologie de la colonie de cou Colonies de coucolonie, dans le leur beige, leur violette, milieu de culture "C" arètes vives, arètes vives, le 21 è jour avec une surface plates, avec ridée (telles am mycéliur aérien montrées dans la (telles que monfig II), trées dans la -15 nmm de Fig III), 15-20 diamètre mm de diamètre Morphologie de la culture culture colonie dans le visqueuse, dene floculeuse,mince milieu de culture "C" de couleur de couleur le 12 è jour (culture beige violet, brunâtre submergée) a) caractéristiques macroscopiques b) caractéristiques longues hyphes, 3-6 p de diamètre microscopiques formant fréquemment des fils Tolérance au phénobarbital a) dans un milieu de 1 mmole/litre 10 mmoles/litre culture solide (gélose) b) dans un milieu de 0,6 mmole/litre 5 mmoles/litre culture liquide 15 20 25 30 35 Aspects morphologiques Souche NO 00164 Souche Ne 00211 et biologiques Taux de cytochrome P-450 (nmole/g cellules myceliales sèches) dans 1,0 1, 5 2,5 3,0 le milieu de culture "C", pendant les 4-7 èmes jours Taux de polysaccharide (mg/ml) le 7 ème jour 20,8 3,8 dans le milieu de culture 'CI Vitesse de production totale d'alcaloïdes (Pg/ml/jour) les 4-7 èmes jours dans le milieu de culture "C" 50-80 200-250 (préparé sans gélose) Teneur en alcaloïdes a) dans le milieu de culture "C" (préparé sans gélose) agroclavine % 75-80 5-15 elymoclavine % 20-25 85-95 b) dans le milieu de culture "Dm (préparé sans gélose) agroclavine % 90-95 5-10 elymoclavine % 5-10 90-95 La nouvelle souche Ne 00211 décrite ci-dessus, est utilisable pour la préparation d'alcaloïdes de la clavine, de la façon ci-après: On utilise dans le procédé de fermentation, un milieu de culture liquide convenable contenant des sources de carbone, d'azote, de sels minéraux et éventuellement un ou plusieurs additifs Les compositions de milieu de culture suivantes sont applicables, entre autres, dans la fermentation produisant des alcaloïdes. 10 Milieu de culture "E" mannitol 40,0 g/litre acide succinique 10,0 g/litre liqueur de macération de mais 2,0 g/litre phosphate monopotassique 1,0 g/litre sulfate de magnésium 0,3 g/litre Le p H de la solution des composants ci-dessus est ajusté à 5,2-5,3 avec de l'hydroxyde d'ammonium. Milieu de culture "F" saccharose 50,0 g/litre pommesde terre r&pées 10,0 g/litre nitrate d'ammonium 1,0 g/litre phosphate monopotassique 0,25 g/litre sulfate de magnésium 0,25 g/litre Le p H de la solution des composants ci-dessus est 25 ajusté à 5,4-5,5 avec de l'hydroxyde d'ammonium. Milieu de culture "G" sorbitol 60,0 g/litre acide succinique 36,0 g/litre ' phosphate monopotassique 0,25 g/litre sulfate de magnésium 0,30 g/litre sulfate ferreux 0,009 g/litre sulfate de zinc 0,003 g/litre Le p H de la solution des composants ci-dessus est ajusté à 5,4-5,5 avec de l'hydroxyde d'animonium. On dissout l'une des compositions indiquées plus haut dans de l'eau à 50600 C et on stérilise à 1100 C pendant 30 minutes. Les milieux de culture 'En, "F et "G" décrits ci-dessus ou les milieux de culture "Ct ou "D' préparés sans gélose, conviennent pour la production d'alcaloïdes. La fermentation est réalisée dans des conditions aérobies stériles, en culture submergée à 20-28 e C, pendant 10 a 15 jours, dans une gamnme de p H de 4,2 à 6,0. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention 10 comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente 15 invention. I 1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples de mise en oeuvre, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. 20 Exemple 1 Des colonies de 14 jours de la souche variante N 00211 de Claviceps fusiformis développés sur le milieu de culture "A", sont enlevées de la surface de la gélose avec 5 ml de solution saline physiologique La suspension résultante est homogénéisée et un inoculum de lml est transféré dans un Erlenmeyer de 50 Oml contenant 100 ml du milieu "C" préparé sans gélose La culture est incubée à 24 C pendant 7 jours sur un appareil rotatif à secousses ( 240 tpm, déplacement de 2 cm). On transfère 4 ml de la culture résultante dans un Erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml du milieu "C" préstérilisé La culture est réalisée pendant 12 jours dans les conditions ci-dessus Les 3 ème et 5 ème jours, on ajoute une fois 1 ml d'une solution aqueuse stérile à 10 % d'extrait de 35 levure (Difco) au bouillon de fermentation. l 1 Le 12 ème jour, la teneur en cellules mycéliales sèches du bouillon est de 18 g/litre La nappe mycéliale de couleur beige-violet est séparée du milieu et la teneur totale en alcaloïdes du filtrat est de 1 300 pg/ml, déter5 minée par le réactif de Van Urk en utilisant l'élymo Clavine coame standard. La teneur en élym Dclavine et en agroclaine du bouillon est déterminée de la façon suivante: on extrait 20 mi de la culture homogénéisée avec 40 ml d'un mélange 4: 1 de chloroforme et d'iso10 prcparol à p H 9 On évapore 10 ml de la couche organique à siccité sous pression réduite Le résidu est dissous dans 0,5 ml d'un mélange 1: 1 de chloroforme et de méthanol On soumet 20 p 1 de la solution à une CCM en utilisant du DC Alufolien Kiesegel 60 F 254 (Merck, Art. 5554) comme adsorbant et un mélange 4: 1 de chloroforme-éthanol coume 15 agent révélateur On a détecté des taches à 254 nm à la lumière UV. L'élymoclavine (Rf = 0,20) et l'agroclavine (Rf = 0,30) sont détectées par spectrophotcmatrie à 283 nm dans un mélange 1: 1 de méthanol et d'acide tartrique La teneur en élymoclavine est de 1 150 pg Aml et la quantité d'agroclavine est de 55 pg/ml. 20 Exemple 2 Des colonies lycphilisées de la souche variante No 00211 de Claviceps fusiformnnis sont mises en suspension dans 2 ml de solution saline physiologique La suspension hbongénéisée est transférée dans un Erlenmeyer de 500 ml, contenant 100 ml de milieu "E" préstérilisé La 25 culture est développée pendant 7 jours dans les conditions qui sont indiquées dans l'Exemple 1. On transfère deux fois 2 ml de la culture résultante dans des Erlenmeyer de 500 mi contenant tous deux 100 ml du milieu '"G" Les cultures sont développées à 24 'C avec secousses, pendant 3 jours Les 30 inocula résultants sont transférés dans une cuve de fermentation en verre de 10 litres, contenant 5 1 du milieu de culture "G" stérile Les cultures sont développées à 24 C avec aération ( 0,5 1//minute) et agitation ( 430 tpm) pendant 12 jours On ajoute, si cela est nécessaire, 0,5 ml/l d'agent antimousse stérile,le Struktol SB 2020. A la fin de la fermentation, le bouillon contient 16 g de cellules mycéliales sèches/litre et la teneur en alcaloides totale, déterminée selon la procédure de l'exemple 1,est de 1 550 pg/ml, dans laquelle l'élymoclavine représente 1 435 pg/ml et l'agroclavine s'élève à 90 pg/ml. Exemple 3 Des colonies de la souche variante Io 00211 de Claviceps fusiformis sont mises en suspension dans 2 ml de solution saline physiologique et la suspension homogénéisée est inoculée sur le milieu "B" La culture est incubée à 24 C pendant 14 jours, dans l'obscurité La culture d'ensemencement ainsi obtenue est enlevée de la surface et homogénéisée avec 5 ml de solution saline physio15 logique On transfère 2 fois 2-ml de culture homogénéisée dans des Erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml de milieu "F" chacun Les cultures sont secouées à 24 C pendant 5 jours, puis transférées dans une cuve de fermentation en verre de 10 litres, contenant 5 litres du milieu de culture 20 "C" stérile. La culture est développée à 24 C sous aération ( 0,5 1/1/minute) et agitation ( 430 tpm) pendant 2 jours. L'inoculum ainsi obtenu est transféré dans une cuve de fermentation en acier inoxydable de 160 litres contenant 110 1 de milieu "C" stérile complété avec 20 g/1 de chlorure de sodium. La culture est effectuée à 24 C sous aération ( 0,4 1/1/minute) et agitation ( 200 tpm) pendant 12 jours. Pendant la procédure de fermentation, on a ajouté de l'agent 30 antimousse stérile Struktol SB 2020 en une quantité totale d'environ 220 ml. Le bouillon de fermentation terminé contient g de cellules mycéliales sèches/litre et une quantité totale de 1 815 p d'alcaloides/ml, dans laquelle l'élymocla35 vine représente 1 630 pg/ml et l'agroclavine s'élève à 240 pg/ml On filtre 1 e bouillon, puis on détermine l'élymoclavine et l'agroclavine par CLHP (adsorbai: Nucleosil 10 C 18; éluant: mélange 3: 2 d'acétonitrile et de carbonate d'ammonium aqueux 0,01 M; détection UV à 280 nm). L'élymoclavine apparaît avec une durée de rétention de 8,7 minutes et l'agroclavine avec une durée de 32,0 minutes. Revndications 1 Procédé micro Dlologlque pour la préparation d'alcaloides de la clavine représentés par la formule générale (I) ci-après R (I) dans laquelle R est un groupe méthyle ou hydroxyméthyle, par la culture d'une souche de Claviceps fusiformis dans un milieu de culture submergé liquide, contenant des sources de carbone, d'azote, de sels minéraux et éventuel20 lement d'autres additifs, dans des conditions aérobies, caractérisé en ce que l'on utilise une souche variante de Claviceps fusiformis déposée sous le N 00211 comme souche produisant des alcaloïdes et que I'on récupère les alcaloides obtenus. 2 Procédé suivant la Revendication 1, caractérisé en ce que la fermentation est effectuée à une température de 20 à 28 C dans une gamme de p H de 4,2 à 6,0. 3 Culture biologiquement pure de la souche 30 variante de Claviceps fusiformis N 00211, caractérisée en ce qu'elle peut être fermentée pour produire des alcaloides de la clavine de formule générale (I). 4 Procédé pour la préparation d'une culture biologiquement pure d'une souche variante du Claviceps 35 fusiformis Ne 00211, caractérisé en ce qu'on cultive la souche de Claviceps fusiformis No 00164 dans un milieu de culture solide contenant des sources de carbone, d'azote, de sels minéraux et de la gélose, ainsi qu'un additif favorisant la formation de cytochrome P-450, et qu'on isole les colonies de la nouvelle souche N 00211 par sélection. Procédé suivant la Revendication 4, caractérisé en ce que l'additif favorisant la formation de cytochrome P-450 est un barbiturate utilisé en une quantité de 1 à 10 mmoles/litre de bouillon de fermentation.