FR 2555607 A2 19850531 FR 8319168 A 19831130 Culture de cellules eucaryotes productrices d'une pro- téine vaccinante, notamment d'antigène HBs. L'invention concerne une culture cellulaire provenant d'organismes de mammifères, notamment de singe, et rendue apte à secréter de façon stable et continue un polypeptide ayant les propriétés immunogè- nes de l'antigène HBs. Elle concerne plus particulière- ment encore une culture cellulaire présentant les pro- priétés sus-indiquées en raison du caractère transformé des cellules qui la composent,par un plasmide contenant à la fois un insérat constitué par un ADN codant pour ledit polypeptide immunogène et un marqueur du type décrit dans la demande de brevet principal n 81 04137 du 2 mars 1981. Il est rappelé que la demande de brevet prin- cipal décrit entre autres des cultures de cellules eucaryotes d'organismes supérieurs, notamment origi- naires de mammifères, et appropriées à la fabrication de vaccins, ces cellules étant caractérisées en ce qu'elles contiennent, à titre de marqueur génétique interne sélectif, un ADN, circulaire ou non, contenant un promoteur eucaryote ou reconnu par sa capacité à diriger l'expression dans une cellule eucaryote, de préférence d'un organisme supérieur, notamment de mam- mifère, d'un gène qui lui est normalement associé,et une séquence d'ADN codant pour une enzyme susceptible d'inactiver un antibiotique, capable de pénétrer dans au moins certaines cellules eucaryotes ou de les dé- truire par un processus toxique ou les deux à la fois, cette séquence étant liée au promoteur susdit et sous son contr6le direct. Un marqueur préféré est celui dans lequel la séquence d'ADN codant pour une enzyme susceptible d'inactiver un antibiotique est choisie parmi celles qui codent une enzyme capable d'inactiver l'antibio- tique G 418. De préférence encore, le plasmide responsable du caractère transformé des cellules susdites, con- tient également la séquence d'ADN codant pour le pep- tide immunogène particulier dont la production est recherchée. Il a été indiqué dans la demande de brevet français que cette dernière séquence d'ADN était avan- tageusement constituée par tout ou partie du gène S contenu dans le génome du virus de l'hépatite B. Un exemple de construction du plasmide utilisable pour la transformation de cellules de mammifères, notamment de singe, a encore été décrit dans la demande de brevet européen nO 82 900640 déposée le 2 mars 1983. Le plas- mide obtenu a été dénommé pAG 66. Des cellules trans- formées,et plus particulièrement des cellules Vero transformées par ce plasmide,ont pu être détectées grâce à la capacité que leur confère le marqueur de se développer dans des milieux de culture contenant même l'antibiotique G 418. Les mêmes cellules se sont révélées capables de secréter un peptide immunogène présentant les propriétés immunologiques de l'antigène HBs. Il est à remarquer que les taux de polypep- tides exprimés atteignent un maximum 10 à 30 jours après la transfection, l'expression tendant ensuite à décliner, même si les cultures en cause se sont ré- vélées dans chaque cas capables d'assurer une produc- tion du peptide immunogène sur une durée pouvant être de plusieurs mois. Le but de la présente invention est de four- nir des cultures cellulaires productrices d'un poly- peptide immunogène ayant les propriétés de l'antigène HBs, les caracteristiques de production de l'antigène HBs par ces cellules, étant stabilisés de façon à assurer une production continue et en quantités non sujette à variations importantes pendant des durées prolongées, en tous cas supérieures à 6 mois. L'invention découle de la découverte que des clones cellulaires particuliers peuvent être sélec- tionnés parmi les cultures de cellules Vero transformées dans les conditions sus-indiquées, qui présentent les caractéristiques souhaitées de production de l'antigène HBs, tout en présentant des caractéristiques d'innocuité tout à fait complètes les rendant aptes à être utilisés pour la production de principes vaccinants contre l'hépa- tite virale B. Le procédé d'isolement des clones producteurs est basé sur la combinaison du test de détection de la préservation dans les cellules transformées des caractéristiques immunologiques spécifiques des cel- lules Vero non transformées, et sur un test de détec- tion de la préservation dans les cellules transfor- mées des sensibilités connues pour les cellules Vero non transformées à des agents pathogènes déterminés. Avantageusement, le test de détection de la préservation des propriétés immunologiques des cellules Vero met en jeu des anticorps spécifiques anti-Vero (mettant en jeu par exemple un test d'immuno- fluorescence effectué avec un sérum polyclonal spéci- fique anti-Vero). Le test de détection des susdites sensibilités à des agents pathogènes met avantageuse- ment en jeu la capacité de ces cellules d'être infec- tées par le poliovirus, par exemple dans les conditions dé- crites par Boon E.J. et Albrecht P., Journal of Virological Methods, 1983, vol. 6, 193-202. La combinaison des tests qui précèdent con- duit à l'isolement des cellules capables de produire un peptide immunogène vaccinant à l'égard du virus de l'hépatite virale B, le taux de production de ce polypeptide immunogène étant à la fois élevé et cons- tant pendant une durée d'au moins 6 mois. La combinaison de ces tests démontre encore que les cellules transformées ont conservé toutes les caractéristiques de la population parentale Vero. S'il en est besoin, un troisième test peut être mis en jeu pour détecter les clones qui doivent être retenus pour la production des polypeptides vac- cinants. Ce dernier test repose sur la vérification de l'absence de tumorigénèse induite dans des sou- ris, auxquelles ont été implantées au préalable de fortes quantités des cellules en cause, par exemple 106 cellules par souris. L'invention consiste encore dans un procédé de production d'un polypeptide ayant les propriétés immunogènes semblables à celles de l'antigène HBs, ce procédé étant caractérisé par la culture en continu des susdits clones isolés dans un milieu de culture approprié au développement des cellules Vero, et par le remplacement périodique du milieu de culture, le polypeptide immunogène produit étant ensuite chaque fois retiré du milieu de culture. D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit d'un mode préféré de construction d'une souche productrice conforme à l'invention. LE CLONE VC 10 Le clone VC 10 de cellules Vero a été utili- sé comme population parentale pour l'établissement du clone GAR 1412 qui exprime 1'HBs. Le clone VC 10 a été isolé en mai 1980 de la population parentale Vero provenant de l'American Type Culture Collection (ATCC CCL 81), reçue au laboratoire au niveau du ème passage. Le clone VC 10 a été obtenu au niveau du 140ème passage (15 passages au laboratoire) par dilution terminale en milieu Dulbecco 5 % et sérum de veau. Un lot de 10 ampoules a été préparé et conser- vé en azote liquide. LES PLASMIDES UTILISES POUR LA TRANSFORMATION DES SUS- DITES CELLULES On a utilisé tant le plasmide pAG 66 mention- né plus haut (représenté de façon schématique dans la fig. unique) qu'un plasmide obtenu à partir de ce dernier, après délétion d'un fragment StuI de 145 paires de bases (pb) dans la région 3' non codante du gène HBs (plasmide pAG 141). Le plasmide pAG 141 a été construit de la façon suivante à partir de pAG 66. Il est tout d'abord rappelé que le gène HBs contient quatre sites StuI aux positions 1206, 1401, 2325 et 2470, selon le sys- tème de numérotation de GALIBERT et al (1979), Nature, 281, 646-650. La première opération a donc consisté dans la digestion complète de pAG 66 par l'enzyme de res- triction StuI, la récupération du fragment le plus important contenant l'ADN de pAG 66 autre que le gène S, mais y inclus les parties proximale et distale de celui-ci vis-à-vis du site EcoRI du plasmide pAG 66, la ligation de ce fragment et du fragment de taille moyenne isolé par électrophorèse sur gel (ce fragment correspondant à la partie du gène S s'étendant entre les positions 1401 et 2325) pour former le plasmide pAG 140 intermédiaire de 8130 pb, puis la réinsertion dans ce plasmide du petit fragment correspondant à celui qui, dans le gène HBs, s'étend entre les positions 1206 et 1401, en amont du fragment 721-1645 vis-à-vis du site EcoRI. Le plasmide obtenu comportant 8320 pb a été dénommé pAG 141. TRANSFECTION DES CELLULES VERO CLONE VC10 ET OBTENTION DU CLONE GAR 1412 La transfegien du plasmide pAG 141 dans les cellules a été réaliséeen esinge d'ADN entraîneur de sperme de saumon selon la techniqud au phosphate de calcium décrite par GRAHAM et VAN DER EB (1973). Vingtquatre heures après la transfection, les cellules ont été mises en présence de l'agent sélectif, l'antibiotique G-418. Un mois après la transfection,des clones de cellules résis- tantes au G-418 ont été isolés et étudiés pour la produc- tion de l'antigène HBs. Le clone GAR 1412, qui produit et excrète l'HBs, a été cloné une deuxième fois pour être étudié de façon plus approfondie. Au cours de nombreuses expériences réalisées avec ou sans entraîneur, avec les plasmides pAG 66., pAG 141, ou des dérivés de ceux-ci, plus de 270 clones ont été isolés et étudiés. Il a été trouvé que 6 % d'entre eux produisent et excrètent l'HBs, qui est décelé par radio- immuno-essai (AUSRIA, ABBOTT). CINETIQUE D'EXPRESSION DE L'ANTIGENE HBs PAR LE CLONE GAR 1412 Les cellules GAR 1412 sont trypsinées et ensemencées dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco contenant % de tryptose phosphate et 10 % de sérum de veau nor- mal aseptique. La production maximale d'HBs est obtenue 3 à 4 semaines après l'ensemencement des flacons. Plus de 85 % de l'antigène est excrété. Lorsque le plateau de production de l'antigène est atteint, le taux d'expres- sion peut être maintenu sans trypsiner les cellules mais en renouvelant le milieu de culture deux fois par semaine avec le milieu mentionné cidessus. Un taux d'expression de 1 microgramme d'antigène HBs par millilitre de surna- geant et par 24 heures peut être maintenu dans ces condi- tions pendant au moins 6 mois. Le taux d'antigène a été calculé en utilisant comme référence la solution référence à 20 microgrammes/millilitre de MERCK SHARP & DOHME. CARACTERISATION DE L'ANTIGENE HBs EXCRETE PAR LE CLONE GAR 1412 L'antigène HBs produit et excrété par le clone GAR 1412 a la même densité en gradient de CsCl que l'antigène préparé à partir de plasma humain ou produit par certaines lignées d'hépat.ome humain. L'antigénicité de l'HBs produit par le clone GAR 1412 est mise en évidence par radio- immuno-essai. Des études d'immunomicroscopie électronique ont montré que l'antigène est porté par des particules sphériques de 22 nm environ de diamètre, semblables à celles que l'on isole du plasma humain. STABILISATION DE L'EXPRESSION DE L'HBs PAR LE CLONE GAR 1412 La stabilité de l'expression de l'HBs par le clone GAR 1412 a été étudiée pendant plus de 7 mois, les cel- lules étant divisées dans un rapport de surface 1:12 une fois par semaine (100 générations cellulaires). La syn- thèse d'HBs s'est avérée stable sur cette période aussi bien en présence qu'en absence de sélection par le G 418. La synthèse maximale d'HBs n'est cependant obtenue qu'en laissant "vieillir" les cellules pendant 3 à 4 semaines après la trypsination comme décrit dans le paragraphe "Cinétique d'expression de l'antigène HBs par le clone GAR 1412". TUMORIGENESE DES CLONES VC10 et GAR 1412 Les recommandations de l'Organisation Mondiale de la Santé concernant la préparation du vaccin antipolio- myélitique inactivé stipulent la possibilité d'employer comme substrat cellulaire les lignées cellulaires conti- nues, à condition qu'elles s'avèrent non tumorigènes pour les animaux immunodéprimés (OMS Rapport Technique 673- Révision 1981, p. 76-82). Des études effectuées par PETRICCIANI et Coll. (J. Nat. Cancer Inst. 1973, 51, 191-196 et Develop. Biol. Standard. 1981, 50, 27-35) ont montré que les lignées continues de singe (parmi lesquelles les cellules Vero) ne sont pas tumorigènes quand elles sont essayées dans différents systèmes in vitro et in vivo. L'emploi de telles cellules pour la production de vaccins viraux est possible si le produit est purifié en vue de l'élimination de l'acide nucléique (Intervirology, 1980, 14, 300-309 et Develop. Biol. Standard. 1981, 50, 59-69). Pour examiner la possibilité d'employer le clone GAR 1412 qui exprime d'une manière stable l'antigène HBs pour la production d'un vaccin anti-hépatite B, la tumo- rigénèse des clones VC 10 et GAR 1412 a été testée. Dans ce but, des cellules des clones VC 10 et GAR 1412 et de la lignée HeLa ont été implantées chez 5 souris nu/nu (pour chaque lignée) à raison de 106 cellules par souris. Après 21 jours, seuls les animaux inoculés avec les cel- lules HeLa ont développé des tumeurs, tandis que les sou- ris ayant reçu les cellules VC 10 et GAR 1412 sont res- tées négatives. Ces résultats ont été confirmés par l'exa- men histologique. CARACTERISATION DES CELLULES GAR 1412 Les cellules GAR 1412 qui expriment l'HBs se sont avérées positives dans un test d'immunofluorescence effec- tué avec un sérum polyclonal spécifique anti-Vero et elles restent sensibles au poliovirus. Ces résultats montrent qu'il s'agit bien d'une cellule ayant les carac- téristiques de la population parentale Vero. PRODUCTION DE L'HBs A partir du clone GAR 1412, il est possible d'effec- tuer des cultures en masse pour obtenir des quantités importantes d'HBs qui peuvent être traitées ultérieurement pour produire un vaccin antihépatite B. Les cellules du clone GAR 1412 produisent et ex- crètent continuellement l'Ag HBs (particule de 22 nm) qui n'est pas infectieux et qui n'a donc aucun effet sur la viabilité des cellules productrices. Lorsque le milieu de culture utilisé pour la production d'HBs est épuisé, il peut être retiré et remplacé par un milieu frais. Les cellules peuvent produire continuellement l'Ag HBs à condition d'utiliser un milieu qui maintient les cellules en vie. Les expériences menées jusqu'à présent ont montré que le changement régulier (1-2 fois par semaine) du milieu de culture permet un minimum de 6 mois de production con- tinue de l'Ag HBs par la même culture cellulaire. Une production à grande échelle de l'HBs sur cel- lules GAR 1412, en vue de la préparation d'un vaccin,est possible aussi bien dans des boîtes de Roux de 200 cm de surface de culture que dans des appareils industriels de culture cellulaire comme celui commercialisé sous la désignation GYROPEN (Chemap, Mannedorf, Suisse), o dans d'autres systèmes de culture cellulaire en masse. Le milieu de culture qui peut être constitué de milieu Dulbecco contenant 10 % de tryptose-phosphate et % de sérum de veau est changé une à deux fois par se- maine. Le milieu de culture dans lequel l'HBs a été libé- ré est récolté et utilisé comme source d'HBs pour la pro- duction du vaccin anti-hépatite B. L'HBs lui-même est alors recueilli, par exemple par ultracentrifugation en gradient continu de chlorure de coesium ou par passage sur une colonne d'affinité sur laquelle ont au préalable été fixés des anticorps anti-HBs. POUVOIR IMMUNOGENE DE L'Ag HBs PRODUIT PAR LE CLONE GAR 1412 Le pouvoir immunogène de l'Ag HBs produit par les cellules GAR 1412 a été testé dans un essai recommandé par le National Institute for Biological Standardization and Control (NIBSC, Londres), en parallèle avec un vaccin anti-hépatite B du commerce, obtenu à partir de l'HBs humain. Des lots de 10 souris Balb C âgées de cinq se- maines ont été immunisées par voie intrapéritonéale avec 1 ml de chaque dilution de chaque vaccin contenant 0,5 mg d'hydroxyde d'aluminium par millilitre. Les animaux ont été immunisés par une seule injec- tion avec les deux vaccins selon le schéma suivant: Quantité d'antigène: 4 microgrammes/ml inoculés à chaque souris (10 souris) 1 " l " " " 0,25 " " " " " " " 62 ng/ml " " " " " diluant " " " " (5 souris) (témoin négatif) Vingt-huit jours après l'injection d'antigène, les souris sont saignées et les sérums sont examinés indivi- duellement pour la présence d'anticorps anti-HBs, en uti- lisant une trousse de diagnostic AUSAB (ABBOTT). En calculant l'indice d'extinction antigénique (la quantité minimale d'antigène capable d'induire des anti- corps chez 50 % des animaux), nous avons trouvé les va- leurs suivantes: Ag HBs - GAR 1412 - 62 ng/ml Vaccin commercial - 65 ng/ml. Ce résultat montre que le pouvoir immunogène de l'HBs produit par le clone GAR 1412 est équivalent au pouvoir immunisant du vaccin commercial. Cette expérience indique que l'HBs exprimé par les cellules GAR 1412 peut être utilisé comme matière première dans la préparation d'un vaccin antihépatite B. Le clone GAR 1412 a été déposé à la Collection Nationale de Culture de Micro-Organismes (C.N.C.M.) de l'INSTITUT PASTEUR de Paris, le 30 novembre 1983 sous le n 1-267. Le tri des clones retenus au terme de l'opéra- tion décrite à la page 6 sous le sous-titre "Transfection des cellules Vero clone VC 10 et hybridation du clone GAR 412" a été réalisé comme suit: Chaque clone est transféré à partir de la boite de transfection, dans une boite de 25 cm. Lorsque le clone a atteint la subconfluence, il est trypsinisé in situ pour étaler toutes les cellules. Puis un dosage radio-immunologique de détection de l'HBs est effectué au 7ème et au 15ème jours après la trypsination. Si le clone est capable-au 15ème jour d'excréter des quantités d'HBs voisines de 50 ng/ml par 5 jours, il est conservé pendant 1 ou 2 mois. Il est alors également vérifié que les clones retenus ont conservé les propriétés immu- nologiques des cellules Vero et qu'ils restent également sensibles au poliovirus. Les clones satisfaisant à l'ensemble de ces conditions sont conformes à l'invention. REVENDICATIONS 1 - Cellules eucaryotes transformées de mammifères,. selon la revendication 1 du brevet principal, et appropriées à la fabrication de vaccins, conte- nant, à titre de marqueur génétique interne sélectif, un plasmide contenant un promoteur eucaryote ou reconnu par sa capacité à diriger l'expression dans une cellule eucaryote, de préférence d'un organisme de mammifère, d'un gène qui lui est normalement associé, et une se- quence d'ADN codant pour une enzyme susceptible d'inac- tiver l'antibiotique G 418, cette dernière séquence étant liée au promoteur susdit et sous son contrôle direct, ce plasmide contenant également encore une séquence d'ADN codant pour le peptide immunogène particulier dont la production est recherchée, caractérisées en ce que ces cellules de mammifères sont constituées par des cellules Vero, que la séquence codant pour le peptide immunogène recherché est une séquence codant pour un peptide immu- nogène ayant les propriétés de l'antigène HBs, et en ce que lesdites cellules ont conservé les propriétés immu- nologiques des cellules Vero non transformées et une capacité d'être infectées par le poliovirus. 2 - Cellules transformées selon la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles réagissent avec des anti- corps polyclonaux formés contre des cellules Vero non transformées. 3 - Cellules selon la revendication 1, caractéri- sées en ce qu'elles sont transformées par le plasmide pAG60. 4 - Cellules selon la revendication 1, caractéri- sées en ce qu'elles sont transformées par le plasmide pAG141. - Cellules selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 4, caractérisées en ce qu'elles ne sont pas tumorigènes dans le test reposant sur la vérification de l'absence de tumorigénèse induite dans des souris, aux- quelles ont été implantées au préalable 10 desdites cel- lules par souris. 6 - Procédé de production d'un polypeptide ayant les propriétés immunogènes semblables à celles de l'anti- gène HBs, caractérisé par la culture en continu des cel- lules selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 dans un milieu de culture approprié au développement des cellules Vero, et par le remplacement périodique du milieu de culture, le polypeptide immunogène produit étant ensuite chaque fois retiré du milieu de culture.