FR 2558481 A1 19850726 FR 8500868 A 19850122 Procédé de préparation de l'acide 4-amino-3-hydroxybutyrique optiquement actif. La présente invention concerne un procédé de préparation d'un composé qui peut fonctionner un intermédiaire clé dans la préparation de la L-carni- tine et des composés qui s'y rattachent notamment l'acide 4-amino-3hydroxy- butyrique optiquement actif. L'acide 4-amino-3-hydroxybutyrique caractérisé par la formule de consti- tution OH 2- H3 N+ C o2 (1) a été d'abord préparé par synthèse par M. Tomita. /2. Physiol. Chem., 124, 253 (1923)7 et a été décelé dans le cerveau du rat par T. Hayaishi. Physiol., 145, 570 (1959)3. L'importance particulière de ce composé provient de sa fonction biologique comme neuromodulateur dans le système nerveux central des mammifères "M. Otsuka et coll., J. Neurochem., 18, 287 (19717. De plus la corrélation métabolique de l'acide 1 aminobutyri- que avec l'acide 4-aminobutyrique et par conséquent avec l'acide glutamique et la glutamine justifie l'intérgt concernant son utilisation dans le traite- ment de l'épilepsie. En outre, un bon nombre de documents mentionnent l'acide (R)-4-amino-3-hydroxybutyrique comme un précurseur valable pour le composé important qu'est la L-carnitine. On connaître quatre méthodes pour la synthèse du composé (1). La première utilise une matière contenant deux atomes de carbone (par exemple la glycine) comme matière de départ mais soulève des difficultés de préparation de l'intermédiaire clé dans le procédé, c'està-dire l'acide 4-phtalimidocrotonique L9. Org. Chem., 19, 1589 (195457. Le second procédé rZ. Physiol. Chem, 124, 253 (1923)7 consiste à faire réagir un phtalimide avec l'épichlorhydrine pour former le l-chloro-2-hy- droxy-3-phtalimidopropane, qui par échange ultérieur avec du cyanure et une hydrolyse finale donne le composé 1. Malgré son application industrielle ce 2558481-. procédé est limité sérieusement du point de vue écologique à cause de la toxicité de l'épichlorhydrine et des cyanures. Le troisième procédé comnporte une série de quatre réactions à savoir la bromation de l'acétoacétate d'éthyle, la réduction du groupe cétonique, le S déplacement de l'halogène par l'hydroxyde d'ammonium et l'hydrolyse finale de l'ester Larmaco, Ed. Sci., 19, 30 (1964)7. Toutefois, la faible réactivité du 4-bromo-3-hydroxybutyrate d'éthyle vis-à-vis du déplacement nucléophile entralne un faible rendement global. Pour pallier ces difficultés, un quatrième procédé a été mis au point 10.J. Pharm. Sci., 67, 120 (1978>7; il consiste à utiliser l'acide 4bromocro- tonique étant donné que le bromure allylique dans l'acide 4brcmocrotonique est plus réactif vis-à-vis du déplacement nucléophile. Dans toutes ces synthèses, l'acide 4-amino-3-hydroxybutyrique (1) résul- tant est sous sa forme racémique. Ce racémate a été séparé par un procédé de résolution difficile et onéreux. LZ. Physiol. Chem., 169, 263 (1927>7. La forme (R) de 1 est particulièrement utile parce qu'elle peut être facilement convertie en le composé important L-carnitine par méthylation LBull. Chem. Soc. Japon, 35I, 1153 (1962)7. La présente invention concerne un procédé de préparation de l'acide 4amino-3-hydroxybutyrique optiquement actif. Particulièrement elle concerne un procédé de coupure asymétrique d'un des groupements ester énantiotopes du diester 3-hydroxyglutarique par action d'enzymes microbiennes. Le monoacide chiral résultant peut être facilement converti en acide 4-amino-3hydroxybu- tyrique optiquement actif par les procédés chimiques. Par conséquent, la présente invention fournit un procédé de préparation de monoester /f-acyloxyglutarique optiquement actif, caractérisé par le fait qu'on soumet un diester /-hydroxyglutarique ayant la formule: RO2CCH2-CHOHCH2C02R o chaque R représente indépendamment CH3 ou C2H5, à une hydrolyse enzymatique en l'exposant à l'action fermentaire de l'enzyme car- boxyestérase élaborée par un microorganisme élaborant la carboxyestérase. Bien que l'hydroyse asymétrique du fi -hydroxyglutarate de diéthyle ou du /i-hydroxy glutarate de diméthyle par l'CO T. Am. Chem. Soc., 83, 4228 (1961)7, la vitesse de réaction de cette hydro- lyse est très lente. Par consequent théoriquement une quantité stoechiométri- que d'd bien qu'à la fois l'hydroxy- /x-acétoxyglutarate de méthyle (+) et l'hydroxy- 3 -acétoxy glutarate de méthyle (-) aient été préparés par les procédés de résolution chimique LArkiv fUr Kemi, volume 10, n 4, 135 (19567, ces procé- dés sont difficiles et le rendement est relativement faible. Au contraire en utilisant l'action hydrolytique (estérases) d'enzymes microbiennes selon le procédé de la présente invention, les hydrolyses asymétiques peuvent être effectuées pour donner soit le monoester 8-hydroxyglutarique (+) soit le monoester /-hydroxyglutarique (-) d'une façon plus économique. Il a été découvert que tout microorganisme qui élabore la carboxyesté- rase désirée est capable de fonctionner pour catalyser l'hydrolyse asymétri- que. Ces microorganismes sont bien connus dans la technique microbiologique Loir "Microbial Transformations of Non-steroid Cyclic Compounds" (Georg Thieme Publishers, Stuttgart, 1976)_. Les microorganismes particulièrement appropriés sont ceux du genre Arthrobacter, Acinetobacter, Citrobacter, Corynebacterium, Mycobacterium, et Rhodococcus, OH OH OH H H ( carboxyestérase carboxyestérase) HOC ODR 2c C2R RD Co2 R= CH3ou C2H5 Après avoir protégé la fonction hydroxyle du monoester P -hydroxy glutarique optiquement actif résultant, le monoester /D-acétoxyglutarique peut être ensuite soumis à des transpositions en passant par un intermédiaire nitrène (déficitaire en électrons), qui provoque la migration du groupe alkyle avec sa paire d'électrons du carbone à l'azote en donnant un isocyana- te. L'amine désirée est obtenue par hydroxyse alcaline de l'isocyanate. Le schema ci-après représente les stades réactionnels de ce procédé: CH H OAc traspositi OAc -ô =}H transposition = n > n -ds Curtiusô, H02C C02R HO2C C02R ( C2R OAc N 'l HO H O0 H2N > t,) OHN Co 4- '2 1 C Il O Isocyanate Par conséquent la présente Invention fournit également un procédé de préparation de l'acide 4-amino-3-hydroxybutyrique optiquement actif qui comprend la protection de la fonction hydroxyle présente dans le mono ester a -acyloxyglutarique optiquement actif ayant la formule RO2CCH2-CHOHCH2CO2H, la soumission du mono ester ainsi protégé a une transposition pour obtenir l'isocyanate correspondant, et la soumission dudit isocyanate à l'hydrolyse alcaline. Le procédé précité montré par le schéma ci-dessus peut subir de nom- breuses variantes. Le spécialiste pourra voir nettement que des transposi- tions similaires quant au mécanisme tel que les transpositions de Hofmann, de Schmidt et de Curtius peuvent être tous utilisés pour effectuer cette trans- formation. Pour simplifier les auteurs de la présente invention ont choisi la réaction de Curtius pour montrer qu'une telle transposition peut être réali- sée sur un substrat rendu très fonctionnel avec des rendements raisonnables. Le diester / -hydroxyglutarique peut être incorporé dans un milieu nutritif de composition normalisée dans lequel ces organismes sont cultivés et les conditions usuelles de fermentation peuvent ensuite être utilisées pour effectuer la transformation hydrolytique. En variantes, le principe actif peut être enlevé de la culture du microorganisme en développement par exemple par une lyse des cellules pour libérer les enzymes ou en mettant en suspension les cellules restantes dans un milieu aqueux neuf. Etant donné que cette transformation hydrolytique ne nécessite pas de coenzymes, les cellules et l'enznyme conviennent uniquement pour l'immobilisation afin de réduire davantage les coûts du procédé. Dans une quelconque de ces techniques, une fonction ester se coupera d'une façon asymétrique dans la mesure o l'enzyme active élaborée par le microorganisme est présente. Bien entendu les condi- tions de température, de temps et de pression dans lesquelles le contact du diester P -hydroxyglutarique avec l'enzyme hydrolytique est effectué sont interdépendantes comme le spécialiste pourra le voir. Par exemple en chauf- fant doucement et sous la pression atmosphérique, la durée nécessaire sera plus faible que si on opère à la température ambiante toutes autres condi- tions restant les mêmes par ailleurs. Bien entendu il faut que ni la tempé- rature, ni la pression ni le temps n'atteignent une valeur trop grande qui entraînerait la dégradation du substrat. Si une culture de l'organisme en développement doit être utilisée, les conditions du procédé doivent être également suffisamment douces pour que l'organisme ne soit pas détruit avant d'avoir élaboré suffisamment d'enzymes protéolytiques afin d'éviter la des- truction de l'enzyme carboxy-estérase. Généralement il faut opérer à la pression atmosphérique, à une température comprise entre 10 C et 35 C et pendant une durée de 12 heurs à 10 jours. Chacun des produits obtenus selon les exemples ci-après qui illustrent en détail la présente invention, est désigné par sa structure chimique en utilisant les spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN) et infrarouge et par sa mobilité chromatographique en couche mince. La pureté optique et la configuration absolue du produit sont établies par comparaison des valeurs de son pouvoir rotatoire avec celles indiquées dans le bibiographie et confir- mées davantage par la conversion en L-carnitine. La présente invention est illustrée par les exemples descriptifs et non limitatifs ci-après. EXEMPLE 1 A. Fermentation. La culture en surface à partir d'un plan incliné d'agar agar vieilli pendant une semaine de Arthrobacter sp. (ATCC 19140) développé sur un agar agar ayant la composition suivante: Gm Agar agar.................... 20 Extrait de boeuf Bacto....... 3 Bacto-peptone................ 5 (stérilisée 15 minutes sous 1,4 bar) est mise en suspension dans 5 ml d'une solution saline à 0,85%. Des portions de 1 ml de cette suspension sont utilisées pour ensemencer le milieu ci- dessous (bouillon nutritif Difco) contenu à raison de 50 ml dans chacune des fioles Erlenmeyer de 250 ml (stade F-1): Gm Extrait de boeuf Bacto.... . 3 Bacto-peptone................ 5 Eau distillée, q.s. 1 litre pH 6-8 (stérilisé pendant 15 minutes sous 2,1 bars) Les fioles sont mises en incubation à 25 C sur une secoueuse rotative (250 tours/min - rayons 50,8 mm) pendant 24 heures, après quoi une quantité égale à 5% en volume est transférée dans une fiole Erlenmeyer de 2 litres..DTD: contenant 500 ml de bouillon nutritif Difco. Simultanément, 2,2 g de 3-hy- droxyglutarate de diéthyle (Aldrich) dans 0,2 ml de Tween 80 à 10% sont ajoutés entrainant une concentration finale du substrat de 0,2%. Les fioles du stade F-2 sont ensuite mises en incubation pendant 48 heures supplémen- taires dans les conditions utilisées pour l'incubation des fioles du stade F-1. B. Isolation. 48 heures après avoir ajouté le substrat, le stade F-2 est terminé en ajoutant du HC1 6N jusqu'à ce que le pH du milieu se soit abaissé à 2. Le contenu est filtré à travers un tampon de célite et le filtrat est extrait avec de l'acétate d'éthyle (3 x 500 ml). Les extraits organiques combinés sont séchés sur du sulfate de sodium et concentrés sous vide pour obtenir un résidu (2,7 g). Ce résidu est analysé par chromatographie sur une colonne (1,2 x 40 cm) de gel de silice ("MN Kieselgel 60", (marque déposée) Brinkmann). La colonne est éluée avec un système solvant comprenant de l'hexane et de l'acétate d'éthyle (1:1) pour obtenir 1,44 g d'hydrogéno- 3(S)-hydroxyglutarate d'éthyle, úEcX 25 +1,50 (c, acétone). C. La progression del'hydrolyse microbiologique du 3-hydroxyglutarate de diéthyle peut être suivie par des analyses chromatographiques en couche mince en utilisant des plaques (EM) de 20 x 20 cm, Brinkmann, (0,25 mm d'épaisseur) de gel de silice contenant l'indicateur PF254.. Le système solvant utilisé est: hexane-acétate d'éthyl-acide acétique (10:10:1). EXEMPLE 2 On répète le procéde de l'exemple 1 en utilisant le 3-hydroxyglutarate de diméthyle comme substrat et on obtient le 3(S)-hydroxyglutarate d'un monomanéthyle b-o D +1,4 (c, 2,1, acétone) comanme produit. EXEMPLE 3 On répète le procédé de l'exemple 1 en utilisant le microorganisme Corynebacterium équi (IFO0-3730) pour obtenir le 3(S)-hydroxyglutarate de monoéthyle CC7(D +1,5 (acétone), avec un rendement de 85%. EXEMPLE 4 On répète le procédé de l'exemple 1 en utilisant le microorganisme Mycobacterium sp (NRRL 15051) pour obtenir le 3(S)-hydroxyglutarate de mono- éthyle LoPK7D +1,5 (acetone), avec un rendement de 50%. EXEMPLE 5 On répète le procédé de l'exemple 1 en utilisant le microorganisme Rhodococcus éqni (ATCC 21690) pour obtenir le 3(S)-hydroxyglutarate de mono- éthyle L/7-CD +1,4 (acétone), avec un rendement de 60%. EXEMPLE 6 On répète le procédé de l'exemple 3 sauf qu'on utilise le 3-hydroxy- glutarate de diméthyle canommie substrat et qu'on obtient le 3(S)-hydroxy- glutarate de monométhyle, RCy7D +1,4 (acétone) canomme produit. EXEMPLE 7 On répète le procédé de l'exemple 5 sauf qu'on utilise le 3-hydroxy- glutarate de diméthyle canomme substrat et qu'on obtient le 3(S)-hydroxy- glutarate de monométhyle, EC3D +1,3 (acétone) commanine produit. Z558481 EXEMPLE 8 On répète le procédé de l'exemple 1 en utilisant le microorganisme Acinetobacter lowfii (ATCC 29064) pour obtenir le 3(R)-hydroxyglutarate de monoéthyle, L-/Y7 -1,72 (acétone), avec un rendement de 80%. EXEMPLE 9 On répète le procédé de l'exemple 1 en utilisant le microorganisme Citrobacter freundii (ATCC 6750) pour obtenir le 3(S)-hydroxyglutarate de monoéthyle, cyJ +1,38 (acétone) avec un rendement de 60%. EXEMPLE 10 Transformation de 1'hydrogéno-3-hydroxyglutarate de(S)-(+)-éthyle en acide (R)-(-)4-amino-3-hydroxybutyrique. A une solution d'hydrogéno- 1 -hydroxyglutarate d'éthyle (1,14 g, C sont relavées avec 75 ml d'acétate d'éthyle chaque fois. La solution organi- que combinée est séchée sur du sulfate de sodium. En chassant le solvant sous vide, on obtient l'acétate sous forme d'une huile jaune pâle (1,282 g) ayant une pureté suffisante, comme on peut le voir par le spectre RNM, pour être utilisée directement dans le stade suivant. A 1,282 g d'hydrcgéno-e -acétoxyglutarate d'éthyle brute dans 18 ml de benzène sous argon à environ 6 C, on ajoute 1,9 ml de chlorure d'oxalyle en l'espace de quelques minutes. On laisse la réaction remonter à la température ambiante puis on agite pendant 5 heures. On chasse le solvant par évaporation sur un évaporateur rotatif et l'huile brune est soumise au vide pendant un court instant. Le chlorure d'acide est utilisé directement dans le stade suivant. A 10 ml de la solution de chlorure d'acide dans l'acétone à 0 C, on ajoute une solution de 1,3 g d'azide de sodium dans 12 ml d'eau pendant 2 minutes. Le mélange est agité à 0 C pendant 15 minutes. On enlève le bain de glace et le mélange est agité pendant encore 15 minutes. Le mélange est dilué avec 100 ml d'eau et extrait avec (2 x 75 ml) de benzène. La solution benzé- nique est lavée avec 125 ml de saumure, séchée sur du sulfate de sodium et filtrée. La solution de l'azide dans le benzène ci-dessus est chauffée au reflux sous une atmosphère sèche pendant environ 70 heures. Le solvant est chassé sous vide et on obtient l'isocyanate, spectre IR (pellicule, cm-1 2980, 2260, 1740, 1370, 1225, 1030) sous forme d'une huile brune (1,190 g). Un échantillon de 730 mg de l'isocyanate est chargé avec 8 ml de HC1 à 18% et chauffé à 100-110'C (température du bain d'huile) pendant 4 heures. Après avoir agité à la température ambiante pendant 18 heures, l'eau et HC1 sont éliminés par évaporation sur évaporateur rotatif. La gomme brune brute est soumise au vide. Le produit est dissous dans une petite quantité d'eau et chargé dans une colonne, (longueur 7 cm, largeur 2 cm) de "Dowex" (marque déposée) (1 x 4, OH). La colonne est éluée avec 100 ml d'eau, 100 ml de NR40H à 5% puis 1500 ml de NH40H à 15%. L'évaporation de l'éluat avec NH40H à % donne l'acide (R-(-)-4-amino-3-hydroxybutyrique sous forme d'un produit solide cristallin blanc (172 mg pure d'après le spectre RNM). Le rendement global du produit à partir de l'hydrogéno-/ -hydroxyglutarate d'éthyle cor- respond à 36,4% (Ze-.7D = -16,9 , H20). Dans cet exemple le groupe hydroxyle est protégé par acylation (réaction de l'hydrogéno- /3 -hydroxyglutamate d'éthyle avec l'anhydride acétique dans le solvant pyridine). Si on le désire, la protection du groupe hydroxyle peut être obtenue par éthérification par exemple par l'addition d'un groupe aikylsilyle ou tétra- hydropyranyle au lieu de l'acylation, comme cela est bien connu du spécia- liste. REVENDICATIONS 1. Procédé pour la préparation de monoester 1 hydie5.lutarIque optiquement actif, caractérisé par le fait qu'on soumet un diester P - hydroxyglutarique ayant la formule: RO2CC2-CROBC2CO2R, co chaque R re- présente indépendamment CH3 ou C2i5, i une hydrolyse enzymatique en l'exposant à l'action fermentaire de l'enzyme carboxyestérase élaborée par un microorganisme élaborant la carboxyestérase. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le microorganisme est du genre Arthrobacter, Corynebacterium, Acinetobacter, Citrobacter, Mycobacterium et Rhodococcus. 3. Procédé selon les revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que R est CH3. 4. Procédé selon les revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que R est C2H5. 5. Procédé de préparation de l'acide 4-amino-3-hydroxybutyrique optique- ment actif caractérisé par le fait qu'on protège la fonction hydroxyle présen- te dans un monoester /1 -hydroxyglutarique optiquement actif ayant la formule R02CCH2-CHOHCH2C02H, qu'on soumet le monoester ainsi protégé à une transposi- tion pour obtenir l'isocyanate correspondant et qu'on soumet ledit isocyanate à une hydrolyse alcaline. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que la transposition est effectuée en passant par la transposition de Curtius. 7. Procédé de préparation de l'acide 4-amino-3-hydroxybutyrique opti- luement actif selon les revendications 5 et 6, caractérisé par le fait qu'on convertit l'hydrogéno fl-acétoxyglutarate d'éthyle en son chlorure d'acide, q,'on soumet ledit chlorure d'acide à une transposition pour obtenir l'iso- cyanate correspondant, qu'on soumet ledit isocyanate à une hydrolyse alcaline et qu'on récupère l'acide 4-amino-3-hydroxybutyrique optiquement actif. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé par le fait qu'on prépare l'acide (R)-4-amino-3-hydroxybutyrique. 9. Le 4-isocyanato-3(R)acétoxybutyrate de méthyle ou d'éthyle.