FR 2549230 A1 19850118 FR 8309806 A 19830614 254923 O La présente invention a pour objet un procédé de détection d'un oligomère dans un milieu liquide contenant des monomères correspondants, ainsi qu'un dispositif destiné à la mise en oeuvre de ce procédé et l'application de ce procédé, notamment à la détection de substances allergènes. Le procédé de l'invention est en particulier applicable aux molécules ou macro-molécules monomères ou oligomères d'origine biologique. On sait qu'il existe de nombreux dispositifs destinés à repérer 10 la présence d'une molécule biologique déterminée (antigène, anticorps, etc) dans un milieu liquide, par exemple à l'aide de réactifs présentés sous forme de billes de polystyrène ou sous forme de plaques de microtitration. L'invention a pour objet un procédé permettant de détecter les 15 oligomères contenant au moins deux molécules possédant chacune un même site récepteur non répétitif, dans un milieu liquide contenant ou susceptible de contenir une solution ou dispersion de ladite molécule à l'état de monomères, ladite solution ou dispersion contenant aussi, ou étant susceptible de contenir ledit oligomère Ce procédé est caractérisé 20 par le fait que l'on met en contact avec ladite solution ou dispersion un support solide sur lequel sont fixées des molécules liantes douées d'une affinité spécifique pour ledit site récepteur non répétitif, que l'on ajoute à ladite solution ou dispersion une solution ou dispersion de ladite molécule liante couplée à un agent traceur, et que l'on détermine 25 qualitativement et/ou quantitativement la présence éventuelle dudit agent traceur fixé sur ledit support solide. Parmi les oligomères qu'il est possible de repérer grâce au procédé de l'invention on citera notamment les complexes immuns tels que les complexes du type anticorps/antigène/anticorps Dans ce cas, ladite 30 molécule liante est un second anticorps spécifique dirigé contre un site non répétitif du premier anticorps. Bien entendu, le milieu liquide dans lequel on effectue la détection est un milieu ne dissociant pas lesdits oligomères Dans le cas de molécules biologiques il s'agit des solutions tampons utilisées de 35 façon usuelle. La molécule liante peut être fixée sur le support solide par tout moyen connu pour la fixation de ces molécules, par exemple par adsorption, par liaison covalente ou non, par exemple par couplage chimique avec un agent de couplage bi-fonctionnel, par affinité 40 imunochimique, etc Le support solide peut être réalisé avec tout matériau solide biologique (globules rouges) ou synthétique doué de propriété adsorbante ou capable de fixer un agent de couplage Ces matériaux sont connus et décrits dans la littérature Parmi les matériaux solides capables de 5 fixer par exemple des anticorps par adsorbtion on citera notamment le polystyrène, le polypropylene, etc Parmi les matériaux utilisables pour fixer lesdites molécules liantes par covalence à l'aide d'un agent de couplage, on cite notamment le dextran, la cellulose, leurs dérivés aminés telles que la diéthylamino-cellulose ou le diéthylamino-dextran. Le support peut se présenter par exemple sous forme de disques, de cubes, de baguettes, de billes ou de plaques, par exemple de plaques de microtitration Le support peut également être un latex en suspension. Les agents de couplage permettant de fixer par covalence les molécules liantes sur le support solide sont par exemple des dérivés 15 carboxyliques, des dérivés bifonctionnels tels que les dialdéydes (glutaraldéyde), des diisocyanates (toluéne-diisocyanate), des quinones (benzo-quinone), etc Quand l'oligomère à repérer est un complexe Immun formé par un premier anticorps avec l'antigène correspondant, la molécule liante est 20 un second anticorps spécifique dirigé contre un site non répétitif dudit premier anticorps De préférence ledit second anticorps spécifique est dirigé contre un site non répétitif du fragment Fc dudit premier anticorps. Ledit premier anticorps est par exemple une Ig E, une Ig D, une Ig G ou une Ig A, ou des sous-classes de ces immunoglobulines De 25 préférence le second anticorps est un anticorps monoclonal ou au moins un anticorps hautement spécifique purifié par exemple par chromatographie d'affinité. On peut également mettre en oeuvre le procédé de l'invention en utilisant comme molécule liante une lectine On sait que les lectines ont 30 une affinité pour des sucres constitutifs de certains sites des molécules d'immunoglobuline ou des sucres présents sur d'autres molécules biologiques ou présents sur la membrane externe de certaines cellules. Dans le procédé de l'invention, ledit oligomère peut être formé in situ par addition à une solution contenant lesdits monomères d'une substance dimérisante ou oligomèrisante spécifique pour lesdits monomères ou pour une sous-classe desdits monomères Dans ce cas le procédé de l'invention est caractérisé par le fait que l'on ajoute audit milieu liquide contenant lesdits monomères une substance dimérisante ou oligomérisante spécifique pour lesdits monomères ou pour une sous-classe 40 desdits monomères que ledit milieu liquide est susceptible de contenir, -3 de façon à former in situ ledit oligomère et à détecter la présence dudit oligomère, et en conséquence la présence du monomère pour lequel ladite substance dimérisante ou oligomérisante est spécifique. La susbtance dimérisante ou oligomérisante est par exemple un 5 antigène et ledit monomère est bien entendu dans ce cas l'anticorps correspondant Ce procédé permet donc de déterminer s'il existe dans une solution contenant des anticorps, des anticorps spécifiques de l'antigène ajouté En particulier lorsque l'antigène est un allergène, on peut déterminer si le milieu liquide étudié contient des Ig E monomères dirigés 10 contre ledit allergène. Ce dernier procédé est particulièrement intéressant car il permet d'ajouter la substance dimérisante ou oligomèrisante sous une forme liquide. L'agent traceur est tout agent qui peut être couplé avec la 15 molécule liante pour donner un conjugué dont il est facile de repérer la présence sur le support solide après lavage convenable Les agents traceurs sont bien connus et sont constitués par exemple par des produits fluorescents (fluorescéine), des produits isotopiques marqués, des enzymes donnant des réactions colorées ou fluorescentes, etc Dans un autre mode de réalisation particulier, le procédé de l'invention est caractérisé par le fait que ladite molécule liante est fixée sur de petites particules solides individuelles capables de se maintenir en suspension dans ledit milieu liquide, que lesdites particules solides jouent à la fois le r 8 le dudit support solide et dudit 25 traceur, et que l'on repère une éventuelle agglutination avec des moyens appropriés. Les particules qui sont utilisables sont notamment des particules de latex. L'invention a également pour objet un dispositif destiné à la 30 mise en oeuvre du procédé caractérisé par le fait qu'il comprend une ou plusieurs unités dudit support solide sur lequel est fixée ladite molécule liante, un ou plusieurs conteneurs contenant ladite molécule liante couplée à un agent traceur, éventuellement des solutions d'antigènes ou d'allergènes, des tampons de dilution, d'incubation et de lavage, et éventuellement un mode 35 d'emploi, le tout étant réuni dans un même emballage à plusieurs compartiments. L'invention va maintenant être décrite plus en détails en faisant référence à des supports solides sur lesquels sont fixés des anticorps monoclonaux anti-Ig E qui sont dirigés contre un site spécifique des 40 molécules d'Ig E, ces dernières étant présentes en quantité importante dans l'organisme dans le cas de réactions allergiques Il faut bien comprendre que c'est uniquement pour faciliter la compréhension de l'exposé qu'on a décrit plus spécialement la recherche des complexes formés avec des anticorps du type Ig E Les spécialistes comprendront que le procédé décrit n'est nullement 5 limité à ces anticorps particuliers et la suite de la description ne doit donc en aucun cas être considérée comme limitative. Sur le plan clinique, la réaction allergique est caractérisée notamment par l'élaboration dans l'organisme humain d'anticorps de classe Ig E, spécifiques d'une substance d'origine externe, l'allergène Cette 10 substance haptènique ou antigénique est susceptible de provoquer la dégranulation des basophiles humains par pontage des Ig E fixées sur ces cellules par leur fragment Fc et sur l'allergène par leur fragment Fab. Une proportion assez forte des Ig E de sujets allergiques est spécifique d'un ou plusieurs allergènes Il existe également des 15 complexes immuns circulants du type Ig E-Allergène-Ig E. La détermination de l'allergène responsable a un intérêt médical certain, soit préventif pour éviter au sujet allergique le contact avec l'agent responsable, soit curatif pour mettre en oeuvre une thérapeutique de désensibilisation. Depuis quelques années, des méthodes ont été proposées pour mettre en évidence in vitro une fixation spécifique des Ig E humaines. Parmi ces méthodes, il faut citer le test de dégranulation des basophiles humains, le test radioimmunologique RAST et son équivalent immunoenzymatique. Les méthodes les plus proches de l'invention utilisent un allergène fixé sur une phase solide Le sérum est mis en contact avec cet allergène fixé et la réaction spécifique prend place sur le support. L'Ig E est ensuite révélée par un anticorps spécifique. Dans certaines méthodes publiées récemment, notamment dans "The 30 Journal of Immunological Methods", l'allergène est marqué par un atome radioactif et l'anticorps Ig E est fixé sur une bille (J of I Methods volume 58, n 1-2, 1983 pp 49-57). Aucune méthode proposée ne permet à la fois de détecter des complexes immuns circulants et d'en analyser la composition à l'aide d'un 35 anticorps monoclonal. Le système décrit a pour but de rechercher les complexes immuns à Ig E et de déterminer la nature de l'allergène impliqué dans une réaction allergique. Le réactif de l'invention utilise un seul type d'anticorps 40 monoclonal spécifique d'un site non répétitif de la molécule d'Ig E, de -5 préférence situé sur le fragment Fc de la molécule. D'une part, ces anticorps monoclonaux identiques sont fixés sur une phase solide soit par covalence soit par adsorption passive La phase solide peut être en suspension, séparable par centrifugation ou force magnétique. Elle sera de préférence en polymère organique de type polystyrène ou polychlorure de vinyle et présentée sous forme de bille, de tube, de plaque de microtitration ou de sous-unités de cette plaque. D'autre part, des anticorps monoclonaux identiques aux premiers sont marqués par un composé radioactif, une enzyme, une molécule fluorescente ou tout autre molécule utilisée comme élément de détection et de quantification des 10 réactions immunochimiques. Les complexes immuns du type Ig E-Allergène-Ig E sont pris en "sandwich" entre les anticorps fixés et les anticorps marqués (figure 1) La quantification est réalisée par le système de marquage utilisé préférentiellement après lavage de la phase solide. Les molécules d'Ig E non complexées, non dimérisées se fixent soit sur la phase solide, soit sur l'anticorps marqué, mais en l'absence de l'allergène correspondant à leur spécificité, elles ne réaliseront pas le sandwich (figure 2). Le système peut être utilisé de deux manières différentes, soit 20 pour repérer et quantifier les complexes immuns à Ig E existant dans le sérum (en cas de crise allergique par exemple, ou pour suivre l'évolution d'une désensibilisation) soit après incubation in vitro et obtention des complexes Ig E-Allergènes-Ig E en utilisant des allergènes présentés sous forme liquide que l'on ajoute pour former in situ ces complexes dans le 25 cas o des Ig E spécifiques de l'allergène étudié sont présents. L'intérêt de cette invention réside dans ces deux possibilités. La détection des complexes immuns est, en effet, plus probablement significative d'une situation allergique que la détermination d'un taux élevé d'Ig E totales. Par ailleurs, l'utilisation d'allergènes non fixes dans un test spécifique in vitro réduit considérablement la mise au point d'un nouveau dosage par rapport aux systèmes précédents du fait de la suppression de l'étape de fixation ou de marquage qui impose de résoudre des problèmes de couplage chimique propre à chaque système allergénique. Le nouveau procédé décrit ici utilise les solutions allergéniques telles qu'elles sont présentées aux cliniciens pour la désensibilisation. Ce système utilise en outre une seule phase solide revêtue d'un type unique d'anticorps et une seule solution d'anticorps marqué. L'anticorps utilisé doit être rigoureusement monospécifique Il ne doit 40 -6 réagir qu'avec un seul site non répétitif de la molécule d'Ig E Deux anticorps agissant sur des sites différents, mais mutuellement exclusifs, peuvent être toutefois utilisables. Un analogue structural des récepteurs Fc des basophiles humains est utilisable également. Outre les techniques radioimmunologiques, immunoenzymatiques et immunofluorescentes, le système peut être très facilement adapté à l'agglutination de particules de latex Dans ce cas, un seul réactif est nécessaire; il contient des particules de latex revêtues de l'anticorps 10 monoclonal anti-Ig E Les particules de latex jouent à la fois le r 8 le de support solide et d'agent traceur générateur d'un signal (ici l'agglutination) Une réaction positive se traduit par une agglutination visible sur lame ou détectée soit par comptage de particules, soit par nephélémétrie, soit par toute autre méthode sensible de mesure des 15 complexes du type Latex-anti-Ig E / Ig E Allergène Ig E / anti Ig E Latex. Ce système, plus sensible aux interférences que les méthodes utilisant une étape de lavage, a cependant l'intérêt de n'utiliser qu'un seul réactif employant l'anticorps monoclonal au lieu de deux comme dans le 20 cas précédent (figure 3). D'autres procédés d'agglutination utilisant par exemple des sels métalliques peuvent également être utilisés Par exemple ceux utilisant des sels d'or pour constituer un réseau colloidal. Le système présenté est non seulement applicable à l'allergie 25 mais également à toute recherche de complexes immuns o l'on veut établir la spécificité de l'anticorps impliqué. Par exemple, pour la recherche des Ig G spécifiques, le système décrit précédemment est complètement transposable L'anticorps anti-Ig E est remplacé par un anticorps monoclonal anti-Ig G, l'allergène devient un antigène de type 30 bactérien viral ou parasitaire La détection peut porter sur des complexes immuns circulants, ou sur des complexes formés in vitro dans le but de déterminer l'antigène responsable de l'infection Dans ce dernier cas, il est utile soit d'éliminer par les méthodes connues avant d'ajouter l'antigène, les dimères ou oligomères éventuellement présents, soit de procéder par 35 comparaison avec une solution témoin à laquelle on n'ajoute pas d'antigène. Pour les Ig M le même système est réalisable à condition soit de disposer d'un anticorps monoclonal ne reconnaissant qu'un seul cycle sur la molécule pentamerique Ig M, soit de dissocier préalablement les sousunités monomères par un agent réducteur tel que le mercapto-éthanol. Un système tout aussi efficace utilise des lectines en lieu et place -7 des anticorps monoclonaux La spécificité de ces lectines est dirigée contre des sucres constitutifs des molécules d'immunoglobulines Chaque fois qu'un site unique de fixation ou des sites mutuellement exclusifs seront impliqués, le procédé sera applicable. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE 1 Recherche des complexes immuns à Ig E La réaction utilise comme support une plaque de microtitration en polystyrène spécialement traitée pour donner un niveau de fixation 10 élevé des anticorps Tout autre support utilisé en technique EIA (tubes, billes, barettes etc) serait possible. L'anticorps, dilué en tampon carbonate, préférablement de faible force ionique à p H neutre ou alcalin, se fixe pendant une nuit La solution d'anticorps déposée dans chaque puits contient 5 lg/ml d'anticorps 15 monoclonal obtenu sur souris ou sur rat. L'anticorps est éliminé et la phase solide lavée avec un tampon salin à p H neutre contenant un agent tensioactif de type Tween 20 par exemple A ce stade, la plaque peut être séchée sous vide et conservée en sachet étanche en présence de déshydratant La solution d'anticorps peut 20 également être conservée sur la plaque quelques semaines si l'évaporation est évitée par un film adhésif. Les sérums à analyser sont dilués et incubés sur la plaque en tampon neutre contenant des protéines, préférablement de l'ascite de souris diluée en présence d'albumine bovine pour éviter les interférences 25 sériques Après une incubation de quelques minutes à quelques heures suivant l'affinité de l'anticorps, la plaque est lavée et on répartit un volume égal ( 10 à 200 1 pl) de conjugué formé par couplage d'un anticorps monoclonal identique au premier avec une enzyme (préférentiellement la 8 Galactosidase, la phosphatase alcaline ou la péroxydase). Après incubation du conjugué pendant quelques minutes à quelques heures, la plaque est lavée et le substrat de l'enzyme (coloré ou fluorescent) est réparti dans les puits utilisés de la plaque Après incubation, le substrat est bloqué par une solution inhibitrice de l'activité enzymatique et la densité optique ou la fluorescence est mesurée. Les puits montrant une activité enzymatique traduisent la présence de complexe à Ig E ou d'Ig E polymérisées Une courbe d'étalonnage peut être réalisée avec un sérum contenant un taux connu de complexes afin de quantifier exactement les complexes sériques des échantillons. Si l'anticorps *monoclonal est de très forte affinité et s'il 40 est utilisé très concentré, l'incubation des sérums et du conjugué anticorpsenzyme peut être simultanée Les volumes et les temps sont ceux utilisés généralement en technique immunoenzymatique L'enzyme peut être remplacée par de l'iode radioactive ou par un composé fluorescent si la détection est appropriée. 5 EXEMPLE 2 Détermination de l'allergène spécifique La réaction utilise les éléments précedents: support ayant fixé l'anticorps et conjugué anticorps-enzyme. Apres réalisation in vitro de complexes Ig E-Allergène-Ig E par addition de différentes concentrations d'allergène supposé, le complexe est mis à 10 incuber comme précédemment. Des concentrations élevées d'allergène dissocient les complexes préexistants alors qu'une concentration optimale permet de réaliser un maximum de sites de fixation polyvalents pour l'anticorps monoclonal. Il s'agit là de phénomènes bien connus et la recherche d'une 15 concentration optimale peut être effectuée par de simples expériences de routine avec diverses dilutions d'allergène. Le mélange Ig E-allergène est réalisé en tube et laissé incuber entre quelques minutes à quelques heures à une température variant entre 4 C et 56 C. On réalisera de préférence des dilutions d'allergènes à partir des 20 solutions utilisées pour la désensibilisation par les allergologues Les dilutions types iront de quelques mg d'allergène par ml à quelques pg/ml. Les mélanges sérum + allergène sont répartis sur des plaques revêtues d'anticorps, incubés quelques minutes à quelques heures Le support est lavé, le conjugué réparti Apres incubation du conjugué et 25 lavage, le substrat est incubé, bloqué et mesuré. Les résultats montrent qu'une forte concentration d'allergène spécifique inhibe la réaction de fixation en "sandwich" de l'anticorps fixé sur la phase solide et de l'anticorps marqué Une concentration optimale au contraire se traduit par un signal mesuré très élevé. La quantification de ce signal peut être faite en relation avec un couple sérum-allergène connu. La réaction peut être simplifiée en présentant en même temps sur la phase solide revêtue d'anticorps en une seule incubation le sérum contenant les Ig E spécifiques, l'allergène et le conjugué 35 anti-Ig E-enzyme Deux dilutions d'allergènes sont suffisantes en routine pour déterminer la spécificité de l'Ig E. Si l'allergène utilisé ne correspond pas au sérum, les deux dilutions donneront des signaux identiques Si l'allergène est celui contre lequel sont dirigés les Ig E du sérum, le signal mesuré sera plus 40 élevé pour la dilution la plus faible de l'allergène si celle-ci a été correctement choisie Des dilutions trop faibles d'allergène donnent en effet un résultat identique au sérum seul. Les réactifs peuvent en outre être présentés séchés ou lyophilisés sur le support, à savoir anticorps fixé, tampon de dilution, conjugué ou allergène. Dans une réaction immunoenzymatique, le substrat seul serait à ajouter après incubation du système: anticorps fixé / Ig E Allergène Ig E / Conjugué anticorps-enzyme et lavage. Dans une réaction radioimmunologique, immunofluorescente, le 10 lavage précéderait immédiatement la lecture directe. Applications Ces applications utilisent des anticorps monoclonaux. Ces anticorps sont obtenus par production de cellules hybrides de souris L'immunisation a été réalisée avec des Ig E humaines et l'anticorps 15 sélectionné est dirigé contre le fragment Fc de la molécule d'Ig E L'anticorps à fixer est incubé une nuit à 4 C en tampon carbonate 50 m M p H 9,6 à raison de 200 il par puits sur une plaque de microtitration de type Immuno I fabriquée par la Société NUNC (Roskilde DK) L'anticorps est en final à 5 pg/ml. Pendant le même temps, un sérum de patient non allergique aux 20 graminées et un sérum de patient allergique sont dilués au 1/10 en tampon protéique et mis à incuber avec une solution allergénique contenant 10 % d'extrait de graminés et dilués entre 40 et 400 000 fois. Les mélanges allergènes-sérum sont répartis, soit 200 1 l par puits de la plaque Après deux heures d'incubation à 22 C et lavage, le conjugué est 25 réparti et incubé 1 heure à 22 C. Le conjugué a été réalisé par couplage au glutaraldéhyde de l'anticorps monoclonal et de la Galactosidase d'E Coli selon la technique d'Avraméas. Après lavage, le substrat, orthonitrophenyl-ç-D-galactosidase est 30 réparti et incubé un temps variable suivant la qualité de l'anticorps Le volume est ici encore de 200 ul Apres coloration, la réaction enzymatique est arrêtée par 100 B 1 d'une solution de glycine Na OH p H 10,4. La lecture des densités optiques est réalisée directement sur la plaque à 405 nm avec l'appareil LOV 1 Biomérieux Le zéro de l'appareil est 35 effectué sur une solution contenant le substrat seul. Les résultats fournis sont en densité optique lue directement après blocage par le tampon glycine Na OH. Application I Utilisations de l'anticorps XB 6-16 On opère selon la même technique que précédemment pour préparer les 40 réactifs. L'anticorps utilisé est fourni par l'Institut Pasteur Production sous la référence XB 6-16. Le tampon de dilution du mélange allergène-sérum est un tampon PBS-Tween contenant 17 % de liquide d'ascite de souris obtenu par inoculation d'une souche sarcomateuse. Le sérum négatif utilisé est connu pour venir d'un patient non allergique Le sérum positif a été prélevé sur un patient allergique aux graminées. L'allergène employé est un extrait de dactyle (graminées) produit par le laboratoire des Stallergènes ( 160 quai de Polangis, Nogent sur Marne, France) Le substrat a été incubé une heure à 22 C. Les résultats (densités optiques) sont résumés dans le Tableau I. TABLEAU I 20 25 Témoin Dilution de la solution d'allergène sans allergène 1/40 1/400 1/4000 1140 000 Diluant seul 0,001 0,004 0,002 0,001 Sérum négatif 0,032 0,057 0,074 0, 064 0,049 S Sérum positif 0,811 0,103 T 0,749 0,951 0,730 l _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ Le sérum négatif seul ou en combinaison avec l'allergène ne donne aucune réponse significative. Le sérum positif seul donne une densité optique élevée traduisant l'importance des complexes immuns circulants présents dans ce sérum. La dilution 1/40 donne une densité optique faible du fait de la dissociation des complexes par l'excès d'allergène. La dilution 1/4000 donne ici le maximum de réponse positive Entre 1/40 et 1/4000 la densité optique est multipliée par 9 ce qui assure une évaluation très facile du phénomène allergique. Le même test a été repris avec une deuxième préparation des mêmes réactifs Les résultats du tableau II montrent pour le sérum positif seul des résultats comparables à ceux du tableau I avec toutefois une réaction maintenue élevée pour une dilution d'allergène 1/400 000. 11 - TABLEAU II Sérum po 10 facteur 5. Les réactions entre les dilutions 1/40 et 1/4000 varient ici d'un Pour s'assurer de la spécificité des réponses obtenues, on a par le mme procédé mis à l'épreuve face au dactyle dilué 1/40 et 1/40000, un sérum de malade titrant 20 000 unités internationales en Ig E ( 1000 fois la normale) sans allergie connues dilué 1/100 et un sérum 15 d'allergique à la poussière de maison dilué 1/10 Les résultats sont résumés dans le tableau III. TABLEAU III 25 Témoin Dilution de l'allergène (dactyle) sans allergène _ X 1/40 1/40 000 Sérum à 20 000 0,482 | 0,472 0,494 en Ig E Sérum positif en poussière 0, 426 0,402 0,425 de maison _i _ _ _ _ _ _ L _ _ _ _ _ _ _ _ _ Le signal obtenu pour les sérums seuls, caractéristique des complexes existants avec l'allergène spécifique (inconnu pour le premier sérum et poussière de maison pour le second), est retrouvé identique pour les deux dilutions de dactyle Il n'y a pas de réponse spécifique en dactyle ce qui est conforme aux spécificités connues des sérums. 35 Conclusion de cet exemple 1 Avec l'anticorps utilisé, les 3 sérums de sujets allergiques montrent des taux élevés de complexe à Ig E Le sérum du patient non allergique ne réagit pas dans le test. 2 Pour l'allergène considéré (Dactyle), deux dilutions, 1/40 40 et 1/40 000 sont suffisantes pour signifier la spécificité de 12 2549230 l'allergène Les 2 sujets allergiques à un autre allergnr e ne réagissent pas Le sérum du sujet allergique montre une très grande différence de densité optique finale entre 1/40 et 1/40 000. Application II Utilisation de l'anticorps clone 2 anti Ig E a Réactifs (préparés comme présenté ci-dessus). L'anticorps utilisé est le clone 2 anti-Ig E préparé par Hybritech (La Jolla CA USA). Les sérums négatif et positif sont les mêmes qu'à l'application I. 10 L'allergène est la même préparation de dactyle. Le tampon de dilution du mélange allergène-sérum est du sérum de chèvre à 10 % dans un tampon PBS-Tween. Le substrat est incubé 3 h à 22 C. b Résultats TABLEAU IV 25 Témoin Dilution d'allergène sans allergène 1/40 1/400 1/4000 1/40000 1/400000 Tampon de dilution 0,000 0,010 0,003 0,002 0,008 Sérum négatif 0, 009 0,008 0,025 0,012 Q,014 0,017 Sérum positif 0,287 0,199 0,229 0,310 0, 323 0,288 Les résultats de l'exemple 4 sont retrouvés quoique avec une sensibilité plus faible La dilution 1/40 000 de l'allergène est encore 30 celle qui donne la réponse maximum. Des résultats du même ordre ont été obtenus pour des conditions identiques avec l'anticorps monoclonal anti-Ig E n 3001 élaboré par Transformation Research Inc (M A USA). Conclusion des applications Ces applications montrent que le système décrit permet d'une part de détecter des complexes circulants et d'autre part, avec deux dilutions d'un allergène supposé, de signer la nature de l'allergie. Plusieurs anticorps monoclonaux de spécificité proche donnent des résultats concordant avec une sensibilité variable suivant la qualité 40 de l'anticorps, et la nature du diluant. 13 2549230 Le test est réalisé avec une solution d'allergène non fixée sur un support Il suffit que l'allergène comporte au moins deux sites de fixation pour l'Ig E sérique Cela est le cas des allergènes utilisés pour la désensibilisation La pénicilline, par exemple, est fixée sur de la polylysine pour l'utilisation in vivo. Les exemples cités sont d'autant plus facilement généralisables que la présentation de l'allergène n'est pas modifiée par rapport à celle utilisée par les allergologues. Une simple dilution est réalisée pendant le test. 10 L'application du test peut sans peine être étendue à tous les allergènes connus qui peuvent être classés dans les rubriques suivantes à titre purement indicatif: pollens et extraits de plante: dactyle poussières acariens poils d'animaux domestiques: chien, chat aliments: oeuf, poisson champignons, bactéries médicaments: péniciline, insuline. 20 Ce système peut en outre être étendu à la recherche de complexes immuns mettant en cause des Ig M, Ig G, Ig A, Ig D ou des sous-classes de ces immunoglobulines. Dans ce cas, l'anticorps utilisé doit être spécifique d'un site non répétitif de l'une de ces molécules La réaction est conduite de la 25 même façon que dans les exemples cités avec la possibilité de détecter des complexes immuns préexistants et celle de repérer une spécificité particulière comme par exemple des Ig M spécifiques de la Toxoplasmose, des Ig A spécifiques d'une infection digestive ou des Ig G spécifiques de la Rubéole. Des tests polyantigéniques ou polyallergéniques sont particulièrement faciles à mettre en oeuvre par ce test puisque les antigènes ou les allergènes sont en phase liquide et peuvent donc être utilisés sur des gammes de concentration très larges. Ce système permet également d'utiliser des antigènes figurés de taille très importante qui seraient difficiles à fixer de façon 35 reproductible sur un support. REVENDICATIONS 1 Procédé de détection d'un oligomère contenant au moins deux molécules possédant chacune un même site récepteur non répétitif, dans un milieu liquide contenant ou susceptible de contenir une solution ou 5 dispersion de ladite molécule à l'état de monomère, ladite solution ou dispersion contenant aussi, ou étant susceptible de contenir ledit oligomère, caractérisé par le fait que l'on met en contact avec ladite solution ou dispersion un support solide sur lequel sont fixées des molécules liantes douées d'une affinité spécifique pour ledit site 10 récepteur non répétitif, que l'on ajoute -à ladite solution ou dispersion une solution ou dispersion de ladite molécule liante couplée à un agent traceur, et que l'on détermine qualitativement et/ou quantitativement la présence éventuelle dudit agent traceur fixé sur ledit support solide. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait 15 que ledit oligomère est un complexe immun formé par un premier anticorps, tel qu'un complexe immun du type anticorps/antigène/anticorps, et que ladite molécule liante est un second anticorps spécifique dirigé contre un site non répétitif dudit premier anticorps. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait 20 que ledit second anticorps spécifique est dirigé contre un site non répétitif du fragment Fc dudit premier anticorps. 4 Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 et 3, caractérisé par le fait que ledit premier anticorps est une Ig E, une Ig D, une Ig G ou une Ig A, ou des sous-classes de ces immunoglobulines. 5 Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé par le fait que ledit second anticorps est un anticorps antiIg E. 6 Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé par le fait que ledit second anticorps est un anticorps 30 monoclonal. 7 Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit oligomère est un complexe immun tel qu'un complexe immun du type anticorps/antigène/anticorps et que ladite molécule liante est une lectine. 8 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'on ajoute audit milieu liquide contenant lesdits monomères, une substance dimérisante ou oligomérisante spécifique pour lesdits monomères ou pour une sous-classe desdits monomères, que ledit milieu liquide est susceptible de contenir, de façon 40 à former in situ ledit oligomère et à détecter la présence dudit oligomère, et en conséquence la présence du monomère pour lequel ladite substance dimérisante ou oligomérisante est spécifique. 9 Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que ladite substance dimérisante ou oligomérisante est un antigène, et que ledit monomère est l'anticorps correspondant. Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait que l'antigène est un allergène et que ledit monomère est une Ig E dirigée contre ledit allergène. 11 Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, 10 caractérisé par le fait que l'on ajoute ladite substance dimérisante ou oligomérisante sous une forme liquide. 12 Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que ladite substance dimérisante ou oligomérisante est une solution d'antigène ou d'allergène. 13 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que ledit support solide est une bille, un tube ou une plaque d'un matériau sur lequel il est possible de fixer par affinité ou par couplage covalent ladite molécule liante. 14 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé par le fait que ledit agent traceur est un agent traceur fluorescent, enzymatique ou isotopique. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé par le fait que ladite molécule liante est fixée sur de petites particules solides individuelles capables de se maintenir en 25 suspension dans ledit milieu liquide, que lesdites particules solides jouent à la fois le rôle dudit support solide et dudit traceur, et que l'on repère une éventuelle agglutination avec des moyens appropriés. 16 Dispositif destiné à la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait 30 qu'il comprend une ou plusieurs unités dudit support solide sur lequel est fixée ladite molécule liante, un ou plusieurs conteneurs contenant ladite molécule liante couplée à un agent traceur, éventuellement des solutions d'antigènes ou d'allergènes, des tampons de dilution, d'incubation et de lavage, et éventuellement un mode d'emploi, le tout 35 étant réuni dans un même emballage à plusieurs compartiments.