FR 2558165 A1 19850719 FR 8400676 A 19840117 Nouveaux conjugués d'oligo-muramylpeptides et compositions biologiques les contenant pour l'activation des macrophages. L'invention est relative à de nouveaux dérivés de muramylpeptides possédant d'importantes propriétés d'ac- tivation des macrophages. Elle concerne également des compositions pour réaliser l'activation des macrophages in vivo, ces compositions contenant ces nouveaux dérivés de muramylpeptides 'en association avec un véhicule biologi- quement acceptable, en vue de l'administration un hôte vivant. On désigne en général sous l'expression "muramyl- peptides" les produits comportant un motif saccharidique, notamment du type N-acétyl-muramyle ou N-acétyl-nor- muramyle, et une chaîne peptidique rattachée à ce motif saccharidique. Le premier résidu aminoacyle de cette chaîne peptidique (et rattaché au motif saccharidique) peut correspondre à l'un quelconque des aminoacides naturels (le cas échéant aussi aux isomères dextrogyres correspondants), voire même à des dérivés de substitution de ces aminoacides. Le second résidu aminoacyle est en général dérivé de l'acide glutamique. Les fonctions carboxyle de ce dernier peuvent être engagées dans des liaisons chimiques, notamment ester ou amide ou encore, notamment en ce qui concerne le groupe gamma-carboxyle, avec un autre résidu aminoacyle. Des résidus amninoacyle supplémentaires préférés sont constitués par des groupes L-lysyle ou alany1è, notamment L-lysyle ou L-alanyle. De nombreuses études ont été réalisées sur le HiDP (N-acétyl-muramyl-Lalanyl-D-isoglutamine), en tant qu'éventuel agent susceptible de stimuler l'immunité faisant intervenir les macrophages et plus particulière- ment une immunité antitumorale. Le MDP lui-même, dont est bien connue l'activité stimulante non spécifique de la réponse immunitaire à l'égard d'antigènes déterminés, témoigne cependant d'une activité réduite à l'égard de l'immunité à médiation cellulaire. Pour renforcer l'im- munité à médiation cellulaire du MDP ou d'autres muramyl- peptides, diverses transformations de ces molécules ont été envisagées. Parmi ces transformations, on retiendra essentiellement les produits résultant de la conjugaison des groupes muramylpeptides à une molécule porteuse, tels que des polymères peptidiques de synthbse et plus parti- culièrement des polymères de L-lysine portant des rami- fications de résidus aminoacyle distincts, notamment D- ou L-alanyle ou les deux à la fois. On peut se reporter utilement au brevet français n 79 00079 pour ce qui est de la constitution de telles molécules porteuses. On rappellera que, dans ce brevet, les polypeptides du genre en question jouaient le rôle de molécule porteuse à l'égard de muramylpeptides dans lesquels les premier et second résidus aminoacyle de la chatne peptidique reliée au groupe muramyle étaient tous deux dextrogyres. Les produits résultant de la susdite conjugaison entre des molécules de MDP ou analogues et de telles molécules porteuses possédant en effet des propriétés de stimulation de l'immunité à médiation cellulaire in vivo. Ils pré- sentent cependant également un certain niveau de toxicité, de sorte que les doses susceptibles d'être mises en oeuvre doivent être maintenues dans diverses limites. Il a également été proposé de conjuguer des muramylpeptides à des antigènes, par l'intermédiaire de liaisons covalentes (brevet européen n 0003833). Ces produits de conjugaison sont d'un intérêt particulier lorsqu'est recherché un accroissement sensible de la stimulation de la réponse immunitaire à l'égard de 2 5 5 8 1 6 5 l'antigène entrant dans ce conjugué. L'utilisation effec- tive de ces conjugués aux fins décrites dans le brevet n'est pas non plus sans inconvénient, dès lors que les doses à mettre en oeuvre deviennent relativement impor- tantes. L'invention a pour but de remédier au moins en par- tie à ces difficultés, et plus particulièrement de fournir de nouveaux types de conjugués de muramylpeptides, carac- térisés par une capacité accrue d'activation des macro- phages, que cette activité soit non spécifique ou au con- traire spécifique et orientée contre un antigène détermi- né, et ce à des doses extrêmement faibles. Les produits selon l'invention sont constitués par des conjugués entre un oligo-muramylpeptide et une molécule- vecteur, choisie parmi celles qui présentent une affinité sélective pour un récepteur membranaire de macrophages. Les conjugués selon l'invention formés entre un oligo-muramylpeptide et une molécule-vecteur choisie pré- sentent des capacités d'activation de macrophages à des doses remarquablement plus faibles que les dérivés de muramylpeptides de l'état de la technique. En particulier, ils possèdent des propriétés de stimulation de l'immunité à médiation cellulaire qui les rendent particulièrement utiles à plusieurs niveaux. Ils sont par eux-mêmes ca- pables d'exercer une immunité renforcée à l'égard des proliférations de cellules tumorales. Lorsqu'ils sont ad- ministrés en association ou en combinaison avec un anti- gène déterminé, ils manifestent un effet d'adjuvant immu- nologique extrêmement efficace à des doses infinitésimales. On entend ici sous l'expression "oligo-muramyl- peptide", tout produit contenant un ou de préférence plu- sieurs motifs muramylpeptide dans sa molécule. Il s'agit par exemple d'un oligomère de muramylpeptide, ou encore du produit résultant de la fixation de groupes muramyl- peptides sur une molécule porteuse, notamment un polypep- 2558 1 6 5 peptide synthétique du genre déjà rappelé plus haut, ou encore sur une protéine naturelle, telle qu'une sérum- albumine, une hémocyanine ou une anatoxine vaccinante, par exemple l'anatoxine tétanique.A.ces oligo-muramylpeptides se rattachent encore ceux dans lesquels des groupes pep- tides sont fixés sur un antigène. La "molécule-vecteur" se distingue des susdites molécules porteuses en ce qu'elle est susceptible d'être spécifiquement reconnue par un récepteur de membrane des macrophages. Parmi ces molécules-vecteurs, on peut men- tionner des immunoglobulines et plus particulièrement en- core - et de préférence - un anticorps orienté contre le muramylpeptide entrant dans le conjugué nouveau lui-même. L'anticorps peut être un sérum polyclonal ou sa fraction immunoglobulinique, obtenue à partir d'un sérum d'un animal préalablement immunisé cotnre le muramyl- peptide concerné ou un muramylpeptide analogue. De pré- - férence, l'anticorps considéré sera un anticorps mono- clonal, et de préférence encore un anticorps monoclonal réagissant sélectivement contre la structure muramyl- peptide globale, et ne réagissant que peu ou pas du tout contre soit la partie muramyle, soit la partie peptidique. D'une façon générale, que l'anticorps soit mono- clonal ou polyclonal, il importera que son site Fc reste disponible et fonctionnel, dans la mesure o c'est par l'intermédiaire de ce site que l'anticorps est apte à se fixer sur le récepteur correspondant porté par la membrane du macrophage. La molécule-vecteur peut également être constituée par un sucre. Il existe en effet sur la membrane du macro- phage des récepteurs spécifiques pour certains sueres comme le mannose. Ces récepteurs permettent la fixation sur le macrophage de glycoprotéines ayant un mannose ter- minal (Baynes and World, 1970, J. Biol. Chem., 251, 6016-6024). Après fixation, ces glycoprotéines sont rapidement internalisées à l'intérieur de ces cellules. Il a ainsi été montré que des glycoprotéines possédant des groupes terminaux mannose étaient captées par les cellules du système réticuloentothélial (et, en particulier, par les cellules de Kupffer ou par les macrophages alvéolaires). D'autres sucres peuvent éventuellement être utilisés. A titre d'exemple, on mentionnera le fucose. Il est à cet égard important de noter aussi que l'expression "conjugué entre un oligo-muramylpeptide et une molécule-vecteur" s'étend tout aussi bien à des con- jugués dans lesquels le couplage met en jeu une liaison covalente ou simplement une liaison du type de celles que l'on rencontre dans les complexes susceptibles d'être formés entre des entités chimiques distinctes ou dans des immuns complexes. Mais l'expression "conjugué entre un oligo-muramylpeptide et une molécule-vecteur" s'étend également au conjugué résultant du couplage de plusieurs motifs muramylpeptide à une molécule-vecteur commune. Lorsque la molécule-vecteur est constituée par un anticorps, la liaison entre celui-ci et le muramyl- peptide est avantageusement du type liaison immunologique antigène-anticorps. Comme il sera montré dans la descrip- tion, la liaison immunologique ne doit pas interférer avec le site de fixation de l'anticorps sur les macrophages. D'une façon générale, il va de soi soi que la liaison, covalente ou non, entre lIe muramylpeptide et la molécule vecteur devra toujours être telle qu'elle n'interfère pas avec le site actif de la molécule vecteur à l'égard du récepteur correspondant des macrophages. La vérification de l'absence d'interférence entre les sites présumés distincts qui, au niveau de la molécule vecteur, apparaissent comme intervenant dans ces deux types de réaction, pourra chaque fois être vérifiée par un test d'activité biologique in vive du conjugué obtenu, pré- cisément au niveau de l'activation des macrophages. On a en effet constaté que la conjugaison particulière qui caractérise l'invention se manifestait par une exaltation considérable de l'activité stimulante du muramylpeptide engagé dans le conjugué. Cette contribution est particu- lièrement remarquable lorsqu'elle s'applique au conjugué particulier que représente le conjugué MDP-anticorps anti-MDP, car cette activation considérable pouvait a priori être considérée comme allant à l'encontre de l'hy- pothèse que l'on aurait pu formuler que la présence de l'anticorps était plutôt de nature à inhiber l'activité stimulante du MDP. Comme on l'a déjà remarqué, les nouveaux conjugués de l'invention sont actifs à des doses excessivement faibles. Les résultats observés peuvent en effet être interprétés comme résultant d'un ciblage particulièrement efficace du muramylpeptide sur les macrophages. On peut même être tenté de formuler l'hypothèse que l'action de stimulation n'est due qu'à la faible proportion de muramylpeptide éventuellement internalisé à l'intérieur des macrophages, par l'intermédiaire de la molécule- vecteur, éventuellement après séparation de cette dernière au niveau de la paroi cellulaire. Des observations analogues peuvent être faites lorsque l'on utilise en lieu et place des anticorps d'autres molécules vecteurs répondant aux conditions sus-indiquées, comme il résultera de l'exposé des exemples dans la suite de cette description. En ce qui concerne ces autres molécules- vecteurs, il sera toujours préférable d'utiliser des molécules qui, de toute façon, ne conduiraient qu'à des réactions anti- géniques faibles chez l'hôte, même lorsqu'elles sont ad- ministrées à fortes doses. En l'occurrence, dans le cas o les molécules porteuses sont elles-mêmes d'origine biolo- gique (cas des immunoglobulines par exemple), il est préférable d'avoir recours à des molécules originaires du même hôte que celui auquel les conjugués selon l'invention sont destinés. Dans le cas de conjugués destinés à l'homme, la molécule porteuse sera également avantageuse- ment d'origine humaine. Les molécules porteuses ne peuvent alors conduire dans la pratique à aucune activité biolo- gique réelle en raison des doses excessivement faibles mises en oeuvre, tant en valeur absolue que vis-à-vis des proportions importantes des molécules circulantes de l'hôte, par exemple des immunoglobulines circulantes. Bien entendu, toutes autres molécules peu antigéniques, mais dont peut être déterminée la capacité de fixation sur le macrophage, sont utilisables dans les mêmes conditions. Il n'y a pas de limitation à retenir à l'égard des muramylpeptides euxmêmes dont le caractère généralement adjuvant découle de la littérature technique abondante disponible à ce jour. Pour mémoire, on fera néanmoins référence ci-après aux brevets et demandes de brevets dans lesquels des catégories de muramylpeptides susceptibles d'être mis en oeuvre également dans le cadre de la pré- sente invention ont été définies. A titre non limitatif, on signalera les familles de muramylpeptides définies ou envisagées dans les brevets français n0 74 22909, 76 06821, 78 080049, 78 16793 et 79 00819, le brevet américain n- 4.153.684 et les demandes de brevet européen n0 0003833, 0025495 et 0089290. Sans qu'il y ait lieu d'y voir une restriction à la portée de l'invention revendiquée, on observera que la catégorie préférée de muramylpeptides susceptibles d'être mis en oeuvre est celle répondant à la formule générale suivante: CH R6 Rf __ H,R i u ou / Nli - COCH j CH - CH - CO - - CR - CH H 1 2 l 2 CO (A)n_ Ré dans laquelle les substituants Rl, R4, R6, X, R7, R8, A et n ont respectivement les significations suivantes: - R1 est -NH2, -OH, -NY ou -OY, Y représentant un groupe substitué ou non par un groupe amino, ce groupe étant choisi parmi alcoyle, aryle ou alcoyl-aryle portant un maximum de 10 atomes de carbone; - R4 est hydroxyle, acyloxy ou alcoxy ayant au plus 4 atomes de carbone, ou monosuccinyle; - R6 est -NH2, -OH,-NHZ ou -OZ, Z étant un radical li- néaire ou ramifié formé par acyle ou alkyle contenant de 1 à 90 atomes de carbone et portant, le cas échéant, des substituants hydroxyle, carboxyle, carbonyle, amino, cy- clopropyle ou méthoxyle; - X est un résidu aminoacyle du groupe comprenant: alanyle, arginyle, asparagyle, aspartyle, cystéinyle, glutaminyle, glutamyle, glycyle, histidyle, hydroxy- propyle, isoleucyle, leucyle, lysyle, méthionyle, phényl- alanyle, propyle, séryle, thréonyle, tryptophanyle, ty- rosyle et valyle, N-méthyl-alanyle; - R7 est un groupe -OH, -NH2, alcoylamide, alcoxy linéaire ou ramifié, aryle ou alcoxy-aryle comprenant au plus O10 atomes de carbone, - R8 est un groupe -OH, -NH2 ou un groupe alcoxy compre- nant de 1 à 10 atomes de carbone, - A représente un acide aminé tel qu'un résidu alanyle, lysine, glutamine et - n est égal à O, 1 ou 2. De préférence, les acides aminés intervenant dans la constitution de la chaîne peptidique sont (à l'excep- tion de la glycine) lévogyres. Les conjugués selon l'invention peuvent âtre produits par des procédés dont les techniques sont en elles-mêmes connues. L'observation qui précede s'étend naturellement également à la production des oligo-muramyl- peptides entrant dans la constitution des conjugués selon l'invention. Des oligo-muramylpeptides préférés sont formés des polymères comportant une cha:ne de nature peptidique soit naturelle, soit synthétique, sur laquelle sont greffés des motifs muramylpeptides, par l'intermédiaire de liaisons covalentes. Une catégorie préférée de polymères de ce type comporte une chaîne dont les maillons sont des résidus aminoacides correspondant au groupe des acides aminés com- prenant l'acide alpha, bêta-diaminobutyrique, l'ornithine, la lysine, l'homo-lysine, les fonctions amines latérales pouvant porter les ramifications peptidiques dont les maillons correspondent aux résidus aminoacides de l'ala- nine, de la glycine, de l'acide alpha-aminobutyrique, de la valine, de la leucine, de la proline, le susdit poly- mère peptidique présentant une masse moléculaire moyenne comprise entre envion 50.000 et 250.000, et sur lequel sont liés de façon covalente des motifs muramylpeptide dont le premier résidu aminoacide (lié au groupe muramyle) est un stéréo-isomère de la série L, le second résidu aminoacide présentant la structure de l'acide D-gluta- mique. Parmi ces polymères, celui dont la chaîne est une polylysine portant des ramifications peptidiques poly- alanyle est préférée. D'autres caractéristiques préférées des chaînes en question (lesquelles jouent le rôle de mo- lécules porteuses de l'oligo-muramylpeptide envisagé dans le cadre de la présente invention) résultent du brevet France n 79 00819. Cette catégorie d'oligo-muramyl- peptides peut être préparée par des procédés en tous points semblables à ceux qui ont été décrits dans le brevet précité, si ce n'est que dans les produits de bee départ mis en oeuvre pour constituer le fragment pepti- dique de l'oligo-muramylpeptide, le résidu L-alanyle est substitué au substitut D-alanyle. Une autre catégorie d'oligo-muramylpeptides avan- tageusement mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention consiste en des oligomères de muramylpeptides du il2 5 8 1 6 5 type de ceux qui ont été décrits dans le brevet France n 78 16792. En ce qui concerne la préparation des conjugués selon l'invention à partir des oligo-muramylpeptides, sus-indiqués et des molécules-vecteurs telles qu'elles ont été définies ci-dessus, on pourra avoir recours à des techniques classiques mettant en jeu des réactions de couplage, par exemple entre un radical amino, carboxyle libre, ester, alcool ou thiol, porté par l'un des part- enaires de la réaction avec une fonction correspondante portée par l'autre partenaire de la réaction. On peut à cet égard se reporter avec avantage aux différentes techniques qui ont été décrites dans la demande de brevet européen n0 0089290, en vue de la préparation des conju- gués de muramylpeptides et d'haptànes. Les liaisons entre l'oligo-muramylpeptide et la molécule-vecteur peuvent être réaliséesen tous sites de ces molécules qui ne mettent pas en jeu la liaison parti- culière entre l'oligo-muramylpeptide et le récepteur ap- proprié de la membrane du macrophage. Lorsque le conjugué selon l'invention comporte une molécule porteuse distincte de la molécule-vecteur, la liaison peut intervenir entre un radical du type sus-indi- qué porté par la molécule-vecteur et un radical complémen- taire porté soit par le groupe muramylpeptide de l'oligo- muramylpeptide (notamment sur la position 6 du cycle sac- charidique ou sur la fonction gamma-carboxyle du muramyl- peptide), soit par la molécule porteuse. Ces deux cas se retrouvent respectivement dans les conjugués suivants dont la préparation sera décrite dans les exemples: - MDP-lysine-mannose et - MDP-SAB-mannose (SAB correspondant aux initiales de "sérum albumine bovine"). La liaison peut également intervenir par l'intermé- diaire d'une molécule jouant le r8le de "pont" entre la molécule-vecteur et l'oligo-muramylpeptide. Des exemples de "molécules-ponts" et des techniques pour les mettre en oeuvre - et qui peuvent également être mises en oeuvre dans le cadre de la présente invention - sont décrits dans la littérature technique, par exemple le brevet européen n 0 O 00 3833, la demande de brevet français n 78 16792 ou encore la demande de brevet européen n O 063 373. On peut également réaliser les conjugaisons entre les partenaires devant aboutir aux conjugués selon l'in- vention par incubation en présence de glutaraldéhyde ou analogues. Les proportions relatives de muramylpeptides vis- à-vis de la molécule-vebteur pourront être aussi élevées que possible, pour, autant que soit maintenu le caractère de solubilité dans l'eau des conjugués obtenus. A titre indicatif, on mentionnera que la proportion pondérale de motifs muramylpeptide vis-à-vis de la totalité de la mo- lécule sera de préférence comprise entre 5 % et 50 %. On peut aussi mentionner que des conjugués préférés conformes à l'invention peuvent comprendre de 5 à 30 motifs muramyl- peptide par molécule-vecteur. Les conjugués selon l'invention peuvent être mis en oeuvre seuls ou en association ou combinaison avec un antigène déterminé. Le conjugué selon l'invention sera utilisé seul dans les cas o une stimulation générale de l'activation des macrophages sera recherchée, notamment pour accroître la résistance de l'hôte contre des infec- tions bactériennes ou virales, ou contre des proliféra- tions de cellules tumorales. Par contre, lorsque l'on souhaitera bénéficier des propriétés stimulantes non spé- cifiques de l'immunité contre des antigènes déterminés, ceux-ci pourront. être administrés à l'hôte, conjointement avec le conjugué selon l'invention. Dans ce dernier cas, il peut être envisagé d'avoir recours à des compositions dans lesquelles le conjugué selon l'invention et l'anti- gène (notamment un antigène vaccinant) sont constitués par des entités chimiques distinctes destinées à être adminis- trées simultanément ou séparément selon un protocole préalablement établi, pour obtenir le meilleur effet de synergie souhaité. On peut aussi avoir recours aux produits de combinaison entre le conjugué selon l'invention et l'antigène particulier, notamment par l'intermédiaire de liaisons covalentes ne faisant cependant pas intervenir le site de fixation sur les récepteurs membranaires de macrophages que porte la molécule-vecteur. Des caractéristiques supplémentaires de l'inven- tion apparaîtront encore au cours de la description qui suit d'exemple de conjugués conformes à l'invention et des conditions dans lesquelles ceux-ci peuvent être utilisés. Il sera d'ailleurs fait référence aux dessins dans lesquels: - la fig. 1 contient des courbes représentatives des va- riations de l'effet cytostatique in vitro exprimées en pourcentage d'inhibition de croissance des macrophages (an ordonnées), en fonction de dosages croissants, en micro- grammes, de MDP-A--L seul (courbe A) ou en association avec des anticorps monoclonaux anti-MDP M-52-11, à raison de 10 microgrammes par millilitre (courbe B); - la fig. 2 comporte des courbes représentatives de la va- riation de l'inhibition de la croissance des macrophages (en % sur l'axe des ordonnées), en fonction de doses croissantes en maicrogrammes par millilitre de MDP-A--L, soit seul (courbe C), soit en présence de 10 microgrammes par millilitre de l'anticorps monoclonal M-52-11 (courbe E), soit de F(ah)2 (courbe D); - la fig. 3 est représentative des résultats obtenus in vivo, après immunisation de l'animal d'essai avec un con- jugué formé entre une albumine humaine et le MDP-lysine (50 microgrammes dans l'essai considéré) et des molécules témoins, en présence ou non d'anticorps anti-MDP (à raison de 0; 0,8; 4; 20; 100 et 500 microgrammes respective- ment), les susdits résultats étant exprimés en accroisse- ments relatifs des taux d'anticorps mesurés contre l'albu- mine humaine en question; - la fig. 4 présente des résultats d'essais analogues, dans lesquels le conjugué selon l'invention met en jeu un complexe immun MDP-A--L et des anticorps monoclonaux anti- MDP. EXEMPLE I: Les conjugués d'oligo-muramylpeptides ont été prépa- rés à partir de multi-[poly-(N-acétyl-muramyl-L-alanyl-D- isoglutaminyl)-D,L-alanyl]-poly-L-lysine soit de façon abrégée le MDP-A--L et d'anticorps monoclonaux murins.- MDP-A--L Le MDP-A--L a été préparé dans les conditions dé- crites par Chedid et Coll. 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76, 6557. Ce produit est caractérisé par des rap- ports molaires MDP/Lys/Ala: 1/1/20, soit encore 0,2 mg de MDP par mg de MDP-A--L. Anticorps monoclonaux murins La préparation et la caractérisation d'anticorps monoclonaux anti-MDP ont été décrites dans la littérature (Bahr et Coll. 1983, Molec. Immunol.,20, 745). Dans cette étude, trois anticorps monoclonaux relatifs à des sous- classes différentes d'IgG ont été sélectionnés. Les clones retenus ont été désignés comme suit: 2-4-5 (IgG3),M-52-11 (IgG2a) et M-5-5 (IgG2b). Ces trois anticorps monoclonaux se fixent au MDP, mais ne reoonnaissent ni l'acide N- acétyl-muramique, ni le dipeptide L-alanyl-D-isoglutamine dans des essais d'inhibition de la fixation de MDP-Lys 2558 1 65 marqué à la péroxydase aux anticorps anti-MDP (Bahr et Coll. 1982). On rappellera que l'on a sélectionné ceux des clones qui ont produit des anticorps monoclonaux qui ont reconnu sélectivement le MDP-A--L, sans cependant réelle- ment reconnaître le composé DP-A--L (c'est-à-dire le com- posé dans lequel le MDP est remplacé par la L-alanyl-D- isoglutamine (DP)). En particulier, les dilutions limites de MDP-A--L que ces anticorps monoclonaux étaient capables de reconnaître sont plus de 100 fois plus élevées que les dilutions limites de DP-A--L et également reconnues par ces mêmes anticorps, dans les essais sur microplaques dé- * crits dans le premier des articles sus-indiqués. Des anticorps monoclonaux de contrôle avec spécifi- cité anti-A--L ou anti-DNP ont été préparés comme décrit dans la littérature (Eshhar et Coll., 1980; Behnaz- Parhami et Coll., 1983). Le précipité en sulfate d'ammo- nium (50 %) de fluide ascitique de chaque clone est uti- lisé pendant l'étude, sauf mention contraire. Préparation de F(ab)2 On fait passer les ascites contenant les immuno- globulines des clones M-52-11 sur une colonne du tamis moléculaire commercialisé sous la marque SEPHACRYL S-200 (PHARMACIA) et on rassemble les fractions du pic corres- pondant à des poids moléculaires de 160.000 daltons et capables de se fixer au MDP. On les concentre et on les dialyse à l'aide d'un tampon d'acétate de sodium 0,1 molaire, pH 4,5. On ajoute à 25 mg d'IgG dans 3 ml, 1 mg de pepsine solide (SIGMA) et on laisse incuber à 37 C pendant 18 heures. On ajuste ensuite le pH à 8,0 avec du Tris 2 M et on dialyse l'IgG digéré à l'aide de PBS à pH 7,4. On élimine le fragment Fc et l'IgG non digéré en faisant passer la préparation deux fois sur 10 ml d'une colonne de protéine A-SEPHAROSE (PHARMACIA). Le fragment F(ab)2 non retenu est récupéré et contrôlé pour sa pureté selon la méthode ELISA en utilisant des antisérums de lapin spécifique de sous-classes anti-souris (Biometics). La préparation pure de F(ab)2 obtenue à partir de M-52-11 a une activité identique à celle de l'IgG non digéré, vis-à-vis de la fixation au MDP-Lys-péroxydase. Cellules Des macrophages récoltés à partir d'exsudats péri- tonéaux quatre jours après une injection intrapéritonéale de 2 ml de milieu thioglycolate (INSTITUT PASTEUR, Paris) sont utilisés comme cellules effectrices. Les mastocytomes P815 utilisés comme cellules cibles sont des cellules tumorales ascitiques péritonéales provenant de sourisDBA2. Préparation de monocouches de macrophaqes Après récupération, on lave les macrophages et on les ensemence à la concentration de 3,5 x 105 cellules dans 0,2 ml de milieu dans les puits de microplaques (NUNCLON, Roskilde, Danemark). Le milieu de culture est un milieu RPMI (FLOW LABORATORIES, Rockville, Md) contenant du sérum de veau foetal inactivé à la chaleur à 10 %, de la glutamine et des antibiotiques. On laisse incuber les cultures à 37 C, sous une atmosphère contenant du CO2 7,5 % (volume/volume). Après avoir maintenu les cellules adhérer pendant 180 mn à 37 C, donc dans des conditions leur permettant d'adhérer aux parois des puits, on enlève les cellules qui n'adhèrent pas en lavant les plaques avec du milieu 199 (INSTITUT PASTEUR, Paris). Test d'activation des macrophaegs On fait - incuber des quantités variables de dif- férentes substances avec des macrophages pendant 24 heures, ce après quoi on les enlève par lavage avant d'ajouter les cellules cibles. On ajoute ensuite 2 x 104 cellules mastocytomes P815 aux monocouches de macrophages et on laisse incuber pendant 24 heures. 4 heures avant la fin de l'essai, on ajoute à chaque puits 0,1 microCI de thymidine (3H). Les cellules marquées sont récupérées sur des disques en fibres de verre dans un collecteur d'échan- tillons multiples (SKATRON, FLOW LABORATORIES). Estimation de la cytostase des cellules cibles On exprime les résultats sous forme de pourcen- tages d'inhibition de la croissance. Ce pourcentage résulte de la formule suivante: inhibition de croissance en % = 100 (C - A)/C. Dans cette formule, C représente la radioactivité incor- porée par les cellules de mastocytomes cultivées sur monocouches de macrophages de contrôle et A la radio- activité incorporée par les cellules mastocytomes cul- tivées sur monocoubhes de macrophages activées. On a fait trois fois l'essai pour chaque groupe d'expérimerntations et les résultats obtenus sont représentatifs d'au moins deux expériences effectuées dans les mêmes conditions. RESULTATS Activation in vitro des macrophaqes par MDP-A--L en combi- naison-avec l'anti-MDP monoclonal On fait incuber les macrophages péritonéaux pen- dant 24 heures avec des doses différentes de MDP-A--L seul ou en combinaison avec l'anticorps anti-MDP (clone M-52-11, 10 microgrammes/millilitre). Comme on le voit sur la fig. 1, une concentration minimum de 1 microgramme/millilitre de MDP-A--L est néces- saire pour rendre les macrophages cytostatiques vis-à-vis des cellules tumorales P815. Au contraire, lorsqu'on laisse incuber les macrophages avec MDP-A--L en présence de 10 microgrammes/millilitre d'anti-MDP monoclonal, une quantité aussi faible que 0,001 microgramme/millilitre de MDP-A--L est suffisante pour activer les macrophages. Cette concentration de MDP-A--L représente 0,2 ng (4 x 10-10 mM) de MDP par millilitre. On observe des effets synergiques similaires entre MDP-A--L et anti- MDP avec 100, 10 ou 1 microgramme/millilitre d'anticorps monoclonaux (données non représentées). On note que lors- qu'il est ajouté seul l'anticorps M-52-11 n'a pas d'effet cytostatique sur les macrophages. Absence de synergie entre MDP-A--L et les anticorps F(ab)2 anti-MDP Les anticorps F(ab)2, préparés comme indiqué plus haut, ont une activité identique quant à leur capacité de fixation à la MDP-Lys-péroxydase que les IgG non digérés. On laisse incuber les macrophages pendant 24 heures avec 0,0001 à 100 microgrammes/millitre de MDP-A--L, soit seuls, soit en présence de 10 micro- grammes/millilitre de M-52-11 ou de F(ab)2. On peut voir d'après la fig. 2 qu'il n'y a pas de synergie entre MDP-A--L et F(ab)2, contrairement à ce qui est observé avec les anticorps intacts. Il résulte des essais qui précèdent qu'il faut au moins 1 microgramme/millilitre de MDP-A--L pour induire une activité cytostatique spécifique de macrophages péri- tonéaux murins. Au contraire, en présence d'anticorps monoclonaux anti-MDP, une quantité aussi faible que 0,001 micro- gramme/millilitre de MDP-A--L est suffisante pour activer les macrophages. Cette concentration de MDP-A--L corres- pond à 0,2 ng (4 x 10-10 mM) de MDP par millilitre. Cet effet synergique avec des quantités correspondant à la limite inférieure de MDP-A--L est observé avec les anticorps monoclonaux anti-MDP de différents isotypes g 2 ' g 2 g 3) et également avec un (IgG2a, IgG2b et IgG3) et également avec un anticorps monoclonal dirigé contre la chaîne A--L. Ainsi, l'effet synergique semble être lié à la formation de complexes immuns entre MDP-A-L et les anticorps. Enfin l'activité synergique entre MDP-A--L et les anticorps spécifiques suppose que le conjugué selon l'invention comporte bien la partie Fe de l'immunoglobuline, comme le démontre l'inaptitude de F(ab)2 à induire une telle activité, ce qui tend à soutenir l'hypothèse selon laquelle l'accroissement de l'activité observée implique la fixation des complexes immuns MDP sur les récepteurs Fc de la membrane des macrophages. EXEMPLE II: Des conjugués entre le MDP-lysine (N-acétyl-L- alanyl-D-isoglutaminyl-L-lysine) et une sérum-albumine humaineont été obtenus par coupage au glutaraldéhyde. Ce couplage a été réalisé dans les conditions suivantes: 2558 1 6 5 Les proportions relatives de MDP-Lys et de sérum- albumine humaine dans le produit final ont été de 16:1. Des groupes de cinq souris ont été immunisées avec des doses égales chaque fois à 50 microgrammes du conju- gué obtenu en présence de doses croissantes d'anticorps monoclonal contre le MDP. 7 jours plus tard, des échantillons de sang ont été prélevés sur les animaux des divers groupes. Leurs teneurs respectives en anticorps à l'égard de la sérum- albumine ont été testées par une méthode ELISA mettant en jeu des plaques de microtitration dont les puits avaient été revêtus de solutions contenant 10 microgrammes/ml de sérum-albumine humaine par puits. Les sérums des ani- maux de chaque groupe avaient été réunis et dilués au 1/100e avant d'être introduits dans les puits. Après la- vage de ces puits, dans des conditions classiques, des immunoglobulines de lapin anti-souris, couplées à de la péroxydase, ont ensuite été ajoutées dans les puits. Les activités des enzymes fixées ont été mesurées par leur action sur un mélange de 0-phénylène-diamine et d'eau oxygénée. Les taux d'anticorps mesurés résultent de l'examen de la fig. 3. Les barres verticales attestent de l'accroissement des taux d'anticorps mesurés (en or- données), en fonction des proportions en microgrammes d'anticorps antiMDP mesurés. Comme le montre la fig. 3, l'utilisation de 20 à 500 microgrammes d'anticorps anti- MDP, au niveau de l'immunisation, conduit à une exaltation de la réponse immunitaire. En particulier, celle-ci est maximum lorsque l'immunisation a été réalisée en présence du complexe obtenu par réaction de 50tug du conjugué formé entre la sérum-albumine et le MDP-Lys et 100 microgrammes d'anticorps anti-MDP. On observe que lorsque l'immunisa- tion a été effectuée en présence de 50 microgrammes du premier conjugué mentionné et de 500 microgrammes d'anti- corps anti-MDP (soit 10 fois plus), on obtient toujours 2558 1 65 encore une réponse immunitaire plus importante que celle qui pouvait être observée après immunisation avec le con- jugué albumine-MDP-Lys, en l'absence d'anticorps anti- MDP ou en présence de faibles doses de ce dernier. EXEMPLE III: Des groupes de cinq souris ont été immunisées avec du MDP-A--L, en présence ou non d'anticorps anti-MDP. Ces immunisations ont été réalisées en ayant recours au protocole suivant: a) 25 microgrammes A--L, b) 25 microgrammes A--L + 100 microgrammes anti-MDP ascitique IgG2a (M-52-11), c) 25 microgrammes MDP-A- -L, d) 25 microgrammes MDP-A--L + 100 microgrammes anti-MDP ascitique IgG3 (2-4-5), e) 25 microgrammes MDP-A--L + 100 microgrammes anti-MDP ascitique IgG2a (M-52-11). Des prélèvements de sang sont effectuéset les sé- rums des animaux de chaque groupe sont réunis aux jours 14 et 28 respectivement après l'immunisation.Ils sont ensuite testés contre A--L par une méthode ELISA sur microplaques dont les puits ont au préalable été revêtus avec une solution contenant 10 microgrammes/millilitre de A-- L. Les sérums réunis, dilués au 1/400e ont été introduits dans les puits. Après incubation et lavage des puits avec des tampons appropriés, des immunoglobulines de lapin anti-souris marquées à la péroxydase diluée au 1/10.000e ont été ajoutées. L'activité enzymatique a été mesurée contre le meme substrat que ci-dessus. Les résultats sont exprimés dans la fig. 4 par des barres verticales correspondant au taux de densité optique mesuré en réponses primaire et secondaireaux jours 14 et 28, respectivement dans les cas a) à e) définis ci-dessus. Comme dans l'exemple II, on observe une forte exal- tation de l'activité stimulante du MDP-A--L, en présence d'anticorps anti-MDP. EXEMPLE IV: Préparations du conjugué MDP-SAB-mannose et du conjugué MDP-lysinemannose. Réaction avec MDP-lysine ou avec SAB. ____________________________________ Du cyanométhyl thiopyranoside (préparé comme décrit par Lee et al. Biochemistry, 1976, 15, 3956, ou provenant des Laboratoires E.Y. (Flobio) est dissous dans de l'étha- nol absolu fratchement distillé à la concentration finale de 0,1M. Du méthylate de sodium est ensuite ajouté afin d'tre à 0,01M final. Après 48 h de contact à température du laboratoire et à l'obscurité, on évapore à sec la solution. Puis on ajoute immédiatement la protéine ou le MDP-lysine, préala- blement dissous dans un tampon borate 0,1M: pH 8,7 (la quantité de protéine ou MDP-lysine ajoutée correspond à 1,5 équivalent molaire de la solution CNM thioglycopyra- noside de départ). On laisse incuber une nuit à température du labora- toire. Une filtration moléculaire est alors effectuée afin d'éliminer le thioglycoside qui n'a pas réagi (par exemple dialyse ou filtration sur le tamis moléculaire commercia- lisé sous la marque SEPHADEX G-25). Le rendement théorique donne un rapport molaire 1 à 1 pour le conjugué MDP-CNM glycoside. Pour le conjugué albumine bovine-CNM glycoside, le rapport est de 1 à 60. Les proportions relatives du MDP et du mannose dans les conjugués selon les exemples IV et V peuvent être modifiés en fonction soit de la concentration de méthoxide de sodium, soit de la température de la réaction terminale entre l'imidate et la protéine ou le MDP-lysine selon le cas. Les produits obtenus paraissent particulièrement bien adaptés à l'activation des macrophages vis-à-vis de proliférations tumorales. Ils doivent pouvoir être utili- 2 5 5 8 1 6 5 sés efficacement chaque fois qu'il est nécessaire ou utile d'augmenter l'activité des immunomodulateurs au niveau du macrophage. L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques dans lesquelles les conjugués d'oligc-mura- mylpeptides et de molécules-vecteurs selon l'invention sont associés à un excipient pharmaceutique permettant leur administration in vivo. Ces compositions se présentent avantageusement sous forme de solutions, suspensions ou liposomes injec- tables, contenant une dose efficace d'au moins un conju- gué selon l'invention. De préférence, ces solutions, sus- pensions ou formes liposomes sont réalisées dans une phase aqueuse stérilisée isotonique, de préférence saline ou glucosée. L'invention concerne plus particulièrement de telles suspensions, solutions ou formes liposomes qui sont aptes à être administrées par injections intradermiques, intramusculaires ou sous-cutanées, ou encore par scari- fications. Elle concerne également des compositions pharma- ceutiques administrables par d'autres voies, notamment par voie orale ou rectale, ou encore sous forme d'aéro- sols destinés à venir en contact avec des muqueuses, no- tamment les muqueuses oculaires, nasales, pulmonaires ou vaginales. En conséquence, elle concerne des compositions pharmaceutiques dans lesquelles l'un au moins des conju- gués selon l'invention se trouve associé à des excipients pharmaceutiquement acceptables, solides ou liquides, adap- tés à la constitution de formes orale, oculaire ou na- sale, ou avec des excipients adaptés à la constitution de formes d'administration rectale, ou encore avec des excipients gélatineux pour l'administration vaginale. Elle concerne aussi des compositions liquides isotoniques contenant l'un au moins des conjugués selon l'invention, adaptées à l'administration sur les muqueuses, notamment oculaire ou nasale. Elle concerne enfin des compositions formées de gaz liquéfiés pharmaceutiquement acceptables, dans lesquels les conjugués selon l'invention sont dis- sous ou maintenus en suspension, et dont la détente pro- voque la dispersion en un aérosol. Lorsque les compositions selon l'invention sont utilisées en association avec un antigène vaccinant, elles contiennent avantageusement en outre un véhicule, tel que la polyvinyl-pyrrolidone, facilitant l'administration du vaccin. A la place de la polyvinyl-pyrrolidone, on peut utiliser tout autre type d'adjuvant au sens classi- que que l'on donnait autrefois à cette expression, c'est- à-dire d'une substance permettant l'absorption plus aisée d'un médicament ou facilitant son action dans l'organisme. A titre d'exemples d'autres adjuvants de ce dernier type, on mentionnera encore la carboxyméthyl-cellulose, les - hydroxydes et phosphates d'aluminium ou tous autres adju- vants de ce type, bien connus de l'homme de l'art. Les compositions pharmaceutiques selon l'inven- tion sont essentiellement destinées à moduler l'activité des macrophages. Elles sont utiles chaque fois que l'on cherche à provoquer une immunité à médiation cellulaire à l'égard d'antigènes pathogènes (par exemple de nature bactérienne, virale ou parasitaire) ou contre des prolifé- rations des cellules tumorales. Sans que les indications qui suivent puissent avoir un caractère limitatif, on mentionnera que les doses unitaires actives du médicament, rapportées aux muramylpeptides peuvent être de l'ordre de 1 à 100 microgrammes par kg. Lorsque la molécule- vecteur entrant dans le conjugué selon l'invention est constituée par un anticorps dirigé contre le muramyl- peptide, les proportions relatives de muramylpeptide et d'anticorps peuvent être de l'ordre de 1 molécule de muramylpeptide pour 10 à 100 molécules d'anticorps. 2558 1 6 5 L'invention concerne encore plus particulièrement des compositions pharmaceutiques dans lesquelles l'oligo- muramylpeptide, d'une part, et la molécule-vecteur, d'autre part, sont en fait présentés dans des conditionne- ments séparés:elles comportent par exemple un flacon conte- nant l'oligomuramylpeptide et un flacon combinant la molécule-vecteur. Ce cas est particulièrement avantageux lorsque la réaction entre les deux constituants est spon- tanée à l'occasion de leur mise en contact, de sorte que le conjugué selon l'invention peut alors être formé extem- poranément au moment de l'usage. Tel sera avantageusement le cas lorsque la molécule-veeteur est à base d'anticorps anti-muramylpeptides. Les deux constituants sont mélangés et dissous (ou vice versa) dans une solution injectable. Il est préférable de laisser reposer la solution formée pendant quelque temps, par exemple 10 minutes à la tempé- rature ambiante, avant l'administration, par exemple par injection. Les proportions relatives des deux constituants sont dans un tel cas avantageusement conformes à celles qui permettent l'obtention d'un conjugué final comportant les proportions relatives en muramylpeptides et en anti- corps contenus dans les intervalles qui ont été indiqués ci-dessus à titre d'exemple. L'invention concerne de même encore les compositions du type sus-indiqué, présentées en conditionnements sépa- rés, les constituants qu'ils contiennent étant le cas échéant destinés à être administrés ensemble ou séparément dans le temps, en conformité avec un protocole d'adminis- tration pré-établi, en vue d'obtenir la manifestation, avec le maximum d'efficacité de leurs effets thérapeu- tiques du type indiqué plus haut. Par exemple, les anti- corps anti-muramylpeptide sont destinés à être administrés avant le muramylpeptide lui-même. L'invention concerne alors plus particulierement les présentations de ces conditionnements sous des emballages appropriés et, le cas échéant, avec notices générales d'utilisation, en ce qui concerne les intervalles de temps devant s'écou- ler entre les administrations décalées des constituants séparés. Il va sans dire que les pré-conditionnements pharmaceutiques ainsi obtenus entrent dans le cadre des revendications qui suivent et relatives à des com- positions pour la stimulation des maerophages in vivo. L'invention concerne encore les réactifs biolo- giques que constituent les conjugués d'oligo-muramyl- peptides et de molécules-vecteurs selon l'invention. Les produits selon l'invention peuvent également être utiles pour la fabrication d'anticorps efficaces et en quantités importantes contre un antigène déterminé, par immunisation d'un animal avec un conjugué préala- blement formé, conformément aux enseignements de cette invention. L'antigène est alors utilisé comme"molécule- porteuse", celle-ci étant associée avec à la fois un muramylpeptide et une molécule-vecteur répondant aux définitions qui ont été données plus haut. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ee qui précède, l'invention ne se limite nulle- ment à ceux de ses modes d'application et de réalisa- tion qui ont été plus spécialement envisagés; elle en embrasse au contraire toutes les variantes; en parti- culier, on citera encore les conjugués qui mettent en oeuvre des molécules-vecteurs ayant une affinité, par exemple pour les sites membranaires suivants de macro- phages: récepteurs mannose 6-phosphate, mannose/N- acétylglucosamine, mannosyl/fucosyl; ou encore ceux décrits dans la demande de brevet européen n O 063 373. On pourra se reporter à la littérature pour ce qui est de la définition de ces sites. REVENDICATIONS l - Conjugué entre un oligo-muramylpeptide et une molécule-vecteur, caractérisé en ce que la molécule- vecteur est choisie parmi celles qui présentent une affinité sélective pour un récepteur membranaire de macrophages. 2 - Conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que la molécule-vecteur est constituée par une immunoglobuline portant un site de fixation sur un récepteur membranaire des macrophages et que la conju- gaison entre cette molécule-vecteur et l'oligo-muramyl- peptide met en jeu, soit une liaison covalente, soit la formation d'un complexe, notamment d'un immun-complexe. 3 - Conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par un complexe de ladite molécule-vecteur et dudit oligo-muramylpeptide, la molé- cule-vecteur étant constituée par un anticorps dirigé contre le muramylpeptide lui-même. 4 - Conjugué selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'anticorps est monoclonal et dirigé préféren- tiellement contre l'ensemble de la structure muramyl- peptide, alors qu'il n'est que peu actif ou même inactif à l'égard de la structure de l'acide N-acétyl muramique acylé ou de celle du peptide entrant dans la constitution dudit muramylpeptide. 5 - Conjugué selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 4, caractérisé en ce que l'oligo-muramyl- peptide est un oligomère du muramylpeptide correspondant. 6 - Conjugué selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 4, caractérisé en ce que l'oligo-muramyl- peptide contenu dans le conjugué comporte une molécule porteuse sur laquelle sont fixées plusieurs molécules de muramylpeptide. - 2558165 7 - Conjugué selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 6, caractérisé en ce que le muramylpeptide dont est dérivé le susdit oligo-muramylpeptide est carac- térisé par la formule suivante: CH2 216 X ?i II[t,1l a ou B / Nl _ COCU, i CH o Cl- CO- X - t- CH - J Cos li1 2 CO - R7 Co- (A)n R8 dans laquelle les substituants R1, R4, R6, X, R7, R8, A et n ont respectivement les significations suivantes: - R1 est -NH2, -OH, -NY ou -OY, Y représentant un groupe substitué ou non par un groupe amino, ce groupe étant choisi parmi alcoyle, aryle ou aicoyl-aryle portant un maximum de 10 atomes de carbone; - R4 est hydroxyle, acyloxy ou alcoxy ayant au plus 4 atomes de carbone, ou monosuccinyle; - R6 est -NH2, -OH,-NHZ ou -OZ, Z étant un radical li- néaire ou ramifié formé par acyle ou alkyle contenant de 1 à 90 atomes de carbone et portant, le cas échéant, des substituants hydroxyle, carboxyle, carbonyle, amino, cy- clopropyle ou méthoxyle; - X est un résidu aminoacyle du groupe comprenant: alanyle, arginyle, asparagyle, aspartyle, cystéinyle, glutaminyle, glutamyle, glycyle, histidyle, hydroxy- propyle, isoleucyle, leucyle, lysyle, méthionyle, phényl- alanyle, propyle, séryle, thréonyle, tryptophanyle, ty- rosyle et valyle, N-mé'thyl-alanyle; - R7 est un groupe -OH, -NH2, alcoylamide, alcoxy linéaire ou ramifié, aryle ou alcoxy-aryle comprenant au plus 10 atomes de carbone, - R8 est un groupe -OH, -NH2 ou un groupe alcoxy compre- nant de 1 à 10 atomes de carbone, - A représente un acide aminé tel qu'un résidu alanyle, lysine, glutamine et - n est égal à 0, 1 ou 2. De préférence, les acides aminés intervenant dans la constitution de la chaine peptidique sont (à l'excep- tion de la glycine) lévogyres. Les conjugués selon l'invention peuvent être produits par des procédés dont les techniques sent en elles-mêmes connues. L'observation qui précède s'étend naturellement également à la production des oligo-muramyl- peptides entrant dans la constitution des conjugués selon l'invention. 8 Conjugué selon la revendication 6 ou selon les revendications 6 et 7 prises ensemble, caractérisé en ce que la molécule porteuse est constituée par une fraction ou molécule ayant des propriétés immunogènes. 9 - Composition pour la stimulation des macro- phages in vivo, caractérisée en ce qu'elle contient, en association avec un véhicule biologique permettant l'ad- ministration de ladite composition in vivo, un conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. - Composition pour la stimulation de la réponse immunitaire in vivo contre un antigène déterminé, carac- térisée en ce qu'elle contient, en association avec un véhicule biologique permettant son administration in vivo, un conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et un agent immunogène apte à induire in vivo la production d'anticorps actif- contre le susdit antigène. 11 - Composition pour la stimulation de la réponse immunitaire in vivo contre un antigène déterminé, carac- térisée en ce qu'elle contient, en association avec un 2558 1 6 5 véhicule biologique permettant son administration in vivo, le conjugué selon la revendication 8, dans lequel la fraction ou molécule ayant des propriétés immunogenes est apte à induire des anticorps actifs contre le susdit antigène. 12 - Composition selon l'une quelconque des reven- dications 9 à 11, caractérisée en ce que la molécule- vecteur est constituée par un anticorps dirigé contre le muramylpeptide, les proportions relatives de muramylpepti- des et d'anticorps étant de l'ordre de 1 molécule de muramylpeptide pour 10 à 100 molécules d'anticorps.