FR 2556009 A1 19850607 FR 8418333 A 19841130 La production de L-proline (appelée ici "proline") et d'autres aminoacides par la fermentation a été l'objet de recherchesconsidérables. Les micro-organismes appartenant aux genres Arthrobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium et autres, nécessitent une certaine quantité de proline afin de survivre et produiront leur propre proline. Une telle production de proline ne dépend pas nécessairement d'un manque de proline dans le milieu, en effet certains micro-organismes peuvent toujours produire certaines quantités de proline. Néanmoins, on pense que la production microbienne de proline est contrôlée, au moins partiellement, par certains mécanismes de réaction tels que les microorganismes cessent usuellement ou réduisent la fabrication de proline lorsqu'ils en disposent en quantités suffisantes. Lorsqu'un analogue de la proline est présent, les micro-organismes le reconnaissent généralement et l'utili- sent en tant que proline, déclenchant ainsi le mécanisme de réaction pour arrêter ou ralentir la production de proline. En l'absence de proline produite dans l'environ- nement ou intérieurement, les micro-organismes meurent. Certains mutants sont insensibles ou résistent à la proline et aux analogues de la proline. Le mécanisme de réaction de ces mutants n'est déclenché ni par la proline ni par les analogues de la proline. En conséquence, ces mutants continueront à produire plus de proline que nécessaire. Le brevet et la littérature technique contiennent de nombreuses références décrivant la résistance aux analogues de la proline en tant que moyen pour choisir des micro-organismes surproducteurs de proline. Par exemple, la publication du brevet japonais No55-148096 décrit un procédé de production de proline en mettant des micro- organismes en culture, appartenant au genre Corynebacterium, Arthrobacter, Brevibacterium ou Microbacterium, qui résistent aux analogues de structure de la proline comme la 3,4-désh-ydroproline, l'hydroxyproline, l'acide azitidine-2-carboxylique, l'hydroxamate de proline et la D- proline. De même, le brevet US N 4 244 409 au nom de Nakamori et autres, révèle un procédé de production de proline, en utilisant des mutants qui appartiennent au genre Brevibacterium, Corynebacterium ou Microbacterium, et qui résistent à la DL-3,4-déshydroproline. Les micro- organismes résistant aux analogues de la proline sont typiquement obtenus en exposant des producteurs connus de proline ou des producteurs connus d'acide glutamique à un-mutagène puis en triant les mutants pouvant produire la proline en présence de l'analogue de la proline. On a trouvé que des micro-organismes uniques caractérisés par une double résistance aux analogues de la proline étaient utiles pour la production de proline en quantités commerciales. Plus particulièrement, une souche de Brevibacterium ammoniagenes a été identifiée, pouvant produire considérablement plus de proline soit que la souche parente non résistante ou une simple souche intermédiaire résistant aux analogues. La nouvelle souche résiste à la fois à l'acide L-azétidine-2-carboxylique ("ACA") et à la 3,4-déshydro-DL- proline ("DHPI"). La proline produite par mise en culture de micro-organismes de cette nouvelle souche peut être facilement séparée du bouillon de fermentation par des méthodes standards. La présente invention a pour objet la production d'un nouveau microorganisme capable d'une meilleure production de proline en quantités commerciales. La présente invention a pour autre objet un micro- organisme o la structure génétique a été modifiée de façon à rendre le micro-organisme résistant à de multiples analogues de la proline. Par ailleurs, il est souhaitable que la nouvelle souche soit utile dans des procédés commerciaux standards de fermentation ou leurs perfectionnements. La présente invention est dirigée vers de nouvelles souches de microorganismes dont la structure génétique modifiée rend les micro-organismes résistant à deux analogues de structure de la proline, ACA et DHP, ou leur permet de résister. En conséquence, les micro- organismes produiront des quantités excessives de proline lors d'une mise en culture en conditions aérobies. Selon un mode de réalisation, une nouvelle souche a été dérivée d'une culture de Brevibacterium ammoniagenes obtenue à l'American Type Culture Collection sous le N ATCC 13746. Brevibacterium ammoniagenes ATCC 13746 est un producteur connu de l'acide glutamique qui s'est révélé, dans un triage préliminaire, produire de faibles quantités de proline (moins d'un milligramme par litre). Il était souhaitable d'obtenir, par résistance aux multiples - analogues de structure de la proline, une souche mutante pouvant produire des taux considérablement élevés de proline. Le procédé de sélection consistait à exposer la souche ATCC 13746 à ACA et à rechercher un mutant spontané ayant une résistance à ACA. Ce mutant intermé- diaire résistant à ACA a été exposé à DHP et on a trouvé un mutant ayant la caractéristique souhaitée, résistance alux analogues multiples. Une gélose inclinée nutritive (commercialisée par Difco) de ATCC 13746 a été lavée avec de l'eau stérile désionisée. Une portion de 0,2 ml de la suspension résul- tante de cellules a été étalée sur une plaque d'agar ou de gélose nutritive (Difco) contenant 10 mg/ml de l'analoguede la proline, ACA. Cette plaque a été incubée à 30 C pendant 3 jours. Du fait de la présence de ACA dans le milieu de culture, la croissance des prototrophes de ATCC 13746 a été supprimée et seuls les micro-organismes résistant à ACA ont été capables de croître. Les plus grandes des colonies résistantes individuelles croissant sur la plaque de ACA ont été transférées à une plaque fraîche d'agar nutritif (Difco) sans ACA. Cette plaque a été incubée jusqu'à ce que les colonies résistant à ACA aient grandi, environ 3 jours. L'un de ces clones résistant à ACA s'est révélé produire des niveaux élevés de proline lors d'une croissance 2556009 - dans le Milieu C de Proline, dont les contenus sont comme suit: Ingrédient Quantité (par litre d'eau désionisée) Glucose 50,Q g NH4Cl 5,0 g Urée 5,0 g KH2PO4 0,5 g K2HP04,5 g MgS04-7 H20 0,5 g FeSO4 7 H20 0,02 g MnS04 4 H20 0,02 g ZnS04-7 H20 0,01 g Biotine 100,0 g Thiamine-HCl 1,0 mg Le pH du milieu a été ajusté à la neutralité, environ 6,8,avec de la soude et le milieu a été passé à l'autoclave pendant 12 minutes à 112 C. On a fait croStre le clone résistant à ACA dans ml d'un Milieu C de Proline dans une ballon dentelé de Erlenmeyer pendant 3 jours à 30 C et à 300 t/mn. Le bouillon a été recueilli, centrifugé à 4.000 t/mn et filtré à travers un filtre millipore de 0,22 micron. Le titre de proline a été déterminé par la méthode de l'auto-analyseur Technicon II en utilisant un colorant d'isatine. Le processus suivi a consisté à chauffer 1% de colorant d'isatine dans 1'isopropanol avec l'échantil- lon pendant 1 minute à 80 C puis à déterminer l'absorption à 590 nm. On a trouvé que le clone résistant à ACA produisait 8,5 mg/ml de proline. Ce mutant intermédiaire résistant à ACA a été inoculé sur une gélose inclinée d'agar nutritif (Difco) et on a incubé pendant 4 jours à 30C. La gélose inclinée a été lavée avec 5,0 ml d'eau désionisée stérile. Une portion de 0,2 ml de la suspension résultante de cellules a été étalée sur une plaque d'agar nutritif (Difco) contenant 2 mg/ml de DHP. Cette plaque a été incubée à C pendant 3 jours. L'une des colonies croissant sur cette plaque, résistant à la fois à ACA et à DHP, a été transférée à une plaque fraîche d'agar nutritif (Difco) ne contenant ni ACA ni DHP. On a alors fait croître cette souche dans un Milieu C10S de Proline, dont les contenus sont comme suit: Ingrédient Quantité (par litre d'eau désionisée) Glucose 100,0 g NH4Cl 5,0 g Urée 5, 0 g KH2PO4 0,5 g K2HP04 0,5 g MgS04-7 H20 0,5 g FeS04.7 H20 0,02 g MnSO4' 4 H20 0,02 g ZnS04.7 H20 0,01 g Bacto-Soytone (Difco) 0,3 g Biotine 100,0. Lg Thiamine-HCl 1,0 mg Le pH du milieu a été ajusté à la neutralité, environ 6,8, avec de la soude, et on a passé le milieu à l'autoclave pendant 12 minutes à 112 C. L'on a fait croître l'un des clones résistant à ACA et DHP pendant 3 jours dans 50 ml d'un- Milieu C10S de Proline dans un ballon dentelé de Erlenmeyer. Le titre de proline a été déterminé au colorant d'isatine comme on l'a décrit ci-dessus. Le clone s'est révélé produire de la proline à des niveaux de 19,6 mg/mlo Une culture lyophilisée de cette souche résistant à ACA et à DLP nouvellement développée de Brevibacterium afmmioniagenes a été déposée à l'American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 30852, Etats Unis d'Amérique, sans restrictionsconcernant 2556009. la disponibilité au public à la délivrance de ce brevet. La culture a été désignée par ATCC N 39101. Une autre fermentation utilisant ATCC 39101 pour la production de proline a été faite en utilisant les milieux qui suivent: Milieu de semence Ingrédient Quantité Glucose 5,0 g NaCl 5,0 g Extrait de levure 10,0 g Peptone 10,0 g Les ingrédients ont été mélangés dans de l'eau désionisée à 1 litre, le pH a été ajusté à 7,0 avec de la soude et le milieu a été passé à l'autoclave pendant minutes à 112 C. - Milieu de production Ingrédient Quantité 1 Urée 5,0 g NI4Cl 5,0 g K2-24 - 1,0 g MgSO4 7H20 0,5 g 4O 2 Isolat de saca (Sheffield Co.) 1,0 g FeS04 7H20 1,0 ml MnSO4 H20 2,0 ml 3 ZnSO4 7H20 1,0 ml Biotine 1,0 ml 5 Thiamine-HCl 1,0 ml6 CaCO3.50,0 g Glucose 7 1. Il faut tenir compte de l'addition de glucose lorsque l'on détermine le volume total d'eau désionisée. 2. Solution d'approvisionnement: 20,0 g/l FeS04'7H20 3. Solution d'approvisionnement: 6,1 g/l MnSO4.H20 4. Solution d'approvisionnement: 10,0 g/l ZnSO4.7H20 25009, 5. Solution d'approvisionnement: 0,1 g/l de biotine 6. Solution d'approvisionnement: 1,0 g/1 de thiamine-HCl 7. Solution d'approvisionnement: 70% de glucose. Autoclave à 110 C pendant 15 minutes. Ajouter 7,0 ml/ballon avant inoculation. Les dix premiers ingrédients ont été mélangés à l'eau désionisée pour former I litre, le pH a été ajusté à 6,8 avec de l'acide sulfurique et CaC03 a été ajouté. Le milieu a été passé à l'autoclave à 121 C pendant 15 minutes. Un ballon à chicane de 250 ml contenant 50 ml du milieu d'ensemencement a été inoculé de Brevibacterium ammoniagenes ATCC 39101 et incubé à 31 C, 300 t/mn pendant 24 heures. On a soumis environ 5,0 ml de la culture en phase logarithmique (0.D.640 = 3,0) aux ultrasons pour désagréger les amas de cellules. La suspension de cellules passée aux ultrasons a été diluée avec une solution stérile à 0,9% de NaCl et plaquée sur un agar nutritif (Difco) pour obtenir des colonies simples. Les plaques ont été incubées à 30 C pendant 72 heures. Une colonie simple des plaques a été inoculée dans un ballon à chicane de 250 ml contenant 50 ml du milieu d'ensemencement et on a incubé à 31 C, 300 t/mn pendant 16 heures. A ce moment, la culture d 'ensemencement était dlns la phase!ogaritbmiae précoce de croissance (0 D640 - 1,7). La culture d'ensemencement a été utilisée pour inoculer des ballonzs à chicane de 250 ml contenant mil de milieu de production à un OoD.640 initial de 0,05. O. chaque ball!on: on a ajouv.té 50#cl de 25,0 % de Pluronic 61 HQ 'VB, Wvyandotte) commre anti-mousse. Les ballons de productiorh ont é-té incubés à 310C, 300 t/mn. Une analyse piar chromalog-raphie liquide de haute précision d'un e cuLtil o.: du..uilOn recueilli au bout de 48 heures a -wonitré des taux de proline e 15,8 g/1. Les micro-organismes de cette souche peuwvent être i.:....... ucUr nroduire de la proline par toute méthode arobie:?,nvenÉti onnelle de ulture ou de fermentation.o 2556009. La fermentation est typiquement effectuée à 20-45'C, de préférence à 2835 C et à un pH de 5 à 9. Le carbonate de calcium et l'ammoniac peuvent être employés pour l'ajustement du pH du milieu. Le milieu de culture peut être tout milieu de fermentation contenant une source de carbone, une source d'azote, des sels inorganiques et, si on le souhaite, d'autres aliments organiques mineurs. Comme source de carbone, des sucres fermentables, des hydrolysats de protéine et des protéines peuvent être utilisés. Comme source d'azote, l'urée, les sels d'ammonium d'acides organiques (comme l'acétate d'ammonium ou l'oxalate d'ammonium) et des sels d'ammonium d'acides inorganiques (comme le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium ou le chlorure d'ammonium) peuvent être satisfaisants. Les quantités des sources de carbone et d'azote dans le milieu sont comp-4ses entre 0,001 et 20 poids/volume %. Des éléments inorganiques (comme le phosphate de potassium ou le sulfate de magnésium) et/ou des vitamines (comme la thiamine) peuvent également être ajoutés. La biotine, une vitamine B complexe, est une substance nutritive nécessaire pour la mise en culture de Brevibacterium ammoniagenes ATCC 39101. La concentration de la biotine dans le milieu de culture peut être comprise entre environ 50 et environ 500 g/l. Des concentrations inférieures à cette gamme ont tendance à forcer ce micro- organisme vers la production de l'acide glutamique, qui est un agent contaminant non souhaité lorsque la proline et l'aminoacide que l'on cherche à produire. L'addition d'autres substances nutritives organi- ques dans le milieu de culture peut être souhaitée. Le micro-organisme selon l'invention est consideré comme étant un bradytrophe, c'est-à-dire un micro-organisme croissant lentement, qui se développera plus probablement lors d'une croissance avec des substances nutritives complexes que sur un milieu minimum. Par exemple, les substances nutritives organiques (comme la liqueur de 2556009, trempage de mals, des peptones, des hydrolysats de protéine ou des extraits de levure), des éléments inor- ganiques (comme le phosphate de potassium ou le sulfate de magnésium) et/ou des vitamines (comme la thiamine) peuvent être ajoutés. Le milieu préféré de culture des micro-organismes de ce type doit contenir des substances nutritives organiques. L'une des substances nutritives organiques préféréespour une fermentation au niveau du ballon est BactoSoytone (Difco), hydrolysat enzymatique de farine de soja, à une concentration d'environ 0,1 à environ 0,5, de préférence d'environ 0,3 gramme par litre du milieu de culture. Alternativement, des extraits de levure, des liqueurs de trempage de mals ou des peptones d'autres sources peuvent être utilisées. De plus, la vitamine thiamine est une substance nutritive préférée. La fermentation est accomplie en environ 16 à 176 heures, typiquement 72 heures au niveau du ballon, et pendant ce temps la proline s'accumule dans le bouillon de fermentation. Les cellules et autres composants solides de la culture peuvent être retirés du bouillon par des processus conventionnels comme une filtration ou une centrifugation. On peut utiliser des processus connus pour la récupération et/ou la purification de la proline du filtrat ou de la solution qui surnage. Par exemple, le bouillon filtré de fermentation peut 8tre traité en utilisant une résine échangeuse d'ions. La proline peut être cristallisée de la solution résultante. 2556009. R E V E N D I C A T I 0 N S 1.- Souche d'un micro-organisme producteur de L-proline, caractérisée par une résistance aux analogues multiples de la proline et par la capacité de sur- production de L-proline. 2.- Souche selon la revendication 1, caractérisée en ce que le micro-organisme est résistant à deux analogues de la proline ou plus choisis dans le groupe comprenant la 3,4-déshydro- DL-proline, l'acide azétidine-2-carboxylique, l'hydroxamate de proline et la D-proline. 3.- Souche selon la revendication 2, caractérisée en ce que le microorganisme est une souche de - Brevibacterium ammoniagenes et résiste à la 3,4-déshydro- DL-proline et à l'acide L-azétidine-2-carboxylique. 4.- Souche selon la revendication 3, caractérisée en ce que le microorganisme est Brevibacterium ammoniagenes ATCC 39101. 5.- Souche selon la revendication 1, caractérisée de plus en ce que l'on utilise un milieu nutritif comprenant des sources de carbone et d'azote aux quantités comprises entre environ 0,001 et environ 20,0 poids/ volume %. 6.- Souche selon la revendication 5, caractérisée en ce que le milieu nutritif comprend de la biotine en une quantité d'environ 50 à environ 500 microgrammes par litre. 7.- Souche selon la revendication 5, caractérisée en ce que le milieu nutritif comprend au moins une substance nutritive complexe choisie dans le groupe consistant en peptones, hydrolysats de protéine, extraits de levure et liqueurs de trempage de mals. 8.- Procédé d'obtention de micro-organismes permettant une production améliorée de L-proline, caractérisé en ce qu'il consiste à: (a) exposer des micro-organismes producteurs de L-proline à un premier analogue de la proline, (b) faire croItre les colonies résistant au premier analogue de la proline qui survivent à l'exposition de l'étape (a), (c) exposer lesdites premières colonies résistant à l'analogue de la proline à un second analogue de la proline, et (d) faire croître les -premières et secondes colonies résistant aux analogues de la proline qui survivent à l'exposition de l'étape (c). 9.- Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le premier analogue de la proline et le second analogue de la proline sont choisis dans le groupe consistant en 3,4-déshydro-DL-proline, acide azétidine- 2-carboxylique, hydroxamate de proline et D-proline, et en ce que le premier analogue de la proline et le second analogue de la proline ne sont pas le même analogue de la proline. 10.- Procédé de production de L-proline, caractérisé en ce qu'il consiste à = (a) choisir une souche de micro-organismes producteurs de L-proline qui résiste aux analogues multiples de la proline, (b) mettre en culture ou en fermentation ladite souche dans tun milieu de culture comprenant une source de carbone et une source d'azote, et (c) récupérer la L-proline du milieu de culture'. l.- Procédé selon l E revendication 10, caractérise r e e a souche des m:icro-organismes producteurs de orol a t--st une souche de Brevibacteri anmmoniagenes 2 _ r +ésiste a. deux analogues différents de la proline u. is' dans le groupe consistant en 3,4-déshydroDL,- roi le acide L-aztcidine-2-carboxylique, hydroxamate de proline et D-proline. 12.- Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le milieu de culture comprend au moins une substance nutritive complexe choisie dans le groupe consistant en peptones, hydrolysats de protéine, extraits de levure et liqueurs de trempage de mals. 13.- Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la souche des micro-organismes producteurs de L-proline est Brevibacterium ammoniagenes ATCC 39101.