FR 2552768 A1 19850405 FR 8315683 A 19830930 1 i 2552768 La présente invention concerne la conjugaison de lipopolysaccharides, ou LPS, à diverses molécules à groupes nucléophiles, par l'intermédiaire de fonctions cyanates, les conjugués obtenus avec des protéines, des peptides, des acides nucléiques, des glycoprotéines, des glycopeptides et des molécules organiques de synthèse et leur utilisation pour l'immunostimulation in vivo ou in vitro des lymphocytes B en vue de la secrétion d'anticorps spécifiques. On sait que les lipopolysaccharides extraits des parois 10 bactériennes stimulent la mitose des lymphocytes B et la secrétion des anticorps par ces cellules BRADLEY S A a fait une revue de ces propriétés dans Ann Rev Microbiol 33, 67 ( 1979). COUTINHO et coll dans 3 Exp Med 139,74 ( 1974) ont 15 décrit la préparation d'un conjugué de lipopolysaccharide d'hy 4 droxy-4 dinitro-3, 5 phényl par action du diazoique correspondant avec un LPS bactérien Ils ont montré que ce conjugué présent à haute concentration dans le milieu de culture, stimule in vitro de façon polyclonale les cellules B, tandis qu'à 20 faible concentration il induit une réponse spécifique antihydroxy- 4 dinitro-3,5 phényl Cette méthode implique l'utilisation d'une molécule porteuse d'une fonction susceptible de réagir sur le LPS ce qui en limite les possibilités En outre les quantités des réactifs mis en jeu sont importantes,de 25 l'ordre de 10 à 100 mg. PRIMI et coll dans 3 Immunol 129 3 ( 1982) ont montré que le mélange réactionnel résultant de l'action du glutaraldéhyde sur un lipopolysaccharide et un anticorps monoclonal en milieu aqueux, peut induire une réponse immunitoire 30 in vivo et in vitro /ce procédé de couplage,classique,ne peut être réalisé qu'entre le LPS et une autre macromolécule telle qu'une immunoglobullie et n ce 3 si*te d'antigènes de travailler sur des quantités importantes,/de l'ordre du mg; en outre les essais décrits ont été effectués avec des 35 milieux réactionnels de composition mal définie,notamment parce que les réactions de couplage utilisées sont difficiles 2 2552768 à contrôler. On a trouvé maintenant un nouveau procédé de conjugaison des lipopolysaccharides à toutes sortes de molécules,porteuses de groupes nucléophiles ou MGN, procédé simple et repro5 ductible qui permet d'obtenir un conjugué LPS/MGN parfaitement défini,conservant les propriétés immunogéniques du LPS de départ Ce procédé n'implique plus, comme avec la méthode de conjugaison de Coutinho et coll la réaction d'un antigène porteur de groupements réagissant sur les LPS mais celle d'un LPS modifién Rolyvalent pouvant réagir sur de très nombreuses molécules/activées préalablement. Ces LPS activés selon l'invention sont porteurs de fonction cyanates; la cyanation des LPS est effectuée,par exemple, par action du bromure de cyanogène ou de tout autre système générateur d'ions CN+. On sait que les LPS sont composés de trois sous-unités: une unité, le lipide A, qui est à l'origine des propriétés immunostimulantes des LPS, liée à deux sous-unités polysaccharidiques Par le procédé de l'invention,seule la structure 20 polysaccharidique sera modifiée,selon le schéma suivant: (Les OH sont ceux présents sur le LPS). OH I, OC = N O LPS i LPS LPS C = NH CN O-, OH CN+OH O OH Les LPS activés de l'invention peuvent porter un nombre variable de groupes cyanates sur le polysaccharide, en fonction 30 des conditions opératoires utilisées Dans une réalisation préférée du procédé de l'invention,on minimise la polymérisation des LPS en vue de maintenir l'activité immunogénique du conjugué LPS/MGN, en effectuant la cyanation en solution aqueuse basique par action de CN Br en solution dans l'acétoni35 trile à concentration,dose et pour des durées de réaction bien définies. 3 2552768 Dans le procédé de l'invention, de O C à température ambiante,on ajoute une quantité donnée de CN Br en solution dans un solvant organique, à une solution aqueuse basique de LPS; après un temps de l'ordre de quelques minutes, entre 1 à 20 minutes, on arrête la réaction par acidification du milieu et on isole les LPS activés en les précipitant par addition d'un solvant organique approprié. On opère de préférence à 4 o C avec du bromure de cyanogène,en solution l Mdans l'acétonitrile et du LPS en solution aqueuse basique de concentration 0,2 à 10 mg/ml;on arrête la réaction après 3 minutes environ et isole immédiatement le LPS du milieu. Le produit obtenu est ensuite mis en suspension dans une solution diluée d'acide chlorhydrique de p H compris entre 15 2,5 et 3,5 puis dispersé, par exemple par passage à travers une aiguille de faible diamètre de 0,1 à 0,5 mm environ,pour obtenir un LPS activé conservant une partie de l'activité mitogenique des LPS de départ; par ce traitement on réduit le degré de polymérisation du LPS activé. Les LPS modifiés, obtenus par le procédé selon l'invention comportent au plus 200 micromoles environ de groupes cyanates par gramme de LPS de départ, de préférence 100 micromoles environ; la quantité de groupes cyanates fixés peut être mesurée par la méthode colorimétrique décrite par KOHN et coll. 25 dans Biochem Biophy Res Comm 87 7 ( 1978) Les LPS activés de l'invention peuvent être conservés plusieurs mois vers -200 C en suspension dans une solution aqueuse d'acide chlorhydrique, 10 3 N environ,sans dégradation appréciable, ce qui est un autre avantage de l'invention. Etant donné la grande réactivité des fonctions cyanates, les LPS modifiés peuvent être facilement couplés à de nombreuses molécules porteuses de groupes nuce Iophiles,tels que des peptides, des protéines, des acides nucléiques,des glycoprotéines et glycopeptides, et des molécules organiques 35 de synthèse Les groupes nucléophiles susceptibles de réagir sur les LPS activés sont nombreux et certains réagiront 4 2552768 même dans des conditions très douces de couplage ne risquant pas, par exemple, de dénaturer les protéines Ces groupes comprennent les hydroxyles des alcools et phénols, les thiols, les fonctions amines primaires et secondaires. La réaction de couplage du LPS modifié selon l'invention et du composé porteur des groupes nueléophiles est effectuée dans une solution tamponnée à un p H basique compris entre 8 et 9,5, sous agitation et à une température comprise entre la température ambiante et O C Les quantités relatives des deux produits à coupler sont essentiellement fonction de leur structure et du résultat recherché et l'homme du métier sera à même de les déterminer P our un rendement efficace de couplage, on les mélange en général dans un rapport minimal de 0,25 en poids de MGN par rapport au poids de LPS de départ La réaction s'effectue en quelques heures à température ambiante, comme en une journée aux environs de 4 C. Le conjugué formé est isolé du milieu réactionnel par centrifugation, opération que l'on répétera après remise en suspension dans une solution tampon jusqu'à obtenir un conjugué débar20 rassé des molécules à groupes nucléophiles de départ. Aussi, un autre avantage de l'invention est la simplicité et le rendement de l'isolement du conjugué du milieu réactionnel; isolement déterminant pour la stimulation des lymphocytes par les conjugués de l'invention; or cette centrifugation per25 met d'isoler 100 % du conjugué formé actif Le conjugué ainsi obtenu peut comporter des fonctions cyanates n'ayant pas réagi,aussi afin de le stabiliser et d'éviter toute réaction secondaire gênante des fonctions cyanates lors des applications ultérieures,on peut traiter par un excès de lysine ou d'éthanolamine le conjugué après l'avoir dépolymérisé dans l'eau par l'action d'ultra-sons. Selon un aspect préféré de l'invention,les conjugués sont utilisés comme agents immunogéniques in vivo et in vitro. Les LPS modifiés convenant particulièrement pour cette applica35 tion sont ceux pour lesquels on a 90 à 110 pmoles de fonctions cyanates par gramme de LPS de départ Selon l'invention,les conjugués LPS/MGN sont utilisés pour déclencher la 2552768 secrétion d'anticorps spécifiques par les lymphocytes B, in vivo comme in vitro Les anticorps produits sont essentiellement dirigés contre la molécule qui participe au conjugué. Pour développer une réaction immunitaire in vivo, on injecte aux animaux le conjugué LPS/MGN en solution dans un tampon physiologique L'utilisation, in vivo, des con Jugués selon l'invention est particulièrement intéressante puisque lorsqu'on ne dispose que d'une quantité d'antigène faible ( inférieure à 10 pg par souris de 20 g), la réaction immunitaire spécifique qui ne serait pas provoquée par l'antigène seul,est parfaitement décelable avec l'antigène conjugué au LPS Ainsi la conjugaison de MGN selon l'invention, du fait du grand potentiel immunogène des conjugués préparés, permet d'obtenir une réaction immunitaire spécifique,nette et 15 utile,avec des quantités très faibles de MGN, ce qui est particulièrement intéressant lorsquetil'antigène,,est rare et coûteux. Une autre propriété des conjugués selon l'invention est leur action mitogénique sur les cellules B in vitro Les LPS 20 modifiés et les conjugués résultants perdent leur action mitogénique si on ne les soumet pas à un court traitement par ultrasons,qui leur permet de retrouver une activité mitogénique comparable à celle des LPS natifs Pour déclencher la secrétion d'anticorps par des lymphocytes B in vitro en 25 culture,on met les cellules cultivées dans un milieu standard en présence d'une quantité définie de conjugué LPS/MGN mitogénique pour ne déclencher la réponse immunitaire que contre le MGN conjugué On introduit par exemple dans le milieu de culture à base de RPMI-1640 R (commercialisé par GIBCO) complet les conjugués à des concentrations allant de 01 à 105 /Vg/ml >la secrétion d'anticorps est décelable dès le cinquième jour de la culture Selon un autre aspect de l'invention,les cellules B cultivées en présence du conjugué LPS/MGN sont utilisées comme partenaire de fusion suivant un procédé classique,par exemple celui décrit par KOHLER et MILSTEIN dans Nature 256 495 ( 1975) et l'on obtient des hybridomes secréteurs 6 2552768 d'anticorps spécifiques du MGN dans le conjugué Cette technique dont toutes les étapes se déroulent in vitro permet l'obtentin d'anticorps monoclaux mettant en oeuvre des lymphocytes stimulés in vitro à partir de MGN en quantité faible Elle per5 met d'envisager l'acyloration par les anticorps monoclonaux de nombreux MGN pondéralement peu représentés,rares et coûteux Les anticorps monoclonaux produits avec les conjugués LPS/MGN peuvent être utilisés comme réactifs de laboratoire et inclus notamment dans des coffrets de diagnostic La composition LPS/MGN éventuellement associée à d'autres substances actives mise sous forme pharmaceutiquement acceptable est utilisable en médecine humaine et vétérinaire. Dans ce qui suit,des exemples non limitatifs sont donnés à titre d'illustration de différents aspects de l'inven15 tion Pour étudier l'activité mitogénique sur les cellules B en culture des conjuguéson a mesuré l'incorporation de thymidine marquée au tritium dans des cultures de cellules de rates en présence de concentrations variables de divers conjugués préparés selon l'invention On a comparé les conjugués avec les 20 LPS natifs, ou même effectué la mesure en l'absence de tout agent de stimulation O O,2 ml de culture cellulaire ( 5 x 105 cellules par ml d'un milieu à base de RPMI 1640 complémenté)dans les micropuits d'une plaque sont incubés 72 heures à 37 C dans une atmosphère à 7 % de CO 2 On introduit alors 25 3,7 x 10 cpm de thymidine tritiée d'activité spécifique lm Ci/mmole dans chacun des puits et 4 heures après on mesure l'incorporation de la thymidine dans les cellules. Pour étudier l'activité immunogénique des conjugués LPS/MGN,qui se traduit par une présence d'anticorps spécifi30 ques de MGN dans le sérum des animaux traités par injection du conjugué ou dans les milieux des cultures cellulaires o le conjugue a été introduit en quantité définieon a effectué des essais d'agglutination entre le sérum ou les surnageants des cultures à étudier contenant les anticorpset des prépara35 tions contenant des érythrocytes de mouton couplés aux MGN Les couplages aux erythrocytes ont été effectués soit par action de Cr Cl,comme décrit par PRIMI, D et CAZENAVE P A. dans J Immunol 129 3 ( 1982)soit par la méthode décrite par RITTENBERG et co T ans Proc Soc Exp Biol Med 132 175 ( 1969) On fait une série de dilutions du sérum ou du surna- 7 2552768 geant à tester dans une solution physiologique contenant 3 % de sérum de veau foetal,et on les répartit dans des plaques de microtitrage à fond en V 25 1 de préparation à 0,5 % d'érythrocytes couplés sont ajoutés dans chaque puits et l'ensemble est agité On attend ensuite 2 heures avant de déterminer visuellement le titre de l'hémagglutination. EXEMPLE 1 Préparation de LPS modifiés Une solution de 20 mg de lipopolysaccharide W provenant de Salmonella Thyphimurium commercialisé par DIFCO Laboratories (Détroit-USA)dans 5 ml d'eau distillée est agitée et refroidie à 4 C On ajoute alors simultanément 0,2 ml de solution de carbonate de sodium 2 M et 0,2 ml d'une solution de CN Br dans l'acétonitrile anhydre à 0,95 M Après 3 minutes, on arrête la réaction par addition de 0,8 ml d'une solution aqueuse d'acide 15 chlorhydrique l N,puis on ajoute immédiatement 50 ml d'acétone, préalablement refroidie à 41 C et contenant 0,1 % de solution de HC 1 IN pour précipiter les LPS modifiés Ceux-ci sont isolés par centrifugation à 13000 rpm dans une centrifugeuse SORVAL RC 5 B rotor SS 34 pendant 5 minutes Le LPS modifié est ensuite 20 lavé deux fois à l'acétone et séché sous vide. On le remet ensuite en suspension à raison de 10 mg dans 2 ml de solution aqueuse d'acide chlorhydrique 10 3 N, pour le conserver à une température d'environ -200 C. Ces composés sont plus ou moins polymérisés et avant couplage avec une molécule à groupes nucléophiles,on pulvérise la suspension chlorhydrique en la faisant passer à travers une aiguille de 0,2 mm de diamètre. Le LPS modifié ainsi obtenu a environ 100 U/moles de fonctions cyanates par gramme de LPS Si on effectue la cyana30 tion avec la quantité double de CN Br,on obtient un produit comportant 160 Jhmoles environ de fonctions cyanates par gramme. EXEMPLE 2 Conjugués de LPS a)macrométhode On centrifuge à 13000 rpm dans la même centrifugeuse pen35 dans 5 minutes,la suspension chlorhydrique préparée selon l'exemple 1 et le LPS modifié est récupéré après détermination du surnageant On introduit alors le MGN en solution dans un tampon à p H compris entre 8 et 9,5 Les tampons 0,1 M de phosphate, carbonate et borate conviennent à l'exclusion des tampons contenant des fonctions susceptibles de réagir sur les cyanates tels que ceux contenant des composés ayant des groupes nucléophiles On laisse la réaction évoluer 3 heures à 200 C, ou encore 18 heures à 40 C, de préférence sous agitation, avant de séparer le conjugué LPS-MCN par centrifugation à 13000 rpm,pendant au moins 15 minutes Dans ces conditions,on élimine aussi dans le surnageant l'antigène de départ; toutefois dans certains cas,il sera nécessaire de répéter plusieurs fois cette opération de centrifugation; pour cela le surnageant est éliminé après chaque centrifugation et un même volume du tampon frais de couplage est réintroduit dans le tube avant une nouvelle centrifugation. Si nécessaire,on soumet ensuite le conjugué ainsi obtenu à l'action d'un excès de lysine en solution aqueuse:après dissolution du conjugué dans l'eau par action brève d'ultrasons et obtention d'une solution de concentration environ 15 1 mg/ml, on ajoute une quantité suffisante de lysine pour que la solution finale soit environ 10 2 M On laisse agir de 30 à 120 minutes,puis centrifuge pour isoler le LPS modifié, ne comportant plus de groupes cyanates libres. On a préparé des conjugués de LPS avec des protéines 20 marqués à 1 ' 5 I, par action de la chloramine T comme décrit par SONODA et coll dans Immunochemistry 7 885 ( 1970),afin de faciliter la détermination de la quantité de protéine fixée par unité de poids de lipopolysaccharides en fonction de la quantité mise en présence du conjugue. La figure 1 donne des résultats obtenus avec 1 mg de t-galactosidase d'Escherichia coli, de cytochrome C de coeur de cheval (commercialisés par Sigma Chem Co StLouis-USA)et de protéine F 6 ( 51) l'immunoglobuline monoclonale anti-M 460 décrite par Buttin et coll -dans Curr Topics. 30 Microbiol Immun 81 127 ( 1978)) On a utilisé 0,1 ml de solution tampon contenant des quantités variables de protéine (de 0,5 à 10 mg/ml environ). La figure 2 montre la quantité de -galactosidase fixée par gramme de LPS modifié prépare selon l'exemple l,en fonction de la quantité de protéine ajoutée et de la concentration de la solution. b)microméthode La suspension de LPS activé dans l'acide chlorhydrique 03 N est soumise à un traitement par ultrasons jusqu'à solubilisation et obtention d'une solution de concentration 1 mg/ml environ On prélève alors environ 5 y de cette solution et y ajoute de 5 à 10 p W du MGN en solution dans le tampon, La suite de la réaction et le traitement sont effectués comme décrit pour la macrométhode L'activité mitogénique des conjugués ainsi préparés, a été mesurée après 10 les avoir soumis à un bref traitement par ultrasons Pour cela,on soumet la suspension de conjugué à des ultrasons d'amplitude 5 à 20 a,pendant 5 à 15 secondes. Dans le tableau 2 les résultats de l'activité mitogénique de conjugués réactivés par ultrasons et du LPS de départ sur des cultures cellulaires, dans le milieu duquel ils se trouvaient à diverses concentrations,sont indiqués. EXEMPLE 3 Immunisation des souris Des groupes de 3 souris Balb/c sont immunisés par une injection intrapéritonéale de 5,u gd'un agent immunogène,dissous dans le tampon de couplage Le 7 ème jour,on prélève le sang au niveau du plexus rétroorbitalaire pour déterminer par hémagglutination,comme décrit précèdemment,le titre en anticorps du sérum. Le tableau 1 donne les résultats obtenus,exprimés en logarithmes décimaux, pour différents immunogènes:des molécules à groupes nucléophiles, du LPS pur ou des conjugués On constate que les lypopolysaccharidesnon conjugués,comme les antigènes non conjugués n'ont aucune activité. On a obtenu les mêmes résultats en injectant 1 A des mêmes immunogènes mais en effectuant les prélèvements sanguins seulement 15 jours après l'injection. 10 TABLEAU 1 Erythrocytes Immunogènes Seuls couplés ' couplés à couplés *** TN** galacto à F 6 ( 51) s idase LPS pur 2 1 1 2 DNP lysine 1 1 2 2 DNP conjugué 2 13 3 1 t -galactosidase 1 1 2 1 -galactosidase onjuguée 2 1 24 1 F 6 ( 51) 2 2 1 2 F 6 ( 51)conjuguée 2 1 2 14 * nmo m I, _ -* il Aun LII Ltroppitunyi J> ysine ** TNP acide trinitrobenzène sulfonique *** F 6 ( 51)immunoglobuline préparée par Buttin et coll. Lorsque les conjugues sont préparés à partir de faibles quantités de protéines,par la microméthode selon l'exemple 1, 20 il suffit de 5 à 10 /4 g de protéines de déparjpour déclencher une réaction spécifique chez ces animaux par injection du conjugué préparé selon l'exemple 1. EXEMPLE 4 Induction de la secretion d'anticorps dans des cultures 25 de cellules par des conjuguésOn prélève les rates de souris Balb/c et les dilacère dans une solution saline isotonique tamponnée On lave les cellules ensuite 2 fois par 50 ml de cette même solution,puis on les met en suspension à raison de 107 cellules par ml dans 30 la même solution et les traite successivement par un anticorps monoclonal anti thy 1-2 et par du complément,selon le procédé décrit par PRIMI et coll Les cellules sont ensuite mises en culture à raison de 5 x 105 cellules/ml dans un milieu R RPMI 1640 complémenté avec de la glutamine ( 2 x 10 3 M), des antibiotiques ( 1000 UI/ml),10 % de sérum de veau foetal et du mercaptoéthanol à une concentration de 2 x 105 M. il Les figures 3 et 4 donnent les résultats obtenus pour des lots de 12 cultures de 0,2 ml chacune; pour chaque lot ont été introduits dans le milieu des quantités variables d'inducteurs différents,conjugués de lipopolysaccharides et protéines ou LPS pur Ne sont pas représentés les essais effectués avec des conjugués n'ayant pas d'activité mitogénique; in vitro ceux-ci ont toujours donné des résultats négatifs, c'est-à-dire qu'il n'y a pas eu de sécrétion d'anticorps dans les cultures o ils ont été introduits. La figure 3 correspond à des conjugués LPS/ -galactosidase,présentant des rapports en poids de protéine fixée au LPS,différents (courbe 1: 200 %-t gal/mg LPS; courbe 2: ' /mg; 33,25 I /mg; 4: O i /mg et LPS non traité) Les surnageants des cultures ont été prélevés 10 jours apres l'addition du LPS conjugué ou non et soumis à une recherche de la présence d'anticorps par agglutination Les érythrocytes étaient couplés à de la p -galactosidase On a noté le pourcentage de résultats positifs, c'est-à-dire le % des cultures parmi les 12 donnant une agglutination La courbe 5 correspond 20 à la même culture que la courbe l,mais l'agglutination a été étudiée avec des érythrocytes couplés au TNP. La figure 4 correspond à des cultures traitées par un conjugué résultant du couplage LPS/DNP lysine,selon le procédé des exemples 1 et 2; l'agglutination a été étudiée 25 avec les érythrocytes couplés au TNP à * ou couplés à la -galactosidase à Sur cette même figure,sont indiqués les résultats obtenus avec des cultures traitées par un conjugué F 6 ( 51) /LPS; 1 ' agglutination a été étudiée pour des érythro30 cytes couplés à F 6 ( 51) ou au TNP J TABLEAU 2 Concentration du mitogène LPS congugué Con Conugué congugue n Conugue Con ugué jxg/ml dans le milieu de pur /3-gal/LPS LPS/DNP LPS/lysine culture a b c d 28634 + 990 17602 + 937 16633 + 1058 17316 + 1135 16907 + 1253 14836 + 971 10560 + 962 10342 + 906 11130 + 991 10996 + 1033 7665 + 738 6512 + 612 6061 + 707 5982 + 512 5897 + 604 0,5 2981 + 340 2811 + 417 2567 + 416 3120 + 498 3040 + 312 0,05 941 + 186 967 + 213 888 + 227 1111 + 175 1001 + 204 Les résultats sont exprimés en coups par minute (cpm) k-' N a conjugué o 100 4 g de+galactosidase b 50 sog N -gal/mg LPS sontfixé par mg de LPS c conjugué o 40 moles de dinitrophényl lysine sont fixés par 1 g de LPS. d LPS modifié mais dans lequel les groupes cyanates ont tous été bloqués par de la lysine Dans les cultures non traitées on trouve environ 1000 coups par minute ut Ln % 114 N 0 % o O 13 2552768 REVENDICATIONS l.Lipopolysaccharides modifiés,chimiquement réactifs, caractérisés en ce qu'ils sont porteurs de groupes cyanates et sont représentés par la formule LPS(OC=: N) pour laquelle n LPS(OH)n est le lipopolysaccharide N 2 Procédé de préparation de lipopolysaccharides modifiés selon la revendication l,caractérisé en ce que l'on fait réagir sur le lipopolysaccharide du bromure de cyanogène ou un système générateur d'ions CN+. 3 Procédé de couplage de lipopolysaccharides à des molé10 cules portant des groupes-nucléophiles,caractérisé en ce que l'on fait réagir le lipopolysaccharide modifié selon la revendication 1 sur une molécule portant des groupes nucléophiles. 4 Procédé selon la revendication 3,caractérisé en ce 15 que les molécules portant des groupes nucléophiles sont choisies parmi des peptides, des protéines,des acides nucléiques, des glycoprotéines et glycopeptides et des molécules organiques de synthèse. 5.Procédé de couplage selon l'une des revendications 3 ou 20 4, caractérisé en ce que la réaction a lieu en milieu basique à p H compris entre 8 et 9,5. 6.Conjugués de lipopolysaccharides et de molécules porteuses de groupes nucléophiles,caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 25 3 à 5. 7 Agent de stimulation immunitaire spécifique des lymphocytes B in vivo et in vitro,caractérisé en ce qu'il comprend un conjugué selon la revendication 6. 8.Application de l'agent de stimulation selon la revendi30 cation 7 à l'immunisation animale et humaine. 9.Composition pour l'immunisation in vivo contre une molécule porteuse de groupes nucléophiles,caractérisée en ce qu'elle comprend un conjugué selon la revendication 6 associé à un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 10.Procédé de préparation in vivo d'anticorps spécifiques de molécules à groupes nucléophiles,caractérisé en ce qu'il consiste à injecter une composition selon la revendication 9. ll Agents mitogéniques des cellules B,caractérisés en ce qu'ils sont préparés par le procédé de couplage selon l'une quelconque des revendications 3 à 5,et que ledit procédé est suivi d'un traitement par ultra-sons. 12.Procédé de préparation in vitro d'anticorps spécifi10 ques, caractérisé en ce que les lymphocytes B sont cultivés en présence d'agent mitogénique selon la revendication 11. 13.Anticorps spécifiques de molécules à fonctions nucléophiles, caractérisés en ce qu'ils sont préparés par le procédé selon la revendication 12. 14 Application des lipopolysaccharides modifiés selon la revendication 1 à la préparation de cellules qui seront fusionnées en vue de l'obtention d'hybridomes secréteurs d'anticorps spécifiques de molécules porteuses de groupes nucléophiles. 15 Anticorps monoclonaux, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus à partir des hybridomes selon la revendication 14.