FR 2553790 A1 19850426 FR 8416301 A 19841024 La présente invention se rapporte à un procédé enzymatique pour convertir le glucose (dextrose) en fructose (lévulose). La plus grande partie du glucose alimentaire est offerte sous la forme d'hydrolysatenzymatique de l'amidon de mals, c'est5 à-dire le sirop de mals du commerce On accorde en général au glucose un pouvoir édulcorant représentant 60 à 80 % de celui du saccharose et par conséquent on le vend à un prix inférieur en correspondance. On sait depuis longtemps isomériser le glucose en fructose (qui est plus sucrant que le saccharose) à l'aide d'une enzyme ayant une 10 activité de glucose-isomérase, de préférence immobilisée sur un support inerte tel que la diéthylaminoéthyl-cellulose, le verre poreux ou la chitine On pourra trouver des descriptions détaillées de conversions enzymatiques du glucose en fructose à l'aide d'une glucose-isomérase dans Hamilton et collaborateurs "Glucose Isomerase 15 a Case Study of Enzyme-Catalyses Process Technology", Immobilized Enzymes in Food and Microbial Processes, Olson et collaborateurs, Plenum Press, New-York, ( 1974), pages 94-106, 112, 115-137; Antrim et collaborateurs, "Glucose Isomerase Production of High-Fructose Syrups", Applied Biochemistry and Bioengineering, Vol 2, Academic 20 Press ( 1979); Chen, et collaborateurs, "Glucose Isomerase (a Review)", Process Biochem, ( 1980), pages 30-35; Chen, et collaborateurs, "Glucose Isomerase (a review) ", Process Biochem, ( 1980), pages 36-41; Nordahl et collaborateurs, "Fructose Manufacture from Glucose by Immobiled Glucose Isomerase", Chem Abstracts, Vol 82, 25 ( 1975), Abs No 110316 h; et Takasaki, "Fructose Production Glucose Isomerase", Chem Abstracts, Vol 82, ( 1975), Abs No. 110316 h; et Takasaki, "Fructose Production by Glucose Isomerase", Chem Abstracts, Vol 81, ( 1974), Abs No 76474 a En outre, il existe de nombreux brevets traitant de i'isomérisation du glucose, 30 parmi lesquels le brevet des Etats-Unis n 3 616 221; le brevet des Etats-Unis "Reissue" 28 885 (à l'origine 3 623 953); les brevets des Etats-Unis n 3 694 314; 3 708 397; 3 715 276; 3 788 945; 3 826 714; 3 843 442; 3 909 354; 3 960 663; 4 144 127; et 4 308 349 constituent des exemples représentatifs. 35 Les quantités de fructose auxquelles on peut parvenir par isomérisation du glucose à l'aide de la glucose-isomérase sont limitées par l'équilibre de la réaction d'isomérisation A 65 C, l'équilibre de la réaction se trouve à environ 51 % en poids de fructose lorsqu'on est parti d'un substrat consistant en dextrose pur Lorsqu'on utilise comme substrat de la liqueur de glucose raffi5 née (contenant jusqu'à 6 % environ en poids de saccharides autres que des monosaccharides) et qu'on laisse séjourner pendant une durée raisonnable dans le réacteur enzymatique, on obtient au maximum, par les procédés mentionnés ci-dessus, un sirop de fructose à une teneur de 48 à 52 % (sur matières sèches) Pour parvenir à des sirops à plus forte teneur en fructose, il faut faire appel à des systèmes de fractionnement qui augmentent considérablement le prix du produit final Toutefois, à des températures plus élevées, l'équilibre devient plus favorable Ainsi par exemple, un procédé enzymatique à la glucoseisomêrase qui pourrait opérer à des tempé15 ratures de 90 à 140 C pourrait être exploité pour donner directement des sirops de mals à forte teneur en fructose (HFCS), contenant 53 à 60 % en poids de fructose sur les matières sèches, ce qui éviterait des fractionnements et des recyclages Mais les systèmes connus à base de glucose-isomérase ont tendance à une dénaturation 20 à la chaleur s'accompagnant d'une forte réduction d'activité, ce qui a constitué un obstacle aux tentatives d'opération à des températures élevées visant à déplacer l'équilibre de l'isomérisation en faveur du fructose En outre, le glucose et spécialement le fructose sont des sucres réducteurs sensibles qui ont une tendance marquée 25 à donner des produits secondaires indésirables tels que le psicose, des produits colorés, des précurseurs de produits colorés, des dianhydrides du fructose, du mannose, du tagatose, et des acides lorsqu'on tente de les chauffer aux températures nécessaires pour isomériser conformément à l'invention. On a maintenant découvert avec surprise que lorsqu'on procédait à une opération d'isomérisation du glucose dans certaines limites critiques de p H et de durée de séjour dans un réacteur enzymatique, spécifiées ciaprès, on pouvait effectivement travailler à des températures d'isomérisation d'environ 90 à 140 C 35 et obtenir directement des sirops HFCS de haute qualité (c'est-àdire avec des formations acceptables de produits secondaires) contenant d'environ 52 à 60 % en poids de fructose,:e qui permet d'éviter les opérations coûteuses et compliquées de fractionnement et de recyclage nécessaires dans les procédés connus d'isomérisation du glucose pour parvenir à l'intervalle de teneur en fructose spécifié. Conformément à l'invention, on isomérise le glucose en fructose par un procédé qui se caractérise en ce que l'on met une liqueur contenant du glucose en contact avec de la glucose-isomérase stabilisée chimiquement à une température d'environ 90 à 140 C et à 10 un p H d'environ 3 à 8 pendant une durée de contact suffisante pour parvenir dans ladite liqueur à une teneur finale d'au moins 53 % en poids environ et jusqu'à 60 % en poids environ de fructose par rapport à la teneur totale en hydrates de carbone, sans formation appréciable de psicose ni de sucres autres que le fructose et le 15 glucose. Le glucose qu'on isomérise en fructose conformément à l'invention peut provenir d'une des sources quelconques connues de ce sucre Pour des raisons d'économie, on utilisera habituellement du glucose obtenu par hydrolyse de la cellulose ou de l'amidon à 20 l'aide d'un acide et/ou d'une enzyme, de préférence à l'aide d'une enzyme, conformément à des techniques connues Les liqueurs contenant du glucose qu'on obtient de cette manière contiennent couramment des proportions mineures de polysaccharides, d'oligomères de sucre, etc, selon la nature de la source d'hydrates de carbone 25 utilisée et selon la technique d'hydrolyse exploitée Les graines de céréales telles que les graines de mais, de millet, de blé, d'orge, et les graines analogues, les racines et tubercules amylacés tels que les pommes de terre, les ignames, les carottes, le manioc, et les végétaux analogues constituent d'excellentes sources 30 d'amidon pour la conversion en le glucose utilisé comme produit de départ selon l'invention Aux Etats-Unis, on préfère l'amidon de mais en raison de son prix relativement bas et de ses facilités d'approvisionnement Du fait que la production du glucose de qualité alimentaire favorise l'utilisation des techniques d'hydrolyse enzy35 matique de l'amidon, ce sont ces techniques qu'on préfère conformément à l'invention On trouvera la description de procédés d'hydro- lyse enzymatique dans les brevets des Etats-Unis n 4 017 363, 3 912 590, 3 922 196, 3 922 197-201 et 4 284 722, dont les descriptions sont considérées comme intégrées à la présente demande. La glucose-isomérase utilisée conformément à l'invention comme source de l'enzyme pour la stabilisation chimique peut être isolée à partir de l'un quelconque des micro-organismes connus pour être producteurs de glucoseisomérase, y compris Streptomyces flavorirens, Streptomyces achromogenes, Streptomyces echinatus, Streptomyces albus, Streptomyces wedmorensis, Streptomyces phaeo10 chromogenes, Streptomyces bobiliae, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces venezuelae, Aerobacter aerogenes, Aerobacter cloacae, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacillus fructosus, Brevibacterium pentaaminoacidicum, Escherichia intermedia, Leuconostoc mesenteroides, et Paracolobactrum aerogenoides En outre, on 15 peut utiliser les glucoses-isomérases élaborées par les genres Nocardia, Micromonospora, Microbispora, Microellobospora et Arthrobacter Streptomyces sp ATCC 21 175 constitue une excellente source de glucoseisomérase pour l'utilisation dans le procédé selon l'invention Comme on l'a signalé déjà, il peut être avanta20 geux d'utiliser une glucoseisomérase stable aux températures d'isomérisation relativement élevées qu'on observe dans l'invention, par exemple la glucose-isomérase produite par Bacillus stearothermophilus, en particulier les souches choisies dans le groupe consistant en Bacillus stearothermophilus ATCC 21 365, NRRL B3680, 25 NRRL B-3681 et NRRL B-3682 telles que décrites dans le brevet des Etats-Unis n 3 826 714; la glucose isomérase produite par un microorganisme du genre Ampullariella tel que Ampullariella digitata, Ampullariella lobata, Ampullarielle campanulata et Ampullariella regularis (brevet des Etats-Unis n 4 308 349); la 30 glucose-isomérase produite par Bacillus licheniformis (demande de brevet européen publiée sous le n 41213); et la glucose-isomérase produite par les thermophiles des genres décrits dans la demande de brevet japonais publiée sous le n 74 30588. En plus des micro-organismes mentionnés ci-dessus, on 35 peut utiliser conformément à l'invention des mutants et des variantes de ces microorganismes ainsi que des micro-organismes ayant subi des transformations génétiques et dérivant des microorganismes précédents par introduction de gènes mutés de glucoseisomérase dans d'autres micro-organismes, y compris des microorganismes mésophiles et thermophiles Les gènes mutés de glucose5 isomérase choisis pour cette utilisation sont ceux qui donnent une glucose-isomérase stable à température élevée, spécialement au-dessus de 90 C et de préférence jusqu'à 140 C environ Ces gènes peuvent être préparés par les techniques usuelles servant à la mutation de microorganismes comme l'irradiation ou les mutagènes 10 chimiques On peut également muter in vitro des gènes isolés de glucose-isomérase qui produisent de la glucose-isomérase à stabilité thermique modérée, telle que produite par exemple par certaines souches de Streptomyces La sélection des gènes mutés appropriés est réalisée par réintroduction du gène muté soit dans 15 le parent soit dans un autre micro-organisme, en faisant suivre d'une croissance et d'une multiplication du microorganisme et d'un contrôle par essais de la stabilité à la chaleur de la glucoseisomérase obtenue. On peut également utiliser des techniques de recombi20 naison d'ADN pour obtenir de la glucose-isomérase à stabilité thermique améliorée et convenant pour la stabilisation chimique et l'utilisation dans l'invention Argos et collaborateurs (Biochemistry 18 ( 25):5698-5703 ( 1979)) indique que certaines substitutions d'alanyle à glycyle, séryle, valyle et lysyle dans des enzymes de micro-organismes mésophiles se trouvent dans les enzymes correspondantes provenant de micro-organismes thermophiles Perutz (Science, 201, 1187-91 ( 1978)) indique que les enzymes de bactéries thermophiles doivent leur stabilité supérieure principalement à des ponts salins additionnels existant à la surface des protéines. 30 Zuber (dans "Biochemistry of Thermophily", Freidman, S M, ed 7 pages 267-285, Academic Press, N Y 1978) donne d'autres renseignements sur la structure des enzymes stables à la chaleur Ainsi, si l'on connaît la séquence d'aminoacides et la structure tridimensionnelle (tertiaire) d'une glucose-isomérase, il est possible 35 de parvenir à une stabilité améliorée par des mutations spécifiques de sites dans le gène d'isomérase et d'obtenir des enzymes dont la structure contient des quantités accrues des aminoacides donnant des structures plus stables Lorsqu'on a déterminé la séquence d'ADN de la glucose- isomérase, on peut utiliser un synthétiseur de gènes pour former de nouvelles séquences, augmentant ainsi la stabilité à la chaleur de la glucose-isomérase produite par ces gènes fabriqués par l'homme Ces enzymes de synthèse sont spécialement avantageuses dans la pratique de l'invention. Du fait que la glucose-isomérase est produite en milieu intracellulaire par ces micro-organismes et d'autres encore, 10 on peut obtenir une source de glucose-isomérase en récoltant simplement les cellules, et on peut séparer l'enzyme des cellules par des techniques connues, par exemple l'autolyse des cellules, la rupture aux ultrasons, et l'utiliser dans un réacteur enzymatique de conception classique connue De préférence, la glucose-isomérase 15 stabilisée chimiquement sera immobilisée sur un support inerte conformément à des techniques classiques et connues si elle n'a pas été insolubilisée par la stabilisation chimique Les produits et procédés utilisés pour l'immobilisation des enzymes sont bien connus et décrits dans un certain nombre de publications y compris 20 Wang et collaborateurs, Fermentation & Enzyme Technology, John Wiley & Sons, Inc, New-York ( 1979), pages 318-338 et Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3 e édition, John Wiley & Sons, Inc, New-York ( 1980) Vol 9 pages 148-172, qui sont considérés comme intégrés à la présente demande La présence de petites quan25 tités de cations cobalt, manganèse et magnésium et/ou de sels hydrosolubles de l'acide sulfureux comme le sulfite de sodium, le bisulfite de sodium, le sulfite de magnésium, et/ou le bisulfite de magnésium, comme décrit dans le brevet des Etats-Unis (Reissue) n 28 885, peut également être envisagée en vue de diminuer ou de 30 supprimer la dénaturation de la glucose-isomérase au cours de la mise en oeuvre du procédé. Il est nécessaire que la liqueur d'alimentation contenant du glucose soit à une concentration en hydrates de carbone dans l'intervalle d'environ 20 à 85, et de préférence d'environ 35 30 à 50 % en poids, si l'on veut parvenir aux résultats voulus. Il est également nécessaire que l'isomérisation soit soit effectuée à un p H dans l'intervalle d'environ 3 à 8, de préférence d'environ 4 à 7 et mieux encore d'environ 5 à 6,5 Si l'on réalise l'isomérisation nettement au-dessous ou au-dessus de l'intervalle de p H spécifié, on forme des quantités excessives de sous5 produits indésirables tels que du psicose, des acides organiques, des produits colorés, des précurseurs de produits colorés, des dianhydrides dufructose et des produits analogues. On a découvert que le p H d'activité optimale de la glucose-isomérase diminuait nettement aux températures élevées. 10 Ainsi par exemple, pour la glucose-isomérase de Streptomyces rubigenosus, l'activité optimale se situe à p H 8,6 à 9,2 à 25 C, 6,9 à 7,5 à 75 C et 5,6 à 6,2 à 125 C Ainsi donc, au fur et à mesure qu'on augmente la température d'isomérisation, on peut diminuer le p H d'isomérisation afin de conserver l'activité maximale 15 de l'enzyme et en outre d'éviterles formations excessives de produits secondaires. Une autre exigence nécessaire conformément à l'invention réside dans la durée du contact entre la liqueur d'alimentation contenant du glucose et la glucose-isomérase stabilisée chimiquement. 20 Un tel contact doit être maintenu dans l'intervalle d'environ une seconde à 5 heures environ, de préférence d'environ 30 secondes à une heure environ, plus spécialement d'environ deux minutes à minutes si l'on veut obtenir un sirop de fructose de qualité acceptable. La durée de contact optimale entre la glucose-isomérase stabilisée chimiquement et la liqueur contenant du glucose dépend dans une grande mesure du p H auquel on procède à la réaction d'isomérisation A l'extrémité inférieure de l'intervalle de p H, on peut tolérer des durées de contact plus longues sans dégradation exces30 sive du glucose et du fructose par formation de psicose et d'autres produits de dégradation indésirables A l'extrémité supérieure de l'intervalle, il faut des duréesde contact plus courtes pour éviter les formations de psicose et de colorants En pratique, la durée totale pendant laquelle le sirop contenant du glucose se trouve à 35 la température de réaction finale ou au voisinage de cette température est considérée comme la durée de dégradation (td) car les réactions de dégradation de sucres qui se produisent sont non enzymatiques et se produisent que la liqueur soit en contact ou non avec la glucose-isomérase. La durée de dégradation (td) comprend la durée de contact rdelle (Ta) au cours de laquelle l'enzyme et le substrat sont en contact plus les durées de manipulation éventuelles, par exemple d'introduction dans le réacteur ou d'évacuation du réacteur, au cours desquelles le substrat est à la température de réaction ou au voisinage de cette température La durée de contact réelle (ta) 10 est la durée au cours de laquelle l'enzyme est en contact réactif avec le substrat, c'est-à-dire que le substrat est en contact direct avec l'enzyme Par conséquent, lorsqu'on procède à des isomérisations à des températures supérieures à 90 C, il est important de réduire -les durées nécessaires pour porter la liqueur de glucose à la tempe15 rature d'isomgrisation voulue (par exemple, en mélangeant la liqueur avec de la vapeur d'eau juste avant ou au cours du contact avec l'isomgrase) et, une fois atteinte la concentration voulue en fructose, pour séparer ensuite rapidement la liqueur de l'isomérase encore active et pour refroidir la liqueur aussi rapidement que possible 20 à une température inférieure à 900 C et de préférence à 70 C. Par conséquent, pour obtenir des sirops ayant des propriétés acceptables sans dégradation excessive du fructose ou du glucose, la durée de dégradation doit être contr 8 ôlée de manière à satisfaire à l'équation suivante: td = a log ( 4300/(T+ 273)-p H-3,23) dans laquelle td est la durée de dégradation en minutes; T est la température de réaction en C; et p H est le p H du mélange de réaction pendant la période durant laquelle le mélange est à la température de réaction. L'équation ci-dessus montre qu'il faut des durées de contact effectives plus courtes aux températures plus élevées et/ou aux p H plus élevés Le p H observé dans la réaction est habituellement le p H optimum pour l'isomérase choisie ou voisin de ce p H La température T peut être réglée selon la composition du substrat et 35 la teneur voulue en fructose comme décrit ci-après Ces relations sont exprimées par exemple par les équations 5, 6 et 7 ci-après. On peut également contrôler la durée de contact e ut lisant la relation de l'équation 4 qui montre que la durée de contact est inversement proportionnelle à l'activité de l'enzyme Par coniséquent, pour une isomérase dont le p H optimum est de 6,0, et une température de réaction de 110 C, le durée de dégradation doit être maintenue à environ 100 minutes ou moins. Si l'on utilise une forme soluble de glucose-isomérase stabilisée chimiquement, il est nécessaire de désactiver (par exemple en abaissant le p H jusqu'à un intervalle ou l'isomérase est 10 désactivée) avant l'opération de refroidissement afin d'éviter toute reconversion du fructose formé au cours de l'isomérisation en glucose car naturellement la réaction d'isomérisation est réversible. Le taux de conversion maximum du glucose en fructose auquel on peut parvenir est gouverné par l'équilibre thermodynamique 15 entre le glucose et le fructose, lequel dépend lui-même de la température à laquelle on procède à l'isomérisation Une analyse très soignée de mélanges de glucose et de fructose en équilibre a permis d'établir la relation suivante: F = 100 K/(K+I) ( 2) ln K = -755 + 2,3005 T + 273 ( 3) dans laquelle F représente le % de fructose à l'équilibre par rapport au poids total de glucose et de fructose, T est la température en C à laquelle on isomérise, et K est la constante d'équilibre glucose25 fructose. La durée de contact réelle entre le sirop contenant le glucose et l'isomérase dans un réacteur peut en général être calculée par la formule suivante lorsqu'on utilise un réacteur contenant une forme d'isomérase immobilisée. F F ta = CV ln F F ( 4) k A dans cette formule t est la durée de contact réelle a C est la concentration de glucose et de fructose V est le volume libre de liquide dans le réacteur (volume du mélange de réaction moins volume occupé par les particules d'enzymes immobilisées) F est la fraction de fructose dans le mélange e glucose/fructose à l'équilibre et à la température d'isomérisation F O est la fraction de fructose (par rapport à G+F) 10 à l'entrée dans le mélange de réaction F est la fraction de fructose (par rapport à G+F) dans la solution sortant du mélange de réaction k est la constante de vitesse de réaction pour l'isomérisation dans les conditions observées 15 A est l'activité de l'isomérase dans le mélange de réaction. Les valeurs de k pour une isomérase immobilisée préparée comme décrit dans les exemples qui suivent, vont d'environ 0,07 à environ 5 g hr 1 UIGI à des températures de 90 à 140 C respec20 tivement Cette relation met en évidence la nécessité de réduire la durée de contact à haute température en utilisant des lits tassés à haute activité par unité de volume Les lits tassés formes par les modes opératoires décrits dans les exemples qui suivent peuvent contenir jusqu'à 2000 UIGI/ml, ce qui peut permettre de parvenir 25 à une teneur en fructose de 99,5 % de la teneur à l'équilibre en moins d'une minute dans un réacteur à haute température lorsqu'on utilise des réacteurs à étages à des températures différentes et qu'on isomérise la liqueur d'alimentation dans un premier réacteur à basse température avant d'isomériser à haute température dans un 30 second réacteur Lorsqu'on utilise un système de réacteur à étages, il est préférable d'exploiter un procédé de conversion enzymatique du glucose en fructose consistant à mettre en contact une liqueur d'alimentation contenant du glucose à une teneur d'environ 20 à % en poids avec la glucose-isomérase à une température d'environ 35 20 à 80 C et un p H d'environ 6,0 à 9,0 avec une durée de contact d'environ 0,5 à 2 heures de manière à convertir de 40 à 45 % en Il poids environ du glucose présent dans la liqueur en fructose, à accroître la température du milieu d'isomérisation jusqu'à un niveau d'environ 90 à 140 C, à régler le p H du milieu d'isomérisation si c'est nécessaire dans l'intervalle d'environ 3 à 8, à mettre la liqueur contenant du fructose en contact avec la glucose-isomérase pendant une durée complémentaire d'environ une seocnde à 5 heures pour accroître le taux de conversion jusqu'à un niveau d'environ 53 à 60 % en poids du glucose présent dans la liqueur d'alimentation initiale, car dans ces conditions, il n'y a pratiquement pas 10 de formation appréciable de psicose ou de sucres autres que le fructose et le glucose Ainsi donc, l'utilisation de lits tassés à grande puissance peut conduire à des durées de contact efficaces très basses, ce qui permet de minimiser les dégradations du fructose risquant de se produire aux températures élevées noces15 saires dans l'invention. Pour le choix des techniques d'immobilisation de la glucose-isomérase, on accordera la préférence à des procèdés permettant d'obtenir des petites particules de catalyseur poreuses, pratiquement non compressibles, de manière à réduire au minimum l'inhibition des effets de diffusion sur la vitesse d'isomérisation. Mais on peut aussi immobiliser l'isomérase dans les pores d'une membrane au travers de laquelle la solution de glucose est refoulée durant l'isomgrisation à haute température; ici encore, on favorise un bon contact entre l'enzyme et le substrat en 25 réduisant les limitations de diffusion Le support utilisé pour l'immobilisation est de préférence totalement insoluble et inerte afin d'éviter une contamination ou une dégradation indésirable des composants glucose/fructose des solutions de substrat. Toutefois, dans la pratique industrielle, les sirops 30 contenant du fructose ne sont pas préparés à partir de glucose pur. On utilise plutôt comme sources de glucose des hydrolysats d'amidon (préparés comme décrit dans les publications précitées) qui contiennent invariablement des saccharides autres que le glucose et le fructose (et qu'on appelle ci-après polysaccharides) résultant 35 d'une hydrolyse incomplète de l'amidon et de la réversion du glucose Couramment, ces constituants représentent de 3 à 8 % du poids total sec des saccharides dérivés de l'hydrolyse de l'amidon. Par conséquent, il est nécessaire, pour le calcul de la température à laquelle on doit procéder à l'isomérisation, de tenir compte des polysaccharides éventuellement contenus dans la liqueur de glucose ainsi que d'autres facteurs tels que la teneur totale en fructose sur matières sèches à laquelle on veut parvenir, la formation de psicose et d'autres produits étrangers au glucose et au fructose au cours de la durée de contact effective de la liqueur de glucose et de l'isomérase Les relations permettant de calculer la tempéra10 ture d'isomérisation sont données ci-dessous: 755 T = 273 ( 5) 2,3005-lnk F K = ( 6) -F F 10 000 (M+C) Q( 100-P) ( 7) dans ces équations Test la température d'isomérisati 9 on en C F est la teneur en fructose à l'équilibre (en % par rapport à la teneur totale en glucose + fructose) à la température T M est la teneur en fructose % sur matière sèche exigée dans le 25 produit d'isomérisation C est la teneur en % en psicose + autres produits de dgradation formés au cours de la durée de contact effective d'isomérisation Q est le % de l'équilibre atteint au cours de la réaction d'isomérisation, et Pest la teneur en polysaccharides, %, de la liqueur de glucose. Couramment, on formera moins de I % et de préférence moins de 0,5 % de psicose et autresproduitsde dégradation et on atteindra 99,5 % de lt'équilibre Par conséquent, pour préparer des sirops à 55,5 % de fructose (sur matière sèche), il faut respecter 35 les tenmpératures d'isomérisation suivantes pour les liqueurs de glucose aux teneurs indiquées en polysaccharides. Polysaccharides dans la Température liqueur de glucose d'isomérisation (% sur matière sèche) ( C) 0 95,7 l 99,1 2 104,3 3 108,9 4 113,8 6 124,3 8 136,1 Le produit commercial courant contient en moyenne 55,5 % de fructose sur matière sèche La raison en est qu'à cette teneur en fructose, le sirop de mais à forte teneur en fructose (HFCS) a un pouvoir édulcorant égal à celui du saccharose, sur la 15 base poids pour poids en matière sèche En outre, le HFCS à 55,5 % de fructose est un produit du commerce bien établi qu'on utilise de manière interchangeable en remplacement total ou partiel du saccharose dans de nombreux produits alimentaires et spécialement dans les boissons sucrées carbonatées La consommation de ce type 20 de produits aux Etats-Unis prévue pour 1982 est d'environ 1,4 milliards de kilogrammes en 1982 et on s'attend à une croissance à près de 2,0 milliards de kilogrammes en 1983 En raison des complications inhérentes au transport, au magasinage, au dosage et au mélange de ce produit dans des produits alimentaires, il existe 25 une demande générale d'uniformité du produit d'un fabricant à un autre, de sorte qu'on-peut utiliser de manière interchangeable et simultanée des produits provenant de sources commerciales différentes Ainsi donc, une teneur en fructose de 55 à 56 % sur les matières sèches a pris une importance spéciale en tant que Niveau 30 recherché dans la technologie de la fabrication de ce type de produits.Le procédé selon l'invention permet de parvenir à des teneurs en fructose d'au moins 53 %, de préférence d'au moins 54 % et mieux encore d'au moins 55 %. Si on le désire, au lieu d'utiliser comme substrat dans l'invention une solution contenant uniquement du glucose, on peut également utiliser une solution de glucose dans laquelle une partie de celui-ci est déjà isomérisée en fructose Ainsi par exemple, on peut traiter conformément à l'invention une solution de glucose isomérisée contenant jusqu'à 50 Z de fructose en vue de porter la concentration du fructose à des teneurs plus recherchées de plus de 50 %, et aux niveaux préférés de 55-56 Z et au-dessus. On peut préparer des solutions de glucose contenant du fructose en proportion inférieure à 50 Z en poids, sur les 10 hydrates de carbone, par des techniques connues. Tenu compte des exigences exposées ci-dessus en matière de concentration du glucose, de p H et de durée de contact, on peut adapter des procédés connus d'isomérisation du glucose à une exploitation à des températures d'environ 90 à 140 C, de préfé15 rence d'environ 100 à 1100 C, en vue de parvenir aux sirops à forte teneur en glucose-fructose de l'invention. La stabilité à la chaleur de la glucose-isomérase peut être accrue dans une mesure importante par un ou plusieurs traitements chimiques dans lesquels l'enzyme conserve une activité 20 appréciable, comme on le verra ci-après Une enzyme traitée dans ces conditions est appelée "isomérase stabilisée chimiquement" dans la présente demande. La stabilisation chimique de l'isomérase est réalisée par un certain nombre de procédés différents qui peuvent conduire 25 à une stabilité accrue à la chaleur Le principe fondamental réside dans l'introduction dans la molécule d'enzyme d'éléments de structure tels que l'enzyme résistera à la dénaturation lorsqu'on la chauffera au-delà de son point de dénaturation normal à la chaleur Un procédé préféré pour parvenir à ce but consiste à modifier l'enzyme 30 par introduction de substituants contenant des groupes vinyles polymérisables dans des conditions telles que ces groupes soient solidement attachés à la surface de la molécule d'enzyme en plusieurs points L'enzyme modifiée est ensuite mélangée avec un ou plusieurs composés vinyliques polymérisables en solution aqueuse et le mélange est copolymérisé, donnant l'enzyme stabilisée chimiquement, fixée solidement en de nombreux points à un réseau polymère tridimensionnel qui a formé une structure de forme complémentaire à celle de l'enzyme. Des exemples de ce type de stabilisation sont décrits par Martinek et collaborateurs dans Biochem Biophys Acta 485, 5 1-12 ( 1977) et par Kulys et collaborateurs dans Biokhimiya, 42, n 3, pages 453-459 ( 1978). Lorsqu'on procède aux réactions décrites ci-dessus, il est essentiel d'éviter des conditions qui pourraient conduire à une dénaturation de l'isomérase et par conséquent à une perte d'activité Ainsi par exemple, il faut éviter des valeurs extrêmes de p H et de température durant toutes les manipulations nécessaires pour la mise en oeuvre de ces réactions. Comme exemples de réactifs utilisables pour modifier l'isomérase par substitution sur cette enzyme de groupes vinyles 15 polymérisables,on citera le chlorure d'acryloyle, le chlorure de méthacryloyle, l'acroléine, l'aldéhyde crotonique, l'anhydride maléique, le 3,4-époxybutène, l'acrylate de 2,3-époxypropyle,l'acrylate de 2,3-thioglycidyle, le 1allyloxy-3-(N-éthylèneimine)-2-propanol, l'ester acrylique de Osuccinamide, l'anhydride 20 chloromaléique, l'azide maléique, le 3bromopropène, et l'isothiocyanate d'allyle Ces composés sont capables de réagir avec les groupes amino libres de l'isomérase, par exemple le groupe epsilonamino des motifs de lysine. On peut utiliser d'autres composés capables de réagir 25 avec les groupes acides carboxyliques libres de l'isomérase pour introduire des motifs vinyles polymérisables, comme il apparaitra clairement aux spécialistes en la matière. Comme exemple de composés vinyliques qu'on peut copolymériser avec l'isomérase modifiée, on citera 'acrylate de sodium, 30 le méthacrylate de sodium, l'acrylamide, le méthacrylate d'hydroxyéthyle, 1 'acryloylpipéridine-4-spiro-2 '-( 1 ',3 '-dioxacrylopentane), la lacryloyl-4-pipéridone, et l'acryloylméthoxyamine En général, on préfère les monomères ou mélanges de monomères solubles dans l'eau donnant des polymères hydrosolubles (s'ils sont polymérisés 35 en l'absence d'agents réticulants). On introduit couramment des composes vinyliques difonctionnelles dans le mélange des monomères ( 0,1-5 % des monomères totaux) pour former des sites de réticulation conduisant à un réseau polymère tridimensionnel Parmi les composés qui conviennent, on citera le N,N'-méthylène-bisacrylamide et le diméthacrylate de l'éthylène-glycol Lorsqu'on utilise ces produits, le mélange polymérisé forme un gel insoluble conduisant à l'immobilisation de l'isomérase. Les systèmes inducteurs couramment utilisés dans les polymérisations vinyliques conviennent à cet effet; on citera par exemple le persulfate d'ammonium plus le bisulfite de sodium, le peroxyde d'hydrogène plus le sulfate ferreux, le sulfate de potassium plus la N,N,N',N'tétraméthyléthylène-diamine, et la riboflavine (plus la lumière). Cependant, une liaison non covalente au réseau 15 polymère tridimensionnel peut suffire pour conférer la rigidité voulue à la molécule d'isomérase et,par suite, accroître dans une mesure importante la stabilité à la chaleur Cela peut se produire lorsque l'isomérase est retenue mécaniquement à l'intérieur d'un gel réticulé Dans un tel cas, il n'est pas nécessaire que l'isomérase soit modifiée par fixation d'un composé vinylique avant l'opération de polymérisation Toutefois, la concentration du gel doit être supérieure à environ 30 % en poids si l'on veut parvenir à une stabilisation appréciable et on préfère les gels à une concentration d'environ 50 % Il faut des monomères capables de 25 donner des gels polymères formant des liaisons électrostatiques et des liaisons hydrogènes avec-l'isomérase, par exemple l'acrylate de sodium, le méthacrylate de sodium, l'acrylamide, et le méthacrylate d'hydroxyéthyle. On trouvera des exemples de stabilisation par incor30 poration dans des gels dans les publications suivantes: Martinek et collaborateurs, dans Biochem Biophys Acta 485, 13-28 ( 1977) et Kulys et collaborateurs, J Solid Phase Biochem, 3, 95-105 ( 1978). Un troisième procédé de rigidification de l'isomérase 35 est la réticulation intramoléculaire qui est capable de conférer une plus grande stabilité à la chaleur. On trouvera des exemples de stabilisation de ce type dans Torchilin et collaborateurs, Biochem Biophys Acta, 522, 277-283 ( 1978), Martinek et collaborateurs, J Solid Phase Biochem, 2, 343-385 ( 1977) et Torchilin et collaborateurs, Biochem Biophys. Acta, 568, 1-10 ( 1979). Parmi les agents réticulants qui conviennent à l'utilisation dans l'invention on citera des composés difonctionnels capables de réagir avec les groupes fonctionnels latéraux de la molécule d'enzyme Le plus couramment, ces groupes fonctionnels sont 10 des groupes amino, en général des groupes amino primaires qui sont capables de réagir avec une grande variété de groupes fonctionnels tels que les groupes acide carboxylique, halogénure de sulfonyle, aldéhydes, isocyanates, propiolates, et analogues. Ainsi donc, parmi les agents réticulants, on citera 15 les anhydrides d'acide dicarboxylique comme l'anhydride succinique et l'anhydride adipique; les dialdéhydes correspondants comme le glyoxal, l'aldéhyde succinique et l'aldéhyde glutarique; des composés insaturés comme l'acroléine et l'aldéhyde crotonique, des propiolates de diol comme le bis-propiolate de l'éthylèneglycol, 20 le bis-propiolate du propylèneglycol et le bis-propiolate de l'hexaméthylèneglycol; et des halogénures de disulfonyle comme le chlorure de benzène-1,3-disulfonyle, le chlorure de naphtalène1,5disulfonyle et le chlorure de tolyl-2,4-disulfonyle. En outre, comme l'enzyme contient des groupes acides 25 réactifs avec les amines, ou peut être modifieede manière à contenir des groupes acides réactifs avec les amines, on peut utiliser des amines difonctionnelles en tant qu'agents réticulants dans l'invention On citera par exemple des diamines contenant jusqu'à 12 atomes de carbone, par exemple la phénylènediamine, la 30 butylène-diamine, l'hexylene-diamine, l'octylène-diamine, la pentylène-diamine, l'éthylène-diamine et la dodécylène-diamine. La quantité d'agent réticulant peut varier dans des limites considérables, le rapport entre l'enzyme et l'agent réticulant allant d'environ 0,1 à 0, 0001 Le procédé permettant de 35 réaliser la liaison voulue est fonction dans une certaine mesure de la nature de l'agent réticulant choisi et de l'enzyme En l 8 général, les réactifs seront dissous dans un milieu solvant inerte approprié et la réaction devra pouvoir être effectuée à des températures suffisamment basses pour éviter tout effet défavorable sur l'enzyme qui peut être sensible aux températures élevées Habituel5 lement, on préfère les réactions à température ambiante ou au voisinage et on utilise comme milieu de réaction de l'eau ou des solvants aqueux. Outre la substitution de groupes vinyles polymérisables sur la molécule d'enzyme, suivie de la polymérisation par les procé10 dés décrits cidessus, on peut dans un autre mode de réalisation condenser un polymère formé au préalable avec l'isomérase par formation de liaisons covalentes intermoléculaires qui donnent une molécule stabilisée Ainsi par exemple, on fait réagir des polypeptides, tels que les protéines d'origine naturelle et leurs produits d'hydrolyse, par les techniques connues pour les formations de liaisons peptidiques, avec de la glucose isomérase, de manière à former une enzyme stabilisée Les produits ainsi obtenus peuvent être solubles dans l'eau mais on peut les rendre insolubles dans l'eau à l'aide d'agents réticulants tels que l'aldéhyde glutarique 20 et le système enzymatique réticulé ainsi obtenu est habituellement encore plus stable Les réactions de formation de peptides sont effectuées par des procédés connus, par exemple à l'aide de carbodiimides. Si on le désire, on peut convertir l'enzyme initiale 25 en un dérivé par introduction d'une fonctionnalité voulue dans la molécule, laquelle servira pour la condensation avec la molécule formée au préalable Ainsi, pour une fonctionnalité carboxylique, on peut faire réagir une enzyme contenant des groupes amino libres avec un acide dicarboxylique, et obtenir ainsi une enzyme contenant 30 des groupes carboxy. Les polymères formés au préalable à utiliser dans le mode de réalisation en question peuvent consister en des polymères quelconques contenant le type et la quantité voulus de groupes fonctionnels, par exemple amino ou carboxy, pour les réactions 35 envisagées On préfère des polypeptides tels que les protéines naturelles, par exemple le chitosanne, les protéines de levure et les matières analogues ainsi que leurs mélanges; et des polymères contenant des groupes amino comme la polyéthylèneimine Habituellement, le polymère préféré forme des produits hydrosolubles et de préférence, on rend ces produits insolubles en les faisant réagir 5 avec des agents rêticulants, par exemple l'aldéhyde glutarique et autres agents réticulants mentionnés ci-dessus. Dans tous les procédés décrits ci-dessus pour la modification de l'enzyme, il est essentiel de s'assurer qu'il y a une fonctionnalité chimique suffisante, par exemple en groupes 10 amino ou carboxy, si l'on veut parvenir au résultat voulu. Ainsi par exemple, pour le choix du polymère formé au préalable qu'on doit faire réagir avec l'enzyme, il est nécessaire que le polymère contienne des groupes réactifs avec les groupes libres de la molécule d'enzyme Ainsi, on choisira une protéine à 15 groupes carboxy latéraux pour la réaction avec les groupes amino latéraux de l'enzyme En outre, il doit y avoir un nombre raisonnable de groupes réactifs sur les réactifs choisis si l'on veut assurer une fixation des réactifs par de multiples points, et parvenir à une stabilisation importante Le choix de la nature et 20 du nombre de ces groupes réactifs pour les divers réactifs possibles est naturellement bien connu des spécialistes. Un autre procédé permettant d'accroîte la stabilité la chaleur des enzymes consiste à modifier chimiquement leur structure superficielle sans perte appréciable d'activité Ainsi 25 par exemple, on peut amidiner les groupes amino (Ludwig, M L et Hunter, M J, Meth Enzymol 11, 595-604 ( 1967)) ou guanidiser (Kimmel, J R, Meth Enzymol 11, 584-589 ( 1967)), formant ainsi des substituants qui ressemblent étroitement à l'arginine On a ainsi stabilisé la déshydrogénase lactique et plusieurs autres 30 protéines (cf Tuengler, F et Pfleiderer, G, Biochem Biophys. Acta, 284, 1-8 ( 1977); Minotani, N et collaborateurs, Biochim. Biphys Acta, 581, 334-341 ( 1979); et Cupo, P et collaborateurs, J Biol Chem, 255, 10828-10833 ( 1980)). L'activité de la préparation d'isomérase soluble a 35 été déterminée comme décrit par Lloyd et collaborateurs dans Cereal Chemistry, 49, n 5, pages 544-553 ( 1972) Une UIGI est la quantité d'isomérase qui convertit I micromole de glucose en fructose par minute dans une solution contenant 2 moles de glucose par litre, 0,02 moles de Mg SO 4 par litre, et 0,001 moles de Co C 12 par litre à un p H de 6,85 (maleate de sodium 0,2 M) et à une tempé5 rature de 60 C, la détermination étant faite par le procédé qu'on vient de mentionner. Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée Dans ces exemples, les indications de parties ou de pourcentages s'entendent en poids sauf mention 10 contraire. Exemple 1 Dans cet exemple, on décrit l'isomérisation directe d'une solution contenant du glucose et consistant principalement en hydrolysat d'amidon de mais raffiné, en une composition à 55,5 % 15 de fructose sur matièressèches dans un procédé d'isomérisation à deux étages On procède d'abord à une isomérisation à basse temperature, 70 C, et le produit obtenu dans cette isomérisation est utilisé pour l'alimentation d'un second réacteur à haute température ( 105,2 C) contenant une isomérase stabilisée chimiquement 20 L'isomérase stabilisée chimiquement est une isomérase liée par des liaisons covalentes à un polymère soluble, qu'on a ensuite insolubilisé en un catalyseur immobilisé. L'hydrolysat a été préparé à partir de l'amidon de mals par des procédés tels que décrits dans les brevets des Etats-Unis 3 644 126 (liquéfaction) et 3 280 006 (saccharification) La liqueur saccharifiée a été raffinée comme décrit dans le brevet des Etats-Unis 3 834 940 et on a obtenu un produit contenant 95,3 Z de glucose sur matièressèches On a ajouté une quantité de glucose cristallisé suffisante pour porter la teneur totale en glucose à 97,6 % sur matières sèches La solution obtenue avait alors la composition suivante: Matières sèches totales (%) 50,2 Glucose (% sur matières sèches) 97,6 Fructose (% sur matières sèches) 0,O Polysaccharides (% sur matières sèches) 2,4 Psicose (% sur matières sèches) 0,0 Na HSO 3 (m M) 50,0 Mg SO 4 (m M) 5,0 Co C 12 (MM) O,1 p H 6, 8 L'isomérisation à basse température a été réalisée à 70 C par pompage de la solution de substrat ci-dessus dans le réacteur à basse température à un débit de 3,2 ml/min Le réacteur d'isomérisation à basse température ( 70 C) consiste en un garnissage d'isomgrase immobilisée sur DEAE- cellulose (préparée comme 15 décrit dans le brevet des Etats-Unis n 3 788 945) dans une colonne de verre de 25 mm de diamètre avec tubulure d'entrée et tubulure de sortie et double enveloppe pour la circulation d'eau provenant d'un thermostat L'espace libre au-dessus du garnissage contient un thermomètre et il est rempli pour le reste de billes 20 de verre afin de réduire l'espace mort autant que possible Le réacteur contient l'isomgrase immobilisée en quantité suffisante pour fournir 20 000 UIGI et le lit de garnissage aune hauteur d'environ 15 cm Les premiers I 000 ml sortant du réacteur sont rejetés On recueille ensuite l'effluent sortant pour utilisation 25 à la seconde isomérisation à haute température. Le catalyseur stabilisé chimiquement qu'on utilise dans le réacteur à haute température a été préparé de la manière suivante: On a cultivé une espèce de Streptomyces rubigenosus 30 dérivant de S Rubigenosus ATCC 21175 par fermentation aérobie submergée sur un milieu à la composition suivante: % Dextrose 9,0 Liqueur de macération de mals (matières sèches) 1,6 Phosphate diammonique 0,08 Sulfate de manganèse 0,06 Agent antimousse (Pluronic PL-61) 0,003 Le milieu a été stérilisé à 121 C pendant 45 min, refroidi et réglé à p H 6,8-7,0 On l'a inoculé par 14 % en volume d'un inoculum consistant en le contenu d'un fermenteur d'ensemencement préparé avec le variant de S rubigenosus indiqué ci-dessus. La fermentation a été conduite dans les conditions aseptiques à 30 C pendant environ 60 h avec aération à 0,65 vvm On peut également utiliser S rubigenosus ATCC 21175 pour l'inoculation et la production d'isomgrase mais on utilise alors des milieux à la composition suivante: Dextrose 0, 24 Liqueur de macération de mais (matières sèches) 1,5 Sorbitol 1,6 Chlorure cobalteux 0,02 Phosphate diammonique 0,56 Xylose 1,0 La glucoseisomérase a été extraite de S rubigenosus par addition de 0,35 % de Maquat-MC 1412 Cde la Firme Mason Chemical Co.), et 10 ppm de lysozyme de jaune d'oeuf et agitation pendant 5 h 20 à 40 C, p H 6,3-6,6 Le mélange a ensuite été filtré;on a ainsi obtenu une solution de glucose-isomérase brute non purifiée. L'isomérase brute a été purifiée par adsorption sur DEAE-cellulose (préparée comme décrit dans le brevet des Etats-Unis 3 823 133), filtration et lavage du produit adsorbé avec une solution de Na Cl 0,1 M pour élimination des impuretés puis on a désorbé l'isomérase par contact avec une solution de Na Cl 0,45 M. Pendant toutes les opérations de purification, toutes les solutions ont été maintenues à p H 7,5 La solution d'isomérase partiellement purifiée ainsi obtenue a été mélangée avec 3 volumes d'éthanol à 30 95 % à O C, ce qui a provoqué la précipitation de l'isomérase. On a ajouté de la perlite comme produit auxiliaire de filtration, on a séparé les matières solides par filtration et on les a séchées à l'air; on a obtenu une préparation d'isomérase soluble contenant 2500 UIGI/g. L'isomérase purifiée a été dissoute dans Mn C 12 I mm, en quantité suffisante pour obtenir une solution contenant 10 mg d'isomérase par ml à température ambiante, et on a éliminé le produit auxiliaire de filtration par filtration du mélange L'activité spécifique de cette préparation est de 37,3 UIGI/mg de protéine. On a préparé une solution d'un polymère polyaminé soluble en dissolvant 39,0 g de chitosanne (produit du commerce Kytex de la Firme Hercules Inc, Wilmington, Delaware 19899) dans 13 1 d'H Cl 0,08 N Après dissolution, on a réglé la solution de chitosanne à la concentration 0,5 M en Na Cl par addition de 380 g de ce sel et on a réglé la solution obtenue à p H 6,15 par Na OH 8 N. Finalement, on a filtré la solution de chitosanne sur papier filtre Whatman n 3 afin d'éliminer les insolubles Aux 13 1 de chitosanne à 0,3 % dans Na Cl 0,5 M à p H 6,15, on a ajouté: 100 ml de l'isomérase soluble contenant une activité de 100 000 UIGI, 197,6 g de xylitol ( de la firme Sigma Chemical Co), et 0,619 g de Co Cl 2,6 H 20. 15 On a agité la solution pendant 2 h puis on a ajouté 6,24 g de 1-éthyl3-diméthylaminopropyl-carbodiimide (de la firme Sigma Chemical Co) de manière à fixer par des liaisons covalentes, dans des points multiples, les groupes carboxyles de l'isomérase aux groupes amino du chitosanne Après 2 h à température ambiante, on a 20 ajouté 15,6 ml d'une solution d'aldéhyde glutarique à 50 % (de la firme Eastman Kodak) réglée à p H 6,0 par Na OH 8 N, qui a insolubilisé le complexe isomérase-chitosanne à liaisons covalentes Après min, on a ajouté 2 1 de solution M de phosphate à p H 8,0 pour faciliter la rupture du gel qui a été formé par addition de l'al25 déhyde glutarique On a ensuite lavé le complexe isomérasechitosanne insolubilisé par de l'eau déminéralisée sur Buchner sous vide On a séché la préparation à l'air pendant une nuit à température ambiante et on l'a broyée et tamisée dans l'intervalle de 0,250 à 1,68 mm Le catalyseur sec a une activité exprimée de 30 384 UIGI/g. On a préparé le réacteur à 105,2 C de la manière suivante On a mis une portion de 13 g du catalyseur en suspension dans le substrat et on a désaéré sous le vide du laboratoire à température ambiante pendant 60 min On a utilisé la dispersion 35 désaérée pour préparer un lit de 1,5 x 20 cm dans une colonne de verre à double enveloppe Le lit de garnissage contenait 4992 UIGI. Le substrat préparé par isomérisation au premier stade à 70 C a été réglé à p H 6,75 et dilué à 42,0 % de matières sèches. Ce substrat a ensuite été pompé au travers de la colonne de réaction à haute température sous une pression manométrique de 0,7 bar et à un débit de 1,96 ml/min à 60 C pendant 30 min La température régnant dans la colonne était suivie à l'aide d'un thermomètre situé directement audessus du lit, et environné de billes de verre de 0,5 cm servant à réduire autant que possible l'espace mort La température de colonne a ensuite été accrue rapidement par circu10 lation d'huile provenant d'un bain maintenu par thermostat à 106 C au travers de la double enveloppe. L'effluent sortant de la colonne a été contrôlé en permanence par un polarimètre enregistreur étalonné pour lire de à 58 Z de fructose Lorsque la température de colonne a atteint 15 105,20 C et que la teneur en fructose de l'effluent a atteint le niveau voulu, on a recueilli l'effluent et on l'a immédiatement refroidi au bain de glace On a réglé le p H à 4,90 par addition d'acide citrique M On a recueilli l'effluent jusqu'à ce que la teneur apparente en fructose ait tombé au-dessous de 55 %. On a soumis les solutions isomérisées obtenues dans les réacteurs à 70 C et à 105,2 C à des analyses pour composition en hydrates de carbone et coloration et on a comparé avec les résultats obtenus dans des analyses analogues sur la solution de substrat non isomérisée; les résultats obtenus sont rapportés 25 dans le tableau I ci-après. TABLEAU I COMPOSITION DES SOLUTIONS DE SUBSTRAT ISOMERISEES A 70 C ET A 105,2 C COMPOSITION EN HYDRATES DE CARBONE (% sur les matières sèches hors cendres) Fructose Glucose Psicose Polysaccharides _ _ _ _ _ ____ COULEUR (CIRF X 100) ________ Traitement de la solution en Non isomgrisée Isomerisge à 70 C Isomgrisge à 105,2 C 51,3 97,6 46,4 41,6 2,4 2,3 0,5 0,7 14,1 ,5 0,3 2,6 ri un Ln 04 % O o> Ces résultats montrent qu'on a obtenu une teneur en fructose de 55, 5 % en maintenant la teneur en psicose audessous de 0,4 Z sur les matières sèches, avec une coloration (CIRFXIOO) inférieure à 20. Exemple 2 Dans cet exemple, on décrit l'isomérisation directe d'une solution contenant du glucose (et consistant en un hydrolysat d'amidon de mais raffiné et du glucose cristallisé) à haute température, jusqu'à une teneur en fructose de 55,2 % sur matières seches, 10 avec isomérisation en deux étages; dans le second étage, on a utilisé une isomérase stabilisée chimiquement constituée de glucoseisomérase complexée par une polyéthylàneimine, le complexe ayant été insolubilisé par traitement avec l'aldéhyde glutarique. Préparation de l'isomérase stabilisée On a préparé une glucose isomérase soluble comme décrit dans l'exemple 1 On l'a dissoute dans Mn C 12, 1 m M, en quantité suffisante pour obtenir une solution contenant 9 mg d'isomérase par ml à température ambiante et on a séparé le produit auxiliaire de filtration On a ajouté 60 ml de polyithylèneimine, PM 600, p H 8 de la firme Dow Chemical Co en solution à 100 g/l et 3 g de xylitol à 300 ml de la solution d'enzyme et on a agité pendant min On a ajouté 10 ml d'aldéhyde glutarique 2,5 M et on a agité à température ambiante pendant 2 h On a filtré l'enzyme insolubiisée, on l'a lavéeà l'eau et séchependant une nuit dans une étuve 25 à convection à 37 C On a obtenu après séchage 12,8 g d'isomérase immobilisée contenant environ 775 UIGI/g On a mis 12 g de l'enzyme immobilisée en suspension dans le substrat, on a désaéré sous vide pendant 60 min à température ambiante et on a utilisé cette enzyme pour préparer un réacteur à haute température de 1,5 cm de diamètre. 30 Le substrat pour le réacteur a été préparé au premier étage de l'isomérisation en deux étages comme décrit dans l'exemple 1. Ce substrat avait la composition suivante: Matières sèches totales (%) 42, 6 Glucose (% sur matières sèches) 46,4 Fructose (% sur matières sèches) 51,3 Polysaccharides (% sur matières sèches) 2,3 Psicose (% sur matières sèches) 0,0 Na HSO 3 (m M) O Mg SO 4 (m M) 50 Co C 12 (il) O,1 p H 6,75 Le substrat a été pompé au travers du réacteur à 60 C pendant 45 min à un débit d'environ S ml/min On a ensuite porté la température de la colonne à 101,6 C et réduit le débit à 2 ml/min. On a appliqué sur la colonne une pression arrière de 0,8 bar environ pour empêcher l'ébullition du substrat On a contrÈ 1 é en permanence 15 l'effluent à l'aide d'un polarimètre enregistreur étalonné pour lire de 50 à 58 % de fructose On a recueilli l'effluent contenant plus de 55 % de fructose dans un bain de glace et on a réglé à p H 4,0 par l'acide citrique M. On a analysé pour composition en hydrates de carbone et 20 coloration l'effluent du réacteur à haute température, le substrat du réacteur du premier étage et la solution initiale contenant du glucose utilisée comme substrat pour le réacteur du premier étage. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau ci-après. TABLEAU 2 COMPOSITIONS DES SOLUTIONS PROVENANT DES ISOMERISATIONS DE PREMIER ET SECOND ETAGES à____________________ ____________ _ -_____ ____________________ ___________________. COMPOSITION EN HYDRATES (% sur les matières sèches Pructose Glucose Psicose à__ _ DE CARBONE hors tendres) Polysaccharides COULEUR (CIRP X 100) Traitement de la solution Non isomérisée Isomgrisée à 70 C Isomérisee à 101,6 C O 51,3 97,6 46,4 42,1 O 2,4 O 2,3 0,5 0,7 51,7 ,2 O 2,7 N Ln Ln % O CD Ces résultats montrent qu'on est parvenu à 55,2 % de fructose en maintenant la teneur en psicose inférieure à 0,2 % sur matières sèches. Exemple 3 Par cet exemple on décrit l'isomérisation directe du glucose en 57,2 % de fructose par un procédé d'isomérisation à deux étages dans lequel le premier réacteur est à 70 C et le second réacteur (haute température) est à 110,4 C L'isomérase stabilisée chimiquement qu'on a utilisée dans la réaction à haute température 10 est fixée par liaison covalente sur un polymère soluble qui a été ensuite insolubilisé; on a ainsi obtenu un catalyseur immobilisé. Le substrat et sa conversion dans le réacteur de premier étage à 70 C ont été décrits dans l'exemple 1. Le catalyseur immobilisé utilisé dans le réacteur à 15 110,4 C a également été décrit dans l'exemple 1. Le réacteur à 110,4 C a été préparé de la manière suivante: on a mis en suspension une portion de 28,4 g du catalyseur dans le substrat et désaéré sous le vide du laboratoire à température ambiante pendant 60 min On a utilisé la dispersion désaérée 20 pour préparer un lit de 2,5 x 12,4 cm dans une colonne en verre à double enveloppe Le lit de garnissage contenait 10 885 UIGI. On a réglé à p H 6,47 le substrat obtenu par isomérisation du premier étage à 70 C et on l'a dilué à 42,0 % de matières sèches Ce substrat a ensuite été pompé dans la colonne de réacteur 25 à haute température sous une pression d'environ 0,85 bar et à un débit de 3,38 ml/min à une température de 60 C pendant 30 min La température dans la colonne a été suivie à l'aide d'un thermomètre placé directement au-dessus du lit et environné de billes de verre de 0,3 cm qui servent à réduire autant que possible l'espace mort. 30 La température de colonne a ensuite été rapidement accrue par circulation d'une huile provenant d'un bain thermostats à 111 OC dans la double enveloppe. On a suivi en permanence l'effluent de la colonne à l'aide d'un polarimètre enregistreur étalonné pour lire de à 58 % de fructose Lorsque la température de colonne a atteint ,4 C et que la teneur en fructose de l'effluent a atteint le 5 niveau voulu, on a recueilli l'effluent et on l'a immédiatement refroidi au bain de glace On a réglé à p H 4,0 par addition d'acide citrique M. On a analysé pour la composition en hydrates de carbone et la coloration les solutions isomérisées obtenues dans 10 les réacteurs à 70 C et à 110,4 C et comparé les résultats avec ceux d'analyses analogues effectuées sur la solution de substrat non isom Frisge; les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau 3 ci-après. TABLEAU 3 COMPOSITIONS DES SOLUTIONS DE SUBSTRAT ISOMERISEES A 70 ET 110,4 C COMPOSITION EN HYDRATES (% sur les matières sèches Fructose Glucose Psicose _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ * DE CARBONE hors cendres) Polysaccharides COULEUR (CIRF x 100) Traitement de la solution Non isoméris'e Isomerisée à 70 C Isom 6 risée à 110,4 C 52,3 99,2 46,9 41,5 0,8 0,6 0,7 0,8 57,2 0,3 1,0 u M u 11 04 c) Les résultats obtenus montrent qu'on a atteint une concentration de 57,2 % de fructose en maintenant la concentration en psicose au-dessous de 0,4 Z sur matières saches et la coloration (CIRFXIOO) au-dessous de 20. Exemple 4 Dans cet exemple, on décrit l'isomérisation directe d'une solution contenant du glucose et consistant principalement en un hydrolysat d'amidon de mais raffiné, en un produit à 56,3 % de fructose sur matières sèches par un procédé d'isomérisation à deux 10 étages On a d'abord effectué une isomérisation à basse température, C, puis utilisé le produit de cette réaction à l'alimentation du second réacteur à haute température, 103,3 C, contenant une isomérase stabilisée chimiquement Celle-ci a été stabilisée chimiquement par coréaction avec une protéine protectrice (provenant par exemple de 15 la levure). L'opération d'isomérisation à basse température, pour ce qui concerne la description du substrat et les conditions expérimentales, a été effectuée comme décrit dans l'exemple 1. La glucose-isomérase stabilisée chimiquement qu'on a 20 utilisée dans le réacteur à haute température a été préparée de la manière suivante: on a préparé de la glucose-isomérase soluble pour la stabilisation chimique et on l'a purifiée par le procédé décrit dans l'exemple 1 L'activité spécifique de cette préparation était d'environ 40 UIGI/mg de protéine On a isolé une protéine protectrice 25 à partir de la levure de boulanger par le mode opératoire suivant à 1 229 g de levure de boulanger, en gâteau humide, on a ajouté 1 000 g d'eau et 500 g de toluène On a agité à température ambiante pendant une nuit puis chauffé à 85 C et maintenu à ce niveau pendant 30 min environ On a filtré le mélange sur Buchner Presque tout le 30 toluène est resté avec les débris insolubles de cellules, le filtrat aqueux contenant l'extrait de levure soluble On a concentré le filtrat aqueux à poids final de 276 g (à l'évaporateur rotatif à 40 C) puis on a ajouté sous agitation 41 g d'acide trichloreacétique On a recueilli la protéine de levure précipitée puis on l'a redissoute dans du tampon au phosphate de sodium 0,1 M (p H 7,0). Apres clarification par filtration, on a traité la solution par 900 ml (environ 3 volumes)id'acétone On a recueilli le précipité, on l'a redissous dans du tampon au phosphate de sodium 0,01 Il (p H 7,0) et on a dialysé la solution obtenue contre du tampon au phosphate de sodium 5 0, 01 M Le produit obtenu ( 150 ml) a été étiqueté protéine protectrice obtenue à partir de levure de boulanger On a préparé une solution de chitosanne à 0,6 % en dissolvant 24 g de chitosanne (produit du commerce Kytex de la firme Hercules Inc, Wilmington, Deleware) dans 4 1 d'H Cl 0, 08 N On a réglé la solution a p H 6,2 par Na OH 8 Ni 10 on l'a filtrée sur papier filtre Whatman n 3 puis dialysée contre 16 1 d'eau déminéralisée Dans un bécher de 400 ml on a placé environ 100 000 UIGI de l'enzyme glucose-isomérase soluble (mélangée avec le produit auxiliaire de filtration), 1 g de xylitol, et ml (les 2/3) de la protéine protectrice de levure de boulanger. 15 A ce mélange, on a ajouté 2,4 mg de Mg 504, 7 H 20 et 24 microlitres de solution M de chlorure de cobalt On a séparé le produit auxiliaire par filtration puis on a concentré la solution (à l'évaporateur rotatif, à 40 C environ) jusqu'au voisinage de la siccité dans un ballon de 2 1 On a ajouté dans le ballon 800 ml de chitosanne 20 h p H 6,2 On a concentré le mélange (h l'évaporateur rotatif, au voisinage de 40 C) jusqu'au voisinage de la siccité et on a ajouté 640 microlitres de solution d'aldéhyde glutarique à 50 % (p H réduit à 6, 5) On a conservé le mélange en chambre froide pendant une nuit. On a alors retiré le gel du ballon et on l'a refoulé au travers 25 d'un tamis h ouverture de maille de 0,59 nm puis séché h l'étuve à 37 C environ On a tamisé la préparation d'enzyme séchée en séparant les fines (au-dessous de 0,177 mm) puis utilisé 8,9 g du produit final pour l'isomérisation h haute température. Le réacteur h 103,3 C a été préparé de la manière 30 suivante On a mis en suspension 8,9 g de la préparation de glucoseisomérase ci-dessus dans le substrat et on a désaéré sous le vide du laboratoire h température ambiante pendant 30 min environ On a utilisé la dispersion désaérée pour préparer un lit de 1,5 X 29 cm dans une colonne de verre h double enveloppe. Le substrat préparé par isomérisation du premier étage à 70 C a été réglé à p H 6,75 et dilué à 42,0 % de matières sèches. Ce substrat a ensuite été pompé au travers de la colonne de réacteur à haute température à un débit d'environ 1,5 ml/min à une température de 60 C pendant 30 min On a suivi latempérature de la colonne à l'aide d'un thermomètre placé directement au-dessus du lit et environné de billes de verre de 0,5 cm de diamètre qui réduisent l'espace mort On a ensuite accru rapidement la température de colonne par circulation d'une huile provenant d'un bain thermostats 10 à 104 C au travers de la double enveloppe. On a suivi en permanence l'effluent de la colonne à l'aide d'un polarimètre enregistreur étalonné pour lire de 50 à 58 % de fructose On a recueilli des fractions (environ 5 ml) jusqu'à ce qu'on trouve 55 % ou plus de fructose; à ce moment, on a arrêté 15 l'expérience Au cours de la récolte des échantillons, les effluents ont été immédiatement refroidis au bain de glace et le p H a été réglé à 4,0 environ par addition de 0,1 ml d'acide citrique M puis d'H Cl dilué. On a analysé pour la composition en hydrates de carbone 20 et la coloration les solutions isomérisées obtenues à partir du réacteur à 70 et à 103,3 C et on a comparé les résultats avec ceux d'analyses analogues effectuées sur la solution de substrat non isomérisée Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau 4 ci-après. TABLEAU 4 COMPOSITIONS DES SOLUTIONS DE SUBSTRAT ISOMERISEES A 70 ET 103,3 C COMPOSITION EN HYDRATES (% sur les matières sèches Fructose Glucose Psicose _ __ _ _ __ _ _ _-__ _ _ DE CARBONE hors cendres) Polysaccharides _ _ _ _ _ _ _ _ _ ____ C Ob LEUR (CIRE x 100) Traitement de la solution w Ln Non isomérisée Isomérisee à 70 O C Isomérisge à 103,3 C 51,3 97,6 46,4 41,5 2,4 2,3 0,5 0,7 34,0 56,3 0,1 2,2 ré, un Ln w o-à % O Ces résultats montrent qu'on parvient à 56,3 % de fructose en maintenant la teneur en psicose au-dessous de 0,2 X sur les matières sèches. Exempfe 5 Dans cet exemple on décrit l'isomgrisation directe d'une solution contenant du glucose et consistant principalement en un hydrolysat d'amidon de mals raffiné à faible teneur en sels, en un produit à 55,4 % de fructose sur matières sèches dans un procèd 6 d'isomérisation à deux étages On procède d'abord à une isomérisa10 tion à basse température, 70 C, et on utilise le produit de cette réaction à l'alimentation d'un second réacteur à haute température, 112,6 C, contenant l'isomgrase stabilisée chimiquement Celle-ci est fixée par des liaisons covalentes sur un polymère soluble par fixation en points multiples, et le polymère a été ensuite insolu15 bilisé, ce qui a donné un catalyseur immobilisé. L'hydrolysat a été préparé à partir de l'amidon de mais par des procédés tels que décrits dans les brevets des Etats-Unis 3 644 126 (liquéfaction) et 3 280 006 (saccharification) La liqueur saccharifiée a été raffinée comme décrit dans le brevet des Etats-Unis 3 834 940 et on a obtenu ainsi un produit contenant 93,8 % de glucose sur matières sèches On a ajouté du glucose cristallisé en quantité suffisante pour porter la teneur totale en glucose à 96,9 % sur matières sèches La solution obtenue avait alors la composition suivante: Matières sèches totales (%) 50,3 Glucose (% sur matières sèches) 96,9 Fructose (Z sur matières sèches) 0,1 Polysaccharides (% sur matières sèches) 3,1 Psicose (% sur matières sèches) 0,0 Na HSO 3 (MM) 2,5 Mg SO 4 (m M) 2,5 Co C 12 (m M) 0,1 p H 6,8 L'isomérisation à basse température a été effectuée à 70 C par pompage de la solution de substrat ci-dessus dans le réacteur à basse température décrit dans l'exemple 1 à un débit de 2,5 ml/min On a rejeté les 1 000 premiers ml sortant du réacteur On a recueilli ensuite l'effluent pour utilisation dans la seconde isomérisation à haute température. Le catalyseur stabilisé chimiquement utilisé dans le réacteur à haute température a été préparé de la manière suivante: on a préparé de la glucose-isomérase soluble et on l'a purifiée 10 comme décrit dans l'exemple 1 L'activité spécifique de cette préparation était d'environ 40 UIGI/mg de protéine On a préparé une solution d'un polymère soluble, une polyamine, en dissolvant 48,4 g de chitosanne (Kytex de la firme Hercules Inc, Wilmington, Delaware 19899) dans 15 1 d'H Cl 0,08 N Apres dissolution, on a 15 réglé la solution de chitosanne à la concentration 0, 5 M en Na CI par addition de 438 g de ce sel et on a réglé la solution à p H 6,1 par Na OH 8 N On a ensuite filtré la solution de chitosanne sur papier filtre Whatman n 3 pour éliminer les insolubles A 15 1 de la solution de chitosanne à 0,3 % dans Na Cl 0,5 M à p H 6,1 on a ajouté les produits suivants: 520 ml d'isomérase soluble contenant environ 602 000 UIGI d'activité, 236 g de xylitol (de la firme Sigma Chemical Co), et 3, 07 g de Mn C 12, 4 H 20 On a agité la solution pendant 2 h puis on a ajouté 7,44 g de 1-éthyl-3-diméthylaminopropyl-carbodiimide (de la firme Sigma Chemical Co) pour 25 fixer par des liaisons covalentes en des points multiples les groupes carboxyles de l'isomérase aux groupes amino du chitosanne. Après 2 h à température ambiante, on a ajouté 15,5 ml d'une solution d'aldéhyde glutarique à 50 % (de la firme Eastman Kodak Chem Co) réglée à p H 6,0 par Na OH 8 N, qui a insolubilisé le complexe isomérasechitosanne à liaisons covalentes 15 min plus tard, on a mélange 4 1 d'une solution de phosphate M p H 8,0, avec le complexe insoluble isomérasechitosanne On a lavé le complexe isomérasechitosanne immobilisé par de l'eau déminéralisée sur Buchner sous vide avec papier filtre Whatman n 3 On a séché la préparation à l'air, on l'a broyée et on l'a tamisée, en conservant les particules de dimension 0,250 à 1,68 mm Le catalyseur sec avait une activité exprimée de 803 UIGI/g. On a préparé le réacteur à f 12,6 C de la manière suivante: on a mis une portion de 7,0 g du catalyseur en suspension dans le substrat et on a désaéré sous le vide du laboratoire à température ambiante pendant 60 min On a utilisé la dispersion désaérée pour préparer un lit de 1,0 X 40 cm dans une colonne de verre à double enveloppe Le lit de garnissage contenait 5621 IUGI. On a réglé le substrat préparé par isomérisation du premier étage à 70 C à p H 6,55 et on l'a dilué à 42,0 % de matières sèches par de l'eau déminéralisée; les concentrations en sel ont 10 été abaissées dans la mesure correspondante, a 2,1 mn pour Na H 503 et 2,1 m M pour Mg SO 4 Ce substrat a ensuite été pompé dans la colonne de réacteur à haute température sous une pression manométrique de 0,85 bar environ pendant 10 min à un deébit de 8 ml/min et à une température de 60,0 C La température de la colonne a été 15 suivie à l'aide d'un thermomètre placé directement au-dessus du lit et environné de sable jusqu'à l'échelle de température, afin de réduire autant que possible l'espace mort On a ensuite rapidement accru la température de la colonne par circulation d'une huile provenant d'un bain thermostaté à 114 C environ La température de 20 -la colonne a été portée à 112,6 C et le débit a été abaissé à 1,89 ml/min. On a suivi en permanence l'effluent de la colonne à l'aide d'un polarimétre enregistreur étalonné pour lire de 50 à 58 % de fructose Lorsque la température de colonne a atteint 25 112,6 C et que la teneur en fructose de l'effluent a atteint le niveau voulu, on a recueilli l'effluent On a immédiatement réglé le p H à 4,0 par addition d'acide citrique M On a recueilli l'effluent jusqu'à ce que la teneur apparente en fructose tombe au-dessous de 55 %. On a analysé pour la composition en hydrates de carbone et la coloration les solutions isomérisées obtenues à partir des réacteurs à 70 et 112,6 C et comparé les résultats avec ceux d'analyses analogues effectuées sur la solution de substrat non isomérisée; les résultats obtenus ont été rapportés dans le tableau 5 35 ci-après. TABLEAU 5 COMPOSITIONS DES SOLUTIONS DE SUBSTRAT ISOMERISEES A 70 EU 112,6 C Traitement de la solution (% Fructose _______- COMPOSITION EN HYDRATES sur les matières sèches Glucose Psicose DE CARBONE hors cendres) Polysaccharides COULEUR (CIRF X 100) Non isomérisée Isomérisge à 70 C Isomgrisee à 112,6 C O 51,4 96,9 45,9 42,0 3,1 2,7 O o 8,5 ,4 0,1 2,5 ri ul Ln -4 o o Ces résultats montrent qu'on a atteint une teneur en fructose de 55,4 % en maintenant la teneur en psicose audessous de 0,2 % sur matières sèches et la coloration CIR Fx 100 à moins de 9. Exemple 6 Dans cet exemple on décrit l'isomérisation directe d'une solution contenant du glucose et consistant principalement en un hydrolysat d'amidon de mars raffiné à faible teneur en sels, en un produit à 54,8 Z de fructose sur matières sèches avec une teneur en psicose extrêmement basse -( Le réacteur de premier étage (basse température) est à 70 C et le réacteur du second étage {haute température) à 105,8 C L'isomérase stabilisée chimiquement utilisée dans le réacteur à haute température est fixée par des liaisons covalentes sur un polymère soluble 15 par fixation en des points multiples, et le polymère a été ensuite insolubilisé, ce qui a donné un catalyseur immobilisé. La substrat a été converti dans le réacteur de premier étage à 70 C comme décrit dans l'exemple 5. Le catalyseur immobilisé utilisé dans le réacteur 20 à 105,8 C est celui décrit dans l'exemple 5. Le réacteur à 105,8 C a été préparé de la manière suivante: on a mis en suspension une portion de 5,63 g du catalyseur dans le substrat et on a désaéré sous le vide du laboratoire a température ambiante pendant 60 min On a utilisé la dispersion 25 désaérée pour préparer un lit de 1,0 x 32 cm dans une colonne de verre à double enveloppe Le lit de garnissage contenait 4521 UIGI. On a réglé le substrat préparé par isomérisation de premier étage à 70 C à p H 6,5 et on l'a dilué par de l'eau déminéralisée à 42,0 % de matières sèches, ce qui a fait également tomber 30 la concentration en sel à 2,1 Nm M pour Mg 504 et 2,1 m M pour Na HSO 3. Ce substrat a ensuite été pompé dans la colonne de réacteur à haute température sous une pression manométrique d'environ 0,7 bar et à un débit de 8 ml/min pendant 10 min à une température de 60,0 C. La température régnant dans la colonne a été suivie à l'aide d'un thermomètre situé directement au-dessus du lit et environné de sable jusqu'au début de l'échelle de température, ce sable servant à réduire l'espace mort autant que possible La température de colonne a ensuite été rapidement accrue par circulation d'une huile provenant d'un bain thermostaté à 107 C environ au travers de la 10 double enveloppe. L'effluent de la colonne a été suivi en permanence à l'aide d'un polarimètre enregistreur étalonné pour lire de 50 à 58 % de fructose Lorsque la température de colonne a atteint 105,8 C et que la teneur en fructose de l'effluent a atteint le 15 niveau voulu, on a recueilli l'effluent On a immédiatement réglé le p H à 4,90 par addition d'acide citrique M. On a analysé pour la composition en hydrates de carbone et la coloration les solutions isomérisées dans les réacteurs à 70 et 105,8 C et comparé les résultats avec ceux d'analyses ana20 logues effectuées sur la solution de substrat non isomérisée; les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau 6 ci-après. TABLEAU 6 COMPOSITIONS DES SOLUTIONS DE SUBSTRAT ISOMERISEES A 70 ET 105,8 C _____-____ _________ _________ _____ ___ à COMPOSITION EN HYDRATES (% sur les matières saches Pructose Glucose Psicose à_______ _à DE CARBONE hors cendres) Polysaccharides COULEUR (CIRF X 100) Traitement de la solution r O Non isomérisge Isomérisge à 70 C 42,3 2,8 1,8 r,0 Ln Ln -.4 *o. Ces résultats montrent qu'on parvient à une concentration en fructose de 54,8 % en maintenant la teneur en psicose au-dessous de 0,1 % sur matières saches et la coloration CIR Fx O OO au-dessous de 2. REVENDICATIONS 1 Procédé pour isomériser du glucose en fructose, caractérisé en ce que l'on met une liqueur d'alimentation contenant du glucose en contact avec une glucose-isomérase stabilisée chimiquement à une température d'environ 90 à 140 C-et un p H d'environ 3 à 8, avec une durée de contact réelle suffisante pour parvenir dans ladite liqueur à une teneur finale en fructose d'au moins environ 53 à 60 % en poids par rapport à la teneur totale en hydrates de carbone en maintenant la durée de dégradation à une valeur égale ou inférieure à celle qui est calculée par la formule td = a log ( 4300/(T+ 273) p H 3,23) ( 1) dans laquelle T est la température de réaction en OC, p H est le p H du mélange de réaction, et td est la durée de dégradation en minutes, afin d'éviter les formations appréciables de psicose et/ou de sucres autres que le fructose et le glucose. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la liqueur contenant du glucose a été obtenue par hydrolyse de l'amidon de mals. 3 Procéde selon la revendication 1, caractérisé en ce que la liqueur d'alimentation contenant du glucose a été obtenue par 20 isomérisation d'un hydrolysat d'amidon de mais jusqu'à une teneur en fructose allant jusqu'à 52 % environ par rapport à la teneur totale en hydrates de carbone. 4 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la source de la glucose-isomérase est un 25 microorganisme choisi dans le groupe formé par les espèces Streptomyces, leurs mutants, leurs variants ou leurs modifications génétiques. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la source de la glucose-isomérase est un 30 microorganisme choisi dans le groupe formé par Streptomyces sp. ATCC 21175, ses mutants, variants et modifications génétiques. 6 Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 3, caractérisé en ce que la source de la glucose-isomérase est un micro-organisme dans lequel on a introduit un gène muté de glucoseisomérase, ce gène muté donnant une glucose-isomérase à haute stabilité à la chaleur. 7 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la glucose-isomérase est stable à la chaleur. 8 Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que la glucoseisomérase stable à la chaleur a été obtenue à partir de Bacillus Stearothermophilus. 9 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le milieu d'isomérisation contient un sel hydrosoluble de l'acide sulfureux en quantité suffisante pour inhiber la dénaturation de l'enzyme. Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 9, caractérisé en ce que la liqueur d'alimentation contenant du glucose contient d'environ 30 à 50 % en poids d'hydrates de carbone. 11 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'on met la liqueur d'alimentation contenant du glucose en contact avec une glucose-isomérase stabilisée chimiquement à une température d'environ 100 à 110 C. 12 Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 11, caractérisé en ce que l'on maintient le p H du milieu d'isomérisation dans l'intervalle d'environ 5 à 6,5. 13 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la durée de contact va d'environ 25 2 minutes à 30 minutes. 14 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la glucose-isomérase stabilisée chimiquement est utilisée à l'état immobilisé. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la glucoseisomérase stabilisée chimiquement est immobilisée sur de la diéthylaminoéthyl-cellulose. 16 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 , caractérisé en ce que l'on met la liqueur d'alimentation contenant du glucose à une teneur d'environ 20 à 65 % en poids de glucose en contact avec une glucose-isomérase à une température d'environ 20 à 80 C et à un p H d'environ 6 à 9 avec une durée de contact suffisante pour parvenir à une teneur finale en fructose d'au moins 40 à 50 % en poids environ dans ladite liqueur, par rapport à la teneur totale en hydrates de carbone; on augmente la température du milieu d'isomérisation jusqu'à un niveau d'environ à 130 C; on règle le p H du milieu d'isomérisation lorsque c'est nécessaire dans l'intervalle d'environ 3 à 8, on met la liqueur contenant du fructose en contact avec de la glucose-isomérase stabilisée chimiquement pendant une durée de contact réelle suffisante pour parvenir à une teneur finale en fructose d'au moins 53 à 60 % en poids environ sur la teneur totale en hydrates de carbone dans ladite liqueur en maintenant la durée de dégradation à un niveau égal ou inférieur à celui calculé à partir de la formule td = a log ( 4300/T+ 273) p H-3,23) ( 1) dans laquelle T est la température de réaction en C; p H est le p H du mélange de réaction; et td est la durée de dégradation en minutes; afin d'éviter des formations appréciables de psicose et/ou de sucres autres que le fructose et le glucose. 17 Procède selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que le sirop de fructose-glucose produit est refroidi à une température inférieure à 80 Cenviron. 18 Procédé selon l'une quelconque des revendication I à 17, caractérisé en ce que le mélange d'isomérisation est refroidi 25 à une température d'environ 20 à 80 C après interruption du contact entre l'enzyme et le mélange d'isomérisation.