FR 2549067 A1 19850118 FR 8309812 A 19830614 La présente invention a pour objet de nouveaux dérivés estradiéniques radioactifs marqués au tritium, leur procédé de préparation et leur application pour l'étude et le dosage de stéroïdes dans les fluides biologiques. Plus particulièrement, elle a pour objet des dérivés estradiéniques radioactifs marqués au tritium de formule générale ( 1): o H 3 N OR dan laqu'lle CE C CH 3 (I) O 9 dans laquelle _le symbole 3 H représente le tritium et R représente de l'hydrogène, un radical alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un radical acyle ayant de i à 10 atomes de carbone. 15 Parmii les vaieurs de R on peut citer ai les radicaux méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, sec-buzyle, tert-b>ui-yle, Pentyle, iso-pentyle, sec-pentyle, tert-pentyie, néopentyle, hexyle, iso-hexyle, sec-hexyle, tert-hexyle; b) les radicaux forrmyle, acétyle, propionyle, butyryle, isobutyryle, 20 vaicryle, caproyle, benzoyve, capryloyle, méthoxy-carbonyle ou éthoxy carbonyl e. Parmi les produits de formule générale (I), on citera notamment: le 17/E hydroxy-1 e -( 4-diméthylamino phényl)-17 -(prop-1-ynyl)estra4,9-dièn-3on E ( 6,7 H), qui sera désigné dans ce qui suit comne 25 produit A. Les produits de formule générale (I) permettent notamment l'étude et le dosage radioimmunologique du 17 t -hydroxy-11/ -( 4-dimthylamino phênyl)- 17 o( -(prop-i-ynyi)estra-4,9-dién-3-one non radioactif, qui sera désigné dans ce Qui suit comme produit B. L'invention a galement pour objet un procède de préparation des produits répondant à la formule générale (I) ci-dessus. Ce procédé est caractérisé en ce que: on bloque la fonction cétone en 3 du produit de formule (i I) dans laquelle le symbole 3 H représente le tritium: 3 = O ot)H 0 (i I) He_) O-H -i-/'. ID L'2 2549067 au moyen d'un agent de cétalisation, soumet le produit de formule générale (Il I) résultant: A S (III) H formule (III) dans laquelle représente un groupement oxo bloqué sous forme de cétal ouvert ou cyclique, à l'action d'un agent de propynylation, obtient un produit de formule générale (IV): 10 OH C_ C CH (IV) A 1 H H que l'on soumet à l'action d'un agent d'époxydation pour obtenir un produit de formule générale {V): OH CZ C CH (V) 3 H sur lequel on fait agir un halogénure de 4-diméthylamino phényl magnésium, puis soumet un produit de formule générale (VI) résultant: 25 C 3 N CH CC_ C CH (VI) 3 O A, à l'hydrolyse et obtient le produit de formule générale ( 1) cherché, dans laquelle R représente de l'hydrogène dont, le cas échéant, on éthérifie ou estérifie la fonction hydroxyle en 17. Ce procédé est encore caractérisé en ce que: l'agent de cétalisation au moyen duquel on bloque la fonction en 3 est un alcanol ayant de 1 à 4 atomes de carbone ou un glycol ayant 2 atomes de carbone substitués ou non par un ou deux groupements alcoyle, tel que le méthyle, et on opère sous atmosphère inerte, 2549067. l'agent de propynylation que l'on fait agir sur un produit de formule générale (III) est le bromure de propylmagnésium et on opère sous atmosphère inerte, -l'agent d'époxydation que l'on fait agir sur un produit de formule générale(IV) est un peracide tel que l'acide m-chloro per-benzo 7 que ou l'eau oxygénée en présence d'hydrate d'hexafluoro acétone et on opère sous atmosphère inerte, 1 'halogénure de 4diméthylamino phényl magnésium que l'on fait agir sur un produit de formule générale (V) est le bromure et on opère sous 10 atmosphère inerte, on soumet un produit de formule générale (VI) à l'hydrolyse acide au moyen d'acide chlorhydrique et on opère sous atmosphère inerte. L'éthérification ou l'estérification de la fonction hydroxyle en 17 du produit de formule gânérale (Il) dans laquelle R représente de 15 l'hydrogène, peut être effectuée selon des méthodes habituelles. L'é,hêrificatio; peut être effectuée par exemple au moyen d'un agent d'éthérification tel qu'un halogénure d'alcoyle ou d'aryle, ou un sulfate de dialcoyle. L'estarification peut être effectuée par exemple au moyen d'un agent 20 d'est érification tel qu'un dérivé fonctionnel d'acide, conm-e un chlorure d'acide ou un anhydride. Selon une variante du procédé de l'invention, également objet de l'invention: on bloque la fonction cétone en 3 du produit de formule (II) sous forme 25 d'un ct-ai ouvert au moyen d'un agent de cétalisation de formule générale Ri OH, dans laquelle _ R représente un radical alcoyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone, soumet un produit de formule gén rale (VII) résultant -3 Ri O R 10 (II) R 1 o (vi:) 1 'action d'un agent de propynylation, obtient un produit de formule 35 générale (VIII) OF R 1 R 10 H R 10 3 H 4 2549067; effectue la transcétalisation de la fonction cétal au moyen d'un glycol en milieu acide de formule R 2 CHOH-CHOHR 3, pour obtenir un produit de formule générale (IX): OH I 2 ' 03 R 2 O, () R 3 dans laquelle __ R 2 et R 3, identiques ou différents, représentent de l'hydrogène ou un radical alcoyle tel que le méthyle que l'on soumet selon le procédé indiqué ci-dessus, à l'action d'un agent d'époxydation, puis fait agir sur le produit résultant un halogénure de 4diméthylamino phényl magnésium et finalement soumet le produit résultant à l'hydrolyse pour obtenir le produit de formule générale ( 1) cherché. q 5 La variante du procédé de l'invention peut encore être caractérisée en ce que: l'agent de cétolisation au moyen duquel on bloque la fonction cétone en 3 du produit de formule (II) est le méthanol et on opère sous atmosphère inerte, l'agent de propynylation que l'on fait agir sur un produit de formule générale (VII) est le bromure de propynylmagnésium et on opère sous atmosphère inerte, le glycol au moyen duquel on effectue la transcétalisation de la fonction cétone du produit de formule générale (VIII) est l'éthylène 25 glycol et on opère sous atmosphère inerte. Le procédé de l'invention est encore illustré en ce que: on choisit favoralement comme atmosphère inerte, sous laquelle il est exécuté, l'atmosphère d'argon, on fait agir un halogénure de 4-diméthylamino phényl magnésium sur un 30 produit de formule générale (V) en présence d'un sel cuivreux, on fait agir un alcanol comme agent de cétalisation au moyen duquel on bloque la fonction en 3, en milieu acide, tel que le mélange acide paratoluène sulfonique-acide chlorhydrique ou acide chlorhydrique-pyridine et éventuellement en présence d'un déshydratant, on fait agir un glycol comme agent de cétalisation au moyen duquel on bloque la fonction en 3 en présence d'un déshydratant, on fait agir l'agent de propynylation sur un produit de formule générale (III) en opérant dans le tétrahydrofuranne, l'agent d'époxydation que l'on fait agir sur un produit de formule 40 générale (IV) est l'acide m-chloro perbenzoique, 2549 f 07 on fait agir le bromure de 4-diméthylamino phényl magnésium sur un produit de formule générale (V) en opérant dans le tétrahydrofuranne et en présence d'un sel cuivreux, la transcétalisation de la fonction cétal d'un produit de formule 5 générale (VIII) au moyen d'un glycol est effectuée en milieuacide, par exemple au sein du chlorhydrate de pyridine, L'invention a également pour objet l'application des produits de formule générale (I) et notamment du produit A à l'étude et au dosage radioimmunologique du produit B dans les fluides biologiques chez 10 l'homme ou chez l'animal. L'invention a également pour objet un moyen pour l'étude et le dosage rad'oiimunologique du produit E comportant un produit de formule g 9 nérale {i) et notamment le produit A. De plus, le produit A, apres son administration peut être suivi dans son évoition et dans son comportement au niveau des fluides biologiques :o's des études phanmacoloogiques et cliniques. Lots de ces études, le produit A permet notamment un dosage spécifique aisé de quantités de l'ordre de quelques dizaines de picogrammes par ml de fluide biologique, sans que l'on soit obligé de 20 recourir a dyes méthodes d'isolement et de purification par chromatographie, avant de Drocéder au dosageproprement dito Pour étudier et doser par des méthodes radioimmunologiques le 17 hydroxy-11 / -( 4-diîmèthyl amino phérnyl)-17 d -(prop-1 yriyl)estra-4,9-dien-3one non radioactif (produit B), on prépare en premier lieu à partir de ce 25 dernier, selon des méthodes connues en soi, des antigènes, en le conjugant avec l'albumine sérique bovine (BSA) ou avec l'albumine sérique humaine (PSA). Les antigènes résultants également objets de l'invention peuvent servir au dévei oppement d'anticorps lorsqu'ils sont injectés chez 30 l'animal, en présence d'un adjuvant Ils permettent ainsi d'obtenir des sérums contenant des anticorps. Ces anticorps servent ensuite de récepteurs de produits radioactifs et/ou de produits nonradioactifs, savoir des récepteurs des produits de formule générale ( 1) et notamment du 17-hydroxy-11,/-( 4-diméthylamino 35 phényli)-17 d -(prop-l-ynyl)estïa-4,9-dièn-3-one ( 6,7-3 H) (produit A) ainsi que du 17,-hydroxy-11 -( 4-diméthylamino phényl)-17 La présence de ces anticorps est mise en évidence au moyen d'un produit de formule générale (I) et notamment au moyen du produit A. On procède ensuite au dosage du produit B selon des méthodes 6 25 49067 radioimmunologiques conventionnelles, telles que celles décrites par: S A BERGSON et R S YALOW, HORMONE 4, p 557 ( 1964), C E ABRAHALI,J of CHEM ENDROCRINAL METAB 29, p 866 ( 1969). Les produits de formule générale (I) et notamment le produit A peuvent en outre être utilisés pour le dosage et la localisation des récepteurs de stéroides, tels que les récepteurs de glucocorticoides, de progestagènes et d'androgènes dans les cellules des tissus cibles. Le dosage et la localisation de ces récepteurs peuvent être effectués selon des méthodes habituelles, telles que celles décrites par: 1 C RAYNAUD J P, PHILIBERT D et al, J of STER Oi D BIOCHEM, 6 ( 1975), p. 615-622, MOGUILEWSKY et al, J of STEROID BIOCHEM, 12 ( 1980), p 309-314. L'invention a également pour objet à titre de produits industriels nouveaux et notamment à titre de produits intermédiaires nécessaires à 15 l'exécution du procédé de l'invention: le 3,3-diméthoxy-17 -hydroxy-17 " (prop-1-ynyl)-estra-5 ( 10), 9 ( 11)di ène( 6,7-3 H), le 3,3-éthylène dioxy-17, -hydroxy-17 m -(prop-1-ynyl) -estra-5 '10), 9 ( 11)-diène( 6,73 H), le 3,3-éthylêne dioxy-5 q, 10 q -époxy-17 /-hydroxy-17 q -(prop-1ynyl)estra 9 ( 11)-ène ( 6,7-3 H), le 3,3-éthylène dioxy-5 ", 17/3 dihydroxy-11 A -( 4-diméthylamino phényl)-17 -(prop-1-ynyl)-estra-9 ( 11)-ène ( 6,7-3 H). L'exemple suivant illustre l'invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE: 17 p-hydroxy-l 18-( 4-diméthylam Inc phényl)-17 Stade A:3,3-diméthoxy-17-oxo-estra-5 ( 10), 9 ( 1 l)-diène ( 6,7-3 H). On introduit 8 Ci soit 40 mg sous atmosphère inerte de 3,17-dioxo 30 estra-5 ( 10), 9 ( 11)-diène ( 6,7-3 H) dans 0,5 ml de diméthylcétal de l'acétone, puis ajoute 50 1 de méthanol contenant 0,5 % de chlorure d'acétyle, laisse au repos le mélange réactionnel pendant 15 minutes environ, puis additionne de 20 1 de triéthylamine et concentre sous vide. On obtient le produit recherché que l'on utilise tel que pour le stade 35 suivant de la synthèse. La chromatographie sur couche mince de silice avec élution par le système cyclohexane/acétate d'éthyle ( 75:25) donne Rf= 0,25. Le produit de départ a été décrit dans la publication J SALMON: "Synthèse et application de la 17 -méthyl triénolone tritiée"(Symposium 40 sur le progrès des techniques nucléaires en pharmacodynamie) (Saclay 11- 7 2549067 13 Mars 1970, Ed; MASSON; G VALETTE et Y COHEN, p 237-248). Stade B:3,3-diméthoxy-17/e-hydroxy-17 q/-(prop-1-ynyl)estra-5 ( 10), 9 ( 11)diène( 6,-3 H). On reprend sous atmosphère inerte le produit obtenu au stade précédent par 0,5 ml de tétrahydrofuranne, ajoute 0,5 ml d'une suspension de bromure de propynyl magnésium 1 M dans le tétrahydrofuranne et agite le mélange réactionnel à température ambiante pendant i heure environ. On ajoute ensuite 1 ml d'une solution aqueuse de chlorure d'ammonium à %, extrait à l'acétate d'éthyle, lave à l'eau, amène à sec sous 10 pression réduite et obtient le produit cherché que l'on utilise tel que pour le stade suivant de la synthèse. La chrom-tographie sur couche mince de silice avec élutiori par le systeme cycohexane/c:ate d'1thyle ( 75/25) donne Rf=O,22. Szta-edétye C -7 " 7 Stade v:À ,,-& hy 1 e dioxy-i 7 -hydroxy-17 l? (prop-1-ynyl)estra 5 ( 10), i 5 9 ( 11 dil ne( 5 i-3 H). On reprend sous atmosphère inerte le produit obtenu au stade précédent l:ar 1 ml de glycol anhydre, ajoute 0,5 mg de chlorhydrate de pyridine, chauffe 30 mn environ c 60 o C, ajoute 2 ml d'eau, extrait à l'acétate d'fthyle, lave à l'eau, sèche, amène à sec et obtient le produit cherché. 20 La chrrmatographie sur couche mince de silice avec élution par le qystème cyciohexane/acétate d'éthyle ( 75/25) donne Rf:0,2. Le produit peut étre purifié par chroûratcgraphie liquide haute oer Fo rnmc;ce sur silice, avec I l ftion par le systemr cyclohexane/acétate d'éthye à 0,06 % d'eau/triethylarine ( 75:24:1). ú 25 On obtient 2,44 Ci soit 15 mg de produit cherché. Stade D:3,3-éthylèine dioxy-5 15 o 117 xy 1/hdroy 7 (pop-1 ynyl)estra 9 ( 11)ene ( 657-3). On dissout sous atmosphère inerte 15 mg de produit obtenu au stade précédent dans 0,5 ml de chlorure de méthylène, ajoute 10 mg d'oxyde de 30 magnésium, refroidit -10 C, puis ajoute sous agitation 12 mg d'acide mchloroperbenzo 7 que, maintient l'agitation pendant 1 heure environ à 10 C, additionne ensuite 1 ml d'une solution aqueuse de thiosulfate de sodium à 0,2 N, extrait à l'acétate d'éthyle, lave à l'eau et amène à sec sous pression réduite. On obtient le produit cherché que l'on utilise tel que pour le stade suivant de la synthèse. La chromatographie sur couche mince de silice avec élution par le système cyclohexane/acétate d'éthyle ( 75/25) donne Rf= 0,1. Stade E:3,3-éthylène dioxy 5 V, 17/F-dihydroxy-111-( 4-diméthylamino 40 phényl)-17 ç 8 2549067 On dissout sous atmosphère inerte le produit obtenu au stade précédent dans 0,5 ml de tétrahydrouranne, ajoute 20 mg d'iodure cuivreux, agite pendant 20 minutes environ puis ajoute 0,5 ml d'une solution de bromure de 4-diméthylamino phényl magnésium 1 M dans le tétrahydrofuranne On 5 maintient le mélange réactionnel sous agitation, à température ambiante, pendant 1 heure environ, puis hydrolyse 0,5 ml d'une solution aqueuse de chlorure d'ammonium à 10 % et de 0,2 M de thiosulfate de sodium On extrait à l'acétate d'éthyle, lave à l'eau, sèche et obtient le produit cherché. La chromatographie sur couche mince de silice avec élution par le système cyclohexane/acétate d'éthyle ( 50:50) donne Rf= 0,22. Le produit peut être purifié par chromatographie liquide haute performance sur silice, avec élution par le système-cyclohexane/acétate d'éthyle à 0,06 % d'eau ( 70:30) renfermant 0,05 % de triéthylamine On 15 obtient 1,08 Ci soit 10 mg de produit cherché. Stade F:17 f-hydrcxy-llfl-( 4-diméthylamino phényl)-17 " -(prop-1-ynyl) estra-4,9-dièn-3-one ( 6,7-3 H). On dissout sous atmosphère inerte 10 mg de produit obtenu au stade précédent dans 0,5 ml de méthanol, ajoute sous agitation 20/,1 d'acide 20 chlorhydrique concentré, maintient l'agitation pendant une demi-heure à température ambiante, ajoute 1 ml d'acétate d'éthyle puis 1 ml de soude N. sépare la phase organique, lave à l'eau, sèche et amène à sec sous pression réduite et obtient le produit cherché brut. La chromatographie sur couche mince de silice avec élution par le 25 systène cyclohexane/acétate d'éthyle ( 50:50) donne Rf= 0,25. Ce produit peut être purifié par chromatographie liquide haute performancesur silice avec élution par le système cyclohexane/acétate d'éthyle à 0,06 % d'eau ( 70:30) On obtient 6,3 mg de produit cherché, d'une activité spécifique de 37,5 Ci mol-1. n >a 2549067 REVENDICATIONS 1) Dérivés estradiéniques radioactifs marqués au tritium de formule générale (I): CI-i 3 N 5 ' C 3 O OR C -5 C c -= CH 5 3 JH dans laquelle 3 H représente le tritium et R représente de l'hydrogène, 10 un radical alcoyle ayant de 1 è 6 atomes de carbone ou un radical acyle ayant de 1 e 10 atcmes de cartone 2 le 17/8nydrox Y-I 1 li ( 4-diméthylamino phéeyl)-17 q'-(prop-i-yryl)estra4,2-die n-3-one ( 6,7 HY 3 i Procédé de préparation des produits définis aux revendications 1 et 2 ca racterie en ce: on, b'oque la fonction c'tone en 3 du produit de formule (Il) dans laquelle le symbole 3 H represente le tritium: 2 CI (L au moyen d'un agent de cétalisation, soumet le produit de formule générale (l I) résultant: f A H formule (III) dans laquelle représente un groupement oxo bloqué sous forme de cétal ouvert ou cyclique, à l'action d'un agent de propynylation, obtient un produit de formule générale (UIV): C c(OHI :' o -(cv) que l'on soumet a l'action d'un agent d'époxydation pour obtenir un 2549067. produit de formule générale (V): OH I "t CEC-C C(V c= c CH 3 A sur lequel on fait agir un halogénure de 4-diméthylamino phényl magnésium, puis soumet un produit de formule générale (VI) résultant: GO O CH -I Ai H CHH -A " EC-= C H 3 CH 3 A l'hydrolyse et obtient le produit de formule générale (I) cherché, dans laquelle R représente de l'hydrogène dont, le cas échéant, on éthérifie ou estérifie la fonction hydroxyle en 17. 4) Procédé suivant la revendication 3 caractérisé en ce que: Ce procédé est encore caractérisé en ce que: l'agent de cétalisation au moyen duquel on bloque la fonction ern 3 est un alcanol ayant de 1 à 4 atomes de carbone ou un glycol ayant 2 atomes de carbone substitués ou non par un ou deux groupements al coyle, tel que le méthyle, et on opère sous atmosphère inerte, l'agent de propynylation que l'on fait agir sur un produit de formule générale Ii I) est le bromure de propylmagnésium et on opère sous atmosphère inerte, -l'agent d'époxydation que l'on fait agir sur un produit de formule générale(IV) est un peracide tel que l'acide m- chloro per-benzoique ou l'eau oxygénée en présence d'hydrate d'hexafiluoro acetone et on opère sous atmosphère inerte, l'halogénure de 4-diméthylamino phényl magnésium que l'on fait agir sur 35 un produit de formule générale (V) est le bromure et on opère sous atmosphère inerte, on soumet un produit de formule générale (VI) à l'hydrolyse acide au moyen d'acide chlorhydrique et on opère sous atmosphère inerte. ) Variante du procédé suivant la revendication 3 caractérisé en ce que: on bloque la fonction cétone en 3 du produit de formule (II) sous forme d'un cétal ouvert au moyen d'un agent de cétalisation de formule générale R 1 OH, dans laquelle _ R 1 représente un radical alcoyle ayant de 1 à 4 atomes de carbone, soumet un produit de formule générale (VII) résultant: R 10 R 1 3 H à l'action d'un agent de propynylation, obtient un produit de formule générale (VIII): CH Rl I ' C- C CH C R 1 3 (Viii) R 10 3 H effectue la transcêtalisation de la fonction cétal au moyen d'un glycol en milieu acide de formule R 2 CHOH-CHOHR 3, pour obtenir un produit de formule générale (i X) OH CES C C C-CH R'2 ' / (ix) l 3 3 dans laquelle R 2 et R 3, identiques ou différents, représentent de l'hydrogène ou un radical alcoyle tel que le méthyle que l'on soumet selon le procédé indiquée ci-dessus, à l'action d'un agent d'époxydation, puis fait agir sur le produit résultant un halogénure de 4diméthylamino phényl magnésium et finalement soumet le produit résultant à 30 l'hydrolyse pour obtenir le produit de formule générale (I) cherché. 6) Procédé suivant la revendication 5 caractérisé en ce que: l'agent de cétolisation au moyen duquel on bloque la fonction cétone en 3 du produit de formule (II) est le méthanol et on opère sous atmosphère inerte, l'agenz de propynylation que l'on fait agir sur un produit de formule générale (VII) est le bromure de propynylmagnésium et on opère sous atmosphère inerte, le glycol au moyen duquel on effectue la transcétalisation de la fonction cétone du produit de formule générale (VIII) est l'éthylène 40 glycol et on opère sous atmosphère inerte. 7) Application des produits tels que définis par la formule générale (I) de la revendication 1 et notamment du 17 g-hydroxy-11 -( 4-diméthylamino phényl)-17 o -(prop-1-ynyl)estra-4,9-di n-3-one ( 6,7-3 H) pour l'étude et le dosage radioimmunologique du 17/,3-hydroxy-11 /-( 45 diméthylamino phényl)-17 D( -(prop-1-ynyl)estra-4,9-dièn-3-one non radioactif dans les fluides biologiques chez l'homme ou l'animal. 8) A titre de produits intermédiaires nécessaires à l'exécution du procédé selon les revendications 3, 4, 5 et 6: le 3,3-diméthoxy-17 A -hydroxy-17 phényl)-17 -(prop-1-ynyl)-estra-9 ( 11)-ène ( 6,7-3 H).