FR 2559349 A1 19850816 FR 8401984 A 19840209 -1- s2559349 DESCRIPTION L'invention concerne un clône de Crambé maritime à partir d'une plante maintenue en conservatoire depuis le 19ème siècle dont un fragment a été soumis à l'organogénèse par culture in vitro, ainsi qu'un procédé permettant sa multiplication végétative in vitro aboutissant à la production de boutures utilisables par l'agriculteur. Le Crambé maritime (Crambe maritima L.) qui était probablement un peu cultivé en France au 19ème siècle, a aujourd'hui totalerhent disparu de la panoplie des légumes cultivés commercialisés en France comme en Europe. La description de ce légume ainsi que les principaux aspects phytotechniques de sa culture sont rapportés dans plusieurs ouvrages d'encyclopédie agronomique de la fin du 19ème siècle (Vilmorin-Andrieux 1883, Nicholson 1895). Chez cette espèce végétale d'origine littorale océanique, vivace par son rhizome, les jeunes pousses à l'état étiolé à la reprise de la végétation au printemps constituent l'organe comes- tible. Le bouturage des racines au champ est le mode de multiplication de l'espèce et donc le procédé traditionnel de mise en place d'une culture pour cette espèce. L'inventeur, à son départ de l'Ecole Nationale Supérieure d'Horticulture de Versailles o il était en poste jusqu'en Août 1971, a prélevé un éclat de rhizome d'une plante de Crambé maritime présente dans la collection des plantes comesti- bles de la chaire de cet établissement depuis le siècle dernier. Le maintien de cette plante par fragmentations successives du rhizome au cours des générations sans qu'il n'y ait eu modification du niveau génotypique de la plante -la description de la plante étant en conformité avec la description faire par les auteurs cités ci-dessus- permet à l'inventeur d'affirmer que la plante dont il vient d'être fait état, était cultivée au siècle dernier dans l'état o elle se trouvait au moment du prélèvement par l'inventeur. Il ne peut donc s'agir du type de Crambé sauvage tel que nous le rencontrons, en stations, sur le littoral breton ou normand. Depuis cette date, la plante a été entretenue dans le conservatoire botanique de la chaire de cultures légumières de l'Ecole Nationale d'Ingénieurs des Travaux Agricoles -option Horticulture- d'Angers o exerce actuellement l'inventeur. A partir de cette plante-mère, l'inventeur a créé un clone selon le procédé ci-après: Un fragment d'organe qui peut être un pétiole ou un limbe, après désinfection dans une solution de NaOCI à 10 % sous vide pendant 10 minutes, et rinçage dans trois bains d'eau stérile, est mis en culture dans des tubes à essais en salle climatisée dans les conditions suivantes: - température: jour = 240 C, nuit = 18 C - lumière 10 000 lux pendant 16 heures/24 heures. - 2- 2559349 Le milieu de culture mis en oeuvre présente la composition suivante (quantités ramenées au litre de milieu de culture) NH4NO3 0,48 g Ca(NO3)2, 4 H20 0,71 g KNO3 0,15 g KCI 0,075 g Mg SO4, 7H20 0,493 g (NH4)2 SO4 0, 265 g KH2 P04 0,140 g K2H PO4 0,175 g Fe EDTA () 5 ml de solution-mère H3BO3 2,48 mg Mn SO4 3,38 mg Zn SO4 1,15 mg KI 0,30 mg Na2Mo O4 0,10 mg Cu SO4 0,05 -mg Co SO4 0,05 mg Ni SO4 0,05 mg AI CI3 0,05 mg Glutamine 200 mg Adénine 40 mg Saccharose 30 g Gélose C 8 g (*) La solution-mère de Fe EDTA (Fer - acide éthylène diamine tétracétique) est préparée de la manière suivante: on mélange 557 mg de Fe SO4, 7 H20 avec 756 mg de Na2 EDTA et on ajuste le volume du mélange à 100 ml avec de l'eau distillée. Le pH du milieu de culture ci-dessus est ajusté à 5,6 par une solution de HCI à 1/1.0. A partir de ces explants, les cals se développent si une auxine qui peut être l'acide indol-acétique, et un mélange de cytokinines sont ajoutés au milieu ci-dessus dans un rapport de concentration approprié, par exemple un rapport de concentration exprimé en mg/l auxine/cytokinine de 0,066, le mélange de cyto- kinines étant également dans un rapport approprié, ce mélange de cytokinines pouvant comprendre par exemple la kinétine et la N-6 benzylaminopurine, ces deux cytokinines étant également dans un rapport approprié, par exemple dans un rapport de concentration (mg/l) de 4. - 3- Dans ces conditions, l'organogénèse intervient en 20-28 jours: plusieurs bourgeons sont néoformés sur les cals et développent ensuite des feuilles. Chaque bourgeon est alors séparé et repiqué, sur un milieu dit de multiplication selon le procédé développé ci-après compris également dans la présente invention. L'ensemble des plantes ainsi obtenues et ayant subi ultérieurement un repiquage sur un milieu d'enracinement approprié -procédé faisant partie également de l'invention- , est homogène et constitué de plantes toutes identiques entre elles: il constitue donc un clône de Crambé maritime obtenu selon le procédé développé ci-dessus. Les caractéristiques des plantes du clone ainsi obtenu sont rassemblées ci-après Sur le plan morphologique, les plantes du clone possèdent des feuilles à limbe applati dont les échancrures marginales appelées dents, peu nombreuses, présentent une constante propre à toutes les plantes du clône qu'il est possible de caractériser par un indice I défini de la manière ci-dessous 1 N E.i X L E.i = longueur,exprimée en cm, de l'espace internervaire considéré enfermant un sinus (position de cet espace identique pour toutes les plantes analysées) N = nombre de dents présentes dans l'espace internervaire (E.i) consi- déré. L = longueur totale, exprimée en cm du limbe de la feuille. Le dessin. annexé est une photocopie de feuille sur laquelle figurent les signes de références. Cet indice s'établit à la valeur moyenne de 0,068. L'homogénéité morphologique des plantes qui constituent le clone crée selon le procédé décrit ci-dessus, est vérifiée au.niveau de l'indice I par l'ana- lyse statistique (détermination de l'écart-type) comme l'indiquent les résultats figurant dans le tableau 1 ci-dessous: TABLEAU 1 Plantes L (cm) E.i (cm) N I 24,9 5,1 6 0,047 2 31,6 9,1 20 0,069 3 37,5 12,5 40 0,085 4 31,9 8,9 24 0,084 39,5 7,4 20 0,068 6 34,4 5,5 12 0,063 7 37,5 9,7 19 0,052 8 23,0 5,5 10 0,079 9' 18,5 3,2 4 0,067 Moyenne 0,068 Ecart-type 0,014 - 4 - 2559349 D'autre part, les feuilles (limbe * pétiole) des plantes du clone attei- gnent à leur plein développement une longueur moyenne de 48 cm et sont vertes par absence de pigments anthocyaniques. Enfin, quelle que soit la date de plantation pour un lieu de culture adapté, les plantes issues d'in vitro selon le procédé faisait également partie de la présente invention, ne présentant pas d'état floral au cours de l'année ou ces plantes ont été installées au champ après la phase de micropropa- gation in vitro. Les plantes du clone, à leur reprise de végétation, in situ ou en enceinte climatisée, après la première année de croissance, développent à l'obscu- rité des pousses -organe comestible de la plante- qui ont un intérêt culinaire. L'invention concerne également un procédé de multiplication du clone de Crambé maritime conduisant à la production de boutures utilisables directement par les agriculteurs. Le procédé est également utilisable sur l'espèce Crambé mariti- me. Les bourgeons, issus d'organogénèse in vitro suivant la méthode confor- me à la présente invention et décrite ci-dessus, sont séparés du cal dans des condi- tions stériles puis repiqués en terrine de verre contenant 130 ml d'un milieu iden- tique au milieu de néoformation précisé ci-dessus, exception faite de la nature des substrances de croissance et de leur équilibre: le milieu contient uniquement une cytokinine ou un mélange de cytokinines dans un rapport approprié, par exemple dans un rapport de concentration exprimé en mg/l de 1,66, ce mélange de cyto- kinine pouvant être la kinétine et la N-6 benzylaminopurine. Les conditions clima- tiques relatives au procédé de néoformation sont maintenues dans le présent procé- dé. L'ensemble des conditions étant respecté, les bourgeons induisent des bourgeons latéraux dont le nombre moyen est de 5 et qui se développent en 3 semaines au terme desquelles un nouveau repiquage, avec séparation des bourgeons néoformés, sera nécessaire. Ce procédé de multiplication in vitro, objet également de la présente invention, permet d'obtenir, à partir d'un bourgeon néoformé, 18 125 boutures au terme de 18 semaines. Lorsque le nombre requis de plantes-boutures à mettre en culture au champ est potentiellement atteint, les bourgeons sont repiqués in vitro, en tubes à essais ou en terrine en verre, sur un milieu dit d'enracinement dont la composi- tiori est identique à celle du milieu de néoformation ou de multiplication à l'excep- tion des substances de croissance qui, dans le cas présent, sont représentées uni- quement par une ou plusieurs auxines. Les conditions climatiques, restant identi- ques aux précédentes, permettent le développement de 3 à 4 racines blanches au bout de 2 à 3 semaines. ^ 2559349 -5 - Les jeunes plantes ainsi obtenues, pourvues de racines de 2 à 4 cm, sont transférées dans des godets contenant un substrat non stérilisé et humidifié, ce substrat pouvant par exemple être composé pour moitié de tourbe blonde et pour moitié de sable et humidifié à 80 % de sa capacité de rétention en eau. Les godets sont placés dans des mini-serres équipées d'un couvercle règlagle, dans les conditions climatiques suivantes: température de jour: 20 C -- température de nuit: 15 C - éclairement naturel du lieu o exerce l'inventeur et intensité lumineu- se maintenue inférieure à 15 000 lux. Maintenues ainsi dans ces conditions, les plantes se développent tant au niveau du feuillage (limbe de 10 cm environ pour les feuilles les plus anciennes) qu'au niveau du système racinaire (émission de trois ou quatre longues racines légèrement tubérisées sur lesquelles nait un chevelu racinaire latéral fin et abon- dant. Après une période d'élevage de 4 à 6 semaines, les plantes sont transfèrables au champ de production pour une mise en place de la culture de production du légume Crambé. Les principaux avantages de la micropropagation végétative in vitro chez le Crambé maritime par rapport au bouturage de racines traditionnel sont les suivantes - parfaite homogénéité des boutures à mettre au champ entrainant une très grande homogénéité de la culture au champ, - la. propagation d'un individu appartenant au cl1ne peut-être réalisée en continu, indépendamment de la saison et des conditions climatiques, - la micropropagation in vitro du Crambé maritime permet d'accroî- tre d'une manière spectaculaire le potentiel de production de boutures à partir d'un individu, - elle permet enfin d'assurer un lancement rapide de cette nouvelle production chez les agriculteurs. -6 - REVENDICATIONS 1. Clône de l'espèce Crambé maritime (Crambe maritima L.), caracté- risé en ce qu'il est obtenu par néoformation in vitro sur cal à partir de fragment de pétiole ou de limbe prélevé sur une plante-mère considérée comme plante ayant été cultivée au 19ème siècle et qui a depuis été, maintenue en conservatoire botani- que par simples éclatements du rhizome au cours des générations, néoformation suivie d'une multiplication végétative in vitro. Ce clone présente les caractéristi- ques morphologiques et physiologiques suivantes: - feuille à limbe applati et non anthocyané, de longueur moyenne de 48 cm - Indice Nombre de dents du limbe dans l'espace internervaire considéré Indice Long.(cm) de l'espace internervaire considéré X Long. totale (cm) 006 du limbe - plante sans état floral au cours de la première année de culture au champ dans des lieux adaptés. 2. Procédé de multiplication végétative du clône et de l'espèce Crambé maritime selon la revendication 1, caractérisé en ce qẻ chronologiquement: a/ des bourgeons sont obtenus par néoformation sur cal à partir des fragments de pétioles ou de limbes de feuilles prélevés sur la plante-mère et placés dans un milieu de culture contenant une auxine et un mélange de cytokinines. b/ La multiplication des plantes sans racines est assurée par micro- propagation in vitro qui consiste à séparer individuellement chaque plante dépourvue de racine et à la repiquer sur un milieu de culture contenant une cytokinine ou un mélange de cytokinines. Le taux de multiplication est de l'ordre de 5 par interval- le de 3 semaines. c/ Les plantes portant une ou deux feuilles, mais dépourvues de racines, sont transférées, in vitro, sur un milieu de culture contenant une ou plusieurs auxines. Le développement des racines intervient sous 2 à 3 semaines. d/ Les plantes pourvues de racines sont repiquées dans un milieu de 'culture non stérile et élevées dans des conditions de photopériode naturelle et d'éclairement inférieur à 15 000 lux jusqu'à l'obtention d'une plante apte à subir la transplantation définitive au champ et servir ainsi de bouture pour la mise en place de la culture de Crambé par les agriculteurs.