FR 2552102 A1 19850322 FR 8414122 A 19840914 La présente invention est relative à des vecteurs constitués par des plasmides, ainsi qu'à leur production et leur utilisation; elle est plus particulièrement relative à des vecteurs de type plasmide qui ont un taux de repli5 cation élevé et à leur production et leur utilisation. La technique dite de manipulation génétique ou en d'autres termes, l'ingénierie génétique prend une importance de plus en plus grande dans la production de produits utiles en médecine Selon une version préférée de cette technique, la section de gène codant pour la production du produit actif du point de vue pharmaceutique recherché, est insérée dans un vecteur, par exemple un plasmide, pour fournir une molécule de plasmide "hybride" recombinant qui est utilisée ensuite pour transformer un microorganisme 15 convenable Le plasmide est alors repliqué conjointement avec l'hôte bactérien et le gène inséré joue son rôle La quantité de produits génétiques dépend de l'intensité de la traduction et de la transcription, de la décomposition du produit génétique à l'intérieur de la cellule et du taux 20 de replication du gène, c'est-à- dire du plasmide portant le gène En conséquence, si l'on réussit à augmenter le taux de replication d'un plasmide dans une cellule, on peut obtenir une augmentation notable de la quantité de produits génétiques par l'augmentation du taux de replication du gène étranger (Quant à la technique de manipulation génétique, voir par exemple le Brevet américain 4 237 224). La présente invention a pour objet des vecteurs constitués par des plasmides qui ont un taux de replication par cellule notablement supérieur à celui des plasmides 30 connus et largement utilisés. On utilise dans la recherche scientifique et dans l'industrie une grande variété de vecteurs constitués par des plasmides généralement construits artificiellement, différents L'un des plasmides le plus largement mis en oeuvre est le p BR 322 qui a été construit pour la première fois par Boyer et Ai /Gene, 2, 95-113 ( 1977) 7 Comme la Demanderesse dispose jusqu'à l'heure actuelle, d'une information scientifique très approfondie à propos de ce plasmide et que la plupart des procédures de clonage de gènes a été 5 effectuée avec ce plasmide ou ses dérivés, la Demanderesse a utilisé cette substance comme matière de départ dans ses expériences La structure du p BR 322 a été déterminée par Sutcliffe ZCSH Symp Quant Biol 43, 77-90 ( 1979)_ 7 et elle est illustrée dans la Figure 1 annexée Le plasmide a une lon10 gueur moléculaire de 4 362 bp La replication du plasmide débute au nucléotide 2536 dans la direction inverse des aiguilles d'une montre et son taux de replication par cellule est généralement compris entre 20 et Le taux de replication est contrôlé par un mécanisme de régulation cormpliqué Plasmide 9, 1, ( 198317 Le fragment situé entre les nucléoti15 des 2978 et 3081 est responsable de la synthèse d'un ARN de bas poids moléculaire qui ne code pour aucune protéine et qui est transcrit dans le sens des aiguilles d'une montre avec une intensité relativement élevée Cet ARN de bas poids moléculaire est le régulateur négatif (répresseur de la replication du plasmide). La présente invention repose sur la constatation selon laquelle on peut augmenter de façon substantielle le taux de replication du plasmide, en réalisant dans la section du gène responsable de la production du répresseur de la replication du plasmide une rutation qui altère cette fonction de ladite section du gène. La Demanderesse a isolé le premier plasmide à taux de replication élevé (p HC 1), en tant que produit de mutation spontanée, dans une expérience effectuée avec des plasmides r s de phénotype ampr, tet, contenant un ADN étranger entre les sites de coupure Eco RI et Bam HI du plasmide p BR 322, pendant 30 l'analyse d'un ensemble de recombinants consistant en environ 5000 plasmides indépendants On a pu isoler, à partir des cellules bactériennes contenant le plasmide p HC 1, environ à 30 fois plus d'ADN du plasmide sans amplification, qu'à partir des clones contenant d'autres molécules recombi35 nantes de structure analogue La retransformation répétée du plasmide p HC 1, en utilisant E coli HB 101 (pro, leu, thi, lac, str, r m rndol,rec A)/Boyer, H W et AL: J Mol Biol 41, 459-472 ( 197917, C 600 (rk,mk,thi,thr, leu, lac) L Boyer, H W et Ail, ibid 7, ED 8800 (sup E, sup F, hsd S, met, lac ZM 15, rec A 56) LZ-Murray, N E et Al: Mol gen Genet 150, 53-61 ( 197717 comme cellules hôtes, s'est traduite à chaque fois par la production de clones r s ampr, tet, contenant une grande quantité de plasmide La Demanderesse a supposé un changement héréditaire dans l'ADN 10 du plasmide pour expliquer le taux de replication élevé, qui était d'environ 20 à 30 fois supérieur à celui des plasmides p BR. Identification de la mutation responsable du taux de replication élevé Le plasmide p HC 1 a été digéré à l'aide des endonucléases de restriction Eco RI et Pvu II et ensuite on a garni les extrémités à brin unique d'un sous-fragment de Klenow de l'enzyme ADN-polymérase I, en présence de substrats de d NTP Les molécules d'ADN à extrémités modifiées pour être rendues cohésives,ainsi produites, ont été mises sous forme d'un anneau à l'aide d'une enzyme, à savoir le polynucléotide ligase et transformées en cellules HB 101 On a isolé l'ADN du plasmide à partir de colonies développées sur un milieu contenant de l'ampicilline et l'on a analysé les échantillons d'ADN qui ont pu être isolés en grande quantité, par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et d'agarose, après digestion par les endonucléases de restriction Eco RI, Pvu II et Bsp RI Le plasmide p HC 81 (Figure 2) choisi pour une étude complémentaire n'a pas pu être digéré par l'enzyme 30 Pvu II et a été linéarisé par Eco RI On a établi, à partir du poids moléculaire total du plasmide ( 2, 3 kb) et de la dimension des fragments obtenus par digestion par Bsp RI ( 587, 457, 434, 267, 240, 80 bp), que le plasmide p HC 81 contenait la section entre les nucléotides 2069 et 2 du 35 plasmide p BR 322 avec une mutation responsable du taux de replication élevé Cette mutation ne pouvait pas être détectée d'après la dimension de l'un quelconque des fragments produits par les enzymes mises en oeuvre Pour situer la mutation, on a isolé le fragment d'ADN 1030 bp obtenu par la digestion de p HC 81 par les endonucléases de restriction Pst I et Taq I, le fragment d'ADN 780 bp obtenu par la digestion de p BR 322 par les enzymes Pst I et Cla I et le fragment d'ADN 218 bp obtenu par la digestion de p BR 329 par l'enzyme Taq I Les trois fragments d'ADN ont été mélangés en propor10 tion équimolaire, ils ont été soudés à l'aide d'un polynucléotide ligase et ensuite les cellules de HB 101 ont été transformées par le produit de forme circulaire obtenu par soudure, ou "ligat" On a isolé l'ADN du plasmide à partir des clones individuels développés sur un milieu contenant de l'ampicilline Ces plasmides présentaient le phénotype du taux de replication élevé En digérant les ADN du plasmide par des endonucléases de restriction, on a établi qu'ils étaient produits par la liaison de trois fragments bien distincts d'origines différentes; dans les plasmides obtenus, 20 la partie proximale du gène e-lactamase était d'origine p BR 322, la région contenant l'"origine" de la replication était dérivée du plasmide p BR 329 et le fragment isolé à partir du p HC 81 contenait en plus de la partie distale du gène a-lactamase, également la mutation dont découle le taux de replication élevé On en a donc conclu que la mutation était formée entre les nucléotides 2573 (Taq I) et 3612 (Pst I) de l'ADN du plasmide p BR 322 La séquence de nuclêotides de cette région a été déterminée et comparée à la séquence p BR 322 connue Cette comparaison a montré qu'une 30 transition G)T (G = désoxyguanyle, T = thimidyle) s'est produite au niveau du nucléotide 3074, ce qui correspond à une transition C,A dans le brin d'ADN complémentaire (C = désoxycytosyle, A = désoxyadényle). Par suite de la mutation ponctuelle qui s'ensuit, 35 la terminaison de la transcription de l'ADN répresseur est est endommagée et un ARN de poids moléculaire supérieur est synthétisé, lequel ne peut plus jouer le rôle de répresseur de la replication La terminaison de la fonction de répresseur se traduit par une augmentation du taux de replication 5 On a pu augmenter d'environ 20 à 30 fois (z 1000) le taux de replication du plasmide par cellule par rapport à la valeur initiale, grâce à cette mutation ponctuelle spontanée qui peut aussi être produite délibérément Cette mutation ponctuelle permet d'augmenter notablement le taux de repli10 cation d'un quelconque plasmide ayant la même région de replication que p BR 322. On a constaté cependant, que le plasmide p BR 322 d'origine, contenant une mutation ponctuelle G T n'est plus viable En effet, en raison du taux de replication élevé, on constate que sur les gènes du plasmide qui déterr minent la résistance aux antibiotiques -Ap = B-lactamase, r Tc,-= protéine(s) de membrane, la synthèse des deux protéines est augmentée et la seconde d'entre elles (protéine de membrane responsable de la résistance à la tétracycline) est 20 létale pour la cellule lorsqu'elle est présente en cette plus grande quantité On observe le mn-m problème dans le cas de n'importe quel dérivé taux de replication élevé, du plasmide p BR 322, qui contient le gène d'origine de résistance à la tétracycline sous une forme non modifiée. La Demanderesse n'avait pas ce problème à résoudre 25 dans ses expériences antérieures, car elle utilisait des plasmides dans lesquels des fragments d'ADN étrangers avait été clones entre les sites Bam HI et Eco RI du plasmide p BR 322 et de cette façon, le gène de résistance à la tétracycline était inactive En conséquence, pour obtenir un plasmide à 30 taux de replication élevé, viable, on doit modifier le p BR 322 ou un dérivé de celui-ci ayant la même région de replication, en inactivant ou en réprimant la fonction du gène de la résistance à la tétracycline. Conformément à un mode de réalisation préféré 35 de la présente invention, celle-ci a pour objet de nouveaux plasmides, dérivés du p BR 322 ou des dérivés de celui-ci contenant la même région de replication, caractérisés en ce qu'ils ne contiennentpas de gène de résistance à la tétracycline ou contiennent celui-ci sous une forme inactive ou modifiée pour exercer une fonction modérée, et en ce qu'ils contiennent une mutation ponctuelle modifiant la production du répresseur sur la section du gène codant l'ARN répresseur. Conformément à un mode de réalisation plus préféré 10 encore de la présente invention, dans l'ADN du plasmide p BR 322 ou d'un dérivé de celui-ci ayant la même région de replication, la paire de base GC, dans la position 3074 (suivant le numérotage de p BR 322, est remplacée par TA, par une mutation ponctuelle contr 8 ôlée ou par le remplacement d'une section contenant cette mutation dans un plasmide p HC, qui sera décrit plus loin, par une section du plasmide désiré qui est identique, mise à part cette mutation. Comme décrit plus haut, si l'on utilise comme substance modèle, du p BR 322 ou un dérivé convenable de celui-ci, la mutation ponctuelle GC TA doit être produite sur un dérivé du plasmide de départ dans lequel le gène de résistance à la tétracycline est totalement absent ou dans lequel sa fonction est inactivée ou réprimée Dans ce contexte, le terme "répression" signifie que le gène codant 25 pour la production de la protéine de membrane responsable de la résistance à la tétracycline, est modifié de façon à induire une production réduite de protéine Selon une version préférée, l'ADN responsable de la résistance à la tétracycline ou la section totale allant jusqu'à l'origine ou "origo" de réplication du p BR 322 est éliminé ou, éventuellement remplacé par un polylinker d'origine synthétique, de telle sorte, qu'en raison des sites supplémentaires de digestion par les endonucléas Es de restriction, insérés dans le plasmide, les possibilités d'application des plasmides 35 obtenus sont notablement étendues. Construction des plasmides p HC 314, p HC 312 et p HC 624 Au cours de la transformation ultérieure des plasmides obtenus dans les expériences décrites ci-dessus, des polylinkers ont été insérés dans le plasmide p HC 81 afin de préparer des vecteurs convenant à l'insertion de fragments d'ADN formés à l'aide de diverses endonucléases de restriction L'ADN du plasmide p HC 81 linéarisé par l'endonucléase Eco RI et déphosphrylé par une phosphatase alcaline bactérienne, a été soudé à des fragments d'ADN du plasmide Z Seed, B: Nucleic Acide Research 11, 2427-2446 ( 1983)7 et descellules d'E Coli HB 101 ont été transformés à l'aide du produit de la soudure ou "ligat" On a isolé l'ADN du plasmide à partir des colonies bactériennes résistantes à Ap et on l'a analysé par électrophorèse surgel, après diges15 tion par les endonucléases de restriction Eco RI et Pst I. Pour procéder à des études complémentaires, on a choisi le plasmide qui pouvait être coupé en fragments 2300 et 110 bp par Eco RI et en fragments 1580 et 820 bp par Pst I (p HC 314, Figure 3) A partir de là, on a construit le plasmide p HC 312 ne contenant qu'un seul site Eco RI, en procédant comme suit: le plasmide a été digéré par l'endonucl 8 ase de restriction Bam HI et la molécule linéaire obtenue partiellement digérée par l'enzyme Hinf I On a séparé les fragments d'ADN dans un gel d'agarose à 1,2 % et isolé le fragment 2010 bp Les extrémités de la molécule contenant des sections à brin unique à la suite de la digestion par les enzymes Bam HI et Hinf I ont été converties en extrémités modifiées par le sous-fragment d E Klenow de l'ADN polymérase I, pour être rendues cohésives, puis elles ont été remises sous forme circulaire à l'aide de polynucléotide ligase induit par T 4. L'ADN soudé a été transformé en cellules HB 101 et on a isolé des clones individuels Pour des opérations-ultérieures, on a choisi le plasmide p HC 312 qui ne pouvait pas être coupé par l'endonucléase Bam HI, mais pouvait être linéarisé par 35 Eco RI et produisait les fragments 1495 bp et 516 bp par digestion par Hin Pl (Figure 4) Pour produire un vecteur à taux de replication élevé, convenant au clonage de fragments d'ADN présentant desextrémités modifiées pour être cohésives, on a digéré le plasmide p HC 312 par les endonucléases de res5 triction Eco RI et Hind III, et isolé le fragment 1980 bp à partir d'un gel d'agarose Ce fragment a ensuite été mélangé à l'ADN du plasmide 'IAN 7 L/-Seed, B: Nucleic Acids Research, 11, 2427-2446 ( 1983)7 digéré par les enzymes Eco RI et Hind III et les molécules sont liées à l'aide 10 d'un polynucléotide ligase On a transformé des cellules d'E coli HB 101 à l'aide du plasmide soudé et on a isolé l'ADN du plasmide à partir des clones bactériens individuels, résistants à l'Ap L'ADN du plasmide préparé de cette façon (p HC 624, figure 5) n'a pas de site Cla I, mais à la diffé15 rence du plasmide p HC 312, il peut être linéarisé par les endonucléases de restriction Sma I, Sa II et Bam HI. Détermination du taux de replication des plasmides Taux de replication relatif Pour déterminer le taux relatif de replication 20 des plasmides p HC, on cultive des cultures d'E coli HB 101 contenant des plasmides de différentes dimensions dérivés du p BR 323 recombinant et de dérivés de replication élevé de même dimension, jusqu'à obtention d'une densité cellulaire identique On a isolé l'ADN du plasmide suivant la technique 25 qui est décrite par Birnboim et Doly -Nucleic Acids Res 7, 1513-1523 ( 1979)7, à partir de quantités indentiques des suspensions obtenues sans amplification Des échantillons prélevées dans des préparations d'ADN ont été soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose, dans des dilutions de 30 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 et 50 fois respectivement Les plasmides à taux de replication élevé et leurs paires à taux de replication normal (ayant le même poids moléculaire) ont été examinés simultanément Les résultats expérimentaux ont montré que le taux de replication des plasmides p HC est environ 20 à 30 fois supérieur à celui des dérivés p BR 322 correspondants "à taux de replication normal". Taux de replication absolu On a déterminé le taux de replication absolu des plasmides p HC en marquant l'ADN des cellules contenant les plasmides in vivo et en mesurant le taux de radioactivité dans l'ADN du plasmide séparé et dans l'ADN chromosomique. Par cette méthode, on a trouvé que le taux de replication des plasmides ayant la même dimension que celle du p HC 314 (P.M = 1,6 106 d) était d'environ 1000/par cellule (poids 10 moléculaire du chromosome = 2 109 d) De 60 à 65 % de la teneur totale en ADN de la cellule était de l'ADN du plasmide. Pour réaliser le marquage in vivo de l'ADN, on a cultivé les cellules contenant les plasmides sur un milieu de culture M 9, complété par les composants suivants: 0,5 % d'acide 15 Casamino (Difco), 0,5 % de glucose, 1 g/ml de vitamine B 1, 1 mmole de Mg SO 4, 2 gg/ml de thymidine, 250 gg/ml d'adénosine et 0,4 m Bq/ml de LJ 3 H 7 -thymidine J 888 t Bq/mmole, Chemapol, Prag 7. Les cellules contenant le plasmide sont digérées 20 selon la méthode de Womble et Coll J Bactériol, 130, ( 1977) 148-153/ L ' A D N c h r o m o S omique et l'ADN du plasmide sont séparés l'un de l'autre par centrifugation avec un gradient de densité à l'équilibre de bromure d'éthydium/ chlorure de césium, du lysat de cellules dérivé d'une sus25 pension de bactéries cultivée, jusqu'à 2 ml (DO 550 = 4-5/ 45000 tpm, rotor Beckman Type 65, 40 heures, 20 C). L'augmentation du taux de replication est représentée aux Figures 6 et 7. La Figure 6 montre des taches correspondant aux 30 ADN de plasmides recombinants Apr,Tc S d'origine p BR 322, après séparation par électrophorèse sur gel d'agarose/bromures d'éthydium Tous les échantillons ont été préparés se Ion là technique à partir de la meme quantité de cellules de HB 101 contenant des plasmides /irnboim and Doly, tucleic Acids Res. 35 7, 1513-1523 ( 1979)7 Les échantillons 1-2 et 4-6 sont des 255212 t plasmides recombinants contenant un ADN étranger à 1,5 à 2,0 kb entre les sites de coupure Eco RI et Bam HI du plasmide p BR 322 L'échantillon 3 est un plasmide de même dimension, qui contient la mutation responsable du taux de repli5 cation élevé (p H Cl). La Figure 7 montre des taches de l'ADN de cellules d'E coli HB 101, contenant le plasmide p 715 (échantillon A) et le plasmide p HC 314 (échantillon B) après séparation par centrifugation par un gradient de bromure d'éthydium/chlorure 10 de césium (Le plasmide p 715 a la même structure que p HC 314, à part la mutation responsable du taux de replication élevé) La photo a été prise après séparation de l'ADN du plasmide et de l'ADN chromosomique par centrifugation, sous irradiation UV du tube de centrifugation contenant l'ADN. Comme on le voit clairement sur la photo, la bande inférieure contenant le plasmide manque presque entièrement dans l'ADN obtenu à partir des cellules contenant le plasmide à taux de replication normal (échantillon A) Au contraire, l'ADN du plasmide p HC 314 obtenu à partir de la même quantité de 20 cellules par la même technique, forme une large bande en dessous de la bande contenant l'ADN chromosomal, en raison du taux de replication notablement augmenté du plasmide. Matières et techniques mises en oeuvre dans les expériences Souches bactériennes et plasmides: r r p BR 322 amp,tet L Bolivar, F et Al: Gene 2, -113 ( 197717; r r r p BR 329 ampr, chlr, tetr L Covarubbias, L, Bolivar, F: Gene, 17, 79-89 ( 198217; Les préparations d'ADN de plasmides f v X et AN 7 30 sont préparées à l'Institut de Biochimie, Centre de Recherches biologiques de l'Académie des Sciences de Hongrie, SZEGED, Hongrie L-Seed, B: Nucleic Acids Research, 11, 2427-2446 ( 1983)7 Les préparations de polynucléotide ligase, de 35 polynucléotide kinase induite par T 4 et d'endonucléase de de restriction employées, sont préparés à l'Institut de Biochimie, Centre de Recherche Biologique de l'Académie des Sciences de Hongrie, SZEGED Hongrie, en utilisant les méthodes de purification publiées Z-Roberts, R J: Nucleic Acids Research 11, r 135-r 137 ( 1983); Murray, N E et Al: J Mol Biol 132, 493-505 ( 1979); Panet, A et Al: Biochemistry, 12, 5045-5050 ( 19731/ Le fragment de Klenow d'ADN polymérase I est un produit des NEW ENGLAND BIOLABS, tandis que la phosphatase alcaline bactérienne (BAP) est 10 produite par WORTHINGTON. Le Zî _ 32 p 7 ATP (Institut hongrois des isotopes Budapest) avait une activité spécifique de 22 T Bq/m M. Le milieu de culture YTB L Miller, J H ed. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York ( 19721/ contient 10 g/l de Bacto Tryptone (Difco), 5 g/1 d'extrait de Bacto Levure (Difco) et 5 g de Nacl Le milieu de culture Y 1 B a été complété par g/litre de Bacto Agar (Difco) pour préparer des plaques de YTA. Pour isoler l'ADN du plasmide, on a cultivé les souches de bactéries HB 101, C 600 et ED 8800 contenant les plasmides convenables, sur un milieu de culture YTB contenant 100 gg/ml d'ampicilline (Pharmachim, Sofia) On a ajouté 170 gg/ml de chloramphénicol à DO 60 o Onm = 0,7 0,8 aux cultures de bactéries qui ont alors été agitées pendant à 12 heures supplémentaires avant de procéder à l'isolation de chaque plasmide non-p HC On a isolé les plasmides à taux de replication élevé (p HC) à partir des cellules d'une culture développée jusqu'à la phase stationnaire, sans ampli30 fication Lorsqu'on a isolé l'ADN du plasmide en quantités suffisantes (à partir de 50 à 100 ml d'une culture de bactéries dans le cas des plasmides p HC et à partir de 1 à 3 litres de culture dans le cas d'autres dérivés), on a préparé un lysat clair selon la technique de Clewell and Helinski 35 Z J Bacteriol, 110, 1135 ( 197217 et l'on a purifié l'ADN du plasmide sur une colonne de Séphacryl 51000 (Pharmacia). Pour isoler l'ADN du plasmide à des fins analytiques (de 1,0 à 1,5 ml de culture de bactéries), on a mis en oeuvre la méthode à l'acétate de potassium, élaborée par Birnboim et Doly et modifié par D Ish-Horowich L Maniatis, T et Coll: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York ( 198217. La digestion d'échantillons d'ADN par des endonucléases de restriction a été effectuée dans les condi10 tions de réaction recommandées par les NEW ENGLAND BIOLABS. Pour transformer des fragments d'ADN à extrémités à brin unique en fragments à extrémités modifiées pour être rendues cohésives, on a précipité l'ADN par de l'alcool après digestion par l'enzyme de restriction, puis on l'a 15 dissous dans un tampon comprenant 50 m M de Tris Cl p H 7,4, 7 m M de Mg C 12, 1 m M de dithiothréitol, 0,1 m M de d ATP, 0,1 m M de d CTP, 0,1 m M de d GTP, 0,1 m M de TTP (volume final: 1020 élit, concentration en ADN: 200-250 gg/ml) La solution a alors été incubée avec 1 2 U de fragment de 20 Klenow d'ADN polymérase I à 37 C, pendant 15 minutes L Maniatis, T et Coll: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York ( 198217 Le mélange réactionnel ( 30-40 il) utilisé pour souder des fragments d'ADN à extrémités cohésives contenait 25 0,5 à 1,0 gg d'ADN, 66 m M de Tris Cl (p H 7,6), 5 m M de Mg C 12, 5 m M de dithiothréitol, 1 m M d'ATP et 1 U de polynucléotide de ligase induite par T 4 La soudure a été effectuée à 14 C pendant 2 à 3 heures L Maniatis, T et Coll: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York ( 198217. 30 Des fragments à extrémités modifiées pour être rendues cohésives ont été soudés dans un tampon contenant 30-40 gg /ml. d'ADN, 25 m M de Tris H Cl(p H 7,4), 5 m M de Mg C 12, 5 m M de spermidine, 1 m M d'ATP, 10 -g/ml de BSA (Sigma, Type V) Le mélange réactionnel a été additionné de 4 à 6 U de polynu35 cléotide ligase induite par du T 4 et incubé à 14 C pendant 8 à 12 heures L Maniatis et Coll: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York ( 1982)7. L'électrophorèse sur gel d'échantillons d'ADN est effectué dans des gels d'agarose de 0,8 à 2,0 % (SIGMA, Type I), dans 5 des équipements d'électrophorèse horizontaux suivant la technique qui est décrite par WTLLING et Coll I-J VIRCL 14, 1235 ( 1974) 7 L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide (en utilisant des gels verticaux de 1 mm d'épaisseur, à 1 % et 8 %) est réalisée selon la méthode de Maniatis et Coll / Biochemistry, 14, 3787-3794 10 ( 1975)7. On a utilisé la technique mise au point par Winberg et Al LZ-Nucleic Acids Res 8, 253-264 ( 1980)7 en utilisant du papier DEAE, pour isoler des fragments d'ADN à partir de gels d'agarose et de polyacrylamide. Des cellules ccmpétentes pour la transformation des souches de bactéries HB 101, C 600 et ED 88 CO ont été préparées selon la méthode dite au Cacl 2, décrite par Mandel et Higa L-J Mol Biol, 53, 154 ( 197017. La déphosphorylation des extrémités 5 ' des frag20 ments d'ADN, le marquage des extrémités par la polynucléotide kinase et le LV' 32 P 7 ATP et la détermination de la séquence de nucléotide, ont été effectuées selon le protocole décrit par Maxam et Gilbert L Methods Enzymol 65, 499 ( 19771/7. Parmi les plasmides conformes à la présente invention on préfère particulièrement les vecteurs de type plasmides à taux de replication élevé, ayant la même région de réplication que p BR 322, une mutation ponctuelle G T dans le gène du petit ARN qui fonctionne comme un répresseur 30 de la replication, et a) contenant le gène de résistance à l'ampicilline du p BR 322 comme marqueur génétique sélectif et dans lequel le gène de résistance à la tétracycline est absent ou est inactivé, ou b) contenant les gènes de résistance à l'ampicilline et à la 35 tétracycline du plasmide p BR 322 en tant que marqueur génétique sélectif et dans lequel la transcription du gène de résistance à la tétracycline est effectuée à partir d'un mutant plus faible que le promoteur naturel, ou à partir d'un promoteur étranger. Les plasmides représentés aux figures 3, 4 et 5 sont des représentants préférés des plasmides à taux de replication élevé, conformes à la présente invention, et présentant les propriétés caractéristiques suivantes: 1) Par suite d'une modification dans la structure du gène 10 codant pour l'ARN de bas poids moléculaire fonctionnant comme répresseur de la replication; la répression de leur replication est éliminée, si bien que le taux de replication à l'intérieur de la cellule est notablement augmenté et est en général d'environ 1 000 (environ 65 % de la teneur totale 15 en ADN de la cellule) Ce taux élevé n'a aucune influence sur les cellules d'E coli utilisées comme cellules-hôtes. 2) Les plasmides de cette série contiennent les sites de coupure pour de nombreuses endonucléases de restriction, si bien que les fragments d'ADN digérés par ces enzymes, par leurs combinaisons ou par d'autres endonucléases produisant les mêmes extrémités, peuvent être facilement insérés dans ces plasmides. Des sites convenant au clonage dans les plasmides préférés conformes à la présente invention, sont les 25 suivants: p HC 314: Cla I, Hind III, Xba I, Bam HI, Bgl II et des combinai- sons facultatives de ces sites; p HC 312: Cla I, Hind III, Xba I, Bgl II, Eco RI et des conbinai sons facultatives de ces sites; p HC 624: Eco RI, Hind III, Bam HI, Xba I, Bgl II, Smal, (Xma I), Sal I et leurs combinaisons avec certaines restrictions. 3) La dimension des plasmides p HC préférés est notablement plus petite que celle du p BR 322 de départ, ainsi, la dimen 35 des plasmides représentés aux figures 3, 4 et 5 est de sion 2405 bp, 2010 bp et 2015 bp Ceci est avantageux puisque le taux de réplication de la plupart des plasmides vecteurs à l'intérieur de la cellule est inversement proportionnel à la dimension du plasmide Dans ces expériences de clonage de gènes, plus les vecteurs employés sont petits et plus grand est le gène pouvant être effectivement cloné. 4) Ces plasmides ont le gène de la résistance à l'ampicilline du p BR 322 d'origine, en tant que marqueur génétique sélectif. ) Ils contiennent l"'origo" de replication du p BR 322 d'origine. 10 Conformrrément à un autre aspect de la présente invention, celle-ci a pour objet un procédé pour la préparation de vecteurs constitués par des plasmides à taux de réplication élevé qui comprend la production d'une mutation modifiant la production du répresseur dans la section du gène d'un plasmide qui est responsable de la production du répresseur de la replication du plasmide. Conformément à un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de la présente invention, une mutation ponctuelle modifiant la production du répresseur est produite dans la 20 section du gène codant l'ARN répresseur dans un dérivé de p BR 322 ou dans tout autre plasmide ayant la même région de replication, dans lequel le gène de résistance à la tétracycline est inactivé ou présente un fonctionnement atténué et, si cela est désiré, la section de l'ADN responsable de la production des protéines de membrane de résistance à la tétracycline, est remplacée par un ADN polylinker de synthèse, en une ou plusieurs étapes. Comme décrit plus haut, la mutation est de préférence une mutation ponctuelle G->T en position 3074, suivant 30 le numérotage d'origine du p BR 322. Il existe plusieurs voies différentes disponibles pour éliminer les problèmes provoqués par la résistance à la tétracycline Selon une possibilité, on remplace la section de l'ADN responsable de la production de la protéine de membrane à laquelle est due la résistance à la tétracycline par un ADN polylinker d'origine synthétique, qui peut être coupé par une ou plusieurs enzymes de restriction importantes Selon une variante, on peut insérer une fraction d'ADN étrangère dans le gène de la résistance à la tétracycline, 5 ce qui inactive son fonctionnement Selon une autre possibilité, on réduit la transcription du gène de résistance à la tétracycline par une mutation dans la région du promoteur ou par le remplaoement du promoteur maturel par un promoteur "étranger" qui assure une transcription moins intense Tcutes oes tech10 niques et leurs modifications videntes entrent dans le cadre de la présente invention. Les vecteurs de type plasmide à taux de replication élevé conformes à la présente invention, ont des possibilités d'application variées, comme la préparation de n'irorte quelle section clonée de la 15 totalité d'un plasmide "chimère" sous une forme pure, pour des tests de contrôle,la vérification de structure, une modification, un transclonage, etc Lorsqu'on a utilisé les plasmides conformes à la présente invention, on peut obtenir la même quantité d'ADN à partir de beaucoup moins de matière de départ que dans le 20 cas des plasmides généralement utilisés connus dans la littérature Dans le cas des plasmides p HC cités en exemple, il faut environ 20 à 30 fois moins de matière de départ pour produire la même quantité d'AEN qu'à partir de p BR 322 L'ADN du plasmide qui peut être isolé à partir d'une seule colonie d'une bactérie portant des plas25 mides p C, suffit pour 3-4 analyses de restriction On peut isoler plus de 10 mg de plasmide pur à partir d'un litre de culture de bactérie Dans le cas o une quantité accrue du produit du gène cloné est supportable pour la cellule-hôte, on peut activer la synthése d'un quelconque produit génétique, en utilisant des plasmides p HC ccnformes à la présente invention Dans un cas cptimum, l'augmentation de rendeient est d'environ 20 à 30 fois puisque ce degré d'au gmentation de la dose de gène peut être atteint Dans certains cas, l'augmentation sera un peu inférieure en raison du rôle limitant d'autres facteurs. L'insertion de sections de polylinker dans les plasmides p HC leur donne une grande flexibilité Si les sites de coupure disponibles ne conviennent pas pour le gène à cloner, ils peuvent être remplacés ou être rendus convenables pour un clonage à l'aide d'autres fragments, au moyen d'adaptateurs de synthèse. La production d'insuline,de vasopressine, etc doit être mentionnée, en tant qu'application industrielle. Il doit être noté que les expériences utilisées pour illustrer la présente invention ne sont données qu'à 10 titre d'exemple et ne constituent en aucune manière des limitations à la portée de celle-ci. En plus des solutions techniques décrites, il existe de nombreuses autres possibilités pour mettre en oeuvre la présente invention Par exemple, on peut, en 15 utilisant les enzymes Fnu 4 HI et Tthi II, respectivement, couper les sections d'ADN correspondantes contenant 21 et 32 nucléotides respectivement, à partir du p BR 322 d'origine; on peut synthétiser chimiquement les fragments correspondants contenant une mutation ponctuelle G T et les insérer dans 20 la molécule de p BR 322 à la place des fragments éliminés. De façon analogue, on peut insérer une grande variété de fragments d'ADN polylinker de synthèse dans la molécule, à la place de la section partiellement ou totalement éliminée d'ADN responsable de la résistance à la 25 tétracycline. Ces solutions et des solutions similaires ainsi que les plasmides obtenus par ces méthodes entrent dans le cadre de la présente invention. Les plasmides p HC 312, p HC 314 et p HC 624 ont 30 été respectivement déposés à la Collection Nationale de Microorganismes (OKI) de Hongrie sous les Nos 00279, 00280 et 00281, respectivement le 7 mars 1984. Les souches de microorganismes et plasmides mentionnés plus haut ont été respectivement déposés à la Collec35 tion Nationale de Microorganismes (OKI) de Hongrie le 255210 t juillet 1984 sous les numéros suivants: E coli HB 101 00290 E coli ED 8800 00291 E coli C 600 00292 p 715 00293 p HC 1 00294 p HC 81 00295 1 AN 7 00296 yt VX 00297 Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1) Vecteurs constitués par des plasmides à taux de réplication élevé, caractérisés en ce qu'ils contiennent dans la section du gène responsable de la production du répresseur de la replication du plasmide, une mutation modifiant la production du répresseur. 2) Vecteurs constitués par des plasmides à taux de replication élevé,caractérisés en ce qu'ils ont la même région de réplication que le p BR 322 et une mutation ponctuelle G +T dans le gène du petit ARN qui fonctionne en tant que répresseur de replication et a) en ce qu'ils contiennent le gène de la résistance à l'ampicilline du plasmide p BR 322 comme marqueur génétique sélectif, le gène de la résistance à la tétracycline dans ces vecteurs constitués par des plasmides étant inactivé ou totalement absent ou ayant une fonction réprimée ou b) en ce qu'ils contiennent les gènes de résistance à l'ampicilline et à la tétracycline du plasmide p BR 322 en tant que marqueurs génétiques sélectifs, la transcription du gène 20 de la résistance à la tétracycline étant réalisée, dans ces vecteurs de type plasmide, à partir d'un mutant plus faible que le promoteur naturel ou à partir d'un promoteur étranger. 3) Vecteurs constitués par des plasmides p HC 314, p HC 312 et p HC 624 selon l'une quelconque des revendications 25 1 et 2. 4) Microorganisme caractérisé en ce qu'il contient et replique l'un quelconque des vecteurs de type plasmide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3. ) Procédé pour la préparation des vecteurs cons30 titués par des plasmides à taux de replication élevé, caractérisé en ce qu'on produit dans la section du gène responsable de la production d'un répresseur de la replication du plasmide, une mutation modifiant la production du répresseur. 6) Procédé selon la revendication 5 pour la pré35 paration de dérivés du p BR 322 à taux de replication élevé, et de ses dérivés ou d'autres plasmides ayant la même région de replication que le p BR 322, caractérisé en ce que l'on produit dans la section du gène codant 'ARN répresseur d'un dérivé du p BR 322 ou d'un quelconque autre plasmide ayant la même région de replication, une mutation ponctuelle modifiant la production du répresseur contenant le gène de résistance à la tétracycline sous une forme inactivée ou sous une forme dans laquelle son action est réprimée, et si cela est désiré, on remplace la section d'ADN responsable de la production de 10 protéine de membrane déterminant la résistance à la tétracycline par un ADN polylinker de synthèse, en une ou plusieurs étapes. 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6 caractérisé en ce que l'on produit une mutation 15 ponctuelle dans la position 3074 de la section du gène codant l'ARN répresseur, suivant le numérotage d'origine du p BR 322. 8) Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6 caractérisé en ce que l'on remplace la section ADN responsable de la production de la protéine de membrane 20 qui provoque la résistance à la tétracycline, dans un plasmide contenant une mutation ponctuelle G->T, par une section d'ADN polylinker de synthèse qui peut être coupée par une ou plusieurs enzymes de restriction, ou en ce qu'on insère dans le gène de résistance à la tétracycline, une section d'ADN étranger qui désactive le fonctionnement de celui-ci, ou bien l'on réprime la transcription du gène de la résistance à la tétracycline, par une mutation dans la région du promoteur, ou par le remplacement-du promoteur naturel nar un promoteur étranger fournissant une transcription moins intense.