FR 2553518 A1 19850419 FR 8316302 A 19831013 "Nouveaux conjugués élaborés par fixation d'un ligand sur un support insoluble, leur préparation et leurs applications bioloaiques". L'invention est relative à de nouveaux conjugués 5 élaborés par fixation d'une molécule organique, ou ligand, sur un support insoluble, à leur préparation et à leurs applications biologiques. Les conjugués du type support-ligand sont largement utilisés en biologie, plus particulièrement pour extraire sélectivement des macromolécules d'origine naturelle à partir d'un milieu d'extraction complexe. En effet, par fixation sur un support insoluble, inerte, d'un ligand qui sera reconnu spécifiquement par la substance biologique à extraire dans un milieu biologique donné, il est possible de retenir sélectivement ladite substance puis, par élution, de l'obtenir à un degré de pureté élevée. Cette purification effectuée selon le principe bien connu de la chromatographie d'affinité, présente un grand 20 intérêt pour obtenir des molécules aussi diverses que des anticorps, des enzymes, des inhibiteurs d'enzymes, des lectines, des récepteurs hormonaux et des acides nucléiques. Il est cependant nécessaire de disposer de supports ne donnant pas lieu à des fixations non spécifiques, dues 25 par exemple à des liaisons de type hydrophobe ou ionique, pouvant être substituées, quantitativement et de manière reproductible par un ligand et présentant les qualités requises pour une application donnée. Ainsi, pour les nombreuses utilisations nécessitant 30 la mise en contact des conjugués avec le sang, on mesurera l'intérêt de disposer de supports hémocompatibles. Outre ces qualité, on conçoit que pour des utilisations à grande échelle, il est important de disposer de conjugués de faible coût de revient. Or, les supports proposes à ce jour pour l'élabora- tion de tels conjugués ne répondent pas de manière totalement satisfaisante aux diverses exigences exprimées cidessus, en particulier au niveau des problèmes de la spéci-ficité de la fixation des macromolécules à retenir de celui de l'hémocompatibilité et du prix de revient. Les travaux des inventeurs dans ce domaine les ont amenés à étudier les possibilités d'utilisation de divers supports, plus spécialement, ceux du type supports greffés. De tels supports sont décrits dans la demande de brevet FR n 82 17 315 du 15 10 1982, au nom du COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE. Il s'agit de supports particulaires greffés en surface, c'est-a-dire obtenus par greffage sur des particules d'un polymère insoluble de molécules insaturées capables de se polymériser et portant une fonction organique substituable du type allylamine, acrylamide ou acide acrylique. D'une manière générale, les particules de copolymère sont insolubles dans la plupart des solvants et notamment dans l'eau et les solutions aqueuses Elles sont 20 inertes dans les conditions de mise en oeuvre et possèdent un taux de gonflement faible, une densité supérieure à l'unité, une bonne tenue dimensionnelle sous pression et une bonne résistance à l'écrasement. A l'étude de ces supports, en vue plus spécialement 25 de réaliser des immunoabsorbants hémocompatibles présentant une forte capacité d'absorbtion très spécifique vis à vis des anticorps anti-groupes sanguins A et B,immunoabsorbants portant le déterminant trisaccharidique responsable de l'antigénicité du groupe sanguin A ou celui du groupe B, il 30 est apparu que seuls certains d'entre eux étaient utilisables Les travaux effectués ont alors montré qu'en modifiant leur groupe fonctionnel terminal, les motifs greffés de ces supports pouvaient être utilisés pour former en partie le bras espaçant le ligand du support, la nécessité de ce bras 35 étant bien connue en chromatographie d'affinité. Les résultats obtenus concernant ces immunoabsorbants ont ensuite amené à développer, par couplage, avec ou sans bras additionnels, sur ces supports, de nouveaux conjugués renfermant des substances biologiques comportant comme ces déterminants des motifs de glucosaminoglucuroglycanes, c'est-à-dire des motifs sucres aminés du type glucosamine et/ou des motifs acide uronique, conjugués élaborés à partir de supports greffés et de ligands à activité biologique. Elle vise plus spécialement à fournir des conjugués de ce type hémocompabtbles et possédant des capacités d'absorption spécifique élevée. L'invention vise également à fournir un procédé de préparation de ces conjugués de mise en oeuvre aisée. Elle vise, en outre, les applications biologiques de ces conjugués en particulier, dans des opérations d'épuration sanguine et de purification de substances biologiques. Les conjugués de l'invention sont caractérisés en ce qu'ils sont élaborés à partir de supports greffés tels qu','évoqués ci-dessus et d'une molécule fixée de façon covalente au support, possédant une activité biologique Cette molécule fixée renferme au moins un motif saccharidique ou une structure plus complexe du type des glucosaminoglucuroglycanes et est choisie en particulier, parmi les détermi25 nants antigéniques de groupe sanguin, l'héparine, des substrats biologiques, tels que des cellules ou des membranes cellulaires, en particulier, des stromas d'érythrocytes, ou la N-acétylglusosamine. La molécule en question est reliée le cas échéant, 30 au support par l'intermédiaire d'une chaine jouant le r 8 le de bras espaceur Ce bras peut être formé à l'aide, d'une part, des motifs du monomère greffé sur le support et, d'autre part, de la molécule considérée et/ou allongé ou fourni par un composé chimique mis en oeuvre pour le 35 couplage. 2553518 ' Ces conjugués permettent de retenir avec une haute spécificité, à partir d'un milieu complexe et hétérogène, les substances ayant une affinité pour la molécule fixée en question. Il est également possible, si on le souhaite de récupérer, par exemple, par élution, la substance fixée que l'on obtient à un degré de pureté élevée. Selon une disposition préférée de l'invention, le bras espaceur comporte un groupe hydrazide Ce groupe est 10 avantageusement obtenu directement à partir de supports greffés à l'aide de motifs monomères à fonction acrylamide, par transformation en fonction acrylhydrazide. Selon une autre disposition préférée, avantageusement utilisée en combinaison avec celle qui précède, le taux 15 de greffage des supports entrant dans la constitution des conjugués est de l'ordre d'environ moins de 10 %, en particulier, d'environ moins de 7 % Des taux de greffages préférés, en particulier, avec des motifs acrylamide sont de l'ordre de 1 à 5 X plus spécialement voisins de 2 à 3 %. 20 D'une manière générale, les conjugués résultants sont avantageusement hémocompatibles ce qui permet d'éviter des fixations non spécifiques et/ou des perturbations biologiques dans des applications pour des épurations sanguines, avec restitution du milieu épuré. Des conjugués préférés à cet égard renferment, comme matière polymère de base constituant le support, du polychlorure de vinyle ou PVC. Un groupe préféré de conjugués de l'invention, utilisable comme immunoabsorbant, comprend, comme molécule 30 fixée, un déterminant antigénique de groupe sanguin. Des conjugués préférés renfermant le déterminant antigénique B répondent à la structure a. HOH^HO OH HO HO avec N représentant un nombre de à et X représentant le restant du bras fourni par le support greffé et ce support 15 de base luimême. D'autres conjugués préférés répondent à la même structure mais comportent le déterminant antigénique A. Dans un autre groupe préféré de conjugués de l'invention, la molécule fixée est formée par l'héparine De tels 20 produits sont particulièrement intéressants pour effectuer, à partir du sang, plus spécialement des épurations de certains types de lipoprotéines, en particulier de LDL (lipoprotéines à faible densité). Dans ces conjugués, l'héparine peut être fixée directement sur le support ou par l'intermédiaire d'un bras. Des bras du type diaminohexane s'avèrent appropriés. Un autre groupe de conjugués renferme des substrats biologiques tels que des stromas d'érythrocytes. Ces conjugués permettent, notamment, d'effectuer des 30 épurations et vivo dans un contexte pathologique lié à la présence d'anticorps reconnaissant des antigènes de groupe sanguin. Dans un autre groupe préféré présentant un grand intérêt pour la purification de lectines ou de substances, telles que les enzymes glycolytiques, dotées d'une affinité spécifique pour la N-ac&tyl gluco- 355351 t samine ou un autre motif saccharidique, l'haptène fixé sur le support est constitué par la N-acétyl glucosamine ou le motif saccharidique. Des conjugués préférés de ce groupe répondent à la structure b. OH o %O(CH 2)OTCO NH-WI-C (CH 1) j X _H Ac A dans laquelle n' est un nombre de 2 à 8, Ac représente le groupe acétyle et X est tel que défini ci-dessus. Les conjugués de l'invention sont préparés par mise 15 en contact avec le support greffé, avantageusement activé selon les techniques classiques, et le cas échéant après avoir subi un traitement afin de modifier les groupes fonctionnels en bout de chaîne. Pour la préparation des conjugués renfermant un déterminant antigénique de groupe sanguin, on a avantageusement recours à un support greffé à l'aide de motifs acrylamide puis soumis à une hydrazinolyse afin de former un groupement acrylhydrazide. L'hydrazine n'ayant pas réagi est éliminée également 25 par lavage. *Le support ainsi modifié est directement utilisable pour le couplage avec un dérivé approprié de déterminant antigénique. Un tel support est avantageusement hémocompatible et par ailleurs ne donne pas lieu à des absorptions non spécifiques. On peut l'utiliser dans des systèmes avec restitution du milieu biologique (plasma sanguin) après épuration externe. Grâce à cette modification de la fonctionnalité du polynmre greffé, à la fois le support et le déterminant antigénique parti- cipent à la formation du bras de couplage qui doit assurer un espacement entre les deux entités du conjugué. Le dérivé du déterminant antigénique comprend alors conformément à l'invention une chaine terminée par une fonction carboxyle de formule O (CH 2)n-COOH dans laquelle N est avantageusement un nombre de 2 à 4. Le couplage est réalisé de manière progressive, 10 sous agitation, de préférence à température ambiante. Le dérivé du déterminant antigénique mis en oeuvre est au préalable avantageusement active. Des solvants du type du diméthylformamide DMF constituent des milieux appropriés. Avantageusement, on utilise des quantités équimolaires de déterminant antigénique, de N-méthylmorpholine et de chloroformiate d'alkyle. Compte-tenu de l'hétérogénéité du milieu réactionnel et de la forte réactivité chimique des agents couplants, il apparaît souhaitable d'utiliser un volume de milieu d'activation équivalent à celui du support humide. De plus, il est souhaitable de soumettre le support hydrazide à un dégazage avant d'effectuer le couplage. Les déterminants antigéniques A ou B comportant une 25 chaîne de substitution à terminaison carboxyle ci-dessus constituent des produits nouveaux et, en tant que tels, entrent également dans le cadre de l'invention. Ces dérivés sont avantageusement obtenus à partir des dérivés correspondants dans lesquels tous les groupes -OH sont bloqués par des groupes protecteurs du type benzyle, benzoyle, acétyle, ou pour deux grouperents voisins benzylidène et la chaîne de substitution est constituée par un groupe -O-(CH 2) n-l OH Conformément à un mode préféré de réalisation de l'invention, ces dérivés sont alors soumis à un traitement d'oxydation puis d'hydrogénation et de saponification. La réaction d'oxydation est avantageusement réalisée à l'aide d'un agent oxydant tel que l'anhydride chromique Cette étape est avantageusement réalisée à température ambiante dans un milieu solvant du type de ceux renfermant en mélange le dichlorométhane et la pyridine. La chaîne à terminaison aldéhyde qui se forme intermédiairement est transformée en chaîne -O-(CH 2)2CH=CH COO Md sous l'action d'un traitement du-type de celui effectué à l'aide du réactif de Wittig; Dans ce cas, la réaction est réalisée à une température voisine de 100 C notamment de 90 C. La réaction d'hydrogénation est avantageusement effectuée en présence de catalyseur, ce qui permet de libérer les groupes -OH de leurs groupements protecteurs hydrogénolysables et de transformer la chaine de substitution en groupe O-(CH 2)n-COO Me. Par saponification de l'ester méthylique, on obtient alors la chaîne à terminaison carboxyle recherchée. 20 Les conjugués renfermant des stromas d'érythrocytes sont avantageusement préparés par mise en contact d'un support greffé préalablement lavé et activé par le glutaraldéhyde et des stromas, égalemnt soumis à un prélavage. Le couplage est de préférence réalisé à base température plus spécialement entre O et 10 C environ, avantageusement à environ 4 C. Les groupes fonctionnels libres éventuellement présents sur le support peuvent être bloqués si nécessaire à l'aide de réactifs appropriés. Des supports du type PVC-acrylamide ou PVC-acide acrylique permettent d'obtenir des conjugués satisfaisants au regard, en particulier, de leur spécificité d'absorption, les supports hémocompatibles, plus spécialement ceux comportant des motifs acrylamide étanb préférés dans les applications pour des épurations sanguines. D'autres conjugués de l'inventiondu type de ceux. renfermant un dérivé de N-acétylglucosamine fixé sur un support greffé sont obtenus par couplage sur le support active d'un dérivé approprié de la N-acétylglucos-d',neo Selon un mrde préféré de réalisation de l'invention, on utilise un support greffé à l'aide de motifs acrylamide avantageusement à raison d'environ noins de 10 %, notamment de 1 à 7 %, ces motifs 10 étant soumis à un traitement d'hydrazinolyse camme indiqué ci-dessus afin de former des groupes acrylhydrazide. Le dérivé de N-acétyl glucosamine comporte um bras de substitution avantageusement en position 1, à terminalson carboxyle. Comme indiqué ci-dessus, les conjugués de l'invention présentent des capacités d'absorption hautement spécifiques qui leur confàrent un grand intérêt pour de nombreuses applications biologiques. Ils sont utilisables, en particulier, comme immunoabsorbants pour épurer le plasma des substances reconnaissant spécifiquement l'haptène ou le ligand des conjugués. Ils permettent ainsi d'effectuer des épurations thérapeutiques dans un contexte pathologique. L'utilisation d' immunoabsorbants renfermant de 1 'héparine permet, par ailleurs, d'éliminer sélectivement comnue déjà indiqué des lipoprotéines LDL. Les conjugués ayant une activité de groupe sanguin par l'internédiaire des stromas ou des oligosaccharides fixés, et ceux comportant des oligosaccharides tels que la N-acétylglucosamnine, permettent l'obtention de réactifs biologiques spécifiques, utilisables pour le typage des groupes sanguins (Rhésus A,B,O et autres), par exemple, par agglutination, 31 l'étude structurale de membranes cellulaires normales ou transformées, la séparation et/ou l'identification de cellules lymphotateuses, 1 'analyse et la purification de glycoproteines et de polysaccharides. EXEMPLE 1: Préparation d'un conjugué renfermant le déterminant antigénique du groupe sanguin B fixé sur un support polychlorure de vinyle-polyacrylarrtde. Pour préparer ce conjugué, on met en oeuvre: _ d'une part un derive du trisaccharide B de formus Lj: OH FiFi ror FOH HO t O o Ho AC CO Of OH CH 30 ( 1) HO HO H HO dans laquelle le symbole COOH représente une chafne - / COH d'autre part, un supp -rt répondant aux 10 caractéristiques suivantes: taux de greffage en acrylamide en poids: 12,5 %(ce qui représente une teneur de 1, 86 mmole d'équivalent amidé par gramme de gel, soit la capacité potentielle de couplage au gel); taux de greffage en acrylamide dosé: 2, 35 %; taux de gonflement dans l'eau ( 25 C): 4,25 %; volume spécifique: 2,2 ml/g. Cette préparation est effectuée selon les lesétapes a et b suivantes: a hydranolyse du support PVC-aciylamide b couplage du trisaccharide 1 sur le support PVC-acrylhydrazide On réalise chacune de ces étapes comme suit: a hydrazinolyse On lave plusieurs fois à l'eau distillée un échantillon de support Après chaque lavage, on laisse le gel sédimenteret on laisse décanter la partie surnageante Le gel lavé est laissé dans l'eau durant 24 heures. On introduit 5,5 ml ( 2,5 g) de gel ainsi traité dans un réacteur en présence d'une solution aqueuse 12 M d'hydrazine. Le mélange est soumis à agitation durant 24 h à température ambiante à l'aide d'un turbula; puis est filtré On effectue ensuite plusieurs lavages avec une solution de Na Cl 0,2 M jusqu'à l'absence d'hydrazine libre On vérifie l'absence d'hydrazine dans les éluats de lavage par addition d'une solution aqueuse de trinitrobenzènesulfonate à 3 % (on ne doit pas obtenir de coloration rouge). Le gel est ensuite rincé plusieurs fois à l'eau distillée. b couplage du trisaccharide 1 sur le support Le gel hydrazide est préalablement dégazé. On solubilise 46,75 pmoles du trisaccharide 1 dans 5,5 ml de DMF anhydre en présence de 6,75 "moles (ô 6 ul) de N-méthyl-morpholine à -15 C. On ajoute 46,75 pmoles (ô 6,u 11) de chloroformniate d'isobutyle Le mélange est incubé pendant 5 mn à -15 C puis ajouté à 2,5 g (soit 5,5 ml) de support PVChydrazide rincé, contenu dans le réacteur. La suspension est mise en agitation rotative 30 pendant 30 mn à température ambiante. On lave le mélange à l'aide de 3 volumes de tampon borate 0,2 M (p H 8) de façon à éliminer H Cl formé Le gel est ensuite rincé à l'eau distillée jusqu'à neutralité de l'éluat. On le conserve en suspension dans l'eau à 40 C et à l'abri de la lumière pour éviter le développement bactérien à température ordi naire et les réactions d'oxydation dues à la lumière. On obtient une fixation de 5,55 ymole de trisaccharide 1 par gramme de support. Dans un autre essai, en utilisant 31,17)moles de trisaccharide 1 par gramme de gel, on obtient une fixation de 4,13 lmole/gramme de gel. L'étude de l'absorption spécifique du conjugué trisaccharide-support contenant 5,5,moles de trisaccharide par gramme de gel vis-à-vis d'antisérum anti-B montre une absorption de 100 % d'anti-B Les essais ont été réalisés en tubes sur lml de conjugué en utilisant 2 ml 15 d'anti-B (CNT 55609, titre C 50 = 15,3) et 2 ml d'anti-A (CNTS 4941, titre C 50 = 14,2) Comme indiqué ci-dessus, l'absorption spécifique des anti-B s'élève à 100 % L'absorption non spécifique d'anti-A est inférieure à 3 %. Les résultats obtenus montrent la spécificité d'absorption du conjugué de l'invention vis-à-vis d'anticorps anti-B. D'autres tests ont permis de vérifier l'absence d'absorption non spécifique sur les gels hydrazides non greffés. L'invention fournit donc un système immunoabsorbant capable d'absorber sélectivement les anticorps dirigés contre le déterminant antigénique correspondant au groupe sanguin de type B présent dans un sérum. En opérant comme décrit précédemment, mais en utilisant 30 à la place de la structure trisaccharidique du déterminant antigénique B la structure saccharidique du déterminant antigénique A, on obtient des immunoabsorbants capables d'absorber à 100 % les anticorps anti-groupe sanguin de type A. Ces systèmes d'immunoabsorbants constituent donc un outil très précieux 'pour la transfusion sanguine en particalier pour l 'obtention de composes permettant le typage spécifique de groupes sanguins ABO, Rhbésus et autres. EXEMPLE 2: Préparation du trisaccha-ide de formule 1 Le trisaecharide 1, mis en oeuvre pour la préparation du conjugué décrit dans l'exemple précédent est avantageusement obtenu à partir du trisaccharide de 10 formule( 2) O Bn 2 Bn O @ ( 2)" Bn O dans laquelle O représente un groupe -C 6 H 5 et Bn un groupe benzyle. La synthèse du trisaccharide 2 est rapportée dans l'exemple 3 de la demande de premier certificat d'addition NO 80 07614 à la demande de brevet FR N 78 10558, ces demandes ayant été déposées respectivement le 3 avril 1980 et le 10 avril 1978 au nom de 1 ' Agence Nationale de Valorisation de la Recherche. A partir du trisaccharide 2, on effectue les étapes à X suivantes pour obtenir le trisaccharide 1. : oxydation du trisaccharide 2 ce qui conduit à l'obtention d'une chaîne CH 2-CH 2-CH = CH-COOCH 3 à la place du groupe hydroxypropyle en position 1 du motif galactopyranose intermediaire : hydrogénation du trisaccharide résultant ce qui permet de libérer les groupes -OH des motifs saccharidiques et de conduire à une chaîne de substitution -O-(CH 2)4COOCH 3 dans la position 1 évoquée ci-dessus; : saponification du trisaccharide hydrogéné pour transformer le groupe ester de la chaîne de substitution en groupe acide. Ces étapes sont réalisées comme suit: 10 oxydation Sous agitation, à la température ambiante, on prépare un mélange de 15 ml de dichlorométhane, de 0,644 ml de pyridine et de 400 mg d'anhydride chromique 15 Cr O 3. Le mélange réactionnel est soumis à agitation durant 20 mn et on ajoute alors en une seule fois une solution de 633 mg du dérivé 2 dans 5 ml de dichlorométhane. Après agitation durant 20 mn à la température ambiante, on extrait le mélange réactionnel avec du chloroforme ( 4 fois 20 ml). La phase organique est lavée avec une solution de bicarbonate de sodium saturée, avec de l'eau puis séchée 25 sur sulfate de sodium et évaporée. Le résidu est élué sur une colonne de silice ( 10 g) à l'aide d'un mélange acétate d'éthyle-hexane 3: 1 pour donner 576 mg d'aldéhyde,(rendement 91 % à partir de l'alcool) qui est immédiatement engagé 30 dans la réaction suivante. L'aldéhyde est dissous dans 15 ml de benzène anhydre et ajouté à 900 C en présence du réactif de Wittig (C 6 H 5)3 P Z CH-COOCH 3 pendant 2 h 30. Le mélange est ensuite refroidi et évaporé à sec. Le produit est élué sur une colonne de gel de silice ( 50 g) àaa'aide d'un mélange hexane-acétate d'éthyle 4: 3 pour donner le composé insaturé renfermant la chaîne de substitution -(CH 2)2-CH=CH-COOCH 3. On obtient 524 mg de produit ee qui représente un rendement de 80 % par rapport à l'alcool de départ. Le produit a un PF 152-1530 C et un pouvoir rotatoire l j 20 C égal à -3 dans le chloroforme. Le spectre RMN et l'analyse centésimale sont en accord avec la structure attendue. hydrogénation On ajoute une solution de 440 mg de trisaccharide dans 20 ml de méthanol sous hydrogène en présence de palladium sur charbon à 10 % 400 mg. Après 48 h le catalyseur est essoré et le filtrat est évaporé pour donner le trisaccharide libre 188 mg 93 % sous forme d'une poudre blanche qui se décompose entre 110 et 114 Le spectre de RMN et l'analyse centésimale sont en accord avec la structure attendue. saponification 53 mg de produit sont purifiés sur une colonne de silice 60 G par élution avec un mélange CHC 13/CH 30 H/CH 3 COOH: 1/1/0,1. Les éluats sont concentrés puis lyophilisés dans CH 3-COOH On recueille 38 mg de produit qu'on redissout dans 0,5 ml d'eau Après percolation sur résine AG 50 ( 5 ml)WX 2 dans l'eau, on effectue une lyophisation On récupère 35 mg ( 58 pmoles) de produit, 20 mg du produit purifié ( 33,2 pmoles) en solution dans 0,5 ml de méthanol sont incubés pendant 24 heures à température ordinaire en presence d'un volume de Na OH 0,1 N On neutralise par la résine DOWEX 50 H+ On filtre et on effectue plusieurs lavages à l'eau On concentre a sec le mélange réactionnel puis on le redissout dans l'eau et on le soumet à un traitement d'ultrafiltration puis à une lyophilisation On obtient 20 mg de produit; Caractéristiques analytiques: détermination de la pureté chimique par analyse es chromatographie phase gazeuse (méthode modifiée de lamp et col,1963): Pureté: 100 % Rapport en nombre de motifs galactose au nombre de 10 motifs fucose: 2, 013. Exemple 3: Fixation de stromas d'érythcocytes sur un support PUC-acide acrylique (taux de greffage È) Une fixation irréversible de stromas d'érythrocytes humains sur un support PVO-acide acrylique est réalisée 15 dans les conditions ci-dessous: Les stromas lyophilisés sont préparés selon la technologie de Faure A, Caron M, Leroy MH, Duval D, et Segard J, in Separation of cells and subcellular elémentsed Peeters, Pergamon Press N Y ( 1979), p 99. Avant utilisation, ils sont dissous sous agitation puis lavés en saline à basse force ionique. Les microbilles greffées et lavées ( 600 mg) sont mises en suspension dans 15 ml d'une solution de 1-cyclohexyl-3-( 2-morpholinoéthyl) carbodiimide-métho-p25 toluène-sulfonate 95 % à lmg/ml et laissées sous agitation à température ambiante pendant 1 h. Les stromas lavés et décantés équivalant à 50 mg de stromas secs sont ajoutés à la suspension des microbilles du support traitées àla carbodiimide. 30 L'ensemble est soumis à une agitation rotative à + 40 C pendant une vingtaine d'heures Les stromas non fixés sont éliminés par sédimentation et décantation des surnageants et 3 lavages avec Na Cl 0,15 M. Le traitement à l'éthanolamine ( 1 M en tampon bicarbonate 0,1 M, Na Cl 0,15 M, p H 9,0) est pratiqué en flacons de verre à + 4 C pendant 1 heure Après lavages dans Na Ci 0,15 M, les microbilles sont conservées à + 40 C en tampons PBS, tween 1 %, albumine bovine 1 %, Na N 3 0,5 %o, Exemple 4: Etude de l'incidence du taux de greffage sur la fixation des stromas et sur l'absorbption des anticorps. Des quantités identiques ( 600 mg) de microbilles greffées à 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 2,7 %, 5 %, 7,2 % en acide acrylique puis activées par la carbodiimide (comme décrit dans l'exemple précédent) ont été parallèlement traitées avec l'équivalent de 10,50, 100 mg 15 de stromas secs, de phénotypes AVR R 2 Les tests d'absorption de lml d'anti-sérum anti-A titrant manuellement le 64 ème ont été pratiqués sur mg de ces différents lots de billes traitées et recouvertes de stromas. L'incubation est réalisée à température ambiante pendant 1 h puis les surnageants, récupérés par centrifugation, sont testés selon la technique de Ropars C, Muller A, Hurel C et Leblanc J, Blood transfusion and immunohaemat XXIV N 1 ( 1981). Les résultats montrent que: 1 ) dans la série des microbilles traitées avec 10 mg de stromas pour 600 mg de billes, le pourcentage d'absorption d'activité anti-A s'échelonne de 80 % pour unrttaux de greffage de 0,4 %, jusqu'à 90 % pour 30 un taux de greffage de 7,2 %. 2 ) Dans les séries traitées par 50 mg et mg de stromas, le pourcentage d'absorption est compris entre 88 et 93 % lorsque le taux de greffage est égal ou supérieur à 0,4 % en acide acrylique, Les tests d'absorption réalisés dans les mêmes conditions avec un anti-sérum anti-B montre que 95 à % de l'activité anti-B sont retrouvées, dans les surnageants d'incubation. EXEMPLE 5: Fixation spécifique d'anti-corps anti-A sur une colonne de chromatographie. On utilise un support PVC greffé à 2,7 % en acide acrylique sur lequel des stromas lyophilisés A 1, Ra et R 2, sont fixés dans les conditions opératoires de l'exemple 3 La colonne (diamètre 2,7 cm) est remplie avec 100 ml de support -stromas A 1 correspondant à environ 70 g de support humide sur lequel 3 g de stromas sont théoriquement fixés Après équilibrage et lavages de la colonne au PBS, on introduit un échantillon constitué par 300 cm 3 d'albumine humaine d'anti-A et d'anti-B titrant 1 132 ème en technique manuelle tube centrifugation vis-à-vis de globules rouges A 1 et B. A la sortie de colonne, on récupère intégralement l'activité anti-B et en fin de pic, une faible activité anti-A (titrant 1/4) correspondant à un excès d'activité anti-A déposé par rapport aux capacités de fixation de la colonne Dans ces conditions opératoires 82 % de l'activité anti-A sont absorbés sur la colonne. Le lavage de la colonne au PBS est poursuivi jusqu'à 25 l'obtention d'une absorption nulle à 280 nm. L'élution de l'anti-A fixé sur le support est obtenue à p H 2,8 en tampon glycine L'éluatanti-A testé après neutralisation n'a pas d'activité anti-B. EXEMPLE 6: Purification d'une lectine de triticum vulgaris à l'aide d'un conjugué de l'invention. On utilise une lectine de triticum vulgaris c'est-àdire de germe de blé (wheat germ agglutinin ou WGA). Le conjugué mis en oeuvre est obtenu par couplage, selon le procédé de l'exemple 1 d'un support PCV greffé avec des motifs acrylamide puis soumis à une réaction d'hydrazinolyse à raison de 2,25 % avec un dérivé de N-acétyl glucosamine de formule OH O ON-(CH 2)-COO H HA Sur une petite colonne contenant lcm 3 de conjugué activé, on dépose un échantillon de 0,3 ml de lectine brute de WGA Après 5 minutes de contact à température ambiante, la colonne est lavée par du tampon Na CI, phosphate, p H 7,2 à un débit de 1 ml/mn. Dans ces conditions 69 % de l'activité WGA testée par 20 agglutination des mématies humaines, sont fixés sur la colonne Ceci correspond à 2,1 mg de proteine WGA fixée. Par passage d'une solution de N-acétylglucosamine O,l M, a travers la colonne, on élue 95,5 % de l'activité fixée. L'activité restante est éluée par passage d'un tampon glycine 25 O,2 M, Na Cl 0,15 M, p H 2,8. Le complexe lectine WGA-N-acétylglucosamine est déplacé par dialyse exhaustive contre du tampon PBS, ce qui permet de récupérer la lectine sous une forme de pureté élevée. EXEMPLE 7: Purification de la lectine Ulex II. 30 On utilise le conjugué de l'exemple 6. Sur une colonne renfermant 1 cm 3 de conjugué, on dépose 6 ml d'un extrait aqueux brut d'Ulex Europaeus stabilisé à p H 6,6 et ayant un titre de 1/64 en tube à 22 C vis-à-vis d'hématies A 1. _ 1 Par rinçagede la colonne avec Na Cl 0,15 M tamponné à p H 7,2,on récupère lafractionprésentantunpicabsrbntà 280 nm Cette fraction possède une spécificité anti-H et correspond à la lectine Ulex I Elle agglutine les globules rouges humains dans l'ordre d'agglutination décroissante: 0, B,A 1 Cette activité agglutinante est inhibée par le fucose. Après passage d'une solution de Na Cl 2 M, la colonne est éluée par une solution de N-acétylglu10 cosamine O; 1 M puis avec un tampon gly cine 0, 2 M, Na Cl, 0,15 M, p H 2,8 L'ensemble de ces deux éluats représente 7 mg de protéine Ils agglutinent les hématies humaines indépendamment du groupe ABO Une agglutination totale observée avec l'éluat à 0,75 mg/ml est complè15 tement inhibée par la N-Acétylglucosamine 0,125 M finale. Ces deux dernières fractions éluées représentent la lectine Ulex II. Les exemples 6 et 7 montrent que toutes les lectines de spécificité (Nacétylglucosamine)npeuvent être purifiées à l'aide des conjugués de l'invention,en particulier, les lectines de Slanum tuberosum (STA), de Laburnum alpinum, de Bandeirea simplicifolia (B S II) EXEMPLES: Préparation de conjugués hémocompatibles à partir d'héparine et d'un support de PVC comportant 3,1 % de groupes acrylamide fixés On procède tout d'abord à l'activation du support puis à la fixation d'héparine sur le support soit par l'intermédiaire d'un bras soit directement. 1 fixation d'héparine par l'intermédiaire d'un bras constitué par du diaminohexane activation du support. Après lavage et équilibrage du support avec un tampon phosphate 0,5 M p H 7,5, on ajoute aux fins d'activation du glutaraldéhyde à raison de 5 ml pour 5 g de support. Après agitation durant 16 h à 37 C, on lave le support avec de l'eau jusqu'à l'obtention d'une densité optique 15 égale à O à 280 nm. Le dosage des fonctions activées donne une valeur de 364 u M par gramme de support sec. * fixation du bras On ajoute 4 g de support sec et 8 ml de 1,6 diaminohexane 20 à 20 mg/ml de tampon phosphate 0,5 M, p M 7,5, puis on soumet l'ensemble à agitation durant environ 14 h à + 4 C Le mélange est filtré puis le support est lavé à l'aide du tampon ci-dessus, puis d'un tampon phosphate 0,050 M contenant 0,5 M Na Cl, p H 7,5. Le taux de diaminohexane fixé est de 127 u M par gramme de support sec. condensation avec l'héparlne du support avec le bras On ajoute au support précédemment obtenu, comportant 1 30 le bras, 8 ml d'eau, 4 ml dhéparine à 20 mg/ml dans 420 et 100 mg de carboxyméthylcellulose. Le p H est maintenu à 5,5-5 pendant 1 heure Le mélange est soumis à agitation durant environ 14 h à + 4 C, puis filtré et lavé avec Na Cl 1 M. On obtient une fixation d'héparine de 5 mg par gramme de support 2 fixation directe d'héparine On lave 3 g de support de PVC greffé avec 3 ml d'eau et 3 mg d'hydrazine. Après une incubation d'l h à 50-C, on refroidit rapidement le mélange, puis on lave abondamment le support avec d el'eau Aux fins de diazotation, on ajoute successivement HC 1 0,5 N 10 puis on laisse sous agitation 5 mn dans puis on ajoute 70 mg/ml de nitrite de sodium en agitant ensuite 2 mn. Le mélange est filtré et le support ainsi activé est lavé. fixation d'héparine On ajoute 4 ml de solution d'héparine dans 50 mg/ml de tampon NH 4 C 1 3 M p H 9,5 à l'équivalent de 2 g de support sec active Après agitation du mélange durant environ 14 h à + 4 C-, le conjugué obtenu est 20 lavé à l'eau puis avec Na Cl 0,5 N. Le taux d'héparine fixée est de 12, 85 mg par gramme de support sec neutralisation des groupements actifs en excès On met en suspension le conjugué obtenu dans 2 ml 25 d'éthanolamine 1 M, p H 8. Apres une agitation de 16 h à 4 C, du mélange, on filtre et on lave le conjugué avec de l'eau, puis un tampon phosphate 0,1 M p H 8,4 contenant 0,5 M Na Cl, suivi d'un tampon acétate 0,1 M p H 4 contenant 0,5 M Na Cl. On conserve le conjugué dans du tampon phosphate 0,2 M p H 4,4 contenant 0,02 % d'azide de sodium. EXEMPLE 9: détermination de supports hémocompatibles Des supports comportant des taux différents d'acide acrylique ou groupes acrylamide greffés ont été testés sur des sangs humains en utilisant divers tests de coagulation (Temps de thrombine,(TT), Temps de Howel, (TH) Temps de Céphaline Kaolin, (TCK), Thromboélastogramme sur 30 plasma riche en plaquette, (TEG/PRP), et numérations plaquettaires). Les essais effectués avec les supports greffés à l'aide d emotifs monomères acrylamide ont montré une variation des effets en fonction des taux de greffage, ainsi qu'il ressort du tableau ci-dessous Les perturbations sont pratiquement négligeables pour des taux inférieurs à 10 % environ L'augmentation des taux de greffage entraine des modifications plus importantes. SANG Né 3 PQ T T T H T C K TEG PRP r k r + k amx TEMOIN eau phys 211 000 23 " 2 '30 56 " 31 10 41 60 Acide acrylamide 1 210 000 24 " 2 '30 56 " 27 8 35 60 PVC Acide acrylamide 16 % 219 000 27 " 2 ' 56 " 25 11 36 58 21 PVC 1 Acide acrylawide 33 O 194 000 34 " 2 '15 56 " 13 3 16 69 EXEMPLE 10: Préparation du dérivé de N-acétyl glucosamine de formule 3 On prépare ce dérivé par condensation, d'une part d'un dérivé d'oxazolidine de formule 4, elle-même obtenue selon la technique décrite par LEMIEUX et al dans J A C S ( 1975), volume 97, PP 4063-4069 à partir du chloro, 3,4,6-tri-0acétyl-2 acétamido 2 désoxy p -D glucopyranoside (ce produit étant à son tour obtenu selon la technique décrite par HORTON dans Methods in Carb Chem ( 1972), volume 4, pp 282-284) avec, d'autre part, un dérivé de l'acide azélaïque de formule 5, obtenu selon la méthode décrite par LEMIEUX et ai dans J.A C S ( 1975), volume 97, pp 4076-4083. La condensation entre ces deux produits est 15 effectuée selon une méthode modifiée par rapport à celle décrite par MATTA et al dans Carb Research ( 1976), volume 51, pp 215-222, en procédant comme suit. Sous atmosphère d'azote et conditions anhydres, on porte à reflux pendant 30 mn, 2 mmoles du composé 4 20 et 2,5 mmoles du composé 5, en solution dans 8 ml d'un mélange anhydre de nitrométhane et de toluène ( 1:1) en presence de 25 mg d'acide p-toluère sulfonique sec. L'analyse chromatographique est réallisée à 25 l'aide de mélanges chloroforme; méthanol ( 20:1), acétated'éthyle:hexane ( 8: 2), et éther-méthpnol 5: 5). A la fin de la réaction, on ajoute de la pyridine Sèche, puis on concentre à sec. Après solutilisation daas le chloroforme et plusieurs lavages à l'eau, on sèche 1 ? phase organique sur du sulfate de sodium, on concentre à sec, puis on purifie à l'aide de silice 60 G dans un mélan Se acétate d'éthyl-hexane ( 8:2) On obtient le produit de condensation de formule 6 avec un rendement ce 35 %. Afin d'obtenir le produit de formule 3 recherché, on soumet le dérivé 6 à l'2 ction de Na dans CH 30 H, ce qui permet de libérer les groupes hydroxyle et de transformer l'ester éthylique en ester méthylique, puis on soumet cet ester à l'action de Na OH en Présence de méthanol ce qui conduit à l'acide. Ces deux dernières etapes sont effectuées selon la méthode décrite par LESIEUX et ai dans J A C S. ( 1975) volume 97, pp 4076-4083. Les formules dont question ci-dessus sont les suivantes: O Ac O -(/ \ HOCH 2- REVENDICATION Nouveaux conjugués caractérisés en ce qu'ils sont élaborés à partir de supports greffés et d'une molécule fixée de façon covalente au support, possédant une activité biologique, cette molécule fixée renfermant au moins un motif saccharidique ou du type des glucosamino-glucuroglycanes et étant choisie en particulier parmi les déterminants antigéniques de groupe sanguin, l'héparine, des substrats 10 biologiques, tels que des cellules ou des membranes cellulaires, en particulier, des stromas d'érythro cytes ou la N-acétylglucosamine.