FR 2553100 A1 19850412 FR 8413916 A 19840911 255310 O La présente invention concerne de nouvelles préparations pour le traitement et la prévention de maladies autoimmunes, à base de substance immunogène, obtenue à partir de membranes de certaines lignées de cellules de lympho5 cytes autoimmuns, ou à base de cellules activées par la pression Elle a également pour objet un procédé de préparation du constituant cellulaire actif, ainsi que les compositions pharmaceutiques renfermant ce constituant. Les agents étiologiques des maladies autoimmunes 10 sont des lymphocytes endogènes qui attaquent les constituants normaux de l'individu La demanderesse a étudié la croissance de lignées cellulaires à longue vie, en particulier de lymphocytes T autoimmuns, qui provoquent un certain nombre de maladies autoimmunes expérimentales Les cultures 15 relativement pures ainsi obtenues, de cellules autoimmunes, ont facilité la recherche sur la pathogénèse, ont fait découvrir l'état messager de l'autoimmunisation et ont fourni également des moyens de vaccination et de traitement contre l'autoimmunisation. La présente invention se rapporte à de nouvelles préparations utilisables pour la prévention et le traitement des maladies autoimmunes, caractérisées en ce que leur constituant actif est formé de matières provenant de la membrane cellulaire de lymphocytes T autoimmuns spécifiques, ou de tels lymphocytes actives sous pression Elle concerne également un procédé d'obtention de ces substances à partir de lymphocytes, un procédé d'activation sous pression de ces lymphocytes, ainsi que les vaccins et préparations pharmaceutiques renfermant ces substances. Les maladies autoimmunes ont la caractéristique commune d'être provoquées par l'attaque du système immun contre les propres tissus de l'individu A la base de toutes les maladies autoimmunes, on trouve des lymphocytes autoimmunes qui reconnaissent spécifiquement les antigènes cibles particuliers des individus Parmi les maladies auto- immunes on peut citer l'arthrite rhumatoide, la sclérose en plaques, certaines formes de diabète sucré et la thyroidite ou goitre inflammatoire Jusqu'à présent, il n'existait pas de forme de traitement spécifique contre ces maladies. On a trouvé,dans le cadre de l'invention qu'il était possible de cultiver, en tant que lignées cellulaires à vie longue, des lymphocytes T, provoquant des maladies autoimmunes chez des animaux de laboratoire, notamment l'encéphalomyélite, l'arthrite et la thyroidite De telles cel10 lules se sont révélées des agents efficaces de vaccination contre ces maladies autoimmunes, spécifiques, ces lymphocytes étant atténués et injectés de manière à ne pas provoquer de maladies autoimmunes On a constaté que ces vaccinations étaient très efficaces et conféraient aux animaux 15 une immunité contre ces maladies, ou les rendaient moins sensibles, la maladie devenant beaucoup moins grave De plus, il a été montré que l'inoculation aux animaux de ces cellules constituait un traitement très efficace de la maladie. Les préparations pharmaceutiques selon la présente invention renferment, comme constituant actif, une substance de membrane provenant de lignées cellulaires autoimmunes T spécifiques, qui renferment certains récepteurs de cellule T. Le nouveau procédé selon l'invention, pour la production et l'isolation de cette substance de membrane, comprend l'exposition de tels lymphocytes-T à une forte pression hydrostatique, suivie d'une diminution progressive de la pression, ce qui a pour résultat une séparation de la substance de 30 membrane qui retient un degré élevé d'activité biologique. On peut également activer ces cellules par pression, en les soumettant à la pression hydrostatique, puis en abaissant peu-à-peu cette pression. Les conditions caractéristiques, mais non limita35 tives, pour la séparation de la substance active comprend 255310-0 des pressions de l'ordre de 500 à 1520 bars, la montée en pression se faisant par degrés en 5 minutes environ, le maintien de cette pression à son niveau supérieur pendant à 45 minutes, et sa diminution progressive sur 5 à 15 minutes. Ainsi, l'activation par la pression des cellules peut être obtenue par exemple, par soumission de celles-ci pendant 5 minutes environ, à une montée de 500 à 1000 bars, le maintien de cette pression pendant 5 minutes environ, suivi d'une diminution progressive d'une durée approximative de 5 minutes Alors il n'y a pratiquement pas de séparation, mais les cellules sont activées, probablement par un déplacement latéral des constituants de la membrane On peut utiliser comme constituants actifs des vaccins selon la présente invention, aussi bien la substance séparée, que les cellules activées par la pression; les cellules conservent leur pleine viabilité. Les substances, ainsi obtenues, comprennent approximativement 107 à 10 o 8 cellules activées, ou la substan20 ce provenant d'un nombre égal de cellules Pour la vaccination des humains, on utilise une quantité voisine de 0,01 à 3 mg de ces substances, c'est-à-dire protéine séparée ou cellule activée, l'injection étant répétée au bout de deux semaines environ. Ces immunisations s'avèrent efficaces pour la prévention et le traitement de certaines maladies autoimmunes. Les lymphocytes sont mis en suspension dans un tampon convenable, on introduit le tout dans un récipient à pression exempt de tout milieu gazeux, et la pression est 30 appliquée comme indiqué plus haut, à l'aide d'une presse de French. La suspension de cellules résultante est soumise à une centrifugation à environ 1500 tours/minute, puis la partie surnageante est elle-même soumise à une ultracentrifugation de 35 l'ordre de 100 000 g pendant environ 1 heure, afin de préci- piter les fragments de membrane Lorsque l'on prépare des cellules activées par la pression, celles-ci sont recueillies par centrifugation. Bases expérimentales -5 Des lignées de cellules T autoimmunes sont cultivées in vitro Au tableau I, sont indiqués trois maladies autoimmunes expérimentales, liées à ces lignées de lymphocyte-T On sait que l'encéphalomyélite autoimmune expérimentale {EAE) peut être activement induite dans des souches 10 génétiquement sensibles de rats,par immunisation de ceux-ci à la protéine de base de la myéline (BP) L'EAE se manifeste habituellement sous forme d'une maladie aigug, caractérisée par de la paralysie et de l'infiltration cellulaire dans la substance blanche du système nerveux central Les rats non 15 traités, habituellement, guérissent spontanément de l'EAE aiguë au bout de 2 ou 3 jours, et sont résistants aux essais ultérieurs faits pour leur conférer l'EAE aiguë L'EAE chronique ou récurrente peut être également induite dans certaines conditions, et cette maladie est similaire, sous 20 différents aspects, à la sclérose en plaques chez l'homme. La thyroidite autoimmune expérimentale (EAT) peut être induite chez des souris H-2 génétiquement sensibles, par immunisation de celles-ci à la thyroglobuline de souris (Tg) dans un adjuvant L'EAT se présente sous forme d'une inflam25 Ration chronique de la glande thyroïde Des souches de-souris résistantes à la lésion provoquée par EAT, peuvent cependant produire des titres élevés d'autoanticorps de Tg. EAT apparait être un type de thyroidite autoimmune (thyroldite de Hashimoto) qui n'est pas inhabituelle chez l'homme. 30 L'arthrite à l'adjuvant (AA) diffère de EAE et de EAT en ce qu'elle est induite chez les rats, par immunisation de ceuxnon ci/à un autoantigène défini, mais à des organismes-de Mycobacterium tuberculosis (Tb) dans de l'adjuvant complet de Freund (CFA) Environ 2 semaines après l'inoculation, les rats génétiquement sensibles présentent une polyarthrite sub- aig Uë, avec des caractéristiques qui rappellent celles que l'on observe dans l'arthrite rhumatoide chez l'homme On a suggéré que le collagène de type Il pouvait être l'autoantigène cible dans l'AA, car l'arthrite peut être induite par immunisation à cet antigène Cependant, une preuve récente indique que AA, et arthrite au collagène II, pouvaient être des entités séparées. Le tableau I illustre également le fait que des lésions autoimmunes similaires pouvaient être induites par inocula10 tion de cellules de lignée spécifiques de l'antigène Des détails concernant l'élaboration et le maintien de cellules de la lignée, et la production des maladies, ont été publiés. Le point principal du procédé consiste à inoculer aux animaux l'antigène de choix, et à sélectionner les cellules spécifiquement réactives par culture avec l'antigène de sélection, conjointement avec des cellules accessoires syngénéiques irradiées Les cellules accessoires présentant l'antigène doivent être syngénéiques, au moins en partie du complexe d'histocompatibilité majeure (MHC), afin de déclen20 cher la réponse prolifère des cellules de la lignée Les cellules de la lignée choisie sont alors cultivées dans un milieu conditionné, en l'absence d'antigène ou de cellules accessoires On a constaté que des lignées stables, capables d'induire des maladies autoimmunes, ont toutes des réactions positives avec les marqueurs de cellule-T en général (Thy 1 chez les souris ou W 3/13), et les marqueurs de type à retardement de cellules hypersensibles/assistantes (Lyt-1 ou W 3/25), avec peu ou pas de cellules positives pour la marque Lyt-2 ou OX 8 de cytotoxique/cellules suppresseur. 30 Aucune des cellules de la lignée n'a de réaction positive avec les marqueurs Ig Afin d'induire la maladie, la lignée de lymphocyteT doit être activée par incubation avec l'antigène spécifique des mitogènes de cellule-T, avant inoculation aux animaux receveurs Une inoculation unique d'aus35 si peu d'anti-BP, ou de cellules anti-Tg, que 104 105, 35 si peu d'anti-BP, ou de cellules anti-Tg, que 10 à 10, peut conduire en un temps relativement court aux signes cliniques et pathologiques d'EAE ou d'EAT marqué La production d'AA nécessite l'utilisation d'un plus grand nombre de cellules de la lignée ( 107) et une irradiation relative5 ment forte du receveur ( 750 R) Les receveurs doivent être syngénéiques avec les cellules de la lignée, en partie du MHC, pour la maladie à se manifester Les lésions autoimmunes caractéristiques sont accompagnées par une accumulation immunologiquement spécifique de cellules de la lignée dans 10 l'organe cible Aucune preuve, indiquant un rôle pour les autoanticorps dans la maladie produite par les cellules de la lignée delymphocyte-T, ne parait évidente. Les demandeurs ont également produit avec succès des cellules clonées d'encéphalomyélite ou d'arthrite; les clones 15 anti-BP se sont révélés quelque peu moins virulents que leurs lignées de départ, alors qu'un clone anti-Tb a été isolé, qui est beaucoup plus virulent que son produit de départ. Vaccination contre la maladie autoimmune L'utilisation de cellules de la lignée en tant que vaccins spécifiques, pour induire la résistance à la maladie autoimmune, est représentée dans le tableau II Les cellules de la lignée anti-BP, soumises à une irradiation, ou traitées avec du mitomycène C, ne se montrent plus capables de 25 produire EAE Cependant, une unique inoculation intraveineuse de ces cellules de lignée atténuée entraîne une résistance chez environ 65 % des rats induits activement par immunisation avec BP/CFA Au cours des expériences initiales, les rats étaient encore sensibles à i'EAE produite par 30 le transfert passif des cellules de lignée anti-BP, ce qui suggère que le mécanisme de résistance pouvait bien être moins efficace contre l'effet préformé de cellules que contre des cellules de différentiation Toutefois, on a observé récemment ce fait nouveau qu'il est possible d'empocher 35 l'EAE due à un transfert positif de cellules de la lignée, aussi bien que l'EAE active, en utilisant des cellules traitées par la pression Par contre, une unique inoculation intraveineuse de cellules de la lignée anti-Tg atténuée, non seulement inhibe complètement l'EAT active, induite par TG/CFA, mais empêche également l'EAT induite par inoculation de cellules de la lignée anti-Tg activée Ainsi, en principe, la résistance à la maladie autoimmune n'est pas limitée aux phases de début de différentiation, mais peut inclure la phase effectrice de la maladie. 10 Thérapie avec les protéines de la membrane Les cellules de la lignée autoimmune se sont révélées efficaces comme agents de prévention et de traitement de l'autoimmunité expérimentale Cette voie peut aider dans le traitement des maladies autoimmunes cliniques, pour les15 quelles il n'existe pas de mode spécifique de thérapie Bien qu'en clinique il soit plus important de traiter que de prévenir, il est possible que dans la pratique cette distinction ne soit pas critique Les maladies autoimmunes de conséquence grave, sont souvent progressives ou récurrentes, et 20 la prévention de la différentiation de nouvelles vagues de lymphocytes autoimmuns peut, en elle-même, constituer une thérapie efficace. La figure 1 illustre le soulagement de AA par une unique inoculation de cellules de la lignée Elle corres25 pond au traitement continu de l'arthrite par des cellules de la lignée En abcisse sont portés le nombre des jours,et en ordonnée la valeur moyenne de l'arthrite L'AA est induite chez 20 rats Lewis par inoculation de CFA 5 jours après l'accès d'arthrite clinique (flèche, au 16 ème jour), un grou30 pe de 10 rats est traité par une unique inoculation intraveineuse de cellules de la lignée anti-Tb activée (cercles pleins) Un second groupe de 10 rats est traité avec une lignée témoin sans rapport avec la précédente (cercles vides). La valeur moyenne de l'arthrite est déterminée comme décrit 35 dans I R- 1983-SCIENCE 219:56-58 On constate que les rats traités avec les cellules de la lignée spécifique sont moins sévèrement atteints et ont une rémission accélérée. Une autre étude consiste à identifier et à rendre accessibles les autoantigènes vis-à-vis desquels doi5 vent être sélectionnées les lignées de lymphocyte autoimmunes Dans de nombreux cas, les autoantigènes sont inconnus ou peuvent être en échantillon très limité Néanmoins, la structure de AA suggère qu'il doit être possible d'augmenter les lignées de cellule concernées en utilisant des mé10 langes d'antigènes mal définis, obtenus même à partir de sources étrangères Pourquoi, ou comment, des lymphocytes autoimmuns spécifiquement virulents se dégagent dans ces conditions, on ne le sait, mais c'est un fait. Il peut être avantageux d'effectuer la thérapie 15 avec de la substance subcellulaire provenant de cellules de la lignée, ou avec des cellules d'antigénicité accrue, et l'on a constaté que les protéines de la membrane pouvaient être utilisées de manière efficace Les protéines de membrane des cellules de la lignée sont préparées selon un nou20 veau procédé qui a été antérieurement appliqué à l'isolement des antigènes de groupe sanguin à partir des êrythrocytes humains Ce procédé est basé sur l'hypothèse que la position d'équilibre des protéines de la membrane est déplacée vers le domaine aqueux, du fait de la rigidisation de la bi-couche lipidique de la membrane, et les protéines se séparent aux viscosités extrêmes des lipides. En principe, chaque protéine constitutive de membrane a un seuil défini de viscosité de lipide, à partir duquel elle se détache de la membrane. La manière la plus efficace pour obtenir une hyperrigidité des membranes consiste à appliquer-une pression hydrostatique ( 500 à 1500 bars), qui peut être accrue par un prétraitement avec du cholestérol Les cellules en général survivent à un tel traitement, et la substance qui se sépa35 re peut être fractionnée selon sa dimension, par centrifu- gation La substance qui subsiste dans la partie surnageante, après centrifugation à 100 000 g pendant 1 heure, peut être considérée comme étant constituée de protéines isolées ou de leurs petits agrégats Le précipité de cette centri5 fugation est constitué par des fragments de membranes et de larges agrégats de protéines Les protéines solubles de la membrane retiennent en général leur activité, contrairement aux protéines de membrane isolées par utilisation classique de détergents. La capacité d'imunisation contre les maladies autoimmunes est observée dans les fractions suivantes: (a) cellules activées par la pression, probablement à cause d'un réarrangement latéral et d'un déplacement vertical des récepteurs d'antigènes spécifiques; (b) les protéines solubles sépa15 rées; (c) les fragments de membrane. Le tableau III montre que les fractions de membrane, isolées par le procédé par pression, sont immunologiquement spécifiques de l'inhibition de la réaction des cellules de lignée autoimmune vis-à-vis de leur antigène particulier Par e20 xemple, la fraction de membrane obtenue à partir de la lignée anti-BP Zla, inhibe la réponse des cellules de la lignée Zla intacte, à BP; elle n'inhibe pas la réponse des cellules de la lignée A 3 produisant l'arthrite à leur antigène Inversement, la fraction de membrane obtenue à partir 25 des cellules A 2 produisant llarthrite, inhibent la réponse des cellules de la lignée A 2 intacte, mais pas celle des cellules de la lignée Zla Ces résultats indiquent que les fractions de membrane renferment des récepteurs biologiquement actifs, spécifiques des autoantigènes. La figure 2 montre les résultats d'une expérimentation au cours de laquelle on administre à des rats, à une semaine d'intervalle, deux doses, chacune de 0,60 gg, de fraction de membrane de cellules de la lignée Zla, obtenue par le procédé par pression; puis, deux semaines plus tard, 35 on confère l'EAE active à ces rats En abcisse sont portés le nombre de jours et en ordonnée la valeur clinique de la paralysie, 1 correspondant à douce, 2 à modérée et 3 à sérieuse Sur cette figure, les cercles pleins concernent les rats témoins et les cercles vides les rats d'essai On peut 5 constater que les rats traités avec la fraction de membrane souffrent de très faible paralysie par rapport aux rats témoins Ainsi, le déroulement de la maladie peut être notablement allégé par l'utilisation de fractions spécifiques de membrane Le tableau IV indique les résultats de la vac10 cination de rats avec des cellules de lignée anti-BP activées par la pression On peut constater que les rats, traités avec les cellules de la lignée témoin, sont sensibles à EAE, alors que les rats traités avec des cellules de la lignée spécifique anti-BP, activée par la pression, sont en15 tièrement résistants à l'EAE active Ils sont également résistants à l'EAE induite par des cellules de lignée anti-BP intacte (non montré). Exemples de maladies autoimmunes pouvant être traitées par des protéines de membrane de cellules de lignée autoimmune Maladies de lignées Antigène utilisé de cellules immunes pour sélectionner humaines T a) Protéine de base de la myéline Sclérose en plaques Sclérose en plaques b) Extrait brut du système 25 nerveux central 35 a) Thyroglobuline Thyroidite b) Extrait brut de la glande thyroïde Diabètes (Type I) Extrait de cellules des -lots a) Certaines bactéries Spondylite ankylosante Klebsiella (types spécifiques) b) Extrait brut d'articulations Arthrite rhumatolde Extrait brut d'articulations 1 1 EXEMPLE DE PREPARATION DE VACCIN Des cellules provenant d'une lignée de lymphocytes T, dirigée contre la protéine de base de la myéline, sont utilisées (lignée Zla) Ces cellules confèrent aux 5 rats l'encéphalite autoimmune expérimentale (EAE) 6 x 108 cellules, mises en suspension dans 2 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à p H 7 2 sont Dlacées dans une chambre à pression stérile Le couvercle est placé directement au-dessus de la solution, afin d'éliminer les bulles On applique progressivement la pression à l'aide d'une presse de French (en 15 minutes) pour atteindre 1013 bars et l'on maintient cette pression pendant 45 minutes Puis on la réduit lentement jusqu'à la pression atmosphérique, en 15 minutes On transfère les cellules dans 15 un tube à essai, on centrifuge à 1500 tours/minute, et l'on sépare le précipité La viabilité cellulaire, essayée par élimination du bleu trypan, est supérieure à 90 % La partie surnageante est alors ultracentrifugée à 100 000 g pendant 1 heure On recueille la partie surnageante, soit en20 viron 600 gg de protéines dans 2 ml de PBS, et on l'utilise pour les expérimentations fonctionnelles in vitro et in vivo, décrites ci-dessous. Au cours de l'expérimentation in vitro, des cellules de la lignée Zla sont induites pour proliférer par addi25 tion de leur antigène spécifique, 0,2 gg/ml de protéine de base de myéline La prolifération cellulaire est exprimée par comptages par minute de la thymidine radioactive incorporée L'addition de 30 gg/ml des protéines séparées (voir plus haut) aboutit à une réduction de 40 à 60 % de la proli30 fération cellulaire Lorsqu'on utilise 30 gg/ml de protéines séparées de cellules d'autres lignées T (y compris l'arthrite), on n'observe aucun effet surla prolifération cellulaire Les résultats caractéristiques d'une telle expérimentation sont rassemblés dans le tableau III, et indi35 quent que la substance, séparée grâce à la pression sur la surface cellulaire, comprend un récepteur spécifique de l'antigène inducteur Cette substance peut être utilisée pour immuniser contre le récepteur, ce qui a pour résultat une élimination partielle ou entière de la maladie autoimmune Une telle expérimentation est décrite ci-dessous. 5 Des rats sont d'abord préimmunisés à deux reprises, à une semaine d'intervalle, par inoculation de 0,5 gg de protéines solubles, séparées par pression de cellules de la lignée Zla Deux semaines plus tard, ces rats sont attaqués par de l'antigène BP dans de l'adjuvant Au bout de 14 10 jours tous les rats du groupe témoin présentent une EAE sérieure, alors que les rats prétraités ne manifestent qu'une forme douce d'EAE Sur la figure 2 sont représentées des courbes caractéristiques après attaque avec une dose encéphalitogène de BP De plus, le prétraitement de rats avec des protéines séparées par pression d'une lignée sans rapport (arthrite), n'a aucun effet sur le développement de EAE. TABLEAU I Maladies autoimmunes induites activement ou produites par des cellules de lignée de lymphocyte T autoimmune Maladie induite activement Maladie Espèce Organe Auto Immuni Période Processus cible antigène sation latente EAE* rat Matière BP BP/CFA 12 jours aigu blanche du SNC EAT souris Thyroide Th Tg/CFA 30 jours chronique AA rat Articula ? CFA 14 jours subaigu tions Maladie produite par des cellules de lignée Maladie Espèce Organe Antigène Inoculum Receveur Période Processus cible pour choisir cellulaire latente la lignée (jours) EAE* rat Matière B 4 EAE* rat blanche B 104-105 Intact 3 à 6 aigu blanche, BP du SNC 4 5 EAT souris Thyrolde Tg 10 -0 Intact 1 à 3 chronique AA rat Articula Tb 10 Irradié 5 à 10 subaigu tions * Abréviations utilisées dans les tableaux: AA = arthrite à l'adjuvant; BP = protéine de base de la myéline; CFA = adjuvant complet de Freund; SNC = système nerveux central; EAE = encéphalomyélite autoimmune expérimentale; EAT = thyroidite autoimmune expérimentale; IFA = adjuvant de Freund incomplet; Tb = organismes de Mycobacterium tuberculosis; Tg = thyroglobuline. w rn tn Ln L o c CD TABLEAU II Vaccination contre les maladies autoimmunes utilisant des cellules de lignée spécifique autoimmune Maladie Vaccin Résistance à la maladie Cellules de Traitement Activement Lignée Degré de lignée induite inocu résislée tance Anti-BP Irradia OUI non 60-70 % tion An i-T " rrri Il à,; r N 1 __ EAE EAT È Y LUU 1 CO Jpl U Vet, autoanticorps se développent ? complète AA Anti-Tb néant OUI Des rats ou des souris sont inoculés par voie intraveineuse avec des cellules de lignée activée (anti-BP, 5 x 106; antiTg, 5 x 106; anti-Tb, 2 x 107), certains d'entre-eux sont irradiés ( 1500 R) Des animaux témoins (non indiqués) sont inoculés avec des cellules de lignée dirigées contre des an20 tigènes sanszapport 2 à 4 semaines plus tard, on confère aux animaux les maladies autoimmunes actives - 30 TABLEAU III Inhibition par des fractions de membrane de la réponse prolifère des cellules de lignée spécifique Origine cellulaire Réponse prolifère à l'antigène de la fraction de spécifique membrane % d'inhibition de la lignée A 2 Zla A 2 39 O Zla O 50 Des fractions de membrane provenant de lignées de cellules A 2 (arthrite) et Zla (encéphalomyélite), sont obtenues par le procédé par pression ( 1013 bars), et on en inclut 50 Fg/ 35 ml dans les réponses prolifères à l'antigène spécifique des 15 cellulse de lignée intacte Le pourcentage d'inhibition est calculé en comparant la réponse en présence de la fraction de membrane obtenue à partir des cellules de la lignée spécifique, avec la réponse en présence de la fraction de membrane pour les cellules d'autre lignée. Des expérimentations, réalisées avec des cellules activées par la pression, donnent des résultats identiques. TABLEAU IV Vaccination contre EAE, utilisant des cellules de lignée anti-BP activée par la pression Traitement des rats EAE induite par immunisation avec des cellules de active avec BF/CFA lignée activée par la pression Incidence Intensité clinique Témoin 4/4 modérée à grave Anti-BP 0/4 néant Des rats Lewis sont inoculés par voie intrapéritonéale avec des cellules de lignée témoin ou de lignée anti-BP, 5 x 106 20 à 4 reprises, à chaque fois avec une semaine d'intervalle, qui ont été activées par une pression hydrostatique de 1165 bars, pendant 15 minutes Une semaine plus tard on leur confère l'EAE active au moyen de BP/CFA. Revendications 1 Composition pour la prévention et le traitement de maladie autoimmune, caractérisée en ce que son constituant actif est formé de protéines provenant de la membrane cellulaire séparée de lymphocytes T autoimmuns ou de tels lym5 phocytes activés par la pression. 2 Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que les protéines de membrane correspondent à la fraction obtenue dans la partie surnageante après ultracentrifugation d'un système renfermant des lymphocytes T dont 10 les protéines de membrane sont séparées. 3 Composition selon une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que les protéines de membrane proviennent de lymphocytes T autoimmuns, spécifiques d'une maladie autoimmune, et obtenus à partir de patients souffrant de 15 sclérose en plaques, thyroldite, diabètes (Type I), spondylite ankylosante ou arthrite rhumatoide. 4 Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le constituant actif est formé de lymphocytes T activés par la pression. 5 Procédé d'isolation et de purification de protéines de membrane selon une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on soumet une lignée cellulaire spécifique de lymphocytes T, provenant de patients souffrant de la maladie spécifique, dans un système tampon approprié, à une pres25 sion hydrostatique élevée que l'on abaisse ensuite progressivement,puis on centrifuge pour séparer les fragments-de cellule, et soumet la partie surnageante à une ultracentrifugation, avant de recueillir la partie surnageante de cette dernière. 6 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la pression appliquée est de l'ordre de 500 à 1520 bars, pendant une durée de 10 à 45 minutes à sa valeur maximale, avant un retour progressif à la pression normale. 7 Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que l'on procède à l'activation des lymphocytes par la pression en élevant progressivement la pression hydrostatique de 500 à 1000 bars et en la maintenant pendant une du5 rée telle qu'il n'y ait pas de séparation des membranes cellulaires, de préférence 5 minutes environ, à sa valeur maximale, avant un retour progressif à la pression normale.