FR 2550801 A1 19850222 FR 8412354 A 19840803 La présente invention se rapporte généralement à la production biologique de L-aminoacides Plus particulièrement, on a trouvé qu'un L-aminoacide pouvait être préparé à partir de son alpha-cétoacide précurseur 5 correspondant en introduisant l'alpha-cétoacide dans une culture en croissance logarithmnique active d'un microorganisme approprié dans un milieu nutritif Il y a de nombreux microorganismes permettant la biotransformation des alpha-cétoacides en L-aminoacides. On sait que les alpha-cétoacides peuvent être convertis par voie enzymatique en L-aminoacides correspondants Par exemple, le brevet US N 2 749 279 révèle un procédé dans lequel on traite l'acide alphacétogluratique et l'ammoniac avec un catalyseur biologique 15 enzymecoenzyme Des catalyseurs biologiques appropriés peuvent être obtenus d'un tissu animal, de plantes à croissance rapide ou de bactéries sous la forme d'autolysats ou d'extraits de la culture des cellules De même, le brevet US N 4 304 858 révèle la conversion d'acides alpha- cétocarboxyliques solubles dans l'eau en aminoacides correspondants en présence de déshydrogénase, d'ions ammonium et de nicotinamide-adénine- dinucléotide (NAD+/N ADH) spécifiques à un substrat La transformation des alpha-cétoacides en aminoacides en utilisant des 25 suspensions de cellules au repos a été rapportée par Yamada et autres, The Production of Amino Acids, pages 440-46 ( 1972). On a maintenant trouvé que labiotransformation d'un alpha-cétoacide en Laminoacide correspondant pouvait être très efficacement aidée par une culture en croissance active de microorganismes Les microorganismes capables de transformer les alpha-cétoacides en L-aminoacides croissent dans un milieu nutritif L'alphacétoacide précurseur du L-aminoacide souhaité est introduit dans la culture en croissance logarithmique active La réaction de transamination est amenée sensiblement à l'aboutissement par un système enzymatique couplé amené par les microorganismes de la culture en croissance, permettant un recyclage continu du donneur d'amine (L-glutamate) et du coenzyme (NADH ou NADPH) Le L-aminoacide peut être récupéré du bouillon de culture. La présente invention a pour premier objet un procédé très efficace pour la transamination biologique d'alpha-cétoacides en L-aminoacides correspondants. Par ailleurs, il est prévu que le procédé de l'invention soit utile avec une large plage de micro10 organismes et pour la production d'une large plage de L-aminoacides. La présente invention a pour objet supplémentaire un procédé dans lequel une seule souche de microorganismes peut produire des quantités suffisantes de tous les enzymes requis pour convertir un alpha-cétoacide donné en L-aminoacide. La présente invention a pour autre objet l'obtention d'un niveau élevé de conversion de l'alphacétoacide en Laminoacide en une courte période de 20 réaction. La présente invention a pour autre objet un procédé produisant un rendement élevé de L-aminoacides en présence d'une faible concentration du donneur d'amine. La croissance bactérienne peut généralement être 25 subdivisée en trois phases séquentielles La phase de croissance ralentie est une période pendant laquelle il y a peu ou pas d'augmentation du nombre des microorganismes dans la culture Dans la phase de croissance logarithmique ou exponentielle, le nombre des cellules augmente exponen30 tiellement avec le temps Dans la phase stationnaire, il y a peu ou pas de croissance ou de division des cellules. On a trouvé que la transamination microbienne d'un alpha-cétoacide en Laminoacide pouvait être entreprise avec une efficacité accrue en ajoutant l'alpha35 cétoacide à une culture en croissance logarithmique de microorganismes appropriés Une fermentation par alimentation discontinue selon le procédé de l'invention a pour résultat de hauts rendements à des taux élevés de conversion Ce procédé utilise avantageusement un système d'enzymes couplés présents dans les microorganismes en croissance pour amener la réaction à l'aboutissement. Le L-aminoacide produit peut être récupéré du bouillon de culture. La biotransformation de l'alpha cétoacide en L-aminoacide est une réaction de transamination enzymatique La biotransformation est aidée par un système enzyme-coenzyme couplés comprenant une transaminase, un glutamate déshydrogénase, le coenzyme NADP+/NADPH (ou NAD+/NADH), et une déshydrogénase Alternativement, ce dernier composant du système d'enzymes peut être une hydrogénase pour le recyclage de NADP+ (ou NAD+) vers 15 NADPH (ou NADH). Le système réactionnel couplé peut être représenté graphiquement comme suit: (NADPH) ou L20 ou(NADH) -céto amino(\/ y N+ N glutarate acide Hydro-N 4 +\a*. génase gluta mate ou déshydro trans25 (dés mase) (NAD+) ( 3) ( 2) ( 1) La réaction de transamination souhaitée (étape ( 1)), alpha-cétoacide en L-aminoacide, est normalement 35 réversible et irait simplement à l'équilibre, limitant ainsi l'efficacité de la conversion en aminoacide En couplant la réaction de transamination à d'autres réactions enzymatiques, la transamination peut théoriquement être amenée à l'aboutissement, bien que des réactions de dégradation chimique puissent être présentes, pouvant diminuer le rendement réel. Dans la réaction enzymatique couplée, désignée à l'étape ( 2) ci-dessus, l'un des produits de transamination, l'alpha-cétoglutarate, est recyclé vers le L-glutamate Cette étape, une amination réductrice, est aidée par le glutamate déshydrogénase et nécessite la présence d'ions ammonium Le Lglutamate disponible pour la transamination de l'alpha-cétoacide'en Laminoacide est continuellement remplacé par cette étape de recyclage. Dans l'étape ( 2), on utilise l'un des coenzymes NADPH ou NADH, qui est converti en NADP+ ou NAD+ Une troisième réaction enzymatique, l'étape ( 3) , reconvertit ce NADP+ (NAD+) produit en NADPH (NADH) soit par réaction de déshydrogénase ou réaction d'hydrogénase Ainsi, le NADPH (NADH) requis pour l'étape ( 2) est également continuellement réapprovisionné Le NH 4 + requis pour 20 l'étape ( 2) est amené dans le milieu nutritif. Le système de la réaction enzymatique en lui-même est connu Cependant, les usages antérieurs de ce système nécessitaient l'addition de trois microorganismes différents pour introduire les composants réactionnels des trois étapes représentées ci-dessus, brevet US N 3 183170 (Kitai et autres) ou l'addition de microorganismes, de donneurs d'amine et d'un cofacteur (Yamada et autres The Microbial Production of Amino Acids, pages 440-46 ( 1976) Par ailleurs, ces procédés selon ltart antérieur 30 utilisent des suspensions de cellules au repos. La présente invention révélée ici utilise une seule souche de microorganismes pour produire tout le système de réaction enzymatique couplée Une culture en croissance logarithmique de microorganismes appropriés, en prévoyant des ions ammonium dans le milieu de culture, produira les trois étapes de la biotransformation des alpha-cétoacides en L-aminoacides respectifs Dans le procédé de l'invention, l'étape ( 3) dans le système d'enzymes couplés utilise une réaction de déshydrogénase pour la conversion de NADP+ (NAD+) en NADPH (NADH). Les réactifs seront décrits maintenant Le système réactionnel enzymatique couplé est présent dans les microorganismes à croissance active Ce système naturel peut maintenant être utilisé pour la conversion efficace d'alpha-cétoacides en L-aminoacides En prévoyant des microorganismes appropriés avec le substrat approprié, 10 la conversion est effectuée a de hauts rendements par les microorganismes eux-mêmes. Les types de microorganismes appropriés à une utilisation dans ce procédé de bioconversion sont très variés Par exemple, les souches bactériennes connues 15 comme étant les producteurs de l'acide glutamique ont été utilisées avec succès Elles comprennent Brevibacterium thioenit (ATCC N 31723); Brevibacterium lactofermentum (ATCC N 13655), Brevibacterium ammoniagenes (ATCC NI 13746) 20 Brevibacterium lutamig enes (ATCC N 13746) Brevibacterium Flavum (ATCC N 13826) et Co ynebaterium hercules (ATCC N 13868) Le N O ATCC indiqué est le numéro de désignation donné à chaque culture par l'American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, 25 Rockville, Maryland 30852, o chacune des cultures cidessus a été déposée On peut s'attendre à ce que d'autres producteurs de l'acide glutamique soient également appropriés pour une utilisation dans ce procédé. De plus, on a trouvé que E coli HB 101, qui n'est 30 pas normalement considéré comme un producteur de l'acide glutamique, pouvait être utilisé dans ce procédé avec des rendements équivalant aux microorganismes cidessus mentionnés E coli n'est pas un producteur de l'acide glutamique dans le sens qu'il ne sécrète pas d'acide 35 glutamique dans le milieu Cependant, tous les microorganismes produisent des petites quantités intracellulaires de la substance Le système d'enzymes d'intérêt ici ne nécessite que des quantités catalytiques de l'acide glutamique pour débuter la réaction et E coli semble produire des quantités suffisantes d'acide glutamique pour accomplir l'étape ( 2) du système couplé. Il est apparent qu'il y a une grande variété de microorganismes utiles dans ce processus de bioconversion La condition principale est que le microorganisme soit capable d'absorber et de convertir un alpha-cétoacide en L-aminoacide correspondant Afin 10 d'effectuer très efficacement la bioconversion, le microorganisme doit être capable de produire des quantités suffisantes des enzymes mis en cause dans les étapes ( 1) à ( 3) du système d'enzymes couplés pour entraîner la réaction de transamination au delà du point d'équilibre, sensiblement vers l'aboutissement Enfin, le microorganisme préféré doit être capable de sécréter le L-aminoacide dans le milieu de culture pour une récupération facile et économique. L'alpha-cétoacide choisi pour une utilisation 20 avec ce procédé dépendra du L-aminoacide qui est le produit souhaité Par exemple, l'acide phénylpyruvique est converti en L-phénylalanine, l'acide alphacétoisocaproique en L-leucine, l'acide alpha-cétoisovalérique en L-valine, l'acide pyruvique en L-alanine, l'acide oxaloacétique en acide Laspartique, l'acide -hydroxyalpha-cétobutyrique en L-thréonine l'acide poxyphényl pyruvique en L-tyrosine, l'acide indole pyruvique en Ltryptophan, l'acide alpha-céto-/3-méthylvalérique en L-isoleucine, etc Comme on peut le voir, on utilise dans le procédé selon l'invention des précurseurs conventionnels de L-aminoacide. Il est préférable que l'alpha-cétoacide soit ajouté à la culture en solution aqueuse car cette forme facilite le pompage du précurseur vers le bouillon de culture Cependant, si on le souhaite, ltlpha-cétoacide peut être sous d'autres formes physiques, comme un solide ou une bouillie. Il s'est révélé que la pureté de l'alpha-cétoacide précurseur affectait le rendement en L-aminoacide assez dramatiquement, au moins dans le cas de la conversion du phénylpyruvate en phénylalanine (voir exemple 5) En plus des quantités accrues de l'alpha-cétoacide disponible dans le précurseur purifié, on pense que les microorganismes peuvent présenter une moindre sensibilité à l'alphacétoacide purifié. La concentration de la solution aqueuse de l'alpha-cétoacide, si c'est la forme dans laquelle il est introduit dans la culture, peut varier considérablement. Par exemple, si l'on utilise l'invention dans une fermentation continue, la solution sera plus diluée que pour une fermentation discontinue La limite supérieure de la 15 concentration peut dépendre de la solubilité de l'alphacétoacide dans le solvant souhaité On peut s'attendre à ce que des niveaux d'environ 1,0 à 200 g/1 puissent être appropriés, la concentration dépendant de l'alphacétoacide particulier, ainsi que des facteurs ci-dessus 20 décrits L'alpha-cétoacide est au mieux dissous dans l'eau mais d'autres solvants compatibles avec la fermentation, le milieu de croissance supplémentaire par exemple, peuvent être utilisés si on le souhaite. Le milieu nutritif doit être choisi pour produire 25 des conditions optimales de croissance du microorganisme utilisé La variation du milieu ainsi que l'ajustement sont bien dans les capacités de toute personne compétente en la matière et ne doivent pas être décrites en détail ici. En plus des conditions nutritionnelles de base, 30 cependant, le milieu doit contenir une source de NH 4 +. Les ions ammonium sont utilisés par le microorganisme à la fois pour augmenter la masse des cellules et pour l'étape ( 2) de la réaction du système enzymatique couplé. Ainsi, les niveaux de l'ion ammonium dans le milieu de 35 culture doivent être en rapport avec la production souhaitée de l'aminoacide et la masse des cellules Cet ajustement du niveau de NH 4 + est également bien connu de toute personne compétente en la matière Par exemple, les ions peuvent avantageusement être fournis en ajoutant, au milieu nutritif, du sulfate d'ammonium à une concentration d'environ 10 à environ 50 g/l Alternativement, on peut utiliser, comme donneur de NH 4 +, de l'urée, du chlorure d'ammonium, du nitrate d'ammonium, de l'acétate d'ammonium, etc. On décrira maintenant le processus de réaction. Le processus de bioconversion selon l'invention nécessite 10 une culture de microorganismes en croissance active Cette culture peut être préparée par inoculation d'une quantité d'une substance nutritive stérile ou d'un milieu de croissance par une culture d'ensemencement de la souche souhaitée On laisse de préférence croître pendant environ 6 à 40 heures, avant utilisation comme inoculum, la culture d'ensemencement utilisée pour inoculer le milieu nutritif Le temps de croissance de la culture d'ensemencement avant inoculation variera selon la souche bactérienne utilisée Il est souhaitable que la culture 20 d'ensemencement comprennent une masse saine de cellules en croissance, suffisante pour former une bonne base pour l'établissement et la croissance de la culture de fermentation. La dimension du réacteur de fermentation dépendra 25 de l'application spécifique de ce procédé Ceux qui sont compétents en la matière savent bien ajuster les quantités du milieu et de la culture d'ensemencement aux conditions d'un réacteur spécifique ou d'un rendement souhaité. On laisse la culture croître dans le réacteur 30 de fermentation jusqu'à ce que la culture se soit acclimatée à l'environnement du réacteur et a atteint une masse de cellules suffisante pour résister à l'addition de l'alpha-cétoacide Cela est particulièrement important lorsque l'on utilise un précurseur impur La densité optique peut être une mesure facile de la croissance des cellules Une densité optique ("O D ") ( 640 nm) d'environ indique généralement que la culture est prête pour l'addition de l'alpha-cétoacide Cela correspond à une période de croissance d'environ 6-40 heures, selon l'organisme et les conditions de croissance Cependant, cela peut être quelque peu variable et ne doit pas être considéré comme une condition stricte, mais plutôt laissé à l'expérience et à la discrétion du travailleur. On fait croître la culture à une température compatible avec la croissance maximale de la souche bactérienne utilisée La plage générale sera comprise 10 entre des températures ambiantes et environ 37 C Pour Colynebacteria et Brevibacterium, la température préférée est d'environ 30 C; pour E coli, la température préférée est d'environ 37 C Le p H de la culture doit de préférence être d'environ 7-8 Une aération peut être prévue si 15 nécessaire pour la souche bactérienne choisie. A ce stade, le réacteur est alimenté de l'alphacétoacide souhaité BL'alpha-cétoacide est de preference une solution aqueuse comme on l'a décrit ci-dessus La concentration de l'alpha-cétoacide dans cette solution aqueuse peut être comprise entre environ 1,0 % et environ % (poids/poids) Le p H de la solution peut être compris entre environ 7 et environ 14 Le p H peut être ajusté à des valeurs inférieures avec de l'acide acétique glacial ou autres acides biologiquement compatibles (comme l'acide sulfurique ou l'acide citrique) ou avec du gaz carbonique gazeux La solution peut être stérilisée à la vapeur (par exemple à 121 C pendant 15 minutes), une filtration sur Millipore (comme une dimension des pores de 0,22 t) ou par tout autre moyen pratique. Si cela est nécessaire pour une croissance continue de la culture, une solution stérile de glucose peut être introduite dans le fermenteur avec ou à peu près en même temps que l'alpha-cétoacide Cependant, le glucose en excès restant dans le bouillon de culture à la fin de 35 la fermentation peut interférer avec la récupération de l'aminoacide produit Si cela se produit, la quantité de glucose introduite dans la culture doit être limitée à la quantité calculée pour une utilisation ear masse des cellules pendant la fermentation. L'addition de l'alpha-cétoacide (et du glco se si on le souhaite) est de préférence faite Dar voie aseptique pour éviter une contamination du réacteur La concentration de l'alpha-cétoacide dans le bouillon de culture du réacteur sera probablement comprise entre environ 20 g/l et environ 50 g/1 pour un réacteur à alimentation discontinue Pour une fermentation continue, 10 la concentration peut être plus faible Cependant, il est souhaitable que la concentration en alpha-cétoacide soit aussi élevée que possible, sans interrompre le métabolisme, afin de rendre maximale son utilisation par les microorganismes pendant la phase de croissance 15 logarithmique. On laisse alors la culture crottre pendant une période supplémentaire, de préférence d'environ 20 à environ 72 heures Cette période, pendant laquelle l'alpha-cétoacide se biotransforme en L-aminoacide, est de préférence aussi courte que possible, tout en permettant encore les meilleurs rendements Par le procédé selon l'invention, les rendements maximum attendus peuvent atteindre 100 % en une période aussi courte que 23 heures, comme cela est montré pour la production de L-phénylalanine 25 de l'exemple 6 Après la période de croissance, le L-aminoacide produit peut être récupéré du bouillon de culture par un moyen conventionnel Les exemples qui suivent sont donnés uniquement pour illustrer l'invention mais ne doivent en aucun cas 30 en limiter le cadre. EXEMPLE 1 Les milieux de culture d'ensemencement qui suivent ont été préparés: Semence ,00 g 2,50 g 2,50 g 1,00 g 0,25 g 10,00 g 1,00 cc 10 1,00 cc Ingrédients Glucose 2 Liqueur de trempage du mals NZ amine B K 2 HP 04 Mg SO 4 7 H 20 (NH 4)2504 Solution d'approvi 2 sionnement en biotine Solution d'approvisionnement en 4 thiamine-HC 1 Tampons MOPS 5 Croissance ,00 g 2,50 g 2,50 g 1,00 g 0,25 g 50,00 g 1,00 cc 1,00 cc 20,90 g ,00 g I par litre d'eau désionisée 2 solution d'approvisionnement en glucose à 70 % (poids/volume) 3 100 mg de d-biotine par litre d'eau désionisée 4 1,0 g de thiamine-H Cl par litre d'eau désionisée MOPS = acide morpholinopropanesulfonique. 20 Tous les ingrédients, à l'exception du glucose ont été combinés et stérilisés à la vapeur à 121 C pendant minutes La solution de glucose a été stérilisée séparément par la même méthode puis ajoutée aseptiquement 25 au reste ces milieux On a utilisé des ballons ( 250 cc) du milieu de culture d'ensemencement pour faire cro Stre les deux cultures d'ensemencement pour chacune des six souches bactériennes produisant l'acide glutamique Les souches et les densités optiques pour chaque souche après avoir 30 laissé les cultures d'ensemencement croître pendant 8 heures sont comme suit Souche Densité optique _( 640 nm) Brevibacterium thiogenitalis (ATCC 31723) 35 Brevibacterium lactofermentum (ATCC 13655) Brevibacterium ammoniagenes (ATCC 13746) 3,9 + 0,1 11,2 + 0,8 6,0 + 0,4 Souche Densité optique ( 640 nm) Brevibacterium glutamigenes (ATCC 13747) 9,2 + 0,2 Brevibacterium flavum (ATCC 13826) 1,3 0,3 Corynebacterium hercules 1 (ATCC 13868)2,3 +,7 Le milieu stérilisé de croissance a été ajouté 10 par portions de 50 cc dans des ballons bosselés à secousses de 250 cc Chaque ballon a été inoculé d'une seule culture d'ensemencement sur une base de 1 % volume/ volume On a laissé les cultures dans les ballons à secousses croître à 300 t/mn de vitesse d'agitation pendant 17 heures à 30 C pour les cultures de Brevibacterium et Corynebacterium. On a utilisé une solution aqueuse d'acide phénylpyruvique sodium (Na-PPA) La solution était un hydrolysat non purifié de soude de 5benzylidènehydantolne. 20 La préparation de l'hydrolysat de 5benzylidènehydantoîne (Hamsphire Chemical Co) était selon le processus qui suit: Qn a combiné 2 233 g d'eau désionisée et 223,3 g de Na OH dans un bécher en acier inoxydable de 3 litres et on a chauffé à l'ébullition Tout en continuant à-faire bouillir, 25 on a ajouté lentement 350 g de 5-benzylidènehydantoîne. On à continué l'ébullition à 101-103 C pendant 2 heures. La solution a été mélangée pendant la réaction au moyen d'un mélangeur électrique Après ébullition, le mélange a été rapidement refroidi dans un bain d'eau et de glace. 30 Le volume final de cet hydrolysat était de 1 810 ml, avec une concentration en Na-PPA-H 20 de 162 g/l, un p H de 13,51 et une couleur ambre-clair Une solution à I molaire du phénylpyruvate de sodium (hydrolysat) contenait 1,2 M de Na OH, 0,5 M de carbonate de sodium et 0,5 M d'urée Le p H 35 de la solution a été ajusté à 8 en utilisant de l'acide acétique à 2 N puis on a stérilisé en utilisant un filtrant Mili pore (dimension des pores 0,222). On a préparé une solution séparée de glucose ( 70 % poids/volume dans l'eau désionisée) et on l'a stérilisée à la vapeur à 121 C pendant 15 minutes La solution de glucose a été ajoutée de manière aseptique, à la solution stérile de Na-PPA à un rapport volumétrique de 3:7 On a ajouté un volume de la solution composite à chaque ballon à secousses de façon à obtenir une concentration en Na phénylpyruvate de 10 g/i dans le bouillon de culture. On a laissé chaque culture dans les ballons a secousses croître pendant 23 heures supplémentaires, pour une durée totale de croissance de 40 heures. A ce moment, des échantillons de bouillon ont été retirés et l'on y a déterminé la L-phénylalanine en 15 utilisant un système de chromatographie liquide haute pression (HPLC) Des échantillons de bouillon filtrés sur Millipore (dimension des pores 0,22,j) ont été dérivés en utilisant une technique de Dansylchlorure avant injection sur HPLC. Les poids des cellules sèches ont également été déterminés pour chaque échantillon de bouillon On a centrifugé un échantillon de 10 cc du bouillon de chaque ballon à 10 000 t/mn pendant 30 minutes La pâte des cellules humides a été séchée dans un four à 80 C pendant 25 24 heures, avec ensuite 15 minutes dans un dessicateur sous vide L'échantillon de cellule sèches a alors été pese. Pour chaque ballon à secousses, le taux moyen de production de L-phénylalanine sur la période de 23 heures 30 a été calculé par gramme de poids sec de la masse des cellules Les résultats des essais pour des ballons à secousses en double pour chaque souche de microorganismes sont montrés au tableau I. Microorganisme ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC No N N N N N 31723 13655 13746 13747 13826 13868 Poids cellules sèches (g/l) 39 + 0,8 22,4 + 3,2 34,7 + 0,6 46,5 + 12,6 51,6 + 5,1 42,5 + 1,5 Tableau 1 m M (g/l) L-phénylalanine % conversion (mole/mole) ,9 + 25,7 + 28,2 + 29,4 + 41,2 + 38,4 + 1,0 4,5 0,3 1,5 7,9 2,1 ( 6,8 0,2) ( 4,3 0,8) ( 4,65 0,05) ( 4,9 0,3) ( 6,8 + 1,3) ( 6,4 0,4) 67 + 42,3 + 46,2 + 48,2 + 67,6 + 63,1 + 1,5 7,5 0,5 2,5 12,9 3,5 Taux 1 moyen ,6 + 1,9 49,6 + 1,7 35,3 + 0,2 + 9,6 34,4 + 3,2 39,3 + 0,8 1 -M L-phénylalanine produite/heure/g de poids de cellules sèches. m u 1 Ln c, CO Co EXEMPLE 2 On a préparé le milieu de culture (bouillon de luria) qui suit: Ingrédient Quantité 1 Bacto-tryptone 2 10,0 g Bacto-extrait de levure 2 5, 0 g Na Cl 5,0 g Tampons MOPS 3 20,9 g 1 par litre d'eau désionisée 2 commercialisé par Difco 3 MOPS: acide morpholinopropane sulfonique. Les ingrédients ont été combinés et stérilisés à la vapeur à 121 C pendant 15 minutes Le milieu stérilisé a été introduit par portions de 50 cc dans des flacons bosselés à secousses de 250 cc Chaque flacon à secousses a été inoculé d'une culture d'Escherichia coli HB 101 sur une base de 1 % (volume/volume). On a laissé les cultures dans les ballons croître 20 pendant 8 heures à 37 o C à une vitesse d'agitation de 300 t/mn pour une utilisation comme cultures d'ensemencement A la fin de cette période, la densité optique ( 640 nm) était de 6,27 + 0,03 pour les expériences des flacons à secousses en double Cette culture d'ensemencement a alors 25 été utilisée pour inoculer des flacons frais à secousses de 250 cc, que l'on a laissé croître pendant 17 heures avant de recevoir l'alpha-cétoacide. On a préparé, comme à l'exemple 1, une solution aqueuse stérile d'acide phénylpyruvique Na-glucose Cette 30 solution a été introduite dans les cultures d'essai des ballons à secousses au bout de la période de croissance de 17 heures (densité optique = 10,3 + 1,3) comme à l'exemple 1, pour obtenir un bouillon final d'acide phénylpyruvique Na de 10 g/l Au bout de 23 heures supplémentaires de croissance, les échantillons ont été retirés et les poids des cellules sèches et les concentrés de Lphénylalanine ont été déterminés comme à l'exemple 1. Les résultats sont montrés au tableau 2 Tableau 2 Poids cellules sèches (g/l) m M (g/l) L-phénylalanine % conversion (mole/mole) Taux moyen 1 19,4 + 0,3 31,8 + 5,8 ( 5,3 + 1,o) 52,2 + 9,5 71,3 + 13,8 1-jp M L-phénylalanine produite/heure/g poids cellules sèches. ru Ln Ln Co c> -à EXEMPLE 3 On a préparé le milieu de culture d'ensemencement qui suit: Inrédients -1 Hysoy ' L-isoleucine Mg SO 4 7 H 20 (NH 4)2504 KH 2 P 04 Trace d'éléments 2 10 Ca CO 3 Solution d'approvisionnement en 3 biotine Solution d'approvisionnement en 4 thiamine-HC 1 Eau désionisée Quantité 3, 0 g 1,0 g 0,4 g 10,0 g 3,0 g 1,0 cc 15,0 g 1,0 cc 1,0 cc 700,0 cc _ I commercialisé par Sheffield Co 2 la solution de trace d'éléments consistait en: Ingrédient Quantité Zn 504 7 H 20 8,8 g Fe 504 7 H 20 10,0 g Cu SO 4 5 H 20 0,06 g Na 2 B 407 10 H 20 0,088 g Na 2 Mo 204 2 H 20 0, 053 g Mn 504 H 20 7,5 g Co C 12 6 H 20 0,12 g Ca C 12 0,055 g Eau désionisée 900,00 cc La solution de trace d'éléments a été ajustée à p H 2 avec H 2504 concentré et de l'eau désionisée 30 a été ajoutée pour ramener le volume final à 1.000 cc. 3 100 mg de d-biotine par litre d'eau désionisée 4 1,0 g de thiamine-HCL par litre d'eau désionisée. Le milieu ci-dessus a été ajusté à p H 7,5 avec 35 Na OH à 5 N et de l'eau désionisée a été introduite pour ramener le volume à 900 cc Le milieu a été stérilisé à la vapeur à 121 C pendant 15 minutes Une solutiond'approvisionnement de glucose ( 50 g/100 cc d'eau désionisée) a été stérilisée à la vapeur séparément à 121 C pendant 15 minutes Après refroidissement, la solution stérile de glucose a été ajoutée de manière aseptique au milieu stérile pour amener le volume final du milieu à 1 000 cc Le p H a été ajusté à 7 avec de l'acide acétique glacial à 5 N. Des portions de 50 cc du milieu de culture d'ensemencement ont été ajoutées à chacun des deux ballons 10 bosselés à secousses de 250 cc Les ballons ont été inoculés de Brevibacterium thiogenitalis ATCC N 31723 et on les a fait croître pendant 8 heures à 30 o C tout en agitant (vitesse d'agitation 300 t/mn) pour former des cultures d'ensemencement A la fin de la croissance de 8 heures, la densité optique ( 640 nm était d'environ 10,0. On a préparé un milieu de croissance de la même façon que le milieu d'ensemencement à l'exception que l'on a utilisé 50 g de (NH 4)2 SO 4 On a distribué des portions de 50 cc du milieu de croissance dans deux ballons à secousses bosselés de 250 cc Les ballons ont alors été inoculés d'un échantillon de 2,5 cc de l'une des cultures d'ensemencement Après inoculation, on a fait croître les cultures dans les ballons pendant 33 heures à 30 C tout en agitant ( 300 t/mn). On a préparé une solution stérile de glucose ( 70 % Poids/volume dans l'eau désionisée) comme à l'exemple 1. Une solution aqueuse non purifiée à 17,5 % (poids/poids) d'acide alphacétoisocaproîque Na (densité: 1,125 g/cc; p H = 13,5) a été utilisée La solution était un hydrolysat 30 de soude d'isobutylidènehydantolne préparé selon la méthode décrite à l'exemple I en utilisant une quantité suffisante de l'isobutylidènehydantolne pour former une solution à 15 % dans l'eau et Na OH avant ébullition Une solution à un molaire de l'acide alpha-cétoisocaproîque Na 35 (hydrolysat) contenait environ 1,2 M de Na OH, 0,5 M de carbonate de sodium et 0,5 M d'urée La solution d'acide alpha-cétoisocaproîque Na a été ajustée à p H 7 avec de l'acide acétique glacial concentré, puis stérilisée à la vapeur à 121 C pendant 15 minutes Des volumes égaux de la solution stérile de glucose et de la solution stérile d'acide alpha-cétoisocaproîque Na ont été mélangés de 5 manière aseptique et le p H a été réajusté à 7 avec de l'acide acétique glacial. Des volumes de la solution combinée ont été ajoutés aux cultures dans les ballons à secousse de façon que les concentrations finales du bouillon de l'acide alpha-cétoisocaproîque soient telles qu'indiquées au tableau 3 On a laissé les cultures croître pendant 62 heures supplémentaires Après cette période de croissance, les échantillons ont été prélevés, filtrés sur Milli pore (dimension des pores 0,22,) pour retirer les cellules, et on a analysé à la recherche de L-leucine en utilisant une détermination par chromatographie liquide haute pression (HPLC) comme décrit à l'exemple 1 Les résultats sont montrés au tableau 3. Tableau 3 Acide O(-cétoiso 2 Rendement caproïque Na L-leucine produite molaire 3 0, 0312 M ( 4,10 g/l) 0,0354 M ( 4,61 g/l) 0,062144 ( 8,12 g/l) 0,025 M ( 3, 28 g/l) 0,037 M ( 4,85 g/1)4 0,058 M ( 7,61 g/l) ,0 % 105,0 % 93,7 % 30 I ajouté à 33 heures de croissance 2 après une croissance supplémentaire de 62 heures 3 rendement molaire = de L-leucine x 100 g d'acide o(-cétoisocaproique Na 4 l'erreur d'analyse sur les déterminations par HPLC est d'environ + 10 %, suggérant que ce nombre est une erreur analytique du côté haut - EXEMPLE 4 Le milieu de culture d'ensemencement et le milieu de croissance de l'exemple 3 ont été utilisés pour la croissance de Brevibacterium thiogenitalis ATCC N 31723 pour la biotransformation de l'acide alphaisovalérique en L-valine Des cultures d'ensemencement et des cultures en ballon à secousses d'essai ont été préparées selon la méthode décrite à l'exemple 3, en utilisant cette souche. Une solution aqueuse non purifiée à 4,53 % (poids/poids) d'une solution d'acide alpha-cétoisovalérique Na a été utilisée La solution était un hydrolysat de soude d'isopropylidènehydantolne préparé selon la méthode décrite à l'exemple 1 en utilisant une quantité suffisante 10 de l'isopropylidènehydantolne pour former une solution à environ 66 dans l'eau et Na OH avant ébullition Une solution à un molaire de l'acide alpha-cétoisovalérique Na contenait environ 1,2 M de Na OH, 0,5 M de carbonate de sodium et 0,5 M d'urée Le p H de la solution a été ajusté 15 de 13,8 à 7,0 avec de l'acide acétique glacial La solution a été stérilisée à la vapeur à 1210 C pendant minutes. On a préparé une solution séparée de glucose ( 70 % poids/volume dans l'eau désionisée) et on l'a stérilisée à la vapeur à 1210 C pendant 15 minutes On a ajouté 70 parties de la solution stérile d'acide alphacétoisovalérique de manière aseptique à 30 parties de la solution stérile de glucose Des volumes de ce mélange ont été ajoutés aux cultures en ballons à secousses d'essai à divers stades de croissance de façon que les concentrations finales dans le bouillon de l'acide alphacétoisovalérique Na soient de 10 ou de 15 g/l comme letableau 4 La période totale de croissance était de heures pour chaque culture en ballon à secousses d'essai A ce point, des échantillons ont été retirés, filtrés sur Milli pore (dimension des pores 0,22,,m) et analysés à la recherche de la L-valine en utilisant une détermination par HPLC comme à l'exemple 1. Dans une étude de contrôle en utilisant les mêmes 35 microorganismes et les mêmes processus, l'acide alphacétoisovalérique Na a été omis de la fermentation Les témoins ont produit une de L-valine à partir du compte de cela dans les au tableau 4. moyenne de 0,0205 M ( 2,4 g/l) glucose L'on n'a pas tenu résultats d'essai montrés Tableau 4 Acide 0,0725 M ( 10 g/l) 0,0725 M ( 10 g/l) 0,1087 M ( 15 g/l) 15 16 h 0,0846 + 0,008 M ( 9,9 U + 0,90 g/l) 24 h 0,0910 + 0, 003 M ( 10,25 + 0,35 g/l) 16 h 0,1004 + 0,005 M ( 11,75 + 0,55 g/l) 999 o 106 % 78 % I au bout de 40 heures de croissance totale 2 rapport molaire = g de L-valine g d'acide (X -cétoisovalérique Na 3 l'erreur d'analyse sur les déterminations est d'environ + 10 %, ce qui suggère que ce est une erreur analytique du côté haut. x 100 par HPLC nombre EXEMPLE 5 Dans cet exemple, on compare l'fficacité de 25 biotransformation de Brevibacteriumn thiogenitalis ATCC N 31723 lorsqu'il reçoit un hydrolysat dans KOH de 5-benzylidènehydantolne (acide phénylpyruvique K) et lorsqu'il reçoit de l'acide phénylpyruvique Na pur à 98 %. Les solutions de l'alpha-cétoacide ont été préparées comme suit: Acide phénylpyruvique K: un hydrolysat non purifié de KOH de 5benzylidènehydantoine (obtenu de Hamsphire Chemical) a été préparé comme à l'exemple 1 à partir de 3 M de KOH par mole de 5-benzylidènehydantoine. 35 Le p H de l'hydrolysat a été ajusté à 8,0 avec C 02 gazeux avant introduction dans les ballons à secousses. Acide phénylpyruvique Na: un phénylpyruvate monohydraté solide de Na ( 98 %) (obtenu de Aldrich Chemical Co) a été dissous dans KOH aqueux à 0,6 M jusqu'à une concentration de 98 g/l (sous forme de phénylpyruvate monohydraté de Na (Na P Pa H 20)) Le p H a été ajusté à 8,0 avec C 02 gazeux avant introduction dans les ballons à secousses. Les milieux d'ensemencement et de croissance utilisés ont été préparés comme décrit à l'exemple 1 à l'exception que les tampons de MOPS ont été remplacés par 20 g/il de Ca CO 3 et que le glucose plus d'autres composants des milieux ont été passés à l'autoclave ensemble pendant minutes à 1100 C (au lieu d'une stérilisation séparée à la vapeur) Les cultures d'ensemencement ont été préparées comme à l'exemple I en utilisant Brevibacterium thiogenitalis ATCC N 31723. On a utilisé les clltures d'ensemencement pour inoculer les ballons à secousses comme décrit à l'exemple 1 Après une période initiale de croissance de 17 heures, des 20 ballons à secousses séparés ont reçu les solutions d'acide phénylpyruvique en quantités telles que les concentrations finales du bouillon de culture de phénylpyruvate soient de 76,22 m M ( 12,51 g/il sous forme d'acide phénylpyruvique) On a laissé les ballons à secousses 25 croître, et les rendements molaires ont été déterminés à 23 heures ( 40 heures de croissance totale) et à 28 heures ( 45 heures de croissance totale) Les déterminations par HPLC ont été faites comme à l'exemple 1 Les résultats, montrés au tableau 5, indiquent que la capacité de Brevibacterium thiogenitalis ATCC N 31723 pour la biotransformation du phénylpyruvate en L-phénylalanine n'est pas totalement réalisée si l'on utilise un précurseur impur dans le processus. -2550801 Tableau 5 Phényl 1 pyruvate Production de phénylalanine (m M) 23 h 2 Rendement 3 28 h 2 Rendement 3 .5 _ molaire molaire K phényl 35,96 + 0,85 47,2 + 1,1 49, 52 + 127 65 + 16,7 pyruvate _Na p hyruvatényl 67,80 + O 89,0 + O 6919 + 1, 2 90,8 + 1,6 p yruvate 10 1 essai en ballon à secousses double 2 moment d'addition du phénylpyruvate 3 rendement molaire = x 100 m M phénylpyruvate EXEMPLE 6 Cet exemple a été entrepris en utilisant de l'acide phénylpyruvique sodium (Na-PPA) purifié par précipitation d'un hydrolysat dans la soude de 520 benzylidènehydantoîne L'hydrolysat a été préparé selon le procédé de l'exemple 1. On a alors préparé un précipité d'acide acétique à partir de l'hydrolysat On a placé un volume de 1 500 ml de l'hydrolysat dans un bécher en-serre de 2 000 ca, dans 25 un bain d'eau et de glace De l'acide acétique glacial (concentration 99,7 %, 17,4 M) a été ajouté graduellement tout en agitant pour abaisser le p H à 9 On n'a pas laissé la température dépasser 30 C Un précipité a comencé à se former à environ p H 12,95 Au bout de 15 minutes, le p H 30 avait atteint 9. On a laissé le mélange au repos, couvert et sous une cloche, pendant I heure à 23 C La bouillie a été filtrée à travers du papier Whatman N 4, sans lavage. Le précipité humide a été placé dans un four sous vide à 50 C pendant 18 heures Le précipité sec a été placé à travers un tamis de maille US N 40 Le produit final était Na-PPA-H 20 pur à 79 %, les autres composants comprenant de l'acétate, Na+ et de faibles quantités de C 03 et de l'azote organique. Les milieux de culture d'ensemencement et de croissance ont été préparés comme décrit à l'exemple 5. On a fait croître Brevibacterium thiogénitalis ATCC N 31723 sur le milieu d'ensemencement comme à l'exemple 5. On a utilisé la culture d'ensemencement pour inoculer des ballons à secousses de 250 cc. Après une période initiale de croissance de 10 18 heures, Na-PPA-H 20 précipité a été redissous dans O,3 M de KOH ( 100 g/l)sous forme de NaPPA-H 20) et ajouté aux ballons à secousses pour obtenir les concentrations finales du bouillon indiquées au tableau 6 On a laissé les cultures croître pendant 23 heures supplémentaires 15 Les déterminations par HPLC pour la L-phénylalanine ont été faites comme décrit à l'exemple 1 Les résultats sont montrés au tableau 6 Les résultats sont approximatifs car les pertes par évaporation du liquide des ballons à secousses n'ont pas été mesurées. Tableau 6 1 2 3 Croissance à 23 h Rendement 4 Essai N Na-PPA-H 20 L-phénylalanine 3 (O Do 640 nm) molaire 1 O O 34 + 4 2 1,73 + 0,12 1,8 + 0,09 41 + 2 100 3 3,06 + 0 3,69 + 0,02 40 + 2 100 4 3,3 + 0,08 3,57 + 0,19 24 + 1 100 5,71 + O 6,32 + 0,19 27 + I 100 6 5,75 + 0,36 6,18 + 0,11 23 + O 100 7 6,80 + 0,05 6,05 + 0,05 43 + 2 88 8 8,16 + 0,44 7,4 + 0 43 + 0 90 9 9,13 + 0,36 6,99 + 0,14 27 + O 76 9,45 + 0 8,35 + 0,15 36 + 7 88 11 9,49 + 0 7,82 + 0,12 24 + 1 82 12 12,91 + 0,04 10,05 + 0,95 37 + 5 78 I Expériences en flacons à secousses doubles 2 Concentration en PPA dans le milieu déterminée par colorimétrie 3 Concentration de L-phénylalanine (g/l) produite en 23 heures 4 Rendement molaire M L phénylalanine x 100 M phény 1 pyruvate R E V E N D I C AT I O N S 1. Procédé de préparation d'un L-aminoacide, caractérisé en ce qu'il consiste à: (a) choisir des microorganismes capables de transformer un alpha-cétoacide en un L-aminoacide correspondant, (b) faire croître lesdits microorganismes dans un milieu nutritif, (c) introduire l'alphacétoacide souhaité dans les microorganismes en croissance logarithmique, et (d) laisser les microorganismes en croissance convertir l'alpha-cétoacide en L-aminoacide correspondant. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les microorganismes comprennent sensiblement une seule souche bactérienne. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les microorganismes sont choisis dans le groupe consistant en bactéries sécrétant de l'acide glutamique et Escherichia coli. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les bactéries sécrétant et produisant l'acide glutamique sont choisies dans le groupe consistant en l'espèce Brevibacterium et l'espèce Corynebacterium. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le Laminoacide est récupéré du milieu de culture. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la durée de la croissance de l'étape (b) est comprise entre environ 6 et environ 40 heures et la durée de croissance de l'étape (d) est comprise entre environ 20 et environ 72 heures. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'alphacétoacide de l'étape (c) est présent en une quantité d'environ 0,5 % (poids/volume) et environ 5,0 % (poids/volume) dans le bouillon de culture. 8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'alphacétoacide est présent en solution aqueuse, dont la concentration est comprise entre environ 1,0 % (poids/volume et environ 20 % (poids/volume). 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'alphacétoacide est choisi dans le groupe consistant en acide phénylpyruvique, acide alpha-cétoisocaproîque, acide alpha-cétoisovalérique, acide pyruvique, acide oxaloacétique, acide -hydroxy-alpha-cétobutyrique, acide p-oxyphényl pyruvique, acide indole pyruvique et 10 -acide alphacéto--méthylvalérique. * 10. Procédé pour la transamination biologique d'alpha-cétoacides en leurs L-aminoacides correspondants en utilisant le système d'enzymes couplés d'une culture bactérienne en croissance logarithmique,caractérisé en 15 ce qu'il consiste à: (a) mettre en contact une culture en croissance logarithmique de microorganismes pouvant transformer les alpha-cétoacides en leurs L-aminoacides correspondants avec l'alpha-cétoacide souhaité en présence d'un milieu 20 nutritif, et (b) laisser le système d'enzymes couplés de ladite culture en croissance entratner l'alpha-cétoacide à une réaction de transamination en L-aminoacide. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le Laminoacide produit à la réaction de transamination est récupéré du milieu. 12. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que les microorganismes sont choisisdans le groupe consistant en Bactéries sécrétant et produisant 30 l'acide glutamique et Escherichia coli. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que les bactéries produisant l'acide glutamique sont choisies dans le groupe consistant en l'espèce Brevibacterium et l'espèce Corynebacterium. 35 14 Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'alpha- cétoacide est choisi dans le groupe consistant en acide phénylpyruvique, acide alpha-cétoisocaprolque, acide alpha-cétoisovalérique, acide pyruvique, acide oxaloacétique, acide A-hydroxyalpha-cétobutyrique, acide p-oxyphénylpyruvique, acide indole pyruvique et acide alpha-céto-/ -méthylvalérique. 15 Procédé selon la revendication 14, caractérisé en-ce que l'alphacétoacide est présent en solution aqueuse dont la concentration est comprise entre environ 1,0 % et environ 20 %. 16. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la culture en croissance logarithmique est mise en contact avec l'alpha-cétoacide pendant environ à environ 72 heures. 17. L-aminoacide caractérisé en ce qu'il est préparé par: (a) la mise en culture dans un milieu nutritif, de microorganismes pouvant transformer un alpha-cétoacide précurseur en L-aminoacide souhaité, (b) la production d'une phase active en croissance logarithmique de la culture, (c) la mise en contact de la culture en croissance logarithmique avec l'alphacétoacide précurseur, et (d) la conversion, par la culture en croissance, de l'alpha-cétoacide en L-aminoacide correspondant. 18 L-aminoacide selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il a été récupéré du milieu de culture. 19. L-aminoacide selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il est préparé à partir d'un alpha30 cétoacide précurseur choisi dans le groupe consistant en acide phénylpyruviq ecide alpha-cétoisocaprolque, acide alpha-c 6 toisovalérique, acide pyruvique, acide oxaloacétique, acide A hydroxy-alpha-cétobutyrique, acide p-oxyphénylpyruvique, acide indole pyruvique et acide 35 alpha-céto-/ -méthylvalérique.