FR 2549854 A1 19850201 FR 8312522 A 19830729 -1 La présente invention est relative à un procédé de production d'alcools par des fermentations microbiennes thermophiles, à de hautes concentrations de solvants organiques. La possibilité de convertir des ressources renouve5 lables, telles que la biomasse, ou les déchets, en produits chimiques présentant un intérêt industriel et en combustibles, par fermentation, constitue un objectif d'un intérêt économique considérable En effet, on sait que les fermentations anaérobies tranforment la matière organique en l'absen10 ce d'oxygène, pour donner un certain nombre de composés organiques plus ou moins réduits tels que l'éthanol, le méthane, l'acide acétique, le butanol, par exemple. Les premières applications de ces fermentations remontent à Louis PASTEUR lBull Soc Chim Paris, 1862 ( 1):537 15 qui a obtenu du butanol par fermentation bactérienne et à Ch WEIZMANN qui, en 1912, a converti de l'amidon en acétone, butanol et éthanol par fermentation à l'aide d'un microorganisme dénommé "Clostridium acétobutylicum souche Weizmann"; le butanol et l'acétone ainsi obtenus par fermentations bac20 tériennes étaient utilisés comme matières premières, -le premier pour la production de butadiène servant à la synthèse du caoutchouc synthétique et le second pour la fabrication d'explosifs Toutefois, les procédés par fermentation ont été abandonnés après la seconde guerre mondiale au profit de l'u25 tilisation de matières premières dérivées du pétrole, pour la synthèse chimique du butanol et de l'acétone, dont le bilan économique était plus favorable que celui des procédés par fermentation. L'augmentation considérable du prix du pétrole et 30 la nécessité pour les fabricants de produits chimiques et pour les Etats de réduire leur dépendance vis-à-vis des pays producteurs de pétrole ont entraîné un regain d'intérêt pour les fermentations microbiennes capables de produire des combustibles et des produits chimiques à partir de substrats re35 nouvelables peu coûteux tels que la biomasse. -2 Toutefois, pour que les fermentations microbiennes soient intéressantes économiquement pour la production de produits chimiques industriels, il est indispensable que non seulement la biomasse utilisée comme substrat soit peu coû5 teuse, mais qu'en outre ces procédés soient faibles consommateurs d'énergie, qu'ils soient capables de fournir les produits recherchés par conversion directe, et que les rendements en ces produits soient élevés. Les bactéries thermophiles constituent une catégo10 rie de microorganismes propres à répondre aux conditions énoncées ci-dessus; en effet, les bactéries thermophiles croissent à des températures égales ou supérieures à 60 C, présentent des vitesses métaboliques élevées, contiennent des enzymes physiquement stables (c'est-à-dire dont la résistance 15 thermique est élevée) et chimiquement stables et procurent un rendement en produit final particulièrement élevé Les bactéries thermophiles anaérobies telles que Clostridium thermoaceticum, qui est une bactérie acétogène, Clostridium thermocellum qui est une bactérie cellulolytique, Clostridium ther20 mohydrosulfuricum qui est une bactérie solventogène, Méthanobacterium thermoautotrophicum, qui est une bactérie méthanogène, par exemple, qui sont présentes dans des environnements auto- caloriques tels que le sol, ou volcaniques, permettent d'obtenir des produits de fermentation utilisables directe25 ment sur le plan industriel tels que l'acide acétique,l'éthanol, le méthane, ou utilisables comme matière première pour la production d'autres produits chimiques, comme c'est le cas, par exemple, de l'éthanol qui constitue une matière première de choix pour la production d'éthylène ou de butadiè30 ne L'isopropanol peut être produit à partir de l'acétone obtenue par fermentation acétonobutylique Il peut servir, par exemple, comme co-solvant à des mélanges méthanol-essence ou comme produit chimique de base L'on sait également que si Clostridium propionicum est apte à produire de l'acide pro35 pionique, il peut, en modifiant chimiquement les paramètres de fermentation, produire de l'acide acrylique L'on sait, en -3 outre, que Clostridium thermocellum et Clostridium thermohydrosulfuricum produisent de l'éthanol avec des rendements élevés, par fermentation de saccharides, et que les rendements les plus élevés en éthanolsont obtenus par fermentation 5 à l'aide de souches spécifiques de ces bactéries, à savoir les souches de C thermocellum LQRI et de C thermohydrosulfuricum 39 E, à des températures de l'ordre de 60 C, de substrats constitués par de la cellulose pour la première souche et des hexoses, des pentoses ou de l'amidon pour la 10 seconde Néanmoins, l'utilisation de la technologie de la fermentation de la biomasse se heurte au problème posé par la récupération du produit final, et en particulier de l'éthanol, produit par biofermentation et se heurte également à la faible tolérance d'une souche telle que C thermohydro15 sulfuricum à l'égard de concentrations élevées en produit final volatil tel que l'éthanol De ce fait, en dépit du développement de techniques d'optimisation des rendements en éthanol obtenus avec cette souche, par exemple par l'introduction de donneurs (H 2 par exemple) ou d'accepteurs (par 20 exemple l'acétone) d'électrons dans le milieu de fermentation, les technologies de fermentation de la biomasse n'ont pas encore atteint le stade industriel. Il a été proposé récemment d'améliorer le rendement d'éthanol obtenu par fermentation de la cellulose, en utili25 sant soit une co-culture de deux microorganismes, à savoir Thermoanaerobacter ethanolicus et Clostridium thermocellum (cf le Brevet américain 4 292 406) pour obtenir des quantités d'éthanol récupérables par distillation, soit une coculture de C thermocellum et de C thermohydrosulfuricum 30 (Appl Environ Microbiol vol 41, 1981, no 6, p 1337-1343, Ng, Ben-Bassat et Zeikus) Toutefois, ce système ne permet pas d'obtenir des concentrations d'éthanol supérieures à 1 %, et il a par ailleurs été démontré (Appl Environ Microbiol, Vol 40: 571-577, Herrero and Gomez) que la présence de con35 centrations d'éthanol inférieures à 1 % inhibe la croissance de C thermocellum. La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à un procédé de production d'alcools par fermentation d'une biomasse renouvelable, à l'aide d'au moins un microorganisme thermophile anaérobie spécifique, qui 5 répond mieux aux nécessités de la pratique que les procédés visant au même but antérieurement connus, en ce qu'il permet la production desdits alcools à des concentrations égales ou supérieures à 1 %, sans provoquer d'inhibition de la croissance du microorganisme mis en oeuvre, en ce que ladite pro10 duction est réalisée aussi bien en cultures continues qu'en cultures discontinues du microorganisme et en ce qu'il permet la production d'alcools en présence de concentrations élevées de solvants organiques. La présente invention a pour objet un procédé de 15 production d'alcools, par bioconversion d'au moins un substrat constitué par des composés organiques oxygénés, à l'aide d'au moins un microorganisme thermophile anaérobie résistant aux alcools obtenus, à température élevée, de préférence comprise entre 40 et 75 C, et plus particulièrement à la tempé20 rature de croissance du ou des microorganisme(s) thermophile(s) anaérobie(s), en présence de concentrations égales ou supérieures à 1 % dudit produit final. Selon un mode de réalisation avantageux du procédé conforme à la présente invention, ledit substrat est soumis à 25 l'action de bioconversion d'au moins un microorganisme thermophile anaérobie, en présence d'un solvant organique liquide de préférence constitué par un alcool aliphatique inférieur ou une cétone, qui stimule la croissance et/ou la production de l'alcool obtenu en tant que produite final. Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé conforme à l'invention, ledit substrat est associé à un co-substrat constitué par un solvant pris dans le groupe des cétones et des aldéhydes. Selon une disposition avantageuse de ce mode de 35 réalisation, le substrat et le co-substrat sont associés à un solvant organique liquide, de préférence constitué par un -5 alcool aliphatique inférieur ou une cétone. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux du procédé conforme à l'invention, ledit substrat est constitué par au moins un saccharide pris dans le groupe qui 5 comprend les pentoses, les hexoses, et autres glucides, qui est soumis à l'action de bioconversion d'au moins un microorganisme thermophile anaérobie résistant au produit organique réduit obtenu, pour fournir un alcool aliphatique inférieur tel que l'éthanol, à une concentration égale ou supé10 rieure à 1 % et pouvant atteindre au moins 5 % (v/v) dans le système de bioconversion. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, le système de bioconversion comprend en outre un allcool aliphatique inférieur ou une cétone qui joue le rôle 15 de stimulant de la croissance du microorganisme, et/ou de la production de l'alcool aliphatique inférieur recherché en ant que produit final. Selon une modalité préférée de cette disposition, l'alcool aliphatique inférieur ou la cétone qui joue le rôle 20 de stimulant de la croissance du microorganisme, est pris dans le groupe qui comprend le méthanol, l'éthanol, l'isopropanol, le butanol et l'acétone. Conformément à l'invention, l'alcool qui joue le rôle de stimulant est présent dans le système de bioconver25 sion à une concentration comprise entre 0,1 et 892 % en volume et plus particulièrement comprise entre 0,1 et 5 % en volume dans le cas o le méthanol est utilisé comme stimulant et entre 0,1 et 8,2 % en volume dans le cas o l'éthanol est utilisé comme stimulant. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le système de bioconversion comprend un substrat constitué par au moins un saccharide, un microorganisme thermophile anaérobie et un co-substrat pris dans le groupe qui comprend les aldéhydes et les cétones, et qui est avantageu35 sement constitué par de l'acétone. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, le système de bioconversion comprend en outre ur. solvant organique liquide avantageusement constitué par un alcool aliphatique inférieur, pris, de préférence, dans le groupe qui comprend le méthanol et l'éthanol, le produit fi5 nal obtenu par bioconversion étant essentiellement de l'isopropanol. Conformément à ce mode de réalisation de l'invention, le co-substrat tel que l'acétone est présent à une concentration de 0,1 à 6 % en volume environ dans le système de 10 bioconversion. Egalement conformément à l'invention, lorsque le substrat constitué par un saccharide et le co-substrat avantageusement constitué par de l'acétone sont associés à un solvant organique liquide constitué par un alcool aliphatique 15 inférieur ou par une cétone, l'alcool aliphatique inférieur ou la cétone est présent à une concentration comprise entre 0,1 et 8,2 % en volume, et plus particulièrement à une concentration comprise entre 0, 1 et 5 % en volume dans le cas du *-;h anol et de 0,1 à 8,2 % en volume dans le cas de l'étha20 nol. Conformément à l'invention, le microorganisme thermophile anaérobie mis en oeuvre dans le système de bioconversi-n est de préférence constitué par une souche mutante de Clostridium thermohydrosulfuricum, dénommée souche 39 EA, dé25 posée dans la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le N I-226 en date du 16 Juin 1983, obtenue après transferts successifs de la souche sauvage de C thermohydrosulfuricum 39 E dans des milieux de culture contenant des concentrations croissantes 30 d'éthanol, et isolement sur milieu solide contenant 6 % d'éthanol. Les caractéristiques comparées de croissance de la souche mutante 39 EA et de la souche sauvage 39 E sont reproduites dans le tableau I ci- dessous, qui fournit les données 35 obtenues respectivement en ce qui concerne la croissance de la souche 39 E et de la souche mutante 39 EA sur un milieu -7 CM 3-3 contenant 5 g/litre de xylose et 5 g/litre d'extrait de levure, en l'absence de solvants, par incubation pendant-24 heures à 62 C, sans agitation. TABLEAU I Comparaison de la croissance des souches 39 E et 39 EA en l'absence de solvants 15 Croissance Produits finaux (m M) Souche DO p H à 540 nm Ethanol Lactate Acétate 39 E 1,05 6,5 41 18 7 39 EA 1,05 6,4 17 22 Le tableau II qui va suivre montre l'action de fermentation exercée par la souche mutante 39 EA sur différents saccharides, sur milieu CM 3-3 contenant 5 g/litre de substrat (saccharide), 5 % d'éthanol (v/v) et 5 g/litre d'extrait de 20 levure, par incubation pendant 24 heures à 62 C, sans agitation - -8 TABLEAU II Fermentation de saccharides par la souche mutante 39 EA en présence de 5 % d'éthanol (v/v) 15 Substrat Croissance p H final (DO à 540 nm) Sans substrat 0,1 7,5 Glucose 1,2 6,3 , Cellobiose 1,0 6,4 Fructose 0,9 6,4 Xylose 1,0 6,5 Lactose 1,0 6,5 Les caractéristiques de croissance de la souche mutante 39 EA sont, en outre, représentées dans les figures 1 à 3 annexées, dans lesquelles: la figure 1 repr 6 sente par des courbes, l'influence de la concentration d'éthanol dans le milieu de bioconversion, 25 sur la croissance de la souche 39 EA, en fonction de la température, la figure 2 représente par des courbes, la relation entre le taux de croissance de la souche 39 EA, la température et la concentration d'éthanol dans le milieu de bioconversion, 30 et la figure 3 représente par des courbes, l'effet de la concentration d'éthanol dans le milieu de bioconversion, sur le rapport du taux de croissance en présence d'éthanol/ taux de croissance en l'absence d'éthanol. Cet effet est caractérisé par le rapport du taux de croissance de l'essai en présence d'éthanol indiqué par: 2549854 ' -9 (gtest léthanoll) sur le taux de croissance en l'absence d'éthanol, pour la souche 39 EA, en fonction de la température. Cet effet est aussi montré pour la souche 39 E à 65 C. Selon un autre mode de réalisation avantageux du 5 procédé conforme à la présente invention, la souche mutante 39 EA est associée à des microorganismes ou des enzymes aptes à dégrader d'autres saccharides que les pentoses, les hexoses, et autres glucides solubles, et notamment à des microorganismes ou des enzymes aptes à dégrader la cellulose et 10 l'hémicellulose en sucres solubles (par exemple cellobiose, glucose, xylobiose et xylose). Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, le substrat est constitué par de la cellulose ou de l'hémicellulose. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, les microorganismes aptes à dégrader la cellulose et l'hémicellulose en hexoses, pentoses et autres glucides solubles, sont des microorganismes exerçant une activité cellulolytique tels que, notamment, Clostridium thermiocel20 lum souche LQRI et les enzymes cellulolytiques sont de préfér'-ce des complexes cellulasiques ou hémicellulasiques. Conformément à l'invention, le système de bioconv Pion constitué par un substrat du type de la cellulose, par au moins un microorganisme ou une enzyme apte à dégrader 25 la cellulose et les hémicelluloses en hexoses, pentoses et autres glucides solubles et par la souche mutante 39 EA utilisant des pentoses, des hexoses et autres glucides résultant de la dégradation de la biomasse cellulosique, comprend, en outre, un solvant, avantageusement constitué par un alcool 30 aliphatique inférieur pris, de préference, dans le groupe qui comprend le méthanol et l'éthanol ou une cétone, qui joue un rôle de stimulant de la croissance des cellules de la souche mutante 39 EA. Egalement conformément à l'invention, le système de 35 bioconversion comprenant un substrat cellulosique, au moins un microorganisme ou une enzyme apte à dégrader la cellulose -10 ou l'hémicellulose en hexoses, pentoses et autres glucides solubles et la souche mutante 39 EA utilisant les sucres résultant de la dégradation de la biomasse cellulosique, comprend, en outre, un co-substrat pris dans le groupe des aldé5 hydes et des cétones. Un tel système de bioconversion comprenant, conformément à l'invention, un substrat cellulosique, un solvant stimulant tel que défini plus haut, l'acétone comme cosubstrat, la souche mutante 39 EA et un microorganisme apte à 10 dégrader la cellulose ou l'hémicellulose en hexoses et pentoses solubles, permet la production d'isopropanol. Selon une modalité avantageuse de cette disposition, l'alcool aliphatique inférieur ou la cétone utilisés comme solvant, est présent à une concentration comprise entre 15 0,1 et 8,2 % en volume et de préférence à une concentration comprise entre 0,1 et 5 % dans le cas du méthanol et de 0,1 à 8,2 % dans le cas de l'éthanol, ou dans le cas de l'acétone de 0,1 à 6 % environ. Selon une autre modalité avantageuse de cette dis20 position, le cosubstrat est présent à une concentration de l'ordre de 1 à 6 % environ en volume. Conformément à l'invention, le produit final obtenu par bioconversion peut être récupéré à la température à laquelle il est produit, qui est, de preférence, comprise entre 25 40 et 75 C, par distillation dudit produit, qui est volatil, en continu, sous pression réduite. Egalement conformément à-l'invention, la souche mutante 39 EA et/ou les microorganismes exerçant une activité cellulolytique est ou sont mis en oeuvre en culture continue 30 ou discontinue ou sous forme de cellules immobilisées. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complé35 ment de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente inven- -li tion. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples de mise en oeuvre sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 Production d'éthanol en l'absence de solvants dans le système de bioconversion 1 Production de la souche mutante 39 EA de C thermohydrosulfuricum. La souche sauvage 39 E de C thermohydrosulfuricum est peu résistante à l'éthanol et il a été établi que sa croissance est fortement inhibée lorsque la concentration d'é;hanol dépasse 2 % en volume. La souche mutante 39 EA a été améliorée génétique15 mer t pour être rendue résistante à l'éthanol Elle a été obteïlue par transferts successifs de la souche sauvage 39 E dans des milieux de culture contenant des concentrations croissanten d'éthanol et elle a été ensuite isolée sur milieu solide contenant 6 % d'éthanol Ses caractéristiques de croissance, 20 ccaparées à celles de la souche sauvage 39 E ont été réunies dans les tableaux I et II ci-dessus et dans la figure 3. 2 Production d'éthanol La souche mutante 39 EA pousse sur les mêmes milieux de culture que la souche sauvage 39 E et notamment sur un mi25 lieu CM 3-3 dont la composition, en g par litre, est la suivante: KH 2 PO 4: 1,5; X 2 HPO 4: 2,2; (NH 4)2 SO 4: 1,3; Mg C 12, 6 H 20: 0,1; Ca C 12 2 H 20: 0,01; Na HCO 3: 5; Fe SO 4 7 H 20: 0,0025; cystéine H Cl ou sulfure de 30 sodium: 0,5; Extrait de levure (Difco): 5; Sources de carbone (habituellement xylose ou glucose): 5, stérilisées à 110 C pendant 30 minutes avant d'être introduites dans le milieu; 1 ml d'une solution à 0,2 % de resazurine. La préparation du milieu se fait sous flux d'un mé- 2549854 ' -12 lange N 2-C 02 ( 95 % 5 %). Le p H initial du milieu complet est égal à 7,4-7,5. Alors que le rendement maximum d'éthanol obtenu par bioconversion de glucose par la souche sauvage 39 E est de 1,6 5 à 1,8 (éthanol/glucose: mole/mole) et qu'il diminue considérablement lorsqu'on ajoute une faible proportion d'éthanol, contrairement à celà, le meilleur rendement obtenu à ce jour avec la souche mutante 39 EA (éthanol/glucose: mole/mole) est sensiblement constant jusqu'à 4 % environ d'éthanol (% poids10 /volume), avec un maximum à 2 %, ainsi que cela ressort des tableaux III à V qui vont suivre. w w CD o n CD Un TABLEAU III Influence de la concentration initiale d'éthanol sur le bilan fermentaire de la fermentation du glucose par la souche mutante 39 EA de Clostridium thermohydrosulfuricum tolérante aux solvants. Formation de produits Croissance (imoles/10 ml) Carbone Ethanol (DO à p H Glucose _ récupéré (% Poids/Vol) 660 nm) consommé Lactate Ethanol Acétate CO 2 (%) 0 0,75 5,0 164 130 150 17 154 92 0,8 0,70 5,1 155 132 135 13 104 94 2,0 0,76 5,0 211 137 217 15 233 90 4,0 0,60 5,0 147 129 116 14 131 87 i N VJI %O o$ -14 Les résultats réunis dans le tableau III ci-dessus ont été obtenus dans les conditions suivantes: on a introduit dans des tubes résistants à la pression, pour cultures anaérobies, 10 ml de milieu TYE (contenant en g/l): NH 4 Cl: 1,0; KH 2 PO 4: 0,3; Na 2 HPO 4, 7 H 20: 2,1; Mg C 12, 6 H 20: 0,2; Bactotryptone: 10; Yeast Extract: 3,0; Fe SO 4: 0, 000625; 5 ml d'une solution de vitamines contenant en g/1: Biotine: 0,002; acide folique: 0,002; pyridoxine-H Cl: 0,001; thiamine, H Cl: 0,005; riboflavine: 10 0,005; acide nicotinique: 0,005; acide pantothénique: 0, 005; vitamine B 12 (cyanocobalamine) cristalline: 0,0001; acide paraaminobenzoïque: 0,005; acide lipoïque: 0,005; ml d'une solution d'élements minéraux contenant en g/l acide nitrilotriacétique: 12,8; Fe SO 4, 7 H 20: 0,1; Mn C 12, 4 H 20: 0,1; Co C 12, 6 H 20: 0,17; Ca C 12, 2 H 20: 0,1; Zn C 12: 0,1; Cu Cl 2: 0,02; H 3 BO 3: 0,01; Na Molybdate: 0, 01; Na Cl: 1,0; Na 2 Se O 3: 0,017; Ni SO 4, 6 H 20: 0,026; 1 ml d'une solution à 0,2 % de résazurine. Le p H est amené à 7,2-7,4 Après ébullition, on re20 froidit et dispense 9,6 ml de milieu par tube de culture arnaerobie sous flux N 2-CO 2 ( 95: 5) On autoclave 30 minutes è 120 C On ajoute au moment de l'emploi 0,25 ml de Na 25,,M 20 à 25 g/l Le milieu est supplémenté avec 220 M de glucose, 2 Curie de 14 C-UL glucose. Après inoculation de la souche mutante 39 EA, les tubes ont été incubés pendant 36 heures à 63 C, sans agitation La formation des produits a été déterminée par analyse de la radioactivité dans les produits finaux, après séparation par chromatographie en phase liquide sous haute pression 30 (EHPLC) Les résultats qui figurent dans le tableau III représentent la moyenne de deux expériences. -15 TABLEAU IV Influence de la concentration initiale d'éthanol sur le bilan des produits de la fermentation du glucose par la souche mutante 39 EA de C thermohydrosulfuricum. c D 15 Ethanol (en %, poids/vol) O 0,8 2,0 4,0 Produit (en m M \ m M glucose consommé) Lactate 80 86 66 82 Acetate 10,4 9,0 7,2 9,5 Anhydride carbonique 99 93 111 94 Ethanol 92 84 99 74 Rapport Ethanol/glucose (mole/mole) 0,92 0,84 0,99 0,74 Nota: 1) Les résultats ci-dessus ont été calculés à partir 20 des résultats indiqués dans le tableau III. 2) Avec la souche sauvage 39 E, on n'observe pas de croissance en présence de 2,0 % d'éthanol (vol/vol); pour une addition initiale d'éthanol égale à O %, le rapport éthanol/glucose est de 1,6 (mole/mole) et pour une addition de 25 1,6 % d'éthanol, ce rapport devient égal à 0,63. EXEMPLE 2 Production d'éthanol en présence de solvants dans le système de bioconversion La souche mutante 39 EA, de même d'ailleurs que la souche sauvage 39 E, sont plus ou moins affectées dans leur 30 croissance et leur production de métabolites, en particulier leur production d'éthanol, lorsqu'elles sont cultivées dans des systèmes de bioconversion contenant des concentrations plus ou moins élevées de différents solvants. Le tableau V ci-après montre l'influence qu'exer35 cent différents solvants (donnés à titre d'exemples non limitatifs), présents à différentes concentrations, sur la crois- 2549854 ' -16 sance de la souche 39 E et de la souche 39 EA, respectivement. Les données réunies dans ce tableau ont été obtenues par incubation desdites souches à 62 C, pendant 24 heures, sans agitation, sur un milieu CM 3-3 contenant 5 g/ litre de xylose et 5 g/litre d'extrait de levure. w Ln w CO t 1 tni >J O o C l TABLEAU V Comparaison de l'influence exercée par différentes concentrations de solvants sur la croissance des souches 39 E et 39 EA de C thermohydrosulfuricum SOLVANTS % (v/v) Sou che METHANOL ETHANOL ISOPROPANOL BUTANOL ACETONE 0 1 2 5 O 1 2 4 6 O 1 2 5 O 1 2 5 O 1 2 4 5 6 39 E DO 0,41 0,31 0,21 O 0,9 O O 01,58 0,76 0,25 O 1,1 0,1 O 0,71 0,72 0, 74 O O O 39 EA nnm 0,73 0,82 0,79 0,73 0,82 0,88 0,88 0,76 0,05 0,9 0,95 0,85 O 0, 9 1,0 0,13 O 0,9 1,12 1,22 1,15 1,05 0,09 I NM V It OD Lan -18 I 1 ressort de ce tableau qu'alors que la croissance de la souche 39 E est totalement inhibée en présence de méthanol ou d'acétone présents à une concentration de 5 %, en présence d'éthanol présent à une concentration de 4 %, en pré5 sence d'isopropanol présent à une concentration de 2 %, et en présence de butanol à une concentration de 1 %, la croissance de la souche 39 EA n'est pas inhibée aux mêmes concentrations de ces solvants De plus, la croissance de 39 EA est stimulée par l'addition des alcools et cétone testés. Il y a lieu de mentionner que l'addition de solvant dans le milieu de bioconversion peut être réalisée indifféremment soit au début, soit à la fin de la fermentation. Il peut être avantageux de réaliser l'opération sous vide partiel, car dans de telles conditions, le solvant 15 ajouté peut jouer un rôle d'entraînement du composé final produit, facilitant ainsi la récupération de ce dernier en provoquant la formation d'un azéotrope ternaire, par exemple. EXEMPLE 3 Production d'éthanol en continu en présence d'une concentration élevée de méthanol dans le système 20 de bioconversion L'addition de 5 % de méthanol (V/V) dans le système de bioconversion se prête à une culture continue de C thermohydrosulfuricum 39 EA et à une production résultante continue d'éthanol Dans ces conditions, le méthanol peut servir, 25 en fin d'opération, d'entraînement pour la récupération de l'éthanol produit, par formation d'un azéotrope ternaire qui permet la distillation, sous vide partiel, de l'éthanol produit; en effet, la croissance de la souche 39 EA ayant lieu à des températures élevées (de l'ordre de 62 C, par exemple), 30 de telles températures sont propices à la récupération en continu de l'éthanol produit. Le tableau VI ci-après montre la production d'éthanol dans une culture continue de 39 EA en présence de 5 % de méthanol (v/v) La croissance de 39 EA est réalisée sur un mi35 lieu CM 3-3 contenant 5 g/litre d'extrait de levure et 5 % de méthanol (v/v), avec diverses concentrations de xylose, à une 2549854 ' -19 température de 62 'C, un p H de 7,0, sous agitation à 100 tours/minute, dans un fermenteur d'un volume de 350 ml On maintient un flux de CO 2 de l'ordre de 5 ml/minute. TABLEAU VI Production continue d'éthanol par fermentation de xylose dans une culture continue de C thermohydrosulfuricum 39 EA en présence de 5 % de méthanol (v/v). 15 20 Concentration Xylose rési Taux de Ethanol de xylose dans duel dans le dilution DO à produit le milieu d'en fermenteur D 540 nm (m M) trée (g/litre) (g/litre) (h-1) 2 non mesuré 0,19 0,54 13,5 0,68 0,26 0,41 3,2 0,19 0,9 11,5 5,9 0,19 2,2 11,1 15,35 0,19 2,15 12,4 L'éthanol peut être récupéré en phase vapeur à sa température de production ( 60 à environ 75 C) et est conti25 nuellement entraîné de la phase liquide dans la phase vapeur en faisant passer un gaz inerte dans le fermenteur. EXEMPLE 4 Production d'isopropanol en présence d'un co-substrat constitué par l'aqétone On trouvera dans le tableau VII qui va suivre les 30 résultats obtenus respectivement avec un système de bioconversion comprenant la souche sauvage 39 E et avec un système de bioconversion comprenant la souche mutante 39 EA. Les opérations respectives ont été menées en discontinu, en inoculant la souche testée sur un milieu CM 3-3 35 contenant 5 g/litre de xylose, 5 g/litre d'extrait de levure et 1 % ou 5 % (vol/vol) d'acétone et en incubant pendant 24 -20 heures à 62 C, sans agitation TABLEAU VII Comparaison de la production d'isopropanol par fermentation de xylose respectivement par les souches 39 E et 39 EA en présence d'acétone. 15 20 Crois Concentration Produits finaux (m M) sance en acétone p H Souche (DO à % Iso Acé Lac540 nm) vol/vol pro tate tate panol 39 E 0,9 1 6,1 63 37 6 39 EA 1,2 1 6,0 69 32 6 39 E 0 5 39 EA 1,05 5 125 EXEMPLE 5 Production d'isopropanol en présence d'un co-substrat et d'un solvant. La souche mutante 39 EA de C thermohydrosulfuricum est mise en culture continue sur un milieu de culture CM 3-3 25 contenant différentes concentrations de xylose, 5 g/litre d'extrait de levure, 1 % d'acétone (vol/vol) comme cosubstrat et différentes concentrations d'éthanol comme solvant, à une température de 62 C, à un p H de 7,0, sous agitation à 100 tours/minute, dans un fermenteur d'un volume de 30 350 ml Les résultats obtenus sont réunis dans le tableau VIII ci-après. -21 TABLEAU VIII Production continue d'isopropanol par fermentation de xylose dans une culture continue de C thermohydrosulfuricum 39 EA en présence de fortes concentrations d'éthanol et de 1 % d'acétone (v/v) 15 20 Concentration Concentration Concentrad'éthanol de xylose DO tion d'isodans le milieu dans le milieu D(h-1) ( 540 nm) propanol d'entrée d'entrée produit (% vol/vol) (g/litre) (m M) ô ______z _à_T 2 0,09 1,3 33 3,3 2 0,2 1,27 46 2 0,44 1,24 45 ,5 5 0,13 1,38 66 7,2 5 0,07 1,45 76 EXEMPLE 6 Production de metabolites présentant un intérêt industriel par fermentation de la cellulose par des co-cultures de souche mutante 39 EA et de souches c 1 llulolytiques. Ainsi qu'on l'a mentionné plus haut, on sait que la fermentation de la cellulose par une co-culture de Clostridium thermocellum LQRI et de Clostridium thermohydrosulfuri30 cum 39 E ne permet pas d'obtenir des concentrations d'éthanol supérieures à 1 %, la croissance de C thermocellum étant, par ailleurs, inhibée en présence de concentrations d'éthanol d'environ 1 %. On a introduit dans des tubes pour cultures anaéro35 bies, 10 ml de milieu CM 3-3, 1 % d'acétone, 1 % de méthanol (v/v) et 0,2 g de cellulose (de marque "SOLKA FLOC"). 2549854 ' -22 Une première série de tubes a été inoculée par 1 ml de culture de 39 EA ayant poussé sur milieu TYE contenant 5 g/litre de glucose et 5 % d'éthanol (v/v). Une deuxième série de tubes a été inoculée par 1 ml de culture de LQRI ayant poussé sur milieu CM 3-3. Une troisième série de tubes a été inoculée à la fois par 1 ml de culture de 39 EA et par 1 ml de culture de LQRI. Les trois séries de tubes ont été incubées pendant 10 5 jours à 60 C, sans agitation. Les résultats obtenus sont réunis dans le tableau IX ci-après: TABLEAU IX Fermentation de la cellulose respectivement par des monocul15 tures et par des co-cultures de C thermohydrosulfuricum souche 39 EA et de C thermocellum souche LQRI, en présence de concentrations élevées de solvants. 25 Produits de fermentation (m M) Conditions __. Ethanol Acétate Isopropanol Pas d'inoculation 5 39 EA 41 LQRI 5 31 63 39 EA + LQRI 43 41 85 Il ressort de ce tableau que dans ce milieu contenant des concentrations élevées de solvants ( 1 % de méthanol 30 et 1 % d'acétone): (i) la souche LQRI pousse sur cellulose (croissance mise en évidence par la formation d'acétate) et convertit une partie de l'acétone en isopropanol et (ii) dans le cas de la co-culture de 39 EA avec LQRI, la croissance est plus importante (production supérieure d'acétate) et, de 35 plus, la production d'isopropanol est plus élevée; cela montre que les dextrines ou hexoses obtenus par dégradation de 2549854 ' -23 la cellulose par C thermocellum sont utilisés par la souche 39 EA pour la croissance (production d'acétate) et pour la production d'isopropanol. Les composés produits par bioconversion conformé5 ment à la présente invention peuvent être récupérés assez facilement avec une consommation d'énergie faible, et sont obtenus à des concentrations supérieures à celles que permettent d'atteindre les procédés proposés dans l'Art antérieur, donc avec des rendements de production nettement améliorés. De plus, la possibilité de réaliser la bioconversion à l'aide de cultures continues du microorganisme permet une réduction des investissements en appareillages. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en 15 oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. 2549854 ' -24 REVENDICATIONS 1 ) Procédé de production d'alcools par bioconversion d'au moins un substrat constitué par des composés organiques oxygénés, à l'aide d'au moins un microorganisme ther5 mophile anaérobie résistant aux alcools obtenus, à température élevée, de préférence comprise entre 40 et 75 C, et plus particulièrement à la température de croissance du ou des microorganisme(s) thermophile(s) anaérobie(s), en présence de concentrations égales ou supérieures à 1 % dudit produit fi10 nal. 2 ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit substrat est soumis à l'action de bioconversion d'au moins un microorganisme thermophile anaérobie, en présence d'un solvant organique liquide de préférence consti15 tué par un alcool aliphatique inférieur ou une cétone, qui stimule la croissance et/ou la production de l'alcool obtenu en tant que produit final. 3 ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit substrat est associé à un co-substrat consti20 tué par un solvant pris dans le groupe des cétones et des aldéhydes. 4 ) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le substrat et le co-substrat sont associés à un solvant organique liquide de préférence constitué par un al25 cool aliphatique inférieur ou une cétone. o) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit substrat est constitué par au moins un saccharide pris dans le groupe qui comprend les pentoses, les hexoses, et autres glucides, qui est soumis à l'action de 30 bioconversion d'au moins un microorganisme thermophile anaérobie résistant au produit organique réduit obtenu, pour fournir un alcool aliphatique inférieur à une concentration égale ou supérieure à 1 % et pouvant atteindre au moins 5 % (v/v) dans le système de bioconversion. 6 ) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le système de bioconversion comprend en outre un -25 solvant constitue par-un alcool aliphatique inférieur ou une cétone, qui joue le rôle de stimulant de la croissance du microorganisme, et/ou de la production de l'alcool aliphatique inférieur recherché en tant que produit final. 7 ) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le système de bioconversion comprend en outre un co-substrat constitue par un solvant pris dans le groupe des cétones et des aldéhydes. 8 ) Procédé selon la revendication 7, caractérisé 10 en ce que le système de bioconversion comprend en outre un solvant constitue par un alcool aliphatique ou une cétone, qui stimule la bioconversion du co-substrat mis en oeuvre. 9 ) Procédé selon la revendication 6 ou la revendication 8, caractérisé en ce que l'alcool aliphatique infé15 rieur ou la cétone qui joue le rôle de stimulant de la croissance du microorganisme, est pris dans le groupe qui comprend le m&thanol, l'éthanol, l'isopropanol, le butanol et l'acétone. ") Procèdé selon la revendication 9, caractérisé 20 en ce que l'alcool ou la cétone qui joue le rôle de stimulant est présent dans le système de bioconversion à une concentration comprise entre 0,1 et 8,2 % en volume. 11 ) Procédé selon la revendication 10, caractérise en ce que dans le cas o le méthanol est utilisé comme stimu25 lant, sa concentration dans le système de bioconversion est comprise entre 0,1 et 5 % en volume. 12 ) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que dans le cas o l'éthanol est utilisé comme stimulant, sa concentration dans le système de bioconversion est 30 comprise entre 0,1 et 8,2 % en volume. 13 ") Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que dans le cas o l'acétone est utilisé comme cosubstrat, sa concentration dans le système de bioconversion est comprise entre 0,1 et 6 % en volume. 14 ) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le système de bioconversion comprend un substrat -26 constitué par au moins un saccharide, un microorganisme thermophile anaérobie, un co-substrat pris dans le groupe qui comprend les aldéhydes et les cétones, et qui est avantageusement constitué par de l'acétone, et le produit final obtenu est essentiellement de l'isopropanol. ) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le système de bioconversion comprend un substrat constitué par au moins un saccharide, un microorganisme thermophile anaérobie, un co-substrat pris dans le groupe qui 10 comprend les aldéhydes et les cétones, et est avantageusement constitué par de l'acétone, et un solvant organique liquide avantageusement constitué par un alcool aliphatique inférieur pris, de préférence, dans le groupe qui comprend le méthanol, l'éthanol et le butanol, le produit final obtenu par biocon15 version étant essentiellement de l'isopropanol. ) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le co-substrat avantageusement constitué par de l'acétone est présent à une concentration de 0,1 à 6 % en volume dans le système de bioconversion, et l'isopropanol est 20 produit à des concentrations comprises entre 0,1 et plus de 2 % (v/v). ) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'isopropanol est produit à une concentration d'environ 6 % (v/v). 18 ") Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que le cosubstrat tel que l'acétone est présent à une concentration de 0,1 à 6 % en volume dans le système de bioconversion, et l'alcool aliphatique inférieur est présent à une concentration comprise entre 0,1 et 8,2 % en volume, et 30 plus particulièrement à une concentration comprise entre 0, 1 et 5 % en volume dans le cas du méthanol et de 0,1 à 8,2 % en volume dans le cas de l'éthanol, pour produire de l'isopropanol à une concentration comprise entre 0,1 et plus de 2 % (v/v). 19 ) Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'isopropanol est produit à une concentration d'en- 2549854 ' -27 viron 6 % (v/v). ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, caractérise en ce que le microorganisme thermophile anaérobie mis en oeuvre dans le système de bioconver5 sion est de préférence constitué par une souche mutante de Clostridium thermohydrosulfuricum, dénommée souche 39 EA, déposée dans la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur, sous le N I-226 en date du 16 Juin 1983, obtenue après transferts successifs de 10 la souche sauvage de C thermohydrosulfuricum 39 E dans des milieux de culture contenant des concentrations croissantes d'éthanol, et isolement sur milieu solide contenant 6 % d'éthanol. 21 ) Procédé selon la revendication 20, caractérisé 15 en ce que la souche mutante 39 EA est associée à des microorganismes ou des enzymes aptes à dégrader d'autres saccharides que les pentoses, les hexoses, et autres glucides, et notamment à des microorganismes ou des enzymes aptes à dégrader la cellulose et l'hémicellulose en sucres solubles. 22 ) Procédé selon la revendication 21,-caractérisé en ce que le substrat est constitue par de la cellulose ou de l'hémicellulose. 23 ) Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que les microorganismes aptes à dégrader la cellulose 25 et l'hémicellulose en hexoses, pentoses et autres glucides solubles sont des microorganismes exerçant une activité cellulolytique tels que, notamment, Clostridium thermocellum souche LQRI et les enzymes cellulolytiques sont de préférence des complexes cellulasiques ou hémicellulasiques pour produi30 re un alcool aliphatique inférieur comme l'éthanol à une concentration égale ou supérieure à 1 % dans le système de bioconversion, jusqu'à au moins 5 % (v/v). 24 ) Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que le système de bioconversion comprenant un substrat 35 du type de la cellulose ou de l'hémicellulose, au moins un microorganisme ou une enzyme apte à dégrader l'hémicellulose -28 et la cellulose en hexoses, pentoses et autres glucides solubles et la souche mutante 39 EA utilisant les hexoses, les pentoses et autres glucides résultant de la dégradation de la biomasse cellulosique, comprend, en outre, un solvant, avan5 tageusement constitué par un alcool aliphatique inférieur pris, de préférence, dans le groupe qui comprend le méthanol et l'éthanol, qui joue un rôle de stimulant de la croissance des cellules de la souche mutante 39 EA. ') Procédé selon la revendication 21, caractérisé 10 en ce que le système de bioconversion comprenant un substrat cellulosique, au moins un microorganisme ou une enzyme apte à dégrader la cellulose ou l'hémicellulose en hexoses, pentoses et autres glucides solubles et la souche mutante 39 EA, comprend, en outre, un co-substrat pris dans le groupe des aldé15 hydes et des cétones. 260) Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que le système de bioconversion comprenant un substrat cellulosique, au moins un microorganisme ou une enzyme apte à dégrader l'hémicellulose et la-cellulose en pentoses, hexoses 20 et autres glucides solubles et la souche mutante 39 EA de bioconversion des pentoses, des hexoses et autres glucides résultant de la dégradation de la cellulose ou de l'hémicellulose, comprend, en outre, un co-substrat pris dans le groupe des aldéhydes et des cétones et un solvant avantageusement 25 constitué par un alcool aliphatique inférieur pris, de préférence, dans le groupe qui comprend le méthanol et l'éthanol, ou le butanol, l'alcool aliphatique inférieur obtenu en tant que produit final étant, dans le cas o l'acétone est le cosubstrat, essentiellement de l'isopropanol. 27 ) Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que le cosubstrat est présent à une concentration de l'ordre de 0,1 à 6 % environ en volume. -28 ) Procédé selon la revendication 24 ou la revendication 26, caractérisé en ce que l'alcool aliphatique infé35 rieur ou la cétone utilisés comme solvant, sont présents à une concentration comprise entre 0,1 et 8,2 % en volume et de -29 préférence à une concentration comprise entre 0,1 et 5 % dans le cas du méthanol et de 0,1 à 8,2 % dans le cas de l'éthanol et de 0,6 % dans le cas de l'acétone. 29 ") Procédé selon l'une quelconque des revendica5 tions 21 à 28, caractérisé en ce que dans le cas o on utilise pour dégrader la cellulose ou l'hémicellulose une enzyme de préférence constituée par des complexes cellulasiques ou hémicellulasiques, ceux-ci sont récupérés, une fois la bioconversion réalisée, pour être recyclée dans une nouvelle 10 charge de bioconversion. ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 29, caractérisé en ce que le produit final obtenu par bioconversion est récupéré à la température à laquelle il est produit, qui est, de préférence comprise entre 40 et 75 C, 15 par distillation dudit produit, qui est volatil, en discontinu ou continu, sous pression réduite et éventuellement avec fluage de gaz inerte à travers le fermenteur. 31 ') Procédé sel On l'une quelconque des revendicaticons 1 à 30, caractérisé en ce que le ou les microorganis20 me(s) mis en oeuvre dans la bioconversion est ou sont en culture continue ou discontinue ou sous forme de cellules immobilisées ou dans un système équivalent. 320) Souche mutante de Clostridium thermohydrosulfuricum, dénommée souche 39 EA, déposée dans la Collection Na25 tionale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur, sous le N* I-226 en date du 16 Juin 1983, obtenue après transferts successifs de la souche sauvage de C thermohydrosulfuricum 39 E dans des milieux de culture contenant des concentrations croissantes d'éthanol et isolement sur mi30 lieu solide contenant 6 % d'éthanol. 330) Alcool aliphatique inférieur produit par la souche 39 EA ou une souche équivalente ou dérivée, mettant en oeuvre une ou plusieurs étapes du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 31. 340) Souche mutante 39 EA selon la revendication 32, capable de produire de l'éthanol ou de l'isopropanol à une -30 concentration supérieure à 1 % à partir d'hexoses ou de pentoses ou autres glucides. 350) Souche mutante selon la revendication 32, capable de produire de l'éthanol ou de l'isopropanol à une con5 centration supérieure à 4 % à partir d'hexoses ou de pentoses ou d'autres glucides. 36 ) Souche mutante 39 EA selon la revendication 32, capable de produire de l'éthanol ou de l'isopropanol à une concentration supérieure à 1 % en utilisant des hexoses, des 10 pentoses ou d'autres glucides obtenus par hydrolyse de biomasse cellulosique.