FR 2559782 A1 19850823 FR 8402350 A 19840216 La présente invention concerne des vecteurs d'expres- sion de l'interleukine-2 dans les levures et la préparation de cette hormone par fermentation. L'interleukine-2 (ci-après IL-2) est une hormone immuno modulatrice. Cette hormone provoque la multiplication des lymphocytes impliqués dans les défenses de l'organisme. L'administration d'IL-2 s'est révélée capable de restaurer les défenses immunitaires de souris dépourvues de thymus, c'est pourquoi IL-2 est potentiellement capable de restaurer les déficits immunitaires liés à certaines maladies, à certains traitements (en particulier radiothérapies) ou bien dans le cas des déficits chroniques. Chez l'individu sain i'IL-2 pourrait être capable d'augmenter les défenses immunitaires et permettre la pré- vention de certaines infections. De façon plus précise l'interleukine-2 appelée précédemment facteur de croissance des cellules T (TCGF) est une lymphokine qui est produite par les cellules T activées par la lectine ou les cellules T activées par antigène. De façon plus précise, son activité biologique comprend la stimulation de la croissance in-vivo à long terme des cellules T activées et l'augmentation de la mitogénèse des thymocites et l'induction de la réactivité des cellules T cytotoxiqueso Comme molécules de régulation, elle présente un rôle clé dans l'étude de la nature moléculaire de la différenciation des cellules T, le mécanisme de fonctionnement des cellules T différenciées de môme que des récepteurs d'antigènes des cellules T. Comme l'interféron il a été démontré que l'IL-2 augmente l'activité des cellules tueuses naturelles, ce qui suggère une utilité potentielle dans le traitement de certains néoplastes. En outre, l'effet synergique de 1'IL-2 dans l'activité antivirale de IFN-y a été décrite récemment. Les propriétés physicochimiques de i'IL-2 ont été bien caractérisées: la protéine d'IL-2 humaine présente un poids moléculairE de 15 000 avec quelques hétérogénéités dues à différents degrés de sialylation. La protéine présente une remarquable stabilité, elle supporte des températures jusqu'à 80 et garde son activité après traitement avec le SDS. La présente invention concerne plus particulièrement la préparation d'IL2 par fermentation de levures en utilisant à titre de souches de fermentation des levures transformées par des vecteurs d'expression plasmidiques particuliers. Le premier clonage d'IL-2 humain a été rapporté par Taniguchi et al (Nature, 302, 305) suivi par Devon et al (Nucl. Acids Res., 11, 4307) qui décrit également l'expression dans E. coli. Bien que les bactéries soient des hôtes de choix pour la préparation de protéines par les techniques de recombinaison génétique, on préfère en général utiliser comme cellules hôtes des cellules eucaryotes qui produisent des protéines de structure plus proche des protéines humaines. C'est pourquoi la présente invention concerne de nouveaux vecteurs d'expression de l'IL-2 humain sous forme mature et non fusionnée dans les levures. Plus particulièrement la présente invention concerne de nouveaux vecteurs d'expression dans les levures de la protéine mature IL-2 caractérisés en ce qu'ils comportent. dans le sens de lecture: - un promoteur de levure, - la séquence codant pour la protéine IL-2 mature sous le contrôle du promoteur. Parmi les promoteurs utilisables, il faut citer plus particulièrement le promoteur de la phosphoglycératekinase (ci-après dénommée PGK). Il est bien entendu possible d'utiliser d'autres promoteurs connus ou bien d'utiliser des promoteurs totalement ou partiellement synthétiques par exemple la séquence de jonction entre le promoteur de PGK et l'ATG de la séquence codant pour la protéine IL-2 mature peut être la suivante: ATATATAAACAAGATCTATG l'ATG ou codon d'initiation étant celui du gène codant pour IL-2 mature. Dans le cas particulier du gène IL-2 la présence sur le plasmide d'une séquence de terminaison particulière n'est pas nécessaire. Les vecteurs selon l'invention comporteront également de préférence une origine de réplication dans les levures par exemple l'origine de réplication du plasmide 2 pm de levure ainsi que l'ADN codant pour tout élément, n'agissant qu'en cis, et nécessaire à la réplication du plasmide 2 p. En outre il est intéressant de disposer sur un des vecteurs d'un gène codant pour un phénotype assurant une sélection des souches transformées. Ainsi les vecteurs selon l'invention comporteront par exemple le gène ura3 ou leu2 qui confère le phénotype ura3+ ou leu2+ aux levures transformées. Ce phénotype permet de sélectionner les levures transformées par les vecteurs en transformant, par exemple, des levures ura3 et en sélection- nant sur milieu sans uracile. 2559782 ' Comme une partie de la synthèse est effectuée en utilisant des bactéries hôtes, il est intéressant que les vecteurs selon l'invention comportent des éléments bactériens. Ainsi la présence d'une origine de réplication pour un plasmide permettra la réplication du vecteur dans les cellules bactériennes correspondantes, en particulier dans le cas de E. coli on utilisera une origine de réplication fonctionnelle dans E. coli (ori-eco). Le vecteur en cause peut également comporter un ou plusieurs gènes de résistance à des antibiotiques s'exprimant dans les bactéries, par exemple l'ampicilline dans le cas de pBR322, mais d'autres gènes de résistance peuvent être utilisés, résistance à la tétracycline (Tet), ou au chloramphénicol (Cmr). L'incorporation d'un tel gène marqueur est nécessaire pour la sélection des bactéries contenant les transformants porteurs du plasmide selon l'invention pendant les expériences de clonage. La présente invention concerne en outre les levures notamment les souches de Saccharomyces cereviseae transformrées par les vecteurs selon l'invention par des techniques connues et dont certaines seront rappelées dans les exemples. Enfin l'invention concerne un procédé de préparation dE IL-2 humain dans lequel on cultive sur un milieu de culture des levures transformées comme décrit précédemment et dans lequel on récupère ensuite l'IL-2 formée. Les milieux de culture mis en oeuvre sont connus de l'homme de métier et devront être adaptés à chaque souche cultivée. IL-2 peut être séparée par des techniques connues après éclatement des cellules. Mais il est particulièrement intéressant de mettre à profit l'hydrophobicité d'IL-2 qui fait qu'après éclatement des cellules et centrifugation, IL-2 tend à se rassembler dans le culot de centrifugation duquel elle peut être extraite à l'aide de SDS qui met IL-2 en solution. La présente invention comporte, bien entendu, d'autres aspects, notamment certains plasmides qui seront décrits dans les exemples ainsi que leurs mutants et dérivés et de façon générale les procédés de fermentation des levures transfor- mées ainsi que l'IL-2 ainsi obtenu. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris a la lecture des exemples ci-après et des dessins ci-annexés sur lesquels: - la figure 1 représente la stratégie permettant de préparer le plasmide pTG907, - la figure 2 représente la stratégie permettant de préparer le phage M13tg910, - la figure 3 représente la stratégie permettant de préparer le plasmide pTG908, - la figure 4 représente la stratégie de préparation de pTG909, - la figure 5 représente la stratégie de préparation de pTG941, - la figure 6 représente la stratégie de préparation de pTG951, - la figure 7 représente la séquence codant pour IL-2 selon Taniguchi, - la figure 8 représente la séquence codant pour IL-2 mis en oeuvre dans la présente invention, - la figure 9 représente l'insertion d'une séquence Accl dans TG26, - la figure 10 schématise la préparation de TG28, - la figure 11 représente la stratégie de préparation de pTG832, - la figure 12 représente la structure de pTG853. Il convient de remarquer que les différentes séquences de nucleotides figurant dans les dessins doivent être considérées comme faisant explicitement partie de la présente description, ces séquences n'ont pas été reproduites dans le corps du texte afin de ne pas l'alourdir inutilement. 1) Procédés généraux a) Souches bactériennes Les souches bactériennes utilisées dans le cadre de la présente invention sont les suivantes: 10. TGE900 qui est une souche de E. coli ayant les caractéristiques suivantes: su F his ilv bio ( N6437, souche de E. coli ayant les caractéristiques suivantes: F--his ilv gal+ A8proC: tnlO lacAml5 (XcI857ABamHI). 15. JM103 qui est une souche de E. coli ayant les caractéristiques suivantes: A(lac-pro) supE thi endA sbcB15 sttA rK-nK+ / F traD36 proAB lacia lacZAml5. b) Souches de levures Saccharomyces cereviseae segregeants TGYlspl TGY lsp4 toutes deux ura3, his 3. Les souches mentionnées précédemment ont été utilisées parce qu'elles étaient disponibles, mais il est bien entendu qu'il est possible d'utiliser d'autres souches dans la mesure o elles présentent certaines caractéristiques essentielles qui sont rappelées dans le cours de la description détaillée. b) Pré2aration des ADN Des mini-préparations d'ADN de plasmides ou de phages M13 sont effectuées comme cela est décrit par Ish-Horowitz (référence 1) à la seule différence que l'ADN est précipité une seconde fois avec de l'éthanol avant d'être utilisé. Les maxi-préparations sont effectuées comme cela est décrit dans la publication précédente, avec une purification complémentaire par un gradient de densité CsCl/bromure d'éthidium. c) Techniques de clonages Le traitement des ADN avec des enzymes de restriction est effectué, sauf indications contraires, en utilisant les conditions indiquées par le fabricant (New England Biolabs, Bethesda Research Laboratories et Boehringer Mannheim). Lorsque cela est nécessaire, les phosphates des extrémités 5' sont éliminés en utilisant, soit une phosphatase alcaline bactérienne, soit une phosphatase d'intestin de veau, pendant 30 minutes à 37 C dans le tampon d'enzyme de restriction. La réparation des extrémités cohésives utilisant la polymérase de Klenow (Boehringer Mannheim) est effectuée à C pendant 15 minutes dans un mélange de 50 mMol. Tris HC1, pH 7,8, 5 mMol. MgC12, 10 mMol. de B-mercaptoithanol, 0,4 mMol. de dNTPs avec l'enzyme et 10 à 200 pg/ml d'ADN. La nucliase Si (Miles) est utilisée i 2 u/pg d'ADN à 25'C pendant 30 minutes dans un milieu 0,3 Mol. NaCl, 0,03 Mol. NaOAc, pH 4,8, 0,003 Mol. ZnC12. BaI31 est utilisée selon le procédé de Panayotatos et al. (référence 2). Les ligations sont effectuées & 15C (sauf lorsque cela est indiqué différemment) pendant 4 & 24 heures en utilisant de 1'ADN ligase T4 (Boehringer Mannheim) avec mMol. de NaCl, 66 mMol. de Tris HCl, pH 7,5, 10 mMol. de MgC12, 0,5 mMol. de spermidine, 0,2 mMol. de EDTA, 2 mMol. de DTT, 1 mMol. d'ATP, 0,1 mg/ml de BSA et 5 a 50 pg/ml d'ADN. Pour la ligation d'extrémités cohésives, on utilise environ 30 unités/ml de ligase. Pour la ligation des extrémités franches on utilise environ 100 unités/ml de ligase. Entre les différentes réactions enzymatiques, des échantillons d'ADN sont extraits avec un mélange phénol/ chloroforme puis précipités à l'éthanol. Lorsque cela est nécessaire, du tARN de E. coli ou de levures est utilisé comme entraîneur. Les adaptateurs moléculaires (Collaborative Research, Bethesda Research Laboratories, New-England Biolabs) sont préhybridés et utilisés en excès molaire de 10 à 50 fois pour les extrémités. franches d'ADN utilisant les conditions de tampon décrites précédemment avec 100 unités/ml de ligase T4 a 4 C pendant 15 heures. Lorsque l'on utilise des adaptateurs non phosphorylés, les adaptateurs qui n'ont pas réagi sont éliminés directement après ligation par précipitation avec le tétrachlorhydrate de spermine (Hoopes et al. - référence 3). Lorsque l'on utilise des adaptateurs phosphorylés, le mélange de ligation est tout d'abord extrait avec un mélange phénol/chloroforme puis précipité avec de l'éthanol avant coupure spécifique avec les enzymes de restriction appropriées puis précipitation avec le tétrachlorhydrate de spermine. Les cellules bactériennes compétentes sont préparées puis transformées avec les plasmides ou transfectées par l'ADN de M13 selon les procédés décrits par Dagert et Ehrlich tréférence 4). Les plasmides de levures sont introduits dans les levures suivant la technique aux sels de lithium de Ito et coll 1983. EXEMPLE 1: Préparation de TG28 La synthèse du plasmide pTG853 nécessite d'une part la préparation d'un plasmide vecteur dans les levures, le plasmide pTG832 et la préparation d'un plasmide bactérien sur lequel on a cloné le gène de l'IL-2: TG28. Ce dernier plasmide a été obtenu par une stratégie complexe mais qui dans le cadre de la présente invention n'est pas essentiel puisque seul le fragment BglII/PvuII de ce plasmide comportant les séquences codant pour IL-2 présente de l'intérêt. C'est pourquoi la synthèse de ce vecteur, qui est développé dans le brevet Français n 83 19776 déposé le 9/12/1983 par la demanderesse, ne sera que brièvement rappelée en regard des schémas ci-annexés. 1) Suppression du site PstI dans pBR322 Le plasmide de base utilisé est le plasmide pBR322 toutefois, celui-ci présente l'inconvénient d'avoir à - R l'intérieur du gene amp un site de restriction PstI, car un site de même nature sera utilisé par la suite dans la zone de clonage comme site unique de restriction. Il convient donc de faire disparaître ce site de restriction PstI en utilisant un mutant du plasmide pBR322, le plasmide pUC8, dans lequel le gène de résistance à l'ampicilline ne présente pas de site de restriction PstI (ce site a été éliminé par mutation in vitro). pBR322 est commercialisé notamment par Bethesda Research Laboratories et pUC8 est décrit dans l'article référencé 5. Pour ce faire, on échange le fragment PvuI/PvuII de 1 669 bp de pBR322 avec le fragment analogue PvuI/PvuII du plasmide pUC8. Afin de réaliser cet échange les plasmides pBR322 et pUC8 sont traités successivement par PvuI, PvuII, puis circularisês par action d'une ligase. On obtient ainsi le plasmide pTG902 qui ne présente plus de site de restriction PstI et qui a également perdu le site de restriction NdeI présent a l'origine sur pBR322 (non représenté sur la figure 1). En outre, le plasmide pTG902 porte un fragment de 50 bp correspondant à la séquence laci' dans lequel se trouve le site PvuII. Le promoteur PL et le gène AN (qui provient du phage A, le gène XN code pour une fonction d'antiterminaison de transcription) sont isolés du plasmide pKC30 pour être insérés dans pTG902 comme celà est indiqué sur la figure 1 ci-annexée par traitement EcoRI, Si, BamHI pour pTG902 et par traitement PvuI, SI1, BamHI pour pKC30 avec ligation. L'un des plasmides obtenus après transformation de la souche TGE900, pTG906, est traité de façon à éliminer le segment PvuII-SalI. Pour ce faire, pTG906 est traité successi- vement avec SalI, la nucléase Si, PvuII et la ligase. On obtient ainsi pTG907. On insère ensuite la "région de fixation des ribosomes" XcIIrbs (provenant elle aussi du phage À) sous forme d'un fragment AvaI/TaqI dans le début du gène lacZ' (fragment a de la B-galactosidase) lequel a été cloné dans le phage M13 nommé M13tgllO. Cette stratégie permet un test fonctionnel simple pour rbs, à savoir la production de la protéine lacZ' et, par conséquent, d'obtenir des plaques bleues en présence d'IPTG et de Xgal; ceci permet également un séquençage rapide de la construction en utilisant la méthode dite du didéoxy. On obtient ainsi après sélection dans les bactéries compétentes un clone résultant M13tg910 dont la structure globale est représentée à la partie inférieure de la figure 2. Le fragment cIIrbs/lacZ' du phage M13tg910 est trans- féré sur le plasmide vecteur pTG907 préparé précédemment. Pour ce faire, on élimine les sites EcoRI, BamHI et AvaI en amont de cIIrbs puis on insère un site BglII. Dans ces conditions, cIIrbs peut être prélevé sous forme d'un fragment BglII-BglII et placé dans le site BamHI en aval du promoteur PL et du gène XN de pTG907. Le phage M13tg910 est digéré avec EcoRI puis traité avec Bal31 puis ensuite par la polymérase de Klenow. Les fragments obtenus sont alors soumis à l'action de la ligase en présence d'adaptateurs BglII non phosphorylés. Le mélange de ligation obtenu est utilisé pour transformer des cellules compétentes JM103. On sélectionne alors les plages bleues. Ces clones sont ensuite analysés afin de vérifier qu'ils contiennent le site BglII et qu'ils ne présentent plus de site EcoRI ou BamHI en amont. On obtient ainsi des clones tels que M13tg 912 dont la structure est représentée sur la figure 3. Le traitement par &a131 a produit une délition de 101 bp Ilimlnant les sites EcoRI, BamHI et AvaI I ainsi que les Séquences de lac ATG et lac Shine/Dalgarno. Le site Bgll! introduit se trouve placé enrion 100 bp en amont de l'ATG de cIl et 10 bp en aval de P!ac * Le fragment BamHI/SphI de pTG907, le fragment BglII/ Epal portant cllrbs et lacZ' et l'adaptateur phosphorylE ont été prEhybridis dans un rapport molaire de 1:2:1 puis traités avec la ligase T. Des aliquots sont utilisés pour transforme les cellules compétentes de la souche 6150 A 30 C. Les cellules intéressantes sont identifiées en sélectionnant les transformants avec un fragment cIIrbs/lacZ' marqué au P32 et la construction obtenue est confirmée par une étude de restriction enzymatique. Afin d'avoir une première indication montrant que lei différents éléments du systAme d'expression se conduisent comme cela est désire, le plasmide obtenu, pTG908, est trans- féré dans une souche hôte N6437 qui possède A la fois c1857 u le fragment M de la B-galactosidase complEmentant le fragment a qui est codé par le plasmide. Les transformants obtenus placEs sur une botte contenant IPTG + Xgal sont blancs I 28 C puis virent au bleu environ 30 minutes après lorsqu'on les transfère & 426C. Ce vecteur avant d'être utilisé pour cloner IL-2 humain a été adapté pour cloner l'interféron y humain: IFN-y, en fait pour le clonage de IL-2 la nature de la protéine intermédiaire clonée n'a pas d'importance, mais les vecteurs ont été réalisés selon le schéma ci-après. L'analyse de la séquence des nucléotides de IFN-y pour les sites de restriction révèle un site EcoRII a 8 bp en aval du départ de la protéine mature et un site Sau3A a 285 bp en aval du codon stop, ce qui permet d'isoler pratiquement toute la séquence codant pour la protéine mature sur un fragment EcoRII/Sau3A. Le clone de IFN-y obtenu & partir d'une banque est nommé pTG11. EXEMPLE 2: Construction de pTG909 La figure 4 schématise la préparation de pTG909. On utilise tout d'abord une molécule d'adaptation synthétique qui permet: a) d'effectuer la jonction entre les extrémités EcoRII et MeI, b) d'introduire les 8 bp manquantes par rapport à la séquence codant pour IFN-y mature et, c) de reconstituer le codon de départ ATG de cIIrbs de façon que la séquence codant pour la protéine IFN-y mature soit traduite sans amino-acides fusionnés a l'exception de l'initiateur F-met. Cet adaptateur est synthétisé chimiquement et sa constitution est représentée sur la figure 2. pTG11 est mis en digestion avec EcoRII et Sau3A et pTG908 avec NdeI et BamHI. Les fragments appropries sont purifi&s sur gel, mélanges avec une quantité Iquimolaire de l'adaptateur, préhybridés et liges. Le mélange est utilise pour transformer des cellules compétentes TGE900 et les transformants sont sélectionnés en hybridant un insert PstI de pTG11 Inlck- traduit" et marqué au p32 avec les transformants. 13 clones sont sélectionnés et contrôlés par carto- graphie et l'un d'eux pTG909 est vérifié par séquençage. EXEMPLE 3: Construction du vecteur pTG941 pTG909 contient 2 sites NdeI, l'un au codon de départ de IFN-y et l'autre 22 bp en aval de la séquence IFN-y (voir figure 7). La région entre ces sites qui est la région codant pour les 7 premiers amino-acides de IFN-y a été éliminée par traitement avec NdeI et remplacée par un oligonucléotide synthétique qui est représenté sur la figure 5. Cette réaction détruit le site NdeI aval et reconsti- tue le site NdeI amont tout en introduisant un site BamHI qui est unique. On obtient ainsi le vecteur pTG941. -EXEMPLE 4: Construction de pTG951 La figure 6 schématise la construction de pTG951 qui est un dérivé de pTG941 dans lequel le fragment contenant le cIIrbs a été remplacé par une séquence synthétique sur la base de la séquence de la région d'initiation de la traduc- tion de l'opéron E. coli lac noté E. coli lac opéron rbs. Cet oligonucléotide synthétique a été inséré au niveau du site HgaI entre le site unique NdeI du codon de départ de la séquence codant pour IFN-y et le site ClaI qui a été inséré dans le gène N. De ce fait par traitement avec Udel et Clai le plasmide pTG951 ne contient plus qu'un gène N tronqué (un codon stop en phase avec la traduction du gene N est placé lmmédiatement en &mont du nouveau site rbs) et est dépourvu des terminateurs de transcription tLl et tRI présents dans pTG909 et pTG941. Le site rbs synthétique de pTG951 contient un site UlII immédiatement avant le codon de départ, il-est donc possible de faire des dérivés de pTG951 par scission avec BglII suivi par diverses manipulations utilisant soit I'ADN polymérase I ou la nucléase S1. Ces dérivés présentent des variations dans la distance et les séquences entre la séquence de Shine/Dalgarno et 1'ATG. Mais aucun des plasmides ainsi préparé ne présente une activité supérieure au pTG951 lui-meme. Les principaux résultats sont rappelés dans le tableau ci-après: N0om PROMOTEUR RBS SEQUENCE DE RBS ET JONCTION AVEC LA SEQUENCE fmet cys tyr cys gln asp pro pTG909 PL cli TAAGGAAGTACTTACATATG TGT TAC TGC CAG GAC CCA fmet cys tyr cys gln asp prc pTG941 PL cII TAAGGAAGTACTTACATATG TGC TAC TGT CAG GAT CCC fmet cys tyr cys gin amp pro TG951 PL SYNTH CACAGGAACAGAGATCTATG TGC TAC TGT CAG GAT CC (lac) ------ BglII EXEMPLE 5 X Isolation du clone de cDNA TG26 codant pour IL-2 La figure 7 ci-annexée représente la séquence de nucléotides complète codant pour 1'IL-2 humaine et qui a été publiée par Taniguchi (Nature, 302, 305). La banque de cDNA utilisée par Taniguchi est obtenue a partir des ARN d'une lignée de cellules T leucémiques JURKAT-3. Dans le cadre de la présente invention on a mis à profit le fait que IL-2 était également produite par les lymphocytes du sang périphérique ou les lymphocytes de la rate lors d'une induction avec des composés mitogènes. C'est pour- quoi le cDNA de i'IL-2 humain a été isolé à partir d'une banque de cDNA de lymphocytes induits par des agents mitogènes, banque qui est identique à celle utilisée pour sélectionner le clone d'IFN-y-TG11. Afin d'effectuer le tri parmi les cDNA de la banque obtenue, on a utilisé une sonde de 19 nucléotides homologues à 1'IL-2 humain entre les positions 138 et 157. Cette sonde a étémise en oeuvre selon les techniques classiques utilisées pour sélectionner une colonie bactérienne, d'une banque de cDNA, qui pr5sente-un plasmide contenant des insertions avec une taille moyenne de 800 bp. Parmi les 50 000 colonies triées une seule a donné un résultat positif; le plasmide correspondant, dénommé pTG26, a été isolé. La séquence de 1'ADN inséré est représentée dans la figure 8. Une comparaison des séquences données dans les figures 7 et 8 montre certaines différences, ces dernières sont reprises dans la figure 8 (toutefois ces différences ne modifient pas la nature de l'amino-acide codé). Il convient, en outre, de remarquer que dans le plasmide pTG26 l'extrémité 5' codant pour le peptide signal et les 6 premiers amino-acides de la protéine mature manquent. EXEMPLE 6 i Expression de l'IL-2 dans E. coli Comme cela a été indique précédemment il est intéres- sant de disposer de l'IL-2 sous forme non fusionnée. Compte tenu de ce qui a été indiqué précédemment, il convient de compléter le clone pTG26 en introduisant en position ' les séquences codant pour les 7 premiers amino-acides de l'IL-2 humain. Pour ce faire on synthétise une molécule adaptatrice qui code pour les 7preriers amino-acides F-met-ala-pro-thr-ser- ser-ser de la protéine mature et qui constitue la séquence qui manque dans le clone pTG26. De façon à intégrer cet adaptateur du reste de la séquence codante dans les différents plasmides d'expression, il est nécessaire d'introduire un site de restriction AccI à l'extrémité 5' de l'insert du cDNA de pTG26. Ceci est effectué par mutagénèse in-vitro dirigé par un oligonucléotide en mettant en oeuvre un 15mer utilisant un modèle d'ADN mono-brin provenant d'un dérivé du phage M13 selon le schéma qui est représenté à la figure 9. On isole ainsi la séquence codant pour l'IL-2 sous forme d'un fragment AccI/PstI auquel manquent les séquences codant pour les 7 premiers aminoacides de la protéine mature. EXEMPLE 7: Construction de pTG28 La construction du vecteur pTG28 est représenté a la figure 10. On part du plasmide pTG951 dont la construction a été décrite précédemment. Le plasmide pTG951 est mis en digestion avec BglII, les extrémités sont complétées par la polymérase de Klenow, puis l'ensemble est traité avec PstI. Le produit de digestion est mis en ligation avec le fragment AccI/PstI obtenu à partir de pTG26 en utilisant en outre un adaptateur synthétique codant pour les 7 premiers amino-acides. L'adapta- teur synthétique est représenté à la figure 10. La ligation du mélange et le remplissage des trous par la polymérase de Klenow conduisent au plasmide pTG28 qui présente en aval de l'ATG de départ l'ensemble des codons codant pour la protéine IL-2 mature. La construction de pTG28 a été confirmée par étude de la structure. Le plasmide pTG28 peut être utilisé pour transformer des souches de E. coli TG900. EXEMPLE 8: Expression de l'interleukine-2 dans la levure Le vecteur d'expression utilisé est le plasmide pTG832. La construction du plasmide pTG832 est rappelé dans la figure 11. Le plasmide de départ est le plasmide pTG902 obtenu à partir de pBR322 par délétion des sites PstI et NdeI. Par digestion de pTG902 et du plasmide portant le gène ura3 (ne possédant pas de site PstI) avec HindIII et ligation du produit de digestion, on obtient le plasmide pTG803. Le plasmide 2p (forme B) de levure est mis en diges- tion avec AvaII et HindIII; ensuite un traitement à la Klenow permet d'obtenir des extrémités franches. Le morceau AvaII (coordonnée 1295) HindIII (coordonnée 105) de 1,19 kb est ligé avec pTG803 digéré par SmaI pour fournir le plasmide pTG807. Le gène ura3 et l'origine de réplicationdu 2" sont libérés sous forme d'un fragment unique par digestion de pTG807 avec HindIII. Ce fragment est traité par la polymérase de Klenow et cloné dans le site EcoRI de pBR322 traité de façon simi- laire pour donner pTG831. Le gène de levure phosphoglycerate kinase (PGK) est muté de façon que le site unique BglII soit introduit à l'ATG d'initiation de la traduction de la protéine PGK. Le fragment HindIII/SalI (2,15 kb), comprenant le promoteur et le début de la région codante du gène correspon- dant à la phosphoglycérate kinase de levure, a été cloné dans les mêmes sites du vecteur M13mp8. La création d'un site BglII au niveau de l'ATG initiateur de la phosphoglycératekinase a été effectuée suivant les techniques classiques de mutagénèse in-vitro (Gillam and Smith, 1979 gene 8, 99-106). Pour ce faire, un oligonucléotide synthétique, de séquence 5' ATATAAAACAAGATCTTTATC 3', a été utilisé afin de modifier la séquence originale 5' ATATAAAACAATGTCTTTATC 3'; 1'ATG initiateur est ainsi rendu non fonctionnel du fait de son remplacement par la séquence AGA. Le fragment HindIII/SalI (2,15 kb) du gêne PGK, ainsi modifié, est cloné dans le plasmide pTG831 pour donner le plasmide pTG832. EXEMPLE 9: Construction du plasmide pTG853 La partie codante, correspondant à la protéine mature de l'interleukine-2, est introduite sous forme d'un fragment BglII/PvuII (provenant du plasmide pTG951) dans le vecteur pTG832 digéré par les mêmes enzymes de restriction. La séquence de jonction PGK-IL2 est alors la suivante ATATAAAACAAGATCT ATG GC. CCA ACT AGC TCG TCG ACA fmet ala pro thr ser ser ser thr par comparaison à la séquence de PGK: ATATAAAACA ATGTCTTTATC - L'introduction du plasmide pTG853 dans les ségrégeants TGYlsp1l et TGYlsp4 (de génotype ura3-, his 3-) est effectuée par transformation par acetate de lithium; la sélection est faite sur milieu minimum synthétique plus histidine (40pg/ml). EXEMPLE 10: Dosages de l'activité IL-2 Les ségrégeants TGYlsp1 et TGYlsp4, de génotype ura3-, his3, contenant soit le plasmide pTG833 (vecteur d'expression sans le gène de l'IL-2), soit le plasmide pTG853 (vecteur d'expression avec le gène de l'IL-2) sont cultivés sur milieu minimum synthétique (yeast nitrogen base 0,67 %, glucose 2 %) additionné d'histidine (40pg/ml). Les cellules sont resuspendues dans le tampon PBS (tampon phosphate de KNa 80mM, NaCl 150 mM) et broyées trois fois une minute par agitation au vortex après addition de billes de verre. Un extrait est également effectué en présence de SDS 0,1 %; une dialyse contre du PBS additionné de BSA 1 % (bovin serumalbumine) est effectuée à 4 C pendant trois heures. Les extraits ainsi obtenus correspondant à-500pl de volume et sont ensuite lyophylisés. tampon sgrgeant unités - unités extraction sIgrgeant plasmde L2/ml extract IL2/mg prot. PBS TGYlsp1 pTG833 2989-2998 (1981). 2. Panayotatos N. et Trong K., Nucl. Acids Res. 9, 5679-5688 (1981). 3. Hoopes B.C. et McClure R.R., Nucl. Acids Res. 9, 5493-5504 (1981). 4. Dagert M. et Ehrlich S.D., Gene, 23-28 (1979). 5. Vieira J. et Messing J., Gene 19, 259-268. 6. Shimatake H. et Rosenberg M., Nature, 292, 128-132, (1981). 7. Oppenheimer A.B., Gottesman S. et Gottesman M., J. Mol. Biol., 158, 327-346 (1982). 8. H. Ito, Y. Fukuda, K. Murata, A. Kimura (1983) J. Bacteriol, 153, 1 163-168. REVENDICATIONS 1. Vecteur d'expression dans les levures de la protéine mature d'IL-2 caractérisé en ce qu'il comporte dans le sens de lecture: - un promoteur de levure, - la séquence codant pour la protéine IL-2 mature sous le contrôle du promoteur. 2. Vecteur selon la revendication 1 caractérisé en ce que le promoteur est le promoteur de PGK. 3. Vecteur selon la revendication 2 caractérisé en ce que la séquence de jonction entre le promoteur de PGK et 1' ATG de la séquence codant pour la protéine IL-2 mature est la suivante: ATA TAA AAC AA GATCT ATG. 4. Vecteur selon les revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il comporte l'origine de réplication d'un plasmide de levure. 5. Vecteur selon la revendication 4 caractérisé en ce qu'il comporte l'origine de réplication du plasmide 2p ainsi que l'ADN codant pour tout élément, n'agissant qu'en cis, et nécessaire à la réplication du plasmide 2u. 6. Vecteur selon les revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'il comporte la séquence codant pour l'expression du gène ura3. 7. Vecteur selon les revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'il comporte en outre l'origine de réplication d'un plasmide bactérien. 8. Vecteur selon la revendication 7 caractérisé en ce que l'origine de réplication est celle de pBR322. 9. Vecteur selon les revendications 1 à 8 caractérisé en ce qu'il comporte un gène codant pour la résistance à un antibiotique. 10. Levure transformée par un vecteur selon l'une des revendications 1 à 9. 11. Levure selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un Saccharomyces cereviseae. 12. Procédé de préparation d'interleukine-2 caractérisé en ce qu'on cultive une levure selon l'une des revendications et 11 sur un milieu de culture et en ce que l'on isole l'inteleukine-2 après culture. 13. Interleukine-2 obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 12.