FR 2556728 A1 19850621 FR 8417956 A 19841126 1. L'invention est relative aux préparations d'acide hyaluronique ("AH") insolubles dans l'eau, ces prépara- tions, en raison de leur biocompatibilité, pouvant être utilisées dans de nombreuses applications in vivo, par exemple des dispositifs divers de prothèse, notamment les valves cardiaques artificielles, les greffes vasculaires, etc. L'acide hyaluronique insoluble dans l'eau ou réticulé peut également être utilisé pour modifier de nombreux ar- ticles polymères qui, de même, peuvent être utilisés dans de nombreuses applications in vivo. L'invention, selon un autre aspect, est également relative à un procédé pour la fabrication de ces préparations à la température ambiante. L'acide hyaluronique est une matière connue qui se rencon- tre naturellement et qui présente de nombreuses applications en médecine et en biologie. On pourra se référer par exem- ple au brevet américain 4 272 522 et aux documents cités dans celui-ci. On connait également des gels réticulés d'acide hya- luronique, notamment par l'article de Laurent et autres dans Acta Chem. Scand. 18 (1964 N 1; p. 274-5). La présente invention concerne par conséquent des pré- parations d'acide hyaluronique insolubles dans l'eau et bio- compatibles. L'expression acide hyaluronique se rapporte, dans la présente description et dans les revendications an- nexées, non seulement à l'acide hyaluronique lui-mêmemais également aux sels d'addition de l'acide, par exemple les sels de sodium, de potassium, de calcium, etc.. En raison de leur biocompatibilité, ces préparations peuvent être utilisées dans de nombreuses applications in vivo et en combinaison avec diverses matières polymères qui ont été modifiées par l'inclusion de telles préparations insolu- bles dans l'eau. Plus particulièrement, l'invention concerne des pré- parations d'acide hyaluronique insolubles dans l'eau et comportant les types suivants de matières: 1) poudre d'acide hyaluronique réticulé; 2) pellicule d'acide hyaluronique réticulé; 3) gel réticulé d'acide hyaluronique; 2. 4) pellicule d'acide hyaluronique réticulé renforcée avec un tissu tricoté en téréphtalate de polyéthylene, de même que d'autres tissus tricotés; et ) les matières particulaires revêtues d'acide hyaluronique réticulé. Les agents de réticulation gui peuvent être utilisés pour obtenir ces préparations comportent: 1) le formaldéhyde; 2) l'urée diméthylol; 3) l'urée diméthyloléthylène; 4) un composé de polyaziridinyle; ) l'oxyde d'éthylène; 6) le polyisocyanate; et 7) le sulfone de divinyle. L'agent de réticulation préféré utilisé pour obtenir les préparations selon l'invention est constitué par le sulfone de divinyle. On a constaté qu'un gel d'acide hyalu- ronique insoluble peut être obtenu par réticulation de l'a- cide hyaluronique avec du sulfone de divinyle (SDV) dans une solution aqueuse à un pH supérieur à 9 et à la tempéra- ture ambiante, c'est-à-dire à environ 20 C. Selon la con- centration et la taille moléculaire de l'acide hyaluronique dans la solution, le rapport acide hyaluronique/sulfone de divinyle et le temps de réaction, le taux de fusion du gel peut varier dans une large mesure, par exemple de 20 à 2000. Le taux de fusion dépend sensiblement de la force ionique et de la concentration en ions hydrogène du milieu et il décroît avec la force ionique. Dans ce procédé, le sulfone de divi- nyle est utilisé à la température ambiante dans des condi- tions alcalines au lieu d'être utilisé comme agent de réti- culation seulement par reflux (60-65 C). Les exemples ci-dessous,dans lesquels tous les pour- centages sont exprimés en poids, sauf indication contraire, illustrent divers modes de mise en oeuvre de l'invention, mais n'en constituent pas une limitation, l'invention trou- vant sa portée dans les revendications. Exemple 1 On a ajouté à un mélange eau-acetone une solution 3. aqueuse à 37 % de formaldehyde et d'acide hydrochloriqcrue concentré. Le mélange obtenu présentait la composition suivante: CH20 0,27 %; HC1 0,19 %; eau-acétone rap- port 1/28. 0,5 g d'une poudre de hyaluronate de sodium a été placé dans 50 ml du mélange pendant 10 mn. Ensuite la poudre a été filtrée, lavée complètement dans un mé- lange eau-acétone (rapport 1/3) puis avec de l'acétone, et elle a été séchée dans un four à vide. La poudre d'aci- de hyaluronique obtenue était insoluble dans l'eau et con- tenait 1,41 % de CH20 combiné. Exemple 2 L'exemple précédent a été répété avec le mélange de réticulation de composition suivante: CH20, 2,5 %; HC1, 0,38 %, eau/acétone rapport 1/2. La teneur en CH20 du pro- duit était de 5,3 %. Dans les exemples 1 et 2, la réticulation de la pou- dre d'acide hyaluronique a été réalisée dans les mélanges eau-acétone. En changeant le rapport eau/acétone et la concentration en CH20, il est possible de commander le taux de fusion du produit. Ainsi, le taux de fusion était de 178 % pour le produit de l'exemple 1 et de 230 % pour celui de l'exemple 2. Le taux de fusion peut être réduit en aug- mentant la quantité d'acétone dans le mélange et la concen- tration de CH20. Les exemples suivants illustrent l'utilisation d'un composé de polyaziridine comme agent de réticulation. Ce composé du type polyaziridine réticule l'acide hyaluroni- que dans des conditions sèches et à la température ambian- te, ce aui est très important dans le cas de l'acide hya- luronique car celui-ci est un polymère sensible à la cha- leur. Exeple 3 On a ajouté à 113 g d'une solution de hyaluronate de sodium dans l'eau (concentration de 14,2 mg/ml), 0,42 g de composé polyaziridine (agent de réticulation CX-100 commer- cialisé par la Société POLYVINYL CHEMICAL INDUSTRIES). Le rapport molaire de l'agent de réticulation à l'acide hya- luronique était de 0,5. Le mélange a été coulé sur une pla- 4. que en verre suivant une couche de 5 mm d'épaisseur et laissé à sécher à la température ambiante pendant 2 jours. On a ainsi obtenu une pellicule d'acide hyaluronique in- soluble dans l'eau et présentant un taux de fusion dans l'eau de 160 %. Exemple 4 On a mélangé 0,5 g d'une poudre sèche de hyaluronate de sodium avec 50 ml d'une solution à 1 % de l'agent de réticulation CX-100 dans l'acétone, on a laissé reposer pendant 5 mn et on a filtré. La poudre a été séchée à l'air pendant 2 heures, puis lavée plusieurs fois à l'eau et sé- chée dans un four à vide à 40 C pendant 4 heures. Le taux de fusion de la poudre réticulée dans l'eau était de 135 %. Exemple 5 Cet exemple illustre l'utilisation d'un composé de polyaziridine pour l'obtention d'un acide hyaluronique ré- ticulé présentant un taux élevé de fusion. On a mélangé 0,6 g de hyaluronate de sodium solide avec 9,2 g d'une solution à 0,6 % d'agent de réticulation CX-100 dans l'eau. La solution obtenue présentait un rap- port molaire de CX - 100 par rapport au hyaluronate de sodium de 0,1. La teneur en hyaluronate de sodium dans la solution était de 6,04 %. Le pH du mélange très visqueux qui a été obtenu a été réglé à 2,5 % avec une solution de HCl à 2 %. La pellicule obtenue était facilement soluble dans l'eau. Elle a été chauffée à 60 C pendant 30 mn. Ce traitement thermique a donné une pellicule résistante et insoluble dans l'eau. Exemple 6 On a mélangé 0,1093 g de hyaluronate de sodium sous forme de fibres avec 25 ml d'une solution & 1 % de poly- isocyanate (Commercialisé par la Société MOBAY CHEMICAL CORP. sous la référence Desmodur N-75) dans de l'acétone et le mélange a été laissé au repos pendant 10 mn. Le pré- cipitat a été séparé et lavé trois fois avec de l'acétone, séché sous vide à une pression de 6 kPa à 60 C pendant mn et, finalement, dans un appareil de séchage sous vi- de en présence de pentoxyde de phosphore. Le produit ob- 5. tenu (0,1127 g) était insoluble dans l'eau et présentait un taux de fusion de 120 %. Exemple 7 Cet exemple illustre l'utilisation d'urée de dimé- thyloléthylène pour réticuler l'acide hyaluronique. On a mélangé 6 g d'une solution de hyaluronate de so- dium dans l'eau (concentration de 9,8 mg/ml) avec 0,017 g d'urée de N, N'diméthyloléthylène et 0,005 g de nitrate de zinc. Le mélange a été versé sur une plaque de verre et laissé à sécher pendant une nuit. La pellicule obtenue a ensuite été traitée à 110 C pendant 15 mn. Elle est deve- nue insoluble dans l'eau et a présenté un taux de fusion de 145 %. Exemle 8 Cet exemple illustre l'utilisation de sulfone de di- vinyle comme agent de réticulation de l'acide hyaluronique. On a utilisé 35 ml d'une solution de hyaluronate de sodium contenant 0,401 g (1 mmole) de sulfone de divinyle. Le pH du mélange a été ajusté à environ 8,5 - 9 à l'aide d'une solution à 1 % d'hydroxyde de sodium. La pellicule a été obtenue à partir du mélange en versant celui-ci sur une plaque de verre et en le laissant sécher une nuit à la température ambiante. Cette pellicule était facilement so- luble dans l'eau. Elle a été chauffée à 60' C pendant 30 mn. Le traitement thermique a permis d'obtenir une pellicu- le résistante et insoluble dans l'eau. Exemle 9 Une pellicule sèche d'acide hyaluronique non réticu- 6lé a été placée dans une solution de 0,6 g de sulfone de divinyle dans un mélange de 26 g d'acétone et de 13 g d'eau et laissée au repos pendant 10 mn. La pellicule a ensuite été retirée de la solution, séchée à l'air pendant mn puis chauffée dans un four pendant 20 mn à 65 C. On a obtenu une pellicule réticulée résistante d'acide hyalu- ronicue. Example -10 On a mélangé 2,95 g de hyaluronate de sodium séché à l'air avec 57,35 g d'une solution à 0,2M de NaOH dans l'eau et on a agité avec une tige de verre jusqu'à dissolution 6. complète. Ensuite, 1 g de sulfone de divinyle a été agité dans le mélange et celui-ci a été laissé au repos pendant une heure à la température ambiante. Le mélange s'est trans- formé en un gel dur. Le gel a été placé dans un homogénéi- seur du type Vir-Tis "45" avec 10O ml de H20 et traité pen- dant 5 mn à 30 000 tr/mn. On a obtenu des petites parti- cules hautement fusibles. Les particules ont ensuite été lavées plusieurs fois à l'eau et filtrées par aspiration sur un filtre en verre. Pour déterminer le taux de fusion, on a placé environ 1 g du gel dans un filtre en verre de ml, lequel à son tour, a été placé dans un tube plasti- que de centrifugation. Le gel a été centrifugé pendant 30mn à 3000 tr/mn. L'eau a été évacuée et récupérée au fond du tube. La concentration de l'acide hyaluronique dans le gel était de 0,21 %, c'est-à-dire que le taux de fusion dans l'eau était de 476 %. Exemple 11 Les opérations de l'exemple 10 ont été répétées, à l'exception que le gel obtenu a été dispersé dans une solu- tion à 0,15 M de NaCl dans l'eau, et les particules ont été lavées dans la méme solution. La concentration de l'acide hyaluronique dans le gel après la centrifugation était de 1,29 % et le taux de fusion était de 77,5 %. Exemple 12 On a dissout 1 g de hyaluronate de sodium séché à l'air dans 9 g d'une solution à 0,2 IM de NaOH en agitant avec une tige en verre. On a agité 0, 33g de sulfone de divinyle dans la solution visqueuse obtenue, et le mélan- ge a été laissé au repos pendant 20 heures à la tempéra- ture ambiante. Le gel dur obtenu a été traité comme dans l'exemple 10. La concentration de l'acide hyaluronique dans le gel après la centrifugation était de 4,3 %, c'est-à- dire que le taux de fusion était de 23,6 %. Exemple 13 - Test de compatibilité avec le sang Ce test permet de démontrer la biocompatibilité des préparations selon l'invention. La fourniture de 3H - sérotonine par des plaquettes sanguines humaines a été utilisée dans des études prélimi- 7. naires pour établir la réactivité du produit selon l'exem- ple 10 avec le sang. Le sang veineux humain normal a été pré- levé dans des seringues en matière plastique et transféré immédiatement dans des tubes en matière plastique contenant 3,8 % de citrate de sodium, à raison d'une partie de citra- te pour 9 parties de sang complet. Du plasma riche en pla- quettes a été préparé par centrifugation à 4 C pendant 15mn, sous une accélération centrifuge de 125 x g, puis extrait à l'aide d'une pipette sérologique et transféré dans un tube d'essai en matière plastique ou à base de silicone. On a ajouté 3H sérotonine (3H-5-hydroxytryptamine, ou 3H-5HT, de la Société NEW ENGLAND NUCLEAR, contenant 26,3 Ci/mmole lmCi/ml éthanol-eau) à du plasma riche en plaquettes, à rai- son de 0,2 à 0,5 1/ml de plasma, puis fait incuber pendant 15 mn à 37 C. Dans cet essai, on a utilisé des tubes de test à base de silicone ou en polypropylene; on a utilisé des caillots comme moyen de contrôle positif, et on a tes- té des échantillons revêtus et non revêtus. 1-2 ml de 3H- HT - plasma ont été ajoutés à chacun de deux tubes conte- nant les échantillons à tester; une partie aliquote de 50pl a été enlevée du mélange de contrôle pour la détermination de la radioactivité totale. Apres la période d'incubation appropriée (10 à 120 mn), des parties aliquotes de 0,2 - 0,5 ml de la suspension ont été enlevées et centrifugées sur une huile au silicone dans un appareil Eppendorf pendant 2 mn sous une accélération de 12 000 x g. 50 Pl du produit surnageant ont été enlevés de chacun des tubes, mélangés avec 5 ml d'un liquide de scintillation et on a mesuré la radioactivité par béta-spectrométrie. La quantité de 3H-5HT libérée par les caillots ou les échantillons de test cons- tituait l'incrément de radioactivité du produit surnageant (radioactivité des échantillons expérimentauxmoins la ra- dioactivité de commande). La matière de test ne présentait pas, après 120 mn, une libération significative de plaquet- tes de 3H-5HT. Bien entendu l'invention n'est pas limitée à la des- cription et aux exemples ci-dessus; on pourrait au contrai- re concevoir diverses variantes sans Sortir pour autant de son cadre. 8. REVENDICATIONS 1) Procédé pour l'obtention d'une préparation d'acide hyaluronique insoluble dans l'eau, caractérisé par le fait qu'il consiste à soumettre l'acide hyaluronique ou l'un de ses sels d'addition, en poudre, pellicule ou gel, à un trai- tement par un agent de réticulation choisi dans le groupe qui comporte: le formaldehyde, l'urée de diméthylol,l'urée de diméthyloléthylène, l'oxyde d'éthylène, une polyaziri- dine, un polyisocyanate et le sulfone de divinyle. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'agent de réticulation est le formaldehyde et que le traitement est effectué en milieu aqueux à une tem- pérature de reflux. 3) Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'agent de réticulation est une polyaziridine et que le traitement est effectué dans des conditions sè- ches à la température ambiante. 4) Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'agent de réticulation est un polyisocyanate et que le traitement est effectué dans de l'acétone à une température de reflux. ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'agent de réticulation est l'urée de diméthylo- léthylène et que le traitement est effectué à environ 110"C 6) Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'agent de réticulation est le sulfone de di- vinyle et que le traitement est effectué A environ 60-65 C. 7) Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le traitement est effectué avec du sulfone de divinyle à environ 20 C dans un milieu alcalin aqueux. 8)Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que le traitement est-effectué à un pH supérieur à environ 9. 9) Procédé selon l'une des revendications 7 et 8, ca- ractérisé par le fait que le traitement est effectué pen - dant 1 à 20 heures. ) Procédé selon l'une des revendications 7 à 9, ca- ractérisé par le fait que le rapport des teneurs de l'aci- 9. de hyaluronique et du sulfone de divinyle est d'environ 3/1 en poids. 11) Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé par le fait que le sel est un sel de sodium, de potassium ou de calcium. 12) Produit caractérisé par le fait qu'il est obte- nu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 11.