FR 2552667 A1 19850405 FR 8414969 A 19840928 La présente invention concerne un revêtement protéolytique pour plaies et un procédé pour sa préparation. Plus particulièrement, le revêtement protéolytique pour plaies de l'invention est sous forme d'une poudre qui sert à revêtir et à traiter les plaies ulcéreuses et nécrotiques. Les poudres constituées de diverses bases (amidon, talc, etc) et de bactéricides ou de bactériostatiques, en particulier d'antibiotiques, de sulfamides et d'antimycosiques, sont recommandées à cet effet en pratique pharmaceutique cou10 rante. Récemment, des revêtements absorbants sous forme de poudres qui contiennent un polymère hydrophyle comme composant principal, se sont révélés appropriés dans le traitement des plaies ulcéreuses Leur effet consiste en l'élimination des 15 liquides de la surface de la plaie par absorption dans une structure poreuse du composant polymère efficace et par aspiration par les forces capillaires dans les interstices entre les particules de la couche de poudre L'exsudat avec les bactéries, les substances provoquant l'inflammation ou égale20 ment les toxines sont éliminés ainsi de la plaie En particulier, des préparations à base de dextrans réticulés (B S. Jacobsson et coll, Scand J Plast Reconstr Surg 10, 6572 ( 1976)) sont utilisées en pratique médicale Des résultats prometteurs ont été également obtenus avec des compositions polymères à base de cellulose contenant un composant polymère très hydrophile, par exemple de la carbocymétylcellulose comme additif (H Dautzenberg et coll, Revêtement absorbant pour plaies; demande de brevet CS PV 4129-82). Dans la poursuite de la mise au point de poudres ayant 30 un effet détersif dans le traitement des plaies ulcéreuses, on s'est intéressé àdes poudres de celluloses contenant des enzymes immobilisées de type protéase (recueil d'articles: Ferments protéolytiques immobilités pour le traitement des processus nécrotiques ulcéreux (en russe), AN SSSR, Sibirskoe 35 Otdel, Institut tsitologii i Genetiki, Novosibirsk, 1981). Dans ce cas l'action enzymatique est utilisée pour obtenir des effets détersifs Les revêtements protéolytiques des plaies provoquent une décomposition hydrolytique et une dissolution des tissus nécrotiques et du pus sur la surface de la plaie ce qui élimine également le milieu de croissance des bactéries et interrompt l'aspiration de produits toxiques à partir de la plaie. L'utilisation pratique du principe protéolytique néces5 site de résoudre les nombreux problèmes de la préparation d' un revêtement efficace ne produisant pas d'effets secondaires nuisibles Pour cela, en médecine humaine, il est avant tout nécessaire d'éviter que de la cellulose ou des dérivés de cellulose pénètrent dans la circulation sanguine car l'orga10 nisme humain n'a pas de systèmes enzymatiques pour éliminer de tels composés Cependant, les préparations de revêtement protéolytique employees à ce jour n'utilisent que des types classiques de cellulose, c'est-à-dire des poudres échangeuses d'ions broyées ayant une structure fibreuse contenant des 15 fractions fines de poudre pouvant pénétrer dans le sang. Pour que les revêtements aient l'efficacité maximale, le principe protéolytique ne doit pas être employé sans utilisation simultanée du principe d'absorption déjà connu Cependant des solutions récentes n'utilisent comme matière de départ que le type classique de cellulose de forte cristallinité et de faible porosité, ce qui produit des revêtements ayant une capacité d'absorption relativement faible. De plus il reste à découvrir pour l'utilisation du principe protéolytique des procédés d'immobilisation des protéases 25 dans la cellulose empêchant la libération de l'enzyme par la matrice et la pénétration de sa forme soluble dans la circulation sanguine o elle produirait une réaction allergique comme le fait un antigène. Les inconvénients précités d'utilisation du principe protéolytique sont supprimés dans le nouveau revêtement pour plaies de l'invention. Un des buts de l'invention est de fournir un revêtement protéolytique pour les plaies qui est constitué de particules sphériques ayant un diamètre de 0,05-0,5 mm, de préférence de 35 0,1-0,3 mm, à base d'un dérivé de cellulose avec des enzymes immobilisées de type protéase choisies parmi le groupe constitué par la chymotrypsine, la trypsine et la subtilisine Un autre but de l'invention est de fournir un procédé pour produire le revêtement protéolytique pour plaies à partir de perles de cellulose, préparées selon le mode opératoire du brevet CS n 172 640, selon lequel des perles de cellulose gonflées dans l'eau, qui n'ont jamais été séchées, ayant une taille des particules de 0,07-0,7 mm, de préférence de 0,145 0,4 mm, sont parfaitement débarrassées des contaminants toxiques par lavage ou distillation à la vapeur d'eau, activées pour la fixation de l'enzyme, modifiées par immobilisation de protéases choisies dans le groupe constitué par la chymo-trypsine, la trypsine et la subtilisine, lavées alternative10 ment avec un tampon ayant un p H de 8,5 à 9,5 et un tampon ayant un p H de 4 à 5 jusqu'à ce que les liquides de lavage aient une activité protéolytique nulle, puis lavées avec un tampon ayant unp H de 7,5 à 8,5 et séchées dans ce milieu à une teneur en eau résiduelle de 0,1 à 15 % dans la substance 15 sèche, de préférence par lyophilisation. La forme sphérique régulière des particules individuelles qui forment le nouveau revêtement pour plaies et la taille choisie des particules ainsi que la distribution de la taille des particules ( 0,05-0,5 mm, de préférence 0,1-0,3 mm) garan20 tissant une manutention facile à la fois dans la production et dans l'emploi, un écoulement régulier de la poudre pendant sont étalement sur les plaies et en particulier évitent la pénétration de la cellulose dans la circulation sanguine. La production du nouveau revêtement emploie de façon avan25 tageuse la cellulose-sphérique régénérée préparée selon le brevet CS n 172 640 précité Elle a pour avantage une grande porosité ce qui facilite l'activation pour la fixation de 1 ' enzyme et l'immobilisation des protéases Le caractère hydrophile poreux du support constitué de perles de cellulose est 30 conservé, même après l'activation, l'immobilisation et le séchage La lyophilisation s'est révélée un procédé de séchage approprié qui élimine l'eau en respectant l'enzyme fixée et confère au dérivé de cellulose sec un pouvoir d'absorption suffisant. Les perles de cellulose préparées selon le mode opératoire décrit dans le brevet CS n 172 640 précité, sont totalement débarrassées des portions solubles en particulier de toutes les impuretés ayant des effets toxiques qui résultent de leur contamination au cours de la préparation (produits de décomposition des groupes xanthogénates, restes d'un milieu de dispersion, par exemple de chlorobenzène) A cet effet on les lave avec de l'eau à 50-90 C et/ou avec de l'éthanol On obtient une élimination efficace du chlorobenzène par distil5 lation à la vapeur d'eau. On peut utiliser divers procédés connus par la littérature pour activer la cellulose pour la fixation d'une protéase (Handbook of Enzyme Biotechnology, Ed A Wiseman; E Hoiwood Ltd, Chichester 1975), mais il faut choisir des procédés 10 qui forment une liaison suffisamment stable entre l'enzyme et la cellulose et qui ne contamine pas le produit avec des composés toxiques devenant actifs lors de l'application du revêtement, par exemple par libération ou par action par contact direct Un procédé approprié est l'oxydation par un 15 periodate qui est relativement simple et facile à réaliser et fournit des produits ayant une porosité suffisante avec un fort effet d'absorption. Diverses protéases conviennent pour l'immobilisation, en particulier la trypsine, la chymotrypsine et la subtilisine 20 mais également la thermolysine, la papaïne et autres La fixation de l'enzyme à la cellulose activée par oxydation par un periodate, c'est-à-dire la cellulose contenant des groupes dialdéhydes réactifs, est effectuée en deux stades: on forme tout d'abord des composés de la cellulose et de l'enzyme de 25 type base de Schiff, puis on les stabilise par réduction des groupes aldéhydes n'ayant pas réagi avec du borohydrure de sodium. Un stade important de la préparation du nouveau type de revêtement est l'élimination parfaite des portions solubles 30 contenant des protéases des perles de cellulose modifiée On l'obtient en utilisant alternativement de façon répétée un tampon faiblement alcalin (p H 8,5-9, 5) et un tampon faiblement acide (p H 4-5) selon une méthode statique ou en colonne A cet effet, on peut utiliser le tampon borate 0,1 M contenant 1 M de 35 Na Cl (p H 9) et le tampon acetate 0,1 M contenant 1 M de Na Cl (p H 4,5) ou ces deux tampons sans Na Cl qu'on applique au produit cellulosique après immobilisation jusqu'à ce que la phase liquide ait une activité protéolytique nulle L'alternance de tampons de p H faible et élevé et de forces ioniques variables facilite l'élution des protéines non fixées par covalence par suppression alternée des interactions électrostatiques et hydrophobes Pour obtenir une préparation parfaitement stable avec l'enzyme immobilisée, on lave finalement les perles avec 5 un tampon borate, par exemple à p H 8 et on lyophilise en suspension dans ce tampon Dans ces conditions le produit obtenu ne contient que l'enzyme fixée par covalence et aucune portion soluble de celle-ci susceptible de pénétrer dans le sang au cours du traitement et de se comporter comme un antigène. Le revêtement protéolytique avec de la chymotrypsine immobilisée a été étudié en pratique clinique Il présente une activité protéolytique vis-àvis du tissu nécrotique, du pus et de la fibrine et en même temps il n'a aucun effet nuisible sur le tissu sain Le revêtement a une remarquable capacité d'absorption conforme à l'hydrophilie et à la structure poreuse de la matrice de cellulose Il aspire l'exsudat d'une plaie qui contient les produits de dégradation du tissu nécrosé et des bactéries La fixation de l'enzyme au support empêche son autolyse et la perte de son activité au cours de 1 ' emploi L'activité protéolytique prolongée de la chymotrypsine élimine dans une grande mesure les substances nécrotiques de la plaie et provoque un nettoyage graduel de la plaie Les sécrétions initialement infectées sont absorbées activement entre les particules de poudre ce qui empêche la macération du pourtour de la plaie et réduit la surface nutritive permettant le développement d'une infection bactérienne La combinaison originale des principes de protéolyse et absorption permet d'obtenir une élimination rapide des débris nécrotiques infectés, la formation d'un bourgeonnement sain et une cica30 trisation rapide de la plaie. On a établi que le nouveau revêtement est approprié pour tous les types de plaies ulcéreuses et nécrotiques, y compris les plaies chirurgicales cicatrisant par deuxième intention, les abcès, les ulcères prolongés et ne cicatrisant pas d'ori35 gines diverses (ulcères variqueux, ulcères causés par les rayons X et ulcères trophiques), les pertes de substance consécutives à des nécroses de décubitus, les pertes de substance infectées et nécrotiques après amputations des extrémités, incision et excision de tissus nécrosés dans les gangrènes diabétiques et les gangrènes dues à l'artériosclérose, les anthrax, les brûlures ulcéreuses du deuxième et du troisième degré, les fractures ouvertes infectées, les traitements des moignons d'amputation et les tumeurs décomposées et ulcéreu5 ses Aucun effet secondaire nuisible n'a été observé lors de l'emploi du nouveau revêtement. Les exemples suivants ullustrent le procédé de production des revêtements selon l'invention et leurs applications sans limiter la portée de l'invention. 10 EXEMPLE 1 Préparation du revêtement avec de la chymotrypsine fixée. a) Introduction de groupes aldéhydes par oxydation par le periodate de sodium. On utilise comme matière de départ des perles de cellu15 lose gonflées dans l'eau et qui n'ont jamais été préalablement séchées, ayant une porosité P = 90 % (c'est-à-dire le pourcentage total en volume des pores) que l'on a préparées selon le brevet CS n 172 640 précité On débarrasse parfaitement la cellulose des impuretés par lavage à l'eau chaude ( 90 C, 5 heures, excès vingtuple) et par distillation à la vapeur d'eau ( 4 heures) On disperse la cellulose filtrée ( 1 000 g) dans litres de periodate de sodium 0,1 M et on agite à la température du laboratoire pendant 45 minutes Après achèvement de l'oxydation, on lave immédiatement la cellulose oxydée avec environ 20 litres d'eau distillée (sur un entonnoir de B Uchner), on transfère dans une colonne et on lave avec de l'eau distillée jusqu'à ce que la conductivité électrique de l'effluent soit égale à la conductivité de l'eau distillée (une nuit). b) Fixation de la chymotrypsine à la cellulose oxydée. On disperse la cellulose oxydée et lavée ( 1 000 g) dans 1 litre de tampon borate 0,1 M (p H 9) contenant 5 g de chymo-trypsine (l'activité protéolytique de la solution est de ,35 j A /min ml comme déterminé avec une solution d'hémo280 -globine dénaturée, p H 8) On agite la suspension à la tempé35 rature du laboratoire On suit l'avancement de la réaction par la baisse de l'activité protéolytique de la solution de fixation Apres une heure, l'activité protéolytique s'est abaissée à 0,1 'A /min ml et on arrête la fixation en aspirant la solution fixante La vitesse de fixation de chymotrypsine s' accroît lorsque le p H s'élève, cependant la solubilisation de la cellulose s'accroît en même temps en fonction du temps d'oxydation Le mode opératoire choisi a été établi à partir de nombreuses expériences comparatives pour établir un compromis entre la quantité d'enzyme fixée et la perte de cellulose provoquée par la solubilisation. c) Réduction de la cellulose à laquelle de la chymotrypsine est fixée pour stabiliser la liaison de Schiff entre le 10 support et l'enzyme et éliminer les groupes aldéhydes n ayant pas réagi. On met la cellulose à laquelle la chymotrypsine est fixée en suspension dans 1 litre de tampon borate 0,1 M (p H 9) avec 500 mg de Na BH 4 dissous On arrête la réduction après 20 mi15 nutes d'agitation à la température du laboratoire en aspirant la solution réductrice et on répète encore la même opération avec une nouvelle solution de borohydrure de sodium On effectue deux fois la réduction par addition de solution de Na BH 4 de concentration moindre pour éviter la baisse de l'ac20 tivité protéolytique de la chymotrypsine par suite de la réduction éventuelle des ponts disulfures. d) Lavage et lyophilisation de la cellulose à laquelle la chymotrypsine est fixée. On lave la cellulose à laquelle la chymotrypsine est fixée, après achèvement de la réduction, alternativement avec deux litres de tampon borate 0,1 M contenant 1 M de Na Cl (p H 9), 2 litres de tampon acétate 0, 1 M contenant 1 M de Na Cl (p H 4,5) et de plus avec les mêmes volumes des deux tampons sans Na Cl On transfère ensuite la cellulose à laquelle 30 la chymotrypsine est fixée dans une colonne o on la lave de façon répétée avec tous les tampons précités jusqu'à ce que l'activité protéolytique de l'effluent soit nulle On lave finalement la cellulose à laquelle la chymotrypsine-est fixée avec du tampon borate 0,25 M à p H 8 et on lyophilise égale35 ment en suspension avec ce tampon La préparation obtenue contient 5 mg de chymotrypsine active sur 1 g de cellulose sèche L'analyse comparative des amino-acides de l'échantillon préparé et d'un échantillon lavé de plus avec du chlorhydrate de guanidine 6 M et de l'eau distillée prouve que toute la chymotrypsine est fixée par covalence à la cellulose et ne peut donc pénétrer dans le sang au cours de l'emploi pour constituer un antigène. EXEMPLE 2 Préparation du revêtement avec de la trypsine fixée par covalence. On effectue l'immobilisation de la trypsine de la même façon que dans l'exemple 1 La préparation obtenue contient 8,2 mg de trypsine active pour 1 g de cellulose lyophilisée. 10 En raison de sa spécificité plus étroite, la trypsine clive les protéines en un nombre de sites moindre (elle clive les protéines uniquement derrière les amino-acides basiques que sont la lysine et l'arginine). EXEMPLE 3 Préparation du revêtement avec de la subtilisine fixée par covalence. On effectue l'immobilisation de la protéinase bactérienne de la même façon que dans l'exemple 1 La préparation obtenue contient 11,3 mg d'enzyme active dans 1 g de prépara20 tion lyophilisée. EXEMPLE 4 On applique le revêtement protéolytique auquel de la chymotrypsine est fixée selon l'exemple 1 à sept malades pendant une période de 1 à 4 semaines avec un très bon effet chez six malades L'effet est caractérisé par une réduction de la sécrétion purulente, un nettoyage de la base de la perte de substance et une séparation des débris nécrotiques adhérents dont la majeure partie a été éliminée par excision chirurgicale On rince la plaie avec une solution de peroxyde 30 d'hydrogène et une solution à 2 pour mille de chloramine avant une nouvelle application de la préparation On obtient ainsi un bourgeonnement rouge vif et une épithélialisation des plaies à partir de leur pourtour avec une diminution de la taille Une application locale d'une pulvérisation de panthénol sur la plaie en cours d'épithélialisation est principalement utilisée après achèvement du traitement. Un cas présentait une diminution de la sécrétion purulente, un cinquième de la perte de substance a été nettoyée avec un bourgeonnement de couleur vive, mais des réactions nécroti- ques adhérentes profondes sont apparues dans les parties restantes de la plaie dans un contexte d'ischémie chronique provoquée par une combinaison d'une micro-angiopathie diabétique et d'une artériosclérose oblitérante des artères périphériques si bien qu'un apport de sang insuffisant par les tissus voisins a été le facteur limitant la cicatrisation de la perte de substance Quatre semaines après l'arrêt de l'application de la préparation, la plaie a évolué vers un abcès diabétique phlegmoneux. Exemples d'application de la préparation 1) J T, homme âgé de 72 ans, dossier n 8357/83: une perte de substance de 3 cm de diamètre après amputation du quatrième orteil droit pour gangrène diabétique avec nécrose humide du fond et sécrétion purulente Après deux semaines d'applica15 tion de la préparation, un bourgeonnement essentiellement sain s'est produit avec des débrits nécrotiques isolés adhérents sur le bord médian de la plaie sans sécrétion purulente. 2) V S, femme âgée de 60 ans, dossier n 6417/83 * après amputation de la jambe droite pour gangrène diabétique, il exis20 tait une perte de substance de 5 cm de diamètre et 2,5 cm de profondeur après un abcès phlegmoneux et des nécroses de la partie latérale inférieure du moignon d'amputation ainsi que des bourgeons médians recouverts d'une croûte sur l'ensemble de la plaie sur une longueur de 10 cm et une largeur de 1 cm 25 avec une sécrétion purulente Apres quatre semaines d'application de la préparation une cicatrisation presque complète a été obtenue à l'exception d'une perte de substance de 2 cm de diamètre et de 1 cm de profondeur dans la partie latérale du moignon avec un bourgeonnement sain et une épithélialisa30 tion progressive du pourtour. 3) F N, homme âgé de 66 ans, dossier n 3376/83: une perte de substance apres amputation des trois premiers orteils y compris les têtes des métatarsiens correspondants pour gangrène diabétique mesurant 5-4 cm, partiellement avec des bour35 geons recouverts d'une croûte et en partie avec des débris nécrotiques adhérents; la profondeur de la perte de substance dans sa partie latérale atteignait 1 cm Après 4 semaines d' application de la préparation, des bourgeons sains sont apparus dans toute la région de la perte de substance avec une épithélialisation progressive du pourtour et une diminution du diamètre à 3 cm Le même malade F N, homme agé de 66 ans, après amputation de la moitié distale du quatrième orteil y compris la tête du quatrième métatarsien, présentait une perte de substance de 3 cm de diamètre avec une partie inférieure couverte d'une croûte; après une semaine d'application de la préparation, la perte de substance a présenté des bourgeons sains sans sécrétion et avec un pourtour sain. 4) F V, homme agé de 77 ans, dossier n 254/84:perte de 10 substance après amputation des deuxième à quatrième orteils pour gangrène diabétique mesurant 5 x 4 cm avec une profondeur atteignant 3 cm et avec une sécrétion purulente abondante et des débris nécrotiques adhérents importants sur toute l'étendue de la plaie; après quatre semaines d'application de la 15 préparation, des bourgeons sains se sont formes sur un cinquième de la plaie; le processus nécrotique s'est maintenu sans diminution dans les autres parties par suite de la mauvaise irrigation périphérique de la jambe due à une microangiopathie diabétique et une artériosclérose oblitérante, mais la sécrétion purulente dans la perte de substance a cessé; la perte de substance a évolué dès l'arrêt de l'application de la préparation. ) Ph Mr M K, homme fgé de 56 ans, dossier n 9568/83 avec une perte de substance après incision d'un abcès phlegmoneux 25 de l'articulation interphalangienne du premier orteil atteignant la portion intraarticulaire, ayant un diamètre de 2,5 cm avec des débris necrotiques et une sécrétion purulente après une semaine d'application de la préparation, la sécrétion a régressé, la perte de substance s'est nettoyée avec 30 un bourgeonnement sain et l'environnement de la perte de substance s'est normalisé. 6) M P, femme agée de 78 ans, dossier n 1994/83, avec une perte de substance après amputation du premier et du deuxième orteil, y compris les têtes des métatarsiens correspondants 35 pour gangrene diabétique mesurant 5 x 3 cm avec une partie inférieure couverte de croûtes, des débris nécrotiques adhérents et une sécrétion purulente dans la partie distale de la plaie Apres 4 semaines d'application de la préparation un bourgeonnement sain a été obtenu dans toute l'étendue de la plaie, la sécrétion purulente s'est tarie et la lacune a été réduite à 3 x 2 cm par progrès de l'épithélialisationo 7) M T, femme âgée de 77 ans, dossier n 17741/83 avec deux pertes de substance dans un moignon d'amputation de la jambe pour gangrène diabétique puis abcès phlegmoneux du moignon provoquant une liquéfaction de la plaie dans toute la région avec des pertes de substance de 10 x 2-4 cm avec une sécrétion purulente, un bourgeonnement couvert de croiûtes et des parties nécrosées étendues Après 4 semaines d'application 10 de la préparation, les bourgeons sont devenus sains, les débris nécrotiques ont été éliminés, la sécrétion s'est tarie et l'épithélialisation a progressé à partir du pourtour des pertes de substance réduisant leur diamètre médian à 3 cm et leur diamètre latéral à 1,5 cm. REVENDICATIONS 1 Revêtement protéolytique pour plaies, caractérisé en ce qu'il est constitué de particules sphériques ayant un diamètre de 0,05-0,5 mm, de préférence de 0,1-0,3 mm, à base de dérivé de cellulose avec des enzymes immobilisées de type protéase choisies parmi le groupe constitué par la chymotrypsine, la trypsine et la subtilisine. 2 Procédé pour la préparation d'un revêtement protéolytique pour plaies selon la revendication 1, caractérisé en ce 10 qu'on débarrasse parfaitement des impuretés par lavage et/ou distillation à la vapeur d'eau des perles de cellulose régénérée gonflées dans l'eau et n'ayant jamais été préalablement séchées, ayant une taille des particules de 0,07-0,7 mm et de préférence de 0,14-0,4 mm, on les active pour la fixation d' 15 enzymes, on les modifie par immobilisation de protéases choisies dans le groupe constitué par la chymotrypsine, la trypsine et la subtilisine, on les lave alternativement avec un tampon à p H 8,5 à 9,5 et un tampon à p H 4 à 5 jusqu'à ce que l'activité protéolytique du liquide de lavage soit nulle, puis 20 on les lave avec un tampon à p H 7,5 à 8,5 et on les sèche dans ce milieu jusqu'à une teneur en eau résiduelle de 0,1 à 15 % de la substance sèche, de préférence par lyophilisation.