FR 2553287 A1 19850419 FR 8316583 A 19831018 COMPOSITIONS A BASE DE MUCOPOLYSACCHARIDES OU D'OLIGOSACCHARIDES, NOTAMMENT A BASE DE FRACTIONS OU FRAGMENTS D'HEPARINE, APPROPRIEES AU TRAITEMENT DE DESORDRES DE LA PROLIFERATION CELLULAIRE. L'invention a pour objet de nouvelles compositions conditionnées pour l'utilisation dans des traitements visant à l'inhibition et/ou la régression de proliférations cellulaires anormales, dont les principes actifs sont constitués par des fractions ou fragments d'héparines de bas poids moléculaire Ces fractions ou fragments peuvent également être dénommés glycosaminoglycanes Les fragments obtenus par synthèse ou constitutifs de fractions obtenues à partir d'héparines naturelles, par fractionnement ou dé10 polymérisation d'héparines naturelles, ont de préférence des tailles n'excédant pas 24 motifs saccharidiques Les fragments obtenus par synthèse ou constitutifs de fractions obtenues à partir d'héparines naturelles, par fractionnement ou dépolymérisation d'héparines naturelles, ont de préférence des tailles n'excédant pas 25 motifs saccharidiques. L'héparine est un médicament dont les activités anticoagulantes sont bien connues Traditionnellement, son activité est exprimée en unités USP Cette activité est le 20 reflet de ce qu'il est convenu d'appeler une activité anticoagulante globale, dans la mesure o elle paraît affecter un nombre important des facteurs sanguins intervenant au niveau de la coagulation. L'héparine est en outre caractérisée par une acti25 vité antithrombotique que reflète l'activité particulière à l'égard du facteur X activé (ou activité anti-Xa), cette activité étant exprimée en unités Yin-Wessler Il est également connu qu'il est possible d'obtenir, à partir de l'héparine, des fractions de poids moléculaire réduit, que ce soit par fractionnement ou dépolymérisation de l'héparine, ces fractions étant caractérisées par une activité anti-Xa au moins égale ou supérieure à celle de l'héparine, 5 mais dont l'activité USP est déprimée dans des proportions qui peuvent être considérables Des fragments ayant une activité anti-Xa considérable et étant pratiquement dépourvus d'activité USP, et ayant en outre une structure du même type que certains éléments de structure contenus dans les héparines naturelles, ont été obtenus par synthèse. L'invention découle de la découverte que des héparines de bas poids moléculaire, en particulier des fractions ayant des poids moléculaires n'excédant pas environ 10.000, peuvent'présenter une activité d'inhibition de proliférations cellulaires anormales, voire même de régression ou de suppression de ces proliférations L'invention concerne donc plus particulièrement les compositions pharmaceutiques conditionnées pour l'utilisation dans des traitements visant à l'inhibition et/ou à la régression de 20 proliférations cellulaires anormales, caractérisées par la combinaison avec un véhicule pharmaceutique approprié au mode d'administration choisi, d'une dose efficace d'une héparine à bas poids moléculaire répondant aux caractéristiques qui ont déjà été évoquées ci-dessus. Ces héparines de bas poids moléculaire peuvent être choisies parmi celles qui présentent une activité antithrombotique remarquable, notamment celles qui sont caractérisées par une activité anti-Xa et une activité anti-USP, dans un rapport supérieur ou égal à 3 A ce titre, l'invention concerne des compositions pharmaceutiques dont le principe actif est constitué par des fractions ou fragments d'héparine tels que décrits dans les brevets identifiés ci-après (ou obtenus par des procédés décrits dans les brevets identifiés ci-après): brevets français n 78 31357 du 6 11 78; n 79 18873 du 20 07 79; n 79 34673; demandes de brevet européen no 80 401425 6 du 6 10 80; n 81 400449 5 du 20 03 81; n 82 900970 3 du 9 12 82; 5 n 82 400739 7 du 26 04 82; n 82 400770 2 du 28 04 82 n 81 301825 6 publiée le 16 12 81; n 81 400728 publiée le 18 11 81; demandes de brevet français no 78 23499 publiée le 9.03 79 et n 81 01508 publiée le 31 07 81; demande de brevet PCT n 81 00252/WO 82 010005 publiée le 1 04 82. Cette liste est bien entendu non limitative. L'invention s'étend encore aux compositions contenant des fractions ou fragments d'héparine de bas poids 15 moléculaire, tels qu'obtenus par les procédés décrits dans la littérature scientifique, même si ces fractions ou fragments ne présentent pas les activités anti-Xa caractéristiques des fractions ou fragments obtenus par les techniques qui sont décrites dans les brevets et demandes de brevet 20 qui précèdent. L'invention concerne plus particulièrement encore les compositions présentant une activité antitumorale et dans lesquelles les fractions oligosaccharidiques ou mucopolysacoharidiques (selon l'expression utilisée plus loin 25 dans les exemples) comporteraient de quatre à huit motifs saccharidiques. D'une façon générale, l'invention concerne également les médicaments conditionnés de façon industrielle, comprenant outre les compositions sus-définies, les embal30 lages et notices d'emploi de ces compositions comprenant les recommandations écrites quant à la façon la plus favorable d'utiliser les médicaments du genre en question. Ces médicaments exercent une activité préférentielle à l'égard des proliférations cellulaires du type 35 sarcome ou mélanome D'autres types de tumeurs sont sus- ceptibles de relever de l'utilisation du médicament, étant évidemment entendu que son action pourra être d'efficacité variable, comme cela est constaté en rapport avec l'utilisation de tout médicament antitumoral connu à ce jour, selon la nature des tumeurs en cause. Lorsque le médicament selon l'invention présente l'activité antitumorale recherchée (et c'est naturellement plus particulièrement le cas lorsque ces tumeurs sont du type sarcome ou mélanome), il est utilisé de façon particulièrement avantageuse comme traitement associé, voire même comme substitut aux chimiothérapies et/ou radiothérapies utilisées à ce jour pour tenter d'éradiquer les cellules tumorales résiduelles ou pour prévenir des métastases chez des patients ayant subi une exérèse de la plus grande partie de la tumeur ou des tumeurs concernées Dans ces conditions, le médicament selon l'invention est utilisable aussi bien à titre curatif qu'à titre préventif Des posologies susceptibles d'être envisagées seront indiquées plus loin. Un autre domaine d'application préféré des médicaments conditionnés selon l'invention est celui de la régulation du renouvellement des cellules lisses subendothéliales de la paroi artérielle et de la prévention, voire de la régression de leurs proliférations excessives, 25 caractéristiques des états d'athérosclérose. Il est remarquable que les susdites activités d'inhibition des proliférations cellulaires anormales induites par les héparines à bas poids moléculaire sont susceptibles de se manifester, même en l'absence de corti30 sone ou de précurseur de celle-ci, tel que la corticostérone Cependant, l'utilisation dans la composition des médicaments selon l'invention de doses relativement faibles de ces derniers types de composés, pourrait être envisagée, dans la mesure o ces doses resteraient tolé35 rables pour des patients A cet égard, ces doses ne de- vraient pas dépasser 2 mg/kg par jour. Des caractéristiques supplémentaires de l'invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit d'essais biologiques effectués avec des fractions 5 d'héparine conformes à celles qui ont été décrites dans les demandes de brevet français no 78 31357 et n 80 06282 du 23 mars 1980. La fraction ci-après dénommée CY 216 a été obtenue par la technique décrite dans l'exemple I de la demande n 78 31357 La composition dénommée CY 222 a été obtenue dans les conditions décrites dans l'exemple 2 de la demande de brevet France n 80 06282. I Action anti-tumorale des fractions d'héparine naturelles ou de fractions naturelles dépolymérisées. Ont principalement été testés, le CY 216 et le CY 222 ayant les caractéristiques suivantes: Activité A Xa Activité USP CY 216 205 u/mg 50 ui/mg CY 222 248 u/mg 30 ui/mg EXEMPLE I: Action du CY 216 et du CY 222 sur un mélanome de type B 16 transplanté chez la souris. 10 Description du modèle expérimental: On utilise une suspension de cellules de mélanome fraîche à la concentration standard Après culture, la suspension cellulaire est lavée, puis centrifugée Le culot cellulaire est repris dans du milieu M 199 à raison de 1 ml 15 du culot pour 4 ml de milieu. 0,2 ml de cette suspension est inoculée par voie sous-cutanée sur le dos de la souris. Le test s'effectue sur des souris C 57 BL/6 La tumeur est syngénéique pour cette espèce et ne se développe 20 pas dans d'autres espèces. Les animaux sont répartis en groupes de 10 Un groupe sert de contr 8 le; le ou les autres groupes sont traités avec les produits à tester. Au jour JO, tous les animaux reçoivent une injec25 tion de cellules de mélanome, 0,2 ml d'une suspension a la concentration standard. Au bout de 6 à 7 jours, les tumeurs atteignent un volume suffisant pour pouvoir être reconnues à la palpation. Le premier groupe reçoit alors 2 injections quotidiennes intrapéritonéales du produit à tester, chaque injection contenant de 150 à 400 tug du produit dans 0,5 à 0,7 ml de soluté chloruré isotonique. Le deuxième groupe reçoit le même volume de soluté chloruré isotonique. Le traitement est poursuivi pendant 5 jours et les animaux sont alors sacrifiés. Les tumeurs sont prélevées et pesées et l'on com5 pare le poids des tumeurs dans les deux groupes. Les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition de la croissance chez les animaux traités par rapport aux animaux contrôle n'ayant reçu que le soluté chloruré isotonique. 10 RESULTATS Produit Dose quoti Poids % dienne par tumeur d'inhibition souris Exp NO 1 témoins 1456 777 O CY 222 2 x 400 ug 1054 6 615 27 CY 216 2 x 150 ug 1488 + 1015 O Exp N 2 témoins 1701 1160 O CY 222 2 x 400 ug 1053 + 650 38 % CY 216 2 x 300 ug 1359 + 692 20 % EXEMPLE 2: Action des fractions CY 222 à l'égard du lymphosaroome 18. Description du modèle expérimental: On utilise des cellules de lymphosarcomes provenant de donneurs leucémiques On utilise des souris C 57 BL/6 Les animaux reçoivent par voie intrapéritonéale x 10 cellules de lymphosarcome au jour JO. Le traitement commence au jour JO et est poursuivi pendant un mois à raison de deux injections de 150 à 500 ug par animal, par voie intrapéritonéale, dans 30 un volume de 0,5 à 0,7 ml. Au bout d'un mois, les animaux sont sacrifiés et autopsies et l'on compte le nombre de sarcomes sur 15 20 25 30 thymus, le fois, la rate et les ganglions lymphatiques. RESULTATS Deux groupes de 6 animaux ont été utilisés, l'un servant de contrôle Le groupe traité reçoit journellement deux injections de 500 Fg du produit CY 222 dans 0,5 ml de soluté chloruré isotonique Le groupe contr 6 le reçoit le même volume du soluté chloruré isotonique seul Parmi le groupe traité, deux animaux sont morts d'hémorragie au cours de l'expérience L'un d'entre eux, à l'autopsie, ne présentait aucun sarcome. Les résultats figurent dans le tableau suivant. Ils sont donnés par animal survivant Les croix représentent le nombre de sarcomes Le tableau indique également les organes sur lesquels les comptages ont été effectués. Résultats Témoins Animaux traités thymus * *** *** _* foie ** * * 1 *rate ** * * ** ganglions **** ** lymphatiques ** **** *** * On constate donc une réduction globale des nombres à la fois de sarcomes et des animaux affectés, lorsque ceux-ci ont été traités, vis-à-vis des résultats observés chez les animaux témoins. Les mucopolysaccharides de l'invention sont, en outre, avantageusement dépourvus de toxicité. Ces produits sont donc particulièrement précieux pour l'élaboration de médicaments utilisables, notamment, pour la prévention et le traitement de proliférations 10 cellulaires anormales, notamment dans 1 ' athérosclérose et dans des affections néoplasiques. L'invention est donc relative également à des préparations pharmaceutiques qui renferment lesdits mucopolysaccharides actifs vis-à-vis de phénomènes de type 15 dégénératif. Elle est plus particulièrement relative à des préparations pharmaceutiques dépourvues de substances pyrogènes, contenant une quantité efficace de principes actifs en association avec des excipients pharmaceutiques. 20 Elle concerne également les compositions dans lesquelles le véhicule pharmaceutique est approprié pour l'administration par voie orale Des formes d'administration de l'invention appropriées pour l'administration par voie orale peuvent être avantageusement des gélules 25 gastrorésistantes, des comprimés ou tablettes, des pilules, ou encore présentées sous forme de liposomes ou de solutions buvables Ces préparations renferment avantageusement de 50 mg à 5 g par unité de prise, de préférence 200 à 250 mg pour les gélules, tablettes 30 et pilules, et de 0,5 à 5 g pour les solutés buvables. En conséquence, les formes d'administration dépendent essentiellement de la dose à administrer Les gélules, tablettes et pilules seront d'une utilisation pratique pour l'administration de faibles doses Pour l'administra35 tion de doses plus élevées, les solutés buvales pourront être d'une utilisation plus pratique. D'autres compositions pharmaceutiques comprennent ces mucopolysaccharidesen association avec les excipients appropriés pour l'administration par voie rectale. 5 D'autres formes d'administration de l'invention sont consitutées par des aérosols ou des pommades. L'invention concerne également des compositions pharmaceutiques injectables, stériles ou stérilisables pour l'administration tant par voie intraveineuse qu'in10 tramusculaire ou sous-cutanée. Ces solutions renferment avantageusement de à 250 mg/ml demucopolysaccharides, de préférence de 100 à 150 mg/ml, par exemple de 150 mg/ml, lorsque ces solutions sont destinées à l'injection par voie 15 sous-cutanée Elles peuvent contenir, par exemple de à 250, notamment 150 mg/ml de mucopolysaccharides, lorsqu'elles sont destinées à l'injection par voie intraveineuse ou par perfusion. Avantageusement, de telles préparations pharma20 ceutiques sont présentées sous la forme de seringues non récupérables, prêtes à l'emploi. Les compositions de l'invention sont plus spécialement appropriées pour lutter contre le vieillissement des tissus ou des manifestations de type dégénératif 25 telles que les alopécies. Afin d'illustrer l'invention, on indique, ciaprès, un exemple de posologie utilisable chez l'homme: cette posologie comprend, par exemple, l'administration au patient de 50 mg à 150 mg par voie sous-cutanée, une 30 à trois fois par jour,selon le degré de développement des proliférations cellulaires anormales, ou de 150 mg/ 24 heures, par voie intraveineuse, en administrations discontinues à intervalles réguliers, ou continues par perfusion, ou encore de 150 mg (trois fois par semaine) par voie intramusculaire ou sous-cutanée Ces doses peuvent être naturellement ajustées pour chaque patient en fonction des résultats et des analyses effectuées auparavant, la nature des affections dont il souffre et, d'une manière générale, son état de santé et de l'état de la coagulation. Il est maintenant bien connu que l'on dispose à ce jour de toute une gamme de fractions d'héparine à faible poids moléculaire, qu'il s'agisse de fractions 10 ou fragments obtenus à partir d'héparines naturelles ou d'oligosaccharides obtenus par synthèse,-ne possédant que des activités USP faibles ou n'en ayant en pratique aucune Il pourra donc être utile de choisir parmi ces différentes fractions celles qui seront les plus compa15 tibles avec l'état de coagulation, éventuellement d'hypocoagulation du patient à traiter Il pourra être utile de choisir, parmi ces fractions d'héparine, celles dont les activités USP sont les plus réduites, voire nulles, lorsque le traitement s'adressera à un patient sujet 20 à de sérieux risques d'hypocoagulation. L'invention concerne encore les réactifs biologiques dont les principes actifs sont constitués par des héparines à bas poids moléculaire, telles qu'elles ont été définies plus haut, ces réactifs biologiques 25 pouvant être utilisés comme référenc esou étalors dans des études des éventuelles propriétés antitumorales d'autres substances, notamment dans des tests mettant en jeu les techniques qui ont été décrites dans les exemples précédents. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés; elle en embrasse au contraire toutes les variantes; en particulier l'in35 vention concerne à ce titre toute composition contenant un mucopolysaccharide formé d'une séquence de motifs saccharidiques, comportant notamment de 4 à 24 motifs saccharidiques, plus particulièrement hexa-, octo, déca et dodécasaccharides par exemple, dont la structure cor5 respond à celle d'une séquence existant à l'intérieur des chaînes polysaccharidiques constitutives de l'héparine, cette composition étant plus particulièrement conditionnée en vue de leur utilisation pour prévenir ou traiter des proliférations cellulaires anormales in vivo. REVENDICATIONS 1 Composition conditionnée pour l'utilisation dans des traitements visant à l'inhibition ou à la régression de proliférations cellulaires anormales, ou les deux à la fois, caractérisée par l'association 5 d'une dose efficace d'héparine à bas poids moléculaire avec un véhicule pharmaceutique. 2 Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la majeure partie des héparines de bas poids moléculaire entrant dans cette composition 10 est constituée de fractions, séquences ou fragments présentant des tailles n'excédant pas 24 motifs saccharidiques. 3 Composition selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que la majeure 15 partie des héparines de bas poids moléculaire ont des poids moléculaires n'excédant pas 10 000. 4 Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la majeure partie des héparines de bas poids moléculaire sont constituées par des motifs oligosaccharidiques comportant de 4 à 8 motifs saccharidiques. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le véhicule pharmaceutique est approprié à l'administration par voie orale de la composition, et en ce que ces compositions sont dosées de façon à permettre l'administration de 50 mg à 5 g par unité de prise. 6 Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le véhicule 30 pharmaceutique est approprié à l'administration par voie parentérale, cette composition étant dosée à des valeurs de 50 à 250 mg/litre. 7 Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est dosée en vue de permettre des administrations en une seule injection de 50 à mg. 8 Médicament conditionné de façon industrielle associant une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, avec un emballage et le cas échéant une notice d'emploi comprenant les recommandations écrites quant à la façon la plus favorable d'utili10 ser ladite composition pharmaceutique dans le but d'inhiber des proliférations cellulaires anormales, ou d'en provoquer la régression, ou encore d'exercer les deux actions à la fois. 9 Réactif biologique utilisable comme réfé15 rences ou étalons dans la réalisation de mesures comparatives des activités antitumorales, notamment antimélanomes ou antisarcomes, de substances à l'étude sous l'angle desdites propriétés, caractérisé par le fait que le principe actif de ce réactif est consti20 tué par une héparine ou des héparines à bas poids moléculaires conformes à l'une quelconque des revendications 1 à 4.