FR 2551084 A1 19850301 FR 8413201 A 19840824 1 25 551084 i CHELAT ES NATURELS POUR L'F LININAI(ION DE RADIONUCLEIDES DU CORPS ET PROCEDE DE DESORPTION D'UN RADIONUCLEIDE. La àprésente inivention concerne un procédé et les cle l ates qui en resu l ternt, pur d O Isorther ull rad i onucl i de sélectionné tel que le thorium, l'uraniuml et le pluto niium, sous une forme hiodisponibl e derivée de pseudomonas 5 ouc, d'autre ilicroorlganismes Un mnicroorganilsme préféré est le F'seudomlonas aeru inosa qui donnie de nombl-elux chelates avec le thor ium dans la gamme de masses moléculaires de 100-1000 a 100 o-2000. La présente inuventlion concerne un procédé de plroduc10 tion de chélates et d'utilisation de ces produits qt 1 i sont dles combinaisons de métaux lourds tels que le thorium, l'uranium et le plutonilum, obtenues à partir cde microorganismes, cormme les isolats de pseudomonas. Une liste des microorganismes se prêtant a une utilisation 15 dans la présente invention est donnée dans le tableau 1. Il est souhaitable de disposer, en particulier dans le domaine des réacteurs atomiques utilisant des particules radioactives, de désorbants qui soient rapides, efficaces, et non toxiques et pouvant être utilisés pour éliminer cliniquement ces métaux du corps humain par ingestion ou administration intraveineuse ou intramusculaire dans le flux sanguin. Le terme de "chelate" est en général bien connu et designe des composés qui sont des complexes avec 25 1 l'EDTA et la NIA Ces complexes sont palr exemple décrits dans l 'Encvclopedia of Chemical Technologqv, 3 ème édition, volume 5, 1979, pages 339-368, de Kirkl Othlmer. Les microorganismes Pseudomonas et d'autres, qui sont utilisables pour la production d'agents de complexation 30 spécifiques de l'uranium du thorium, du plutonium, ete, sont cultivés dans des conditions de laboratoire optimales permettant une production maximale d'agents de séquestration pour ces métaux Les cellules obtenues à partir de 2 2551084 cultures en discontinu et/ou en continu et qui se développent pour chacun des métaux ont été recueillies et fractionnées en fractions intracellulaires et subcellulaires Les fractions contenant les concentrations les 5 plus élevées en métal, par exemple en thorium, ont été chimiquement séparées et classées selon les principales classes de produits naturels responsables de la complexation des métaux considérés En général, il suffit simplement d'effectuer un mélange intime en utilisant un micro10 organisme de titre moyen ou élevé ( 1-20) tel que P. Aeruginosa et des combinaisons semblables de sels métalliques (par ex Th+ 4) pour produire un chélate soluble dans l'eau. Dans la présente application, P Aeruginosa a été 15 utilisé comme agent ou modèle préféré et on a découvert qu'il produisait en réalité plusieurs agents de chélation dans des milieux de culture lorsqu'il était provoqué par du thorium et de l'uranium. Plusieurs agents de chélation différents de masses 20 moléculaires (MM) inférieures à 2000 sont produits par P Aeruginosa Dans la gamme de MM de 1000-2000, on ne trouve pas de complexes du thorium Dans la gamme de MM de 300-1000, il se forme quatre complexes du thorium. De même dans la gamme de MM 100-300, il se forme égale25 ment quatre complexes du thorium Dans des cultures se développant en présence d'uranium, au moins deux complexes sont produits dans la gamme de MM de 1000-2000; dans la gammine de MM de 300-1000, il se forme quatre complexes de l'uranium; alors que pour une MM inférieure à 300, il 30 se forme au moins sept complexes. Ces résultats montrent que les nouveaux agents de chélation possèdent des centres réactifs constitués par des radicaux isoquinoléine, catéchol, phénol, amino et hydroxamate Les analogues synthétiques sont des agents 35 de chélation in vitro efficaces et possèdent certaines propriétés avantageuses par rapport aux acides polyaminopolycarboxyliques (comme i'EDTA) in vivo. 255 1 0 8 4 On peut s'attendre à ce que les agents de chélation produits biosynthétiquement soient plus sélectifs et stables dans des conditions biologiques, puisqu'ils sont générés in vitro dans des conditions hautement compétitives Par comparaison à de nombreux composés de chelation qui ont été et/ou qui peuvent être synthetises chimiquement et essayés à des fins thérapeutiques, cette approche biosvnthètique utilise les microorganiismes pour présé 11 ectionnler un nombre relativement faible 10 de composés de chelation efficaces. Conditions requises pour le chelate de métal lourd La lpresenrte invention est étroitement liee aux effets bioiogiqiies des radionucléides, cetlx-ci ayant fait l'objet d'études et de recherches approfondies. 'lang c ces recherches, on ne dispose toujours pas d'agents de chelation appropriés qui soient spécifiques et efficaces pour l'élimination de radlionucleides ingéres par des êtres humains, cette utilisation finale étant celle qu'envisage la présente invention Les caractéristiques 20 d'Un agent de chelation idéal sont: ó 1 i inoffensif dans le cas d'une administration prolongée a un patient interne ou non; ( 2) une chélation contrôlable des traces d' éléments essentiels; ( 3) un rapport dlose thérapeutique' dose toxique élevé; et l) réduction efficace des charges 25 imposées aux tissus mous et aux os, en particulier lorsque le traitement a commencé longtemps après l'e xposition au radionucleide. L'invention concerne également en particulier le fait que les systèmes vivants tcomnme les microorga30 nismes) peuvent a la fois servir d'indicateurs et de sources d'agents de chélation naturels pour le thorium, l'uranium, le plutonium et d'autres radionucltides. Par comparaison aux travaux antérieurs utilisant des agents de chelation synthétiques tels que l 'EDTA, la NTA etc ces microorganismes peuvent étre tres sèlectlfs. Répartition des métaux lourds et des radionucléides La répartition des métaux lourds, parmi lesquels les radionuiclides, dans divers organismes vivants a fait l'objet d'études approfondies Ces études ont 5 clairement établi qu'il existait une sélectivité des espèces, tant du point de vue des organismes que des métaux Les facteurs d'absorption et de concentration dépendent de la spéciation chimique du métal en solution. Celle-ci dépend à son tour du p Hf de la solution-composition, par exemple de la concentration en ions complexants. de la formation de produits anioniques insolubles, et des particules en suspension qui entrent en compétition par adsorption superficielle L'un des points particu15 li iem-enit intéressants de cette étude est 1 l'aptitude qu'ont certains microorganismes à bioaccumuler sélectivement des métaux lourds En ce qui concerne les mécanismes par lesquels les microorganismes peuvent accumuler certains métaux, plusieurs possibilités peuvent étre 20 envisagées Le métal peut étre lié à la surface de l'organisme, absorbé intracellulairement et soumis à des transformations biochimiques du radionucleide pouvant conduire à une solubilisation ou une précipitation, par l'intermédiaire de métabolites spécifiques et par 25 conséquent, mettre en jeu un mécanisme biochimique dans les processus metaboliques etiou de détoxication iesponsables de la discrimination sélective des métaux lourds par les microorganismes Les acgents biochimiques qui sont responsables de la liaison et ou de la solubi30 lisation de metaux Iourds tels que l'uranium et d'autres, dans des systemes biologiques, sont d'un intérêt particulier pour la présente invention Un agent de chélation efficace pour la complexation d'un métal lourd dans des conditions biologiques doit étre spécifique, non toxique, stable ln vivo et rapidement excrété La caractéristique saillante de la préesente invention est l'utilisation d'organismes capables d'interagir sélectivement avec des métaux 255 '108 4 lourds, à la fois comme indicateurs et comme sources d'agents de chélation naturels Dans les processus biochimiques d'un organisme, ces composés doivent satisfaire in vivo les conditions ci-dessus. L'une des étapes clés de l'invention est de cultiver des microorganismes sélectionnes dans des conditions optimales en présence du métal La biodisponibilité d'un metal dans un milieu de culture est influencée par la composition clhimique du milieu, la solubilité 10 et la forme sous laquelle se trouve le métal, ainsi que par la complexation du métal, à la fois par les agents complexants présents (par exemple des constituants du milieu) et ou par des agents complexants nouvellement fomils pal les microorganismes pendant la phase de 15 cu lture. Speciation et biodisponibilité du métal Aux fins de l'invention, la "forme biodisponibl&" du métal doit satisfaire les conditions suivantes: 1 le métal présent dans le milieu est sous forme 20 soluble; 2) dans les conditions expérimentales, la concentration en métal du milieu n'est pas toxique vis à vis du microorgan i sme; 3) le métal doit être lié à des composés de masse 25 moléculaire élevée, tels que des hydrates de carbone et des proteines, qui peuvent précipiter etou qui ne peuvent pas traverser la paroi cellulaire; 4) dans les conditions expérimentales, la complexa tion du métal devrait empêcher la formation de polymeres 30 h Ydl oxvlles insolubles; ) s'-il se produit une interaction entre le métal et les constituants du milleu de culture de contrôle, le piodult ne devra alors pas étre insoluble et se sepaler de la solution par précipitation. La 'forme insoluble" initiale, telle qu'un sel du metal peut étre considérée comme étant la forme la moins biodisponible par rapport à la forme ionique ou complexée du métal en solution Il est en outre connu que le plutonium, le thorium, I'uranium et les métaux transuraniens donnent naissance à des polymères dans des solutions aqueuses dans certaines gammes de p H et de concentrations Ces formes polymères ont une large gamme de masses moléculaires ( 2000 5000) et, en ce qui concerne la complexation et/ou l'accessibilité au microorganisme, sont inertes et par conséquent, sont par définition, dans ce protocole expérimental, non biodisponibles. Methodololie du thorium et de l'uranium Il est à noter que selon la présente invention, le thorium est utilisé au même titre que le plutonium, 15 car l'expérience montre que les agents de chélation efficaces pour le thorium le sont en général aussi pour le plutonium. Pour la détermination photomérique du thorium, on se reportera à l'Exemple 1. Contrairement à la méthode photomérique, la détermination du thorium par une électrode non sélective s' effectue à p H pratiquement neutre, c'est à dire dans la gamme de p H des milieux de culture. Selon cette méthode, la teneur en thorium est 25 déterminée indirectement A une solution échantillon contenant du thorium, on ajoute une excès connu de fluorure Une fois la réaction achevee, on mesure la quantité d'ions fluorure n'ayant pas réagi à l'aide d'une électrode spécifique des ions fluorure. Une réaction typique de ce procédé est donnée par: 2 Th + SF -4 L Th L 4 + Th F 4 + 4 F 4 4 o L est un agent complexant pour le thorium avec un K 106, c'est à dire supérieur à celui du fluorure de thorium Comme le thorium donne lieu à un complexe 35 de tetrafluorure de thorium en quantité importante, la concentration en thorium est déterminée à partir de la différence entre la quantité de fluorure ajoutée En général, la concentration en ion fluorure est déterminee dans un tampon d'acétate de sodium contenant de l'ACDT (acide cyclohexylene dinitrilo tétracetique) comme agent complexant Cependant, le thorium est aussi complexe par l'ACDT et l'acétate dans ce tampon, de sorte que cette méthode ne peut être utilisée aux fins de la présente invention Un procédé modifié a été mis au point pour ces déterminations de routine de la concentration en thorium Dans le procédé modifié. 10 on utilise une solution tampon de triéthanolamine qui n'interfère pas avec la détermination indirecte du thorium On mesure des échantillons de fluorure dans des coupelles de plastique pour éviter l'adsorption par le verre On utilise un p H-mètre à échelle dilatée 15 óCoraning Digital 110) avec une électrode combine à fluorure Orion Le fluorure de sodium (qualité ACS pur pour analyse) a été obtenu auprès de la Allied Chemical Co, Specialty Chemical Division, Morrison, New Jersey La triéthanolamine a été obtenue auprès 20 de la societe Fisher Scientific Company. Les echantillons préparés doivent avoir un p H compris entre 5 et 6 pour éviter la formation de fluorure d'h drogene en dessous de p H 5 ainsi que la formation de complexes polyhydr-oxo du thorium au-dessus de p H 6. 25 Le tampon a base de triethanolamine présente un faible pouvoir de neutralisation à un p H proche de 5,5 et nécessite par conséquent un facteur de dilution important ( 1 à 10) poui maintenir le p H à proximité de 5,5 Jusqu'à présent, la limite de détection atteinte en laboratoire 30 est de -, 10 pprn de Th Cette méthode peut également être utilisée pour la détermination de l'uranium et, avec la modifications nécessaires, pourra être utilisée de facon routinière. La caracteristique saillante de ce procédé est que l'électrode à sélectivité ionique mesure seulement la concentration en fluorure libre Par conséquent. si un compose de chélation est produit dans le milieu de culture en quantité notable et s'il est capable d'entrer en compétition avec les ions fluorures libres pour la complexation du thorium, une quantité équivalente d'ions fluorures devra alors étre libérée et devenir decelable La présence de chelates du thorium peut donc être détectée par différence dans ce système à plusieurs chelates. Cultures Le Pseudomonas aeru Qinosa CSU connu pour bioaccumuler 10 le plutonium et l'uranium, a été obtenu auprès du labonatoire National d'Oak Ridge Tenessee Plusieurs isolats de bactéeries provenants d'échantillons de produits de lixiviation obtenus dans des sites de dépôt de déchets faiblement radioactifs du commerce, se trouvant a Malxey Flat, Kentucky; West Valley, New York; et Barnell, South Carolina; et plusieurs cultures de bacteries, de fungi et d'actinonyc Ates connus pour bioaccumuler les radionucléides ou capables de produire des agents de séquestration dans le milieu de culture, ont été obtenus auprès de 20 la "American Type Culture Collection" (ATCC) et sont énumérés dans le Tableau 1 Ces cultures ainsi que d'autres, sont conservées en tant que partie de la collection de cultures au Brookhaven national Laboratory et seront soumises à des essais de production d'agents 25 de séquestration du Th et de l'U dans le milieu de culture. Milieu de culture Bouillon nutritif (Dufco Michigan> contenant i de dextrose ou milieu défini ayant la composition 30 suivante par litre: 0,1 S mg de Fe SO 4 7 H 20; 0,035 mg de Mg SO 7 H 10; 0,67 g de glycérol-2-phosphate disodique hydrate ( 5-1/2 H 20); _ 0,85 g de KNO 3; 1,17 g de NH 4 NO 3; 2,0 g de glucose; 27,1 g de citrate trisodique; p H ajsuté à 6,9 par addition 35 d'acide citrique ( 2 g) Dans ces conditions, le sel de thorium ajouté reste en solution Le nitrate de thorium a été obtenu auprès de la ICN Pharmaceuticals, Plainview, New York. Tableau I Liste des cultures 1 Aspergillus niger ATCC 34467 2 Actinomyces humiferus ATCC 25174 3 Azotobacter vinelandii ATCC 7496 4 A vinelandii ATCC 9104 5 Micrococcus luteus ATCC 15176 6 M luteus ATCC 15932 7 Micobacterium phlei ATCC 354 8 M phlei ATCC 10142 9 M phlei ATCC 15610 10 Pseudomonas aeruginosa ATCC 14885 11 P aeruginosa ATCC 15522 12 P fluorescens ATCC 11250 13 P fluorescens ATCC 13475 14 P fluorescens ATCC 25289 15 Brevibacterium iodinum ATCC 15729 16 Pseudomonas sp ATCC 15165 17 Pseudomonas sp ATCC 15779 18 Pseudomonas sp ATCC 19286 19 Pseudomonas sp ATCC 31155 20 Pseudomonas sp ATCC 17483 21 Pseudomonas aeruginosa CSU La culture des bactéries dans un milieu défini contenant du thorium a pu être vérifiée dans une gamme de O à 10000 ppm de Th sous forme de Th(N 03) 4 Un grand nombre des cultures soumises à l'essai ne se sont pas développées dans le milieu défini Un milieu de culture adéquat dans lequel Th ou U n'intéragit ou ne précipite pas avec les constituants du milieu doit être mis au point pour évaluer l'aptitude des cultures microbiennes à produire des agents de séquestration du Th ou de U 10 dansele milieu de culture Les cultures qui se développent dans le milieu défini contenant du Th (Tableau II) ont été soumises à un essai de production d'agents de complexation. En ce qui concerne la sélection de bactéries 15 utilisables dans des milieux contenant du thorium comme indiqué dans le Tableau II, on a découvert que la famille de bactéries des Pseudomonadales, couvrant globalement les Pseudomonas et en particulier aeruginosa, fluorescens, et Pseudomonas sp, ainsi 20 que les bactéries de la famille des Micrococcacées comprenant S Lutea, étaient en général utilisables. En outre, pour tous les métaux sélectionnés, le thorium, l'uranium et le plutonium, les microorganismes tels que ceux indiqués dans le Tableau I sont également efficaces en ce qui concerne la formation de chélates non toxiques solubles dans l'eau: Aspergillus niger, Actinomyces humiferus, Azotobacter vinelandii, A. vinelandii, une mycobactérie telle que Mycobacterium phlei et une brevibactérie telle que Brevibacterium 30 iodinum Les autres microorganismes énumérés dans le Tableau I par indice et propriété possèdent l'indice de chélation indiqué pour une utilisation avec le thorium et l'uranium, ainsi qu'avec le plutonium du fait de ses caractéristiques très proches de celles 35 de l'uranium. 1 1 Tableau II Culture de bactéries dans un milieu défini contenant du Th. Culture Micrococcus luteus ATCC 15176 M luteus ATCC 15932 Pseudomonas aeruginosa CSU P aeruginosa ATCC 14885 10 P aeruginosa ATCC 15522 P fluorescens ATCC 11250 P fluorescens ATCC 13475 P Iodinum ATCC 15729 Pseudomonas sp ATCC 15165 15 Pseudomonas sp ATCC 17483 Pseudomonas sp ATCC 19286 14 cultures isolaties à partir d'un lixiviat de déchets faiblement radio20 actifs 4 cultures provenant de sédiments de Morro do Ferro Th(ND 3) 4 0 10 100 m - Th + 4 1,000 (pmn) 10., 000 _Z + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + = Croissance A 0-1000 ppm la croissance s'amorce au bout de 24 h alors qu'à 10000 ppm, il ne se produit aucune croissance après 4 jours. = Pas de croissance dans le milieu défini. Il a été noté que lorsqu'on ajoute un métal à un milieu défini, la croissance des microorganismes se ralentit Cette mesure a pu être effectuée à partir des différences d'augmentation de la turbidité en tant 5 que mesure de la croissance En d'autres termes, l'une des caractéristiques courantes des effets de concentrations sublétables de métaux sur les bactéries est un retard du début de la croissance. Le degré de développement de P Aeruginosa dans 10 un milieu contenant 0, 1, 10, 100 et 1000 ppm de Th ajouté sous forme de Th(NO 3)4 a été déterminé Le p H du milieu après addition de 1000 ppm de Th passe de 6,4 à 7 Le p H du milieu est par conséquent ajusté à 6,9 avec du Na OH 1 N On transfère 1 ml d'une culture 15 de P Aeruginosa de 24 h cultivée dans un bouillon nutritif, dans un milieu défini contenant diverses concentrations de Th On note l'augmentation de la turbidité indicatrice du degré de développement On observe en général une période de retard dans les êchan20 tillons témoins, principalement due au transfert de l'inoculum d'un milieu riche en matières nutritives vers un milieu défini Cependant, au fur et à mesure que la concentration en Th augmente, la période de retard de croissance de l'organisme augmente également. 25 A la concentration de 10000 ppm de Th, on remarque un prolongement du retard de croissance suivi d'une diminution de la croissance Cet effet du thorium sur les bactéries peut être dû à la toxicité ou à des propriétés bactériostatiques Les cultures se développent 30 d'abord lentement, puis à une vitesse sensiblement égale à celle du témoin ne contenant pas de thorium. L'effet de l'uranium sur la croissance de P,Aeruginosa dans un milieu à base de citrate contenant 0, 10, , 1000 et 10000 ppm d'uranium (U), ajouté sous forme 35 de nitrate d'uranyle, a été évalué Les rsultats indiquent que i'U produit un effet inhibiteur plus intense sur la croissance de l'organisme que-le Th aux mêmes concentrations. L'étude de l'effet du fer sur le développement de P Aeruginosa en présence et en l'absence de thorium ou d'uranium a montré qu'il n'y avait pas d'effet significatif sur la croissance des bactéries Cela suggère que des traces de fer présentes dans les sels minéraux sont suffisantes pour permettre la croissance de l'organisme. 10 L'addition de Th au milieu avec et sans fer n'a pas d'effet sur la croissance de P Aeruginosa Bien que l'on constate une augmentation de la période de retard dans des milieux contenant U, l'addition de fer au milieu diminue cette période de retard de croissance 15 de l'organisme d'environ 12 h Cela indique qu'il existe une certaine forme d'interaction entre Fe et U avec le métabolisme de l'organisme. Tableau III Bioaccumulation de Th ou de U par P Aeruginosa dans un milieu avec et sans addition de fer. Supplément Cbnc (ppm) en métaux % trouvé dans les 30 Métal Fe Pds des des cellules du liquide cellules cellules surnageant (pds sec) (ppm) (ppm) à sec (g) O * 0,04 O O O 18 0,05 O O O Th ( 100) O 0,06 0,21 93,4 0,22 Th ( 100) 18 0,05 0,23 91,8 O U ( 100) 0 0,03 1 U ( 100) 18 0,05 2,20 125 1 * Pas d'addition de fer, à l'exception de traces présentes dans les sels minéraux utilisés pour préparer le milieu. EXEMPLE 1 Détermination photométrique du thorium. La concentration en thorium (Th) a été déterminée de façon routinière par un procédé photométrique (McKlveen et al, Nuc Techn 28:159-164, 1976) Selon ce procédé on utilise de l'arsenazo III (mélange de 1,8dihydroxynaphtalène, d'acide 3,6-disulphonique et d'acide 2,7-bis(azo-2)ph 6 nylarsonique), qui est un colorant azoique, pour le faire réagir avec du thorium IV dans du HC 1 9 N ou du H 2 SO 4 0,1 N La formation du complexe thorium-arsenazo III est rapide ( distillée (cellule étalon de I cm mesurée à 665 nm). Pour effectuer les déterminations de routine, on mélange en volume des échantillons de milieux de culture contenant du Th et des agents nutritifs pour la croissance bacté20 rienne avec le réactif arsenazo III selon un rapport 1:5 pour maintenir le p H à environ 1,5 et ainsi, éliminer les éventuels autres complexes, tels que ceux qui sont dus au milieu La sensibilité pratique de la détermination est de 0,05 ppm dans des milieux de culture du thorium. 25 Comme les milieux de culture sont légèrement colorés, on évalue un facteur correctif de l'absorption du milieu et on l'applique à toutes les mesures dans des conditions normalisées Selon ce procédé, les solutions utilisées doivent être exemptes d'agents oxydants (H 202, C 12, + 3 Br 2, etc) et réducteurs (Na 2 SO 3, Ti) car ils diminuent la sensibilité Ce procédé est simple et sensible pour les déterminations routinières de la concentration en thorium et en uranium. Un autre avantage offert par le procédé utilisant 35 le complexe thoriumarsenazo III est que ce complexe est stable dans une solution fortement acide dans laquelle les complexes thorium-anion de constituants du milieu de culture (oxalate, phosphate, sulfate, etc) se décomposent La quantité de thorium mesurée 5 par ce procédé représente la totalité du thorium en solution (c'est-à-dire MT). De l'arsenazo III contenant moins de 0,1 % de calcium a été obtenu auprès de la Société Aldrich Chemical Co Du nitrate de thorium, fourni par la Société 10 K+K Laboratory, Inc, Plainview, New York (Lot numéro 18800), a été utilisé pour préparer des échantillons de référence sans purification supplémentaire De l'eau désionisée ainsi qu'un spectromètre Beckman DBG pour toutes les mesures spectrophotométriques. 15 EXEMPLE 2 Détermination du thorium dans les cellules bactériennes. Deux procédés d'incinération au mouillé ont été 20 évalués pour déterminer la concentration en thorium dans des cellules lavées L'un de ces procédés utilise un mélange 1:1 (v/v de 70 % de H Cl O 4 et de 30 % de H 202). L'incinération des cellules s'effectue à la température ambiante pendant 16 h puis par chauffage à 70 C pendant 25 2 h Ce procédé est efficace pour la digestion des cellules; cependant, le mélange réactionnel obtenu contient des agents fortement oxydants qu'il est difficile d'éliminer sans modifier la teneur en Th De ce fait, ce procédé ne se prêtait pas aux déterminations routinières de la présente invention et a été rejeté Dans le second procédé, ce problème d'interférence est résolu par digestion des cellules dans du HNO 3 7 N à C pendant 24 heures On évapore ensuite l'acide jusqu'à siccité à 130 C et on dissout de nouveau le résidu dans de l'eau distillée On utilise ensuite les échantillons ainsi préparés dans les déterminations photométriques routinières de la teneur en thorium. EXEMPLE 3 Electrophorèse/chromatographie sur couche mince. La combinaison d'une électrophorèse et d'une chromatographie sur couche mince permet de séparer des complexes du thorium par chromatographie et électrophorèse bidimensionnelles sur des plaques uniques On analyse les complexes séparés tant qualitativement que quantitativement Actuellement, les fractions séparées sont visualisées par coloration (Arsenazo III) avec une limite de détection d'environ 10 picogrammes du métal. 15 EXEMPLE 4 Détermination du thorium par comptage de la radioactivité. Pour détecter et mesurer de faibles concentrations 20 en thorium dans des chélates de thorium pouvant être produits dans un milieu de culture, on peut utiliser des procédés de comptage de radioactivité Deux procédés sont préférés Dans l'un des procédés, on utilise du thorium à pic 234 Th et on effectue le dosage du thorium 25 au moyen d'un détecteur au Ge(Li) bien calibré pour le comptage des rayons y (Chu et al, Phy Rev C, 17 ( 4): 150761509, 1978). Le second procédé de dosage met en jeu un comptage à scintillation liquide Le compteur est équipé de 30 dispositifs discriminateurs de la hauteur et de la forme de l'impulsion qui éliminent les signaux de fond tels que l'activité beta et gamma de l'échantillon, du support d'échantillon et du tube photomultiplicateur. Outre les améliorations apportées par l'électronique, le signal est amplifié par l'utilisation d'un scintillateur liquide efficace, d'un déflecteur blanc diffus sphérique 255 1084 pour le photomultiplicateur et d'huile de silicone pour améliorer la transmission de la lumière Grâce à certaines améliorations de l'électronique et de la chimie de la préparation des échantillons, on peut obtenir des bruits de fond extrément faibles et la limite de détection est d'environ 10 f Ci pour le plutonium. Ces deux procédes permettent d'atteindre des dosages du thorium nettement inferieurs a la picocurie. EXEMPLE 5 Ciyodessication et chromatographie liquide sous haute pression On élimine les fractions de masses moléculaires élevées (> 5000) par ultrafiltration et on concentre les échantillons importants par cryodessication On a besoin de fractions brutes concentrées pour caractériser de facon detaillée les nouveaux composés intéressants que l'on isole des concentres bruts en effectuant à titre de préparation, une chromatographie par permeation sur colonne de gel et par chromatographie liquide sous 20 haute pression et en utilisant des techniques dérivées Lors de la chromatgraphie par perméation de gel (CPG>, on effectue une seconde vérification de la masse moléculaire Comme la séparation par CPG repose sur la différence des tailles moléculaires, on isole des fractions de masses moléculaires déterminées Toutes les opérations de fractionnement sont suivies d'un chromatographie sur couche mince diagnostique. EXEMPLE 6 Titrages potentiom Otriques 30 Le_ système de titrage est constitue d'une eélectrode de verre et d'un récipient de titrage thermostaté à à 25 C Pendant le titrage, on mélange les solutions de façon constante au moyen d'un agitateur magnétique à de l'azote exempt de C 0, en faisant passer 35 de la vapeur d'eau sur la solution On mesure le p H avec un p H-métre numérique Orion 210 A calibré avec 5 1 O 8 4 des solutions étalons (normes NBS) à p H 4,01, 6,86 et 9,18 Toutes les solutions utilisées pour les titrages sont exemptes de carbonate et on évite les impuretés métalliques La burette automatique fonctionne automati5 queinent au moyen d'un moteur pas à pas qui délivre 100 du volume par l'intermédiaire d'une seringue de verre calibrée, en 10000 incréments On surveille 1 ' évolution du titrage au moyen d'un enregistreur X-Y. IL'axe X est converti en burette numérique au moyen d'un convertisseur numérique-analogique, et l'axe Y est directement converti en p H Le processus de titrage est commandé par un micro-ordinateur Les résultats du titrage sont automatiquement stockés sur bande magnétique en vue de leur utilisation dans les calculs des constantes 15 de formation. EXEMPLE 7 Complexes du thorium et complexes de l'uranium L'information diagnostique présentée dans le Tableau 4 indique que les complexes du thorium sont associés aux fractions C, D, E et F Dans le biosystème se développant en l'absence de fer, la fraction C, c'est à dire, la gamme de masses moléculaires (MM) de 300 à 1000, contient quatre complexes du thorium Trois de ces complexes du thorium Rf= 0,53, 0,62 et 0,70, contiennent les constituants fluorescents (tels que l'isoquinoléine), amino et/'ou hydroxamate, phénol et catéchol Le quatrième complexe, Rf= 0,74 ne contient que les constituants ainino et ou hydroxamate, phénol et catéchol. Dans les fractions D, E, I, c'est à dire dans la gamme de 30 MM 100-300, on trouve six complexes, dont deux ne sont pas nouveaux puisqu'ils sont observés dans l'échantillon témoin vraisemblablement trois nouveaux complexes de l'uranium. Le complexe de Rf= 0,60 contient les constituants fluores15 cents amino et/'ou hydroxamate, phénol et catéchol, alors que le Rf= 0,78 contient des constituants fluorescents, vraisemblablement du phénol, mais pas d'amino et 'ou d'hydroxamate La nature du troisième composé, Rf= 0,67, nécessite des concentrations plus élevées et d'autres analyses de composition La fraction C, c'est à dire la gamme de MM de 300-1000 contient quatre complexes de 1 ' uranium L'un d'eux, ayant un Rf de 0,70, est actuellement considéré comme étant d a une modification du témoin et -ou du citrate d'uranium étalon Le composé ayant un 25 Rf de 0 526 contient les constituants fluorescents amine et/ou hydroxamate, catechol et phénol Le composé ayant un Rf de 0,62 montre l'absence de phénol et de catechol et celui de Rf= 0,78, l'absence des constituants amino et ou hydroxaiiate Les fractions D,E et F c'est à dire la gamme de MM de 300 100 contiennent sept complexes qui possèdent tous les groupes actifs mentionnés ci-dessus. Des concentrations plus élevées sont nécessaires pour les etudes de differerntiation et de caractérisation Le biosystéme se développant en présence de fer diffère considérablement de celui qui se développe enl 1 'absence de fer En effet, la fraction B, c'est à dire la gamme de MM de 1000-2000, contient trois et vraisemblablement quatre complexes de l'uranium: ceux qui ont un Rf de 0,56 et de 0,71 contiennent les constituants fluorescents amino et/ou hydroxamate, phénol et catéchol; et sans doute un nouveau complexe ayant un Rf= 0,628 contenant les mêmes constituants Le complexe ayant un Rf de 0,78 ne contient que les constituants fluorescents phénol et catéchol La fraction C, c'est-à-dire la gamme de MM de 300-1000 contient cinq complexes de l'uranium contenant 10 tous les constituants fluorescents amino et/ou hydroxamate, phénol et catéchol Les fractions D, E et F, c'està-dire la gamme de MM de 300- catéchol et phénol. Tableau IV Complexes du thorium. Ci-après Fraction de la colonne gamme PM TLC Rf Absence de fer Caractérisations Fluores Ninhy Phénol Colorant cente drine azo Présence d fer TLC Caractérisations Rf Fluores Ninhy Colorant cente drine Phénol azo A 2500 0,12 2 U O O 0,46 0,f(o 0,74 B 13 20 t)O 0,12 1000 0,26 0,60 1 0,74 0,78 i C 1000 0,53 300 0,62 0,70 0,74 0,79 D " 0,53 300 0,60 1 0,65 0,73 0,78 0,86 _ O 8 E ' 0,56 0,65 0,72 0,74 0,78 _ t _ 1. I. t-+ + + + + F + + t+ -t+ f + + + + + + + I+ + + + + + + + 0,12 O 47 0,60 0,73 0,12 4 + + + + + + + + + + ? + ? -? + + 0,60 0,74 0,79 0,53 0,62 0,70 0,74 0,78 0,56 0,60 0,65 0,72 0,78 0,55 0,64 0,71 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ? + - Pl + + + + + + + + + + 4- ? ? + + + + + + + + + + + + + 078 + 0,78 ro Ln Ln o oo + Fraction Je la -olonne gamme PM Absence de fer TLC Caractérisations TLC Rf Fluores Ninhy Phénol Colorant Rf cente drine azo F l 0,58 0,72 0,74 0,72 0,78 témoin 0,58 0,70 0,73 Th-oxalate 0 Th-citrate 0,65 Th-glucose O Th-glucose O 2-phosphate + 4. +. + + {. ? 0,55 ? 0,64 0,71 + -+ ' 0,78 0155 O 064 0,71 0,78 + 0,62 + 0,70 + + + + + Présence de fer Caractérisations Fluores Ninhy Phénol Colorant cente drine azo + + + ? + + + + + + + + + + ? + 4 + + 4 +__ +. + + + + + + + + + + Tableau 4 (suite) r%) "I Ln o o O Tableau 5 Complexes d'uranium Absence de fer ?raction TLC Caractérisations e la Pgame Rf Fluores Ninhy Phénol Colorant olonne cente drine azo Pr 6 sence de fer TLC Caractérisations Rf Fluores Ninhy Phénol Colorant cente drine azo t A 2500 0,128 2000 O A 74 0,60 b 0,73 + + + + + 0,128 0,474 o,60 0,78 + + + B 2 ff 0,128 + 0,128 + 1000 0,60 4 + + + + 0,564 + + + + 0,667 + ++ ? 0,628 + + +:? 0,78 + -? + 0,705 + + + + Lt 0,78 + + + f C 1000 0,526 i + + 4 0,487 + + + + 300 0,62 4 + + 0,567 + + + + o,705 + + + 0,66 + + + + 0,78 + ? + + 0,718 + + + + 0,78 + + + + N W D *300300- 0,526 0,62 0,78 + + ± + -.F + 0,551 + 0,62 + 0,78 + + + + + + + + + + + E 0,551 0,64 0,71 0,75 + + + + + + + 1 + 0,63 + + + + + U.1 o co Fraction e la 2 Dolonne Absence de fer TLC Caractérisations ga IT Ie Pmm Rf Fluores Ninhy Phénol Colorant cente drine azo TLC Rf Présence de fer aractérisations Fluors Ninhy Ph W cente drine Colorant inol azo F 1 O O + 0 0,76 0,69 0,76 + + + + + + témoin 0,70 U-oxalate O U-citrate 0,70 U-glucose O U-glucose O 2-phosphate + + + + + + 0,70 + + + + + + + + t'-> Tableau 5 (suite) ru ul Ln -. o co REVENDICATIONS: 1 Chélate non toxique soluble dans l'eau d'un radionucléide choisi parmi le thorium et l'uranium obtenu à partir de cultures sous une forme biodisponible combinée à un microorganisme choisi parmi Micrococcus luteus ATCC 15176 M luteus ATCC 15932, Pseudomonas aeruginosa CSU, P aeruginosa ATCC 14885, P aeruginosa ATCC 15522-, P fluorescens ATCC 11250 P iodinum ATCC 15729, Pseudomonas sp ATCC 15165 Pseudomonas sp. ATCC 17483 et Pseudomonas sp ATCC 19286. 2 Chélate selon la revendication 1, caractérisé en ce que ce microorganisme est le Pseudomonas aeruginosa. 3 Chélate selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est préparé et utilisé en présence de fer. 4 Chélates multiples du thorium non toxiques solubles dans 15 l'eau, caractérisés en ce qu'ils ont une masse moléculaire dans la gamme d'environ 100-1000 avec le Pseudomonas aeruginosa. Cheéates multiples de l'uranium non toxiques solubles dans l'eau, caractérisés en ce qu'ils ont une masse moléculaire 20 d'environ 100-1000 avec le Pseudomonas aeru 9 inosa. 6 Chelates multiples de l'uranium non toxiques solubles dans l'eau ayant une masse moléculaire d'environ 1000-2000 avec le Pseudomonas aeruginosa. 7 Procédé de désorption d'un radionucleide choisi 25 parmi des cultures contenant du thorium, de l'uranium et du plutonium, caractérisé en ce qu'il consiste à préparer un chelate non toxique soluble dans l'eau à partir de ce radionucléide avec un microorganisme choisi parmi rmicrococcus luteus ATCC 15176, M luteus ATCC 15932, 30 Pseudomonas aeruginosa CSU P aeruginosa *CC 14885, P aeruginosa ATCC 15522, P fluorescens ATCC 11250, P fluorescencs ATCC 13 i 475, P iodinum ATCC 15729, Pseudomonas sp ATCC 15165, Pseudomonas sp ATCC 17483. et Pseudomonas sp ATCC 19286. S Procéde selon la revendication 7, caractérisé en ce que le microorganisme est le Pseudomonas aeruginosa.