FR 2549725 A2 19850201 FR 8312496 A 19830728 L'invention concerne des fractions polypeptidiques inductrices d'anticorps protecteurs contre des parasites du paludisme, ainsi que des compositions immunogènes les contenant, susceptibles de conduire à la production de vaccins pour l'homme et l'animal. Elle est également relative aux anticorps spécifiques induits in vivo par ces fractions. On a déjà décrit dans la demande de brevet principal des fractions polypeptidiques immunogènes présentant les caractéristiques suivantes - elles possèdent une masse moléculaire moyenne de l'ordre de 75.000 daltons (mesurable dans un système de migration électrophorétique et par comparaison aux migrations dans des conditions semblables de peptides marqués, notamment à l'isothyocyanate de fluorescéine, et de poids moléculaires connus, plus particulièrement des IgG humaines, la sérumalbumine bovine (BSA) et l'ovalbumine de poulet) - elles sont reconnues par des anticorps actifs à l'égard de Plasmodium falciparum et par des anticorps monoclonaux ou polyclonaux formés contre elles-mêmes - elles peuvent être mises en évidence par l'incorporation métabolique d'acides aminés marqués, par exemple la méthio 35 nine 35S ;; - elles sont inductrices notamment chez le singe,. et plus particulièrement le singe Saimiri Sciures, d'anticorps actifs contre des parasites du paludisme, plus particulièrement de Plasmodium falciparum ou des parasites qui présentent les mêmes caractéristiques biologiques essentielles. I1 va de soi que l'expression "polypeptidiques" utilisée dans la demande de brevet principal et dans la présente demande ne doit pas être interpretée de façon restrictive. I1 peut s'agir en fait de fractions de protéines ou de fractions immunogéniques ayant une structure chimique distincte, par exemple contenant des antigènes saccharidiques ou glycoprotéiniques ou glycopeptidiques; I1 a également été indiqué dans la demande de brevet principal que cette fraction polypeptidique de masse moléculaire moyenne de l'ordre de 75.000 pouvait encore, par fractionnement supplémentaire, fournir des fractions ayant des poids moléculaires moyens de l'ordre de 72.000, 76.000, 80.000.On a également isolé, à partir de cette fraction de poids moléculaire moyen 75.000, une bande mineure dans la zone de poids moléculaire 90.000. On a également décrit dans la demande de brevet n" 82 21817 des fractions polypeptidiques présentant des masses moléculaires moyennes de l'ordre de 100.000, mesurables dans le même système de migration électrophorétique que les susdites fractions de masse moléculaire moyenne 75.000. Ces fractions de masse moléculaire moyenne de l'ordre de 100.000 présentaient par ailleurs des caractéristiques semblables à celles des fractions 75.000 - d'être reconnues par des anticorps actifs à l'égard de Plasmodium falciparum, - d'incorporer la méthionine 35S, - d'être inductrices chez les mêmes singes d'anticorps actifs contre lesdits parasites du paludisme. Comme dans le cas précédent, cette dernière fraction de poids moléculaire moyen 100.000 comporte en fait des sous-fractions ayant des poids moléculaires moyens de l'ordre de 90.000, 95.000, 100.000, 110.000, 115.000 et 130.000 daltons, au sein d'un ensemble complexe s'étageant de 83.000 à 140.000 daltons. On a également décrit dans les deux susdites demandes de brevet un procédé pour obtenir ces différentes fractions, ce procédé consistant à traiter une fraction préalablement obtenue de Plasmodium falciparum avec une solution d'un détergent, tel que le Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) ou celui connu sous la désignation commerciale TRITON x 100, ou analogue, susceptible d'induire la dissolution de la-majeure partie des structures cellulaires et des constituants protéiniques des préparations parasitaires, de récupérer et de séparer à partir de ce milieu les groupes de polypeptides qui présentent des poids moléculaires moyens, respectivement de l'ordre de 75.000 et 100.000 daltons.Ces groupes de polypeptides sont susceptibles de réagir avec des anticorps (sérums ou fractions d'immunoglobulines) originaires d'animaux résistant à Plasmodium falciparum et, le cas échéant, d'être marqués par la méthionine 35 S I1 est remarquable que ces différentes fractions peuvent être dénaturées au moins en partie sans perdre, notamment en présence de dodécylsulfate de sodium, une partie de leur activité immunogène. La présente invention concerne des perfectionnements et des compléments à celle décrite dans les deux demandes de brevet antérieures, dont les contenus respectifs doivent être considérés comme faisant également partie intégrante de la présente description. La présente invention s'adresse plus particulièrement à certaines des sous-fractions susmentionnées, lesquelles présentent des propriétés immunogènes importantes, notamment chez le singe et l'homme. Elle concerne en outre une fraction supplémentaire, telle qu'elle peut être obtenue à partir du milieu soumis à fractionnement dans les conditions sus-indiquées, cette fraction étant caractérisée en ce que - elle possède une masse moléculaire moyenne dé l'ordre de 50.000, notamment + 5.000 (mesurable dans le même système de migration électrophorétique que les fractions protéiniques susdites), - elle n'incorpore pas la méthionine 35, - elle est reconnue par des anticorps actifs à l'égard de Plasmodium, notamment Plasmodium falciparum et par des anticorps monoclonaux ou polyclonaux formés contre elle-même, - elle est inductrice notamment chez le singe, et plus particulièrement le singe Saimiri Sciureus, d'anticorps actifs contre des parasites du paludisme, plus particulièrement de Plasmodium falciparum ou des parasites qui présentent les mêmes caractéristiques biologiques essentielles. Cette fraction polypeptidique peut être isolée des fractions de poids moléculaire plus important, lorsque le fractionnement dont il a été question plus haut pour séparer les groupes polypeptidiques présentant des poids moléculaires moyens, de l'ordre de 75.000 et 100.000 respectivement, est fait par électrophorèse sur gel de poly acrylamide ou analogue, la fraction ayant migré dans la région correspondant aux protéines de poids moléculaire moyen 50.000 étant alors révélable, à l'occasion du transfert des différentes bandes séparées selon leur poids moléculaire sur feuille de nitrocellulose, exposition de la feuille de nitrocellulose à des anticorps actifs contre Plasmodium falciparum et détection des bandes séparées selon leur poids moléculaire ayant réagi avec de la protéine A du Staphylococcus aureus marquée, notamment par autoradiographie. Comme dans le cas des autres fractions, les fractions polypeptidiques de poids moléculaire moyen 50.000 (ou toute fraction analogue) peuvent encore être caractérisées en ce qu'elles sont reconnues par des anticorps pro tecteurs obtenus à partir d'animaux résistant à la souche de Plasmodium falciparum déposée à la C.N.C.M. sous le n" FUPC I-212 le 23 décembre 1982. La présente invention concerne également plus particulièrement les fractions davantage purifiées, de poids moléculaires moyens 72.000 et 90.000 daltons. Cette purification peut notamment s'exprimer par une fourchette de poids moléculaires plus resserrés dans le système électrophorétique qui a été envisagé dans la demande de brevet principal. Ils peuvent être considérés comme présentant des poids moléculaires respectivement contenus dans les intervalles 72.000 - 2.000 et 90.000 + 5.000 daltons. Des caractéristiques-supplémentaires de 1' invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit d'un nouvel exemple de fractionnement de fractions protéiniques actives, à partir d'une culture de parasites sur des globules rouges d'origine humaine. Un certain nombre de caractéristiques supplémentaires seront encore fournies eu égard aux propriétés biologiques de ces fractions. Culture des parasites et préparation. Les parasites (provenant de la souche de P. falciparum, C.N.C.M. n" FUPC I-212) ont été cultivés sur globules rouges humains A+, selon la technique décrite par GYSIN J. et Coll. (Les Ann. Immunol. (Institut Pasteur) 133 D, 95-102 (1982)) et synchronisée par la technique au sorbitol telle que décrite par LAMBROS C. et Coll. (J. Parasitol. 65, 418-420 (1979)). Les cultures infectées ont été collectées quand la parasitémie a atteint 5 à 10 % des cellules et quand les parasites ont atteint le stade des schizontes. Après deux lavages avec du milieu RPMI-1640 gibco, les globules rouges ont été lysés par la saponine (à 0,025 % en poids) pendant 10 minutes à 37"C. La suspension a ensuite été refroidie à 4"C et centrifugée à 3.500 g pendant 10 minutes. Le culot a été resuspendu dans du-RPMI-1640, introduit dans un gradient au PERCOLL (produit fabriqué par PHARMACIA) (20-40 %), puis centrifugé à 3.500 g à 4"C pendant 30 minutes. Les parasites libres ont été collectés à l'interface 20/40, lavés deux fois dans le tampon PBS et congelés à -20 C, en présence d'inhibiteurs de protéase, tels que ceux commercialisés sous les désignations TLCK et PMSF (SIGMA). Préparation des protéines immunogènes semi-purifiées. Les préparations de parasites (20/40) sont introduites dans 5 volumes d'une solution tampon (tris 0,0625 M, pH 6,8, dodécylsulfate de sodium à 6 %, 2-mercaptoéthanol à 5 %, glycérol à 5 %), portés à l'ébullition pendant 5 minutes et centrifugés à 15.000 g pendant 10 minutes. Le surnageant a été appliqué sur un gel de SDSpolyacrylamide, en parallèle avec des marqueursde poids moléculaires déterminés et marqués à l'isothiocyanate de fluorescéine (sérum albumine bovine, IgG de lapin et ovalbumine). Après migration à travers le gel, les bandes de poids moléculaires correspondant aux zones 70.000 85.000 et 90.000 - 120.000 respectivement (vis-à-vis des distances de migration des marqueurs) ont été découpées. Les protéines ont ensuite été éluées à partir de ces bandes de gel par électrophorèse dans un tampon trisglycine, pH 8,6, et contenant 0,1 % en poids de dodécylsulfate de sodium (SDS), et récoltées dans un sac à dialyse. La concentration en protéines a été déterminée par dosage colorimétrique des protéines, méthode au bleu de Coomasie, "Biorad Assay", test commercialisé par BIORAD et décrit par Spector, "Analytical Biochemistry", 1978, 86, 142 On a ainsi obtenu les fractions I et II ultérieurement utilisées dans les essais d'immunisation décrits ci-après. Ces fractions contenaient environ 100 microgrammes de protéine/20 mg de protéine contenue dans l'extrait brut initial. Ces fractions se sont révélées contenir des bandes de poids moléculaires distincts, à l'occasion d'un refractionnement dans un gel de polyacrylamide - SDS à 7,5 %. Ces fractions ont été révélées par coloration par le nitrate d'argent. La fraction I s'est révélée contenir quatre bandes polypeptidiques majeures de poids moléculaires 72.000, 76.000, 85.000 et 90.000 et la fraction II s'est révélée contenir principalement cinq bandes de poids moléculaires moyens 90.000, 96.000, 100.000, 105.000, et 120.000, respectivement. La présence de bandes mineures correspondant à la région 50.000 daltons a été détectée dans les deux préparations. Essai d'immunisation de singes écureuils. Des groupes de cinq animaux splénectomisés reçoivent trois injections sous-cutanées successives aux jours 0, 21 et 41. Chaque injection consiste en 100 microgrammes soit de la fraction I, soit de la fraction II, contenue dans une émulsion formée à partir d'une solution saline tamponnée au phosphate et contenant 0,1 % de SDS et d'un même volume de l'adjuvant complet de Freund (pour les premières injections) ou de l'adjuvant incomplet de Freund (pour les injections suivantes). Dix animaux témoins ne reçoivent que la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant D,1 % de SDS avec l'adjuvant complet ou l'adjuvant incomplet de Freund pour l'applicaion du même protocole d'administration.Des prélèvements de sang sont faits périodiquement, avant et pendant la vaccination, et examinés pour ce qui est de leurs caractéristiques hématologiques, parasitologiques, microbiologiques et sérologiques. Les animaux ont très bien toléré la vaccina tion. Aucune lésion n'a été observée aux sites d'injection. Les singes ont toujours paru en bonne santé et manifestaient une activité normale. Aucune anémie n'a été détectée tant chez les animaux vaccinés que chez les animaux témoins. Des anticorps antimalariques, mesurés par immunofluorescence indirecte, ont été détectés dès après la seconde injection. Les animaux ont reçu, par injection intraveineuse, 6 50 x 106 parasites (souche FUP) au jour 55. Après cette épreuve, les parasitémies ont été mesurées quotidiennement sur des prélèvements colorés par le réactif de Giemsa. La parasitémie aiguë qui s'est développée chez neuf animaux sur les dix animaux témoins a nécessité une chimiothérapie à la quinine dans les huit jours qui ont suivi, pour éviter la mort. Parmi les cinq animaux ayant reçu la fraction I, un seul a présenté une réponse semblable à celle des témoins. Les quatre autres animaux ont manifesté une résistance élevée à l'épreuve. Une parasitémie marginale a été observée dans deux d'entre eux. Dans les deux autres, la parasitémie s'est élevée à environ 5 % pour disparaître complètement dans les trois semaines suivantes. Les cinq animaux immunisés avec la fraction II ont tous manifesté une bonne résistance à l'épreuve. On a observé un accroissement de 10 % de la parasitémie au dixième jour après l'épreuve chez l'un d'entre eux seulement. Cette parasitémie a cependant décru dans les trois semaines suivantes. Des frottis de contrôle ont été ensuite effectués deux fois par semaine pendant les deux mois qui ont suivi l'épreuve. Les mesures ont donné des résultats négatifs dans tous les animaux vaccinés, alors qu'une recrudescence de la parasitémie a été observée dans cinq des animaux témoins qui avaient été traités par la quinine, après l'interruption du traitement, de sorte qu'ils ont dû être soumis à un second cycle de chimiothérapie. Tous les ani maux infectés par le parasite (animaux vaccinés et animaux témoins) ont présenté dans les premières semaines une certaine anémie avec une chute moyenne de 30 % des taux en globules rouges. L'anémie a cependant été différée dans les animaux vaccinés. En outre les hématocrites ont repris une valeur normale quatre semaines après l'épreuve. Les variations de poids des animaux avant et après la vaccination ntónt pas dépassé 2 %. La réponse humorale des singes aux différentes immunisations a été appréciée par immunoprécipitation réalisée entre des extraits de parasites marqués à la 35S-méthionine et des échantillons de sérum prélevés chez les animaux avant et après les susdites immunisations. On n'a observé aucune immunoprécipitation spécifique avec les échantillons de sérum prélevés chez tous les animaux avant l'immunisation et chez les animaux témoins, avant l'épreuve par le parasite vivant. Chez les animaux immunisés aussi bien par la fraction I que par la fraction II, on a constaté des réponses sensiblement homogènes contre principalement deux polypeptides de masse moléculaire 72 et 90.000 et des répones de moindre importance à l'égard de peptides de masse moléculaire 96.000 et 100.000. Une bande de précipitine dans la région de poids moléculaire 110.000 a été constatée chez les animaux vaccinés avec la fraction II. Aucune réponse n'a été constatée, du moins dans les conditions de l'expérience,contre la bande 76.000 contenue dans la fraction I originale. Cette dernière observation trouve peut-être son explication dans la modification des déterminants antigéniques que présente la protéine répondant à ce poids moléculaire chez les parasites vivants au cours des étapes de purification décrites plus haut. Les réponses comparables qui ont été observées dans les deux groupes d'animaux immunisés donnent à penser qu'il existe une parenté anti génique importante entre les protéines des deux fractions, parenté qui explique sans doute le degré de résistance comparable contre le parasite, qui a été observé dans les deux groupes. Les résultats qui précèdent témoignent donc de l'importante capacité vaccinante des fractions de l'inven- tion. Ce résultat est d'autant plus remarquable, que cette vaccination a été obtenue avec des protéines de parasites "dénaturées" par le SDS. La dénaturation chimique des protéines par le détergent n'entraîne pas la perte des propriétés vaccinantes de ces dernières. Une purification plus poussée de l'antigène vaccinant contenu dans les susdites fractions peut être réalisée selon les techniques décrites dans la demande de brevet principale. L'invention concerne plus particulièrement les fractions de poids moléculaires 72.000 et 90.000. Les fractions de l'invention davantage purifiées ou non, y inclus la fraction de poids moléculaire 50.000, peuvent également être utilisées comme réactifs pour le diagnostic et/ou le titrage des anticorps anipaludéens. Dans leur utilisation comme réactifs pour un diagnostic, on peut avoir recours à des techniques classiques, par exemple à la technique ELISA. On rappelle ci-après le principe d'une telle méthode. Elle comprend, par exemple, les étapes suivantes - dépôt de quantités déterminées du peptide selon l'invention dans les puits d'une microplaque du type de celle utilisée pour la mise en oeuvre de la méthode ELISA - introduction de dilutions croissantes du sérum contenant, le cas échéant, les anticorps à détecter, voire à -doser, dans les puits de cette microplaque-;; - incubation - lavage poussé de la microplaque avec un tampon approprié - introduction d'anticorps marqués dirigés contre les premiers, le marquage étant fait au moyen d'une enzyme capable d'hydrolyser un substrat choisi parmi ceux pour lesquels cette hydrolyse se manifeste par une variation d'absorbance pour une radiation de longueur d'onde donnée, - mesure de la variation d'absorbance et - détermination, de préférence vis-à-vis de mesures semblables faites vis-à-vis d'un témoin, de la teneur en anticorps du sérum étudié. L'invention concerne encore plus particulièrement un nécessaire ou coffret de diagnostic du paludisme contenant plus particulièrement - l'une des fractions définies dans la demande de brevet principal ou dans la présente demande, cette fraction étant marquée soit radioactivement, soit par une enzyme, soit par un composé fluorescent, - d'anticorps spécifiques de la fraction utilisée, - des tampons et substrats nécessaires à la révélation du marqueur. Le coffret peut également permettre de suivre chez le malade l'évolution de la maladie par dosage des anticorps et des parasites présents dans le sang du sujet atteint. I1 convient de souligner que l'antigène de poids moléculaire 72.000 est immuno-précipité avec des immunsérums anti P. vivax, anti P. ovale, anti P. chabaudi. cet antigène apparaît comme un constituant commun à différentes espèces de Plasmodium. A titre d'exemple, on a incubé un extrait polypeptidique de P. chabaudi marqué par 35S-méthionine (300.000 cpm) avec 10 microlitres d'immunsérum anti P. falciparum ~ p r obtenu après immunisation de Saimiri Sciureus ou d'un patient résistant à P. falciparum vivant en zone endémique ou encore de souris immunisées avec la fraction selon l'invention. Sur gel, l'analyse des bandes immunoprécipitées, révèle cet antigène de 72.000 daltons produit par P. chabaudi. Une observation identique a été faite avec la fraction de poids moléculaire 90.000 préparée à partir de P. chabaudi. Ces résultats sont particulièrement intéressants, dans la mesure où ils montrent que l'antigénicité des peptides obtenus à partir de ces différents Plasmodiums n'a pas une spécificité d'espèce. On remarque en particulier que P. chabaudi est un Plasmodium se développant chez la souris. I1 en résulte que l'utilisation des polypeptides antigéniques issus de P. chabaudi ou de tout autre Plasmodium se développant dans des petits animaux, sera particulièrement avantageuse, en ce sens que la culture de ces Plasmodiums est moins onéreuse que celle de P. falciparum dont l'un des hôtes naturels est le grand singe. Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes. En particulier, l'in vention concerne encore toutes les fractions peptidiques immunogènes susceptibles d'être obtenues à partir d'autres Plasmodiums, notamment P. vivax, P. ovale et P. chabaudi déjà nommés, en mettant en oeuvre des procédés semblables à ceux qui viennent d'être décrits. A cet égard, il y a lieu de remarquer que l'invention n'est pas limitée aux polypeptides de poids moléculaires moyens de 72.000 et 80.000 daltons respectivement, tels qu'ils peuvent être obtenus à partir de ces différents micro-organsimes, même s'ils constituent les polypeptides préférés de l'invention. Celle-ci concerne également les fractions qui présentent les différents poids moléculaires distincts qui ont été envisagés tant dans cette demande de certificat d'addition que dans la demande de brevet principal ou la demande de brevet nO 82 21817. D'une façon générale, lrinvention concerne des polypeptides immunogènes susceptibles d'être obtenus à partir de tout Plasmodium, dès lors qu'il est reconnu par des anticorps formés plus particulièrement contre les fractions définies dans cette demande ou dans les demandes n" 82 21817 et 82 21818. L'invention concerne également encore des peptides immunogènes de poids moléculaire plus faible, par exemple des peptides immunogènes résultant d'une hydrolyse partielle des peptides précé- dents, dans la mesure où cette hydrolyse ne porte pas atteinte à l'immunogénicité recherchée. Entrent 'encore dans le cadre de l'invention tous conjugués entre l'un des peptides immunogènes envisagés ci-dessus et une molécule porteuse ("carrier"), chaque fois qu'un tel couplage peut être jugé désirable pour renforcer l'immunogénicité des peptides en cause. REVENDICATIONS 1 - Fractions protéiniques, notamment polypeptidiques, inductrices d'anticorps protecteurs contre des parasites du paludisme qui présentent les caractéristiques suivantes - elles possèdent une masse moléculaire moyenne de l'ordre de 72.000 daltons - elles sont reconnues par des anticorps dirigés contre Plasmodium, notamment contre Plasmodium falciparum et par des anticorps monoclonaux ou polyclonaux formés contre elles-mêmes - elles peuvent être mises en évidence par incorporation métabolique d'acides aminés marqués, par exemple la méthionine 35S ; - elles sont inductrices notamment chez le singe, et plus particulièrement le singe Saimiri Sciureus, d'anticorps actifs contre des parasites du paludisme, plus particulièrement de Plasmodium falciparum ou des parasites qui présentent les mêmes caractéristiques biologiques essentielles. 2 - Fractions polypeptidiques inductrices d'anticorps protecteurs contre des parasites du paludisme qui présentent les caractéristiques suivantes - elles possèdent une masse moléculaire moyenne de l'ordre de 90.000 daltons - elles sont reconnues par des anticorps dirigés contre Plasmodium, notamment contre Plasmodium falciparum et par des anticorps monoclonaux ou polyclonaux formés contre elles-mêmes - elles peuvent être mises en évidence par incorporation métabolique d'acides aminés marqués, par exemple la méthionine 35S - - elles sont inductrices notamment chez le singe, et plus particulièrement le singe Saimiri Sciureus, d'anticorps actifs contre des parasites du paludisme, plus particulièrement de Plasmodium falciparum ou des parasites qui présentent les mêmes caractéristiques biologiques essentielles. 3 - Fractions protéiniques inductrices d'anticorps protecteurs contre des parasites du paludisme qui présentent les caractéristiques suivantes - elles possèdent une masse moléculaire moyenne de l'ordre de 50.000 daltons - elles sont reconnues par des anticorps dirigés contre Plasmodium falciparum et par des anticorps monoclonaux ou polyclonaux formés contre elles-mêmes - elles sont inductrices notamment chez le singe, et plus particulièrement le singe Saimiri Sciureus, d'anticorps actifs contre des parasites du paludisme, plus particulièrement de Plasmodium falciparum ou des parasites qui présentent les mêmes caractéristiques biologiques essentielles. 4 - Préparation immunogène associant une fraction conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 3 avec un véhicule ou un excipient pharmaceutique du type de ceux utilisés pour la constitution de vaccins 5 - Réactif de diagnostic et de titrage d'anticorps antipaludiques contenant une fraction conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 3. 6 - Coffret de diagnostic du paludisme constitué - d'une fraction quelconque des revendications 1 à 3, marqué radioactivement ou par une enzyme ou par un composé fluorescent, - d'anticorps spécifiques de la fraction utilisée, - des tampons et substrats nécessaires à la révélation du marqueur.