FR 2555199 A1 19850524 FR 8419450 A 19841219 Suite à l'apparitionr de la technologie de(]. ta- cide désoxyribonucléique (ADN) recombinant, la produc- tion bactérienne contr6lée d'une énorme variété de poly- peptides utiles est devenue possible. Il existe déjà des bactéries modifiées par cette technologie et permet- tant la production de produits polypeptidiques tels que la somatostatine (K. Itakura et a]., Science 198, 1056 [1977]), les chaînes A et B (composantes) de l'insuline humaine (D. V. Goeddel et al., Proc. Nat'l Acad. Sci., E.U.A. 76, 106 [1979]) et l'hormone de croissance hu- maine (D.V. Goeddel et al., Nature 281, 544 [1979]). Plus récemment, on a adopté des techniques à l'ADN re- combinant pour assurer la production bactérienne de la thymosiiie alpha 1, qui est une substance de potentiali- satiO imilitulUe produite par le llhymilus (demande ce b:reve(t cles Etats-Unis d'Amériquc (le Robert.o Crea et Ronald Wetzel, déposée le 28 février 1980 au nom de la Deman- deresse). Le pouvoir de cette technologie est tel que pratiquement n t'importe quel polypoptide utile peut être produit par voie bactérienne, tout en permettant la fabrication contrô6lée d'hormones, d'enzymes, d'anti- corps et de vaccins contre une large variété de mala- d(lies. La littérature précitée o; l'on décrit plus en d(etail les exemples repr(sentatifs mentionnés ci-dessus est reprise ici à titre de référence, au même titre que d' autres publications mentionnées dans la présente spé- cification, afin de clarifier le fondement de l'inven- tion. Le cheval de bataille de la technologie de l'ADN recombinant est le plasmide, c'est-à-dire une boucle non chromosomique de 1'ADN bicaténaire que l'on trouve dans les bactéries et, très souvent, en copies multiples par cellule bacterien.e. Les informations codtes (L;tis llADN (lu plasmlide einglobent celle requise pou. rel)p.oluire le plasmidie dals (Ites cellules filles (c'cst-à-dirc un "réplicoti") cL habituellement une ou plusieurs caractéristiques de sélection telles que la résistance aux antibiotiques, permettant aux clones de la cellule hôte contenant le plasmide concerné d'être reconnus et de croître de mariire préférentielle dans des milieux sélectifs. L'utilité des plasmides bacté- riens réside dans le fait qu'iis peuvent être clivés spécifiquement par l'une ou I';utrc endonucléase de restriction ou "enzyme (lde r(t rtion" reconnaissant chacune un emplacement différecnt sur l'ADN plasmidique. Ensuite, des fragments de gènes ou des gènes hétérolo- gues peuvent être insérés dans le plasmide en étant réunis bout à bout à l'emplacement du clivage ou à des extrémités reconstruites près de ce dernier. Telle qu'elle est utilisée dans la présente spécification, l'expression "hétérologue" désigne un gène que l'on ne trouve habituellement pas dans E. coli ou une séquence de polypeptides qui n'est habituelleo.ent pas produite par cette bactérie, tandis que l'expression "homologue" désigne un gène ou un polypeptide produit dans E. coli de type sauvage. La recombinaison de l'ADN s'effectue à l'extérieur de la bactérie, mais le plasmide "recom- binant" obtenu peut être introduit dans la bactérie par un procédé connu sous le nom de "transformation", tandis que d'importantes quantités du plasmide recombi- nant contenant un gène hétérologue peuvent être obtenues par la croissance du transformant. De plus, lorsque le gène est inséré de manière adéquate en référence à des parties du plasmide qui déterminent la transcrip- tion et la traduction du message codé de l'ADN, le véhicule d'expression obtenu peut être utilisé pour produire réellement la séquence de polypeptides pour laquelle le gène inséré effectue le codage; ce procédé est appelé "expression". L'expression est amorcée dans une zone connue sous le nom de "promoteur" qui est reconnu et fixé pal la polymérase de l'acide ribonucléique (RNA). Dans certains cas, par exemple, dans l'opéron de trD dont il sera question dans la présente spécification, des zones de promoteurs sont chevauchées par des zones dt"opérateurs" pour former une combinaison promoteur/opérateur. Les opérateurs sont des séquences d'ADN qui sont reconnues par (les protéines dites "répiesseurs" servant à régler la fréquence du déclenchement die la transcription sur un promoteur particulier. La polymérase voyage le long de l'ADN en transcrivant les informations contenues dans le brin de codage entre les extrémités 5' et 3' de ce dernier, en RNA messager qui est à son tour traduit en un polypeptide comportant la séquence d'acides ami- nés pour laquelle l'ADN effectue le codage. Chaque acide aminé est codé par un triplet de nucléotides par- ticulier ou "codon" à l'intérieur de ce que l'on peut appeler, pour l'objet de la présente invention, le "gè'eu structural", c'est-à-dlire la partie qui encode la séquence d'acides aminés du produit exprimé. Après sa fixation sur le promoteur, la polymérase de RNA transcrit tout d'abord les nucl iotides encodant un cm- placement de fixation de ribosomes,puis un déclenche- ment de traduction ou un signal de "démarrage" (habi- tuellement ATG qui, dans le RNA messager obtenu, de- vient AUG) et ensuite les codons de nucléotides dans le gène structural lui-même. Les codons dits d'arrêt sont transcrits à la terminaisol du gène structural, apres q(uit() la polymérase peut former une séquence sup- plémentaire de RNA messager q(lui, par suite de la pré- sence du signal d'arrêt, reste non traduit par les ri- bosones. Les ribosomes se fixent à l'emplacement de fixation prévu sur le RNA messager (dans les bactéries, habituellement à mesure que le mRNA se forme) et ils produisent eux-mêmes le polypeptide encodé, en conmmnien- çant au signal de démarrage de traduction pour se ter- miner au signal d'arrêt mentionné ci-dessus. Le pro- duit désitré est obtenu si les séquences encodant le pointl de i.xation (les r.i.bosoii(s sont placées de ma- nière adé(lquate par rapport au codon initiateur d'AUG et si touts les codons restants suivent le codon initia- teur en phase. Le produit formé peut être obtenu en lysant la cellule hôte et en récupérant le produit d'une autre protéine bactérienne moyennant une purification appropriée. Les polypeptides exprimés par l'adoption de la technologie de 1'ADN recosmbiriant peuvent être entière- ment hoterologues comme c'est le cas pour l'expression directe de l'hormone de croissance humaine ou, en va- riante, ils peuvent comporter un polypeptide hètéroLo- gue auquel est fusionnée au moins une partie de la sé6- quence d'acides aminés d'un peptide homologue, comme c'est le cas pour la production de produits intermé- diaires pour la somatostatine et les composants de l'insuline humaine. Dans ce dernier cas, par exemple, le polypeptide homologue fusioiné comprend une partie de la séquence d'acides amines pour la r-galactosidasc. Dans ce cas, le produithbio-actir envisagé est bio-inacti- vé par le polypeptide homologue fusionné jusqu'à ce que ce dernier soit clivé dans un environnement extracellu- laire. Les protéines de fusion telles que celles qui viennent d'être mentionnées, peuvent être conçues pour permettre un clivage hautement spécifique de la protéi- ne précurseur hors du produit envisagé, par exemple, par l'action du bromure de cyanogène sur la méthionine ou, en varilante, par clivage enzymatiquc (voir, par cxeinpl.e, le brevet britatique publié n 2.007. 676 A Si la technologie à l'ADN recombinant doit tenir pleinement ses promesses, il convient d'élaborer des systèmes optimalisant l'expression des gènes insé- rés de telle sorte que l'on puisse obtenir les produits polypeptidiques envisagés avec un haut rendement. Quoi- que utiles, les systèmes promoteurs/opérateurs de [3- lactamase et de lactose que l'on a le plus couranunent utilisés antérieurement, n'ont pas exploité pleineme.Lt la ctapacitLé de cette teclmolo i: (lu point de vue rende- ment. Il s'est avéré nécessaire de trouver un véhicule d'expression bactérienne cap;table d'assurer l'expression contrôlée de produits p) olypeptidliqucs désirés avec un rendement plus élevé. Le tryptophanne est un acide aminé produit par lcs bactéeries et que l'on utilise conmmne partie constitu- tive des polypeptides homologues dans un cycle bio- synthétique se déroulant conuno suit: acide chorisminque acide anthranilique > acide phosphoribosyl- anthranilique > CDRP [énol-l-(o-carboxyphénylamino)- 1-désoxy-D-ribulose-5-phosphateJ] - indol-3-glycérol- phosphate et, finalement, le tryptophanne lui-même. Les réactions enzymatiques de ce cycle sont catalysées par les produits du tryptophanne ou opéron "trp" qui est un segment polycistronique d'ADN, lequel est trans- crit sous la direction du système promoteur/opérateur (le trp. Le RNA messager polycistronique obtenu encode La sélquellcc trp B et trp A. Ces polypeptides catalysent et contri- lent de diverses manières les étapes individuelles du cyecle acide chorismique - tryptophanne. Dans E. coli de type sauvage, l'opéron de tryp- tophanne est sous au moins trois formes distinctes de contrôle. Dans le cas de la répression promoteur/opé- rateur, le tryptophanne agit cormne corépresseur et il vient se fixer sur son aporéprecsseur pour former un complexe répresseur actif qlui, à son tour, vient se fixer sur llopérateur, fermant ainsi la totalité du cycle. En deuxième lieu, par un processus d'inhibi- tion de rétro-action, le tryptophanne vient se fixer sur un complexe des polypeptides trp E et trp D, entpê- chant ainsi leur participation au cycle de synthèse. Enúin, le contrôle est effectué par un procédé connu sous le nom d't"atténuation" sous le contrôle (le la "zone d 'atténuation" du gène, cette zone se trouvant dans la séquence directrice de trp). (Voir, d'une iiia- niiLre _ GnJuals, G.F. Mliozzatri et al., J. Bacteriology 133, 1457 (1978) ; The Operon z63-302, Cold Spring Harbor Laboratory (1978), Miller et Reznikoff, eds.; F. Lee et al, Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 74, 4365 (1977) et K. Bertrand et al, J. Mol. Biol. 103, 319 (1976)). Le degré d'atténuation semble être gouverné par la concentration intracclluLaire du tryptophanne et, dans E. coli de type sauvage, dans environ neul: cas sur dix, l'atténuateur termine l'expression probat- blemnent par la formation d'une structure secondaire ou "boucle de terminaison" dans le RNA messager, donnant ainsi lieu au désengagement prématuré de la polymérase de RNA vis-à-vis de l'ADN associé. D'autres chercheurs ont utilisé l'opéron de trp pour obtenir une certaine mesure de l'expression des polypeptides hétérologues. On pense que ces travaux ont eu pour but de tenter de résoudre les problèmes de répression et d'atténuation par addition d'acide indole- acrylique, qui est un inducteur et un analogue entrant en compétition avec le tryptophanne pour les molécules de répresseurs de trp tendant vers une dérépression par inhibition compétitive. En même temps, l'inducteur diminue l'atténuation en inhibant la transformation enzymatique de l'indole en tryptophanne, mettant ainsi efficacement la cellule en état de carence de trvYpto- phlille. En conséquence, une plus grande quantité de polymérases sont lues efficacement par l'atténuateur. Toutefois, cette méthode semble être problématique en ce qui concerne l'obtention est prématurément arrêtée suite à l'absence de trypto- phanne utilisable. En fait, une réduction efficace de l'atténuation par cette méthode dépend entièrement d'une carence importante en tryptophanne. La présente invention aborde les problèmes associés à l'atténuation et à la répression du trypto- phanne d'une manière différente et elle prévoit: (1) un procédé en vue d'obtenir un véhicule d'expression conçu pour 1 expression dii ucte die gênes hétérolo.rues a partil du pl'omrnoteur/opér;t(,itl. de trp, (2) des proc dés en vue d'obtenir des véhicules conçus pour l'ex- pression, au départ de l'opérateur/promoteur de tryp- tophanne, de polypeptides spéc.ifiquement elivables et codés par des fusions de gènes homologues-hétérologues et (3) un procédé en vue d'exprimer des polypeptides hétérologuos d'lune manière contr$lable, efficace et avec un haut rendement, de même que les éléments as- sociés à ce procédé. Suivant la présente invention, on prévoit de nouveaux véhicules d'expression plasmidique pour la pro- duction, dans les bactéries, de produits de polypepti- des hétérologues, ces véhicules comportant une séquence d'ADN bicaténaire comprenant, cn phase depuis une pre- mière extré'llité 5' jusqu'à une deuxième extrémité 31 du brin de codage, un promoteur/opérateur de trp, des nucléotides assurant le codage de l'emplacement de fixation des ribosomes directours de trp, ainsi que des nucléotides encodant le début de traduction pour l'ex- pression d'un gène structural encodant la séquence d'acides aminés du polypeptide hétérologue. La séquence (I'ADN dlonU il question, ne contient ni une zone d'atté- nuatCeuI deC tl.p), ni des uilC..t i.clCs codant 1 elplacenllent dle fixatioln d(es ribosomes E cie tli). Au contraire, l'm- placement de fix^tion des ribosomes directeurs de trp est utilisé efficacement pour effectuer l'expression ie l'information codée par un gène inséré. Les cellules sont trmansformées par l'addition dles plasmides de l'invention contenant le promoteur/ opérateur de trp et dépourvus diatténuateur, tandis qu'elles croissent en présence de tryptophanne coluhc additif. L utilisation cde milieux riches en trypto- phlane fournit une quantité sans être inhibée par l'expression prématurée d'impor- tantes quantités de polypeptides hétérologues codés par une insertion par ailleurs sous le contrôle du système promoteur/opérateur de trp. D'autre part, lorsque la culture du recombinant s'est développée jusqu'aux ni- veaux appropriés pour la production industrielle du polypeptide, on élimine la soul.ce extérieure de trypto- phanne, la cellule ne dépendant alors que du trypto- phanne qu'elle peut elle-même produire. Il en résulte une limitation modérée du tryptophanne et, par consé- quent, le cycle subit une dérépression et lion obtient une expression hautement efficace de l'insertion hétérologue sans aucune inhibition par atténuation, puisqu'aussi bien la zone d'atténuateur a été supprimée du système. De la sorte, les cellules ne subissent jamais une privation grave lde tryptophanne et toutes les protéines (qu'elles contiennent du tryptophanne ou non) peuvent être produites avec de hauts rendements. En outre, l'invention fournit des moyens per- mettant de cliver l'ADN bicaténaire en n'importe quel point désiré, même en absence d'un emplacement d'enzyme de restriction, cette technique étant utile, entre autres, pour la création d'opérons de trp comportant des délétions d'atténuateurs et différents de ceux ob- tenus antérieurement par sélection de mutants. Enfin, l'invention fournit une variété de pro- duits intermédiaires et de produits finals utiles, y compris des protéines de fusion hétérologues/homolo- gues spécifiquement clivables et stabilisées contre la dégradation dans les conditions d'expression. La façon de réaliser ces différents objets et avantages de l'invention, ainsi que d'autres, apparal- tra plus clairement à la lccture de la description détaillée ci-après donnée cn s., les figures 1 et 2 illustrent chacune un sché- ma préféré pour la formation de plasmides capables d'ex- primer des gènes hétérologues sous forme de fusions avec une partie du polypeptide D de trp, fusions desquelles ils peuvent être clives ulterileuremènt; la figure 3 montre]c ré(sultait dc la ségréga- tion, sutr gel de polyacrylami(de, de protéines de fusion homologue (trp D')/hétérologue (somatostatine ou thymo- sine a 1) contenant des protéines cellulaires; les figures 4, 5 et 6 illustrent des stades successifs d'un schéma préféré pour la création d'un plasmide capable d'exprimer directement un gène hétéro- logue (hormone de croissance humaine) sous le contr6le du système promoteur/opérateur de trp; la figure 7 illustre le résultat de la sg'ré- gation, stur goel de polyacrylamide,de l'hormone de crois- sauce lhuainc contenant des protéines cellulaires, cx- primée directement sous le contrôle du système promo- tcur/opérateur de trp; les figures 8, 9(a-bj et 10 illustrent les sta- des successifs d'un schéma prceré pour la création de plasmides capables d'exprimer des gènes hétérologues (dans le cas illustré, pour la somatostatine) sous forme de fusions avec une partie du pllol)peptide E de trp, fusions desquelles ils peuvent être clivés ultérieurement; la figure 11 illustre le résultat de la ségré- gation, stir gel de polyacrylamidc, de protéines de fu- sion lhomologue (trp E)/hétérologue contenant des pro- téines ccl lulaires, respectivement pour la production de somatostatine, de thymosine t 1, de pro-insuline hu- maine et des chaînes A et B de l'insuline humaine; les figures 12 et 13 illustrent les stades successifs de la méthode par laquelle on manipule le plasmide ci'é selon les schémas des figures 8 à 10 inclus pour former un système dIans lequel d'aubres gë- nos iétéOIologues peuvent être exprimés de manière in- terchang-cable sous forme de fusions avec des séquences de polypeptides E dc trp. Dans les dessins annexes, pour la clarté d(e l'illustration, dans la plupart des cas, on ne repré- sente que le brin de codage du plasmide bicaténaire et des acides désoxyribonucléiques linéaires. Les gènes d'encodage de r-sistance aux antibliotiqules sont désignés RR par ap (anipicilline) et par tc (tétracycline). La légende tcS désigne un gène pour la résistance à la tétracycline, qui n'est pas sous le contrôle d'un sys- tème promlloteur/opérateur, de sorte que les plasmides contenant ce gène seront néanmoins sensibles à la té- tracyclinc. La légende "apS" désigne la sensibilité à l'ampicilline résultant de la délétion d'une partie du gène encodant la sensibilité à l'ampicilline. Les promoteurs et opérateurs plasmidiques sont désignés par "p" et "o". Les lettres A, T, G et C désignent respec- tivement les nucléotidces conltetnant les bases ad(éninc, thymine, guanine et cytosine. D'autres légendes des figures apparaltront dans lc texte de la présente spé- cification. Les formes de réalisation préférées de l'in- vention qui seront décrites ci-après, impliquent l'uti- lisation d'un certain nombre d'endonueléases de restric- tion habituellement disponibles, qui seront identifiées ci-après avec leurs séquences correspondantes do carac- térisation et leurs types de clivage (indiqués par des flèches). 1 XbaI: TCTAGA TaqI: TCGA AGATCT AGCT t 1k EcoRI: GAATTC HindIII: AAGCTT CTTAAG TTCGAA Bgl Il AGATCT Hpal.: GTTAAC TCTAGA CAATTG I,{ PvuII: GAGCTG PstI: CT(GCAt GTCGAC GACGTC tt BamIlI: GGATCC CCTAGG Lorsque Les points de clivaw.,c- sont espacés sur les lriins respectif.s, les extremite. c livn.s seront "co]lanrts" c'est-i-.-dl'Ce qu'elles poul'lo,,, etrue mises ou remllises sous foerne dc bicatérnaircs ave: c un autre ADN à ext1(e L- tés l'collantes" complémentaii.es par appariement de bases selon WatsonCrick (A à T et G à C) à la manière d'un assemblage à tenons ct mortaises. Certaines en- zymes de restriction telles que HpaI et PvuII ci-dessus subissent un clivage en laissant des extrémités "épointées". Les séquences de nucléotides ci-dessus sont representées suivant la convention adoptée partout: lc brin supérieur est lc br'in d'encodage des protéines et, en allant de gauche à droite sur ce brin, on se déplace de son extrémité 5' à son extrémité 3', c'est- à-dire dans le sens de transcription d'un point "proxi- mal" vers un point "distal". Enfin, à propos des conventions, le symbole "l A" désigne une délétion. C'lest ainsi que, par exem- ple, la désignation d'un plasmide, par exemple, par "AEcoRI-XbaI" décrit le plasmide duquel la séquence de nucleotides comprise entre les emplacements d'enzymies d(e restriction EcoRI et XbaI a été éliminée par diges- Lit),, avec ces enzymes. Pl'oui' plus de commodité, certai- nes délétions sont désignaées par un nombre. C lest ainsi que, ien commençant par la premièr'e paire de bases ("bp") de l'emplaeement de caractérisation de EcoRI qui précède le gène pour la résistance à la tétracycli- ne dans le plasmide parental pBR322, "Al" désigne la délétion de bpl-30 (c'est-à-dlire AEcoRI-Hind III), rendant ainsi inopérant le système promoteur/operateur cie lat t(tt'.lacycline; I, l" dssigne la délétion de la îlpa'ie de bases 1-375 (A'est-l-di,'e AEcoRI-Bamlli) avec, pour conséquence, l'élimination à la fois du promoteulr/ opérateur de la tétracycline et du gène structural qui 1'' encode la résistance à la tetracycline; par ailleurs, "A3" désigne la délétion de la paire de base 3611-4359 (c'est-à-dire APstI-EcoRI) et l'élimination de la ré- SiStalC. I 'aIIIicilline. "A,1" est lutilisé poulr dsigner l'élimi- nation dela paiiredebasesDde' trp,-9oe0 - ' 1.500 du fragment de l'opéron de trp (figure 1) avec élimination du g'ne strul-ttutral pour le polyp(l)ti.(lc 1) dc trp. La séquence directt.ice de trp est constituée de paires de bases ("bp") 1162 en commençant par le point de départ prévu pour trp mRNA. Un polypeptide directeur putatif de trp à 14 acides aminés est encodé par la paire de bases 27-71 suivant les nucléotides ATG qui encodent le signal de déclenchement de traduc- tion. La zone d'atténuateur de trp comprend des séquen- ces successives riches en GC et en AT se situant entre les paires de bases 114 et 156 et l'atténuation est ap- paremmsent effectuée sur les nucléotides de mRNA codés par la paire de bases -134 -141 de la séquence direc- trice. Pour exprimer un polypeptide hétérologue sous la direction de l'emplacement de fixation des ribosomes directeurs de trp et en même temps prévenir l'atténua- tion, il convient d'observer les critères suivants: 1. les paires de bases 134-141 ou au-delà doivent être supprimées; 2. le codon ATC.(; Siti.omii ('ll ti.lation coIl'(;t'e Iavec ulin ellpllacellei:t 1de fixation de ribosomes de façon bien connue (voir, par exemple, J.A. Steitz "Genetic signals and nucleotide séquences in messenger RNA" dans "Biological Regulation and Control" (éd. R. Goldberger) Plenum Press, N.Y. (1978). 3. Lorsqu'une protéine de fusion homologue- * hétérologue doit être produite, le signal de déclen- clhement cde traduction ld'une séquence de polypeptides homologues doit rester disponible et les codons prévus pour la partie homologue ide la protéine do fusion doi- vent être insérés en phase sans l'intervention de si- grnaux dl arrêt de traduction. Par exemple, la dcltion de toutes les pai- res de bases renfermées dans la séquence directrice distale de la paire de bases 70 élimine la zone d'atte- nuateur en laissant la sequence ATG qui encode le si- gnal de déclenchement dc traduction en éliminant l'in- tel'vet io01 du signal d ' ar'-t. de tlraduction codé par TCA (pailr(s de bases 69-71) par l'élimination des nucléo- tides A et suivants. Cette délétion entraîne l'expres- sion d'une protéine de fusion commençant par le poly- peptide directeur, se terminant par celui encodé par l'une ou l'autre insertion hétérologue et comportant une zone distale d tun des polypeptides post-directeurs de l'opéron de trp, lesquels sont déterminés par le degri- de (d(écleétion dans la direction 3' Dès lors, unle dclétion s'étendant dans le gêne E conduit à l'expres- s iO), dit unt précurseur- homo IoL'u; com.)renallt la séquence L et la zone distale de E (au-delà du point final de délétion) fusionnées à la séquence encodée par n'impor- te quelle insertion.suivantc et ainsi de suite. Deux plasmides particulièrement utiles dont la zone d 'atténuateur a ét(é èliminéee sonit les plasmi.i- des pGM1 et pGM3 (G.F. Mlioz.:ari et ali, "J. Bacteriolo- gy 133" 1457 (1978)). Ces plasmidcs po)tent respectiver.cnt!cs dl1é- tiollts trp iú LE 1413 et trip ALE 1417 et ils expriment (sous l.e contrôle du promoteur/operateur de trp) un polypeptide comprenant it peu priès les six premiers acides aminés des zones distales et directrices de trp du polypeptide E. Dans le cas de loin préféré, pGNl, à peu près le dernier tiers seulement du poly- peptide E est exprimé, tandis que pGM3 exprime presque la moitié distale des codons du polypeptide E. coli K-1 souclthe WV3110 tna 2-trp -A102 contenant pGMI a et( déposée à l' "Ame,.ican Type Culture Collec- tion" (ATCC n 31622). pGMI peut être eliminé de la manière habituelle de cette souche pour être utilisc dans les prl'océdés décrits ci-après. En variante, des del1tions peuvent être effec- tuées par des moyens fournis par la présente invention afin de cliver spécifiquement l'ADN bicaténaire à n'im- porte quel emplacement désiré. Un exemple de cette technique de clivage est donné dans la parti.e IV de l'exposé expérimental ci-après. C'est ainsi que 1'ADN bicaténaire est transformé en ADN monocaténaire dans la zone entourant le point de ciivage envisagé, par exeii- ple, par réaction avec la -exonucléase. Une matrice synthétique ou autre d'ADN ijionocaténaire est ensuite hybridée à la longueur monocatcnaire formée antérieure- ment et ce, par appariement de bases selon Watson-Crick, la séquence de matrice étant prévue de telle sorte que son extrémité 51 soit coterminale avec le nucléotide sur le premier brin immédiatement avant le point de clivage envisagé. La matrice est ensuite étendue dans la direction 3' par réaction avec la polymérase d'ADN en recréant, avant le clivage envisagé, la partie de 1'ADN bicaténaire initial qui avait été perdue lors de lapremière étape. Simultanément ou par la suite> la partie du premier brin qui se situe au-delà du point de clivage envisagé, est éliminée par digestion. En résumé, si l'on désigne par "v" le point de clivage envisagé, on a a)...... v point de clivage envisagé b)...... v monocaténaire autour de c)...... v hybridation de la matrice d)...... v extension à paitir de la 35........ matrice e)...... v digestion du monocaté- naire Dans la forme de réalisation de loin préférée, on effectue les étapes (d) et (e) simultanément en uLL- lisant une polymérase qui digère simultanément l'extré- mité iinonocaténaire en saillie ldants la direction 3 '- 5 ' en étendant la matrice (en présence de dATP, dGTP, dTTP et dCTP) dans la direction 5' S 3'. La matière pré- féréc à cet effet est la po Lymlw;ise I de Klenow, c' cst,- à-dire le fragment obtenu pa. clivage protéolyticque de la polvi(îirase I d'ADN qui conti.ent l'activité de poly- mérisation 5' --> 3' et l'activité exonucléolytique 3' - 5' de l'enzyme parentale, cependant que son ac- tivité exonucléolytique 5' - 3' fait défaut (A. Kornberg, DNA Synthesis, 98, W.H. Freeman et Co., SF0 (1974)). En adoptant le procédé décrit ci-dessus, les délétions d'atténuateurs peuvent être effectuées de n'importe quelle manière désirée dans un plasmide con- tenant l'opéron de trp, qui est tout d'abord linéarisé, par exemple, par clivage à un emplacement de restric- tion situé en aval du point auquel la molécule doit avoir des extrémités épointées ("v" ci-dessus). La recircularisation suivant la délétion de la zone d'at- ténuateur peut être effectuée, par exemple,. par liga- ture des extrémités épointées ou selon d'autres métho- des bien connues de l'homme de métier. Bien que l'invention englobe l'expression directe du polypeptide hétérologue sous la direction du promoteur/opérateur de trp, le cas préféré comporte l'expression de protéines fusionnees contenant à la fois des séquences homologues et des séquences hétéro- logues, ces dernières étant, (le préférence, spécifique- ment clivables des premières dans les environnements extracellulaires. Sont particulièrement préférées, les fusions dans lesquelles la partie homologue coim- prend un ou plusieurs acides amxinés du polypeptidc directeur d(le tr p et CenlVi'on Un tici's ou plus de lat séquence ci' acides aminés ES de L tp (extrémité distia Le). Les protéines de fusion ainsi obtenues semblent être remarquablement stabilisées contre la dégradation dans les conditions d'expression. La bactérie E. coli K-12, souche W3110 tna 2-trp-A 10Z (pGM1), ATCC N 316'2 peut être utilisée pour amplifier les stocks du plasimide pGM1 que l'on emploie de préférence pour construire les systèmes promoteurs/opérateurs de trp déficients en atténuateurs suivant l'invention. Cette souche est phénotypiquement tr+ en présence d'anthranilate et elle peut être déve- loppée dans des milieux minima tels que LB complétés de ug/ml d'anthranilate. Toutes les souches bactériennes utilisées dans l'expression dirigée par le promoteur/opérateur de trp suivant l'invention sont le répresseur de trp ["'trp R+ "), tout cornIIIe dans le cas de E. coli de type sauvage de façon à assurer la répression jusqu1à ce que l'on envi- sage l'expression hétérologue. Dans la forme de réalisation préférée, la re- combinaison d'ADN est effectuée dans E. coli K-12 souche 294 (terminaison A, thi, hsr-, hsmk), ATCC n 31446, c'est-à-dire une souche bactérienne dont les membranes comportent des caractéristiques facilitant les transformations. Les plasmides producteurs de poly- pepticldes hétérologues se dévcloppaiit dans la souche 294 sont extraits de la manière habituelle et maintenus en solution (par exemple, lOmiM de tris, lni1 d'acide éthylène-diamine-tétracétique, pH 8) à une température comprise entre environ -20 C et environ 4 C. D'autre part, pour effectuer une expression dans des conditions industrielles, il est préférable d'utiliser une souche plus robuste, c'est-à-dire E. coli K-121 F RV 308 strr, gal 308-, ATCC n 31608. Du point de vue nutri- tif, RV 30S est de type sauvage et se développe bien dans des milieux minima en synthétisant toutes les macromolécules nécessaires à partir de mélanges clas- siques de sels d'ammonium, de sels phosphates et de sels dle magnésiullm, dc méetaux à l.'état dc traces et dce glucose. Après transformation dc la culture RV 308 avec le plasmide dérivant de la souche 294, on dépose lat culturec en plaques sur des milieux sélectifs pour un marqueur (par exemple, la résistance aux antibioti- ques) porté par le plasmide, puis on prélève une colonie de transformants que l'on développe dans une culture en ballon. On congèle (ids p.arties aliquotes de cette culture dans une solution de glycérol ou de diméthyl- sulfoxyde à 10% dans des fioles stériles de Wheaton et dans un bain dtéthanol et de glace carbonique à -800C. Pour produire le polypeptide hétérologue codé, on déve- loppe les échantillons de la culture dans des milieux contenant du tryptophanne afin de réprimer le promo- teur/opé)rattcur de trp, après quoi, on prive le système de l'additif tryptophanne pour provoquer l'expression. Pour lc premier stade de croissance, on peut employer, par exemple, lc milieu LB (J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, 433, Cold Spring Harbor Laboratory 1972) qui contient, par litre de so- lution aqueuse, 10 g de tryptone Bacto, 5 g dtextrait de levure Bacto et 10 g de NaCl. De préférence, l'ino- culant croît jusqu'à unc densité optique de 10 ou plus (à- 550 nMi), plus avantageusement, jusqu'à une densité optique (de 20 ou plus et, mieux encore, jusqu'à une densité optique de 30 ou plus, quoique à une valeur Imoindre qu'en phase stationnairc. Pour la dérépression et lle cxpression, on fait ensuite croître l' inoculant dans des conditions privant la cellule de l'additif tryptophanne. Un milieu appro- prié pour cette croissance est le milieu M9 (voir J.H. Miller ci-dessus à 431), préparé conmme suit (par litre): Kil PO 3 4 3 4 Na2H1>04 6 4 4 NaCL 0,5 Nil Cl 1 g 4 C 1 On traite en autoclive, puis 11m.-joute: ml de CaCl2 0,01Mi 1 ml de MgSO4 1M ml de glucose à 20- Vitamine B1 1 / ml Acides aminés Iumnko hycase anmino ou DIFCO cas. anino 40 /pg/n 1. Le suppléa.:cnt d'acides aminés est un hydrolysat acide de caséine dépourvu de tryptophanne. Pour commencer l'expression du polypeptide hétérologue, l'inoculant dont la croissance a eu lieu dans un milieu riche en tryptophanne, peut être, par exemple, dilué dans un volume plus important d'un mi- lieu ne contenant pas d'additif tryptophanne (par exem- ple, une dilution de 2-10 fois), après quoi on le lais- se croître jusqu'à n'importe quel niveau désiré (de pré- férence, en deçà de la phase de croissance stationnaire), tandis que le produit recherché peut être obtenu de la manière habituelle par lyse, centrifugation et purifica- tion. Au stade de croissance privé de tryptophanne, il est préférable de laisser croître les cellules jusqulà une densité optique supérieure à 10, plus avantageuse- ment, jusqu'à une densité optique supérieure à 20 et, mieux encore, jusqu'à une densité optique de 30 ou plus (toutes à 550 nM) avant de procéder à la récupéra- tion du produit. Toutes les expériences de recombinaison d'ADN décrites dans l'exposé expérimental ci-après ont été effectuées à la "Genentech Inc." conformément aux di- rectives des "National Institutes of Health Guidelines for Recombinant DNA research". I. Expression de la protéine de fusion du polypeptide D. En se référant aux figures 1-3, on décrira un l)OC(h'I pl'-éféré, pour l'exlpression dle protéines de( Lu- sion comII)'prenant des polypcpti(des désirés auxquels est fusionune une partie de la séquence d'acides aminés du polypeptide D de trp qui est séparable in vitro grace à un acide aminé de métlhioninc spécifiquement sensible au clivage par CD3r. A. Construction de pBRHtrp. Le plasmide pG1l (1, figure 1) porte ltopéron de tryptophlanne de E. coli contenant la délétion ALE1413 (G.F..iozzari,i et; a., (1978) J. B3acteriology 1457-1466) eLt, partant, il cxprime,, une protéinc de fu- sionI complrenant les six pre;mnieJs acides aminés du di- recteur de trp et à peu près le dernier tiers du poly- peptide E (le trp (que l'on désignera ci-après conjoin- temuent par LE'), de même que la totalité du polypeptide D de trp et ce, sous le contrôle du système promoteur/ opérateulr de trp. Le plasmide (20 tg) est mis à digé- rer avec l'enzyme de restriction PvuII qui clive le plasmide on cinq emplacements. Les fragments de gènes 2 sont ensuite combinés avec des agents de liaison EcoRT (constitués dtun oligonucléotide autocomplimen- taire 3 de la séquence: pCATGAATTCATG) en formant un emplacement die clivage de EeoRI pour un clonage ulté- rieur en un plasmide contenant un emplacement de EcoRI (20). Les 20 ug des fragments 2 d'ADN obtenus à partir de pGM1 sont traités avec 10 unités de ligase de T4 ADN en présence de 200 picomoles de l'oligonueléotide syn- thétique 5' -phosphorylé pCATGAATTCATG (3) et dans 20 pl de tamlpon de ligase cde T4 ADN (20 mM de tris, pli 7,6, o0,5 mla dtATI', 10 mM del 'gCl2, 5 mm de dithio- thréitol) à 4 C pendant une nuit. Ensuite, on chauffe la solution pendant 10 minutes à 700C pour arrêter la ligature. Les agents de liaison sont elivés par (liges- tion avec EcoRI et les fragments comportant à présent des terminaisons EcoRI, sont séparés par électrophorèse sur gel. de polyaerylamide à 5'o, tandis que les trois plus gros Cil.agments sont isolés dlu gel en procédant tout d'aborld à une coloration avec du bromure di'éthi- dilum, en localisant les fragments avec de la lumière ultraviolette et en coupant, du -el, les parties con- cernees. On dépose chaque fragment de gel avec 300 microlitres de O,lxTBE, dans un sac de dialyse et on le soumet à une électrophorese a 100 v pendant une heure dans le tampon 0,lxTBE (le tampon TilE contbient: 10,8 g de base tris, 5,5 g d'acide borique, 0,09 g de Na2EDTA dans 1 litre de H10). On recueille la solution aqueuse (lu sac de( dialyse, on l'uxtrait au phénol, puis au chlo- roforme et on l'amène à une concentration de O,2M au chlorure de sodium, puis on récupère l'ADN dans 1l'eau après précipitation à l'éthanol. [Toutes les isola- tions des fragments d'ADN décrites ci-après sont effec- tuées en utilisant une électrophorèse sur gel de poly- acrylamide suivie du procédé d'électroélution qui vient d'être décrit]. Le gène contenant le promoteur/opéra- teur de trp avec les extrémités collantes 5 de EcoRI est identifié dans le procéddé dcrit ci-après, provo- quant ainsi l'insertion de fragments dans un plasmide 6 sensible à la tétracycline et qui, lors de l'inser- tion du promoteur/opérateur, devient résistant à la tétracycline. B. Création du plasmide pBlUItrp exprimant la résistance à la tétracycline sous le contrôle du promoteur/opé- rateur de trp, ainsi que l'identification et l'am- plification du fragment 5 d'AI)N contenant le promo- tctiur/opér-ateur dc trl; et isole sutl) (A) ci-dessus. Le plasmide pBIUI1 (6) (R.I. Rodriguez et al., Nucleic Acidcs Research 6, 3267-3287 [1979]) exprime la résistance à l'ampicilline et il contient le g&nc pour la résistance à la tétra;cycline mais, n'ayant au- cun promoteur associé, il n'texprime pas cette résistan- ce. En conséquence, ce plasmide est sensible à la tétracycline. En introduisant un système promoteur/ opérateur dans l'emplacement de EcoRI, le plasmide peut être rendu résistant à la tétracycline. On met pBRIH1 à digérer avec EcoRI et on 6li- mine l'enzyme par extraction au phénol suivie d'une extraction au chloroforme, puis on procède à une récu- pération dans l'eau apres précipitation à l'éthanol. La molécule 7 d'ADN ainsi obtenue est combinée, dans des mélanges réactionnels séparés, avec chacun des trois fragments d'ADN obtenus comme décrit sub (A) ci-dessus, puis elle est ligaturée avec la ligase de T4ADN conmme décrit précédemment. LIADN présent dans le mélange réactionnel est utilisé pour transformer la bactérie compétente E. coli K-12 souche 294, K. Backman et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. E.U.A. 73, 4174-4198 [1976]) (ATCC n 31448) par des techniques classiques (V. Hershfield et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. E.U.A. 71, 3455-3459 [1974]), puis on dépose la bactérie sur des plaques de LB contenant 20 /-g/l A d'ampicilline et 5 ig/ mnl de ttracycline. On sélectionne plusieurs colonies résistant à la tétracycline, on isole l'ADN du plasmnide et l'on confirme la praseice du fragment désiré par analyse de l'enzyme de restriction. Le plasmide 8 ob- tenu désigné par pBRHtrp, exprime la P-lactamase con- férant la résistance à l'ampicilline et il contient un fragment d'ADN comportant le promoteur/opérateur de trp et encodant une première protéine comprenant une fusion des six premiers acides aminés du directeur de trp et environ le dernier tiers du polypeptide E de trp (ce polypeptide est désigné par LE'), ainsi qu'une deuxième protéine correspondant à peu près à la première moitié du polypeptide D die trp (ce polypeptide est dé- signé par D') et une troisième protéine codée par le gène de résistance à la tétracycline. C. Gèncs de clonage pour différents polypeptides de produits finals et expression de ces derniers sous forme de protéines de fusion comprenant le produit final et le précurseur de polypeptide D de trp spécifiquement clivable (figure 2). Un fragment d'ADN comprenant le promoteur/opC- r;teur de trp et les codons pour les polypeptides LE' et Dl est obtenu à partir it lu)lismide pBRIltrp et il est insre6 dtans des plasmiides contenant des gènes structuraux pour différents polypeptides désirés dont des exemples seront donnes ci-après pour le cas dc la somatostatine (figure 2). Le plasmide pBPlItrp est mis à digérer avec l'enzyme de restriction EcoRI, tandis que le fragment 5 obtenu est isolé par électrophorèse sur gel de poly- acrylamniide et par électroélution. Le plasmide pSom 11 mis à digérer avec l'enzy- me EcoRI (K. Itakura et al., Science 198, 1056 (1977); brevet britannique publié n 2 007 676 A) est combiné avec le fragment 5. Le mélange est ligaturé avec la ligase de T4 ADN comme décrit précédemment et ltADN obtenu est transformé en E. coli K-12 souche 294 égale- ment comme décrit précédemment. Les bactéries trans- formantes sont sélectionnées sur des plaques contenant de l'ampicilline. On sélectionne les colonies obtenues résistant à l'ampicilline par hybridation (M. Gruenstein et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. E.U.A. 72, 39513965 5]) en utilisant, conme sonde, le fragment 5 conte- nant le promoteur/opérateur de trp isolé du plasmide pBlHtrp qui a été marqué radioactivement par p32. On sélectionne plusieurs colonies que l'hybridation a révélées positives, on isole l'ADN du plasmide et l'on détermine l'orientation des fragments insérés par ana- lyse de restriction en utilisant les enzymes de restric- tionI BgIII et B;amllI dans une (ligestionldoubl)lc. On Laisse croître la bactérie E. coli 294 contenant le plasmide désigné pSOM7 A2, 11, comportant le fragment de promo- teur/opérateur de trp dans l'orientation désirée, dans un milieu LB contenant 10]ig/ml dlampicilline. On laisse croître les cellules jusqu'à la densité optique de 1 (à 550 nM), on les recueille par centrifugation et on les remet en suspension dans un milieu M9 en une dilution de 10 fois. On laisse croître les cellules pendant 2-3 heures, à nouveau jusqu'à une densité opti- que de 1, puis on les soumet ai uI,: lyse et on analyse la teneur totale en proteines cellulaires par électro- phorèse sur gel de polyacrtylamidc/urée (15%)/dodécyl- sulfate de sodium (J.V. Maizel Jr. et al., Meth. Viral , 180-246 [1971]). La figure 3 illustre une analyse de protéines sur gel dans laquelle on sépare toutes les protéines de différentes cultures selon leurs dimensions. La densité des bandes individuelles reflète la quantité dans laquelle les protéines respectives sont présentes. En figure 3, les couloirs 1 et 7 sont des témoins et ils comprennent une variété de protéines d'une dimen- sion préalablement déterminée servant de points de réf é- rence à titre de comparaison. Les couloirs 2 et 3 sépa- rent la protéine cellulaire des colonies de E. coli 294 transformées avec le plasmide pSom7 A2 et que l'on a laissé croître dans les milieux LB (couloir 2) et iM9 (couloir 3). I,cs cotiloirs 4 l r séparent la proteinec cellulaire obtenue de cellules semblables transformées avec le plasmide pThc7A2, qui est un plasmide d'expres- sion de thymosine obtenu par des procédés essentielle- ment identiques à ceux déjà décrits, en commençant avec le plasmide pThal (voir la demande de brevet des Etats- Unis d'Amérique déposée le 28 février 1980 aux noms de Roberto Crea et Ronald B. Wetzel pour la "production de thymosinc alpha 1", dont la description est men- tionnée ici à titre de référence)..Lc couloir 4 sépare la protéine cellulaire cde E. coli 294/pThia72 que l'on a laisse croître dans le milieu LB13, tandis que le cou- loir 5 sépare la protéine cellulaire du même transfor- mant que l'on a laissé croitre dans le milieu M9.Lecou- loir 6 (qui est un autre témoin) représente le type de protéine de E. coli 294/pBR322 que l'on a laissé croître dans le milieu LB. Une comparaison vis-a-vis des témoins démontre que les deux b)alldes supérieures les plus prononcées de chacun lies couloirs 3 et 5 sont des protéines de la dimension anticipée dans]e cas de l'expression d'une protéine (le fusion comprenant le polypeptide D' et respectivement la somatostatinc et la thymosine (lXautre bande prononcée représente le polypeptide LEt résultant de la délétion de l'atténuateur). La figure 3 confirme que l'expression est réprimée dans un mi- lieu riche en tryptophanne, mais qu'elle est déréprimée dclans des conditions déficientes en tryptophanne. D. Clivage au bromure de cyanogène ctradio-immunotitra- ge pour un produit hormonal. A la fois pour le cas de la thymosine et de la somatostatine, toutes les protéines cellulaires sont clivées au bromure de cyanogène, tandis que le produit du clivage est récupéré et, après séchage, il est re- mis en suspension dans un tampon et soumis à une analy- se par radio-immunotitrage confirmant que l'expression du produit est, du point de vue immunologique, identi- que à la somatostatine et à la thymosine respectivement. Le clivage au bromure de cyanogène a été décrit par D.V. Goeddel et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. E.U.A. 76, 106-110 [1979]). II. Construction de plasmides pour l'expression direc- * te de gènes hétérologues sous le contrôle du sys- tème promoteur/opérateur de trp. La stratégie adoptée pour l'expression directe a donné lieu à la création d'un plasmide contenant un emplacement de restriction particulier distal de tous les éléments de contrôle de it 'opéron de trp dans le(quel des gènes hétérologues pourraient être clonés au lieu de la séquence directrice de trp et à une distance ap- propriée vis-à-vis de l'emplacement de fixation des ri- bosomes du polypeptide directeur de trp. La méthode d'expression directe sera décrite ci-après à titre d'exemple pour le cas de l'expression de l'hormone de croissance humaine. Le plasmide pSom7A2 (101g) est clivé avec EcoRI et le fragment 5 dtADN contenant les éléments génétiques de tryptophanne est isolé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et par électroélution. Ce fragment (2 tg) est mis à (diérer avec l'endonucléase de restriction Taq I (deux unités) pendant 10 minutes à 37 C de telle sorte que, en moycnne, on ne clive qu'un des cinq (environ) emplacements de Taq I de chaque molecule. Ce mélange partiellement digéré de fragments est sépa.re par électrophorèse sur gel de polyacrylamiîide, tandis qu'un fragment 12 d'environ 300 paires de bases (figure 4) contenant une extrémité de EcoRI et une cx- trémité (le Taq I est isolé par (lectroélution. L'em- placement correspondant de Taq I est situé entre ltem- placement du déclenchement de transcription et l'em- placement du déclenchement de traduction, tandis qu'il devance, de 5 nucléotides, le codon ATGdu peptide direc- teurde trp.La figure 4 illustre la séquence d'ADN existant autour de cet emplacement. En procédant de la manière décrite, on pourrait isoler un fragment contenant tous les éléments de contrôle de l'opéron de trp, c'est-à- dire le système promoteur/opérateur, le signaldedéclen- chlellcntdetranscription et l'emplacement de fixation des ribosomes directeurs de trp. Le résidu de Taq I à l'extrémité 3' du frag- ment obtenu près du signal de déclenchement de traduc- tion pour la séquence directrice de trp est ensuite transformé en un emplacemnentldeXbaI comme représenté en figure 5. Cette transformation est effectuée en liga- turant le fragmnient 12 obtenu ci-dessus à un plasmide co n tl:;t. iun emnplacezment p i cu i i ier (c est-à-dlit.l' u seul emplacement) do EcoRI et un emplacement particu- lier de XbaI. A cet effet, on peut utiliser essentiel- lement n'importe quel plaslmidce contenant, dans l'ordre, un réplicon, un marqueur pouvant être sélectionné, par exemple, une résistance aux antibiotiques, ainsi que des emplacements de EcoRI, XbaI et BamHI. Clest ainsi que, par exemple, un cmplacement deeXbal peut être intro- duit entre les emplacements EcoRI et BamHI de pBR322 (F. B13oliva;r et al., Gene 2, 95-119 [1977]), par exem- ple, en effectuant le clivage à l'emplacement particu- lier llind III du plasmide avec llind III, ce clivage étant suivi de la digestion, par la nucléase monocaté- naire spécifique, des extrémités collantes obtenues avec ligature des extrémités épointées d'un nucléotide synthétique bicaténair, se mettant de lui-même sous cette forme bicaténaire et contenant l'emplacement de car'actérisation, par exemple, CCTCTAGAGG. En variante, tout commne d(ans le cas p'ésent, on peut utiliser des fragments naturels d'ADN contenant un seul emplacement de XbaI entre les résidus de clivage de EcoRI et BamHlI. Dès lors, un produit de digestion, par EcoRI et BamHI, du génomc viral de l'hépatite B est obtenu par des moyens classiques et il est cl.one en emplacements EcoRI et BamHI du plasmide pGH6 (D.V. Goeddel et al., Nature 281, 544 [1979]) pour former le plasmide pHS32. On cli- ve le plasmide pHS32 avec XbaI, on l'extrait au phénol, puis au chloroforme et ensuite, on le précipite à 1'6- thanol. On le traite ensuite avec 1 Il de polyméraso I de E. coli, fragment de Klenow (Boehringer-Mannheim) dans 30/ul d'un tampon de polymérase (50 mM de phosphate de potassium, pH 7,4, 7 n' de MgCl2, 1 mM de P-mercapto- éthanol) contenant 0,1 mM de dTTP et 0,1 mM de dCTP pendant 30 minutes à 0 C, puis pendant 2 heures à 370c. Suite à ce traitement, deux des quatre nucléotides complémcntaires à l'extrémité on saillie 5' de l'empla- cement de clivage au XbaI viennent s'insércr dans: ' CTAGA 5' CTAGA- 3' T- 3' TCT- On incorpore deux nucléotides (dC et dT) pour obtenir une extrémité comportant deux nucléotides ressortant en 5'. On clive ce résidu linéaire du plasmide pHS32 (après extraction au phénol et au chloroforme et récu- pération dans l'eau après précipitation à liéthanol) avec EcoRI. On sépare le grand fragment 13 du plasmide du plus petit fragment de EcolI- XbaI par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et on l'isole après électro- elution. Ce fragment d'ADN provenant de pHS32 (0,2 1g) est ligaturé, dans des conditions analogues à celles ? décrites ci-dessus, au frlagment EcoRlI-Taq I de l Xop)r'on de tryptophanne (-_0,01 ug) comniu représenté en figure 5. Dans ce procédé, l'extrémite saillante de Taq I est ligaturée à l'autre extrémité saillante de XbaI bien qu'elle ne soit pas complètement appariée par bases suivant Watson-Crick: -T + CTAGA- -TCTAGA AGC TCT- AGCTCT- On transforme une partie de ce mélange de réaction de ligature en cellules de E. coli 294 comme décrit dans la partie I ci-dessus, puis on soumet ces cellules à un traitement thermique et on les dépose sur des plaques de LB contenant de l'ampicilline. On sélectionne 24 colonies qu'on laisse croître dans 3 ml de milieu LB, puis on isole les plasmides. On constate que six de ces plasmides comportent l'emplacement de XbaI régénéré par réparation et réplication d'ADN, cataly- sées par E. coli: -TCTAGA- TCTAGA AGCTCT- - AGATCT - On constate également que ces plasmides donnent également lieu à un clivage avec EcoRI et HpaI pour donner les fragments de restriction escomptés. Un plas-- mide 14, désigné par pTrp 14, est utilisé pour l'expres- sion de polypeptides hétérologues, ainsi qu'on le décri- ra ci-après. Le plasmide plIGII 107 (18 en figure 6, D.V. Goeddel et al., Nature, 281, 544, 1979) contient un gène pour l'hormone de croissance humaine comportant 23 codons d'acides amines produits par des fragments synthétiques d'ADN et 163 codons d'acides aminés obtc- nus à partir d'ADN complémentaire produit via une trans- cription inverse du RNA mniessager de l'hormone de crois- sance humaine. Quoique dépourvu des codons de la "prd"- séquence de l'hormone de croissance humaine, ce gène 21 contient un codon de déclenchement de traduction d'ATG. On isole le gène de 10/1g de pllGII 107 après 2S traitement avec EcoRI, puis avec la polymérase I de B. coli, fragment de Klenow, ainsi qu'avec dTTP et dATP, comme décrit ci-dessus. Après extraction au phénol et au chloroforme, ainsi qu'après précipitation à ltéthanol, on traite le plasmide avec BamHI. (Voir figure 6). Le fragment 21 contentant le gène de l'hormonc de croissance humaine ("HGIIH") est isolé par électro- phorèse sur gel de polyacrylamide, suivie d'une élec- troélution. Le fragment d'ADN obtenu contient égale- ment les 350 premiers nucléotides du gène structural de résistance à la tétracycline, mais il est dépourvu du système promoteur/opérateur de tétracycline si bien que, lorsqu'il est ultérieuremnent cloné en un plasmide d'expression, les plasmides contenant 1' insertion peuvent être localisés par rétablissement de la resis- tance à la tétracycline. Etant donné que la terminai- son EcoRI du fragment 21 a été insérée par le procédé à la polymérase I de Klenow, le fragment comporte une extrémité épointée et une extrémité collante,assurant ainsi l'orientation adéquate lors de l'insertion ulté- rieure dans un plasmide d'expression (voir figure 6). Le plasmide d'exprcssion pTrpl4 est ensuite préparé pour recevoir le fragment contenant le gène de l'hormone de croissance humaine préparé comme décrit ci-dessus. C'est ainsi que l'on fait digérer pTrpl4 avec XbaI, tandis que l'on insère les extrémités col- lantes obtenues par le procédé à la polymérase I de Klenow en employant dATP, dTTP, dGTP et dCTP. Après extraction au phénol et au chloroforme, ainsi qu'après précipitation à l'éthanol, on traite l1ADN 16 obtenu avec BanHI et l'on isole le grand fragment 17 de plas- mide obtenu p a r électrophorèse sur gel de poly- acrylamide et électroélution. Le fragment 17 dérivant de pTrp14 comporte une extrémité épointée et une extré- mité collante, permettant ainsi la recombinaison dans l'orientation appropriée avec le fragment 21 contenant le gène de l'hormone de croissance humaine que l'on a décrit ci-dessus. On combine le fragment 21 du gène de l'hormone de croissance humaine et le fragment 17 AXbaI-BaiHI de pTr]l4, puis on les ligature ensemble dans des conditions analogues à celles décrites ci-dessus. Les terminaisons XbaI et EcoRI insérées sont ligaturées ensemble par li- gature des cxtrémités épointées afin de recréer à la fois les cmplacemenits dc XbaI et EcoRI: XbaI inséré EcoRI inséré Initiation du gène de l'hormone de croissance humaine TCTAG + AATTCTAT- CTAGTTCTAT-G.--- -AGATC TTAAGATAC AGAT TTAIGATAC- XbaI EcoRI Cette construction recrée également le gène de résistance à la tétracycline. Etant donné que le plas- mide pHGH 107 exprime la résistance à la tétracycline à partir d'un promoteur situé en amont du gène de l'ho- mone de croissance humaine (promoteur lac), cette cons- truction 22, désignée par pHGII 207, permet l'expression du gène pour la résistance à la tétracycline sous le contrôle du proirmoteur/opérateur de tryptophanne. Dès lors, le mélangc de ligature est transformé en E. coli 294 avec des colonies sélectionnées sur des plaques de LB contenant 5 /lg/ml de tétracycline. Afin de confiimer l'expression directe de l'hormone de croissance humaine à partir du plasmide pIIGHI 207, tout comme dans le cas décrit dans la partie I ci-dessus, on soumet, à une électrophorèse sur gel dc dodécylsulfate de sodium, la totalité des protéines cellulaires dérivant de E. coli 294/plIGH 207 que l'on a laissé croître jusqu'à une densité optique de 1 dans un milieu LB contenant 10 Pg/mnil d'ampicilline et que l'on a (lilue de 1 à 10 fois dans un milieu M9, pour le laisser à nouveau croître jusqu'à une densité optique de 1; ensuite, on a effectué une comparaison avec des données dI éLcctrophiorsc anal[ogues obtenues pour l'hormone de croissance humaine t(Lellc qu'ellec a été exprimée antéricurement par d'autres chercheurs (D.V. Goeddel et al., Nature, 281, 544 (1979)). La figure 7 est une photographie du gel coloré obtenu dans lequel: les couloirs 1 et 7 contiennent des marqueurs de protéines de différentes dimensions connues; le couloir 2 est un témoin séparant toutes les protéines cellulaires de E. coli souche 294 pBR322; le couloir 3 sépare la protéine de E. coli 294/pIIGII 107 que l'on a laissé croître dans un milieu LB; le couloir 4 sépare la protéine de E. coli 294/plHGII 107 que l'on a laissé croîitre dans le milieu M9; le couloir 5 sépare la protéine de E. coli 294/pHGH 207 que l'on a laissé croître dans le milieu LB et le couloir 6 sépare la protéine de E. coli 294/pHGH 207 que l'on a laissé croître dans le ''ilieu M9. La bande dense du couloir 6 est l'hormone de croissance humaine comme indiqué par comparaison avec les bandes semblables des couloirs 2-4. Selon les prévisions de la présentec invention, lorsqu'on laisse croître l'organism E_ coli 294/pHGlCII 207 dans un milieu LB riche en tryptophannc, il pro- duit moins d'hormone de croissance humaine en raison des interactions répresseur/opérateur de tryptophanne et, lorsqu'on laisse croître cet organisme dans un mi- lieu M9, il produit beaucoup plus d'hormone de crois- sance humaine que l'organisme E. coli 294/pIIGH 107 sui- te à l'induction du système promoteur/opérateur de tryptophanne plus puissant que le système promoteur lac/opérateur dans pHGH 107. III. Création d'un plasmide général d'expression pour l'expression directe de gènes hétérologues sous le contrôle du système promoteur/opérateur de tryptophanne. Le plasmide pIGH. 207 créé dans le paragraphe précédent est ensuite utilisé pour obtenir un fragment d'ADN contenant les éléments de contrôle de l'opéron de 3' tryptophanne (avec délétion de l'atténuateur), de même que pour creter un "vecteur d' expression" de plasmidces approprié pour 1' expression directe de différents gènes structuraux inséres. La stratégie adoptée pour la créa- tion du plasmide général d'expression implique l'élimi- nation, de pGIGH 207, de la zone de contrôle de trypto- phanne par digestion avec EcoRI et insertion dans le plasmide pBRII que lIon a mis à digérer avec EcoRI et que l'on a utilisé dans la partie I cidessus. Comme on lTia indiqué préccdemment, pBRHIil est un plasmide ré- sistant à l'anmpicilline et contenant le gène de r(ésis- tance à la tétracycline, cependant qu'il est sensible à la tétracycline par suite de l'absence d'un système promoteur/opérateur approprié. Le plasmide obtenu, pHKY 1, dont la construction est décrite plus particu- lièrement ci-après et illustrée en figure 8, résiste à la fois à l'ampicilline et à la tétracycline, il con- tient le système promnioteur/opérateur de tryptophanne, il est dépourvu de 1latténuateur de tryptophanne et il contient un emplacement particulier de XbaI distal du système promoteur/opérateur de tryptophanne. Le sys- tème promoteur/opérateur de tryptophanne et 1 emplace- mnient particulier de XbaI sont fixés par les emplace- ments de EcoRI, si bien que le fragment renfermant le système promoteur/opérateur et XbaI peut être éliminé pour être inséré dalns d'autres plasmides contenant des gènes structuraux. En variante, des gènes structuraux hétérologucs peuvent être insérés soit dans ltemeplace- ment de XbaI, soit (aprèes digestion partielle avec EcoRI) dans ltemplacement de EcoRI distal de la zone de contrô- le de tryptophanne de façon à venir se placer, dans l'un ou l'autre cas, sous le contrôle du système promoteur/ opérateur de tryptophanne. Le plasmide pHIGH 207 est mis à digérer avec EcoRI, tandis que le fragment 23 de EcoRI contenant le promoteur de tr'p est récupéré par électrophorèse sur gel de polyacrylamide, suivie d'une électroélution. 32- Le pl.asniRde pJBRII1 est mis à digérer avec EcoRI et les extrémLitLés clivees sont traitées avec une phospha- tase alcaline bactérienne (1 Ipg, dans 50 mM de tris, pli 8 et 10 mi de M-ClC1 pendant 30 minutes à 650C) afin dlé- liminer les groupes phosphates se trouvant sur les ex- trémités en saillie de EcoRI. On élimine l'excès de phosphatase alcaline bactérienne par extraction au phé- nol, extraction au chloroforme et précipitation à l'é- thanol. Etant donné qu'il est dépourvu de phosphates sur ses extrémités saillantes, l'ADN 7a linéaire obtenu n'acceptera, lors de la ligature, que les insertions dont les extrémités collantes complémentaires sont phosphorylées, mniais il ne se recircularisera pas, per- mettant ainsi une sélection plus aisée pour les plasmi- des contenant les insertions. Le fragment de EcoRI dérivant de pHGH 207 et l'ADN linéaire obtenu à partir de pBRH1 sont combinés en présence de ligase T4 comme décrit précédemment et ils sont ligaturés. Une partie du mélange obtenu est transformée en E. coli souche 294 comme décrit précédemment, puis elle est déposée sur des plaques du milieu LB contenant 5 fg/ml de tétracycline avec sélection de 12 colonies résistant à la tétracycli- ni. On isole le plasmide de chaque colonie et on l'exa- mine pour déterminer la présence d'une insertion d'ADN par analyse à l'endonucléase de restriction en employant EcoRI et XbaI. Un plasmide contenant l'insertion est désigné par plIKYl. IV. Création d'un plasmide contenant l'opéron de tryp- tophanne capable d'exprimer une protéine de fusion spécifiquement clivable comprenant 6 acides aminés du peptide directeur de trp et le dernier tiers du polypeptide E de trp (désigné par LE'), ainsi qu'un produit de gènes structuraux hétérologues. La stratgieC adoptée pour la création d'un plasmide d'expression de protéine tde fusion LEt comnpor- te les étapes suivantes: a. I"oa'1L. tïones(un t.i'a'mC-le (f(ret d gêie co)ll[)renlanllt des codons pour la zone distale du polypeptide LE' com- portant les extrOmités collantes Bgl 11 et EcoRI respec- tivement aux extrémités 5' et 3' du brin de codage; b. élimination des codons de lat zone dista].e (ldu fragment de uL, ne LE' et de ceux p'revus pour Le gene D de trp lo.s dlu pl;tasmide(l SOM 7 A'z avec insertion (du fragment forme, l.,rs dc l'etape 1, reconstituant ainsi la séquence d celle prévue potr' l.e gtlne hetérologuto (de la somatosta- tine. 1. En se reférant à la figure 9(a), on met le plasmide pSom7A2 à digérer avec Hind III pour pro- céder ensuite à une digestion avec la lambda-exonucléase (une exonucléase de 5' à 3') dans des conditions choisies de facon à obtenir une digestion au-delà de l'emplace- ment dc restriction le 13B1l II dans la zone d'encod[age LEt. On dissout 20/,_ du p]lasmide pSoîîr 7 A2 que l'onr a mis a digérer avec llind III, dans un tampon [20 mM de tampon dc glycine, pli 9,6, I mM de blgC12, 1 nt de 3-mercaptoéthanol;. On traite le mélange obtenu avec unités de laibdaexonucléase pendant 60 minutes à la température ambiante. Ensuite, on soumet le mélange réactionnel obtenu à une extraction au phénol, à une extraction au chloroforme et à une précipitation à l'éthanol. Afin de créer finalement un résidu de EcoRI à l'extrémitéc distale du fragment de gène LE', on syn- thétise une matrice 32pCCTGTGCATGAT par le procédé per- fectionné au phosphotriester (R. Crea et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. E.U. A. 75, 5765 [1978]) et on l'hybride en extrémité monocaténaire du fragment de gène LE' réstultant de la digestion à la lambda-exonucléase. On effectue l'hybridaztion comme décrit ci-après. On dissout 'O/u g du produit de digestion au Hind III du plasmide pSom7, 7Z, que l'on a traité à la lambda-cxornucliase, cdlans 20 /l de 110z et on les combine avec 6 pl d'une solution contenant environ 80 picomoles de l'oligonucléo)tide 5'-phosphorylé décrit ci-dessus. On hybride le fragment synthétique sur l'lextrémité 3t de la séquence de codage de LE' et l'on insère la partie monocaténaire restante du fragment de LE' par.le procédé à la polymérase I de Klenow décrit ci-dessus en utilisant dATP, dTTP, dGTP et dCTP. On chauffe le mélange réactionnel à 50 C et on le laisse refroidir lentement à 10 C, après quoi on ajoute 4 rl de lV' 'zy-me de Klenow. Après incubation pendant 15 minutes à la température ambiante, suivie d'une incubation pendant 30 minutes à 37 C, on arrête la réaction par 9ddition de 5 il d'acide éthylène-diamine- tétracétique O,25M. On soumet le mélange réactionnel à une extraction au phénol, à une extraction au chlorofor- me et à une précipitation à l'éthanol. On clive ensuite l'ADN avec l'enzyme de restriction Bgl II. On sépare les fragments par électrophorèse sur gel de polyacryla- mide. Un autoradio4ranmmne obtenu à partir de ce gel révèle un fragment marqué 32p de la longueur escomptée d'environ 470 paires de bases que l'on récupère par électroélution. Comme on l'a souligné, ce fragment LE'(d) comporte une extrémité Bgl II et une extrémité épointée coïncidant avec le début de la matrice. Le plasmide pThal décrit dans la partie I(C) ci-dessus porte un gène structural pour la thyzeosine al cloné, à l'extrémité 5' de son brin de codage, en un emplacement de EcoRI et, à son extrémité 31, en un emplacement de BamHI. Comme représente en figure 9, le gène de thymosine contient également un emplacement de Bgl II. Le plasmide pThal contient égalemnent un gène spécifiant la résistance à l'ampicillinie. Afin de créer un plasmide capable d'accepter le fragment LE'(d) préparé ci-dlessus, on met le plasnmide)pTht1 i digérer avec EcoRI, puis on procède à la réaction de polymérase I de Klenow avec (dTTPr et dATP pour élpo inte' les résidus 255 199 (le EooI{. EEn n,'et,Ut;t I e produit oblt('untt à d(ligrer avec Bgl II, on crée un ira'ntent linéaire 33 d'ADN contenant le gène pour la résistance à ltampicilline et, à ses extrémités opposées, un résidu collant de Bgl II et une extrémité épointée. Le produit obtenu peut être recir- cularisé par réaction avec le fragment LEt (d) contenant une extrémité collantc Bgl II et une extrémité épointée en présence de la ligase T4 pour former le plasmide pTrpZ4 (figure 9b). En procédant de la sorte, on re- crée un emplacemlienrt dc EcoRI à l'endroit o a eu lieu la ligature des extrémités épointées. En se référant à la figure 10, en mettant pTrp24 à digérer successivement avec Bgl II et EcoRI, pour procéder ensuite à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide et à une électroélution, on obtient un fragment comportant des codons pour le polypeptide LE' (d) avec une extrémité collante de Bgl II et une extrémité collante de EcoRI près de sa termnuinaison de codage 3'. Le fragm;ent 38 (le LEt (d) peut être cloné en empla- z0 cement Bgl II du plasmide pSomn7 A? pour former une pro- téine de fusion de polypeptide LE'/somatostatine expri- mée sous le contrôle du système promoteur/opérateur de tryptophanne, comme indiqué en figure 10. A cet effet, il convient: (1) de mettre le plasmide pSom7 A2 à di- gérer partiellement avec EcoRI afin de cliver l'emplace- ment de EcoRI distal du systèm promoteur/opérateur de tryptophanne, coomme indique en figure 10, et (2) de choisir judicieusement la séquence de matrice (figure 9) afin de maintenir l'unité de lecture des codons de ma- nière adéquate et egalement afin de recréer un emplace- ment de clivage (le EcoRI. C'est ainsi que l'on dilue 16 7g du plasmide pSom7y2 dans 200 ul d'un tampon contenant 20 nml de / tris, pli 7,5, 5 m(, dle MgC1., 0,02 mul ide détergent NP40 et 100 mM de NaCI, puis on effectue un traitement avec 0,5 unité de EcoRI. Après 15 minutes à 37 C, on soumet le médlange réactionnel à une extraction au phénol, à une extraction au chloroforme et à une précipitation à l'étha- nol, puis on le met à digérer avec Bgl II. On isole le grand fragment 36 ainsi obtenu par le procédé d'électro- phorèse sur gel de polyacrylamide, suivi d'une électro- élution. Ce fragment contient les codons "LE'(p)" pour l'extrémité proximiale du polypeptide LEt', c'est-à-dire ceux situés en amont de l'emplacement de Bgl II. On ligature ensuite le fragment 36 avec le fragment 38 en présence de ligase T ADN pour former le plasmide _1 4 pSom7A2A4 qui, lors de la transformation en E. coli- souche 294, comme décrit précédemment, produit efficace- ment une protéine de fusion constituée du polypeptide LE' entièrement reconstitué, ainsi que de somatostatine, sous le contrôle du système promoteur/opérateur de tryp- tophanne. La protéine de fusion dont la somatostatine peut être spécifiquement clivée par suite de la présence d'une méthioninc à l'extrémité 51 de la séquence de so- matostatine, est séparée par électrophorèse sur gel de dodécyl-sulfate de sodium/polyacrylamide comme décrit précédemment. Le produit constitué de la protéine de fusion est représenté par la bande la plus distincte que l'on aperçoit dans le couloir 6 de la figure 11, ainsi qu'on le décrira de manière plus détaillée dans la partie VI ci-après. V. Création d'un système d'expression pour des fusions de polypeptides LE' de trp en plaçant la résistance à la tétracyc]inc sous le contrôle du système pro- moteur/opérateur de tryptophanne. La stratégie adoptée pour la création d'un véhicule d'expression capable de recevoir une large variété de gènes de polypeptides hétérologues pour l'expression sous forme de protéines de fusion LE' de trp sous le contrôle de l'opéron de tryptophanne, donne lieu à la construction d'un plasmide présentant les ca- ractéristiques suivantes: 1. La résistance à la tétracycline qui serait perdue en cas d'excision du système promoteur/opérateur 2555 1 99 contrôlant les g_ènes spécifiant cette résistance. 2. Eliminiation du système promoteur/opérateur qui contrôle la résistance a la tétracycline et recircu- larisation par ligature avec un gène hétérologue et un système promoteur/opérateur de tryptophanne dans la phase de lecture appropriée et en référence à celle- ci, rétablissant ainsi].a résistance à la tétracycline, tout en permettant, dès lors, l'identification de plas- inides contenant l ' insertion de gènes lhétérologues. En résumé et, en compatibilité avec la nature des insertions cnvisagées, le but est de créer une par- tie lineaire d'ADN comportant un résidu de Pst à son extrémité.3' et un résidu de Bgl II à son extrémité 5', fixant ainsi un gène capable de spécifier la résistance à la tétracycline sous le contrôle cd'lun système promo- teur/opérateur. C'est ainsi que, en se référant à la figure 12, on met le plasmide pBR322 à digérer avec lind III et l'on met, à leur tour, les extrémités saillantes de Hind III à digérer avec la nucléase S1. La digestion à la nucléase S1 consiste à traiter 10 pg de pBR322 clivé avec Hind III dans 30o1 de tampon S1 (NaCl 0,3M, 1 mM de ZnC12, 25 mM d'acétate de sodium, pI 4,5) avec 300 unités de nucléase SI pendant 30 minutes à 15 C. On arrête la réaction par addition de I pl de solution d'arrêt dle nuc] ése 30 X S1 (base tris 0,8M, 50 miMl d'acide éthylène-dli aminetètracétique). On soumet le mélange à une extraction au phénol, puis à une extrac- tion au chloroforme et à une précipitation à ltéthanol et ensuite, on le met à digérer avec EcoRI comme décrit ci-dessus, tandis que l'on obtient le grand fragment 46 par le procédé d'lectrophorèse sur gel de polyacryla- mide, suivi d'une électroélution. Le fragment obtenu comporte une première extrémité collante de EcoRI et une deuxième extrémité épointée dont le brin de codage commence par le nucléotide thymidine. Comme on le dé- crira ei-après, lc résidu de llind III (lue I on a mis à * digérer à la nucléase SI et qui colunlerice par la thymnii- dine, peut être réuni à un résidu de 13-1 II traité à la polymérase I de Klcnow afin de reconstituer]'emplace- ment de restriction de Bgl Il sur la li-ature. Le plasmide pSom7 L2, préparé cornmme décrit dans la partie I ci-dessus, est mis à digérer avec Bgl II, tandis que les extrémités collantes de Bgl II qui en résultent, sont rendues bicaténaires par le procédé à la polymérase I de Klenow en utilisant les quatre triphos- phates de déoxynucléotides. Par clivage du produit obtenu avec EcoRI, puis par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et électroélution du petit fragment 4Z, on obtient une partie linéaire d'ADN contenant le pro- moteur/opérateur de tryptophanne et des codons de la séquence "proximale" de LE' en amont de l'emplacement de Bgl II ("LE'(p)"). Le produit comporte une extrémité de EcoRI et une extrémité épointée résultant de l'inser- tion de l'emplacement de Bgl II. Toutefois, l'emplace- ment de Bgl II est reconstitué par ligature de l'extré- mité épointée du fragment 42 avec l'extrémité épointée du fragment 46. Dès lors, les deux fragments sont liga- turés en présence de la ligase de T4 ADN pour former le plasmide recircularisé pHKY 10 (voir figure 12) qui est propagé par transformation en cellules compétentes de E. coli souche 294. On laisse croître les cellules résistant à la tétracycline et portant le plasmide re- combinant pHKY 10, on extrait l'ADN du plasmide et on le met, à son tour, à digérer avec Bgl II et Pst, après quoi on l'isole par le procédé d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide et par électroélution du grand frag- ment, s o i t une partie linéaire d'ADN comportant des extrémités collantes de Pst et de Bgl II. Ce frag- ment 49 d'ADN contient l'origine de réplication et il s'avère ultérieurement utile comme premier composant dans la construction de plasmides dans lesquels les gènes codant les protéines de fusion du polypeptide LE' de trp et le gène de résistance à la tétracycline sont contre- lés par le proinoLtt'/opérateur de trp. Le plasli(!dc pSom7A 2A4 préparé comme décrit dans la partie 1V ci-dessus, pourrait être manipulé pour fournir un deuxième composant pour un système capa- S ble de recevoir une large variété de gènes structuraux hétérologucs. En se référant à la figure 13, on soumet le plasmide à une digestion partielle avec EcoRI (voir partie IV), putis;à une digestion avec Ils; et iton isole le fragment 51 colitet,;t.l le proiOot(eui/ol)plé'ltCUr (le trp par le procédé (i'électrophorèse sur gel de polyacryla- mide, suivi d'tune électroélution. La digestion par- tielle avec EcoRI est nécessaire pour obtenir un frag- ment qui est clivé près de l'extrémité 5'du gène de somatostatine, mais qui n'est pas clivé à l'emplacement de EcoRI présent entre le gène de résistance à l' ampi- cilline et le promoteur/opérateur de trp. La résistance à l'ampicilline perdue par le Pst I coupé dans le gène R ap pourrait être rétablie par ligature avec le frag- ment 51. Dans une première démonstration, on obtient le troisième composant, à savoir un gène structural pour la thymosine El, en mettant le plasmide pThal à digérer avec EcoRI et BamllI. On purifie le fragment 52 par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et par électro- élution. Les trois fragments de gènes 49, 51 et 52 pour- raient alors trce ligaturés cnsemblet dans l'orientation appropriée commin re)présenté en figure 13 potur former le plasmide pThlY7 A1 4 qui pourrait être sélectionne en raison du rétablissement de la résistance à l'ampi- cilline et à la tétracycline. Lorsqu'il est transformé en E. coli souche 294 qu'on laisse croître dans des conditions analogues à celles décrites dans la partie I ci-dessus, le plasmide exprime une protéine de fusion du polypeptideLE' detrp de laquelle la thymosine cl pourrait être spécifiquement clivée par traitement au bromure de cyanog6ne. Lorsque d'autres gènes structu- raux hétérologues comportant des terminaisons EcoRI et BamHI sont ligaturés de la même manière avec les com- posants dérivant de pHKY 10 et pSOMN17 A2 A4, on obtient efficacement de la même manière les protéines de fusion du polypeptide LL' ide trp contenant les polypeptides pour lesquels ces gènes hétérologues effectuent le codage. La figure 11 illustre une séparation entre toutes les protéines cellulaires et les transformants de E. coli souche 294 par électrophorèse sur gel de polyacrylamide/ dodécyl-sulfate de sodium, la bande la plus foncée re- présentant, dans chaque cas, le produit des protéines de fusion qui est obtenu sous le contrôle du système promoteur/opérateur de tryptophanne. En figure 11, le couloir 1 est un témoin qui sépare toutes les protéines cellulaires de E. coli 294/pBR322. Le couloir 2 con- tient le produit de fusion de la somatostatine obtenu à partir du plasmide pSom7A 2 A4 préparé dans la partie IV ci-dessus. Le couloir 3 est le produit d'expres- sion de pSom7 A1 A4 contenant de la somatostatine. Le couloir 4 contient le produit d'expression de pThc7Aà1 4, tandis que le couloir 5 contient le produit exprimé à partir d'un plasmide obtenu lorsque les fragments décrits ci-dessus dérivant de pHKY-10 et de pSom7A2 A4 sont ligaturés avec un gène structural terminé par EcoRI/BamHI encodant la pro-insuline humaine et pré- paré en partie par la Demanderesse. Les couloirs 6 et 7 contiennent respectivement (sous forme de la bande la plus foncée) une protéine de fusion du polypeptide - LE' detrp de laquelle on peut cliver les chaînes B et A de l'insuline humaine. On obtient les gènes structu- raux B et A de l'insuline en mettant à digérer, avec EcoRI et BamHI, les plasmides pIB1 et pIA11 respective- ment dont la construction est décrite par D.V. Goeddel et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. E.U.A. 76, 106 [1979]. Le couloir 8 contient des marqueurs de dimensions comme décrit précédemment. 2555 1 99 BiIcn quc I t invention ait été décrite clans sa forme de réalisation de loin préférée en référence à E. coli, d'autres entérobactériacées pourraient égale- mnient servir de cellules hMtes pour l'expression et éga- lement de sources pour les opérons de trp; parmi ces entérobactériacées, on peut mentionner, par exemple, Salmonellatvphimluîriîm. et Serratia marcesans. Dès lors, ltinvention n'est nullement limitée aux formes de réalisation préférées décrites ci-dessus, mniais uni- quement par le cadre légitime des revendications ci- après. REVENDICATIONS 1. Procédé de clivage d'ADN bicaténaire en n'importe quel point donné, caractérisé en ce qu'il consiste à: (a) transformer l'ADN bicaténaire en ADN monocaténaire dans une zone entourant ce point; (b) hybrider, sur la zone monocaténaire formée lors de l'étape (a), une longueur de matrice complémentai- re d'ADN monocaténaire, l'extrémité 5' de cette matrice étant opposée au nucléotide adjacent à l'em- placement de clivage envisagé; (c) rétablir la partie du deuxième brin qui a été élimi- née lors de l'étape (a) et qui est située dans la direction 3' à partir de cette matrice, par réaction avec la polymérase d'ADN en présence de triphosphates de déoxynucléotides contenant de l'adénine, de la thymine, de la guanine et de la cytosine; et (d) mettre à digérer la longueur monocaténaire restante j d'ADN faisant saillie au-delà du point de clivage envisagé. 2. Procédé suivant la revendication 1, carac- térisé en ce qu'on effectue simultanément les étapes (c) et (d) par réaction avec la polymérase d'ADN qui polymérise dans la direction 5' -- 3', qui est exonucléo- lytique dans la direction 3' - 5', mais qui est non exonucléolytique dans la direction 5' -3'. - 3. Procédé suivant la revendication 2, carac- térisé en ce que la polymérase est la polymérase I de Klenow.