FR 2537725 A1 19840615 FR 8220632 A 19821209 La présente invention est relative à un nouveau procédé de détection immunobactériologique de germes pathogènes possé- dant des déterminants antigéniques spécifiques tels que notam- ment la fraction 1 + 2 définie dans le Brevet français ANVAR n 73 03734, dans des milieux biologiques contaminés, et notam- ment à un procédé de détection immunobactériologique de germes pathogènes possédant une fraction 1 + 2, tels que Vibrio cho- lerae, Salmonella typhimurium, Malleomyces mallei, Pseudomonas pseudomallei, dans des milieux biologiques contaminés, et notamment dans les selles, le sang, l'urine, l'eau, les excrétions de toutes sortes. Par déterminants antigéniques on entend toutes frac- tions provenant d'un agent pathogène susceptibles d'induire un anticorps polyspécifique ou monoclonal capable de recon- naître ledit agent pathogène. Les fractions antigéniques 1 + 2 sont connues par le Brevet français ANVAR n 73 03774 du 2 février 1973 et les premier et deuxième Certificats d'Addition à celui-ci n 74 06983 du 1 er mars 1974 et n 77 12152 du 22 avril 1977. On connaît, d'autre part, par le Brevet français n 75 36889 au nom de l'INSTITUT PASTEUR, un gel magnétique utilisable pour des dosages immunoenzymatiques constitués par un gel d'acrylamide/agarose contenant des parti- cules magnétiques, couplé avec une protéine telle qu'un anti- gène ou un anticorps par l'intermédiaire d'un agent de cou- plage tel que le glutaraldéhyde, un tel gel couplé à un anti- gène ou à un anticorps étant utilisé pour le dosage immuno- enzymatique de l'anticorps ou de l'antigène correspondant présent dans un liquide biologique, par incubation de ce gel avec le liquide biologique, suivie de plusieurs lavages du gel avec séparation de ce dernier à l'aide d'un champ magnétique, puis incubation du gel avec des anticorps ou des antigènes marqués à l'aide d'ureenzyme couramment utilisée en dosage immunoenzymatique telle que la glucose-oxydase ou la peroxydase, et mesure de l'activité enzymatique du gel par lecture de la densité optique. Par ailleurs, la Demande de Brevet français INSTITUT PASTEUR et C N R S no 81 18985 du 8 octobre 1981 fait con- naître un procédé de détection de germes pathogènes dans des fluides, et notamment dans l'eau d'alimentation, par filtra- tion sur un immunoadsorbant constitué par un support insolu- ble, et plus particulièremenit un polymère insoluble tel qu'un gel, notamment gel de polyacrylamide et/ou d'agarose, sur lequel sont fixés par liaison chimique, des anticorps spécifiques du germe pathogène dont on souhaite déterminer la présence dans un fluide, en particulier des anticorps antifraction Ch 1 + 2 de Vibrion cholerae, des anticorps anti-Salmonella thyphimu- rium, des anticorps anti-virus polyomyélitique type I et II, antiEscherichia coli, anti-virus de l'encéphalomyocardite, cette filtration étant suivie de la caractérisation des fac- teurs antigéniques retenus par l'immunoadsorbant, laquelle caractérisation est réalisée par des moyens classiques tels que dilution du gel et culture sur gélose en milieu liquide sélectif, caractérisation biochimique et sérologique du germe (agglutination), etc. La présente invention a pour but d'isoler le germe pathogène du milieu biologique contaminé, directement sur des billes de gel magnétique sur lesquelles est couplé chimi- quement un anticorps en le concentrant à l'aide de ces billes en des quantités très supérieures aux faibles concentrations en germes initialement présents dans un milieu biologique. Ceci permet de diagnostiquer non seulement la maladie, mais la présence de germes pathogènes chez un porteur de ces germes en faibles quantités et la caractérisation du germe pathogène en moins de 48 heures en immunodiffusion, ainsi que de diagnos- tiquer la présence éventuelle de plusieurs germes pathogènes dans un même milieu biologique, entraînant ainsi une économie notable de milieu à tester et de temps puisque plusieurs germes peuvent être détectés simultanément grâce au procédé qui fait l'objet de la présente invention, qui, en outre, ne nécessite pas la mise en oeuvre de milieux de culture sélec- tifs. La présente invention a pour objet un procédé de détec- tion immunobactériologique de germes pathogènes possédant des déterminants antigéniques spécifiques tels que notamment la fraction antigénique 1 + 2, dans des milieuxbiologiques con- taminés, à l'aide d'un gel magnétique sur lequel sont couplés des anticorps anti-déterminants antigéniques spécifiques, lequel procédé est caractérisé en ce qu'on met en contact un milieu biologique supposé contaminé par un germe pathogène possédant ledit déterminant antigénique spécifique, tel que par exemple la fraction 1 + 2, avec des billes ou analogues dudit gel magnétique, pendant un temps suffisant pour permettre la fixation sur le gel, des germes contenus dans le milieu biologique, en ce qu'on retire les billes ou analogues de gel magnétique du mélange, par des moyens magnétiques, et en ce qu'on les ensemence sur un milieu gélosé approprié sur lequel elles sont incubées pendant une durée et à une température appropriées, après quoi on creuse dans la gélose, à proximité des billes magnétiques recouvertes de colonies de cultures, incrustées dans la gélose, des puits que l'on remplit de sérum anti-germe pathogène à détecter, approprié, en ce qu'on lyse les germes au moyen d'agents de lyse appropriés, en ce qu'on incube le lysat avec le sérum pendant un temps appro- prié pour permettre à la réaction sérologique anticorps-anti- gènes de se produire par immunodiffusion sur la gélose et en ce qu'on dénombre par lecture directe, grâce à la réaction antigène-anticorps sur la gélose, la qualité des germes con- tenus dans le milieu biologique. Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de détection immunobactériologique conforme à la présente inven- tion, appliqué à la détection simultanée de plusieurs germes pathogènes dans un milieu biologique, les puits creusés dans la gélose sont remplis de sérums anti-germe pathogène différents, Selon un autre mode de réalisation avantageux du pro- cédé conforme à l'invention, les billes ou analogues de gel magnétique sont couplées avec des anticorps anti-fraction 1 + 2 provenant d'un sérum hyperimmun anti-fraction 1 + 2 obtenu conformément au Brevet français n 73 03734 ou à l'une de ses Additions n 74 06983 ou 77 12152, par extraction des Ig G dudit sérum hyperimmuno Selon une modalité avantageuse de ce mode de réalisa- tion,pour l'application du procédé conforme à l'invention à la détection simultanée de plusieurs germes pathogènes dans un milieu biologique, des séries de billes ou analogues de gel magnétique dont chacune est couplée avec des anticorps anti-fraction 1 + 2 provenant de cultures de chacun des ger- mes pathogènes à détecter, sont mises en contact avec le milieu biologique. Conformément à l'invention, le sérum anti-germe patho- gène introduit dans les puits creusés dans la gélose est choisi dans le groupe qui ccaprend les sérums spécifiques de germes anti-fraction 1 + 2, les sérums polyvalents anti-germes pathogènes possédant une fraction 1 + 2, les sérums anti-toxine du germe pathogène, les sérums anti-sous- unité A ou B desdits germes pathogènes. Selon un mode de réalisation avantageux du procédé conforme à l'invention, le milieu biologique auquel le procédé est appliqué est choisi dans le groupe qui comprend les selles, le sang, l'urine, les excrétions de toutes sortes, l'eau. Selon un autre mode de réalisation avantageux du pro- cédé conforme à l'invention, les moyens magnétiques utilisés pour-retirer les billes ou analogues de gel magnétique du milieu biologique après incubation avec ce dernier, sont cons- titués par une tige aimantée. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux du procédé conforme à l'invention, l'agent de lyse des germes en culture sur les billes incrustées dans la gélose est un agent de lyse chimique tel que le toluène, un 'Tween"-ou pro- duit de condensation d'un détergent "span"' formé d'esters d'acides gras et de sorbitol avec l'oxyde d'éthylène -ou le glucose à forte concentration, notamrent, ou un agent de lyse enzymatique tel que du Complément par _exemple. Selon un mode de réalisation avantageux du procédé conforme à l'invention, les billes ou analogues de gel magnétique fixées sur les moyens magnétiques sont soumises, avant d'être ensemen- sées sue la gélose, à plusieurs layages. Selon un autre a ode de réalisation ava n tageux du pro- cédé conforme à l'invention, les billes ou analogues de gel magnétique fixées sur les moyens magnétiques,sont détachées de ces derniers pour être ensemencées sur la gélose, par action d'un champ magnétique,. Conformément à l'invention,la durée du contact entre les billes de gel magnétique sur lequel sont couplés des anti- corps anti-déterminants spécifiques est d'environ 2 heures,à la température ambiante; la durée de la culture sur gélose des germes fixés sur les billes de gel magnétique est de l'ordre de 14 à 18 heures,à 37 C 1 C et la durée de la réac- tion entre les anticorps anti-fraction 1 + 2 et les antigènes de sérum contenu dans les puits, par immunodiffusion, est de l'ordre de 14 à 18 heures à la température ambiante. La présente invention a également pour objet un coffret ou "kit" prêt à l'emploi pour la mise en oeuvre du procédé de détection immunobactériologique de germes pathogènes possé- dant des déterminants antigéniques tels que la fraction 1 + 2, dans des milieux biologiques contaminés, défini dans ce qui précède, lequel coffret est caractérisé en ce qu'il comprend (dans le cas notamment de la fraction 1 + 2): un réceptacle contenant une quantité appropriée de billes de gel magnétique couplé avec un anticorps anti-fraction , 1 + 2, une tige ou analogue aimantée enrobée de "Téflon" ou d'un autre matériau isolant analogue, une boite de culture,telle qu'une boîte de Pétri, notamment, dont la face extérieure du fond est pourvue en son centre 3 C d'un aimant de forte puissance, un réceptacle contenant une quantité appropriée de milieu gélosé pour la culture de germes pathogènes possédant une fraction 1 + 2, un réceptacle contenant une quantité appropriée de sérum anti-germe pathogène à détecter, un réceptacle contenant une quantité appropriée d'agents de lyse des cultures de germes pathogènes sur gélose, un réceptacle contenant une quantité appropriée d'eau de lavage physiologique tamponnée. Selon un mode de réalisation avantageux du coffret ou kit prêt à l'emploi, utilisable pour la détection simultanée de plusieurs germes pathogènes dans un milieu biologique, celui-ci comprend plusieurs réceptacles contenant chacun une quantité appropriée de billes de gel magnétique couplé à des anticorps anti-fraction 1 + 2 différents et plusieurs récep- tacles contenant chacun un sérum anti-germe pathogène à détec- ter correspondant à chacun des anticorps, différents. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, la détection immunobactériologique de germes pathogènes possé- dant une fraction 1 + 2, dans un milieu biologique contaminé, est réalisée de la façon suivante: 1) On utilise des billes de gel magnétique "Act Magnogel Ac A 44 " produits par IBF, comprenant 4 % de polyacrylamide, 4 % d'agarose, 7 % de Fe 3 SO', de 60 à 140 lam de diamètre et présentant une capacité de couplage pour les Ig G de 2 à 4 mg/ml. On couple sur ces billes, à l'aide de glutaraldéhyde, con- formément au Brevet français INSTITUT PASTEUR N O 75 36889, des Ig G extraites d'un sérum hyperimmun anti-fraction 1 + 2, obtenu par la technique d' imunisation d 'OIUDIN, en injectant à un ianin une fraction antigénique 1 + 2 obtenue conformément aux dispositions du Brevet français ANVAR N O 73 03734 ou de l'un de ses Certificats d'Addition N O 74 06983 ou 77 12152, c'est-à-dire soit par séparation de germes gram- négatifs mis en culture dans des milieux de culture appro- priés, par centrifugation, extraction des fractions endo- géniques endocellulaires par lyse des germes dans des conditions stériles (soit par congélation-décongélation, soit par ultra-sons), puis séparation de la fraction anti- génique 1 + 2 par chromatographie sur gel; soit par lyse des germes par la méthode de Gallut, et purification de la fraction antigénique 1 + 2 par l'acide chloracétique, soit par autoclavage du bouillon de culture, suivi d'une centrifugation et d'une dialyse du surnageant contre de l'eau distillée. Les Ig G fixées sur les billes-de gel magnétique sont -soit identiques sur toutes lés billes si on vise à détecter la présence d'un germe pathogène, soit différentes si on vise à détecter plusieurs germes pathogènes dans un même milieu biologique. 2) Les billes de gel magnétiques sur lesquelles sont fixés 2 à 4 % d'anticorps anti-fraction 1 + 2, sont mises en contact pendant environ 2 heures à la température du labo- ratoire, avec un milieu biologique contaminé en solution tel que de l'eau, des selles, du sang, de l'urine ou d'au- tres excrétions. 3) On plonge une tige aimantée enrobée-de "Téflon", d'environ 12 mm de diamètre,dans la solution, avec agitation manuelle lente; les billes magnétiques viennent se fixer sur la tige. On lave 3 fois dans 250 ml d'eau physiologique tamponnée à p H 7,4. 4) Après le troisième lavage, les billes magnétiques concen- trées à la face-inférieure de la tige sont ensemencées sur un milieu gélosé du commerce, par exemple un milieu gélosé PASTEUR à 1,5 % ("Agar Noble" Difco) ou un milieu -MULLER-HINTON, contenu dans un boite de Pétri sous laquelle est placé un aimant de forte puissance disposé sensible- ment dans l'axe de la boite; la tige aimantée chargée de billes est placée au centre de la boîte de Pétri, au contact de la gélose; sous l'action du champ magnétique émis par l'aimant placé sous la boîte, les billes se détachent de la tige et s'incrustent dans la gélose sur laquelle elles forment une tache de 1 cm de diamètre environ La boite de Pétri est incubée pendant 14 à 18 heures environ à 370 C + 1 C. Il est également possible avec une anse de prélever, si on le désire, des germes de ces colonies en vue d'une bacté- riologie classique. ) A la fin de la période d'incubation, on creuse à environ 1 cm de la tache de billes magnétiques recouvertes de colonies, 3 ou 4 trous à l'aide d'un emporte-pièce sté- rile On coule une microgoutte de gélose au fond 'de cha- cun des puits pour en colmater le fond, puis on remplit les puits de sérum spécifique du germe pathogène anti- fraction 1 + 2, ou de sérum polyvalent anti-germe patho- gène à détecter, ou de sérum anti-toxine compléte du germe pathogène à détecter ou de sérum anti-sous-unité A ou B de la toxine du germe pathogène à détecter. En variante, on remplit chacun des puits de sérums corres- pondants à des germes pathogènes différents si les billes magnétiques portent elles-mêmes des anticorps anti-frac- tion I + 2 différents, pour permettre la détection de plu- sieurs germes pathogènes dans un même milieu biologiqueo Les sérums mis en oeuvre sont obtenus par la méthode de OUDIN, à partir de cultures de germes pathogènes gram- négatifs possédant une fraction antigénique 1 + 2, tels que Vibrio cholerae, Salmonella typhimurium, Malleomyces mallei, Pseudomonaspeeudmoallei, notamment, de même que les Ig G couplées sur les billes de gel magnétique sont extrai- tes de sérums des germes pathogènes précités. 6) On dépose sur les billes magnétiques recouvertes de colo- nies, une goutte d'un agent de lyse chimique tel que du toluène ou un "Tween" -ou du glucose si les Ig G fixées sont des Ig G anti-fraction 1 + 2 de Vibrio cholerae-, ou d'un agent de lyse enzymatique tel que du Complément. 7) La boite de PETRI est fermée pour évitertoute évaporation de son contenu et maintenue pendant 14 à 18 heures à la tempéra- ture ambiante, pour permettre à la réaction sérologique antigènesanticorps de se produire par immunodiffusion dans la gélose. A l'issue de cette période d'incubation, les antigènes du Z 2537725 germe pathogène se révèlent sur la gélose par une ou plu- sieurs bandes de précipitation contre le sérum correspon- dant: c'est ainsi que les antigènes de Vibrio cholerae se révèlent par une bande unique de précipitation contre le sérum anti-fraction Ch 1 + 2 spécifique, par 4 ou 5 bandes contre le sérum p Dlyvalent anticholérique Les sou- ches non-toxinogènes ne présentent pas de bandes anti- toxine ou anti sous-unité toxique Les souches toxino- gènes se révèlent par unebande de précipitation contre le sérum antitoxine ou les sérums anti-sous-unités A et B de la toxine. Le procédé de détection de germes pathogènes conforme à l'invention présente le très grand avantage, par rapport à la méthode préconisée par l'Organisation Mondiale de la Santé qui ne permet que d'identifier le germe pathogène sans permettre de reconnaître son caractère toxinogène, de permettre de détecter un germe toxinogène. Dans le cas de Vibrio cholerae par exemple, le procédé conforme à l'invention permet de dénombrer des quantités de vibrions allant de 102/100 ml (cas des porteurs deger- mes)à 106/ml (cas des malades). Outre les dispositions qui précèdent, l'invention com- prend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exem- ples de mise en oeuvre, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne cons- tituent en aucune manièke une limitation. EXEMPLE 1 Détection de germes de Vibrio cholerae chez un porteur de germe 1) On part de selles supposées contaminées par Vibrio cho- lerae El Tor sérotype Ogawa; on réalise une suspension de selles à 10 % sur agitateur: 10 g de selles pour millilitres d'eau On ajoute à cette suspension 1 ml de billes "Magnogel" contenant 2 mg par ml d'anticorps anti-fraction Ch 1 + 2 - On laisse en contact pendant 2 heures à la température ambiante. 2) On plonge une tige aimantée enrobée de "Téflon", de 12 mm de diamètre dans la suspension avec agitation manuelle lente; les billes se fixent sur la tige; on lave 3 fois dans 250 ml d'eau physiologique tamponnée à p H 7,5. 3) On place la tige à la face inférieure de laquelle sont concentrées les billes, au contact d'un milieu gélosé PASTEUR à 1,5 % ("Agar Noble" Difco) contenu dans une boite de Pétri sous laquelle est placé un aimant de forte puissance; la tige est placée au centre de la boite, dans le même axe que l'aimant Les billes se détachent et s'in- crustent dans la gélose pour former une tache de 1 cm de diamètre. La boite de Pétri est incubée pendant 18 heures à 370 C. 4) A la fin de cette période d'incubation, on creuse dans la gélose 4 trous en croix à l'aide d'un emporte-pièce stérile, à environ 1 cm de la tache de billes magnétiques recouver- tes de colonies On coule une microgoutte de gélose au fond des puits pour les colmater et on remplit ceux-ci avec du sérum anti-toxine cholérique complète. ) On dépose sur les billes magnétiques recouvertes de colo- nies, une goutte de toluène qui lyse immédiatement les germes. 6) On ferme la boite de Pétri, et on l'incube pendant 18 heures à la température ambiante. Au bout de ce temps les antigènes de la souche toxinogène de Vibrio cholerae se révèlent par une bande de précipita- tion contre le sérum anti-toxine. EXEMPLE 2 Détection de germes de Vibrio cholerae chez un malade En procédant comme décrit à l'exemple 1 ci-dessus et en plaçant dans deux puits du sérum anti-fraction Ch 1 + 2 et dans les deux autres puits du sérum anti-toxine cholérique complète, on a dénombré 106 vibrions/ml de solution de selles et déterminé qu'il s'agit d'une souche toxinogène, alors qu'en soumettant un échantillon des mêmes selles à la méthode O.M S on a pu identifier le germe, mais non son caractère toxinogène. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, le procédé de détection conforme à l'invention permet de diagnostiquer la présence de germes pathogènes en moins de 48 heures, alors qu'il faut 4 jours au minimum pour réaliser la-même détection par voie bactériologique En outre, le procédé de détection nécessite un matériel très réduit et son prix de revient est faible 'Les quantités de milieu biologique qu'il requiert sont petites, de même que les quantités de réactifs mises en oeuvre De plus, à partir d'un seul échantillon de milieu biologique, il permet d'identifier plusieurs germes pathogènes éventuellement présents dans celui-ci, en utilisant des billes magnétiques sur lesquelles sont couplés des anticorps diffé- rents selon le germe à détecter et des sérums différents cor- respondants placés dans les puits creusés dans la gélose. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1) Procédé de détection emmunobactériologique de ger- mes pathogènes possédant des eéterminants antigéniques spéci- fiques, dans des milieux biologiques contaminés, à l'aide d'un gel magnétique sur lequel sont couplés des anticorps anti-déterminants antigéniques spécifiques, lequel procédé est caractèrisé en ce qu'on met en contact un milieu biolo- gique supposé contaminé par un germe pathogène possédant un déterminant antigénique sp cifique, avec des billes ou ana- logues dudit gel magnétique, pendant un temps suffisant pour permettre la fixation sur le gel, des germes contenus dans le milieu biologique, en ce qu'on retire les billes ou analogues de gel magnétique du mélange, par des moyens magnétiques, et en ce qu'on les ensemence sur un milieu gélosé approprié sur lequel elles sont incubées pendant une durée et à une tempé- rature appropriées, après quoi on creuse dans la gélose, à proximité des billes magnétiques recouvertes de colonies de culture, incrustées dans la gélose, des puits que l'on rem- plit de sérum anti-germe pathogène à détecter, approprié, en ce qu'on lyse les germes au moyen d'agents de lyse appropriés, en ce qu'on incube le lvsat avec le sérum, pendant un temps approprié pour permettre à la réaction sérologique anticorps- antigènes de se produire par immunod-ffusion sur la gélose et en ce qu'on dénombre par lecture directe, grâce à la réac- tion antigènes-anticorps sur la gêlose, la qualité de germes contenus dans le milieu biologique. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le déterminant antigénique spécifique est constitué par la fraction antigénique 1 + 2. 3) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, appliqué à la détection simultanée de plusieurs ger- mes pathogènes, caractérisé en ce que les puits creusés dans la gélose sont remplis de sérums anti-germe pathogène diffé- rents. 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les billes ou analogues de gel magnétique sont couplées avec des anticorps anti-déterminants antigéniques spécifiques provenant d'un sérum hyperimmun anti- déterminant antigénique spécifique; par extraction des Ig G -dudit sérum hyperimmun. 5) Procédé selon la revendication 4, pour l'application à la détection simultanée dé plusieurs germes pathogènes dans un milieu biologique, caractérisé en ce que des séries de billes ou analogues de gel magnétique dont chacune est cou- plée avec des anticorps anti-déoerminants spécifiques provenant de culturesde chacun des germes pathogènes à détecter, sont mises en contact avec le milieu biologique. 6) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le sérum antigerme pathogène introduit dans les puits creusés dans la gélose est choisi dans le groupe qui comprend les sérums spécifiques de germes anti-déterminants antigéni- ques spécifiques, les sérums polyvalents anti-germes patho- gènes possédant un déterminant antigénique spécifique, les- sérums antitoxine du germe pathogène, les sérums anti-sous- unité A ou B des toxines desdits germes pathogènes. 7) Procédé selon l'une-quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le milieu biologique auquel le procédé est appliqué, est choisi dans le groupe qui comprend les selles, le sang, l'urine, les excrétions de toutes sortes, l'eau. 8) Procédé selon la revendication 1,-caractérisé en ce que les moyens magnétiques utilisés pour retirer les billes ou analogues de gel magnétique au milieu biologique après incu- bation avec ce dernier, sont constitués par une tige aimantée. 9) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent de lyse des germes en culture sur les billes incrustées dans la gélose est un agent-de lyse chimique tel que le-toluène, un produit de condensation d'un détergent "span" formé d'esters d'acides gras et de sorbitol avec l'oxyde d'éthylène, ou le glucose, notamment. 10) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent de lyse des germes en culture sur les billes incrustées dans la gélose, est un agent de lyse enzymatique tel que le Complément, notamment. 11) Procédé selon l'un quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les billes ou analogues de gel magnétique fixées sur les moyens magnétiques sont soumises, avant d'être ensemencées sur la gélose, à plusieurs lavages 12) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les billes ou analogues de gel magnétique fixées sur les moyens magnétiques, sont détachée de ces derniers pour être ensemencées sur la gélose, par action d'un champ magnétique. 13) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la durée du contact entre-les billes de gel magnétique sur lequel sont couplés des anti- corps anti-déterminants antigéniques spécifiques, est d'en- viron 2 heures, à la température ambiante. 14) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la durée de la culture sur gélose des germes fixés sur les billes de gel magnétique, e de l'ordre de 14 à 18 heures, à 370 C + 10 C. ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que la durée de la réaction entre les anticorps anti-déterminants antigéniques spécifiques et les antigènes du sérum contenu dans les puits, par immunodi fusion, est de l'ordre de 14 à 18 heures à la température ambiante. 16) Coffret ou "kit" prêt à l'emploi pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce qu'il comprend un réceptacle contenant une quantité appropriée de billes de gel magnétique couplé avec un anticorps anti-détermin E antigénique spécifique, unetige ou analogue aimantée enrobée de "Téflon" ou d'un autre matériau isolant analogue, une boîte de culture, telle qu'une boîte de Pétri, notam- ment, dont la face extérieure du fond est pourvue en son centre d'un aimant de forte puissance, un réceptacle contenant une quantité appropriée de milieu gélosé pour la culture de germes pathogènes possédant un déterminant antigénique spécifique, un réceptacle contenant une quantité appropriée de sérum anti-germe pathogène à détecter, un réceptacle contenant une quantité appropriéed'agents de lyse des cultures de germes pathogènes sur gélose, un réceptacle contenant une quantité appropriée d'eau de lavage physiologique tamponnée. 17) Coffret selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend comme anticorps anti-déterminants antigé- niques spécifiques, un anticorps anti-fraction 1 + 2, et con déterminant antigénique spécifique, la fraction 1 + 2. 18) Coffret ou kit prêt à l'emploi selon les revendica tions 16 et 17, utilisable pour la détection simultanée de plusieurs germes pathogènes dans un milieu biologique, carac térisé en ce qu'il ccmprend plusieurs réceptacles contenant chacun une quantité appropriée de billes de gel magnétique couplé à des anticorps anti-déterminants anti-géniques spéci- fiques différents et plusieurs réceptacles contenant chacun un sérum antigerme pathogène à détecter correspondant à chacun des anticorps, différents.