FR 2546905 A1 19841207 FR 8309215 A 19830601 PROCÉDÉ DE PRÉVENTION ET TRAITEMENT DES ARR TS DE FERMENTATION EN VINIFICATION La présente invention concerne la prévention et le traitement des arrêts de fermentation en vinification. En vinification traditionnelle, on observe assez souvent des arrêts spontanés de la fermentation avant la trans- formation totale du sucre, ce qui peut entraîner parfois la perte de la récolte. De même, en vinification suivant la méthode champe- noise on observe quelquefois des difficultés pour induire la deuxième fermentation (prise de mousse). Le but de l'invention est d'éviter ces difficultés en proposant un moyen capable non seulement d'éviter l'arrêt de fermentation mais encore, en cas d'arrêt spontané, de fa- ciliter le départ de la deuxième fermentation. A cet effet, l'invention a pour objet un procédé de prévention et de traitement des arrêts de fermentation en vinification, caractérisé en ce qu'il consiste à faire adsor- ber une partie au moins des acides gras et de leurs esters par des écorces de levures mortes, lavées à l'eau et ajoutées au moût de raisin. D'une manière générale, l'adsorption desdits acides, en particulier des acides octanoique et décanoique, et de leurs esters permet d'augmenter la résistance de la levure aux milieux alcoolisés, en conséquence d'éviter l'arrêt de fermentation, et, en cas d'arrêt spontané de la fermentation, de lever en grande partie l'inhibition des levures et de fa- ciliter, par là, le départ de la deuxième fermentation. Les modalités de mise en oeuvre de ces écorces de -2- levure varient bien entendu selon les applications et les types de moûts à traiter comme on le verra dans la descrip- tion détaillée qui va suivre du procédé de l'invention et de divers essais réalisés à l'occasion de sa mise au point, description donnée à titre d'exemple uniquement et en regard des dessins annexés sur lesquels les Figures 1 à 3 illustrent des résultats d'étu- des d'évolution des populations de levures Sac- charomyces cerevisiae, inoculées en phase de pro- lifération dans différents milieux. Le tableau II illustre l'adsorption par des écor- ces de levure des acides octanolque et décanolque et de leurs esters correspondants, Le Tableau III illustre la stimulation de la fer- mentation alcoolique par addition au moût d'écor- ces de levures, Le Tableau IV illustrela stimulation de la f ermen- tation alcoolique par addition au moût d'écorces de levures à la température de 200 C, Le Tableau V illustre l'incidence de l'addition au moût d'écorces de levures sur la composition du vin en esters 'et acides gras, Le Tableau VI illustre la prévention des arrêts de fermentation par chauffage, Le Tableau VII illustre la stimulation de la fer- mentation alcoolique par addition au moût d'é- corces de levures humides, et Le Tableau VIII illustre la stimulation de la deuxième fermentation après arrêt spontané de la fermentation alcoolique par addition au milieu d'écorces sèches de levures. On va tout d'abord en se référant aux Figures 1 à 3, rappeler les fondements scientifiques ayant conduit à la mise au point dudit procédé. Au cours de la fermentation alcoolique de moûts de raisins les levures sont progressivenent inhibées dans leur croissance et leur métabolisme Ceci se traduit par l'arrêt spontané de la fermentation avant l'épuisement du milieu en sucre. Des expérimentations ont montré que cet arrêt n'est pas dû à des carences nutritionnelles (or les seuls traite- ments-préconisés jusqu'ici tendaient à enrichir le milieu nutri- tionnellement) mais à des substances toxiques libérées par la levure elle-même. Sur les figures 1 à 3 des dessins annexés, on a repor- té les résultats d'étude d'évolution des populations de leyures Saccharomyces cerevisiae inoculées en phase de prolifération dans différents milieux. La levure expéri Lnentée est une souche de saccharomyces cerevisiae, levure sèche active. On est parti d'un milieu de base, de p H égal à 3,5 et contenant par litre: saccharose: 200 g; acide D-L malique 6 g; acide tartrique: 3 g; asparagine 2 g; sulfate d'am- monium: 2 g; sulfate de potassium: 2 g v acide citrique:0,3 g; sulfate de magnésium: 0,2 g; sulfate de manganèse 0,01 g; solution de vitamines: 10 ml. A partir de cette base, on a réalisé différents mi- lieux par adjonction aux milieux témoins IIIIII (voir plus loin) d'un mélange d'alcools supérieurs (par litre t propanol-l: 30 mg méthanol: 100 mg; méthyl-2 propanol-1 ': 60 mg; phényl-2 éthanol: 100 mg; méthyl-3 butanol-1: 100 mg); d'acides gras (par litre: acide hexanoîque: 3 mg; acide octanoique: 3 mg; acide décanot- que: 3 mg) et des esters d'éthanol correspondants (par litre: mg) à partir de solutionsmèreshydroalcooliques On a appliqué aux milieux divers traitements: a) traitement à la bentonite: 700 mg de bentonite sont injec- tés dans les milieux; après lh de contact, l'abondant flo- culat formé est éliminé par centrifugation ( 10 o 000 tours/ mn pendant 5 mn) b) traitement au charbon * 2 g de charbon sont mis en suspen- - sion dans les milieux après lh de contact on centrifuge ( 10 000 tours/mn pendant 5 mn); on recueille le surnageant; c) chauffage: des erlens de 250 ml remplis de milieux et bouchés hermétiquement sont chauffés au bain-marie pen- dant des durées déterminées Apres refroidissement, on a vérifié par dosage le titre alcoométrique des milieux. Les milieux ont été stérilisés par filtration sur mem- brane de 0,45 m répartis en flacons stériles, bouchés d'un dis- positif qui assure une semi-aérobiose. Les milieux préfermentés IDII et III (Figure 1) sont obtenus en interrompant la fermentation du milieu de base par élimination des levures au moyen d'une double cen- trifugationaux phases de prolifération stationnaire et de déclin du cycle de croissance de la population de Sacch cere- visiae. Les milieux témoins correspondants (o, A,f) sont composés du milieu de base, ajusté aux teneurs en sucre et en éthanol des milieux préfermentés (I,11, III). Sur la Figure 1, la courbe o est relative à un mi- lieu témoin non fermenté I comprenant, entre autres E,1 t 7 % en volume d'éthanol et 160 g/l de saccharose. la courbe e est relative à un milieu préfermenté I comprenant, entre autres, 1,7 % en volume d'éthanol et 160 g/1 d' hexoses. La courbe A est relative à un milieu témoin non fermenté II comprenant, entre autres, 7 % en volume d'éthanol et 65 g/l d:'hexoses. La courbe A est relative à un milieu préfermenté Il comprenant, entre autres, 7 % en volume d'6thanol et 65 g/l d 'hexoses. La courbe P est relative à un milieu témoin non fermenté III comprenant, entre autres,9,5 % en volume d'étha- nol et 23 g/l de saccharose. La courbe I est relative à un milieu préfermenté III comprenant, entre autres, 9,5 % en volume d'éthanol et 23 g/l d 'hexoses. En ordonnée est porté le rapport entre le nombre Nt de cellules par ml à l'instant t et le nombre No de cellu- les par ml à l'origine, soit environ 107 en l'occurrence. Les populations servant à l'inoculation ont été précultivées dans le milieu de base pendant 24 h à 250 C et recueillies par centrifugation. Les populations viables sont dénombrées' par les co- lonies formées en milieu nutritif solide constitué d'une so- lution gélosée à 20 g/l et de moût de raisin ( 170 g/l de sucre,p H 3,2), dilué au demi Le sucre est dosé par méthode enzymatique. Dans chacun des milieux témoins jo,A, O) on observe -= 5- une augmentation des populations viables, plus ou moins impor- tante selon la teneur en éthanol Dans les milieux préfermen- tés I et Il également, on note le même phénomène mais les croissances totales sont respectivement deux fois et vingt cinq fois moins fortes que dans leurs témoins respectifs Par contre, dans le milieu préfermenté III, toute multiplication est interdite; la population régresse de 107 à 105 cellules par ml en 7 jours. Dans les trois milieux témoins la totalité du sucre est dégradée au 7 e jour; il reste 7 à 10 g/l de sucre dans les milieux préfermentés Ces résultats montrent clairement que, parmi les produits formés par les levures, l'éthanol n'est pas le seul facteur inhibiteur. Dans les conditions de l'expérimentation, les caren- ces nutritionnelles ne sont pas responsables des phénomènes d'inhibition. En effet, si Ion ajoute aux milieux préfermentés Il et III 10 ml d'une solution de vitamines B comprenant par litre: 4 gg de biotine; 500 mg de mesoinositol; 100 mg de thiamine, pyridoxine, acide nicotinique, acide pantothé- nique,acide paraaminobenzoique, il ne se produit aucun effet. De même, l'adjonction auxdits milieux d'un mélange d'activateurs(par litre: lg de sulfate d Eâzmonium; 0,1 g de sulfate de magnésium; 0,01 g de sulfate de manganèse) est sans effet. En conséquence, on peut penser que les phénomènes d'inhibition sont induits par la formation, au cours de la fermentation, de substances toxiques pour la levure. Dans une autre série d'essais, on a tenté de détrui- re ces substances par chauffage à 650 C pendant 15 minutes; ce traitement demeure sans effet Il ne s'agit donc pas de susbtance de nature protéique On a essayé également la fi- xation sur bentonite ou sur charbon Le premier traitement est inefficace Par contre, le second appliqué au milieu pré- fermenté III (Figure 2) autorise une croissance totale de 6,7 x 106 cellules par ml; 25 g de sucre sont fermentés res- pectivement en 6 et 8 jours dans le milieu témoin III et le milieu préfermenté III traité au charbon; il faut 20 jours pour obtenir ce même résultat dans le milieu préfermenté III non traité. -6- Sur la Figure 2 on a représenté en a la courbe d'évolution pour un milieu préfermenté III (avec 10,5 % en volume d'éthanol et 25 g/l d'hexo- ses) en o la courbe d'évolution pour un milieu préfermentéIII traité au charbon à 2 g/l; en A la courbe d'évolution pour un milieu témoin non fermenté III (avec 10,5 % en volume d'éthanol et 25 g/l de saccharose; en à la courbe d'évolution pour un milieu témoin non fermenté III traité au charbon. Les substances inhibitrices doivent donc être pour l'essentiel de poids moléculaire relativement faible puisque non adsorbées par la bentonite, mais en partie éli- minées par le charbon. On a essayé d'identifier ces substances parmi les produits secondaires du métabolisme levurien; albools supé- rieurs, esters, acides gras. La croissance totale est peu modifiée par l'addi- tion d'alcools supérieurs; elle est sensiblement diminuée par celle des esters et du mélange esters/alcools supérieurs. Après 7 jours d'incubation, la fermentation alcoolique est complète dans les milieux témoins et additionnés des alcools supérieurs; on dose respectivement 8 et 12,5 g/l de sucre résiduel dans les milieux témoins additionnés d'esters et du mélange alcools supérieurs et esters. Mais surtout, l'action des trois acides gras (aci- des hexanoique, octanoique et décanoique) aux doses existant dans les vins ( 3 mg/l) est particulièrement significative. Ces acides entraînent une mortalité rapide et considérable des populations de Sacch cerevisiae comme illustré par la figure 3. Sur cette Figure 3, la courbe o est relative à un milieu témoin non fermenté III ( 9,25 % en volume d'éthanol et 26,5 g/l de saccharose). La courbe A est relative à un milieu témoin III additionné d'alcools supérieurs. La courbe I est relative à un témoin II Iaddition- né d'esters. 7 - La courbe x est relative à un témoin d'esters et d'alcools supérieurs. La courbe * est relative à un témoin d'aóides gras et la courbe o est relative à un menté III à 9,25 % en volume d'éthanol et 26,5 ses. III additionné III additionné milieu préfer- g/l d'hexo- Comme on peut le constater sur la figure 3, les po- pulations de Sacch cerevisiae dans le milieu additiopné d O acides gras (courbe *) régressent en 4 jours de 8 x 106 'à 4 x 104 cel- lules par ml La courbe de régression est trèé comparable à celles des populations dans le milieu préfermenté correspon- dant (courbe ) On n'observe aucune croissance pendant une dizaine de jours La dégradatiôn du sucre est quasi totelement inhibée. L'action inhibitrice des acides gras (en C 6, C 8 et C 10) varie selon le titre alcoométrique du milieu et l'état physio- 1 ogique des populations A titre d'exemple le tableau I ci'. dessous illustre l'inhibition de la seconde fermentation par la présence d'acides gras dans les milieux alcoolisés selon l'état physiologique des levures d'inoculum llevures g Sacchocerevisiae; inoculum: 106 cells/ml) o TABLEAU I APRES 15 JOURS D"INCUBATION A 25 C :: levures levures: levures: : * = sèches prolifé station: :: actives rantes naires : A: e e :A : étb 3 anol 11 %:cells/ml * 3 x 106 3,4 101 X 107 : sucre rési: :saccharose 20 g/ duel (g/l) 0,4 19,3 À 1,4 :A' mêe milieu que: : A+ acides gras:cells/ml I 3 x 106 O O 3,6 x 106: :'C 6: 7 mg/l 1 m/l * 3 suc re si O 4 19,6 2,8 s duel (g/l): 04 C 10 3 mg/ (/) :: : O: :ethano 1 l 13 %) cells/Ml: 8,2 x 105 O 3,1 x 102 chaose10 g/ sucre, {-: 0,6 9,6 O 9,2 :B' mne milieu que : B + acides gras cells/ml: 1,3 x 105 O 102 :lC 6: 7 mg/l :JC 8: 10 mg/1: sucre rési-: 9,5: 9,6 9,6: C 10:3 g/ duel 1: _ 8 ' Les observations ci-dessus conduisent à penser que l'adsorption des acides gras en C 62 C 8 et C 10 doit suffire pour faciliter la croissance et la fermentation des levures en présence d'éthanol (figure 2, tableau 1). En effet, on a vérifié que le traitement au char- bon du milieu témoin III additionné de 7, 10 et 3 mg/1 des acideshexanoique, octanoique et décanoique élimine respecti- vement 61,4 %, 97,2 % et 97 % de ces acides Par contre, la bentonite (autorisée) se révèle inefficace. On a trouvé conformément à la présente invention, qu'il était particulièrement intéressant d'opérer une telle adsorption à l'aide d'écorces de levure préparées par simple ébullition dans l'eau de levures sèches, ou apres autolyse et lavage à l'eau, par exemple Sacch cerevisiae. -Ces écorces, en effet, fixent une partie importante des esters éthyliques et des acides grast de manière variable selon la qualité ajoutée et te temps de contacto Le tableau II annexé illustre l'adsorption par les écorces de levures des acides octanoique et décanoique et des esters correspondant après trois jours de contact dans un mi- lieu à 11 i % en volume d'éthanol et en teneurs initiales sui- vantes: acide octanolque: 10 mg/1 acide décanoique: 4 mg/1 esters d'acide octanoique: 1,5 mg/l esters d'acide décanoique: 0,8 mg/l La levure utilisée est Sacch cerevisiae. L'adsorption est très importante pour les esters d'a- cide décanoique, un peu moins importante pour les esters d'aci- de octanoique et pour l'acide décanoique et faible pour l'acide octanoique. Il est à noter que-le broyage des écorces de levure ou leur atomisation après autolyse augmente la surface d'ad- sorption et l'efficacité. Les écorces de levure permettent la fermentation d'une plus grande quantité de sucre lorsqu'on les ajoute en début de fermentation ou pendant la phase stationnaire, au 5 ème jour, com- me illustré par les tableaux III et IV. Le tableau III montre la stimulation de la-fermenta tion par addition à un moût Listel ( 250 g/l de sucre; levure: Sacch cerevisiae;inoculum: 106 cells/mi; température 25 C) de i g/l d'écorces humides, d'une part, 24 h après le début de fermentation et, d'autre part, 5 jours après. On constate la très nette diminution du sucre rési- duel non fermenté au fil des jours suivant l'adjonction d'é- corces par rapport au témoin non traité. Le tableau IV illustre la stimulation de la fermen- tation par addition à un moût Listel (sucre: 200 g/l; levu- re: Sacch cerevisiae; inoculum: 106 cells/ml; température 20 C) d'écorces de levures à raison de 1 g/1 d'écorces humi- des ajoutées au moment de l'ensemencement (cas d'une vinifi- cation en blanc sec). La diminution du poids de sucre résiduel non fermen- té au cours des jours suivants est, par rapport au témoin, moins nette qu'à 25 C (tableau III) mais néanmoins encore sensible. A 30 C (tableau VI) la diminution du poids de sucre résiduel non fermenté est, par contre, plus accentuée et net- tement plus accusée pour une addition de 5 g/l d'écorces hu- mides que pour 1 g/l. Une température de fermentation trop élevée (> 30 C) est souvent la cause de l'arrêt de la fermentation; dans ce - cas l'addition d'écorces est particulièrement efficace. L'adjonction d'écorces de levure n'a pas d'effet sur les qualités organoleptiques des vins. Le tableau V illustre cette particuliarité en mon- trant l'incidence de l'addition à un moût de raisin (sucre: 250 g/l; levure: Sacch cerevisiae; inoculum: 106 cells/ml; température z> 25 C) d'écorces de levure sur la composition du vin en esters et acides gras. Les différences de teneurs pour les acides en C 6, C 87 et C 10 et leurs esters correspondants, entre un témoin et deux milieux auxquelson a ajouté 1 g/1 d'écorces humides respective- ment après 24 h et après 5 jours du départde la fermentation, ne sont pas significatives et n'ont pas de retentissement au plan organoleptique. Il a également été observé que l'adjondtion d'écor- ces de levure avait un effet de stimulation de la fermentation alcoolique en vinification en liquoreux dans le cas de moûts parasités par la moisissure Botrytis cinerea. Le tableau VII illustre une telle stimulation par addition d'écorces de levures humides dans un moût de raisin parasité par Botrytis cinerea; (sucre initial 330 g/l: levu- re: Sacch cerevisiae; inoculum: 106 cells/ml; température 22 C). Les nombres indiqués dans ce tableau expriment le poids (g/l) de sucre résiduel non fermenté. Enfin, l'adjonction d'écorces de levures facilite la deuxième fermentation lors d'un arrêt spontané de la fer- mentation alcoolique par excès de sucre et par excès de tem- pérature. A cet effet, dès la constatation de 11 arrêt de la fermentation on traite le vin aux écorces de levure, conformé- ment à l'invention, puis, un à deux jours après ce traitementon inocule en Sacch cerevisiae à 106 cells/ml de vin environ pour faire repartir la fermentation. Le tableau VIII illustre à ce propos la stimula- tion de la deuxième fermentation après un arrêt spontané de la fermentation alcoolique par addition d'écorces sèches dans un moût Listel (levure: Sacch cerevisiae;inoculum 1 06 cells/ml). Ce moût fermenté est traité avec 500 mg d'écorces séchées; 24 heures après on ensemence avec 106 cells/ml. Dans le tableau VIII les nombres indiqués expri- ment le poids (g/l) de sucre résiduel non fermenté La réduc- tion de la teneur en sucre résiduel est manifeste pour les mi- lieux traités par rapport aux témoins, quelles que soient les caractéristiques de la première fermentation. * D'une manière générale dans le cas de la prévention des arrêts de fermentation on ajoute les écorces de levure de préférence au départ de la fermentation dans le moût clarifié dans la vinification en blanc et dans le moût sans clarifica- tion dans le vinification en rouge Dans le cas du traitement (stimulation de la seconde fermentation), dans la vinification en rouge et en blanc, on écoule puis on ajoute au jus les é- corces Après 24 h ou 48 h on réensemence. Bien entendu l'invention n'est pas limitée aux exemples mentionnés ci-dessus mais couvre toutes les applica- tions de telles écorces de levures (sèches ou humides) quels que soientleur dosage et leur fabrication. Préférentiellement on utilise la levure Sacch cere- visiae car c'est la levure majoritaire dans les moûts de raisin et qui là - a une action déterminante dans l'élaboration du vin Mais on pourrait utiliser éventuellement d'autres levures. On peut utiliser par ailleurs des levures mortes ou des écorces de levures lavées provenant du sous=-produit de la fabrication de 11 autolysat de levures. o O on 12 - R E V E N D I C A T I O N S 1 Procédé de prévention et de traitement des arrêts de fermentation en vinification, caractérisé en ce qu'il con- siste à faire adsorber une partie au moins des acides gras et de leurs esters par des écorces de levures, de préférence Sacah cerevisiae, ajoutées au moût de raisin ou de vin. 2 Procédé suivant la revendication 1 caractérisé en ce que les écorces sont préparées par ébullition de levu- res vivantes ou après autolyse, pulvérisation ou atomisation. 3 Procédé suivant la revendication 1 ou 2 caractes risé en ce que la dose d'écorces de levures est en poids sec d'environ 100 mg à 500 mg par litre de moût de raisin ou de vin. 4 Procédé suivant la revendication 3 caractérisé en ce que l'addition des écorces est effectuée avant le départ de la fermentation. 5 Procédé suivant la revendication 3 -caractérisé en ce que l'addition des écorces est effectuée 24 heure après le départ de la fermentation. 6 Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que l'addition des écorces est effectuée cinq à dix jours environ après le départ de la fermentation. 7 Procédé suivant la revendication 1 ou 2 appliqué à la stimulation de la deuxième fermentation après un arrêt spontané de la fermentation alcoolique et à la prise de mousse dans l'élaboration des vins mousseuxcaractérisé en ce que dès l'arrêt de la fermentation on traite le vin aux écorces de le- vure puis, un à deux jours ap Eréès, on inocule de préférence en Sacch cerevisiae à raison de 106 cells/ml de vin environ. 8 Application du procédé suivant l'une des revendi- cations 1 à 3 à la stimulation de la fermentation alcoolique par addition des écorces de levures humides à des moûts de raisins parasitées par Botrytis cinerea, l'addition étant effec- tuée avant ou après le départ de la fermentation. 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