FR 2538249 A1 19840629 FR 8315121 A 19830922 Compositions prophylactiques s'opposant à la multiplication de cellules cancéreuses DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention a pour objet des substances et des composi- tions contenant des produits susceptibles d'être employés dans la pro- phylaxie des situations favorables au cancer. ARRIERE PLAN DU PROBLEME En 1980 Horrobin (La réversibilité du cancer: L'application de l'AMP cyclique, Calcium, Acides gras essentiels et Prostaglandines E en médecine Hypothèses 1980, Vol 6, pages 469 à 486) traitait abondamment des anomalies métaboliques communes à la plupart des cellules cancé- reuses, avec la possibilité de facteurs causaux en ce qui les concerne. Horrobin conclut qu'une anomalie métabolique dans la synthèse de la thromboxane A 2 des prostaglandines (TXA 2) et de la prostaglandine E 1 (PGE 1) est le facteur final qui permet à une cellule cancéreuse initiale d'exprimer sa nature anormale c'est-à-dire celle de se diviser indéfini- ment Horrobin suggérait ensuite (sur la base d'une constatation pré- sente dans la littérature générale) que le mal qui mène à l'anomalie dans la synthèse des TXA 2 et PGE 1 est une inhibition de l'enzyme delta-6désa- turase Cette enzyme transforme l'acide essentiel gras, l'acide linoléi- que (LA) en acide gamma-linolénique (GLA) dans toutes les cellules nor- males du corps Le GLA est ensuite métabolisé en acide dihomo-gamma-linolénique (DGLA) qui est converti à son tour en prosta- glandines de la série 1 qui inclut la prostaglandine PGE 1. Les PGE 1 et TXA 2 sont de puissants régulateurs intercellulaires de la biochimie de toutes les cellules normales La TXA 2 ne peut toutefois pas agir en l'absence de PGE 1 Horrobin conjecturait que la déficience de la PGE 1 et donc aussi de la TXA 2 amoindrie, devait entraîner un métabo- lisme anormal de la cellule, de puissance suffisante pour pouvoir déclencher une division incontr 8 ôlée de cellules cancéreuses poten- tielles. Horrobin proposait donc, qu'entre autres, un complément de GLA devait être administréeaux victimes du cancer recevant déjà un traite- ment conventionnel, afin de tester son hypothèse, à savoir qu'en contournant le bloquage métabolique provoqué par une inhibition de -3- SELON LE SCHEMA SUIVANT: Elongase Dé: C 18:3, W a C 20:3, - e -A Linolénique Dihomo-i- A Linolénique PGE 1 - PGF TXA 1 18:4, W 3 > Ostadéca- tétraënoique LTA 3 LTC 3 LTD 3 C 20:4, 3- Eicosa- tetraënoique 3 saturase t 5 -> C 20:4, W 6 Arachidonique PGE 2 PGE 3 PGF 2 PGF 3 PGD 2 PGD 3 Prostacycline à 17 prostacycline TXA 2 TXA 3 LTA 4 LTA LT 5 LTB 4 LTB 5 LTC 4 LTC 5 LTD 4 LTE 4 C 20:5, uj 3 Eicosa- pentaënoique Dans la forme proposée de l'invention, le précurseur est choisi à partir des GLA, AA et EPA, ou de sels ou de dérivés de ceux-ci, ou de produits analogues. Une telle administration n'implique aucun effet secondaire nocif (par exemple les compositions n'affeetent pas la croissance des cellules bénignes). La présente invention concerne seulement l'emploi prophylactique de substances pour le cancer et n'implique pas de traitement contre un cancer déjà manifestement pathologique. D'une façon générale, les traitements conventionnels contre le cancer, même si on les emploie à titre prophylactique (en petites doses) provoquent une grande gêne et une détresse, et pourraient même préci- piter d'autres conditions cancérigènes. -2 - l'activite de la désaturase-delta-6 (d-6-d), il devrait être possible de normaliser les cellules cancéreuses par une transformation inverse. Dans la demande de brevet d'invention européen 0 037 Horrobin revendique un mélange de GLA et de thioproline pour le traitement du cancer. BUT DE L'INVENTION L'objeetif de la présente invention est de fournir des composi- tions prophylactiques et des compléments diététiques en vue de la pré- vention du cancer en prenant en considération la production d'un ou de plusieurs mélanges normalisés d'eicosanoldes. L'INVENTION Une méthode prophylactique en vue de la prévention de la multipli- cation des cellules cancéreuses viables comporte l'administration, sur une base régulière, à l'être humain ou à l'animal, d'une quantité prophy- lactique d'un ou de plusieurs précurseurs pour la production "in vivo" d'un ou de plusieurs mélanges suivants d'eicosanoides, à savoir: b PGE 2 PGE 2 PGD 2 Prostacycline à 17 TXA 2 LTA 4 LTB 4 LTC 4 LTD 4 LTE 4 c PGE 3 PGE 3 PGD 3 Prostacycline TXA 3 LTA 5 LTB 5 a PGE 1 PGE 1 TXA 1 LTA 3 LTC 3 LTD 3 253824 e -4- Contrairement aux hypothèses de Horrobin d'après lesquelles les GLA restaurent simplement la proportion entre les PGE 1 et les TXA 2 dans les cellules malignes, il a été démontré que l'effet s'opposant à la prolifération produit par les GLA capsules, tablettes ou autres formes pharmaceutiques conventionnelles, - ou bien en mixture avec des produits alimentaires, des boissons ou autres semblables La quantité d'un ingrédient actif dans un tel supplément ou produit alimentaire ou boisson ne doit pas, de préférence, être plus grande que celle d'une dose moyenne allant jusqu'à 100 mg par 100 kg de poids du corps. L'invention peut également fournir une méthode de faire dériver les effets de la déficience de la delta-6-désaturase sur-des individus bien portants à d'autres points de vue. On peut stimuler le d-6-d par l'inclusion de quantités relative- ment plus grandes de l'acide W -6 linoléique ou d'acide u -3-linolé- nique-WV -3 dans les compositions de l'invention. Il est également appréciable que des sels appropriés, des dérivés ou des produits chimiques analogues des substances mentionnées ci-dessus correspondent également au domaine de l'invention Les sels de magnésium et de zinc sont particulièrement importants. La substance ou la composition peut être fournie sous forme d'unités de dosage, par exemple pour une administration une ou deux fois journalière sous forme de capsules ou de tablettes Dans chaque capsule l'ingrédient actif peut être en solution, selon la description ci-dessus mentionnée, ou bien il peut y être sous forme d'une tablette ou d'un -5mélange particulaire comprenant l'ingrédient actif avec un diluant ou excipient Une dose-unité pour une administration journalière peut, comme exemple, pour une personne de 50 à 100 kg de poids physique, contenir jusqu'à 100 mg d'ingrédient actif, ce qui représente 5 10 % de la dose recommandée pour le traitement d'un cancer pathologique, ce qui constitue une différence dans l'ordre de grandeurs. Une telle dose-unité n'est pas utile pour le traitement dans les conditions d'un cancer pathologique Le dosage proposé par l'invention est également bien plus faible que celui employé pour le traitement de l'alcoolisme ou d'autres maladies. Les solvants appropriés aux ingrédients actifs comprennent des huiles végétales, des solutions salines isotoniques ou tous autres sol- vants lipides ou aqueux convenant à l'homme Les compositions de l'in- vention peuvent également contenir des dérivés de la Vitamine A (pour la protection des effets du cancer de la peau), un ensemble de Vitamines B (en tant que co-facteurs), la Vitamine C (qui semble produire un effet synergétique) ou la Vitamine E (qui sert également en tant qu'anti oxy- dant) On peut ajouter à la composition des sels de magnésium ou de zinc. L'invention sera maintenant décrite et illustrée au moyen des exemples suivants EXEMPLE 1 Procédé expérimental Matériaux Acide Gamma Linolénique (GLA) L'acide gras GLA (Sigma L-2378) a été préparé pour addition à un bouillon de culture dans des conditions d'anaérobie par la méthode décrite par IngermanWojenski et d'autres (Prostaglandines 1981: 21, 655-664) L'acide gras chimiquement pur a été dissous dans 0,1 M Na 2 Co 3 selon une concentration de 10 mg/ml sous N 2 O Cette solution concentrée était conservée à -800 C Selon le besoin, cette mixture concentrée était diluée davantage avec 0,1 M Na 2 Co 3 jusqu'à la concentration d'acide gras finale de l'ordre de 0,5 à 10)4 g/m Il Ces concentrations finales ont été ajoutées au bouillon de culture décrit ci-dessous, selon les besoins et après stérilisation au moyen de filtrage millipore (type GS, dimension de pore 0,22 p m). -6 - Cellules Des souches de cellules étaient maintenues dans des bouteilles de plastique de Greiner (Labortechnique) dans un bouillon de culture Ple Coys 5 A (Laboratoires Flow) contenant 10 % de sérum foetal de veau (Laboratoires Flow) et des antibiotiques (CRYSTAPEN, c'est-à-dire benzyl pénicilline de sodium, et NOVOSTREP) Les cultures concentrées étaient réalimentées deux fois par semaine et subdivisées en sous-cul- tures à intervalles d'une semaine ou plus souvent selon le besoin, c'està-dire quand la culture était épuisée Les deux souches de cellules comprenaient des cellules mélanomes BL 6 de souris fournies par le Dr C Albrecht, Département de Pharmacologie, Université de Stellenbosch, et des cellules du rein de bovin MDBK fournies par le Dr. D Verwoerd, Institut de Recherches Vétérinaires, Onderstepoort. Expérience critique Courbes de réponse aux doses de GLA On a évalué seize groupes indépendants de courbes de réponse au GLA par les deux procédéstypes suivants: 1/ en déterminant le nombre total de cellules et leur viabilité (n = 6) et 2) en évaluant la prolifération des cellules au moyen de la détermi- nation des taux de DNA et de la synthèse protéine et en procédant à l'incorporation de thymidine (n = 5) et de méthionine (n = 5) radioac- tives, respectivement Toutes les expériences étaient réalisées par une addition identique et simultanée de GLA aux deux souches de cellules, en faisant un total de 32 groupes de culture expérimentaux distincts. Chacun de ces 32 ensembles de culture contenaient deux cultures de témoins et un groupe de cultures contenant du GLA Les dosages en GLA pour le comptage des cellules étaient 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et 10 > g/ml respectivement De la sorte, chaque ensemble de cultures comprenaient 13 expériences distinctes On a employé un total de 156 cultures distinctes, de la sorte, pour la détermination du taux de crois- sance de GLA Les dosages de GLA pour la thymidine et la méthionine servaient en tant que deux contrôles (sans GLA), et 2, 3, 6, 8 et p g/ml Chaque ensemble de dosages était doublé pour les deux souches de cellules On a employé ainsi pour ces déterminations un total de 280 cultures distinctes Pour le traitement statistique une valeur moyenne de chaque double étaient employée N = 1. -7- ( 1) Protocole des courbes de croissance:Les cellules étaient ensemen- cées dans un bouillon de culture-type (McCoys 5 A) à partir de cultures concentrées en des tubes de plastique Greiner de 50 ml à des densités sous-confluentes allant de 1 x 105 à 2 x 105 cellules/tube Selon la fixation des cellules après 6 24 heures, on y ajoutait du GLA pour obtenir les concentrations finales décrites ci-dessus. On avait traité les cultures témoins d'une façon identique sauf l'ommission de GLA On avait laissé incuber ces tubes de culture dans une atmosphère humide à 5 % de C 02 et 95 % d'air, à une température de 37 C durant 7 jours Après cette période, l'on procédait à la détermination de la quantité de cellules et de leur viabilité, cette dernière par l'exclu- sion de la teinture bleue de trypan. ( 2) Protocole de la prolifération des cellules: Pour la détermination de DNA et de la synthèse de protéines, on ajoutait 200 p l de suspension de cellules ( 2,4 x 104 cellules) à chacune des 12 cavités du plat de Dynatech (Microtiter) (M 29 AR), suivie, après la fixation des cellules, par les concentrations de GLA décrites ci-dessus On laissait incuber "Ies plats dans une atmosphère humide à 5 % de C 02 sous 370 C Durant les dernières 24 heures on ajoutait à chaque mixture d'incubation sur le micro-plat 0,4 " Ci de ( 6-3 H) thymidine ou 1 p Ci de L- (Méthyle-3 H)-méthionine -(New England Nuclear, Boston, Mass) On procé- dait ensuite au rassemblage des cellules au moyen de l'appareil automa- tique de Skatron sur des filtres de résine renforcés de fibres de verre. On a séché les filtres et rincé dans 10 ml de Picofluor TM 30 (Packard) On a compté la quantité d'incorporation de ( 6-3 H)-thymidine dans DNA et l'incorporation de L-(méthyle-3 H) méthionine dans les protéines au moyen du compteur de scintillations Packard Tri-Carb. Données relatives à la réduction et analyses statistiques En employant les valeur de l'évaluation obtenue des cellules comme décrit ci-dessus, on a exprimé la différence entre l'énumération de chaque groupe de cellules par rapport au tube témoin correspondant en pourcentage par rapport au témoin Comme les courbes de croissance étaient répétées plusieurs fois pour ehaque dose de cellules normales et cancéreuses, on a déterminé pour chaque dose la valeur moyenne et l'erreur-type On a obtenu la signification de la différence entre la 253824, -8- réponse des eellules BL 6 et MDBK au GLA par l'emploi du test Student t couplé. Aux fins de la présentation, on a exprimé ces différences de pour- centage en tant que pourcentage de réduction du taux de crois- sance (-GR%). Résultats: Courbes réponses de la dose de GLA ( 1) Taux de croissance: La figure 1 et le Tableau I montrent la réduc- tion de pourcentage des taux de croissances (-GR%) des cellules BL 6 et MDBK dans la réponse à des doses croissantes de GLA On a trouvé une réduction de pourcentage statistiquement de haute signification dans le taux de croissance des cellules cancéreuses BL 6 par rapport aux cellules MDBK normales avec chaque dose de GLA de 0,05 p g/ml (p g/ml (p ses BL 6 révèlait une progression en marches d'escalier de -GR% pour les doses de GLA de 0,5)j g/ml à environ 7,0 p g/ml Pour des doses de GLA supérieures à 7 p g/ml, la courbe de réponse de croissance atteint un palier à -GR% d'environ 70 % Ce phénomène suggère une courbe de réponse- dose saturable La réponse des eellules MDBK est remarquable par le fait qu'il n'y a aucune réponse apparente à aucune des doses de GLA. ( 2) Prolifération de cellules: L'effet de l'accroissement des doses de GLA sur l'absorption de thymidine et de méthionine radioactives par les cellules BL 6 et MDBK est montré sur le Tableau II et sur les Figures 2 et 3 Comme on s'y attendait, ces réponses sont semblables aux réponses de croissance de cellules respectives Il s'est produit une réduction sta- tistiquement importante dans l'absorption de méthionine et de thymidine dans les cellules malignes BL 6 en comparaison avec les cellules normales IDBK A un niveau de dose de 10 g/ml de GLA la réduction d'absorption de méthionine et de thymidine par les cellules BL 6 s'élevait à 58,9 % et 59,1 % respectivement. 9- TABLEAU I L'effet de l'accroissement de doses de GLA sur le taux de croissance des cellules malignes BL 6 et normale MDBK Concentration de GLA Jf g/ml. 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 ,0 6,0 7,0- 8,0 9,0 ,0 BL 6 Taux de réduction % sance moyenne (-GR%) 16,42 27,35 34,87 ,87 54,3 54,68 ,08 68,23 64,12 ,08 68,43 de la crois- Erreur-type sur La moyenne MDBK Taux de réduction % de la crois- sance moyenne (-GR%) Erreur-type surmoyenne moyenne i l l 3,69 ,95 6,57 9,08 6,29 ,75 6,16 3, 62 1,72 4,55. 7,04 -3,23 -2,04 -1,56 2,04 3,3 -0,69 3,16 -2,7 1,43 2,1 3, 13 3,46 ,49 7,27 4,68 ,89 3,21 2,96 1,81 6,4 4,31 4,56 valeur p Importance Très important id. id. id. id. id. id. id. id. id. id. nl CD cr i TABLEAU II L'effet de l'accroissement des doses de GLA sur l'absorption de thymidine et de m 6thionine radioactives par les cellules malignes BL 6 et par les cellules normales MDBK Réduction moyenne d'absorption 34,85 42,42 ,69 46, 34 59,09 ,93 44,05 51,94 ,65 58,88 BL 6 erreur-type sur la moyenne + MDBK Réduction moyenne d'absorption erreur-type sur la moyenne + valeur p _I I Absorntion le thamidine _ r ,19 -16,53 8,25 -11,97 4,73 -17,79 7,62 -21,8 8,44 7,3 Absorption de méthionine 7,97 8,91 8,97 9,11 3,03 -25,08 -11,78 -19,11 3,93 1,49 ,51 11,08 9,87 6,15 12,34 11,82 8,53 13,35 ,28 7,26 ( 0,01 Importance Très important id. id. id. id. Très important id. id. id. id. id. Concen- tration GLA p g/ml ré w Co Ne i EXEMPLE 2 Procédé expérimental Matériaux GLA: On a dissous du GLA (Sigma 2378) dans du carbonate de soude sous N comme décrit ci-dessus, exemple 1 Dans ces expériences on a employé une dose de GLA de 20)4 g/ml L'opération a été accomplie par l'adjonc- tion de 20 p 1 de GLA à la concentration de carbonate de soude ( 10 mg/ml) directement dans chaque tube de GLA contenant 10 ml de bouillon de cul- ture On a ajouté aux tubes témoins seulement 20 P l du véhicule carbo- nate de soude. Cellules: Des cellules de carcinome humain primaire de l'espèce foie avaient été fournies par le Dr J J Alexander de la Division de Virologie, Département de Microbiologie, Faculté de Médecine de l'Uni- versité de l'Afrique du Sud) Ces cellules avaient été maintenues en des flacons en plastique Grenier dans un bouillon McCoys 5 A, comme décrit dans l'Exemple 1. Protocole du taux de croissance Les cellules avaient été ensemencées dans un bouillon de crois sance type à partir de cultures de souche dans des flacons de plastique Grenier à des densités allant de 2 x 105 à 3 x 105 cellules par flacon. Après la fixation des cellules après 6 heures, on a ajouté 20 4 g/ml de GLA dans du carbonate de soude aux flacons GLA, tandis qu'on ajoute seulement du carbonate de soude aux' flacons témoins On a laissé ces flacons incuber dans une atmosphère humide à 5 % de C 02 et 95 % d'air à 37 A la fin de chaque expérience on éliminait les cellules détachées mortes avec le bouillon de culture Les cellules vivantes-étaient trai- tées à la trypsine et ensuite comptées à l'aide de l'appareil Coulter On a vérifié la viabilité des cellules par l'exclusion-de la teinture bleue trypan En outre, les flacons de culture, étaient examinés quotidien- nement et photographiés à l'aide d'un microscope à phase inversée Nikon diaphoto On avait adopté deux procédés différents pour la détermination de l'effet de la durée du traitement au GLA. ( 1) Effet de la dose quotidienne: On changeait le bouillon de culture quotidiennement et chaque jour on ajoutait du nouveau GLA Les cellules 2538249. 12 - avaient été photographiées et comptées les jours 1, 2 et 3 et 4 (série 1: N =-4) pour les deux GLA et flacons témoins chaque jour) On a répété le proces- sus le jour 4: (série 2: N = 4 pour les deux, GLA et témoin). ( 2) Effet d'une seule dose * On a ajouté une dose de GLA aux flacons GLA (n = 8) et une dose de carbonate de soude aux flacons témoins (n = 8) le jour 1 de l'expérimentation On a compté les cellules dans la culture après 4 jours. Résultats Effets de la dose quotidienne Le Tableau III montre les effets d'une dose quotidienne de GLA sur le taux de croissance de cellules de l'hépatome humain La réduction moyenne du taux de croissance dans les flacons GLA comparés aux flacons témoins était de 66 % au jour 2, de 78 % au jour 3 et de 87 % et 78 % au jour 4 pour la première série et la deuxième série respectivement La Figure 4 montre les les valeurs moyennes et l'erreur standard sur la moyenne pour la série 1 Cela montre le taux normal de prolifération des cellules de contrôle non traitées Il y eut un plafonnement d'efficacité d'envi- ron 35 % et un doublement à intervalle de deux jours ce qui est considéré comme un fait typique pour cette souche de cellules de l'hépatome Au contraire, il y eut une réduction très importante du point de vue statis- tique dans le taux de croissance des cellules traitées au GLA en compa- raison avec les cellules témoins Les différences suivantes avaient été notées après 3 jours entre les cellules traités au GLA et les cellules témoins dans des agrandissements 100 x et 200 x Les cellules témoins étaient distribuées uniformément sur le flacon Au contraire, dans les flacons des cellules traitées au GLA il y avait de grands espaces avec la croissance zéro des cellules et les cellules vues étaient de beaucoup plus petites, moins denses et différaient considérablement des cellules de contrôle et des autres rapportées, ce qui est typique pour cette ligne de cellules. 13 - TABLEAU III L'effet des doses supplémentaires quotidiennes d'acide gamma-linolénique sur le taux de croissance des cellules de culture de l'hépatome humain Jour d'expér. série 1 série 2 Nombre de cellules GLA supplémentaires (x 104) n = 4 moyenne 8,12 3,79 3,35 2,96 7,25 SE de moyenn, 0,88 0,39 0,29 0,47 0,75 Cellules témoins (x 104) n = 4 moyenne ,63 11,25 ,42 23,44 32,5 écart sur la moyenne 1,08 0,73 0,87 1,83 1,96 Réduction du taux de croissance 44 valeur P > 0,05 Importance peu important très important id. id. id. rv VI w c. ri No Effets de doses uniques Après quatre jours la quantité de cellules, après une dose indivi- duelle de GLA au jour 1 était 19,81 x 104 + 4,85 face à 2,18 pour les cellules témoins Il n'y avait pas de différence importante entre les taux de croissance des cellules ayant subi des doses supplémentaires de GLA et les cellules témoins. Les résultats des exemples 1 et 2 montrent que dans les deux cas de cellules de mélanome de souris et de cellules du cancer humain, la dose supplémentaire de GLA administrée in vitro produit une réduction impor- tante statistiquement du taux de croissance de cellules cancéreuses. * Ainsi, en maintenant le niveau de GLA à une certaine quantité on prévient la multiplication incontrôlée de cellules potentiellement cancéreuses. Contrairement à la réponse des cellules du mélanome de souris à la dose unique de GLA, les cellules de l'hépatome humain semblaient exiger des suppléments de GLA afin de produire un effet semblable. EXEMPLE 3 Méthodes et matériaux Cellules: On a obtenu des cellules d'ostéoide sarcome mélanique MG 63 des Laboratoires Flow Des cellules de carcinome de l'oesophage avaient été fournies par le Professeur J Alexander du Département de Microbiologie de Medunsa Les cellules de rein de bovin bénignes (MDBK) provenaient de la même souche que celle employée dans les exemples précédents. Techniques: Les techniques employées pour les cellules en accroissement dans la culture, les suppléments de GLA des bouillons de croissance et l'énumération des cellules étaient semblables à ceux mentionnés dans les exemples précédents. Résultats: Cellules d'ostéoide sarcome mélanique MG 63: On constate que des addi- tions de GLA au bouillon de culture de cellules MG 63 produisaient un effet de suppression de croissance très important statistiquement de ces cellules en comparaison avec-la croissance des cellules MG 63 n'ayant pas eu ces additions (Tableau IV): au bout de sept jours dans la culture suivant l'addition de GLA, le nombre moyen de cellules MG 63 passait de la densité d'ensemencement initial de 0,3 x 106 cellules à 0,56 x 106. Le nombre moyen de cellules MG 63 témoins non traitées s'accrois- sait en passant de 0,3 x 106 à 2,3 x 106 cellules pour la même période de temps Cette différence dans le-taux de croissance représente un effet de suppression de croissance de 76 % dans les cellules MG 63 traitées avec des additions de GLA durant la même période de 7 jours d'expérimentation. Le nombre moyen de cellules MDBK de contr 8 le traitées avec des additions de GLA, contrairement aux cellules MG 63, dépassait de nombre moyen de cellules MDBK non traitées avec des doses supplémentaires à la fin de la période de sept jours. Cellules de carcinome de l'oesophage: On a comparé le taux de croissance de cellules de carcinome de l'oesophage après l'adjonction dans leur bouillon de culture de croissance de 10 p g de GLA par jour durant six jours, à celui de cellules témoins des cultures de carcinome de l'oeso- phage non traitées La qualité de cellules non traitées s'accrut du nombre d'ensemencement initial de 0,14 x 106 à 6,62 x 106 après 8 jours de séjour dans la culture (Tableau IV) Au contraire le nombre de cellules traitées avec des additions de GLA passait de 0,14 x 106 à seulement 2,04 x 106 cellules pour la même période de temps On a trouvé un effet de suppression de croissance de 69 % à la fin d'une période de huit jours, ce qui statistiquement est très élevé. L'effet statistiquement considérable de suppression de croissance par le GLA des cellules de carcinome de l'oesophage devint évident à partir du sixième jour de séjour dansla culture (Tableau IV). EXEMPLE 4- Procédé expérimental Matériaux GLA: Du GLA (Sigma 2378) était dissous dans du carbonate de soude sous N 2, comme décrit dans les Exemples 1 et 2 Une dose de GLA de 20)Al de GLA dans la solution de carbonate de soude était introduite directement dans chaque flacon contenant 10 ml de bouillon de culture On ajouta seulement 20)A 1 du véhicule carbonate de soude aux flacons témoins. Cellules Des cellules malignes de mélanome de souris étaient maintenues en des flacons de plastique de Grenier (Labortechnik) contenant 10 % de