FR 2545838 A1 19841116 FR 8407133 A 19840509 PROCEDE DE PRODUCTION D'ETHANOL A PARTIR D'UNE SUBSTANCE CONTENANT DU XYLOSE La présente invention concerne un procédé de production d'éthanol à partir d'une substance contenant du xylose, comprenant la fermentation de cette substance avec une levure Des procédés de ce type ont été décrits récemment dans les US-P-4 359 534 et 4 368 268, dans lesquels la fermentation utilise la levure Pachvsolen tannophilus et des mutants de levures de la souche Candida sp Le but de la présente invention est de four- nir un procédé pour faire fermenter le xylose avec un rendement élevé. Les levures utilisables dans l'invention sont Pichia stipitis, Pichia segobiensis et Candida shehatae. La souche du type P stipitis CBS 5773 (NRRL Y-7124 T) a été isolée initialement d'une larve d'insecte et a été désignée par Pignal La description générale de P stipitis, faite par Kreger-van Rij, 1970 (The Yeasts A taxonomic Study (Lodder, J ed) p 533-535 North- Holland Publishing Company Amsterdam, London) est la suivante: Culture dans de l'extrait de malt: au bout de 3 jours, les cellules sont sphériques à ovales ( 2-7,5 x 2 5-7,5) au; isolées ou par paires Il se forme un sédiment Au bout d'un mois à 17 'C, un sédiment, et occasionnellement un anneau, sont présents. Culture sur de la gélose au malt: au bout de 3 jours à 25 'C, les cellules sont sphériques ou de forme ovale raccourcie, ( 2,5-4,5 x 2,5-6) p; isolées ou par paires. Des cellules pseudomycéliales ayant jusqu'à 15 p de long peuvent se former Au bout d'un mois à 17-C, la culture en stries est de couleur crème, avec occasionnellement une nuance rougeâtre, elle est molle, lisse ou finement plissée en son milieu, et semi-brillante Le bord est frangé de pseudomycélium. Culture sur plaques sur gélose farine de pomme de terre et de mais: du pseudomycélium se forme en abon- dance Il est plus ou moins ramifié et consiste en lon- gues cellules pseudomycéliales avec de petites blasto- spores. Formation d'ascospores: une conjugaison entre cellule-mère et bourgeon ou entre deux cellules isolées précède la formation d'asques Les cellules peuvent for- mer des protubérances de diverses longueurs Les spores sont en forme de chapeau: il s'en forme deux par asque. Elles sont aisément libérées de l'asque Des spores ont été observées dans les trois souches étudiées sur gélo- se-YM, -extrait de malt Difco et -farine de mais. Fermentation: Glucose + (lente) Tréhalose + (très faible) Galactose + (lente) ou lactose - Raffinose - Sucrose - Maltose + (lente) Assimilation de composés carbones: Glucose + D-ribose + Galactose + L-rhamnose + L-sorbose Ethanol + Sucrose + Maltose + Cellobiose + Tréhalose + Lactose + Melibiose - Raffinose - Melezitose + Inuline - Amidon soluble + D-xylose + L-arabinose + D-arabinose - Glycérol + Erythritol + Ribitol + Galactitol - D-mannitol + D-glucitol + alpha-méthyl-D-glucoside + Salicine + Acide DLlactique + Acide succinique + Acide citrique + Inositol - Scission de l'arbutine: positive Assimilation de nitrate de potassium: négative Croissance en milieu exempt de vitamine: négative ou très faiblement positive Croissance sur gélose au glucose extrait de levure à 50 Z (P/P): négative - Croissance à 37 'C positive En plus des substrats fermentables cités ci-dessus, on a trouvé de manière inattendue que P stipitis fait également fermenter le D-xylose. P segobiensis est décrit dans la référence suivante: 3 Santa Maria et G G Aser, An Inst Nac Invest. Agrarias, Ser General 5 ( 1977) 45-50 On a trouvé que cette levure fait fermenter le D-xylose en éthanol à un degré comparable à celui de P stinitis Toutes les sou- ches de P stipitis essayées -CBS 5773, CBS 5774, CBS 5775, CBS 5776, CBS 6054 et la souche de P segobiensis CBS 6857, ont en commun cette caractéristique L'utili- sation de toutes ces souches est donc envisagée dans le procédé décrit La forme de P stipitis (candida Shehatae) provisoirement considérée comme imparfaite (Lodder: the Yeast ( 1970) p 535, 1 046, 1 047) fait fermenter le D-xylose en éthanol et son utilisation est donc également envisagée dans le procédé décrit. Tous les substrats contenant du D-xylose con- viennent dans le procédé décrit pourvu qu'ils ne con- tiennent aucun constituant qui soit un inhibiteur puis- sant pour le processus. Comme le glucose disponible fermentera lui aussi en éthanol, la cellulose hydrolysée et l'hémicellulose hydrolysée ou des mélanges de ceux-ci conviennent parti- culièrement comme substrats dans le procédé décrit Par conséquent, n'importe quelle matière lignocellulosique contenant de la cellulose et de l'hémicellulose telle que bois, herbe, paille, bagasse etc peut servir de- matière première pour le procédé Des fluides résiduai- res tels que liqueur sulfitique usée, contenant du D-xylose à côté d'autres sucres éventuels, conviennent également Il est entendu que le monosaccharide prédo- minant trouvé dans l'hémicellulose hydrolysée est le D-xylose. Le procédé décrit met en jeu la fermentation dans un milieu aqueux du D-xylose, et du D-glucose s'il est présent, en éthanol Les conditions chimiques et physiques du milieu doivent par ailleurs être telles que la viabilité des cellules soit maintenue, comme il est connu des spécialistes. Lorsqu'une croissance cellulaire est nécessaire, la concentration en éthanol ne doit pas dépasser 45 gl. A 30 g/l, la vitesse de croissance est considérablement réduite Le rendement en éthanol est réduit aux concen- trations en éthanol de 30 g/i ou davantage - P stipitis se développe bien à 28-32 C La fer- mentation est entretenue dans l'intervalle de températu- res de 15-40 'C La vitesse la plus élevée est observée entre 30 et 37 'C, l'intervalle de 32-34-C étant optimum pour la vitesse de production d'éthanol. Le développement de P stipitis CBS 5773 s'ef- fectue dans l'intervalle de p H de 3 à 7 Un p H de 5 don- ne un développement légèrement meilleur qu'un p H de 4 et un p H de 6 La vitesse de production d'éthanol est bonne entre p H 3 et p H 8, le p H de 6 étant à peut prés le ma- ximum Comme il est souhaitable d'effectuer la fermenta- tion au p H le plus bas possible pour réduire au minimum le risque d'infection, il est à noter qu'à p H 4 la vi- tesse de production est plus de 90 Z du maximum et la vitesse de développement est également satisfaisante à ce p H. La production d'éthanol s'effectue en milieu aérobie Le rendement en éthanol de la fermentation aé- robie est approximativement égal à celui d'une fermen- tation avec un apport d'air limité, bien que la vitesse de fermentation soit un peu plus faible. Dans une fermentation de type discontinu typi- que, une suspension cellulaire de P stipitis obtenue à partir d'une préculture de préférence en phase de crois- sance exponentielle, est alimentée en D-xylose Les con- ditions sont réglées et maintenues dans l'intervalle défini ci-dessus La production d'éthanol est ainsi amorcée et se poursuivra à la vitesse commandée par la concentration effective des cellules et par les condi- tions qui prévalent par ailleurs Pourvu que les condi- tions soient maintenues dans l'intervalle défini ci- dessus, et que la viabilité des cellules soit conservée, la production d'éthanol ne s'arrêtera que lorsque le D-xylose sera épuisé. Le brevet US nô 4 359 53 it décrit un procédé dans lequel la levure Pachvsolen tannophilus est utilisée pour faire fermenter une substance contenant du D-xylose Il est indiqué que l'aération est une condi- tion préalable à une production d'éthanol accrue Le rendement le plus élevé indiqué dans le brevet est de 0,34 g d'éthanol/g de D-xylose Le brevet US n' 4 368 268 décrit un procédé similaire dans lequel une souche mutante de Candida s D, XF 217 est utilisée pour faire fermenter le Dxylose en éthanol Il est indiqué que de l'oxygène doit être disponible pour obtenir une production accrue d'éthanol à partir du D-xylose Le rendement le plus élevé indiqué dans ce brevet est celui qui ressort des figures 1 et 2 montrant la fermentation aérobie, à partir desquelles on peut estimer un rende- ment de 0,42 g d'éthanol/g de D-xylose. Une faible quantité d'air (oxygène) est néces- saire pour le développement des cellules Le rendement en éthanol-dans la fermentation aérobie utilisant P stipitis avec une quantité d'air limitée est à peu près le même que dans la fermentation anaérobie Ceci rend possible un processus de fermentation pouvant sa- tisfaire simultanément à des conditions favorables pour le développement et pour une fermentation efficace. L'effet d'une faible quantité d'oxygène est ainsi dou- ble; il rend possible la croissance cellulaire néces- saire, et il augmente la productivité spécifique des cellules en éthanol. Le rendement le plus élevé obtenu dans une ex- périence unique de fermentation est de 0,46 g d'étha- nol/g de D-xylose La Demanderesse est convaincue que 3/2 molécules d'éthanol se forment pour chaque molécule de D-glucose. Ceci correspond au rendement théorique maximum de 0,46 g d'éthanol/g de D-xylose consommé Par consé- quent, le rendement ci-dessus est de 100 X Habituelle- ment, le rendement est légèrement plus faible, de 0,43- 0,45 g/g (= 93-98 X du maximum). Exemples Les exemples suivants sont destinés à décrire plus complètement le procédé de l'invention, mais ne doivent pas être considérés comme limitant le domaine de l'invention défini par les revendications. Procédure expérimentale générale Des cultures inclinées sur gélose de Pichia stipitis, souches C 8 S 5773, 5774, 5775 5776, 6054, Pichia seqobiensis CBS 6857 et Candida shehatae, souches CBS 5712 et 5813, ont été obtenues auprès du Laboratorium voor Microbiologie, Technische Hogeschool Delft, Delft Les cultures ont été maintenues sur des cultures inclinées de gélose à 30 'C Le milieu de cultu- re incliné contenait 20 g/1 de D-xylose, 7 g/1 d'extrait de levure et 15 g/l de gélose Sauf indications contrai- res, les milieux liquides pour la propagation de la le- vure contenaient 7 g/1 d'extrait de levure, 10 g/1 de D-xylose et une base minérale de (NH 4)2504 ( 2,35 g/1), KH 2 PO 4 ( 0,55 g/l), Mg SO 4 x 7 H 20 ( 0,25 g/l), Na 2 HPO 4 x 12 H 20 ( 0,25 g/l), Ca C 12 x-2 H 20 ( 20 mg/l) et des oligo-éléments H 3 803 ( 0,5 mg/l), Mn SO 4 x 4 H 20 ( 0, 2 mg/1), Zn SO 4 x 7 H 20 ( O 2 mg/l), Cu 504 x 5 H O 20 ( 0,23 mg/l), Fe SO 4 x 7 H 20 ( 1,25 mg/l). (NH 4)6 Mo 702 x 4 H 20 ( 0,1 mg /l), H 2504 ( 0,5 mg/l), Co(NO 3)2 x 6 H 20 ( 0,25 mg/1), KJ ( 0,05 mg/l) (p H 5,0). Dans les cas o on a utilisé une concentration en xylose différente, les proportions relatives des autres consti- tuants du milieu étaient les mêmes que ci-dessus L in- cubation a été effectuée sur un agitateur rotatif à 'C, sauf indications contraires. A moins que des conditions aérobies ne soient stipulées, la fermentation désigne l'état dans lequel la phase gazeuse présente dans le récipient d'essai se com- pose de CO et l'équilibrage de la pression est réalisé au moyen d une seringue à travers le bouchon de caout- chouc obturant hermétiquement le récipient La procédure expérimentale générale mettait en jeu une propagation aérobie des cellules de levure dans un milieu liquide tel que décrit ci-dessus, une récolte des cellules dans la phase exponentielle de développement, par centrifuga- tion, et une remise en suspension de celles-ci dans du milieu frais, conduisant à un mélange de fermentation final contenant (environ) 5 g (poids sec) de cellules/L. L'éthanol produit était mesuré par chromatographie en phase gazeuse ou chromatographie liquide sous haute pression (HPLC) Le D-xylose et le xylitol ont été quan- tifiés par HPLC Le développement cellulaire (exprimé en g/l, en poids sec) a été mesuré par la densité optique à 620 nm et la concentration cellulaire correspondante a été calculée par multiplication par un facteur déterminé expérimentalement. Exemple 1: Mesures de rendement L'expérience a été effectuée conformément à la procédure expérimentale générale, mais la concentration en xylose utilisée était de 20 g/1 Le xylose était com- plètement fermenté par toutes les souches essayées Le rendement en éthanol et la vitesse de fermentation spé- cifique sont donnés dans le tableau 1. TABLEAU 1 Souche : Rendement en: : éthanol: : g d'éthanol/g: : de xylose: P stipitis CBS 5773 P stipitis CBS 5774 P stipitis CBS 5775 P stipitis CBS 5776 P stipitis CBS 6054 P segobiensis CBS 6857 C Shehatae CBS 5712 C shehatae CBS 5813 0 44 0,46 0,45 0, 45 0,43 0,45 0,45 0,44 Vitesse de fermentation spécifique g d'éthanol/g de cellules, h > 0,10 > 0,10 > 0,10 > 0,10 > 0,10 > 0,10 0,08 a > 0,10 Exemple 2: Effet Dans une de l'oxygène expérience, typique de P stipitis, on a ajouté à un milieu contenant 15 g/l de xylose et d'au- tres constituants tels que décrits ci-dessus, 2,3 g/J (poids sec) de cellules de P stipitis souche C 85 5776. La fermentation a été effectuée dans deux récipients agités doucement, dont l'un était initialement balayé par un courant de gaz carbonique de haute pureté et l'autre était initialement balayé par un courant d'air. Le rapport gaz: liquide était d'environ 5: 1 Les ré- cipients ont été hermétiquement obturés avec des joints de caoutchouc et l'équilibrage de la pression a été réa- lisé par des seringues Des échantillons ont été préle- vés au cours de la fermentation pour la détermination de l'éthanol, du xylose, du xylitol et de la densité des cellules Les résultats sont donnés dans le tableau 2. TABLEAU 2 :: Vitesse:: : Rende: de:: Crois: : ment en: fermen-: Xylitol: sance: : éthanol: tation:g de xy-: cellu: Phase: g d'é:spécifi-: litol/: laire: Xylose gazeuse: thanol/: que g:g de xy-: g de: résiduel initiale:g de xy:d'étha: lose: cellu: g/l : lose:nol/g de:: les/: ::cellules:: g de: :: h:: xylose : CO: 0,43: 0,16: 0,03: O: O ::: :: air: 0,44: 0,23: O: 0,15: O ::: :: ::: :: Le rendement en éthanol est proche du rendement théorique, ( 0,46 g/g) et il n'est pas réduit significa- tivement dans des conditions anaérobies Cependant, un accès à l'air (oxygène) limité au cours de la fermenta- tion stimule la vitesse de fermentation spécifique, ré- duit la production de xylitol à zéro et favorise la croissance de cellules. Exemple 3: Effet du p H sur la vitesse de fermentation L'expérience a été effectuée conformément à la procédure expérimentale générale, mais avant l'inocula- tion, le p H dans huit milieux de fermentation différents a été ajusté à des valeurs différentes La vitesse de fermentation initiale a été estimée en déterminant la quantité d'éthanol produite entre la 30 ème et la 60 ème minute Le p H a été mesuré au bout de 60 minutes Le ta- bleau 3 donne les résultats obtenus. TABLEAU 3 : p H Souche de: initial P stipitis : p H : final ____________ _________ CBS 5773 CBS 5774 CBS 5775 CBS 5776 CBS 6054 :À :2,0:3,0:ó,0:5,0:8,0:?,0:8,0:9,0 :2,3:3,0:4,1: :::: ::: : :::: : 36: 74: 94: : 25: 81: 96: : 5: 5: 81: : 48: 81:100: : 37: 70: 89: :::: :::: 4,8:5,8:6,5:6,9:8 5 :::: :: :-_ 97:100:100: 90: O 88: 79:100: 58: O 73: 90:100: 68: O : 96: 85: 96: O 91:100: 91: 83: O Exemple 4: Effet de la température sur la vitesse de développement L'influence de la température sur la vitesse de développement a été étudiée pour cinq souches de P stioitis Dans un flacon (Shake flash) à agitation contenant du milieu décrit dans la procédure expérimen- tale générale, on a inoculé 0,05 g/l de cellules, on l'a couvert avec des filtres de coton pour permettre un li- bre accès de l'air et on l'a fait incuber dans un agita- teur rotatif à 8 températures différentes Le tableau 4 donne les résultats obtenus. 1 1 *TABLEAU 4 Vitesse spécifique de croissance lh-h l Exemple 5: Effet de la température sur la vitesse de fermentation L'expérience a été effectuée conformément à l'exemple 3, mais le p H était de 5,0 et la fermentation a été effectuée à diverses températures Le tableau 5 donne les résultats obtenus. S o ce e::: :::: -:: Souche de::: P stipitis: 20: 25: 28: 30: 32: 34: 36: 38: 40 CBS 5773:0,26:0,37:0,39:0,46:0,41:0 39:0 17:0: O CBS 5774:0,24:0,32:0,37:0,50:0,46:0,41:0,28:0,12: 0 CBS 5775:0,23:0,33:0,43:0,35:0,31:0,29:0:0: O CBS 5776:0,22:0,37:0,41:0,53:0,46:0,37:0,28:0,06: O CBS 6054:0,18:0,39:0,43:0,46:0,50:0,39:0,35:0,13: O TABLEAU 5 X de la vitesse de fermentation initiale maximum Exemple 6: Effet de l'éthanol sur la croissance L'expérience a été effectuée conformément à l'exemple 4, mais de '1 éthanol a été ajouté à 3 concen- trations diférentes et la température d'incubation était de 30 'C Le tableau 6 donne les résultats obtenus. : Température, C Souche de: _ P stipitis:: ::: ::: : : 15: 20: 25: 28: 30: 32: 34:37: 40 ::::: ::: : :::: :::: : CBS 5773: 5 l: 11: 38: 62: 87: 94:100: 80: 45 ::::: ::: : C 85 S 5774:: 23: 48: 67: 85:100: 94: 86: 72 ::: : :::: CBS 5775:: 8 : 35: 52: 75: 88:100: 90: 66 ::::: ::: : CBS 5776:: 7 : 40: 68: 84: 97:100: 95: 53 :CBS6054::22 33 58 82:::: 87:63 CB$ 6054:: 22: 33: 58: 82:100: 91: 87: 63 ::::: ::: : TABLEAU B Croissance des cellules en g/l Exemple 7: Effet de l'éthanol sur le rendement en étha- nol L'expérience a été effectuée conformément à la procédure de fermentation générale, mais de l'éthanol a été ajouté à 4 concentrations différentes La-températu- re d'incubation était de 30 'C pour toutes les souches de P stipitis, et de 25 'C pour P seqobiensis CBS 6857 Le tableau 7 donne les résultats obtenus. : Ethanol, 9/1 Souche: : O: 30: 45 P stipitis CBS 5773: 2,1: O 7 O P stipitis CBS 5774 2 6: 1,2: O 3 P stipitis CBS 5775: 1,3 O: O P stipitis CBS 5776 2,2: 1,0: O P stipitis CBS 6054: 2 4: 1,1: O P segobiensis CBS 6857:2,2: O 1; O C shehatae CBS 5712: O 7 O O C shehatae CBS 5813 1,0 O: O TABLEAU 7 g du rendement maximum (q d'&éthanol/q de xylose) Exemple 8 On neutralise une liqueur sulfitique usée à p H 6 avec KOH, on l'alimente en extrait de levure et en élé- ments nutritifs minéraux comme il a été décrit dans la procédure expérimentale générale, et on y inocule 5 g/l de P stipitis CBS 6054. La fermentation est effectuée dans un ballon (flash) à agitation, bouché avec du coton à 30 'C pendant 24 heures Le tableau 8 donne les résultats obtenus. 9 n : Ethanol, g/1 Souche : O: 30: 45: 60 :::: : : :: P stipitis CBS 5773: 100: 80: 51: 26 P stipitis CBS 5774 100: 80 51: 8 P stipitis CBS 5775: 100: 61: 76: 45 P stipitis CBS 5776: 100: 90: 76: 34 :::: P stipitis CBS 6054: 100: 100 68: 29 P segobiensis CBS 6857: 100: 66: 80: 55 :::: : TABLEAU 8 Concentration en g/l Il est à noter que les conditions expérimentales de cet exemple ne sont pas optimisées pour le rendement en éthanol. en éthanol. Durée de::: Galac-:: fermentation:Glucose:Hannose: tose: Xylose:Ethanol heures::: :: 0: 4,6: 11,0: 2,5: 6,2: O 24 O: O:O 0,4: 9,9 :::: : REVENDICATIONS 1 Procédé de préparation d'éthanol à partir d'une substance contenant du xylose, consistant à faire fermenter cette substance avec une levure du genre Pichia ou ses formes imparfaites appartenant au genre Candida, choisie parmi les espèces Pichia stipitis et/ou Pichia seqobiensis et/ou Candida shehatae, en aérobie ou en anaérobie. 2 Procédé suivant la revendication 1, caracté- risé en ce que le rendement en éthanol est d'au moins 0,43 g d'éthanol par g de D-xylose. 3 Procédé suivant l'une quelconque des reven- dications 1 ou 2, caractérisé en ce que la levure est Pichia stipitis, une souche choisie parmi CBS 5773, CBS 5774, CBS 5775, CBS 5776, C 85 6054. 4 Procédé suivant l'une quelconque des reven- dications 1 ou 2, caractérisé en ce que la levure Pichia segobiensis est la souche CBS 6857. Procédé suivant l'une quelconque des revendi- cations 1 ou 2, caractérisé en ce que la levure est Candida shehatae, une souche choisie parmi CBS 5813 et CBS 5712. 6 Procédé suivant la revendication 3, caracté- risé en ce que le p H est maintenu dans l'intervalle d'environ 2 à 8, et la température dans l'intervalle d'environ 15 à 40 *C. 7 Procédé suivant la revendication 6, caracté- risé en ce que le p H est maintenu à 4-7 et la tempéra- ture à 30-37 'C. 8 Procédé suivant la revendication 1, caracté- risé en ce que la concentration en oxygène dans le mi- lieu de fermentation est maintenue de façon à impliquer des conditions pratiquement anaérobies. 9 Procédé suivant la revendication 1, caracté- risé en ce que cette substance contenant du xylose est un produit de dégradation lignocellulosique.