FR 2547587 A1 19841221 FR 8309811 A 19830614 La présente invention a pour objet de nouveaux stéroïdes radioactifs, leur procédé de préparation, leur application à la mise en évidence des récepteurs de glucocorticoîdes et au dosage du nombre de sites de fixation des glucocorticoides. Plus particulièrement, elle a pour objet des stéroîdes radioactifs marqués au tritium de formule générale (I): RO OR 1 "CE C-CH 3 C H 3 dans laquelle 3 H représente le tritium, R et R 1, semblables ou différents représentent de l'hydrogène, un radical alcoyle ayant de 1 à 6 15 atomes de carbone ou un radical acycle ayant de 1 à 20 atomes de carbone. Parmi les valeurs de R et R 1, on peut citer: a) les radicaux méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, sec-butyle, tert-butyle, pentyle, iso-pentyle, sec-pentyle, tert-pentyle, nêo-pentyle, hexyle, iso-hexyle, sec-hexyle, tert-hexyle; b) les radicaux formyle, acétyle, propionyle, butyryle, isobutyryle, valéryle, caproyle, benzoyle, capryloyle, méthoxycarbonyle ou éthoxy carbonyle. Parmi les produits de formuie générale (I), on citera notamment: le 116,17 f-dihydroxy 6-méthyl 3 H 3 _ 17 " -(prop-1-ynyl) androsta-1,4, 625 trièn-3-one. L'invention a également pour objet un procédé de préparation des produits répondant à la formule générale (I). Ce procédé est caractérisé en ce que: on fait réagir un produit de formule générale (II) RO O R (I) dans laquelle R à les significations précitées et R 2 représente un groupement alcoxy ayant de 1 à 6 atomes de carbone, un groupement acyloxy ayant de 2 à 12 atomes de carbone, ou R 2 représente le reste d'une amine secondaire cyclique avec un agent d'halogéno méthylation, obtient un produit de formule générale (III) 2 2547587 RO O CX 2 dans laquelle X représente un halogène, que l'on réduit par action du tritium en présence d'un catalyseur, bloque en milieu acide la fonction cétone en 3 du produit de formule générale (IV) résultant: RO O (Iv) C 3 H 3 au moyen d'un agent de O-alkylation de formule Ho C(OR 3)3 dans laquelle 15 R 3 représente un groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone, obtient un produit de formule générale (V): RO O (v) R 3 C H 3 dans laquelle R et R 3 ont les significations précitées, soumet ce dernier à l'action d'un agent de propynylation, _ fait agir sur un produit de formule générale (VI) résultant: RO OH "C C-CH 3 (VI) R 30 CH 3 un agent de déshydrogénation et obtient un produit de formule générale (I) dans laquelle R 1 représente un atome d'hydrogène que, le cas échéant, si R n'est pas un atome d'hydrogène, on ethérifie ou estérifie la fonction hydroxyle en 17, et si R représente de l'hydrogène, on éthérifie ou estérifie sélectivement l'une ou l'autre des fonctions hydroxyles en 11 pet 17/, ou éthérifie ou estérifie les deux fonctions hydroxyles en 11 f et 17/ Parmi les significations de R 2 de la formule générale (II) cidessus, on entend par le reste d'une amine secondaire cyclique par exemple 40 les groupements pyrrolidynyle, morpholino ou pipéridino. Dans les conditions préférentielles de mise en oeuvre, le procédé est caractérisé par les points suivants: l'agent d'halogénométhylation est le tétrabromure de carbone et on opère sous atmosphère inerte dans le dioxanne en présence de pyridine, à température ambiante puis à température du reflux du mélange réactionnel; le catalyseur en présence duquel on fait agir le tritium est l'hydroxyde de palladium et on opère dans le dioxanne en présence de triéthylamine; l'agent de O-alkylation de la fonction cétone en 3 du produit de formule générale (IV) est l'orthoformiate d'éthyle et on opère sous atmosphère 10 inerte en milieu acide; l'agent de propynylation que l'on fait agir sur le produit de formule générale (V) est le bromure de propyne-1-yle magnésium et on opère sous atmosphère inerte dans le tétrahydrofuran; l'agent de déshydrogénation que l'on fait agir sur le produit de formule 15 générale (VI) est la dichlorodicyanoquinone et on opère sous atmosphère inerte dans un solvant aromatique ou chloré, tel que le benzène ou le chlorure de méthylène. L'éthérification et/ou l'estérification des produits de formule générale (I) peuvent être effectuées selon les méthodes habituelles. L'éthérification peut être effectuée par exemple au moyen d'un agent d'éthérification tel qu'un halogénure d'alcoyle ou d'aryle, ou un sulfate de dialcoyle. L'estérification peut être effectuée par exemple au moyen d'un agent d'estérification tel qu'un dérivé fonctionnel d'acide, tel qu'un chlorure 25 d'acide ou un anhydride. Dans ses modes d'exécution, le procédé de l'invention peut encore être illustré par le fait qu'à la suite de l'action de l'agent d'halogénométhylation sur un produit de formule (II), il se produit successivement la condensation dudit agent sur le stéroîde à température ambiante, puis 30 sous l'effet de la chaleur, la deshalohydratation de la molécule formée in situ. L'invention a également pour objet l'application des produits de formule générale (I) et notamment du 11 17/ -dihydroxy 6méthyl 3 H 317 " -(prop-1-ynyle) androsta-1,4,6-trièn-3-one à la mise en évidence des 35 récepteurs de glucocortico Tdes et au dosage du nombre de sites de fixation des glucocorticoides dans les tissus des organes de l'homme et des animaux. L'invention a également pour objet le moyen pour la mise en évidence des récepteurs des glucocortico Ydes et le dosage du nombre de sites de fixation des glucocorticoides comportant un produit tel que défini par la formule générale (I) et notamment le 11,17,-dihydroxy-6-méthyl-3 H 3-17 k(prop-1-ynyl) androsta-1,4,6-triên-3-one. L'invention a également pour objet à titre de produits industriels 5 nouveaux et notamment à titre de produits intermédiaires nécessaires à l'exécution du procédé de l'invention, les produits suivants le 11 E hydroxy-6-dibromométhylène-androsta-4-èn-3,17-dione; le 11 f-hydroxy-6méthyl-3 H 3-androsta-4-èn-3,17-dione le 3-éthoxy-11 -hydroxy-6-méthyl-3 H 3-androsta-3,5-di n-17-one le 3-éthoxy-11 l,17,p -dihydroxy-6-méthyl-3 H 3-17 o( -( 1-propynyl) androsta-3,5-di ène. Les produits de formule générale (I) et notamment le 11 p,17 e dihydroxy6-méthyl-3 H 3-17 o( -(prop-1-ynyl) androsta-1,4,6-tri n-3-one permettent comme déjà mentionné, la mise en évidence des récepteurs de 15 glucocorticoides et le dosage du nombre de sites de fixation des glucocortico des. On savait déjà que le 11 F,17/3-dihydroxy-6-méthyl-17 p(-(prop-1-ynyl) androsta-1,4,6-trièn-3-one non radioactif se fixe d'une manière sélective sur des récepteurs de glucocortico Tdes (G TEUTSCH, R DERAEDT, et Al. 20 STEROIDS, Vol 38,N 6, p 651-665, 1981). Par contre d'autres corticoîdes naturels ou synthétic:,s l'on utilise pour ce type d'expérimentation, se fixent simultanément sur d'autres récepteurs de stéroïdes et notamment sur des récepteurs de minéralocortico Tides. Néanmoins, lors de telles expérimentations, le 11/,17,B -dihydroxy6méthyl-17 " -(prop-1-ynyl) androsta-1,4,6-triên-3-one avec le produit non radioactif, en particulier lorsque les tissus d'organes examinés comportaient simultanément des récepteurs de glucocorticoîdes et des récepteurs de minéralocorticoides, on était souvent obligé de recourir à 30 une succession de méthodes compliquée et longues. Or, on vient de constater à présent que les produits de formule générale (I) et notamment le 11/8 117 p-dihydroxy-6-méthyl-3 H 3-17 o(prop-1-ynyl) androsta-14,6-trièn-3-one, radioactif, objets de l'invention, présentent la même réactivité sélective par rapport aux 35 récepteurs de glucocortico Tdes que les produits analogues non radioactifs. Du fait de la radioactivité des produits de formule générale (I), il est beaucoup plus aisé de mettre en évidence l'existence des récepteurs de glucocorticoides dans les tissus d'organes, lorque des récepteurs de minéralcortico Tdes sont présents également, grâce à l'application des méthodes habituelles de mesures de liaison ayant recours aux produits radi oactifs. En outre, ce qui n'était pas possible avec un produit non radioactif, comme par exemple le dosage du nombre de sites de fixation des récepteurs de glucocortico Tdes, devient réalisable grâce à l'utilisation des produits de formule (I). On peut envisager également que lors d'une utilisation in vivo des produits de formule générale (I) et notamment du I 1/,17/ -dihydroxy-610 méthyl-3 H 3-17 o -(prop-1-ynyl) androsta-1,4,6-trièn-3-one, on puisse, grâce à leur radioactivité, détourner aisément l'emplacement exact des sites de fixation des glucocortico Tdes. Les produits de formule générale (I) peuvent ainsi être utilisés comme un moyen particulièrement intéressant de mise en évidence des récepteurs 15 de glucocorticoîdes et du dosage du nombre de sites de fixation, par exemple dans les tissus des organes comportant des récepteurs des glucocorticnideset des récepteurs des minéralocorticoides, tels que l'hippocampe et autres stuctures du cerveau, les reins, le colon, l'hypophyse et autres tissus périphériques. Les produits de formule générale (I), dans des conditions de travail in vitro et dans certains tissus, ne sont pas sujet au métabolisme,dans des conditions d'incubation dans lesquels la corticostérone ou le cortisol, par exemple, se métabolisent dans certains tissus. Les techniques utilisées pour la mise en évidence des récepteurs de 25 stéro Tdes et le dosage du nombre de sites de fixation sont celles le plus couramment utilisées dans ce domaine: RAYNAUD J P, PHILIBERT D et al, J of STEROID BIOCHEM, 6 ( 1975), 615-622; MOGUILEWSKY et al, J of STEROID BIOCHEM 12, ( 1980), p 309-314. Lors de l'expérimentation avec le 11/, 17 _-dihydroxy-6-méthyl3 H 3-17 c" -(prop-1-ynyl androsta-1,4,6-trièn-3-one (produit A), il a été constaté qu'il satisfaisait aisément à toutes les exigences nécessaires pour la mise en évidence des récepteurs de glucocorticoîdes et le dosage de sites de fixation Il a été ainsi établi que: a) le produit A ne donne lieu à aucune fixation spécifique sur des protéines plasmatiques chez l'animal ou chez l'homme, lesquelles protéines contaminent généralement toute préparation de récepteurs tissulaires. b) A O C la constante d'association du produit A Kan 109 M-1 envers des récepteurs de glucocorticoides du cytosol de thymus de rat, fournie par la lecture d'adsorption au moyen de charbon-dextrane, est environ deux fois plus élevée que celle de la dexaméthasone; c) Le produit A est doté d'une vitesse d'association élevée K+ 1, 106 M-1 mnl et d'une vitesse de dissociation basse vis-à-vis des récepteurs de glucocorticoîdes dans le thymus (t 4/I 16 h) et vis-à-vis des récepteurs de glucocorticoides de l'hippocampe (t 4,4 24 h) Dans ces deux tissus, il se dissocie selon la courbe à une pente tandis que la 3 H-déxamétasone et la 3 Hcorticostérone dans le cytosol d'hippocampe présentent une courbe de dissociation à deux pentes, qui est caractéristique d'une fixation sur au moins deux sites de liaison de glucocortico Ydes et de minéralocortico 7 des. d) A O C et 15 C le produit A forme avec des récepteurs de glucocorticoides de thymus des complexes qui sont stables au moins 24 h. Dans ces conditions, le dit produit A ne manifeste pas de perte de tritium; il n'est pas sujet au métabolisme et ne présente qu'une faible fixation non spécifique. e) Soumis à l'incubation à 15 C pendant 24 h, le produit A remplace totalement la corticostérone non radioactive et le cortisol non 20 radioactif fixés sur des récepteurs de glucocortico Ydes De ce fait, il permet de doser le nombre total de sites de fixation de glucocortico Tdes dans différentes conditions physiologiques. L'exemple suivant illustre l'invention sans toutefois la limiter. EXEMPLE:11 P,17 g -dihydroxy 6-méthyl-3 H 3-17 q -(prop-1-ynyl) 25 androsta-1,4,6-triên-3-one Stade A: 11 -hydroxy-6-dibromométhyl ne-androsta-4-èn-3,17-dione. On prépare le mélange réactionnel de 3,7 g de 3-éthoxy 11/,-hydroxy androsta-3,5-diène 17-oae, 20 ml de dioxannne, 1 ml de pyridine et 4 g de tétrabromure de carbone, le soumet sous atmosphère inerte à l'agitation à 30 température ambiante pendant 24 h environ, sépare le précipité, le lave à plusieurs reprises par du dioxanne, réunit les filtrats organiques et les porte au reflux pendant 4 heures environ Une fois la solution refroidie, on ajoute 50 ml d'acide chlorhydrique 2 N, soumet à l'agitation pendant une dizaine de minutes, extrait par l'acétate d'éthyle, lave les phases 35 organiques successivement à l'eau et à l'eau saturée au chlorure de sodium, sèche et amène à sec On reprend le résidu par l'acétate d'éthyle et laisse le produit cherché cristalliser à -20 C Le produit est purifié par recristallisation dans l'acétate d'éthyle et on obtient 0,6 g de produit cherché dont le Pf= 256 C. Spectre UV (Et OH) max 252 nm infl 284 nm La pureté peut être appréciée par chromatographie sur couche mince de 5 silice en éluant par le mélange cyclohexane/acétate d'éthyle ( 1-1), Rf= 0,2. Parmi les produits de départ de formule générale (II), le 11hydroxy-3éthoxy-androsta-3,5-dièn-17 =one a été décrit dans la demande de brevet japonais 9577/71. D'autres produits correspondant à cette formule peuvent être préparés selon les méthodes connues en soi. Stade B:11 -hydroxy-6-méthyl-3 H 3-androsta-4-èn-3,17-dione. On refroidit par l'azote liquide le mélange réactionnel constitué par mg de produit dibromé préparé au stade précédent, 2 ml de dioxanne, 15 20 mg de charbon palladié à 2 % sur talc et 120/ 1 de triéthylamine. Puis introduit sous vide 15,5 ml de tritium d'une activité spécifique de 58 Ci/mmol On laisse revenir le mélange réactionnel à température ambiante, puis chauffe vers 40 C et agite sous tritium jusqu'à fin d'absorption On récupère ensuite l'excès du tritium, filtre, ajoute 1 ml 20 d'H Cl 2 N, abandonne au repos pendant 1 heure environ à température ambiante, extrait à l'acétate d'éthyle, lave à l'eau, sèche, évapore à sec et obtient 60 mg de produit brut, que l'on utilise tel que pour le stade suivant. Spectre UV (Et OH) max 240 nm La pureté du produit peut être appréciée par chromatographie sur couche mince de silice en éluant par le mélange cyclohexane/acétate d'éthyle ( 1-1), Rf= 0,17. Stade C:3-éthoxy-ll -hydroxy-6-méthyl-3 H 3-androsta-3,5-dièn-1730 one. On introduit sous atmosphère inerte et sous agitation le produit tritié obtenu au stade précédent dans 120 ld'orthoformiate d'éthyle et 20 " 1 d'orthoformiate d'éthyle à 1 % de chlorure d'acétyle, puis ajoute 400/, 1 d'éthanol On maintient l'agitation à température ambiante pendant 35 10 minutes environ, puis ajoute 100,/l de triéthylamine, concentre ensuite le mélange réactionnel à sec sous pression réduite et obtient 58 mg de produit brut attendu que l'on utilise tel que pour le stade suivant. La pureté du produit peut-être appréciée par chromatographie sur couche mince de silice en éluant par le mélange cyclohexane/acétate 2547587. d'éthyle ( 1-1), Rf= 0,5. Stade D:3-éthoxy-11 A/,17 / -dihydroxy-6-méthyl-3 H 3 17 ' -(prop-1ynyl)androsta-3,5-di ne. On introduit le produit obtenu au stade précédent, sous agitation et 5 sous atmosphère inerte, dans 100/M 1 de tétrahydrofuran, ajoute 2 ml d'une solution de bromure de propyn-1 yl-magnésium 1 M dans le tétrahydrofuran, maintient le mélange réactionnel sous agitation, à température ambiante, pendant une demi-heure environ, puis ajoute 5 ml d'une solution aqueuse de chlorure d'ammonium à 10 %, extrait par l'acétate d'éthyle, lave l'extrait 10 à l'eau, le sèche et le concentre à sec On obtient 60 mg de produit d'une activité de 7 Ci Le produit est utilisé tel que pour le stade suivant. La pureté du produit peut être appréciée par chromtographie sur couche mince de silice en éluant par le mélange cylohexane/acétate d'éthyle ( 11) , Rf= 0,4. Stade E:11 p 17 -dihydroxy-6-méthyl-3 H 3-17 (prop-1-ynyl)androsta1,4,6trièn-3-one. On ajoute en 15 minutes sous agitation et sous atmosphère inerte au produit obtenu dans le stade précédent dans 0,5 ml de benzène, la solution de 90 mg de dichlorodicyano quinone On maintient l'agitation pendant une 20 demi-heure environ, puis ajoute 0,5 ml d'acétone, 100 ll de bisulfite de sodium (une solution aqueuse de d= 1,32) et i ml d'une sol-:': -' -se a 10 % de bicarbonate de soude On extrait ensuite par 1 'agtat o eyie, lave l'extrait par une solution aqueuse à 10 % de bicarbonate de soude et obtient après purification par la chromatographie liquide haute pression 25 sur silice en éluant par un mélange chloroforme/méthanol à 5 % d'eau ( 99/1) et obtient 50,3 mg de produit cherché, dont l'activité spécifique est de 37 Ci/mmol. La chromatographie sur couche mince de silice, en éluant par le mélange cyclohexane/acétate d'éthyle ( 1-1) donne un produit dont Rf= 0, 15. REVENDICATIONS 1) Stéroides radioactifs de formule générale (I): RO OR 1 C C-CH 3 (T) C H 3 dans laquelle 3 H représente le tritium,R et R 1, semblables ou différents, représentent de l'hydrogène, un radical alcoyle ayant de 1 à 10 6 atomes de carbone ou un radical acyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, 2) Le llf,17 -dihydroxy 6-méthyl-3 H 3-17 " -(prop-l-ynyl)androsta-1,4,6trièn-3-one. 3) Procédé de préparation des produits définis aux revendications 1 et 2 caractérisé en ce que l'on fait réagir un produit de for15 mule générale (II): RO O R dans laquelle R a les significations indiquées à la revendication 1 et R 2 représente un groupement alcoxy ayant de 1 à 6 atomes de carbone, un groupement acyloxy ayant de 2 à 12 atomes de carbone, ou R 2 représente le reste d'une amine secondaire cyclique, avec un agent d'halogéno méthylation, obtient un produit de formule générale (III): RO O (III) CX 2 dans laquelle X représente un halogène, que l'on réduit par action du tritium en présence d'un catalyseur, bloque en milieu acide la fonction cétone en 3 du produit de formule générale (IV) résultant: RO O | J (IV) A C 3 H 3 au moyen d'un agent de 0-alkylation de formule H-C(OR 3)3 dans laquelle R 3 représente un groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone, obtient un produit de formule générale (V) RO j O () R 3 C H 3 dans laquelle R et R 3 ont les significations précitées, soumet ce dernier à l'action d'un agent de propynylation, fait agir sur un produit de formule générale (VI) résultant: RO OH t"f,'t C -= C-CH 3 (vi) R 2 D * R 30 CH C H 3 un agent de déshydrogénation et obtient un produit de formule générale (I) dans laquelle R 1 représente un atome d'hydrogène que, le cas échéant, si R n'est pas un atome d'hydrogène, on ethérifie ou estérifie 25 la fonction hydroxyle en 17/, et si R représente de l'hydrogène, on éthérifie ou estérifie sélectivement l'une ou l'autre des fonctions hydroxyles en 11/ilp et 17/f, ou éthérifie ou estérifie les deux fonctions hydroxyles en 11/et 17/ 4) Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que: l'agent d'halogénométhylation est le tètrabromure de carbone et on opère sous atmosphère inerte dans le dioxanne en présence de pyridine, à température ambiante puis à température du reflux du mélange réactionnel; ) Procédé selon les revendications 3 et 4 caractérisé en ce que: le catalyseur en présence duquel on fait agir le tritium est l'hydroxyde 35 de palladium et on opère dans le dioxanne en présence de triéthylamine; 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5 caractérisé en ce que: l'agent de O-alkylation de la fonction cétone en 3 du produit de formule générale (IV) est l'orthoformiate d'éthyle et on opère sous atmosphère inerte en milieu acide; 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6 caractérisé en ce que: l'agent de propynylation que l'on fait agir sur le produit de formule générale (Y) est le bromure de propyne-1-yle magnésium et on opère sous atmosphère inerte dans le tétrahydrofuran; 8) Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 7 caractérisé en ce que: l'agent de déshydrogénation que l'on fait agir sur le produit de formule générale (VI) est la dichlorodicyanoquinone et on opère sous atmosphère inerte dans un solvant aromatique ou chloré, tel que le benzène ou le chlorure de méthylène. 9) Application des produits tels que définis par la formule générale (I) 15 de la revendication 1 et notamment du 11,17/3-dihydroxy 6-méthyl3 H 317 sites de fixation des glucocorticoîdes. ) Moyen pour la mise en évidence des récepteurs de glucocortico Tdes et 20 pour le dosage du nombre de sites de fixation des glucocortico 7 des comportant un produit tel que défini par la formule générale (I) de la revendication 1 et notamment le 11,17,8-dihydoxy-6-méthyl-3 H 3-17 " (prop-1-ynyl)androsta-1,4,6-tri èn-3-oneo 11) A titre de produits intermédiaires nécessaires à l'exécution du 25 procédé selon les revendications 3,4,5,6,7 ou 8: le 11/8 -hydroxy-6-dibromométhyl ène-androsta-4-èn-3,17-dione; le 11/ hydroxy-6-méthyl-3 H 3-andrôsta-4-èn-3,17-dione; le 3-éthoxy-11 -hydroxy6-méthyl-3 H 3-androsta-3,5-dièn-17-one; le 3-éthoxy-11/l,17/ -dihydroxy-6-méthyl-3 H 3-17 " -( 1-propynyl) 30 androsta-3,5-diène.