FR 2542744 A2 19840921 FR 8304123 A 19830314 Le présent certificat d'addition au brevet 82 20274 a pour objet un 3 ',5 '-diarabinoside,sa préparation et son applica- tion en thérapeutique. Le dinucléotide de l'invention est constitué par deux motifs Ara A (Adenine Arabinoside ou 9-e-D-arabinofuranosyl-adénine) liés par un groupe phosphate en 3 ',5 '. Le dinucléotide Ara A-p-Ara A ne possède qu'une seule charge électrique pour deux molécules de nucléosides et a une solubi- lité satisfaisante, beaucoup plus grande que celle du 5 '-mono- phosphate du nucléoside de base. Le composé de l'invention est préparé selon le schéma réaction- nel suivant: dans un premier temps on prépare le synthon de départ portant un groupe OH libre en 3 ' (figure 1), puis dans un deuxième temps on prépare le synthon de départ portant un groupe OH libre en 5 ' (figure 2), et enfin on prépare le dinucléotide Ara A-p-Ara A (schémas réactionnels 3, 4 et 5) par la méthode aux phosphotriesters qui nécessite deux étapes: la première étape consiste en une phosphorylation du syn- thon portant un OH libre en 3 ' (figure 3) la deuxième étape consiste en une condensation du diester ainsi obtenu et du nucléoside à l'aide d'un agent de conden- sation qui est par exemple le mésitylènesufonyl-l nitro-3 trazole-1, 2, 4 (MSNT) (figure 4); Puis en la déprotection des dimères que l'on obtient finalement sous la forme de sel de triéthylammonium (figure 5). La phosphorylation du synthon portant un OH libre en 3 ' peut être effectuée par un agent phosphorylant bifonctionnel tel que l'o-chloro-phényl-phosphorodichloridate. La réaction du dérivé nucléosidique p Totégé en 2 ' et 5 ' ( 6) avec un excès d'o-chlorophényl phosphorodi-(tria) zol-l, 2, 4 ide) ( 19) préparé in situ dans la pyridine con- duit, après traitement avec de la triethylamine, au phospho- diester ( 20 a) Ce dernier a été isolé sous la forme de sel de triethylammonium après extraction au chloroforme et préci- pitation dans de l'éther de pétrole (figure 3). Dans la deuxième étape, l'agent de condensation choisi est le mésitylène sulfonyl-1 nitro-3 trazole-l,2,4 (MSNT). Une solution, dans de la pyridine du nucléoside phosphodies- ter ( 20 a) et du synthon ( 15) est traitée par 2,5 à 3 équiva- lents de -SNT durant 45 mn à la température ambiante. Le mélange réactionnel brut est ensuite versé dans une solution aqueuse saturée d'hydrogénocarbonate de sodium, et extrait au chloroforme (figure). Le dinucléoside monophosphate (-21 a) est obtenu après purifi- cation sur colonne de gel de silice et précipitation dans de l'éther de pétrole. La déprotection du composé ( 21 a) a-été effectuée de la manière suivante: les groupements 0-chlorophényles sont débloqués par une solution de nitro-4 benzaldoxime ( 0,3 M) et de triéthylamine ( 0,3 M) dans un mélange dioxanne-eau ( 1/1, V/V) pendant 24 h A 35 C; les groupes benzoyles sont éliminés par l'ammoniaque à 50 C pendant 24 h; le groupe monométhoxytrityle est hydrolysé par de l'acide acétique à 80 % pendant 1 h 15 mn. Après extraction, le dimère ( 22 a) est purifié sur colonne de DEAESephadex A 25, puis repurifié par HPLC semi préparative sur colonne C 18 en phase inverse avec un gradient eau/acêtonitrile (figure 5). Il est obtenu sous la forme de son sel de triéthylammo- nium. Les schémas réactionnels sont indiqués ci-dessous. Les exemples suivants illustrent l'invention. Les analyses et les spectres UV, IR et RMN confirment la structure des composés. 2 5 4 27 li 4 NH 2 e N -' N N N H C) -1 " HO HO il 1) _c_ ci- 2) Na OH NHR N N N b -,j ITIPO Si CI 2 (il NHR 1-r,,, N RO e N j N e)- i O H O O O 1 -V Dr)2 Si 1 \ 0, Si-0 (i Pr)2 3 is illun N 1 %, -;;) - m R = B -L Figure 1 NHR N N N N- 1-j Me O-tr O -1 O J,,O HO 13 NHR N a S'i / l -'i N N Me O Tr O R O R O 1 4 NHR N Y,, -l'll N N H O HO R=Bz NHP N N;j Ho - O R R O Fiqure 2 5. ci O il 0-P-N 1 \N J N -N -' ' - 1 1 N ct O il / N O-P-ct + H-N" -1 1 N ci pyridine B Me O Tr O -1 O _ JRO 1 H O =benzoyl-N arieffine R = Bz is B Me O Tr O - 1 / N o= P-N, 1 N-1 Èj 1 i()l Il B Me O T, O Et 3 N 1 H 20 pyridine N H ",-,:O 203 8 = berizoyl -t-j 6 adenine Figure 3 H O O li 4 _ _ 1 \F jo R O Bibenzoyl-N 6 adenine Me O Tr O B 1 1 + 0 = P_ O Et 3 NH u; r a B = benzoyl, N 6 adeni ne 1 __ 1 ci Ar '= - R r% 1 - Il -0 -P -0 - o Ar p r% v M Me O Tr O 1 _ 1 -OR 2 la BI B,) = benzoyl-N 6 ad 6 nine 2 5 Fiqure 4 y B 1 IL Z 542744 BBZ Me O Tr O -1 O RO 0 Sz 1 B Aro-P-0 O Il 0 -1 Rio RO N 1-1 nitro-4 benzatdoxime /TM G ou / Et 3 N 2) NH 40 H aqueux 2011/o, 5011 C, 24 h e-xla-zc-, iorP%':sDEAE 1 ,r , a 1 E 1 = 2 -CI ' N il ne B 2 = adénine H 0-1 O O 81 + 1 Et 3 N 1 C) -P-0 il 0 ( 32 - H jo H O BI = adénine 82 =adénine Ficrure s 22 a f 1 Exemple 1: $ynthon Ara-adénosine portant un groupe OH libre en 3 '. 1.1 benzoyl-N 6 arabinofuranosyl-9 adénine ( 2) A une suspension de 1 g ( 3,74 mmole) d'Arabinosyl-Adénine ( 1) dans 30 ml de pyridine anhydre, on ajoute goutte à goutte, en refroidissant, 18 ml ( 150 mmole) de chlorure de benzoyle. Après 36 heures d'agitation à la température ambiante, on ajoute 100 ml d'eau glacée Le mélange réactionnel est extrait au chloroforme ( 4 x 60 ml). La phase organique est lavée à l'hydrogénocarbonate de sodium aqueux ( 5 x 70 ml), puis à l'eau ( 5 x 50 ml), séchée sur sul- fate de sodium, filtrée, évaporée, ensuite coévaporée au to- luène ( 2 x 50 ml) - Après purification sur colonne de gel de silice (gluant CHC 13), les nucléosides obtenus sont dissous dans 25 ml de pyridine. Cette solution est ajoutée a 40 ml de Na OH ( 2 N), puis agitée durant 20 mn 80 ml de résine Dowex 50 X 2 (pyridinium) (p H = 6-7) sont ensuite ajoutés La résine est filtrée, lavée avec ( 3-x 50 ml) d'eau La phase aqueuse est extraite à l'é- ther ( 6 x 100 ml), concentrée, le précipité formé est filtré, puis cristallisé dans l'eau On obtient le composé ( 2) = 145 147 C (eau) 1.2 TIPD Si-3 ',5 ' benzoyl-N 68 D arabinofuranosyl-9 adenine( 3) A 1,98 g ( 6,71 mmole) de TIPD Si C 12, on ajoute 1,34 g ( 19,66 mmole) d'imidazole, 1,66 g ( 4,47 mmole) du composé ( 2) et 50 ml de DMF anhydre. Après une heure d'agitation à la température ambiante, on ajoute 50 ml d'eau On évapore le mélange sous pression réduite Le résidu est redissous dans 100 ml d'eau puis extrait au chloroforme ( 3 x 80 ml) La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et évaporée à sec. Apres purification sur colonne de gel de silice (éluant CHC 13/ Ac O Et, 50/50, V/V), on obtient le composé ( 3) sous la forme d'une mousse blanche. 1.3 TIPD Si-3 ',5 ' dibenzoyl-2 'N 68-D arabinofuranosyl-9 adé- nine ( 4) On agite,3 heures,à la température ambiante une solution con- tenant 2,1 g ( 3,42 mmole) du composé ( 3), 0,851 g ( 3,76 mmole) d'anhydride benzoique et 0,138 g ( 1,14 mmole) de diméthylami- no-4 pyridine dans 15 ml de pyridine anhydre. Après évaporation sous pression réduite de la pyridine, le résidu est dissous dans 100 ml de chloroforme; la solution résultante est lavée successivement avec une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium et avec de l'eau ( 2 x 100 ml). La phase organique est séchée sur sulfate de sodium, filtrée et évaporée sous pression réduite. Après chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant: CHC 13/éther, 98/2, 95/5, 90/10, V/V) le composé ( 4) est obtenu sous la forme d'une mousse blanche. 1.4 Di-benzoyl-2 ',N 6 e-D arabinofuranosyl-9 adenine ( 5) On dissout 100 mg ( 0,139 mmole) du composé ( 4) dans 6 ml d'une solution ( 0,5 M) de fluorure de tétrabutylammonium dans du tétrahydrofuranne; après 45 mn d'agitation à la température ambiante, la solution est évaporée sous pression réduite Le résidu est chromatographié sur colonne de gel de silice (éluant CHC 13/Me OH, 99/1, 98/2, V/V/) Le composé ( 5) est obtenu après précipitation dans le chloroforme. F = 124 126 C (CHC 13) 1.5 Monomethoxytrityl-5 'di-benzoyl-2 ',N 6 -D arabinofurano- syl-9 adenine ( 6) Une solution contenant 0,900 g ( 1,89 mmole) du composé ( 5) et 1,10 g ( 3,78 mmole) de chlorure de monométhoxytrityle dans 20 ml de pyridine anhydre est agitée durant 22 heures à la température ambiante à l'abri de l'humidité et de la lumière. Après addition de 150 ml d'eau glacée, le mélange réactionnel est extrait avec du chloroforme ( 3 x 70 ml) La phase organi- que est séchée sur sulfate de sodium, filtrée, évaporée à sec, puis coévaporée au toluène ( 2 x 30 mil) Le résidu est chroma- tographié sur colonne de gel de silice (éluant: CHC 13/Et 3 N /0,1, V/V/) Le produit ( 6) est obtenu après précipitation dans de l'éther de pétrole. Exemple 2 Synthon Ara-adénosine portant un groupe OH libre en 5 '. 2.1 Monomethoxytrityl-5 ' benzoyl-N 6 -D arabinofuranosyl-9 adenine ( 13) On agite une solution de 400 mg ( 1,08 mmole) du composé ( 2) et 650 mg ( 2, 16 mmole) de chlorure de monométhoxytrityle dans 7 ml de pyridine anhydre, à la température ambiante, durant 22 heures, à l'abri de l'humidité et de la lumière Apres addition de 25 ml d'eau glacée, le mélange réactionnel est extrait au chloroforme ( 3 x 15 ml) La phase organique est séchée sur sulfate de sodium, filtrée, évaporée, puis coéva- porée au toluène ( 2 x 10 ml). Le résidu est chromatographié sur colonne de gel de silice (éluant CHC 13/Me OH/Et 3 N, 98/1/1, V/V/V) On obtient le composé ( 13). 2.2 Monomethoxytrityl-5 ' tribenzoyl-21,3 ',N 6 e-D arabinofura- nosyl-9 adénine ( 14) On agite une solution de 200 mg ( 0,31 mmole) du composé ( 13) de 146 mg ( 0,69 mmole) d'anhydride benzoique et de 13 mg ( 0,10 mmole) de diméthylamino-4 pyridine dans 2 ml de pyri- dine anhydre, à la température ambiante, durant 1 h 15. Après addition de 30 ml d'hydrogénocarbonate de sodium aqueux, la solution est extraire au chloroforme ( 3 x 20 ml) La phase organique est lavée à l'eau ( 3 x 15 ml), séchée sur sulfate de sodium, filtrée, évaporée, coévaporée au toluène ( 2 x 10 ml). Le résidu est purifié sur colonne de gel de silice (éluant CHC 13/hexane/Et 3 N, 80/19/1; V/V/V). Le compose ( 14) est obtenu après précipitation dans de l'he- xane. Z 1 2.3 Tribenzoyl-2 ',3 ',N 6 -D arabinofuranosyl-9 ad"nine ( 15) On dissout 200 mg ( 0,24 mole) du composé ( 14) dans 9 ml d'un mélange chloroforme/méthanol ( 7/3, V/V) contenant 2 % d'aci- de benzène-sulfonique On agite le mélange réactionnel pen- dant 20 mn à O C On ajoute 10 ml d'hydrogénocarbonate de sodium aqueux Le mélange est extrait au chloroforme ( 3 x 8 ml). La phase organique est lavée avec 10 ml d'hydrogénocarbonate de sodium aqueux, puis avec de l'eau ( 3 x 10 ml), séchée sur sulfate de sodium, filtrée et évaporée sous pression réduite. Le résidu est purifié sur colonne de gel de silice (éluant CHC 13/Me OH, 99/1, V/V). Le produit ( 15) est obtenu après cristallisation dans de l'éthanol. F = 135 1370 C (&thanol) Exemple 3 o-Chlorophenylphosphate-3 ' (monométhoxytrityl-5 ' dibenzoyl-2 ',N 6 Ara-A) de triethylammonium( 20 a) On prépare, in situ, une solution d'o-chlorophénylphosphorodi- (triazol-l, 2,4 ide) ( 12) dans 1 ml de pyridine anhydre, à partir de 100 mg ( 0,408 mmole) d'o-chlorophénylphosphorodichlo- ridate et de 162 mg ( 2,347 mmole) de triazole-l,2,4. Apres 20 minutes d'agitation à la température ambiante, 80 mg ( 0,107 mmole) du composé( 6)sont ajoutés L'agitation est poursuivie durant 20 mn On ajoute ensuite une solution compo- sée de 0,75 ml de triéthylamine, 0,5 ml d'eau et 0,5 ml de pyridine La réaction est arrêtée 10 mn après, en ajoutant 8 ml d'hydrogénocarbonate de sodium aqueux Le mélange est extrait avec du chloroforme ( 3 x 8 ml). La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, fil- trée, évaporée, coévaporée au toluene ( 2 x 5 ml). Après purification sur colonne de gel de silice (éluant: CHC 13/Me OH/Et 3 N, 98/2/0,1 V/V/V) le composé( 20 a)est obtenu après précipitation dans de l'éther de pétrole. Rf = 0,11 (éluant CHC 13/Me OH, 90/10, V/V) U V m:ax (éthanol 95): 278 nm (t= 20 700) 232 nm max (t= 33 500) Dimère Ara A p Ara A( 21 a) complètement protégé A une solution de 106 mg (o,103 mmole) du phosphodiesteét 20 a) et de 58 mg ( 0,100 mmole) du tribenzoyl-2 ',3 ',N 6 Ara-A( 15) dans 0,5 ml de pyridine, on ajoute 91 mg ( 0,307 mmole) de mésity- lène sulfonyl-1 nitro-3 triazole-1,2,4 La réaction est arrêtée après 45 mn d'agitation à la température ambiante, en ajoutant 0,2 ml d'hydrogénocarbonate de sodium Apres 10 mn, la solu- tion obtenue est versée sur 12 ml d'hydrogénocarbonate de sodium aqueux, puis extraite au chloroforme ( 4 x 13 ml) La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée, évaporée, et coévaporée au toluène ( 2 x 5 ml) Le résidu est fractionné sur colonne de gel de silice (éluant: CHC 13/ Me OH/pyridine 99/1/0,1 V/V/V) Le dimère ( 21 a) est obtenu a- près précipitation dans de l'éther de pétrole. Rf = 0,57 deux diastéréoisomères (éluant CHC 13/ Me OH 95/5 V/V) Déprotection et purification du dimère Ara A-p-Ara A. 1 g du mélange (dimère 21 a + impureté) est co 6 vaporé à la pyridine anhydre ( 3 x 20 ml), puis dissous dans 5 ml de pyridine; on ajoute 2 ml de chlorure de benzoyle Apres 24 heures d'agitation, on ajoute 100 ml d'eau, on extrait le mélange au chloroforme ( 5 x 20 ml) La phase organique est lavée à l'eau ( 5 x 10 ml),à l'hydrogénocarbonate de sodium aqueux ( 5 x 10 ml), à l'eau ( 5 x 10 ml), séchée sur sulfate de magnésium, filtrée, évaporée, coévaporée au toluène, puis au méthanol anhydre Le résidu est dissous dans 15 ml de méthanol, puis additionné de 6 ml ( 0,92 M)-de méthylate de sodium Après 4 heures d'agitation, on neutralise avec une résine Dowex 50 W-X 2 (pyridinium), la résine est filtrée, lavée à l'eau ( 3 x 50 ml) La solution est évaporée sous pression réduite La gomme obtenue est solubilisée dans 20 ml d'eau, lavée au chloroforme ( 15 x 20 ml), à l'éther ( 10 x 20 ml). Après purification sur DEAE-sephadex A-25, avec un gradient linéaire ( 10 3 M à 0,3 M) en hydrogénocarbonate de triéthylam- donium (p H = 7,5), les fractions contenant le dimère 21 a sont repurifiées par HPLC semi pràparative sur colonne de C 18 avec un gradient linéaire (CH 3 CN 4 % à 20 %, 15 mn, débit ml/mn) évaporées, co 6 vapor es à l'eau, puis lyophilisées. On obtient ainsi le sel de trifthvlammonium ( 22 a) du dimère Ara A-p-Ara A. Le composé de l'invention a été soumis à des essais phar- macologiques montrant son intérêt dans le domaine antitumoral. L'action du composé sur le développement de la tumeur asci- tique d'Ehrlich chez la Souris a été observée. Les essais se font sur des lots de 5 ou 6 souris Swiss de 12 à 15 g Chaque animal reçoit 2 x 106 cellules malignes par voie péritonéale Le traitement débute 16 h après l'inocula- tion et consiste en 2 injections par jour de 0,75 ml d'une solution de dinucléotide à 2 mg/ml dans le péritoine c'est-à- dire 3 mg par animal et par jour ou 200 mg/kg La durée du traitement est de 4 jours. Le dinucléotide,composé de l'invention, a été testé de la manière indiquée. Les résultats sont donnés dans le tableau suivant: Z 542744 TABLEAU Le composé de l'invention possède: des propriétés antitu- morales et peut-être utilisé pour-le traitement de diver- ses maladies telles que certaines affections virales causées par des virus à ADN Herpes dans toutes ses localisations Varicelle Zona Cytomégalie Mononucléose infectieuse Hépatite B Maladies du groupe Variole-Vaccine Adénoviroses certaines affections malignes sensibles Ara A (leucémies myéloides chroniques en cours de poussées aiguës). Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être liquides ou solides et se présenter sous la forme de solutions, collyres, onguents, pommades Témoins Ara A Ara A p Ara A Durée de survie 14,67 j 20,5 j 21,17 des-Souris % d'augmentation 39,75 % 44,3 % Elles sont préparées selon les méthodes usuelles Le principe actif peut y être incorporé à des excipients pharmaceutiques habituellement utilisés dans de telles compositions et choisis en fonction de la forme galénique à réaliser Ces excipients peuvent être constituéspar des solvants aqueux ou non, des stabilisants, des mouillants, des vaselines, des lanolines, des polyéthylene -glycols, des esters d'acides gras du sorbitanne, polyhydroxyéthylés ou non. La concentration en principe actif des préparations pharma- loceutiques ainsi réalisées est variable selon la gravité des cas et le mode d'utilisation envisagé: elle peut être par exemple comprise entre 0,1 % et 5 %. Revendications 1 Dinuc-léotide de formule Ara A-p-Ara A dans laquelle Ara A est la 9-f-Darabinofuranosyl-adénine et p est le groupe monophosphate. 2 Procédé de préparation du composé selon la revendication 1, procédé caractérisé en ce que 1) on prépare le synthon adénine portant un groupe OH libre en 3 ', 2) on prépare le synthon adénine portant un groupe OH libre en 5 ', 3) on effectue la synthèse du dinucléoside monophosphate en phosphorylant le synthon portant un OH libre en 3 ' à l'aide d'un agent phosphorylant bifonctionnel, en condensant le diester obtenu avec le nucléoside àl'aide d'un agent de condensation,- et en déprotégeant le composé obtenu pour arriver au dimère cherché sous la forme de sel de triéthylammonium. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent phosphorylant bifonctionnel est l'o-chloro-phényl phosphorodichloridate. 4 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent de condensation est le mésitylène sulfonyl-l nitro-3 tiazole-l,2,4 (MSNT). Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on déprotège les groupements o-chloro-phényles par une solution de nitro-4 benzaldoxime et de triéthylamine, l'on élimine les groupes benzoyles par de l'ammoniaque l'on hydrolyse le groupe monométhoxytrityle par de l'acide acétique. 6 Médicament caractérisé en ce qu'il contient le dinucléos - de monophosphate tel que spécifié dans la revendication 1. 7 Composition pharmaceutique caractérisée ce ce qu'elle con- tient le dinucléoside monophosphate tel que spécifié dans la revendication 1 en association avec tout excipient appro- prié.