FR 2536415 A1 19840525 FR 8318369 A 19831118 25364 1 5 Procédé de synthèse enzymatique de la L-sérine La présente invention concerne un procédé de synthèse de l'acide aminé appelé L-sérine Cet acide aminé est un produit commercial de valeur qui est utilisé en hyperalimentation et dans des compositions nutritionnelles et qui est également utilisé comme intermédiaire ou comme produit de départ dans certains procédés de synthèse Il existe donc une demande pour la L-sérine, et divers procédés ont été mis au point pour la produire Un certain nombre de ces procédés mettent en jeu la production de la L-sérine par fermentation. Voir, par exemple, Morinaga, Y, et al, Agric Biol Chem. ( 6)1419-24 ( 1981; Morinaga, Y, et al, Agric Biol Chem. ( 6) 1425-1430 ( 1981) D'autre part, le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3 616 224 décrit un procédé permettant de produire divers acides aminés, y compris la sérine, par fermentation, dans lequel on cultive des Souches de certaines bactéries sur des milieux contenant du méthanol comme source de carbone assimilable Voir également le brevet des Etats- Unis d'Amérique N 3 943 038, qui décrit un procédé de préparation de la sérine et d'autres acides aminés par culture de souches spécifiques de diverses bactéries dans un milieu de culture aqueux en présence d'oxygène, d'hydrogène et de gaz carbonique. Un inconvénient commun aux procédés de fermentation enseignés par la technique antérieure est que la concentration de la L-sérine produite dans le bouillon et récupérée est relativement faible, même après des fermentations relativement longues. La sérine peut également être produite par des procédés de synthèse chimique Voir par exemple Kanedo (ed), Synthetic Production and Utilization of Amino Acids, Halsted Press Books ( 1974) Souvent, ces procédés chimiques produisent la sérine sous la forme d'un mélange racémique des isomères optiques D et L ou bien sous la forme de l'isomère D qui est le moins intéressant Les mélanges DL doivent être résolus par des procédés qui utilisent des bactéries catabolisant la D- sérine, la racémase de sérine, par acylase d'acide aminé L, par cristallisation fractionnée de dérivés de la sérine, ou par des procédés similaires, ce qui ajoute au prix de revient du produit. On sait que la Lsérine peut être produite à partir de la glycine La production biologique de L-sérine à partir de glycine a été accomplie avec plusieurs micro-organismes. Voir par exemple Tanaka, Y, et al, J Ferment Technol, 59:447 ( 1981) Comme avec les procédés de fermentation, un inconvénient de cette méthode est que le rendement de la L- sérine n'est généralement pas très élevé. Il existe donc un besoin pour un procédé de synthèse de la L-sérine avec un rendement élevé C'est par conséquent un objectif de la présente invention de mettre au point un procédé de synthèse de la L-sérine dans lequel la sérine soit produite avec une forte concentration dans une solution à partir de laquelle on puisse la récupérer efficacement. C'est également un objectif de la présente invention de procurer un moyen enzymatique de production de la L-sérine, dans lequel la réaction puisse être menée en discontinu ou dans un système immobilisé. Il a été découvert que la L-sérine pouvait être synthétisée efficacement à partir de la glycine et du formaldéhyde en présence de quantités biocatalytiques d'une enzyme, l'hydroxyméthyltransférase de sérine, et d'un co- facteur, le tétrahydrofolate, dans des conditions propres à produire de la sérine L'enzyme peut se trouver dans des cellules entières, sous la forme d'un extrait brut, ou bien sous la forme d'une enzyme purifiée et peut être sous une forme immobilisée ou non immobilisée. On sait que l'hydroxyméthyltransférase de sérine (ci-après SHMT) est une enzyme qui catalyse la coupure de la sérine en glycine dans une réaction qui dépend de deux co- facteurs, le 5 '-phosphate de pyridoxal et le tétrahydrofolate. La réaction donne de la glycine et du méthylène tétrahydro- folate Voir Schirck, L, Advances in Enzymology 53:83 ( 1982) Il a maintenant été découvert que l'enzyme SHMT / pouvait être utilisée efficacement comme biocatalyseur pour produire la L-sérine à partir de la glycine et du formaldéhyde. La réaction a lieu en présence du co-facteur tétrahydrofolate (THF) La source du THF peut être la source de la SHMT, car le THF se trouve dans les cellules de micro-organismes qui contiennent de la SHMT, ou bien le THF peut être ajouté à partir d'une source exogène L'un des avantages de ce procédé est qu'il ne produit que l'isomère optique L de la sérine Un autre avantage est que, après que la réaction s'est effectuée,- le produit du réacteur ne contient que de la glycine et de la L-sérine, et non un mélange complexe tel que celui que l'on s'attendrait à trouver dans un bouillon de fermentation ou à la suite d'une synthèse chimique. Il est surprenant que la L-sérine puisse être synthétisée à partir de la glycine et du formaldéhyde, car on sait que le formaldéhyde réagit chimiquement avec les protéines et provoque l'inactivation des enzymes (French, D., et al, Advances in Protein Chemistry 2:277-335 ( 1945). En fait, la SHMT est inactivée rapidement par le formal- déhyde Mais il a été découvert que l'on pouvait protéger l'enzyme en ajoutant au mélange réactionnel un excès du tétrahydrofolate Le THF réagit avec le formaldéhyde, protégeant ainsi l'enzyme. La modification chimique de la SHMT assure également sa stabilité et la protège d'une inactivation par le formal- déhyde A titre d'exemple, il a été constaté que la réaction d'imidoesters avec des groupements amine (voir Means, G, et al., Chemical Modification of Proteins, Holden-Day, Inc, 1971) à la surface de l'enzyme permet à cette dernière de fonctionner en présence de concentrations plus fortes du formaldéhyde que l'enzyme non modifiée. Le chemin enzymatique que l'on pense expliquer la synthèse de la L-sérine à partir de la glycine est le suivant: formaldéhyde + THF méthylèneTHF mthyl Sne-THF + glycineL-srine + THF méthylène-THF + glycine d'azote, pour éviter l'oxydation du THF. On peut faire réagir ensemble les substrats, la SHMT et le co-facteur THF de différentes façons Bien que l'ordre dans lequel les produits réagissants et les catalyseurs sont introduits ne soit pas crucial, il est préférable que la glycine et le formaldéhyde soient ajoutés lentement à la SHMT en présence du THF On mène la réaction dans des conditions propres à produire la L-sérine. Lorsqu'on utilise le gène SHMT de E coli (gly A) comme source de la SHMT, ces conditions comprennent généralement une température de réaction d'environ 4 à environ 600 C et un p H dans l'intervalle d'environ 4 à environ 11 Les conditions de réaction préférées comprennent une température d'environ 20 à environ 450 C et un p H d'environ 6 à 8,5 Si la température est inférieure à 40 C environ, la durée de la réaction est considérablement allongée, et si la température s'élève au- dessus de 60 'C environ l'enzyme risque d'être dénaturée De même, à un p H inférieur à 4 environ ou supérieur à 11 environ, l'enzyme risque d'être inactivée La SHMT est une enzyme centrale dans le métabolisme des microorganismes et des organismes supérieurs; aussi existe-t-il de nombreuses sources potentielles de l'enzyme Les limites des conditions dans lesquelles la réaction de production de la L-sérine est. menée sont liées à la source de l'enzyme utilisée A titre d'exemple, les enzymes tirées des micro-organismes thermophiles pourraient être utilisées à une température plus élevée que cela n'est possible lorsque la source de l'enzyme est E coli. L'hydroxyméthyltransférase de sérine peut éventuellement être sous la forme de cellules entières, d'un extrait brut, ou d'une enzyme purifiée L'enzyme peut être utilisée sous une forme immobilisée ou non immobilisée. L'enzyme est utilisée en quantités suffisantes pour catalyser la réaction - L'enzyme peut être tirée de micro-organismes qui ont été modifiés à l'aide de techniques classiques de manipulation génétique pour la produire avec des rendements élevés Voir Stauffer, G, et al, Gene 15:63- 72 ( 1981) On peut isoler le gène SHMT (gly A) et le cloner en un plasmide, que l'on peut alors utiliser pour transformer les cellules hôtes appropriées résultant en un haut niveau d'expression de la SHMT Les micro-organismes mutants qui ont été modifiés dans leur métabolisme de la méthionine surproduisent également la SHMT Voir Stauffer, G V, et Brenchley, J E, Genetics 88, 221 ( 1978) et Stauffer, G V, et Brenchley, J E, J. Bacteriol 129, 740 ( 1977) En utilisant des techniques de clonage des gènes, on a augmenté l'activité enzymatique jusqu'à la multiplier par vingt, ce qui peut représenter plus de 10 % des protéines solubles de la cellule Une souche de E coli (Gx 1703) transformée par un tel plasmide, plus précisément un dérivé de p BR 322 dans lequel le gène gly A a été clone, le p Gx 122, a été déposée au Northern Regional Research Laboratory de Peoria, Illinois sous le n NRRL B-15215 Une souche de Klebsiella aerogenes (Gx 1704) transformée par un plasmide similaire mais plus petit, avec une altération provoquant un grand nombre de réplication, le p Gx 139, a été déposée à l'American Type Culture Collection de Rockville, Maryland sous le n ATCC 39214, et une souche de Salmonella typhimurium (Gx 1682) transformée par le p Gx 139 a été déposée sous le N ATCC 39215. De plus, lorsque le gène provient d'une source telle que E coli, il peut être modifié par mutagenèse aléa- toire ou mutagenèse dirigée sur le site de façon à produire une enzyme ayant une plus grande stabilité Ou bien, le gène peut être obtenu par synthèse chimique totale avec des modifications multiples pour améliorer la stabilité de l'enzyme au cours du procédé décrit. L'utilisation de cellules entières peut constituer une source de THF Le cas échéant, on peut ajouter un supplément de THF pour atteindre des niveaux de saturation, qui dépendent du p H et de la température A titre d'exemple, à un p H de 7,5 environ et à une température de réaction de 37 C environ, en solution aqueuse, on peut ajouter le THF de façon à atteindre une concentration bien supérieure à 50 m M. Le p H doit être ajusté tandis que le THF se dissout Si la SHMT est ajoutée sous la forme d'un extrait brut ou d'une enzyme purifiée, une source indépendante de THF est nécessaire. La quantité de THF qui peut être ajoutée varie avec la- température, les conditions du solvant et le p H auquel la réaction est menée. Il a été découvert que le THF conservait son activité vis-à-vis de la SHMT lorsqu'il était immobilisé Il est avantageux d'immobiliser le THF en le fixant sur un support qui peut être conservé à l'intérieur d'un bioréacteur utilisé pour mener la réaction, car cela favorise l'utilisation répétée du co-facteur après que la synthèse de la L-sérine est terminée A titre d'exemple, le THF peut être immobilisé avec des polymères solubles, tels que le dextrane, le polyéthylène glycol ou la polyéthylène-imine. L'immobilisation se fait par liaison covalente dans les deux premiers cas et par interaction ionique dans le troisième La liaison covalente se fait généralement par l'intermédiaire des groupements carboxyle du THF avec un groupement amine du support Ou bien, en utilisant des modes de liaison similaires, on peut également fixer le THF sur un support insoluble. Ou bien, si la sérine est synthétisée selon un procédé discontinu, il est possible de recycler le THF A titre d'exemple, après que la L-sérine a été synthétisée, on peut faire passer la solution réactionnelle sur du charbon actif ou dans une colonne d'échange d'ions, qui retiendront et sépareront le THF de la solution de L-sérine produite On peut ensuite libérer le THF et le neutraliser Ou bien, on peut modifier le THF en le fixant par liaison covalente sur une petite nrolécule, telle que la glucosamine, pour faciliter la récupération du co-facteur Après que la L- sérine a été synthétisée, on fait passer la solution qui sort du réacteur sur une colonne de borate Le borate se fixe uniquement sur la combinaison THF-glucosamine, et le THF modifié peut être libéré et recyclé. On ajoute de préférence la glycine et le formal- déhyde au mélange de tétrahydrofolate et de SHMT La quantité de glycine que l'on peut ajouter varie avec le p H, la température et les conditions du solvant de la réaction, mais on peut généralement l'ajouter jusqu'à ce que le niveau de saturation soit atteint. Comme indiqué précédemment, le formaldéhyde peut être très toxique vis-à-vis de la SHM To C'est pourquoi, généralement, on ajoute le formaldéhyde lentement aux autres composants, et on régule son addition On ajoute le formal- déhyde en quantité suffisante pour conserver l'activité enzymatique, généralement de façon à maintenir une concentration supérieure de moins de 10 m M environ à la concentration de THF utilisée, encore que l'on puisse ajouter le formaldéhyde de façon à maintenir une concentration supérieure de pas moins de 50 m M environ à la concentration de THF utilisée Plus la concentration du THF dans le système est grande, plus la concentration du formaldéhyde peut être maintenue élevée, car le THF réagit favorablement avec le formaldéhyde, protégeant ainsi l'enzyme Le mécanisme de la réaction du THF et du formaldéhyde est décrit par Kallen, R.G, et al, J Biol Chem 241 ( 24) 5851-5863 ( 1966) Plus l'activité de l'enzyme est grande dans le réacteur, plus on ajoute rapidement le formaldéhyde pour maintenir la concentration voulue. -25 Il a également été découvert qu'il pouvait être avantageux d'ajouter un second co-facteur de la SHMT, le 5 '- phosphate de pyridoxal, aux produits réagissants Le 5 '- phosphate de pyridoxal se fixe étroitement à l'enzyme Si la L-sérine est synthétisée dans un réacteur sur un laps de temps prolongé, le phosphate de pyridoxal peut disparaître ou s'inactiver, auquel cas on peut ajouter un supplément de phosphate de pyridoxal La disparition du co-facteur pendant la synthèse est indiquée par la disparition de la couleur jaune de la solution de réaction et par la perte d'activité de l'hydroxyméthyltransférase de sérine La concentration du phosphate de pyridoxal ajouté au mélange réactionnel peut varier de O à environ 20 m M, suivant les besoins, et est de préférence d'environ 0,1 m M à environ 1 m M. 25364 15 L'addition d'un excès de phosphate de pyridoxal peut remplir une fonction supplémentaire Il a été découvert que dans certains micro-organismes qui ont été transformés par des plasmides contenant le gène gly A et qui expriment des hauts niveaux de SHMT, l'addition de 5 '-phosphate de pyridoxal est nécessaire pour saturer la SHMT présente et améliorer l'activité enzymatique observée L'un de ces micro-organismes est Klebsiella aerogenes contenant le plasmide p Gx 139 identifié ci-dessus. La réaction de synthèse peut être menée en présence de n'importe quel solvant non délétère Des exemples de ces solvants comprennent ll'éthanol, le méthanol, l'isopropanol et le dioxanne. Les exemples suivants sont destinés à décrire l'invention plus en détail. EXEMPLE 1 On a cultivé des souches bactériennes' avec et sans plasmide p Gx 139 dans un milieu LB ( 10 g/litre de tryptone Bacto, 5 g/litre d'extrait de levure, 5 g/litre de chlorure de sodium) ou dans un milieu minimal ( 10,5 g/litre de K 2 HPO 4, 4,5 g/litre de KH 2 PO 4, 1,0 g/litre de (NH 4)2 SO 4 et 0,5 g/litre de citrate de sodium bihydraté), supplémenté par 0,4 % de glucose ou de lactose On a ajouté 20 mg/ml d'acides aminés et 1 gg/ml de vitamines dans les cas indiqués L'activité spécifique de l'hydroxyméthyltransférase de sérine est exprimée en nmoles de f-phényl sérine transformée en benz- aldéhyde et en glycine par minute et par mg de protéines extrayables après sonication des cellules. On a procédé aux dosages dans 50 m M de tampon de phosphate à p H 7,3 avec Q,1 mû de phosphate de pyridoxal et m M de g-phénylsérine à 20 C L'apparition du benzaldéhyde était surveillée à 279 n M dans un spectrophotomètre d'enregistrement. SHMT spécifique (nmoles/mn/mg) Plasmide p Gx 139 p Gx 139 p Gx 122 Milieu LB 39 - Milieu minimal N.D * N. D. Supplément glucose, phénylalanine, thiamine glucose, phénylalanine, thiamine Salmonella typhimurium LT 2 GX 1682 28 10 glucose, tryptophane 17 lactose, tryptophane GX 1682 p Gx 139 152 133 glucose, tryptophane 306 lactose, tryptophane Klebsiella aerogenes GX 1704 36 N D. GX 1704 p Gx 139 590 114 glucose 223 108 lactose Souche Génotype E coli GX 1698 trp EA, tna 2, ser B, lac Iq ts 402 GX 1671 thi, ara, str R, gly A, lser B trp Rl, lac Iql, lac Z::tn 5 GX 1703 gly A, phe A, thi, lac, ara, str R Salmonella typhimurium LT 2 GX 1682 trp BEDC 43, F' lac Iq ts 420 pro Klebsiella aerogenes GX 1704 lsd (mutant de désaminase de L- sérine) * non déterminé La souche GX 1671 de E coli, qui contient le plasmide p Gx 139, est une souche supplémentaire représentative qui a été utilisée comme source de SHMT dans le procédé selon la présente invention. Activité Souche E coli GX 1698 GX 1671 GX 1703 GX 1703 2536-415 ' EXEMPLE 2 On a inoculé une colonie de souche GX 1703 d'Escherichia coli (contenant du p Gx 122), qui a été déposée sous le N NRRL B-15215, dans 100 ml du milieu de culture I décrit ci-dessous, et on a secoué à 37 C pendant une nuit. Milieu de culture I: K 2 HPO 4 10,5 g/1 KH 2 PO 4,5 g/l 2 / (NH 4)2 SO 4 1 g/1 Citrate de sodium 2 H 20 0,5 g/l Phénylalanine 20 gg/ml Vitamine Bl 1 ig/ml Ampicilline 100 _g/ml Mg S 2 m M Me SO 4 Fe SO 4 5 mg/ml On a recueilli les cellules par centrifugation du milieu de culture des cellules et on les a utilisées comme source de l'enzyme On a mélangé de la glycine ( 12 m M, concentration finale) avec du tétrahydrofolate ( 5 m M, concentration finale), du phosphate de pyridoxal ( 1 m M) et du formaldéhyde ( 10 m M, concentration finale) sous azote On a maintenu le p H à 7,6 avec un tampon de phosphate de potassium 0,1 M, et le volume final de ce mélange réactionnel était de ml On a fait démarrer la réaction en mélangeant la solution réactionnelle susmentionnée et les cellules à 37 C en secouant Au bout de 8 heures, 5 m M de sérine ont été produites (le rendement était de 45 % par rapport à la glycine) La totalité de l'activité enzymatique s'était conservée On a déterminé la concentration de la glycine et de la sérine par chromatographie liquide à haute performance. EXEMPLE 3 On a inoculé une colonie de souche GX 1704 de Klebsiella aerogenes (contenant du p Gx 139), qui a été déposée sous le N ATCC 39214, dans 100 ml du milieu de culture II décrit ci-dessous, et on a secoué à 30 C pendant une nuit. Milieu de culture II Tryptone 10 g/l Na Cl 10 g/l Extrait de'levure 5 g/l Glucose 10 g/l On a recueilli les cellules par centrifugation du milieu de culture des cellules et on les a utilisées comme source de l'enzyme. On a suivi le mode opératoire de l'Exemple 2 pour la production de la sérine, à cela près que l'on a utilisé Klebsiella aerogenes à la place de Eo coli Au bout de 8 heures, 7 m M de sérine ont été produites (le rendement était de 64 % par rapport à la glycine) La totalité de l'activité enzymatique s'est conservée. EXEMPLE 4 On a suivi le mode opératoire de l'Exemple 2, à cela près que l'on a utilisé de l'hydroxyméthyltransférase de sérine partiellement purifiée provenant de E coli (souche GX 1703) On a brisé les cellules par sonification à 4 Co On a mélangé le surnageant recueilli après centrifugation avec du sulfate d'ammonium ( 50 % de saturation) à 4 C et à p H 7,5. Après avoir séparé le solide par centrifugation, on a expulsé l'enzyme de la solution en portant la teneur en sulfate d'ammonium à 100 % de la saturation On a recueilli l'enzyme par centrifugation et on l'a dialysée 10 m M de sérine ont été produites après 4 heures de réaction Le rendement était de % par rapport à la glycine Toute l'activité enzymatique s'est conservée. EXEMPLE 5 On a suivi le mode opératoire de l'Exemple 3, à cela près que la concentration initiale de la glycine était de 340 m M et que l'on a introduit le formaldéhyde (concentration initiale de 2 M) à un débit de 1 ml/heure Au bout de 12 heures, 119 m M de sérine ont été produites. EXEMPLE 6 On a suivi le mode opératoire de l'Exemple 3, à cela près que l'on a introduit la glycine (concentration initiale de 2 M) et le formaldéhyde (concentration initiale de 2 M) au même débit de 1 ml par heure Au bout de 5 heures, 57 m M de sérine ont été produites. EXEMPLE 7 On a suivi le mode opératoire de l'Exemple 3, à cela près que le THF était modifié On a dissous du dextrane ( 5 g, Pharmacia T 40) dans de l'eau jusqu'à une concentration finale de 5 % On a oxydé la solution de dextrane avec du Na IO 4 0,1 M pendant une heure à la température ambiante On a fait précipiter le dextrane oxydé en ajoutant de l'éthanol à 60 % (volume/volume) On a répété cette opération deux fois On a dissous le dextrane oxydé dans 100 ml de 1,6-hexanediamine (HMD) 0,2 M à p H 9,0 On a ajouté du borohydrure de sodium ( 0,2 g) au bout de 30 et 60 minutes respectivement On a dialysé le HMD-dextrane avec de l'eau pendant une nuit et on l'a lyophilisé On a mélangé du THF ( 5 m M) avec 10 m M de 1- éthyl-3-( 3-diméthylaminopropyl) carbodiimide et du HMD- dextrane à 0,5 % à p H 7,0 sous atmosphère d'azote On a recueilli par centrifugation le précipité formé et on l'a lavé deux fois avec une solution de chlorure de sodium 0,5 M. On a mélangé le THF solide avec le mélange réactionnel comme décrit à l'Exemple 3 Après trois heures de réaction, 7 m M de sérine ont été produites. REVENDICATIONS 1 Procédé de synthèse de la L-sérine, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir la glycine et le formal- déhyde en présence de quantités biocatalytiques d'hydroxyméthyltransférase de sérine et de tétrahydrofolate dans des conditions propres à produire de la L-sérine. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on maintient la température entre 4 C environ et 60 C environ et le p H entre 4 environ et 11 environ, 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la température est comprise entre 20 C environ et C environ et le p H entre 6 environ et 8,5 environ. 4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'hydroxyméthyltransférase de sérine est contenue dans des cellules entières. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'hydroxyméthyltransférase de sérine est sous la forme d'un extrait brut. 6 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'hydroxyméthyltransférase de sérine est sous la forme d'une enzyme purifiée. 7 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'hydroxyméthyltransférase de sérine est immobilisée. 8 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on mène la réaction en discontinu. 9 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on mène la réaction en continu. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la source de tétrahydrofolate est constituée par des cellules microbiennes entières contenant de l'hydroxyméthyl- transférase de sérine. 11 Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'on ajoute un supplément de tétrahydrofolate au mélange réactionnel pour porter la concentration du tétrahydrofolate au maximum du niveau de saturation. 12 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration du tétrahydrofolate est comprise entre 0,15 m M environ et 50 m M environ. 13 Procédé en ce qu'on immobilise 14 Procédé en ce qu'on immobilise polymère soluble. Procédé en ce qu'on immobilise un support solide. 16 Procédé en ce qu'on modifie le l'on peut le recycler. 17 Procédé selon la revendication 1, caractérisé le tétrahydrofolate. selon la revendication 13, caractérisé le tétrahydrofolate à l'aide d'un selon la revendication 13, caractérisé le tétrahydrofolate en le fixant sur selon la revendication 1, caractérisé tétrahydrofolate de telle sorte que selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on ajoute de la glycine jusqu'à ce que la solution de réaction soit saturée de glycine 18 Procédé selon la revendication'1, caractérisé en ce qu'on ajoute du formaldéhyde jusqu'à une concentration maximale supérieure d'environ 30 m M à environ 50 m M à la concentration du THF. 19 Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'on porte la concentration du formaldéhyde à un état permanent dans lequel elle est supérieure d'environ m M à la concentration du THF. 20 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on ajoute du phosphate de pyridoxal aux produits réagissants, à une concentration de O à 20 m M environ. 21 Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que la concentration du phosphate de pyridoxal se situe entre 0,1 et 1,0 m M environ. 22 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la source de SHMT est la souche GX 1703 d'Escherichia coli, contenant le plasmide p Gx 122, déposée au Northern Regional Research Laboratory sous le N NRRL B-15215. 23 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la source de SHMT est la souche GX 1682 de Salmonella typhimurium, contenant le plasmide'p Gx 139, déposée à l'American Type Culture Collection sous le N ATCC 39215. 24 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la source de SHMT est la souche GX 1704 de Klebsiella aerogenes, contenant le plasmide p Gx 139, déposée à l'American Type Culture Collection sous le N ATCC 39214. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'activité de l'hydroxyméthyltransférase de sérine dans les cellules a été amplifiée par manipulation génétique. 26 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'activité de l'hydroxyméthyltransférase de sérine dans les cellules a été amplifiée par clonage du gène de l'hydroxyméthyltransférase de sérine en un plasmide, et transformation d'une cellule hôte par ce plasmide pour surproduire de l'hydroxyméthyltransférase de sérine. 27 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'hydroxyméthyltransférase de sérine est tirée d'une source biologique quelconque. 28 Procédé selon la revendication 1, caractérisé. en ce que le gène de l'hydroxyméthyltransférase de sérine a été modifié par mutagenèse aléatoire ou par mutagenèse dirigée sur le site de façon à accroître la stabilité de l'enzyme. 29 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on modifie chimiquement l'hydroxyméthyltransférase de sérine de façon à accroître la stabilité de l'enzyme. Procédé selon la revendication 29, caractérisé en ce qu'on modifie l'enzyme-en la faisant réagir avec des imido-esters. 31 Culture sensiblement pure,du point de vue biologique, de souche GX 1703 d'Escherichia coli contenant le plasmide p Gx 122. 32 Culture sensiblement pure, du point de vue biologique, de souche GX 1682 de Salmonella typhimurium contenant le plasmide p Gx 139. 33 Culture sensiblement pure, du point de vue biologique, de souche GX 1704 de Klebsiella aerogenes contenant le plasmide p Gx 139.