FR 2541579 A1 19840831 FR 8402755 A 19840223 La présente invention concerne le génie génétique et a notamment pour objet un nouvel interféron N leucocyta- ire humain et un procédé d'obtention de celui-ci dans les cellules bactériennes L'interféron N leucocytaire humain présente une activité antivirale et peut trouver des applications en médecine en tant qu'agent antiviral, antibactérien et antitumoral. Les interférons, y compris l'interféron leucocytaire, constituent une classe de protéines inductibles des vertebrés, manifestant une activité antivirale et antibac- térienne, participant à la régulation des réactions immu- nologiques de la cellule et possédant une action radiopro- tectrice et antitumorale Les interférons leucocytaires de l'homme constituent une famille multigène ayant au moins 12 membres; ce qui a été confirmé par l'analyse de la structure de l'ADN et du k-ADN chromosomique, synthétisé sur le m-ARN des interférons, et également par l'analyse de la séquence des acides aminés des protéines individuelles à partir d'un mélange hétérogène d'interférons leucocytaires de l'homme. On connait divers interférons leucocytaires humains obtenus par voie microbiologique, par exemple l'interféron A produit par l'ADN de recombinaison dans les cellules de E.coli (Goeddel Do V et al, 'Human leukocyte interferon produced by E coli is biologically active", "Nature", 1980, 287, 411-416), ou l'interféron leucocytaire humain F (Ovchinnikov Jur A et al "Expression directe du gêne de l'interféron leucocytaire F humain dans les cellules de E.coli", "'Doklady Akademii Nauk", 1982, 265, 238-242), interféron qui est une protéine renfermant 166 acides aminés dont la séquence est la suivante: CDLPQTHSLGNRRALITJLAQMGRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISV LHEMIQQTFNI ?STKDSSATWEQSLLEKFSTELNQQLNDMEACVIQEVGVEETPLM NVDSILAVKEYQRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSKIFQERLRRKE A ala; C cys; D asp; E glu; F phe; G gly; H his; I ile; K lys; L leu; M met; N asn; P pro; Q gln; R arg; S ser; T thr; V val; W trp; Y tyr. Pour obtenir l'interféron F, on prépare l'ARN informateur à partir des leucocytes du sang humain, inoculés avec le virus de Newcastle, par la méthode au guanidinechlo- rure-guanidinethiocyanate On obtient la fraction poly-A de m-ARN par purification double sur l'oligo-d T-cellulose. On réalise la synthèse de k-ADN en utilisant un oligonu- cléotide synthétique complémentaire du gène de l'interféron dans le domaine de la terminaison de transfert On réalise la synthèse de la deuxième chaîne à l'aide du fragment de Klenov de l'ADN I-polymérase L'ADN à double chaîne obtenu de cette façon est incorporé, après reconstruction, dans le plasmide vectoriel p BR 322 sous contrôle d'un promoteur au tryptophane On transforme les cellules de E coli avec le plasmide de recombinaison précité. Les interférons leucocytaires humains indiqués se distinguent entre eux tant par leur efficacité dans la suppression de l'action cytopathique du même virus que par leur activité vis-à-vis de divers virus. On s'est donc proposé de créer un nouvel interféron leucocytaire humain présentant une spécificité d'action antivirale et antiprolifère. Ce problème est résolu du fait que, suivant l'invention, l'interféron N est une protéine dont la séquence des acides aminés est la suivante: CDLPQTHSLGNRRALILLAQMGRISHFSCLKDRYDFGFPQEVFDGNQFQKAQAISAF HEMIQQTFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYIELFQQLNDLEACVTQEVGVEEIALMNE DSILAVRKYFQRITLYLMGKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSFSTNLQRGLRRKD L'interféron N leucocytaire humain revendiqué est nouveau et n'est pas décrit dans la littérature. Le nouvel interféron N leucocytaire humain revendi- qué présente une spécificité d'action antivirale et antiprolifère L'utilisation de ce nouveau type d'interféron permettra d'élargir l'arsenal desmoyens d'action sélective sur les virus et les néoformations malignes. Le procédé d'obtention de l'interféron N leucocytaire humain revendiqué, consistant en une séparation du poly(A)- m-ARN matriciel à partir de leucocytes inoculés ou infectés de l'homme, et une synthèse du gène de l'interféron, en son incorporation, sous contr 81 e d'un promoteur au tryptophane, dans le plasmide vectoriel p BR 322, et en une transformation de l'ADN de recombinaison de cellules de bactéries E coli obtenu, caractérisé, suivant l'invention, en ce qu'on utilise en qualité de gène d'interféron le gène de l'interféron N à structure primaire de l'ADN suivante: TGT GAT CTG CCT CAG ACT CAC AGC CTG GGT AAT AGG AGG GCC TTG ATA CTC CTG GCA CAA ATG GGA AGA ATC TCT CAT TTC TCC TGC CTG AAG GAC AGA TAT GAT TTC GGA TTC CCC CAG GAG GTG TTT GAT GGC AAC CAG TTC CAG AAG GCT CAA GCC ATC TCT GCC TTC CAT GAG ATG ATC CAG CAG ACC TTC AAT CTC TTC AGC ACA AAG GAT TCA TCT GCT GCT TGG GAT GAG ACC CTC CTA GAC AAA TTC TAC ATT GAA CTT TTC CAG CAA CTG AAT GAC CTA GAA GCC TGT GTG ACA CAG GAG GTT GGG GTG GAA GAG ATT GCC CTG ATG AAT GAG GAC TCC ATC CTG GCT GTG AGG AAA TAC TTT CAA AGA ATC ACT CTT TAT CTG ATG GGG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG GTT GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA TCC TTC TCT TTT TCT ACA AAC TTG CAA AAA GGA TTA AGA AGG AAG GAT L'invention sera mieux comprise et d'autres buts, détails et avantages de celle-ci apparaîtront mieux à la lumière de la description explicative qui va suivre d'un exemple concret mais non limitatif de réalisation de l'invention. Exemple 1 Isolement, purification et caractéristique du poly (A)-m-ARN 1,4 '1010 leucocytes purifiés du sang humain, inoculés avec le virus Senday(Cantell K et al, "Meth Enz ", 1981, 78, part A, 29-38) sont précipités par centrifugation après 4,5 heures d'incubation ( 30 min, 1500 tr/min) et sont mis en suspension dans 100 ml d'une solution à 0,85 % de Na Cl On isole le poly(A)-m-ARN de la suspension de leucocytes et on le purifie suivant la méthode décrite (Nagata S et al, "Nature", 1980, 284,316-320), comprenant une chromatographie d'affinité sur l'oligo-d T-cellulose, un fractionnement du saccharose dans le Iradient linéaire ( 5-20 %), et une concentration de la fraction 12 S sur l'oligo-d T-cellulose L'activité de la matrice dans les oocystes de Xenopus laevis sert de critère de la qualité du poly(A)-m-ARN, qui est de 3000 unités d'activité de l'interféron par microgramme d'ARN, le rendement moyen en 125 poly(A)-mARN étant de 4 à 5 microgrammes. 2 Synthèse de k-ADN sur la matrice de poly(A)-m-ARN. a) Synthèse de k-ADN à chaîne unique Le mélange réactionnel ( 600/1) contient: 50 m M de tris-H Cl(p H 8,1), 6 m M de Mg C 12,5 m M de dithiothreite, 150 m M de K Cl, un mélange de L 3 Hl d CTR, d ATP, d TTP, d GTP à réison de 0,5 m M chaque, 7,,4 g/ml de poly(A)-m-ARN, / g/ml d'oligo/dt 12-18 et 200 unités d'activité/ml de transcryptase inverse AMV On conduit la réaction pendant 1 heure à 42 C La synthèse terminée, on ajoute EDTA ( éhylènediamine-tetraacétate) au mélange jusqu'à une concentration de 10 m M, on déprotéinise le mélange avec un volume de phénol-CH C 13 (l:l), et on fait passer le milieu aqueux à travers une colonne ( 0,4 15 cm) de Séphadex G 50 dans 10 m M de tris-H Cl (p H 7,5), 0,25 M de Na Cl On fait précipiter le complexe k-ADN avec le poly(A)-mARN par l'éthanol dans les fractions et on dissout le résidu dans 50/1 de H 20 On ajoute à la solution 5,11 l de solution 5 N de Na OH et, après incu- bation pendant 40 minutes-à la température de 20 C, on neutralise la solution avec 8,5/ 1 de solution 3 M d'acétate de sodium (p H 4,5), on ajoute 3041 de H 20 et on fait précipiter le k-ADN à chaîne unique dans l'éthanol. b) Synthèse de k-ADN à deux chaînes On dissout le précipité de k-ADN à chaîne unique dans 100/1 l d'un mélange réactionnel (Kurtz D T et al, "Gene", 1981, 13, 145-152) contenant 50 m M de tampon potassium-phosphate (p H 7,4), 5 m M de Mg C 12,1 m M de 2-mercapto-éthanol, un mélange de L 6 32 pi d TT Pl d ATP, d CTP, d GTP à raison de 50 m M chaque, 100 unités activité/ml d'ADN-polymérase I (fragment de Klenov)/et on réalise une incubation pendant 30 minutes à 37 C La réaction terminée, on sépare le produit de la synthèse comme décrit au paragraphe 2 a ci-dessus Apres chromatographie sur Séphadex G 50, on fait passer en solution la fraction macromoléculaire ( 850 1 l), contenant 30 m M d'acétate de sodium (p H 4, 5); 0,3 M de Na Cl, 3 m M de Zn SO 4, 2//g/ml de t-ARN de E coli et 115 unités activité/ml de nucléase Si On effectue l'incubation du mélange pendant 30 minutes à la température de 370 C et on isole le k-ADN à deux chaînes comme décrit au paragraphe 2 a ci-dessus. 3 Clonage dans les cellules de E coli k-12 RRI des plasmides vectoriels p BR 322 portant en Pst I "site" des gènes d'interféron incorporés par la méthode à l'oligo(d C)-oligo(d G) connecteurs. a) Addition des connecteurs On incorpore les oligo (d C) connecteurs dans k-ADN a deux chaînes de la manière suivante. A 1 d'un mélange réactionnel contiennent 140 m M de cacodylate de potassium (p H 6,9), 4//M de Zn SO 4, 0,8 m M de 2-mercapto-éthanol, 0,4 m M de COC 12, 0,1 m M l 3 Hl de d CTP, 100 mg de k-ADN à deux chaines et 50 unités acti- vité/ml de désoxynucléotidyletransf Orase terminale. Apres incubation pendant 5 minutes à 37 "C, on isole le produit de la réaction par la méthode décrite dans le point 2 a. On ajoute les oligo(d G) connecteurs au plasmide p BR 322 dédoublé par restrictase Pst I de la façon suivante. /1 l d'un mélange réactionnel contiennent 200 m M de cacodylate de potassium (p H 6,9), 10/IM de Zn SO 4, 2 m M de 2-mercapto-éthanol, 4 m M de Mg Cl 2, 1 m M de CO C 12, 0,2 m M d'ô _f 32 p J d CTP, 10/Ug de plasmide p BR 322 dédoublé par restrictase Pst I, et 400 unités activité/ml de désoxynucléotidyletransférase terminale On incube le mélange pendant 5 minutes à la température de 37 C et on isole le produit de la synthèse comme décrit au paragraphe 2 a ci-dessus. Dans les conditions de réaction indiquées, 15-20 unités monomères de d CMP et d CMP, respectivement, sont fixées à la molécule de k-ADN à deux chaînes et au plasmide p BR 322 dédoublé. b) Clonage des ADN de recombinaison dans les cellules de E coli K-12 RRI. On chauffe 20/Il d'une solution de 6 ng de k-ADN et de 40 ng de vecteur, obtenus comme décrit au paragraphe 3 a dans 10 m M de tris-H Cl (p H 7,5), 0,1 M de Na Cl et lm M d'EDTA, pendant 10 minutes à la température de 65 C et pen- dant 2 heures à la température de 42 C, on refroidit pendant 3 heures jusqu'à 22 C et on utilise pour la transformation d'après la méthode (Dagert M et al,"Gene", 1979, 6, 23-28) des cellules de E coli K -12 RRI (F, pro, leu, thi, lac yl, str,,r k' mk, endo I) On obtient ainsi 1200 tétracyclines ( 5 Xg/ml) transformées stables, dont 98 % manifestent l'ampicilline-sensibilité et sont utilisés pour le screening de recombinants. 4 Prélèvement des ADN de recombinaison portant les gènes de l'interféron leucocytaire humain. a) On réalise le prélèvement des ADN de recombinaison portant les gènes de l'interféron leucocytaire humain à l'aide de sondes d'oligonucléotides synthétiques à 16 membres marqués au l 32 Pl, de séquence: d TCTCATCATTTCTCCT(A) et d CCTCTCATCTCCCTCA(B), complémentaires aux fragments conservatifs des nucléotides 504-519 de la chaîne codifiante et des nucleotides 68-83 de la chaîne non codifiante, respectivement, caractéristiques de la plupart des gènes de l'interféron leucocytaire de l'homme (Goeddel D V et al, "Nature", 1981, 290, 20-26) Pour introduire la marque 5 ' terminale, on fait incuber 30 mmoles d'oligonucléotide pendant 30 minutes à la tempéra- ture de 370 C dans 20/1 d'un mélange réactionnel contenant m M de tris-H Cl (p H-8,0), 5 m M de dithiothreite, 7 m M de Mg Cl 2 3 g M de Y W 32 PlATP et 20 unités activité polynucléo- z-Cl3 -1 M dy 2 18 3 tidekinase du phage T 4 5 ' LP, on purifie l'oligonuclé- otide marqué par chromatographie sur Séphadex G 50 ( 0,4 22 cm) dans H 20. b) Hybridation des colonies sur filtres à nitrocellulose avec les sondes d'oligonucléotides marqués à 5 ' l 32 pl On cultive Tcr Aps transformées sur les filtres à nitrocellulose (diamètre 90 mm) jusqu'à apparition des colonies, on transfère ensuite les filtres sur de l'agar contenant du chloramphénicol ( 500 filtres par une solution 0,5 N de Na OH avec neutralisa- tion subséquente dans le tris-H Cl à 1 M (p H 8,0) et séchage sous vide ( 2-4 heures à 800 C), et on réalise la préhybridation des filtres pendant2 heures à 37 C dans un mélange contenant 0,15 M de tris-H Cl (p H 8,0), 0,75 M de Na Cl, 5 m M d'EDTA, 1 m M de Na 2 HPO 4, 250/g/ml de t-ARN et de dodécylsulphate de sodium, la sérine bovine, le phycol et la polyvinylpyrrolidone, à raison de 0,1 % chaque Apres séchage sur papierfiltre, on mouille les filtres avec ledit mélange ( 300/l/filtre) contenant 1.106 imp/min/ml d'oligonucléotide-5 ' l 32 pl, on soude dans un paquet de polyethylène et on réalise l'incubation pendant 20 heures à la température de 37 C Après -2541579 hybridation, on lave les filtres trois fois à la tempéra- ture de 22 C avec une solution 0,1 M de tris-H Cl (p H 8,0), 0,5 M de Na Cl de dodécylsulphate de sodium à 0,1 %, on sèche et on autographie sur une pellicule radiographique pendant 20-70 heures L'autoradiographie des filtres a révélé quelques colonies positives dans l'hybridation avec les deux sondes d'oligonucléotides A et B marquées à 5 _ l 32 pl L'analyse restrictive de l'ADN de plasmide à partir de ces colonies et l'analyse de la séquence nucléotidique du k-ADN incorporé a montré qu'un ADN de recombinaison p IFN 105 contient une courte séquence du fragment 5 '-non transmissible, codifiant la séquence du gène total de l'interféron leucocytaire humain d'un nouveau type, l'interféron N leucocytaire, et de 370 nucléotides de la partie 3-non transmissible du gène. Construction des ADN de recombinaison assurant la synthèse de l'interféron N dans les cellules de E coli. a) Plasmide p IFN 105-1 portant le gène du préinter- féron N sous le contrôle du promoteur-trp. On isole l'ADN du plasmide de recombinaison p IFN 105 contenant le gène précité de l'interféron N, dans le lysat de cellules transformées de E coli, et on purifie sur l'hydroxy-apatite par la technique connue (Colman A. et al, "J Biochem" 1978, 91, 303-310) On traite 50 /g d'ADN par restrictase Pst I et on sépare les produits de dédoublement par électrophorèse dans le gène d'agarose à 0,8 % Un fragment d'ADN (près de 960 paires de bases) contenant le gène d'interféron est séparé par électro- élution et purifié comme décrit dans "Analyt Biochem", 1981, 112, 295-298) On dédouble 10/(g de fragment d'ADN par restrictase Bam H I, on traite le mélange avec le nucléase SI ( 0,5 unité activité //g d'ADN, 30 minutes, à 22 C) et un grand fragment de Bam H I-Pst I ( 947 paires de bases) est isolé après l'électrophorèse dans le gène d'agarose à 1,5 % d'une façon analogue à celle du fragment Pst I. //g de plasmide vectoriel p BR 322-trp (Ovchinni- kov Ju A et al, "DAN", 1982, 265, 238-242) contenant un fragment promoteur de l'opérone tryptophanique de E coli sont dédoublés par restrictase de E coli RI, les extré- mités adhérentes de l'ADN sont remplies par polymérase I (fragment de Klenov) suivant la technique décrite (Back- man K et al, "Proc Natl Acad Sci", USA, 1979, 73, 4171- 4178) On ligature 1,5 g de vecteur pendant 18 heures à la température de 10 C dans 10/,1 de solution-tampon, de 50 m M de tris-H Cl (p H 7,6) 10 m M de Mg C 12, 10 m M de dithiothreite renfermant O,27/11 g de fragment d'ADN avec le gène d'interféron et 20 unités activité T 4 ADN-lygase. On dilue le mélange avec 1504 l de tampon de 10 m M de tris-HC 1 (p H 7,5) , 50 m M de Na Cl, 1 m M d'EDTA,-et on transforme les cellules de K coli K-12 RR I Les cellules transformées, contenant le gène de l'interféron, sont prélevées par hybridation des colonies, comme décrit au paragraphe 4 b Le plasmide p IFN 105-I contenant le gène de préinterféron N sous contrôle du promoteur de triptophane a été identifié par analyse restrictive. Les cellules transformées p IFN 105-I de E coli K-12 RR I dans un milieu contenant (en g/1): bactotryptone-10,0; extrait de levure-5,0; Na Cl-10,0; ampicilline-O,O 2, sont cultivées jusqu'à une densité optique de A 650 1, 0, puis elles sont précipitées et dédoublées par traitement avec la lysozyme et par congélation-décongélation, comme décrit dans "Nature", 1980, 284, 316-320. L'activité de l'interféron constitue 0,5-10 106 unités activité par litre de suspension bactérienne. b) Plasmide d'expression de l'interféron N mûr. / g de grand fragment Bam H I-Pst I (ADN p IFN 105) sont soumis à une hydrolyse partielle par restrictase Sau 3 A ( 2 un act/fg d'ADN, pendant 5 minutes, à la température de 370 C), le mélange de fragments est séparé par électrophorèse dans le gel d'agarose à 1,5 % et on isole un fragment à une longueur de 869 nucleotides contenant le gène de l'interféron mûr sans premier codon On réunit à ce fragment un oligonucléotide synthétique ("DAN", 1982, 265, 238-212) à extrémités collantes Eco R I et Sau 3 A, on ligature d'après Pst I et Eco R I sites du plasmide vectoriel p BR 322 Les cellules de E coli sont transformées par ADN de recom- binaison et, après hybridation avec les sondes et analyse restrictive de l'ADN, on prélève le plasmide p IFN 18 portant un gène modifié de l'interféron N mûr dans les cellules transformées Le fragment court Eco R I-Pst I du plasmide p IFN 18 avec le gène d'interféron modifié est ligaturé avec le fragment Pvu II-Eco R I ( 340 paires de bases) de l'ADN du plasmide p BR 322-trp, portant le promoteur-trp, et on incorpore O, 4#/g de produit sur Pst I et sur le site Eco R I remplis de plasmide vectoriel p BR 322 Apres transformation des cellules de E coli RRI, on prélève 1000 clones Tcr Aps, dans lesquels on prélève, après analyse d'hybridation et de restriction des ADN de recombinaison, le plasmide p IFN 18-36 contenant le gène de l'interféron mûr N sous contrôle du promoteur au tryptophane. Le rendement en interféron N leucocytaire est de 4-6 108 un.act par litre de suspension bactérienne. 1 1 R E V E N D I C A T I 0 N S REVENDICATIONS 1 Interféron N leucocytaire humain caractérisé en ce que c'est une protéine dont la séquence des acides aminés est la suivante: CDLPQTHSLGNRRALILLAQMGRISHFSCLKDRYDFGFPQEVFDGNQFQKAQAISA FHEMIQQTFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYIELFQQLNDLEACVTQEVGVEEIALM NEDSILAVRKYFQRITLYLMGKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSFSTNLQKGLRRKD 2 Procédé d'obtention, dans des cellules bactériennes, de l'interféron N leucocytaire humain suivant la revendi- cation 1, du type comprenant l'isolement du poly(A)-m-ARN de matrice dans des leucocytes inoculés de l'homme, la synthèse du gène de l'interféron, son incorporation dans le plasmide vectoriel p BR 322, sous le contrôle d'un pro- moteur au tryptophane, et la transformation de l'ADN de recombinaison des cellules de bactéries E coli obtenu, caractérisé en ce qu'on utilise en qualité de gène d'in- terféron le gène de l'interféron N de structure primaire de l'ADN suivante: TGT GAT CTG CCT CAG ACT CAC AGC CTG GGT AAT AGG AGG GCC TTG ATA CTC CTG GCA CAA ATG GGA AGA ATC TCT CAT TTC TCC TGC CTG AAG GAC AGA TAT GAT TTC GGA TTC CCC CAG GAG GTG TTT GAT GGC AAC CAG TTC CAG AAG GCT CAA GCC ATC TCT GCC TTC CAT GAG ATG ATC CAG CAG ACC TTC AAT CTC TTC AGC ACA AAG GAT TCA TCT GCT GCT TGG GAT GAG ACC CTC CTA GAC AAA TTC TAC ATT GAA CTT TTC CAG CAA CTG AAT GAC CTA GAA GCC TGT GTG ACA CAG GAG GTT GGG GTG GAA GAG ATT GCC CTG ATG AAT GAG GAC TCC ATC CTG GCT GTG AGG AAA TAC TTT CAA AGA ATC ACT CTT TAT CTG ATG GGG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG GTT GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA TCC TTC TCT TTT TCA ACA AAC TTG CAA AAA GGA TTA AGA-AGG AAG GAT.