FR 2542871 A1 19840921 FR 8304251 A 19830315 La présente invention concerne un procédé de dosa- ge en phase hétérogène de substances biologiques antigéniques/ mettant en oeuvre des dérivés hybrides d'anticorps tels que des conjugués préparés par couplage d'anticorps antiimmunoglobulines et d'anticorps anti-enzymes et les réactifs pour sa réalisation. On connaît des procédés de dosages immunochimiques, dans lesquels on fixe sur une matrice un anticorps dirigé contre la substance à doser, et on utilise une enzyme comme marqueur dosable par les techniques classiques, ladite enzyme étant liée de manière covalente à un anticorps dirigé contre la substance à doser Ce procédé est décrit par exemple par S AVRAMEAS, J.L GUESDON dans "Solid phase enzyme immuno-assays publié dans "Applied Biochemistry and Bio- engineering" Academic Press Editeuri 1981, 73, 471-482 " Toutefois, la préparation du pro- duit résultant du couplage de l'anticorps et de l'enzyme est délicate et l'enzyme est fréquemment dénaturée, partiellement, au cours de cette réaction. On a maintenant trouvé un nouveau procédé de dosa- ge de substances biologiques antigéniques, en phase hétérogène, et avec marqueur enzymatique mettant en oeuvre un nouveau pro- duit intermédiaire coupleur qui est le résultat du couplage covalent de deux anticorps, l'un dirigé contre la substance à doser, l'autre dirigé contre une enzyme qui est choisie comme le marqueur du système et sera révélée par les techniques clas- siques L'invention concerne aussi ce nouveau produit et le système de réactif nécessaire à la mise en oeuvre du procédé. Le procédé de dosage de substances biologiques antigéniques selon l'invention consiste à 1/ mettre le milieu contenant la substance à doser en contact avec un anticorps de ladite substance fixé sur une matrice solide, insoluble dans le milieu biologique contenant la substance, séparer et laver la matrice modifiée sur laquelle sont fixés l'anticorps et la substance à doser; 2/ faire réagir ladite matrice modifiée avec un produit coupleur intermédiaire ayant simultanément une affinité p Dur la substance à doser et pour une enzyme, ledit produit résultant de la fixation - covalente de deux anticorps dont l'un est dirigé contre la 2 2542871 substance à doser et l'autre contre l'enzyme, puis séparer et laver la matrice ayant réagi; 3/ mettre l'enzyme isolée ou non au contact de la matrice ainsi traitée au cours d'une étape di- te de marquage, puis séparer et laver la matrice ainsi traitée; 4/ doser l'enzyme fixée, au cours d'une étape dite de révéla- tion en mesurant l'activité enzymatique de la matrice traitée mise en présence d'une solution du substrat de l'enzyme Ce procédé est également applicable au dosage des anticorps Dans ce cas, l'antigène est fixé sur la matrice. Lors de son dosage l'enzyme sera donc fixée à la matrice par l'intermédiaire d'un complexe "anticorps-antigène", lui-même lié de manière non covalente au produit intermédiaire composé d'un anticorps lié à un autre anticorps par liaison covalente. Une variante du procédé de dosage selon l'invention consiste lors de la deuxième étape à faire réagir la matrice modifiée avec un mélange préparé préalablement du produit in- termédiaire de couplage et de l'enzyme choisie. Le procédé selon l'invention est approprié pour doser toute substance biologique pour laquelle on peut prépa- rer des anticorps et notamment des antigènes, des anticorps, des haptènes, des immunoglobulines, des protéines, des hormo- nes Les enzymes, utilisables comme marqueurs, sont d'origine végétale ou bactérienne ou animale et purifiées ou non, et so- lubles ou fixées sur des particules telles que des particules de diamètre compris entre 0,5 à 20 pu environ, comme des micro- billes de latex Ces microbilles peuvent fixer des protéines comme cela a été indiqué par SINGER, PLOTZ, Am J Med,1956, 21, 888 Un des avantages de l'invention réside dans le fait que les enzymes utilisées comme marqueurs n'ont pas besoin d'étre purifiées, ce qui manifestement simplifie le procédé et le rend moins coûteux. Les anticorps utilisés pour préparer le produit cou- pleur intermédiaire selon l'invention sont avantageusement des anticorps monoclonaux préparés comme décrit dans "Nature 1975, 256, 495 par K 8 hler et Milstein. Des anticorps polyclonaux anti-enzyme préparés sont aussi utilisés selon des méthodes connues ( 3 L GUESDON Handbook of Experimental Immunology, ed D M WEIR,Blackwell Scientific Publication,1973). Les résultats obtenus sont équivalents à ceux obtenus avec les anticorps monoclonaux,si A'état de pureté des premiers est suffisante. Le couplage des anticorps est réalisé selon un procédé décrit par S AVRAMEAS dans Immunochemistry 6, 43 ( 1969), c'est-à-dire par action du glutaraldéhyde qui crée une liai- son covalente entre les deux anticorps On peut encore cou- pler les anticorps par la benzoquinone, ou tout autre réac- tif difonctionnel susceptible de se lier de manière covalente aux protéines I 1 n'est pas nécessaire que les deux anticorps qui seront couplés proviennent d'animaux de même race, ce qui est un autre avantage de l'invention Le produit résultant du couplage doit être soluble dans les solutions aqueuses cou- ramment utilisées dans ce type de dosage biologique,et les conditions de la préparation sont choisies en conséquence. Dans un tampon phosphate à p H voisin de 7 ?,on dissout l'anti- corps dirigé contre la substance à doser, tel qu'un anti-Ig E ou anti-Ig G,pour obtenir une solution contenant de 20 à mg/100 ml On ajoute ensuite de 1 à 10 fois le poids du premier anticorps,en anticorps anti-enzyme, puis une solution aqueuse de glutaraldéhyde à 1 %,de telle sorte que le mélange final contienne une concentration de glutaraldéhyde comprise entre 0,02 % à 0,5 % (concentration finale) La durée d'incuba- tion du mélange est fonction des concentrations relatives des trois composés; elle peut être d'une demi-heure à plus de cinq heures La réaction de pontage est ensuite stoppée par addition de glycine (concentration finale 0,1 M) Le procédé selon l'invention permet de doser de faibles quantités de substances,puisqu'on obtientdéjà un résultat fiable lorsque la concentration de cette substance antigénique dans le milieu est d'environ lng/ml pour un antigène protéique et 5 à 10 ng pour un anti- corps Il est aussi plus précis que les procédeés antérieurs utilisant une enzyme liée à un anticorps,le pouvoir amplifica- teur du système étant supérieur à celui des systèmes précé- demment décrits. Les exemples ci-après,non limitatifs,illustrent 1 ' invention. Les matrices sont des cavités ou godets,ménagées dans des microplaques du commerce formées d'un produit sur lequel peut être immobilisé l'anticorps de la substance à do- ser; le produit peut être du polystyrène sur lequel la fixa- tion de l'anticorps est réalisée par un procédé connu en soi, par exemple par contact d'une solution tamponnée de l'anti- corps quelques heures à 37 o C puis 1 journée environ à 40 C Les plaques avec microgodetsen U ou en V sont fournies par GREINER en France,par exemple Les immunsérums de mouton (anti- Ig E humaines ou antipéroxydase de radis noir,et les immun- sérums de lapin anti P-D-galactosidase d'E coli peuvent être obtenus en hyperimmunisant les animaux avec les protéi- nes correspondantes mélangées à de l'adjuvant complet de Freund (produit vendu par les Laboratoires Difco-Détroit USA) comme décrit dans Immunochemistry 6,43-53 ( 1969). Les anticorps polyclonaux dirigés contre les Ig E humaines ou la péroxydase peuvent être isolés de ces immunsérums par chromatographie d'affinité avec des immuno- adsorbants préparés avec de l'Ultrogel (R)(Marque de Pharm,. Industrie) comme décrit dans 3 Immunol Meth 11, 129 ( 1976). Les anticorps polyclonaux dirigés contre la ?-galactosidase peuvent être isolés de l'immunsérum par chromatographie sur DEAE cellulose comme décrit dans Proc Soc Exp Méd Biol. 103,250 ( 1960). Les anticorps monoclonaux anti-peroxydase et anti P-galactosidase peuvent être préparés par exemple selon la technique décrite par Milstein et Kbhler ( 1975 of supra). La mesure de l'activité enzymatique de la ma- trice traitée,lors de l'étape de révélation,qui permet de dé- terminer la quantité d'enzyme fixée à la matrice par l'inter- médiaire des différents produits (antigène,anticorps,conjugué hybride anticorps-anticorps),dont la substance à doser,peut être réalisée de façon classique,en mettant l'enzyme en pré- sence d'une solution convenable de son substrat. Par exemple,pour la -galactosidase,on intro- duit dans le godet de la microplaque 0,2 ml d'une solution aqueuse 2542871 de tampon phosphate O,1 M à p H 7 (M étant mis pour mole/litre) contenant 2,67 m M d'o-nitrophénylgalactopyranoside, O,1 M de ) -mercaptoéthanol, lm M de sulfate de magnésium, 0,2 m M de sulfate de manganèse et 2 m M de Titriplex (produit vendu par la Société Merck, Darmstadt-RFA), La plaque est incubée à l'ob- scurité, à 37 C; cette incubation peut durer de 1 à 4 heures et on choisit arbitrairement une durée dans ces limites En fin d'incubation, on inactive l'enzyme par addition de 50 ul de carbonate de sodium 2 M et mesure l'absorption de la solu- tion à une longueur d'onde de 414 nm. Pour la péroxydase,on introduit par exemple dans le go-det, 0,2 ml d'une solution aqueuse de p H 4,8 contenant 4 mg/ml d'o-phénylènediamine et 0,06 % (en poids) d'eau oxygé- née et tamponnée avec une solution de 0,05 M de citrate de sodium Les plaques sont incubées 10 minutes à l'obscurité, à 37 C La réaction enzymatique est alors interrompue par addition dans le godet de 501 de HC 1 3 N L'absorption est lue à 492 nm. Lorsqu'on fait réagir le:mélange de la réâction /consti- tué du conjugué hybride anticorps-anticorps et de l'enzyme choisie, avec la matrice modifiée c'est-à-dire sur laquelle a été fixée la substance à doser par l'intermédiaire de son antigène ou de son anticorps, ce mélange est effectué par exemple dans une solution de tampon phosphate sans modifica- tion des quantités d'anticorps et d'enzyme utilisées. EXEMPLE 1 Dosage des immo^ 1 obulines humaines IE dans le sérum humain Dans cet exemple on utilise comme produit intermédiai- re, le résultat du couplage par le gl Utaraldéhyde de l'anti- corps anti-Ig E humainesavec de l'anticorps anti 5 -galacto- sidase de E coli préparé comme suit: On introduit dans 0,9 ml de tampon phosphate O,1 M à p H 6,8, 0,5 mg d'anticorps de mouton anti-Ig E humaine et 2 à 4 mg d'anti corps monoclonaux anti aalactosidase, ou 1 à 2 ma d'anticorps polyclonaux anti galactosidase,puis sous agi tation douce 0,1 'ml d'une solution aqueuse a 1 g/100 ml de glutaraldéhyde, Le mélange réactionnel est laissé 2 heures à température ambiante Une autre variante consiste à ajouter 0,1 ml de solution à 5 % de glutaraldéhyde et incuber 1/2 heure, Ensuite 50,1 d'une solution aqueuse 2 M de glycine sont ajou- tés Le mélange réactionnel est alors laissé 2 heures à tem- pérature ambiante avant centrifugation et dialyse une nuit: à 4 C contre du tampon phosphate (PBS), avant d'être mélangé avec un même volume de glycérol bidistillé La solution est ensuite conservée à -20 C jusqu'à son emploi, pendant plusieurs mois. Les godets d'une plaque de polystyrène sont recouverts d'anticorps de mouton anti-ig E humainesen introduisant dans chacun 0,1 ml d'une solution de carbonate 0,1 M, p H = 9,6 contenant 0, 11 ug d 'anticorps anti-Ig E La plaque est incu- bée 2 heures à 37 C, puis 18 heures à 4 C et lavée 0,1 ml du sérum à étudier, dilué, est alors introduit dans chaque go- det et la plaque laissée à incuber 18 heures à 4 C. Le sérum à étudier est dilué avant le dosage par ad- dition d'une solution saline de phosphate tamponnée conte- nant 0,1 g/100 ml de TWEEN-20 R (esters d'acides gras et sor- bitol polyéthoxylés,fournisseur Merck) et 0,3 g/100 ml de gélatine pour que la concentration des Ig E humaines à do- ser soit comprise entre environ 100 UJ/ml et 0,2 U 4/ml Après la fin de l'incubation, la plaque est lavée 3 fois avec une solution saline de phosphate tamponnée, contenant 0,lg/100 ml de TWEEN-20 puis on ajoute dans chaque godet une solution du produit de couplagedesdeuxanticorps précédémment préparé, ladite solution étant diluée si nécessaire pour que la con- centration en anti-Ig E soit d'environ 5 vug/ml. Apres une incubation de deux heures, à 370 C, la plaque est de nouveau lavée trois fois et 0,1 ml d'une solution à environ 50,ug/ml de l'enzyme choisie comme marqueur, c'est-à- dire la _ -galactosidase, sont ajoutés dans chaque godet et la plaque est laissée incuber 2 heures Après les lavages habi- tuels, 0,2 ml d'une solution du substrat de la;-galactosidase, préparée comme décrit précédemment,sont ajodtés et la révéla- tion est effectuée selon la méthode classique. 7 2542871 Dans la figure 1 est représentée l'absorption de la solution finale, lue à 414 nm en fonction de la concentration en Ig E du sérum humain à étudier, exprimée en U I/ml Cette concentration a été déterminée préalablement pour permet- tre l'étude, par une méthode classique immunoenzimatique, en utilisant un sérum de référence normalisé comme décrit dans J Allergy Clin Immunol 61 l 23 ( 1978) La relation entre l'absorption et la concentration en Ig E est fonction du pro- duit de couplage entre les deux anticorps La courbe 1 cor- l O repond au dosage d'Ig E en utilisant un conjugué hybride pré- paré en couplant 0,5 mg d'anticorps de mouton anti-Ig E humai- nes avec 1 mg d'anticorps monoclonaux anti-;?-galactosidase; pour la courbe 2, on a utilisé 0,5 mg d'anticorps anti Ig E humaines et 4 mg d'anticorps monoclonaux anti:-ga Iactosidase et là courbe 3, 0,5 mg et 8 mg respectivement. EXEMPLE 2 Autre dosage des immunoglobulines humaines Ig E dans le sé um hnu m aï in Dans cet exemple l'enzyme marqueur est la peroxydase de radis noir, type I îindice de -pur-e-té:,6-)- -Le pr-od-u-i-t in- termédiaire de couplage par le glutaraldéhydede l'anticorps anti-Ig E avec l'anticorps anti-peroxydase est préparé en sui- vant le mode opératoire décriit dans l'exemple 1 en faisant réa- gir 0,5 mg d'anticorps de mouton anti-Ig E avec 2-mg d'anti- corps anti-peroxydase. La figure 2 donne la représentation graphique de l'absorption mesurée finalement en fonction de la concentra- tion en Ig E du sérum étudié, exprimée en unitésinternationa- les par ml (U I /ml). La courbe 1 a été obtenue avec des anticorps monoclo- naux de souris, la courbe 2 avec des anticorps polyclonaux de mouton On a appliqué cette méthode au dosage de diffé- rents sérums contenant des concentrations connues d'Ig E et en utilisant des lots de peroxydase de puretés variables Les résultats sont consignés dans le tableau I. La concentration minimale d'Ig E décelable par cette méthode est indépendante de l'état de pureté de l'enzyme: on dose 8 2542871 0,4 à 0,8 unités internationales d'Ig E par ml,que la prépa- ration de peroxydase utilisée soit très purifiée (indice de pureté: 3,0) ou brute (indice de pureté: 0,6). EXEMPLE 3 Dosage simplifié des Ig E dans le sérum humain On utilise comme conjugué hybride, un produit préparé comme dans l'exemple 2, en solution dans du tampon phosphate. On mélange 0,1 ml de cette solution avec 0,1 ml de la solu- tion de peroxydase ( 50 jug/ml) et introduit ce mélange dans les godets sur les parois desquels a été fixé préalablement l'anticorps anti-Ig E et qui ont été mises au contact du sérum à étudiesepuis lavées comme décrit dans l'exemple l Apre 7 ?in- cubation/deux heures, la plaque est lavée et la révélation est conduite de manière classique. Le dosage est plus rapide, car une étape et une incu- bation sont supprimées, cependant la méthode est un peu moins sensible que celle décrite dans l'exemple 2 (figure 3). EXEMPLE 4 Dosage de l'anticorps anti-Echinococcus granulosus dans le sérum humain On fixe dans les godets d'une plaque de microtitration en polystyrèneun antigène extrait de l'Echinococcus granulo- sus préparé à partir du liquide des kystes de moutons infec- tés par le parasite. La fixation est réalisée en laissant les microgodets 2 heures à 37 C et 18 heures à 4 C, 0,1 ml de solution de tampon phosphate contenant 1 ug d'antigène La plaque est ensuite lavée trois fois avec du tampon phosphate contenant 0,1 % de TWEEN-20 et 0,1 'ml du sérum humain à étudier, dilué convenablement, sont introduits dans chaque godet La dilution du sérum entre 1/200 et 1/204 800 environ est réalisée avec du tampon phosphate contenant 0,1 % de TWEEN-20 et 0,3 % de gélatine. La plaque, couverte, est incubée 2 heures à 37 C, et lavée trois fois, puis on ajoute 0,1 ml de la solution à pg/ml du produit de couplage des deux anticorps et la pla- que est maintenue 2 heures à 37 C avant trois lavages par la même solution tamponnée que précédemment. Le produit de couplage entre l'anticorps anti-Ig G hu- maineset l'anticorps anti galactosidase, a été préparé avec le glutaraldéhyde en utilisant le procédé décrit ci-dessus. On utilise 0,5 mg d'anticorps anti Ig G humaines, 4 mg d'anti- corps anti-enzyme et O,1 ml d'une solution à 1 % de glutaral- déhyde dans un volume total de 1 ml. La révélation de la l? -galactosidase est effectuée comme décrit à l'exemple 1. On a comparé les résultats obtenus par ce procédé à ceux obtenus en utilisant un dosage immunoenzymatique connu, mettant en oeuvre un anticorps anti-Ig G marqué par la phos- phatase, préparé par réaction de 5 mg d'anti-Ig G humaines de lapin sur 10 mg de phosphatase alcaline de E coli en présence de glutaraldéhyde, comme décrit dans Immunochem 6 43-53 ( 1969) Au lieu d'ajouter le produit de couplage des deux anticorps dans les godets, on ajoute 0,1 ml d'une solution à /ug/ml résultant du couplage anticorps/enzyme On laisse la plaque 2 heures à 37 C et on la lave plusieurs fois, puis on effectue la révélation en ajoutant 0,2 ml d'une solution 1 M de Na Cl contenant 0,1 M de tampon Tris/H Cl (p H = 8) et 1 m M de phosphate de p-nitrophénol Arès 16 heures à 37 C, la réaction enzymatique est arrêtée par addition de 50/ul de K 2 HP 04 3 M et l'absorption, due au p-nitrophénol, est mesurée à 405 nm. Le tableau II donne les résultats de cette étude comparée. La présente invention est également applicable aux ma- trices constituées d'un support magnétique ou non tel que le Magnogel (Pharm-industrie) préparé selon le brevet FR 36 889 du 2 Décembre 1975, ou le polyacrylamide ou l'agaro- se ou tout autre substance permettant d'immobiliser un réactif biologique. TABLEAU'I Dosag-e des I Pg E humaîne-qavec le coniugué hybride, "afiti-Iq E/entirperoxydase" Ig E (c en UJI/ml) ,0 ,0 ,0 12,5 6, 3 3, 1 1,6 0,8 0, 4 0, 2 Peroxydase lot 1 0, 972 0,776 0,620 0,372 0,207 0,094 0,052 0,023 0,009 0,000 Peroxydase lot 2 0, 907 0,790 0,533 0,318 0, 174 0,092 0,056 0,020 0,010 0,000 Pér oxydase lot 3 0, 869 0,710 0, 489 0, 247 0,130 0,053 0,027 0,010 0,000 0,000 Péroxydase lot 4 0,620 0,549 0,9371 0,224 0, 115 0,040 0,022 0,0008 0,O 000 0,O 000 Lot 1 peroxydase dans dii sulfate d'ammonium (indice de Lot 2 peroxydase lyophilisée (indice de pureté: 3,0: Lot 3: peroxydase lyophilisée (indice de pureté 1,7) Lot 4 peroxydase lyophilisée (indice de pureté 0,57) c=concentration. I-J o puret te 3,0) I-fl Co TABLEAU II des Dosage comparatiflanticorps anti-Echinococcus granulosus dans le sérum d'un malade ou d'un témoin, selon la techngque Mjlsant- un conjugué hybri Ce anti Ig G/anti 'gal actosidlase,; (AC G)osen la technique classique de a 1 '4 nticorus couplé avec la phôsphatase alcaline' (Aci P) - Absorptions dilutions du Ac P Ac-Gz sérum M T M T 1/400 0,( 919 0,082 1/800 1,979 0,265 0,755 0,059 1/1600 1,620 0,155 0,493 0,028 1/3200 1,281 0,094 0,339 0,037 1/6400 0,682 0,083 0,189 0,030 1/12800 1,341 0,052 0,103 0,023 1/25600 0,201 0,026 0,032 0,019 1/51200 0,105 0,002 1/102400 0,039 0,000 M = malade T =témoin Fi- r>a Ln 1 MU Co -.5 REVENDICATIONS 1.Produit immunologique de couplage constitué par un conjugué hybride préparé en couplant de manière cova- lente un anticorps specifique de la substance à doser avec un anticorps anti-enzyme. 2 Produit selon la revendication l,caractérisé en ce que l'anticorps anti-enzyme est monoclo 4 al ou poly- clonal. 3.Procédé de dosage en phase hétérogène de substances biologiques antigéniques,caractérisé en ce qu'il consiste: a) à immobiliser un anticorps de la substance à doser ou un antigène sur une matrice insoluble, b)à fixer la substance à doser sur son anti- corps ou son antigène, c)à mettre en contact la matrice ayant réagi avec un produit coupleur intermédiaire soluble ayant simulta- nément une affinité antigénique pour la substance à doser et pour une enzyme d'origine bactérienne ou végétale ou animale, d)mettre l'enzyme, isolée ou non,au contact de la matrice ainsi modifiée pour la marquer, e) doser l'enzyme fixée, en mesurant l'activité enzymatique de la matrice modifiée. 4.Procédé selon la revendication 3,caractérisé en ce que le produit coupleur intermédiaire soluble est le résultat de la fixation d'un anticorps de la substance à doser sur un anticorps anti-enzyme monoclonal ou polyclonal par l'intermédiaire de ponts fixés sur chaque anticorps par liai- sons covalentes avec un agent bifonctionnel. 5.Procédé selo-n les revendications 3 et 4, caractérisé en ce que la molécule bifonctionnelle utilisée pour le pontage est le glutaraldéhyde. 6.Procédé selon les revendications 3 à 5, caractérisé en ce que l'enzyme a un substrat chromogène ou fluorigène. 7 Procédé selon la revendication 6,caractérisé en ce que l'enzyme est la peroxydase. 8 Procédé selon la revendication 6,caractérisé en ce que l'enzyme est la -galactosidase de E coli. 9 Procédé selon la revendication 3,caractérisé en ce que les étapes c) et d) sont effectuées simultanément en mettant en contact la matrice sur laquelle est fixée la substance à doser,avecle mélange du produit coupleur et de l'enzyme correspondante. 10.Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations précédentes caractérisé en ce que l'enzyme est fixée sur des particules insolubles de diamètre compris entre 0,5 et 20 t environ. ll.Réactif pour le dosage selon le procédé de la revendication 3, caractérisé en ce que le produit coupleur intermédiaire soluble est le résultat de la fixation d'un anticorps de la substance biologique à doser sur un anticorps anti-enzyme monoclonal ou polyclonal liés de manière covalente, résultant de l'action de molécules bifonctionnelles se fixant sur les protéines. 12 Réactif selon la revendication 11 lcaractérisé en ce qu'il résulte de l'action du glutaraldéhyde sur un mélange d'anti-Ig E et d'anti-enzymechoisi parmi l'anti- -galactosidase d'E coli et l'anti-peroxydase. 13 Procédé de dosage selon la revendication 3,caractérisé en ce que la substance à doser est une immuno- globuline. 14.Coffret de réactifs pour doser les substances antigéniques en appliquant le procédé selon la revendication 3,caractérisé en ce qu'il comporte: -un anticorps de la substance à doser ou un antigène immobilisé sur une matrice insoluble, -un produit coupleur résultant du pontage entre un antigène ou un anticorps de la substance à doser et un anticorps anti-enzyme, -1 ' enzyme -un système de composés pour révéler l'enzyme. 15.Procédé selon la revendication 3,appliqué au dosage des anticorps, l'antigéne correspondant étant alors fixé sur la matrice. 16.Procédé selon la revendication 3,appliqué au dosage des antigènes, l'anticorps correspondant étant alors fixé sur la matrice.