FR 2541897 A1 19840907 FR 8308415 A 19830520 1 C La présente invention se rapporte à un procéde de préparation d'extraits de poissons, mollusques et/ou crustacés uti- lisables comme médicaments, utiles notamment en raison de leurs fonc- tions d'équilibre de la nutrition, de leur activité anti-ulcereuse, de leur activité analogue à celle de l'insuline, de leur activité antilipémique, et de leurs effets bénéfiques sur les rhumatismes et l'arthrite Elle comprend également des compositions thérapeutiques contenant en tant que substances actives les extraits de poissons, mollusques et/ou crustacés prépares par le procédé ci-dessus. Parmi les procédés connus pour extraire les chairs de poissons, on citera un procédé décrit dans le brevet japonais n 31 935/1978 Dans ce procéde, les poissons crus, sans traitement préalable tel qu'un hachage ou un broyage, sont chauffes à une tem- perature non inférieure à 60 C, puis décomposés à l'aide d'une protéase résistante aux alcalis à une température de 50 a 60 C et à un p H de 9 à 10 Les produits obtenus sont soumis a une nouvelle décomposition à l'aide d'une autre protease résistante aux acides après réglage du p H à un niveau de 5 à 6 Ce procédé connu présente des inconvénients le p H de la matière première doit être règle a un niveau de 9 à 10 par addition d'un composé contenant l'ion sodium tel que le carbonate de sodium, pour provoquer l'activation de la protease résistante aux alcalis, ce qui présente des inconvénients du point de vue de l'hygiène alimentaire En outre, ce procédé connu demande une opération diffi- cile et gênante de réglage du p H car le produit de réaction doit être régle à un p H de 5 à 6 avant l'addition d'une protease résistante aux acides Un autre inconvénient de ce procéde connu réside entce que la protéase résistante aux alcalis n'est pas entièrement désactivée au moment o on ajoute la protéase résistante aux acides, de sorte qu'elle poursuit son action; il est alors difficile d'obtenir un extrait contenant uniquement des peptides à un poids moléculaire nettement inférieur à 3 000 et des aminoacides libres. L'invention concerne un premier lieu un procédé de préparation d'extraits de poissons, mollusques et/ou crustacés possédant des propriétés pharmacologiques et constitues principalement de peptides dont le poids moléculaire est nettement inférieur à 3 000 et d'amino- acides libres; elle comprend egalement, à titre de médicaments nou- veaux, les extraits de poissons, mollusques et/ou crustacés ainsi 254 1897 obtenus, ainsi que des compositions thérapeutiques contenant ces extraits en tant que substances actives. Le procédé selon l'invention évite les opérations délicates de réglage du p H et donne des extraits de poissons, mollusques et/ou crustacés qui constituent des médicaments de valeur. En effet, on a constaté que ces extraits de poissons, mollusques et/ou crustacés avaient une fonction d'équilibre de la nutrition, des propriétés anti-ulcdreuses, des propriétés analogues à celles de l'insuline, d'o l'application dans le traitement du diabète, et des propriétés anti-lipémiques, d'o leur utilisation dans un traitement visant à diminuer la teneur en cholestérol du sang, et également des propriétés curatives sur les rhumatismes et l'arthrite. D'autres buts et avantages de l'invention apparat- tront à la lecture de la description ci-après. Le procédé selon l'invention pour préparer les extraits de poissons, mollusques et/ou crustacés possédant des propriétés pharmacologiques de valeur se caractérise, conformément à l'invention, en ce qu'il comprend les stades opératoires suivants on chauffe lespoissons, mollusques et/ou crustacés crus, non broyés, à une température non inférieure à 750 C, afin de provoquer une désac- tivation complète des enzymes autolytiques contenues et, simultané- ment,d'éliminer l'odeur de poisson, on ajoute une protêase obtenue à partir de Bacillus subtilis aux poissons, mollusques et ou crustacés à une température de 50 à 600 C et à un p H de 6,0 à 7,0 afin de pro- voquer la décomposition des protéines contenues dans les chairs de ces poissons, mollusques et/ou crustacés jusqu'au stade de protéoses, on porte la température à un niveau non inférieur à 750 C afin de pro- voquer la désactivation complète de la protéase de Bacîllus substilis, on ajoute une protéase obtenue à partir de la moisissure Koji aux protéoses de poissons, mollusques et/ou crustacés à une température de à 50 C et à un p H de 6,0 à 7,0 et on maintient le mélange à cette température pendant 1 à 3 h, afin de provoquer la décomposition des protéoses en peptides de poids moléculaire nettement inférieur à 3000 et aminoacides libres, on porte la température à un niveau non inférieur à 750 C afin de provoquer la désactivation complète de la protéase de moisissure Koji et on sépare puis on concentre les pro- duits de décomposition obtenus. D'autres caractéristiques et avantages de l'inven- tion ressortiront plus complètement à la-lecture de la description détaillée donnée ci-après en référence aux figures des dessins annexés sur lesquels: la figure 1 est une photographie représentant les poumons d'un porc auquel on a administré un extrait de maquereau préparé par le procédé selon l'invention et les poumons d'un porc témoin auquel on n'a pas administré cet extrait, la figure 2 est une photographie représentant le coeur d'un porc auquel on a administre un extrait de maquereau préparé par le procède selon l'invention et le coeur d'un porc témoin auquel on n'a pas administre cet extrait; la figure 3 est une photographie représentant le foie d'un porc auquel on a administre l'extrait de maquereau préparé conformément à l'invention et le foie d'un porc témoin auquel on n'a pas administré cet extrait la figure 4 est une photographie représentant un échantillon découpe en tranches du foie du porc témoin de la figure 3 la figure 5 est une photographie représentant l'estomac d'un rat auquel on a administré l'extrait de maquereau prépare par le procédé selon l'invention et les estomacs de rats témoins auxquels on n'a pas administré cet extrait; la figure 6 est un graphique illustrant la fonc- tion analogue à celle de l'insuline exercée par l'extrait de maquereau préparé par le procède selon l'invention, graphique qui représente les quantités d'acides gras libres déchargées de cellules grasses; et la figure 7 est un graphique qui représente le pourcentage de gonflement de la patte du rat auquel on a administre- l'extrait de maquereau préparé par le procédé selon l'invention et le pourcentage du gonflement de la patte du rat non traité par cet extrait - La demanderesse a donc étudié un procédé de prépara- tion d'extraits de poissons, mollusques et/ou crustacés qui comprend les stades opératoires suivants-: décomposition de poissons, mollusques et/ou crustacés variés à ur p H de 6,0 à 7,0 et à une température de à 600 C par action d'une protéase produite à partir de Bacillus subtilis, desactivation complète de la protéase de Bacillus sibtilis et décomposition des produits obtenus à partir des poissons, mollusques et/ou crustacés sous l'action d'une protease elle-même produite à partir de la moisissure Koji à un p H de 6,0 à 7,0 et à une tempéra- ture de 40 à 50 C pendant 1 à 3 h A la suite de cette étude, la demanderesse a trouvé qu'on pouvait obtenir par ce procédé des extraits de poissons, mollusques et/ou crustacés constitues principa- lement de peptides de poids-molèculaire nettement inférieur à 3 000 et d'aminoacides libres et que les extraits de poissons, mollusques et/ou crustacés obtenus par ce procédé avaient des propriétés phar- macologiques variées car les organismes entiers des poissons, mol- lusques et/ou crustacés, y compris les organes internes, sont décom- posés par ce procédé On a en outre trouvé que les extraits de pois- sons, mollusques et/ou crustacés préparés par le procède selon l'in- vention et possedant la composition particulière en aminoacides indiquée, c'est-à-dire qu'ils sont constitués principalement de peptides de poids moleculaire nettement inférieur à 3 000 et d'amino- acides libres provenant de la décomposition des protéines contenues dans les poissons, mollusques et/ou crustacés crus, avaient des pro- priétés d'équilibre de la nutrition, des propriétes anti-ulcereuses, une fonction analogue à celle de l'insuline, des propriétés anti- lipemiques et des propriétés curatives sur les rhumatismes et l'arthrite. Dans le procède selon l'invention, les corps entiers de poissons, mollusques et/ou crustacés crus, tels que Trachurus japonicus, maquereaux, sardines, Cololabis saira, thons, Pleurogrammus azonus, morues, seiches, poulpes, crevettes grises, crevettes roses, huîtres, Corbiculus leana, Ruditapes philippinarum; moules, Anadara brunghtoni, palourdes, sont introduits dans un récipient de réaction sans aucun traitement préalable tel qu'un hachage ou un broyage en bouillie Toutefois, les parties de grandes dimensions doivent être découpées aux dimensions appropriées. Immédiatement après introduction dans le récipient de réaction, on porte la température des poissons, des mollusques et/ou crustacés charges à un niveau non inférieur à 75 C, de preférence non infeé- rieur à 80 C, afin de désactiver complètement les enzymes auto- lytiques contenues dans les mollusques et/ou crustacés crus et simul- tanément d'éliminer l'odeur de poisson ou les mauvaises odeurs émises par les produits d'autolyse Le contenu du récipient de réaction peut être maintenu à cette température éleve> en général pendant une durée d'environ 10 min à 10 h pour la désactivation des enzymes auto- lytiques Dans le procède de la technique antérieure dont il a eté question ci- dessus, la température minimale de désactivation des enzymes autolytiques estde 60 C Toutefois, dans le procédé selon l'invention pour préparer des extraits de poissons, mollusques et/ou crustacés ayant des propriétés pharmacologiques, la temperature minimale de désactivation des enzymes autolytiques ne doit pas être inférieure a 75 C si l'on veut éliminer totalement les odeurs de poissons ou autres mauvaises odeurs. On décompose ensuite les protéines contenues dans les poissons, mollusques et/ou crustacés jusqu'au stade protéoses à une température de 50 à 60 C et un p H de 6,0 à 7,0, de préférence 6,0 à 6,5 par addition d'une protease obtenue à partir de Bacillus subtiliso Une enzyme préférée pour l'utilisation à ce stade est une enzyme soluble fabriquée au Japon par la firme I Kinki Yakuruto Manufacturing Co, Ltd et vendue par la firme Yakuruto Biochemistry Co, Ltd, sous la marque commerciale Aroaze AP- 10 "; c'est cette enzyme qu'on utilise dans les exemples ci-après La durée de cette opération de décomposition ne constitue pas un facteur critique mais se situe en général entre 1 et 3 h, de préférence entre 1,5 et 2 h Dans le pro- cède selon l'invention, il n'est pas nécessaire de procéder à un réglage de p H car cette opération de décomposition est effectuée à un p H de 6,0 à 7,0, c'est-à-dire neutre à légèrement acide, et le gonflement de la chair musculaire des poissons, mollusques et/ou crustacés crus, et sa séparation d'avec les arêtes ou les os, ne sont pas appréciables comparativement au procédé dans lequel le premier stade de décomposition est réalisé en milieu alcalin En poursuivant la décomposition dans l'intervalle de p H specifié, c'est-à-dire à un p H de 6,0 à 7,0, il y a décomposition complète des proteines en protéoses sans formation de peptides à-bas poids mole- culaire ni d'aminoacides libres Dans ce stade, il est essentiel que les protéines soient entièrement décomposées en proteoses, car 254 1897 ces dernières sont bien adaptées à la decomposition enzymatique du stade suivant. La température du contenu du récipient de réaction est ensuite portée au minimum à 75 C et, de préférence, à une tempe- rature non inférieure à 40 C Au cours de cette opération dans laquelle le contenu du récipient de réaction est maintenu à cette température élevée, il y a desactivation complète de la protease de Bacillus substilis utilisée dans l'opération de décomposition pré- cédente A cet effet, le contenu du récipient de réaction est main- tenu en général à la température de desactivation pendant une durée de 10 min à 1 h, de préférence de 15 à 30 min Si l'on supprime cette opération de désactivation, la protease utilisée dans l'opération de décomposition précédente poursuit son action sur le contenu du récipient au cours de l'opération suivante de décomposition enzyma- tique, on ne parvient pas à obtenir des extraits de poissons, mol- lusques et/ou crustacés ayant la composition voulue en aminoacides et les propriétes pharmacologiques variées recherchées, c'est-à-dire qu'on n'atteint pas les buts recherches dans l'invention. Le stade opératoire suivant du procédé selon l'invention est le stade de décomposition enzymatique effectué à une température de 40 à 50 C et à un p H de 6,0 à 7,0 par addition d'une protease obtenue à partir de la moisissure Koji Avant cette opéra- tion, il n'est pas nécessaire d'ajuster le p H du contenu du récipient de réaction L'enzyme particulière utilisée dans cette opération consistera avantageusement en une enzyme fabriquée au Japon par la firme Kinki Yakuruto Manufacturing Co, Ltd et vendu par la firme Kakuruto Biochemistry Go, Ltd sous la marque commerciale "PUNCHDAZE". Du fait que la protease de Bacillus subtilis est entièrement desac tivee avant cette opération, seule la protease de la moisissure Koji agit sur les proteoses formàes dans l'opération de decomposition pré- cedente, provoquant leur propre décomposition en peptides de poids moléculaire nettement inférieur à 3 000 et en aminoacideslibres Ladurée nécessaire pour cette opération de décomposition se situe entre 1 et 3 h et est de préférence d'environ 2 h Du fait que cette opération de décomposition est effectuée dans des conditions plus modérées que les conditions du procédé de la technique antérieure, à savoir à une température plus basse, et dans un intervalle de p Hl légèrement acide ou neutre, on peut parvenir à la composition particulière recherche en aminoacides Si la durée de cette opération de décomposition est inférieure à 1 h, il subsiste une certaine fraction de proteoses et on ne parvient pas à la composition particulière recherchee en amino- acides Par contre, si la durée de cette opération de décomposition dépasse 3 h, les propriétés pharmacologiques du produit obtenu sont affectées. Immédiatement après l'opération de décomposition, la température du contenu du récipient de réaction est portée à un niveau non inférieur à 75 C, de préférence non inférieur à 80 C, afin de provoquer la desactivation complète de la protease de moisissure Koji En effet, si on laissait cette protease poursuivre son action, il y aurait dégradation du produit et de ses propriétés pharmacolo- giques. Les produits de décomposition sont ensuite sépares par des techniques classiques telles que la centrifugation ou d'autres techniques connues, en une couche d'extrait de poissons, mollusques et/ou crustacés, une couche d'huile et un résidu comprenant des fragments d'arêtes et d'os et des matières non décomposéeso L'extrait de poissons, mollusques et/ou crustacés peut alors être filtré et concentré sous vide à une température ne dépassant pas 60 C. Les extraits de poissons, mollusques et/ou crustacés obtenus par le procède selon l'invention contiennent des peptides et aminoacides libres varies, y compris l'acide glutamique, l'acide aspartique, la lysine, l'arginine, la glycine, l'alanine, la leucine, la la proline, l'histidine, la phenylalanine, la serine, etc, et ils sont constitués principalement de peptides et aminoacides ayant un poids moléculaire nettement inférieur à 3 000 Conformément a l'inven- tion, on peut préparer des extraits de poissons, mollusques et/ou crustacés contenant environ 30 % en poids d'eau, plus de 50 % en poids, par exemple environ 60 % en poids, de protéines brutes et pas plus de 1 % en poids de matières grasses brutes, et ces extraits ont des propriétés pharmacoligiques variées qui seront décrites plus en détail dans les exemples qui suivent et qui illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée Dans ces exemples, les indications de parties et de pourcentages s'entendent en poids sauf mention contraire. EXEMPLE 1: préparation de l'extrait de poissons On introduit 4 t de maquereaux entiers, sans aucun traitement préalable, dans un récipient de réaction équipé d'un agi- tateur, avec 4 t d'eau et-on chauffe le contenu du récipient à 80 C. Au bout de 15 min, on abaisse la température du contenu du récipient à 55 C et on ajoute 4 kg d'une protéase de Bacillus subtilis qu'on fait réagir à p H 6,2 pendant 1,5 h On porte la température du contenu du récipient à 80 C o on maintient pendant 15 min, puis on refroidit à 45 C; on ajoute alors 2 kg d'une protéase de moisissure Koji et on maintient à la même température pendant 2 h pour réaction a p H 6,5 avec le contenu du récipient. On chauffe ensuite à nouveau le contenu du récipient à 80 C afin de désactiver la protéase On sépare le produit de réaction par une technique normale, telle que la centrifugatbn, en une couche d'extrait, une couche d'huile et un résidu contenant des morceaux d'arêtes et d'os et des matières non converties On filtre la couche d'extrait et on la concentre sous vide à 60 C; on obtient ainsi un extrait de maquereau. L'analyse de cet extrait de maquereau montre qu'il contient 35,4 % d'eau, 57,4 % de protéines brutes, 0,4 % de matières grasses brutes, 0,5 % d'hydrates de carbone et 6,3 % de cendres; son pouvoir calorique est de 235 calories/g L'analyse chromatographique de ce produit fait apparaître 3 pics de poids moléculaire de 2 500, 1 300 et 760, ce qui indique que le poids moléculaire des composants aminoacides est nettement inférieur à 3 000 La composition des aminoacides à l'état libre ou à l'état de peptide est indiquée dans le tableau I ci-après. TABLEAU I Aminoacides libres et à l'état combiné contenus dans la (g/100 g). composition* arginine 3,40 alanine 3,62 lysine 4,37 glycine 4,37 histidine 2,76 proline 2,53 phénylalanine 1,44 acide glutamique 7,46 tyrosine 1,27 sérine 2,24 leucine 3,31 thréonine 2,14 isoleucine 1,70 acide aspartique 4,43 méthionine 1,23 triptophane 0,31 valine 2,38 cystéine 0,27 EXEMPLE 2: fonction d'équilibre de la nutrition On dilue l'extrait de maquereaux préparé dans l'exemple 1 par 30 fois son poids d'eau et on administre 10 m I de l'extrait dilué à des porcs a l'engraissement, chaque jour, après la p&riode de sevrage par mélange avec l'alimentation; les porcs sont abattus après engraissement de 6 mois et comparés à des porcs témoins auxquels on n'a pas administré l'extrait. dans le tableau Les résultats de l'examen anatomique sont rapportés II ci-après. TABLEAU Il meilleur état que ceux des porcs témoins, coloration poumonl claire, sans foyer de maladie (voir note 1 ci-après) meilleur état que ceux des porcs témoins, pas de coeur matière grasse adhérence sur les parois extérieurs (voir note 2 ci-après) les foies des porcs auxquels on a administré foie l'extrait ne contiennent pas de foyer de maladie ni foie de partie éliminée et ont une belle couleur brute (voir note 3 ci-après) gros intes peu de graisse autour des intestins des porcs aux- tin et intes quels on a administré l'extrait tin grêle les viandes des porcsauxquels on a administré l'extrait ont une bonne forme et forment des masses carcasse épaisses auxquelles adhèrent des quantités de graisse appropriées; les viandes des porcs auxquels on a administré l'extrait sont denses, ont une bonne texture et une bonne coloration, et les graisses ont une bonne coloration ' Comparativement aux porcs témoins, on observe des différences nettes: les quantités de graisse adhérant aux organes ont diminué et il n'y a pas de portion malade ni disparue. Note 1: les poumons des porcs sont représentés sur les photographies de la figure 1, les poumons A étant ceux d'un porc auquel on a administré l'extrait de maquereau selon l'inven- tion et les poumons B ceux d'un porcs non traité On notera que les poumons A ont une coloration claire sans foyer de maladie, alors que les poumons B ont une coloration terne avec un foyer de mala- die 1. Note 2: les coeurs des porcs sont représentés dans les photographies de la figure 2, le coeur A est celui d'un porc auquel on a administré l'extrait de maquereau selon l'invention et le coeur B est celui d'un porc témoin On peut constater que le coeur A ne porte pas de graisse adhérente, alors que le coeur B porte une grosse quantité de graisse 2. Note 3: les foies des porcs sont représentés sur les photographies des figures 3 et 4; le foie A de la figure 3 est celui d'un porc auquel on a administré l'extrait de maquereau selon l'invention et le foie B de la même figure est celui d'un porc témoin Le foie A ne contient pas de foyer de maladie, alors que le foie B contient un foyer de maladie 3 - La figure 4 est une photographie représentant un échantillon découpé en tranches du foie du porc B de la figure 3 on peut constater que le foyer de maladie 4 s'étend profondément dans la région interne. EXEMPLE 3: activité anti-ulcéreuse On a étudié l'activité anti-ulcéreuse de l'extrait de maquereau de l'exemple 1 dans le test de l'ulcère de Shay, qui constitue l'un des modèles de formation d'ulcère sur les rats On a étudié l'influence de la dose d'extrait sur la sécrétion de suc gastrique par la méthode de ligature du pylore. Mode opératoire d'essai 1) Activité anti-ulzdreuse (ulcère par ligature du pylore). On a soumis des rats Wistar mules pesant chacun à 200 g au je 1 ne pendant 24 h, puis on a ligature la région du pylore de ces animaux d'une manière générale conformément à la méthode de Shay et collaborateurs (H Shay, S A Kowarov, S S Fels, D Meranze, M Gruentein and Mo Siplet, Gastroenterology, 543 ( 1945)), sous anesthésie à l'éther. Apres avoir laissé les rats au repos pendant 12 h sans alimentation ni boisson, on a prélevé les estomacs et on a évalué les ulcères apparus chez chacun des animaux dans la région frontale de l'estomac par l'indice d'ulcère selon la méthode de Narumi et collaborateurs (S Narumi, T Hirata, K Gomaibashi et M Kanno, J Takeda Res Lab, 29, 85 ( 1970)). A chacun des rats soumis aux essais, on a adminis- tré 500 mg/kg de l'extrait de maquereau dissous dans l'eau par voie orale 1 h avant la ligature du pylore. 2) Activité d'inhibition de la sécrétion du suc gastrique. Cette activité a été déterminée d'une manière générale d'après la méthode de Shay et collaborateurs En détail, on a soumis des rats Wistar mâles pesant 150 & 200 g au je ne pendant 48 h, puis on a ligaturé des pylores Au bout de 4 h on a prélevé le suc gastrique contenu dans l'estomac et on a mesuré le volume gastrique, le débit d'acidité totale et l'activité peptique totale. Le débit d'acidité totale a été déterminé par titrage avec Na OH 0,2 N avec la phtaléine du phénol comme indicateur et l'activité peptique totale a été déterminée d'une manière géné- rale d'après la méthode d'Anson (M L Anson, Jo Gen Physiolo, 22, 79 ( 1938)) La matière de base utilisée était la caséine. Aux rats soumis aux essais, on a administré l'extrait par voie orale 1 h avant la ligature du pylore Les détails et Ies résultats des essais cidessus sont rapportés dans le tableau III ci-après. TABLEAU Ili Traitement Dose Nombre Indice volume Débit d'aci Activité peptique (P.o) (mg/kg) de d'ulcère gastrique, dité totale totale, mg, exprimé rats (moyenne (ml/ 100 g) (mîcroéquiva en tyrosine/10 O g + e t) lents/100 g) 8 3, 13 0, 55 Extrait de maquereau 8 2, 63 + 046 4,24 0,6 470,8 + 42 $ 5 2-5 O,50 *ï O 3039 + 76 1 ** 217,7 t 38,2 157 à 3 43, 6 Sulfate d'atro- pine 8 0, 00 + 0,00 * 0, 62 0, 18 t** 43, 7 17,l*ft a) 0,2 % de CMC (carboxyméthylcellulose) dans l Veau. Différence signifiante avec le groupe témoin * p y a des différences signifiantes dans l'inhibition du volume gas- trique et le débit d'acidité totale, et on observe une tendance à l'inhibition des formations d'ulcères lorsqu'on administre l'extrait de maquereau préparé par le procédé selon l'invention en quantité de 500 mg/kg. La figure 5 est une photographie représentant les estomacs de rats soumis aux essais décrits en détail ci-dessus dans cet exemple, l'estomac A étant celui d'un rat auquel on a administré l'extrait de maquereau préparé par le procédé selon l'invention, l'estomac B celui d'un rat témoin et l'estomac C celui d'un rat auquel on a administré du sulfate d'atropine L'exa- men de la figure 5 montre clairement que les tranches d'estomac A et C sont transparentes et sans ulcère, alors que la tranche d'esto- mac B est ulcérée en 5 o EXEMPLE 4: fonction analogue à celle de l'insuline. On a étudié la fonction analogue à celle de l'insu- line de l'extrait de maquereau de l'exemple 1 en utilisant comme critère l'effet de l'extrait de maquereau sur la lipolyse, induite par l'adrénaline, de cellules grasses libres. Mode opératoire d'essai: On a prélevé l'épididyme de chaque rat et on a utilisé les cellules grasses obtenues par traitement à la collagé- nase pour étudier l'effet d'inhibition de l'émission d'acides gras libres à partir des cellules grasses, émission induite par la lipolyse due à la présence d'adrénaline Les résultats de cet essai sont représentés graphiquement dans la figure 5 des dessins annexés. En référence à cette figure, on voit qu'on isole ,6 microdquivalents/ml d'acides gras libres losqu'on ajoute lg/ml d'adrénaline aux cellules grasses libres La quantité des acides libres isolés tombe a 2,3 microéquivalents/g lorsqu'on ajoute 1 m UI/l d'insuline, Lorsqu'on remplace l'insuline par l'extrait de maquereau, on observe un effet appréciable d'inhibition de l'iso- lation des acides gras libres lorsqu'on porte la concentration d'extrait de maquereau dans le système soumis a l'essai a 500/ g/mlo. On peut donc déduire des résultats représentés graphiquement dans la figure 6 et décrits ci-dessus que l'extrait de maquereau préparé par le procédé selon l'invention a une acti- vité analogue à celle de l'insuline et peut être utilisé en tant que médicament efficace dans le traitement du diabète. EXEMPLE 5: effet anticholestérolémique On a étudié l'efficacté thérapeutique de l'extrait de maquereau préparé dans l'exemple 1 sur la diminution de la teneur encholestérol du sang ou sur le traitement de troubles hépatiques légers dans le cas d'alimentation à forte teneur en graisses. Mode opératoire d'essai On a chauffé une huile à salade à 170-180 C pendant 2 h en y faisant barboter de l'oxygène, formant ainsi des graisses peroxydées On a préparé un aliment mélangé en mélangeant un ali- ment en poudre contenant du cholestérol-cholate de sodium avec l'huile à salade contenant des graisses peroxydées, et on a donné l'aliment mélangé à un groupe de rats Au bout de 5 semaines, les rats avaient une forte cholestérolémie et de légers troubles hépa- tiques. A un groupe de rats, on a administré l'extrait de maquereau, en vue d'étudier l'effet sur la diminution de la teneur en cholestérol par hématologie On a obse 2 vé les organes internes des rats du point de vue pathologique-morphologique. L'extrait a été donné à chaque rat par voie orale une fois par jour. Résultats de l'essai Les détails et résultats de l'essai sont rapportés dans les tableaux IV et V ci-après On peut constater à l'examen -de. ces tableaux qu'il se produit une diminution signifiante des acides gras libres provenant des graisses nutritives et indiquant la maladie cholestérolémique lorsqu'on administre 500 mg/kg de l'extrait de maquereau On constate également une diminution signi- fiante de la valeur GOT (transaminase glutamique-oxaloacdtique) pour le groupe auquel on a administré l'extrait, on sait que cette valeur indique des troubles hépatiques L'observation pathologique- morphologique du foie a révélé que les groupes nourris par l'huile de salade peroxydée avaient un certain nombre de cellules mortes et que le nombre des cellules mortes chez les rats du groupe traité par -l'extrait de maquereau avait diminué. TABLEAU IV Effet de l'extrait de maquereau sur la peroxydation de l'huile à salade. Traitement, Dose, Nombre Transaminase Transaminase Phosphatase Dihydro Bili Bili Choles- p.o mg/kg de glutamique glutamique alcaline génase rubine rubine térol rats oxaloacétique pyruvique lactique totale directe normal 7 88 + 5 26 + 2 13,2 + 1, O252 + 65 0,30 O, O 1 + O40-+ 3 témoin 7 93 + 6 39 + 5 19, 2 + 1, 8359 + 58 O, 3 + 0 0,1 + 0 55 + 3 extrait de maquereau 200 7 94 + 2 38 + 3 17, 6 + 1, 6398 + 68 O, 3 + O 0,1 + 0 56 + 4 extrait de 500 7 8113 * 33 + 3 18,3 + 0,9 316 + 56 0,3 + 0 0,1 + O 56 + 2 maquereau Différence signifiante avec le groupe témoin: p L-n 00, un Traitement (p. o) normal témoin extrait de maquereau e.xtrait de maquereau Différence signifien TABLEAU V Effet: de l'extrait de maquereau sur le 1 Dose, Nombie Trigly Pro- mg/kg de cérides tdines g/g rats totales alb. 7 28 + 4 6,9 + 0,13,2 ±0 7 26 + 6 6,9 + 0,13,1 + 0 7 23 + 4 7,1 + 0,1 3,2 + 0,11 500 7 11 + 2 7,1 + 0,1 3,140 te avec le groupe témoin * p 0, 84 + 0,01 0, 81 JO, O l 0,82 -0,02 0,77 + 0,02 de l'huile Ac ides gras libres 446 + 29 578 + 45 516 + 44 480 + 29 * à salade. 9-lipo- protéine 78 + 5 107 + 6 107 + 8 108 + 4, Lipopro- téine à haute densité + 2 33 + 2 38 + 2 + 2 Peroxy- dation 8,9 + 0,4 , 3 + 0, 6 ,0 +,03 Fr 340,8 Ln Coo O 1 EXEMPLE 6: effet thérapeutique sur le-rhumatisme et l'arthrite On a étudié l'effet pharmacologique de l'extrait de maque- reau préparé dans l'exemple l sur l'arthrite par adjuvant qui cons- titue l'expérience modèle pour les inflammations, y compris le rhuma- * tisme et l'arthrite. Mode opératoire d'essai L'essai a été conduit d'une manière générale selon la méthode de Sele On a utilisé des rats pesant de 140 à 160 g auxquels on a injecté par voie sous-cutanée dans la patte droite 0,05 ml d'un mélange de germes stérilisés de Mycobactérium butyricum (DIFCO) dans du Bayol à la concentration de 10 mg/ml et on a injecté par voie sous-cutanée 0,05 ml du même mélange dans la queue de chaque rat On a déterminé le pourcentage de gonflement en mesurant le volume de l'oedème produit sur la patte et sur la queue de chaque rat Les résultats obtenus sont représentés graphiquement sur la figure 7 des dessins annexés Sur cette figure, on a porté en ordonnées le pour- centage de gonflement en fonction de la durée en jours, en abscisses. La courbe I est celle des rats témoins, la courbe II est celle obte- nue avec les rats traités par l'extrait de maquereau à 200 mg/kg, la courbe III celle obtenue avec les rats auxquels on a administré 500 g/kg de l'extrait de maquereau et la courbe IV celle obtenue avec les rats traités par de la phénylbutazone. Au bout de 1 mois, on a prélevé le sang de chaque rat dans le coeur et on a soumis à un examen hématologîque On a observé les dégradations des os des deux pattes par radiographie Pour les rats soumis aux essais, on a administre l'extrait par voie orale une fois par jour Les résultats des mesures sont rapportés dans les tableaux VI et VII. Résultats des essais A l'injection sous-cutanée, on constate une inflammation primaire de la patte arrière droite avec un pic d'inflammation le cinquième jour après l'injection; l'inflammation secondaire commence le quinzième jour après l'injection Cette inflammation secondaire est supprimée lorsqu'on administre 500 mg/kg de l'extrait de maquereau. L'examen des radiophotographies montre également qu'on a supprimé le gonflement des oedèmes. TABLEAU VI Effet de l'extrait de maquereau sur le sérum de rat traité par adjuvant Traitement (p o) Dose, Nombre Transaminase Transaminase Phosphatase N Cuivre mg/kg de glutamique glutamique alcaline d'urée rats oxaloacétique pyruvique normal 7 126 + 7 30 + 3 23,0 + 2,5 20 '-2 152 + 13 témoin 10 118 + 6 23 + 3 23,1 + 2,8 25 + 2 207 + 11 extrait de maquereau 200 10 117 + 5 23 + 2 19,3 + 1,8 22 + 1 214 + 10 extrait de maquereau 500 10 127 + 12 29 + 7 19; 5 + 2,7 25 + 3 217 + 7 phénylbutazone 50 7 118 + 6 22 + 2 16,4 + 0,5 19 + 2 193 + 22 Io on 1 %> 1 Oc. TABLEAU VII Effet de l'extrait de maquereau sur le sérum des rats traités par adjuvant Traitement Dose, Nom Protéine Rapport (P.o) mg/kg bre de alb a-G ct -G P Y-G totale albumine/ rats globuline normal 7 2,59 + 0 " 20,84 + 0, 07 0,39 + 0,03 0,83 + 0,1 0,8740 J 1 5,80,2 0,85 + 0,1 t?émoin 10 2,08 + 0,08 1,37 + 0,06 0,37 + 0,06 0,88 + 0,09 1,07 + 0,14 5 8 + 0,1 0,56 + 0, 03 extrait de 200 10 2,07 + 0,16 1,09 + 0,06 0,50 + 0,04 0,89 + 0,04 0,94 + 0,09 5702 0,61 + 0,06 maquereau -' * * >'- extrait de 500 10 1,854 + 0,181,2849,10 p,47 o 0,o 60,95 + 0,050,79 + 0, 04 5 > 4 + 0,20,54 + 0,07 maquereau phénylbutaÉone 50 7 2,62 + O f,220,94 + 0,140,43 0,04 O 88 + 0,05 0,88 + 0,ll 5,8 + 0,2 0,86 + 0,13 a-. r O Ln' Il est clair que l'invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'exemples et que l'homme de l'art peut y apporter des modifications sans pour autant sortir de son cadre. 254 1897 R E V EN DI C A T I O N S 1 Procédé de préparation d'extraits de poissons, mollusques et/ou crustacés possédant des propriétés pharmacologiques, caractérisé en ce qu'il comprend les stades opératoires suivants: a) on chauffe des poissons, mollusques et/ou crustacés crus non broyés à une température non inférieure à 75 C afin de provoquer une désactivation complète des enzymes autolytiques contenues dans ces organismes et simultanément d'éliminer l'odeur de poisson, b) on ajoute aux poissons, mollusques et/ou crustacés une protéase obtenue à partir de Bacillus subtilis à une température de 50 à 60 C et à un p H de 6,0 à 7,0 afin de décomposer les protéines de ces poissons, mollusques et/ou crustacés jusqu'au stade protéoses, c) on porte la température à un niveau non inférieur à 75 C afin de désactiver complètement la protêase de Bacillus subtilis, d) on ajoute aux protéoses obtenues à partir des poissons, mollusques et/ou crustacés une protéase obtenue à partir de la moisissure Koji à une température de 40 à 50 C et à un p H de 6,0 à 7,0, et on maintient le mélange à cette température pendant 1 à 3 h afin de décomposer les protéoses en peptides d'un poids moléculaire nettement inférieur à 3 000 et aminoacides libres, e) on porte la température à un niveau non inférieur à 75 C afin de provoquer la désactivation complète de la protéase de moisissure Koji, et f) on sépare et on concentre les produits de décomposition obtenus. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, dans le stade opératoire a), les poissons, mollusques et/ou crustacés crus sont chauffés à une température non inférieure à 800 C pendant une durée de 10 min à 1 h. 3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, dans le stade opératoire b), les protéines des poissons, mollusques et/ou crustacés sont décompoées à un p H de 6,0 à 6,5. 4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, dans le stade opératoire b), on décompose des poissons, mollusques et/ou crustacés pendant une durée de 1 a 3 h. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, dans le stade opératoire c), on désactive en chauffant à une température non inférieure à 80 C, pendant une durée de 10 min à 1 h. 6 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les poissons, mollusques et/ou crustacés sont choisis dans le groupe consistant en Trachurus japonicus, les maquereaux, les sardines, Cololabis saira, les thons, Pleurogrammus azonus, la morue, la seiche, le poulpe, les crevettes grises, les crevettes roses, les huîtres, Corbicula leana, Ruditapes philippinarum, les moules, Anadara brunghtoni, les palourdes et leurs mélanges. 7 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les extraits de poissons, mollusques et/ou crustacés ne contiennent pas moins de 50 % en poids de protéines brutes et contiennent moins de 1 % en poids de graisses brutes. 8 A titre de médicaments nouveaux, utiles notamment en raison de leur activité anti-ulcéreuse, anti-diabétique, anti- lipémique, anti-rhumatismale et anti-arthritique, les extraits de poissons, mollusques et/ou crustacés préparés par le procédé selon la revendication 1. 9 Compositions thérapeutiques contenant en tant que substance active un extrait de poissons, mollusques et/ou crustacés obtenu par le procédé selon la revendication 1. Forme d'administration des compositions thdrapeu- tiques selon la revendication 9.