FR 2545837 A1 19841116 FR 8407287 A 19840511 TRANSFORMATION DE CELLULES EUCARYOTES FAVORISEE PAR DES LIPOSOMES L'invention concerne un procédé d'encapsulation de molécules biologiquement actives, par exemple d'acide désoxyribonucléique (DNA), dans des vésicules lipidiques ou liposomes et des méthodes d'utilisation de ce DNA encapsulé dans un lipide pour transformer des cellules, parti- culièrement des cellules végétales. Une transformation peut être définie comme le processus général de transfert unidirectionnel d'information génétique selon lequel du DNA ayant son origine dans une cellule est absorbé et est maintenu de façon stable dans une autre cellule Ces transferts de DNA prennent plusieurs formes Entre des bactéries, le transfert d'information se produisant naturellement sur des plasmides s'appelle conjugaison Le DNA viral peut être intégré de façon relativement stable dans le chromosone bactérien dans une infection non lysogénique pour n'être libéré qu'après, en ré- ponse à un stimulus inducteur. La transformation de l'information sous la forme de DNA existant à l'état naturel ou construit de façon artificielle à partir d'une source d'origine dans une cellule procaryote ou eucaryote se situe au coeur du génie génétique Cette transformation peut s'accomplir d'un certain nombre de façons Le plus habituellement, des cellules, notamment des cellules bactériennes, sont exposées pendant une certaine période de temps à des solutions aqueuses tamponnées de DNA en cours de transforma- tion qui contient un marqueur susceptible d'être sélectionné Les cellules sont sélectionnées pour la caractéristique conférée par le marqueur La résistance aux antibiotiques est un marqueur susceptible d'être sélectionné communément utilisé Une autre méthode de transformation implique l'incubation des cellules à transformer dans une solution tamponnée contenant du polyéthylèneglycol (PEG) à des concentrations approchant 50 % et dans une solution aqueuse tamponnée de DNA en cours de transformation Les cellules qui survivent sont sélectionnées pour les caractéristiques qui leur sont conférées par le DNA en cours de transformation. En général, avant que les cellules puissent être transformées, elles sont prétraitées pour les rendre capable de transformation Ces prétraitements autorisent un accès à la membrane cellulaire et un trans- fert ultérieur du DNA en cours de transformation à travers la membrane cellulaire Avant que quelques cellules bactériennes puissent être transformées par les techniques brièvement décrites ci-dessus, les cel- lules bactériennes sont traitées avec des enzymes ou des antibiotiques qui digèrent la paroi cellulaire bactérienne ou interfèrent avec sa formation La membrane cellulaire est ainsi exposée et les cellules sont rendues osmotiquement fragiles Dans d'autres cellules bactériennes, les cellules sont rendues aptes par transformation par exposition à des tampons contenant du chlorure de calcium. La transformation de cellules eucaryotes peut être accomplie à l'aide de techniques semblables Les cellules animales manquent en général de parois cellulaires et sont donc osmotiquement fragiles si elles ne subissent un prétraitement aux enzymes ou aux antibiotiques. Les cellules de levure sont généralement rendues osmotiquement fragiles par prédigestion avec la zymolyse de l'enzyme Le sphéroplast qui en résulte, c'est-à-dire la cellule de levure manquant de paroi cellulaire, est incubé en même temps que le DNA en cours de transformation avec ou sans PEG Les cellules végétales sont aussi généralement rendues osmotiquement fragiles par digestion enzymatique de la paroi de la cellule végétale avant sa transformation par l'une ou l'autre des méthodes brièvement décrites ci-dessus Ces cellules végétales osmotiquement fragiles sont généralement désignées sous le nom de protoplasts cellulaires végétaux. Les personnes cherchant à transformer les cellules, notamment les cellules osmotiquement fragiles, qu'elles soient procaryotes ou eucaryo- tes, et particulièrement les protoplasts végétaux, se sont heurtés à deux problèmes majeurs, imbriqués l'un dans l'autre, pour parvenir à une transformation à fréquence élevée Premièrement, les cellules absorbent généralement le DNA à travers la membrane cellulaire pour des fréquences très faibles Ce phénomène est une manifestation d'une caractéristique plus générale de la membrane cellulaire; celle-ci est généralement sélec- tivement perméable, ce qui permet aux petites molécules de les traverser mais empêche le passage de molécules importantes, par exemple de pep- tides ou de protéines, de saccharides et de polynucléotides tels que le 3 2545837 DNA ou l'acide ribonucléique (RNA) Deuxièmement, outre la faible fré- quence de l'absorption de DNA, les enzymes de dégradation, notamment les nucléases, c'est-à-dire les enzymes qui dégradent les acides nucléiques, DNA et RNA, présents dans des préparations'de cellules osmotiquement sensibles, y compris des protoplasts végétaux, digèrent les acides nucléiques et endommagent l'information qui y est contenue avant qu'elle ne puisse être absorbée par la cellule. Un certain nombre de techniques sont généralement disponibles pour augmenter l'efficacité de l'absorption du DNA par les cellules. Parmi ces techniques, il faut citer l'encapsulation de solutions aqueuses de la substance à absorber par la cellule dans des vésicules lipidiques, qui sont des enveloppes de bicouches lipidiques formant une membrane continue qui englobe un espace aqueux Les vésicules lipidiques ou liposomes sont alors incubés avec la cellule osmotiquement fragile dans des conditions qui, le semble-t-il, permettent aux membranes lipidiques du liposome de fusionner avec la membrane cellulaire de la cellule à transformer Lorsque la membrane lipidique du liposome a fusionné avec la membrane cellulaire, le contenu aqueux des liposomes est, on le pense, libéré dans le cytosol aqueux que constitue la phase aqueuse de l'intérieur de la cellule. Divers facteurs affectent l'efficacité de l'introduction favori- sée par un liposome de substances aqueuses dans l'intérieur de la cel- lule Spécifiquement, eu égard à l'introduction favorisée par un liposome de macromolécules telles que des acides polynuclêiques, par exemple DNA et RNA, protéines et polysaccharides, l'efficacité avec laquelle la substance aqueuse est encapsulée dans le liposome, la stabi- lité des substances à encapsuler pendant la formation du liposome, et la variabilité de l'absorption des liposomes par différentes cellules affectent toutes la vitesse d'introduction des substances aqueuses dans la cellule. Une excellente revue des facteurs affectant l'encapsulation et relative au domaine des liposomes en général est donnée dans l'étude "Liposomes: Preparation and Characterization" par Szoka S et Papahadjopoulos D, apparaissant dans le chapitre 3 de Liposomes: From Physical Structure to Therapeutic Applications, Elsevier/ North Holland Biomedical Press ( 1981), Knight, Editeur. Brièvement résumées, les méthodes actuellement utilisées sont les suivantes Les liposomes se formant les plus simplement sont les vési- cules multilamellaires (appelés dans la présente "MLV") Les MLV sont 4 25 45837 formés par dépôt d'un film lipidique mince sur la paroi d'un ballon ou d'un tube, addition d'une phase aqueuse, et agitation modérée du récipient Les MLV ainsi formés présentent des couches ou lamelles lipidiques multiples L'inconvénient majeur du MLV, reside dans son encapsulation aqueuse faible due à de la formation des couches lipidiques multiples, ( Bangham et coll ( 1965), J Mol Biol, 13:238-252). Si les MLV sont soumis à un traitement sonique sous atmosphère inerte, par exemple sous azote, une population homogène de petits vési- cules unilamellaires (SUV) de moins de 100 nanomètres (NM) de diamètre se forment La petite taille des SUV limite à la fois l'encapsulation de l'espace aqueux par mole de lipide et la taille des macromolécules qui peuvent être encapsulées est généralement inférieure d'environ 000 daltons (d) Papahad Jopoulos D et Miller N ( 1967), Biochim. Biophys Acta, 135:624-638 Adrian G et Huang L ( 1979), Biochemistry, 18:5610-5614. Plusieurs méthodes ont été mises au point pour produire des vési- cules unilamellaires importants (LUV), qui sont des vésicules lipidiques de plus de 100 NM de diamètre L'injection de solvant, c'est-à-dire la formation de vésicules par infusion de solvants organiques contenant des phospholipides dans un volume comparativement important d'une phase aqueuse, a été utilisée mais le rendement d'encapsulation du plasmide p BR 322 DNA n'est seulement que d'environ 3 % Deamer D W et Bangham A D. ( 1976), Biochem Biophys Acta 443:629-634 Fraley R T et coll. ( 1979), P N A S 76:3348-3352 En outre, la technique est mise en oeuvre à environ 60 C, température qui est relativement élevée pour conserver l'intégrité de la plupart des molécules biologiques. Une autre technique impliquant l'élimination, par divers moyens, de détergents de mélanges détergents/phospholipides a été utilisée mais les rendements d'encapsulation vont seulement d'environ 6 % à environ 12 %, (Enoch H G et Strittmatter P ( 1979), Po No A S, 76:145-149) En outre, le reste de détergent associé au liposome peut affecter la survie de la cellule lorsque le liposome produit par cette méthode est employé pour le transfert du contenu de l'espace aqueux à l'intérieur de la cel- lule. Une fusion induite par du calcium a été également utilisée pour former des LUV, (Papahadjopoulos et coll ( 1975), Biochem Biophys. Acta, 394:483-491) Dans cette méthode, les SUV préformés constitués de 254583 t phospholipides acides sont traités par du calcium et de l'acide éthylène- diaminotétraacétique (EDTA) pour former des grands vésicules unilamellai- res fermés Le rendement de l'encapsulation pour des particules telles que des virus et macromolécules, telles que RNA messager et DNA, est seulement d'environ 10 % si l'on utilise cette technique; pour des molécu- les plus petites telles que sucrose, on observe un rendement d'encapsula- tion d'environ 15 % En outre, la technique est limitée par la dimension des molécules qui sont initialement encapsulées dans les SUV utilisés dans cette méthode. Une autre méthode, l'évaporation de phase inverse, a été utilisée pour encapsuler des substances dissoutes dans une phase aqueuse En fonction de la force ionique du tampon aqueux, de 20 % à environ 60 % de la phase aqueuse peuvent être encapsulés à l'aide de cette technique, (Szoka S et Papahadjopoulos D ( 1978), Ann Rev -Biophys Bioeng, 9:467-508; Fraley et coll ( 1980), J Bio Chem, 255:10431-10438) Dans cette méthode, les lipides sont dissous dans des solvants organiques ou dans des hydrocarbures fluorés à bas point d'ébullition La matière aqueuse est ajoutée directement dans le mélange lipide/solvant et la préparation est ensuite soumise à un traitement sonique pour former une émulsion homogène L'étape de traitement sonique est cruciale pour obte- nir des vitesses d'encapsulation élevées Les solvants sont ensuite éliminés par évaporation, étape pendant laquelle les liposomes se for- ment. En cherchant à employer l'évaporation de phase inverse pour pré- parer des liposomes contenant du DNA pour la transformation de proto- plasts végétaux et d'autres cellules osmotiquement fragiles, la demande- resse a découvert que l'étape de traitement sonique enseignée par l'état de la technique, même pendant des périodes de temps brèves, dégrade et endommage sensiblement le DNA qui est contenu dans les liposomes et qui est finalement transféré dans la cellule à transformer Il en résulte que, bien que le rendement d'encapsulation soit élevé lorsque l'on uti- lise la technique d'évaporation de phase inverse, la fréquence de trans- formation est faible. La demanderesse a en outre découvert qu'une agitation vigoureuse de la préparation aqueuse-solvant-lipide produisait des liposomes avec des rendements d'encapsulation élevés sans endommager ou dégrader autre- ment les macromolécules, notamment le DNA, contenues au sein de l'espace aqueux du liposome. 6 2545837 En particulier, on a découvert que des liposomes préparés par évaporation de phase inverse dans laquelle on omettait l'étape de traitement sonique et on la remplaçait par une étape de traitement dans un vortex pour émulsionner la préparation aqueuse-solvant-lipide contenant divers plasmides, pouvaient être utilisés pour transformer des cellules végétales avec une fréquence élevée En outre, on a découvert que les plasmides pouvaient être introduits sensiblement intacts dans des protoplasts végétaux à l'aide des liposomes produits de cette façon. Spécifiquement, on a trouvé que le plasmide p BR 327 encapsulé par un liposome pouvait être transféré avec une fréquence élevée dans des protoplasts cellulaires végétaux o il se maintenait et se reproduisait de façon stable et inattendue En outre, on a trouvé que le p BR 327 se maintenait de façon stable et se reproduisant dans les cellules végétales. Le procédé emploie un mélange approprié de lipides pour préparer les liposomes Ces lipides peuvent comprendre par exemple la phosphati- dyl-sérine (PS), phosphatidyl-choline (PC), dipalmitidyl-phosphatidyl- choline, cholestérol (CH), stéarylamine (SA) et dicétylphosphate (DCP). L'alphatocophéral peut aussi être ajouté au mélange. Le rapport des divers lipides peut varier mais en général l'in-: tervalle est compris era entre les rapports molaires suivants: 0-10 PS/O-9 PC/0-5 CH/O-1 SA/0-1 DCP. Bien qu'il soit possible de former des liposomes à partir de PS seuls ou de PC seule, on emploie le plus habituellement des mélanges de lipides. En général, le rapport de divers lipides peut varier pour former des liposomes ayant une charge nette positive, neutre ou négative Par exem- ple, 1 PS/4 PC/5 CH donne des liposomes ayant une charge nette négative; 1 PC/1 CH des liposomes ayant une charge nette neutre, 1 SA/4 PC/5 CH des liposomes ayant une charge nette positive On préfère des liposomes ayant une charge nette négative. Si les divers lipides sont fournis dans un solvant, par exemple le chloroforme, les lipides sont mélangés dans le solvant dans le rap- port désiré; le solvant est évaporé et les lipides restent dans le récipient Un solvant organique tel qu'éther diéthylique ou éther diiso- propylique, ou un mélange de solvants organiques, par exemple diisopro- pyléther et chloroforme, ou fluorocarbures à bas point d'ébullition, est ajouté au mélange de lipides On utilise de préférence le diéthyléther. 7 2545837 On prépare une solution aqueuse contenant la substance à encapsu- ler dans les liposomes, En général, la solution aqueuse comprend la substance à encapsuler, par exemple une macromolécule telle que DNA, RNA, protéine, polysaccharide, glycoprotéine ou analogue ou un plasmide dans un tampon approprié Par exemple, si l'on doit encapsuler du DNA, on utilise du tri(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris) 10 millimolaires (m M) et de V'EDTA 0,1-1,0 m M à p H 8 ou un tampon de mannitol 0,4 molaire (M) au même p H La solution aqueuse est ajoutée au mélange lipide-solvant pour former une préparation aqueuse solvant-lipide. La préparation aqueuse-solvant-lipide est alors vigoureusement agitée par des moyens qui n'endommagent ni ne détruisent sensiblement l'intégrité de la substance à incorporer Ces moyens comprennent généra- lement une rotation et un secouage simultanés et rapide de la prépara- tion pendant une période de temps suffisante pour permettre une émulsifi- cation sensible des phases aqueuses et lipide-solvant de la préparation. Un secouage rapide et vigoureux seul et une rotation vigoureuse et rapide seule conviendaient également à cette fin Un dispositif approprié pour l'agitation rapide requise, consiste en un mélangeur de type vortex Le traitement dans le mélangeur vortex pendant une période de temps s'éten- dant entre approximativement 30 secondes à 10 minutes, donne une émulsi fication convenable de la préparation aqueuse lipide-solvant Le traite ment au vortex pendant 3 minutes est habituellement utilisé Un traite- ment sonique n'est pas souhaitable puisqu'il occasionne une dégradation de la structure de nombreuses macromolécules, particulièrement des poly- nucléotides tels que DNA et RNA et des polypeptides tels que protéines. Après une agitation adéquate pour émulsionner la préparation, le solvant est éliminé de la préparation, de préférence à des températures physiologiques non supérieures à 370 C Bien que l'on préfère 370 C, parce qu'il ne se produit sensiblement pas de dégradation de la plupart des molécules biologiques telles que DNA, RNA, polysaccharides et polypep- tides à cette température, la température peut être augmentée, ceci dépendant de la résistance de la molécule à incorporer au chauffage, ou baissée, ceci dépendant de la viscosité du mélange de lipide, de l'opti- mum de transition de phase pour les lipides utilisés et de la tempéra- ture optimum pour l'absorption du liposome des cellules De façon opti- mum, le solvant est éliminé à une pression négative, de préférence envi- ron 304 mm de mercure, ( 314 bars) sous une atmosphère de gaz inerte due par exemple à un gaz tel que l'azote. 8 2545837 Les liposomes obtenus ainsi qu'il est indiqué ci-dessus peuvent être utilisés directement pour transformer des cellules osmotiquement fragiles telles que des protoplasts végétaux ou les liposomes peuvent être soumis à une étape de purification En général, la purification peut être accomplie par centrifugation analytique, ou par chromatographie ou par dialyse Les liposomes peuvent également être sélectionnés pour leur charge par électrophorèse Une purification peut être accomplie par exemple par formation de couches de la préparation de liposome sur un gradient étagé ou linéaire de sucrose ou de sucrose osmotique dans un tube centrifuge et en faisant tourner la préparation de liposome à une vitesse et pendant une durée appropriée dans une centrifugeuse pour permettre une sélection de la fraction de liposome désirée Une méthode utilisée avec beaucoup de succès a consisté à remettre les liposomes en suspension dans une solution de sucrose à une concentration entre environ 0,4 et environ 0,8 M au fond d'un tube centrifuge Une couche de sucrose, à une concentration comprise entre environ 0,2 à environ 0,4, et de sucre osmotique, de préférence du manni- tol, à une concentration entre environ 0,1 et 0,4 M, est placée au-dessus des liposomes remis en suspension De préférence, la solution de sucrose osmotique est comprise entre 0,3 m de sucrose et 0,1 M de mannitol Le tube est centrifugé à environ 100 000 fois l'intensité de la pesanteur pendant environ 40 minutes, période à la fin de laquelle on recueille les liposomes qui flottent au sommet du tube. D'autres méthodes d'identification des liposomes ayant des carac- téristiques particulières et d'isolation des liposomes identifiés peu- vent aussi être utilisées Par exemple, la chromatographie d'exclusion sur gel à large pore et la chromatographie en couche mince sur des perles d'agarose sont des méthodes bien connues pour déterminer la distribution de dimension des préparations de liposomes, (Van Renswoude et coll. ( 1980), Biochem Biophys Acta, 595:150-156). La préparation de liposome, qu'elle soit purifiée ou non puri- fiée, est alors mise en contact avec les cellules à transformer En général, toutes cellules osmotiquement fragiles ou cellules rendues capables d'être transformées peuvent être employées dans cette étape mais en pratique, la cellule à transformer sera choisie pour une fin particulière et pour un certain complexe de caractéristiques On peut ainsi sélectionner des cellules animales Des cellules de levure modi- fiées par voie enzymatique ou antibiotique pour former des sphéroplasts 9 254583 t peuvent être mises en contact si par exemple les cellules de levure transformées doivent finalement être utilisées dans un processus de fermentation, de brasserie ou de clonage Des protoplasts bactériens ou des cellules bactériennes prétraités avec des solutions de chlorure de calcium ou par d'autres méthodes qui rendent la cellule bactérienne capable de transformation, peuvent être utilisés pour toute une variété de fins, par exemple production d'amino acide, production d'hormones, clonage et analogue; Les protoplasts cellulaires végétaux produits par toute une diver- sité de méthodes bien connues à l'homme de l'art, ont été à plusieurs reprises transformés en utilisant des liposomes contenant du DNA exogêne produit de la façon décrite ci-dessus Les conditions de transformation des protoplasts cellulaires végétaux varient, mais en général, les proto- plasts cellulaires végétaux seront maintenus dans un tampon approprié qui est conçu pour maintenir l'équilibre osmotique du protoplast cellu- laire végétal Ces tampons sont bien connus dans la technique de la culture des cellules végétales Un exemple d'un tel tampon, consiste en le Tris 5 m M comprenant un sucre osmotique, par exemple le mannitol, dans une proportion de 0,4 M à 0,8 M, et du chlorure de calcium dans une proportion supérieure à environ 1 m M et inférieure à environ 50 m M à urn p H compris entre environ 5,0 et environ 8,0 Pour la transformation, on préfère un p H d'environ 6,5. La transformation utilisant des liposomes est facilitée par addi- tion à l'échantillon de tampon et des protoplasts cellulaires végétaux, du PEG dans un intervalle de poids moléculaire compris entre environ 1000 et environ 20 000 d et un intervalle de concentration compris entre environ 10 % et environ 40 % volume/volume (v/v) de l'échantillon total. Le PEG dans un intervalle de poids moléculaire d'environ 1000 à environ 6000 d convient particulièrement et un PEG de poids moléculaire d'envi- ron 4000 d en concentration d'environ 20 % v/v de l'échantillon total s'est avéré être l'optimum En utilisant le système de transformation par liposome décrit ci-dessus, il a été possible d'introduire dans les protoplasts végétaux toute une variété de plasmides d'origine procaryo- te, et/ou eucaryote Les plasmides introduits dans les protoplasts végé- taux à l'aide des méthodes décrites ci-dessus comprennent: Ye P-13 LT 5, Escherichia coli p BR 322 et p BR 327 et des portions du génome SV 40, bien que ces plasmides ne se soient pas tous maintenus de façon stable De 2545837 façon surprenante, on a trouvé que le p BR 327 se maintenait de façon stable dans la cellule végétale et s'y reproduisait de façon stable. L'invention sera mieux appréciée par l'homme de l'art à partir des exemples suivants, qui ne sont donnés qu'à titre d'exemple Il appa- rait facilement que l'on peut se départir des concentrations chimiques exactes, des températures, de la durée de traitement, du type des cel- lules et analogues, sans déborder du cadre de la présente invention. EXEMPLE 1 Effet d'un traitement sonique ou d'un traitement mécanique par vortex sur le rendement de l'encapsulation du DNA par des liposomes chargés négativement Un mélange de lipide contenant de la phosphatidylsérine 1 micro- molaire ("M), de la phosphatidylcholine 4 p M et du cholestérol 5 p M, est dissous dans 0,5 millilitres (ml) d'éther pour former un mélange lipide- solvant On prépare une solution aqueuse tamponnée, contenant du DNA marqué par du phosphate 32 ( 32 p), à partir de plasmide BAMH/29 inséré dans du p BR 322, à une concentration de 10 microgrammes (pg) par ml dans du chlorure de potassium 10 m M, du phosphate de potassium 10 m M et de l'EDTA 0,1 m M à p H 6,5 On ajoute alors 0,15 ml de cette solution au mé- lange solvant-lipide pour former une préparation aqueuse lipide-solvant. La solution aqueuse lipide solvant est émulsifiée par traitement sonique pendant une période de 5, 20 ou 120 secondes dans un appareil sonique du type à bain, ou par soumission à un traitement mécanique par vortex un pendant 30, 120 ou 600 secondes Après émulsification, les liposomes sont formés par élimination de l'éther sous vide partiel d'environ 300 mm de mercure ( 304 bars), sous une atmosphère d'azote inerte Les liposomes ainsi obtenus sont purifiés par centrifugation comme-suit: environ 0,15 ml des liposomes sont mélangés avec environ 0,85 ml de sucrose 0,4 M Ensuite, 2,85 ml d'une solution sucre-osmotique de sucrose 0,3 M et de mannitol 0,1 M sont mis en couche au-dessus de la couche liposome-sucrose 0,4 M et le tube est centrifugé à environ 100 000 x g pendant environ 40 minutes Les liposomes purifiés flottent au sommet du tube o on les recueille. Le pourcentage d'encapsulation du DNA est estimé par mesure du DNA marqué 32 p dans un compteur à scintillation liquide réglé pour répondre au 32 p Les rendements d'encapsulation des divers traitements sont représentés sur le tableau I Les rendements d'encapsulation utili- sant un passage au vortex sont d'approximativement 65 % de ceux que l'on obtient par traitement sonique pendant environ la même période de temps il 2 45837 ( 120 secondes) Augmenter la période de passage au vortex à 600 secondes donne un taux d'encapsulation du DNA égal a environ 71 % du taux maximum observé en utilisant le traitement sonique. TABLEAU I Durée du % d'encapsulation du Durée du traitement par DNA marqué par 32 p traitement Vortex sonique secondes 19 31 5 secondes secondes 24 38 20 secondes- 600 secondes 27 37 120 secondes EXEMPLE 2 Effet du passage au vortex ou du traitement sonique sur l'inté- grité du DNA encapsulé dans un liposome - Des liposomes sont produits comme dans l'exemple 1 ci-dessus. Après que les liposomes se soient formés, des parties aliquotes d'envi- ron 30 Pl chacune d'une préparation de liposome purifié sont placées dans des tubes micofuges de 0,25 ml On ajoute 0,1 ml de phénol et l'on mélange énergiquement avec les parties aliquotes de liposome et ensuite on centrifuge pendant 30 secondes 20 ml de suspension aqueuse restants après l'extraction du phénol sont enlevés par électrophorèse sur gel effectué sur un gel d'agarose à 1,4 % en présence d'un tampon de Tris 10 m M, EDTA lm M à p H 8 Les échantillons sont traités pendant environ 2,5 heures à 150 volts Le front de l'échantillon est déterminé à l'aide d'un colorant traceur bleu dans du glycérol à 50 % ajouté à chaque puits d'échantillon du gel Les fractions-de DNA sont visualisées par traitement avec du bromure d'éthidium sous lumière ultraviolette (UV) Du DNA non traité et des standards de la taille du DRA sont traités sur le gel en même temps On n'observe pas de différences notables entre les échantillons passés au vortex et le plasmide de DNA non traité Une rupture importante enfragments de longueur aléatoire du DNA de tous les échantillons traités par voie sonique est mise en évidence par des lon- gues tâches de DNA ne présentant pas de pics de migration discernables. EXEMPLE 3 Introduction favorisée par un liposome de plasmide p BR 327 sur des protoplasts de blé Des protoplasts de blé sont préparés comme suit Des cellules de blé en suspension sont incubées dans: mannitol 0,2 m, Ca C 12 0,08 M, Cellulysine à 5 % (p/v) (Cal Biochem), pectinase à 2,5 % (Sigma) et 12 2545837 Driselase à 1,25 %, (Kyowa Hakko Kogyo Co, Ltd, Tokyo, Japon) à 16 C pendant 4 à 6 heures, dans des ballons placés sur un incubateur rotatif à 70 tr/mn Les protoplasts de blé sont recueillis par centrifugation à faible vitesse pendant 2 minutes dans un centrifugeur clinique Les protoplasts de blé sont lavés deux fois dans mannitol 0,4 M, K Cl 10 m M et dans l'acide 2-(N-morpholino)éthane sulfonique 10 m M (MES)-Tris à p H 6,5 puis remis en suspension à raison de 1 x 106 protoplasts par ml dans un tampon de mannitol 0,4-M. Les liposomes sont formés comme suit: 0,81 mg de PS, 3,1 mg de PC, 1,9 mg de CH et 25 pg d'alpha-tocophénol sont mélangés dans le chlo- roforme et le chloroforme est éliminé par évaporation sous vide 0,5 ml d'éther sont ajoutés aux lipides pour un volume final d'environ 0,5 ml. Du DNA provenant de plasmide p BR 327, soit marqué avec du 32 p par trans- lation sur franges, soit non marqué, est mis en suspension à une concen- tration de 1 mg/ml dans un solution aqueuse de tampon contenant 10 m M de Tris, 1 m M de EDTA à p H 8,0 25 pl du DNA contenant une solution de tam- pon aqueux sont ajoutés au mélange lipide-éther De l'eau et du sorbitol sont ajoutés à ce mélange à une concentration finale en sorbitol de 0,4 M avec un volume aqueux final de 0,15 ml formant une préparation aqueuse lipide-solvant La préparation aqueuse lipide-solvant est passée au vortex pendant environ 3 minutes Après passage au vortex, l'éther est évaporé dans un évaporateur rotatif à environ 300 mm de mercure, sous une atmosphère d'azote à 37 C Des liposomes se forment pendant l'étape d'évaporation de l'éther 0,15 ml de liposomes bruts sont purifiés par mise en suspension dans 0,85 ml de sucrose 0,4 M dans un tube centrifuge à un volume final de 1 ml Le mélange liposome-sucrose est surmonté de 2, 85 ml de sucrose 0,3 m et de mannitol 0,1 M Le tube est centrifugé à environ 100 OO Oxg pendant 40 minutes à 20 C Les liposomes flottent à la surface, formant une préparation de liposomes purifiés que l'on récupère pour procéder à une incubation avec les protoplasts de blé. Environ 1 ml des protoplasts de blé dans le tampon de mannitol 0,4 M contenant 1 x 106 protoplasts de blé par ml est incubé avec 0,1 ml de la préparation de liposome purifié contenant approximativement 0,97 mg/ml de lipide Du PEG 4000 est ajouté à ce mélange à une concen- tration finale d'environ 20 % Le mélange liposome-protoplast-PEG est incubé à 25 C pendant environ 15 minutes. Le mélange liposome-protoplast-PEG est dilué lentement et par étape avec un tampon de mannitol 0,4 M à un volume final d'environ 13 2-545837 ml La préparation diluée est centrifugée à environ 100 xg pendant 2 minutes sur un centrifugeur clinique à basse vitesse Ce qui surnage est éliminé et les protoplasts de blé sont remis en suspension dans 8 ml de tampon de mannitol 0,4 M, recentrifugés comme ci-dessus et remis en suspension dans des milieux de culture Un litre de mélange de culture contient ce qui suit: phosphate monopotassique 170 mg, nitrate d'ammonium 1 600 mg, nitrate de potassium 1 900 mg, chlorure de calcium dihydraté 440 mg, sulfate de magnésium hepta hydraté 370 mg, sulfate de manganèse monohydraté 16,9 mg, sulfate de zinc monohydraté 10,3 mg, acide borique 6, 2 mg, iodure de potassium 3,83 mg, molybdate de sodium 0,25 mg, sulfate de cuivre 0,025 mg, chlorure de cobalt 0,025 mg, acide nicotinique 5 mg, chlorhydrate de thiamine 10 mg, chlorhydrate de pyridoxine 10 mg, iinositol 100 mg, acide 2,4-dichlorophénoxy acétique 2,0 mg, sucrose 20 g, glucose 250 mg, mannitol 64 a et agar-agar à 0,1 %. Le p H du milieu est ajusté à 5,0 Les milieux conditionnés constitués à partir des milieux décrits ci-dessus dans lesquels on fait tout d'abord croître des protoplasts de blé pendant 2 ou 4 jours et on les élimine ensuite, est ajouté aux milieux de croissance à une concentration finale d'environ 20 % Les protoplasts de blé sont cultivés sur des plaques contenant les milieux décrits ci-dessus à 28 à 30 C dans le noir pendant une période suffisante pour une croissance maintenue. Du plasmide de DNA est isolé des cellules à divers moments pen- dant une période de croissance de 26 jours Les cellules sont recueil- lies par centrifugation et le milieu de croissance qui surnage est jeté. 104 à 105 cellules sont remises en suspension dans 0,2 ml de tampon d'extraction contenant 1 % de sarkozyl, 20 m M de EDTA, 50 m M de Na Cl, 250 m M de sucrose, 50 m M de Tris, à un p H de 8,0 pendant environ 4 heures 14 2545837 à la température ambiante Le tampon d'extraction est lavé à deux repri- ses à l'aide de 0,5 ml de phénol saturé avec 50 m M de Tris, 50 m M de chlorure de sodium, 2 ml d'EDTA et 1 m M de béta-mercaptoéthanol à un p H de 7,5 Le DNA est précipité à l'éthanol et on le stocke pendant la nuit à -20 C Les pastilles de DNA sont lavés et remises en suspension dans de l'éthanol à 95 %, séchées à l'air et finalement redissoutes dans un tampon de chlorure de sodium-citrate de sodium 0,1. Des parties aliquotes de cette préparation de DNA purifié sont utilisées pour transformer des E coli en utilisant des méthodes bien connues dans l'état de la technique Apres transformation et croissance ultérieure des cellules transformées de E coli, le plasmide est réisolé de la culture de cellules de E coli Les plasmides de DNA réisolés sont digérés avec des enzymes de restriction et traités par électrophorése en même temps que le plasmide de DNA isolé auparavant à partir des cellules végétales à des fins de-comparaison. Le DNA isolé des cellules végétales est remis en solution par électrophorèse sur gel d'agarose à 1,4 % Le DNA est pointé sur nitrocel- lulose en utilisant la méthode de pointage Southern et il est hybridisé en un échantillon de DNA marqué par du 32 p de p BR 327 Le filtre qui en résulte est autoradiographié sur film Kodak X-omat. On ne trouve pas de différence entre le DNA p BR 327 isolé à partir des protoplasts végétaux ou de E coli et les standards de p BR 327 De façon significative, les bandes de DNA p BR 327 augmentent d'intensité avec l'augmentation dans la période de la culture de protoplasts de blé, ce qui indique que le plasmide p BR 327 s'est reproduit au sein des cul- tures de cellules de blé. 22545837 REVENDICATIONS 1. Un procédé pour faire passer une substance au-travers de la membrane cellulaire d'une cellule consistant: (a) à préparer un mélange lipidique approprié; (b) à dissoudre ce mélange lipidique dans un solvant miscible à l'eau; (c) à former une préparation aqueuse lipide-solvant par addition à ce mélange lipide-solvant dissous d'une solution aqueuse de ladite substance; (d) à mélanger intimement cette préparation aqueuse lipidesolvant dissoute par des moyens non destructifs de ladite substance; (e) à éliminer ce solvant pour former des liposomes; et - (g) à mettre en contact cette cellule avec ces liposomes dans un tampon convenable. 2 Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le solvant est un solvant organique polaire pouvant s'évaporer dans des conditions non destructives vis-à-vis de ladite substance. 3. Un procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ce solvant est l'éther éthylique. 4 Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape d'élimination se fait par évaporation à environ 37 C à 304 mm de mercure ( 314 bars), sous une atmosphère formé d'un gaz approprié. 5. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape de mélange intime est autre qu'un traitement sonique. 6 Un procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite étape de mélange est un traitement dans un vortex. 7. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit mélange lipidique approprié est choisi dans le groupe constitué par un ou plusieurs des lipides suivants: phosphatidylsérine, phosphati- dylcholine, dipalmitylphosphatidylcholine, cholestérol, stéarylamine et dicétylphosphate. 8. Un procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ces mélanges comprennent encore de l'alpha-tocophoral. 9. Un procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les rapports molaires de ces lipides pour phosphatidylsérine/cholestérol/sté- arylamine/diacétylphosphate ou phosphaditylcholine/cholestérol/stéarylami- ne/diacétylphosphate, respectivement sont de l'ordre de 0-10/0-9/0-5/0-1. 16 2545837 10. Un procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit rapport molaire pour phosphatidylsérine/phosphatidylcholine/chole- stérol est de 1/4/5 respectivement. 11. Un procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ce rapport molaire pour phosphatidylcholine/cholestérol, respectivement est de 1/1 12. Un procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le rapport molaire pour stéarylamine/phosphatidylcholine/cholestérol, res- pectivement est de 1/4/5 13 Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits liposomes ont une charge nette négative. 14. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits liposomes ont une charge nette neutre. 15. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits liposomes ont une charge nette positive. 16. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite substance à faire passer au travers de la membrane est un saccha- ride. 17. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite substance à faire passer au travers de la membrane est un peptide. 18. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite substance à faire passer au travers de la membrane est un acide nucléique. 19. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite substance à faire passer au travers de la membrane est une macro- molécule. 20. Un procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que ladite macromolécule est un polysaccharide. 21. Un procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que ladite macromolécule est un polypeptide. 22. Un procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que ladite macromolécule est un acide polynucléique. 23. Un procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que ledit acide polynucléique est le RNA. 24 Un procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que ledit acide polynucléique est le DNA. 25. Un procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que ledit acide polynucléique est un plasmide. 26. Un procédé selon la revendication ledit plasmide est le Yep 13 LT 5. 27. Un procédé selon la revendication ledit plasmide est le p BR 322. 28 Un procédé selon la revendication ledit plasmide est le p BR 327. 29. Un procédé selon la revendication ledit plasmide se reproduit dans la cellule. 30. Un procédé selon la revendication ledit acide nucléique est un vecteur. 31. Un procédé selon la revendication ledit vecteur 32. Un ledit vecteur 33. Un ledit vecteur 34. Un ledit vecteur 35. Un est le Yep 13 LT 5. procédé selon la revendication est le p BR 322. procédé selon la revendication est le p BR 327. procédé selon la revendication se reproduit dans la cellule à procédé selon la revendication , caractérisé en ce que , caractérisé en ce que , caractérisé en ce que 28, caractérisé en ce que 22, caractérisé en ce que 22, caractérisé en ce que 22, caractérisé en ce que 22, caractérisé en ce que 33, caractérisé en ce que transformer. 1, caractérisé en ce que lesdites cellules à mettre en contact sont des cellules procaryotes. 36. Un procédé selon la revendication 35, caractérisé en ce que lesdites cellules à mettre en contact sont des cellules osmotiquement fragiles ou des cellules procaryotes compétentes. 37. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites cellules à mettre en contact sont des cellules eucaryotes osmoti- quement fragiles. 38. Un procédé selon la revendication 37, caractérisé en ce que lesdites cellules à mettre en contact sont des protoplasts végétaux. 39. Un procédé selon la revendication 37, caractérisé en ce que lesdites cellules à mettre en contact sont des sphéroplasts de levure. 40. Un procédé selon la revendication 37, caractérisé en ce que lesdites cellules à mettre en contact sont des cellules animales. 41. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite étape de mise en contact comprend encore les étapes de: (i) mise en suspension dans un tampon approprié des cellules à mettre en contact (ii) addition de ces liposomes à ces cellules mises en suspension; (iii) incubation simultanée, à une température appropriée, de ces cellu- les mises en suspension et des liposomes; (iv) addition de polyéthylèneglycol auxdites cellules et liposomes mis en suspension et en cours d'incubation; (v) incubation de ces liposomes et des cellules mises en suspension pendant une période de temps suffisante pour permettre la fusion de ces liposomes et de ces cellules. 42. Un procédé selon la revendication 41, caractérisé en ce que ces cellules à mettre en contact sont des cellules procaryotes. 43. Un procédé selon la revendication 41, caractérisé en ce que ces cellules à mettre en contact sont des cellules procaryotes osmotique- ment fragiles ou compétentes. 44. Un procédé selon la revendication 41, caractérisé en ce que ces cellules à mettre en contact sont des cellules eucaryotes osmotique- ment fragiles. 45. Un procédé selon la revendication 44, caractérisé en ce que ces cellules à mettre en contact sont des protoplasts végétaux. 46. Un procédé selon la revendication 44, caractérisé en ce que ces cellules à mettre en contact sont des sphéroplasts de levure. 47. Un procédé selon la revendication 44, caractérisé en ce que ces cellules à mettre en contact sont des cellules animales. 48 Un procédé selon la revendication 41, caractérisé en ce que: cette étape d'incubation dure pendant environ 5 minutes à 60 minutes à une température d'environ 16 à 280 C. 49. Un procédé selon la revendication 41, caractérisé en ce que ladite étape d'incubation dure pendant environ 20 minutes à une température d'environ 250 C. 50. Un procédé selon la revendication 41, caractérisé en ce que ledit polyéthylèneglycol présente un intervalle de poids moléculaire d'environ 1 000 à environ 20 000 daltons et que sa concentration est d'environ 10 % à environ 40 % de la solution totale. 51 Un procédé selon la revendication 41, caractérisé en ce que ledit polyéthylèneglycol a un poids moléculaire dans un intervalle d'en- viron 1 000 à environ 6 000 daltons et sa concentration finale est d'en- viron 20 % de la solution totale. 52. Un procédé selon la revendication 41, caractérisé en ce que ledit polyêthylèneglycol a un poids moléculaire d'environ 4 000. 53. Un procédé selon la revendication 41, caractérisé en ce que le tampon approprié contient du chlorure de calcium dans un intervalle de concentration supérieur à environ 1 m M et inférieur ou égal à environ m M, un sucre osmotique dans un intervalle de concentration d'environ 0,4 M à environ 0,8 molaire, du Tris H Cl en concentration d'environ 5 ml et une zone de p H d'environ 5,0 à 8,0. 54. Un procédé selon la revendication 41, caractérisé en ce que ledit tampon approprié comprend environ 10 m M de chlorure de calcium, environ 0,4 molaire de mannitol, environ 5 m M de Tris H Cl et se trouve à un p H d'environ 6,5. 55. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ce solvant est un solvant organique polaire pouvant s'évaporer dans des conditions non destructrices vis-à-vis de ladite substance. 56 Un procédé selon la revendication 55, caractérisé en ce que l'étape de purification comprend encore les étapes de: (i) remise en suspension de ces liposomes dans un volume d'une solu- tion de sucrose; (ii) on place au dessus de ladite solution de sucrose un volume d'une solution sucrose-sucre osmotique; (iii) on centrifuge les liposomes remis en suspension pendant une pé- riode de temps suffisante pour séparer des substances qui ne sont pas contenues dans les liposomes formés à partir de ceux-ci; (iv) on recueille ces liposomes après qu'il se trouvent flotter à la surface dudit mélange sucrose-sucre osmotique; et (v) on remet en suspension ces liposomes dans un tampon. 57. Un procédé selon la revendication 56, caractérisé en ce que ladite solution de sucrose se situe est de l'ordre d'environ 0,4 molaire à environ 0,8 molaire et que la solution dudit sucrose osmotique est constituée de sucrose en une proportion d'environ 0,2 à environ 0,4 mol- aire et de mannitol dans une proportion d'environ 0,1 à environ 0,4 molai- re. 58. Un procédé selon la revendication 56, caractérisé en ce que ledit sucrose est en une proportion 0,4 molaire et ladite solution de sucrose-mannitol est en un proportion 0,3 molaire de sucrose et 0,1 mol- aire de mannitol. 59. Un procédé selon la revendication 56, caractérisé en ce que la solution de sucrose et de sucrose-mannitol est dans un rapport volumi- que d'environ 1/3. 60 Un procédé selon la revendication 56, caractérisé en ce que lesdits liposomes purifiés comprennent environ 2 micromoles de lipide liposomal pour 106 cellules à mettre en contact. 254583 i 61. Un procédé de transformation de cellules végétales, caracté- risé en ce qu'il comprend les étapes de: (a) formation de protoplasts cellulaires végétaux; (b) transformation de ces protoplasts cellulaires végétaux avec du DNA, 62. Un procédé selon la revendication 61, caractérisé en ce que le DNA est un plasmide. 63. Un procédé selon la revendication 62, caractérisé en ce que ce plasmide est le p BR 327. 64 Un procédé selon la revendication 61, caractérisé en ce que le DNA est encapsulé dans un liposome. 65. Un procédé selon la revendication 64, caractérisé en ce que ce DNA est encapsulé par les étapes de: (a) introduction d'un mélange lipidique approprié; (b) dissolution de ce mélange lipidique dans un solvant miscible à l'eau; (c) formation d'une préparation aqueuse lipide-solvant par addition à ce mélange lipide-solvant dissous dudit DNA dans une solution aqueuse; (d) mélange intime de cette préparation aqueuse lipidesolvant dissoute par des moyens non destructeurs de ce DNA; et (e) élimination de ce solvant pour former des liposomes. 66. Un procédé selon la revendication 65, caractérisé en ce que ce DNA est un plasmide. 67 Un procédé selon la revendication 66, caractérisé en ce que ce plasmide est le p BR 327. 68. Cellules végétales transformées par le procédé selon la re- vendication 61. 69. Cellules végétales selon la revendication 61, caractérisées en ce que ce DNA est un plasmide. 70. Cellules végétales selon la revendication 69, caractérisées en ce que ce plasmide est le p BR 327. 71. Cellules végétales selon la revendication 68, caractérisées en ce que ce DNA est encapsulé dans un liposome. 72 Cellules végétales selon la revendication 64, caractérisées en ce que ce DNA est encapsulé par les étapes de: (a) fourniture d'un mélange lipidique approprié; (b) dissolution de ceêmélange lipidique dans un solvant miscible à l'eau; 21 45837 (c) formation d'une préparation aqueuse lipide-solvant par addition à ce mélange lipide-solvant dissous de ce DNA en solution aqueuse; (d) mélange intime de cette préparation aqueuse lipide-solvant dissou- te par des moyens non destructeurs à ce DNA; et (e) élimination de ce solvant pour former les liposomes. 73. Cellules végétales selon la revendication 72, caractérisées en ce que le DNA est un plasmide. 74. Cellules végétales selon la revendication 37, caractérisées en ce que ce plasmide est le p BR 327.