FR 2546180 A1 19841123 FR 8407470 A 19840515 PROCEDE D'AUGMENTATION DE LA PRODUCTION D'ANTIBIOTIQUE PAR RECOMBINAISON GENETIQUE IN VIVO. L'invention concerne un procédé d'augmentation qua- litative et quantitative de la production d'antibiotique chez les micoorganismes par recombinaison génétique in vivo. Dans ce procédé, on prépare des bouillons de fermentation con- tenant des antibiotiques du type aminoglucoside en cultivant des souches de Streptomyces à matériel génétique modifié et à productivité d'antibiotique modifiée, que l'on a obtenues par recombinaison génétique in vivo de souches de Streptomyces productrices d'antibiotique. Les antibiotiques du type aminoglucoside sont au- jourd'hui largement utilisés en thérapeutique humaine et ont une grande importance économique Etant donné leur large spectre d'activité, ils sont utilisés non seulement en théra- peutique humaine mais encore dans la pratique vétérinaire. Il est connu que Streptomyces tenebrarius produit la nébramycine qui est un mélange de plusieurs antibiotiques (Stark, Hoehn et Know, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1967, page 314; Brevet GB 1 178 489; Brevet US 3 691 279 et Brevet HU 176 103) Umezawa et ses collaborateurs décri- vent l'obtention de kanamycine en partant de Streptomyces kanamyceticus ATCC 12853 LZ(J Antibiotics 10 A, 181 ( 1957), Brevet JP Kokai 8695 ( 196117 Les constituants A, B et C de la kanamycine sont aussi des antibiotiques du type aminoglu- coside. Il est aussi connu que des cellules de micro- organismes de la famille des streptomycétacées (souches de Streptomyces et de Micromonospora) donnent naissance, dans des conditions appropriées, à des protoplastes (forme dépour- vue de paroi cellulaire) que l'on peut régénérer ensuite en cellules normales L(Brevet US 4 294 927; Okanishi, Suzuki et Umezawa, J Gen Microbiol 80, 389 ( 1973)/ La fusion de protoplastes de différentes souches provoque des recombinai- sons génétiques avec formation de cellules qui sont porteuses de nouvelles informations génétiques L-par exemple Hopwood, Wright et Bibb, Nature'' 268, 171 ( 1977); Alf Zldi, Szvoboda et Collaborateurs, Brevet US 4 294 927 ( 1978); Godfrey, Ford et Huber, Can J Microbiol 24, 994 ( 1978); Oichi, Hitch- cock et Katz, J Bact 139, 984 ( 1979)7 Les expériences ont été effectuées avec des souches auxotrophes déficientes en aminoacides, en bases de nucléotides et en vitamines On a démontré la recombinaison génétique elle-même en fusion- nant des protoplastes provenant de cellules qui d'une part avaient été cultivées dans un milieu nitritif minimal conte- nant de l'uracile et qui d'autre part avaient été formées en présence de cystéine et en isolant après régénération les prototrophes non déficients en aminoacides (Oichi et Colla- borateurs, voir citation précédente). Baltz et ses Collaborateurs ont décrit dans les Brevets BE 868 472 et 868 473 un procédé de préparation et de régénération de protoplastes de Streptomyces ainsi que de fusion de protoplastes mais n'ont mentionné aucun résul- tat concernant l'influence sur la biosynthèse d'antibiotique. Leurs expériences étaient toujours exécutées avec des sou- ches -auxotrophes. Il ne semble pas que l'on ait déjà parlé, dans la littérature, d'une influence exercée sur la biosynthèse d'an- tibiotique par recombinaison génétique in vivo grâce à une fusion de protoplastes. L'invention a pour objet un procédé nouveau vi- sant à influencer qualitativement et quantitativement la biosynthèse d'antibiotique par recombinaison génétique in vivo, dans lequel on influence avantageusement la qualité et la quantité de composés biologiquement actifs qui sont biosynthétisés par des microorganismes producteurs d'anti- biotique. On a trouvé de façon inattendue que la capacité de production d'antibiotique d'une certaine partie de cel- lules recombinantes que l'on avait préparées par fusion de protoplastes selon le procédé était modifiée dans une pro- portion étonnament grande en comparaison du nombre total des souches recombinantes Une partie des recombinantes engen- drait des complexes d'antibiotiques à composition modifiée et en outre, en comparaison des partenaires de fusion, la productivité était ou bien augmentée notablement ou bien diminuée. En outre, on a trouvé que l'efficacité de la fusion des protoplastes et encore davantage celle de la recombinai- son peuvent être accrues notablement par le procédé selon l'invention. Les expériences faites ont montré, de façon inat- tendue, que la recombinaison génétique se déroule même lors- que les protoplastes de l'un des partenaires de fusion ont été inactivés par traitement chimique ou physique Ainsi, il n'est pas nécessaire de marquer génétiquement les deux partenaires de fusion. L'invention a pour objet un procédé de préparation de bouillons de fermentation contenant des antibiotiques du type aminoglucoside par la recombinaison génétique in vivo de souches productrices d'antibiotique à matériel génétique modifié Selon l'invention, après une préculture dans un milieu nutritif contenant du saccharose, des ions calcium et des ions magnésium, on forme des protoplastes en partant des cellules de souches de Streptomyces marquées génétique- ment et prototrophes, on fusionne les protoplastes qui ont été formés soit en partant de deux souches marquées généti- quement soit en partant d'une ou plusieurs souches inacti- vées par traitement chimique ou physique, on régénère les protoplastes combinés, on isole les souches à matériel géné- tique modifié, on vérifie leur capacité de production d'an- tibiotique et on sélectionne les souches dont la capacité de production est modifiée et avec ces nouvelles souches, on conduit des fermentations aérées en culture profonde dans un milieu nutritif contenant des sources organiques de carbone et d'azote, des sels minéraux, des oligoéléments et/ou des huiles animales ou végétales et/ou des graisses. Selon un mode d'exécution préférentiel de l'in- vention, on prépare des souches auxo-rophes déficientes en aminoacides ou en bases de nucléotides On peut obtenir les auxotrophes par traitement mutagène au moyen de N-méthyl-N'- nitro-N-nitrosoguanidine L Davis, J Am Chem Soc, 70, 4267 ( 1948)7 On vérifie, en des expériences en série, la capacité de production d'antibiotique ainsi que la stabilité génétique des auxotrophes obtenus On cultive les isolats génétiquement stables dans un milieu nutritif liquide conte- nant des sources organiques de carbone et d'azote, du saccha- rose, des ions calcium et magnésium et de la glycine (la glycine freine la croissance cellulaire) On sélectionne celle des cultures o l'effet de freinage de la croissance exercé par la glycine a été le plus fort mais n'a pas en- core été complet, on centrifuge les cellules et on les lave. On met en suspension les cellules lavées dans du soluté physiologique contenant du saccharose et des lysozymes e il se forme des protoplastes On lave les protoplastes obtenus et on en transfère une partie sur de 1 agar solide de rég- nération On réunit l'autre partie des protoplastes en un rapport de l:làdas protoplastes sélectionnés pour la recom- binaison génétique et prépares de façon analogue en partant de cellules partenaires On ajoute au mélange de protoplas- tes du polyéthylèneglycol (poids moléculaire 1000 à 20000) et des sels qui se dissocient en ions magnésium et calcium pour provoquer la fusion des protoplastes Ensuite, on ré- génère les cellules Si l'on conduit la régénération dans un milieu nutritif minimal, il ne peut se former de colo- nies que pour celles des cellules hybrides o la recombi- naison génétique in vivo a effectivement eu lieu Toutefois, on peut aussi effectuer la régénération dans un milieu nu- tritif contenant de l'azote organique On peut alors déter- miner le nombre des prototrophes en transférant sur un milieu nitritif minimal des colonies cultivées dans ce mi- lieu. Par le procédé ci-dessus, on isole les recombinan- tes prototrophes après la fusion de protoplastes qui ont été formés en partant d'un ou plusieurs auxotrophes Toutefois, malheureusement, la conversion des souches productrices d'antibiotique en souches auxotrophes diminue notablement leur productivité Pour des raisons économiques, il est ap- paru désirable qu'au moins un des partenaires de fusion puisse biosynthétiser de grandes quantités de l'antibioti- que On a ainsi mis au point un procédé dans lequel un seul des partenaires était auxotrophe tandis que l'autre était un prototrophe dont les protoplastes avaient été rendus non viables avant la fusion par un traitement chimique ou phy- sique Après la fusion, de tous les auxotrophes ou prototro- phes tués qui étaient présents mais ne pouvaient ni se régé- nérer ni croître, on régénère seulement les cellules hybri- des, car elles seules forment des colonies. Dans le procédé selon l'invention, on obtient l'inacti Mation des protoplastes soit par des procédés chimiques soit par des procédés physiques On peut utiliser tout réac- tif chimique qui entraîne la perte de l'aptitude à la régé- nération des protoplastes tout en conservant leur intégrité génétique, par exemple sans que cela limite le cadre de l'invention l'acide cannabidiolique (acide 3-méthyl-6-iso- propényl-4 '-n-pentyl-2 ",6 '-dialydroxy-l,2,3,6-tétrahydro-bi- phényle-3 '-carboxylique) ou ses sels, le N-méthyl-maléimide, la pyrrolnitrile ( 3-chloro-4-( 3-chloro-2-nitrophényl-pyrrole) le vert brillant/ sulfate de N-L 4-ZL 4-(diéthylamino)-phény 17 phénylméthylène 7-2,5-cyclohexadièn-l-ylidène 7-N-éthyl-étha- naminium/et le 2-mercaptoéthanol Après la fin de l'inacti- vation chimique, on lave les protoplastes et on les utilise comme partenaires de fusion. Selon un mode d'exécution préférentiel du procédé, on peut aussi inactiver les protoplastes par irradiation y On irradie les protoplastes avec l'isotope 60 Co, à une dose de 30 à 120 krad, de préférence de 80 krad, puis on centri- fuge les protoplastes et on les utilise comme partenaires de fusion. On vérifie en des expériences en série la produc- tivité d'antibiotique des isolats prototrophes obtenus Après la fusion, on détermine aussi la productivité d'auxotrophes doubles et aussi de prototrophes obtenus en partant de ceux- ci par ségrégation On détermine la productivité des souches en inoculant avec celles-ci des milieux nutritifs contenant avantageusement des sources organiques de carbone et d'azote, des sels minéraux et des huiles végétales et en faisant in- cuber les cultures Au bout de 16 à 24 heures, on utilise ces inoculums pour inoculer le milieu de fermentation prin- cipale de même composition On poursuit la fermentation pen- dant 140 à 160 heures On prélève des échantillons d'abord à la 96 ème heure, puis toutes les 24 heures pour déterminer la teneur en antibiotique et le rapport entre les antibio- tiques formés. On cultive les mutantes obtenues par le procédé ci-dessus, ayant une grande productivité d'antibiotique, en cultures profondes aérées, dans un milieu nutritif contenant des sources organiques de carbone et d'azote, des sels mi- néraux, des huiles et/ou des graisses de provenance végé- tale et/ou animale, entre 32 et 40 C, de préférence à 37 C, jusqu'à ce qu'il se forme des quantités appropriées de l'an- tibiotique. On peut préparer des recombinantes en partant de Streptomyces tenebrarius MNG 169 et MNG 204 déposés à la Banque des Souches de l'Institut National de la Santé Publi- que, Budapest Streptomyces tenebrarius 169 peut biosynthé- tiser la nébramycine-2, la nébramycine-4 et la nébramycine- ', par contre Streptomyces tenebrarius MNG 204 peut bio- synthétiser la nébramycine-5 ' plus des traces de nébramycine- 4 En partant de ces souches, par un traitement mutagène 2546180 ' usuel par la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, on forme des mutantes auxotrophes et on vérifie leur stabilité géné- tique par plusieurs réplications et leur productivité d'an- tibiotique par des expériences en série On sélectionne les souches génétiquement stables et en partant de celles-ci, on forme des protoplastes selon le procédé défini par les Exemples On réunit les protoplastes aux partenaires de fu- sion choisis et ensuite on les régénère La formation de pro- toplastes aussi bien que la régénération sont quantitatives, si l'on effectue la culture, la formation des protoplastes et la régénération en présence de saccharose et de sels qui se dissocient en ions calcitm et magnésium On isole les hy- brides régénérés et on les cultive sur agar incliné La fré- quence de la formation de prototrophes en partant de souches auxotrophes, qui est seulement de 10 8 dans le cas de muta- tion spontanée, est de 1 x 10 -3 à 5 x 10 -4 avec le procédé de fusion selon l'invention. En analysant la productivité des recombinantes pro- totrophes isolées, on a trouvé que les différents antibio- tiques constituant le complexe d'antibiotiques engendré par la souche parente sont aussi biosynthétisés par chaque recom- binante mais avec un rapport modifié des constituants et une concentration de production modifiée Les souches parentes produisent deux (MNG 204) ou trois (MNG 169) constituants nébramycine tandis que lors de l'autodiffusion de protoplas- tes de MNG 204 ou MNG 169 et lors de la fusion de protoplas- tes de MNG 204 et MNG 169, il se forme des recombinantes gé- nétiques qui, en comparaison des souches parentes: a) ou bien ne biosynthétisent pas du tout d'antibiotique, ou des concentrations très basses ou très élevées d'an- tibiotique, b) ou bien biosynthétisent un seul constituant nébramycine: nébramycine-2, nébramycine-4 ou nébramycine-5 ', c) ou deux constituants nébramycine: nébramycine-2 et né- bramycine -4 ou nébramycine-2 et nébramycine-5 ', d) ou trois constituants nébramycine: nébramycine-2, nébra- mycine-4 et nébramycine-5 '. Des souches obtenues, la souche Streptomyces tene- brarius 35 TL productrice de nébramycine-2 a été déposée sous le N MNG 00243, la souche Streptomyces tenebrarius F 104 productrice de nébramycine-4 sous le N O MNG 00244 et la sou- che Streptomyces tenebrarius F 77 productrice de nébramycine- ' sous le N MNG 00242 à la Banque des Souches de l'Insti- tut National de la Santé Publique, Budapest. Les souches selon l'invention peuvent engendrer des bouillons de fermentation contenant des constituants nébra- mycine La fermentation elle-meme peut s'effectuer avantageu- sement par le procédé du Brevet EU 176 103 tandis que les antibiotiques peuvent avantageusement être isolés par le pro- cédé des Brevets HU 174 315 et 176 103 o Selon un autre mode d'exécution préférentiel du procédé selon l'invention, on peut utiliser, pour la formation de recombinantes, Streptomyces kanamyceticuso La culture des microorganismes, la formation des protoplastes, la fusion des protoplastes-et la régénération ainsi que l'expérimenta- tion en série sur la productivité des souches sélectionnées peuvent s'effectuer soit selon le procédé ci-dessus soit se- lon le procédé décrit aux Exemples 3 et 8. Le procédé selon l'invention a beaucoup d'avanta- ges Les recombinaisons et diploidisations exécutées dans le procédé influencent la biosynthèse des souches soit en modifiant le rapport des constituants soit en augmentant la productivité d'antibiotiques. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complé- ment de description qui va suivre, qui se réfère à des Exem- ples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente in- vention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces Exemples de mise en oeuvre, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne cons- tituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 Formation des' proto Plastes, 'fusion des protoplastes -et régé- nération. On inocule des agars inclines avec une suspension de spores ou une culture surgelée de Streptomyces tenebra- rius MNG 169 et de Streptomyces tenebrarius MNG 204 ou avec des souches auxotrophes formées en partant de ceux-ci L'a- gar incliné a la composition suivante: Dextrine 1,0 % Extrait de levure 0, 1 % Hydrolysat de caséine (à 10 %) 2,0 % Extrait de viande 0,1 % Dichlorure de cobalt hexahydraté 0,001 % Agar 2,5 % + hydrolysé enzymatiquement. Avant la stérilisation, on règle le p H du milieu nutritif à 7,2 avec une solution aqueuse d'hydroxyde de so- dium, ensuite on stérilise à 121 "C pendant 20 minutes. On fait incuber les cultures inclinées à 37 C pen- dant 4 jours, puis on élimine les spores de la surface de l'agar par lavage à l'eau distillée stérile Avec la suspen- sion de spores obtenue, on inocule un milieu nutritif sté- rile d'inoculum de la composition suivante: Glucose 1,0 % Extrait de levure 1,0 % On règle le p H du milieu à 7,2. On fait incuber les cultures pendant 48 heures à 37 C, puis on inocule, avec des portions de 0,2 ml de cet inoculum, un milieu nutritif sterile de la composition sui- vante: Glucose 1,0 % Extrait de levure 1,0 % Saccharose 20,5 % Dichlorure de calcium dihydraté 0,3 % Dichlorure de magnésium hexahydraté 0,6 % Glycine 4, 5 ou 6 % On règle le p H des milieux entre 7,0 et 7,2. On fait incuber les cultures à 37 C pendant 48 heu- res dans la secoueuse, puis on sélectionne celle des cultures o l'action de freinage de croissance exercée par la glycine est la plus prononcée, sans être encore complète Avec ces cultures, on inocule les milieux nutritifs ci-dessus à te- neur accrue en glycine Si la culture sélectionnée conte- nait primitivement 4 % de glycine, on inocule avec celle-ci des milieux nutritifs contenant 5 et 6 % de glycine. Ensuite, on centrifuge le mycélium formé ( 15 minu- tes, 2300 G) et on le lave avec une solution de la composi- tion suivante: Saccharose 20,5 % Dichlorure de calcium dihydraté 0,3 % Dichlorure de magnésium hexahydraté 0,6 % Chlorure de potassium 0,0075 % p H de la solution: 7,2, désignation: M ensuite on centrifuge à nouveau. On remet en suspension la masse de mycélium dans la solution ci-dessus et on y ajoute de la lysozyme à 0,5 % ZL-Serva, Feinbiochemica, Heidelberg 7 On fait incuber le mycélium en agitant modérément et on contrôle au microscope toutes les 10 minutes la formation de protoplastes Selon la nature de la souche, la formation quantitative de proto- plastes dans des cultures mycéniennes de Streptomyces dure environ 1 à 4 heures. On centrifuge ( 25 mn, 2300 G) la culture qui s'est transformée quantitativement en protoplastes, on la lave avec la solution M et on centrifuge à nouveau. On met le dépôt en suspension avec précaution dans 0,05 ml de solution M, puis on régénère les protoplastes. Pour l'élimination des fragments de mycelium éven- tuellement restés, on filtre la suspension de protoplastes sur une couche d'ouate de 2,5 cm On dilue le filtrat avec de la solution M et on l'applique sur de l'agar de régéné- ration stérile de la composition suivante Glucose 1,0 % Extrait de levure 1,0 % Saccharose 20,5 % Dichlorure de calcium dihydraté 0,3 % Dichlorure de magnésium hexahydraté 0,6 % Agar 3,0 % p H de la solution: 7,0 à 7,2. On applique 0,1 ml de la suspension de protoplas- tes sur la surface de 25 ml d'agar de régénération dans une boite de Petri, puis on le recouvre de 3 ml de l'agar de régénération L'agar utilisé pour le recouvrement a la com- position ci-dessus mais on utilise 1,2 % d'agar au lieu de 3 %. On fait incuber les cultures dans une chambre hu- mide entre 35 et 37 O Co Le 3 ème ou le 4 ème jour, on peut déjà observer librement les colonies régénérées Compte tenu du nombre de protoplastes que l'on a appliqué sur la plaque de régénération, on peut considérer la régénération comme quantitative. * On fusionne les protoplastes tirés des deux sou- ches auxotrophes Si parmi les hybrides, il y a lieu d'iso- ler seulement les recombinantes prototrophes, on les appli- que sur un milieu de culture minimal de la composition sui- vante: Sulfate de dianmonium 0,5 % Dihydrogénophosphate de potassium 0,1 % Sulfate de magnésium heptahydraté 0,05 % Glucose 1,0 % Chlorure de calcium dihydraté 0,3 % 2546180 À Chlorure de magnésium hexahydratâ 0,6 % Saccharose 20,5 % Solution de vitamines Wickerham 0,01 % Agar 3,0 % p H du milieu: 7,2. Composition de la solution de vitamines Wickerham: Acide folique 0,2 mg Biotine 0,2 mg Pantothénate de calcium 20,0 mg Inositol 200,0 mg Niacine 40,0 mg Acide paminibenzolque 20,0 mg Chlorhydrate de pyridoxine 40,0 mg Chlorhydrate d'aneurine 40,0 mg Riboflavine 20,0 mg Eau distillée 100,0 ml On peut aussi isoler les prototrophes en répli- quant sur un milieu nutritif minimal de la composition ci- dessus ou d'une autre composition les colonies qui s'étaient développées sur un milieu nutritif de régénération complet. Selon un mode d'exécution préférentiel du procédé selon l'invention, on fusionne les protoplastes selon le procédé ci-dessus en mélangeant dans un rapport quelconque, avantageusement 1:1 les protoplastes formes en partant de deux ou plusieurs souches et en ajoutant 0,2 ml de ce mé- lange de protoplastes à 2 ml de solution de fusion de la composition suivante: Polyéthylèneglycol, poids moléculaire 1000 à 20000 35,0 % Dichlorure de calcium dihydraté 0,3 % Dichlorure de magnésium hexahydraté 0,6 % on règle le p H de la solution à 7,2 au moyen d'hydroxyde de sodium aqueux. Le mélange avec la solution de fusion provoque l'agrégation des protoplastes, leurs membranes se soudent, la fusion se produit Les ADN de deux ou plusieurs cellules qui sont porteuses de l'information génétique sont très proches l'un de l'autre et ainsi, la recombinaison généti- que peut se dérouler. Au Tableau 1, on compare le procédé selon l'inven- tion au procédé des Brevets BE 868 472 et 868 473 en ce qui concerne la formation de protoplastes et la fréquence de régénération. TABLEAU 1 Formation et régénération de protoplastes de Streptomyces tenebrarius par des procédés connus et par le procédé selon l'invention. -15 Procédé Formation de Régénération Colonies de cellules protoplastes nombre de intactes ( 90 mn) colonies % nombre de colonies % Connu 92,5 13 0,065 1500 7,5 ____________________________________________________________ selon l'in- vention 99,81 18000 90,0 38 0,19 Le Tableau montre nettement que par le procédé selon l'invention, grâce à une préculture en présence de chlorure de calcium, de chlorure de magnésium et de saccha- rose, on peut augmenter notablement l'efficacité de la for- mation de protoplastes mais encore davantage celle de la régénération. Les Exemples suivants expliquent quelques expé- riences de régénération génétique in vivo et leurs résul- tats. EXEMPLE 2 Fusion de souches auxotrophes et biosynthèse d'antibioti- que par des souches recombinantes. 2546180 ' a Fusion de souches auxotrophes A 222 his et 404 ura En partant de la souche Streptomyces tenebrarius MNG 204 qui biosynthétise la nébramycine5 ' plus des traces de nébramycine-4 et de la souche Streptomyces tenebrarius MNG 169 qui produit de la nébramycine-2, de la nébramycine- 4 et de la nébramycine-5 ', on prépare par traitement muta- gène usuel et connu, des souches A 222 his dépendant de l'histidine et des souches 404 ura dépendant de l'uracile. En partant des deux souches,on forme des pntoplastes par le procédé de l'Exemple 1, on fusionne les protoplastes et on les régénère On isole une partie des recombinantes prototrophes Fréquence de recombination: 5 x 10-5. On détermine selon le procédé de l'Exemple 8 la productivité d'antibiotique des souches prototrophes iso- lées Le Tableau 2 récapitule les résultats de la fermen- tation de 147 recombinantes isolées. TABLEAU 2 Production d'antibiotique de prototrophes obtenus par re- combinaison ADN in vivo d'auxotrophes A 222 his et 404 ura Productivité Nombre de souches % Aucune production d'antibiotique 16 10,9 Nébramycine5 ' 24 16,3 Nébramycine-4 11 7,5 Nébramycine-4 et -5 ' 57 38,8 Nébramycine-2 et -5 ' 7 4,7 Nébramycine-2, -4 et -5 ' 32 21,8 Productivité des partenaires de fusion: A 222 his: Nébramycine-2: O pg/ml Nébramycine-4: 30 pg/ml Nébramycine-5 ': 675 pg/ml 404 ura: Nébramycine2: 1120 pg/ml Nébramycine-4: 75 pg/ml Nébramycine-5 ': 145 pg/ml En même temps, la productivité d'une partie des recomnbinantes dépasse très notablement celle des partenaires de fusion Ainsi, par exemple, Streptomyces tenebrarius F 105 biosynthétise 2140 pg/ml de nébramycine-2, 380 pg/ml de nêbramycine-4 et 1510 pg/ml de nébramycine-5 ', Strepto- myces tenebrarius F 88 biosynthétise O pg/ml de nébramycine-2 pg/ml de nêbramycine-4 et 1440 pg/ml de nébramycine-5 ', Streptomyces tenebrarius F 77 biosynthétise 840 pg/ml de nébramycine-5 ' et Streptomyces tenebrarius F 104 biosynthé- tise 1520 pg/ml de nébramycine-4, plus des traces de nébra- mycine-5 ' (moins de 1 %). La productivité des souches isolées après l'auto- fusion de protoplastes tirés de souches parentes est restée inchangée Avec la souche Streptomyces tenebrarius F 104 on prépare 10 litres de bouillon de fermentation selon le procédé de l'Exemple 8 et on isole les composés biologique- ment actifs selon le Brevet HU 174 315 Rendement: 1308 g de nébramycine-5 (kanamycine-B) et 9 mg de nébramycine-6 (tobramycine). Streptomyces tenebrarius F 77 et F 104 ont été déposés sous les N MNG 00242 et MNG 00244 à la Banque des Souches de l'Institut National de la Santé Publique, Buda- pest. b Fusion des souches auxotrophes 7-34 trp et 73 1 Ys En partant de la couche Streptomyces tenebrarius 7-34 trp, dépendant du tryptophane et de la souche Strep- tomyces tenebrarius 73 lys * dépendant de la lysine, que l'on a obtenues par traitement mutagène usuel en partant de Streptomyces tenebrarius FNG 169, on forme des proto- plastes selon le -procédé de l'Exemple 1, on fusionne les protoplastes et ensuite on les régénère On isole une partie des prototrophes et on vérifieleur productivité selon le procédé de l'Exemple 8 Fréquence de recoxbinaison: 1 x 105. TABLEAU 3 Production d'antibiotiques de prototrophes obtenus par re- combinaison ADN in vivo en partant d'auxotrophes 7-34 trp et 73 lys. Productivité Nombre de souches Aucune production d'antibiotique 1 2,9 Nébramycine-2 2 5,9 Nébramycine-2 et -5 ' 16 47,3 Nébramycine-2, -4 et -5 ' 15 43,9 Les partenaires de fusion eux-mêmes biosynthgti- sent tous les trois constituants nébramycine. Apres la fusion et la régénération, on observe que certaines souches, quii ne pouvaient pas croître dans le milieu nutritif minimum en présence de lysine ou de tryptophane croissent très rapidement en présence simulta- née de tryptophane et de lysine Les souches primitivement auxotrophes se transforment, par la recombinaison, en auxo- trophes doubles (trp lys) On a vérifié la productivité de 13 auxotrophes doubles selon le procédé de l'Exemple et les résultats sont récapitulés au Tableau 4 Apres la ségrégation, en partant des auxotrophes doubles, on isole deux prototrophes dont la productivité est également indi- quée. TABLEAU 4 Production d'antibiotique d'auxotrophes doubles trp lys et de souches isolées de ceux-ci par ségrégation. Souche Constituant nébramycine % biosynthétisé Streptomyces tene Nébramycine-2 23,1 brarius trp lys Nébramycine-2 et -4 7,7 Nébramycine-2 et -5 ' 30,7 Nébramycine-2, -4 et -5 ' 38,5 Streptomyces tene Nébranmycine-4 et -5 ' 100,0 brarius 35 W et 40 W Le Tableau montre nettement que la productivité des souches isolées après recombinaison génétique in vivo est notablement modifiée Il est particulièrement remarqua- ble que les prototrophes isolés en partant d'auxotrophes doubles aient perdu leur propriété de biosynthétiser l'apra- mycine mais qu'en même temps leur productivité d'antibio- tique soit devenue notablement supérieure à celle des sou- ches parentes Ainsi, les souches 7-34 trp et 73 lys- produisent 1300 à 1700 pg/ml de nébramycine-2, 200 pg/ml de nébramycine-4 et 1040 pg/ml de nébramycine-5 ' tandis que les recombinantes 35 W et 40 W biosynthétisent 1040 pg/ml de nébramycine-4 et 1950 pg/ml de nébramycine-5 '. La souche Streptomycés_ tenebrarius 35 TL, pro- duisant exclusivement de la nébramycine-2, a été déposée sous le N MNG 00234 à la Banque des Souches de l'Institut National de la Santé Publique, Budapest. c Fusion des auxotrophes J 1006-3 ade et J 211/2 ura On obtient Streptomyces tenebrarius J 1006-3 ade et J 211/2 ura en partant de Streptomyces tenebrarius MNG 204, paf traitement mutagène Ces souches ne biosynthéti- sent pas d'antibiotique du tout, ou bien seulement des tra- ces de nébramuycine-5 ' (moins de 5 pg/ml) Après leur fusion selon le procédé de l'Exemple 1, on vérifie la productivité des 150 recombinantes prototrophes selon le procédé décrit -4 à l'Exemple 8 Fréquence de recombinaison: 1 x 104. Des souches étudiées, 60 % ( 90) ne biosynthétisent toujours aucun antibiotique, tandis que 40 % ( 60) produi- sent soit de la nébramycine-4 et de la nébramycine-5 ', soit exclusivement de la nébramycine-5 ' Des souches productives, 13 % ( 8)biosynthétisent la nébramycine-5 ' en quantités supé- rieures à 1500 pg/ml. Ces résultats montrent nettement que la producti- vité d' tntïbiotioque des souches de Streptomyces peut être accrue notablement par le procédé selon l'invention. EXEMPLE 3 Fusion des souches auxotrophes Streptomyces kanamycéticus leu et arg. On applique le procédé décrit à l'Exemple 1 avec cette différence que l'on poursuit la culture des souches marquées génétiquement, à 28 C, jusqu'à ce que l'on puisse observer une légère croissance dans un milieu nutritif contenant 3 % de glycine On isole les souches auxotrophes après le traitement mutagène de Streptomyces kanamyceticus ATCC 12 853 (Umezawa et coll JO Antibiotics, 10 A, 181 à 188 ( 1957) et JP Kokai 8695/1961) La souche parente produit de la kanamycine La mutante dépendant de la leucine ne biosyn- thétise pas du tout d'antibiotique, par contre la mutante qui se développe dans le milieu nutritif minimal en présence d'arginine produit 15 pg/ml de kanamycine. On vérifie la productivité d'antibiotique de Streptomyces kanamyceticus selon le procédé décrit à l'Exem- ple 8 avec cette différence que l'on conduit la culture à 28 C au lieu de 37 C et que pour l'essai d'activité biolo- gique, on utilise Bacillus subtilis comme organisme d'essai. Après la fusion et la régénération des protoplas- tes fusionnés, on isole les prototrophes et on vérifie la productivité de 144 souches Douze souches peuvent biosyn- thétiser 10 fois plus (en moyenne 155 pg/ml de kanamycine) que la mutante auxotrophe dépendant de l'arginine Fréquence -4 de recombinaison: 3 à 8 x 104 EXEMPLE 4 Préparation de protoplastes intacts mais non viables et leur utilisation comme partenaires de fusion. En partant de Streptomyces tenebrarius MNG 169 et de son auxotrophe 404 ura, on forme des protoplastes selon le procédé de l'Exemple 1 Afin d'inactiver le prototrophe Streptomyces tenebrarius MNG 169, on ajoute à 30 C, à la suspension de protoplastes formée en partant de celui-ci ( 108 protoplastes/ml de solution M), 50 à 100 pg/ml de can- nabidiolate de triéthylamine en solution dans le diméthyl- sulfoxyde Au bout de 4 heures de traitement, on centrifuge les protoplastes ( 2300 g, 25 minutes), puis, pour éliminer l'agent d'inactivation en excès, on les lave avec de la so- lution M et on les centrifuge à nouveau La fusion des pro- toplastes inactivés chimiquement-et formes en partant du prototrophe Streptomyces tenebrarius MNG 169 et des proto- plastes formes en partant de l'auxotrophe 404 ura s'effec- tue par le procédé de l'Exemple 1 Les résultats de fusion sont récapitulés au Tableau 5. TABLEAU 5 Plaque de régénération Milieu nutri Fréquence (nombre de colonies/ml) tif minimal Souche (nombre de de recom- (nombre de avant et après colonies/ml) binaison traitement par l'acide cannabidiolique MNG 169 2 x 104 O 2,1 x 104 - 404 ura 1,5 x 104 0- MNG 169 3 x 404 ura 30 2 x 10 EXEMPLE 5 Préparation de protoplastes intacts mais non viables et leur utilisation comme partenaires de fusion. On conduit le procédé défini à l'Exemple 4 avec cette différence qu'au lieu de cannabidiolate de triéthyl- amine, on utilise comme agent chimique d'inactivation 80 à 240 pg/ml de pyrrolenitrine ou 10 à 300 pg/ml de vert bril- lant Dans les expériences, l'inactivation des protoplastes se déroule quantitativement On utilise les protoplastes non viables obtenus comme partenaires de fusion. EXEMPLE 6 Préparation de protoplastes intacts mais non viables et leur utilisation comme partenaires de fusion. On prépare des protoplastes selon le procédé de l'Exemple 3 avec cette différence que l'on utilise comme souche parente Streptomyces kanamyceticus ATCC 12 853 non marque On inactive les protoplastes de Streptomyces kana- myceticus obtenus selon le procédé de l'Exemple 4 avec cette différence qu'au lieu d'acide cannabidiolique on utilise comme agent chimique d'inactivation 400 et 800 pg/ml de N- éthylmaléimide (EM) Les résultats sont récapitulés au Ta- bleau 6. TABLEAU 6 Plaque de régénération Traitement par Souche (nombre de colonies/ml) 800 pg/m EM non traité traité par 400 pg/ml EM Streptomyces 6 5 kanamyceticus 3,2 x 10 4,2 x 10 O ATCC 12 853 on utilise les protoplastes traites et inactives par 800 pg/ml de N-éthylmaléimide comme partenaires de fu- sion. EXEMPLE 7 Préparation de protop'lastes non viables par inacti Vation physique. Dans un tube en matière plastique, on soumet à l'irradiation y ( 60 Co) la suspension de protoplastes de Streptomyces kanamyceticus ( 108 cellules/ml) préparée selon l'Exemple 1 On utilise comme partenaires de fusion les cel- lules inactivées par une dose de 80 krad. EXEMPLE 8 Vérification de la productivité d'antibiotique de souches qui biosynthétisent des constituants nébramycine et prépa- ration de bouillons de fermentation d'antibiotique. On inocule sur de l'agar incliné préparé à l'eau distillée les spores ou la culture végétative de la souche à vérifier Composition de l'agar incliné: Dextrine 1,0 % Extrait de levure 0,1 % Hydrolysat de caséine (à 10 %) 2,0 % Extrait de viande 0,1 % Dichlorure de cobalt hexahydraté 0, 001 % Agar 2,5 % + hydrolysé enzymatiquement. Avant la stérilisation, on règle le p H du milieu nutritif à 7,2 avec une solution aqueuse d'hydroxyde de so- dium, puis on stérilise pendant 20 minutes à 121 "C. On fait incuber les cultures pendant 4 jours à 37 C, puis on sépare les spores de la surface du milieu nutritif avec de l'eau distillée stérile et on inocule cette suspension de spores dans deux milieux nutritifs d'inoculum de 100 ml préparés à l'eau du robinet et stérilisés dans des ballons Erlenmeyer de 500 ml Composition du milieu: Farine de soja 2,0 % Hydrolysat de caséine (à 10 %) 3,0 % Nitrate d'ammonium 0,1 % Chlorure d'ammonium 0,3 % Carbonate de calcium 0,3 % Sulfate de magnésium heptahydraté 0,5 % Mélange 1:1 d'huile de palme et d'huile de lin 3,0 % Glucose (stérilisé à part sous forme de solution à 50 %) 2,0 % + hydrolysé enzymatiquement On règle le p H du milieu nutritif à 7,2 avec une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium, puis on stérilise à 121 C pendant 20 minutes à l'autoclave. On fait incuber les cultures inoculées sur une ta- ble à secousses horizontale (diamètre 2,4 cm, 280 mn-1) à 37 C. On inocule cet inoculum mûr soit dans 100 ml de milieu nutritif stérilisé dans un ballon Erlenmeyer de 500 ml, soit dans 5 litres de milieu stérilisé à 121 C pen- dant 45 minutes dans un fermentateur de laboratoire de 10 litres Ce milieu de fermentation principal préparé avec de l'eau du robinet a la composition suivante: Farine de soja 3,0 % Hydrolysat de caséine (a 10 %)+ 5,0 % Nitrate d'ammonium 0,1 % Chlorure d'ammonium 0,5 % Acide Lglutamique 0,8 % Carbonate de calcium 0,5 % Sulfate de magnésium heptahydraté 0,5 % Dinitrate de cobalt hexahydraté 0,001 % Mélange 1:1 d'huile de palme et d'huile-de lin 3,0 % Glucose (stérilisé à part en solution à 50 %) 4,2 % + hydrolysé enzymatiquement. On règle le p H du milieu nutritif à 7,2, avant la stérilisation, avec une solution aqueuse d'hydroxyde d'am- monium - On conduit la fermentation à 37 C On cultive les cellules qui se trouvent dans le ballon Erlenmeyer sur une secoueuse horizontale On règle à 360 mn-1 la vitesse de rotation de l'agitateur du fermentateur et on fait passer à travers le milieu nutritif-3 1/mnn d'air stérile On détermine la teneur des cultures en antibioti- que par une méthode connue, biologiquement ou par chroma- tographie en couche mince avec bioautographie Comme orga- nisme d'essai, on utilise pour la détermination biologique Staphylococcus epidermidis, pour la détermination spécifique de la nébramycine-5 ',ainsi que d'autres constituants nébra- mycine, on utilise Rhizobium meliloti résistant à la nébra- mycine-2 et à la nébramycine-4 o Dans la détermination de la composition en consti- tuants par chromatographie en couche mince, on applique goutte à goutte des quantités d'antibiotique de 0,1 à 0,5 pg/ml sur des plaques de gel de silice (Merck, Darmstadt) et on développe les plaques avec un mélange 1:1:1 d'alcool éthylique, de méthyl-éthylcétone et d'hydroxyde d' ammonium à 25 % Après séchage complet du gel, on applique par des- sus la surface des plaques du milieu nutritif contenant Ba- cillus subtilis ATCC 6633, puis on fait incuber les plaques pendant 16 heures à 37 Co Ensuite, on détermine la grandeur des zones d'inhibition relativement à l'étalon Cette méthode convient aussi bien à la détermination qualitative que quan- titative. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'inven- tion ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au con- traire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de bouillons de fermen- tation contenant des antibiotiques du type aminoglucoside par la recombinaison génétique in vivo de souches productrices d'antibiotique à matériel génétique modifié, procédé caracté- risé par les mesures suivantes: après une préculture dans un milieu nutritif contenant du saccharose, des ions calcium et des ions magnésium, on forme des protoplastes en partant des cellules de souches de Streptomyces marquées génétique- ment et prototrophes, on fusionne les protoplastes qui ont été formés soit en partant de deux souches marquées généti- quement soit en partant d'une ou plusieurs souches inacti- vées par traitement chimique ou physique, on régénère les protoplastes combinés, on isole les souches à matériel géné- tique modifié, on vérifie leur capacité de production d'an- tibiotique et on sélectionne les souches dont la capacité de production est modifiée et avec ces nouvelles souches, on conduit des fermentations aérées en culture profonde dans un milieu nutritif contenant des sources organiques de carbone etd'azote, des sels minéraux, des oligoéléments et/ou des huiles animales ou végétales et/ou des graisses. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on effectue la formation des protoplastes et la fusion des protoplastes dans un milieu nutritif con- tenant 0,1 à 0,5 % de sel de calcium, 0,3 à 0,8 % de sel de magnésium et 12 à 14 % de saccharose. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que pour l' inactivationchimique, on utilise l'acide cannabidiolique ou ses sels, le N-éthylma- léimide, la pyrrolenitrile, le vert brillant ou le 2-mer- capto-éthanol. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait que pour l'inactivation physique, on utilise l'irradiation y. 5 Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que comme souche productrice d'anti- biotique, on utilise $treptomyces tenebrarius. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que comme souche productrice d'anti- biotique, on utilise Streptomyces kanamyceticus.