FR 2545836 A1 19841116 FR 8406934 A 19840504 La présente invention se rapporte à un gène conférant par transformation de la levure la résistance intrinsèque de celle-ci à un inhibiteur de croissance de type herbicide Plus particulièrement, elle se rapporte au plasmide dans lequel un tel gène a été inséré afin de rendre intrinsèquement résistante à cet inhibiteur la levure transformée par ce plasmide L'invention concerne aussi une levure rendue résistante à un inhibiteur de croissance du type herbicide par transformation avec un tel plasmide De plus, la présente invention se rapporte à un procédé de culture sélective de la levure transformée par un plasmide porteur de ce gène. Il est connu de reprogrammer génétiquement des micro-organismes par transformation de ceux-ci avec de l'ADN exogène dans des conditions telles que cet ADN se réplique dans la cellule transformée etlse transmette à sa descendance L'intérêt pratique de ces techniques est évident lorsque l'ADN exogène est porteur d'au moins un gène assurant l'expression dans la cellule transformée d'un polypeptide d'intérêt commercial, qu'il s'agisse d'une hormone à usage médical comme l'insuline, ou d'une enzyme à usage industriel comme l'amylase Il suffit en effet de cultiver dans des conditions appropriées les micro- organismes ainsi transformés pour qu'ils produisent le polypeptide intéressant qu'on pourra récupérer ensuite au départ du microorganisme lui-même ou du milieu de culture suivant que le polypeptide reste lié à la cellule, ou qu' au contraire il est excrété dans le milieu. Une méthode de laboratoire couramment mise en oeuvre pour transformer un microorganisme consiste à utiliser comme vecteur du gène en question un plasmide auto-réplicatif, c'est-à-dire une molécule circulaire d'ADN comportant une séquence lui conférant le caractère de réplicon dans la cellule-hôte Ce plasmide doit aussi comporter au moins un site de restriction, c'est à-dîre une séquence clivable spécifiquement par une enzyme de restriction. -2- Si le plasmide clivé est mis en présence de fragments d'ADN obtenus par restriction d'un ADN exogène ou par synthèse in vitro, il est possible d'obtenir par des techniques appropriées d'usage courant des plasmides dits chimériques dans lesquels un fragment d'ADN exogène se trouve inséré au site de restriction Après avoir incubé une population de micro-organismes en présence d'une prépara- tion d'ADN contenant de tels plasmides, il est possible de sélectionner les clones ayant acquis par transformation un ou plusieurs de ces plasmides chimériques On procède ensuite au criblage de la banque de clones ainsi constituée en vue d'identifier celui ou ceux dont le génome a été reprogrammé par le gène auquel on s'intéresse Ceux-ci se reconnaissent soit parce qu'ils ont un trait phénotique nouveau qui peut être aisément mis en évidence par culture sur un milieu indicateur ou sélectif, soit parce qu' ils répondent positi- vement à un test fondé sur l'usage de sondes moléculaires spécifiques tels des acides nucléiques complémentaires du gène recherché, ou des immunoglobulines dirigées contre le polypeptide correspondant. Après avoir identifié les clones recherchés, il reste à développer le procédé de fermentation assurant une production optimale du polypeptide auquel on s'intéresse. Pour ce faire, deux voies d'approche complémentaires sont couramment suivies: d'une part, le vecteur chimérique est soumis à diverses manipulations in vitro visant à conférer à la portion codante du gène correspondant un ensemble de séquences assurant au mieux son expression, et d'autre part, on recherche les conditions de culture les mieux appropriées à la survie et/ou à la prolifération des micro- organismes transformés à l'exclusion des révertants phénotypiques susceptibles d'apperaître en cours de fermen- tation Lorsque les conditions de culture ont pu être ainsi définies, le procédé de fermentation est qualifié de génétiquement stable, et se prête à une transposition industrielle. -3- On sait que la transformation d'un micro- organisme par les méthodes décrites ci-dessus produit le plus souvent un transformant instable Cette instabilité se manifeste par l'apparition, au cours des générations successives en milieu de culture non sélectif, d'une proportion croissante de cellules phénotypiquement réver- tantes L'analyse révèle que celles-ci ont perdu la majorité ou la totalité de leurs plasmides (voir K Nagahari, J Bacteriol 136,312,1978) Cette situation résulte de la conjonction de deux phénomènes: 1 l'apparition spontanée au sein de la culture de micro- organismes partiellement ou totalement curés Ce curage peut résulter de diverses causes: ségrégation aléatoire des plasmides lors de la division cellulaire, découplage de la réplication des plasmides et des chromosomes, désavantage réplicatif des plasmides chimériques par rapport aux plasmi- des endogènes (voir C P Nollenberg, Curr Top Microbiol. Immunol 96, 119, 1982); 2 la prolifération préférentielle des microorganismes partiellement ou totalement curés en vertu du désavantage sélectif dont soufrent les transformants (voir K Sakaguchi, Molecular breeding and genetics of applied microorganisms, Ed K Sakaguchi, et M Okanishi, Academic Press, 1980, p l) Celui-ci est d'autant plus accentué que l'expression des gènes portés par le plasmide est intense, et mobilise une part plus importante de l'économie cellulaire Cette situation est paradoxale, puisque c'est justement vers une expression maximale des gènes clonés que tendent les efforts des chercheurs désireux de développer un procédé rentable de fermentation industrielle. Il est donc nécessaire, si l'on veut contrôler- la stabilité génétique de la population de micro-organismes au cours de la fermentation, de mettre en oeuvre une pression de sélection artificielle en faveur des trans- formants Celle-ci peut s'exercer en additionnant le milieu de culture d'un inhibiteur de croissance vis-à-vis -4- duquel le plasmide-vecteur porte un marqueur de résistance extrinsèque:c'est le cas de la plupart des vecteurs utili- sés pour la manipulation génétique des micro-organismes procaryotes, qui confèrent aux transformants la résistance à divers antibiotiques tels l'ampicilline (inactivée par une A-lactamase), la néomycine (inactivée par une phospho- rylase), le chloramphénicol (inactivé par une acétylase). La pression de sélection peut également s'exer- cer en réalisant la fermentation dans un milieu de culture artificiel dépourvu d'un métabolite essentiel dont la synthèse de novo est assurée par une enzyme codée par un gène exclusivement porté par le vecteur l'allèle corres- pondant porté par le chromosome de 1 'hôte étant inactivé par mutation Cette situation s'applique tout particuliè- rement à la levure, qui acquiert par transformation au moyen des vecteurs les plus couramment en usage la capacité de croltre dans un milieu dépourvu de leucine (p JDB 207), de tryptophane (T Rp 7), d'uracile (p F Ll>. Le-contrôle de la stabilité ne constitue géné- ralement pas un sérieux handicap pour la mise en oeuvre de procédés industriels de fermentation à petite échelle, tels ceux développés en vue de la fabrication de produits d'intérêt médical à très haute valeur ajoutée comme les hormones ou les vaccins: soit qu'aucun problème majeur de coût ni d'approvisionnement n'est à craindre si l'on recourt à une sélection du premier type, soit que l'usage d'un milieu de culture artificiel est acceptable d'un point de vue économique aussi bien que pratique, si l'on fait appel à une sélection du second type les quantités requises restant, dans les deux cas, relativement limitées. Par contre, la nécessité de recourir à de telles pratiques limite considérablement les perspectives de mise en oeuvre de procédés industriels de fermentation à grande échelle, tels ceux qui visent à la fabrication en grandes quantités de produits à valeur ajoutée relative- ment faible, comme par exemple la production de certaines - enzymes à usage agro-alimentaire au départ de levures transformées Dans ce cas, l'usage de milieux artificiels dépourvus d'un métabolite essentiel que les révertants phénotypiques, contrairement aux transformants, sont incapables de synthétiser, est particulièrement désavanta- geux compte tenu de la difficulté de préparation et du coût prohibitif de ceux-ci Par ailleurs, l'usage de milieux de culture naturels relativement abondants et peu coûteux, comme le lactosérum ou la mélasse, s'avère totalement impraticable, puisque ceux-ci, de par leur contenu relati- vement riche en métabolites essentiels, sont par essence non sélectifs L'addition à de tels milieux de quantités importantes d'antibiotiques tels le chloramphénicol ou un dérivé de la néomycine connu sous le symbole G 418, vis-à-vis desquels une résistance extrinsèque a pu être récemment conférée à la levure par transformation (voir C P Hollenberg, ICN-UCLA Symp Mol Cell Biol 15, 325, 1979 et A Jimenez et J Davies, Mature, 287, 869, 1980), non seulement augmenterait significativement le coût de la fermentation, mais entraînerait inévitablement de sérieuses difficultés d'approvisionnement en ces molécules dont l'usage prioritaire est d'ordre médical ou vétérinaire Il est connu par ailleurs que la levure, comme les autres eucaryotes, est insensible à la plupart des antibiotiques actuellement disponibles a il est donc très improbable que d'autres marqueurs de résistance vis-à-vis d'inhibiteurs de ce type puissent être découverts chez la levure, et a fortiori mis à profit pour contrôler efficacement la stabilité. La présente invention a notamment pour objet de fournir un gène tel que, après transformation dans une cellule de levure au moyen d'un plasmide autoréplicatif porteur de ce gène, la levure devienne intrinsèquement résistante à un ou plusieurs inhibiteurs de croissance de type herbicide organique synthétique De tels inhibi- teurs, contrairement aux antibiotiques, ont l'avantage d'être abondants et peu coûteux Dans l'une des réalisa- -6- tions de l'invention, ce gène confère à la levure ainsi transformée la résistance à un herbicide de formule Ar N(R 1) CO R 2 o Ar est un radical comportant un noyau à caractère aromatique, R 1 est choisi dans le groupe comprenant l'hydrogène, la radical méthyle ou le radical hydroxyle et R 2 est un radical compris dans le groupe formé par les radicaux alkyle, cycloalkyle, alkényle, alkylamino, cyclo- alkylamino, dialkylamino, méthoxyméthylamino et alkoxy. Dans une autre de ses réalisations, la présente invention fournit un gène conférant à la levure la résistance à un herbicide de formule 'N R 1 R 2 o X est un radical compris dans le groupe des radicaux chloro, méthoxy et méthylthio, R 1 et R 2 t identiques ou différents, sont compris dans le groupe des radicaux éthylamino et isopropylamino. Un autre objet de l'invention est de fournir un plasmide comportant le gène tel que défini ci-dessus et pouvant être utilisé pour la transformation de la levure dans des conditions telles que la réplication et la transmission du gène à la descendance, de -même que l'expression par les levures transformées du phéno- type de résistance correspondant au gène, soient assurées. L'invention a encorepour objet une levure rendue résistante à au moins un herbicide organique synthétique par transformation avec un plasmide tel que mentionné ci-dessus. Un autre objet de l'invention est de fournir un procédé qui permette de développer à l'échelle industrielle une fermentation génétiquement stable de levures transformées par un tel plasmide. 7 - On a trouvé de façon inattendue que la crois- sance de la levure est inhibée par de nombreux produits chimiques de synthèse couramment utilisés comme herbicides totaux ou sélectifs en agriculture et en horticulture. Ce fait est d'autant plus surprenant que la plupart de ces herbicides sont connus pour agir au niveau de la photosynthè- se des plantes alors que la levure est totalement dépourvue d'activité photosynthétique. Parmi ces herbicides, un grand nombre se carac- térisent chimiquement par le fait qu'ils répondent à la formule générale: Ar M(R 1) CO R 2 o Ar est un radical comportant un noyau à caractère aromatique. Ce radical Ar est généralement un noyau benzé- nique ou alkylbenzénique, pouvant comporter un ou plusieurs substituants polaires, tels que des atomes d'halogène, un radical méthoxy;ou trifluorométhyle Le radical Ar peut être aussi un noyau hétérocyclique, comme celui du benzo- thiazole ou du thiadiazole Dans cette formule générale, R 1 est généralement un atome d'hydrogène mais ce peut être aussi un groupe alkyle ou hydroxyle R 2 peut être un radi- cal alkyle, cycloalkyle, alkényle C'est le cas pour une catégorie d'herbicides du type carboxyanilide o Ar est un radical phényle généralement substitué Ces herbicides sont connus pour avoir une action inhibitrice sur la photosynthèse Un exemple typique en est le 3 ', 4 '- dichloro-propioanilide, généralement connu sous le nom commun de "Propanil" (voir "The Pesticide Manuel" Ed Ch. R Worthing, ECPC éth Ed 1979, p 446) R 2 peut aussi être un groupe alkoxy Dans ce cas, on a affaire à une caté- gorie d'herbicides du type carbamate Un exemple typique est fourni par le méthyl-3,4-dichlorophénylcarbamate couramment appelé "Swep" (Ibid p 569) et dont l'action s'exerce également sur la photosynthèse Un autre exemple est l'isopropyl-N-( 3-chlrophényl)carbamate mieux connu sous le nom de "Chlorpropham" (Ibid,p 118) R 2 peut être enfin un groupe alkylamino, cycloalkylamino, alkoxyalkylamino, 8 - dialkylamino, etc Ce sont les herbicides dérivés de l'urée et connus eux aussi pour leur action inhibitrice de la photo- synthèse Un exemple classique de cette catégoried'herbi- cides est le 3-( 3,4-dichlorophényl)-l,l-diméthylurée couramment appelé "Diuron"(Ibid p 224) Comme exemples de composés o Ar est un noyau hétérocyclique, on peut citer le l-( 2-benzothiazolyl)-3-méthylurée, dénommé benzothiasuron (Ibid, p 37) et le 1-( 5-tert-butyl-l,3,4- thiadiazol-2-yl) 1,3-diméthylurée, dénommé tebuthiuron (Ibid p 495). Une autre famille importante d'herbicides qui se sont révélés avoir une action inhibitrice sur la crois- sance des levures se caractérise chimiquement par le fait qu'ils répondent à la formule générale: X Ne N R 1 R 2 o X peut être un radical chloro, méthoxy ou méthylthio, R 1 et R 2 étant constitués par un radical éthylamino et/ou isorpopylamino Il s'agit donc d'herbicides dérivés de la S-triazine qui agissent également au niveau de la photosynthèse et dont l'importance commerciale est considé- rable L'un des plus utilisés est le 2-chloro-4-éthylamino- 6-isopropylamino-l,3,5-triazine mieux connu sous le nom d'"Atrazine" (Ibid p 21) Un autre est-le 2-chloro-4,6-bis (éthylamino)-1,3,5-triazine encore appelé "Simazine" (Ibid,p 474). D'autres herbicides, ne répondant pas aux for- mules générales décrites ci-dessus, peuvent être utilisés conformément à la présente invention A titre d'exemple, on peut citer le 3-amino-l,2,4triazole, communément appelé amitrole Cet herbicide est connu pour son action au niveau de la biosynthèse des caroténol- des. 9 - Bien que le mécanisme exact de l'action de ces herbicides chez la levure n'ait pas été étudié dans le détail, on peut considérer, pour un grand nombre d'entre eux, que cette action se situe au niveau de la fonction respiratoire, au vu de leur effet différentiel sur la croissance de la levure dans un milieu o la seule source de carbone est un substrat exclusivement respira- toire, par exemple le glycérol, comparé à une culture témoin réalisée dans un milieu pourvu d'une source de carbone tel le glucose, permettant à la fois la fermenta- tion et la respiration. Il est connu que, dans un cas ou moins, des mutants de la levure Saccharomyces cerevisiae intrinsè- quement résistants à un herbicide (Diuron) ont pu être isolés (voir A M Colson et al, Eur J Biochem 74, 721, 1977) Cependant, la localisation exclusivement mitochon- driale des marqueurs génétiques correspondants rend ceux- ci totalement impropres à une utilisation visant à confé- rer, par transformation, un phénotype de résistance à la levure Par ailleurs, on sait que les marqueurs de résis- tance intrinsèque sont en règle générale récessifs, ce qui en principe les rend impropres au clonage dans le but indiqué ci-dessus Cette règle s'applique de toute éviden- ce à la levure Saccharomyces cerevisiae (voir J R Broach, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae Life cycle and inheritance, Ed J M Strathern, E W. Jones et J R Broach, Gold Spring Harbor Laboratory, 1981, p.723), et ce principe se vérifie clairement dans le seul cas connu de clonage d'un marqueur rêcessif de résistance intrinsèque chez la levure Saccharomyces cerevisiae, o le phénotype de résistance à l'inhibiteur correspondant (l'antibiotique trichodermine) n'a pas pu être exprimé chez le transformant (voir C P Hollenberg, Curr Top. Microbiol, Immunol 96, 119, 1982). On a trouvé, et ceci constitue un aspect impor- tant de la présente invention, qu 'il est possible d'isoler des mutants de la levure Saccharomyces cerevisiae - intrinsèquement résistants à des inhibiteurs de type herbi- cide tels que ceux décrits plus haut, et caractérisés en ce que le marqueur génétique responsable du phénotype de résistance est localisé dans les chromosomes du noyau, et est semi-dominant De tels montants ont été obtenus par la méthode classique de sélection sur un milieu de cultu- re contenant l'herbicide en question. On a trouvé de façon inattendue sur base de l'étude du phénotype de résistance de ces mutants, que ceux-ci étaient résistants non seulement vis-à-vis de l'her- bicide ayant permis leur sélection, mais également vis-à- vis d'autres inhibiteurs de type herbicide organique synthé- tique Cette caractéristique constitue une propriété impor- tante des gènes de résistance intrinsèque de la présente invention. On a également trouvé, et ceci constitue un autre aspect important de l'invention, que la levure Saccharomyces cerevisiae pouvait acquérir par transformation au moyen d'un gène de ce type un phénotype de résistance multiple semblable à celui du mutant d'origine, et ceci en appliquant des méthodes de manipulation génétique couramment en usage chez la levure. L'opération de transformation d'une levure sensible en une levure résistantes au moins un des herbi- cides auxquels se rapporte l'invention peut en principe être menée à bien avec n'importe lequel des gènes de ré- sistance intrinsèque auxquels elle se rapporte, et ceci au moyen de n'importe quel vecteur autoréplicatif utilisable chez la levure Saccharomyces cerevisiae Comme exemples de vecteurs connus se prêtant à un tel usage, on peut notamment citer ceux construits par J D Begge (p JDB 207, p JDB 219, p JDB 248; voir J D Begge, Genetic Engineering 2, Ed R Williamson, Academic Press 1981, p 175) ou par C P. Hollenberg (p MP 78, p MP 81; voir C P Hollenberg, Curr Top. Microbiol Immunol 96, 119, 1982) ou par Ph Fournier et al. (voir demande de brevet européen No 11 562). Les levures transformées par un de ces plasmides il - dans lequel on a inséré au préalable un gène de résistance conforme à la présente invention peuvent être cultivées dans un but commercial, par exemple pour la production industrielle d'un po Jypeptide dont l'expression est assurée par un gène inséré dans le même plasmide que le gène de résistance, et ceci dans des conditions assurant la sta- bilité génétique de la fermentation, et sans les inconvé- nients ou obstacles inhérents aux méthodes de contrôle de la stabilité actuellement utilisables, et dont il a été fait mention plus haut Il suffit pour cela d'ajouter au milieu de culture l'un des inhibiteurs de croissance auxquels la levure aura été rendue résistante par trans- formation, à une concentration telle que seuls les trans- formants puissent survivre et/ou se multiplier, à l'inver- se des révertants phénotypiques qui pourraient apparaître en cours de fermentation. D'autres modalités et avantages de l'utilisa- tion d'un gène de résistance conforme à la présente inven- tion sont considérés comme relevant de celle-ci, et c'est à titre d'illustration seulement que sont donnés les exemples qui suivent. Exemple 1. Isolement d'un mutant de la levure Saccharomyces cerevisiae spontanément résistant à des inhibiteurs de croissance de type herbicide. Au départ de la couche D 273-l OB/A 21 de Saccharomyces cerevisiae, on a isolé un mutant spontané de résistance appelé D 273-10 B/A 21/DR (en abrégé DIUR appelé,D 217 g 217 par sélection sur milieu glycérol additionné de Diuron à la concentration de 100 p M le seuil d'inhibition pour cette couche ayant été préalablement établi expérimentalement à p M pour les cellules haploïdes aussi bien que diploïdes. La localisation nucléaire du marqueur de résistance de ce mutant a été attestée par l'étude de son mode de transmis- sion à la descendance d'un croisement entre le mutant DIUR et une couche sensible: l'analyse des tétrades a 12 - révélé que le marqueur obéissait à une ségrégation typique- ment mendélienne L'analyse du phénotype de résistance des diploïdes hétérozygotes issus de ce croisement à démontré le caractère semidominant du marqueur de résistance: le seuil d'inhibition se situant dans ce cas à 100 M, alors que le mutant haploïde résistait à la concentration de 150 p M Ce mutant s'est avéré être résistant non seule- ment vis-à-vis de l'herbicide qui avait permis de la sélectionner, mais également vis-à-vis d'autres herbicides inhibiteurs respiratoires tels que: l'atrazine (seuil 2 m M, résistance 5 m M), l'amitrole (seuil 10 m M, résistance 20 m M), le chlorpropham (seuil 0,3 m M, résistance 1 m M), le chloroxuron: 3-l 4-( 4-chlorophénoxy)phény 13-1,1- diméthylurée (seuil 0,01 m M, résistance 0,05 m M) le monuron: 3-( 4chlorophényl)-l,l-diméthylurée (seuil 0,5 m M, résistance 1,5 m M) le monolinuron: 3-( 4-chlorophényl)-l-méthoxy-l-méthyl- urée (seuil 1 m M, résistance 3 m M) la desmetryne: 2-isopropylamino-4-méthylamino-6-méthyl- thio-1,3,5-triazine (seuil 1 m M, résistance 5 m M) la metribuzine: 4-amino-6-tert-butyl-4,5-dihydro-3-méthyl- thio-l,2,4-triazine-5-one (seuil 5 m M, résistance 50 m M) le dinoseb: 2sec-butyl-4,6-dinitrophénol (seuil 0,2 m M, résistance 0,4 m M) Exemple 2 Clonage et expression dans la levure Saccharomyces cerevisiae d'un gène de résistance intrinsèque à des herbicides. L'ADN a été purifié au départ d'une culture liquide du mutant DIUR 7, et soumis à la restriction par l'enzyme Pst I Les fragments de restriction ainsi obtenus ont été insérés par recombination in vitro dans le plasmidenavette p JDB 207 restreint au site Pst I du marqueur de résistance à l'ampicilline La couche HB 101 d'Escherichie coli a été transformée au moyen de ces plasmides, de manière à constituer une banque génomique 13 du mutant DIUR 7 sous la forme d'une collection comprenant environ 100 000 clones d'Escherichia coli hébergeant chacun un ou plusieurs plasmides chimériques et présentant un phénotype sensible à l'ampicilline et résistant à la tétracycline. Une culture d'Escherichia coli a été réalisée par ensemencement au moyen de l'ensemble des clones de cette banque, de manière à amplifier les plasmides chimé- riques contenus dans celle-ci L'ADN a été extrait de cette culture, et les plasmides ont été purifiés par centrifuga- tion isopycnique sur chlorure de césium en présence de bro- mure d'éthidium Ces plasmides ont été utilisés pour transformer la souche AH 22 de Saccharomyces cerevisiae suivant une méthode classique (voir A Hinnen et al, Proc. Natl Acad Sci, USA 75, 1929, 1978) Les transformants ont été sélectionnés sur milieu glucose carencé en leucine, et les clones transformés résistants au Diuron ont été ensuite sélectionnés par culture sur milieu glycérol addi- tionné de Diuron à la concentration de 100 p M. On a montré que le phénotype de résistance de nombreux clones obtenus par cette méthode résulte effectivement de la présence dans ceux-ci d'un ou plusieurs plasmides chimériques porteurs du marqueur de résistance issu de la souche DIUR 7, et ceci par deux voies. Tout d'abord, on a procédé au curage de chacun des clones de la collection par la méthode de Hollenberg (voir C o P. Hollenberg, Curr Top Microbiol Immunol, 96, 119, 1982), et vérifié que bon nombre d'entre eux révertaient vers un phénotype à la fois auxotrophe pour la leucine et sensible au Diuron après curage; les clones ne répondant pas positivement à ce test ont été écartés Par ailleurs, on a extrait l'ADN d'une culture liquide ensemencée avec l'un des clones retenus à la suite de ce test, et transformé la couche HB 101 d'Escherichia coli au moyen de celui-ci, de manière à constituer une banque de plasmides du clone de levure en question Les clones d'Escherichia coli 14 - ainsi obtenus, désignés ici comme "secondaires", ont été rassemblés par groupes de 50 pour l'ensemencement d'autant de cultures mixtes dont on a extrait les plasmides comme décrit plus haut Ceux-ci ont été utilisés pour transformer la souche AH 22, comme ci-dessus: on a obtenu par cette méthode, et avec une très haute fréquence, un très grand nombre de clones de levure résistant au Diuron, qualifiés ici de "secondaires". On a recherché lequel, parmi l'ensemble des plasmides chimériques représentés dans la banque secondaire d'Escherichia coli, était responsable de la transformation de résistance observée Dans ce but, on a procédé comme ci-dessus à la purification des plasmides de chacun des clones individuels composant les groupes de 50 répondant positivement lors de la transformation secondaire de la levure On a observé par électrophorèse qu'une grande variété de plasmides avait été obtenue de cette manière, se manifestant par des différences notables quant a la taille des fragments y insérés, d'une part, et quant à leurs profils de restriction, d'autre part ces différents plasmides se regroupant en une dizaine de classes distinc- tes attestant du caractère hétéroplasmidiqcjdu transformant primaire de levure, cet état résultant de la nature multiple de l'évènement initial de transformation, de même que de l'occurrence ultérieure d'événements de recombinaison. Des clones représentatifs de chacune de ces classes ont pu être ainsi identifiés, et ont fourni chacun une prépara- tion de plasmides individuellement purifiés comme ci-dessus, dont l'unappelé ici p DIU 202 s'est révélé capable de conférer concomitamment par transformation de la souche AH 22 suivant les méthodes décrites plus haut un phénotype à la fois prototrophe pour la leucine et résistant vis-à-vis des herbicides auxquels le mutant DIUJR d'origine était 217 iinétt luimême résistant La taille du fragment inséré dans le plasmide p DIU 202 a été estimée par électrophorèse à 1.5 kb. - Une couche de Escherichia coli HB 101 transformée par le plasmide p DIU 202 a été déposée le 4 mai 1983 auprès du Centraalbureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, 3740 AG Baarn, Pays-Bas, sous le numéro LMD 83 07 = CBS 396 73. Exemple 3 Procédé de culture sélective de la levure Saccharomyces cerevisiae transformée par un plasmide porteur d'un gène de résistance intrinsèque à des herbicides assurant la stabilité génétique de la population. Une culture liquide de la souche AH 22 de Saccharomyces cerevisiae, préalablement transformée au moyen du plasmide p DIU 202 comme décrit dans l'exemple 2, a été réalisée à 30 C sous agitation constante dans un erlenmeyer contenant 100 ml de milieu glycérol complet additionné de Diuron à la concentration finale de 100 p M. Au cours de la phase exponentielle de cette culture, on a prélevé une fraction aliquote de celle-ci que l'on a utilisée pour ensemencer un milieu de culturesemblable dans un rapport de dilution tel que cette seconde culture soit immédiatement en phase exponentielle de croissance. Cette opération a été répétée de la même manière au cours d'une période d'observation totalisant 300 heures, et correspondant à 132 générations successives Des prélève- ments ont été réalisés au cours de ces cultures successives à des moments correspondant aux nombres de générations successives suivants: 0, 8, 15, 25, 43, 57, 68, 78, 91, et 132 Les cellules ont chaque fois été étalées sur des boites de Pétri contenant un milieu glycérol complet solide de manière à obtenir des colonies isolées, dont cinquante ont été chaque fois repiquées par la technique du cure-dent stérile sur un jeu de quatre boites de Pétri contenant les milieux solides suivants: 1 glycérol complet 2 glycérol complet + diuron 100 -M 3 glycérol minimum + histidine 4 glucose minimum + histidine 16 - Les colonies ayant poussé sur chacune de ces boîtes ont été chaque fois dénombrées Dans tous les cas, on a observé que la totalité des 50 colonies repiquées poussaient sur chacune des quatre boîtes définies ci-des- sus Ces résultats indiquent qu'aucun révertant phénotypi- -que, ni pour le caractère d'auxotrophie leucine, ni pour le caractère de sensibilité au Diuron, n'est apparu au cours de 132 générations successives de culture au cours desquelles une pression de sélection positive a été exer- cée par la présence du Diuron Cette remarquable stabili- té génétique de la population de levures transformées au moyen du plasmide p DIU 202 s'oppose radicalement à l'ensemble des observations rapportées dans la littérature (voir: N GUNGE, Ann Rev Microbiol, 37, 253, 1983) pour des levures transformées au moyen de plasmides auto- réplicatifs de la classe Y Ep (Yeast Episomal plasmids) à laquelle appartient le plasmide p DIU 202 faisant l'objet de la présente invention, et pour lesquels des fréquences de réversion phénotypique de l'ordre de un ou plusieurs pourcents par génération sont généralement observées, même dans des conditions de culture o une pression de sélection (négative dans tous les cas décrits) est exer- cée A titre d'exemples, on peut citer les observations décrites pour des levures transformées au moyen des plas- mides suivants et s'avérant génétiquement instables: pleu 1,4 et pleu 2 6 (voir: J B Hicks, A Hinnen and Go R Fink, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, 43, 1305,1979) p JD Bl 10, p JDB 207, p JDB 209, p JDB 210 et p JDB 211 (voir: J D Beggs, A Benzon Symposium, 16, 383, 1981) p JDB 219 (voir: J D Beggs, A Benzon Symposium, 16, 383, 1981; C.P Hollenberg, Curr Top Microbiol Immunol 96, 119, 1982; A Toh-E, P GuerryKopecko and R B Wickner, J Bacteriol, 141, 413, 1980; R M Walsley, D C J. Gardner and S G Oliver, Mol Gen Genet 192, 361, 1983). 17 - -G 9 (voir: C Gerbaud, P Fournier, H Blanc, M Aigle, H. Heslot and M Guerineau, Gene, 5, 233, 1979) Y Ep 13 (voir: C L Hsiao and J Carbon, Proc Natl Acad Sci USA, 78, 3760, 1981) -Y Ep 4 (voir: K Struhl, D T Stinchcomb, S Scherer and R W. Davis, Proc Natl Acad Sci USA, 76, 1035, 1979) Afin de confirmer directement, si besoin en était, le caractère d'instabilité d'une culture-témoin transformée par le plasmide p JDB 207, en tous points semblable au plasmide p DIU 202 sinon qu'il est dépourvu du fragment de 1 5 kb responsable de la résistance au Diuron et que par conséquent il ne se prête pas à la mise en oeuvre d'une pression de sélection positive par l'ajoute de cet herbicide au milieu de culture, nous avons réalisé l'expérience suivante Des cultures liquides sériées de la souche AH 22 de Saccharomyces cerevisiae, préalablement transformée au moyen du vecteur p JDB 207 comme décrit dans l'exemple 2, ont été réalisées suivant un protocole en tous points semblable à celui décrit ci-dessus, sinon que le milieu n'était pas additionné de Diuron, et les prélè- vements ont été réalisés à des moments correspondant aux temps de génération suivants: 0, 13, 26, 38, 51 et 66. Des révertants auxotrophes pour la leucine ont effectivement été observés dès la 26 e génération ( 2 %), et avec une fréquence croissante: 38 générations ( 4 %), 51 générations ( 6 %), 66 générations ( 20 %) Ces résultats confirment bien que le procédé de culture sélective faisant l'objet de la présente invention garantit effectivement la stabilité génétique d'une population de levures transformées par la mise en jeu d'une pression de sélection positive exercée par un herbicide en faveur des cellules hébergeant un plasmide porteur d'un gène de résistance intrinsèque vis-à-vis de cet herbicide. 18 - Revendications: 1 Un gène conférant par transformation dans une cellule de levure la résistance intrinsèque de celle-ci à au moins un inhibiteur de croissance de type herbicide organique synthétique. 2 Un gène suivant la revendication 1 caractérisé en ce que l'herbicide correspond à la formule: Ar N(R 1) CO R 2 o Ar est un radical comportant un noyau à caractère aromatique, R 1 est choisi dans le groupe comprenant l'hydrogène, le radical méthyle et le radical hydroxyle, R 2 est un radical compris dans le groupe formé par les radicaux alkyle, cycloalkyle, alkényle, alkylamino, cycloalkylamino, dialkylamino, alkoxyalkylamino et alkoxy. 3 Un gène suivant la revendication 2 caractérisé en ce que le radical R 2 de l'herbicide est compris dans le groupe des radicaux méthylamino, dimâthylamino et méthoxy- méthylamino. 4 Un gène suivant l'une quelconque des revendi- cations 2 et 3 caractérisé en ce que le radical Ar de l'herbicide comporte un noyau benzénique substitué ou non. Un gêne suivant la revendication 4 caractérisé en ce que le radical Ar de l'herbicide est un radical phényle comportant 1 ou 2 substituants choisis dans le groupe formé par les atomes d'halogène et les radicaux alkyle, méthoxy et trifluoromâthyle. 6 Un gène suivant la revendication 2, caractérisé en ce que l'herbicide est l'isopropyl-N-( 3-chlorophényl) carbamate. 7 Un gène suivant la revendication 2, caractéri- sé en ce que l'herbicide est le 3-( 3,4-dichlorophényl)-l,1- diméthylurée. 8 Un gène suivant la revendication 1, caractéri- sé en ce que l'herbicide correspond à la formule: 19 - X N N -II R 1 N R 2 o X est un radical compris dans le groupe des radicaux chloro, méthoxy et méthylthio, R 1 et R 2 sont des radicaux compris dans le groupe des radicaux éthylamino et/ou isopropylamino 9 Un gène suivant la revendication 8, caractérisé en ce que l'herbicide est le 2-chloro-4-éthylamino-6- isopropylamino-l,3,5-triazine. 10 Un gène suivant la revendication 8, caractérisé en ce que l'herbicide est le 2-chloro-4,6-bis(éthylamino)- 1,3,5-triazine. 11 Un gène suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'herbicide est le 3-amino-1,2,4-triazole. 12 Un plasmide comportant le gène suivant l'une quelconque des revendications 1 à 11 et assurant l'expres- sion de ce gène dans la levure, la rendant ainsi résistante au moins à l'herbicide correspondant. 13 Levure résistant à au moins un herbicide organi- que synthétique caractérisée en ce qu'elle comporte un plasmide selon la revendication 12 e 14 Un procédé de culture sélective de levures transformées par le plasmidesuivant la revendication 12 et assurant la stabilité génétique de la population en cours de fermentation.