FR 2540516 A1 19840810 FR 8401863 A 19840207 Procédé de production de protéines correspondant à la toxine diphtérique La présente invention concerne un procédé de production d'une protéine qui correspond à la toxine diphtérique, par culture, dans un milieu nutritif liquide contenant des ions fer à une concentration de 0,05 gg/ml à 0,5 gg/ml, à une température de 30 à 40 C, dans un milieu de culture neutre et dans des conditions aérobies, d'un micro- organisme appartenant au genre Corynebacterium diphtheriae avec deux phages (bactériophages) mutants codant pour la protéine qui correspond à la toxine diphtérique et intégrés en mode non-tandem dans leurs chromosomes. La toxine diphtérique est une protéine qui est remarquablement toxique envers les cellules eucaryotes. Cette toxine se compose de deux sous-unités, à- savoir: le fragment B qui peut se fixer aux récepteurs qui se trouvent sur la membrane de la cellule eucaryote, et le fragment A, qui est toxique et qui, après avoir pénétré les cellules, y bloque la synthèse de la protéine. La toxine diphtérique est codée par un gène, dont la structure primaire a récemment été déterminée (C Ratti, R Rappuoli, E Go Giannini, Nucleic Acid Research, 11, 6589, 6595, ( 1983), et qui est présent dans l'ADN de quelques bactériophages correspondants (B, y, ) capables d'infecterle Corynebacterium diphtheriae (J Jo Costa et al, Jo Bacteriol, 148, 124-130 ( 1981); V Freeman, J Bacteriol. 61, 675-688 ( 1951)). Ces phages, après avoir infecté la bactérie, peuvent la dissoudre et ainsi la tuer, ou bien peuvent s'intégrer au chromosome bactérien, rester inactifs et être repliques chaque fois que la bactérie est elle-même repliquée. L'ADN du phage intégré sera transmis en même temps que le chromosome bactérien aux cellules-filles qui contiendront ainsi le gène codant la protéine. A l'heure actuelle, on produit la toxine diphtérique en cultivant la souche PW 8 et on l'utilise, après détoxication avec du formol, pour la préparation du vaccin 25405 1- antidiphtérique. Récemment, des mutants du phage B on't -t b 2 b 6 tenùs, par traitement à la nitrosoguanidine, par Uchiï et:a (Nature New Biol, 233, 8-11, ( 1973)). De tels phages mutants qui sont intégres au chromosome bactérien du micro-organisme Corynebaterium diphtheriae, codent la synthèse de protéines cmrespondnnt a la toxine diphtérique, dont ils diffèrent quant leur structure et/ou quant à leur fonction en raisonde l-a présence d'une ou de plusieurs mutations insérées dans le gane structurel de la toxine. Les protéines du type mentionné ci-des sus bnt tt dénommées "substances de réaction croisée" (CRM/),4 v l ual'es entraînent une réaction croisée immunologique av 1 N tzxine diphtérique. Parmi les plusieurs phages mutants qui ont éitg isolés, on a plus particulièrement exploré ceux-qui codent pour les protéines CRM 176, CRM 197, CRM 228 et CR 435 (Uchida et al, J Biol Chem, 218, 3838-3844 1973 j)- Plus particulièrement, la protéine CRM 45 est une protéine qui se compose d'un fragment A, ressemblant par sa structure et par sa fonction à la toxine diphtér 1 que, et d'un fragment B, qui est dépourvu d'un segment capable -de fixer la protéine aux récepteurs qui se trouvent à 1 a surface des cellules eucaryotes. Le résultat est que la protéine CR 45, bien qu'ayant un fragment A qui est totalement actif in vitro, n'a absolument aucune activité in vivo, étant donn qu'elle est incapable de pénétrer les cellules. Inversement, le fragment B possède, non modifiée, la structure hydrophobe qui est nécessaire pour faire passer le fragment A à l'intérieur de lacellule. En raison de ces caractéristiques, c'est dire présence du fragment actif A, présence, dans le fragment B, de la structure qui est requise pour faire passer le fragment A à l'intérieur de la cellule, et absence de la région qui est capable de reconnaître les récepteurs des membranes cellulaires, il a été envisagé de faire appel à la protéine CRM 45 pour constituer des toxines hybrides En fait, en remplaçant le segment manquant par une substance telle que anticorps, anticorps monoclonal, hormone ou autre substance d'intérêt biologique, capable de reconnaître des molécules spécifiques sur les surfaces de quelques cellules, telles que des cellules-cibles, on a obtenu une toxine hybrides qui est capable de ne tuer sélectivement que quelques sortes de cellules. Une telle toxine hybride peut trouver une application élective dans le domaine pharmacologique et, par- dessus tout, pour le traitement de quelques types de tumeurs (P Bacha et al, J Biol Chem, 258, 1565-1570, ( 1983)). La protéine CRM 197 a le même poids moléculaire que la toxine diphtérique et se compose d'un fragment B qui est identique, par sa fonction et par sa structure, à la toxine, et d'un fragment A, qui est atoxique et qui diffère du fragment d'origine par un amino-acide La protéine CRM 197, qui est atoxique, ne peut pas être distinguée immunologiquement de la toxine diphtérique et peut ainsi constituer une solution de rechange au toxoide diphtérique qui est employé à l'heure actuelle pour la production du vaccin. En fait, un traitement doux de la protéine CRM 197 avec du formol suffit à obtenir des niveaux protecteurs satisfaisants d'anticorps diphtériques chez les cochons d'Inde (M Porro et al, J Infect Dis, 142, 5 (-1980)). Mais jusqu'à présent, des développements plus poussés de produits dérivant de protéines correspondant à la toxine diphtérique et obtenus selon le mode opératoire révélé par Uchida, ont été entravés par les faibles rendements des synthèses de ces protéines par culture. En conséquence, un objet de la présente invention est de procurer un procédé de production de protéines correspondant à la toxine diphtérique, qui comprend une étape de culture, dans un milieu nutritif liquide contenant des ions fer à une concentration de 0,05 gg/ml à 0,5 g/ml, à une température de 30 'C à 40 QC, dans un milieu de culture neutre et dans des conditions aérobies,d'un micro- organisme appartenant au genre Corynebacterium diphtheriae avec deux phages mutants qui codent pour la protéine correspondant à la toxine diphtérique et qui sont intégrés en mode non-tandem dans leurs chromosomes. Plus particulièrement,'l'objet de la présente invention est de procurer un procédé de production de la protéine CRM 45 avec des rendements de 50 Lf/ml à 200 Lf/ml, et la protéine CRM 197 avec des rendements de 30 Lf/ml à 60 Lf/ml, par culture de la souche C 7 ( 145) M 8 avec deux phages mutants 145 intégrés en mode non-tandem dans leurs chromosomes, et par culture de la souche C 7 (B 197) M 1 avec des phages 1197 intégrés en mode non-tandem dans leurs chromosomes. La présente invention est basée essentiellement sur la découverte relativement surprenante du fait que la souche C 7 (ATCC 27010) de Corynebacterium diphtheriae possède dans son propre chromosome deux points de fixation att B o l'ADN bactériophage peut être intégré Les processus lysogènes d'un phage d'après la méthode de Campbell (Epitomes Adv Genetics, 11, 101-145, ( 1982)), illustré sur la Figure 1 A, suppose la coupure de l'ADN bactériophage circulaire en un point spécifique, att P, et l'intégration, en un point tout aussi spécifique, du chromosome bactérien, att B, qui est appelé point de fixation Jusqu'à maintenant, dans toutes les configurations connues, un seul point att P et un seul point att B ont été identifiés. Il a maintenant été constaté que la souche C 7 (ATCC 27010 Y de Corynebacterium diphtheriae possède dans son chromosome deux points de fixation, att B 1 et att B 2, o l'ADN bactériophage peut être intégré En utilisant le milieu de culture TYE, modifié selon l'invention, on a isolé, dans le procédé de lysogénisation de cette bactérie, les souches lysogènes suivantes monolysogènes, lorsque le phage n'est présent qu'une seule fois en att B 1 ou att B 2; bi-lysogènes (tandem) lorsque deux phages sont simultanément présents en un même point att B; et bi- lysogènes non-tandem, lorsque deux phages sont simultanément présents, l'un en att B 1 et l'autre en att B 2 (Figure l B). Selon la présente invention, on a infecté la souche C 7 (ATCC 27010) de Cor nebacterium diphtheriae avec un phage mutant qui code pour la protéine correspondant à la toxine diphtérique, par "placage" sur un milieu de culture CY. Après 48 heures de croissance à une température de 350 C, on a observé les plaques de lyse du phage, qui contenaient en leur sein une zone opaque due à la croissance de-cesbactéries, dans laquelle le phage avait été intégré au chromosome bactérien. On a prélevé les souches d'une manière stérile et on les a plaquées sur un milieu CY de manière à isoler les différentes colonies, pour les analyser ensuite afin de vérifier la présence de phages lysogènes par la "méthode de libération des phages" (Miller et al, Virology, 29, 410-425, ( 1966 J)) On a procédé à un tri des bi-lysogènes en se basant sur le fait que les lysogènes qui contenaient deux couples du phage intégré possédaient deux gènes codant pour la protéine correspondant a la toxine diphtérique, si bien qu'ils sont capables de synthétiser une quantité deux fois plus grande de ladite protéine. On a préparé des plaques du milieu de culture TYE, contenant respectivement 3, 4, 6, 8 et 12 unités/ml de sérum d'antitoxine diphtérique, et on a ensuite titré la concentration de chaque lysogène dans le séruempartransfert de plaques On a fait précipiter la protéine produite par les différents lysogènes, par diffusion à travers la gélose, à partir de l'anticorps qui se trouvait dans le milieu, formant ainsi un halo dont la taille était directement proportionnelle à la quantité de CRM produite par chacune des colonies. Dans les plaques qui contenaient une concentration d'anticorps égale à 3 unités/ml, tous les lysogènes formaient un halo identique Dans celles de concentration intermédiaire, 4 à 6 unités/ml d'anticorps, on a observé des halos de tailles différentes: très petits pour les mono- lysogènes et plus grands pour les bi-lysogênes. Dans les plaques contenant une concentration d'anticorps de 8 à 12 unités/ml, seuls les bi-lysogènes faisaient apparaître un halo de précipitation. La Figure 2 est la photographie d'une plaque TYE contenant 6 unités/ml d'anticorps, sur laquelle il est possible de distinguer trois halos de tailles différentes, correspondant à des lysogènes différents: monolysogènes (petit halo), bi- lysogènes en tandem (halo A) et bi-lysogènes non-tandem (halo B) On a fait la démonstration du fait que les lygosènes ayant le halo le plus grand contiennent deux phages intégrés dans leurs chromosomes respectifs en mettant en évidence l'organisation moléculaire des phages par purification de l'ADN chromosomique selon des modes opératoires classiques. Sur la Figure l B, on peut voir qu'en coupant l'ADN bactériophage aux points A et B à l'aide d'une enzyme de restriction, on obtient un fragment AB, alors que, si l'on utilise la même enzyme pour le monolysogène, on devrait obtenir deux fragments, A et B, contenant chacun une partie du chromosome bactérien, quatre fragments pour le bi-lysogène non-tandem et trois pour le bi-lysogène tandem. En fait, les analyses effectuées par le mode opératoire de la tache de Southern (J Mol Biol, 98, 503- 517, ( 1975), en utilisant comme sonde le fragment 8 Bam 4 contenant le point att P marqué au phosphore 32 correspondent, comme le montre la Figure 3, aussi bien par le nombre que par la position des bandes, à ce qui avait été prévu selon l'invention à partir de l'analyse de la Figure l B. Sur la Figure 3, l'ADN du phage donne une bande unique (A), celui du monolysogène deux bandes (B), celui du bi-lysogène non-tandem quatre bandes (C), tandis que le bi- lysogène tandem donne trois bandes, dont l'une migre en même temps que celle du phage (D). On a vérifié la stabilité des bi-lysogènes en prélevant des colonies isolées de cultures anciennes ( 5 jours), en les plaquant sur un milieu CY, et en analysant par la méthode du halo la présence d'un ou de deux phages Cette analyse a donné les résultats suivants: les bi-lysogènes en E 540516 tandem étaient médiocrement stables en raison de leur tendance à perdre un phage et à se transformer en mono- lysogènes Sur 250 colonies essayées, 180 environ étaient devenues des monolysogènes, tandis que les bi-lysogènes du type non-tandem étaient extrêmement stables: en fait, sur 450 colonies essayées, on n'a trouvé aucun monolysogène. Selon la présente invention, on a infecté la souche C 7 avec le phage mutant B 45 codant pour la protéine CRM 45, et avec le phage 197 codant pour la protéine CRM 197, et on a isolé les souches lysogènes suivantes: C 7 ( 345)M 3 et C 7 (M 197)M 5 (monolysogènes), C 7 ( (bi-lysogènes tandem) et C 7 (B 45)M 8 et C 7 ( 5197 YM 1 (bi- lysogènes non-tandem) Les souches C 7 (g 45)M 8 et C 7 (B 197)M ont été déposées à l'American Type Culture Collection (ATCC) et les numéros ATCC39526 et ATCC 39255 leur ont été attribués. On a examiné les différentes souches lysogènes pour voir si elles produisaient les protéines CRM 45 et CRM 197 en les cultivant dans des conditions aérobies et dans un milieu liquide nutritif contenant des ions fer à une concentration de 0,05 g/ml à 0,5 gg/ml, de préférence de 0,1 gg/ml, à une température de 30 C à 40 C, de préférence de 35 C à 37 C, à p H neutre et pendant un laps de temps suffisant pour accumuler une quantité considérable de protéines dans le milieu de culture. On a ensuite recueilli la protéine et on l'a purifiée par l'un quelconque des modes opératoires classiques connus de l'homme du métier. Milieux de culture utilisés dans le mode opératoire Milieu TYE permettant de produire le halo de précipitation On a modifié le milieu suivant par rapport à la formule d'origine de Pappenheimer (Inf Imm, 18, 203-209, ( 1977)), et il avait la composition suivante: tryptose: 10 g; extrait de levure: 5 g; Na Cl: 5 g; KH 2 PO 4: 5 g; eau: 1 litre. On a ajusté le p H à 7,4 et on a ajouté au miiieu 2 ml de chlorure de calcium à 50 % avant de le faire passer à l'autoclave On a laissé décanter le précipité, après quoi on a ajouté 2 ml/1 d'une solution II, 1 ml/l d'une solution III et 12 ml/l de gélose noble. Enfin, on a ajouté du sérum de sang de cheval anti- diphtérique à une concentration de 4, 6, 8 ou 12 unités/ml, en fonction du halo qui était attendu. Milieu CY permettant la production de protéines CRM Extrait de levure: 20 g; avino-acides dérivés ae la caséine: 1010 g;tryptophane à 1 %: 5 ml; KH 2 PO 4: 5 g; eau: 1 litre A p H 7,4, on porte à ébullition et on filtre sur papier Whatman pendant que l'ébullition continue On ajoute 2 ml de solution II, 1 ml de solution III, puis on met le mélange réactionnel dans un autoclave Avant de l'utiliser, on lui ajoute 3 ml d'une solution de maltose et de chlorure de calcium par fraction de 100 ml de milieu. Solution II Mg SO 4 7 H 20: 22,5 g; alanine: 115 mg; acide nicotinique: 115 mg On ajoute ensuite 1 ml d'eau et d'acide chlorhydrique concentré pour dissoudre les composants, après quoi on ajoute 7,5-mg d'acide pimélique, 5 ml de Cu SO 4 5 H 20 ( 1 %), 4 ml de Zn SO 4 5 H 20 à 1 % 1, 5 ml de Mn C 12 4 H 20 à 1 %, et 3 ml d'acide chlorhydrique concentré, puis de l'eau jusqu'à 100 ml. Solution III L-cystine: 20 g; acide chlorhydrique concentré: ml; eau jusqu'à 100 ml. Solution de maltose chlorure de calcium: maltose 50 g; 2 ml de chlorure de calcium à 50 %; 1 g de KH 2 PO 4, et de l'eau jusqu'à 100 ml On ajuste le p H à 7,4 et on filtre la solution sur papier filtre Whatman 40, après quoi on place la solution dans un autoclave. Description des dessins: Figure IA: processus de lysogénisation selon Campbell. L'ADN bactériophage est cassé en un point spécifique att P et est intégré en un point tout aussi spécifique, att B, du chromosome bactérien. Figure l B: processus de lysogénisation dans la souche C 7 (ATCC 27010) de Corynebacterium diphtheriae. 25405 16 L'ADN bactériophage est cassé au point de fixation att P et peut être intégré au niveau des deux points de fixation att B 1 et att B 2 qui sont présents dans le chromosome bactérien pour donner des monolysogènes, des bi-lysogènes tandem et des bi-lysogènes non-tandem. Figure 2: plaque avec milieu TYE contenant six unités/ml de sérum antidiphtérique On peut distinguer trois halos de précipitation, à savoir: halo très petit (monolysogènes), halo intermédiaire A (bi-lysogènes tandem) et grand halo B (bi- lysogènes non-tandem). Figure 3: analyse de l'ADN des lysogènes par la méthode de la tache de Southern On a fait digérer l'ADN avec du Bam H 1 et on-a séparé les fragments sur gel d'agarose ( 1,3 %) puis on les a transférés dans de la nitrocellulose, après quoi on les a hybridés avec le fragment 5 Bam 4 contenant le point att P marqué au phosphore 32 Le fragment e Bam 4 correspond au fragment AB de la Figure l B. On peut voir un fragment unique AB dans l'ADN bactériophage (A) deux fragments AB dans le mionolysogène (B), quatre fragments dans le bi- lysogène non-tandem (C) et trois fragments dans le bi-lysogène tandem {D). Figure 4 production de la protéine CRM 197 avec la souche C 7 (W 197)M 5 de monolysogène: symbole O; la souche C 7 (e 197)M 8 de bi-lysogène tandem: symbole V; la souche C 7 (g 197)M 1 de bi-lysogène non-tandem: symbole a. Les petits carrés pleins O, indiquent la densité optique de la culture. Les exemples expérimentaux qui suivent sont des illustrations et non des limitations de l'invention. EXEMPLE 1 On prépare des ballons de 125 ml contenant chacun ml de milieu CY et on les stérilise à 120 C pendant 15 minutes Dans cs ballonson inocule une quantité, correspondant à une"boucle" de platine, de souches lysogènes suivantes: C 7 (r 197)M 5, C 7 {( 197)M 8 et C 7 ( 197)M 1, que l'on avait cultivées pendant 24 heures à 35 C sur des plaques CY. On cultive pendant une nuit à 35 C les ballons qui ont été ainsi inoculés. On inocule 0,1 ml de chaque culture isolée dans des fioles d'Erlenmeyer ayant une capacité de 125 ml, dont chacune contient 10 ml de milieu CY déferrisé et complété par 0,1 gg/ml de Fe++, puis on met en incubation sur un agitateur tournant à 240 tours par minute pendant 45 heures à une température de 35 C. On prélève des échantillons à intervalles de deux heures, et on détermine alors la densité optique et le contenu de CRM 197 libéré dans le surnageant On mesure la densité optique à 590 nm à l'aide d'un spectrophotomètre "Perkin- Eler"Midèle 35 (marque déposée)(longueur du trajet des rayons lumineux 1 em)et on détermine la protéine CRM 197 par la méthode immuno- électrophorétique (Murfy et al, J Clin Microbiol, 7, 91- 96 ( 1978 >) et/ou par floculation (G Ramon C R Soc Biol, 86, 661-671, ( 1922)) Par "Lf/ml", on entend l'unité de floculation telle qu'elle est définie par G Ramon dans C R. Soc Biol (Paris), 86, 661-671 ( 1922)). Les résultats que l'on a obtenus sont illustrés sur la Figure 4 Ainsi qu'on peut le voir, la production de CRM 197 nepeutpas commencer avant que la densité optique (O D) de la culture ait atteint une valeur de 4,5 à 5,correspondant à la fin de la phase logarithmique Au début de la partie finale de cette dernière phase, la production massive de CRM 197 commence, et elle se poursuit jusqu'au début de la phase stationnaire ( 20 heures environ), au moment o l'on observe la densité optique maximale et la quantité maximale de CRM 197. Après la 24 ème heure de culture, on observe une diminution de 25 % de la production de CRM 197 après 30 heure S et après 45 heures,cette diminution est de 75 % La tendance de la courbe de production de CRM 197 est pratiquement la même pour les différents lysogènes, tandis Ä 5405 6 que la production est de: 20 Lf/ml pour les mono- lysogènes, 30 Lf/ml pour les bi-lysogènes tandem et 60 Lf/ml pour les bi-lysogènes non tandem. Exemple 2 On prepare par le _mme mode opératoire que celui indiqué à l'exemple l, les inoculats de C 7 (B 45)M 3, C 7 ( B 4-)Mll et C 7 (B 45)M. On inocule 0,1 ml de chaque culture dans des ballons de 125 ml contenant chacun 10 ml de milieu CY déferrisé, et complété avec 0,1 gg/ml de Fe+. On ret en incubation les ballons pendant 36 heures à une température de 35 C sur un agitateur tournant ( 240 tours par minute) On analyse les échantillons prélevés au bout de heures et de 30 heures après le début de la fermentation, par le même mode opératoire que celui de l'Exemple 1 pour déterminer la densité optique et la production de la protéine CRM 45 libérée dans le surnageant. Les résultats qui ont été obtenus sont résumés dans le tableau cidessous: TABLEAU-1 Souches Densité optique CRMP 45 gg/ml lysogènes 20 heures 30 heures 20 heures 30 heures C 7 (R 45)M 34,5 9,7 16 31,5 C 7 ( C 7 ($ 45)M 84,7 10 40 70 Les résultats rapportés ci-dessus montrent que la production maximale de CRM 45 est détectée après 30 heures de culture et est pratiquement la même pour les monolysogènes et pour les bi-lysogènes tandem, et est presque deux fois plus grande pour les bi-lysogènes non-tandem. EXEMPLE 3 On a préparé une préculture du lysogène C 7 ( 345)M 8 comme décrit à l'Exemple 1, et on a transféré 2 ml de cette préculture dans deux fioles d'Erlenmeyer de 2 000 ml contenant chacune 500 ml de milieu CY déferrisé, avec un supplément de 0,1 gg/ml de Fe++, et on a cultivé en agitant ( 240 tours par minute) à une température-de 35 C pendant 24 heures. On a inoculé 1 000 ml de la culture de lysogènes a 5405 16 résultante dans 40 i d'un milieu de culture CY ayant une concentration en ions Fe de 0,1 gg/ml, contenu dans un fermenteur ayant un volume de 50 1, et on a cultivé à une température de 370 C en aérant à un débit de 15 l/minute de bas en haut, en agitant à 600 tours/minute et en maintenant le p H du milieu de culture entre 6,5 et 7,5 à l'aide d'une solution de glucose à 20 %, ou bien à l'aide d'une solution de soude 4 N, pendant 40 heures La quantité de CRM 45, après 30 heures de fermentation, était de 200 Lf/ml On a centrifugé le bouillon de culture résultant dans une centrifugeuse à circulation continue et on a récupéré la protéine du surnageant en la faisant précipiter avec du sulfate d'ammonium complété à un degré de saturation de 75 %. On a centrifugé la bouillie ainsi obtenue et on a purifié le sédiment, par lavage avec un tampon de phosphate à p H 7,5, dans une colonne garnie d'une résine échangeuse d'ions (diméthylammoniuméthylcellulose). On a recueilli la protéine en éluant la colonne avec un gradient de chlorure de sodium, avec un rendement de % o 5405 'i 6 REVENDICATIONS 1 Procédé de production d'une protéine correspondant à la toxine diphtérique, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver, dans un milieu nutritif liquide contenant des ions fer à une concentration de 0,05 g/ml à 0,5 g/ml, à une température de 30 WC à 40 C, à p H neutre et dans des conditions aérobies, un micro-organisme appartenant au genre Corynebacterium diphtheriae, avec deux phages mutants qui codent pour la protéine correspondant à la toxine diphtérique et qui sont intégrés en mode non-tandem aux deux points de fixation du chromosome bactérien. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la protéine qui correspond à la toxine diphtérique est la protéine CRM 45. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le micro-organisme est la souche C 7 (R 45)M 8 ATCC- 39526 avec deux phages 45 mutants intégrés en mode non- tandem dans leurs chromosomes. 4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la protéine qui correspond à la toxine diphtérique est la protéine CRM 197. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le micro-organisme est la souche C 7 39255 avec deux phages mutants f 197 intégrés en mode non- tandem dans leurs chromosomes. 6 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise, pour isoler le micro-organisme, un milieu nutritif solide contenant un sérum antidiphtérique à une concentration de 4 à 12 unités/ml. 7 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration des ions fer dans le milieu nutritif liquide est de 0,1 gg/ml.