FR 2541686 A1 19840831 FR 8403052 A 19840228 La _résente inventioe aonoern la transfeatiou génétique de plantes dicaotl Wdee (en vus de provoquer une =roissanoe'bénîfique cuntrôlêe de leurs racines. Agrobacterium rhizogenes est l'organisme causal de ce qu'on a appelé la "maladie de la racine pileuse" dans un certain nombre d'espèces de plantes supérieures. A rhizogenes peut âtre isolé du sol, et est un espèce d'agrobactérie qui a les caractéristiques suivantes: aérobie, en forme de bâtonnet ( 0,8 x 1, 5-30 microns), 1 à 4 flagelles à cils péritriches, gram-négative, et ne formant pas de spores Les espèces communes sont A tumefaciens qui a une action tumorale; A rhizogenes, qui provoque la maladie de la racine pileuse, et A radiobacter, qui est non pathogène. La possibilité d'utiliser A rhizognes au bénéfice de l'homme a été mentionnée dans un article intitulé "Studies on Infectious Hairy Root of Nursery Apple Trees", Journal of Agricultural Research, vol 41, ne 7, pp 507-540, A J Riker et coll Les auteurs affirment en p 537 "Dans des expériences préliminaires, des boutures ou couches de certaines plantes traitées avec l'organisme à racine pileuse se sont enracinées plus rapidement et plus vigoureusement que celles qui n'ont pas été traitées. Ces résultats suggèrent la possiblité d'utiliser cet organisme pour stimuler la production de racines dans la propagation de certaines plantes Des travaux plus poussés sont nécessaires avant de pouvoir tirer des conclusions " En dépit de cette invitation, A rhizogenes n'a pas été activement dévelôppé au bénéfice de l'homme, et reste considéré comme un organisme pathogène indési- rable. On a maintenant trouvé que l'on peut provoquer effectivement la croissance bénéfique contrôlée de racines dans les plantes dicotylédones par transformation génétique avec A rhizogenes inducteur de racines, de préférence une nouvelle souche désignée par Agrobacterium rhizogenes ATCC 39207 La régulatkn existe en ce que A rhizogenes fonctionnel possède ou manifeste un potentiel indésirable pour contaminer le sol, et peut être effectivement régulé par l'utilisation d'Agrobacterium radiobacter, de préfé- rence A radiobacter K-84, utilisé conjointement avec ou après transformation génétique de la plante avec A rhizogenes Quel que soit l'A rhizogenes utilisé, une plante est transformée par contact du péricycle exposé de la plante avec A rhizogenes dans une suspen- sion aqueuse ou autre milieu, comme la tourbe,, de préfé- rence à une concentration efficace d'au moins environ 108 cellules par ml, pendant une durée permettant d'ef- fectuer la transformation On obtient des résultats uni- formes par une exposition d'au moins environ 20 h. L'exposition actuellement préférée pour la concentration mentionnée est d'au moins environ 24 h Il se produit une transformation irréversible Tout A rhizogenes restant alors à la surface de la plante est superflu pour le développement des racines On peut donc le réduire à des niveaux non infectieux par exposition à A radio- bacter Il suffit d'une simple immersion dans une suspension aqueuse o la concentration d'A radiobacter est d'environ 107 à environ 109 cellules/ml De façon commode, on a trouvé que la transformation peut s'effec- tuer en combinant A rhizogenes avec A radiobacter dans les mêmes solutions de traitement, dans un rapport cellulaire d'au moins environ 4 à 1, de préférence d'environ 4 à 1 à environ 8 à 1 d'A rhizogenes à A radiobacter Les solutions actuellement préférées contiennent environ 109 cellules d'A rhizogenes et environ 2,5 x 108 cellules de A radiobacter par ml. Là encore le contact dure au moins environ 20 h Avec un 41686 tel traitement, *A radiobacter rend l'excédent d'A. rhizpgenes inoffensif. Quoiqu'il en soit, tant A rhizogenes qu'A ' radio- bacter, seuls ou combinés résistent à la transformation e N pastilles par centrifugation et lyophilisation pour donner des cellules sèches et viables En outre ils peuvent être * et sont de préférence, portés par d'autres milieux comme la tourbe neutre à alcaline à utiliser directement par application à la zone réceptrice de la 1.0 plante pour la durée de prescription, ou d'o l'on extrait le ou les organismes aux fins d'utilisation en solution aqueuse. on a établi que A rhizogenes ATCC 39207 est plus efficace que sa source pour le développement des racines, ayant le pouvoir de doubler la croissance des racines dans le mime temps. Brève description des dessins La figure 1 est une photographie d'un cerisier North Star témoin prise 45 jours après la plantation, présentant le degré de développement des feuilles. La figure 2 est une photographie d'un cerisier North Star transformé prise 45 jours après la planta- tion, présentant l'accroissement du développement des feuilles. La figure 3 présente des rondelles de carotte découpées dans la même carotte 'A titre de référence, la rondelle 10 est un témoin non transformé Les rondelles 12 et 14 ont été transformées avec A rhizogenes TR 105. La rondelle 16 a été transformée avec A rhiz 2 genes ATCC 30207. Selon l'invention, il est fourni une nouvelle souche d'A rhizogenes, & savoir A rhizogenes ATCC 39207, qui a été isolé à partir d'A rhizogenes. TR 105, que l'on peut utiliser seule ou combinée avec d'autres A rhi zogenes inducteurs de racines aux fins de transformation génétique de plantes dicotylédones pour accroître le développement des racines, la régulation de l'A rhizogenes étant possible grâce à l'utilisation d'A radiobacter, de préférence A radiobacter K-84. Une plante génétiquement transformée avec A rhizogenes peut être ultérieurement traitée avec A radiobacter ou les deux combinés, pour obtenir une transformation Dans le processus, A radiobacter rend l'excès d'A rhizogenes inoffensif Si l'on combine les deux, on peut les combiner dans un rapport cellulaire d'environ 4 à 1 ou plus d'A rhizogenes à A radiobacter, de préférence d'environ 4 à 1 à environ 8 à 1, A radiobacter servant essentiellement à empacher A rhizogenes de contaminer le sol sans gêner la transfor- mation-des plantes La transformation d'une plante avec A rhizogenes nécessite dans tous les cas l'exposition au péricycle, car l'organisme est non-envahissant. L'exposition se fait pendant une durée suffisante pour qu'il y ait transformation génétique On préfère actuel- lement que l'exposition efficace à A rhizogenes trans- formant se fasse pendant au moins environ 20 h, de préférence au moins environ 24 ho La transformation nécessite généralement l'exposition de A rhizogenes à une blessure de la plante, soit créée au moyen d'une entaille (nouvelle ou non), soit simplement par le sectionnement de racines La concentration d'A rhizogenes dans un milieu traitant est normalement d'au moins environ 108 cellules/ml, de préférence d'au moins environ 109 cellules/ml Des concentrations plus faibles sont également utiles mais peuvent nécessiter une exposition plus longue pour que la transformation se produise. On peut la fournir sous la forme d'une solution aqueuse ou par l'intermédiaire d'un support, comme la tourbe, que l'on met en contact avec la surface réceptrice exposée de la plante, et à partir de quoi une transfor- mation se produit par diffusion cellulaire Dans l'autre solution, le ou les organisme(s) contenu(s) peut(peuvent) tre extrait(s) de la tourbe dans une solution aqueuse utilisée pour la transformation de la plante. Les avantages de l'utilisation d'A rhizogenes selon l'invention sont nombreux On peut l'employer tout d'abord pour favoriser un enracinement précoce de la population de racines nues, aboutissant à un plus grand développement des feuilles, tant en taille qu'en nombre; à un moindre rabougrissement des branches et des tiges; à un accroissement des possibilités de développement des fruits pendant la plantation de première saison; à une diminution de l'élagage de l'arbre avant la plantation; et, de façon significative, à un accroisse- ment du potentiel de survie de la plante à la sécheres- se On peut transmettre les mêmes avantages aux boutures de plantes, o les tiges coupées sont mises dans des bancs de nébulisation jusqu'à ce qu'une quantité suffisante de racines se développe Dans ce cas, on peut escompter un plus grand développement de racines par unité de temps par application de l'invention L'in- vention peut également être employée pour transplanter des plantes plus importantes, comme des arbres, dont il est bien connu qu'ils subissent un choc au cours du processus de transplantation On peut utiliser la trans- formation avec A rhizogenes par l'intermédiaire de racines sectionnées pour favoriser le développement rapide de nouvelles racines à l'endroit de la section, en permettant une absorption convenable d'humidité par l'arbre pour empêcher la chute des feuilles et la mort de l'arbre Au fond, le traitement peut tre utilisé pour accroître la vigueur de la plante. Enfin, les plantes souffrant d'une atteinte ou d'une maladie des racines peuvent également bénéficier du traitement avec A rhizogenes pour favoriser le développement rapide d'une nouvelle croissance racinaire pour compenser celles qui subissent une dégénérescence. En dépit des avantages potentiels de l'invention, A rhizogenes peut rester considéré comme un agent pathogène du sol Dans ce cas, son effet peut être élimi- né ou abaissé à des niveaux non infectants par l'utilisa- tion d'A radiobacter On préfère actuellement A radio- bacter K-84 A radiobacter K-84 est cultivé et vendu par Ag Bio Chem Inc,3 Fleetwood Court, Orinda, Californie 94563 On peut simplement plonger la plante transformée dans une solution aqueuse d'A radiobacter, de préférence présente à une concentration dépassant environ 107 cellules/ml, pendant simplement quelques secondes pour mettre fin efficacement à l'activité d'A rhizogenes. Plus commodément, on peut combiner les deux dans un milieu de transformation commun Lorsqu'ils sont présents dans un rapport cellulaire d'A rhizogenes a A radiobacter d'au moins environ 4 à 1, de préférence d'environ 4 à 1 à environ 8 à 1, la transformation peut s'effectuer sans laisser un résidu d'A rhizogenes actif sur la plante Dans ce cas, comme dans le cas de l'utilisation d'A rhizogenes seul, la transformation nécessite l'exposition d'une zone réceptrice de la plante à l'organisme transformant Cependant, il ne semble pas que A radiobacter gêne le processus de transformation. On a trouvé que la tourbe est un excellent hôte pour les organismes On a trouvé des organismes qui prospèrent dans la tourbe essentiellement neutre à alca- line (p H), qui sert de support commode et de milieu traitant efficace On peut également employer une lyophilisation Si l'on emploie la tourbe, on maintient A rhizogenes séparé d'A radiobacter et on combine les unités de tourbe qui les portent au moment de l'utilisation. Sans la limiter, les exemples suivants précisent l'invention En ce qui concerne les plantations au sol, les plantations, sauf indications contraires, sont faites pendant la saison normale de plantation au 45 e parallèle dans l Etat de Montana des Etats-Unis d' Amérique. Exemples 1 à 4 et témoins A à D On blesse aux racines des pruniers à racines nues ayant en moyenne de 122 à 152 cm de hauteur, puis on les traite avec A rhizogenes TR 105, fourni par le Dr Nester, du Département de Microbiologie et d'Immuno- logie de l'Université de l'Etat de Washington, Seattle, Washington 98195, en plongeant la zone blessée de la plante dans une solution contenant A rhizogenes à une concentration de suspension cellulaire d'environ 9 x 109 cellules par mm pendant 24 hr On plonge les racines témoins dans l'eau seule On conserve les pieds traités et témoins à 4,40 C jusqu'au moment de la plantation, puis on les plante dans un mélange 1:1 sol/vermiculite au champs On arrose les arbres tous les 3 jours pendant 9 jours, puis on compte sur la pluviometrie naturelle pour le développement des racines. Au bout d'une période deenviron 30 jours, on enlève doucement les plantes du sol et on les rince avec de l'eau On sépare les nouvelles racines des anciennes en les pinçant à l'aide de pinces à épiler, puis on sèche et on pèse Les résultats sont présentés au Tableau l. TABLEAU I Poids des nouvelles racines Exemple Plante transformée (g) Témoin g) 1 0,025 A 0,004 2 0,018 B 0,009 3 0,019 C 0,014 4 0,012 D 0,006 x 0,019 x 0,008 La différence significative est au niveau 0,1. Exemples 5 à 8 et témoins E à H On traite de la mime manière d'autres pruniers provenant de la mime source que ceux utilisés dans les exemples 1 à 4 et les témoins A à D, mais on mesure le développement des feuilles Les mesures sont prises res- pectivement à la fin du solstice d'été et environ 2 semaines plus tard Les résultats sont présentés au tableau II. TABLEAU II Développement des feuilles Exemple Taille des feuilles de plantes transformées (cm) 3,919 long. 2,725 larg. 6 4,183 long. 2,253 larg. 7 5,124 long. 4,001 larg. 8 4,501 long. 4,173 larg. Nb Taille de des feuilles Témoin feuilles (cm) E 2,028 long. 1,740 larg. F 1,920 long. 1,680 larg. 113 G 2,529 long. 2,109 larg. 158 H 2,348 long. 2,440 larg. Nb de feuilles Toutes les différences entre les traitements et les témoins sont significatives au niveau 0,01. Exemples 6 à il et témoins I à la nuit, et on conserve à froid et dans l'obscurité pen- dant 18 jours La plantation s'effectue t 8 t dans la saison de plantation Les plantes transformées fleuris- sent 5 jours après le bourgeonnement Les témoins pren- nent 10 jours de plus pour fleurir Environ 45 à 50 jours après la plantation, on observe des cerises sur les plantes transformées, et on fait un décompte des feuilles, des tiges et des cerises au solstice d'été. Avec des différences significatives au niveau 0,05, on observe' la comparaison des plantes transformées et des témoins, du nombre de feuilles, du nombre de cerises, du nombre de branches, du rabougrissement et de la longueur des feuilles,, comme il est mentionné au Tableau III La figure 1 est une photographie d'une plante témoin environ 45 jours après la plantation La figure 2 est une photographie d'une plante transformée qui a été exposée aux mêmes conditions de croissance que celles de la plante présentée dans la figure 1, sauf qu'en cas quant à l'utilisation d'A, rhizogenes pour favoriser la croissance des racines outre les différences apparen- tes, il y a également plus de formation de dards sur les racines, ce qui indique un plus fort développement des fleurs et des racines dans les années de croissance ultérieures TABLEAU III Nb de Nb de cerises feuilles mûries Exemple #9 Exemple #10 Exemple #11 Témoin I Témoin J Témoin K o O Nb de branches Lonqueur rabougries des feuilles (cm) 6/13 6,5 /14 6 1/07 6 /15 - /16 4,5 6/10 2,5 Dans une saison de croissance ultérieure, les plantes traitées donnent plusieurs fois la quantité de cerises que donnent les arbres non traités ou témoins. Exemple 12 et témoin L On obtient A rhizogenes ATCC 39207 & partir d'Agrobactertum rhizogenes TR 105 en triant des colonies uniques isolées de TR 105 sur des rondelles de racines de carottes jusqu'à ce qu'on observe une modification du degré de développement des racines On prépare une solution traitante d I Agrobacterium rhizogenes TR 105 à une concentration cellulaire de 2,1 x 10 cellules/ml, et une soh Ition de comparaison d'A rhizogenes ATCC 39207 à une concentration cellulaire de 4 x 10 cellules par mi On traite les rondelles de carotte à une con- centration de 0,1 ml par rondelle de carotte et on fait incuber pendant 3 semaines à la température ambiante. Les résultats du degré de formation des racines sont présentés au tableau IV et précisés dans la figure 3, dont la légende se trouve en page 3 de la présente description. Carotte # 1 A rhizocenes TR 105 4 16 8 6 Tatleau IV Carotte 62 Carotte z 3 Carotte c 4 0,,0054 010010 or O O I:_ 010011 Oi O O O 9 0 0030 00,17 OP 0043 O 00 i 5 0700-,6 0000277 010030 010001 -r-3 De O O 44 Oi 0030 Oe O O -* 6 OLO 0-9 6 O ú -O _V_ 1 x 010040 O,0026 A rh -zrcenes ATCC 39207 080024 -OSOOOZI) 00 0101 080003 0 $ 0036 010010 090113 070012 0,,0118 0#0063 010093 000018 0,FO 078 090004 010123 00,0034 Or O 127 0,0035 0 ú_O _" 6 0,0059 010082 0#0024 0,0000 Oi 0060 0,,O 037 0 ? 0020 Dj, O 00 3 01 00 17 Oe D O 3 4 09 0042 013 0, 004-7 Or O O 2 77 oi,0001 0000 'IL 5 OPOO 07 0,0035 0,0058 0#0019 oi, O O 1 1 0 t-( 0-5 1 0#0023 006 01 O O O 3 0 'r 00 1 6 ci O O l t 5 0, O O O 9 0, O O - P O# O 01, 1 ai 111 i 6 f-00-0 5 oi, () O O 9 01 O O O C. oi ti C 1 3 0 9 O O O ___ 0,10005 0 y O O 2 7 -Oeo 00 2 0.10031 0#0010 04-00-0 2 o.roolo Les données x pour la carotte Wldiffèrent de TR 105 à ATCC 39207 au niveau 0,05. Dans le travail ci-dessus, la densité cellulaire est d'environ 20 cellules par cm 2 de surface de rondelle de carotte. - Si une plante a la capacité d'Itre une excellente productrice de racines, A rhizogenes ATCC 39207 double au moins le poids à see des racines; autrement, on n'observe pas de différence A rhizogenes ATCC 39207 est déposé sous la forme d'une souche vivante à l'American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr, Rockville, Maryland 20852, et elle a initialement reçu de la demanderesse l'identification Agrobacterium rhizogenes MT 232. Exemple 13 et témoin M On utilise des boutures de tige d'avocat de -12 cm de longueur pour le témoin ( 80 plantes expéri- mentales) et pour la transformation ( 100 plantes expé- rimentales) Pour transformer les plantes, on plonge les boutures dans une suspension contenant A rhizog 2 enes TR 105 à une concentration de 10 cellules/ml pendant minutes Ceci assure une inoculation avec un nombre suffisant de cellules pour obtenir une transformation. On plante les boutures dans un mélange d'enracinement de 40 % en poids de perlite et 60 % en poids de tourbe. On dispose les boutures sur un banc de nébulisation à système de distribution réglé sur le nuage n 9, et toutes les 10 minutes on applique le brouillard pendant les heures de jour seulement (jours de 16 h) Deux mois après la plantation, on détermine que 5 des 80 plantes témoin sont vivantes et ont produit des feuilles et des racines, tandis que 61 des 100 plantes transformées sont vivantes et ont produit des feuilles et des racines. Exemple 14 et témoin N Ce qui suit vise à établir qu'A rhizogenes est efficace pour favoriser le développement des racines chez des plantes qui se propagent de manière végétative. On plonge des boutures de tige avec des feuilles de violettes dans une suspension de Ao rhizogenes à une concentration d'environ 109 cellules par ml, et on les dispose sur le banc de nébulisation jusqu'à ce qu'un enracinement se produise Dans ce cas, les plantes témoins 1 donnent une moyenne de 0,002 g de poids sec de développe- ment de racines par plante, tandis que les boutures trans- formées donnent une moyenne de 0,005 g de racines par plante sur la base du poids sec Ceci constitue une différence significative au niveau 0,1. Les observations sont faites deux semaines après dis- position sur le banc de nébulisation, et sont présentées au tableau V. Table au V: POIDS A SEC DES RACINES PRODUITES SUR DES BOUTURES DE TIGES DE VIOLEME N témoin Exenmple 14 O 0015 O 0043 0,0042 0,0038 0,0011 010040 0 o 0054 0,0063 0,0002 O,0030 0,0020 0,0028 0,0010 0,0036 0,0022 0,0034 0 o 0014 o,0103 0,0012 O O 0026 0,0012 0,0054 0,0004 0,0064 0,0025 0,0056 0,0023 00086 0,o 0028 0,0050 x= %,0020 x= O o 005 o - Exemple 15 et témoin O On transforme des boutures de mangue d'environ cm de longueur en plongeant les 7 cm inférieurs dans une suspension bactérienne contenant 7 x 105 cellu- S les d'A rhiz 2 genes par ml On utilise 40 boutures de mangue pour chaque test On dispose les boutures transformées et les témoins sur le banc de nébulisation et on les maintient à 21,1-26,7-C Dans le cas des témoins, 41,0 + 7,5 % des boutures donnent naissance à des plantes, tandis que les boutures traitées avec A rhizogenes donnent naissance à des plantes dans *79 + 7 % des cas. Exemple 16 On répète le procédé des exemples 6 à 11 avec des témoins pour des cerises North Star dans la période de végétation suivante Il donne des résultats analogues. Les arbres traités de l'exemple 16 donnent plusieurs fois la quantité de cerises produites par les témoins non traités, comme on le voit au tableau VI. Tableau VI Témoins Traités 113 28 61 0 161 Exemple 17 Pour cet exemple, les plants d'amande choisis sont des pieds à racines nues mesurant environ 1,0 cm de diamètre au-dessus du sol La longueur des tiges est d'environ 40 cm On plante les plants traités et non traités (témoin) du 13 au 17 mai, et on les arrose tous les 10 jours pendant 4 h à raison de 2 litres par heure, pour un total de 20 litres par plante On accroit l'arrosage de 10 % toua les mois L'engrais employé compor- te 6 % de N, 6 % de P, 6 % de K + des mieroéléments appli- qués à une concentration de 50 à 100 ppm dans chaque arrosage On n'emploie pas de pesticides. Deux à trois mois après la plantation, on mesure: le diamètre du tronc à 20 cm au-dessus du niveau du sol; le nombre de feuilles par plante, et la longueur des nouvelles branches (moyennes par groupes de 5). On utilise 20 à 25 arbres par détermination au tableau VII. Tableau VII Décompte des Diamètre des Nouvelle lon- feuilles troncs gueur des tiges uaités 1049 + 134 l,8 + 0,19 64 + 8,4 Témoins 622 + 134 1,4 + 0,17 41 + 8,1 Toutes les différences entre les arbres traités et les témoins sont significatives au niveau 0,001. Exemple 18 Un an et quatre mois après la plantation des pruniers, comme il est dit dans les exemples 1 à 8, on s'efforce de recueillir A rhizogenes à partir de la rhizosphère et du rhizoplan des pruniers auxquels on a inoculé A rhizogenes au moment de la plantation On prélève des échantillons de sol dans la zone racinaire de chaque arbre et on les dépose en plaques sur un milieu sélectif pour les Agrobacterium Au bout de 2 jours à 27 C, on applique aux rondelles de carottes 8 zones différentes de chacune des plaques présentant une croissance bactérienne Ainsi le sol provenant de chaque arbre possède 16 échantillons ( 8 rhizosphères et 8 rhizoplans) Au bout de 2 semaines on vérifie l'enracinement des rondelles. Le sol provenant de 4 arbres non traitée (témoins), lorsqu'on le dispose sur le milieu sélectif, donne des organismes capables de produire le syndrôme d'enracine- ment sur des rondelles de carottes On effectue au total 72 tests: 36 tests de la rizosphère et 36 tests du rhizoplan Chez les arbres inoculés, 3 sur 5 donnent une indication d'Ao rhizogenes Dans un cas, 3 rondelles sur 8 de la rhizosphère d'un arbre sont positives tandis que le sol du rhizoplan est négatif Chez l'autre arbre, 6 sur 8 rondelles de carottes sont positives à partir de la rhizosphère, et 3 sur 8 sont positives à partir du rhizoplan Dans un autre cas, 1 échantillon de rhizoplan sur 8 est positif. Ainsi, bien que l'on puisse recueillir A rhizogenes à partir de la zone racinaire de plantes antérieurement inoculées, il semble relativement confiné au sol de la rhizosphère (celui qui est attaché à la surface de la racine) Etant donné la difficulté de la tâche, le nombre de cellules bactériennes infectieuses par g de sol n'est pas déterminé. On effectue un procédé pour déterminer s'il y a suffisamment d'A rhizogenes-présent dans la zone des racines pour infecter une plante hôte charnue et munie des racines (carotte) avec A rhizogenes A la fin du mois de mai, on sème des graines de carotte à -100 cm de la principale tige des arbres traités comme des arbres témoins Au début de septembre, on enlève les carottes avec soin du sol et on les rince dans l'eau. Les résultatas sont présentés au tableau VIII. Tableau VIII Traités Témoins Sans racines Avec racines Sans racines Avec racines pileuses pileuses ileuses pileuses 96 O 63 O 73 O 40 O 27 O 22 O 53 O 57 O O Les résultats suggèrent qu'A rhizogenes, ayant été inoculé sur les racines de pruniers à une saison, est présent dans et autour des racines de certains arbres dans la seconde saison, mais pas en quantité suffisante pour infecter les racines d'une plante normalement sensible, charnue et munie de racines, à savoir la carotte. Exemple 19 et témoin P On utilise A rhizogenes ATCC 39207 dans un mélange 4-1 (poids-poids) avec A radiobacter, dans une bouillie aqueuse de 1 g du mélange pour 10 ml d'eau, pour donner des racines à des plants de poivrier (Yolo Wonder). On lave les systèmes de racines de plantes et on les dispose dans la bouillie de transformation pendant une période d'l h avant la plantation aux champs Le tableau IX montre les observations faites pour 5 plantes, 46 jours après la plantation. Un rendement élevé précoce de poivriers de plus de 5 cm de longueur donne l'avantage économique d'arriver tôt sur le marché. 2 541686 T'ableau IX Teémoins NI de vol des parcelle racines (m 1) 1) _ _ _ _ 'Ibtaux pour plantes: Moyenne par plante: 33,00 52,00 42,00 39,30 166,30 Diamètre des tigre (mmn) 2) ,0 56,0 49,0 49,0 Nb total de poi-. vriers 3 > Nb de poids poivriers total de + de des poi- cm de vriers Apg (g) O 29,0 4 125,0 2 91,0 i 18,5 7 263,5 Z 97 Traités N' de Vol des 1 parcelle racines (ml)> Diamètre Nb total Nb de des tiges de poi poivriers (umm) 2 > vriers de + de 3) 5 cmde Poids total des poi- vriers (g) Ibtaux pour plantes: Moyenne par plante: ,0 52,0 42,0 62,0 206,0- 56,0 46,0 63,0 218,0 8 26600 9 379,0 2 121,0 2 87,0 21 853,0 = 103 1) obtenu par le déplacement du sytème de racines lavé. 2) Nemze prise -juste au-dessus du premier anneau élevé au dessus du système racinaie 3) 1 Mus les poivriers Sont recueillis à partit de plants sacri- fiés pouw lexamen du cdéveloppumet des racines. Avec un total de 10 plants par parcelle, les observations reportées au tableau X sont faites après un nombre de jours suivant la plantationindiqué au tableau X Au moment de la récolte finale, les plants témoins, en rendement pondéral, ont rattrapé les plants transformés. Tableau X ( lo plante par parcelle> Témoins Jours de récolte: Parcelle 531 > Poids 0.933 0,621 0,621 0,544 2 1,046 3 0,679 6 0,766 7 0,362 1221 > Nb de pomivrersq Traités il Poids (kg>) 1,105 1,359 2,265 1,219 1,359 1, 871 1,046 1,785 1322 > Nb de poivriers poids (kg-) 16 0,906 21 0 $ 1965 0,453 0,480 17 0,707 18 0,707 12 0,566 19 1,132 Totaux- Témoins Poids Parcelle (kg> 1 2,944 4 3,397 3,339 8 2,242 l tal général 11,923 Nb de poimzerier Traités Poids Parcelle (kg>) -Total général 3,* 112 3,257 2,378 3,280 12,027 1 > On ne recueille que les poivriers de de longueur au moins>. taille vendable ( 63,5 mmn 2) 1 Tzs les poivriers sont récoltés en supposant un gel destructeur au 13-14/10/83. Nb de poivriers Nb de poivri-ersq Exemple 20 Des expériences faisant intervenir des roses à thé, des choux, du tabac à fumer et des chrysanthèmes, donnent des résultats non concluants Cependant, les lilas sont sensibles, avec des résultats présentés au tableau XI (significatifs à 0,14). Tableau XI Témoins Traités (nb total de feuilles) (nb total de feuilles) 39 151 124 109 99 170 Totaux 262 430 Exemple 21 On détermine la longévité d'A rhizogenes ATCC 39207, préparé dans la tourbe et conservé à 23 + 3 C Le tableau XII donne le nombre de cellules vivantes par g de tourbe, en fonction du temps. Tableau XII A la 1 mois 3 mois 10 mois préparation plus tard plus tard plus tard 3,1 x108 2,7 x 109 l,l x 109 2,0 x 107 Exemple 22 On transforme quelques plants d'oliviers d'une variété à racines nues, de 30 cm de hauteur de tige et de 0,60 cm de diamètre à 5,0 cm au-dessus du niveau du sol, en utilisant A rhizogenes ATCC 39207 D'autres plants servent de témoins On les plante tous dans le désert au mois de juin, et on les arrose et on leur donne selon l'exemple 17 6 mois après la plantation, on prend les mesures montrées au Tableau XIII. Ttbleau XIII Diamètre des tiges (en cm) i, 64 2,00 1,55 1.70 Traités 2,05 2,001 2 20 1,35 Longueur des quatre plus longues branches latérales (en cm I) ,50,70,40 ,48,67,68 62,50,42,45 ,55,75,81 ,25,30,35 ,60,55,45 ,60,40,45 ,75,68,72 ,58,78,72 ,80,78,94 ,110,90,88 ,80,82,'90 ,90,100,95 ,80,72,85 ,78,86,100 ,95,718,80 ,110,120,100 ,100,90,80 ,80,70,70 110,90,80 ,100,QO 0,80 1 Tnoins 0,91 1,257 1,405 1,35 1,30 i 42 -26 REVENDICATIONS 1 Agrobacterium rhizogenes ATCC 39207. 2 Composition pour la transformation génétique de plan- tes dicotylédones pour la croissance bénéfique de racines comprenant: (a) A rhizogenes inducteur de racines fourni en une concentration suffisante pour donner une suspen- sion aqueuse de cellules à une concentration suffisante pour transformer génétiquement une plante dicotylédone pour favoriser la croissance des racines; et (b) A radiobacter en une quantité suffisante pour rendre A rhizogenes pratiquement non infectant. 3 Composition selon la revendication 2 o A rhizogenes et A radiobacter sont contenus sous forme d'unités séparées, au moins une étant présente dans la tourbe. 4 Composition selon l'une des revendications 2 ou 3 o A rhizogenes inducteur de racines est présent en une concentration suffisante pour en donner une suspen- sion aqueuse de cellules, d'au moins environ 107 cellules/ ml, et A radiobacter est présent en une concentration en cellules/ml telle que le rapport cellulaire d'A. rhizogenes à A radiobacter est d'au moins environ 4 à 1. Composition selon l'une quelconque des revendica- tions 2 à 4 o le rapport cellulaire d'A rhizogenes à A radiobacter est d'environ 4 à 1 à environ 8 à 1. 6 Composition selon l'une quelconque des revendications 2 à 5 o A rhizogenes comprend A rhizogenes TR 105 et o A radiobacter comprend A radiobacter K 84. 7 Composition selon l'une quelconque des revendica- tions 2 à 5 o A rhizene comprend A rhizogenes ATCC 39207. 8 Composition selon la revendication 7 o A radiobacter comprend A radiobacter K 84. 9 Procédé pour transformer génétiquement des plantes dicotylédones dans lequel on met en contact des racines de la plante dicotylédone ayant un péricycle exposé à l'action de transformation d'A rhizogenes inducteur de racines pendant une durée suffisante pour transformer la plante dicotylédone de manière à favoriser la crois- sance des racines, et on met en contact la plante avec A radiobacter pendant une durée suffisante pour rendre A rhizogenes pratiquement non infectant. 1 S 10 Procédé pour transformer génétiquement des plantes dicotylédones dans lequel on met en contact des racines de la plante dicotylédone ayant un péricycle exposé à l'action d'A rhizogenes dans un milieu o A rhizogenes inducteur de racines est présent en une concentration équivalant-à une suspension aqueuse d'au moins 108 cellules/ml pendant au moins environ 20 h et suffisante pour transformer génétiquement la plante di- cotylédone et favoriser la croissance des racines, puis on met en contact la plante avec A radiobacter dans un milieu o A radiobacter est présent à une concentration équivalant à une suspension d'environ 107 cellules/ml pendant une durée suffisante pour rendre A rhizogenes pratiquement non infectant. 11 Procédé selon la revendication 10 o le contact avec A rhizogenes se fait pendant au moins environ 24 h. 12 Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11 o A rhizogenes comprend A rhizogenes TR 105 ou A rhizogenes ATCC 39207. 13 Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 12 o A radiobacter comprend A radiobacter K-84. 14 Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 13 o le milieu est aqueux et A rhizogenes et A radiobacter sont contenus dans une suspension aqueuse et o le rapport cellulaire d'A rhizogenes à A radio- bacter est d'environ 4:1 à environ 8:1. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 14 o A rhizogenes et A radiobacter sont fournis sous forme d'unités séparées, dont au moins une est fournie dans la tourbe.