FR 2544330 A1 19841019 FR 8405948 A 19840413 D 544330 La présente invention concerne un procédé pour purifier de la matière biologique produite par des cellules. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé pour extraire des substances produites par les cellules, mais non excrétées par celles-ci, et pour récupérer ces substances débarrassées de nombreuses impuretés inopportunes à poids moléculaire élevé. Des progrès en biologie cellulaire ont montré que la concentration d'un certain nombre de substances biologiques actives est sensiblement supérieureà l'intérieur de la cellu- le que dans le ou les milieux environnants Par suite de leur poids moléculaire, de leur charge ou pour d'autres raisons, ces substances ne traversent pas facilement la membrane cellu- laire ou ne sont tout simplement pas excrétées, par un proces- sus de sécrétion complète, par la cellule Tout procédé de récupération de ces produits exige la rupture ou la lyse de la membrane cellulaire Lors d'une lyse des cellules, les milieux sont contaminés par des fragments de cellules et par des impuretés inopportunes à poids moléculaire élevé Puisque la concentration de la substance non excrétée est relativement faible en comparaison de la concentration totale des consti- tuants cellulaires, une extraction ou récupération de la substance intéressante peut s'avérer difficile L'expression "substance non excrétée" telle qu'elle sert ici, signifie une substance qui est produite en de fortes quantités récupérables à l'intérieur de la cellule mais qui n'est pas excrétée du tout ou ne l'est que partiellement. Un problème associé est la libération par les cellules, au cours de la lyse de celles-ci, de matières pyro- gènes qui sont des substances provoquant de la fièvre De nombreuses bactéries protocaryotes ou procaryotes, en particu- lier les entérobactéries à Grain négatif, produisent des endotoxines qui sont pyrogènes Puisque ces bactéries à Gram -négatif, par exemple E coli, un bacillus et pseudomonas, sont les bactéries fondamentales servant dans la technologie de recombinaison de l'acide désoxyribonucléique (ADN), les endotoxines pyrogènes produites par ces bactéries soulèvent un problème grave Ces substances pyrogènes sont principale- ment des lypopolysaccharides ayant des poids moléculaires supérieurs à 5 x 104 daltons Un certain nombre d'enzymeb et d'autres substances intéressantes non excrétées ont des poids moléculaires inférieurs à ceux des matières pyrogènes et 9 donc, un procédé de filtration moléculaire retenant les impuretés libérées lors d'une lyse des cellules faciliterait la purification et la récupération. Le brevet US-A-4 409 33 i décrit un procédé pour obtenir des substances produites par des cellules Plus par- ticulièrement, le brevet cité révèle que des substances à bas poids moléculaire, secrétées par des cellules, peuvent diffuser à travers la membrane semi-perméable de la micro- capsule et peuvent être collectées dans le milieu extracapsu- laire avec une contamination minimale, et que les substances a poids moléculaire supérieur produites ou secrétées par les cellules peuvent être emprisonnées au sein des microcapsules et peuvent être collectées lorsqu'on rompt la membrane capsu- laire sans provoquer la lyse des cellules. Les objets de la présente invention sont notamment de proposer et/ou fournir: un procédé pour récupérer des substances non excrétées et que l'on obtient sensiblement sans impuretés; un procédé pour extrairegde microorganismes producteurs de pyrogêneszdes substances non excrétées par ces microorganismes et que l'on recueille sensiblement sans pyrogènes; un procédé pour lyser les membranes de cellules encapsulées sans rompre la membrane de la microcapsule qui les entoure; et un procédé pour extraire et récupérer, à partir de bactéries génétiquement modifiées, des substances à bas poids moléculaire que ces bactéries ont sécrétées mais n'ont pas excrétées. Ces objets, buts et caractéristiques de l'invention ressortiront de la description plus détaillée suivante, faite à titre illustratif et nullement limitatif en regard des dessins annexés sur lesquels la figure 1 montre une courbe de croissance d'une bactérie génétiquement modifiée, contenant des pyrogènes et qui produit l'enzyme pénicillinase (ou pénase) Le graphique (ordonnées: coefficient d'absorption, ou absorptance, à 550 nm;abscisses: temps en heures) illustre le fait que l'encapsulation des bactéries (o) ne nuit pas à la vitesse - de croissance en comparaison d'une culture classique réalisée en suspension (a); la figure 2 est un graphique (ordonnées: unités de pénicillinase par millilitre; abscisses: temps en heures) illustrant le fait que la production intracellulaire de la substance intéressante est sensiblement identique que la croissance des cellules se soit effectuée dans une culture classique en suspension (e) ou sous forme d'une culture encapsulée (o) la figure 3 est un graphique 'ordonnées: unités de pénicillinase par millilitre;abscisses: temps en heures) montrant la cinétique de libération de la pénicillinase à travers la membrane semiperméable des capsules après la lyse de la membrane des cellules (e: concentration à l'intérieur des capsules; o: concentration à l'extérieur des capsules); la figure 4 est un graphique (ordonnées: logarithme de l'activité des endotoxines, en ng/ml;abscissesi temps en heures) montrant la concentration des matières pyrogènes ou endotoxines dans le fluide extracapsulaire (o), le fluide intracapsulaire (o) et dans un milieu de culture classique en suspension (A) après la lyse des cellules; et la figure 5 montre une courbe de croissance (ordon- nées: nombre de cellules par millilitre;abscisses temps en jours) d'une culture de cellules eucaryotes Le graphique illustre le fait que la technique d'encapsulation (o, ligne pleine) rie nuit pas à la vitesse de croissance, en comparaison d'une culture classique réalisée en suspension (I,ligne brisée) Pour résumer l'invention, on peut indiquer que celle- ci propose et/ou fournit un procédé de récupération de substan- ces produites par les cellules, mais que celles-ci n'ont pas excrété, et que l'on obtient sous forme d'un produit brut ayant une concentration réduite en des impuretés à poids moléculaire élevé et présentant une plus grande activitt spécifique L'invention est particulièrement utile pour récu- pérer des substances à bas poids moléculaire, produites par des bactéries, naturelles ou génétiquement modifiées, mais qui produisent en même temps des matières pyrogènes et n'ont pas excrété les substances intéressantes Le procédé de l'invention comprend les étapes consistant à encapsuler une 0 cellule au moins au sein d'une membrane ayant des propriétés de perméabilité permettant un passage rapide de la substance intéressante à bas poids moléculaire tout en retardant ou empêchant le passage des impuretés inopportunes à poids molé- culaire plus élevé On met la cellule encapsulée en suspension dans un milieu aqueux de culture et on laisse se poursuivre le métabolisme, la croissance des cellules et la mitose à l'intérieur de la membrane capsulaire Il se forme une colonie de cellules qui se multiplient jusqu'à emplir sensiblement le volume de la capsule mais sans rompre la membrane des microcapsules On lyse ensuite la membrane des cellules sans rompre la membrane capsulaire, et la substance intéressante diffuse à travers la membrane capsulaire pour pénétrer dans le fluide extracapsulaire entourant ces capsules, et dans lequel la substance intéressante est récoltée sous forme de produit brut Le moyen préféré pour lyser la membrane cellu- laire consiste à mettre les capsules en suspension dans un détergent qui ne rompt pas la membrane capsulaire. Les cellules procaryotes, naturelles ou génétiquement modifiées, constituent les cellules que l'on préfère utiliser dans le procédé,car ce procédé est particulièrement utile pour récupérer des substances produites par des cellules capables aussi de produire des matières pyrogènes La majorité des matières pyrogènes à poids moléculaire élevé, comme des endo- toxines, reste au sein de la capsulecependant que les substances à plus bas poids moléculaire diffusent rapidement à travers les pores de la membrane capsulaire Les pores de la membrane comprennent ou constituent des trajets tortueux Dermettant aux substances intéressantes 9 à bas poids molé- culaire, de traverser la membrane tout en retenant les impu- retés inopportunes à poids moléculaire élevé. On peut indiquer que, dans son aspect le plus large, l'invention concerne un procédé pour extraire et récupérer des substances produites par les cellules, mais -non excrétées par celles-ci, et que l'on obtient à un état partiellement purifié en retenant à l'intérieur d'une membrane semi- perméable les impuretés à poids moléculaire élevé, ce qui comprend des fragments de cellules, des acides nucléiques, des polysaccharides, des lipides et des protéines, tout en laissant diffuser à travers la membrane les substances à poids moléculaire relativement bas que les cellules ont secrêtées mais n'ont pas excrétées. Le procédé est applicable à n'importe quelle cellule ou à n'importe quel système ou ensemble de cellules qui produit une substance intéressante ayant un poids molécu- faire inférieur au poids moléculaire des impuretés poten- tielles Le procédé convient particulièrement bien pour la culture de cellules procaryotes, naturelles ou génétiquement modifiées, comme source de la substance secrétée mais non excrétée Les exigences nutritives des cellules procaryotes sont principalement constituées par des molécules à bas poids moléculaire traversant facilement une membrane semi-perméable, ce qui facilite la croissance des cellules et leur mitose, conduisant à une plus grande production de la substance inté- ressante Les cellules des colonies se reproduisent jusqu'à emplir sensiblement les capsules mais sans rompre la membrane capsulaire. Comme antérieurement noté, la plupart des techniques de recombinaison de ADN (acide désoxyribonucléique) utilisent comme organismes hôtes, des entérobactéries à Gram nég-atîf,. Beaucoup de ces bactéries produisent des endotoxines pyro- gènes qui sont libérées lors d'une lyse des cellules Pour obtenir sous'une forme utilisable une substance intéressante produite par ces-cultures pyrogènes, il faut normalement éli- miner les matières pyrogènes La quasi-totalité des matières pyrogènes ont un poids moléculaire supérieur à 5 x 104 dal- tons Donc, une membrane semi-perméable ayant des propriétés de perméabilité permettant le passage ou transport d(i: u- ies à une vitesse qui est en fonction inverse de leur poids moléculaire, ou qui empêche le passage d'impuretés à poids moléculaire élevé, peut nettement favoriser la purification de produits à plus bas poids moléculaire. Un autre aspect positif de l'invention consiste en la facilité de maintenir la stérilité des cultures et donc de diminuer la possibilité d'une contamination de la culture du ou des produits Puisque la quantité de la ou des substan- ces produites par les cellules est très faible, toute contami- nation éventuelle de la culture constitue un problème d'impor- tance majeure Une encapsulation assure une barrière physique empêchant une contamination. Le procédé est applicable à des subtances très diver- ses produites, élaborées ou secrétées par des cellules, notam- ment des matières à poids moléculaire relativement faible Des exemples de matières pyrogènes pouvant être éliminées par ce mode opératoire comprennent des endotoxines comme les lipo- protéines produites par Eo coli Une limitation de l'effica- cité du procédé consiste en ce que la substance intéressante doit posséder un poids moléculaire inférieur à la matière pyrogène ou à d'autres impuretés que l'on cherche à exclure. Le procédé de l'invention dépend en partie de la possibilité d'encapsuler des cellules dans une membrane semi- perméable sans nuire à leur viabilité ultérieure Une techni- que convenable d'encapsulation est décrite ci-après en détail. Encapsulation des cellules La technique suivante de microencapsulation sert avec succès à produire des cultures de cellules viableso La pour- suite de la viabilité de la culture de cellules exige que des quantités suffisantes de matières nutritives et d'oxygène traversent la membrane d'encapsulation La membrane des micro- capsules exclut aussi de la culture les bactéries risquant de contaminer celles-ci Les membranes des capsules doivent être formées dans des conditions de p H ne nuisant pas à la viabilité des cellules La dimension des microcapsules peut largement varier, mais l'on obtient les meilleurs résultats avec des cellules ayant de 100 à 1000 pm. Pour encapsuler les cellules, une substance hydroso- lubie, physiologiquement compatible avec les cellules et que l'on peut rendre insoluble dans l'eau forme, autour de cellu- les individuelles ou d'un groupe de cellules, une masse cohé- rente ou "matrice temporaire" conservant sa forme On peut ensuite traiter cette "matrice temporaire" pour déposer autour de la ou des cellules une membrane semi-perméable plus perma- nente tout en garantissant la viabilité de la ou des cellules. On ajoute la substance hydrosoluble, typiquement en une quan- tité de l'ordre de 0,5 à 2 %, à une suspension des cellules dans une solution saline physiologique et l'on donne au mélange résultant la forme de gouttelettes On rend les gout- telettes insolubles dans l'eau et on les gélifie pour former la matrice temporaire Cette matrice temporaire est munie d'une membrane de capsule plus permanente et, de préférence, on liquéfie à nouveau l'intérieur de la capsule en établissant les conditions dans lesquelles la substance hydrosoluble était liquide L'étape de liquéfaction à nouveau permet le transport en masse ou la traversée des manière nutritives ainsi que la croissance des cellules. La matière servant à former la matrice temporaire peut être n'importe quelle matière hydrosoluble non toxique qui, sous l'effet d'une variation de l'environnement ou de la concentration ionique, peut être transformée en une masse conservant sa forme La matière doit aussi contenir plusieurs fragments anioniques faciles à ioniser, par exemple des groupes carboxyles, pouvant réagir par formation de sel(s) avec des polymères contenant plusieurs groupes cationiques Comme on l'expliquera ci-après, l'utilisation de ce type de matières permet de déposer une membrane de capsule permanente, ayant une limite supérieure de perméabilité choisie, sans difficulté en des couches superficielles de la matrice temporaire. Les matières que l'on préfère actuellement pour for- mer la matrice temporaire sont des polymères ou gommes du type polysaccharides naturels ou synthétiques, hydrosolubles et acides De telles matières sont disponibles à l'échelle commerciale On les extrait typiquement d'une matière -ve'r 1 p et on les utilise souvent à titre d'additifs pour divers aliments L'alginate de sodium est la gomme hydrosoluble actuellement préférée -On peut utiliser un alginate dont le poids moléculaire est de l'ordre de plus de 150 000 daltons, mais, en raison de ses dimensions moléculaires et de sa vis- cosité, il ne pourra habituellement pas traverser par perméa- tion les membranes de capsules finalement formées De l'algi- nate à plus faible poids moléculaire, compris par exemple entre 50 000 et moins de 80 000 daltons, peut être plus faci- lement enlevé du volume intracapsulaire par diffusion à travers une membrane de porosité suffisante, et est donc préféré D'autres polymères utilisables comprennent des frac- tions acides de gomme guar, de caragliénine, de pectirie, de gomme adragante ou de gomme de xanthane. Ces matières comprennent des chaînes de saccharides liées par des glycosides Leurs groupes acides libres sont, en fait,souvent présents sous forme reliée à un ion de métal alcalin, par exemple sous forme sodique Si un ion multivalent, comme du calcium ou de l'aluminium, est introduit pour rempla- cer l'ion de métal alcalin, les molécules de polysaccharides hydrosolubles sont "réticulées" pour former un gel insoluble dans l'eau, qui conserve sa forme et peut être solubilisé à nouveau lorsqu'on enlève les ions multivalents par échange d'ions ou à l'aide d'un agent de séquestration Si l'on peut utiliser essentiellement n'importe quel ion multivalent pou- vant former un sel avec la gomme acide, on préfère utiliser des ions physiologiquement compatibles, par exemple du calcium. Cela tend à garder le tissu à l'état vivant On peut utiliser d'autres cations multivalents mais il s'est avéré que les ions magnésium ne sont pas capables de gélifier l'alginate de sodium. Un protocole ou mode opératoire typique pour former les microcapsules consiste à mettre tout d'abord les cellules en suspension dans une solution à 0,5 à 2,5 % (en poids/volume) du polymère choisi dans une solution saline physiologique. Dans le cas de l'alginate de sodium, on peut utiliser avec succès une solution en comportant 0,6 à 2,4 % en poids/vollumie. On donne ensuite à la solution du polymère contenant les cellules la forme de gouttelettes de dimensions souhaitées et l'on gélifie immédiatement les gouttelettes pour former des masses pouvant conserver leur forme, et ayant de préfé- rence, mais non nécessairement, une forme sphérique ou sphé- roldale On peut réaliser par des procédés connus, comme par exemple, le mode opératoire suivant, la formation des gouttes. A un tube contenant une solution aqueuse de cations multivalents, par exemple une solution contenant 1,5 % en poids/volume de Ca C 12, on fixe un bouchon maintenant un appa- reil de formation de gouttes L'appareil consiste en une enve- loppe comportant une buse supérieure d'admission d'air et un corps creux allongé introduit avec frottement dans le bouchon. Une seringue de 10 cm 3, équipée d'une pompe pas à pas, est montée au sommet de l'enveloppe cependant qu'une aiguille, par exemple une aiguille de 0,25 mm de diamètre intérieur et revêtue de "Teflon" traverse l'enveloppe sur toute la longueur de celle-ci L'intérieur de l'enveloppe est conçu pour que l'extrémité de l'aiguille soit soumise à un écoulement lami- naire constant d'air jouant le rôle d' une lame d'air En fonctionnement, la seringue étant pleine d'une solution conte- nant la matière à encapsuler, on fait fonctionner la pompe pas à pas de façon à refouler progressivement des gouttelettes de solution de l'extrémité de l'aiguille Chaque goutte est "découpée" par le courant d'air et tombe d'environ 2,5 cm dans la solution de Ca C 12 dans laquelle elle se gélifie immédia- tement par absorption des ions calcium La distance entre l'extrémité de l'aiguille et la surface de la solution de Ca Cl est assez grande, dans ce cas, pour permettre à la sus- pension de cellules dans de l'alginate de sodium de prendre la forme physiquement la plus favorable: celle d'une sphère (volume maximal pour le minimum de surface) L'air contenu dans le tube s'échappe par un orifice percé dans le bouchon. Ce mode opératoire aboutit à une "réticulation" du gel et à la formation d'une matrice temporaire protectrice à grande viscosité, conservant sa forme et contenant le tissu en sus- pension et son milieu Les matrices se rassemblent dans 1 solution en formant une phase séparée, que l'on peut séparer par aspiration. Dans l'étape suivante, on provoque le dépôt d'une membrane semi-perméable autour de la surface de la matrice temporaire en "réticulant" des couches superficielles On peut y parvenir en soumettant la matrice temporaire gélifiée à l'action d'une solution aqueuse d'un polymère contenant des groupes cationiques pouvant réagir avec les fonctions anioni- ques présentes dans les molécules du gel On préfère des poly- mères contenant des groupes pouvant réagir avec les acides, comme les groupes imines ou amines libres Dans ce cas, la gomme de polysaccharides est réticulée par interaction (forma- tion de liaisons salines) entre les groupes carboxyles et les groupes imines ou amines On peut régler entre certaines limi- tes la perméabilité en choisissant le poids moléculaire du polymère utilisé pour la réticulation et en régulant la con- centration de la solution du polymère ainsi que la durée d'exposition Une solution d'un polymère ayant un bas poids moléculaire pénétrera, en un temps donné, plus profondément dans les capsules temporaires qu'un polymère à poids molécu- laire élevé Il existe des corrélations entre le degré de pénétration de l'agent de réticulation et la perméabilité obtenue En général, plus le poids moléculaire est élevé et moins la pénétration est grande, et plus grande est la dimen- sion des pores En gros, on peut utiliser des polymères dont le poids moléculaire se situe entre 3 000 et 100 000 daltons ou davantage, selon la durée de la réaction, la concentration de la solution du polymère et le degré de perméabilité sou- haité Lorsqu'on utilise de la polylysine ayant un poids moléculaire moyen d'environ 35 000 daltons, un groupe de con- ditions réactionnelles ayant servi avec succès implique une réaction durant 2 minutes, avec agitation, d'une solution saline physiologique contenant 0,0167 % de polylysine Cela donne une membrane de capsule ayant une limite supérieure de perméabilité d'environ 100 000 daltons En tenant compte des règles ci-dessus de guidage, on peut facilement déterminer expérimentalement des conditions optimales de réaction conve- nant pour régler la perméabilité d'un système donné En utili- sant ce procédé, on peut régler à un niveau choisi la limite supérieure de perméabilité des membranes. Des exemples de polymères convenant pour la réticu- lation comprennent des protéines et polypeptides, naturels ou synthétiques, ayant des groupes amino ou imino libres, des polyéthylène amines, des polyéthylène imines, et des polyvinyl amines On a utilisé avec succès de la polylysine, sous forme D aussi bien que sous forme L On peut aussi utiliser des protéines comme de la polyarginine, de la polycitrulline ou de la polyornithine Des polymères se situant dans la gamme supérieure de la densité des charges positives, par exemple de la polyvinyl amine, adhèrent vigoureusement aux groupes anioniques des molécules de gel en formant des molécules stables, et les membranes des capsules sont alors plus diffi- ciles à rompre. On peut utiliser, pour maîtriser encore davantage la dimension des pores, un revêtement supplémentaire par un polymère cationique Ce revêtement supplémentaire peut être constitué par le même polymère que celui ayant servi à former la matrice temporaire ou par n'importe lequel des polymères décrits ci-dessus, et, par exemple, on peut utiliser un revê- tement de polyvinyl amine sur des microcapsules alginate de sodium/poly-llysine. Un traitement par une solution diluée de gel va fixer les groupes amino libres sur les surfaces des capsules et qui, sinon, risqueraient de conférer aux capsules une tendance à s'agglomérer. A ce point de l'encapsulation, les capsules collec- tées comprennent une membrane semi-perméable entourant une solution gélifiée du polymère, un milieu de culture compatible avec le type des cellules, et au moins une cellule Puisqu'il convient de promouvoir un transfert de masse au sein de la capsule et à travers la membrane de la capsule, on préfère liquéfier à nouveau le gel et le faire passer à nouveau à sa forme hydrosoluble On peut y parvenir en rétablissant les conditions dans lesquelles le gel est un liquide, par exenple en enlevant les cations calcium ou autres cations multifonc- tionnels du gel intérieur On peut resolubiliser le milieu présent dans la capsule tout simplement en immergeant la capsule dans une solution tamponnée par des phosphates et qui contient des ions de métal alcalins et des ions hydrogène. Les ions monovalents remplacent les ions calcium ou d'autres ions multifonctionnels au sein du gel lorsque la capsule est immergée, avec agitation, dans la solution On peut utiliser des solutions de citrate de calcium dans le même but, et elles servent à séquester les ions divalents. Les cultures de cellules encapsulées comme décrit ci-dessus peuvent être mises en suspension dans un milieu de culture destiné spécifiquement à satisfaire toutes les exigen- ces du type particulier de cellules en causejet ces cellules vont continuer à manifester un métabolisme normal Typiquement, les constituants servant normalement à favoriser la croissance des cellules sont des espèces à poids moléculaire relativement faible qui diffusent facilement à travers la membrane des capsules pour pénétrer dans le microenvironnement de la ou des cellules d'o ces espèces traversent par perméation la membrane cellulaire De même, des produits du métabolisme cellulaire, qui sont sécrétés dans le milieu intracapsulaire diffusent, s'ils ont un poids moléculaire inférieur à la limite supérieure de perméabilité de la membrane et des cap- sules, à travers cette membrane et se rassemblent dans le milieu extracapsulaire. La cellule encapsulée peut être cultivée dans des conditions de température, de p H et d'environnement ionique identiques à celles valant pour des cultures classiques Le procédé de microencapsulation ne nuit pas à la vitesse de croissance de la culture La culture de cellules emplit la capsule de cellules mais cela ne provoque pas la rupture de la membrane de la capsule. Lyse des cellules Après croissance de la culture, la majeure partie de la substance intéressante secrétée, mais non excrétée, est toujours contenue au sein des cellules Pour obtenir cette substance, on enlève les cellules du milieu de croissance de la culture et l'on soumet la membrane des cellules à une lyse sans altérer la membrane des capsules Le procédé préféré pour la lyse consiste à mettre à nouveau les cellules en suspension dans un détergent qui ne rompt pas la membrane capsulaire mais lyse la membrane des cellules On peut utiliser avec succès un certain nombre de détergents, ce qui comprend du dodécyl sulfate de sodium, du désoxycholate de sodium et des déter- gents non ioniques, mais le détergent que l'on préfère uti- liser avec des cellules procaryotes est le chlorhydrate de guanidine Chose étonnante, des détergents destinés à rompre les interactions ioniques, comme du dodécylsulfate de sodium, du désoxycholate de sodium et du chorhydrate de guanidine, ne rompent pas la membrane des microcapsules et on les préfère en fait pour des applications concernant des cellules de procaryotes. Dans un mode opératoire typique, on sépare par aspi- ration les capsules du milieu de culture, on les lave avec une solution saline tamponnée et on les mélange à un volume égal de, par exemple, chlorhydrate de guanidine 4 M On dilue la suspension avec du chlorhydrate de guanidine 2 M jusqu'à ce que les capsules représentent environ le dixième du volume de fluide total On fait ensuite incuber la suspension à 370 C et l'on collecte le produit à partir du liquide surnageant. Les exemples non limitatifs suivants vont encore expliquer plus complètement le procédé de l'invention et en montrer l'efficacité. Exemple 1 Le présent exemple montre l'efficacité du procédé de l'invention pour des cellules procaryotes en comparant la technique d'encapsulation avec la technique de culture clas- sique, c'est-à-dire des suspensions monodispersées d'une bactérie génétiquement modifiée La bactérie utilisée dans l'expérience, HB 1 o 1 /p BR 322 amp, est une souche K-12 de E. coli modifiée par l'introduction du plasmide p BR 322 rie rroduc- tion de pénicillinase Cette bactérie, qui résiste a i' - cilline, est un exemple illustrant les cellules génétiquement modifiées et que l'on peut utiliser dans le cas de la présente invention HB 101 produit un lypopolysaccharide pyrogène, endotoxine dont le poids moléculaire moyen excède environ x 104 daltons Cette endotoxine soulève le problème majeur lors de la purification de produits destinés à une utilisation sur l'être vivant Environ 20 % seulement de la pénicillinase sont excrétés par les cellules, le reste étant retenu au sein des cellules La pénicillinase produite à partir du plasmide p BR 322 présente un poids moléculaire d'environ 3 x 104 daltons. La première étape du procédé consiste en l'encapsu- lation des cellules A partir d'un stock congelé, on fait incuber durant la nuit dans du bouillon Luria normal une cul- ture de HB 101 /p BR 322-ampr Le bouillon de Luria contient par litre 10 g de tryptone (Difco Laboratories), 5 g d'extrait de levure (Difco), 10 g de chlorure de sodium (Sigma Chemical Company) et 25 mg d'ampicilline (Sigma) On prépare le milieu en dissolvant les ingrédients ci-dessus et en stérilisant ce milieu par filtration sur un filtre de 0,22 pm (Gelman Labora- tories) Ce milieu favorise la croissance des cellules HB 1 tout en éliminant d'autres souches ne pouvant pas résister à l'ampicilline. On centrifuge durant trois minutes un millilitre de la suspension dans une microcentrifugeuse "Brinkmann 3200 ", ce qui donne un petit culot bactérien de centrifugation On remet les bactéries en suspension dans 0,2 ml de chlorure de sodium 0,15 M et l'on incorpore par mélangeage poussé à ml d'une solution à 1,6 % (poids/volume) d'alginate de sodium (lot n 55 072 A de Kelco LV) On produit des matrices temporaires en refoulant le mélange alginate/bactéries à travers un appareil de formation de gouttelettes (tel que décrit ci-dessus) et en mettant les microsphères liquides résultantes au contact d'une solution contenant 1,2 % (en poids/volume) de Ca C 12, ce qui gélifie l'alginate On lave de façon répétée les matrices temporaires avec une solution 0,15 M de chlorure de sodium et on les place durant 6 minutes dans une solution contenant par litre 0,5 g de poly-l-lysine (Sigma; poids moléculaire: 6,5 x 104 daltons) pour former la membrane des capsules On lave ensuite les capsules dans une solution à 0,2 % (en poids/volume) de Ca C 12, dans un tampon à 0,014 % (en poids/volume) d'acide N-cyclohexylamino éthane sulfonique (Sigma; p H 7,4),puis on lave avec Ca C 12 à 0,2 % (en poids/volume) On ajoute un second revêtement de polyvinylamine (PVA) en plaçant les capsules durant cinq minutés dans une solution saline contenant 0,6 % (en poids/ volume) de PVA (Polysciences) On lave ensuite deux fois les capsules dans une solution saline et on les place durant quatre minutes dans une solution saline contenant 0,06 % (en poids/volume) d'alginate de sodium Après deux lavages supplé- mentaires par de la solution saline, on lave les capsules deux fois dans une solution saline contenant 55 m M de citrate de sodium, en effectuant le premier lavage durant seize minutes et le second durant six minutes Après deux lavages supplémen- taires par de la solution saline, on remet les capsules en = suspension dans du bouillon de Luria frais auquel on a ajoutés du citrate de sodium jusqu'à une concentration finale de mm afin d'empêcher l'alginate de gélifier à nouveau On fait incuber les cellules durant 24 heures à 37 'C avant de ls récolter. La figure 1 (ordorinées: absorptance, ou coefficient d'absorption, à 550 n M;abscisses: temps en heures) illustre les vitesses comparatives de croissance des cellules encapsu- lées (o) et des cellules d'une culture classique en suspension (C) On prélève des échantillons des deux cultures à divers intervalles et l'on détermine la vitesse de croissance en mesurant l'absorption à 550 nm Les vitesses de croissance sont virtuellement identiques, ce qui illustre le fait que la technique d'encapsulation ne nuit pas à la viabilité des cellules (dans ce cas HB 101/p BR 322 _ampr) Les capsules ont une dimension moyenne d'environ 800 rm et chaque capsule con- tient jusqu'à environ 105 cellules. Après la croissance de la culture des cellules, on sépare par aspiration les capsules du bouillon de Luria et on les lave de façon répétée avec une solution saline stérile tamponnée par des phosphates On mesure le volume des capsules et l'on ajoute une égale quantité de chlorhydrate de guanidine 4 M (Sigma) dans de la solution saline tamponnée par des phos- phates On dilue la suspension résultante avec du chlorhydrate de guanidine 2 M jusqu'à ce que le volume des capsules repré- sente environ 10 % du volume du fluide On fait incuber les 0 capsules à 370 C dans un flacon pour cultures "Costar T-1509 et l'on prélève à divers intervalles des échantillons du liquide surnageant et des capsules A chaque intervalle, on retire de la culture, à l'aide d'une pipette, 3 ml de la solu- tion contenant les capsules en suspension On retire du liqui- de surnageant constituant un échantillon et l'on ajoute aux capsules un égal volume de chlorhydrate de guanidine 2 M frais. On provoque la rupture de la membrane des capsules en utili- * sant un homogénéisateur "Wheaton" de 7 ml *On utilise un petit modèle de centrifugeuse pour séparer comme culot les fragments de membrane de capsule et de membrane cellulaire, et l'on prélève comme échantillon intracapsulaire le liquide surna- geant résultant. On soumet chaque échantillon à des examens de déter- mination de la concentration de l'enzyme et de la concentra- tion de l'endotoxine Pour vérifier la concentration en enzyme, on dilue l'échantillon avec de l'eau jusqu'à un volume de 1 ml, et l'on ajoute 1 ml d'eau contenant 1 % de gélatine. On ajoute ensuite le mélange gélatine/échantillon à 5 ml d'un tampon de phosphate, p H 6,5, contenant par litre 2 mg de péni- cilline G, et l'on fait incuber durant 30 minutes à 30 C. On ajoute au mélange 10 millilitres d'un mélange d'iode 0,017 N, d'iodure de potassium 0,6 M et d'acétate de sodium 1,75 M, p H 4,0, et on laisse incuber durant 10 minutes supplémentaires. On titre la solution colorée résultante avec un thiosulfate de sodium 0,017 N jusqu'à disparition complète de la couleur. Le dosage se fonde sur la réaction entre l'acide pénicil- loique et l'iode libre La pénicillinase présente dans dans l'échantillon réagit avec la pénicilline ajoutée pour former l'acide pénicilloique L'acide pénicilloique réagit ensuite avec l'iode libre, en enlevant l'iode de la solution. Le thiosulfate de sodium réagit aussi avec l'iode libre, de sorte que la quantité de thiosulfate nécessaire pour enlever la couleur constitue une mesure de la quantité d'acide péni- cilloïque en solution et, indirectement, une mesure de l'ac- tivité de la pénicillinase Moins il faut de thiosulfate pour clarifier la solution et plus il y a dans la solution d'ori- gine présence d'une activité de pénicillinase On mesure l'activité de pénicillinase par les unités de pénicilline transformées en acide pénicillinoique par unité de temps. On titre la concentration de l'endotoxine en plaçant ml de solution d'entotoxine, diluée par de l'eau stérile, dans un tube à essai stérile et en ajoutant un égal volume de lysat de Amoebocytek-Limulus (LAL, Cape Cod Associates) dans de l'eau On fait incuber le tube durant 1 heure à 37 O C et l'on observe pour voir s'il y a formation d' un caillot. S'il y a formation d'un caillot que l'on ne déloge pas en renversant le tube, cela constitue une indication positive de présence d'endotoxineo On dilue en série l'échantillon pour obtenir une valeur numérique. La figure 2 est un graphique concernant l'activité de pénicillinase totale ( ordonnées: unités de pénicillinase par ml;abscisses: temps en heures), en comparant le cas d'une culture de HB 1 /p BR 322-amp encaspulée (o) avec celui d'une culture classique en suspension (o) L'activité de pénicilli- nase totale est virtuellement identique pour les deux modes de culture, ce qui illustre le fait que la technique d'encap- sulation ne nuit pas à la production de pénicillinase. La figure 3 (ordonllnées: unités de pénicillinase par ml;abscisses: temps en heures) illustre la vitesse de diffu- sion de la pénicillinase, produite dans les cellules de HB 101/p BR 322 ampr, à travers la membrane semi-perméable des capsules Ii' place au temps zéro, les capsules dans du chlorhy- drate de guanidine 2 M et l'on détermine à divers intervalles de temps l'activité de pénicillinase des fluides intracapsu- laire () et extracapsulaire (o) Comme on le voit sur la figure 3, la concentration initiale de pénicillinase est faible dans le liquide surnageant,mais la pénicillinaé-. diffuse à travers les pores de la membrane semi-perméable et apparaît au cours du temps dans le milieu extracapsulaire. La concentration intracapsulaire de pénicillinase diminue, ce qui montre le passage de transfert de pénicillinase s'effectuant à travers la membrane des capsules. La figure 4 (ordonnées: logarithme d'activité d'endo- toxine, en mg/ml;abscisses: temps en heures) illustre, en particulier lorsqu'on l'examine avec la figure 3, l'efficacité de l'invention: la formation d'une barrière s'opposant au passage de transport des pyrogènes tout en laissant s'effec- tuer, à travers la membrane des capsules, le passage de trans- r port de l'enzyme produite dans HB 101/p BR 322-amp r La figure 4 montre que la concentration extracapsulaire (o) de l'endo- toxine est inférieure d'au moins un ordre de grandeur à la concentration intracapsulaire (û) Ces chiffres indiquent que la membrane des capsules empêche le passage de l'endotoxine tout en laissant librement s'effectuer le passage de transport de la pénicillinase, ce qui facilite la récupération de la pénicillinase à partir de la culture La figure 4 montre aussi que le liquide surnageant présente, dans le cas des cultures classiques () environ 100 fois plus d'endotoxine qu'il n'y en a dans le fluide extracapsulaire obtenu selon la présente invention. E 5 emple 2 Cet exemple montre que le procédé ici décrit est efficace pour des cellules eucaryotes aussi bien que proca- ryotes La lignée de cellules que l'on utilise dans cette expérience est la lignée de cellules érythroleucémiques de Friend (FE 1 1/), une lgnée de noliris prsellatni d(le lVërythro- leucémie, cellules qui croissent facilement dans une culture en suspension Par traitement par du diméthyl sulfoxyde (DMSO), on induit chez les cellules de FEL 745 la production d'hémoglo- bine L'hémoglobine ainsi produite possède un poids molécu- laire d'environ 6,3 x 104 daltons et elle est essentiellement laire d'environ 6,3 x 10 daltons et elle est essentiellement retenue au sein de la cellule jusqu'à lyse de celle-ci. L'expérience compare la viabilité des cellules et la facilité de purification de l'hémoglobine dans le cas de cultures encaspulées, en comparaison de cultures effectuées en suspension On centrifuge durant 5 minutes dans une micro- centrifugeuse une culture de cellules FEL 745, puis l'on remet en suspension le culot de centrifugation, ainsi obtenu, dans une solution à 1,2 % (en poids/volume) de chlorure de sodium (Sigma) On produit une matrice temporaire en refoulant le mélange alginate/cellules à travers un appareil de formation de gouttelettes (tel que décrit ci-dessus) et en mettant les microsphères liquides résultantes au contact d'une solution comportant 1,02 % (en poids/volume) de Ca Cl ce qui gélifie l'alginate On lave deux fois la matrice temporaire résultante, une fois avec du tampon CINES 5 m M (acide N-cyclohexyl amino éthane sulfonique), p H 7,5 dans Ca C 12 75 m M, puis dans une seconde solution de lavage contenant 75 m M de Ca Cl 2 L'addition, durant trois minutes avec agitation, d'une solution à 0,05 % (en poids/volume) de poly-llysine (Miles Laboratories; poids moléculaire 42 600 daltons) dans Na Cl 0,15 M forme la membrane permanente des capsules On lave les capsules résultantes trois fois, tout d'abord avec du tampon-5 m M CHES, p H 7,5, dans Ca Cl 2 75 m M, puis avec Ca Cl 75 m M et enfin avec Na Cl 0,15 M. 2 2 On fait incuber les capsules durant 4 minutes avec une solution saline contenant 0,03 % (en poids/volume) d'alginate de sodium. puis on lave deux fois avec le milieu de culture "RPMI-1640 " (Flow Labs) contenant 10 % (en poids/volume) de sérum de foetus de veau (Flow Labs) et des antibiotiques On place les micro- capsules dans des flacons pour culture de tissus avec le milieu de culture et l'on fait incuber à 370 C dans une atmosphère comportant 5 % de C 02. La figure 5 (ordonnées: nombre de cellules par ml Ubscisnos: temps en jours) illustre les vitesses comparatives de croissance des cellules encapsulées (o) en comparaison d'une culture classique en suspension(tl) On échantillonne les cultures à divers intervalles et l'on effectue un dénombrement des cellules Les densités de cellules sont virtuellement identi- ques pour les deux types de culture, ce qui indique que la technique d'encapsulation ne nuit pas à la croissance des cellules. On provoque dans les cultures une production d'hémo- globine en les traitant par du diméthyl sulfoxyde (Mallinkrodt Chemical) On fait incuber durant 48 heures des cultures ayant une densité de 8 x 105 cellules/ml avec 1 % de diméthyl sul- foxyde dans le milieu de culture, 24 heures supplémentaires avec 1,5 % de diméthylsulfoxyde, enfin 24 heures avec 2 % de _O diméthylsulfoxyde On lave les cultures avec Na Cl O,15 M et on les remet en suspension dans 5 volumes d'un tampon de lyse contenant du tris-50 m M, p H 7,0, KCL 25 m M, Mg C 12 5 m M, du B- mercaptoéthanol lm M et 0,3 % (en poids/volume) de "Triton 100 ". On fait incuber les cultures durant deux périodes de dix minutes à 4 C avec un tourbillonnement modéré avant et après chaque période On centrifuge les cultures à 10 000 x g durant minutes à 4 C et l'on collecte le fluide surnageant On dose par spectrophotométrie à 414 nm la teneur en hémoglobine et l'on dose la teneur en protéines globale en utilisant un mode opératoire normalisé de Lowry. TABLEAU A B A/B Concentration concentration d'hémoglobine totale en pro- pg/10 cellules téines 6 _ (g/10 cellules) suspension témoin 2,59 25,2 0, 102 microcapsules intactes 3,18 9,6 0,331 Le tableau illustre l'efficacité du procédé de l'invention La quantité d'hémoglobine produite par les cul- tures en suspension et encapsulée est approximativement égale, mais, pour la culture encapsulée, le rapport hémoglobine/ protéines (A/B) est plus du triple du rapport A/B correspon- dant à la culture en suspension Ce rapport A/B est une mesure de l'activité spécifique d'hémoglobine du liquide surnageant. Cette expérience montre que les microcapsules retiennent les protéines à poids moléculaire élevé, les lipides, les polysac- charides et les acides nucléiques tout en permettant d'obtenir une plus grande activité spécifique de la substance intéres- 2 21 sante. Le procédé ici décrit est extrêmement utile quand la substance intéressante, secrétée mais non excrétée, présente un poids moléculaire relativement faible On peut cependant noter que ce procédé peut également fonctionner dans le cas de n'importe quel système comportant une substance sensiblement non excrétée et une impureté à poids moléculaire supérieur. Il va de soi que, sans sortir du cadre de l'inven- tion, de nombreuses modifications peuvent être apportées aux détails du procédé décrit de récupération de substances produites par des cellules mais non excrétées par celles-ci. * On notera qu'un homogénéisateur 'Wheaton" est un appareil du type comportant un tube en verre ainsi qu'un piston plongeur de tolérance dimensionnelle définie Quand le piston plongeur est abaissé, la matière dont l'épaisseur excède la tolérance est broyée à l'interface piston-plongeur/tube. REVENDICATIONS 1 Procédé pour extraire et récupérer une substance produite par une cellule vivante, mais non excrétée p;ar celle- ci, et pour récupérer cette substance sous forme d'unfi produit brut présentant une concentration réduite en des impuretés à poids moléculaire élevé, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il comporte les étapes selon lesquelles: A On encapsule la cellule au sein d' une membrane de capsule ayant des propriétés de perméabilité permettant Do le passage de ladite substance mais retardant le passage des impuretés à poids moléculaire élevé; B On met la cellule encapsulée en suspension dans un milieu aqueux de culture; C On laisse cette cellule poursuivre son métabolisme au sein de la membrane de capsule; D On lyse la membrane de cette cellule sans rompre la membrane des capsules; E On laisse la substance traverser la membrane de capsule pour diffuser préférentiellement dans un fluide extra- capsulaire; et F On récolte cette substance à partir du fluide extracapsulaire. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue l'étape (A) d'encapsulation en formant la membrane des capsules par réaction entre plusieurs groupes cationiques de chaînes polymères et plusieurs groupes anioni- gues d'un polymère hydrosoluble, afin de former une matrice présentant des liaisons de type salin et insolubles dans l'eau. 3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue l'encapsulation en mettant la cellule en suspension dans un milieu aqueux physiologiquement compatible avec elle et qui contient un polymère hydrosoluble présentant plusieurs fragments anioniques, en donnant à la suspension la forme d'une gouttelette contenant la cellule, en soumet- tant la gouttelette au contact d'une solution comportant des cations multivalents, physiologiquement compatibles, afin de gélifier la gouttelette sous forme d'une matrice temporaire bien séparée, insoluble dans l'eau et conservant sa forme, et en réticulant les couches superficielles de cette matrice temporaire pour produire autour de cette gouttelette une membrane semi-perméable de capsule en soumettant la goutte- lette au contact d'un polymère comprenant plusieurs groupes cationiques pouvant réagir avec lesdits fragments anioniques. 4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte l'étape supplémentaire consistant à laisser lesdites cellules subir le phénomène de mitose au sein de la membrane de capsule pour produire une colonie de cellules emplissant sensiblement le volume présent au sein de cette membrane de capsule, sans rompre ladite membrane de capsule. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue la lyse de la membrane cellulaire en mettant la cellule encapsulée en suspension dans un détergent. 6 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le détergent est une solution aqueuse d'un tensio-actif non ionique, de chlorhydrate de guanidine, de dodécylsulfate de sodium, de désoxycholate de sodium ou d'un de leurs mélan- ges. 7 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la cellule est ou comprend une cellule génétiquement modifiée et l'impureté comprend une matière pyrogène. 8 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la membrane de capsule présente une limite supérieure de perméabilité supérieure au poids moléculaire de la subs- tance à récupérer et inférieure au poids moléculaire de l'impureté à poids moléculaire élevé. 9 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la membrane de capsule comporte de multiples pores constituant un trajet tortueux et en ce que la vitesse à laquelle ces pores laissent passer une molécule est inverse- ment proportionnelle au poids moléculaire de cette molécule.