FR 2542976 A1 19840928 FR 8404506 A 19840323 La présente invention concerne un procédé de production de substances comestibles protéinées et elle a trait, en particulier, à la production de protéines fongiques par action microbienne. Le brevet GB 1 210 356 concerne un procédé de produc- tion de substance comestible protéinée qui consiste à faire incuber et proliférer, dans des conditions d'aérobie, un organisme qui est une souche non toxique d'un champignon microscopique appartenant à la classe Fungi imperfecti, dans un milieu de culture contenant des substances nutritives essentielles favorisant la croissance et dans lequel le carbone, sous la forme d'hydrate de carbone assimilable, constitue le substrat limitant la prolifération, puis à séparer du milieu épuisé en hydrate de carbone assimilable, l'organisme qui a proliféré et qui constitue la substance comestible protéinée. Le brevet GB 1 331 471 revendique une substance comes- tible protéinée constituée de mycélium fongique possédant une valeur d'utilisation nette en protéine élevée, d'après des essais sur le rat, d'au moins 70 -par rapport à l'azote a -amino. Le brevet GB 1 346 062 décrit un procédé de production de substance comestible protéinée qui consiste à faire incuber et proliférer, dans des conditions d'aérobie, une souche non toxique du genre Fusarium ou une variante ou un mutant de celui-ci, dans un milieu de culture contenant des substances nutritives essentielles favorisant la croissance et dans lequel le carbone, sous la forme d'hydrate de carbone assimilable, constitue le substrat limitant la prolifération, puis à séparer l'organisme ayant proliféré formant la substance comestible protéinée. Bien que la maîtrise du procédé de production d'une protéine comestible donne le rendement le plus élevé par rapport au carbone lorsque le carbone est l'élément nutritif limitant, il a été constaté que les propriétés physiques et les qualités gustatives de la substance comestible protéinée pouvaient maintenant être améliorées. Ces avantages du produit compensent la perte en rendement par rapport à ce que l'on obtient avec une limitation par le carbone En conséquence, la présente invention apporte un procédé de production d'une substance comestible protéinée qui consiste à inoculer et à opérer une fermentation continue en utilisant Fusarium graminearum, dans un milieu de culture contenant toutes les substances nutritives nécessaires favorisant la croissance, en aérant de telle manière que l'oxygène constitue l'élément nutritif limitant. La présente invention apporte également un mycélium fongique non toxique de Fusarium graminearum capable d'être utilisé comme aliment à usage humain et ayant des hyphes d'une longueur moyenne supérieure à 0,3 mm produites par fermentation continue d'un milieu de culture contenant Fusarium graminearum et toutes les substances nutritives- nécessaires favorisant la croissance avec l'oxygène comme élément nutritif limitant. L'organisme qui a proliféré, qui a été séparé et qui constitue la substance comestible protéinée peut être incorporé dans un aliment à usage humain ou animal Le procédé selon l'invention est un perfectionnement de celui qui a été décrit dans le brevet GB 1 346 062 On a constaté, à l'expérience, lors de-l'utilisation de ce procédé, et des produits résultants pour incorporation -dans divers aliments en vue de former des produits de remplacement de la volaille, du poisson et de la viande, ainsi que des produits de restauration rapide suaves et savoureux, que l'on se heurte à un problème et que la limitation par le carbone donne un produit qui est fait de brins d'hyphes ramifiées ayant une longueur moyenne de 0,25 à 0,3 mm Cependant, on a constaté que, pour de tels produits, on pouvait texturer une substance comestible protéinée ayant une plus grande longueur de fibre pour donner un produit qui se rapproche plus étroitement de la texture de l'aliment que l'on cherche à imiter En utilisation une fermentation dans laquelle l'oxygène est l'élément nutritif limitant, la qualité du produit est améliorée La fermentation limitée par l'oxygène donne généralement des hyphes ayant une -longueur moyenne supérieure à 0,3 mm, généralement comprise entre 0, 3 mm et 0,5 mm, avec peu ou pas de ramification. Après la croissance, la substance comestible protéinée peut être traitée par choc thermique pour réduire la quantité d'acide ribonucléique (ARN) dans le produit Un procédé de réduction de l'ARN est décrit dans le brevet GB 1 440 642 Pour la texturisation ultérieure, comme il est décrit dans le brevet Ga 1 502 455, de la substance comestible protéinée recueillie et dont la teneur en ARN a été réduite, il est souhaitable d'avoir des brins hyphiques longs (longueur comprise entre 0,3 et 0,5 mm) n'ayant que peu ou pas de ramification de manière à permettre un plus 1.5 grand degré d'alignement des hyphes et à obtenir une texture plus fibreuse perçue dans le produit fini En outre, la limitation par l'oxygène produit un matériau recueilli à teneur réduite en ARN dont la couleur est chamois clair et dont l'odeur et le goût sont doux Il ne se produit en substance aucun métabolisme anaérobie pourvu que le taux d'oxygène contrôle simplement la concentration en cellules dans la culture et le matériau recueilli peut conserver son odeur douce. La présente invention est adaptée à une fermentation continue La limitation par l'oxygène permet de produire des hyphes ayant des caractéristiques désirables pour une vaste gamme de produits finis, avec une bonne productivité dans le réacteur de fermentation Si tous les autres éléments nutritifs sont présents en excès, on peut maintenir des productivités de 3,0 g 1 1 h 1 ou plus. On introduit de l'oxygène ou de l'air enrichi en oxygène dans la cuve de fermentation à une pression égale ou supérieure à la pression atmosphérique, par exemple allant de 101 Pascal à 505 Pascal On a étudié des systèmes à des pressions comprises entre 101 Pascal et 330 Pascal dans la cuve de fermentation avec différentes vitesses d'agitation et divers débits d'introduction d'oxygène. Bien que l'objectif ne soit pas de se limiter à une théorie, on pense que la consommation de l'oxygène par l'organisme est réglée par la diffusion, et qu'elle dépend donc de plusieurs facteurs: (a) le débit d'introduction de l'oxygène ou de l'air enrichi en oxygène (b) la puissance de l'agitateur donnant la force d'entraînement adaptée à la dissolution de l'oxygène dans le bouillon de culture; (c) la surpression et la température (maintenue à 300 C) qui déterminent la concentration de saturation en oxygène (d) la durée de rotation dans la cuve de fermentation qui est fonction de l'efficacité de l'agitateur pour le mélange du bouillon de culture; et (e) la viscosité et la structure du bouillon de culture- qui déterminent les vitesses limitantes de diffusion. Le substrat employé dans la fermentation peut être d'origine végétale, par exemple de l'amidon, des matériaux contenant de l'amidon, ou des produits de leur hydrolyse, par exemple du glucose Il peut s'agir de sucrose, de matériaux contenant du sucrose ou du sucrose hydrolysé, c'est-à-dire du sucre inverti ou de mélanges de ceux-ci. Donc, le substrat peut être formé de pomme de terre hydrolysée, de mélasses, de glucose, de maltose, d'amidon de haricot hydrolysé ou de manioc En variante, on peut utiliser des substrats d'origine animale, par exemple du lait. La souche non toxique de Fusarium peut être une souche de Fusarium graminearum. La souche non toxique que l'on préfère est la souche de Fusarium graminearum Schwabe (FGS) qui est décrite et revendiquée avec sesvariantes et ses mutants dans le brevet GB 1 346 061, qui a été déposée au Commonwealth Mycological Institute, Kew, et qui a reçu le numéro IMI 145425. Le brevet GB 1 -346 061 décrit et revendique spécifique- ment cinq variantes de la souche de Fusarium graminearum Schwabe IMI 145425, à savoir I-7, I-8, I-9, I-15 et I-16 déposées au Commonwealth Mycological Institute et qui ont reçu respectivement les numéros IMI 154209, IMI 154211, IMI 154212, IMI 154213 et IMI 154210. La température d'incubation est en général comprise entre 250 C et 340 C et de préférence elle est d'environ 30 C. La mise en oeuvre du procédé commence par l'inoculation du bouillon nutritif dans la cuve de fermentation avec une culture en croissance active de l'organisme FGS en culture végétative. Le p H du milieu de culture pendant l'incubation est de préférence maintenu dans une gamme appropriée à un dévelop- pement maximal, par exemple, entre 3,5 et 7 et de préférence il est d'environ 6 La période de croissance dans la culture par charge dans les conditions précitées dépend de la taille de l'inoculum et du volume de la cuve de fermentation et on a constaté qu'elle était habituellement de 20 à 48 heures pour une cuve de 1 300 litres. Comme le comprendra l'homme de l'art, des quantités suffisantes de substrat carboné sous la forme d'hydrate de carbone assimilable avec les éléments nutritifs de crois- sance essentiels tels que l'azote, le soufre, le phosphore et d'autres éléments à l'état de traces sont maintenues dans le milieu de culture de manière que la croissance de l'organisme ne soit limitée que par l'oxygène accessible au champignon. En plus des éléments nutritifs indiqués ci-dessus, il peut être souhaitable d'ajouter une ou plusieurs vitamines, par exemple sous la forme de biotine, pour conserver une vitesse de croissance maximale. La substance produite selon la présente invention peut être isolée de toute manière connue dans la technique considérée Ainsi, le mycélium résultant peut être récupéré par séparation du milieu nutritif, par exemple par filtra- tion La substance produite selon la présente invention peut être texturisée comme il est décrit dans le brevet GB 1 502 445 après avoir été mélangée avec des agents colorants et aromatisants convenables autorisés Le matériau texturisé peut être formulé en produits qui sont stockés, congelés ou refroidis. Le mycélium fongique, du fait de sa structure filamen- teuse, peut être utilisé comme produit de remplacement de différentes viandes, en particulier par addition de maté- riaux aromatisants et colorants. La présente invention est décrite avec davantage de détails dans les exemples suivants EXEMPLES Les exemples qui suivent illustrent les vitesses d'introduction du milieu nutritif et les conditions de mise en oeuvre du procédé dans la cuve de fermentation pour une culture continue de Fusarium graminearum Schwabe IM 145425 avec différents éléments nutritifs limitants. Comme élément limitant, les exemples 1 à 8 utilisent l'oxygène et l'exemple 9 utilise le carbone, à titre de comparaison. Dans tous les exemples, les composants du milieu sont ajoutés aseptiquement Le sirop de glucose, le sulfate de magnésium, le sulfate de potassium, le phosphate de monoamonium, le chlorure ferrique ou le sulfate ferrique, le sulfate de zinc, le sulfate manganeux et le sulfate de cuivre sont réunis dans un milieu nutritif unique qui est stérilisé à 138 C, en général pendant de 5 à 7 minutes sous une pression de 377 Pascal, refroidi à la température ambiante et introduit en continu dans une cuve de fermenta- tion en acier inoxydable de 1 300 litres contenant le milieu de culture, à la vitesse d'introduction indiquée Dans tous les exemples, la cuve de fermentation est maintenue à 30 C et est agitée à la vitesse indiquée par un agitateur double comprenant une turbine en disque à 18 aubes (diamètre (D) = 0, 508 m) et un couteau à triple lame (D) = 0,7 m dans une cuve totalement en chicane. La cuve est traversée par les quantités d'air stérile indiquées et le p H de la culture est maintenu à 6 par introduction directe d'ammoniac dans l'air pénétrant dans le récipient La biomasse produite quitte la cuve de fermenta- tion en un écoulement stable et l'acide ribonucléique (ARN) est réduit par le procédé décrit dans le brevet GB I 440 642 Les données de la biomasse présentées en tableau se réfèrent au matériau qui a été traité pour réduire la teneur en ARN par ce procédé. La biomasse est récupérée au moyen d'un filtre Le tableau suivant montre que la longueur hyphique moyenne de l'organisme, et la couleur, la texture et l'odeur de la biomasse recueilliesont influencées par l'élément nutritif limitant du procédé de fermentation. La biomasse AAN est une mesure-de l'azote d'acide aminé qui donne un indice de la quantité de protéine présente dans le matériau produit. La longueur moyenne de la biomasse est la longueur moyenne des brins hyphiques présents. La texture est estimée et qualifiée par un jury. Le facteur de rendement par rapport au carbone est calculé comme étant le poids de l'organisme formé par rapport au poids de substrat carboné utilisé. La productivité est le poids de biomasse produite par unité de volume et unité de temps et elle est calculée comme étant le poids de biomasse par litre multiplié par le taux de dilution Le taux de dilution est la vitesse d'intro- duction des éléments nutritifs dans la cuve de fermentation divisée par le volume de la cuve et il est exprimé en unité- de h-1 La surpression est la pression positive dans la cuveé de fermentation au-dessus de la pression atmosphérique exprimée en Pascal Ainsi la pression absolue dans la cuve de fermentation est la pression atmosphérique plus la surpression. Les exemples 1 à 8 illustrent différentes conditions de fermentation permettant de produire un matériau dont la qualité gustative va de moyenne à bonne avec l'oxygène comme facteur limitant. Les exemples 1 et 8 illustrent une surpression élevée dans la cuve de fermentation Les exemples 2, 4, 5 et 6 illustrent une faible surpression et l'exemple 7 est intermédiaire. Les exemples 1, 3 et 8 illustrent une forte introduc- tion d'air L'exemple 6 illustre une faible introduction d'air. Les exemples 1, 7 et 8 illustrent une haute producti- vité Les exemples 2, 4 et 6 illustrent une faible producti- vité. Bien que les productivités les plus souhaitables soient obtenues avec des taux de dilution compris dans la gamme 0,17-0,19, il est possible de permettre à l'organisme de se développer avec l'oxygène comme facteur limitant à des taux de dilution excédant 0,25 L'exemple 6 illustre la croissance un taux de dilution de,25 h-1 croissance à un taux de dilution de 0,25 h 1 I 1 _, __ 1,-, __ * EXEMPLE N 1 2 3 4 5 Facteurs limitants 02 2 2 2 2 Eléments nutritifs Glucose (sirop de mais) 39,5 4 i,5 27,22 34,83 23,3 Phosphate de mono ammonium 2,1 2,1 1,30 2,26 1,30 Sulfate de potas- siuml edpoa 2,1 2,1 2,1 3,65 2,1 Sulfate de magné- sium 0,87 0,87 0,87 1,51 0,87 Biotine 0,0134 0,009 0,004 0,009 0,004 Choline 87,0 87,0 87,0 113,9 87,0 Fe SO 4 7 H 20 1,26 7,57 3,79 Fe 15C 3 6 H 2 3,64 5,94 Zn SO 4 7 H 20 19,30 26,09 8,7 15,13 8,7 Mn 504 4 H 20 15, 46 17,39 8,7 15,13 8,7 Cu SO 4 5 H 20 1,85 3,48 0,87 3,03 0,90 Conditions Vitesse d'intro- 0 duction 218 265 255 265 264 Volume de la cuve 1252 1340 1280 1342 1245 Taux de dilution 0,174 0,20 0,20 0,20 0,21 Concentration en cellules de la biomasse 17,9 9,2 11,1 10,2 10,7 Vitesse de l'agi- tateur 180 180 180 185 180 Introduction d'air 1500 1211 1316 1239 1216 Surpression 207 34,5 55 34,5 34,5 Excès en glucose 5,5 17,7 6,2 13,2 3,9 Résultats B 13 iomasse AAN 75,5 66,0 68,1 63,5 68,5 Longueur moyenne de la biomasse 0,38 0,40 0,39 O 43 0,41 Couleur Chaeois Chamois Chamois Chamois Chamois o r clalrclair Texture Bonne Moyenne Bonne Bonne De moyenne à bonne Facteur de ren dement par rap- port au carbone 0,53 0,39 0,53 0,47 0,47 Productivité 3,11 1,84 2,22 2,04 2,25 EXEMPLE N Facteurs limitants Eléments nutritifs Glucose (sirop de maîs) Phosphate de mono ammonium Sulfate de potas- sium Sulfate de magné- sium Biotine Choline Fe SO 4 7 H 20 Fe C 13 6 H 20 3 2 Zn S$ 4 7 H 20 Mn SO 4 4 H 20 Cu SO 4 5 H 20 Conditions Vitesse d'intro- duction Volume de la cuve Taux de dilution Concentration en cellules de la biomasse Vitesse de l'agi- tateur Introduction d'air Surpression Excès en glucose R Rsultats Biomasse AAN Longueur moyenne dc la biomasse Couleur Texture Facteur de ren- dement par rap- port au carbone Productivité * (ramifié) 22,45 46,25 1,30 2,1 0,8 j 0,004 87,0 4,34 8,7 0,87 0,25 8,7 34,5 ,0 68,2 0,44 Chamois De moyenne à bonne 0,50 2,1 1,65 2,1 0, 87 0,004 ' 670,0 4,34 8,7 8,7 0,87 0, 188 ,7 1 O, 8 ,8 67, i; 0, 36 Chamois foncé Moyenne - 0, S 8 3,89 48,00 1,39 2,1 0,87 0,004 456,5 4,34 8,7 8,7 0,87 0, 172 ' 21,4 7,4 64, 1 0,32 Chamois foncé Moyenne 0,53 3,68 ,73 g/l 1,34 g/l 2,1 0,87 0,004 87,0 4,34 8,7 8,7 0.87 0,22 9,8 34, 5 0,28 * Rouge-rosi De moyenne à médiocre 0,62 2,16 mm g/l/h 02. Unité C REVENDICATIONS 1 Procédé de production d'une substance comestible protéinée qui consiste à inoculer Fusarium graminearum dans un milieu de culture contenant toutes les substances nutritives nécessaires favorisant la croissance et à opérer une fermentation continue, caractérisé en ce que la fermentation est aérée de telle manière que l'oxygène constitue l'élément nutritif limitant. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le taux d'oxygène règle la concentration en cellule dans la culture sans qu'il se produise de culture anaérobie. 3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que tous les éléments nutritifs pour Fusarium graminearum, à part l'oxygène, sont présents en excès. 4 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la fermentation est mise en oeuvre à une pression comprise entre 101 Pascal et 505 Pascal. 5 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la fermentation est mise en oeuvre à une pression comprise entre 101 Pascal et 303 Pascal. 6 Mycélium fongique non toxique de Fusarium grami- nearum produit par fermentation continue d'un milieu de culture contenant Fusarium graminearum et toutes les substances nutritives nécessaires à la promotion de' la croissance, caractérisé en ce que l'oxygène est l'élément nutritif limitant et en ce que les hyphes ont une longueur moyenne supérieure à O M 3 mm, ledit mycélium pouvant être utilisé comme aliment à usage humain. Mycélium selo 6 N a_ rèevendication 6; -caractrisé en ce que la longueur moyenne des hyphes est comprise entre 0,3 mm et 0,5 mm avec peu ou pas de ramification.