FR 2547925 A1 19841228 FR 8310422 A 19830623 La présente invention concerne un procédé pour doser divers constituants dans un prélèvement corporel,en n'utilisant qu'un seul échantillon du prélèvement de volume classique,et en ajoutant successivement,dans un même récipient,des réactifs permettant de révéler quantitativement chaque constituant, lesdits réactifs étant compatibles entre eux. De nombreux procédés de dosage des éléments du sang sont connus,mais il est habituel d'effectuer la détermination de chaque paramètre sur une nouvelle prise d'essai du sérum 10 à étudier, afin d'éviter tous les problèmes dus à l'incompatibilité des différents réactifs, ou à l'interférence des méthodes de mesure. Dans le demande de brevet FR n 79 040 80,des procédés de dosage photométrique de deux des composants d'un même échan15 tillon de sérum ont été décrits et cela dans le cas des triglycérides et du cholestérol, du glucose et de l'urée,de l'albumine et des protéines totales,de la X -glutamyltransférase et de l'acide urique avec des réactifs déjà connus. La Demanderesse a maintenant trouvé de nouveaux réactifs, 20 particulièrement avantageux étant donné leur stabilité et faible coût pour effectuer de telles déterminations successivement sur un même échantillon et tels qu'il n'existe auco ne incompatibilité entre leurs composants et qu'aucune interférence ne vient fausser les résultats de la mesure de l'un 25 quelconque des paramètres; en effet,on a constaté que les résultats des mesures ne sont pas fia bles quand on ajoute successivement,dans un même échantillon,certains des réactifs couramment utilisés pour les dosages séparés et qu'il est nécessaire de modifier leur composition au moins qualitative, 30 même si les réactions chimiques mises en jeu dans les différentes étapes de révélation restent parfois les mêmes Ainsi, selon l'invention,on effectue le dosage photométrique d'un premier constituant sur un échantillon de sang classique avec un réactif enzymatique classique,puis on ajoute dans le 35 milieu un second réactif enzymatique classique,utile pour doser un second constituantet simultanément au second réactif ou après la première lecture photométrique,on ajoute un système de composés pour transformer les composants présents à la fin de la premiere révélation et susceptibles d'interférer dans la deuxième révélation le système et le second réactif pouvant éventuellement avoir été mélangés préalablement pour former un réactif unique;on effectue la5 lecture photométrique après addition du système et du second réactif à la longueur d'onde habituelle pour le second réactif,qui peut ou non être différente de celle de la première lecture, et ajoute éventuellement un troisième réactif avec un nouveau système de composés pour transformer les composants présents à la fin de la deuxième révélation susceptibles d'interférer dans la troisième révélation et ainsi de suite. Selon l'invention,les réactions révélatrices, c'est-à-dire celles qui conduisent à la formation d'un composé dont la concentration dans le milieu peut être déduite d'une mesure d'absorption de la lumière dans l'ultraviolet ou le visible,peuvent être déjà connues,notamment l'oxydation enzymatique du NADH en NAD+, ou l'action du peroxyde d'hydrogène,formé par réaction enzymatique à partir d'un consti20 tuant du sang,sur un composé ou ensemble de composés dont l'oxydation conduit à la formation d'un nouveau composé absorbant la lumière différemment L'invention concerne, par exemple,des procédés de dosage combiné des triglycérides et du cholestérol ou de l'urée et du glucose,couples retrouvés fréquemment dans les prescriptions médicales,qui utilisent comme première réaction de révélationpour les triglycérides ou l'urée,la transformation du NADH en NAD+ en présence d'un substrat et de l'enzyme correspondante et comme seconde réaction de révélation pour le cholestérol ou 30 le glucose,l'oxydation du mélange d'une amino-4- antipyrine, ou équivalent,cavec un phénol,ou équivalent par le peroxyde d'hydrogène formé in situ par réactions enzymatiques du cholestérol ou du glucose sanguins,procédés au cours desquels la révélation du second composant est effectuée en présence d'un système oxydant du NADH,et notamment un système enzymatique tel que lactate déshydrogénase associée au pyruvate ou glutamate déshydrogénase associée à l'oxo-2 glutarate et à l'ammoniac,ou tel que malate déhydrogénase associée à l'oxaloacétate,ou encore un système oxydant nonenzymatique,tel que l'ion ferrique en milieu acide,ces systèmes étant ajoutés à l'échantillon de sérum après la première lecture photométrique et avant le second réactif ou inclus dans le second réactif. Pour le dosage combiné des triglycérides et du cholestérol,le procédé selon l'invention consiste à ajouter à un échantillon de sérum de volume habituel placé dans un récipient classique, un premier réactif Ade préférence tamponnée 10 contenant:phosphoénol pyruvate, ATP, Mg++, NADH, glycérol kinase, pyruvate kinase,lipase et lactate déshydrogénase. afin de déterminer par photométrie à 340 nm la teneur en triglycérides du sérumselon un principe connu en soi,puis à introduire dans l'échantillon déjà traité,sans opération intermédiaire et sans changer de récipient,un second réactif B tamponné Contenant:cholate, un système phénol, amino-4 antipyrine ou équivalent,peroxydasecholestérol estérase,cholestérol oxydase ainsi que pyruvate et lactate déshydrogénase,puis à effectuer une lecture de l'absorption 20 de la solution à 500 nm pour déterminer la concentration du cholestérol dans le sérum selon un principe connu en soi. Selon une variante du procédé de l'invention,on utilisera un réactif B ne contenant pas de pyruvate et lactate déshydrogénasemais on introduira ces deux constituants avant 25 le réactif B ou simultanément. Selon une autre variante de l'invention,on introduira avec le réactif ou avant celui-cicomme système additionnel un mélange glutamate déshydrogénase et oxo= 2 glutarate en milieu ammoniacal ou un mélange malate déshydrogénase et 30 oxaloacétate ou encore des ions ferriques en milieu acide. La quantité de système additionnel dépend essentiellement de la quantité de premier réactif introduit; il doit être au moins en quantité suffisante pour transformer les constituants du premier réactif qui n'ont pas réagi au cours 35 de la révélation,dans le cas du système enzymatique, on peut en utiliser un net excès jusqu'à 100 fois plus et, avantageusement 10 équivalents molaires du substrat choisi par rapport au NADH introduit avec le premier réactif, la 4 2547925 quantité d'enzyme correspondante s'en déduisant de façon habituelle pour le spécialiste. Pour le dosage combiné de l'urée et du glucose,le procédé selon l'invention implique l'utilisation d'un réactif C contenant: oxo-2 glutarate, NADH, ADP, glutamate déshydrogénase et uréase et un réactif D contenant:un système phénol amino-4 antipyrine ou équivalent 9 glucose oxydase, peroxydase ainsi que pyruvate et lactate déshydrogénase, ces deux derniers composés pouvant être aussi ajoutésxséparément avant la seconde révélationles lectures photométriques étant effectuées successivement à 340 et 500 nm. Les ensembles de réactifs utilisés dans le procédé selon l'invention sont un autre objet de l'invention. Ces ensembles sont composés de deux ou trois réactifs;un 15 premier réactif classiquelpour doser un premier constituant du sang et un second réactif convenablement choisi pour doser un second constituant,et tel qu'il n'y ait pas d'interférence avec les composés formés au cours de la première réaction de révélation et qui contient un système additionnel 20 comprenant des composés qui permettent de transformer les constituants de la première révélation susceptibles d'interférer avec la seconde, ce système additionnel pouvant se présenter sous la forme d'un réactif séparé. Les différents réactifs des ensembles pour le dosage 25 combiné des constituants du sang sont stables et peuvent être préparés à l'avancece qui est un autre avantage de 1 ' invention. Le procédé et les ensembles de réactifs selon l'invention conviennent aussi bien pour les dosages manuels que pour 30 les dosages automatiques Ce procédé combiné est d'autant plus intéressant que les cliniciens demandent fréquemment de déterminer à la fois le taux sanguin des triglycérides et du cholestérol ou de l'urée et du glucose I 1 est même parfaitement concevable d'associer un nouveau réactif à 35 chacun de ces ensembles pour permettre la détermination 2547925 des trois composants fréquemment demandés simultanément lors d'un même bilan sanguin tels que: -triglycérides,cholestérol et phospholipides -urée, glucose et urates. Le procédé selon l'invention présente de nombreux avantages: un volume limité d'échantillon de sang est utilisé pour chaque bilan puisqu'il n'est pas supérieur à celui habituellement nécessaire pour doser un seul paramètre, mais aussi le nombre des manipulations est réduit et on utilise beaucoup moins de petit matériel d'analyse (cuves, pipettes)ce qui représente évidemment une économie de coût sensible que ce petit matériel soit à usage unique ou non. Dans ce qui suit,des exemples de réalisation de l'inven15 tion,non limitatifs sont exposes. EXEMPLE 1: Dosage combiné des triglycérides et du cholestérol. On utilise un réactif A composé des produits suivants en solution aqueuse: Mg++ (sous forme de Mg SO 4) 4 mmol/l NADH 0,28 mmol/l ATP (adénosine triphosphate) 0,43 mmol/1 Phosphoénol pyruvate de sodium 0,97 mmol/1 Glycérol kinase ' 400 q/1 Pyruvate kinase > 600 U /1 Lipase 200 000 /1 Lactate déshydrogénase 1000 ( 2/1 Tampon phosphate (p H = 6,7) 20 mmol/l ainsi qu'un réactif B,composé des produits suivants en solu30 tion aqueuse: Phénol 26 mmol/1 Cholate de sodium 2,4 mmol/l Amino-4 antipyrine 0,5 mmol/l Peroxydase 2000 U /1 Estérase 3 300 (/1 Cholestérol oxydase d 40 JI/1 Pyruvate de sodium -10 mmol/l Lactate déshydrogénase >Ioo Li/î Tampon phosphate (p H = 6,5), > 100 mmol/l Dans un récipient habituel, on introduit 20 1 pi du sérum à étudier puis 1 ml du réactif A Apres 5 minutes environ d'incubation à 37 C, on lit l'absorption de la solution à 340 nm. On déduit la concentration du sérum en triglycérides de la différence entre l'absorption ainsi mesurée et celle d'un témoin, en se référant à une courbe d'étalonnage. Après cette première lecture, on introduit dans le même récipient 1 ml du réactif B; après 5 minutes environ d'incubation à 37 C on lit l'absorption à 500 nm environ. On déduit la concentration du sérum en cholestérol de la différence entre l'absorption ainsi mesurée et celle d'un échantillon témoin, sans sérum, en se référant à une courbe 15 d'étalonnage. Exemple 2: dosage combiné de l'urée et du glucose. On utilise un réactif C, composé des produits suivants, en solution aqueuse: NADH 0,33 mmol/l oxo-2 glutarate de sodium 13,7 mmol/1 ADP (adénosine diphosphate) 1,2 mmol/1 glutamate déshydrogénase 250 (J 1 uréase > 4000 /il tampon triéthanolamine 75 mmol/1 (p H = 7,9) et un réactif D: phénol 26 mmol/1 amino-4 antipyrine 0,5 mmol/1 glucose oxydase a 30000 (J 1 peroxydase > 2000 U/l pyruvate de scdium 10 mmol/l lactae déshydrogénase >o 1500 À/1 tampon phosphate 100 mmol/1 (p H = 7,3) On introduit 10 à 20 pl du sérum à étudier dans 35 un récipient, la quantité étant fonction de l'appareil de mesure, puis 1 ml du réactif C On fait une mesure à 340 nm de l'évolution de l'absorption de la solution à 37 C (lecture cinétique) et on en déduit la concentration du sérum en urée par la méthode classique,puis on introduit dans le récipient 1 ml du réactif D,et après 10 minutes environ d'incubation à 37 Con lit l'absorption de la solution à 500 nmce qui permet de calculer la concentration en glucose du sérum. EXEMPLE 3 Résultats des dosages combinés de l'urée et du glucose dans différents sérums normaux ou pathologiques. On a appliqué la méthode combinée décrite à l'exemple 2 et sur le même prélèvement sanguin et on a dosé séparément l'urée et le glucose par des méthodes classiques, C'est-àdire qu'ils ont été déterminés dans deux échantillons différents. Les résultats des dosages sont donnés dans le tableau ci-dessous urée glucose glucose méthode classiu méthode combinée 0,39 g/1 l,00 g/l 0,99 g/1 1,0 g/1 2,47 g/l 2,,t 6 g/1 0 026 g/1 0,No g/l 0, 68 g/1 1,85 g/l 4,31 4,30 EXEMPLE 4: Résultats des dosages combinés du cholestérol et des 25 triglycérides dans différents sérums. On a appliqué la méthode combinée décrite à l'exemple 1 et sur le même prélèvement sanguin,dosé séparément,le cholestérol et les triglycérides par des méthodes classiques, c'est-à-dire sur deux échantillons différents, Les résultats desdosagessont indiqués dans le tableau cidessous. cholestérol triglycérides méthode classique méthode combinée 2 g/l 2,26 g/l 2,19 g/l 2 g/1 4,02 g/l 4,05 g/1 g/1 1,80 g/1 1,85 g/l g/1 4, 25 g/1 4,34 g/l. 8 2547925 REVENDICATIONS 1.Procédé de dosage de plusieurs constituants sanguins sur un seul échantillon de sang consistant à ajouter un premier réactif pour mesurer la concentration d'un premier constituant par une méthode photométrique puis à ajouter un second réactif pour mesurer la concentration d'un second constituant par une méthode photométrique et ainsi de suite, caractérisé en ce que les réactifs sont choisis pour qu'il n'y ait pas d'interférence entre les révélations des différents constituants. 2 Procédé selon la revendication lcaractérisé en ce qu'on utilise un premier réactif enzymatique classique et un deuxième réactif enzymatique classique auquel on ajoute un système de composés pour transformer les composants présents à la fin de la première révélation et susceptibles 15 d'interférer dans la deuxième révélation. 3.Procédé selon les revendications 1 et 2 dans lequel on effectue une première mesure photométrique qui dépend de l'oxydation enzymatique du NADH en NAD+ et une seconde,de l'oxydation d'un mélange d'amino-4 antipyrineou analogues, 20 et d'un phénol,substitué ou nonepar le peroxyde d'hydrogène formé in situ par réaction enzymatiquecaractérisé en ce que, simultanément,ou avant ce deuxième réactif classique,est ajouté au milieu réactionnel un ensemble de composés formant un système oxydant du NADH. 4 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes,caractérisé en ce que le système oxydant est un systèmeenzymatique. 5.Procédé selon la revendication 4,caractérisé en ce que le système enzymatique est choisi parmi la lactate déshydro30 génase associée au pyruvate ou la glutamate déshydrogénase associée à l'oxo-2 glutarate et l'ammoniacoou la malate déshydrogénase associée à l'oxaloacétate. 6.Procédé selon l'une des revendications 1 à 3,caractérisé en ce que le système oxydant est non-enzymatique. 7 Procédé selon la revendication 6,caractérisé en ce que le système oxydant est le mélange Fe 3 + et H'+ 8 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes pour le dosage combiné des triglycérides et du cholestérol, dans lequel on ajoute à l'échantillon de sérum un premier réactif à base de NADH, ATP, Mg++, phosphoénol pyruvate, glycérol kinase, pyruvate kinase, lipase et lactate déshydrogénase et fait une lecture photométrique à 340 nm environ pour déterminer les triglycérides, caractérisé en ce que le deuxième réactif est ajouté après la lecture et qu'il est à base de cholate, amino-4 antipyrine, phénol, pe10 roxydase, cholestérol estérase, cholestérol oxydase et en ce qu'avant ou simultanément au deuxième réactif, on ajoute un système oxydant du NADH et que l'on effectue la détermination du cholestérol par lecture photométrique à 500 nm environ. 9 Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 pour le dosage combiné de l'urée et du glucose dans lequel on ajoute à l'échantillon à doser un premier réactif à base de NADH, ADP, oxo-2 glutarate, glutamate déshydrogénase et uréase et détermine l'urée par photométrie à 340 nm, carac20 térisé en ce que l'on ajoute dans le milieu, après la lecture, un deuxième réactif qui contient de l'amino-4 antipyrine,un phénol, de la glucose oxydase, de la peroxydase et en ce qu'avant ou simultanément à celui-ci, on ajoute un système oxydant du NADH, et que l'on détermine le glucose 25 par photométrie à 500 nm environ. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, caractérisé en ce que les réactifs classiques contiennent un mélange tampon. 11 Ensemble de réactifs pour le dosage combiné des constituants sanguins selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 12 Ensemble de réactifs pour le dosage combiné des triglycérides et du cholestérol selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 8 et 10. 13 Ensemble de réactifs pour le dosage combiné de l'urée et du glucose selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1, 2, 9 et 10. 5.9 83