FR 2542999 A1 19840928 FR 8304592 A 19830321 1. La présente invention se rapporte à une composi- tion de liposome de stérylglucoside ou de monopalmitate de stérylglucoside, ainsi qu'à un procédé de fabrication de ce produit. Les stérylglucosides et les monopalmitates de stérylglucosides sont contenus dans les plantes et ils peu- vent être extraits et séparés, principalement sous la forme d'un mélange de C-sitostéryl-C-D-glucoside, de stigmasté- ryl- -D-glucoside et de campestérylglucoside, ainsi que de leurs esters avec les acides gras, à partir de diverses ma- tières naturelles telles que, par exemple, le soja, les graines de coton, le pois chiche, des résidus de raisin et analogues,par un procédé,par exemple, de T Kiribuchi et collaborateurs décrit dans Agricultural Biological Chemis- try, volume 30, n 8, pages 770 à 778 ( 1966) Afin de fournir le stérylglucoside à partir des matières des plan- tes, un mélange obtenu par le procédé donné ci-dessus est hydrolysé avec un alcali Pour fabriquer des monopalmita- tes de stérylglucosides, les stérylglucosides obtenus par le procédé d'hydrolyse ci-dessus sont soumis à une réaction de synthèse chimique, Les taux de constituants des stérylglucosides extraits et séparés des plantes sont donnés dans le tableau 1. 29 2542999 TABLEAU 1 Èt tb-sitostérylStigmastéryl Campestéryl-F- l_____ _ g-D-glucosîde D-g 1 ucoside D-glucoside Soja 56 % 23 % 21 % Graines de coton 96 % 4 % O % Pois chiche 87 O % 3 % Résidus de raisin 84 % 9 % 7 % 84 9 % 7 % Les stérylglucosides peuvent être synthétisés à partir de stérols des plantes,obtenus sous une forme de $-sitostérol, de stigmastérol, de campestérol ou de leurs mélanges, par un procédé connu tel que, par exemple, celui indiqué dans Chemische Berichte, volume 105, pages 1097 à 1121 En partant du stérylglucoside résultant, on peut fabriquer leurs monopalmitateso Les stérylglucosides sont solubles dans la pyri- dine, quelque peu solubles dans le dioxane, difficilement solubles dans les alcools et les cétones, et presque inso- lubles dans les solvants organiques ordinaires, tels que les hydrocarbures et les solvants contenant des halogènes, ainsi que dans l'eau. I 1 n'y a pas de différence substantielle de pro- priétés physiques et chimiques des stérylglucosides, même quand les parties stérols diffèrent ou même dans des mélan- ges extraits de plantes D'autre part, les monopalmitates de stérylglucosides sont solubles dans les solvants non po- laires, quelque peu solubles dans les alcools et presque in- solubles dans l'eau Il n'y a pas de différence de propriétés physiques et chimiques des monopalmitates de stérylglucosi- des, même quand les parties stérols diffèrent, ou même dans des mélanges extraits des plantes. Les stérylglucosides et les monopalmitates de sté- rylglucosides présentent une action hémostatique, une ac- tion de renforcement vasculaire, une action anti-choc et ana- logues, comme décrit dans la demande de brevet japonais publiée Sho-5411369 et dans la demande de brevet japonais non examinée Sho-53-109954 et sont des composés utiles dans 3. les produits pharmaceutiques On désire que ces composés soient utilisés dans des solutions pour les injections par suite de leur action pharmacologique mais,par suite de leur inso- lubilité dans I'eau,il a été impossible de les dissoudre dans des sol- vants aqueux pour préparer des solutions injectables Ainsi,pour prépa- rer les composés dans des solutions injectables,on a essayé leur disso- lution dans des solvants non aqueux ou leur transformation en suspen- sions Cependant,dans le premier cas, les solubilités des compo- sés dans le propylèneglycol, le produit dit Macrogol et les huiles végétales, qui sont fréquemment utilisés comme solvants pour les solutions d'injection, sont faibles et il n'est pas possible d'obtenir les concentrations dési- rées Dans le dernier cas, la préparation de la solution d'injection est possible, mais, quand on l'injecte in vivo, la dissolution du composé de la partie injectée dans l'or- ganisme est si lente que l'on ne peut pas s'attendre à des effets pharmaceutiques désirés En tout cas, les deux ten- tatives ne peuvent pas fournir des solutions désirées pour les injections. Ainsi,par suite de la technique classique de préparation de solution d'injection de composés difficile- ment solubles, il n'a pas été possible de fournir des solutions injectables de stérylglucosides et de monopalmi- tates de stérylglucosides, et, en conséquence, on exige une technique spéciale Pour une telle exigence, la deman- deresse a réalisé avec succès une solubilisation dans l'eau de ces composés par l'utilisation de solvants hydrophiles et d'agents de solubilisation, comme décrit, par exemple, dans les demandes de brevets japonais publiées examinées Sho-53-31210 et Sho-53-20567 Cependant, selon ces procé- dés, il y a encore plusieurs points qui doivent être amé- liorés. Par exemple, il y a les points suivants: 1) Puisque l'affinité des stérylglucosides et des monopalmitates de stérylglucosides vis-à-vis de l'eau est très faible, une quantité comparativement grande de sol- vants ou d'agents tensio-actifs est nécessaire pour solu- biliser des quantités définies de ces composés dans l'eau. 4 2542999 2) Quand on réalise la stérilisation par chauf- fage,les agents tensio-actifs se séparent et adhèrent sur la paroi d'une ampoule. 3) Quand on réalise l'injection par voie intravei- neuse, l'effet pharmacologique de ce composé est affecté par l'agent de solubilisation utilisé En fait, l'effet désiré n'est pas obtenu par l'emploi d'agents de solubili- sation, sauf quelques uns tels que le produit connu sous la marque déposée HCO-60 ( 60 moles de polyoxyéthylène et huile de ricin durcie). La demanderesse a réalisé des études importantes pour trouver une solution pour des injections, qui peut être soumise facilement à la stérilisation par chauffage, qui contient des concentrations importantes d'ingrédient actif convenables pour le domaine du renforcement des vaisseaux sanguins et des agents anti-choc o une-dose élevée est exigée, et qui fournit un effét pharmaceutique sûr, même par injection intraveineuse; par suite, la deman- deresse a trouvé que ces objets peuvent être tous atteints, en fabriquant les composés inclus dans le liposome et elle est arrivée à la présente invention Ainsi, la présente invention concerne un liposome qui est une nouvelle compo- sition de stérylglucosides et de monopalmitates de stéryl- glucosides et un procédé pour sa fabrication, Des exemples d'utilisation de liposome comme sup- port pour des produits pharmaceutiques ont été récemment trouvés dans la littérature et sa structure, sa composi- tion et ses procédés de fabrication se trouvent dans diver- ses revues Par exemple, on se référera à l'article de Tyrell D H et collaborateurs: Biochimica et Biophysica Acta MR 457, pages 259 à 302 ( 1976); et de Flender, J H. et collaborateurs: Life Science, 20 ( 7), pages 1109-1020 ( 1977). Les liposomes sont généralement obtenus sous les formes suivantes Ainsi, une solution de lipide dans le chloroforme est placée dans un ballon du type aubergine, le chloroforme est évaporé si bien qu'une membrane mince du lipide est formée sur la paroi du ballon, puis un tam- , pon et une solution aqueuse du produit pharmaceutique sont ajoutés, et la membrane de lipide est retirée de la paroi par agitation; de ce fait, une solution aqueuse du produit pharmaceutique est incluse dans le petit globe ou véhicu- le résultant En conséquence, il a été nécessaire de reti- rer les produits pharmaceutiques non incorporés dans le li- posome par filtration sur gel ou par ultracentrifugation. En outre, pour autant que le liposome soit sous la forme ci- dessus, une solution aqueuse du produit pharmaceutique dans le liposome diffuse en dehors vers la couche aqueuse extérieure dans un temps bref, même quand le liposome est séparé des produits pharmaceutiques libres et il y a l'inconvénient que le liposome peut difficilement être uti- lisé comme préparations pharmaceutiques pratiques. Cependant, après des études importantes réalisées par la demanderesse, elle a trouvé de manière inespérée que les stérylglucosides ou les monopalmitates de stérylgluco- sides ont une forte affinité pour le lipide qui constitue le liposome, étant donné qu'en utilisant une telle proprié- té, ces composés peuvent être inclus dans le lipide de lipo- some et elle est arrivée à la présente invention Ainsi, la présente invention se rapporte à une composition de liposo- me ou les stérylglucosides ou les monopalmitates de stéryl- glucosides sont inclus dans le lipide obtenu en dissolvant le lipide dans le chloroforme, en ajoutant les stérylgluco- sides ou les monopalmitates de stérylglucosides, en les ame- nant à être dissous par addition d'un stabilisant de membra- ne (tel que le cholestérol) ou d'un agent de charge, si cela est nécessaireen évaporant le chloroforme, et en agitant avec une solution saline physiologique ou une solution tam- pon ou en soumettant à des ondes ultrasons L'invention se rapporte aussi à un procédé de fabrication de la composi- tion de liposome. Des exemples de lipides utilisés dans la présente invention sont des lipides naturels tels que la lécithine, les phosphoglycérides de sphingolipides, les gangliosides, etc ou des lipides de synthèse tels que la dimyristoyl-, le dipalmitoyl-, le distéaryl et la dioléylphosphatidyl- 6. choline etc, et, parmi eux, les lécithines naturelles ou synthétiques sont préférées Des exemples de stabilisants pour des membranes de liposome sont le cholestérol, le 0- sitostérol, le stigmastérol, le campestérol, ou des mélan- ges des stérols extraits des matières des plantes Des exem- ples d'agents de charge sont une starylaine qui charge avec des charges électriques positives, et l'acide phosphatidique et l'acide dicétylphosphorique qui chargent avec des charges électriques négatives. Des exemples de stérylglucosides dans la présente invention sont le C-sitostéryle-D-glucoside, le stigmasté- ryl--D-glucoside, le campestéryl D-glucoside, le cholesté- ryl-e-D-glucoside et les stérylglucosides sous forme de mé- langes principalement composés des stérylglucosides ci-des- sus, extraits des matières des plantes Des exemples de mono- palmitates de stérylglncosides utilisés dans la présente invention sont les 6-monopalmitates des stérylglucosides donnés ci-dessus. Le rapport ingrédient principal/constituant lipi- dique est de 1 partie en poids de l'ingrédient principal, pour 1 à 10 parties (de préférence 3 à 5 parties) de lipi- des, 0,1 à 5 parties (de préférence 0,3 à 2 parties) de stérols, et 0,05 à 0,5 partie d'agent de chargeo Selon la résistance et le temps pour l'agitation et l'irradiation par ondes d'ultrason, on obtient un liposome à multistrates ou à unistrates. Le liposome de la présente invention contenant des stérylglucosides ou les monopalmitates de stérylglucosides est administré par voie parentérale et présente les avanta- ges suivants. 1) Par suite de l'utilisation de quantité faible, telle que 3 à 5 parties en poids de lipide pour 1 partie en poids de l'ingrédient principal, il est possible de fournir une solution d'injection convenable pour l'injection intra- veineuse. 2) Il est possible de préparer une solution d'in- jection contenant même 5 % ou à peu près 5 % d'ingrédient principal, et, en conséquence, il est possible de fournir 7, 2542999 des solutions d'injection non seulement dans des buts hé- mostat Uques mais aussi pour le renforcement des vaisseaux sanguins et des domaines antiîchoc, exigeant de hautes do- ses d'administration. 3) La composition de la présente invention four- nit un effet pharmacologique défini, même par injection intraveineuse. 4) La stérilisation par chauffage peut être réa- lisée facilement. En plus des avantages donnés ci-dessus, le lipo- some de la présente invention présente des propriétés mar- quées de manière telle que, lorsqu'on le remplit dans une ampoule avec de l'azote gazeux et qu'on le maintient dans un endroit à l'obscurité, le liposome est stable au moins pendant deux ans aux températures ambiantes, ne présentant pas de changement d'aspect et de concentration. Les exemples représentatifs de la présente inven- tion sont comme suit. EXEMPLE 1 De la lécithine de jaune d'oeuf ( 20 mg) est pla- cée dans un ballon en forme d'aubergine de 50 ml, le conte- nu est dissous dans 2 ml de chloroforme, puis on dissout dedans 5 mg de e-sitostéryl-C-D-glucoside et 2 mg de cho- lestérol, et le chloroforme est évaporé au bain-marie bouillant à 30 C, en utilisant un évaporateur rotatif On insuffle de l'azote gazeux dans le résidu pendant 10 minu- tes, on sèche pendant 6 heures dans un dessiccateur à vide, on y ajoute 5 ml de solution saline physiologique et on homogénéise pendant 3 minutes sous un courant d'azote en utilisant un homogénéiseur à ondes d'ultrason du type dit à sonde (Choompa Kogyo Co; 25 K Hz, 150 W) pour donner un liquide jaune pale presque transparent Il est soumis à une filtration sur milieu stérile, en-utilisant le filtre dit millipore type GS pour fournir un filtrat dans lequel on identifie 99,6 % de -sitostéryl-e D-glucosïde, par com- paraison avec sa quantité avant filtration, Le filtrat est rempli dans une ampoule de 5 ml avec de l'azote gazeux et soumis à une stérilisation dans un autoclave à 120 C 8. pendant 20 minutes On n'observe pas de séparation de l'ingrédient principal ou du lipide par la stérilisation. Quand la solution d'injection est emmagasinée à l'obscuri- té, on n'observe pas de séparation de matières étrangères, ni d'abaissement de concentration d'ingrédient principal pendant plus de deux ans aux températures ambiantes Cet- te solution d'injection et une solution témoin préparée en retirant l'ingrédient principal de la solution d'injection ci-dessus-sont injectées par voie intraveineuse à des sou ris ( 10 souris par groupe) Leurs queues ( 1 cm à partir de l'extrémité) sont coupées, avec un couteau chirurgical, im- prégnées dans l'eau et le temps nécessaire jusqu'à ce que le saignement s'arrête est mesuré (voir Motohashi et collabora- teurs: Tokyo Jikeikai Medical Journal, 75 ( 5), 1008, 1959) pour évaluer l'activité pharmacologique des solutions de la présente invention par injection intraveineuse Les ré- sultats sont comme donnés dans le tableau 2 d'o il appa- rait qu'alors que le temps hémostatique moyen dans le grou- pe témoin est 14,7 0,82 minutes, le groupe ayant reçu l'administration de 0,2 mg/kg de la solution d'injection présente un temps hémostatique de 12,3 0,27 minutes Ain- si, il y a une différence importante du niveau de P invention par voie intraveineuse est sûrement prouvée. EXEMPLE 2 De la dipalmitoyllécithine ( 20 mg), 10 mg de mo- nopalmitate de 5-sitostéryl--D-glucoside et 5 mg de cho- lestérol sont dissous dans 3 ml de chloroforme et le mélan- ge est évaporé sous vide au bain-marie à 30 C, en utili- sant un évaporateur rotatif On insuffle de l'azote gazeux dans le résidu résultant pendant 10 minutes et on sèche pen- dant plus de 6 heures dans un dessiccateur à vide On y ajoute 5 ml de tampon phosphaté à p H 6,2 (préparé en dis- solvant 1,8 gramme de phosphate trisodique, 6,4 grammes de phosphate diacide de sodium et 5,1 grammes de chlorure de sodium, dans de l'eau distillée pour l'injection pour cons- tituer 1 litre) et le mélange est homogénéisé pendant trois minutes en utilisant un homogénéiseur à onde d'ultrason,du type à sonder pour fournir une solution de liposome légère- ment trouble Elle est filtrée avec un filtre dit millipo- re type HA pour fournir un filtrat o L 99,2 % du monopalmi- tate de 0-sitostéryl-C-D"glucoside sont contenus Le fil- trat est rempli dans une ampoule avec de l'azote gazeux et stérilisé avec de la vapeur d'eau à haute pression à 120 C pendant 20 minutes dans un autoclave L'effet pharmacolo- gique de la solution d'injection résultante par voie intra- veineuse est donné dans le tableau 2, n 2. EXEMPLE 3 Dans un ballon de 50 ml du type en aubergine, on place 4 mg de dioléylphosphatidylcholine et 4 mg de dipalmi- toylphosphatidylcholine, le mélange est dissous dans 2 ml de chloroforme, puis 3 mg de cholestéryl-5-D-glucoside et 1 mg de cholestérol y sont dissous, et le chloroforme est évaporé ensuite au bain-marie à 30 C en utilisant un évapo- rateur rotatif Il est ensuite traité comme dans l'exemple 1 pour fournir 5 ml de solution de liposome contenant 3 mg de cholestéryl-r D-Dglucoside L'activité pharmacologique de la solution est donnée dans le tableau 2, n 3. EXEMPLE 4 Dans un ballon de 50 ml du type en aubergine, on place 15 mg de dipalmitoyllécithine, dissous dans 2 ml de chloroforme, puis 5 mg de stigmastéryl D-glucoside, 5 mg de stigmastérol et 1 mg de stéarylamine y sont dissous, et le chloroforme est évaporé au bain-marie à 30 C en utilisant un évaporateur Le produit est alors traité de la même ma- nière que dans l'exemple 2 pour donner 5 ml de solution de liposome ayant une charge positive contenant 5 mg de stig- mastéryl-5-D-glucoside L'activité pharmacologique de la solution d'injection résultante est donnée dans le tableau 2, n 4. EXEMPLE 5 Au lieu de 1 mg de stéarylamine dans l'exemple 4, on ajoute 1 kg d'acide diacétylphosphorique et puis on trai- te comme dans l'exemple 4 pour donner 5 ml de solution de liposome qui chargent de manière négative, contenant 5 mg de stigmastéryl D-glucoside, L'activité pharmacologique 10. de la solution d'injection est donnée dans le tableau 2, n 5. EXEMPLE 6 De la lécithine de jaune d'oeuf ( 200 mg) est placée dans un ballon de 100 ml du type en aubergine, on y dissout 5 ml de chloroforme puis on y dissout 50 mg de stérylglucoside et 25 mg de cholestérol extrait du soja, et le chloroforme est évaporé sous vide au bain-marie à C en utilisant un évaporateur rotatif On insuffle de l'azote gazeux sur le résidu pendant 10 minutes et on sè- che pendant 6 heures dans un dessiccateur à vide On y ajoute 5 ml de tampon phosphaté qui est utilisé dans l'exem- ple 2, on lhomogénéise pendant 5 minutes sous un courant d'azote en utilisant un homogénéiseur à ondes d'ultrason du type à sonder pour donner une solution de liposome légère- ment trouble Elle est filtrée en utilisant un filtre dit millipore type HA pour donner un filtrat contenant 98,2 % de stérylglucoside I 1 est alors traité de la même maniè- re sue dans l'exemple 1 pour donner 5 ml de solution de liposome contenant 50 mg de stérylglucoside L'activité pharmacologique de cette solution d'injection est donnée dans le tableau 2, n 6 o EXEMPLE 7 Dans un ballon de 100 ml du type en aubergine, on place 200 mg de lécithine de jaune d'oeuf, dissoute par addition de 5 ml de chloroforme, 50 mg de cholestérol et mg de monopalmitates de stérylglucosides extraits de graines de coton qui sont dissous, puis on traite comme dans l'exemple 6 pour donner 5 ml d'une solution de lipo- some contenant 50 mg de monopalmitates de stérylglucosi- des extraits de graines de coton,L'activité pharmacologi- que de cette solution d'injection est donnée dans le ta- bleau 2, n 7, A partir du tableau 2 il apparaît très bien que les compositions de la présente invention montrent une activité pharmacologique par injection intraveineuse. TABLEAU 2 Activîtéspharmacologiques de solutions d'injection de' liposome N Composition Voie d'administrto emps, exg Pour arr ter le sainmn mnts sel 1 on 0,4 mg/kge0,2 mg/kga>) 0,1 mg/kga) Témoin I 1 Exemple i intraveineuse 11,1 1,55 "e 11,7 -0,87 N 14,0 1,13 14,7 -0,82 2 Exemple 2 Intraveineuse 9,5 O,91 lmm11,1 1,12 Nf R 13,8 1,02 ______ 3 Exemple 3 Intraveineuse 11,3 -1, 20 " 11,4 0,78 mm 12, 0,6 ______ 4 Exemple 4 Intraveineuse 10,8 0,91 " -11 e 6 0, 8 o13,3 1,12 Exemple 5 Intraveineuse 11,2 0,81 mm 12,2 + 0,75 M 12,I 8 1,00 6 Exemple 6 Inteaveineuse 9,7 0,88 x 10,9 1,15 ' 12,1 0,80 14,2 -0,95 + mm 7 Exemple 7 Intraveineuse 11,6, 0,73 11,2 0, 82-"'12,5 0,961 a) Dose administrée Y p * 12 2542999 La présente invention n'est pas limitée aux exem- ples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de modifications et de variantes qui apparaîtront à l'homme de l'art. 13 2542999 REVENDICATIONS 1 A titre de produit industriel nouveau, lipo- some contenant un ou plusieurs stérylglucosides et monopal- mitates de stérylglucosides comme ingrédient(s) efficace(s). 2 Liposome selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est sous la forme d'une strate simple, 3 Liposome selon la revendication 1, caractéri- sé en ce qu'il est sous la forme de strate à couches multi- ples. 4 Liposome selon l'une quelconque des revendi- cations 1 & 3, caractérisé en ce que le ou les ingrédient(s) efficace(s) est ou sont contenus dans le lipide. Liposome selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 4, caractérisé en ce que le lipide est de la phosphatidylcholine naturelle ou synthétique. 6 Liposome selon la revendication 5, caractéri- sé en ce que la phosphaditylcholine naturelle est de la lé- cithine de jaune d'oeuf. 7 Liposome selon la revendication 5,caractéri- Sé en ce que la phosphaditylcholine de synthèse est au moins un des produits constitués par la dimyristoylphospha- tidylcholine, la dipalmitoylphosphatidylcholine, la disté- arylphosphatidylcholine et la dioléylphosphatidylcholine. 8 Liposome selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 7,caractérisé en ce que le stérol est contenu sous forme de stabilisant pour le liposome. 9 Liposome selon la revendication 8, caractéri- sé en ce que le stérol est au moins un des produits formés par le cholestérol, le 5-sitostérol, le stigmnastérol et le campestérol. Liposome selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 9,caractérisé en ce que le liposome contient une substance qui donne des charges positives, 11 Liposo Qme selon la revendication 10, caracté- risé en ce que la substance donnant les charges positives est la stéarylamine, 12 Liposome selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 9, caractérisé en ce que le liposome contient 14. une substance qui donne des charges négatives. 13 Liposome selon la revendication 12, carac- térisé en ce que la substance donnant les charges négati- ves est l'acide phosphatidique ou l D acide dïc 6 tylphospho- rique. 14 Liposome selon l'une quelconque des reven- dications 1 a 3, caractérisé en ce que le stérylglucoside est le 0-sitostéryl D-glucoside, le stigmastéryl-C-D- glucoside, le campestéryl-B-D-glucosilde ou le cholesté- ryl-C-D-glucoside et le monopalmitate de stérylglucoside est un monopalmitate des stérylglucosides donnés ci-des- sus. Procédé de fabrication de liposome, carac- térisé en ce qu'un ou plusieurs des produits formés par le stérylglucoside et le monopalmitate de stérylglucosi- de est/sont dissous dans une solution de lipides et, si cela est nécessaire, de stérol et d'un agent de charge dans du chloroforme puis le chloroforme est évaporé pour for- mer une membrane de lipide sur la paroi du récipientet puis on agite ou on soumet à une irradiation d'ondes d'ultrason après l Daddition d'un milieu.