FR 2544080 A1 19841012 FR 8305638 A 19830406 2544 O$-O Procédé de détection et de mesure par fluorescence d'une endocytose cellulaire dépendante de protéines de la membrane cellulaire. L'invention est relative à un procédé de détection et de mesure par fluorescence d'une endocytose cellulaire dépendante de protéines de la membrane des cellules con- cernées, plus particulièrement à un procédé permettant des mesures quantitatives de cette endocytose cellulaire. Il est connu que des molécules de la surface cel- lulaire appartenant à la catégorie des récepteurs de pro- téines de transport et d'hormones, des récepteurs Fc d'immunoglobulines, des immunoglobulines de surface ou des antigènes codés par le complexe majeur d'histocompa- tibilité (MHC) peuvent donner lieu à des phénomènes d'endocytose par les cellules qui les expriment, en d'autres termes favoriser un mouvement desdites molé- cules vers l'intérieur desdites cellules ou une pénétra- tion de molécules étrangères dans lesdites cellules, à la faveur de la réaction desdites molécules avec des molé- cules capables de les reconnaître spécifiquement. Les molécules de la susdite catégorie ne sont que des exemples des nombreux types de protéines ou plus gé- néralement encore des molécules portées par les membranes cellulaires, notamment à leur surface, et susceptibles de donner lieu à de tels phénomènes d'endocytose Pour la commodité de langage, l'ensemble de ces molécules sera généralement désigné ci-après par l'expression de "déter- minants", en tant qu'ils sont aptes à se combiner avec une autre classe de molécules ou "ligands", cette combi- naison étant alors à l'origine, au moins dans un grand nombre de cas, de l'induction d'une endocytose cellulaire. Les anticorps monoclonaux constituent une catégo- rie particulière de ligands, particulièrement indiqués pour l'étude des interactions déterminant-ligand, par exemple en vue de la quantification des déterminants correspondant à la surface des cellules Cette étude est même facilitée par le fait que l'on peut "'visuali- ser" ces interactions grâce à l'utilisation de liposomes couplés, de façon covalente, à une molécule telle que la protéine A, ces liposomes modifiés pouvant alors être fixés spécifiquement aux déterminants concernés par l'in- termédiaire des anticorps monoclonaux correspondants. Lorsque se produit l'endocytose cellulaire, on observe alors une "internalisation" de ces liposomes, en d'autres termes une pénétration de ces liposomes à l'intérieur desdites cellules. L'utilisation de liposomes ainsi modifiés a déjà été envisagée dans des procédés d'évaluations quantita- tives relatives à des réactions d'endocytose mettant en jeu un couple récepteur-ligand déterminé C'est ce qui a été réalisé, par exemple par P Machy et Coll. ("Proc Natl Acad Sci USA", vol 79, p 4148-4152, juillet 1982) pour étudier l'endocytose différentielle de déterminants des surfaces de lymphocytes T et B avec des liposomes fluorescents porteurs d'anticorps recon- naissant spécifiquement ces déterminants et contenant du méthotrexate La fixation des liposomes modifiés à ces déterminants était alors détectée par fluorométrie, tandis que les endocytoses différentielles étaient éva- luées par les internalisations différentielles des lipo- somes modifiés, elles-mêmes mesurées par l'inhibition, médiée par le méthotrexate, de l'incorporation d'une désoxyuridine radioactivement marquée dans les deux types de lymphocytes Il a alors été constaté que les effets d'inhibition exercés par le méthotrexate transféré à l'intérieur des deux types de lymphocytes,par l'inter- médiaire des liposomes, étaient reconnaissables à la nature desdites cellules et des récepteurs membranaires-cibles corres- pondants, mais non liés aux nombres respectifs de lipo- somes fixés à leurs surfaces Les possibilités d'ana- lyses différentielles auxquelles la méthode décrite donne accès sont cependant encore assez limitées en raison des sensibilités relativement faibles des mar- queurs radioactifs, auxquelles s'ajoutent encore les risques liés à la radioactivité. L'invention a donc pour but de fournir une mé- thode encore plus sensible et à l'abri des risques dus à la radioactivité de détection et de mesure quantitative d'une endocytose cellulaire mettant en jeu un déterminant spécifique des cellules étudiées, à l'occasion de sa reconnaissance par un ligand correspondant. Elle a encore pour but de fournir une méthode per- mettant facilement des évaluations quantitatives diffé- rentielles des endocytoses induites par la même réaction déterminantligand, dans le cas de différents types de cellules susceptibles de porter le même ligand. Le procédé selon l'invention de détection d'une endocytose cellulaire à la faveur d'une mise en contact avec un ligand déterminé des cellules à étudier et éven- tuellement porteuses d'un déterminant susceptible d'être reconnu par ledit ligand et avec des liposomes modifiés par couplage covalent à une molécule elle-même apte à se fi- xer sur ledit ligand ou au ligand lui-même et retenant par en- capsulation une solution d'un fluorochrome, est caractérisé en ce que la concentration en fluorochrome de la solution encapsulée est initialement suffisamment élevée pour que soit assurée une auto-extinction de sa fluorescence. Il faut souligner que la susdite mise en contact doit être réalisée à une température à laquelle la cel- lule est-apte à exercer ses fonctions biologiques, par exemple à une température de l'ordre de 370 C pour des cel- lules d'origine humaine. Il est bien connu que les substances fluorochromes ou fluorescentes donnent en général lieu à une auto-extinction très marquée à concentration élevée. Un fluorochrome particulièrement efficace est consti- tué par la carboxyfluorescéinequi donne lieu,à con- centrations élevées,à une auto-extinction extrêmement forte Ceci étant,on peut avoir recours à tout autre fluorochrome, choisi de préférence parmi ceux qui se manifestent à l'extinction par un changement de colora- tion ou analogue, détectable par fluorométrie ou colo- métrie: on citera par exemple la fluorescéine, l'iso- thiocyanate de fluorescéine (FITC) ou le fluorochrome dénommé "Lucifer-yellow". Selon la présente invention, l'activité endocy- tique est alors détectée et mesurée par la libération dans le cytoplasme du fluorochrome encapsulé dans les liposomes, comme conséquence de l'internalisation des liposomes et de leur transport dans des compartiments intracellulaires, notamment acides La mesure de l'endo- cytose est alors directement liée à celle de la diminu- tion de l'extinction de la fluorescence initiale du fluorochrome, donc de l'augmentation, qui peut être quantifiée, de la fluorescence totale associée aux cel- lules, du fait de la dilution du fluorochrome dans les cytoplasmes de ces cellules. Ce procédé permet donc de mesurer: la densité relative de composants de la surface cellu- laire ou à leinverse d'un ligand susceptible de recon- naitre spécifiquement l'un de ces composants cellu- laires, la vitesse à laquelle ces composants peuvent être endocytés. L'invention offre la possibilité nouvelle et ad- ditionnelle de mesurer le devenir du ligand ou du déter- minant, c'est-à-dire son endocytose par la cellule qui l'exprime Cette information peut être obtenue soit pour une population de cellules par fluorométrie convention- nelle ou automatisée, soit pour ces cellules isolées au sein d'une population par cytofluorométrie. Le procédé selon l'invention est enfin d'une très grande sensibilité Il permet des analyses diffé- rentielles, notamment des mesures différentielles des cinétiques d'internalisation des liposomes, en fonction tant du déterminant ou du récepteur mis en jeu que de la cellule qui l'exprime. Le procédé selon l'invention permet également de distinguer lescouplesligand-déterminant qui,à l'occa- sion de leur interaction mutuellene conduisent pas à des réactions d'endocytose Ce sera le cas pour ceux des couples ligand-déterminant qui ne mettent en jeu que des réactions limitées strictement aux surfaces des membranes Dans un tel cas, la suppression de l'extinc- tion de la fluorescence ne sera pas observée, en raison de l'absence d'internalisation des liposomes. Les liposomes sont constitués de façon en soi connue Ils sont essentiellement à base de lipides, no- tamment de phospholipides, compatibles au moins en par- tie avec les constituants correspondants des membranes cellulaires Ils sont préparés par les techniques usuelles, notamment par traitement ultrasonique d'un mélange des lipides choisis et d'une solution concentrée du fluorochrome choisi Les liposomes formés peuvent en- suite être couplés de façon covalente avec ou conjugués à la mo- lécule destinée à assurer la liaison avec le ligand choisi, par exemple la protéine A lorsque le ligand est constitué par un anticorps, par toute méthode permettant ce cou- plage sans sensiblement affecter les liposomes Ce couplage est par exemple effectué par l'intermédiaire d'un agent de réticulation, tel que le N-hydroxysucci- nimidyl-3-( 2-pyridyldithio)-propionate (SPD?), selon les méthodes décrites par L D LESERMAN et Coll. ("Nature", vol 288, n 5791, p 602-604, il décembre 1980) ou J BARBET et Coll ("Journal of Supramolecular Structure and Cellular Biochemistry", 16: 243-258 ( 1981), "Cellular Recognition", 237-252). La molécule permettant la fixation audit ligand et qui est couplée ou conjuguée aux liposomes peut encore être rempla- cée par le ligand lui-même, le réactif ainsi formé n'étant cependant plus apte qu'à l'utilisation pour la détection de déterminants ou ré- cepteurs correspondants reconnaissables par ce même ligand sur les celluies étudiées. L'invention met à profit la différence considéra- ble des volumes des liposomes et des cellules à l'étude. Les dimensions des liposomes seront en général infé- rieures à 4000 Angstr 3 ms, de préférence inférieures à 1000 Angstr Oms, voire même à 600 Angstr 8 ms Si l'on sait que les cellules étudiées originaires de mammifères ont le plus souvent des dimensions de 10 à 15 microns, on reconnaîtra que l'utilisation de liposomes ayant des dimensions de 1000 Angstr 5 ms ( 0,1 micron), conduira à un coefficient multiplicateur de volume de l'ordre de 106 qui est à l'origine du phénomène de dilution du fluorochrome libéré à l'intérieur du cytoplasme desdites cellules, à l'occasion de l'internalisation des liposnomes dans des cellules subissant l'endocytose à l'occasion de la mise en oeuvre du procédé selon l'in- vention. La concentration initiale du fluorochrome des so- lutions encapsulées est telle que l'on observe de préférence au moins 70 % d'auto-extinction du fluorochrome,de préférence d'au moins 90 % et même 95 % vis-à-vis de l'intensité de fluorescence maximum qui peut être observée pour des solutions plus diluées de ce même fluorochrome Ces intensités maxima et les concentrations minima per- mettant d'obtenir les susdits effets d'auto-extinction peuvent être déterminées expérimentalement pour chacun des fluorochromes mis en oeuvre Dans le cas du fluorochrome préféré, la carboxyfluorescéine, ses con- centrations minima seront d'au moins 10 ihillimolaire, de préférence même d'au moins 100 millimolaire Les concentrations de fluorochrome utilisables ne sont pas limitées vers les concentrations les plus éle- vées, si ce n'est par des considérations de solubilité ou d'ordre pratique La dilution conduisant à la sup- pression de l'auto-extinction sera dans tous les cas suffisante, compte tenu des rapports volumiques très élevés entre les liposomes et les cellules étudiées, dont il a déjà été fait état plus haut. Les mesures relatives à la suppression de l'auto- extinction du fluorochrome mettent en jeu une fonction complexe de plusieurs paramètres, parmi lesquels les trois paramètres suivants ) le taux ou la vitesse d'endocytose du déterminant de surface cellulaire, par conséquent d'internali- sation des liposomes; ) la vitesse et le degré de libération de fluoro- chrome initialement encapsulé par le liposome dans le cytoplasme cellulaire; ) le flux du fluorochrome libéré à l'intérieur de la cellule qui est transporté à l'extérieur de la cel- lule. Il résulte de l'e 5 camen du premier et du second paramètres que le procédé selon l'invention permet des mesures cinétiques différentielles de l'internalisation des liposomes, par conséquent des évolutions relatives des endocytoses étudiées Lorsque le troisième para- mètre joue un rôle important, il peut limiter les pos- sibilités d'étudesdifférentielles de l'endocytose au niveau de la cellule isolée C'est ce qui peut se pro- duire dans les cas o l'on observerait que le troi- sième paramètre est prépondérant vis-à-vis du second, c'est-à-dire lorsque le flux de fluorochrome transporté à l'extérieur de la cellule tend à excéder la vitesse ou le degré de libération du fluorochrome initialement encapsulé par le liposome dans le cytoplasme cellu- laire On observera cependant que même dans ce-cas, des mesures différentielles pourront être effectuées au niveau global (diminution de l'extinction de fluores- cence au niveau de l'ensemble des cellules et du milieu dans lequel elles se trouvent), sinon au niveau de la cellule isolée. D'autres caractéristiques de l'invention apparaî- tront encore au cours de la description qui suit d'exemples de mise en oeuvre du procédé selon l'inven- tion, notamment en rapport avec le dessin dans lequel la fig 1 est un histogramme de fluorescence établi à partir d'environ 10 000 cellules fibroblastoides L de souris marquées selon l'invention et fournissant les intensités relatives de fluorescence (IRP) mesurées à C et 370 C respectivement, en fonction du nombre de cellules (NC), la fig 2 comporte des courbes représentatives de la variation de la fluorescence (F) observée pour un mar- queur utilisé dans les conditions de l'invention ou non,pour suivre l'internalisation des liposomes mar- qués en fonction du temps, en heures (H), la fig 3 est représentative de courbes semblables représentatives des variations de fluorescence observées, selon que le système déterminant-ligand est de ceux qui permettent l'observation d'une endo- cytose ou au contraire de ceux qui ne le permettent pas. Dans le cadre du présent exemple, on a utilisé des lymphocytes T provenant de souris CBA/J stimulés par de la concanavaline A et de cellules fibroblastoides L On a effectué des liaisons de conjugués de protéine A et de liposomes aux cellules T et L par l'intermédiaire d'un anticorps monoclonal anti-MHC (H-2) constitué par un anticorps kappa anti- H-2 Kk (H 100-30/33), du type Ig G 2 b décrit par LEMKE et Coll (Ed Hammerling, Elsevier North Holland Promedical Press, Amsterdam, 102-109, 1981) et par l'intermédiaire d'antisérums de lapins anti- fibronectine obtenus selon les techniques décrites par RAFF et Coll (BRAIN RES 174, 283-308, 1979) et GHANDOUR et Coll (J HISTOCHEM CYTOCHEM, 30, 165-170, 1982) Les conjugués de protéine A et de liposomes ont été préparés comme décrit par LESERMAN et Coll dans "Nature", 288, 602-604, 1980 Les petits liposomes, obtenus par un traitement aux ultrasons et à base de choline dipalmitoyl-phosphatidyle ( 65 % molaire), de cholestérol ( 34 %) et de phosphatidyl-éthanolamine modifié par SPDP ( 1 %) et contenant de la carboxy- fluorescéine 40 m M, ont été incubés pendant 16 heures avec de la protéine A modifiée par SPDP (à raison de 10 moles de SPDP par mole de protéine A) à une concen- tration finale de protéine A de 200 pg/m 11 ) Etude dela liaison spécifique des conjugués de pro téine A et de liposomes aux lymphoblastes T et aux cellules L préincubés avec des anticorps anti-H-2 K (H 1 i 00-30/33) ou antifibronectine. Des cellules T provenant de souris CBA/J sont in- cubées ( 30 x 106 cellules, 37 C, 7 % C 02) dans des fla- cons de cultures de tissus avec 20 ml de milieu 1 640 RPMI (GIBCO) additionné de sérum foetal de veau (FCS) à 5 % inactivé par la chaleur (GIBCO), de glutamine 2 m M, de 2-mercaptoéthanol à 0,05 M de pénicilline, de streptomycine et, afin d'induire la prolifération, de concanavaline A à 2 pg/mlo 40 heures plus tard, on re- cueille les cellules et on les met en suspension dans un milieu complété sans agent mitotique, à une concen- tration de 8 x 106 cellules/ml Les cellules L mises en culture dans un milieu RPMI additionné de FCS à 7 % sont recueillies par traitement avec de 1 'EDTA 1,5 m M dans un tampon PBS ( 5 minutes, 37 C),pour détacher les cel- lules adhérentes, sont ensuite lavées et remises en sus- pension à la même concentration Des aliquotes de 50 Pl de cellules sont ensuite placées dans des puits coniques de plaques de microtitrage à 96 puits et 10 pl de H 100- /33 à une concentration finale de 40 pg/ml ou d'anti- sérums antifibronectine à une dilution finale de 1/100 sont ajoutés aux puits appropriés Après 1/2 heure d'in- cubation à 4 C, on lave les cellules une fois et on les remet en suspension dans un milieu frais 10 pl de conjugué protéine A-liposomes représentant 220 pmoles de carboxyfluorescéine sont ensuite ajoutés à tous les puits contenant des échantillons et on laisse incuber à 4 C, pen- dant 1,5 heures De la protéine A libre ( 80 pg/ml) est ajoutée dans les puits correspondants quelques minutes avant les liposomes Les cellules sont ensuite lavées trois fois dans un tampon pour liposomes (Na Cl: 145 m M; HEPES 10 m M; p H 7,4) et la fluorescence associée me- surée sur un spectrofluorimètre Aminco SPF (Excitation: 488 nm, Emission: 520 nm), après lyse des cellules avec du TRITON X-100 à 0,5 % Les calculs sont faits par référence à des étalons de carboxyfluorescéine à 20 n M. Les résultats obtenus figurent dans le tableau qui suit: TABLEAU :: Protéine-A: Carboxyfluoresceine * Anticorps libre associée à la cellule :: (pmoles) : H 100-30/33:: 4, 23 -0,2 Cellules T: H 100-30/33: +: 0,06 0,01 :*: 0,09 0,01 Cellules L: H 100-30/33:: 7,77 0,24 : H 1100-30/33: +: 0,07 + 0,005 : anti-fibronectine: 1,53 0,006 : anti-sérum: : anti-fibronectine: +: 0, 17 + 0,05 : anti-sérum: :: : 0,08 t 0,02 ::: Les résultats figurant dans ce tableau témoignent donc de la fixation desdits liposomes sur les cellules. 2 ) Etude des cinétiques d'internalisation des liposomes marqués. Les expérimentations dont'les résultats sont illus- trés dans les figures ont été réalisées comme suit. Les lymphoblastes T et les cellules L sont récoltés dans les conditions sus-indiquées, remis en suspension dans un milieu RPMI et additionnés de FCS ( 4 x 107 cel- lules/ml) et incubés ( 40 C, 1 heure) dans des tubes à essai en plastique jetables, en présence ou en l'absence d'anticorps Après un lavage, ils sont réincubés ( 4 O C, 1,5 heures) en présence soit de conjugué protéine A- liposomes (équivalant à 40 pg phospholipide/106 cellules), soit d'un conjugué FITO-protéine A ( 20 pg/ml, Pharmacia) et lavés deux fois pour éliminer le matériau non lié Afin d'examiner la cinétique d'internalisation, on incube les cellules dans un bain d'eau à 37 C,et à des instants dif- férents, on transfère des aliquotes dans des tubes dans un bain de glace, ces tubes contenant un volume de milieu égal à trois fois celui du volume de chacun des aliquotes. Il en résulte un refroidissement rapide des cellules et l'arrêt des processus enzymatiques et métaboliques dépendant d'un apport en énergie On analyse ensuite les échantillons sur un détecteur de tri cellulaire EPICS V, en utilisant un modèle laser à ion argon 154 ( 4 W) L'excitation laser est de 200 m W à 488 nm avec un filtre Schott SAL 530 en combinaison avec un filtre en verre entaillé ("eut on glass filter") à 530 nm Le pho- tcmultiplicateur est réglé à 600 V Le flux de cellules est ajus- té à 1000 cellules par seconde Après exclusion des cellules mortes par tri basé sur des mesures de diffraction de lumière, on analyse 10 000 cellules à partir de chaque échantillon pour l'intensité de fluorescence. La carboxyfluorescéine qui n'est pas associée aux cel- lules n'interfère pas avec les mesures parce que seul un petit volume extra-cellulaire est illuminé. La figure 1 représente un histogramme de fluo- rescence de cellules L qui ont été colorées avec H 100-30/33 ( 100 pg/ml) et des protéines A-liposomes (CF 40 m M) à 41 C (courbe a) ou après incubation à 370 C (courbe b) pendant 2 heures. Les variations de fluorescence (F) des cellules T en fonction du temps sont illustrées dans la fig 2. Les cellules ont été mises en contact soit avec des liposomes contenant de la carboxyfluorescéine 100 N (courbe c) et 10 m M (courbe d), soit avec un conjugué FITC-protéine A (courbe e) Les valeurs retenues ont été basées sur les fenêtres de fluorescence correspondant à des intensités de fluorescence minima, de façon à ex- dure 90 % des cellules colorées au temps zéro comme fond de fluorescence Les intensités de fluorescence, après des temps d'incubation variables à 370 C sont en- suite mesurées et comparées à la mesure initiale. La fig 3 fournit des courbes représentatives des variations de fluorescence (F) observées pour des cellules qui ont été incubées en présence des anti- corps et en présence des conjugués protéine A-liposome La courbe g correspond aux observations faites en rapport avec les anticorps H 10030/33 et la courbe h correspond aux observations faites en rapport avec un antisérum-antifibronectine. Les observations suivantes peuvent être tirées de l'examen du tableau susdit et des figures. Les lymphocytes T et les cellules L fixent tous deux les conjugués protéine A-liposomes, lorsqu'ils sont incubés à 4 C en présence de H 10030/33, mais pas en son absence La liaison se produit aussi lorsque les cellu- les L sont préincubées avec des antisérums antifibronec- tine La liaison des conjugués protéine A-liposomes aux deux types de cellules peut être inhibée par les proté- ines A libres L'histogramme de fluorescence de la fi- gure effectué sur 10 000 cellules L marquées avec le con- * jugué protéine A-liposomes par l'intermédiaire des anti- H-2 Kk a montré que 98 % de ces cellules avaient été mar- qués, même si la plupart d'entre elles ne manifestaient qu'une fluorescence faible Le profil n'est pas modifié de façon importante au bout d'une durée de 4 heures à 4 C (non représenté). Lorsque ces cellules sont portées à 37 C pendant 2 heures, on observe un déplacement vers les intensités de fluorescence plus élevées (fig 1) Ce phénomène est lié à la suppression de il'auto-extinction de la carboxy- fluorescéine initialement fortement concentrée Dans l'expérience dont les résultats découlent de la fig 2, les blastes de cellules T, prétraités par les anticorps monoclonaux anti-H-2 Kk, ont été incubés à 37 C en pré- sence des deux préparations de conjugués protéine A- liposomes contenant de la carboxyfluorescéine à des con- centrations 100 millimolaire et 10 millimolaire ( 100 m M et 10 m M), respectivement, mais par ailleurs, identiques en taille, en composition lipidique et en densité de protéine A liée Ces figures révèlent que les liposomes contenant de la carboxyfluorescéine 100 mn I entraînèrent une augmentation importante de la fluorescéine, celle-ci continuant encore à s'accroître 4 heures après le début des mesures (figure 2) Les cellules incubées avec des liposomes contenant de la carboxyfluorescéine 10 m M ne présentèrent pas une augmentation de fluorescence ana- logue Les valeurs d'auto-extinction pour ces deux types de liposomes étaient initialement de 96 % et 74 % respec- tivement Ainsi les liposomes contenant de la carboxy- fluorescéine 100 m M étaient potentiellement aptes à am- plifier le signal de fluorescence jusqu'à 25 fois la valeur initiale, lorsqu'est supprimée l'auto-extinction, tandis que les liposomes à 10 m M ne pouvaient amplifier ce signal que 3 à 4 fois. La fig 2 montre qu'il n'y a pas eu d'augmentation de la fluorescence lorsqu'on remplace la carboxyfluores- céine non liée dans les liposomes par l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) lié de façon covalente à la protéine A. La suppression de l'auto-extinction initiale dépend du déter- minant de surface cellulaire visé Une comparaison de cel- lules L retenant des liposomes par l'intermédiaire d'anti- corps contre H-2 Kk et d'anticorps contre la fibronectine révèle que seul le déterminant H-2 Kk est associé à une augmentation de fluorescence cellulaire (fig 3), alors que le déterminant fibronectine ne l'est pas La fibro- nectine est une protéine structurelle exprimée à la sur- face des membranes dont on connaissait auparavant l'inca- pacité à induire une endocytose. Dans ce qui précède, on a essentiellement pris en considération le cas o les cellules portant le dé- terminant étudié étaient mises en contact séparément avec le ligand correspondant et les liposomes portant la molécule (ou conjugué à la molécule) suscepti- ble de se lier à son tour à ce ligand. Les cellules pourraient éventuellement être mises en contact également avec le complexe(liposome- molécule de 4 iaison-ligand)préalablement formé, par exemple avec le complexe liposome-protéine A-anticorps,. Bien que dans ce qui précède, on ait surtout considéré le cas des anticorps, il va de soi que l'in- vention pourrait être étendue à l'étude des endocytoses cellulaires accompagnant des mises en contact des cellules concernées avec des ligands autres que des anticorps, tels que les hormones ou protéines de trans- port qui pourraient reconnaître des déterminants corres- pondants sur lesdites cellules. D'une façon plus générale encore, le ligand peut être constitué par toute molécule possédant une affini- té pour un composant de la membrane cellulaire. Le procédé selon l'invention est applicable à toute forme'de diagnostic in vitro Par exemple, il pourra être utilisé dans des tests de routine sur des cellules sanguines obtenues,par exemple,par prélèvement veineux, en vue de déterminer les vitesses d'endocytose induites par certains couplesligand-déterminant, en vue de leur comparaison avec les vitesses d'endocytose induites par le même couple dans des cellules d'indivi- dus normaux Dans une autre application, on peut étu- dier l'effet des principes actifs de médicament à l'égard de cette endocytose, notamment lorsque le principe actif du médicament aura été encapsulé dans les liposomes avec le fluorochrome utilisé L'action du médicament pourra alors être'détectée par les variations constatées au niveau des cinétiques d'internalisation des liposomes marqués, donc des cinétiques de suppressions de l'auto-extinction initiale du flubrochrome. REVENDICATIONS 1 -Procédé de détection et de mesure d'une endo- cytose cellulaire à la faveur d'une mise en contact avec un ligand déterminé des cellules à étudier, qui comprend la mise en contact de ces cellules et de ce ligand avec des liposomes modifiés par couplage covalent à une molécule elle-même apte à se fixer sur ledit ligand et retenant par encapsulation une solution d'un fluorochrome, caractérisé en ce que la concentration en fluorochrome de la solution encapsulée est initiale- ment suffisamment élevée pour que soit assurée une auto- extinction de sa fluorescence et en ce que l'on mesure ensuite la suppression au moins partielle de l'auto-extinction de la fluorescence qui résulte de l'internalisation desdits liposomes modifiés. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration du fluorochrome est telle que l'auto-extinction observée est égale à au moins 70 % vis-à-vis de la fluorescence maximum qui peut être ob- servée pour des solutions plus diluées du même fluoro- chrome. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que pourcentage d'auto-extinction est d'au moins %, de préférence d'au moins 95 %,vis-à-vis de l'in- tensité de fluorescence maximum qui peut être observée pour des solutions plus diluées de ce même fluorochrome. 4 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les liposomes ont des dimen- sions de préférence inférieures à 4000 Angstr 8 ms, de préférence inférieures à 1000 Angstr 5 ms, voire même à 600 Angstr 5 ms. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le fluorochrome est consti- tué par la carboxyfluorescéine. 6 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la concentration de la carboxyfluorescéine encapsulée est au moins 10 millimolaire, de préférence au moins 100 millimolaire 7 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 6, caractérisé en ce que le ligand est un anticorps monoclonal et la molécule couplée de façon co- valente au liposome est de la protéine A.