FR 2543409 A1 19841005 FR 8404894 A 19840329 La présente invention concerne un additif ali- mentaire et un aliment pour animaux contenant Bacillus Licheniformis et une nouvelle souche de Bacillus licheni- formis La nouvelle souche de Bacillus licheniformis est la souche MN-001, portant le numéro de dépôt FERM BP-266. Ces dernières années, les aliments pour animaux ont beaucoup évolué et sont passés des aliments simples d'origine locale aux aliments composés produits dans des usines modernes, les aliments composés constituant à ce jour une proportion importante de la totalité des aliments consommés. On emploie en général dans ces aliments composés des ingrédients complémentaires constitués de divers addi- tifs tels que des amino-acides, des minéraux, des vitami- nes, des antibiotiques, des enzymes, des préparations de micro-organismes vivants, etc, à diverses fins, par exem- ple pour l'équilibrage alimentaire, l'amélioration de la digestion et de l'absorption, l'accélération de la crois- sance, la prévention des maladies, en plus des ingrédients principaux tels que les grains de céréales, les tourteaux, les farines de poissons, les huiles et graisses, etc. Cependant, en ce qui concerne les antibiotiques, leur emploi'tend maintenant à être soumis à des limitations et leur domaine d'utilisation tend à être limité et réduit car on craint que les antibiotiques résiduels transmis à l'organisme humain ne provoquent des allergies ou des modifications de la flore bactérienne intestinale. En ce qui concerne les enzymes, des préparations de lipase, d'amylase, de cellulase, de protéase, etc et de leurs mélanges ont été étudiées, cependant, dans les conditions actuelles, on ne peut pas espérer un résultat net car leurs effets sont irréguliers. En ce qui concerne les préparations de micro-or- ganismes vivants, on a étudié celles à base de Bacillus natto, de bactéries productrices d'acide lactique, de bac- téries productrices d'acide butyrique, de Lactobacillus bifidus, etc, cependant, bien qu'elles produisent un cer- tain effet, elles ne sont pas encore appropriées. Par conséquent, on ne dispose pas actuellement de l'additif alimentaire pour animaux idéal. Pour ces raisons, les demanderesses ont effectué des recherches pour trouver des micro-organismes naturels du genre Bacillus utiles pour créer un additif alimentaire pour animaux et ont découvert que, de façon inattendue, Bacillus licheniformis est non seulement sans danger mais produit divers effets sur les animaux L'invention repose sur cette découverte. L'invention concerne un additif alimentaire et un aliment pour animaux contenant'Bacillus licheniformis comme micro-organisme utile. Le Bacillus licheniformis utilisé dans l'inven- tion appartient au groupe des bactéries anaérobies faculta- tives du genre Bacillus Selon l'invention, on peut utili- ser efficacement non seulement les souches naturelles mais également leurs mutants artificiels Parmi ces souches, une souche préférée est un mutant appelé Bacillus licheni- formis MN-001 qui a été déposé au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, sous le numéro de dépôt FERM BP-266. La souche MN-001 de Bacillus licheniformis (qu'on appelle ci-après souche MN-001) présente les propriétés microbiennes suivantes A A Propriétés morpho 06 giques: ( 1) Bacille-'large de 0,5-0,8 Dm et long de 2-3 mm. ( 2) Coloration de Gram: positive ( 3) Formation d'endospores elliptiques. ( 4) Mobilité: positive B Propriétés culturales: ( 1) Gélose ordinaire: culture abondante Pas de pro- duction de pigment. ( 2) Milieu contenant de la mélasse et du sulfate d'am- monium comme composants principaux: culture abondante Pas de production de pigment. ( 3) Milieu liquide contenant du chlorure de sodium: -5 % de sel: culture 7 % de sel: culture % de sel: culture C Propriétés physiologiques: ( 1) Activité catalasique: + ( 2) Culture en conditions anaérobies: + ( 3) Test VP (Voges-Proskauer): + ( 4) Culture à température élevée: à 50 C: + à 55 C: - ( 5) Formation d'acide à partir des glucides: Glucose: + L-arabinose: + Dxylose: + Mannitol: + D-tagatose: + ( 6) Activité argininedihydrolasique: + ( 7) Activité lécithinasique: - ( 8) Hydrolyse de l'amidon: + ( 9) Hydrolyse de la gélatine: + ( 10) Hydrolyse de l'ADN: + ( 11)Utilisation des citrates: + ( 12)Utilisation des propionates: + ( 13) Réduction des nitrates: + ( 14)Formation d'indole: - ( 15)Désamination de la phénylalanine: -. Le Bacillus licheniformis utilisé dans la pré- sente invention peut être cultivé en milieu liquide ou sur milieu solide selon des techniques classiques de fermenta- tion. Comme milieu, on peut utiliser de façon générale divers milieux tels qu'un milieu naturel, un milieu semi- synthétique et un milieu synthétique. ( 1) Comme source de carbone, on peut utiliser les suivantes: glucose, saccharose, dextrine, glycérol,ami- don, mélasse et similaires. ( 2) Comme source d'azote: peptone, extrait de viande, extrait de levure, levure sèche, tourteaux de soja, urée, thio-urée, sels d'ammonium, nitrates et autres composés azotés organiques ou minéraux. ( 3) Comme sel minéral: phosphates, nitrates, carbona- tes, chlorures etc de magnésium, manganèse, potassium, calcium, fer, etc. De plus, on peut ajouter au milieu, des amino- acides, des vitamines, des acides nucléiques et des compo- sés apparentés Selon les techniques classiques de fermen- tation, on cultive le micro-organisme à une température appropriée et pendant une période adéquate, de préférence par exemple à une température de 20 à 50 'C et pendant une période de 12 heures à 5 jours. Selon l'invention, on peut utiliser le liquide de culture obtenu avec ou sans isolement des cellules par lavages répétés De plus, le liquide de culture, un de ses produits de transformation et les cellules isolées peuvent êt-re soumis à un traitement de lyophilisation ou de séchage par pulvérisation, etc avec ou sans les additifs à combi- ner La composition ainsi obtenue peut être utilisée comme additif alimentaire ou aliment de l'invention. Pour préparer un aliment ou un additif alimen- taire d'emploi général pour les animaux selon l'invention, il suffit de combiner le liquide de culture directement ou sous une forme diluée avec les agents diluants suivants farine de blé, amidon, dextrine, etc et des matières pre- mières pour aliments, par exemple des graines de céréales, des balles et des sons tels que du son-de riz déshuilé, des tourteaux de graines riches en huile et en graisse et simi- laires. Si on le désire, après isolement des cellules du liquide de culture par lavage, on peut combiner les cellu- les isolées de la même façon que décrit ci-dessus. La composition à base de micro-organismes vivants constitués de Bacillus licheniformis ainsi obtenue est four- nie aux animaux sous forme d'un aliment la contenant ou sous forme d'un additif alimentaire en une quantité appro- priée permettant un accroissement du poids corporel et une accélération de la croissance Des exemples'typiques des animaux auxquels-convient l'additif alimentaire ou l'ali- ment de la présente invention sont les suivants: les ani- maux d'élevage tels que les bovins de boucherie, les vaches laitières, les veaux, les porcs, les porcelets, les moutons, les chèvres, les chevaux, les lapins, les chiens, les chats, etc; les volailles telles que les poulets, les poules pondeuses, les jeunes oiseaux de basse-cour, les coqs re- producteurs, les canards domestiques, les oies, les dindes, les cailles, les petits oiseaux, etc. De plus, comme la quantité administrée varie se- lon des facteurs tels que la nature des animaux, leur âge et la nature des autres ingrédients alimentaires, il est difficile de la définir sans variations Cependant, de fa- çon générale, on ajoute la composition de l'invention à la nourriture à raison de 102 à 1015 cellules vivantes de Bacillus licheniformis, de préférence de 104 à 1012 cel- lules et mieux de 105 à 10 cellules par kg de nourriture. L'invention est illustrée ci-après par des exem- ples de production et des exemples non limitatifs. Exemple de production en poids de sulfate d'ammonium, 0,1 partie en poids de phos- phate dipotassique et 0,05 partie en poids d'extrait de le- vure à 100 parties en poids d'eau du robinet pour préparer une solution nutritive On ajuste le p H de la solution ain- si obtenue à 8,0 avec de l'acide chlorhydrique 0,1 N et de l'hydroxyde de sodium 0,1 N pour préparer un milieu liquide. On introduit 1 litre de milieu liquide dans une jarre de fermentation et on stérilise à 121 'C pendant 15 minutes. On ensemence ensuite le milieu liquide stérilisé avec une culture préalable de la souche MN-001, PERM BP266 de Bacillus licheniformis, puis on cultive avec agitation pen- dant 24 heures. On recueille ensuite les cellules par centrifuga- tion du liquide de culture On ajoute 1 kg d'amidon aux cel- lules recueillies et on sèche pour obtenir la composition de la souche MN001 de Bacillus licheniformis (qu'on appelle ci-après composition de MN001) Cette composition contient 1 i 8 cellules par kg. D'autre part, on obtient également une autre com- position en opérant comme décrit ci-dessus, si ce n'est qu'on remplace l'amidon par du son de riz déshuilé. EXEMPLE 1 - (Elevage de poulets à rôtir) On divise 120 poulets à rôtir ( 60 femelles, 60 mâles) en trois groupes constitués respectivement de 40 poules à rôtir ( 20 femelles, 20 mâles) et on effectue des essais d'alimentation pendant 8 semaines en fournissant un aliment préparé par addition de la composition de MN-001 obtenue dans l'exemple de production (contenant 108 cellu- les par kg d'amidon) à l'aliment de base dont la composi- tion figure dans le tableau 1 ci-dessous Le groupe témoin de poulets à rôtir reçoit un aliment préparé par addition d'amidon à l'aliment de base (groupe amidon). Les résultats figurent dans le tableau 2. TABLEAU 1 (Composition de l'aliment de base) 0-4 semaines après le début de l'élevage -8 semaines après le début de l'élevage Aliment du commerce pour poulets à rôtir pour la première période (nota *) Aliment du commerce pour poulets à rôtir pour la seconde période (nota **) (nota) Aliment standard d'essai fabriqué par Nippon Haigoshiryo Co Ltd. Protéines brutes Graisses brutes Fibres brutes Cendres brutes EM (énergie métabolisable) (k J/kg) SD pour poulets à rôtir pour la première période * > 5 3 12550 SD pour poulets à rôtir pour la seconde période ** > 19 > 12970 o o -J t'l Ln 4 '- -,0 C> Do TABLEAU 2 Poids corporel initial (g/poulet à rôtir) Poids corporel après 8 semai- nes (g/poulet à rôtir) Accroissement du poids corporel (g/poulet à rôtir) (indice) Indice de consonmation (indice) Témoin (groupe à 0,1 % d'amidon) Groupe à composition de MN-001 ( 0,1 %) 2,32 ( 100) 2,13 ( 91,8) en OD ( 100) ( 108,0) EXEMPLE 2 (Elevage de porcelets) On divise 30 porcelets sevrés âgés de 25 jours ( 15 femelles, 15 mâles) en trois groupes constitués res- pectivement de 10 porcelets ( 5 femelles, 5 mâles) et on effectue les essais d'alimentation suivants pendant 14 semaines: le premier groupe, c'est-à-dire le groupe de porcelets témoins, est élevé avec un aliment préparé par addition de son de riz déshuilé à l'aliment de base dont la composition figure dans le tableau 3 ci-dessous (groupe son de riz déshuilé) Le second groupe de porcelets est élevé avec un aliment préparé par addition de la composi- tion à base de Bacillus natto "Glogen 8 " (nom de marque d'un produit d'Eisai Co, Ltd, contenant 108 cellules/g d'amidon) à l'aliment de base Le troisième groupe de por- celets est élevé avec un aliment préparé par addition de la composition de MN-001 obtenue dans l'exemple de produc- tion (avec du son de riz déshui 16 et contenant 108 cellules /g) à l'aliment de base. Les résultats de ces essais d'élevage figurent dans le tableau 4. Mais Farine de bl Tourteau de Farine de po Lait écrémé Son de riz déshuilé Son de blé Glucose Minéraux, vitamines e TABLEAU 3 (Composition de l'alimentation de 0-1 2-5 semaine semaines 28,1 34,3 d 20 25 soja 7 8 isson 7 5 27 15 tc - 0,9 base) 6-14 semaines ,9 6,5 7,3 2,7 5,3 (parties en poids) TABLEAU 4 Poids corporel initial (kg/porcelet) Poids corporel après 14 semai- nes (kg/porcelet) Accroissement du poids cor- porel (kg/porcelet) (indice) Indice de consommation (indice) Témoin (groupe à 0,1 % de son de riz déshuilé) Groupe Glogen-8 ( 0,1 %) Groupe à composition de MN-001 ( 0,1 %) 7,3 7,3 7,3 67,9 ,1 73,8 2,80 ( 100) ,6 ( 100) 62,8 ( 103,6) 66,5 ( 109,7) 2,69 ( 96,O) o- 2,55 ( 91,1) UL 4 o C% C) % O Ces résultats montrent que l'addition de micro- organismes vivants de Bacillus licheniformis à un aliment pour animaux permet d'obtenir un accroissement important du poids corporel, de l'indice de consommation et du taux de digestion. EXEMPLE 3 On répartit 40 truies pleines pesant de 170 kg à kg en trois groupes constitués respectivement de 20 truies et on effectue les essais d'alimentation suivants pendant 80 jours ou plus (de 60 jours avant la mise bas à 21 jours après la mise bas) On élève le groupe de truies témoins en leur fournissant un aliment préparé par addi- tion d'amidon à du Highbreed B (nom de marque d'un aliment de Kumiai Haigoshiryo Co, Ltd dont la composition figure à titre de référence dans le tableau 5) (groupe amidon) On élève les truies du groupe d'essai en leur fournissant un aliment préparé par addition de la composition de MN001 obtenue dans l'exemple de production (contenant de l'ami- don et 108 cellules vivantes/g) à l'aliment ci-dessus Les résultats de ces essais d'alimentation figurent dans le ta- bleau 6. TABLEAU 5 Composition du Highbreed B Protéines brutes 15,0 % ou plus Graisses brutes 2,0 % ou plus Fibres brutes 10,0 % ou moins Cendres brutes 10,0 % ou moins Calcium 0,6 % ou plus Phosphore 0,45 % ou plus Protéines brutes di- gestibles 11,5 % ou plus Quantité totale d'aliments diges- tibles 72,0 %-ou plus TABLEAU 6 Groupe témoin Groupe d'essai Composition de l'aliment: Aliment composé pour l'éleva- ge des truies (%) Additifs (%) Nombre de truies Truies: poids corporel moyen (kg/truie) Nombre de truies ayant mis bas Nombre moyen de porcelets nés (porcelets/truie) Poids moyen des porcelets nés (kg/porcelet) Nombre moyen des porcelets se- vrés (porcelets/truie) Survie (%) (nombre moyen de por- celets sevrés/nombre moyen de porcelets nés x 100) amidon (O, 1) composition de MN-001 ( 0,1) 178,0 9,4 i 1,39 7,7 177,0 9,6 1,40 8,6 89,6 81,9 EXEMPLE 4 On répartit 10 taurillons reproducteurs de race Holstein âgés de 1 semaine en deux groupes constitués cha- cun de 5 taurillons D'une part, on prépare un succédané de lait pour le groupe témoin par addition d'amidon au succé- dané de lait-de base dont la composition figure dans le ta- bleau 7, et, d'autre part, on prépare le succédané de lait du groupe d'essai par addition de la composition de MN-001 obtenue dans l'exemple de production (contenant de l'amidon et 108 cellules vivantes/g) au succédané de lait de base. On effectue les essais d'alimentation comme suit on dissout et disperse dans 7 parties en poids d'eau chaude 1 partie en poids du succédané de lait de chaque groupe dé- crit ci-dessus et on alimente respectivement chaque groupe avec le succédané de lait On élève chaque groupe de tau- rillons en leur fournissant respectivement le succédané de lait obtenu'ci-dessus pendant 4 semaines - Les résultats de ces essais d'alimentation figu- rent dans le tableau 8. Selon la méthode récente d'élevage du jeune bé- tail au Japon,on fournit un aliment en pastilles (conte- nant moins de protéines et de graisses que le succédané de lait) qui est appelé Calfstarter en combinaison avec un succédané de lait comme décrit ci-dessus, cependant, dans cet exemple, pour examiner uniquement l'effet du succédané de lait lui-même, on n'utilise pas le Calfstarter en combi- naison avec lui. TABLEAU 7 Division Ingrédients et rapport de mélange dans le succédané de lait (parties en poids) Groupe témoin Lait écrémé 70 Petit lait 10 Suif de boeuf 18 Additif ali- mentaire (Note 1) 2 Amidon 0,1 Composition de MN-001 - Lécithine 0,5 (Note 1) Contenant des vitamines et des minéraux TABLEAU 8 Groupe témoin Poids corporel moyen (kg/veau): Début de l'alimentation (âge: t semaine) 45,0 Fin de l'alimentation (&ge: semaines) 72,3 Accroissement moyen du poids corporel (kg/veau) 27,3 Indice d'accroissement du- poids corporel 100 Groupe d'essai 0,1 0,5 Groupe d'essai 44,8 74,1 29,3 107,3 TABLEAU 8 (suite) Groupé témoin Groupe d'essai Consommation d'aliments (nota 2)(kg/veau) 45,7 46,0 Indice de consommation 0,60 0,64 Crises de diarrhée (nombre/ veau/période d'essai): Diarrhée liquide + explosive 5,0 2,5 Diarrhée explosive 2,5 0,3 (Nota 2) Succédané de lait (les valeurs correspondent à la conversion en poudre)- *EXEMPLE 5 Parmi 100 poules White Leghorn âgées de 68 se- maines, on en choisit 60 ayant présenté des taux de ponte élevés au cours des quatre semaines précédentes et on les répartit en deux groupes On effectue ensuite les essais d'élevage suivants: pendant 2 semaines après la période préliminaire d'alimentation de 1 semaine: on élève les poules-du groupe témoin en leur fournissant un aliment pré- paré par addition d'amidon au "Mylayer 17 " (nom de marque du produit alimentaire pour poules pondeuses de Kumiai Haigoshiryo Co, Ltd, dont la composition figure dans le tableau 9) (groupe amidon) On élève les poules du groupe d'essai en leur fournissant un aliment préparé par addition de la composition de MN-001 obtenue dans l'exemple de pro- duction (contenant de l'amidon et 108 cellules vivantes/g) à l'aliment ci-dessus. Les résultats de ces essais d'élevage figurent dans le tableau 10. Voir Tableaux 9 et 10 à la page suivante. TABLEAU 9 Composition du Mylayer 17 Protéines brutes 17 % ou plus Graisses brutes 3, 5 % ou plus Calcium 2,8 % ou plus Phosphore 0,55 % ou plus Fibres brutes 5,0 % ou moins Cendres brutes 13 % ou moins Energie métabolisable 11 500 kg J/kg ou plus TABLEAU 10 Groupe Groupe témoin 'd'essai Composition de l'aliment: Aliment pour les poules pondeuses % 100 100 Additifs (%) 0,1 0,1 Nombre de poules étudiées 30 30 Taux moyen de ponte-(%) 68 75 Poids moyen des oeufs 59,5 60,0 Indice moyen de conversion alimentaire 2,78 2,58 (valeur relative) ( 100) ( 92,8) Revendications 1 Additif alimentaire pour animaux caractérisé en ce qu'il contient des micro-organismes de Bacillus lichenifor- mis comme micro-organismes utiles. 2 Additif alimentaire pour animaux selon la revendi- cation 1, caractérisé en ce que les micro-organismes appar- tiennent à la souche MN-001 de Bacillus licheniformis qui a été déposée au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, sous le numéro de dépôt FERM BP-266. 3 Aliment pour animaux caractérisé en ce qu'il con- tient des micro-organismes de Bacillus licheniformis comme micro-organismes utiles. 4 Aliment pour animaux selon la revendication 3, ca- ractérisé en ce que les micro-organismes appartiennent à la souche MN-001 de Bacillus licheniformis qui a été déposée au Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, sous le numéro de dépôt FERM BP- Souche MN-001 de Bacillus licheniformis caractéri- sée en ce qu'elle présente les propriétés microbiennes sui- vantes: A propriétés morphologiques: ( 1) bacille large de 0,5-0,8 gm et long de 2-3 gm ( 2) coloration de Gram: positive - ( 3) formation d'endospores elliptiques ( 4) mobilité: positive B propriétés culturales: ( 1) gélose ordinaire: culture abondante; pas de pro- duction de pigment ( 2) milieu contenant de la mélasse et du sulfate d'ammo- nium comme composants principaux: culture abondan- te; pas de production de pigment ( 3) milieu liquide contenant du chlorure de sodium: % de sel: culture 7 % de sel: culture % de sel: culture C propriétés physiologiques: ( 1) activité catalasique: + ( 2) culture en conditions anaérobies: + ( 3) test VP (Voges-Proskauer): + ( 4) culture à température élevée-: à 50 C: + à 550 C: - ( 5) formation d'acide à partir des glucides: glucose: + L-arabinose: + Dxylose: + mannitol: + D-tagatose: + ( 6) activité argininedihydrolasique: + ( 7) activité lécithinasique: - ( 8) hydrolyse de l'amidon: + ( 9) hydrolyse de la gélatine: + ( 10) hydrolyse de l'ADN: + ( 11)utilisation des citrates: + ( 12)utilisation des propionates: + ( 13)réduction des nitrates: + ( 14)formation d'indole: - ( 15)désamination de la phénylalanine: - ( 16)propriétés spéciales: présente une grande capacité de production de protéase et de cellulase exocellu- laires.