FR 2543970 A1 19841012 FR 8405575 A 19840409 Anticor Ds vis-à-vis de cham Dianons du genre Asperaillus La présente invention concerne le domaine des techniques de fusion de cellules, en particulier un anti- corps produit par une cellule résultant de la fusion entre une cellule capable de produire un anticorps et une cellule capable de proliférer en permanence in vitro par sous-cul- ture, la cellule résultant de la fusion étant désignée par la suite sous le nom "hybridome" Plus particulièrement, cette invention concerne un anticorps contre l'antigène de surface d'un champignon appartenant au genre Aspergil- lus, un tel anticorps ayant un pouvoir (monoclonal) haute- ment spécifique L'invention concerne également un hybri- dome produisant un tel anticorps et la préparation et l'utilisation d'un tel anticorps. Récemment, les maladies infectieuses causées par les bactéries ont diminué grâce au développement de la médecine préventive et à la diffusion des antibiotiques, tandis qu'au contraire, les maladies causées par les cham- pignons, c'est-à-dire les mycoses, ont tendance à augmen- ter dans le monde La plupart de tels champignons causant des mycoses sont habituellement présents dans l'environne- ment normal, par exemple dans la bouche, l'appareil diges- tif, le pharynx, la peau ou le vagin d'un corps en bonne santé Parmi les mycoses, on a signalé l'endocardite, la pneumonie, l'uropathie, la méningite, l'osthéopathie, l'arthrite, les dermatoses et similaires Il est également connu que les mycoses coïncident avec les maladies chro- niques destructrices telles que la phtisie et le cancer et en aggravent considérablement leurs sympt 8 mes. Actuellement, on connait peu de remèdes efficaces pour guérir les mycoses et de plus actuellement les remèdes disponibles sont accompagnés de graves effets secondaires. Par ailleurs, jusqu'ici, on a utilisé des antibiotiques fongicides tels que l'amphotéricine B et la 5-fluorocytô- sine pour guérir les mycoses Leur effet sur les champi- gnons est cependant insuffisant et des effets secondaires se produisent lors de leur utilisation. On a également essayé de traiter de telles mala- dies par un anticorps, par exemple en administrant à un malade une préparation de gamma-globuline humaine contre une infection Une telle préparation est considérée, ce- pendant, comme ayant une faible teneur en anticorps spéci- fique vis-à-vis du champignon causant l'infection puisqu'il n'est pas soumis par exemple à une immunisation dans son procédé de préparation, et par conséquent les activités sont quelque peu limitées Pour un traitement avec un anti- corps ayant un titre augmenté par suite d'immunisation, - on connait déjà une sérdthérapie dans un cas d'empoisonne- ment aigu par exemple par un serpent Bien qu'une telle thérapie montre un certain effet remarquable, on peut susciter une réaction d'immunité vis-àvis de l'antigène étranger et il peut se produire une réponse allergique étant donné qu'un tel sérum est un sérum étranger, par exemple de chevalet contient un certain nombre de conta- minants autres que l'anticorps spécifique Une telle séro- thérapie n'a pas été appliquée aux traitements de mycoses. La détection rapide et l'identification précise de ces champignons sont, par conséquent, importantes pour un diagnostic clinique et un mode de guérison efficace pour les mycoses est requis Par ailleurs, il est néces- saire de reconnaître et séparer une levure de ferment à partir de champignons dangereux dans le procédé de fermen- tation et de brassage L'Asperaillus, qui constitue l'ob- jet de la présente invention, est un exemple typique de tels champignons. Jusqu'à présent, la classification et l'identifi- cation de champignons du genre Aspergillus sont basées sur les propriétés morphologiques et biochimiques Un tel pro- cédé nécessite des analyses expérimentales longues, péni- bles et par conséquent il ne convient pas à l'utilisation pratique On connaît également une méthode d'identifica- tion sérologique qui utilise les facteurs du sérum obtenus par l'immunisation d'un animal tel que le lapin suivie de l'absorption avec une cellule d'une espèce différente de celle ayant été utilisée lors de l'immunisation Le fac- teur sérologique est un mélange de divers anticorps ayant différentes spécificités et par conséquent la spécificité ou titre diffère inévitablement entre les lots dans une certaine mesure De plus, une réaction secondaire inatten- due due aux contaminants peut parfois se produire Par ailleurs, le titre du facteur sérologique obtenu est en général relativement faible étant donné que les champi- gnons appartenant au môme genre se ressemblent quant aux propriétés antigènes De plus, l'immunisation comprend des procédés difficiles Ainsi, ces méthodes de classifi- cation et/ou d'identification des champignons sont limitées quelque peu du point de vue fiabilité. Les inventeurs de la présente invention ont fait un gros effort pour rechercher un procédé pour préparer un anticorps monoclonal contre un champignon du genre Asper- qillus et sont arrivés à l'invention dans laquelle on peut obtenir un tel anticorps avec une haute spécificité, un titre élevé et une faible concentration en agents de con- tamination à partir d'un hybridome entre une cellule capa- ble de produire un anticorps contre un champignon du genre Asveraillus (désigné quelquefois par la suite sous le nom "cellule productrice d'anticorps anti-aspergillus", ou simplement sous le nom de "cellule productrice d'anti- corps") et une cellule capable de repiquage permanent in vitro (désignée quelquefois par la suite sous le nom de "cellule repiquée") Les présents inventeurs ont également découvert qu'un tel anticorps est utile pour la classifi- cation et/ou l'identification d'un champignon du genre Aspergillus L'anticorps peut être aussi utile pour four- nir un procédé de guérison efficace d'une infection avec un tel champignon. Il est déjà connu qu'un hybridome qui peut pro- duire un anticorps spécifique peut être obtenu par fusion de cellules à partir d'une cellule capable de produire un anticorps et une cellule de myélome Voir par exemple Kbhler et al, Nature, 256, 495-497 ( 1975) et Eur J. Immunol, 6, 511-519 ( 1976) On n'a pas connu, cependant, d'hybridome capable de produire un anticorps vis-à-vis d'un champignon tel que l'Aspergillus avant la présente invention. Un objet de la présente invention est par consé- quent de fournir un procédé de préparation d'un anticorps spécifique contre l'antigène de surface d'un champignon appartenant au genre Asperaillus - Un autre objet de l'invention est de fournir un anticorps anti-aspergillus hautement spécifique et un pro- cédé-de préparation de celui-ci par la technique de fusion de cellules. Encore un autre objet de l'invention est de four- nir un hybridome capable de produire un tel anticorps. Un autre objet est de fournir un procédé de classification et/ou d'identification du champignon du genre Aspergillus par un tel anticorps. Egalemezint, un objet de la présente invention est de fournir un remède pour l'aspergillose contenant un tel anticorps comme composant efficace. La présente invention a également pour objet de fournir un dérivé d'un tel anticorps efficace dans l'uti- lisation pour la classification, l'identification et/ou la guérison des maladies sus-mentionnées. D'autres objets de la présente invention appa- raitront évidents dans les descriptions détaillées sui- vantes des modes de réalisation spécifiques, non limitatifs. Le procédé pour préparer un anticorps anti-asper- gillus de la présente invention comprend la préparation d'un hybridome à partir d'une cellule produisant un anti- corps anti-aspergillus et d'une cellule repiquée, en parti- culier une cellule de myélome, et la récupération de l'an- ticorps secrété par l'hybridome. Le procédé de l'invention va être décrit par la suite avec plus de détails. A PREPARATION DE LA CELLULE PRODUISANT DE L'ANTICORPS. Dans la présente invention, une cellule capable de produire un anticorps contre un champignon appartenant au genre Asperaillus et une cellule qui peut être conservée de façon permanente par repiquage in vitro sont essentiel- les pour obtenir un hybridome capable de produire l'anti- corps anti-aspergillus et de proliférer de façon permanente par repiquage in vitro. La cellule produisant l'anticorps anti-aspergil- lus peut être obtenue à partir de toute espèce animale y compris l'homme Une immunisation de l'animal n'est pas essentielle bien qu'une telle immunisation préliminaire puisse améliorer remarquablement l'efficacité de récupéra- tion de l'hybridome désirable. Lorsque l'origine d'une telle cellule est hu- maine, on peut choisir toute personne qui a des antécé- dents d'aspergillose ou bien une valeur de titre élevée de sérum contre le champignon du genre Aspergillus On peut aussi obtenir une telle cellule à partir d'un corps vivant immunisé avec un immunogène L'immunogène peut être une cellule viable, une cellule qui est traitée avec de la glutaraldéhyde, de la mitomycine ou par la chaleur et de ce fait ne peut pas proliférer, ou bien l'antigène de surface séparé d'une cellule par un traitement approprié avec par exemple une enzyme et purifiée. Toute espèce du genre Aspergillus peut être uti- lisée dans l'invention et toute morphologie peut être ac- ceptable, par exemple, hyphe, spore, etc Un exemple de telle espèce est: l'Aspergillus fumigatus, l'Asperaillus niaer, l'Aspergillus flavus ou l'Aspergillus orvzae. L'immunogène utilisé dans l'immunisation peut être mélangé avec un adjuvant tel que l'adjuvant complet ou incomplet de Freund L'immunogène peut être administré par tout moyen classique tel que des injections sous-cuta- nées, intrapéritonéales, intraveineuses, intradermiques et intramusculaires Une injection sous-cutanée ou intrapéri- tonéale peut être préférable Une seule immunication peut être possible bien que l'immunisation puisse être effectuée de façon répétée plusieurs fois avec un intervalle appro- prié par exemple de une à cinq semaines En mesurant le titre de l'anticorps dans le sérum de l'animal immunisé, on peut utiliser l'animal dont le titre a été suffisamment élevé pour obtenir la cellule produisant l'anticorps, ce qui entraîne une amélioration de l'efficacité des opéra- tions ultérieures La cellule préférable dérive de l'animal le 3 ème-5 ème jour après l'immunisation finale La cellule produisant l'anticorps est une cellule de plasmocyte ou de lymphocyte qui est une cellule précurseur de celle-ci et peut provenir de n'importe quel endroit du corps, généra- lement la rate, les ganglions lymphotiques, le sang péri- phérique ou une combinaison de ceux-ci. B FUSION DE CELLULES. La cellule qui peut être conservée de façon per- manente par repiquage in vitro peut être toute cellule ap- propriée qui peut être unie par fusion à la cellule pro- ductrice d'anticorps pour donner un hybridome capable de produire un anticorps désiré L'une de telles cellules à préférer est une cellule leucémique telle qu'une cellule de myélome Une telle cellule peut provenir de n'importe quelle-espèce telle que l'homme, le rat, la souris, etc. La cellule qui est déficitaire en hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransférase (HGPRT) ou en thymidine kinase (TX) est préférable du fait que de telles cellules mères ne peuvent pas se développer dans un milieu sélectif. Un exemple de lignée de cellules préférable est GM-1500 6 TG-A 1-2 ou RPM 18226 provenant d'humain ou P 3X 63-Ag 8, P 3-NSI/1-Ag 4-1, Sp 2/0-Ag 14, X 63-Ag 8 653, etc, provenant de souris. Il est préférable d'utiliser une cellule produc- trice d'anticorps et une cellule repiquée, les deux prove- nant des mêmes espèces, bien que ce ne soit pas essentiel, sous les aspects de l'efficacité de la fusion, de la sta- bilité des propriétés des cellules réunies et de leur fa- cilité de culture in vivo En particulier, lorsque la li- gnée de cellules P 3-X 63-Ag 8, P 3-NSI/1-Ag 4-1, Sp 2/O-Ag 14 ou X 63-Ag 8 653 est utilisée comme cellule sous-cultivée, on peut utiliser de préférence une souris BALB/c consan- guine ou sa souris hybride. Pour la fusion, on peut utiliser un accélérateur tel que le virus Sendai (HVJ) et le polyéthylèneglycol, en particulier, on peut utiliser de préférence le poly- éthylèneglycol 1000, 1540, 2000, 4000 ou 6000 La fusion des cellules peut être réalisée dans une solution de 30- 55 % environ de tel polyéthylèneglycol En outre, le di- méthylsulfoxyde peut être présent dans la solution. C SELECTION DE L'HYBRIDOME. Dans la solution après fusion, il y a en pré- sence, en plus de la celule résultant de la fusion, la cellule parente restante productrice d'anticorps et la cellule parente repiquée La première ne peut pas survivre pendant la culture in vitro suivante tandis que la der- nière peut se propager avec l'hybridome désiré Il est par conséquent préférable ou même nécessaire d'éliminer la cellule repiquée de la solution contenant les cellules mélangées Pour cela, on utilise de préférence la cellule déficitaire en HGPRT ou en TK comme cellule parente repi- quée et les cellules mélangées contenant les cellules pa- rentes sont cultivées dans un milieu de sélection conte- nant de l'hypoxanthine, de l'aminoptérine et de la thymi- dine après la fusion des cellules, ce qui permet le déve- loppement sélectif de l'hybridome désiré seulement Ou bien encore, la cellule parente repiquée, lorsqu'elle n'est pas telle qu'une cellule déficitaire en HGPRT ou TK, peut être traitée avec l'émétine et l'actinomycine D avant la fusion des cellules La cellule parente ne peut pas proliférer avec un tel traitement et par conséquent l'hybridome désiré peut être choisi facilement à partir de cellules mélangées. Les hybridomes ainsi obtenus contiennent généra- lement deux ou plusieurs clones, par conséquent ceux-là peuvent ne pas avoir des propriétés complètement semblables. Pour les séparer en clones individuels, le clonage peut être nécessaire et même désiré lorsqu'un anticorps mono- clonal peut être requis Le clonage est également efficace au plan de la prévention du changement de population qui peut souvent se produire dans une culture à long terme d'un système dans lequel plusieurs sortes de clones mélangés. Le clonage peut être effectué par culture à dilution limi- tante, culture sur gélose molle ou culture sur gel de fi- brine Un appareil pour séparer par triage les cellules activées fluorescentes peut également être utilisé pour séparer les cellules dans le clonage Le clonage peut être utilisé égalementpour séparer les cellules aberrantes possibles apparaissant pendant la longue culture et rete- nir les cellules ayant les mêmes propriétés que celles de l'hybridome d'origine. L'hybridome ainsi obtenu peut être conservé par repiquage in vitro ou in vivo ou sous forme de cellules lyophilisées selon n'importe quelle méthode classique. D PRODUCTION ET RECUPERATION DE L'ANTICORPS. Pour la production de l'anticorps, l'hybridome produisant un anticorps anti-aspergillus est cultivé in vitro ou in vivo. Dans la culture in vitro, on peut choisir un bouillon nutritif approprié pour l'hybridome de la présente invention, par exemple, le milieu RPMI 1640 contenant du sérum bovin foetal à 10 % (v/v), du e-mercaptoéthanol 5 x -5 M, du pyruvate de sodium 1 m M et des antibiotiques, ou bien, du MEM de Eagle modifié de Dulbecco (désigné par la suite sous le nom de MEM de Dulbecco) contenant 4,5 g/l de glucose au lieu du milieu RPMI 1640 Une concentration en cellule initiale appropriée pour la prolifération peut être généralement environ 105 par ml alors que celle-ci peut varier selon chaque hybridome, et la concentration en cellules pendant la culture va de préférence jusqu'à 2 x O 106 par ml. Dans la culture in vivo, l'hybridome est trans- planté dans un organisme vivant et développé sous forme solide ou dans du liquide d'ascite Une humeur corporelle, de préférence le sérum ou le liquide d'ascite, est prélevée de l'organisme vivant pour récupérer l'anticorps sécrété par l'hybridome La solution brute de l'anticorps obtenue peut contenir comme impuretés (agents contaminants) diver- ses substances issues de l'organisme vivant hôte, néanmoins elle est plus remarquable que la solution d'anticorps ob- tenue in vitro à cause d'une concentration plus élevée de l'anticorps désiré Lorsque l'hybridome est transplanté intrapéritonéalement, du pristane ( 2,6,10,14-tétraméthyl- pentadécane) peut être administré intrapéritonéalement avant la transplantation, de préférence 3 à 9 semaines avant la transplantation Ce traitement peut augmenter le rendement de la solution brute d'anticorps mais n'est pas essentiel Comme hôte, un animal de la même espèce et du même sang que l'animal duquel la ou les cellule(s) mère(s) provient (proviennent) est préférable et dans ce cas l'hy- bridome peut se développer dans l'animal même s'il n'a pas été traité spécialement Lorsque les sérotypes de l'histo- compatibilité des antigènes coïncident les uns les autres entre l'hybridome et l'hôte, l'hôte est nécessairement traité au préalable avec par exemple une administration d'anticorps anti-lymphocyte ou une irradiation par rayons X Les cellules commencent à se développer à partir de 1 3 semaines après la transplantation. Les anticorps obtenus comprennent des anticorps réagissant avec l'Asperaillus fumiqatus, des anticorps réagissant avec les autres espèces du genre Aspergillus telles que l'Asneraillus flavus, l'Asperaillus oryzae et l'Asperqillus niqer de même que l'Asperqillus fumiaatus, et des anticorps réagissant également avec les autres champignons. A titre de comparaison, les anticorps obtenus par absorption d'antiserum de lapin immunisé avec l'Asper- aillus fumigatus par l'Asperaillus flavus réagissent avec les autres espèces du genre Aspergillus de même que l'Asperqillus fumigatus De plus, les anticorps obtenus en absorbant l'antisérum par l'Asperaillus flavus, l'Asnerqillus orvzae ou l'Aserpillus niqer ont un titre très faible et réagissent rarement avec l'Asperaillus fumigatus. Les anticorps de la présente invention peuvent être utilisés tels quels dans la solution d'anticorps brute, ou bien ils peuvent être purifiés pour l'utilisation par n'importe quel procédé classique pour l'immunoglobuline, par exemple par fractionnement au sulfate d'ammonium ou par chromatographie d'échange d'ions, ou par chromatogra- phie d'affinité avec la protéine A ou l'antigène De tels anticorps purifiés peuvent être utilisés indépendamment ou dans un mélange de ceux-ci. Selon le procédé de préparation de l'anticorps anti-aspergillus de la présente invention, le défaut lié aux procédés classiques peut être nettement surmonté. L'hybridome de l'invention peut être repiqué et on peut le faire substantiellement de façon permanente à la fois in vitro et in vivo En outre, l'hybridome peut produire un anticorps à un déterminant antigénique spécifique. L'anticorps produit, par conséquent, peut avoir une spé- cificité monoclonale, est un anticorps vis-à-vis d'un champignon du genre Asperaillus et consiste essentielle- ment en une espèce moléculaire unique Le procédé de la présente invention permet la production d'une quantité nécessaire de l'anticorps qui dépend de la demande, de la suppression des différences entre lots, et de la pré- paration ultérieure d'une solution contenant l'anticorps avec un titre élevé De plus, le procédé n'exige pas une absorption difficile qui a été inévitable classiquement. Par ailleurs, l'antigène non purifié tel qu'un champignon ver se du genre Aspergillus peut être utilisé sans diffi- culté dans le procédé et on peut même obtenir dans un tel cas l'anticorps hautement spécifique Une telle réactivité élevée avec un antigène de l'anticorps permet une identi- fication rapide d'un champignon du-genre Asperaillus avec une fiabilité élevée sans les procédures difficiles clas- siques De plus, étant donné que la pureté de l'anticorps est élevée, les réactions allergiques dues aux impuretés contenues inévitablement dans la préparation classique apparaissent rarement, permettant l'utilisation comme remède pour l'aspergillose. Le procédé de classification et/ou d'identifica- tion de la présente invention peut être appliqué à un su- jet de toute origine Par exemple, les cellules fongiques peuvent être séparées des matériaux cliniques tels que crachat et tissu obtenus à partir d'un malade qui peut souffrir éventuellement d'aspergillose du point de vue clinique et ensuite cultivées. Dans l'identification, un réactif contenant l'anticorps de la présente invention est mis en contact avec un sujet contenant des cellules d'Asperaillus Il utilise commodément la microscopie d'immunofluorescence, l'immunoélectromicroscopie, le test de liaison radioactive, l'immunotest enzymatique, le test de fixation complémen- taire, etc Dans une microscopie d'immunofluorescence directe, on peut utiliser commodément l'anticorps de l'invention après l'avoir marqué avec un colorant fluores- cent tel que la fluorescéine et la rhodamine L'autre forme commode de l'anticorps de l'invention peut être un anticorps marqué avec une substance de marquage telle que la ferritine pour une immunoélectromicroscopie, un anti- corps marqué avec un radioisotope tel que 125 I et 131 I pour un test de liaison radioactive ou un anticorps marqué avec une enzyme telle que la peroxydase, la phosphatase alcaline et la e-galactosidase pour un immunotest enzyma- tique Naturellement, on peut réaliser un procédé indirect au moyen d'un anticorps secondaire ou de son produit de liaison comme substitut du premier, par exemple on peut utiliser un anticorps anti-aspergillus marqué à la biotine avec l'avidine comme anticorps secondaire Egalement, on peut utiliser une fraction de l'anticorps obtenue par di- vision restrictive avec un traitement chimique et/ou en- zymatique telle que F(ab')2 à la place de l'anticorps per se Detels dérivés et produits de restriction divers sont utiles dans le procédé de classification et/ou d'iden- tification de l'invention et par conséquent inclus dans le cadre de la présente invention. * L'anticorps, ses dérivés et produits de restric- tion peuvent être mélangés pour l'utilisation si nécessai- re De plus, le réactif destiné à la classification et/ou à l'identification de l'invention peut contenir de plus un support ou un diluant classiquement utilisés. La présente invention concerne également un agent de guérison (remède) pour l'aspergillose de n'importe quel site, par exemple, un poumon infecté par un champignon du genre Aspergillu's tel que âsperaillus fumigatus, Asperail- lus niper, Asnergillus flavus et Aspergillus orvzae. L'effet de guérison peut être estimé et établi par la protection contre l'infection fatale par un champi- gnon du genre Asnergillus, comme on le voit dans l'exemple décrit cidessous Le mécanisme de la protection peut être considéré comme accélérant une réaction de fi-ation complé- mentaire et l'attaque du macrophage et/ou d'autres immuno- cytes vis-à-vis du champignon du genre Aspergillus lorsque l'anticorps administré se lie à l'antigène de surface du champignon Ces réactions peuvent être également confirmées même in vitro. L'anticorps de la présente invention peut être utilisé indépendamment ou dans un mélange L'anticorps est utilisé de préférence après avoir été combiné chimiquement avec un germicide ou un agent antifongique tel que l'ampho- téricine B, la 5-fluorocytosine, la nystatine et la griséo- fulvine, puisque l'anticorps seulement per se est légère- ment moins efficace Une fraction de l'anticorps obtenue par division restrictive avec un traitement chimique ou par enzyme, par exemple F(ab')2, peut également être utili- sé comme agent de guérison de l'invention à la place de l'anticorps per se Dans ce cas, on peut éviter une possi- bilité qu'a le tissu de pouvoir être affecté par un dommage dû à une réaction de fixation complémentaire non spécifi- que, etc Ces dérivés (produits de combinaison avec un agent antifongique ou un germicide) et les produits de restriction peuvent être utilisés soit indépendamment soit -sous la forme d'un mélange de ceux-ci comme agent de gué- rison de la présente invention. Pour évaluer la toxicité aiguë des anticorps, de ses dérivés ou produits de restriction, on a administré l'agent de guérison de l'invention à trois groupes (de 10 animaux chacun) de souris IRC; premièrement en une quantité de 2 g/kg par voie orale, deuxièmement en une quantité de 400 mg/kg intrapéritonéalement et troisièmement en une quantité de 200 mg/kg intraveineusement, et on n'a observé aucune mortalité pendant 14 jours L'agent de guérison de l'invention peut donc être utilisé sans danger comme remède pour les maladies infectieuses causées par les champignons du genre Asperuillus. L'agent de guérison de l'invention peut être ad- ministré de manière sous-cutanée, intramusculaire ou intra- veineuse, de préférence par injection sous-cutanée ou intra- musculaire L'agent de guérison peut même être administré par voie orale étant donné qu'une partie de l'agent admi- nistré peut être absorbée à travers les voies intestinales tout en retenant la structure sous la forme d'un anticorps, ce qui a été confirmé par les présents inventeurs On peut préparer une préparation pour injection en dissolvant ou en mettant en suspension par exemple, avec 50 mg de manni- tol, 10 mg de l'anticorps ou de son dérivé dans de l'eau distillée à concurrence de 10 ml, en stérilisant de n'im- porte quelle manière classique, en divisant en fractions de 2 ml chacune dans des ampoules et en lyophilisant Le produit obtenu sera dissous ou mis en suspension dans une solution saline à l'utilisation Une préparation injectable peut contenir en plus de l'anticorps un support, un di- luant, un tampon, un stabilisant, un agent isotonique, etc, ces agents étant connus de ceux qui sont experts dans l'art La préparation injectable peut être préparée sous n'importe quelle forme d'injection sous-cutanée, intramus- culaire ou intraveineuse On peut préparer un agent admi- nistrable par voie orale par tout procédé classique pour entrer dans un médicament entérique Une quantité unitaire de l'agent de guérison de l'invention peut dépendre prin- cipalement des symptômes, et va généralement de 0,001 mg à 10 g par jour par kg de poids du corps pour un animal tel qu'une souris et 0,01-3 000 mg par jour par kg de poids du corps d'un être humain. La présente invention va être illustrée par les exemples non limitatifs suivants. EXEMPLE 1. ( 1) PREPARATION DE L'IMMUNOGENE. On a inoculé de l'Asneraillus fumipatus IAM 3006 dans un tube incliné contenant un milieu de dextrose de pomme de terre et on l'a fa'it incuber à 250 C pendant deux semaines Après incubation, on a collecté les hyphes et les spores avec une anse de platine et on les a mis en suspen- sion dans un milieu salin tamponné au phosphate (PBS, p H 7,2) contenant du Tween 80 (R) à 0,01 % Après avoir récupé- ré les cellules, on a effectué une centrifugation à 1000 x g, 4 C, pendant 10 minutes pour obtenir un culot (spore). On a répété ce procédé de lavage quatre fois, on a ajouté la concentration en cellules avec du PBS à 5 x 105 par ml pour obtenir, une suspension d'immunogène que l'on a utili- sée dans les expériences suivantes. ( 2) PREPARATION DE LA CELLULE PRODUCTRICE D'ANTICORPS. On a administré la suspension d'immunogène par voie intraveineuse en une quantité de 0,O,2 ml à des souris femelles BALB/c âgées de 8 semaines (NIHON CHARLES LIVER, JAPON) pour l'immunisation On a répété l'immunisation une fois le 14 ème jour et on a effectué un rappel par une in- jection intraveineuse de 0,2 ml de la suspension d'immuno- gène le 42 ème jour après le début de l'immunisation Trois jours après le rappel, les souris ont été saignées à blanc et on a prélevé la rate aseptiquement sur une paillasse propre (HITACHI, LTD, JAPON) On a placé la rate dans une boîte de pétri contenant du milieu RPMI 1640, on l'a divi- sée en petits morceaux avec des pinces, on l'a pipettée doucement et filtrée à travers une toile en acier inoxyda- ble pour obtenir une suspension de cellules spléniqueso Après centrifugation ( 500 x g, 10 minutes), on a ajouté du tampon Tris-H Cl 1, 7 m M (p H 7,65) contenant du chlorure d'ammonium à 0,747 % pour mettre en suspension le culot cellulaire résultant pour séparer et enlever les érythro- cytes On a centrifugé encore la suspension résultante de cellules spléniques à 500 x g pendant 3 minutes Après avoir lavé trois fois le culot cellulaire résultant avec le milieu RPMI 1640, on a ajusté la concentration des cellules à 108 par ml en ajoutant du milieu RPMI 1640. ( 3) FUSION DES CELLULES POUR LA PREPARATION DE L'HYBRIDOME. On a mélangé la suspension de cellules spléniques préparée en ( 2) ( 1 x 108 cellules) avec 1 x 107 cellules de lignée de-cellules de myélome de souris Sp 2/O-Ag 14 cul- tivées in vitro au préalable Après centrifugation du mé- lange de cellules à 500 x g pendant 5 minutes, on a rejeté le liquide surnageant pour obtenir un culot cellulaire. Après avoir détaché le culot cellulaire en frappant douce- ment le fond du récipient, on a ajouté au récipient 1 ml de milieu RPMI 1640 contenant du polyéthylèneglycol 4000 à 50 % (v/v) ( 37 C) et on l'a laissée reposer pendant une minute On a placé le récipient dans un four thermostatique ( 37 C) et on a tourné doucement pendant une minute pour mélanger la solution de polyéthylèneglycol avec le culot cellulaire On a ajouté au mélange 10 ml de quantité totale de milieu RPMI 1640 maintenu à 37 C à raison de 1 ml en 30 secondes et on l'a centrifugé à 500 x g pendant 5 minutes. Après avoir rejeté le liquide surnageant, on a remis le culot cellulaire en suspension dans du milieu RPMI 1640 et on l'a centrifugée à 500 x g pendant 5 minutes pour obte- nir un culot cellulaire On a répété une fois encore ce procédé de lavage On a bien mis en suspension le culot cellulaire résultant dans 20 ml de milieu HAT (milieu RPMI 1640 contenant du sérum bovin foetal à 20 %, de la gluta- mine 2 m M, de l'acide pyruvique 1 m M, 4,5 g/l de glucose, du emercaptoéthanol 5 x 10 5 M, de l'hypoxanthine 1 x 10 M, de l'aminoptérine 4 x 10-7 M, de la thymidine 1,6 x 10-5 M, et 50 mg/i de sulfate de kanamycine) à 370 C On a placé la suspension de cellules résultante sur une plaque de culture de tissu à 96 godets (Nuns 167008, NUNC INC, Danemark) avec 100 pl dans chaque godet et on l'a laissée incuber à 37 WC dans un incubateur à C 02 contenant 5 X d'anhydride carbonique 24 heures après le début de l'incubation, on a ajouté du milieu HAT dans chaque 100 pl On a continué l'incubation tout en enlevant 100 pl du milieu dans chaque godet et en ajoutant à leur place 100 pl de milieu HAT frais à chaque godet tous les 2 ou 3 jours, et on a choisi des hybridomes capables de proliférer dans le milieu HAT. A partir de deux semaines après le commencement de l'incubation, on a observé continuellement la croissance des hybridomes et on a examiné la production des anticorps dans le liquide surnageant de chaque godet avec un inter- valle approprié de la même manière que décrit en ( 4) ci- dessous. ( 4) SELECTION ET CLONAGE DE L'HYBRIDOME PRODUCTEUR DE L'ANTICORPS. On a utilisé l'immunotest enzymatique pour dé- terminer la présence d'anticorps sécrétés dans le liquide surnageant des godets de culture C'est-à-dire, on a ino- culé de l'Asperaillus fumigatus IAM 3006 dans un bouillon de dextrose de Sabouraud et on a laissé incuber en agitant à 250 C pendant 3 semaines Après centrifugation ( 1000 x g, minutes), on a filtré le liquide surnageant avec un - filtre à membrane ( 0,45 p) On a chargé le filtrat dans un tube à dialyse, et on a réalisé la dialyse à l'eau distil- lée à 40 C pendant 4 jours tout en remplaçant le liquide de dialyse par de l'eau distillée fraîche une fois par jour. Après dialyse, le dialysat a été séché par évaporation de la glace pour obtenir une poudre d'anticorps brute qui a été dissoute à son tour dans du PBS et ajustée à 100 pg/ml. On a versé 50 pl de la solution résultante dans chaque godet de la plaque à 96 godets (Nunc-Immunophate I, Nunc Inc, Danemark) et laissé reposer à 40 C pendant la nuit. Après avoir lavé trois fois avec du PBS contenant du Tween à 0,05 %, on a obtenu une plaque d'antigène. A chaque godet de la plaque d'antigène lavé, on a ajouté 100 pl du sujet (le liquide surnageant de chaque godet) et on les a laissés réagir à 370 C pendant une heure. Après avoir lavé trois fois chaque godet avec du PBS conte- nant du Tween 20 (R) à 0,05 %, 50 pl d'une solution d'anti- corps immunoglobine anti-souris de chèvre lié à de la per- oxydase provenant de raifort (Cappel Corp, USA), dilué 1000 fois avec du sérum de cheval, ont été versés dans chaque godet et laissés réagir à 370 C pendant une heure. Après réaction, on a lavé chaque godet cinq fois avec du PBS contenant du Tween 20 (R) à 0,05 %, et on a ajouté à chaque godet et laissé réagir à la température ambiante pendant 30 minutes 100 pl de tampon citrate 0,1 M (p H 4,5) contenant l mg/ml d'o-phénylènediamine et 0,04 % (v/v) de solution aqueuse à 31 % d'eau oxygénée La réaction enzy- matique a été arrêtée en ajoutant 50 pl d'acide sulfurique à 12,5 % à chaque godet et la mesure d'absorption à 492 mm a montré la production d'anticorps dans 15 godets sur 192 godets Les hybridomes dans les godets destinés à produire les anticorps ont été ensuite clonés C'est-à-dire, les cellules de rate en tant que cellules nourricières ont été obtenues de la même manière que décrit en ( 2) ci-dessus à partir de rate prélevée sur des souris BALB/c femelles (témoin) non traitées âgées de 8 semaines et on a ajusté la concentration des cellules à 5 x 106 par ml avec du milieu HAT On a ajusté l'hybridome mentionné ci-avant à la suspension de cellules de rate résultante à raison de 2 cellules par ml et on a agité énergiquement On a inocu- lé 100 pl du mélange de cellules dans chaque godet de la plaque de culture de tissu à 96 godets (Nunc 167008, Nunc Inc, Danemark) Au bout de 24 heures, on a ajouté à chaque godet 100 pl de milieu HAT et laissé incuber à 370 C dans un incubateur contenant 5 % d'anhydride carbonique. Après deux semaines de clonage, on a observé le développement de l'hybridome et on a examiné la présence d'anticorps dans le liquide surnageant de chaque godet de la manière sus-mentionnée On a obtenu de 2 à 70 hybrido- mes produisant de l'anticorps par un tel clonage à partir de chaque godet Parmi ces hybridomes, des clones stables capables de produire une grande quantité d'anticorps et hautement proliférants ont été choisis et reclonés de la manière mentionnée ci-dessus pour obtenir l'anticorps produisant les hybridomes AS-1, AS-2 et AS-3. ( 5) PRODUCTION DE L'ANTICORPS (CULTURES IN VITRO). On a mis en suspension l'hybridome AS-1, AS-2 ou AS-3 dans du milieu RPMI 1640 contenant du sérum bovin foetal à 20 %, de la glutamine 2 m M, de l'acide pyruvique 1 m M, 4,5 g/l de glucose, du B-mercaptoéthanol 5 x 10 5 M et 50 mg/1 de sulfate de kanamycine, à une concentration de cellules de 1 x 105 par ml On a placé la suspension résultante ( 25 ml) dans un flacon de 75 cm 3 pour une cul- ture de tissu (Corning Galss Works, USA) et on l'a laissée incuber à 37 C dans un incubateur à C 02 contenant 5 % de C 02 Le quatrième jour, le développement a atteint un état approximativement stationnaire et on a collecté le liquide surnageant du flacon Le nombre de cellules qui se sont développées était approximativement de 2 x 106 par ml et les teneurs en anticorps du liquide surnageant étaient de 2,5 pg/ml (AS-i), 3,1 vg/ml (AS-2) et 1,4 pg/ml (AS-3), respectivement. (CULTURES IN VIVO). On a injecté par voie intrapéritonéale du pris- tane ( 2,6,10,14-tétraméthylpentadécane) an une quantité de 0,5 ml à des souris BALB/c et le 10-30 ème jour après l'injection 5 x 10 cellules de l'hybridome AS-1, AS-2 ou AS-3, que l'on avait fait proliférer in vitro, ont été inoculées par voie intrapéritonéale aux souris Deux ou trois semaines après, on a collecté de l'ascite et on l'a centrifugé à 1000 x g, 4 C pendant 15 minutes pour obtenir du liquide surnageant ascitique On a obtenu environ 30 ml de liquide surnageant ascitique à partir de dix souris sur chaque hybridome et les teneurs en anticorps ont été, respectivement, de 1,5 mg/ml (AS-1), 3 1 mg/ml (AS-2), 2,7 mg/ml (AS-3). ( 6) SPECIFICITE ET PROPRIETES DE L'ANTICORPS. (SPECIFICITE): On a inoculé chaque souche d'Aspergillus fumigatus IAM 3006, Asperaillus fumigatus IFO 5840, Asperaillus fumigatus IFO 4057, Asperqillus flavus IAM 3003, Aspergillus niaer IAM 2093 et Asperqillus oryzae IAM 2600 à un milieu de dextrose de pomme de terre et on l'a culti- vée en agitant à 250 C pendant 3 semaines pour obtenir les liquides surnageants On a préparé une plaque d'antigène selon le procédé de ( 4) et on a observé les réactions avec les liquides surnageants de la culture in vitro de l'hybri- dome AS-1, AS-2 ou AS-3 Les résultats sont indiqués dans le tableau 1 ci-dessous. (PROPRIETES): On a versé 50 pl d'une solution d'anticorps Ig G antisouris, d'anticorps Ig A anti-souris et d'anticorps Ig M anti-souris (Miles USA), diluée 100 fois avec du bicar- bonate de sodium 0,1 M, dans chaque godet d'une plaque à 96 godets (NuncImmunoplate I, Nunc, Danemark), et on l'a laissée reposer à 4 C pendant 24 heures Après avoir lavé complètement chaque godet avec du PBS contenant du Tween (R) à 0,05 %, on a ajouté 100 pl du liquide surnageant de la culture de l'hybridome AS-1, AS-2 ou AS-3 obtenu en ( 5) ci-dessus à chaque godet et on a laissé incuber à 370 C pendant une heure Après réaction, on a lavé chaque godet trois fois avec du PBS contenant du Tween 20 (R) à 0,05 % et on a ajouté à chaque godet 50 pl d'une solution d'anti- corps immunoglobuline anti-souris lié à une peroxydase dérivée du raifort (Cappel, USA), diluée 1000 fois avec du sérum de cheval, et on l'a laissée incuber à 37 C pendant une heure Après avoir lavé chaque godet cinq fois avec du PBS contenant du Tween 20 (R) à 0,05 %, on a ajouté à cha- que godet 100 pl de tampon de citrate (p H 4,5) contenant 1 mg/ml d'o-phénylènediamine et 0,04 % (v/v) d'eau oxygé- née aqueuse à 31 % et on l'a laissé incuber à la tempéra- ture ambiante pendant 30 minutes La réaction enzymatique a été arrêtée en ajoutant de l'acide sulfurique à 12,5 % à chaque godet et on a mesuré l'absorption à 492 nm pour identifier l'anticorps produit Les résultats sont indiqués dans le tableau 1 ci-dessous. EXEMPLE 2. ( 1) PREPARATION DE L'IMMUNOGENE. On a inoculé l'Asperaillus fumicatus IAM 3006 dans un bouillon de Czapek-docks et on l'a cultivé en agi- tant à 250 C pendant 3 semaines Après centrifugation à 1000 x g, 15 minutes, on a récupéré le liquide surnageant et on l'a filtré sur un filtre à membrane ( 0,45 P) On a placé le filtrat dans un tube à dialyse, et on a effectué la dialyse à l'eau distillée à 40 C pendant 4 jours tout en changeant l'eau de dialyse avec de l'eau fraichement dis- tillée une fois par jour Après dialyse, on a lyophilisé le dialysat en une poudre d'antigène brute qui a été dis- soute ensuite dans du PBS suivi d'un ajustement de la concentration en cellules à 100 pg/ml On a utilisé la solution résultante comme solution d'immunogène. ( 2) PREPARATION D'UNE CELLULE PRODUISANT UN ANTICORPS. Un mélange de la solution d'immunogène avec l'ad- juvant complet de Freund a été administré par voie sous- cutanée dans chaque fraction de 0,2 ml à des souris CDF 1 femelles âgées de 8 semaines (NIPPON KREA, JAPON) pour l'immunisation Les souris ont été immunisées de façon répétée deux fois toutes les deux semaines Le 70 ème jour après le début de l'immunisation les souris ont été trai- tées à nouveau par une injection intraveineuse de 0,2 ml de la solution Le troisième jour après l'injection de rappel, les souris ont été saignées à blanc et on a préle- vé aseptiquement la rate et des ganglions lymphatiques de mésentère sur une paillasse propre (HITACHI LTD, JAPON). On a ensuite placé la rate et les ganglions lymphatiques de mésentère dans une boîte de pétri contenant du milieu MEM de Dulbecco et on a obtenu une suspension de cellules de rate de 1 x 10 par ml de la même manière que dans l'exemple 1 ( 2). ( 3) FUSION DE CELLULES POUR LA PREPARATION DE L'HYBRIDOME. On a mélangé une lignée de cellules de myélome de souris P 3-X 63-Ag 8 ( 1 x 107) cultivées in vitro au préa- lable avec la suspension de cellules de rate (l x 108), on a centrifugé à 500 x g, 5 minutes et on a évacué le liquide surnageant pour obtenir un culot cellulaire Après avoir détaché le culot cellulaire en frappant doucement le fond du récipient, on a maintenu la température à 37 WC Du mi- lieu MEM de Dulbecco, 1 ml, contenant 45 % de polyéthylène- glycol 4000 ( 370 C) a été ajouté progressivement en une minute environ Après l'avoir maintenu à 370 C pendant 7 minutes, on a ajouté 15 ml de milieu MEM de Dulbecco, à 370 C, le long de la paroi du récipient en cinq minutes environ tout en faisant tourner doucement le récipient. Environ 25 ml de milieu MEM de Dulbecco ont été ajoutés et centrifugés à 500 x g, 5 minutes et on a évacué le liquide surnageant. On a ajouté au culot cellulaire du milieu MEM de Dulbecco contenant du sérum bovin foetal à 10 %, à 370 C, on l'a ajusté à 1 x 106 par ml, mélangé doucement avec une pipette, placé dans chaque godet d'une plaque à 24 godets pour la culture du tissu (Nunclon, Nunc, Danemark) dans chaque portion de 1 x 106 et laisse incuber à 370 C dans un incubateur contenant 5 X d'anhydride carbonique 24 heures après le commencement de l'incubation, on a ajouté 1 ml de milieu HAT à chaque godet Pendant la culture, on a enlevé 1 ml du milieu dans chaque godet et on a ajouté 1 ml de milieu HAT frais à chaque godet tous les 2 ou 3 jours On a sélectionné l'hybridome capable de proliférer dans le milieu HA To A partir de deux semaines après le commencement de l'incubation, on a observé la croissance de l'hybridome de façon continue et on a recherché l'anticorps produit dans le liquide surnageant de chaque godet avec un inter- valle approprié par la méthode décrite dans l'exemple 1 ( 4) Vingt et un godets ont montré la production d'un anticorps sur 48 godets. ( 4) ETABLISSEMENT DE L'HYBRIDOME PRODUISANT UN ANTICORPS. Les hybridomes produisant un anticorps de 21 godets ont été clonés en utilisant de la gélose molle. A savoir, on a mélangé 30-ml de gélose à 2,5 % (Difco, Allemagne dé l'Ouest) à Dulbecco de 10 fois la 117 ml de milieu MEM de de gélose, on a ajouté CDF 1 femelles (témoins) en une quantité de 5 x cières Chaque fraction résultante a été placée 3003, Becton-Dickinson, 450 C, et 3 ml de milieu MEM de concentration, et on a ajouté Dulbecco à 450 C A cette solution les cellules de rate de souris non traitées âgées de 8 semaines par ml comme cellules nourri- de 10 ml de la solution de gélose dans-chaque boite de pétri (Falcon USA) de 10 cm de diamètre et lais- sée reposer à la température ambiante-pendant 15 minutes pour se gélifier On a mélangé environ 2 ml de la suspen- sion d'hybridome dans chaque godet se montrant positif dans la production de l'anticorps et la quantité équiva- lente de milieu MEM de Dulbecco contenant 0,5 % d'agar et on a placé 2 ml du mélange résultant sur le gel obtenu ci-dessus de sorte que les cellules étaient distribuées uniformément sur la couche de gel L'incubation a été effectuée à 37 WC dans un incubateur à 5 % de C 02 Le di- xième jour après le commencement de l'incubation, on a collecté les colonies se développant sur la gélose molle au moyen d'une pipette de Pasteur et on les a transférées sur une plaque de culture sur tissu à 96 godets à fond plat, on a ajouté ensuite 0,2 ml de milieu MEM de Dulbecco à chaque godet et on a laissé incuber à 370 C dans un incu- bateur à 5 % de C 02 On a observé' le développement de l'hy- bridome et on a recherché simultanément la présence d'un anticorps dans le liquide surnageant de chaque godet par la méthode décrite dans l'exemple 1 ( 4). Des clones stables produisant une grande quantité de l'anticorps et se propageant bien ont été sélectionnées parmi les hybridomes positifs, rbclonés de la même manière que décrit ci-dessus et on a obtenu les hybridomes AS-4 et AS-5 produisant un anticorps. ( 5) PRODUCTION DE L'ANTICORPS (CULTURE IN VITRO). On a cultivé les hybridomes AS-4 et AS-5 par le procédé décrit dans l'exemple 1 ( 5) pour obtenir les li- quides surnageants. (CULTURE IN VIVO). Selon le procédé 1 ( 5), on a transplanté les hy- bridomes AS-4 et AS-5 par voie intrapéritonéale dans des souris CDF 1, on a collecté de l'ascite 2 ou 3 semaines après et on a obtenu du liquide surnageant ascitique On a obtenu environ 30 ml d'un tel liquide surnageant à par- tir de dix souris. ( 6) SPECIFICITE ET PROPRIETES DE L'ANTICORPS. Les spécificités et les classes d'immunoglobuline des anticorps contenus dans les liquides surnageants de la culture des hybridomes AS-4 et AS-5 ont été recherchées selon la méthode de l'exemple 1 ( 6) Les résultats sont indiqués dans le tableau 1 ci-dessous. TABLEAU 1 SPECIFICITES ET CLASSES D'IMMUNOGLOBULINES DES ANTICORPS ANTI-ASPERGILLUS DE L'INVENTION. + positif; négatif. HYBRID Off PRODUISA Nr L'ANTICORPS AS-1 AS-2 AS-3 AS-4 AS-5 Aspergillus fumnigatus IAM 3006 + + + + + MEME Aspergillus fumigatus 1 F 05840 + + + + + ES- PECE Aspergillus fumnigatus IF 04057 + + + + + SPECI- FICITE Aspergillu S f lavus IAM 3003 + + + MEME Aseglu nigler IAM 2093 + + + Aspergillus oryzae 1 AM 2600 + + + PROPRIETE CLASSE IMMUNOGLOBULINE Ig M Ig M Ig M Ig G Ig G h M (l> N ut 14 J CD i i EXEMPLE 3. Les anticorps obtenus dans les exemples 1 et 2 ont été administrés à des souris IRC avec un groupe de dix souris en une quantité de 2 g/kg par voie orale, 400 mg/kg par voie intrapéritonéale ou 200 mg/kg, par voie intra- veineuse et les souris ont été observées pendant 14 jours. On n'a pas observé du tout de mort due aux anticorps. Par ailleurs, les formes des hybridomes AS-1 à AS-5 étaient à peu près sphériques, leurs dimensions étaient de 10-20 p, la plupart étant de 15 i environ, et les hybridomes AS-1 à AS-5 flottaient et adhéraient fai- blement à la paroi du récipient. EXEMPLE 4. IDENTIFICATION DU CHAMPIGNON D'ASPERGILLUS PAR L'ANTICORPS. (i) SUJET: On a prélevé du crachat provenant de trois malades qui étaient sensés souffrir d'aspergillose pulmo- naire, on l'a étalé dans une boite de pétri contenant du milieu d'agar de dextrose de Sabouraud et on l'a laissé incuber à 250 C pendant 2 semaines Les colonies comme dans un moule apparues dans la plaque de gélose ont été utilisées comme sujet. (ii) IDENTIFICATION: On a réalisé les identifications par une technique d'anticorps fluorescent utilisant les anti- corps (liquide surnageant ascitique) sécrétés par l'hybri- dome AS-1 ou AS-4. A savoir, les cellules obtenues avec une anse de platine à partir des colonies à tester ont été étalées sur une lamelle de verre, fixées par de la formaline à 1 % à 40 C pendant la nuit, lavées complètement avec du PBS (p H 7,2), on a ajouté une goutte de la solution d'anti- corps susmentionnée et on fait incuber à 370 C pendant une heure Après avoir lavé complètement avec du PBS (p H 7,2) pour éliminer les anticorps n'ayant pas réagi, on a ajouté une goutte d'immunoglobuline (Cappel, USA) et on a laissé incuber à 370 C pendant une heure Après avoir enlevé les anticorps liésà la fluorescéine n'ayant pas réagi en la- vant avec du PBS (p H 7,2), on a observé de la fluorescence au moyen d'un microscope de fluorescence (Olympus Vanox, Olympus, Japon) sur chaque cellule du sujet de la lamelle. * Simultanément, on a observé morphologiquement les sujets C'est-à-dire, on a observé les formes du coni- diophore, le nombre de stérigmes et la couleur des colonies du sujet. (iii) RESULTATS (tableau 2): Comme on le voit dans le ta- bleau 2, les résultats de l'identification par les anti- corps de la présente invention étaient tout à fait iden- tiques aux résultats des observations morphologiques. TABLEAU 2 M +: positif;: négatif u o : c C) e technique de l'anti- \méthodcteh ude ec l'anti identification morphologique Résultats corps fluorescent Réuts identification by (souche antibody from conidiophore couleur de identifie) la colonie sujet \ AS-1 AS-4 (crachat) patient A + + long cylindri bleu ou Aspergillus que (un gris bleuâtre fumigatus stérigme) patient B + + " " patient C fin, long, rose Fusarium sp. taille indéfinie (verticillate) EXEMPLE 5. ( 1) MARQUAGE AVEC LA PEROXYDASE DES ANTICORPS SECRETES PAR LES HYBRIDOMES AS-1 et AS-4. On a dissous 4 mg de peroxydase de raifort (type VI Sigma, USA) dans 1 ml d'eau distillée et on a ajouté pl d'une solution de Na IO 4 0,1 M, préparée immédiatement avant utilisation, et on a effectué le mélange à la tempé- rature ambiante pendant 20 minutes La solution résultante a été dialysée pendant la nuit contre du tampon d'acétate de sodium 1 m M (p H 4,4) et on a ajouté 20 ml d'une solution de carbonate de sodium O,2 M Bientôt après, l'anticorps sécrété par l'hybridome AS-1 ou AS-4 (liquide surnageant ascitique purifié, teneur en protéine de 10 mg) dissous dans 1 ml de tampon de carbonate 0,01 M (p H 9,5) a été ajouté et maintenu à la température ambiante pendant deux heures tout en agitant Après réaction, on a ajouté 0,1 ml de solution de Na BH 4 aqueuse fratchement préparée ( 4 mg de Na BH 4 dissous dans 1 ml d'eau distillée)', et on l'a laissée reposer à 4 C pendant deux heures et dialysée pendant la nuit au PBS. La solution mélangée résultante a été appliquée à une colonne de Sephadex G-l OO(R) (Pharmacia, Suède), éluée avec du PBS et on a recueilli la première fraction dont les absorptions correspondaient mutuellement à 280 nm et 403 nm A 1 ml de la fraction (produit de liaison en- zyme-anticorps), on a ajouté 10 mg d'albumine de sérum de lapin à dissoudre et on a conservé à -70 C jusqu'à l'uti- lisation. ( 2) MARQUAGE AVEC LA PHOSPHATASE ALCALINE DES ANTICORPS SECRETES PAR LES HYBRIDOMES AS-1 et AS-4. mg de phosphatase alcaline de type VII (Sigma, USA), dialysée au préalable au PBS pour enlever complète- ment le sulfate d'ammonium, et 17 mg d'anticorps sécrété par l'hybridome AS-1 ou AS-4 (liquide surnageant ascitique purifié) ont été dissous dans du PBS à un volume total de 1 ml A la solution résultante, on a ajouté 10 Pl de solu- tion de glutaraldéhyde à 20 % et on a agité à la tempéra- ture ambiante pendant deux heures Après réaction, le mé- lange réactionnel a été appliqué à une colonne Sephadex G-200 (R) (Pharmacia, Suède) équilibré avec du tampon tris-H Cl (p H 7,6) et élué avec le même tampon On a re- cueilli une fraction à haut poids moléculaire du volume vide au point d'élution de l'Ig C, on a ajouté de l'albu- mine de sérum de bovin jusqu'à 5 % (p/v), on l'a stérili- sée par passage sur un filtre Millipore ( 0,22 p, Millipore, USA) et conservée à 45 C dans le noir jusqu'à utilisation. ( 3) MARQUAGE AVEC LA e-GALACTOSIDASE DES ANTICORPS SECRETES PAR LES HYBRIDOMES AS-1 et AS-4. Les anticorps sécrétés par les hybridomes AS-1 et AS-4 ont été marqués avec la e-galactosidase selon le procédé de ( 2) ci-dessus La egalactosidase utilisée était de qualité Sigma IV (Sigma, USA). ( 4) MAROUAGE PAR 125 I DES ANTICORPS SECRETES PAR LES HYBRIDOMES AS-1 et AS-4. A 10 pl de solution de Na 125 I de 100 m Ci/ml (exempt de support, Amersham, USA), on a ajouté 50 pl de la solution d'anticorps sécrétée par l'hybridome AS-1 ou AS-4 (liquide surnageant ascitique purifié, teneur en pro- téine de 1,0 mg/ml) et 30 pl de tampon de phosphate O,5 M (p H 7,2) contenant 0,30 mg/ml de chloramine T et bien mé- langé 15 secondes après, on a ajouté 100 p 1 de PBS saturé avec de la Ltyrosine et on a mélangé immédiatement On a chromatographié le mélange résultant sur une colonne char- gée avec de l'Amberlite IRA 400 et on l'a élué avec du PBS contenant 1 % d'albumine de sérum bovin On a recueilli la fraction éluée et on l'a conservée à 4 C jusqu'à utilisa- tion L'activité spécifique du produit marqué était de 1,0 p Ci par mg de protéine d'anticorps. ( 5) MARQUAGE A LA FLUORESCEINE DES ANTICORPS SECRETES PAR LES HYBRIDOMES AS-1 ET AS-4 A 1 ml d'une solution d'anticorps secrétés par les hybridomes AS-1 et AS4 (surnageant ascitique purifié) à une concentration de 10 mg/ml, 0,1 ml d'un tampon carbo- nate 0,5 M (p H 9,3) est ajouté, 0,1 mg de poudre d'iso- thiocyanate de fluorescéine est ensuite ajouté et mélangé à 4 C pendant 6 heures sans remuer Immédiatement après la réaction, le mélange réactionnei est appliqué à une co- lonne Séphadex G-25 (R) (Pharmacia, Suède) pour éliminer les substances à bas poids moléculaire et la fraction de haut poids moléculaire souhaitée est obtenue Le produit obtenu est conservé à 4 C dans le noir jusqu'à utilisation. ( 6) MARQUAGE PAR LA TETRAMETHYLRHODAMINE DES ANTICORPS SECRETES PAR LES HYBRIDOMES AS-1 et AS-4. A 1 ml de solution à 10 mg/ml de l'anticorps sécrété par l'hybridome AS-1 ou AS-4 (liquide surnageant ascitique purifié), on a ajouté 0,1 ml de tampon de carbo- nate 0,5 M (p H 9,3), on a ajouté encore 0,2 mg de poudre de tétraméthylrhodamine-isothiocyanate et on a agité à 4 C pendant 20 heures sans faire barboter Après réaction, le mélange réactionnel a été immédiatement appliqué à une colonne Sephadex G-25 (R) (Pharmacia, Suède) pour éliminer les substances à bas poids moléculaire n'ayant pas réagi et on a obtenu la fraction à haut poids moléculaire-dési- rable On a conservé le produit à 4 C dans le noir. ( 7) MARQUAGE PAR LA-BIOTINE DES ANTICORPS SECRETES PAR LES HYBRIDOMES AS-1 et AS-4. On a dissous de la d-biotine 1 m M ( 244 mg) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd, Japon) et de la N-hydroxysuccinide 1,5 m M ( 173 mg) (Eastman Kodak, USA) dans un mélange de 8 ml de diméthylsulfoxyde (Walko Pure Chemical Industries, Ltd, Japon) et 5 ml de 1,2-diméthoxy- éthane (Nakarai Chemical, Japon) A la solution résultante, on a ajouté une solution de 206 mg ( 1 m M) de N,N'-dicyclo- hexylcarbodiimide (Kanto Chemical, Japon) dans 0,5 ml de 1,2diméthoxyéthane et on a fait réagir à 4 C pendant la nuit On a éliminé par filtration le précipité résultant pour obtenir un filtrat On a éliminé sous vide le solvant dans le filtrat et on a dissous le matériau huileux rési- duel dans 10 ml de dichlorométhane (Wako Pure Chemical Industries, Ltd, Japon) et on l'a refroidi à 4 C On a ajouté 10 ml de solution de Na HCO 3 0,1 M et on a agité pour bien mélanger On a éliminé la phase dichlorométhane résultante et ensuite on a ajouté 10 ml d'eau distillée, C, et on a répété encore ce processus On a ajouté la phase de dichlorométhane résultante avec de la poudre de sulfate de sodium anhydre (Koizumi Chemical, Japon) pour déshydrater On a éliminé la poudre par filtration et on a ajouté du n-hexane au filtrat pour le rendre trouble. On a refroidi la solution à -20 C, on a placé le cristal précipité dans un dessicateur pour éliminer le solvant et sécher On a obtenu le produit, l'ester de biotine-N- hydroxysuccinimide. On a dissous le biotine-N-hydroxysuccinimide dans le diméthylsulfoxyde et on a ajusté la concentration à 1 mg/ml On a mélangé la solution ( 60 pl) avec 1 ml de solution de l'anticorps sécrété par l'hybridome AS-1 ou AS-4 (liquide surnageant ascitique purifié, teneur en protéine de 1 mg/ml) et l'a fait réagir à la température ambiante pendant 4 heures Après réaction, la solution a été dialysée au PBS à 4 C pendant trois jours Pour cela, on a changé le liquide de dialyse trois fois Le dialysat (solution dans le tube à dialyse) a été conservé à 4 C jusqu'à utilisation. EXEMPLE 6. Les crachats des trois malades qui étaient sensés souffrir d'aspergillose pulmonaire et l'Asperaillus fumi- gatus IAM 3006 ont été inoculés chacun dans un milieu d'agar de dextrose de Sabouraud et on les a fait incuber dansun incubateur à 25 C pendant deux semaines La colonie à l'aspect moulé apparaissant sur la plaque d'agar a été prélevée avec une anse de platine, mise en suspension dans 3 ml de PBS contenant du Tween 20 (R) à 0,05 % homogénéisée dans un appareil à homogénéiser et on a utilisé la suspen- sion de cellules résultante. ( 1) IDENTIFICATION PAR L'IMMUNOTEST ENZYMATIQUE. On a placé la suspension de cellules ( 0,3 ml) dans un tube à essai traité par un silicone de 1,2 cm de diamètre, on l'a centrifugée ( 1000 x g, 5 minutes), on a éliminé le liquide surnageant, et on a ajouté 0,5 ml d'une solution, diluée 100 fois avec du sérum de cheval, de l'anticorps marqué par la peroxydase, la phosphatase alca- line ou la e-galactosidase préparé dans l'exemple 5 ( 1), ( 2) ou ( 3) et on a fait réagir à 37 C pendant une heure. Après réaction, le mélange réactionnel a été lavé cinq fois avec du PBS contenant du Tween 20 (R) à 0,05 % On a ajouté ensuite 1 ml d'une solution substrat. A savoir, on a ajouté dans l'anticorps marqué par la peroxydase 1 ml d'un tampon de citrate O,1 M (p H 4,5) contenant 1 mg/ml d'o-phénylènediamine et 0,04 % (v/v) d'une solution aqueuse d'eau oxygénée à 31 %, on a fait réagir à la température ambiante pendant 30 minutes, et on a ajouté 0,5 ml d'acide sulfurique à 12,5 % comme blo- queur réactionnel et on a mesuré l'absorption à 492 nm. Dans l'anticorps marqué par la phosphatase alca- line, on a ajouté 1 ml d'une solution support (p H 9,8) contenant 1 mg/ml de phosphate de p-nitrophényl (Sigma, USA), 9,7 % (v/v) de diéthanolamine et-0,O 1 % d'hexahy- drate de chlorure de magnésium, on l'a fait réagir à la température ambiante pendant 30 minutes, on a ajouté 0,5 ml d'hydroxyde de sodium 5 M comme bloqueur réactionnel et on a mesuré l'absorption à 405 nm. Dans l'anticorps marqué par la 0-galactosidase, on a ajouté 1 ml de tampon de borate (p H 8,5) contenant 1 mg/ml de 4-méthylombelliféryl-Bgalactoside, on a fait réagir à 300 C pendant 10 minutes, on a ajouté 0,5 ml de tampon glycine-hydroxyde de sodium O,l M (p H 10,3) comme bloqueur réactionnel et on a mesuré le 4-méthylombelliféron libre au spectrofluoromètre HITACHI ( 360 nm comme longueur d'onde d'excitation et 450 nm comme longueur d'onde d'émis- sion, Hitachi Ltd, Japon). Les résultats sont indiqués dans le tableau 3. ( 2) IDENTIFICATION PAR LE PROCEDE DE L'ANTICORPS FLUORESCENT. La suspension de cellules a été étalée sur une lamelle de verre, fixée avec de la formaline à 1 % pendant la nuit et lavée avec du PBS On a ajouté une goutte d'une solution, diluée 100 fois avec du sérum de cheval de l'anti- corps marqué par la fluorescéine, la rhodamine ou la bio- tine préparé dans l'exemple 5 ( 5), ( 6) ou ( 7), on l'a fait réagir à 37 C pendant une heure, on l'a lavée complètement avec du PBS pour éliminer les anticorps n'ayant pas réagi. Dans l'anticorps marqué par la fluorescéine ou la rhodamine, on a recherché la présence de fluorescence sur le champignon du sujet avec un microscope de fluores- cence (Olympus Vanox, Olympus, Japon) sur la lamelle. Dans l'anticorps marqué par la biotine, on a ajouté une goutte d'avidine D liée à de la fluorescéine à 5 g/ml (Funakoshi Yakuhin, Japon), on l'a fait réagir à la température ambiante pendant une heure et lavée en- tièrement avec du PBS On a observé la présence de fluores- cence sur la lamelle de verre par une microscopie de fluo- rescence. Les résultats sont indiqués dans le tableau 3. Par ailleurs, les colonies dérivées du crachat des patients D et E ont été identifiées comme étant de l'Asperaillus fumicatus dans l'observation morphologique effectuée simultanément sur les formes du conidiophore, le nombre de stérigmes et la couleur des colonies du sujet, qui étaient entièrement identiques aux résultats donnés par les anticorps marqués De plus, la colonie dérivée du crachat du malade F a été identifiée comme étant l'esp. Fusarium. TABLEAU 3 +: absorption ou fluorescence positive. : absorption ou fluorescence négative. Méthode Réactif Sujet Désgnation Source de Crachat du Crachat du Crachat du Aspergillus fumigatus l'antiorps patient D patient E patient F IAM 3006 peroxydase AS +( 492 nm) +( 492 nm) -( 492 m) +( 492 nm) peroxydase AS-1 +( 492 nm) +( 492 nm) -( 492 nm) +( 492 nm) AS-4+( 492 nm) +( 492 nm) -( 492 nm) +( 492 nm) immuno test phosphatase AS-1 +( 405 nm) +( 405 nm) -( 405 nm) +( 405 nm) enzyma alcaline AS-4 +( 405 nm) +( 405 nm) -( 405 nm) +( 405 nm) tique e-galactosidase AS-4 + + + AS-4 + + + , _r tech fluoresc ine AS-1 + + + nique AS-4 + + + de l'anti rhodamine AS1 + + + corps AS-4 + + + f luo rescent biotine AS-1 + + + AS-4 + + + a (t O tn O 4 Lw. ca EXEMPLE 7. Les crachats de deux malades, qui étaient sensés souffrir d'aspergillose pulmonaire, et une pleine anse d'Asperaillus fumipatus IAM 3006 ont été mis en suspension dans du PBS contenant du Tween 20 (R) à 0,05 % On a versé 1 ml de la suspension dans un tube à essai traité par un silicone de 1,2 cm de diamètre, et après avoir ajouté 4 ml de PBS contenant du Tween 20 (R) à 0,05 % et bien agité, on a soumis la suspension à la centrifugation ( 1500 x g, 20 minutes) pour obtenir un culot cellulaire. Après avoir lavé le culot cellulaire deux fois avec du PBS contenant du Tween 20 (R) à 0,05 %, on a ajouté pl de chaque anticorps marqué par 125 I préparé dans l'exemple 5 ( 4) (activité spécifique de 1 p Ci par mg d'an- ticorps) ou d'immunoglobuline de souris marquée par I et on a fait réagir à 37 C pendant une heure Après avoir lavé cinq fois avec du PBS contenant du Tween 20 (R) à O,05 X, on a mesuré la radioactivité avec un compteur y (Beckman, Gamma 8500, Beckman, USA) Simultanément, la cellule du sujet a été inoculée dans un milieu d'agar de dextrose de Sabouraud, laissée incuber à 25 o C et la colonie résultante a été examinée morphologiquement. Les résultats sont indiqués dans le tableau 4. Comme on le voit dans le tableau 4, les sujets ont été liés à tous les anticorps marqués avec 125 I, mon- trant qu'ils contenaient de l'As Deraillus fumigatus Par ailleurs, l'observation morphologique simultanée a montré que des colonies bleues ou bleuâtres ayant du conidiophore cylindrique avec un stérigme ont apparu, indiquant les su- jets contenant de l'Asperaillus fumigatus. - 35._. TABLEAU, 4 IAM 3006 w Go Ln ut " l LY -'J : o EXEMPLE 8. ( 1) PREPARATION DU PRODUIT DE LIAISON ANTICORPS-AGENT ANTIFONGIQUE. Après avoir ajusté à 10,4 mg/ml en ajoutant de l'eau distillée à l'anticorps (liquide surnageant ascitique purifié) dérivé de l'hybridome AS-1, AS-2, AS-3, AS-4 ou- AS-5, on a ajouté 13,0 mg/ml de solution d'amphotéricine Bdiméthylsulfoxyde, et ensuite on a ajouté de l'acide chlorhydrique tout en agitant pour ajuster le p H de la solution à 4,75 et on a ajouté simultanément 3,7 mg de chlorhydrate de 1-éthyl-3-( 3-diméthylaminopropyl)-carbo- diimide Après avoir fait réagir pendant 1, 3 ou 4 heures, on a arrêté la réaction en ajoutant 2 mi de tampon d'acé- tate (p H 4,70) Le mélange réactionnel a été ensuite dia- lysé contre 5 1 d'eau distillée à 4 C pendant 72 heures en changeant la solution de dialyse trois fois Après avoir concentré, le dialysat a été appliqué à une colonne de 1,5 cm de diamètre et de 55 cm de hauteur chargée de Sephadex G-25 (R) (Pharmacia, Suède) pour éliminer complè- tement les substances à bas poids moléculaire La solution résultante a été séchée par évaporation de la glace à -200 C pour obtenir le produit de liaison amphotéricine B-anti- corps Les quantités d'amphotéricine B liées dans les pro- duits par mg d'anticorps sont indiquées dans le tableau 5 Les produits de liaison de la 5-fluorocytosine avec les anticorps ont été obtenus de la même manière que mentionné ci-dessus Les quantités de 5-fluorocytosine liées dans les produits par mg d'anticorps sont indiquées dans le tableau 5 - ( 2) TOXICITE. Ces produits de liaison de l'agent antifongique avec l'anticorps et l'anticorps per se ont été administrés à des souris IGR par groupes de 10 animaux chacun en une quantité unitaire de 2 g/kg par voie orale, 400 mg/kg par voie intrapéritonéale ou 200 mg/kg par voie intraveineuse. Aucune mort n'a été observée pendant 14 jours. TABLEAU 5 taux de liaison (ig/mg) agent agent anticorps antifongique, 1 lheure 3 heures 4 heures dérivé de AS-1 1,0 15 2 r 5 " AS-2 113 1,5 278 amphotéricine B AS-3 10 O 2 t 0 2,5 " AS-4 10 2 j 0 2,5 " AS-5 10 1,8 2 3 dérivé de AS-1 1 O 1,5 2; 5 " de AS-2 1,3 2;O 3,3 -fluorocytosine " de AS3 1,3 2; 0 2,8 "de AS-4 1,3 2,0 2 5 "de AS-5 1,0 2,0 2 5 EXEMPLE 9. On a examiné l'effet de guérison sur les maladies infectieuses des anticorps de l'invention et des produits de liaison agent antifongiqueanticorps préparés dans l'exemple 8 A savoir, on a inoculé l'Asperqillus fumiaatus IAM 3006 ( 5 x 107 CFU) par voie intraveineuse à des souris BALB/c femelles âgées de 8 semaines (NIHON CHARLES LIVER, JAPON) par groupes de 15 animaux chacun, et on a administré l'anticorps dérivé de l'hybridome AS-1, AS-2, AS-3, AS-4 ou AS-5 ou chacun des produits de liaison agent fongique- anticorps préparés dans l'exemple 8 par une réaction de 4 heures a été par voie intraveineuse (produits de liaison anticorps per se et amphoréticine B) ou par voie intra- péritonéale (produits de liaison avec la 5-fluorocytosine) 1, 24 ou 48 heures après l'injection La mort due à l'in- fection a été observée pendant 14 jours Par ailleurs, on a administré les produits de comparaison, amphotéricine B et 5-fluorocytosine par voie intraveineuse et par voie ora- le, respectivement Les quantités unitaires des produits de liaison de l'invention étaient de 5 pg d'amphotéricine B et 20 pg de 5-fluorocytosine, respectivement dans chaque animal. Les résultats sont identiques dans le tableau 6. Comme on le voit dans le tableau 6, les produits de liaison avec l'agent antifongique de la présente inven- tion ont montré un effet de guérison apparemment sur la maladie infectieuse causée par l'Aspergillus fumigatus. De plus, on a observé de l'animal survivant dans le groupe auquel on a administré les anticorps Der se dérivés de l'hybridome AS-1, AS-3 ou AS-4 bien que quelque peu moins efficaces. TABLEAU 6 survivant/total -Témoin 0/15 Anticorps dérivé de AS-1 (i v) 1/15 " t " AS2 0/15 O,i AS-3 2/15 "" 8 AS-4 1/15 " *," AS-5 0/15 amphotéricine B 5 pg (i v) 4/15 produit de liaison de l'anticorps AS-1 de l'amphotéricine B (i v) 9/15 AS-2 8/15 AS-3 9/15 " AS-4 10/10 " AS-5 11/15 -fluorocytosine 2000 pg (p o) 3/15 produit de liaison de l'anticorps AS-1 de la 5-fluorocytosine 6/15 AS-2 5/15 " AS-3 5/15 " AS-4 7/15 AS-5 4/15 *Nombre d'animaux survivants 14 jours après l'inoculation de l'Asperaillus fumiiatus. REVENDICATIONS 1 Procédé de préparation d'un anticorps contre l'antigène de surface d'un champignon appartenant ù genre As Deraillus, qui comprend la préparation d'un hybridome entre une cellule capable de produire un anticorps et une cellule qui peut être conservée de façon permanente par repiqudge in vitro et la récupération de l'anticorps sécré- té par l'hybridome. 2 Procédé selon la revendication 1, dans lequel la cellule capable de produire l'anticorps est une cellule de rate, une cellule de ganglions lymphatiques, une cellule de leucocyte du sang périphérique ou un mélange de celles- ci. 3 Procédé selon la revendication 2, dans lequel la cellule provient d'une souris. 4 Procédé selon la revendication 3, dans lequel la souris est une souris BALB/c ou une souris hybride de celle-ci. Procédé selon 'ta revendication 1, dans lequel la cellule qui peut être conservée de façon permanente par repiquage in vitro est une cellule de myélome. 6 Procédé selon la revendication 1, dans lequel la cellule qui peut être conservée de façon permanente par repiquage in vitro est déficitaire en hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransférase ou en thymidine kinase. 7 Procédé selon la revendication 5 ou 6, dans lequel la cellule provient d'une souris. 8 Procédé selon la revendication 7, dans lequel la cellule provient de la lignée de cellules P 3-X 63-Ag 8, P 3-NSI/1-Ag 4-1, Sp 2/0-Agl 4 ou X 63-Ag 8 653. 9 Procédé selon la revendication 1, dans lequel la cellule capable de produire l'anticorps provient d'un animal immunisé avec le champignon. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'hybridome est préparé en présence de polyéthylèneglycol. 11 Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'hybridome est cultivé dans un milieu contenant de l'hypo- xanthine, de l'aminoptérine et de la thymidine pour la sé- lection. 12 Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'hybridome est cloné pour obtenir un clone unique. 13 Procédé selon la revendication 12, dans le- quel le clonage est réalisé par culture à dilution limitan- te, culture sur gélose molle ou culture sur gel de fibrine. 14 Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'hybridome est cultivé in vitro pour la sécrétion de l'an- ticorps. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'hybridome est transplanté à un animal et cultivé in vivo et l'anticorps sécrété est séparé de l'humeur corporelle de l'animal. 16 Procédé selon la revendication 15, dans le- quel l'humeur corporelle est du sérum ou de l'ascite. 17 Procédé selon la revendication 15 ou 16, dans lequel l'animal est une souris. 18 Procédé selon la revendication 17, dans le- quel la souris est une souris BALB/c ou une souris hybride de celle-ci. 19 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 18, dans lequel le champignon est une race d'Asneraillus fumiaatus. Hybridome produisant un anticorps vis-à-vis de l'antigène de surface d'un champignon appartenant au genre Aspergillus, préparé à partir d'une cellule capable de produire l'anticorps et d'une cellule qui peut être conservée de façon permanente par repiquage in vitro. 21 Hybridome selon la revendication 20, qui est AS-1, AS-2, AS-3, AS-4 ou AS-5. 22 Anticorps contre l'antigène de surface d'un champignon appartenant au genre Aspergillus, préparé par le procédé selon la revendication 1 - 23 Anticorps selon la revendication 22, qui est sécrété par l'hybridome AS-1, AS-2, AS-3, AS-4 ou AS-5. 24 Anticorps contre l'antigène de surface d'une souche d'Asperaillus fumigatus, qui est sécrété par l'hy- bridome AS-1 ou AS-4. Anticorps contre l'antigène de surface d'une souche d'Asperaillus fumigatus, Aspergillus flavus, Asper- gillus niaer et Asperaillus orvzae qui est sécrété par l'hybridome AS-2, AS-3 ou AS-5. 26 Réactif pour la classification et/ou l'iden- tification d'un champignon appartenant au genre Asperaillus, qui contient un ou plusieurs anticorps selon la revendica- tion 22. 27 Réactif selon la revendication 26, qui con- tient de plus un support ou un diluant. 28 Réactif selon la revendication 26, qui est pour la classification et/ou l'identification d'une souche d'Asnergillus fumicatus. 29 Réactif selon l'une quelconque des revendica- tions 26 à 28, qui sert à l'identification de l'aspergillo- se de l'homme ou d'un animal. Dérivé ou produit de restriction de l'anti- corps selon la revendication 22. 31 Dérivé selon la revendication 30, dans lequel une substance radioactive, un colorant fluorescent, une enzyme, un marqueur pour la microscopie électronique ou un groupe résiduel contenant une structure pour-la combinaison secondaire de ceux-ci est chimiquement lié(e) à l'anticorps. -32 Produit de restriction selon la revendication , qui est obtenu par division restrictive de l'anticorps par un traitement chimique ou par une enzyme. 33 Dérivé selon la revendication 31, dans lequel la substance radioactive est 125 I. 34 Dérivé selon la revendication 31, dans lequel le colorant fluorescent est la fluorescéine ou la rhoda- mine. Dérivé selon la revendication 31, dans lequel l'enzyme est de la peroxydase, de la phosphatase alcaline ou de la e-galactosidase. 36 Dérivé selon la revendication 31, dans lequel la structure est la biotine. 37 Réactif pour la classification et/ou l'iden- tification d'un champignon appartenant au genre Aspergillus, qui contient un ou plusieurs dérivés ou produits de res- triction selon la revendication 30. 38 Réactif selon la revendication 37, qui con- tient de plus un support ou un diluant. 39 Procédé de classification et/ou d'identifica- tion d'un champignon appartenant au genre Aspergillus avec l'utilisation du réactif selon la revendication 26 ou 37. Procédé selon la revendication 39, dans le- quel un sujet contenant le champignon est en contact avec le réactif et la réaction antigène-anticorps est utilisée. 41 Procédé selon la revendication 40, dans le- quel le sujet est issu d'un humain ou d'un animal. 42 Agent de guérison de l'aspergillose contenant un ou plusieurs anticorps selon la revendication 22. 43 Agent selon la revendication 42, qui contient de plus un support ou un diluant. 44 Produit de liaison de l'anticorps selon la revendication 22 avec un agent antifongique. Produit selon la revendication 44, dans le- quel l'agent antifongique est l'amphotéricine B ou la 5- fluorocytosine. 46 Agent de guérison de l'aspergillose contenant un ou plusieurs produits de liaison selon la revendication 44.