FR 2543018 A1 19840928 FR 8304674 A 19830322 PROCEDE DE PREPARATION DE VESICULES LIPIDIQUES PAR VAPORISA- TION DE SOLVANTS. La présente invention a pour objet un procédé de préparation de vésicules lipidiques unilamellaires ayant un O diamètre moyen supérieur à 1 OOO A. Les vésicules lipidiques constituent des moyens permettant d'encapsuler un liquide aqueuxg, par exemple une solution aqueuse d'une substance biologiquement active; on sait que, selon la méthode que l'on emploie pour préparer ces vésicules, on obtient ou bien des vésicules multilamel- laires (MLV), qui sont constituées chacune par une plurali- té de feuillets lipidiques sphéroïdes, ou bien des vésicules unilamellaires, dont chacune ne comporte qu un seul feuillet lipidique Dans cette dernière catégorie, on obtient d'ail- leurs, selon la méthode de preéparation utilisée, soit un diamètre moyen inférieur à 1 000 A (SUV), soit un diamètre moyen supérieur à 1 000 A (LUV) o Il va de soi que les vésicules unilamellaires présentent des avantages sur les vésicules multilamellaires, car ces dernières ont une taille hétérogène et possèdent un nombre de feuillets irrégulier v En outre, parmi les v'e sicules unilamellaires, celles de la seconde catégorie (LUV) présentent des avantages sur celles de la première catégorie (SUV) car, vu leur taille supérieure, elles pré- sentent une capacité d'encapsulation avec un rendement su- périeur De plus, elles permettent d'encapsuler des macro- molécules à poids moléculaire élevé Il en résulte que l'on cherche à obtenir à l'échelle industrielle, avec le meilleur rendement possible, des vésicules unilamellaires du type (LUV). Pour préparer ce type de vésicules unilamellai- res, deux méthodes de préparation Sont actuellement connues: la méthode d'élimination de détergent par dialyse et la mé- thode de vaporisation de solvants. L'article de David S Cafiso (Biochemica et '43018 Biophysica Acta, 649 ( 1981), 129-132, intitulé "Preparation of unilamellar lipid vesicles at 37 C by vaporization methods ") décrit un procédé utilisant des solvants à bas point d'ébullition pour preparer des vésicules de type LUV à des temperatures physiologiques Conformément à ce procédé connu, on injecte,dans une colonne d'un tampon aqueux à 37 C, des solutions d ethy 1-méthyléether ou de dichlorofluo- ométhane à 4 C contenant des lipides solubiliséso Il est indique dans ce document que les principaux avantages du pro- l O cédé sont, d'une part, que les substances sensibles à la chaleur peuvent Gtre plus facilement piégées dans le volume interne de la vésicule sans dénaturation thermique et, d'autre part, que le nombre des lipides, qui sont solubles dans le dichlorofluorométhane, est supérieur au nombre de lipides pouvant être solubilisés dans de nombreux autres sol- vantso i 1 l n'en reste pas moins que, si ce procédé dans lequel l'étape d'injection est réalisée dans N milieu à 37 C, représente un perfectionnement par rapport aux procé- dés antérieurement connus, o le milieu d Ainjection était généralement a une température de l'ordre de 60 à 650 C, il n'est cependant pas applicable à des substances sensibles à des temperatures inférieures à 37 C; à 37 'C, on constate par exemple la dénaturation de certaines protéines ou l'inactivation de certaines molécules actives. I Ii, On a, toutefois, déjà cherché à remédier aux inconvénients précités, comme le montre la demande de brevet européen n O 055 576; dans cette demande, on propose un procédé industriel pour fabriquer des vésicules dans des con- ditions douces (c'est-à-dire en dessous de la température de transition des substances lipidiques et sans que l'on ait besoin d'agir fortement sur le milieu récepteur). Conformément à ce procédé, on utilise un système de solvants pour les lipides qui comprend un solvant Si hydrosoluble choisi parmi le méthanol, l'éthanol, le-propanol et l'iso- propanol,et un solvant 52 hydrophobe, plus volatil que la solution aqueuse, et qui est choisi parmi l'hexane, le cyclohexane, le 2,2diméthyl-butane, le pentane, l'isopentane et le 11,,2-trichlorotriflnu Déthane Le fait que 52 présente un point d'ébullition supérieur à la température ambiante ( 280 C-81 C), oblige à porter la dispersion de vésicules à unetempérature relativement élevée pour éliminer 52, et le fait que 51 soit hydrosoluble oblige à purifier cette dis- persion par dialyse ou filtration sur colonne afin d'élimi- ner le solvant Si Il en résulte que le procédé décrit dans la demande de brevet européen O 055 556 ne peut pas non plus convenir à l'encapsulation de substances thermo-sensibles. Selon l'invention, on a pensé que l'on pouvait former des vésicules à basse température si l'on diminuait la pression à laquelle est conditionnée la phase aqueuse à encapsuler An a observé alors que si l'on injectait, avec un débit réduit, dans un milieu récep- teur aqueux sous pression réduite, une solution lipidique conditionnée dans un récipient pressurisé, on obtenait, aux températures précitées, des vésicules avec un rendement très satisfaisant Le phénomène observé est dû à la combinaison de deux facteurs: d'une part, l'injection est effectuée avec un débit réduit, d'autre part, la pression, à laquelle est conditionnée la phase aqueuse à encapsuler, est inférieure à la pression, à laquelle est conditionnée la solution lipidique à l'état liquide et à la tension de vapeur du (ou des) solvant(s) dans les gouttelettes qui se forment au point d'injection à la température du milieu récepteur. -Pour expliquer le rendement très supérieur du procédé selon l'invention par rapport aux procédés connus de vaporisation de solvants, o les milieux lipidiques et récepteurs sont à pression normale, on a émis l'hypothèse, sans toutefois que cette explication soit aucunement limita- tive, que, dans les procédés connus, il se produit, dans le milieu d'injection, un échange thermique relativement lent, les gouttelettes lipidiques se divisant et donnant alors naissance à des vésicules relativement petites ( 150 nm de diamètre moyen) Au contraire, dans le cas de la présente invention, on observe que les gouttelettes qui sont introduites dans le milieu récepteur explosent presque instantanément, ce qui conduit à des vésicules unilamellai- res de plus grande taille Il en résulte que le "flash" en milieu aqueux qui est réalisé selon l'invention par diminu- tion de la pression n'est pas l'équivalent du flash connu du à une élévation de temperature par injection dans le mi- lieu de réception La présente invention permet, en outre, de travailler avec une tempéerature de réception quelconque, que l'on choisit, de préférence, inférieure à 25 C pour permettre l'encapsulation de substances thermosensibles. La présente invention a, en conséquence, pour objet, un procédé de préparation de vésicules lipidiques unilamellaires ayant un diamètre moyen supérieur à 1 000 A, chacune de ces vésicules étant constituée par un feuillet lipidique sphérolde à l'intérieur duquel est placée une substance à encapsuler, procédé suivant lequel on solubilise le (ou les) lipide(s) destiné(s) à former le feuillet des vésicules dans au moins un solvant insoluble dans l'eau, on conditionne la solution lipidique à l'état liquide dans un récipient à une pression Pl et à une température el, on so- lubilise la substance à encapsuler pour obtenir une phase aqueuse, on conditionne ladite phase aqueuse à encapsuler à une pression P 2 et à une temperature e 2 et on injecte la solution lipidique dans la phase aqueuse, de telle sorte que le (ou les) solvant(s) de la solution lipidique se vapo- rise(nt) lorsqu'il(s) arrive(nt) au contact de ladite phase aqueuse, caractérisé par le fait que l'on injecte la solu- tion lipidique dans la phase aqueuse à encapsuler avec un débit réduit pour constituer initialement des gouttelettes, la pression P 2 étant inférieure à Pl et à la tension de vapeur du (ou des) solvant(s) dans lesdites gouttelettes à la température e 2. On choisit, de préférence, les températures 01 et 82 sensiblement égales. Dans un mode préféré de rmise en oeuvre du procé- dé selon l'invention, on conditionne la solution lipidique dans un récipient du type "bombe aérosol" renfermant un agent propulseur et l'on choisit la pression P 2 au-dessou$ de la pression atmosphérique On préfère alors, pour des raisons exposées plus loins utiliser un (ou des) lipide(s) ayant une solubilité totale dans le eontenu liquide de la bombe aérosol On choisit la pression Pl dans la bombe aéro- sol à une valeur comprises par exemple, entre 1 et 8 bars absolus De préférence, la pression Pl a une valeur comprise entre 4 et 6 bars absoluso Pour pouvoir encapsuler des substances thermo- sensibles, on choisit commre solvant(s) pour le(s) lipide(s) un (ou des) solvant(s) qui a (ou ont) un point d'ébullition inférieur à 25 C G et l'on choisit les températures 8 L et t 2 sensiblement égales à la température ambiante De plus, on choisit comme solvant(s) pour le(s) lipide(s), un (ou des) solvant(s) preésentant une faible polarité Les solvants qui remplissent les conditions précitées sont notammnent les carbures halogénés, parmi lesquels on peut citer le trichlo= rofluorométhane, le dichdilom Dfluoroméhane et le didorcfli Domnl ane L'agent propulseur utilisé selon l'invention peut être un gaz comprimé soluble dans la phase liquide con- tenue dans la bombe aérosol, ce gaz pouvant tre le protoxy- de d'azote ou le gaz carbonique Lnagent propulseur peut également être un gaz liquéfié miscible à la solution lipi- die cataenue dans la banmbe aéol et cosistt essentiellement en un hy- drocarbure halogéné ou non Parmi les hydrocarbures, on ci- tera le butane et le propane et parmi les carbures halogénés, les chiorofluoroalcanes coumme le dichlorofîuoromé-thane, le dichlorodifluorcmaéthane, le dic-hloro-1,2 tétrafluozo- 1,1,2 t 2 éth&ne O Leagent Pr OPUI Seur peut également consister en un gaz comprîmé non soluble dans la phase Iliquîde conte- nue dans la bombe aérosol, ce gaz comprime pouvant 3 tre de l'azote Dans le cas o l'agent propulseur est un gaz li- qué fié miscible à la solution lipidiîqî:e de la bombe aérosol, il se peut qu'il dîminue la solubilité des lipidea dans le solv;,ant, auquel cas, on peut séparer le propulseur et le wovar j O daa Jalbenaérosol par Une poche Plastique ou métallique. selon I Vi-iven-tion-, lan dissout le (Ou les) 1 ipide(s) dans le solvant choisi à une concentration allant e 0,01 à 10 g pour 100 ni de solvant. De plus, dans le cas o l'on utilise un (ou des) lipide(s) ionique(s), on utilise avantageusement Un Solvant con Mlémentaire plus polai:re que le(s) solvan-t(s) de base, -pour alirrla solubilité' dre ce(s) I Lpi-de(-) iîonique(s) A titre d'exemîple de solvant clmnar L on peut citer ilthyl-méti-yl Ué-ther. En outre, il est également possible deintroduiree dans la solution lipidique, des substances lip ophiles à encapsuler, ces substances restant dans les parois des vésiâ-4 cules qui seront formées ultérieurement. Pour fournir le débit réduit de la solution li- pidique dans le récipient renfermant la phase aqueuse a en- capsuler, on utilise avantageusement un-e maicrovanne que l'on régle, de préférence, pour qu'elle -fournisse un débit comn- pris en tre 5 ml par heure et 10 mi par minute. Conformément à d'autres caractéristiques du pro- cédé selon la présente invention on choisit la pression 'O comprise entre 0,1 mxbar et 15 =bars; on amène la solution lipidique dans le récipient con, tenant la phase aqueuse de la substance à encapsuler par leintermédiaire d'un tube capillaire; on maintient const ad et ba 3 sse la tnmprature 8 de la phase à encapsuler, à l'aide d'un thermostat; on cé'oisit d erénre hla tente e injieure à 25 C; on ate de façon douce la phase aqueuse i encapsuler; dans le cas o la substance à encapsuler est une substance non dégradable, on agite mécaniquement, par bains à ultrasons, la phase aqueuse à encapsuler; dans le cas o la substance à encap- suler est une substance protéinique, on introduit dans la phase aqueuse à encapsuler, un agent anti-mousse. En outre, selon l'invention, on peut avantageu- sement produire les vésicules en continu; dans un mode avan- tageux de mise en oeuvre, on injecte la solution lipidique dans une canalisation dans laquelle on fait circuler la pha- se aqueuse à encapsuler. En pratique, dans la conduite du procédé, on règle les valeurs du débit données par la microvanne et la valeur de la pression P 2 en fonction de la substance à en- capsuler On peut indiquer que, pour des solutés autres que protéiniques, on peut utiliser le débit maximum et choisir une pression P 2 de 15 mbars puis de 0,1 mbar En revanche, pour l'encapsulation de produits protéiniques, au cours de laquelle une mousse stabilisée risque de se former, on appli- que un débit faible et une pression faiblement réduite. On a constaté que l'hétérogénéité de la distribu- tion des vésicules dépend peu du débit, moyennement de la concentration en lipides dans la bombe aérosol et des moyens d'agitation de la solution aqueuse, fortement de la substan- ce à encapsuler et, en particulier, de sa viscosité, de la floculation des vésicules formtes dans certains types de soluté. La solution finale de vésicules, que l'on obtient avec le procédé selon l'invention, présente une concentration en lipides pouvant varier entre 0, 1 et 10 % en poids, le volume encapsulé est élevé comparativement aux modes de pré- paration connus de vésicules. La présente invention a également pour objet un appareillage destiné à la mise en oeuvre du procédé ci-des- sus défini, caractérisé par le fait qu'il conmporte un pre- mier récipient, du type bombe aérosol, doté d'une valve de sortie et un second récipient dans lequel une pression ré- duite peut être établie, des moyens permettant de mettre en communication de fluide le premier et le second réci- pients, de sorte que le contenu du premier récipient puisse être injecté dans le contenu du second récipient, une mi- crovanne étant associée aux moyens précites en vue de régler le débit d'injection. Conformément à un mode de réalisation préféré de l'appareillage selon l'invention, les moyens permettant de mettre en communication de fluide le premier et le second récipients consistent, d'une part, en une piece tubulaire de transfert s'adaptant, à l'une de ses extrémités, sur la tubu- lure de sortie de la valve de sortie du récipient aérosol et, à l'autre extrémité, sur l'entrée de la microvanne et, d'au- tre part, en un tube capillaire de distribution, dont une extrémité s'adapte sur la sortie de la microvanneo De préfé- rence, cette dernière est une microvanne à pointeau. Gonformément à d'autres caractéristiques de l'ap- pareillage pour la mise en oeuvre du procédé selon l'inven- tion, le tube capillaire a un diamètre intérieur de 0,3 mm environ; un dispositif diffuseur est adapté à l'extrémité du tube capillaire de distribution; le second récipient comporte un thermostat; le second récipient comporte des moyens permettant d'agiter son contenu. Pour mieux faire comprendre l'objet de l'inven- tion, on va en décrire maintenant, à titre d'exemples pure- ment illustratifs et non limitatifs, plusieurs modes de mise en oeuvre Le dessin annexé fournit des représentations schématiques relatives au dispositif destiné à la mise en oeuvre du procédé. Sur ce dessin: la figure 1 représente schématiquement l'ap- pareillage de mise en oeuvre du procédé selon l'invention dans son ensemble; la figure 2 représente, à plus grande échelle, un mode de réalisation particulier du récipient aérosol uti- lisé, sur la sortie duquel est adaptée une microvanne desti- née à fournir le débit réduit nécessité par le procédé selon l'invention; la figure 3 représente schématiquement une coupe d'un récipient aérosol destiné à renfermer un propul- seur liquéfié, susceptible de diminuer la solubilité des li- pides dans le solvant. L'appareillage, qui est représenté sur la figure 1, comporte un premier récipient, qui consiste en une bombe aérosol 1, et un second récipient constitué par un ballon 2, dans lequel une pression réduite P, est susceptible d'être établie. Le récipient aérosol 1 comporte une valve de fermeture 3 ainsi qu'une tubulure 4 plongeant dans le liqui- de 5 qu'elle contient La sortie de la bombe aérosol est re- liée à une microvanne 6 à la sortie de laquelle est disposé un tube capillaire 7 plongeant dans le liquide 8-du ballon 2. Ce capillaire présente un diamètre d'environ 0,3 mm et une longueur de 20 cm. Dans le mode particulier de réalisation de la figure 2, une pièce tubulaire de transfert 9 s'adapte, à l'une de ses extrémités, sur la tubulure de sortie de la valve 3 et, à son autre extrémité, sur l'entrée de la mi- crovanne 6 A cet effet, la pièce 9 s'engage par son extré- mité de sortie dans l'alésage central 10 d'une première bague 11, l'alésage 10 recevant à l'opposé la tubulure de sortie 12 de la microvanne 6 Par ailleurs, la bague 11, qui consti- tue une bague de serrage, est réunie à une seconde bague 13 entourant le goulot du récipient aérosol 1 Les deux bagues sont réunies entre elles par vissage de deux jupes concern triques lla et 13 a portées respectivement par les bagues 11 et 13. La microvanne 6 est une microvanne à pointeau, qui permet un réglage très fin par la vis 14 o On peut utili- ser, par exemple, une vanne "Nupro", référence S 525 G, en acier inoxydable Le capillaire 7 est assermblé à lae sortie de la microvanne 6 par i'intermédiaire d'un raccord 15. Dans le cas particulier o le récipient aérosol 1 renferme un propulseur consistant en un gaz liquéfié mis- cible à la solution lipidique contenue dans la bombe aérosol et susceptible de diminuer la solubilité des lipides dans les solvants utilisés, on sépare l'agent propulseur du sol- vant dans lequel les lipides sont solul Aisés par une poche en matière plastique ou métallique 17, le propulseur étant disposé à l'extérieur de la poche 17. On décrira ci-après un exemple de préparation de vésicules lipidiques selon l'invention ainsi que des exemples comparatifs A, B, C suivant lesquels des vésicules de composition lipidique identique sont preparées en mettant en oeuvre des procédés connuso Le tableau I peret de mettre en évidence que le volume encapsul I dans les vésicules selon la présente invention est bien plus élevé que celui qui peut Otre encapsulé dans des vésicules preparées suivamt les procédés connus. La composition lipidique utilisée pour tous ces exemples (exprimée en % en poids) est la suivante: composé lipidique non ionique de formule générale R -+OCN 2 CH - OH 225 n CH 20 H dans laquelle R est un radical hexadécyl et n a une valeur statistique moyenne égale à 3 47,5 % cholestérol, * O * o ç 47,5 % dicétyl phosphate o * e 00 oo* O eoo O * 5 % EXEPLE 1 Préparation de vésicules lipidiques utnilamellaires du type LUVW par le procédé selon l'invention Dans un récipient aérosol de 150 ml, on pèse 0, 5 g du mlange lip Uque de la compositim précitée On ajoute 100 g de trichlorofluorométhane On sertit de façon hermétique le récipient aérosol avec un ensemble bague-valve-tube plon- geur On dissout les lipides dans leur solvrant par agita- tion du récipient à une température d'environ 40 Cpuis on laisse refroidir à la température amblante On transfère dans le récipient aérosol 4 g de protoxyde d'azote pour y établir une pression de 6 bars On monte sur le récipient aérosol le dispositif composé d'une pièce de transfert, d'une micro- vanne à pointeau à commande micrométrique, d'un tube capil- laire de diamètre interne de 053 mm et d'un diffuseur a grille métallique inoxydable a mailles de 2 microns On im- merge le diffuseur dans 50 ml d'une solution de glucose 0,3 molaire contenue dans un récipient du type erlen à fond plat muni d'une prise de vide On place un barreau aimanté dans la solution de glucose On place 'erlen dans un bain-marie d'eau thermostaté à 20 C et sur un agi- tateur magnétiq Ue On reli U la prise de vide de I'erlen à une trompe à eau assurant une pression réduite de 15 mbars. On règle la microvanne pour qué'elle fournisse un débit de 3 ml par minute On soumet la dispersion aqueuse de vésieu- les ainsi formées à une pression rédu'ite de:I mhar pendant une heure afin de chasser Jee dernière traces de solvant. La dispersion de vésicules est htenue à une c Oncentration en lipides de I % Par eamen au Vranulomètre à diffusion quasi-6 lastique (Nanosi Lzer la taille moyenne est dter- minée à 300 nm Ear dasage du glucose encapsulê, le taux de gonflement est déterminé a 18 pl/mg de lipideso. E 3 XEPLE COMPARATIF A Préparation de vésicules multilamellaires par ultra-disper- sion Ce procéde est celui décrit dans le brevet fran- çais 2 315 991. Dans un bécher en acier inoxydable de 250 ml, on pèse 8 g du msélage lpidique de la compositn précitée que l'on fond à 100-120 C A 800 C, on ajoute 20 g d'une solution aqueuse de glucose 0,3 molaire et,à l'aide d'une spatule métallique, on homogénéise la phase lipidique ainsi form e (phase lamellaire) On ajoute ensuite 72 g de la solution aqueuse de glucose 0,3 M On soumet le nsemble à l'action d'un ultradisperseur Virtis modèle 60 K On règle la vitesse de la turbine à 40 000 tours par minute et on agite pendant minutes On limite l'chauffement de la dispersion vésiculaire en l'immergeant dans un bain=marie d'eau thermostaté à 20 C La dispersion de vésicules emt obtenue à une concentration en lipides de 8 % Par examen au 1 anosizer, la taille moyenne est déterminée à >, 300 n. Par dosage dn glucose encapsulé, le taux de gonflement est déterminé à 7} ul/mg de lipideso EX Et PLE COMPARATIF B Préparation de vésicules i 1 nilamellaires du tte SUV par le procédé par ultrasons Dans un ballon rond de 100 ml, on pèse 0,3 g du émgan pidique de la canrositionpzcitée On dissout le mélange dans 5 ml d'un mélange chloroforme'mgthanol dans le rapport 2:1 On évapore le solvant à l'aide d'un évapora- teur rotatif, puis on élimine les dernières traces de sol- vant en soumettant le mélange des produits pendant une heure à la pression réduite donnée par une pompe à palettes. On met en contact le film lipidique obtenu avec 10 ml d'une solution aqueuse de glucose 093 molaireo Le ballon, placé sur une secoueuse, est fortement agité durant deux heures à la température de 60 'Cpuis en refroidissant pro- gressivement jusqu'à revenir à la temperature ambiante. La dispersion de vésicules est alors soumise à l'action des ultrasons par contact pendant 20 minutes avec une microsonde reliée à un générateur Branson du type Sornifier B 30 Pendant l'ultrasonnage, l'échauffement de la disper- sion de vésicules est limité par l'utilisation d'un bain- marie d'eau thermostaté à 20 C La dispersion de vésicules est obtenue à une concentration en lipides de 3 % Par examen au Nanosizer, la taille moyenne est déterminée à nm Par dosage du glucose encapsulê, le taux de gonfle- ment est déterminé à 2 pl/mg de lipides. EXEMPLE COMPARATIF C Préparation de vésicues l pid ques nilamellaires du type LUV par dialyse Dans un ballon rond de 100 ml, on pèse 0,15 g du mlage lipidique de la cnmpos Lticn précitée On les dissout dans 3 ml d'un mélange chioroforme-méthanol dans le rapport 2:1. On évapore le solvant à l'aide d'un évaporateur rotatif, puis on élimine les dernières traces de sorlvant en soumet- tant le mélange des produits pendant une heure à la pression réduite donnée par une pompe à palettes On met en contact le film lipidique obtenu avec 10 ml d'une solution aqueuse de glucose 0,3 molaire Le ballon, placé sur une secoueuse est fortement agité durant deux heures à la température de 60 "C On ajoute alors 600 mg d'octylglucoside en pour- suivant l'agitation pendant deux heures à 60 C La solution micellaire ainsi obtenue est limpide On introduit 5 ml de cette solution dans la cellule de dialyse du LIPOPREP DIACHEMA:"Bilayer Liposome Preparation Device' Les réglages sont faits pour l'obtention des conditions suivantes: température du compartiment de dialyse: 60 C pendant dix-huit heures,puis refroidissement progressif de 60 a 25 C en quatre heures; - débit de dialyse: 2 ml par minute pour chacune des deux demi-cellules; solution de dialyse: glucose 0,3 molaire vitesse d'agitation du barreau aimanté dans la cellule 100 tours/minute. La dispersion de vésicules est obtenue à une concentration en lipides de l,5 % Par examen au Nanosizer, la taille est déterminée à 150 nm Par dosage du glucose encapsulé, le taux de gonflement est déterminé à 4 pl/mg de lipides. TABLEAU I déterminé par microdosage le glucose Les vésicules enzymatique d'un soluté encapsulé formées dans une solution de glu- cose 0)3 M sont filtrées sur une colonne de gel =Pharmacia du type Sephadex G 50 Coarse élué par une solution aqueuse- de chlorure de sodium 0,15 molaire Les vésicules ainsi lavées de toutes traces de glucose non encapsulé sont alors micellisées par un agent de surface tel que le Triton X 100 (octylphénoxypolyéthoxyéthanol), ce qui permet de libérer et consécutivement de doser le glucose préa- lablement encapsulé. I 1 est bien entendu que les modes de mise en oeuvre de réalisation cidessus décrits ne sont aucunement limitatifs et pourront donner lieu à toutes modifications désirables sans sortir pour cela du cadre de linvention. Tpes de Ta Ml Volum Incompatibilité ésicule Méthode Mvr encapsulé avec _(nm) J(u /mdg l _pi __s) MLV Utcre&spe 2 ion I 300 7 Substances senshles Exemple A àla tempérare et agitatim mécanique. SUV Ul trasons 2 Substances sensibles à Exemple B 90 la taemperature et agi- tation mécanique. LUV Dialyse 4 Substances thermo- * Exemple C sensibles LUV Procédé sele i ' invention 18 eucune Exemple 1 REVENDICATIONS 1 Procédé de préparation de vésicules lipidiques unilamellaires ayant un diamètre moyen supérieur à 1 000 A, chacune deces vésicules étant constituée par un feuillet lipidique sphérolde à l'intérieur duquel est placée une substance âencapsuler, procédé suivant lequel on solubilise le (ou les) lipide(s) destiné(s) & former le feuillet des vésicules dans au moins un solvant insoluble dans l Vea, on cornditionne la solution lipidique à létat liquide dans un récipient a une pression Pl et à une température 0 1, on solubilise la substance à encapsue pour obtenir une phase aqueuse, on conditionne ladite phase aqueuse a encapsuler à une pression P 2 et: à une température e 22 et on injecte la solution lipidique dans la phase aqueuse, de telle sorte que le (ou les) solvant(s) de la solution lipidique se vaporise(nt) lorsqu'il(s) arrive(nt) au contact de ladite phase aqueuse, caractérisé par le fait que l'on injecte la solution lipidique dans la phase aqueu- se à encapsuler avec un débit réduit pour constituer initialement des gouttelettes' la pression P 2 étant infgú rieure a Pl et à la tension de vapeur du (ou des) sol- vant(s) dans lesdites gouttelette à la température 02 o 2 Procédé selon la revendication l, caractérisa par le fait que 'on choisit les températures 1 et 2 sensiblemernt égales. 3 Procédé selon l'une des revendicationa 1 ou 22 caractérisé par le fait que lon econditionne la solution lipidique dans un récipient du type 'bombe aércsol' renfermant un agent propulseur et que l'on ch Qv 2 sit lares sion P 2 au dessous de la pression atzosphériqum. 4 Procédé selon la revendication 3, caractrisé par le fait que l'on utilise un (ou des) lie Lde(s) ayant une solubilité totale dans le contenue liquide de la bombe aéro- sol. Procédé selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisé par le fait que 1 'on choisit la pression Pl à une valeur comprise entre 1 et 8 bars absolus. 6 Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que l'n choisit la pression Pl a mne valeur comprise entre 4 et 6 bars absolus. 7 Procédé selon l'une des revendications i à 6, caractérisé par le fait que l'on choiîsf come solvant( 8) pour le(s) lipide(s) un (ou des) oolvant(s), quî a, (ont) un point dbullition inférîeur & 250 'Oet que l'on choisit les températres e t e 2 senâiblement égale à la tepatue ambianteo 8 procédé selon 'une de revesdicatiem 1 à 7, caractrisé par le fait que l'on choioit comme oalvant(s)pouz le( 53 lip Ide(s Y, un (O Udes) Z-lv Enp(G qui snl)ue po 1 azltd. 9 Procédé selon les revendications 7 et 8 prises simultanément, caractérisé par le fait que l'on clàoisit le(s) solvant(s) parmi les carbures halogénâso Procédé selon l'une des revendications 3 à 6, caractérisé par le fait que l'on choisîtt come agent propulseur, un gaz comprimé soluble dans la phase liqulde contenue dans la bombe aérosol, 11 Procédé selon l'une des revendications 3 à 6, caractérisé par le fait que l'on choisit, comme agent pro- pulseur, un gaz liquéfié miscible à la solution-lipidique contenue dans la bombe aéroso 10 12 Procédé selon la revendication 11 caractérisé' par le fait que l'on choisit, comme agent propulseur, un hydrocarbure halogéné ou non. 13 Procédé selon l'une des revendications 3 à 6, caractérisé par le fait que l'on choisit, comme agent pro- pulseur, un gaz comprimé non soluble dans la phase liquide contenue dans la bombe aérosol. 14 Procédé selon l'une des revendications 11 ou 12, caractérisé par le fait que l'on sépare le propulseur et le solvant dans la bombe aérosol par une poche plastique ou métallique. Procédé selon l'une des revendications 2 & 14, caractérisé par le fait que l'on dissout lea (ou les) lipide() dans son (ses) solvant(s) & une concentration allant de 0,01 à l Og par 100 ml de solvant(s). 16 Procédé selon l'une des revendications 1 à 15, suivant lequel on utilise un (ou des) lipide(s) ionique(s), caractérisé par le fait que l'on utilise un solvant complé- mentaire, plus polaire que le(s) solvant(s) de bases pour améliorer la solubilité de ce(s) lipide(s) ionique(s) o 17 Procédé selon la revendication 16, caractérisé par le fait que l'on utilise, comme solvant compltmentaire, 1 ' thyl-mé thyl-é ther. 18 Procédé selon l'une des revendications 1 à 17, caraetérisé par le fait que lon introduit, dans la solution lipidique, des substances lipophiles à encapsuler. 19 Procédé selon l'une des revendications 1 à 18, caraetérisé par le fait que l'on utilise une microvanne pour fournir le débit réduit de la solution lipidique dans le récipient renfermant la phase aqueuse a encapsuler. Procédé selon la revendication 19, caracttrisé par le fait que l'on règle la microvanne pour qu'elle four- nisse un débit compris entre 5 ml par heure et 1 Oml par minute. 21 Procédé selon l'une des revendications 1 à 20 caractérisé par le fait que l'on choisit une pression P 2 comprise entre 0,1 mbar et 15 mbarso 22 Procédé selon l'une des revendications 1 à 21 l caractérisé par le fait que l'on amène la solution lipidique dans le récipient contenant la phase aqueuse de la substance a encapsuler par l'intermédiaire d'un tube capillaireo 23, Procédé selon l'une des revendications 1 à 22, caractérisé par le fait que l'on maintient constante et basse la température e 2 de la phase aqueuse à encapsuler a l'aide d'un thermostat. 24 Procédé selon l'une des revendications 1 à 23, caractérisé par le fait que l'on choisit la température 82 inf 6 rieure à 25 'C. Procédé selon l'une des revendications 1 & 24, caractérisé par le fait que l'on agite de faeon douce la phase aqueuse à encapsuler. 26 Procédé selon l'une des revendications 1 à 24, dans lequel la substance =à encapsuler est une substance non dégradable, caractérisé par le fait que i'on agite mécanique- IO ment par bain à ultra-sons, la phase aqueuse à encapstler. 27 Procédé selon l'une des revendications 1 & 26, dans lequel la substance à encapsuler est une substance prot 6 inique, caractérisé par le fait que l'on introduit dans la phase aqueuse à enceapsuier un agent antîimousseo 28 Procdg selon l'une des revendicat Ions I à 27 caractérisé par la fait que l'on produit les vésicules en continu. 29 Procéd& selon la revenadcavion 28, caractérisd par le fait que l'on injecte la solution lipîi Oque dans une canalisation dans laquelle on faît circuler la phase aqueuse & encapouler. Appareillage pour lm rise en oeuve du procédé tel que défini à l'une des revendications 1 à 29, caractéri- sé par le fait qu'il comporte un premier récipient, du type "bombe aêrosol"l ( 1), doté d'une valve de sortie ( 3), et un second récipient ( 2) dans lequel une pression réduite peut être établie, des moyens permettant de mettre en communica- tion de fluide le premier et le second récipient, de sorte que le contenu du premier récipient puisse Otre Injecté dans le contenu du second récipient, une microvanne ( 6) étant associée aux moyens précités en vue de régler le débit d'in- jection. 31 Appareillage selon la revendication 30, carac- térisé par le fait que les moyens permettant 'de mettre en communication de fluide le premier et le second récipient consistent, d'une part, en une pièce tubulaire de transfert ( 9) s'adaptant, à l'une de ses extrémitr Z, sur la tubulure de sortie-de la valve de sortie du récipient aérosol ( 1) et, à l'autre extrémité, sur l'entrée de la microvanne ( 6), et, d'autre part, en un tube capillaire de distribution ( 7) dont une extrémité s'adapte sur la sortied la microvanne ( 6). 32 Appareillage selon l'une des revendications 30 ou 31, caractérise par le fait que la microvanne ( 6) est une microvanne à pointeau. 33, Appareillage selon la revendication 319 carac- térisé par la fait que le tube capil laire ( 7) a un diamètre intérieur de 0,3 mm environ 34 Appareillage selon la revendication 31, carac- térisé par le fait qu'un dispositif diffuseur est adapt à tl'extrémité du tube capillaire de distribution, Appareillage selon l'une des revendications a 34, caractérisé par le fait que le second récipient comporte un thermostat. 36 Appareillage selon l'unes des revendications 30 à 35, caractérisé par la fait que le second récipient comporte des moyens pemettant daigter son contenuo