FR 2536281 A1 19840525 FR 8318502 A 19831121 253628 I La présente invention concerne des compositions pharmaceutiques permettant de réguler la fonction phagocy- taire, qui comprennent de la pepsine humaine et/ou une en- zyme analogue à la pepsine de leucocyte humain comme ingré- dient actif. L'une des fonctions exercées par l'organisme vivant pour maintenir l'hémostase est le mécanisme immuni-' taire On sait qu'une matière étrangère qui a pénétré de l'extérieur ou qu'une substance qui est devenue une matière étrangère in vivo peut parfois agir de façon nuisible sur l'organisme vivant et que le mécanisme immunitaire exerce un effet sur l'attaque et le développement de maladies telles que des maladies infectieuses, des tumeurs, des ma- ladies autoimmunes, etc Pour cette raison, on a récemment essayé de traiter ces maladies en maîtrisant le mécanisme immunitaire et on a utilisé des immunomodulateurs pour le traitement de tumeurs Cependant, les agents immunomodula- teurs classiques sont des médicaments qui commandent princi- palement les fonctions des lymphocytes dans leur rôle d'in- tervention en-faveur de l'immunité humorale et de l'immunité cellulaire, et il y a eu peu de recherches faites sur des médicaments qui commandent directement les fonctions phago- cytaires. Les phagocytes non seulement ingèrent et digè- rent une matière étrangère ayant pénétré dans l'organisme vivant, par exemple des microorganismes tels que des virus, des bactéries, des eumycètes, etc, et une matière étrangère ayant été engendrée dans l'organisme vivant, par exemple des tumeurs, etc, mais ils jouent également un rôle important en régul'ant une réponse immunitaire par transmission aux lymphocytes d'une information concernant ladite matière étrangère En outre, on suppose que la goutte et l'artério- sclérose sont provoquées par des dépôts d'acide urique ou de cholestérol engendrés dans l'organisme vivant, et on suppose que les phagocytes participent également à l'élimi- nation de ces dépôts Par conséquent, on peut s'attendre à ce que des médicaments ayant pour effet de réguler les fonc- tions phagocytaires soient des médicaments pour la traitement non seulement des maladies auxquelles les agents régulant les fonctions lymphocytaires ont été couramment appliqués, mais également des maladies telles que des maladies infec- tieuses, des tumeurs, l'artériosclérose, etco Etant donné qu'un médicament ayant pour effet de réguler les fonctions phagocytaires est supposé 3 tre un médicament pour le traitement de maladies telles que des maladies infectieuses provoquées par des virus, des bacté- ries, des-eumycètes, etc, la goutte, l'artérioscléroses etc, la demanderesse a effectué des recherches intensives dans le but de mettre au point un tel médicament et elle a découvert que la pepsine humaine et/ou une enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain avait pour effet de réguler l'immunité liée à l'action des phagocytes et d'améliorer des états dûs à des maladies infectieuses, à la goutte et à l'artériosclé- rose, et elle a ainsi mis au point la présente invention. Par conséquent, un but de la présente invention est de fournir une composition pharmaceutique ayant pour effet de réguler la fonction phagocytaire, qui comprend de la pepsine humaine et/ou une enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain en même temps qu'un véhicule ou support pharmaceutiquement acceptable. Un autre but de la présente invention est de fournir un agent thérapeutique pour le traitement de mala- dies infectieuses, de la goutte et de l'artériosclérose, qui comprend dela pepsine humaine et/ou une enzyme analogue à la pepsine de Cleucocyte humain en même temps qu'un support pharmaceutiquement acceptable. Un autre but de la présente invention est de fournir un procédé de traitement de maladies infectieuses, de la goutte ou de l'artériosclérose, qui consiste à admi- nistrer une quantité à effet thérapeutique de pepsine humaine 3. et/ou d'une enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain à un malade atteint de maladies infectieuses, de goutte ou d'artériosclérose. La pepsine humaine et l'enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain qui sont les ingrédients actifs des agents thérapeutiques de la présente invention ont pour effet de favoriser la phagocytose des phagocytes, de renfor- cer une telle activité des phagocytes en transmettant une information immunitaire aux-lymphocytes, de renforcer la phagocytose des hétérocytd N par les macrophages, de renfor- cer l'activité bactéricide par les neutrophiles, d'inhiber le dépôt de cholestérol sur les parois des artères et d'inhi- ber un trouble expérimental de la démarche résultant de l'in- jection d'un urate dans la cavité d'une articulation. La pepsine humaine qui est l'un des ingrédients actifs de la présente invention est une enzyme connue (Etherington et coll, Biochim O et Biophi Acta, 236, 92, ( 1971)) et peut être obtenue à partir de cellules gastriques humaines, de suc gastrique humain, d'urine humaine, etc, en combinant de façon appropriée des procédés généraux couram- ment utilisés pour la purification des protéines, par exem- ple un relargage, une chromatographie par adsorption en uti- lisant des adsorbants minéraux, une chromatographie par échange d'ions en utilisant des résines échangeuses d'ions, une chromatographie sur gel avec un effet de tamis molécu- laire, etc En outre, elle peut être produite en masse par culture de cellules obtenues par fusion de cellules produc- trices de pepsine telles que les cellules gastriques humai- nes avec des cellules cancéreuses, ou par des procédés de manipulation génétique, par exemple en préparant l'ADN com- plémentaire en utilisant de l'ARN messager de pepsine humai- ne comme moule et en utilisant une transcriptase inverse, puis en incorporant cet ADN à Escherichia coli, etc. Par exeirile, la pepsine humaine utilisée dans la présente invention peut être obtenue conformément à un procédé de Seijffers et coll Amer Jo Physiolo, 206, 1106 ( 1964) en faisant passer de l'urine humaine à travers une colonne de DEAE-cellulose équilibrée avec un tampon d'acé- tate 0,1 M (p H 5,3) pour y faire adsorber la pepsine humaine, en l'éluant avec le même tampon à la différence qu'il corn- tient enipius du chlorure de sodium 0,3 M, puis en concen- trant l'éluat et finalement en purifiant davantage le con- centré par chromatographie sur gel en utilisant du Sephadex G-100 (marque déposée) gonflé avec une solution saline phy- siologique à 0,9 % On a trouvé que cette pepsine humaine avait un poids moléculaire de 32 000 à 38 000 selon l'ana- lyse par chromatographie sur gel en utilisant du Sephadex G-100, un point isoélectrique de 1-3, mesuré par électro- phorèse isoélectrique à l'amphoréine et une absorption maxi- male de 274 nm, donnait une réaction positive à la ninhydri- ne et était facilement soluble dans l'eau et insoluble dans l'éther et le chloroforme. D'autre part, l'enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain est une enzyme découverte par la demande- resse (demande de brevet: PCT JP 82-00213) et peut être ob- tenue à partir de leucocytes humains ou de souches HL-60 de cellules de leucémie promyélocytique, traitées par l'acti- nomycine D, etc, en combinant de façon appropriée les pro- cédés généraux couramment utilisés pour purifier les protéi nes, par exemple un relargage, une chromatographie par ad- sorption en utilisant des adsorbants minéraux, une chromato- graphie par échange d'ions en utilisant des résines échan- geuses d'ions, une chromatographie sur gel avec un effet de tamis moléculaire, etc En outre, elle peut être produite en masse par culture de cellules obtenues par fusion de cellules produisant une enzyme analogue à la pepsine, comme les leucocytes humains, avec des cellules cancéreuses, ou par des procédés de manipulation génétique, par exemple en préparant l'ADN complémentaire en utilisant l'ARN messager de l'enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain comme 2536 81 moule et en utilisant une transcriptase inverser puis en incorporant cet ADN à Escherichia coli, etco Par exemple, 1 l'enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain peut être obtenue en homogénéisant les cel- lules cultivées précitées pour obtenir une liqueur surna- geante, en faisant passer la ligueur surnageante à travers une colonne de DEAEcellulose équilibrée avec un tampon d'acétate 0,1 M (p H 583) pour faire adsorber l'enzyme ana- logue à la pepsine de leucocyte humain, puis en l'éluant avec le même tampon à la différence qu'il contient en plus du chlorure de sodium 0,5 M, en concentrant l'éluat, et finalement en purifiant davantage le concentré par chroma- tographie sur gel en utilisant du Sephadex G-100 gonflé avec une solution saline physiologique à 0,9 % O On a décou- vert que ette enzyme analogue à la pepsine de leucocyte hu- main avait un poids moléculaire de 35 000 à 41 000 d'après l'analyse par chromatographie sur gel au moyen de Sephadex G-100, un point isoélectrique de 2,5-3, 5 tel que mesuré par électrophorèse isoélectrique à l'amphoréine et une absorp- tion maximale de 278 nm, donnait une réaction positive à la ninhydrine et était facilement soluble dans l'eau et inso- luble dans l'éther et le chloroforme En outre, l'enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain déploie une grande activité hydrolytique contre l'hémoglobine dans une région acide de p H 7,0 ou moins et son p H optimal est de 2,0-3,5. L'efficacité, là toxicité, le procédé d'utilisa- tion et la posologie de la pepsine humaine et de l'enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain sont expliqués ci-aprèso Exemple Experimental 1. Influence sur la phagocytose des monocytes humains. Des monocytes périphériques humains ( 106 cellu- les) fixés sur une surface de culture sont préparés à partir d'une suspension de leucocytes périphériques dans un milieu essentiel minimal de Eagle par une culture des cellules dans une boîte en matière plastique à 37 C pendant 1 heure. ml de milieu essentiel minimal de Eagle (MEM de Eagqle additionné de 10 % en volume/volume de sérum de foetus de boeuf et contenant de la pepsine humaine ou une - enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain sont ajo- tés a 106 cellules de monocytes périphériques humains, puis sont cultivés à 37 C Au bout de 20 heures, on modifie le milieu en MEM de Eagle additionné de 10 % de sérum de foetus de boeuf et contenant de la pepsine humaine ou une enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain et 2 x o 10 G cellu- les de levure pour panification traitée thermiquement, et on conduit la culture pendant encore 2 heures Après la culture, on calcule le taux de phagocytose d'après 11 équation sui- vante Taux de phagocytose (%) = Monocytes phagocytaires x y Monocytes totaux x 10 Echantillon Les résultats sont indiqués dans le TABLEAU 1 Concentration (lig/ml) tableau 1. Taux de phagocytose (%) Pas de pepsine (MEM de Eagle seulement) Pepsine humainc. 0,6 37,3 42,6 48, 1 2, 9 + 2,8 2,3 e Enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain 6 47,9 + 2, 5 i P La pepsine humaine et l'enzyme analogue à la - pepsine de leucocyte humain favorisent la phagocytose de la levure par les monocytes humainso D'après ces résultats, on voit clairement que la pepsine humaine et une enzyme analo- gue à la pepsine de leucocyte humain favorisent la phagocy- tose des phagocytes. Exemple Expérimental 2. Influence sur la phagocytose des monocytes humains, Des monocytes périphériques humains ( 106 cellu- les) fixes sur une surface de culture sont préparés à partir d'une suspension de leucocytes périphériques dans un MEM de Eagle par une culture des cellules dans une boite en matière plastique à 37 C pendant 1 heure 5 ml du MEM de Eagle addi- tionné de 10 % en volume/volume de sérum de foetus de boeuf et contenant une quantité déterminée de pepsine humaine ou d'enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain sont ajou- tés auxdits monocytes périphériques humains et cultivés à 37 C Au bout de 20 heures, on modifie le milieu pour qu'il contienne 2 x 108 globules rouges de mouton et on conduit la culture pendant encore 2 heures On fixe alors les cellules avec du méthanol, puis on les colore avec un colorant de Giemsa pour calculer le taux de phagocytose de la même ma- nière que dans l'Exemple Expérimental 1 Les résultats sont indiqués dans le tableau 2. TABLEAU 2 Echantillon Concentration Taux de ( ig/ml) phagocytose MEM de Eagle seulement 7,5 + 0,6 Pepsine humaine 0,6 8,5 + 0,6 6 9,6 + 0,5 k Enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain 6 9,5 + 0,4- P La pepsine humaine et l'enzyme analogue à la pep- sine de leucocyte humain favorisent la phagocytose des glo- bules rouges de mouton par les monocytes humains Ces résul- tats indiquent nettement que la pepsine humaine et l'enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain renforcent la pha- gocytose des phagocytes. Exemple Expérimental 3. Influence sur l'activité des monocytes humains pour trans- mettre une information immunitaire aux lymphocytes. Le milieu MEM de Eagle additionné de 10 % de sérum de foetus de boeuf et contenant la pepsine humaine ou une enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain est ajouté à 106 cellules/ml de monocytes périphériques humains et la culture est conduite pendant 20 heures A la fin de la culture, on modifie le milieu en un milieu MEM de Eagle ad- ditionné de 10 % de sérum de foetus de boeuf et contenant de la pepsine humaine ou une enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain et 2 x 107 cellules/ml d'érythrocytes de mouton, et on conduit la culture à 37 C pendant 30 minutes. A la fin de la culture, on modifie encore le milieu en un milieu RPMI 1640 additionné de 10 % de sérum humain et con- tenant 3 x 107 cellules/ml de lymphocytes périphériques hu- mains, et on conduit la culture pendant 7 jours A la fin de la culture, on recueille les lymphocytes et on compte le nombre de plaques selon le procédé de Dosch et coll, J. Immunol, 118, 302 ( 1972) Les résultats sont indiqués dans le tableau 3. TABLEAU 3 Echantillonc Concentration Nombre de (u Xc/-l piaque: (/106 cellules) Milieu MEM de Eagle seulemr 4 86 11 Pepsine numain 1 = 0,6 97 + 9 6 138 + 116 Enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain 6 131 t 12 " XP La pepsine humaine et l'enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain augmentent la production de l'anticorps contre les érythrocytes de mouton, c'est-à-dire une matière étrangère pour les lymphocytes o D'après ces ré- sultats, il est évident que la pepsine humaine et l'enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain favorisent 1 Jacti- vité des phagocytes pour transmettre une information immuni- taire aux lymphocytes. Exemple Expérimental 4. Influence sur la hagocytose des macrophages de souris. ml de MEM de Eagle additionné de 10 % de sérum de foetus de boeuf et contenant de la-pepsine humaine, une enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain ou de la pepsine de souris sont ajoutés à 106 cellules de macrophages intrapéritonéaux de souris et sont cultivés à 37 C pendant heures Apres la culture, on modifie le milieu en MEM de Eagle additionné de 10 % de sérum de foetus de boeuf et con- tenant de la pepsine humaine, une enzyme analogue à la pep- sine de leucocyte humain ou de la pepsine de souris et 2 x 108 cellules d'érythrocytes de mouton ou d'érythrocytes hu- mains, et on conduit encore la culture pendant 2 heures A la fin de la culture, on observe les macrophages et on calcule le taux de phagocytose de la même manière que dans l'Exemple Expérimental 1 Les résultats sont indiqués dans le tableau 4. TABLEAU 4 Echantillon Concentration Taux de phagocytose (%) (ig/ml) Mouton Homme Milieu de MEM Eagle seulement 26,3 2,1 53,1 2,7 Pepsine humaine 0,6 31,3 2,2 45,8 3,0 6 35,0 l,9 Q 42,1 + 2,4 * Enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain 6 34,7 2,5 e 41,8 277 Pepsine de souris 6 35,1 2,6 * 63,5 2,3 ' ce P La pepsine humaine et l'enzymc analogue à la pep- sine de leucocyte humain augmentent la phagocytose des éryth- rocytes de mouton par les macrophages de souris comme dans le cas de la pepsine de souris Cependant, dans la phagocy- tose par des macrophages de souris des érythrocytes humains, la pepsine humaine et l'enzyme analogue à la pepsine de leu- cocyte humain inhibent tous deux la phagocytose tandis qu- la pepsine de souris l'augmente D'après ces résultats, on voit que la pepsine humaine et une enzyme analogue i la pep= sine de leucocyte humain ont pour effet de r 9 guler les fonc- tions phagocytaires ainsi que d'augmenter la phagocytose des érythrocytes hétérogènes (mouton) mais 9 par contre, d 2 inhiber la phagocytose des érythrocytes allogènes (humains). Exemple Expérimental 5. Influence sur l'activité bactéricide des neutrophileso On fait incuber à 37 C pendant 15 minutes 2,6 x s 15 1 o 5 cellules de leucocytes périphériques humains, 3 x 108 morceaux de particules de latex de polystyrène, 50 pl du réactif Bleu de tétrazolium et 150 pl de tampon Krebs- Henseleit contenant de la pepsine humaine, une enzyme ana- logue à la pepsine de leucocyte humain ou un mélange à poids égaux de pepsine humaine et d'une enzyme analogue à la pep- sine de leucocyte humain, et on mesure le coefficient d'ab- sorption de la solution du mélange à une longueur d'onde de 710 nm selon un procédé de Okamura et coll, Chem Pharm. Bull 24, 2175 ( 1976) Les résultats sont rapportés au ta- bleau 5. TABLEAU 5 Echantillon Concentration Coefficient ___________ (iig/ml) d'absorption Solution tampon de Krebs-Henseleit seulement 0,132 O o,012 Pepsine humaine 6 0,181 + 0,020 Enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain 6 0,175 + 0,018 Mélange égal de pepsine humaine et d'enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain 6 0,180 0,015 La pepsine humaine, l'enzyme analogue à la pep- sine de leucocyte humain et leur mélange favorisent l'acti- vite bactéricide des neutrophiles D'après ces résultats, on voit clairement que l'effet de régulation des fonctions pha- gocytaires s'observe non seulement dans le cas de l'utilisa- tion de la pepsine humaine ou de l'enzyme analogue à la pep- sine de leucocyte humain seuls, mais également dans le cas o on les utilise en combinaison. Exemple Expérimental 6. Effet sur les maladies infectieuses provoquées par Pseudomonas aeruginosa. On injecte par voie intrapéritonéale à-des groupes de 10 souris de souche ICR, pesant chacune environ 18 g, 10 cellules de P aeruginosa, IFO 3445 en suspension dans 0,2 ml de solution saline physiologique Au bout d'une heure, on injecte par voie intraveineuse chaque jour pendant 7 jours une solution saline physiologique contenant de la sérum-albumine humaine, de la pepsine humaine, une enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain ou un mélange à poids égaux de pepsine humaine et d'une enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain, et on observe les animaux pour déterminer s'ils meurent ou s'ils survivent Les ré- sultats sont indiqués dans le tableau 6. 253628 I TABLEAU 6 Echantil ion Posologie Taux de survie (mg/kg) (%) Sérum-albumine humaine 6 O Pepsine humaine 0,6 20 6 40 Enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain 6 40 Mélange à poids égaux de pepsine humaineet d'enzyme analogue à la-pepsine de leucocyte humain 6 40 La pepsine humaine, l'enzyme analogue à la pep- sine de leucocyte humain et leur-mélange ont un effet sur les maladies infectieuses. Exemple Expérimental 7. Action curative sur une infection pulmonaire locale par E coli. On administre par voie intranasale à des groupes de 10 souris de souche ICR, pesant chacune environ 15 g, 109 cellules de E coli (souche A 4) en suspension dans 0,05 ml de solution saline physiologique Une heure après l'infec- tion, on injecte par voie intraveineuse une solution d'une quantité déterminée de sérum-albumine humaine, de pepsine humaine, d'enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain ou un mélange de pepsine humaine et d'enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain-en quantités égales dissoutes dans 0,1 ml de solution saline physiologique, l'injection étant poursuivie quotidiennement pendant sept jours On observe la survie des animaux et les résultats sont indiqués dans le tableau 7. TABLEAU 7 Echantillon Posologie Taux de survie (%) Sérum-albumine humaine 6 30 Pepsine humaine 0,6 70 6 90 e Enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain 6 909 Mélange à poids égaux de pepsine humaine et d'enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain 6 90 c c P La pepsine humaine, 1 enzyme analogue à la pep- sine de leucocyte humain et leur mélange exercent une action curative sur l'infection locale pulmonaire. Exemple Expérimental 8. Action curative sur une infection de Eo coli chez la souris sous immunosuppression. On administre par voie intrapéritonéale à des groupes de 10 souris de souche ICR, pesant chacune environ g, 200 mg/kg de cyclophosphamide dissous dans une solution saline physiologique à une concentration de 20 mg/mlo Au bout de quatre jours, on administre par voie intrapéritonéale 3 x 107 cellules de E coli (souche A 4) en suspension dans 0,2 ml de solution saline physiologique Une heure après l'infection, on administre par voie intraveineuse une solu- tion d'une quantité déterminée de sérum-albumine humaine, de pepsine humaine, d'enzyme analogue à la pepsine de leuco- cyte humain, ou d'un mélange en quantités égales de pepsine humaine et d'enzyme analogue à la pepsine de leucocyte hu- * main en solution dans 0,1 ml de solution saline physiologique, l'administration étant poursuivie quotidiennement pendant sept jours On observe la survie des animaux et les résultats sont indiqués dans le tableau 8. TABLEAU 8 Echantillon Posologie Taux de survie (mg/kg) (%) Sérum-albumine humaine 6 O Pepsine humaine 0,6 20 6 40 Enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain 6 40 Mélange en quantités égales de pepsine humaine et d'enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain 6 40 ' La pepsine humaine, l'enzyme analogue à la pep- sine de leucocyte humain et leur mélange exercent une action curative sur une infection par E O coli chez la souris sous immunosuppressiont Exemple Expérimental 9 o Action curative sur une infection par Candida. On administre par voie intrapéritonéale à des groupes de 10 souris de souche ICR, pesant chacune environ g, 6 x 108 cellules de Co albicans en suspension dans 0,2 ml de solution saline physiologiqueo Une heure après l'injection, on administre par voie intraveineuse une solu- tion d'une quantité déterminée de sérum-albumine humaine, de pepsine humaine, d'enzyme analogue à la pepsine de leuco- cyte humain ou d'un mélange en quantités égales de pepsine humaine et d'enzymrie analogue à la pepsine de leucocyte hu- main en solution dans 0,1 ml de solution saline physiologi- que, l'administration étant poursuivie quotidiennement pen- dant sept jours On observe la survie des animaux et les résultats sont indiqués dans le tableau 9. 253628 q TABLEAU 9 Echantillon Posologie Taux de survie (mg/kg) (%) Sérum-albumine humaine 6 40 Pepsine humaine 0,6 60 6 80 Enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain 6 100 e Mélange en quantités égales de pepsine humaine et d'enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain 6 90 SP o La pepsine humaine,, l'enzyme analogue à la pep- sine de leucocyte humain et leur mélange exercent une action curative sur une infection par Candida. Les maladies infectieuses étudiées dans les exemples expérimentaux précédents sont considérées comme représentatives des maladies infectieuses découlant d'une invasion de l'organisme par une matière étrangère ou d'une production de celle-ci dans l'organisme, par exemple par des microorganismes comme les virus, les bactéries, les eumycè- tes, etc. Exemple Expérimental 10 = Influence sur un dépôt de cholestérol sur les artères. On fait consommer par des groupes de 10 rats mâles de souche Wistar, pesant chacun environ 180 g un aliment pour animaux additionné de 10 % de cholestérol Au début de l'alimentation, on administre quotidiennement par voie intraveineuse*Ol ml de solution saline physiologique contenant de la sérum-albumine humaine, de la pepsine humai- ne, une enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain ou un mélange à poids égaux de-pepsine humaine et d'une enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain Au bout de trois mois, on sacrifie les animaux et on prélève leurs artères. 2536213 'o On lyophilise 100 mg d'artères, on les extrait avec 20 volu- mes d'un mélange 1:3 de méthanol-chloroforme, et on sèche ml de l'extrait dans l'azote gazeux On mesure le taux de cholestérol dans les résidus en utilisant un ensemble Wako (marque déposée)o Les résultats sont indiqués dans le tab Jeau 10.o TABLEAU 10 Echantillon Posologie Cholestérol (mg/kg) (mg/kg d'artères) Sérumalbumine humaine 6 112 + 18 Pepsine humaine 0,6 91 + 20 6 -50 + 11 Enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain 6 51 + 9 Mélange à poids égaux de pepsine humaine et d'enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain 6 48 + 14 * e P La pepsine humaine, l'enzyme analogue à la pep- sine de leucocyte humain et leur mélange inhibent le dépôt de cholestérol sur les artères et exercent un effet sur l'ar- tériosclérose. Exemple Expérimental 11. Influence sur une inflammation provoquée par des cristaux d'urate. On injecte dans l'articulation de la patte avant gauche de chaque chien mâle ( 3 animaux dans chaque groupe) pesant environ 10 kg, 10 mg de cristaux d'urate de sodium, l'injection étant immédiatement suivie d'une injection in- traveineuse de 10 ml de solution saline physiologique conte- nant de la-sérum-albumine humaines de la pepsine humaine, une enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain ou un mélange à poids égaux de pepsine humaine et d'une enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain Pendant les 24 heures suivantes, on observe la démarche des chiens Les résultats sont indiqués dans le tableau 11. TABLEAU 11 Edhantillon Posologie Observations (mg/kg) _ Sérumualbumine humaine 6Marchent sur 3 pat- tes pendant 1 à 6 heures après l'in- jection Pepsine humaine 6 Pas d'anomalie Enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain 6 Pas d'anomalie Mélange à poids égaux de pepsine humaine et d'enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain 6 Pas d'anomalie La pepsine humaine, l'enzyme analogue à la pep- sine de leucocyte humain et leur mélange inhibent l'anomalie de la démarche provoquée par l'urate et exercent un effet thérapeutique sur la goutte. Exemple Expérimental I 24 Essai de toxicité aiguë. On administre par voie intraveineuse ou intra- péritonéale à des groupes de 10 souris màles de souche dd Y, pesant chacune 20 à 25 g, 2 g/kg de pepsine humaine, d'une enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain ou d'un mélange de ces derniers en poids égaux, en solution dans une solution saline physiologique et on observe leur état pendant une semaine On n'observe pas d'anomalie. Ainsi qu'il ressort des exemples expérimentaux décrits ci-dessus, la pepsine humaine et une enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain qui sont les principaux ingrédients des compositions pharmaceutiques de la présente invention ont pour effet de réguler les fonctions phagocy- taires et, en même temps, -ont pour effet de traiter diverses maladies associées aux fonctions phagocytaires telles que des tumeurs, des allergies, des maladies infectieuses, des maladies auto-immunesg des déficiences du mécanisme imiuni- taire, llartériosclérose, la goutte, etc Les-doses adminis- trées sont des quantités suffisamment sures, comme cela ressort de l'essai de toxicité aigug En outre, du fait qg - ce sont des protéines dérivant de l Uhomme, on pense également qu'il y a peu de risque d'apparition d'effets secondaires graves dûs à des effets d&antigénicitâ tels qu un choc ana- phylactique, etc Ainsi, on présume que ce sont des agents extrêmement utiles cliniqueèrent pour le traitement de diver= ses tumeurs Les agents thérapeutiques de la présente inven- tion sont généralement administrés sous forme d'injections intraveineuses, intra-artérielles, sous-cutanées, intramus- culaires, topiques, etc, et on peut également les utiliser sous forme de preparations orales, duinhalations, de suppo- sitoires pour la voie rectale, etc La posologie de la pep- sine humaine ou de l'enzyme analogue à la pepsine de leuco- cyte humain pour un humain adulte est de 1 à 1000 mg, de préférence de 5 à 500 mg/jour, ces quantités pouvant varier en fonction de la gravité de la maladie ou du mode d'utili- sation En outre, la pepsine humaine et l'enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain peuvent être utilisées en combinaison à N importe quels rapports. La pepsine humaine et une enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain peuvent être formulées en prépa- rations pharmaceutiques d'une manière classique en même temps que des supports ou excipients pharmaceutiques classiques. Des exemples de supports et excipients solides utilisables avantageusement dans ce cas comprennent les exci- pients courants tels que lactose, mannitol, amidon de mais et fécule de pomme de terre; des liants tels que la cellu- lose cristalline, les dérivés de cellulose, la gomme arabique, l'amidon de mais et la gélatine; des agents de désagrégation tels que l'amidon de maïs, la fécule de pomme de terre et le sel de calcium de la carbohydroxyméthylcellulose; et des lubrifiants tels que le talc et le stéarate de magnésium. Des exemples de supports liquides utilisables avantageuse- ment dans ce cas comprennent l'eau distillée pour injection, une solution saline physiologique, des huiles végétales pour injection et des glycols tels que le propylène-glycol et le polyéthylène-glycol. Des exemples préférés de formulations pour in- jections comprennent des préparations lyophilisées pouvant être dissoutes avant utilisation et des préparations liqui- des injectables; des exemples de préparations orales com- prennent des capsules, comprimés, granulés, poudres et pré- parations liquides orales; des exemples de produits à inha- ler comprennent les poudres lyophilisées; et des exemples de préparations pour administration rectale comprennent les suppositoires pour la voie rectale. Des exemples de la présente invention sont il- lustrés ci-après. Exemple 1. On dissout 100 mg de pepsine humaine dans 10 ml de solution saline physiologique et on filtre de manière aseptique en utilisant un filtre à membrane On place le filtrat dans des récipients en verre stérilisés, de 1,0 ml chacun, puis on lyophilise et on scelle pour obtenir des préparations de poudre lyophilisée. Exemple 2. On pèse respectivement 100 g de pepsine humaine lyophilisée, 97 g de lactose et 3 g de stéarate de magnésium et on les mélange uniformément On place ce mélange dans des capsules de gélatine N O 2 de 200 mg chacune, et on ap- plique un revêtement entérique pour obtenir des capsules entériques - Exemple 3. On dissout 100 mg d'une enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain dans 10 ml de solution saline physiologique et on filtre de manière aseptique en utilisant 25362 à 'a un filtre à embraneo On place le filtrat dans des récipients en verre stérilisés, de 1,0 ml chacun O puis on lyophilise pour obtenir des préparations de poudre lyophilisée. Exemple On mélange de la lécithine de jaune d'oeuf, d& cholestérol et du phosphate de diacétyle à un rapport molaire de 752 s 10 puis on dissout 100 mg de ce mélange dans 12,5 ml de chloroforme, et on forme une m-ince pellicule sur la paroi d'un flacon Cette pellicule et 25 ml de tampon de phosphate i O contenant 50 mg de pepsine humaine et 50 mg d'une enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain sont mélanges pour former une dispersion On traite cette dispersion aux ultra- sons et la centrifuge à 110 '000 x g, puis on met en suspen- sion les précipités obtenus dans 3 ml de solution saline physiologique et les stérilise, de manière à obtenir une preparation comportant un liposome contenant un mélange à poids égaux de la pepsine humaine et de l'enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain - REVENDICATIONS 1 Composition pharmaceutique permettant de régu- ler la fonction phagocytaire, caractérisée en ce qu'elle com- prend une quantité pharmaceutiquement efficace de pepsine humaine et/ou d'une enzyme analogue à la pepsine de leuco- cyte humain et un support pharmaceutiquement acceptable. 2 Composition pharmaceutique selon la revendica- tion 1, caractérisée en ce que la pepsine humaine provient d'un estomac humain ou d'urine humaineo 3 Composition pharmaceutique selon la revendica- tion 1, comprenant une quantité pharmaceutiquement efficace de pepsine humaine et d'un support pharmaceutiquement accep- table. 4 Composition pharmaceutique selon la revendica- tion 3, dans laquelle la pepsine humaine a un poids molécu- laire de 32 000 à 38 0000 un point isoélectrique de 1-3, une absorption maximale de 274 nm, donne une réaction positive à la ninhydrine et est facilement soluble dans l'eau et inso- luble dans l'éther et le chloroforme. 5 Composition pharmaceutique selon la revendica- tion 1, qui comprend une quantité pharmaceutiquement efficace d'une enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain et un support pharmaceutiquement acceptable. 6 o Composition pharmaceutique selon la revendica- tion 5, dans laquelle l'enzyme analogue à la pepsine de leu- cocyte humain a un poids moléculaire de 35 000 41 000, un point isoélectrique de 2,5-3,5, une absorption maximale de 278 nmg donne une réaction positive à la ninhydrine et est facilement soluble dans l'eau et insoluble dans l'éther et le chloroforme. 7 Composition pharmaceutique selon la revendica- tion 1, qui est une solution injectable hydrosoluble ou une solution injectable lyophilisée 8 Composition pharmaceutique selon la revendica- tion 1, caractérisée en ce qu'elle est sous la forme de cap- su Ies, de comprimés, de granulés, de poudre ou d'une prépa- ration orale liquide. 9 Composition pharmaceutique selon la revendica- tion 1, caractérisée en ce qu'elle est sous la forme d'un produit pour'inhalation ou d'un suppositoire. Composition pharmaceutique selon la revendi- cation l *qui se trouve sous la forme d'une dose unitaire contenant de 1 à 1000 mg de ladite pepsine humaine et/ou de l'enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain. o 1 Composition pharmaceutique selon la revendi- cation 10, qui se trouve sous la forme d'une dose unitaire contenant de 5 à 500 mg de ladite pepsine humaine et/ou de l'enzyme analogue à la pepsine de leucocyte humain.