FR 2545687 A1 19841116 FR 8405657 A 19840410 L'invention concerne un procédé d'hybridation utilisant une combinaison de la stérilité mâle cytoplas- mique et de la tolérance aux herbicides ainsi que des se- mences de Brassica napus é Les spécialistes des sciences végétales savent depuis de nombreuses années que l'hybridation de plantes très proches peut produire une descendance présentant une combinaison de caractères souhaitables que les plantes parentes possédaient auparavant séparément Egalement, les hybrides de diverses plantes cultivées possèdent souvent une vigueur ou hétérosis contribuant notablement au rende- ment de cultures et ayant donc une importance économique considérable. Comme les plantes, choisies pour les études d'hy- bridation, sont habituellement capables de présenter à la fois une autopollinisation et une pollinisation croisée, le croisement désiré a souvent été difficile à réaliser de façon fiable lorsqu'on opère à une échelle industrielle. Par conséquent, il faut réaliser une pollinisation croisée contrôlée, essentiellement en l'absence d'autopollinisa- tion Une technique couramment utilisée à ce jour pour at- teindre cet objectif est l'emploi de plantes mâle-stériles cytoplasmiques comme parent porte-graine qu'on cultive sous forme d'une population essentiellement uniforme à cô- té d'une autre population essentiellement uniforme de plan- tes dont dérive le pollen Cette technique a nécessité une surveillance précise des diagrammes de mise en culture, un transfert suffisant de pollen d'un bloc de plantes à un autre et la surveillance précise de la récolte des semen- ces pour éviter le mélange des deux semences produites dif- férentes. Le brevet US 3 842 538 décrit un procédé de pro- duction de semences hybrides de céréales dans lequel on propose la culture conjointe du parent mâle-stérile cyto- plasmique et du parent pollinisateur Les semences capables de former des plantes hybrides sont ensuite séparées des semences non hybrides en fonction de la couleur Cette technique de séparation des semences demeure cependant malaisée et il ne semble pas qu'elle ait été commerciali- sée Voir également les articles de D E Falk, K J Kas- ha, et E Reinbergs figurant dans Proceedings of the Fourth International Barley Genetics Symposium, Edimbourg, 22-29 juillet 1981 (Edinburg University Press), pages 778 à 785, et de D E Falk et K J Kasha figurant dans Crop Science, vol 22, mars-avril 1982, page 450, o une rela- tion étroite entre la stérilité mâle génétique et la ré- traction de l'endosperme est exposée. Bien que dans le passé, l'adoption de diverses techniques bien connues d'hybridation ait eu un succès considérable, il reste néanmoins nécessaire de trouver d'autres voies d'hybridation moins malaisées, plus effica- ces ou améliorées d'autre façon De plus, pour de nombreu- ses plantes cultivées, malgré la poursuite des recherches par des spécialistes des sciences végétales travaillant dans le monde entier, on ne dispose pas d'une technique d'hybridation applicable à l'échelle industrielle. Un exemple de plante cultivée pour laquelle on ne dispose pas encore à l'échelle industrielle de semences permettant d'obtenir des plantes hybrides est le colza (ou la navette) (c'est-à-dire Brassica napus ou Brassica cam- pestris) Bien que le grand public l'ignore parfois, le_ colza (et en particulier ses variétés de qualité supérieu- re, telles que le canola) est une plante cultivée dans de nombreuses parties du monde dont l'importance comme plante oléagineuse est croissante et qui est à l'origine de la farine de colza L'huile peut être utilisée comme huile végétale de qualité supérieure et la farine peut être uti- lisée comme concentré protéique nutritif pour le bétail. L'importance du colza comme culture agronomique est expo- sée dans ( 1) Highlights of Agricultural Research in Onta- rio, décembre 1982, pages 18-19 dans un article de W D. Beversdorf et David J Hume intitulé "Canola: A New Oil- seed Crop for Ontario", et dans ( 2) l'Ontario Ministry of Agriculture and Food Factsheet n 82-017, février 1982, intitulé "Spring Canola in Ontario" par D J Hume, R J. McLaughlin et W D Beversdorf. Des publications caractéristiques de travaux de recherche dans le domaine de la technologie du colza ayant mis en évidence la stérilité mâle cytoplasmique des plants de colza figurent ci-dessous: Bannerot, H, Boulidard, I, Cauderon, Y et Tempe, J. ( 1974) "Cytoplasmic Male Sterility Transfer From Raphanus to Brassica " Proc Eucarpia Mee- ting Cruciferae Vegetable Crop, Sect 25:52-54. Bartkowiak-Broda, I, Rousselle, P, et Renard, M ( 1979). "Investigation of Two Kinds Qf Cytoplasmic Male Sterility in Rape (Brassica napus L) Genet. Polon 20:487-497. Ohkawa, Y, Shiga, T, et Ishige, T ( 1979) "Male Steri- lity-Inducing-Cytoplasm in Brassica campestris var rapifera", Annual Report, Division of Gene- tics, Dept of Physiol and Genetics, Nat Inst. of Agric Sciences,_ Kannondai, Yatabe, Tsukuba, Japon, Pages 30-31. Palmer, J D, Shields, C R, Cohen, D B,-et Orton,G T J ( 1983) "'An Unusual Mitochondrial DNA Plasmid in the Genus Brassica" Nature 301:725- 728 Rousselle, P, and Renard, M ( 1982) "Intérêt du cultivar "Bronowski" pour l'obtention de plantes mâle- stériles cytoplasmiques chez le colza (Brassica napus L)" Agronomie 2 ( 10):951-956. Shiga, T ( 1976) "Studies on Heterosis Breeding Using Cytoplasmic Male Sterility in Rapeseed Brassiàea napus L ", Bull Nat Inst Agric -Sci Tokyo Series D 27:75-85 Shiga, T ( 1976) "Cytoplasmic Male Sterility and Its Uti- lization for Heterosis Breeding in Rapeseed, Brassica napus L ", JARQ 10:177-182. Shiga, T ( 1980) "Male Sterility and Cytoplasmic Diffe- rentiation" Chapter 12 in Brassica Crops and Wild Allies-Biology and Breeding Japan Sci. Soc Press, Tokyo, Pages 205-221. Thompson, K F ( 1972) "Cytoplasmic Male-Sterility in Oil-Seed Rape" Heredity 29 ( 2):253-257. Vedel, F, Mathieu, C, Lebacq, P, Ambard-Bretteville, F., et Remy, R ( 1982) "Comparative Macromo- lecular Analysis of the Cytoplasms of Normal and Cytoplasmic Male Sterile Brassica napus". Theor Appl Genet 62:255-262. On a également établi dans le passé que la lutte contre les mauvaises herbes est importante pour les culti- vateurs de colza Les mauvaises herbes, lorsqu'elles se développent, réduisent le rendement final et peuvent dimi- nuer notablement la qualité en raison de la contamination inévitable par diverses graines récoltées avec la plante cultivée désirée Pour résoudre le problème des mauvaises herbes, diverses variétés de colza présentant une toléran- ce aux herbicides ont été proposées de façon à ce que les mauvaises herbes indésirables puissent être éliminées ef- ficacement, même lorsqu'elles poussent à proximité des plants de colza Voi-r à cet égard "Transfer of Cytoplasmi- cally-Inherited Triazine Resistance From Bird's Rape to - Cultivated Oilseed Rape (Brassica campestris et B napus-)" par W D Beversdorf, J Weiss-Lerman, L R Erickson-et V Souza Machado dans Canadian Journal of Genetics and Cytology, volume XXII, n 2, juin 1980, pages 167-172. Voir également "Uniparental Inheritance of Chloroplast Atrazine Tolerance in Brassica Campestris" par V Souza Machado, J D Bandeen, G R Stephenson et P Lavigne, Can J Plant Sci 58:977-981, 1978. Un des buts de l'invention est de fournir un pro- cédé d'hybridation amélioré utile pour former une variété prédéterminée d'un végétal cultivé: dans lequel le végétal cultivé est capable de subir à la fois une autopollinisation et une pollinisation croisée; dans lequel le végétal cultivé est capable de subir à la fois une autopollinisation et une pollinisation croisée et le parent porte-graine est à stérilité mâle cy- toplasmique et le parent porte-pollen peut, de façon pra- tique, être cultivé conjointement avec le parent porte- graine pendant au moins un stade du procédé sans qu'un dia- gramme de culture précis, avec les inconvénients qui lui sont associés, soit nécessaire; dans lequel la fertilisation croisée des plantes mâlestériles cytoplasmiques avec des plantes d'entretien peut facilement être réalisée; dans lequel le végétal cultivé peut subir une au- topollinisation et une pollinisation croisée, le produit désiré pouvant être formé d'une manière sure, et le produit étant approprié à l'utilisation économique à une échelle industriellement intéressante; dans lequel le végétal cultivé est capable de su- bir une autopollinisation et une pollinisation croisée et le produit désiré présente de plus une tolérance aux herbi- cides permettant facilement de détruire sélectivement les mauvaises herbes gênantes poussant dans la zone de la plan- te hybride cultivée; et qui convient particulièrement bien à l'obtention d'une variété prédéterminée de colza (par exemple Brassica napus) et constitue donc une voie industrielle de formation d'un colza hybride. L'invention a également pour but de fournir de nouvelles semences de Brassica napus appropriées pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention. D'autres caractéristiques et avantages de l'in- vention ressortiront de la description qui suit. Selon l'invention, un procédé amélioré pour for- mer une population essentiellement homogène d'individus ap- partenant à une variété hybride prédéterminée d'une plante cultivée capable de subir une autopollinisation et une pol- linisation croisée consiste à: 6 254568 ? (a) cultiver dans une première zone de culture une population pratiquement aléatoire de ( 1) des plantes mâle-stériles cytoplasmiques présentant une tolérance cy- toplasmique aux herbicides, et ( 2) des plantes mâle-ferti- les capables de polliniser les plantes mâle-stériles cyto- plasmiques et qui sont dépourvues de tolérance cytoplasmi- que aux herbicides, grâce à quoi les plantes mâle-stériles cytoplasmiques ( 1) et les plantes mâle-fertiles ( 2) sont pollinisées par le pollen provenant des plantes mâle-ferti- les et des graines se forment sur les plantes mâle-stériles cytoplasmiques et sur les plantes mâle-fertiles, (b) récolter ensemble les graines formées sur les plantes de la première zone de culture, (c) cultiver au moins une portion des graines du stade (b) dans une seconde zone de culture en l'absence de ségrégation entre les graines dérivant des plantes mâle- stériles cytoplasmiques présentant une tolérance cytoplasmi- que aux herbicides et des plantes mâle-fertiles dépourvues de tolérance cytoplasmique aux herbicides,et (d) mettre en contact essentiellement la totalité des plantes présentes dans la seconde zone de culture avant la pollinisation avec un herbicide efficace pour détruire les plantes résultant des graines formées sur les plantes mâle-fertiles de lapremière zone de culture, grâce à quoi on forme une population essentiellement homogène d'une va- riété hybride prédéterminée résultant des graines formées sur les plantes mâle-stériles de la première zone de culture. On a également trouvé qu'un procédé amélioré capa- ble de produire des graines pouvant former une variété hy- bride prédéterminée d'une plante cultivée capable de subir une autopollinisation et une pollinisation croisée consiste (a) cultiver dans une zone dé culture une popula- tion essentiellement aléatoire de ( 1) des plantes mâle-sté- riles cytoplasmiques présentant une tolérance cytoplasmique aux herbicides, et ( 2) des plantes mâle-fertiles capables de polliniser les plantes mâle-stériles cytoplasmiques qui 7 2545687 sont dépourvues de tolérance cytoplasmique aux herbicides, grâce à quoi on pollinise les plantes mâle-stériles cyto- plasmiques ( 1) avec le pollen dérivé des plantes mâle-fer- tiles ( 2), os 05 (b) mettre en contact pratiquement la totalité des plantes présentes dans la zone de culture après la pol- linisation avec un herbicide qui est efficace pour détruire les plantes mâle-fertiles et qui est inefficace pour détrui- re les plantes mâle-stériles cytoplasmiques, et (c) récolter les graines des plantes mâle-stéri- les cytoplasmiques capables de former les plantes hybrides essentiellement pratiquement en l'absence des graines des plantes mâle-fertiles qui poussent initialement dans la zo- ne de culture. La composition clé utile dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de l'invention est une semence de Brassica napus constituée d'un ensemble essentiellement ho- mogène de graines qui, par culture, fournissent des plants de colza présentant une combinaison de stérilité mâle cyto- plasmique et de tolérance cytoplasmique à l'atrazine lors- qu'on applique cette dernière par pulvérisation foliaire à la dose de 2 kg/ha. Une autre composition importante selon un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention est une semence de Brassica napus constituée d'un mélange binaire essentielle- ment homogène de graines qui, par culture, fournissent ( 1) un premier colza présentant une stérilité mâle. cytoplasmique et une tolerance cytoplasmique à l'atrazine lorsqu'on applique cette dernière par pulvérisation foliaire à la dose de 2 kg/ha, et ( 2) un second colza capable de polliniser le pre- mier colza, qui-est un entreteneur homozygote récessif dé la stérilité mâle cytoplasmique du premier colza et qui est dé- pourvu de tolérance à l'atrazine lorsqu'on applique cette dernière par pulvérisation foliaire à la dose de 2 kg/ha. Une autre composition importante selon un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention est une semence de 8 2545687 Brassica napus constituée d'un mélange binaire essentielle- ment homogène de graines qui, par culture, fournissent ( 1) un premier colza présentant une stérilité mâ- le cytoplasmique et une tolérance cytoplasmique à l'atrazi- ne lorsqu'on applique -cette dernière par pulvérisation fo- liaire à la dose de 2 kg/hà, et ( 2) un second colza capable de polliniser le pre- mier colza, qui est un restaurateur de la fertilité homozy- gote dominant du premier colza et qui est dépourvu de tolé- rance à l'atrazine lorsqu'on applique cette dernière par pulvérisation foliaire à la dose de 2 kg/ha. Des modes de réalisation préférés de l'invention vont maintenant être décrits. Le principe d'hybridation de l'invention semble s'appliquer de façon générale à la formation d'une variété prédéterminée d'une plante cultivée quelconque capable de subir une autopollinisation et une pollinisation croisée. En ce qui concerne l'invention, on considère qu'une hybrida- tion se produit lorsque les deux plantes parentes subissant la pollinisation croisée ne sont pas identiques du point de vue nucléaire et cytoplasmique Par conséquent, on considè- re qu'une graine capable de former une plante hybride se forme par fécondation d'une plante mâle-stérile cytoplasmi- que par le pollen soit d'une plante d'entretien, soit d'une plante de rétablissement capable de la polliniser. -Selon le procédé de l'invention, on peut former une variété hybride prédéterminée d'une plante à grains, - d'une plante fourragère, d'une plante à fruits propagée par semis, d'une plante ornementale propagée par semis ou d'une espèce industrielle, etc Selon l'invention, les cultures à grains sont celles qui sont cultivées principalement pour leurs graines, et les cultures fourragères sont celles qui sont cultivées principalement pour la-consommation des par- ties autres que les graines, telles que les'feuilles ou d'au- tres structures végétatives. Des exemples caractéristiques de plantes à graines que l'on peut hybrider selon le procédé de l'invention com- 9 2545687 prennent des céréales (par exemple le blé, l'avoine, l'or- ge, le seigle, le mais, le triticale, le sorgho, etc), des légumineuses (par exemple les féveroles, les pois, les arachides, les lentilles) et les plantes oléagineuses (par exemple le lin, la moutarde, le carthame, le tournesol, le soja, le colza, etc) Des exemples de plantes fourragè- res que l'on peut hybrider selon le procédé de la présente invention comprennent la luzerne, les betteraves sucrières, les oignons, les poivrons, les pommes de terre propagées par semis, les navets, les choux, les brocolis, le brome, etc Des exemples de plantes à fruits qu'on peut hybrider selon le procédé de la présente invention comprennent les tomates, les poivrons, les pastèques, etc Des exemples de plantes ornementales propagées par semis que'l'on peut hybrider selon le procédé de la présente invention compren- nent les pétunias, les soucis, etc Des exemples caracté- ristiques d'espèces industrielles que l'on peut hybrider selon le procédé de la présente invention comprennent les peupliers, les érables, le coton, le lin textile, le tabac, le varech, etc Le procédé de la présente invention convient par- ticulièrement bien à la formation d'une variété hybride d'u- ne plante cultivée de la famille des Brassicaceae, qu'on ap- pelle parfois famille des Cruciferae ou famille de la mou- tarde Dans cette famille, on peut choisir plus particuliè- rement une plante cultivée du genre Brassica (par exemple une variété hybride de colza ou navette appelée Brassica na- pus ou Brassica campestris) Chacune des espèces précitées existe en une variété de printemps et d'hiver Les formes de qualité supérieure du colza, qu'on utilise principalement comme source d'huile végétale et de farine de colza (un con- centré protéique pour le bétail), sont couramment appelées canola Par exemple, le terme canola est souvent appliqué à un colza de qualité supérieure à faible teneur en acide éru- cique (moins de 5 %) et en glucosinolates (moins de 3 mg/g de farine déshuilée) Sinon, on peut utiliser le colza pour produire des lubrifiants, des peintures, des vernis et des 2545687 matières plastiques selon des techniques connues. Dans la mise en oeuvre du procédé de l'invention, il est nécessaire de choisir une plante parente potentielle présentant une combinaison de stérilité mâle cytoplasmique et de tolérance cytoplasmique aux herbicides On choisit selon des techniques connues une plante parente dont le cy- toplasme possède ces deux caractéristiques nécessaires Par conséquent, la stérilité mâle et la tolérance aux herbici- des doivent se manifester en raison du type spécifique de cytoplasme présent de façon inhérente Il est de plus géné- ralement essentiel, lors de la formation de plantes à grai- nes cultivées, que la plante mâle-stérile cytoplasmique soit capable de former des graines qui fournissent des plantes hybrides entièrement fertiles après pollinisation par une source de pollen présentant des gènes de restauration de la fertilité dominants homozygotes capables d'interaction avec le cytoplasme La plante mâle-stérile cytoplasmique doit être capable de former des graines produisant des plantes mâle- stériles cytoplasmiques après pollinisation avec une source de pollen dépourvue des gènes de rétablissement de la fertilité dominants Il n'est pas nécessaire que la tolé- rance cytoplasmique aux herbicides ne puisse pas être trans- mise à une génération suivante En fait, on préfère que la tolérance cytoplasmique aux herbicides ne soit en aucun cas influencée par les gènes introduits à partir de la source de pollen. Selon la présente invention, on considère qu'une plante est mâle-stérile lorsqu'elle est incapable de libé- rer du pollen fonctionnel (c'est-à-dire lorsqu'elle est in- capable de féconder in situ une ovule). Selon la présente invention, on considère qu'une plante possède une tolérance cytoplasmique aux herbicides lorsque sa capacité de résister à un herbicide donné, en remplissant ses fonctions végétales normales (par exemple la formation de graines), peut être rattachée à la nature de son cytoplasme Au contraire, les plantes dépourvues de cette tolérance aux herbicides sont fortement altérées ou détruites dans les mêmes conditions Cette absence de tol 6- rance aux herbicides peut également se manifester par l'in- hibition de la germination des graines, si bien que la plante potentielle est détruite en un stade précoce de son *développement. Le mode d'action de l'herbicide particulier em- ployé dans le procédé de la présente invention peut varier beaucoup tant que l'élimination requise des plantes indési- rables peut être effectuée sélectivement sans altération excessives des plantes à tolérance cytoplasmique aux herbi- cides dans le stade approprié du procédé On doit employer un herbicide dont l'innocuité d'emploi en agriculture est établie Par exemple, il s'est révélé que des herbicides agricoles connus agissant par inhibition de la photosynthè- se peuvent être choisis Cependant, des herbicides agissant selon d'autres voies peuvent également être choisis tant que l'élimination contrôlée désirée des plantes indésirables peut être réalisée Des catégories caractéristiques d'her- bicides appropriés sont les s-triazines et les as-triazines. Dans un mode de réalisation préféré concernant le colza, l'herbicide est l'atrazine (c 2 est-à-dire la 2-chloro-4- éthylamino-6-isopropylamino-srtriazine) Sinon, d'autres exemples caractéristiques d'herbicides utiles avec le colza sont la cyanazine (c'est-à-dire le Jt-chloro-6-(éthylamino J -5-triazine-2-yl 7 amino J-2-méthylpropionitrile et le métri- buzin (c'est-a-dire la 4-amino-6-tert-butyl-3-(méthylthio)- as-triazine-5 ( 4 H)-one). L'herbicide peut être appliqué de fa-on classique avant ou après la pollinisation Avant la pollinisation, l'herbicide peut être appliqué aux graines a l'létat de pré- levée de façon à empêcher la germination ou aux jeunes pous- ses dans le stade de post-levée qui suit la germination Si- non, l'herbicide peut être appliqué à des plantes plus àgées. L'herbicide peut être appliqué à la totalité dé la plante ou à des parties de la plante, telles que les racines, par l'in- termédiaire du sol, aux feuilles, aux tiges, etc Par exem- ple, lorsqu'on utilise l'atrazine comme herbicide avec le 12 '2545687 colza, l'herbicide peut, de façon pratique, être appliqué sous forme d'une pulvérisation foliaire aqueuse aux eeuil- les et aux tiges des plantes en développement a une dose d'environ 0,4 à 4 kg/ha (par exemple environ 2 kg/ha) L'ap- plication à la dose de 2 kg/ha d'atrazine à des plants de Brassica napus s'est révélée être sans danger et efficace; cependant, on peut souvent utiliser une dose d'application plus faible Un émulsifiant ou une huile classique peuvent éventuellement être présents lors de l'application Sinon, l'herbicide peut être appliqué sous forme de granulés soli- des directement à la plante ou au sol, comme il est évident pour les spécialistes de l'emploi des herbicides - La plante clé utile dans le procédé de la présen- te invention peut être choisie parmi les plantes qui ont été soumises à l'action d'un herbicide pendant une période pro- longée, de préférence pendant plusieurs générations, ou qui dérivent de telles plantes. Le processus de sélection naturelle qui s'est ré- vélé se manifester chez ces plantes survivantes a permis aux chercheurs d'obtenir des plantes individuelles possédant de façon inhérente la tolérance requise aux herbicides Un es- sai ultérieur peut être utilisé pour identifier nettement les plantes individuelles possédant la tolérance requise aux herbicides et dont Là tolérance peut être attribuée au cyto- plasme et non exclusivement aux facteurs nucléaires transmis par le pollen Pendant le processus de sélection, il est également possible d'examiner des plantes qui sont apparen- tées mais non analogues& tous les égards à la plante qu'on désirehybrider. Dès qu'on dispose de plantes possédant la toléran- ce cytoplasmique aux herbicides requise, on peut en pollini- ser une population selon un vaste programme de production de plantes d'hybridation et observer et choisir les plantes qui ne libèrent pas de pollen fonctionnel On peut ainsi obtenir les plantes requises qui présentent une combinaison de la stérilité mâle cytoplasmique et de la tolérance cyto- -plasmique aux herbicides Comme le même cytoplasme s'est 13 2545687 révélé intervenir dans chacune de ces caractéristiques, la recherche de la stérilité male requise est simplifiée. D'autres techniques que l'on peut utiliser pour obtenir la plante clé utile dans l'invention comprend l'in- trogression réglée des gènes récessifs de rétablissement de la fertilité provenant de male-stériles disponibles dans le noyau d'une lignée tolérante aux herbicides Des techni- ques récentes de biotechnologie peuvent être utilisées, tel- les que la fusion de protoplastes portant sur une lignée tolérante aux herbicides et une lignée à stérilité male cy- toplasmique, la transformation d'organites et la transfor- mation d'ADN dans laquelle un organite et un ADN nucléaire sont modifiés Egalement, la mutagenèse du génome cytoplas- mique de la lignée à tolérance aux herbicides peut être ré- alisée Dès que la plante clé, possédant à la fois la tolé- rance cytoplasmique aux herbicides et la stérilité mâle cy- toplasmique, est localisée ou synthétisée, une culture tis- sulaire peut être employée pour la multiplier afin que ses caractéristiques puissent être confirmées à grande échelle. Les plantes d'entretien qui sont capables de pol- liniser les plantes présentant la stérilité mâle cytoplas- mique et la tolérance cytoplasmique aux herbicides doivent nécessairement être des entreteneurs homozygotes en ce qui concerne les gènes rétablisseurs de fertilité récessifs qui interagissent avec le cytoplasme requis Elles doivent éga- lement être dépourvues de tolérance cytoplasmique aux her- bicides en ce qui concerne l'herbicide pouvant être toléré - par les plantes à stérilité mâle cytoplasmique et à toléran- ce cytoplasmique aux herbicides Des plantes d'entretien ap- propriéespeuvent être développées simultanément à la recher- che des plantes mâle-stériles cytoplasmiques car, générale- ment, elles sont nécessaires pour confirmer facilement la présence réelle du cytoplasme désiré La planite d'entretien choisie possède habituellement pratiquement le-même génotv- pe nucléaire que la plante mâle-stérile cytoplasmique, à l'exception du cytoplasme L'introgression réglée de gènes récessifs de rétablissement de la fertilité à partir de 14 2545687 plantes à stérilité mâle partielle dans des cytoplaanses fertiles peut être réalisée Ces plantes à stérilité male partielle sont hétérozygotes car la moitié seulement des gamètes produits sont récessifs pour le gène de rétablis- sement de la fertilité Les parents mâles qui se sont ré- vélés provoquer une stérilité mâle cytoplasmique après une hybridation à grande échelle peuvent faire l'objet d'une recherche de la présence des gènes récessifs de rétablisse- ment de la fertilité Egalement, des populations recurren- tes naturelles ou des cultivars couramment cultivés peuvent être évalués selon des techniques connues pour déterminer la présence de gènes récessifs de rétablissement de la fer- tilité Les propriétés agronomiques des plantes clés peu- vent être améliorées selon des techniques bien connues de rétrocroisement La descendance d'un croisement entre la plante mâle-stérile cytoplasmique et la plante d'entretien présente toujours une stérilité mâle cytoplasmique et éga- lement une tolérance cytoplasmique aux herbicides. Il est facile de se procurer les plantes de réta- blissement capables de polliniser les plantes présentant une stérilité mâle cytoplasmique et une tolérance cytoplas- mique aux herbicides et leur localisation nécessite peu de recherches Ces plantes doivent nécessairement être des ré- tablisseurs homozygotes en ce qui concerne les gènes domi- nants de rétablissement de la fertilité qui interagissent avec le cytoplasme requis En raison du mode de transmission dominant, ces plantes sont souvent bien plus courantes que les plantes d'entretien dans une population de plantes don- nées Ces plantes de rétablissement sont dépourvues d'une tolérance cytoplasmique aux herbicides en ce qui concerne l'herbicide toléré par les plantes mâle-stériles cytoplasmi- ques présentant également une tolérance cytoplasmique aux herbicides. L'article publié dans Canadian Journal of Genetics and Cytology, volume XXII, no 2, juin 1980, par W D Be- versdorf, J Weiss-Lerman, L R Erickson et V Souza Macha- do, intitulé "Transfer of Cytoplasmically-Inherited Triazi- 2545687 ne Resistance from Bird's Rape to Cultivated Rape (Brassica campestris et B napus)", expose une voie permettant d'ob- tenir une tolérance cytoplasmique vis-à-vis d'un herbicide dans les plantes indiquées qui sont importantes en agrono- mie Plus particulièrement, on a initialement observé qu'un biotype de Brassica campestris connu sous le nom de colza des oiseaux, constituant une mauvaise herbe, infestait un champ de mais près de Brampton Québec, Canada, malgré des applications prolongées d'herbicides classiques de la fa- mille des triazines Par conséquent, ce biotype de mauvai- ses herbes s'est révélé tolérant vis-à-vis d'au moins sept herbicides de type s-triazine, y compris l'atrazine Cette tolérance aux triazines a été transférée selon des techni- ques de rêtrocroisement réglé à des cultivars connus des formes oléagineuses du colza et de la navette (c'est-à-dire Brassica campestris et Brassica napus) pour fournir des cul- tivars oléagineux améliorés pouvant être utilisés dans des programmes de lutte contre les mauvaises herbes Plus parti- culièrement, pendant la floraison, des croisements ont été effectués entre des fleurs émasculées-de colza des oiseaux et de cultivars de colza (navettes) oléagineux (par exemple cultivar Tower) Il s'est révélé que toute la descendance de rétrocroisement de (colza des oiseaux X cultivar) X cul- tivar résistait à une application d'atrazine alors que tou- te la descendance de rétrocroisement de (cultivar X colza des oiseaux) X cultivar était tuée par application d'atra- zine, de même que les cultivars témoins Les résultats in- diquent donc que la résistance à l'atrazine a été transmise par voie cytoplasmique. Des échantillons des semences obtenues de Brassica napus'à tolérance aux herbicides ont été précédemment mis à la disposition du public par le Crop Science Department,- Ontario Agricultural College, Université de Guelph, Ontario, Canada, sous les désignations Reg No GP 2, et Catalogue No ATR-5 Tw dans ses Germ Plasm Releases de 1980 et 1983. On peut également à cet égard consulter "Registration of Triazine Resistant Brassica napus Germplasm", paru dans Crop Science, vol 20, marsavril 1980, page 289 Egalement, des semences de Brassica napus à tolérance aux herbicides provenant de ce programme ont été déposées au National Seed Storage Laboratory à Fort Collinsg Colorado, USA, sous no- tre Sample No ATR-5 Tw, Laboratory Assession No B Na-21 et Serial No 180 171 Les semences identifiées ci-dessus sont capables de fournir des plantes qui sont toutes à fertilité mâle complète Il est envisagé que l'emploi de semences présentant une telle tolérance aux herbicides permette une culture industrielle du colza dans laquelle il est facile d'éliminer, sans danger pour la culture, des mauvaises her- bes telles que le tabouret des champs (Thlaspi arvense, L) et la sanve (moutarde sauvage) (Brassica kaber, D C Whee- ler). La demanderesse a ensuite découvert que des plants de colza présentant une tolérance cytoplasmique aux herbici- des peuvent être obtenus à partir d'ATR-5 Tw possédant la stérilité mâle cytoplasmique requise pour l'emploi dans le procédé de l'invention Ceci a été réalisé par croisement d'un tel colza Brassica napus de rétrocroisement à toléran- ce cytoplasmique aux herbicides servant de parent femelle avec le pollen d'un parent mâle constitué d'un cultivar de Brassica napus tel que Bronowski, qui s'est révélé très va- riable en ce qui concerne les gènes récessifs de rétablis- sement de la fertilité, puis autopollinisation forcée pour produire l'hybride F 2 Les hybrides F 2 présentant une ferti- lité mâle réduite ont été ensuite sélectionnées et isolés par examen visuel Ces plantes ont une stérilité male par- tielle et sont hétérozygotes en ce qui concerne les gènes de rétablissement de la fertilité L'autopollinisation for- cée des plantes à stérilité mâle-partielle a produit les plantes à stérilité mâle complète qui sont caractérisées par l'absence totale de pollen Ces plantes se sont révé- lées présenter une stérilité mâle cytoplasmique ainsi qu'u- ne tolérance à l'atrazine et posséder des gènes de rétablis- sement de la fertilité nucléaire totalement récessifs et homozygotes En l'absence des gènes dominants habituels de rétablissement de la fertilité, le cytoplasme manifeste uniformément une stérilité mâle en plus de la tolérance à l'herbicide atrazine Les propriétés agronomiques ont été améliorées selon des techniques bien connues de rétrocroi- sement Ces plantes présentent une tolérance cytoplasmique à l'atrazine lorsqu'on applique cette dernière par pulvé- risation foliaire a la dose de 2 kg/ha. La demanderesse a découvert que des plants d'en- tretien appropriés de Brassica napus peuvent être obtenus à partir du cultivar Bronowski car cette source de plasma germinal s'est révélée, comme précédemment indiqué, être très variable en ce qui concerne les gènes récessifs de ré- tablissement de la fertilité Par exemple, des plants indi- viduels Bronowski ont fait l'objet d'un échantillonnage re- latif à la présence des gènes récessifs de rétablissement de la fertilité Le pollen de ces plants individuels a été croisé séparément avec des plants présentant une stérilité mâle complète et les graines obtenues ont été cultivées et ont fait l'objet d'une évaluation de la stérilité mâle. Chaque plant Bronowski individuel a également été autopol- linisé pour fournir une source de graines qui s'est révélée posséder la capacité d'entretien de la stérilité mâle; Il a été aussi découvert que des plants d'entre- tien appropriés de Brassica napus peuvent être obtenus à partir du cultivar Westar Ce cultivar est connu comme ayant une importance économique considérable en raison de ses ca-. ractéristiques agronomiques supérieures Le pollen de plants individuels du cultivar Westar a été croisé séparément avec des plants à stérilité mâle complète et il a été observé qu'il était possible d'isoler un plant Westar permettant de produire une descendance à stérilité mâle partielle Ce plant Westar n'a présenté une dominance homozygote que pour un seul gène de rétablissement de la fertilité Des plants a stérili- té mâle partielle ont ensuite été croisés comme source de pollen avec le plant Westar à dominance homozygote pour le gène de rétablissement dé la fertilité servant de parent porte-graine La descendance a été autopollinisée, les grai- nes ont été cultivées et ont fait l'objet d'une évaluation 18 2545687 de la capacité d'entretien de la stérilité mâle Les indi- vidus qui sont des mainteneurs récessifs homozygotes pour le plant à stérilité mâle cytoplasmique peuvent être iso- lés et conservés Par autopollinisation, on obtient une source de graines de mainteneurs. Lorsqu'un plant mainteneur de Brassica napus est identifié, on peut éventuellement utiliser la culture tis- sulaire pour le multiplier afin de confirmer ses caracté- ristiques à plus grande échelle Les plants mainteneurs de Brassica napus identifiés comme décrit ici sont dépourvus de tolérance à l'atrazine lorsqu'on applique cette dernière par pulvérisation foliaire à la dose de 2 kg/ha. Des plants rétablisseurs appropriés de la stérili- té mâle des plants précédemment exposés de Brassica napus sont obtenus à partir de plants de colza essentiellement uniformes dont la variabilité a été essentiellement suppri- mée selon des techniques de multiplication végétale telles que l'autopollinisation et la sélection La seule condition est que ces plantes soient homozygotes pour les gènes domi- nants de rétablissement de le fertilité Par conséquent, on obtient dans tous les cas une descendance entièrement fertile. Le procédé de la présente invention présente l'a- vantagé d'une culture conjointe simple de ( 1) des plantes mâle-stériles cytoplasmiques présentant une tolérance cyto- plasmique pour les herbicides, et ( 2) des plantes mâle-fer- tiles qui sont capables de les polliniser et qui sont dé- pourvues de tolérance aux herbicides Les plantes mâle-fer- tiles peuvent être soit des plantes d'entretien, soit des plantes de rétablissement, comme précédemment exposé Des conditions classiques de culture peuvent être utilisées pour former un mélange aléatoire des deux plantes Il n'est pas nécessaire d'utiliser des quantités égales des deux types de semences Par exemple, des semences capables de former les plantes mâle-stériles cytoplasmiques et à tolérance aux her- bicides qui servent de parent porte-graine peuvent habituel- lement être prépondérantes Par conséquent, ces semences peuvent habituellement constituer 60 à 80 % ou plus de la quantité totale des graines mises en culture Par consé- quent, une plante mâle-fertile peut habituellement pollini- ser plus d'une plante mâle-stérile Comme il est apparent pour le spécialiste de la technologie végétale, les propor- tions relatives des deux types de plantes doivent être ajus- tées de façon à ce qu'on obtienne le taux désiré de polli- nisation de façon régulière en utilisant la quantité minima- le de plantes mâle-fertiles. Dans la mise en pratique du procédé de la présen- te invention, il faut choisir des plantes parentes respec- tives dont les cycles de floraison se chevauchent De plus, le procédé de la présente invention a recours aux modes classiques de transfert dupollen (par exemple des insectes transporteurs de pollen tels que les abeilles et/ou le vent). On peut également utiliser des techniques classiques de ré- colte des plantes. Dans un mode de mise en oeuvre préféré du procé- dé, après la mise en culture conjointe dans une première zone de culture des deux plantes nécessaires, on peut cul- tiver les plantes obtenues jusqu'à maturité et recueillir conjointement les graines formées sur chacun-des deux types de plantes On peut ensuite mettre en culture au moins une portion des graines ainsi produites dans une seconde zone de culture sans séparation pour obtenir de nouvelles plan- tes auxquelles on applique un herbicide avant la pollinisa- tion pour obtenir une population essentiellement uniforme de plantes présentant une tolérance aux herbicides Si la plante male-fertile présente dans la première-zone de cul- ture est un rétablisseur, les graines formées sur les plan- tes de la seconde zone peuvent être simplement récoltées. Dans ce cas, l'herbicide peut, de façon pratique, être ap- pliqué par le cultivateur en association avec-un programme de lutte contre les mauvaises herbes Cependant, dans le mode de réalisation ou la plante de la première zone de culture est un entreteneur, on peut, de façon pratique, cultiver, à une proximité permettant la pollinisation des plantes demeurant dans la seconde zone de culture après application de l'herbicide, une population essentiellement homogène de plantes de rétablissement de la fertilité pale. Les populations essentiellement homogènes respectives peu- vent, de façon pratique, être sous forme de rangs, de ban- des ou de blocs alternés se prêtant à une récolte sélecti- ve Les semences capables de former une variété hybride prédéterminée F 1 à fertilité mâle peuvent ensuite être re- cueillies sélectivement sur les plantes mâle-stériles cyto- plasmiques de la seconde zone de culture. Dans un autre mode de mise en oeuvre préféré du procédé dans lequel on applique l'herbicide dans le stade de postfloraison à un mélange à deux composants de plantes cultivées de façon aléatoire et comprenant un entreteneur, et les graines obtenues sont récoltées, la semence obtenue peut ensuite être mise en culture à une proximité permet- * tant la pollinisation des plantes de rétablissement qui pol- linisent les plantes mâle-stériles cytoplasmiques Cette proximité permettant la pollinisation peut être obtenue par mise en culture conjointe ou par rapprochement de popula- tions végétales essentiellement homogènes Si on effectue - une culture conjointe, les plantes de rétablissement peu- vent être éliminées par un herbicide après la pollinisation de façon a permettre une récolte sélective des plantes mâle- stériles cytoplasmiques Sinon, cette proximité permettant la pollinisation peut être obtenue par culture de popula- tions essentiellement homogènes voisines, par exemple sous forme de rangs, de bandes ou-de blocs alternés permettant une récolte sélective Dans ce cas, on peut également récol- ter sélectivement les graines des plantes de rétablissement. La présente invention fournit pour la première fois la possibilité de former des-semences essentiellement homogènes de Brassica napus qui, par culture, fournissent des plants de colza présentant une combinaison de-stérilité- mâle cytoplasmique et de tolérance cytoplasmique à l'atrazi- ne lorsqu'on applique cette dernière par pulvérisation fo- liaire à la dose de 2 kg/ha On peut aussi former des mé- langes binaires essentiellement homogènes de semences dans lesquels les semences précédentes sont présentes soit avec un entreteneur récessif homozygote de la stérilité male cy- toplasmique, soit d'un rétablisseur dominant hétérozygote de la fertilité mâle dépourvus tous deux de tolérance pour l'atrazine Dans de tels mélanges binaires, les semences capables de former les plantes mâlefertiles sont présentes à une concentration suffisant pour permettre la pollinisa- tion essentiellement complète des plantes mâle-fertiles après germination et pollinisation. REVENDICATIONS 1 Procédé perfectionné pour former une popula- tion essentiellement homogène de plantes d'une variété hy- bride prédéterminée d'une plante cultivée capable de subir une autopollinisation et une pollinisation croisée, carac- térisée en ce qu'il comprend a (a) la culture dans une première zone de culture d'une population essentiellement aléatoire de ( 1) des plan- tes mâle-stériles cytoplasmiques présentant une tolérance cytoplasmique aux herbicides et ( 2) des plantes mâle-ferti- les qui sont capables de polliniser lesdites plantes male- stériles cytoplasmiques et qui sont dépourvues de toléran- ce cytoplasmique aux herbicides, grâce à quoi les plantes mâle-stériles cytoplasmiques ( 1) et les plantes mâle-ferti- les ( 2) sont pollinisées avec le pollen des plantes mâle- fertiles et des graines sont formées sur les plantes mâle- stériles cytoplasmiques et sur les plantes mâle-fertiles. (b) la récolte ensemble des graines formées sur lesdites plantes dans la première zone de culture. (c) la culture d'au moins une partie des graines du stade (b) dans une seconde zone de culture en l'absence de ségrégation entre les graines dérivées des plantes mâle- stériles cytoplasmiques présentant une tolérance cytoplas- mique aux herbicides et des plantes mâle-fertiles dépour- vues de tolérance cytoplasmique aux herbicides, et (d) la mise en contact de pratiquement la totali- té des plantes présentes dans la seconde zone de culture, avant la pollinisation, avec un herbicide qui est efficace pour détruire les plantes résultant des graines formées sur les plantes mâle-fertiles de la première zone de culture, grâce à quoi il se forme une population essentiellement homogène d'une variété hybride prédéterminée résultant des graines formées sur les plantes mâle-stériles de la premiè- re zone de culture. 2 Procédé perfectionné pour produire des graines capables de former une variété hybride prédéterminée d'une plante cultivée capable de subir une autopollinisation et une pollinisation croisée, caractérisé en ce qu'il com- prend: (a) la culture dans une zone de culture d'une po- pulation essentiellement aléatoire de ( 1) des plantes mâle- stériles cytoplasmiques présentant une tolérance cytoplas- mique aux herbicides et ( 2) des plantes mâle-fertiles capa- bles de polliniser les plantes mâle-stériles cytoplasmique, et qui sont dépourvues de tolérance cytoplasmique aux her- bicides, grâce à quoi les plantes mâles-stériles cytoplas- mniques ( 1) sont pollinisées avec le pollen provenant des plantes mâlefertiles ( 2), (b) la mise en contact de pratiquement la totali- té des plantes présentes dans la zone de culture après la pollinisation avec un herbicide qui est efficace pour dé- truire les plantes mâle-fertiles et qui est inefficace pour détruire les plantes mâle-stériles cytoplasmiques,,et (c) la récolte des graines des plantes mâle-stéri- les cytoplasmiques capables de former lesdites plantes hy- brides essentiellement en l'absence des graines des plantes mâle-fertiles qui ont été initialement cultivées dans la zone de culture 3 -Procédé selon la revendication 1 ou 2, carac- térisé en ce que la plante cultivée est choisie parmi les plantes cultivées à graines, les plantes fourragères, les plantes à fruits propagés par semis, les plantes ornementa- les propagées par semis et les espèces industrielles. 4 Procédé selon la revendication 1 ou 2, carac- térisé en ce que la planrfte cultivée appartient à la famille des Brassicaceae. 5 Procédé selon la revendication 1 ou 2, carac- térisé en ce que la plante cultivée appartient au genre Brassica. 6 Procédé selon la revendication 1 ou 2, carac- térisé en ce que la plante cultivée est Brassica napus - 7 Procédé selon la revendication 1 ou 2, carac- térisé en ce que la plante cultivée est Brassica campestris. 8 Procédé selon la revendication 1 ou 2, carac- térisé en ce que les plantes mâle-fertiles ( 2) sont des plantes d'entretien récessives homozygotes des plantes ma- le-stériles cytoplasmiques ( 1) o 9 Procédé selon la revendication 1 ou 2, carac- térisé en ce que les plantes mâle-fertiles ( 2) sont des plantes de rétablissement de la fertilité dominante homo- zygote des plantes mâle-stériles cytoplasmiques ( 1). Procédé selon la revendication 1, caractéri- sé en ce que les plantes mâle-fertiles ( 2) sont des plantes de rétablissement de la fertilité dominantes homozygote des plantes mâle-stériles cytoplasmiques ( 1) et les plantes ob- tenues au stade (d) sont des plantes hybrides F 1 à fertili- té mâle, le procédé comprenant le stade additionnel de (e) récolte des graines qui se forment sur les plantes hy- brides F 1 à fertilité mâle par suite de l'autopollinisation. 11 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les plantes male-fertiles ( 2) sont des plantes d'entretien récessives homozygotes des plantes mâle-stéri- les cytoplasmiques ( 1) et les plantes obtenues au stade (d) sont des plantes male-stériles cytoplasmiques, le procédé comprenant les stades additionnels de (e) culture, à une proximité permettant la pollinisation de la population es- sentiellement homogène de plantes du stade (d), d'une popu- lation essentiellement homogène de plantes de rétablisse- ment de la fertilité homozygote dominante des plantes mâle- stériles cytoplasmiques, grâce à quoi les plantes mâle-sté- riles cytoplasmiques, du stade (d) sont pollinisées par le pollen des plantes de rétablissement, et (f) la récolte des graines des plantes mâle-stériles cyto- plasmiques capables de former une variété hybride F 1 à fer- tilité mâle prédéterminée essentiellement en l'absence de graines de la population des plantes dé rétablissement. 12 Procédé selon la revendication 1 ou 2, carac- térisé en ce que la pollinisation s'effectue à l'aide d'in- sectes transporteurs de pollen. 13 Procédé selon la revendication 1 ou 2, carac- térisé en ce que l'herbicide opère par inhibition de la photo-synthèse. 14 Procédé selon la revendication 1 ou 2, carac- térisé en ce que l'herbicide est choisi parmi les s-triazi- nes et les as-triazines. os 05 15 Procédé selon la revendication i ou 2, carac- térisé en ce que l'herbicide est l'atrazine. 16 Procédé selon la revendication 1-ou 2, carac- térisé en ce que l'herbicide est la cyanazine. 17 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les plantes mâle-fertiles ( 2) sont des plantes d'entretien homozygotes récessives des plantes m-le-stéri- les cytoplasmiques ( 1), le procédé comprenant les stades additionnels de: (d) culture d'au moins une partie des graines du stade c) capables de former des plantes qui sont des plantes mâle-stériles cytoplasmiques et qui présentent une tolérance cytoplasmique aux herbicides à une proximité per- mettant la pollinisation de plantes qui sont des plantes de rétablissement de la fertilité homozygotes dominantes des plantes mâle- stériles cytoplasmiques, grâce à quoi les plantes mâle-stériles cytoplasmiques sont pollinisées par le pollen provenant des plantes de rétablissement, et (e) la récolte sélective des graines qui sont formées sur les plantes mâle-stériles cytoplasmiques. 18 Procédé selon la revendication 17, caractéri- sé en ce quedans le stade (d), les plantes male-stériles cytoplasmiques sont cultivées sous forme d'au moins une po- pulation pratiquement uniforme adjacente à au moins une po- pulation essentiellement uniforme des plantes de rétablisse- ment. 19 Procédé selon la revendication-17, caractéri- sé en ce que, dans le stade (d), les plantes mâle-stériles cytoplasmiques et les plantes de rétablissement sont culti- vées en une population pratiquement aléatoire et les plantes sont mises en contact avec un herbicide qui détruit sélec- tivement les plantes de rétablissement après la pollinisa- tion des plantes mâle-stériles cytoplasmiques et avant le stade de récole (e).