FR 2540135 A1 19840803 FR 8401114 A 19840125 2 540133 PLASMIDE ET VECTEUR DERIVES DU CORYNEBACTERIUM La présente invention concerne des plasmides et des vecteurs dérivés du corynébactérium glutamicum ATCC 39269 qui est lui-même un dérivé du corynébactérium glutamicunm ATCC 13058. Le corynébactérium glutamicum et les micro-organismes appartenant au genre corynébactérium se sont avérés importants dans la production industrielle des amino-acides, y compris de l'acide glutamique et de la lysine et les sels de ceux-ci, y compris le glutamate monosodique Le corynébactérium s'est cependant avéré être réfractaire dans les condi- tions opératoires du domaine du génie génétique utilisant les techniques de la recombinaison de l'ADN par manque de plasmides de corynébactérium convenables susceptibles d'etre modifiés par des moyens enzymatiques permettant leur utilisation comme vecteurs. L'utilité des plasmides et des plasmides modifiés en tant que vecteurs a été démontrée à plusieurs reprises pour le E coli, le Bacillus subtillus et les actinomycètes, qui ont tous été modifiés avec succès grâce à l'emploi de vecteurs dérivés de plasmides provenant de chacun des organismes respectifs et permettant de produire des subs- tances chimiques utiles Ces substances comprennent des antibiotiques, des acides aminés obtenus avec un rendement amélioré et diverses hor- mones provenant d'espèces eukaryotes et en particulier de mammifères. L'utilité du corynébactérium glutamicum qui a été utilisé dans de nom- breux procédés de fermentation industrielle à grande échelle peut être grandement améliorée si l'on peut mettre au point un système de vecteur convenant à son utilisation dans ce micro-organisme. Un groupe de plasmides a été isolé à partir du corynébactérium glutamicum Les plasmides ont été caractérisés par leurs sites de res- triction et ils peuvent être ainsi utilisés comme vecteurs pour la modi- fication du corynébactérium. Un objet de la présente invention est d'isoler et de caractériser des plasmides apparaissant dans les micro-organismes du genre 2 540133 corynébactérium Un autre objet de la présente invention est de mettre au point à partir de ces plasmides, des vecteurs que l'on puisse utili- ser pour modifier intentionnellement le complément génétique des micro- organismes du genre corynébactérium et d'autres micro-organismes. Ces objets de la présente invention et d'autres apparaîtront mieux en se référant à la figure 1, schéma décrivant les sites de cli- vage de l'endonucléase de restriction pour p RN 3,1 Le p RN 3,1 a une lon- gueur approximative de 3,1 kilobases Les positions des divers 'endonu- cléases de restriction sont données sous la forme de coordonnés de kilo- base relatives au site Bgl II à 0:0/3,1 - Le p RN 3,1 est dérivé du corynébactérium glutamicum qui a fait l'objet d'un dépôt à la collection américaine de cultures types sous le numéro d'accès 39 269 Cette souche est dérivée du corynébactérium glutamicum ATCC 13058 et elle est disponible au public à l'accord d'un brevet décrivant l'ATCC 39269, brevet de la demanderesse, la Stauffer Chemical Company, auprès de la collection américaine de cultures types située à Rockville, Maryland, U S A Le dépôt est aussi disponible pour répondre aux-exigences des lois étrangères sur les brevets de pays dans lesquels une demande correspondante à ce sujet a été déposée La disponi- bilité du dépôt ne constitue pas en elle même une autorisation de prati- quer la présente invention en dérogation de droits de brevet ou de certi- ficat d'invention accordé à la demanderesse par une décision gouverne- mlentale Des colonies de corynébactérium glutamicum ATCC 39269 sont pré- cultivées sur 10 millilitres (ml) de bouillon de soja tryptocase (TSB) (Difco) Des répliques de la pré-culture de bactéries sont inoculées dans des portions de 1 litre de milieux minima contenant un extrait de levure Des formules de milieux minima appropriés à la croissance du corynébactérium sont bien connues dans l'état de la technique Dans le cas présent, le milieu est préparé comme suit: Sels MMYE Quantité/l H 20 (NH 4)2504 200,0 g Na Cl 2,0 g Na C 1 2,0 g Mg SO 4,7 H 20 8,0 g Fe SO 4,4-6 H 20 0,04 g Mn 504,4-6 H 20 0,04 g Tampon MMYE Quantité/l H 20 urée 60,0 g KH 2 PO 4 20,0 g biotine 0,001 g thiamine 0,004 g Le milieu de MMYE est préparé en ajoutant 50 ml de la solution stérile de sel de MMYE et 50 ml de la solution tampon stérile de MMYE à une solution stérile contenant 900 ml de H 20, 20 grammes de glucose et 1 gramme d'extrait de levure. Les cultures inoculées sont cultivées sous agitation par secousses à approximativement 200 tr/mn à 30 'C Lorsque les cellules sont bien entrées dans la croissance de phase log, mais ne l'ont pas passé et se trouvent de préférence à la croissance mi-log, indiquée dans l'exemple par une valeur de Klett d'environ 50, on ajoute de la pénicil- line G à chaque culture à une concentration finale de 1 microgramme (ug) par ml Après l'addition de pénicilline G, on fait incuber la culture sous agitation à 30 'C pendant une période de temps suffisante pour assu- rer au moins deux divisions des cellules, soit dans cet exemple, environ 150 minutes. Les cellules sont récoltées par centrifugation à 40 C à une vi- tesse suffisante pour mettre les cellules en pastilles Dans cet exem- ple, on utilise un rotor Sorvell GS-3 à environ 6 000 tr/mn mais, sui- vant le volume de la culture, on peut tout aussi bien utiliser un autre rotor. Les pastilles sont lavées une fois avec un excès de 50 millimoles (m M) de TRIS à p H 8, contenant approximativement 20 m M d'EDTA Après lavage, les cellules sont amenées dans une centrifugeuse convenable et elles sont stockées pendant la durée d'une nuit à -20 'C On peut cepen- dant se dispenser de l'étape de congélation lorsqu'il est souhaitable de procéder directement à l'isolement du plasmide à partir des bactéries. Méthode d'isolement du plasmide à partir des bactéries Pour la digestion des bactéries, on remet en suspension 0,5 g de cellule dans huit-dizième du volume de travail final de 50 m M de tampon TRIS Un dizième du volume de travail final de tampon TRIS contenant une quantité suffisante de lysozyme pour une concentration finale de 2 mg/ml est ajouté à la solution ci-dessus On laisse incuber la solution sans agiter dans un bain d'eau à 371 C pendant une période convenable, de pré- férence entre 30 minutes à 1 heure Après cette incubation, on ajoute de l'EDTA à la solution jusqu'à une concentration finale de 20 m M en même temps qu'une pronase jusqu'à une concentration finale de 500 pg/m 1 et du dodécylsulfate de sodium (SDS) en quantité suffisante pour atteindre une concentration finale de 1 % (p/v) On fait alors incuber cette solution pendant une période appropriée, de préférence environ une demi-heure dans ce cas à environ 370 C. A la suite de cette digestion, la solution est rapidement dénatu- rée en utilisant de l'hydroxyde de sodium 3 N (Na OH) que l'on ajoute pour obtenir un p H dans l'intervalle compris entre 12,5 et 12,4, de préfé- rence entre 12,1 et 12,2 La solution dénaturée est rapidement neutra- lisée avec une quantité de TRIS H Cl 2 molaires à un p H de 7,0 suffisant pour amener le mélange réactionnel dans une zone de p H comprise entre 8 et 8,4 On ajoute alors du chlorure de sodium à une concentration finale de 3 % (p/v). La solution est extraite une fois dans le phénol et ensuite on procède à une extraction ultérieure avec un mélange chloroforme/alcool amylique dans un rapport d'environ 24/1 On ajoute de l'acétate de sodium à la fraction contenant le plasmide d'ADN jusqu'à une concen- tration finale d'environ 300 m M d'acétate de sodium On ajoute deux volumes d'éthanol à cette solution Le précipité formé pendant la durée d'une nuit à -20 'C est recueilli par centrifugation à environ 10 000 - fois la pesanteur. Le précipité est remis en suspension dans un tampon de 50 m M TRIS, 20 m M EDTA, 100 m M de chlorure de sodium, à un p H d'approximative- ment 8 De l'acétate de sodium est ajouté à cette solution à une concen- tration finale d'approximativement 300 m M Deux volumes d'éthanol sont ajoutés à cette solution et on laisse un précipité se former pendant une période de temps appropriée, de préférence environ 2 heures à -70 %C Le plasmide est mis en pastilles par centrifugation comme ci-dessus Les pastilles sont remises en suspension dans 3,9 ml de tampon TES contenant 4,1 g de chlorure de césium et 0,3 ml d'une solution de bromure d'éthy- dium à une concentration de 10 mg par ml La solution est centrifugée pendant une période de temps et à une vitesse suffisante pour former un gradient à l'équilibre de chlorure de césium, dans cet exemple à environ 000 fois la pesanteur pendant la nuit Les raies contenant l'ADN sont mises en évidence à la lumière ultra-violette et la raie contenant le plasmide d'ADN est extraite au moyen d'une piqûre du tube avec une ai- guille D'autres moyens d'enlever sélectivement la raie de plasmide d'ADN peuvent être utilisés avec une égale efficacité Le plasmide d'ADN est encore purifié par remise en suspension dans un tampon de TES conte- nant du chlorure de césium et du bromure d'éthydium et en répétant l'é- tape de centrifugation ci-dessus. 2 5 4 O 133 Résolution du plasmide Les plasmides sont résolus par utilisation de moyens appropriés, par exemple, en faisant passer la solution contenant le plasmide dans un gradient linéaire de 5 % à 20 % de sucrose ou en chargeant cette solution sur un gel de 0,7 % d'agarose et en soumettant le gel à une tension appro- priée pour garantir la résolution des raies de plasmide Dans un mode de réalisation, on utilise du gel à 0,7 % d'agarose La séparation des raies est suivie au moyen d'un colorant de visualisation contenant du bleu de bromophényle, 2 % de SDS et 50 % de glycérol La position des raies sépa- rées est déterminée par coloration avec une solution de bromure d'éthy- dium et visualisation sous lumière ultra-violette. L'électrophorèse de gel d'agarose mise en oeuvre comme décrit ci-dessus indique que le C glutamicum ATCC 39269 dérivé de î'ATCC 13058 possède au moins trois plasmides Le premier plasmide a un poids molécu- laire d'environ 2 x 103 daltons (d) et une longueur d'approximativement 3, 1 kilobases (kb) Ce plasmide est désigné p RN 3,1 Le second plasmide est équivalent approximativement à 14,5 x 106 d et il a une longueur approximative de 23,7 kb Le troisième plasmide est équivalent à environ x 106 d et il a une longueur approximative de 32,6 kb. Une fois que les diverses fractions de plasmides sont résolues, elles sont isolées par des moyens appropriés Dans la méthode que l'on préfère, les fractions résolues sont enlevées par découpage du gel pour former un puits et l'on procède à une électroélution de la fraction de plasmide sur une membrane de dialyse Cette méthode est bien connue dans l'état de la technique et elle est décrite avec beaucoup de détails dans Methods of Enzymology, Vol 65 ( 1980), pages 219 à 327 Les fractions de plasmides éluées de cette façon sont alors extraites dans le phénol et précipitées dans l'éthanol, ce qui permet donc de concentrer le plasmide d'ADN. Caractérisation des plasmides de C glutamicum par des endonucléases de restriction Des parties aliquotes distinctes du plasmide 2 x 106 d contenant approximativement 0,2 pg d'ADN tel que déterminé par la densité optique de la solution à 260 nanomètres dans un spectrophotomètre, sont mises en suspension dans un excès de chacune des endonucléases suivantes et sels appropriés pour chacune des nucléases respectives tel que déterminés par le fabricant: Hind III, Bgl II, Kpn 1, Sal I, Hinf I et Hae III On pro- cède à une double digestion en utilisant Bgl II et Hind III dans les 40135 conditions suivantes Deux dizièmes de microgrammes d'ADN sont mis en suspension dans un tampon contenant un excès d'enzyme Bgl II et contenant les sels appropriés à l'endonucléase de restriction Bgl II tel que le fabricant le recommande On fait digérer le plasmide dans ces conditions avec Bgl II pendant 45 minutes Après cela, on ajoute du chlorure de sodium à la solution à une concentration finale de 60 m M et on ajoute à la solution un excès d'endonucléase de restriction Hind III. On fait alors incuber la solution pendant 30 minutes à 370 C Les produits de la digestion du plasmide par l'endonucléase sont résolus en les faisant passer sur un gel d'agarose à 1 % ou un gel d'acrylamide à % Des étalons d'ADN approprié sont comparés au plasmide dans les produits de la digestion de l'ADN Les résultats sont reportés sur le tableau suivant: 1 TABLEAU En ce qui concerne les emplacements relatifs des sites Hind III et Bgl II, le fragment de 2,85 kilobases se retrouve à la fois dans les produits de digestion Hind III et dans les produits de digestion combi- nés Hind III/Bgl II Ceci indique que le site Bgl Il est situé au sein du plus petit des deux fragments Hind III Sur la base de ces données, on propose le schéma de restriction de ce plasmide désigné p RN 3,1, Illustré sur la figure 1. Enzyme de Sites de Taille des restriction clivage fragments Hind III 2 2, 85 kb; 0,245 Bgl II 1 3,2 kb Kpn I O Sal I O Hinf I > 7 Hae III > 10 Bgl II + Hind III 3 2,85 kb; 0,15 kb; 0,095 kb REVENDICATIONS 1. Plasmide p RN 3,1 dérivé du corynébactérium glutamicum, carac- térisé en ce qu'il présente un poids moléculaire d'environ 2 x 106 daltons et une pluralité de sites de clivage pour endonucléases de restriction disposés comme suit: Enzyme de restriction Site de clivage Hind III 2 Bgl II 1 Kpn I O Sal I O Hinf I > 7 Hae III > 10 2. Plasmide p RN 3,1 sensiblement pur, caractérisé en ce qu'il a un poids moléculaire d'environ 2 x 106 daltons et qu'il possède un sché- ma de restriction tel qu'indiqué sur la figure 1, i e que le site Bgl II est situé au sein du plus petit des deux fragments Hind III. 3. Plasmide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il présente une longueur d'environ 3,1 kilobases, un site Bgl II, un pre- mier site Hind III disposé à environ 0,095 kilobase dudit site Bgl II, un second site Hind III disposé à environ 2,85 kilobases du premier site Hind III, ledit site Bgl II étant disposé à environ 0,15 kilobase dudit second site Hind III. 4. Un plasmide p RN 3,1, vecteur, caractérisé en ce qu'il a un poids moléculaire d'environ 2 x 106 daltons et une pluralité de sites de clivage pour endonucléases de restriction disposés comme suit: Enzyme de restriction Site de clivage Hind III 2 Bgl II 1 Kpn I O Sal I O Hinf I > 7 Hae III > 10 5. Plasmide vecteur sensiblement pur, caractérisé en ce qu'il a un poids moléculaire d'environ 2 x 106 daltons et qu'il présente un schéma de restriction tel que représenté sur la figure 1, i e que le site Bgl II est situé au sein du plus petit des deux fragments Hind III. 6. Plasmide selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il présente une longueur d'environ 3,1 kilobases, un site Bgl II, un pre- mier site Hind III disposé à environ 0,095 kilobase dudit site Bgl II, un seconde site Hind III disposé à environ 2,85 kilobases dudit premier 8 2540135 site Hind III, ledit site Bgl II étant disposé à environ 0,95 kilobase dudit second site Hind III. 7. Culture biologiquement pure de corynébactérium glutamicum enregistrée sous le numéro de dépôt ATCC 39269, et contenant aussi un premier plasmide p RN 3,1. 8 Culture selon la revendication 7, contenant en outre un deu- xième plasmide ayant un poids moléculaire d'environ 14,5 x 106 d et une longueur d'approximativement 27,3 kilobases et un troisième plasmide ayant un poids moléculaire d'approximativement 20 x 106 d et une lon- gueur d'approximativement 32,6 kilobases.