FR 2539759 A1 19840727 FR 8400828 A 19840119 2539759, Linvent- ion concesne de nouvelles lignées de cellules utilisables comme parent dans la préperation d'u hybridome, lesquelles lignées de cellules sont créées à partir de cal- lulos tumoreles humaines autres que celles dérivées de cel-= lules de moelle osseuse, L-linvention concerne également un p Eocédé pour la création do ces nouvelles lignées de cellules, mia que de nouveaux hybridomes préparés par fusionnement do _es lignées de cellules parentes avec des cellules dun autre ps-ent (eppel& ci-après partenaire) provenant de cellules I 0 humaine Ds et enimales L'invention concerne en outre un p Lpocgdi pour le production d'una substance utile telle que des anti- corps ou des l,mrtphokines, par culture des nouveaux hybridomes. Des efforts intensifs ont (t& poursuivis dens les domai- nes du l'imnmunologie, de la biologie, de le science médicale et de le phermiacologie pour ut-ilisoe 2 P comme agente de diag- riost-c ou agents thérepeutiques les anticorps homogènes et t 2 s hautzment spécifiques (anticorps monoclonaux) produits à nertir de cel lules d'hybridome qui peuvent se développer i.n Vitro et sont capables de fournir des anticorps opposée à des mntignms sp&cifiques Lm possibilité de prépaere lac hybridones et de les utiliser dans l a production de substan- Ce O biologiques in vitro s 9 t démontrée pour le premiàre ?ois on 1975 par Ceeser H 2 ilstsin et al à l'Universîté de Canmbridge biologiquement actives, mais qui ont uns capacité de proli- fration in vitro faible ou nulle. A la suite du rapport de Milstein et al, de nombreux chercheurs ont entrepris des études sur des hybridomes pro- duisant Mo Ab opposé à des antigènes spécifiques o Dans toutes ces études, les cellules mères utilisables dans la préparae tion des hybridomes étaient des cellules tumorales dérivant de cellules de moelle osseuse telles que des cellules de myllome et des cellules tumorales provenant de cellules Bo Les prop:it&s génétiques des c ellules tumoralss telles que des cellules de myélome nécessaires pour la préparation des hybridomes et llaspact théorique de la préparation des hybri- domes sont décrits ci-après en détail, La premiere condition pour la préparation d'un hybridome à partir de deux ou plusieurs sortes de cellules mères est d Vutilisse un systeme dans lequel survivent uniquement les cellules hybridéess l a survis des parents étant em'pcheo En conséquencs dans la plupart des essais de préparation d'hybridomes, les cellules tumorales qui peuvent se dévelop- par vigoureusement in vitro, sont des cellules mutan'tes manquant d hypçâanthinesguanine phospho 2 ibosyl transifrase (HGPRT) ou ds thymidine kinase (TK)o Le comportement géné= tbique et biochimique de ces deux mutants est essentiellement la mmes de sortbe que la dsscription suivante sera basse sur leas cellules manquant de HGPRT, les plus communes o Comme il est bien connu, la HGPRT sst une des enzymes responsables dans tcutes les cellules de la synthèse d'ADN par un circuit "de récupération" sur la voie de la synthèse d UAD No Plus spé- cifiquement, si la synthèse d'A DN dans le circuit de novo exigeant des constituants de purine ou de pyrimidine comme substrats pour la réaction enzymatique est supprimée par un certain inhibiteur (par exemple l'aminoptàrine), la HGPRT commande le circuit de récupération comme voie de secours et permet à la synthèse d'ADN, poursuivie, de maintenir les cellules vivantes En conséquence, aucune cellule manquant de HGPRT ne peut survivre dans un milieu contenant de l'hypo- -3- xanthine, de l'aminoptérine et de la thymidine (circuit HAT), par suite de la présence d'aminoptérine qui est un inhibiteur contre le circuit de novo Les cellules partenaires pour la préparation d'un hybridome, par exemple des cellules de rate (cellules B), sont capables de synthétiser l'ADN à la fois par les circuits de nova et de récupération L'hybridome produit par fusion des cellules de rate avec les cellules parentes manquant de HGPRT échappe à l'inhibition du circuit de nova par l'aminoptérine dans le milieu HAT et utilise efficacement l'hypoxanthine pour synthétiser l'ADN par le crcuit de récupération provenant des cellules de rate En d'autres termes, l'hybridome possède à la fois la capacité des cellules parentes de myélomes de se développer vigoureu- sement in vitra et la capacité de synthétiser l'ADN par le circuit de récupération provenant des cellules de rate, même lors de l'inhibition du circuit de nova en présence d 1 amino- ptérine dans le milieu HAT De plus, l'hybridome a l'infor- mation génétique provenant desre Llules de rate pour produire des immunoglobulines (anticorps) opposées à des antigènes - spécifiques, de sorte qu'il est capable de se développer dans le milieu HAT pour produire des immunoglobulines. La souche manquant de HGPRT, utilisée comme parent pour la préparation d'hybridomes, est normalement choisie comme lignée de cellules engendrée par une technique de mutation appropriée et qui est résistante à la 8-azaguanine et inca- pable de se développer dans le milieu HAT De manière clas- sique, ce parent consiste en moelle osseuse provenant de cellules tumorales telles que des cellules de myélome ou de lymphomes à cellules B Cependant, la plupart des cellu- les tumorales qui peuvent être clonées pour utilisation dans la préparation d'hybridomes proviennent de souris ou de rats, et on utilise rarement des cellules de myélomes humains Les raisons en sont les suivantes: 1) les clones qui peuvent être soumis à une sélection dans le milieu HAT (appeléeparfois ci-après sélection HAT), sont difficiles à préparer à partir de cellules de myélomes humains; 2) les cellules de myélomes -4 - humains ne possèdent pas la capacité de prolifération élevée exigée pour un parent, de sorte qu'un hybridome préparé par fusion de ces cellules avec des cellules partenaires n'a qu'une capacité de développement limitée et de plus n'est pas suffisamment stable pour produire une grande quantité de la substance désirée telle que des immunoglobulines Il s'est donc avéré impossible dans la technique de préparer des hybridomes humains-humains possédant une capacité de dévelop- pement suffisante et produisant des substances utiles Les chercheurs ne sont pas capables de-produire des immunoglo- bulines humaines en quantité à partir de cellules cultivées et ils sont donc obligés d'utiliser des immunoglobulines provenant de cellules d'hybridomes animaux-animaux Cepen- dant, les immunoglobulines produites à partir d 9 hybridomes animauxanimaux sont des protéines étrangères aux humains, de sorte que leur antigénecité emp 8 ch leur utilisation extensive chez les humains On recherche donc intensément à produire des immunoglobulines à partir d'hybridomes humains- humains Mais, comme on l'a déjà indiqué, la culture en masse d'hybridomes provenant de celles de myélomes humains impli Que de grandes difficultés en raison de leur instabilité. Les cellules de myélomes produisent de grandes quantités d'immunoglobulines appelées protéines myélomateuses Cepen- dant, on ignore si les immunoglobulines ainsi produites sont des anticorps vis à vis de n'importe quel antigène spécifi- que, et il est presqu'impossible de sélectionner des cellules de myélomes produisant un anticorps opposé à un antigène spécifique Les scientifiques en ont conclu que la présence de protéin Emyélomateuses complique la sélection des hybri- domes ou la purification des anticorps, de sorte que les cellules de myélomes qui produisent des protéines myéloma- teuses doivent être remplacées par celles qui ne produisent pas de protéines myélomateuses En d'autres termes, la capa- cité de développement in vitro est maintenant considérée comme un facteur plus important pour les cellules de myélomes comme parent pour la préparation d'hybridomes. 2539759, -5 Dans ces circonstances, on désire obtenir des cellules humaines comme lignée de cellules parentes pour la prépa= ration d'hybridomes D qui se développent vigoureusement et puissent âtre soumises à une sélection HAT après fusionne- ment avec des cellules partenaires, ainsi que des hybridomes humains qui restent suffisamment stables in vitro pour pro- duire de grandes quantités de substances désirées telles que des immunoglobulineso On S compris de manière générale que les cellules parentes à fusionner avec des cellules partenaires pour une préparation d'hybridomes doivent être choisies parmi des cellules cancéreuses dérivées de cellules myélomateuses et de cellules B (comprenant des cellules transformées par le virus d'Epsstein-Barr (EBV))o Cependant 9 comme on l'a indiqué précédemment 9 ces cellules parentes présentent divers défauts qui ampechent leur utilisation extensive dans des applications cliniqueso En conséquence, l'invention S pour objet de créer un typa entièrement nouveau de lignée de cellules humaines conséquentes 9 fusionnables avec des cellules partenaires pour la préparation d'hybridomes 9 cette lignée de cellules ne possédant pas les défauts de la lignée de cellule clas= sique préalablement utilisée comme parent Ceci repose sur la constatation faite par la demanderesse que toute cellule capable de se développer vigoureusement in vitro peut être utilisée comme parent à fusionner avec des cellules parte= naires dans la préparation d'hybridomeso Plus spécifiquement 9 l'invention a pour objet de créer un nouveau type de lignée de cellules humaines à partir d'un mutant de cellules produit soit par mutation naturelle ou induite de cellules cancéreuses provenant de cellules autres que des cellules myélomateuses ou des cellules B, telles que des cellules tumorales dont on citera comme exemples des cellules du cancer de la peau (mélanome), de l'hépatome, du cancer gastrique 9 du cancer intestinal, du cancer du poumon, et du cancer du sein, de préférence des cellules du mélanome humain, de l'fipatoma et du cancer du 2539759, 6- poumon Des e Xemples spécifiques de mutant sont des cellules génétiquement déficitaires, incapables de produire quelques- unes des enzymes responsables de la synthèse del V'AD No Ltinvention a encore pour objet de créer une lignée de cellules parentes, qui prolifère plus in vitro que les lignées de cellules classiques provenant de cellules tumorales dérivées de la moelle osseuse (cellules myéloma- teuses) et qui peuvent 9 tre fusionnées avec des cellules productrices d'anticorps (cellules B) pour fournir un hybri- dome qui prolifère autant que la cellule mère et qui reste cependant suffisamment stable pour produire des immunoglo- buliness L'invention a également pour objet de fournir un hy- bridome à partir de la lignée de cellules parentes, qui reste suffisamment stable in vitro pour produirse une sub- stance utile telle qu'un anticorps, Plus spécifiquement, l'invention concerne la préparation d'un hybridome produi- sant un anticorps spécifique, par fusionnement de la lignée de cellules parentes, en particulier d'une lignée-de cel- lules tumorales humaines avec d es cellules B dlanimaux autres que des humains, qui sont sensibilisés avec un anti- gène spécifiques L'invention a ancore pour objet la préparation d'un hybridome humain-humain produisant un anticorps spécifique,. par fusionnement de la lignée de cellules parentes avec des cellules B provenant de cellules du sang périphérique, des amygdales, des ganglions lymphatiques ou de la rate d'itres humains, sensibilisés avec un antigène particulier, L'invention a encore pour objet la préparation d'un hybridome huimain-humain qui produit dessimmunoglobulines humaines et qui peut Ctre administré à des humains sans entraîner un problème d'antigénécité indésirable. L'invention a encore pour objet la préparation d'un hybridome de cellules T par fusionnement de la lignée de cellules parentes avec des oellules T humaines, capable de produire du gamma-interféron ou des lymphokines. Enfin, l'invention a Dour objet cde fournir un procédé pour la production d'une-substance utile telle qu'un anticorps, l'interféron ou des lymphokines, soit directement à partir de l'hybridome, soit à partir d'une culture de l'hybridome. Les figures 1 et 2 des dessins annexés reproduisent chacune une vue en plan illustrant le mode opératoire du test d'Ouchterlony effectué dans l'expérience 1, et la figure 3 représente un diagramme comportant trois courbes de développement, l'une pour un mélanome et les autres pour la lignée de cellules parentes (ME 1) selon l'invention, pour la préparation d'un hybridome. Le procédé de préparation d'une nouvelle lignée de cel- lules tumorales pour la préparation d'un hybridoma selon l'invention, le procédé de préparation d'un hybridome en uti- lisant cette lignée de cellules comme parent et le procédé pour la production d'une substance biologique utile à partir de cet hybridome sont décrits ci-après La lignée de cellules parentes pour la préparation d'un hybridome selon l'invention peut être obtenue par mutation naturelle ou piat mutation induite de cellules tumorales autres que celles- provenant de cellules de moelle osseuse, en particulier de cellules tumo- rales humaines telles que des cellules de mélanome humain, des cellules de cancer du poumon humain et des c ellules d'hépatome humain L'hybridome selon l'invention peut être -préparé par fusionnement de cette nouvelle lignée de cellules avec un autre parent, c'est à dire un partenaire dérivé de, par exemple, les cellules B d'animaux comprenant des êtres humains immunisés avec'un antigène particulier Dans un but de simplicité, l'invention est décrite ci-après en se référant en particulier au mode de production d'un anticorps monoclonal (Mo Ab) à partir de la culture d'un hybridome préparé par fusionnement de cellules tumorales humaines avec des cellules de rate de souris Mais, il est évident que l'invention n'est aucunement limitée à ce mode de mise en oeuvre particulier. Le procédé pour la préparation de cellules tumorales humaines comme parent pour la préparation d'un hybridome commence par l'isolement d'un clone déficitaire en une enzyme (HGPRT) impliquée dans la synthèse de l'ADN dans le circuit de récupération, afin de mermettre la sélection HAT ultéri- eure des hybridomes Cette opération peut être effectuée par l'un des deux procédés suivants Dans un procédé, à un milieu de culture on ajoute directement une concentration appropriée de 8-azaguanine de manière à obtenir une souche résistante à la 8-azaguanine Dans l'autre procédé, on traite les cellules cancéreuses soit par irradiation UV, soit avec un inducteur de mutation selon le type spécifique de cellules cancéreuses, et on transfère ensuite les cellules ainsi traitées dans un milieu contenant de la 8-azaguanine. L'irradiation UV est effectuée en exposant les cellules à une lampe UV (GL-15) placée 30 cm au-dessus, pendant une période de 15 secondes à 10 minutes Comme inducteur de mutation approprié, on citera l'éthylméthane sulfonate (EMS) ou la N-méthyl-Nt-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), qu'on utilise en une quantité de 0,05 à 10 ug/ml Après avoir cultivé les cellules en présence de l'inducteur de mutation pendant une période de plusieurs heures à 3 jours, on lave soigneusement la culture avec un milieu sans sérum et on transfère dans un milieu contenant de la 8azaguanine Quel que soit le procédé utilisé,, le premier stade du procédé se termine avec l'apparition d'une ou-plusieurs souches résis- tantes à la 8-azaguanine. La seconde opération consiste à vérifier si les cellules de la souche résistante à la 8-azaguanine permettent la sé- lection HAT ultérieure On cultive des cellules de souches résistantes à la 8-azaguanine dans un milieu approprié qu'on sépare ensuite par centrifugation On lave alors deux fois les cellules avec un milieu HAT Ot on transfère dans un milieu HAT frais ( 10 cellules/ml) Après une incubation de jours, on colore les cellules avec du bleu Trypan Si presque toutes les cellules sont trouvées mortes, on dépose des cellules'de la même souche résistante à la 8-azaguanine ( 105 cellules/ml) sur une plaque de Costar no 3596 (une micro-plaque avec 96 puits) après avoir déposé 105 cellules nutritives (par exemple des cellules de rate) dans chaque puits Avant la déposition sur une plaque, on dilue les cellules résistantes à la 68 =azaguanine à une concentration qui fournit au plus une cellule dans chaque puits (OQI cel- lule/puits selon touts probabilité)O On incube les cellules déposées sur la plaque pendant environ une semaine, On laisse les clones accroître leur population cellulaire et lorsque cette population atteint environ 105 cellules/ml, on les nourrit de nouveau avec un milieu HAT et on les laisse jusqu'à ce qu'ils soient tous mortso On répète ce mode opératoire de préférence au moins deux foiso Le second stade se termine avec la confirmation de la mort complète des cellules résistantes à la 8-azaguanine dans le milieu HATO Il ast nécessaire d'ajouter toujours de la 8 =azaguanine dans le milieu HAT jusqu'à l'obtention de la lignée de cel- lules désirées Dans les modes opératoires ci-dessus, la 8-azaguanine peut âtre remplacée par Bud R 9 auquel cas on peut obtenir des clones déficitaires an TK et de nouveau sensibles au milieu HAT Après l'obtention de la lignée de cellules désirée, on la maintient dans un milieu contenant de la 8-azaguanine si celà s'avère souhaitable Le milieu utilisé pour la culture de la lignée de cellules créée peut etre le même que celui utilisé avant la mutation des cellules tumorales humaines De plus, la lignée de cellules créée peut être utilisée comme parent pour la préparation d'un hybridome ans nécessiter une composition de milieu spéciale La lignée de cellules créée peut âtre efficacement conservée par un procédé classique en la mettant en suspension dans un milieu contenant 10 % de FCS (sérum foetal de veau) et % de DMSO (diméthyl sulfoxyde) qu'on maintient dans l'azote liquide ou dans un congélateur à environ fr O O C ou moins. La lignée de cellules créée selon l'invention est utilisable comme parent pour la préparation d'un hybridome. _ Si la lignée de cellules provient de cellules tumorales humaines, elle convient comme parent pour la préparation d'un hybridome humain-humaino L'autte parent (cellules par- tenaires) peut être des cellules B du sang périphérique, des amygdales, des ganglions lymphatiques etde la rate d'humains immunisés avec un antigène particulier, Un gand avantage de l'hybridome humain-humain est qu'on le suppose capable de produire des immunoglobulines qui sont des protéines humaines et qui peuvent donc 'tre administrées à des humains sans entraîner un problème d'antigénécité indésirableo g 9 une manière plus importante, on pense que l'invention donne la possibilité de préparer des hybridomes non seulement à partir de cellules B humaines, mais égale- ment à partir de cellules T humaineso C'est ainsi que la lignée de cellules parente selon l'invention peut être fu- sionnée avec un partenaire qui est une cellule T humaine capable de produire du gamm-interféron ou des lymphokines o On pense que l'hybridome de cellule T résultant est capable de produire legamma-interféron et des lymphokineso En consé- quence, les lignes de cellules de l'invention trouvent une large gamme d'applications et peuvent Atre utilisées pour préparer divers types d'hybridomeso Le procédé pour la préparation d'un hybridome utili- sant la ligne de cellules créée comme parent est le suivant. Le milieu à utiliser peut être l'un des milieux usuels, tels que le MEM de Eagle, le MEM amélioré de Dulbecco et le RPMI 1640 qui contient 10 % de CS (sérum de veau), 5 % de FCS + 5 % de CS ou 10 % de FC So Pour la conservation usuelle des cellules parentes, l'un quelconque de ces milieux peut être utilisé, mais dans le but spécifique d'une prépa- ration d'hybridome, on préfère le milieu avec 10-% de FCS. Au premier stade, les cellules parentes, c'est à dire les cellules cancéreuses humaines et lesoa,llules partenaires, par exemple des cellules de rate, sont fusionnées-dans un rapport de 1:5, avec HVJ (virus hémagglutinant du Japon, connu également sous le nom de virus Sendai) ou du poly- 11 - éthylène glycol (PEG) utilisé comme médiateur On préfère une solution de PEG 1000 à 30-50 % Les cellules fusionnées peuvent être soumises à une sélection HAT selon le mode opé- ratoire décrit ci-dessus La sélection des cellules d'hybri- dome résultantes est effectuée principalement en examinant le produit surnageant de la culture quant à l'apparition d'immunoglobulines, pour recueillir des clones d'hybridome produisant des immunoglobulines par le procédé SPA-SRBC (SPA: staphylococcus aureus protéine A; voir "Procedures of Immnunological Lxperiments VII", p 2375) ou le procédé ELISA t Procédé Dynatech) On laisse les clones augmenter progressivement en population cellulaire et lorsqu'ils ont atteint 105 cellules/ml, on les soumet à un sous-clonage. Pour s'assurer que toutes les cellules d'hybridome sont monoclonales, on les dépose sur une microplaque avec 96 puits dans chacun desquels on a déposé auparavant environ 105 cel- lules normales de rate comme couche nutritive Les cellules d'hybridome doivent gtre diluées à une concentration qui garantit la présence d'une cellule d'hybridome au plus dans chaque puits (nombre moyen de 0,1 cellule/puits selon toute probabilité) Après une incubation d'une semaine environ, on examine l'aptitude des clones résultants à produire un anticorps spécifique On répète le mode opératoire ci-dessus jusqu'à obtention de cellules d'hybridome monoclonales. On peut facilement déterminer les classes et les sous- classes des immunoglobulines produites par l'hybridome grâce à la technique d'Ouchterlony utilisant un gel d'agarose. On force des anticorps opposés aux immunoglobulines qu'on suppose etre produites par l'hybridome, à réagir avec le produit surnagant de la culture sur une plaque d'agarose et on observe l'apparition d'une ligne de précipitation 24 heures plus tard Pour les détails de la méthode d'Ouchterlony, voir l'expérience 1. Il ressort de la descripticn précédente que l'invention infirme la conclusion de Milstein et al, à savoir qu'une ? 539759 12 - lignée de cellules parente pour la préparation d'un hybridome doit être celle de cellules tumorales telles que des cellules myélomateuses ou des lymphomes à cellules B provenant de cellules de moelle osseuse En d'autres termes, la demande- resse a démontré que toutes les cellules tumorales qui sont capables de se développer in vitro, peuvent êtrs utilisées pour la création de lignées de cellules parentes pour la préparation d'un -hybridome La lignée de cellules tumorales humaines, créée selon l'invention, peut gtre cultivée plus simplement que la lignée de cellules myélomateuses, classique, et est en outre plus stableet prolifère mieux que cette dernière En utilisant cette lignée de cellules comme parent, il est possible de préparer un hybridome humain-souris selon l'invention Conformément à l'invention, on peut préparer non seulement un hybridome produisant un anticorps monoclo- nal, mais également des hybridomes qui produisent des lym- phokines possédant d'utiles activités physiologiques. Le procédé pour la préparation de la lignée de cellules parente de l'invention pour la préparation d'hybridome, le procédé pour la préparation d'un hybridome à partir de la lignée de cellules parente, ainsi que le procédé pour la production d'un anticorps à partir de l'hybridome résultant, et la méthode pour son identification sont décrits ci-après à l'aide des exemples et des données expérimentales. Exemple 1 Préparation, à partir d'une cellule tumorale humaine Colo 38, d'une lignée de cellules parente pour la préparation d'un hvbridome (procédé A) Dans les exemples suivants, toutes les cultures sont effectuées dans une atmosphère composée de 5 % de CO 2 et de % d'air à une humidité relative (r h) d'environ 1000 C et une température de 37 C. On cultive des cellules de mélanome malin humain (Colo 38) pendant 2 ou 3 jours jusqu'a ce qu'elles atteignent une phase log On ajoute aux cellules un inducteur de mutations MNNG (N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine de Sigma Chemical 2539759, Co.) pour obtenir une concentration finale de 0,05 à 10 og/ ml Après une incubation de 36 heures à une concentration en MNNG de 5 g/ml, environ 20 % des cellules de mélanome sont trouvées mortes On sépare la MNNG de la culture par lavage avec un milieu RPMI 1640 sans sérum (produit de Nissui Sei- yaku Coo Ltd) avec trois centrifugationso On ajoute un total de 10 ml des cellules ainsi traitées ( 2 x 105 cellules/ml) à un milieu contenant de la 8-azaguanine à une concentration finale de 1 à 50 ug/ml, On poursuit la culture pendant au moins une semaine à des concentrations respectives en 8-aza- guanine qui garantissent la mort deau moins 99 % des oellules en une semaine dans 20 ug/ml de 8-azaguanine A cette con- centration en 8-azaguanine, on poursuit la culture pendant au moins 2 semaines à partir du début avec une observation V 5 quotidienne du développement des cellules, On recueille donc les cellules par centrifugation et on ajoute ces cellules à un milieu contenant de la 8azaguanine à une concentration finale de 5-0 ug/ml (le nombre de cellules ajoutées est le m 9 me que celui utilisé dans le premier traitement avec la 8-azeguanine: 2 x 105 cellules/ml)o Les cellules qui survi- vent à une incubation de 2 semaines dans le milieu sont sélectionnées comme des souches résistantes à la 8 aezaguanine. On lave des cellules des souches résistantes à la 8-aza- guanine avec un milieu sans sérum, avec 3 centrifugations, et on les transfère dans 10 ml d'un milieu HAT Le milieu consiste en un milieu RPMI 1640 avec 10 % de FCS (produit de CSL Coo, Australie) auquel on ajoute de l'hypoxanthine, de l'aminoptérine et de la thymidine en des concentrations finales respectives de 1 O-4 M, 4 x 10-7 M St I 16 x 10 '5 Mo La concentration des oellules dans le milieu HAT est de 105 cel- lules par mi, Le 5 ème jour de l'incubation, on vérifie la survie des cellules en les colorant avec du bleu Trypan Si toutes les cellules sonttrouvées mortes dans le milieu HAT, on dépose une autre portion de cellules résistantes à la 8-azaguanine de la même souche, sur une plaque dans 96 puits à raison d'environ 0,1 cellule/puits, en ayant déposé au 14 - préalable dans chaque ouits une couche nutritive de cellules de rate à une concentration de 105 cellules/puits Après une incubation d'environ une semaine, six clones se sont formes parmi les 96 puits En poursuivant l'incubation pendant encore une ou deux semaines 9 le nombre de cellules dans chaque clone augmente jusqu'à environ 105/ml, On soumet en- suite les clones à une sélection HATO Les cellules dans chaque clone meurent dans les 5 jourso On redépose un des six clones dans les 96 puits d'une plaque, selon le mode opératoire ci-dessus et on sous-clone pour obtenir 8 cloneso On les laisse également augmenter en nombre et on les soumet à une sélection HAT pour confirmer que toutes lescellules sont mortes dans le milieu HA To Les cellules de mélanome malin humain ainsi obtenues qui résistent à la 8-azaguanine et sont sensibles à la sélec- tion HAT, sont appelées lignées de cellules de série ME 1 o On les conserve dans un milieu composé de 10 % de FCS,9 10 de DMSO (diméthylsulfoxyde) et 80 % de milieu ordinaire, dans l'azote liquide ou dans un congélateur à environ -80 OC. E 2 emple 2 Préparation, à partir de cellules tumoreles humaines Colo 38, d'une lignée de cellules parente pour la prépa- ration d'un hybridome (procédé B) Le procédé B diffère du procédé A en ce qu'on induit une mutation par irradiation UV plutât que par un inducteur chimique On place les cellules de mélanome malin humain dans une phase log dans une boîte de Petri ( 10 cm de diamètre)- à une concentration de 2 x 10 cellules/ml (au total 10 ml). Après irradiation avec une lampe UV (GL-15 de Matsushita Electric Industrial Co Ltd) placée à 30 cm au-dessus de la boîte, on ajoute de la 8-azaguanine Est cellules à une concen- tration finale de 20 ug/ml En une semaine environ, au moins 99,5 % des cellules meurent On poursuit l'incubation pendant encore environ deux semaines dans les memes conditions avec des observations quotidiennes Environ trois semaines après la première addition de 8-azaguanine, le nombre des cellules 2539759, - augmente rapidement en formant une suspension uniforme de cellules On les recueille par centrifugation et on les introduit dans un milieu à une concentration de 2 x 105 cellules/ml en présence de 6-azaguanine à une concentration finale de 50 pg/ml Les cellules qui survivent à une incubation de deux semaines supplémentaires sont sélectionnées comme cellules résistantes à la 8-azaguanine. On soumet ces cellules à une sélection HAT ultérieure comme dans l'exemple 1 et on obtient trois lignées de cellu- les de série ME 1 La probabilité pour l'apparition de cel- lules résistantes à la 8-azaguanine est d'environ le cinqui- ème de la valeur obtenue dans l'exemple 1 o Cependant, la probabilité selon laquelle les cellules résistantes à la 8-azaguanine sont sensibles à une sélection HAT, est la même pour les deux exemples. Exemple 3 Préparation, à partir d'une cellule tumorale humaine Colo 38, d'une lignée de cellules parente pour la pré- paration d'un hybridome (procédé C) Le procédé C diffère des procédés A et B en ce qu'on ajoute directement la 8-azaguanine au milieu de culture de cellules tumorales humaines On incube une culture ( 10 ml) contenant 2 x 105/ml cellules de mélanome malin humain (Colo 38) dans une phase log pendant 5 jours en présence de 8-azaguanine à une concentration de 5 ig/ml Puis, on aug- mente la quantité de 8-azaguanine pour obtenir une concen- tration finale de 20 Oug/ml Pendant les 10 jours d'incuba- tioh, presque toutes les cellules meurent Mais on poursuit l'incubation pendant encore environ 20 jours dans les m 9 mes conditions La probabilité d'obtenir un développement des cellules est faible, mais on observe une augmentation rapide du nombre des cellules dans l'un des-18 flacons On cultive une partie des cellules multipliées pendant encore deux semaines en présence de 8-azaguanine à une concentration finale de 50,g/ml Les cellules qui sont capables de se développer normalement dans ces conditions sont sélection- _ 16 - nées comme cellules résistantes à la 8-azaguanine. Ces cellules sont ensuite soumises à une sélection HAT comme dans l'exemple t et on obtient six lignées de cellules de série ME 1. Dans les exemples 1 à 3, on prépare un total de 17 lignées de cellules de série ME 1 à partir de cellules de mélanome malin humain (Colo 38) par trois procédés différents. Les lignées de cellules sont identifiées par les numéros SUN N-2161 à SUN N-21-17. Exemole 4 Préparation, à partir de cellules tumorales humaines (M 21), d'une lignée de cellules parente pour la prépa- ration d'un hybridome Cet exemple prouve qu'une lignée de cellules parente pour la préparation d'un hybridome peut également tre obtenue à partir de cellules tumorales humaines autres que Colo 38 Le procédé utilisé dans l'exemple 4 est pratique. ment le même que dans l'exemple 1. On cultive des cellules de mélanome humain (M 21) pen- dans 60 heures jusqu'à ce qu'elles aient atteint une phase log On ajoute aux cellules un inducteur de mutation de MNNG à une concentration finale de 5 ig/ml Après 36 heures d'incubation, pendant lesquelles environ 35 % des cellules de mélanome sont trouvées mortes, on sépare la MNNG de la culture par lavage avec un milieu RPMI 1640 sans sérum et trois centrifugations On incube 2 x 105 cellules via- bles par ml ( 10 ml) dans un milieu contenant de la 8-aza- guanine à une concentration finale de 20 pg/ml En une semaine, au moins 99,5 % des cellules meurent, mais on poursuit l'incubation pendant encore deux semaines-dans les mêmes conditions. On examine la culture une fois par jour pour déterminer tout développement de cellule au microscope Environ 20 jours plus tard, on observe une augmentation progressive du nombre des cellules et dans les 5 jours suivants, on constate un rapide développement des cellules On recueille 17 - les cellules développées par centrifugation, et on met 2 x 105 cellules/ml en suspension dans un milieu ( 10 ml) contenant de la 8azaguanine à une concentration finale de 50 jg/ml On poursuit l'incubation pendant environ 2 semaines et les cellules dont le nombre a augmenté sont sélectionnées comme cellules résistantes à la 8-azaguanine. On soumet ces cellules à une sélection HAT et on répète le sous-clonage comme dans l'exemple 1 o En résulstat, à partir de cellules de mélanome humain M-21, on a pu obtenir six lignées de cellules parente pour la prépazration d'un hybridoma qui sont résistantes à la 8-azaguanine et qui meurent dans le milieu HAT Ces six lignées de cellules sont identifiées par les numéros SUN N-22 = 1 à SUN N= 22-6 de série Me 2. Exmple 5 Préparation,' partir de cellules d'hépatome humains d'uns lignée de cellules parente pour la préparation d'un h bridome (procédé D) On cultive des oellules d'hépatome humain HC C= 4 dans un milieu RPMI 1640 pendant 24 heures A la cultures on ajoute un inducteur de mutation de-EMS (éthylméthane sulfo- nate de Sigma Chemical Co) pour obtenir une concentration finale de 1 m Mo Par une incubation de 3 heures, on induit une mutation dans les cellules d'hépatome humain HC C-4 o On lave alors trois fois les cellules avec un milieu RP Ml 1640 sans sérum, on cultive dans un milieu RPMI 1640 com- plet (contenant du sérum) pendant une période de temps de 48 à 72 heures, et on cultive ensuite pendant de 3 à 4 semaines dans un milieu RM Pl 1640 contenant 2 Q O pg/ml de B-azaguanine. Trois semaines plus tard environ,on observe une rapide aug- mentation du nombre des cellules et des clones uniformes de cellules adhérentes se forment On incube la culture pendant encore deux semaines dans un milieu RM Pl 1640 contenant ug/ml de 8-azaguanine On sélectionne les cellules deve- loppées comme-cellules résistantes à la 8-azaguanine. On vérifie ensuite la sensibilité de ces cellules à une _ 18 sélection HAT comme dans l'exemple 1 En résultat, on peut obtenir 8 clones de lignées de cellules déficitaires en HGPRT comme parent pour la préparation d'un hybridome, à partir de cellules d'hépatome humain Ces clones sont iden- tifiés sous les numéros SUN N-31-1 à SUN-31-8 o Exemole 6 Préparationv à partir de cellules 'dhépatome humain, d'une lignée de cellules parente pour la préparation d'.un hybridome (procédé E) Comme dans l'exemple 5, on traite une culture de cellu- les d'hépatome humain HC C-4 avec un inducteur de mutation de EM So On sépare ensuite l'EMS de la culture par lavage avec un milieu RPMI 1640 sans sérum On incube la culture pendant de 3 à 4 semaines dans un milieu contenant 2,0 pg/ml de Bud R (b 2 omodésoxyuridine de Sigma Chemical Coo) o On transfère les cellules développées dans un milieu contenant 10 jg/ml de Bud R aû on les incube pendant environ 2 semaineso Les cellules développées pendant cette inbucation sont sélect tionnéeas comme cellules résistantes à Bud Ro On vérifie ensuite leur sensibilité à une sélection HAT comme dans l'exemple 1 I En résultat, on peut obtenis 6 clones de lignées de cellules déficitaires en TK comme parent pour * la préparation d'un hybridome, à partir de cellules d'hépa- tome humain Ces clones sont identifiés sous les -numéros SUN N-32-1 à SUN N-32-6 o Exemple 7 Préparation, à partir de cellules de carcinome pulmo- naire humain, d'une lignée de cedllules patente pour -la- p_éperation d'un hybridome On cultive des cellules de carcinome pulmonaire humain A-549 dans un milieu RPMI 1640 pendant 24 heures, A la cul- ture, on ajoute un inducteur de mutation d'EMS pour obtenir une concentration finale de 1 m Me Par une incubation de 3 heures, on induit une mutation dans les cellules de carci- nome pulmonaire humain A-5490 On lave alors trois fois les cellules avec un milieu RPMI 1640 sans sérum, on cultive 19 - dans un milieu RPMI 1640 complet pendant une période de temps de 48 à 72 heures, et on cultive ensuite pendant de 3 à 4 semaines dans le milieu RPMI 1640 contenant 2,0 pg/ml de Bud R Environ 3 semaines plus tard, on observe une rapide augmentation du nombre de cellules et la formation d'une couche uniforme de cellules adhérentes On incube la culture pendant encore deux semaines dans le milieu RPMI 1640 conte- nant 10 mg/ml de Bud R Les cellules développées sont sélec- tionnées comme cellules résistantes à Bud Ro On vérifie ensuite la sensibilité de ces cellules à une sélection HAT comme dans l'exemple 1 En résultat, à partir des cellules de cancer pulmonaire humain, on peut obtenir clones de lignées de cellules déficitaires en TK comme parent pour la préparation d'un hybridome Ces clones sont identifiés sous les numéros SUN N-33-1 à SUN N-33,5 o Les lignées de cellules parentes créées dans les exem- ples 1 à 7 peuvent fusionner avec des cellules B telles que des cellules-de rate pour former des hybridomes qui produi- sent des immunoglobulines dans la culture, tel que démontré par l'exemple suivant. Exemele 8 Préparation d'un hybridome par fusionnement de ME 1 de l'exemple 1 avec des cellules de rate de souris immunisées avec des cellules de carcinome pulmonaire humain (A-549) et confirmation de la secrétion d'un anticorps monoclonal à partir de l'hybridome On fusionne une culture de 107 cellules de SUN N-21-2 (cellules parentes) avec 5 x 10 cellules de rate (cellules partenaires) d'une souris BALB/c femelle (agée de 4 semaines), inoculée avec des cellules de carcinome pulmonaire humain (A-549) une fois par semaine pendant 4 semaines, à une dose de 10 cellules chaque fois On utilise du polyéthylène glycol (PEG 1000 de Wako Pure Chemical Industries, Ltd) comme médiateur de fusionnement,à une concentration de 40 %. Le procédé de fusionnement est le suivant On mélange les cellules mères et les cellules partenaires et m centrifuge D dans un tube à centrifuger en rejetant le produit surnageant. Aux cellules rassemblées, on ajoute environ 0,5 ml de PEG 1000 dilué à 40 % avec le milieu RPMI 1640 On laisse le mélange reposer pendant 3 minutes et on centrifuge à 500 tours/minute pendant 3 minute On ajoute ensuite lentement environ 5 ml d'un milieu, puis on centrifuge et on rejette le produit surnageant On transfère lentement toutes les cellules dans une fiole T-75 (Falcon N O 3024) et on ajoute ensuite le milieu pour obtenir un volume total d'environ 40 ml Après une culture d'une nuit, on transfère la culture contenant toutes les cellules dans un tube X centrifuger et après la centrifugation on rejette le produit surnageant. On ajoute 40 ml de milieu HAT aux cellules rassemblées et on agite vigoureusement On répartit le-mélange parmi les 96 puits d'une microplaque, en une quantité d'environ 100 pl par puits On répète le même mode opératoire pour remplir les puits de 4 micro-plaques avec un mélange de cellules et de milieu HAT Après une semaine d'incubation, des colonies se forment dans environ 10 % des puits Ces colonies ont tendance à s'étaler plus nettement que la colonie des cel- lules parentes Au début de la première semaine d'incuba- tion, on ajoute dans chaque puits une goutte (environ de à 30,ul) de milieu HT (identique au miliau HAT, mais sans aminoptérine) Lorsqu'un développement raisonnable de l'hybridome est observé (environ de 10 à 14 jours plus tard), grâce à la méthode à la protéine A SREC, on vérifie l'appa- rition d'un anticorps monoclonal opposé au carcinome pulmo- naire humain (A-549) dans le produit surnageant dans la cul- ture On constate que 4 des 45 clones formés produisent un anticorps monoclonal opposé à A-549 Un de ces 4 clones est soumis à un sous-clonage comme dans l'exemple 1 Quatre sous-clones se développent et produisent tous un anticorps monoclonal opposé à A-549. Ces cellules d'hybridome peuvent être conservées par des procédés connus tels que suspension dans un milieu ( 10 % de FCS, 10 % de DMSO et 80 % d'un milieu usuel) 21 - et conservation dans l'azote liquide ou dans un congélateur à environ -80 C. Exoérience 1 Détermination par la méthode ds Ouchterlony de la classe et sous-classe des immunoglobulines produites parl'h bridome préparé dans l'exemple 8 Dans 4 boites de Petri (diamètre interne 52 mm)q on verse une solution d'agarose à 15 % ( 5 ml, avec 0,01 % de Na N 3) et on laisse reposer pendant environ 30 minutes jusqu'à 0 ce que l'agarose se solidifie On creuse des puits dans le gel d'agareose dans chaque bbote 9 tel que représenté sur la fi- gure 1 des dessins annexés Dans les puits périphériques, on ajoute 51 ul de chacun des anticorps énumérés dans le tableau 1 D alors queadahs les puits du centre dans les gels respectifs d'agarosea on verse chaque fois 15 jul du milieu de culture, concentré 10 fois, contenant 4 anticorps monoclonaux (LAC 1, 2, 3 et 4) produits par l'hybridome préparé dans l'exemple 8 On laisse les gels au repos pendant 24 heures et on détermine la chasse de chaque anticorps monoclonal par la formation de la ligne de précipitation. Tableau 1 Numéro Anticorps Origine i anti-Ig M humaine (Hoechst AG) Lapin 2 anti-Ig G humaine (Noechst AG) Lapin 3 anti-Ig G de souris (Capel Coo) Lapin 4 anti-Ig M de souris (Hoechst AG) Mouton anti-Ig(G+A+M) humaine (Hoaechst AG) Mouton 6 anti-Ig A humaine (Hoechst AG) Lapin Les 4 anticorps monoclonaux examinés s'avèrent être du type "Ig G" de souris, car toutes les lignes de précipi- tation formées sont situées entre le puits 3 et le puits central 7. On détermine la sous-classe d'Ig G par le même procédé. tel que représenté sur la figure 2, on creuse 5 puits dans le gel d'agarose dans chacune des 4 boites de pétri Les 4 puits périphériques sont remplis chacun avec 5 pil des anti- corps des sous-classes énumérées dans le Tableau 2 et les puits des centres dans les sels respectifs d'agarose sont remplis avec 15,l de chacun des anticorps monoclonaux (LAC 1-4) On laisse les bdoîtes de Petri au repos pendant 24 heures à la température ambiante. Tableau 2 umérol Anticorps Origine 1 anti-Ig Gl de souris (Miles Labs, c) Lapin 2 I anti-Ig G 2 a de souris (Miles Labso 9 Inc) Lapin 3 anti-Ig G 2 b de souris (Miles Labso, Inc) Lapin 4 anti-Ig G 3 de souris (Miles Labs v Inc) Lapin Les 4 anticorps monoclonaux examinés s'avèrent être de type Ig G 2 a, car leurs lignes de précipitation sont formées entre les puits 2 et 5. Les quantités d'anticorps monoclonaux produits par les hybridomes de l'exemple 8 sont d'environ 30 pg/ml, ce qui correspond presque aux quantités d'anticorps monoclonaux produits par les hybridomes préparés en utilisant comme parent des cellules de myélome de souriss La qualité des anticorps produits par l'hybridome de l'exemple 8 est en outre confirmée par une électrophorèse sur gel. Les résultats ci-dessus montrent que les lignées de cellules parentes humaines selon l'invention (par exemple SUN N-21-1 de série ME 1) fusionnées avec des cellules B produisent des immunoglobulines exprimant l'information génétique données par les cellules B o Les cellules myélomateuses humaines qu'on a essayé. d'utiliser comme parent pour la préparation d'hybridomes, présentent divers défautsisls qu'une difficulté de culture, une faible vitesse de développement et une instabilité. Cependant, tel que montré ci-dessous la lignée de cellules de l'invention est capable d'un développement constant qui est la nature inhérente des cellules cancéreuseso Expérience 2 Profils de développement de cellules cancéreuses et 23 - de la lignée de cellules ME 1 de l'invention On incube une culture ( 10 ml) de 2 x 105 cellules de mélanome humain (Colo 38) par ml dans un milieu RPMI 1640 contenant 10 % de FCS On incube également une culture ( 10 ml) de 2 x 105 cellules/ml de SUN N-21-1 de série ME 1 dérivées de Colo 38 dans un milieu RPMI 1640 contenant 10 % de FCS On incube une autre culture ( 10 ml) d'un nombre égal de cellules SUN N-21-1 dans un milieu RPMI 1640 avec % de FCS contenant de la 8- azaguanine à une concentration finale de 20, g/ml On prélève des échantillons et on compte le nombre de cellules viables dans chaque culture Les résul- tats sont représentés sur la figure 3, à partir de laquelle on peut voir que le profil de développement de SUN N-21-1 est semblable à celui du mélanome humain Colo 38 et ne subit que peu de changement même en présence de 8-azaguanine. Les 4 clones d'hybridome préparés dans l'exemple 6 ont également des profils de développement semblables à celui de SUN N-21-1, bien que ce ne soit pas montré sur la figure 3. 24 - REVENDICATIGNS 1 Lignée de cellules pour la préparation d'un hybri- dome, qui est produite soit par mutation naturelle, soit par mutation induite de cellules tumorales autres que celles provenant de cellules de moelle osseuse. 2 Lignée de cellules selon la revendication 2, carac- térisée en ce que les cellules tumorales sont des cellules tumorales humaines. 3 Lignée de cellules seion la revendication 2, carac- térisée en ce que les cellules tumorales humaines sont des cellules de mélanome humain. 4 Lignée de cellules selon la revendication 3, carac- t=risée en ce que les cellules de mélanome humain sont celles de Colo 38 ou de M 21. 5 Lignée de cellules selon la revendication 1, carac- térisée en ce que les cellules tumorales qui ont subi une mutation naturelle ou induite, sont celles qui sont défici- taires en hypoxanthine-guanine phosphorybosyl transférase ou en thymidine kinase. 6 Lignée de cellules selon la revendication 1, carac- torisée en ce que les cellules tumorales qui ont subi une mutation naturelle ou induite, proviennent du mélanome humain Colo 38, du mélanome humain M 21 ou de lthépatome humain HC C-4 déficitaires en hypoxanthine-guanine phospho- ribosyl transférase. 7 Lignée de cellules selon la revendication 1, carac- térisée en ce que les cellules tumorales qui ont subi une mutation naturelle ou induite, proviennent de l'hépatome humain HC C-4 ou du carcinome pulmonaire humain A-549, déficitaires en thymidine kinase. 8 Procédé pour la préparation d'une lignée de cel- lules humaines pour la production d'un hybridome, caracté. risé en ce qu'il consiste à cultiver des cellules tumorales humaines dans un milieu contenant de la 8-azahuanine ou de la bromodésoxy-uridine (Dud R), à séparer les cellules résis- tantes à la 8-azaguanine ou à Bud R par clonage et à sélection- ner parmi les clones résistants, ceux qui sont incapables de survivre dans un milieu HA To 9, Procédé pour la préparation d'une lignée de cellu- les humaines pour la production d'un hybridome, caractérisé en ce qu'il consiste à traiter des cellules tumorales hu- maines par irradiation UV ou par Un inducteur de mutation chimique, à cultiver les cellules dans un milieu contenant de la 8-azaguanine ou Bud R,-à séparer les cellules résis- tantes à la 8-azaguanine ou à Bud R par clonage et à sélec- tionner parmi les clones résistants ceux qui sont incapables de survivre dans un milieu HA To o Hybridome produit par fusionnement de cellules d'animaux comprenant les êtres humains, avec des cellules d'une lignée de cellules préparée par mutation naturelle ou induits de cellules tumorales autres que celles provenant de cellules de moelle osseuseo 11 o Hybridome selon la revendication 10,p caractérisé an ce que la lignée de cellules est déficitaire en hypoxan' thineaguanine phosphoribosyl transférase ou en thymidine kinases 12 Hybridome selon la revendication 10, caractérisé en ce que la lignée de cellules provient de cellules tumo- rales humaineso 13 Hybridome selon la revendication 10, caractérisé en ce que les cellules tumorales proviennent du mélanome hu- main Colo 38, du mélanome humain M 21 ou de l'hépatome humain HC C-4 et sont déficitaires en hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transféraseo 14, Hybridome selon la revendication 10, aractérisé en ce que ls S cellules tumorales proviennent de l'hépatome humain HC C-4 ou du carcinome pulmonaire humain A-549 et sont déficitaires en thymidine kinase. Hybridome selon la revendication 10, caractérisé en ce que les cellules d'animaux, -comprenant les êtres humains, sont des cellules B immunisées avec un antigène. 26 - 16 Hybridome selon la revendication 10, caractérisée en ce que les cellules d'animaux comprenant des 9 tres humains sont des cellules To 17 o Hybridome selon la revendication 109 capable de produire un anticorps humain et qui est préparé par fusion- nement, provoqué_ par un agent de fusionnement, entre des cellules B humaines immunisées avec un antigène et une lignée de cellules qui est préparée à partir de cellules humaines par un procédé qui consiste à cultiver des cellules tumorales humaines dans un milieu contenant de la 8-azaguanine ou Bud Rp à séparer par clonage les cellules résistantes à la 8-azagua- nine ou à Bud R et à sélectionner parmi les clones résistants ceux qui sont incapables de survivre dans un milieu HATO 18 i Hybridome selon la revendication 10 qui est capable de produire un anticorps humain et est préparé par fusionne- ment, provoqué par un agent de fusionnement, entre des cellu les B humaines immunisées avec un antigène et une lignée de cellules qui est préparée à partir de cellules humaines par un procédé qui consiste à traiter des cellules tumorales humaines par irradiation UV ou par un inducteur de médiation chimique, à cultiver les cellules dans un milieu contenant de la 8 eazaguanins ou Bud R, à séparer par clonage des cel- luleÈ résistantes à la 8-azaguanine ou à Bud R et à sélec- tionner parmi les clones résistants ceux qui sont incapables de survivre dans un milieu HA To 19 o Procédé pour la production d'une substance utile telle qu'un anticorps, le gamma-interféron ou une lympho- kine par culture d'un hybridome préparé par fusionnement entre des cellules d'animaux comprenant les âtres humains et une lignée de cellules produites par mutation naturelle ou induite de cellules tumorales autres que celles provenant de cellules de moelle osseuseo