FR 2540349 A1 19840810 FR 8302097 A 19830208 La présente invention concerne un procédé dtextrac- tîon des protéines foliaires d'une matière végétale et plus particulièrement d'une plante genre Nicotiana Selon un aspect de l'invention, elle a trait à un procédé d'ex- traction de la fraction I protéique hydrosoluble de la plante. Différents procédés ont été publiés Ils sont basés sur les observations très anciennes de H M ROUELLE qui, dès 1773, met en évidence, par'pressurage et chauffage des jus, la présence de "matières glutineuses et végéto- animales" dans les parties vertes des végétauz La frac- tion I protéique a été identifiée pour la première fois en 19417. Il est admis par l'homme de l'Art que les protéines foliaires peuvent 8 tre réparties en deux groupes princi- paux en fonction de leur solubilité dans l'eau les protéines membranaires, insolubles dans l Veau, liées en particulier aux pigments chlorophylliens, qui correspondent pour llessentîel aux protéines vertes décri- tes dans les différents procédés d'extraction connus. les protéines hydrosolubles Ces protéines appelées également protéines blanches après extraction, sont cons- tituées pour moitié environ par la Ribulose 1-5 diphospha- te carboxylase oxygénase (Bc, 4 1 1 39) ou fraction I protéique, d'origine chloroplastique et pour moitié par la fraction II protéique, mélange des autres enzymes d'origine essentiellement cytoplasmiques. Ces protéines jusqu'à présent, malgré leur abondance dans le règne végétal et leur valeur nutritive pour l'hom- me et l'animal, n'ont pas fait l'objet d'une exploitation intensive car les procédés connus ne sont pas utilisables industriellement q La protéine de la fraction I eot celle qui potentiel- lement est la plus intéressant car à l'état pur elle est inodore, insipide et incolore O La plante de tabac, genre Nicotiana, est le seul végétal actuellement connu qui permet d'obtenir une quantité importante de ladite pro- téine sous forme cristallisée ou pré-cristallisée, donc très pure De plus, elle est remarquablement équilibrée en acides aminés essentiels, ce qui permet d'envisager son utilisation dans certains régimes alimentaires pour malades souffrant de troubles du métabolisme (maladie rénale,). Les procédés connus pour isoler les protéines débu- tent par la réduction en pulpe des-feuilles ou bien des feuilles et des tiges de la plante par broyage Ce broyage est suivi d'un pressurage qui permet de séparer de la masse fibreuse le jus vert contenant la plus grande partie des protéines insolubles et des protéines solubles dans l'eau. La séparation des protéines insolubles de ce jus se fait jusqu'à présent après avoir provoqué leur coagulation par chauffage du jus à 500 C 2 "C pendant 10 à 30 mn suivi d'un refroidissement rapide à la température ambiante voi- sine de 20 C Après cette étape, deux techniques courantes peuvent 8 tre mises en oeuvre, La centrifugation ou la filtration sous vide Cette dernière technique, qui requiert l'emploi d'additifs de filtration-du type " 1 perlite" ou "dicalite"l pour atteindre son maximum d'efficacité, est parfaitement adaptée au traitement industriel. Le jus clarifié de couleur brune, qui contient en mélange les fractions protéiques I et Il est, de manière connue, traité suivant divers procédés abondamment décrits dans la littérature et plus particulièrement dans la demande de brevet français N O 81 09950 Il est évident pour l'homme de l'Art que ces procédés sont coûteux, par- fois longs, voire inefficaces, dans la mesure o, si aucun additif n'est apporté au jus, la précipitation de la fraction I sera inexistante dans les cas ou la plante utilisée sera en fin de période végétative, par exemple. L'acidification réalisée par addition d'acides miné- raux ou organiques demande un-ajustement d'une extrême précision pour éviter que la fraction I protéique ne pré- 3 cipite sous forme amorphe et cet ajustement est d'autant plus délicat qu'il varie en fonction d'un grand nombre de facteurs tels que l'état physiologique du végétal, la variété, la température du jus. L'invention vise un procédé d'extraction des protéi- nes des feuilles de plantes genre Nicotiana comprenant les étapes consistant:_ a) à réduire les feuilles en pulpe par exemple en présence de O à 2,5 fois le poids de matières vertes d'eau etde 0,5 à 2 parties d'un agent anti-oxydant pour 100 parties de matière végétale. b) à extraire immédiatement du mélange obtenu le jus vert contenant la majeure partie des protéines insolubles en suspension et des protéines solubles. c) à faire précipiter les protéines insolubles. d) à séparer le précipité du liquide. e) à faire précipiter la fraction I protéique du li- quide clarifié résultant de l'étape précédente. f) à extraire la fraction I protéique ainsi obtenue dans laquelle pour faire précipiter les protéines, on diffuse de l'anhydride carbonique à l'état gazeux dans le jus. Toutes les matières du genre Nicotiana, mais plus particulièrement Nicotiana tabacum L se prêtent à ce procédé d'extraction. La fraction I protéique (F Ip) est localisée essen- tiellement au niveau des feuilles, mais la présence des tiges peut favoriser l'extraction Les feuilles seules ou conjointement avec les tiges sont utilisées Elles peuvent être issues de plantes sénescentes ou de repousses tardi- ves ( 3 ème ou 4 ème coupe) Le procédé suivant l'invention 4 2540349 permet lrextraction de Filp encore importante avec ce type de plants, ce qui neest pas le cas des procédés connus jusqu'à présent. Lesdites parties de la plante sont broyées et rédui- tes en pulpe en presence d'une quantité d'eau comprise entre O et 2,5 fois le poids de matière végétale traitée. Afin d'éviter les réactions parasites (oxydations, formations de complexes qui réduiraient les rendements), on ajoute un antioxydant,9 de préférence le métabisulfite de sodiurm par pulvérisation au cours du broyage, ou par trempage juste avant broyage à raison de 095 à 2 parties d'anti-oxydant pour 100 parties de matière végétale. On presse immédiatement la masse broyée pour en ex- traire la portion liquide ou jus vert contenant la majeure partie des protéines du végétalo L'unr des buts de 19 inven-tion est d'obtenir un procédé perfectionné de séparation des protéines du jus de pres- surage. Un autre but de 11 invention est d'obtenir la précipi- tation des protéines insolubles du jus de pressurage de manière rapide et sans dépense énergétique importante. Un autre but de l'invention est d'obtenir la protéine de la fraction I par un procédé simple et rapide sans contaminationo Un autre but de l'invention est deextraire des pro- téines de plantes en fin de saison végétative ( 3 ème ou 4 ème coupe). La manière dont ces objectifs, ainsi que dtautres, sont atteints conformément à la présenite invention ressort de la description détaillée qui suit. A cet effet l'invention prévoit, pour séparer les protéines insolubles du jus vert, de diffuser du C 02 gazeux pendant un temps suffisant pour obtenir la coagula- tion des protéines insolubles sans faire précipiter les protéines de la fraction Ipo 5. Ce résultat est obtenu de manière variable suivant le produit traité mais de préférence le débit de C 02 sous pression atmosphérique doit être compris entre 10 à ml/mn et litre de jus traité et la durée du traite- ment est inférieure à une heure, de préférence comprise entre 5 et 15 minutes Ce traitement provoque la précipi- tation rapide des protéines insolubles sans qu'il soit nécessaire de chauffer le jus La séparation est alors effectuée de manière connue, par exemple par centrifuga= tion ou filtration sous vide Le jus clarifié obtenu par ce procédé ou d'autres procédés par ailleurs connus con- tient les fractions protéiques I et Il. L'invention prévoit encore d'assurer la précipitation de la fraction I en diffusant du 002 gazeux à travers la masse de jus à traiter au moins jusqu'à saturation du jus. Ce traitement conduit de préférence à température ambiante voisine de 200 C provoque en quelques minutes, une preci- pitation sélective de la F Ip sous forme cristallisée ou précristalliséeo Selon une modalité de l'invention, la réaction est conduite dans l'tbscuritéo Le précipité est récupéré par soutirage ou par centrifugation, le liquide contient encore la fraction I Ip qui peut 8 tre récupérée à son tour selon un procédé connu, par exemple soit par acidification, soit par traitement thermique. Le rendement d'extraction par le procédé selon l'in- vention est majoré de 10 à 30 % par rapport à ceux des procédés connus La fraction I protéique obtenue se pré- sente sous une structure pré-cristalline nettement diffé- renciée et le traitement par CO ne contamine pas le pro- duit Le jus traité s'ajuste de lui-même au p H optimum par saturation de la solution en C 020 D'autres avantages et dé-tails de linvention sont illustrés par les exemples suivants: 6 -2540349 EXEMPLE 1 Matériel végétal: Nicotiana tabacum variété PB (tabac noir) variété BB 16 (tabac type Burley) variété BB 16 sénescente ( 45 jours après 3 coupe) cultivé à 250 000 plants/ha, récolté en plantes entières (tiges + feuilles). Broyage: Un lot de 20 kg de tabac est broyé dans un appareil de type LAW (hélice bi-pales + trémie de 2 mm) Au cours de cette opération, une solution de métabisulfite de sodium à 10 g/l est pulvérisée sur le tabac o raison de 0,5 1 par kg de tabac. Pressurae: La "bouillie" obtenue est immédiatement transférée dans une presse à plateaux et soumise à une pression de kg/cm (une presse à bande ou à vis pourrait également être utilisée)0 Les caractéristiques du tabac avant broyage du fjus vert" et du "tourteau" sont rassemblées dans le tableau ci-après (Voir tableau page 10) Traitement du jus vert: La coagulation thermique des "protéines vertes" est réalisée à t = 500 O 2 C par passage du "jus vert" dans un serpentin immergé dans un bain- marie à 750 C Grace à ce procédé, la température s'élève rapidement (en 1 mn environ) à 50 C; elle est ensuite maintenue à ce niveau, pendant 10 mn, à l'aide d'un deuxième bain-marie stabi- lisé à 500 C. Le jus est alors refroidi rapidement ( 1 mn) jusqu'à C par passage dans un serpentin plonge dans une cuve à eau réfrigérée. La clarification du jus ainsi traité est réalisée par filtration sous vide à l'aida de fioles à vide de 5 1 équipées de filtres de type Bichnero Les filtres Bichner ( = 24 cm) sont garnis au préalable d'une feuille de papier filtre (PRAT et DU Ma S, réf 202 IFS) sur laquelle est déposée une couche d'environ 0,5 cm de perlite ou 3 dicalite (adjuvant de filtration) La clarification ainsi obtenue ne peut être parfaite que dans la mesure o de la perlite (ou dicalite) est mélangée, avant filtration au jus à clarifier ( 1 O g/l). Si un tel montage convient bien pour le traitement de quelques dizaines de litres de jus, il doit cependant 8 tre remplacé par un filtre rotatif à tambour 9 sous vide, dans le cas o des quantités plus importantes de jus sont à traitero La clarification du jus peut également être obtenue par centrifugation à haute vitesse ( > 10 000 g), difficile à rea Liser sur de grandes quantités. Traitement du jus clarifié Le jus clarifié est divisé en 3 fractions aliquotes de 5 1 chacune. La première fraction (A) est conservée telle quelle à 25 C, à l'obscurité O La seconde fraction (B) est traitée par le CO 02 gazeux pendant 15 mn (débit du CO 2:50 ml/mn)" à l'aide doun dif: fuseur placé dans le fond d O un récipient et relié à une bouteille de gaz C 02 ( 38 kg) par l'intermédiaire d'un détendeur. La troisième fraction (C) est acidifiée avec HC Ol ( 2 N) jusqu'à obtenir le p H atteint dans la fraction (B) après traitement par le CO 2 Après précipitation de la P Ip (quasi immédiate dans. le cas des fractions (B) et (C), les dépôts cristallins sont récupérés par soutirage et/ou centrifugation à 2000 g puis lyophilisés. Les résultats sont rassemblés dans le tableau ci-après. (Voir tableau page 11) o Cet exemple démontre la supériorité du traitement par le gaz C O 02 sur les traitements témoins (A) et (C) (très forte augmentation des rendements d 9 extraction, rapidité de la cristallisation) et sur les traitements par acidification (simplicité de mise en oeuvre, pureté de la fraction I protéique précipitée). EXEMPLE II A partir de plants de tabac juvéniles (variété BB 16), le protocole expérimental de l'exemple 1 a été conservé jusqu'au traitement du jus clarifié par le gaz C 02. La variante apportée dans cet exemple est la durée du traitement par le C 02: le jus clarifié a en effet été divisé en 5 parties égales et "gazéifié" pendant 15 mn, 1 h, 2 h, ou 4 h. Les rendements en P Ip correspondants sont reportés dans le tableau ci-après Une durée de traitement supérieure à 15 mn augmente relativement peu le rendement d'extraction, elle peut néanmoins se justifier pour certains tabacs qui se pr O- tent mal à l'extraction de la F Ip (tabacs sénescents, cer- taines variétés). EXEMPLE 3 Des plants de tabac de la variété BB 16, récoltés au stade juvénile ( 35 jours), sont traités selon le protocole de l'exemple 1 jusqu'à l'obtention du "jus vert". Les protéines vertes sont alors précipitées non pas Durée du traitement p H PF Ip cristallisée au C 02 (g/kg tabac frais) Témoin (non traité) 6,0 1, 66 mn 5,70 3,21 1 h 5,60 3,66 2 h 5,60 3,57 4 h 5,60 3,61 2540349- par la chaleur, comme dans l'exemple 1, mais par -"gazéi- fication" du "jus vert" par le CO 2 La floculation des protéines vertes est obtenue après 15 mn de traitement à température ambiante (débit de CO 2: 25 ml/mn/l jus). La récupération des protéines solubles (F Ip + FI Ip) est effectuée de la même manière que dans l'exemple 1 (filtration sous vide ou centrifugation). La cristallisation de la F Ip peut alors être réalisée soit en laissant décanter le jus clarifié tel quel, soit en traitant à nouveau le jus par le CO selon une des modalités des exemples 1 et 2. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau ci-après (Voir tableau page 12). Cet exemple souligne ltintérêt d'un traitement au C 02 sur "jus vert" En effet, la phase de chauffage à 5000 est dans ce cas "court-circuitée" ce qui entraîne une simplification supplémentaire de la technique d'ex- traction et surtout une économie d'énergie non négligeable. Ce procédé comporte toutefois le risque de précipiter une partie des protéines solubles avec les protéines "vertes" si la durée du traitement par CO 2 est mal contr 8 lée. Ces exemples illustrent de manière non limitative l'objet de l'invention et on peut y apporter des modifi- cations sans sortir de son cadre. Volume Poids p H Azote total F Ip-FII p (i)(kg) ( 5 n s tabac(%ns tabac avant broya avant broya- ___ e e) Variété PB -20 -3,9 8,7 TABAC " BB 16 -20 -4,9 10,2 VNANT " BB 16 20 -4,4 6,7 3 RO Yt AGE' sénescente Variété PB 21,0 21,5 599 2,4 6,3 "JUS VERT" " BB 16 21,5 22,0 6,0 3,0 8,0 "' BB 16 20,5 21,5 6,1 2,97 5,3 sénescente -Variété PB -8,5 152,4 LR 12 A le-BB 16 80 1,9 2,2 BB 16 -8, 5 -1,7 1,4 sénescente p o ru 41, %O Durée de la cristall - sation 48 h qq mu qq mu 24 h qq mn qq mn qq mn qq mu F Ip cristal- lisée (g/icg tabac vert) p H JUS CLARIFIE avant ' après i traite, traite- ment 1 ment Teneur en % de la F Ip précipitée (% n s) f î i i i ,1 ,2 14, 8 ,8 ,7 i 4, 2 i 4, 3 Fraction A il B et c Fraction A fi B il C Fraction A Il B le C ,8 ,8 ,8 6,2 6,2 6,2 59 5 ,8 ,4 ,4 6, 2 19 5 3,2 2,9 2,0 4, i 1,8 Variété PB Variété BB 16 Variété BB 16 sénescente Fi w N LM -LI. CD u O Fi- ru N VI o 4- Traitement du "jus vert" Traitement du p H après F Ip cristallisée "jus clarifié" traitement (g/kg tabac frais) _,,_ ,, , chauffage à 500 C ( 10 mn) témoin 6,1 1,90 CO 2 ( 15 mn) 5,6 3,95 diffusion C 02 ( 15 mn) témoin 5,9 1,50 C 02 ( 15 mn) 5,5 2,75 REVENDICATIONS 1 Procédé dtextraction des protéines des feuilles de plantes, plus particulièrement du genre Nicotiana selon lequel: a) on réduit les feuilles en pulpe par exemple en présence de O à 2,5 fois le poids de matières vertes d'eau et de 0,5 à 2 parties d'un agent anti-oxydant pour 100 par- ties de matière végétale, b) on extrait immédiatement du mélange obtenu le liquide, ou jus vert, contenant la majeure partie des pro- téines insolubles en suspension et des protéines solubles c) on fait précipiter les protéines insolubles, d) on sépare le précipité du liquide pour clarifier ce liquide contenant une fraction I et une fraction II protéiques, e) on fait précipiter la fraction I protéique du li- quide clarifié résultant de l'étape précédenteet f) on extrait la fraction I protéique ainsi obtenue, procédé caractérisé par le fait que, pour faire précipiter la fraction I protéique, on diffuse de l'anhydride carbo- nique (C 02) à l'état gazeux dans le liquide clarifié au moins jusqu'à saturation du liquide en C 02. 2 Procédé selon la revendication 1, dans lequel la précipitation des protéines insolubles est obtenue par chauffage du liquide à 50 C 2 C pendant 10 à 30 mn et refroidissement à 20 C - 3 Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la plante est du genre Nicotiana tabacum L. 4 Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel A l'étape c), on précipite les protéines inso- lubles par diffusion d'anhydride carbonique (C 02) à l'état gazeux dans le liquide pendant un temps suffisant sans entraîner la précipitation de la fraction I protéiqueo Procédé selon lu des revendications 1 à 4, dans lequel la température du lúqr-id clarifié est voisine de 200 C O 14 2540349 6 Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel l'étape d) est réalisée dans l'obscurité. 7 Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel les feuilles et les tiges des plantes sont réduites en pulpe. 8 Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel l'agent anti-oxydant est du métabisulfite de sodium.