FR 2540886 A1 19840817 FR 8401990 A 19840209 La présente invention concerne un procédé pour synthétiser par voie enzymatique la S-adénosyl-L- homocystéine d'une manière efficace àpartird'adénosine et d'homocystéine avec des cellules traitées ou non trai- tées d'un micro-organisme comme source d'enzyme, et pour recueillir le produit ainsi synthétisé. La S-adénosyl-L-homocystéine (en abrégé SAH dans ce qui suit) est une importante substance douée d'activi- té biologique, qui se forme in vivo par une réaction donnant un groupe méthyle à laquelle participe la S-adénosyl-méthio- nine (en abrégé SAM) Ces dernières années, la SAH s'est avérée être un sédatif et un somnifère efficace, et on cher- che donc à la produire en grandes quantités. Des méthodes connues pour obtenir la SAH com- prennent par exemple l'extraction à partir de levures du genre Saccharomyces or Candida Lvoir par exemple Arh Biochem. Biophys, 69, 575 ( 1 62)/, la déméthylation enzymatique de la SAM Lvoir par exemple Jo Biol Chem, 240, 2512 ( 1965)7, ainsi que la démêthylation chimique de la SAM (voir par exemple le brevet US No 3 642 772), mais ces méthodes sont très coû- teuses et elles ne sont pas applicables dans l'industrie. On connaît aussi une méthode pour synthétiser l'adénosine et l'homocystêine par voie enzymatique en présence d'un extrait sans cellules d'une levure du genre Saccharomyces ou Candida /voir par exemple Arch Biochem Biophys, 69, 575 ( 1962), mais les types de microorganismes pouvant servir dans cette méthode sont limités, et l'on a voulu trouver par sélec- tion (screening) d'autres microorganismes intéressants. Etant donné l'état ci-dessus de la technique, la présente Demanderesse a étudié d'une manière approfondie la synsthèse enzymatique de la SAH, étude qui a conduit a la découverte qu'avec certains microorganismes spécifiés, on peut synthétiser la SAH avec un bon rendement, que ceux-ci soient sous la forme d'un extrait sans cellules, de cellules broyéesde cellules quiescentes ou de cellules séchées. La présente invention apporte ainsi un procédé de production de SAH, qui comprend la réaction de l'adéno- sine avec lhomocystéine par mise en contact de ces deux substances dans un milieu aqueux en présence de cellules traitées ou non d'un microorganisme pouvant synthétiser la SAH à partir d 'adénosine et d thomocystéine, micro- organisme qui est soit une bactérie appartenant au genre Enterobacter,Agrobacterium,Micrococcus, Corynebacterium,Arthro- bacter, Brevibacterium, Chromobacterium, Xanthomonas, O 10 Rhodopseudomonas, Pseudomonase Alcaligenes, Acinetobacter, Flavobacterium, Cellulomonas Protaminobacter ou Azotobacter; soit une levure appartenant au genre, Saccharomycopsis, Schizosaccharomyces, Pichia, Hansenula, Schwanniomyces, Debaryomyces, Saccharomycodes, Hanseniaspora, Lipomyces, Sporobolomyces, Kluyveromyces, Cryptococcus, Torulopsis, Kloeckera, Wickerhamia, Torula, Rhodotorula, Trichosporon, Oosporidium ou Lodderomyces; soit-une moisissure apparte- nant au genre Mucor, Rhizopus, Absidia, Aspergillus, Penicillium, Monascus, Neurospora, Aureobasidium, Fusarium, Gibberella, Arthroderma, Sporothrix, Verticillium, Glio- cladium, Trichophyton, Phytophthota, Eurotium ou Cylindro- carpon; soit un actinomycête appartenant au genre Strepto- myces, Mycobacterium, Nocardiaa Streptoverticillium, Micromonospora, Micropolyspora, Streptosporangium ou Microellobosporia; soit encore un basidiomycète appartenant au genre Gloephyllum, Shizolphyllum, Trametes, Laetiporus, lentinus, L Yophyllum, Pycnoporus ou Lepista, puis on recueille la SAH ainsi synthétisée. Le microorganisme qui est employé comme source d'enzyme dans cette invention peut être tout microorganisme appartenant aux genres ci-dessus, sous la forme de cellules traitées ou non traitées, pouvant synthétiser la SAR à par- tir d'adénosine et dthomocystéine Des exemples particuliers de ces microorganismes comprennent: des bactéries telles que: Enterobacter cloacae IFO 13535, Agrobacterium tumefaciens IFO 13265, Micrococcus luteus IFO 3333, Corynebacterium fascians IFO 12077, Arthrobacter goioms IFO 12137, Brevibacterium protophormiae IFO 12128, Chroamobacterium iodi num IFO 3558, Xanthornonas ca Mpestris IFO 13303, Rhodopseudomonas srpheroides IFO 12203, Pseudomanas putida IFO 12996, Pseudomonas dacunhae IPO 12048, Pseudomonas aeruginosa IFO 3445, Alcaligenes faecalis IFO 12669, Alcaligenes faecaîlis IFO 13111, A 1 caligenes eutrophus IAM 12305, Acinetobacter calcoaceticus IFO 12552, Plavobacterium gasogenes IPO 12065, Cellulomonas tili IPO 3753, Azotobacter vinel-andii IF O 12018, et Protamninobacter ruber IFO 3708; des levures telles que la Saccharo Mycopsîs f ibuligera IPO 0103, Shizosaccharo My Ses pombe IFO 0346, Pichia farinosa IFO 0459, Hansenula silvicola -IFO 0807, Schwanniomnyces occiclentalis IF O 0371, Debaryomyces castellii F O O 1359, Saccharomycodes ludwigii IFO 0798, Hanseniaspora v Lalbensis IFO 0115, Lipomyces lipofer IFO 0673, Sp 2 orobolomyces holsaticus IFO 1034, Kluyvero Myces thermotolerans IPO 0662 e Cryptococc-us neoformans IFO 0410, Touopi candida IFO 0380, Kloeckera apiculata MFO 0151, Wickerhamia fluorescens 1 F O 1116, Torula dematia IFO 6216, Rhodotorula glutinis IPO 0389, Trichosporon cutaneum IFO 1198, Oosporidium margaritiferum IFO 1208, et Lodderomyces elongisporus IFO 1676; des moisissures telles que Mucor subtilissimus IFO 6338, Rhizopus oryzae IFO 5440, Absidia corymbifera IFO 4009, Aspergillus terreue IFO 6346, Penicillium xpnsum IFO 5854, Monascus anka IAM 8001, M 4 onascus ruber IFO 9203, Monascus serorubescens IFO 4487, Neurospora crassa IFO 6067, Aureobasidium pullulans IFO 6405, Fusarium culmorum IFO 5902, Gibberella fujikuroi IFO 6605, Arthroderma uncinatum IFO 7865, Sporothrix schenckii IFO 5983, Verticillium albo-atrum IFO 5922,- Gliocladium deliquescens IFO 6617, Trichophyton mentagrophytes IPO 5809, Phytophthora infestans IFO 9173, et Cylindrocarpon destructans IFO 5998; des actinoinycêtes tels que Strptoyce hygroscopicus IFO 3192, Streptomyces griseolus IEFO 3403, Mlycobacterîum phlie IFO 3158, Nocardia asteroides IFO 3424, Streptoverticillium kentuchense IFO 12880, Micromonospora coerules IFO 13504, Micropolyspora angiospora IFO 13155, Streptosporangium roseum IFO 3776, et Mîcroellobosporia violacea IFO 12517; et des bâsidicmycètes que Gloeophyllum trabeum IFO 6430, Shizolphyllum commune IFO 6504, Trametes gibbosa IFO 4946, Laetiporus sulphureus IFO 6497, Lentinue edodes IFO 8340, Lyophyllum decastes IFO 30161, Pycnoporus coccineus IFO 9768, et Lepista nuda IFO 30139. Tous mutants naturels ou artificiels peuvent être utili- sés dans l'exécution de cette invention s'ils ont la capa- cité de synthétiser la SAH. Dans le présent procédé de synthèse de la SAH,on met à profit l'action d'une enzyme endocellulaire sous la forme des cellules de microorganismes ou d'un produit de traitement de ces cellules On peut préparer l'enzyme par culture du microorganisme d'une manière habituelle, culture qui peut se faire dans un milieu ordinaire contenant une source de carbone, une source d'azote, des sels minéraux et des traces de sources de matières nutritives organiques, le milieu poivant être choisi convenablement suivant la nature du microorganisme La culture se fait généralement dans un milieu liquide, mais-on peut aussi l'effectuer sur une sur- face solide, et les conditions de la culture peuvent être choisies d'une manière appropriée d'après le type du micro- organisme La culture-peut se faire ordinairement à une température de 15 à 800 C à un p H de 3 à 12, de préférence entre 20 et 450 C à un p H de 4 à 9, pendant une durée de 10 à 120 heures, et la multiplication du microorganisme peut être activée par une aération et une agitation au cours de la culture. Dans la réaction de synthèse de la SAH selon cette invention, le microorganisme cultivé comme il est dit ci-dessus est employé sous forme de cellules trai- tées ou non traitées, et par exemple la réaction se fait même si les cellules du bouillon de culture du micro- organisme sont utilisées directement Si les composants du bouillon de culture entraînent des risques ou si l'on veut employer de grandes quantités de cellules,il est pré- férable d'utiliser des cellules séparées du bouillon de culture, des cellules quiescentespouvant tout-à-fait bien servir-à cette fin Mais pour des raisons de commodité de conservation ou de manipulation, on peut employer des cellules séchées à l'air, des cellules lyophiliséesou des cellules traitées à l'acétone On peut également employer des cellules traitées, par exemple broyées, ou un extrait sans 2540886 - cellules On peut encore utiliser les cellules ou les cellules traitées après les avoir fixées (immobilisées) d'une manière habituelle. Dans le présent procédé, l'adénosine et l'homocystéine, qui constituent les substrats de la réaction enzymatique, sont mises en contact mutuel dans un milieu aqueux en présence des cellules ou des cellules traitées du microorganisme L'homocystéine peut être un isomère L ou un isomère DL Les concentrations des substrats sont ordinairement d'au moins 1 m M, de préférence 10 à 500 m M, pour l'adénosine, et d'au moins 1 m M également, de pré- férence de 10 à 500 m M, pour l'homocystéine Le terme "homocystéine" comprend ici également des substances qui donnent l'homocystéine dans le système réactionnel, par exemple l'homocystine et la thiolactone de l'homocystéine. Le p H du milieu réactionnel dans la synthèse de la SAH est de 4 à 12, de préférence de 6 à 10, et on peut l'ajuster par les méthodes ordinaires, par exemple avec un tampon au phosphate de potassium, du tampon Tris, un tampon au chlorure d'ammonium ou au glycocolle etc On choisit la température de réaction de manière que celle-ci se fasse bien et que l'activité de l'enzyme ne soit pas altérée, non plus que les substrats et le produit formé Cette température est en-général de 15 à 60 C, de préférence de 20 à 500 C On peut choisir un temps de réaction qui élève le taux de conversion des substrats en SAH, et dans des opérations discontinues, la durée de réaction est en général de 0,1 à 48 heures, de préférence de 0,5 à 36 heures A certaines fins, on peut ajouter au milieu réactionnel aqueux des solvants organiques tels que l'acétone et l'éthanol, ou divers agents surfactifs. On peut récupérer la SAHI synthétisée du mélange réactionnel d'une manière courante Une méthode pour cela consiste à mettre le mélange en contact avec une résine d'échange de cations fortement acide pour faire adsor- ber la SAH, puis à éluer la résine avec de l'acide sulfu- rique et à ajouter de l'acide phosphotungstique à l'éluat pour précipiter la SAH Une autre méthode consiste à mettre le mélange réactionnel en contact avec du charbon actif pour y faire adsorber la SAH, puis à éluer le charbon avec un mélange 50: 50:1 de-phénol, d'eau et d'une solution aqueuse concentrée d'ammoniac, à concentrer ensuite il'éluat sous pression réduite, à ajuster le p H du concentré à 7 avec de l'acide acétique et enfin à laisser cristalliser la SAH à O C. Les exemples qui suivent servent à illustrer plus particulièrement la présente invention, mais dont ils ne limitent aucunement la portée. Dans ces exemples, on dose quantitative- ment la SAH par la méthode suivante. Dès que la réaction est terminée, on re- froidit le mélange entre O et 5 C et on lui ajoute de l'aci- de perchlorique pour arrêter la réaction On sépare les matières insolubles par centrifugation et on ajoute au liquide surnageant un tampon au phosphate de potassium (p H 7,0), puis on élimine par centrifugation le perchlorate de potassium formé On prélève une quantité déterminée du liquide sur- nageant, dans lequel on dose la quantité de SAH par chromato- graphie en phase liquide à haute efficacité (modèle 638-30 de Hitachi Limited; colonne de Cosmocil 5 C 18; détecteur d'UV 260 nm). EXEMPLE I: On inocule un oeillet de platine de cha- cune des souches bactériennes du tableau I ci-après, qui ont été cultivées à 28 C pendant 24 heures dans un milieu de culture de gélose incliné à p H 7 composé de 1 g/dl de glu- cose, 1,5 g/dl de peptone, 0,3 g/dl d'extrait de levure, 0,3 g/dl de K 2 HPO 4, 0,2 g dl de Na CI, 0,02 g/dl de Mg SO 4 7 H 20 et 2 g/dl de gélose, dans 10 ml d'un milieu liquide stérili- sé à chaud formé de 1 g/dl de glucose, 1,5 g/dl de peptone, 0,3 g/dl d'extrait de levure, 0,3 g/dl de K 2 HPO 4, 0,2 g/dl de Na Cl et 0,02 g/dl de Mg SO 4 7 H 20, ajusté à p H 7, et tout en secouant on cultive pendant 40 heures à 28 C On recueille ensuite les cellules par Centrifugation, on les lave avec un tampon au phosphate de potassium O,1 M à p H 8 et on les met en suspension dans 1 ml d'une solution de substrat constitué par 10 m M d#adénosine, 10 m N de DL-homocystéine et 100 m M d'un tampon au phosphate de potassium à p H 8, puis on secoue la suspension à 300 C pendant i heure pour faire la réaction. Les résultats obtenus sont donnés au tableau I. T A BL EAU I Souche bactérienne Rendement en SAH (micro- moles/ml) pseudomonags Dutida IFO 12996 2 P 07 En.tero bacter cloacae IFO 13535 OP 80 Agrobateri Utumefaiens IFO 13265 0 03 n 14 icr Ococcu S lUteus IFO 3333 0 ? 05 Corynebacterium fascians IFO 12077 O 17 Arthro) bacter alobiormi IFO 12137 0,31 Breviba cterium proohrlla IFO 12128 0,04 Chrom Obacterl Um iodinum IFO 3558 0; 03 Xanthom Uonar camsetrais IFO 13303 13 Rhodo P Se U onl Ofas 2 pheroides IFO 12203 OY 87 h Icaligefls faecai i Fo 12669 0,; 93 Alcaliqenes eutrophu S IAMI 12305 O i 59 Al Caligef ecal i IFO 13111 0189 Pseudomfla acunhae IFO 12048 0 66 Pseudomoflas Aeug lsa i FO 3445 1 97 Acinetob acte r -Cal-c-a-C eticus IF 252 05 Fiavobacteriuffi A gaoele-s IFO 12065 0731 Cellîulom Wofas faigena IFO 3753 0,07 Azotobacter vinelandii IFO 12018 0, 14 Protamiobacterruber IFO 37081 0)20 EXEMPLE 2: On inocule un oeillet de platine de chacune des souches de levures du tableau II ci-après qui ont été cultivées à 28 C pendant 48 heures dans un milieu de culture de gélose incliné à p H 6, composé de g/dl de glucose, 0,5 g/dl de petone, 0,1 g/dl d'extrait de levure, 0,2 g/dl de KH 2 PO 4, 0,1 g/dl de K 2 HPO 4, 0,02 g/dl de Mg SO 4 7 H 20 et de 2 g/dl de gélose, dans 10 ml d'un milieu de culture liquide stérilisé à chaud formé de 5 g/dl de glucose, 0,5 g/dl de peptone, 0,lg/dl d'extrait de levure, 0,g 2 g/dl de KH 2 PO 4, 0,1 g/dl de K 2 HPO 4 et 0,02 g/dl de Mg So 4 7 H 20, ajusté à p H 6,5, et tout en secouant on cul- tive pendant 40 heures à 28 Co On recueille ensuite les cellules par centrifugation, on les lave avec un tampon au phosphate de potassium O 01 M à p H 8 et on les met en suspension dans 1 ml d'une solution de substrat comprenant m M d'adénosineg 10 m M de DL-homocystéine et 100 m M d'un tampon au phosphate de potassium à p H 8, puis on secoue la suspension pendant 2 heures à 30 C pour faire la réaction. Les résultats obtenus sont donnés au tableau II. (Voir tableau II page suivante) i 11 T A B LEA U II Souche de levure Saccharomycopsis fibuligera IFO 0103 Schizosaccharomnyces pombe I 10 0346 Sporobolomyces hoissaticus IFO 1034 Pichia farinosa IFO 0459 Hansenula silvicola IPO 0807 Schwanniomyces occidentalis IFO 0371 Debaryomyces casteillii IFO 1359 Saccharo Mycodes ludwiciii IF O 0798 Hanseniaspora valbyensis IFO 0115 Lipomyces lipofer I 10 0673 Kluyveromyces thermotolerans IFO 0662 Cryptococcus neoformans IFO 0410 Torulopsis candida IFO 0380 Kloeckera apiculata IF O 0151 Wickerhamia fluorescens IFO 1116 Torula dematia IFO 6216 Rhodotorula glutinis IFO 0389 Trichosporon cutaneum IFO 1198 O O osporidium margaritiferum IFO 1208 Lodderomyces elongisporus I 10 1676 Quantité de SAIH obtenue (micromnoles/ml) 0,17 0; 60 0,60 0 f 08 or 14 0,03 0,01 0,08 0 > 14 OY O > 04 0 > 29 0 M 3 0 y 19 0,04 0,? 11 0 > 19 0)03 0.720 EXEMPLE 3: On procède à la même réaction que dans l'exemple 2 avec des cellules de chacune des souches de moisissures du tableau III qui ont été cultivées de la même manière que dans l'exemple 2, recueillies par filtra- tion et lavées avec du sérum physiologique, sauf que l'on modifie la durée de la réaction, les temps de réaction étant indiqués au tableau III, ainsi que les quantités de SAH obtenues. T A B L E A U III Souche de moisissure Temps de;Quantité de réaction SAH obtenue (heures) (micromoles/ml) Mlucor subtilissimus IFO 6338 4 r 5 O; 06 Rhizopus oryzae IFO 5440 415 0; 54 Absidia corymbifera IFO 4009 4,5 0141 Asperqillus terreus IFO 6346 2 0; 03 Penicillilum expansum IFO 5854 4 O f 44 Monascus ruber IFO 9203 4 t 5 0,88 Monascus serorubescens IFO 4487 4 r 5 0170 Neurospora crassa IFO 6067 4 1,36 Aureobasidium pullulans IFO 6405 4 0 > 25 Fusarium culmorum IFO 5902 4,5 1754 Gibberella fu'ikuroi IFO 6605 2 1, 61 Arthroderma uncinatum IFO 7865 4 0,13 Sporothrix schenckii IFO 5983 4 0,32 Verticillium albo-atrum IFO 5922 4 0,19 Gliocladium deliquescens IFO 6617 4,5 1,24 Trichophyton mentagrophytes IFO 5809 2 0,03 Phytophthora infestans IFO 9173 2 0; 04 Cylindrocarpon destructans IFO 5998 2 0,08 EXEMPLE 4: On inocule un oeillet de platine de cellules de chacun des actinomycètes du tableau IV ci-après qui ont été cultivées 48 heures à 28 C dans un milieu de culture de gélose incliné à p H 7,2, constitué de 0,2 g/dl d'extrait de levure, 1 g/dl d'amidon soluble et 2 g/dl de gélose, dans 10 ml d'un milieu de culture stérilisé à chaud compre- nant 1 g/dl de peptone, 0,5 g /dl d Pextrait de viande, 0,1 g/dl d'extrait de levure et 0,5 g/dl de Na Cl, ajusté à p H 7,1, et tout en secouant on cultive pendant 40 heures à 28 Co On traite ensuite le bouillon de culture comme dans l'exemple 1 pour obtenir les cellules avec lesquelles on pro- cède à la même réaction que dans l'exemple 1, sauf que le temps de réaction est de 2 heures, Les résultats obtenus sont donnés au tableau IV o T A B L E A U IV Souche d Uactinomycète Quantité de SAH obtenue (micromoles/ml) 4 _ycobacteriumhlei IFO 3158 O ? 05 Nocardia asteroides IFO 3424 O 06 ^^^Streptomycges eolus IFO 3403 2,27 Streptoverticillium kentuchense 2 32 IFO 12880 Micromonosora coerulea IFO 13504 3 24 3 Micropolyspora angiospora IFO 13155 4,00 Streptosporandium roseum IFO 3776 0,87 Microellobos Poria violacea IFO 12517 3 X 58 Stre Ptom Yces hyqrosco Picus IFO 3 192 3)40 EXEMPLE 5: On inocule un oeillet de platine de cellules de chacun des basidiomycètes du tableau V, qui ont été culti- vées à 28 C pendant 96 heures dans un milieu de culture de gélose incliné à p H 5, formé de 2 g/dl de glucose, 0,3 g/dl d'extrait de levure, 0,3 g/dl de peptone, O e 1 g/dl de KH 2 POV. 0,05 g/dl de Mg S Oo 7 H 20 et 2 g/dl de gélose, dans 10 ml d'un milieu de culture liquide stérilisé à chaud comprenant 2 g/dl de glucose, 0,3 g/dl d'extrait de levure, 0,g 3 g/dl de peptone, 0,1 g/dl de KH 2 P 04 et 0,05 g/dl de Mg SO 4 o 7 H 20, ajusté à p H 5, et tout en secouant on cultive pendant 90 heures à 280 Co On recueille ensuite les cellules par filtration, on les lave avec du sérum physiologique et avec cescellules on procède à la même réaction que dans l'exemple 1, sauf que le temps de réaction est de 4 heures et demieo Les quantités de SAH ainsi obtenues sont données au tableau Vo T A B L E A U V Souche de basidiomycète Quantité de SAH obtenue (micromoles/ml) Gloeophyvllum trabeum IFO 6430 0,04 Shizophyllum commune IFO 6504 O 62 Trametes qibbosa IFO 4946 O; 33 Laetiporus sulphureus IFO 6497 0,05 Lentinus edodes IFO 8340 0,03 Lyophyllum decastes IFO 30161 0,11 Pycnoporus coccineus IFO 9768 0,06 Lepista nuda IFO 30139 EXEMPLE 6: On inocule un oeillet de platine d'Alcaligenes faecalis IFO 12669, cultivé dans un milieu de culture de gélose incliné dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, dant 5 ml d'un milieu liquide ayant la même composition que celui de l'exemple 1, et tout en se- couant on procède à une culture préalable pendant 24 heures à 28 C On inocule ensuite 5 ml de cette préculture dans 500 ml d'un milieu de culture stérilisé à chaud ayant la même composition que le milieu de préculture, placé dans un ballon de Sagakuchi de 2 litres, et tout en secouant on cultive pendant 40 heures à 28 C Après cette culture princi- pale on lave le bouillon une fois avec du sérum physiologi- que et on centrifuge pour recueillir les cellules formées, que l'on commence par sécher à la température ordinaire pendant environ 15 heures tout en faisant passer un courant d'air, et dont on complète ensuite le séchage sous pression réduite dans un dessiccateur contenant du pentoxyde de phos- phore, à 5 C pendant 1 jour On broie le produit séché dans un mortier et on le sèche de nouveau au dessiccateur sous pression réduite pour obtenir des cellules sèches, dont on ajoute 50 mg à 1 ml d'une solution de substrat comprenant 2 m M d'adénosine, 4 m M de DL-homocystéine et 50 m M d'un tam- pon au phsophate de potassium à p H 8,5, et on secoue le mélange pendant 1 heure à 35 C pour faire la réaction On obtient ainsi 1,97 micromole/ml de SAH. EXEMPLE 7: On ajoute 50 mg de cellules sèches de chacune des souches du tableau VI qui ont été préparées de la même manière que dans l'exemple 6, à 1 ml d'une solution de substrat formée de 10 m M d'adénosine, 10 m M de DL-homocysté- ine et 100 m M d'un tampon au phosphate de potassium à p H 8, et on secoue le mélange pendant 2 heures à 37 C pour faire la réaction Les quantités de SAH obtenues sont données au tableau VI. T A B L E A U 6 Souche Quantité de SAH obtenue (micromoles/ml) Pseudomonas putida IFO 12996 4 t 62 Acinetobacter calcoaceticus IFO 3 X 84 Alcaliqenes faecalis IFO 13111 4; 36 Alcaliqenes faecalis IFO 12669 4)02 EXEMPLE 8: On inocule un oeillet de platine de Schizosaccharomyces pombe IFA 0358, cultivé sur un milieu de culture de gélose incliné dans les mêmes conditions qu'à l'exemple 2, dans 5 ml d'un milieu de culture liquide ayant la même composition que celui de l'exemple 2, et tout en secouant on procède à une préculture pendant 40 heures à 28 C On inocule ensuite 5 ml de cette préculture dans 500 ml d'un milieu de culture stérilisé à chaud ayant la même com- position que le milieu de préculture, et on cultive pendant heures à 28 C Avec ce bouillon de culture on prépare des cellules sèches comme dans l'exemple 6, avec lesquelles on procède de la même réaction que dans l'exemple 6, ce qui donne 1,83 micromole/ml de SAH. EXEMPLE 9: On synthétise la SAH de la même manière que dans l'exemple 6, mais avec chacune des souches de moisis- sures du tableau VII et les cellules étant recueillies par filtration Les résultats obtenus sont donnés au tableau VII. T A B L E A U VII Souche de moisissure Quantité de SAH obtenue (micromoles/ml) Monascus anka IAN 8001 Hucor subtilissimus IFO 6338 Trichophyton mentagro P tes IFO 5809 Fusarium culmorum IFO 5902 1 a 79 0 p 51 17 06 spoothri 2 g shenckii IFO 5983 E"EMPLE 10 g On ajoute 50 ml de cellules sèches de Pseudomonas putida IFA 12996 qui ont été préparées par la -'i même méthode que dans l'exemple 6 D à 1 ml d'une solution de substrat contenant 100 m M d Uun tampon au phosphate de po- tassium à p H 8 et les deux'substrats A et B du tableau VIII ci-après D et on fait réagir à 37 C pendant les temps qui sont indiqués au tableau VIII, tableau qui donne également les quantités de SAH obtenueso T A B L E A U VIII Substrat A (m M) Substrat B (m M) Temps de Quantit de réaction (heures) SAH obtenues (micromoles/ ml) Adenosine ( 5) Adenosine ( 5) L=homocysteine ( 5 DL-homocysteine ( 5) Adenosine ( 10) L-homocystine ( 10) Adenosine ( 10) DL-homocystine ( 10) 1 ? 5 Adenosine ( 200) DL- homocysteine ( 200) 20 2 f 82 2 y 58 6 ? 05 '96 87 4 Ce tableau montre que l'on peut obtenir de bons résultats même en remplaçant la L-homocystéine par la DL-homocystéine ou par la L ou DLhomocystineo EXEMPLE 11 On inocule 5 ml d'un bouillon de culture de Pseudomonas putida IFO 12996, cultivé dans les mêmes condi- tions que dans liexemple 1 sauf que le temps de culture dans le milieu liquide est de 20 heures et que la quantité du milieu de culture est de 5 ml, dans 500 ml d'un milieu de culture stérilisé à chaud ayant la même composition que celui de l Uexemple 1, placé dans un ballon de Sakcaguchi de 2 litres, et tout en secouant on cultive pendant O 40 heu- res à 28 Co Apres cette culture on centrifuge le bouillon pour obtenir les cellules quuon lave avec un tampon au phosphate de potassium O,1 M à p H 8 et que l'on met en suspen- sion dans 10 ml d'un tampon au phosphate de potassium 01,M à p H 8 contenant 10 m 4 de dithiothréitol D et on traite la suspension aux ultrasons à 19 K Hz pendant 3 minutes, puis on centrifuge le produit ainsi traité On ajoute le liquide surnageant ( 0,5 ml) à O 5 ml d'une solution de substrat com- prenaiit 2 Om M 4 duadénosine, 20 m M de DL-homocystéine et 100 m M d'un tampon au phosphate de potassium à p H 8, et on laisse réagir le mélange pendant 2 heures à 37 c C, ce qui donne 2,70 micromoles/ml de SAHO EXEMPLE 12 On met 200 mg de cellules sèches de Pseudomonas putida IFO 12996, qui ont été préparées par la même méthode que dans l'exemple 6 a en suspension dans 2 ml d'un tampon au phosphate de potassium 10 m M à p H 7, on re- froidit la suspension avec de la glace puis on lui ajoute 375 mg d'acrylamide, 20 mg de NN -méthylène-bis-acrylamide et 0,25 ml d'une solution aqueuse à 5 % de NNN',N'-tétra- méthyléthylène-diamine On place la solution sous pression réduite pour en éliminer l'oxygène puis on lui ajoute 0,25 ml d'une solution aqueuse à 2, 5 % de persulfate d'ammonium et on la garde au repos tout en refroidissant avec de la glace. Au bout d'une heure on broie finement le gel formé conte- nant les cellules et on lave avec un tampon au phosphate de potassium l Om M à p H 7 pour préparer un produit cellulaire fixé (immobilisé) Onajoute 175 g de ce produit immobilisé à 3 ml d'une solution de substrat formée de 20 m M d'adénosine, m M de DL-homosystéine et 100 m M d'un tampon au phosphate de potassium à p H 8, et on laisse réagir le mélange pen- dant 14 heures à 20 C, ce qui donne 2,23 micromoles/ml de SAH. EXEMPLE 13: On met 200 mg de cellules sèches de Pseudomo- nas putida IFO 12996, qui ont été préparées par la même mé- thode que dans l'exemple 6, en suspension dans 4 ml d'une solution de substrat composée de 200 m M d'adénosine, 200 m M de DL-homocystéine et 100 m M d'un tampon NH 4 Cl-NH 4 OH à p H 9,5, et on laisse réagir la suspension pendant 30 heures à 325 C, ce qui donne 394 micromoles ( 151 mg) de SAH synthéti- sée dans le mélange réactionnel On refroidit le mélange avec de la glace et on lui ajoute 0,4 ml d'une solution aqueuse à 30 % d'acide perchlorique pour arrêter la réaction, on sé- pare par centrifugation les matières insolubles telles que les résidus cellulaires, on ajuste le liquide surnageant à p H 6 avec une solutionaqueuse 1 M de KHCO 3 et on élimine par centrifugation le précipité formé de perchlorate de potassium. On fait passer le liquide surnageant sur une colonne de Dowex 50 x 8 (colonne de type H+) (nom de marque d'une résine d'échange de cations fortement acide), puis on lave la co- lonne avec une solution aqueuse à 0,025 % de thiodiglycol et de l'acide sulfurique binormal contenant 0,025 % de thiodigly- col, puis on fait passer sur la colonne de l'acide sulfurique 6 N contenant 0,025 % de thiodiglycol On ajoute à l'éluat une solution aqueuse à 20 % d'acide phosphotungstique, on recueille par centrifugation le précipité formé et on le lave à l'eau froide, on le dissout dans 5 fois son volume d'un mélange 50/50 en volum E d acétone et d'eau et on extrait avec un mélange 1/1 en volumes d'alcool isoamylique et d'éther On ajuste la couche aqueuse à p H 3,9 avec du car- bonate de baryum, on sépare par filtration le sulfate de baryum précipité puis en lyophilisant le liquide surnageant on obtient 93 mg d'un produit solide blanc que l'on identi- fie comme étant de la SAH par chromatographie en couche mince sur du gel de silice, chromatographie en phase liquide à haute efficacité, chromatographie sur papier, spectrosco- pie d'absorption dans l'infrarouge, ainsi que par son pouvoir rotatoire spécifique. EXEMPLE 14: On met 400 mg de cellules sèches de Pseudomo- nas putida IFO 12996, qui ont été préparées par la même mé- thode que dans l'exemple 6, en suspension dans 8 ml d'une solution de substrat composée de 200-m M d'adénosine, 100 m M de L-homocystine et 100 m M d'un tampon de NH 4 Cl-NH 40 H à p H 9, et on laisse réagir la suspension pendant 25 heures & 35 C, ce qui donne 631 micromoles ( 243 mg) de SAHI qui a été synthé- tisée dans le mélange réactionnel En traitant et en puri- fiant cette SAH brute de la même manière que dans l'exemple 13 on obtient 149 mg de SAH sous la forme d'une susbstance solide blanche. REVENDICATIONS 1.-Procédé de production de S-adénosyl-L- homocystéine selon lequel on fait réagir l'adénosine avec l'homocystéine par mise en contact de ces deux substances dans un milieu aqueux en présence de cellules traitées ou non traitées d Dun microorganisme pouvant synthétiser la S-adénosyl T-homocystéine à partir d'adénosine et d'homo- cystéine, microorganisme qui est soit une bactérie apparte- nant au genre Enterobacter, Agrobacterium; Micrococcus, Corynebacterium O Arthrobacter, Brevibacterium, Chroobacterium, Xanthomonac, Rhodopseudomonas, Pseudomonas, Alcaligenese Acinetobacter, Flavobacterium, Cellulomonas, Protaminobacter ou Azobacter; soit une levure appartenant au genre Saccharomycopsis, Schizosaccharomyces, Pichia, Hansenula, Schwanniomyces, Debaryomyces, Saccharomycodes, Hanseniaspora, Lipomyces, Sporobolomyces, Kluyveromyces, Cryptococcus, Torulopsis, Kloeckera, Wickerhamia, Torula, Rhodotorula, Trichosporon, Cosporidium ou Lodderomyces soit une moisissure appartenant au genre Mucor, Rhizopus, Absidia, Aspergillus, Penicillium, Monascus, Neurospora, Aureobasidium, Fusarium, Gibberella, Arthroderma, Sporothrix, Verticillium, Gliocladium, Trichophyton, Phytophthora, Eurotium ou Cylindrocarpon; soit un actino- mycète appartenant au genre Streptomyces, Mycobacterium, Nocardia, Streptoverticillium, Micromonospora, Micropoly- spora, Streptosporangium ou Microellobosporia; soit un basidiomycâte appartenant au genre Gloeophyllum, Shizol- phyllum, Trametes, Laetiporus, Lentinus, Lyophyllum, Pycnoporus ou Lepista, puis on recueille la S-adénosyl-L-. homocystéine synthétisée. 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel les cellules du microorganisme sont des cellules quies- centes on des cellules sèches. 3. Procédé selon la revendication 1 dans lequel les cellules traitées du microorganisme sont des cellules broyées ou un extrait sans cellules. 4. Procédé revendications précédentes, effectuée à une température période de 0,1 à 48 heureso 5 Procédé revendications précédentes, est une bactérieo - selon l'une quelconque des dans lequel la réaction est de 15 à 60 C pendant une selon l'une quelconque des dans lequel le microorganisme 6 Procédé selon la revendication 5 dans lequel la bactérie est du genre Pseudomonas, Alcaligenes ou Rhodopseudomonaso 7 o Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le microorganisme est une moisissure. 8. Procédé selon la revendication 7 dans la moisissure est du genre Neurospora, Fusarium, Gibberella ou Gliocladiumo 9. Procédé selon l'une quelconque des revendication 1 à 4 dans lequel le microorganisme est un actinomycète. 100 Procédé selon la revendication 9 dans lequel l'actinomycète est du genre Streptomycesg Streptover- ticillium, Micromonospora ou Micropolysporia.