FR 2544715 A1 19841026 FR 8306492 A 19830420 Nouveaux dérivés peptidiques inhibiteurs de la sécrétion gastrique et procédé pour leur préparation. La caeruleine, la cholecystokinine et la gastrine sont des polypeptides naturels doués d'activités pharmacologiques diverses. Ainsi la gastrine stimule la sécrétion gastrique, la cholecystokinine stimule la libération d'enzymes pancréatiques alors que la caeruleine augmente les sécrétions gastriques, pancréa- tiques et biliaires. Sur le plan structural-ces 3 composés possèdent la particularité de présenter la même séquence C-terminale qui, en utilisant pour désigner les a aminoacides les abréviations à 3 lettres recommandées par la Commission de Nomenclature de l'IUPAC-IUB, peut 8 tre représentée par: Trp Met Asp Phe NH 2 Selon la présente invention, il a été trouvé que des composés peptidiques dérivés des séquences C-terminale de la cae- ruleine, de la cholecystokinine et de la gastrine par suppression du groupe Phe NH 2 terminal possèdent de façon surprenante la propriété d'inhiber la sécrétion gastrique. Ces composés répondent à la formule générale o tous les aminoacides sont de configuration L: R A Gly Trp Met Asp NH 2 (I) dans laquelle: Asp NH 2 représente l'amide en a de l'acide aspartique de formule COOH C 2 NH 2 CHCO NH 2 R représente l'hydrogène, un groupe protecteur de la fonction amine terminale tel que t butyloxy carbonyl (BOC), benzyloxy carbonyl (Z), alcanoyle inférieur A désigne: soit la tyrosine, la tyrosine-O-sulfate, la thréonine ou la méthionine; soit un dipeptide choisi parmi: Ala TYR -, TYR Thr -, TYR Met -, en désignant par TYR l'ensemble des 2 amino-acides constitués par la tyrosine ou la tyrosine-0-sulfate; soit un tripeptidechoisi parmi: Glu Ala TYR -, Asp TYR Thr -, Asp TYR Met; soit un tétrapeptide choisi parmi: Glu Glu - Ala TYR -, -Gln Asp TYR Thr -, Arg Asp - TYR Met; soit un pentapeptide choisi parmi: Glu Glu - Glu Ala TYR -, Pyr -Gln Asp TYR Thr -, Asp Arg Asp TYR Met-. Les composés selon l'invention peuvent être pré- parés par les techniques habituelles de synthèse peptidique soit en phase solide selon Merrifield, soit en phase liquide. A partit de l'acide aspartique a-amide, on intro- duit successivement les différents aminoacides présents dans la séquence Les réactions de couplage sont effectuées avec un ester activé de l'acide aminé à introduire au sein du diméthylformamide et en présence de diiscpropyléthylamine et d 'hydecy-l benzotriazole. Tous les aminoacides sont incorporés so US la forme du dérivé protégé sur l'amine en a, le groupe protecteur étant choisi parmi les groupes benzyloxycarbonyle et t-butyloxycarbonyle. Lorsque l'aminoacide utilisé présente dans sa chaine latérale des fonctions susceptibles de réagir, celles-ci doivent être bloquées au préalable Ainsi les fonctions acides en E de l'acide aspartique ou de l'acide glutamique doivent être bloquées sous forme d'ester en particulier l'ester benzylique ou l'ester tertiobutylique et le groupe guanidino de l'arginine peut être protégé par un groupe nitro. Apres chaque réaction de couplage, la déprotec- tion de l'amine en a est effectuée soit par hydrogénolyse s'il s'agit d'un groupe benzyloxy carbonyle, soit par hydrolyse acide s'il s'agit d'un groupe butyloxycarbonyle. Finalement, les peptides protégés dans leurs fonctions des chaenes latérales sont partiellement ou entièrement déprotégés pour conduire aux composés de formule (I). Les composés de formule (I),o TYR représente la tyrosine-0-sulfate, sont cbtenus partir ds composéso o TYR représeno la tyrosine par action de l'anhydride sulfurique en présence de pyridine. 25447 1 5 Les exemples suivants non limitatifs permet- tront de mieux comprendre l'invention. Dans ces exemples, on utilisera les abréviations suivantes: Acides aminés e aminés sont de it groupes protecteurs: Asp NH 2: Acide aspartique aamide Met: Méthionine Trp: Tryptophane Gly: Glycine Tyr: Tyrosine Tyr (SO 3 H): Tyrosine-O-sulfate A l'exception de la glycine, tous ces acides configuration L. Boc: Tertiobutyloxycarbonyl Z: Benzyloxycarbonyl Bzl:Benzyle O but: O-tertiobutyl ON Su - : -O N O Np ': N 020 On utilisera également les abréviations suivantes: DIEA: Diisopropyléthylamine HO Bt: Hydroxy-l benzotriazole Exemple 1 H -Met Cly Trp Met Asp N 12. (I) R = H; A =Met a)-Z-As (à O Bu On dissout 5 g d'acide N-benzyloxycarbonyl aspar- tique a ester de N-hydroxy succinimide P ester de tertiobutyle dans un mélange de 100 ml d'acétate d'éthyle et 100 ml de dichlorométhane. On fait passer un courant d'ammoniac gazeux au-dessus de la solution bien agitée durant 1 heure. Par évaporation, on obtient le produit attendu. F: 88-92 C; Rendement: 95 %. b) Z Met Asp (y O But) NH La solution de 3,5 g du composé obtenu en a) dans l'éthanol absolu est additionnée de 2 ml d'acide chlorhydrique et 0, 35 g de palladium sur charbon & 10 % On hydrogène pendant 4 heures puis on filtre le catalyseur et évapore le solvant Le résidu est lavé plusieurs fois avec de l'éther, puis il est ajouté à une solution de 2,7 g de Z Met O Np, 2,3 ml de DIEA et 0,9 g d'HO Bt dans le diméthylformamide. Après 24 heures, on évapore le solvant sous vide et reprend le résidu dans le dichlorométhane On lave la solution avec de l'eau plusieurs fois ave c une solution d'acide chlorhy- drique à 5 % 7 et avec une solution saturée de bicarbonate de sodium. On évapore à siccité sous vide et obtient le produit attendu. F: 155-157 C; Rendement: 80 %. lal 25 = 3,9 (c = 1, diméthylformamide). la D c):_Trp_-_Met : Is (O But N 2 2,2 g du composé obtenu ci-dessus sont dissous dans un mélange de 150 ml de diméthylformamide, 30 ml d'eau et 15 ml de DIEA On ajoute 0,4 g de palladium sur sulfate de baryum à 10 % et hydrogène pendant une nuit. On filtre le catalyseur, et concentre les solvants sous vide On dissout le résidu dans le diméthylformamide ( 100 ml) et ajoute 1,8 g de Z Trp O Np, 1,6 g de DIEA et 0,75 g d'HO Bt. On laisse une nuit en contact puis on concentre à environ 50 ml et filtre sur 30 g d'alumine neutre On poursuit l'élution avec 200 ml de dimdthylformamide, évapore à siccité et triture le résidu avec de l'acétate d'éthyle. On obtient une poudre blanche. lal 25 = 30 (c = 1, diméthylformamide); Rendement: 82 %. d) -B Zu-Tr Met As( Bu)-NH 2 A partir du composé obtenu ci-dessus, on opère comme indiqué dans le paragraphe c) en remplaçant Z Trp O Np par une quantité équivalentede Z Gly O Np. On obtient de la même façon une poudre blanche. F: 187-189 C; Rendement: 75 %. laid 5 = 18 ( c = 1, diméthylformamide). e) -_Boc-:Met Gl_-_ Tr -_ Net_-Ap (_ _O Bu_) -: A partir du composé obtenu au paragraphe d), on opère comme en c) en remplaçant Z Trp O Np par une quantité équi- valente de Boc Met O Np On isole de la même façon le produit attendu. F: 194 C (dec); Rendement: 75 %. f) H Met Gly Tr: -Met Asp N:2. Le peptide protégé obtenu ci-dessus est dissous dans l'acide trifluorac 4 tique A raison de 5 ml par g de produit et on ajoute 0,5 ml d'anisole et 0,5 ml de thtoanisole On laisse en contact pendant 2 heures puis on ajoute 200 ml d'éther On essore le précipité qui est lavé plusieurs fois avec de l'éther. On obtient le trifluoracetate sous forme de solide incolore. Rendement: 85 %. Exemple 2 Z Tyr Met Gly Trp Met Asp NH-2 (I) R = Z; A = Tyr Met On dissout 1,8 g du trifluorac 4 tate obtenu a l'exemple 1 f) dans le diméthylformamide, puis on ajoute 1,12 g de Z Tyr O Np et 0,71 g de DIEA et laisse 12 heures en contact. On ajoute de l'acétate d'éthyle et essore le précipité qu'on lave plusieurs fois avec de l'acétate d'éthyle puis avec de l'éther. On chromatographie sur gel de silice et,en éluant avec le mélange acétate d'4thyle-pyridine-acide acêtique-eau ( 60- -6-10 vol/vol),on obtient le produit attendu avec un rendement de 80 %. Exemple 3 Z Tyr (SO 3 H) Met Gly Trp Met Asp NH 2. (I) R = Z; A = Tyr ( 503 H) Met. On dissout 0,1 g du peptide obtenu a l'exemple 2 dans 3 ml de diméthylformamide et 3 ml de pyridine On ajoute 0,75 g du complexe anhydride sulfurique/pyridine et agite durant une nuit. On évapore les solvants sous vide et amène le p H à 6,5-7 par addition de solution saturée de bicarbonate de sodium. On laisse 1 heure en contact puis on isole le précipité qui est purifié par chromatographie sur gel de silice de façon analogue à la purification du peptide de l'exemple 2. On obtient le produit attendu avec un rendement de 55 % F: 260 C (déc). Spectre IR: une bande à 1060 cm due au sulfate. Rf = 0,3 (acétate d'éthyle 60 pyridine 20 acide acétique 6 - eau 10, vol/vol). Exemple 4 Boc Tyr Gly Trp Met Asp NH 2. (I) R = Boc; A = Tyr a) Boc Met Asp ( O Bzl) NH 2. On dissout 1,91 g de trifluoracétate de Asp (P O Bzl) NH 2 dans 10 ml de diméthylformamide et on ajoute 2,07 g de Boc Met O Np et 0,76 g d'HO Bt. On refroidit la solution à 5 C et ajoute 2,06 ml de DIEA Après 8 heures, on concentre sous vide et reprend le résidu huileux dans l'acétate d'éthyle ( 200 ml) On lave la solution orga- nique avec une solution saturée de bicarbonate de sodium ( 2 fois ml), avec de l'eau ( 1 fois 50 ml), avec une solution saturée de chlorure de sodium ( 1 fois 50 ml), avec une solution d'acide citrique à 20 % ( 1 fois 50 ml) puis a nouveau avec de l'eau ( 1 fois 50 ml) et avec une solution saturée de chlorure de sodium ( 1 fois 50 ml) On sèche la solution organique sur sulfate de sodium et concentre le solvant sous vide à température inférieure à 50 C. 254471 5 Le résidu, lavé plusieurs fois avec le mélange acétate d'éthyle-éther ( 1-9, vol/vol) puis avec de l'éther, cristal- lise. F: 109-111 'C; Rendement: 85 %. Chromatographie en couche mince: Rf = 0,4 (chloroforme 7 hexane 3 vol/vol) Rf = 0,3 (acétate d'éthyle 8 - hexane 2 vol/vol). b) b>-"Boc Tr 2 Met Asp (# O Bzl 2 N 2 g du composé obtenu ci-dessus sont dissous dans 5 ml d'acide trifluorac/tique On laisse 1/2 heure puis on ajoute 100 ml d'éther en agitant On essore le précipité qui s'est formé, on le rince plusieurs fois avec de l'éther puis on le sèche sur potasse. On dissout le produit dans 10 ml de diméthylfor- mamide et on ajoute 1,7 g de Boc Trp O Np et 0,56 g d'HO Bt Après avoir refroidi à 5 C, on ajoute 1,47 ml de DIEA. On laisse 8 heures et traite comme indiqué en a). On obtient un solide, F: 178-180 'C; Rendement: 86 %. Chromatographie en couche mince: Rf a 0,35 (chloroforme 7 hexane 3 vol/vol) Rf 0,2 (acétate d'4thyle 8 - hexane 2, vol/vol). c) -Boc " Gly Tr 2 Met As 2 (d O Bzl>l H 2. C) 2 On élimine le groupe Boc terminal du peptide obtenu au paragraphe b) par action de l'acide trifluoracétique 1 g du trifluoracdtate obtenu est mis en solution dans le diméthylfor- mamide et on ajoute 0,48 g de Boc Gly O Np, 0,22 g de HO Bt et 0,6 g de DIEA Après 8 heures de réaction on concentre la solution et on traite comme décrit en a). On obtient apres évaporation du solvant un solide, F: 152-156 o C; Rendement: 86 %. Chromatographie en couche mince: 1 seule tache de Rf = 0,55 (acétate d'éthyle méthanol 9-1, vol/vol). d): -y:G:y: P Me Bzl) - Le produit obtenu au paragraphe c) ( 0,71 g) est traité par 3,5 ml d'acide trifluoracétique pendant 30 minutes à température ambiante Par addition d'éther, on précipite une poudre blanche qu'on essore, lave avec de l'éther et sèche sous vide en présence de potasse. Ce solide est dissous dans le diméthylformamide ( 10 ml) et on ajoute 0,4 g de Boc Tyr O Np et 0,18 ml de DIEA. Après 8 heures de réaction, on traite comme indiqué au paragraphe c) On chromatographie sur une colonne de gel de silice en éluant avec un mélange acétate d'éthyle-méthanol, 9-1 (vol/vol) pour obtenir un solide, F: 128-135 C; Rendement: 72 %. Chromatographie en couche mince: 1 seule tache de Rf = 0,4 (acétate d'éthyle-méthanol, 95-5, vol/vol). e) -:Boc-Tv_:yr-:Glv - Trp_: -et-: Asp_ NH 0,2 g du produit obtenu ci-dessus sont dissous dans un mélange diméthylformamide-eau-DIEA ( 8-1-1, vol/vol) et on hydrogène en présence de palladium sur sulfate de baryum à 10 % ( 0,050 g) pendant 12 heures On filtre le catalyseur et évapore les solvants à siccité sous vide à température inférieure à 50 C. Le résidu est repris dans 20 ml d'acétate d'éthyle et 20 ml de solution d'ammoniaque à 5 % On agite et décante La phase aqueuse est acidifiée par addition d'acide citrique solide et extraite 2 fois avec de l'acétate d'éthyle Les extraits organiques réunis sont lavés avec de l'eau, séchés et con- centrés à siccité sous vide On obtient une poudre blanche, F: 210 C (déc); Rendement: 56 %. Chromatographie en couche mince: Rf = 0,4 (acétate d'éthyle 9 - méthanol 1 acide acé- tique 0,5, vol/vol). 4 4 7 1 5 Essais pharmacologiques Les composés selon l'invention ont été étudiés en ce qui concerne leurs propriétés thérapeutiques Plus particuliè- rement, ces composés ont été étudiés in vivo en ce qui concerne leur effet sécrétoire gastrique chez le rat. Le modèle choisi pour la mesure de l'effet sécré- toire est celui de l'estomac de rat anesthésié reperfusé Le proto- cole suivi est une modification de celui décrit préalablement par Ghosh et Schild. Un rat mâle de souche Wistar de 300 g, à jeun de 18 heures, est anesthésié à l'uréthane (solution à 10 %, 1,5 ml/100 g i.p) On pratique ensuite une trachéotomie et un cathétérisme de la veine du pénis qui permettra l'administration i v des peptides On place ensuite une canule dans l'oesophage jusqu'au cardia et une seconde dans le duodénum (par une duodénotomie effectuée à 3 cm environ du pylore) Jusque dans la zone antrale gastrique. Un soluté propionique-succinique (p H 5,5) qui donne une variation linéaire du p H en fonction de la concentration en ions H est utilisé pour perfuser l'estomac en circuit ouvert ou fermé avec un débit de 3 ml/min La température corporelle, ainsi que celle du soluté, est contrôlée et maintenue & 30 C La sécrd- tion acide de l'estomac va entraîner une variation de p H détectée par l'électrode de verre et enregistrée en fonction du temps Après stabilisation de la sécrétion basale, on injecte la gastrine par voie intraveineuse soit en perfusion, soit en injection unique La réponse est enregistrée en fonction du temps et la quantité d'acide sécrété est mesurée sur l'enregistrement par différence avec la sécrétion basale. La même expérience est réalisée soit en injectant le peptide à étudier i v sur un plateau de sécrétion acide stimulée par la gastrine, soit en associant le peptide avec le stimulant dans des rapports de concentration variables Enfin, le peptide est admi- nistré seul à différentes doses pour examiner son effet agoniste. Les expériences effectuées avec les produits de l'exemple 3: Z Tyr ( O 503 H) Met Gly -Trp Met -Asp NH 2 et de l'exemple 4: Boc Tyr Gly Trp Met Asp NH 2 ont donné les résultats suivants. A) Effet agoniste Peptide Dose Effet sécrdtoire ( 40 minutes) Exemple 3 1 000 sug/kg 0,15 / mol H Exemple 4 5 000 ug/kg 0,1 u mol H Gastrine (HG 13) 0,5,ug/kg 16/u mol H B) Effet antagoniste Peptide Dose d'agoniste Dose d'antagoniste Effet inhi- (minigastrine) biteur % ,,,, Exemple 3 1,5 ug/kg/h 1,5 mg/kg 47,4 (perfusion) 0,6 ug/kg 1,5 mg/kg 47 (unique) Exemple 4 0,6 ug/kg 1 P 2 mg/kg 50,4 (unique) __ =, D'après les rdsultats, on constate que: les composés selon l'invention présentent un effet agoniste extrêmement faible vis-à-vis de la gastrine et ce mal- gré la valeur élevée des doses utilisées; les composés selon l'invention présentent un effet inhibiteur'important sur la sécrétion gastrique, de l'ordre de % dans les conditions expérimentales utilisées. Par suite, les composés selon l'invention pourront être utilisés en thérapeutique humaine dans tous les cas o il est utile de diminuer la sécrétion gastrique et en particulier pour le traitement des ulcères gastro-duodénaux. Les composés de la présente invention peuvent être utilisés de préférence par voie injectable: intraveineuse, intramus- culaire ou sous-cutanée Ils sont utilises dans un solvanttel que le sérum physiologique (solution saline isotonique). La posologie peut varier suivant l'intensité de l'effet thérapeutique recherchée, la gravité de l'affection à traiter et la voie d'administration utilisée Elle doit donc être déterminée pour chaque patient en fonction de ces divers critères Le plus souvent elle est comprise entre 1 et 100 mg de principe actif par kg de poids corporel. R E V E N D I C A T I O N S 1 Peptides de formule générale R A Gly Trp Met Asp NH 2 () dans laquelle: Asp Nt 2 représente l'amide en a de l'acide aspartique de formule: COOH CH NH 2 CH CO NH 2 R représente l'-hydrogène, un groupe protecteur de la fonction amine terminale tel que t butyloxy carbonyl soit un tripeptide choisi parmi: Glu Ala TYR -, Asp - TYR Thr -, Asp TYR Met -; soit un tdtrapeptide choisi parmi: Glu Glu Ala TYR-, Gln-Asp TYR Thr -, Arg -Asp TYR Met -; soit un pentapeptide choisi parmi: Glu Glu Glu Ala - TYR -, Pyr Gln Asp TYR Thr -, Asp Arg Asp - TYR Met -. 2 Peptide selon la revendication 1 de formule H Met Gly Trp Met Asp NH 2 3 Peptide selon la revendication 1 de formule R Tyr Met Gly Trp Met Asp NH 2, 2544715 ' 4 Peptide selon la revendication 1 de formule R Tyr( 503 H) Met Gly Tryp Met Asp NH 2 Peptide selon la revendication 1 de formule R Tyr Gly Trp Met Asp NH 2. 6 Procédé de preparation des peptides selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que: on utilise comme produit de départ l'acide aspartique a-amide on réalise successivement sur ledit acide les couplages des divers acides aminés en utilisant un ester actvé desdits acides, la réaction étant réalisée au sein du diméthylformamide et en présence d'un composé choisi parmi la diisopropyléthylamine et l'hydroxy-l benzo- triazole, lesdits acides aminés ayant été au préalable convenablement protégés sur leur fonction amine en a 7 Médicaments utiles notamment comme inhibiteurs de la sécrétation gastrique, caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins un peptide selon les revendications 1 a 5.