FR 2537586 A1 19840615 FR 8220845 A 19821213 La présente invention a pour objet de nouveaux dérivés estratriéniques radioactifs marqués à l'iode, leur procédé de préparation et leurapplication aux dosages radioimmunolo- giques. Plus particulièrement, elle a pour objet des dérivés estratriéniques marqués à l'iode, sous forme d'isomères syn ou sous forme d'isomères anti, ou sous forme de mélange d'i- somères syn et anti de formule générale (I): OR 2 H b-O NH R 1 dans laquelle les lignes ondulées signifient que la fonction OR peut être en position o ou P et que la fonction oxime peut être en position syn ou anti, formule dans laquelle R représente de l'hydrogène, un groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un groupement acyle d'un acide car- boxylique ayant de 2 à 12 atomes de carbone et R 1 représente le reste d'un acide aminé R 1 NH 2 ou le reste d'un dérivé de ce dernier, ce reste étant accepteur d'iode. L'invention a plus particulièrement pour objet les déri- vés estratriéniques radioactifs marqués à l'iode de formule générale (I) dans laquelle R 1 représente le reste d'un acide aminé R 1 NH 2 ou le reste d'un dérivé de ce dernier, choisi dans le groupement constitué par l'histidine, la tyrosine, l'histidinol, l'histamine, l tyramine et le tyrosinateode méthyle marqués à l'iode 125 ou 131. Parmi les produits de formule générale (I), on citera no- tamment: le 17 3-hydroxy-4,9,11-trièn-3-carboxyméthyloxime sous forme d'isomère syn couplé à 11 '( 125 I) histamine de formule: A OH N O CH 2 CO J NH (c H 2)2 II -f1125 \NI H dans laquelle l'iode peut être en position 2 ou 5. le 17 1-hydroxy-4,9,11-trièn-3-carboxyméthyloxime sous fonme d'isomère anti couplé à 1 '( 125 I) histamine de formule OH OC-CH 2-O -N NH (ICH 2) 2 k 125 H dans laquelle l'iode peut être en position 2 ou 5. le 17 a-hydroxy-4,9,11-tri&n-3-carboxyméthyloxime sous forme d'isomère syn couplé à 1 '( 1251) histamine de formule PH I N O CH 2 Co NH (c H 2) 2 i I l_ 125 \N/ H dans laquelle l'iode peut être en position 2 ou 5. le 17 a-hydroxy-4, 9,11-trièn-3-carboxyméthyloxime sous forme d'isomère anti couplé à 11 ( 125 I) histamine de formule p H OC-C OC-CH 2-O-N NH (CH 2)2 l N 125 N H dans laquelle l'iode peut être en position 2 ou 5. le 17 D-ou le 17 î-hydroxy-4,9,11-trièn-3-carboxyméthyloxime sous forme de mélange d'isomères syn et anti couplés à 1 '( 125 I) histamine, l'iode pouvant -_-tre en position 2 ou 5. L'invention a également pour objet un procédé de prépa- ration des produits répondant à la formule générale ci-dessus. Ce procédé est caractérisé en ce que: on fait réagir un produit de formule générale (II): OR (h) 0 ' dans laquelle et dans ce qui suit R a les significations précitées, avec un halogénure de carboxyméthoxylamine en pré- sence d'une base et obtient un produit de formule générale (IIIA): OR - N// +J OR (IIIA) N R 2 O dans laquelle la ligne ondulée sur l'azote indique que ce produit est sous forme de mélange d'isomères syn et anti et R 2 représente de l'hydrogène, puis: soit fixe sur la fonction acide de ce produit un groupement activateur de la fonction carbonyle et obtient le produit de formule générale (IIIC): OR N (IIIC) >JH / O R 2 dans laquelle R 2 représente un groupement activateur de la fonction carbonyle et la ligne ondulée sur l'azote indique que ce produit est sous forme de mélange d'isomères syn et anti que l'on fait réagir avec un acide aminé accepteur d'iode marqué à l'iode 125 ou 131 ou avec un dérivé d'un tel acide et obtient le produit cherché de formule générale (I), que l'on isole sous forme de mélange d'isomères syn et anti que l'on sépare éventuellement en ces isomères; soit soumet le produit de formule (IIIA), dans laquelle R 2 représente de l'hydrogène et la ligne ondulée sur l'azote indique que ce produit est sous forme de mélange d'isomères syn et anti, à l'action d'un agent d'estérification pour ob- tenir un produit de formule générale (IIIB): 0 OR bH 2 ( (IIIB) R 20-Q O dans laquelle R 2 représente un groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone, sous forme de mélange d'isomères syn et anti,sépare les dits isomères syn et anti,puis saponifie séparément la fonction ester de chacun de ces isomères syn et anti au moyen d'une base forte, pour obtenir des produits 25375 L 6 de formule générale (IIIA) sous forme d'isomère syn et sous forme d'isomère anti, dans laquelle R 2 représente de l'hydrogène, fixe sur la fonction acide de ces derniers, un groupement activateur de la fonction carbonyle pour obtenir des produits de formule générale (IIIC), sous forme d'iso- mères syn et anti dans laquelle R 2 représente le groupement activateur précité que l'on fait réagir avec un acide aminé accepteur d'iode ou avec un dérivé d'un tel acide et obtient le produit cherché de formule générale (I) sous forme d'iso- mère syn et d'isomère anti séparés. Ce procédé est encore caractérisé en ce que l'acide aminé accepteur d'iode ou le dérivé d'acide aminé est choisi dans le groupe constitué par l'histidine, la tyrosine, l'his- tidinol, l'histamine, la tyramine ou le tyrosinate de méthyle; l'halogénure de carboxyméthylamine est l'hémihydrochlorure de carboxyméthylamine et on opère sous atmosphère inerte, à l'obscurité et en présence de soude; on fixe sur la fonction acide un groupement activateur de la fonction carbonyle en faisant agir un halogéno formiate d'alcoyle en présence d'une base tertiaire, en milieu anhydre et sous atmosphère inerte. Dans les conditions préférentielles de mise en oeuvre, le procédé est caraotérisé par les points suivants: l'halogéno formiate d'alcoyle est le chloroformiate d'iso- butyle et on opère en présence de tri-n-butylamine; l'agent d'estérification est le diazoéthane; on saponifie la fonction ester au moyen de la soude métha- nolique; l'acide aminé ou son dérivé, que l'on fait réagir avec le produit de formule générale (IIIC) dans laquelle R 2 repré- sente un groupement activateur de la fonction carbonyle, est l'histamine marquée à l'iode 125 ou 131, et l'on opère sous atmosphère inerte et à l'obscurité. L'activation de la fonction carbonyle du produit de formule générale (I), dans laquelle R 1 représente de l'hy- drogène, peut aussi être réalisée en faisant agir sur celui- ci le N-hydroxy succinimide ou le dicyclohexylcarbodiimide, générateur des groupements activateurs de ladite fonction carbonyle. Le procédé décrit permet d'obtenir au départ du 173- hydroxy-4,9,11-trièn-3-one, le produit de formule: H sous forme de mélange d' isomères syrn et anti, ou sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isômère anti, et au départ du 17 c-hydroxy-4,9,11-trièn= 3-one, le produit de formule: N H b=o _(Cc H 2)21 I 125 \N/ H sous forme de mélange d'isomères syn et anti, ou sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti, et au départ du L'invention a également pour objet l'application des pro- d Uits de formule génrale (I), objet de l'invention, au do- sages radioimmunologiques de 17 et 7-hydroxy-4,9,11 trin-le produit de formule 3 -ones dans la bile, l'urine, les fecès, le plasma des ani- maux ou de l'homme et les tissus des animaux, ainsi que dans les aliments des animaux ou de l'homme. L'invention a également pour objet à titre de produits industriels nouveaux et notamment à titre de produits inter- médiaires nécessaires à l'exécution du procédé de l'invention, les produits de formule générale (III) sous forme de mélange d'isomères syn et anti, ou sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère ati H 2 L_(CH 2)2-N I 125 \IN sous forme de mélange d'isom Hères syn et anti, ou sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti. L'invention a également pour objet l'application des pro- duits de formule générale (I), objet de l'invention, au do- sages radioimmunologiques de 17 P et 17 OE-hydro DW-4,9,11-trièn- 3-ones dans la bile', l'urine, les fécès, le plasma des ani- maux ou de l'homme et les tissus des animaux, ainsi que dans les aliments des animaux ou de l'homme. L'invention a également pour objet à titre de produits industriels nouveaux et notamment à titre de produits inter- médiaires nécessaires à l'exécution du procédé de l'invention, les produits de formule générale (III) sous forme de mélange d'isomères syn et anti, ou sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti: OR N (III) C 2 R 2 O dans laquelle les lignes ondulées signifient que la fonction OR peut être en position a ou P et quela fonction oxime ne peut être en position d'isomère syn ou d'isomère anti, et dans laquelle R représente de l'hydrogène, un groupement alcoyle ayant de I à 6 atomes de carbone ou un groupement acyle d'un acide carboxylique ayant-de 2 à 12 atomes de car- bone, R 2 représente de l'hydrogène, un groupement alcoyle ayant de I à 6 atomes de carbone, un groupement activateur de la fonction alcoyle Ce groupement est constitué par un radical de formule CO-O-alk, alk étant un radical alcoyle ayant de I à 6 atomes de carbone. Parmi ces produits, on citera les produits suivants 17 p-hydroxy-4,9,11trièn-3-carboxyméthyloxime sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn et sous forme d'isomère anti; 17 î-hydroxy-4,9, 11-trièn-3-carboxyméthyloxime sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn et sous forme d'isomère anti; 17 p-hydrox4,9,11-trièn-3-carbéthoxyméthyloxime sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn et sous forme d'isomère anti; 17 ahydroxy-4,9,11-trièn-3-carbéthoxyméthyloxime sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn et sous forme d'isomère anti; l'anhydride mixte de 17 p-hydroxy-4,9,11-trièn-3-carboxymé- thyloxime avec le formiate d'isobutyle sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn et sous for- me d'isomère anti de formule générale: OH z O Nv.O CH 2 _ / (CH 3)2 CH CH 2 -O C dans laquelle la ligne ondulée signifie que la fonction oxime peut être en position d'isomère syn, en position d'isomère anti ou peut représenter le mélange de ces deux fonctions; l'anhydride mixte de 17 a-hydroxy-4,9, 11-trièn-3-carboxymé- thyloxime avec le formiate d'isobutyle sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn et sous for- me d'isomère anti, de formule générale: OH E t O. Nv O CH 2 O x (c H 3)2 CHCH 2 O C \\ O dans laquelle la ligne ondulée signifie que la fonction oxime peut être en position d'isomère syn, en position d'iso- mère anti ou peut représenter le mélange de ces deux isomères. Les produits de formule générale (III), notamment ceux dans lesquels R 2 représente de l'hydrogène, sont des produits de départ utiles pour la préparation d'antigènes, nécessaires également aux dosages radioimmunologiques des 173 et 17 a- hydroxy-4,9,11-trièn-3-one. Leur application en tant que telle fait également l'objet de la présente invention et est caractérisée en ce que l'on conjugue un de ces produits avec l'albumine serique bovine (BSA) ou avec l'albumine serique humaine (HSA) et obtient l'antigène cherchéS Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre, l'application des produits de formule générale (III), dans q 25375 C 6 laquelle R 2 représente de l'hydrogène, est caractérisée par les points suivants: on fait réagir un produit de formule générale (IIIA) sous forme de mélange d'isomères syn et anti,sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti: OR N (II Ii) 2 H R 2 O CO dans laquelle les lignes ondulées et R ont les significations précitées et R 2 représente de l'hydrogène en vue de l'acti- vation de la fonction carbonyle, avec un halogéno formiate d'alcoyle, en présence d'une base tertiaire, en milieu anhy- dre et sous atmosphère inerte; on obtient l'anhydre mixte correspondant de formule (IIIC): OR (IIIC) -R 2 dans laquelle R 2 représente un radical de formule -CO-O-alk, alk étant un radical alcoyle ayant au plus 6 atomes de car- bone, que l'on conjugue avec l'albumine serique bovin (BSA) ou humaine (HSA) et obtient l'antigène cherché. L'application des produits de formule générale (III), notamment de ceux dans laquelle R 2 représente de l'hydrogène, est encore caractérisée par les points suivants: l'halogéno formiate d'alcoyle est le chloroformiate d'iso- 25375 CQ 6 butyle et on opère en présence de tri-n-butylamine et sous atmosphère inerte; on fait réagir l'anhydride mixte de formule générale (IIIC) avec l'albumine serique bovine (BSA) ou humaine (HSA) en ayant préalablement dissout cette dernière dans un mélange eau-dioxane sous atmosphère inerte. L'application décrite permet d'obtenir respectivement au départ de: 17 lhydroxy-4,9,11-trièn-3-carboxyméthyloxime, sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn et sous forme d'isomère anti, les antigènes de formule: I OR I N (IV) 6 H 2 n I BSA dans laquelle N = 20 à 30 et la partie oxime de stéroide est sous forme d'isomère syn, d'isomère anti et sous forme de mélange d'isomères syn et anti: I OR 1 N H (y) H n HSA dans laquelle N = 20 à 30 et la partie oxime de stéroide est sous forme d'isomère syn, d'isomère anti et sous forme de mélange d'isomères syn et anti; et au départ de 17 a-hydroxy-4,9,11-trièn-3carboxyméthyloxime sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomères syn et sous forme d'isomères anti, les antigènes 1 1 25375 e,6 de formule: dans laquell sous forme d forme de mél OR N 5 ' H 1 2 NH.-R 1 n BSA e N = 20 à 30 et la pai isomère syn, sous forts ange d'isomère syn et ^^^^__^"OR 1 H HSA (VI) rtie oxime de stéroide est ne d'isomère anti et sous anti: (v II) dans laquelle N = 20 à 30 et la partie oxime de stéroide est sous forme d'isomères syn, sous forme d'isomère anti et sous forme de mélange d'isomères syn et anti. L'invention a également pour objet, à titre de produits industriels nouveaux, les antigènes obtenus lors de l'appli- cation décrite ci-dessus, et notamment les produits de for- mules générales IV, V, VI et VII précitées. L'invention a également pour objet l'application des an- tigènes ci-dessus à la préparation des anticorps. Les produits de formule générale (I), objet de l'in- vention et notamment le 17 W-hydroxy-4,9,11-trièn-3-carboxy- méthyloxime ( 125 I) histamine sous forme d'isomère syn, sous forme d'isomère anti et sous forme de mélange d'isomères syn et anti, et le 17 a-hydroxy-4,9,11-trièn-3-carboxyméthyloxime ( 125 I) histamine, sous forme d'isomère syn, sous forme d'iso- 12 - mère anti et sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sont utilisés comme déjà dit lors de dosages radioimmunolo- giques des 173 et 17 a-hydroxy-4,9,11-trièn-3 ones. Ils permettent le dosage de ces produits dans les liquides et tissus biologiques, les fécès des animaux ou de l'homme ainsi que dans des produits d'alimentation humaine et ani- male. Ils permettent notamment un dosage spécifique des quan- tités inférieures aux p p b de 17 P et 17 a-hydroxy-4,9,11- trièn-one, sans que l'on soit obligé de recourir aux métho- des d'isolement et de purification par chromatographie, avant de procéder au dosage de ces derniers. Le dosage radioimmunologique a été effectué selon la mé- thode décrite par S A BERGSON et R S YALOW, HORMONE 4, p 557 ( 1964) et G E ABRAHAM, Journal of Chemical Endocri- nonal Metab 29, p 866 ( 1969). Les antigènes de formules IV, V, VI et VII précités, également objet de l'invention sont utilisés au dévelop- pement d'anticorps injectés chez l'animal en présence d'un adjuvant, ils permettent,en effet, d'obtenir chez celui-ci des sérums contenant des anticorps contre le 17 P-hydroxy- 4,9,11-trièn-3-one et le 17 î-hydroxy-4,9,11-trièn-3-one. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toute- fois la limiter Exemple 1: 17 e-hvdroxv et 17 alhydjro X '4 ',9,11- trien-3-carboxy- méthyloximes 'sous: forme -de ilàe i s r essyn et anti. a) 17 -hydroxy 4,9,11-trien-3-carboxyméthyloxime sous forme de mélange d'isomères syn et anti. On prépare sous atmosphère inerte et dans l'obscurité une suspension de 3, 29 g de 17 P-hydroxy 4,9,11-trièn-3-one dans ml d'éthanol puis ajoute successivement 3,05 g d'hémihydro- chlorure de carboxyméthoxylamine et 15 ml de solution de Na OH N. On soumet le mélange réactionnel à température ambiante et à l'obscurité à l'agitation pendant 3 heures environ, le verse ensuite dans de l'eau glacée, en présence d'acide chlorhydrique, essore le précipité, le lave à l'eau jusqu'à neutralité des eaux de lavage et sèche sous vide On obtient 3,86 g de produit cherché que l'on purifie par chromatographie sur silice On élue par le mélange chlorure de méthylène, méthanol, acide acétique ( 90/10/1) et isole le produit de Rf = 0,35 Ce produit est un mélange d'isomères syn et anti. Analyse: RMN à 90 M Hz 529 Hz: H 4 de l'isomère anti 558-584 Hz: H 4 de l'isomère syn (masqué). b) 17 _-hydroxy 4,9,11-trien-3-carboxyméthyloxime sous forme de mélange d'isomères syn et anti. En procédant comme décrit ci-dessus, on prépa- re à partir de 1,59 g de 17 e-hydroxy 4,9,11-trien-3-one, 40 ml d'éthanol, 1,5 g de hémihydrochlorure de carboxyméthoxylamine et 15 ml d'une solution de Na OH N On obtient 1,75 g de produit cherché que l'on purifie par chromatographie sur silice On élue par le mélange cyclohexane, acétate d'éthyle ( 70/30) et isole le produit de Rf = 0,25 Ce produit est un mélange d'iso- mères syn et anti. Exemple 2: SéDaration d'isomères svn et anti des 17:-hydrox et 17 g L-hvdroxv 4,9 11-trien-3-carboxvméthyloximes. Stade A: - a) 17-hydroxy 4,9,11-trien-3-carbéthoxyméthyloxime sous forme de mélange d'isomères syn et anti. ESTERIFICATION On prépare sous atmosphère inerte et sous agitation, une suspension de 1,3 g de 17 P-hydroxy 4,9,11-trien-3-carboxyméthyl- oxime, sous forme de mélange d'isomères syn et anti, dans 20 cm 3 de chlorure de méthylène, la refroidit vers O OC et l'additionne de 25 cm 3 de diazoéthane On maintient le mélange réactionnel sous agitation et vers O C pendant une heure environ, sépare la phase organique, l'évapore sous vide et ibtient 1,53 g de pro- duit cherché sous forme d'une huile, que l'on utilise tellequelle pour la séparation d'isomères syn et anti. SEPARATION D'ISOMERES. On dissout le produit obtenu ci-dessus dans 3 cm 3 d'acétate d'éthyle, chromatographie la solution obtenue sur silice, on élue par le mélange cyclohexane, acétate d'éthyle ( 50/50). On obtient une première fraction contenant 750 mg d'un produit présumé êtrel'isomère anti, Rf = 0,32. Une deuxième fraction constituée par 350 mg d'une huile est présumée comporter l'isomère syn Rf = 0,28. Les isomères séparés comme décrit ci-dessus seront saponi- fiés et analysés sous forme d'acides, afin de confir- mer leurs structures syn et anti. b) En procédant d'une manière comme décrit ci-dessus, on prépare, à partir de 1,64 g de 17 oxime, sous forme de mélange d'isomères syn et anti obtenu à l'exemple 1 a), 26 cm 3 de chlorure de méthylène et 35 cm 3 de diazoéthane, 1,55 g de 17,-hydroxy 4,9,11-trien-3-carbéthoxy- méthyloxime sous forme de mélange d'isomères syn et anti La totalité de ce produit est chormatographiéesur silice avec élu- tion par le mélange cyclohexane, acétate d'éthyle ( 70/30) On sépare une fraction A contenant 580 mg d'un produit présumé être l'isomère anti, Rf = 0,17 Une deuxième fraction B contient 490 mg d'un produit présumé être l'isomère syn, Rf = 0,-13. Ces deux produits seront saponifiés et analysés sous forme d'acides. Stade B: a) 17-hydroxy 4,9,11-trien-3-carboxyméthyloxime sous forme d'iso- mère syn. On prépare sous atmosphère inerte et à l'obscurité, le mé- lange réactionnel de 350 mg de 17 j-hydroxy 4,9,11-trien-3-carbé- toxyméthyloxime, isomère syn, préparé au stade précédent, 5 cm 3 de méthanol et 1 cm 3 de lessive de soude, le soumet à température ambiante pendant une heure environ à l'agitation, puis refroidit vers O OC et additionne de 1 cm 3 d'acide chlorhydrique concentré. On essore le précipité formé, le sèche sous vide et obtient 295 mg de produit cherché. Spectre RMN: 90 M Hz 570-590 Hz: pour H 4, H 11 et H 12 d'isomère syn. Spectre UV dans l'éthanol. infl 313 nm E 1 = 883 * 1 max 325 nm: E = 1144 ú = 39300 infl 335 nm E 1 = 1098 Dichroisme circulaire dans l'éthanol. max 231 nm AE = + 2,75 infl 255 nm a = -2,25 infl 290 nm N = -2,7 max 302 nm a i= -3,8 max 315 nm a = -4,5 max 331 nm ú = -2,5 max 347 nm ú= + 1,3 b) 17-hydroxy 4,9,11-trien-3-carboxyméthyloxime sous forme d'isomère anti. En procédant comme pour l'isomère syn ci-dessus, on obtient à partir de 750 mg de 17 P-hydroxy 4,9,11-trien-3-carboxy- méthyloxime, obtenu selon le stade A de cet exemple, 10 cm 3 de méthanol et 1,6 cm 3 de lessive de soude On obtient 660 mg de produit cherché. Analyse: Spectre RMN: 90 M Hz 526 Hz pour H 4 d'isomère anti. S Dectre UV dans l'éthanol. infl 310 nm: E 1 = 855 infl 335 nm: E 1 = 1010 E= 39300 max 322 nm: E 1 = 1144 Dichroisme circulaire dans l"'éthanol. max 231 nm E= + 3,0 max 253 nm f ú= -1,05 infl 290 nm E = -2,7 max 300 nm a F= -4,2 max 315 nm e E= -4,6 max 329 nm e= -1,6 max 343 nm at= + 2,75 Ce produit n'est pas décrit dans la littérature. c) 17 (-hydroxy 3,4,11-trien-3-carboxyméthyloxime isomère syn. * En procédant comme décrit ci-dessus, on obtient, à partir de 490 mg de 17 o-hydroxy 3,4,11-trien-3-carbétoxyméthyloxime isomère syn, préparé selon le stade A de cet exemple, 6,5 cm 3 de méthanol et 1,1 cm 3 de lessive de soude, 325;mg de produit cherché. Analyse Spectre RMN: 90 M Hz 532 Hz pour H 2 10585 Hz pour H 4 de l'isomère syn. Spectre UV dans éthanol/eau ( 1/4). Infl 312 nm E 1 = 888 max 325 nm E 1 = 1168 infl 335 nm E 1 = 1136 1 = Dichroisme circulaire dans éthanol/eau ( 1/4) max 250 nm 4 = -3,3 max 303 nm = -3,0 max 316 nm e = -3,1 max 350 nm ú = + 2,6 d) 17 En procédant comme décrit ci-dessus, on obtient, à partir de 580 mg de 17 mère anti, préparé selon le stade A de cet exemple, 7 cm 3 de méthanol et 1,3 cm 3 de lessive de soude, 440 mg de produit cher- ché. Analyse: Spectre RMN: 90 M Hz 532 Hz pour H 4 d'isomère anti. Spectre UV dans éthanol/eau ( 1/4). infl 312 nm E 1 874 max 323 nm E 1 = 1132 39000 infl 335 nm E 1 = 1010 Dichroisme circulaire dans éthanol/eau ( 1/4). max 251 nm Aú= -2,4 max 303 nm As= -2,9 max 315 nm Ẻ= -2,8 max 349 nm 6 = + 2,8 1.7 25375 i 6 Exemole 3: Anti_ènes à p;arzti 'de Ie 7 '-hydroxv et i 7 "-hydrox 4,9,1 i 1 i-trienl-3-carbxvh Vm 1 oxie 'i'somèr'es anti et d'albumine seriaue bovine(BSA). a) Antigène à partir de 174-hydroxy 4,9,11 -trien-3-carboxyméthyl- oxime isomère anti. Stade A:L'anhydridemixtedel'-hydroxy 4,9,11-trien-3-carboxymé- thyloxime isomère anti avec le formiate d'isobutyle. On dissout sous agitation et sous atmosphère inerte 170 mg de 17 flhydroxy 4,9,11-trien-3-carboxyméthyloxime isomère anti dans 5 cm 3 de dioxane, ajoute 0,23 cm 3 de tri-n-butylamine, puis abaisse la température vers 13 OC; ajoute 0,65 cm 3 de chlorofor- miate d'isobutyle et maintient l'agitation pendant 30 minutes à 13 Cenviron On obtient la solution de produit cherché que l'on utilise telle quelle par le stade suivant. Stade B: Dissolution de la BSA. On introduit sous agitation et sous atmosphère inerte 690 mg de BSA dans 20 cm 3 d'eau glacée, puis ajoute après dissolu- tion 2 cm 3 de dioxane, maintient la solution sous agitation en- viron 20 minutes, additionne successivement 20 cm 3 de dioxane et 0,7 cm 3 de Na OH N. Stade C: Conjugaison. On ajoute à cette solution de BSA la solution d'anhydride mixte obtenueprécédemment au stade A, et soumet le mélange réac- tionnel à l'agitation pendant 4 heures à 4 C environ. On ajoute ensuite 50 cm 3 d'eau distillée, a-juste le p H à 4,1 par addition d'acide chlorhydrique N, sépare le précipité formé, puis le reprendpar 50 cm 3 d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 1 % La solution résultante est soumise à ultrafil- tration,puison fait passer 505 cm 3 d'eau afin d'épuiser les molécules de poids moléculaire 24 heures et obtient 759 mg de l'antigène cherché. Analyse: Spectre UV dans eau/présence de dioxane. i max 325 nm E = 125 infl 339 nm E = 98 Dichroisme circulaire dans eau/Drésence de dioxane. max 209 nm AE 1 = -0,350 max 220 m a El = -0,305 max 335 nm N E 1 = -0, 020 Ce produit contient 24 à 25 groupes de stéroides liés par mole. b) Antigène à partir de 17 o thyloxime isomère anti. En procédant comme décrit sous a) de l'exemple 3 (stades A, B et C) en partant de 170 mg de 17 boxyméthyloxime isomère anti et de 690 mg de BSA, on obtient 912 mg d'antigène cherché Ce produit contient 22 à 23 groupes de stéroides liés par mole. Analyse: Spectre UV dans eau/présence de dioxane. max 325 nm E = 111 infl 340 nm E 1 = 89 Dichroisme circulaire max 213 nm AE 1 = -0,328 max 223 nm &E = -0,324 max 305 nm AE 1 = -0,010 max 316 nm &E 1 = -0,009 E 1 = max 351 nm AE 1 = b 01 25375 6 Exemple 4: Antigène à partir de 17 "-hydroxy 4,9,11-trien-3- carboxyméthyloxime isomère syn et d'albumine sérique bovine (BSA). En procédant comme décrit à l'exemple 3 (Stades A, B et C), en partant de 170 mg de 17 C-hydroxy 4,9,11-trien-3-carboxy méthyloxime isomère syn et de 690 mg de BSA, on obtient 902 mg d'antigène cherché Ce produit contient 22 à 24 groupes de stéroidesliés par mole. Analyse: Spectre U V dans eau/présence de dioxane. Max 325 nm E 1 = 118 Infl 340 nm 1 100. i Dichroisme circulaire. Max 210 nm e E 1 = -0,396 Max 222 nm & E 1 = -0,010; Max 317 nm A E 1 = 0,009 Max 351 nm E = + 0,012. En procédant comme décrit dans l'exemple 3 ci-dessus, on prépare: L'antigène à partir du 17 M-hydroxy 4,9,11 trien-3-carboxy méthyloxime isomère syn et de BSA. De même, les antigènes peuvent d'une manière analogue être préparés àpartir des mélanges d'isomères syn et anti, décrits dans l'exemple 1, des 17 -hydroxy et de 17 g(-hydroxy-4,9,11- trien-3-carboxyméthyloximes et de BSA. En outre, de la même manière comme décrit ci-dessus, on peut préparer également les antigènes par conjugaison de l'albumine sérique humaine (HSA) avec les mélanges d'isomères syn et anti des 17,-hydroxy et 17 "hydroxy 4,9,11-trien-3-carboxyméthyl oximes, ainsi qu'avec chacun des isomères syn ou et/anti isolés desdits composés stéroides, préparés selon les' exemples 1 et 2. Exemple 5: 17 k-hydroxy 4,9,11-trien-3-carboxyméthyloxime couplé. A 1 '( 125), histamine sous forme de mélange d'isomèressyn et anti, sous forme d'isomère syn et sous forme d'isomère anti. Préparation d'anhydride mixte. On dissout sous agitation et sous atmosphère inerte,2,4 mg 17 A-hydroxy 4, 9,11-trien-3-carboxyméthyloxime, sous forme de mélange d'isomères syn et anti dans 50 cm 3 de tétrahydrofuran, puis ajoute sous refroidissement l Ocm 3 de mélange tri-n-butyl- amine/tétrahydrofuran ( 1/5) et -O 10 cm 3 de mélange chloroformiate d'isobutyl/tétrahydrofuran ( 1/10). Après une demi-heure d''agitation sous refroidissement, on ajoute 3,4 cm 3 de tétrahydrofuran On obtient la solution d'anhydride mixte de 17/-hydroxy 4,9,11-trien-3-carboxyméthyl- oxime sous forme de mélange d'isomères syn et anti, que l'on utilise tel quel pour le stade suivant. Iodation de l'histamine A 10 /tl d'une solution d'histamine 2 m M dans une solution tampon de phosphate de sbdium 0,5 M de p H 8, on ajoute succes- sivement 1 m Ci de iodure 125 de sodium 2000 Ci/mmol et 50 1 g de chloramine T dans 10 /l d'eau distillée, on agite le mélange réactionnel pendant 90 secondes environ, ajoute 300 pg de métabisulfite de sodium dissout dans 10 1 d'eau distillée et obtient une solution aqueuse de produit cherché Rf = 0,1 (chromatographie sur silice, système de solvant méthanol/triéthylamine ( 98/2) que l'on utilise telle que pour la suite: Condensation: On ajoute à cette solution d'histamine iodée,50 /4 l d'anhydride mixte, précédemment préparée, agite et abandonne à l'obscurité sous refroidissement proche de 4 C pendant une heure environ. On dilue ensuite le mélange réactionnel dans 0,4 cm 3 de solu- tion aqueuse de bicarbonate de sodium 0,1 M, extrait par 1,5 cm 3 de chlorure de méthylène, concentre la phase organique et ob- tient le produit cherché sous forme de mélange de ces isomères syn et anti On sépare les isomères par chromatographie, liquide à haute pression avec élution par le mélange chlor-oforme/méthanol ( 97/3) On obtient un premier pic comportant le conjugué de l'isomère antide temps de rétention de 38 minutes, et un deuxième pic comportant le conjugué de l'isomère syn, de temps de rétention de 42 minutes. Le conjugué de l'isomère anti présente une activité totale de Ci et le conjugué de l'isomère syn présente une activité totale de 50 -Ci. Exemple 6: 17 -hydroxy 4,9,11-trien-3-carboxyméthyloxime coupléeà 1 '( 125 I) histamine sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn et sous forme d'isomère anti. En procédant comme décrit dans l'exemple 5, on prépare au départ de 2,4 mg de 17 o dans cm 3 de tétrahydrofuran et de 10 cm 3 de mélange chlorofor- miate d'isobutyl/tétrahydrofuran ( 1/10),une solution d'anhydride mixte correspondant. On prépare d'autre part, une solution d'histamine iodé 125 à partir de 10 Al d'une solution d'histamine 2 m M dans une solu- tion tampon de phosphate de sodium 0,5 M de p H 8, 1 m Ci et /g dechloramine T dans 10 b 1 d'eau distillée On chromatogra- phie sur silice la solution résultante (système d'éluants: méthanol/triéthylamine ( 98/2) et obtient la solution comportant l'histamine iodée Rf = 0,1. On condense comme décrit à l'exemple 5, 50 /-1 de solution d'anhydride mixte et la solution d'histamine iodéee ci-dessus et obtient le produit cherché sous forme de mélanges d'isomères syn et anti. On sépare ces isomères par chromatographie liquide à haute performance (élution par le mélange chloroforme/méthanol ( 97/3). On obtient un premier pic comportant le conjugué de l'isomère anti de temps de rétention de 34 minutes et un deuxième pic comportant le conjugué de l'isomère syn de temps de rétention de 42 minutes. Le conjugué de l'isomère anti présente une activité totale de Ci et le conjugué de l'isomère syn présente une activité totale de 150/Ci. 25375 e 6 REVENDICATIONS 1. Produits estratriéniques marqués à l'iode 125 ou 131 sous forme d'isomères syn ou anti, ou sous formes de mélange d'iso- mères syn et anti, de formule générale (I): Ni 1 OR N - 6 H 2 b= O IH-R 1 dans laquelle les lignes ondulées signifient que la fonction OR peut être en position " ou et que la fonction oxime peut être en position syn ou anti, formule dans laquelle R représente de l'hydrogène, un groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un groupement acyle d'un acide carboxylique ayant de 2 à 12 atomes de carbone et R 1 repré- sente le reste d'un acide aminé R 1 NH 2 ou le reste d'un dérivé de ce dernier, ce reste possédant un groupe accepteur d'iode et marqué 125 131 étant marqué à l'iode 125 ou 131 2. Produits estratriéniques radioactifs marqués à l'iode de formule générale (I) selon la revendication 1 dans laquelle R 1 représente le reste d'un acide aminé R 1 NH 2 ou le reste d'un dérivé de ce dernier choisi dans le groupe constitué par l'his- tidine, la tyrosine, l'histidinol, l'histamine, la tyrosine et 131 le tyrosinate de méthylemarqués à l'iode ou 11. 3 La 17 P-hydroxy 4,9,11-trien-3-carboxyméthyloxime sous forme d'isomère syn coupléeà 1 '( 125 I) histamine de formule OH (A N O CH 2 CO NH {l f 125 \N/ dans laquelle l'iode peut être en position 2 ou 5. 4. La 17 f-hydroxy 4,9,11-trien-3-carboxyméthyloxime sous forme d'isomère anti couplée à 1 '( 125) histamine de formule OH OC-CH 2-O-N -0 NH (CH 2)2 2 - r HI 125 N H dans laquelle l'iode peut être en position 2 ou 5. 5. La 17 d-hydroxy 4,9,11-trien-3-carboxyméthyloxime sous forme d'isomère syn coupléeà 1 '( 125 I) histamine de formule N O CH 2 -CO NH (c H 2)2 Il 4 125 \N/ H dans laquelle l'iode peut être en position 2 ou 5. 6 La 17 ç-hydroxy 4,9,11-trien-3-carboxyméthyloxime sous-forme d'isomère anti coupléeà 1 ' ( 125 I) histamine de formule OH o 2 c-c O N NH (CH 2)2 i 125 N H dans laquelle l'iode peut être en position 2 ou 5. 7. La 17-hydroxy ou la 17 o-hydroxy 4,9,1-1-trien-3-carboxymé- thyloxime sous forme de mélange d'isomères syn et anti couplées à 1 '( 125 I) histamine, l'iode pouvant être en position 2 ou 5. 8. Procédé de préparation des produits définis aux revendica- tions 1 à 7, caractérisé-en ce que on fait réagir un produit de formule générale (II): O dans laquelle et dans ce qui suit R a les significations indiquées à la revendication 1, avec un halogénure de car- boxyméthoxylamine en présence d'une base et obtient un produit de formule (IIIA): A N Nt (IIIA) 2 H R 2-o O dans laquelle la ligne ondulée sur l'azote indique que ce pro- duit est sous forme de mélange d'isomères syn et anti et R 2 re- présente de l'hydrogène, puis soit fixe sur la fonction acide de ce produit un groupement activateur de la fonction carbonyle et obtient le produit de formule générale (IIIC): ( c) OR (MIIC) 2 H /0 - R 2 25375 C 6 dans laquelle R 2 représente un groupement activateur de la fonc- tion carbonyle et la ligne ondulée sur l'azote indique que ce produit est sous forme de mélange d'isomères syn et anti/que l'on fait réagir avec un acide aminé accepteur d'iode marqué à l'iode 125 ou 131 ou avec un dérivé d'un tel acide et obtient le produit cherché de formule générale (I), que l'on isole sous forme de mélange d'isomères syn et antique l'on sépare éventuel- lement ces isomères soit soumet le produit de formule générale (IIIA), dans la- quelle R 2 représente de l'hydrogène et la ligne ondulée sur l'azote indique que ce produit est sous forme de mélange d'iso- mères syn et anti, à l'action d'un agent d'estérification pour obtenir un produit de formule générale (IIIB) OR N (IIIB) R O-4 _ -O dans laquelle R 2 représente un groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone, sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sépare lesdits isomères syn et anti, puis saponifie séparément la fonction ester de chacun de ces isomères syn et anti au moyen d'une base forte, pour obtenir des produits de formule générale (III) sous forme d'isomère sy I et sous forme A d'isomère anti, dans laquelle R 2 représente de l'hydrogène, fixe sur la fonction acide de ces derniers un groupement activateur de la fonction carbonyle pour obtenir des produits de formule générale (III), sous forme d'isomère syn et sous forme d'isomè- re anti, dans laquelle R 2 représente le groupement activateur précité que l'on fait réagir avec un acide aminé accepteur d'iode ou avec un dérivé d'un tel acide et obtient le produit cherché de formule générale (I) sous forme d'isomère syn et d'isomère anti séparés. 9 Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'acide aminé accepteur d'iode ou le dérivé d'acide aminé est choisi dans le groupe constitué par l'histidine, la tyrosine, l'histidinol, l'histamine, la tyramine et le tyrosinate de mé- thyle. 10. Procédé selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que l'halogénure de carboxyméthylamine est l'hémihydrochlorure de carboxyméthylamine et on opère sous atmosphère inerte, à l'obscu- rité et en présence de soude. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8, 9 et 10,caractérisé en ce que l'on fixe sur la fonction acide un grou- pement activateur de la fonction carbonyle en faisant agir un halogèno formiate d'alcoyle en présence d'une base tertiaire, en milieu anhydre et sous atmosphère inerte. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications e à 11, caractérisé en ce que l'halogène formiate d'alcoyle est le chlo- roformiate d'isobutyle et on opère en présence de tri-n-butyl- amine. 25375 6 13) Procédé suivant l'une quelconque des revendications 8 à 12, caractérisé en ce que l'agent d'estérification est le diazo- éthane. 14) Procédé suivant l'une quelconque des revendications 8 à 13, caractérisé en ce que l'on saponifie la fonction ester au moyen de la soude méthanolique. ) Procédé suivant l'une quelconque des revendications 8 à 14, caractérisé en ce que l'acide aminé ou son dérivé que l'on fait réagir avec le produit de formule générale IIIC dans laquelle R 2 représente un groupement activateur de la fonction carbonyle, 131 OU% div est l'histamine marquée à l'iode 125 ou 131 et on opère sous atmosphère inerte et à l'obscurité. 16) Procédé suivant l'une quelconque des revendications 8 à 15, caractérisé en ce que le produit de départ étant la 17 A-hydroxy 154,9,11trien 3-one, on obtient le produit de formule: OH N CH 2 T= O NH-(CH 2)2 N 1 H î 125 sous forme de mélange d'isomères syn et anti, ou sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti. 17) Procédé suivant l'une quelconque des revendications 8 à 15, caractérisé en ce que le produit de départ étant le 17 NH (CH 2)2 I I 125 \N/ H sous forme de mélange d'isomères syn et anti, ou sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti. 18) Application des produits tels que décrits aux revendications i à 7, aux dosages radioimmunologiques de 17 A et 174 -hydroxy 54,9,11trien 3-ones dans les liquides et les tissus biologiques et dans l'alimentation humaine et animale. 19) A titre de produits intermédiaires nécessaires pour la préparation des produits de formule générale I selon les reven dications 1 à 7, les produits de formule générale III sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti R Dû (III) N 2 H R 2-0-OO dans laquelle les lignes ondulées signifient que la fonction OR peut être en positions ouïet que la fonction oxime peut être en position syn ou anti et dans laquelle R représente de l'hydrogène, un groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un groupement acyle d'un acide carboxylique ayant de 2 à 12 atomes de carbone, R 2 représente de l'hydrogène, un groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone, un groupement activateur de la fonction alcoyle. ) Produit 5 selon la revendication 19, à savoir: 17 h-hydroxy 4,9,11-trien 3- carhoxyméthyloxime sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn et sous forme d'isomère anti; 17 et sous forme d'isomère anti; - 25375 t 6 17 d -hydroxy 4,9,11-trien 3-carbéthoxyméthyloxime sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn et sous forme d'isomère anti; l'anhydride mixte de 17 k -hydroxy 4,9,11-trien-3-carboxyméthyl- Soxime avec le formiate d'isobutyle sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn et sous forme d'isomère anti: OH z- D û O N O CH 2 O (CH 3)2 CH CH 2 O C % O dans laquelle la ligne ondulée signifie que la fonction oxime lopeut être en position d'isomère syn, en position d'isomère anti ou peut représenter le mélange de ces deux fonctions. l'anhydride mixte de 17 "-hydroxy 4,9,11-trien 3-carboxyméthyl- amine avec le formiate d'isobutyle sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn et sous forme d'isomère anti: OH //" O O N O CH 2 O (CH 3)2 CH CH 2 O C % O dans laquelle la ligne ondulée signifie que la fonction oxime peut être en position d'isomère syn, en position d'isomère anti, ou peut représenter le mélange de ces deux isomères. 21) Application des produits de formule générale III selon la revendication 19, dans laquelle R 2 représente de l'hydrogène à la préparation d'antigènes, caractérisée en ce que l'on 25375 t 6 conjugue un de ces produits avec -de l'albumine sérique bovine (BSA) ou avec de l'albumine sérique humaine (HSA) et obtient l'antigène cherché. 22) Application selon la revendication 21, caractérisée en ce que l'on fait réagir un produit de formule générale IIIA sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti: j/ R (IIIA) N 2 H R 2-0-O- dans laquelle les lignes ondulées et R ont les significations précitées et R 2 représente de l'hydrogène, en vue de l'activa- tion de la fonction carbonyle, avec un halogènoformiate d'alcoyle, en présence d'une base tertiaire, en milieu anhydre et sous atmosphère inerte, obtient l'anhydride mixte correspon- dant, de formule II Ic: R 2 R N ( IIIC) alc étant un radical alcoyle ayant au plus 6 atomes de carbone, que l'on conjugueavec l'albumine sérique bovine (BSA) ou humaine (HSA) et obtient l'antigène cherché. 2 O 23) Application selon la revendication 22, caractérisée en ce que: l'halogénoformiate d'alcoyle est le chloroformiate d'isobutyle et l'on opère en présence de tri-n-butylamine et sous atmos- phère inerte; on fait réagir l'anhydride mixte de formule générale IIIC avec l'albumine sérique bovine (BSA) ou humaine (HSA) en ayant préalablement dissous cette dernière dans un mélange eau-dioxane sous atmosphère inerte. 24) Antigènes constitués par la conjugaison d'un des produits de formule générale III selon la revendication 19, dans laquelle R 2 représente de l'hydrogène avec de l'albumine sérique bovine (BSA) ou avec l'albumine sérique humaine (HSA), à savoir les antigènes de formules: OR I Jo N I NH n BSA dans laquelle N = 20 à 30 et la partie oxime de stéroide est sous forme d'isomère syn, d'isomère anti et sous forme de mélange d'isomères syn et anti: N H 2 1 O II O H S HSA (V) dans laquelle N = 20 à 30 et la partie oxime de stéroide est sous forme d'isomère syn, sous forme d'isomère anti et sous forme de mélange d'isomères syn et anti: t " -OR | /,(z 2 (VI) I BSA dans laquelle N = 20 à 30 et la partie oxime de stéro Ide est sous forme d'isomère syn, sous forme d'isomère anti et sous forme de mélange d'isomères syn et anti: -OR (VII) HO I 5 = O I i T'Ttz -HSA dans laquelle N = 20 à 30 et la partie oxime de stéroide est sous forme d'isomère syn, sous forme d'isomère anti et sous forme de mélange d'isomères syn et anti. ) Application des antigènes selon la revendication 24, à la préparation des anticorps.