FR 2540137 A1 19840803 FR 8401208 A 19840126 i La présente invention concerne un procédé très sensible d'analyse quantitative enzymatique Plus particu- lièrement, l'invention concerne un procédé d'analyse quan- titative dans un échantillon analytique d'un quelconque des composants Lglycéro-3-phosphate (G 3 P), dihydroxyacétone-3- phosphate (DHAP), nicotine adénine-dinucléotide (NAD) et NAD réduit L'invention concerne particulièrement un procé- dé très sensible d'analyse quantitative enzymatique qui comprend la réaction d'un composant de l'échantillon avec un composant constituant une réaction cyclique (I) ci- après pour constituer ladite réaction cyclique comprenant les composants G 3 P, DHAP, glycérophosphate-oxydase (GPO), glycérophosphatedéshydrogénase (GPDH), NAD, NAD réduit, 02 et H 202, 02 GPO H 2 2 G 3 P DHAP () \ NAD GPDH NAD réduit et la mesure quantitative de changements détectables. On connaît à ce jour un procédé de dosage enzyma- tique utilisant une réaction cyclique, telle qu'une réaction cyclique du NAD, du NADP ou du Co A Par exemple, on fait réagir l'alcooldéshydrogénase avec l'éthanol comme substrat en présence de NAD pour former du NAD réduit qui est oxydé en NAD par l'action de la malatedéshydrogénase sur un substrat constitué d'oxalo-acétate pour constituer en tota- lité la réaction cyclique NAD-NAD réduit (Japan Biochem. Soc ED "Experimental Method in Biochemistry", Vol 5, "Research methods in enzymology", p 121-135, Tokyo Kagaku Dojin Publ, Aout 1975, Mori, A Ed "Manual for Assay Methods in Neuro-transmitter", p 165-172, Ishiyaku Publ, Novembre 1979). 2 - On connaît également l'autre procédé suivant. Dans la réaction ci-dessus, on remplace la malate-déshydro- génase par la NAD réduit-oxydase pour constituer une réac- tion cyclique dans laquelle l'oxygène et le NAD réduit sont consommés et de l'H 2 O et du NAD sont produits (Institute for Phys and Chem Sci Ed; "Present and Future of Life- Science", p 30-32, K K Creative Life Sci Res Ass, Mar, 1981) On traite un hydroxystéroide avec l'hydroxystéroide- déshydrogénase pour réduire le NAD en NAD réduit qui est transformé en NAD avec formation de formazane par l'action d'une transférase, telle que la diaphorase, en présence d'un sel de tétrazolium pour constituer une réaction cycli- que (demande de brevet japonais publiée n 56-144096) On traite le glutathion et le déhydro-ascorbate avec la glutathion-déhydroascorbate-oxydo-réductase pour trans- former le déhydroascorbate en ascorbate qui consomme de l'oxygène et forme de l'H 2 O et du déhydroascorbate par action de l'ascorbate-oxydase pour constituer une réaction cyclique (demande de brevet japonais publiée n 56-151498). La réaction cyclique du JAD dans laquelle de l'oxygène est consommé et du peroxyde d'hydrogène est produit par emploi de NAD réduit-oxydase est également connue (demande de brevet japonais publiée n 56-78599). La demanderesse a découvert la réaction cyclique du G 3 P-DHAP utilisant la GPO, qui consomme de l'O 2 et pro- duit de l'H 202 et du DHAP, avec un substrat constitué de G 3 P et, de plus, de la GPDH qui consomme du NAD réduit et produit du NAD et du G 3 P, avec le DHAP comme substrat On peut se procurer ces composés réagissants à bas prix et avec une bonne qualité et, de plus, on peut obtenir une réaction cyclique efficace malgré la coexistance d'H 202 à caractère oxydant et de NAD réduit à caractère réducteur. De plus, la Demanderesse a découvert que dans la réaction cyclique, si l'on fait réagir l'un quelconque des compo- sants d'un échantillon contenant du G 3 P, du DHAP, du NAD 2 5 4 0 1 3 7 -3- et du NAD réduit avec un autre composant restant et qu'on effectue plus de dix cycles par minute en mesurant quanti- tativement des changements détestables produits dans la réaction On peut détecter de façon simple et sensible, avec une bonne précision, le composant contenu dans l'échantillon. Un des buts de l'invention est de fournir un procédé d'analyse d'un quelconque des composants G 3 P, DHAP, NAD ou NAD réduit contenu dans un échantillon, ce nouveau procédé d'analyse quantitative enzymatique très sensible comprenant la réaction d'un composant de l'échan- tillon avec un composant constituant une réaction cyclique (I) pour réaliser la réaction cyclique (I) ci-dessous comportant du G 3 P, du DHAP, de la GPO, de la GPDH, du NAD et du NAD réduit, de l'02 et de l'H 202 2 GPO F 2 C 2 G 3 P _ __DE___ _(I) NAD GP Dw NAD -réduit et la mesure quantitative de changements détectables. Des exemples d'échantillon sont un échantillon contenant l'un quelconque des composants G 3 P, DHAP, NAD ou NAD réduit ou qui libère ou produit ledit composant Dans ce dernier cas, on peut mentionner la détermination de l'activité enzymatique ou de la quantité de substrat dans diverses réactions enzymatiques Des exemples en sont illus- trés ci-dessous. Des systèmes réactionnels enzymatiques qui libè- , rent ou produisent du G 3 P sont les suivants: -4- ( 1) Un système réactionnel pour la détermination du phosphatidylglycérol dans le liquide amniotique pour l'examen de la fonction respiratoire du foetus à terme Un échantillon contenant du phosphatidyl- glycérol (PG), tel que le liquide amniotique, est traité avec de la phospholipase C (EC 3 1 4 3) pour libérer un diglycéride et du G 3 P et le G 3 P est dosé. PG + H 20 diglycéride + G 3 P phospholipase C ( 2) Un système de dosage du G 3 P libéré par un système enzymatique constitué d'ATP, de glycérol et de glycérokinase (GK, EC 2 7 1 30) pour la détermination de l'ATP ou du glycérol ou la détermination de l'activité de la glycérokinase: Mg ATP + glycérol 'ADP + G 3 P GK ( 3) Dans le système réactionnel ( 2) ci- dessus, le glycérol est fourni par la réaction enzymatique du PG et de la phospholipase D (ED 3 1 4 4) et on dose le PG ou l'activité de la phospholipase: PG + H 2 O +phosphatidate + glycérol phospholipase D ++ Mg glycérol + ATP ADP + G 3 P GK ( 4) Dans le système réactionnel ( 2) cidessus, le glycérol est fourni par réaction enzymatique de mono-, di ou tri-glycéride et de lipase (EC 3 1 1 3) et on dose un glycéride, tel qu'un triglycéride, dans le sérum ou une lipase, telle que la lipase pancréatique, dans le sérum: - glycéride + N H 20 acide gras + glycérol lipase (n 1 dans un monoglycéride, N = 2 dans un diglycéride, n = 3 dans un triglycéride) ++ mg glycérol + ATP ADP + G 3 P GK ( 5) Dans le système réactionnel ( 2) ci-dessus, l'ATP est fourni par un système réactionnel enzymatique constitué de créatine-phosphate, d'ADP et de créatine- kinase (CK, EC 2 7 3 2) et on mesure la créatine-phosphate ou l'activité de la créatine-kinase (CK): M++ créatine-phosphate + ADP g créatine + ATP CK ATP + glycérol Mg + ADP + G 3 P GK ( 6) Dans le système réactionnel-{ 2), l'ATP est fourni par un système réactionnel enzymatique constitué de phospho-énolpyruvate, d'ADP et de pyruvate-kinase (PK, EC 2 7 1 40) et on dose le phospho-énolpyruvate ou on détermine l'activité de la pyruvatekinase: À ++ phospho-énolpyruvate + ADP Mg pyruvate + ATP PK ATP + glycérol M++ ADP + G 3 P GK ( 7) Dans le système réactionnel ( 2) cidessus, 1 'ATP est fourni par un système réactionnel enzymatique constitué d'acétylphosphate, d'ADP et d'acétate-kinase (EC 2 7 2 1): Mg acétylphosphate + ADP Mg acetate + ATP ++ acétate-kinase ATP + glycérol M 9 ADP + G 3 P GK 254 a 137 -6 - ( 8) Dans le système réactionnel ( 2) ci-dessus, l'ATP est fourni par un système réactionnel enzymatique constitué de 4-phospho-L-aspartate, d'ADP et d'aspartate- kinase (Asp K, EC 2 7 2 4): ++ Mg 4-phospho-L-aspartate + ADP, Laspartate + ATP Mg++ Asp K ATP + glycérol, ADP + G 3 P GK ( 9) Dans le système réactionnel ( 2) ci-dessus, l'ATP est fourni par l'argininephosphate, l'ADP et l'arginine-kinase (Arg K, EC 2 7 3 3): ++ Mg argininephosphate + ADP L-arginine + ATP Mg++ Arg K Mg ATP + glycérol ADP + G 3 P GK Un système réactionnel enzymatique qui libère ou produit du DHAP est illustré comme suit. ( 1 OG) Un système réactionnel pour la mesure d'un cétose-1-phosphate ou la détermination de l'activité de l'aldolase par dosage du DHAP qui est libéré ou produit par un système réactionnel enzymatique constitué de cétose-1-phosphate (K-1-P) et d'aldolase (EC 4 1 2 7): K-1-P aldéhyde + DHAP aldolase ( 11) Un système réactionnel pour la mesure du D-glycéroaldéhyde-3-phosphate ou le dosage de la triose- phosphate-isomérase par dosage du DHAP qui est libéré ou produit par un système réactionnel enzymatique constitué -7- de D-glycéroaldéhyde-3-phosphate et de triphosphate- isomérase (TPI, EC 5 3 1 1): D-glycéroaldéhyde-3-phosphate DHAP TPI. De plus, un système réactionnel enzymatique qui libère ou produit du NAD réduit est illustré ci-après. Dans ce système réactionnel, le NAD restant n'ayant pas réagi doit être décomposé après achèvement de la réaction par chauffage à 10 C pendant 10 minutes dans des conditions alcalines telles qu'un p H supérieur à 12. ( 12) Un système réactionnel pour la mesure de l'éthanol ou la détermination de l'activité de l'alcool- déshydrogénase par dosage du NAD réduit qui est libéré ou produit par un système réactiohnel enzymatique constitué d'éthanol, de NAD et d'alcooldéshydrogénase (ADH, EC 1.1 1 1): éthanol + NAD) acétaldéhyde + NAD réduit ADH ( 13) Un système réactionnel pour la mesure d'un 3-4-hydroxystéroide dans les acides biliaires ou la déter- mination de la 3-a-hydroxystéroide-déshydrogénase par dosage du NAD réduit qui est libéré ou produit par un système réactionnel enzymatique constitué de 3-a-hydroxy- stéroide, de NAD et de 3-a-hydroxystéroide-déshydrogénase (HSDH, EC 1 1 1 50): 3-a-hydroxystéroide + NAD - 3-cétostéroide + NAD réduit HSDH 8 - ( 14) Un système réactionnel pour la mesure du L-lactate ou la détermination de l'activité de la lactate- déshydrogénase par dosage du NAD réduit qui est libéré ou produit par un système réactionnel enzymatique constitué de L-lactate, de NAD et de lactate-déshydrogënase (LDH, EC 1 1 1 27): L-lactate + NAD pyruvate + NAD réduit LDH ( 15) Un système réactionnel pour la mesure du glucose ou la détermination de l'activité de la glucose- déshydrogénase par dosage du NAD réduit qui est libéré ou produit par un système réactionnel enzymatique cons- titué de glucose, de NAD et de glucose-déshydrogénase (GDH, EC 1 1 1 47): glucose +NAD D-glucono-6-lactone + NAD réduit GDH De plus, un système réactionnel enzymatique qui libère ou produit du NAD est illustré ciaprès Dans ce système réactionnel, le NAD réduit n'ayant pas réagi restant doit être décomposé après achèvement de la réac- tion par chauffage à 50 C pendant plus de 3 minutes à un p H inférieur à 2 et neutralisé pour permettre le dosage du NAD. ( 16) Un système réactionnel pour la mesure de la proline ou la détermination de la D-proline-réductase par dosage du NAD qui est libéré ou produit par un système réactionnel enzymatique constitué de proline, de NAD ré- duit et de D-proline-réductase (PR, EC 1 4 1 6): proline + NAD réduit) 5aminovalerate + NAD PR -9- ( 17) Un système réactionnel pour la mesure de la L-cystine ou le dosage de l'activité de la cystine- réductase par dosage du NAD qui est libéré ou produit par un système réactionnel enzymatique constitué de L-cystine, de NAD réduit et de cystine-réductase (CR) (EC 1 6 4 1): L-cystine + NAD réduit 2-L-cystéine + NAD CR Les systèmes réactionnels enzymatiques ci-dessus ne sont qu'illustratifs et les échantillons analytiques peuvent être choisis de plus avec addition d'un ou plusieurs autres systèmes réactionnels pouvant libérer ou produire un quelconque des composants correspondant aux systèmes réac- tionnels ci-dessus. On ajoute à l'échantillon contenant l'un quel- conque des composants à doser dans ces systèmes réaction- nels enzymatiques, les réactifs nécessaires pour que le système réactionnel enzymatique fonctionne Ce mélange réactionnel peut être un échantillon contenant un compo- sant quelconque constitué de G 3 P, DHAP, NAD ou NAD réduit. Ces systèmes réactionnels peuvent être préparés et peuvent fonctionner individuellement ou simultanément avec la réaction cyclique (I). La quantité d'échantillon peut être de 0,05 à ml et la réaction s'effectue par mélange avec une solu- tion tampon faiblement acide à faiblement alcaline conte- nant les réactifs nécessaires à 30 'C pendant généralement plus d'une minute La quantité des réactifs à ajouter n'est pas limitée mais, généralement, elle est en excès par rapport au composant à doser. La réaction cyclique de la présente invention est illustrée par le schéma (I) précédent. - Dans la réaction (I), une mole de G 3 P est transformée par consommation d'une mole d'O 2, générale- ment d'oxygène dissous, en une mole de DHAP avec forma- tion d'une mole d'H 202 sous l'effet de la GPO (GPO: voir le brevet US n 4 275 161) pour constituer le système réactionnel de type GPO, puis une mole de DHAP est ensuite transformée sous l'effet de la GPDH (EC 1.1 1 8) en présence d'une mole de NAD réduit en une mole de G 3 P avec formation d'une mole de NAD pour cons- tituer le système réactionnel de type GPDH. De plus, le G 3 P ainsi produit est transformé en DHAP pour constituer le système réactionnel de type GPO, ce qui établit la réaction cyclique Ladite réaction cyclique (I) s'effectue en présence des six composants G 3 P, DHAP, GPO, GPDH, NAD réduit et 02, cependant le G 3 P et le DHAP peuvent être formés l'un par l'autre par la réaction cyclique et, par conséquent, on peut utiliser de préférence l'un quelconque d'entre eux. De plus, dans la réaction cyclique (I), l'H 202 et le NAD réduit peuvent être unis pour former du NAD, si bien qu'une mole d'H 202 et une mole de NAD réduit sont consommées pour former deux moles d'H 20 et une mole de NAD sous l'effet de la NAD-peroxydase (EC 1 11 1 1) (J Biol Chem, 225:557, 1957) comme illustré par la réaction (II) ci-dessous. 02 GPO HXO 2 2 i / 2 2 > NAD-Deroxydasi G 3 P DP P j( I NAD GD Hr NAD réduit 220 NADI Dans la réaction cyclique (II), l'H 202 produit par la réaction cyclique (I) est consommé par du NAD ré- duit pour former du NAD, si bien que deux moles de NAD réduit sont consommées dans chaque cycle de la réaction 11 - cyclique (II), ce qui double l'importance des variations du NAD réduit et accroît la sensibilité du procédé d'ana- lyse. Sinon, le NAD peut être transformé par une autre déshydrogénase (seconde déshydrogénase) et son substrat en NAD réduit pour constituer une réaction cyclique de type NAD constituée de NAD, de la seconde déshydrogénase et de son substrat Cette réaction cyclique de type NAD peut être associée à la réaction cyclique (I), comme illustré par la réaction (III) ci-dessous. 02 GPO E DHAP G 3 PA NAD GPDE NAD réduit Par exemple, un composant de l'échantillon (représenté par m"a) et un composant entrant dans la réaction cyclique (I) (représenté par ô) peuvent être illustrés comme suit. (a) Composants de l'échantillon; G 3 P Mi i GPC > DHAP " -D G 3 ? Dii A (Ia) AD ID | INAD réduit 1 Dans la réaction cyclique (Ia), dans laquelle le composant de l'échantillon est le G 3 P, on utilise comme composant de la réaction cyclique GPO, GPDH, 2 et 12 - NAD réduit La GPO catalyse une réaction dans laquelle le- G 3 P est un substrat, qui consomme une mole de G 3 P et d'O 2 et forme une mole d'H 202 et de DHAP De plus, la GPDH agit sur le substrat de DHAP pour consommer une mole de DHAP et de NAD réduit et former une mole de G 3 P et de NAD en cons- tituant ainsi une réaction cyclique de type G 3 PDHAP Dans la réaction, 1102 peut être apporté par de l'oxygène dis- sous dans le système et la GPO, la GPDH et le NAD réduit doivent être apportés en excès comme réactifs analytiques. La quantité du G 3 P dans l'échantillon n'est pas limitée mais, naturellement, on dilue lorsque la concentration est élevée. La quantité de GPO et de GPDH dépend de la quantité de G 3 P dans l'échantillon et elle est généralement supérieure à 0,1 unité par détermination, de préférence de 2 à 50 unités pour la GPO, et 0,5-40 unités pour la GPDH La quantité de NAD réduit peut être en excès du produit de la quantité de G 3 P dans l'échantillon et du nombre de cycles et elle est généralement en excès par rapport à la quantité de G 3 P, par exemple en excès de 50 et de préférence de 100 à 1000 fois On peut déterminer quantitativement des chan- gements détectables après achèvement de la réaction cycli- que par la quantité d'O 2 ou de NAD réduit consommée ou d'H,20 produite Comme le montre la réaction cyclique (II) ci-dessus, 1 'H 2 2 produit et le NAD réduit consommé peuvent être couplés pour que l'analyse soit très sensi- ble Dans cette réaction couplée, on utilise généralement la NAD-peroxydase à raison de plus de 0,5 unité par déter- mination, de préférence de 1 à 20 unités On peut de pré- férence déterminer quantitativement les changements détec- tables par mesure du NAD réduit consommé. (b) Composant de l'échantillon; DHAP Le schéma réactionnel est illustré en (Ib) ci-dessous. 13 - NAD rdui t HFNAD G 3 P (lb) DHALP ( 1 b F,"C 2 i G?O; t 3 Les composants constituant la réaction cyclique (Ib) sont GPO, GPDH, 2 et NAD réduit Dans la réaction, le cycle de type DHAP-G 3 P s'établit par consommation d'une mole de DHAP et de NAD réduit avec formation d'une mole de NAD et de G 3 P puis consommation d'une mole de G 3 P et d'O 2 pour former une mole d'H 2 2 et de DHAP L'O 2 peut être apporté par de l'oxygène dissous et on ajoute donc simplement un excès de GPO, de GPDH et de NAD réduit La quantité de GPDH et de GPO est généralement supérieure à 0,1 unité, de préférence de 5 à 40 unités pour la GPDH et de 1 à 50 unités pour la GPO La quantité de NAD ré- duit à utiliser est déterminée par le produit de la quantité de DHAP dans l'échantillon et le nombre de cycles, et est en général en excès par rapport à la quantité de DHAP, par exemple en excès de 50 fois et de préférence de 100 à 1000 fois On peut déterminer quanti- tativement les changements déte ctables après achèvement de la réaction cyclique par l'oxygène ou le NAD réduit consom- mé ou l'H 202 produit On peut effectuer une analyse très sensible par emploi de la NAD-peroxydase, comme précédem- ment illustré. (c) Composant de l'échantillon; NAD réduit La réaction cyclique peut être illustrée par le schéma (Ic) ci-dessous. 25430 37 14 - substrat NAD 22 oxydé réduit seconce- (dé shydro-GPDE I Ce__ genase (Ic) substrat ae NAD t | la seconde13 P r déshydro 3 LL génase Dans la réaction, on utilise comme composants constituant la réaction cyclique (Ic) le DHAP, la GPO, la GPDH, une seconde déshydrogénase, un substrat pour la seconde déshydrogénase et 02 et une mole de NAD réduit et le DHAP est consommée pour former une mole de NAD et de G 3 P sous l'effet de la GPDH sur le NAD réduit De plus, la GPO agit sur le G 3 P par consommation d'une mole de G 3 P et d'O, pour former une mole d'H 202 et de DHAP Une réaction cyclique de type DHAP-G 3 P peut donc se constituer Simul- tanément, le NAD formé à partir du NAD réduit sous l'effet de la GPDH est transformé sous l'action de la seconde déshydrogénase avec une quantité équimoléculaire de substrat de la seconde déshydrogénase et formation de quantités équimoléculaires de NAD réduit et de produit d'oxydation Ledit NAD réduit retourne ainsi dans la réaction cyclique de type DHAP-G 3 P L'O 2 peut être apporté par l'oxygène dissous dans le système et il suffit donc d'ajouter un excès de DHAP, de GPO, de GPDH, de la seconde déshydrogénase et de son substrat. On peut déterminer quantitativement les change- ments détectables par mesure de l'02 et du NAD réduit consommés et de l'H 202 produit. - (d) Composant de l'échantillon; NAD: La réaction cyclique est illustrée en (Id) ci-dessous. substrat |DEAP| oxydé 1 ND 2 secon Ye NA Date N d eshydroé( réduit lgénase y Gp Oj (Id) substrat de / la seconde / \\ /déshydro-: /lAD. génase AD G 3 p On utilise comme composants de la réaction cyclique (Id) du DHAP, de la GPDH, de'l'02, une seconde déshydrogénase et un substrat de la seconde déshydro- génase Dans la réaction, la seconde déshydrogénase agit sur le NAD et une mole de NAD et une mole de substrat de la seconde déshydrogénase sont consommées pour produire une mole du produit d'oxydation et de NAD réduit puis le NAD réduit retourne dans la réaction cyclique de type DHAP-G 3 P La GPDH agit sur le NAD réduit produit et une quantité équimoléculaire de DHAP pour former une mole de NAD et de G 3 P et, de plus, une mole de G 3 P et une mole d'O 2 sont consommées sous l'effet de la GPO pour former une mole d'H 202 et de DHAP Dans la réaction, l'02 peut être apporté par l'oxygène dissous dans le mélange, si bien qu'on apporte comme réactif analytique des excès de DHAP, de GPO, de GPDH, de la seconde déshydrogénase et de son substrat La détermination quantitative des chan- gements détectables peut être effectuée par mesure de 1 '02 consommé ou de l'H 202 produit. La seconde déshydrogénase utiliséedans les réactions cycliques (Ic) et (Id) peut être une enzyme 16 - qui catalyse une réaction à partir d'un substrat de ladite déshydrogénase et du NAD pour former le produit d'oxyda- tion dudit substrat et du NAD réduit et des exemples en figurent ci-dessous. ( 18) Déshydrogénase: D-arabitol-déshydrogénase (A Dase) (EC 1 1 1 11) et son substrat, le D-arabitol: D-arabitol + NAD) D-xylose + NAD réduit A Dase ( 19) Lactate-déshydrogénase (LDH) (EC 1 1 1 27) et L-lactate: Llactate + NAD pyruvate + NAD réduit LDH ( 20) Malate-déshydrogénase (décarboxylante) (MDH) (EC 1 1 1 28) et L-malate: L-malate + NAD pyruvate + C 02 + NAD réduit MDH ( 21) Glucose-déshydrogénase (GDH) (EC 1 1 1 47) et glucose: B-D-glucose + NAD D-glucono-6-lactone + NAD réduit GDH ( 22) 3-a-hydroxystéroide-déshydrogénase K-HSDH) (EC 1 1 1 50) et 3-a-stéroide, tel que l'andostérone, et un cholate: 3-a-hydroxystéroide +NAD 3cétostéroide +NAD réduit a-HSDH ( 23) Formiate-déshydrogénase (FDH) (EC 1 2 1 2) et formiate: formiate + NAD CO 2 + NAD réduit FDH ( 24) Galactosedéshydrogénase (Gal DH) (EC 1 1 1 48) et D-galactose: D-galactose Dgalactose-y-lactone + NAD réduit Gal DH 17 - ( 25) S-hydroxystéroïdedéshydrogénase (S-HSDH) (EC 1 1 1 51) et 3-6-hydroxystéroide: 3-Bhydroxystérolde +NAD 3-cétostéroïde +NAD réduit S-HSDH Dans la réaction cyclique (Id), le NAD de l'échantillon est transformé en NAD réduit sous l'effet de la seconde déshydrogénase en présence de son substrat pour former la réaction cyclique de type NAD, puis le NAD réduit ainsi formé participe à la même réaction cyclique qu'en (Ic) précédemment. La quantité de réactifs utilisée dans les réactions cycliques (Ic) et (Id) peut être un excès par rapport à la quantité de NAD ou de NAD réduit De plus, ladite réaction cyclique de type NAD peut être couplée par l'action de la NAD-peroxydase, comme illustré dans la réaction cyclique (II). Donc, l'un quelconque des composants G 3 P, DHAP, NAD ou NAD réduit de l'échantillon ou d'un échantillon qui libère ou produit ledit composant est mesuré et ledit composant ou échantillon peut être analysé par emploi des réactions cycliques (Ia), (Ib), (Ic) ou (Id) ci-dessus. Dans la réaction, le nombre des cycles de réactions dépasse 10, si bien que la quantité de réactifs utilisée est de préférence un excès molaire par rapport à ce nombre de cycles et, de plus, on utilise de façon avantageuse des quantités d'échantillons correspondant à des traces ou un échantillon dilué Le milieu réactionnel peut être une solution stable tamponnant le p H, généralement faiblement acide à faiblement alcaline, par exemple un tampon phosphate à p H 6,5-8,5, un tampon Tris-H Cl, un tampon imidazole-H Cl, un tampon glutarate de diméthyl-Na OH ou un tampon PIPES- Na OH La réaction s'effectue généralement à 370 C en plus d'une minute. La réaction cyclique (I) s'effectue généralement à plus de 50 cycles par minute, bien que cette fréquence 18 - varie avec la quantité d'enzyme utilisée et sa Km, si bien que la quantité d'enzyme et de réactifs peut être déterminée pour que la réaction s'effectue de préférence à plus de 80 cycles/minute On mesure ensuite après achèvement de la réaction des changements détectables apparus dans la réaction et ces changements détectables correspondent à un composant dont une mole est consommée ou produite dans un cycle de réaction cyclique (I) ou une mole de G 3 P ou de DHAP est consommée ou produite De préférence, on détermine l'02 ou le NAD réduit consommés ou l'H 202 produit. La quantité d'O 2 consommée peut généralement être déterminée par des modifications électrochimiques avec une électrode à oxygène La quantité de NAD réduit consommée peut -tre déterminée par soustraction de la quantité restante de NAD réduit à la fin de la réaction de la quantité initiale de NAD réduit La mesure de cette quantité de NAD réduit peut être effectuée selon diverses méthodes de dosage connues On mesure par exemple l'absor- bance spécifique du NAD réduit et l'absorbance non spécifique du NAD Comme le NAD a un maximum d'absorption spécifique de 260 nm et le NAD a des maximums d'absorption à 260 nm et à 340 nm, on mesure l'absorbance à 320-360 nm et de préférence à 340 nm pour déterminer le NAD réduit. Une autre méthode de détermination du NAD réduit est un dosage colorimétrique utilisant un chromogène de trans- port d'électron ayant un accepteur d'électron du NAD réduit. Des exemples de chromogènes à transport d'électron sont un sel de tétrazolium, tel que le chlorure de 3-(p-iodophényl)-2-(p-nitrophény D 2)-5-phényl- 2 H-tétrazolium, le bromure de 3-( 4,5-diméthyl-2-thiazolyl)- 2,5-diphényl-2 H-tétrazolium, le 3,3 '-( 4,4 '-biphénylène/- bis-(chlorure de 2,5-diphényl-2 H-tétrazolium), le 3,3 '- 19 - ( 3,3 '-diméthoxy-4,4 '-biphénylène)-bis-lchlorure de (p- nitrophényl)-5-phényl-2 H-tétrazolium J (ou nitrotétra- zolium: NTB), le 3,3 '-( 3,3 '-diméthoxy-4,4 '-biphénylène)- bis-lchlorure de 2,5-bis-(p-nitrophényl)-2 H-tétrazolium_ et le 3,3 '-( 3, 3 '-diméthoxy-4,4 '-diphénylène)-bis- (chlorure de 2,5-diphényl-2 H-tétrazolium), et le 2,6- dichlorophénol-indophénol Un exemple préférable est une combinaison d'un sel de tétrazolium soluble dans l'eau et de diaphorase ou de méthosulfate de phénazine Ce chromo- gène à transport d'électron est un accepteur d'électron du NAD réduit quiforme un pigment coloré de type formazane et on mesure par colorimétrie le pigment ainsi formé à son maximum d'absorption, tel que 500- 550 nm. Un autre procédé de dosage du NAD réduit est la fluorométrie dans laquelle on traite le NAD réduit par la diaphorase en présence d'un réactif fluorescent, tel que la résazurine Pour la détermination du NAD réduit dans la réaction cyclique (I), 1 'H 202 doit de préférence être décomposé et éliminé par la catalase De la NAD-peroxydase (EC 1 11 1 1) peut être ajoutée dans la réaction cyclique (I) pour doubler la sensibilité comme illustré par le système réactionnel (II) précédent L'H 202 formé peut être mesuré à partir de changements électrochimiques par emploi d'une électrode au peroxyde d'hydrogène ou sous forme d'un produit détectable par réaction d'un indica- teur et d'H 202 Des exemples d'indicateurs sont des réactifs que l'on peut mesurer par spectrophotométrie, tels qu'un indicateur coloré, un réactif fluorescent ou un réactif luminescent. L'invention fournit donc un nouveau procédé de dosage utilisant une réaction cyclique de type G 3 P-DHAP avec plus de 10 cycles par minute pour mesurer un com- posant d'un échantillon avec une bonne précision et une grande sensibilité. L'invention sera mieux conmprise à la lecture des exemples non limitatifs suivants faite en regard des dessins annexés dans lesquels: La Figure 1 est une courbe tative de 1 'ATP ou du glycérol; La Figure 2 est une courbe tative de 1 'ATP selon une réaction non La Figure 3 est une courbe tative du G 3 P ou du DHAP; La Figure 4 est une courbe tative du tative de oxygène; d'analyse quanti- d'analyse quanti- cyclique; d'analyse quanti- d'analyse quanti- G 3 P avec emploi de NAD-peroxydase; La Figure 5 est une courbe d'analyse quanti- l'ATP ou du G 3 P avec emploi d'une électrode à * La Figure 6 est une courbe d'analyse quanti- tative de i'ATP ou du G 3 P avec emploi d'une électrode à peroxyde d'hydrogène; - La Figure 7 est une courbe d'analyse quanti- tative de la créatine-kinase; La Figure 8 est une courbe d'analyse quanti- tative du phosphatidylglycérol; et La Figure 9 est une courbe d'analyse quanti- tative du DL-G 3 P selon la méthode du point final. EXEMPLE 1 Mélange réactionnel ( 1,0 ml): Tampon phosphate (p H 7,5)50 m M Glycérol 10 m M Mg C 12 10 mr Glycérokinase (Toyo Jozo Co, produite à partir de Streptomyces): 2 unités/détermination GPO (Toyo Jozo Co, produite à partir d'Aerococcus): unités/détermination NAD réduit 0,25 m M GPDH (produit du commerce: muscle de lapin): 8 unités/ détermination. 254 137 21 - On ajoute 1,0 ml de mélange réactionnel ci-dessus dans une cuve de quartz ( 1,0 ml) et on place dans un spectrophotomètre comportant un portoir de cuve à tempé- rature constante réglé à 37 C. On ajoute 20 Al d'échantillon contenant de l'ATP (respectivement 0, 10, 20, 30, 40 et 50 g M) et on incube à C On mesure à 340 nm les variations de l'absorbance à 340 nm en 2 minutes entre la troisième et la cinquième minute suivant le début de la réaction Les résultats qui sont illustrés par la Figure 1 (o-o) montrent que la détermination est très sensible. Dans le mélange réactionnel ci-dessus, on remplace le glycérol par 5 m M d'ATP et on incube une solution contenant des traces de glycérol (respectivement 0, 10, 20, 30, 40 et 50 g M) et on mesure dans les mêmes conditions que prédédemment Les résultats sont illustrés par la Figure 1 ( 0-*) qui montre l'obtention de bons résultats quantitatifs. On effectue une mesure témoin par addition de 20 gl d'échantillon contenant de l'ATP (respectivement 0, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 6,0 et 10,0 m M) dans un mélange réactionnel ( 3 ml) contenant 50 m M de tampon phosphate (p H 8,0), 10 m M de glycérol, 10 m M de Mg C 12, de la glycérokinase ( 2 unités/détermination) de la GPO ( 5 unités/détermination), 1,5 m M de 4-amino-antipy- rine, 1,5 m M de phénol, de la peroxydase ( 5 unités/ détermination) et 0, 1 % de Triton X-100, incubation à 37 C pendant 10 minutes et mesure colorimétrique à 500 nm Les résultats sont illustrés par la Figure 2. Par comparaison avec les résultats d'une réaction non cyclique de détermination de l'ATP comme illustré par la Figure 2, la réaction cyclique de l'invention est estimée à environ 35 cycles/minute et est environ 2000 fois plus sensibles pour une heure de réaction que la détermination témoin illustrée par la Figure 2. 254 C 137 22 - EXEMPLE 2 Mélange réactionnel ( 1,0 ml): Tampon phosphate (p H 7,5) 50 m M GPO ( 20 unités/détermination) NAD réduit 0,25 m M GPDH ( 8 unités/détermination) On ajoute 1,0 ml du mélange réactionnel ci- dessus dans une cuve de quartz de 1,0 ml et on pré- incube à 37 C On ajoute 20 il d'échantillon contenant du G 3 P (respectivement 0, 10, 20, 30, 40 et 50 m M) On mesure la variation de l'absorbance à 340 nm dans un intervalle de temps de 2 minutes entre la troisième et la cinquième minute suivant le début de l'incubation et on calcule la variation de l'absorbance par minute Les résultats sont illustrés par la Figure 3 (o-o) On remplace l'échantillon contenant de la G 3 P par un échantillon contenant du DHAP (respectivement 0, 10, , 30, 40 et 50 g M) et on incube et mesure de la même façon que précédemment Les résultats sont illustrés par la Figure 3 (e-O). Comme illustré, on peut déterminer des traces de G 3 P ou de DHAP. EXEMPLE 3 On ajoute de la NAD-peroxydase ( 3 unités/ml) (provenant de Streptococcus; Dolin et coll, J Biol. Chem, 225:557 1957) au mélange réactionnel de l'exemple 2 pour préparer 1,0 ml de mélange réactionnel. On ajoute à 1,0 ml de ce mélange réactionnel des échantillons de 20 g 1 contenant du G 3 P (respective- ment 0, 5, 10, 15, 20 et 25 g M) et on incube à 37 C On mesure à 340 nm l'absorbance dans l'intervalle de 2 minutes entre la troisième et la cinquième minute du début de la réaction Les résultats sont illustrés par la Figure 4 Sur la Figure 4, la courbe o-o correspond 23 - à l'emploi de NAD-peroxydase et lacourbe o-* correspond à l'absence d'addition de NADperoxydase Comme le montre la Figure 4, l'emploi de NAD-peroxydase permet d'obtenir une sensibilité double. EXEMPLE 4 Mélange réactionnel ( 1,0 ml): Tampon phosphate (p H 7,5) 50 m M Glycérol 10 m M Mg C 12 10 m M Glycérokinase ( 2 unités/détermination) GPO ( 2,0 unités/détermination) NAD réduit 0,25 m M GPDH ( 8 unités/détermination) On ajoute 1,0 ml du mélange réactionnel ci-dessus dans le récipient réactionnel maintenu à une température constante de 37 C et on équilibre la température du mélange réactionnel par mélange avec un agitateur magné- tique. On ajoute un échantillon contenant de l'ATP (respectivement 0, 5, 10, 15, 20 et 25 M) et on mesure la consommation d'oxygène dans le milieu incubé avec une électrode à oxygène de type Galvani Les résultats sont illustrés par la Figure 5 (o-o) (consommation d'O 2/minute (%)) On remplace l'ATP par du G 3 P et on utilise pour l'incubation un échantillon de 20 Al contenant du G 3 P (respectivement 0, 5, 10, 15, 20 et 25 M) Les résultats sont illustrés par la Figure 5 (O-e) Comme on le voit, l'ATP et le G 3 P peuvent être facilement déterminés avec une bonne précision et une grande sensibilité. EXEMPLE 5 On utilise 1,0 ml de mélange réactionnel ayant la même composition que dans l'exemple 4 et on mesure la quantité d'H 202 produite dans la réaction avec une 24 - électrode à peroxyde d'hydrogène par détermination de la variation du courant électrique (n A) par minute. Les résultats sont illustrés par la Figure 6. Sur la Figure 6, la courbe o-o est la courbe de détermi- nation quantitative de l'H 202 avec un échantillon conte- nant de l'ATP ( 0-25 g M, 20 il) et la courbe e-e corres- pond à l'échantillon contenant du G 3 P ( 0-25 g M; 20 il). Electrode de détermination du peroxyde d'hydro- gène: appareil de mesure d'oxydation: -YSI ú-c-ï modèle 25. YSI Co, modèle 25 sonde à l'oxydase Clark 2510. EXEMPLE 6 Mélange réactionnel pour la détermination de la créatine- kinase: Mélange réactionnel I: Tampon phosphate (p H 7,5) 50 m M Créatinephosphate 40 m M $-mercaptoéthanol 5 m M ADP 3 m M Mg C 12 10 m M Glycérokinase ( 1 unité/détermination) Mélange réactionnel II GPO ( 15 unités/détermination) NAD réduit 0,3 m M GPDH ( 8 unités/détermination). On ajoute 0,2 ml du mélange réactionnel 9 ci- dessus dans un petit tube à essai et on préincube à 37 C. On ajoute 10 il de créatine-kinase (Boehringer: muscle de lapin, 0,01 unité/ml) et on incube pendant 10 minutes. On arrête la réaction par chauffage à 100 C pendant 2 minutes On ajoute 0,8 ml du mélange réactionnel II (préincubé à 37 C) puis on mesure avec une électrode à oxygène la consommation d'oxygène après le début de la réaction. - EXEMPLE 7 Mélange réactionnel pour la détermination du phosphatidyl- glycérol: Mélange réactionnel I: Tampon collidine (p H 8,0) 20 m M Phospholipase C ( 20 unités/détermination) Ca C 12 10 m M désoxycholate de sodium 0,1 % Mélange réactionnel II: Tampon Tris-H Cl (p H 7,5) 50 m M GPO ( 15 unités/détermination) Catalase ( 200 unités/détermination) NAD réduit 0,25 m M GPDH ( 8 unités/détermination) On ajoute à 0,2 ml du mélange réactionnel I du liquide ammiotique ( 10 il, respectivement aux dilutions de 1-1/8) (contenant du phosphatidylglycérol) et on incube à 37 C pendant 10 minutes On ajoute 0,8 ml du mélange réactionnel II et on mesure les variations de l'absorbance par minute à 340 nm Les résultats sont illustrés par la Figure 8. On utilise comme témoin le mélange réactionnel I sans phospholipase C. Le phosphatidylglycérol dans le liquide ammioti- que peut être déterminé avec une bonne sensibilité Dans cette expérience, la concentration déterminée dans le liquide ammiotique du phosphatidylglycérol a été de 6,10 mg/100 ml. Le mélange réactionnel II sans catalase peut être utilisé pour la détermination du phosphatidyl- glycérol par mesure de 11 '02 avec une électrode à oxygène ou mesure de la quantité d'H 202 produite avec une électrode au peroxyde d'hydrogène. On prépare également le mélange réactionnel suivant pour la détermination du phosphatidylglycérol avec une électrode au peroxyde d'hydrogène. 2 540137 26 - Tampon phosphate (p H 7,5) 50 m M Phospholipase D ( 10 unités/détermination) Mg C 12 10 m M ATP 5 m M Glycérokinase ( 2 unités/détermination) GPO ( 15 unités/détermination) NAD réduit 0,25 m M GPDH ( 8 unités/détermination) EXEMPLE 8 Tampon Tris-H Cl (p H 8,0) 50 m M NAD réduit 0,75 m M GPO ( 6 unités/détermination) GPDH ( 5 unités/détermination) On préincube à 37 C 0,5 ml du mélange réactionnel ci-dessus dans un petit tube à essai On ajoute 28 g 1 d'une solution de DL-G 3 P (respectivement 0, 2, 4, 8, 12, 16 et g M) et-on incube à 37 C pendant exactement 5 minutes. On ajoute pour arrêter la réaction 2,5 ml d'une solution à 1 % de laurylsulfate de sodium contenant 5 m M de N-éthyl- maléimide On mesure l'absorbance à 340 nm et on la corrige par comparaison avec un témoin On obtient une bonne détermination quantitative linéaire, comme le montre la Figure 9. On ajoute 20 1 d'eau distillée au lieu de DL-G 3 P comme témoin Dans cet exemple, la vitesse de la réaction cyclique est de 5400 cycles/heure 27 - REVENDICATIONS 1 Procédé très sensible d'analyse quantitative enzymatique, dans un échantillon analytique, d'un quel- conque des composants suivants: L-glycéro-3-phosphate (G 3 P), dihydroxyacétone-3-phosphate (DHAP), nicotine adénine-dinucléotide (NAD) et NAD réduit, qui comprend la réaction d'un composant de l'échantillon avec un compo- sant constituant la réaction cyclique (I) ci-après de façon à constituer ladite réaction cyclique comprenant les composants: G 3 P, DHAP, glycérophosphate-oxydase (GPO), glycérophosphate-déshydrogénase (GPDH), NAD, NAD réduit, 02 et H 202: 02 GPO > O 2 \ 7 o> G 3 P DHAP (I) NAD GPDH NAD réduit et la mesure d'une quantité de changements détectables. 2 Procédé d'analyse selon la revendication 1, caractérisé en ce que, dans la réaction cyclique (I), on fait réagir la NAD-peroxydase qui catalyse ur e réaction consommant une mole d'H 202 et une mode de NAD réduit et produisant deux moles d'H 202 et une mole de NAD, et on mesure une quantité des changements détectables. 3 Procédé d'analyse selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'une quantité de changements détec- tables est une quantité de NAD réduit consomme. 4 Procédé d'analyse selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on convertit le NAD produit dans la réaction cyclique (I) par une seconde déshydrogénase et son substrat en NAD réduit pour constituer une réactia 1 cyclique avec ledit NAD réduit. 2 540137 28 - Procédé d'analyse selon la revendication 1, caractérisé en ce que le G 3 P d'un échantillon est produit par un système réactionnel enzymatique comprenant du phosphati Cylglycérol et de la phospholipase C. 6 Procédé d'analyse selon la revendication 1, caractérisé en ce que le G 3 P d'un échantillon est produit par un système réactionnel enzymatique comprenant de l'adénosine-triphosphate (ATP), du glycérol et de la glycérokinase. 7 Procédé d'analyse selon la revendication 6, caractérisé en ce que le glycérol dérive d'un système réactionnel enzymatique comprenant du phosphatidyl- glycérol et de la phospholipase D. 8 Procédé d'analyse selon la revendication 6, caractérisé en ce que le glycérol dérive d'un système réactionnel enzymatique comprenant du glycérol et une lipase. 9 Procédé d'analyse selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'ATP dérive d'un système réac- tionnel enzymatique comprenant du créatine-phosphate, de l'adénosire-diphosphate (ADP) et de la créatine- kinase. Procédé d'analyse selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'ATP dérive d'un système réac- tionnel enzymatique comprenant du phospho-énolpyruvate, de l'ADP et de la pyruvate-kinase. 11 Procédé d'analyse selon la revendication 1, caractérisé en ce que la quantité de changements détec- tables est la quantité d'O 2 consommée. 12 Procédé d'analyse selon la revendication 1, caractérisé en ce que la quantité de changements détec- tables est la quantité d'H 202 produite. 29 - 13 Procédé d'analyse selon la revendication 1, caractérisé en ce que la quantité de changements détec- tables est la quantité de NAD réduit consommée.