FR 2538250 A1 19840629 FR 8221899 A 19821228 La présente invention, réalisée au Centre de Recherches PIERRE FABRE, concerne un procédé de préparation de nouveaux extraits de Ruscus (Liliacées), et en particulier de Ruscus aculeatus, utiles en thérapeutique dans le domaine cardiovasculaire. Il est bien connu que les substances stéroliques du Ruscus aculeatus, c'est-à-dire les Ruscogénines et les saponines correspondantes, sont douées de propriétés veinotoniques, et constituent d'ailleurs les principes actifs de diverses spécialités pharma- ceutiques. Dans la technique antérieure, aucun autre principe actif n'a pu être localisé dans un extrait de Ruscus, et en particulier de Ruscus aculeatus On a toujours considéré jusqu'à ce jour que les propriétés thérapeu- tiques de ces extraits connus étaient directement liées à la présence des hétérosides stéroliques, ou des produits issus de leur hydrolyse. De façon tout à fait surprenante, la demanderesse a découvert à présent que certaines fractions extraites de Ruscus, bien qu'étant totalement exemptes de saponines et de génines, possédaient néanmoins des propriétés veinotoniques remarquables qui seront évoquées plus en détail ci-après La demanderesse a ainsi découvert que la technique antérieure d'extraction du Ruscus qui conduisait à l'obtention de composés stéroliques à base de ruscogénine, néoruscogénine et composés apparentés, n'était donc pas la mieux appropriée à l'obtention de principe actifs dans le système cardiovasculaire. Conformément à la technique antérieure, les extraits de Ruscus étaient obtenus par épuisement des rhizomes par l'eau ou par des solutions hydroalcooliques, et la purification éventuelle avait pour seul but un enrichissement en composés stéroliques par exemple par extraction liquide-liquide en milieu alcalin ou relargage par le sulfate d'ammonium. La demanderesse a découvert à présent qu'en mettant en oeuvre un nouveau procédé d'extraction, il était possible d'obtenir un extrait de Ruscus, et en particulier de Ruscus aculeatus, fondamentalement différent des extraits de la technique antérieure En effet, conformément à la présente invention, l'extrait de Ruscus est exempt de saponinesstéroliqueset contient d'environ 0,5 % à environ 5 % en poids de ruscobenzoxépine de formule Conformément à la présente invention, le procédé de préparation d'un extrait de Ruscus,et en particulier de Ru 2 cus aculeatus, se trouve caractérisé par le fait qu'il comporte au moins une première étape d'ex- traction par un alcool ou un mélange hydroalcoolique, suivie d'une évaporation et d'une seconde étape d'ex- traction par un ester ou une cétone, en vue d'éliminer les saponines stéroliques présentes dans l'extrait résultant de la première étape. Selon une caractéristique particulière de la présente invention, la première étape d'extraction peut avantageusement être mise en oeuvre par épuisement des rhizomes de Ruscus aculeatus avec de l'éthanol à 95-99 % Il est cependant parfaitement possible d'effectuer cette première étape d'extraction à l'aide d'alcool constitué par des alcanols en C 1 à C 7 ou par des mélanges hydroalcooliques en proportions diverses,mais contenant cependant de préférence une fraction prépondérante d'un alcanol'en C 1 à C 7 L'opé- ration d'évaporation du solvant alcoolique ou hydro- alcoolique contenant le principe actif peut être réalisée de façon classique par exemple par évaporation sur une matière inerte et/ou absorbante telle que la silice, l'alumine, un carbonate alcalin ou alcalino- terreux, des sucres, du kaolin, de la cellulose, ou de la cyclodextrine. La seconde étape d'extraction, après évaporation du solvant alcoolique ou hydroalcoolique, est réalisée par reprise de l'extrait sec ainsi obtenu par exemple dans de l'acétate d'éthyle Dans pareil cas, l'extractible à l'acétate d'éthyle ne représente que 10 à 20 % de l'extrait alcoolique résultant de la première étape, soit un maximum de 3 à 4 % environ des rhizomes de départ S Il est clair que des résultats parfaitement satis- faisants peuvent également être obtenus en mettant en oeuvre, pour la première étape d'extraction, des solvants de polarité voisine de l'éthanol, tels que le méthanol, le propanol ou le butanol. Par ailleurs, dans la pratique l'acétate d'éthyle a également pu être remplacé sans aucun inconvénient majeur par d'autres esters tels que l'acétate d'iso- propyle et l'éther isopropylique ou encore par des cétones telles que l'acétone, la diméthylcétone, la méthyléthylcétone ou la méthylisobutylcétone. L'exemple rapporté ci-après concerne un procédé mis en oeuvre avec l'éthanol et l'acétate d'éthyle respectivement pour la première et la seconde étapes d'extraction, car ce sont des solvants usuels non toxiques. Les extraits ainsi obtenus,à la suite de la seconde étape d'extraction par un ester ou une cétone, peuvent encore être purifiés par traitement à la silice ou à l'alumine, soit en cuve, soit par chromatographie sur colonne Un tel traitement permet d'isoler les fractions les moins polaires de l'extrait. A titre-d'exemple non limitatif, 10 g de l'extrait obtenu à-la suite de la seconde étape d'extraction, par exemple à l'acétate d'éthyle, sont charges sur 250 g de silice et l'élution est réalisée par un mélange ternaire chloroforme-méthanol-eau On remarquera à ce propos que les principes actifs recherchés dans le nouvel extrait de Ruscus conformément à la présente invention, ont des propriétés phénoliques, par conséquent, toutes les opérations mettant en oeuvre les extractions liquide-liquide en milieu alcalin, puis acide, les résines échangeuses d'ions ou la poudre de polyamide ou polyvinylpyrrolidone contribueront à la purification de l'extrait. Exemple: 100 kg de parties souterraines de Ruscus aculeatus sont épuisés par 500 litres d'éthanol à 95 G L à ébullition pendant 2 heures, et après filtration du solvant, le végétal est soumis à une deuxième extraction dans les mêmes conditions Les solutions alcooliques sont concentrées à sec, poids: 15 kg environ (produit A). 12 kg de produit A sont mis en suspension dans 120 litres d'acétate d'éthyle et portés à ébullition pendant 6 heures L'insoluble est filtré et repris dans 60 litres d'acétate d'éthyle dans les mêmes conditions Les solutions organiques réunies sont évaporées sous vide. On obtient ainsi un résidu à consistance de miel, poids 2,5 kg environ (produit B). Une purification complémentaire est effectuée par chromatographie de 250 g du produit B sur une colonne de silice éluée par le mélange chloroformeméthanol-eau ( 65-25-10) Les fractions les moins polaires contiennent les principes actifs du Ruscus aculeatus et représentent alors moins de 2 % du poids de plante mise en oeuvre. L'extrait conforme a la présente invention, c'est-à- dire le produit B a ensuite été soumis à des analyses physicochimiques qui ont permis de relever les consta- tations suivantes: produit pâteux, de couleur jaune brunâtre, solubilités: éther, chloroforme, éthanol, C C M: silice, chloroforme, méthanol 9-1. Principales taches: Rf = 0,93 0,87 0,80 0,75 0,53 - 0,3 0,25 0,20 0,05. identification du composé de Rf = 0,53: a PM = 254 Formule brute: C 16 H 1403 * D = 43 ( C = 1, CH 30 H) I R = 3400, 2900, 1610, 1505 cm U V = 219, 266, 303 nm Masse = M+ = 254 fragments à 147 (C 9 H 702) et 107 (C 7 H 70) RMN dans CD 30 D: 7 H aromatiques entre 6,3 et 7,1 ppm 1 H (doublet J = 12 Hz) à 6,3 ppm 1 H (doublet de doublet, J 1 = 12 Hz, J 2 = 5 Hz) à 5,7 ppm 2 H (singulet élargi) à 4,95 ppm 2 H (multiplet) à 4,1 ppm 1 H (multiplet) à 3,80 ppm; RMN dérivé diacétylé dans CDC 13: 7 H aromatiques entre 6,6 et 7,3 ppm i H (doublet, J = 12 Hz) à 6,4 ppm 1 H (doublet de doublet, J 1 = 12 Hz, J 2 = 4 Hz) à 5,9 ppm 2 H (multiplet) à 4,2 ppm 1 H (multiplet) à 3,9 ppm 6 H (singulet) à 2,2 ppm. RMN 13 C (dérivé acétylé) (CDCL 3 o TMS = O): ,86 ( 2 q) 49,4 (d) 74,58 (t) 113,24 (d) 115,77 (d) 121,48 ( 2 d) 124,19 (s) 127,90 (d) 129,25 ( 2 d) 132,31 {d) 133,13 (d) 138,14 (s) 150,0 ( 2 s) 159,56 (s) 169,03 (s) 169,27 (s) f XD 20 (c = 1 %, CH 30 H)= 43 O L'ensemble des caractéristiques physicochimiques relevées précédemment ont permis de conclure à la présence de ruscobenzoxépine de formule r O Jy OH PHARMACOLOGIE Afin de quantifier l'activité veinotonique des produits A et B selon l'exemple précédent, nous avons utilisé le test d'Anneaux de veines Saphène isolés,in vitro, suspendus dans du liquide de Krebs-Ringer La standardisation est faite en calculant la contraction, induite par les produits A et B, en pourcentage de la contraction induite par une dose constante de Noradrenaline ( 3 10 M) correspondante à 50 % de la contraction maximale de la veine (ED 50 NA = 9,13 g 2,05 g). Con. 1 2 3 4 5 Produi i 3 A O 2 4 16 17 B O 17,5 31 32 33 Conc: Concentration de produit (en mg) ajouté dans la cuve ( 50 ml) de façon cumulative. Le produit B permet donc une amélioration nette de la veinotonicité par rapport au produit A de plus de 40 % en moyenne. Compte tenu des excellentes propriétés veinotoniques de l'extrait de Ruscus conforme a la présente invention, ce dernier peut avantageusement être utilisé en tant que principe actif dans diverses compositions tant à usage pharmacologique qu'à usage cosmétologique. 2538 zs 250 REVENDICATIONS 1/ Procédé de préparation d'un extrait de Ruscus (Liliacées), en particulier de Ruscus aculeatus, caractérisé par le fait qu'il comporte au moins une première étape d'extraction par un alcool ou un mélange hydroalcoolique, suivie d'une évaporation et d'une seconde étape d'extraction par un ester ou une cétone, en vue d'éliminer les saponines stéroliques présentes dans l'extrait de ladite première étape. 2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les alcools utilisés pour la première étape sont choisis parmi les alcanols en C 1 à C 7. 3/ Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les esters utilisés pour la deuxième étape sont choisis parmi les acétates d'éthyle et d'isopropyle, et les cétones parmi la diméthylcétone, la méthyléthylcétone ou la méthylisobutylcétone. 4/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par une purification chromatographique complémentaire sur silice ou alumine visant à 1 tiso- lement des fractions les moins polaires. / Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par une étape de purification complémentaire visant à enrichir l'extrait en composés-phénoliques, par résines échangeuses d'ions, poudre de polyamide ou polyvinylpyrrolidone. 6/ Procédé selon l'une des revendications l à-5, caractérisé par le fait que ladite évaporation du solvant alcoolique ou hydroalcoolique contenant le principe actif est réalisée sur une matière inerte et/ou adsorbante telle que la silice, l'alumine, un carbonate 2538250 I alcalin ou alcalino-terreux, des sucres, du kaolin, de la cellulose ou de la cyclodextrine. 7/ Extrait de Ruscus (Liliacées), en particulier de Ruscus aculeatus, caractérisé en ce qu'il est exempt de saponines stéroliques et qu'il contient d'en- viron 0,5 % à environ 5 % en poids de ruscobenzoxépine de formule -OH 8/ Composition à usage pharmacologique ou cosméto- logique, caractérisée en ce qu'elle contient à titre de principe actif veinotonique un extrait de Ruscus selon la revendication 7.