FR 2527211 A1 19831125 FR 8308412 A 19830520 La présente invention concerne de nouveaux els de théophylline 8-substituée utiles comme réactifs dans un dosage imnu- nologique de la théophylline avec inhibiteur enzymatique compétitif irréversible. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4 273 866 décrit un dosage immunologique avec inhibiteur enzymatique compétitif irréversible et divers conjugués ligand-inhibiteur enzyntique con- pétitif irréversible, en particulier le N-(éthoxyméthylphosphinylthio- 2 éthyl) lméthyl-1 dioxo-2,6 tétrahydro-l,2,3,6-7 H-purinel-3-hexana- mide de formule 0 H CH (I) ()5 -C-NH-CH 2-CH 2-S-CH 2-CH 2-S-P-CH 3 21 2 O-CH 2-CH 3 utile comme réactif dans la détermination de la théophylline. Un dosage immunologique avec inhibteur enzymatique compétitif irréversible pour la détermination d'un ligand dans un échantillon, consiste à mélangeravec l'échantillon contenant le ligand à déterminer, un conjugué ligand-inhibiteur enzymatique com- pétitif irréversible et une protéine fixatrice fixable au ligand et au conjugué ligand-inhibiteur enzymatique compétitif irréversible. Le conjugué ligand-inhibiteur enzymatique compétitif irréversible et le ligand entrent en compétition vis-à-vis des sites de fixation Je la protéine fixante Donc la quantité de conjugué ligand-inhibiteur enzymatique compétitif irréversible fixée à la protéine fixatrice est en relation avec la quantité de ligand contenue dans l'échanrtil- lon La protéine fixatrice inactive l'inhibiteur enzymatique irré- versible lorsqu'elle se fixe au conjugué ligand-inhibiteur enzyma- tique compétitif irréversible Lorsqu'on mélange une enzyme au mé- lange réactionnel, la portion d'inhibiteur enzymatique irréversible du conjugué non fixée par la protéine fixatrice réagit avec l'en- zyme pour former des liaisons covalentes, ce qui inactive l'enzyme. 252721 1 Donc, apres l'addition d'un substrat à l'enzyme, on peut suivre la réaction enzyme-substrat qui fournit une indication de la quantité de ligand présente dans l'échantillon. Le dosage immunologique peut être illustré par le schéma réactionnel suivant: K ( 1) L +eq L K (eqz LAI + LA ( 2) LAI q > k 2 En 1 X ( 3) LAI + Enz > Enz-I + X k'2 ( 4) LAI +Enz k 2 Enz-I + X Comme le montrent les réactions ( 1) et ( 2), un ligand (L) et un conjugué ligand-inhibiteur enzymatique compétitif irréversible (LAI) entrent en compétition avec la protéine fixatrice (>p,) La protéine fixatrice fixée au conjugué ligandinhibiteur enzymatique compétitif irréversible (LAI) inactive l'inhibi- teur tandis que le conjugué ligand-inhibiteur enzymatique compétitif irréversible libre est disponible pour inhiber de façon irréversible l'enzyme (Enz) Plus la quantité de ligand présente dans l'échantil- lon est importante, plus la quantité de conjugué ligand-inhibiteur enzymatique compétitif irréversible fixée à la protéine fixatrice est faible et par conséquent plus l'enzyme est inhibée (Enz-I) par le conjugué ligand-inhibiteur enzymatique compétitif irréversible libre L'enzyme non inhibée réagit avec un substrat approprié et on suit la réaction enzyme-substrat Dans la plupart des cas, k'. est pratiquement réduit à zéro; c'est-à-dire que la protéine fixa- trice inactive le conjugué ligand-inhibiteur enzymatique comp titif irréversible. La réaction peut être suivie selon une technique ciné- tique ou à point final Ainsi on suite la réaction d Enz = k 2 lLAIl lEnzl dt 2 selon les techniques cinétiques Lorsqu'on emploie un excès d'enzyme et qu'on laisse à la réaction le temps de s'achever essentiellement à 99 7, ce système convient bien aux techniques à point final. Comme illustré par le mécanisme réactionnel ci-dessus, la vitesse d'inhibition de l'enzyme dépend de la constante de vitesse secondaire (k 2) Donc l'accroissement de la valeur de la constante de vitesse secondaire accroît la sensibilité du dosage car on peut réduire la durée du dosage, la quantité des réactifs nécessaires et/ou accroître la dilution de l'échantillon, ce qui diminue nota- blement les interférences de fond. L'invention concerne une catégorie de composés de formule: H o -9 CH 2-1-1-(CH 2) (CH 2)-S-;OR' (II) e CH 3 CH 3 Z dans laquelle N est un nombre entier de 2 à 6; R et R' sont indépendamment un alkyle en C 1-C 4; et Z est un ion complémentaire compatible du point de vue biologique. Les composés de formule (II) sont utiles comme réac- tifs dans un dosage avec inhibiteur enzymatique compétitif irréver- sible de la théophylline Lorsqu'on les emploie dans une telle tech- nique, les composés de formule (II) accroissent la constante de vitesse secondaire et améliorent donc notablement la sensibilité du dosage. L'invention va maintenant être décrite de façon détaillée. Telle qu'on l'emploie ici, l'expression "ion complé- mentaire compatible du point de vue biologique ',appliquée aux antons représentés par "Z", englobe par exemple les anions chloro, iodo, méthylsulfate, tétrafluoroborate et similaires. Les radicaux représentés par R et R' comprennent les radicaux alkyles ayant 1 à 4 atomes de carbone, y compris par exemple méthyle, éthyle, propyle, butyle, tert-butyle, et similaires. On peut préparer les composés de l'invention selon le mode opératoire suivant: Cn fait réagir le dia-tino-5,6 diméthyl-l D 3 vracile hydraté avec l'acide cvanoac 4 tique pour obtenir le cyancacétani 4 'io 1-5 amino6 dirséthyl-1,3 uracile de formule On traite le cyanoaeêtamido-5 amino-6 dinhy-, uracile avec de l'hydroxyde de sodium à une température comprise dans la gamme de 145 à 1550 C pour obtenir la carboxyméthl- '-8 théo- phylline de formule CH 1.5 N H C 00 H (IV) On traite la carboxyméthyl-8 théophylline avec un Inhibiteur alkyle de formule e CF COOH i 12 N(CH 2)n S(CR 2)2 SPOR' Cv R CH 3 pour obtenir les composés de formule (II). L'invention sera mieux comprise à la lecture les exemples non limitatifs suivants: -EX-El PLE I Préparation de l'inhibiteur aikyl A 25 mg ( 0,62 mmol) de méthylphosphonothioate d'O- éthyle et de S-(N-tert-butoxycarbonyl am 4 ino-9 thia-3 nonyle) dissous dans 3 ml de chlorure de méthylène et refroidi à 00 C, on ajoute 3 mi d'iodonéthane puis 134 mg ( 0,69 mmnol) de tétrafluoroborate d'argent. On laisse le mélange réactionnel se réchauffer à la température or- dinaire et on l'agite pendant 30 minutes On filtre le mélange réac- tionnel et on le concentre sous vide pour obtenir le méthylphosphono- thioate d'O-éthyle et de S-(N-tert-butoxycarbonyl amino-9 méthyl- thia-3 nonyle) sous forme d'une huile ( 250 mg; rendement 80). A 250 mg ( 0,50 mmol) de méthylphosphonothioate d'O-éthyle et de S-(Ntert-butoxycarbonyl amino-9 méthylthia-3 nonyle) dissous dans 3 ml de chlorure de méthylène et refroidi à 0 C, on ajoute 1 ml d'acide trifluoroacétique et on agite le mélange réactionnel obtenu à O C pendant 45 minutes On concentre le mélange réactionnel sous vide pour obtenir le trifluoroacétate du méthyl- phosphonothioate d'O-éthyle et de S-(amino-9 méthylthia-3 nonyle) sous forme d'une huile. EXEMPLE II On chauffe à 120-130 C sous atmosphère d'azote un mélange de 19,0 g ( 0, 11 mol) de diamino-5,6 diméthyl-l,3 uracile hydraté et 19,0 g ( 0,22 mol) d'acide cyanoacétique Le mélange fond et se resolidifie en 30 minutes On refroidit à la température ordi- naire le résidu resolidifié et on le reprend dans l'acétone On recueille le résidu sur un filtre, on recristallise dans l'eau en employant du charbon décolorant, on sèche et on triture sous vide pour obtenir 14,2 g ( 54 %) de cyanoacétamido-5 amino-6 diméthyl-l,3 uracile sous forme d'un solide. A 140 ml d'hydroxyde de sodium 2 N, on ajoute 14,0 g ( 0,059 mol) de cyanoacétamido-5 amino-6 diméthyl-l,3 uracile et on chauffe le mélange obtenu à 145-155 C jusqu'à ce que la majeure par- tie de la phase liquide soit éliminée et qu'il demeure un résidu foncé On refroidit le résidu à la température ordinaire et on ajoute ml d'éthanol absolu On broie le résidu et on le recueille sur un filtre On dissout le solide recueilli dans de l'eau On ajoute goutte à goutte de l'acide chlorhydrique concentré à la solution aqueuse, en agitant jusqu'à ce qu'il se forme un précipité épais On recueille le précipité sur un filtre, on recristallise dans l'acide chlorhydrique 1 N en employant du charbon décolorant et on sèche sous vide pour obtenir 3,5 g ( 25 %) de carboxyméthyl-8 théophylline sous forme d'un solide. On dissout 120 mg ( 0,48 mmol) de carboxyméthyl-8 théophylline dans du diméthylformamide et on refroidit à O C On 252721 1 ajoute au mélange 106 mg ( 0,65 mmol) de carbonyl-l,1 imidazole et on agite la réaction pendant 15 minutes à -10 OC On dissout le tri- fluoroacétate de méthylphosphonothioate d'O-éthyle et de S-(amino-9 mnéthylthia-3 nonyle) (préparé dans l'exemple I) dans du diméthylfor- mamide et on l'ajoute au mélange réactionnel puis on ajoute 1 à 2 équivalents de triéthylamine jusqu'à ce que le mélante ait un p H de 9 On laisse la réaction se poursuivre pendant 20 minutes puis on verse le mélange réactionnel dans 200 ml d'éther et on maintient à la température ordinaire pendant 10 minutes On décante l'éther pour obtenir une huile qu'on dissout dans un minimum de méthanol On ajoute la solution méthanolique à de l'éther, ce qui précipite un produit brut On centrifuge la solution éthérée contenant le produit brut, on décante et on sèche pour obtenir un produit qu'on purifie par chromatographie avec deux colonnes préparatives de gel de silice EM Lobar RP-8 avec comme éluant un mélange 65/35 d'eau et d'acétoni- trile 0,01 M en acide trifluoroacétique On reprend dans l'éthanol l'éluat contenant le produit et on précipite avec de l'éther pour obtenir 104 mg (rendement 33 % 7) de fluoborate de N-l(éthoxyméthyl- phosphinylthio)-9 méthylsulfonia-3 nonyllthéophylline acétamide sous forme d'un solide répondant à la formule: BF CH O H N C Hl C 1, C> C' CH 3 3 CH 3 EXEPLE III On estime comme suit-la constante de vitesse d'inhi- bition de l'acétylcholinestérase par les composés de l'invention. Réactifs: Tampon: On prépare toutes les solutions de travail de tous les réac- tifs dans du tampon phosphate de sodium 0,1 M (p H 7,0) contenant 0,1 % d'a-globuline bovine (phosphate-BGG). Solution de conjugué de ligand-inhibiteur compétitif irréversible: 252721 1 On prépare une solution de travail 5,0 x 10 '6 M du composé (VI) dans le tampon phosphate-BGG par dilution d'une solution mère 0,005 M du composé (VI) dans le méthanol. Acétylcholinestérase: on prépare une solution de travail a 0,6 unité d'acétylcholinestérase par ml dans du tampon phosphate-BGG. Une unité d'activité enzymatique est par définition la quantité d'enzyme qui catalyse l'hydrolyse d'une micromole d'acétylcholine - par minute à 25 C Pour une vitesse de turn-over de 5 x 10 min, la concentration de l'enzyme dans cette solution est de 1,7 x 10 M. Substrat: On mesure l'activité enzymatique en employant un tampon phosphate-BGG contenant 7,4 x 10 4 M d'iodure d'acétyl e-(m 6thyl- thio)choline et 2,4 x 104 M de DTNB. On mesure la pseudo-constante de vitesse de premier ordre pour la réaction d'inhibition par mélange de 25 Mul de la solu- tion de travail d e conjugué avec 25 ju 11 ( 0,015 unité) de solution d'acétylcholinestérase On agite la solution pendant 5 minutes puis on l'incube à la température ordinaire On mesure la quantité d'activité enzymatique résiduelle par addition de 5 p 1 de la solu- tion à O,25 pl de phosphate-BGG et 0,15 ml de solution de substrat. On mesure la vitesse d'accroissement de l'absorbance avec un Abbott Bichromatic Analyzer (ABA-100) avec un filtre de 415/550 nm On calcule la constante de vitessede second ordre (k 2) selon l'équa- tion suivante: (Adx) In (Adc) 2 t lIl dans laquelle Adx est la vitesse d'accroissement de l'absorbance en présence du composé (VI); Adc est la vitesse d'accroissement de l'absorbance en l'absence du composé (VI); t est l'intervalle d'incubation (minutes) pour l'enzyme et le composé (VI) (c'est-&-dire 5 minutes); et lIl est la concentration du composé (VI) (mol/l) de la solution d'incubation enzyme/composé initiale. La constante de vitesse de second ordre (k 2) obtenue pour le composé de formule (VI) est 3,2 x 108 l mol min 1 La valeur de la constante de vitesse de second ordre ainsi obtenue est donc environ 100 fois supérieure à la constante de vitesse de second ordre obtenue à partir du composé de l'art antérieur de formule (I) (k 2 pour le composé de formule (I) est égal à 3 x 1061 mol min-). Donc la sensibilité d'un dosage immunologique avec inhibiteur enzy- matique compétitif irréversible de la théophylline employant les composés de la présente invention présente un accroissement notable et inattendu. Bien entendu diverses modifications peuvent être appor- tées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1 Nouveaux composés caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule: O H C 1 H R O N I I 1 N O C 2-C N-(CH 2)n(CH 2)-S-P-ORI (II) CH 3 ZO dans laquelle N est un nombre entier de 2 à 6; R et R' sont indépendamment un radical alkyle en C 1-C 4; et st un que Z a te. ion complémentaire compatible du point de vue biologique. Composés selon la revendication 1, caractérisés en est un ion chlorure, iodure, méthylsulfate ou tétrafluoro- Composés selon la revendication 2, caractérisés en que Z est un ion tétrafluoroborate. Composés selon la revendication 1, caractérisés en que R est un radical méthyle et R' est un radical éthyle. Composés selon la revendication 4, caractérisés en que Z est un ion tétrafluoroborate. Application des composés selon la revendication 1 comme réactifs dans le dosage immunologique de la théophylline avec inhibiteur enzymatique compétitif irréversible. Z e 2. ce bor 3. ce 4. ce 5. ce 6.