FR 2531863 A1 19840224 FR 8313363 A 19830817 I La présente invention concerne un procédé nouveau pour produire une substance carcinostatique et, plus particulière- ment, elle concerne un procédé nouveau de production d'une sub- stance carcinostatique-possédant les propriétés indiquées plus loin ou un sel d'une telle substance, qui consiste à soumettre des organismes appartenant au genre Fusobacterium à un traite- ment d'extraction avec un dialkylsulfoxyde et à obtenir une substance TF500 ou un sel de celle-ci à partir de l'extrait résultant. -10 Depuis quelques années, on a utilisé de façon poussée à titre de remède pour des patients souffrant de divers types de cancer, un remède consistant à rehausser la fonction immu- nologique de l'h Ste et à obtenir un effet carcinostatique avec l'assistance de la fonction immunologique. La Demanderesse a examiné l'activité pharmacologique des composants obtenus par le traitement d'extraction avec un dialkyl-sulfoxyde des organismes appartenant au genre Fuso- bacterium isolés de la cavité buccale pour trouver qu'un compo- sant spécifique obtenu de l'extrait possède une activité car- cinostatique; que ledit composant présente une activité carci- nostatique indirdcte en augmentant l'activité antitumorale chez l'hôte ou l'immunité de l'hôte et en utilisant l'assistance de l'immunité; et que ledit composant présente une très faible toxicité, et elle a étudié des procédés pour préparer ce produit et c'est ainsi que la présente invention a été élaborée. La présente invention a pour but de fournir un nouveau procédé qui consiste à soumettre des organismes appartenant au genre Fusobacterium à un traitement d'extraction avec un di- alkyl-sulfoxyde et à obtenir une substance carcinostatique de l'extrait résultant. D'autres buts de l'invention ressortiront de la descrip- tion suivante. Comme organismes utilisés dans l'ihvention, on peut employer toutes les bactéries produisant la substance TF-500 et appartenant au genre Fusobacterium et, par exemple, on utilise de préférence les organismes du genre Fusobacterium nucleatum Plus précisément, on utilise Fusobacterium nuclea- tum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) et des souches que l'on considère comme ayant lesdites propriétés dans le cadre des connaissances générales de microbiologie, à savoir les souches mutantes spontanées ou artificiellement modifiées. Les propriétés bactériologiques de Fusobacterium nuclea- tum TF-031 sont comme suit: I Forme 1 Forme des cellules: fusiforme (figure 1) 2 Polymorphisme des cellules: absent 3 Motilité: absente 4 Spores: absents Coloration Gram: Gram-négative 6 Résistance aux acides: négative II Conditions de croissance dans un milieu de culture 1 Plaauette a Rar-a Rar TF-a et milieu de culture penché Forme externe: une forme ronde Dimension: environ 1 mm Protubérance: forme hémisphérique Structure: analogue à une goutte de rosée Surface: lisse Bords: lisses Couleur: blanc jaunâtre laiteux Transparence: opaque Milieu de culture liquide TF-a Degré de croissance: vigoureux Turbidité: coagulum Précipité: néant Croissance de surface: néant, pas de croissance à une profondeur d'environ 5 mm Gaz: néant III Propriétés physiologiques 1 Production de gaz sulfhydrique: + 2 Réduction de nitrates: - 3 Production d'acide butyrique: + 4 Production d'indole: + Urgase: - 6 Catalase: - 7 Hydrolyse de l'amidon: - 8 Comportement à l'oxygène: anaérobie 9 Production d'ammoniac; + Production d'anhydride carbonique; + Il Intervalles pour croissance: p H 5,0 8,5 température 30 -45 C 12 Production de gaz à partir-de saccharides L-arabinose (-), D-xylose (-), D-glucose (-), D-mannose (-), D-fructose (-), D-galactose (-), sucre de malt (-), saccharose (-), trehalose (-), sorbitol (-), mannitol (-), inositol (-), glycérol (-),amidon (-) On peut par exemple effectuer le procédé de production de la substance carcinostatique-TF-500 de la façon suivante: 2531863 ' Culture des bactéries appartenant à *Fusobacterium nucleatum * 1 Filtration Fluide surnageant Organismes dialkyl-sulfoxyde Insolubles Extra t Solvant organique hydrophile (acide) Préci pté O Déprotéinisation et/ou Ultrafiltration Substance carcinostatique TF-500 On va expliquer ci-après le procédé de production indi- qué. (I) Culture de bactéries On effectue la culture des bactéries du genre Fusobac- terium par un procédé classique de culture anaérobie de bacté- ries En d'autres termes, on règle à p H de 5 à 8,5, de préfé- rance, de 6,5 à 7,5 d'un milieu de culture contenant une source d'azote telle que des extraits de cerveau et de coeur bovins, diverses peptones ou similaire; une source de vitamines telle 253 f 863 qu'un extrait de levure ou similaire; un sel minéral tel que le chlorure de sodium ou similaire; une source de carbone comme le glucose, le lactose ou similaire; un agent réducteur tel que la L-cystine, le sulfite de sodiumle thioglycolate de sodium ou similaire, en utilisant une solution aqueuse d'hydro- xyde de sodium et on innocule le milieu de culture avec les bactéries, après quoi on effectue une culture à régime constant ou une culture sous agitation dans des conditions anaérobies à 30-450 C, de préférence, à 32-370 C, pendant 1 à 5 jours, de préférence I à 4 jours En particulier, il est souhaitable d'employer le milieu de culture décrit dans le Tableau 1 (qu'on appellera ci-après milieu de culture TF) Cependant, l'infusion cerveau-coeur qui est un extrait du cerveau et du coeur bovins n'est pas toujours nécessaire comme source d'azote et peut être remplacée par une infusion de coeur qui est un extrait de coeur bovin, un extrait de boeuf, un extrait de poisson, une liqueur de macération du mais etc Parmi les diverses peptones, la protéose-pept 6 ne et la phytone-peptone ne sont pas toujours nécessaires et la trypticase- peptone peut être remplacée par une polypeptone. Quand on n'utilise pas d'agar-agar, il est souhaitable d'effectuer une culture sous agitation. 253186 5 Tableau 1 Constituants du milieu de culture (g/jt) Trypticase- peptone Phytone- peptone Protgose- peptone Infusion cer- veau-coeur Infusion de coeur Extrait de levure Chlorure de sodium Glucose Lactose L-Cystine Sulfite de sodium Thioglycolate de sodium Agar-agar TFa TF-b TF-c TF-d TF-e TF-f 17 17 17 17 17 17 1,5 17,5 7,5 0,25 0, I 0,5 O ou 0,7 -25 20 3 3 3 7,5 0,5 0, 1 0,5 o ou 0,7 7,5 0,5 0,1 0,5 7,5 15 7,5 7,5 12 12 12 10 10 0,1 0,5 O ou O ou 0,7 0,7 0,1 0,5 0,1 0,5 O ou O ou 0,7 0,7 Hydrogènophosphate dipotass ique 2,52,5 2,5 2,5 2,5 (II) Collectage des organismes de la culture On soutire un fluide surnageant de la culture obtenue comme ci-dessus pour collecter les organismes Pour l'enlève- ment du fluide surnageant, on peut utiliser un procédé classi- que, par exemple la centrifugation et la filtration en utili- sant un adjuvant de filtrage tel que la "Celite" (marque ddpo- see de Johns-Manville, USA) On lave les organismes obtenus avec une solution de sel physiologique et' on sèche de façon classique, par exemple par lyophilisation, ou on lave avec une solution de sel physiologique et ensuite avec un solvant organique hydrophile tel que l'éthanol, l'acdtone ou similaire, en un temps bref et ensuite on sèche de façon usuelle, par exemple par séchage à l'air ou similaire, pour obtenir les organismes séchés Si nécessaire, on pulvérise les organismes séchés pour obtenir une poudre sèche. (III) Procédé d'extraction Aux organismes séchés obtenus ci-dessus on ajoute un dialkyl-sulfoxyde, par exemple le dim 9thyl-sulfoxyde, le di- éthyl-sulfoxyde etc, de préférence le dim 9thyl-sulfoxyde à raison de 10 à 50 ml par gramme des organismes séchés On ef- fectue le traitement d'extraction avec agitation à température ambiante jusqu'à 80 C pendant une durée de 30 minutes à plu- sieurs jours, de préférence à environ 65 C pendant 3 à 5 heures On retire ensuite les insolubles par une technique clas- sique telle que la décantation, la centrifugation, la filtration ou similaire A l'extrait obtenu on ajoute un solvant organi- que hydrophile, par exemple une cétone telle que l'acétone, la diéthylc 9 tone, la méthylgthylcetone ou similaire, ou un alcool tel que le méthanol, l'éthanol, l'isopropanol ou similaire, en une quantité de plus de 5 fois celle de l'extrait (volume/ volume) à une basse température De préférence, on ajoute le solvant organique hydrophile dans des conditions acides, par exemple on ajoute l'acétone ensemble avec l'acide chlorhydri- que et on laisse le mélange résultant au repos à environ 4- C pendant une durée de plusieurs heures à plusieurs jours, On sépare le précipité d'une façon classique et on le soumet ensuite à un traitement de déprotéinisation ou d'ultra- filtration isolément ou à une combinaison des deux, Quand on lave les organismes avec une solution de sel physiologique et ensuite on sèche par lyophilisation, on peut supprimer le traitement de déprotéinisation ou d'ultra- filtration pour obtenir une substance carcinostatique TF-500 ou un sel de cette'dernière. (IV) Déprotéinisation, ultrafiltration et collectage de la substance recherchée. On soumet le précipité obtenu ci-dessus à un traitement de déprotéinisation suivi d'un traitement d'ultrafiltration, ou seulement à un traitement de déprotéinisation ou un traite- ment d'ultrafiltration, pour obtenir une substance carcinosta- tique TF-500 ou un sel de celle-ci. Pour le traitement de déprotéinisation, on peut utiliser des procédés connus Quand on effectue la déprotéinisation par un traitement avec une enzyme protéolytique, on dissout ou on met en suspension le précipité ainsi obtenu dans l'eau ou une solution 7 tampon, on ajoute une enzyme protéolytique à la solution ou suspension résultante et on effectue le traitement par l'enzyme d'une façon usuelle. En ce qui concerne les enzymes protéolytiques, on peut utiliser la pronase, la papaine, la trypsine, la chémotrypsine etc On préfère la pronase et la trypsine, Il est recommandé qu'avant ou pendant le traitement à l'enzyme, la solution aqueuse soit réglée et maintenue à un p H de 7 à 8 Dans ce but on peut employer de l'hydroxyde de sodium ou de potassium, du carbonate de sodium ou d'ammonium, de l'hydrogéno-carbonate de sodium etc Pour empêcher la putréfaction du mélange de réaction pendant le traitement à l'enzyme il est souhaitable d'ajouter ure petite quantité d'un solvant organique tel que le chloroforme, le toluène ou similaire On utilise normalement l'enzyme en une proportion d'environ 1 à 4 % par rapport au poids de la poudre (solide) devant être soumise au traitement par l'enzyme. On effectue habituellement ce traitement à l'enzyme à une température de 30 à 40 C pendant I à 72 heures, de pré- férence 24 à 48 heures On peut également l'effectuer en ajou- tant d'abord, par exemple, environ I à 2 % en poids d'une enzy- me à une poudre (solide) et en soumettant cette poudre (solide) à un traitement à l'enzyme pendant I à 24 heures, puis on ajou- te de nouveau I à 2 % en poids de l'enzyme en vue d'un traite- ment supplémentaire à l'enzyme. Apres ce traitement à l'enzyme, on élimine éventuelle- ment les produits insolubles par une technique telle que la centrifugation, la filtration etc, après quoi on recueille une substance carcinostatique TF-500 de la portion soluble dans 1 'eau ainsi obtenue. Le collectage de TF-5 OO de la portion soluble dans l'eau peut se faire d'abord par au moins un fractionnement selon le p H, une précipitation séparée à partir d'un solvant organique hydrophile ou un fractionnement avec une matière échangeuse d'ions etc puis par ultrafiltration (le traitement peut être répété à deux reprises)o Plus précisément, on obtient la substance caroinostatique TF-500 en réglant le pi H de la portion soluble dans l'eau à une valeur qui est, de préférence, inférieure à 2,5 (si nécessaire on peut ajouter de l'acide trichloracétique), en enlevant le précipité résul- tant, en ajoutant à la portion soluble un solvant organique hydrophile tel que l'éthanol de sorte que sa concentration devient de 30 à 80 %, de préférence de 60 à 80 % en volume, en collectant le précipité résultant qui est la fraction de la substance recherchée, en traitant ultérieurement, si neces- saire, ce précipité avec une résine échangeuse d'anionstel que "Dowex 1 " (marque déposée), "Amberlite IRA-400 " (marque déposée), "DEAE-Sephadex" (marque déposée), "DEAE-Cellulose" (marque déposée) ou similaire (ce traitement pouvant être effectué plusieurs fois) pour recueillir les fractions non-adsorbées et ensuite en concentrant et en relarguant une solution aqueu- se du précipité obtenu ou les fractions obtenues par ultrafil- tration (seuil de coupure de poids moléculaire nominal: 50.000-200 000) par exemple en utilisant une Membrane d'Ultra- filtration UK-50 (seuil de coupure de poids moléculaire nominal 50.000), une Membrane d'Ultrafiltration UK-200 (seuil de coupure de poids moléculaire nominal: 200,000) ou similaire (les Membranes d'Ultrafiltration UK-50 et UK-200 sont des marques déposées de membranes d'ultrafiltration de Toyo Roshi Kabushiki Kaisha) et en séchant le produit concentré et relar- gué Une solution aqueuse à 0,2 % de ce TF-500 (poids moléculai- re/volume) est transparente. Comme expliqué plus haut, au lieu du traitement de dé- protéinisation suivi d'un traitement d'ultrafiltration, on peut effectuer seulement le traitement de déprotéinisation ou le traitement d'ultrafiltration. La substance carcinostatique TF-500 ainsi obtenue possè- de les propriétés suivantes et peut être convertie en un sel pharmaceutiquement acceptable par un procédé classique Les sels pharmaceutiquement acceptables sont notamment les sels de métaux alcalins tels que les sels de sodium, de potassium, etc et lles sels de métaux alcalino-terreux tels que les sels de magnésium, de calcium,etc. Les propriétés de la substance carcinostatique TF-500 sont: (a) Poudre de couleur blanc grisâtre-brun clair. (b) Elle possède une activité carcinostatique et immunostimu- lante. (c) Elle est soluble dans l'eau mais insoluble dans le méthanol, l'éthanol, l'acétone, le benzène, le chloroforme, l'acétate d'éthyle et l'éther diéthylique. (d) Elle n'a pas de point de fusion précis et commence à se décomposer à environ 180 C, la décomposition étant très forte au dessus de 195 C. (e) Son spectre d'absorption IR obtenu par le procédé au K Br comprend des bandes d'absorption au voisinage de 3500-3200, 2920, 2850, 1660-1600, 1580-1520, 1460-1400, 1380-1360, 1120- 1100, 1080-1000, 970 et 840-800 cm-1. (f) Le spectre d'absorption U V de sa solution aqueuse à p H 7,0 montre une forte absorption sur le bord d'absorption et un pic d'absorption au voisinage de 246-280 nm. (g) La réponse à la réaction de Molish est positive de mame qu'à la réaction au phénol-acide sulfurique, la réaction à l'anthrone-acide sulfurique, la réaction à llindole-acide chlorhydrique et la réaction de Lowry-Folin, mais la réponse est négative à la réaction à la ninhydrine, (h) Valeurs d'analyse élémentaire: C: 38-47 %, H: 5-7 %, N: 1-4 % (i) La teneur en saccharides déterminée par le procéde au phénol et à l'acide sulfurique est d'environ 12 à 30 % en - poids exprimée en glucose, et la teneur en protéines détermi- ne par le procédé Lowry-Foli N est d'environ 10 % en poids ou moins exprimée en albumine de sérum bovin. Les acivités pharmacologiques de la substance carcino- statique TF-500 sont comme suit: (I) Effet de la substance TF sur la viabilité des cellules (titrage de formation de Colonies) En se basant sur le procédé de Kim J H et al. C Cancer Res 25, 698 ( 1965)l, on cultive les cellules He La S-3 dans MEM d'Eagle additionné de sérum de veau à 10 % pen- dant 3 à 5 jours à 37 C, après quoi on enlève la culture et on ajoute à l'aide d'une pipette à la couche cellulaire obte- nue, pour former une suspension une solution de PBS(-) (solu- tion aqueuse contenant 8,0 g/l de chlorure de sodium, 0,2 g/l de chlorure de potassium, 1,15 g/l d'hydrogénophosphate diso- dique et 0,2 g/l de dihydrogénophosphate de potassium) conte- nant 0,01 % en poids d'acide éthylènediaminetétraacétique et 0,1 % en poids de trypsine On dilue la suspension cellulaire ainsi obtenue avec MEM Eagle additionné de sérum de veau à % de sorte que le produit renferme 300 cellules par ml On cultive un ml de cette suspension cellulaire à 37 C pendant 24 heures dans un incubateur à C O 02 et on ajoute à la culture résultante la substance carcinostatique TF-500 obtenue dans l'exemple 1 ci-après de sorte que la concentration devient 250, 500, 1000 Ag/ml On effectue deux essais dont l'un com- porte l'addition de sérum ( 20 % volume/volume) à la culture et dont l'autre ne comporte pas d'addition de sérum Apres traitement pendant 24 heures, on lave les cellules avec la culture exempte de sérum et on ajoute aux cellules la culture additionnée de sérum de veau à 20 %, après quoi on cultive les cellules pendant 6 jours dans un incubateur à C 02 Apres la culture, on fixe Ies cellules à l'éthanol et on les colore avec une solution de coloration Giemsa et on compte les colo- nies résultantes pour déterminer la viabilité des cellules, Les résultats obtenus apparaissent dans le Tableau 2 dans lequel on détermine la viabilité des cellules par l'équation suivante: Nombre de colonies dans le groupe traité Viabilité des cellules x 100 (%)M Nombre de colonies dans le groupe non traité Tableau 2 (II) Activité immuno-stimulante On utilise pour chaque groupe trois souris de la souche ICR (femelles, âgées de 6 semaines) On administre par voie i p la substance à tester aux souris en une quantité Concentration de Viabilité des cellules (%) la substance car- cinostatique milieu de cul milieu de culture (/Lg/m> ture sans sérum avec sérum O 100 100 250 103,8 103,2 500 100,2 98,5 1000 55,2 97,1 de 5 /g, 50,g et 500,"g/kg 24 heures après l'administration, on injecte par voie i v dans la queue de chaque souris 0,2 ml d'une suspension de carbone qu'on prépare en mélangeant 1 ml d'encre à dessin Perikan N 17 Noir (produit de G Unthe r-Wagner Go, Ltd) avec 2 ml d'une solution de sel physiologique conte- nant 3 % en poids de gélatine, et 1, 5, 10 et 15 minutes après l'injection, on prélève un échantillon de sang de 0,02 ml de l'orbite en utilisant un capillaire d'hématocrite enduit d'héparine et aussitôt après on dilue et on hémolyse avec 1,6 ml d'une solution aqueuse à 0,1 % en poids de carbonate de sodium On soumet cette suspension à une colorimétrie à 675 nm et on détermine l'indice phagocytotique, à savoir la valeur K, à partir de l'équatio de Halpern et ai, Aux souris du groupe témoin on administre 0,2 ml de la solution de sel physiologique. log CO log C K = t t O équation dans laquelle CO= concentration du carbone dans le sang au temps to, et C = concentration de carbone dans:- le sang au temps t. Les résultats sont donnés dans le Tableau 3, Tableau 3 Dose (/fg/kg) Valeur moyenne de K 0,0418 + 0,0089 0,0560 + 0,0016 500 0,0561 + 0,027 Témoin 0,0276 + 0,0020 Note: La substance carcinostatique obtenue dans l'exemple 1 est utilisée. (III) Activité antitumorale à l'égard des cellules de Sarcome- On transplante par voie sous-cutanée les cellules de Sarcome-180 aux souris de la souche ICR (femelles âgées de 6 semaines) dans l'aisselle à raison de 1 x 107 cellules par souris Ultérieurement, on dissout chacune des substances à tester dans une solution aqueuse à 5 % de glucose et on admi- nistre par voie i v 0,2 ml de chacune des solutions résul- tantes aux souris une fois par jour as dixième et douzième joursà partir de la transplantation des cellules de carcinome. On administre au groupe témoin 0,2 ml d'une solution aqueuse à 5 % de glucose de la même façon que ci-dessus Les résultats sont donnts dans le Tableau 4. Tableau 4 Notes: * 1 on utilise la substance carcinostatique obtenue dans l'exemple 1. * 2 on utilise la substance dans l'exemple 2. * T/C (%) carcinostatique obtenue Poids moyen de la tumeur chez les souris du groupe ayant reçu la substance x 100 Poids moyen de la tumeur chez les souris du groupe témoin Dose Poids moyen Nécrose h 9 morragi T/C* 3 (mg/kg) de la tumeur que de la tumeur (%) + E T (jour 14) (jour 14) (g) 0,5 * 1 3,4 0,7 5/5 53 1,O 1 3,6 + 0,7 4/5 56 0,5 * 2 4,1 + 2,4 3/5 63 1,0 2 ' 5,0 1,9 3/5 79 Témoin 6,4 + 2,7 0/5 100 253 1863 (IV) Toxicité algue La valeur DL 50 pour des souris (souche ICR, femelles âgées de 6 semaines, administration i v) de TF-500 est supé- rieure à 10 mg/kg. Il est évident à l'examen des tests pharmacologiques ci-dessus que la substance TF-500 selon l'invention est un agent carcinostatique utile et on peut s'attendre à une acti- vité contre diverses maladies cancéreuses. La substance TF-500 ou son sel pharmaceutiquement ac- ceptable peut être utilisé(e)aprèsêtre amené(e) sous la forme de divers produits pharmaceutiques, tels que des médicaments pourvoie orale, des injections, des suppositoires etc. Quand on les utilise sous forme de médicaments pour voie orale, les produits peuvent contenir divers excipients et peuvent être sous forme de gélules, comprimés, poudre ou gra- nulés Quand on les utilise en injections, on peut prévoir des injections sous-cutanées, intramusculaires et intraveineu- ses et on peut les utiliser sous forme d'une suspension, d'une solution ou d'une poudre dissoute dans une solution saline physiologique ou une solution contenant du glucose ou un anesthésique local au moment de l'emploi Le dosage de TF-500 ou de son sel pharmaceutiquement acceptable est déter- miné selon l'état du malade bien qu'en général il soit recom- mandé de l'administrer à un adulte à raison de 0,001 à 0,1 mg/kg, une ou plusieurs fois par jour et, en ce qui concerne la méthode d'administration, on préfère la voie orale, sous- cutanée, intramusculaire ou intraveineuse ou encore une injec- tion localisée dans la partie malade. L'invention sera maintenant décrite en détail en se référant aux exemples, exemples de préparation et aux dessins annexés sur lesquels: la figure 1 est une micro-photographie montrant la forme de Fusobacterium nucleatum TF-031 utilisé dans l'inven- tion; la figure 2 représente un spectre d'absorption IR Z 531863 de TF-500 obtenu dans l'exemple I dont il sera question ci- dessous; la figure 3 représente un spectre d'absorption U V de ladite substance; -5 -la figure 4 représente un spectre d'absorption I R de TF500 obtenu dans l'exemple 2 ci-après; la figure 5 représente un spectre d'absorption U V. de cette substance; la figure 6 représente un spectre d'absorption IR, de TF-500 obtenu dans l'exemple 3 ci-après; la figure 7 représente un spectre d'absorption U V, de ladite substance; la figure 8 représente un spectre d'absorption I R de TF-500 obtenu dans l'exemple 4 ci-après; et la figure 9 représente un spectre d'absorption U V de cette substance. Exemple ( 1) Dans un bocal de fermentation d'une contenance de litres (type MSJ-U, fabriqué par Marubishi Rika Kenkyusho). on place 70 litres du milieu de culture TF-f contenant 1190 g de trypticase-peptone, 1050 g d'une infusion de coeur, 210 g d'un extrait de levure, 525 g de chlorure de sodium, 840 g de glucose, 700 g de lactose, 7 g de sulfite de sodium, 35 g de thioglycolate de sodium et 175 g d'hydrogénophosphate dipotas- sique et on règle le milieu de culture à p H 7,5 à l'aide d'une solution aqueuse tdtranormale d'hydroxyde de sodium, On stéri- lise le milieu de culture pendant 15 minutes à 118 C Après refroidissement du milieu de culture, on fait passer de l'azote gazeux à travers celui-ci à un débit de 250 ml/mn pendant 1 heure On inocule ce milieu de culture avec environ 900 ml d'une solution prdcultivge de Fusobacterium nucleatum TF-031 * (FERM 5077, ATCC-31647) préalablement préparée en la culti- vant dans un milieu de culture TF-f ayant la même composition que cidessus On cultive les cellules pendant 4 jours à 33 C avec agitation ( 90 t/mn) tout en introduisant de l'azote ga- zeux à un débit de 250 ml/mn. ( 2) On soumet une portion de 12 litres de la culture ainsi obtenue à une centrifugation ( 4 x 103 t/mn, 10 minutes) pour recueillir les organismes et on lave les organismes avec 1 litre d'une solution physiologique de sel et ultérieurement on dégraisse et on lave avec 1 litre d'éthanol et 1 litre d'acétone dans cet ordre, puis on sèche et on obtient 14,2 g d'organismes On met en suspension les organismes dans 300 ml de diméthyl-sulfoxyde et on soumet à l'extraction sous agita- tion pendant 4 heures tout en chauffant la suspension à C On filtre la suspension par aspiration et on obtient un filtrat On ajoute à ce filtrat 2 litres d'acétone et 8 ml d'acide chlorhydrique concentré, puis on laisse le mélange au repos pendant 2 jours pour lui permettre de déposer et vieillir le précipité résultant On recueille le précipité par centrifugation ( 4 x 103 t/mn, 10 minutes) ( 748 mg). ( 3) On dissout les 748 mg du précipité ainsi obtenu dans ml d'eau et on règle le p H de la solution résultante à 7,8-8,0 avec du carbonate d'ammonium On ajoute à cette solu- tion deux portions de 7,5 mg de "Pronase E" (marque déposée de Kaken Kagaku; 1 000 o 000 d'unités de tyrosine/g) à un intervalle de 30 minutes et on ajoute ensuite plusieurs gout- tes de toluène après quoi on soumet le mélange résultant à un traitement par enzyme à 37 C pendant 24 heures A ce mélange traité on ajoute de l'acide chlorhydrique pour régler le p H à I puis on ajoute de l'éthanol de manière que la concentra- tion d'éthanol soit de 80 % en volume On soumet le mélange résultant à une centrifugation ( 4 x 103 t/mn, 10 minutes) et on recueille le précipité résultant ( 288,6 mg), ( 4) On dissout les 288,6 mg de ce précipité dans 50 ml d'eau et on concentre la solution résultante à 5 ml par ultra- filtration en utilisant la Membrane d'Ultrafiltration UK-50 et on ajoute 45 ml d'eau à cette solution concentrée, après quoi on concentre de nouveau la solution diluée à 5 ml par ultrafiltration avec la Membrane UK50 On filtre la so lution 2531863, concentrée à travers un filtre "Millipore" (marque déposée d'un filtre à membrane fabriqué par Millipore Ltd, Japon) ayant un diamètre de pore de 0,2 micron, puis on lyophilise pour obtenir 264 mg de la substance carcinostatique TF-500 lyophilisée. La substance TF-500 possède les propriétés indiquées plus haut et le spectre d'absorption I R de la figure 2 et le spectre d'absorption U V de la figure 3. Exemple 2 ( 1) A partir de 70 litres de la culture obtenue dans la partie ( 1) de l'exemple 1, on recueille des organismes par filtration à travers "Hyflo Super Cel" (marque déposée de Johns-Manville, USA) et on lave le mélange résultant des organismeset de"'Hyflo Super Cel" avec 20 litres d'une solution saline physiologique, puis on dégrasse et on lave avec 3 li- tres d'éthanol et 3 litres d'acétone dans cet ordre pour obte- nir 3,2 kg de ce mélange séché On met en suspension une portion de 320 g de ce mélange dans 400 ml de diméthyl-sulfoxy- de et on soumet la suspension résultante à une extraction avec agitation pendant 4 heures tout en chauffant à 65 C Ulté- rieurement-, on filtre la suspension par aspiration pour recueillir le filtrat et on ajoute 2,5 litres d'acétone et ml de H Cl concentré, après quoi on laisse au repos le mélange résultant à 4 C pendant 2 jours pour déposer et faire vieillir le précipité On recueille le précipité par centrifugation ( 4 x 103 t/mn, 10 minutes) ( 94 mg). ( 2) Dans 50 ml d'eau on dissout les 94 mg du précipité ainsi obtenu et on concentre la solution résultante à 5 ml par ultrafiltration en utilisant la Membrane d'Ultrafiltration UK-50 et on ajoute 45 ml d'eau à la solution concentrée ainsi obtenue, après quoi on concentre de nouveau la solution ainsi diluée à 5 ml par ultrafiltration en utilisant la Mem- brane d'Ultrafiltration UK-50. On filtre la solution ainsi concentrée à travers un filtre "Millipore" ayant un diamètre de pores de 0,2 microns 2531863, et ensuite on lyophilise pour obtenir 62,6 mg de la substance carcinostatique TF-500 lyophilisée. La substance TF-500 ainsi obtenue possède les proprié- tés mentionnées plus haut et son spectre I R est tel qu'in- diqué à la figure 4 alors que son spectre U V apparaît à la figure 5. Exemple 3 ( 1) On soumet une portion de 7,2 litres de la culture obtenue dansle paragraphe ( 1) de l'exemple l à une centrifu- 3 gation ( 5 x 10 t/mn, 10 minutes) pour recueillir les orga- nismes et on les lyophilise On met en suspension une portion de 3,5 g des organismes ainsi lyophilisés dans 100 ml d'une solution saline physiologique et on règle le p H de la suspen- sion résultante à 8,0 avec une solution aqueuse binormale d'hydroxyde de sodium, on agite pendant 3 heures, puis on laisse au repos pendant 24 heures et ensuite on soumet à une centrifugation ( 5 x 103 t/mn 10 minutes) pour enlever le surnageant Au précipité obtenu on ajoute 100 ml de solution de sel physiologique et on règle à 8,0 le p H du mélange résul- tant avec une solution aqueuse binormale d'hydroxyde de sodium. On agite le mélange pendant 2 heures et on soumet ensuite à la centrifugation ( 5 x 103 t/mn, 10 minutes) pour enlever le surnageant Ultérieurement, on lave le précipité obtenu avec trois portions de 50 ml d'éthanol, une portion de 50 ml d'acétone et une portion de 50 ml d'éther diéthylique, dans cet ordre (on effectue l'élimination des fluides de lavage par centrifugation ( 10 minutes; 5 x 103 t/mn)) et ensuite on sèche pour obtenir desorganismes secs On pulvérise les organismes pour obtenir une poudre A cette poudre on ajoute 70 ml de diméthyl-sulfoxyde et on soumet le mélange résultant à une extraction avec agitation à 63-65 C pendant 4 heures, puis à une filtration par succion pour recueillir le filtrat. A ce filtrat on ajoute 536 ml d'acétone et 1 ml de HC 1 con- centré, puis on laisse le mélange résultant au repos à 4 C pendant 24 heures pour déposer et faire vieillir le précipité, On recueille'le précipité par centrifugation ( 5 x 103 t/mn, minutes) ( 269 mg). ( 2) Aux 269 mg de ce précipité on ajoute 2,7 ml d'eau et on règle le mélange résultant à p H 8,0 avec une solution aqueuse normale d'hydroxyde de sodium, puis on ajoute de l'eau pour ré- gler le volume final à 4 ml A ce mélange on ajoute 2,7 mg de "Pronase E" ( 1 000 000 d'unités de tyrosine/g) et on soumet le mélange résultant à un traitement par enzyme à 37 C pendant 1 heure On ajoute 2,7 mg de "Pronase E" et plusieurs gouttes de toluène et on soumet ce mélange à un traitement enzymatique à 37 C pendant 24 heures On élimine les insolubles du mélange ainsi traité par centrifugation ( 5 x l 03 t/mn, 10 minutes) et on ajoute à cette solution du H Cl binormal pour régler le p H à 1,0, puis on ajoute de l'éthanol de manière que la con- centration d'éthanol soit de 80 % en volume On recueille ce précipité par centrifugation ( 5 x 103 t/mn, 10 minutes) ( 78,5 mg). ( 3) Aux-78,5 mg du précipité ainsi obtenu on ajoute 20 ml d'eau et on règle le p H à 7 avec une solution aqueuse normale d'hydroxyde de sodium On concentre le mélange résultant à ml par ultrafiltration en utilisant la Membrane UK-50 et on ajoute 45 ml d'eau à la solution concentrée ainsi obte- nue, puis on concentre de nouveau la solution ainsi diluée à 5 ml en utilisant pour l'ultrafiltration la Membrane UK-50. A la solution concentrée ainsi obtenue on ajoute 45 ml d'eau et on concentre à 5 ml par ultrafiltration avec la Membrane UK-50 On filtre ce concentré à travers un filtre à membrane ayant un diamètre de pores de 0, 2 micron ("TM-4 ", Toyo Roshi Kabushiki Kaisha) et ensuite on lyophilise pour obtenir 65 mg de la substance carcinostatique lyophilisée TF-500. La substance TF-500 ainsi obtenue possède les proprié- tés citées plus haut, un spectre d'absorption I R selon la figure 6 et un spectre d'absorption U V selon la figure 7. Exemple 4 ( 1) On traite par centrifugation une portion de 10 litres de la culture obtenue dans la partie (l) de l'exemple I ( 5 x 103 t/mn, 10 minutes) pour collecter les organismes. Aux organismes on ajoute 500 ml d'une solution de sel physio- logique et on agite le mélange pendant 30 minutespuis on effectue une nouvelle centrifugation ( 5 x 103 t/mn, 10 minutes) pour recueillir le précipité On répète cette opération deux fois On ajoute au précipité ainsi obtenu 500 ml de la solu- tion saline physiologique, on agite pendant 30 minutes, puis on règle le p H à 8,0 avec une solution aqueuse normale d'hydro- xyde de sodium et on agite pendant 30 minutes On effectue une centrifugation ( 5 x 103 t/mn, 10 minutes), on dégraisse et on lave avec 500 ml de solution saline physiologique On effectue une nouvelle centrifugation ( 5 x 103 t/mn; 10 minu- tes) pour obtenir le précipité On lave ce précipité avec une portion de 500 ml de la solution saline physiologique, une portion de 300 ml d'éthanol et une portion de 300 ml d'acétone, dans cet ordre ll'enlèvement des fluides de lavage se fait par centrifugation ( 5 x 103 t/mn, 10 minutes)3 et on sèche pour obtenir des organismes séchas On pulvérise les organismes secs en une poudre et on ajoute à la poudre 160 ml de diméthyl- sulfoxyde, puis on extrait le mélange résultant avec agita- tion à 63-65 C pendant 4 heures Ultérieurement, on filtre le mélange par succion et on obtient un filtrat auquel on ajoute 1,2 litre d'acétone et 4,2 ml de HC 1 concentré, puis on laisse le mélange au repos à 4 C pendant 24 heures pour déposer et faire vieillir le précipité On soumet le précipité à une cen- trifugation ( 5 x 103 t/mn, 10 minutes) pour recueillir le précipité ( 246 mg). ( 2) Aux 246 mg de ce précipité on ajoute 5 ml d'eau et on règle à 7,8 le p H de ce mélange à l'aide d'une solution aqueu- se normale d'hydroxyde de sodium A ce mélange on ajoute 5 mg de "Pronase E" ( 1 000 000 d'unités de tyrosine/g) et on traite le mélange par enzyme à 37 C pendant 30 minutes, après quoi on ajoute au mélange une solution aqueuse normale d'hydroxyde 2531863 ' de sodium pour régler le p H à 7,8 et on ajoute de nouveau mg de "Pronase E" et plusieurs gouttes de toluène On sou- met le mélange résultant à un traitement par enzyme à 37 C pendant 24 heures A ce mélange traité on ajoute du H Ci nor- mal pour régler le p H à 1,0 et on laisse le mélange résultant au repos pendant 2 heures, puis on effectue une centrifuga- tion ( 5 x 103 t/mn, 10 minutes) pour obtenir le liquide sur- nageant A ce surnageant on ajoute de l'éthanol de manière que la concentration d'éthanol soit de 80 % en volume On laisse au repos le mélange résultant pendant 2 heures et on effectue une centrifugation ( 5 x 103 t/mn, 10 minutes) pour recueillir le précipité déposé ( 98 mg). ( 3) Aux 98 mg de ce précipité on ajoute 20 ml d'eau et on règle le p H à 7 avec une solution aqueuse normale d'hy- droxyde de sodium On concentre le mélange résultant à 5 ml en utilisant pour l'ultrafiltration la Membrane UK-50 et on ajoute 45 ml d'eau à la solution concentrée ainsi obtenue et on concentre la solution ainsi diluée à 5 ml à l'aide de la Membrane UK-50 On filtre le concentré obtenu à travers un filtre à membrane ayant un diamètre de pores de 0,2 micron ("TM-4 " de Toyo Roshi Kabushiki Kaisha) et ensuite on lyo- philise pour obtenir 83 mg de la substance carcinostatique lyophilisée TF-500. La substance TF-500 ainsi obtenue possède les proprié- tés indiquées plus haut, son spectre I R est indiqué sur la figure 8 et son spectre U V est indiqué sur la figure 9. Exemple de préparation 1: On charge dans une fiole une solution aqueuse ayant un p H de 7,0 à 7,5 et contenant la substance carcinostatique TF500 obtenue dans l'exemple 1 et on lyophilise pour obtenir une composition lyophilise de substance carcinostatique TF-500 à une dose unitaire de 0,5 ou 1 mg Au moment de l'utilisation, on dissout ce produit dans une solution saline physiologique stérile, une solution de lidocaine à 0,5 %, une solution aqueuse de glucose à 0,5 % ou une solution simi- laire et on l'utilise pour injection. Exemple de préparation 2: - On charge dans une fiole une solution aqueuse ayant un p H de 7,0 à 7,5 contenant la substance carcinostatique TF-500 obtenue dans l'exemple 2, on lyophilise et on obtient une composition lyophilisée de substance TF-500 à une dose unitai- re de 0,5 ou I mg Au moment de l'utilisation, on dissout ce produit dans une solution saline physiologique stérile, une solution de lidocaine à 0, 5 %, une solution aqueuse de glucose à 0,5 % ou une solution similaire et on l'utilise pour injec- tion. Exemple de préparation 3 On charge dans une fiole une solution aqueuse ayant un p H de 7,0 à 7,5 contenant la substance carcinostatique TF-500 obtenue dans l'exemple 3, on lyophilise et on obtient une composition lyophilisée de substance TF-500 à une dose uni- taire de 0,5 ou 1 mg Au moment de l'utilisation, on dissout ce produit dans une solution saline physiologique stéril-e, une solution de lidocaine à 0,5 %, une solution aqueuse de glucose à 0,5 % ou une solution similaire et on l'utilise pour injection. Exemple de préparation 4: On charge dars une fiole une solution aqueuse ayant un p H de 7,0 à 7,5 contenant la substance TF-500 de l'exemple 4, on lyophilise et on obtient une composition lyophilisée de TF-500 à une dose unitaire de 0,5 ou 1 mg Au moment de l'utilisation, on disso-ut ce produit dans une solution saline physiologique stérile, une solution de lidocaine à 0,5 %, une solution aqueuse de glucose à 0,5 %ou une solution simi- laire et on l'utilise pour injection. REVENDICATIONS 1 Nouvelle substance carcinostatique TF-500 possédant les propriétés ci-après, ainsi que les sels de cette substan- ce: (a) poudre blanc grisâtre-brun clair; (b) activité carcinostatique et immunostimulante; (c) soluble dans l'eau mais insoluble dans le méthanol, l'éthanol, l'acétone, le benzène, le chloroforme, l'acétate d'éthyle et l'éther diéthylique; (d) pas de point de fusion précis, un début de décompo- sition à environ 180 C et une très forte décomposition au dessus de 195 C, - (e) spectre d'absorption I R obtenu par le procédé au K Br ayant des bandes d'absorption au voisinage de 3500-3200, 2920, 2850, 1660-1600, 1580-1520, 1460-1400, 1380-1360, 1120- -1 1100, 1080-1000, 970 et 840-800 cm; (f) spectre d'absorption U V de sa solution aqueuse à p H 7,0 montrant une forte absorption sur le bord d'absorption et montrant un pic d'absorption au voisinage de 246-280 nm (g) réponse positive à la réaction de Molish, à la réaction au phénol acide sulfurique, à la réaction à l'anthro- ne-acide sulfurique, à la réaction à l'indole-acide chlorhydri- que et à la réaction de Lowry-Folin, mais négative à la réac- tion à la ninhydrine; (h) analyse élémentaire: C: 38-47 %, H: 5-7 %, N: 1-4 %; (i) teneur en saccharides déterminée par le procédé au phénol-acide sulfurique d'environ 12 à 30 l en poids expri- mée en glucose, et teneur en proténines déterminée par le pro- cédé de Lowry-Folin d'environ 10 % en poids ou moins exprimée en albumine de sérum bovin. 2 Substance carcinostatique TF-500 selon la revendica- tion 1, correspondant à celle obtenue en soumettant les orga- nismes appartenant au genre Fusobacterium à un traitement d'extraction avec un dialkyl-sulfoxyde et en isolant ladite substance à partir de l'extrait obtenu. 3 Procédé de préparation de la substance carcinosta- tique ou du sel défini à la revendication I ou 2, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre les organismes appartenant au genre Fusobacterium à un traitement d'extraction avec un dialkyl-sulfoxyde et à isoler ladite substance de l'extrait, 4 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on soumet les organismes du genre Fusobacterium à un traitement d'extraction avec un dialkyl-sulfoxyde, on ajoute à l'extrait résultant un solvant organique hydrophile, on soumet le précipité ainsi obtenu à un traitement de dépro- téinisation et ensuite à un traitement d'ultrafiltrationo Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le dialkyl-sulfoxyde est le diméthyl-sulfoxyde. 6 Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que le solvant organique hydrophile est l'acétone. 7 Procédé selon la revendication 4, 5 ou 6, caractéri- sé en ce que le traitement de déprotéinisation est un traite- ment enzymatique avec une enzyme protéolytique. 8 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'enzyme protéolytique est une pronase. 9 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on soumet les organismes du genre Fusobacterium à un traitement d'extraction avec un dialkyl-sulfoxyde, on ajoute un solvant organique hydrophile à l'extrait résultant et on sou- met le précipité obtenu à une ultrafiltration. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le dialkyl-sulfoxyde est le diméthyl-sulfoxyde. 11 Procédé selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que le solvant organique hydrophile est l'acétone. 12 Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 11, caractérisé en ce qu'on effectue le traitement d'ultra- filtration avec un ultrafiltre ayant un seuil de coupure de poids moléculaire nominal de 50 000 à 200 000. 13 Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 12, caractérisé en ce que les organismes appartenant au genre Fusobacterium sont Fusobacterium nucleatum. 14 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on soumet des organismes Fusobacterium nucleatum à un traitement d'extraction avec un dialkyl-sulfoxyde; on ajoute un solvant organique hydrophile dans des conditions acides à cet extrait en une quantité de plus de 5 fois celle de l'extrait (volume/volume); on soumet le précipité formé à une déprotéinisation avec une pronase; on ajoute un alcool de manière que la concentration d'alcool devienne de 30 à 80 % en volume; on recueille le précipité formé, on le soumet à une ultrafiltration et on filtre à travers un filtre à mem- brane, et ensuite on lyophilise le filtrat pour obtenir la substance carcinostatique.