FR 2526318 A1 19831110 FR 8307696 A 19830509 La présente invention concerne des analogues des hormones neurohypophysaires ayant des propriétés inhibitrices. Plus particulièrement, l'invention concerne S des analogues des hormones neurohypophysaires que sont l'ocytocine et la vasopressine, qui présentent des ef- fets inhibiteurs de l'activité utérotonique et pressive des hormones naturelles La caractéristique structurale commune à tous ces analogues est la présence d'un D- amino-acide aromatique hydrophobe en position 2 Cette caractéristique structurale est la cause principale des effets inhibiteurs, tandis que des modifications struc- turales complémentaires de la molécule réduisent l'effet inhibiteur ou modifient sa nature. On sait que les hormones neurohypophysaires possèdent plusieurs activités biologiques (Handbook of Experimental pharmacology, vol XXIII, Neurohypophysial Hormones and Similar Polypeptides, B Berde, Ed; SpringerVerlag, Berlin, 1968), qui sont utilisées en médecine Les composés qui annulent (inhibent) certaines de ces activités sont également utiles dans certains cas La demanderesse a découvert que ces composés peu- vent être obtenus par introduction d'un D-amino-acide aromatique hydrophobe dans la molécule des hormones neu- rohypophysaires au lieu d'un reste de tyrosine dans la. position 2 Par rapport aux analogues précédemment publiés (Rudinger J, Krejci I dans "Handbook of Expe- rimental Pharmacology Vol XXIII Neurohypophysial Hor- mones and Similar Polypeptides" (B Berde, Ed), pp. 748-801, SpringerVerlag, Belrin 1968; Sawyer W H, Crzonka Z, Manning M: Mol Cell Endocrinol 22, 117- 134 ( 1981)), les composés selon l'invention sont des inhibiteurs plus efficaces avec éventuellement des modi- fications qualitatives des activités biologiques (par exemple un effet inhibiteur prolongé). L'invention concerne des analogues des hormo- nes neurohypophysaires qui répondent à la formule géné- rale I que l'on peut préparer selon des procédés connus en chimie organique (certaines voies de synthèse sont illustrées dans les exemples de réalisation), R 1 21 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ R 2-C R 5 CH 3 _ 2 3 R 3-CH-CO-NH-CH-CO-X -Gln-Asn-NH-CH-CO-Pro-X -X t CH 2 Formule I dont tous les amino-acides chiraux appartiennent à la série L et l'amino-acide marqué d'un * appartient à la série D et R 1 et R 2 représentent un atome d'hydrogène ou un radical méthyle, R 3 représente un atome d'hydrogène ou un radical triglycylamino, R représente un atome d'hydrogène ou un radical méthyle, éthyle ou éthoxy, R 5 représente un radical S-CH 2 ou S- S, X 1 représente un reste d'anisoleucine ou de phénylalaline, X 2 représente un reste de leucine ou de lysine et X 3 représente un reste de glycinamide ou un radical hydroxy. L'invention concerne particulièrement les com- posés suivants: Composé R 1 R R R 4 5 X 1 X 2 X 3 Ia H H H H S-CH 2 Ile Leu Gly NH 2 Ib H H H OC 2 H 5S-CH 2 Ile Leu Gly NH 2 Ic H H -H CH 3 S-CH 2 Ile Leu Gly NH 2 Id H H H C 2 H 5S-CH 2 Ile Leu Gly NH 2 Ie H H H C 2 H 5S-S Ile Leu Gly NH 2 If H H NH 2 C 2 H 5S-S Ile Leu Gly NH 2 Ig CH 3 CH 3 NH 2 C 25 S-S Ile Leu Gly NH 2 (Suite) Composé R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 X 1 X 2 X 3 Ih H H NH 2 C 2 H 5 S-S Phé Lys Gly NH 2 Ii H H Gly C 2 H 5 S-S Ile Leu Gly NH 2 Gly Gly NH Ij H H H CH 3 S-CH 2 Ile Leu OH Tous les analogues indiqués ci-dessus ont des effets d'inhibition puissants Le Tableau I présente certaines valeurs numériques de ces activités, la valeur p A 2 étant le logarithme décimal changé de signe d'une constante d'inhibition selon la relation: B p A 2 = -log A 50 B _ _ _ _ _ _ _ 1 A 50 dans laquelle B est la concentration de l'inhibiteur (en mol/1), A 50 est la concentration d'un composé agoniste (ocytocine) produisant 50 % de l'effet maximal et A 50 B est la concentration d'un composé agoniste produisant % de l'effet maximal en présence de la centration B de l'inhibiteur (Eggena P, Schwartz I L, Walter R; J Gen Physio, 52, 465 ( 1968)). Tableau 1-Valeurs de p A 2 dans l'essai sur l'utérus de rate isolé: ' Composé de formule p A 2 Ia 8,26 Ib 7,54 Ic 8,73 Id 8,73 Ie 8,06 If 8,15 Ig 8,09 Ih 7,05 a Ii 6,14 b Ij 8,8 a Logarithme décimal changé de signe de la concentration en analogue provoquant une diminution de l'effet biologique de la vasopressine (c'est-à-dire de la tension artérielle d'un rat déspinalisé) à 50 % de la réponse d'origine (Schild H O Brit J Parmacol Chemo- ter 2, 189 ( 1947)); le volume sanguin du rat est fixé à 6,7 ml/100 g de poids corporel dans l'essai in vivo (Nestor J J, Ferger M F, du Vigneaud V J; med Chem. 18, 284 ( 1975)). b L'analogue a un effet inhibiteur prolongé vis-à-vis de l'activité utérotonique de l'ocytocine dans l'essai in vivo sur l'utérus par rapport à la dose équi- potentielle du composé supposé produit ( E 2-D-p-éthyl- phényllalanine ocytocine): l'effet inhibiteur est maintenu même si le reste glycinamide est enlevé de la molécule (composé Ij); on sait que ce type de modifica- tion élimine les activités endocrines (demandes de bre- vets CS PV 2803-82, PV 2099-81 et PV 8301-82), ce qui est très favorable pour l'emploi des inhibiteurs L'acy- lation du groupe ckamino primaire avec une chaîne pepti- dique courte fournit un inhibiteur à effet prolongé. Cette effet prolongé est dû au clivage enzymatique sé- quentiel de la portion ajoutée de la molécule qui s'ac- compagne d'une production progressive de l'inhibiteur, c'est-à-dire de l'utilisation du principe de l'effet hormonopolétique (BerankovaKsandrova Z, Bisset G W, Jost K, Krejci I, Pliska V, Rudinger J, Rychlik I, Sorm F: Brit J Pharmacol 26, 615-632 ( 1966)) dans le domaine des inhibiteurs. Le procédé de production des analogues des hormones neurohypophysaires est de plus décrit dans les exemples de réalisation suivants: Exemple 1 2-D-phénylalaninel désamino-6-carba-ocytocine On dissout 150 mg d'o-nitrobenzènesulfényl-D- phénylalanyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-( B - carboxyéthyl) homocystéinyl-prolyl-leucyl-glycinamide dans 4 ml de dyméthyl-formamide, on ajoute une solution d'acide chlorhydrique dans l'éther ( 3,2 M; 0,4 ml) et on laisse le mélange reposer pendant 6 minutes à la tem- pérature ambiante Le chlorhydrate de l'oetapeptide pré- cipite après addition d'éther, on le reprécipite dans le diméthylformamide avec de l'éther, on filtre et on sèche sous vide On dissout ensuite dans 4 ml de diméthylfor- mamide, on mélange avec 181 mg d'hydroxybenzotriazole, on refroidit à O C et on ajoute au mélange 200 mg de dicyclohexylcarbodiimide On agite la solution pendant 1 heure à O C et pendant 1,5 heure à la température ordi- naire On sépare par filtration les cristaux d'urée précipités, on ajoute la solution à 150 ml de méthanol chauffé à 45 C et on ajuste le p H du mélange à 8,5 par addition de N-éthylpipéridine On chauffe le mélange à C pendant 2 heures puis on concentre sous un faible volume On précipite le produit par addition d'éther, on filtre et on sèche sous vide ( 140 mg) On dissout une partie du produit ( 30 mg) dans 10 ml d'un mélange 1/1 de méthanol et d'eau, on applique à une colonne de gel de silice modifié par des chaînes octadécyles ( 50 x 0,9 cm) et on élue avec un mélange 55/45 de méthanol et d'acide trifluoroacétique aqueux à 0,05 % On concentre sous vide la fraction contenant un composé de k = 7,3 et on lyo- philise pour obtenir 6,5 mg du composé qui est pur selon la chromatographie liquide haute pression et la chroma- tographie en couche mince dans quatre systèmes solvants. Pour C 44 H 67 N 110115 2 H 20 ( 994,2) théorique: 53,16 % C; 7,20 % H; 15,50 % N; trouvé 52,88 % C; 7,39 % H; 15,29 % N Analyse des aminoacides: Asp 1,04; Glu 1,05; Pro 0,95; Gly 1,04; Ile 0,94; Leu 1,05; Phé 0,98; Hcy (C 2 H 4 COOH) 0,97. Exemple 2 E 2-D-O-éthyltyrosinel désamino-6-carba-ocytocine On cyclise de la même façon que dans l'exemple 1, 130 mg d'o-nitrobenzènesulfényl-D-O-éthyltyrosyl- isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-( B-carboxyéthyl)- homocystéinyl-prolyl-leucyl-glycinamide On obtient 135 mg du produit brut dont on dissout 30 mg dans un mélange 4/6 de méthanol et d'eau qu'on applique à une colonne de gel de silice modifié par des chaînes octadécyles ( 50 x 0,9 cm) et on élue avec un mélange 1/1 de méthanol et d'acide trifluoroacétique aqueux à 0,05 % On concentre la fraction contenant un composé de k = 26,3 et on lyo- philise pour obtenir 6,2 mg d'un composé pur selon la chromatographie liquide haute pression et la chromato- graphie en couche mince. Pour C 46 H 71 N 11012 S 4 H 20 ( 1074) théorique: 51,43 % C; 7,41 % H; 14,34 % N; trouvé: 51,27 % C; 7,65 % H; 14,08 % N Analyse des aminoacides: Asp 1,02; Glu 1,03: Pro 1,00; Gly 1,04; Ile 0,93; Leu 0,98; Tyr (Et) 0,41; Tyr 0,56; Hcy (C 2 H 4 COOH) 0,92. Exemple 3 :2-D-p-méthylphénylalaninel désamino-6-carba-ocytocine On cyclise de la même façon que dans l'exemple 1, 220 mg d'o-nitrobenzènesulfényl-D-p-méhtylphénylala- nyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-(B-carboxyé- thyl)homocystéinyl-prolyl-leucyl-glycinamide On purifie une partie ( 30 mg) du produit brut comme dans l'exem- ple 1 On concentre sous vide la fraction contenant un composé de k = 13,6 et on lyophilise pour obtenir 7,3 mg de produit pur selon la chromatographie liquide haute pression et la chromatographie en couche mince. Pour C 45 H 69 N 11011 S 3 H 20 ( 1026) théorique 52,67 % C; 7,37 % H; 15, 01 % N; trouvé 52,40 % C; 7,61 % H; 14,83 % N Analyse des amino acides: Asp 1,00; Glu 1,00; Pro 1,05; Gly 1,01; Ile 0,91; Leu 1,04; Phé(Mé) 0,99; Hcy (C 2 H 4 COOH) 0,99. Exemple 4 l 2-D-p-éthylphénylalaninel désamino-6-carba-ocytocine On cyclise 200 mg d'o-nitrobenzènesulfényl-D- p.éthylphénylalanyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-(B -carboxyéthyl) homocystéinyl-prolyl-leucyl-glycinamide et on purifie une partie ( 30 mg) du produit de la même fa- çon que dans l'exemple 1 pour obtenir 5,3 mg de composé pur selon la chromatographie liquide haute pression et la chromatographie en couche mince. Pour C 46 H 71 N 11011 S 4 H 20 ( 1055) théorique: 52,21 % C; 7,52 % H; 14,56 % N; trouvé: 51,90 % C; 7,54 % H; 14,41 % N Analyse des aminoacides: Asp 1,01; Glu 1,03;; Pro 0,94; Gly 0,99; Ile 0,92; Leu 1,05; Phé(Et) 1,00; Hcy (C 2 H 4 COOH) 0,95. Exemple 5 l 2-D-p-éthylphénylalaninel désamino-ocytocine On dissout 50 mg de S-benzylmercaptopropionyl- D-p-éthylphénylalanyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S- benzylcystéinyl-prolyl-leucyl-glycinamide dans de l'am- moniac liquide et on réduit avec un fil de sodium jus- qu'à ce qu'on obtienne une coloration bleue stable pen- dant 1 minute On supprime la coloration bleue avec une goutte d'acide acétique et on lyophilise le mélange On dissout le produit lyophilisé dans 8 ml d'acide chlorhy- drique 0,1 M, on dilue à 100 ml avec de l'eau et on a Juste le p H à 7 par addition d'hydroxyde de sodium 0,l M. On ajoute ensuite en 20 minutes une solution de K-Fe- D (CN)6 ( 25 mg dans 5 ml d'eau) en 20 minutes en main- tenant le p H à 7 pendant cette période On agite le mé- lange pendant encore 40 minutes à la température ordi- naire On ajuste ensuite le p H à 4 par addition d'acide acétique et on applique la solution à une colonne de gel de silice modifié par des chaînes octadécyles ( 25 x 0,4 cm) au moyen d'une pompe haute pression On lave la co- lonne à l'eau et on élue les peptides avec un mélange 80/20 de méthanol et d'acide trifluoroacétique aqueux à 0,05 % On concentre l'éluat sous vide et on lyophilise, on redissout dans 8 ml d'un mélange 1/1 de méthanol et d'eau, on applique à une colonne de gel de silice modi- fié par des chaînes octadécyles ( 50 x 0,9 cm) et on élue avec un mélange 65/35 de méthanol et d'acide trifluoro- acétique aqueux à 0,05 % On concentre sous vide la frac- tion contenant un composé de k = 16,6 et on lyophilise pour obtenir 8,6 mg de produit pur selon la chromatogra- phie liquide haute pression et la chromatographie en couche mince. Pour C 45 H 69 N 1101152 4 H 20 ( 1076) théorique ,22 % C; 7,21 % H; 14, 32 % N; trouvé: 49,94 % C; 7,24 % H; 14,18 % N Analyse des amino-acides: Asp 1,02 Glu 0,97; Pro 0,89; Gly 1,00; Cys 0,53; Ile 0,91; Leu 1,00; Phé(Et) 1,00. Exemple 6 l 2-D-p-éthylphénylalaninel ocytocine On réduit et on oxyde comme dans l'exemple 5, mg de Nc-benzyloxycarbonyl-S-benzylcystéinyl-D-p- éthylphénylalanyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S- benzyleystéinyl-prolyl-leucyl-glycinamide Après cycli- sation, on applique la solution à une colonne d'échan- geur de cations carboxylique ( 30 ml), on lave la colonne avec de l'acide acétique à 0,25 % et on élue les peptides avec de l'acide acétique à 50 %. On dissout une partie ( 1/3) du produit obtenu par lyo- philisation dans 8 ml d'un mélange 1/1 de méthanol et d'eau, on applique à une colonne de gel de silice modi- fié par des chaînes octadécyles ( 50 x 0,9 cm) et on élue avec un mélange 60/40 de méthanol et d'acétate d'ammo- nium aqueux 0,1 M à p H 7 On concentre sous vide la fraction contenant un composé de k = 21,1 et on lyophi- lise pour obtenir 16,3 mg de produit pur selon la chro- matographie liquide haute pression et la crhomatographie en couche mince. Pour C 45 H 70 N 1201152 2 H 20 C 2 H 402 ( 1115) théorique: ,61 % C; 7, 05 % H; 15,07 % N; trouvé: 50,36 % C; 6,81 % H; 15,23 % N Analyse des amino-acides: Asp 0,96; Glu 0,98; Pro 1,02; Gly 0,96; Cys 1,73; Ile 1,06; Leu 1,03; Phé(Et) 1,02. Exemple 7 l 1-pénicillamine, 2-D-p-éthylphénylalaninel ocytocine On réduit et on oxyde de la même façon que dans l'exemple 5, 200 mg de Na-benzyloxycarbonyl-S-ben- zylpénicillaminyl-D-p-éthyphénylalanyl-isoleucyl-glutaminyl- asparaginyl-S-benzylcystéinyl-prolyl-leucyl-glycinamide. Après cyclisation, on traite le mélange et on le purifie D comme dans l'exemple 6, si ce n'est qu'on emploie pour l'élution un mélange contenant 65 % de méthanol On ob- tient 8,2 mg de produit pur selon la chromatographie liquide haute pression et la chromatographie en couche mince. Pour C 47 H 74 N 1201152 3 H 20 C 2 H 402 ( 1161) théorique: ,07 % C; 7,29 % H; 14,47 % N; trouvé: 50,78 % C; 7,43 % H; 14,31 % N Analyse des amino-acides: Asp 0,98; Glu 1, 00; Pro 0,89; Gly 1,00; Ile 1,03; Leu 1,02; Phé(Et) 0,97; Cys+Pen 1,48. Exemple 8 E 2-D-p-éthylphénylalanine, 8-lysinel vasopressine On réduit par le sodium dans l'ammoniac liquide ( 40 ml) jusqu'à obtention d'une coloration bleue stable pendant 60 secondes 100 mg de N-benzyloxy- carbonyl-S-benzyleystéinyl-D-p-éthylphénylalanyl-phény- lalanyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcystéinyl-prolyl- NS-p-toluènesulfonyllysyl-glycinamide On décolore par addition d'acide acétique et on lyophilise la solution. On dissout le résidu dans 10 ml d'acide chlorhydrique 0,1 M, on dilue avec de l'eau à 200 ml et on ajuste à p H 7 Après addition d'une solution de K 3 Fe(CN)6 jusqu'à coloration jaune persistante, on maintient ce p H sous agitation pendant 1 heure On applique ensuite la solu- tion à un échangeur de cations de type carboxylate, on lave la colonne avec de l'acide acétique à 0,05 % et on élue avec de l'acide acétique à 50 % On lyophilise le produit, on dissout dans 10 ml d'eau, on applique à une colonne de gel de silice modifié par des chaînes octadé- cyles (dimensions de la colonne 50 x 0,9 cm) et on élue avec un mélange 40/60 de méthanol et d'acide trifluoroa- cétique aqueux à 0,1 % On lyophilise les fractions ap- propriées On vérifie la pureté du produit par chroma- tographie en couche mince (quatre systèmes solvants) et par électrophorèse sur papier (deux tampons de p H diffé- rents). Analyse des amino-acides: Lys 1,07; Asp 1,03, Glu 0,92; Pro 0,94; Gly 1,04; Cys 1,84; Phé 1,06; Phé(Et) 0,92. Exemple 9 Na-glycyl-glycyl-glycyl E 2-D-p-éthylphénylalanine ocyto- cine On ajoute une solution de 10 mg de l'ester N- hydroxy-succinimidique de l'o-nitrobenzènesulfénylgly- cyl-glycyl-glycine dans 0,3 ml de diméthylformamide à une solution de 4 mg de l 2-D-p-éthylphénylalaninelocyto- cine dans 0,3 ml d'eau Après 2 heures d'agitation à la température ordinaire, on rajoute 14 mg de l'ester actif de la triglycine et on alcalinise la solution à p H 8 par addition de 11 pl d'hydroxyde de sodium 1 M On suit la réaction par chromatographie liquide haute pression en phase inverse Après disparition du composé de départ ( 20 heures), on évapore la solution sous vide dans un évaporateur rotatif à la température ordinaire, on dis- sout le résidu dans 1 ml de méthanol, on ajoute 60 pl d'acide chlorhydrique 2,3 M dans l'éther, on laisse séjourner la solution à la température ordinaire pendant minutes et on évapore à nouveau On disperse le résidu dans 1 ml d'acide acétique 3 M et on filtre On dilue le filtrat avec 5 ml d'eau, on applique à une colonne de gel de silice modifié par des chaînes octadécyles (di- mensions de la colonne 50 x O,9 cm) et on élue dans les conditions suivantes: phase mobile, mélange 40/60 de méthanol et d'acide trifluoroacétique aqueux à 0,1 % pen- dant 40 minutes puis gradient linéaire jusqu'à une con- centration en méthanol de 60 % pendant 20 minutes, débit 4 ml/min On concentre sous vide les fractions appro- priées et on lyophilise pour obtenir 2,3 mg de produit pur selon la chromatographie (chromatographie en couche mince, chromatographie liquide haute pression) et l'électrophorèse. Analyses des amino-acides: Asp 0,99; Glu 1,05; Pro 0,90, Gly 4,08; Cys 1,29; Ile 0,96; Leu 1,02, Phé(Et) 0,99. Exemple 10 l 2-D-p-méthylphénylalanine, 9-désglycinamidel désamino- 6-carba-ocytocine On dissout 2,5 mg de l 2-D-p-méthylphénylala- ninel désamino-6-carba-ocytocine dans 50 pl de méthanol et 300 pl de tampon phosphate 20 m M à PH 7,7, on ajoute 2,5 mg de chymotrypsine et on incube le mélange à 37 C pendant 12 heures On suit la réaction par chromatogra- phie liquide haute performance Après disparition du composé de départ, on applique le mélange réactionnel à une colonne ( 25 x 0,4 cm) de gel de silice modifié par des chaînes octadécyles et on élue avec un mélange 40/60 de méthanol et d'acétate d'ammonium 0,05 M à p H 7,0 comme phase mobile On obtient après lyophilisation 1,6 mg du composé I qui se révèle être pur par chromatogra- phie dans quatre systèmes solvants employés en chromato- graphie en couche mince et dans deux systèmes solvants employés en chromatographie liquide haute performance. Analyse des amino-acides: Asp 0,96; Glu 0,98; Pro 1,02; Hcy (C 2 H 4 CO 2 H) 0,93; Ile 1,03; Leu 1,03 Phé(Mé) 1,05. REVENDICATION Analogues des hormones neurohypophysaires ayant des propriétés inhibitrices, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule générale I: R 1 R 2-C R 5 CH 2 () I I 2 3 CH-CO-NH-CH-CO-Xl-Gln-Asn-NH-CH-CO-Pro-X -X 3, CH 2 dans laquelle tous les amino-acides chiraux appartien- nent à la série L et l'amino-acide aromatique de la position 2 indiqué par un * appartient à la série D, R 1 et R 2 représentent un atome d'hydrogène ou un radical méthyle, R 3 représente un atome d'hydrogène, un radical amino ou un radical triglycylamino, R 4 représente un atome d'hydrogène ou un radical méthyle, éthyle ou étho- xy, R 5 représente un radical S-CH 2 ou S-S, X 1 représente un reste d'isoleucine ou de phénylalanine, X 2 représente un reste de leucine ou de lysine et X 3 représente un reste de glycinamide ou un radical hydroxy.