FR 2528451 A1 19831216 FR 8309632 A 19830610 i La présente invention décrit d'une façon générale des lignées cellulaires nouvelles d'hybridome et en par- ticulier des lignées cellulaires d'hybridome destinées à produire des anticorps monoclonaux contre l'activateur de plasminogène humain de type tissulaire (PA II), les anticorps qui sont produits de cette façon, des applica- tions expérimentales, thérapeutiques et diagnostiques ainsi que des préparations pharmaceutiques qui contien- nent ces anticorps. Le fusionnement de cellules myélomateuses de souris avec des cellules spléniques de souris immunisées (Kôhler et Milstein, Nature 256, 495-497 ( 1975)) a été le premier indice de la possibilité d'obtenir des lignées cellulaires continues qui produisent des anticorps homo- gènes (dits "monoclonaux") Depuis lors, de nombreux essais ont été entrepris en vue de produire diverses cellules hybrides (appelées "hybridomes") et pour utiliser dans différentes études scientifiques les anticorps qui sont formés par ces cellules (voir, par exemple: Current Topics in Microbiology and Immunology, volume 81 - "Lymphocyte Hybridomas", F Melchers et collaborateurs, Springer-Verlag ( 1978), de même que les références biblio- graphiques citées par ces auteurs; C J Barnstable et collaborateurs, Cell 14, 9-20 ( 1978); P Parham, W F. Bodmer, Nature 276, 397-399 ( 1978); Handbook of Experi- mental Immunology, 3 ème édition, tome 2, D M Wier, rédacteur en chef: Backwell, 1978, chapitre 25, Chem. Eng News, 15-17 ( 1979)) Ces travaux exposent les prin- cipes de la technique de production d'anticorps mono- clonaux par des hybridomes. Des anticorps monoclonaux contre des antigènes d'histocompatibilité, contre des haptènes, des protéines et des enzymes, ont déjà été produits Toutefois, on ne sait rien encore sur la production d'anticorps d'hybrides cellulaires somatiques contre l'activateur de plasminogène humain du type tissulaire. L'activateur de plasminogène du type tissulaire est un enzyme du système fibrinolytique, qui transforme le plasminogène en plasmine, laquelie peut, de son côté, décomposer la fibrine Elle a donc une action thrombolyti- que Les trois protéines mentionnées (plasminogène, plas- mine, fibrine) existent dans le sang L'activateur de plasminogène peut donc présenter une utilité dans le trai- tement d'états d'hypercoagulation, notamment dans le cas de maladies thrombo-emboliques. On utilise à l'heure actuelle comme fibrinolytique l'urokinase que l'on tire de l'urine humaine ou de cultures de cellules rénales, et la streptokinase qui est isolée de filtrats de culture de streptocoques e-hémolytiques. Toutefois, l'utilisation thérapeutique de ces deux substan- ces n'est pas sans poser de problèmes. L'activateur de plasminogène du type tissulaire peut être distingué de l'urokinase et de la streptokinase. Pour l'activateur de plasminogène du type tissulaire, on a trouvé un poids moléculaire d'environ 72 000 Il est produit par des cellules mélanomateuses humaines et peut être isolé des surnageants de cultures correspondants par la méthode de Rijken et Collen (JBC 256, 7035-7041 ( 1981)). Des anticorps monoclonaux contre l'activateur de plasminogène de type tissulaire sont intéressants à plu- sieurs points de vue Ainsi, par exemple, le procédé com- portant jusqu'à présent trois étapes pour la purification de l'activateur de plasminogène peut être ramené à une seule étape par l'utilisation de ces anticorps dans une chromatographie par immuno-adsorption. La présente invention propose des lignées cellu- laires d'hybridome qui synthétisent et sécrètent des anticorps monoclonaux à haute spécificité contre l'activa- teur de plasminogène du type tissulaire Ces hybridomes sont produits par la méthode précitée de K Mhler et Milstein Après l'immunisation de souris avec l'activa- teur de plasminogène du type tissulaire, les cellules spléniques de ces souris sont fusionnées avec des cellules d'une lignée de cellules myélomateuses de souris; les hybridomes qui en résultent ont été expérimentés systéma- tiquement sur des anticorps qui réagissent sélectivement avec l'activateur de plasminogène de type tissulaire qui est fixé à des plaques de microtitrage On a isolé de la sorte des hybridomes qui produisent des anticorps contre l'activateur de plasminogène Quelques-uns de ces anti- corps réagissent exclusivement avec l'activateur de plas- minogène de type tissulaire, tandis que d'autres présen- tent une réaction croisée avec l'urokinase Les anticorps ainsi produits constituent un autre objet de l'invention. Ils sont monospécifiques à l'égard d'un certain détermi- nant antigénique dans la molécule de l'activateur de plasminogène La présente invention décrit en outre des procédés de production de ces hybridomes. Les anticorps conformes à l'invention peuvent être utilisés, par exemple, pour le dosage d'un activateur de plasminogène dans des cellules normales et malignes. On peut donc les utiliser à des fins diagnostiques et pronostiques, par exemple pour surveiller la croissance d'une tumeur ou le statut fonctionnel de cellules nor- males. La production des hybridomes comprend d'une façon générale les étapes suivantes: A immunisation de souris avec l'activateur de plasminogène humain Des femelles de souris Balb/c se sont montrées utilisables à cet égard, mais on peut aussi utiliser d'autres souches de souris Le schéma d'immuni- sation et la concentration en activateur de plasminogène ont dû être choisis de manière que des quantités suffi- santes de lymphocytes stimulés par l'antigène soient formées Trois immunisations à intervalle de 14 jours avec 100 gg de protéine par souris et par injection avec une solution physiologique de chlorure de sodium tampon- née au phosphate se sont révélées efficaces. B Prélèvement des rates des souris immunisées et préparation d'une suspension de cellules spléniques dans un milieu approprié Un volume d'environ 1 ml de milieu par rate est suffisant Les techniques expérimen- tales relatives à cette manipulation sont connues. C Fusionnement des cellules spléniques en sus- pension avec des cellules myélomateuses de souris d'une lignée cellulaire correspondante (par exemple P 3 x 68 Ag 8), en utilisant à cet effet un promoteur de fusionnement appro- prié (par exemple le polyéthylène-glycol) Des promoteurs de fusionnement appréciés sont des polyéthylène-glycols de poids moléculaire moyen compris entre 1000 et 4000 (par exemple le PEG 1000 du commerce, etc) Toutefois, on peut aussi utiliser d'autres promoteurs de fusionnement connus. On donne la préférence à un rapport d'environ 10 cellules spléniques par cellule myélomateuse Un volume total d'en- viron 0,5-1,0 ml de milieu de fusionnement est suffisant pour 108 cellules spléniques On connaît de nombreuses lignées de cellules myélomateuses de souris que l'on peut se procurer, par exemple, auprès d'instituts scientifiques ou d'institutions de dépôt de cellules, telles que, par exemple, le Salk Institute Cell Distribution Center de La Jolla, CA La lignée cellulaire utilisée doit de pré- férence être du type qualifié de "drug resistent", de manière que des cellules myélomateuses non fusionnées meurent dans un milieu sélectif, tandis que les hybrides survivent On utilise le plus fréquemment des lignées cellulaires résistant à la 8-azaguanine, auxquelles il manque l'enzyme appelé hypoxanthine-guanine-phosphoribo- syl-transférase, et qui sont donc incapables de se déve- lopper dans un milieu HAT (hypoxanthine, aminoptérine, thymidine). La lignée de cellules myélomateuses utilisée doit également, de préférence, être du type "non- secreting", afin qu'elle n'élabore pas elle-même des anticorps ou des chaînes H ou, respectivement, L d'immuno- globulines Toutefois, dans certains cas, des cellules myélomateuses sécrétoires peuvent être avantageuses. D Dilution et culture dans des récipients indi- viduels des cellules spléniques non fusionnées, des cellules myélomateuses non fusionnées et des cellules fusionnées dans un milieu sélectif dans lequel les cellu- les myélomateuses non fusionnées ne se multiplient pas, de manière que les cellules non fusionnées meurent (envi- ron 1-2 semaines) Les cellules fusionnées individuelles sont isolées par ajustement du volume du diluant de manière à parvenir à un nombre déterminé de cellules (environ 1- 4) dans le récipient individuel (par exemple chaque alvéole d'une plaque de microtitrage) Le milieu (par exemple le milieu HAT) empêche la croissance de la lignée de cellules myélomateuses non fusionnées résistante (par exemple vis- à-vis de la 8-azaguanine); par conséquent, cette lignée meurt Les cellules spléniques non fusionnées n'ont qu'un nombre limité de cycles de division; c'est pourquoi ces cellules meurent également au bout d'un certain temps (en- viron 1-2 semaines) En revanche, les cellules fusionnées continuent de se multiplier, attendu qu'elles ont hérité des cellules myélomateuses parentales la permanence de la croissance et, de la cellule splénique parentale, l'aptitude à synthétiser l'enzyme appelé hypoxanthine- guanine-phosphoribosyl-transférase, et qu'elles peuvent donc survivre dans le milieu sélectif. E Contrôle de présence d'anticorps contre l'activateur de plasminogène dans chaque récipient. F Sélection (par exemple par dilution limitée) et clonage des hybridomes qui produisent les anticorps désirés. Une fois que l'hybridome désiré a été sélectionné et cloné, on peut produire l'anticorps de deux façons différentes On obtient des anticorps monoclonaux de très grande pureté en cultivant les hybridomes pendant un certain temps dans un milieu approprié et en isolant l'anticorps de la liqueur surnageante Un milieu approprié et la durée optimale de culture sont simples à déterminer Cette technique in vitro fournit des anticorps monoclonaux qui ne sont contaminés que par de faibles quantités de pro- téines provenant du sérum hétérologue (par exemple du sérum de foetus de veau). Pour préparer une concentration très élevée d'anticorps monoclonaux de pureté un peu plus faible seulement, on peut injecter l'hybridome choisi d'une souris de préférence une souris isogénique ou semi-isogénique. Après une certaine durée d'incubation, cela entraîne chez la souris la formation d'une tumeur qui libère de fortes concentrations d'anticorps ( 5-20 mg/ml) dans le sang et dans l'exsudat péritonéal (ascite) de l'animal hôte Bien que ces souris renferment des anticorps normaux dans le sang et dans l'ascite, ces anticorps n'existent pourtant qu'à une concentration d'environ 5 % des anticorps mono- clonaux L'anticorps monoclonal ainsi-obtenu a un titre élevé l'immunoglobuline non spécifique s'élève à environ 20:1. Exemple 1 Préparation de l'antigène utilisé pour l'immunisation L'activateur*de plasminogène a été préparé à partir de surnageants de cultures de cellules mélanoma- teuses d'après la méthode de Rijken et Collen (JBC 256, 7035-7041 ( 1981)). Immunisation de souris Balb/c Des femelles de souris Balb/c ont été immunisées par voie sous-cutanée avec 100 gag d'activateur de plasmi- nogène dans l'adjuvant complet de Freund Les animaux ont reçu une injection sous-cutanée de rappel de 100 ig d'activateur de plasminogène au bout de 14, 28 et 42 jours. Les rates ont été prélevées au 53 ème jour en vue du fusion- nement des cellules Quatre jours avant le prélèvement des rates, les animaux ont reçu quotidiennement par voie intra- péritonéale encore 30 gg d'activateur de plasminogène. Préparation d'une suspension de cellules spléniques On a préparé des suspensions de cellules indivi- duelles à partir des rates prélevées, en pressant les organes à travers un tamis en acier inoxydable Les cellu- les ont été transférées dans le milieu essentiel minimal de Dulbecco (DMEM) qui avait été supplémenté avec 4,5 litres de glucose, 1000 unités/ml de pénicilline et 100 gg/ml de streptomycine Les cellules ont été lavées trois fois au DMEM, puis remises en suspension dans le même milieu, à la concentration désirée On a généralement obtenu environ 108 cellules par rate. Préparation des cellules myélomateuses La lignée de cellules myélomateuses X 63-Ag 8 653 utilisée ici est un sub-clone de la lignée de cellules myélomateuses de souris P 3-X 63-Ag 8 La lignée cellulaire n'exprime pas de chaînes lourdes ou légères d'immuno- globulines (J Immunol 123, 1548-1550 ( 1980)) Elle a été établie par le Docteur Lemke de "Institut f Mr Genetik der Universitât Kbln" Les cellules sont résistantes envers 20 gg/ml de 8-azaguanine dans un milieu qui contient de l'hypoxanthine, de l'aminoptérine et de la thymidine (HAT). Elles ont été utilisées dans le milieu DMEM qui avait été supplémenté avec 4,5 g/litre de glucose, 20 m M de gluta- mine, 1000 unités/ml de pénicilline et 100 ug/ml de strepto- mycine et avec 10 % de sérum de foetus de veau (milieu complet) Les cellules myélomateuses se trouvaient dans la phase logarithmique de multiplication cellulaire au moment du fusionnement. Fusionnement des cellules Les suspensions de cellules spléniques ont été ajoutées aux cellules myélomateuses en milieu DMEM sans sérum dans un rapport de 10:1 et centrifugées pendant minutes à 200 x g dans des godets à fond rond Après la formation du dépôt de sédiment, le milieu surnageant a été décanté avec précaution Les sédiments ont été sou- mis à l'incubation pendant 1 minute à 37 C avec 2 ml d'une solution de polyéthylène-glycol de poids moléculaire 2000 (diluée à 30 % en poids/poids avec le milieu DMEM, à p H 7,6) On a ensuite ajouté 20 ml de DMEM, après quoi les cellules ont été remises en suspension avec précaution pendant quelques minutes Ensuite, elles ont été centri- fugées pendant encore 5 minutes à 200 x g et elles ont alors été remises en suspension en milieu complet de manière à obtenir une concentration de 106 cellules/ml, après quoi elles ont été réparties en portions de 1 ml sur des plaques Costar. Sélection et culture des hybridomes Après le fusionnement cellulaire, les cellules ont été cultivées en milieu HAT (hypoxanthine, amino- ptérine, thymidine) à 37 C en atmosphère humide avec 5 % de CO 2 Au bout de quelques semaines, on a effectué un contrôle d'activité antiactivateur de plasminogène sur il des surnàgeants des cultures de cellules d'hybri- dome. Les lignées cellulaires d'hybridome qui ont montré des résultats positifs dans le test anti-activateur de plasminogène ont été sélectionnées en vue du clonage Les hybridomes ont alors été exposés à une technique de clonage par double dilution dans laquelle on a procédé à un ense- mencement dans 96 alvéoles de microtitrage pour une dilu- tion calculée de 0,5 cellule/alvéole, en utilisant 105 thymocytes de souris comme "cellules d'alimentation". Les cellules produisant encore des anticorps après ce processus de clonage ont été multipliées, congelées et conservées en azote liquide dans le milieu complet qui contenait 25 % de sérum de foetus de veau ainsi que 7,5 % de diméthylsulfoxyde. Détermination de l'activité en anti-activateur de plasmi- nogène II il de liqueur surnageante de culture ont été prélevés sur les cultures cellulaires et déposés dans des alvéoles de microtitrage auxquels on avait fixé l'acti- vateur de plasminogène ( 5 gg/ml) pendant 3 heures à la température ambiante et que l'on a ensuite lavé à épuise- ment avec de l'eau On a ensuite ajouté de l'immuno- globuline de chèvre anti-souris, marquée à l'iode 125 I ( 8-10 x 104 chocs/minute); ensuite, on a fait incuber les plaques pendant 3 heures à la température ambiante. Après un nouveau lavage à l'eau distillée, les échantillons ont été comptés dans un compteur gamma LKB Le tableau I illustre quelques exemples représentatifs d'hybridomes qui sécrètent des anticorps contre l'activateur plasmino- gène humain de type tissulaire. Les mêmes hybridomes ont été injectés par voie intrapéritonéale à des souris préalablement traitées avec 0,5 ml de pristane, afin d'obtenir 10 à 15 jours plus tard du liquide d'ascite contenant des anticorps L'acti- vité des anticorps a été déterminée de la manière décrite ci-dessus Comme le fait apparaître le tableau I, les titres d'anticorps des liquides d'ascite s'étendent sur un intervalle de 10 à 3 x 10-6- T A B L E A U I Titre des activités d'anticorps dans des surnageants d'hybridomes contre de plasminogène tissulaire humain, mesuré dans le test de fixation de anti-souris avec marquage à l'iode 125 I ( 1 25 i)-anti-Ig fixé du surna- geant de culture (cpm) x 10 4,03 4,22 4,76 8,38 9,24 4,39 1,98 2,07 3,97 , 42 2,16 1,83 3,55 2,80 Titre en anti- corps d'ascite (valeur réci- proque) 1 x 105 1 x 105 3 x 105 1 x 106 1 x 106 1 x 105 1 x 10 1 x 103 1 x 105 3 x 104 1 x 103 1 x 10 3 x 105 1 x 104 Numéro 131 B 11 C 11 137 'G 7 164 G 6 167 E 9 C 8 206 G 5 239 E 8 243 D 8 245 D 8 251 G 9 260 D 12 265 E 9 280 A 7 ( 125 I)-anti-Ig fixé du surna- geant de culture (cpm) x 10 3 ,47 3,18 1,72 2,04 2,56 1,47 ,21 13,01 ,04 2,97 ,53 3,82 2,95 4,69 1 'activateur l'Ig G Titre en anti- corps d'ascite (valeur réci- proque) 3 x 1 x 1 x 1 x 1 x 1 x 3 x 3 x 3 x 3 x 3 x 1 x 1 x 3 x 1 0 6 1 io 6 1 05 Numéro 7 C 6 22 D 12 31 C 10 33 B 12 34 C 4 46 D 10 F 8 57 F 11 71 C 12 73 E 10 77 G 7 86 E 6 C 10 E 11 o ui tn > T A B L E A U C (Suite) Titre des activités d'anticorps dans des suxnageants d'hybridomes contre l'activateur de plasminogène tissulaire humain, mesuré dans le test de fixation de l'Ig G anti-souris avec marquage à l'iode 125 I ( 125 I)-anti-Ig Numéro fixé du surna- geant de culture (cpm) x 103 108 G 12 109 F 6 124 D 8 ,32 3,34 9,76 Titre en anti- corps d'ascite (valeur réci- proque) 1 x 105 1 x 105 1 x 106 Numéro 282 B 8 286 G 8 299 G 12 ( 125 I)-anti-Ig fixé du surna- geant de culture (cpm) x 10 3 9,68 2,46 12,65 Titre en anti- corps d'ascite (valeur réci- proque) 1 x 106 3 x % O 3 x 106 A. Nombre de chocs par minute, multiplié par 103 d'Ig G de chèvre anti- souris marquée à l'iode 12 I, qui est liée à l'activateur de plasminogène fixé à des plaques de microtitrage Les volumes initiaux des échantillons s'élevaient à 100 1 l. M) vli 1 ' Co Lx -4 Caractérisation des immunoglobulines produites par les hybridomes clonés Les classes et sous-classes des anticorps pro- duits par les clones d'hybrides ont été analysées Chaque anti- corps a été concentré à partir des surnageants de cultures par précipitation au sulfate d'ammonium (saturation à %) et partiellement purifié Les classes d'immuno- globulines correspondantes ont été déterminées dans le test de diffusion dans un gel d'Ouchterlony en utili- sant des antisérums anti-immunoglobulines de souris spécifiques des classes Comme l'indique le tableau II, * la plupart des anticorps contre l'activateur de plasmino- gène appartiennent à la classe Ig M ou Ig G 1; un seul est du type Ig G 2 b. TA'B L E A U II Caractérisation d'anticorps monoclonaux contre l'activateur de de type tissulaire par analyse isotypique plasminogène humain Lignée cellulaire Ig G 1 Ig G 2 b Ig M K Lignée cellulaire Ig G 1 Ig G 2 bIg M + + + + + + + + + 160 F 9 + 164 G 6 + 167 E 9 G 8 191 B 12 206 G 5 + 211 219 C 10 + 239 E 8 + 243 D 8 + + 245 D 8 + 251 G 9 260 D 12 265 E 9 + 267 K A + 7 C 6 8 D 9 22 D 12 31 C 10 33 B 12 34 C 4 36 C 5 46 D 10 F 8 57 H 11 64 D 10 71 C 12 73 E 10 77 G 7 86 E 6 C 10 + + + + + + + + + + + w + + + + + + + + + + + + + + + + + + DO tn 4 N co % T A B L E A U II (Suite) Caractérisation d'anticorps monoclonaux contre l'activateur de plasminogène humain de type tissulaire par analyse isotypique Lignée Lignée Ig K cellulaire Ig G 1 2 b Ig M K cellulaire 1 Ig G 2 b 268 A 8 + 275 280 A 7 282 B 8 285 A 10 286 G 8 + 297 C 6 299 G 12 + + + + + + + + + + + + E 11 106 E 9 108 G 12 109 F 6 D 7 124 D 8 131 B 11 C 11 137 G 7 + + + + + + + + + en oo Un Exemple 2 Inhibition de l'activité de l'activateur de plasminogène par des anticorps contre cet activateur L'activateur de plasminogène est une protéase qui transforme le plasminogène en plasmine L'activité d'activateurs de plasminogène peut être mesurée par la technique des plaques de fibrine Du plasminogène qui est incorporé à la fibrine est alors activé par son acti- vateur L'effet d'anticorps anti-activateurs de plasmino- gène individuellement ou en diverses associations - a été déterminé par le test sur plaques de fibrine Le tableau III montre que six anticorps sur 34 inhibent la réaction fibrinolytique dans les conditions de ce test. Les six anticorps actifs se distinguent quantitativement dans leurs propriétés inhibitrices Une inhibition addi- tive dans le test sur plaques de fibrine s'observe lorsque deux anticorps sont mélangés Cela démontre que les deux anticorps sont dirigés contre des déterminants antigéni- ques différents. T A B L E A U III Inhibition de l'activateur de plasminogène de type tissulaire dans le test sur plaques de fibrine par des mélanges d'anticorps contre l'activateur de plasminogène 131 B 11 282 B 8 206 G 5 33 B 12 137 G 7 299 G 12 73 E 10 131 B 11 % % % 91 % 86 % 79 % 72 % 282 B 8 % 97 % % % % 52 % % 206 G 5 % % % 62 % % % % 33 B 12 91 % % 62 % % % % % 137 G 7 86 % % % % 22 % % % 299 G 12 79 % 52 % % % % 14 % 14 % 73 E O O % % % % % % Dilution des anticorps: 102 uy co Un Exemple 3 Réaction croisée des anticorps contre l'activateur de plasminogène humain de type tissulaire avec l'urokinase L'urokinase, protéase qui est tirée soit de l'urine humaine (par exemple Ukidan (R) de Serono) soit de surnageants de cultures de tissu (par exemple Abbo- kinase(R) de Abbott) est capable de transformer le plasmi- nogène en plasmine de la même manière que l'activateur de plasminogène de type tissulaire Pour cette raison, on a étudié la réactivité croisée des anticorps avec de l'urokinase des deux types mentionnés ci-dessus Le tableau IV montre que 5 anticorps sur 35 sont dirigés uni- quement contre l'activateur de plasminogène de type tissulaire, tandis que les 30 autres anticorps réagissent également avec le produit Ukidan(R) , et parmi eux, réagissent avec le produit Abbokinase(R). T A BL EAU IV Réactions croisées des anticorps contre l'activateur de plasnminogène avec l'urokinase Réactivité d'anticorps contre l'activateur de plasminogène avec ativateur Ukidan PM 54 000) se (R) se 000) Lignée cellulaire Ac d E Réactivité d'anticorps contre l'activateur de p 1 asminogèx 4 e avec tivaleur Ukidan plasmi (uroki (uroki- nogène nase de nase d, PM 54 000 > PM 33 00 + 135 C 11 0 137 G 7 0 164 G 6 + 167 E 9 + 180 G 8 0 206 G 5 0 239 E 8 0 243 D 8 0 245 D 8 + 251 G 9 0 260 D 12 0 265 E 9 + Lignée c el lula ire C 6 22 D 12 31 C 10 33 B 12 34 C 4 46 D 10 F 8 57 H i 11 71 C 12 73 E 10 77 G 7 86 E 6 se 0) + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + à'J VI A( dg T A B L I A U IV (Suite) Réactions croisées des anticorps contre l'activateur de plasminogène avec l',, rokinase Lignée cellulaire Ac de Réactivité d'anticorps contre l'activateur de plasminogène avec: tivateur Ukidan(R) Abbokinai plasmi (uroki (urokinaî nogène nase de de PM 33 PM 54 000) se (R) se 000) Lignée cellulaire Ac de Réactivité d'anticorps contre l'activateur de plasminogène avec: _tivateur Ukidan(R) Abbokina plasmi (uroki (uroki- nogène nase de nase d, PM 54 000) PM 33 00 0 265 E 9 0 280 A 7 0 282 B 8 0 * 285 A 10 0 286 G 8 0 299 G 12 PM = poids moléculaire + + + + 86 E 6 C 10 E 11 108 G 12 109 F 6 124 D 8 131 B 11 + + + + + se e 0) + + + + + + + + + + + + + + + %D + i -à ui r\) Co -P. LM -3, Cette réactivité croisée des anticorps a pu être attribuée à des éléments structuraux communs entre l'acti- vateur de plasminogène de type tissulaire et l'urokinase, mais aussi à une contamination de cette protéine par de l'urokinase Afin de décider sur le point de savoir laquelle des deux interprétations est la plus vraisemblable, on a préparé l'activateur de plasminogène de type tissulaire par chromatographie par immuno-adsorption, en utilisant en l'occurrence un anticorps monoclonal réagissant exclu- sivement avec cette protéine L'activateur de plasminogène ainsi purifié a été utilisé ensuite comme antigène pour ce test Le test de fixation a montré que cet activateur de plasminogène réagissait lui aussi avec tous les anti- corps Cette expérience démontre que des réactions croisées ont lieu entre l'activateur de plasminogène de type tissu- laire et l'urokinase; par conséquent, les deux enzymes ont des déterminants antigéniques communs. Exemple 4 Purification et concentration de l'activateur de plasmino- gène de type tissulaire par chromatographie par immuno- adsorption Les anticorps qui réagissent exclusivement avec l'activateur de plasminogène humain de type tissulaire - à savoir 131, 206 et 282 ont été liés par covalence à du Sepharose 4 B R) à une concentration de 10 mg de pro- téine par ml de gel par la méthode de S C March, J. Parikh, P Cuatrecasas, Anal Biochem 60, 149 ( 1974). La capacité de fixation de la colonne envers l'activateur de plasminogène a été trouvée égale à 0,5-1,5 mg/ml de gel L'activité enzymatique de la matière ainsi purifiée a été concentrée à plus de 1000 fois sa valeur par rapport à la solution initiale L'électrophorégramme de l'activa- teur de plasminogène purifié de cette façon a été identique à celui de la matière qui avait été purifiée de manière classique Le rendement enactivateur de plasminogène dans la chromatographie par immuno-adsorption a atteint 90 %, comparativement à la valeur d'environ 40 % que permet d'obtenir la méthode classique. Exemple 5 Détermination des sites de fixation à la fibrine Des échantillons d'anticorps ont été traités avec de la trypsine immobilisée afin d'éliminer les inhibiteurs de protéase existant naturellement dans ces échantillons. Ces préparations ont été introduites dans une épreuve dans laquelle on a fait incuber ensemble un substrat chromogène, du plasminogène et l'activateur de plasmino- gène en présence ou en l'absence de monomères de fibrine. L'inclusion de monomères de fibrine fait normalement crottre l'activité de l'activateur de plasminogène d'un facteur 10 environ. Cet accroissement est supprimé par trois des anticorps testés, ce qui démontre une interaction de ces anticorps avec les sites de liaison à la fibrine de l'acti- vateur de plasminogène Les résultats sont reproduits sur le tableau V. TABLEAU V Réaction d'anticorps avec des sites de liaison à la fibrine de l'activateur de plasminogène Activité sans Activité avec monomères de monomères de fibrine fibrine Témoin 1,5 10,8 206 G 5 1,4 2,4 131 B 11 1,8 3,0 299 G 12 1,5 9,1 282 B 6 1,4 3,5 239 C 8 1,6 8,8 7 C 6 1,4 9,5 E 11 1,4 9,3 Les activités sont indiquées en unités arbitraires. La concentration des anticorps était d'environ 10 gg/ml. ú 528451 REVENDICATIONS 1 Des anticorps monoclonaux contre l'activateur de plasminogène de type tissulaire. 2 Procédé de production d'anticorps monoclonaux contre l'activateur de plasminogène de type tissulaire, caractérisé en ce qu'on fait fusionner des cellules myélo- mateuses avec des cellules qui proviennent de mammifères qui ont été immunisés avec l'activateur de plasminogène de type tissulaire et on sélectionne parmi les hybridomes résultants, ceux qui produisent les anticorps. 3 Procédé suivant la revendication 2, caracté- risé en ce qu'on utilise des cellules de souris. 4 Des cellules d'hybridomes qui produisent des anticorps monoclonaux contre l'activateur de plasminogène de type tissulaire. Cellules d'hybridomes suivant la revendication 4, caractérisées en ce qu'elles ont été préparées par fusionnement de cellules spléniques de souris immunisées avec des cellules myélomateuses de souris. 6 Utilisation d'anticorps monoclonaux contre l'activateur de plasminogène de type tissulaire pour la purification de l'activateur de plasminogène par chroma- tographie par immuno-adsorption. 7 Utilisation d'anticorps monoclonaux contre l'activateur de plasminogène de type tissulaire pour la détection de l'activateur de plasminogène dans des cellu- les et tissus normaux ou malins. 8 Application d'anticorps monoclonaux spécifiques à la détermination de sites de liaison à la fibrine.