FR 2527079 A1 19831125 FR 8308418 A 19830520 Le brevet de la République Fédérale d'Allemagne DE-PS 10 76 888 décrit déjà un procédé pour l'obtention à partir du sang de substances actives accélérant la respiration cellulaire, dans lequel on défibrine par exemple du sang de veau frais, on soumet la solution obtenue à une hémolyse, on soumet la solution hémolysée ainsi obtenue à une dialyse pour la séparation des cons- tituants de haut poids moléculaire, comme par exemple les protéines, et on transforme le dialysat ainsi obtenu en une solution de substances actives appropriée directement pour des buts thérapeu- tiquespar concentration douce ultérieure à une teneur en substance sèche de 30 à 60 mg/ml La dialyse nécessaire dans ce procédé peut être mise en oeuvre, d'après les indications données dans ce brevet, avec n'importe quel matériau de dialyse connu et habituel, l'utili- sation de tubes de cellulose régénérée étant particulièrement appropriée. Ce procédé connu conduit bien à un produit ayant l'activité thérapeutique souhaitée, mais il a l'inconvénient que la dialyse nécessaire est relativement coteuse et longue, donne un produit soumis à des variations quant à sa limite supérieure de poids moléculaire et à sa position,et donc pas constamment uniforme,et laisse du reste encore beaucoup à désirer quant au rendement en produit. Le procédé du brevet DE-PS 10 76 888 conduit en outre aussi à un produit ayant une teneur relativement élevée en sels inorganiques, en particulier en chlorure de sodium et en chlorure de potassium, ce qui doit être attribué principalement à un enri- chissement de la fraction de ces sels présente dans le sang, car ces sels ne peuvent être séparés par le procédé décrit dans le brevet La teneur en sel de la solution de substances actives ainsi obtenue peut parfois représenterpar exempleenviron 25 à 80 % en poids, de sorte que les solutions pour injection ou les formes locales à haute concentration correspondantes sont plusieurs fois hypertoniques Par suite de cette hypertonicité, une administration intramusculaire de ces solutions de substances actives s'accompagne d'une part de douleurs et d'autre part d'une dégradation cellulaire qui s'oppose à l'effet de régénération des cellules recherché. La teneur en sel trop élevée gênante des substances actives accélérant la respiration cellulaire qui peuvit être o tees par le procédé du brevet DEPS 10 76 888, et aussi selon la première étape du procédé de l'invention, à savoir l'ultrafiltration continue, pourrait en principe être abaissée par divers procédés différents, de manière à obtenir ainsi directement une solution de substances actives isotonique à faiblement hypertonique seulement, à savoir par exemple par dialyse,ultrafiltration, échange d'ions ou filtration sur gel Mais tous ces procédés ne sont ou bien pas applicables du tout, ou seulement avec des résultats très insuffisants, pour le cas présent à une désalinisation d'une solution de composition et de constitution très complexes contenant des substances actives accélérant la respiration cellulaire D'après le brevet de la République Fédérale d'Allemagne DE-PS 25 12 936, 1 e problème d'une désalinisation ou d'une désalinisation partielle de la solution de substances actives accélérant la respiration cellulaire en question doit donc être résolu par l'application d'un procédé de filtration sur gel tout à fait spécial, à savoir par application de la solution à forte teneur en sel des substances actives accélérant la respira- tion cellulaire sur une c Ouche filtrante, se trouvant dans un tam- bour centrifugeur perforé, d'un gel à degré élevé de réticulation avec un rapport en volume de la solution au gel d'environ 1:2,5 à 1:4,5 On discute également de manière détaillée dans ce brevet allemand les inconvénients des autres procédés connus, en principe possibles, pour l'obtention d'une désalinisation partielle Mais tous ces procédés possibles,y compris le procédé décrit dans le brevet DE-PS 25 12 936,ont l'inconvénient que leur rendement de séparation est très faible et que les frais d'appareil sont très - élevés, car on doit opérer ici en général avec une dilution élevée. Ils comportent en outre des pertes de substances actives plus ou moins grandes, car outre la séparation souhaitée des sels inorga- niques, il se produit aussi une adsorbtion des substances actives accélérant la respiration cellulaire sur les agents de séparation nécessaires La régénération des gels et résines échangeuses d'ions à utiliser, obligatoirement nécessaire dans ce cas, nécessite en outre une grande dépense de temps et permet seulement un mode opératoire discontinu avec variation continue des conditions de séparation. Le procédé connu d'après le brevet DE-PS 10 76 888 pour la récupération de substances actives accélérant la respira- tion cellulaire a, d'après les indications ci-dessus,les lacunes les plus diverses, et celles-ci ne peuvent pas non plus être résolues en faisant appel au procédé décrit dans le brevet DE-PS 25 12 936 pour la séparation des sels inorganiques gênants contenus en quantité trop élevée L'objet de l'invention est donc la mise au point d'un nouveau procédé pour l'obtention de substances actives accélérant la respiration cellulaire, qui ne présente pas les inconvénients des modes opératoires connus et qui soit surtout mis en oeuvre de manière simple et en continu, qui soit réglable de manière nette et qui donne ainsi un produit ayant des limites supérieure et, dans une certaine mesure aussi,inférieure de poids moléculaires uniformes et qui en outre, du fait de la possibilité d'une décali- nisation partielle commandée, conduise directement à une solu- tion des substances actives accélérant la respiration cellulaire, qui soit adaptée à chaque type d'administration et qui aussi bien dans le cas de l'administration locale que générale, présente également une meilleure compatibilité physiologique que le produit thérapeutique à activité accélérant la respiration cellulaire qui peut être obtenu de manière connue Ce problème est maintenant résolu par le procédé selon l'invention. La solution de ce problème consiste donc en une combi- naison d'un procédé d'ultrafiltration pour la séparation des pro- téines et substances de haut poids moléculaire contenues dans la solution hémolysée et d'une électrodialyse pour la séparation partielle des sels inorganiques gênants. Le procédé selon l'invention conduit à un produit thérapeutique dont l'activité d'accélération de la respiration cel- lulaire est essentiellement la même que celle du produit obtenu selon le brevet DE-PS 10 76 688, mais représente une amélioration notable à de nombreux points de vue, par l'utilisation de la combi- naison de l'ultrafiltration et de l'électrodialyse L'ultrafiltration donne un produit uniforme avec séparation plus nette des protéines et des autres substances de haut poids moléculaire avec l'avantage simul- tané d'une meilleure rentabilité quant au temps et à l'espace néces- saires et au rendement L'électrodialyse qui fait suite à l'ultra- filtration, après une certaine concentration de la solution obtenue dans l'ultrafiltration, a l'avantage que d'une part elle peut être mise en oeuvre avec utilisation d'une solution relativement concen- trée, par exemple une solution ayant une teneur en solides de 15 à % en poids, et que d'autre part on peut opérer dans un équilibre quasistationnaire, qui s'établit sur les membranes échangeuses d'ions après une phase initiale Par modification des paramètres tels que densité de courant, température et durée, on peut en outre régler le procédé de désalinisation dans certaines directions et l'optimiser de telle sorte qu'il ne se perde qu'une quantité mini- male de substance organique Le degré de désalinisation est déter- miné chaque fois de manière très simple par mesure continue de la conductibilité,ou aussi par détermination continue de l Vosmolarité. Les mesures,connues ou propres à l'invention, néces- saires dans le procédé de l'invention sont par ailleurs mises en oeuvre de manière suivante Le sang de veau nécessaire comme matière première est- défibriné directement après son prélèvement, par agitation intense, éventuellement avec refroidissement, suivi de filtration de la fibrine formée Ce processus est habituellement mis en oeuvre directement dans les abattoirs correspondants. Après la défibrination, éventuellement après addition d'un agent conservateur, le sang est directement congelé et stocké à l'état congelé jusqu'à son utilisation ultérieure. Pour la mise en liberté des substances actives accélé- rant la respiration cellulaire, le sang défibriné et éventuellement congelé pour le stockage doit être soumis à une hémolyse, à savoir une dissolution des globules rouges A cet effet, les membranes cellulaires des globules doivent être détruites de n'importe quelle manière. Une destruction de ce type peut être obtenue aussi bien par voie chimique que par voie mécanique Pour l'hémolyse chimique, on ajoute au sang défibriné, par exemple,des ferments ou bactéries qui attaquent et détruisent les membranes cellulaires. L'hémolyse mécanique peut s'effectuer par addition d'agents qui conduisent à une élévation de la pression osmotique à l'intérieur des cellules, comme par exemple l'addition d'eau ou de solvants organiques tels qu'éthanol, éther éthylique ou acétone, ce qui fait alors éclater les membranes cellulaires, ou bien elle peut s'effectuer aussi par la technique dite "d'hémolyse par la glace", dans laquelle on fait lentement gonfler le sang de telle sorte que les membranes cellulaires peuvent former des cristaux de glace plus gros qui les perforent Après l'hémolyse, les globules rouges sont pratiquement tous détruits et les substances qu'ils contien- nent mises en liberté. L'hémolyse est également effectuéeavantageusement en présence de conservateurs. Le sang ainsi obtenu est alors prêt pour la mise en oeuvre de la première étape du procédé selon l'invention, à savoir l'ultrafiltration multiétage continue avec utilisation de membranes ayant une limite d'exclusion de poids moléculaire de plus d'environ 8 000 unités ("dalton") et de préférence de plus d'environ 5 000 unités. Les membranes utilisées dans l'ultrafiltration peuvent consister en les matières les plus diverses; on préfère les membranes en triacétate de cellulose ou en polyoléfine hydrophile. Les meabranes de ce type ayant une limite d'exclusion de poids moléculaire de plus d'environ 8 000 unités sont caracté- risées du point de vue de leur perméabilité par une séparation à % du dextranne ayant un poids moléculaire de 20 000, une sépa- ration nominale à 85 % du dextranne ayant un poids moléculaire de- 000, une séparation nominale à 50 % du polyéthylèneglycol ayant un poids moléculaire de 6 000 et une séparation nominale à 10 % du lactose d'un poids moléculaire de 342. Les membranes ayant une limite de poids moléculaire d'exclusion de plus d'environ 5 000 unités sont caractérisées quant à leur perméabilité par une séparation à 100 % du dextrane d'un poids moléculaire de 10 000, une séparation nominale à 97 % du polyéthylèneglycol d'un poids moléculaire de 6 000 et une séparation nominale à 30 % du polyéthylèneglycol d'un poids molé- culaire de 1 000. L'ultrafiltration de la solution obtenue après défi- brination et hémolyse du sang de veau avec utilisation de membranes du type décrit ci-dessus, donne alors un produit prat à l'emploi ayant un poida moléculaire limite d'exclusion d'environ 8 000 uni- tés ou d'environ 5 000 unités. Pour la mise en oeuvre de l'ultrafiltration multi- étage continue, on utilise de préférence un appareil d'ultrafil- tration à 4 étages telle qu'elle est décrite plus en détail dans l'exemple ci-après en référence à la figure 1 Un tel appareil contient des modules d'ultrafiltration du type Bl tels qu'ils sont décrits plus en détail dans le prospectus BPL 3/73 2 M de la Reverse Osmosis Division de la société Paterson Candy International Ltd, Whitchurch, Grande Bretagne, et découlent de la demande de brevet de la République Fédérale d'Allemagne DE-AS 20 65 812 Cet appareil spécial contient des membranes ayant un poids moléculaire limite d'exclusion de plus d'environ 8 000 unités Mais elle peut tout aussi bien ttre équipée de membranes ayant un autre poids moléculaire limite d'exclusion, par exemple une limite de poids moléculaire de plus d'environ 5 000 unités. On fait fonctionner l'appareil d'ultrafiltratton avec utilisation de pression comprise par exemple entre 8 et 10 bars et refroidissement de la solution à ultrafiltrer à une température comprisepar exempleentre 18 et 22 C L'appareil est alimenté de préférence avec une solution de sang de veau qui est additionnée d'un agent conservateur habituel, par exemple une solution alcoolique de 4-hydroxybenzoate de méthyle ou de 4hydroxybenzoate de propyle' de préférence une solution éthanolique d'une combinaison de ces deux agents conservateurs. Entre le premier et le dernier étage de l'ultrafiltra- tion multi-étage continue, on introduit avantageusement chaque fois, comme agent diluant pour la solution de sang concentré se formant dans chaque module d'ultrafiltration et devant ensuite être à nouveau soumise à l'ultrafiltration,une quantité telle d'agent de conserva- tion que la quantité de filtrat s'écoulant chaque fois du module d'ultrafiltration soit compensée avec maintien d'un niveau à peu près constant de solution de sang à soumettre à l'ultrafiltration. On opère avantageusement dans toutes les étapes de l'ultrafiltra- tion multi-étage continue précédant la dernière étape en maintenant chaque fois un niveau à peu près constant en solution de sang à soumettre à l'ultrafiltration Dans la dernière étape, la solution de sang provenant de l'avant-dernière étape est alors dialysée sans nouvelle dilution et ainsi expulsée de l'appareil. Le sang résiduel obtenu finalement dans l'ultrafiltra- tion est jeté. La solution débarrassée de protéines et de substances de haut poids moléculaire obtenue comme filtrat dans l'ultrafiltra- tion est concentrée dans une autre étape sous pression réduite à une température ne dépassant pas 40 'C, à une densité à 20 'C comprise entre 1,10 et 1,15 g/ml, par distillation de cette solution sous pression réduitepar exemple à une température de 30 à 350 C Le but de cette concentration est d'une part l'élimination du solvant organique éventuellement utilisé pour l'hémolyse ou du solvant orga- nique nécessaire pour chaque agent conservateur et la séparation simultanée de l'agent conservateur et d'autre part une concentration de la solution ultrafiltrée à une teneur en matière sèche appropriée pour la mise en oeuvre de l'étape ultérieure de l'électrodialyse selon l'invention, par exemple une teneur en matière sèche de 180 à 230 mg/ml L'agent conservateur précipité dans cette concentration est au mieux séparé par filtration, les traces d'agent conservateur éventuellement encore présentes dans la solution étant précipitées par réglage approprie du p H de la solution, par exemple par addition de faible quantité d'acide chlorhydrique jusqu'à un p H de 4,5, et ensuite éliminées par filtration La distillation nécessaire pour cette concentration est avantageusement mise en oeuvre dans un évaporateur sous vide approprié. Pour la séparation partielle des sels inorganiques contenus dans le concentrat obtenu après la concentration ci-dessus et pour la formation d'une solution isotonique à faiblement hyper- tonique ayant une osmolarité dans l'intervalb de 250 à 550 m Osmol ou u ne conductivité dans l'intervalle de 40 à 75 m S/cm ou une densité à 20 C dans l'intervalle de 1,05 à 1,08 g/ml, on soumet alors ce concentrat à la second étape du procédé selon l'invention, à savoir l'électrodialyse au moyen d'une batterie de cellules de membranes échangeuses de cations et échangeuses d'anions disposées alternativement, ayant une perméabilité de membrane jusqu'à un poids moléculaire d'environ 300 unités et de préférence jusqu'à environ 400 unités. Les membranes utilisées à cet effet sont caractérisées par leur perméabilité aux ions inorganiques et organiques d'un poids moléculaire jusqu'à environ 300 et de préférence jusqu'à environ 400, tandis que ces membranes sont bloquées pour les oligopeptides et les molécules plus grosses. Par L'utilisation de ces membranes,on obtient pour les substances actives une limite inférieure de poids moléculaire d'envi- ron 300 unités ou de préférence d'environ 400 unités. L'électrodialyse peut être mise en oeuvre avec applica- tion des conditions habituelles pour la séparation de sels inorga- niques de concentrats aqueux correspondants, de telle sorte que l'on opère selon l'invention à cet effet par exemple avec application d'une densité de courant dans l'intervalle de 5 à 70 m A/cm de section droite libre de la membrane, de préférence de 20 à 50 m A/cm 2, une tension continue de 0,2 à 2 V par membrane, de préférence de 0,5 à 1 V par membrane,et une température dans l'intervalle de O à 30 O C, notamment de 5 à 30 OC. L'étape de l'électrodialyse selon l'invention peut etre mise en oeuvre avec utilisation d'appareils habituels d'électro- dialyse consistant en une batterie de cellules à membranes échan- geuses de cations et échangeuses d'anions disposées alternativement, ayant chaque fois la-perméabilité de membrane souhaitée Dans l'exemple ci-après, on utilise à cet effet un appareil d'électro- dialyse selon la figure 2 décrite plus en détail ultérieurement. Il s'agit ici d'un appareil du type désigné sous le nom de BEL 2 par la société Berghof Cmb H, T Ubingen, République Fédérale d'Alle- magne Les membranes de cet appareil présentent une perméabilité de membrane jusqu'à un poids moléculaire d'environ 400 unités. Une description détaillée de la batterie de cellules de cet appa- reil d'électrodialyse est donnée dans la demande de brevet de la République Fédérale d'Allemagne DE-OS 29 46 284. La solution aqueuse contenant des substances actives accélérant la respiration cellulaire obtenue dans le procédé selon l'invention peut Atreselon sa forme d'application projetéesoit utilisée directement telle quelle pour des fins thérapeutiques, ou si on le désire encore diluée par de l'eau apyrogène, soit aussi à nouveau concentréesi besoin est Les formes correspondantes des médicaments sont alorspar exemple,des solutions aérosols, pom- mades, crèmes ou gels L'activité accélérant la respiration cel- lulaire de ces formes de médicaments est comme on l'a déjà indiqué - essentiellement la même que celle des substances actives obtenues selon le brevet DE-PS 10 76 888 Ces formes de médicaments sont donc utilisés en particulier pour l'accélération des processus de cicatrisation et l'action sur ces processus La dose de substance active à utiliser dans ce cas dépend chaque fois du mode d'applica- tion, ainsi que de la nature et de la gravité de l'état à traiter. Les types de blessures qui peuvent être soignées avec les substances actives accélérant la respiration cellulaire obtenues par le procédé selon l'invention sont par exemple les brûlures, les ulcères ou les escarres de décubitus La substance active peut être appliquée dans ce cas par voie intraveineuse, intraartérielle ou intramusculaire et dans le cas de blessures ouvertures également par voie locale. Pour une thérapie par injections comme pour le traitement d'ulcères chez l'homme, il faut par exemple'au début une dose journalière intra- veineuse ou intraartérielle de 200 à 800 mg de substance active, et cette phase initiale est suivie d'un post-traitement par voie intraveineuse ou intramusculaire à des doses journalières de 80 à 200 mg de substance active. A propos de ces possibilités d'application, et d'autres, d'une telle substance active, on consultera en général la brochure "Solcoseryl reaktiviert den gest 15 rten Energiestoffwechsel der Zelle, regeneriert dao Gewebe" (le Solcoséryl réactive le métabolisme éner- gétique perturbé des cellules, régénère le tissu) de la société Solco Basel AG, Birsfelden, Suisse, pûbliée sous le numéro SS-CH/d-6 81. Une condition essentielle pour l'application réussie du procédé selon l'invention est que dans ce procédé, et en parti- culier dans l'ultrafiltration et surtout dans l'électrodialyse, il ne puisse pas y avoir de dégradation de l'activité biologique de l'extrait de sang de veau Son activité biologique initiale doit donc être totalement conservée Le procédé selon l'invention doit donc aussi conduire à un extrait de sang dont l'activité biologique corresponde au moins ou soit même supérieure à celle du produit obtenu-selon le DE-PS 10 76 888. Le risque d'une perte possible d'activité biologique pendant l'ultrafiltration à mettre en oeuvre selon l'invention doit ttre considéré dans ce cas comne faible, car dans cette étape du procédé on sépare seulement des protéines et des substances de haut poids moléculaire et la majeure partie pourrait se situer, d'après des examens correspondants d'activité biologique, dans le domaine inférieur de poids moléculaires des substances actives accélérant la respiration cellulaire que l'on peut obtenir selon le procédé de l'invention On peut donc partir du fait que l'ultrafiltration n'a essentiellement pas d'autre influence sur l'extrait de sang que la simple dialyse à mettre en oeuvre selon le procédé du brevet DE-PS 10 76 888 Une étude comparative de la dégradation possible de l'activité biologique par l'ultrafiltration selon l'invention peut donc être supprimée. La concentration de la solution de substances actives qui suit l'ultrafiltration peut également être mise en oeuvre dans des conditions qui ne s'accompagnent d'acune dégradation de l'acti- vité biologique de cet extrait de sang Des essais comparatifs sont donc également inutiles dans cette étape. La séparation par électrodialyse selon l'invention des sels inorganiques présents dans le concentrat de substances actives pourrait par contre conduire à une dégradation gtnante de lactivité biologique de l'extrait de sang Autrement dit, on doit séparer des quantités de sels relativement grandes et les poids moléculaires des sels à séparer sont en outre relativement proches de la limite inférieure de poids moléculaire des substances actives accélérant la respiration cellulaire à récupérer selon l'invention. On doit donc déterminer au moyen d'examens correspondants si l'étape d'électrodialyse donne dans la solution de substances actives obtenue une détérioration de l'activité biologique,par rapport au concentrat de départ Bien entendu, il faut en outre étudier cog nent les pro- priétés physiques sont modifiées par l'application de cette électrodialyse, par rapport au concentrat de départ, et quelles substances essentielles sont séparées en même temps que les sels inorganiques. Les examens comparatifs sur chaque degré d'activité biologique ont été mis en oeuvre par trois méthodes différentes, à savoir a) étude de l'activité accélérant la croissance chez les fibroblastes après dégradation par élimination de carbonate (détermination de l'activité sur les fibroblastes) b) étude de l'activité d'accroissement du métabolisme de 02 selon Warburg (détermination de l'activité Warburg) et c) étude de l'activité accélérant la cicatrisation dans les br Ulures dorsales normalisées chez les rats (détermination de la durée de cicatrisation, par rapport au sérum physiologique). Les deux premiers essais in-vitro indiquent dans toutes les conditions d'essais que l'activité biologique totale est conser- vée et même partiellement accrue, car les sels endommageant les cellules ne sont plus présents Les essais de cicatrisation des blessures indiquent le résultat attendu, que les extraits de sang partiellement désalinisés obtenus selon le procédé de l'invention sont mieux tolérés par les animaux de laboratoire. Dans toutes les comparaisons d'activité entre le concentrat de départ non désalinisé et l'extrait partiellement désalinisé, on a bien entendu opéré avec des proportions normali- sées, à savoir avec utilisation de solutions ayant la m Lme teneur en substance actives,et non pas la même teneur en substance sèche. A cet effet, les solutions à comparer sont chaque fois diluées à une teneur déterminée en azote total, par exemple une teneur en azote de 1 mg par ml de solution injectable, et cette teneur totale en azote est ensuite prise comme représentant la proportion de matière organique présente à chaque fois dans les solutions On procède aussi bien entendu exactement de la même manière avec les solutions utilisées pour des fins thérapeutiques, chaque charge étant en outre étudiée dans l'essai Warburg et l'essai sur les fibroblastes. On détermine par des essais comparatifs les variations de teneur en matière sèche, de conductibilité, d'osmolarité et de teneur en cendre Les variations obtenues par rapport au concentrat de départ par la séparation des substances de bas poids moléculaire, à savoir essentiellement les ions anioniques et les autres produits de bas poids moléculaires, sont déterminées par comparaison des analyses chimiques de substances et de paramètres caractéristiques. Les résultats obtenus dans tous les essais comparatifs avec utilisation de deux concentrats de départ différents et de huit extraits partiellement désalinisés obtenus selon l'invention ressortent du tableau I de l'exemple Ils justifient l'hypothèse selon laquelle, outre les ions inorganiques, il y a également élimination partielle d'acides carboxyliques inférieurs et d'amino- acides, mais que l'activité biologique est totalement conservée. Pour prouver encore que l'électrodialyse à mettre en oeuvre selon l'invention ne donne pas de variation, ou seulement une variation négligeable,de la composition de l'extrait de sang quant à ses composants organiques, on a également effectué des examens par chromatographique liquide haute pression On a obtenu dans ce cas chaque fois des chromatogrammes identiques pour les concentrats de départ et pour les extraits partiellement désalinisés. L'exemple suivant illustre l'invention sans toutefois en limiter la portée. -Exemple Ultrafiltration. On utilise un appareil d'ultrafiltration du type mentionné au début (type Bl de la société Paterson Candy Interna- tional Ltd) Cet appareil d'ultrafiltration à quatre étages et son fonctionnement sont représentés schématiquement dans la figure 1 du dessin ci-annexé. Chaque étage de l'appareil comportant au total quatre étages(étages 1 à 4) se compose de deux modules tubulaires d'ultra- filtration (U 1 à U 4) ayant chacun une surface filtrante de 1,7 m 2 Leurs membranes consistent en acétate de cellulose ayant la caracté- ristique de perméabilité déjà mentionnée, à savoir une limite d'exclusion de poids moléculaire de plus d'environ 8 000 unités. Les pompes de circulation sous pression P à P sont des pompes à piston tournant qui donnent un débit d'environ 1 000 litres par heure sous une pression de 10 bars Les pompes d'admission P à P- et les pompes d'évacuation P 8 à P 10 sont des pompes doseuses qui peuvent être réglées à volonté dans un domaine de 2 à 20 litres par heure Les réservoirs au nombre total de quatre T 1 à T 4 ont chacun une capacité d'environ 300 litres Les solutions alimentant ces réservoirs sont maintenues à une température de 181 C au moyen des réfrigérants K à K 4 alimentés en eau de refroidissement On désigne chaque fois par Pl des indicateurs de pression, et par FI des indicateurs de débit Les abréviations encore contenues dans la présente description ont les significations suivantes B = solution de sang défibrinée et hémolysée KL = solution d'agent conservateur UF = ultrafiltrat AB = sang résiduaire. Pour la mise en marche de l'appareil, on charge chaque fois dans les réservoirs T 1 (étage l), T 2 (étage 2) et T 3 (étage 3) 250 litres de sang de veau défibriné et hémolysé, qui contient comme solution de conservateur 15 % en volume d'une solution alcoolique à 2 % en poids par volume d'un mélange 9:1 en poids de 4-hydroxy- benzoate de méthyle et de 4-hydroxybenzoate de propyle Ensuite, on met en marche les pompes de circulation sous pression P à P 3 e de sorte que l'ultrafiltrat UF commence à s'écouler et le contenu des réservoirs T 1 à T 3 diminue également dans la même mesure Dès que le contenu des réservoirs T 1 à T 3 atteint environ 150 litres, on met en marche les pompes d'admission P 5 à P 7 et les pompes d'éva- cuation P 8 à P 10 On introduit alors par la pompe d'admission P 5 10 L/h de sang de veau défibriné et hémolysé, contenant l'agent conservateur du type déjà décrit ci-dessus Simultanément, on introduit chaque fois par les pompes d'admission P 6 et P 7 dans les réservoirs T 2 et T 3 comme agent diluant 10 1/h d'une solution d'agent conservateur KL consistant en 85 % en volume d'eau et 15 % en volume d'une solution alcoolique à 1 % en poids/volume d'un mélange de 4-hydroxybenzoate de méthyle et de 4hydroxybenzoate de propyle 9:1 en poids Les pompes d'évacuatim P 8 à Pl O sont réglées de telle sorte que le niveau dans les réservoirs T 1 à T 3 reste constamment à 150 litres On alimente ainsi les réservoirs T 2 et T 3 chaque fois avec une quantité telle d'agent diluant KL que la quantité d'ultra- filtrat UF qui s'écoule chaque fois soit compensée avec maintien d'un niveau constant en solution destinée à l'ultrafiltration. Dès que le réservoir T 4 (étage 4) contient environ 1 de solution de l'étage 3, on met en marche la pompe de cir- culation sous pression P 4 On jette le sang résiduaire AB s'écou- lant par le trop-plein de ce réservoir T 4. Apres environ 36 heures, il s'est établi un équilibre dans les quatre étages L'ultrafiitrat UF s'écoulant des modules tubulaires d'ultrafiltration U 1 à U 4 est donc représentatif du procédé de l'invention, de sorte qu'il est rassemblé en vue d'une nouvelle utilisation (concentration ultérieure) Le débit de sortie de l'ultrafiltrat UF est d'environ 4,7 1/h dans l'étage 1, environ 11 1/h dans l'étage 2, environ 10,4 1/h dans l'étage 3 et environ 1,8 1/h dans l'étage 4 Les débits en ultrafiltrat UF sont donc de 5,3 1/h pour la pompe d'évacuation P, de 4,3 l/h pour la pompe P 9 et de 3,9 1/h pour la pompe Plo, tandis que le trop-plein de sang résiduaire AB du réservoir T 4 (étage 4) est de 2,1 1/h. Concentration L'ultrafiltrat UF obtenu dans l'ultra filtration à quatre étages ci-dessus est ensuite concentré sous une pression de 30 mbars et à une température de 35 C par distillation à une densité à 20 C de 1,130 mg/ml et ainsi débarrassé de l'alcool contenu dans la solution d'agent conservateur Dans cette concen- tration, il précipite aussi la majeure partie de l'agent conser- vateur, qui est séparé par filtration Le filtrat obtenu est additionné de faibles quantités d'acide chlorhydrique concentré jusqu'à atteindre un p H de 5, ce qui précipite les dernières traces d'agent conservateur Ce précipté est à son tour éliminé par fil- tration. Le produit obtenu par utilisation de l'ultrafiltration et de la concentration ci-dessus est rassemblé et sert de concentrat de départ désigné sous le n 733 10 pour l'étape d'électrodialyse selon l'invention qui suit. Répétition de l'ultrafiltration et de la concentration Les deux stades opératoires ci-dessus sont répétés exactement dans les détails à un instant ultérieur avec utilisation de sang de veau d'une autre origine; on obtient ainsi un autre concentrat de départ désigné sous le n 350 03 pour l'étape ulté- rieure d'électrodialyse. Electrodialyse Les concentrats de départ n 733 10 et 350 03 obtenus précédemment sont divisés une fois en deux portions et une autre fois en six portions et envoyés chaque fois dans les processus opé- ratoires séparés de l'appareil d'électrodialyse indiqué à la figure 2. On obtient de cette manière les électrodialysats n 12 et 13 en utilisant le concentrat de départ n 733 10 et les électrodialysats n 14, 15, 16, 17, 18 et 19 en utilisant le concentrat de départ n 350 03. On utilise un appareil d'électrodialyse du type pré- cédemment mentionné (type BEL 2 de la société Berghof Gmb H) Cet appareil et son fonctionnement sont indiqués schématiquement dans la figure 2 du dessin annexé. La partie essentielle de cet appareil est un assemblage de cellule qui consiste entre 7 paires de chacune une membrane échangeuse d'anions a et une membrane échangeuse de cations k (type CMV et AMV) et contient en outre de chaque côté comme fermeture une membrane k (Pour simplifier, on a représenté dans le schéma que trois paires demembranes échangeuses d'ions Les membranes utilisées présentent une perméabilité jusqu'à un poids moléculaire d'environ 400. Les trois circuits de liquide suivants sont raccordés à la batterie de cellules: La solution à désaliniser qui est dénomée diluat D de manière analogue à la littérature, circule depuis le réservoir T 1 par une pompe Pl et un réfrigérant K 1. La solution aqueuse qui absorbe et concentre les sels, dénomée concentrat K, circule depuis le réservoir T 2 par une pompe P 2 et un réfrigérant K 2. Une solution aqueuse à 2 7 en poids par volume de sulfate de sodium, dénomée solution de rinçage des électrodes EL, circule depuis le réservoir T 3 par une pompe P 3. On évacue la chaleur produite par le frottement par les réfrigérants K et K 2 et on maintient les solutions à 250 C. Une cellule de mesure de conductivité LF est incorporée dans le circuit du diluat D après le réfrigérant K 1 On règle au moyen d'un second régulateur R l'admission de l'ultrafiltrat con- centré UK. Du côté du concentrat, on évacue en continu du réser- voir T une partie de la solution saline concentrée KA et on la remplace par de l'eau distillée W par la pompe P 5 * En outre, il se produit dans la batterie de cellules un certain transport d'eau du côté diluat vers le côté concentrat. * Une partie du diluat D est prélevée en continu après la mesure de conductivité dans la cellule de mesure de conducti- vité LF et envoyée à travers un filtre stérile SF et conservée comme produit prêt à l'emploi PR dans le réservoir T 4 à 00 C jusqu'à la transformation ultérieure en médicament prêt à l'emploi. Pour la mise en marche de l'appareil d'électrodialyse, on charge le réservoir T 1 d'une capacité de 2 1 avec 1,2 1 d'un ultrafiltrat concentré UK préparé de la manière décrite ci-dessus - Dans le réservoir T 2 de même capacité, on charge 1 1 d'eau distillée et dans le réservoir T 3 d'une capacité de 1 1 on charge 750 ml d'une solution à 2 % de Na 2 S 4 Après avoir rempli et dégazé la batterie de cellules et toutes les canalisations, on met en route les trois pompes Pl à P 3 qui ont chacune un débit d'environ 90 1/h On applique aux deux plaques d'électrodes (+ et -) un courant continu, en choi- sissant une tension telle qu'il passe sur la section droite libre de la membrane un courant d'environ 20 m A/cm Dans l'assemblage de cellules utilisé d'une section droite de membrane libre de 37 cm 2 il passe ainsi un courant total d'environ 750 mi La tension ini- tiale d'environ 16 V est a nouveau réglée en 1 heure à la valeur d'environ 5,5 V, alors stationnaire, pour la batterie de cellules consistant en 7 paires de membranes. Après 10 heures, la conductivité est tombée à une valeur comprise entre 45 et 50 m S/cm Le régulateur R règle alors l'admission de l Vultrafiltrat concentré UK par une pompe doseuse P 4 de telle sorte que la conductivité du-diluat reste comprise entre et 50 m S/cm, en moyenne à environ 100 ml/h. La pompe doseuse P 5 est réglée à 200 ml/h, le débit de sortie du concentrat salin K du réservoir T 2 est d'environ 220 ml/h. Les résultats obtenus après répétition à plusieurs reprises de la dialyse ci-dessus avec utilisation des deux con- centrats différents N O 733 10 et N O 350 03 et formation des électrodialysats différents N O 12 et 13 et no 14, 15, 16, 17, 18 et 19 sont indiqués dans le tableau I ci-après, conjointement avec les conditions de température,densité de courant et tension continue appliquées dans l'électrodialyse, ainsi que les différents résultats d'analyse pour les concentrats de sortie et les électrodialysats obtenus, ainsi que les résultats comparatifs quant à l'activité biologique. Les résultats des essais montrent que l'on peut fabriquer de manière particulièrement élégante et économique à partir du sang de veau,par application du procédé selon l'inventionune solution de substances actives accélérant la respiration cellulaire, dont l'activité biologique est au moins égale et même partiellement supérieure à celle de la solution de substances actives correspon- dante obtenue par les procédés connus. Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustra- tion et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention. TABLEAU I Teneur en matière sèche Densite ( 20 C) Conductivité Osmolarité Teneur en cendre Azote total Azote amino Chlorure Sodium Potassium Glucose Urée Phosphore total Lactate Acide acétique Activité sur les fibro- blastes Activite Warburg Durée de cicatrisation, par rapport au sérum physiologique Température Densité de courant Tension continue par membrane Unités mg/ml g/ml m S/cm m Osm % de matière % de matière % de matière % de matière % de matière % de matière % de matière % de matière % de matière % de matière 7 % de matière Accélération sèche sèche sèche sèche sèche sèche sèche seche sèche s èche sèche de la croissance, par rap- port à la culture normalisées %,par rapport à l'étalon Diminution, %. C m A/cm V i Concentrat départ n 733 10 de 212,1 1, 129 1053 ** 66,25 2,55 0,65 ,88 27, 19 4,34 ,91 2,15 0,78 9,72 1,83 1,6 ** 92 ** 2 x 9,9 Electrodialysat n 12 103,0 1,057 404 * 33,90 4,83 1,23 ,74 17,30 1,59 22,30 3,59 1,52 17,58 3.45 ?' 5 *X* + 10 0,7 Electrodialysat n'13 108,7 1,060 497 *** 41,80 4,57 1,25 19,31 19,49 2,14 ,52 3,43 1,39 17,71 3,18 1, 5 *** + 14 ** 13,7/10,9 1,0 *Toutes les valeurs de plus de 1,0 sont bonnes; des gradations quantitatives ne sont plus possibles. ^Ces données de mesures concernent un ultrafiltrat qui a été dilué 5 x par l'eau stérile. ***Ces données de mesures concernent un électrodialysat qui a été diiué 5 x par l'eau stérile. tu UNQ * 00. TABLEAU I (suite) Concentrat Electro-1 Electro Electro Electro i Electro Electro- Unités de départ dialysat ialysat dialysat dialysat ialysat dialysat 305 03 n 14 n 15 n 16 v 17 n 18 n 19 Teneur enimatière sèche Densite ( 20 C) Conductivité Osmolarite Teneur en cendre Azote total Azote amino Chlorure Sodium Potassium Glucose Uree Phosphore total Lactate Acide acetique Activite sur les fibro- plastes Activité Warburg Duree de cicatrisation, par rapport au sérum physiologique Tempeérature Densité de courant Tension continue par membrane mg/ml g/ml m S/cm m Osm % de matière % de matière % de matière % de matière % de matière % de matière % de matière % de matière % de matière % de matière % de matière sèche sèche sèche sèche sèche sèche sèche sèche sèche sèche sèche Acceleration de la croissance, par rap- port à la culture l normalisee* % 7 par rapport aà l'étalon Diminution, % i c 2 t V/cm iv: * Toutes les valeurs de plus e 1,0 * Ces données de oesure: concarient *** Ces données de mesures conqernent 213,11 1,129 ** ,57 2,73 0,64 37, 17 24,79 3,78 3,87 2,43 0,77 9,78 2,37 e X ,7 t* 109,7 1,060 56 *** 34,55 ,59 1,38 12,28 18,03 1,20 8,65 4,76 1,75 ,62 4,48 1, 1 " + 5 " * 1,0 106,37 1,057 ** 32,48 6,26 1,56 9,20 16,99 1,07 9,81 ,39 1,91 22,72 4,58 1,2 **h + 6 *** 1,2 107,58 1,058 *** 410 * 36, 11 l ,61 1,46 11,89 18,23 1, 10 9,06 4,56 1,75 21,69 4,56 1,3 -7 - i 25 0,8 111,37 1,060 56 *** 36,72 ,87 1,45 12,69 18,36 1,12 9 09 , 11 1,67 21,63 4,62 0, 7 * + 30 ** 1,2 129,62 1,073 o X Cc 43,90 ,13 1,28 16,30 %,40 1,53 7,95 4,34 1,56 18,32 4,01 1, 8 *s 1,3 sont bonnes; des gradations quantitatives ne sont plus possibles. un ultrafiltrat qui a été dilue x 5 par l'eau sterile. un électrodialysat qui a été dilué x 5 par l'eau stérile. 101,28 1,052 46 *** 28, 10 6,16 1,64 7,30 17,30 0,92 ,28 ,04 1,94 22, 60 4,68 2,0 *** 9 O t* 0,4 t" j NO i Zj U REVENDICATIONS 1 Procédé pour l'obtention de substances actives accélérant la respiration cellulaire ayant des poids moléculaires ayant un intervalle de 300 à 8 000 unités par défibrination du sang de veau directement après prélèvement, par agitation intense et élimination par filtration de la fibrine formée, hémolyse de la solution ainsi obtenue, séparation des protéines et substances de poids moléculaires de plus de 8 000 unités contenues dans la solution hémolysée par un procédé de séparation par membrane, concentration de la solution ainsi obtenue, débarrassée de pro- téines et de substances de haut poids moléculaire, sous pression réduite à une température ne dépassant pas 400 C, à une densité à C comprise entre 1,10 et 1,15 g/ml et séparation partielle des sels inorganiques présents dans le concentrat obtenu, suivie éven- tuellement de dilution du concentré obtenu pour la formation d'une solution isotonique à faiblement hypertonique ayant une osmolarité comprise entre 250 et 550 m Osmol, caractérisé en ce que l'on utilise comme procédé de séparation par membrane une ultrafiltration multi- étage continue avec utilisation de membranes ayant une limite d'exclusion de poids moléculaire de plus d'environ 8 000 unités et on effectue la séparation partielle des sels inorganiques par électrodialyse au moyen d'une batterie de cellules à membranes échangeuses de cations et échangeuse d'anions disposées alterna- tivement, ayant une perméabilité de membrane jusqu'à un poids molé- culaire d'environ 300 unités. 2 Procédé selon la revendication 1 pour l'obtention de substances actives accélérant la respiration cellulaire ayant des poids moléculaires compris entre 400 et 5 000 unités, caracté- risé en ce que l'on utilise dans l'ultrafiltration des membranes ayant une limite d'exclusion de poids moléculaire de plus d'envi- ron 5 000 unités et dans l'électrodialyse des membranes ayant une perméabilité jusqu'à un poids molédulaire d'environ 400 Dalton. 3 Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on met en oeuvre l'électrodialyse avec utilisation d'une densité de courant dans l'intervalle de 5 à 70 m A/cm 2 de section droite libre de membrane, de préférence de 20 à 50 m A/cm de section droite libre de membrane, d'une tension continue de 0,2 à 2 V par membrane, de préférence de 0,5 à 1 V par membrane et d'une tempéra- ture dans l'intervalle de O à 30 C. 4 Procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que dans les étapes comprises entre la première et la der- nière étape de l'ultrafiltration multi-étage, on introduit une quantité de diluant telle que la quantité d'ultrafiltrat s'écoulant de chaque module d'ultrafiltration soit ainsi compensée avec main- tien d'un niveau à peu près constant de la solution de sang à ultra- filtrer. Procédé selon la revendication 1, 2, 3 ou 4, caracté- risé en ce que dans toutes les étapes avant la dernière étape de l'ultrafiltration multi-étage, on opère chaque fois avec maintien d'un niveau à peu près constant de la solution de sang à ultra- filtrer.