FR 2535324 A1 19840504 FR 8218003 A 19821027 L'invention est relative à un procédé de syn- thèse organique d'oligosaccharides constituant ou compor- tant des fragments de mucopolysaccharides acides Elle con- cerne également la synthèse de dérivés de ces oligosaccha- rides. L'invention se rapporte, en outre, à de nouveaux oligosaccharides du genre indiqué ci-dessus et à leurs dé- rivés, possédant, notamment, des propriétés biologiques leur conférant, en particulier, un intérêt en tant que mé- dicaments et/ou utilisables, par exemple, comme réactifs de laboratoire. Elle vise également leurs applications notamment biologiques et biochimiques. Par le terme "mucopolysaccharide acide", on dé- signe des dérivés également couramment appelés glycosamino- glycuronoglycanes Il s'agit d'oligosaccharides et poly- saccharides rencontrés plus spécialement dans les chaînes de dérivés biologiquement actifs tels que des dérivés du type héparine, héparane-sulfate, dermatane-sulfate, chon- droltines, chondroitines-sulfates, ou acide hyaluronique. Dans les produits naturels, les mucopolysaccha- rides en question sont essentiellement formés de motifs alternés sucre aminé-acide uronique, ou inversement Dans ces motifs, le sucre aminé, désigné ci-après par A, pré- sente plus spécialement une structure D-glucosamine ou D-galactosamine L'acide uronique, qu'on appellera U, présente, plus spécialement, une structure acide D-glucu- ronique ou acide L-iduronique. Les structures de base pour A répondent respec- tivement aux formules a et b et pour U aux formules c et d ci-dessous: 6 OH 6 {_ o H HOO dérivé d'amine (a) D-glucosa Tnine COOH e OH > OH HO OH dérive d'amine (b) D-gaiactosamine COOH \ OH > OH O HO OH (c) acide Drgluc Uronique (d) acide L-iduronique Dans les produits naturels en question, ces différents motifs sont liés entre eux de manière stéréo- spécifique généralement par des liaisons 1 4, 1 4 et 1 B > 3. On trouve ainsi, par exemple dans l'héparine, des liaisons de type 1 a) 4 (entre les motifs d et a, a et, et a et d) et de type 1 4 (entre les motifs c et a). Dans les chondroitines et les chondroltines- sulfates, on rencontre de plus des liaisons de type 1 B) 3 (entre les motifs c et b) et 1 4 (entre les motifs b et c). Des liaisons de type 1 î 3 (entre les motifs d et b) et 1 B 4 (entre les motifs b et d) existent, en outre, dans le dermatane-sulfate. Dans l'acide hyaluronique, on trouve des liai- sons de type 1 3 (entre les motifs c et a) et 1 B 4 (entre les motifs a et c). 2 3 5 32 4 On notera, en outre, toujours en se référant aux produits naturels, que les motifs ci-dessus comportent des substitutions spécifiques, c'est-à-dire des substitu- tions déterminées en des positions données Les chaînes des produits naturels renferment, ainsi, par exemple, des motifs -O-substitués acide 2O-sulfate-L-iduronique, 3-0 sulfate-D-glucosamine, 3,6-di-O-sulfate-Dglucosamine, 6-0-sulfate-D-glucosamine et des motifs non-O-substitués, ainsi, par exemple, des motifs acide D-glucuronique, L-idu- ronique, D-glucosamine et D-galactosamine En outre, les motifs a et b sont N-substitués en position 2 des groupes -N-acétyle et/ou -N-sulfate. On connait l'importance des applications théra- peutiques des mucopolysaccharides acides ci-dessus, en par- ticulier, pour la prévention et pour le traitement des troubles de la coagulation et de la paroi vasculaire, et en particulier des thromboses et des athéroscléroses et artérioscléroses, ou pour lutter contre le vieillissement des tissus, ou des manifestations de type dégénératif, telles que des alopécies. On connait, par ailleurs, les nombreux travaux de la Demanderesse pour l'obtention de fragments de haute affinité pour l'AT III et biologiquement actifs à partir de chaînes d'héparine Les inventions mises au point sur la base de ces travaux font l'objet de différentes deman- des de brevets dont la demande de brevet EP N 80 40 1425 6 du 6 Octobre 1980 et la demande de brevet FR N 81 08604 du 29 Avril 1981. On rappelle que dans la demande EP, on décrit notamment un octasaccharide appelé ABCDEFGH possédant des propriétés antithrombotiques de grand intérêt, répondant à la structure: 25355 324 CO OR OR OR OR 0 - H 04 I"/'O H O H O 53 53 O OH NH Ac OH NH 503 00 NHSO 3 A B C D E F G H X Dans cette formule, R représente un groupe SO 3 ou un atome d'hydrogène. Dans la demande FR ci-dessus de la Demanderesse, on décrit une composition homogène d'hexasaccharides de structure C'DEFGH, possédant également des propriétés anti- thrombotiques élevées Cette structure répond à la formule: OR C O OR ont , v OO Il O O XO*V 11 o OH Il OH NI Ac 011 NHSO O SO NHSO 3 C' D E F G H dans laquelle R représente un groupe SO 3 ou un atome d'hydrogène. Les procédés proposés à ce jour pour obtenir ce type de produits mettent en jeu des techniques d'ex- traction à partir d'héparine ou de produits obtenus au cours de la préparation de l'héparine, ou encore des techniques de dépolymérisation des chaînes d'héparine sous l'action d'un agent chimique ou enzymatique, suivi de fractionnement spécifique notamment par chromatographie affine. L'état d'avancement des travaux des inventeurs dans ce domaine les a conduits à rechercher de nouveaux moyens permettant d'accéder à ce type de produits et plus spécialement à étudierles possibilités de les obtenir par voie de synthèse. A cet égard, il convient de mesurer le nombre de problèmes soulevés par une telle synthèse En effet, d'une part, ces produits renferment dans leurs chaînes plusieurs types de motifs A et U D'autre part, les liai- sons entre ces motifs répondent à une stéréochimie donnée et sont de type 1,4, dont les difficultés de réalisation particulières sont bien connues En outre, chaque motif comporte une ou plusieurs substitutions spécifiques selon le type de produit considéré On considérera également que les motifs glucosamine dans les produits naturels comportent deux groupes azotés différents l'un de l'autre, à savoir un groupe N-acétyle et un groupe -N-sulfate. Il s'ensuit que de telles synthèses n'ont prati- quement jamais été envisagées jusqu'à présent dans la lit- térature scientifique, tout particulièrement, en ce qui concerne l'acide L-iduronique. Tous ces éléments fixent des impératifs contrai- gnants dont il est aisé d'apprécier les difficultés qu'ils engendrent pour l'élaboration d'un processus général et du processus de synthèse. En recherchant des conditions de synthèse osi- dique appropriées à l'élaboration de ce type de composés, les inventeurs ont développé une stratégie en choisissant certains types de protection particuliers pour les produits mis en oeuvre. Les travaux effectués ont alors montré qu'avec de tels produits ainsi protégés, il était possible de réa- liser un enchaînement stéréospécifique puis d'introduire, si souhaité, sur les séquences formées, des substitutions données en des positions déterminées. Selon un aspect présentant un intérêt dont on mesurera l'importance, le procédé mis au point présente une grande souplesse Il est ainsi possible d'accéder, avec les avantages, notamment de spécificité et de pureté, liés à un processus de synthèse, à de nombreux dérivés d'oligosaccharides copportant les substitutions spécifiques rencontrées avec les produits naturels, ou même des substi- tutions différentes et/ou encore des motifs de structure analogue avec des configurations différentes. Grâce à ce procédé, les inventeurs ont obtenu des oligosaccharides dotés notamment de propriétés médica menteuses de grande valeur et plus spécialement à activité antithrombotique élevée Le procédé de l'invention permet également d'accéder à un grand nombre d'oligosaccharides particulièrement précieux, notamment comme réactifs biolo- giques et/ou comme composés de référence pour des études de structures. L'invention a donc pour but de fournir un pro- cédé d'obtention, par voie de synthèse, d'oligosaccharides et de leurs dérivés ou analogues, comportant ou correspon- dant à des fragments de mucopolysaccharides acides. Elle a également pour but de fournir des moyens permettant d'établir entre des motifs de type A et U des liaisons glycosidiques selon la stéréospécificité souhaitée. Elle vise également à fournir des moyens permet- tant d'introduire sur les motifs de la chaîne glycosidique des groupes fonctionnels donnés, en particulier des substi- tuants spécifiques tels que rencontrés dans les chaînes de molécules biologiquement actives, notamment celles du type héparine, héparane-sulfate, dermatane-sulfate, chondroiti- nes-sulfates, chondroitines ou acide hyaluronique. Elle a également pour but de fournir des moyens permettant d'obtenir des oligosaccharides tels qu'évoqués ci-dessus, mais dont les substituants et/ou la nature chi- mique des sucres et/ou la position et la configuration des liaisons interglycosidiques et/ou la configuration des mo- nosaccharides et/ou l'ordre des enchaînements sont diffé- rents de ceux des produits naturels. Selon un autre aspect, l'invention a également pour but de fournir de nouveaux oligosaccharides constituant 253 W 5 32 4 des produits intermédiaires du procédé de synthèse en ques- tion dans lesquels tous les groupes -OH des différents mo- tifs sont bloqués par des groupements protecteurs et les groupements précurseurs des radicaux fonctionnels éventuel- lement présents; le cas échéant, ces radicaux eux-mêmes sont également protégés. Selon encore un autre aspect, l'invention vise à fournir de nouveaux oligosaccharides présentant la struc- ture des produits naturels ci-dessus ainsi que des oligosac- charides correspondant à des fragments de ces produits. Elle vise également à fournir de nouveaux oligo- saccharides possédant les substitutions spécifiques des produits naturels. L'invention vise en outre à fournir de nouveaux oligosaccharides portant des substitutions différentes de celles des substitutions spécifiques en question et/ou comportant des motifs différents par rapport aux produits naturels considérés ci-dessus. L'invention vise également les applications bio- logiques de ces oligosaccharides, notamment en tant que substances actives de médicaments, réactifs de laboratoire ou produits de référence pour l'étude, en particulier, de composés comportant ce type de structure. Le procédé de synthèse de l'invention est carac- térisé en ce qu'on fait réagir deux composés constitués ou terminés respectivement par des motifs A de structure glucosamine, en particulier D-gluco- samine, ou galactosamine, en particulier D-galactosamine et des motifs U de structure acide glucuronique, en parti- culier D-glucuronique, ou acide iduronique, en particulier L-iduronique: l'un des motifs A ou U étant un alcool dans lequel le groupe -OH de la fonction alcool occupe l'une quelconque des positions 3, 4 ou 6 dans le cas d'un motif A et 2, 3 ou 4 dans le cas d'un motif U, l'autre motif 5 324 oo. possédant un carbone anomère activé, c'est-à-dire compor- tant un groupement réactif capable d'établir avec le grou- pe -OH de l'alcool la liaison de glycosylation -O recher- chée, selon la stéréochimie souhaitée, pour former une séquence-A-U ou -UA. le groupement réactif de A et U étant compa- tible avec les groupements protecteurs et/ou fonctionnels présents sur les motifs; - toutes les positions de A et U excepté celles dont le carbone anomère est activé portant des groupes -OH, amino ou carboxyle, ou des précurseurs de tels groupes, les groupes eux-mêmes, lorsqu'ils sont présents étant blo- qués par un ou avantageusement plusieurs types de groupe- ments protecteurs, ces différents groupements étant compa- tibles entre eux et avec les précurseurs ci-dessus, ces groupes protecteurs et précurseurs étant inertes vis-à-vis de la réaction de glycosylation et avec les groupes réac- tifs, autorisant la mise en place, au cours d'opérations ultérieures, de substituants donnés aux diverses positions, et ce, le cas échéant, de manière séquentielle, les condi- tions de mises en oeuvre pour faire réagir les produits de départ étant choisies de manière à ne pas altérer la struc- ture des motifs de ces produits et la nature des divers substituants présents, sous réserve que l'établissement de la liaison interglycosidique ne conduise pas à l'obten- tion d'un disaccharide à structure Z 2-N-sulfate ou ( 2-N- acétyl)-6-O-sulfate-D-glucosamine 7-lacide méthyl-D-glucu- ronique 7. Grâce aux dispositions ci-dessus, il est ainsi possible de réaliser une liaison covalente entre des mo- tifs de structure A et U et ce, selon la stéréochimie que présente ce type d'enchaînement dans les molécules biologiquement actives déjà considérées. Il est même possible à l'aide de l'invention de réaliser les enchaînements souhaités selon un ordre donné et/ou possédant une stéréospécificité donnée. Les moyens proposés selon l'invention permettent ainsi d'établir notamment une liaison de type 1 a > 4 en- tre un motif D-glucosamine et soit acide D-glucuronique, soit acide Liduronique, une liaison de type 1 Bl 4 en tre un motif acide Dglucuronique et un motif D-glucosamine et une liaison de type 1 N 4 entre un motif acide L-idu- ronique et un motif D-glucosamine. Les intermédiaires mono ou oligosaccharides de cette synthèse sont des produits semi-ouverts ou ouverts. On appellera composé semi-ouvert à droite un composé acti- vé ou potentiellement activable sur son carbone anomère, permettant ainsi son transfert sur l'extrémité non réduc- trice d'un monosaccharide ou d'un oligosaccharide L'ex- pression "composé semi-ouvert à gauche"désignera un mono- saccharide ou un oligosaccharide possédant une seule fonc- tion -OH libre ou potentiellement libre, permettant sa glycosylation spécifique A titre illustratif, on indique ci-après la formule 1 d'un exemple de composé semi-ouvert à gauche et celle 2 d'un exemple de composé semi-ouvert à droite: o & O Bl 6 3 1 2 Il s'ensuit qu'on appellera dérivés ouverts un dérivé semi-ouvert à la fois à droite et à gauche selon la définition ci-dessus, de tels dérivés autorisant une élon- gation de chaine dans les deux directions Un dérivé de ce type répond par exemple à la formule 3: Z 5 3 5 324 *c I,'2 l bi e Quant aux dérivés fermés, il s'agit de produits dont les motifs ne peuvent pas donner lieu à élongation de chaînes en raison de la nature de leurs substituants. Selon une disposition supplémentaire pour pou- voir ajouter des motifs à la séquence A-U ou U-A formée dans l'étape précédente, les motifs A ou U de la séquence formée doivent renfermer des groupements protecteurs tem- poraires, c'est-à-dire des groupements capables de bloquer sélectivement une position du motif A ou U destinée à inter- venlr dans une nouvelle réaction de glycosylation Ces groupements sont éliminables en présence des autres grou- pements présents sur les motifs des produits de départ en recréant un alcool, ce qui permet en répétant l'étape pré- cédente de glycosylation d'allonger le squelette glucidique. L'invention donne donc accès à la synthèse d'oligosaccharides à enchaînements variés, qu'il s'agisse de stéréospécificité a ou O et/ou d'ordre d'enchainement entre les motifs a et/ou b et d et/ou c, l'élongation pou- vant être effectuée à volonté. Selon encore une autre disposition du procédé * de l'invention, la chalne glucidique élaborée est soumise à une ou plusieurs réactions chimiques afin d'introduire un type de groupements fonctionnels donnés ou, successi- vement, plusieurs types de groupements, puis de former, si on le désire, des dérivés de ces groupements fonction- nels. Cette étape de fonctionnalisation peut être 35 324 réalisée en n'éliminant que certains groupements protec- teurs et/ou certains groupements précurseurs des dérivés aminés'ou encore la totalité des groupements protecteurs et/ou des groupements précurseurs et en introduisant à leur place un type de substituants donné, ou, successive- ment, des substituants différents, puis en libérant une partie ou la totalité des groupes -OH encore bloqués, si on le désire. Il est entendu alors que les différents groupes présents sur les motifs de la chaîne sont compatibles avec les substituants introduits à chaque étape. La ou les réactions chimiques mises en oeuvre au cours des étapes de fonctionnalisation sont réalisées de manière à ne pas altérer la structure de la chaîne et les groupes que l'on désire éventuellement maintenir et/ou ceux qui ont déjà été introduits. Selon un mode préféré de réalisation de l'inven- tion, pour obtenir des oligosaccharides à substitutions spécifiques comme définies ci-dessus, on utilise avec avan- tage des produits de départ renfermant plusieurs types de groupements protecteurs, à savoir ( 1) un ou plusieurs grou- pements semi-permanents et ( 2) un ou plusieurs groupements permanents. Par groupements semi-permanents, on entend des groupements éliminables en premier lieu après les réac- tions de glycosylation lorsque le squelette glucidique comporte le nombre de motifs désirés, sans enlèvement ou altération des autres groupes présents, permettant alors l'introduction de groupements fonctionnels souhaités aux positions qu'ils occupent. Les groupements permanents sont des groupements capables de maintenir la protection des radicaux -OH du- rant l'introduction de groupements fonctionnels à la place des groupements semi-permanents. Ces groupements sont choisis parmi ceux compa- 2 5 134 tibles avec les groupes fonctionnels introduits après éli- mination des groupes semi-permanents Il s'agit, en outre, de groupements inertes vis-à-vis des réactions effectuées pour la mise en place de ces groupes fonctionnels et qui sont éliminables sans que ces groupements fonctionnels ne soient altérés. D'une manière avantageuse, la mise en oeuvre * de ces dispositions permet d'élaborer une chaîne glucidi- que dans laquelle les motifs A et U sont sélectivement substitués. Pour préparer plus particulièrement des oligo- saccharides renfermant les motifs A et/ou U des molécules biologiquement actives évoquées ci-dessus, on a avantageu- sement recours à des groupements protecteurs tels que les radicaux acyle, alcoyle éventuellement substitués ou aryle. Les motifs des produits mis en oeuvre de type A comportent, en position 2, un groupe azoté autorisant le maintien de la présence d'une fonction azotée durant les opérations mises en oeuvre dans le procédé Ce groupe azoté est avantageusement constitué par des groupes tels que -N 3 ou -NHCOO-CH 2-C 6 H 5, ou tout autre groupe consti- tuant un précurseur de fonction amine ou d'un dérivé d'ami- ne, en particulier de -NHSO 3 ou de -NH-acyle, plus spécia- lement de -NH-COCH 3. Quant aux fonctions carboxyle des motifs f U, elles sont bloquées par des groupes inertes vis-à-vis des réactions mises en jeu pour le remplacement des groupes protecteurs et éliminables en fin de synthèse pour libérer les groupes carboxyle, éventuellement aux fins de salifi- cation Ces groupes protecteurs de fonction carboxyle sont choisis avantageusement parmi les radicaux alcoyle, ou les radicaux aryle. La structure du produit mis en oeuvre dans la réaction de glycoxylation est choisie en fonction des mo- tifs du squelette glucidique recherché ainsi que des sub- 3 5 324 stitutions recherchées. Pour former, par exemple, un disaccharide de type -U-A-, on utilise deux composés respectivement à structure acide uronique et sucre aminé, répondant, par ailleurs, aux définitions données ci-dessus. En vue d'une élongation de chaine, ces composés- tels que mis en oeuvre pour former le disaccharide en question, renferment, en outre, un groupement temporaire sur la position destinée à être impliquée dans la nouvelle réaction de glycosylation Pour une élongation disaccharide U-A vers la gauche, ce groupement temporaire est présent sur le motif U et pour une élongation à droite sur le mo- tif A. Il est ainsi po-sible d'obtenir, notamment, des enchaînements Uw Ax Uy Az dans lesquels la somme des indi- ces est comprise entre 2 et 12, ces valeurs étant incluses dans l'intervalle, W et y ne pouvant être nuls simultané- ment Des enchaînements réguliers sont du type U (AU)n n (AU) A, (UA) ou encore (AU) avec 1 N 6. n N n Selon une variante de réalisation du procédé de l'invention, l'alternance de type A-U ou U-A rencontrée dans les structures des produits naturels peut être modi- fiée en utilisant, à la place de l'un ou plusieurs des motifs A ou U, un sucre constituant un analogue structural de motif A ou U, tel qu'un sucre neutre ou un désoxy-sucre, ou encore d'autres motifs acides uroniques ou sucres aminés U ou A de configurations différentes. Selon un mode préféré de réalisation du procédé de l'invention, on fait réagir l'alcool ci-dessus avec un dérivé réactif tel qu'un halogénure, un imidate ou un or- thoester Ces condensations sont réalisées dans des condi- tions anhydres. La réaction de condensation entre l'halogénure et l'alcool est avantageusement du type Koenigs-Knorr. L'halogénure est avantageusement constitué par un bromure ou un chlorure en raison de commodités d'obtention. On opère en milieu solvant, plus spécialement dans un solvant organique, notamment du type dichlorométha- ne ou dichloroéthane. Avantageusement, on utilise un catalyseur, en général un sel d'argent ou de mercure, par exemple, le trifluorométhane sulfonate d'argent, communément appelé triflate d'argent, le carbonate d'argent, l'oxyde d'argent, le bromure mercurique ou le cyanure mercurique On utilise également un accepteur de protons tel que la sym-collidine de même qu'un capteur pour l'eau Éventuellement présente et/ou pour l'acide halogénohydrique formé, par exemple des O tamis moléculaires 4 A. L'étude des conditions de réaction montre qu'il est approprié d'opérer à température ambiante ou encore à une température inférieure pouvant atteindre O C ou moins, sous atmosphère d'un gaz inerte tel que l;azote ou l'argcn. Ces conditions permettent de condenser les mo- tifs de structure a et c ou d (ou l'inverse), ou b et c ou d (ou l'inverse), selon la stéréochimie souhaitée Elles permettent également l'établissement de liaisons covalentes avec des sucres neutres ou des déscoxy-sucres. Une variante comportant l'utilisation, comme catalyseur, de dérivés mercuriques, en particulier de cya- nure et/ou de bromure mercurique, s'avère appropriée pour réaliser des liaisons covalentes entre des alcools de structures variées et un précurseur L-idose du motif de structure d (acide L-iduronique) Selon cette variante, on utilise également des tamis moléculaires 4 A Le sol- vant organique est choisi selon la réactivité de l'alcool. Ainsi, on utilise avantageusement un solvant du type du nitrobenzène lorsque la condensation requiert une tempéra- ture supérieure à 100 C Pour des températures inférieures, on utilise des solvants, tels que le benzène ou le dichlo- rométhane Des mélanges de solvants conviennent également ' 32 pour réaliser la réaction de condensation. Avec les motifs de type U, en particulier les motifs d, il est avantageux d'utiliser, comme groupe réac- tif, un orthoester On réalise alors de préférence la réac- tion à une température supérieure à 1000 C. Le milieu solvant est du type du chlorobenzène - ou tout autre solvant dont le point d'ébullition dépasse 1000 C et se trouve avantageusement entre 100 et 150 C Pour activer la réaction, on utilise un catalyseur tel que du perchlorate de 2,6-diméthyl pyridinium. Ce mode de réalisation de l'étape de ccordensa- tion s'avère d'un grand intérêt pour établir une liaison interglycosidique entre un motif de structure d (acide L-iduroniq-ie) et un motif de structure a (D-glucosamine) ou b (D-galactosamine). L'utilisation du groupement orthoester présente, en particulier, un double avantage. D'une part, elle permet de conférer au carbone anomère de d la réactivité nécessaire pour la réaction de glycosylation D'autre part, l'ouverture de ce groupe as- sure la mise en place en position 2 de d d'un groupe pro- tecteur, éliminable sélectivement, en permettant l'intro- duction, à sa place, d'un groupe de substitution spécifi- que. Ainsi, par réaction d'un groupe 1,2-O-méthoxy- éthylidène d'un motif d avec le radical -OH d'un motif a ou b, il est possible à la fois d'établir une liaison interglycosidique entre les deux produits utilisés et de disposer en position 2 de d d'un groupe -O Ac (Ac repré- sentant un groupe acétyle) qui pourra être éliminé sélec- tivement aux fins d'introduction d'un groupe fonctionnel donné,par exemple -503 Cette disposition permet égale- ment de laisser toute liberté pour traiter la position 4 du motif d. Ces dispositions, particulièrement avantageuses, 253 5 3 2 4 permettent de disposer d'un motif 2-O-sulfate L-iduronique tel qu'existant, par exemple, dans les chaînes d'héparine. Lorsqu'on utilise comme groupe réactif un groupe imidoyle, il s'avère approprié d'opérer à basse température, plus spécialement à une température inférieure ou égale à 0 C environ, en milieu solvant, tel que du dichlorométhane, O en présence de tamis moléculaire 4 A et d'un catalyseur tel que de l'éthérate de trifluorure de bore. Dans l'alcool de départ, le groupe -OH libre occupe la position que l'on souhaite engager dans la liai- son de glycosylation. En choisissant l'alcool de manière appropriée, il est ainsi possible d'établir des liaisons du type 1-2, 1-3, 1-4 ou 1-6. A partir de la séquence formée à l'issue de la réaction de condensation, on élabore une chaîne comportant le nombre de motifs désirés en répétant l'étape de glyco- sylation. La fonction alcool de l'un des motifs A ou U impliqué dans la séquence glucidique déjà constituée est alors avantageusement libérée de son groupement protecteur temporaire Le choix de ce groupement sera aisément déter- miné par l'homme de l'art selon la nature des autres grou- pements présents sur la chaîne glucidique Parmi les divers groupements pouvant être uti- lisés, on citera le groupe allyle qui, par traitement, par exemple d'abord avec un agent isomérisant tel que des dé- rivés de Pd, Rh et Ir,en particulier le chlorure de tris- triphénylphosphine rhodium (I), ou encore le tertio-buto- xyde de potassium, puis dans des conditions acides, en particulier avec un mélange d'oxyde mercurique et de chlo- rure mercurique, permet aisément de recréer un alcool à la position qu'il occupe. De même, il est possible d'obtenir un groupe -OH par Esponifcrfication à partir d'un groupe -O-acyle, en particulier -O-acétyle, ou 0-chloroacétyle. Ces radicaux peuvent être éliminés pour libérer une fonction -OH, par exemple, à l'aide de thiourée en mi- lieu solvant, avantageusement à une température supérieure à 800 C, de préférence de l'ordre de 1000 C. Les dispositions qui précèdent permettent d'ob tenir une chaîne glucidique à motifs alternés A-U ou U-A. Cette alternance régulière peut être modifiée en mettant en oeuvre les produits appropriés dans la réac- tion de glycosylation Il est ainsi possible d'élaborer une structure irrégulière avec incorporation de motifs autres que U ou A, en particulier des sucres neutres ou encore des désoxy-sucres Un autre type de structure irrégulière peut être obtenu en ajoutant plusieurs motifs A ou plusieurs motifs U consécutifs entre deux motifs de structure A-U ou U-A. Il est entendu que les différentes dispositions de l'invention concernant les motifs A et U s'appliquent également aux autres motifs que peut comporter la chaîne glucidique tels que les sucres neutres ou les désoxy-sucres. Comme déjà indiqué, les différents groupements présents sur les motifs A et U sont choisis de manière à conférer à ces derniers une réactivité suffisante pour réaliser la tiaison glycosidique en question. Les groupements protecteurs de r-dicaux -OH, mis à part les groupements temporaires déjà considérés, sont généralement choisis dans le groupe ccmprenant les radicaux acyle (notamment acétyle, alcoyle, alcoyle substi- tué tel que benzyle), et pour deux positions voisines, parmi les groupes acétals ou cétals, par exemple benzyli- dène Une autre forme de protection consiste à effectuer un blocage de deux groupes -OH sous forme époxyde ou de pont 1,6-anhydro. Avantageusement, les produits utilisés dans la réaction de glycosylation renferment plusieurs types de 2 5 3 5 32 -4 groupements protecteurs, ce qui permet au cours de l'étape de fonctionnalisation d'introduire successivement un ou plusieurs groupements fonctionnels et de libérer un ou plusieurs radicaux -OH si on le désire. D une manière générale, les groupements protec- teurs peuvent déjà occuper des positions déterminées sur les produits mis en oeuvre dans la réaction de glycosyla- tion. Ils peuvent également être introduits à partir d'autres groupements une fois le squelette glucidique cons- titué Cette variante comporte, par exemple, l'utilisation pour la glycosylation d'un produit A dans lequel les grou- pes -OH en positions 2 et 3 et en positions 1 et 6 sont bloqués sous forme anhydre, respectivement 2,3-époxyde et 1,6-anhydro Grâce à ce blocage, on dispose durant l'éla- boration du squelette glucidique d'un élément constituant- potentiellement un motif A mais n'interférant pas avec les réactions mises en jeu dans la synthèse Cette disposition présente l'avantage de laisser une large liberté pour ef- fectuer les réactions désirées sur les groupements des autres motifs. On remarquera, en outre, dans le cas considéré, que l'ouverture de la fonction époxyde par de l'acide de sodium permet d'introduire, en position 2, un groupe N 3 qui constitue donc un précurseur de fonction amine. D'une manière préférée, pour disposer d'une chaine glucidique permettant d'introduire sélectivement un ou plusieurs types de substituants au cours de l'étape de fonctionnalisation, en particulier les substitutions spécifiques ci-dessus, on met en oeuvre des produits com- portant plusieurs types de groupements protecteurs, à sa- voir les groupes semi-permanents et les groupes permanents définis plus haut. Comme déjà indiqué, les substitutions des pro- duits naturels considérés, mises à part celles des posi- tions 2 des motifs A, sont essentiellement constituées par des groupes sulfate. Les travaux des inventeurs pour mettre au point des conditions de sulfatation appropriées ont montré qu'il est possible et même avantageux d'effectuer une réaction de sulfatation en présence de groupements benzyle Contrai- rement aux opinions admises dans ce domaine, l'élimination de groupements permanents benzyle, en présence de groupe- ments -O-sulfate, peut être réalisée. D'une manière préférée, les radicaux -OH des produits de départ destinés à être sulfatés sont alors protégés par des groupes acyle, en particulier acétyle, tandis que les radicaux -OH destinés à être libérés en fin de synthèse sont protégés par un groupe permanent tel que le groupe benzyle. Selon une grande souplesse du procédé de l'in- vention, il est possible de soumettre l'ensemble de la chaîne glucidique élaborée à une réaction chimique donnée afin d'introduire un type de substituant déterminé. Ce traitement peut consister par exemple en une estérification, notamment une sulfatation à l'aide d'un agent approprié, réalisée dans des conditions n'altérant pas la structure osidique Cette sulfatation peut être réalisée de manière spécifique ou non, le cas échéant sur le glycoside totalement déprotégé. Selon un mode préféré de réalisation de l'in- vention, l'étape de fonctionnalisation est cependant réa- lisée sélectivement de manière à introduire sur la chaîne, successivement, plusieurs types de substituants puis de libérer certains radicaux -OH. Selon des conditions particulièrement avanta- geuses, permettant d'introduire des groupes sulfate sur des positions déterminées des motifs, de libérer des radi- caux -OH sur d'autres positions, de former en position 2 des motifs A un dérivé d'amine et en position 6 des motifs 2 5 3532 4 U des dérivés d'acide, on met en oeuvre des motifs répon- dant aux caractéristiques suivantes. Les groupes semi-permanents de ces motifs occu- pent des positions destinées à être sulfatées et sont cons- titués par des groupes -O-acétyle. Quant aux positions correspondant à un groupe - -OH destinées à être libérées, elles sont occupées par des groupes semi-permanents constitués par des groupes benzyle. Les positions 2 des motifs A sont substituées par des groupes tels que N 3 ou NH-COO-CH 2-C 6 H 5 et les po- sitions 6 des motifs U sont occupées par des groupes car- boxyle protégés par un radical alcoyle, en particulier mé- thyle. Ce jeu de conditions permet de réaliser l'étape de fonctionnalisation, par exemple comme suit: On introduit tout d'abord sélectivement les groupes sulfate après avoir éliminé les groupes -Oacétyle de blocage Cette réaction est réalisée de manière à ne pas affecter les groupes benzyle et les groupes azotés et carboxyle présents. A cet égard, on effectue avantageusement une réaction de saponification à l'aidé d'une base forte telle que la soude. Cette réaction est réalisée de préférence à une température inférieure à l'ambiante et plus spécialement voisine -de Oc. On soumet le produit résultant de l'hydrolyse à l'action d'un agent d'alcoylation afin d'introduire, sur le groupe carboxyle, les groupes alcoyle protecteurs qui se sont trouvés éliminés lors de l'hydrolyse. Par réaction avec un agent de sulfatation, on obtient alors l'introduction de groupes sulfate aux posi- tions libérées par l'hydrolyse et laissées libres après l'action de l'agent d'alcoylation. Des conditions de réaction satisfaisantes pour la conduite de la sulfatation comprennent la mise en oeuvre d'un agent de sulfatation, tel qu'un complexe triméthylami- ne/SO 3- Cette réaction est avantageusement réalisée en milieu solvant, plus spécialement dans un solvant tel que le diméthylformamide De Préférence, on opère à une tempé- rature supérieure à l'ambiante, généralement voisine de - C, ce qui correspond à une durée de réaction d'environ 12 heures. Après l'introduction des groupes sulfate sur les fonctions alcool, on procède à la libération des groupes -OH bloqués par les radicaux benzyle. L'élimination de groupes benzyle est avantageu- sement réalisée par hydrogénation catalytique dans des conditions compatibles avec le maintien des groupes sul- fate et la transformation des groupes azotés en groupes fonctionnels amine. On opère de préférence sous pression d'hydrogène en présence d'un catalyseur du type Pd/C. Cette réaction est avantageusement réalisée en milieu solvant organique, en particulier alcoolique, addi- tionné d'eau. Pour obtenir l'hydrogénation des groupes azotés précurseurs et l'élimination des radicaux protecteurs des groupes -OH, la réaction est avantageusement réalisée sur une durée d'environ 3 à 4 jours. Comme déjà indiqué, les groupes fonctionnels amine se présentent sous forme de dérivés de type N-acé- tyle ou N-sulfate dans les molécules biologiquement actives considérées. Pour former des groupes N-acétyle, on soumet le produit résultant de la réaction d'hydrogénation à l'ac- tion d'un agent d'acétylation A cet égard, l'anhydride acétique constitue un agent particulièrement approprié. Pour réaliser cette réaction d'acétylation sé- lective sans affecter les autres substituants présents sur 2 5 3 5 -3 2 4 les motifs, il convient, notamment, d'opérer à p H basique, en particulier voisin de 8 en milieu aqueux. On peut également souhaiter former des groupes N-sulfate, ce qui peut être réalisé à l'aide d'un agent de sulfatation du type indiqué ci-dessus Des p H supérieurs à 9, avantageusement de l'ordre de 9-10, sont utilisés pour la sulfatation. Après la réaction de sulfatation, l'addition d'une base forte permet de libérer les groupes carboxyle. Les produits formés peuvent être aisément sali- fiés à l'aide de résines échangeuses d'un cation approprié. Dans les produits naturels, le cation en particulier est constitué par du sodium On utilise donc avantageusement * des résines échangeuses de cations sodium. On peut également former des sels de potassium, lithium, magnésium, calcium On utilise alors une résine échangeuse de protons: puis on neutralise l'acide formé avec la base du cation. L'invention vise également les oligosaccharides constituant des intermédiaires dans les différentes étapes du procédé de synthèse défini ci-dessus. Dans une famille, ces oligosaccharides renfer- ment au moins un motif binaire A-U et U-A complètement protégé et possédant soit un groupe réactif sur le carbone anomère du motif à l'extrémité réductrice, soit un seul groupe -OH libre sur le motif à l'extrémité non réductrice, ce groupe -OH occupant la position 3, 4 ou 6 dans le cas d'un motif A et la position 2, 3 ou 4 dans le cas d'un motif U. Dans une autre famille, les oligosaccharides sont constitués par des motifs complètement protégés tels qu'obtenus à l'issue de l'étape de glycosylation Une autre famille encore comprend les produits dans lesquels un ou plusieurs groupes -OH sont libérés. Ces différents oligosaccharides comportent une 2 535324 chaîne à base de motifs binaires de structure (A-U) ou n (U-A)n dans laquelle N est un nombre de 1 à 6. Ces oligosaccharides correspondent à un enchal- nement de type a-c, b-c, a-d, ou encore b-d. Dans un groupe d'oligosaccharides intermédiaires de l'invention, la chaîne glycosidique est constituée par un seul type de ces enchaînements binaires. Dans un autre groupe, plusieurs de ces types sont présents. Des oligosaccharides correspondants comportent dans leurs chaînes des motifs a-c et a-d, b-c et b-d ou encore a-c et b-d. Il est entendu que l'ordre des enchaînements considéré ci-dessus dans l'un ou plusieurs des motifs bi- naires peut être inversé conformément à l'invention. Selon une variante, les oligosaccharides inter- médiaires définis ci-dessus renferment un ou plusieurs mo- tifs consécutifs a ou b, ou encore c ou d. Selon une autre variante, les oligosaccharides intermédiaires renferment un ou plusieurs motifs de sucres neutres et/ou plusieurs désoxy-sucres dans leur structure. Les différents groupements protecteurs de ces sucres répon- dent aux définitions données ci-dessus pour les motifs A et U. Dans ces oligosaccharides, les motifs constitu- tifs sont reliés entre eux par des liaisons de type 1-2, 1-3, 1-4 ou 1-6 selon la nature de l'alcool mis en oeuvre dans l'étape de glycosylation. Les oligosaccharides possédant la structure de fragments d'héparine ou d'héparane-sulfate comportent des liaisons d 1 _ 4 a, a 1) 4 c, a 1) 4 d et c 1 4 a. Les oligosaccharides possédant la structure des fragments de chondroitines, de chondroitines-sulfates ou dermatane-sulfate renferment des liaisons de type 1 3 253 i 324 et comportent respectivement des motifs c 1 B 3 b, d 1 3 b, b i 1 B 4 d et b 1 4 c. Un groupe d'oligosaccharides préférés renferme au moins un motif binaire Possédant une structure de type 8 c 1 4 a, c'est-à-dire 1 acide-Dglucuronique J 1 4 ZD-glucosamine 7 répondant à la formule I: COOK OR c O OR 0 R uns des autres, éventuellement conjointement avec R, repré- sentent un groupe protecteur, en particulier un groupement SD semipermanent ou un groupement D permanent, T, un groupement temporaire t, ou un groupe- ment permanent y, ou un atome d'hydrogène, N, un groupe azoté précurseur d'amine ou de dérivé d'amine, R, un radical aliphatique ou aromatique, no- tamment un radical alcoyle comportant de 1 à 4 atomes de carbone, o OR représente un groupe réactif tel qu'un halo- génure ou encore R un radical alcoyle et M, un groupement bloquant la fonction acide, ces différents symboles présentant les significations don- nées ci-dessus. Dans un sous-groupe, tous les radicaux R, R 1 et T sont identiques et représentent un groupement D ou sp. Dans un autre sous-groupe, les radicaux R 1 sont différents les uns des autres, l'un au moins représentant un groupement de type sp, éventuellement conjointement avec R, le ou les autres radicaux R 1 représentant un groupe D. On notera que les significations générales des symboles de la formule I s'appliquent également aux formules des différents groupes considérés ci-après De même, on re- trouve dans chacun de ces groupes, notamment, les deux sous- groupes évoqués ci-dessus. Des oligosaccharides préférés répondent aux formules (II), (III) ou (IV) Ce M 1-o m S Coor'1 O //30 an O gn +R(Io dans lesquelles les différents symboles présentent les significations données plus haut. De préférence, dans les formules (II) à (IV), les symboles donnés présentent indépendamment, ou en combi- naison, les significations suivantes: M représente un atome d'hydrogène ou un radi- cal alcoyle, en particulier méthyle, s D un groupe acyle, en particulier acétyle, P, un groupe alcoyle substitué, en particu- lier benzyle, R, un groupe acyle en a ou B, en particulier un groupe acétyle, un radical alcoyle, en particulier mé- thyle ou alcoyle substitué, notamment benzyle, ou -OR un halogène, en particulier un bromure, ou encore un radical imidoyle, N, un groupe azido, T, le groupe t représentant un radical acyle, en particulier acétyle, un radical acyle halogéné, en par- ticulier, un radical monochloro ou trichloroacétyle, ou le groupe D représentant un radical alcoyle substitué en par- ticulier le radical benzyle, le cas échéant lui-même para- méthoxy ou encore un atome d'hydrogène. Un autre groupe préféré d'oligosaccharides ren- ferme au moins un motif de type d 1) 4 c, c'est-à-dire D-glucosamine 7 1 > 4 'acide D-glucuroniquej répondant à la formule (V): r o I (y) Des oligosaccharides préférés répondent aux formules (VI) ou (VII) suivantes: 2 55 3 2 4 (v I) (vii) -r 14 o? Dans ces formules (VI) et (VII), les symboles M, N sp, p orésentent, de préférence, les significations particulières données ci-dessus en rapport avec les formu- les (II) à (IV), et R représente, en outre, de préférence, un groupe propényle, allyle, imidoyle, ou -H avec N repré- sentant alors plus spécialement un groupe -NH-acétyle. On rappelle que l'ordre des enchaînements des motifs peut être inversé. Dans un autre groupe préféré, les oligosaccha- rides renferment au moins un motif binaire de type d 1 4 a, c'est-à-dire lacide-L-iduronique 1 4 Zb-glucosamine J, répondant à la formule (VIII): (VIII) O Rf, yiv Des oligosaccharides préférés répondent aux formules (IX) et (X) suivantes: rosé 1 o R (IX) Osf proQd O R(X (x) P teI, De manière préférée, les symboles figurant dans ces formules (IX) et (X) présentent les significations sui- vantes: les différents groupes S et p peuvent être identiques et représentent un radical acyle, en particulier acétyle, ou différents, et choisis parmi les radicaux acyle, en particulier acétyle ou benzoyle et les radicaux aryle ou alcoyle substitué, N représente un groupe azoté précurseur éven- tuellement différent de celui présent dans les composés de formules (I) à (V), en particulier un groupe NHCOO-(alcoyle substitué), notamment un groupe -NH-COO-CH 2-C 6 H 5, ce qui permet de soumettre ces groupes azotés à des traitements différents et de former des dérivés d'amine différents en position 2 des motifs A, T représente le radical acétyle, acyle halo- géné, en particulier, monochloro ou trichloroacétyle, p-mé- thoxybenzoyle, les symboles p, M et R présentant avantageu- sement les significations préférées données ci-dessus en ra Dpport avec les formules (II) à (IV). Un autre type de motif binaire d'oligosaccha- rides préférés présente une structure _ 1 a 4 d, c'est- à-dire Zb-glucosamine 7, 1 a 4 Zcide-L-iduronique J ré- pondant à la formule (XI) suivante: o\o( /1 r\/g 1 O c(gr T I RO f Des oligosaccharides particuliers répondent aux formules (XII) et (XIII): (XII) (XIII) -1 dans lesquelles les significations préférées correspondent à celles données ci-dessus pour les formules (II) à (IV). Une autre famille préférée d'oligosaccharides renferme des motifs de structure D-galactosamine. Les oligosaccharides correspondants répondent avantageusement aux formules (XIV) à (XVII) suivantes: 21 5 (, T- (Xiv) De(XIV) o: C Xv) R? (cv -T t P XV Cv Ii) Dans ces formules, les différents symboles pré- sentent les significations générales données ci-dessus pour les familles d'oligosaccharides comportant un motif gluco- samine. Dans des produits préférés, les symboles consi- dérés présentent également les significations particulières envisagées pour les séquences renfermant un motif glucosa- mine. Tj O T o CC 7 D A >\ - D, AI, OP,, l 2535 324 Une autre famille d'oligosaccharides inter- médiaires préférée entrant dans le cadre de l'invention correspond aux produits dont les groupes protecteurs ont - été éliminés partiellement en cours de synthèse En particulier, de tels produits comportent un groupe -OH à la place des groupes sp. Des produits intermédiaires préférés corres- pondent à des oligosaccharides présentant la structure de la séquence complète octasaccharidique (ABCDEFGH) ou hexasaccharidique (C'DEFGH) évoquéesci-dessus. D'une manière préférée, il s'agit de disaccha- rides AB, BC, CD, etc de trisaccharides ABC, BCD, de tétrasaccharides ABCD, BCDE, de pentasaccharides, ABCDE, d'hexasaccharides, ABCDEF d'heptasaccharides ABCDEFG ou BCDEFGH ou de l'octasaccharide lui-même. Parmi ces oligosaccharides, on citera les structures BC, DE, DEF, EF, GH, FGH, EFG, EFGH, DEFGH et CDEFGH. Des disaccharides intermédiaires préférés correspondent aux motifs binaires des formules (I) à (XVII). Un groupe préféré de trisaccharides inter- médiaires présente une structure DEF et répond à l'une des formules XVIII à XXI. QOM EL O (XVIII) F r 324 2% -_ 3: LOS. PE O -r o lo t\ F o v Y -r (xix) (XI) (xx) r (xx I) NI De préférence, N 4 et N 2, identiques ou diffé- rents l'un de l'autre, représentent un groupe azido ou -NH-acyle, en particulier -NH-acétyle. D'autres trisaccharides préférés possedent une structure de type FGH de formule 0 O E HOP SWLO (R;=I) -t (XXII) 2 5 3 324 dans laquelle les différents symboles présentent les significations données ci-dessus, les deux substituants N 1 et N 2 des deux motifs glucosamine de structure F et H étant identiques ou encore avantageusement différents, comme dans les produits naturels, et choisis parmi le groupe azido ou -NH-C 00-acyle, en particulier -NH-COO- acétyle ou -NH-COO-CH 2-C 6 H 5. D'autres oligosaccharides intermédiaires préférés sont constitués par des tétrasaccharides Des tétrasaccharides plus spécialement avantageux possèdent la structure EFGH et répondent à la formule suivante Ov, (XXIII) T Or Osp dans laquelle les significations préférées des différents symboles correspondent à ceux indiqués pour la formule XXII. Une autre famille d'oligosaccharides intermé- diaires est constituée par des pentasaccharides, en particulier, par ceux de structure DEFGH de formule Co O M - \ A,0 ' NLC \-(XX 0 X @ 4 9 IV) " "L 't Ir 14 dans laquelle les différents symboles présentent les signi- fications préférées ci-dessus, N 1, N 2, N 3 pouvant être identiques ou différents les uns des autres et choisis parmi les significations déjà données. Comme évoqué ci-dessus pour les motifs bi- naires, l'invention concerne également les oligosaccharides -n' 2 o 3 324 ci-dessus dans lesquels un, plusieurs ou, le cas échéant, la totalité des groupes -OH se trouvent libérés en cours de synthèse. L'invention vise, en outre, en tant que pro- duits nouveaux, les oligosaccharides répondant respective- ment aux différentes définitions données ci-dessus, mais renfermant un ou plusieurs groupements fonctionnels, à l'ex- clusion du disaccharide D-N-sulfate(ou 2-N-acétyl)-6-O- sulfate-D-glucosaminej 7-acide méthyl-D-glucuronique. Ces groupements fonctionnels sont constitués, de préférence, par des esters, et se présentent plus spé- cialement sous forme d'anions minéraux. Des esters particulièrement préférés, en raison de leur présence dans les molécules biologiquement actives de type héparine, héparane-sulfate, chondroitines et chon- droitines-sulfates, dermatane-sulfate et acide hyaluronique, sont constitués par des esters sulfates. D'autres esters avantageux correspondent à des esters phosphates. Ces groupements fonctionnels sont portés par une ou plusieurs fonctions alcool primaire et/ou alcool secondaire et/ou amine primaire. Une famille préférée d'oligosaccharides de l'invention renferme ainsi des motifs a ou b comportant un anion tel que défini ci-dessus en position 6 et/ou 3 pour a et 6 et/ou 4 pour b. Une famille particulièrement préférée renferme un motif a comportant un ester, en particulier un groupe sulfate, en position 6 et en position 3. Des oligosaccharides de cette famille renfer- ment, en position 2, de ces motifs a ou b, un groupe fonc- tionnel amine orimaire avantageusement substitué par un sulfate ou par un autre groupe substituant. Dans les oligosaccharides de l'invention ren- fermant au moins deux motifs a et/ou b, les groupements fonctionnels amine en position 2 peuvent être substitués par un même groupement ou par des groupements différents. Un groupe préféré d'oligosaccharides de la fa- mille considérée renferme des motifs a ou b comportant des groupes sulfate sur les fonctions alcool seconeaire et spé- cialement alcool primaire Des oligosaccharides préférés de ce groupe com- portent en position 2 de ces motifs un groupe -NHSO 3- D'au- tres oligosaccharides comportent un groupe -NH-acyle, en particulier -NH-acétyle. D'une manière préférée, les esters ci-dessous se présentent sous forme de sels avec un cation minéral ou organique, en particulier un cation métallique, notamment un cation alcalin, ou encore un cation dérivé d'une base organique azotée, par exemple du triéthylammonium. Les cations utilisés sont constitués par du sodium D'autres cations sont appropriés tels que les ca- tions potassium, magnésium ou calcium. Dans une autre famille préférée d'oligosaccha- rides de l'invention, les groupes carboxyle des motifs c ou d sont libres ou se présentent de préférence sous forme de sels avec un cation organique ou minéral tel que défini ci-dessus Ils peuvent également être protégés comme rappor- té plus haut. Des produits préférés renferment des motifs d comportant un groupe sulfate en position 2. D'autres produits préférés présentent des sul- fates sur le motif c. Dans ces différentes familles d'oligosacchari- des, les fonctions hydroxyle des cycles pyraniques sont soit libres, soit protégées par des groupements permanents de type alcoyle, en particulier par des groupes méthyle. Des produits préférés de ces différentes famil- les renferment, en combinaison, des motifs A et U répondant aux caractéristiques ci-dessus. a 2535324 Compte tenu de leur présence dans les molécules biologiquement actives ci-dessus et notamment dans l'octa- saccharide ABCDEFGH ou l'hexasaccharide CDEFGH, les oligo- saccharides préférés correspondent aux produits de formules (I) à (XXIV) ci-dessus, mais dans lesquelles les groupes -s D sont remplacés par les anions Des produits préférés correspondent aux sels des produits définis ci-dessus. D'autres oligosaccharides préférés comportent en outre à la place des groupes N des motifs a et b, des groupes NH-acyle, en particulier -NHCOCH 3, -NHSO 3. Des disaccharides préférés de ce type présentent une structure de type BD, DE, EF ou GH et répondent respec- tivement aux formules (XXV) à (XXVIII) suivantes: 0503 O ú,Voz/j O XVV P (XXV) p (XXVI) r T 3 co Go j * 1 eyl V of O| V 3A J 3 - 35324 o O (XXVIII) M i o D'autres oligosaccharides préférés de l'inven- tion renferment ou sont constitués par un enchaînement de structure DEF ou FGH respectivementde formules (XXIX) et (XXX) suivantes: Lr 50 co 1 > N 4 %N h S Qo (Xx IX) o 4 (ax) ws O- o 03 D'autres oligosaccharides préférés ou sont constitués par des tétrasaccharides de EFGH répondant à la formule (XXXI) suivante: COO' r Ogo S, _OCQ r- co 3 O 35 O - I I renferment structure I (XXXI) /NMSVO M 450),5 UM 903 rv H 50 o D'autres oligosaccharides encore spécialement préférés renferment ou sont constitués par des pentasaccha- rides de formule (XXXII) suivante: So -' CO O 0, o O SO 3 P 33 3 ou NH-acyle Des oligosaccharides de l'invention particuliè- rement préférés comprennent ou sont constitués par des hexa- * saccharides de structure CDEFGH répondant à la formule (XXXIII) suivante: 0 O 1 Lo e O O _ __- 0 o NHSO 3 O o NSO 3 OSO 3 NHISO 3 ou NK-acvle (Xxxr II) D'autres oligosaccharides répondent à l'une des formules (XXV) à (XXXIII) cidessus, mais renferment des groupes -OH libres à la place des groupes -Op Ces produits sont alors complètement "déorotégés". Dans d'autres oligosaccharides encore une par- tie des groupes -OSO 3 peut être remplacée par des groupes -OH. De préférence, les oligosaccharides de l'inven- tion comportent des sels, éventuellement des sels doubles, des anions cidessus avec les cations déjà définis Grâce à leur structure, les produits de l'invention constituent Z 5 à 32 4 des intermédiaires de synthèse de grand intérêt permettant d'obtenir des fragments donnés, ou des dérivés de fragments, de molécules biologiquement actives. Ils constituent, notamment, des composés de ré- férence pour des études de structure. L'étude pharmacologique d'oligosaccharides de l'invention a montré chez certains de ces composés des ac- tivités biologiques leur permettant de contr 6 ler de manière spécifique certaines étapes de la coagulation sanguine Des produits intéressants sont constitués, par exemple, par les trisaccharides de formule (XXIX), sulfatés et déprotégés et plus particulièrement le dérivé de l'exemple 13 bis. D'une manière remarquable, les pentasaccharides de formule (XXXIII) sulfatés et déprotégés et tout spéciale- ment le dérivé 50 se révèlent dotés notamment d'une haute affinité pour l'AT III et d'une très haute activité d'inhi- bition sélective du facteur X activé ou facteur Xa du sang. L'invention concerne donc également leur appli- cation à la constitution de réactifs biologiques, utilisa- bles en laboratoire, notamment comme éléments de comparaison pour l'étude d'autres substances dont on souhaite tester l'activité anticoagulante, notamment au niveau de l'inhibi- tion du facteur Xa et du dosage de l'antithrombine III. Le trisaccharide de formule (XXIX) à structure DEF dans laquelle le motif D comporte un groupe N-sulfate présente, par exemple, une activité antiXa mesurée selon le test de Yin-Wessler, de l'ordre de 7 u/mg. Le pentasaccharide 50 de l'exemple 9 est carac- térisé par des titres Yin-Wessler nettement supérieurs à ceux de l'héparine. Plus spécialement, ce pentasaccharide est doté d'une activité anti-Xa (Yin-Wessler) égale ou supérieure à 2000 u/mg et d'une haute affinité pour l'AT III. Dans un test utilisant un substrat chromogène, cette activité a même été de 4000 unités anti Xa/mg (méthode de TEIEN A M et LIE modifiée; Thrombosis Research NO , 1977, 388-410). Ce test consiste à utiliser le facteur Xa com- mercialisé par la Société SIGMA en solution à 8 u/ml dans du sérum physiologique, la concentration du substrat étant de 1,33 m M. Pour effectuer ce test, on peut procéder de la façon suivante. On mélange 10 pl de solution à doser et 300 pl de plasma humain dilué avec du tampon Tris maléate 0,02 M, p H 5. On laisse incuber une minute à 370 C. On ajoute 100 pl du susdit facteur Xa ( 8 u/ml) et une minute après, on injecte la solution obtenue dans le substrat. L'activité anticoagulante globale de ce produit est très faible, 4 u/mg dans le test APTT. Ces propriétés leur permettent de contrôler, de manière spécifique, certaines étapes de la coagulation san- guine. L'étude de ces produits montre qu'ils sont ca- pables d'exercer une activité antithrombotique puissante. En outre, des dérivés selon l'invention présentent un grand intérêt pour lutter contre les troubles de la paroi vascu- laire, (athéroscléroses et artérioscléroses) et le vieillis- sement des tissus. De plus, ils présentent l'avantage de ne pas avoir d'effet d'activation sur l'aggrégation plaquettaire et de ne pas entraîner de thrombocytopénie Ils présentent également l'avantage d'être pratiquement dénués d'effet sur le temps de saignement, ce qui élimine les risques d'hémor- ragie Ces deux propriétés sont extrêmement importantes pour les applications médicales. En outre, on observe notamment par voie sous- cutanée une pharmacocinétique allongée, ce qui procure également à ces produits un grand intérêt. Les oligosaccharides de l'invention sont, en outre, avantageusement dépourvus de toxicité. Ces produits sont donc particulièrement précieux pour l'élaboration de médicaments utilisables, notamment, pour la prévention et le traitement des thromboses et du vieillissement des tissus. L'invention est donc relative également à des préparations pharmaceutiques qui renferment lesdits oligo- saccharides à activité anti-Xa élevée, plus spécialement les pentasaccharides dont question ci-dessus ou actifs vis-à-vis de phénomènes de type dégénératif. Elle est plus particulièrement relative à des préparations pharmaceutiques dépourvues de substances pyro- gènes, contenant une quantité efficace de principes actifs en association avec des excipients pharmaceutiques. Elle concerne également les compositions dans lesquelles le véhicule pharmaceutique est approprié pour l'administration par voie orale Des formes d'administration de l'invention appropriées pour l'administration par voie orale peuvent être avantageusement des gélules gastrorésis- tantes, des comprimés ou tablettes, des pilules, ou encore présentées sous forme de liposomes. D'autres compositions pharmaceutiques compren- nent ces oligosaccharides en association avec les excipients appropriés pour l'administration par voie rectale Des for- mes d'administration correspondantes sont constituées par des suppositoires. D'autres formes d'administration de l'invention sont constituées par des aérosols ou des pommades. L'invention concerne également des compositions pharmaceutiques injectables, stériles ou stérilisables pour l'administration tant par voie intraveineuse qu'intramuscu- laire ou sous-cutanée. Ces solutions renferment avantageusement 1000 à 000 u (Yin-Wessler)/ml d'oligosaccharides, de préférence de 5000 à 50 000, par exemple de 25 000 u/ml, lorsque ces solutions sont destinées à l'injection par voie sous-cutanée. Elles peuvent contenir, par exemple, de 500 à 10 000, notam- ment 5000 u/ml d'oligosaccharides lorsqu'elles sont desti- nées à l'injection par voie intraveineuse ou par perfusion - Avantageusement, de telles préparations pharma- ceutiques sont présentées sous la forme de seringues non récupérables, prêtes à l'emploi. L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques contenant lesdits oligosaccharides en asso- ciation avec un autre principe actif, utilisable en particu- lier pour la prophylaxie et le traitement de thrombose, tel qu'un agent veinotonique comme la dihydroergotamine, un sel d'acide nicotinique ou un agent thrombolytique comme l'uro- kinase. Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont particulièrement adaptées pour le contrôle (préventif ou curatif) de certaines étapes de la coagulation du sang chez l'homme ou l'animal), notamment dans le cas o le pa- tient est soumis à des risques d'hypercoagulabilité résul- tant notamment d'opérations chirurgicales, de processus athéromateux, de développement de tumeurs et de troubles de la coagulation par des activateurs bactériens ou enzyma- tiques, etc. Certaines compositions sont plus spécialement appropriées pour lutter contre le vieillissement des tissus ou des manifestations de type dégénératif telles que les alopécies. Afin d'illustrer l'invention, on indique, ci- apres, un exemple de posologie utilisable chez l'homme: cette posologie comprend, par exemple, l'administration au patient de 10 O à 25 000 u (Yin et Wessler) par voie sous-cutanée, une à trois fois par jour, selon le niveau des risques d'hypercoagulabilité ou la condition thrombo- 2 3 5 3 2 4 tique du patient, ou de 1000 à 25000 u/24 heures, par voie intraveineuse, en administrations discontinues à intervalles réguliers, ou continues par perfusion, ou encore de 1000 à 25000 u (trois fois par semaine) par voie intramusculaire ou sous-cutanée (ces titres sont exprimés en unités Yin- Wessler) Ces doses peuvent être naturellement ajustées - pour chaque patient en fonction des résultats et des ana- lyses de sang effectuées auparavant, la nature des affec- tions dont il souffre et, d'une manière générale, son état de santé. Outre les compositions pharmaceutiques renfer- mant les oligosaccharides tels quels, l'invention vise éga- lement les compositions pharmaceutiques renfermant au moins un oligosaccharide tel que défini ci-dessus, conjugué, par liaison covalente, à un support soluble ou à un support insoluble, avantageusement au moyen du sucre terminal ré- ducteur. Des conjugués fixés à des supports solubles préférés sont constitués par des oligosaccharides conjugués à 'AT III. Un conjugué de ce type comportant le pentasac- charide 49 est tout spécialement préféré De tels produits constituent des médicaments particulièrement intéressants dans la prévention de thromboses, en cas de déficits en AT III. D'autres conjugués préférés avec supports solu- bles sont formés d'un oligosaccharide fixé à un véhicule tel qu'une protéine, notamment la pôlylysine, ou le sérum albumine bovine. Ces produits sont utilisables comme immunogènes eux-mêmes sources d'anticorps circulants produits in vivo ou d'anticorms monoclonaux, clones in vitro selon les tech- niques appropriées. Dans d'autres conjugués préférés, les oligo- saccharides de l'invention sont conjugués à des supports insolubles On utilisera avantageusement les supports clas- siques. Ces conjugués sont utilisables comme immunoab- sorbants, par exemple pour une purification de haute spéci- ficité de l'AT III et pour son dosage ou pour l'élaboration, par fixation sur des polymères biocompatibles, de nouveaux - polymères hémocompatibles athrombotiques. L'invention vise également l'application des oligosaccharides considérés en médecine nucléaire, en tant que produits radiopharmaceutiques Ces produits sont alors marqués par des traceurs choisis parmi ceux couramment uti- lisés dans ce domaine, et notamment à l'aide de technétium 99 m. A cet effet, on transforme le technétium 99 m obtenu à Dartir de générateurs du commerce, sous forme de pertechnétate de sodium de valence 7 non réactif, en tech- nétium réduit de valence 4 qui serait la forme la plus réactive du technétium Cette transformation est effectuée grâce à un système réducteur réalisé à partir de sels d'é- tain (chlorure stanneux), de sels de fer (sulfate ferreux), de sels de titane (trichlorure de titane) ou autres sels. La plupart du temps, cette simple réduction du technétium suffit, dans des conditions de p H données, à réa- liser la fixation du technétium sur la molécule considérée. On peut utiliser les produits de l'invention, qui constituent en quelque sorte un support, à des doses de l'ordre de 100 à 200 u Yin-Wessler. Pour l'élaboration de ces réactifs radiopharma- ceutiques, on meut opérer conformément à la méthode de P V. KULKARNI et al dans The Journal of Nuclear Medecine 21, N 2, p 117-121. Les Droduits ainsi marqués sont avantageusement utilisés dans des tests in vivo pour la détection et le diagnostic d'extension des thromboses et des états thrombo- tiques. 2 5 3 5 3 2 4 Les oligosaccharides de l'invention peuvent être également utilisés pour la détermination de la spéci- ficité des nombreuses enzymes impliquées dans le métabo- lisme des glycosaminoglucuronoglycanes. D'autres caractéristiques avantageuses de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent et en se reportant aux figures 1 à 32 illustrant les produits mis en oeuvre dans les synthèses décrites. Dans ces figures, les références numériques des formules sont utilisées également dans les exemples pour désigner les mêmes produits. Les abréviations utilisées dans ces formules présentent les significations suivantes: Ac: un grouoe acétyle; Me: méthyle: Bn: benzyle; Bz: benzoyle; MCA O monochloroacétyle; Tr trityle; but butyle et S un groupe 503. EXEMPLE 1 Synthèse du dérivé 13 à savoir du (prop-l'-enyl 2,3-di-0-benzy 1 D- glucopyranoside) uronate de méthyle de formule COM COO Me O Br HO,, P OBI On effectue cette synthèse à partir du glucose selon les étapes a) à m) suivantes: a) préparation du dérivé allyle; b) blocage des positions 4 et 6 du dérivé allyle par un groupe benzylidène; c) introduction de groupes benzyle en positions 2 et 3 d) déblocage des positions 4 et 6 par l'élimination du groupe benzylidène; e) introduction d'un groupe trityle en position 6/suivie d'une réaction d'acétylation de la position 4; f) élimination du groupe trityle en position 6; g) oxydation du groupe alcool primaire en position 6; h) méthylation-du groupe carboxyle en position 6; i) introduction du groupe propényle en position 1; j) élimination du groupe acétyle en position 4. Ces étapes sont réalisées comme suit(voir les figures 1 et 2): a) préparation de 1 allyl I d -D-alucopyranoside (composé 1)- Une solution d'acide chlorhydrique gazeux ( 18 g) dans de l'alcool allylique ( 600 ml) est chauffée à 700 C On ajoute alors du glucose anhydre ( 300 g) et on maintient à cette température pendant 3 heures. La réaction peut être suivie en chromatographie sur couche mince (c c m) dans le solvant méthanol/chloroforme ( 1/4,v/v) La solution brune obtenue après 3 heures est concentrée à sec, sous vide, neutralisée par une solution concentrée d'ammoniaque ( 50 ml) puis concentrée à nouveau à sec Au résidu obtenu, on ajoute del'acétone ( 500 ml), on porte à ébullition et on maintient ainsi jusqu'à dissolution totale Après refroidissement, le liquide est décanté Le résidu est denouveau soumis au même traitement jusqu'à ce que l'analyse en c c m de l'extrait montre un épuisement du résidu en dérivé 1 ou bien une trop forte contamination de l'extrait par des impuretés. Une partie de la première fraction extraite ( 12 g) est chromatographiée sur silice On récupère le dérivé 1 qui peut être cristallisé dans un mélange acétone/éther ( 6,5 g; pf 95-990 C) Le reste du produit peut être purifié selon le mime processus. o 10 b) blocage des positions W et 6 du dérivé allyle conduisant a l'allyl 4,6-O-benzvlidène-k-D-glucopyranoside (composé 2). Le compose _ ( 37 g) est dissous dans du diméthylformamide ( 200 ml) Du diméthoxytoluène ( 41 g) est alors ajouté suivi d'acide paratoluène sulfonique hydraté ( 130 mg). Après 2 heures de chauffage (bain-marie) sous vide et reflux, la réaction est terminée (c c m méthanol/chloro- forme, 2/25,v/v) Le solvant est évaporé Le sirop est dissous dans du méthanol (le minimum), cette solution est versée goutte à goutte dans une solution aqueuse de bicar- bonate de sodium ( 6,3 g dans 320 ml d'eau) Le précipité obtenu est recristallisé dans l'éthanol ( 21 g;p f 120-121 e C) Les eaux-mères livrent encore du produit 2 Rendement total ( 37 g; 71,4 %). c> introduction du groupe benzyle conduisant à l'allyl d 2,3 _di_ _benzyl_ 4,6 _Obenzylidne__D Sgú-ucopyranoside Le composé 2 45 g) est dissous dans du DMF anhydre ( 500 ml) De l'hydrure de sodium ( 28 g d'une dispersion à 50 X dans l'huile) est ajouté. Après 30 minutes, le mélange est refroidi à o OC et on ajoute alors, goutte à goutte, du bromure de benzyle ( 52 ml) La réaction est suivie en c c m (éther/hexane, 1/1,v/v) On ajoute ensuite lentement du méthanol ( 150 ml), évapore à sec et reprend par du chloroforme La phase chloroformique, est lavée avec de l'eau, séchée sur sulfate de sodium Après évaporation du solvant, le résidu est cristallisé dans un mélange éther/hexane ( 36,5 g: PF 83-840 C). Ce produit est légèrement contaminé par une impureté migrant plus haut en c c m (éther/hexane; 1/1; v/v). d) élimination du aroupe benzylidène conduisant à l'allyl 2,3-di-0-benzyl-(-D-alucopyranoside-(composé 4) - A une solution du composé 3 ( 56 g) dans le méthanol ( 1 Z) on ajoute de l'eau ( 450 ml) puis de l'acide paratoluène sulfonique hydraté ( 17 g). Après 2 heures à 80 C, on laisse refroidir le mélange, on évapore le solvant et on reprend le résidu par du chloroforme ( 1 1), La solution chloroformique est lavée avec de l'eau jusqu'à p H neutre, puis séchée sur sulfate de sodium. On obtient ainsi un sirop jaune pâle ( 48 g) qui est engagé dans l'étape suivante (synthèse du composé 5). -e) introduction d'un qroupeftrit Yle en position 6 suivie d'une réaction d'acétylation de la position 4 condui- sant successivement à l'allyl 2,3-di-0-bienzy 1-6-0-trityl-"- D-alucopyranoside(composé 5) et de son analogue 4-O-acétylé -(composé ba)- Le drive 4 ontenu ( 48 g) est dissous dans de la pyridine ( 250 ml) et du chlorure de trityle ( 38,5 g) est ajouté. Après 1 heure à 1000 C, la réaction est terminée (c c m. éther/hexane, 1/1, v/v) A la solution précédente, on ajoute de l'anhydride acétique ( 200 ml) Apres une nuit, la réaction est complète (c c m, éther/hexane, 1/2, v/v) On évapore à sec, reprend le résidu par du chloro- forme ( 500 ml), lave la phase chlorofprmique avec une solu- tion de sulfate acide de potassium à 10 % avec de l'eau et sèche sur sulfate de sodium. Le chloroforme est évaporé On obtient ainsi le composé 6 a qui est engagé tel quel dans la réaction de préparation du composé 7 a. f) élimination du groupe trityle conduisant à l'allyl 4-0-acetyl 2,3-di-0benzyl D-qglucopyranoside (composé 7 a)- Le dérivé 6 a obtenu est dissous dans du chloroforme ( 500 ml) A cette solution, refroidie àOOC, on ajoute goutte à goutte sous agitation, une solution de trifluorure de bore dans le méthanol ( 20 %, 120 ml) La réaction est suivie c c m. (toluène/acétone, 10/2,v/v). Le mélange réactionnel est transvasé dans une ampoule à décanter La phase chloroformique est lavée par de l'eau ( 2 fois 100 O ml) par une solution saturée de bicarbonate de sodium, puis avec de l'eau jusqu'à p H neutre Après séchage, et évaporation, le résidu obtenu est introduit sur une colonne de gel de silice ( 500 g) équilibrée dans le toluène. Après élution de la plupart des impuretés par le toluène pur, le produit est élué par un mélange toluène/acétone ( 10/2,v/v) On obtient ainsi 48 g du composé a_ qui sera engagé directement dans la synthèse du composé 8 a. Une partie du composé y a été obtenue pure:Z/ = + 11 (chloroforme) Ses spectres IR et RMN, de même que l'analyse élémentaire, confirment la structure. g) oxvdatiorrdu'arou De aicool primaire on position G conduisant à l'acide (all 1 y-4 ' 0-a-cétyl-2,3-di-0- benz Yl-K-D-qlucopyranoside) uronique (composé 8 a). Une solution du composé 7 a ( 48 g) dans l'acétone ( 800 ml) est refroidie -50 C On ajoute ensuite goutte à goutte, une solution de trioxyde de chrome ( 30 g) dans l'acide sulfurique ( 3,5 M; 125 ml) On laisse le mélange revenir à la température ambiante La réaction est contrôlée en c.c m (méthanol/chloroforme, l/10,v/v) A la fin de la, réaction, le mélange réactionnel est versé dans de l'eau (SO Oml) Le produit est extrait par le chloroforme ( 3 fois 250 ml) La phase chloroformique est lavée à l'eau jusqu'à p H neutre, séchée sur sulfate de sodium et concentrée à sec. Le sirop obtenu ( 83 g) est utilisé tel quel pour la prépa- ration du composé 9 a. 2 3 5 3 24 h) mnéthylation du groupe carboxyle en position 6 con- duisant à l'(allyl-4-O-acétyl-2,3-di-0-benzyl- qlucopyranoside) uronate de méthyle (composé 9 a). Le sirop obtenu à l'étape de préparation du composé 8 a est dissous dans de l'éther ( 300 ml) Une solution éthérée de diazométhane est alors ajoutée jusqu'à disparition du composé 8 a (c c m éther/hexane), 1/1, v/v Après acidification par l'acide acétique, les solvants sont évaporés. t 10 Le résidu obtenu ( 53 g) est dissous dans l'éthanol à chaud. Le dérivé 9 a cristallise au refroidissement Après recris- tallisation, on obtient ce composé _ 9 a pur ( 18,4 g)-Pf * -86 C ( 7 = + 120 ( 1,2 chloroforme). D Ce produit est caractérisé par ses spectres IR,RMN et par son analyse élémentaire. A partir du filtrat de cristallisation, on obtient encore 7,6 g du composé 9-a. Le rendement klobal en 9 a à partir du composé 2 est de 38 %. i) introduction du groupe propényle en position 1 conduisant au (prop-1 '-ényl 4-0-acétyl-2,3-di-0- benzyl-,-D-glucopyranoside uronate de méthyle (compo- sé 10 a) - Le dérivé 9 a ( 4 g) est dissous dans un mélange d'éthanol ( 119 ml) de benzène ( 51 ml) et d'eau ( 17 ml) On ajoute ensuite du diazabicyclo octane ( 170 mg) et on porte à reflux On ajoute à la solution bouillante du chlorure de tris (tri- phénylphosphine)-rhodium (I) ( 550 mg) L'ébullition est maintenue pendant 4 heures (c c m, éther/hexane, l/1,v/v). A la fin de la réaction, la solution est filtrée et les solvants sont éliminés Le résidu est chromatographié sur gel de silice ( 150 g) dans un mélange acétate d'éthyle/ chloroforme ( 1,50, v/v) On obtient le composé 10 a ( 3,25 g + 120 81 %) qui cristallise dans l'éthanol &J D =+ 120 -(l, chloroforme) PF 90 C La structure est confirmée par l'analyse élémentaire et les spectres RMN et IR. j) élimination du croupe acétyle en position 4 conduisant au (prop-1 l'ényl 2,3-di-0-benzyl-ç-D-glucopyranoside) uronate de méthyle (composé i 3. re d Crivé 10 a ( 350 mg) est dissous dans le méthanol ( 5 ml) Du méthanolate de sodium ( 0,2 ml,2 M) est ajouté Après 1 h à tempé- rature ambiante, la réaction est arrêtée par addition de résine dowex 50H+ Après filtration, le produit 13 est obtenu, contaminé par un peu de produit résultat de J'I élimination. Selon une variante de l'étape e), au lieu d'effectuer une réaction d'acétylation, on réalise une réaction de benzojlation, ce qui conduit à l'allyl-4-0-benzoyl, 2,3-di-0-benzyl-4-0-benzoyl, 6-0-trityl-O Dglucopyranoside (composé 6 b) dont on élimine ensuite le groupe trityle, ce qui permet d'obtenir l'allyl-4-0-benzoyl-2,3-di-0-benzyl D- glucopyranoside (composé 7 b). Ces réactions sont réalisées comme suit: préparation des composés 6 b et 7 b - A la solution pyridinique du composé 5 on ajoute alors du chlorure de benzoyle ( 1,5 équivalents) et la réaction est suivie en c c m (acétate d'éthyle/benzène,1/20,v/v). L'excès de chlorure de benzoyle est détruit par addition d'un excès de méthanol Après évaporation à sec, le résidu, repris par du chloroforme, est lavé avec une so- lution de KHSO 4 à 10 %, avec del'eau, séché et concentré 2535324. L 53 3 2 4- à sec Le sirop obtenu est engagé tel quel dans la synthèse du composé 7 b Ce sirop ( 105 g, obtenu à partir de 30 g de composé 3) est dissous dans du chloroforme ( 300 ml). De l'acide paratoluène sulfonique ( 76 g de monohydrate dans 100 ml de méthanol) est ajouté Après une nuit, la réaction est terminée (c c m, acétate d'éthy W/chloroforme, 1/20,v/v) La phase chloroformique est lavée avec de l'eau jusqu'à p H neutre, séchée et concentrée àsec Le sirop obtenu ( 98 g) est chromatographié sur une colonne de gel de silice ( 1,2 kg), éluée avec du chloroforme ( 0,6 1) puis avec un mélange acétate d'éthyle/chloroforme ( 1/20,v/v). On obtient ainsi le dérivé 7 b pur ( 30 g) qu'on engage tel quel dans l'étape de préparation du composé 8 b. A partir du composé 7 b, il est possible d'oxyder le groupe -CH 20 H en position 6 puis d'introduire un groupe méthyle sur le groupe carboxyle obtenu, en formant successivement, l'acide (allyl 4-0-benzoyl-2,3-di-0- benzyl-QO-D-glycopyranoside) uronique (composé 8 b) et l'ester méthylique correspondant (composé 9 b). Ces dérivés sont préparés en procédant comme suit: préparation du composé 8 b et de l'ester 9 b: Le composé 7 b ( 27 g) est traité comme décrit pour 7-a dans la préparation de 8 a Le sirop obtenu en fin de traitement contient le composé 8 b qui est méthylé par le diazométhane comme décrit pour le composé 8 a. Le résidu obtenu à l'issuede la méthylation est purifié sur gel de silice ( 200 g éther 1/hexane 1) On obtient ainsi le composé 9 b ( 21 g: 77,5 %) Ses spectres IR et RMN confirment sa structure. A partir du dérivé 9 b, on prépare le dérivé propényle corresp 6ndant l Ob, en opérant comme pour l Oa. Le dérivé 13 est alors obtenu à partir de l Ob selon la réaction donnée pour l Oa. Selon une autre variante, on prépare l'acide (allyl 2,3-di-0-benzyl-\-Dglucopyranoside) uronique et l'(allyl 2,3-di-0-benzyl-c-D-glucopyranoside) uronate de méthyle (composés 11 et 12) le composé 8 b ( 1,9 g) est dissous dans du méthanol ( 40 ml) On ajoute alors de la soude( 5 N)en quantité suffisante pour avoir une concentration de 1 M en soude La réaction est suivie en c c m (méthanol/chloroforme,l/4,v/v). Quant elle est terminée, on ajoute del'eau (l O Oml) On lave avec de l'éther, on acidifie et on extrait le produit à l'éther La phase étheréeacide est lavée avec de l'eau jusqu'à p H neutre Le dérivé Il n'est pas isolé Il est méthylé par une solution éthérée de diazométhane, donnant ainsi le composé d-L ( 9 OO mg; 56 %) qui est alors purifié sur une colonne de gel de silice (éther/hexane, 1/1,v/v) 7 = t 35,2 "( 1,3, chloroforme) Ses spectres IR et RMN et son analyse éleû,,entaire confirment sa structure. De la même manière, le déivé 11 et donc 12 peuvent être obtenus à partir de 9 a ou 9 b. Le composé 13 peut être obtenu à partir du composé 12 en opérant comme suit: Le dérivé 12 est traité par le complexe au rhodium comme décrit pour 9 a Le composé 13 est obtenu avec un rende- ment de 90 % Il est caractérisé par ses spectres IR et RMN De plus, traité par de l'anhydride acétique (lml pour 180 mg de 9 a) il donne le composé l Oa. Selon encore une autre variante, le dérivé 13 peut être obtenu à partir de loa ou lob en opérant comme décrit pour l'obtention de 17 à partir de 9 a ou 9 b. EXEM 1 PLE 2 y 3 nthse du disacchari O oihoo 3 cnîloroacety EI Dglucopyrano)syl) uronate d-e -méthyle -D glucopyranose de formul ee CO T'Me OA 3 r cette synthèse comporte les étapes suivantes (voir les figures 3 et 4) A) la préparation à partir du dérivé 1 _ 3 de l'ex Crn PIC i du iionosaccharide 16 ou ( 1-bromo-2,3-di-0 benzyl-4-0 chloroac Ct Yl-JD-gucopyrano>ye) uronate de méthyle îoi B) la condensation du composé i avec le monosaccharide 17 conduisant au disaccharide 18; C) îacétâlysecau-composé 18 conduisant au disaccharide 19 et, D) -la bromuration donnant le disaccharide 20. A) préparation du monosaccharide17. Clette synthèse est effectuée à partir du monosaccharid& 13 ou (prop-11-ényl 2,3-di-0-benlzyl-r D- glucopyranoside) uronate de méthyle, selon les trois étape - suivantes i chloroacétylation du com Poséi 13; 2 déblocage du carbone anomère; 3 zbromuration du carbone anomère 1 cliloroacétla,2 tion du composé 13 conduisant au compose TI 1, à Savoir le(Iprop-1 '-énlyl 2,3di-O-benzyl 0-chlor ac'âétyle -C"-D-glucopyranoside) uronate de méthyle. On dissout 2,8 g du composé 13 dans 30 ml de pyridinle ( 6,56 mmoles) Après refroidissement à OOC, on ajoute goutte à goutte 10 ml d'une solution de 2 ml de chlorure de chloroacétyle dans 20 ml de dichlorométhane Après 30 minutes, on évapore à sec, on reprend le résidu par 200 ml 1 e chloroforme, on lave avec une solution à 10 % de KH 504, puis avec de l'eau, on sèche et on concentre Le sirop obtenu est chromatographié sur gel de silice ( 200 g; éluant Ac O-Et/hexane; 1/3; v/v) On obtient ainsi 2,7 g de composé 14 pur sous forme de sirop (rendement: 80 %). :20:= + 2 (c = 1,5; chloroforme). L'anayse élémentaire et le spectre de RMN confirment la structure attendue. 2: déblocage du carbone anomère conduisant au composé 15 ou -2,3-di-0benzyl-4-0-chloroacétyl-D-glucopyranoside) uronate de méthyle. On dissout 2,7 g ( 5,3 mmoles) du dérivé 14 dans ml d'un mélange acétone/eau ( 5/1; v/v) De l'oxyde mercurique ( 3,1 g) est ajouté suivi d'une solution de chlorure mercurique ( 3,9 g) dans l'acétone ( 27 ml) Après minutes, les sels sont éliminés par filtration Après concentration à sec, le résidu estrepris par du chloroforme La phase chloroformique est lavée avec une solution de KI à 10 % puis avec del'eau Après évaporation, le produit est cristallisé dans un mélange acétate d'éthyle/ hexane On obtient 2 g d'un solide de pf 105-1070 C; X (rendement 80 %). 3 bromuration du carbone anomère conduisant au composé 1 ou 1-bromo-2,3-di benzyl-4-0-chloroacétyl D- glgopyranos A) uronate de méthyle. On dissout 2 g ( 4,30 moles) du composé 15 dans 50 ml de dichlorométhane On ajoute 4,8 ml ( 34,4 m moles) de sym-collidine à OOC suivie de bromure de bromométhylène diméthyl ammonium ( 17 mmoles) préparé selon HEPBURN D R et HUDSON H R J Chem Soc Perkin I ( 1976) 754-757. Lb 3 3 2 4 Après 4 heures de réaction, le mélange est dilué par ml de dichlorométhane, puis versé dans de l'eau glacée. Après lavage avec de l'eau glacée, le solvant est évaporé. Après chromatographie sur gel de silice ( 20 g; éluant hexane/acétate d'éthyle, 2/1; v/v) on obtient 2,06 g de composé 16 sous forme d'un sirop (rendement:90 %). " 20 = + 82,5 (c = 1,5; chloroforme) L'analyse élé- D mentaire et l'étude en RMN confirment la structure. B) préparation du disaccharide 18 ou 3-0-acétyl- ,6-anbydro-2-azidlo 4 L',5-Ii-u- enzyi-4-U- chloroacètyl-e-D-glucopyranosyl)uronate de metnylei 3 -D-glucopyranose - Cette synthèse est basée sur la condensation des mo- nosaccharides 16 et 17 de 870 mg ( 3,8 mmoles) A une solution de 870 mg ( 3,8 mmoles) de composé 17, dans le dichlorométhane, on ajoute 1 g de driérite o 0,5 g de tamis moléculaires 4 A, en poudre, et 0,525 g de carbonate d'argent fraîchement préparé Après 2 heures d'agitation, on ajoute goutte à goutte à O C 670 mg ( 1,3 mmoles) du composé 16 Après 6 jours, les solides sont éliminés par filtration Le sirop obtenu après concentration est chromatographié sur gel de silice ( 50 g; éluant: chloroforme/acétate d'éthyle; 4/1, v/v) On obtient le disaccharide 18 sous forme de mousse ( 421 mg; 50 %) l(JO = _ 170 (c = 1,chlo- roforme) L'analyse élémentaire confirme la structure. L'étude en RMN confirme la configuration de la liaison intergljcosidique. C) préparation des disaccharides de struc- * 30 ture i 9 j par acetolyse du aisaccnarice 18 - On prépare lesdisaccharides_ 9 en soumettant le disaccharide 18 à une réaction d'acét Qlyse comme suit. 300 mg du composé 18 sont dissous dans un mélange de 4 ml d'anhydride acétique et de 0,5 ml d'acide tri- fluoracétique fraîchement distillé Le mélange réactionnel est soumis à agitation durant 10 h à 18 C, puis évaporé à sec et co-évaporé avec du toluène Le résidu est chromatographié sur unecolonne de gel de silice ( 15 g) Par élution avec un mélange dichlorométhane acétate d'éthyle ( 19: 1, v/v), on récupère 282 mg d'un mélange d'acétates anomères de structure 19 sous forme d'un sirop incolore (rendement, 86 %) Le rapport des formes O aux formes,déterminé par analyse par RMN, est de 4/1. Le spectre RMN confirme la structure attendue. D) préparation du disaccharide 2 Q par bromurati ndes disaccharidéss On soumet le mélange d'acétates de structure * 1 19 à l'action de Ti Br 4: On soumet à agitation une solution de 140 mg du mélange d'acétatesg dans un mélange de 3 ml de dichlorométhane et de 0,3 ml d'acétate d'éthyle à 17-18 C, sous atmosphère d'argon sec, en présence de mg de Ti Br (% 2 équivalents) pendant 20 heures. Apres refroidissement à O C et dilution avec 30 ml de dichlorométhane, le mélange est lavé avec de l'eau gla- cée, puis avec une solution aqueuse à 5 % de bromure de potassium et ensuite avec de l'eau et séché sur du sul- fate de sodium, filtré et évaporé Le résidu est chroma- tographié sur une colonne de gel de silice ( 10 g) Par élution avec un mélange dichlorométhane apetate d'é- thyle ( 19: 1, v/v),on récupère, par ordre d'élution: le bromure ao ( 74 mg; rendement 50 %) sous forme d'un sirop incolore, instable (immédiatement en- gagé dans la réaction suivante); Le spectre RMN confirme la structure attentue. une fraction ( 28 mg; rendement 20 %) cor- respondant au produit de départ qui n'a pas réagi, une fraction migrant peu correspondant à des produits de 0-débenzylation partielle. EXEM PLE 3 $ynthèse du monosaccharide 22 ou benzyl b-O-ac 4 ty 1-3-O-benzyl-2-benzyloxycarborylamino- 2-désoxy-c-D-glucopyranosidde e formule - O* osn HO NHCOO B a Ce dérivé est préparé à partir du benzyl-3-0- benzyl-2-benzyloxy-carbonylamino-2-désoxy-d-D-glucopyra- noside (dérivé 211 i en procédant comme suit (voir figure 5): Une suspension du composé 21 ( 987 mg,2 m M, ce composé est préparé selon P C WYSS and J KISS,Helv. Chim Acta,58 ( 1975) 1833-1847) dans le 1,2-dichloroéthane anhydre ( 15 ml) est agitée à reflux pendant 30 h en présence de N-acétyl-imidazole ( 2,5 m M, fraîchement préparé) Après refroidissement etdllution avec du chloroforme ( 50 ml), la phase organique est lavée avec une solution glacée d'acide chlorhydrique M, avec de l'eau, avec une solution aqueusesaturée d'hydrogénocarbonate de sodium, avec de l'eau, séchée (sulfate de sodium), filtrée et évaporée. Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice ( 50 g) L'élution par le mélange dichlorométhane acétone ( 15: 1,v/v) donne le dérivé 22 sous forme d'un sirop cristallisant dans un mélange acétate d'éthyle- hexane ( 759 mg, 71 %),PF: 114-115 C; " 7 D = + 88 (c = 1, chloroforme). 253 5324 EXEMPLE 4: Synthèse du monosaccharide 33 de formule C OO Me H H OH On effectue cette synthèse à partir du composé 23 selon les étapes suivantes (voir figure 6): 1) introduction d'un groupe benzoyle en position 5, 2) méthylation de la fonction carboxyle en po- sition 6 3) isomérisation du groupe OH en position 5, 4) formation du cycle pyraniqué. 1) réaction de benzoylation - 63 g de 3-O-benzyl-1,2-0 O-isopropylidèneo -D-glucofurancside (composé_ 3) sont dissous dans 500 ml de pyridine anhydre. On ajoute 85 g de chlorure de trityle et on chauffe à C pendant une heure On obtient ainsi le composé 24. Pouvoir rotatoire: LJ 20 = 34,70, chloroforme D La structure de ce composé a été confirmée par ses spectres IR et RMN, son analyse élémentaire est correcte. Le mélange est ensuite refroidi à 00 C et on ajoute 45 ml de chlorure de benzoyle Après une nuit, on détruit l'excès des réactifs par addition de 300 ml de méthanol Le mélange obtenu, évaporé à sec, est repris par du chloroforme La phase chloroformique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium et concentrée. On obtient ainsi le composé 25 Le sirop obtenu est dissous dans 400 ml de chloroforme Après addition de 100 ml d'une solution d'acide paratoluènesulfonique 5 M dans le méthanol, la solution est laissée à 40 C pendant une nuit On obtient, après lavage à l'eau de la phase organique, 215 g d'un mélange Le composé est obtenu par chromatographie de ce mélange sur gel de silice dans le solvant éther-hexane 2/1 (v/v) On obtient ainsi 36 g du composé 26. Pouvoir rotatoire: lP 7 = 65,30, chloroforme. La structure du composé Dú a été confirmée par ses spectres IR et RMN. ) méthylation de la fonction carboxyle en position 6 Le composé 26 ( 1,88 g) est dissous dans l'acétone ( 20 ml) On ajoute, goutte à goutte à -50 C 3,5 ml d'une solution de Cr O 3 ( 13 g) dans H 2504, 3,5 M ( 29 ml) On laisse la température remonter et on laisse une heure dans ces conditions Le mélange réactionnel est alors versé dans la glace et le produit est extrait au chloroforme Après lavage à l'eau et séchage, on évapore à sec On obtient le composé 27. Le mélange obtenu est dissous dans du méthanol ( 20 ml), on ajoute ensuite 10 mi de soude 1 N et on laisse une nuit à température ambiante Lemélange réactiornel est alors passé au travers d'une colonne ( 25 ml) de résine Dowex sous forme H +au préalable rincée avec du méthanol Le produit est obtenu par concentration de l'éluat On obtient ainsi le composé 2 P. B 1 Ce composé est dissous dans l'éther et méthylé de façon classique par le diazométhane On obtient, après évapo- ration, le composé ? 9 ( 1,08 g; 70,4 %). Pouvoir rotatoire ii 20 _ 270, chloroforme. D L'analyse élémentaire trouvée du composé 29 est correcte Sa structure est de plus confirmée par ses spectres IR et RMN. 3 ) isomérisation du groupe -OH en position 5 A une solution d'annÈydride triflique ( 0,8 ml) dans le dichlorométhane ( 16 ml), refroidie à -20 C, on ajoute goutte à goutte une solution de pyridine ( 0,8 ml) dans le dichlorométhane ( 8 ml) On ajoute ensuite, à -10 C, goutte à goutte, 800 mg de composé 29 dissous dans du dichlorométhane ( 8 ml) Après une heure à -50 C, le mélange réactionnel est versé dans un mélange d'eau et de glace ( 8 ml) contenant 160 mg de bicarbonate de sodium On agite jusqu'à séparation des deux phases organique et aqueuse La phase organique est lavée par HC 1 l 3 %, H 20, Na Cl saturé, séchée et concentrée On obtient ainsi le composé 39. Le sirop est repris par du DMF (l Oml) On ajoute du trifluoroacétate de sodium ( 1,6 g) et chauffe à 80 C pendant 3 heures On obtient ainsi le composé 3 U. Après évaporation, reprise par du dichlorométhane, lavage à l'eau et séchage, le résidu est repris par du méthanol puis le solvant est évaporé après une heure Après chroma- tographie sur colonne dans le solvant éther-hexane 2/1, on obtient le composé 32 ( 450 mg: 56,2 %). pouvoir rotatoire:;o 720 =o 33 o chloroforme. La structure du composé est confirmée par ses spéctres IR et RMN L'analyse -élémentaire trouvée est correcte. 2.535324 fl) ormation du cycle pyrariique- Cette synthèse est effectuée à partir du composé 32. Le composé 2 _( 200 mg) est dissous dans un mélange acide trifluoroacétique/eau 9/1) Après 15 minutes, les solvants sont évaporés Le résidu est cristallisé dans de l'acétate d'éthylelhexane On obtient ainsi 110 mg de composé Les caractéristiques de ce dérivé sont les suivantes -1 spectre IR dans Cu C 13,yen cm- (i 2 be:izyke) et 1740 1,25-1260 c. (s,311 C Oo'4 e) t rouvé 56,17 5.135 2 3 O 3 24 Exemple 5: Synthèse du dérivé 38 ou 3-O-benzyl-4-O-chloro- acetyl-1,2-0 tert bàtoxyéthylidène L-méthyl idopyranuro- nate de formule CO Me\ Me. Cette synthèse (voir figure 7) est effectuée à partir du dérivé 33 à structure acide iduronique en soumettant c) le dérivé 3 à une réaction d'acétylation, P) le mélange d'acétates anomères 34 et 35 obtenus à l'action d'un agent de bromu- ration afin d'introduire un atome de brome sur le carbone anomère,)en formant un orthoester en positions 1, 2 et Zen effectuant une monochloroacétylation en 4 de l'orthcester. c) réaction d'acétylation conduisant aux 1,2,4-tri-O- acétyl-3-O-benzyl-o,, L-méthyl idopyranuronates (dérivés 34 et 35). Une solution du composé 33 ( 3 g) dans un mélange de pyridine anhydre ( 20 ml) et d'anhydride acétique ( 10 ml) est agité à O "C, à l'abri de l'humidité, pendant 5 h Le mélange réactionnel est évaporé à sec, évaporé avec du toluène ( 4 x 20 ml), et séché sous vide Le résidu est chro- matographié sur une colonne de gel de silice ( 150 g). L'élution par le mélange toluène: acétate d'éthyle( 4:1 v/v) donne, par ordre d'élution: une fraction de tête composée de dérivés furanniques, le composé 34, (anomère d': 6,23 (s, 1 H, H-1 l). le composé 35 (anomère), cristallisant dans un mé- lange éther-hexane, ( 2,688 g, 63 %), P F: 112-113 C, (d, 1 H, H-1, 1,2: 1,5 Hz). Les anomères procède à la succession des synthèses décrites. Leur mélange est utilisé directement sous forme de sirop pour les réactions ultérieures. È) réaction de bromuration conduisant au composé 36 ou bromure de 2,4-di-O-acétyl-3-O-benzyl-O L-méthyl idopyra- nuronyle. Un mélange d'acétates -4 et 35 ( 212 mg; 0,5 m M) est dissous dans du dichlorométhane anhydre ( 5 ml) et de l'acétate - d'éthyle anhydre ( 0,5 ml) Du tétrabromure de titane ( 25,0 mg, 0,7 m M) est ajouté en une seule fois, et le mélange réac- tionnel est agité 24 h à la température ambiante à l'abri de l'humidité Apres refroidissement à O C et dilution avec du dichlorométhane, la phase organique est lavée avec de l'eau glacée ( 3 fois), séchée (sulfate de sodium), fil- trée et évaporée pour donner le dérivé 36 sous forme d'un sirop légèrement coloré -( 217 mg, 96 %), R M N (CDC 13):: 6,41 (s, 1 H, H-1) Ce composé, très instable est immédiate- ment engagé dans la réaction suivante. ) préparation de l'orthoester ou 4-O-acétyl-3-0-benzyl- 1,2-O-tert-butoxyéthylidène-, -L-méthyl idopyranuronate. Une solution de bromure 36 (fraîchement préparée à partir de 2,122 g, 5 m M, de mélange d'acétates 3 _ 4 et 35 dans du dichlorométhane anhydre ( 20 ml) est agitée à la température ambiante sous atmosphère d'argon sec De la sym-collidine ( 2,65 ml, 20 m M) et du tert-butanol anhydre ( 3 ml; 30 m M) sont successivement ajoutés, et le mélange réactionnel est agité h dans ces conditions Apres dilution avec du dichloro- méthane ( 50 ml) la phase organique est lavée avec une solu- tion aqueuse saturée d'hydrogénocarbonate de sodium, avec de l'eau, séché sur sulfate de sodium, filtré et évaporé. Le résidu est chromatographié sur colonne de gel de silice ( 120 g) L'élution par le mélange hexane:acétate d'éthyle ( 2:1, v/v, contenant 0, 5 % de triéthylamine) donnele composé 37 sous formnne d'un sirop pur ( 1, 542 g,70 % à partir de 34 et 35-} /"_ 7 = -23 (c: 1, chloroforme), R M N (CD C 13):&: 5,48 (d, 1 H, H-1, J 1 2: 2,5 Hz). e R J 5 3 2 4 ) monochloroacétylation de l'orthoester 37: Une solution de l'orthoester j ( 220 mg,O,5 m M) dans le méthanol anhydre ( 10 ml) est refroidie a -20 C sous agi- tation et atmosphère d'argon sec Du carbonate de potassium anhydre ( 40 mg) est ajouté et le mélange réactionnel est agité pendant 5 h dans ces conditions Les solides sont essorés, le filtrat est évaporé et le résidu est repris dans du chloroforme ( 50 ml) La phase organique est lavée - rapidement avec de l'eau glacée ( 3 fois), séchée (sulfate de sodium), filtrée et évaporée Le résidu est immédiate- ment dissous dans de la pyridine anhydre ( 4 ml) et du di- chlorométhane anhydre ( 2 ml) Apres refroidissement à -20 C sous atmosphère d'argon sec, une solution de chlorure de chloroacétyle ( 0,1 ml, 1,24 m M, fraîchement distillé) dans le dichlorométhane anhydre ( 1 ml) est ajoutée goutte à goutte Le mélange réactionnel est agité dans ces conditions pendant 30 mn, puis versé dans un mélange eau-glace ( 10 Oml). Après agitation pendant 15 mn, le mélange est extrait avec du chloroforme ( 3 x 20 ml) Les phases organiques sont lavées avec de l'eau glacée, avec une solution aqueuse à 2 % d'hydrogénocarbonate de sodium, avec de l'eau, séchées (sulfate de sodium), filtrées et évaporées Le résidu est chromatographié rapidement sur une colonne de gel de silice ( 12 g) L'élution par le mélange hexane:acétate d'éthyle ( 5:2, v/v, contenant 0, 2 % de triéthylamine) donne, par ordre d'élution: un composé insaturé 39 ( 15 mg, 8 %), l'orthoester 38 sirop ( 145 mg, 61 % a partir de 12), c_ 7 D= + 19 (c:l, chloroforme),R M N (CDC 13): &:5,45 (d, 1 H, H-1, J 1,2: 2,5 Hz), 5,24 (d de d, 1 H, H-4, J 3,4: 2,5 Hz, J 45: 1,5 Hz), 4,00 (s, 2 H; Cl-CH 2-COO-). EXEMPLE 6: Synthèse du disaccharide Ill ou benzyl 6-0-acétyl- 3-.-benz yl 2-benzyloxycarbor,,1 An Ano -2-désoxy-4-0-( 2-0-acé tyl- 3-0-benzyl c -L-méthyl idopyranuronyl) O-D-glucopyranoside. H OB OO Bn O Ac NHCOO Bn ( 41) On prépare tout d'abord selon l'étape 6) le disaccha- ride 4 _ O par condensation des monosaccharides 3 _ et 22, puis on élimine le groupe monochloroacétyle en position 4 dans l'étape 4, ce qui conduit au disaccharide 41 recher- ché (voir figure 8) étape O: préparation du disaccharide 40 ou benzyl 6-O-acétyl-3-0-benzyl-2-benzyloxycarbonylamino-2-désoxy- 4-0 ( 2-O-acétyl-3-O-benzyl-4-O-chloroacétyl-d -L-méthyl idopyranuronyl) c -D-glucopyranoside. Une solution de l'orthoester 38 ( 284 mg, 0,6 m M) et de l'alcoo 122 _ ( 214 mg, 0,4 m M) dans du chlorobenzène anhydre ( 12 ml) est chauffée à 140 C sous agitation et léger courant d'argon sec Apres distillation lente de 10 ml de solvant, une solution de perchlorate de 2,6- diméthylpyridinium ( 0,006 m M, franchement prépare) dans du chlorobenzène ( 4 ml) est ajoutée goutte à goutte en 30 mn avec distillation si- multanée de solvant ( 4 ml) Le mélange réactionnel est agité 1 h, avec addition de solvant frais ( 10 ml) et dis- tillation simultanée de telle sorte que le volume réac- * tionnel reste constant et égal à 4 ml Après refroidisse- ment et dilution avec du chloroforme, la phase organique est lavée avec une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium, avec de l'eau séchée sur sulfate de sodium, filtrée et évaporée Le résidu est chromatographié sur une 35 324 colonne de gel de silice ( 40 g) L'élution par le mélange hexane:acétate d'éthyle ( 4:3, v/v) donne, par ordre d'élu- tion: le produit 22, ( 120 mg, 56 %) le disaccharide 4 O, cristallisé dans un mélange éther-hexane ( 112 mg, 30 %, PF: 144-145 C, /__ 7 D + 35 D (c:l, chloroforme), R M N (CDC 13): conforme à la struc- ture attendue. étape: élimination du groupe monochloroàcétyle. Un mélange du disaccharide an ( 56 mg, 0,06 m M) et de thiou- rée ( 7 mg, 0,lm M) dans de la pyridine ( 2,5 ml) et de l'étha- nol absolu ( 0,5 ml) est agité à 1000 C pendant 30 mn Apres refroidissement et évaporation à sec, le résidu est repris par un mélange eau-chloroforme ( 1: 1, v/v 40 ml) La phase organique est lavée avec de l'eau, séchée (sulfate de sodium), filtrée et évaporée Le résidu est chromato- graphié sur une colonne de gel de silice ( 2 g) L'élution par le mélange acétate d'éthyle: hexane ( 2: 1, v/v) donne le disaccharide 41, cristallisé dans l'éther ( 46 mg, 30 %), P F: 146-147 C L_ 7 D = 44 o (c: 1, chloroforme), R.M N (CDC 13): conforme à la structure attendue. Exemple 7: Synthèse du tétrasaccharide 13 de formule COO Me O Ac g OA c\ O Bn oo A 13 r B o'cG Bn B HO l O Bn No O C C=O 011 n on On prépare le tétrasaccharide 43 en effectuant: dans l'étape a) la condensation des disaccharides 20 et 41 dont la synthèse est décrite dans les exemples 2 et 6 et en soumettant au cours de l'étape b) le tétra- saccharide 42 formé à une réaction sélective de -0- démonochloroacétylation en position 4 (voir figure 9): 3 5 3 4 a) Réaction de condensation Un mélange de 64 mg ( 80 /M) du bromure 20 fraîchement prepare,-de 51 mg ( 60 FM) du composé 41 et de 80 mg de O tamis moléculaire 4 A en poudre dans 1,5 ml de dichloro- éthane anhydre est soumis à une agitation durant une demi- heure à la température ambiante, sous atmosphère d'argon sec, puis est refroidi à 20 C On ajoute successivement ml ( 150 M) de sym-collidine et 31 mg ( 120 "M)de triflate d'argent Le mélange réactionnel est soumis 1 h à agitation à -20 C, puis on laisse la température remonter vers la tem- pérature ambiante pendant 15 h Après dilution avec 50 ml de dichlorométhane, les solides sont essorés et le filtrat est lavé avec une solution aqueuse glacée d'acide chlorhy- drique I M puis avec de l'eau (deux fois) On le sèche ensuite sur du sulfate de sodium, on le filtre puis on éva- pore. Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice ( 8 g, gel 230-400 mesh) L'élution par le mélange hexane-acétate d'éthyle ( 4:3, v/v) permet de récupérer 37 mg de tétrasaccharide Il" (rendement 39 %) sous forme d'un verre incolore lc l 20 = + 56 (c = 0,6; CHC 13); le spectre de RMN confirme la structure attendue. Par élution de la colonne avec le mélange acétate d'éthyle-hexane ( 2:1, v/v), on récupère 23 mg du produit de départ 41 (rendement 44 %). (b) Réaction de -O-déchloroacétylation Une solution de 36 mg ( 23 v M) du tétrasaccharide 42 dans 1,25 ml d'un mélange de pyridine et 0,25 ml d'éthanol absolu est chauffée à 100 C en présence de 7 mg ( 100 p M) de thiourée pendant 20 mn Après refroidissement et évapora- tion à sec, le résidu solide est repris avec 20 ml d'eau et extrait avec du chloroforme ( 5 fois 5 ml) Les phases organi- ques sont lavées avec une solution aqueuse à 10 % d'hydrogéno- sulfate de sodium, avec de l'eau, séchées sur du sulfate de sodium, filtrées et évaporées Le résidu est chromatographi sur une colonne de gel de silice ( 3 g) Par élution avec un mélange acétate d'éthyle-hexane ( 3:2, v/v), on obtient 27 mg du dérivé 43 (rendement 80 %) sous forme d'un verre incolore l l 20 = + 61 (c = 0,8; chloroforme); le spectre de RMN confir Ie la structure attendue. EXEMPLE 8 (voir fiaure 10): Synthèse du pentasaccharide 45 de formule oso; m+ coopko o I 0 N} OI 3 N CO 4 O O j 3 N O N 3 O 53 N"+ NH O SON N 8 V On effectue une réaction de condensation entre le tétrasaccharide 113 et le monosaccharide 44, ce qui conduit au pentasaccharide 45. Un mélange de 27 mg ( 54 p M) de bromure la préparé selon H PAULSEN und W STENZEL, Chem Ber, 111 ( 1978) 2334-2347, de 26 mg ( 18 u M) du tétrasaccharide 43 et de 50 mg de tamis moléculaire 4 A en poudre dans 0, 8 ml de dichloroéthane est soumis à agitation durant 1/2 h à la température ambiante sous atmosphère d'argon sec, puis refroidi à -20 C 16 ml ( 120 p M) de sym-collidine et 26 mg ( 100 p M) de triflate d'argent sont ajoutés successivement et le mélange réactionnel est soumis à agitation pendant 18 h en laissant la température remonter lentement vers la température ambiante. Après dilution avec 50 ml de dichlorométhane, les solides sont essorés et le filtrat est lavé avec une solution aqueuse glacée d'acide chlorhydrique 1 M puis avec de l'eau ( 2 fois) On le sèche ensuite sur du sulfate de sodium, on le filtre, puis on évapore. Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice ( 5 g, gel 230-400 mesh) Par élution avec un mé- lange hexane-acétate d'éthyle ( 4:3, v/v), on récupère 30 mg de pentasaccharide 45 sous forme d'un verre incolore (rende- ment 90 %) f 20 = + 670 (c 1: chloroforme) Le spectre de RMN confirme la structure attendue On trouve en particulier pour les protons anomères des unités de glucosamine des déplace- ments ( 6,TMS) de 5,36 et 5,52 ppm pour les protons apparte- nant à H, F et D respectivement. EXEMPLE 9: Préparation du pentasaccharide 50 (voir figures 10 et 11) On a recours aux étapes suivantes: (a) d'élimination des groupes acétyle (penta- saccharide 46) (b) de sulfatation des groupes -OH ainsi libé- rés (pentasaccharide 47) (c) d'hydrogénation pour libérer les groupes -OH protégés par des groupes benzyle et pour transformer le groupe -N 3 en groupe -NH 2 (pentasaccharide 48) d) de sulfatation des groupes NH 2 (pentasaccha- ride 49, puis saponification des groupes -COO Me en position 6 (pentasaccharide 50). Ces étapes sont réalisées comme suit: a) élimination des groupes acétyle du dérivé 45. Une solution de 28 mg du pentasaccharide 45 dans un mélange de 2,5 ml de 1,2-diméthoxyéthane et de 0,8 ml de méthanol est refroidie à OOC sous agitation. On ajoute alors 1 ml d'une solution 1 M de soude, goutte à goutte, en 10 minutes Le mélange réactionnel est soumis à agitation 1 heure à OOC, puis 12 heures à la température ambiante Après refroidissement à O O C, on ajoute 3 ml d'a- cide chlorhydrique 1 M et le mélange laiteux est immédiate- ment extrait avec du chloroforme ( 5 fois 5 ml) Les phases organiques sont lavées avec de l'eau, séchées sur du sul- fate de sodium, filtrées et évaporées Le résidu est 25353 24 repris dans 2 ml de méthanol et traité par une solution éthérée de diazométhane (excès jusqu'à persistance de la coloration jaune) pendant une demi-heure. Après évaporation à sec, le résidu est chro- matographié sur une colonne de gel de silice ( 2 g, gel 230-400 mesh) L'élution par le mëlange dichlorométhane- méthanol ( 15:1, v/v) permet de récupérer 18 mg du penta- saccharide 46 (rendement 72 %) sous forme d'un verre in- colore /ç 7 O= + 57 (c = 1; chloroforme); - La structure attendue est confirmée par le spectre de RMN. D) sulfat 2 tion des groupes -OH A une solution du composé 46 ( 22 mg) dans le diméthyvlforma- mide ( 0,5 ml), on ajoute du complexe trim Athylamine/SO 3 ( 22 mg, 2,5 éq/OH) Le mélange réactionnel est chauffé à oc durant environ 14 h On ajoute alors a nouveau du complexe triméthylamine/Sb 3 ( 10 mg) et laisse la réaction évoluer durant 24 heures On ajoute au mélange réactionnel du méthanol ( 0,5 ml) et du chloroforme (O, ml) La solution est introduite au sommet d'une "olcnne de séFhadex LH 20 'quili - brée dans un mélange CHC 1 13/CH 3 OH ( 1/1; v/v) Les fractions contenant le produit sulfaté sont regroupées et le solvant est évaporé On obtient ainsi un verre ( 30 mg). Ce verre est ensuite chrcmatographié sur gel de silice ( 10 g) dans un solvant constitué de 3 parties du mélange acétate d'éthylène/pyridine acide acétiqu-/eau, ( 6/2/0,6/1, v/v/v/v) et de 2 parties du mélange acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau, ( 5/b/1/3, v/v/v/v). parties du mélange acétate d'éthyle/pyridine/acide acé- tique/eau, 5/5/1/3 'z/v/v/v. 2 b 3 j 32 4 Les fractions contenant 1 e produit d 4 siré sont rassemblées et concentrées Après Évaporation des solvants, le résidu obtenu est dissous dans du méthanol additionnéd'eau, puis passé au travers d'une colonne de Dowex 50 W x 4,Na+, équilibrée dans un mélange méthanol/eau ( 50/50, v/v). On obtient ainsi le sel de sodium (composé 47). c) hydrog 6 lnation Le produit obtenu ci-dessus est dissous dans du méthanol ( 3,7 ml) additioné d'eau ( 0,3 m 11). A cette solution, on ajoute le catalyseur (Pd/C,5 %,40 mg) et on agite sous atmosphère d'hydrogène pendant 5 jours. Après élimination du catalyseur par filtration, l'analyse du spectre U V de la solution obtenue montre la disparition totale de l'absorption due aux groupes benzyle Le solvant est alors évaporé,laissant un résidu,à savoir le composé 48. d) sulfatation * des groupes -NH 2, puis sapont- fication des groupes carboxyle. Le composé 48 est dissous dans l'eau ( 4 ml) Le p H est ensuite ajusté à 9,5 puis on ajoute à la solution du complexe trim 6thvlamine/O 3 ( 54 mr g) Le p H est maintenu à 9,5 pendant toute la durée de la réacticn par addition de soude 0,1 N. Après une nuit, on procède à une nouvelle addition d'agent de sulfatation ( 27 mg) Une dernière additionest effectuée après 2 h. Apres 48 h on ajoute de la soude ( 3 M, 34 mil u ccmpos; 49 - formé,puis la solution est soumise a agitation pendant 3 heures à température ambiante de manière à hydrclyser les méthylesters des motifs de type acide uronique. 0 Le mélange réactionnel est ensuite ne 1 itralisé puis concentré jusqu'à un volume d'environ 2 ml. La solution ainsi obtenueest déposée au sommet d'une colonne de Séphadex G 25 ( 100 ml) éluée'avec de l'eau. Les fractions collectées sont analysées par absorption UV ( 206 nm) et en polarométrie ( 265 nm) Les fractions présentant une activité optique sont regroupées, le sol- vant est éliminé et le résidu repris par environ 2 ml d'eau et lyophilisé. On obtient ainsi le dérivé 50 sous forme de poudre blanche ( 5,6 mg, 25 % par rapport au produit 45). L'étude en RMN confirme la structure attendue. On trouve en particulier pour les protons anomères des uni- tés de glucosamine, des déplacements ( 6, TMS) de 5,36, ,45 et 5,52 ppm pour les protons appartenant à H, F et D respectivement. EXEMPLE 10 Synthèse du disaccharide 51, à savoir du 1 prop-1 '-é 2,3-di-O-benzyl-4-O/2-azido- 3,4-di-O-benzyl-6-0-acétyl _-D-glucopyrano- side J uronate de méthyle de formule COO Me 0 O U Bn Qn Bn O^^^^^/ O-CH=CH-Me N 3 ( 51 b Bn On se reportera à la figure 12. A une solution de monosaccharide 13 ( 0,215 g; 0,5 mmole) dans le dichlorométhane ( 3 ml), on ajoute le monosaccharide 44 ( 0,49 g; 1 mmole) dans du dichlorométhane ( 3 ml) puis des tamis 4 A en poudre On refroidit le mélange à O C, puis on ajoute de la sym-collidine ( 0,16 ml) , et du triflate d'argent ( 0,3 g) Après 1 heure, le mélange est dilué avec du dichlorométhane ( 50 ml) Les solides sont essorés, puis la solution est lavée avec une solution à 5 % de bicarbonate de sodium, avec del'eau, puis du sulfate acide de potassium à 10 % et à nouveau avec de l'eau On obtient ainsi, après évaporation 591 mg de résidus Après purification sur silice dans un mélange toluéne/acetone 30/1 ( v/v), on récupère 211 mg de disaccharide 51 pur. Ce oroduit est caractérisé par son analyse élémentaire. EXEMPLE 11 Synthèse du disaccharide 54, à savoir du ( 1-trichloroacétimidyle-2,3-di-O-benzvl-4-O- /-acétylamido-2-désoxy-3,4-di-O-benzyl-6-O- acétyl-a-D-glucopyranoside 7 uronate de méthvle, de formule 3 O 2 5535324 O Ac I COO Me Ot Bn OB N ONH Bn O '9 ( 54) IO-C-CCL 3 NH Ac O Bn On se reportera à la figure 12 pour le schéma de syn- thèse. A une solution du disaccharide 51 ( 180 mg) dans 6 ml d'un mélange acétone/eau ( 5/1, v/v), on ajoute successi- vement de l'oxyde mercurique ( 232 mg) puis goutte à goutte une solution de chlorure mercurique dans un mélange acétone/eau ( 292 mg/2 ml). Après filtration, évaporation, reprise par du chloroforme et lavage par une solution d'iodure de potassium à 10 % et à l'eau, on obtient le disaccharide 52 ( 140 mg). On dissout 100 mg du disaccharide 52 dans 1,6 ml de mét Ianol A cette solution, on ajoute du formiate d'ammonium ( 160 mg) et du catalyseur Pd/C 10 % ( 100 mg) Après cinq minutes, on élimine le catalyseur et on ajoute de l'anhydride acétique ( 10 gouttes) Après évaporation, le produit obtenu est purifié sur silice dans un mélange toluène/acétone ( 4/1 v/v) On obtient ainsi 61 mg de disaccharide 53. Le disaccharide 53 est caractérisé par son Rf sur plaque de silice (Merck, référence 5719) dans deux solvants différents: chloroforme/acétate d'éthyle, 3/2,v/v Rf = 0,40 et toluène/ acétone, 4/1, v/v; Rf = 0,20. 253; 32 4 Le dérivé 53 ( 60 mg) est dissous dans du dichlorométhane ( 1,5 ml) On ajoute alors du trichloroacétonitrile ( 75 pil) et de l'hydrure de sodium ( 1,5 mg) Après 15 minutes, le dérivé 53 a disparu au profit du dérivé 54 Après filtra- tion et évaporation, on obtient 5 ( 67 mg) Le dérivé 54 est caractérisé par son Rf sur plaque de silice (Merck, référence 5719) chloroforme/acétate d'éthyle, 2/1, v/v; Rf = 0,59 (O,-37 pour le composé 53). EXEMPLE 12 Synthèse du dérivé 57, à savoir du 1,6-anhydro-2,3-éooxy-4-O f 2,3-di-O 0benzyl-uronate de méthyle 7-a-D-glucopyranoside de formule: C 00 * CO O On 0. , Ét Ac O Bn ( 57) On effectue cette synthèse à partir des dérivés 55 et 56 (voir figure 13). a) Préparation du (bromo 2,3-di-0-benzyl-4-O-acetyl- D-glucopyranoside) uronate de mréthyle-(composé 55) - SY}WTRSE DU C Ol'i'O E V A urge solution de 14 ( 32 g; 85,5 r, oles) dans la pyridi: e ( 750 ml), on ajoute du chlorure de trityle ( 2 F G; 1,? eq) nuis cn chauffe à 800 C Une nouvelle addition de chlorure de trityle 4,9 O; 0,2 eq) est faite après 3 heures de réaction Lorsque la formation de 1 l est complète (c c m silice; riéthanol/chloroforple, I/70 i, viv, on refroidit la solution jusqu'à Oo C, puis on ajoute du chlorure de benzoyle ( 15 ml; 1,5 eo) Anrés une nuit l C est formé ouantitativement. Du méthanol ( 150 ml) est alors ajouté goutte à goutte au mélar oe réactionnel qui est ensuite concentré à sec Le résidu obtenu est repris dans du méthanol ( 500 ml) contenant de l'acide oaratoluîfne- sulfonique ( 95 g) Aurès 2 heures de réaction, le mélange r actic,:el est transvasé dans une ampoule à décanter contenant de l'eau glacée ( 2 1 Le produit 1 est extrait au chloroforme puis engagé tel nue dans l'étape suivante. Une partie de ce produit a-été nurifiée L'enalyse du spectre IR 61 l (chlor- confirme la structure C'est une gome incolore 61 (chloro- forme). S N 7 LHESE DU CIOMPOSE lj Le sirop obtenu à l'étape orécédente ( 95 o) est dissous dans l'acétone ( 1 1), puis à la solution, refroidie à O C, on ajoute goutte à goutte, une solution d'oxyde de chrome ( 52 g) dans l'acide sulfurique 3,5 M ( 220 ml) A Drès 2 heures de réaction, le mélange réactionnel est versé dans de l'eau glacée ( 1 1) Le nroduit' $est extrait du chloroforrc ( 5 x 200 ml) La phase chloroforil:ique est lavée jusqu'à DH neutre, séchsc et concentrée à sec. Au résidu obtenu ci-dessus, dissous dans le méthanol ( 650 ml), on ajoute goutte à goutte de la soude en solution dans l'eau ( 20 g dans 50 ml), puis on chauffe le mélar'ge à 50 C Après une nuit, la solution obtenue est concentrée partiellement, nuis ve e dais l',- u ( 1,5 1) La phase aqueuse est ensuite lav e avec de l'ét/er, u;, 1; -s acidification par l'acide chlorhydrique, le oroduitif est extrait à l'éther La phase éthérée est séchée sur sulfate de sdium:, nuis cor - centrée à sec, livrant une masse jaune ( 50 g)oui corntientle. À Ce résidu ( 50 g) est dissous dans un mélange d'acide acétique et d'. acide trifluoroacétioue ( 15/1, v/v, 615 nil) A cette solution, agitée à 100 C, on ajoute de l'eau ( 160 ml) Anrès une nuit on évanore à sec et élimine les traces d'acide acétique, évanoration de toluène Le résidu formé en partie de lfnon hydrolysé et delj est dissous dans l'éther ( 400 ml). A cette solution, on ajoute à O C, une solution éthérée de dia- zométhane jusqu'à complète méthylation (c c m silice, etherhexane, 2/1, v/y) L'excès de diazoméhane est alors détruit nar l'acide acétique puis le mélange réactionnel est concentré à sec. 263 324 Le résidu est purifié sur une colonne de gel de silice ( 200 g) éluee d'abord par du chloroforme Dur, puis Dar un mélange chloroforme/ ether, 3/1, v/v On obtient ainsi lk( 8,6 g; 22,2 mmoles, 26 % par rapport à la) Le dérivélk est cristallin n f 122-123 C L'analyse élémentaire et le spectre de RMN confirment sa structure. SJ)A'ITHESE DU CO;:u OSE 1, A une solution delk ( 3,9 g; 10 mmoles) dans la Dyridine ( 50 ml), on ajoute de l'anhydride acétinue ( 4 ml, 42 n"rioles) Anrès 2 heures, le mélange réactionnel est évaporé à sec On obtient ainsil Z ( 4,62 g; E % S.YNTHUSL Dl C Of P t 55 A une solution de) ( 1,4 a) dans le dichlcror-Ét J:ane 30 n I et l'acétate d'éthyle ( 3 ml), on ajoute du têtratrc,,ure de tit 5 ne ( 1,5 c;. La solution est agitée toute la nuit à température ambiante Apres dilution par du dichlorométhane, le i;é)latnn réactionriel est ver-; dans l'eau glacée La ohase organique est lavée avec du bicarbonate à 5 % dans l'eau, séchée et concentrée Le résidu est chrcmatcgraphié sur silice ( 50 g, ether/hexane, 1/1, v/v). On obtient ainsi le composé 55 ( 920 mag, 62 %); c'est un siro D incolore lol O = + 97,5 (c = 1, chloroforme) L'analyse éléi entairè et le s'etre de RIIN confirment la structure. 533 î 24 b) Ufie solution du dérivé 56 ( 432 mg, 3 mmoles) dans le dichlorométhane ( 10 ml) est agitée à O OC en présence de o tamis moléculaire 4 A ( 0,5 g), de driérite ( 1 g) et de car- bonate d'argent fraichement préparé ( 0,42 g) Après refroi- dissement à O OC, on ajoute, goutte à goutte, une solution du composé 55 ( 490 mg, 1 mmole) dans le dichlorométhane ( 6 ml). La réaction dure deux heures, le mélange réactionnel est en- suite filtré Après évaporation à sec et chromatographie sur gel de silice du résidu, (solvant: acétate d'éthyle/chloro- forme, 1/6, v/v), on obtient le dérivé 57 ( 285 mg, 51 %). La structure du dérive 57 est confirmée par son analyse élémentaire et son spectre de RMN Pouvoir rotatoire: = 39 o; chloroforme; PF = 156-159 C. EXEMPLE 13 Synthèse du dérivé 59, de formule: OAC COO Me o B Bn N O O Bn Le trisaccharide 59 est préparé par réaction du disaccharide 58 (obtenu par élimination du groupe acétyle en position 4 du comrosé 57 de l'exemple 12), avec le monosac- charide 44 en opérant comme suit (voir figure 13): réaction de désacétylation du composé 57: A une solution du disaccharide 57 ( 260 mg) dans le a méthanol ( 25 ml), on ajoute, à O C, une solution de soude 1 N ( 25 ml) Après une heure, le mélange est acidifié par addition d'acide chlorhydrique 1 N ( 30 mi) Le produit est extrait au chloroforme Après évaporation, le résidu est cristallisé dans un mélange acétate d'éthyle/hexane On ob- tient 167 mg (rendement 70 %) du dérivé 58. Pouvoir rotatoire: 720 = -31 ; chloroforme, PF = 169- C L'analyse trouvée est correcte La structure du dé- rivé 58 est de plus confirmée par son spectre RMN. condensation du disaccharide 58 avec le monosaccharide 44: A une solution des composés 44 ( 300 mg) et 58 ( 155 mg) dans le dichlorométhane ( 5 ml), on ajoute successi- O vement du tamis de 4 A en poudre ( 500 mg), puis de la colli- dine ( 100 pil) et du triflate d'argent Après 15 minutes, la solution est diluée avec du dichlorométhane ( 50 ml), fil- trée, lavée avec successivement de l'eau, une solution à X de sulfate acid de potassium et de l'eau Après sé- chage et concentration, le résidu est chromatographié sur gel de silice dans un mélange acetate d'éthyle/chloroforme ( 1/10, v/v) On obtient ainsi le dérivé 59 sous forme de mousse blanche. Ce dérivé 59 est caractérisé par son analyse élé- mentaire, son spectre de RMN et son pouvoir rotatoire (Iri = + 250, chloroforme). EXEMPLE 13 A: Synthèse du trisaccharide de formule coo-N * oso;, OSO t CN 4 N $ 3 n N OH $C OH N HRSDM O / H NH S Olasq On fait réagir le monosaccharide 20 avec du méthanol dans les conditions décrites pour la synthèse du tétrasaccharide EFGH ci-dessus On obtient ainsi un e-mé- thylglycoside Le groupe MCA est éliminé de manière classi- que puis le disaccharide est soumis à l'action du monosac- charide 44 dans les conditions décrites ci-dessus pour l'élaboration du pentasaccharide. Le trisaccharide obtenu est ensuite soumis aux réactions classiques aux fins de dprotection et de fonctionnalisaticn. La structure est confirmée par le spectre RMN. EXEMPLE 14 Synthèse dutrisaccharide 62 de formule: O Ac COO Me O Ac / o o o B Bno O NH Ac O Bn N 3 ( 62) Ce trisaccharide 62 est préparé selon les étapes suivantes (voir figure 14): a) transformation du groupe N 3 en position 2 du motif gluco- samine en groupe -NH Ac. b) ouverture du pont époxy 2,3 du motif à l'extrémité réduc- trice. c) ouverture du pont anhydro-l,6 de ce meme motif. a) Passage de -N 3 à -NH Ac: A une solution du dérivé 59 ( 10 mg) dans un mélange DMF/éthanol ( 1/1; 1 ml), on ajoute du catalyseur Pd/Ca CO 3 à 5 % ( 5 mg) La suspension est agitée sous une pression d'hydrogène de 1 atmosphère pendant 96 heures. Après filtration du catalyseur et évaporation, le résidu est dissous dans du méthanol puis acétylé par addi- tion d'une goutte d'anhydride acétique On obtient quanti- tativement le dérivé 60. Le dérivé 60 est caractérisé par son spectre RMN, son analyse élémentaire, son pouvoir rotatoire: la JD = + 35,5 ; chloroforme PF: 147-149 C. b) Ouverture du pont époxy: Le dérivé est tout d'abord saponifié comme indiqué pour la synthèse du dérivé 58, et ce afin d'éliminer le groupement acyle en position 6 du motif terminal non réduc- * teur et le groupement méthyl-ester en position du motif in- termédiaire. Après extraction, le résidu est dissous dans du DMF et chauffé à 1200 C, en présence d'azide de sodium, pen- dant 48 heures Après évaporation, extraction par le chloro- 2 5 3 5 32 4 forme, lavage par H Cl, 0,1 N, par l'eau, séchage et évapora- tion du solvant, on obtient un résidu qui est traité par du diazométhane, puis acétylé (pyridine anhydride acétique), donnant ainsi le composé 61. c) Ouverture du pont anhydro: Le composé 61 est acétolysé dans les conditions habituelles (anhydride acétique, acide sulfurique) à -20 C. Après traitement du mélange réactionnel, on obtient le dé- rivé 62. EXEMPLE 15 Synthèse du dérivé 63 de formule: O Ac COO Me O Ac 0 00 B O 15O Bn o O O NH Ac O Bn N 3 ( 63) Le traitement du dérivé 62 obtenu dans l'exemple 14 par le tétrabromure de titane dans une solution de dichlo- rométhane et d'acétate d'éthyle conduit à l'halogène 63 dont la structure est confirmée par son spectre RMN Son analyse élémentaire est correcte (voir figure 14). EXEMPLE 16 Synthèse du monosaccharide 68 ou méthyl 2-acétamido-3-6-di- O-benzyl-2-désoxy-a-D-glucopyranoside de formule: O Bn o HO O Me ( 68) NH Ac b 35324 Cette synthèse est effectuée selon les 4 étapes suivantes à partir du monosaccharide 64 préparé selon la technique de A Neuberger, Journal of Chemical Society 1941, pages 50-51: 1 benzylation du groupe OH en position 3, 2 élimination du radical benzylidène aux fins de libéra tion des groupes -OH en positions 4 et 6, 3 tosylation du groupe -OH en position 6, 4 déplacement du groupe -O Ts en position 6 par un benzy- late (voir figure 15). Etane 1: réaction de benzylation. A une solution du composé 64 ( 6,5 g, 20,10 m M) dans le diméthylformamide ( 120 ml), on ajoute de l'hydroxyde de baryum octa- hydrate ( 3,6 g) et de l'oxyde de baryum ( 16 g) Après 10 minutes d'agitation à température ambiante, du bromure de benzyle ( 4,5 ml) est ajouté goutte à goutte. La réaction se poursuit pendant toute une nuit Après dilu- tion par du chloroforme ( 100 ml) le mélange réactionnel est filtré sur Célite Le filtrat est concentré à sec, on ob- tient ainsi un résidu blanc dont l'analyse en chromatogra- phie sur couche mince indique qu'il contient un seul pro- duit, à savoir le dérivé 65, qui sera engagé tel quel, dans l'étape suivante. Etape 2: élimination du groupe benzylidène. Le résidu obtenu ci-dessus est dissous dans un mélange de méthanol ( 370 ml) et d'eau ( 130 ml) A cette solution, on ajoute de l'acide paratoluène sulfonique mono- hydrate ( 3 g), Duis on porte le mélange à reflux pendant une heure Après refroidissement, la majeure partie du méthanol est évaporée, puis de l'eau ( 250 ml) est ajoutée Après la- vage par une faible quantité de chloroforme ( 100 ml), la phase aqueuse est soumise au traitement suivant: ) précipitation des sels de baryum avec de l'acide sulfurique; 20) filtration du sulfate de baryum formé; 3 ) élimination de l'excès d'acide à l'aide d'une rési- ne IRA 45 (OH). Apres élimination de la résine et concentration, on obtient un résidu légèrement jaune ( 5,7 g), à savoir le dérivé 66 _ Ce dérivé est engagé tel quel dans la préparation du composé 67. Etape 3: réaction de tosylation. Ce dérivé 66 est dissous dans un mélange de dichloro- méthane ( 150 ml) et de DMF ( 10 ml) A cette solution, on ajoute du chlorure de tosyle ( 5,6 g, 30 m M), puis de la diméthylaminopyridine ( 121 mg) et enfin de la triéthylamine ( 5 ml) La réaction évolue à l'abri de l'humidité et sous courant d'azote sec. Apres 18 heures de réaction, on ajoute de l'eau glacée 515 puis on abandonne le mélange sous agitation pendant 14 heu- res environ. Le mélange réactionnel est ensuite dilué avec du di- chlorométhane puis la phase dichlorométhane est lavée suc- cessivement avec de l'acide chlorhydrique 2 M, du bicarbo- nate de sodium saturé, puis avec de l'eau jusqu'à p H neutre. Apres séchage sur sulfate de sodium et filtration, le sol- vant est évaporé Le résidu obtenu est purifié sur une colonne de gel de silice ( 200 g) dilué avec un mélange acétate d'éthyle-hexane ( 4/1, v/v). Les fractions contenant le dérivé 67 pur sont regrou- pées. Apres élimination des solvants, on obtient un résidu solide ( 4,6 g) qui est engagé directement dans la syn- thèse du composé fia. Etape 4: réaction de benzylation. Le dérivé 67 obtenu ci-dessus est dissous dans du di- méthylformamide anhydre ( 50 ml) A cette solution, on ajoute une solution molaire de benzylate de sodium dans l'alcool benzylique ( 30 ml) Le mélange est ensuite chauf- fé à 90 C pendant une heure Après refroidissement à tem- pérature ambiante, le mélange est ensuite concentré à sec. Il est ensuite repris par du chloroforme ( 400 ml), la phase chloroformique est lavée avec de l'eau, du chlorure de sodium saturé, séchée, puis concentrée à sec. Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice ( 200 g, chloroforme/acétate d'éthyle, 1/1, v/v). On obtient ainsi le dérivé 68 ( 2,3 g) Le rendement par rapport au composé 64 est de 27,6 %. Le composé 68 est cristallin, PF 149-150 C, (a 20 = 870 (c= 1, chloroforme) L'analyse du spectre infrarouge et l'analyse élémentaire confirment la structure attendue pour le produit 68. Exemple 17 Synthèse du disaccharide 73 (voir figure 15). Cette synthèse comporte: ( 1) La condensation des dérivés 68 et 69 conduisant au disaccharide 70. ( 2) L'élimination des groupes benzyle conduisant au dérivé 71. ( 3) La sulfatation des groupes -OH du dérivé 71 conduisant au dérivé 72, suivie de la salification des groupes anioniques et de l'élimination des groupes acétyle. 1 ) Synthèse du disaccharide 70. Cette synthèse est effectuée à partir des mono- saccharides 68 et 69. L'halogénure est préparé selon la technique de G N, Bollenback et al, Journal of American Chemical Society, 77 ( 1955), p 3312. A une solution de monosaccharide 68 ( 450 mg, 1,1 m M), dans le dichloroéthane ( 30 ml), on ajoute du bromure mercu- rique ( 400 mg, 1,1 m M) Après distillation d'environ 10 ml de dichloroéthane, on ajoute au mélange réactionnel des tamis moléculaires en poudre ( 4 ). L'halogénure 69 ( 1,1 g, 2,75 m M) dans du dichloro- éthane ( 10 ml) est alors ajouté Après distillation de 10 ml de dichloroéthane, le mélange réactionnel est aban- donné à reflux pendant environ 14 heures à une température de 90-I 00 C Après refroidissement, le mélange réactionnel est dilué par du dichlorométhane ( 100 ml), puis les solides sont éliminés par filtration sur filtres plissés La phase organique est lavée avec une solution de iodure de potassium à 10 % ( 2 x 25 ml), puis avec une solution de bicarbonate de sodium a 5 % ( 2 x 25 ml) et enfin avec de l'eau jusqu'à p H neutre Après séchage sur sulfate de sodium, filtration' et concentration, le résidu est purifié sur une colonne de gel de silice ( 150 g), dilué, successivement, avec trois mélanges acétone-éther ( 1/5 puis 1/4, puis 1/2, v/v). On obtient ainsi le disaccharide 70 pur ( 390 mg) sous D forme de cristaux PF = 189-1900 C; (C)20 O = + 600 (c= 0,4 chloroforme) Le spectre infrarouge, de même que le spectre RMN et l'analyse élémentaire, confirment la structure atten- due. 2 ) Synthèse du disaccharide 71-. A une solution du dérivé ( 100 mg) dans le méthanol ( 20 ml), on ajoute du catalyseur (Pd/C, 5 %, 100 mg) et on agite la suspension ainsi obtenue sous courant d'hydrogène pendant 3 jours. Le catalyseur est ensuite éliminé par filtration. Après évaporation, on obtient un résidu ( 73 mg, 97 %) cons- titué par le disaccharide 71 Le spectre de RMN confirme la structure attendue pour ce composé. On notera que le disaccharide 7 l est le précurseur du motif de base de l'héparane -sulfate Il suffit pour le déprotéger de le soumettre à une réaction de saponification, comme rapportée ci-après pour l'obtention du dérivé 73 à partir du dérivé 72-. 3 ) Synthèse du disaccharide 73. A une solution du composé 71 ( 70 mg) dans le diméthyl- formamide ( 2 ml), on ajoute l'agent de sulfatation (complexe triméthylamine-sulfure-trioxyde) ( 75 mg) Après une nuit, on procède à une nouvelle addition de complexe ( 35 mg). Après 6 heures, la réaction est terminée, le mélange est évaporé à sec, repris par du chloroforme, neutralisé avec de la triéthylamine et évaporé. Une chromatographie sur colonne de gel de silice ( 20 g, méthanol/chloroforme, 1/2, v/v) permet d'isoler lé dérivé 72 sulfaté pur qui se présente sous forme de poudre blanche Ce dérivé est engagé directement dans la synthèse du disaccharide déprotégé 73. 263 324 A une solution du dérivé 72 ( 71 mg) dans le méthanol ( 9 ml), on ajoute de l'eau ( 4 ml) puis,goutte à goutte, une solution de soude I M ( 1 ml) Après 4 heures d'agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est passé sur une colonne d'Amberlite IR 120 H+ La solution ainsi obtenue est neutralisée puis les sels sont éliminés par passage sur une colonne de Sephadex G 25 diluée avec de l'eau Les frac- tions contenant le disaccharide sulfaté sont regroupées. Après lyophilisation, on obtient le dérivé 73 sous o 10 forme d'une poudre blanche ( 46 mg) (a)20 = 34,5 (c= 1, eau). L'analyse conductimétrique indique pour ce dérivé un rapport sulfate/carboxyle égal à 2 L'analyse élémentaire, de même que l'analyse en RMN du carbone 13, confirment la structure attendue pour ce produit. EXEMPLE 18: Synthèse des composés 75, 76 et 77 à structure D-glcosamine (voir figure 16). Composé 75: Méthyl 3-0-benzyl-4,6-0-benzylidène-2-benzyloxy- carbonylamino-2-désoxy-a-D-glucopyranoside. Une solution de composé 74 (préparé selon ZU YONG KYI, Sci. Sinica(Peking),5 ( 1956)461-467,CA 52 ( 1958) 3694) ( 415 qmg, l}M)dans le N,N-diméthylformamide anhydre ( 10 ml)est agitée à la température ambiante à l'abri de l'humidité pendant 5 h en présence de baryte anhydre ( 613 mg), d'hydroxyde de barium octahydraté ( 158 mg) et de bromure de benzyle ( 0,15 ml) Le mélange réactionnel est alors dilué avec du chloroforme ( 50 ml), la phase organique est lavée avec de l'acide acétique à 50 % glacé, avec de l'eau, séchée (sulfate de sodium), filtrée et évaporée Le résidu solide est recristallisé dans l'éthanol ( 461 mg, 91 %); P F: 202-203 C;Z D = + 46 (c:l,chloroforme). Composé 76:Méthyl-3-0-benzyl-2-benzyloxycarbonylamino-2- désoxy e Une suspension du composé 76 ( 300 mg) dans de l'acide acétique à 60 % ( 10 ml) est agitée à 1000 C pendant 30 mn La solution est alors refroidie, évaporée à sec, évaporée avec de l'eau ( 4 xl O ml), le résidu solide est séché sous vide et recristallisé dans le 2-propanol pour donner le caiposé 76 ( 220 mg, 89 %),P F: 151-152 C, / carbonylamino-2-désoxy-c -D-glucopyranoside. Une solution du composé 76 ( 835 mg, 2 m M) dans un mélange de pyridine anhydre ( 5 ml) et de dichlorométhane ( 12 ml) est agitée à la température ambiante à l'abri de l'humidité en présence de cyanure de benzoyle ( 400 mg,3 m M) pendant 5 h. L'excès de réactif est alors détruit par addition de méthanol ( 5 ml) et agitation pendant 30 mn Le mélange réactionnel est évaporé à sec,évaporé avec du toluène et séché sous vide Le résidu solide est recristallisé dans un mélange acétate d'éthyle-hexane cour donner le camosé 77 ( 935 mg) %) P F: 154-155 C, - EXEMPLE 19 Synthèse des composés 78 et 79 à structure acide L-iduronique (voir figure 16). Composé 78: 4-0-acétyl-3-0-benzyl-l, 2-o-méthoxyethyli- ) dène-U-L-méthyl idopyranuronate Une solution du bramure 36 obtenu selon 1 ' exemole 5, dans l'étape O (fraichenent orénaré à partir de O, 425 g, 1 Mi, de mélange d'acétates 34 et 35) dans du dichlorcmnéthane anhydre (l Oml)est agitée à la tene- rature ambiante sous atmosphère d'argon sec De la sym-collidine ( 0,66 ml, 5 m M) et du méthanol anhydre (O,40 ml, l Om M) sont successivement ajoutés, et le mélange réactionnel est agité 20 h dans ces conditions Apres dilution avec du dichlorométhane ( 50 ml), la phase organique est lavée avec une solution saturée aqueuse d'hydrogénocar- bonate de sodium, avec de l'eau,séchee (sulfate de so- dium), filtrée et évaporée Le résidu est chromatogra- phié sur une colonne de gel de silice ( 20 g) L'élution par le mélange hexane: acétate d'éthyle ( 3:2 v/v, contenant 0,5 % de triéthylamine) donne le cmanoosé 78 sous forme d'un sirop pur ( 302 mg,76 % à partir desaoctates 34 et 35), -WD = -21 (c: 1, chloroforme),R M N (CD Cl 3):: , 52 (d,l H, H-l, J 1,2: 3 Hz). 3 5 -3 a-4 Composé 79 3-0-benzyl-1,2-O-tert-butoxyéthylidène-4-L- méthyi idopyranuronate. U Lne solution de 1 'orthoester 37 obtenu dans 1 ' exem Dle S dans l'étape ( 484 mg, 1, lr M) dans le méthanol anhydre ( 15 ml) est refroidie à -20 C sous agitation et atmosphère d'argon sec Du carbonate de potassium anhydre ( 60 mg) est ajouté, et le mélange réac- tionnel est agité 5 h dans ces conditions Les solides sont essorés, le filtrat est évaporé et le résidu est repris dans du chloroforme ( 5 Oml) La phase organique est lavée avec de l'eau glacée ( 3 fois) séchée (sulfate de sodium, filtrée et évaporée Le résidu est chromatographié rapi- dement sur une colonne de gel de silice ( 25 g) L'élution par le mélange hexane:acétate d'éthyle ( 2:1,v/v,contenant 0,5 % de triéthylamine), donne, par ordre d'élution: le composé insaturé 39 ( 31 mg,7 %) sirop,Z-7 D=+o 1030 (c: 1, chloroforme),R M N (CD C 13): : 6,27 (d ded, 1 H,H-4, J:5 Hz, 1 Hz), 5,67 (d, l H,H-1, J 4 Hz) ' 'J 2,4 J 1,2 une fraction principale ( 271 mg,62 %),qui est cristal- lisée dans un mélange éther-hexane pour donner le composé 79 ( 123 ng, 28 X),P F: 68-69 o C; -Dj = -19 (c: l,chloroforme), R.M N (CDC 13):c: 5,41 (d, 1 H, H-1, J 12: 2 Hz), 2,85 (d, 1 H, CH-4, J 12 Hz, échangé avec D 20). Au cours de la chromatographie sur silice, et lors des essais de cristallisation de 79, un composé nouveau de Rf légèrement supérieur à celui de 79 apparaît Une chromatographie sur gel de silice des eaux-mères de cris- tallisation de 79 permet d'isoler quelques fractions pures de ce nouveau composé 80 ( 41 mg, 11 %), sirop, _ 7 D=+ 210 (c: 1, chloroforme), R M N (CDC 13):3: 5,83 (d, 1 H, H-1, J 1,2: 4,5 Hz). Dans le cadre de la succession des synthèses envisagées selon l'invention, afin d'éviter la formation de 80, lesirop brut de 37 n'est pas chromatographié, mais utilisé immé- diatement pour la réaction suivante. EXEMPLE 2 o: Préparation des disaccharides 8 l, 82 et 83 (figure 17). Composé 81: Méthyl 6-O-benzoyl-3-0-benzyl-2-benzyloxycar- bonylamino-2-désoxy-4-0-( 2,4-di-O-acétyl-3-O- benzyl v-L-méthyl idopyranuronyl) D- glucopyranoside. Une solution de l'orthoéster 78 ( 8 amg, O,Z Tl)obtenu dans l'exemple 19 et de l'alcool 77 ( 52 mg, O, l M) obtenu dans l'exemole 18 dans le chloroben- zène anhydre( 8 ml)est chauffée à 140 C sous agitation et léger courant d'ar- gon sec Après distillation lente de 6 ml de solvant, une 1 O solution de perchlorate de 2,6 diméthylpyridinium ( 0,OO 2 m Mr fraîchement préparé selon N K KOCHETKOV,A F BOCHKO'l,T A. SOKOLOVSKAIA et V J SNTATKOVA, Carbonhdr Res, 16 ( 1971) 17-27, dans le chlorobenzène ( 2 ml) est ajoutée goutte à goutte en 15 mn avec distillation simultanée de solvant ( 2 ml) Le mélange réactionnel est alors agité pendant 1 h, dans ces conditions, avec addition de solvant frais ( 1 Oml) et distillation simultanée de telle sorte que le volume réactionnel reste constant et égal à 2 mi Après refroidissement et dilution avec du chloroforme, la phase organique est lavée avec une solution saturée d'hydrogéno- carbonate de sodium, avec de l'eau, séchée (sulfate de so- dium), filtrée et évaporée Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice ( 15 g) L'élution par le mélange hexane: acétate d'éthyle ( 4:3,v/v) donne, par ordre d'élution: le produit de départ 77, ( 2 Omg,38 %), une fraction homogène en chromatographie sur couche mince ( 54 mg) Le spectre de R M N de cette fraction montre la présence de plusieurs signaux O-méthyl (&:3,35-3,50) dus aux méthyl glycosides provenant du réarrangement de l'orthoester 78 Cette fraction est cristallisée dans un mélange éthanol-eau, et recristallisée dans un mélange acétate d'éthyle-hexane pour donner 8 _ ( 44 mg,50 %), P.F: 120- 1210 C,Z-K D = + 170 (c: 1, chloroforme), R M N. (CD C 13): conforme à la structure attendue. Composé 8: Méthyl 6-O-benzoyl-3-0-benzyl-2-benzyloxycar- bonylamino-2-désoxy-4-0-( 2-0-acétyl-3-0-benzyl- 4-0-chloroacétyl-%-L-méthyl idopyranuronyl)-,>. D-glucopyranoside. Une solution de l'orthoester 38 ( 120 m Gq, 0,25 n M) obtenu dans l'exemple 5 et de l'alcool 77 ( 66 mg, 0,125 m M) dans du chlorobenzène anhydre ( 8 ml) est chauffée à 140 C sous agitation et léger courant d'argon sec Après distillation lente de 6 ml de solvant, une solution de perchlorate de 2,6-diméthylpyridinium (O,0025 m M) dans du chlorobenzène est ajoutée goutte à goutte en 15 mn, avec distillation simultanée de solvant ( 2 ml) Le mélange réactionnel est agité pendant 1 h puis traité dans les conditions décrites pour la préparation de 81 Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice ( 15 g). L'élution par le mélange hexane:acétate d'éthyle ( 7: 4, v/v) donne, par ordre d'élution: le produit 77, ( 40 mg, 60 %), le disaccharide 82, cristallisé dans un mélange éther-hexane, ( 36 mg, 30 %), PF: 143-144 C, k 7:D = + (c: 1, chloroforme), R M N (CDC 13): conforme à la structure attendue. Composé 83 ': 0-déchloroacétylation et acétylation du di- saccharide 82. Un mélange du disaccharide 82 ( 12 mg) et de thiourée (Smg) dans de la pyridine ( 1,2 ml) et de l'éthanol absolu ( 0,3 ml) est agité à 1000 C pendant 30 mn Après refroi- dissement, le mélange réactionnel est évaporé à sec et le résidu est repris par un mélange eau-chloroforme ( 1:1, v/v, 20 ml) La phase organique est lavée avec de l'eau, séchée (sulfate de sodium), filtrée et évaporée. Le résidu est lavé sur une colonne de gel de silice (lg). L'élution par le melange acétate ct'thyle: hexane ( 1: 1, v/v) donne le disaccharide 83 ( 8 mg) sous forme d'un sirop pur qui n'a pas été analysé, mais immédia- tement acétylé (pyridine: anhydride acétique, 2: 1, v/v, 1,5 ml) Après 15 h à la température ambiante, le mélange réactionnel est évaporé à sec et le résidu est appliqué sur une colonne de gel de silice ( 0,55 g). L'élution par le mélange acétate d'éthyle: hexane ( 1:l,v/v) donne le disaccharide 81 ( 7 mg), cristallisé dans un mélange éther-hexane, PF: 120-120,50 C, P F. de mélange avec 81 120-1210 C. EXEMPLE 21 Synthèse du trisaccharide 85 (voir figure 18) - Une solution du bromure 84 (préparé selon H. PAULSEN et W STENZEL, Chem Ber 111 ( 1978) 2334-2347, 110 mg, 0,25 mm) et de l'alcool 41 (préparé selon l'exem- ple 6, 113 mg, 0,13 m M) dans du dichlorométhane anhydre( 2,5 ml) est agitée à l'abri de la lumière sous atmossphere d'argon O sec en présence de tamis moléculaire 4 A (poudre, 100 mg) pendant 30 mn Après refroidissement à 200 C, de la symcol- lidine ( 70 V 1,055 m M) et du triflate d'argent ( 78 mg,0,30 m M) sont ajoutés successivement et l'agitation est maintenue dans ces conditions pendant 2 heures Le mélange réactionnel est alors dilué avec du dichlorométhane ( 50 ml), les solides sont essorés, et le filtrat est lavé avec une solution 0,1 M d'acide chlorhydrique glacée, avec de i'eau, avec une solution aqueuse saturée d'hydrogénocarbo- nate de sodium, avec de l'eau, séché (sulfate de sodium), filtré et évaporé. Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice ( 18 C L'élution par le mélange hexane: acetate d'éthyle ( 4:3,v/v) donne le trisaccharide 85 sous forme d'un verre incolore qu'il n'a pas été possible de cristalliser ( 139 mg, 88 %); l^ D =+ 83 (cl, chloroforme); Spectre RI-N ( 90 M Hz,CDC 13):: 7,25 (m,25 H, 5 Ph) H 3, ': 9 Hz): ,44 (d de d, 1 H, I'J: 10,5 Hz,J 3 "" 9 Hz),4 il 3 2, 3 ,26 (d, 1 H, H J 1 " 2 ": 3,5 Hz): 3 59 (s 3 H CO Oe) À 502(, H, ' J 1,2 ''- 3,06 (d de d, 1 H, H", J 1 " 2: 3,5 Hz, J 2 " 3 ": 10,5 Hz) 2 12 2,12 2,08, 2,01 et 1,297 ( 4 s, 12 H, 4 O Ac). EXEMPLE 22 Synthèse du trisaccharide 89 (voir figure 18). Selon les quatre étames suivantes: a) élimination des groupes acétyle, b) sulfatation, c) hydrogénation, d) sulfatation des fonctions amino, a) Elimination des groupes méthyle conduisant au trisaccha- ride 89: Une solution de trisaccharide 85 ( 122 mg) dans un mélange de 1, 2-diméthoxyéthane ( 6 ml) et de methanol ( 2 ml) est agitée à G C Une solution aqueuse 1 M de soude ( 2 ml) est ajoutée goutte à goutte en 10 ml, et le mélange réactionnel est agité 6 heures à O C De l'acide chlorhydrique 1 M est alors ajouté goutte à goutte jusqu'à p H O (apparition d'un précipité blanc) Le mélange est versé dans de l'eau glacée ( 100 ml) et extrait avec du chloroforme ( 5 fois ml) Les phases organiques sont lavées avec de l'eau glacée, séchées (sulfate desodium), filtrées et évaporées. Le résidu sirupeux est dissous dan-s du méthanol ( 2 ml) et traité par une solution éthérée de diazométhane jusqu'à persistance de la coloration jaune Après 30 minn, le mélange réactionnel est évaporé à sec Le résidu est chromatogra- phié sur une colonne de gel de silice ( 10 g) L'élution par le mélange acétate d'éthyle/hexane ( 2:1,v/v) donne le trisaccharide 86 sous forme d'une mousse incolore qu'il n'a pas été possible de cristalliser ( 85 mg, 81 X); ic D = + 77 (cl,chloroforme), spectre RMN ( 90 M Hz, CDC 13): absence de signaux O Ac (vers C= 2 ppm). Analyse élémentaire: en accord avec la structure recherchée. b) Sulfatation conduisant au trisaccharide 87. A une solution du dérivé 86 ( 41 mg) dans le Dt 4 MF ( 2 ml) on ajoute du complexe triméthylamine/trioxyde de soufre (Th A/SO 3; 60 mg; 2,5 équivalents par OH). Après une nuit à 500 C, la réaction est complète Du méthanol ( 0,5 ml) est ajouté puis la solution est déposée sur une 372 4 colonne de Séphadex LH-20 ( 1,5 x 25 cm) équilibrée dans un mélange chloroforme/méthanol ( 1:1; v/v) L'élution par le même mélange permet de séparer le produit de la réaction de l'excès de réactif et du solvant de réaction Le résidu obtenu est chromatographié sur une colonne de gel de silice ( 10 g). élué par un mélange acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/ eau ( 98: 56: 13: 32; v/v/v/v) Le produit pur obtenu est dissous dans du méthanol, puis passé à travers une colonne de résine Dowex 50 W x 4, Na+ ( 5 ml) Après évaporation et séchage, on obtient le dérivé 87 ( 58 mg, 100 %) Il est homogène en c c m (acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/ eau: 5: 5: 1: 3; v/v/v/v et acétate d'éthyle/méthanol/ acide acétique: 7: 3: 0,1: v/v/v). to 7 D = + 55 (méthanol) Le spectre de RMN est compatible avec la structure recherchée. c) Hydrogénation conduisant au trisaccharide 88. Une solution du composé 87 ( 20 mg) dans un mélange de mé- thanol ( 2 ml) et d'eau ( 0,5 ml) est agitée pendant 96 heures sous une pression d'hydrogène de 0,2 bar, en présence de Pd/C à 5 % ( 20 mg) Le catalyseur est alors éliminé par filtra- tion L'analyse en ultra-violet confirme l'absence de noyaux aromatiques Après évaporation, le produit est engagé dans la synthèse du trisaccharide 89. d) Sulfatation conduisant au trisaccharide 89. Le dérivé 88 obtenu précédemment est dissous dans l'eau ( 2 ml) Le p H de la solution est ajusté à 9,5 puis il est maintenu à cette valeur au moyen d'un p H-stat On ajoute alors le complexe T Mt 4 A/SO 3 ( 14 mg; 5 éq./NH 2) Après une nuit, la même quantité de complexé est ajoutée Après 48 heures, le p H est amené à 12 au moyen de soude 2 M, puis il est maintenu à cette valeur pendant 2 heures Après neutralisation par l'acide chlo- rhydrique, le mélange réactionnel est chromatographié sur une colonne de Séphadex G-25, éluée avec del'eau Le compose 89 est détecté par une réaction colorée au carbazole, caractéristique des acides uroniques (Bitter et Muir, Anal. Biochem 4 ( 1962) 330-334) Ces fractions contenant 89 sont regroupées et passées au travers d'une colonne de résine Dowex 50 W x 4,Na+ éluée avec de l'eau Apres lyophilisation, on obtient 89 ( 4,5 mg). L'analyse colorimétrique des constituants glucidi- ques donne 2,55 moles d'acide uronique pour 5,15 moles de gluco- samine (rapport 1/2). Le spectre de R 4 N de ce produit confirme la structure (séquence, anomérie des liaisons, substitutions par les sulfates). EXEMPLE 23: Synthèse du disaccharide 92 de formule: COO Me O Bn O O Bn N 3 -( 92) *On se reportera à la fiqure 19. Le produit 91 (lg), en solution dans du dichloro- méthane ( 50 ml), est agité en présence de driérite ( 6 g) et de carbonate d'argent fraîchement préparé ( 4,5 g), pendant 1 heure sous une atmosphère d'argon On ajoute alors l'halogénure 90 ( 2,8 g) dissous dans du dichloro- méthane ( 10 ml) Apres 1 heure 1/2 on ajoute à nouveau 2,8 g d'halogénure 90 Apres une nuit les solides sont éliminés par filtration et le résidu obtenu après évaporation des solvants est purifié sur colonne de silice dans le solvant acétate dtéthyle/chloroforme ( 1/30; v/v). On obtient ainsi le produit 92 _ ( 866 mg; rendement 42 %) Il est cristallisé dans un mélange hexane/acétate d'éthyle. P.F: 104-106 C; 720 =O O (c= 1 chloroforme) D L'analyse élémentaire et le spectre RMN sont conformes à la structure recherchée. EXEMPLE 24: Synthèse du dérivé 94 de formule: -o O A f,0 o On se reportera aux figures 19 et 20. Le dérivé 92 ( 1,5 g) est dissous dans un mélange de chloroforme et de méthanol ( 1/1; v/v) On ajoute ensuite 2 ml de méthanolate de sodium ( 2 M dans méthanol) Apres 20 minutes, la solution est neutralisée par addition de résine Dowe X 50 conduisant au dérivé 93 qui n'est pas isolé Apres filtration et évaporation, une méthylation classique par le diazomé- thane dans l'éther permet de réestérifier la fraction d'acide carboxylique éventuellement libéré Apres éva- poration le résidu est traité par un mélange de pyri- dine ( 20 ml)et d'anhydride acétique ( 2 ml) pendant une nuit Apres évaporation, le résidu est cristallisé dans de l'acétate d'éthyle/hexane donnant le produit 94 ( 1,125 g; rendement 81,6 %) 20 P.F: k 03-105 C; /3 =+ 5,2 (c = 1; chloroforme) D L'analyse élémentaire et le spectre RMN sont conformes a la structure recherchée. En variante, on prépare le dérivé 94 en opérant comme décrit ci-dessus mais en mettant en oeuvre le dérivé 95 au lieu du dérivé 91. EXEMPLE 25 Synthèse du dérivé 97 (voir figure 20). Dans une remière étape, on procède à une ouver- ture du pont anhydre, Duis dans l'étape suivante, on effectue une réaction de bromuration. 1: Ouverture du pont 1,6-anhydro. Le composé 94 (lg) est dissous dans l'anhydride acétique ( 10 ml), puis refroidi à 200 C sous argon A la solution froide, on ajoute de l'acide sulfurique concentré ( 100 1 il) Apres 30 minutes, le mélange réactionnel est dilué par du chloroforme ( 150 ml) puis versé sur une solution aqueuse de bicar- bonate de sodium ( 26,5 g dans 400 ml) A la fin du dégagement gazeux la phase chloroformique est lavée deux fois avec une solution saturée de Na Cl puis séchée et concentrée Apres chromatographie sur silide ( 50 g) dans un mélange d'acétate d'éthyle et de chloroforme 1/20 v/v, on obtient le composé 96 ( 995 mg rendement 86,7 %). Ce composé se présente sous forme d'une mousse blanche. Le spectre et l'analyse élémentaire confirment l'obtention de la structure recherchée. 2: Bromuration. A du tétrabromure de titane ( 213 mg) on ajoute une solution du dérivé 96 ( 0,2 g) dans du dichlo- rométhane/acétate d'éthyle ( 9/1; v/v 4 ml) Apres une nuit sous agitation suivie d'une dilution par du dichlo- rométhane, on verse sur un mélange eau glace ( 50 ml),puis on lave avec deux fois 50 ml d'eau glacée Apres séchage et évaporation le sirop obtenu est chromatogra- phié sur silice dans le solvant acétate d'éthyle/chlo- roforme 1/20; v/v On obtient ainsi le dérivé 97 avec un rendement de 25 à 50 %. 26 52 o 4 Spectre de RMN: (ppm,CD C 13): 2,04; 2,11: 2 singulets de 3 protons 2-O Ac; 3,7: 1 singulet de 3 protons COO Me; 6,33: 1 doublet de 1 proton H 1; J 1 2 = 35 Hz EXEMPLE 26: Synthèse du tétrasaccharide 98 (voir figure 20). Une solution de bromure 97 ( 50 mg,60 >M) et de l'alcool 41 préparé selon l'exemple 6 ( 43 mg, 50 um)dans du dichlorcéthane anhydre (lml) est agitée a l'abri de la lumière sous atmosphère d'argon sec en présence de tamis moléculaire O- _ _ 4 A (poudre, 100 mg) pendant 15 minutes Apres refroi- dissement à 100 C, de la sym-collidine ( 11,ul, 80 M) et du trifluorométhanesulfonate d'argent (triflate d'Al, 18 mg, 70 p M) sont ajoutés successivement, et l'agitation est maintenue dans ces conditions pendant 3 heures Le mélange réactionnel est alors dilué avec du dichloromé- thane ( 30 ml), les solides sont essorés, et le filtrat est lavé avec une solution 0,1 M d'acide chlorhydrique glacée, avec de l'eau,avec une solution aqueuse saturée d'hydrogénocarbonate de sodium, avec de l'eau, séché (sulfate de sodium), filtré et évaporé. Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice ( 7 g) L'élution par le mélange hexane-acétate d'éthyle ( 4:3, v/v) donne 56 mg de tétrasaccharide 98 (rendement 70 %) sous forme d'un verre incolore qu'il n'a pas été possible de cristalliser. Caractéristiques du spectre RMN: ( 270 M Hz, CD C 13): S: 7,25 (m,35 H, 7 Ph); ,35 (d ded,1 H H 3 ' J 2 '3 Hz, J 3 " 4 " 9 Hz) " J 2 "#3 ,27 (d, 1 H,1 H, Ji",211: 3 5 H) 4 31 (d, IR, H 1 J 1 2: 7,5 Hz); 3,68 (s, 3 H, COO Me IDO); 3,59 (s, 3 HCOO Me gluco); 3,37 (d de d, 1 H, H 2J"', 2 ": 7,5 Hz, J 2 3 3:2 HZ 2 ' J 3: 5 3,18 (d de d, 1 H, H", J: 35 1) 1 ", 2 " 311 I 2, 2,06 et 1,97 ( 2 s, 9 et 3 H, 4 OAM Ce spectre est reporté sur la figure 3. C (d e spetr est r Hprt su la figu 5 H, EXEMPLE 27 Synthèse du tétrasaccharide 99 (voir figure 21). Une solution de tétrasaccharide 98 ( 28 mg) dans le méthanol anhydre ( 3 ml) est refroidie à -15 C sous atmosphère d'argon sec Du carbonate de potassium anhydre ( 12 mg) est ajouté et le mélange est agité 6 heures dans ces conditions Les solides sont alors essorés, le filtrat est évaporé et le résidu est repris avec du chloroforme ( 15 ml) La phase organique est lavée avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, avec de l'eau,séchée (sulfate de sodium), fil- trée et évaporée. Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice ( 2 g) L'élution par le mélange acétate d'éthyle/hexane ( 3:2,v/v) donne le tétrasac- charide 99 sous forme d'un verre incolore ( 22 mg, 85 %)j. Spectre RMN ( 270 M Hz,CDC 13):&: 7,30 (m,35 H 1, 7 Ph); Il 3 ,37 (d,1 H H J " ': 3 5 Hz); 2,, ,29 (d de d, 1 H, J 10 Hz, 3 J 8,5 Z) 3# 20 Hz J 3 3 3 f 4 ,09 (d, 1 Hi, f I 1 J 1,2 3,5 Hz); 3,57 (s,3 H, COO Me ido); 3,43 (s, 3 H, COO Me gluco); 2,06 (s, 3 H,O Ac). Ce composé 99, qui est und érivé mono-O-acétylé (en posi- tion 3 sur le 2 ème motif) du tétrasaccharide 103 est un intermédiaire potentiel pour la synthèse d'un analogue de ce tétrasaccharide qui ne serait pas sul- faté sur la position 3 du deuxième motif. EXEMPLE 28 Synthèse du tétrasaccharide 103 (voir figure 21). On a recours aux étapes a) à d) suivantes: a) élimination des groupes acétyle, b) sulfatation, c) hydrogénation, d) sulfatation des groupes amine. a) Elimination des groupes acétyle conduisant au dérivé 1 C: 101. Une solution du tétrasaccharide 98 ( 40 mg) dans un mélange de 1,2diméthoxyéthane ( 3 ml) et de méthanol (lml) est refroidie à -15 C Une solution aqueuse M de soude ( 1 ml) est ajoutée goutte à goutte en 10 mn. et le mélange réactionnel est agité 5 heures à O C De l'acide chlorhydrique M est alors ajouté goutte à goutte jusqu'à p H = O et le mélange est versé dans de l'eau glacée ( 50 ml) Après extraction avec du chloro- forme ( 5 fois 5 ml), les phases organiques sont lavées avec del'eau, séchées (sulfate de sodium) filtrées et évaporees. Le résidu est dissous dans du méthanol ( 1 ml) et traité par une solution éthérée de diazométhane jusqu'à persistance de la coloration jaune Après 30 mn, le mélange réactionnel est évaporé à sec Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice ( 3 g) L'élution par le mélange acétate d'éthyle/ hexane ( 2:1, v/v) donne le tétrasaccharidel OO( 27 mg, %): P F 126-127 C (éthanol); SD= + 55 {cl, chloroforme)). Spectre RMN ( 90 M Hz, CDC 1 3): absence totale de signaux O Ac(vers ( = 2) - Analyse élémentaire: conforme avec la structure recherchée. b) Sulfatation conduisant au dérivé 101. A une solution du dérivé 1 ( 24 mg) dans le DMF ( 1 mi), on ajoute le complexe TMA/503 ( 24 mg) Apres une nuit à 50 OC la réaction de sulfatation est complète. Du méthanol ( 0,5 ml) est ajouté au mélange réactionnel puis celui-ci est déposé sur une colonne de Séphadex Lli- équilibrée en chloroforme méthanol ( 1:1, v/v) Les fractions-contenantl Olsont regroupées Apres évapora- tion à sec, le résidu est chromatographié sur gel de sili ce {( 10 g) dans le mélange acétate d,éthyle/pyridine/acide acétique/eau ( 160:77:19:42: v/v/v/v) Les fractions pures sont regroupées Après concentration à sec, le 253 324 102. résidu est passé au travers d'une colonne Dowex 505 x 4, + Na éluée avec de l'eau Le produit obtenu ( 30 mg) est homogène en chromatographie sur couche mince dans le solvant ci-dessus son spectre RMN confirme la structure. 720 = + 390 ( 1,méthanol). c) Hydrogénation conduisant au dérivé 102. Une solution du dérivé 101 ( 10 mg) dans un mélange de méthanol ( 1,8 ml) et d'eau ( 0,2 ml) est agitée sous une pression d'hydrogène de 0,2 bar en présence de Pd/C à 5 % ( 10 mg) Apres 96 heures, le cata- lyseur est éliminé par filtration L'analyse en ultra- violet confirme l'absence de noyaux aromatiques Apres évaporation, le dérivél O 2 est utilisé tel quel pour la préparation du dérivé 103. d) Sulfatation conduisant au dérivé 103. Le dérivélo 2 obtenu à l'étape précédente, est dissous dans l'eau ( 2 ml) Le p H de cette solution est ajusté à 9,5; il est maintenu à cette valeur pendant toute la durée de la sulfatation Le complexe TMA/503 ( 14 mg) est ajouté Une deuxième addition est faite après 24 heures ( 14 mg)3 Après 48 heures, le p H est amené à 12, puis à 7, deux heures plus tard Le mélange réactionnel est alors chromatographié sur une colonne de Séphadex G-25 ( 50 ml) Les fractions contenant le dérivé 103 (détection par réaction colorée des acides uroniques) sont regroupées, passées au travers d'une colonne de résine Dowex 50 W x 4 Na puis lyophilisées. On obtient ainsi le tétrasaccharide 103 ( 2 mg). LS'analyse colorimétrique des constituants 3 Odu dérivéLO 3 _donne 1,84 moles de glucosamine pour 2,06 moles d'acides uroniques. La structure du dérivél O 3 (séquence, anomérie. position desgroupes sulfates) est confirmé par le spec- tre R:i M ( 270 14 Hz, TNS):& pour les protons anomeres respectivement des ler, 2 ème, 3 ème et 4 ème motifs, 4,72; 5 30; 5,55; et 5,67. 25553 O 324 EXEMPLE 29. Synthèse du monosaccharide 115 (voir figure 22). Cette synthèse est effectuée selon les étapes 1 à 7 suivantes. Etape 1: synthèse du monosaccharide 105. On prépare ce monosaccharide à partir du composé 104 obtenu selon la technique de N L Holder et B Fraser- Reid, Canadian Journal of Chemistry, 51 ( 1973) page 3357. A une solution du composé 104 ( 1 g, 12,67 m M) dans le di- chlorométhane ( 20 ml), on ajoute du chlorure de tosyle ( 0,55 g), puis de la diméthylaminopyridine ( 16 mg) et en- fin, de la triéthylamine ( 0,7 ml) Après agitation sous courant d'azote à l'abri de l'humidité, pendant environ 14 heures, la réaction est arrêtée par addition de glace et d'eau Après dilution du mélange réactionnel avec du dichlorométhane ( 50 ml), la phase dichlorométhane est la- vée avec de l'acide chlorhydrique 2 M, puis une solution saturée de bicarbonate de sodium, et enfin avec de l'eau jusqu'à p H neutre Après séchage et évaporation, on ob- tient un résidu, à savoir le dérivé 105 ( 1,4 g, 97 %) qui est engagé tel quel dans la synthèse du dérivél OO. Etape 2: synthèse du dérivé 106. Le monosaccharide 105 ( 31,8 g) et de l'iodure de sodium ( 39 g) sont dissous dans de l'acétonitrile ( 250 ml), puis la solution est portée à reflux pendant 3 heures. Après refroidissement du mélange réactionnel, le précipité blanc formé est filtré Le filtrat est concentré, le rési- du est repris par du chloroforme, puis la phase chlorofor- mique est lavée avec de l'eau jusqu'à p H neutre, séchée sur sulfate de sodium et concentrée à sec On obtient un sirop qui est chromatographié sur une colonne de gel de silice ( 200 g, éther-hexane, 1/1, v/v) On obtient ainsi le dérivé iodélo 6 ( 24,7 g, 71,5 %) lc 70 = 240 ( 1, chloro- forme). Le spectre infrarouge, le spectre de RMN et l'analyse élé- mentaire confirment la structure de 106. ZJ 35324 Etape 3: synthèse du dérivé 107. A une solution du dérivé 106 dans de la pyridine anhydre ( 200 ml), on ajoute de l'anhydride acétique ( 43 ml) Après environ 14 heures sous agitation, la réaction est terminée Le mélange réactionnel est concentré à sec, puis le résidu est purifié sur une colonne de gel de si lice, sous pression, dans un solvant acétate d'éthyle- hexane ( 1/6, v/v) Les fractions pures sont regroupées. On obtient ainsi le produitl O 7 ( 16,4 g, 70 %) Ce produit se présente sous forme d'un sirop /O 2 = + 4,5 ( 1,3, chloroforme) L'analyse élémentaire ainsi que l'analyse du spectre infrarouge confirment la structure. Etaoe 4: synthèse du dérivé 108. A une solution du dérivé 107 ( 4 g) dans de la py- ridine ( 100 ml), refroidie à OOC, on ajoute du fluorure d'argent (Ag F, 6,9 g) Après deux heures et demie, le mé- lange réactionnel est versé dans un mélange contenant du chloroforme et de l'éther ( 1/4, v/v, 1 1) La suspension obtenue est passée au travers d'un filtre plissé Le fil- trat est concentré à sec, puis le résidu est repris dans du chloroforme ( 500 ml) La phase chloroformique est lavée avec du sulfate acide de potassium en solution à 10 % dans l'eau, puis avec de l'eau jusqu'à p H neutre Après séchage sur sulfate de sodium et concentration à sec, on obtient un résidu ( 2,7 g), qui est chromatographié sur une colonne de silice ( 200 g) (éluant: acétate d'éthyle-hexane, 1/4, v/v) Les fractions contenant le produit 108 sont regroupées et apres évaporation des solvants, on obtient un produit cristallin ( 1,62 g, 54 X). PF: 81-82 C, Z/D 5 = 20 ( 1, chloroforme). L'analyse du spectre infrarouge, l'analyse élémentaire et l'analyse du spectre de résonnance magnétique nucléaire confirment la structure du composé 108. Etape 5: synthèse du dérivé 109. Le produit 108 ( 2 g) est dissous dans du méthanol ( 20 ml) et du chloroforme ( 20 ml) A cette solution, on ajoute du méthanolate de sodium ( 2 M, 2 ml) Après 1,5 heure, la réaction de désacétylation est terminée Le mé- lange réactionnel est dilué avec du chloroforme La phase chloroformique est lavée avec de l'eau jusqu'à p H neutre, séchée, puis évaporée à sec On obtient ainsi un résidu, le composé 1 OR' ( 1,8 g, 100 %) Il est immédiatement dis- sous dans du tétrahydrofuranne ( 50 ml), puis de l'hydrure de bore (BH 3, 1 M) dans le tétrahydrofuranne; ( 10 ml) est ensuite ajouté Après une heure de réaction, l'excès d'hy- drure de bore est détruit par addition d'éthanol A la fin du dégagement gazeux, le mélange réactionnel est dilué par addition de tétrahydrofuranne ( 100 ml) De la soude 3 M ( 12 ml) est ensuite ajoutée, suivie d'eau oxygénée ( 120 volumes, 8 ml) Après 2 heures de chauffage à 500 C, la réaction est arrêtée La solution est versée dans du chlo- roforme ( 500 ml), puis la phase organique ainsi obtenue est lavée avec de l'eau, de l'acide chlorhydrique 2 M, puis enfin avec de l'eau jusqu'à p H neutre On obtient ainsi une phase chloroformique très laiteuse, qui devient limpide au cours du séchage sur sulfate de sodium Après filtration, le chloroforme est évaporé puis le résidu ob- tenu est chromatographié sur silice ( 200 g chloroforme- méthanol, 30/1, v/v). On obtient ainsi le dérivé de l'idosel O 9 ( 1,05 g, 55 %) Ce produit se présente sous forme d'un sirop. J' = + 85,5 ( 1, chloroforme). L'analyse élémentaire ainsi que l'analyse en RMN confir- ment la structure attendue. Etape 6: synthèse du dérivé 112. Cette synthèse est effectuée à partir du dérivé 109 en une seule étape (les intermédiaires 110 et 111 ne sont pas isolés) A une solution du dérivél O 9 ( 2,25 g 6 m M) dans le dichlorométhane ( 50 ml), on ajoute successivement de la diméthylaminopyridine ( 60 mg: 0,24 m M) de la tri- éthylamine ( 1,7 ml; 12 m M) et du chlorure de trityle ( 2,5 g; 9 =M) Après environ 14 heures, la réaction est terminée On obtient ainsi en solution le dérivé 110. ajoute alors au mélange réactionnel de la diméthylamino- pyridine ( 150 mg), de la triéthylamine ( 1,7 ml) et du chlorure de benzoyle ( 1,05 ml) Après 6 jours, le dichlo- rométhane est éliminé par passage d'un courant d'azote et remplacé par du diméthylformamide ( 40 ml) Le mélange réactionnel est chauffé à 70 C pendant une nuit On ajoute alors à nouveau du chlorure de benzoyle ( 1 ml) et de la triéthylamine ( 1,7 ml), puis on maintient le chauffage à 70 C pendant 2 jours Le diméthylformamide est ensuite évaporé, puis le résidu est repris par du chloroforme, la phase-chloroformique est lavée avec de l'eau, avec une so>lution saturée de bicarbonate de sodium, puis avec une solution d'acide chlorhydrique 2 M et enfin avec de l'eau jusqu'à p H neutre Après séchage, le chloroforme est éva- poré, ce qui permet d'obtenir le composé 111. Celui-ci est immédiatement soumis à une réaction pour éliminer le groupe trityle afin d'obtenir le dérivé 112. Le résidu contenant le dérivélllest dissous dans 25 ml de chloroforme et on ajoute à cette solution 10 ml d'une so- lution d'acide paratoluènesulfonique monohydrate dans le méthanol ( 1 M) A Drès 4 heures de réaction à température ambiante, la réaction est terminée Le mélange réactionnel est alors dilué avec du chloroforme, lavé avec de l'eau, séché puis évaporé à sec Le résidu obtenu est chromato- graphié sur gel de silice ( 200 g, éther-hexane, 3/1, v/v). Le dérivé l 12 est ainsi obtenu à l'état pur ( 1,5 g; 52 %). Ce dérivé se présente sous forme d'un sirop Zk, = O ( 1, chloroforme). L'analyse du spectre infrarouge et du spectre RMN confir- ment la structure du produit attendu. Etaoe 7: synthèse du composé 115. Cette synthèse est effectuée directement à par- tir du dérivé 112 sans isoler les intermédiaires 113 et 114. A la solution du composé 112 ( 1,2 g) dans l'acétone ( 20 ml), on ajoute, goutte à goutte, après refroidissement à O C, une solution ( 2,9 ml) d'oxyde de chrome (Cr O 3; 1,17 g) dans l'acide sulfurique 3,5 M ( 5 ml) Après 30 minutes d'agitation à o OC, la température est ramenée à l'ambian- te La réaction évolue pendant 3 heures Le mélange réac- tionnel est ensuite versé dans une ampoule à décanter con- tenant de l'eau glacée ( 100 ml) Le produit formé est ex- trait par du chloroforme ( 3 x 50 ml) La phase chlorofor- mique est lavée avec de l'eau jusqu'à p H neutre, puis sé- chée sur sulfate de sodium, filtrée et concentrée à sec. Le résidu obtenu (le comoosé 113) est dissous dans du mé- thanol ( 130 ml) On ajoute à cette solution de la soude 3 M dant environ 14 heures Après acidification par l'acide sulfurique, le com Dosé 114 est extrait à l'éther, puis immédiatement méthylé par du diazométhane selon la méthode classique pour donner le composé 115. Après évaporation de l'éther, le composé 115 est obtenu pur au moyen d'une chromatographie sur gel de si- lice ( 50 g; éther-hexane; 4/1; v/v) Les fractions ou- res contenant le dérivé 115 sont rassemblées et les sol- vants sont éliminés On obtient ainsi le dérivé 115 de l'acide iduronique ( 587 mg, 59 X par rapport au dérivé 12). Ce produit se présente sous forme d'un sirop ldc 5 = + 980 ( 2,65, chloroforme). L'analyse en RMN, l'analyse en infrarouge et l'analyse élémentaire confirment la structure attendue. EXEMPLE 30. Synthèse du disaccharide 117 (voir figures 22 et 23). Cette synthèse s'effectue à partir du monosac- charide 115 préparé comme ci-dessus et du monosaccharide li 5 préparé selon la technique de H Paulsen et W Stenzel, chemische Berichte 111 ( 1978) 2234-2247. A une solution du composé 1-5 ( 200 mg, 0,5 ml M) dans le dichlorométhane ( 10 ml), on ajoute successivement le composé ti ( 0,450 g) de la symcollidine ( 150 Pil) et du triflate d'argent ( 260 mg). 253 i 324 Le mélange réactionnel est maintenu à O OC sous courant d'azote et sous agitation à l'abri de l'humidité et de la lumière pendant 3 heures. Il est ensuite dilué avec du dichlorométhane ( 100 ml) puis les solides sont éliminés par filtration sur filtres plissés La solution obtenue est lavée avec une solution saturée de bicarbonate de sodium avec de l'eau et avec de l'acide sulfurique 2 M, puis à nouveau avec de l'eau jusqu'à p H neutre. Après séchage sur sulfate de sodium et évapora- tion du dichlorométhane, le résidu obtenu est chromatogra- phié-sur gel de silice ( 50 g; chloroforme/acétate d'éthy- le; 15/1; v/v). On obtient ainsi le dérivé 117 pur ( 327 mg, 82 %). Le produit se présente sous forme d'un sirop / = + 570 ( 1, chloroforme). L'analyse en RMN de même que l'analyse élémentaire confir- ment la structure et l'anomérie du disaccharide 117. *EXEMPLE 31. Synthèse du disaccharide 122 (voir figure 23). On met en oeuvre les étapes suivantes de: élimination des groupes acétyle, sulfatation, hydrogénation, sulfatation du groupe amine primaire. élimination du groupe Me du radical -OYOH conduisant au ccposé 118. Le disaccharide 117 ( 260 mg) est dissous dans du méthanol ( 5 ml) et de la soude 1 M ( 1 ml) est ajoutée goutte à goutte A la fin de la réaction, le mélange réactionnel est introduit au sommet d'une colonne de - résine DOWEX 50 sous forme HT ( 5 ml) L'effluent est concentré à sec, repris par du méthanol, et le produit acide libre, obtenu à l'issue de la saponification du dérivé 117 est méthylé par addition de diazométhane On obtient ainsi le dérivé 118 qui est purifié au moyen d'une colonne de gel de silice ( 20 g: éther/hexane; 8/1; v/v). Le rendement en composé 118 est de 92 mg Ce produit est engagé directement dans la synthèse du dérivé 119. Sulfatation conduisant au disaccharide 119. Le produit 1118 obtenu ci-dessus ( 92 mg) est dis- sous dans du diméthylformamide ( 5 ml) puis du complexe triméthylamine/sulfure trioxyde ( 25 mg) est ajouté La solution est portée à 50 C pendant environ 14 heures. Après évaporation à sec, le résidu est repris par du chloroforme, puis la phase chloroformique est lavée avec de l'eau, séchée et concentrée à sec Le solide obtenu est purifié sur une colonne de gel de silice ( 15 g: éluant: méthanol/chloroforme, 1/4 v/v) Après évanora- tion des fractions pures, on obtient le disaccharide sulfaté 119 ( 58 mg; 55,6 %). Hydrogénation conduisant au disaccharide 120. Le disaccharide 1119 ( 58 mg) est dissous dans un mélange méthanol-eau ( 15 ml + 2 ml) On ajoute ensuite du catalyseur (Pd/C 5 %; 60 mg) puis on soumet cette suspen- sion a agitation sous atmosphère d'hydrogène pendant 48 heures A ce stade, on constate la disparition totale des groupes benzyle portés par le dérivé 119, de même que la réduction du groupe azide du dérivé 119 en groupement aminé. Le catalyseur est éliminé par filtration, puis le mélange réactionnel est concentré à sec. On obtient ainsi le disaccharide 120 qui sera traité directement pour obtenir le produit 121 puis 122. Sulfatation du groupe -NH 2 conduisant au disaccha- ride 122. Le disaccharidel 2 o est dissous dans l'eau ( 6 ml). On ajoute à cette solution du complexe triméthylamine/sul- fure trioxyde ( 25 mg), tout en maintenant le p H à 9,5 par addition de soude ( 0,1 N) Après 45 heures de réaction, 324 de la soude I N est ajoutée pour amener le DH à 12 Puis, il est maintenu à cette valeur pendant 1 heure La solution de 121 est ensuite neutralisée avec de l'acide chlorhydrique 1 N, puis passée au travers d'une colonne de DOWEX 50 ( 5 ml) sous forme Na+ L'éluat de cette colonne est introduit sur une colonne G 1 x 2 ( 16 ml, 1,6 x 8 cm) La colonne est éluée par un gradient de chlorure de sodium de O à 3 M. Les fractions contenant le disaccharide 122 sous forme de sels de sodium sont rassemblées concentrées nuis le nro- dluit est dessalé par passage sur une colonne de Sephadex G 25 ( 50 ml) éluée avec de l'eau On obtient ainsi le di- saccharide 122 ( 27 mg, 68 %) Après lyophilisation, le produit se présente sous la forme d'une poudre blanche. lD O = + 95,50 ( 1,3; eau). L'analyse en RMN du carbone 13 confirme la structure at- tendue Dour le produit 122- EXEMPLE 32: Préparation du 2-0-(a-L-idopyranosyl)-D- qalactose (composé 128) (voir figure 24). Cette synthèse est effectuée selon les quatre étapes a) à d) suivantes. a) Rpxéparationdubromure de 2,3,4,6-tétra-0-acétyl-a-L- idopyranosyle (composé 124) - Une solution de 5 g de penta-0-acétyl-ck-L-idopyranose (composé 1,préparé selon P PERCH Ei LITFEST OS AWA, F A. DAVIDSON et R W JEANTCOZ Carbohydr Re;,3 ( 1967) 46 ', dans du dichlorométhane anhydre (loo 100 ml) est saturée à OOC avec du gaz bromhydrique Après 2 h à température ambiante, le milieu réactionnel est verseé sur de la glace et extrait au chloroforme La phase organique est lavée avec de l'eau, séchée (chlorure de calzium) et évaporée Le résidu est cristallisé dans le mélange dichloroéthane-ether-pentane, donnant le bromure 124 ( 5 g, 95 %), P F 126-127 C fr/D = 1200 (c À 0,75, chloroforme). b) Préparation du benzyl 3,4,6-tri-0-benzyl-2-0 ( 2,3,4,6- té tra-0-acétyl L-idopyranosyl) D-qalactopyranoside (composé 126) Une solution de 200 mg de henzyl-3,4,6-tri-0-benzyl--D- galactopyranoside (composé 125 préparé selon la méthode de J.C JACQUINET et P SINAY décrite dans Tetrahedron, 32 ( 1976) 1693)dans le dichloroéthane anhydre ( 10 ml) est agitée sous azote sec à 900 C en présence de tamis moléculaire 4 A ( 300 mg) et de bromure mercurique ( 80 mg), jusqu'à ce que le volume soit réduit de moitié Une solution du bromure 124 ( 300 mg) dans du dichloroéthane ( 10 ml) est ajoutée durant 3 h,; le volume du milieu réactionnel étant maintenu constant par distillation continue du dichloroéthane. 3 heures après la fin de l'addition, le milieu réactionnel est refroidi à la température ambiante, dilué avec du chloroforme ( 100 ml), filtré, lavé successivement avec une solution aqueuse à 10 % d'iodure de potassium, avec une solution aqueuse diluée d'hydrogénocarbonate de sodium, avec de l'eau, séché (sulfate de sodium) et évaporé Le résidu est purifié par chromatographie sur une colonne de cel de silice ( 30 g) à l'aide du mélange acétate d'éthyle-hexane 3 324 ( i 1,v/v), donnant le disaccliaride L 2-6 à l'état de sirop ( 290 mg, go,), C-, 0,27,55 Trouvé: C 65,98;H, 6,13 0,27,35 %. c) Préparation du benzyl-3,4,6-tri-0-benzyl-2-0-(a-L- idop Yranos Yl) L-6D-calactopyranoside (composé 1 27) Le disaccharide 126 ( 200 mg) est dissous dans du méthanol anhydre ( 10 ml) et une solution M de méthylate de sodium dans le méthanol anhydre ( 0 2 m 1 l) est ajoutée Au bout d'une heure, le milieu réactionnel est neutralisé àl'aide de résine Dowex 50 (H 4-), filtré et évaporé T e résidu est purifié par chromatographie sur une colonne de gel de silice ( 10 g) à l'aide du mélange dichloroéthaneacétone ( 7:3,v/v) -donnant le disaccharide 127 ( 154 mg, 95 %), à l'état pur, 6 t 9 IY) =_ 43 o (c: 1,4, chloroforme). Analyse:calculé pour C 4 H 460 il: C, 66,36 H 1,6,60 0,25,04; brouvé: C, 68,38 H, 6,64; 0,25,27 %. d) Préparation du 2-0 (c-L-idopyranosyl) -D-galactose (composé 123) Le disaccharidel 27 ( 200 mg) est hydrogéné pendant 48 hl dans de-l'éthanol ( 10 ml) contenant de l'acide acétique ( 0,1 ml), en présence de palladium sur charbon à 10 % mélange méthanol-chloroforme ( 4:1, v/y), donnant le. disaccharide libre 6 sous forme d'une poudre blanche hy- groscopique ( 97, 5 mng, 100 %), { -{= 280 (c: 1, 2, méthanol) + 150 ( 10 min) + 930 ( 2 h) (c 1,2 eau). Analyser calculé pour C 1 fi 22 i C, 42,10; il, 6,48 trouvé: C, 41,71; H, 6,48 %. EXEMPLE 33: Synthèse-du 1,2: 3,4-di-0-iso Pr P Ylidele- 6- s o (a-L-idopyranosyl) -_a-D-coalactopyranose (cxnosé 131) or préoare tout d'abord le 1 2: 3,4-di-O-isoororl"li'l,ne- pvranose (composé 130 Une solution de 300 mg de 1,2: 3,4-di-0-isopropy 1 idene-'41 D' galactopyranose plus haut pour la préparation du disaccharide 4 L 6 Une? puri fi-. cation par chromatographie sur une colonne de gel de silice P.F 160- 1610 C, ( 86 o, 23 Bs Analyse -calculé pour C 6301 c, 52,88; l,6,48 0, 40, 64 irouvé: C, 52,89; H-, 6,41 O, 40,63 %. Le dérivé 130 est ensuite mis eni oeuvre pour la préoaration du 1,2:3, 4di-0-isnorropylidène-6-0 (c-L-idppyranosyl-', D-aalactopvranose Le disaccharidel 30 est désacétylé selon la tech- nique décrite précédcmment pour la préparation du disaccha- ride Une purification par chromatographie sur une colonne de gel de silice ( 15 g) à l'aide du mélange méthanol-chloro- forme ( 4:1,v/v) conduit au disaccharide 131 obtenu sous forme d'une poudre amorphe et hygroscopique ( 204 mg, 95 %), t 7 D= -630 (c 0,7, méthanol). Ana'lyse:calculé pour C 18 H 301, 51,18; H, 7,16; 0,41,66. 18 30 '11: C'- t'rouvé: C, 50,86 (voir figures 24 et 25). EXEMPLE 34: Préparation du benzyl-2,_ 3,4-tri-0-benzyl-6-0- (a-L-idopyranosyl) -e-D-galactopyranoside (comiposé 3 J 4) On orévare tout d'abord le benzvl-2,3,4-tri-0-benzyl-6-0 Pyranoside (composé 13 J 3 Une solution de 200 mg de benzyl -2,3,4- tri-0henzyl-C,-1 Ä-D galactopyranoside JEANLOZ, Carbohydr Re,:, 21 ( 1972)45), dans du dichloro- 3 3 2 -4 éthane anhydre ( 51 ml) est agitée sous azote sec à qn OC en presence de tamis moléculaire 47 A ( 300 mq) et de bromure mercurique ( 80 mg), jusqu'à ce que le volume soit réduit à mi Une solution de bromure 124 ( 160 mg) dans du dichloro- éthane ( 10 ml) est ajoutée et le milieu réactionnel est agité à 900 C pendant 24 h Un traitement analogue celui décrit précédemment pour la préparation du disaccha- ride i 26 conduit à un résidu qui est purifié par chromatogra- phie sur une colonne de gel de silice ( 30 g) à l'aide du mélange dichloroéthane-ac Atone ( 12:1,v/v), donnant le disacc)aride 133 ( 227 mg; 70 %), Analyse'calculé pour C 481154015: C,66,20:,6,25 0,27,55 Trouv 4: C, 65,96: H 6,23: 0,27 66;'. Le com Dosé 133 est ensuite mis en oeuvre Dour la DréDara- tion du-benz 1 y-2,3 4-tri-O-benzyl-6-0 (a-L-ido Dvranosyll - -D-galactopyranoside (com P Dosé 134) en procédant comme suit: Le disaccharide 133 ( 200 mg) est désacétylé selon la technique décrite précédemment pour la préparation du disaccharide 127. Une purification par chromatoaranhie sur uns colonne de Lo gel de silice (l Og) à l'aide du m A-lanqe cbloroforre-r thanol ( 9:1,v/v) conduit au disacckarlde 134 obtenu sous forme amorphe ( 147 mg,90 O%), "ZD =-88 (c: 0,8, chloroforme) - Analyse:calculé pour C 4 H 460 Ol: C,68,36: H,6,60; 0,25,04, Trouvé: C,68,74 H,6,68; 0,25,37 % (voir figure 25). EXEMPLE 35: Préparation du 2-acétamido-1,3,6-tri-O-acétyl- 4-0-( 2,3,4,6-tétra-0-acétyl-a-L-idopyranosvl) 2-désoxy D-qglucopyranose (composé 138) (figure 26). La préparation de ce composé est effectuée selonles étapes a) à c) suivantes. a) Préparation du 2-acétamido-3-0-acétyl-1,6-anhydro-2- désoxy-4,0-( 2,3,4,6-tétra-0-acétyl-a-L-idopyranosyl- i-D-glucopyranose (composé 136) Une solution de 1 g de 2-acétamido-3-0-acdtyl-1,6-anhydro- 2-désoxy-_-D-glucopyranose (composé 135 préparé selon F SCHMITT et P SINA?, Carbohydr Res, 20 (lq 73) 99) dans du nitrobenzène anhydre ( 40 ml) est agitée pendant 2 h à 130 O Cen présence de tamis moléculaire 4 A en poudre ( 1 g), 253 $ 5 i 24 préalablement activé nendant 48 h à 2500 C Une solution de bromure 1241,43 g) dans le dichloroéthane ( 10 ml) est ajou- tée et le milieu réactionnel est maintenu à 1300 C pendant 10 h Une nouvelle addition de bromnure 124 (O,7 g) dans le dichloroéthane ( 5 ml) est alors effectuée et la réaction poursuivie pendant 24 h Un traitement analogue à celui décrit pour la préparation du disaccharide 126 conduit à un composé qui estpurifié par chromatographie sur une colonne de gel de silice ( 200 g) à l'aide du mélange acétate d'éthyle-éther ( 5:1,v/v), donnant le disaccharide 136 ( 1,8 g, 85 %), Z/D= 70,6 (c: 1, chloroforme). Analyselcalculé pour C 24 H 33014 N: C, 51,52; H,5,q 4: il, 2,50; 0,40,03 Trouvé: C, 51,35; H, 5,89; N, 2,51: 0,40,05 %. b) Préparation du 2-acétamido-1,6-anhydro-2-désoxy-4-0- (a-L-idopyranosyl) D-glucopyranose (composé 137) Le diseccharide 136 ( 500 mg) est désacétyle selon la technique décrite précédemment pour la préparation du di- saccharide 127 Une purification par chromatographie sur une colonne de gel de silice ( 40 g) à l'aide du méAlanne acetate d'éthyle-mêthanol ( 2:l,v/v) conduit au disaccharide 137 ( 300 mg, 90 %), É(/D =-65 (c: 1,6, méthanol). Analyse:calculé pour C 14 H 230 o N, 0,5 H 20: C, 44,Q 2 - H, 6,46 À N, 3,74 trouvé: C,44,95; H,6,61; N 4,27 '. c) Préparation du 2-acétamido-l,3,6-tri-0-acétyl-4-0-( 2, 3,4,6-tétra-0-acétyl-a-L-idopyranosyl) 2-désoxy-6-D- qlucopyranose (composé 138) Le disaccharide 136 ( 150 mg) est acétolyse a température ambiante pendant 12 heures en présence d'un mélange (Sml) anhydride acétique-acide acétique et acidesulfurique concentré. ( 7:3:0,1,v/v/v) Le milieu réactionnel est ensuite versé dans de l'eau glacée et agité pendant 4 heures, puis extrait avec du chloroforme ( 100 ml) La phase chloroformique est lavée avec une solution aqueuse diluée d'hydrogénocarbonate de sodium, avec de l'eau, séchée (sulfate de sodium) et évaporée Le résidu est purifié par chromatographie sur une colonne de gel de silice ( 10 g) à l'aide du mélan ( 120 mg, 64 '), PF 120 C, C JD = 40 (c: 1,chloroforme). Analyse élementairelcalculé pour C 28 139018 l: C,49,63; H, ,80; 0,42,50 N, 2,07. trouvé:C, 49,68, H, 5,91; 0,42,16; f 1,2,12 %. EXEMPLE 36: Synthèse du 2-acétamido-2 dclésoxy-4-O-(r-L- idopyranosyl)-D-qlucopyranose (composé 139 Xfigure 26) Le disaccharide 138 ( 100 mg) est désacétylé selon la technique décrite précédemment pour la'-préparation du disaccharide 127;- Une purification par chromatographie sur une colonne de gel de silice ( 5 a) à l'aide du mélange méthanol-chloroforme ( 3:2,v/v) conduit au disaccharide 139 qui est cristallisé dans de l'éthanol aqueux ( 48 mg, 85, PF 143-145 C, in D = -20 31 (c 0,8, eau-méthanol, 19:1,v/v, au bout de 14 h. Analyse;-calcul é pour: C 14 H 25 N 1 0,5 2 0: C, 42,86 14 251 Oil, 2 H, 6,68; N, 3,57 Touvé: C, 42,83:; y 6,68; 1;, Z,59 %. E Xi'PLE 37: variante -de préparation du oeposé 138 selon los tapes l à 6 (voir figure 27), a 6: reparatlon du benzyl 2-acétamido-3,6-di-0- benzyl-2-désoxv-4-O ( 6-0-tosyl-'-D- 11 ucopyranosvyl)- m(-D-clucopyranoside (composé 140) Une solution du composé 139 ( 0,2 g) dans la pyridine ( 5 ml) est refroidie à O C On ajoute alors du chlorure de tosyle ( 0,07 g) dissous dans la pyridine ( 2 ml) La réaction est abandonnée à la température ambiante pendant 24 heures. Après addition de quelques goutte d'eau, le mélange est agité pendant une demi-heure avant d'être versé sur de la glace Après reprise par du chloroforme ( 0,2 1), la phase chloroformique est lavée successivement avec une solution aqueuse à 10 % de KHSO 4, de l'eau, une solution saturée de Na HCO 3 et de l'eau Après séchage sur sulfate de sodium et concentration à sec, le résidu est chromatographié sur gel de silice ( 20 g) dans un mélange acétate d'éthyle/méthanol ( 15/1, v/v) On obtient ainsi le composé 140 pur ( 150 mg; %) J'k,720 = + 74 ( 1,1 chloroforme). D Analyse élémentaire: Calculé pour C 42 H 49013 N S ( 807,912) C, 62,40; H, 6,11 N, 1,73; 0,25,74; S, 3,97 Trouvé: C, 62,77; H, 6,13; N, 1,73; O, 24,98; S,3,48. Le spectre RMN confirme la structure recherchée. 2:Préparation du benzyl 2-acétamido-3,6-di-0-benzyl- 2-désoxy-4-O-( 2,3,4-tri-0-acétvl-6-0-tosv 1 D-alucopyranosvl) -d-DPlucopyranosidc (composé 141) A une solution du composé 13 ( 2 00 g dans la pyridine ( 5 ml), on ajoute de l'anhydride acétique ( 5 ml) Après une nuit à température ambiante,'le mélange réactionnel est concen- tré à sec Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice ( 25 g) dans un mélange acétate d'éthyle/hexane ( 3/1, v/v) On obtient ainsi le composé 141 ( 208 mg, 90 %) sous forme de sirop l O c 220 = + 700 ( 1, chloroforme). Analyse élémentaire: Calculé pour C 48 H 55 NS 016 ( 934, 023) C, 61,78 '; H, 5,94; N,1,5; 0,27,41: S, 3, 43. Trouvé: C, 61,58; H, 5,91; N 1,27; S, 3,23. Le spectre RMN confirme la structure recherchée. 3; Préparation du benzyl 2-acétamido-3,6-di-0-benzyl- 2-désoxy-4-0 ( 2,3,4-tri-0-acétyl-6-désoxy-6- iodo D lucopyranosyl) --D-qlucopyranoside t_ omposé 142 - 1) A partir du composé 141 - A une solution du composé 141 ( 150 mg dans l'acétone ( 5 ml), on ajoute de l'iodure de sodium ( 150 mg) Le mélange est chauffé a 70 C dans un tube scellé pendant 7 heures Apres évaporation à sec, le résidu est repris par l'eau et le chloroforme La phase, chloroformique est lavée avec de l'eau et séchée sur sulfate de sodium Après évaporation à sec, le résidu est cristallisé dans un mélange chloroforme/pentane ( 102 mg, 70 %) p f 173-174 C /20 = + 78,50 ( 1,2,chloro- forme). Analyse élémentaire: Calculé pour C 41 H 48013 NI ( 889,733) C, 55,34: H, 5,44: N 1,57: 0,23,38; I, 14,28. Trouvé: C,54,98: H, 5,52; N 1,45; 0,23,57 1,14,10. Le spectre RMN correspond à la structure recherchée. 2) A partir du composé 139 via le composé 143- Une solution du composé ( 1 g) et de:N-iodo-succinimide ( 1 g) dans le DMF ( 50 ml) est agitée à O C pendant 30 minutes. De la triphénylphosphine ( 1,2 g) est alors ajoutée lente- ment en une heure Apres chauffage à 50 C pendant une - heure, du méthanol ( 1 ml) est ajouté puis le mélange réac- tionnel est concentré à sec Le produit est extrait au chloro- forme, La phase chloroformique est lavée avec de l'eau, avec une solution de thiosuifate de sodium puis de nouveau avec de l'eau Après séchage et évaporation du chloroforme, le résidu est déposé sur une colonne de gel de silice ( 50 g) Le composé 143 contaminé par de la triphénylphos- phine est élué par un mélange acétate d'éthyle méthanol ( 15/1,v/v). Après évaporation du solvant de chromatographie et séchage, le dérivé 143 est dissous dans la pyridine ( 10 ml) puis acétylé par de l'anhydride acétique ( 10 ml) Après traitement classique, le dérivéI 142 est cristallisé dans un mélange chloroforme/pentane Le rendement par rapport au composé 139 est de 85 % Ce composé est en tout point analogue à celui obtenu à partir du composé 141. Préparation du benzyl 2-acetamido-3 6-di-0- benzyl-2-désoxy-4-0-( 2,3,4-tri-0-acétyl-6- désoxy D-xylo-hex-5-(éno Pyranosyl) -'-D-aluco- iyrancside-2 (composé 144) - A une solution du composé 142 ( 400 mg) dans la pyridine-anhydre ( 5 ml), on ajoute du fluorure d'argent ( 400 mg) La suspen- sion est agitée dans le noir pendant 48 heures Le mélange est ensuite versé sous agitation dans l'éther ( 200 ml) Après filtration, la phase éthérée est lavée avec une solution à % de Na HSO 4, puis avec une solution à 10 % de Na HCO 3 et enfin avec de l'eau Après séchage et concentration a sec, le résidu est cristallisé dans un mélange chloroforme/éther ( 206 mg; 60 %) p f 184-185 C = + 70 ( 1,4, chlo- roforme). Analyse élémentaire: Calculé pour C 41 H 47 N 013 ( 761,821): C, 64,69; H, 6,22 N 1,84. Trouvé: C, 64,5; H 5,96: N 1 79. Le spectre RMN est conforme à Ia structure recherchée. :Préparation du benzvl 2-acétamido-3,6-di-0- benzvl-2-désoxy-4-0 (o-L-idopyranosyl) -"-D- glucopyranoside (composé 1145)- Le composé 144 { 380 g) est dissous dans du tétrahydrofuranne ( 8 ml) franchement distillé Après refroidissement à O C sous atmc Tsphère d'azote, l'hydrure de bore (BH 3,1 M dans THF, 1 ml) est ajouté puis on laisse la température remonter jusqu'à la température ambiante Apres une heure de réaction, une nouvelle addition d'hydrure est effectuée (lml). Après 30 minutes, de l'éthanol est ajouté goutte à goutte. Lorsque le dégagement gazeux a cessé, le mélange est dilué par du THF ( 10 ml) De la soude ( 3 M, 1,2 ml) est ajoutée suivie par de l'eau oxygénée ( 120 vol: 0,8 ml) Après deux heures à 50 C, la solution est versée dans du chloro- forme La phase chloroformique est lavée avec une solution aqueuse d'acide chlorhydrique (O, 11 N) puis avec de l'eau. Après séchage (Na 2 SO 4) et concentration à sec, le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice ( 45 g) dans un mélange acétate d'éthyle/méthanol ( 15/4; v/v) Le cerivé 145 est élué d'abord ( 63 mg 15 %) suivi du dérivé 139 ( 225 mg; 54 %) Le dérivé 145 est cristallisé dans un mélange acétate d'éthyle/méthanol p f 191 C 20 = + 64,40 D ( 1,méthanol) D Analyse élémentaire: Calculé pour C 35 H 43 N Oil, H 20:C, 12,57; H, 6,75; N, 2,08. Trouvé C,62-42; H, 6,55; N 1,88. 6 Préparation du 2-acetamido-1,3,6-tri-0-acétyl-2-désoxy-4-0 ( 2,3,4,6-tétra-0-acétyl-'-L-idopyranosyl) -D- glucopyranose -(Composé 138)- 535324. Une solution du dérivél 45 ( 35 mg) dans le méthanol ( 10 ml) est agitée en présence de catalyseur (Pd/C,5 % mg) sous atmosphère d'hydrogène pendant 48 heures. Après filtration et évaporation, le résidu( 17 mg) est acétylé par un mélange pyridine/anhydride acétique ( 2 ml/lml). Après traitement classique, le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice ( 10 g) eluée par l'acétate - d'éthyle Après cristallisation, on obtient le composé 138 4 mg; 32) p f 191 C 20 = + 8 (,6,chloroforme). ( 14 mg; 32 %) p f 1910 C tvl + 80 ( 0,,6,chloroforme). 121- EXEMPLE 38 Synthèse du trisaccharide 149 de formule COO Me O Ac O Bn On O Ac OB Bn {O O Bn N 3 O Ac ( 149) Cette synthèse est réalisée en 3 étapes(voir figure 28). Tout d'abord, on procède à la glycosylation de l'ortho- ester d'un dérivé d'acide L-iduronique On élimine ensuite sélectivement le groupe monochloroacétyle, puis on fait réagir l'un des alcools formés avec un disaccharide. 1) Glycosylation de l'orthoester 38 par l'alcool benzy- lique - Une solution de l'orthoester 38 ( 118 mg 0,25 m M) obtenu se- lon l'exemple 5 et d'alcool benzylique ( 0,15 ml, 1,5 m M, fraîchement distillé) dans du chlorobenzène anhydre ( 10 ml) est chauffée à 140 C à l'abri de l'humidité Après distillation lente de 8 ml de solvant, une solution de perchlorate de 2,6-diméthylpyridinium ( 2,5 u M) dans le chlorobenzène ( 2 ml) est ajoutée goutte à goutte en 30 mn avec distillation simultanée de solvant ( 2 ml) Le mélange réactionnel est alors agité 30 mn dans ces conditions, avec addition goutte à goutte de solvant frais et distillation simultanée, de telle sorte que lc volume réactionnel reste constant et égal à environ 2 ml Après refroidissement et dilution avec du chloroforme ( 50 ml), la phase organique est lavée avec une solution aqueuse à 5 % d'hydrogénocarbonate de sodium, avec del'eau, séchée (sulfate de sodium) filtrée et évaporée. Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de si- lice ( 8 g) L'élution par le mélange hexane-acétate d'éthyle 2 5 35 324 ( 2: 1, v/v) permet d'obtenir une fraction contenant le mélange 146 de glycosidest forme V et Vt; f: ôté 2: 1). 2) O-démonochloroacétylation sélective - Une solution du mélange 1146 précédent ( 102 mg) dans de l> pyridine ( 5 ml) et de l'éthanol absolu (lml) est chauffée à 100 C pendant 20 min en présence de thiourée ( 25 mg) Après refroidissement, le mélange réactionnel est évaporé à sec et le résidu est repris par un mélange eauchloroforme ( 1:1, v/v, 50 ml) La phase organique est lavée avec de l'eau, séchée (sulfate de sodium), filtrée et évaporée. Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice ( 10 g) L'élution par le mélange acétate d'éthyle-hexane ( 4:3, v/v) permet d'isoler (par ordre d'élution): le glycosides 148 ( 26 mg, 25 %), sirop incolore, 7 D+ 70 (el, chloroforme) R M N ( 9 OMH, Od C 13):C: 7,30 (m, 1 OH, 2 Ph); 5,05 (m, 1 H, H 2); 4,90 (d, 1 H, H, 1,2 -J= 2 H); 3,78 (s, 3 H,COO Me); 3,12 ( 1 H, OH, échangé avec D 20); 2,05 (s,3 H,O Ac). le glycosidec 147 ( 54 mg, 50 % à partir de 38) sirop incolore, l * échangé avec D 20); 2,06 (s, 3 H, O Ac). 3) Glycosylation de l'alcool 147 à l'aide du disaccha- rie 57. Une solution de l'alcool 147 ( 22 mg, 50 "M), et du bromure 37 obtenu selon l'exemple b ( 57 mg,70 M) dans du dichlo- 2535 324 méthane anhydre ( 1,5 ml) est agitée à l'abri de la lumière etde l'humidité en présence de tamis moléculaire O 4 A (poudre, 50 mg) Le mélange réactionnel est refroidi à -20 C et de la sym-collidine (c 110 p 1) et du triflate d'argent ( 26 mg, 100,M) sont ajoutés successivement. Le mélange réactionnel est agité 2 h dans ces conditions, dilué avec du dichlorométhane ( 50 ml) les solides sont essorés et le filtrat cst lavé avec une solution aqueuse glacée d'H Cl O; 1 M, avec de l'eau, avec une solution aqueuse à 5 % d'hydrogénocarbonate de sodium, avec de l'eau, séché (sulfate de sodium), filtré et évaporé. Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice ( 8 g, gel 230-400 mesh) L'élution par le mélanrge toluène-acétate d'éthyle ( 5:1, v/v) permet d'isoler le trisaccharide 149 sous forme d'un sirop incolore ( 50 mg, 86 %). Le spectre R M N ( 270 M Hz, CD C 13) est conforme avec la structure attendue Ce spectre est représenté sur la figure 34 Exmle 39 Synthè'se des disaccharides 160 et 161 de formule CW Mme O Bn B n O Bn O Bn NH-Ac -( 160) COOME O Bn On O Bni NH Ac ( 161) 1) Préparation du benzyl-2-acétamido-2-désoxy-"-D-galacto- pyranoside 151. Une suspension de N-acétyl-D-galactosamine 150 ( 3 g) dans de l'alcool benzylique anhydre ( 40 ml) contenant 2 % d'acide chlorhydrique (gaz, séché) est agitée à 70 C à l'abri de l'humidité pendant 16 heures Après refroidisse- ment, la solution limpide est versée lentement dans de l'éther froid ( 400 ml) Le précipité est alors refroidi 2 heures à -20 C, puis essoré Les solides sont rincés avec de l'éther, puis dissous dans un mélange méthanol-eau ( 4:1, v/v, 100 ml) et portés à ébullition pendant 1/2 heure en présence de charbon actif ( 1 g) La solution chaude est filtrée, puis évaporée à sec Le résidu est soumis à une cristallisation fractionnée dans le 2-propanol pour donner le composé 151 ( 2,54 g, 60 %);?F = 205- 206 ;LlD + 210 (c 4, H 20). (Lit: H M FLOWERS and D SHAPIRO, J O g Chem, 30 ( 1965) 2041-43, PF = 203-205 , |l D + 204 O (c O 98, H 20) 2) Acétalation du composé 151. a) Acétalation par l'acétone en milieu acide. Une suspension du composé 151 ( 311 mg, 1 m M) dans de l'acétone anhydre ( 20 ml) est agitée à l'abri de l'humidité en présence d'acide paratoluènesulfonique (monohydrate, 40 mg) Le mélange devient homogène après 1 heure, et est agité 3 heures 30 au total De la triéthy- lamine ( 0,5 ml) est ajoutée et le mélange réactionnel est évaporé à sec Le résidu est repris avec du chloro- forme ( 50 ml), la phase organique est lavée avec une so- lution aqueuse à 5 % d'hydrog 6 nocarbonate de sodium, avec de l'eau, séchée (sulfate de sodium), filtrée et évaporée. Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice ( 20 g) L'élution par l'acétate d'éthyle donne: le composé 152, sirop,( 222 mg, 63 %), la ID + 193 (cli, méthanol), R M N ( 90 M Hz, CDC 13): 6: 7,30 (s, 5 H, Ph); 5, 95 (d, 1 H, NH, J = 8,5 Hz),4,92 (d, 1 H, H 1 ' J 1,2 = 3,5 Hz), 2,80 ( 1 H, OH, échangé avec D 2 O), 1,97 (s, 3 H, N Ac), 1,55 et 1,32 ( 2 s, 2 x 3 H, Isopropyl); le composé 1535, sirop ( 110 mg, 31 %); lalD + 154 (ci, chloroforme), R M N ( 90 M Hz, CD C 13):: 7,32 (s, 5 H, Ph), 5,80 (d, 1 H, NH, J = 8,5 Hz), 5,0 (d 1 H, H 1 J 1,2 = 35 Hz); 2,75 ( 1 H, OIH, échangé avec D 20); i,96 (s, 3 H, N Ac); 1,46 (s, 6 H, Isopropyl). b) Acétélation par le 2-méthoxypropène (contrôle cinétique). Ce composé 11 ( 311 mg, 1 e M) est dissous dans du N,N-diméthylformamide anhydre ( 8 ml) Du 2- méthoxypropène ( 0,3 ml) et de l'acide para-toluènesulfo- nique (monohydrate, 3 mg) sont ajoutés successivement, et le mélange réactionnel est agité à l'abri de l'humidité pendant 3 heures. Un traitement identique à celui décrit au paragraphe a, suivi d'une chromatographie sur colonne de gel de silice ( 20 g), donne, par élution avec le mélange dichlorométhane-méthanol ( 15:1, v/v, contenant 0,1 % de triéthylamine). Le composé 152, sirop ( 34 mg, 10 %) Le composé 153, sirop ( 299 mg, 85 %) Benzoylation du composé 153. Une solution du composé 153 ( 90 mg, 0,25 m M) dans un mélange de dichlorométhane anhydre ( 5 ml) et de 2 35324 pyridine anhydre ( 1 ml) est traité à O C à l'abri de l'hu- midité par du chlorure de benzoyle ( 60 pl, 0,5 m M) pendant 4 heures Du méthanol ( 1 ml) est alors ajouté, et après minutes, le mélange réactionnel est dilué avec du dichlo- rométhane ( 20 ml) La phase organique est lavée avec une solution aqueuse à 10 % d'hydrogénosulfate de sodium, avec de l'eau, avec une solution aqueuse à 5 % d'hydrogénocar- bonate de sodium, avec de l'eau, séchée (sulfate de sodium); filtrée et évaporée Le résidu gélatineux est cristallisé dans un mélange acétate d'éthyle-éther-hexane pour donner le composé 154 ( 105 mg, 90 %),?F = 185186 C; tai D + 189 (ci, chloroforme), R M N ( 90 M Hz, CD Cl: 5: 8,05 (m, 2 H, H ortho de benzoyle); 7,40 (t, 8 H, 1 Ph + H méta, para de benzoyle), 5,73 (d, 1 H, NH, J = 9 Hz), 5,33 (d de d, 1 H, = z 2,3 = OH J 34 = 3,5 Hz), 1,83 (s, 3 H, N Ac), 1,48 et 1,39 ( 2 s, 2 x 3 H, Isopropyl). N.B: La présence à 6 = 5,33 ppm d'un doublet de doublet ayant des constantes de couplage de 10 et 35 Hz montre de manière non ambiguë la présence d'un groupement électro- attracteur (benzoate) en C-3, et donc assure la position en 4 et 6 de l'isopropylydène. Hydrolyse et benzoylation sélective en 6 du composé 154. Un mélange du ccmposé 154 ( 72 mg) et d'acide acétique à 80 % ( 5 ml) est chauffé à 100 Csous agitation pendant 30 minutes Après refroidissement à la température ambiante, le mélange réactionnel est évaporé à sec, évaporé avec de l'eau ( 3 fois 10 ml), puis avec du toluène Le ré- sidu solide est séché au dessicateur sous haut-vide. Le diol brut est dissous dans un mélange de pyridine anhydre ( 0,5 ml) et de dichlorométhane ( 3 ml) Du cyanure de benzoyle ( 33 mg) est ajouté et le mélange réac- tionnel est agité pendant 16 heures Du méthanol ( 5 ml) est ajouté, et, après 1 heure sous agitation, le mélange réac- tionnel est évaporé à sec Le résidu est cristallisé dans un kb 3 i 324 mélange acétate d'éthyle-hexane pour donner le composé 155 ( 71 mg, 86 % à partir du éomposé 154); PF= 180-181 o C; Ell + 1090 (cl, chloroforme); R M N ( 90 M Hz, CD C 13): 6:D 8,02 (m, 4 H, H ortho des 2-benzoyle); 7, 40 (m, 11 H, l Ph + H métz, para des 2-benzoyle); 5,88 (d, 1 H, NH, J = 9 Hz); ,38 (d de d, 1 H, H 3, J 2,3 = 10 Hz, J 3,4 = 3 Hz), 5,02 (d, 1 H, H 1 J 12 = 35 HZ) 3,30 ( 1 H, OH, échangé avec D 2 Q, 1,81 (s, 3 H, N Ac). On notera que par benzylation, O-débenzoylation, puis acylation sélective en C-6, le composé 155 peut con- duire à un dérivé du type -O-acyle Bn Bn NHAC qui est un précurseur convenablement protégé utilisable pour la synthèse de la chondroitine-6-sulfate. Benzylation du dérivé 152. Le composé 151 ( 200 mg, 057 m M 4) est dissous dans du N,Ndiméthylformamide anhydre ( 5 ml) De la baryte anhydre ( 700 mg, 4,5 m M), de l'hydroxyde de baryum octa- hydraté ( 158 mg, 0,5 4 m M) et du bromure de benzyle ( 120 pl, 1 m M) sont ajoutés successivement Le mélange réactionnel est agité à l'abri de l'humidité pendant 20 heures Du mé- thanol ( 0,5 ml) est ajouté, puis, après 30 minutes, le mé- lange réactionnel est filtré, les solides sont rincés avec du chloroforme ( 50 ml) La phase organique est lavée avec une solution froide d'acide acétique à 50 %, avec de l'eau, avec une solution aqueuse à 5 % d'hydrogénocarbonate de sodium, avec de l'eau, séchée (sulfate de sodium), filtrée et évaporée Le résidu est lavé sur une colonne de gel de silice ( 10 g) L'élution par le mélange acétate d'éthyle- hexane ( 3:1, v/v) donne le composé 156 sous forme d'un verre incolore qu'il n'a pas été possible de cristalliser ( 228 mg, 91 %; MlD + 136 (c 1,5, chloroforme), R M N. ( 90 MHZ, CDC 13): 6: 7,30 (m, 10 H, 2 Ph), 5, 86 (d, 1 H, NH, J = 8,5 Hz), 4,89 (d, 1 H, H 1 ' J 1,2 = 3,5 Hz); 1,93 (s, 3 H, NAC), 1,55 et 1,31 ( 2 s, 2 x 3 H, Isopropyl). Hydrolyse acide du dérivé 156. Un mélange du composé 156 ( 150 mg) et d'acide acétique à 80 % ( 5 ml) est agité à 100 Cpendant 1/2 heure. Après refroidissement à la température ambiante, le mé- lange réactionnel est évaporé à sec, évaporé avec de l'eau ( 3 fois 10 ml), puis avec du toluène Le résidu gé- latineux est cristallisé dans l'éthanol pour donner le diol 157 ( 121 mg, 89 %), PF= 183-184 C Ia ID + 171 (cl, méthanol). Préparation du dérivé 4-0-acétylé 158. Un mélange du composé 157 ( 100 mg) de toluène anhydre ( 5 ml), de triméthylorthoacétate ( 0,5 ml) et d'acide para-toluène sulfonique (monohydrate, 1 mg) est agité à l'abri de l'humidité pendant 1 heure (le milieu devient homogène après environ 45 minutes) De la tri- éthylamine ( 0,2 ml) est ajoutée et le mélange réactionnel est dilué avec du toluène ( 20 ml) La phase organique est lavée avec de l'eau ( 2 fois), séchée (sulfate de sodium), filtrée et évaporée Le spectre de R M N du produit brut est en accord avec la structure attendue ( 6: 3,24 (s, 31 t, O Me); 1,65 (s, 3 H, C Me), mais l'orthoester instable est engagé immédiatement dans la réaction suivante: Un mélange de l'orthoester précédent et d'acide acétique à 80 x ( 5 ml) est agité 10 minutes à la tem- pérature ambiante, puis évaporé à sec Ce résidu est évapo- ré avec de l'eau, puis avec du toluène Une cristallisation dans un mélange acétate d'éthyle-hexane donne le composé 158 ( 95 mg, 85 % à partir du composé 157 f PF = 146 -147 C, La D + 94 , (ci, chloroforme), R M N ( 90 M Hz, CD C 13): 6: 7,32 (m, 1 OH, 2 Ph), ,92 (d, IH, NH, J = 8,5 Hz), 5,37 (d de d, 1 H, H 4 ' J 3,4 = 3 Hz, J 45 = 1 H), 4,96 (d, 1 H, H 1, J 12 = 3,5 H), 3,60 ( 1 H, OH, échangé avec D 2 o), 2,11 et 1,95 ( 2 s, 2 x 3 H, O Ac et N Ac). (La présence à 6 = 5,37 d'un doublet de doublet ayant des constantes de couplage de 3 et 1 Hz montre de manière non ambiguë la présence d'un groupement acylé (acétate) en C-4). Le dérivé 158 est un précurseur de choix pour la préparation du disaccharide de base des: chondroitine-4-sulfate, - (acide L-tduronique 1 3 N-Ac-D-galactosamine-4-0-sulfate). Condensation entre l'alcool 158 et l'imidate 159. Imidate 159: Lit: R R SCHMIDT and G GRUNDLER, Synthesis, ( 19 81) 885-87. Une solution de l'alcool 158 ( 76 mg, 0,17 m M) et de l'imidate 159 ( 175 mg, 0,28 m M) dans le dichlorométhane anhydre ( 2,5 ml) est agitée à l'abri de l'humidité en pré- sence de tamis moléculaire 4 A (poudre, 100 mg) Le mélange réactionnel est refroidi à O C, et de l'éthérate de tri- fluorure de bore (BF 3: Et 2 O, 4 P, 32 PM) est ajouté en une seule fois Après agitation 1 heure à O C puis 3 jours à la. température ambiante, de l'hydrogénocarbonate de sodium ( 100 mg) est ajouté Après 15 minutes, les solides sont es- sorés, rincés avec du dichlorométhane ( 50 ml) et la phase organique est lavée avec une solution aqueuse à 5 % d'hydro- génocarbonate de sodium, avec de l'eau, séchée (sulfate de sodium), filtrée et évaporée. Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice ( 18 g) L'élution par le mélange acétate d'éthyle-hexane ( 1:1, v/v) permet d'isoler: une fraction disaccharidique ( 62 mg), 2535 3 Z 4 le produit de départ qui n'a pas réagi ( 47 mg, 60 %). La fraction disaccharidique est rechromatograr phiée sur une colonne de gel de silice ( 5 g, gel 230- 400 mesh) L'élution par le mélange dichlorométhane- acétate d'éthyle ( 5:1, v/v) permet d'isoler (par ordre d'élution): le disaccharide 1 3 161, sirop incolore ( 24 mg, 15 %), (i D + 98 (cl, chloroforme); R M N ( 90 M Hz, CD C 13): 6: 7,30 (m, 25 H, 5 Ph); 5,65 (d, 1 H, NH, J = 9,5 Hz); 5,52 (d de d, 1 H, H 4, J 3 4 = 3 Hz); -05 (d, 1 H H'1, Jl'2 = 3,5 z); 4,95 (d, 1 H, HI, J 1 2 = 3,5 H); 3,63 (s, 3 H, Coo Me), 1,92 et 1,82 ( 2 s, 2 x 3 H, O Ac et N Ac); le disaccharide 1 13160, sirop incolore ( 24 mg, 15 %), a D + 80 (cl, chloroforme); R M N ( 90 M Hz, CDC 13): 6: 7,30 (m, 25 H, 5 Ph); 5,48 (d, 1 H, NH, J = 9 Hz); ,46 (d de d, 1 H, H 4, J 3,4 = 3 Hz); 4,97 (d, 1 H, Hi, J 1,2 = 3,5 Hz); 3,78 (s, 3 H, COOL Me); 2,04 et 1,61 ( 2 s, 2 x 3 H, O Ac et N Ac. EXEMPLE 40: Fixation du tétrasaccharide sur BSA: COO Na 53 Na O 503 Na OSO 3 Na o ooo OHH OH 00 Na O O HO O NHSO 3 Na OSO 3 Na NHSO 3 Na A une solution de bovine sérum albumine (BSA: 7 mg; 0,1 Vmole) et de tétrasaccharide ( 15 mg; 10 pmoles) dans un tampon ohosphate de sodium ( 0,15 M; p H 7,0; 2,5 ml), on ajoute du cyanoborohydrure de sodium ( 13 mg; pmoles) et porte la solution à 37 C pendant cinq jours Le mélange réactionnel est ensuite chromatographié sur une colonne de Séphadex G-50 ( 1 x 100 cm), éluée par l'eau, de façon à séparer les sels et le pentasaccharide non fixé du conjugué protéine-oligosaccharide Dans ces conditions, on obtient une fixation de 12 moles de tétra- saccharide par mole de BSA. La même réaction meut être effectuée sur un support insoluble tel que le 2-aminoéthyl-polyacrylamide ou la 2-aminoéthyl-cellulose, ou tout autre support conte- nant une fonction amine primaire. De même, en travaillant en présence d'antithrom- bine III (au lieu de BSA), dans les conditions définies ci-dessus, on obtient une fixation de l'oligosaccharide sur l'antithrombine III, et par là une antithrombine III activée en permanence (BJORK et al, FEBS Letters, 143 ( 1982), 96-100). SYNTHESE DU DISACCHARIDE 163 A une solution du composé 2 ( 5,6 g) et de cyanure mercu- rique ( 3,5 g) dans le dichloroéthane ( 40 ml), on ajoute, après O distillation d'environ 30 ml de solvant, du tamis moléculaire 4 A ( 1 g) puis le composé 1 ( 3,44 g; 8,82 mmoles) Apres une nuit sous agitation les solides sont éliminés par filtration, D Ui S lavés avec du dichloro- méthane Celui-ci est joint à la solution puis la phase organique obtenue est lavée avec une solution saturée d'iodure de potassium, puis avec de l'eau Après séchage et concentration à sec, le sirop obtenu ( 10 g) est désacétylé en présence de méthanolate de sodium ( 2 M, 1 ml) dans le méthanol ( 20 ml) Le composé 163 obtenu ( 2,7 g) après chromatographie sur gel de silice ( 50 g; chloroforme/méthanol; 20/1; v/v) C'est un sirop (lalD O _ 12 ( 1,1; chloroforme) qui est engagé tel quel dans la synthèse de 5 SYNTHESE DU COMPOSE 164 Le disaccharidel 63 ( 2,7 g) est dissous dans du DIF anhydre ( 27 ml) puis on ajoute successivement à cette solution du chlorure de trityl ( 4,42 g) de la diméthylaminopyridine ( 135 mg) puis de la triethy- lamine ( 2,7 ml) Apres deux jours à température ambiante, le mélange réactionnel est concentré sous vide, puis le résidu est chromatographié sur gel de silice ( 50 g; hexane puis hexane/acétate d'éthyle; 2/1 puis 1/1; v/v) On obtient ainsi 164 '2,6 g) C'est un sirop; lal 2 D 16,3 ( 1, 3; chloroforme) SYNTHESE DU DISACCHARIDE 166 Le sirop obtenu à l'issue de la préparation de 1164 ( 2,4 g) est dissous dans du DMF ( 40 ml) On ajoute alors de l'hydroxyde de barium octahydrate ( 1,64 g), de l'oxyde de barium ( 7,08 g) et enfin du bromure de benzyle ( 2 ml) Après 4 heures de réaction, du méthanol est ajouté puis suivi de chloroforme ( 100 ml) Les solides sont essorés puis la phase chloroformique est concentrée à sec Le disaccharide 165 obtenu à ce stade est directement transformé en 166 Pour cela, le résidu est repris dans du dichlorométhane ( 20 ml) puis une solution de BF 3 dans le méthanol ( 2 ml) est ajoutée, à OC, à l'abri de l'humidité Après 4-heures de réaction, le mélange réactionnel est dilué par du dichlorométhane puis lavé avec une solution aqueuse de bicarbonate de sodium Apres séchage et concentration, le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice ( 100 g; hexane/acétate d'éthyle; 4/1 puis 1/1; v/v) On obtient ainsi 166 r 2( O lalD 2 ( 0,7, chloroforme). SYNTHESE DU COMPOSE 166 Le dérivé 166 est dissous dans l'acétone ( 20 mi) On ajoute alors, à O C, une solution d'oxyde de chrome (VI) ( 670 mg) dans l'acide sulfurique 3, 5 M ( 3 ml) Apres 1,5 heures, de la glace et de l'eau sont ajoutées au mélange réactionnel, puis le produit oxydé est extrait au chloroforme La phase chloroformique est lavée à l'eau, séchée, et concentrée à sec Le résidu, dissous dans l'éther est méthylé par addition de diazométhane livrant ainsi 168 qui est purifié sur gel de e', silice (hexane/acétate d'éthyle; 4/1 puis 1/1; v/v) C'est un sirop lal O 8,5 ( 1, chloroforme) L'analyse élémentaire et le spectre IR confirment la structure attendue pour 168. REMARQUE:le 6 aeut-être acétolysé et transformé en halogènure de la façon décrite dans l'exemple 25 (passage de 94 à 97). Z 3 324 REVENDICATION Procédé de synthèse organique d'oligosaccharides constituant ou correspondant à desfragments de muco- polysaccharides acides caractérisé en ce qu'on fait réagir deux composés: constitués ou terminés respectivement par des motifs A de structure glucosamine, en particulier D- glucosamine, ou galactosamine, en particulier D-galacto- samine et des motifs U de structure acide glucuronique, en particulier Dglucuronique, ou acide iduronique, en particulier L-iduronique; l'un des motifs A ou U étant un alcool dans lequel le groupe -OH de la fonction alcool occupe l'une quelconque des positions 3,4 ou 6 dans le cas d'un motif A et 2,3 ou 4 dans le cas d'un motif U, l'autre motif possédant un carbone anomère activé, c'est-à-dire comportant un groupement réactif capable d'établir avec le groupe -OH de l'alcool la liaison de glycosylation -O recherchée, selon la stéréochimie souhaitée, pour former une séquence -A-U ou -U-A; le groupement réactif de A ou U étant compatible avec les groupements Protecteurs et/ou précurseurs et/ou fonctionnels présents sur les motifs; toutes les positions de A et U excepté celles dont le carbone anomère est activé portant des groupes -OH, amine ou carboxyle, ou des précurseurs de tels groupes, les groupes euxmêmes lorsqu'ils sont présents étant bloqués par un ou avantageusement plusieurs types de groupements protecteurs,ces groupements protecteurs étant compatibles entre eux et avec les précurseurs ci-dessus, ces groupements protecteurs et Précurseurs étant inertes vis-à-vis de la réaction de glycosylation et avec les groupes réactifs, autorisant la mise en place, au cours d'opérations ultérieures, de substituants donnés aux diverses positions et ce, le cas échéant, de manière séquentielle, les conditionsde mises en oeuvre pour faire réagir les produits de départ étant choisies de manière à ne pas altérer la structure des motifs de ces produits et la nature des divers substituants présents, sous réserve que l'établissement de la liaison inter _ glycosidique ne conduise pas à l'obtention d'un disaccha- ride à structure ( 2-N-sulfate ou ( 2-N-acétyl)-6-O-sulfate- D-glucosaminel-lacide -méthyl-D-glucuronique 7. b