FR 2531313 A1 19840210 FR 8312904 A 19830804 La présente invention concerne la protection des éléments du règne végétal contre les maladies et en particulier elle concerne l'utilisation de molécules d'in- terféron (IFN) entier provenant d'une source phylogéné- tique quelconque et/ou de leurs composants ancestraux, afin que les infections virales des plantes soient empêchées ou interrompues. L Oubiquité des virus des plantes contribue au problème global de la création d'aliments à un coût efficace Aucun hémisphère de la Terre n'est épargné par les ravages des virus des plantes sur les récoltes et même les plantes ornementales Par exemple, on peut consi- dérer que la pathologie des plantes induite par les virus peut provoquer une maladie mortelle des cocotiers dans les régions tropicales et peut ravager les cultures de blé, d'orge et d'autres grains dans le Nord canadien. Actuellement, il n'existe pas de remède ou de solution thérapeutique connu, mis à part la technique primitive de la "cueillette" au cours de laquelle le fermier ou le pépiniériste retire la matière infectée des plantes avant propagation par contagion aux plantes qui ne sont pas encore infectées Si l'on considère la nature micros- copique des organismes viraux assurant l'infection et ainsi l'impossibilité évidente de la détection de l'in- fection à l'oeil nu avant qu'il soit trop tard pour l'ex- tirpation par cueillette, il apparaît immédiatement qu'une approche fondamentalement différente est nécessaire. Il faut ( 1) pouvoir modifier le plasma germi- natif des plantes de manière particulière afin que la résistance intrinsèque des plantes aux virus soit accrue, et ( 2) pouvoir ajouter de manière exogène, aux cellules de plantes dejà infectées, une ou plusieurs substances sûres assurant une protection générale des cellules des plantes contre tout un spectre de virus différents des plantes, afin que d'autres détériorations des récoltes soient évitées et que la propagation continue des agents infectieux soit interrompue L'invention satisfait à ces critères et concerne des procédés permettant l'obtention des effets physiologiques avantageux de l'interféron dans des éléments du règne végétale On a déjà effectué des études concernant la disposition d'interféron humain exogène (Hu IFN) dans des plantes,-comme décrit dans l'article de Crchansky et al, Proc Natl Acad Sci USA 79, 2278, ( 1982) une étude analogue a aussi été effectuée dans le cadre de la dis- position exogène d'un "médiateur intracellulaire" ( 2 '-5 '- oligoadénylate synthétase) dans des plantes comme décrit dans l'article de Devash et al, Science 216, 1415 ( 1982). L'invention dérive de la détermination, par l'inventeur, du fait que certaines séquences d'amino- acides essentielles ou certains fragments biologiques d'une classe naturelle de protéines, appelées interférons (IFN),sont capables d'arrêter à la fois la croissance des virus des plantes et la détérioration des cellules lorsqu'une plante a été infectée, ainsi que d'empêcher la propagation de différents virus chroniques ou latents des plantes à des plantes normales non infectées, c'est- à-dire que l'infection est empêchée dans un premier stade. Cette double aptitude est appelée "protection" d'une plante contre les virus, dans le présent mémoire. Des séquences d'aminoacides essentielles indi- quées précédemment sont aussi appelées, dans le présent mémoire, séquences "ancestrales" Une séquence ancestrale est une séquence qui a été conservée au cours de l'évolu- tion, c'est-à-dire pendant une période d'au moins plu- sieurs millions d'années et probablement même de plu- sieurs dizaines ou centaines de millions d'années, sans modification, Dans le présent mémoire, les expressions "séquence ancestrale' et "fragment ancestral" désignent toute séquence d'aminoacides qui n'est pas normalement rencontréeelle-même à l'état libre dans la nature et qui possède en elle-même et par elle-même l'aptitude à pro- voquer une réponse antivirale d'une plante L'inventeur a déterminé que des séquences ancestrales sont responsa- bles, au moins en partie, de la communication de proprié- tés de l'interféron à des molécules entières ou de plus grands fragments qui contiennent la séquence ancestrale (ou plusieurs séquences ancestrales). L'invention peut être mise en oeuvre dans de nombreux modes différents qui reposent essentiellement sur deux niveaux a) leniveau génétique, c'est-à-dire l'incor- poration de l'information génétique qui code (programme) la biosynthèse dans la cellule végétale d'une séquence ancestrale ou d'une molécule b) le niveau mécanique c'est-à-dire l 1 addi- tion physique d'interférons ou de fragments d'interféron d'une manière exogène, c'est-à-dire locale, à des tissus végétaux déjà infectés ou qui risquent sous peu une in- fection virale. En outre, des acides ribonucléiques ARN à dou- ble spirale (ds ARN) d'origine synthétique ou naturelle (toute source phylogénétique) peuvent donner le même ré- sultat (pourvu que les cellules cibles des plantes con- tiennent un élément génétique IFN programmable> et en fait augmentent même l'issue thérapeutique dans diverses interactions des virus et des cellules végétales. L'une des déterminations les plus importantes conduisant à l'invention est qu'il suffit, pour la produc- tion d'une réponse antivirale, d'un élément inférieur à des molécules entières d'interféron En d'autres termes et comme décrit en détail dans la suite du présent mé- moire, l'inventeur a déterminé que certaines séquences d'aminoacides contenues dans une molécule d'interféron donnent une réponse antivirale pratiquement équivalente de celle que donnerait la molécule entière d'interféron. L'inventeur a en-outre déterminé que les séquences sont ancestrales, que, comme indiqué précédemment, elles ont probablement évolué au cours du temps et en outre qu'elles sont communes à des molécules de nombreux organismes, végétaux et animaux. L'implication de cette détermination est-très simplement que la présente invention peut être mise en oeuvre d'une façon très large, au-delà de la portée des molécules entières d'interféron Ainsi, toute molécule contenant une séquence d'aminoacides (ancestrale), telle que définie dans la suite du présent mémoire, peut être appliquée localement afin qu'elle donne une réponse anti- virale En outre, toute plante contenant un codage géné- tique assurant la production d'une séquence ancestrale ou un codage d'une molécule contenant une séquence an- cestrale, peut être "induite" à produire cette séquence ou molécule Ainsi, certaines plantes, sans être modifiées génétiquement en vue de la production de molécules entières d'interféron, peuvent néanmoins être poussées à répondre d'une manière analogue à l'interfér cnc'est-à-dire comme si la plante avait été programmée génétiquement pour la produc- tion de son propre interféron ou comme si elle avait été traitée localement avec des molécules entières d'interfé- ron L'expression "analogue à l'interféron" a cette si-y 31 i- fication dans le présent mémoire Evidemment, lorsqu'une plante a été modifiée génétiquement afin qu'elle contien- ne un codage génétique pour l'interféron (molécules en- tières),elle peut aussi être induite artificiellement pour la production d'interféron entier. En outre, on a déterminé selon l'invention que les plantes elles-mêmes produisent des substances qui contiennent des séquences ancestrales, c'est-à-dire que les plantes produisent de l'interféron végétal (Pl IFN), cette détermination n'ayant pas été réalisée jusqu'à pré- sent Ainsi, la modification génétique du plasma germina- tif des plantes afin qu'il contienne un gène fonctionnel exprimant un interféron végétal, malgré l'origine végé- tale du gène, entre aussi dans le cadre de l'invention. L'invention permet donc l'interruption ou la prévention des infections virales des végétaux, par in- duction des plantes afin qu'elles présentent une réponse analogue à l'interféron Le mode opératoire donnant ce résultat peut être de différent type. 1 Modification génétique du plasma germina- tif des plantes afin qu'il contienne une ou plusieurs copies des gènes de l'interféron si bien que la plante produit en réalité son propre interféron Les gènes im- plan-tés peuvent soit être rendus actifs à nouveau soit être rendus actifs à l'aide de substances inductrices. La modification génétique est particulièrement utile dans les plantes n'ayant pas de gènes d'interféron du tout ou n'ayant que des gènes défectueux d'interféron. 2 L'application locale de molécules contenant une séquence ancestrale à la plante. 3 L'induction d'une plante, qui n'a pas été obligatoirement modifiée génétiquement, à produire une molécule contenant une séquence ancestrale Ce mode active les gènes d'interféron végétal qui sont par ailleurs la- tents ou dormants. Les agents externes de traitement des plantes utiles selon l'invention comme sources applicables à ti- tre d'exemples pour la protection virale (c'est-à-dire utiles pour la production d'une réponse analogue à l'in- terféron) comprennent ainsi divers interférons entiers, leurs fragments moléculaires ancestraux (c'est-à-dire essentiels) des inducteurs d'interféron (comprenant no- tamment des acides ds ARN mais pouvant être aussi d'au- tres agents) ainsi que des substances particulières à base, d'oligonucléotide ("médiatrices") qui peuvent assurer les changements moléculaires à l'intérieur de la cellule de la plante associéeà la résistance au virus assurée spécifiquement par l'exposition des cellules aux fragments ancestraux actifs biologiquement d'interféron. Le traitement ou l'application locale peut être mise en oeuvre de manière très diverses étant donné les aptitudes biologiques de ces agents De tels trai- tementssont par exemple, à titre purement illustratif, le trempage des plantes ou des graines, la pulvérisation ou le saupoudrage des récoltes. Le terme "interféron" utilisé dans le pré- sent mémoire désigne (a) toutes les formes naturelles d'interféron animal, notamment l'interféron humain alpha, bêta ou gamma, (b) les formes "synthé_-tiques" d'interféron animal produites dans des organismïes non humains auxquels des gènes d'interféron animal (par exemple humain) ou des morceaux de tels gènes (formant des gèneshybrides) ont été ajoutés, et (c) les dérivés chimiques de tels interférons ayant par exemple des chaînes polypeptides modifiées ou des motifs glycosyle modifiés. L'invention a évidemment une utilité impor- tante et étendue, l'importance économique et la plus immédiate est la protection des récoltes coupées produites à l'échelle du pays ou même du monde entier En outre, l'invention permet même, par augmentation des mécanismes intrinsèques de défense des plantes par exemple, une "mise sous tension" des plantes dans le milieu ambiant sans qu'elles succombent à une infection virale, un cas qui se présente couramment étant par exemple celui de la ten- tative faite par un fermier de modifier une zone géogra- phique de croissance naturelle de matière végétale Il faut considérer que de nombreuses plantes tropicales ne peuvent pas pousser dans des zones non tropicales à cause des "tensions" correspondantes qui augmentent apparemment la sensibilité à des agents pathogènes, notamment les virus; par exemple, les papayers qui sont relativement dépourvusde virus dans les régions tropicales, prennent presque uniformément des infections virales mortelles lorsque leur croissance est tentée en Californie En con- séquence, l'invention est non seulement d'une utilité immédiate mais elle présente aussi des avantages agricoles supplémentaires qui n'apparaissent, même à l'observa- teur expérimenté en biotechnologie agronomique, qu'au cours du temps lors de sa mise en oeuvre pratique progressive. En outre, des espèces pathogènes autres que des virus, dont le cycle vital utilise des produitsintra- cellulaires des cellules végétales, sont aussi arrêtées par l'interféron, comme décrit dans le présent mémoire. De telles autres espèces pathogènes sont notamment cer- taineç bactéries et des protozoaires, comme décrit dans l'ouvrage "Selective Inhibitors of Viral Functions", W A. Carter, Ed; Chemical Rubber Company Press; Cleveland, Ohio; 1973 qui décrit de façon étendue divers agents pathogènes non viraux susceptibles de réagir à l'effet de l'interféron, notamment à concentration élevée d'in- terféron. D'autres caractéristiques et avantages de l'in- vention ressortiront mieux de la description qui va suivre faite en référence au dessin annexé sur lequel les figures la et lb représentent des structures tridimensionnelles comparatives d'interféron humain bêta 1 (Hu IFN-81) et d'interféron gamma humain (Hu IFN- y). I Détection et exploitation thérapeutique des domaines ancestraux essentiels actifs biologiquement d'interfé- ron et des fragments ancestraux résultant d'interféron La détermination de l'homologie structurale de l'interféron (c'est-à-dire que la plupart des interfé- rons, sinon tous, possèdent des éléments structuraux com- muns sous forme de séquences d'aminoacides) sur un long temps d'évolution peut être prouvée comme l'indique la construction originale des modèles tridimensionnels re- présentés sur les figures Les modèles établissent des similitudes tertiaires étroites (tridimensionnelles) qui révèlent finalement la communauté des domaines (régions) formant le site actif, c'est-à-dire la partie de la molé- cule d'interféron qui donne l'activité biologique de la molécule entière sur la cellule cible, qu'il s'agisse d'une cellule de mammifère ou d'origine végétale. Les figures sont des représentations bidimen- sionnelles de modèles tridimensionnels, établiesd'après les données qui figurent dans le tableau I qui suit. 25313 1 3 TABLEAU I Caractéristiques de structures de IFN/l et'y r ip Lp r Ip t J Spires inverses y 3-6 1 il-29 0,88 0,99 e 912 1,35 0,77 0,75 y 27-30 1,38 1,01 0,86. e 32-35 1,14 0,92 1,00 y 43-46 1,21 0,91 0,79 -y 65-68 1,33 0 -98 0,84 7 I-74 1,44 0,84 0,74 Y 86-89 1,39 0,83 0,69 -113 1,12 0,80 0191 y 132-135 0,86 0,81 e 136-139 1 'l-8 0,85 1,01 Hélice a -y 8-1 6 1,13 1, 01 16-22 1,27 1,01 y 3 I-42 1,23 0,93 ff I-55 1,29 0,92 y 5 I-65 1,03 1,10 559-68 l'il 1,18 Y 95-100 1,10 0,89 9 l- 107 1,22 0,81 l 16- 12 l 1,09 0,89 Nappe y 103-121 1,14 1,15 123- 135 0,89 1,15 14 l-16 l 0,96 1,16 -y 47-60 1,04 1,25 559-68 1117 1,18 Les aminoacides sont considérés par quatre à la fois et la probabilité d'existence de certaines struc- tures ponfigurationnelles dans la molécule entière d'inter- féron est calculée Par exemple, l'existence de spires in- verses est calculée à l'aide des formules de Chou et Fasman (Annual Review 7 S of Biochemistry, vol 47, p 251-276, 1978). L'existence d'hélices alpha et de nappes ondulées bêta a été déduite de séries comprenant en moyenne 10 à 20 aminoacides consécutifs, avec les mêmes formules Pt dési- gne la probabilité d'une spire inverse, Pa la probabilité de formation d'une hélice alpha et PS la probabilité de formation d'une nappe ondulée bêta Les chiffres de la colonne de gauche correspondent à la position relative des résidus des aminoacides à partir de l'extrémité ter- minale aminée de la molécule d'interféron. La déduction globale et à grande portée de l'homologie structurale de l'interféron n'a jamais encore été déclarée ou publiée car elle implique la coalescence créative de certains faits connus et isolés et une déri- vation inductive supplémentaire tirée d'une nouvelle ap- proche effectuée par l'inventeur Cette approche, par mise en oeuvre de données comparativesde séquences de nucléotides, de données comparatives de séquences de pro- téines, de données de fréquence de mutation, de données configurationnelles et d'analyse de chaînes de Markov (toutes ces études étant réalisées pour diverses formes d'interféron)a conduit à la détermination des séquences génératrices ancestrales ou primordiales d'interféron qui sont capables d'assurer l'activité antivirale dans toutes les formes vivantes actuelles, notamment les espèces dispersées de vie végétale A partir de l'intérieur des séquences génératrices, une détermination supplémentaire a porté sur les constituants aminoacides de base En d'au- tres termes, ces séquences génératrices (ancestrales) qui sont présentes dans des molécules plus grosses, ne se rencontrent pas isolées dans la nature et peuvent pré- senter par elles-mêmes et en elles-mêmes une activité biologique et donner une résistance virale aux plantes, c'est-à-dire une résistance à la multplication des virus. L'inventeur a déterminé qu'une structure tertiaire incor- porée aux séquences est présentée même lorsque certains aminoacides subissent une mutation en arrivant à la molé- cule ancestrale ou gênératrice d'interféron qui n'existe manifestement plus dans la nature, car elle a subi une mutation il y a des millions d'années Seuls des vestiges, sous forme de séquences d'aminoacides essentiels ayant une activité biologique, existent dans la vie végétale et animale actuelle, notamment chez l'être humain. Les sites moléculaires voulus (c'est-à-dire les séquences d'aminoacides actives biochimiquement) des interférons peuvent être facilement isolés par une série de techniques disponibles et représentés soit sous forme génomique (J Bresser et D Gillespie, Analytical Bioche- mistry, vol 129, p 351, 1983) soit sous forme de pro- téines, le produit génomique étant exprimé sur un papier de nitrocellulose (Bresser et al, Proceedings National Academy Science, U S, sous presse, 1983; Bresser et al., DNA, sous presse, 1983) Ensuite, de nombreuses va- riantes disponibles de synthèse de peptides, en phase solide, peuvent être utilisées pour la création des frag- ments actifs de l'interféron, avec la valeur thérapeu- tique indiquée dans le présent mémoire Ainsi, la produc- tion synthétique de telles séquences d'aminoacides,par tout chemin (synthèse en phase solide ou technologie de l'acide désoxyribonucléique ADN recombinant dans les bactéries, la levure ou les cellules animales), entre dans le cadre de l'invention dans la mesure o elle est destinée à affecter avantageusement le fonctionnement des cellules végétales et à interrompre une pathologie virale. Les séquences essentielles d'aminoacides cor- respondent approximativement en général à 10 à 15 % de la longueur moléculaire normale des interférons, ayant une longueur de l'ordre de 25 à 45 aminoacides, en plus 11 * 3 X ou en moins, plutôt que la longueur habituelle d'environ 162 aminoacides constituants La détermination de ces éléments aminoacides essentiels(peptides) a été rendue possible par la déduction effectuée par l'inventeur et facilitée par analyse sur ordinateur de dizainesde milliers de-séquences théoriquement possibles de certains domaines ou de certaines régions de nombreux interférons différents conservés au cours, de l'évolution des vertébrés. L'emplacement absolu de ces régions varie d'une molécule d'interféron à une autre puisque certains interférons (par exemple l'interféron humain gamma) ont été raccourcis d'environ 10 à 15 % de leur longueur L'activité tridimen- sionnelle et non l'emplacement relatif à partir de l'extré- mité aminée de la molécule intacte,; est le facteur le plus important pour les fragments actifs. En plus des propriétés physicochimiques avanta- geuses, les séquences ou morceaux d'interféron sont aussi utiles au point de vue du coût car leur faible dimension permet leur production à grande échelle à une fraction du coût des molécules entières d&interféron et par divers procédés de fabrication, tels que la méthodologie de l'acide ADN recombinant, la synthèse en phase solide, etc comme noté précédemment. L 1 invention peut aussi être mise en oeuvre évidemment avec des molécules d'interféron de longueur entière, de synthèse ou naturelles (technologie de ADN recombinant dans des bactéries, de la levure ou des cel- lules animales) pourvu qu'elles contiennent les domaines actifs biologiquement nécessaires et ne présententpas d'amé- lioration moléculaire (habituellement des groupes carbo- hydratesou sucre) qui peuvent cacher le site actif biolo- giquement de la surface des cellules végétales ou autre- ment, par exemple par déformation rendant le domaine du site actif biologique relativement ou complètement inerte sur les cellules végétales Habituellement, la présence de chaînes auxiliaires encombrantes de groupes oligosaccharides périphériques ou d'âme empêche l'expression de l'activité de l'interféron entre espèces par un tel mécanisme direct ou configurationnel (voir-par exemple l'article de W Carter, in Life Sciences, vol 25, p. 717-728, 1979 et articles parus dans Pharmocology et Therapeutics, vol 8, p 359-355, 1980. II Doma ines actifs d'interféron Les gènes qui codent l'interféron ont été élevés sous forme de clones (comme décrit par exemple dans 1 'ar- ticle Derynk et al, Nature, volume 285 p 542-547, 1980). Ces gènes ont été mis sous forme de séquences (Goeddem et al, Nature, volume 290, p 20-26, 1980 et Derynk et al., Nature, volume 285, p 542-547, 1980) et la structure primaire de neuf des divers interférons a été déterminée. L'inventeur a déterminé, à l'aide de programmes d'ordina- teur, des domaines qui sont nécessaires à l'obtention de certaines propriétés biologiques (Gillespie et Carter, Handbook of Experimental Pharmacology of Interferon, sous presse) dans le système des interférons. Les séquences ancestrales d'aminoacides d'in- terféron qui montrent la réponse antivirale comprennent les séquences 2540 et 115-141 L'analyse des séquences publiées de gènes (Derynk et al et Goeddel et al) permet la détermination de l'existence de ces deux séquences ancestrales au moins dans chacun des interférons humains alpha et gamma Des analyses analogues à celle qui pré- cède s'appliquent à d'autres interférons animaux. Le domaine d'interféron déterminé comme es- sentiel pour la liaison à des récepteurs spécifiques des cellules comprend les aminoacides 115 à 141 (Gillespie et Carter, 1982) La position de ce domaine est déterminée en partie ou facilitée par l'homologie avec une région du sous-motif B de la toxine du choléra (Lai, Journal Biol Chem volume 252 p 7249-7256, 1977) qui est une substance qui concurrence l'interféron dans la liaison aux récepteurs cellulaires. Il faut noter que d'autres fragments ances- traux différents de ceux qui sont identifiés précédemment, existent dans la nature, et l'invention n'est pas limitée aux seuls fragments ancestraux indiqués L'invention con- cerne le traitement des plantes par des molécules conte- nant des fragments ancestraux ou par de tels fragments eux-mêmes L'identification de fragments supplémentaires est à la portée de l'homme du métier. III Préparation de morceaux d'interféron ayant des do- maines choisis On peut préparer des morceaux d'interféron de plusieurs manières Par exemple, on décrit maintenant un procédé convenable Cependant, d'autres moyens tels qu'une modification chimique d'interféron naturel ou une modification chimique d'interféron entier de clones (de synthèse), des inducteurs d'interféron, etc sont bien connus et entrent dans le cadre-de l'invention. * Des gènes d'interféron de clones peuvent être découpés à des emplacements choisis avec des endonucléases réductrices spécifiques Le fragment résultant de gènes d'interféron, assurant le codage d'un morceau de poly- peptide d'interféron, peut être associé à un vecteur d'ex- pression contenant un promoteur de polymérase de ARN, un site de liaison de ribosome, un codon d'amorçage ou n'importe quel autre signal qui peut être nécessaire. Cet ADN recombinant peut être introduit dans des cel- lules hôtes convenables pour la synthèse du morceau d'in- terféron. Dans un exemples on utilise le procédé suivant pour l'expression dans un hôte d'un fragment de gène d'in- terféron humain 5 microgrammes du gène d'interféron hu- main bêta, "accrochés" à du poly A d T et appartenant à un clone dans p BR 322, subit une incubation à 37 WC pen- dant 2 heures avec 50 unités d'Endo R P 1 dans une solu- tion 2 Om M tris, p H 7,4, 10 m M Mg C 12, 50 m M (NH 4)25 04 et mg/cm 3 d'albumine de sérum bovin afin que le gène d'interféron soit clivé et laisse une extrémité à un seul brin à partir des bases 203-206 L'acide ADN est mis à 0,3 M dans de l'acétate de potassium et précipité à l'aide d'éthanol Le ADN est dissous dans 100 cm 3 de phosphate de potassium 50 m M, p H 7,4, 6,7 m M de Mg C 12, 1 m M de mer- captoéthanol, 35 m N de désoxyadénosine et de désoxycyti- dine, et 25 unités de l'extréPmité formant le fragment de Klenow de la polymérase ADN de Escherichia coli Le ADN est mis à une concentration de 0,3 m N dans l'acétate de potassium et précipité à partir de l'éthanol, Le pré- cipité est dissous dans 100 cm' d'acétate de sodium 30 m M, p H 4,6, 50 m M de Na Clj 1 m M de Zn SO 4, 5 % de glycérol et 25 unités de nucléase 51 avant incubation à 37 C pen- dant une heure Ces opérations forment un fragment de gène d'interféron ayant une extrémité émoussée allant jusqu'au nucléotide 204, le premier défini en mot codé pour la leucémie en position 45 L'acétate de sodium est ajouté jusqu'à 0,3 M et le ADN est précipité à partir d'éthanol. On fait incuber séparément 5 g de gène d'in- terféron bêta humain "accroché" à du polyd A d T et d'un clone dans p BR 322, à 37 'C pendant 2 heures avec 50 unités de Endo R Mbo II dans une solution 10 m M tris, p H 7,9, 6 m M de K Cl, 10 m M de Mg Cl 2, 1 m M de dithiothreitol et mg/cm 3 d'albumine de sérum bovin Le ADN précipite à -partir d'éthanol et est traité avec la nuclé- ase 51 comme décrit précédemment Le fragment d'extrémité émoussée de la paire de bases 288 contenant les nuc 11 o- tides 401 à 698 du gène de l'interféron est purifié par électrophorèse dans une solution à 3 % d'agarose Une quantité de 0,25 mg de ce fragmentest incorporée à 5 g de ADN traité par Pstl, et de ADN traité par une polymé- rase et traité par une nucléase Sl. Le ADN recombinant ainsi formé contient un gène d'interféron n'ayant pas les nucléotides 205 à 400 qui codent un polypeptide d'interféron n'ayant pas les aminoacides 46 à 111. Ce fragment d'interféron recombinant peut être introduit dans de nombreux vecteurs convenables afin qu'il soit exprimé dans des cellules de bactéries ou de mammifères à l'aide de techniques classiques L'interféron ou des morceaux d'interféron peuvent êtrepurifiés par une métho- dologie bien connue,, bien que l'invention puisse être mise en oeuvre avec des interférons dont la pureté est inférieure à 1 %, pourvu qu'aucune substance nuisible par ailleurs ne soit présente Par exemple, des protéines en solutions contenant de l'interféron sont liées dans du bleu sépharose "Cibachrom" en présence d'éthylèneglycol ou de propylèneglyco I La colonne est lavée avec diverses solutions qui retirent la plupart des protéines, sauf l'interféron, et celui-ci subit une élution avec des so- lutions contenant de l'éthylèneglycol ou du propylèneglycol ou d'autres agents éluants convenables (Carter et al, Pharmacology and Therapeutics, volume 8, p 359-377, 1980)4 Le cas échéant, une autre purification de fractions dans le bleu "Cibachrom" ou d'autres matières peut être réa- lisée par circulation de solutions contenant l'interféron sur des matrices de colonne contenant des anticorps-anti- interféron, par utilisation de conditions classiques de liaison et d'élution. Le ADN recombinant décrit précédemment peut être préparé avec certains ou la totalité des mêmes en- zymes dans des conditions différentes ou suivant des sé- quences différentes ou à l'aide de variantes des enzymes et gênes d'interféron précités D'autres ADN recombinants convenables peuvent être formés avec d'autres enzymes et d'autres protocoles Enfin, l'utilisation de ADN recom- binant pour l'obtention de morceaux d'interféron n'est qu'un exemple d'un moyen de création d'un morceau d'in- terféron D'autres moyens tels que la synthèse à l'état solide, la coupure protéolytique de matière ou d'inter- féron de clones génétiques préparés dans des bactéries et de la levure peuvent être utilisés de manière équiva- lente. IV Modification de plasma germinatif de plante, destinée à donner une plante ayant une résistance héréditaire aux infections virales L'inventeur a déterminé que des plantes pro- duisant des concentrations élevées d'interféron végétal et humain ont une bonne résistance à tout un spectre d'agents pathogènes Ainsi, l'invention concerne un pro- cédé de création d'une telle plante La nouvelle plante créée par le procédé suivant est génétiquement nouvelle. Le procédé comprend A la formation de clones de gènes d'interfé- ron humain et végétal dans de l'ADN recombinant, B l'insertion de 1 ' ADN recombinant dans des protoplastes et l'isolement de cellules qui synthétisent des concentrations élevées d'interféron végétal et humain, et C la production d'une plante mûre à partir des protoplastes. Dans un exemple, on a utilisé la plante de tabac Nicotiana et on la décrit à titre de prototype. A Clones d'interféron humain et végétal Comme indiqué précédemment, on a formé des clones de gènes d'interféron humain (par exemple Derynck et al, supra) On peut utiliser plusieurs procédés clas- siques pour la formation analogue de clones de gènes d'in- terféron végétal; il faut évidemment une sonde conve- nable destinée à déterminer le ADN recombinant Une sonde qui peut être utilisée à cet effet est la partie très conservée de l'interféron humain ou du gène contenu dans les nucléotides 345 à 423 par exemple (Gillespie et Carter 1982, Handbook of Experimental Pharmacology of Interferon, sous presse) D'autres sondes qui conviennent peuvent aussi exister Le point important est que l'invention n'est pas tirée de la section des procédés utilisés pour la formation du clone des gènes d'interféron végétal mais est plutôt tirée de l'originalité génétique et des carac- téristiques avantageuses améliorées de la plante finale. B Insertion de ADN recombinant dans des pro- toplastes de Nicotiana et isolement de cellules qui syn- thétisent des concentrations élevées d'interféron végétal et humain A l'aide des procédés d'analyse décrits dans le présent mémoire pour l'interféron humain, on peut faci- lement déterminer des séquences ancestrales comparables dans divers interférons animaux ou végétaux Les méthodes décrites dans le présent mémoire pour l'isolement de frag- ments de gènes et l'insertion et l'expression résultante mettent en oeuvre des procédés comparables et, dans cer- tains cas 2 identiques à ceux qui sont décrits pour les séquences ancestrales des interférons humains bêta et gamma Des protoplastes peuvent être formés et ADN peut être introduit dans les protoplastes par des techniques classiques (Bourgin et al 1979 Physiol Plant 45/288-292; Caboche, M; 1980 Planta 149:7-18; Cocking et al 1981, Nature 293:265-270) La difficulté qui se manifeste est que peu de ADN recombinant s'introduisent d'eux-mêmes dans les chromosomes des plantes-et ne deviennent donc pas une partie stable du matériau génétique végétal Le plasmide Ti ADN de Agrobacter (Dravey et al 1980 Pi. Sci Lett 18/307-313; Wullems et al 1979; Adv Protoplast Res Proc Sth Symp:407-424) est une exception, mais ce plasmide a plusieurs caractéristiques défavorables. Parmi les problèmes posés, il faut noter que le ADN de plasmide Ti est trop gros, les ADN introduits dans ce plasmide n'expriment pas les protéines convenables et les cellules infectées par le plasmide ne se développent pas convenablement Le plasmide de ADN Ri de Agrobacter per- met un développement convenable des plantes, mais con- serve les autres propriétés indésirables. On peut utiliser, pour l'insertion de ADN étrangers, dans les chromosomes de Nicotiana, le plasmide suivant: le plasmide p BR 322 de Eo Coli peut être modifié afin qu'il contienne deux copies inversées en tandem d'un court ADN répété et imbriqué de Nicotiana Ce plasmide contient seulement un site Eco R 1, placé à la jonction entre les deux séquences répétées Nicotiana Le plasmide est ouvert avec Eco R 1, et les gènes d'interféron végétal et/ou humain peuvent alors être introduits dans le plas- mide Dans une variante, p BR 322 contenant d'autres sé- quences végétales ou d'autres vecteurs tels que les plas- mides Ti et Ri de Rhizobium peuvent être utilisés. De nombreuses copies du plasrcide contenant un gène d'interféron végétal peuvent être introduites dans des protoplastes de Nicotiana par microinjection, précipitation au phosphate de calcium 1 infection par Agro- bacter, fusion de protoplaste, etc Les protoplastes trans- formés peuvent se propager sous forme de cellules végétales et peuvent être détectés par hybridation moléculaire in situ en ADN de chromosomes avec une sonde p BR 322 De telles cellules induites avec poly I:C peuvent être tes- tées afin qu'elles donnent des concentrations accrues de m ARN d'interféron végétal par hybridation in situ à l'aide d'un gène d'interféron de plante pure comme sonde. De telles cellules donnant des concentrations élevées de m ARN des plantes peuvent être testées afin qu'elles donnent une synthèse améliorée d'interféron végétal par le test biologique classique du facteur de croissance antiviral. Des cellules de Nicotiana donnant des concentra- tions élevées d'interféron végétal peuvent être retrans- formées en protoplastes et transformées comme indiqué précédemment par lesdits vecteurs qui contiennent alors des gènes d'interféron humain Les protoplastes transfor- més peuvent se propager sous forme de cellules végétales et peuvent être testés afin qu'ils possèdent des concentra- tions accrues de m ARN et de protéines d'interféron végétal et d'interféron humain par hybridation moléculaire in situ et pour la détermination biologique du facteur de croissanceantiviral Ces protoplastes transformés peuvent alors être cultivés sous forme de plantes mûres de tabac. Plus précisément, le procédé peut être mis en oeuvre de la manière suivante. Des protoplastes peuvent être isolés à partir de Spp Nicotiana selon Chupeau et al (C R Acad Sci. Ser; D (Paris) 278:1565-1568, 1974) Des feuilles stérili- sées peuvent être séparées par pelage et incubées dans le milieu T ( 10,3 m M NH 4 NO 3, 9,4 m M KNO 3,1,5 m M Ca C 12 7 H 20, 0,75 m M Mg SO 4 7 H 20, 0,62 m M KH 2 PO 4, 0,1 m M Fe SO 4 7 H 20, 0,1 m M Na 2 EDTA, 16 m M H 3 BO 3, 0,6 m M Mn SO 4 H 20, 3,5 m M Zn SO 4 7 H 20, 0,2 m M Cu SO 4 5 H 20, 0,22 m M Al C 13, 0,13 m M Ni C 12 6 H 20, 8 g M Nicotinique acide, 2 g M pantho- ténate de Ca, 0,04 m M de Biotine, 16,1 LM d'acétate naph- talénacétique, 4,4 LM de 6-benzyladénine, 58 m M de sac- charose, 440 m M de mannitol), ne contenant pas de saccha- rose et contenant 0,02 % de macérozyme R 10, 0,1 % de cel- lulase "Onozuka" R 10 et 0,05 % de drisélase Les proto- plastes libérés peuvent être lavés par centrifugation faible vitesse dans le milieu TO D'autres procédés d'isolement de protoplastes peuvent être utilisés dans la mesure ou ils permettent l'isolement de cellules via- bles séparées n'ayant pas de parties importantes de leur paroi cellulaire. Les protoplastes spp Nicotiana peuvent être incubés avec des gènes d'interféron portant de l'ADN vec- teur transformateur ou avec des bactéries contenant un tel ADN, suivant un certain nombre de procédés classiques de transformation (Davery et al 1980 Pl Sci Lett. 18; 307-313; Willems et al 1979, Adv Protoplast Res Proc. Re symp:407-424) Un tel ADN vecteur peut être un plas- mide E Coli contenant des séquences végétales répétées comme décrit précédemment ou tout autres ADN vecteur qui peut se propager dans un microorganisme et peut s'inté- grerà des chromosomes de protoplastes. Des protoplastes transformés peuvent être cul- tivés dans le milieu TO à 25 C à l'obscurité pendant 4 jours puis transférés sous des lampes fluorescentes ( 2500 lux, 16 heures par jour) Lorsque 30 à 60 % des protoplastes se sont divisés une fois, ils peuvent être collectés par centrifugation et lavés une fois dans le milieu AG 110 m M KNO 3, 3 m M Ca C 12 2 H 20, 3 m M Mg SO 4 7 H 20, 1 m M KH 2 PO 4, 0, 1 m M Fe SO 4 7 H 20 O, 0,1 m M EDTA, 49 m M H 3 BO 3, 1,8 m M Mn SO 4 H 20, 10,4 m M Zn SO 4 7 H 20, 0,04 m M Co C 12 6 H 20, 0,36 g M Cu SO 4 5 H 20, 0,41 M Na Mo O 4 2 H 20, 0,66 LM AIC 13, 0,40 m M Ni C 12 6 H 20, 0, 18 u M KI, vitamines comme dans milieu Te, 0,53 FM d'acide naphnalénacétique, 4,4 g M de 6-benzyladénine, 58 m M de saccharose, 440 m M de mannitol, 1 m M de glutamine) Les cellules peuvent être revêtues sur des boîtes de Pétri dans le milieu AG (Caboche, Planta 149:7-18, 1980) Les boîtes peuvent alors subir une incubation dans des conditions lumineuses nor- malisées à 25 C dans des boites transparentes et bien fermées et, dans ces conditions, les protoplastes trans- formés forment des colonies. Les colonies individuelles peuvent alors être prélevées, retransformées en suspensions de protoplastes simples et utilisées comme germes sur des boîtes de Pétri formant des répliques dans le milieu*AG Les boites de répliques peuvent être évaluées pour l'expression des gènes d'interféron ou vecteurs par les essais suivants: 1) la présence de séquences spécifiques de ADN par hybri- dation moléculaire (Robins et al 1981 J Molec; Appl. Gen 1:191-203), 2),la présence de segments transcrits de ARN spécifique par hybridation moléculaire (Brahic et Haase 1978 Proc Nat Acad Sci, USA 75:6125-6129) et/ou 3),la présence d'un excès de protéines d'interféron par analyse immunologique ou biologique (Sela 1982 Inter- feron Sci Memo, Memo n Ia 1134, janvier) D'autres ana- lyses utilisées pour la protection d'interféron en excès peuvent convenir. C Production d'une plante mûre de tabac à partir de cellules de plantes manipulées génétiquement. Des colonies présentant une présence et une expression de nouveaux gènes d'interféron peuvent être cultivées dans le milieu AG pendant 1 à 2 mois puis déposées sur un milieu solide R 4 afin que les bourgeons soient régé- nérés (Bourgin et al 1979 Physiol Plant 45:288-292). Les bourgeons produits peuvent être transférés sur un milieu B de formation de racines afin qu'ils constituent des petites plantes (Bourgin et al 1979 Physiol Plant. :288-392) Les petites plantes ayant des racines peuvent être empotées-et cultivées à maturité en serre D'autres procédés de transformation de cellules végétales trans- formées séparées en petites plantes mûres peuvent aussi être utilisés. La production d'interféron et la résistance au virus de la mosaïque du tabac (Sela 1981 Adv Vir. Res 26:201-234) ou à d'autres agents étrangers des pe- tites plantes peuvent être vérifiées par les procédés classiques d'évaluation Des souches résistant aux mala- dies et produisant des quantités importantes d'interfé- rons peuvent être choisies et propagées sexuellement par tout moyen commode et efficace. Le protocole précité n'est donné qu'à titre d'illustration de la faisabilité du procédé de construc- tion de cette plante génétiquement nouvelle, ayant des caractéristiques souhaitables Evidemment, dans ce do- maine qui varie rapidement, de nombreuses variantes du procédé peuvent donner satisfaction sans sortir du cadre de l'invention. V Application locale Comme indiqué précédemment, les agents théra- peutiques selon l'invention peuvent être appliqués lo- calement par de très nombreuses techniques allant des plus simples (par exemple-d l'aide d'un arrosoir dans une s Oerre) au plus compliqué de centaines ou de milliers d'hectares de récolte). Le procédé le plus avantageux de mise en oeuvre de l'invention dépend de facteurs biologiques aussi bien que mécaniques au moment du traitement des plantes; par exemple, la protection permanente de graines est assurée de préférence par altération du plasma germinatif à l'aide d'un nombre accru de copies d'interféron (gènes d'inter- féron végétal et Jou animal) Dans une variante, le sau- poudrage des récoltes est avantageux pour la protection des plantes occupant déjà une grande surface dans les champs Dans ce cas, des conditions locales particulières (concernant notamment la stabilité moléculaire, l'effet des vents transversaux, etc, le fait que les consti- tuants ancestraux de l'interféron sont déversés par un aéronef volant à faible altitude) doivent aussi être pri- ses en considération de même que des caractéristiques biochimiques (considérations du rendement de prélèvement par les structures des cellules des feuilles jeunes ou mures et sénilesi Dans de tels cas, le mode de réalisa- tion le plus avantageux met en oeuvre des constituants de poids moléculaire relativement réduit, ayant une plus grande stabilité thermique et physique et donnant de meil- leures propriétés de prélèvement cellulaire et de liaison au récepteur Les oligonucléotides ancestraux dirigés par l'interféron et les peptides formant des fragments d'interféron sont des exemples de motifs actifs résistant relativement bien à la chaleur et aux tourbillons et qui sont obtenus selon l'invention. Lors d'une application locale, un interféron au moins ou une autre substance contenant une séquence ancestrale (ou un inducteur) est dispersé dans un véhicule ou support convenable acceptable en agriculture, tel que de l'eau, c'est-à-dire que l'application s'effectue en solution La concentration peut être comprise entre environ 0,0001 et 100 000 UI (unité internationale de référence) par centimètre cube de solution Lorsqu'il est souhaitable que 1 ' interféron soit appliqué en poudre sèche, dans une appli- cation par saupoudrage, une plage de concentrations pon- dérale comprise entre environ 1 ppm et une partie en 1015 et 1016 parties est efficace lorsque l'interféron est ajouté à un véhicule sec acceptable en agriculture. Des véhicules convenables sont bien connus dans la techni- que du saupoudrage sur les récoltes L'interféron peut être mélangé ou combiné à d'autres agents de traitement des plantes tels que des pesticides, des herbicides, des engrais, etc, pourvu qu'aucun des agents supplémentaires n'affecte l'activité biologique de la séquence ancestrale. La concentration-finale de l'interféron ou d'une autre substance ancestrale dépend de la récolte pro- tégée, du virus contre lequel la protection est voulue et des conditions ambiantes La concentration finale peut aussi varier avec la fraction moléculaire (c'est-à-dire la fraction de la molécule) qui n'est pas ancestrale. Par exemple, dans un fragment d'interféron de synthèse qui ne comprend pratiquement que là séquence des amino- acides 115-141, la fraction moléculaire de matière non ancestrale est proche de zéro Au contraire, dans les molécules d'interféron entier, la fraction moléculaire de la matière non ancestrale est d'environ 0,6, c'est- à-dire que 60 % environ de la molécule d'interféron en- tier (par exemple interféron humain) ne sont pas ances- traux. Un exemple d'application d'interféron à des récoltes correspond par exemple à une concentration de une partie par milliard (il faut noter que, pour l'inter- féron, 1 mg correspond à 108 unités internationales environ) Dans le cas d'une application en surface (né- cessitant environ 0,94 m 3 par hectare)-, il faut moins de 1,25 mg d'interféron humain entier par hectare Le saupoudrage des récoltes, nécessitant un volume corres- pondant au cinquième ou au dixième d'une application en surface, nécessite des quantités comparables d'inter- féron ou éventuellement moins suivant l'efficacité de l'application locale. Dans certaines circonstances cependant, il peut être souhaitable de donner une stabilité supplémen- taire à l'interféron ou à ses fragments ancestraux afin qu'ils puissent mieux résister aux rigueurs de l'applica- tion et à une exposition qui peut être prolongée aux élé- ments atmosphériques On considère maintenant ce mode de réalisation. L'interféron, comme d'autres protéines, est un produit chimique relativement labile La solubilité en solution aqueuse et l'activité biologique dépendent de l'orientation tridimensionnelle particulière des di- vers aminoacides formant un arrangement linéaire (voir figures la et 1 b) Plus précisément, des domaines de la molécule d'interféron responsable de la liaison à des cellules et de la présentation des réponses biologiques complexes doivent être exposés et alignés convenablement. Cependant, un vaste arrangement d'autres orientations non fonctionnelles est aussi possible et peut se former librement Ces autres états sont encouragés par la cha- leur, certains produits chimiques externes et un stockage prolongé. Une solution pour la prévention de la forma- tion des autres états inactifs est la construction de molécules présentant l'activité de l'interféron mais n'ayant qu'un nombre limité d'autres états, tels que les fragments d'interféron décrits précédemment Une autre solution, mise au point par l'inventeur, est la restric- tion de la formation des autres états par immobilisation de l'interféron sur une structure ou molécule formant -un véhicule ou support. Des enzymes actives sont souvent rencontrées comme partie de structures complexes, sous forme fixée à des membranes cellulaires, des acides nucléiques, des protéines, etc, et les enzymes sont habituellement plus stables à l'état complexé L'inventeur a évalué la faisa- bilité d'un tel procédé par construction de plusieurs ma- trices de colonnes contenant divers ligants pouvant cons- tituer des agents stabilisants actifs {voir figure 2, Carter et al, 1980, Pharmac Ther 8:359-377) La colonne était caractérisée par de l'albumine qui y était fixée. cm 3 d'une préparation d'interféron non dialysée, con- tenant 11 500 unités et 0,99 mg de protéines par centi- mètre cube, étaient appliquées* sur une colonne à l'aide d'une pompe péristaltique avec un débit de 60 cm 3/cm 2 et par heure La colonne d'albumine était mise en équilibre avec du phosphate de sodium 0,02 M (p H 7,4) contenant Na Cl 0,15 M L'éluant de la colonne était divisé par un dispo- sitif séparateur avec un rapport 1/9 La partie formant % de l'éluant était collectée dans 1 cm 3 d'une solu- * tion à 1 % d'albumine de sérum bovin contenant 0,02 M de phosphate de sodium et 0,15 M de Na Cl, et était uti- lisée pour la détermination de l'activité de l'interféron. La partie formant 90 % de l'éluant était utilisée pour la mesure de la concentration des protéines Les frac- tions ayant traversé contenaient 98 % environ des pro- téines appliquées et moins de 1 % de l'activité de l'in- terféron appliqué Une élution supplémentaire de la co- lonne était réalisée avec 50 % (en volume/volume) d'éthy- lèneglycol et 50 % de phosphate 0,04 M (p H 7,4) et Na Cl 0,30 M Le reste de l'activité d'interféron ( 86 %) était récupéré avec une très faible quantité de protéines ori- ginales a été récemment publiée (Carter, W A, Methods in Enzymo- logy 78; 576-582, 1981). L'expérience précédente montre que l'interfé- ron peut être couplé à de l'albumine du sérum alors que la pluspart des autres protéines cellulaires ne le peuvent pas Des expériences effectuées avec d'autres protéines immobilisées telles que le cytochrome C, ont montré que l'interféron avait la propriété générale de se combiner avec des protéines L'inventeur a fait l'hypothèse selon laquelle la nature hydrophobe puissante de l'interféron favorise les interactions avec des poches hydrophobes ordinairement séquestrées d'autres protéines, et cette expérience suggère la précision de cette hypothèse Quel que soit le mécanisme, l'expérience précédente a encouragé la mise au point de complexes avec des protéines pour la stabilisation de l*'interféron. Le procédé mis au point par l'inventeur à cet effet est le suivant De l'interféron humain peut être préparé par tout procédé classique à partir de toute sour- ce biologique; des cellules humaines, des microorganismes recombinants, etc Après purification, l'albumine de sé- rum humain ou un autre véhicule contenant les protéines peut être ajouté en excès, habituellement jusqu'à 3 mm/cm 3. La solution peut être dialysée à l'aide d'une solution saline tamponnée par un phosphate ou un autre tampon con- venable, et la matière peut alors être liophylisée Dans un exeple, un million d'unités d'interféron purifié sont liophylisés avec 3,46 mg de phosphate de sodium. Diverses modifications de ce procédé convien- nent dans ce domaine qui évolue rapidemant Les protéines vêhicules autres que l'albumine ou le cytochrome C sont acceptables D'autres molécules ou structures véhicules peuvent aussi être acceptables telles que des lipides, de petits ligands hydrophobes, des fragments de membranes ou même des particules solides, D'autres dispositifs de fixation tels que des liaisons ioniques ou covalentes, peuvent aussi convenir D'autres sels ou tampons ou d'au- tres concentrations de sels ou tampons (en particulier absence de sel ou de tampon) peuvent aussi être accepta- bles Cependant, il est évident que le procédé stabilise l'interféron visà-vis des changements configurationnels externes, notamment la dénaturation due aux effets par exemple des vents latéraux et des éléments atmosphériques. L'application locale d'interféron humain à des plantes est en général efficace dans la lutte contre la propagation du virus d'une plante à une autre Ceci est démontré par infection systématique de jeunes feuilles de pomme de terre par le virus N de la pomme de terre ou le virus de la tordeuse des feuilles du tabac Des disques sont perforés dans les feuilles et cultivés pen- dant 7 à 10 jours à 25 C dans un milieu nutritif ne con- tenant pas d'interféron humain alpha ou en contenant. Après cette incubation, les feuilles sont broyées dans 1 % de Brij 35 et la matière particulaire est retirée par centrifugation La quantité de protéines virales est déterminée par analyse immunologique (ELISA), la mesure du virus étant la mesure de la densité optique Des va- leurs élevées de la densité optique correspondent à des quantités importantes de virus Les résultats figurent dans le tableau II qui suit. TABLEAU II Arrêt de la propagation de virus de la pomme de terre par Hu IFN-y Jours d'in Unités/cm 3 de Hu IFN-y Virus cubation O 100 1000 Virus N de la 7 0, 519 0,342 0,184 pomme de terre Virus N de la 10 1,331 0,702 0,838 pomme de terre Virus de tordeuse 10 0,673 0,298 0,254 Comme l'indiquent les résultats, l'interféron a un effet antiviral prononcé sur les plantes, bien que l'interruption de l'action virale paraisse plafonner, c'est-àdire que, dans la plage étudiée, l'interruption de l'action virale n'augmente pas-linéairement avec l'aug- mentation de la concentration de l'interféron En outre, bien que l'application locale ralentisse considérablement le virus, cet effet diminue quelque peu au cours du temps, indiquant que les applications répétées peuvent être néces- saire à intervalles réguliers, par exemple'tous les 10 à 15 jours L'inventeur a déterminé de façon importante que l'application périodique d'interféron à des plantes infectées par des virus empêche la progation des virus dans ces plantes et empêche aussi la transmission des virus de ces plantes à des plantes non infectées L'inven- teur a obtenu des séries de photographies des feuilles pendant les expériences avec l'interféron humain, indiqué précédemment, et a noté que les feuilles croissaient et se développaient en même temps que le cycle vital des virus était interrompu. Et 1 ant donné les rendements accrus de récoltes dus à l'application locale, associés au fait que de très faibles puretés de l'interféron suffisent (c'est-à-dire que les procédés coûteux de purification ne sont pas né- cessaires)7 les applications répétées sont envisageables d'une manière très rentable Par exemple, d'après ces expériences, l'inventeur estimequ'une serre ayant une surface d'environ 9,3 m 2, peut être protégée pour 75 francs par mois environ aux prix actuels L'interféron, quelle que soit sa pureté, peut être administré pourvu qu'il satisfasse à la condition qu'il ne contienne pas d'orga- nismesvivantspouvant contaminer (bactéries, etc) ou d'agents viraux intacts pour pourraient induire une cytopathologie dans les plantes ou une pathologie dans les consommateurs finaux, qu'ils soient animaux ou humains Apres des opéra- tions convenables-de décontamination telles que la retenue d'organismes vivants sur des filtres, de tels lots d'inter- férons sont utiles selon l'invention, bien-qu'ils puissent être rejetés pour les applications cliniques humaines. En outre, l'expression "application Iocale" recouvre aussi l'application de substances appelées "induc teurs" qui, bien qu'elles ne constituent pas elles-mêmes des molécules d'interféron, ont 11 a propriété de jouer le rôle d'un déclencheur biologique forçant un organisme produisant de l'interféron à produire son propre interféron en un-intervalle de temps court par rapport à celui qui serait nécessaire en l'absence de l'inducteur appliqué. Les principaux sont les acides désoxyribonucléiques ds AR Ni désappariés qui sont de puissants inducteurs d'interféron mais qui présentent quelques effets auxiliaires toxiques dans le cas des êtres humains Le mode biologique de fonc- tionnement de ces substances et leur liste figurent dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4 103 641 Des- acides ds ARN sont aussi efficaces dans le cas d'éléments du règne végétal et peuvent être appliqués de la même manière qu'indiquée précédemment pour les molécules d'in- terféron ou des éléments biologiquement actif de telles molécules La plante n'a pas obligatoirement subi des manipulations génétiques Il suffit qu'un acide ds ARN particulier induise la formation d'une molécule ayant une séquence essentielle active biochimiquement (amino- acides) qui donne une réponse analogue à celle de l'inter- féron Comme indiqué précédemment, ce critère indique que la plante doit contenir une séquence de polynucléotides assurant le codage d'une séquence d'aminoacides actifs biologiquement Le fait qu'une espèce végétale particu- lière satisfait à ce critère peut être déterminé par quelques expériences simples, c'est-à-dire par applica- tion locale d'un ou plusieurs acides ds ARN à des plantes intéressantes et par détermination, de manière connue dans la technique, du facteur de croissance antivirale. Dans une variante, un test d'aptitude à induire l'inter- féron peut être mis en oeuvre avec la technique d'hybrida- tion in situ illustrée par l'inventeur à propos de la plante Nicotiîa. En outre, il existe une série de substances appelées"'médiateurs intracellulaires"' dont un exemple est l'acide 2 ',5 '-oligoadénylique et/ou un dérivé fonc- tionnellement actif d'un tel médiateur qui sont aussi utiles comme agents d'application locale Le mécanisme biochimique exact du fonctionnement de ces composés n'est pas connu mais on sait qu'il simule l'effet de l'interfé- ron par exposition à un virus, remplaçant en fait la né- cessité de l'utilisation de l'interféron L'inventeur a déterminé que ce mimétisme peut être étendu aux plantes. On peut aussi utiliser des éléments analogues, notam- ment le 2 '-5 ' oligoadénylate (déphosphorylé),le 3 '-5 ' oligoadénylate et le 2 '-5 ' oligoadénylate-cordécypine ( 3 '-désoxyadénosine) - La plage de concentrations utiles pour l'ap- plication des acides ds ARN (tels "Ampligen" de HEM Re- search, Rockville, Maryland, Poly -I poly C) est comprise entre environ 0101 et 1 000 g/cm 3 en solution aqueuse. La plage de concentrations utiles pour l'application des médiateurs intracellulaires est comprise entre environ 0701 et 100 900 nanomoles par centimètre cube en solu- tion aqueuse. Un mode de réalisation avantageux concernant l'application locale comprend la combinaison, en général sous forme d'un mélange physique bien que des applications séparées suffisent aussi, d'un d'interféron ou d'un frag- ment essentiel ou d'un inducteur d'une telle matière, avec une substance qui chasse les insectes, notamment les aphides, afin qu'ils ne se posent pas sur la Dlante et ne Jouent pas lerôle d'un vecteur qui propage le virus Ain- si, les insectes tels que les aphides représentent peut- être le mode principal de transmission des virus, alimen- tant de nombreuses plantes en des temps relativement courts et échangeant la matière infectée et les tissus sains des plantes que les aphides réinfectent alors, avec échange avec d'autres plantes saines et ainsi de suite suivant un cycle indéfini La combinaison d'une substance capable de donner une réponse analogue à l'interféron à une subs- tance qui bloque les insectes, (c'est-à-dire les chasse) permet le montage d'une attaque efficace et double contre la propagation des virus Ainsi, la première partie de l'attaque empêche les insectes de choisir la plante trai- tée Si cette attaque ne convient pas, la matière végétale infectée par les virus échangés par l'insecte avec une plante saine est combattue par la substance qui donne la réponse de l'interféron humain. En particulier, des substances particulièrement efficaces pour chasser les vecteurs formés par les insec- tes (et notamment les aphides) et qui sont compatibles chimiquement avec les interférons sont les substances qui sont des hormones appelées pyrèthres et phéromones. Les pyrèthres sont des substances naturelles dérivées par exemple des chrysanthèmes Les phéromones sont aussi des substances naturelles tirées des patates sauvages. L'interféron mélangé à l'une de ces substances hormonales naturelles ou avec les deux et appliqué sépa- rément ou en même temps que ces substances forme une com- binaison ou bien qui chasse efficacement les insectes dans le premier cas ou bien qui empêche la propagation du virus par les insectes qui viennent au contact de plan- tes saines, malgré la substance destinée à les chasser. L'agent de blocage et l'agent antiviral se renforcent ainsi au niveau biochimique et, pendant leur biodégrada- tion finale, ils ne laissent pas de résidus ou d'impuretés nocifs pour le milieu. Ä 531313 L'interféron peut être administré en combinai- son avec les concentrations indiquées précédemment (par exemp le 0,0001 à 100 000 unités internationales par centi- mètre cube de solution) Les pyrèthres et/ou les phéromones sont administrés à raison d'environ 0,005 à 12 kg/ha. Ainsi, un procédé comprend simplement la combinaison des concentrations voulues d'interféron (ou de fragments, d'inducteurs, etc) avec le pyrèthres tula phéromone et un véhicule convenable (par exemple de l'eau ou un véhi- cule sec acceptable en agriculture), et l'application en solution. Il est bien entendu que l'invention n'a été décrite et représentée qu'à titre d'exemples préféren- tiels et qu'on pourra apporter toute équivalence technique dans ses éléments constitutifs sans pour autant sortir de son cadre. REVENDICATIONS 1 Procédé de protection des plantes contre les agents pathogènes, caractérisé en ce qu'il co-;rend le traitement des plantes afin qu'elles présentent une ré- ponse analogue à celle d'un interféron. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent pathogène est un virus. 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la réponse est provoquée par modification géné- tique des plantes afin qu'elles produisent au moins une substance qui donne une réponse analogue à l'interféron. 4 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ladite substance est choisie dans le groupe qui comprend les molécules entières d'interféron et les fragments moléculaires contenant des séquences ancestrales d'aminoacides. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la'modification génétique est assurée par inser- tion dans les cellules des plantes d'un gène humain assu- rant le codage de la production d'au moins un composé contenant au moins une séquence ancestrale d'aminoacides. 6 Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'introduction dans les cellules de la plante d'un gène végétal de codage de la production d'interféron végétal ou d'une molécule conte- nant une séquence ancestrale d'aminoacides. 7 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la réponse est créée par application locale aux plantes, d'une substance comprenant au moins un com- posé contenant une séquence ancestrale d'aminoacides. 8 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit composé au moins est stabilisé contre une dénaturation. 9 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la substance contient, comme dit composé, des molécules entières d'interféron. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la substance contient, comme dit composé, une partie d'une molécule d'interféron humain. 11 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la substance est appliquée en solution à une concentration équivalant à une valeur comprise entre 0,0001 et 100 0 * 00 unités internationale pàr centimètre cube. 12 Procédé selon la revendication 111 caractérisé en ce que la solution est aqueuse. 13 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la réponse est créée par application locale aux plantes, d'une substance comprenant au moins un composé ne constituant pas de l'interféron et capable d'induire une telle réponse. 14 Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit composé induit la production d'un second composé contenant une séquence ancestrale d'aminoacides. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le composé inducteur est un acide désoxyribonu- cléique ds ARN. 16 Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le second composé est l'interféron humain entier. 17 Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le second composé est un fragment-d'interféron humain. 18 Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit composé est un médiateur intracellulaire. 19 Procédé selon la revendication-18, caractérisé en ce que le médiateur est l'acide 2 ',5 '-oligoadénylique ou un de ses dérivés. 20 Procédé de protection des plantes contre les virus, caractérisé en ce qu'il comprend l'application locale, en combinaison, d'un premier composé qui assure le traitement de la plante de manière qu'elle présente une réponse analogue à celle de l'interféron, et un se- cond composé qui bloque les vecteurs des virus. 21 Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que le premier composé est choisi dans le groupe qui comprend les acides désoxyribonucléiques ds ARN et les médiateurs intracellulaires. 22 Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que le second composé est choisi dans le groupe qui comprend les pyrèteset les phéromones. 23 Composition de matière, caractérisée en ce qu'elle comprend un premier composé choisi dans le groupe qui comprend les acides désoxyribonucléiques ds ARN et les médiateurs intracellulaires, mélangés à un second composé choisi dans le groupe qui comprend les pyrèthres et les phéromones. 24 Application du procédé selon la revendication 1 à une plante. Application du procédé selon la revendication 20 à une plante.