FR 2532055 A1 19840224 FR 8313252 A 19830812 l - La présente invention concerne un procédé de chromatographie nou- veau, qui sera appelé ci-apres 'chromatographie en phase liquide sur colonne dynamique" (et qui est désigné en anglais par leabré- viation D C L C), destiné à la séparation de deux ou de plusieurs composants Ltinvention concerne en particulier un procédé nouveau de séparation de deux ou de plusieurs composés présents dans une solution, selon lequel on utilise un système chromatographique à lit mobile, Comme on le sait le terme chromatographie désigne un certain nombre de procédés physiques qui sont utilisés en chimie et en biologie pour séparer et identifier des mélanges de composés chi- n 4 uidèso Le piincipe qui est à la base de toutes les variantes de procédés de chromatographie réside en ce que l'on soumet de fa- gon répétée un mélange de composés chimiques à une extraction par liquide ou à une adsorption sur une surface d'une matière solide. Le mélange est déplacé physiquement sur une phase fixe (lit ou colonne), qui peut être soit une matière solide, soit une matière liquide immobilisée dans les pores d'une matière solide (placée dans le lit ou dans la colonne précité) Pour la séparation de composés chimiques par chromatographie peuvent 4 tre utilisées, selon le système chromatographique particulier dont il s'agit, ltune ou plusieurs des forces physico-chimiques qui sont indi- quées ci-après: (a) différences d'adsorption par le milieu poreux, appelé sor- bant; (b) différences entre les solubilités relatives d'tun liquide couvrant le milieu inerte (phase fixe) et le liquide, appe- 16 phase mobile, qui filtre à travers la colonne poreuse; (c) différences d'échange d'ions avec le sorbant; 2- (a) différences de dimension moléculaire, comme la solution fil- tre à travers un gel de très petite dimension. la ehromatographie est aussi appelée chromatographie préparatoire lorsqu'elle est utilisée à l Visolement d'une fraction dtun mélan- ge préalablement à l'exécution d'autres opérations,,telles que celles que comportent la spectroscopie, l'identification et la synthèse à des fins de recherche ou dans des buts commerciaux. le travail initial, en ce qui concerne la chromatographie, est ba- sé sur les différences d'adsorption sur une matière inerte conte- nue dans une eolonne* La séparation des composants, également connue sous l'appellation de chromatographie de partage, est ba- sée spr les solubilités relatives dans le solvant que l'on fait passer sur la colonne Le pouvoir résolvant qui est obtenu dans le cas de cette chromatographie est fonction du p H et de la résis- tance ionique du solvant la phase mobile ainsi que des solu- bilités relatives des constituants dans les deux phases; les dif- férentes matières peuvent Otre éluées au moyen d'un solvant con- venable et les fractions liquides peuvent 8 tre recueillies dans une série de tubes et 4 tre ensuite analysées par des procédés chimiques ou physiques La chromatographie sur couche mince (dé- signée en anglais par l'abréviation TIC) et la chromatographie sur papier sont basées sur les différences dtadsorption relative d'un composant sur un milieu inerte Dans le cas de la chromato- graphie sur couche mince (TLC), la phase fixe est constituée par une mince couche d'une substance finement divisée appliquée à une feuille,à un support de matière plastique ou à une plaque de verre Les sorbants communément utilisés, qui peuvent Stre ob - tenus dans le commerce sous la forme de plaques finies, sont -3l'alumine, le gel de silice et la cellulose Dans le cas de la chromatographie sur papier, la phase mobile peut se déplacer vers le haut, par effet de capillarités auquel cas il s'agit de la chromatographie ascendante, ou la phase mobile peut se déplacer vers le bas, par gravité, auquel cas il stagit de la chromatographie descendanteo' la chromatographie à échange dlions consiste en la séparation de molécules sur base de leur charge ionique Le sorbant ou phase fixe est constitué par des polymères à ions à liaison covalente Dans les résines échangeuses de cations, les ions étroitement liés sont chargés négativement,et sont associés à des ions positifs qui sont reliés de façon lèche par des charges électrostatiqueso Les substances chargées positivement qui sont à séparer dfun mélange sont tout d'abord adsorbées vers le sor- bant, les cations présents dans la résine étant déplacés La solution est tamponnée à un p H- qui facilitera la liaison et:el- le est ensuite éluée au moyen du même tampon afin qu'en soient éliminées les fractions non liantes Un échangeur d'anions agit exactement de la même façon, si ce n'est que ses ions à liaison covalente sont chargés de façon opposée pour attirer les anions en dehors de la solution. La séparation basée sur les différences de dimension moléculai- re se rencontre dans la filtration par gel et est également con- nue sous l'appellation de chromatographie à tamis moléculaire. Par ce procédés, les molécules sont séparées selon leur dimen- sion, bien que la forme de la molécule affecte la filtration dans une certaine mesure Les gels se présentent sous la forme de perles contenant un réseau d'ouvertures de pores dans les- -4 2 2532055 quelles de petites molécules peuvent être retenues Le vaste in- térgt commercial porté à la chromatographie, dtune manière géné- rale, et à la chromatographie en phase liquide préparatoire, en particulier, est révélé par le grand nombre de publications dans lesquelles il est question de remplissages de colonnes microparticulaires de genres divers et de colonnes préalablement remplies de différentes sortes devant permettre d'obtenir une meilleure séparation que ne le permettent les adsorbants connus qui sont utilisés dans ce domaine. les inventeurs du procédé de chromatographie qui est proposé dans la présente demande de brevet ont concentré leur recherche sur la mise au point d'un principe nouveau de chromatographie selon lequel on utilise des adsorbants de types connus, mais qui pe 5 mette de mener la se'paration très rapidement et plus ai- sément que ce n'était le cas jusqu'à présent le principe nou- veau de la chromatographie consiste, suivant la présente inven- tion, à utiliser une colonne dynamique dans laquelle le lit contenant l'adsorbant soit mobile, contrairement à ce qui se présente dans le cas de la technique de la chromatographie clas- sique et courante, selon laquelle la matière adsorbante est fixe. La présente invention concerne donc un procédé pour un type nou- veau de technique de chromatographie, appelé ci-aprè;c& 3 matogra- phie en phase liquide à colonne dynamique (désigné en anglais par l'abréviation DCLC), prévu pour la séparation d'un ou de plusieurs composés présents dans une solution, le procédé proposé étant ca- ractérisé en ce qu'il est utilisé un lit de matière adsorbante so- lide mobile et un dispositif comportant un piston qui est muni à -5- la base d'un élément d'étanchéité et qui présente un canal longi- tudinal contenant une matière adsorbante qui est maintenue entre deux barrières, ainsi qu'un tube à essai qui est muni à la partie inférieure dtune valve à plusieurs voies, le piston précité s'a- justant étroitement dans le tube à essai, et en ce qu'en poussant le piston dans le tube à essai, on fait passer dans le canal l Vé- luant voulu, qui a tout d'abord été amené à traverser la valve, les composés adsorbés à séparer se trouvant entre les barrières précitées étant ainsi déplacés et la solution obtenue sortant par un ajutage prévu à l'une des extrémités du piston Le cas général, qui semble se présenter le plus fréquemment, est l'emploi d'une colonne ou d'un lit de matière adsorbante solide oomme zone d'ad- sorption, auquel cas le procédé concurrencera le plus favorable- ment-les procédés de chromatographie classiques et usuels Le pro- cédé qui est proposé selon la présente invention est d'une très grande précision et il offre, par rapport à ces procédés de chro- matographie classiques et usuels, les principaux avantages qui sont indiqués ci-après: (a) contrairement au fait que, dans le cas de la chromatographie classique et usuelle, il se présente un écoulement gravita- tionnel, dans le cas de la chromatographie en phase liquide à colonne dynamique, une certaine pression est exercée de façon inhérente dans le lit de matière adsorbante, ce qui as- sure un meilleur pouvoir résolvant dans la séparation des constituants; (b) le procédé est d'une exécution très rapide, en conséquence de ce que la pression intrinsèque est Ce:rcée dans le système; (c) la quantité dtéluant que nécessite l'application du procédé 6 2532055 est moindre que celle que nécessite l'application des procé- dés de chromatographie classiques et usuels; (d) la présence de la pression intrinsèque dans le système de chromatographie dynamique permet dlutiliser une matière ad- sorbante à paa-ticules de moindre dimension que ce ntest le cas pour la chromatcgraphie classique et usuelle, ce qui donne lieu à une plus haute sensibilité. La prévision de la valve à plusieurs voies revêt un caractère - d'importance particulière lorsqu'il doit être introduit dans le tube à essai plusieurs éluants consécutifs, qui doivent ensuite passer par le lit de matière adsorbante en vue de l'obtention du fractionnement voulu Lorsque le lit de matière adsorbante est utilisé en ordre principal pour le traitement préalable d'un échantillon ou pour l'élimination de l'un des composés, la pré- sence de la valve n'est pas obligatoire, et un simple tube à es- sai fermé à la base, qui est adjoint au piston, peut 8 tre utili- sé Dans ce case l'éluant doit être introduit dans le tube à es- sai avant que le piston soit abaissé Il semble évidemment que, même si aucun fractionnement n'est nécessaire, il soit plus avan- tageux d'utiliser le tube à essai muni d'une valve, en ce qui concerne le lavage de la matière adsorbante et l'introduction de l'éluant par aspiration de celui-ci par la valve. L'élément d'étanchéité glisse le long de-la face interne de la paroi du tube à essai et se trouve donc en m 6 me temps en bon contact avec cette face interne, ce qui permet un ajustement étroit du piston dans le tube à essai L'élément d'étanchéité sera en règle générale constitué par un joint torique fait de 7 2532055 caoutchouc ou d'une autre matière convenable, joint torique pré- sentant une ouverture de passage et prévu pour glisser le long de la face interne de la paroi du tube à essai Si le disposi tif est fait de verre, la face externe du piston recevra à la fabrication un poli tel qu'elle puisse remplir le r 8 Ie du joint torique. Le procédé, dans son ensemble, est dtune trè S grande souplesse et il peut trouver son application dans un grand nombre de cas, étant donné ses diverses formes de réalisation possibles entrant dans le cadre de la présente invention Une question difficile à résoudre, qui se présente dans le cas de tous les genres de chromatographie, est l'application uniforme de l'échantillon à la surface du lit Si l'échantillon est appliqué directement par écoulement gravitationnel, une application uniforme peut Etre re- lativement difficile à obtenir, étant donné que le lit a tendance à tourbillonner lorsque l'échantillon y est introduit Ctest là la raison pour laquelle il est dfune importance toute particuliè- re que la surface soit protégée, par exemple au moyen d'un mor- ceau de papier-filtre de rayonne L'un des fabricants de colon- nes (la Pharmacia Pine Chemicals AB) munit certaines des colonnes d'un dispositif spécial, auquel 1 il a donné le nom de 11 sample ap- plicator" (dispositif applicateur d'échantillon), qui est desti- né à protéger la surface du lit Dans ce dispositif de protec- tion, il est prévu un mince tissu de Nylon qui est placé à l'ex- trémité d'un court bout de tube de Perspex qui s'adapte à l'inté- rieur du tube de chromatographie La prévision d'un dispositif de ce genre augmente évidemment le prix de la fabrication de lappa- reil, sans compter qu'elle présente un inconvénient, en ce sens que la présence de ce dispositif a pour effet de faire agir une pression sur l'écoulement de l'échantillon, ce qui entratne un ralentissement de la filtration de celui-ci dans la colonne. Dans le cas de la plupart des systèmes de chromatographie dans lesquels le principe de la présente invention est appliqué, la difficulté d'obtenir une application uniforme-et régulière est allégée dans une importante mesure Dans le courant dynamique qui se présente dans le lit chromatographique, le liquide étant chassé vers le haut lorsque le piston est poussé dans le tube à essai, il ne se manifeste aucune tendance au tourbillonnement du fait de l'introduction de l'échantillon De plus, la pres- sion qui est exercée dans le système lorsque le piston est pous- sé dans le tube à essai accélérera l'écoulement de l'échantillon. Un autre moyen auquel on a recours pour favoriser une applica- tion uniforme et régulière de l'échantillon consiste à placer au-dessus du lit une autre matière adsorbante convenable, diffé- rente de la matière adsorbante qui est déjà présente dans le lit, cette matière adsorbante supplémentaire ayant pour r 8 le de sou- mettre l'échantillon à une concentration préalable et de favori- ser de cette manière l'obtention d'une étroite bande de résolu- tion Un exemple type d'une telle matière adsorbante convenable est la silice grossière, qui diffère de la silice active par ses hautes propriétés d'adsorbant. la dimension des particules et la répartition des dimensions des particules doivent 6 tre contrôlées avec minutie dans la plupart des opérations de la chromatographie classique et usuelle Comme on le sait, un lit qui sera constitué de petites particules donne- ra en règle générale un bon pouvoir résolvant La raison de ceci est que les mécanismes qui donnent lieu à un élargissement des zones sont amplifiés à mesure que la dimension des particules est accrue Lorsque les particules sont de grosse dimension, la diffu- sion dans les particules et hors des particules prend plus de temps L'écoulement dans un lit de grosses particules est infé- rieur, ce qui donne davantage lieu à un nouveau mélange D'autre parts la résistance à l'écoulement dans un lit qui contient de grosses particules est plus faible et la vitesse d'écoulement ma- xlmum qui peut 8 tre atteinte est plus élevée Par conséquent, dans le cas des opérations de la chromatographie classique et usuelle, il s'agit de réaliser, en ce qui concerne la dimension des particules, un compromis qui puisse assurer le maximum de résolution de zones dans les conditions d'écoulement requises. Dans le cas du procédé nouveau de chromatographie en phase liqui- de à colonne dynamique (DOL), qui est proposé par la présente invention, on peut utiliser une matière adsorbante eh particules de petite dimension sans éprouver l'inconvénient que l'on rencon- tre lorsquton a recours aux procédés connus, la faible pression qui est exercée de manière inhérente dans le système dominant la résistance à l'écoulement qui est due à la petite dimension des particules Par conséquent, ce procédé peut même etre adopté dans les cas o il stagit d'obtenir un fractionnement rigoureux, lors- que l'emploi d'une matière relativement fine est nécessaire en vue de l'obtention du pouvoir résolvant voulu. Dans l'une des demandes de brevet antérieures de la Demanderesse, (R F Ao No 3126926 5), on a décrit un procédé nouveau de trans- úertéde masse et de séparation au moyen de barrières sélectives selon lequel on utilise un dispositif qui comporte des éléments semblables à ceux qui sont prévus dans le cas de la présente in- - ventiono Comme on l'a indiqué dans cette demande de brevets le dispositif comporte un séparateur-mélangeur qui est muni dtune membrane et un réservoir mélangeur dans lequel le séparateur-mé- langeur est poussé Sur le séparateur-mélangeur, il est prévu un dispositif destiné à assurer l'accumulation d'une poche d'air en vue d'une diminution de la pression exercée sur la membrane Au cours du fonctionnement du mélangeur-séparateur, une quantité d'air déterminée est retenue dans la poche dfair, quantité d'air qui, lorsqu'elle est cnmprimée -joue le $ 8 le dtun coussin ou d'un amortisseur de choc pour reprendre une partie de la pression qui résulte de la résistance de la membrane à l'écoulement du liqui- de En ce qui concerne la chromatographie en phase liquide à co- lonne dynamique qui fait l'objet de la présente invention, la présence de la poche d'air peut être considérée comme moins néces- saire que dans le cas précédent Toutefois, en ce qui concerne certains systèmes, dans le cas desquels des pressions relative- ment élevées sont mises en jeu, la poche d'air semble avoir un r 8 le important à jouer, la quantité d'air retenue renvoyant dans le tube à essai tout liquide pouvant avoir grimpé dans l'espace compris entre la face interne de la paroi du tube à essai et la face externe de la paroi de l'extrémité de bout du piston La quantité d'air retenue par ce moyen sur le piston sera fonction de nombreux facteurs, tels que le type de barrière utilisé, les constituants des mélanges à séparer et les conditions partièuliè- res régnant dans le système chromatographique spécifique en ques- tion Un avantage particulier de l'utilisation d'une telle poche d'air se présente dans le cas o il est nécessaire de laisser sortir complètement l'éluant par un joint torique placé à la par- tie inférieure du piston pour Jouer le r 8 le d'élément d'étanchéité. -.11 - Le procédé qui fait l'objet de la présente invention peut être utilisé avec succès dans les différentes sortes de chromatogra- phies chromatographie au gel de silice, chromatographie en phase liquide inversée, chromatographie capillaire, chromatographie par affinité, chromatofoaalisation, chromatographie à exclusion de dimension (également connue sous l'appellation de filtration par gel) et chromatographie à échange dtions. La chromatographie au gel de silice est l'un des procédés les plus communément répandus, le gel de silice, qui représente de loin l'une des meilleures matières adsorbantes connues, étant relativement peu coûteux par rapport aux autres matires adsor- bantes, les résultats de séparation qui sont obtenus à l'aide du gel de silice dans le cas du procédé Faisant l'objet de la présente invention sont en substance les m 8 mes ou sont meilleurs, 1.5 en ce qui concerne la précision de la séparation et les rende- ments de récupération, que ceux qui sont obtenus dans le cas des procédés de genre classique et usuel, mais cette séparation est plus rapide et nécessite également l'emploi d'une moindre quantité de solvant Ce procédé offre aussi un avantage particu- lier en ce sens que la colonne peut être réutilisableo De plus, on peut utiliser des particules de gel de silice de dimension relativement petite et prévoir un remplissage relativement den- se, en bénéficiant des avantages d'une séparation plus élevée. La chromatographie en phase liquide inversée se caractérise par le fait que sa phase fixe est moins polaire que la phase mobile. Le principal inconvénient que présente l'utilisation du gel de silice est qu'il ne peut 8 tre obtenu qu'une récupération partielle 12 - des composés qui passent par un tel lit Etant donné les avanta- ges qu'offre le proeédé de chromatographie en phase liquide à co- lonne dynamique (TCLC) qui fait l'objet de la présente invention, la chromatographie en phase liquide inversée pourrait également 9 tre utilisée avec succès dans la chromatographie préparatoire. Au cours des derniers temps, un vif intér 4 t a été porté à la chro- matographie capillaire, en particulier en raison de mises au point de microcolonnes permettant la chromatographie en phase liquide de haut rendement La raison de ces mises au point réside dans les avantages de ce type de chromatographie qui sont indiqués ci-après: (a) obtention possible de plus grands rendements de séparation pour des mélanges complexes et des produits difficiles à dis- soudre; (b) diminution sensible de la consommation d'éluant. le procédé de chromatographie en phase liquide à colonne dynamique (DOCLC) qui fait l'objet de la présente invention pourrait aisément trouver son application dans le cas de la chromatographie capillai- re, avec un étroit canal dans le piston qui a été décrit plus haut. la filtration par gel, qui est également connue sous l'appellation de chromatographie à exclusion de dimension, fait actuellement l'objet d'un intérêt de plus en plus marqué dans l'épuration de substances biologiques, moyennant l'utilisation d'une matière ad- sorbante convenable comme milieu de séparation De bons résultats ont été obtenus dans la séparation de l'Iodine-h CG marquée à par- tir d'Iodine marquée, par l'emploi d'une matière adsorbante du type Sephadex G (produite par la Pharmacia Fine Chemicals, Suède), la chromatographie dynamique qui fait l'objet de la présente in- 13 2532055 13 - vention étant utilisée (voir exemple 3) La chromatographie à filtration par gel est également considérée comme un procédé simple et rapide pour le dessalement ou le chaingément de iam- pon le lit de gel doit 8 tre équilibré avant ltexpérienoe au moyen d'une solution présentant la composition ionique qui est voulue, par exemple de l'eau distillée dans le cas du dessale- ment Ltélution est effectuée à l'aide du m 8 me liquide Etant donné les hautes vitesses qui peuvent Otre prévues, l'ensemble de l'opération peut se terminer en un court laps de temps, la matière dessalée étant recueillie en quelques minutes D'autres applications de la chromatographie à filtration par gel asso- ciée à la chromatographie dynamique sont le traitement préala- ble à la chromatographie en phase liquide à haute pression (désignée en anglais par l'abréviation EPLO: et la concentra- tion dtéchantillons dilués suivie de séparation. La chromatofooalisation est utilisée dans une ample mesure pour la séparation de protéines selon leurs points isoélectriques. Etant donné que la chromatofocalisation produit des bandes ex- trgmement étroites de matière séparée et nécessite en règle gé- nérale de longues colonnes étroites, il est clair que la ohro- matographie en phase liquide sur colonne dynamique sera un pro- cédé idéal pour ce type de chromatographie, avec un étroit pis- ton pour le dispositif qui a été décrit précédemment. La chromatographie en phase liquide sur colonne dynamique (DCLC) représente également un procédé qui se pr Ote de façon avantageu- se à la chromatographie à-échange d'ions, bien connue comme l'un des procédés de séparation les plus courants On a effectué dif- férentes expériences pour séparer:du sulfate de cuivre et du bi- chromate de sodium sur du Dowex 50 WX 8 comme matière adsorbante 14- (voir exemple 2) On a constaté qu'en utilisant la chromatogra- phie en phase liquide sur colonne dynamique (DCLC), on pouvait obtenir d'importants avantages en ce qui concernait la durée, le volume de solvant et la commodité. Un autre avantage qu'offre la chromatographie en phase liquide sur colonne dynamique (DCLC) qui fait l'objet de la présente invention est une importante diminution du volume mort Comme on le sait, le volume mort est défini comme le volume de liqui- de qui est contenu dans l'espace intersticiel entre les grains de la matière adsorbante constituant le lit Dans la plupart des opérations de chromatographie classique et usuelle, le vo- lume mort représente une difficulté qui affecte la détermina- tion d'un résultat précis En ce qui concerne la chromatogra- phie en phase liquide sur colonne dynamique (D Co C), étant donné qu'un remplissage dense est possible, la répartition d'équilibre de la substance entre la matière adsorbante et le liquide est établie très rapidement, avec un très faible volume mort Par conséquent, il sera possible d'obtenir des zones nettes et étroi- tes Ceci est très important dans le cas des expériences de frace tionnement,dans lesquelles les différences de volume d'élution entre les substances sont en règle générale faibles, Dans le cas de la filtration sur gel, en particulier, d'importants volumes morts affaibliront le pouvoir de résolution obtenu. Suivant une autre forme de réalisation de la présente invention, la matière adsorbante est contenue dans une cartouche que l'on place à l'intérieur du canal longitudinal du piston De cette ma- nière, le dispositif de chromatographie se pratera à 8 tre utilisé 5253 Z 055 _ à de nombreuses fins; il suffira, dans chaque cas particulier, de remplacer la cartouche par une cartouche contenant la matiè- -e adsorbante convenable La figure 5 des dessins qui sont anne- xés à ce mémoire illustre cette forme de réalisation de la pré- * sente invention Le procédé est très simple, et sa grande sou- plesse d'application peut 4 tre citée au nombre de ses divers avantages Il existe de nombreuses formes de réalisation, que l'on propose par la présente invention, du dispositif qui per- met d'appliquer le procédé nouveau décrit dans ce mémoire On expliquera ci-après, de façon amplement détaillée, certaines de ces formes de réalisation du dispositif en se référant aux fi- gures 1 à 9 des dessins ci-annexés, mais il est bien entendu que ces formes de réalisation ne sont présentées qu'à simple titre d'exemples, afin de faire mieux comprendre ltinvention,- et qu'elles ntont aucune portée limitative. Sur la figure 1 des dessins annexés à ce mémoire, on a repré- senté un tube à essai, désigné par la lettre de référence R, qui est muni d'un obturateur de Luer L, auquel est fixée une valve à trois voies LV L'éluant voulu, désigné par la lettre de référence E, est chassé dans le tube à essai R Le piston, désigné par la lettre de référence C, que comporte le disposi- tif présente un canal longitudinal, dans lequel est placée la matière adsorbante, désignée par la lettre de référence P, qui est maintenue par les deux membranes Pl F 1 et P 2, prévues respec- tivement à la partie inférieure et à la partie supérieure du piston C Audessus de la membrane supérieure PZ, il est prévu un bouchon S, qui est percé d'un passage D, par lequel la frac- 16 - tion ayant té' séparée du lit de matière adsorbante est recueil- lie A la partie inférieure du piston C, il est prévu un joint torique O, dont le rôle est d'assurer l'étanchéité, joint tori- que qui est monté de fagon qu'il puisse glisser le long de la fa- ce interne de la paroi du tube à essai R. Dans le cas de la forme de réalisation du dispositif qui est pro- posé pour l'application du procédé faisant l'objet de la présen- te invention que l'on a illustrée par la figure 2 des dessins ci-annexés, il n'est pas prévu de valve à la partie inférieure du tube à essai, désigné ici encore par la lettre de référence R, une quantité limitée de lléluant choisi E étant introduite dans le tube à essai R dès le début de l'opération Le piston C pré- sente, ici encore, le canal longitudinal dans lequel la matière adsorbante P est placée et est maintenue entre les deux membra- nes F 1 et F 2 Au-dessus de la membrane supérieure F 2, il est, dans ce cas comme dans celui qui est illustré par la figure 1, prévu un bouchon S L'ajutage D, par lequel est recueillie la fraction séparée du lit de matière adsorbante, est en communi- cation avec le piston C A la partie inférieure du piston O, il est ici encore prévu un joint torique O comme élément dtétanchéi- té Le dispositif dont il vient d'être question peut 6 tre utili- sé lorsqu'aucun fractionnement ntest nécessaire, l'opération ne comportant qu'un seul cycle et un seul éluant étant utilisé. Dans le cad de la forme de réalisation du dispositif proposé se- lon la présente invention qui est illustrée par la figure 3 des dessins ci-annexés, le tube à essai se présente exactement comme celui qui est représenté sur la figure 2, c'est-à-dire qu'il 17 - n'est pas muni de valve à la partie inférieureo Le piston C pré- sente encore le canal longitudinal dans lequel la matière adsor- bante P est placée et est maintenue par les deux membranes F 1 et F 2 Audessus de la membrane supérieure F 2, il est, ici encore, prévu un bouchon S, qui est percé d'un passage D par lequel est recueillie la fraction séparée du lit de matière adsorbante A la partie inférieure du piston C, il est encore prévu un joint tori- que O comme élément; d'tétanchéité. Dans le cas de la forme de réalisation du dispositif qui est il- lustrée par la figure 4 des dessins ci-annexés, le dispositif se présente sous sa forme la plus simple; il ne comporte toujours pas de valve à la partie inférieure du tube à essai R et il ne>'por- tentaede bouchon S à la partie supérieure du piston C Une quan- tité limitée d'éluant; choisi:E est introduite dans le tube à es- sai R dès le début de l'opération Le piston C présente toujours le canal longitudinal dans lequel la matière adsorbante P est pla- cée et est maintenue entre les deux barrières Pl et F 2 membra- nes ou filtres Le joint tonique O est prévu à la partie inférieu- re du piston C et a pour r 8 le d'assurer l'étanchéité; il est monté, ici encore, de façon qutil puisse glisser à la face interne de la paroi du tube à essai R, Avec le canal longitudinal qui contient la matière adsorbante P communique un ajutage D, par lequel la fraction séparée est recueillie. La figure 5 des dessins ci-annexés illustre le cas du procédé se- lon lequel on utilise une cartouches désignée par les lettres de référence CA, contenant la matièe-'adsorbante voulue P, cartouche que l'on introduit dans le canal longitudinal, désigné par la lettre de référence 1, que présente le piston C L'éluant peut t re recueilli par un passage, comme dans le cas des formes de réalisation que l'on a décrites plus haut en se référant aux figures précédentes le joint torique O, destiné à assurer I'é- tanchéité, est prévu à la partie inférieure du piston C. Le mode de travail est très simple, comme on pourra s'en rendre compte en se référant à la description qui sera donnée ci-après avec référence à la figure 1 des dessins ci-annexés Le piston C est abaissé dans le tube à essai R, qui est rempli de l'éluant choisi E De cette manière, l'éluant est chassé à travers la membrane inférieure Fil puis à travers la matière adsorbante P que contient le canal longitudinal du piston C,et il s'écoule enfin goutte à goutte par l'ajutage D (voir figure 4) Lorsque le dispositif est rempli d'une matière de support convenable P, il agit comme une colonne,:de chromatographie Le remplissage du tube à essai R est effectué simplement; il suffit d'ouvrir la sortie du tube à essai et d'introduire une quantité dtéluant par la valve LV (voir figure 1)o La figure 6 des dessins ci-annexés illustre une forme de réali- sation de la colonne dynamique dans le cas de laquelle le piston C de la colonne se déplace vers le haut pour pénétrer dans le tube à essai R et dans le cas de laquelle la sortie de l'éluant a lieu par un étroit canal vertical X, qui se trouve dans le prolongement direct de la matière de support chromatographique de la colonne La figure 7 illustre une variante de réalisation -19- de la colonne dynamique qui est représentée sur la figure 6, variante selon laquelle un réservoir de solvant en colonne est relié à la colonne dynamique. la figure 8 des dessins ci-annexés illustre une forme de réali- sation du dispositif qui 'f Ait 1 Vobjet de la présente invention selon laquelle le piston C de la colonne dynamique est formé de deux ou de plusieurs sous-unités qui peuvent contenir chacune la m 9 me matière adsorbante ou une matière adsorbante différen- te PS aveo possibilité de recueillir l'éluant obtenu de chacu- ne des sous-unités. la figure 9 des dessins ci-annexés illustre une autre forme de réalisation encore du dispositif proposé pour llapplication du procédé faisant ltobjet de la présente invention et elle permet de se rendre compte de la souplesse d'application de la chroma- tographie en phase liquide sur colonne dynamique (DCLC), dont l'utilité peut, dans ce cas, Otre plus étendue; selon cette au- tre forme de réalisation, léluant sortant est transporté vers une autre colonne, qui peut contenir la mume matière adsorbante P que celle qui est contenue dans la première ou une matière adsorbante différente P, transport qui a lieu par le conduit Y. Les figures 10 à 12 des dessins ciannexés représentent par des diagrammes les résultats de la séparation de divers mélanges, telle qu'elle est décrite dans les exemples 4, 5 et 6 donnés plus loin Quant à la figure 13, elle illustre par un diagramme le procédé de chromatographie par affinité pour l'isolementde Ig G, tel qu'il est décrit dans l'exemple 9 donné plus loin. En principe, il peut 8 tre envisagé d'utiliser la chromatographie 253 g 0555 dynamique dans des échangeurs ad' ions liquides également Les échangeurs d'ions liquides sont définis comme des systèmes d'extraction liquide liquide qui travaillent, au moins dans le principe, par échange d'ions à l'interface entre une solu- tion aqueuse et un solvant non miscible, avec distribution né- gligeable de l'agent d'extraction dans la phase aqueuse Des échangeurs d Manions liquides sont utilisés dans la chromato- graphie par extraction à phases inversées Selon ce procédé, -la matière de support (gel de silice, poudre de cellulose, etc), imprégnée de l'échangeur d'anions liquide, est utilisée comme phase fixe et une solution d'un acide ou de tl'un des sels de l'acide est utilisée comme éluant (phase mobile) Pour l'application de la présente invention, la membrane doit 9 tre choisie de telle sorte qu'elle ne soit perméable qu'à lt'éluant, mais qutelle ne puisse pas laisser passer l'échangeur d'ions li- quide, lequel doit rester dans le canal longitudinal que présen- te le piston. te dispositif à utiliser pour l'application du procédé de chroma- tographie en phase liquide sur colonne dynamique (DCLC) qui fait l'objet de la présente invention peut 9 tre fait de toute matière inerte, telle que du verre, du polyéthylène ou toute autre matiè- re plastique convenable, et il peut mime être envisagé d'utiliser un dispositif fait de métal pour certains usages spéciaux. On expliquera encore l'invention de façon plus concrète à l'aide des exemples d'application de celle-ci qui seront donnés plus loin, mais il est bien entendu que la portée de tl'invention n'est nullement limitée à ces exemples, ni aux formes de réali- 253;'O 55 21 - sation qui sont décrites dans la présente spécification Il est au contraire prévu que soient couvertes ici toutes variantes, modifications et équivalents pouvant entrer dans le cadre de la présente invention tel qu'il sera défini dans les revendications qui seront formulées en fin de ce mémoire. Exeple: Séparation d'un mélange de ferrocène et d'2 aldéhyde de ferrocène. (a) Procédé de remplissage 1,0 g de silice (Merck, Kieselgel E (gel de silice), type 60) est mis en dispersion dans 5 ml d'une solution dégazée de dichlo- rométhane/hexane 1:1 dans le tube à essai fermé, en vue de l'ob- tention d'une boue le piston, muni du bouchon et de la membrane supérieure, est introduit dans le tube à essai de telle façon qu'il soit obtenu un ferme contact entre le joint torique et le tube à essai. L Tensemble de l'unité ainsi formée est retourné de manière à occu- per une position verticale, le bouchon se trouvant à la base et ltai est éliminé de cette unité par la sortie que présente le tube à essai O La sortie du tube à essai est ensuite fermée et le remplissage est effectué par abaissement du tube à essai sur le piston fixe, à une vitesse d'écoulement d'environ 1 ml/min Lors- que le lit de siliee stest complètement déposé, la sortie du tube à essai est ouverte et le tube à essai est retiré du piston La membrane inférieure est alors mise en place, et la colonne est ainsi prdte à recevoir l'échantillon. (b) Mise en place de l'échantillon Un mélange de ferrocène et d'aldéhyde de ferrocène est dissous 22 - dans 0,2 0,4 ml de dichlorométhane et la solution est mise en place sur la membrane inférieure de la colonne, qui occupe la position verticale La solution traverse la membrane et les com- posants sont adsorbés par la silices La marche de ce procédé peut tre accélérée si l'on applique une certaine pression d'air, en utilisant le tube à essai fermé. (o) Elution Le piston rempli est introduit dans le tube à essai, qui contient ml de l'éluant choisi L'air est éliminé comme lors du remplissage de la colonne et l'élution est effectuée par descente du piston dans le tube à essai rempli, à une vitesse d'écoulement d'environ 1 ml/min. 2532055- 23 - TABLEAU I 1) Séparation d'un mélange type contenant et de l'aldéhyde de ferrocène ( 19 Mg-s) NO de Volume Eluanit Poids de fract d'éluant résidu o 4 a i mi 0 'a hexane il i' N la dichloro- méthane a, il w i N n a' le ia si o 11,4 meg 0,79 traces- 1,I 79 13,36 4,59 1,69 taces du úerrocène ( 13 mg) Caractéristique Lerrbcène ferrocène ferrocène aldéhyde aldéhyde aldéhyde aldéhyde 11) Séparation dtun mélange type contenant du ferrocène ( 25,3 mg) et de l'aldéhyde de ferrocène ( 15 6 m In NO de Volume fract d'éluant; o 4 8 E Muant 1 Mil hexazie i, i, le la st i le a, le le dichloro- méthane la le- n O n nf Poids de résidu 0,2 mg 19,0 o 1,7 0,.3 11,5 2,9 09 '7 o Caractéristique ferrocène ferrocène ferr Zoc ène ferrocène aldéhyde aldéhyde aldéhyde aldéhyde 24 " Exemple 2: Séparation de Ta 2 Cr 207 2 H 20 de CU 504 120 par échange d'ions. La matière adsorbante est constituée par du DOWEX 50 WX 8 (dimension de maille 200 400) La matière adsorbante est tout dfabord lavée et, ensuite, laissée pendant;un laps de temps de minutes environ dans de l'eau distillée acidifiée au moyen d'acide chlorhydrique ( 2 N) L'acidité est alors éliminée par lavage à l'eau distillée, et la matière adsorbante neutre est introduite dans le canal que-présente le piston Les deux mem- branes qui maintiennent le lit de matière adsorbante sont cons- tituées par deux disques de filtre de polyéthylène poreux. l 'échantillon de solution aqueuse est constitué par 359,3 mg de Na 2 Cr 207 2 H 20 et par 369,7 mg de C 504 5 H 20 dissous dans 1 oc d'eau L'échantillon est introduit dans la matière adsor- bante, la quantité d'échantillon prise pour l'analyse étant de 0 10,ul Les ions sont séparés de la colonne par lavage et séparés comme il est indiqué ci-après: -les anions par eau distillée, -les cations par une solution acide constituée par de l'acide chlorhydrique 2 N. Les parties sont recueillies dans des tubes à essai La fin du la- vage est déterminée d'après la couleur de la solution de sortie. Les échantillons sont ensuite analysés quantitativement par sé- chage des différentes parties à 110 C et par pesée du résidu sec. On a effectué une expérience pour le résidu en introduisant 100 ?al de l'échantillon dans un tube à essai et en séchant à la tem- pérature de 110 ' C Le résidu solide pesait 68,5 mg. Les résultats relatifs aux différentes fractions séchées pesées 2532 t O 55 - sont donnée dans le tableau 2 qui suit Pour l'expérience 2, la colonne, après l'expérience 1, a été lavée au neutre et neulralisée O TAB 1 E U 2: Séparation par phie dynami que N O de N O de la Eluant l'exp fract utilisé a * fraction sans 2 1 G a a 2 Il I IC 1 ( 2 N) i, nf le t couleur H 20 i H Vl( 2 N) si la le N échange d'ions par la chz'omatogra- Poids de la tract. séchée mg 43,0- 0,2 o 0,5 27,5 3,2 1,3 ,1 0,1 0,4 2,3 34,0 ,97 O 0,8 Poids total Mg 431,2 47, 7 ,3 43,2 Remarque s * * * * * fraction sans couleur Il ressort des résultats qui sont donnés ci-dessus qu'après la filtration de 8 fractions à travers la mati ère adsorbante, pra- tiquement tous les composes avaient été enlevés et séparés. 253, 55 Afin de mettre en évidence l'efficacité du procédé de chroma- tographie en phase liquide sur colonne dynamique (DCLC) qui fait l'objet de la présente invention, on a effectué un essai comparatif en utilisant la chromatographie classique et usuel- le, par écoulement gravitationnel, à l'aide de la m 9 me quanti- té de 100 ul d'échantillon et de la meme matière adsorbante. J les résultats de cet essai sont donnés dans le tableau 3 qui suit. 27 T Al BLEAU 3: NO de la fraction 5 ú 10 il 15 20 Séparation par échange d' ions au moyen d'une colonne de chromatographie de genre classique Eluant Poids de Poids Remarques utilisé la fract U total séchée mg nmg E 20 le s il I I Hgl( 2 N) le I le t' N ID 0,5 ,3 1,3 0,5 0,2 0,3 0, 0, 1 0,4 0,1 0,1 0,0 2,3. 23,0 12,7 3,93 1,4 1,4 54,9 44,1 fraction sans couleur fraction sans couleur -28 - Exe Mnle 3 Au cours de cette expérience, on a séparé une solution de 100,ul de i-h CG contenant 30 35 o d'iodine marquée (*I 2) par le pro- cédé de chromatographie en phase liquide sur colonne dynamique (DOIC), en utilisant comme matière adsorbante du Sephadex G-10. On a effectué l'télution à l'aide de 10 ml de tampon au p H dten- viron 8 Chaque fraction était d'environ 0,4 ml. Les résultats de cette expérience sont donnés dans le tableau 4 qui suit. 29 - TA 2 BLEAU 4: NO de la fraction b a 9 il 14 19 Séparation de j,-h CG contenant de ltiodine marquée *I 2 sur -du Sephadex G- 10, avec élution à ilaide d 'un tampon p H: environ 5 Eft blanc c p m déterminé Total 29,0 O 93485,0 1946,0 292,0 ,0 114,0 ,0 78,0 79,30 980,0 182,0 414,0 4855,0 766,0 854,90 635,0 O 450,0 504,0 378,0 254,0 131,0 o 9578,0 267,j 7 ' 104, 82,0 48,2 49,6 67,,7 102,9 g 152, 5 389,3 464, 4 757,-5 834,7 615,5 424,6 3485, 256,5 99,5 12125 opm 5169 c-pm Total 2053420 20594,4 17294. - Il ressort du tableau qui précède que la récupération est dtenvi- ron 85 d Cette séparation, lorsqulelle est effectuée par le pro- cédé de chromatographie classique et usuel, exige ltutilisation d'une quantité beaucoup plus importante d'éluant et elle prend également un temps plus long. Exemple 4 Au cours de cette expérience, une solution d'un mélange de colo- rants se composant de 35 % de rouge Cérès 7 B, de bleu Nitro ra- pide 2 B à raison de 28 %, de violet Nitro rapide FBL à raison de 25 % et de jaune Cérès R à raison de 12 % (pourcentage en volume pour chacun des colorants) a été séparée par le procédé de chromatographie en phase liquide sur colonne dynamique (DCLC) Le mélange de colorants avait été procuré par Merck (numéro du catalogue 9354). Une quantité de 30 ul du mélange de colorants dans du dichloro- méthane a été injectée dans une DCLOC contenant du LICEROPREP Si-60 (marque de Merck, numéro du catalogue 9336), matière ad- sorbante à base de silice comportant des particules de silice d'une dimension de l'ordre de 15 à 25 um Les dimensions de la colonne étaient les suivantes: longueur 10,6 cm et diamètre in- terne 10 mm La vitesse d'écoulement fut de 2 ml/min et l'élu- ant était du dichlorométhane. Les résultats de la séparation sont rendus par le diagramme que représente la figure l O des dessins annexés à ce mémoire, dia- gramme dans lequel on a porté en ordonnée la densité optique (o.D) à 254 mm et en abscisse les fractions Comme on peut 2532 0055 _ 31- s'en rendre compte en se référant à ce diagramme, il a été ob- tenu une séparation rapide et nette. Exemple 5 Au cours de cette expérience, un mélange d'aromatiques polycy- cliques se composant de benzène à raison de 50 %, de naphtalène à raison de 30 % et d'anthracène à raison de 20 % (pourcentages en volume) dans une solution de n-heptane a été séparé par le procédé de chromatographie en phase liquide sur colonne dyrnami- que (DCLC). Ltéchantillon injecté était de 50,ul et l'on a utilisé une co- lonne présentant les mêmes dimensions que celle qui a été uti- lisée dans le cas de l'expérience décrite dans l'exemple 4, la colonne contenant la même matière adsorbante que dans le cas de cette expérience la vitesse d'écoulement fut aussi de 2 ml/min te L'x Q m &e-claque r otion étant de 1 ml L'éluant était du n-heptane. Les résultats de la séparation sont rendus par le diagramme que représente la figure 11 des dessins annexés à ce mémoire, diagramme dans lequel on a porté en ordonnée la densité opti- que ( O D) à 254 nm et en abscisse les fractions Comme on peut sten rendre compte en se référant à ce diagramme, les composants ont été séparés en trois pointes aigu's. Exemple 6 Au cours de cette expérience, un mélange d'alkylphtalates a été séparé par le procédé de chromatographie en phase liquide sur colonne dynamique (DCLC) et l'on a utilisé une colonne semblable à celle qui a été utilisée dans le cas de l'expé- rience décrite dans l'exemple 4, la colonne contenant la même 32 - matière adsorbante que dans le cas de cette expérience. Le mélange d 1 alkylphtalates était un mélange de dibutylphtala- te, de diéthylphtalate et de diméthylphtalate dans du n-hepta- ne / acétate d'éthyle ( 90/10 parties par volume) L'éluant était'un mélange de n-heptane / acétate d'éthyle ( 90/10 parties par volume) La vitesse d'écoulement fut de 3 ml/min, le volume de chaque fraction étant de 1 ml Les résultats de la séparation sont rendus par le diagramme que représente la figure 12 des dessins annexés à ce mémoire, diagramme dans lequel on a porté en ordonnée la densité optique (o D) à 254 nm et en abscisse les fractions. Comme on peut Sten rendre compte en se référant à ce diagramme, une séparation nette a été obtenue. Exemple 7 Epuration d' anti-h CG Lépuration de l'anti-h CG a été effectuée par le procédé de chro- matographie en phase liquide sur colonne dynamique (DCLC) et l'on a utilisé deux sources différentes de ce composé: a) SERONO et b) MILES, la seconde étant connue pour 8 tre moins concentrée que la première. a) Epuration de l Janti-h CG (SERONO) Une ampoule djanti-h CG a été reconstituée au moyen de 1 ml de tampon de phosphate (p H 6,3) La solution a été appliquée sur une colonne de 10,6 cm de longueur et de 10 mm de diamètre inter- ne, qui contenait comme matière adsorbante 3 grammes de cellulose (DEAE DE-52, marque de Whatman) La colonne a été éluée au moyen 33 - de tampon de phosphate (p H 6,3) à une vitesse d'écoulement de 2,5 ml/min Une très haute pointe de protéines fut immédiatement visible dans les premières fractions ( 4 à 8) La colonne était reliée à une cellule d'éooulement avec enregistreur pour la dé- tection immédiate Un changement de tampon, p E = 791, a détermi- né une apparition quasi immédiate de protéines Deux autres poin- tes majeures de protéines ont été éluées. La détermination a été effectuée par lecture dtadsorbance à la densité optique (O D) 280 nm pour chaque fraction On a établi l'activité immunologique de chacune des fractions de h CG par le procédé RIA (essai radio-immanologique), en utilisant les solu- tions qui sont indiquées ci-après 100,ul de 125 I h CG, 100,l * de sérum exempt de h CG et 100 j 1 de chacune des fractions Lin- cubation eut une-durée de 3 heures et eut lieu à la température ambiante On a effectué la séparation en utilisant un polyéthy- lène glycol / double anticorps ( 20/1 parties en volume). les résultats qui ont été obtenus par cette expérience sont in- diqués dans le tableau 5 qui suit. 34 - la,'bleaua 5. Séparation d' anti-h CG SERONO sur du DEAE _DE-52 N' de la fraction i il Densité optique 0 O 0,,002 0,9006 0,63 0,879 0,097 0,01 0,008 0,,003 0,002 0,002 0,,003 0,01 e Q,013 9 s,039 0,03 0,019 0,044 0,029 0,018 0,015 O 0008 0,0 002 0,01 Essai radio-immano- logique RIA / liaison 0,1 %', 00,1 % 14 i, 11 2,1 % 22,8 % 12,3 % 2.,8 %I 0,.1 % 0,1 % 0,1 % 0,1 % 0,1 %. 0,1 %O 0,1 % 0,1 10 19 % 16,4 % ,0 %I 3,0 % 6,4 5 % ,3 % 4 s,5 % 4,0 % 3,0 O % 2,6 % 24 % 051 % 4 0,1 % 0,i 1 % Comme l'indiquent les résultats qui sont repris dans le tableau 5 qui précède, trois crgtes majeures ont été obtenues; l'activi- té i I Xflh If Ol Ogiq Ue est restée extrêmement élevée en comparaison de la concentration en protéines - -35 - b) Epuration de ilanti-h CG (MILES) ,ul d'anticorps (tel que du sérum de lapin) ont été appliqués à la colonne de DEAE DE-52, comme dans le cas décrit précédem- ment et l'on a tout d'abord procédé à l'élution au moyen d'un tampon de phosphate (p HE 6,3) De même que dans le cas décrit précédemment aussi, une cri de protéines rapide a été éluée en fractions 3 et 4; par une diminution de la densité optique (O.D) et un changement de tampon p H 7,l on a recueilli trois autres cretes majeures. Les résultats qui ont été obtenus par cette expérience sont indiqués dans le tableau 6 qui suit. 253-2055 'x 6 - Tableau 6 Sél 2 aration d'anti-h CG MILES sur du DEAD-SE-22 NI de la fraction Densité optique 0.1), Essai radio-iminu- nologique RIA Io liaison Protéine A* % liaison 0 $ 1 O., lo 64,2 y 6 ogi % oel oel ogi o gl 011 % oli 091 % ogl yo 021 % osi % 65.,4 % 5595 % 6 i,4 63 $ 6 % 64,8 % 63 4 % igo 6 o 3 67.,7 % ,95 % 58.,4 % 66 go% 54 % 51 93 % 59 7 % 97 % ,9 % 59 5 % 5 10 il 14., 15 le ig 20 25 30 -34 35 39 - Ot 102 C.,656 os 416 ogogi Os O 55 O.,044 ojo 16 O.,007 Oo,005 0,003 Os OO 3 0,,004 01011- 0,,034 O.,291 O.,247 0 094 Os O 42 0,041 O.,07 Oe 5 18 O 161 oe 12 o O Ogl O.,074 O.,062 Oe O 34 0,,035 01,-021 296 % 712 % 1221 % li.16 Y. 7.,O % 7 92 % ,9 % ,3 % 4,5 % 357 % 2,5 % ige % 3 P 9 % 2.,4 % non connu 199 % -37 - Comme il ressort des résultats qui ont été repris dans le tableau 6 qui précède, l'anti-h CG séparé a été recueilli en trois crates ou pointes principales Chacune de celles-oi présentait une actif vité immunologique, ltabsorption à 280 nm et la détermination protéine A* Toutes les crêtes ont été nettement séparées l'une de l'autre et recueillies. Exemple 8 Separation de sérum humain On a effectué une séparation de sérum humain en utilisant le pro- cédé de chromatographie en phase liquide sur colonne dynamique (DCIC), suivant la m me marche de traitement que celle qui est décrite dans le Handbook of Experimental Immunology (DOM Weir, Md Blackwell Scientific Publications, Oxford, Londres, 1973, 2 ème éd). la chromatographie était basée sur l'échange d'ions sur une ma- tière adsorbante de cellulose et un gradient d'élution à l'aide d'un tampon de phosphate ( 0,02 M) de p H 5,7. La colonne, dtun diamètre interne de 10 mam, a été chargée de 3 g de DEAD DE-52 (marque de Whatman) et elle a été lavée à l'aide du tampon de phosphate (p H = 8), à 1 l vitesse d'écoule- ment de 2,5 ml/min Le gradient a été produit à l'aide d'un système à deux chambres, avec utilisation de 40 ml de tampon de phosphate de p E 8 et de 60 ml de tampon de phosphate de p E ,7 Une quantité de 3 ml de sérum humain a été séparée, des fractions de 1,5 ml chacune ont été recueillies et leur teneur en protéines a été déterminée par densité optique (O D) à 280 ni'. Les résultats de cette expérience sont indiqués dans le tableau 7 qui suit. 38 - Tableau 7 56 paration de sériim humiain (densité optique O D à 280 _nm) N" de la Mens té optique N' de la Densité optique fraction 00 f D O fraction 0,D, 1 090017 19 0,379 2 1,3 20 0,361 3 193 21 0,313 4 1,3 22 0,233 ' 0,554 23 0,156 6 0,262 24 0,098 7 09135 25 0,06 8 0,082 26 0,026 9 0,067 27 0, 008 O,064 28 0,004 1 il 0,,055 29 0,011 12 0-,052 30 0,003 13 0,0 t 52 31 01,008 14 09061 32 09015 O j,102 33 0,016 16 34 0,011 17 0,,187 35 0,005 la O,355 36 0,006 Comme il ressort des résultats qui sont repris dans le tableau 7 qui précède, la sdparation effectuée par le procédé de chromato- graphie en phase liquide sur colonne dynamique (D Ci C) donne le schéma traditionnel de la séparation de sérum humain à deux cl tes majeures (Ig(G, albumine) La séparation a été effectuée en un court laps de temps 39 - Exemple 9 Dans le cas de cet exemple, on a appliqué le procédé de chromato- graphie en phase liquide sur colonne dynamique (DCLC) à la chroma- tographie par affinité, en vue de l'isolement de Ig G de lapin, en utilisant comme ligand du SEPHAROSE-4 B (marque de la Pharmacia) - anticorps (anticorps double anticorps Ig G). SEPHAROSE-4 B ant: o Colonne DCLC: Détections Tampon: icorps: ltanticorps a été couplé à la matière adsorbante SEPHAROSE-4 B (marque de la Pharmacia), selon les directives données par Axel Porath et al (Nature 214, 1967); 1 g de SEPH ROSE-4 B liaison mg de double anticorps Ig G 50 % colonne de verre de 6 mm de diamètre in- terne, chargée de SEPHAROSE-4 B anti- corps; a été effectuée directement à partir de la colonne, avec cellule d'écoulement; par WV à 280 nm adsorption; 1 tampon de phosphate / Na Cl, p H 7,8; 2 glycine / HC 1 ( 0,1 M), p H 2,5. La marche du traitement comportait les opérations qui sont indi- quées ci-après: 1 couplage du SEPHAROSE-4 B au sérum de lapin double anticorps Ig G; 2 remplissage de la colonne DCLC au moyen de 3 ml de gel SEPHAROSE- 4 B anticorps, fermeture aux deux c 8 tés au moyen de filtres système VYON (marque), approximativement 40,u nm; 3 lavage de la colonne chargée à l'aide de 6 ml du tampon 1; -40 - 4 charge de la colonne au moyen de 0, 5 ml de N Ro S, (sérum de lapin normal; o incubation d'une durée de 2 h à la température de 370 C; 6 élution à l'aide du tampon 1 et recueillement de fractions jusqu'à ce que la densité optique au photomètre soit devenue inférieure à 0,1; 7 élution à l'aide du tampon 2 de p H 2,5 et recueillement de fractions jusqu'à ce que la densité optique soit devenue in- férieure à 0,1. Un diagramme de la chromatographie par affinité de cet exemple est représenté sur la figure 13 des dessins qui sont annexés à ce mémoire LEGENDES DE LA FIGURE 10 1 Rouge Cérès 7 B 2 Bleu Nitro Rapide 2 B 3 Violet Nitro Rapide FBL 4 Jaune Cérès R LEGENDES DE LA FIGURE 11 1 BENZENE 2 NAPHTALENE 3 ANTHRACENE LEGENDES DE LA FIGURE 12 1 DIBUTYLPHTALATE 2 DIETHYLPHTALATE 3 DIMETHYLPHTALATE LEGENDE DE LA FIGURE 13 56 rum protéins 41 - Revendications 1 Procédé pour un type nouveau de technique-de chromatographie, appelé ci-après chromatographie en phase liquide à colonne dyna- mique, prévu pour la séparation d'un ou de plusieurs composés présents dans une solution, le procédé étant caractérisé en ce qu'il est utilisé un lit de matière adsorbante solide mobile et un dispositif comportant un piston qui est muni à la base d'un élément d'étanchéité et qui présente un canal longitudinal con- tenant une matière adsorbante qui est maintenue entre deux bar- o 10 rières, ainsi qu'un tube à essai qui est muni à la partie infé- rieure dtune valve à plusieurs voies, le piston précité s'ajus- tant étroitement dans le tube à essai, et en ce qu'en poussant le piston dans le tube à essai, on fait passer dans le canal ltéluant voulus qui a tout dtabord-été amené à traverser la val- ve précitée, les composés adsorbés à séparer se trouvant entre les barrières précitées étant ainsi déplacés et la solution ob- tenue sortant par un passage prévu à l'une des extrémités du piston. 2 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que, lorsque la valve précitée se trouve en position de fermeture, le liquide pénètre sous pression intrinsèque dans le canal, les composés adsorbés à séparer se trouvant entre les barrières étant ainsi déplacés. 3 Procédé suivant les revendications 1 et 2, caractérisé en ce quỈne matière adsorbante convenable additionnelle, différente de la matière adsorbante utilisée dans la chromatographie en phase liquide à colonne dynamique, est incorporée afin que l'té- chantillon introduit soit soumis à une concentration préalable. 4 o Procédé suivant les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le tube à essai est fermé à la partie inférieure, l'éluant étant introduit dans le tube à essai avant que le piston soit abaissé dans celui-ci. Procédé suivant une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la chromatographie en phase liquide est réalisée sur du gel de silice, en phase liquide inversée, par affini- té, par capillarité, par chromatofocalisation, par filtra- tion sur gel ou par échange d'ions. 6 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la matière adsorbante, solide, est contenue dans une cartou- che qui est placée dans le canal longitudinal que présente le piston. 7 Dispositif de chrormatographie en phase liquide à colonne dynamique prévue pour la séparation d'un ou de plusieurs composés présents dans une solution, caractérisé en ce qu'il comporte un tube à essai qui est muni à la partie inférieure d'un élément de fermeture et d'une valve à plusieurs voies, un piston qui s'ajuste étroitement dans le tube à essai, ce piston présentant un canal longitudinal contenant une matiè- re adsorbante, tenue entre deux barrières, et un passage prévu à l'une des parties d'extrémité du piston. 8 Dispositif suivant la revendication 7, caractérisé en ce que la sortie de l'éluant a lieu par un étroit canal vertical qui se trouve dans le prolongement direct de la colonne. 9 Dispositif suivant l'une des revendications 7 ou 8, ca- ractérisé en ce qu'il est muni, à la partie inférieure du piston, d'un élément d'étanchéité monté de façon qu'il puis- se glisser le long de la face interne de la paroi du tube à essai, l'élément étant de préférence en matière inerte, en particulier constitué par un joint torique en caoutchouc présentant un passage communiquant avec le canal longitudi- nal. 10 Dispositif suivant une des revendications 7 à 9, carac- térisé en ce que le piston de la colonne dynamique est for- mé de deux ou de plusieurs sous-unités qui contiennent cha- cune la même matière adsorbante ou une matière adsorbante différente. _ 43 _ 2532055 11 Dispositif suivant une des revendications 7 à 10, caracté- risé en ce que le passage est relié à la barrière supérieure du piston. 12 Dispositif suivant une des revendications 7 à 11, caracté- risé en ce qu'un bouchon est prévu à la partie supérieure du piston, le passage étant relié de préférence par un canal tra- versant le bouchon. 13 Dispositif suivant une des revendications 7 à 12, caracté- risé en ce que le tube à essai est fermé à la partie inférieure. 14 Dispositif suivant une des revendications 7 à 13, caracté- risé en ce que le piston est muni d'un dispositif qui sert à l'accumulation d'une poche de gaz. Dispositif suivant la revendication 14, caractérisé en ce que le dispositif, qui sert à l'accumulation d'une poche de gaz, est constitué par des rainures horizontales, verti- cales ou hélicoïdales, formées dans le piston.