FR 2529463 A1 19840106 FR 8211749 A 19820705 La présente invention, réalisée en collaboration avec le CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE, le CENTRE REGIONAL DE TRANSFUSION SANGUINE représenté par le CENTRE HOSPITALIER REGIONAL DE TOURS, et le STUDIENGESELLSCHAFT KOHLE mb H, concerne un procédé d'encapsulation dans les érythrocytes humains ou animaux d'au moins une substance présentant une activité biologique, un dispositif utile pour la mise en oeuvre de ce procédé et les érythrocytes obtenus. Préalablement à l'exposé de la présente invention, il peut être intéressant de rappeler certaines notions en la matière. Le sang est un mélange complexe constitué d'un liquide, le plasma, dans lequel sont en suspension des globules rouges (érythrocytes) transportant l'oxygène, des globules blancs (leucocytes) et les plaquettes Le plasma contient en solution des sels, des protéines et des métabolites solubles qui s'échangent dans les différents tissus. Dans le cadre de la présente invention-, seuls les érythrocytes nous intéressent. De façon simplifiée, on peut considérer que les érythrocytes sont constitués d'une membrane qui entoure un cytoplasme rempli essentiellement d'hémoglobine. Le rôle de l'hémoglobine est de se combiner à l'oxygène moléculaire pendant le passage des érythrocytes à travers les poumons et de transporter cet oxygène à tous les tissus du corps pour qu'il y soit utilisé. Comme pour toutes les cellules, les érythrocytes peuvent être lysés dans certaines conditions, en particulier de pression osmotique, mais c'est en 1952 que Teorrel a introduit la notion de rescellement de la membrane érythrocytaire, c'est-à-dire de la reconstitution de la membrane érythrocytaire après une lyse des érythrocytes. Dans la mesure o il devenait ainsi possible d'ouvrir et de refermer les érythrocytes, il devait donc être possible d'y introduire certains composants exogènes. Outre la technique de base qui consiste à mettre les érythrocytes dans une solution contenue dans un récipient dont on fait successivement changer la pression osmotique afin d'effectuer la lyse puis le rescellement, il faut citer certains procédés mettant en oeuvre une lyse en milieu iso-osmotique en appliquant aux érythrocytes un choc électrique ou thermique Dans certains cas il a également été utilisé des virus ou des protéines virales afin de réaliser cette encapsulation. Il a également été réalisé des encapsulations par dialyse dans un sac de cellophane Tous les procédés utilisés précédemment ont en commun de présenter des rendements d'encapsulation faibles, d'être excessivement aléatoires quant à leur reproductibilité, et de ne permettre de traiter que des quantités faibles de suspensionsérythrocytaires. Ainsi, bien que l'on ait rapporté l'encapsu- lation de certaines enzymes, du facteur IX, de la desferrioxamine, des acides organiques, du glucose, du saccharose, du fragment A de l'antitoxine diphtérique et du méthothrexate, ces procédés sont restés au stade du laboratoire et n'ont pas permis jusqu'à présent leur utilisation chez l'homme. Seule une publication récente de Green R et al. (The Lancet ( 1980), 16 août, 327-330) décrit l'encap- sulation de desféral et l'utilisation des érythrocytes obtenus chez l'homme. Cette encapsulation ayant été réalisée parsimple dilution en milieu hypoosmotique montre toutefois des rendements très faibles d'incorporation du desféral dans les érythrocytes. C'est pourquoi la présente invention a pour but la mise au point d'un procédé et d'un dispositif permettant de réaliser l'encapsulation dans les érythrocytes de substances présentant une activité biologique avec un rendement d'encapsulation très élevé et permettant de traiter des grandes quantités de suspensions d'érythrocytes tout en assurant le maintien de bonnes conditions de stérilité qui permettent d'utiliser les érythrocytes ainsi obtenus chez l'homme ou l'animal. Bien que la présente invention ait été développée pour l'encapsulation d'un grand nombre de composés à activité biologique, l'une des classes de composés à activité biologique paraît plus particulière- ment intéressante, il s'agit des effecteurs allostériques de l'hémoglobine. L'hémoglobine forme avec l'oxygène au niveau des poumons un produit d'addition réversible l'oxyhémoglobine. Ce produit d'addition se décompose au niveau du système capillaire pour libérer l'oxygène car la pression partielle de l'oxygène dans le système capillaire est plus faible (de l'ordre de 70 mm de Hg) que dans les poumons (de l'ordre de 100 mm de Hg). Dans les conditions normales, seule une partie, environ 25 %, de l'hémoglobine se dissocie, le reste retourne aux poumons par le système veineux. In vitro, il a été possible de montrer le rôle de certaines substances comme l'inositol hexaphosphate (IHP), l'inositol pentaphosphate (IPP), le pyridoxal phosphate, par exemple, qui sont susceptibles de se combiner avec l'hémoglobine au niveau du site de fixation du 2,3diphosphoglycérate. Ces produits dénommés "effecteurs allostériques de l'hémculobine" (EAH) modifient la conformation allostérique de l'hémoglobine, ce qui a pour effet de diminuer l'affinité de l'hémoglobine pour l'oxygène. La diminution de l'affinité de l'hémoglobine pour l'oxygène rend plus facile la libération de l'oxygène à partir de l'oxyhémoglobine, même pour des pressions partielles d'oxygène relativement élevées - Dans ces conditions, sans que le contenu global en oxygène du sang soit notablement modifié, il est possible d'envisager d'accroître le pouvoir oxyphorique du sang vis à vis des tissus en utilisant des globules rouges comportant une hémoglobine modifiée. Ce type de traitement de l'hémoglobine permet une meilleure oxygénation du tissu par amélioration de la libération de l'oxygène. -5 On conçoit que les applications de ces effecteurs allostériques de l'hémoglobine puissent être nombreuses, par exemple dans le traitement de certaines affections telles que les insuffisances respiratoires, les troubles circulatoires, ou bien pour améliorer ou accélérer certains processus thérapeutiques, par exemple dans la prévention de l'infarctus du myocarde lié à certaines ischémies, ou pour modifier la physiologie respiratoire à de arandes altitudes ou profondeurs. Le problème essentiel est, bien entendu, d'amener les effecteurs in situ afin qu'ils puissent se fixer sur l'hémoglobine intracellulaire. Les tentatives de transformation de l'hémoglobine en solution par les effecteurs allostériques de l'hémoglobine ont pu être réalisées in vitro, mais les applications pratiques ne sont pas encore susceptibles d'une utilisation thérapeutique du fait de la durée de vie insuffisante de l'hémoglobine en solution et des propriétés réduites qu'elle a alors dans le transport de l'oxygène. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique no 4 192 869 et le brevet européen N O O 001 104 décrivent des procédés destinés à transformer les globules rouges par interaction desdits globules avec des liposomes chargés en effecteurs allostériques de l'hémoglobine, en particulier chargés en IHP. Le procédé et le dispositif selon la présente invention permettent, en utilisant comme composé à activité biologique un effecteur allostérique de l'hémoglobine, la transformation de l'hémoglobine dans des conditions qui autorisent son utilisation au niveau thérapeutique. Pour ce faire, la présente invention propose un procédé d'encapsulation dans les érythrocytes humains ou animaux d'au moins une substance présentant une activité biologique, caractérisé en ce qu'on alimente en continu le compartiment primaire d'au moins un élément de dialyse avec une suspension aqueuse d'érythrocytes, dont le compartiment secondaire contient une solution aqueuse hypotonique par rapport à la suspension d'érythrocytes afin de lyser les érythrocytes, et en ce que le lysat d'érythrocytes est alors en contact avec ladite substance présentant une activité biologique, et en ce que,afin de resceller la membrane des érythrocytes, on augmente la pression osmotique et/ou oncotique du lysat érythro- cytaire après sa mise en contact avec ladite substance à activité biologique, et en ce que l'on recueille la suspension d'érythrocytes rescellés. Dans le cadre de la présente description, on entendra par "élément de dialyse" de façon générale un élément comportant deux compartiments séparés par une paroi de dialyse à travers laquelle peut se faire un échange ionique qui permet de modifier de façon contrôlée la pression osmotique d'une solution aqueuse située dans l'un des compartiments en introduisant dans l'autre compartiment une solution aqueuse d'un sel. Ce type d'élément de dialyse est largement utilisé tant dans le domaine médical pour la mise en oeuvre d'hémodialyse en flux continu, par exemple de dialyse péritonéale ou d'échange plasmatique avec séparation des cellules et du plasma, que dans le domaine industriel dans des opérations de purification, par exemple dans l'industrie pharmaceutique et alimentaire. Il doit être bien entendu que l'invention ne porte pas sur la structure d'un tel élément de dialyse qui peut être quelconque et être constitué, par exemple, par des membranes ou des fibres creuses avec des cheminements quelconques à travers plusieurs chambres de dialyse, l'aspect essentiel du procédé étant que l'on puisse modifier la tonicité de la solution aqueuse introduite dans le compartiment primaire grâce à l'adjonction dans le compartiment secondaire d'une solution aqueuse hypotonique par rapport à la suspension d'érythrocytes, ceci bien entendu afin de lyser les érythrocytes. Le lysat d'érythrocytes doit être en contact avec la substance présentant une activité biologique que l'on souhaite encapsuler, mais il est possible d'introduire cette substance soit avant, soit pendant la lyse, soit même éventuellement après la lyse,- toutefois, dans ce dernier cas les rendements d'encap- sulation sont moins bons. Il existe plusieurs possibilités afin d'augmenter la pression osmotique du lysat d'érythrocytes lorsque l'on désire resceller la membrane des érythrocytes. Dans un premier mode de réalisation, on augmente la pression osmotique du lysat d'érythrocytes en le faisant passer dans le circuit primaire d'un élément de dialyse dont le circuit secondaire contient une solution hypertonique par rapport au lysat, la solution après rescellement étant recueillie en continu. Dans un second mode de réalisation, on augmente la pression osmotique du lysat en le mélangeant avec une solution hypertonique et/ou hyper-oncotique par rapport audit lysat. Dans ce qui précède, il convient de remarquer que le produit traité est une suspension aqueuse d'érythrocytes, c'est-à-dire que dans la plupart des cas on préférera travailler sur une suspension "synthétique" d'érythrocytes et non sur le sang total, c'est-à-dire une suspension ne comportant principalement comme composant d'origine sanguine que les érythrocytes. Dans ces conditions, et comme cela se pratique de façon courante dans les circulations extra-corporelles, le circuit comprendra de préférence en amont un séparateur de cellules qui permettra d'isoler les érythrocytes du sang, puis un dispositif assurant le lavage de ces érythrocytes, toutestechniquesparfai- tement connueset qui mettent en oeuvre par exemple des systèmes de centrifugation. L'utilisation d'une suspension "synthétique" d'érythrocytes permet de contrôler avec précision la pression osmotique de ladite suspension aqueuse et donc assure une bonne reproductibilité des résultats obtenus. Lorsque l'on prépare cette suspension aqueuse d'érythrocytes, il est possible d'effectuer divers types de "conditionnement" de la suspension. On peut tout d'abord placer les érythrocytes dans un milieu iso-osmotique par rapport au sang, c'est-à-dire dans les conditions naturelles de pression osmotique, dans ces conditions la lyse sera effectuée en présence d'une solution aqueuse hypotonique par rapport à la suspension d'érythrocytes. Mais il est également possible de conditionner les érythrocytes dans une solution aqueuse contenant des substances diffusibles à travers la membrane, dans ces conditic ces érythrocytes vont avoir tendance à gonfler et il sera possible d'effectuer la lyse en utilisant un milieu iso-osmotique ou même, dans certains cas, hyper-osmotique (ces pressions étant évaluées par rapport à la pression osmotique normale dans le sang). Il peut être également intéressant lorsque l'on prépare la suspension synthétique d'érythrocytes destinée à être traitée d'ajouter à cette suspension des composés macromoléculaires, en particulier des colloides, de façon à créer dans cette solution une pression oncotique, cette pression oncotique aura pour effet lors de la lyse de limiter la perte des macromolécules intracytoplasmiques et en particulier la perte de l'hémoglobine. Il est bien entendu possible d'envisager, au stade de la lyse ou du rescellement, d'utiliser non seulement des modifications de la pression osmotique de la solution, mais également des modifi- cations de la pression oncotique afin d'améliorer la lyse ou le rescellement. L'un des avantages considérable du procédé selon la présente invention, outre les possibilités de contrôler la stérilité et la présence de pyrogène, ce qui permet l'utilisation des produits obtenus chez l'homme, est que ce procédé se prête particulièrement bien à un asservissement par contrôle des paramètres tels que temps, volume, température, débit, surface d'échange, conductivité, force ionique, notamment. Les différents paramètres de mise en oeuvre du procédé peuvent varier suivant la nature des éléments traités mais la lyse sera effectuée, de préférence, à une température comprise entre O et 100 C et le rescellement à une température comprise entre et 400 C. Comme cela a été indiqué précédemment, il a été constaté que bien que le procédé selon la présente invention soit un procédé en continu, on obtenait des rendements très supérieurs aux rendements observés par la technique dite en 'sac de dialyse" En outre, les volumes de sang traités peuvent être très importants, le traitement s'effectuant avec une très grande rapidité. Les différences observées entre ces résultats peuvent s'expliquer en partie car les deux procédés sur le plan fondamental sont très différents En effet, l'un des procédés est une méthode cinétique alors que l'autre est une méthode d'équilibre Dans ces conditions, le raccourcissement considérable de la durée durant laquelle les hématies-sont maintenues lysées limite les échanges physicochimiques membrane-milieu s'accompagnant d'une perte de constituants de-la membrane érythrocytaire, ce qui réduit très fortement la proportion d'hématies pour lesquelles la lyse est devenue irréversible. Bien entendu, outre les avantages liés à la rapidité de traitement qui peut être obtenue par la mise en oeuvre du procédé, il faut mentionner le fait qu'il est possible, pour la phase de dialyse, de traiter des volumes importants, par exemple il est possible de traiter 200 ml de culot globulaire lavé en 10 minutes au lieu de 10 à 20 ml en 2 heures et demie par la méthode en sac de dialyse. Le procédé selon la présente invention peut être mis en oeuvre pour encapsuler un grand nombre de substance présentant une activité biologique Il s'agit en particulier: des protéines, des enzymes, des hormones, des substances à activité pharmacologique de façon générale, des substances modifiant le métabolisme des érythrocytes, telles que, par exemple, les effecteurs allostériques de l'hémoglobine, et des substances protectrices, notamment cryoprotectrices, de l'hémoglobine et des érythrocytes. Comme cela a été développé précédemment, parmi les substances présentant une activité biologique qui peuvent être mises en oeuvre dans le procédé de l'invention, il faut citer les effecteurs allostériques de l'hémoglobine. Parmi les effecteurs allostériques de l'hémoglobine, il faut mentionner l'inositol hexaphosphate (IHP), mais d'autres effecteurs sont utilisables, par exemple les sucres phosphates tels que l'inositol pentaphosphate, l'inositol tétraphosphate, l'inositol triphosphate, l'inositol diphosphate et le diphosphatidynil- inositol diphosphate. Il est possible d'utiliser également des polyphosphates tels que des nucléotides triphosphates, nucléotides diphosphates, nucléotides monophosphates, des esters phosphate-alcools et le phosphate de pyridoxal. Bien entendu, il est possible, si cela est nécessaire et/ou utile, d'encapsuler plusieurs composés à activité biologique. L'encapsulation de ces produits permet pour certains d'entre eux un ciblage sélectif sur certains organes ou bien l'induction d'un effet retard prolongé qui peut atteindre 15 à 25 jours ou plus selon les données actuelles recueillies chez l'animal. Il est également important de noter que l'encapsulation peut induire un effet protecteur pour certains médicaments qui sont toxiques à l'égard de la plupart des tissus et des organes non visés par le médicament Une activité de même type est observée dans l'induction d'un effet protecteur à l'égard du médicament ou de l'hormone transportée qui, dans certains cas, sont susceptibles d'induire une réponse immunitaire, ou bien lorsqu'elles sont injectées à des individus qui possèdent un anticorps dirigé contre ces substances dans la circulation sanguine, par exemple un anticorps anti-insuline Cet effet protecteur peut aussi s'exercer à l'égard d'une dégradation métabolique du médicament ou d'hormone. Le procédé selon l'invention peut être également utilisé pour une activité essentielle sur l'érythrocyte, par exemple en utilisant les enzymes du métabolisme des globules rouges susceptibles d'assurer une régulation de certains composés présents dans le sang. Enfin, le procédé permet d'introduire des composés cryoprotecteurs de l'hémoglobine et de la membrane permettant notamment de protéger l'intégrité des érythrocytes. La présente invention concerne également un dispositif destiné à l'encapsulation dans les érythrocytes humains ou animaux d'au moins une substance présentant une activité biologique, caractérisé en ce qu'il comporte en combinaison au moins: un élément de dialyse comportant au moins un compartiment primaire et un compartiment secondaire séparés par une paroi de dialyse, un dispositif d'alimentation en continu de la suspension d'érythrocytes dans le compartiment primaire dudit élément de dialyse, un moyen permettant d'amener une solution aqueuse dans le compartiment secondaire de l'élément de dialyse, un moyen assurant l'introduction de la substance à activité biologique dans le compartiment primaire de l'élément de dialyse, un moyen assurant le transfert de la solution effluente du compartiment primaire dans un ensemble de rescellement comportant au moins un moyen pour augmenter la pression osmotique et/ou oncotique de la solution effluente. En ce qui concerne l'élément de dialyse, sa structure ne constitue pas en soi une caractéristique du dispositif selon la présente invention et il est possible d'utiliser tout type d'élément de dialyse comme cela a été indiqué précédemment dans le cadre du procédé. Comme dispositif d'alimentation en continu, on peut envisager un dispositif quelconque, notamment un système de pompe, en particulier les pompes péristaltiques couramment utilisées dans le domaine des dialyses. Le dispositif selon la présente invention peut comporter différents modes de réalisation, en particu- lier au niveau de l'ensemble de rescellement. Le premier mode de réalisation de l'ensemble de rescellement peut être constitué par un élément de dialyse comportant au moins un compartiment primaire et un compartiment secondaire séparés par une paroi de dialyse, la solution effluente étant amenée dans le compartiment primaire par le moyen de transfert et le moyen pour augmenter la pression osmotique étant constitué par une solution hypertonique par rapport -à la solution effluente, ladite solution hypertonique étant contenue dans le compartiment secondaire de l'élément de dialyse. Mais il est également possible de prévoir d'autres modes de réalisation de cet ensemble de rescellement qui peut être constitué par-une enceinte comportant un moyen d'amenée d'une solution hypertonique par rapport à la solution effluente. Comme la lyse est effectuée de préférence à température assez basse, comprise entre O et 100 C, et de préférence aux environs de 40 C, et comme le rescelle- ment est effectué de préférence à une température plus élevée, par exemple entre 20 et 40 'C, le dispositif selon l'invention comportera, de préférence, un moyen de chauffage de la suspension à traiter, le moyen de chauffage pouvant être situé entre l'élément de dialyse et l'ensemble de rescellement ou bien directement à l'intérieur de l'ensemble de rescellement. Dans un autre mode de réalisation, il est possible de prévoir après le premier élément de dialyse un récipient permettant de recueillir l'ensemble du volume de suspension à traiter, puis après avoir changé la tonicité de la solution aqueuse circulant dans le compartiment secondaire de l'élément de dialyse, de recycler le lysat d'érythrocytes ainsi obtenu dans le même élément de dialyse, dans ce cas cet élément de dialyse est utilisé dans un premier temps pour la lyse de la suspension d'érythrocytes, dans un deuxième temps comme ensemble de rescellement. -15 Le dispositif selon la présente invention peut également comporter des circuits d'asservissement qui, en réponse à des modifications de caractéristiques de la suspension traitée, agiront sur l'ensemble des paramètres de la réaction afin de ramener les caracté- ristiques de la suspension au niveau d'un seuil de consigne déterminé. D'autres caractéristiques et avantages du procédé et dispositif selon la présente invention pourront être dégagés dans la description des figures ci-après sur lesquelles: la figure 1 représente un premier mode de réalisation du dispositif selon la présente invention, et la figure 2 représente un second mode de réalisation du dispositif selon la présente invention. Le dispositif de la figure l est constitué d'un élément de dialyse l comportant un compartiment primaire 2 et un compartiment secondaire 3 séparés par une paroi de dialyse 4. Le compartiment primaire 2 est alimenté par une suspension d'érythrocytes contenue dans le réservoir 5 placé dans l'incubateur 6. Le sang avant d'être introduit dans le dialyseur i est amené à la température de lyse, en général 40 C, par l'intermédiaire d'un échangeur de température 7. La suspension d'érythrocytesest mise en circulation par l'intermédiaire de pompes péristaltiques telles que 8. Dans le mode de réalisation décrit, le composé à activité biologique est introduit dans le circuit par l'intermédiaire de la pompe péristaltique 9 avant que la suspension d'érythrocytes ne pénètre dans l'échangeur de température 7. Le compartiment secondaire 3 de l'élément de dialyse est alimenté en une, solution hypotonique contenue dans le récipient 10 placé dans l'incubateur 11. Cette solution hypotonique est amenée dans le comparti- ment secondaire de l'élément de dialyse par l'inter- médiaire d'une pompe péristaltique 12 et à travers un échangeur de température 13 Après son passage dans le compartiment secondaire de l'élément de dialyse, la solution hypotonique retourne au récipient 10; elle peut aussi être éliminée. Afin de s'assurer que la lyse des érythrocytes est complète, il est possible, comme cela est représenté à la figure 1, de placer à la sortie de l'élément de dialyse i une ligne retard 14, c'est-à-dire le plus souvent une simple tuyauterie de grande longueur par exemple. Dans le cas le plus fréquent o l'opération de rescellement doit être effectuée à une température supérieure à la température de lyse, on introduit après la ligne retard un échangeur de température tel que 15 qui permettra d'amener la suspension d'érythro- cytes lysée à la température, par exemple, de 370 C. Le lysat est placé en continu dans un récipient 16 contenu dans un incubateur 17, c'est dans ce récipient 16 que l'on ajoute en continu, ou bien en une seule fois, la solution de rescellement placée dans le récipient 18 contenu dans l'incubateur 19 par l'intermédiaire de la pompe péristaltique 20. Lorsque le rescellement est complet, la suspension d'érythrocytes dans laquelle se trouve encapsulé le composé à activité biologique est prélevée directement à partir du récipient 16. L'un des avantages du dispositif selon la présente invention est qu'il est possible de contrôler en permanence tous les paramètres de la réaction. Bien entendu, il est possible de contrôler la température des différents fluides circulant à l'aide de dispositifs qui n'ont pas été figurés car ils sont bien connus de l'état de la technique. Mais il est, en outre, très intéressant de pouvoir contrôler la pression des fluides et également leur pression osmotique afin de s'assurer que les échanges se feront dans les conditions optimum. Il n'est bien entendu pas nécessaire de rentrer dans le détail de ces dispositifs de contrôle qui sont de type connu On prévoiera, de préférence, au moins un manomètre tel que 21 pour contrôler la pression des fluides dans le circuit primaire et un élément de mesure de la pression osmotique, par exemple par mesure de la conductivité à l'aide d'un dispositif tel que 22, ces éléments permettant d'agir pour modifier les autres paramètres de la réaction tels que le débit d'alimenta- tion, afin de ramener les valeurs de la pression et de la pression osmotique à des valeurs de consigne. Il en ira de même sur le circuit secondaire o un dispositif schématisé 23 permettra de mesurer la pression du fluide ainsi que la pression osmotique afin de maintenir les caractéristiques des fluides à certaines valeurs de consigne. Il est représenté également d'autres dispositifs de contrôle tels que 24 et 25 assurant des fonctions identiques à celles définies précédemment. La figure 2 représente un dispositif qui est identique à celui de la figure 1 jusqu'au niveau du second échangeur thermique référencé 15 sur la figure 1, c'est pourquoi cette partie du dispositif ne sera pas redécrite puisqu'elle est absolument identique à celle de la figure 1. Par contre, pour ce qui concerne l'étape de rescellement, celle-ci est effectuée par l'intermédiaire d'un second élément de dialyse 30 comportant un compartiment primaire 31 et un compartiment secondaire 32 séparés par une membrane de dialyse 34. Une solution de rescellement hypertonique circule dans le compartiment secondaire 32 par l'inter- médiaire d'une pompe péristaltique 35 qui prélève cette solution hypertonique dans le récipient 36 et la conduit par l'intermédiaire del'échangeur de température 37 dans le compartiment secondaire de l'élément de dialyse Cette solution hypertonique peut 252946 ' être recyclée dans le récipient 36. La suspension de lyse provenant du premier élément de dialyse,et après son passage dans la ligne retard et dans l'échangeur de température, est amenée dans le compartiment primaire de l'élément de dialyse 30 dans lequel les érythrocytes sont rescellés, la suspension après rescellement étant recueillie dans un récipient 38 contenu dans un incubateur. Là encore, tout comme cela a été mentionné précédemment, on prévoit différents dispositifs de contrôle tels que 40, 41 et 42 permettant de contrôler en continu les paramètres de mise en oeuvre du procédé. De façon générale, le débit du circuit primaire contenant les érythrocytes est compris entre 20 et 80 ml/min alors que les débits des solutions hypertoniques ou hypotoniques du circuit secondaire sont de l'ordre de 100 à 1 000 ml/min. Dans les essais qui seront rapportés ci-après, les surfaces de dialyseurs mis en oeuvre sont en général de l'ordre de 0,41 m 2. *Les pressions dans les circuits sont voisines. de 100 mm de mercure selon les débits utilisés. Les forces ioniques des solutions de lyse sont d'environ 40 mosmoles et les forces ioniques des solutions de rescellement sont d'environ 300 mosmoles. Le schéma de la figure 2 qui est symétrique pour les deux opérations de lyse et de rescellement montre qu'il est possible d'envisager l'utilisation d'un dispositif ne comportant qu'un seul élément de dialyse et de le faire fonctionner dans un premier temps pour lyser la suspension d'érythrocytes puis, après avoir recueilli l'ensemble de la solution 2529463 - lysée, de faire fonctionner cette bobine de dialyse pour le rescellement en changeant uniquement la tonicité de la solution alimentant le compartiment secondaire. Les dispositifs schématisés aux figures 1 et 2 ont été utilisés afin de mettre en oeuvre le procédé revendiqué. EXEMPLE 1 Incorporation de desferrioxamine (Desféral) Dans cet exemple, on utilise le dispositif schématisé à la figure 1. Le dialyseur 1 présente une surface de 0,41 m et est alimenté par une suspension d'érythrocytes avec un débit de 60 ml/min dans le compartiment primaire alors que dans le compartiment secondaire on fait passer, avec un débit de 500 ml/min, une solution de lyse comportant Na H 2 PO 4 -Na 2 HP 4, p H 7,4, 10 m M, Ca Cl 2 0,5 m M et 2 m M de glucose. La suspension d'érythrocytes a été obtenue de la façon suivante: A 200 ml de culot globulaire lavés, à 70 % d'hématocrite, on ajoute 5 ml de solution contenant 250 mg de Desféral La lyse est effectuée à 4 WC en maintenant la suspension de lyse dans un récipient 16 à cette température pendant 10 min On introduit ensuite ml de Na Cl 1,5 M, contenant 10 % de PEG 4000 La suspension est maintenue en contact avec cette solution de rescellement pendant 30 min à 37 WC Ensuite, on prélève l'ensemble et on effectue 3 lavages par Na Cl à 9 g/l. Il est utile d'effectuer un lavage intermédiaire par une solution à 200 mos ou 250 mos environ pour éliminer certaines populations érythrocytaires fragilisées. De même, la resuspension dans le plasma initial ou dans des solutions de régénération peut se révéler nécessaire pour une bonne conservation des hématies. Après dosage, on constate que l'on a incorporé dans le culot globulaire 148 mg de Desféral (soit un rendement brut de 59 %), mais il convient de remarquer que 12 mg de Desféral ont été éliminés dans la solution de dialyse, ce qui conduit en fait à un rendement net d'incorporation du Desféral dans les érythrocytes de 63,5 %. Si l'on modifie le débit d'alimentation en suspension d'érythrocytes pour l'amener à 80 ml/min, le rendement brut d'incorporation est de 47,3 % et le rendement net est de 57,9 %. Pour un débit de 40 ml/min le rendement brut est de 49,4 % et le rendement net de 59,1 %. Pour un débit de 20 ml/min le rendement brut est de 46,1 % et le rendement net de 64,2 %. Ces résultats démontrent qu'il existe un optimum de débit de suspension érythrocytaire pour une surface de dialyseur donnée, lorsque la substance qui doit être incorporée est une substance susceptible de diffuser à travers la membrane de dialyseur. EXEMPLE 2 Incorporation de desferrioxamine (Desféral) Dans cet exemple, on met en oeuvre le dispositif décrit à la figure 2, c'est-à-dire que l'on effectue le rescellement à l'aide d'une deuxième dialyse à 220 C à l'aide d'un élément de dialyse tel que 30. Dans ce cas, on utilise le tampon de rescellement suivant: Na H 2 PO 4-Na 2 HPO 4 10 m M, p H 7,4, Ca C 120,5 mm, glucose 2 m M, Na Cl 144 m M. Les autres paramètres restant identiques, le débit de suspension érythrocytaire est de 50 ml/min. Dans ce cas, on observe un rendement net d'incorporation de 46,7 % alors que le rendement brut est de 32,5 %. Ces résultats s'expliquent aisément puisque le Desféral est une substance diffusible et que l'on tend à perdre encore une nouvelle quantité-de Desféral lors de la seconde dialyse. EXEMPLE 3 Incorporation d'insuline Dans cet exemple on encapsule de l'insuline dans les érythrocytes en mettant en oeuvre le dispositif schématisé à la figure 1 Dans ce qui suit il ne sera mentionné que les paramètres qui diffèrent de ceux indiqués à l'exemple 1. Afin de permettre le dosage de l'insuline, le produit utilisé est marqué avec I par la méthode de la chloramine T. On ajoute 10 ml d'insuline ( 4 U/ml-432 800 cpm/ml) à 200 ml de culot globulaire lavés trois fois avec Na Cl à 9 g/l. Le débit de suspension érythrocytaire utilisé est de 60 ml/min Apres la lyse, l'incubation se poursuit min à 4 C. Le rescellement est effectué à 37 C à l'aide de 20 ml de Na Cl 1,5 M contenant 10 % de PEG 4 000. L'incubation est poursuivie 30 min à 37 "C et les globules rouges sont ensuite lavés trois fois par Na Cl à 9 g/l. Dans ces conditions, le rendement d'incorporation de la radioactivité est de 48 % -(+ 4 %) Bien entendu, cette incorporation ne saurait préjuger de l'activité biologique de l'insuline encapsulée dans les globules rouges Il est bien connu que cette hormone est modifiée en présence d'hémolysat de globule rouge. Toutefois, ce résultat confirme les possibi- lités d'incorporer dans les érythrocytes une protéine de 7 000 daltons. Afin de conserver l'intégrité fonctionnelle de l'insuline, il peut être nécessaire de prévoir d'incorporer des substances protectrices de l'insuline au milieu érythrocytaire, ceci peut bien entendu être réalisé très aisément à l'aide du dispositif selon la présente invention. EXEMPLE 4 * Incorporation d'albumine On opère comme cela est décrit dans l'exemple 3 en utilisant de l'albumine marquée à I 5 Dans ces conditions, on observe un rendement qui est de l'ordre de 35 %, ce résultat montre l'influence de la masse moléculaire sur le rendement d'incorporation d'une protéine. Les exemples suivants sont destinés à illustrer l'encapsulation d'effecteurs allostêriques de l'hémo- globine, notamment l'inositol hexaphosphate (IHP) grâce au procédé de la présente invention. Pour réaliser une transformation plus ou moins importante des globules rouges à l'aide de l'inositol hexaphosphate, on utilise par exemple deux types de solution permettant de faire varier le rapport IHP/Na. Solution A g d'IHP 12 Na ( 12 % H 20) dans 55 ml d'eau distillée sont passés sur une colonne de DOWEX 50 W- 400 mesh équilibrée en ions H On obtient 63 ml d'IHP acide ( 14,2 10-3 mole). Cet IHP acide est utilisé pour neutraliser une autre solution d'IHP 12 Na jusqu'à p H 7,4 38,1 10-3 mole 2529463 - d'IHP 12 Na dans 153 ml sont neutralisés par 97 ml d'IHP acide contenant 17 10-3 mole d'IHP. Au total on obtient une solution contenant 10-3 mole IHP et 457 10 3 mole sodium dans 250 ml Cette solution est diluée pour obtenir un milieu à 250 mosmoles/l. Solution B 11 g d'IHP 12 Na ( 12 % H 20) sont neutralisés par 40 ml d'H Cl N dans 750 ml d'H 20 à p H 7,4 On obtient un milieu à 230 mosmoles/l. EXEMPLE 5 Incorporation d'IHP Dans cet exemple, on utilise le dispositif schématisé à la figure 1. Le dialyseur 1 présente une surface de 0,41 m et est alimenté par une suspension d'érythrocytes avec un débit qui varie selon les expériences de 20 à 60 ml/min. Le circuit secondaire est alimenté à 500 ml/min par un tampon de lyse ayant la composition suivante: CO 3 H Na 10 m M PO 4 H 2 K/PO 4 HK 2 10 m M, glucose 2 m M, p H 7,4. La suspension d'érythrocytes utilisée a été obtenue de la façon suivante: A 200 ml d'un culot globulaire d'érythrocytes lavés 3 fois par une solution de Na Cl à 9 g/1 ( 70 % d'hématocrite), on ajoute un volume équivalent de l'une des solutions A ou B. Après centrifugation, le surnageant légèrement hémolysé est éliminé. La lyse est effectuée à 40 C La suspension de lyse est maintenue dans un récipient 16 pendant minutes à 370 C en présence d'IHP. La suspension de lyse est rescellée par addition de 10 % en volume d'une solution contenant Na Cl 1,5 M, PEG 4000 à 10 % Après incubation de 30 minutes à 370 C, les culots globulaires sont lavés 3 fois par une solution de Na Cl à 9 g/l et remis en suspension dans le plasma d'origine. Il est utile d'effectuer un lavage intermédiaire par une solution à 220 mos environ afin d'éliminer certaines populations érythrocytaires fragilisées. De même, la resuspension dans le plasma initial ou dans des solutions de régénération peut se révéler nécessaire pour une bonne conservation des hématies. Les résultats de ces expériences sont rassemblés dans le tableau ciaprès: H Ww) úS'1 6 V'l S Z '1 L 6 'TV 9 '1 05, E TTîli BP u urw) v L'op 9 9 c CILL S 9 9 S i S 9 '61 05 a (UTUJ/TW) oz op 09 oz op 09 09 a Uo Tqnjos v uo Tqn Tas TDUN as Al ên 1 %O r C 3 % Cj Ln CU 252946. Les courbes de liaison de l'oxygène représentées à la figure 3 sont mesurées à 250 C par la méthode de diffusion rapide à l'aide de l'appareil de Duvelleroy (J Appl Physsiol 28, 227-233 ( 1970) et Tesseirre et al (Bull Physiopath Resp 11, 837-851 ( 1975). La courbe de la figure 3 représente pour divers débits de suspension érythrocytaires et suivant la nature de la solution utilisée, A ou B, la pression partielle d'oxygène en mm de mercure en fonction du pourcentage de saturation des érythrocytes. La pression de demi-saturation notée dans le tableau P 50 est une indication de l'affinité de l'oxygène pour l'hémoglobine La pente de la courbe au voisinage de la demi-saturation, c'est-à-dire entre 40 et 60 %, représente le degré de coopération des quatre sites de fixation de l'oxygène dans l'hémoglobine, cette pente permet de calculer le coefficient de HILL. On détecte une amélioration de la libération de l'oxygène, c'est-à-dire une diminution de l'affinité de l'hémoglobine pour l'oxygène, soit par une diminution du coefficient de HILL, c'est-à-dire une diminution de la pente de la courbe de la figure 3 au voisinage de 50 % de la saturation, ou bien par un déplacement global de la courbe vers la droite qui correspond à une augmentation de la pression partielle d'oxygène au voisinage de 50 % de la saturation. Pour les érythrocytes témoins de la courbe T dont la P 50 est de 19,3 mm de mercure, on observe que les mêmes érythrocytes traités par le procédé de l'exemple en présence initiale de sérum physiologique ont une p 50 de 18,5 mm de Hg alors qu'après incorpo- ration d'IHP par le procédé selon la présente invention les P 50 observées varient entre 36,8 et 77 mm de Hg suivant les débits utilisés ainsi que la nature de la solution d'IHP utilisée. EXEMPLE 6 En utilisant la solution A diluée pour obtenir 210 mosmoles/l on effectue une lyse à 4 C avec un débit de 20 ml/min puis un rescellement de 30 min en faisant varier la température Le tableau ci-après montre l'influence de la température de rescellement sur la valeur de la P 50 obtenue mais aussi sur le rendement en globules rouges reconstitués exprimé en faisant le rapport des hématocrites des suspensions de globules rouges reconstitués à l'hématocrite de la suspension initiale pour un volume total équivalent. Température de p (mm Hg) Rendement rescellement -50 g (hmatocrite) C 42 27 % C 48 36 % C 50,5 45 % C 54,5 50 % Après rescellement et maintien en milieu plasmatique, la plus grande partie de globules rouges retrouve une forme discocytaire bien que faiblement microcytaire Les formes plus ou moins vésiculaires ne sont pas significativement plus nombreuses que dans la population native Ceci est confirmé par la figure 4 correspondant à une photographie au microscope électronique à balayage d'une suspension érythrocytaire rescellée dont la P 50 est de 68 mm de Hg. Les conditions expérimentales décrites démontrent les grandes possibilités d'utilisation de la dialyse en flux continu pour réaliser dans des conditions variables l'incorporation d'IHP ou d'autres effecteurs allostériques de l'hémoglobine afin de réaliser une modification des propriétés oxyphoriques du sang. Le contrôle des paramètres de la réaction de lyse-rescellement, volumes, débits, températures, compositions des milieux, est aisément réalisable à l'aide du dispositif expérimental utilisé. Ce dispositif permet la transformation rapide de quantités importantes de globules rouges Il pourrait éventuellement être incorporé dans un circuit de circulation extracorporelle Les conditions d'utilisation permettent une application thérapeutique chez l'homme. La méthode d'incorporation d'effecteurs allostériques de l'hémoglobine dans les globules rouges décrite dans ce brevet présente une série d'avantages évidents par rapport à la méthode liposomale décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n' 4 192 869 1) Elle n'utilise pas de phospholipides et du cholestérol exogènes et en cela simplifie considé- rablement les problèmes de toxicité ainsi que d'activités immunologiques acquises par les globules rouges. 2) Elle permet une quantification très précise de la concentration d'effecteurs allostériques de l'hémoglobine incorporée et par conséquent permet l'obtention de la p 50 souhaitée. 3) Le processus d'incorporation est plus rapide et largement automatisable. 4) La reproductibilité de cette méthode est supérieure à celle de la méthode liposomale. REVENDICATIONS 1) Procédé d'encapsulation dans les érythrocytes humains ou animaux d'au moins une substance présentant une activité biologique, caractérisé en ce que: on alimente en continu le compartiment primaire d'au moins un élément de dialyse avec une suspension aqueuse d'érythrocytes, dont le compartiment secondaire contient une solution aqueuse hypotonique par rapport à la suspension d'érythrocytes afin de lyser les érythrocytes, en ce que le lysat d'érythrocytes est alors en contact avec ladite substance présentant une activité biologique et en ce que, afin de resceller la membrane des érythrocytes, on augmente la pression osmotique et/ou oncotique du lysat érythrocytaire après sa mise en contact avec ladite substance à activité biologique. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on augmente la pression osmotique du lysat d'érythrocytes en le faisant passer dans le circuit primaire d'un élément de dialyse dont le circuit secondaire contient une solution hypertonique par rapport au lysat et en ce que l'on recueille en continu le lysat rescellé. 3) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on augmente la pression osmotique du lysat en le mélangeant avec une solution hypertonique et/ou hyperoncotique par rapport audit lysat. 4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la lyse est effectuée à une température comprise entre O et 100 C. ) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le rescellement est effectué à une température comprise entre 20 et 400 C. 6) Procédé selon l'une des revendications i à 5 caractérisé en ce que la substance présentant une activité biologique est ajoutée avant ou pendant la lyse. 7) Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la substance présentant une activité biologique est choisie parmi: les protéines, les enzymes, les hormones, les substances à activité pharmacologique, les substances modifiant le métabolisme des érythrocytes, les effecteurs allostériques de l'hémoglobine, les substances protectrices de l'hémoglobine et des érythrocytes. 8) Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la substance à activité biologique est un effecteur allostérique de l'hémoglobine. 9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'aait d'un composé choisi parmi les sucres phosphates, les polyphosphates et les esters phosphate- alcools. ) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un composé choisi parmi l'inositol hexaphosphate, l'inositol pentaphosphate, l'inositol tétraphosphate, l'inositol triphosphate, l'inositol diphosphate et le diphosphatidynilinositol diphosphate, les nucléotides triphosphates, les nucléotides diphosphates, les nucléotides monophosphates et le phosphate de pyridoxal. 11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le composé utilisé est l'inositol hexaphosphate. 12 > Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on incorpore un composé choisi parmi la desferriaxamine, l'insuline, l'albumine. 13)Dispositif destiné à l'encapsulation dans les érythrocytes humains ou animaux d'au moins une substance présentant une activité biologique, caractérisé en ce qu'il comporte au moins: un élément de dialyse comportant au moins un compartiment primaire et un compartiment secondaire séparés par une paroi de dialyse, - un dispositif d'alimentation en continu de la suspension dtérythrocytes dans le compartiment primaire dudit élément de dialyse, un moyen permettant d'amener une solution aqueuse dans le compartiment secondaire de l'élément de dialyse, un moyen assurant l'introduction de la substance à activité biologique dans le compartiment primaire de l'élément de dialyse, - un moyen assurant le transfert de la solution effluente du compartiment primaire dans un ensemble de rescellement comportant au moins un moyen pour augmenter la pression osmotique et/ou oncotique de la solution effluente. 14) Dispositif selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'ensemble de rescellement est constitué par un élément de dialyse comportant au moins un compartiment primaire et un compartiment secondaire séparés par une paroi de dialyse, la solution effluente étant amenée dans le compartiment primaire par le moyen de transfert et le moyen pour augmenter la pression osmotique étant constitué par une solution hypertonique par rapport à la solution effluente, ladite solution hypertonique étant contenue dans le compartiment secondaire de l'élément de dialyse. ) Dispositif selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'ensemble de rescellement est constitué par une enceinte comportant un moyen d'amenée d'une solution hypertonique par rapport à la solution effluente. 16) Dispositif selon l'une des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que le dispositif comporte entre l'élément de dialyse et l'ensemble de rescellement un moyen de chauffage. 17) Dispositif selon l'une des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que l'ensemble de rescellement est muni d'un moyen de chauffage. 18 > Dispositif selon l'une des revendications 13 à 17, caractérisé en ce qu'il est muni d'un moyen de contrôle de la pression osmotique des suspensions érythrocytaires. 19, Dispositif selon l'une des revendications 13 à 18, caractérisé en ce qu'il est muni de moyen de contrôle de la pression des fluides circulant dans le dispositif. > Suspension d'érythrocytes dans laquelle est encapsulée une substance à activité biologique obtenue par la mise en o-uvre du procédé selon l'une des revendications l à 12. 21) Suspension d'érvthrocvtes selon la revendication 20, caractérisée en ce que la substance à activité biologique est choisie parmi les protéines, les enzymes, les hormones, les substances à activité pharmacologique, les substances modifiant le métabolisme des érythrocytes, les effecteurs allostériques de l'hémoglobine, les substances protectrices de l'hémoglobine et des érythrocytes.