FR 2530956 A1 19840203 FR 8213409 A 19820730 Procédé de séparation de facteurs ayant des propriétés d'activation des lymphocytes à partir de milieu d'incuba- tion de populations cellulaires, notamment de lignée granu- locyto-macrophagique, par une réaction antigène-anticorps mettant en jeu des anticorps anti-MDP. L'invention est relative à un procédé de sépa- ration de facteurs ayant des propriétés d'activation de lympohocytes, parmi lesquels également des facteurs pré- sentant des propriétés pyrogènes-endogènes, à partir d'un milieu d'incubation de populations cellulaires, de lignée granulocyto-macrophagique, par une réaction antigène- anticorps mettant en jeu des anticorps anti-MDP. On sait que l'administration d'endotoxines et de nombreux autres produits bactériens est susceptible d'induire la production par des leucocytes de facteurs ayant des propriétés d'activation ou de stimulation des lymphocytes plus particulièrement des lymphocytes T (activité de type "Lymphocyte Activating Factor" ou "LAF"): Parmi les facteurs ayant ce type d'activité fi- gurent également des pyrogènes endogene; PÉ obtenus a partir de leucocytes Ces facteurs sont tenus pour res- ponsables en grande partie de l'élévation de température induite in vivo par l'administration desdites endo- toxines et autres produits bactériens Le N-acétylmuramyl-L-alanyl-Disoglutamine, ou MDP (pour muramyl dipeptide), a été identifié comme étant la structure minimale des peptidoglycanes bacté- riens capable de remplacer les mycobactéries entières dans l'adjuvant complet de Freund (ACF) Par ailleurs, cet adjuvant, qui peut être obtenu par synthèse, s'est révélé capable de produire une hyperthermie chez le lapin, soit en libérant des pyrogènes leucocytaires circulants, soit par action directe sur les centres de la thermorégulation. Il est à noter que la dose minimale pyrogène de MDP est de 30 microgrammes/kg, lorsque le produit est injecté par voie intraveineuse, alors que, après administration par voie intracérébroventriculaire, la dose de O,1 nano- gramme, soit environ 20 picomoles est active Cette dose est voisine de celle à laquelle le pyrogène endogène est théoriquement actif. Des facteurs ayant une activité du type LAF, et notamment de tels facteurs qui possèdent des proprié- tés pyrogènes-endogènes, peuvent également être induites in vitro En particulier, les susdites populations cel- lulaires, notamment celles appartenant aux séries monocy- taires et lymphocytaires, sont susceptibles de libérer des facteurs ou cytokines, par exemple lymphokines ou monokines, lorsqu'elles sont incubées dans un milieu de culture contenant un agent immunostimulant Ces facteurs, qui sont libérés dans le milieu de culture, peuvent être isolés à partir de celui-ci Parmi ces facteurs peuvent également figurer les pyrogènes-endogènes, notamment ceux qui sont également connus sous la désignation Interleukines 1 (IL-1). De nombreux agents immuno-stimulants peuvent être mis en eouvre, pour induire la production in vitro desdites interleukines 1 On mentionnera par exemple des lectines, des produits naturels notamment d'origine virale, bac- térienne, fongique ou parasitaire, plus particulièrement des produits provenant de parois bactériennes tels que les produits du type lipopolysaccharide bactérien (LS). On peut aussi mettre en oeuvre des micro-organismes entiers Des Il-1 peuvent être induites dans des cultures de cellules mononucléées humaines du sang périphérique, stimulées pendant une heure à llaide de staphylocoques tués par la chaleur Après lavage, les cellules adhérentes sont incu- bées 24 heures, puis leur surnageant de culture contenant les pyrogènes leucocytaires, ci-après désignés par l'abréviation "PL", est centrifugé à 25 000 G et conservé à 4 C. Il a également été montré que le MDP et de nombreux homologues du MDP pouvaient être utilisés pour induire la production in vitrb des IL-1 susdites Les fractions LAF qui peuvent ainsi être isolées des milieux de culture stimulés présentent également une activité pyrogène Cependant lorsque l'on a recours à une classe préférée d'homologues du MDP, plus particulièrement-aux dérivés a-esters de la N-acétyl-muramyl-L-alanyl-D- glutamine, tels que décrits notamment dans la demande de brevet européen n 79400357 et de préférence à l'a-nbutyl- ester de la N-acétyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamine, il est possible d'induire dans lesdites cultures cellulaires la production de monokines présentant les activités immuno- stimulantes caractéristiques du LAF, ces monokines étant cependant dépourvues de pyrogénicité-endogène On pourra se rapporter avec avantage,pour la description des condi- tions dans lesquelles cette induction peut être réalisée, à la demande de brevet français n O 82 00241. Des procédés de séparation, voire de purifica- tion mettant en jeu des réactions antigène-anticorps ont déjà été décrits Ainsi on a déjà décrit un procédé d'obtention d'une fraction d'immunoglobulines anti- pyrogène, par immunisation du lapin avec un surnageant d'une culture de leucocytes humains antérieurement stimu- lés et doués d'activité pyrogène (DINARELLO, C A, RENFER, L et WOLFF, S M, J Clin Invest,vol 60,1977,p 465-472). De même l'utilisation de ces anticorps pour constituer des colonnes de chromatographie d'affinité, par fixation sur le matériau immunoabsorbant connu sous la désignation SEPHAROSE 4 B, activé au préalable par le bromure de cyanogène a également été décrite par ANFINSEN et Coll dans "Proc Natl Acad Sci USA",vol 71,p 3139-3142. Ce sont cesanticorps qui seront dans ce qui suit dési- gnés par l'expression "anti-PL humain". Ces anticorps fixés sur SEPHAROSE 4 B sont à l'origine d'un procédé connu pour purifier le PL, ou plus généralement lespyrogènes-endogènes (PE) issus de toute autre source. Ce procédé comprend notamment les étapes consistant à mettre en cortact les surnageants préalablement concen- trés, par exemple dans les conditions déjà indiquées, avec une colonne immunoabsorbante de SEPHAROSE 4 B activé par le bromure de cyanogène et portant les anticorps de lapin anti-PL-humains, à éluer le PL, à soumettre l'éluat à une chromatographie sur une colonne du tamis molécu- laire commercialisé sous la désignation SEPHADEX G 50, et à recueillir les fractions ayant un poids moléculaire de l'ordre de 15 000, donnant une bande unique sur gel de polyacrylamide contenant 7,5 % de sodium- dodécyl sulfate (SOS), et douées d'activité pyiogène et d'activité LAF. Les fractions PL ainsi obtenues, certes concen- trées en pyrogène-leucocytaire, contiennent cependant toujours encore de quantités substantielles d'autres fac- teurs, notamment lymphokines, monokines etinterféron a, dont la séparation par les procédés classiques n'est guère permise. L'invention a pour but de remédier à cette dif- ficulté, plus particulièrement de fournir un procédé pous sélectif de séparation à partir des susdits milieux ou, selon le cas, de purification des facteurs présentant une activité du type LAF, ci-après désignés sous l'expression "facteurs LAF" des PL ou, plus généralement, des fractions pyrogènes-endogènes, ci-après désignées sous l'abréviation PE, également douées des propriétés LAF. L'invention a encore pour but,à l'inverse, de fournir un procédé d'élimination des PE, à partir de tout milieu susceptible d'en contenir, en vue de l'obtention d'un milieu substantiellement dépourvu de pyrogènes-endo- gènes et à partir duquel pourront ensuite être obtenus d'autres principes actifs essentiellement dépourvus de PE. L'invention découle de la découverte que des facteurs ayant des propriétés du type LAF, et parmi eux les facteurs pyrogènes-endogènes, pouvaient être reco mus de façon sélective par des anticorps anti-MDP spécifiques. Le procédé selon l'invention de séparation ou de purification des facteurs ayant une activité de type LAF, et notamment de PE, à partir d'un milieu biologique liquide les contenant à ltétat dissous, est caractérisé par la mise en contact de ce milieu avec des anticorps anti- MDP, et la récupération à partir du complexe facteur PE-anticorps anti-MDP du fnctpur PE lui-même. Les anti-corps anti-MDP susceptibles d'être mis en oeuvre dans le procédé de purification selon l'in- vention peuvent être obtenus de toute façon en soi con- nue, notamment par immunisation de l'animal, par exemple le lapin, avec un MDP ou dérivé de MDP préalablement fi- xé sur une molécule porteuse, telle que la sérumalbumine bovine, des polylysines ou autre molécule ayant un poids moléculaire suffisamment élevé pour conférer au conjugué obtenu l'immunogénicité requise En ce qui concerne les conditions générales de la fabrication des anticorps anti- MDFP, on peut se référer à l'article de REICHERT C M. et coll publié dans Molec Immun 17, 357-363 ( 1980) On peut aussi se reporter à l'article de BAHR G M et coll. publié dans Molec Immun 19, no 5, 737-745 ( 1982). Les anticorps contenus dans les antisérums obtenus peuvent être purifiés, par exemple par chromatographie affine sur une colonne de résine portant des molécules de MDP ou dé- rivées de MDP fixées sur cette résine Avantageusement, cn aura recours à une colonne du matériau support insoluble commercialisé sous la désignation SEPHAROSE 4 B sur laquelle ont été fixés des groupes MDP-lysine (Ni-acétyl-muramyl-L- alanyl-D-isoglutaminyl-L-lysine), après activation préalable du matériau support au bromure de cyanogène. Les anticorps anti-MDP (anticorps anti-MDP poly- clonaux) fixés sur un tel matériau peuvent ensuite être élués par exemple par acidification du milieu, notamment à un p H inférieur à 4, ou par accroissement de la concentra- tion ionique du milieu, grâce à des sels ioniques fortement solubles dans l'eau, tels que le thiocyanate de sodium. Selon une caractéristique préférée importante de l'invention, on a cependant recours à des anticorps anti-MDP "sélectifs" en ce qu'ils reconnaissent de façon spécifique la structure N-acétyl-muramyl-L-alanyl-D- isoglutamine dans son ensemble, à l'exclusion notamment soit de la structure de l'acide N-acétyl-muramique isolé, soit de celle de la L-alanyl-D-isoglutamine isolée. Ces derniers anticorps anti-MDP sélectifs, plus particulièrement des anticorps monoclonaux, permettront un degré de purification nettement plus poussé que les anti- corps polyclonaux, puisque ces derniers sont susceptibles de fixer d'autres constituants des milieux biologiques concer- nés, par exemple de nombreuses autres structures glycopepti- des également présentes dans ces milieux Néanmoins les anti- corps anti-14 DP polyclonaux peuvent être utilisés avec avan- tage pour produire un premier enrichissement en facteur PE, des purifications plus poussées étant ensuite, si besoin, répétées en mettant en oeuvre des anticorps "sélectifs" mono- clonaux Une technique d'obtention d'hybridomes secrétant de tels anticorps monoclonaux et à la récupérer-de ceux-ci à partir des milieux de cultures de ces hybridomes, ainsi que les conditions dans lesquelles ils peuvent être mis en oeuvre, seront indiquées plus loin, exclusivement à titre d'exemples - Le procédé selon l'invention présente donc les caractéristiques essentielles que constitue la formation de complexes entre les facteurs LAF, et notamment les facteurs PE, d'une part, et les anticorps anti-MDP, de préférence les anticorps "sélectifs", d'autre part, et la récupération des facteurs LAF et, le cas échéant, PE eux-mêmes, à partir de ces complexes, après dissociation de ceux-ci. Il est avantageux d'avoir recours à des anti- corps sélectifs anti-MDP supportés par un support inso- luble en milieu aqueux A cet effet, on peut avoir re- cours à tout support, de préférence pulvérulent, sur le- quel les anticorps anti-MDP peuvent être fixés sans que soit mise en cause leur capacité de former des com- plexes avec le facteur LA Fisolé On préfère avoir recours à des anticorps anti-MDP sélectifs fixés sur le matériau support commercialisé sous la désignation SEPHAROSE 4 B, après activation de celui-ci au bromure de cyanogène. Bien entendu, d'autres supports peuvent être envisagés tels que billes de verre, agarose et SEPHADEX, étant naturellement entendu qu'il appartiendra au spé- cialiste dé procéder aux essais de fixation des anti- corps sélectifs anti-MDP et de vérification de la pré- servation de l'activité complexante des anticorps anti- MDP ainsi fixés. Les opérations de récupération du facteur PE à partir du complexe préalablement formé entre celui-ci et des anticorps sélectifs anti-MDP peuvent être conduites de toute façon en soi connue, par exemple par acidification du milieu, notamment à un p H inférieur à 4, ou par Z 530956 accroissement de la concentration ionique du milieu, grace à des sels ioniques fortement solubles, par exemple tels que le thiocyanate de sodium, le chlorure de soude et le thiocyanate d'ammonium Ces méthodes sont particulière- ment avantageuses, surtout lorsque les anticorps anti-MDP, auront au préalable été fixés sur un support insoluble ap- proprié On peut avantageusement utiliser un anticorps anti-MDP obtenu à partir d'une solution d'anticorps anti- MDP polyclonaux, préalablement purifiée par chromatographie affine sur une colonne de SEPHAROSE 4 B-MDP-lysine, les anticorps anti-MDP étant ensuite élués de la colonne, no- tamment dans les conditions qui ont été indiquées plus haut D'une façon générale, on peut avoir recours, pour la fixation des anticorps anti-MDP sur support insoluble, à toute technique classique de fixationd'anticorps de ce type, par exemple telle que décrite dans "Chromatographie d'affinité: Principes et Méthodes", Pharmacia. Le milieu contenant lesdits facteurs LAF dont ils peuvent être extraits par le procédé selon l'invention peut être constitué par le surnageant de toute culture de lignées cellulaires susceptibles de produire des LAF,IL1 ou PE sous l'effet d'une immunostimulation telle que ci-dessus définie. Il s'agit principalement de monocytes, macrophages, suscep- tibles d'être obtenus notamment à partir du sang périphé- rique, de la rate, du poumon, du péritoine et de la moelle osseuse. Il peut être fait appel à des cellules de toutes origines, notamment des cellules humaines, de souris, de rat, de cobaye, de singe, de lapin ou de chien, en cultures primaires ou en lignées continues. Une source de cellules activables est aussi cons- tituée par les cellules susmentionnées, dont ont été sépa- rés auparavant les éléments non adhérents aux flacons de culture du type de ceux commercialisés sous la marque NUNCLON ou FALCON On peut notamment, pour les sources de cellules activables, se référer encore à l'article de I GERY et B H WAKSMAN, intitulé "Potentiation of the T-lymphocyte Response to Mitogens", publié dans "The Journal of Experi- mental Medicine", volume 136, 1972, p 143-155, et à l'ou- vrage édité par E PICK avec la collaboration de M LANDY, intitulé "Lymphokine Reports 1 "t, Academic Press, Inc. Les milieux contenant lesdits LAF et, le cas échéant, PE auxquels le procédé selon l'invention est ap- plicable peuvent encore être constitués par des fractions enrichies desdits surnageants, par exemple obtenus par dia- lyse de ces derniers pour en éliminer les teneurs en sels minéraux et en"petites molécules", par exemple celles ayant un poids moléculaire inférieur à environ 12 000. L'invention sera davantage encore illustrée par la description des techniques qui ont permis la dé- termination de la capacité de reconnaissance du facteur S ou de facteurs analogues par des anticorps sélectifs anti- r DP. 1 Production d'anticorps monoclonaux a) Immunisation des souris Deux groupes de souris femelles BALB/c, âgées de deux mois, ont été immunisés avec du MDP préalable- ment fixé sur de la sérumalbumine bovine (MDP-BSA) Le premier groupe reçoit deux injections intradermiques décalées l'une de l'autre par un intervalle de trois semaines, de 100 dg de i-P- WA érrulsifiés avec de l'adjuvant complet de FREUETD (CFA) Le seconad grcupe subit le même traitement, par voie intrapéritonéale, et avec des doses de 100 pg de l P-BSA dans le tampon PBS. b) Fusion des cellules et culture deshybrides cellulaires h Ybridomes) Neuf semaines après la dernière immunisation, les souris reçoivent deux rappels à un jourd'intervalle, avec 100 pg de MDP-BSA, en milieu salin, cette fois-ci par voie intrapéritonéale Trois jours après le dernier rappel, on sacrifie les souris, récupère les cellules spléniques et réalise une fusion cellulaire de ces cellules spléniques avec une lignée de cellules de myélo- me, par exemple du myélome NSO/1 il va naturellement de soi que l'on peut utiliser tout autre type accessible de cellules de myélome susceptibles de former, par fu- sion avec des cellules spléniques, des hybrides cellu- laires capables d'induire la production d'ascites chez l'animal alors susceptibles d'être utilisés comme source des anticorps présentant les caractéristiques de ceux initialement produits par les cellules spléniques mises en jeu dans la fusion. La fusion cellulaire de i D O millions de cellu- les spléniques de chaque groupe de souris avec 107 cellules 11 SO/lenprésence d'une solution de polyéthylène glycol 1 500 à 41 %, peut être réalisée selon la technique décrite par Z ESHHAR et coll dans J Immunol 124, 775, 1980 Après fusion, les cellules sont distribuées dans trois à quatre microplaques à 96 puits, puis sélectionnées dans un milieu de EAGLES, modifié par DULBECCO, contenant les constituants caractéristiques du milieu HAT, ayant une teneur en hypoxanthine, aminoptérine et thymidine (HAT- DMEM) et une forte teneur en glucose, milieu qui en ou- tre est complété pour contenir 15 % de sérum de cheval, unités par ml de pénicilline et de streptomycine,- 1 i m M de pyruvate de sodium et 2 n M de glutamine. Apres deux semaines de culture, les hybrides cellulaires sont transférés dans un milieu HT-DME Mo Les cellules qui se sont développées, peuvent ensuite être cultivées en routine dans un milieu à base seulement de DMEM et de sérum de cheval. Tri des cl 8 nes fabriquant des anticorps anti-MDP sélectifs De 10 à 15 jours après l'opération de fusion, on fait le tri des hybrides susceptibles de produire des anticorps anti-MDP, en,ayant recours à la technique dite de "radioimmunoassay" en phase solide, sur microplaques de poly(chlorure de vinyle) dont les puits ont au préala- ble été revêtus avec du MDP fixé sur multi(poly-D-L-alanyl)- (poly-L-lysine): i DP-A L, à raison de 100 p 1 d'une sol NJ- tion de 25 pg/ml de MDPP Arr L par puits Après incubation à la température ambiante,ipendant une heure, les microplaques sont lavées trois fois avec une solu- tion de sérum de cheval à 1 % dans le tampon PBS (PBS-HS). pjl de surnageants des cultures d'hybridomessont alors ajoutés dans chacun des puits et incubés pendant 2 heures à la température ambiante Après trois lavages avec PBS-HS, on ajoute 50 pl d'anticorps Ig de chèvre anti-souris, marqués à l'iode 125 ( 125 I) ( 1 Q 5 coups par minute: cpm) On laisse incuber-pendant une nuit à 4 O C Le niveau de radio-activité est déterminé dans un compteur de rayonnements Gamma après 4 lavages, séchages et découpages des puits. Le tableau qui suit résume les "efficacités de fusion" des deux essais de fusion mentionnés plus haut. :*: W Nombre de cultu :Grp: u res de cellules Hybridomes Groupe:Imunisation hybrides : hybrides qui ont positifs : * poussé À_: __:_ _ _ _ _ _ _ _ _________________ -: i MDP-BSA dans le 384/384 72/384 :CFA: 2 MDP-BSA dans le 288/288 29/288 : PBS Ont été considérés comme hybridomes positifs ceux qui ont conduit à des détections de 5 000 à 15 000 cpm, eu égard à un bruit de fond de 500 épm dans les es- sais réalisés avec des surnageants non producteurs d'anti- corps anti-MDP. Une deuxième sélection dans des conditions sem- blables mettant en jeu une deuxième série d'essais avec des microplaques dont les puits ont été revêtus respec- tivement de MDP-A L, de M-A L et DP-A L (c'est-à-dire de composés dans lesquels le MDP est remplacé par ses constituants de base: acide muramique (M) et L-alanyl- D-isoglutamine (DP)) Les anticorps monoclonaux permettent de sélectionner les anti-MDP qui ne présentent que peu ou pas d'activité à l'égard de DPA L ou M-A L. Pour produire des quantités d'anticorps plus importantes, les hybridomes sélectionnés sont administrés par voie intrapéritonéale à raison de 107 cellules hybrides à des souris BALB/c x DBA/2)F 1 Les anticorps secrétés sont ensuite récupérés de façon connue en soi à partir des tumeurs ascitiques fluides induites par ces hybridomes chez ces souris. On a également sélectionné, dans les conditions sus-indiquées les anticorps monoclonaux capables de recon- naître spécifiquement la molécule porteuse, c'est-à-dire la BSA Ces anticorps monoclonaux ont été utilisés à titre de témoins. Pour produire des quantités d'anticorps plus importantes, les hybridomes sélectionnés sont administrés par voie intrapéritonéale à raison de 10 x 106 cellules hybrides à des souris BALB/c x DBA/2)F 1 Les anticorps secrétés sont ensuite récupérés de façon connue en soi- à partir des tumeurs ascitiques fluides induites par ces hybridomes chez ces souris. Mise en évidence de la capacité des anticorps anti-MDP de se combiner au facteur PE. Pour démontrer la capacité des anticorps monoclonaux anti-MDP à se combiner sélectivement aux PE, on a eu recours à l'étude de la capacité de ces prépa- rations d'anticorps anti-MDP d'inhiber l'augmentation de l'incorporation de thymidine 3 H (activité spécifique 1 Ci/m Mol) par des thymocytes de souris C 57 B 1/6 âgées de 6 semaines, stimulées par les PE en présence de PHA (phytohémagglutinine), employée à la dose de 1 pg/ml, dans les conditions décrites par ROSENWASSER, L, - DINARELLO, C A, dans f Cel Ul Inol ", volo 63,1981, p 134-142. Les tests basés sur la détection de l'activité LAF, basée sur l'augmentation mesurée de l'incorporation de la thymidine tritiée, sont extrêmement sensibles et impliquent des doses de PE bien plus faibles que celles qui seraient requises pour la mise en évidence de l'inhibition par les anticorps anti-MDP de l'activité pyrogène elle-même in vivo sur le lapin. Dans les expériences d'inhibition de l'activi- té LAF, 1-a fraction PL purifiée susdite; diluée au 1/100 a été préincubée pendant 1 h à 37 C puis 12 h à 4 C avec les différents anticorps, c'est-à-dire: a) soit les différents anticorps monoclonaux anti-MDP obtenus chez la souris, dilués au 1/20; b) soit la fraction immunoglobulinesde lapin anti-PL ou la fraction immunoglobulines normales de lapin (dilu- tion au 1/200). Le mélange a ensuite été ajouté à la culture de thymocytes en présence de PH Ao Comme l'indiquent les résultats présentés dans le tableau 1, seule l'incorporation de thymidine 3 H est légèrement augmentée par l'addition de PHA L'ad- dition de l'anticorps monoclonal anti-DFP à la PHA ne mo- difie pas cet effet En présence de PL et de PHA, on observe une augmentation de la réponse proliférative (P % de l'augmentation ainsi observée. Dans une série suivante d'expériences, les effets de l'anticorps monoclonal anti-MDP sur l'activité LAF de la préparation purifiée de FL ont été comparés à ceux des autres anticorps: anticorps monoclonal anti- BSA, immunoglobulines de lapin spécifiquement anti-PL et immunoglobulines normales de lapin. Comme le montrent les résultats présentés plus loin, aucun des antisérums témoins n'a été capable de modifier de façon significative l'incorporation de thymi- dine 3 H induite par l'association PHA + PL En revanche, l'antisérum de lapin spécifiquement anti-PL utilisé à la dilution de 1/200 entraîne une inhibition de 48 % à 38 %. Dans toutes les expériences le sérum monoclonal de souris spécifiquement anti-MDP a inhibé de façon très significa- tive l'activité LAF de la préparation de PE purifiée *( 53, 34, 59 et 28 %). Afin de vérifier que l'inhibition induite par l'anticorps monoclonal antiMDP était spécifiquement liée à une activité anti-MDP, 100 pg/ml de MDP ont été ajoutés au moment de l'incubation du PL avec les différents anti- sérums, avant la stimulation des thymocytes par la PHA. Dans cette expérience répétée à trois reprises, l'addi- tion de MDP n'a pas modifié l'inhibition de l'activité LAF induite par le sérum de lapin spécifiquement anti-FL. De même, les réponses observées avec les deux autres antisérums témoins, immunoglobulines normales de lapin et monoclonal anti-BSA, n'ont pas été modifiées En re- vanche, l'inhibition induite par l'anticorps monoclonal anti-MDP a été significativement réduite ( 41 à 100 %) (P v 0,01). Les résultats moyens sont rassemblés dans le tableau ci-après: INHIBITION PAR UN ANTICORPS MONOCLONAL ANTI-MDP DE L'ACTIVITE LAF IN VITRO DU PE Témoin 317 38 PHA ( 1 pg/ml 615 + 49 PHA + anti-MDP ( 1/20) 569 57 PHA + PLI 2079 237 PHA + PL: + anti-MDP 921 33 Il découle de ce qui précède que cette réaction de complexation sélective du facteur PFL peut être mise à profit pour le séparer à pabtir d'un milieu le contenant, en mélange avec d'autres peptides, glycopeptides et en particulier fragments de peptidoglycanes Il est à cet égard remarquable de noter que cesderniers ne conduisent à aucune réaction immunologique avec les anticorps anti- MDP. Le facteur PL tel qu'il est retenu dans les coinm- plexes facteur PL anticorps anti-MDP, peut être obtenu à partir de celui-ci par dissociation dudit complexe. Mlais comme on l'ta indiqué plus haut, cette dissociation pourra être réalisée beaucoup plus simplement si les anticorps anti-,DP sont utilisés sous une forme supportée sur un support insoluble On décrit ci-après une méthodologie susceptible d'être utilisée pour procéder à une séparation de quanti-' tés plus importantes de facteur LAF et éventuellement PE à partir d'un surnageant de culture de cellules d'une lignée granulocyto-macrophagique appropriée. a) On utilise une colonne de SEPHAROSE 4 B activée au bromure de cyanogène couplé selon des techniques cl siques à des anticorps monoclonaux anti-MDP. b) Immuno-absorption du facteur LAD. Le surnagant, le cas échéant concentré au préa- lable, est mis en contact avec une colonne immuno-absorbante retenant des groupes anti-MDP fixés Après un contact suf- fisant à permettre la fixation sélective du facteur LAF, le matériau immuno-absorbant est lavé pour éliminer les produits retenus non spécifiques Avantageusement, on travaille sur colonne, et les rinçages sont effec- tués par le passage du liquide de rinçage au travers de la colonne Les molécules retenues sur les anticorps de la colonne, c'est-à-dire le facteur LAF et éventuellement d'autres monokines ou médiateurs de poids moléculaires distincts et susceptibles de contenir la structure MDP sous une forme accessible aux anticorps, sont éluées par un tampon à bas p H, par exemple une solution à base de glycine/H Cl, p H 3,2 ou par une solution à concentra- tion saline élevée, par exemple le thiocyanate de so- dium 1 M. c) Pour le cas o d'autres molécules seraient éluées en même temps que le facteur LAE, il sera souhai- table de séparer ces molécules par chromatographie sur tamis moléculaire permettant des séparations de molé- cules selon leurs poids moléculaires. Parmi les molécules éventuellement présentes, on mentionne des facteurs ayant un poids moléculaire généralement moins élevé En conséquence, il peut être souhaitable d'avoir recours à une séparation, notamment des molécules ayant un poids moléculaire inférieur à 12 000 'loute autre méthode de séparation est envisageable. Le procédé selon l'invention pourrait par conséquent également s'appliquer à une séparation et une purification rapide des monokines à tivité LAF, dépour- vues de pyrogènes-endogènes, telles qu'elles peuvent être obtenuesà partir de surnageants de populations cellu- laires de lignée granulocyto-macrophagique, en présence d'ester de la Nacétyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamine, notamment dans les conditions décrites dans la demande de brevet français déjà mentionnée N O 82 00251. Le procédé selon l'invention permet par con- séquent une séparation très sélective des facteurs LAF et plus particulièrement PE et présente par conséquent le grand avantage de faciliter l'étude des autres facteurs que pouvaient initialement contenir les milieux précé- dents, en même temps que ces pyrogènes-endogènes. En particulier, l'invention permet aussi l'obtention de monokines ou lymphokines distinctes, es- sentiellement dépourvues de pyrogènes-endogènes, mono- kines ou lymphokines dontl'étude peut alors être consi- dérablement facilitée. Le procédé selon l'invention doit trouver dés applications particulièrement avantageuses dans tout pro- cédé d'extraction de principes actifs à partir de tout milieu également susceptible de contenir des PE ou fac- teurs ayant des propriétés biologiques analogues et, de ce fait, susceptibles de contaminer les produits d'extrac- tion finals. Par exemple, il a été montré que l'interféron a peut être produit par des leucocytes humains, après stimulation par différents agents, dont les virus des oreillons (TSUNEO, K et MINAGAWA, T, J Gen Virol, 54 ( 1981), pages 293 à 299) ou par le virus de Sendai (MOGENSEN, K E, Blood Transfusion and Immunohémtatology D volume 23, N O 3,( 1980), pages 373 à 397) Le système d'induction de l'interféron a est semblable à celui par lequel d'autres monokines et lymphokines sont également induites Il consiste à prélever le '"buffy coat" de sang humain centrifugé et de le conserver 24 heures à 40 C ou bien à séparer les cellules mononucléaires du sang péri- phérique sur un gradient de Ficoll-paque Des leucocytes débarrassés des globules rouges sont suspendus dans un milieu de culture et incubés avec les paramyxovirus (habituellement virus de Sendai) pendant 24 heures Les cellules et les débris sont centrifugés et le surnageant contient alors de l'interféron a qui peut ensuite être purifié et concentré Cependant la plupart-de ces prépa-, rations dtinterféron, même après purification, contiennent de nombreux médiateurs et des protéines libérées des leu- cocytes pendant ces opérations Aussi les préparations d'interféron a utilisées en clinique sont capables d'in- duire de fortes hyperthermies (STRANDER, H, Texas Rep. Biol Med vol 35 ( 1977), page 429) Ces auteurs ont sug- géré que ces hyperthermies pouvaient être dues à des con- taminations des préparations d'interféron par des pyro- gènes leucocytaires qui peuvent être produits par les mêmes stimulations in Vitro Par conséquent, la méthode selon l'inventionpour l'élimination de ces pyrogènes, permettrait d'Qbtenir un interféron de grande valeur pour les essais thérapeutiques Aussi une méthode de séparation sélective du pyrogène-endogène des cultures leucocytaires, par passage de ce surnageant sur des colonnes contenant des anticorps anti-MDP, pourrait servir à produire de l'interféron oa débarrassé d'acti- vité pyrogène. Comme il va de soi et comme il résulte d'ail- leurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réali- sation qui ont été plus spécialement envisagés; elle en embrasse au contraire toutes les variantes, notamment celles mettant en jeu des anticorps monoclonaux obtenus à partir d'hybridomes résultant de la fusion de cellules de myélomes avec des splénocytes de-souris ou autres ani- maux immunisés avec tout homologue de MDP, tels que par exemple des dérivés a-ester-y-amide de l'acide N-acétyl- muramyl-L-alanyl-D-glutamique, dans la mesure o ces anti- corps permettentcoimie ceux qui ont été évoqués plus haut,de pro- céder aux séparations qui ont été décrites, d'un facteur S ou d'un facteur ayant des propriétés biologiques analogues Il va encore de soi que les anticorps monoclonaux ainsi obte- nus, et plus particulièrement leur utilisation pour réali- ser de telles séparations constituent des équivalents de ceux qui ont été plus particulièrement décrits et, de ce fait, ne sauraient échapper à la portée de l'invention telle qu'elle a été définie dans les revendications. D'une façon générale, les anticorps mono- clonaux susceptibles d'être mis en oeuvre dans le pro- cédé selon l'invention peuvent être constitués par tout anticorps monoclonal reconnaissant sélectivement les homologues du MDP, caractérisé par la présence d'une chaîne peptidique liée au groupe acide-N-acétylmuramique, le premier aminoacyle de la chaine peptidique, c'est-à- dire l'aminoacyle assurant la liaison avec le groupe N- acétyle muramique, étant choisi parmi L-alanyle L séryle ou L-valyle Le deuxième aminoacyle de la chaîne pepti- dique n'intervient guère dans la spécificité du déterminant antigénique important à prendre en considération, pour ce qui est des anticorps monoclonaux susceptibles d'être mis en oeuvre Les anticorps monoclonaux particulièrement sé- lectifs seront ceux qui, parmi ceux qui viennent d'être définis, ne reconnaissent pas la structure acide N-acétyle muramique dépourvue du groupement peptidique sus-indiqué, même à des concentrations 100 fois plus importantes que la concentration minimale nécessaire à la formation du com- plexe dérivé de MDP répondant à la condition sus-indiquée: anticorps monoclonal correspondant. Il résulte donc bien de ce qui précède, quià l'inverse,les anticorps monoclonaux susceptibles d'être mis en oeuvre peuvent également être obtenus en mettant en oeuvre initialement dans la réalisation des fusions cellu,- laires nécessaires à la production des hybridomes produc- teurs d'anticorps monoclonaux, des homologues de MDP dans lesquels les fonctions a et y-carboxyle peuvent porter ides substituants différents En particulier, on pourra avoir recours à des anticorps monoclonaux obtenus en mettant en oeuvre des diesters de l'acide N-acétyl -muramyl-L-alanyl- D-glutamique ou encore les a-esters de la N-acétyl-muramyl- L-alanyl-D-glutamine, tels qu'ils ont été décrits dans la demande de brevet européen déjà mentionnée n 79 400357. En ce qui concerne enfin la fabrication des hy- bridomes, il va de -oi que l'on peut avoir recours à tout type de myélome couramment utilisé à cet effet En particu- lier, on aura recours à tout myélome décrit dans la litté- rature technique ou dans des demandes de brevets ou brevets publiés On mentionnera, à titre d'exemple, les myélomes plus particulièrement décrits dans les demandes de brevets européens no O 014 519, n O 018 794, n O 018 795 et la demande de brevet français publiée n O 78 17545/2 394- 607. REVENDICATIONS 1 Procédé de séparation ou de purification. d'un facteur LAF, ayant des propriétés d'activation des lymphocytes et, le cas échéant, des propriétés pyrogènes- endogènes, à partir d'un milieu biologique liquide le contenant à l'état dissous, ou d'enrichissement de ce milieu en ce facteur LAF, caractérisé par la mise en contact de ce milieu avec des anticorps anti-MDP, et la récupération soit du facteur LAF lui-même, à partir du complexe facteur LAF-anticorps anti-MDP, soit du milieu -alors substantiellement dépourvu de ce facteur. 2 Procédé selon la revendication 1, carac- térisé en ce que les anticorps anti-MDP mis en oeuvre sont essentiellement constitués par des anticorps re- connaissant spécifiquement la structure N-acétyl- muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine dans son ensemble, à l'exclusion de la structure de l'acide N-acétyl-mura- mique isolée ou de celle de la L-alanyl-D-isoglutamine isolée. 3 Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que les anticorps anti-MDP sont fixés sur un support insoluble en milieu aqueux. > 4 Procédé selon l'une quelconque des re- vendications i à 3, caractérisé en ce que l'opération de récupération du facteur LAF, à partir du complexe facteur LAF anticorps anti-MDP, comprend la mise en con- tact de ce dernier avec un milieu tamponné acidifié à p H inférieur à 4, ou avec une solution d'un sel ionisé à concentration élevée. 5 Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 4, caractérisé en ce que les milieux bio- logiques susdits, initialement mis en oeuvre sont cons- titués par le surnageant, éventuellement concentré au préalable, de cultures de cellules d'une lignée granulo- cytomacrophagique, en présence d'un facteur immuno- stimulant. 6 Procédé selon la revendication 5, carac- térisé en ce que le milieu biologique susdit est essen- tiellement dépourvu de protéines ayant un poids molécu- laire inférieur à une valeur de l'ordre de 12 000. 7 -Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 3, caractérisé en ce que le susdit milieu biologique liquide contient à la fois un principe biolo- gique à extraire et un facteur pyrogène-endogène ayant également des propriétés LAF, et en ce que l'on recueille finalement le milieu biologique sensiblement dépourvu de pyrogène-endogène, le principe biologique pouvant ensuite être extrait dudit milieu biologique,à l'état sensible- ment dépourvu de contamination pyrogène-endogène.