FR 2534487 A1 19840420 FR 8217311 A 19821015 i 2534487 La présente invention concerne un procédé pour l'homogénéisation de dispersiorsde phases lamellaires lipidiques hydratées telles que, par exemple, des liposomes, et a plus particulièrement pour objet un procédé d'homogénéi- sation sous pression d'une telle dispersion On connait déjà plusieurs procédés tels que, par exemple, la dialyse, les ultrasons, des procédés mécaniques, permettant d'homogénéiser une suspension de phases lamellaires hydratées pour obtenir une suspension de phases lamellaires tels que des liposomes, relativement homogène Toutefois, ces procédés permettent de traiter à chaque opération seulement de petites quantités de suspension et donc sont difficilement exploitables pour la fabrication industrielle de suspension de liposomes. Par ailleurs, pour stabiliser la suspension il est souvent nécessaire de mettre des émulsionnants et/ou des conservateurs pour éviter toute détérioration ou dépôt des liposomes Ces additifs peuvent avoir un effet nocif sur l'organisme humain et notamment un effet irritant des tissus sur lesquels est appliquée la suspension de liposomes, par exemple lorsqu'elle est utilisée en cosmétique ou pharmacie. La présente invention a pour but de remédier à tous ces inconvénients en proposant un nouveau procédé d'homogénéisa- tion d'une dispersion de phases lamellaires lipidiques hydra- tées permettant d'homogénéiser un volume de suspension de phaseslamellaires lipidiques hydratées acceptable d'un point de vue industriel De plus, la qualité de l'homogénéisation ainsi réalisée permet d'éviter l'addition d'émulsionnants et l'utilisation de conservateurs étant donné que la suspension homogène peut subir une filtration stérilisante, par exemple. A cet effet, la présente invention a pour objet un procédé pour l'obtention d'une suspension homogénéisée de- phases lamellaires lipidiques hydratées dans un liquide,telles que, par exemple, des liposomes,consistant à disperser une phase lipidique ou une phase lamellaire lipidique contenant un ou plusieurs-lipides amphiphiles tels que, par exemple la lécithine ou analogue, d a N S 1 e d i t liquide 2 2534487 puis à homogénéiser ladite dispersion, caractérisé en ce que pour homogénéiser ladite dispersion, on alimente cette dernière, sous pression, dans un passage de faible largeur défini entre les parois d'un orifice et les bords d'un élément obturateur disposé de manière réglable dans la section dudit orifice, à l'encontre du flux de ladite dispersion. Selon une autre caractéristique du procédé on réalise plusieurs passages successifs de la dispersion dans le passage précité Avantageusement, la pression d'alimentation de la dispersion dans le passage précité est comprise entre environ 000 et environ 70 OOOK Pa et de préférence est de l'ordre de 000 K Pa environ. Avantageusement, quand-la dispersion est recyclée dans le passage précité, on refroidit celle-ci entre chaque alimentation dans ledit passage. En outre, la dispersion précitée contient de 20 % à 99,9 % environ de liquide et de 0,1 à 80 % de la phase lipidique précitée contenant un ou plusieurs lipides amphiphiles tels que, par exemple, la lécithine ou analogue. Le liquide précité est, de préférence, une solution aqueuse d e chlorure de sodium ou de d-glucose, le liquide étant éventuellement une solution d'un produit actif à encapsuler dans la phase lipidique. Selon une autre caractéristique du procédé de l'invention, la suspension à homogénéiser est alimentée sous pression sous une atmosphère inerte. L'invention a également pour objet une suspension de *phases lamellaires lipidiques hydratées obtenues par le procédé décrit ci-dessus dont les p a r t i c u 1 e s ont une taille moyenne de l'ordre de 100 nanomètres environ. Avantageusement, cette suspension est stérilisée parune filtration stérilisante, de préférence à la température ambiante Ainsi, il n'est pas nécessaire d'additionner à la suspension homogénéisée obtenue par le procédé de l'invention des additifs de conservation souvent indésirables dans les produits à usage pharmaceutique ou cosmétique L'invention sera mieux comprise et d'autres caractéris- tiques, détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement au cours de la description explicative qui va suivre faite en référence aux dessins schématiques annexés donnés uniquement à titre d'exemple, et dans lesquels: la figure 1 est un schéma illustrant le principe du procédé d'homogénéisation de l'invention; la figure 2 est un schéma synoptique illustrant une instal-lation pour la production d'une suspension homogénéisée selonle procédé de l'invention; la figure 3 est un diagramme représentant la variation des dimensions des particules contenues dans la suspension en fonction de la durée de traitement de l'homogénéisation;et la figure 4 est un diagramme dont la courbe (c) montre la variation de la différence de dimension entre les particules avant le traitement d'homogénéisation et après le traitement d'homogénéisation en fonction de la pression d'alimentation de la suspension et la courbe (d) indique les variations du taux d'encapsulation du produit actif dans la phase lamellaire lipidique hydratée en fonction de la pression d'homogénéisation. En se référant aux figures 1 et 2, le procédé de l'invention pour l'obtention de suspensions homogénéisées de phases lamellaires lipidiques hydratées dans le liquide telles que, par exemple, une suspension de liposomes,consiste tout d'abord à disperser une phase lipidique contenant un ou plusieurs lipides amphiphiles tels que par exemple de la lécithine dans un liquide pour obtenir une dispersion de grosses particules représentées symboliquement par la phase A de la figure 1. Le liquide est de préférence une solution aqueuse physiologique de chlorure de sodium dans laquelle est éventuellement dissous un produit biologiquement actif et/ou ayant des propriétés organoleptiques, et/ou physicochimiques. En outre la phase lipidique qui peut contenir un ou plusieurs lipides amphiphiles choisis par exemple parmi les composés appartenant à la famille des glycolipides, 4: 2534487 phospholipides ou phospho-aminolipides, tels que par exemple, la lécithine de soja ou d'oeuf, peut également contenir des composés à caractère hydrophobe tels que par exemple le cholestérol, l'ubiquinone ou analogue. Cette phase lipidique peut être obtenue-par tout procédé susceptible de former des phases lamellaires, et par exemple par le procédé d'atomisation décrit dans la demande de brevet français n 8202620 du 17 février 1982. Par ailleurs, la phase lipidique dispersée dans le liquide peut être une phase lamellaire lipidique très hydratée ou une phase lipidique peu hydratée comme cela sera illustré ci-après dans les exemples dans laquelle a été éventuellement encapsulé un produit biologiquement actif et/ou possédant des propriétés organoleptiques et/ou physicochimiques. La dispersion ainsi obtenue est alimentée sous pression au moyen d'une pompé 1 dans un appareil 2 dont le principe est illustré à la figure 1 et comprenant un passage 3 de faible largeur défini entre les parois 4 a, 4 b d'un orifice 4 et les bords 5 a, 5 b d'un élément obturateur 5 qui est disposé de manière réglable dans la section de l'orifice 4, à l'encontre du flux de la dispersion A représentée par la flèche I Sous l'effet de la pression et des turbulences provoquées par les faibles dimensions du passage 3, les particules contenues dans la suspension sont réduites en de fines particules de dimensions de l'ordre de 100 manomètres à quelques centaines de nanomètres. Dans un mode de réalisation préféré du procédé de l'inven- tion appliqué dans l'installation illustré à la figure 2, la dispersion est réalisée dans le bac à dispersion 9 au moyen, par exemple, d'une agitation mécanique, la dispersion A ainsi obtenue est aspirée par la pompe 1 puis introduite sous pression dans l'appareil 2 A la sortie de l'appareil, la suspension homogénéisée B obtenue est soit soutirée pour son utilisation soit en partie ou totalement recyclée en amont de la pompe 1 pour un nouveau passage dans l'appareil 2 par le conduit 6 et au moyen des vannes 7,8 Avantageusement, pour éviter un échauffement de la suspension par ces compres- sions successives et ces passages dans l'appareil 2, on refroidit la suspension B recyclée au moyen d'un réfrigérateur 11. Avantageusement, l'alimentation de la suspension A dans la pompe 1 peut être réalisée sous pression à partir d'un réservoir d'alimentation appelé réservoir de pré- alimentation qui peut être constitué soit par le bac de dispersion 9 soit par un autre récipient disposé entre le bac de dispersion 9 et la pompe 1 Dans l'exemple illustré, nous considérons que le bac de dispersion 9 constitue également le réservoir de pré-alimentation sous pression. Pour effectuer cette pré-alimentation sous pression, le bac de dispersion est rendu étanche aux gaz et on alimente au-dessus de la dispersion A un gaz sous pression, avantageusement un gaz inerte tel que de l'azote, ou un gaz rare, sous une pression comprise entre environ 100 K Pa et 1000 K Pa pour avoir une atmosphère non oxydante de préférence, par le conduit d'alimentation 10 Cette pré- alimentation sous pression est fortement souhaitéelorsque la dispersion A a une viscosité elévée par exemple de l'ordre de 1 000 à 10 000 centipoises et notamment pour l'homogénéisation d'une suspension de phases lamellaires lipidiques peu hydratées, ayant une teneur en phase lipidique entre 50 % et 80 % environ De plus, l'alimentation du liquide de dispersion et de la phase lipidique sous forme de poudre ou de la phase lamellaire lipidique à disperser peut être réalisée en continu dans le bac de dispersion 9 par la conduite 12, par exemple. Le débit qui peut être traité selon le procédé de l'invention est relativement important et fonction notamment de la viscosité de la dispersion à homogénéiser et de la pression d'alimentation dans l'appareil 2 A titre d'exemple, sous une alimentation de 35 000 K Pa, le débit de suspension traitéapar le procédé de l'invention est égal à environ 57 litres par heure. Par ailleurs, les avantages du procédé d'homogénéisa- tion sous pression de l'invention seront clairement illustrés par les exemples suivant de fabrication de suspension homogénéisée de phases lamellaires lipidiques hydratées, 6 2534487 ces exemples ne doivent en aucun cas être considérés comme limitant le cadre de la présente invention étant donné que de nombreuses variations et modifications notamment dans les produits utilisés, sont possibles. Exemple 1. a) production d'un mélange pulvérulent de constituants lipidiques par atomisation: à 20 g de lécithine de soja on ajoute 0,3 g d'ubiquinone et 120 millilitres de chloroforme Ce mélange est atomisé à 750 C selon le procédé de la demande de brevet français n 82 02620 Après 15 mn on obtient 18 g de poudre jaune sans odeur particulière avec un rendement de 90 %. b) obtention d'une dispersion aqueuse: à 980 g dune solution aqueuse de Na Cl à 0,9 % contenant l U de serum albumine bovine, on ajoute progressivement et sous agitation 10 g de mélange obtenu dans l'étape (a) L'agitation est poursuivie pendant 1 heure à température ambiante dans un mélangeur à rotor. La dispersion ainsi obtenue apparaît d'un jaune laiteux. c) homogénéisation sous pression de la dispersion: la dispersion obtenue dans l'étape (b) ci-dessus est versée dans le réservoir d'alimentation 9 de l'installation illustrée à la figure 2 On alimente cette dispersion sous une pression de 40 000 K Pa et un débit de 50 litres par heure. La dispersion est recyclée en amont de la pompe d'alimentation L'homogénéisation est maintenue pendant minutes et la suspension homogénéisée obtenue a une apparence homogène jaune et opalescente. Le tableau ci-dessous indique la taille moyenne des particules mesurées au nano-sizer ainsi que l'observation au microscope électronique des particules de la suspension. 7 2534487 Tableau 1 Traitements Tailles des parti Observations cules dispersées microscopiques (nm) Avant homogé- néisation 308 Liposomes sous pression Après homogé- néisation 101 Liposomes sous pression Cet exemple montre qu'il est possible d'homogénéiser une dispersion de liposomes avec un débit de passage de la solution dans l'appareil 2 élevé De plus, comme le procédé de l'invention peut être mise en oeuvre de manière continue, il est donc possible d'homogénéiser une quantité importante d'une dispersion-de liposomes ou de phases lipidiques, et donc de produire industriellement une-telle suspension homogénéisée La suspension ainsi obtenue présente des propriétés tout à fait comparables et même supérieures à celle obtenue par des techniques de laboratoire de recherche utilisant par exemple l'évaporateur rotatif et la sonification. Exemple 2. a) production d'une poudre par atomisation Dans un bécher de 100 millilitres on introduit 5 g de lécithine de soja solubilisées dans 25 millilitres, de chloroforme et 0,05 g de-dopamine dissoute dans 10 millilitres de méthanol. La solution obtenue est atomisée selon le procédé de l'exemple 1 à 750 C et on recueille une poudre blanche. b) obtention d'une dispersion La poudre recueillie en (a) est introduite dans un bécher de 1 litre contenant 5 g de polypeptides de collagène en solution dans 500 millilitres de solution aqueuse de chlorure de sodium à 0,9 % Le mélange est soumis à une agitation magnétique pendant 2 heures à température ambiante. A la fin de l'agitation, la taille moyenne des liposomes mesurée au nano-sizer est de 254 nanomètres. c) homogénéisation sous pression de la dispersion On alimente la dispersion obtenue en (b) dans l'orifice 3 de l'appareil 2 sous une pression de 40000 K Pa et un débit de 50 litres par héure avec recyclage de la solution en amont de la pompe d'alimentation L'homogénéisation est maintenue pendant 5 minutes et la taille moyenne des liposomes de la suspension est égale à 98 manomètres. Exemple 3. Dans un bécher de 2 litres on introduit 10 g de poudrede lécithine de soja obtenue par atomisation, selon le procédé de l'exemple 1, g de polypeptides de collagène et 920 g d'une solution physiologi- que de Na Cl à 0,9 % On mélange pendant 15 minutes à tempéra- ture ambiante au moyen d'un agitateur à hélice. La dispersion ainsi obtenue est ensuite traitée aux ultrasons à l'aide d'un sonificateur à lames vibrantes pendant 1 heure sous refroidissement A la suite de ce traite- ment, la taille moyenne des liposomes passe de 300 nanomètres à 190 nanomètres. Ensuite, on soumet la suspension obtenue après sonification à une homogénéisation sous pression conforme au procédé de l'invention en alimentant ladite suspension sous une pression de-35000 K Pa. On détermine la taille moyenne des liposomes à diffé- rentes durées d'homogénéisation sous pression Les résultats obtenus sont représentés par la courbe (a) de la figure 4 portant en ordonnées la taille moyenne des liposomes et en abscisses la durée d'homogénéisation à 35000 K Pa Ces résultats montrent que l'on obtient très rapidement des particules de dimension moyenne de l'ordre de 100 nanomètres ce qui est nettement inférieur aux dimensions obtenues par le procédé de sonification. Exemple 4. Dans un bécher de 1 litre on introduit 25 g de poudre de lécithine de soja obtenue par atomisation, selon le procédé de l'exemple 1, 2,5 g de sel disodique d'adénosine triphosphate (Na 2 ATP) et 472,5 g d'une solution de Na Cl à 0,9 % On mélange pendant 15 minutes à température ambiante au moyen d'un agitateur à hélice On soumet la suspension ainsi obtenue au procédé d'homogénéisation sous pression de l'invention avec une pression d'alimentation de 40 000 K Pa. La taille des liposomes ainsi obtenue est mesurée pour différentes durées de traitement Le résultats obtenus sont représentés par la courbe (b) de la figure 3 qui-montre comme dans l'exemple 3 que l'on obtient très rapidement des particules de taille moyenne d'environ 100 nanomètres. D'après les exemples 3 et 4, on déduit donc que le procédé d'homogénéisation de l'invention permet d'obtenir une suspension ayant des particules de taille moyenne très petite même si l'on traite une dispersion contenant des particules de taille moyenne relativement élevée De plus, sur des dispersions préparées comme dans l'exemple-4, on effectue une homogénéisation sous pression pendant une durée déterminée de 5 minutes à différentes pressions d'alimentation A chaque suspension obtenue on mesure la taille moyenne des particules ou liposomes ainsi que le taux d'encapsulation de Na 2 ATP dans ces liposomes. Les résultats obtenus sont représentés par les courbes (c) et (d) de la figure 4. La courbe (c) représente la variation de la différence de taille moyenne des liposomes entre la taille avant homogénéisation sous pression et la taille après 5 minutes de traitement pour différentes pressions de travail. La diminution maximum de taille moyenne des particules est obtenue pour des pressions supérieures à environ 20000 K Pa. La courbe (d) représente le pourcentage d'encapsula- tion de Na 2 ATP obtenu après 5 minutes d'homogénéisation sous pression de la suspension de liposomes, à différentes pressions d'alimentation Cette courbe montre que l'on obtient une augmentation de l'ordre de quelques pourcents du pourcentage d'encapsulation pour des pressions d'alimentation inférieures à environ 40 000 K Pa et supérieures à 10 000 K Pa environ. Exemple 5. a) Préparation d'une phase lamellaire lipidique peu hydratée - On verse dans le bac de dispersion 9 de l'installa- tion représentée à la figure 2, une solution aqueuse, par exemple, une solution physiologique de Na Cl contenant un produit physiologiquement actif tel qu'un extrait d'aloès et une quantité égale d'une poudre de lécithine obtenue par atomisation selon le procédé de l'exemple 1 qui peut contenir un constituant à caractère hydrophobe On obtient ainsi une phase lamellaire lipidique peu hydratée. b) production de la suspension homogénéisée: A la phase lamellaire lipidique peu hydratée on ajoute une solution aqueuse de dilution contenant par exemple 0,9 % de Na Cl ou 0,5 % de d-glucose pour obtenir une dispersion contenant de 0,10 à 80 % de la phase lamellaire lipidique peu hydratée, puis on alimente ce mélange dans le passage 3 de l'appareil 2 pour réaliser une homogénéisation sous pression Le taux d'encapsulation de l'extrait d'Aloès dans les liposomes ainsi produits est compris entre 50 et % environ. Dans une variante, la phase lamellaire peu hydratée peut être préparée par dispersion de la poudre atomisée de lécithine contenant éventuellement un constituant à caractère hydrophobe dans une quantité inférieure d'une solution aqueuse à encapsuler Le mélange est réalisé par exemple au broyeur à rouleaux, et est ensuite dilué dans une solution aqueuse de dilution pour obtenir une dispersion contenant de 0,1 à 80 % de ladite phase lamellaire lipidique peu hydratée comme indiqué ci-dessus Le taux d'encapsu- lation de la solution à encapsuler est compris également entre 50 et 70 %. 11 2534487 Les exemples ci-dessus montrent qu'il est possible avec le procédé d'homogénéisation de l'invention, d'obtenir des suspensions homogénéisées de liposomes ou de phases lamellaires lipidiques peu hydratées stables Comme le volume de dispersion traitée par unité de temps est important et que le procédé peut être conduit en continu, il est donc possible de produire des quantités importantes de disper- sion de phases lamellaires lipidiques compatibles avec une production industrielle. Par ailleurs, comme la dimension des liposomes est de l'ordre de 100 nanomètres environ, il est possible de stériliser ces suspensions par filtration stérilisante compte tenu que les micro-organismes ou bactéries ont des dimensions supérieures à 220 nanomètres. Ainsi, on peut stériliser à froid la suspension de liposomes ce qui est très important compte tenu que les composés constituant les liposomes ou encapsulés dans lesdits liposomes sont souvent dégradables par la température. De plus, comme la suspension est stérilisée, il n'est plus nécessaire d'ajouter des conservateurs. Par ailleurs, comme la suspension obtenue est très homogène, il n'est généralement pas nécessaire d'ajouter des émulsionnants pour stabiliser cette suspension. Toutefois, comme le montre la baisse du taux d'encap- sulation observé dans l'exemple 4, l'alimentation de la dispersion sous une pression élevée entraîne une détérioration des liposomes. Le procédé d'homogénéisation sous pression de l'invention, permet donc d'obtenir des suspensions de liposomes présentant une meilleure stabilité et homogénéité que celle obtenue par dialyse et permet surtout de produire notamment, de manière continue des quantités industrielles de dispersion ce qui n'est absolument pas possible avec le procédé d'homogénéisation aux ultrasons De plus, l'homogénéisation sous pression peut être effectuée à froid sans élévation de température tandis que le procédé aux 1 2 ultrasons demande un refroidissement de la solution pour éviter une dégradation des produits constituants les liposomes. 13 2534487 R e v e N d i c a t i o N s- 1 Procédé pour l'obtention de suspension homogénéisée de phases lamellaires lipidiques hydratées dans un liquide telles que, par exemple, une suspension de liposomes, consistant à disperser une phase lipidique ou une phase lamellaire lipidique contenant un ou plusieurs lipides amphiphiles tels que par exemple, la lécithine, et éventuellement un ou plusieurs composants à caractère hydrophobe, dans ledit liquide puis à homogénéiser ladite dispersion, caractérisé en ce que pour homogénéiser ladite dispersion, on alimente cette dernière, sous pression, dans un passage de faible l argeur défini entre les parois d'un, orifice et les bords d'un élément obturateur disposé de manière réglable dans la section dudit orifice, à l'encontre -du flux de ladite dispersion. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la phase lamellaire lipidique est une phase lamellaire lipidique peu hydratée ayant une teneur en phase lipidique entre 50 % et 80 % environ. 3 Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on réalise plusieurs passages successifs de la dispersion dans le passage précité, avec éventuellement un refroidissement de ladite dispersion entre chaque passage. 4 Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la pression d'alimentation précitée de la dispersion dans le passage précité est comprise entre 000 et 70 000 K Pa- environ, de préférence de l'ordre de 000 K Pa environ. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la dispersion précitée contient de 20 à 99,9 % de liquide, et de 80 à 0,1 % de la phase lipidique ou de la phase lamellaire lipidique hydratée précitée. 6 Procédé selon l'une des revendications précédentes, -caractérisé en ce que la dispersion à homogénéiser est 14 2534487 pré-alimentée sous pression dans un dispositif effectuant l'alimentation sous pression de la dispersion dans le passage précité. 7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite préalimentation sous pression de la dispersion est réalisée sous atmosphère inerte ou non oxydante. 8 Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le liquide de dispersion précité est une solution d'un produit biologiquement actif et/ou possédant des propriétés organoleptiques et/ou physico- chimiques. 9 Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le liquide précité de la dispersion est une solution aqueuse physiologique de chlorure de sodium ou de d-glucose. Suspenéion de phases lamellaires lipidiques hydratées, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par le procédé selon l'une des revendications 1 à 9. 11 Suspenision selon la revendication 10, caractérisée en ce que les particules contenues d;a N S 1 a suspension ont une dimension moyenne de l'ordre de 100 nanomètres environ. 12 Suspension selon l'une des revendications 10 ou 11, caractérisée en ce qu'elle est stérilisée par filtra- tion stérilisante, de préférence, à température ambiante.