FR 2530624 A1 19840127 FR 8312297 A 19830725 La présente invention concerne des analogues fluorés de la vitamine D 3. I 1 est actuellement bien établi que l'effet de la vitamine D 3 dans la régulation de l'homéostase du calcium et du phosphate chez l'homme et les animaux dépend du métabolisme des formes hydroxylées de la vitamine in vivo Dans le cas de la vitamine D 3, cette activation métabolique comprend une hydroxylation initiale en C-25 donnant naissance A la 25- hydroxyvitamine D 3, puis une autre hydroxylation en C-1 donnant naissance A la lo,25-dihydroxyvitamine D 3 Ce dernier composé est généralement considéré comme étant la forme active de la vitamine D 3 et est, à ce titre, l'agent directement responsable de la stimulation du transport du calcium intestinal et de la mobilisation des minéraux osseux in vivo. Toutefois, la lo,25-dihydroxyvitamine D 3 est métabolisée à son tour in vivo en étant convertie, par exemple, en l",24,25-trihydroxyvitamine D 3 par hydroxy- lation enzymatique en C-24 Cette forme 24-hydroxylée est cependant moins active que la 11,25-dihydroxy- vitamine D 3 et la 24-hydroxylation peut en fait consti- tuer un stade vers l'inactivation et la dégradation de la forme active de la vitamine Dès lors, A mesure que la 24-hydroxylation progresse, elle épuise les réserves de l'organisme en 11,25-dihydroxyvitamine D 3 qui est le métabolite physiologiquement le plus actif Pour cette raison, les dérivés 24,24-difluorés ont récemment été proposés comme analogues et produits de remplacement pharmacologiquement intéressants, parce que la présence des deux radicaux fluoro en C-24 bloque les réactions de 24hydroxylation qui font baisser l'activité En effet, ces composés se sont révélés avoir une activité au moins équivalente et généralement supérieure à celle du métabolite non fluoré correspondant (voir, par exemple, les brevets des Etats-Unis d'Amérique n 4 196 133 et 4 201 881). La présente invention a pour objet des compo- sés ayant les intéressantes propriétés qui consistent en une activité élevée et en le blocage de la position C-24 Un exemple d'un tel composé est la 24-fluoro- 1,25-dihydroxyvitamine D 3 de formule: F OH HO OH L'invention a également pour objet les dérivés acylés correspondants de ces composés (dans lesquels 1, 2 ou 3 des radicaux hydroxyle sont acylés), de même que leurs isomères 5,6-trans. Aux fins de l'invention, par radical acyle, il convient d'entendre un radical acyle aliphatique de 1 à 6 atomes de carbone sous toutes les formes isomères possibles, par exemple acétyle, propionyle ou butyryle, ou un radical acyle aromatique classique, par exemple benzoyle, nitrobenzoyle, halobenzoyle ou méthylben- zoyle, de même qu'un radical acyle dicarboxylique de 2 a 6 atomes de carbone, par exemple oxalyle, malonyle, succinyle, glutaryle, adipyle ou diglycolyle. Par conséquent, les composés faisant l'objet de l'invention répondent aux formules: F OR 3 O 3 R 10 OR 2 R 20 OR 1 o R 1, R 2 et R 3, identiques ou différents, représentent chacun un atome d'hydrogène ou un radical acyle. La structure ci-dessus se caractérise par la présence en C-1 et C-25 des radicaux hydroxyle accen- tuant l'activité tels qu'ils existent dans le métabo- lite naturel et par la présence du fluor comme substi- tuant bloquant en C-24 Le substituant bloquant fait obstacle à l'apparition du radical 24-hydroxyle à la faveur du métabolisme in vivo En raison -de la présence d'un seul atome de fluor comme substituant, ces com- posés offrent l'avantage sur les analogues 24-bloqués déjà proposés d'être biologiquement et chimiquement plus semblables et plus étroitement apparentés au métabolite 1,25-dihydroxylé naturel et donc d'être plus intéressants comme produits de remplacement du composé naturel De même, en raison de cette substitution moins abondante par le fluor, les nouveaux analogues peuvent être administrés avec avantage et plus généralement pour le traitement des affections osseuses et des troubles apparentés du calcium, parce que pour les applications pharmaceutiques pratiques des médicaments, il est souvent désirable d'éviter autant que possible l'introduction d'éléments étrangers non naturels. La 24-fluoro-l(,25-dihydroxyvitamine D 3 peut être préparée par hydroxylation enzymatique in vitro de la 24-fluoro-25-hydroxyvitamine D 3 (brevet des Etats- Unis d'Amérique n 4 305 880) en C-1 au moyen d'un produit d'homogénéisation de tissu rénal prélevé chez des poulets carencés en vitamine D Le produit d'homo- généisation requis peut être obtenu de la façon décrite ci-après: on donne à des poussins de race leghorn âgés de 1 jour une alimentation carencée en vitamine D contenant 1 % de calcium pendant 1 mois l(Omdahl et al, Biochemistry, 10, 2935-2940 ( 1971)J Les poulets sont ensuite sacrifiés en vue du prélèvement des reins et ceux-ci sont préparés à l'état de produit d'homogénéi- sation à 20 % p/v dans une solution de saccharose 0,19 M glacée contenant de l'acétate de tris 15 m M (acétate de trihydroxyméthylaminométhane) de p H 7,4 et de l'acétate de magnésium 1,9 m M l(Omdahl, J, et al, Biochemistry, , 2935-2940 ( 1971) et Tanaka, Y, et al, Arch. Biochem Biophys 171, 521-526 ( 1975)l. Pour la préparation de l'analogue désiré, le composé précurseur, au 24fluoro-25-hydroxyvitamine D 3, est ensuite mis à incuber avec le produit d'homogéné- isation La technique décrite ci-après illustre une incubation à petite échelle, mais il est évident que les quantités peuvent être augmentées suivant les besoins. Un échantillon (environ 3 /ug) de 24-fluoro- -hydroxyvitamine D 3 (dans 25 /ul d'éthanol à 95 %) est ajouté à une aliquote du produit d'homogénéisation de tissu rénal (préparé comme décrit ci-dessus et appor- tant environ 600 mg de tissu rénal) en suspension dans 4,5 ml de solution tampon (p H 7,4) contenant du saccha- rose 0,19 M, de l'acétate de tris 1,5 m M, de l'acétate de magnésium 1,9 m M et du succinate 25 m M Après secouage du mélange à 37 C pendant 2 heures, la réac- tion est arrêtée par addition d'un mélange 2:1 de méthanol et de chloroforme La phase organique du mélange résultant est séparée et évaporée et le résidu contenant la 24-fluoro-1 l,25-dihydroxyvitamine D 3 est soumis à la chromatographie. La purification initiale du produit est exécutée aisément par chromatographie sur de petites colonnes de Sephadex LH-20 (Société Pharmacia Corpora- tion, Piscataway, N J) au moyen de systèmes tels que CHC 13:hexane ( 65:35 v/v) ou hexane:CHC 13:Me OH ( 9:1:1 v/v), mais le plus avantageusement le produit est purifié par chromatographie liquide sous haute pression lUn chromatographe convenant à cette fin est le chromatographe liquide sous haute pression ALC/GPC 204 (Société Waters Associates, Medford, MA) muni d'un détecteur fonctionnant à 254 nm dans l'ultraviolet ' L'échantillon obtenu comme ci-dessus est injecté sur une colonne de gel de silice (Zorbax-SIL, 0,46 x 25 cm, Société Dupont, Inc) fonctionnant sous une pression de 70 bars, avec un débit d'environ 2 ml par minute A l'aide d'un système solvant contenant 9 % de 2-propanol dans de l'hexane, l'échantillon est recyclé deux fois dans la colonne (par mise en service de l'instrument suivant le mode avec recyclage) avant d'être recueilli. Le solvant est évaporé et le résidu est purifié à nouveau sur une colonne à inversion de phase lZorbax- ODS (octadécylsilane fixé sur gel de silice à grain fin) de 0,45 x 25 cm, Société Dupont and Co l à l'aide du même chromatographe liquide sous haute pression fonc- tionnant sous 210 bars Le produit est élue avec un mélange H 20:Me OH ( 1:3), recyclé une fois et enfin collecté Les fractions collectées sont évaporées et le résidu est chromatographié à nouveau sur la colonne de gel de silice en phase normale (Zorbas-SIL, 0,46 x 25 cm) exactement dans les conditions décrites ci-dessus. Après deux recyclages, l'échantillon est collecté et après évaporation du solvant, le produit pur ou 24-flu- oro- 11,25-dihydroxyvitamine D 3 est recueilli et carac- térisé et dosé par son maximum-' d'absorption dans l'ultraviolet a 264 nm et par le profil caractéristique de son spectre de masse (PM= 434). A partir de la 24-fluoro- 110/25-dihydroxyvi- tamine D 3, l'isomère 5,6-trans correspondant est obtenu aisément par isomérisation catalysée par l'iode suivant la technique générale de Verloop et al, Rec Trav. Chim Pays-Bas 78, 1004 ( 1969) En pratique, le trai- tement de la 24-fluoro-1 ",25-dihydroxyvitamine D 3 en solution éthérée contenant une goutte de pyridine au moyen d'une solution d'iode dans l'hexane (environ 0,5 mg par ml) pendant 15-minutes, puis l'addition d'une solution aqueuse de thiosulfate avant la sépara- tion de la phase organique et l'évaporation du solvant donnent un résidu, à partir duquel la 24-fluoro-la C,25- dihydroxy-5,6-transvitamine D 3 recherchée peut être isolée par une combinaison de chromatographie liquide à haute performance en phase inverse et phase normale au moyen des sytèmes décrits ci-dessus, ou bien par chromatographie en couche mince sur du gel de silice avec des mélanges d'acétate d'éthyle et d'hexane comme solvant. Les dérivés acylés des deux composés ci-dessus qui peuvent être intéressants pour certaines appli- cations peuvent être préparés suivant des procédés traditionnels, à savoir par réaction d'une solution du composé hydroxylé avec un agent d'acylation, comme un anhydride d'acyle ou chlorure d'acyle Différentes techniques pour ces acylations sont connues et il en est de même des réactifs d'acylation nécessaires à cette fin Par exemple, la réaction de la 24-fluoro- 1,25-dihydroxyvitamine D 3 avec l'anhydride acétique dans la pyridine ou dans un mélange de pyridine avec un co-solvant inerte, à des températures inférieures à C, donne le 1,3-diacétate correspondant, tandis que dans des conditions plus sévères, par exemple à 80- 90 "C, le 1,3,25-triacétate peut se former D'autres acylates, comme les propionates, butyrates, benzoates, nitrobenzoates, hémisuccinates, hémiglutamates, hémi- adipates et hémidiglycolates peuvent être prépares de façon analogue par réaction de la forme alcoolique de la vitamine avec l'anhydride ou le chlorure d'acyle correspondant Si la chose est désirée, les radicaux acyle des dérivés acylés peuvent être éliminés suivant des techniques connues, comme l'hydrolyse alcaline modérée (KOH/Me OH ou des conditions analogues) Par acylation et/ou désacylation sélectives exécutées sur la 24-fluoro-1,25-dihydroxyvitamine D 3 ou son isomère ,6-trans, tous les composés conformes à la présente invention peuvent être obtenus. L'intense activité vitaminolde D des composés de l'invention, semblable à celle de l'hormone natu- relle ou 1,25-dihydroxyvitamine D 3, suggère leur application comme agents thérapeutiques contre les troubles impliquant le métabolisme du calcium et du phosphate, avec éventuellement un meilleur maintien des réserves in vivo en raison de l'obstacle qui est fait à la 24-hydroxylation. Les composés de l'invention peuvent être administrés aisément par voie parentérale sous forme de solutions stériles par injection intraveineuse ou par voie alimentaire sous forme de doses orales ou sous forme de suppositoires Les doses d'environ 0,1 /ug à environ 2,5 /ug par jour sont efficaces pour susciter les réponses physiologiques du bilan du calcium qui sont caractéristiques d'une activté vitaminoide D, les doses d'entretien d'environ 0,25 /ug étant appropriées. Des formes dosées des composés peuvent être préparées par combinaison de ceux-ci avec un excipient non toxique pharmaceutiquement acceptable connu De tels excipients peuvent être des solides ou des liquides, par exemple l'amidon de mais, le lactose, le saccharose, l'huile d'arachide, l'huile d'olive, l'huile de sésame ou l'eau Si l'excipient est solide, les formes dosées des composés de l'invention peuvent être des comprimés, des capsules, des poudres, des pastilles ou des tablettes Si l'excipient est liquide, les capsules de gélatine molle, les sirops et les suspensions, émulsions ou solutions liquides peuvent constituer les formes dosées Les formes dosées peuvent également contenir des adjuvants, comme des agents de conservation, des stabilisants, des mouillants, des émulsionnants, des promoteurs de dissolution, etc E Lles peuvent contenir également d'autres substances thérapeutiquement intéressantes. Il convient de noter que bien que des inter- valles de doses aient été indiqués, la dose particu- lière à administrer dépend de l'affection spécifique, du résultat recherché dans le cas particulier et de divers autres facteurs connus du spécialiste de l'ap- plication thérapeutique des médicaments de ce genre. La Demanderesse a découvert également que les composés hydroxylés de l'invention sont utiles pour le traitement de la fièvre de lait chez la vache laitière. Tous les traitements proposés jusqu'à présent comme étant les moyens les plus efficaces pour prévenir la fièvre de lait consistent à administrer des dérivés de la vitamine D comme la 25-hydroxyvitamine D 3, la 1,25dihydroxyvitamine D 3 ou la l-hydroxyvitamine D 3, c'est-à-dire des composés non hydroxylés en C-24 La Demanderesse est arrivée à la conclusion que l'absence de radical hydroxyle en C-24 est une caractéristique importante d'un agent efficace contre la fièvre de lait Toutefois, tous ces dérivés de la vitamine D peuvent, directement ou indirectement, subir la 24- hydroxylation enzymatique in vivo et donner naissance aux dérivés 24,25dihydroxylés non désirés (par exemple par les réactions 25-hydroxyvitamine D 3 > 24,25-dihy- droxyvitamine D 3; lo,25-dihydroxyvitamine D 3 3 ,24,25trihydroxyvitamine D 3; l"-hydroxyvitamine D 3 ->l*,25-dihydroxyvitamine D 3 l X,24,25-trihydroxy- vitamine D 3) L'existence in vivo de la 24- hydroxylation, suivant les réactions indiquées, est bien établie et dès lors les dérivés de vitamine D administrés actuellement pour le traitement de la fièvre de lait donnent inévitablement naissance à des métabolites 24,25-dihydroxylés Il en va de même des *dérivés de la vitamine D 2 dont on sait qu'ils subissent des hydroxylations successives analogues Une autre complication tient au fait que chez un animal déter- miné, les vitesses de ces 24-hydroxylations in vivo ne sont ni connues ni prévisibles du fait qu'elles dépen- dent d'un certain nombre de paramètres physiologiques (par exemple les taux de calcium et de phosphate et ceux d'autres hormones), de sorte que l'efficacité de ces composés contre la fièvre de lait peut être influ- encée de façon imprévisible par la mesure dans laquelle le métabolisme in vivo les transforme en les métabo- lites 24,25-dihydroxylés non désirés. Les observations et résultats ci-dessus démontrent à l'évidence que la prophylaxie efficace de la fièvre de lait peut être réalisée par administration a la vache laitière d'un dérivé de vitamine D qui conserve les particularités de structure qu'on sait être importantes pour une telle activité, à savoir l'hydroxylation en au moins une des positions C- 1 et C-25, mais sans possibilité d'une hydroxylation aisée -2530624 in vivo en la position C-24. Les composés ci-dessus satisfont à ces cri- tères du fait qu'ils comprennent des radicaux hydroxyle en C-1 et C-25, qui leur confèrent une grande activité contre la fièvre de lait, et un radical de blocage en C-24 sous la forme d'un radical 24-fluoro, dont la fonction est d'empêcher l'apparition du radical 24- hydroxyle au cours du métabolisme in vivo. Les substituants fluoro C-25 sont connus comme bloquant l'hydroxylation in vivo, de sorte que les composés ne peuvent donner naissance aisément à des formes 24,25-dihydroxyl'es de la vitamine D qui, au cours du métabolisme normal, se forment aux dépens d'un dérivé 25-hydroxylé quelconque de la vitamine D, mais les dérivés C-24 fluorés analogues sont au moins aussi efficaces que les dérivés correspondants exempts de radical de blocage fluoré en la position C-24. Les dérivés 24-bloqués de la vitamine D peuvent être administrés à la vache avant la mise bas. Avantageusement, les composés sont administrés environ 3 ou 4 à 8 jours avant la date de vélage prévue et peuvent être administrés en une dose unique ou, s'il y a préférence, en doses multiples pendant quelques jours Les doses de 0,1 à 1 mg par jour sont généra- lement efficaces. L'administration d'une combinaison de composés -bloqués actifs de la vitamine D est également possible et efficace De telles combinaisons compren- nent, le plus avantageusement, l'administration con- jointe d'un dérivé de 25-hydroxyvitamine D et d'un analogue de 1-hydroxyvitamine D Par exemple, l'admi- nistration d'un dérivé 24-fluorobloqué de 25-hydroxy- vitamine D et du dérivé 24-bloqué de l-hydroxy- vitamine D dans un rapport établissant un excès du composé 25-hydroxylé d'environ 5 à 10 fois sur le 1 l composé 1-hydroxylé est hautement efficace Norma- lement, les quantités sont d'environ 0,4 mg du composé de l'invention avec environ 4 mg du composé 25 hydro- xylé correspondant. Tout mode d'administration classique convient. Par exemple, les composés en solution dans une huile inoffensive d'usage courant en pratique vétérinaire, comme l'huile de mais, l'huile de sésame ou le propy- lèneglycol, etc peuvent être administrés en injection intramusculaire ou sous-cutanée ou bien être appliqués sous la forme d'une solution dans un solvant tel que le diméthylsulfoxyde pour l'absorption transcutanée En variante, les composés peuvent être administrés, après avoir été mis en composition avec d'autres substances, sous la forme d'un bol ou sous forme encapsulée, à nouveau avec des adjuvants appropriés, ou dans un solvant convenable sous forme de suppléments alimen- taires pour le grain ou d'autres aliments distribués aux animaux, ou bien ils peuvent être incorporés à ces aliments. Lorsque les composés doivent être administrés sous la forme d'un supplément alimentaire, le composé ou le mélange des composés à administrer est d'abord dispersé dans un excipient liquide comestible ou inoffensif, comme l'huile d'arachide, l'huile d'olives, l'huile de mais ou l'huile de coton, et est pulvérisé sur, par exemple, 900 à 1400 g des aliments distribués a l'animal. La dispersion dans l'excipient peut être réalisée aisément par dissolution préalable du composé ou du mélange dans de l'éther et ensuite par dispersion de la solution dans l'excipient liquide et enfin par évaporation de l'éther La concentration en le composé dans l'excipient liquide n'est pas critique et la Demanderesse a observé qu'une quantité s'élevant à 16 mg de la 25-hydroxyvitamine D 24-bloquée peut être dispersée aisément dans 5 ml d'huile En tout cas, la concentration doit être suffisante pour que l'aliment auquel l'additif est ajouté ne devienne pas excessi- vement huileux De plus, le composé en dispersion dans l'huile doit être appliqué en quantité suffisante sur les 900 à 1400 g d'aliments pour que l'animal reçoive environ 0,1 à 1 mg de lc(-hydroxyvita)mine D 24-bloquée ou environ 1 à 10 mg de 25-hydroxyvitamine D 24- bloquée, indépendamment du fait que ces composés sont administrés isolément ou en mélange. En variante, la dispersion liquide du composé peut être absorbée sur une base amylacée ou sucrée, par exemple de l'amidon de mais, du saccharose, du lactose ou du fructose et ce concentré peut être ensuite mélangé ou pulvérisé sur 900 à 1400 g d'aliment, la quantité de concentré étant dans chaque cas suffisante pour apporter la dose spécifiée ci-dessus. Lorsque les composés doivent être administrés sous la forme d'un bol, ils sont d'habitude d'abord dispersés dans une huile ou un autre liquide inof- fensif, par exemple le propylèneglycol comme décrit ci- dessus, après quoi la dispersion est absorbée sur un substrat comestible ou inerte, mais propre à l'inges- tion, par exemple des amidons ou des sucres, pour être ensuite conditionnée dans des capsules de gélatine en vue de l'administration ou bien pour être combinée avec d'autres matières inertes qui permettent et facilitent le pressage en comprimés De façon générale, le bol sous forme de capsule ou de comprimé, doit contenir une dose de l'un des composés 24bloqués ou d'un mélange de ceux-ci tombant dans les intervalles indiqués ci- dessus. Il convient de noter que tant la forme cis que la forme trans des dérivés 24-bloqués de la vitamine D peuvent être administrés de manière efficace De plus, les dérivés de la vitamine D bloqués en position 24 par des substituants autres que ceux spécifiquement indi- qués conviennent aussi Par exemple, le radical de blocage peut être un halogène autre que le fluor, ou bien le composé peut être 24-dialcoylé, par exemple 24- diméthylé Dans tous les cas, les composés bloqués doivent manifester de la stabilité métabolique et de l'activité vitaminoide D. Dans tous les cas d'administration, si le vélage n'a pas lieu dans le délai prévu après la première administration du composé, qui' est généra- lement de 5 jours, une dose de rappel du composé peut être administrée En fait une troisième dose du composé peut être administrée si la chose apparait utile après encore 5 jours si la vache n'a pas vêlé. Il convient de noter que les doses spécifiques ne sont pas nécessairement critiques Elles peuvent évidemment varier avec le poids de la vache à laquelle elles sont administrées En tout cas, la quantité doit être suffisante pour exercer l'effet désiré, qui est de prévenir la fièvre de lait L'administration de quan- tités supérieures à celles indiquées est généralement à éviter parce qu'elle est économiquement non intéres- sante. R E V E N D I C A T I ON S 1. Composé de formule: F F OR 3 O 3 " OXOR 1 R 20 OR, o 1, -R 2 et R 3, identiques ou différents, représentent chacun un atome d'hydrogène ou un radical acyle. 2. Composé suivant la revendication 1, dans la formule duquel Ri, R 2 et R 3, identiques ou diffé- rents, représentent chacun un atome d'hydrogène ou un radical acétyle ou benzoyle. 3. La 24-Fluoro-l",25-dihydrovitamine D 3. 4. La 24-Fluoro-1,25-dihydroxy-5,6-trans- vitamine D 3. 5. Composition pharmaceutique ou vétérinaire, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé suivant l'une quelconque des revendications précé- dentes, outre un excipient ou diluant acceptable. 6 Composition suivant la revendication 5, caractérisée en ce que RI, R 2 et R 3 représentent des atomes d'hydrogène. 7. Composition suivant la revendication 5 ou 6, caractérisée en ce qu'elle se prête à l'injection et comprend une huile inoffensive. 8. Composition suivant la revendication 5 ou 6, caractérisée en ce qu'elle est présentée sous forme de bol ou de supplément alimentaire pour les aliments des animaux