FR 2533584 A1 19840330 FR 8216316 A 19820928 Procédé de détection du pouvoir mutagène de substances, susceptibles d'induire la détérioration d'ADN cellulaires, mettant en jeu la production d'une réponse SOS. L'invention concerne-un procédé de détection du pouvoir mutagène de substances susceptibles d'induire la détérioration d'ADN cellulaire, mettant en jeu la produc- tion d'une réponse SOS Plus particulièrement, elle con- siste en un perfectionnement du procédé de détection du caractère éventuellement mutagène de substances, qui fait l'objet de la demande de brevet européen no 82 400664 Ce procédé consiste à cultiver au sein d'un milieu approprié un micro-organisme transformé par un recombinant d'un gène sfi, notamment sfi A, et d'un gène codant pour une enzyme dosable, avantageusement la S-galactosidase, en présence de la substance étudiée, le caractère mutagène de cette dernière étant évalué par la détection d'un ac- croissement éventuel de l'enzyme dosable, ou de l'enzyme hybride, constituée au moins en partie par ladite enzyme dosable. On a cependant constaté que les réponses suscep- tibles d'être obtenues à l'occasion de la mise en oeuvre du procédé de détection décrit dans la demande de brevet européen étaient susceptibles d'être modifiées, au moins pour certaines concentrations de la substance à tester, par exemple lorsque celle-ci s'avère exercer des actions distinctes, indépendantes,sur le micro-organisme étudié, par exemple lorsqu'elle possède la propriété d'induire une inhibition de la synthèse des protéines Dans un tel cas, l'induction de la _-galactosidase ou de l'enzyme hybride contenant la R-galactosidase peut être suffisam- ment réduite, même lorsque la substance étudiée possède effectivement des propriétés mutagènes, pour rendre aléa- toires les conclusions susceptibles d'être tirées des ré- sultats obtenus, au moins en ce qui concerne l'intensité des pr- priétés mutagènes effective de la substance étudiée. L'invention a pour but de remédier à ce type de difficultés, plus particulièrement d'obvier aux pertur- bations éventuelles dues à des propriétés souvent non connues de la substance à l'étude et s'ajoutant à ses propriétés effectivement mutagènes ou génotoxiques, et par conséquent de remédier au masquage éventuel de l'in- duction de l'enzyme dosable, par lesdites perturbations. Le procédé selon l'invention pour détecter l'éven- tuel effet mutagène d'une substance ou composition, qui comprend la réalisation d'une culture d'un micro- organisme, notamment E oo Zi, hébergeant un recombinant d'un gène sfi et d'un gène codant pour une enzyme do- sable, plus particulièrement une fusion sfi A È opéron lac Z, en présence de la substance à étudier et la mesure de l'activité 5-galactosidase, éventuellement induite sous le contrôle du gène sfi, lorsque celui-ci est ac- tivé du fait du caractère mutagène de ladite substance ou composition, est caractérisé en ce que l'on mesure également l'activité d'une enzyme distincte, susceptible d'être synthétisée par le micro-organisme en question, cette enzyme étant codée par un gène non impliqué dans les processus d'activation des gènes intervenant dans la production d'une réponse SOS, le caractère éventuel- lement mutagène de la substance étudiée découlant de la variation, plus particulièrer Ement de 1 ' augoentation du rapport de l'activité de la susdite enzyme dosable à 1 'activité de l'au- tre enzymenotamment eu égard à la valeur observée du même rapport dans une culture du même micro-organisme, mais en l'absence de substance mutagène. De préférencel' autre enzyme est choisie parmi celles que le micro-organisme hébergeant le susdit re- combinant est capable de produire en quantités signifi- catives Au besoin, il est rendu constitutif pour ce qui est de la synthèse de l'enzyme choisie Cette en- zyme est avantageusement constituée par la phosphatage alcaline. Bien entendu, toute autre enzyme que la phospha- tase alcaline peut être utilisée comme référence A titre d'exemple d'enzyme susceptible d'être mise en jeu en lieu et place de la phosphatase alcaline, on citera: la tryptophanase et la glucuronidase. Cela vaut également en ce qui concerne la susdite enzyme dosable, laquelle peut éventuellement consister en l'en- a zyme codée par l'un des gènes suivants: UVR A, rec ou umu C. L'utilisation du rapport susdit comme paramètre à prendre en considération, rend le diagnostic essentiel- lement indépendant des perturbations auxquelles la syn- thèse de l'enzyme dosable peut être soumise, en réponse à l'induction du gène sfi, comme conséquence des pro- priétés distinctes de la substance étudiée et suscepti- bles d'influencer les synthèses enzymatiques On a en effet constaté que les perturbations en cause s'exer- çaient toujours de façon telle, vis-à-vis tant de l'en- zyme dosable induite que de l'enzyme de référence, que le susdit rapport tend de toute façon à s'accroître de façon très notable, lorsque la substance étudiée présente effectivement un caractère mutagène, quels que soient les degrés d'inhibition relatifs des synthèses de l'enzyme dosable, alors induite par l'activation du gène sfi et de l'enzyme de référence. L'invention concerne également plus particulière- ment les souches des micro-organismes hébergeant les sus- dits recombinants, dans la mesure o ils ont été rendus constitutifs pour ce qui est de la synthèse de l'enzyme de référence A ce titre, l'invention concerne en par- ticulier les souches de micro-organismes, plus particu- lièrement de E coli, hébergeant le recombinant sfi A:: opéron lac Z et autorisant l'expression du gène lac Z, comme suite à l'activation du gène sfi A, ces micro- organismes étant plus particulièrement caractérisés en ce qu'ils sont égaiements constitutifs pour la synthèse de la phosphatase alcaline. Un micro-organisme hébergeant un recombinant sfi:: opéron lac constitutif pour la synthèse de la phosphatase alcaline peut être obtenu par l'induction d'une mutation dans le gène de régulation pho R ou par transduction du marqueur pho? au moyen du bactério- phage P 1. D'autres caractéristiques de l'invention appa- raltront encore au cours de la description de modes de mise en oeuvre préférés du procédé selon l'invention, en mettant en oeuvre une souche également conforme à l'in- vention, hébergeant un recombinant sfi Az:lac, et rendue constitutive pour la synthèse de laphosphatase alcaline. Référence sera faite au dessin, dans lequel: -la fig 1 contient des courbes représentatives des varia- tions des activités (en unités enzyatiques:-u e) de la e-galactosidase et de la phosphatase alcaline res- pectivement, d'une part, et du rapport de l'activité B-galactosidase à l'activité phosphatase alcaline, d'autre part, en fonction de la' teneur (en nanomoles: N 4 du mi- lieu de culture du susditmicro-organisme) en composé carcinogène (ou génotoxique) bien connu, constitué par le 4-nitroquinoline-1-oxyde ( 4 NQO), les fig 2 et 3 contiennent des courbes représentatives des variations du logarithme du susdit rapport, ci- après dénommées SOSIF (abréviation de "SOS induction factor"), mesurables dans des cultures semblables, en présence de différentes substances génotoxiques, en fonction de leurs concentrations respectives dans les milieux de culture, en nanomoles:par échantillon étudié. Le microorganisme mis en oeuvre dans les essais dont la description suit est une souche de E co Zi transformée, dénommée PQ 37, déposée à la Collection Na- tionale des Cultures de Micro-organismes (C N C M. de l'INSTITUT PASTEUR de Paris, sous le n I-205 à la date du 24 septembre 1982 Les caractéristiques génétiques de ce micro-organisme sont les suivantes: F thr leu his-4 pyr D thi qal E qal K ou T lac AUI 69 sr 1300::Tn 10 rpo B rps L uvr A rfa trp::Muc+ sfi A::Mud(Ap, lac)c-Ts Il est constitutif pour la synthèse de l'al- caline phosphatase (Pho C). Cette souche a été obtenue par les recombinai- sons génétiques appropriées pour lui conférer le géno- type sus-indiqué, à partir de la souche contenant le recombinant sfi A::lac Z déposé à la C N C M sous le no I-152 le 13 avril 1981. Le procédé selon l'invention peut notamment être mis en oeuvre dans les conditions suivantes: Une culture du susdit micro-organisme préalable- ment développé jusqu'à la phase exponentielle dans le milieu de culture LB ( 3 acto tryptone 10 g, Bacto yeast extract 5 g, Na Cl 10 g, eau Q So P 1 1), contenant également de l'ampicilline, est diluée dix fois soit dans du milieu frais, soit dans le mélange d'activation décrit par AMES B No et Coll ( 1975), "Mutation Research" 31, 347-364 Des aliquotes de 0,6 ml sont réparties dans des tubes à essais en verre con- tenant chacun une dose déterminée de la substance à tester Après deux heures d'incubation à 37 C sous agi- tation, les activités B-galactosidase et phosphatase alcaline sont dosées. On peut en particulier effectuer le dosage de la phosphatase alcaline dans les conditions suivantes: 2,7 ml de tampon T (solution de 121 g de Tris (hydroxy- méthyl)-aminométhane par litre, dont le p H a été ajusté à 8,8 avec HC 1) sont ajoutés à 0,3 ml de la culture des cellules Les membranes cellulaires sont rompues par addition d'une solution de dodécyl-sulfate de sodium à O, 1 % et de O,15 ml de chloroforme et par agitation vigoureux dans un agitateur du type VORTEX Les tubes sont ensuite amenés à la température stabilisée de 28 C. La réaction débute par addition de 0,6 ml d'une solution de paranitrophénylphosphate (PNPP)( 4 mg/ml dans le tampon T) Elle est ensuite arrêtée par addition de 1 ml de H Cl 2 No 5 minutes plus tard, 1 ml de Tris 2 N est ajouté pour restituer la cou- leur, laquelle est mesurée au spectrophotomètre à 420 nm Les unités enzymes sont calculées comme pour la 0-galactosidase, selon la méthode décrite par MILLER J. ( 1972) "Cold Spring Harbour Laboratory", New York. Le dosage de l'activité 3-galactosidase est effec- tué selon la méthode également décrite par MILLER Le protocole opératoire est le même que pour la phosphatase alcaline, sauf que le tampon T est remplacé par le tampon Z dont la composition est indiquée ci-après et que l'on utilise à la place du PNPP le substrat cons- titué par (ONPG) et enfin que la réaction est interrompue avec du carbonate de sodium. La composition du tampon Z est la suivante (par litre): Na 2 HPO 4, 7 H 20 s* s*==* 6 Na 2 HP 04, 7 H 20 16,1 g Na H 2 PO 4, H 20 5,5 g K Cl 0,75 g KC 1 0,75 g Mg SO 4, 7 H 20 0,25 g B-mercaptoéthanol, p H ajusté à 7,0 2,7 ml p H ajusté à 7,0. Les courbes de la fig 1 sont représentatives des variations, en fonction des concentrations en substance génotoxique ( 4 NQO): de l'activité Sgalactosidase (courbe a); de l'activité de la phosphatase alcaline (courbe b); du rapport SOSIF (courbe c). Les différentes mesures ont été effectuées 2 heures après le début de l'expérience En effet, l'expérience montre que la courbe représentative du fac- teur SOSIF,pour toute concentration en substance géno- toxique, atteint un plateau au bout de 70 à 100 minutes, et reste stable en général pendant plus de 2 heures. Les courbes montent en outre,au-delà d'une certaine concentration en substance génotoxique, qu'ils'ensuit un effet inhibiteur de la synthèse des protéines se mani- festant par une réduction des activités e-galactosidase et phosphatase alcaline Cependant, le rapport SOSIF, utilisé'pour l'appréciation de l'effet mutagène ou géno- toxique de la substance étudiée, n'est pratiquement pas affecté En effet, il reste sensiblement constant à des concentrations de la substance génotoxique qui sont de nature à inhiber la synthèse des protéines. Les courbes des fig 2 et 3 sont représentatives des variations du rapport SOSIF en fonction des concen- trations utilisées en divers agents génotoxiques. Les substances génotoxiques utilisées ont été les suivantes: R 5255: 2nitro-5-méthoxybenzofuranne AF Bl: aflatoxine 4 NQO: 4-nitroquinoline-1oxyde R 5144: 2-nitro-benzofuranne AF G 1: aflatoxine G AF B 2: aflatoxine B B(a)P: benzo-a-pyrène MNNG: N-inéthyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidine Il est particulièrement remarquable que le facteur SOSIF soit en fonction sensiblement linéaire de la concentration de la substance génotoxique utilisée, en particulier pour des doses contenues dans un inter- valle de doses relativement faibles La sensibilité du test est particulièrement remarquable, si l'on observe que les variations des valeurs mesurées s'étendent dans un intervalle de 1 à 60 millions, lorsque l'on passe de la limite inférieure à la limite supérieure de l'inter- valle des concentrations exprimées en abscisse. L'invention fournit par conséquent un test d'une sensibilité tout à fait remarquable, apte à donner des indications quantitatives précises, eu égard à l'intensi- té de l'effet mutagène des substances étudiées_ Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nulle- ment à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés; elle en embrasse au contraire toutes les variantes. REVENDICATIONS 1 Procédé pour détection de l'éventuel effet mutagène d'une substance ou composition, qui comprend la réalisation d'une culture d'un micro-organisme, no- tamment E coi, hébergeant un recombinant d'un gène sfi et d'un gène codant pour une enzyme dosable, plus parti- culièrement une fusion sfi A::opéron lac Z, en présence de la-substance à étudier et la mesure de l'activité B-galactosidase, éventuellement induite sous le contrôle du gène sfi, lorsque celui-ci est activé du fait du ca- ractère mutagène de ladite substance ou composition, caractérisé en ce que l'on mesure également l'activité d'une enzyme distincte, susceptibles d'être synthétisée par le micro-organisme en question, cette enzyme étant codée par un gène non impliqué dans les processus d'activation des gènes intervenant dans la production d'une réponse SOS, le caractère éventuellement muta- gène de la substance étudiée découlant de la variation observée, plus particulièrement de l'augmentation duû rapport dé l'activité de la susdite enzyme dosable à 1 ' activité de l'autre en- zyme, notanment eu égard à l'évolution du même rapport dans une culture du même micro-organisme, mais en l'absence de substance mutagène. 2 Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que l'enzyme dosable est constituée par la a-galactosidase. 3 Procédé selon les revendications 1-ou 2, caractérisé en ce que l'enzyme distincte est constituée par la phosphatase alcaline. 4 Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 3, caractérisé en ce que le micro-organisme a été rendu constitutif pour la synthèse de l'enzyme distincte. Micro-organisme, particulièrement E co Li, hébergeant le recombinant sfi A::opéron lac Z et autorisant l'expression du gène lac Z, comme suite à l'activation du gène sfi A, ces micro-organismes étant plus particulière- ment caractérisés en ce qu'ils sont également consti tutifs pour la synthèse de la phosphatase alcaline.