FR 2535204 A1 19840504 FR 8316950 A 19831025 La présente invention est relative à un procédé pour la préparation d'un vaccin adjuvé, inactivé, contre la peste de cocar. La peste de cocar qui doit son nom à celui qui l'a décrite le premier, le Hongrois ALADAR AUJESZKY (Zbl Bakt. Orig 1903 I, 32, 353-357) est une maladie des animaux domes- tiques qui est connue depuis longtemps et qui occasionne de lourdes pertes C'est principalement le cheptel porcin, et plus particulièrement les jeunes animaux, qui est atteint. Au fur et à mesure de l'avance en âge des porcelets, les maladies à issue mortelle deviennent plus rares, il apparait cependant des pertes dans la rentabilité des élevages d'ani- maux, en raison des maladies de l'appareil respiratoire, du système nerveux central ainsi que de leurs complications. Les animaux atteints par le virus peuvent porter en eux l'agent pathogène pendant longtemps ( 1-2 ans) et évacuer le virus sous l'action d'un stress (par exemple d'une naissance) et propager de ce fait la maladie (J Am Vet Med Ass 176, 998-1000 et 1345-1347, 1980) Les truies infectées perdent fréquemment les embryons par avortement (Acta Vet Acad Sci. Hung 12, 17-23, 1962) Les porcs infectés jouent également un rôle important dans la transmission de la peste de cocar aux ruminants (boeuf, mouton) (Acta Vet Acad Sci Hung. 12, 53-58, 1962). Les procédés de lutte contre la peste de cocar sont basés sur le fait que les animaux les plus sensibles à la maladie, à savoir les porcelets qui sont encore allaités, doivent être protégés au cours des premières semaines de leur vie par des anticorps spécifiques. En Hongrie, a été mise au point une technologie de fabrication d'un sérum hyperimmun préventif pour la protec- tion contre la maladie (Acta Vet Acad Sci Hung 7, 423- 427, 1957) Le sérum hyperimmun obtenu à partir de porcs, réduit, lorsqu'il est utilisé au moment voulu, les pertes, cependant ses inconvénients sont importants: la préparation du sérum est très coûteuse, et de plus il est éliminé de l'organisme en l'espace d'un temps très bref (en 10 à 14 jours) Son utilisation chez les jeunes animaux et chez les animaux qui ont terminé leur croissance, n'entre pas en question en raison du prix élevé du sérum. L'étape suivante de protection contre la peste de cocar a consisté en l'instauration de l'immunisation active. Des souches de virus ont été atténuées dans des mesures variables et de différentes manières et ont été utilisées pour la production de vaccins En Hongrie, un vaccin vivant qui contient le virus vivant présentant une virulence atté- née, est dans le commerce depuis 1961 Ce vaccin est utili- sé pour l'immunisation active de porcs, de ruminants et de chiens (MAL 16, 42-45, 1961) Les pertes économiques provo- quées par la maladie sont en régression depuis l'instauration du programme de vaccination (Cah Med Vet 43, 240-247, 1974), cependant, l'utilisation de vaccins viraux vivants présente quelques inconvénients: 1) Après l'immunisation de truies gravides, la teneur en anticorps du colostrum et du lait assure une immu- nité passive des porcelets, qui persiste pendant 4 à 6 semai- nes Pendant ce laps de temps, il n'est pas possible de réaliser l'immunisation avec un vaccin viral vivant, car même le faible taux des substances immunisantes colostrales comprises dans la disparition, est suffisant pour inhiber la multiplication du virus dans la mesure nécessaire à l'appari- tion de l'immunité active. 2) Pour ces raisons, il peut se trouver dans le cheptel des animaux chez lesquels la vaccination a échoué et dans un cheptel infecté ces individus dont l'immunité a échoué assurent la perpétuation du virus virulent. 3) L'utilisation de vaccins vivants est interdite dans certains pays et dans certains cas cette interdiction s'étend à l'introduction de viande provenant d'animaux immunisés à l'aide de vaccins vivants Ceci limite les possi- 3 - bilités d'exportation des pays dans lesquels on procède à l'immunisation pardes vaccins vivants. 4) Bien que le vaccin atténué fabriqué en Hongrie se soit avéré jusqu'à présent comme inoffensif et génétique- ment stable, des publications d'autres pays rendent compte de cas dans lesquels les souches virales utilisées pour la production du vaccin atténué ont récupéré brusquement leur virulence (The Vet Bull 43, 465-480, 1973; Dtsch Tierârzt. Wschr 85, 381-420), ce qui a entraîné des réactions vacci- nantes trop violentes chez les animaux traités par le vaccin. ) Le vaccin atténué utilisé en Hongrie n'est pas totalement sans danger chez les chiens et les visons et il n'immunise pas du tout les chats. En raison des difficultés liées à l'utilisation du vaccin vivant, on a fait des essais pour produire un vaccin inactive On a utilisé par l'inactivation, la formaline, le rayonnement ultra-violet, la epropiolactone, la saponine, le Violet Cristallisé et l'éthanol, et on a utilisé comme adjuvant, les gels d'hydroxyde d'aluminium (Acta Microbiol. Hung 2, 151-160, 1954; Arch exp Vet Med 21, 501-507, 1967) Les vaccins prépares de cette manière sont cependant insuffisamment actifs Des procédés plus modernes utilisent pour l'inactivation l'éthyléthylèneimine, et comme adjuvant le DEAE-dextrane (Zbl Vet Med B 20, 127-138, 1973), cependant le DEAE-dextrane a déclenché des réactions aller- giques. La présente invention a pour but de produire un vaccin inactive, actif à l'égard de la peste de cocar, qui: 1) est aussi actif ou plus actif que les vaccins atténués contre la Peste de cocar. 2) est sans danger pour tous les animaux sensibles à la Peste de cocar, indépendamment de leur race et de leur age, et leur assure une immunité appropriée, 3) convient également à l'immunisation active de porcelets bénéficiant encore de l'immunité colostrale. -4- Ce but est atteint conformément à la présente invention en ce que la souche de virus de peste de cocar dénommée "Phylaxia" déposée à l'Institut National Hongrois de la Santé Publique (Orszagos K 5 zegészség Ugyi Intézet) sous le numéro 00236/82 et qui a été sélectionnée parmi les différentes souches de virus de peste de cocar en raison de ses propriétés d'immunisation, est ensemencée et cultivée sur une culture primaire de cellules fibroblastiques d'embryons de poulets La solution virale obtenue est inac- tivée par un agent d'inactivation connu, tel que l'éthylène- imine de préférence, puis mélangée avec un adjuvant connu, de préférence l'adjuvant huileux incomplet "Phylaxia". L'excellente action immunisante des vaccins prépa- rés conformément à la présente invention est due à de nonbreux facteurs La souche "Phylaxia"l virulente qui provient d'une épidémie nationale est caractérisée par les propriétés biolo- giques suivantes: elle peut être cultivée avec succès aussi bien dans des cultures cellulaires que chez des animaux récep- teurs, elle présente un titre infectant élevé et présente une bonne aptitude à l'immunisation Le processus d'inacti- vation ménagée contribue à l'excellente activité, ses para- mètres (température, concentration de l'agent d'inactivation, durée) permettant aux antigènes protecteurs d'être conservés. L'éthylène-imine, qui est utilisée comme agent d'inactivation, est cyclisée avant -d'être utilisée sous la forme d'une solution aqueuse diluée L'action immunisante des antigènes inactivés de façon ménagée est encore augmen- tée par l'adjuvant incomplet "Phylaxia". Le vaccin préparé de la manière qui sera décrite ci-après dans les Exemples est utilisé pour l'immunisation de porcs, de boeufs et de chiens, et l'immunisation est de préférence répétée. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complé- ment de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. -5Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples de mise en oeuvre, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple 1 PREPARATION DU VIRUS VACCINANT On infecte des lapins qui pèsent de 2 à 2,5 kg, par voie intracérébrale, d'une souche de virus de peste de cocar 'Phylaxia" isolée dans un cas d'épidémie aigae, et déposée à l'Institut National Hongrois de la Santé Publique sous le numéro 00236/82 On observe les symptômes caracté- ristiques de la peste de cocar chez les animaux, la mort a lieu au bout de 72 à 96 heures Le cerveau est extrait dans des conditions stériles et on l'utilise pour préparer une suspension à 10 % à l'aide d'une solution physiologique de chlorure de sodium Cette suspension est utilisée pour la multiplication du virus en masse. Exemple 2 PREPARATION DE LA SUSPENSION VIRALE Le virus vaccinant virulent obtenu conformément à l'Exemple 1 est cultivé sur une culture primaire de cellules en une seule couche de fibroblastes d'embryons de poulets ou de testicules de veau, dans des boites de Roux d'un volume de 2 000 ml (ou dans les bouteilles en rotation d'un dispo- sitif "Rolling") On utilise comme solution de croissance pour la culture de cellules, une solution de Hanks ou une solution MEM-H, pour la maintenance et pour la multiplica- tion des virus on utilise une solution de Earle ou une solution de MEM-E La composition de ces solutions peut être trouvée dans les publications suivantes: J Nat Cancer Inst. 8, 83, 1974; Proc Soc exp Biol Med 71, 196, 1949; Science 139, 1959; Bakacs, Farkas: Orvosi virologia, Medicina, Budapest) La solution de Hanks ou la solution MEM-H utilisée pour la croissance de la culture cellulaire en une seule couche, est additionnée de 10 % de sérum de -6- veau, tandis que la solution utilisée pour la multiplication du virus ne contient pas de sérum de veau Après que la culture de cellules en une seule couche s'est contituée, c'est a dire après confluence des cellules, on élimine la solution de croissance On verse alors sur les cultures de la solution de maintien contenant du virus Les cultures sont incubées à 37 C jusqu'à la destruction totale des cellules (au bout de 48 à 72 heures environ) La suspension de virus obtenue convient à la production du vaccin inactive, si elle est stérile et si son titre infectant, mesuré dans une culture de cellules, est d'au moins 107 TCID 50/ml. Exemple 3 INACTIVATION ET FORMULATION La suspension de virus obtenue conformément à l'Exemple 2 est inactivée par une solution d'éthylène-imine dont la concentration est de 200 g/ml, à 37 C, pendant 6 heures La solution d'éthylène-imine est préparée juste avant son utilisation, par cyclisation de brométhylamine. On décompose ensuite l'éthylène-imine par du thiosulfate de Sodium et on ajuste le p H de la suspension inactivée à 7,2-7,4 Pour contrôler si la suspension est effectivement inactivée, on ensemence une culture de cellules préparée comme décrit plus haut, avec cette suspension, puis on vaccine avec cette suspension des lapins qui pèsent 2-2,5 kg et des moutons qui pèsent 25-30 kg. La matière virale est alors mélangée avec un volume égal d'adjuvant huileux incomplet "Phylaxia" La suspension de virus aqueuse et l'adjuvant huileux sont traités dans un émulgateur sous pression élevée, pour donner lieu à une émulsion stable qui ne se décompose pas dans la zone de températurescomprise entre O et + 45 C Le vaccin terminé est introduit stérilement dans des ampoules qui sont fermées à l'abri de l'air. Exemple 4 VERIFICATION DE REACTIONS A LA VACCINATION -.7- Le vaccin obtenu de la manière qui vient d'être décrite est inoculé par voie intramusculaire à une dose de 2 ml aux animaux d'expérimentation suivants: lapins, moutons, chiens, porcelets à l'âge de 2 jours, de 3 semaines et de 8 semaines, truies dans le dernier tiers de la gestation. Les porcs sont surveillés pendant 3 mois et les autres ani- maux pendant 6 semaines Pendant ce temps, il ne s'est pro- duit aucune réaction à la vaccination. Exemple 5 IMMUNISATION DE PORCELETS Des porcelets de 2 jours, de 3 semaines et de 8 semaines ont été vaccinés par la voie intramusculaire, chacun à l'aide de 2 ml de vaccin Au bout de 3 semaines, ce traitement a été répété Chez les animaux traités, il appa- rait des anticorps spécifiques qui protègent les porcelets de l'infection effectuée par la voie intranasale à l'aide d'une dose de 2 xl D 6 TCID 50 du virus virulent de la peste de cocar, alors que les animaux témoins,qui n'avaient pas été vaccinés,sont morts lorsqu'ils ont été infectés par la même dose. Exemple 6 PRODUCTION DE L'IMMUNITE COLOSTRALE Des truies d'élevage gravides sont vaccinées au cours du dernier tiers de leur gestation,par voie intramus- culaire à l'aide de 2 ml du vaccin obtenu conformément à l'Exemple 3 Le traitement est répété 3 semaines plus tard, en choisissant les dates de vaccination de telle manière que la deuxième vaccination ait lieu 2 mois avant la date prévue pour la mise bas. Dans le colostrum des truies traitées, il apparait des anticorps spécifiques et, de ce fait, on peut encore mesurer au septième jour, dans le sérum sanguin des porcelets allaités, un titre de neutralisation moyen de 1:16 Ce titre de neutralisation du virus offre une protection contre une infection réalisée avec le virus virulent à une dose de -8- 4 x 10 TCID 50 Des vaccinations de contrôle au 30 ème, au ème et au 90 ème jour (lorsque la teneur du colostrum en anticorps diminue) ont entraîné dans le groupe traité,des mortalités de 18, 26 et 40 % respectivement, tandis que les porcelets provenant de mères non immunisées sont tous morts. Les anticorps spécifiques contenus dans le lait protègent de ce fait les jeunes animaux à l'age auquel ils sont le plus sensibles à la maladie. Exemple 7 VACCINATION DE PORCELETS PENDANT L'INTERVALLE DE TEMPS O L'IMMUNITE COLOSTRALE EXISTE Les porcelets provenant de mères immunisées con- formément à l'Exemple 6, qui bénéficient d'une immunité colostrale, sont vaccinés au 7 ème et au 28 ème jour chaque fois à l'aide de 2 ml du vaccin préparé conformément à l'Exemple 3 Les anticorps spécifiques se forment avec un titre élevé ( 1:44) A l'âge de 60 jours, les porcelets sont infectés par voie intranasale par du virus virulent à une dose de 2 x 10 TCID 50 Les animaux soumis à l'expérimentation ne présentent aucun symptôme tandis que les témoins (il s'agit de porcelets non vaccinés, provenant de mères non immunisées) sont morts à 100 % De ce fait, on peut immuniser avec succès même des porcelets à l'allaitement, qui bénéficient de l'immunité colostrale, par le vaccin inactivé. Exemple 8 FREQUENCE DE LA VACCINATION Les truies d'élevage vaccinées à deux reprises pendant leur gestation, à la manière décrite à l'Exemple 6, ont été à nouveau vaccinées par 2 ml de vaccin (vaccination de rappel), alors qu'elles étaient à nouveau gravides De ce fait, le titre d'anticorps a à nouveau fortement augmenté dans le colostrum des truies traitées, et leurs porcelets se sont avérés protégés contre une infection de contrôle effectuée avec 2 x 10 TCID 50 Chez les porcelets des truies non vaccinées pendant leur deuxième gravidité, la mortalité 9 - a été plus élevée (de 35 % à l'âge de 6 semaines) Ceci montre que dans l'intérêt d'une protection colostrale suffi- sante, les truies doivent subir une vaccination de rappel pendant la gestation. Exemple 9 IMMUNISATION DE MOUTONS Des moutons agés de 3 et de 6 mois ont été immuni- sés par 2 ml du vaccin préparé conformément à 1 ' Exemple 3. Quinze jours après la vaccination, les animaux ont été infectés par du virus virulent de peste de cocar, à une dose de 1000 TCID 50 Tous les animaux du groupe témoin non vacci- nés sont morts, tandis que les moutons traités n'ont présen- té aucun symptôme. Exemple 10 Des chiens âgés d'un mois et de six mois ont été traités par le vaccin préparé conformément à l'Exemple 3. Le traitement a été répété 3 semaines plus tard Quinze jours après la deuxième vaccination, les chiens traités ont été infectés par le virus virulent, de même qu'un groupe témoin non traité Le titre en anticorps dans le sang des chiens immunisés est de 1:32, ces chiens ne sont pas tombés malades, tandis que dans le groupe témoin, les chiens ont présenté des symptômes caractéristiques de la maladie et sont morts. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'inven- tion ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au con- traire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. - REVENDICATIONS 1) Procédé de préparation d'un vaccin inactivé de lutte contre la peste de cocar, caractérisé en ce que l'on cultive la souche de virus de peste de cocar virulent "Phylaxia" déposée auprès de l'Institut National Hongrois de la Santé Publique (OKI) sous le numéro 00236/82,sur une culture de cellules préparée d'une manière connue en elle- même, en ce qu'on inactive cette culture et en ce qu'on mélange l'antigène inactivé avec un adjuvant huileux incom- plet et on homogénéise. 2) Procédé selon la Revendication 1,caractérisé en ce que l'on utilise pour l'ensemencement de la culture de cellules,les premiers à troisièmes passages de la suspension de cerveau de lapin du virus déposé. 3) Procédé selon la Revendication 1,caractérisé en ce que l'on inactive la suspension de virus par de l'éthylène- imine préparée immédiatement avant son utilisation, par cycli- sation de brométhylamine. 4) Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que l'on utilise comme adjuvant huileux incomplet, l'immuno-adjuvant incomplet "Phylaxia".