FR 2535057 A1 19840427 FR 8217737 A 19821022 253505 ? PROCEDE POUR LA DETEEMINATION DE L 'AB 50 RPTIOXN -RCUI-i MEE D'UN PRODUIT CHEZ LES MAMlFERES. L'ivenionconcerne la détermination da l'abaorp- tion percutenée d'un produit chez leo mammifères. On sait queil est particuli rement important de d&- terminer dano quelle mesure un produit mis-on contact avec la peau d'un amfère, notaw;ntc avec la peau de l'homeî, est susceptible de passer la barrière outanée et de se re- trouver dans 1 l'organiswi La détermination de 1 's soorption percutanée est notamment très utile en cosmnétique ou dans le domaine médical pour pouvoir définir des compositions cosm&- tiques ou médicinales p Fmoettant de tixuter ou d'aeixafiter selon le cas la péné-tratioe des produits u Wisés à l 'intérieur de i organismie. Dans I'été da la teckàiqua, on a indiqué que le Cratum corneim constituait la barrière principale o'oppooent au passage des molécules à U'intérieur de l'organis = et Il on a défini que le stratum cornélum Jouait un re Jke de réservoir pour lea oole Scules appliquées sur la peau (voir notamment MALKINSONI PD et PEPRGUSON E He J INVES'TO DEENPATOL 25,, 281-283, 1955), on a également constat& que les mesures de la pénétrmtion in vivo sont fonction des techniques utilisées, da Ilepâce animale étudiée, de 1 'emplacepment anatomique aoumio à l'ap-' plicatione de la concentration et de la nature des produite testés et de la durée du temps d'application Jusqu 2 à ce jour, pour déterminer la quantité de produit ayant pénétré dans un organisme de amm fèrce après une application d'un pro'- duit, il était nécessaire de sacrifier le mamodfère traité; il en résulte qu'il était impossible d Vobtenîr deo rêsultats précis concernant il'homme, ce qui consdtibm Lt uin obstacle pour l' am&- Ito J Jratton des caractér L Iqes d'àunccdiê des compa 00 eiqso La présente invention a pour but de proposer un procédé pour la détermination de l'absorption percutanée d'un produit chez les mamfères Selon llnvn tîon, on a constaté que si l'on déterminait la quantité de produit qui, après l'application sur la peau, reste stockée dans le stratum corneum, on pouvait facilement en déduire pour des conditions d'application données et pour un maami- fare donné, la quantité totale de produit qui sera introduite dais l'organisme Selon lt'invention, on a constaté que le procédé de détermination était utilisable quel que soit le produit testé et qutil suffit donc d'en définir les paramé- tres au moyen de produits ayant une totale innocuité pour pouvoir utiliser le procédé afin de déterminer l'absorption percutanée pour des produits éventuellement moins inoffensifso La présente invention a, en conséquence, pour objet, un procédé pour la détermination de la quantité y d'un pro- duit qui a pénétré dans le corps d'un mammifère après que la peau dudit mammifère ait &té mis en contact avec ledit produit pendant un temps t O, caractérisé par le fait qu'après la mise en contact peau/produit et après lavage de la zone de la peau traitée, on prélève sur la peau traité une one de atratum corneum; que 1 'on détermine la quantité X de gproduit contenu dans le stratum corneum prêle- vé;et que lon en Déduit la qualtit y par une relation Y a X b avec y O si Y est négatif ou nul et y Y si Y est positif, formule dns laquelle a et b sont des constan- tes positives indépendantes du produiat appliqué sur l'épider- me. Dans un mode préféré de vea en oeuvre du procédé selon l'invention, on effectue le prélèvement de stratum corneum par arrachages (ou strippings) successifs des couches de stratum corneum; on effectue, de préférence, six strippings successifs, chaque stripping atant r 6 alisé au moyen' d'un ruban adhésif que l'on applique sur la peau puis que l'on arrache; on effectue le prélèvement de stratum corneum juste après la fin de la mise en contact du produit avec la peau; on met en contact le produit testé avec lapeau sous forme liquide, notamment en solution ou en formulation. Si le mammifère étudié eot un rat Hairlesa, si le temps 8 t est égal à 30 minutes et si l'on travaille sur le dos de l'animal, on a défini que a 1,644 et b 0,536. Pour mieux faire comprendre l'objet de l'invention, on va décrire ciaprès, les expériences réalisées sur des rats Hairless pour définir la relation Y = a X b utilisable pour ce mamndfère. On a testé la pénétration percutanée de dix molécu- les radiomarquées à savoir l'acide benzorque (cycle 14 C) à deux concentrations (respectivement produit A et B), l'acide acétyl (carboxyle 4 C) salicylique (produit C), la déhydro(l,2,6,7 3 H) épiandrostérone (produit D), le sali- cylate (carboxyle 14 C) de sodium (produit E), la testostérone ( 4 14 C) (produit F), la caféine ( 8 3 H) (produit G), la thiourée ( 14 C) (produit HL), le D-_ nitol ( 1 14 C) (produit I), l'hydrocortisone ( 1,2, 697 3 L) (produit J), la dexamétheaone ( 1,2 3 K) (produit K). L'activité miee en oeuvre pour chaque produit et le solvant utilis sont indiqués dans la tableau I Pour chaque produit, on utilise un lot de douze rat 8 Sprague- Dawley Hairless femelles agés de douse semaines pesant 240 + l Og Les produite test As sont appliqués sur 1 cm 2 de la peau du dos des animaux préalablement anesthésias par administration intra péritonéale de g a butyrolactone à la dose de 0,5 mil/kg La surface d'application est délimi- tée par une cellule circulaire ouverte de 1 cm 2 maintenue en place par une colle siliconée Les produits sont déposés sur la peau à des doses et dans des,solvants définis dans le tableau I La durée de l'application a été limitée à minutes L'excès de produit se trouvant sur la zone trai- tée est ensuite éliminé par une série de deux lavages utili- sant le solvant qui a servi de véhicule au produit (voir tableau I) et de deux rinçages à l'eau distillée; on sèche ensuite légèrement la zone avec un coton. Le lot de douze animaux est alors partagé en deux groupes égaux Le stratum corneum de la zone d'application de chaque animal du premier groupe est prélevé par une série de six strippings pratiquée avec du ruban adhésif vendu par la société " 3 M'; on sait que de la sorte, on enlève la majeure partie du stratum corneum, la couche cornée de la peau du rat Hairless ayant une épaisseur de 10 à 15, et étant constituée de 7 à 8 assises cellulaires La radio- activité portée par chaque ruban est mesurée après digestion complète du matériau kératinique dans un produit "Soluène 350 (Packard)" puis addition du produit "Dimilume 30 (Packard)"; on compte en scintillation liquide (Packard 460 C); on obtient ainsi les quantités de produit contenues dans le stratum corneum. Les animaux du deuxième groupe, munis de collerettes afin d'éviter tout léchage, sont placés individuellement pendant 4 jours dans des cages à métabolisme Pendant cette période, la nourriture (Extra-labo) at l'eau de ville sont fournies "ad libitum" Les urines et les fécès sont collec- tées quotidiennement; les fécès sont lyophilisées et homo- généisées; après combustion des échantillons à 1 ' "Oxidizer 306 (Packard) ",en co Wpte globalement la radio-activité en scintillation liquide Apres quatre jours, les animaux sont sacrifiés Une série de six strippings est pratiquée sur la zone d'application afin de déterminer la quantité de produit non pénétrée 96 heures après le début de l'expérience. Le reste de la peau de la zone traitée (épiderme + derme) est prélevé et compté en scintillation liquide après diges- tion dans le produit "Soluène 350 " Les animaux sont lyo- philisés, homogénéisés et les échantillons sont comptés en scintillation liquide après combustion, Pour les molécules marquées au tritium, on prend soin de compter la radio-acti- vité présente dans l'eau de lyophilioation et d'en tenir compte dans l 'établissement du bilan final La quantité to- tale de produit pénétrée en 96 heures est donc déterminée par addition des quantités retrouvées dans les excrétats (urine et fécès), l'épiderme et le derme du site d'applica- tion et dans le corps de l'animal Ces quantités sont données -2.535057 dans le tableau II'. Le tableau III indique les quantités de produit pr 6 zentez dans le stratum cornauza à la fin du temps deappli- cation de 30 minutes et les quantités totales pénétrées en 96 heures On constate que leo-quant Ltés totalesl Y peuven Z Pâtre obtenue a à partir des quanités M présentes dans le stratum cornaum après Ilzpplica Zion gr 9 ce à la'relation y - 11644 X - 0,536 Il est clair que y étant toujours P Osi- tif, la relation uenmentionnge ne s'applique qu'à compterz du moment o l'exression(l,644 X -O 0536)est positives y restant nul lorsque cette sxpession est négative, ceatâ dire lorsque la quantité de produit; appliquée eset Suffioanm' smet faible Le t ateienrt S o-qedeo itoato =sntrg que les vaiables y et M sont Crrf C 1 ée S av Q %M ceffi@ 2 nt de 08,998. Sur la úgw uieon a représenrté, sn coordonnées logarithtniques les rsultavts fournis dans le tableau Ille, les pointe du graphique étant identifîée par lae lettres qui désignent les produites (correspondante O On a porté sn ordonnées la quan Zité: y de produit ayant pénétréâ dans l 1 organism e N 96 heures e 2 &rîmépe N nmao-moloo par em 2 et: en abscisses la quantité de produit présente dans le stra- tum corneumi après 30 minutes d'application exprimée en nano'-moles par cm 2 également. on constate qu'il ouffît, pour pouvoir appliquer le procédé selon I Uinventionde déterminer la droite correspon- dant à un manmifêre donné et à une modalité d'application doenéepour que la simple connaissance de la quantité de produit retenue dans le stratum corneum en Uin d'application permette de savoir quelle est l'absorption percutanée tot Qal dans l'organisme pouÈ le produit considéré. Il est bien entendu que le mode de mise en oeuvre ci-dessus décrit n'est aucunement limitatif et pourra donner lieu à toutes idodîfications désirables, se-ns que l'on g'Mi 2 ro te pour cela du cadre de l'invention Q 1 UV 1 ( I 6) (ç 4 66) (OOZ) (ç/ç 6) z 6 c SNOSVIUM M(l (ç/ç 6) (s'on) (OOZ) (ç/ç 6) 69 ú ZNOSUUOOO'da AH ( ú/ Z) WI) (Ooz) (ç 4 lçz) zsi lioZINM (S/W (s'Zn) (OOZ) (S/W 9 L ZMMOIHI ( / 6) (ç 461) (OOZ) (F/W IV 61 21 N Igqva ( / 6) (ç"zl) ( 0071) ( /56) 06 Z smumsoism (O /05) (O Il -V) (OOZ) (Os/O ) 091 Kniaos ( / 6) (O îr 8) (GOZ) Wç 6) sez 3 moumsolda Nv idsoldamma W 6) (O e ti) (OOZ) 081 aabiuoiqvs ILUSDV z(li 3 v Wç 6) ( 01 úi) ( 00 ?) ( / 6) zzi ( / 6) (oer-T) (oçfî) Wç 6) z(liov (A/A) (A/A) nua/lougtl:49(c;Dlin 3-oza Tm) 14-fCe TCOE -u) OZ 'N'il sam Dalic H SDVDiiu za NOLMIIOS aznbilddv uiimvnb A N - v )MLECULES URINES FECES + DES % DE"JE n-,q ed 2 trait" ANIMAUX DE LA ZCHE APPLIQUEE ACIDE BERZOIQUE 450 nanomoles cm 2 71 2 6 25 1,70 O 16 79 30 17 60 nanomoles CW,2 ( 2:90) ( 1:65) ( 0,40) ( 0:02) ( 3:60) ( 0:80) 24,80 1,32 0,50 0,01 26 60 13,30 ( 0150) ( 0930) ( 0,05) ( 0,004) ( 0:65) ( 0,32) ACIDE ACETYL 5,40 O 43 O 85 O 6 70 3 35 SALICYLIQUE ( 0,70) (O Il 1 5) (O lll 20) ( 0:70)', ( 0,'35) DMMROEPI 1,67 3,00 0,19 0,43 5,28 2,65 ANDROSTERONE ( 0,15) ( 0,30) ( 0,03) ( 0,08) ( 0,20) ( 0,10) SALI CYLATE DE 3 30 0,48 1,00 O 4,98 2,50 SODIM 4 ( 0:50) ( 0,10) ( 0,117) ( 0,70) ( 0,33) TESTOSTMONE 1 72 2 05 O 24 O 33 4,32 2 16 ( 0:43) ( 0:05) ( 0:15) ( 0,45) ( 0:23) CAFEINE 2 l' 52 0,42 O 15 O 65 3 73 1,86 ( 055) 0,07) ( 0:01) ( 0:06) ( 0:30) ( 0,15) TMOUREE 2,10 O 76 O 20 0020 3,23 1,61 ( 0,40) ( 0:04) ( 0:02) (O D 04) ( 0,50) ( 0,25) MANNITOL S,60 0,42 0,30 0,30 2 63 1,32 ( 0,20) ( O 115) ( 0,10) ( 0,10) ( 0:17) ( O 08) HYDROCORTISONE O " 46 O 04 0,03 O 86 0,43 0, 4 0,30 0,10 O 04 0,60 0,30 ( 0,02) ( 0105) e Erreur type (n-G) 0,02) O 011 ( 0,06 0,03) r*) Un w ul tn a T A B L t A U il MO S;D,lOm-oueu + ( 9 u) ed Xj inelzaa Coeo) +"Ilo + 09O SNOSVIUSKVX 3 (t (Silo) -( 90 03 WO 9840 amosuxooouam (LE go) (Lillo) zzar IOIIRM (CE "O) C 911 r Cz C ammoini a (OC:O) 9 L z CL 9 O (cz,10) (":O) golz ZE ZKOMSOI 531 ( 6 Z:O) (IL:0) Nfliaos ça C 86 (oz,O) 6 1 (Ivg:o) ( 01:0) T ç oz 9 ILUSDV SUM ( 051) (OL:0) 09 Li 09 9 z Po uelow-u 003 ( 01:0 ( 09:ú) 01 ft DE 6 L 1 no, salctueu oçfy v mbiozmaa samv saidm IN OE sauciv slmaoxd 3 ali'Au ZNOZ Yi sa SMMSH 96 NZ SZM Ug N Zc I NUMS 211 SHV" SZOE SSISZL Sj;m(loxd SIIII(loui M SZWR-ORVN NOUVOISZ" N. ulé c> Ln Io tn Cu 1 Procédê pour la dêteinnation de la quantité y d'un produit, qui a p&iétr 6 deanc 2 la corps d'un manfère aprês que la peau dudit mzîfêra it ét mia en contact avec ledit produit pendant un telve t Og cratgricé par la fait qusaprêo la aise en contact peau /produite et aprtêo lavage de la 2 one d'épîderme traitée on prélève sur la peau traitée-, une zone de etratum corneum;que l'on détermi-' ne la quantité X de produit contenue dans la stratum corneum pr&levé; et que l'on an déduit y par une relation y = ax b avec y O ai y est ngatif ou nul et y 3 f Y i Yest positif, fornafle danc laquelle a et S ont deo conate - tes pnoîtîvao indépendantes du produit cappliqué our l épïde Le- 2 Frocédé a-elon In rovendïcatie Lo 12 eacas par le fnit que l'on effectue la prâlèvem, nt de atratun, corneum par arrachages Cpu otrippin Ss) qucceeoifo des coucheo de stratum corne n. 3 -Pro,"édé sel-on la revendic-etion 2, ccér par le fait que UL on effectue o J, Ot Lrippingo ou*ce Sif O - chaque stripping étant réalisé nu moyen d'un ruban adhéaif que l'on appli que sur la peau puis que l'on airrache O 4 -Procédâ selon l'mne des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que l'on effectue la prélèévement de stratum corneum juste eprès lo fin de la asïîe an contact du produit avec l'épiderme. -Procédé selon leune des revendications 1 à 49 caractérisé par le fait que l'on maet en (contact le produit testé avec la peau sous forme liquide O 6 Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 e dans lequel le 'amfère est un rat Haîrlees et dana lequel 1 'application, de produit est faite pendant 30 minutes sur le dos de l 'animal, caractérisé par le fait que l'en prend a 1,644 et b 0,536.