FR 2533217 A1 19840323 FR 8314696 A 19830915 Procédé de préparation d'enzymes semisynthétiques et produits ainsi obtenus. Les protéines sont des macromolécules synthétisées par voie biologique et remplissant des rôles variés dans des systèmes vivants Les enzymes sont des variétés particulières de protéines biologiquement actives pouvant catalyser des réactions spécifiques A l'heure actuelle, on utilise la technologie des enzymes dans de nombreux domaines industriels et de larecherche, comme par exemple, la recherche médicale, le traitement et la conservation des aliments, la production de boissons fermentées, la fabrication de produits pharmaceu- tiques et la détermination analytique de la concentration de divers métabolites et composants d'aliments par des techniques analytiques enzymatiques. Les enzymes sont hautement spécifiques en ce qui con- cerne leur activité biologique et en général elles catalysent une réaction particulière à une vitesse qui est très grande par comparaison à la réaction correspondante ayant lieu à la température ordinaire sans catalyse _biolog Xq-t Je nzyme peut faire preuve d'activité catalytique pour un certain nombre de substrats bien définis sur lesquels elle peut agir En con- séquence, une enzyme donnée peut catalyser la synthèse ou la dégradation de plus d'un substrat Certaines protéines qui ne sont pas considérées comme des enzymes classiques, comme par exemple la séro-albumine bovine, font preuve d'une activité catalytique très limitée sur un ou plusieurs substrats. De nombreuses enzymes se trouvent dans la nature en de très petites quantités En conséquence, leur isolement, puri- fication et utilisation sont limités à une opération à petite échelle par suite des frais et du temps nécessaires pour les isoler sous une forme utilisable. Certaines enzymes se trouvent dans la nature en quan- tités relativement importantes et elles sont relativement fa- ciles à isoler, purifier et utiliser Malheureusement, en rai- son du comportement catalytique précis des enzymes, celles qui sont disponibles en grosses quantités ne peuvent catalyser que certaines réactions choisies. Depuis peu de temps, de nombreux efforts ont été con- sacrés à une synthèse des catalyseurs biologiques synthétiques faisant preuve d'un comportement enzymatique similaire à celui des enzymes naturelles qui sont ou bien rares ou bien coûteuses à isoler En outre, certaines tentatives ont été faites pour mo- difier les enzymes naturelles afin de changer leur spécificité enzymatique de façon à ce qu'elles puissent fonctionner pour catalyser une réaction qu'elles ne pouvaient pas catalyser an- térieurement. - Une technique connue pour obtenir un comportement enzyma- tique permettant de catalyser une réaction spécifique désirée consiste en une synthèse de ce qu'on appelle les molécules d'en- zymes-modèles Par exemple, on peut lier par voie covalente des composés de bas poids moléculaire à des groupes fonctionnels qui manifestent l'activité du site actif d'une enzyme Des exemples de telles préparations sont décrites dans les publications sui- vantes: Breslow, R, Advances in Chemistry Series, R F Gould, X Ed, American Chemical Society, Washington, D C 21-43 ( 1971) et Tang, C C; Davalian, D; Haung, P et Breslow, R, J Ameri Chem Soc, 100, 3918 ( 1978). Une autre technique comporte l'emploi d'une matrice de polymère synthétique qui est modifiée suivant sa structure de base pour fournir dès groupes fonctionnels jouant le rôle du site actif d'une enzyme donnée On trouve des exemples de telles techniques dans les articles suivants: Wulff, G et Schulza, I., Israel J Chem, 17, 291 ( 1978) et Suh, J et Klotz, I M, Bioorganic 6 165 ( 1977). Une autre technique implique la fixation d'un nouveau fragment chimique à une enzyme naturelle près du site actif de l'enzyme pour tenter de permettre à une telle enzyme de réagir avec une activité catalytique différente Un exemple est la con- version de la papaine, qui est une enzyme protéolytique, en une enzyme du type oxydase par la fixation covalente d'une flavine près du site actif de l'enzyme papaine naturelle, comme décrit dans les articles suivants: Levine, H L et Kaiser, E T, J Amer Chem Soc, 100, 7670 ( 1978), Kaiser, Eo T, ef al, Adv In Chemistry Series, No 191, Biomimetic Chemistry page 35, 1980; et Otsuki, T; Nakagawa, Y et Kaiser, E T, Jo C So Chem. Comm, 11, 457 ( 1978) D'autres exemples d'une telle modifica- s tion enzymatique sont donnés dans l'article de: Wilson, M E. et Whitesides, G M,'J Amer Chem Soc 100, 306 ( 1978). Une autre tentative encore pour changer la spécifité des enzymes est l'immobilisation d'une enzyme naturelle dans une ma- trice de gel Par exemple, on a immobilisé l'enzyme trypsine dans un gel de polyacrylamide Le gel de polyacrylamide permet aux esters de amino- acides de diffuser à travers la matrice de gel pour réagir avec l'enzyme mais il ne permet pas la diffusion à travers lui de protéines plus grosses Ainsi, la spécificité de l'enzyme est changée par l'élimination de l'accès de l'une des molécules du substrat à l'enzyme Des changements de spécifi- cité de ce type sont-décrits, par exemple, 'dans Kirk-Othmer Encyebpedia of Chemical Technology, 3 Ed, 9, 148 ( 1980) publié par Wiley and Son, Inc. On savait également qu'une mono-oxygénase de lysine naturelle pouvait être mise en réaction pour bloquer les groupes sulfhydryle sur l'enzyme Quand on traite ainsi une mono-oxygé- nase de lysine enzymatique spécifique, elle fait preuve d'une nouvelle activité catalytique vers les amino-acides et elle catalyse la désamination par oxydation au lieu de sa décarboxy- lation naturelle par oxygénation Cependant, les spécialistes ne peuvent pas expliquer ce comportement modifié; voir, par exemple, l'article de Yamauchi, T; Yamamoto, S et Hayaishi, O, dans The Journal of Biological Chemistry, 248, 10, 3750-3752 ( 1973). On a également indiqué que si l'on fait réagir une enzyme natu- relle, par exemple la trypsine, avec son inhibiteur naturel et qu'ensuite on réticule l'enzyme, son activité sur ses substrats naturels sera modifiée; voir l'article de Beaven, G Ho et Gratzer, W.B dans Int J Peptide Res', 5, 215-18 ( 1973). En outre, on a synthétisé des protéines synthétiques par l'ancrage d'un résidu amino-acide sur un support solide et ensuite par l'addition de résidus d'amino-acides les uns après les autres. On a également synthétise des protéines semisynthétiques par un procédé selon lequel on soumet une protéine naturelle à une hydrolyse limitée pour produire des fragments de protéine. On soumet ensuite les fragments de la protéine naturelle à un procédé par lequel on ajoute ou on élimine un ou plusieurs ré sidus d'amino-acides aux fragments ou des fragments pour obte- nir ainsi des fragments modifiés Les fragments modifiés ré- sultaats sont ensuite fixés à nouveau pour former la protéine semisynthétique avec une composition altérée de résidus d'amino- acides Comme exemples des technologies concernant les protéines synthétiques et semisynthétiques, qui ont été citées plus haut, on peut mentionner le livre Semisynthetic Proteins par R E. Offord, édité par John Wiley and Sons Ltd,Copyright 1980. Alors que ces techniques conviennent pour de nombreuses applications, il existe un besoin d'avoir un procédé simple, efficace et économique permettant de modifier chimiquement une protéine naturelle peu coûteuse et disponible dans le commerce pour produire une protéine modifiée analogue à une enzyme, qui exerce une activité sur une réaction chimique désirée, laquelle n'était pas jusqu'à présent une réaction d'intérêt industriel catalysée par l'enzyme naturelle, et laquelle réaction nouvelle peut être prédéterminée d'une façon systématique Les prodédés décrits dans les références susmentionnées consistent simplement à soumettre une enzyme à une série de conditions et à tenter d'élucider son comportement Ces procédés ne constituent pas un procédé systématique permettant de modifier la protéine. La présente invention fournit une protéine modifiée possé- dant des caractéristiques analogues à une enzyme en soumettant une protéine d'origine naturelle dite "protéine native" à une dénaturation partielle par exposition a un agent dénaturant, pour déplier partiellement la structure de conformation -de la pro- téine native Ensuite, un inhibiteur de l'enzyme-modèle dont l'activité doit être modelée, est choisi et on l'immobilise sur un support solide On met ensuite en contact la protéine native partiellement dénaturée avec l'inhbiteur immobilisé de l'enzyme- modèle Après cela, on réticule la protéine native partiellement dénaturée en présence de l'inhibiteur pour définir une nouvelle protéine modifiée On enlève ensuite l'inhibiteur immobilisé et tout excès éventuel d'agent de réticulation de la protéine modifiée nouvel- lement formée analogue à une enzyme pour obtenir un analogue fonctionnel à l'enzyme-modèle La protéine modifiée analogue à une enzyme ainsi obtenue possède la caractéristique d'activité de l'enzyme-modèle. En réalisant les objectifs et les avantages de la pré- sente invention, on a maintenant découvert qu'une protéine pouvait être modifiée depuis sa conformation naturelle jusqu'à une con- formation modifiée enzymatiquement active grâce à la mise en oeuvre du procédé de la présente invention. Dans le présent mémoire, le terme "enzyme" est défini comme une protéine possédant une activité catalytique bien connue pour des substrats spécifiques Le terme "protéine" utilisé dans 151 e présent mémoire est défini par son sens généralement accepté dans la technique, à savoir un polypeptide formé d'amino-acides pour donner une molécule biologique. La présente invention comprend un procédé de modifica- tion d'une protéine native d'une première conformation à une seconde conformation Le procédé de modification donne uxne pro- téine modifiée analogue à une enzyme qui reproduit une ou plu- sieurs caractéristiques de la protéine enzymatique-modèle choisie. Dans la réalisation préférée, on convertit une protéine native non enzymatique par le procédé de l'invention en une protéine modifiée analogue,à une enzyme possédant les caractéristiques d'activité de l'enzyme-modèle. Le mode de mise en oeuvre préféré de l'invention comprend un procédé pour modifier une protéine native d'une première con-_ formation à une seconde conformation et pour produire ainsi une protéine nouvelle modifiée à activité enzymatique à partir de la protéine native choisie En variante, on peut augmenter l'activité enzymatique marginale présente dans l'enzyme natuelle jusqu'à un niveau industriellement utile par la mise en oeuvre du procédé de la présente invention. Le procédé de la présente invention comprend la prépara- tion et l'utilisation d'un agent inhibiteur immobilisé et d'une protéine partiellement dénaturée pour préparer une protéine modi- fiée qui fait preuve-de caractéristiques de catalyse analogues à celles d'une enzyme Dans la variante préférée, on choisit une enzyme qu'on veut reproduire Ensuite, on identifie un inhibiteur pour cette enzyme prédéterminée L'inhbiteur de l'enzyme à reproduire est immobilisé sur un support solide ' -S On choisit une protéine native qui doit être convertie en une protéine modifiée analogue à une enzyme On purifie et on dénature partiellement la protéine native Après la dénaturation partielle de l'enzyme naturelle, on la met en contact avec l'inhibiteur immobilisé On prévoit un temps et une température suffisante pour qu'une certaine quantité de la protéine native partiellement dénaturée soit liée à l'inhibi- teur immobilisé On enlève ensuite par lavage l'excès de la protéine native partiellement dénaturée et non liée à partir du support solide qui contient l'inhibiteur. La protéine native partiellement dénaturée qui reste liée à l'inhibiteur immobilisé est réticulée Ensuite on élimine par lavage de l'inhibiteur immobilisé l'excès de l'agent de réti- culation On enlève sélectivement par lavagç de l'inhibiteur immobilisé la protéine liée à l'inhibiteur et réticulée pour obtenir ainsi une protéine modifiée analogue à une enzyme fai- sant preuve des caractéristiques catalytiques de l'enzyme- modèle dont l'inhibiteur a été utilisé dans le procédé. Dans le présent mémoire, l'expression "inhibiteur immo- bilisé" désigne un inhibiteur fortement fixé à un support solide, de préférence insoluble dans l'eau, de façon que l'inhibiteur soit sensiblement insoluble dans l'eau pendant tous les stades du présent procédé. Dans le mode de mise en oeuvre préféré, l'inhibiteur est lié sur le mode covalent à un support insoluble dans l'eau Ce support peut être organique ou minéral Un tel support organique insoluble dans l'eau est un polysaccharide de poids moléculaire élevé, réticulé et transformé en perles dont la réticulation a été effectuée avec l'épichlorhydrine Une telle matière est disponible dans le commerce sous la marque déposée r I Sephadext I vendue par Pharmacia Fine Chemicals. Un autre support organique solide préféré qui est égale- ment insoluble dans-l'eau est un polysaccharide à base d'agarose, à chaîne droite, réticulée et contenant des restes alternés de D-galactose et de 3,6-anhydrq-L-galactose Une telle matière est disponible dans le commerce sous la marque déposée "Sepharose" vendue par Pharmacia Fine Chemicals. Un autre support solide préféré qui est organique et insoluble dans l'eau est un réseau tridimensionnel de polyacry- lamide comportant un gel interstitiel d'agarose Une telle matière est disponible dans le commerce sous la marque déposée "Ultrogel" vendue par LKB produkter, AB de Stockholm, Suède. Les supports minéraux insolubles dans l'eau, préférés, comprennent des oxydes céramiques réfractaires Les oxydes cé- ramiques appropriés comprennent des oxydes poreux d'une matière céramique particulaire qu'on peut former en agglomérant et en frittant des poudres d'oxydes céramiques réfractairesjtelles que la poudre d'alumine la poudre de zircone, la poudre de magnésie, la poudre de silice et la poudre de thorine La pré- paration et l'utilisation de tels supports en oxydes céramiques sont décrites dans le brevet US 4 001 085 o- Dans le présent mémoire, l'expression"dénaturation partielle" désigne un changement de la conformation d'une pro- téine de façon à perturber la forme ou conformation de la pro- téine sans provoquer de dénaturation importante irréversible de la protéine Le terme "conformation" est utilisé dans son sens courant comme étant la combinaison de la structure secon- daire et de la structure tertiaire d-une protéine La dénatura- tion partielle-des protéines est bien connue et décrite en détail dans les textes de référence ci-après:le livre Biochemistry, par A L Lehninger, Editeurs Worth Editeurs, Inc, N Y, 1970,'pg 58; l'article par P L Privalov inti- tulé "Stability of Proteins" dans Advances in Protein Chemistry, Vol 33, pg 167-192; l'article par C Sanford intitulé "Protein Denaturation, PART C" dans Advances in Protein Chemis- try, Vol 24, pg 2-97; l'article par F R N Gurd, et al. intitulé "Motions in Proteins": dans Advances in Protein Ghemistr X, Vol 33, pg 74-166; l'article par 0 Jardetzky dans BRA, Vol 621, pg 227-232; l'article par R Huber dans TIBS, Dec 1979, pg 271, et l'article par D S Markovich, et al. dans Molekulyarnaya Biologiya, Vol 8, No 6 pg 857-863. Dans le présent mémoire, l'expression "agent dénaturant" désigne les conditions du procédé ou les réactifs qui provo- quent la dénaturation partielle d'une protéine Par exemple, on peut réaliser la dénaturation partielle d'une protéine en trempant la protéine dans une solution aqueuse à des tempéra- tures élevées, par exemple de 25 à 60 C Pour la plupart des protéines, la température de 25 à 60 C pertubera ainsi la struc- ture de la protéine pour ainsi provoquer une dénaturation par- tielle de celle-ci Cependant, comme le savent bien les spécia- listes, certaines protéines provenant de sources bactériennes thermophiles sont stables jusqu'au voisinage du point d'ébul- lition de l'eau et elles nécessiteraient des températures plus élevées que celles généralement indiquées plus haut On peut aussi réaliser la dénaturation partielle d' une protéine en trempant la protéine dans une solution aqueuse contenant un sel minéral, un acide minéral ou organique ou un solvant organi- que miscible avec l'eau. Parmi les sels minéraux servant à déstabiliser;la struc- ture des protéines, on peut citer NF, (NH 4)2504, (CH 3)4 N Cl, (CH 3)4 N Br, KCH 3 COO, NH 4 Cl, Rb Cl, K Cl, Na Cl, Cs CI, Li Cl, K Br, N Ia Br, :KN 03, Mg C 12, Na N 03, Ca C 12, KSCN, Na SCN, Ba C 12, Na I et Lii. Parmi les acides minéraux appropriés, on-p eut citer les acides chlorhydrique, nitrique, sulfurique et ph Qosphorique ainsi que les acides minéraux forts d'un type similaire donnant des protons Parmi les acides organiques appropriés, on peut citer, les acides acétiques formique, propionique et citrique. Parmi les solvants miscibles avec l'eau qu'on pense ca- pables de solubiliser les groupes hydrophobes sur la protéine et ainsi de déstabiliser sa structure, on citera le t-butanol, l'acétonitrile, le dioxanne, l'acétone, le méthanol, l'éthanol et le diméthylsulfoxyde. Dans le présent mémoire, le terme "inhibiteur" désigne un composé quelconque ayant une similitude structurale suffi- sante avec le substrat naturel pour pouvoir servir de modèle pour le site actif d'une protéine modifiée analogue à une enzyme. Dans le mode de mise en oeuvre préféré de la préparation d'une protéine modifiée analogue à une enzyme, l'inhibiteur est l'un quelconque des inhibiteurs classiques connus pour une enzyme-modèle donnée Cependant, dans le présent contexte, le terme "inhibiteur" peut englober une molécule quelconque ayant une similitude structurale suffisante avec l'inhibiteur clas- sique pour préserver un site analogue à l'inhibiteur sur la protéine modifiée Le substrat naturel de l'enzyme-modèle peut agir comme inhibiteur ou modèle pour la p-protéine modifiée dans de nombreux cas Un exemple d'une telle similitude struc- turale entre un inhibiteur d'enzyme et le substrat naturel de l'enzyme est celui de la glucose-oxydase Le glucose est le substrat naturel de la glucose-oxydase alors que le D-glucal est l'inhbiteur pour la glucose oxydase Le glucose et le D- glucal-sont très similaires sur le plan structural. Comme utilisé dans le présent mémoire, le terme "réti- culation" désigne la formation de liaisons covalentes entre les sites réactifs d'une protéine Pour la réticulation, on effectue habituellement le procédé en utilisant des réactifs multifonctionnelstels que le glutaraldéhyde D'autres exemples de réactifs de réticulation'appropriés pour effectuer la réti- culation d'une protéine sont: la 2-amino-4,6-dichloro-5- triazine; les sels de diazonium; le N-hydroxy-succinamide; le p-benzoylazide et les réactifs décrits -dans les textes de ré- férence suivants: Wold, F, Methods Enzymol, 11; Hirs, C H Wo éditeur, Academic Press, 1967, 617; Fasold, H et al, Augen. Chem Int Ed Engl, 10, 795, 197, et Keyes, M H, Kirk- Othmer: Encyclopedia of Chemical Technology, 9, 3 d ed, 1980, J Wiley and Sons, Inc, 148-172. Comme exemples d'enzymes susceptibles d'être par le présent procédé pour produire leurs analogues protéiques modi-. fiés analogues à des enzymes à partir d'une protéine native choisie, on peut-,citer les enzymes hydrolytiques, les enzymes redox et les enzymes transférases A titre d'exemple: le premier groupe, c'est-à-dire les enzymes hydrolytiques, com- prend les enzymes protéolytiques qui hydrolysent les protéines, par exemple _i les papaine, ficine, pepsine, trypsine, chymo- trypsine, broméline, kératinase, les carbohydrases qui hydro- lysent les hydrates de carbone, par exemple cellulase, amylase, maltase, pectinase, chitanase; les estérases qui hydrolysent des esters, par exemple le lipase, cholinestéarase, lécithi- nase, phosphoatases alcalines et acides; les nucléases qui hydrolysent l'acide nucléique par exemple ribonucléase, désoxy- ribonucléase, et les amidases qui hydrolysent les amines, par exemple arginase, asparaginase, glutaminase, histidase et uréase Le second groupe est constitué par es enzymes redox qui catalysent les réactions d'oxydation ou de réduction On citera dans ce domaine la glucose-oxydase, xanthine-oxydase, catalase, peroxydase, lipoxydase et cytochromeréductase Le troisième groupe est constitué par les enzymes transférases qui transfèrent des groupes d'une molécule à une autre Comme exemples on peut mentionner la transaminase glutamique-pyruvi- que, la transminase glutamique-oxalacétique, la transméthylase et la transphosphorylase phosphopyruvique. Dais la pratique usuelle, on commence par choisir une protéine enzymatique modèle devant être modelée On choisit ensuite une protéine native ou seconde protéine devant être modelée selon la protéine enzymatique-modèle pour obtenir une protéine modifiée analogue à l'enzyme Dans de nombreux cas, la protéine native est elle-même une protéine enzymatique, étant donné que de nombreuses enzymes courantes sont disponibles en grosses quantités et à des prix relativement bas dans des échantillons homogènes Cependant, les protéines non-enzymati- ques sont pareillement utiles quand on peut les purifier pour être utilisées dans le procédé Une telle protéine est la séro- albumine bovine. Par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, on peut façonner sur mesure la protéine native en une protéine modifiée différente qui fait preuve de caractéristiquesd'aativité enzymatique de l'enzyme-modèle La capacité de façonner ainsi une protéine pour obtenir une activité catalytique prédétermi- née procure de grands avantages dans un éventail étendu d'ap- plications chimiques et industrielles Par exemple, si l'enzyme qu'on désire utiliser est peu abondante, est très coûteuse ou très difficile à purifier, on peut la préparer par le procédé de la présente invention. Ainsi une protéine native qui est-disponible en abon- 1 1 dance et/ou à un bas prix peut être reformée ou modifiée par le procédé selon l'invention pour convertir la protéine dis- ponible en une protéine modifiée analogue à l'enzyme et cata- lytiquement active en partant d'une protéine enzymatique moins disponible et/ou plus coûteuseo Dans le mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, une colonne à écoulement continu est employée pour mettre en oeuvre le procédé en raison du réglage précis qu'on peut appliquer aux vitesses d'écoulement continu On tasse à l'état humide l'inhibiteur immobilisé sur-5-on support dans la colonne de,façon à ce que les agents chimiques utilisés par la suite puissent être mis en contact avec le support et la protéine native liée au support par un simple pompage avec un débit réglé, de diverses solutions aqueuses à travers la colon- ne. De nombreux inhibiteurs immobilisés insolu- bles dans l'eau sont disponibles dans le;commerce o ils ont été immobilisés sur des supports de polysaccharides, des sup- ports minéraux ou des supports en polymères synthétiques, comme décrit plus hauts On peut également lier l'inhibiteur à une protéine hydro- soluble analogue à un support, tel que la séroalbumine Dans un tel cas, l'inhibiteur est immobilisé sur la protéine mais demeure sous une forme hydrosoluble On peut emprisonner ces inhibiteurs immobilisés solubles dans une colonne à écoulement continu, comme il a été précédemment décrit, en plaçant des membranes d'ultrafiltration aux deux bouts de lacolonneafin de maintenir en place l'ensemble support-inibiteur soluble On on pompe la protéine native à travers la membrane et/ la met en contact avec l'inhibiteur soluble immobilisé, emprisonné par la membrane. Dans certains cas o la protéine native à modifier con- tient des nombres importants de ponts disulfures, par exemple la zéroalbumine bovine ou l'uréase, on peut effectuer la dénaturation partielle en rompant les liaisons disulfures dans la protéine, en soumettant pour cela la protéine à l'action du mercapto-éthanol ou d'un autre réactif réducteur sulfhydry- lique capable de cliver les liaisons disulfures. Quand la protéine native a été partiellement dénaturée, on fait couler une solution de la protéine partiellement déna- turée lentement à travers la colonne, habituellement à une vi- tesse d'environ 1 ml/min quand la concentration de la protéine native est d'environ 1 % en poids et que la colonoe présente environ 7,5 cm de longueur et environ 1,5 cm de diamètre inté- rieur On injecte habituellement dans la colonne une quantité aliquote d'environ 2 ml de la solution à environ 1 % Alors que la protéine native partiellement dénaturée s'écoule à travers la colonne de l'inhbiteur immobilisé, on pense, sans vouloir se limiteraune théorie mécanique quelconque, que la protéine se lie à l'inhibiteur en permettant à une portion de la protéine d'épouser par moulage la forme de leinhibiteur Ainsi l'inhbi- teur agit comme un modèle pour la formation d'une nouvelle géométrie sur la protéine partiellement dénaturée, ce qui était impossible jusqu'à présent Sans vouloir lier l'invention à une théorie quelconque, on pense que les résultats avantageux de la présente invention sont obtenus parce que la dénaturation par- tielle de la protéine native a pour effet un relâchement de la structure de la protéine La structure relâchée de la protéine permet à l'inhibiteur de se lier à la protéine et de définir une structure moléculaire nouvelle sur la protéine native par- tiellement dénaturée, complémentaire à la forme de l'inhibiteur. Après le contact ou la liaison de la protéine native partiellement dénaturée à l'inhibiteur immobilisé, pour créer une nouvelle structure à la surface de la protéine, complémen- taire à la forme de l'inhibiteur, on doit stabiliser la pro- téine native partiellement dénaturée pour préserver le nouveau site On stabilise la nouvelle forme de la protéine par réticu- lation Fréquemment, on effectue la réticulation avec l'agent de réticulation glutaraldéhyde car ce composé est relativement bon marché Cependant on peut utiliser efficacement l'un quel- conque des agents de réticulation cités plus haut. Dans le mode de mise en oeuvre préféré, on effectue la réticulation en faisant couler une solution de l'agent de réti- culation à travers la colonne portant la protéine liée à l'inhi- biteur sur un mode de recirculation Habituellement on rac- corde une pompe à petite vitesse et à petit volume à un réser- voir d'o cette pompe aspire la solution de l'agent de réticu- lation On pompe la solution par la boucle englobant la colon- ne et le réservoir pendant environ 1 heure et demie Normale- ment on ajoute à la solution en circulation environ 20 microli- tres de glutaraldéhyde à 8 % en poids, une fois que la colonne est entièrement garnie et qu'elle présente environ 8 cm de longueur et environ 2 cm de diamètre. Quand on fait circuler de nouveau la solution de l'agent de réticulation à travers la colonne pendant la durée désirée, * on charge dans la colonne un éluant qui désorbera l'enzyme pro- téique modifiée, stabilisée, nouvellement formée et analogue à une enzyme à partir du support solide Dans ce but on a utilisé une solution acide de glycine. On contrôle par spectrophotométrie l'efflbuent de la colonne dans le domaine des U V pour détecter l'élution de la protéine modifiée On détermine la quantité de protéine modi- fiée recueillie par analyse spectrale pour bien établir le rendement On détermine l'activité enzymatique de la protéine modifiée, nouvelle produite, analogue à une enzymeopar un quelconque procédé cinétique classique des enzymes. Dans une variante de réalisation du présent procédé, on peut mélanger la protéine native avec l'inhibiteur immobilisé avant la dénaturation partielle Ultérieurement, on ajoute l'agent dénaturé au mélange de protéine native et d'inhibiteur. Ce mode de mise en oeuvre de l'invention rend l'inhibiteur dis- ponible immédiatement lors de la dénaturation partielle de la protéine native On réticule ensuite la protéine partiellement dénaturée, liée à l'inhibiteur. Le procédé selon-la réalisation préférée de la présente invention permet de préparer une nouvelle protéine modifiée enzymatiquement active et offre un certain nombre d'avantages. Grâce à la découverte qu'un inhibiteur immobilisé peut être utilisé, on peut maintenant employer des quantités minimales d'inhibiteur qui sont essentiellement recyclables, puisque l'inhibiteur n'est pas rejeté, pour purifier la protéine modi- fiée analogue à une enzyme On préfère employer des éluants plutôt économiques pour séparer par lavage le produit final de l'inhibiteur immobilisé, ce qui permet de préserver l'inhibi- teur Coûteux. Lorsqu'on utilise l'inhibiteur immobilisé dans un cir- cuit/écoulement, il est également facile de déterminer si la protéine native partiellement dénaturée se lie à l'inhibiteur. Si la protéine native particulière ne se lie pas à l'inhibiteur, cette protéine native s'écoule à travers la co- lonne et peut être facilement détectée à la sortie de la colon- ne Si l'inhibiteur était solubilisé dans une solution aqueuse, -il aurait fallu une étude complète pour déterminer si la pro- téine partiellement dénaturée s'était réellement liée à l'inhi- biteur Cela pourrait conduire à des pertes de réactifs et de la protéine native purifiée de départ. D'autre part, en immobilisant l'inhibiteur, on peut intro- duire une quantité réglée d'inhibiteur sur le support insoluble dans l'eau En choisissant la fraction de charge, par exemple, une charge légère de l'inhibiteur sur le support, on peut régler le degré de formation des oligomères dans la protéine modifiée finale Quand le support est parcimonieusement revê- tu d'inhibiteur immobilisé, la probabilité de formation d'un dimère, d'un trimère ou d'un oligomère, par suite des molécules de protéine native disposées les unes à côté des autres avec réticulation intermoléculaire, est réduite En général, la formation des oligomères est indésirable car des agrégats pro- téiques de ce genre font fréquemment preuve d'une&faible solu- bilité dans l'eau et ils ne sont pas faciles,à purifier et à manipuler. D'autre part, quand on utilise l'inhibiteur immobilisé dans un système à écoulement continu, il est inutile d'employer des techniques complexes de séparation pour séparer l'agent de réticulation de la protéine native de départ et pour séparer la protéine modifiée finale de l'inhibiteur La facilité de manipulation des matières permet également de réduire la durée totale du procédé Ceci est avantageux du fait que de nombreuses protéines et enzymes, qu'on pourrait choisir comme matière naturelle de départ, sont sensibles à la température et à l'oxygène Si l'on utilisait des techniques classiques de-sé- paration pour séparer diverses matières les unes des autres, le procédé serait prolongé-et les rendements diminués par suite de la dégradation par oxydation et de la dégradation thermique. Pour lutter contre de tels problèmes; il aurait fallu des techniques à basses températures et sous atmosphère inerte, avec des frais supplémentaires, pour conserver les rendements. Pour faciliter la description, tous les brevets et autres publications dont il a été question plus haut sont incorporés à titre de référence dans la présente demande. D'autres réalisa-tion Gde la présente invention ressorti- ront de la description dé-taillée qui va suivre La présente invention est illustrée par les exemples descriptifs et non limitatifs ci-après. EXEMPLE 1 PARTIE A Préparation d'une colonne d'inhibiteur immobilisée d'en- zyme-modèle On utilise dans ce procédé une colonne de chromatographie de parois en verre ayant environ 7,5 cm de longueur et environ 1,5 cm de diamètre intérieur On emmagasine un inhbiteur immo- bilisé, le gel de L-tryptophanagarose, 'vendu par Sigma Company, n T0137, lot 80 F-9610, dans une solution 0,5 M de-Na Cl à une température d'environ O C jusqu'à utilisation. Pour préparer la colonne en vue de l'acceptation de la protéine native, on garnit la colonne avec l'inhibiteur immobi- lisé jusqu'à une hauteur d'environ 3,8 cm,Après garnissage de la colonne, on purge cette colonne des agents de contamination éventuels comme suit on fait passer rapidement à travers la colonne une quantité aliquote de 200 ml d'eau distillée à rai- son de 1 ml par minute Ensuite,' on fait passer 500 ml d'un tampon de carbonate 0,1 M contenant Na Cl 0,5 M à p H 10, à tra- vers la colonne avec un débit de 1 ml/minute Ensuite, on fait passer 500 ml d'un tampon d'acétate de sodium 0,1 M, à p H 4,0-, contenant Na Cl 0,5 M à travers la colonne avec un débit de lml par minute Un lavage final avec 500 ml d'une solution d'urée 2,0 M permet d'achever la purification de la colonne. PARTIE B Dénaturation partielle de la protéine et liaison à l'inhibiteur. On prépare une solution fraîche à 1 % de séro-albumine- bovine (SAB) en dissolvant 0,2 g de séro-albumine bovine essen- tiellement exempte d'acides gras, provenant de Sigma Company, n A 7511, lot 90 F-9315, dans 20 m l-d'eau distillée On déter- mine l'absorbance de la SAB fraîche selon les enseignements de D M Kirschenbaum dans Int J Peptide Res, 5, 1973, pages 49-62 On mesure l'absorbance à 280 nm et on trouve 6,43 En utilisant le coefficient d'absorption de 6,62 pour une solu- tion à 1 %, la concentration de la solution est d'environ 9,7 mg par ml. On remplit la colonne de la PARTIE A avec un courant en mouvement d'un tampon d'acétate 0,01 M à p H 4,4 s'écoulant à raison de 1 ml/min, qui agit en tant que solution d'agent dé- naturant On injecte 2 ml de la solution à 1 % de SAB à la tête de la colonne Par une injection ainsi effectuée, la SAB est amenée à un p H plus faible et avec ce p H faible, elle est appliquée à la colonne à l'état partiellement dénaturé. On contrôle l'éluant de la colonne à 254 nm Quand la portion de SAB qui n'est pas liée à l'inhibiteur immobilisé est élu 7 ée de la colonne, on la recueille et on détermine par l'absorbance à 280 nm qu'elle contient environ 16 mg En con- séquence, environ 3,4 mg de SAB sont liés à l'inhibiteur lors d'une seule exposition à la colonne. PARTIE C Réticulation On raccorde la sortie de la colonne de la PARTIE B à une pompe de recirculation On raccorde le refoulement de la pompe à la tête de la colonne et on établit ainsi une boucle fermée d'écoulement avec recirculation Ensuite, on ajoute 20 micro- litres de glutaraldéhyde à 8 % provenant de Polysciences, Inc, Cat n 216, lots 4-1462, à 25 ml du tampon d'acétate de p H 4,4. On injecte la solution de glutaraldéhyde sur la colonne et on fait circuler cette solution en circuit fermé pendant 90 minu- tes environ. PARTIE D Collecte de la protéine modifiée On débranche le circuit fermé de la PARTIE C et on pompe à travers la colonne qui contient à ce stade l'inhibiteur lié et la protéine analogue à une enzyme modifiée et stabilisée, un tampon H Cl glycine 0,02 M et à p H 3,0, avec un débit de 1 ml/mino Après 15 minutes environ, la protéine modifiée commence à être éluée de la colonne On recueille environ 24 ml d'éluant avant que la protéine modifiée ne cesse de s'éluer de la colonne On élève de 3 à environ 6,9 le p H de la protéine modifiée recueil- lie pour stabiliser la structure de la protéine, en ajoutant 1 ml d'un tampon tris 0,1 M à p H 7,5 à 9 ml de l'éluaÉt On recueille au total environ 0,3 mg de protéine modifiée. PARTIE E Résultats On enregistre l'activité suivante concernant le substrat pour une enzyme estérase à partir d'un échantillon d'une pro- téine modifiée analogue à l'estérase préparée selon l'invention. On analyse une portion de la solution de l'éluant de la protéine modifiée pour l'activité enzymatique d'estérase par chromatographie en phase liquide sous haute pression comme suit: on prépare de la suivante l'échantillon de titrage: on mélange 16 mi d'un tampon tris 0,1 M de p H 7,7 et 2 ml d'ester éthylique de la N-o-benzoyl-L-arginine à'0,1 M (EEBA) en quali- té de substrat avec 2 ml de protéine modifiée. On prépare la solution-témoin en ajoutant 16 ml de ce tampon tris 0,1 M de p H 7,7 à 2 ml de EEBA 0,1 et 2 ml de H Cl- glycine 0,02 M qui est l'éluant de colonne qu'on règle à p H 6,9 à l'aide-du tampon tris de p H 7,5. Les conditions de la colonne de chromatographie en phase liquide sous haute pression pour le titrage sont les suivantes la colonne est garnie avec un support de glycophase CM fourni par Pierce Chemical Co Produit n 23512, qui est une couche d'hydrate de carbone non ionique et hydrophile renfermant des chaînes latérales carboxyle méthyle liées sur le mode covalent au verre dont les grosseurs de pores sont réglées La granulo- métrie est d'environ 125 à 177 microns et la grosseur des o pores est d'environ 200 A L'éluant de la colonne est un tampon tris 0,005 M de p H 8,1 contenant Na Cl 0,05 M Le débit est de 1,75 mi/min pour une colonne de 27 x 0,3 cm On injecte 20 microlitres de l'échantillon et on enregistre la hauteur du pic pour la benzoyl-L-arginine à 254 nm On injecte ensuite le témoin Après avoir recueilli le produit en au moins quatre points aussi bien pour l'échantillon que pour le témoin, on calcule l'activité à partir d'un graphique donnant la concen- tration de benzoyl-L-arginine en fonction du temps Les résul- tats du titrage sont les suivants: Substrat EEBA (U/g) Activité initiale 0,00 Activité finale 0,18 Ces résultats montrent que la protéine modifiée analogue à l'estérase de la PARTIE D fait preuve d'activité vis-à-vis du substrat d'estérase EEBA o aucune activité n'a été précédemment détectée dans la protéine native SAB Cela démontre la conver- sion d'une espèce de protéine non enzymatique (une albumine) en une autre espèce de protéine (protéine analogue à l'estérase qui est enzymatiquement active). Pour faire ressortir que la protéine native SAB ne fait preuve d'aucune activité catalytique détectable pour le substrat EEBA, on effectue l'essai décrit dans l'exemple 3 Le résultat montre que la SAB ne présente aucune activité catalytique décelable pour le substrat d'estérase EEBA. EXEMPLE 2 PARTIE A Préparation d'une colonne d'inhibiteur immobilisé d'enzyme-modèle On utilise dans ce procédé une colonne de chromatographie à parois en verre d'environ 7,5 cm de longueur et 1,5 cm de diamètre intérieur On emmagasine un inhibiteur immobilisé, le gel de L-arginine-agarose, vendu par Sigma Company, n A-1018, Lot 20 F-9740, dans une solution de Na Cl 2, 0 M à environ O C jusqu'à utilisation. 25332 i 7 Pour préparer la colonne pouvant accepter la protéine native, on garnit cette colonne à une hauteur d'environ 4 cm avec l'inhibiteur immobilisé Après-garnissage de la colonne, on la purge comme suit des agents possibles de contamination: on fait passer une quantité aliquote de 200 ml d'eau distil- lée à travers la colonne avec un débit de 1 ml/min Ensuite on fait passer 500 ml d'un tampon de carbonate 0,1 M contenant Na Cl 0,5 M, à p H 10 à travers la colonne avec un débit de 1 ml/min Ensuite, on fait passer 500 ml d'un tampon d'acétate de sodium 0,1 M, à p H 4, contenant Na Cl 0,5 M à raison-de 1 ml par minute Un lavage final avec 500 ml d'une solution d'urée 2 M termine le traitement PARTIE B Dénaturation partielle de la protéine et liaison à l'inhibiteur On prépare une solution fraîche de 1 % de SAB en dissolvant 0,1 g de séro- albumine bovine (fraction V) exempte d'acides gras, provenant de Sigma Company n A-6003,lot 110 F-9305, dans ml d'eau distillée désionisée On détermine l'absorbance de la solution de SAB selon les enseignements de Do M Kirschenbaum dans Int J Peptide Res, 5, 1973, pages 49-62 On mesure l'absorbance à 280 nm et on trouve 6,83 En utilisant le coef- ficient d'absorption de 6,62 pour une solution 1 %, la con- centration de la-solution est d'environ 10,3 mg/ml. Avant l'addition de la SAB à la colonne, on ajoute 0,2 ml de 2mercaptoéthanol Q 01 M dans l'eau distillée désionisée à ml de la solution à 1 % de SAB On laisse la dénaturation- partielle se poursuivre pendant 1 heure environ à la tempéra- ture ordinaire. On pompe un tampon tris 0,001 M à p H 7 à travers la colonne à raison de 1,5 ml/min On injecte 3 ml de la solution de SAB dans la colonne avec un débit de 1,5 ml/min On appli- que ainsi à la colonne un total d'environ 30,9 mg de SAB. PARTIE C Réticulation et collecte de la protéine modifiée - On prépare une solution pour réticulation en dissolvant environ 0,14 g de dichlorhydrate de diméthyl-subérimidate, qui est un agent de réticulation, dans 25 ml de tampon tris 0,001 M de p H 7,0 On raccorde la sortie de la colonne de la PARTIE B à une pompe de recirculation On raccorde le refoulement de la pompe à la tête de la colono pour obtenir ainsi une boucle fermée d'écoulement de recirculation On fait ensuite circuler l'agent de réticulation en circuit fermé à travers la colonne pendant 3 heures avec un débit de 1 ml/ min. On trouve que la solution de l'agent de réticulation en circulation contient environ 15 mg de la protéine modifiée initialement liée à la colonne, ce qui laisse 15 mg encore liés. On débranche le circuit fermé et on remplace l'éluant par un tampon H Clglycine 0,02 M de p H 2,5 pour recueillir le reste de la protéine modifiée liée à la colonne. Apres pompage du tampon H Cl-glycine 0,02 M de p H 2,5, avec un débit de 1,5 ml/min pendant 15 minutes environ, la protéine modifiée commence à être éluée de la colonne On recueille environ 20 ml d'éluant avant l'arrêt de l'élution de la protéine modifiée. L'absorbance à 280 nm est déterminé comme dans la PARTIE B comme étant de 0,432 et on recueille ainsi environ 13 mg de pro- téine modifiée. PARTIE D Résultats On enregistre l'activité suivante concernant le substrat de l'enzyme estérase à partir d'un échantillon de protéine mo- difiée analogue à l'estérase qui a été préparée selon l'inven- tion et recueillie dans la PARTIE Cctdessus. On analyse une portion de la solution d'éluant de la protéine modifiée pour l'activité enzymatique d'estérase par la chromatographie en phase liquide sous haute pression. Les conditions de la colonne de chromatographie en phase liquide sous haute pression pour le titrage sont les suivantes: on garnit la colonne avec un support de glycophase CM fourni par Pierce Chemical Company, qui est une couche d'hydrate de carbone non ionique et hydrophile, renfermant des chaînes la- térales carboxyle méthyle en liaison covalente avec le verre à grosseur de pores réglée La granulométrie est d'environ 125 o à 177 microns et la grosseur des pores est d'environ 200 A - L'éluant de la colonne est un tampon-tris 0,005 M de p H 8,0, renfermant Na Cl 0,01 M Le débit est de 8,5 ml/min. On prépare l'échantillon de titrage comme suit: on mélange 14 ml de tampon tris 0,01 M de p H 7,7 avec 2 ml d'ester éthyli- que de la N "benzoyl-L-arginine (EEBA) 0,1 M à titre de substrat avec 4 ml de protéine modifiée recueillie dans la colonne de la PARTIE C ci-dessus On prépare une solution- témoin en ajoutant 14 ml de tampon tris 0,01 M, de p H 7,7, à 2 ml de BEBA ( 0,1 M) et 4 ml de tampon H Cl-glycine 0,02 M de p H 2,5 Après mélange, on trouve que le p H de l'échantillon de titrage et de la solution-témoin est de 7,5. On injecte 20 microlitres de l'échantillon dans la colon- ne de chromatographie en phase liquide sous haute pression ci- dessus On effectue l'élution comme décrit plus haut et on enregistre la hauteur du pic de la benzoyl-L-arginine détec- tée à 254 nm Ensuite, on injecte le témoin et on enregistre la hauteur du pic de la benzoyl-L-arginine Après avoir recueilli des résultats en au moins cinq points aussi bien pour l'échantillon que pour le témoin, on calcule l'activité à partir d'un graphique donnant la concentration de benzoyl-L- arginine en fonction du temps en utilisant l'analyse par ré- gression linéaire' Pour déterminer l'activité initiale, on titre une SAB naturelle fournie par Sigma Chemical Company, A-6003, lot n 110 F-9305, par rapport au substrat de EEBA pour déterminer l'activité enzymatique potentielle On prépare la solution de SAB native en dissolvant 0,013 g de SAB dans 20 ml de tampon H Cl-glycine 0,02 M de p H 2,5 La solution de SAB présente-une absorbance à 280 nm de 0,453 En utilisant le coefficient d'absorption de 6,62 pour une solution à 1 % on calcule la concentration comme étant de 0,68 mg/ml On prépare la solu- tion de titrage de SAB naturelle comme suit: on mélange 14 ml de tampon tris 0,01 Mde p H 7,7, 2 ml de EEBA 0,1 M et 4 ml de solution de SAB naturelle Pour préparer la solution-témoin, on mélange 14 ml de tampontris 0,01 M de p H 7,7 avec 2 ml de BEBA 0,1 et 4 ml de tampon H Clglycine 0,02 M de p H 2,5 Après mélange, on trouve que le p H de la solution de titrage de la SAB naturelle et de la solution-témoin est de 7, 5 On injecte microlitres de la solution de titrage de SAB native et on enregistre la hauteur du pic pour la benzoyl-L-arginine qu'on détecte à 254 nm On injecte ensuite la solution-témoin. Après avoir recueilli en au moins cinq points aussi bien dans le cas de la solution de titrage de SAB naturelle que pour le témoin, on calcule l'activité à partir d'un graphique donnant la concentration de la benzoylL-arginine en fonction du temps en utilisant l'analyse par régression linéaire Les résultats du titrage montrent que la pente de la solution de titrage de SAB naturelle est de 2,48 0,11 x 10 7 mole/minute, et que la pente de la solution-témoin est 2,59 0,04 x 10-7 mole/minute, ce qui indique l'abence d'une activité détectable d'estérase naturelle vis-à-vis du substrat de EEBA dans la SAB native. L'activité calculée à partir du titrage pour la protéine modifiée analogue à l'estérase est la suivante: Substrat EEBA (U/g) Activité initiale 0,00 Activité finale 0,813 0,146 Ces résultats montrent que la protéine modifiée analogue à l'estérase de la PARTIE C fait preuve d'une activité vis-à- vis du substrat d'estérase EEBA dans un cas o aucune activité n'a été précédemment détectée avec la protéine SAB naturelle. On démontre ainsi la conversion d'un type de protéine non enzy- matique (albumine) en un autre type de protéine, en l'occurren- ce une protéine analogue à l'estérase possédant une activité enzymatique. EXEMPLE 3 PARTIE A Préparation d'une colonne d'inhibiteur immobilisé d'enzyme-modèle. On utilise dans ce procédé une colonne de chromatographie parois en verre ayant environ 7,5 cm de longueur et 1,5 cm de diamètre intérieur On utilise un inhibiteur immobilisé, le gel de L-tryptophane-agarose, vendu par Sigma Company, n T-0137, Lot 80-F-9610 qu'on emmagasine dans une solution de Na Cl 0,5 M à environ O C jusqu'à emploi. Pour préparer la colonne en vue de l'acceptation de la protéine native, on garnit cette colonne avec l'inhbiteur immobilisé à une hauteur d'environ 3,8-cm Après garnissage de la colonne, on purge des agents possibles de contamination comme suit: on fait passer à travers la colonne une quantité aliquote de 200 ml d'eau distillée avec un débit de'l ml/min, puis 500 ml d'un tampon de carbonate 0,1 M contenant Na Cl 0, 5 M, de p H 10,avec un débit de 1 ml/min, puis 500 ml d'un tampon d'acétate de sodium 0,1 M de p H 4 contenant Na CI 0,5 M avec un débit de 1 ml/min, et finalement 'on lave la colonne avec 500 ml d'une solution d'urée 2 M. PARTIE B Dénaturation partielle de la protéine et liaison à l'inhibiteur. On prépare une solution franche à 1 % de SAB en dissolvant 0,2 g de SAB essentiellement exempte d'acides gras, vendue par Sigma Company, n A 7511, lot 90 F-9315 dans 20 ml d'eau distil- lée On trouve que l'absorbance à 280 nm est de 6,22 On déter- mine la concentration de la solution de SAB selon Do M Kirschenbaum dans Int J Peptide Res, 5, 1973, pages-49-62. En utilisant le coefficient d'absorption de 6,62 pour une solu- tion à 1 %, la concentration de la solution est d'environ 9,4 mg/ml On remplit la colonne de la PARTIE A d'un courant mobile de tampon d'acétate 0,01 M de p H 4,0 qui circule avec débit de 1 ml/min, son rôle étant celui d'une solution d'un agent de dénaturation On injecte 2 ml de la solution à 1 % de SAB à la tête de la colonne, de sorte qu Von ajoute environ 18,8 mg de SAB à la colonne Par une telle injection, on abaisse le p H de SAB et à ce p H bas, on provoque une dénaturation partielle pendant l'écoulement à travers la colonne. On règle l'éluant de la colonne à 280 nm On recueille la partie de SAB qui n'est pas liée à l'inhibiteur immobilisé éluée de la colonne et par le procédé décrit plus haut, on dé- termine qu'elle contient environ 17,25 mg En conséquence, environ 1,6 mg de SAB est lié à l'inhibiteur pendant une seule exposition à la colonne. PARTIE C Réticulation et collecte de la protéine modifiée On prépare une solution de réticulation en dissolvant environ 0,068 g de dichlorhydrate de diméthyl-subérimidate (agent de réticulation) dans 50 ml de tampon d'acétate 0,01 M de p H 4,0 On raccorde la sortie de la colonne de la PARTIE B à une pompe de recirculation On raccorde le refoulement de la pompe à la tête de la colonne pour former une boucle fermée d'écoulement à recirculation On fait ensuite circuler en cir- cuit fermé l'agent de réticulation à travers la colonne pen- dant 2 heures un débit de 1 ml/min. On débranche le circuit fermé et on pompe un éluant qui est un tampon H Cl-glycine 0,02 M de p H 3 à travers la colonne pour recueillir toute protéine modifiée liée à la colonne. PARTIE D Résultats On enregistre l'activité suivante concernant le substrat pour l'enzyme estérase à partir d'un échantillon d'une protéine modifiée analogue à l'estérase préparée selon l'invention. On analyse une portion de la solution d'éluant de la pro- téine modifiée provenant de la PARTIE C pour déterminer l'acti- vité enzymatique d'estérase par chromatographie en phase liqui- de sous haute pression de la façon suivante-: On prépare l'échantillon de titrage comme suit: on mélange 14 ml de tampon-tris 0,01 M de p H 8,0, et 2 ml d'ester éthylique de la N-c -benzoyl-L-arginine (EEBA) à 0,1 M en qua- lité de substrat avec 4 ml de protéine modifiée. On prépare la solution-témoin en ajoutant 14 ml du tampon tris 0,01 M de p H 8,0 à 2 ml de EEBA 0,1 M et à 4 ml de H Cl- glycine 0,02 M de p H 3,0 qui est l'éluant de la colonne Le p H final aussi bien de la solution de titrage que de la solu- tion témoin est de 7,7. On titre la SAB naturelle (fournie aussi par Sigma Chemical Company, A7511, lot n 90 F-9315) contre le substrat d'estérase EEBA pour déterminer l'activité initiale On prépa- re la SAB naturelle en dissolvant 0,1 g de SAB dans 10 ml d'eau distillée désionisée On dialyse la solution résultante à 1 % dans un tampon H Clglycine 0,02 M, p H 3, pendant 2 heures On dilue ensuite 1 ml de la solution dialysée de SAB à 1:50 avec le tampon H Cl-glycine 0,02 M, p H 3, pour obtenir une absorbance à 280 nm de 0,119 On calcule la concentration de la protéine comme étant de 0,18 mg/ml La solution de titrage de SAB natu- relle est préparée comme suit: on mélange ensemble 14 ml de tampon-tris 0,01 M, p H 7,7; 2 ml de EEBA 0,1 M; et 4 ml de SAB naturelle en solution et on forme ainsi une solution On prépare la solution-témoin en mélangeant 14 ml de tampon-tris 0,01 M, p H 7,7, à 2 ml de EEBA ( 0,1 M) et à 4 ml de tampon HC 1- glycine 0,02 M, p H 3. Après mélange le p H de la SAB naturelle et de la solution- témoin est de 7,7 On injecte 20 microlitres de la solution de SAB naturelle et on enregistre la hauteur du pic pour la benzoyl-L-arginine qu'on détecte à 254 nm On injecte ensuite la solîtion-témoin. Après avoir recueilli en cinq points au moins aussi bien la solution naturelle que la solution témoin, on calcule l'ac- tivité à partir d'un graphique donnant la concentration de la benzoyl-Larginine en fonction du temps en utilisant l'analyse par regression linéaire Les résultats des titrage S montrent que la pente de la SAB naturelle est de 4,39 0,22 x 10-7 mole/min et que la pente du témoin est de 4,69 0,17 X 10-7 mole/min on-voit ainsi qu'aucune activité d'estérase naturelle n'existe pour le substrat de EEBA. Les conditions de la colonne de chromatographie en phase liquide sous haute pression pour le titrage sont les suivantes: on garnit la colonne avec un support de glycophase CM fournit par Pierce Chemical Co, Prodilit n 23512, qui est une couche d'hydrate de carbone non ionique hydrophile, contenant des chaînes latérales carboxyle méthyle en liaison covalente avec le verre à grosseur de pores réglée La-granulométrie est d'en- viron 125 à 177 microns et la grosseur des pores est d'environ oL'éluant de la colonne est un tampon-tris 0,005 M de p H 8,0 contenant Na Cl -0,05 M Le débit est de 4,0 ml/min pour une colonne de 27 x 0,3 cm On injecte 20 microlitres de l'échantillon et on enregistre la hauteur du pic pour la benzyl- L-arginine qu'on détecte à 254 nm On injecte ensuite le témoin Après avoir recueilli en au moins quatre points aussi bien l'échantillon que le témoin, on calcule l'activité à partir d'un graphique donnant la concentration de la benzoyl- L-arginine en fonction du temps Les résultats du titrage sont: Substrat EEBA (U/g) Activité initiale O,00 Activité finale 17,0 Ces résultats montrent que la protéine modifiée de la PARTIE D fait preuve d'une activité par rapport au substrat d'estérase EEBA alors qu'aucune activité n'a été détectée pré- cédemment dans la protéine naturelle SAB On démontre ainsi la conversion d'un type de protéine non enzymatique (une albumine) en un autre type de protéine (protéine similaire à l'estérase à activité enzymatique). EXEMPLE 4 PARTIE A Préparation d'une colonne d'inhibiteur immobilisé d'enzyme-modèle. On utilise dans le procédé une colonne de chromatographie à parois en verre ayant-environ 7,5 cm de longueur et 1,5 cm de diamètre intérieur On emmagasine un inhibiteur immobilisé, gel de L-tryptophane-agarose (Sigma Company, n T-0137, Lot F-9610), dans une solution de Na Cl 0,5 M à environ O C jusqu'à utilisation. Pour préparer la colonne de l'acceptation de l'enzyme glucoamylase naturelle, on garnit la colonne à une hauteur * d'environ 3,8 cm avec l'inhibiteur immobilisé Après garnissa- ge de la colonne, on la purge des agents éventuels de contami- nation de la façon suivante: on fait passer une quantité aliquote de 200 ml d'eau distillée à travers la-colonne avec un débit de 1 ml/min, puis 500 ml d'un tampon de carbonate 0,1 M contenant du Na Cl 0,5 M, à p H 10, avec un débit de 1 ml/min, puis 500 ml d'un tampon d'acétate de sodium 0, 1 M, à p H 4, contenant Na Cl 0,5 M avec un débit de 1 ml/min-,; et on effectue enfin un lavage final de la colonne avec 500 ml d'urée 2 M. PARTIE B Dénaturation partielle de la protéine et liaison à l'inhibiteur. On dialyse 5 ml de glucoamylase, vendue sous le nom d "amyloglucosidase" par Sigma Chemical Co, glucoamylase n A-3514, lot 28 C-0442, avec un nom systématique "I -1,4- glucane-glucohydrolose contre un tampon tris 0,001 M, p H 7, pendant toute une nuit Sous la forme livrée par Sigma Chemical Co., on met ensuspension 100 mg de glucoamylase dans environ 10 ml d'une solution 3,2 M de sulfate d'ammonium à p H 6 On dialyse l'enzyme glucoamylase à l'aide d'un tube de dialyse dont le seuil de coupure des poids moléculaires naturels est de 12 000 à 14 000 daltons. L'absorbance de la solution de glucoamylase à 280 nm est mesuréeet on trouve 9,44 La concentration de l'enzyme glucoamylase naturelle est déterminée selon D o M Kirschenbaum dans Analytical Biochemistry, 82, pages 83-100, 1977 En utilisant le coefficiant d'absorption de 13,6, la concentration de la solution est d'environ 6,9 mg d'enzyme par ml de solution. On remplit la colonne de la PARTIE A avec un courant d'un tampon d'acétate 0,01 M de p H 4,0, s'écoulant avec un débit de 1 ml/min, et qui joue le rôle de la solution d'un agent déna- turant On injecte 2 ml de la solution d'enzyme glucoamylase naturelle dialysée ( 13,9 mg) dans le sommet de la colonne. Avec une telle injection, on abaisse le p H de l'enzyme naturelle et à ce p H faible, l'enzyme est partiellement dénaturée pendant son écoulement à travers la colonne. On contrôle l'éluant de la colonne-à 280 nm Quand on recueille la partie de l'enzyme qui n'est pas liée à l'inhibi- teur immobilisé éluée de la colonnes-on détermine par le pro- cédé indiqué ci-dessous qu'elle ne contient virtuellement aucune enzyme partiellement dénaturée En conséquence, environ 13,9 mg d'enzyme sont liés à l'inhibiteur au cours d'une seule exposi- tion à la colonne. PARTIE C Réticulation et collecte de la protéine modifiée On prépare une solution de réticulation en-dissolvant environ 0,034 g de dichlorhydrate de diméthyl-subérimidate, qui est un agent de réticulation, dans 25 ml d'un tampon d'acé- tate 0,01 M de p H 4,0 On raccorde la sortie de la colonne de la PARTIE B à une pompe de recirculation On raccorde le refoulement de la pompe à la tête de la colonne et on établit ainsi une boucle fermée d'écoulement de recirculation On fait alors circuler l' agent de réticulation en circuit fermé à travers la colonne pendant 3 heures avec un débit de 1 ml par minute. On débranche le circuit fermé et on pompe un éluant, qui est un tampon d'acétate 0,01 M de p H 4,0, à travers la colonne pour établir une ligne de base stable pour l'enregistrement. Le tampon d'acétate 0,01 M permet de déterminer une ligne de base stable pour contrôler l'élution de la protéine modifiée. Après l'établissement d'une ligne de base stable, on élue la protéine modifiée avec un tampon H Cl-glycine 0,02 M de p H 3 et on recueille toute la fraction contenant la protéine. PARTIE D Résultats On enregistre l'activité suivante pour un échantillon de la protéine modifiée analogue à l'estérase préparée selon l'in- vention. On analyse une portion des solutions dans l'éluant de la protéine modifiée pour déterminer l'activité de l'estérase par chromatographie en phase liquide sous haute pression et on trouve l'existence d'une activité d'estérase Pour vérifier que la glucoamylase naturelle n'a pas d'activité d'estérase, on procède comme suit: on titre la glucoamylase naturelle contre l'ester méthy- lique du L-tryptophane (EMT) et on ne constate aucune activité d'estérase naturelle pour EMT. On effectue le titrage de l'échantillon d'enzyme gluco- amylase naturelle en ajoutant 14 ml de tampon tris 0,005 M, p H 9,1 et 4 ml de glucoamylase naturelle dialysée à 2 ml de EMT 0,1 M La glucoamylase est dialysée contre 1000 ml d'un tampon H Cl-glycine 0,02 M, p H 3, pendant une heure environ, après quoi on remplace le dialysat par 1000 ml d'un échantil- lon frais de tampon On dilue alors la glucoamylase à 1:70 avec le tampon H Cl-glycine 0,02 M, p H 3, pour approcher la concentration de l'enzyme modifiée récupérée On prépare la solution-témoin pour ce titrage en ajoutant 14 ml de tampon tris 0,005 M, p H 9,1, 4 ml de tampon H Clglycine 0,02 M à p H 3,0 et 2 ml de EMT 0,1 M Cet échantillon ne montre aucune activité-d'estérase naturelle pour le substrat EMT Le p H final du témoin et de la solution de titrage naturelle est de 6,7. Pour déterminer le niveau de l'activité d'estérase de la protéine modifiée préparée selon l'invention, on procède comme suit: on prépare d'abord l'échantillon de titrage et pour cela on mélange 14 ml d'un tampon tris 0,005 M, p H 9,1, et 2 ml de substrat EMT 0,1 M avecó 4 ml de protéine modifiée. On prépare la solution-témoin en ajoutant 14 ml de tampon tris 0,005 M, p H 9,1, à 2 ml de EMT 0,1 M et 4 ml de H Cl-glycine 0,02 M, p H 3,0, qui est l'éluant de la colonne Le p H final de la solution témoin et de la solution de titrage est de 6,7. La colonne de chromatographie en phase liquide sous haute pression pour le titrage est préparée comme suit: on grnit la colonne avec un support "Baker Bonded Phase Carboxyl" de la Baker Chemical Co qui est un carboxysilane lié à du gel de silice La granulométrie est d'environ 40 millimicrons L'éluant de la colonne est un tampon d'acétate 0,03 M à p H 6 Le débit est de 4 ml/min pour une colonne de 27 x 0,3 cm On injecte microlitres de l'échantillon et on enregistre la hauteur du pic pour le tryptophane détecté à 254 nm Puis on injecte le témoin Après avoir recueilli en au moins quatre points-aussi bien l'échantillon que le témoin, on calcule l'activité à partir d'un graphique donnant la concentration de tryptophane en fonction du temps Les résultats du titrage sont les suivants: Substrat EMT (U/g) Activité initiale 0,00 Activité finale 1,1 Ces résultats montrent que la protéine modifiée analogue à une enzyme de la PARTIE D fait preuve d'une activité pour le substrat EMT d'estérase quand aucune activité n'a été précé- demment détectée dans l'enzyme naturelle On démontre ainsi la conversion d'un type de protéine enzymatique (glucoamylase) en un autre type de protéine (protéine analogue à l'estérase à activité enzymatique). EXEMPLE 5 PARTIE A Préparation d'une colonne d'inhibiteur immobilisé d'enzyme-modèle On utilise dans ce procédé une colonne de chromatographie à parois de verre ayant environ 7,5 cm de longueur et 1,5 cm de diamètre intérieur On emmagasine un inhibiteur immobilisé, le gel de L-tryptophane-agarose (Sigma Company, n T-0137, lot 80 F-9610) dans une solution de Na Cl 0,5 M à environ O C jusqu'à utilisation. Pour préparer la colonne en vue de lui permettre d'accep- ter la protéine native, on la garnit à une hauteur d'environ 3,8 cm avec l'inhibiteur immobilisé Après garnissage de la colonne, on la purge pour faire disparaître les agents éventuels de contamination, comme suit: on fait passer à travers la colonne une quantité aliquote de 200 ml d'eau distillée avec un débit de 1 ml/min puis 500 ml d'un tampon de carbonate 0,1 M contenant Na Cl 0,5 M, à p H 10 avec un débit de 1 ml/min, puis 500 ml d'un tampon d'acétate de sodium 0,1 M à p H 4, contenant Na Cl 0,5 M avec un débit de 1 ml/min et finalement on on lave la colonne avec 500 ml d'une solution d'urée 2 M. PARTIE B Dénaturation partielle de la protéine et liaison à l'inhibiteur On prépare une solution fraîche de 1 % de SAB en dissolvant 0,2 g de sero- albumine bovine essentiellement exempte d'acides gras (Sigma Co, n A 7511, lot 90 F-9315) dans 20 ml d'eau distillée On mesure l'absorbance à 280 nm et on trouve 6,43. On détermine la concentration de la SAB selon D M Kirschenbaum, dans Int J Peptide Res, 5, 1973, pages 49-62 En utilisant le coefficient d'absorption de 6,62 pour une solution à 1 %, la concentration de la solution est d'environ 9,7 mg/ml. On remplit la colonne de la PARTIE A avec un courant en mouvement d'un tampon d'acétate 0,01 M de p H 4,4 qui s'écoule avec un débit de 1 ml/min, jouant le rtôle d'une solution d'agent dénaturant On injecte 2 ml d'une solution à-1 % de SAB à la tête de la colonne et, par cette injection, on baisse le p H de la SAB et à ce p H faible, on effectue une dénaturation partielle pendant l'écoulement à travers la colonne. On contrôle l'éluant de la colonne-à 254 nm Quand la partie de SAB qui n'est pas liée à l'inhibiteur immobilisé est éluée de la colonne, on la recueille et par le même procédé que décrit plus haut on détermine que sa teneur est d'environ 16 mg. En conséquent, environ 3,4 mg de SAB sont liés à l'inhibiteur pour une seule exposition à la colonne. PARTIE C Réticulation On raccorde la sortie-de la colonne de la PARTIE B à une pompe de recirculation dont le refoulement est raccordé, à la tête de la colonne pour établir une boucle fermée d'écoulement avec recirculation On ajoute 20 microlitres de glutaraldéhyde à 8 % (Polysciences, Inc, Cat n 216, lot 4-1462), à 25 m 1 du tampon d'acétate 0,01 M de p H 4,4 On injecte la solution de glutaraldéhyde dans la colonne et on la fait circuler en cir- cuit fermé pendant 90 minutes environ. PARTIE D Collecte de la protéine modifiée On débranche le circuit fermé de la PARTIE C et on pompe à travers la colonne un tampon HC 1 glycine 0,02 M de p H 3,0, la colonne contenant à ce stade la protéine modifiée, stabili- sée, liée à l'inhibiteur, le pompage se faisant avec un débit de 1 ml/min Après 15 minutes environ, la protéine modifiée commence à être éluée de la colonne On recueille l'éluant au fur et à mesure que la protéine modifiée est éluée de la colon- ne On élève le p H de la protéine modifiée recueillie de 3 à environ 6,9 pour stabiliser la structure de la protéine, en ajoutant 1 ml de tampon tris 0,1 M, p H 7,5, à 9 ml de l'éluant. On recueille au total environ 0,3 mg de protéine modifiée. PARTIE E Résultats On enregistre l'activité suivante concernant le substrat de l'enzyme estérase à partir d'un échantillon de protéine modifiée préparée selon l'invention. On analyse une portion de la solution dans l'éluant de la protéine modifiée pour déterminer l'activité enzymatique d'estérase par chromatographie en phase liquide sous haute pression comme suit: on prépare l'échantillon de titrage de la façon suivante: on mélange 16 ml de tampon tris 0,1 M, p H 7,7, et 2 ml d'ester éthylique de la N-O(benzoyl-L-arginine (BEBA) 0,1 M à titre de substrat avec 2 ml de protéine modifiée. On prépare la solution-témoin en ajoutant 16 ml de tampon tris 0,1 M, p H 7,7, à 2 ml de EEBA 0,1 M à 2 ml de H Cl- glycine 0,02 M qui est l'éluant de la colonne et dont on règle le p H à 6,9 à l'aide du tampon-tris, p H 7,5. Les conditions de la colonne de chromatographie en phase liquide sous haute pression pour le titrage sont les suivantes: on garnit la colonne avec un support de glycophase CM fourni par Pierce Chemical Co, qui est une couche d'hydrate de car- bone non ionique, hydrophile, liée de façon covalente au verre dont les pores sont d'une épaisseur réglée et renfermant des chaînes latérales carboxyle méthyle Les particules ont une granulométrie d'environ 125 à 177 microns et la grosseur des pores est d'environ 200 A L'éluant de la colonne est le tampon tris 0,005 M de p H 8,1 contenant Na Cl 0,05 M; Le débit est de 1,75 ml/minute pour une colonne de 27 x 0,3 cm On injecte microlitres de l'échantillon et on enregistre la hauteur du pic de la benzoyl-L-arginine qu'on détecte à 254 nm On injecte ensuite le témoin Après avoir recueilli en au moins quatre points aussi bien l'échantillon que le témoin, on calcule l'activité à partir d'un graphique donnant la concentration de la benzoyl-L-arginine en fonction du temps Les résultats du titrage sont: Substrat BEBA (U/g) Activité initiale O,00 Activité finale 4,3 Ces résultats montrent que la protéine modifiée analo- gue à l'estérase de la PARTIE D fait preuve d'activité pour le substrat d'estérase EEBA alors qu'aucune activité n'a été précédemment détectée dans la protéine naturelle SAB On démon- tre ainsi la conversion d'un type de protéine non enzymatique (une albumine) en un autre type de protéine, à savoir une protéine analogue à l'estérase ayant une activité enzymatique. EXEMPLE 6 PARTIE A Préparation d'une colonne d'inhibiteur immobilisé d'enzyme-modèle On utilise dans ce procédé une colonne de chromatogra- phie à paroisde verre ayant environ 7,5 cm de longueur et 1,5 cm de diamètre intérieur On emmagasine un inhibiteur immobilisé, le gel de Ltryptophane-agarose (Sigma Company, n T-0137, lot 80 F-9610) dans une solution de Na Cl 0,5 M à environ O C jusqu'à l'utilisation. Pour préparer la colonne en vue de lui permettre d'accep- ter la protéine naturelle, on la garnit à une hauteur d'envi- Ton 3,8 cm avec l'inhibiteur immobilisé Après garnissage de la colonne, on la purge pour faire disparaître les agents éventuels de contamination, comme suit: on fait passer à travers la colonne d'abord une quantité aliquote de 200 ml d'eau distillée avec un débit de 1 ml/min puis 500 ml d'un tampon de carbonate 0,1 M contenant Na Cl 0,5 M, à p H 10, avec un débit de 1 ml/min, puis 500 ml d'un tampon d'acétate de sodium 0,1 M à p H 4, contenant Na Cl 0,5 M, avec un débit de 1 ml/min et;finàlement,on lave la colonne avec 500 ml d'une solution d'urée 2 M. PARTIE B Dénaturation partielle de la protéine et liaison à l'inhibiteur On prépare une solution franche à 1 % de SAB en dissolvant 0,2 g de séro- albumine bovine essentiellement exempte d'acides gras (Sigma Co, n A 7511, lot 90 F-9315) dans 20 ml d'eau distillée On mesure l'absorbance à 280 nm et on trouve 7,69. On détermine la concentration de la SAB selon D M Kirschenbaum, dans Int J Peptide Tes 5, 1973, pages 49-62 En utilisant le coefficient d'absorption de 6,62 pour une solution à 1 %, la concentration de la solution est d'environ 11,6 mg/ml. Avant l'addition de la SAB à la colonne, on ajoute 100 microlitres de 2mercaptoéthanol 0,01 M dans l'eau désio- nisée à 10 ml d'une solution franchement préparée à 1 % de SAB On agite doucement la solution résultante de SAB et 2- mercaptoéthanol (agent dénaturant) pendant environ 1 heure à -la température ordinaire pour dénaturer partiellement la pro- téine native. On remplit la colonne de la PARTIE A avec un courant mobile d'un tampon d'acétate 0,01 M de'p H 4,4 qui circule à raison de 1 ml/min et qui agit également comme une solution de l'agent dénaturant On injecte 2 ml de la solution à 1 % de SAB et de 2-mercaptoéthanol dans la tête de la colonne. Avec une telle injection, on abaisse le p H de la SAB et à ce p H faible et par exposition au 2-mercaptoéthanol, on provoque la dénaturation partielle. On contr 8 le l'éluant de la colonne à 280 nm Quand la portion de SAB qui n'est pas liée à l'inhibiteur immobilisé *est éluée de la colonne, on la recueille et par le même procé- dé que décrit plus haut, on détermine sa teneur qui est d'en- viron 18,9 mg En conséquence, environ 4,3 mg de la SAB snnt liés à l'inhibiteur pendant une seule exposition à la colonne. PARTIE C Réticulation On ferme hermatiquement la sortie de la colonne de la PARTIE B On laisse la colonne au repos pendant 17 heures à p H 4,4 pour permettre la réticulation des liaisons de disulfures. PARTIE D Collecte de la protéine modifiée Après 17 heures environ, on remplace l'éluant par un tampon H Cl-glycine 0,02 M de p H 3,0 et on recueille la protéine modifiée en cours d'élution. PARTIE E Résultats On enregistre l'activité suivante concernant le substrat pour l'enzyme estérase à partir d'un échantillon de la protéine 35. modifiée analogue à l'estérase préparée selon l'invention. On analyse une portion de la solution dans l'éluant de la protéine modifiée pour déterminer l'activité enzymatique d'estérase par chromatographie en phase liquide sous haute pression. On prépare l'échantillon de titrage comme suit: on mélange 14 ml de tampon tris 0,01 M, p H 7,8, et 2 ml de EEBA â,1 M en qualité de substrat avec 4 ml de protéine mo- difiée. On prépare la solution-témoin en ajoutant 14 ml de tampon tris 0, 01 M, p H 7,8, à 2 ml de EEBA 0,1 M et à 4 ml de H Cl-glycine 0,02 M, p H 3,0, qui est l'éluant de la colonne. Le p H final de la solution témoin et de la solution de titra- nge est de 7,7. Les conditions du titrage sont les suivantes: on garnit la colonne avec un support de glycophase CM (Pierce Chemical Co.) qui est une couche d'hydrate de carbone non ionique et hydrophile en liaison covalente avec un verre ayant des pores d'une grosseur réglée, comportant des chaînes latérales car- boxyle méthyle La granulométrie est d'environ 125 à 177 mi- o crons et-la grosseur des pores est d'environ 200 A L'éluant de la colonne est le tampon tris 0,005 Mvà p H 8,1,contenant Na Cl 0,05 M Le dé 1 it est de 1,75 ml/min pour une colonne de 27 x 0,3 cm, On injecte 20 microlitres d'échantillon et on enregistre la hauteur du pic pour la benzoyl-L-arginine détec- tée à 254 nm On injecte ensuite le témoin Après avoir recueil- li en quatre points au moins aussi bien l'échantillon que le témoin, on calcule l'activité à partir d'un graphique donnant la concentration de benzoyl-L-arginine en fonction du temps. Les résultats du, titrage sont Substrat EEBA (U/g) Activité initiale 0,00 Activité finale 8,4 Ces résultats montrent que la protéine modifiée analogue à l'estérase de la PARTIE D-fait preuve d'une activité pour 'le substrat d'estérase EEAB alors qu'aucune activité n'a été pré- cédemment détectée dans la protéine SAB On démontre ainsi là conversion d'un type de protéine non enzymatique (une albu- mine) en un autre type de protéine (protéine analogue à l'estérase à activité enzymatique). EXEMPLE 7 PARTIE A Préparation d'une colonne d'inhibiteur immobilisé d'enzyme-modèle On utilise dans ce procédé une colonne de chromatogra- phie à parois de verre ayant environ 3,8 cm de longueur et 1,5 cm de diamètre On immobilise l'inhibiteur, la cellobiose, sur un support organique solide insoluble dans l'eau compre- nant un polysaccharide réticulé linéaire à base d'agarose et comportant des résidus -alternés de D-galactose et de 3,6- anhydro-L-galactose Le support d'immobilisation est vendu par Pharmacia Fine Chemicals sous le nom "Sepharose 4 B Gel". On prépare la matière de la colonne par le procédé décrit par Sunberg et Porath dans J of Chromatography On procède comme suit: on lave 25 g de "Sepharose 4 B Gel" sur un entonnoir 2 O à filtration en verre à l'aide de 2 litres d'eau désionisée distillée et on sèche par aspiration pendant 5minutes sous vide On ajoute au gel séché par aspiration 25 ml d'éther diglycidylique de 1,4-butanediol et 25 ml de Na OH 0,6 M contenant 2 mg de borohydrure de sodium par ml de solution. On secoue la suspension résultante pendant 5 heures à faible vitesse sur un agitateur Eberbach. Après 5 heures, on lave la suspension sur un entonnoir de filtration en verre avec 750 ml d'eau désionisée distillée; puis 750 ml d'un tampon de phsophate de sodium 0,02 M, p H 7,5; puis 750 ml d'un tampon de tris-H Cl 0,001 M, p H 7,0; puis 750 ml d'un tampon H Cl-glycine 0,02 M, p H 3,0; et finalement 750 ml d'un tampon de carbonate de sodium 0,05 M, p H 10,0 et on sèche par aspiration pendant 5 minutes. A ce gel séché par aspiration on ajoute 25 ml d'une so- lution à 2 % de D(+)-cellobiose Onprépare la solution de cellobiose à partir de 500 mg de cellobiose dans 25 ml d'un tampon de carbonate de sodium 0,05 M, p H 10, en utilisant la cellobiose de Stgma Chemical Co, n C-7252, lot n 11 OF-0656. On agite la solution de gel dans la cellobiose à petite vitesse pendant 16 heures. Après 16 heures, on lave la suspension sur un entonnoir à filtration en verre avec 750 ml d'un tampon de carbonate de sodium 0,05 M; p H 10,0; 750 ml d'eau désionisée distillée; 750 ml d'un tampon tris-H Cl 0,001 M à p H 7,0; 750 ml de H Cl- glycine 0,02 M, p H 3,0; finalement 750 ml d'un tampon de car- bonate de sodium 0,05 M, p H 9,5 On sèche le gel par aspira- tion sous vide pendant 5 minutes. On ajoute 12,5 g de la matière séchée par aspiration à ml d'une solution d'éthanolamine 2,0 M On prépare l'étha- noamine en ajoutant 2,54 ml d'éthanolamine à 95 % à une quan- tité suffisante d'un tampon de carbonate de sodium 0,05 M, p H 9,5, pour atteindre un volume de 20 ml On agite la solu- tion de gel et d'éthanolamine pendant 5 heures et on lave ensuite sur un entonnoir à filtration en verre comme suit, dans l'ordre indiqué: 500 ml de tampon de carbonate de sodium 0,05 M, p H 9,5; 500 ml de tampon de phosphate de sodium 0,02 M, p H 7,5; 500 ml de tampon tris-H Cl 0,001 M, p H 7,0; et 500 ml d'eau désionisée distillée On sèche ensuite le gel par aspira- tion sous vide, on le remet en suspension dans l'eau désioni- sée distillée et on l'emmagasine sous réfrigération jusqu'à ce que la colonne soit garnie. La colonne de 3,8 x 1,5 cm est entièrement garnie à l'état humide avec le gel inhibiteur et on lave la colonne garnie comme suit dans l'ordre indiqué; 200 ml de tampon de carbonate de sodium 0,02 M, p H 10,0; 200 ml d'eau désionisée distillée; 200 ml V'un tampon H Cl-glycine 0,02 M, p H 3, 0, et ml d'un tampon de phosphate de sodium 0,02 M à p H 8,0. PARTIE B Dénaturation partielle de la protéine et liaison à l'inhibiteur On prépare une catalase bovine fraîche à 0,4 %, nom systématique "oxydoréductase peroxyde d'hydrogène", en solu- tion en dissolvant 0,04 g de catalase bovine cristallisée (Sigma Chemical, n C-40, lot N O 100 F-7275) dans 10 ml d'eau désionisée distillée On agite la solution pendant 15 minutes à la température ordinaire pour dissoudre la catalase. L'absorbance à 280 nm est 5,71 Le nombre réel de milligram- me de catalase dans la solution est calculé en utilisant 12,9 à 280 nm comme coefficient d'absorption pour une solu- tion à 1 %, comme décrit par D M Kirschenbaum dans Int J. Peptide Protein Res, 5, 1973, page 53 La concentration calculée en protéine est de 4,43 mg/ml Puis on abaisse le p H de la solution à 3 par titrage avec H Cl 0,1 N et on le maintient à 3 pendant une heure On ajoute ensuite lentement en l'espace de deux heures et avec agitation 20 microlitres de Bmercaptoéthanol 0,1 M. On injecte 2 ml de la solution de catalase sur la colonne en ajoutant 8,86 mg de protéine à la colonne de l'inhibiteur. Alors que la protéine commence à être éluée, ce qui indique une liaison incomplète, on recueille l'éluant On recueille 30 ml de matière ayant un pouvoir absorbant de 0,078, ce qui donne 1,83 mg de catalase recueillie Ainsi, environ 7 mg de catalase sont liés à l'inhibiteur dans la co- lonne. PARTIE C Réticulation On prépare une solution d'agent de réticulation en dis- solvant 0,035 g de dichlorhydrate de diméthyl-subérimidate (Sigma Chemical Co N D-763, lot n 11 OF-0322) dans 25 ml d'un tampon de phosphate de sodium 0,02 M à p H 8 On raccorde' la sortie de la colonne de la PARTIE B à une pompe de recir- culation On relie le refoulement de la pompe à la tête de la colonne pour former une boucle fermée d'écoulement de recircu- lation On fait alors circuler 25 ml de l'agent de réticulation dans la colonne pendant 1 heure environ avec un débit de lml/min. PARTIE D Collecte de la protéine modifiée On débranche le circuit fermé de la PARTIE C et on pompe à travers la colonne un tampon H Cl-glycine 0,02 M à p H 3,0 cette colonne contenant à ce stade la protéine modifiée, stabilisée, liée à l'inhibiteur, le pompage se faisant à'rai- son de 1 ml/min Après 5 minutes environ, la protéine modi- fiée commence à éluer de la colonne On recueille environ ml de l'éluant avant que la protéine modifiée cesse d'être éluée. L'absorbance à 280 nm est déterminé comme dans la PARTIE B comme étant de 0,249 de sorte qu'environ 2,9 mg de protéine modifiée ont été recueillis O Ensuite, on remplace l'éluant par un tampon de carbonate de sodium 0,02 M, p H 10,0, et on recueille 5 ml d'éluant sup- plémentaire, contenant 0,27 mg de protéine modifiée supplémen- taire. PARTIE E Résultats On enregistre l'activité suivante concernant le substrat d'un enzyme de P-glucosidase à partir d'un échantillon d'une protéine modifiée analogue à la P-glucosidase préparée selon l'invention dans les PARTIES A à Do On analyse une portion de l'éluant recueilli dans la PARTIE D pour l'activité enzymatique de 1-glucosidase. On détermine cette activité par voie spectrqphotométrique RI" en utilisant un spectrophotomètre CARY-14/et en mesurant la variation de l'absorbance en fonction du temps sur une échelle de O à 0,1 unité d'absorbanceo On prépare comme suite le mélange de réaction: 2,4 ml d'un tampon de phosphate de sodium 0,02 MS p H 7,0, et 0,5 ml de p-nitrophényl D-glucoside (NPG) 0,014 M à titre de substrat, sont mélangés avec 0,1 ml de la protéine modifiée de la PARTIE D recueillie à p H 3,0 On prépare la solution de substrat en dissolvant j 0,-042 g de substrat dans 10 ml d'eau désionisée distillée. On prépare le mélange-témoin en mélangeant 2,4 ml du tampon de phosphate de sodium 0,02 M, p H 7,2, et 0,5 ml d'eau désionisée distillée avec 0,1 ml de protéine modifiée de la PARTIE D. On prépare une seconde solution-témoin en mélangeant 2,4 ml du tampon de phosphate de sodium 0,02, p H 7,1, et 0,5 ml de NPG 0,014 M avec 0,1 ml d'eau distillée désionisée. La variation de l'absorbance à 405 nm est enregistrée pendant minutes aussi bien pour les témoins que pour le mélange de réaction Le p H final pour les trois solutions est de 7,1. La variation de l'absorbance pour le premier témoin est de 0,001 en 4,5 minutes Le second témoin ne fait preuve d'aucune variation de l'absorbance, ce qui indique aucune vitesse due à l'hydrolyse du substrat. On constate que l'activité observée est biphasée La vitesse pendant les premières minutes est notablement plus importante que la vitesse de régime La variation initiale de l'absorbance pour le mélange de réaction est de 0,0025 pendant 1 minute ou la phase 1 de la mesure d'activité et de 0,0017 pour 4,5 minutes pendant la vitesse de régime ou la phase 2 d'activité. On utilise la formule ci-après pour calculer l'activi- té enzymatique de la protéine modifiée analogue à la glucosi- dase préparée selon les PARTIES A à D de la présente inven- tion. Unités/g = (Variation de l'absorbance/min) (volume de l'échantillon en litres) ( 106 p M/mole) ( 13 x 103 litres/mole) (g de protéinemodifiée dans le mélange réactionnel Dans cette formule: 13 x 103 litres/mole est le coeffi- cient d'extinction pour le p-nitrophénol déterminé pour le p H et le système-tampon utilisés. Les résultats du titrage sont les suivants:. Substrat NPG (U/g) Activité initiale 0,00 Phase 1 30,0 Phase 2 4,5 Etant donné que la catalase précipite facilement, on utilise un second procédé de titrage avec le spectrophotomètre CARY 14-RI On utilise l'essai à point isosbestique pour le p-nitrophényl /9-D-glucoside pour déterminer si la protéine modifiée analogue à la glucosidase précipite à p H 7,1 qui est le p H du titrage Le point isosbestique de p-nitrophényl L-D- glucoside et de p-nitrophénol à p H 7,1 dans un tampon de * phosphate de sodium 0,02 M est 331,8 nm. On utilise deux cuvettes tandem du spectrophotomètre. La longueur de trajet de chaque cellule est de 0,5 cm La cuvette tandem de référence est remplie d'un côté avec de l'eau désionisée distillée Le secordcôté est rempli avec 1,2 ml de tampon de phosphate de sodium 0,02 M, p H 7,2; 0,2 ml de p-nitrophényl-i 5 -D-glucoside 0,014 M; et 50 ml d'eau distillée désionisée. La cuvette tandem d'échantillon est remplie d'un côté avec de l'eau désionisée distillée et, de l'autre côté avec 1,2 ml de tampon de phosphate de sodium 0,02 M, p H 7,2; 0,2 ml de p-nitrophényl-19-D-glucoside 0,014 M; et 50 micro- litres de la solution de protéine modifiée. Pendant l'expérience, on ne constate aucune variation de l'absorbance à 331,8 nm Puisqu'aucune augmentation de l'absorbance n'est constatée, l'absence de contribution à la vitesse mesurée de réaction est due à la précipitation de la protéine modifiée. Pour mettre en évidence que la catalase bovine naturelle ne fait preuve d'aucune activité catalytique mesurable pour le substrat de glucosidase, on effectue l'essai suivant: on titre une solution de catalase bovine naturelle (Sigma Chemical Co, n C-40, lot n 100 F-7275) contre le p-nitro- phényl-f -D-glucoside (NPG) à titre de substrat pour déter- miner une éventuelle activité -enzymatique pour le NPG On prépare la solution de catalase bovine naturelle en dissolvant 0,1 g de la catalase dans 10 ml d'eau désionisée distillée. On agite pendant 15 minutes la solution résultante à 1 % à la température ordinaire pour dissoudre la catalase Ensuite, on abaisse le p H de la solution à 3 par titrage avec HC 1 0,1 N. On dialyse cette solution dans un tampon H Cl-glycine 0,02 M à p H 3,0 pendant 1 heure environ Au bout d'une heure, on remplace le dialysat par une quantité aliquote fraîche de 1000 ml de tampon On utilise un tube de dialyse "Spectra/Por" (marque déposée) ayant un intervalle d'exclusion de poids moléculaire de 12 000 à 14 000 daltons On dilue ensuite la catalase dialysée à 1:50 avec le tampon H Cl-glycine 0,02 M, p H 3, pour approcher la concentration dq la protéine modifiée récupérée analogue à la glucosidase, qui a été examinée pré- -33217 cédemment L'absorbance à 280 mu est de 0,251 En utilisant la valeur du coefficient d'absorption de 12,9 (comme précé- demment expliqué dans Int J Peptide Protein Res article 5, 1973, page 53), on trouve que la concentration de la solution est d'environ 0,2 mg de protéine modifiée par ml de solution. On effectue le titrage par voie spectrophotométrique en utilisant le spectrophotomètre CARY-14 RI et on mesure la variation de l'absorbanc-e en fonction du temps L'instrument CARY-14 possède une dérive établie de la ligne de base infé- rieure à 0,001 unité d'absorbance à l'heure. On prépare un mélange de titrage d'enzyme catalase naturelle comme suit: 2,4 ml de tampon de phosphate de sodium 0,02 M à p H 7,1, et 0,5 ml de NPG 0,014 M à titre de substrat sont mélangés avec 0,1 ml de catalase naturelle dialysée, à p H 3,0 On prépare la solution de substrat NPG en dissolvant 0,042 g de NPG (substrat) dans 10 ml d'eau dé- sionisée distillée. On prépare une solution-témoin en mélangeant 2,4 ml de tampon de phosphate de sodium 0,02 M à p H 7,1 et 0,5 ml de substrat NPG avec 0,1 ml de tampon H Cl-glycine 0,02 M à p H 3,0. Le p H final des deux solutions est de 7,1 La variation de l'absorbance à 405 nm est enregistrée pendant 5 minutes pour les deux solutions Celle du mélange d'enzyme catalase naturelle est celle du mélange témoin sont les mêmes, à savoir 0,001 unité d'absorbance en 5 minutes Ainsi, la catalase bovine naturelle ne possède par d'activité initiale détectable de /-glucosidase pour le substrat NPG. En conséquence, l'essai montre que la catalase bovine naturelle n'a pas d'activité catalytique mesurable pour le substrat NPG de la glucosidase. EXEMPLE 8 PARTIE A Priparation de la colonne d'inhibitlir immohilige d'enzyme-modèl e On utilise dans ce procédé une colonne de chromatographie à parois de verre ayant environ 3,8 cm de longueur et 1,5 cm de diamètre intérieur On prépare l'inhibiteur immobilisé, le gel de cellobiose, comme décrit dans l'exemple 7 Pour préparer la colonne afin qu'elle accepte la protéine native, on garnit cette colonne à une hauteur d'environ 3,8 cm avec l'inhibiteur immobilisé Après garnissage de la colonne, on la purge pour la débarrasser des agents possible de contamina- tion en lavant la colonne comme suit: 200 ml de tampon carbonate de sodium 0,02 M à p H 10,0; 200 ml d'eau désionisée distillée; 200 ml de tampon H Cl-glycine 0,02 M, p H 3,0; et finalement 100 ml de tris-H Cl 0,001 M à p H 7,0. PARTIE B Dénaturation partielle de la protéine et liaison à l'inhibiteur On dilue 2,5 ml de glucoamylase, une o" -glucosidase portant le nom systématique o(-1,4-glucane-glucohydrolase (vendue par Sigma Chemical Co Sous le nom glucoamylase n A-3514 Lot 28 C-0442) avec 7,5 ml d'eau désionisée distil- lée et on dialyse contre le tampon tris-H Cl 0,001 M à p H 7,0 pendant 16 heures environ Sous la forme livrée par Sigma Chemical Co, on met en suspension 100 mg de glucoamylase dans environ 10 ml d'une solution de sulfate d'ammonium 3,2 M, p H 6 On dialyse l'enzyme glucoamylase en utilisant un tube de dialyse ayant un seuil de coupure-des poids moléculaires de 12 000 à 14 000 daltons. On détermine la concentration de l'enzyme glucoamylase naturelle dans la solution selon D M Kirschenbaum dans Analytical Biochemistry 82, pages 83100, 1977 L'absorbance à 280 nm est mesurée comme étant 2,78 En utilisant le coef- ficient d'absorption de 13,6, la concentration de la solution est d'environ 2,1 mg d'enzyme glucoamylase naturelle par ml de solution. Avant l'addition de la glucoamylase dialysée à p H 7,0 à la colonne de l'inhibiteur, on ajoute 20 microlitres de 2-mercaptoethanol 0,1 M dans l'eau désionisée distillée à 10 ml de la glucoamylase dialysée On agite doucement la solu- tion'résultante de glucoamylase et de 2-mercaptoéthanol (agent dénaturant) pendant 60 minutes à la température or- dinaire pour dénaturer partiellement l'enzyme naturelle. On remplit la colonne de la PARTIE A avec un courant mobile de tampon de tris-H Cl 0,001 M à p H 7,0 qui circule de avec un débit de 0,5 ml/min On injecte 5 ml la solution de glucoamylase et de 2-mercapto-éthanol à la tête de la colonne. Au fur et à mesure que la protéine commence a éluer, ce qui lndique une liaison incomplète, on recueille l'éluant un recueille 15 ml de la matière protéique avec uneabsorbance de U,03 pour donner 0,33 mg de glucoamylase collectée Ainsi, environ 10 mg de glucoamylase sont lies à l'inhibiteur sur la colonne. PARTIE C Réticulation On prépare une solution de l'agent de réticulation en dissolvant 0,044 g de dlchiorhydrate de diméthyl-subérimidate (Sigma Chemical Co n D-7636, lot n 31 F-0225) dans 25 ml de tampon tris-H Cl 0, 005 M, p H 7,5 On raccorde la sortie de la colonne de la PARTIE B à une pompe de recirculation On rac- corde le refoulement de la pompe à la tête de la colonne pour établir une boucle fcrmée d'écoulement de recirculation On fait circuler en circuit fermé 25 'ml de l'agent de réticula- tion à travers la colonne pendant 1 heure environ avec un débit de 0,5 ml/min. PARTIE D Collecte de la protéine modifiée On débranche le circuit fermé de la PARTIE C et on pompe un tampon de H Cl-glycine 0,02 M, à p H 3,0, à travers la colonne qui contient alors la protéine modifiée, stabilisée, analogue à une enzyme et liée à l'inhibiteur, avec un débit de 0,5 ml/min Après 5 minutes environla protéine modifiée commence à éluer de la colonne On recueille environ 16 ml de l'éluant avant que la protéine modifiée cesse d'être éluée. L'absorbance à 280 nm déterminée comme dans la PARTIE B a une valeur de 0, 764; ainsi on recueille environ 8,9 mg de protéine modifiée - PARTIE E Résultats On enregistre l'activité suivante concernant le substrat pour une enzyme de /?-glucosidase à partir d'un échantillon 2533217 de protéine modifiée analogue à la -glucosidase préparée selon les PARTIES A à D de la présente invention. On analyse la portion de l'éluant recueillie dans la PARTIE D pour l'activité enzymatique de /-glucosidase; comme suit: on détermine l'activité par voie spectrophotométrique en utilisant un spectrophotomère ACTA III (Beclman Instrument Co.), en mesurant la variation de l'absorbance en fonction du temps. On prépare la solution réactionnelle comme suit: 0,7 ml de tampon d'acétate de sodium 0,002 M, p H 5,0 et 0,2 ml du substrat p-nitrophényl-/e-D-glucoside 0,014 M (NPG) sont mélangés avec 0,1 ml de la protéine /-glucosidase modifiée de la PARTIE D, recueillie à p H 3,0 On prépare la solution de substrat en dissolvant 0, 042 g de substrat dans 10 ml d'eau distillée désionisée. On prépare la solution témoin en mélangeant 0,7 ml de tampon d'acétate de sodium 0,002 M, p H 5,00 et 0,2 ml de substrat NPG 0,014 M avec 0,1 ml;de tampon H Cl-glycine 0,02 M à p H 3,0 Le p H final de la solution témoin et de la solution de titrage est de 5,0. Après incubation de la solution réactionnelle et de la solution témoin pendant 15 minutes à 30 C,dans un bloc de température à chaleur sèche, on arrêt la réaction en ajoutant 1 ml de carbonate de sodium 0,02 M. L'absorbance de la solution témoin est de 0,028 quand on la mesure à 405 nm et celle de la solution réactionnelle est de 0,043 On obtient ainsi une variation de l'absorbance de 0,015 au bout de 15 minutes. On utilise la formule suivant pour calculer l'activité enzymatique de la protéine modifiée analogue à la f-glucosida- se préparée selon l'invention. Unités/g = (Variation de l'absorbance/nin)(volume de l'échantillon en litres) ( 106 p M/mole) ( 16,2 x 103 litres/mole) (mg protéine modifiée dans le mélange réactionnel) Dans cette formule: 16,2 x 103 litres/mole est le coefficient d'extinction pour le p-nitrophénol tel que dé- terminé pour le p H et le système-tampon utilisés. Les résultats du titrage sont: Substrat NPG (U/g) Activité initiale 0,00 Activité finale 2,2 Ces résultats montrent que la protéine modifiée analogue à la 0-glucosidase de la PARTIE D présente une activité pour le substrat NPG de fy-glucosidase alors qu'aucune activité pour le NPG n'a été précédemment constatée dans la glucoamylase naturelle. Pour vérifier que, la glucoamylase naturelle n'a pas l'activité de la t-glucosidase naturelle, on procède comme suit: on dialyse la glucoamylase naturelle contre un tampon tris-H Cl 0,001 M à p H 7,0 toute la nuit On dialyse la gluco- amylase en utilisant un tube de dialyse, dont le seuil de cou- pure des poids moléculaires est de 12 000 à 14 000 daltons. On prépare le mélange réactionnel de la glucoamylase suit naturelle comme/: 0,7 ml de tampon d'acétate de sodium 0,002 M à p H 5,0 et 0,2 ml de NPG 0,014 M sont mélangés avec 0,1 ml de la glucoamylase naturelle dialysée. Pour préparer lemélange témoin pour ce titrage, on mélange 0,7 ml de tampon d'acétate de sodium 0,002 M à p H 5,0 et 0,2 ml de substrat NPG 0,014 M avec 0,1 ml de tampon tris- H Cl 0,001 M à p H 7,0 Le p H final du mélange de réaction témoin et du mélange naturel est de 5,0. Après incubation des mélanges réactionnel et témoin pendant 15 minutes à 30 C dans un bloc de température à cha- leur sèche réglée, on arretele titrage en ajoutant 1 ml de carbonate de sodium 0-,02 M. L'absorbance du-mélange témoin et du mélange réaction- nel est de 0,026 quand on la mesure à 405 nm On ne constate donc aucune variation nette de l'absorbance et donc aucune activité mesurée pour la glucoamylase naturelle vis-à-vis du substrat NPG de P-glucosidase. REVENDICATIONS 1 Procédé de modification chimique de la spécificité du substrat d'une proteine naturelle pour préparer une pro- téine modifiée, prédéterminées analogue à une enzyme, carac- térisé en ce qu'il consiste a à choisir une protéine à activité enzymatique pour servir de modèle; b à immobiliser un inhbiteur de ladite enzyme-modèle prédéterminée sur un support solide; c à dénaturer partiellement ladite protéine naturelle, et d à réticuler cette protéine naturelle partiellement dénaturée en présence dudit inhibiteur immobilisé sur le sup- port de ladite enzyme-modèle. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on immobilise de façon covalente ledit inhbiteur de l'enzyme- modèle sur ledit support solide. 3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ce support solide est un hydrate de carbone. 4 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'hydrate de carbone est un gel d'agarose Procédé selon la revendication 1, caractérisé en-ce qu'on dénature partiellement la protéine naturelle en formant une solution aqueuse de cette protéine naturelle et en mainte- nant cette solution aqueuse à une température et pendant une durée suffisante pour dénaturer partiellement ladite protéifie naturelle. 6 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on dénature partiellement ladite protéine naturelle, en la mélangeant avec de l'eau pour former une solution aqueuse et en mélangeant la solution résultante avec un agent dénaturant. 7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit agent dénaturant est un acide minéral. 8 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce 3 que ledit agent dénaturant est un solvant organique miscible avec l'eau. 9 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce - que ledit agent dénaturant est un sel minéral - Procédé selon la revendication 15 caractérisé en ce que ledit support est un support insoluble dans l'eau. 11 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on met en contact laditeprotéine partiellement dénatu- rée avec ledit inhbiteur immobilisé de ladit enzyme-modèle en faisant couler cette protéine partiellement dénaturée à travers une colonne creuse qui contient l'inhibiteur en ques- tion immobilisé de l'enzyme-modèle. 12 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on-met en contact ladite protéine partiellement dénaturée avec ledit inhibiteur immobilisé de l'enzyme-modèle en trem- pant cette protéine partiellement dénaturée dans un milieu aqueux contenant ledit inhibiteur immobilisé de l'enzyme- modèle. 13 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on réticule ladite protéine partiellement dénaturée en fai- sant couler une solution aqueuse de l'agent de réticulation à travers une colonne creuse contenantla protéine dénaturée par- tiellement liée à l'inhibiteur. 14 Procédé selon la revendication-1, caractérisé en ce qu'on met en contact ladite protéine dénaturée avec ledit agent de réticulation en trempant cette protéine dénaturée partiel- lement liée à l'inhibiteur dans un milieu aqueux-contenant le- dit agent de réticulation. 15 Procédé de production d'une protéine modifiée analo- gue à une enzyme, caractérisé en ce qu'il consiste: a à choisir une protéine enzymatique active pour servir de modèle; b à choisir une seconde protéine devant être modifiée pour reproduire les caractéristiques d'activité de ladite protéine enzymatiquement active; c à choisir un inhibiteur pour laditeprotéine enzymati- quement active. d à immobiliser ledit inhibiteur de l'enzyme-modèle choisie sur un support solide; e; à dénaturer partiellement ladite seconde protéine; et f à réticuler ladite protéine partiellement dénaturée en 49 25 33217 présence dudit inhibiteur d'enzyme modèle immobilisé sur son support. 16 Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que ledit inhibiteur de l'enzyme-modèle est immobilisé sur le mode covalent sur ledit support solide. 17 Procédé selon la revendication -15, caractérisé en ce que ledit support solide est un hydrate de carbone. 18 Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que ledit hydrate de carbone est un gel d'agarose. 19 Procédé selon la'revendication 15, caractérisé en ce qu'on dénature partiellement ladite seconde protéine en formant une solution aqueuse de cette seconde protéine et en maintenant cette solution aqueuse à une température et pendant une durée suffisante pour dénaturer partiellement cette seconde protéine. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'on dénature partiellement ladite seconde protéine en la mélangeant avec de l'eau pour former une solution aqueuse et en mélangeant la solution résultante avec un agent dénaturant. 21 Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que ledit agent dénaturant est un acide minéral. 22 Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que ledit agent dénaturant est un solvant organique miscible avec l'eau. 23 Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que ledit agent dénaturant est un sel minéral. 24 Procédé selon la-revendication 15, caractérisé en ce que ledit support solide-est un support insoluble dans l'eau. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'on met en contact ladite seconde protéine partiellement dénaturée avec ledit inhibiteur immobilisé de l'enzyme-modèle en faisant couler cette seconde protéine partiellement déna- turée à travers une colonne creuse qui contient ledit inhibi- teur immobilisé de l'enzyme-modèle. 26 Procédé selon la revendication 15,, caractérisé en ce qu'on met en contact ladite seconde protéine partiellement dénaturée avec ledit inhibiteur immobilisé de l'enzyme-modèle en trempant cette seconde protéine partiellement dénaturée ' 2533217 dans un milieu aqueux qui contient ledit inhibiteur immobi- lisé de l'enzyme-modèle. 27 Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'on réticule ladite seconde protéine partiellement déna- turée en faisant couler une solution aqueuse de l'agent de réticulation à travers une colonne creuse qui contient ladite protéine partiellement dénaturée, liée à l'inhibiteur. 28 Procédé selon la revendication 15, caractérisé enh ce qu'on met en contact ladite seconde protéine partiellement dénaturée avec ledit agent de réticulation en trempant cette seconde protéine partiellement dénaturée liée à l'inhibiteur dans un milieu aqueux qui contient ledit agent de réticulation. 29 Le produit obtenu par le procédé selon la revendi- cation 1. 30 Le produit obtenu par le procédé selon la revendi- cation 15.