FR 2534594 A1 19840420 FR 8316543 A 19831018 1 2534594 L'invention est du domaine général de la technologie de l'ADN recombinant Plus précisément, elle concerne des protéines biologiquement actives, modifiées par mutation, qui diffèrent de leurs analogues parents par une ou plusieurs substitutions/suppressions de reste cystéine. Des protéines biologiquement actives qui sont produites par voie microbienne selon la technologie de l'ADN recom- binant (AD Nr), peuvent contenir des restes cystéine qui ne sont pas essentiels à leur activité, mais sont libres de former des liaisons intermoléculaires ou intxamoléculaires indésirables Une telle protéine est le béta-interféron humain produit par voie microbienne (IFN-() Au cours de la préparation de l'IFN- par des techniques avec l'AD Nr, on a observé la formation de dimères et d'oligomères d'IFN-5, produit par voie microbienne, dans des extraits de E coli contenant des concentrations élevées en IFN- Cette formation de multimères rend la purification et la séparation de l'IFN- très laborieuses et longues et néces- site plusieurs autres opérations dans les procédés de puri- fication et d'isolement, tels que la réduction de la protéine pendant la purification et la ré-oxydation pour lui redonner sa conformation originale, augmentant ainsi la possibilité d'une formation incorrecte de liaison disulfure De plus, - on a également trouvé que l'IFN- produit par voie micro- bienne montrait une activité spécifique constamment faible, due peut-être à la formation de multimères ou de ponts di- sulfure intramoléculaires désordonnés Il serait donc souhaitable de pouvoir modifier les protéines biologiquement actives, produites par voie microbienne, telles que l'IFN, d'une manière qui n'affecte pas leur activité, mais qui réduise ou élimine leur aptitude à former des réticulations intermdléculaires ou des liaisons intramoléculaires qui obligent la protéine à adopter une structure tertiaire indé- sirable (par exemple, une conformation qui diminue l'acti- vité' de la protéine). 2- L'invention a pour but de produire par des techniques de mutagénèse dirigée des protéines biologiquement actives, modifiées par mutation (ces protéines sont appelées "mutéines", Glossary of Genetics and Cytogenetics, 4 ème édition, p 381, Springer-Verlag ( 1976)>, qui conservent l'activité de leurs analogues parents, mais ne sont plus capables de former des liaisons intermoléculaires ou des liaisons disulfure intramoléculaires indésirables A cet égard,Shepard H M, et al, Nature ( 1981) 294, 563-565, décrit une mutéine d'IFN-P dans laquelle la cystéine en position 141 de sa séquence d'acides aminés (il y a trois cystéines dans l'IFN-, humain natif en les positions 17, 31 et 141, Gene ( 1980)10, 11-15 et Nature ( 1980) 285, 542- 547) est remplacée par la tyrosine Cette mutéine a été obtenue par expressicn bactérienne d'un gène hybride construit à partir d'un clone d'AD Nc d'IFN-1 partiel ayant une transition G-+A sur le nucléotide 485 du gène IFN La mutéine ne possédait pas l'activité biologique de ' l'IFN natif, ce qui a autorisé les auteurs à conclure que la cystéine remplacée était essentielle à l'activité. Les techniques de mutagénèse dirigée sont bien connues et ont été revues par Lather Ro F et Lecoq J P _dans Genetic Engineering, Academic Press ( 1983), pages 31-50. La mutagénèse dirigée sur oligonucléotide a fait l'objet d'une revue spécifique par Smith M et Gillam S dans Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press ( 1981),3, 1-32 - Selon un de ses aspect, l'invention fournit une mutéine synthétique d'une protéine biologiquement active ayant au moins un-reste cystéine, capable de former une liaison disulfure et qui n'est pas essentiel à l'activité biologique, caractérisée en ce que la mutéine a au moins un des restes cystéine supprimé ou remplacé par un autre acide aminé. Selon un autre de ses aspects, l'invention fournit des gènes structuraux synthétiques possédant des séquences d'ADN, spécifiquement conçues ("gènes construits") pour -3- coder pour les mutéines synthétiques décrites ci-dessus. Des aspects secondaires de cet aspect concernent des vecteurs d'expression qui comprennent des gènes construits structuraux, des cellules hôtes ou des organismes transformés avec ces vecteurs, et des procédés-pour produire la mutéine synthétique par culture des produits de transformation ou de leur descendance e récupérer la mutéine à partir de la culture. Dans le cas de mutéines qui présentent une utilité théra- peutique, des compositions thérapeutiques qui contiennent des quantités thérapeutiquement efficaces des mutéines constituent un autre aspect de l'invention. Selon un autre de ses aspects, l'invention fournit un procédé pour empêcher qu'une protéine ayant un ou plusieurs restes cystéine, capablesde former une liaison disulfure indésirable, ne forme une telle liaison, lequelprocédé est caractérisé en ce que la protéine est modifiée par mutation, par suppression des restes cystéine ou leur remplacement par d'autres acides aminés. Selon encore un autre de ses aspects, l'invention fournit un procédé pour la production du gène structural synthétique, décrit ci-dessus, par une mutagénèse dirigée sur Pligonucléotide, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comporte les opérations suivantes: à l'exception d' un mauvais assortiment avec le codon ou. le triplet "non-sens", selon le cas, qui définit une suppres- sion du codon ou un triplet qui code'pour l'autre acide aminé; ( b) allongement du primaire avec ll ADN polymérass pour former un hétéroduplex de mutation; et (c) réplicaticn del'hétéroduplex -de mutation. -4 - Les primaires oligonucléotides mutants utilisés dans ce procédé sont un autre aspect de l'invention. Aux dessins annexés, on a représenté: figure 1, un diagramme de la séquence d'acides aminés de IFN; figure 2, un schéma illustrant la préparation d'un gène IFN-Q mutant par mutagénèse dirigée sur un oligonucléotide; figure 3, un diagramme d'un plasmide p lbtrp comprenant le gène IFN; figure 4, un diagramme du clonage du phage vecteur M 13 mp B; figure 5, la carte de restriction du clone M 13-11; figure 6, l'image sur gel du gène IFN-a ser 17 mutant, montrant un seul changement de base dans la région codantes; figure 7, un diagramme du plasmide d'expression p Trp 3; figure 8 a,le mode de restriction Hinf I du clone p SY 2501 et figure 8 b, les deux fragment résultant 169 bp et 28 bp; figure 9, une carte de restriction du clone p SY 2501; figure 10, la séquence d'ADN codant pour la mutéine IFN 17 avec la séquence d'acides aminés correspondante; ser 17 i figure 11, la simple bande i la protéine à 18 000 daltons correspondant à IFN- ser 17 dans les extraits des clones p SY 2501 et ppltrp; figure 12, un diagramme du plasmide p LW 1 qui contient le gène interleukine-2 (IL-2) humaine, sous le contrôle du promoteur Eo Coli trp; figure 13, une carte de restriction du clone du phage M 13-IL 2; figure 14, une carte de restriction du plasmide p LW 46; figures 15 a et 15 b, la séquence de nucléotides de la chaîne codante du clone p LW 46 et la séquence des acides aminés correspondants de la mutéine IL-2 appelée IL-2 ser 125 o Modes opératoires pour appliquer l'invention L'invention fournit des mutéines de protéines biologi- quement actives dans lesquelles les restes cystéine qui ne sont pas essentiels à l'activité biologique ont été délibé- rément supprimés ou remplacés par d'autres acides aminés pour éliminer des sites de réticulation intermoléculaire ou de formation incorrecte de liaison disulfure intramoléculai- re; des gènes mutants codant pour ces mutéines; et des S procédés pour produire ces mutéines. Des protéines qui peuvent être modifiées par mutation selon l'invention peuvent 9 tre identifiées à partir d'une information concernant le teneur en cystéine des protéines biologiquement actives et les rôles joués par les restes cystéine quant à l'activité et à la structure tertiaire. Dans le cas de protéines au sujet desquelles-on ne dispose pas d'une telle information dans la littérature, ce tte information peut être obtenue en modifiant systématiquement chaque reste de cystéine de la protéine par les modes opératoires décrits ici et en déterminant l'activité biolo- gique des mutéines résultantes et leur tendance à former des liaisons disulfure intermoléculaires ou intramolécu- laires indésirables En conséquence, bien que l'invention soit décrite spécifiquement et illustrée par les exemples ci-dessous concernant des mutéines d'IFN-P et de IL-2, il est évident que les enseignements suivants s'appliquent également à toute autre protéine biologiquement active qui contient un reste cystéine fonctionnellement non-essen- tiel qui rend la protéine capable de former une liaison disulfure indésirable Comme exemples de protéines autres que IFN-? et IL-2 qui ' p e u v e N t S u b i r une modification par mutation selon l'invention, on citera la lymphotoxine (facteur de nécrose tumorale) etle facteur-1 stimulant les colonies,et IFN-" 1 Ces protéines ont normalement un nombre impair de restes cystéine,. Dans le cas de IFN,on a rapporté dans la littéra- ture que les IFN glycosylé et non-glycosylé montrent des activités spécifiques qualitativement semblables et qu'en conséquence, les parties glycosyle ne sont pas impliquées dans et ne contribuent pas à l'activité biologique d'IFN-P. Mais l'IFN- produit par voie bactérienne, qui ne contient 6- pas d'unités glycosyle, montre constamment une activité spécifique quantitativement inférieure à celle d'IFN- qui est glycosylé L'IFN t est connu pour posséder trois restes cystéine en les positions 17, 31 et 141 Shepard et al, ci-dessus, ont démontré que la cystéine 141 est essen- tielle pour l'activité biologique Dans l'IFN ', qui con- tient quatre restes cystéine, il y a deux liaisons -5-S- intramoléculaires; l'une entre cys 29 et cys 138 et l'autre entre cys I et cys 98 A partir de l'homologie entre IFN- et IFN-o, cys 141 d'IFN-? courrait être impliqué dans une liaison -S-S intramoléculaire avec cys 31, laissant cys 17 capable de former des réticulations intermoléculaires. En supprimant cys 17 ou en le remplaçant par un autre acide aminé, on peut alors déterminer si cys 17 est essentiel à l'activité biologique et quel est son rôle dans la forma- tion de liaison -SS- Si cys 17 n'est pas essentiel pour l'activité biologique de la protéine, la protéine sans cys 17 ou dans laquelle on a remplacé cys 17, résultante, pourrait montrer une activité spécifique proche de celle d'IFN- natif et ceci pourrait faciliter également l'isolement et la purification de la protéine. En utilisant le procédé de mutagénèse dirigé sur oligo- nucléotide, avec un primaire oliqonucléotide synthétique complémentaire de la région du gène IFN-? au codon pour cys 17, mais qui contient des modifications de base simple ou multiple dans ce codon, il est possible de produire un gène "construit" en remplaçant cys 17 par un autre acide aminé choisi. Lorsqu'on désire une suppression, le primaire oligcnucleotide ne possède pas de codon pour cys 17 La conversion de cys 17 en des acides aminés neutres tels que la glycine, la valine, l'alanine, la leucine, l'isoleucine, la tyrosine, la phényl- alanine, l'histidine, le tryptophane, la sérine, la thréo- nine et la méthionine constitue l'approche préférée La sérine et la thréonine sont les acides aminés de remplacement particulièrement préférés en raison de leur analogie chimi- que avec la cystéine Lorsque la cystéine est supprimée, la mutéine mature est plus courte d'un acide aminé que la pro- téine parente native ou l'IFN 4 p produit par voie microbienne, L'IL-2 humaine est connue pour avoir trois restes cystéine en les positions 58, 105 et 125 de la protéines Comme dans le cas d'IFN- IL-2 se présente sous une forme oligomère agrégée après isolement à partir de cellules bac- tériennes et doit être réduite par des agents réducteurs pour obtenir un bon rendement à partir des extraits bacté- riens De plus, la protéine IL-2 réduite, purifiées, est instable et se réoxyde facilement au stockage en une forme oligomère inactive La présence de ces trois cystéines signifie que par réoxydation la protéine peut former au hasard l'un des trois ponts diàulfure intramoléculaires possibles, l'un seulement d'entre eux étant le pont correct trouvé dans la molécule native Etant donné qu'on ne connait pas la structure disulfure de la protéine IL-2 natives il est possible d'utiliser l'invention pour créer des mutas tions aux codons 58, 105 et 125 du gène IL-2 et identifier les résidus de cystéine qui sont nécessaires pour l'activité et par conséquent les plus probables à impliquer dans la formation du pont disulfure natif De la même manière, I. reste cystdine qui n'est pas nécessaire pour l'activité, peut 8 tre modifié de manière à éviter la formation de ponts disulfure intramoléculaires incorrects et minimiser le risque de ponts disulfure intermoléculaires en éliminant ou en remplaçant le résidu cystéine libre. La dimension du primaire oligonuclêotide est déter- minée par la nécessité d'une hybridation stable du primaire dans la région du gène o la mutation doit 8 être induite et par les limites des procédés actuellement disponibles pour synthétiser des oligonucléotides Les facteurs à considérer dans la constitution d'oligonucléotides utilisables dans la mutagénèse dirigée sur un oligonucléotide (par exemple dimension globale, dimensions des portions adjacentes au. site de mutation) sont décrits par Smith Mo et Gillam S,, ci-dessus De manière générale, la longueur totale de loli gonucléotide doit permettre d'optimiser une hybridation unique, stable sur le site de mutation, les extensions 5 ' et 3 ' à partir du site de mutation ayant une dimension suffisante pour éviter que la mutation ne soit dirigée par l'activité exonucléase de l'ADN polymérase Les oligonucléo- tides utilisés pour la mutagénèse selon l'invention contien- nent normalement environ de 12 à 24 bases, de préférence environ ds 14 à 20 bases et avantageusement environ de 15 à 18 bases Ils contiennent normalement au moins environ trois bases 3 ' du codon modifié ou manquant. Le procédé pour préparer le gène IFN-e modifié implique de manière générale l'induction d'une mutagénèse spécifique d'un site dans le gène IFN-( au codon 17 (TGT) au moyen d'un primaire oligonucléotide synthétique qui omet le codon ou le modifie de manière à ce qu'il code pour un autre acide aminé Lorsque la thréonine remplace la cystéine et que le primaire est hybridé avec la chaîne "non-sens" du gène IFN-, le nucléotide primaire préféré est GCAATTTTCACTCAG (la partie soulignée représente le codon modifié) Lorsqu'il est souhaitable de supprimer la cystéine le primaire préféré est AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTG qui omet le codon TGT pour cys Lorsque la cystéine est remplacée par la sérine, on choisit de préférence un primaire à 17 nucléotides, GCAATTTTCAGAGTCAG, qui comprend un codon AGT pour la sérine La-transition T A de la première base dans le codon 17 cys se traduit par le remplacement de la cystéine par la sérine Il faut reconnattre que lorsqu'on introduit des suppressions, le système de lecture conve- nable pour la séquence d'ADN doit être maintenu pour l'expression de la protéine désirée. La primaire est hybridé avec un phage mono-caténaire tel que M 13, fd ou OX 174 dans lequel on a cloné une chaine du gène IFN- o Il faut noté que le phage peut porter la chaine "qui a un sens" ou la chaîne "non-sens" du gène. Lorsque le phage porte la chaîne "non-sens", le primaire est identique à la région de la chaîne "qui a un sens", qui -9- contient le codon à muter, si ce n'est un mauvais assortiment avec ce codon,qui définit une suppression du codon ou un triplet qui code pour un autre acide aminé. Lorsque le phage porte la chaîne "qui a un sens", le primai- re est complémentaire de la région de la chaîne "qui a un sens", qui contient le codon qui doit être muté, si ce n'est un mauvais assortiment approprie dans le triplet qui est apparié avec le codon à supprimer Les con- ditions utilisables dans l'hybridation sont décrites par Smith M et Gillam S, ci-dessus La température est norma- lement comprise entre 0 et 700 C, de préférence entre 10 et C Après l'hybridation, le primaire est prolcngé sur l'ADN du phage par réaction avec l'ADN polymérase I, la T 4 ADN polymérase, la reverse transcriptase ou d'autres ADN polymérases appropriées L'ADN bicaténaire résultant est converti en ADN bicaténaire circulaire fermé,par traite- ment avec une ADN ligase telle que la T 4 ADN ligaseo Les molécules d'ADN contenant des régions mono-caténaires peuvent être détruites par un traitement avec la 51 endo- nucléase. Une mutagénèse dirigée sur un oligonucléotide peut être également utilisée pour produire un gène IL-2 mutant qui code pour une mutéine ayant une activité IL-2, mais dont cys 125 est changé en sérine 125 Le primaire oligo- nucléotide utilisé dans la production de ce gène IL-2 mutant lorsque le phage porte la chaîne "qui a un sens du gène, est GATGATGCTTCTGAGAAAAGGTAATC Cet oligonucléotide comporte un changement C _G sur la base centrale sur le triplet qui est apparié avec le codon 125 du gène IL-2. L'hétéroduplex de mutation résultant est alors utilisé pour transformer un organisme ou une cellule hôte compétent. La réplique de l'hétéroduplex par l'hôte fournit des des- cendants à partir des deux chaenes Après la réplique, le gène mutant peut 6 tre isolé à partir des descendants de-la chaîne mutante, inséré dans un vecteur d'expression appro- prié, puis le vecteur utilisé pour transformer un organis- 253 kln 94 me ou cellule hâte approprié Comme vecteurs appropriés, on citera les plasmides p BR 322,p CR 1 et leurs variantes, des vecteurs synthétiques et autres Des organismes hâtes appropriés sont E coli, Pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, différentes souches de levures, Bacillus thermophilus, des cellules animales telles que des cellules de souris, de rat ou d'ovaires d'hamster de Chine (CHO), des -ellules végétales, des hâtes animaux et végétaux et similaires Il faut noter que lorsqu'un hâte choisi est transformé avec le vecteur, des séquences promo- teur-opérateur appropriées sont également introduites de manière à exprimer la mutéine Les h 8 tes peuvent être procaryotes ou eucaryotes ( des procédés pour l'insertion d'ADN dans des cellules eucaryotes sont décrits dans les "PCT applications", n U 581/00239 et USB 1/00240, publiés le 3 septembre 1981) Les hâtes préférés sont E coli et les cellules CHO Les mutéines obtenues selon l'invention peuvent être glycosylées ou non-glycosylées, selon la glycosylation se produisantdans la protéine parente native et l'organisme hôte utilisé pour-produire la mutéine Si celà s'avère souhaitable, une mutéine non-glycosylée - obtenue lorsque l'organisme hôte est E coli ou un Bacilus. peut être éventuellement glycosylée in vitro par voie chi- mique, enzymatique ou par d'autres types de modifications connus dans la technique. Dans le mode de réalisation préférée de l'invention relative à IFN-f, le reste cystéine en position 17 dans la séquence d'acides aminés d'IFN-, tel que représenté sur la figure 1 des dessins annexés, est changé en sérine par une transition T->A de la première base du codon 17 de la chaîne "qui a un sens" de la séquence d'ADN qui code pour IFN- mature La mutagénèse spécifique du site est induite au moyen dlun primaire à 17 nucléotides GCAATTTTCAGAGTCAG, identique à la séquence de 1 7 nucléoti- des dla chaîne "qui a un sens" d'IFN-@ dans la région du codon 17, si ce n'est un mauvais assortiment d'une 11 - simple base sur la première base du codon 17 Le mauvais assortiment est spr le nucléotide 12 dans le primaire Il faut noter que le code génétique est dégénéré et que de nom- breux acides aminés peuvent être codés par plus d'un codon. Le code de base pour la sérine, par exemple, est dégénéré de 6 manières, et donc les codons TCT, TCG, TCC, TCA, AGT et ACG codent tous pour la sérinse, Le codon AGT a été choisi par convenance pour le mode de réalisation préfé 6 ré De même, la thréonine est codée par l'un quelconque des codons ACT, ACA, ACC et ACG Il est entendu que lorsqu'un codon est spé- cifié pour un acide aminé particulier, il comprend tous les codons dégénérés qui codent poux cet acide aminé, Le mer 17 est hybridé avec un ADN provenant d'un phage M 13 mono-caté- naire qui porte la chains " non-sens" du gène IFN- o Le primaire oligonucléotide est alors allongé sur l'ADN au moyen d'un fragment Klenow de l'ADN polyméfase I et l'ADN bicaténaire résultant est converti en ADN circulaire fermé avec la T 4 ligase Une réplique de l'hétéroduplex de muta- tion résultant donne des clones à partirde la chaîne d'ADN contenant le mauvais assortiment Des clones mutants peuvent être identifiés et sélectionnés par l'apparition ou la dis- parition de sites de restriction spécifiques, la résistance ou la sensibilité aux antibiotiques ou par d'autres procédés connus dans la technique Lorsque la cystéine est remplacée par la sérine, la transition T^-+A, représentée sur la figure 2 des dessins annexés, se traduit par la création d'un nou- veau site de restriction Hinf I dans le gène structural Le clone mutant est-identifié en utilisant l'oligonucléotide primaire comme un mbdéle dans une sélection par,hybrida- tion des plaques de phages mutés Le primaire comporte un. seul mauvais assortiment lorsqu'il est hybridé avec le parent, mais montre un assortiment parfait lorsqu'il est hybridé avec l'ADN du phage muté, tel que représenté sur la figure 20 Les conditions d'hybridation peuvent alors être choisies de telle sorte que le primaire oligonucléotide hybride de préférence avec l'ADN muté, mais pas avec l'ADN parent,, g 4 4 Le nouveau site engendré Hinftl I sert également comme moyen de confirmation de la simple mutation de base dans le gène IFN L'ADN du phage M 13 portant le gène muté est isolé et adjoint à un vecteur d'expression approprié tel que le plasmide p Trp 3, et la souche MM 294 de E coli est transformée avec le vecteur Des milieux de- développement appropriés pour la culture des produits de transformation et de leur descendance sont connus des spécialistes de la technique. La mutéine de IFN-P exprimée est isolée, purifiée et carac- térisée. Les exemples non-limitatifs suivants sont donnés à %itre d'illustration de l'invention Les exemples 1 à 9 décrivent la préparation d'une mutéine de IFN- Les ex- emples 10 à 15 décrivent la préparation d'une mutéine de IL-2. Exemple 1 Clonage du gène IFN-A dans le vecteur M 13 L'utilisation du vecteur du phage M 13 comme source de copie d'ADN mono-caténaire a été démontrée par G F Temple et al, Nature ( 1982) 296, pages 537-540 On fait digérer le plasmide p ltrp (figure 3) contenant le gène IFN-p sous contr le du promoteur trp de E coli, avec les enzymes de restriction Hind III et Xho I Io On fait digérer l'ADN de la forme répliquée (RF) M 13 mp B (figure 4) (J Messing, "Third Cleveland Symposium on Macromolecules: Recombinant DN Al I, Ed A Wealton, Elsevier Press, 143-153 ( 1981) avec les enzymes de restriction Hind III et Bam HI, et on mélange avec l'ADN p S ltrpqu'on a préalablement fait digérer avec 3 O Hind II et Xho II On relie le mélange avec la T 4 ADN ligase et l'ADN lié est transformé dans des cellules compétentes de E coli souche JM 103 et appliqué sur des plaques d'indi- cateur Xgal(J Messing et al, Nucleic Acids Ras ( 1981), pages 309-321) On rassemble les plaques contenant le phage recombinant (plaques blanches), on inocule dans une culture fraîche de JM 103 et à partir des cellules infectées 13 _ on obtient des mini-préparations de molécules RF (H D Birn- boim et J Doly, Nucleic Acid Res ( 1979) 7, 1513-1523). On fait digérer les molécules RF avec différentes enzymes de restriction pour identifier les clones contenant l'insert IFN- La carte de restriction d'un tel clone (M 13 1) est reproduite sur la figure 5 des dessins annexés On prépare l'ADN mono-caténaire provenant du phage à partir du clone M 13-t 1 pour servir de copie pour une mutagénèse spécifique d'un site en utilisant un oligonucléotide synthétique. Exemple 2 Mutaqénèse spécifique d'un site x On traite 40 picomoles de l'oligonucléotide synthétique 6 CAATTTTCAGAGTCAG (primaire) avec la T 4 kinase en présence de 0,1 m M d'adénosine triphosphate (ATP), 50 m M de chlorhy- drate d'hydroxyméthylaminométhane (Tris-H Cl) de p H 8,0, m M de Mg C 12, 5 m M de dithiothréitol (DTT) et 9 unités de T 4 kinase, dans 50 pil à 37 C pendant 1 heure On hybride le primaire traité avec la kinase ( 12 pmoles), avec 5,ug d'ADN MJ 3- 1 mono-caténaire -dans 50/pl d'un mélange conte- nant 50 m M de Na Cl, 10 m M de Tris-HC 1 de p H 8, 0, 10 m M de Mg C 12 et 10 m M de S -mercaptoéthanol, en chauffant à 67 PC pendant 5 minutes et à 42 C pendant 25 minutes, On refroidit le mélange ainsi traité sur de la glace et on ajoute 50,,u L d'un mélange réactionnel contenant 0,5 m M de chacun des désoxynucléoside triphosphates (d NTP), 80 m M de Tris-HC 1 de p H 7,4; 8 m M de Mg C 12, 100 m M de Na Cl, 9 unités d'ADN polymérase I, fragment Klenow, 0,5 m M d'ATP et 2 unités de T 4 ADN liguse, on incube à 37 C pendant 3 heures et à 250 C pendant 2 heures On termine alors la réaction par une ex- traction au phénol et une précipitation avec de l'éthanol. On dissout l'ADN dans 10 m M de Tris-H Cl de p H 8,O, 10 m M d'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA), 50 % de sucrose et 0,05 % de bleu de bromophénol et on soumet à une électrophorèse sur un gel d'aragose à 0, 8 % en présence de 2 pg/ml de bromure d'éthidium On élue les bandes d'ADN 14 - correspondant aux formes RF de M 13-Pl à partir de découpes de gel par le procédé au perchlorate (R W Davis et al, "Advanced Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Labora- tory, N Y pages 178-179 ( 1980))o On utilise l'ADN élué pour transformer des cellules compétentes de JM 103, on laisse se développer pendant une nuit et on isole l'ADN mono-caté- naire à partir du produit surnageant de la culture On utilise cet ADN mono-caténaire comme copie dans un second cycle d'extension du primaire, on transforme les formes RF purifiées sur gel,de l'ADN dans des cellulescompétentes JM 103, on dépose sur des plaques de gélose et on incube pendant une nuit pour obtenir des plaques de phage. Exemple 3 Mutaqénèse spécifique d'un site On répète l'expérience de l'exemple 2 cidessus, si ce n'est qu'on utilise comme primaire oligonucléotide synthé- tique GCAATTTTCAGACTCAG pour changer le codon 17 du gène IFN- en partant d'un codon qui code pour la cystéine pour arriver à un codon qui code pour la thréonine. Exemple 4 Suppression de la spécificité d'un site On répète l'ex périence de l'exemple 2 ci-dessus, si ce n'est que le primaire oligonucléotide synthétique utilisé est AGCAATTTTCA GCAGAAGCTCTG pour supprimer le codon 17 du-gène IFN-j. Exemple 5 Sélection et identification des plaques obtenues par muta- qénèse On refroidit à 4 C des 'lames contenant des plaques de M 13-j 1 muté (exemple 1) ainsi que deux lames conte- nant des plaques de phage M 13- 1 non-muté et on transfère des plaques de chaque lame sur deux ronds de papier-filtre en nitrocellulose en plaçant un filtre sec sur la lame de gélose pendant 5 minutes pour le premier filtre et 15 minutes pour le second filtre On place alors les filtres sur des papiers filtres épais imbibés dans Na OH 0,2 N, Na Cl 1,5 M et 0,2 % de Triton X-100 pendant 5 minutes, puis on neutralise en recouvrant avec des papiers filtres impré- gnés de 0,5 M de Tris-HC 1 de p H 7,5 et 1,5 M de Na Cl pen- dent 5 autres minutes On lave deux fois les filtres de la même manière sur des filtres imprégnés dans SSC x 2 (solu- tion saline de citrate standard, on sèche et on cuit dans une étuve à vide à 80 C pendant 2 heures On pré-hybride les filtres en double à 55 C pendant 4 heures avec 10 ml par filtre d'un tampon d'hybridation d'ADN (SSC x 5) de p H 7,0, une solution de Denhardt x 4 (polyvinylpyrrolidone, ficoll et albumine sérique bovine, I fois = 0, 02 % de chacune des substances), 0,1 % de dodécyl sulfate de sodium (SDS), 50 m M de tampon de phosphate de sodium de p H 7,0 et ,ug/ml d'ADN de sperme de saumon dnaturéo On prépare un modèle marqué à 32 P en traitant par-une kinase le primaire oligonucléotide avec ATP marqué à 32 p On hybride les fil- 32 tres avec 3,5 x 10 cpm/ml de primaire marqué à P dans ml par filtre de tampon d'hybridation d'ADN à 55 C pendant 24 heures On lave les filtres à 55 C pendant 30 minutes chacun dans des tampons de lavage contenant 0, 1 % de SDS et des quantités décroissantes de SS Co On lave initialement les filtres avec un tampon contenant du SSC x-2 -et on examine les filtres témoins contenant des plaques de M 13- 1 non-muté, quant à la présence d'une radioactivité quelconque, en utilisant un compteur-de Geiger On abaisse progressivement la concentration en SSC et on lava les filtres jusqu'à disparition de toute radioactivité détectas ble sur les filtres témoins avec-des plaques de M 13 i non= muté La plus faible concentration en SSC utilisée est de SSC x 0,1 o On sèche les filtres à l'air-et on les soumet à une autoradiographie à -70 C pendant de 2 à 3 jours Avec le modèle d'oligonucléotide traité par une kinase, on sélec- tionne 480 plaques de M 13 t j 1 muté et 100 plaques témoins de M 13 f 1 non"mutéo Aucune des plaques témoins n'hybride avec le modèle, alors que 5 plaques de M 13 ? 1 muté hybri= dent avec 1 e modèleo 16 - On recueille une des 5 plaques de M 13-g 1 muté (M 113 Y 2501) et on inocule dans une culture de JM 103 On prépare un ADN mono-caténaire à partir du liquide surnageant et un ADN bicaténaire à partir du culot de cellules On utilise l'ADN monocaténaire comme copie pour la séquence didésoxy du clone avec le primaire universel M 13 Le résultat de l'analyse de la séquence est reproduit sur la figure 6, confirmant que le codon cys TGT a bien été converti en un codon ser AGT. Exemole 6 Expression d'IFN-L muté dans E coli On fait digérer l'ADN RF de M 13-SY 2501 avec les enzymes de restriction Hind III et Xho II et on purifie le fragment d'insert 520 bp sur un gel d'agarose à 1 % On fait digérer le plasmide p Trp 3 contenant le promoteur trp E coli (figure 7) avec les enzymes Hind III et Bam HI, on mélange avec le fragment d'ADN M 13-SY 2501 purifié et on mlie en présence de T 4 ADN ligase L'ADN ligaturé est transformé dans une souche MM 294 de E coli On sélectionne les produits de transformation résistant à ltampicillinequant à leur sensi- bilité au médicament de tétracycline On fait digérer l'ADN plasmique provenant de 5 clones résistant à l'ampicilline, sensibles à la tétracycline avec Hinfl pour déterminer la présencei l'insert M 13-SY 2501 La figure Bareproduit le mode de restriction par Hinf I d'un des clones (p SY 2501), le comparant au mode de restriction par Hinf I du clone d'IFN-? original, p ltrp Comme attendu, on observe un site supplémentaire Hinf I dans p SY 2501, coupant le fragment interne 197 bp IFN-p en un fragment 169 bp et un fragment 28 bp (figure 8 b) Une carte de restriction du clone p SY 2501 est reproduite sur la figure 9 La séquence totale d'ADN du gêne IFN-Q mutant et reproduite sur la figure 10 avec la séquence des acides aminés prévue. Le plasmide désigné comme le clone p SY 2501 est déposé auprès de léAgricultural Research Culture Collec- tion (NRRL), Fermentation Laboratory, Northern Regional 17 - Research Center, Science and Education Administration, U S. Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 60604 et a reçu les numéros d'irmatricula- tion CMCC N -1533 et NRRL no E-15356. Les cultures de p SY 2501 et p ltrp, qui comprennent leur descendance, sont poursuivies jusqu'à une densité opti- que (D 600) de 1,0 On prépare des extraits sans ellules et on détermine l'activité antivirale d'IFN sur des cellules de GM 2767 dans un microtitrage Les extraits du clone p SY 2501 montrent une activité de 3 à l Iu fois supéri- eure à celle de ptltrp (Tableau I), indiquant que le clone p SY 2501 a synthétisé plus de protéine montrant une-activité IFN"t ou que la protéine obtenue a une activité spécifique supérieure Tableau I Extrait Activité antivirale (U-/ml) p SY 2501 6 x 105 p ltrp 1 x 1 l D 5 ptrp 3 (témoin) 30 Pour déterminer si le clone p SY 2501 a synthétisé plu- sieurs fois une protéine plus active, on soumet les extraits des deux clones a une électrophorèse sur un gel de polyacryl- amide SDS avec un extrait témoin et on colore le gel avec du bleu de Coomassie pour visualiser les protéines Comme montré sur la figure 11 on n'observe qu'une seule bande de protéine correspondant à une protéine apparente à 18000 daltons, présente dans les extraits des clones p SY 2501 et p 3 ltrp, mais non dans l'extrait témoin ptrp 3 Cette protéine qui a une masse moléculaire d'environ 20 000 daltons, mais montre un mode de migration sur gel d'une protéine de 18 000 daltons, s'est montrée au préalable être IFN par purifi- cation de cette protéine à partir d'extraits de pp ltrp. Etant qu'il y a une moindre quantité de cette protéine dans les extraits de p SY 2501 que dans'les extraits de p pltrp, l'activité spécifique dela protéine dans des extraits du clone p SY 2501 est supérieure à celle du clone p îltrp. 1 B- Exemole 7 Purification de IFN 5 ser 17 On recueille IFN-_ser 17 à partir de E coli qu'on a transformé pour produire IFN ser 17 On cultive E coli dans le milieu de culture suivant à une DO de 10-11 à 680 nm poids sec 8,4 g l). Ingrédient Concentration NH 4 Cl 20 m M K 2504 16,1 m M KH 2 PO 4 7,8 m M Na 2 HPO 4 12,2 m M Mg SO 47 H 20 3 m M Citrate trisodique, di-hydraté 1, 5 m M Mn SO 44 H 2 30 p M 4 2 Zn 504 7 H 20 30 u M Cu 504 5 H 20 3 p M L-tryptophane 70 mg/1 Fe SO 47 H 20 72 IM Thiamine H Cl 20 mg/1 Glucose 40 g/1 Ajustement du p H avec NH 40 H On refroidit à 20 C 9,9 litres ( 0,9 kg) de culture de E.coli transformé et on concentre en faisant passer la culture sur un filtre à écoulement transversal sous une chute de pression moyenne d'environ 110 k Pa et un débit de filtrat constant de 260 ml/mn jusqu'à ce le filtrat pèse 8,8 kg. On verse le produit concentré (environ un litre) dans une cuve et on refroidit à 15 C On rompt les cellules dns le produit concentré en le faisant passer sur un homogénéiseur de Manton-Gaulin à 5 C, environ 69 000 k Pa On lave l'homo- généiseur avec un litre de solution saline tamponnée au phosphate, de p H 7,4 (PBS) et on ajoute l'eau de lavage au produit de ellules brisées pour obtenir un volume final de 2 litres On centrifuge ce volume en continu à 12000 x g à un débit de 50 ml/mn On sépare le solide du produit sur- 19 _ nagent et on remet en suspension dans 4 litres de PBS conte- nant 2 % en poids de SDS On agite cette suspension à la température ambiante pendant 15 minutes, après quoi il n'y plus de matériau visible en suspension On extrait alors la solution avec du 2-butanol dans un rapport volumique 2-bu- * tanol/solution de 1:1 On effectue l'extraction dans un sépa- rateur de phases liquide-liquide avec un débit de-200 ml/mn. On sépare alors la phase organique et on évapore à sec pour obtenir 21,3 g de protéine On remet cette dernière en sus- pension dans de l'eau distillée dans un rapport volumique de 1:10. Dans le produit recueilli, on détermine l'activité IFN- humain au moyen d'un essai basé sur la protection contre l'effet cytopathique viral (CPE)o L'essai est effectué sur des plaques de microtitrage Dans chaque puits, on introduit p 1 de milieu essentiel minimum et dans le premier puits on place 25 pl de l'4 chantillon, dans les puits suivants on fait des dilutions en série selon un rapport volumique de 1:3 Sur chaque plaque, on dépose des témoins de virus (stomatite vésiculaire), de cellules(lignée de fibroplastes humains GM-2767) et d'IFN)b Le témoin IFN-y est utilisé à raison de 100 unités par ml On irradie ensuite les plaques avec une lumière UV pendant 10 minutes, Après l'irradiation, on ajoute i O 10 ul de la suspension de cellules ( 1,2 x 105 cellules/ml) dans chaque puits et on incube les plateaux pendant de 18 à 24 heures Dans chaque puits, à l'exception du témoin de cellules, on ajoute une solution de virus à raison d'un unité formant une plaque/cellule On incube les plateaux j Usqu'à ce que le témoin de virus montre un CPE de 100 % Ceci se produit généralement 18 à 24 heures après avoir ajouté la solution de virus On interprète les résultats de l'essai quant à l'emplacement du puits à 50 % de CPE du témoin IFN- de références On détermine à partir de ce point le titre en int erféron pour tous les échantillons sur la plaque L'activité spécifique du produit recueilli est évaluée à 5 x 107 U/mg, 2 4 94 - Exemple 8 Précipitation avec un acide et purification chromatosaophiqu Un répète le procédé de l'exemple 7, si ce n'est qu'à- pràs l'extraction i la séparation des phases aqqeuse et orga- nique et le mélange de la phase organique avec du PBS selon un rapport volumique de 3:1, on abaisse le p H du mélange vers 5 par addition d'acide acétique glacial Un sépare le précipité résultant parcentrifugation à 10 OOC 17 000 x g pendant 15 minutes et on redissout le culot dans du SDS à 10 % en poids/volume, 10 m M de DTT, 50 m M de tampon d'acé- tate de sodium de p H 5,5 et on chauffe à 80 C pendant 5 mi- nutes. On verse ensuite la solution sur une colonne "Aquapore" de Brownlee RP-300, 10 u M an utilisant un système de gra- dient de Beckman Le tampon A est 0,1 % d'acide trifluozo- acétique (TFA) dans H 20, le tampon B est 0,1 % de TFA dans l'acétonitrile La détection se fait par absorbance ultraviolette à 280 nm Le solvant est programmé selon un gradient linéaire de O % de tampon B à 100 % de tampon B en 3 heures On rassemble les fractions contenant les plus fortes activités en interféron et on détermine l'activité spécifique de la préparation d'interféron rassemblée comme étant de 9,0 x 107 à 3,8 x 108 unités internationales/ mg de protéine, comparée à environ 2 x 108 U/mg pour IFN-J natif. Exemple 9 Caractérisation biochimique de IFN-, Ber 17 * On détermine les compositions en acides aminés après une hydrolyse de 24 à 72 heures d'échantillons de 40 pl s* 30 d'IFN dans 200 il de HC 1 5,7 N et 0,1 % de phénol, à 108 "C. On détermine la proline et la cystéine de la meme manière après une oxydation à l'acide performique; dans ce cas, on omet le phénol pour l'hydrolyse On analyse le tjyptophane après une hydrolyse de 24 heures d'échantillons de 400,ul dans HC 1 5,7 N et 10 % d'acide mercaptoacétique (sans phénof On effectue l'analyse sur un analyseur pour acides aminés 21 - Beckman 121 MB en utilisant une simple colonne de résine AA 10. La composition en acides aminés calculée à partir d'hy- drolyses acides représentatives de 24, 48 et 72 heures de IFN-jn Ser 17 purifié concorde bien avec celle prédite par la séquence d'ADN des clones du gène IFN, moins la méthionine N-terminale absente. On détermine la séquence d'acides aminés des 58 premiers résidus de la terminaison acide aminé d'IFN purifié sur un éhantillon de 0,7 mg dans un "Sequanator" Beckman 890 C avec un tampon de Quadrol 0,1 M On détermine les acides aminés de PTH par chromatographie en phase liquide sous haute pression, en phase inversée, sur une colonne d'ultrasphères ODS Altex ( 4, 6 x 250 mm) à 45 "C en éluant à 1,3 minute avec % de tampon A et à 8,4 minutes avec de 40 à 70 % de tampon B, le tampon A étant constitué de 0, 0115 M d'acétate de sodium et 5 % de itrahydrofuranne (THF),de p H 5,11, et le tampon B de 10 % de THF dans l'acétonitrile. La séquence d'acides aminés N-terminaux d'IFN-l Ser 17, déterminée, correspond à la séquence attendue, prédite à partir de la séquence d'A-N, si ce n'est l'absence de méthio- nine N-terminale. Tel qu'indiqué ci-dessus, la préparation d'IFN-3 serl? montre des taux d'activité spécifique très proches de,ou supérieurs à ceux d'IFN-, natif IFN ser I ne contient pas de groupes sulfhydryle libres, mais montre une liaison -S-S entre les seules cystéines restantes en les positions 31 et 141 La protéine ne forme pas facilement d'oligomères et semble être pratiquement-sous la forme monomèreo IFN-j ser 17 obtenu selon l'invention peut être formulé comme un simple produit ou comme des mélanges de diverses formes, dans des préparations pharmaceutiquement accepta- bles avec des milieux de véhiculesnon-toxiques, non-aller- gisants, physiologiquement acceptables, pour des utilisa- tions cliniques et thérapeutiques dans la thérapie du cancer ou dans des conditions o une thérapie par l'interféron est indiquée, et dans le cas d'infections virales Comme exemples 22 - de ces milieux, on citera sans que la liste en soit exhaus- tivé, l'eau distillée, une solution saline physiologique, une solution de Ringer, une solution de Hank et similaires. D'autres adjuvants de stabilisation et de solubilisation tels que le dextrose, la HSA (albumine sérique humaine) et autres peuvent être incorporés de manière optimale Les formulations thérapeutiques peuvent être administrées par voie orale ou parentérale, tel que des administrations intraveineuses, intramusculaires, intrapéritonéales ou souscutanées Les préparations d'IFN-? modifié de l'invention peuvent également être utilisées pour des applications topiques dans des mi- lieux appropriés, normalement utilisés dans ces cas. Les principaux avantages de la mutéine de IFN-b décrite ci-dessus résultent de l'élimination d'un groupe sulfhydryle libre en position 17 dans IFN-P, forçant ainsi la protéine à former des liaisons disulfure correctes entre cys 31 et cys 141 et à assumer la conformation ostensiblement requise pour une activité biologique totale L'activité biologique plus élevée de IFN-A servi permet l'emploi de plus faibles doses dans des administrations thérapeutiques -En supprimant la cystéine en position 17 et en éliminant le groupe -SH libre, la protéine IFNI ser 17 ne forme pas de dimères, ni d'oligomères aussi facilement que l'IFNproduit par voie microbienne Ceci facilite la purification de la protéine et augmente sa stabilité. Exemple 10 La séquence de nucléotides pour un clone d'AD Nc codant pour la IL-2 humaine, des modes opératoires pour préparer des registres d'AD Nc de IL2 et pour leur sélection quant à IL-2 sont décrits par Taniguchi T et al, Nature ( 1983) 24, pages 305 et suivantes. On obtient des registres d'AD Nc enrichis en clones d'AD Nc de IL-2, potentiels, à partir de fractions d'AR Nm enrichies en IL-2 provenant de lymphocytes sanguins péri- phériques (PBL) et de cellules de Jurkat par des procédés classiques On enrichit l'AR Nm quant au message IL-2 par un fractionnement de l'AR Nm et une identification de la fraction ayant une activité AR Nm de IL-2 par injection des fractions dans des oocytes de Xenopus laevis et en détermi- nant l'activité en IL-2 des lysats d'ooocytes sur des cal- lules HT-2 (J Watson, J Exp Med ( 1979) 150, pages 1570- 1579 et S Gillis et al, J Immun ( 1978) 120, pages 2027- 2032). Exem ple 11 Sélection et identification de clones d'AD Nc de IL-2 On sélectionne les registres d'AD Nc de IL-2 en utilisant le procédé d'hybridation de colonies On réplique chaque plaque de micro-titrage sur des papiers filtres en nitro- cellulose (S & S type BA-85)(essais en double) et on laisse se développer des colonies à 37 C pendant de 14 à 16 heures sur de la gélose L contenant 50 ug/ml d'ampicilline On lyse les Colonies et on fixe l'ADN sur le filtre par un traite- ment séquentiel pendant 5 minutes avec 500 m M de Na OH, 1,5 M Na Cl, on lave deux fois pendant 5 minutes chaque fois avec la solution seline de citrate standard (SSC) 5 fois concentrée Un sèche les filtres à l'air et on cuit à 800 C- pendant 2 heures On pré-hybride les filtres en double à 42 C pendant de 6 à 8 heures avec 10 ml par filtre de tampon d'hybridation d'ADN ( 50 % de-formamide, 55 C x 52 p H de 7,0, solution de Denhardt x 5 (polyvinylpyrrolidone, ficoll et albumine sérique bovine; 1 fois = 0,2 % de chacune de ces substances), 50 m M de tampon de phosphate de sodium à un p H de 7,0, 0,2 % de SDS, 20 Pg/ml de Poly U et 50 pg/ml d'ADN desperme de saumon dénaturé. On prépare un modèle d'oligonucléotide 20-mère marqué à 32 p d'après la séquence du gène IL-2 rapportée par Tani-= guchi T et al, voir ci-dessus La séquence de nucléotides du modèle est GTGCCTTCTTGGGCATGT Ao On hybride les échantillons à 420 C pendant de 24 à 36 heures avec 5 ml par filtre de tampon d'hybridation dv ADN contenant le modèle d'AD Nc marqué à 32 po On lave les fil tres avec 2 fois SSC x 2 et 0,1 % de SDS à 500 C pendant minutes chaque fois, puis on lave avec deux fois 55 C x 1, 0,1 I' de SDS à 50 C pendant 90 minutes chaque fois, on sèche à l'air et on autoradiographie à -70 C pendant de 2 à 3 jours On identifie les clones positifs et on les sélectionne de nouveau avec le modèle On identifie de pleines longueurs de clones et on confirme en établissant une carte d'enzymes de restriction et par comparaison avec la séquence du clone d'AD Nc de IL-2 rapportée par Taniguchi T et a Il, ci-dessus. Exemple 12 Clonaqe du one IL-2 dans le vecteur M 13 On clone le gène IL-2 dans M 13 mp 9 tel que décrit dans l'exemple 1 en utilisant le plasmide p LW 1 (figure 12) conte- nant le gène IL-2 sous le contrôle du promoteur trp E Coli. Un échantillon de p LW 1 est déposé dans l'American Type Cul- ture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Mary 20852 US, depuis le 4 aout 1983 et a reçu le numéro ATCC 39 405 La carte de restriction d'un clone (appelé M 13-IL 2) contenant l'insert de IL-2 est reproduite sur la figure 13. On prépare un ADN de phage mono-caténaire à partir du clone M 13-IL 2 pour servir de copie pour la mutagénèse dirigée sur oligonucléotide. Exemple 13 Mutaqinèse dirigée sur oliqonucléotide Tel qu'indiqué précédemment, IL-2 contient des résidus cystéine sur les positions des aides aminés 58, 105 et 125. A partir de ces séquences de nucléotides des portions du gène IL-2 qui contiennent les codons pour ces trois résidus cystéine, on construit trois oligonucléotides primaires et on les synthétise pour une mutation des codons pour ces résidus en codons pour la sétine Ces oligonucléotides ont les séquences suivantes: CTTCTAGAGACTGCAGATGTTTC (DM 27) pour changer cys 58, CATCAGCATACTCAGACATGAATG (DM 28) pour changer cys 105 et GATGSATGCTCTGAGAAAAGGTAATC (DM 29) pour changer cys 125. On traite séparément avec une kinase 40 pieomoles de chaque oligonucléotide en présence de 0,1 m M d'ATP, 50 m M - de Tris-HC 1, de p H 8,0, 10 m M de Mg C 12, 5 m M de DTT et 9 unités de T 4 kinase dans 50 11 à 37 C pendant 1 heure On hybride chacun des primaires traités avec une kinase ( 10 pmoles),avec 2,6 -g d'ADN M 13-IL 2 monocaténaire dans 15 ul d'un mélange contenant 100 m M de Na Cl, 20 m M de Tris-HC 1 l de p H 7,9, 20 m M de Mg C 12 et 20 m M de'i-mercaptoéthanol, en chauffant à 67 C pendant 5 minutes et à 42 C pendant 25 minutes On refroidit les mélanges ainsi traités sur de la glace et on ajuste à un volume final de 25,l d'un mélange de réaction contenant 0,5 m M de chaque d NTP, 17 m M de Tris-H Cl de p H 7,9, 17 m M de Mg C 12, 83 m M de Na Cl, 17 m M de -mercap- toéthanol, 5 unités d'ADN polymnérase I, fragment Klenow, 0,5 m M d'ATP et 2 unités de TA ADN ligase, on incube à 37 C pendant 5 heures On termine les réactions en chauffant à 80 OC et on utilise les mélanges réactionnels pour transfor- mer des cellules de JM 103 compétentes, on dépose sur des plaques de gélose et on incube pendant une nuit pour obtenir des plaques de phages. Exemple 14 Sélection et identification des plaaues de pha$es ayant subi une mutagénèse On refroidit à 4 C des lames contenant des plaques de M 13-IL 2 ayant subi une mutagénèse ainsi que 2 lames conte- nant des plaques de phage, M 13-IL 2 non-soumis à une mutagé- nèse et on transfère les plaques de phages de chaque lame sur deux filtres circulaires en nitrocellulose en déposant un filtre sec sur la plaque de gélose pendant 5 minutes pour le premier filtre et pendant 15 minutes pour le second filtre. On place alors les filtres sur des papiers filtres épais imprégnés dans Na OH 0,2 N, Na Cl 1,5 M et 0,2 % de Triton pendant 5 minutes, puis on neutraliseen déposant sur les filtres des papiers filtres imprégnés avec 0,5 M de Tris-H Cl de p H 7,5 et 1,5 M de Na Cl pendant 5 autres minutes On lave deux fois les filtres d'une manière analogue sur des filtres imprégnés de SCC x 2, on sàche et on cuit dans une étuve à vide à 80 C pendant 2 heures On pré-hybride les filtres en 26 - double à 420 C pendant 4 heures avec 10 ml par filtre d'un tampon d'hybridation d'ADN (SSC x 5, p H de 7,0, solution de Denhardt x 4 (polyvinylpyrrolidone, ficoll et albumine séri- que bovine, 1 fois = 0,02, de chacune de ces substances)), 0,1 % de SDS, 50 m M d'un tampon de phosphate de sodium de p H 7,0 et 100,ug/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé On prépare des modèles marqués à 32 P en traitant par une kinase les primaires oligonucléotides avec ATP marqué On hybride les filtres avec 0,1 x 10 cpm/ml de primaires marqués à 32 p dans 5 ml par filtre d'un tampon d'hybridation d'ADN à 42 O C pendant 8 heures On lave deux fois les filtres à 50 C pendant 30 minutes chaque fois dans des tampons de lavage contenant 0,1 % de SDS et SSC x 2, et deux fois à 50 C pendant 30 minutes chaque fois avec 0,1 % de SDS et SSC x 2. On sèche les filtres à l'air et autoradiographie à -70 C pendant de 2 à 3 jours. Etant donné qu'on a construit les oligonucléotides pri- maires DM 26 et DM 29 pour créer un nouveau site de restriction Dde I dans les clones ayant subi une mutagénèse (figure 14), on a fait digérer ADN-RF de plusieurs clones hybridés avec chacun des primaires traités par une kinase, avec l'enzyme de restriction Dde I On recueille une des plaques M 13-IL 2 ayant subi une mutagénàse, hybridée avec le primaire DM 28 et ayant un nouveau site de restriction Dde I (M 13-LW 44) et on inocule cns une culture de JM 103, on prépare un ADN mono- caténaire à partir du liquide surnageant dans la culture et on prépare un ADN-RF bicaténaire à partir du culot de cellules De la même manière, on recueille une plaque hybri- dée avec le primaire DM 29 (M-13-LW 46) et à partir de cette plaque on prépare un ADN monocaténaire et un ADN-RF Le pri- maire oligonucléotide DM 27 a été conçu pour créer un nouveau site de restriction au lieu d'un site Bde I En conséquence, on sélectionne les plaques hybridées avec ce primaire quant à la présence d'un nouveau site Pst I On identifie une telle plaque de phages (M 13-LW 42) et à partir de cette plaque on prépare un ADN monocaténaire et un ADN-RF On analyse les 27 - séquences d'ADN de ces trois clones pour confirmer que les codons cible TGT pour la cystéine ont bien été convertis en un codon TCT pour la sérineo Exemole 15 Reclona Se du qgne I 1-2 ayant subi une mutaq_ nàse pour l'expression dans E coli On fait digérer séparément les ADN-RF de M 13-LW 42, M 13-. LW-44 et M 13-LW 46 avec des enzymes de restriction Hind III et Ban II et on purifie les fragments d'inserts à partir d'un gel d'agarose à 1 %, De la même manière, on fait digérer le plasmide p Trp 3 (figure 7) avec Hind III et Ban II, on puri- fie le grand fragment de plasmide contenant le promoteur trp sur un gel d'agarose et on le relie avec chacun des fragments d'inserts isolés à partir de M 13-LW 42, M 13-LW 44 et M 13-LW 46. On transforme les plasmides liés dans une souche MM 294 de E coli K 12, compétentes On analyse les ADN plasmiques provenant-de ces produits de transformation en établissant la carte des enzymes de restriction pour confirmer la pré- sence des plasmides p LW 42, p LW 44 et p LW 46 La figure 14 reproduit une carte de restriction de p LW 46 Lorsque chacun des clones individuels est développé en l'absence de trypto- phane pour induire le promoteur trp et qu'on analyse les - extraits libres de cellules sur des gels de SDS-polyacryl- amide, ces trois clones, p LW 42, p LW 44 et p LW 46,s'avàreot capables de synthétiser une protéine 14-,5 kd semblable à celle trouvée dans le témoin positif, p LW 21 qui s'est avéré capable de synthétiser une protéine 14,4 kd IL-2 Lorsque ces mêmes extraits sont examinés quant à leur activité an I 1-2 sur des cellules HT-2 de souris, seuls les clones p LW 21 (témoin positif) et p LW 46 montrent des quantités signi- ficatives d'activité IL-2 (Tableau II ci-dessous), indiquant que cys 58 et cys 105 sont nécessaires pour l'activité biolo- gique et que leur changement en sérines (p LW 42 et p LW 46 res- pectivement) se traduit par une perte de l'activité biolo- gique Cys 125 d'autre part ne doit pas être nécessaire pour l'activité biologique car son changement en ser 125 (p LW 46) 28- n'affecte pas l'activité biologique. Tableau II Clones Activité IL-2 (u/ml) p IL 2-7 (témcin négatif) 1 p LW 21 (témoin positif) 113 000 p LW 42 660 p LW 44 1 990 p LW 46 123 000 La figure 15 areproduit la séquence de nucléotides de la chaîne codante du clone p LW 46 Par comparaison avec la chaîne codante du gène IL-2 humain natif, le clone p LW 46 montre un simple changement de base de G C sur le nucléo- tide 374 La figure 15 b reproduit la séquence d'acides aminéE correspondante de la mutéine IL-2 codée par p LW 46 Cette mutéine est désignée par IL-2 ser 125 Par comparaison avec Il-2 natif, la mutéine a une sérine au lieu d'une cystéine en position 125. Un échantillon de la souche MM 294 de E coli K 12, transformé avec p LW 46 est déposé dans l'American Type Cul- ture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, US depuis le 26 septembre 1983 et a reçu le numéro ATCC 39 452. Les mutéines de IL-2 dans lesquelles la cystéine en position 125 a été supprimée ou remplacée par un autre acide aminé, telles que la mutéine Il-2 ser 125 ' conservent l'acti- vité 11-2 Elles peuvent donc etre formulées et utilisées de la même manière que IL-2 natif En conséquence, des mutéines IL-2 sont utilisables dans le diagnostic et le traitement des infections bactériennes, virales, parasitaires, proto- zoaires et fongiques; dans des manifestations de lymphokine ou d'immunodéficience; pour la reconstitution de fonctions immunes normales chez les êtres humains et les animaux agés; dans le développement de dosages diagnostiques tals que ceux utilisés dans l'amplification des enzymes, le radiomarquage, la radiovisualisation et d'autres procédés connus dans la technique de surveillance des taux de IL-2 chez un malade; 29 - pour la promotion du développement des cellulss T in vitro dans des buts thérapeutiques et de diagnostic pour le blocage des sites récepteurs pour leslymphokines; et dans diverses autres applications thérapeutiques, i diagnostic et de re- cherche Les diverses applications thérapeutiques et de diagnostic de IL-2 humain ont été étudiées et-rapportées par S A Rosenberg, E A Grimm et al, A Mazumder et ai, et E A Grimm et S A Rosenberg Les mutéines de IL-2 peu- vent être utilisées par elles-mêmes ou en association avec d'autres cellules B ou T immunologiquement applicables ou d'autres agents thérapeutiques Pour des applications thérapeutiques ou de diagnostic, elles peuvent être formu- lées dans des milieux de véhicules non-toxiques, non-aller- gisants, physiologiquement acceptables, tels que l'eau dis- tillée, une solution de Ringer, une solution de Hank, une solution saline physiologique et autres Les administra- tions des mutéines IL-2 à des hommes ou à des animaux peu- vent se faire par voie orale ou intrapéritonéale, intra- musculaire ou souscutanée, selon l'avis du médecin Comme exemples de cellules applicables, on citera les cellules B ou T, les cellules tueuses naturelles et autres, et comme réactifs thérapeutiques utilisables en association avec les polypeptides de l'invention, on citera à titre d'exemples les divers interférons, en particulier le gamma interféron, le facteur deczoissance descellules B, IL-1 et autres. b 4594 REVENDICATIONS 1 ?'utéine synthétique d'une protéine biologiquement active ayant au moins un reste cystéine capable de former une liaison disulfure et non-essentiel à l'activité biolo- gique, caractérisée en ce que la mutéine a au moins un des restes cystéine supprimé ou remplacé oar un autre acide aminé. 2 ' Mutéine synthétique selon la revendication 1, caracté isée en ce qu'il y a seulement un des restes cys- téine. 3 Mutéine synthétique selon la revendication 1, caractérisée en ce que les restes cystéine sont remplacés par la sérine, la thréonine, la glycine, l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, l'histidine, la tyrosine, la phényl- alanine, le tryptophane ou la méthionine. 4 Mutéine synthétique selon la revendication 1, caractérisée en ce que les restes de cystéine sont rempla- cés par la sérine ou la thréonine. Mutéine synthétique selon la revendication 1, caractérisée en ce que la mutéine n'est pas glycosylée. 6 Yntéine synthétique selon la revendication 1,caractérisée en ce que la protéine est IFN-B, IL-2, la lynphotoxine, le facteur 1 sti- nulant les colonies ou IEN oÀ 1. 7 "lutéine synthétique selon la revendication 1, caractérisée en ce que la protéine est IFN-i 5, le reste cystéine est en position 17 d'IFN-", et le reste cystéine est remplacé par un reste sérine. 8 Mutéine synthétique selon la revendication 7, caractérisée en ce que la mutéine n'est pas glycosylée. 9 Mutéine synthétique selon la revendication 1, caractérisée en ce que la protéine est IL-2, le reste cys- téine est en position 125 de IL-2, et le reste cystéine est remplacé par la sérine. Mutéine synthétique selon la revendication 9, caractérisée en ce que la mutéine n'est pas glycosylée. 11 Gène structural caractérisé en ce que le gène a une séquence d'ADN qui code pour la mutéine synthétiqueselon ltune quelconque des revendications 1 à 10. 31 = 12 Vecteur d'expression caractérisé en ce que le vecteurcomprend le gène structural de la revendication 11 en une position qui en permet l'expression. 13 Cellule ou organisme h 8 te, caractérisé en ce que lacellûle ou l'organisme hôte est transformé avec le vecteur d'expression de la revendication 12, et sa descendance. 14 E coli caractérisé en ce que E coli est transformé avec le vecteur d'expression de la revendication 12,et sa descendance. 15 Procédé pour produire une mutéine synthétique, caractérisé en ce qu'on cultive l'hôte ou sa descendance selon la revendication 13 et on recueille la mutéine synthéti- que à partir de la culture. 16 Procédé pour empocher une protéine ayant au moins un reste cystéine oapable de former une liaison disulfure, de former la dite liaison, caractérisé en ce qu'on modifie la protéine par mutation en supprimant le reste cystéine ou en remplaçant le reste cystéine par un autre acide aminé. 17 o Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que la protéine est biologiquement active et la cystéine n'est pas essentielle à l'activité biologique. 18 Procédé selon l'une des revendications 16 et 17, caractérisé en ce que le reste cystéine est remplacé par la sérine ou la thréonine. 19 Procédé pour produire un gène selon la revendica- tion 11, caractérisé en ce que: (a) on hybride un ADN mono-caténaire comprenant une chatne d'un gène structural qui code pour la protéine, avec un primaire oligonucléotide mutant qui est complémentaire de la région de la dite chaîne qui comprend le codon pour le:reste cystéines ou le triplet "non-sens'" apparié au codon, selon le cas, si ce n'est un mauvais assortiment avec le codon ou le triplet "non-sens" qui définit une suppression du codon ou un triplet qui code pour l'autre acide aminé; (b) on prolonge le primaire avec l'ADN polymérase pour former un hétéroduplex de mutation; et 32 - (c) on réplique l'hétéroduplex de mutation. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le mauvais assortiment définit un triplet qui code pour la sérine ou la thréonine. 21 Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'ADN monocaténairs est un phage mono-caténaire qui comprend la dite chaîne et l'hétéroduplex de mutation du stade (b) est converti en un hétéroduplex circulaire fermé. 22 Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que la réplicationest effectuée en transformant un h 8 te bactérien compétent avec l'hétéroduplex circulaire fermé et en cultivant les produits de transformation résultants. 23 Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que les autres stades comprennent l'isolement de la des- cendance de la chaîne mutante de l'hétéroduplex, l'isole- ment de l'ADN de la dite descendance et l'isolement du gène à partirde l'ADN de la descendance. 24 Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 23, caractérisé en ce que la protéine est l'IFN-F humain, le reste cystéine est en position 17 et le mauvais assortiment définit un codon pour la sérine. Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que la chaîne est la chaîne "non-sens" d'IFN-) et le primaire oligcnucléotide mutant est GCAATTTTCAGAGTCAG. 26 Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 23, caractérisé en ce que la protéine est IL-2 humaine, le reste cystéine est en position 125 e{ le mauvais assorti ment définit un codon qui code pour la sérineo 27 Oligonucléotide utilisable pour produire le gène structural selon la revendication 11 par une mutagénèse dirigée sur un oligonucléotide, caractérisé en ce que l'oli- gonucléotide a une séquence de nucléotides complémentaire de la région de la chaîne du gène structural qui comprend le codon pour le reste cystéine ou le triplet "non-sens" appa- rié au dit codon, selon le cas, si ce n'est un mauvais assor- 33 - timent avec le codon, qui définit une suppression du codon ou un triplet qui code pour l'autre acide aminé. 28 Composition thérapeutique ayant une activité IFN-e, caractérisée en ce que la composition comprend une quantité thérapeutiquement efficace de la mutéine synthétique selon l'une des revendications 7 et 8, en mélange avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 29 Composition thérapeutique ayant une activité IL-2, caractérisée en ce que la composition comprend une quantité thérapeutiquement efficace de la mutéine synthétique selon l'une des revendications 9 et 10, en mélange avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Vecteur d'expression selon la revendication 12 qui est le plasmide p SY 2501. 31 Cellules selon la revendication 13 qui sont des bactéries transformées avec le plasmide p SY 2501, et leur descendance. 32 Bactéries selon la revendication 31, caracté- risées en ce que les bactéries sont E coli. 33 Mutéine selon la revendication 7 qui est IFN-Bser 17 o* 34 Vecteur d'expression selon la revendication 12 qui est le plasmide p LW 46. Cellules selon la revendication 13 qui sont des bactéries transformées avec le plasmide p LW 46, et leur descendance. 36 Bactéries selon la revendication 35, caracté- risées en ce que les bactéries sont E coli - 37 Mutéine selon la revendication 9 qui est IL-2125 ser 125 '