FR 2534273 A1 19840413 FR 8216819 A 19821007 Lignées cellulaires originaires de mammifères supérieurs, productrices d'hormone decroissance, de préférence humaine, et vecteurs pour leur obtention. L'invention concerne de nouvelles lignées stables de cellules eucaryotes, plus particulièrement de mammifères supérieurs, capables de synthétiser et d'excré- ter une hormone qui possède les propriétés essentielles de l'hormone de croissance et elle concerne aussi des vecteurs contenant une séquence codant pour une protéine ayant les propriétés de l'hormone de croissance humaine h GH et susceptible d'être exprimée dans des cellules eu- caryotes, plus particulièrement de mammifères supérieurs et antérieurement inaptes à synthétiser une telle protéine. L'hormone de croissance (h GH), synthétisée par l'hypophyse, est nécessaire à la croissance de l'enfant. Seule l'hormone humaine est active chez l'homme et elle est actuellement utilisée dans le traitement du nanisme hypo- physaire L'hormone est obtenue par extraction à partir d'hypophyses de cadavres Cette source limitée ne permet pas de satisfaire Ies besoins thérapeutiques, ni de con- firmer et d'exploiter d'autres indications telles que le traitement de brûlures, de fractures, et des ulcères d'es- tomac La structure de l'hormone principale est connue depuis longtemps (Li, C H, Dixon, J S and Chung, D. ( 1973) Arch Biochem Biophys 155, 95110), mais il est possible que des hormones voisines existent (Lewis, U J, et al ( 1978), J Biol Chem 253, 2679-2687). L'hormone de croissance humaine est synthétisée dans des cellules de l'hypophyse antérieure comme pré- hormone (Roskam, W G et Rougeon, F, 1979, Nucl Acids. Res 7, 305-320) comportant à l'extrémité NH 2 une exten- sion de 26 acides aminés Cette extension est enlevée lors de l'excrétion pour donner l'hormone active circulante de 191 acides aminés. Les techniques du génie génétique ont été appli- quées au clonage du gène de l'hormone de croissance humaine (clonage du c DNA: Roskam, W G et Rougeon, F. op cit; Goeddle, D V et ai ( 1979) Nature 201, 544-548; Martial, J A et al ( 1979) Proc Natl Acid Sci USA 76, 42944298) Le c DNA cloné a été manipulé pour en obtenir l'expression dans E coli L'équipe de Goodman (Martial, J A et al ( 1979) op cit) décrit la synthèse d'une protéine hybride contenant une séquence bacté- rienne L'équipe de Genentech (Goeddel, D V et al ( 1979) op cit décrit la synthèse de méthionine-h GH, contenant à l'extrémité NH 2 terminale une méthionine supplémentaire par rapport à la protéine naturelle. L'aminoacyle supplémentaire est la conséquence de l'in- sertion d'un codon d'initiation (ATG) au début du gène codant pour l'hormone naturelle Il est évident que seule une expérimentation en clinique à long terme pourra confir- mer que la méthionine-h GH n'a pas des propriétés indési- rables par rapport à l'hormone naturelle et éventuelle- ment infirmer les craintes que certains auteurs ont ex- primées Au surplus la purification de méthionine-h GH à partir d'extraits de E coll s'est avérée nettement plus difficile que celle de h GH à partir d'hypophyses, notm- ment en ce qui concerne l'élimination des pyrogènes, sources d'effets secondaires indésirables. Il a certes déjà été proposé de modifier des cellules animales et de les rendre aptes à produire de l'h GH Ainsi Pavlakis et ses collaborateurs ( 1981, Proc Natl Acad Sci USA, 78, 7398) ont réalisé l'in- troduction du gène chromosomal de h GH, placé sous le contrôle d'un promoteur de SV 40 et la production de la protéine, à l'occasion de la réalisation d'un cycle lytique, lequel entraîne alors la lyse de la cellule et la production de particules virales. On a également décrit la cotransformation de fi- broblastes de souris, initialement déficients en ce qu'ils ne sont pas capables de synthétiser la thymidine-kinase (cellules tk-), d'une part, avec un recombinant contenant le gène chromosomal codant pour l'hormone de croissance et, d'autre part, avec un marqueur de sélection contenant un gène de la thymidine-kinase (tk) Les cellules transformées se sont révélées capables de synthétiser des quantités détectables d'une protéine ayant les propriétés de l'hor- mone de croissance, les quantités produites pouvant être accrues en présence d'inducteurs constitués par-des gluco- corticoldes (D M Robins et Coll ( 1982), Cell,vol 29, 623-631). Les quantités produites, même en présence de tels inducteurs, sont cependant trop faibles pour que cette technique puisse être envisagée au niveau industriel Au surplus, les cellules utilisées sont tumorigènes, de sorte que leur utilisation pour la production de substances à caractère thérapeutique est a priori exclue. L'invention a donc pour but de remédier aux inconvénients s'attachant à toutes les techniques anté- rieures Plus particulièrement, elle s'est fixée les objec- tifs que constituent les obtentions de lignées stables de cellules eucaryotes supérieures, notamment de mammifères -supérieurs, capables de produire des quantités importantes d'une protéine ayant l'essentiel de la structure et les propriétés de l'h GH naturelle, cultivables industrielle- ment et susceptibles de correspondre aux exigences des autorités responsables de la santé publique. Les lignées selon l'invention consistent en lignées stables de cellules de mammifères supérieurs, no- tamment de singe, dans le génome desquelles est intégré de façon stable un fragment d'ADN contenant une première séquence co- dant pour une protéine ayant les propriétés de l'hormone de croissance humaine et, de préférence aussi,jne seconde séquen- ce codant pour le peptide signal normalement associé à l'hormone de croissance humaine, immédiatement en amont de -4 la précédente vis-à-vis de la direction de la transcrip- tion, l'expression de ce fragment étant sous le contrôle d'un promoteur exogène également incorporé de façon stable dans le génome desdites cellules. Dans ce qui suit, on désignera par l'abréviation h GH l'hormone de croissance humaine, ainsi que toute pro- téine en possédant les propriétés essentielles. De préférence, lesdites séquences codant pour h GH et le peptide signal correspondant sont dérivées d'un -c ADN codant pour la préhormone de croissance humaine de 217 aminoacides mentionnée plus haut et dont le "peptide signal" consiste en l'extension déjà mentionnée de 26 acidesaminés, qui est séparée de l'hormone active à l'occasion de son excrétion par les cellules de l'hypo- physe Ces c ADN sont susceptibles d'être obtenus de façon en soi connue par transcription reverse de l'ARN messager correspondant et par bicaténarisation de l'ADN obtenu en présence des nucléotides et d'une polymérase appropriés. On peut également envisager le recours à la sé- quence d'ADN chromosomique, à condition que celle-ci soit d'abord isolée, notamment par hybridation avec un c ADN, excisée de l'ADN chromosomiqueaetenfin incorporée dans un fragment d'ADN, dans les conditions qui seront indiquées plus loin. Le promoteur mis en oeuvre peut avantageusement être choisi en fonction de l'espèce et du tissu dont les cellules sont originaires Lorsque ces cellules sont ori- ginaires du singe, il est avantageux d'avoir recours à un promoteur issu du virus SV 40, dont est connue la capacité de s'intégrer dans le génome de cellules de singe Avanta- geusement, ce promoteur correspond au promoteur "précoce" du virus SV 40, lequel contrôle normalement l'expression de l'antigène "petit T" ("small T antigen") et également de l'antigène "grand T" ("large T antigen"). L'invention ne se limite cependant pas à l'utili- sation de ce promoteur particulier, bien que celui-ci ait donné des résultats particulièrement favorables eu égard à la production de h GH par les cellules transformées et à son excrétion dans le milieu de culture On peut également - avoir recours par exemple au promoteur tardif de SV 40 (qui contrôle l'expression des protéines VP 1, VP 2 et VP 3) On peut se reporter à la carte de restriction du virus SV 40 (J Tooze, Ed DNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N Y, 1980, chaps 2-5), pour apprécier les positions relatives de ces promoteurs et des gènes codant pour les différents antigènes qui leur sont associés. Il va de soi que l'on peut substituer aux promo- teurs de SV 40 tout autre type de promoteur connu comme possédant ou dont pourrait être découverte la capacité de s'incorporer et d'entraîner l'incorporation avec lui d'une séquence codant pour h GH et, de préférence, une sé- quence codant pour le peptide signal susdit dans le génome des cellules de mammifères supérieurs, avec pour résultats la capacité des cellules ainsi transformées de synthétiser et d'excréter des quantités équivalentes de h GH et la préservation de la capacité ainsi acquise dans les géné- rations successives issues de ces cellules. De préférence encore le susdit fragment contient égale- ment les régions d'une troisième séquence comprenant, d'une part, au moins une partie susceptible d'être transcrite, sous le contrôle du susdit promoteur, en une partie corres- pondante d'ARN messager, de préférence au moins un intron, avec les séquences né- cessaires à son excision à l'occasion de cette transcrip- tion et d'autre part; un site de polyadénylation en aval à la fois de l'intron et des susdites première et, le cas échéant, seconde séquences dans le sens de la transcription. Les positions relatives de l'intron vis-à-vis des susdites première et seconde séquences ne présentent pas un caractère essentiel L'intron peut être situé en amont ou en aval desdites première et seconde séquences, ou même être insérées dans ces séquences. Les différentes parties de la troisième séquence sont de la même origine que le promoteur ou d'une origine différente Elles peuvent encore être de différentes ori- gines; la seule condition, dans le cas de parties de dif- férentes origines, étant que la troisième séquence ainsi formée ne contienne pas de partie codante pour un signal d'arrêt de la transcription en amont du susdit site de polyadénylation. Il est en outre préférable, surtout lorsque la troisième séquence est elle-même originaire de SV 40, ou lorsqu'elle contient une partie originaire de SV 40, que les parties directement codantes qui appartenaient initia- lement aux gènes concernés (par exemple gène "petit T" ou gène "grand T", lorsque le promoteur mis en jeu est le promoteur précoce de SV 40) soient assez réduites ou-in- terrompues pour que les antigènes complets, à caractère tumorigène, ne soient pas synthétisés par les cellules qui les ont incorporées dans leur génome. De préférence encore, les régions de ladite troi- sième séquence sont issues d'ADN, dont les gènes suscepti- bles d'être transcrits ne sont pas aptes à donner nais- sance à des protéines ou peptides susceptibles de posséder un caractère tumorigène Il est à cet égard avantageux d'avoir recours à une troisième séquence dont l'essentiel des régions est originaire d'un gène d'alphaglobine, par exemple de souris. Il va de soi que la susdite troisième séquence peut encore, le cas échéant, être prolongée en aval du site de polyadénylation par une séquence supplémentaire correspon- dant à celle qui suit aussi le site de polyadénylation dans l'ADN dont il est issu, dans le sens de la transcrip- tion. Il est à remarquer que les lignées cellulaires selon l'invention sont capables de synthétiser h GH en des quantités importantes rarement atteintes par des cellules de manmifères transformées par les techniques du génie géné- tique Sont d'un usage particulièrement avantageux les fragments d'ADN mettant en jeu, à la fois un promoteur pré- coce de SV 40 et, sous le contrôle de ce promoteur,-une troisième séquence originaire pour l'essentiel d'une partie au moins du gène codant pour l'alpha-globine de souris, qui contient un intron et un site de polyadénylation Les cel- lules obtenues se sont révélées avoir une capacité de pro- duction et d'excrétion de protéines h GH particulièrement importante. L'invention concerne encore plus particulièrement les lignées de ce type qui possèdent également, intégré dans leur génome, un marqueur de sélection Celui-ci est plus particulièrement du type des "marqueurs dominants", qui sont aptes à conférer aux cellules transformées la capacité d'induire une nouvelle activité enzymatique Un marqueur préféré de ce type contient une séquence d'ADN codant pour la xanthine-guanine phosphoribosyl-transférase, Le marqueur dominant est de préférence luimême sous le contrôle direct d'un promoteur distinct du précédent Ce promoteur distinct peut être identique au premier promo- teur mentionné ci-dessus Il peut également être de nature différente Dans ce dernier cas, il peut provenir d'un ADN naturel distinct de celui dont avait été extrait le premier promoteur mentionné Le cas échéant encore, il peut être extrait du même acide nucléique que le premier promoteur Par exemple, le fragment codant pour la pro- téine h GH est sous le contrôle du promoteur précoce de SV 40 et le marqueur sous le contrôle du promoteur tardif également de SV 40. Le marqueur-et le promoteur dont il dépend sont avantageusement associés avec une "troisième séquence" du même type que celle considérée plus haut, en rapport avec la séquence codant pour h GH Par exemple, lorsque le promoteur utilisé en rapport avec le marqueur est égale- ment constitué par un promoteur précoce de SV 40, la sé- quence transcriptible considérée contient une séquence (y compris l'intron et le site de polyadénylation) dont la transcription conduit à la formation d'une partie ré- duite de l'antigène "petit T". L'incorporation stable dans le génome des cellules selon l'invention d'un marqueur sous le contrôle d'un pro- moteur distinct s'est révélée avantageuse en ce qu'elle confère une propriété nouvelle (capacité notamment de- synthétiser une nouvelle enzyme) aux dites cellules Cette nouvelle propriété permet en particulier leur repérage ou leur sélection En outre, cette incorporation peut se ré- véler particulièrement bénéfique, surtout lorsqu'elle résulte en un accroissement du rendement en h GH des cel- lules selon l'invention, comme on l'obtient avec un mar- queur constitué par une séquence d'ADN codant pour la xanthine-guanine-phosphoribosyl-transférase, sous le con- trôle également d'un promoteur précoce de SV 40, et ce plus particulièrement lorsque les cellules sont originaires du singe. Les lignées selon l'invention sont avantageusement originaires de cellules non tumorigènes Elles sont avan- tageusement constituées par des cellules de rein de singe, par exemple des cellules du type véro ATCC: CCL 81, ou encore par des cellules humaines pour autant que celles-ci puissent être maintenues en culture On peut aussi, pour la sélection de cellules non tumorigènes de mammifères su- périeurs, à partir desquelles les cellules modifiées selon l'invention peuvent être obtenues par transformation à l'aide du vecteur décrit ciaprès, se reporter utilement aux éditions récentes des catalogues de souches édités par l'American Type Culture Collection (ATCC). Il va de soi que les fragments d'ADN insérés dans les génomes des cellules des lignées selon l'invention peuvent encore présenter les caractéristiques particulières qui seront encore décrites ci-après, en rapport avec les différentes formes de réalisation de vecteurs applicables à la transformation de cellules de mammifères supérieurs, initialement non aptes à excréter, voire même simplement synthétiser l'hormone de croissance, en vue de leur confé- rer ces dernières capacités. Le vecteur selon l'invention, de préférence un plas- mide, est caractérisé en ce qu'il contient, en combinaison, un promoteur choisi parmi ceux qui sont aptes à s'incorpo- rer de façon stable dans le génome de cellules de mammi- fères supérieurs et un fragment d'ADN sous le contrôle du- dit promoteur, ce fragment contenant une première séquence, de préférence un c ADN codant pour h GH, et, de préférence aussi, une seconde séquence codant pour le peptide signal normalement associé à l'hormone de croissance humaine, im- médiatement en amont de la séquence précédente vis-à-vis de la direction de transcription, et une troisième séquence comprenant, d'une part, au moins une partie susceptible d'être transcrite, sous le contrôle du susdit promoteur, en une partie correspon- dante d'ARN messager, de préférence au moins un intron, avec les séquences néces- saires à son excision à l'occasion de cette transcription et d'autre part, un site de polyadénylation en aval à la fois de l'intron et des susdites première et, le cas &chéant, seconde séquences dans le sens de la transcription. La troisième séquence de ce vecteur peut donner lieu aux mêmes variantes de constitution, tant en ce qui concerne les natures et les origines de ses différentes régions et de leurs dispositions respectives vis-à-vis desdites pre- mière et seconde séquences, que celles qui ont été envisa- gées en rapport avec les fragments d'ADN incorporés dans le génome des susdites cellules transformées selon l'invention. Des résultats particulièrement favorables sont ob- tenus lorsque l'on a recours à une "troisième séquence" originaire du gène de l'alpha-globine de souris Une "troisième séquence" favorable, qui contient un intron et un site de fixation de poly(A) issu du gène de l'alpha- globine de souris, correspond à celle qui a été décrite par Nishioka, Y et Leder, P ( 1979, Ceil 18, 875-882). De préférence, la partie proximale de la seconde séquence codant pour le peptide signal est très proche, voire directement liée au promoteur, la troisième séquence pouvant alors être placée en son entier en aval de ladite première séquence codant pour h GH. Un vecteur préféré sélon l'invention contient un "gène composite" mettant en jeu un c ADN cloné comportant toute 1 a séquence codante pour le précurseur de l'hormone de croissance humaine, placée sous le contrôle du promoteur précoce du virus de singe SV 40 et suivi d'un fragment d'ADN issu du gène de l'alpha-globine de souris comportant un intron et un site de fixation de poly(A), notamment du type décrit ci-dessus. Les différents vecteurs qui ont été décrits et qui contiennent le gène codant pour h GH peuvent être utilisés pour transformer des cellules appropriées, plus particu- lièrement des cellules de mammifères non tumorigènes La transformation peut être effectuée dans des conditions en soi connues, par exemple en ayant recours à la technique qui sera rappelée dans les exemples Les cellules trans- formées peuvent être repérées ou sélectionnées, par exemple si l'on a eu soin de réaliser cette transformation en pré- sence d'un marqueur de sélection, notamment d'un plasmide apte à transformer les mêmes cellules et contenant une sé- quence apte à elle-même conférer aux dites cellules la ca- pacité de synthétiser une nouvelle enzyme, par exemple la xanthineguanine-phosphoribosyl-transférase. Cependant un vecteur préféré de l'invention est caractérisé par le fait qu'un marqueur de sélection est également intégré de façon covalente dans son ADN. Ce marqueur est avantageusement consti- i 1 - tué par un gène codant pour l'enzyme xanthine-guanine- phosphoribosyl-transférase De préférence encore, ce marqueur de sélection se trouve sous la dépendance d'un promoteur également incorporé de façon stable dans ce vecteur, mais distinct du promoteur associé au fragment contenant le gène codant pour h GH Ce promoteur distinct peut présenter l'une quelconque des différentes caracté- ristiques qui ont été envisagées à l'occasion de la des- cription des lignées préférées de cellules selon l'in- vention Il est de même préférable que ce marqueur de sélection soit incorporé à une "troisième séquence" pré- sentant les mêmes caractéristiques que celle qui est associée avec le gène codant pour h GH Cette dernière séquence correspond avantageusement à celle qui se trouve dans l'acide nucléique initial naturel dont le promoteur choisi est issu Cette troisième séquence, associée au marqueur peut donner lieu aux mêmes variantes de consti- tution, en ce qui concerne les natures et les origines de ses différentes régions et leurs dispositions relatives vis-à-vis du marqueur, que celles qui ont été envisagées en rapport avec les susdites première et seconde séquences. Un vecteur préféré selon l'invention contient à la fois le "gène composite" défini plus haut et un fragment distinct comportant un promoteur précoce de SV 40, un gène ou c ADN codant pour la xanthine-guanine-phosphoribosyl- transférase sous le contrôle de ce promoteur et associé avec une "troisième séquences contenant une partie del'ADN originaire de SV 40 codant pour une partie de l'antigène "petit T" et le site de polyadénylation correspondant. L'incorporation d'une séquence codant pour h G-H dans des systèmes de vecteurs tels que définis ci-dessus, a pour -effet d'en optimiser l'apparente efficacité, si l'on en juge par la production et l'excrétion de quantités parti- culièrement importantes de h GH par les cellules de mammi fères supérieurs transformées par le c ADN codant pour h GH, préalablement introduit dans ces cellules par l'intermé- diaire de ces systèmes de vecteurs La stabilité des transforma- tions que permet le vecteur selon l'invention peut s'ap- précier par la conservation du caractère ainsi acquis par les cellules filles, obtenues au cours des généra- tions successives issues des cellules transformées (au moins 10 générations). Des caractéristiques supplémentaires de l'inven- tion apparaîtront au cours de la description qui suit d'un exemple de vecteur particulièrement préféré de l'in- vention, des conditions dans lesquelles ce vecteur peut être mis en oeuvre pour transformer des cellules de mam- mifères supérieurs et des résultats auxquels ladite trans- formation peut donner lieu. La figure unique jointe illustre de façon schéma- tique les étapes successives de la construction de ce vecteur. Le plasmide de départ est constitué par le plas- mide p SV 498, déposé à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes de l'Institut Pasteur de Paris (C.N C M) sous le n I-206 Il a été obtenu par recom- binaison, d'une part, du grand fragment isolé sur un gel de polyacrylamide de 3,5 %, après digestion de p SV 2 gpt, décrit par Mulligan et Berg ( 1981), Proc Natl Acad Sci. USA 78 2072-2076, par Eco RI et Bam HI et, d'autre part, du fragment de restriction Eco RI-Bam HI de 375 paires de bases (p b) issu de p BR 322. Les principaux éléments de structure du plasmide p SV 2 gpt sont représentés dans la figure unique Le frag- ment de restriction de 375 p b issu de p BR 322 est représenté en (a) p SV 498 diffère donc de p SV 2 gpt par la substitution du fragment (a) au fragment représenté dési- gné schématiquement par (b) dans lé schéma de p SV 2 gpt. Ces deux plasmides comprennent en outre en (c) le promo- * teur précoce de SV 40, en (d) un gène extrait de E coli et codant pour la xanthine-guanine-phosphoribosyl- transférase (gène Ecogpt), suivi d'une séquence schémati- quement désignée en (e) originaire de SV 40 et comprenant une séquence susceptible d'être transcrite en une partie de l'ARN messager correspondant à l'antigène "petit T", un intron et un site de polyadénylatign. ) p SV 498 est coupé partiellement par Hind III ( 20 pg d'ADN est incubéavec 5 unités de Hind III pendant minutes à 37 C dans un tampon de 10 m M Tris-H Cl, p H 7,6 7 MM Mg C 12, 60 ml Na Cl et 100 pg/ml de gélatine). Après arrêt de la réaction par addition d'EDTA jusqu'à 20 m N final, l'ADN est extrait par un mélange de chloroforme et d'alcool isoamylique, puis précipité à l'éthanol Il est ensuite incubé en présence de Bam HI Les fragments d'ADN sont séparés par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide de 3,5 % Le fragment de 2779 p b. (repéré par (f) dans le dessin) est électro-élué Ce frag- ment est lié à la séquence du c ADN de l'hormone de crois- sance humaine (Roskam et Rougeon, op cit) représenté en (g) contenant un linker (petit fragment de jonction en ADN synthétique) Bam HI sur le site Sma I et un linker Hind III sur le site Alu I qui précède la séquence codante pour la préhormone Le plasmide p SV 499 est alors obtenu. p SV 499 est coupé par Bam HI et lié à un fragment (h) de 593 p b contenant la partie distale du gène de l'alpha-globine de souris (Nishioka et Leder, op cit) entre les sites Mbol situésaux nucléotides 808 et 1401 par rapport au début du m ARN (extrait du plasmide p 78 C 16 dé- posé à la C N C I sous le n I-207 et schématiquement représenté en (e) L'orientation de cette insertion est vérifiée après coupure par Sac II et Cla I Un recombinant qui a l'insertion dans le bon sens est nommé p SV 500; p SV 500 est incubé avec Cla I et traité par ia polymérase I (fragment de Klenov) pour bicaténairiser: les extrémités obtenues sous forme de brins simples Après extraction avec un mélange chloroforme-alcool isoamylique et précipi- tation à l'éthanol, le plasmide est digéré par Pvu I Un fragment d'environ 3550 p b est isolé et lié à un frag- ment d'environ 3100 p b obtenu par incubation de p SV 498 avec Pvu I et Pvu II Le plasmide obtenu est appelé p SV 507. Expression transitoire de p SV 500 et p SV 507 dans des cel- lules véro. Des cultures semi-confluentes de cellules véro (ATCC: CCL 81) dans des boites de 60 mm de diamètre sont transfectées avec 10 pg de l'ADN plasmidique par la mé- thode de DEAE dextran modifiée par Sompayrac L M et Danna K J ( 1981) Proc Natl Acad Sci USA 78, 7575). Après transufection, les cellules sont cultivées dans 2,5 ml de milieu 199 ( Morgan, J F et al ( 1950 à Proc. Soc Explt Biol Med 71, 1) contenant 2 % de sérum de veau foetal pendant 5 jours La concentration d'h GH excré- tée est déterminée par un dosage RIA (kit Institut Pasteur Production) Les quantités sont calculées par pmol d'ADN ajouté ( 10 pg d'ADN correspond à 3,6 pmol d'ADN de p SV 500 et 2,3 pmol d'ADN de p SV 507). p SV 500 4,3 ng h GH/pmol ADN p SV 507 10 0 hg h GH/pmol ADN p BR 322 O ng h GH/pmol ADN Les quantitésde h GH produites dans le milieu de culture doivent être considérés comme d'autant plus consi- dérables que seule une partie des cellules ont été trans- fectées par le vecteur selon l'invention. Transformation de cellules véro par le plasmide p SV 507. Environ 1,5 x 105 cellules véro par boite de 6 cm de diamètre sont transfectées par 7 pg de plasmide c p SV 507, linéarisé par l'enzyme de restriction Pvu I La mé- thode utilisée est celle de la précipitation au calcium (Graham et van der Eb ( 1973, J Virol 52, 455-456) Après transfection, les cellules sont cultivées dans du milieu 199 avec 5 % de sérum de veau nouveau-né, pendant 3 jours. Les cellules sont trypsinisées et environ 1 x 104 cellules sont étalées par boite de 10 cm de diamètre La culture est poursuivie dans un milieu sélectif contenant 10 % de sérum de veau foetal dialysé (milieu sélectif: MEI modifié selon Dulbecco (Dulbecco et Freeman: Virology 8 ( 1959), 396) contenant 150 pg/ml glutamine, 15 ig/ml hypoxanthine, 2 pg/Ml aminoptérine, 250 pg/ml xanthine, 10 pg/ml thymi- dine et 250 pg/ml ribavérine) - Le milieu est changé de Ux fois par semaine. Après 3 semaines, des colonies denses sont isolées par trypsination dans des cylindres de verre, et cultivées sépa- rément dans un milieu sélectif contenant 25 pg/ ml de ribavérine (permettant la sélection de celles des co- lonies-dont les cellules ont incorporé le plasmide) Les colonies sont ensuite testées pour la production et l'ex- crétion de l'hormone de croissance humaine-par test radio- immunologique. Plusieurs colonies ont ainsi été obtenues. Elles peuvent ensuite être cultivées dans un milieu non sélectif (milieu de Eagles modifié par Dulbecco et complété avec du sérum de veau dialysé: 10 % en poids) après adaptation à celui-ci La lignée qui s'est révélée excréter la plus grande quantité d'hormone h GH a été isolée Elle a été dénommée VEH 1. Caractérisation de la lignée VE Hi. La lignée VE Hi est étudiée plus particulièrement La quantité d'h GH synthétisée par cette lignée est importante Par exemple pendant la phase exponen- tielle de la croissance en 1 journée, il y a une excrétion de 10 pg d'h GH alors que la quantité de cellules-a augmen- 3 P té de 1,2 x 106 à 2,7 x 106 par boite La lignée VEH 1 est stable concernant l'excrétion de l'h GH pendant au moins l passages en milieu non sélectif. Caractérisation de l'hormone excrétée. Pour déterminer la nature exacte de la protéine produite, les cellules VEH 1 sont incubées en présence de la S méthionine Le milieu de culture est ensuite soumis à une immunoprécipitation en utilisant un antisérum de lapin contre l'h GH L'analyse des précipités sur gel d'acrylamide de 20 % en présence de SDS (Laemli, Nature 227 ( 1979) 681) révèle une seule bande qui migre exacte- ment à la même position que l'h GH extraite d'hypophyses humaines Cette bande n'apparaît pas après immunoprécipi- tation avec un sérum de lapin non-immunisé Pour confirmer qu'il s'agit vraiment de l'hormone de croissance mature et non-de la préhormone les produits d'une traduction in vitro avec del'ARN codant pour le précurseur de l'h GH sont utilisés comme témoins Le produit synthétisé in vitro est la préhormone Les résultats montrent que l'hor- mone excrétée est l'hormone de croissance et non le pré- curseur. L'invention concerne encore: les h GH, telles qu'elles-sont produitespar les cellules de mammifères transformées selon l'invention, les compositions pharmaceutiques contenant ces h GH, en association avec les véhicules pharmaceutiques du type de ceux qui sont utilisés en association avec l'h GH na- turelle, ces compositions pharmaceutiques étant utili- sables pour les mêmes applications thérapeutiques que l'hormone naturelle d'extraction, notamment pour le traitement du nanisme hypophysaire, les anticorps qui peuvent être formés in vivo contre les h GH produites par lesdites cellules de mammifères; ces anticorps pouvant en particulier, après fixation sur un support insoluble, être utilisés pour la purification d'h GH à partir de mélanges la contenant. Comme il va de soi et comme il résulte d'ail- leurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisa- tion qui ont été plus spécialement envisagés; elle en embrasse au contraire toutes les variantes A titre d'exemples d'autres promoteurs susceptibles d'être utilisés - à la place de ceux issus de SV 40, on mentionnera le promo- teur tardif d'adénovirus, les promoteurs des gènes codant pour les métallothionéines 1, les promoteurs des rétro- virus. A titre d'exemple d'autres marqueurs, susceptibles d'être utilisés à la place du gène Ecogpt, on peut men- tionner ceux codant pour la dihydrofolate réductase de sou- ris, les enzymes de phosphorylation conduisant à l'inacti- vation de l'antibiotique G 418. A titre d'exemple d'autre "troisième séquence" susceptible d'être utilisée à la place de celle issue du gène de l'alpha-globine de souris; on peut mentionner celle issue du gène de la bêta-globine de souris. REVENDICATIONS i -Lignées stables de cellules de mammifères su- périeurs, notamment de singe, dans le génome desquels est intégré de façon stable un fragment d'ADN contenant une séquence codant pour une protéine ayant les propriétés de l'hormone de croissance humaine et, de préférence aussi, une séquence codant pour le peptide signal normale- ment associé à l'hormone de croissance humaine, immédiate- ment en amont de la précédente vis-à-vis de la direction de la transcription, l'expression de ce fragment étant sous le contrôle d'un promoteur exogène également incor- poré de façon stable dans le génome desdites cellules. 2 Lignées selon la revendication 1, caractéri- sées en ce que ledit fragment d'ADN correspond au c ADN codant pour la préhormone de croissance humaine. 3 Lignées selon la revendication 1 ou la reven- dication 2, caractérisées en ce que le promoteur est -ori- ginaire de SV 40, et de préférence correspond au promoteur précoce de SV 40. 4 Lignées selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 3, caractérisées en ce que ledit fragment com- prend une "troisième séquence" contenant, d'une part, au moins une partie susceptible d'être transcrite, sous le contrôle du susdit promoteur, en une partie corres- pondante d'ARN messager, de préférence au moins un intron, avec les séquences né- cessaires à son excision à l'occasion de cette transcrip- tion et d'autre part, un site de polyadénylation en aval à la fois de l'intron et des susdites première et, le cas échéant, seconde séquences dans le sens de la transcription. Lignées selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 4, caractérisées en ce que le site de polyadényla- tion ou l'intron, ou les deux à la fois, sont issus du gène codant pour l'alpha-globine de souris. 6 Lignées selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 5, caractérisées en ce qu'elles ont également, intégrée dans leur génome, une séquence d'ADN codant pour un marqueur dominant, notamment un gène codant pour la xanthine-guanine phosphoribosyltransférase, ce marqueur dominant étant de préférence lui-même sous le contrôle direct d'un promoteur distinct du précédent. 7 Lignéesselon la revendication 6, caractérisées en ce que ledit promoteur distinct et le marqueur dominant sont associés à une "troisième séquence", telle que dé- finie dans la revendication 4. 8 Lignées-selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 7, caractérisées en ce qu'elles sont formées de cellules non tumorigènes, d'origine animale, de préférence de singe. 9 Lignées selon la revendication 8, caractérisées en ce qu'elles sont dérivées de cellules du type véro (ATCC: CCL 81). Vecteur pour la transformation de cellules de mammifères supérieurs, notamment de singe, pour les rendre aptes à produire une protéine ayant les propriétés de l'hormone de croissance humaine, caractérisé en ce qu'il contient,-en combinaison un promoteur choisi parmi ceux qui sont aptes à s'incorporer de façon stable dans le génome de cellules de mammifères supérieurs et un frag- ment d'ADN sous le contrôle dudit promoteur, ce fragment contenant une première séquence, de préférence un c ADN codant pour h GH, et, de préférence aussi, une seconde sé- "quence codant pour le peptide signal normalement associé à l'hormone de croissance humaine, immédiatement en amont de la séquence précédente visà-vis de la direction de transcription, et une troisième séquence comprenant, d'une part, au moins une partie susceptible d'être transcrite, sous le contrôle du susdit promoteur, en une partie corres- pondante d'ARN messager, -J de préférence au moins unintron, avec les séquences nécessaires à son excision à l'occasion de cette trans- cription et d'autre part, un site de polyadénylation en aval à la fois de l'intron et des susdites première et, le cas échéant, seconde séquences dans le sens de la transcrip- tion. il Vecteur selon la revendication 10, carac- térisé en ce que l'essentiel de la susdite troisième sé- quence est issue du gène de l'alpha-globine de souris. 12 Vecteur selon la revendication 10 ou la re- vendication 11, caractérisé en ce que le promoteur est originaire de SV 40 et que, de préférence, il consiste en un promoteur précoce de SV 40. 13 Vecteur selon l'une quelconque des revendica- tions 10 à 12, caractérisé en ce que la partie proximale de la séquence codant pour le peptide de signal est très proche, voire directement liée à la séquence du promoteur. 14 Vecteur selon l'une quelconque des revendi- cations 10 à 13, caractérisé en ce qu'il contient également un marqueur, de préférence un marqueur dominant apte à induire chez la cellule hôte la capacité à produire une nouvelle activité enzymatique, telle que l'enzyme xanthine- guanine phosphoribosyl-transférase, ce marqueur étant lui- même sous le contrôle d'un promoteur distinct du précédent. Vecteur selon la revendication 14, caracté- risé en ce que ledit promoteur distinct et le marqueur do- minant sont associés à une"troisième séquence" telle que définie dans la revendication 4. 16 Les protéines ayant les propriétés essentielles de l'hormone de croissance, obtenues à partir de culture de cellules de mammifère supérieur, selon l'une quelconque des revendications 1 à 9. 17 Les compositions pharmaceutiques contenanten association avec un véhicule pharmaceutique, une protéine conforme à la revendication 16. 21,- 18 Les anticorps contre les protéines selon la revendication 16.