FR 2529344 A1 19831230 FR 8310593 A 19830627 La présente invention concerne un procédé de détec- tion immunologique d'une substance fixante spécifique multivalente ou monovalente et une suspension aqueuse d'agrégats de particules utile dans ce procédé. Le dosage immunologique par comptage de particules est une technique non radiologique de dosage immunologique bien connue, J IMMUNOL METHODS, 18, 33-44 ( 1977) Cette technique repose sur l'agglutination de particules de latex ou de particules semblables revêtues d'une substance fixable de façon spécifique à une substance à déterminer On mesure l'agglutination par emploi d'un compteur optique ou électrique, tel que ceux conçus pour le comptage de cellules sanguines, pour déterminer la diminution du nombre des particules non agglutinées Cette technique a été employée pour déterminer des antigènes, des anticorps et des complexes immuns. J AUTOM CHEM, 2, 149-152 ( 1980); J IMMUNOL METHODS, 23, 29-50 ( 1978); et J IMMUNOL METHODS 28 13-23 ( 1979) Une variante de cette technique a été employée pour déterminer de petites molécules telle que la digoxine, CLIN CHEM 27/1, 1205-1209 ( 1981) Le comptage du nombre de particules agglutinées est également bien connu. Des variantes des techniques par comptage de parti- cules ont été mises au point pour résoudre des problèmes qui sont apparus Par exemple, l'emploi de deux stades d'incubation et de particules de tailles différentes a été décrit pour résoudre le problème que pose le phénomène de prozone (les échantillons ayant des teneurs très élevées en antigène semblent être négatifs, car l'agglutination est minime) Voir les demandes de brevets de la République Fédérale d'Allemagne P 30 06 899 6 déposée en septembre 1980 parla Société Technicon Instrument et P 29 18 342 4 déposée le 20 novembre 1980 par la Société Behringwerke A G, L'invention se différencie particulièrement de l'art antérieur en ce qu'elle emploie des particules qui ont des pro- priétés détectables différentes, telles que la taille et la fluorescence Au lieu de mesurer la disparition des particules non agrégées, on mesure la formation des agrégats des deux particules différentes et de la substance à doser par détermination dans les agrégats des propriétés différentes des particules associées par antigène nucléocapsidique de l'hépatite), à l'herpès et à d'autres maladies virales associées, ainsi que leurs anticorps sont des exemples de substances fixantes spécifiques multivalentes Les bactéries et les antigènes bactériens tels que Neisseria gonorrheae et Streptococcus sont d'autres substances fixantes spécifiques multivalentes Les antigènes associés au cancer, tels que l'antigène carcinoembryonnaire (CEA) sont également des substances fixantes spécifiques multivalentes que l'on peut déterminer selon les pro- cédés de l'invention Le spécialiste du dosage immunologique connaît une grande diversité de substances fixantes spécifiques multi- valentes. Les substances fixantes spécifiques monovalentes peuvent également être déterminées selon les procédés et avec les réactifs de l'invention par emploi de polymères ayant de nombreuses molécules de substances fixantes spécifiques monovalentes fixées et de parti- cules revêtues d'une substances fixable à la substance fixante spécifique monovalente La substance fixante spécifique monovalente dans l'échantillon à analyser entre en compétition avec les sites de fixation sur les particules et inhibe l'agglutination entre les particules et le polymère auquel est fixée la substance fixante spécifique monovalente On conjugue ainsi des médicaments et des hormones à des polymères, par exemple des protéines telles que la sérum-albumine bovine ou des polysaccharides, tels que le dextran pour'former des substances fixantes spécifiques multivalentes synthé- tiques qui sont capables de fixer des particules microscopiques du type précédemment décrit, de préférence des particules microsco- piques non fluorescentes revêtues d'une substance fixable aux substances fixantes spécifiques multivalentes synthétiques et de petites particules fluorescentes microscopiques revêtues de façon semblable Les agrégats obtenus sont détectés comme précédemment décrit. L'invention utilise au moins deux types de particules microscopiques ayant chacun des propriétés détectables distinctes. Les particules sont généralement faites de polymères synthériques tels que le polystyrène, le polypropylène, le polyacrylate et simi- laires Des globules rouges du type décrit dans le brevet des Etats- Unis d'Amérique n 3 715 427 sont également des particules 2 2529344 exemple à de grosses particules (c'est-à-dire la taille) et à de petites particules fluorescentes (c'est-à-dire la fluorescence). On effectue cette mesure dans un compteur de cellules électro- optique à double canal, du type décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N O 4 198 160 ou avec un microscope à fluorescence. L'invention comprend un procédé pour la détection d'une substance fixante spécifique multivalente dans un liquide biolo- gique Des premières et des secondes particules microscopiques ayant des propriétés détectables différentes et revêtues d'une substance fixable à la substance fixante spécifique multivalente pour que des agrégats contenant lesdites premières et secondes particules micro- scopiques se forment en présence de la substance fixante multivalente, sont détectées par mesure des propriétés différentes associées aux premières et aux secondes particules microscopiques dans les agrégats. De façon typique l'invention comprend la détection d'antigènes multi- valents dans la solution par emploi de particules de deux tailles différentes revêtues d'anticorps des particules non fluorescentes ayant une taille de 4 à 50 m et des particules fluorescentes ayant une taille de 0,08 à l Ojim Dans un échantillon sans antigène, les particules fluorescentes et non fluorescentes ne sont pas fixées, tandis que,dans un échantillon contenant un antigène, les grosses particules non fluorescentes portent des particules fluorescentes attachées pour former des agrégats. L'invention comprend les nouveaux agrégats de parti- cules non fluorescentes de 4-50 m et de particules fluorescentes de 0,081 Oym revêtues chacune d'une substances fixable à une substance fixante spécifique multivalente et fixées entre elles par cette substance fixante spécifique multivalente. L'invention comprend également des procédés pour détec- ter les substances fixantes spécifiques multivalentes. L'invention va maintenant être décrite de façon détaillée. Le terme substance fixante spécifique multivalente dans le contexte de l'invention désigne des antigènes, des anticorps et d'autres molécules biologiques ayant plus d'un site de fixation spé- cifique Les antigènes viraux, tels que ceux associés à l'hépatite (antigènes de surface de l'hépatite B, antigène de l'hépatite A et appropriées à l'emploi dans l'invention Une matière particulaire préférée est constituée de polystyrène et on l'appelle également particules de latex de polystyrène Les particules appropriées sont connues de façon générale dans le domaine des microparticules On préfère également employer des particules de deux tailles différentes, les grosses particules ayant une taille de 4 à 50 ym et les parti- cules plus petites ayant une taille de 0,08 à 10,m On préfère éga- lement que les petites particules aient un marquage fluorescent Ce marquage est réalisé par incorporation d'une matière fluorescente aux particules ou fixation de molécules fluorescentes à la surface des particules. Chaque particule est revêtue d'une substance fixable de façon spécifique à la substance fixante multivalente De façon typique, si on veut détecter un antigène multivalent, on revêt les particules d'un anticorps dirigé contre l'antigène Plus particulièrement, si on doit détecter l'antigène de surface de l'hépatite B, on revêt les particules d'un anticorps ou d'un fragment F(ab')2 de l'anticorps dirigé contre l'antigène de surface de l'hépatite B Des systèmes courants sont les suivants: Revêtement des grosses particules 6 ym Ig G de cobaye a ti-H Bs Ag - 6}m anticorps mono- cional I anti-CEA 6 ym-antigène de surface dé l'hépatite B Anticorps monoclonal I anti-Chlamydia Hématies fixées Ig G de cobaye anti-H Bs Ag 6 ?m anticorps contre la digoxine 6 m anticorps contre la digoxine Substance fixante Revêtement des petites multivalente particules Antigène de surface 0,49 m F(ab') * de de l'hépatite B chèvle anti-H Bs Xg CEA 0,49 m -anticorps mono- clonal II anti-CEA Anti-l Bs AG -0,49 pm antigène de surface de l'hépatite B Chlamydia 0,9 m anticorps mono- clohal anti-Chlamydia H Bs Ag 0,624 m F(ab')2 * de chèvre anti-H Bs Ag Sérum-albumine bovine 0,49 ym anticorps ayant plusieurs molé-conte la digoxine cules de digoxine qui lui sont fixées Dextran ayant plu 0,49 m anticorps sieurs molécules de contae la digoxine digoxine qui lui sont fixées * F(ab')2 fragment d'Ig G anti-H Bs Ag actif contre l'H Bs Ag. On revêt les particules par adsorption ou par liaison covalente en employant l'un quelconque des nombreux procédés de revêtement connus. En pratique, la présence de la substance fixante spé- cifique multivalente dans l'échantillon à analyser provoque l'agglutination (agrégation) des particules Donc des particules ayant des propriétés détectables différentes sont présentes dans les agré- gats et les agrégats sont détectés par mesure de ces propriétés. Plus particulièrement, plusieurs petites particules fluorescentes sont fixées à une grosse particule non fluorescente et on détecte l'agrégat par mesure de cette combinaison unique en son genre de taille et de fluorescence On peut également détecter les agrégats par marquage des grosses particules et des petites particules avec des colorants fluorescents différentes et détection de la fluorescence double des agrégats Le système à deux paramètres (volume + fluorescence ou deux particules fluorescentes) est parti- culièrement avantageux en ce qu'il évite les réponses faussement positives dues à une agrégation non spécifique de chaque type de particules. Les réponses faussement positives sont également réduites par le prétraitement du sérum avec de la pepsine pour digérer les substanves sériques gênantes non spécifiques Ainsi, l'incuba- tion de volumes égaux de sérum et de pepsine à 1 % dans l'acide chlor- hydrique 0,15 M-pendant 15 min à 317 C, puis neutralisation de la solu- tion avec de l'hydroxyde de sodium 0,5 M constitue un prétraitement efficace Le traitement par la pepsine est particulièrement utile dans les analyses relatives à l'hépatite, en ce que l'antigène de l'hépa- tite résiste à la digestion par la pepsine. La demanderesse a également découvert que l'aggluti- nation non spécifique des deux types de particules au cours du stockage ainsi que pendant le dosage est réduite par la mise en sus- pension des particules dans un tampon optimalisé Par exemple une solutiont 0,1 M en glycine et 0,15 M en chlorure de sodium tamponnée a p H 9,2 et contenant 1 % de sérum-albumine bovine 1 M en chlorure de sodium et à 10 % de diméthylformamide réduit l'agglutination non spécifique et améliore le dosage. L'invention est illustrée par les exemples suivants. EXEMPLE I Revêtement de microparticules avec des anticorps anti-H Bs Ag On lave des particules de polystyrène ( 6/m; suspen- sion à 10 %) pour les débarrasser des agents tensioactifs par lavage répété dans l'eau, puis trois lavages dans le méthanol On ajoute 6 g d'Ig G de cobaye anti-H Bs Ag à une suspension de 6 x 108 par- ticules dans du tampon salé phosphaté (PBS) à p H 7,4 (volume total 14 ml) On agite le mélange pendant une nuit ( 20 h) à la tempéra- ture ordinaire en utilisant un barreau magnétique d'agitation On lave deux fois les particules avec du PBS et on remet en suspension à 6 x 10 particules/ml dans du PBS contenant 1 % de sérum-albumine bovine et 0,1 % d'azide de sodium. De façon semblable, on revêt des particules fluores- centes de 0,49 pm (Polysciences Inc; 4 x 1010 au total) avec 300,Pg de F(ab')2 de chèvre anti-H Bs Ag purifié par affinité (volume de revêtement total 1 ml) Après revêtement, on lave les particules deux fois avec du PBS et on remet en suspension à la concentration de 6 x 108 particules/ml dans du PBS contenant 1 % de sérum-albumine bovine et 0,1 % d'azide de sodium. EXEMPLE II MODE DE DETERMINATION DE L'H Bs Ag Prétraitement: A 1001 l de sérum ou de plasma, on ajoute 100 p 1 de solution à 1 % de pepsine dans du HC 1 0,15 M On laisse la digestion du mélange s'effectuer pendant 15 min dans un bain-marie à 37 C avant de neutraliser avec de l'hydroxyde de sodium 0,5 M. Dosage: On ajoute à l'échantillon prétraité 50 p 1 de par- ticules de 61 m revêtues d'Ig G de cobaye anti-H Bs Ag ( 3 x 10 particules au total) On agite le mélange ( 220 tr/min) pendant 1 h à la temp 6- rature ordinaire sur un agitateur rotatif Tektator On ajoute ensuite de petites microparticules fluorescentes ( 0,491 m; 3 x 107 au total) revêtues de fragments F(ab')2 de chèvre anti-H Bs Ag On centrifuge le mélange à la température ordinaire à environ 1 500 x g pendant 5 min pour mélanger les grosses particules et les petites. Dans des échantillons contenant de l'H Bs Ag, il se forme des agrégats de particules de 6 m et des petites particules fluorescentes Dans les échantillons H Bs Ag négatifs, il se forme seulement une faible teneur d'agrégats de particules de 6 m et de 0,491 m On peut déterminer la présence ou l'absence de ces agré- gats par emploi d'un microscope à fluorescence ou d'un appareil conçu pour mesurer de façon coïncidente les signaux de volume et de fluorescence. EXEMPLE III Revêtement de microparticules avec des anticorps monoclonaux anti-CEA On lave cinq fois des microparticules ( 6 pm; 2 x 108 au total; Microspheres Research) dans du PBS à p H 8,3 On ajoute aux particules lavées 200/g d'anticorps monoclonal I anti-CEA et /1 de PBS à p H 8,3 On agite les particules pendant une nuit à la température ordinaire et on lave trois fois dans du tampon 0,1 M en glycine et 0,15 M en chlorure de sodium a p H 9,2 contenant 1 % de sérum-albumine bovine (GBS-BSA) et on remet en suspension dans 1 ml de GBS-BSA. De façon semblable, on ajoute des particules de 0,491 m à marqueur fluorescent ( 1,6 x 10 au total; Polysciences Inc) à une solution de revêtement contenant 120/1 d'anticorps mono- clonal II anti-CEA ( 90 pg) et 120)1 de PBS à p H 8,3 On agite le mélange pendant une nuit, on lave deux fois avec du GBS-BSA et on remet en suspension dans 1 ml de GBS-BSA. EXEMPLE IV Détermination du CEA On dilue les particules revêtues au 1/30 dans du GBSBSA A 300 Pl de sérum, on ajoute 50/1 de particules de 61 m revêtues d'anticorps monoclonal I ( 3,18 x 10 au total) et 200)1 de tampon 1 M en glycine et 0,5 M en Na Cl à p H 9 On incube le mélange pendant une nuit à 45 C, puis on lave avec 1 ml de GBS. On ajoute les particules de 0,49 rm à marquage fluorescent ( 50)1; 2,6 x 10 au total) revêtues d'anticorps monoclonal Il et on centrifuge le mélange à la température ordinaire à environ 1 500 x g pendant 5 min pour mélanger les particules de 6 m et de 0,49/m On dilue la suspension avec 1 ml de soluté salé normal et on détermine le nombre des agrégats de particules de 6)m et de 0,491 m Cette méthode permet de déterminer la quantité de CEA de façon quantitative, comme le montre le tableau ci-dessous. Courbe étalon pour le dosage selon une technique en écoulement du CEA avec des anticorps monoclonaux mélangés. Concentration du CEA Nombre d'agrégats de particules de 6 m et 0,49 m pour un total (ng/ml) de le 000 particules de 6,pm - Moyenne 1 709 2 850 942 10 1154 1541 EXEMPLE V On emploie l'invention pour déterminer des substances fixantes monovalentes On revêt des particules non fluorescentes de 6,Oym d'anticorps contre la digoxine On incube l'échantillon à analyser avec des particules revêtues et de la sérum-albumine bovine à laquelle sont couplées plusieurs molécules de digoxine. Après l'incubation, on ajoute de petites particules fluorescentes revêtues d'anticorps anti-digoxine Dans un échantillon sans digoxine, la digoxine-BSA fixe ensemble les grosses particules et les petites. Dans un échantillon contenant de la digoxine,-ce médicament entre en compétition avec de la digoxine-BSA vis-à-vis des sites de fixa- tion de la première phase solide et réduit ainsi le nombre des agrégats émettant des signaux de volume et de fluorescence formés. De façon semblable, on peut fixer des substances monovalentes (un seul site de fixation spécifique), telles que des médicaments, des hormones et similaires à de la sérum-albumine bovine, du dextran ou des polymères synthétiques semblables pour effectuer des déterminations similaires Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. R E V E N D I C A T I O N S 1 Procédé pour la détection d'une substance fixante spécifique multivalente dans un liquide biologique,caractérisé en ce qu'il consiste à mélanger avec le fluide biologique des premières particules microscopiques et des secondes particules microscopiques ayant des propriétés détectables différentes et revêtues d'une substance fixable à la substance fixante spécifique multivalente, si bien que des agrégats contenant lesdites premières et lesdites secondes particules microscopiques se forment en présence de la substance fixante multivalente, et à détecter lesdits agrégats par détection des propriétés différentes associées aux premières et aux secondes particules microscopiques des agrégats. 2 Procédé pour la détection d'une substance fixante spécifique multivalente dans un liquide biologique, caractérisé en ce qu'il comprend le mélange avec le liquide biologique de parti- cules microscopiques non fluorescentes et de particules microsco- piques fluorescentes plus petites, les particules fluorescentes et les particules non fluorescentes étant revêtues d'une substance fixable à la substance fixante spécifique multivalente, si bien que des agrégats contenant lesdites particules non fluorescentes et une ou plusieurs particules fluorescentes se forment en présence de la substance fixante spécifique multivalente, et la détection des agrégats par leurs caractéristiques de taille et de fluorescence. 3 Procédé selon la revendication la revendication 2, caractérisé en ce que le liquide biologique est prétraité par diges- tion par la pepsine. 4 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le procédé est effectué dans une solution qui est environ 0, 1 M en glycine, 0,15 M en chlorure de sodium, tamponnée à p H 9,2 et contenant 1 % de sérumalbumine bovine, 1 M en Na Cl et 10 % de diméthylformamide. Suspension aqueuse d'agrégats d'une particule microscopique non fluorescente à laquelle sont fixées des particules microscopiques fluorescentes plus petites, les particules étant toutes revêtues d'une substance fixante spécifique et fixées ensemble avec une substance fixante spécifique multivalente fixable à la substance fixante spécifique revêtant les particules. 6 Procédé pour la détection d'une substance fixante spécifique monovalente dans un liquide biologique, caracté- risé en ce qu'il comprend le mélange avec le liquide biologique d'un polymère auquel sont fixées plusieurs molécules de la substance fixante spécifique monovalente, des particules microscopiques non fluorescentes et des particules microscopiques fluorescentes plus petites, les particules fluorescentes et non fluorescentes étant revêtues d'une substance fixable à la substance fixante spécifique monovalente dans le liquide biologique et à la substance fixante spécifique monovalente fixée au polymère, si bien que les substances fixantes spécifiques monovalentes du liquide biologique empêchent la formation d'agrégats entre le polymère auquel sont fixées plu- sieurs molécules de la substance fixante spécifique monovalente et les particules microscopiques fluorescentes et non fluorescentes et la mesure de l'importance de la formation des agrégats par détection des caractéristiques de taille et de fluorescence des agrégats.