FR 2529199 A1 19831230 FR 8310306 A 19830622 Oligo-imino-amines présentant des activités phyto- physiologiques et leur procédé de préparation. L'invention concerne de nouvelles oligo-imino- amines, substances physiologiquement actives vis-à- vis des plantes, qui sont formées par chauffage du dicyanodiamide, du cyanamide, de la guanylurée ou de ses sels, ainsi que leur procédé de préparation. Pour que la race humaine puisse encore sub- sister sur la terre dans un proche avenir, il importe que les ressources de nourriture et d'énergie soient assurées La biomasse est devenue un centre d'intérêt en tant que source régénératrice d'énergie, formant une partie de ces ressources En d'autres termes, el- le représente une fixation aussi élevée que possible de l'énergie solaire dans le tissu des plantes, pour lesquelles il est nécessaire d'obtenir une augmenta- tion de productivité. Diverses substances physiologiquement actives participent à la croissance normale des plantes On connaît des phyto-hormones telles que les auxines, les gibberellines, les cytokinines, l'acide abscissique et autres substances semblables On alaussi constaté récemment que le stévioside, un composant de Stevia rebaudiana, présente une phyto-activité pour favori- ser la croissance des plantes Outre ces substances connues, il existe probablement une grande variété de substances physiologiquement actives, et on peut con- cevoir que la capacité potentielle de production des plantes puisse être matérialisée par un réglage adé- quat de ces substances, en vue d'augmenter la produc- tivité. Des recherches ont été effectuées de ce point de vue, pour de nouvelles substances présentant des activités phyto-physiologiques, notamment des activi- tés antivirales et de facilitation de la division des cellules Ces recherches ont abouti à la découverte des substances de la présente invention, présentant à la fois des activités de cytokinine et antivirales, obtenues en traitant par la chaleur un diamide calci- que (contenant 97 % ou moins de Ca CO 3), sous-produit de la préparation du dicyanodiamide à partir de cyana- mide calcique, sous pression normale ou élevée. Afin d'élucider la nature de ses activités, on soumet le composé actif à une séparation et une puri- fication, par extraction aux solvants organiques et divers processus chromatographiques On analyse la structure chimique par spectroscopie infrarouge, spectroscopie de masse et spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (désignée par l'abréviation NMR) avec 1 H et 13 C, afin de vérifier la présence d'oligo- mères du dicyanodiamide, qui sont des substances nou- velles selon l'invention, inconnues jusqu'à présent. Des recherches pour la préparation efficace de ces substances actives ont abouti à la découverte, sur la- quelle est également basée la présente invention, qu'on les produit avec un rendement relativement éle- vé à partir du dicyanodiamide, du cyanamide, de la guanylurée ou de ses sels. Les nouvelles substances de l'invention, phyto-physiologiquement actives, sont représentées par la formule générale suivante: H 2 C-C XN-C:= N OCN 2 1 _ n l I NH 2 NH 2 ou H H H 2 NC N C-+ N-CN I n NH NH o N = 4 6. On obtient les oligo-imino-amines (OIA en abrégé) par chauffage du dicyanodiamide, du cyanamide, de la gua- nylurée ou de ses sels, dans des conditions de pres- sion ordinaire ou élevée. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui suit et à l'examen du dessin annexé qui représente, à titre d'exemple non limitatif, un mode de réalisation suivant l'invention. Sur ce dessin, la figure est un graphique qui montre les effets des oligoimino-amines de l'invention sur un cultivar de tomates infecté par le virus de la mosaïque du tabac (désigné par l'abréviation TMV ci- après) Le pourcentage de concentration virale est in- diqué sur la figure, o la courbe A se rapporte à l'oligo-imino-amine monomère avant la condensation par la chaleur, et la courbe B se rapporte à l'oligo- imino-amine après la condensation par la chaleur. On constate selon l'invention que, lorsqu'on chauffe le diamide calcique précédemment décrit, à 80-220 C, sous pression, pendant une durée de quel- ques minutes à 10 minutes, un certain composant secon- daire présent dans le diamide calcique en quantité minime, est soumis à une modification chimique qui le convertit en une substance physiologiquement active, favorable à la croissance des plantes, comme décrit ci-après On extrait le diamide calcique traité par la chaleur dans les conditions indiquées, par l'eau bouillante et l'alcool bouillant On soumet l'extrait brut et une substance obtenue par purification ulté- rieure au moyen d'une chromatographie en phase liquide de haute performance, à un essai d'activité de cytoki- nine, exprimée en termes de variation de l'activité de biosynthèse de la bêtacyanine, en utilisant Amaran- thus caudatus L'essai permet de constater que les- dites substances présentent une activité de cytokini- ne dans des concentrations de 0,1 à 0,0017 %. De même, lorsqu'on chauffe le dicyanodiamide, le cyanamide, la guanylurée ou ses sels, à 100-250 C, sous une pression de 1 à 6 atmosphères et qu'on ex- trait et purifie le produit de la réaction, la subs- tance obtenue présente une activité de cytokinine. En outre, quand on soumet lesdites substances à l'essai de leur effet sur la concentration virale dans lestomates des cultivars "Fukuju No 2 " et "Zuiko", infectés par TMV, on constate que les subs- tances, à des concentrations de 10 à 100 ppm, sont actives pour réduire la teneur virale. L'invention est encore illustrée par les exemples pratiques suivants. EXEMPLE 1 Le diamide calcique, sous-produit dans la fabrication du dicyanodiamide à partir du cyanamide calcique, est traité par la chaleur à 100-300 C On chauffe 2 kg du produit dans 2 litres d'eau bouillan- te à reflux pendant 7-10 heures Le mélange réaction- nel est filtré a chaud, et on laisse refroidir le filtrat pour obtenir 2,5 grammes de précipité incolore. Le produit présente une faible activité de cytokinine dans le bioessai de bêtacyanine en utilisant Ama-ran- thus Cependant, comme on constate la présente d'une grande quantité de substances minérales, on effectue une purification comme décrit ci-après. A 2,5 grammes du produit brut, on ajoute ml de méthanol fraîchement distillé, et on chauf- fe le mélange sur un bain d'eau à 750 C On filtre la solution chaude pour séparer les substances insolu- bles Le filtrat clair jaune pâle ainsi obtenu est roto-évaporé sous pression réduite jusqu'à un début de cristallisation. Les cristaux formés, d'un poids de 600 mg, d'un point de fusion (PF) de 209-2100 C, sont identi- fiés comme constitués de dicyanodiamide, par spectro- scopie infrarouge et par l'essai de point de fusion mixte On filtre les cristaux et on évapore le filtrat sous pression réduite Après refroidissement, on ob- tient une deuxième récolte de cristaux, qu'on sépare. Le filtrat est encore évaporé sous pression réduite et par refroidissement de la solution résiduelle de couleur orange, on obtient la récolte finale de cris- taux ( 280 mg, PF = 207-210 'C) On effectue le bioessai de bêtacyanine avec Amaranthus sur une portion ( 0,04 ml) de filtrat (environ 4 ml) pour constater une haute activité de cytokinine Le filtrat est alors soumis à une chromatographie sur gel de silice (vendu sous la dénomination commerciale de GF 254 par la Société dite Merck & Co, 0,25 mm) (solvant = couche supérieu- re du mélange acétate d'éthyle: 1-propanol: eau = 4: 1: 2 v/v; détection par lampe d'ultraviolet) pour observer des taches d'absorption d'ultraviolet, à des valeurs Rf respectives de 0, 0,35, 0,75 et 0,95 On soumet alors le filtrat mentionné ci-dessus à une chromatographie en couche épaisse (gel de silice GF 254, 0,5 mm, même solvant que précédemment) On élimine les quatre bandes d'absorption d'ultraviolet par grattage et on effectue une élution à l'éthanol jusqu'à ce qu'on n'observe plus d'absorption de l'ul- traviolet Chacun des éluats est évaporé à sec sous pression réduite On obtient ( 1) 2,0 mg, ( 2) 23,4 mg, ( 3) 146 mg, et ( 4) 3 mg de cristaux, respectivement. On prépare des solutions aqueuses de concentrations 0,1 % à 0,01 % avec chacun des cristaux ( 1) à ( 4), avec lesquelles on fait l'essai de bêtacyanine- Amaranthus Les cristaux ( 2) et ( 3) présentent une activité de cytokinine, en particulier l'activité des cristaux ( 3) étant comparable à celle de la benzyladénine, et celle des cristaux ( 2) étant plus faible On mesure alors les caractéristiques physico- chimiques avec les données spectrales suivantes: PF: 195-197 C. Absorption d'ultraviolet maximale: X CH 3 OH 265 nm; X 0,05 N-Na OH-Me OH 265 nm. max max. Spectre d'absorption infrarouge: nujol (cm-1) 3350 (-NH 2str) 2 max ( 2 3100 (-N hstr); 2250 (C = Nstr); 2200 (C = N conjugué Nstr) 1656 (N-Hdef) 1636 (N-Hdef); 1624 (N-Hdef); 1580: 1550 (N Hdef)scissorine) 1250 (C-nstr); 9 24 (N-Hdef. (oscillant). Spectre de masse (méthode d'introduction directe: m/ z 336 (M); 294; 208; 149; 126 (trimère); NH ll 84 (H 2 N-C-NHCN pic de base); 68; 43 (H 2 N-C=N H); 42 (H 2 N-C-N). 1 H-NMR: Solvant DMSO-d 6, 200 M Hz, 6 6,65 ppm (S, -NH 2, deutérium échangeable). 13 C NMR: solvant DMSO-d 6, JEOL-FX 200 NH I (instrument utilisé) 6 163,0 (H 2 N-C-N); 152,7; 140,2; 139,4; 128,5; 127,4; six 127,0. (les/atomes de carbone cités représentent des atomes de carbone de guanidyle intermédiaires); 118,7 (CEN) ppm. Le spectre de masse indiqué ci-dessus montre que le poids moléculaire du composant ( 3), l'un des composants importants des substances actives en ques- tion, est de 336. Le spectre 13 C-NMR (de résonance magnétique nucléaire) indique la présence de huit variétés d'ato- mes de carbone, parmi lesquels un atome de carbone NH l (e 163,0 ppm) est attribué au groupe terminal H 2 N-C-N-, l'atome de carbone avec e 118,7 ppm est attribué à celui du groupe -CEN et six atomes de carbone avec 6 152,7-127,0 ppm sont attribués à des atomes de car- bone de guanidyle, entre le groupe guanidyle terminal et le groupe cyano Ces présomptions sont confirmées par le spectre infrarouge. On soumet la substance à l'essai de bêtacyani- ne-Amaranthus, pour la mesure de l'activité de cyto- kinine La solution aqueuse à 0,01 % est équivalente à 0,83 x 10-6 en termes de benzyladénine, qui est une cytokinine synthétique typique. Comme cultivars d'essai de tomates, on utilise le Fukuju No 2 (F 2); un cultivar sensible au TMV, et le Zuiko (ZK), un cultivar résistant Des solutions d'essai de la substance de l'invention (concentration -100 ppm) sont absorbées par la racine de la tomate. Après incubation à 25 C pendant 7 jours dans une étuve à incubation, sous 3000 lux, on détermine chimi- quement la concentration en TMV On constate que la concentration du virus est réduite d'environ 30 % dans le cultivar résistant, comme le montre la figure. En outre, on applique la substance de l'invention, aux mêmes concentrations que ci-dessus, à des demi- feuilles de haricot nain, qu'on innocule avec le virus, et on observe une inhibition élevée de l'infec- tion, atteignant environ 90 %. EXEMPLE 2 On prépare un mélange de 10 grammes de guanyl- urée, 2 grammes de charbon actif (vendu sous la déno- mination commerciale de Carboraffin par la Société dite Takeda Chemical Industries) et 100 ml d'eau, qu'on agite à fond et qu'on chauffe dans un autoclave à 1200 C, sous 1,4 atmosphère pendant environ 15 minu- tes Après refroidissement à température ambiante, on retire le mélange réactionnel, qu'on sèche à l'air. On ajoute ensuite 50 ml d'éthanol-à 97 % à la masse obtenue, et on chauffe le mélange à reflux pendant 2 heures On élimine par filtration des matières inso- lubles (contenant le charbon actif) et on roto-évapôre à sec la solution alcoolique sous pression réduite, dans un évaporateur rotatif, au-dessous de 50 C On fractionne le produit obtenu et on le purifie comme dans l'exemple 1, pour obtenir 1,5 mg de cristaux de PF = 195-1970 C. On mesure l'activité de cytokinine des cris- taux par l'essai de biosynthèse de bêtacyanine en utilisant Amaranthus caudatus cv de premier éclat. Comme le montre le tableau I, on observe une activi- té élevée de cytokinine. g 9- TABLEAU 1 Résultats d'essai d'activité de cytokinine (la méthode d'essai est celle décrite par Biddington et Thomas dans "Planta") EXEMPLE 3 On mélange à fond 15 grammes de guanylurée, 2 grammes de charbon actif, de l'acide silicique anhydre (vendu par Koizumi Kagaku Yakuhin & Co) et ml d'eau On chauffe le mélange dans un autocla- ve à 120 C, sous pression pendant 15 minutes Après refroidissement à température ambiante, on soumet le mélange à l'extraction par l'éthanol, puis à la sépa- ration par chromatographie en couche épaisse, comme dans l'exemple 2 On obtient 60 mg de la substance présentant une activité de cytokinine. Des recherches expérimentales sur la tempéra- ture et la pression de réaction dans l'autoclave men- tionné ci-dessus, permettent de conclure que l'inter- Absorbance A 542 A 620 A 542-A 620 Témoin 1 0,111 0,052 0,059 Témoin 2 0, 099 0,046 0,053 Témoin 3 0,102 0,051 0,051 Benzyladénine ( 0,25 x 1 0,440 0,146 0,294 -5 molés)100440 0,146 0,294 -5 moles) le 2 0,383 0,102 0,281 Produit de l'invention ( 0,067 % solution 0,428 0,122 0,306 aqueuse) A 542 représente l'absorbance à une longueur d'onde de 542 nm, etc. - valle de 1200 C ( 1,4 atmosphère) à 2100 C ( 6 atmosphère) est le plus favorable. EXEMPLE 4 A 5 grammes de phosphate de guanylurée et 50 grammes de diamide calcique, on ajoute une petite quantité de cuivre métallique On chauffe le mélange à 1200 C pendant 15 minutes, puis on laisse refroidir. Le mélange est ensuite chauffé avec de l'éthanol à 99 % pendant plusieurs heures, puis on le filtre à chaud Après refroidissement du filtrat, on sépare les cristaux ainsi formés, par filtration Le rende- ment est de 300 mg. Ce produit présente une activité de cytokini- ne, à l'essai avec Amaranthus De plus, et pour étu- dier l'effet de la température réactionnelle sur le rendement, on effectue les réactions thermiques pen- dant 15 minutes, aux températures respectives de 1100 C, 1200 C, 1500 C, 2100 C, 2200 C et 2600 C, et on me- sure le rendement en substance active. On constate qu'il se forme des substance acti- ves à 1100 C ou au-dessous, et à 2200 C ou au-dessus, et que la température de 1200 C est optimale. On étudie aussi le rapport des quantités de diamide calcique et de phosphate de guanylurée On constate que dans les conditions précitées de réac- tion, un rapport en poids de diamide calcique phosphate de guanylurée de 3:1 est optimal. Quand on utilise le sulfate de guanylurée comme produit de départ et qu'on le fait réagir dans les conditions précitées, on n'obtient pas de subs- tance active. EXEMPLE 5 A 50 grammes de dicyanodiamide, on ajoute ml d'eau et 100 ml d'une solution aqueuse à 10 % d'ammoniaque On agite le mélange à environ 80 C pendant 30 minutes Après refroidissement, on lave à l'eau, plusieurs fois, les cristaux en forme de pris- me ainsi formés, et on sèche à l'air A 10 grammes de ces cristaux, on ajoute 2 grammes de charbon actif, et 100 ml d'eau au mélange On chauffe ce mélange dans un autoclave sous pression à 1200 C ( 1,4 atmos- phère) pendant 15 minutes On traite le mélange obte- nu comme précédemment décrit, pour recueillir 2,3 grammes de cristaux qui sont actifs. Les activités phyto-physiologiques, outre l'activité de cytokinine et l'activité antivirale, comprennent un grand nombre d'effets favorables diffé- rents sur la croissance des plantes, comme la diffé- rentiation, l'adhérence et l'épaississement du bour- geon floral, pour des céréales végétales, des plantes et arbres floraux, des vergers, de jeunes arbres de forêt, des pâturages, etc. Les substances de l'invention favorisent la multiplication de microorganismes dans les systèmes des racines et dans la rhizosphère Les effets inhibi- teurs de maladies virales des plantes, intraitables jusqu'à présent, sont considérés-comme remarquablement avantageux Les effets d'accroissement de la résis- tance aux maladies virales et d'inhibition des infec- tions sont intéressants pour augmenter notablement l'efficacité de la culture des pommes de terre, du tabac, des tomates, etc, par exemple en per- mettant une culture sans risque du cultivar résistant de l'aubergine, avec un rendement élevé. La multiplication de Rhizobium meliloti et de microorganismes utiles favorise la fertilisation du sol et est aussi considérée comme une contribu- tion intéressante à l'industrie de la fermentation. Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux exemples de réalisation décrits, elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans s'écarter pour cela du cadre de l'invention. REVEND ICAT IONS 1 Oligo-imino-amines, caractérisées par leurs activités phyto-physiologiques, et par la formule géné- rale suivante: ou H 2 N-C= N-C=)n N CN I I NH 2 NH 2 H H H 2 N-C (N-C -) N-CN NH NH NH NHî o N = 4 6. 2 Procédé de préparation d'oligo-imino- amines, caractérisé en ce qu'il consiste à chauffer le dicyanodiamide, le cyanamide, la guanylurée ou ses sels, sous pression ordinaire ou élevée.