FR 2532948 A1 19840316 FR 8314715 A 19830915 " Suppléments et combinaison pour milieux jde croissance de cellules, et procédé pour leur fabrication " Les sérums animaux, et particulièrement le sérum foetal de veau, sont connus comme suppléments pour les milieux courants de culture de tissus Ainsi, il est connu. que l'on peut ajouter jusqu'à 20 % en volume et fréquem- ment 10 % de sérum de bovins aux cultures de tissus de cellules animales dans de tels milieux de croissance de tissus standard tels que le F 12 de Ham, l'Eagle modifié de Dulbecco et autres Ce sérum apparaît propre à fournir certaines matières essentielles pour la culture des tissus qui ne sont pas fournies facilement, si même elles le sont par les substituts connus L'utilisation de sérum animal comme supplément aux milieux de croissance aide fréquemment les cellules à remplir une fonction différenciée, à s'ac- croître aux concentrations voulues et à maintenir la croissance et la viabilité pendant de longues durées. Toutefois, l'utilisation du sérum animal peut soulever certains problèmes dans la culture des tissus. Le principal de ces problèmes est la variabilité de la composition du sérum Par suite, l'aptitude à promouvoir la croissance de lots de sérum différents peut varier dans de larges limites Les fournisseurs de sérum animal s'ef- forcent de réduire au maximum cette variation en rassem- blant le sérum de nombreux animaux et en maintenant les troupeaux d'animaux donneurs d'une quantité connue, et/ou en triant ou essayant les taux d'hormones, de facteur de croissance et autres composants du sérum Toutefois, ces efforts peuvent être onéreux et ne sont pas toujours efficaces pour réduire les problèmes de variabilité Ces problèmes peuvent restreindre l'usage par les utilisateurs et peuvent causer des variations dans les résultats des recherches Fréquemment, les utilisateurs doivent procéder à de vastes investigations sur le sérum avant de l'utili- ser, ce qui peut être coûteux en temps de même qu'en ar- gent La possibilité de se procurer du sérum de bovin en quantités importantes peut constituer un problème du fait qu'elle varie suivant les hauts et les bas de l'industrie du boeuf Et aussi le sérum foetal de veau, de même que les autres sérums de bovins peuvent être obtenus comme sousproduit, et l'obtention est liée aux dimensions du troupeau qui varient cycliquement. On a constaté que l'utilisation de sérum animal comme supplément aux milieux de croissance normaux présente des inconvénients D'autres personnes ont essayé de réduire la proportion de sérum utilisé dans les cultures de tissus ou même de supprimer complètement l'utilisation du sérum. On a établi des milieux de croissance exempts de sérum qui sont spécifiques pour des types particuliers de cellules. De même, on a fait appel à une diminution de la quantité de sérum normalement ajoutée, en même temps qu'on utili- sait des facteurs de croissance fournis par d'autres sup- pléments destinés à des séries spécifiques de cellules. Et aussi, quand les proportions de sérum ont été réduites, ou supprimées dans la croissance normale de tissust dans le passe, elles l'ont été en connexion avec des types parti- culiers de cellules La technique antérieure n'a pas réa- lisé un supplément sensiblement universel pour lacroissance des tissus, qui ait été accepté par l'industrie pour être utilisé avec une large variété de cellules de différents types, y compris les cellules primaires transformées et non-transformées d'origine aussi bien fibroblastoldes qu'épithèlioide, et les lignes ou souches de cellules continues, transformées ou non transformées. Dans ces conditions, l'invention a pour objet de réaliser un supplément pour milieu de croissance de cellules contenant du sérum animal et une combinaison de substituts des composants du sérum animal, ce supplément pouvant être utilisé pour promouvoir la croissance des cellules dans la culture. Elle a aussi pour objets a) de réaliser un supplément pour milieu de croissance de cellules suivant l'objet mentionné ci-dessus qui puisse être produit avec des propriétés essentiellement-compati- bles en volumes désirés pour être utilisé en rapport avec- la croissance des cellules dans une variété de milieux, ces cellules pouvant être choisies dans une large variété de types de cellules. b) de réaliser des suppléments pour milieux de culture des cellules en concordance avec les objectifs mentionnés ci- dessus en combinaison avec des milieux de cultures courants pour tissus destinés à être utilisés pour la croissance des cellules. c) de réaliser des procédés avantageux pour fabriquer et utiliser le supplément pour milieux de croissance de cellules suivant l'invention. Suivant l'invention, un supplément pour milieu de crois- sance de cellules comprend une proportion mineure de sérum animal, de préférence du sérum de veau nouveau-né, avec une proportion majeure d'hormones thyroïdiennes et peptidiques choisies, de corticoîdes, d'androgènes, d'oestrogènes, de facteurs de croissance, de produits- nutritifs et de facteurs de transport, de sels minéraux, d'acides aminés, de vitamines, de sucre et d'une quantité faible d'autres composants, dans une phase aqueuse, pour permettre une croissance rapide et prolifique d'une large variété de types de cellules dans une lignée primaire et dans des lignées continues de culture de cellules, des lignées de cellules transformées et non transformées, y compris des cellules fibroblastoides et épithèlioldes. Dans un mode de réalisation recommandé, le sérum utilisé est du sérum de veau nouveau-né, l'hormone pepti- dique est l'insuline, le facteur de transport est la transferrine, les facteurs de croissance sont le facteur de croissance épidermique et un supplément de croissance des cellules endothéliales, pendant les agents nutritifs comprennent l'acide sélénieux et l'0-phosphoryl-éthanola- mine et l'hormone thyroïdienne est la triiodothyroxine, -le corticolde est l'hydrocortisone, l'oestrogène est l'oestradiol 17, la progestérone, et l'androgène est la testostérone. De préférence, le supplément de l'invention est formulé, mélangé intimement, et on utilise une étape de filtration pour stériliser le mélange, La filtration est de préférence effectuée comme dernière étape de la forma- tion du supplément. C'est une caractéristique de l'invention que ce supplément peut réduire ou supprimer les problèmes soule- vés par la variabilité de la composition du sérum d'un lot à l'autre La petite quantité de sérum utilisé peut varier sans avoir un effet substantiel du fait qu'elle constitue seulement un faible composant de la culture des tissus, le plus souvent un quart ou moins de la quantité qui est utilisée normalement D'une façon surprenante, alors même que l'on utilise seulement une faible propor- tion de sérum, celle-ci assure les composants nécessaires pour un milieu de culture universel pour la croissance des tissus, comme par exemple les facteurs de réunion des cellules, et les protéines assurant le transport des sub- stances insolubles à l'eau La faible addition de sérum de base collabore avec les autres facteurs pour la mul- tiplication des cellules Comme la proportion de sérum est faible, les taux de substances toxiques normalement apportées par le sérum sont diminués Du fait que le taux de protéines dans la culture ultime des cellules est réduite par rapport à l'utilisation du sérum seul, la séparation des protéines du produit final est rendue plus facile La concentration des cellules produites, dévelop- pées dans les milieux de culture peut être accrue quand on utilise le supplément suivant l'invention pour exalter la croissance La diminution de la teneur total en pro- téines du milieu de croissance des cellules peut aussi avoir pour résultat une augmentation de l'efficacité et de la facilité de récupération et de purification des produits cellulaires désirés Cela peut être extrêmement important dans -l'industrie de la pharmacie et des vaccins. La reproductibilité d'un produit constant est augmentée par le supplément suivant l'invention Cela peut suppri- mer la variabilité de la promotion de croissance obser- vée habituellement avec différents lots de sérum animal entier, et supprime la nécessité d'essayer de nombreux lots pour trouver un lot acceptable On peut ainsi obte- nir facilement une diminution des frais et du temps passé dans l'ensemble des opérations de culture des tissus. Le supplément pour milieu de culture de cellules suivant l'invention est utilisé à la place du sérum animal dans la culture des tissus et cellules, Habituellement, on utilise du sérum animal dans la culture de cellules dans des proportions de 5 à 20 % en volume des milieux de culture normaux des tissus t toutefois, il est préfé- rable d'utiliser le supplément pour milieu de culture de cellules suivant l'invention dans des proportions de 1 à. % en volume des milieux courants de culture des tissus. Dans des lignées de cellules limitées, on peut utiliser des proportions plus hautes ou plus basses du supplément au milieu courant, comme par exemple de 0,1 à 40 Q de sup- plément pour 99,9 à 60 % de milieu courant Ces milieux normaux de culture de tissus utilisables avec le supplé- ment suivant l'invention et qui ont été précédemment uti- lisés avec du sérum seul comprennent, sans y être limités les produits suivants: Milieu de McCoy 5 a McCoy, T A, Maxwell, M and Kruse, P F, Proc. Soc Exper Biol and Med, 100, 115-118 ( 1959). Milieu essentiel minimum Eagle, H, Science 130, 432 ( 1959) Milieu Eaglemodifié Daniel, M D and Melendez, L V, Proc of the Soc for Exp Biol and Med 127, No 3 (March 1969) Milieu Eagle modifié de Dulbecco Dulbecco, R and Freeman, G Virology 8, 396 ( 1959) Smith, J D, Freeman, G, Vogt, M and Dulbecco, R, virology 12, 185-196 ( 1960) Tissue Culture Standards Committee, In Vitro 6, No 2, 93 Milieu de (Leibovitz) L-15 Leibovitz, A, Am J Hyg 78, 173-180 ( 1963) Mélanges nutritifs Milieux F-10 et F-12 Ham, R G, Exp Cell Res 29, 515-526 ( 1963) Ham, R G, Proc Nat Acad Sci 53, 288-293 ( 1965) Milieu de Waymouth Waymouth, C, J Nat Cancer Insto 22, 1003-1017 ( 1959) Comme exemples de formulations aqueuses de tels milieux, on peut citer: Milieu nutritif de HAM F-12 (fourni par Gibco Laboratories) COMPOSANTS Sels minéraux Ca C 12 2 H 208 Cu 504 5 IH 208 Fe SO 4:7 H 20 K Cl t 4 g C 12 6 H 20 Na CI Na HCO 3 Na 2 HPO 4 7 Hg O Zn SO 4 7 H 2 Autres composants: D-Glucose - Hypoxanthine Acide-linolêXque Acide lipoique, Rouge de phénol Putrescine 2 H Cl Pyruvate de sodium Thymidine Acides aminés L-Alanine L-Arginine H Cl L-Asparagine H Ob Acide L-Aspartique L-Cysteine H Cl H 20 Acide LGlutaraique L-Glutamnind Glycine L-Histidine H Cl H 20 L-Isoleucine LLeucine L-Lysine HCI L-Metnionine L-Phényialanine L-Proline L-Sérine LThréonine L-Tryptophano- L-Tyrosine- L-Valine 44 00 0 00249 0 834 223 60 122 00 7599 00 1176 00 268 00 0 863 1802 00 4 10 0.084 0.21 1 20 0 161 0.73 211 00 15.01 13.30 35.12 14 70 146 00 7.50 20.96 3, 94 13 10 36.50 4 96 34. 50 10.50 11.90 5.40 I 1 70 mg/i 1 Vitamines Biotineb D-pantothénateb de Ca Chlorure de choline Acide folique i-Inositol Niacin amide Pyridoxine H Cl Riboflavine Thiamine HCI Vitamine B 12 MILIEU EAGLE DE DULBECCO MODIFIE (dans H 910) COMPOSANTS Sels minéraux Ca C 12 tanihyci > -Fe(N 03)3 9 H 20 KC 1 mg SO 4 7 H 20 Na Ci Na HCO 3 Na 2 HPO 4 H 2 Autres com Dosants D -Glucose Rouge de phénol Pyruvate de sodium- Acides aminés L-Arginine HC 1 L-Cystine L-Glutamine Glycine L-Histjdine HC 1 H 20 L-Isoleucine L-Leu ci ne L-Lysine H Cl L-Mdth ionine L-Ph L Cnylalanine L-56 rine L-Thr 4 onine L-Tryptophane L-Tyrosime L-Valin e 0.0073 0 4800 13.9600 1 300 18 000 O 03 70 0.06 20 0.0380 0.3400 1 3600 mg/L' 00 400,00 00 6400 00 3700 00 1000 00 15.00 00 84 00 48.00 584 00 30.00 42.00 00 00 146 00 00 66.00 42 00 95.00 16.00 72 00 94.00 Vitamines D-pantothénate de Ca 4 00 Chlorure de choline 4 00 y Acide folique 4 00 Myo-Inositol 7 20 Nicotinamide 4 00 Pyridoxal H Cl 4 00 Riboflavine 0 40 Thiamine HC 1 4 00 Vitamine B 12 a Les valeurs indiquées sont en conformité avec celles du "Tissue Culture Standards Committee", In Vitro, 9 N-6 ( 1970). D'autres milieux de culture des tissus standard peuvent être utilisés en commun avec le supplément suivant l'invention pour la croissance des cellules Les variations de ces milieux sont nombreuses La limitation consiste uni- quement en ce que l'on utilisera le supplément seulement avec des milieux connus pour promouvoir la croissance en présence de sérum animal. Le sérum de veau nouveau-né est préféré comme constituant la partie sérum du supplément suivant l'in- vention parce qu'il est plus universel que les autres sérums animaux. Le sérum de veau nouveau-né est prélevé sur des veaux agés de 10 jours et moins Dans certains cas, le sérum de veau nouveau-né peut ét re remplacé par un autre sérum de bovin, ou le sérum d'un autre animal, tel que le sérum de cheval, le sérum de bovidés, le sérum de poulet, le sérum de lapin, le sérum de porc, le sérum d'ovins ou de caprins, ou une combinaison de ces sérums Quand des lignées de cellules en cours de développement croissent normalement dans d'autres sérums que celui du veau nouveau- né, on peut utiliser cet autre sérum comme-le constituant sérum du supplément de croissance des cellules de l'inven- tion. Dans tous les cas, il est préférable d'obtenir une combinaison d'ingrédients qui assurent au supplément une grande versatilité et qui le rendent utilisable pour une large variété de lignées de cellules De même, les hormones et autres ingrédients sont choisis tels que, bien que certains ne soient pas indispensables pour l'utilisa- tion dans toutes les lignées de cellules, aucun d'inter- fère avec l'action des autres dans aucune lignée de cellules. Les composants hormones peptidiques de l'inven- tion peuvent comprendre l'insuline Le facteur de transport est la transferrine qui est aussi une hormone peptidique. Les hormones thyroïdiennes sont la tritodothyroxine et la thyroxine. Les facteurs de croissance utilisés sont de préférence le facteur de croissance épidermique, tel qu'il est vendu par Collaborative Research, Inc of Waltham, Massachusetts, sous leur désignation CR-EGF Cet EGF est tel qu'il est décrit dans la littérature, référence Savage C R et Cohen S J Biol Crtem, 247, 7609 à 7611 ( 1972) Un supplément pour la croissance des cellules en- dothéliales utilisable suivant l'invention et contenant un facteur de croissance des cellules endothéliales peut être obtenu de Collaborative Research, Inc de Waltham, Massachusetts sous leur désignation CR-ECGS Ce facteur de croissance est en outre décrit dans la littérature, référence Maciag T, Cerundolo J, Ilsley S, Kelley P R. et Forand R, Proc Nat Acad Sci USA 76, 5674 à 5678 ( 1979). L'androgène utilisé peut être la testostérone, la dihydrotestostérone, la nandrolone et l'oxymétholone, l'oestrogène utilisé peut être la progestérone, le 17 (béta)oestradiol, l'oestrone. Le corticolde est de préférence l'hydrocortisone, mais on peut utiliser d'autres matières comme les cortisone dexaméthasone, prednisolone, et corticostérone. Les agents nutritifs comprennent de préférence l'acide sélénieux, ltortho Lphosphory-éthanolamine et d'autres matières qui interviennent dans les fonctions enzymatiques cellulaires. Les sels minéraux utilisables dans l'invention sont ceux que l'on utilise couramment dans les milieux de -culture des tissus tels que par exemple les sels de cal- cium, cuivre, fer, manganèse, ammonium, potassium, magné- sium, sodium et zinc, sous forme de chlorure, sulfate, 1 O phosphate ou autres, certains d'entre-eux pouvant être hydratés. Des additifs acides aminés aux milieux de culture des tissus peuvent être aussi utilisés et l'on peut citer comme exemples les L-alanine, L-arginine H Ci, Lasparagine, acide L-aspartine, L-cystéine H Clo H 20, L-isoleucine, Llysine I Cl, L-méthionine, L-pnénylalanire, L-proline, L-sérine, Lthréonine, L-tryptophane, L-tyrosine, L-valine, acide L-glumatique, Lglycineg L-glutamine, L-histidine et L-leucine. Les vitamines essentielles comprennent les d-Biotin, D-Pantothénate de Ca, Chlorure de choline, acide folique, Myo-inositol, Nicotinamide, Pyridoxine H Cl, Riboflavine, Thiamine H Cl et Vitamine B 12 o Comme autres composants de natures diverses, on peut citer les sucres comme le glucose, hypoxanthine, acide linoléique, rouge de phénol, putrescine-2 H Cl, pyruvate de sodium, thymidineg acide ascorbique, calciférol, niacine, acide para-aminobenzoique, pyridoxal Cli vitamine A. On utilisera de préférence de l'eau distillée déminéralisée présentant une résistance supérieure à 8 méga-ohms Toutefois toute eau que l'on utilise habi- tuellement dans la culture des tissus peut être utiliséeo On comprendra facilement que les composants peuvent être utilisés sous leur forme soluble à l'eau, par exemple sous la forme de sels des hormones, acides aminés vitamines et autres. Le supplément suivant l'invention est utilisé de préférence à la place du sérum que l'on utilise ordi- nairement dans les cultures de tissus Ainsi, de préfé- rence, le supplément peut être utilisé dans des proportions de l'ordre de 1 à 25 % en volume de la solution totale des milieux courants de culture des tissus, comme par exemple dans les milieux de Ham F 12 ou de Eagle par exemple dans une proportion de 1: 99 à 1: 4 Et aussi le taux de sérum de veau, quand le sérum animal est du sérum de veau, se monte de préférence à un taux de 0,25 % à 6,25 % en volume de l'ensemble du milieu de culture des tissus Ce taux de sérum dans l'invention est assez bas pour éviter toute addition sensible de facteurs toxiques, diminue la tendance des variations dans la consistance du sérum à avoir un effet, et fournit des matières nécessaires pour la croissance des cellules autres que la matière entière- ment à base de protéines. Dans la formulation préférée de l'invention, un supplément pour milieu de croissance des cellules est formulé comme zsuit et peut être considéré comme le substitut universel recommandé par l'invention: FORMULATION 1 Composant Concentration Veau nouveau-né % en volume du supplément mg/L Insuline 25 Transferrine 50 EGF 5 ECGS 77 5 Acide selenieux 0 16-12 O-phosphoryl-éthanolamine 56 44 L-3,5,3 'triiodothyroxine 1 683 x 10-4 Hydrocortisone 4 33 x 10-3 Oestradiol 17 3 41 x 10-3 Progestérone 3 93 x 10-3 Testostérone 3 6 i x 10-3 Sels minéraux Ca CI 2 CUSU 4 5 H 20 Fe SU 4 7 H 20 KCI Mg CI 2 6 H 20 Na Cl Na 2 HP 04 Zn SO 4 7 H 20 Aoides aminés L-alanine L-arginine HCI L-asparagine Acide L-aspartic Tue Lcyste'ine' H Cl H 20 Acide L-glumnatique Glycine L-Histidine HCL H 20 ' Lisoleucine L-Lysine H Cl L-mèth-ionine L-phenyloilanine L-proline L-se rine L ttirëonine L-tryptophane L tyrosine L-valine Vitamines IDpantothénate de Ca Chlorure de choline. Acide folique b Myo-inositol Nicotinamnide Pyridoxine HCI Ribof lavine Thiamine HCI Vitamine B 12 Composants divers Glucose Hypoxanthine Acide 1 &noléique Rouge de phénol Putrescine 2 HCI Pyruvate de sodium Thymidine Bicarbonate de sodium 23 24 0 00174 0.58 156 56 40 ,319 30 99.40 0,60 153 73 50 24 58 30 , 26, 14 67 ' 56 3.13 3, 47 24 17 7,36 8-.20 0 0051 12 61 0.026 0.043 0 026 0.95 1, 261 12 2.86 0 059 0 87 0.11 77.07 1176. Eau distillée déminéralisée ayant une résistivité supérieure à 8 méga-ohms, quantité suffisant (QS) pour arriver à 1 litre. La formulation recommandée peut être réalisée en un lot important ou en faibles quantités, comme par exemple 1 litre, les quantités étant maintenues dans les proportions indiquées dans la formulation 1 ci-dessus. Bien que cette formulation spécifique ait été trouvé recommandable, des variations sont possibles. Comme il est décrit précédemment, on peut utiliser d'autres sérums d'animaux à la place du sérum de veau nouveau-né. La formulation spécifique ci-dessus peut être utilisée là o l'on utilisait précédemment du sérum de bovins comme supplément aux milieux courants de culture de tissus Ainsi, on peut ajouter de 0,1 à 40 % en volume de la formulation ci-dessus à des milieux normaux de culture de tissus, pour une large variété de lignées de cellules qui auraient autrement dû se développer avec un volume égal d'une ad- dition de sérum animal Les conditions de croissance utilisées pour les cellules sont essentiellement les mêmes que celles que l'on utilise quand le supplément est constitué par du sérum animal seul. Les conditions courantes de culture des tissus sont utilisées quand les suppléments de cette invention sont mélangés avec des milieux de culture de tissus et utilisés pour le développement des cellules dans des cul- tures de tissus Par exemple, on peut utiliser des tempé- ratures de culture courantes de 30 à 380 C Les durées de * croissance des cellules varient considérablement, en géné- ral et sont de six heures et plus Les types de culture de cellules peuvent être d'un quelconque des types normaux utilisés, y compris la culture en suspension, la croissance de cellules fixées sur un substrat, croissance de cellules fixées sur un grain micro-transporteur, croissance sur de l'agar mou, croissance de cellules avec du collagène ou ou d'autres supports formant biomatrice On peut utiliser les techniques de culture en tambour, secoueuse, ou en suspension immobile Les milieux auxquels on a ajouté le supplément de l'invention sont de préférence maintenus à un p H de 6,5 à 7,8 environ pour obtenir une croissance maximum des cellules Les tampons normalement utilisés dans les milieux tels que F 12 ou milieux Eagle modifié tamponnent les milieux de culture de cellules de tissus animaux à un p H de l'ordre physiologique. L'atmosphère gazeuse qui règne au-dessus des mélanges de culture de l'invention peut être celle que l'on utilise couramment pour la lignée de cellules parti- culière que l'on cultive Ainsi; on peut utiliser des atmosphères contenant du dioxyde de carbone à raison de O à 15 % comme atmosphères de mélanges gazeux contenant de l'oxygène, de l'azote, du dioxyde de carbone et de l'air. Les variations recommandées à partir des propor- tions indiquées plus haut dans la formulation du supplément recommandé peuvent être de l'ordre indiqué ci-dessous Composant Veau nouveau-né Insuline Transferrine EGF ECGS Acide sélénieux O-pnosphoryl-ethanolamii L3,5,3 'triiodothyroxine Hydrocortisone Oestradiol 17 Progesterone Testostérone Ordre de grandeur -25 % mg/L -10 -100 2-100 2-100 0.013-0 13 ne 1 4-140 e 6 73 x 10-7 6 73 -4 3.46 x 10-4 3 4 E -2 2 72 x 10-4 2 7; 2 3.15 x 10-4 3 o 1 -2 2.88 x 10-4 2 8 E -2 3 x 6 x x 8 x Le reste des composants, qui sont des additifs courants que l'on introduit dans les milieux de culture de tissus, peuvent varier dans une mesure plus large et une plus grande possibilité de substitution que les composants énumérés ci-dessus Ces composants restants sont ceux qui sont énumérés en supplément dans la formultation 1 comme sels minéraux, acides aminés, vitamines et composants de natures diverses. Les proportions de chacun des composants peuvent varier, en dehors des ordres de grandeur indiqués, pour certaines lignées de cellules. Dans la formultation du supplément recommandé au milieu de croissance de cellules suivant l'invention, on mélange les matières d'une manière courante quelconque. Toutefois, il est préférable de filtrer la matière totale après mélange afin de réaliser la stérilisation finale. Une méthode recommandée de réaliser la -for- mulation 1 préférée est exposée dans l'exemple 1 ci- dessous: EXEMPLE 1 Le supplément pour milieu de -croissance de cellules suivant l'invention avec les proportions de composants dans la formulation 1 est réalisée comme suit: 1 On dégèle du sérum de veau nouveau-né congelé et le chauffe à 370 C pour assurer la solubilisation des globulines insolubles à froid. 2 On dissout les sels minéraux, les acides'- aminés, les vitamines et les composants de diverses natu- res dans l'eau distillée déminéralisées, à une température de l'ordre de 31 à 350 C, pour former une solution - 3 On prélève une fraction ( 25 %) de la solu- tion de la phase 2 pour solubilisation des composants res- tants Le sérum de veau nouveau-né est ajouté à cette fraction, de façon à obtenir une concentration finale de 2 % en volume. On prépare des solutions de réserve des com- posants suivants, en utilisant de l'eau distillée déminé- ralisée; Insuline bovine ( 25 g/l): Transferrine ( 25 g/l) EGF, qualité récepteur ( 10 mg/1); ECGS ( 1,5 g/l); acide sélênieux ( 16,12 mg/l); Ophosphoryléthanolamine ( 56,44 g/l) dans de l'hydroxyde de sodium; (triiodothyroxyne 168225 ug/l) et dans l'éthanol absolu hydrocortisone ( 4 g 12 mg/l) oestradiol 17 ( 3,41 mg/l) g progestérone ( 3,93 mg/l) tes- tostérone ( 3,61 mg/l) 5 On ajoute lentement le volume approprié de chacune des solutions de réserve, en agitant constamment, la solution de la-phase 2, dans l'ordre suivant insuline, transferrine, EGF, ECGS, acide sélénieux, O- phosphoryl éthanolamine, triiodothyroxine en les diluant d'abord dans un petit volume de solution de la phase 2 avant l'addition à la formulation finale Dans des con- ditions similaires, l'hydrocortisone, l'oestradiol, la progestérone et la testostérone sont dilués dans la solu- tion de la phase 2 avant d'être ajoutés à la formulation finale. 6 o Le sérum de veau nouveau-né chauffé à 37 C est ajouté lentement, tout en agitant. 7 Le p H final de la formulation est de l'ordre de p H 7,2 à 8, et elle a une osmolarité de 330 à 350 milliosmoles, 8 La solution subit une double filtration dans un filtre à 0,2 micron de façon à réaliser un produit final stérilisé ayant la composition de la formulation lo On a cultivé, dans des exemples spécifiques d'utilisation du supplément de sérum universel, recommandé, de la première formulation ci-dessus, plusieurs lignées de cellules, comme suit EXEMPLE 2 On a utilisé le supplément pour milieu de cul- ture ayant la formulation 1 en rapport avec le développe- ment de BHK-21, cellules de la collection de l'American Type Culture, Rockville, MD ATCC no CCL-10 (cellules de rein de jeunes hamsters) On introduit en supplément % de sérum de veau dans le milieu Eagle de Dulbecco modifié (DMEM), en un volume de 5 ml chaque fois, dans une première série de boîtes de Petri de 60 mm Les cel- lules ont été cultivées pendant 6 jours à 370 C dans une ambiance de 5 % C 02/95 % d'air, humidifiée. Dans une seconde série de boites de Petri de 60 mm, on a cultivé des cellules BHK-21, dans les mêmes conditions, dans du DMEM, pourvu avec 10 % du supplément de culture de la formulation 1 de l'invention. Les première et seconde séries ont été compo- sées de plusieurs boîtes de Petri dans chacun des lots A, B et C de supplément et des lots A, B et C de milieu au sérum de veau modifié Au bout de 3 jours et d'environ jours, on a remplacé le milieu comprenant le supplément de formulation 1 et le milieu contenant du sérum, par une quantité fraiche de chacun dans chaque boite. L'avantage de la substitution du supplé- ment dans la culture des cellules BHK-21 est illustré dans le graphique de la figure 1 Ainsi, la durée de génération de BHK-21 dans le supplément au milieu de cul- ture des cellules de l'invention, a été suivant les cons- tatations de 13,1 heures que l'on doit comparer avec la durée de 16,5 heures, trouvée dans le milieu additionné de sérum de veau à 10 % La durée de génération des cel- lules ou temps nécessaire pour le doublement des cellules est utilisée pour mesurer la vitesse de croissance, ou vitesse de doublement de la population cellulaire La durée de génération des cellules est par suite une mesure quantitative de l'aptitude à la promotion de la croissance du supplément au milieu pour culture des tissus La den- sité des cellules au sixième jour est de 2,23 X 10 cel- lules par cm 2 avec un supplément de 10 % de la formulation 1.9 1 pour la culture des cellules dans le DMEM, et de 1,59 X 105 cellules par cm 2 avec 10 % de sérum de veau dans le DMEM. De même, la formulation 1 est apparue comme étant un supplément sensiblement universel de croissance des cellules à ajouter aux milieux de culture de tissus. On peut citer, comme autres cellules que l'on a cultivées avec des résultats positifs en utilisant la formulation 1 suivant l'invention comme supplément, les cellules suivantes: A 431 Adénocarcinome épidermoide humain BALB 3 T 3 Fibroblaste de l'embryon de souris C 6 Gliome du rat CV-1 Rein du singe vert africain Endothéliales (non transformées) Endothéliales aortiques de la souris F 9 Carcinome embryonique de la souris FS-1230 Fibrobalstes diploides humains Hela Carcinome cervical humain Il Hybridoma Sp-2 Apparenté au myélome de la 2 souris-production continue d'anticorps Hybridoma NS-1 Apparenté au myélome de la souris KB Carcinome épidermoîde oral humain L 6 Myoblaste de muscle de squelette du rat MCF-7 Carcinome du sein humain Sarcome de la souris - Myoblastoide (non transformé) Murine SV 403 T 3 SV-40,BALB C 3 T 3 transformé par virus TR-M Tumeur testiculaire du rat TR-ST Tumeur testiculaire du rat TM-4 Sertoli de la souris TR-1 Cellule testiculaire du rat (non trans- formée) VERO Rein de singe vert africain WI-38 Fibroblaste diplolde humain MRC-5 Fibroblaste diploïde humain OMTW 9 PL Tumeur mammaire du rat 6 clônes indépendants, Cultures primaires de fibroblastes humains Cultures primaires de spéciments de biopsies de tumeurs humaines. Bien que certaines lignées de cellules telles que celles du fibroblaste de l'embryon du rat ne se dé- veloppent habituellement pas dans le milieu de culture des cellules suivant l'invention, on considère cependaji Io que ce supplément est universal du fait qu Dil provoque le développement d'une grande-variété de culture de cellu 1:7. Le terme "Croissance" tel qu'il est utilisé dans cette demande se rapporte à la multiplication des cellules qui prennent une grande densité quand on les cultive sur des supports solides ou librement en suspen- sion Quand le supplément suivant l'invention est utilisâ avec des milieux courants du type décrit ci-dessus, dans les proportions largement indiquées de 0,1 à 40 % du sup- plément de l'invention dans le milieu de culture pour 99,9 à 60 % du milieu, et de préférence de 1 à 25 % en volume du supplément de l'invention pour 99 à 75 % en volume du milieu de culture, la croissance des cellules d'une large variété de lignées est fortement favorisée. Le supplément suivant l'invention peut être conservé pendant de longues périodes de temps sans perte notable de son activité Par exemple, le supplément peut être congelé à -20 'C On a constaté que ce supplément est stable à des températures de 40 C pendant des durées d'au moins quatre semaines Même après mélange avec des mi- -30 lieux courants, le supplément conserve ses activités favorisant la croissance des cellules pendant de longues durées Bien que ce supplément ait été décrit comme une solution séparée destinée à être ajoutée à un milieu de culture courant, on comprendra facilement que la formu- lation de supplément elle-même peut être formée directe- ment dans des milieux courants par additions des portions nécessaires à ces derniers Dans tous les cas, il est pré- férable d'ajouter le sérum utilisé comme étape finale après avoir solubilisé au moins une portion du sérum dans une fraction d'un mélange de sels minéraux, d'acides aminés, de vitamines et de composants de natures diverses. R E V E N D I C A T IONS 1 ) Supplément pour un milieu decroissance destine au développement de cellules in vitro, caractérisé en ce que ce supplément est constitué essentiellement d'une quantité mineure de sérum animal et d'une proportion majeure d'un mélange d'hormones peptidiques et thyroidien- nes, d'oestrogènes, d'androgène, de corticoides, de pro- duits nutritifs, de facteurs de croissance, de facteurs de transport, de sels minéraux, d'acides aminés, de vitamines de sucre et de faibles quantités d'autres composants. 2 ) Supplément pour milieu de croissance de cllules suivant la revendication 1 dans lequel le sérum animal, les hormones, oestrogènes, androgènes, corticoides, facteurs de croissance, produits nutritifs et facteurs de transpo Lt sont constitués essentiellement par du sérum de mammifère, de l'insuline, transferrine, EGF, ECGS, acide sélénieux, ophophoryléthanolamine, triiodothyroxine, hydrocortisone, oestradiol 17, progestérone et testostérone. 3 ) Supplément suivant la revendication 2, carac- térisé en ce que le sérum est du sérum de bovin. -4 ) Supplément suivant la revendication 3, carac- térisé en ce que les composants sont utilisés dans les proportions suivantes du supplément: Composants Ordre de grandeur Sérum de bovin 5-25 % en volume mg/L Insuline 5-10 Transferrine 20-100 EGF 2-100 ECGS 2-100 Acide sélênieux 0 013-0 13 O-phosphoryl-ethanolamine 1 4-140 L-3,5,3 'triiodothyroxine 6 73 x 10-7 6 73 x -4 Hydrocortisone 3 46 x 10-4 3 46 x 2 Oestradiol 17 2 72 x 10-4 2 72 x -2 Progestérone 3 15 x 10-4 3 15 x 10-2 Testostérone 2 88 x 10-4 2 88 x -2. ) Supplément pour milieu de croissance de cellules caractérisé en ce qu'il est constitué essentiellement par les matières suivantes: une proportion mineure de sérum de bovin et une proportion majeure d'hormones peptidiques et thyroidiennesg oestrogènes, androgènes, corticoîdes, pro- duits nutritifs, facteurs de croissance, facteurs de trans- port, sels minéraux, acides aminés, vitamines, sucre et de faibles quantités d'autres composants, ce supplément pou- vant être utilisé pour aider à la croissance d'une grande variété de types différents de cellules y compris les cej- lules primaires, transformées ou non-transformées, d'ori- gine aussi bien fibroblastolde qu Uépithélioide et des souches continues de cellules transformées ou non trans- forméeso 6 ) Supplément suivant la revendication 5, carac- térisé en ce que le sérum de bovin, les hormones, oestro- gènes, androgènes, corticoides, facteur de croissance, produits nutritifs et facteur de transport sont constitués essentiellement par du sérum de bovin, de l Uinsuline, transferrine, EGF, ECGS, acide $élénieux, o-phosphorylé- thanolamine, triiodothyroxine, hydrocortisone, oestradiol 17, progestérone et testostérone O 7 ) Supplément suivant la revendication 6, carac- térisé en ce que le sérum est du sérum de veau nouveau-né. 8 ) Supplément pour milieu de croissance de cellules caractérisé en ce qu'il est constitué essentiellement des composants suivants Composant Sérum animal Insulire Transferrine EGF ECGS Acide siélénieux 0priosphoryl -et nanolamin e L-3,5, 3 ' triiodothyroxine Hydrocortisone Oestradiol 17 Pro ges te rone Tes tos te rone Sels minéraux Ca C 12 Cu SO 4 5 H 20 Fe SO 4 7 H 20 KC 1 Mg C 12 6 H 20 Na Cli Na 2 HPO 4 Zn SO 4 7 H 20 Acides aminés L-alanine L-arginine HC 1 L-asparagine Acide Laspartique L-cysteine H Cl H 20 Acide L-glutamique glycine L-histidine HCL H-, 0 1612 56.44 1.683 x 1- 4.33 x 10-3 -3.41 x i D-3 3.93 x i O -3 3.61 x i D -3 E 9 /L 23 24 0 00174 156 56 85.40 ,319 30 99.40 6.24 153 73 50 9 32 24 58 30 14 67 25.56 24 17 7.36 3 81 o O 25 Vitamines d-biotine 0 0051 D-Pantothénate de Ca 0 18 Chlorure de choline 9 77 Acide folique 0 93 Myo-inositol 12 61 Nicotinamide 0 026 Pyridoxine HC 1 0 043 Riboflavine 0 026 Thiamine HC 1 0 24 Vitamine B 12 O 95 Composants de natures diverses Glucose 1,261 12 Hypoxanthlne 2 86 Acide linoléique O 059 Rouge de phénol 0 87 Putrescine 2 HC 1 O 11 Pyruvate de sodium 77 07 " Thymidine O o 51 Bicarbonatedesodium 1176. Eau distillée Qo So pour 1 litre 9 ) Supplément suivant la revendication 8, carac- térisé en ce que le sérum animal est du sérum de veau nouveau-né dans la proportion de 5 à 25 % en volume. ) Supplément suivant la revendication 9, carac- térisé en ce que lon utilise le sérum de veau nouveau-né dans la proportion de 25 %. 11 ) Combinaison pour milieu de culture caractérisé en ce qu'il est constitué par une combinaison comprenant de 99,9 à 60 % en volume de a) un milieu de culture de cellules contenant tous les com- posants de croissance nécessaires pour la culture de cellules animales quand il a été combiné avec un sérum animal, et b) de 0,1 à 40 % en volume d'un supplément pour milieu de crois- sance de cellules constitué essentiellement d'une pro- portion mineure de sérum animal et d'une proportion majeure d'un mélange d'hormones peptidiques et thyroidiennes, des oestrogènes, androgènes, corticoides, produits nutritifs, facteurs de croissance, facteurs de transport, sels miné- raux, acides aminés, vitamines, sucre, et de faibles quan- tités d'autres composants. 12 ) Combinaison suivant la revendication 11, caractérise en ce que le sérum animal, les hormones, oes- trogènes, androgènes, corticoides, facteurs de croissance, produits nutritifs et facteur de transport sont constitués essentiellement de sérum de mammifère, d'insuline, trans- ferrine, EGF, ECGS, acides sélénieux, o-phosphoryléthano- lamine, triiodothyroxine, hydrocortisone, oestradiol 17, progestérone et testostérone. 13 ) Combinaison suivant la revendication 11, caractérisée en ce que le sérum est du sérum de veau nouveau-né. 14 ) Combinaison caractérisée en ce que le suivante: suivant la supplément revendication 11, présente la formule Composant Sérum animal Insuline Transferrine EGF ECGS Acide sélénieux O-phosphoryl-et hanolamine L-3,5,3 'triiodothyroxine Hydrocortisone Oestradiol Progesté rone Testost 4 rone Concentration 0.1 à 40 % en -volume mg/L 77.5 0.I-612 56.44 1.683 x 10-4 4.33 x 10-3 3.41 x 10-3 3.93 x 10-3 3.61 x 10-3 * Sels inin 6 raux Ca C 12 Cu 504 5 H 20 Fe 504 7 H 20 KC 1 l Mg C 12, 6 H 20 Na Cl Na 2 HPO 4 Znl SO 4 7 H 20 mgq Lter 0 00174 0 58 156 56 40 , 319 30 99.40 O 60 Acides aminés L-ai-anine L-arginine H Cl L-asparagine Acide Laspaàrtique L-cysteine HCI H 20 Acide L-glutani 7 que glycine L-histidine HCL H 20 L-isoleucine L-lysine H Cl L=xnethionine L-phénylalanine L-p; oline L-serine L-thréonine L-tryptophan L-tyrosine L-valine Vitamines d bio tine D-Panitothénate de Ca Chlorure de choline Acide folique Myoinositol Ni.cotinamnide Pyridoxine H Cl Riboflavine Thijamine H Cl Vitamioe B 12 6 24 153 73 50 9, 32 24 58 10.30 26 14 67 25.56 3.13 3,47 24 17 7 36 8 34 8 20 0 0051 9,77 0 93 12 61 0.026 0 043 0.026 0.24 Comnosants de natures différentes Glucose 1,261 12 Hypoxanthine 2 86 Acide linoléique 0 059 Rouge de phénol 0 87 Putrescine 2 HC 1 0 11 Pyruvate de sodium 77 07 Tnymidine O 51 Bicarbonate de sodium 1176. Eau distillée Q S nour 1 litre 15 ) Procédé pour la croissance de cellules i-nviro caractérisé en ce qu'on cultive les cellules en présence d'un milieu de culture de cellules auquel est mélangé un supplément pour milieu de culture de cellules dans une proportion de 0,1 à 40 % en volume du mélange, ce supplé- ment étant constitué essentiellement d'une proportion mineure d'un sérum animal et d'une proportion majeure d'un mélange d'hormones peptidiques et thyroidiennes, oestrogènes, androgènes, corticoldes, produits nutritifs, facteurs de croissance, facteurs de transport, sels miné- raux, acides aminés, vitamines, sucre, et une petite quantité d'autres composants pour permettre une croissance rapide et prolifique des cellules. 16 ) Procédé suivant la revendication 15, carac- térisé en ce que le supplément de sérum animal, dlhormones d'oestrogènes, d'androgènes, corticoides, facteurs de crois- sance, produits nutritifs et facteurs de transport, est constitué essentiellement de sérum de mammifères, d'insu- line, transferrine, EGF, ECGS, acide sélénieux, o-phospho- ryléthanolamine, triiodothyroxyne, hydrocortisone, oestrodiol 17, progestérone et testostérone. 17 ) Procédé suivant la revendication 16, carac- térisé en ce que le sérum de mammifère est du sérum de veau nouveau-né. 18 ) Procédé suivant la revendication 16, carac- térisé en ce que le supplément est ajouté dans une propor- tion de 5 à 25 % en volume du mélange. ) Procédé suivant la revendication 16, carac- térisé en ce que le supplément au milieu de croissnce des cellules est constitué essentiellement des matières suivantes Composan-t. Sérum de veau nouveau-né insuline Transferrine EGF ECGS Acide sélénieux 0 pho spho ry 11-ethanolamine L-3,5,3 ' triiodothyroxine Hydroco-rtisone oestradiol 17 Progesterone Testosterone Sels minéraux Cu 50405 H 20 Fe 504 7 H 20 Mg C 12 6 H 20 Na Cl Na 2 HPO 4 Zn SO 4, 7 H 20, Acides aminés L-alanine Larginine H Cl L-asparagine Acide L-aspartique L-cystéinè H Cl H 20 ' Acide L-glumatique glycine L-histidine HCL H 20 L-isoleucine L-lysine HCI Concentration % envolume du supplement 77; 5 0 1612 56 44 1.683 10 x 4.33 10 x 341 10 3,93 10 3.61 x O mq/Liter 0 00174 0 58 156 56 40 , 319 30 99 40 0 60 153 73 24 58 30 14 67 56 L-methionine 3 13 L-phénylalanine 3 47 L-proline 24 17 L-serine 7 36 Lthréonine 8 34 L-tryptophane 1 43 L-tyrosine 3 81 L-valine 8 20 Vitamines d-biotlne 0 0051 D-Pantothénate de Ca 0 18 Chlorure de choline 9 77 Acide folique O 93 Myo-inositol 12 61 Nicotinamide 0 026 Pyridoxine HC 1 O 043 Riboflavine 0 026 Thiamine HC 1 O 24 Vitamine B 12 O 95 Composants de natures diverses Glucose 1,261 12 Hypoxanthine 2 86 Acide linoléique 0 059 Rouge de phénol 0 87 Putrescine 2 H Cl 0 11 Pyruvate de sodium 77 07 Tnymidine O 51 Bicarbonate de sodium 1176 Eau distillée Q S pour I litre ) Procédé pour la croissance de cellules Ln vitro caractérisé en ce qu'on cultive ces cellules dans un milieu constitué essentiellement d'un milieu de culture de tissus et d'un supplément pour milieu de croissance de cellules utilisable à la place de sérum animal pur, ce mélange étant capable de favoriser la croissance des cellules, y compris les cellules primaires transformées et non-transformées d'origine aussi bien fibroblastoide qu'épithélioldes et de souches continues de cellules, transformées et non- transformées, ce supplément fournissant les matières essen- tielles nécessaires pour la croissance des cellules qui seraient autrement fournies par le sérum animal entier, ce supplément contenant en outre au moins une portion mineure de sérum animal. 210) Procédé pour fabriquer un supplément aux milieux de croissance de cellules dont une portion est constituée par du sérum animal, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes qui consistent à solubiliser le sérum animal dans une portion de ce supplément, à com- plèter le mélange de composants du supplément et, comme étape essentiellement finale, à ajouter le reste du sérum animal, et enfin à filtrer le supplément pour le stériliser -