FR 2532949 A1 19840316 FR 8314648 A 19830914 -1- PROTEINES MODIFIEES ET LEUR PROCEDE DE PREPARATION Les protéines sont des macromoléculessynthétisées par voie biologique et remplissant des rôles variés dans les systèmes vivants Les enzymes sont des variétés parti- culières de protéines biologiquement actives pouvant cata- lyser des réactions spécifiques A l'heure actuelle, on utilise la technologie des enzymes dans de nombreux domai- nes industriels et de recherche, comme par exemple, la re- cherche médicale, le traitement et la conservation des ali- ments, la production de-boissons fermentées, la fabrication de produits pharmaceutiques et la détermination analytique de la concentration de divers métabolites et composants d'aliments par des techniques analytiques enzymatiques. Les enzymes sont hautement spécifiques en ce qui concerne leur activité biologique et en général elles cata- lysent une réaction particulière à une vitesse qui est très grande par comparaison à la réaction correspondante ayant lieu à la température ordinaire et sans catalyse biologi- que Une enzyme peut faire preuve d'activité catalytique pour un-certain nombre de substrats sur lesquels elle peut agir En conséquence, une enzyme donnée peut catalyser la synthèse ou la dégradation de plus d'un substrat Certaines protéines qui ne sont pas considérées comme des enzymes classiques, comme par exemple la séro-albumine bovine, font preuve d'une activité catalytique très limitée sur un ou plusieurs substrats. De nombreuses enzymes se trouvent dans la nature en de très petites quantités En conséquence, leur isolement, purification et utilisation sont limités à une opération à petite échelle par suite-des frais et du temps nécessaires pour les isoler sous une forme utilisable. Certaines enzymes se trouvent dans la nature en quan- tités relativement importantes et elles sont relativement faciles à isoler, purifier et utiliser Malheureusement, en 2 - raison du comportement catalytique précis des enzymes, cel- les qui sont disponibles en grosses quantités ne peuvent catalyser que certaines réactions choisies. Depuis peu de temps de nombreux efforts ont été consacrés à une synthèse des catalyseurs biologiques syn- thétiques faisant preuve d'un comportement enzymatique si- milaire à celui des enzymes naturelles qui sont ou bien rares ou bien coûteuses à isoler En outre, certaines ten- tatives ont été faites pour modifier les enzymes naturelles afin de changer leur spécificité enzymatique de sorte qu'el- les puissent fonctionner pour catalyser une réaction qu'elles ne pouvaient pas catalyser antérieurement. Une technique connue pour obtenir un comportement enzymatique-permettant de catalyser une réaction spécifi- que désirée consiste en une synthèse de ce qu'on appelle les molécules d'enzymes-modèles Par exemple, on peut lier par voie covalente des composés à bas poids moléculaire à des groupes fonctionnels qui font preuve d'activité qui est la même que celle du site actif d'une enzyme Des ex- emples de telles préparations sont décrites dans les publi- cations suivantes: Breslow, R, Advances in Chemistry Series, R F Gould, Ed, American Chemical Society, Washington, D C 21-43 ( 1971) et Tang, C C; Davalian, D; Haung, P et Breslow, R, J Amer Chem Soc, 100, 3918 ( 1978), et Breslow, R, Doherty, J, Guillot, G et Lipsey, C, J Amer Chem Soc, 100, 3227 ( 1978). Une autre technique comporte l'emploi d'une matrice de polymère synthétique qui est modifiée suivant son édi- fice de base pour fournir des groupes fonctionnels jouant le rôle du site actif d'une enzyme donnée On trouve des exemples de telles techniques dans les articles suivants Wulff, G et Schulza, I, Israel J Chem 17 291 ( 1978) et Suh, J et Klotz, I M, Bioorganic Chemistry, 6, 165 ( 1977). Une autre technique implique la fixation d'un nou- veau fragment chimique à une enzyme naturelle près du site actif de l'enzyme pour tenter de permettre à une telle en- 3 - zyme de réagir avec une activité catalytique différente. Un exemple est la conversion de la papaine, qui est une enzyme protéolytique en une enzyme du type oxydase par la fixation covalente d'une flavine près du site actif de l'enzyme de papaine naturelle, comme décrit dans ies arti- cles suivants: Levine, Ho L et Kaiser, E T, J Amer. Chem Soc, 100, 7670 ( 1978); Kaiser, E T, et al, Advo In Chemistry Series, n 191, Biomimetic Chemistry, 1980; et Otsuki, T; Nakagawa, Y et Kaiser, E To, J C S Chem. Comm, 11 457 ( 1978) D'autres exemples d'une telle modi- fication enzymatique sont donpés dans l'article: Wilson, M.Eo et Witesides, G M, J Amer Chem Soc 100, 306 ( 1978). Une autre tentative encore pour changer la spécifi- cité des enzymes est l'immobilisation'd'une enzyme natu- relle dans une matrice de gel Par exemple, on a immobili- sé l'enzyme trypsine dans un gel de polyacrylamide Le gel de polyacrylamide permet aux esters des amino-acides de diffuser à travers la matrice de gel pour réagir avec l'enzyme mais il ne permet pas la diffusion S travers lui de protéines plus grosses Ainsi, la spécificité de l'en- zyme est changée par l'élimination de l'accès de l'une des molécules du substrat à l'enzyme. L'immobilisaton des enzymes naturelles est bien con- nue des spécialistes On connaît également des exemples de changements de la spécificité des enzymes par immobilisa- tion Aussi bien l'immobilisation que les changements de la spécificité des enzymes sont décrites dans Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 3 Edo, 9, 148 ( 1980) publiée par Wiley-and Son, Inc. Deux autres procédés concernant l'immobilisation des enzymes sont décrits dans les brevets US 3 802 997 et 3.930 950 Dans le brevet US 3 802 o 997, on décrit un pro- cédé de stabilisation d'enzymes consistant à lier les en- zymes à des supports minéraux, en présence de leurs subs- trats, de sorte que l'enzyme est immobilisée Dans le bre- -4- vet US 3 930 950, on décrit un procédé d'immobilisation des enzymes selon lequel on fournit un élément de support actif capable de réagir avec une enzyme pour devenir chi- miquement lié à cette dernière Ultérieurement, on met en contact le support actif avec un complexe enzyme/substrat qui a été formé par mélange de l'enzyme avec un substrat spécifique, tout en réduisant au minimum la transforma- tion du substrat en produit Ainsi le composant enzyme du complexe est chimiquement lié à l'élément de support. On savait également qu'une mono-oxygénase de lysine naturelle pouvait être mise en réaction pour bloquer les groupes sulfhydryle sur l'enzyme Quand on traite ainsi l'enzyme spécifique mono-oxygénase de lysine, elle fait preuve d'une nouvelle activité catalytique envers les amino-acides et elle catalyse la désamination par voie d'oxydation au lieu de sa décarboxylation naturelle par voie d'oxydation Cependant, les spécialistes ne peuvent pas expliquer ce comportement modifié, voir, par exemple, l'article de Yamauchi, T; Yamamoto, S et Hayaishi, O, dans The Journal of Biological Chemistry, 248, 10, 3750- 3752 ( 1973) On a également indiqué que si l'on fait réa- gir une enzyme naturelle, par exemple la trypsine, avec son inhibiteur naturel et qu'ensuite on réticule l'enzyme, son activité sur ces substrats naturels sera modifiée; voir l'article de Beaven, G H et Gratzer, W B dans Int J Peptide Res, 5, 215-18 ( 1973). En outre on a synthétisé des protéines synthétiques par l'ancrage d'un résidu d'amino-acide sur un support so- lide puis par l'addition de résidus d'amino-acides les uns après les autres. On a également synthétisé des protéines semi-synthé- tiques par un procédé selon lequel on soumet une protéine naturelle à une hydrolyse limitée pour produire des frag- ments de protéine On soumet ensuite les fragments de la protéine naturelle à un procédé par lequel on ajoute un ou plusieurs résidus d'amino-acides aux fragments ou on éli- -5 mine de ceux-ci un ou plusieurs de ces résidus pour obte- nir ainsi des fragments modifiés Les fragments modifiés résultants sont ensuite fixés à nouveau pour former la protéine semi-synthétique avec une composition altérée de résidus d'amino-acides Comme'exemp es des technologies concernant les protéines synthétiques et semi-synthétiques, qui ont été citées immédiatement ci-dessus,-on p-eut men- tionner le livre Semisynthetic Proteins par R E O fford, édité par John Wiley and Sons Ltd, déposé-en 1980. Alors que ces techniques conviennent-pour de nom- breuses applications, il existe un besoin pour un procédé simple, efficace, économique et systématique permettant de modifier chimiquement une protéine naturelle peu coû- teuse et disponible dans le commerceè 4 ur produire une protéine modifiée analogue à une enzyme La protéine peut faire preuve d'une activité catalytique enzymatique pour une réaction chimique désirée qui n'était pas jusqu'à pré- sent une réaction d'intérêt industriel catalysé par une enzyme naturelle, ladite réaction nouvelle pouvant être prédéterminée sur un mode systématique--Lés 'procédés dé- crits dans les références mentionnées plus-haut consistent simplement à soumettre une enzyme à une sérié de condi- tions et à tenter d'élucider son comportement Ces procé- dés ne constituent pas un procédé systématique permettant de modifier les caractéristiques de la protéine. La présente invention fournit une protéine modifiée analogue à une enzyme par conversion d'une protéine natu- relle en une protéine modifiée analogue à une enzyme pos- sédant des caractéristiques différentes de celles de:la protéine naturelle de départ Selon un mode de mise en oeuvre de l'invention, on dénature grossièrement une protéine naturelle en la met- tant en contact avec un agent dénaturant, pendant une du- rée et à une concentration suffisantes pour provoquer une dénaturation essentiellement grossière de la protéine On soumet ensuite la protéine grossièrement dénaturée à des -6- conditions qui provoquent une régénération partielle de la protéine pour obtenir une protéine naturelle partiel- lement dénaturée On met en contact cette protéine par- tiellement dénaturée avec un inhibiteur d'une enzyme- modèle dont l'activité catalytique doit être reproduite, pour former un complexe de protéine partiellement dénatu- rée et d'inhibiteur On réticule ensuite la protéine par- tiellement dénaturée dans le complexe pour obtenir une nouvelle protéine modifiée analogue à une enzyme. Ultérieurement, on enlève l'inhibiteur de l'enzyme- modèle et tout excédent de l'agent de réticulation de la protéine modifiée analogue à une enzyme nouvellement for- mée pour obtenir un produit fonctionnel, stable et ana- logue à l'enzyme-modèle La protéine modifiée analogue à une enzyme ainsi obtenue possède les caractéristiques d'activité catalytique de l'enzyme-modèle. En réalisant les avantages de Japrésente invention, l'auteur de celle-ci, a découvert qu'une protéine pouvait être modifiée à partir de sa conformation naturelle en une conformation modifiée par la mise en oeuvre du procé- dé selon l'invention Le nouvel état de conformation dé- finit une protéine modifiée analogue à une enzyme. Dans le présent mémoire, le terme "enzyme" est dé- fini comme une protéine possédant une activité catalyti- que bien connue sur des substrats spécifiques Le terme "protéine" est défini ici dans son sens généralement admis, à savoir un polypeptide formé d'amino-acides pour obtenir une molécule biologique. Le procédé de la présente invention consiste à mo- difier chimiquement une protéine naturelle à partir d'une conformation, son état naturel, en une seconde conforma- tion qui est un état nouveau modifié Le procédé donne une nouvelle protéine modifiée analogue à une enzyme qui est produite de façon à fournir une nouvelle protéine modifiée analogue à une enzyme qui reproduit une ou plusieurs des caractéristiques de l'activité enzymatique de l'enzyme- -7- modèle choisie. Dans le mode de réalisation préféré de l'invention, on choisit une protéine naturelle qui doit être chimique- ment modifiée pour produire la protéine modifiée analogue à une enzyme d'un type reproduisant l'enzyme-modèle dési- rée Le procédé de la présente invention convertit la protéine naturelle soluble, qui ne possède pas l'activité catalytique désirée, à savoir le comportement de catalyse enzymatique de l'enzyme-modèle, en une protéine modifiée stable, analogue à une enzyme,qui reproduit ou copie les caractéristiques de l'activité catalytique biologique de l'enzyme-modèle. Une façon préférée d'exécuter le nouveau procédé selon la présente invention de modification chimique d'une protéine naturelle pour obtenir une protéine modifiée ana- logue à une enzyme, prédéterminée, consiste O à dénaturer grossièrement la protéine naturelle en mettant cette pro- téine naturelle en contact avec un agent dénaturant, pen- dant une durée et à une concentration suffisantes pour dénaturer grossièrement la protéine naturelle; à régéné- rer partiellement la protéine grossièrement dénaturée pour obtenir une protéine qui n'est que partiellement dénatu- rée, en mettant en contact la protéine grossièrement dé- naturée avec des réactifs ou des conditions opératoires suffisants pour régénérer ou replier partiellement la pro- téine; à mettre en contact la protéine résultante qui n'est que partiellement dénaturée avec un inhibiteur pour l'enzyme-modèle choisie, pendant une durée suffisante et à une température suffisante pour réaliser un complexe de la protéine partiellement dénaturée et de l'inhibiteur puis à réticuler la protéine partiellement dénaturée dans le complexe pour former la nouvelle protéine modifiée, stable, analogue à une enzyme en mettant en contact la protéine partiellement dénaturée avec un agent de réticu- lation Tout excès de l'agent de réticulation et l'inhi- biteur de l'enzyme-modèle sont éliminés de la protéine -8- modifiée analogue à une enzyme qui vient d'être créée pour isoler la nouvelle protéine modifiée, analogue à une enzyme, et catalytiquement active. Alors que dans le mode de mise en oeuvre préféré, on convertit des matières de départ qui sont des protéi- nes naturelles non-enzymatiques, qu'on appelle également les protéines-hôtes, en une protéine modifiée analogue à une enzyme et catalytiquement active, on envisage la pos- sibilité de la conversion d'une protéine naturelle quel- conque en une protéine modifiée analogue à une enzyme- modèle En général, les protéines naturelles ou hôtes qui sont le plus abondamment disponibles pour la conversion en un produit modifié analogue à une enzyme, sont les protéines non-enzymatiques telles que la séroalbumine bovine De préférence, la protéine naturelle de départ est choisie en raison de sa disponibilité sous une forme raisonnablement pure, des quantités qu'on trouve dans le commerce à des prix unitaires raisonnables, etc Cepen- dant, comme on le verra dans les exemples, on peut utili- ser une protéine quelconque comme protéine naturelle de départ, aussi bien une protéine enzymatique qu'une proté- ine non-enzymatique Normalement, les protéines non enzy- matiques, telles que la séro-albumine bovine, sont dispo- nibles dans un état pur, en grosses quantités et à un prix inférieur à celui des protéines enzymatiques, et ce sont donc les matières de départ préférées. Comme il a été expliqué, on dénature grossièrement ou on déplie la protéine naturelle de départ afin de dé- truire essentiellement sa structure chimique tridimension- nelle naturelle Ensuite, pour réaliser une structure de protéine capable de lier l'inhibiteur, bien qu'incapable de lier la structure naturelle, on replie partiellement la protéine grossièrement dénaturée et on obtient une pro- téine partiellement dénaturée Cette protéine partielle- ment dénaturée ne possède ni la structure chimique (qu'on appelle la conformation), du produit parent, c'est-à-dire -9- la protéine de départ naturelle, ni celle de la protéine grossièrement dénaturée à partir de laquelle elle vient d'être préparée Sans vouloir lier l'invention à une thé- orique quelconque, on pense que la dénaturation grossière de la protéine naturelle de départ puis son repliement seulement partiel permettent de créer des sites potentiels nouveaux pour liaison de l'inhibiteur Ainsi, des sites différents sont engendrée et seraient disponibles si la protéine naturelle elle-même était partiellement dénaturée sans passer par le stade de dénaturation grossière avant la mise en contact de la protéine avec l'inhibiteur. Dans le présent mémoire, l'expression "grossière- ment dénaturée" est utilisée dans son sens généralement accepté dans ce domaine, à savoir, un changement majeur à partir de l'état naturel qui provoque un dépliage es- sentiellement complet de la protéine A l'état grossière- ment dénaturé, la protéine manque à la fois de structure secondaire et de structure tertiaire et ressemble à une bobine à structure embrouillée On peut déterminer l'état grossièrement dénaturé par une comparaison des mesures physiques de la protéine grossièrement dénaturée avec celles de la bobine embrouillée-modèle Comme exemples de telles mesures physiques servant à la détermination de la dénaturation grossière, on indiquera la viscosité, le di- chroisme circulaire, le coefficient de sédimentation et le spectre UV A l'intérieur de cette définition des pro- téines grossièrement dénaturées, on connaît certaines pro- téines qui peuvent contenir des traces de structures ré- siduelles secondaire et/ou tertiaire Ces traces de struc- ture résiduelle n'affectent pas fâcheusement le fonction- nement de la présente invention. Les caractéristiques des protéines grossièrement dé- naturées sont bien connues des spécialistes Par exemple, quand on utilise une mesure de viscosité pour contrôler la dénaturation de la protéine, la viscosité d'une protéine globulaire augmente en général au cours du procédé de dé- - pliage D'autre part, la viscosité de la protéine fibreu- se est très importante à l'état naturel et peut augmenter ou diminuer pendant le dépliage Une telle mesure change pendant la dénaturation comme il a été abondamment expli- qué dans les textes cités plus loin On peut aussi contrô- ler le dépliage par le changement du spectre UV Le chan- gement principal du spectre se produit en raison du trans- fert des chaînes latérales phénylalanyle, trypyle et tryp- tophyle depuis l'intérieur de la protéine vers le solvant environnant au cours de la dénaturation En général, le pouvoir d'absorption molaire diminue à certaines longueurs d'ondes tout en augmentant à d'autres par suite du dépla- cement des bandes d'absorption La dénaturation grossière de la structure protéique change très fortement le pouvoir rotatoire optique et le spectre du dichroisme circulaire. La nature exacte des changements est en rapport avec les structures secondaire et tertiaire de la protéine naturel- le Ces paramètres physiques qu'on utilise pour déterminer la dénaturation grossière, ainsi que de nombreux autres, peuvent être contrôlés pour déterminer si une protéine est grossièrement dénaturée, comme il est expliqué dans de nombreux ouvrages concernant la dénaturation des protéines, comme par exemple Charles Tanford, Advances in Protein Chemistry, 23, 121 ( 1968). Divers articles parus dans des périodiques décrivent le procédé de dénaturation grossière et les critères ser- vant à démontrer la dénaturation grossière en termes géné- ralement acceptés dans la spécialité et qu'on utilise éga- lement dans la présente invention, à savoir les articles suivants: Charles-Tanford, Adv Protein Chemistry, 23, 121 ( 1968); P L Privalov, Adv Protein Chemistry, 33, 167 ( 1979); et C B Anfinsen, Science, 181, 223 ( 1973). Les procédés préférés de dénaturation grossière des protéines, selon l'invention, sont les suivantes. On peut réaliser la dénaturation grossière d'une protéine naturelle de départ pour la plupart des protéines 11 - en utilisant le chlorhydrate de guanidine (Gu H Cl) La dé- naturation grossière de la protéine est en général terminée avec des concentrations de 6 à 8 M de Gu H Cl Dans de nom- breux cas, on peut remplacer le Gu H Cl par de l'urée à une concentration d'environ 8 M pour réaliser la dénaturation grossière On peut aussi réaliser la dénaturation grossière en élevant la température jusqu'à ce que la transition de dépliage bien reconnue ait lieu En outre, on peut utili- ser des conditions acides ou basiques extrêmes isolément ou en combinaison avec la température En général, pour la plupart des protéines, une température de l'ordre de 50 à 'C est suffisante pour dénaturer grossièrement la proté- ine naturelle de départ Les acides qui conviennent pour la dénaturation grossière sont notamment les acides acéti- ques, formique, propionique et citrique, alors que les ba- ses convenables sont notamment les hydroxydes de sodium et' de potassium Des-acides minéraux appropriés comme agents dénaturants sont notamment les acides nitrique, phosphori- que, sulfurique et-chlorhydrique. Quand les conditions de dénaturation grossière sont réduites, les molécules de protéines se régénèrent partiel- lement Cet état de régération partielle peut être consti- tué par des molécules de protéine qui restent presqu'en- tièrement dénaturées en mélange avec d'autres molécules qui sont presqu'entièrement repliées Dans une variante, presque toutes les molécules de la protéine sont pres- qu'entièrement repliées Sỉvant une autre variante, pres- que toutes les molécules de la protéine pourraient être * repliées partiellement et d'une façon pratiquement égale. L'état-physique exact de la protéine partiellement régéné- rée n'est pas critique pour la présente invention Pour reconnaître l'état partiellement régénéré de la protéine, on observe les paramètres physiques qui indiquent que la protéine n'est plus une bobine embrouillée mais contient des structures secondaire et tertiaire considérables Ce- pendant l'état de régénération partielle ne possède pas 12 - la structure hautement ordonnée de l'état de la protéine naturelle et on pense que des sites potentiels fournis pour la liaison avec l'inhibiteur sont différents de ceux d'une protéine naturelle partiellement dénaturée On pen- se que la protéine partiellement régénérée offre des sites de liaison différents à l'inhibiteur puisque la protéine a été regroupée à peu près entièrement en ce qui concerne sa structure par suite du stade de dénaturation grossière. On peut régénérer partiellement la protéine grossièrement dénaturée pour offrir des sites nouveaux qui n'existaient pas précédemment dans la protéine naturelle partiellement dénaturée, pour liaison avec l'inhibiteur. La régénération partielle des protéines grossièrement dénaturées est-bien connue des spécialistes et est étudiée en détail dans les textes suivants L G Chavez, Jr et H A Scheraga, Biochemistry, ( 1980), 19, 996-1004; H Taniuchi et C B Anfinsin ( 1968), J Biol Chem, 243, 4778; H Taniuchi et C B Anfinsin ( 1969), J Biol Chem, 244, 3864; M I Kanehisa et T Y. Tsong, Biopolymers, 18, 2913 2928 ( 1979); E W Miles, K Yutani, et K Ogasachara, Biochemistry, 21, 11, ( 1982) et D B Witlanfer, Adv Protein Chemistry, 34, 61 ( 1981). Après la régénération partielle de la protéine, on la met en contact avec un inhibiteur d'une enzyme-modèle dont l'activité catalytique doit être reproduite - Dans le présent mémoire, le terme "inhibiteur" dési- gne tout composé possédant une similitude structurale suf- fisante avec le substrat naturel de l'enzyme-modèle afin de servir de modèle pour le site catalytique de la proté- ine modifiée analogue à une enzyme Dans le mode de réali- sation préféré de la préparation d'une protéine modifiée analogue à une enzyme, l'inhibiteur est l'un quelconque des inhibiteurs classiques connus pour une enzyme-modèle donnée Cependant, dans le présent contexte, "inhibiteur" peut désigner aussi toute molécule ayant une similitude structurale suffisante avec l'inhibiteur classique pour -2532949 13 - préserver un site analogue à l'inhibiteur sur la protéine modifiée Le substrat naturel de l'enzyme-modèle peut agir comme un inhibiteur ou un modèle pour la protéine modifiée, dans de nombreux cas En général, les inhibi- teurs ne sont pas détériorés par l'enzyme comme le sont les substrats, et ils servent à préserver un site cataly- tique plus facilement que le substrat naturel Un exemple de la similitude structurale d'un inhibiteur d'enzyme et du substrat naturel d'une enzyme est celui de l'oxydase de glucose Le glucose est un substrat naturel de l'oxy- dase de glucose alors que le D-glucal est l'inhibiteur de l'oxydase de glucose Le glucose et le D-glucal sont très similaires sur le plan structural. Dans le mode de réalisation préféré, après la mise en contact de la protéine partiellement régénérée avec l'inhibiteur pendant une durée suffisante et à une tempé- rature suffisante pour former le complexe protéine inhibi- teur, on réticule la portion protéine partiellement régé- nérée du complexe pour stabiliser la nouvelle structure. Dans le présent mémoire, l'expression "réticulation" désigne la formation de liaisons covalentes entre les si- tes réactifs sur une protéine En général, on réalise la réticulation de la protéine en utilisant des réactifs mul- tifonctionnels tels que le glutaraldéhyde D'autres exem- ples de réactifs appropriés de réticulation permettant d'effectuer la réticulation d'une protéine sont: la 2-amino-4,6-dichloro-5-triàzine; les sels de diazonium; le N-hydroxysuccinamide; le p-benzoylazide; et les ré- actifs décrits dans les textes suivants: Wold, Fo, Methods Enzymol, 11, edité par C Ho W Hirs, Co H Wo, Academic Press, 1967, 617; Fasold, H et alo, Augeno chem Int. Edo Engl, 10, 795, 197 et Keyes, Mo Ho, dans KirkOthmer Encyclopedia of Chemical Technology, 9, 3 ème Ed, 1980, J. Wiley & Sons, Inco; 148-172. On peut également effectuer la réticulation par un regroupement des disulfureso 14 - Un procédé préféré de dénaturation grossière d'une protéine naturelle de départ avec du 3-mercaptoéthanol est le suivant: on mélange la protéine naturelle avec le B- mercaptoéthanol dans un rapport molaire d'environ 1000 unités de mercaptoéthanol pour 1 unité de protéine. Après traitement avec le 3mercaptoéthanol à un p H neutre, pendant une ou plusieurs heures, on ajoute du chlorhydrate de guanidine à une concentration de 6 M Ces conditions sont suffisantes pour dénaturer en totalité la plupart des protéines De préférence, la concentration de la protéine et le p H doivent être tels qu'une partie ou la plus grande partie de la protéine reste en solution Le -mercaptoétha- nol scinde les ponts de disulfures et facilite la dénatu- ration grossière de la protéine en contribuant à la dégra- dation de la structure. Dans le mode de mise en oeuvre préféré de l'inven- tion, on convertit chimiquement une protéine naturelle ou protéine-hôte faisant preuve de peu ou pas d'activité ca- talytique pour le substrat choisi, par le procédé selon l'invention, en une protéine modifiée analogue à une enzy- me-modèle De nombreuses enzymes peuvent servir de matières de départ qu'on peut convertir par le présent procédé en leurs analogues protiques modifiés semblables à des enzymes- modèles en partant d'une matière de départ protéique na- turelle choisie Comme exemples d'enzymes-modèles qui peu- vent servir à préparer des analogues protéiques modifiés semblables à des enzymes, on peut citer les enzymes hydro- lytiques, les enzymes redox et les enzymes transférases. A titre d'exemple: le premier groupe, c'est-à-dire les enzymes hydrolytiques, comprend les enzymes protéolytiques qui hydrolysent les protéines, comme par exemple la pa- paine, la ficine, la pepsine, la trypsine, la chymotryp- sine, la broméline et la kératinase; les carbohydrases qui hydrolysent les hydrates de carbone, par exemple la cellulase, l'amylase, la maltase, la pectinase et la chi- tanase; les estérases qui hydrolysent les esters, par - exemple la lipase, la cholinestérase, la lécithinase et les phosphatases alcalines et acides; les nucléases qui hydrolysent l'acide nucléique, par exemple la ribonuclé- ase et la désoxyribonucléase; et les amidases qui hydro- lysent les amines, par exemple l'arginase, l'asparaginase, la glutinase, l'histidase et l'uréase Le second groupe est constitué par les enzymes redox qui catalysent les réactions d'oxydation ou de réduction On citera la glu- cose oxydase du glucose, la xanthine oxydase, la catalase, la peroxydase, la liposydase et la cytochrome-réductase. Dans le troisième groupe, c'est-à-dire les enzymes trans- férases qui transfèrent les groupes d'une molécule à une - autre, on peut citer la transaminase glutamique-pyruvique, la transaminase glutamique-oxalacétique, la transméthylase et la transphosphorylase phosphopyruvique. Dans la mise en oeuvre usuelle de l'invention, on choisit une première enzyme ou enzyme-modèle On choisit ensuite une seconde protéine naturelle ou protéine dite "hôte" devant reproduire l'enzyme-modèle pour obtenir une protéine modifiée analogue à l'enzyme Comme il a déjà été dit, il arrive fréquemment que la protéine naturelle soit elle-même enzymatiquement active pour un support donné, puisque de nombreuses enzymes courantes sont disponibles en grosses quantités et à des prix raisonnablement bas sous forme d'échantillons homogènes Toutefois, les pro- téines non-enzymatiques conviennent également quand on peut les acheter dans un état pur ou bien les purifier par des moyens classiques en vue de l'utilisation dans le pré- sent procédé Un exemple d'une telle protéine non-enzyma- tique qu'on peut utiliser comme protéine naturelle à titre de matière de départ, est la séro-albumine bovine (SAB). La SAB est disponible sous une forme relativement pure et à un prix assez bas à partir de nombreuses sources indus- trielles. Quand on met en oeuvre le procédé de la présente in- vention, on peut façonner à volonté la protéine naturelle 16 - pour obtenir une forme de protéine modifiée stable, ana- logue à une enzyme, faisant preuve des caractéristiques de l'activité catalytique de l'enzyme qui a été copiée. La possibilité de façonner à volonté une protéine naturel- le en une protéine possédant une activité catalytique pré- déterminée procure des avantages plus importants dans de nombreuses applications chimiques et industrielles Par exemple, si-l'on désire employer une enzyme peu abondante, très chère ou très difficile à isoler et/ou à purifier, une telle enzyme peut servir d'enzyme-modèle pour la pré- paration de la protéine modifiée analogue à une enzyme, par le procédé de la présente invention, pour reproduire l'activité de l'enzyme-modèle. Ainsi une protéine naturelle abondamment disponible ou bon marché peut être reformée ou modifiée par le procé- dé de la présente invention pour convertir la protéine na- turelle disponible de départ en une forme protéique modi- fiée analogue à une enzyme qui est moins abondamment dis- ponible et/ou plus chère. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, on purifie une protéine naturelle de départ et on la dis- sout dans un solvant aqueux proche de la neutralité en présence d'un tampon convenable afin de maintenir la solu- tion dans un état proche de la neutralité Ensuite, on dé- nature grossièrement la protéine naturelle par l'un quel- conque des moyens décrits plus haut et on obtient un pro- duit qui est la protéine de départ sous une forme gros- sièrement dénaturée et, de préférence, soluble Ensuite, on régénère ou on replie ensuite partiellement la protéine grossièrement dénaturée pour obtenir une protéine partiel- lement dénaturée On mélange alors un inhibiteur de l'en- zyme-modèle avec la protéine partiellement dénaturée On laisse suffisamment de temps et on porte la température à une valeur suffisante pour obtenir un complexe protéine partiellement dénaturée inhibiteur Ensuite, pour préser- ver la nouvelle protéine modifiée analogue à une enzyme, 17 - on doit stabiliser la portion de protéine naturelle par- tiellement dénaturée du complexe protéine/inhibiteur. On stabilise la nouvelle protéine par réticulation pour obtenir une protéine modifiée analogue à une enzyme. Fréquemment, on effectue la réticulation comme il a été expliqué plus haut à l'aide de glutaraldéhyde comme agent réticulant, puisque ce réactif est bon marché On peut ce- pendant utiliser l'un quelconque des agents ré'ticulants décrits plus haut, efficacement et de façon classique. Le procédé de la présente invention donne une nouvel- le protéine modifiée analogue à une enzyme qui présente un certain nombre d'avantages et de possibilité d'utilisation. Grâce aux découvertes exposées dans la présente invention, on peut préparer une protéine modifiée analogue à une en- zyme qui est stable et qui fait preuve d'une nouvelle ac- tivité catalytique similaire à celle d'une enzyme, activi- té qui n'existait pas dans la protéine naturelle De telles protéines modifiées présentant un comportement catalytique analogue à celui d'une enzyme sont utiles pour effectuer des réactions catalytiques anaboliques et cataboliques en remplacement d'une enzyme d'origine naturelle. Dans tous les modes de mise en ouvre de la présente invention, on élimine l'inhibiteur de l'enzyme-modèle après la synthèse de la protéine modifiée analogue à une enzyme En général, des lavages répétés de la protéine mo- difiée immobilisée sont suffisants pour éliminer l'inhibi- teur On peut aussi employer dans ce but une solution aqueuse tamponnée, certains tampons étant cités plus loin à titre d'exemples. Pour la commodité de la description, tous les brevets et tous les textes de référence cités plus haut sont incor- porés à titre de référence dans la présente demande. Les exemples suivants, dans lesquels toutes les pro- portions sont en poids sauf indication contraire, Servent à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la por- tée: 18 - EXEMPLE 1: On dissout 60 mg de l'enzyme naturelle ribonu- cléase pancréatique (R Nase) purifiée par chromatographie (produit de Sigma Chemical Company, lot 11 OF-02051, type IIA, N R-5000) dans 3 ml d'un agent dénaturant à base d'urée 8 M contenant un tampon de chlorhydrate de 2-amino- 2-(hydroxméthyl)-1,3-propanediol 0,1 M (qu'on appellera ci-après "tampontris"), à p H 8, avec une lente agitation à 25 C. On ajoute ensuite 0,1 ml de l'agent dénaturant 3-mercaptoéthanol non dilué à cette solution pour rompre les liaisons disulfure On agite lentement la solution résultante par secousses pendant 15 minutes à 25 C, puis on l'introduit dans un flacon d'Erlenmeyer avec bouchon étanche sous atmosphère d'azote pendant 16 heures à 25 C. On maintient l'environnement clos du flacon au moyen d'un réservoir d'azote sous pression qui dégage de l'azote ga- zeux dans le flacon ce dernier étant muni d'un dégagement dans un piège à eau. Ensuite, on chromatographie 3 ml de la solution sur une colonne de filtration de gel, ayant 30 x 2,5 cm et contenant une matière de filtration de gel G-15 marque "Sephadex" Le "Sephadex" est un polysaccharide réticulé, en perles, d'un poids moléculaire élevé ayant subi une ré- ticulation avec l'épichlorhydrine, ce produit étant vendu par Pharmacia Fine Chemicals On utilise de l'acide acéti- que à 0,1 M et à p H 3 comme éluant pour la colonne de gel. On maintient le débit de l'éluant à 1 ml/min à l'aide d'une pompe péristaltique à vitesse lente On place un contrôleur d'absorption en un point de sortie du courant de la colonne de chromatographie et on installe un détec- teur UV à 276 nm pour détecter les fractions de protéine qui sont éluées Une fraction importante de protéine d'en- viron 5 ml est éluée de la colonne dans ces conditions et est recueillie dans un petit bécher On analyse la frac- tion de protéine à l'aide d'un spectrophotomètre "ACTA-III" 19 - de Beckman Instruments Company On détermine la molarité de la fraction de protéine comme étant 2,67 x 10-5, alors que le coefficient d'absorption à 28 nm est de 0,254; le poids moléculaire de la protéine est de 13 000 daltons et la valeur du coefficient d'extinction E est de 7,3 pour une solution à 1 %. Aux 5 ml de léluant contenant la protéine re- cueillis ci-dessus, on ajoute 1 ml de tampon tris-H Cl 1,0 M, à p H 8; 1 ml d'acide éthylènediaminetétracétique (EDTA) 1 m M; 1 ml de glutathione réduite 5 x 10-4 M; 1 ml de glutathione oxydée 5 x 10-4 M; et 1 ml de chlo- rhydrate de tryptamine 0,02 M à titre d Uinhibiteur On ajoute ce chlorhydrate' à titre d'inhibiteur alors que les autres réactifs (à savoir EDTA et glutathione) sont ajou- tés selon les enseignements de Lloyd Chavez Jr et Harold Scheraga dans "Folding of Ribonuclease, S-Protein and Des ( 121-124) ribonuclease during Glutathione Oxidation of Reduced Proteins",'1980, Biochemistry, 19, 996-1004 La solution résultante présente un p H de 5,5 On agite la so- lution pendant 1,5 heure à p H 5,5 avec une agitation len- te On élève ensuite le p H à environ 8,0 par' addition de mg de cristaux à base de triso On agite la solution résultante contenant le tris lentement à p H,8 et à 25 C pendant 2,5 heures supplémentaires Pendant l'agitation, on observe un précipité blanc duveteux A l'expiration de la période de 2,5 heures, on dialyse la solution contre le tampon tris-HC 1 I m M à p H 7,2 contenant l'inhibiteur tryptamine O 005 M La membrane de dialyse est une membra- ne tubulaire N 2 marque "'Spectrapor"' ayant un seuil de coupure de poids moléculaire de 12 à 14 000 daltons Le procédé de dialyse comporte deux changements de tampon avec un grand volume de tampon de 7 ' 000 ml au cours d'une période de 17 heures, ' 0,50 C, avec une lente agitation par secousses de la tubulure de dialyse dans le milieu de dialyse. Après la dialyse, on chromatographie 2 ml de la - solution contenant la protéine modifiée analogue à une en- zyme sur une colonne G-15 de "Sephadex", colonne dont les dimensions sont 1,27 x 30 cm, la colonne étant remplie d'un agent de filtration de gel utilisant un tampon tris- H Cl 1 m M à p H 7 à titre d'éluant On utilise cette colonne de filtration de gel pour séparer les matières à bas poids moléculaire des matières protéiques Le débit de l'éluant est de 1 ml/min On contrôle l'éluant à 254 nm pour détec- ter l'élution de la protéine modifiée analogue à une enzy- me On recueille une première portion de la protéine modi- fiée analogue à une enzyme en cours d'élution et on titre par rapport au substrat pour l'enzyme estérase Le subs- trat utilisé est l'ester méthylique du tryptophane (EMT), le substrat étant un produit de Sigma Chemical Company, lot 109-C-0048, N T-5505. Pour déterminer l'activité de la protéine modi- fiée analogue à l'enzyme estérase, on opère comme suit: on titre la fraction de protéine recueillie ci-dessus par chromatographie en phase liquide sous haute pression (CLHP) pour déterminer l'activité vis-à-vis du substrat EMT Les conditions du titrage sont: l'éluant de la colonne CLHP est un acétate 0,03 M à p H 6 La matière de support de la colonne est matière de phase contenant des chaînes latéra- les carboxyliques et liée à une silice poreuse La colonne est en acier inoxydable et ses dimensions sont 2 mm x 25 cm, le débit étant de 4 ml/minlqu'on maintient par une pompe classique à haute pression, par exemple une pompe "Altex", Modèle 110 A On détecte l'éluant de la colonne par un con- trôleur classique UV à 254 nm. On prépare l'échantillon à titrer comme suit: on mélange 1 ml de la protéine modifiée analogue à l'enzyme estérase (avec une absorption de 0, 222 à 280 nm, soit O 0335 mg/ml) avec 8 ml de tampon tris-H Cl 5 m M, à p H 8 et 1 ml de substrat EMT 0,1 M On prépare la solution-témoin de titrage en ajoutant 8 ml de tampon tris-H Cl 5 m M, à p H 8, à 1 ml de EMT 0,1 M et 1 ml du tampontris, à p H 7, servant 21 - comme solution de l'éluant Le p H aussi bien de la solution- témoin que de la solution de l'échantillon à titrer est de 6,6. On prélève dans le bécher 1 ml de l'échantillon en utilisant une seringue hypodermique de 2 ml munie d'une aiguille de jauge 18, On fait passer 1 ml de l'échantillon travers une boucle d'échantillon d'injection de 20 micro- litres sur la colonne de CLH Po On enregistre la durée de l'injection On répète la même opération avec la solution- témoin On chromatographie aussi bien l'échantillon que le témoin à quatre reprises et on obtient un graphique de la molarité du tryptophane en fonction du temps pour l'échan- tillon et le témoin devant être élués de la colonne. On effectue une analyse statistique des données obtenues par cette opération, ce qui montre une pente de 0,-3171 x 10-5 M/min, avec une erreur de 0,00685 x 10-5 M/min déterminée pour l'échantillon Pour le témoin, on détermine une pente de 0,2878 d 10-5 M/min avec une erreur de 0,0091 x 10-5 M/mino On utilise l'équation suivante pour calculer l'activité de la protéine modifiée analogue à l'enzyme es- térase selon la présente invention: - Activité = (changement de pente + erreur) Vs ( 106) PM dans laquelle: le changement de pente est la différence entre les pentes de l'échantillon et du témoin ( 0,0293 dans l'exemple consi- déré); l'erreur est la somme des erreurs des pentes de l'échantillon et du témoin ( 0,016 dans l'exemple considé- ré); Vs est le volume de l'échantillon en litres; 106 = micromoles/mole; et PM est la quantité de protéine modifiée dans l'essai, en mg. Dans cette équation, la concentration de la pro- téine modifiée est calculée à partir de son absorbante à 280 nm, en utilisant le coefficient d'extinction pour la 22 - ribonucléase qui est de 7,3 pour une solution à 1 % Le coefficient d'extinction est décrit dans le texte de réfé- rence Int J Peptide Protein Res 5, 49-62 ( 1973) par D M Kirschenbaum. Les résultats du titrage sont: Substrat EMT (U/g) Activité initiale 0,000 Activité finale 8,0 0,717 Ces résultats montrent que la protéine modifiée analogue à une enzyme estérase préparée selon la présente invention fait preuve d'activité pour le substrat EMT d'en- zyme estérase, alors qu'aucune activité n'a été précédem- ment détectée dans l'enzyme ribonucléase naturelle On dé- montre ainsi la conversion d'un type d'enzyme, à savoir une nucléase en un second type de protéine, à savoir une pro- téine modifiée analogue à une enzyme estérase. EXEMPLE 2 On dissout 120 mg de ribonucléase pancréatique bovine (R Nase) purifiée par chromatographie, qui est une enzyme naturelle vendue par Sigma Chemical Company, lot F-02051 Type IIA, N R-5000, dans 6 ml d'urée 8 M conte- nant un tampon tris-H Cl 0,1 M, à p H 8, avec une agitation lente à 25 C Ensuite, on ajoute 0,2 ml de 8-mercaptoétha- noi (agent dénaturant) et on agite la solution lentement pendant 15 minutes à 25 C On laisse ensuite la solution au repos sous atmosphère d'azote pendant 16 heures à 25 C dans un flacon avec bouchon hermétique On maintient l'en- vironnement clos à l'aide d'un réservoir d'azote sous pres- sion qui débite continuellement de l'azote dans le flacon, ce dernier ayant un dégagement dans un piège à eau. Ensuite, on chromatographie 5 ml de la solution sur une colonne de gel G15 "Sephadex" ayant 30 x 2,5 cm qui est remplie de gel L'éluant de la colonne est l'acide acé- tique 0,1 M à p H 3 Le débit de l'éluant à travers la colon- ne est de 1 ml/min L'absorbante du courant sortant de la 23 - colonne est contrôlé par un détecteur U V à 276 nm On * recueille une fraction de protéine brute de 5 mlo On ana- lyse cette fraction sur un spectrophotomètre "ACTA III" de Beckman Instruments Company On détermine la molarité de la fraction de protéine recueillie comme étant de 6,64 x 10-5, alors que l'absorbante à 280 nm est de 0 r 63, le poids moléculaire de la protéine étapt de 13 o 000 daltons et le coefficient d'extinction E étant de 7,3 pour une solution à 1 %o Aux 5 ml de la protéine recueillie ci-dessus, on ajoute 0,5 ml d'un tampon tris-H Cl 1,0 M, à p H 8; 0,5 ml d'EDTA 1 m M; 0,5 ml de glutathione réduite 5 x 10-4 M 0,5 ml de glutathione oxydée 5-x 10-4 M;et 0,5 ml d'un inhibiteur tryptamine 0,02 M pour l'enzyme estérase On ajoute la tryptamine à titre d'inhibiteur pendant qu'on introduit l'EDTA et la glutathione conformément aux ensei- gnements de Lloyd Chavez, Jr et Harold Scheraga dans "Folding of Ribonuclease, S-Protein and Des ( 121-124) ri- bonuclease during Glutathione Oxidation of Reduced Pro- teins", 1980, Biochemistry, 19, 996-1004 " A l'expiration de-la périodede-4,0 heures, le p H de la solution résultante est de 5,0 o Après agitation de cette solution pendant 0,5 heure à p H 5, on élève-le p H à 8 par addition de 100 mg de cristaux à base de tris. On agite -lentement la solution à p H 8 et à 25 C pendant 4 heures Au cours de l'agitation, il se forme un préci- pité blanc duveteux. A la fin de la période de 4 heures, on dialyse la solution résultante contre le tampon tris-HC 1 1 m M, à p H 7, contenant 2 % de tryptamine (inhibiteur) On utili- se pour la dialyse une membrane "Spectropor" qui est une tubulure de taille N 2, possédant un seuil de coupure des poids moléculaires de 1214 o 000 daltons On effectue la dialyse avec deux changements de tampon avec un grand volume de tampon de 7000 ml, au cours d'une période de 17 heures, à une température de O à 5 C et avec une lente 24 - agitation par secousses à cette température. On chromatographie 2 ml de la solution de proté- ine ci-dessus sur une colonne de gel "Sephadex" G-15 ayant 1,27 x 30 cm en utilisant comme éluant un tampon de tris- H Cl 1 m M à p H 7 Le débit de l'éluant est de 1 ml/minute. L'absorbance de la solution d'élution est contrôlé à 254 nm On recueille la première moitié de la fraction de protéine qui s'élue et on titre par rapport à un substrat d'estérase, à savoir, EMT (Sigma, lot 109 C-0048, N T-5505). On effectue le titrage de l'activité enzymatique de la nouvelle protéine modifiée synthétisée analogue à une enzyme estérase, préparée selon la présente invention, à l'aide d'un appareil de CLHP On garnit la colonne d'une matière de support qui est une matière de phase comportant des chaînes latérales carboxyliques et liée à une silice poreuse L'éluant de la colonne est l'acétate 0,03 M à p H 6 La colonne est en acier inoxydable et ses dimensions sont 2 mm x 25 cm On maintient un débit de 4 ml/minute à l'aide d'une pompe classique à haute pression, par exemple une pompe "Altex", Modèle 110 A On détecte l'éluant de la colonne par un détecteur classique U V à 254 nm et on en- registre les hauteurs des pics de tryptophane. On prépare l'échantillon à titrer comme suit: on mélange 3 ml de la protéine modifiée analogue à une enzyme estérase (absorbante à 280 nm de 0,450, ce qui correspond à 0,67 mg/ml) avec 6 ml d'un tampon tris-H Cl 1 m M à p H 7,5, et 1 ml de substrat EMT 0,1 M On prépare une solution- témoin de titrage en ajoutant 6 ml du tampon tris-H Cl 1 m M, à p H 7,5, à 1 ml de substrat EMT et 3 ml de tampon pour l'éluant G-15 "Sephadex", à savoir le tampontris 1 m M à p H 7 Le p H de l'échantillon-témoin et de l'échantillon à titrer est de 6,4. On prélève dans le bécher 1 ml de l'échantillon à l'aide d'une seringue hypodermique de 2 ml munie d'une ai- guille de jauge 18 On fait passer 1 ml de l'échantillon à travers une boucle d'échantillon d'injection de 20 micro- - litres sur la colonne de CLHP On enregistre la durée de l'injection On répète cette même opération avec la solu- tion-témoin On chromatographie à la fois l'échantillon et le témoin à quatre reprises pour obtenir un graphique de molarité de tryptophane en fonction du temps pour l'échantillon et pour le témoin devant êtreélués de la colonne. On effectue une analyse statistique avec les don- nées obtenues par cette opération, montrant une pente de 0,81333 x 10-5 M/min avec une erreur de 0,1021 x 10-5, selon les déterminations faites sur l'échantillon Pour le témoin la pente est de 0,54062 x 105 M/min avec une erreur de 0,03291 x 10-5 M/min. On utilise l'équation suivante pour calculer l'activité de la protéine modifiée analogue à une enzyme estérase selon l'invention. Activité = (changement de pente + erreur) Vs ( 106 PM dans laquelle le changement de pente est la différence entre les pentes de l'échantillon et du témoin (dans ce cas 0,272713); l'erreur est la somme des erreurs des pentes de l'échan- tillon et du témoin (dans ce cas 0,134); Vs est le volume de l'échantillon en litres; 106 est exprimé en micromo Ies/mole; et PM est le poids en mg de la protéine modifiée dans l'essai. Dans ce calcul, la concentration de la protéine modifiée est obtenue à partir de son absorbante à 280 nm, en utilisant le coefficient d'extinction pour la ribonu- cléase, qui est 7,3 pour une solution à 1 % Le coefficient d'extinction est décrit dans le texte de référence Int J. Peptide Protein Res 5, 49-62-( 1973) par D M Kirschen- baum. Les résultats du titrage sont 26 - Substrat EMT (U/g) Activité initiale 0,000 Activité finale 13,62 6,62 Ces résultats montrent que la protéine modifiée analogue à l'enzyme estérase préparée selon la présente invention possède une activité pour le substrat EMT d'en- zyme estérase, alors qu'aucune activité n'a été précédem- ment détectée dans l'enzyme ribonucléase naturelle, ceci illustre, la conversion d'un type d'enzyme, une nucléase, en un second type de protéine, une protéine modifiée ana- logue à une enzyme estérase. EXEMPLE 3 On dissout 100 mg de SAB (Sigma Chemical Company, lot 90 F-9315, N A7511) dans 5 ml d'urée 8 M contenant du tampon tris 0,1 M, à p H 8, avec une agitation lente à 25 C. On ajoute, ensuite, à la solution 0,2 ml de 8- mercaptoéthanol (agent dénaturant) On agite lentement la solution par secousses pendant 15 minutes à 25 C On place la solution sous atmosphère d'azote pendant 16 heures à C, comme expliqué dans l'exemple 1. Ensuite, on chromatographie 5 ml de la solution sur une colonne de filtration à gel ("Sephadex G-15-", ma- tière filtrante) Les dimensions de la colonne sont de 30 x 2,5 cm et elle est remplie de gel G-15 "Séphadex" On utilise comme éluant pour la colonne de gel de l'acide acé- tique à 0,1 M, p H 3 On maintient le débit de l'éluant à 1 ml/minute à l'aide d'une pompe péristaltique à vitesse lente d'un modèle classique On installe un contrôleur d'absorbance au point de sortie de l'écoulement de la co- lonne de chromatographie et on utilise un détecteur U V. réglé à 276 nm pour détecter les fractions de protéine qui s'éluent Lorsque la protéine commence à éluer de la co- lonne, on commence à la recueillir et on recueille ainsi environ 5 ml de protéine. Aux 5 ml de protéine recueillie, on ajoute 1 ml 27 - de tampon de tris-H Cl 1,0 M, à p H 8; 1 ml de EDTA I m M; 1 ml de glutathione réduite 5 x 10 '4 M; 1 ml de gluta- thione oxydée 5 x 10-4 M; et 1 ml d'inhibiteur d'estérase qui est la tryptamine 0,02 M Le p H de la solution résul- tante est de 5,2 On agite lentement pendant 0,5 heure-à p H 5,2 Après 0,5 heure, on élève le p H de la solution à 6 par addition goutte à goutte de Na OH 0,1 M On agite lentement la solution à p H 6, à 25 C, pendant 4 heures de pluso Pendant cette agitation, il se forme un précipité blanc duveteux A l'expiration de la période de 4 heures, on dialyse la solution contre un tampon de tris-H Cl 1 m M, à p H 7, contenant 2 % de tryptamine (inhibiteur)o On ajou- te le tryptophane à titre d'inhibiteur pendant l'addition des autres réactifs selon les enseignements de Chavez et al, dont il a été question plus haut On effectue la dia- lyse en utilisant une membrane tubulaire de dialyse du type '"Spectrapor' N 2 dont le seuil de coupure des poids moléculaires est de 12-14000 daltons Le procédé de dia- lyse comporte deux changements de tampon avec un grand volume de tampon de 7000 ml, au cours de 17 heures, à 0,5 C, sous agitation lente par secousses du tube de dia- lyse dans le milieu de dialyse. Après la dialyse, on chromatographie 4 ml de la solution contenant la protéine modifiée analogue à une en- zyme estérase sur une colonne "Sephadex G-10, les dimen- sions de la colonne étant 1,27 x 30 cm, et la colonne étant remplie de gel et utilisant comme éluant un tampon de tris-H Cl 1 m M à p H 7 L'éluant sort à un débit de 1 ml/ min On contrôle l'éluant de la colonne à 254 nm pour dé- tecter la protéine modifiée analogue à une enzyme en cours d'élution On recueille une,première portion de la proté- ine éluée et on titre contre un substrat pour l'enzyme estérase Le substrat utilisé est le EMT, provenant de Sigma, Chemical Company; lot 109 C-0048, N T-5505. On détermine comme suit l'activité de -la protéine modifiée analogue à une enzyme estérase On titre la frac- 28 - tion de protéine recueillie ci-dessus par CLHP pour déter- miner son activité vis-à-vis du substrat d'estérase EMT. Les conditions du titrage sont comme suit: l'éluant de la colonne CLHP est un acétate 0,03 M, à p H 6 Le support de la colonne est une matière de phase liée à une silice poreuse et contenant des chaînes carboxyliques latérales. La colonne est en acier inoxydable de 2 mm x 25 cm, le débit d'éluant étant de 4 ml/min qu'on maintient par une pompe classique à haute pression, par exemple une pompe "Altex", Modèle 110-A On détecte l'éluant de la colonne par un détecteur classique U V à 254 nm et 0,005 cna On prépare l'échantillon à titrer comme suit on mélange 5 ml de tampon d'acétate 0,03 M, à p H -6, avec 1 ml de EMT 0,1 m M et 4 ml de protéine modifiée analogue à une enzyme estérase préparée ci-dessus (avec une adsorp- tion à 280 nm de 0,016, égale à 0,024 mg/ml) On prépare le témoin de titrage en ajoutant 5 ml du tampon d'acétate 0,03 M, à p H 6, à 1 ml de EMT 0,1 M et à 4 ml de l'élu- ant, à savoir, le tampon de tris-H Cl à p H 7 Le p H de la solution-témoin et de la solution de l'échantillon à ti- trer est de 5,8. On prélève 1 ml de l'échantillon dans le bécher en utilisant une seringue hypodermique de 2 ml avec une aiguille de jauge 18 On fait passer 1 ml de l'échantil- lon à travers une boucle d'échantillon d'injection de 20 microlitres sur la colonne de CLHP On enregistre la du- rée de l'injection On répète cette même opération avec la solution-témoin On chromatographie aussi bien l'échan- tillon que le témoin à quatre reprises pour obtenir un graphique de la molarité du tryptophane en fonction du temps pour l'échantillon et pour le témoin devant être élués de la colonne. On effectue une analyse statistique avec les don- nées obtenues par l'opération ci-dessus, ce qui montre une pente de 0, 05596 x 10-5 moles/minute avec une erreur de 0,00213 x 10-5 moles/min pour l'échantillon Pour le té- 29 - moin, la pente est de 0,0244857 x 10-5 moles/minute avec une erreur de 0,000823 x 10-5 moles/minute. Pour calculer l'activité de la protéine modifiée analogue à une enzyme estérase selon la présente invention, on utilise l'équation suivante v Activité (changement de pente + erreur) Vs ( 106) PM dans laquelle: le changement de pente est la différence entre les pentes de l'échantillon et du témoin (dans ce -cas 0,0314) j l'erreur est la somme des erreurs des pentes de l'échan- tillon et du témoin, (dans ce cas 0,00296) Vs est le volume de l'échantillon en litres 106 est exprimée en micromoles/mole; et PM est le poids en mg de la protéine modifiée dans l'essai. Dans cette équation, -on calcule la concentration de la protéine modifiée à partir de son absorbance à 280 nm, en utilisant le coefficient d'extinction de la ri- bonucléase qui est de 6,62 pour une solution à 1 % Le coefficient d'extinction est décrit dans l'article de réfé- rence Int J Peptide Protein Res 5, 49-62 ( 1973) par D M Kirschenbaum. Les résultats du titrage sont Substrat EMT (U/g) Activité initiale 0,00 Activité finale 32,7 + 3,08 Ces résultats montrent que la protéine modifiée analogue à une enzyme estérase, préparée selon la présente invention, possède une activité pour le substrat EMT d'en- zyme estérase Aucune activité d'estérase n'a été détectée précédemment dans la protéine naturelle SAB. On démontre ainsi la conversion d'un type de pro- téine non-enzymatique (une albumine) en un autre type de protéine, une protéine modifiée analogue à une enzyme es- térase et possédant une activité enzymatique. - EXEMPLE 4: On dissout 250 mg de SAB (Sigma Chemical Compa- ny, lot 90-F-8351, N 7511), dans 25 ml d'urée 8 M avec une lente agitation à p H 7,8 pendant 2 heures à 25 C. Après cette période d'agitation de 2 heures, on ajoute 1 ml d'une solution de l'agent réducteur, B-mercaptoétha- nol 10 m M On agite lentement la solution résultante pen- dant 1 heure,à p H 7,6, à 25 C. On ajoute 75 ml d'une solution à 1 % d'inhibi- teur de l'enzyme estérase, la tryptamine et on agite len- tement pendant 2 heures à p H 7,0. Ensuite, on réticule la protéine comme suit: on place la solution contenant la protéine dans un sac de dialyse qui est une tubulure de dialyse N 2 "Spectrapor". On dialyse la protéine contenue dans le sac contre la so- lution à 1 % de tryptamine (inhibiteur) dans un tampon de tris 1 m M à p H 7,0, à une température de O à 5 C pendant 17 heures. On purifie comme suit la protéine modifiée analo- gue à une enzyme estérase ainsi obtenue On chromatogra- phie 2 ml de la solution décrite plus haut sur une colonne de chromatographie de "Sephadex" G-10 en utilisant comme éluant un tampon d'acétate 0,03 M à p H 6 Le débit de l'éluant est de 2 ml/minute La moitié initiale du maxi- mum de la protéine est d'environ 5 ml d'éluant et son ab- sorbance à 280 nm est de 0,666. On détermine comme suit l'activité de la protéine modifiée analogue à une enzyme estérase On titre par CLHP la fraction de protéine recueillie cidessus Le support de la colonne est une matière de phase liée à une silice poreuse et contenant des chaînes carboxyliques latérales. La colonne est en acier inoxydable et ses dimensions sont 2 mm x 25 cm Le débit de l'éluant est de 4 ml/min en uti- lisant le tampon d'acétate 0,03 M, à p H 6. On détecte la fraction de protéine en élution de la colonne à l'aide d'un détecteur classique U V à 254 nm. -31- On prépare l'échantillon à titrer comme suit * on mélange 5 ml d'acétate 0,03 M, à p H 6, avec 1 ml de EMT 0,1 M et 4 ml de la solution contenant-la protéine Pour préparer la solution-témoin-de titrage, on mélange 9 ml d'acétate 0,03 M, à p H 6, avec 1 ml desubstrat EMT 0,1 M. Le p H aussi bien de la solution échantillon à titrer que la solution-témoin est de 6,0. On prélève 1 ml de l'échantillon dans le bécher à l'aide d'une seringue hypodermique de 2 ml munie d'une aiguille de jauge 18 On injecte 1 ml de l'échantillon à travers une boucle d'échantillon d'injection de 20 micro- litres sur la colonne de CLHP On-enregistre la durée de l'injection On répète cette même opération en utilisant la solution-témoin On chromatographie aussi bien l'échan- tillon que le témoin à quatre reprises pour obtenir un graphique de molarité du tryptophane en fonction du temps pour l'échantillon et le témoin devant être élués de la colonne. On effectue une analyse statistique avec les don- nées de l'opération ci-dessous, et on a une pente de 0,0516 x 10 mole/minute avec une erreur de 0,004 M/minu- te pour l'échantillon La pente pour le témoin est de 0,0287 x 105 M/minute avec une erreur de -0,0016 x 105 M/minute. On utilise l'équation suivante pour calculer l'ac- tivité de la protéine modifiée analogue à une enzyme esté- rase selon la présente invention - Activité = (changement de pente + erreur) Vs ( 106) PM dans-laquelle le changement de pente est la différence entre les pentes de l'échantillon et du témoin l'erreur est la somme des erreurs des pentes de l'échantil- lon et du témoin Vs est le volume de l'échantillon en litres 106 est exprimé en micromoles/mole; et 32 - PM est le poids (mg) de la protéine modifiée dans l'essai. Dans cette équation, on calcule la concentration de la protéine modifiée à partir de son absorbance à 280 nm en utilisant le coefficient d'extinction pour la séro- albumine bovine qui est de 6,6280 pour une solution à 1 %. Ce procédé est décrit dans l'article de référence Int J. Peptide Protein Res 5, 49-62 ( 1973) par D M Kirschenbaum, Les résultats du titrage sont Substrat EMT (U/g) Activité initiale O,0 Activité finale 0,57 0,16 Les résultats montrent que la protéine, modifiée analogue à une enzyme estérase préparée selon la présente invention possède une activité pour le substrat EMT de l'enzyme estérase Aucune activité pour le substrat EMT de l'estérase-n'avait été détectée précédemment dans la SAB naturelle. On démontre ainsi la conversion d'un type de pro- téine non-enzymatique (une albumine) en un autre type de protéine, à savoir, une protéine modifiée analogue à une enzyme estérase qui est enzymatiquement active. EXEMPLE 5: Pour démontrer que la SAB naturelle ne possède aucune activité catalytique pour le substrat EMT de l'Ex- emple 4, on effectue l'opération témoin ci-après. On dissout 1 g de SAB (Sigma Chemical Company, type 7511, lot 90 F-9315) dans 25 ml d'eau distillée dé- sionisée avec agitation lente à 25 C On ajoute à cette solution 75 ml de la solution à 1 % de tryptamine-H Cl On met la solution résultante en incubation pendant 15 minu- tes à 25 C On dialyse ensuite la solution dans un tube de dialyse "Spectra/por" (marque déposée) N 2 contre 3500 ml d'une solution de tryptamine-H Cl pendant 4 heures Le seuil de rupture des poids moléculaires par le tube N 2 est de 12-14 000 daltons On maintient la température de 33 - la solution entre O et 5 C et le p H à-6,0 pendant la dia- lyse Après 4 heures de dialyse, on chromatographie 2 ml de la solution sur une colonne de chromatographie au gel G-10 "Sephadex" On élue la colonne avec un tampon d'acé- tate 0,03 M, à p H 6, avec un débit de 2 ml/min La dimen- sion de la colonne est de 63,5 x 1,27 cm. On recueille deux pics différents, Le premier pic est élué à environ 30 ml On identifie ce premier pic par un balayage à 300-200 nm sur le spectrophotomètre "ACTA III (Beckman Instruments Company) comme étant la protéine SAB On élue le second pic à 60 ml et on l'identifie par spectrophotométrie Uo Vo comme étant la tryptamine. On titre ensuite 4 ml de SAB recueillie en fonc- tion du substrat EMT pour détecter une éventuelle activité enzymatique Pour ce titrage on opère comme suit: on uti- lise un système CLHP pour le titrage La colonne est en acier inoxydable et a 2 mm x 25 cm, garnie de particules de silice poreuse comportant des chaînes latérales carbo- xyliques, la grosseur moyenne des pores des particules étant de 40 microns (produit de Baker Chemical Company). L'éluant de la colonne est un tampon d'acétate-0,03 M, à p H 6, avec un débit de 4 ml/mino L'absorbance du courant qui sort de la colonne est contrôlée à 254 nm On mélange ml du tampon d'acétate 0,03 M, à p H 6, et 1 ml de subs- trat EMT 0,1 M avec 4 ml de la solution de SAB décrite plus haut. On prépare le témoin de titrage en mélangeant 9 ml de tampon d'acétate 0,03 M, à p H 6, et 1 ml de subs- trat EMT 0,1 M Pour l'échantillon et le témoin le p H est de 6,0. On prélève 1 ml de l'échantillon à titrer dans le bécher à l'aide d'une seringue hypodermique de 2 ml mu- nie d'une aiguille de jauge 18 et on injecte à travers une boucle d'échantillon d'injection de 20 microlitres sur la colonne On enregistre la durée de l'injection. On répète cette opération en utilisant la solu- 34 - tion-témoin de titrage On chromatographie aussi bien la solution de l'échantillon que la solution-témoin à quatre reprises pour obtenir un graphique de la molarité de EMT en fonction du temps pour les solutions de l'échantillon à titrer et du témoin de titrage. Une analyse statistique des données obtenues fait ressortir une pente de 0,19689 x 10 5 M/min avec une er- reur de 0,0089 x 10-5 M/min pour l'échantillon de SAB. Pour l'échantillon-témoin, la pente est de 0,20296 x 10-5 M/min avec une erreur de 0,0062 x 10-5 M/min Les pentes, plus la somme des erreurs sont virtuellement identiques. En conséquence la protéine SAB naturelle ne possède pas de propriétés mesurables d'activité catalytique pour les substrats EMT. EXEMPLE 6: Pour démontrer que l'enzyme ribonucléase naturel- le ne possède pas d'activité catalytique pour le support ester méthylique du L-tryptophane (EMT) des Exemples 1 et 2 ci-dessus, on effectue le contrôle suivant. On dissout 60 mg d'enzyme ribonucléase (Sigma Chemical Company, type R5000 lot 20 F-2010) dans 100 ml de tampon de tris 1 m M, à p H 7, avec une lente agitation à 250 C. On dialyse la solution contenant la ribonucléase en utilisant le tube de dialyse No 3 "Spectra/Por" contre 3500 ml de tampon de tris 1 m M, p H 7, pendant 17 heures à une température de O à 50 C Le seuil de rupture des poids moléculaires du tube N O 3 est de 35-4500 daltons On ti- tre ensuite 1 ml de la solution contenant la ribonucléase vis-à-vis du substrat EMT pour détecter une activité enzy- matique possible pour le EMT On effectue ce titrage com- me suit: On utilise un appareil de CLHP pour le titrage. La colonne est en acier inoxydable, et a 2 mm x 25 cm, garnie de silice poreuse qui contient des chaînes latéra- * les carboxyliques, la dimension moyenne des pores étant de r microns (produit de Baker Chemical Company) L'éluant de la colonne est un tampon d'acétate 0,03 M à p H 6, avec un débit de 7 ml/min L'absorbance du courant de sortie de la colonne est contrôlée à 280 nm. On prépare comme suit une solution de l'échantil- lon à titrer contenant la ribonucléase naturelle On mé- lange 8 ml d'un tampon de tris de 1 n M, à p H 8,5, avec 1 ml de EMT 0,1 M, à p H 324, et 1 ml de la solution de ri- bonucléase préparée ci-dessus On prépare la solution- témoin de titrage en mélangeant 8 ml de tampon de tris de 1 m M, à p H 8, 05; 1 ml de EMT 0,1 M, à p H 3,4; et 1 ml de tampon de tris de 1 m M à'p H 7,0 Le p H-des solutions témoin et d'échantillon est de 6,5. On prélève dans le bécher 1 ml de la solution de l'échantillon à titrer à l'aide d'une seringue hypodermi- que de 2 ml munie d'une aiguille de jauge 18 et on injec- te dans la colonne à travers une boucle d'échantillon d'injection de 20 microlitres On enregistre la durée de l'injection. On répète cette opération en utilisant la solu- tion-témoin de titrage On chromatographie la solution de l'échantillon et la solution-témoin à quatre reprises pour obtenir un graphique de molarité de EMT en fonction du temps pour la solution de l'échantillon et la solution du témoin. Une analyse statistique des données obtenue mon- tre des pentes virtuellemeht identiques de 0,1400 0,003 pour la solution témoin et la solution d'échantillon Ainsi la ribonucléase naturelle ne possède pas de propriétés me- surables d'activité catalytique pour le substrat EM To EXEMPLE 7: Pour démontrer l'activité de la SAB naturelle pour le EMT (substrat de l'Exemple 3 ci-dessus) on effec- tue le contrôle suivant. On dissout 100 mg de SAB (Sigma Chemical Company, N 7511, lot 90 F-8351) dans 100 ml d'un tampon de tris de 36 - 1 m M, à p H 7, avec agitation lente à 250 C. On dialyse ensuite la solution contenant la SAB en utilisant le tube de dialyse N O 2 "Spectra/por" contre 3500 ml d'un tampon de tris de lm M, à p H 7, pendant 17 heures, à une température de O à 50 C Le seuil de rupture des poids moléculaires du tube No 2 est de 12-14 000 dal- tons On titre ensuite 1 ml de la solution contenant la SAB par rapport au substrat EMT pour détecter une activi- té enzymatique éventuelle pour EMT On effectue ce titrage comme suit. On emploie un appareil de CLHP pour ce titrage. La colonne est en acier inoxydable ( 2 mm x 25 cm) garnie de silice poreuse portant des chaînes latérales carboxy- liques, et ayant une grosseur moyenne des pores de 40 mi- crons (produit de Baker Chemical Company) L'éluant de la colonne est l'acétate 0,03 M, à p H 6, avec un débit de 7 ml/min L'absorbance du courant sortant de la colonne est contrôlée à 280 nm. On prépare comme-suit la solution de l'échantil- lon à titrer contenant la SAB naturelle- On mélange 8 ml d'un tampon de tris de 1 m M, à p H 7,5, avec 1 ml de EMT 0,1 M, à p H 3,2, et 1 ml de la solution de ribonucléase préparée ci-dessus On prépare la solution-témoin de ti- trage en mélangeant 8 ml de tampon de tris de 1 m M, à p H 7,5, 1 ml de EMT 0,1 M, à p H 3,2, et 1 ml de tampon de tris de 1 m M, à p H 7,0 Le p H de la solution-témoin et de la solution de l'échantillon est de 5,8. On prélève dans le bécher de l'échantillon 1 ml de la solution d'échantillon à l'aide d'une seringue hypo- dermique de 2 ml munie d'une aiguille de jauge 18, et on injecte dans la colonne à travers une boucle d'échantillon d'injection de 20 microlitres La durée d'injection est enregistrée. On répète cette opération avec la solution témoin de titrage On chromatographie les deux solutions à quatre reprises pour obtenir un graphique de molarité de EMT en 37 - fonction du temps pour la solution de l'échantillon et pour la solution-témoin. Une analyse statistique des données obtenues mon- tre des pentes virtuellement identiques de 0,06 0,065 aussi bien pour la solution témoin que pour la solution de l'échantillon Ainsi la ribonucléase naturelle ne pos- sède aucune propriété mesurable d'activité catalytique pour le substrat EMT. 38 - REVENDICATIONS 1. Procédé de modification chimique de la spéci- ficité du substrat d'une protéine naturelle pour obtenir une protéine modifiée analogue à une enzyme, caractérisé en ce qu'il consiste: (a) à choisir une enzyme devant servir de modèle (b) à dénaturer grossièrement une protéine natu- relle; (c) à régénérer partiellement ladite protéine na- turelle grossièrement dénaturée pour obtenir une protéine partiellement dénaturée; (d) à mettre en contact ladite protéine partiel- lement dénaturée avec un inhibiteur pour ladite enzyme- modèle pour former un complexe de protéine partiellement dénaturée et d'inhibiteur d'enzyme-modèle; et (e) à réticuler ladite protéine partiellement dé- naturée dans ledit complexe protéine-inhibiteur. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que pour dénaturer grossièrement ladite protéine na- turelle, on forme une solution aqueuse de ladite protéine naturelle et on maintient cette solution aqueuse à une température et pendant une durée suffisantes pour dénatu- rer grossièrement ladite protéine naturelle. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite température est comprise entre 50 et 700 C. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on dénature grossièrement ladite protéine naturel- le en la mélangeant avec de l'eau pour former une solution aqueuse et en mélangeant la solution aqueuse résultante avec un agent dénaturant. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit agent dénaturant est un acide organique. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit acide organique est choisi dans le groupe comprenant les acides acétique, formique, propionique et citrique. 39 - 7. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit agent dénaturant est un acide minéral. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit acide minéral est choisi dans le groupe comprenant les acides nitrique, phosphorique, sulfurique et chlorhydrique. 9. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit agent dénaturant est le chlorhydrate de guanidine. 10 Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit agent dénaturant est l'urée. 11. Procédé selon la revendication 4, caracterisé en ce que ledit agent dénaturant est un mélange d'urée et de B-mercaptoéthanolo. 12 o Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on réticule ladite protéine partiellement dénatu- rée en la mettant en contact avec un agent de réticulation. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit agent de réticulation est le glutaraldéhy- de. 14. Procédé de modification chimique de la spéci- ficité du substrat d'une protéine naturelle pour obtenir une protéine modifiée analogue à une enzyme, caractérisé en ce qu'il consiste: (a) à choisir une enzyme devant servir de modèle (b) à dénaturer grossièrement une protéine natu- relle (c) à mélanger ladite protéine grossièrement déna- turée avec un inhibiteur de ladite enzyme-modèle; (d) à régénérer partiellement ladite protéine grossièrement dénaturée en présence dudit inhibiteur pour obtenir un complexe de protéine partiellement dénaturée et d'inhibiteur; et (e) à réticuler ladite portion de protéine par- tiellement dénaturée dudit complexe protéine-inhibiteur. Procédé selon la revendication 14, caractérisé - en ce que pour dénaturer grossièrement ladite protéine na- turelle, on forme une solution aqueuse de ladite protéine naturelle et on maintient cette solution aqueuse à une température et pendant une durée suffisantes pour dénatu- rer grossièrement ladite protéine naturelle. -16 Procédé selon la revendication 15, caractéri- sé en ce que ladite température est comprise entre 50 et 700 C. 17. Procédé selon la revendication 14, caracté- risé en ce qu'on dénature grossièrement ladite protéine naturelle en la mélangeant avec de l'eau pour former une solution aqueuse et en mélangeant la solution aqueuse ré- sultante avec un agent dénaturant. 18. Procédé selon la revendication 17, caracté- risé en ce que ledit agent dénaturant est un acide organi- que. 19. Procédé selon la revendication 18, caractéri- sé en ce que ledit acide organique est choisi dans le grou- pe comprenant les acides acétique, formique, propionique et citrique. 20. Procédé selon la revendication 17, caracté- risé en ce que ledit agent dénaturant est un acide minéral. 21. Procédé selon la revendication 20, caracté- risé en ce que ledit acide minéral est choisi dans le groupe comprenant les acides nitrique, phosphorique, sul- furique et chlorhydrique. 22. Procédé selon la revendication 17, caracté- risé en ce que ledit agent dénaturant est le chlorhydrate de guanidine. 23 Procédé selon la revendication 17, caracté- risé en ce que ledit agent dénaturant est l'urée. 24. Procédé selon la revendication 17, caracté- risé en ce que ledit agent dénaturant est un mélange d'urée et de S-mercaptoéthanol. 25 Procédé selon la revendication 14, caracté- risé en ce qu'on réticule ladite protéine partiellement 41 - dénaturée en la mettant en contact avec un agent de réti- culation. 26. Procédé selon la revendication 25, caracté- r Pisé en ce que ledit agent de réticulation est legluta- raldéhyde. 27. La protéine modifiée analogue à une enzyme obtenue par le procédé défini dans la revendication 1. 28. La protéine modifiée analogue à une enzyme obtenue par le procédé défini dans la revendication 14.