FR 2534027 A1 19840406 FR 8315801 A 19831004 La présente invention concerne un procédé-pour garnir des colonnes chromatographiques et le produit résul- tant, et elle porte plus particulièrement sur un procédé pour garnir une colonne chromatographique étroite avec des micro-particules, pour l'utilisation dans la chromatogra- phie en phase gazeuse ou liquide, et sur le produit résul- tant. la tendance en chromatographie a été de passer à des pressions plus élevées et à des colonnes de plus petit diamètre, pour parvenir à une utilisation efficace des sol- vants dans la chromatographie en phase liquide à hautes performances, et à un rendement élevé de la colonne en chromatographie en phase gazeuse De plus, l'utilisation de colonnes de grande-longueur peut permettre de parvenir à un plus grand pouvoir de séparation, comme on le désire. Ces développements font qu'on peut séparer efficacement des mélanges complexes, tout en utilisant de plus petites quan- tités de solvant mobile en chromatographie en phase liquide, et avec un temps d'analyse minimal en chromatographie en phase gazeuse On trouvera un examen de ces développements dans l'article de F J Yang, "Fused-Silica Narrow-Bore Microparticle-Packed-Colum Hig>i-Performance Liquid Chroma- tography", Journal of Chromatography, volume 236, page 265 ( 1982) Il résulte de ces développements qu'on dispose de nouveaux appareils chromatographiques et de techniques chromatographiques plus puissantes. Alors qu'en chromatographie en phase gazeuse on a obtenu la résolution et la vitesse d'analyse la plus éle- vées en utilisant des colonnes tubulaires ouvertes étroites (voir par exemple le brevet US 4 293 415), en chromatogra- phie en phase liquide, c'est essentiellement avec des eo- lonnes étroites garnies de micro-particules qu'on a obtenu- la résolution la plus élevée Cette dernière circonstance pour la chromatographie en phase liquide est due au fait que de petites particules (par exemple inférieures ou éga- les à 10 pm) peuvent 9 tre chargées efficacement dans de grandes longueurs de colonnes étroites Pour avoir un exa- men des développements en chromatographie en phase liquide à hautes performances, par opposition auxdéveloppements en chromatographie en phase gazeuse, on pourra voir par exem- ple l'article de F J Yand, "Narrow-Bore Microparticle- Packed Column High-Performance Liquid Chromatography", J. Chromatography, Proceedings, The VI International Liquid Column Chromatography Conference ( 1982). Du fait que les colonnes étroites garnies de micro-particules offrent des avantages de performances pour la chromatographie en phase liquide à hautes perfor- mances, et m 9 me pour la chromatographie en phase gazeuse, il est nécessaire de développer des matières et des tech- niques satisfaisantes pour les colonnes et leur garnissage. les procédés anciens de garnissage de colonnes, par gravité, ne se sont pas avérés satisfaisants pour les colonnes étroites On pourra voir à ce titre les articles suivants: G H lathe, et Col, "Separation of Substance and Estima- tion of Their Relative Molecular Sizes by the Use of Columns of Starch in Water", Bio-chemical Journal, volume 62, page 665 ( 1950) et P Flodin, "Methodological Aspects of Gel Filtration with Special Reference to Desalting Operations", Journal of Chromatography, volume 5, NO 2, page 103 ( 1961) Une technique pour garnir des colonnes de faible diamètre consiste à garnir une colonne en verre classique, puis à chauffer et à étirer la colonne pour lui donner un plus faible diamètre On a ainsi lié sur place des phases fixes en chromatographie en phase liquide; voir à cet égard l'article de M Novotny et Col, "Pa- cked Microcapillary Columns in High Performance Liquid- Chromatography", Anal Chem, 50 271 ( 1978)o Les produits formés par cette technique sont différents de colonnes garnies de façon classique, dans la mesure o les colonnes ont des rapports faibles, dans la plage d'environ 2-3, entre le diamètre de la colonne et la taille des particules. L'inconvénient de cette technique consiste en ce que, du fait des tailles de particules relativement grandes qui sont utilisées, les performances des colonnes micro-capillaires garnies sont nettement inférieures à celles de colonnes de diamètre classique de 4 à 5 mm qui sont garnies avec des particules de 5 lim O Cette technique ne permet pas de garnir une colonne avec des particules ayant des tailles inférieu- res à 30 pm, du fait de l'obstruction et de la difficulté à obtenir un garnissage uniformes Comme on peut le voir, il devient de façon générale difficile de garnir avec des mi- cro-particules des colonnes de plus en plus étroites, du fait que le diamètre intérieur des colonnes commence à s'approcher de la taille des particules, ce qui fait qu'un garnissage non uniforme ou une obstruction des colonnes peuvent se produire, ou bien le produit peut avoir des ré- sistances élevées à la circulation du solvants Le problème devient plus important lorsqu'on augmente les longueurs de colonne - On conna Zt également d'autres techniques de gar- nissage de colonnes qui'sont utilisées pour garnir des co- lonnes de chromatographie en phase-liquide ayant un diamè- tre intérieur de 4 à 5 mm Parmi ces techniques figurent le garnissage équilibré avec une bouillie, développé, par R E Majors, Anal Chem 44 1722, 1723 ( 1972) et J J. Kirkland, J Chromatogr Soi, 9 206, 207 ( 1971), pour des colonnes garnies pour chromatographie en phase liquide; et le garnissage classique par lit sec et compression par de l'air sous haute pression, qui est employé avec les colonnes de chromatographie en phase gazeuse Pour des co- lonnes de faible diamètre, par exemple des colonnes ayant des diamètres intérieurs de 500 pm ou moins, une technique connue consiste à incorporer les particules dans une-bouil- lie et à faire circuler la bouillie dans la colonne; voir par exemple la brochure " 1 C Slurry Packing Kit", Scientific Systems, Inc, State College, PA 16801 On met en oeuvre de façon caractéristique la technique de garnissage par bouillie en établissant un écoulement de la bouille dans la colonne, en arrêtant l'écoulement, en évacuant le liqui- de et en etenant les particules qui sont alors présentes dans la colonne Des études de cette technique ont évalué la relation entre la vitesse de garnissage et la taille de la colonne (voir l'article de Y Kato, et Col, "Packing of Toyopearl Column For Gel Filtration", J Chromatography, volume 205, page 185 ( 1981), volume 206, page 135 ( 1981)), et ont montré qu'un garnissage à pression semi-constante avec une vitesse d'écoulement variable peut être préférable pour le garnissage de colonnes destinées à la filtration sur gel (voir l'article de Y Kato, et Col, "Packing of Toyopearl Columns For Gel Filtration, 111, Semi-Constant Pressure Packing", J Chromatography, volume 208, page 71 ( 1981). L'article de D Ishii, et Col, "Development of Technique for Miniaturization of High-Performance Liquid Chromatography", J Chromatography, volume 144, page 157, 1977 décrit la préparation d'une colonne faite d'un tube de PTFE de 0,5 mm de diamètre intérieur et de 1,0 mm de diamètre extérieur, en utilisant une technique de garnissa- ge par bouillie On a choisi un tube d'une longueur plu- sieurs fois supérieure à celle nécessaire pour la colonne terminée On a mis en suspension la phase fixe dans un solvant ap- proprié, sous la forme d'une bouillie qu'on a placée dans une petite bouteille On a raccordé au tube une seringue hermétique de 250 pl, et on les a emplis avec le solvant qui a été utilisé pour préparer la bouillie On a ensuite plongé l'extrémité inférieure du tube dans la bouillie, on a fixé la seringue à un dispositif d'avance micrométrique et on a aspiré la bouillie jusqu'à l'extrémité supérieure du tube, en actionnant le dispositif d'avance manuellement ou électriquement On a ensuite bouché de façon étanche l'extrémité inférieure du tube avec une petite quantité-de laine de quartz, pour que la matière de garnissage ne fuie plus On a actionné manuellement ou électriquement le dis- positif d'avance micrométrique pour évacuer le solvant. Les colonnes résultantes ont une mauvaise stabilité du lit tassé, et elles se déforment aisément en pré- sence de débits élevés et de pressions d'entrée de colonne élevées Elles ne conviennent pas pour la chromatographie en phase liquide à haute pression. L'invention a donc pour but de procurer un procé- dé pour garnir des colonnes étroites à haut rendement, choisies parmi les matières suivantes: silice fondue, ver- re, acier inoxydable ou-acier inoxydable revêtu de verre. Un autre but de l'invention est de procurer un procédé pour garnir uniformément une colonne chromatogra- phique étroite, sur toute sa longueur, avec des micro-par- ticules ayant un diamètre dans la plage de 3 pim à 10 pim pour la chromatographie en phase liquide et de 3 pim à 100 Fm pour la chromatographie en phase gazeuse. Un but supplémentaire de l'invention est de pro- curer une colonne chromatographique étroite garnie de mi- cro-particules, ayant une porosité uniformément faible et un lit tassé stable. Un autre but de l'invention est de procurer unie colonne comportant des extrémités prévues pour le raccor- dement à l'interface d'injecteur et de détecteur, qui pré- sente un rendement de colonne optimal et une bonne stabi- lité du lit tassé. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre d'un mode de réalisation et en se référant aux dessins annexés sur lesquels la figure 1 est une coupe d'un dispositif desti- né au garnissage d'une colonne chromatographique étroite conformément au procédé de l'invention; Les figures 2 a-2 e sont des coupes latérales 2534 È 27 d'autres raccords d'extrémité prévus pour l'utilisation à l'extrémité d'une colonne chromatographique étroite, lors- qu'elle est garnie conformément au procédé de l'invention La figure 3 est un organigramme décrivant le procédé de garnissage de colonne de l'invention; la figure 4 a est une reproduction d'une photo- graphie de la totalité de la section transversale d'une colonne; la figure 4 b est une reproduction d'une photogra- phie d'une partie de la section transversale d'une colonne, à l'extrémité d'entrée de la colonne, près du centre de la colonne; - La figure 4 c est une reproduction d'une photogra- phie d'une partie de la section transversale d'une colonne, à l'extrémité d'entrée de la colonne, près de la paroi; Les figures 4 d 4 e sont des reproductions de photographies de parties de sections transversales de la colonne, à l'extrémité de sortie de la colonne, près de la paroi; La figure 5 est un graphique de performances de Van Deemter pour une colonne étroite garnie de micro-par- ticules, de 330 m de diamètre intérieur, avec des particu O es de 3 Vm a phase greffées C 18, d a N S u N c a S d a N s lequel le composé analysé consiste en pyrène; La figure 6 est un chromatogramme montrant la séparation d'un mélange d'hydrocarbures aromatiques poly- nucléaires; Ia figure 7 est un chromatogramme montrant la séparation d'un échantillon d e P N A polluant je S S e N t i e i S e i o N l'EPA, en utilisant une colonne de 320 pi-x 1 m, avec des particules de 3 Fm à polarité de phases inversée, greffées Cl 8 L'invention procure un procédé pour garnir des colonnes chromatographiques étroites On choisit une co- lonne flexible d'un diamètre intérieur inférieur à 500 pm. On forme une bouillie dans un réservoir, à partir d'un sol- vant mobile et de particules de diamètre spécilé Pour la chromatographie en phase liquide, la taille des particules va de 3 pm à 1 à pm; pour la chromatographie en phase ga- zeuse, la taille des particules va de 3 pm à 100 pm On place une restriction d'extrémité à l'extrémité de la co- lonne, pour permettre l'écoulement du solvant mobile et pour emnpcher la sortie de particules par l'extrémité de la colonne On fixe le réservoir à la colonne et on fait passer la bouillie dans la colonne, sous pression On uti- lise une séquence de pression à deux étapes pour emplir tout d'abord la colonne et former le lit de particules, puis pour comprimer uniformément le lit Ainsi, on main- tient une pression initiale pendant une durée initiale, de préférence moins de 10 minutes On élève ensuite la pres- sion à partir de la pression initiale jusqu'à une pression maximale, pendant une seconde durée Le produit est une colonne garnie de façon stable mais néanmoins l Cche, ayant un nombre élevé de plateaux théoriques par unité de loegueur. le but ultime dans le garnissage de colonnes est d'obtenir des répartitions uniformes et reproductibles des matières de garnissage, aussi bien sur la section que sur la longueur des colonnes De telles colonnes garnies uni- formément tendent à avoir un pouvoir de résolution-élevé et sont susceptibles d'être utilisées pour l'analyse rapi- de Comme indiqué précédemment, on a employé des techniques de garnissage par gravité, de garnissage à sec et de gar- nissage par bouillie Lorsque les diamètres de colonne de- viennent plus étroits, par exemple 500 pm, il devient de plus en plus difficile de garnir les colonnes d'une ma- nière reproductible L'utilisation des techniques classi- ques de garnissage par bouillie a conduit à une mauvaise uniformité, à cause d'effets de paroi Il s'est avéré par- ticulièrement difficile d'effectuer un garnissage avec des micro-particules de taille inférieure à 5 um, et on a abou- ti à une densité de garnissage non uniforme, ainsi qu'à une faible porositéS Comme le montre le Tableau I, certaines catégo- ries de colonnes sont apparues au cours du développement de colonnes étroites garrnies de micro-particules pour la chromatographie en phase liquide à hautes performances. Tableau I Diamètre intérieur Taille de Débit Désignation de la colonne (dm) particule (Pl/mn) (Pm) I Xicro-capillaire, non garnie 3-100 (phase gazeuse) Chaque catégorie a sa propre gamme de diamètre intérieur de colonne, de taille de particule et de débit. Bien que potentiellement difficiles à fabriquer, les co- lonnes micro-capillaires ne nécessitent que de faibles quantités de matière de garnissage et leur utilisation est économique du fait qu'elles n'utilisent que de faibles quantités de solvant Comme il est souligné par ailleurs, lorsqu'on garnit des colonnes étroites il est nécessaire d'effectuer un garnissage uniforme sur toute la longueur de la colonne; il est également nécessaire d'éviter de garnir la colonne de façon trop serrée à une position par- 2534 È 27 ticulière quelconque le long de la colonne, du fait qu'un tel garnissage serré pourrait restreindre excessivement l'écoulement du solvant mobile dans la colonne pendant le fonctionnement En outre, on désire également obtenir une densité de garnissage uniforme sur le diamètre de la co- lonne, de façon à parvenir à une séparation avec un rende- ment élevé Les caractéristiques des colonnes particulières garnies conformément au procédé de l'invention sont les suivantes: (a) des colonnes étroites et longues sont gar- nies efficacement avec des particules dont la taille peut descendre jusqu'à 3 pm et (b) elles ont une porosité suf- fisamment-faible pour permettre une séparation efficace mais néanmoins (c) , du fait de la répartition stable et uniforme des particules, on peut faire fonctionner les co- lonnes avec un débit élevé ( O I-20 pl/mn). Dans la forme préférée du procédé de l'invention, on choisit parmi les matières suivantes: silice fondue, verre, acier inoxydable ou acier inoxydable revêtu de ver- re, une colonne ayant un diamètre intérieur inférieur à 500 pm On relie la colonne-à un dispositif comportant un réservoir de bouillie, du type représenté sur la figure 1. On introduit dans un tube en acier inoxydable 13 la colonne étroite 10 consistant en un tube capillaire 11 en silice fondue Une extrémité du tube 13 s'embotte dans un raccord 12 et son autre extrémité s'embote dans un raccord 16 et est maintenue en place par un embout 15 Le réservoir de bouillie 17 est également introduit dans le raccord 16; et le réservoir de bouillie 17 communique avec une pompe (non représentée) par l'intermédiaire d'un raccord 20. L'extrémité -de la colonne 10 est ainsi introduite à travers le tube 13 de façon à être aboutée au bas du-réservoir de bouillie 17 La partie inférieure de la paroi 19 du réser- voir 17 a une forme qui lui permet de s'ajuster exactement dans la paroi intérieure 14 du raccord 16 Dans le mode de réalisation préféré, représenté sur la figure 1, la paroi intérieure du raccord 16 présente au centre une forme en entonnoir, ce qui fait que la partie inférieure de la pa- roi 19 a de façon similaire une forme en entonnoir O A son extrémité, la paroi 19 rencontre l'extrémité supérieure du tube 13 L'extrémité supérieure du tube capillaire 11 ne communique donc qu'avec la bouillie 18, ce qui fait que pendant le garnissage, la bouillie s'écoule régulièrement dans l'extrémité de la colonne 10 Comme il est représenté, la partie inférieure de l'entonnoir a de préférence un diamètre comparable au diamètre intérieur de la colonne 10, de façon à éviter que l'effet de porte ne gene l'écoule- ment; pendant le garnissage, la bouillie s'écoule uniformé- ment dans l'extrémité de la colonne 10. Pendant l'opération de garnissage, une restric- tion pour les particules est montée à l'extrémité aval de la colonne Comme on l'envisagera ultérieurement et comme le montrent les photographies des figures 4 a 4 e, la res- triction permet d'obtenir une garniture de porosité uni- formément faible Contrairement à la technique d'Ishii, décrite ci-dessus, l'écoulement de particules dans la bouillie sous pression est arreté à l'extrémité de la co- lonne et les particules sont recueillies et tassées uni- formément dans le lit Pendant l'opération de garnissage, la restriction établit une contre-pression et permet au solvant de sortir par l'extrémité de la colonne, mais elle retient les matières de garnissage dans la colonne Les matières de garnissage ont de façon caractéristique un diamètre dans la plage de 3 à 10 pm pour la chromatogra- phie en phase liquide et de 3 à 100 p I pour la chromato- graphie en phase gazeuse. Les restrictions peuvent prendre plusieurs for- mes Comme le montre la figure 2 a, un fil 28 est introduit dans l'extrémité de la colonne 25 et cette extrémité porte sur sa longueur un revêtement protecteur externe 26 Le fil 28 qui est introduit a un diamètre légèrement inférieur il au diamètre intérieur de la colonne 25, ce qui permet au solvant de sortir de la colonne par l'ouverture annulaire 29.Leouverture annulaire 29 a une dimension suffisam- ment faible pour ne pas être traversée par les particules de garnissage 27 de la colonne Une fois que la colonne est complètement garnie conformément au procédé de l'invention, on peut retirer le fil et introduire un bouchon poreux Le bouchon doit satisfaire l'exigence suivante: il doit etre traversé par le solvant mobile, tout en retenant de façon permanente les particules dans le corps de la colonne La figure 2 b montre un second type de restriction d'écoulement. On introduit dans l'extrémité de la colonne 25 et on fait adhérer à cette extrémité une colonne 30 en silice fondue à parois épaisses ayant un petit passage central 32, et dont le diamètre extérieur est approximativement égal au diamètre intérieur de la colonne 25 Le solvant traverse le passage central 32 de la colonne 30, mais les particules de garnis- sage 27 ne peuvent pas sortir de la colonne 31 à cause de l'étroitesse de l'ouverture centrale 32 La figure 2 c montre un troisième type de restriction On introduit la colonne 25 dans un tube de raccord 33, par exemple un tube de Teflon, dont le diamètre intérieur est approximativement de la tail- le du diamètre extérieur de la colonne 25 On introduit à force un bouchon 31 contre l'extrémité de la colonne 25 On raccorde une colonne ou un tube 34 au bouchon 31 pour réa- liser la jonction avec un détecteur L'ouverture qui tra- verse le bouchon 31 est suffisamment étroite pour empocher le passage des particules 27 En plus du bouchon 31 de la figure 2 c, l'élément introduit peut 6 tre un fil 39 dans une colonne 37, comme le montre la figure 2 d La figure 2 e mon- tre un-autre type-de restriction Il s'agit d'une variante qui peut être appliquée à n'importe laquelle des configura- tions ci-dessus Dans ce cas, on garnit tout d'abord l'ex- trémité de la colonne ou la région située à la jonction avec la restriction d'extrémité 31 (ou avec l'une quelcon- que des configurations de restriction ci-dessus), avec des particules 35 de plus grande taille On choisit les parti- cules plus grandes de façon qu'elles soient suffisamment grandes pour ne pas passer à travers l'ouverture, quiil s'agisse d'une ouverture annulaire (figures 2 a, 2 d), du diamètre intérieur d'ume colonne (figure 2 b) ou de l'ou- verture centrale d'un bouchon (figure 2 c) On fait ensuite circuler dans la colonne les particules plus petites qui constituent la partie active de la colonne, conformément au procédé de l'invention, et on emplit avec ces particu- les toute la longueur de la colonne Les particules plus petites sont effectivement arrêtées par la couche de par- ticules plus grandes La restriction utilisée dans le pro- cédé de garnissage pour des colonnes de grande longueur peut également être une colonne garnie courte (par exemple une colonne de 4 cm x 2 mm garnie avec des particules de pm) Une fois que le garnissage est terminé, on peut enlever la colonne garnie faisant fonction de restriction et mettre en place un raccord d'extrémité constituant une restriction permanente. On emplit de préférence le réservoir de bouillie avec une concentration élevée (de l'ordre de > 20 % de particules/volume) de matière de garnissage dans un sol- vant tel que le méthanol ou l'acétone On raccorde l'ex- trémité supérieure du réservoir à une pompe à haute pres- sion, par l'intermédiaire d'un raccord classique 20, pour introduire le solvant sous pression en tant que phase mo- bile pendant le garnissage L'orientation du réservoir 17 et de la colonne 10 peut 9 tre celle représentée sur la figure 1; ceci conduit à un garnissage descendant Il est préférable que la colonne 10 se trouve audessus du réservoir 17, dans un mode de garnissage ascendant, pour éviter que les micro-particules se déposent dans le réser- voir et donnent lieu à un garnissage non uniforme Pour assurer un garnissage uniforme, il est préférable d'agiter la bouillie dans le réservoir, de préférence par des moyens sans contact, comme des moyens ultrasonores (non repréàen- tés) On augmente ensuite la pression de la bouillie dans le réservoir, jusqu'à une pression de garnissage initiale O La pression initiale du réservoir est proportionnelle à: (a) la longueur de la colonne, (b) le diamètre intérieur de la colonne, et (c) la taille de particules On choisit la pression conformément au Tableau MI pour des colonnes ayant une longueur initiale de 50 cm ou plus O Tableau II Longueur de la Diamètre intérieur Pression colonne (cm) de la colonne (mm) initiale (M Pa) 0,5 5 0,3 15 50 0,2 30 0,1 40 0,5 20 0,3 30 0,2 40 200 0,1 50 Lorsque la pression initiale est atteinte, la bouillie com- mence à s'écouler dans la colonne On maintient la pression du réservoir et l'écoulement aux valeurs correspondant à la pression initiale pendant une durée ne dépassant pas 10 mi- nutes On élève ensuite la pression pas à pas ou de manière linéaire, depuis la pression initiale, dans la plage de 5 à M Pa, jusqu'à une pression de-20 à 80 M Pao Pendant la du- rée au cours de laquelle la pression initiale est maintenue, pendant la durée d'élévation de la pression et pendant la durée de fonctionnement à la pression maximale, le solvant correspondant à la phase mobile circule et des particules sont entraînées dans la colonne et se tassent dans celle-ci. Au début de la durée pendant laquelle la pression initiale est maintenue, le débit approche de 1 cm 3/mn Pendant que la colonne s'emplit avec la matière de garnissage, le débit diminue progressivement Ia séquence de pression à deux étapes (pression initiale, puis maximale) permet au lit de se former uniformément, puis d'être comprimé plus forte- ment, jusqu'à ce qu'il s'approche asymptotiquement du niveau de compression qui est associé à-la pression maximale la séquence à deux étapes permet d'obtenir l'uniformité, du fait que le lit est formé à des pressions inférieures, ne produisant pas de turbulences, après quoi la compression complète est effectuée une fois que les particules sont en place Si on utilisait initialement la pression maximale, des défauts d'uniformité pourraient apparattre sur la lon-. gueur de la colonne Après fonctionnement à la pression maximale pendant dix à trente minutes, on arrête la pompe et on réduit progressivement la pression dans la colonne, * soit pas à pas soit de façon linéaire Du fait que la ré- duction de pression est progressive, il n'y a pas de force de refoulement notable susceptible de déloger la matière de garnissage On enlève ensuite la colonne 10 du tube 13 et elle est ainsi séparée du réservoir de bouillie On purge ensuite le lit formé avec un solvant chromatographi- que de façon que la colonne soit prote à l'utilisation pour l'analyse chromatographique. Pour garnir des colonnes de façon un peu plus dense, on peut utiliser des colonnes plus courtes et des pressions initiales plus élevées La limite concernant des pressions initiales plus élevées est établie par le défaut d'uniformité qui serait introduit s'il y avait un écoule- ment turbulent initial On met en oeuvre le-procédé de l'invention de la même manière, à l'exception du fait qu'on choisit la pression de départ initiale conformément au Tableau III, Tableau III Longueur de la colonne (cm) Diamètre intérieur de la colonne (mm) 25 50 0,5 0,3 0,2 0,1 0,5 0,3 0,2 0,1 On ne peut garnir que des colonnes courtes avec des pres- sions initiales aussi élevées, du fait que des colonnes garnies avec des pressions initiales aussi élevées se- raient plus denses et l'écoulement du solvant mobile se- rait gêné dans les derniers incréments de longueur de la colonne. Des colonnes garnies par le procédé de l'inven- tion conformément au Tableau II ont une faible résistance à l'écoulement On obtient des valeurs dans la plage de à 400 pour un facteur de résistance à l'écoulement 0, défini par la relation: d 2 Ap 0 = dans laquelle: dp = taille de particule A p = gradient de pression dans la colonne, u = débit linéaire du solvant mobile, = viscosité du solvant mobile, et L = longueur de la colonne. Le produit a une porosité > 0,5 et il est classé dans la catégorie "colonne garnie de façon l Cche"o Pour des colon- nes de chromatographie en phase liquide, les matières de Pression initiale (M Pa) garnissage préférées sont de petites particules, par exemple de 3 à 10 pn; pour des colonnes de chromatographie en phase gazeuse, des particules dans la plage de 3 à 100 pm sont préférables Les produits ont une porosité pratiquement uni- formes sur la longueur et sur le diamètre de la colonne, corme le montrent les figures 4 a 4 d les figures 4 b et 4 c montrent des vues obtenues au microscope électronique à balayage des répartitions des particules à l'extrémité d'en- trée d'une colonne de 1 m sur 0,3 mm de diamètre intérieur, garnie de particules de 3 pim Les figures montrent qu'il n'y a pas de différences notables dans les répartitions des particules entre le centre et le voisinage de la paroi de la section transversale de la colonne Ia répartition uni- forme des particules sur le diamètre de la colonne est évidente Les figures 4 d et 4 e montrent les vues obtenues au microscope électronique à balayage de la répartition des particules à l'extrémité de sortie de la colonne Les vues au microscope électronique à balayage montrent que la taille de particule et la densité de répartition sur le diamètre de la colonne, à l'extrémité de la colonne, sont les mêmes De plus, la densité et l'uniformité de la répartition des par- ticules qu'indiquent les figures 4 a-4 b et 4 c-4 d sont les mômes Ceci indique l'uniformité du garnissage sur la lon- gueur de la colonne Cette uniformité est confirmée par la vue de la figure 4 a montrant la totalité de la section transversale Cette uniformité se distingue nettement de ce qu'on obtient avec des colonnes garnies par des techniques classiques, dans lesquelles les plus grandes particules tendent à se rassembler le long des parois, du fait que les parois exercent des forces de traînée plus élevées sur les plus grandes particules Cette uniformité est avantageuse du fait qu'aucun effet d'étalement hors bande ne se produit lorsque des échantillons sont analysés, et les colonnes ont donc une grande efficacité Pour des longueurs de colonne supérieures ou égales à 50 cm, de telles colonnes garnies de façon lâche sont préférables, du fait qu'elles permettent l'écoulement du solvant mobile à des débits raisonnables de l'ordre de 0, 1 à 20 pl/mn pendant l'accomplissement de l'analyse chromatographique Bien que la porosité soit éle- vée, on constate que les matières de garnissage ne se dépo- sent pas au cours de l'utilisation Ceci est de au fait que bien que les colonnes fonctionnent à pression élevée, la force totale qui est appliquée au lit tassé es-t faible, du fait que l'aire de section droite est faible De telles colonnes permettent d'accomplir une analyse rapide, du fait qu'à des pressions élevées, on peut atteindre des débits élevés La possibilité de garnir des colonnes longues avec des particules de 3 pm ou moins pour la chromatographie en phase liquide permet d'obtenir un pouvoir de séparation très élevéo Les spécifications de colonnes garnies conformé- ment au procédé de l'invention, y compris leurs performan- ces,sont indiquées en détail dans un article de F Jo Yang, intitulé "Fused-Silica Narrow-Bore Microparticle-Packed- Column High-Performance Liquid Chromatography", J Chroma- tography, volume 235, pages 265, 266 ( 1982) Le Tableau IV indique quelques comparaisons importantes entre ces colon- nes et les colonnes de l'art antérieur: Tableau IV Caractéristique Art antérieur Présente invention Nombre de plateaux 20 000 30 000 200 000 théorics,es (diamètre inté (diamètre intérieur: rieur: 4,6 rm, 300 Mm, longueur: longueur: 25 cm) 2 m) Capacité de crgte 50 150 200 Consommation de 1 cm 3/mn 2 pl/mn solvant Taille d'échan 1 mg 10 g tillon On a garni un tube de silice fondue avec un diamètre inté- rieur allant de 57 à 376 pm, et avec des longueurs allant jusqu'à 2 m, avec des particules greffées 018, de 3, 5 et 10 un, en utilisant la technique de garnissage de l'invention L' octadécylsiloxane à po 3 arité de phases inverse a été lié chimiquement sur la silice sous forme de micro-parti- cules, avant introduction dans les colonnes étroites La phase mobile consistait en un mélange acétonitrile-eau 70:30 dans des conditions d'isocratie Le pouvoir de sépa- ration de la colonne est indiqué par le graphique de Van Deemter de la figure 5, pour des colonnes de 1 m x 330 pm de diamètre intérieur, garnies avec des particules sphéri- ques de silièe greffée 018, de 3 m Le graphique ne montre aucun effet de débit notable Pour la plage de débits comprise entre 0,3 et 1,6 mm/s, le rendement de la colonne se maintient à sa valeur élevée à cause de l'uniformité du lit tassé dans -la colonne Le nombre total de plateaux théo- riques dépasse 110 000 pour la plage de débit étudiée. Ceci est à comparer à des nombres de plateaux théoriques de 000 pour des colonnes classiques. Les chromatogrammes des figures 6 et 7 illustrent davantage le pouvoir de séparation du produit obtenu par le procédé de l'invention Ia figure 6 montre la séparation d'un mélange d'hydrocarbures aromatiques polyrnucléaires par une colonne de silice fondue de 320 pim x 2 m, garnie par le procédé de l'invention avec' des particules de silice de 3 ymn à polarité dephases inversése, greffées C 3 De s Dlvant mobile consistait en 70 % d'acétonitrile: H 20, et le débit était de 1,8 pi/mn Pour la colonne de deux mètres, le nombre total de plateaux théoriques mesuré pour le pyrène avec k' = 10 était de 144 000 plateaux Un rendement total de 144 000 plateauxpour une seule colonne n'a jamais été si- gnalé précédemment pour une colonne de 3 pm avec 018 Ceci démontre l'efficacité de la technique de garnissage pour garnir une colonne longue avec de petites particules Sur la figure 7, un échantillon a e P N A polluant e S S e N t i e i S e 1 o N 1 'EPA, a été séparé en uti- lisant une colonne de silice fondue de 320 p F x 1 m, garnie par le procédé de l'invention avec des particules de silicede 3 im gieffées avec polarité de phases inversée Le solvant mobile c onsis- tait en 70 % d'acétonitrile: H 20, et le débit était de 0,9 pl/mn On notera qu'on a obtenu la résolution corres- pondant à la ligne de base-pour le mélange de PNA. On notera en particulier la séparation du benzo(a)anthracène et du chrysène, qui est normalement ca- ché dans un système isocratique à po Lrsité de phases invarsée On voit de façon évidente les avantages de l'utilisation d'une colonne étroite et longue garnie de micro-particules, dans l'analyse d'échantillons complexes et pour l'économie de solvant. Les matières de colonne pour la chromatographie en phase liquide et gazeuse avec des colonnes étroites gar- nies de micro-particules, peuvent 9 tre choisies parmi les' matières suivantes: silice fondue, verre, acier inoxydable et acier inoxydable revêtu de verre Les exigences consis- tent en ce que la matière soit inerte et se prête à l'ob- tention des faibles diamètres nécessaireso Il est préféra- ble aue les matières soient flexibles, lorsqu'on leur a donné de faibles diamètres, de façon à pouvoir enrouler de grandes longueurs pour qu'elles occupent de petits volumes. En outre, les matières ont de préférence des surfaces inté- rieures lisses et ne présentent pas d'effets de paroi On a trouvé que la silice fondue est une matière préférée, du fait que ses parois intérieures sont extrêmement lisses et du fait qu'elle est capable de dissiper de la chaleur à travers les parois; avec une telle dissipation de chaleur, il n'y a aucun gradient de température notable dans la co- lonne les colonnes en silice fondue sont également idéales poux l'association directe à des détecteurs tels que des détecteurs de base de flamme, des spectrographes de masse et des détecteurs infrarouges à transformation de Fourier, du fait que les débits sont adaptés aux exigences de débit de ces détecteurs Des colonnes garnies conformément au procédé de l'invention ont de façon caractéristique un dia- mètre intérieur qui est inférieur à environ 500 pm Pour la chromatographie en phase liquide, elles ont une taille de particule de moins de 10 pm et une longueur de plus de cm Pour la chromatographie en phase gazeuse, elles ont une taille de particules de moins de 100 Pm les particules peuvent être revêtues physiquement ou peuvent 9 tre liées à n'importe quels types de phases utiles pour la chromatogra- phie par gaz, par liquide, par gel ou par échange d'ions. Il va de soi que de nombreuses modifications peu- vent Ctre apportées au procédé et au dispositif décrits et représentés, sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1 Procédé pour garnir une colonne étroite au moyen d'une bouillie, caractérisé' en ce qu'il comprend les opérations suivantes: on choisie une colonne flexible ( 10) ayant un diamètre inférieur à 500 im; on bouche l'extrémité de sortie ( 25) de cette colonne avec une res- triction d'extrémité ( 28, 30, 31, 36, 39) qui permet l'écoulement d'un solvant mobile mais qui emp 9 che le pas- sage de la matière de garnissage ( 27); on prépare une bouillie ( 18) à partir d'un solvant mobile et d'une matière de garnissage ( 27); on fait circuler cette bouillie dans la colonne ( 10), sous pression, de la manière suivante: on applique une pression initiale et on maintient cette pression initiale pendant une durée initiale; on élève la pression de la pression initiale jusqu'à une pression ma- ximale; et on maintient la pression maximale pendant une seconde durée. 2 Procédé pour garnir une colonne étroite au moyen d'une bouillie, prévu spécialement pour la chromato- graphie en phase gazeuse, selon la revendication 1, carac- térisé en ce qu'on accomplit l'opération de préparation d'une bouillie ( 18) à partir d'un solvant mobile et d'une matière de garnissage ( 27) par l'opération qui consiste à préparer une bouillie à partir d'un solvant mobile et d'une matière de garnissage composée de particules ayant un dia- mètre dans la plage de 3 pm à 100 pm. 3 Procédé pour garnir une colonne étroite au moyen d'unebouillie, prévu spécialement pour la chromato- graphie en phase liquide, selon la revendication 1, carac- térisé en ce qu'on accomplit l'opération consistant à pré- parer une bouillie ( 18) à partir d'un solvant mobile et d'une matière de garnissage ( 27) par l'opération consis- tant à préparer une bouillie à partir d'un solvant mobile et d'une matière de garnissage composée de particules ayant un diamètre dans la plage de 3 pm à 10 pmo. 4 Procédé pour garnir une colonne étroite au moyen d'une bouillie, selon l'une quelconque des revendi- cations 2 ou 3, caractérisé en ce qu'on accomplit l'opéra- tion consistant à appliquer une pression initiale et à maintenir cette pression initiale pendant une durée ini- tiale, par l'opération qui consiste à appliquer une pres- sion initiale choisie dans le tableau ci-dessous, et à maintenir cette pression initiale pendant une durée ini- tiale de moins de 10 minutes: Longueur de la Diamètre intérieur Pression colonne (cm) de la colonne (mm) initiale (M Pa) 0,5 5 0,3 15 0,2 30 50 0,1 40 0,5 20 0,3 30 0,2 40 0,1 50 5 Procédé pour garnir une colonne étroite au moyen d'une bouillie, selon la revendication 4, caractéri- sé en ce qu'on accomplit l'opération consistant à mainte- nir la pression maximale par l'opération qui consiste à maintenir cette pression maximale pendant une durée de plus de dix minutes. 6 Procédé pour garnir une colonne étroite au moyen d'une bouillie, selon la revendication 4, caractéri- sé en ce que, après l'opération de préparation d'une bouillie ( 18) et avant l'opération-consistant à fairesleé- couler la bouillie dans la colonne ( 10),sous pression, on ajoute l'opération qui consiste à agiter la bouillie O 7 Procédé pour garnir une colonne étroite au moyen d'une bouillie, selon la revendication 6, caractéri- sé en ce qu'on accomplit l'opération d'agitation de la bouillie ( 18) par l'opération qui consiste à agiter la bouillie par ultrasons. 8 Procédé pour garnir une colonne étroite au moyen d'une bouillie, selon la revendication 1, caractéri- sé en ce qu'on accomplit l'opération consistant à boucher l'extrémité de sortie ( 25) de la colonne ( 10) par l'opéra- tion qui consiste à boucher l'extrémité de sortie de la colonne avec un tube étroit ( 30) qui permet l'écoulement du solvant mobile mais qui empêche le passage de la matiè- re de garnissage ( 27). 9 Procédé pour garnir une colonne étroite au moyen d'une bouillie, selon la revendication 1, caractéri- sé en ce qu'on accomplit l'opération consistant à boucher l'extrémité de sortie ( 25) de la colonne ( 10) par l'opéra- tion qui consiste à boucher l'extrémité de sortie de la colonne avec un fil ( 28), de façon à former un passage an- nulaire entre le fil et la colonne, pour permettre l'écou- lement du solvant mobile et pour empocher le passage de la matière de garnissage ( 27). Procédé pour garnir une-colonne étroite au moyen d'une bouillie, selon la revendication 1, caractéri- sé en ce qu'on accomplit-l'opération consistant à boucher l'extrémité de sortie ( 25) de la colonne ( 10) par les -opé- rations suivantes: on applique un manchon ( 33) sur l'ex- trémité ( 25) de la colonne; et on introduit dans ce man- chon un bouchon ( 31) percé d'un passage étroit, qui est abouté à l'extrémité ( 25) de la colonne ( 10). 11 Procédé pour garnir une colonne étroite au moyen d'une bouillie, selon la revendication 1, caractéri- sé en ce qu'on accomplit l'opération consistant à boucher l'extrémité de sortie ( 25) de la colonne ( 10) par les opé- rations suivantes: on applique un manchon ( 33) sur l'ex- trémité ( 25) de la colonne ( 10); on introduit dans ce manchon une colonne de prolongement ( 37) qui est aboutée à l'extrémité ( 25) de la colonne; et on introduit une ai- guille ( 39) dans l'extrémité de la colonne de prolongement 25342-i 2 ( 37). 12, Procédé pour garnir une colonne étroite au moyen d'une bouillie, selon l'une quelconque des revendica- tions 8 à 11, caractérisé en ce que, avant l'opération con- sistant à faire circuler la bouillie ( 18) sous pression dans la colonne ( 10), et après l'opération consistant à boucher l'extrémité ( 25) de la colonne, on accomplit l'opé- ration qui consiste à placer à l'extrémité ( 25) de la co- lonne adjacente à la restriction d'extrémité un amas de particules ( 35) de diamètre supérieur à celui des particu- les constitutives de la matière de garnissage ( 27), pour former ainsi une couche d'arrgt pour la matière de garnis- sage. 13 Procédé pour garnir une colonne étroite au moyen d'une bouillie, selon la revendication 1, caractéri- sé en ce qu'on accomplit l'opération consistant à choisir une colonne flexible ( 10) par l'opération qui consiste à choisir une colonne flexible parmi les matières suivantes: silice fondue, acier inoxydable ou acier inoxydable revêtu de verre. 14 Procédé pour garnir une colonne étroite au moyen d'une bouillie, selon la revendication 13, caracté- risé en ce qu'on accomplit l'opération consistant à choisir une colonne flexible ( 10) en choisissant une colonne fle- xible en silice fondue ayant une longueur supérieure à cm. Procédé pour garnir une colonne étroite au moyen d'une bouillie, selon la revendication 4, caractéri- sé en ce que, après l'opération consistant à maintenir la pression maximale pendant une seconde durée, on ajoute l'opération qui consiste à réduire progressivement la pression de la bouillie ( 18) dans la colonne. 16 Colonne étroite garnie caractérisée en ce qu'elle est fabriquée conformément à l'un quelconque des procédés des revendications 1 à 15. 17 Colonne étroite garnie, caractérisée en ce qu'elle est fabriquée par le procédé suivant: on choisit une colonne flexible ( 10) ayant un diamètre intérieur in- férieur à 500 ymÀ on bouche l'extrémité de sortie ( 25) de la-colonne avec une restriction d'extrémité ( 28, 30, 31, 36, 39) qui permet l'écoulement d'un solvant mobile mais qui empêche -le passage de la matière de garnissage ( 27) on prépare une bouillie ( 18) à partir d'un solvant mobile et d'une matière de garnissage ( 27); et on fait circuler la bouillie dans la colonne ( 10)-, sous pression, de la ma- nière suivante: on applique une pression initiale et on maintient cette pression initiale pendant une durée ini- tiale; on élève la pression de la pression initiale jusqu'à une pression maximale; et on maintient la pres- sion maximale pendant une seconde durée.