FR 2531857 A1 19840224 FR 8312439 A 19830727 "Compositioh injectable pour prolonger la stabilité et la rétention de particules enrobées, injectées dans le flux sanguin d'animaux et d'êtres humains" L'invention concerne un procédé pour prolonger la stabilité et la rétention de matières dans le flux sanguin d'animaux et d'êtres humains. L'alimentation en sang naturel entierrest déficiente et ce déficitaugmentera probablement De nouvelles mé- thodes pour prolonger la conservation du sang à l'état congelé, et des perfectionnements dans le stockage du sang à l'état liquide, ont eu pour résultat une plus grande efficacité de l'utilisation du sang disponible dans certains domaines, mais les besoins de sang à l'échelle mondiale pour des transfusions excède de loin la collecte Comme il est peu probable qu'il se produise une augmentation appréciable de cette collecte, ces be- soins devront être satisfaits au moyen de substances au- tres que le sang naturel ou ses dérivés Un sang artifi- ciel, disponible en quantités illimitées et exempt d'agents infectieux et d'antigènes serait un agent théra- peutique extrêmement utile. Les émulsions de composés perfluorés semblent main- tenant être très utilisables avec succès comme sang arti- ficiel Les sangs artificiels à base d'émulsions de pro- duits chimiques perfluorés sont exempts d'agents infec- tieux et d'antigènes (on utilisera indifféremment, dans ce qui suit les termes composé perfluoro, et produit chi- mique perfluoré) On n'a pas besoin de tenir compte du groupe sanguin du récepteur Toutefois, ces sangs artifi- ciels sont dépourvus de facteurs de coagulation, de pla- quettes, d'immunoglobulines et d'anticorps. Les émulsions de produits chimiques perfluorés ont été utilisées avec succès comme substituts des globules rouges du sang dans la perfusion d'organes isolés d'ani- maux et pour la fourniture d'oxygène aux tissus d'animaux intacts Récemment, une émulsion de produits chimiques perfluorés a été utilisée pour-le traitement de patients humains. Bien que les composés perfluorés soient chimiquement inertes, ils peuvent affecter défavorablement les plaquet- tes du sang et les facteurs de coagulation, ce qui aurait pour résultat une thrombocytopénie (c'est-à-dire, une diminution du nombre absolu des plaquettes du sang) et des troubles dans la coagulation du sang On a trouvé que les effets sur les plaquettes sont probablement dûs aux propriétés de surface inhabituelles des composés perfluo- rés, notamment une tension superficielle très faible Cet effet peut être surmonté en revêtant les particules de composé perfluoré avec une substance qui masque son acti- vité superficielle - Parmi les brevets antérieurs concernant les compo- sitions de sang artificiel, on remarquera les suivantes Miller et al brevet U S 4 133 874 est dirigé sur l'hémoglobine soluble à l'eau, encapsulée dans un liquide. Watanabé et al brevet U S NO 3 958 014; Yokoyama et al, 3 962 439; Moore et al 4 105 798; et Yokoyama et al, 4 252 827 concernent des particules de composés perfluorés émulsionnées, transportant de l'oxygène. Dans les sangs artificiels antérieurs, la durée de rétention dans le flux sanguin est limitée Toutes les particules disparaissent virtuellement de la circulation dans les 2 à 4 jours qui suivent la transfusion de parti S cules d'un composé perfluoré émulsionnées De plus, on observe fréquemment de la throm-bocytopénie chez les ani- maux de laboratoire après injection Ce que l'on recher- che est un procédé pour allonger la vie effective de la composition de sang artificiel dans la circulation. Un important problème concernant l'usage clinique d'émulsions de composés perfluorés est'la rétention de ces composés perfluorés dans les tissus, principalement dans le foie et la rate La voie principale d'élimination du composé perfluoré est le passage par les poumons Un accroissement de la durée pendant laquelle la matière reste dans la circulation a pour résultat une augmentation de l'élimination sous la forme de gaz expiré, et par suite une diminution de la rétention dans le foie et la rate. L'invention se propose de permettre le prolongement du taux effectif de sang artificiel dans la circulation jusqu'à quatorze jours ou plus-après l'injection Grâce au maintien d'un taux continu relativement élevé de la substance d'enrobage dans le plasma du sang, l'élimination de l'enrobage des particules de sang artificiel est appa- remment ralenti Un taux élevé, continu, de substance d'en- robage dans le plasma du sang est maintenu par l'injection périodique de substance d'enrobage à la suite'de ltinjec- tion de sang artificiel. L'invention a pour objet un procédé pour prolonger la stabilité in vivo, et la rétention de particules enro- bées insolubles à l'eau dans le flux sanguin des animaux, y compris les êtres humains, comprenant une ou plusieurs injections de la même substance d'enrobage qui revêt les particules insolubles à l'eau. Suivant l'invention, la vie effective d'une émulsion formant le sang artificiel, en particulier une émulsion de composés perfluorés enrobés de lécithine, peut être prolongée dans la circulation sanguine d'animaux chez qui le sang artificiel a été injecté L'augmentation de la rétention des composés perfluorés dans la circulation a aussi pour résultat que la rétention dans le foie et la rate diminue. Conformément à l'invention, les particules enrobées sont introduites dans le flux sanguin d'animaux, y com- pris des êtres humains La durée de l'existence d'un taux effectif de particules dans le flux sanguin est brève, en raison de l'élimination apparenté de l'enrobage et de la mise à nu de la surface des particules dans le flux san- guin Suivant l'invention, le patient qui a préalablement reçu une injection d'une émulsion de particules enrobéest reçoit, une ou plusieurs fois, une injection de la subs- tance d'enrobage c'est-à-dire de la même substance qui forme l'enrobage qui entoure les particules injectées. La plus notable application de l'invention réside dans le prolongement du taux effectif de sang artificiel dans la circulation Les compositions de sang artificiel comprennent des émulsions de produits chimiques perfluo- rés Les produits chimiques perfluorés ont la propriété de transporter de l'oxygène Toutefois, en raison de ce que les plaquettes sont affectées par les produits chimi- ques perfluorés, ces derniers doivent être enrobés Quand on utilise un lipide ou une autre substance d'enrobage pour former l'enrobage des particules de produits chimi- ques perfluorés, on assure la rétention des particules - dans la circulation suivant l'invention, par injection du lipide ou de la substance d'enrobage seuls. Les avantages de l'invention sont démontrés sur des sangs artificiels o la substance d'enrobage agit aussi comme émulsionnant pour les particules de-composé per- fluoré, ce qui dispense de l'emploi d'un émulsionnant séparé Les compositions de sang artificiel peuvent aussi contenir des particules de composés perfluorés émulsion- nées enrobées avec une substance qui est différente de l'émulsionnant La rétention de ces compositions de sang artificiel dans la circulation est obtenue par injection de la substance d'enrobage. L'émulsionnant spécifique utilisé doit être non- toxique, On a utilisé des produits tensio-actifs non- ioniques à haut poids moléculaire, y compris différents polyoxyéthylènes polyoxypropylènes et leurs copolymêres que lion peut se procurer dans le commerce sous la marque de fabrique " PLURONIC" de BASF-Wyandotte Corp On pré- fère généralement les lipides, et plus particulièrement la lécithine des phospholipides du jaune d'oeuf On peut aussi se procurer de la lécithine sous la forme de phos- pholipides du soja, mais en raison de la nécessité de purifier les phospholipides du soja, on préfère le jaune d'oeuf comme source. La lécithine est préférée comme substance d'enro- bage et comme émulsionnant du fait qu'elle n'est pas rejetée par le récepteur de l'injection L'enrobage de lécithine sera assimilé dans la circulation à la membrane d'un érythrocyte naturel La lécithine n'est pas toxique et n'a pas d'effet sur la coagulation du sang. Les compositions de sang artificiel sont contenues dans un milieu physiologiquement acceptable Les milieux physiologiquement acceptables comprennent sans que cela constitue une limitation, des solutions isotoniques telles que la solution de Tyrode, la solution de Ringer, la solution de Ringer lactée, ou la solution de Ringer con- tenant du glucose Certaines compositions peuvent conte- nir supplémentairement un adjuvant d'émulsionnant tel que des traces d'acide gras. Les injections du produit de l'invention peuvent être administrées par une voie d'injection quelconque. Sur de petits animaux de laboratoire tels que les rats, on préférera la voie intrapéritonéale Chez les humains 253 1857 on préférera la voie intramusculaire. La substance d'enrobage que l'on devra injecter pourra être mise en suspension dans un des milieux phy- siologiquement-acceptables ci-dessus La solution de Tyrode est celle que l'on préfère en général L'injection doit contenir une concentration de substance d enrobage propre à assurer le taux voulu pour la rétention de l'émulsion dans la circulation. L'invention est de préférence exécutée après l'in- jection d'une émulsion de sang artificiel contenant des particules de composé perfluoré, enrobées avec une léci- thine adhèrente dans la proportion de 50 à 70 /tlmol/ml de produit chimique perfluoré Une telle émulsion contient environ 15 à 40 % (v/v) de composé perfluoré, ce qui cor- respond à environ 30 à 75 % (w/v), et environ 7 à 9 % (w/v) de lécithine. Ici et dans la suite, "% (w/v)" signifie la quantité de matière mesurée en grammes, contenue dans 100 ml d'émulsion; "% (v/v)" signifie le volume de matière mesu- rée en ml, contenue dans 100 ml d'émulsion. Le présent procédé permettant de prolonger la réten- tion de particules émulsionnées dans le flux sanguin, bien qu'elle soit applicable à une large série d'émulsions, sera démontrée ici, sans que ce soit une limitation, sur une composition de sang artificiel comprenant une émulsion avec la lécithine de perfluorotripropylamine Comme autres composés perfluorés appropriés, on peut citer, à titre d'exemples non limitatifs, les perfluorodécaline, perfluo- rométhyldécaline, et perfluorotributylamine Des émulsions de ce type sont décrites dans la demande co-pendante, série NI 402 451, déposée à la même date que la présente et portant le titre "Emulsion perfluorochimique utilisable comme sang artificiel". Préparation d'une émulsion de lécithine et de perfluoro- tripropylamine: A 7 ml d'une solution de Tyrode froide (p H 7,4) dans une cellule de Rosette, on ajoute 960 mg de lécithine purifiée (dérivée du jaune d'oeuf) On traite le mélange aux ultra-sons sous 110 watts pendant 15 sec On répète ce traitement aux ultra-sons, une fois, après un intervalle de temps de 1 min A cette lécithine dispersée dans la cellule de Rosette à O C, on ajoute 4 ml de perfluoro- tripropylamine, puis traite le mélange aux ultra-sons comme précédemment, pendant huit périodes de 15 sec, avec un intervalle de temps d'une minute après chaque action des ultra-sons On centrifuge d'émulsion blanc laiteux obtenue, à 4 C, pendant 60 minutes, sous 100 x g, pour faire sédimenter toutes les grosses particules Le fond, soit 5 % de l'émulsion, est écarté L'émulsion contient 35 à 40 % (v/v) de composé perfluoré dispersé, et son p H se situe entre 7,35 et 7,40 Les particules per- fluorées émulsionnées ont un diamètre d'environ 0,1 P et contiennent 50 à 70 I"mol de lécithine par ml de composé perfluoré. La teneur en lécithine des particules perfluorées a été mesurée en lavant deux fois Ies particules sédimen- tées à partir d:une partie aliquote de l'émulsion avec la solution de Tyrode, en extrayant deux fois la lécithine avec un mélange de chloroforme et de méthanol, et en déterminant la teneur en phosphore de l'extrait La quantité de lécithine présente, mesurée en micromoles est calculée en divisant la teneur en phosphore en microgram- mes par le facteur 31 (poids atomique du phosphore) Ce calcul donne les micromoles de lécithine car une molécule de lécithine contient un atome de phosphore. L'émulsion de perfluorotripropylamine ci-dessus a été injectée à des rats comme suit. Injection deémulsion de perfluorotripropylamine à des rats: Quatre groupes de rats mâles Sprague-Dawley ( 200 à 250 g), anesthésiés au pentobarbital ( 30 mg/kg), ont reçu 8 à 10 ml d'émulsion par rat, injectés au moyen d'une pompe dans la veine fémorale à raison de 0,2 ml/min. Pendant cette injection, on a retiré un volume approxima- tivement égal de sang Le groupe I (tableau I) a reçu une preparation en émulsion "sans excès de lécithine" qu'on avait fait sédimenter, lavée pour éliminer l'excès de lécithine et remise en suspension dans 8 % d'albumine de sérum bovin dans une solution de Tyrode Les groupes 2 à 4, (tableau I) ont reçu une préparation en émulsion "avec excès de lécithine" contenant environ 0,5 g de lécithine dans la phase aqueuse de l'émulsion. On a prélevé des échantillons à différents inter- valles après l'injection, afin de mesurer l'hématocrite, la concentration en perfluorotripropylamine, et de compter les plaquettes La concentration en perfluorotripropylami- ne dans 1 e sang des rats, quand l'injection a été termi- née était de l'ordre de 19 à 22 % (v/v) Dans le groupe 4 désigné comme "FCrit élevé", ces chiffres étaient de l'ordre de 24 à 28 % (v/v) Par analogie avec le terme hématocrite, le terme "F-Crit" a été utilisé pour dési- gner le pourcentage (v/v) de composé perfluoré émulsionné dans le sang en circulation. Effet de l'injection de lécithine sur la rétention de perfluorotripropylamine émulsionnée avec la lécithine dans la circulation: Les groupes I et 2 ont reçu une injection journa- lière, intrapéritonéale de solution de Tyrode Le groupe 3 a reçu une injection journalière de i g de lécithine dispersée par traitement aux ultra-sons dans la solution de Tyrode Les rats du groupe 4 ont reçu la même chose que ceux du groupe 3, si ce n'est que la concentration initiale en perfluorotripropylamine émulsionnée dans le sang était plus élevée Des échantillons de sang ont été prélevés chaque jour sur chaque rat, immédiatement avant 9-' l'injection de lécithine pour mesurer la proportion de perfluorotripropylamine dans la circulation La présence d'une concentration relativement élevée de lécithine dans le plasma du sang a été déterminée par chromatographie en couche mince Les résultats sont donnés dans le tableau I Tous les chiffres du tableau I s'entendent en moyenne +SEM. Les chiffres entre parenthèses dans le tableau I sous les chiffres du F-Crit pour 48 h et 96 h représentent la pro- portion de chaque valeur de F-Crit respective par rapport à la valeur du F-Crit 10 min après l'injection. Les résultats du tableau 1 montrent que les injec- tions journalières de lécithine ont provoqué une importan- te augmentation de la proportion de perfluorotripropylami- ne émulsionnée retenue dans-la circulation, soit 67 % retenue au bout de 96 heures comparés aux 3 % retenus chez les rats qui n'ont pas reçu d'injection de lécithine. La durée de rétention de perfluorotripropylamine émulsion- née dans la circulation a augmenté de 4 jours pour les rats qui n'ont pas reçu d'injection de lécithine (groupes 1 et 2) à 10 jours pour les rats ayant reçu des injections de lécithine (groupe 3) et à 14 jours pour les rats chez qui il avait été injecté une concentration initiale plus élevée de perfluorotripropylamine (groupe 4 l. Dans les quatre groupes de rats, le nombre des pla- quettes après l'injection de perfluorotripropylamine n'est pas très différent des nombres obtenus avant l'in- jection (voir Tableau 1) Dans les rats témoins qui n'avaient pas reçu d'injection de perfluoropropylamine mais qui avaient reçu des injections journalières de lécithine, il n'y avait pas de changements nets du nombre de plaquettes Tous les rats, y compris les quatre groupes expérimentaux et les témoins sont restés en bonne santé et se sont montrés normalement actifs Le plasma de tous les rats recevant des injections journalières de lécithine était opalescent, et se montrait chromatographiquement positif en ce qui concerne la lécithine pendant vingt quatre heures après l'injection de lécithine. Ainsi, on peut augmenter largement la rétention dans la circulation d'un composé perfluoré émulsionné, enrobé de lécithine, en maintenant une concentration en lécithine élevée dans le plasma Ces résultats conduisent à conclure que les particules enrobées de lécithine du composé perfluoré sont phagocytées après qu'une grande partie ou la totalité de leur lécithine a été éliminée. En l'absence d'injections journalières de lécithine, l Vélimination complète du composé perfluoré de la circu- lation s'effectue en 3 à 4 jours Chez ces rats, la demi- vie du composé perfluoré dans les tissus est beaucoup plus longue que chez les rats qui ont subi des injections de lécithine Il a été relaté que la demi-vie de la per- fluorotripropylamine émulsionnée dans les tissus du rat est de 60 jours Le prolongement de la rétention du com- posé perfluoré en émulsion dans la circulation a pour résultat une augmentation de l'élimination du composé perfluoré dans le gaz expiré par les poumons La rétention dans les tissus, notamment le foie et la rate, est par suite réduite Ceux des rats qui ont reçu des injections journalières de lécithine ont fait apparaître une demi- vie de la perfluorotripropylamine dans les tissus de 10 jours, que l Ton doit comparer aux 60 jours constatés en l'absence du régime d'injections de lécithine. w o P% UT N CD 1-' UT o Ut Tableau I: Effet de l'injection de lécithine sur la rétention de perfluorotripropylamine émulsionnée avec de la lécithine dans la circulation des rats. Préparation Nombre de rats F-Crit Durée écoulée après injection min 48 h 96 h jours à partir de l'in- jection jusqu'à F-rri t=n F-CrftO avant in Nombre de plaquettes jection x 10-3 ul-1 après injection min 48 h 96 h Groupe 1: sans excès de lécithine 8 20 + 0,5 ( 100 %) + 0,9 ( 25 %) ( O %) 3 730 + 40 690 + 60 630 + 70 720 + 50 Groupe 2: excès de léci. thine Groupe 3: injection 1 g léci- thine par jour 18 21 + 0,4 ( 100 %) 18 21 + 0,3 ( 100 %) 12 + 0,4 ( 57 %) 18 + 0,5 ( 86 %) 3 + 0,4 ( 14 %) 14 + 0,4 ( 67 %) 690 + 20 650 + 20 680 + 20 680 + 20 720 + 30 610 + 20 610 + 20 650 + 20 Groupe 4: F-Crit élevé, injec- tion 1 g de lécithine par jour. 6 26 + 0,5 ( 100 %) j-. 21 + 0,3 ( 81 %) 19 + 1,0 ( 73 %) 680 + 20 640 + 30 600 + 30 640 + 20 o tn % 4 25318 5 7 *Les chiffres montrent que l'invention contribue à la sécurité et à l'efficacité du sang artificiel Le pro- longement de la rétention du composé perfluoré dans la circulation augmente la durée de transport et d'alimenta- tion en oxygène des tissus La diminution de la rétention du composé perfluoré dans les tissus du corps réduit les risques d'une action carcinogène ou autre action toxique chronique sur ces tissus. Le présent procédé de prolongement de la rétention de particules émulsionnées dans la circulation, en main- tenant, dans le plasma, un taux élevé de la substance qui enrobe les particules, est considéré comme étant applica- ble à toute émulsion d'un composé perfluoré quelconque. Par exemple, la rétention des sangs artificiels ou des particules assurant un transfert d'oxygène, émulsionnés avec différents tensio- actifs, tels que les tensio-actifs "PLURONIC" peut être prolongée par des injections du tensio-actif-d'enrobage particulier utilisé sur les parti- cules De plus, le présent procédé est considéré comme ayant une plus large application pour prolonger la réten- tion dans la circulation'd'autres systèmes d'émulsions et comme n'étant pas limité étroitement aux compositions de sang artificiel. L'invention peut être réalisée sous d'autres formes spécifiques sans sortir de son esprit ou de ses attributs essentiels et l'on se référera, à ce sujet, aux revendi- -cations annexées plutôt qu'à la spécification qui précède comme indiquant le champ d'action de l'invention. REVENDICATIONS l -) Composition injectable pour prolonger la stabilité et la rétention de particules enrobées, injectées dans le flux sanguin d'animaux et d'êtres humains, caractérisée en ce qu'elle contient un excès de la substance qui enrobe les particules. ) Composition suivant la reven- dication 1, caractérisée en ce que l'excès de substance d'enrobage est mis en suspension dans un milieu physio- logiquement acceptable. ) Composition suivant la reven- dication 2, caractérisée en ce que le milieu physiolo- giquement acceptable est une solution isotonique. 4 ) Composition suivant l'une quelconque des revendications 2 et 3, caractérisée en ce que le milieu physiologiquement acceptable est choisi parmi les solution de Tyrode, solution de Ringer, solution de Ringer lactée et solution de Ringer contenant du glucose. 50) Composition suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que les particules injectées sont présentes dans une émulsion contenant un émulsionnant qui est une substance différente de celle qui enrobe les particules enrobées. ) Composition suivant l'une quel- conque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les particules injectées contiennent du sang artificiel. ) Composition suivant la revendi- cation 6, caractérisée en ce que le sang artificiel est une émulsion comprenant un compose perfluoré transpor- tant de l'oxygène, un émultionnant qui enrobe le com- posé perfluoré et un milieu physiologiquement acceptable. ) Composition suivant la reven- dication 7, caractérisé en ce que le sang artificiel contient aussi un adjuvant émulsionnant les acides gras- 9 ) Composition suivant l'une quelconque des revendications 7 et 8, caractérisée en ce que le composé perfluoré est choisi parmi les perfluorod 6 caline, perfluorom 6thyl décaline, perfluorotripropylamine et perfluorotributylamineo ) Composition suivant l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que l'émul- sionnant est choisi parmi les lipides et les agents tensio-actifs non-ioniques à haut poids moléculaire. 11 ) Composit'ion suivant la revendication , caractérisée en ce que l'émulsionnant est un copo- lymère de polyoxyéthylène-polyoxypropylène 12 ) Composition suivant la revendica- tion 10, caractérisée en ce que l'émulsionnant est un phospholipide. 13 ) Composition suivant la revendication , caractérisée en ce que l'émulsionnant est la lécithine. 14 ) Composition suivant l'une quelconque des revendications 7 à 13, caractérisée en ce que le composé perfluoré est présent dans l'émulsion injectée dans une proportion pouvant atteindre 75 % en poids. ) Composition suivant l'une quelconque des revendications 7 à 14, caractérisée en ce que l'6 mul- sionnant est présent dans l'émulsion injectée dans une proportion de l'ordre de 7 à 9 % en poids.