FR 2529572 A1 19840106 FR 8310867 A 19830630 La présente invention concerne des procédés enzy- matiques pour transformer le glucose (dextrose) en fructose (ldvu- lose). La majeure partie du glucose de qualité alimen- taire est fournie sous forme d'hydrolysat enzymatique de l'amidon de mars, c'est-a-dire du sirop (liqueur de trempage) de mats du commerce Le glucose est généralement noté comme ayant un caractère sucré de 60 à 80 % de celui du saccharose et se vend donc à un prix plus faible correspondant On sait depuis longtemps isomériser le glucose en fructose (qui est même plus sucré que le saccharose) en utilisant une enzyme douée d'activité de glucoseisomérase, de pré- férence une enzyme qui a été immobilisée sur un support inerte tel que diéthylaminoéthylcellulose, verre poreux ou chitine On pourra trouver des descriptions détaillées de la conversion enzymatique du glucose en fructose utilisant la glucoseisomérase dans Hamilton et coll "Glucose Isomerase: Case Study of Enzyme-Catalysed Process Technology", Immobilized Enzymes in Food and Microbial Processes, Olson et coll, Plenum Presse, New York ( 1974), pages 94-106, 112, -137; Antrim et coll, "Glucose Isomerase Production of Hight- Pructose Syrups", Applied Biochemistry and Bioengineering, Vol 2 Academic Press ( 1979); Chen et coll, "Glucose Isomerase (a Review)", Process Biochem ( 1980), pages 30-35; Chen et coll "Glucose Isomerase (a Review)", Process Biochem, ( 1980), pages 36-41; et Takasaki, "Fructose Production by Glucose Isomerase", Chem Abstracts, Vol 81, ( 1974), Abs N 76474 a Il existe en outre de nombreux brevets concernant l'isomérisation du glucose; on citera a titre d'exemples les brevets des Etats-Unis d'Amérique n 3 616 221; Reissue 28 885 (initialement 3 623 953); 3 694 314; 3 708 397; 3 715 276; 3-788 945; 3 826 714; 3 843 442; 3 909 354; 3 960 663; 4 144 127 et 4 308 349. La teneur en fructose que l'on peut obtenir par l'isomérisation du glucose avec la glucoisomêrase est limitée par l'équilibre de la réaction d'isomérisation A 65 C, l'équilibre de réaction s'établit à environ 51 % en poids de fructose à partir d'un substrat de depart de dextrose pur Lorsqu'on utilise une liqueur de glucose raffinée comme substrat (contenant jusqu'à environ 6 % en poids de sucres qui ne sont pas des monosaccharides) et en tenant compte d'une durée de séjour raisonnable dans le réacteur enzymatique, la teneur en fructose la plus élevée que l'on peut obtenir (exprimée en poids de matière sèche) avec les techniques antérieures mentionnées est celle d'un sirop à 48-520 C Pour obtenir des sirops à teneur plus élevée en fructose, on doit utiliser des systèmes de fractionnement qui augmentent fortement le prix de revient du produit final A des températures supérieures, cependant, l'équilibre devient plus favorable Par exemple, un procédé enzy- matique à la glucoseisomérase pouvant fonctionner à des tempe- ratures d'environ 90-1400 C a pu être utilisé pour donner directement des sirops de mats à teneur élevée en fructose (HFCS) contenant 53-605 % en poids de fructose, en matière sèche, ce qui élimine la nécessité d'un fractionnement et d'un recyclage La tendance des systèmes connus à la glucoseisomérase a subir une dénaturation thermique s'accompagnantd'uoe forte réduction d'activité a donc fait échouer jusqu'à présent les tentatives d'utiliser des régimes à température plus élevée pour déplacer davantage l'équilibre de l'isomérisation en faveur du fructose. De plus, le fructose est un sucre extrêmement labile qui est facilement dégradé en un certain nombre de sous- produits indésirables lorsque l'on chauffe es solutions aux tempé- ratures élevées nécessaires pour la conversion du glucose en fructose à 53-60 % Les sous-produits les plus courants formes lorsque l'on chauffe fortement des solutions de fructose sont le psicose, le mannose, le tagatose, les dianhydrides de fructose des acides organiques, des produits colorés et des précurseurs de produits colorés. La demanderesse a maintenant découvert de façon surprenante qu'en mettant en oeuvre une technique d'isomérisation du glucose dans certaines limites essentielles de p H et de temps de séjour dans un réacteur enzymatique, telles que définies ci-après, on peut utiliser effectivement des températures d'isomérisation d'environ 90 à environ 140 'C pour donner directement des sirops HFCS de qualité élevée avec une formation de sousproduits acceptable, contenant d'environ 50 à environ 607 en poids de fructose, éliminant ainsi la nécessité d'opérations conteuses et complexess de fraction- nement et de recyclage qui sont nécessaires avec les procédés connus d'isomérisation du glucose pour obtenir la gamme ci-dessus de teneurs en fructose. Selon l'invention, le glucose est isomérisé en sirop de fructose-glucose par le procédé qui consiste à mettre en contact une liqueur contenant du glucose avec la glucoseisomérase chimiquement stabilisée à une température d'environ 90 C à environ C et à un p Hi d'environ 3 à environ 8 pendant une durée de contact suffisante pour obtenir une teneur finale dans ladite liqueur d'au moins environ 53 à environ 60 % en poids de fructose, par rapport à la teneur totale en hydrates de carbone dans ladite liqueur, sans formation notable de psicose et/ou d'autres sucres n'appartenant pas aux séries du fructose et du glucose. Le procédé précédent ne dépend pas de l'utilisation d'une glucoseisoméraseparticulière mais peut être mis en oeuvre avec une glucoseisomérase suffisamment stable pour résister à l'inacti- vation à 90 C et plus pendant une durée permettant un degré suf- fisant d'isomérisation, comme il sera défini ci-après Le cadre de la présente invention comprend cependant l'utilisation d'une glucoseisomèrase particulièrement remarquée pour sa stabilité thermique, par exemple la glucoseisomérase produite par Bacillus stearothermophiluscomr me décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 826 714 et la glucoseisomérase produite par des micro-organismes du genre Ampullariellacomme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4 308 349 En outre, on peut obtenir une glucoseisomérase thermiquement stable en utilisant Bacillus iicheniformiscomme décrit dans la demande de brevet européen n 41 213, ainsi que des thermophiles des genres Thermoactinomyces, Thermopolyspora, Thermomonospora et Pseudomonocardia, comme décrit dans la publication de brevet japonais 74/30588 (C A 81; 76474 a). Chacune de ces références est incorporée ici comme référence. Le glucose qui est isomérisé en fructose selon l'invention peut dériver de n'importe quelles sources connues de ce sucre Pour des raisons d'économie, le glucose dérive ordinaire- ment de l'hydrolyse de la cellulose ou de l'amidon utilisant un acide et/ou une enzyme, de préférence cette dernière, selon des techniques connues Les liqueurs contenant du glucose obtenues de cette manière contiennent de manière caractéristique de faibles quantités de poly- saccharides, de sucres oligomères, etc, selon la source d'hydrate de carbone utilisée et la méthode d'hydrolyse employée Des graines de céréales, telles que mais, milo, blé, seigle, et analogues et des racines et tubercules amylacés tels que pommes de terre, ignare, carottes, cassave (manioc) et analogues sont d'excellentes sources d'amidon pour la conversion en glucose de départ de l'invention. Aux Etats-Unis d'Amérique, l'amidon de maîs est spécialement préféré en raison de son prix relativement faible et de sa facilité d'obten- tion Comme la production de glucose de qualité alimentaire favorise l'utilisation de techniques d'hydrolyse enzymatique de l'amidon, ces techniques sont préférées dans l'invention Des méthodes d'hydro- lyse enzymatique sont décrites dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique N O 4 017 363, 3 912 590, 3 922 196, 3 922 197-201 et 4 284 722, dont les descriptions sont incorporées à titre de référence dans la présente description. Comme le fructose formé selon l'invention est dérivé du glucose, il est avantageux de maximaliser la teneur en glucose d'un hydrolysat d'amidon utilisé pour l'isomérisation On préfère les procédés enzymatiques pour la production de glucose. On préfère en particulier les procédés qui utilisent une combinaison d'enzymes telles que la glucoamylase et une enzyme de suppression des ramifications ("debranching") comme décrit dans la demande de brevet britannique no 2 097 405 A On préfère spécialement des combi- naisons d'enzymes capables de convertir simultanément l'amidon liquéfié en glucose + fructose, comme par une exemple une combi- naison de glucoamylase, de pullulanase et de glucoseisomérase, comme décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique no 4 111 750. Ce dernier procédé est capable de fournir des hydrolysats isomérisés contenant 48 % de fructose et 50 % de glucose, en matière sèche, qui sont remarquablement appropriés pour la conversion ultérieure en fructose à 5360 % selon l'invention Il est également possible d'utiliser des procédés à membrane pour éliminer les polysaccharides des hydrolysats d'amidon en donnant des fractions contenant du glucose à plus de 99 % qui sont des matières premières idéales pour le procédé de l'invention Bien entendu, les solutions de glucose dérivées par cristallisation d'hydrolysats d'amidon font partie des matières premières appropriées pour la pratique de l'invention. Les solutions de glucose et/ou glucose/fructose utilisées comme matières premières sont raffinées de préférence dans un stade de la préparation pour éviter tout effet nuisible d'impuretés autres que les hydrates de carbone sur la glucoseiso- mérase et pour la formation minimale de couleur pendant l'isoméri- sation à haute température selon l'invention Les hydrolysats d'amidon non raffinés peuvent convenir, cependant, à condition que l'on suive les principes de leur préparation indiqués dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N O 4 376 824. Si on le désire, au lieu d'utiliser une solution contenant seulement du glucose comme substrat pour le procédé de l'invention, il est également possible d'utiliser une solution de glucose dans laquelle une partie du glucose est déjà isomêrisee en fructose Par exemple, on peut traiter selon le procédé de l'inven- tion une solution de glucose isomérisée contenant jusqu'à 52 % de fructose pour augmenter la concentration de fructose jusqu'aux teneurs plus souhaitées de plus de 52 %/ et de préférence de 55-56 % et plus. On peut préparer par des techniques connues des solutions de glucose contenant du fructose en quantité de moins de % en poids des hydrates de carbone. Comme auxiliaires empêchant une coloration excessive pendant l'isomérisation à haute température, on peut ajouter des substances formant du bisulfite à la solution d'alimen- tation glucose/fructose selon les indications du brevet des Etats- Unis d'Amérique no 3 623 953 (Reissue 28 885) On préfère maintenir à l'abri de l'oxygène-toutes les solutions qui peuvent venir en contact avec la glucoseisomêrase pendant la réaction d'isomérisation à haute température, pour réduire au minimum toute oxydation de l'enzyme qui peut conduire à l'inactivation. La glucoseisomdrase utilisée dans l'invention peut être isolée à partir de n'importe lequel des micro-organismes connus producteurs de glucoseisomdrase, tels que Streptomyces flavovirens, Streptomyces achromogenes, Streptomyces echinatus, Streptomyces albus, Streptomnyces wedmorensis, Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces bobiliae, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces venezuelae, Aerobacter aerogens, Aerobacter cloacae, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacillus fructosus, Acetobacter oxydans, Acetobacter suboxydan, Acetobacter roseus, Acetobacter melanogenus, Lactobacillus fermenti, Lactobacillus brevis, Lactobacillus gavonii, Lactobacillus lycopersici, Lactobacillus mannitopoeus, Lactobacillus pentoaceticus, Pseudomonas hydrophilia, Brevibacterium pentaaminoacidicum, Escherichia intermedia, Leuconostoc mesenteroides et Paracolobactrum aerogenoides Une excellente source de glucoseisomérase à utiliser dans le procédé de l'invention est Streptomyces sp ATCC 21 175 Comme indiqué précédemment, il peut être avantageux d'utiliser une glucoseisomé- rase stable aux températures d'isomérisation relativement élevées utilisées dans l'invention, par exemple la glucoseisomérase produite par Bacillus stearothermophilus, en particulier les souches choisies parmi Bacillus steraothermophilus ATCC 21 365, NRLL B-3680, NRRL B-3681 et NRLL B-3682 comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 826 714; la glucoseisomérase produite par un micro-organisme du genre Ampullariella, tel qu'Ampullariella digitata, Ampullariella lobata, Ampullariella campanulata et Ampullariella regularis (brevet des EtatsUnis d'Amérique n 4 308 349); la glucoseisomérase (produite par Bacillus licheniformis (demande de brevet européen 41213); et la glucoseisomérase produite par les thermophiles des genres décrits dans la publication de brevet japonais 74/30588. Outre les micro-organismes ci-dessus mentionnés, l'invention concerne l'utilisation de leurs mutants et variants ainsi que les micro-organismes transformes génétiquement qui en dérivent par introduction dans les microorganismes de gènes à mutation glucoseisomérase, y compris les microorganismes mésophiles' et thermophiles Les gènes à mutation glucoseisomérase choisis pour cette utilisation sont ceux qui donnent une glucoseisomérase qui est stable à températures élevées, spécialement audessus de 90 C et de préférence jusqu'à environ 140 C Ces gènes peuvent être préparés par les techniques habituelles utilisées pour la mutation de micro- organismes comme les techniques d'irradiation ou aux mutagènes chimiques On peut également produire la mutation in vitro de gènes de glucoseisomérase isolés qui produisent une glucoseisomérase de stabi- lité thermique moyenne, comme celle produite, par exemple, par certaines souches de Streptomiyces Le choix des gènes mutés appro- priés s'effectue par réintroduction du gène muté soit dans l'orga- nisme père, soit dans un autre organisme, suivie de croissance et reproduction de l'organisme et détermination de la stabilité thermique de la glucoseisomérase résultante. On considère également que l'on peut utiliser des techniques à 1 'DN recombinant pour donner une-glucoseisomérase de stabilité thermique améliorée convenant pour la stabilisation chimique et l'utilisation dans l'invention Argos et coll (Bioche- mistry 18 ( 25) 5698-5703 ( 1979) indiquent que l'on trouve dans les enzymes correspondantes d'organismes thermophiles certains remplace- ments de restes alanyles par des restes glycyles, séryles, valyles et lysyles Perutz (Science 201, 1187-91 ( 1978)" indique que les enzymes de bactéries thermophiles doivent leur stabilité supérieure pour la plupart à des ponts salins supplémentaires à la surface de la protéine. Zuber (dans "Biochemistry of Thermophily", Friedman, S M, ed, pages 267285, Academic Press, New York 1978) donne des renseignements supplémentaires sur la structure d'enzymes thermostables Ainsi donc, si l'on connaît l'enchaînement d'aminoacides et la structure tridi- mensionnelle (tertiaire) d'une glucoseisomérase, il est possible d'obtenir une stabilité améliorée au moyen de mutations spécifiques du site dans le gène d'isomérase pour donner des enzymes conçues et fabriquées de manière à contenir des quantités accrues des aminoacides qui donnent des structures plus stables Après avoir déterminr l'enchaînement d'ADN de la glucoseisomérase, on peut utiliser un agent de synthèse des gènes pour produire de nouveaux enchaînements, augmentant ainsi la thermostabilité de la glucose- isomérase produite par ces gènes fabriqués par l'homme On considère que ces enzymes fabriquées seraient spécialement intéressantes pour la mise en oeuvre de l'invention. Comme la glucoseisomérase est produite de manière caractéristique par voie intracellulaire par ces micro-organismes et par d'autres, une source de glucoseisomérase peut être produite en récoltant simplement les cellules L'enzyme peut être séparée des cellules par des techniques connues de l'homme de l'art, par exemple par broyage par ultrasons et utilisée dans un réacteur enzymatique de conception connue et classique De préference, la glucoseisomérase utilisée dans l'invention, indépendamment de sa source, est immobilisée sur un support inerte selon des techniques classiques Des matériaux et modes opératoires utilisés pour l'immobilisation d'enzymes sont bien-connus et décrits dans un certain nombre de publications, par exemple: Wang et coll, Fermentation & Enzyme Technology, John Wiley & Sons, Inc, New York ( 1979), pages 318- 338 et Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3 e édition, John Wiley a Sons, Inc, New York ( 1980) volume 9, pages 148-172, dont les descriptions sont incorporées ici à titre de référence La présence de faibles quantités de cations cobalt, manganèse et magnésium et/ou d'un sel hydrosoluble de l'acide sulfureux, tel que sulfite de sodium, bisulfite de sodium, sulfite de magnésium et/ou bisulfite de magnésium, telle qu'elle est préco- nisée dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N O 28 885 pour réduire ou inhiber la dénaturation de la glucoseisomérase pendant la mise en oeuvre du procédé, est également considérée dans l'invention. Il est souhaitable que la concentration d'hydrates de carbone dans la liqueur d'alimentation contenant du glucose soit comprise dans l'intervalle d'environ 20 à 85 % en poids, et de préfé- rence d'environ 40 à 65 % en poids, pour obtenir les résultats désirés. Il est également nécessaire que l'isemérisation soit effectuée à un p H d'environ 3 à 8, de preférence d'environ 4 à 7, et plus spécialement de 5 à 6,5 La mise en oeuvre de l'isomérisation à un pli notablement inférieur ou supérieur à la gamme indiquée ci- dessus conduit à la formation de trop fortes quantités de sous- produits indésirables, tels que psicose, acides organiques, produits colorés, précurseurs de produits colorés, dianhydrides de fructose et analogues. La demanderesse a découvert que le p H pour l'activité optimale de la glucoseisomérase diminue nettement aux températures élevées Donc, pour la glucoseisomérase de Streptomyces rubigenosus on obtient l'activité optimale à p H 8,6-9,2 à 250 C, à p H 6,9-7,5 à 750 C et à p H 5,6-6,2 à 1250 C Donc, lorsque l'on augmente la température d'isomérisation, le p H d'isomérisation peut être diminué pour maintenir l'activité enzymatique maximale et, en outre, pour éviter une formation excessive de sous-produits. Pour le procédé de l'invention, la durée de contact est de préférence limitée à la durée nécessaire pour obtenir une concentration finale d'au moins environ 53 à environ 60 % en poids de fructose, par rapport aux hydrates de carbone totaux présents dans le mélange de réaction Comme la liqueur d'alimentation conte- nant du glucose peut consister essentiellement en glucose seul, c'est-àdire contenir peu ou pas de fructose, ou bien peut consister en glucose avec des quantités de fructose allant jusqu'à environ 52 o,- les durées de réaction varieront avec la nature de la liqueur d'ali- mentation Donc, une durée de contact de pas plus d'une seconde jusqu'à plusieurs heures peut se révéler efficace, la durée ordi- nairement préférée étant d'environ 2 à environ 30 min. La durée de contact préférée entre la glucoseiso- mérase chimiquement stabilisée et la liqueur contenant le glucose dépend dans une grande mesure du p H auquel est effectuée la réaction d'isomérisation A l'extrémité inférieure de la gamme de p H, une durée de contact plus longue peut être tolérée sans provoquer une dégra- dation excessive du glucose par formation de psicose et d'autres produits de dégradation indésirables A l'extrémité supérieure de la gamme de p H, une durée de contact plus courte est nécessaire pour éviter la formation de psicose et de produits colorés Dans la pra- tique, la durée zotale pendant laquelle le sirop contenant le glucose est à la température finale de réaction ou à une température voisine est calculée comme durée de contact efficace puisque les réactions de dégradation du sucre qui ont lieu ne sont pas enzyma- tiques et se produisent, que la liqueur soit ou non en contact avec la glucoseisomérase Par conséquent, dans la mise en oeuvre d'iso- mérisations au-dessus de 90 C O il est important de réduire au minimum la durée nécessaire pour amener la liqueur de glucose à la tempéra- ture d'isomérisation désirée (par exemple en mélangeant la liqueur avec de la vapeur juste avant ou pendant le contact avec l'isomérase) et, une fois que la teneur en fructose désirée a été atteinte, de séparer ensuite rapidement la liqueur de l'isomerase active et de refroidir ensuite la liqueur aussi rapidement que possible au-dessous de 90 'C et, de préférence à moins de 70 'C Si l'on utilise une forme soluble de glucoseisomérase chimiquement stabilisée, il sera nêces- saire d'inactiver celle-ci (par exemple par réduction du p H dans une gamme de valeurs inactivant l'isomérase) avant l'étape de refroi- dissement pour éviter une éventuelle reconversion en glucose du fructose formé pendant l'étape d'isomérisation à température élevée, puisque la réaction d'isomérisation est bien entendu réversible. Le degré de conversion maximal du glucose en fructose que l'on peut obtenir est commandé par l'équilibre thermo- dynamique entre le glucose et le fructose, qui dépend à son tour de la température à laquelle est effectuée l'isomérisation Une analyse très soigneuse des mélanges à l'équilibre de glucose et de fructose a établi la relation suivante: F = 100 K/(K+ 1) ( 1) ln K = 5 + 2,3005 ( 2) T+ 273 o F est le pourcentage de fructose à l'équilibre, par rapport au poids total de glucose et de fructose, T est la température ( O C) à laquelle est effectuée l'isomérisation et K est la constante d'équilibre glucose/fructose. La durée de contact réelle entre le sirop contenant le glucose et I'isomérase dans un réacteur peut généralement être calculée au moyen de la formule suivante lorsque l'on utilise un réacteur contenant une forme immobilisée d'isomérase. CV in le O o t= k Al ( 3) t est la durée de contact réelle C est la concentration de glucose et fructose V est le volume libre de liquide dans le lit de garnissage (volume du lit diminué du volume occupé par les particules d'enzyme im- mobilisée) Fe est la fraction de fructose dans le mélange glucose/fructose à l'équilibre quand il se trouve à la tempeérature d'isomérisation F est la fraction de fructose (par rapport à G + F) à l'entrée dans o le lit de garnissage F est la fraction de fructose (par rapport à G + F) dans la solution sortant du lit de garnissage k est la constante de vitesse de réaction pour l'isomérisation dans les conditions d'isomérisation et A est l'activité de l'isomérase dans le lit de garnissage. Les valeurs de k pour l'isomérase immobilisée préparée selon les exemples suivants varient d'environ 0,07 à environ 5 g h 1 IGIU 1 à des températures de 90 à 140 C, respectivement Cette relation montre la nécessité de réduire au minimum la durée de contact à température élevée par l'utilisation de litsde garnissage d'activité élevée par unité de volume Les lits de garnissage formés selon les modes opératoires indiqués dans les exemples suivants peuvent conte- nir jusqu'à 2 000 I Gi U/mi, ce qui permet d'atteindre une teneur en fructose de 99,5 % de la teneur à l'équilibre en moins de 1 min dans un réacteur à température élevée lorsque l'on utilise des réacteurs étagés à des températures différentes et que la charge entrant dans un premier réacteur est isomérisée à basse température avant l'iso- mdrisation à température élevée dans un second réacteur Lorsque l'on utilise un système à réacteurs étagés, on préfère utiliser un procédé qui consiste à mettre en contact une liqueur d'alimentation de glucose à environ 20-85, en poids en hydrates de carbone avec la glucoseiso- mérase à une température d'environ 20 à 80 C, à un p H d'environ 6,0 à 9, 0 et pendant une durée de contact d'environ 0,5 à 2 h, pour atteindre jusqu'à environ 52 % en poids du fructose, par rapport aux hydrates de carbone totaux présents dans ladite liqueur, à augmenter la température du milieu d'isomérisation à environ 90-140 C, à -2529572 régler le pli du milieu d'iscmêrisation si nécessaire dans la gamme d'environ 3 à 8, à mettre en contact la liqueur contenant le fructose avec la glucoseisomérase pendant une durée supplémentaire d'environ 1 S à environ 5 h pour augmenter le degré de conversion jusqu'4 environ 53 % à environ 60 ' en poids du glucose présent dans la liqueur d'alimentation initiale contenant le glucose, sans qu'il n'y ait de formation notable de psicose ou d'autres sucres n'appartenant pas aux séries du fructose et du glucose Donc, l'utilisation de lits de garnissage à pouvoir élevé peut conduire à des durées de contact efficaces très faibles, ce qui réduit à son tour la dégradation du fructose qui a lieu aux températures élevées nécessaires pour l'invention. Dans le choix des techniques d'immobilisation de la glucoseisomérase, il est préférable d'utiliser des procédés pouvant donner de petites particules de catalyseur poreux, sensi- blement incompressibles, de manière à réduire au minimum la limita- tion de la vitesse d'isomérisation par les effets de diffusion. L'isomérase peut également être immobilisée dans les pores d'une membrane à travers laquelle on fait passer la solution de glucose en circulation forcée pendant l'isomérisation à température élevée, comme dispositif pour favoriser un bon contact entre l'enzyme et le substrat, réduisant au minimum les limitations par diffusion Le support utilisé pour l'immobilisation est de préférence totalement insoluble et inerte, pour éviter une contamination ou une dégradation excessives des composants glucose et fructose des solutions de substrat. Dans la pratique industrielle, cependant, les sirops contenant du fructose ne sont pas fabriqués à partir de glucose pur. On utilise plutôt des hydrolysats d'amidon (préparés dans les réfé- rences mentionnées ci-dessus) comme sources de glucose et ceux-ci contiennent invariablement des saccharides n'appartenant pas aux séries du glucose et du fructose (ci-après dénommés polysaccharides) dérivés de l'hydrolyse incomplète de l'amidon et de l'inversion du glucose Ceux-ci constituent de manière caractéristique de 3 à 8 % du poids total à sec en saccharides dérivés de l'hydrolyse de l'amidon Il est donc nécessaire, lorsque l'on calcule la température à laquelle l'isomérisation doit être effectuée, de tenir compte des polysaccharides éventuellement contenus dans la liqueur de glucose, ainsi que d'autres facteurs, tels que lateneur totale en fructose, en poids sec, à atteindre, la formation de psicose et d'autres produits n'appartenant pas aux séries du glucose et du fructose pendant la durée de contact efficace de la liqueur de glucose et de l'isomérase Les relations pour le calcul de la température d'isomérisation sont indiquées ci-dessous: T = 755 -273 ( 4) 2,3005-ln K K F K = 1 F ( 5) -F 000 (M+C) ( 6) Q( 100-P) T = température d'isomérisation ( C). F = teneur en fructose a l'équilibre (% par rapport au total glucose + fructose) à la température T. M = fructose, % en poids sec, nécessaire dans le produit isomérisé. C = psicose + autres produits de dégradation, %, formes pendant la durée de contact d'isomé- risation efficace. Q = % de l'équilibre atteint pendant la réaction d'isomérisation. P = teneur en polysaccharides, %, dans la liqueur de glucose. De manière caractéristique, il se forme moins de 1 %, et de prêfé- rence moins de 0,5 %,de psicose et d'autres produits de dégradation et on peut atteindre 99,5 % de l'équilibre Donc, pour préparer des sirops à 55, 5 % de fructose (en matières sèches), les températures d'isomérisation suivantes sont nécessaires pour des liqueurs de glucose ayant les teneurs en polysaccharides indiquées. Polysaccharides dans la Température liqueur de glucose (% en d'isomérisation matières sèches) ( O C) O 95,7 1 99,1 2 104,3 3 108,9 4 113,8 6 124,3 8 136,1 Le produit du commerce accepté contient en moyenne 55,5 % de fructose, en matières sèches Cela tient à ce que, à cette teneur en fructose, un sirop de mats à teneur élevée en fructose (HFCS) atteint un goût sucré égal à celui du saccharose, à poids égaux de matièressèches. Cependant, le HFCS à 55,5 % de fructose est solidement établi comme produit commercial que l'on utilise pour le remplacement de tout ou partie du saccharose dans de nombreux produits alimentaires et spé- cialement dans les boissons sucrées au gaz carbonique On s'attend à ce que la consommation de ce type de HFCS aux Etats-Unis d'Amérique soit de 1,3 billion de kg en 1982 avec une croissance & 1,8 billion de kg en 1983 En raison de la complexité propre aux opérations de distribution, stockage, mesure et formulation du RFCS dans les produits alimentaires, il y a une demande universelle d'uniformité du produit d'un fabricant de HFCS à un autreafin que l'on puisse utiliser de manière interchangeable et simultanément des produits de différentes origines Une teneur en fructose de 55-56 %, en matières sèches, a acquis une importance spéciale comme teneur visée dans la technologie associée à la fabrication du IFCS. Le procédé de l'invention donne des teneurs en fructose d'au moins 53 %, de préférence au moins 54 %, et mieux encore d'au moins 55 %. Le produit du procédé de l'invention est également caractérisé par une couleur-acceptable qui, bien entendu, est très souhaitable puisqu'elle réduit au minimum le coût du raffinage. Ordinairement, l'augmentation de couleur est de moins d'environ 55 (CIRFX 100), de préférence moins de 20, et mieux encore moins de 10. En gardant présentes à l'esprit les conditions précédentes de concentration de glucose, p H et durée de contact, on peut adapter convenablement des procédés connus d'isomérisation du glucose pour opérer entre environ 90 et environ 140 C, de préférence entre environ 100 et 110 C, pour fournir les sirops à teneur élevée en glucose-fructose de l'invention. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 Cet exemple illustre l'isomérisation directe du glucose a haute température pour atteindre une composition contenant ,5 % 7 de fructose, en matières sèches, en utilisant un système d'isomérisation en deux stades On prépare la glucoseisomérase soluble par un procédé semblable à celui décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 788 945. On fait pousser une espèce de Streptomyces rubiienosus dérivée de S rubigenosus ATCC 21175 en fermentation aérobie submergée sur un milieu de composition suivante: % en poids Dextrose 9,0 Liqueur de trempage de mais (solides) 1,6 Phosphate de diammonium 0,08 Sulfate de manganèse 0,06 Antimousse (Pluronic PL-61) 0,003 On stérilise le milieu à 121 C pendant 45 min, on refroidit et on ajuste à p H 6,8-7,0 On inocule avec 14 % en volume d'un inoculum comprenant le contenu d'un fermenteur d'ensemencement préparé avec la variante S rubigenosus mentionnée ci- dessus La fermentation est effectuée en conditions aseptiques à 30 C pendant environ 60 h, avec aération à 0,65 min 1 Onpeut aussi utiliser S rubigenosus ATCC 21175 pour l'inoculation et la production d'isomérase; dans ce cas, on utilise la composition suivante: en poids Dextrose 0,24 Liqueur de trempage de mars (solides) 1,5 Sorbitol 1,6 Chlorure cobalteux 0,02 Phosphate de diammonium 0,56 Xylose 1,0 On extrait la glucoseisomérase de S rubigenosus en ajoutant 0,35 % de "Maquat MC 1412 " (de la Société Mason Chemical Co) et 0,001 % de lysozyme d'oeuf de poule et en agitant pendant 5 h à 40 C à p H 6,3-6,6. On filtre ensuite le mélange pour obtenir une solution de glucose- isomérase brute non purifiée. On purifie l'isomérase brute par adsorption sur DEAE-cellulose (fabriquée selon le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 823 133), filtration et lavage du produit adsorbé avec une solu- tion de Na Cl 0,1 M pour éliminer les impuretés et ensuite désorption de l'isomérase par mise en contact avec une solution de Na Cl 0,45 M. Le p H de toutes les solutions est maintenu à 7,5 pendant les étapes de purification On mélange la solution d'isomérase partiellement purifiée ainsi obtenue avec 3 volumes d'éthanol à 95 % à O C pour précipiter l'isomérase On ajoute de la perlite comme auxiliaire de filtration, on recueille les solides par filtration et on sèche à l'air pour obtenir une préparation d'isomérase soluble contenant 2 500 IGIU/g L'activité spécifique de la préparation dtisomérase est de 40 IGIU/mg de protéine. On prépare un réacteur d'isomérase à basse tempé- rature ( 70 C) en garnissant une colonne de verre de 2,54 cm de diamètre avec l'isomérase immobilisée prdparée selon le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 788 945 pour donner un lit de 5 cm de haut contenant 20 000 IGIU d'activité L'espace de tête au-dessus du lit de garnissage contient un thermomètre et des billes de verre pour réduire au minimum le volume mort dans la mesure du possible. La colonne est munie d'orifices d'entrée et de sortie et d'une enveloppe pour la circulation d'eau provenant d'un thermostat. On prépare de la même manière un réacteur à haute température ( 930 C) en utilisant une isomérase immobilisée préparée par adsorption de l'isomérase purifiée décrite ci-dessus sur DEAE-cellulose Le lit de garnissage a une hauteur de 15 cm et contient 97 000 IGIU. L'activité de la préparation d'isomérase soluble a été déterminée comme décrit par Lloyd et coll dans Cereal Chemistry, 49, n O 5, pages 544-553 ( 1972) Une unité IGIT est la quantité d'iso- mérase qui convertit une micromole de glucose en fructose par minute dans une solution contenant 2 moles de glucose par-litre, 0,02 mole de Mg SO 4 par litre et 0,001 mole de Co C 12 par litre à un p H de 6,85 (maléate de sodium 0,2 M) et à une température de 60 C, la détermi- nation étant faite par la méthode ci-dessus, On prépare une solution contenant du glucose en dissolvant du glucose cristallise ("Clintose A granulation" de la Société Clinton Corn Processing Co) dans l'eau déminéralisée pour donner une solution contenant 48 % en poids de substance sèche On dissout dans la solution de glucose un activeur et un stabilisant pour obtenir une solution 25 m M en métabisulfite de sodium, 5 m M en sulfate de magnésium et 0,1 m M en chlorure de cobalt On ajuste la solution à p H 6,8 par l'hydroxyde de sodium. On effectue une première isomdrisation a basse température à 700 C par pompage de la solution de glucose ci-dessus à travers le réacteur à basse température à un débit de 3,7 ml/min. On jette les 2500 premiers ml de solution sortant du réacteur et on recueille ensuite l'effluent du réacteur pour l'utiliser dans une seconde isomérisation à haute température Dans l'isomérisation à haute température, on envoie par pompage la solution obtenue par isomérisation à 70 C a travers le réacteur à haute température, préparé comme décrit cidessus, à un débit de 5 ml/min en maintenant la température du réacteur à 930 C La durée de contact-de la solution avec l'enzyme immobilisée dans le réacteur à haute température est d'environ 12 min La durée totale pendant laquelle la solution est à 930 C dans le réacteur est d'environ 18 min On refroidit la solution au bain de glace immédiatement à la sortie du réacteur à haute température et on l'ajuste à p H 4,0 On jette l'effluent recueilli pendant la première heure à la sortie du réacteur à haute température. On détermine la composition en hydrates de carbone et la couleur de solutions de glucose isomérisées obtenues dans les réacteurs à 70 C et à 93 C et on compare les résultats avec ceux obtenus de manière analogue sur la solution de glucose non isomérisée, comme indique dans le tableau I ci-après. Les résultats obtenus montrent que l'on atteint ,5 % de fructose tout en maintenant le psicose au-dessous de 0,5 % en poids, en matières sèches L'augmentation de couleur est de mans de 5 (CIRF x 100). On détermine la teneur en hydrates de carbone par la méthode E-61 et la couleur par la méthode F-14 des Standard Analytical Methods des Sociétés Membres de la Corn Refiners Association; Corn Refiners Association, Inc, 1001 Connecticut Avenue, Washington, D C, 20036 Les valeurs de couleur obtenues par la méthode F-14 sont multipliées par 100 et sont exprimées en CIRF x 100. EXEMPLE 2 Cet exemple illustre la préparation d'un produit contenant du fructose à 55,27 % de fructose préparé à partir d'une solution contenant du glucose consistant principalement en un hydrolysat d'amidon de mats raffiné. L'hydrolysat est préparé à partir d'amidon de mars par les procédés décrits dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique n 3 644 126 (liquéfaction) et n 3 280 006 (saccharification) La liqueur saccharifiée est raffinée selon le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 834 940 pour donner un produit contenant 95,3 % de glucose, en matières sèches, à 50 %/ de substances sèches totales On ajoute suffisamment de glucose cristallisé pour amener la teneur totale en glucose à 97,1 %, en matières sèches On prépare à partir de cet hydrolysat une solution de composition suivante: Substancessèches totale (%) 42,4 Glucose (% en poids sec) 97,1 Fructose (% en poids sec) 0,1 Polysaccharides (% en poids sec) 2,8 Psicose (% en poids sec) 0,0 Na HSO 3 (m M) 50,0 Mg SO 4 (n OI) 5,0 Co C 12 (m H) O,1 p H 6,8 On prépare à haute température un réacteur comme décrit à l'exemple 1, contenant 147 500 IGIU dans un lit de 16,5 cm de haut On règle la * température à 97,4 C On fait circuler par pompage la solution ci- dessus à travers le lit de garnissage a 2,2 ml/min On jette les premiers ml d'effluent du réacteur et on prélève ensuite l'effluent de la colonne à des fins d'analyse Les résultats sont indiqués dans le tableau II ciaprès en regard de la composition de la solution de glucose non isomérisée. Les résultats obtenus montrent que l'on atteint plus de 55 % de fructose avec formation de seulement 0,2 % de psicose. La formation de couleur plus élevée dans cet exemple est due au fait que toute l'isomérisation est effectuée à haute température ( 97,4 C), contrairement au procédé en deux stades de l'exemple 1, dans lequel la majeure partie du fructose se forme à une température inférieure (c'est-àdire 70 C) et cette formation de couleur aurait pu être évitée par l'utilisation d'un réacteur à deux étages Néanmoins, la couleur formée est de moins de 13 (CIRF x 100). EXEMPLE 3 Cet exemple illustre la préparation d'un produit contenant du fructose à 55,3 % de fructose, en matières sèches, à partir d'une solution contenant du glucose consistant en hydrolysat d'amidon de mats raffiné plus glucose cristallisé, en utilisant un système d'isomérisation en deux stades dans lequel le second stade emploie une glucoseisomérase immobilisée du commerce. La glucoseisomérase soluble pour le réacteur de premier stade est préparée et purifiée par la méthode décrite à l'exemple 1 L'activité spécifique de cette préparation est de ,9 IGIU/mg de protéine On immobilise un total de 25 000 IGIU de cette enzyme par adsorption sur DEAE-cellulose "Whatman DE-23 " Cette enzyme immobilisée est utilisée pour préparer un réacteur à 70 C dans une colonne en verre à'enveloppe chauffante de 2,54 cm de diamètre comme décrit à l'exemple 1 La hauteur du lit est de 13 cm. Le substrat pour le réacteur est préparé essen- tiellement comme décrit à l'exemple 2 et possède la composition suivante: Substancessèch estotales(%) 50,2 Glucose (% en poids) 97,6 Fructose (% en poids) 0,0 Polysaccharides (% en poids sec) 2,4 Psicose (% 7 en poids sec) 0,0 1 Sa H 503 (mm) 50,0 Mg SO 4 (Im) 5,0 Co C 12 (me) O 1 p H 6,8 L'isomérisation à basse température est effectuée à 70 C en pompant la solution de substrat ci-dessus à travers le réacteur a basse température, à un débit de 3,2 ml/min On jette les 1000 premiers ml sortant du réacteur L'efflu 2 nt est ensuite recueilli pour l'utilisation dans la seconde isomérisation à température élevée. L'enzyme utilisée pour préparer le réacteur à haute température est une isomérase immobilisée du commerce fournie par la Société Enzyme Development Corporation sous le nom de Naxazyme GI immob, lot K-12467 On broie d'abord cette enzyme au mortier pour réduire sa dimension de particules On fait ensuite passer l'enzyme broyée à travers un tamis normalisé de 0,84 mm d'ouverture de mailles et on met en suspension dans le substrat la portion retenue dans un tamis de 0,250 mm et on désaère sous le vide du laboratoire à 60 OC pendant 60 min On utilise la suspension désaerée pour préparer un lit-de 1,5 x 39 cm dans une colonne de verre à enveloppe chauffante Le lit de garnissage contient 5 200 IGIU. On ajuste à p H 6,5 le substrat préparé à partir de la première étape d'isomérisation à 70 'C et on dilue à 42,6 % de substance sèche On fait ensuite circuler ce substrat par pompage à travers la colonne à un débit de 6 ml/min à une température de C pendant 30 min On contr Ole la température dans la colonne avec un thermomètre situé juste au-dessus du lit et entouré de billes de verre de 0,5 cm pour réduire au minimum le volume mort dans la mesure du possible On augmente ensuite rapidement la température de la colonne en faisant circuler dans l'enveloppe chauffante de l'eau provenant d'un bain thermostaté à 97,80 C Lorsque la température de la colonne a atteint 97 C, on réduit le débit du substrat à 2,0 ml/min A ce débit, la durée de contact du substrat avec l'enzyme immobilisée est d'environ 22 min et la durée totale pendant laquelle la solution est à 970 C dans le réacteur est d'environ 35 min. On contr 6 le l'effluent de la colonne au moyen d'un polarimètre enregistreur étalonné entre 50 et 58 % de fructose. Lorsque la teneur en fructose de l'effluent a atteint la valeur désirée, on recueille l'effluent et on le refroidit immédiatement au bain de glace On ajuste le p H à 4,0 par addition d'acide citrique 1 M On recueille l'effluent jusqu'à ce que la teneur apparente en fructose tombe audessous de 55 %, On détermine la composition en hydrates de carbone et la couleur des solutions isomérisées obtenues dans les réacteurs à 700 C et à 970 C et les résultats obtenus sont comparés comme indiqué dans le tableau III ci-après avec les résultats obtenus de manière analogue sur la solution de substrat non isomérisée. Les résultats obtenus montrent que l'on atteint 55,3 % de fructose tout en maintenant le psicose au-dessous de 0,4 %/o en poids, en matières sèches. EXEMPLE 4 Cet exemple illustre l'isomérisation directe du glucose A température élevée pour obtenir une composition contenant 55,8 % de fructose, le second stade d'isomérisation étant effectué avec une isomérase immobilisée produite par une souche Arthrobacter sp. On fait pousser une souche d'Arthrobacter citreus en fermentation aérobie submergée dans un milieu de composition suivante: % en poids Xylose 1,5 BHI ("brain heart infusion medium') 4,2 Extrait de levure 0,1 Chlorure de sodium 0,2 Aminoacides de caséine 0,5 Sulfate de magnésium 0,024 p H 6,97,2 La fermentation est effectuée en conditions aseptiques à 30 C pendant 44 h La masse de cellules est récoltée par centrifugation, lavée par le chlorure de sodium à 0,85 % et à nouveau centrifugée On obtient 66 g d'une masse de cellules ayant une activité totale d'isomérase de 10 260 IGIU On extrait la glucoseisomérase de 45 g de la masse de cellules en mettant les cellules en suspension dans 250 ml d'eau contenant 900 mg de lysozyme d'oeuf de poule et 250 mg, en matières sèches, de tensio- actif "BTC-835 " de la Société Onyx Chemical Co, en réglant le p H à 7,0 et en faisant incuber pendant 16 h à 45 C On centrifuge ensuite la suspension et on met de c 8 té le liquide surnageant On remet la matière insoluble en suspension dans 250 ml de "Triton X-100 " (de la Société Sigma Chemical Co) à 0,1 % 7, p H 7,0, et on fait incuber pendant 8 h à 45 C On centrifuge cette suspension et on combine le liquide surnageant avec celui obtenu dans la première centrifugation. On concentre les extraits combinés et on purifie par ultrafiltration avec une cellule agitée "Amicon 401 " en utilisant une membrane "YM-30 " (Société Amicon Corporation) Le rétentat est diafiltré avec deux portions de 5 volumes de solution de Co CI 2 0,2 m M et Mg SO 4 1 m M à p H 7,0 Le rétentat final contient après ultrafil- tration un total de 3 115 IGIU On utilise cette enzyme pour préparer. une isomérase immobilisée par adsorption sur DEAE-cellulose selon le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 788 945 On ajoute A la solution un total de 4,0 g de DE-23 de la Société Whatman, on règle le p H à 7,0 et on agite la suspension pendant 60 min à la température ambiante On recueille par filtration l'enzyme insoluble résultante et on la lave à l'eau On met en suspension dans le substrat une por- tion de l'enzyme immobilisée lavée, on désaère à 60 C pendant 60 min et on l'utilise pour préparer un lit de 1,5 x 13 cm dans le réacteur à haute température. Le substrat du réacteur est préparé sensiblement comme décrit à l'exemple 1 par un premier stade d'isomérisation à 70 C Ce substrat a la composition suivante: Substance sèche totale 42,6 Glucose (% en poids sec) 46,9 Fructose (% en poids sec) 52,3 Polysaccharides (% en poids sec) 0,8 Psicose (% en poids sec) 0,0 Na HC 03 (m 1 M) 50,0 Mg SO 4 (e 4) 5,0 Co C 12 (m M) 1 p H 6,7 On fait circuler par pompage le filtrat à travers le réacteur à 60 C pendant 30 min à un débit de 6 ml/min On élève ensuite rapidement la température de la colonne a 97,8 C, on réduit le débit a 2 ml/min et on controle l'effluent comme dans l'exemple précédent On recueille l'effluent dans un bain de glace et on l'ajuste à p H 4,0 par l'acide citrique 1 M. On détermine la composition en hydratesde carbone et la couleur de l'effluent du réacteur à 97,8 C, du substrat préparé dans la première étape d'isomérisation à 70 C et de la solution initiale de dextrose utilisée comme substrat pour le réacteur à 70 C Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau IV ci-après. Les résultats obtenus montrent que l'on atteint ,8 % de fructose tout en maintenant le psicose au-dessous de 0,2 % et la couleur au-dessous de 6 (CIRF x 100). EXEMPLE 5 Cet exemple illustre l'utilisation d'un système d'isomérisation à deux étages (deux étapes) dans lequel le réacteur du second étage est utilisé au-dessus de 100 C pour donner un produit contenant du fructose à 55,5 % de fructose. Le substrat pour le réacteur du second étage est préparé par un réacteur de premier étage exactement comme décrit à l'exemple 3 et ajusté à p H 6,6. L'isomérase immobilisée pour le réacteur du second étage est le produit "Maxazyme GI immob " qui a été broyé et tamisé comme décrit à l'exemple 3 On met cette enzyme en suspension dans le substrat, on désaère à 60 C et on l'utilise pour préparer un lit de 1,5 x 40,5 cm dans le réacteur à haute température L'activité totale d'isomérase est de 5 820 IGIU On fait circuler le substrat par pompage à travers le réacteur à un débit de 6 ml/min pendant une durée de 90 min tout en maintenant la température à 60 C On élève ensuite la température de la colonne à 102 'C et on réduit le débit à 3 ml/min Dans ces conditions, la durée de contact du substrat avec le lit d'enzyme est d'environ 16 min et la durée totale de passage à 102 'C est d'environ 24 min. On recueille l'effluent de la colonne et on l'analyse comme décrit dans les exemples 3 et 4 Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau V ci-après. On obtient un produit contenant 55,5 % de fructose avec seulement 0,2 % de psicose. TABLEAU I Composition de solutions de glucose isonvàrisé'es à 70 'C et 930 C Traitement de la solution non isomê-lrisée isomérisée à 7 O'C isomcris Ce à 930 C Composition en hydrates de carbone ( 7 % en poids, -en matières schessans cendre) Fructose Glucose Psicose Polysaccharides O 99,6 O 0,4 52,3 47,3 0,1 0,4 ,5 43,7 0,4 0,4 Couleur (CIRF c 100) 0, 2,1 4,8 u 13 LM TABLEAU II Compositions de solutions de glucose ïsomérisées â 97,40 C Traitement de la solution Composition en hydrates de carbone ( 7/ en poids, en matièroesèchoessans cendre) Fructose Glucose Psicose Polysaccharides non isomé-risèe isomtérisée à 97,40 C 0,1 ,2 97,1 42,4 Couleur (CIRF xloo) o 0,2 t N a' 2,8 2,2 0,6 12,4 ui ri T A BL EAU III Compositionsde solutions de substrats isomérisées à 700 C et 970 C Traitement de la solution ( 7, Fructose Composition en poids, en Glucose eni hydrates de carbone Couleur matièroes sèchessans cendre) (CIRF Psicose Polysaccharides Xl OO) non isomn Criste isomérisée à 7 O'C isomeérisée à 970 C o 51,3 ,3 97,6 46,4 41,8 o 0,3 2,4 2,3 2,6 0,5 % 0, 7 ,2 Nb k N ru "I Ni N T A BL EAU IV Compositions de solutions isomérisées A 70 'C et 97 80 C Traitement de la solution Composition (Z en poids, en. Fructose Glucose en hydrates de carbone miatièroessèchoessans cendre) Psicose Polysaccliarides non isomôrisées isomrisôes à 700 C isomérisées à 97,80 C o 52,3 ,8 Couleur (CIRF x î 6 o) 99,2 46,9 43,8 o 0,2 0,8 0,8 0, 2 0,6 0,7 , 7 N% -.4 tu TABLEAU -V Compositions de solutions isomêrisées à 700 C et 1020 C Traitement de la solution Composition en hydrates de carbone Couleur (%en poids, en matîèrcssècloessans cendre) (CIRF Fructose Glucose Psicose Polysaccharides x 100) non isomnerisée isom R E V E N D I C A T I O N S l Procédé pour isomériser le glucose en fructose, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact une liqueur d'alimentation contenant du glucose avec la glucoseisomérase chimi- quement stabilisée à une température d'environ 90 à environ 140 C à un p H d'environ 3 à environ 8, pendant une durée de contact suffi- sante pour obtenir dans ladite liqueur une teneur finale d'au moins environ 53 à 60 % en poids de fructose, par rapport à la teneur totale en hydrates de carbone, sans formation notable de psicose ou d'aitres sucres n'appartenant pas aux séries du fructose et du glucose, ou leurs mélanges. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la liqueur contenant du glucose est obtenue par hydrolyse d'amidon de mals. 3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite liqueur d'alimentation de glucose est obtenue par isomérisation d'un hydrolysat d'amidon de mals jusqu'à une -teneur en fructose d'environ 52 % par rapport à la teneur totale en hydrates de carbone. 4 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 3, caractérisé en ce que la source de la glucoseisomérase est un micro-organisme choisi parmi l'espèce Streptomyces et ses mutants, variants et modifications génétiques. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que la source de glucoseisomérase est un microorganisme choisi parmi Streptomyces sp ATCC 21175, ses mutants, variants et modifications génétiques. 6 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la source de glucoseisomérase est un microorganisme dans lequel on a introduit un gène de mutation de glucoseisomérase, ledit gène de mutation produisant une glucose- isomérase de stabilité thermique élevée. 7 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 a 5, caractérisé en ce que la glucoseisomérase est une glucose- isomérase thermiquement stable. 8 Procddl selon la revendication 6 ou 7, carec-. t 6 risé en ce que la glucoseisomndrase thermiquement stable est obte- nue à partir de Bacillus Stearothermnophilus. 9 Procédé selon la revendication 6 ou 7, carac- térisé en ce que la glucoseisomérase thermiquement stable est obte- nue à partir de Bacillus licheniformis. Procédé selon la revendication 6 ou 7, carac- t 6 risê en ce que la glucoseisomrérase thermiquemient stable est obte- rue à partir d'un thermophile appartenant au:genres Tnermoactinomyces, Iliernopolvspora, Thermomonospora ou Pseudonocardia. 1 l Procédé selon la revendication 6 ou 7, carac- térisé en ce que la glucoseisomérase thermiquement stable est obte- nue à partir d'un micro-organisme du genre Ampullariella. 12 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 11, caractérisé en ce que le milieu d'isomérisation contient une quantité d'un sel hydrosoluble d'acide sulfureux inhibant la dénaturation de l'enzyme. 13 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 12, caractérisé en ce que la liqueur d'alimentation contenant du glucose contient d'environ 40 à 65 % en poids d'hydrates de carbone. 14 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 13, caractérisé en ce que la liqueur d'alimentation contenant du glucose est mise en contact avec la glucoseisomdrase chimiquement stabilisée à environ 100-110 C - Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 14, caractérisé en ce que le milieu d'isomérisation est maintenu à environ p Hl 5-6,5. 16 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 13, caractérisé en ce que la durée de contact est d'environ 2 min à enwiron 30 min. 17 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 16, caractérisé en ce que laglucoseisomérase chimiquement stabilisée est utilisée sous une forme immobilisée. 18 Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la glucoseisomérase chimiquement stabilisée est irrrobilise sur diétlhylaminoéithylcellutlosc. 19 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 18, caractérisé en ce que, dans une lère étape, la liqueur d'alimentation contenant du glucose est mise en contact avec la glucoseisomérase à une température d'environ 20 à 80 C, un p Hl d'environ 6 à 9 et pendant une durée de contact d'environ 0,5 à 2 h, pour atteindre une teneur en fructose dans ladite liqueur allant jusqu'à environ 52 % en poids, par rapport aux hydrates de carbone totaux dans ladite liqueur de fructose, et,dans une 2 ème étape, la température du milieu d'isomérisation est élevée à envi- ron 90-140 C, le p H étant réglé si nécessaire dans l'intervalle d'environ 3 à 8; et la liqueur contenant le fructose est mise en contact avec la glucoseisomérase chimiquement stabilisée pendant une nouvelle durée suffisante pour augmenter la teneur en fructose à environ 53-60 % en poids. 20 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 19, caractérisé en ce que le sirop de fructose-glucose obtenu est refroidi à une température inférieure à 80 C. 21 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 20, caractérisé en ce que le mélange d'isomérisation est refroidi à une température d'environ 20 à 80 C après élimination de l'enzyme en contact avec le mélange d'isomérisation.