FR 2523810 A1 19830930 FR 8204892 A 19820323 1 - 23810 TISSU BIOLOGIQUE GREFFABLE ET PROCEDE POUR SA PREPARATION La présente invention concerne un tissu biologique greffable et un procédé pour sa préparation. La conservation par le glutaraldéhyde des tissus biologiques, en particulier des valvules cardiaques bioprothétiques porcines, a permis de: a) éviter les mauvaises performances des tissus valvulaires greffés conser- vés par le formaldéhyde; b) cesser de réaliser des homogreffes valvulaires; et c) éviter l'emploi indésirable des antioagulants nécessaires pour empé- cher une thromboembolie associée a l'emploi des valvules cardiaques non bioprothétiques (mécaniques) en particulier chez l'enfant Cependant comme c'est le cas d'autres découvertes importantes semblables, il semble que les bioprothèses conservées par le glutaraldéhyde posent des problèmes qui leur sont propres. Bien que les valvules de Carpentier et autres conservées par le glutaraldéhyde, qui sont relativement inertes du point de vue biologique, présentent une excellente longévité dans la plupart des cas, leur emploi continu présente des inconvénients graves, telsqu'une fatigue tissulaire et une tendance à la calcification De plus on considérait au départ que les enfants et les adolescents seraient les sujets tirant le plus grand profit des valvules cardiaques bioprothétiques conservées par le glutaral- déhyde, grâce à la suppression des anticoagulants que nécessitent les pro- thèses mécaniques Les résultats d'un nombre croissant d'études cliniques récentes montrent qu'une calcification grave de ces tissus s'accompagnant d'une défaillance relativement rapide, s'observe chez les enfants et les adolescents Donc, malgré leur longévité prolongée et la fréquence globale réduite des complications, ces valvules conservées par le glutaraldéhyde sont considérées par certains comme inappropriées à l'emploi chez l'enfant. La calcification tissulaire demeure en grande partie mystérieuse; cependant on a précédemment montré que divers facteurs, tels que les anomalies du métabolisme du calcium, l'âge, l'alimentation, la dégénéres- cence de composants tissulaires tels que le collagène et les turbulences, interviennent tous dans une certaine mesure Récemment, l'existence d'un amino-acide spécifique fixant le calcium, qui s'accumule après l'implanta- tion des xénogreffes porcines conservées par le glutaraldéhyde, a été établie et on a pensé qu'il jouait un rôle dans la calcification Bien que la calcification s'accompagne de dégradations des fibres de collagène du tissu greffé traité par le glutaraldéhyde, on ne sait pas si la calcifica- tion dystrophique est la cause ou le résultat de la dégénérescence tissu- laire Néanmoins, on a poursuivi les efforts pour élucider la source du problème de la calcification des tissus greffés en espérant y porter rapide- ment remède A ce jour ni la source ni la cause de la calcification des greffons biologiques ni des mesures appropriées pour éviter ou réduire la calcification des greffons biologiques n'ont été établies. Selon l'invention on a déterminé une cause sous-jacente de la calcification des greffons biologiques et en particulier des bioprothèses valvulaires conservées par le glutaraldéhyde De plus on a simultanément mis au point des procédés permettant de réduire ou d'atténuer de façon efficace la calcification des tissus biologiques greffés. Une des causes sous-jacentes de la calcification des bioprothèses valvulaires, notée pour la première fois dans les études immédiates des demandeurs, est la présence de phosphate en contact avec les tissus avant la greffe en des quantités qui entretiennent la calcification après la greffe Les teneurs en phosphate normalement observées dans les milieux d'expédition, tels que les solutions salées équilibrées (solution de Hanks, etc), le plasma, et le tampon salé phosphaté 0,01 à 0,10 M (PBS), utilisés classiquement dans les solutions de fixation à base de glutaral- déhyde, entretiennent tous à des degrés divers la calcification des tissus. A ce jour, les effets nuisibles du phosphate en contact avec les greffons biologiques, n'ont pas été appréciés et par conséquent les chercheurs, les cliniciens et les fabricants ignorent les conséquences indésirables que provoque le traitement de ces greffons par des solutions phosphatées; en particulier du fait que des solutions phosphatées, telles que la solution de Hanks, le PBS et le glutaraldéhyde-PBS, ont été couramment utilisées et sont très recommandées On comprend donc pourquoi on ait parfois recommandé, au lieu du tampon PBS, d'utiliser pour le stockage des tissus des tampons bicarbonate (ayant des capacités tampons et des gammes de p H semblables), l'emploi dans ce cas d'un milieu ne contenant pas de phosphate ne résultant 23810 pas d'une intention délibérée De plus, dans certains cas, même les milieux de conservation des tissus tamponnés au bicarbonate ont des teneurs élevées en phosphate Comme les conséquences fâcheuses du maintien des greffons tissulaires en contact avec un phosphate n'étaient pas connues, les cli- niciens ou les fabricants des bioprothéses ne cherchaient pas délibérément à éviter le-contact des tissus avec les solutions de phosphate. L'invention concerne des procédés qui réduisent de façon efficace la calcification des tissus biologiques greffés Ces procédés réduisent de façon avantageuse la tendance à la calcification des bioprothèses et résol- vent certains des problèmes associés à la longévité des xénogreffes de valvules cardiaques. L'invention concerne un procédé amélioré pour traiter un tissu biologique avant la greffe qui atténue ou réduit la calcification après la greffe Selon un mode de réalisation, le procédé comprend la mise en con- tact du tissu avec une solution hypophosphatée, ladite solution ayant une teneur en phosphate abaissée à une valeur efficace pour'réduire la calcifi- cation dudit tissu après la greffe, cette solution ne détruisant pas et ne déstabilisant pas le tissu, et le maintien du tissu en contact avec une telle solution hypophosphatée Selon un autre mode de réalisation, le pro- cédé comprend la mise en contact du tissu avec une quantité d'un cation divalent s'opposant par compétition à la fixation du calcium, efficace pour réduire la calcification du tissu après la greffe, et le maintien du tissu en contact avec ledit cation. L'invention va maintenant être décrite de façon détaillée, L'invention a pour objet de rendre résistants à la calcification divers types de tissus biologiques greffables provenant de nombreuses sour- ces animales et de nombreuses régions de l'organisme Ainsi le tissu peut provenir entre autres de bovins, de porcins, de chevaux ou de lapins; et il peut être constitué de tendons, de ligaments, de valvules cardiaques ou de tissus utilisés pour réaliser des valvules cardiaques, tels que la duremère et le péricarde Egalement l'invention peut s'appliquer à un tissu utilisé pour réaliser des greffes en plaque telles que des plaques cutanées, des plaques péricardiques, des plaques aortiques et des tympans Selon l'in- vention on n'a pas observé de différence significative de la vitesse de calcification entre le péricarde de porc et les tissus des valvules aortique, tricuspide et mitrale de porc. Bien que l'on se soit principalement intéressé aux préparations tissulaires qui sont fixées ou tannées, telles que les valvules cardiaques traitées au glutaraldéhyde, les tissus conservés non fixés bénéficient de l'invention Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, des val- vules cardiaques ou du tissu péricardique de porc fixés dans le glutaral- déhyde et traités puis implantés sous la peau de rats et de lapins ont bénéficié d'une atténuation ou réduction prolongée inattendue de la calcifi- cation après l'implantation Cette atténuation prolongée de la calcification constitue un procédé d'accroissement de la longévité du tissu greffé, en particulier des valvules cardiaques bioprothétiques. Selon un mode de réalisation de l'invention, un tissu biologique, maintenu avant la greffe dans une solution hypophosphatée, présente de façon avantageuse une diminution ou une atténuation prolongée de la calcification après la greffe Selon un mode de réalisation de l'invention, les solutions considérées comme hypophosphatées sont celles ayant des teneurs en phosphate inférieures à une valeur entretenant la calcification; c'est donc une teneur inférieure à celles actuellement utilisées pour lesquelles on n'observe pas de diminution ou d'atténuation notable de la calcification On considère que les solutions hypophosphatées sont constituées des solutions contenant nette- ment moins de phosphate que les solutions tampons salées phosphatées (PBS) 0,01 à 0,2 M utilisées classiquement pour la préparation des tissus avant la greffe et ces solutions hypophosphatées se sont révélées efficaces pour atténuer ou réduire la calcification après la greffe Dans un mode de réali- sation préféré de l'invention, ces teneurs réduites en phosphate sont infé- rieures à la gamme des teneurs en phosphate normalement présentes dans le plasma ou les solutions salées équilibrées telles que les solutions de Hanks et de Earle qui sont comprises entre environ 0,001 et environ 0,002 M De plus il s'est révélé particulièrement préférable d'éliminer à fond par rin- çage du tissu hôte après le prélèvement pour éliminer ou réduire fortement la quantité de phosphate du sang venant en contact avec le tissu. Les solutions pratiquement dépourvues de phosphate sont des solu- tions qui ne contiennent que des traces de phosphate, telles que les quanti- tés correspondant aux impuretés présentes dans la plupart des composés chi- miques utilisés pour la préparation des solutions classiques de traitement des tissus Les solutions de tampon HEPES préparées selon l'invention et décrites ci-après contiennent environ 2 à 4 ppm d'ions phosphates De plus, certaines solutions de glutaraldéhyde préparées selon l'invention et décri- tes ci-après contiennent environ 2 à 23 ppm d'ions phosphates utilisés comme stabilisants par certains fabricants Selon l'invention, ces traces ou résidus de phosphate sont négligeables Selon l'invention, on préfère particulièrement les solutions pratiquement dépourvues de phosphate. On évite que le tissu avant la greffe soit placé dans un environ- nement phosphaté entretenant la calcification, mais de plus on préfère utiliser des solutions qui ne détruisent pas ou ne déstabilisent pas les tissus On a par exemple constaté que des valvules cardiaques fixées dans du formaldéhyde à 1 % dans l'eau ne se calcifient pas après avoir été gref- fées à des rats tandis que les mêmes valvules fixées dans du formaldéhyde à 1 % dans du PBS présentent une calcification considérable pendant la même période Cependant les valvules traitées par la solution aqueuse de formal- déhyde présentent une dégénérescence appréciable après environ 1 mois Le traitement des valvules par le formaldéhyde aqueux, malgré l'absence de phos- phate, altère la stabilisation du tissu après la greffe et doit être évité. Les solutions hypophosphatées de l'invention comprennent l'eau distillée, des solutions tampons ou des compositions compatibles avec les tissus, telles que les solutions salées ou leurs combinaisons, telles que les solutions salées tamponnées Dans un mode de réalisation préféré, la solution hypophosphatée est une solution salée non tamponnée et dans un mode de réalisation particulièrement préféré, c'est une solution salée tamponnée Dans toutes ces solutions, on préfère opérer dans une gamme de p H stabilisant le tissu, c'est-à-dire dans une gamme de p H n'ayant pas d'effet nocif vis-à-vis des composants des tissus Une gamme de p H préférée est com- prise entre environ 7,0 et environ 7,6 et mieux entre environ 7,1 et envi- ron 7,4 Le p H que l'on préfère tout particulièrement selon l'invention a une valeur de 7,3. Les tampons utilisés selon un mode de réalisation de l'invention sont de préférence stables, inertes vis-à-vis du processus de stabilisation et ont un pouvoir tampon suffisant pour maintenir un p H acceptable en par- ticulier pendant la fixation des tissus Le choix du tampon approprié et de sa concentration dépend des conditions particulières de préparation des tissus auxquelles plusieurs fabricants ont apporté des variantes Les tampons préférés selon l'invention comprennent les tampons borate, carbo- nate, bicarbonate, cacodylate (non toxiqueschez l'animal) et d'autres tampons synthétiques artificiels ou organiques tels que l'HEPES (acide N-2hydroxyé- thylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique), le MOPS (acide morpholinepropanesul- fonique) et le PIPES (acide 1,4-pipérazinediéthanesulfonique) Les tissus préparés dans le tampon HEPES présentent de façon avantageuse une diminu- tion importante de la calcification après la greffe et on préfère donc particulièrement ce tampon dans l'invention. Dans l'invention, on choisit essentiellement la concentration du tampon dans la solution hypophosphatée pour maintenir le tissu dans un environnement hypophosphaté ou pour remplacer de façon efficace le phosphate déjà présent dans les tissus tout en ajustant simultanément le p H de la solution Il est important que la quantité de ce tampon utilisé seul ou en combinaison avec des solutions telles qu'une solution salée, soit efficace pour amener ou maintenir le tissu immergé dans un environnement hypophos- phaté Dans un mode de réalisation préféré, on utilise un tampon ayant une concentration d'environ 0,001 à environ 0,10 M en HEPES Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, on utilise un tampon ayant une concen- tration en HEPES d'environ 0,002 à environ 0,050 M Le tampon que l'on pré- -fére particulièrement pour la fixation par le glutaraldéhyde a une concen- tration en HEPES d'environ 0,02 M. De préférence, les solutions tamponnées ou non tamponnées utilisées selon l'invention doivent être inertes vis-à-vis du processus de stabilisa- tion des tissus que provoquent des agents fixateurs tels que le glutaraldé- hyde Ils ne doivent donc pas réagir avec l'agent fixateur ni empêcher l'agent fixateur de réaliser la fixation appropriée des tissus On sait que des tampons contenant des amines primaires et secondaires, tels que le tris(hydroxyméthyl)aminométhane (TRIS), réagissent avec les groupes aldéhy- des du glutaraldéhyde et gênent ainsi le processus normal de stabilisation des tissus Des tampons, tels que le TRIS, bien qu'ils soient pratiquement dépourvus de phosphate, nuisent à la stabilisation des tissus après la greffe et doivent donc être évités. Selon un mode de réalisation de l'invention, une exposition de courtedurée du tissu biologique à une solution hypophosphatée ou pratique- ment dépourvue de phosphate est inefficace pour réduire la calcification. Selon un mode de réalisation de l'invention, on doit maintenir le tissu biologique dans une solution fortement hypophosphatée entre le moment o l'on met le tissu hors de contact avec un phosphate dans l'un quelconque des divers stades et le moment précédant immédiatement la greffe Par exem- ple on a constaté qu'un tissu porcin traité avec une solution hypophosphatée ou une solution pratiquement dépourvue de phosphate après le prélèvement et pendant l'expédition présente une calcification importante si l'on utilise des solutions entretenant la calcification lors des stades de fixation et des stades suivant la fixation de la préparation D'autre part on a cons- taté que des tissus traités par le PBS, qui est une solution entretenant la calcification, après le prélèvement et pendant l'expédition, présentent une calcification réduite si l'on utilise des solutions pratiquement dépour- vues de phosphate dans les stades de fixation et les stades suivant la fixation de la préparation Un tissu traité avec des solutions pratiquement dépourvues de phosphate après le prélèvement, pendant l'expédition, pendant la fixation et les stades de conservation et de stérilisation après la fixation, présente la réduction maximale de la calcification. Selon un mode de réalisation de l'invention, on préfère maintenir le tissu biologique dans une solution hypophosphatée pendant la période suivant la fixation, c'est-à-dire pendant la période de conservation et de stérilisation, par exemple dans le formaldéhyde, qui suit la fixation et le moment qui précède immédiatement la greffe On préfère particulièrement mettre le tissu biologique en contact avec une solution fortement hypophos- phatée pendant la fixation et maintenir le tissu en contact avec une telle solution hypophosphatée jusqu'au moment qui précède immédiatement la greffe. De préférence, la solution hypophosphatée est un composant de la solution de fixation On préfère tout particulièrement mettre le tissu en contact immé- diatement après le prélèvement avec une solution hypophosphatée et maintenir le tissu dans une solution hypophosphatée pendant l'expédition, la fixation et le stockage et la stérilisation qui suivent la fixation jusqu'au moment qui précède immédiatement la greffe. Dans un mode de réalisation préféré, le tissu est mis en contact avec une solution fortement hypophosphatée pendant la fixation, cette solu- tion étant un composant de la solution de fixation On préfère, selon l'in- vention, des solutions salées contenant du glutaraldéhyde, tamponnées ou non tamponnées, contenant de préférence environ 0,2 à 6,0 % en poids de glutaral- déhyde et mieux environ 5 à environ 0,7 % en poids de glutaraldéhyde Une solution de fixation que l'on préfère particulièrement est constituée de solution salée tamponnée contenant environ 0,5 à environ 0,7 %io en poids de glutaraldéhyde Une solution de fixation pratiquement dépourvue de phosphate constituée de solution salée tamponnée 0,02 M en HEPES et contenant environ 0,625 % en poids de glutaraldéhyde à un p H d'environ 7, 1 à environ 7,5, s'est révélée efficace pour réduire la calcification après la greffe et constitue donc un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention. On envisage de plus que le tissu biologique expédié et/ou fixé en présence de quantités de phosphate entretenant la calcification, par exemple avec du PBS environ 0,01 à 0,02 M, soit rincé à fond ou traité d'autre façon avec une solution hypophosphatée avant la greffe pour en éliminer le phosphate et ainsi réduire ou atténuer la calcification du tissu greffé selon l'invention Le rinçage ou le traitement du tissu greffable contenant une quantité de phosphate entretenant la calcification avant la greffe, est de pré- férence réalisé avec une solution pratiquement dépourvue de phosphate. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, un tissu biologique traité avec des cations divalents, avant la greffe et maintenu en contact avec lesdits ions, présente une réduction ou une atténuation avantageuse de la calcification après la greffe. Les ions divalents ajoutés au tissu semblent entrer en compétition de façon efficacevis-à-vis des sites de fixation du calcium du tissu, en particulier après la greffe, lorsque dans certains cas des sites additionnels de fixation du calcium sont formés L'accroissement de la quantité des ions divalents tels les ions magnésium dans le tissu après fixation dans du glutaraldéhyde-PBS, provoque une réduction ou une atténuation prolongée de la calcification, tandis qu'un tissu fixé dans du glutaraldéhyde-PBS avec des quantités accrues de cation divalent puis exposé à des quantités additionnelles de phosphate entretenant la calcifica- tion, ne présente pas de diminution ou d'atténuation de la calcification Donc selon l'invention il n'est pas nécessaire de maintenir le tissu traité par le cation divalent en contact avec une solution hypophosphatée avant ou pendant le traitement par l'ion, cependant on préfère maintenir le tissu dans une solution ? O hypophosphatée après le traitement par l'ion divalent avant la greffe. Selon la présente invention, il est apparu que tout ion divalent qui entre en compétition de façon efficace vis-à-vis des sites de fixation du calcium dans le tissu réduit la calcification Par conséquent les cations divalents employés de préférence sont les ions Ba, Mg, Sr, Cu, Zn, Ag et Hg On a constaté conformé- ment à l'invention qu'un tissu traité par des ions Ba, Mg et Sr préalablement à l'implantation réduisent de façon efficace la calcification L'ion Mg est employé de préférence dans le cadre de l'invention. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les ions magnésium proviennent de solutions de sel de magnésium; on préfère particulièrement des solutions de sel soluble dans l'eau tel que le chlorure de magnésium (Mg C 12), le sulfate de magnésium (Mg SO 4) et le carbonate de magnésium (Mg C 03) Dans le mode de réalisation que l'on préfère particulièrement, le sel de magnésium contient des ions magnésium en une quantité efficace pour réduire ou atténuer la calcification du tissu après la greffe Bien que la concentration des ions magnésium et le moment de leur mise en contact avec le tissu puissent varier, il est préférable que le tissu soit pratiquement saturé de solutions contenant des quantités efficaces de cet ion. Selon l'invention, on considère que les quantités efficaces de cations diva- lents tels que les ions magnésium en contact avec le tissu sont des quantités supé- rieures aux quantités observées dans certains PBS,les solutions salées équilibrées et le plasma Les solutions classiques de PBS ont généralement une teneur en ions magnésium et l'ordre dû 0 001,of en poids les solutions salées équilibrées 2 2523810 une teneur de l'ordre de 0,002 % en poids et la limite supérieure dans la plasma est de l'ordre d'environ 0,003 % en poids La quantité préférée d'ions magnésium est supérieure à environ 0,003 à environ 0,004 % en poids La quantité maximale d'ions magnésium considérée comme utile dans l'invention est celle néces saire à l'obtention d'une solution isotonique La saturation du tissu avec des solutions contenant environ 0,03 % d'ions magnésium réduit de façon efficace la calcification du tissu et constitue un procédé préféré Pour effectuer cette satu ration, on plonge le tissu dans une solution de chlorure de magnésium à 0,26 % en poids qui constitue une solution à 0,03 % en poids d'ions magnésium Des solutions consistant en des solutions salines équilibrées contenant plus d'environ 0,003 % d'ions magnésium normalement présents dans le plasma conduisent à un effet bénéfique et sont employées de préférence. Selon un mode de réalisation de l'invention, un tissu valvulaire porcin prélevé, expédié dans une solution salée tamponnée à l'HEPES, fixé dans une solution salée tamponnée à l'HEPES contenant 0,25 % en poids de chlorure de magnésium et 0,625 % en poids de glutaraldéhyde, rincé dans une solution salée tamponnée à l'HEPES contenant 0,26 % en poids de chlorure de magnésium, stérilisé dans une solution salée tamponnée à 1 'HEPES contenant 0,26 % en poids de chlorure de magnésium et environ 4,0 % en poids de formal- déhyde, rincé et conservé dans une solution salée tamponnée à l'HEPES conte- nant 0,26 % en poids de chlorure de magnésium et 0,625 % en poids de glutaral- déhyde, jusqu'à un moment précédant immédiatement la greffe, présente de façon avantageuse une atténuation ou une réduction importante de la calcifi- cation après la greffe Donc selon un mode de réalisation de l'invention on préfère particulièrement fixer le tissu biologique par le glutaraldéhyde dans une solution salée tamponnée à l'HEPES contenant une quantité efficace de magnésium et maintenir la solution en contact avec ladite solution salée tamponnée à l'HEPES et les ions magnésium jusqu'à un moment précédant immié- diatement la greffe. Egalement selon l'invention, le tissu biologique traité en l'absence de quantités efficaces de cations divalents tel que Mg peut être rincé dans des solutions stériles, telles que des solutions de chlorure de magnésium, immé- diatement avant la greffe pour réduire la calcification ultérieure. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. EXEMPLE I On rince à fond un tissu de valvule aortique porcine prélevé, on l'expédie, on le fixe avec du glutaraldéhyde à 0,625 %o en poids, on le stéri- lise dans du formaldéhyde à environ 4 %, on le conserve entre environ 4 et 250 C, le tout en présence d'une solution isotonique ( 285 15 inilliosmoles) hypophosphatée contenant 0,885 % en poids de chlorure de sodium à p H 7,3, on 2 523810 rince dans une solution salée pour éliminer le glutaraldéhyde résidu l immédiatement avant l'implantation et on implante à des lapins en cours de croissance On récupère le tissu valvulaire à des intervalles réguliers d'une semaine pendant une durée totale de 6 semaines Après récupération, on évalue l'importance de la calcification tissulaire par détermination quantitative du pourcentage pondéral de calcium dans le tissu sec par analyse par absorption atomique, et on l'évalue du point de vue histologi- que par observation du degré de calcification de coupes de tissu colorées selon la méthode de Von Kossa De façon simultanée et identique, on évalue l'importance de la calcification d'un tissu de valvule cardiaque que l'on a rincé, expédié, fixé avec du glutaraldéhyde à 0,6257 O en poids, stérilisé dans du formaldéhyde à environ 4 %, conservé entre environ 4 et 250 C, le tout en présence d'une solution isotonique 0,02 M en phosphate et à 0,885 % en poids de chlorure de sodium à p H 7,3 (PBS 0,02 M), rincé dans une solu- tion salée pour éliminer le glutaraldéhyde résiduel immédiatement avant l'implantation et implanté à des lapins en cours de croissance. Les résultats histologiques et quantitatifs indiquent que le tissu valvulaire implanté traité avec la solution hypophosphatée présente une diminution nette de la calcification par rapport au tissu valvulaire traité avec du PBS 0,02 M. EXEMPLE Il On effectue des expériences identiques à celles de l'exemple I, si ce n'est que l'on implante le tissu à des lapins adultes et qu'on le récupère à des intervalles réguliers de un mois pendant une durée totale de six mois. De façon semblable, les résultats de l'examen histologique et du dosage quantitatif montrent que le tissu valvulaire implanté traité avec la solution hypophosphatée présente une diminution importante de la calcification par rapport au tissu valvulaire traité avec du PBS 0,02 M. EXEMPLE III On effectue des expériences semblables à celles de l'exemple II,si cen'est que la solution hypophosphatée contient de plus 0,54 g/l du sel de sodium de l'HEPES lors du rinçage et de l'expédition et 5,83 g/l du sel de sodium de l'HEPES pendant la fixation, la conservation et la stérilisation. Dans ce cas également, les résultats de l'examen histologique et du dosage quantitatif indiquent que le tissu valvulaire implanté traité avec la solu- tion hypophosphatée présente une calcification réduite par rapport au tissu valvulaire traité avec le PBS 0,02 M. EXEMPLE IV On effectue des expériences semblables à celles de l'exemple I, si ce n'est que les solutions hypophosphatées contiennent de plus 0,54 g/l du sel de sodium de l'HEPES pendant le rinçage et l'expédition, 5,39 g/1 du sel de sodium de l'HEPES pendant la fixation, le stockage et la stérilisation et 2,6 g/l de Mg C 12, 6 H 20 pendant la fixation, la conservation et la stérilisation Dans ce cas également les résultats de l'examen histologique et des dosages quantitatifs montrent que le tissu valvulaire implanté traité avec la solution hypophosphatée présente une diminution nette de la calcifi- cation par rapport au tissu valvulaire traité avec le PBS 0,02 M. EXEMPLE V On effectue des expériences identiques à celles de l'exemple IV, si ce n'est que l'on implante le tissu à des lapins adultes et qu'on le récupère à des intervalles réguliers de un mois pendant une durée totale de 6 mois Les résultats de l'examen histologique et du dosage quantitatif montrent que les tissus valvulaires implantés traités avec la solution hypophosphatée, présentent une diminution nette et prolongée de la calcifica- tion par rapport aux tissus valvulaires traités avec du PBS 0,02 M. EXEMPLE VI On effectue des expériences semblables à celles de l'exemple I, si ce n'est que la solution hypophosphatée contient de plus du tampon cacodylate à la concentration de 0,5 M et que l'on récupère le tissu valvu- laire uniquement après une et deux semaines De plus on évalue simultanément et de façon identique l'importance de la calcification observée lorsqu'avant la greffe on utilise une solution 0,012 M en phosphate et à 0,885 % en poids de chlorure de sodium à p H 7,5 (PBS 0, 012 M) Les résultats histologiques montrent que le tissu valvulaire implanté traité avec une solution hypophos- phatée présente une légère diminution de la calcification après une semaine par rapport au tissu valvulaire traité avec le PBS 0,012 M Ensuite on observe une calcification modérée. EXEMPLE VII On effectue des expériences identiques à celles de l'exemple VI, si ce n'est que l'on remplace le cacodylate par du tampon borate 0,1 M Les résultats histologiques sont semblables à ceux de l'exemple 6. EXEMPLE VIII On effectue des expériences identiques à celles de l'exemple VII, si ce n'est qu'aucune des solutions comparatives n'est hypophosphatée, les solutions utilisées pour la fixation, la conservation et la stérilisation étant constituées de PBS 0,02 M au lieu de tampon HEPES Les résultats de l'examen histologique et du dosage quantitatif montrent que le tissu valvu- laire implanté traité avec la solution de chlorure de magnésium phosphatée présente une réduction de la calcification par rapport au tissu valvulaire traité sans chlorure de magnésium. EXEMPLE IX On effectue des expériences semblables à celles de l'exemple III, pour évaluer l'intégrité du tissu apres l'implantation Les résultats des analyses indiquent qu'il n'y a pas de différence significative de la tempé- rature de rétraction, des valeurs de la réaction à la ninhydrine, de la teneur en acide uronique lixiviable dans le produit de lixiviation acide des mucopolysaccharides, de la stabilité du tissu soumis à une digestion par la pronase, de la coloration histologique, de l'analyse des amino- acides, de l'ultrastructure évaluée par microscopie électronique par trans- mission et de la teneur en humidité. EXEMPLES X à XXII On traite du tissu valvulaire cardiaque porcin prélevé, avec des solutions hypophosphatées ou des solutions contenant du phosphate à divers stades du traitement (avant fixation, pendant la fixation avec le glutaral- déhyde et après la fixation) avant l'implantation à des rats pour évaluer le degré d'atténuation de la calcification obtenu pour chaque stade du traitement Les résultats du tableau suivant résument les observations faites pendant une période atteignant dans certains cas deux mois après l'implantation Dans le tableau, Gp indique le tissu traité par le glutaral- déhyde dans du PBS 0,02 M; FH 20 indique le tissu traité par du formaldéhyde aqueux; Geau indique le tissu traité par le glutaraldéhyde aqueux; Fp indique le tissu traité par le formaldehyde dans du PBS 0,02 M; GHEPES indique le tissu traité par le glutaraldéhyde dans de l'HEPES 0, 002 M; Gcarbonate indique le tissu traité par le glutaraldéhyde dans du tampon carbonate; solution salée/HEPES désigne la solution salée tamponnée par l'HEPES à 0,002 M et BSS indique une solution salée équilibrée. TABLEAU ETUDE DE LA CALCIFICATION CHEZ LE RAT Avant fixation Traitement de Après fixation Degré de calcifi- fixation cation PBS PBS PBS PBS PBS PBS HANKS óBSS) Solution salée HEPES HANKS (BSS) PBS Solution salée Solution salée PBS PBS Gp FH 20 Fp Gwater GHEPES Gcarbonate Gp G p G solution saltée/HEPES G solution salée/HEPES G solution salée/HEPES G p G p phosphatée hypophosphatée phosphatée hypophosphatée hypophosphatée hypophosphatée phosphatée phosphatée hypophosphatée hypophosphatée hypophosphatée Mg C 12 hypophosphatée Mg C 12-Gp important réduit (degenerescence) important (degenerescence) réduit réduit legérement réduit important important réduit réduit réduit (prolongé) réduit (prolongé) important - 14 25 2523810 EXEMPLE XXIII Des essais identiques à ceux de l'exemple IV sont mis en oeuvre si ce n'est que l'on remplace Mg C 12, 6 H 20 par Ba C 12, 2 H 20 à une concen- tration de 2 2 g/t Les résultats obtenus montrent que Ba a un effet sur la calcification similaire à celui du Mg EXEMPLE XXIV Des essais identiques à ceux de l'exemple IV sont mis en oeuvre si ce n'est que l'on remplace Mg C 12, 6 H 20 par Sr C 12, 2 H 20 à une concen- tration de 2,3 q/Q Les résultats obtenus rontrent que Sr a un effet * sur la calcification similaire à celui du Mg. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation décrits et représentés et elle est susceptible de nombreuses variantes, accessibles à l'homme de l'art, sans que l'on ne s'écarte de l'esprit de l'invention. REVENDICATIONS 1 Procédé pour traiter un tissu biologique avant la greffe, in vitr caractérisé en ce qu'il comprend les stades de: a) mise en contact dudit tissu avec une solution hypophospha- tée, ladite solution ayant une teneur en phosphate abaissée à une valeur efficace pour réduire la calcification dudit tissu après la greffe, ladite solution ne provoquant pas de destruction ou de destabilisation dudit tissu; et b) maintien du tissu en contact avec ladite solution hypophos- phatée. 2 Procédé selon la revendication 1, tion hypophosphatée est pratiquement dépourvue 3 Procédé selon la revendication 1, biologique est mis en contact avec la solution conservation après la fixation. 4 Procédé selon la revendication 1, biologique est mis en contact avec la solution stérilisation. Procédé selon la revendication 1, biologique est mis en contact avec la solution fixation. caractérisé en de phosphate. caractérisé en hypophosphatée caractérisé en hypophosphatée caractérisé en hypophosphatée ce que la solu- ce que le tissu pendant la ce que le tissu pendant la ce que le tissu pendant la 6 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la solution hypophosphatée est un composant de la solution de fixation. 7 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le tissu biologique est maintenu dans la solution hypophosphatée pendant l'expédition. 8 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le tissu biologique est maintenu dans la solution hypophosphatée pendant une période suivant le prélèvement à l'hôte et un moment précédant immédiate- ment l'implantation. 9 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution hypophosphatée est inerte vis-à-vis du processus de stabilisation du tissu. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la solution hypophosphatée comprend un tampon. 11 Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que-le tampon hypophosphaté est inerte vis-à-vis du glutaraldéhyde. 12 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la solution pratiquement dépourvue de phosphate est constituée d'une solution 2 523810 salée. 13 Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la solution hypophosphatée est choisie parmi celles contenant du borate, du carbonate, du bicarbonate, du cacodylate, de l'HEPES, du MOPS et du PIPES. 14 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la solution pratiquement dépourvue de phosphate est constituée d'une solution salée tamponnée par l'HEPES Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 8, 10 ou 14, caractérisé en ce que le tissu biologique est utilisé pour la prépa- ration d'une valvule cardiaque. 16 Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la solution hypophosphatêe comprend un tampon ayant un pouvoir tampon efficace pour maintenir un p H stabilisant les tissus. 17 Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que le tampon est l'HEPES et a une concentration d'environ 0,001 à environ 0,10 M. 18 Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que le tampon est l'HEPES et a une concentration d'environ 0,002 à environ 0,50 M. 19 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend de plus un stade de mise en contact dudit tissu avec une quantité d'un cation divalent entrant en compétition vis-à-vis des sites de fixation du calcium, efficace pour réduire la calcification du tissu après la greffe. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le cation divalent est un ion magnésium ou un de ses sels. 21 Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que le sel de magnésium est choisi parmi Mg C 12, Mg SO et Mg CO 3. 22 Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que le sel de magnésium est Mg C 12. 23 Procédé selon l'une des revendications 19, 21 ou 22, caracté- risé en ce que le tissu est traité avec une quantité de cation divalent suffisante pour saturer le tissu. 24 Procédé selon l'une quelconque des revendications 19, 21 ou 22, caractérisé en ce que le tissu biologique est utilisé pour la préparation d'une valvule cardiaque. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que le tissu est utilisé pour la préparation d'une valvule cardiaque et que la concentration en chlorure de magnésium (Mg Clg) est d'environ 0,26 O en poids. 26 Procédé pour traiter un tissu biologique avant la greffe, caractérisé en ce qu'il comprend les stades de: a) mise en contact du tissu avec une quantité d'un cation divalent entrant en compétition vis-à-vis des sites de fixation du calcium, efficace pour réduire la calcification du tissu après la greffe; et b) maintien du tissu en contact avec ledit cation. 27 Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que le cation divalent est un ion magnésium ou un de ses sels. 28 Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que le sel de magnésium est choisi parmi Mg C 12, Mg 504, et Mg CO 3. 29 Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que le sel de magnésium est le chlorure de magnésium. Procédé selon l'une quelconque des revendications 26, 27 ou 29, caractérisé en ce que le tissu est traité avec une quantité de cation divalent suffisante pour le saturer. 31 Procédé selon l'une quelconque des revendications 26, 27, 28 ou 29, caractérisé en ce que le tissu biologique est utilisé pour la prépa- ration d'une valvule cardiaque. 32 Procédé selon la revendication 29, caractérisé en ce que le tissu est utilisé pour la préparation d'une valvule cardiaque et la concentration du chlorure de magnésium est d'environ 0,26 % en poids i 33 Procédé pour accroître la longévité d'un tissu biologique greffable, caractérisé en ce qu'il comprend les stades de: a) réduction de la quantité de phosphate en contact avec ledit tissu avec une solution hypophosphatée, ladite solution ayant une teneur en phosphate abaissée à une valeur efficace pour réduire la calcifi- cation dudit tissu après la greffe, ladite solution ne détruisant ni ne destabilisant ledit tissu; et b) maintien du tissu en contact avec une telle solution hypo- phosphatée. 34 Procédé selon la revendication 33, caractérisé en ce que la solution hypophosphatée est pratiquement dépourvue de phosphate. Procédé selon la revendication 33, caractérisé en ce que le tissu a été préalablement traité avec une solution contenant un phosphate pendant le transport ou la fixation. 36 Procédé selon la revendication 35, caractérisé en ce que la solution hypophosphatée comprend un tampon. 37 Procédé selon la revendication 34, caractérisé en ce que la solution pratiquement dépourvue de phosphate est constituée d'une solution salée. 38 Procédé selon la revendication 36, caractérisé en ce que la solution hypophosphatée est choisie parmi les solutions contenant du borate, du carbonate, du bicarbonate, du cacodylate, de l'HEPES, du MOPS et du PIPES. 39 Procédé selon la revendication 36, caractérisé en ce que la solution pratiquement dépourvue de phosphate est constituée d'une solution salée tamponnée par l'HEPES. Procédé selon l'une quelconque des revendications 33, 34, 36 ou 37, caractérisé en ce que le tissu biologique est utilisé pour la prépa- ration d'une valvule cardiaque. 41 Procédé selon la revendication 40, caractérisé en ce que le tissu contient une quantité de phosphate entretenant la calcification. 42 Procédé selon la revendication 41, caractérisé en ce que le tissu a été fixé dans une solution salée tamponnée au phosphate. 43 Procédé selon la revendication 40, caractérisé en ce que la solution hypophosphatée comprend un tampon ayant un pouvoir tampon efficace pour maintenir un p H stabilisant les tissus. 44 Procédé selon la revendication 43, caractérisé en ce que le tampon est l'HEPES et a une concentration d'environ 0,001 M à environ 0,1 M. 45 Procédé selon la revendication 33, caractérisé en ce qu'il comprend de plus un stade de contact dudit tissu avec une quantité d'un cation divalent entrant en compétition vis-à-vis des sites de fixation du calcium, efficace pour réduire la calcification du tissu après la greffe. 46 Procédé selon la revendication 33, caractérisé en ce que le cation divalent est un ion magnésium ou un de ses sels. 47 Procédé selon la revendication 46, caractérisé en ce que le sel de magnésium est choisi parmi Mg C 12, Mg SO 4 et Mg CO 3. 48 Procédé selon la revendication 46, caractérisé en ce que le sel de magnésium est Mg C 12. 49 Procédé selon l'une quelconque des revendications 45, 46 ou 48, caractérisé en ce que le tissu est traité avec une quantité du cation divalent suffisante pour le saturer. Procédé selon l'une quelconque des revendications 45, 46 ou 48, caractérisé en ce que le tissu biologique est utilisé pour la prépara- tion d'une valvule cardiaque. 51 Procédé selon la revendication 48, caractérisé en ce que le tissu est utilisé pour la préparation d'une valvule cardiaque et la concen- tration du chlorure de magnésium (Mg C 12) est d'environ 0,26 ' en poids. 52 Procédé pour accroître la longévité d'un tissu biologique greffable, caractérisé en ce qu'il comprend les stades de: a) accroissement de la quantité des cations divalents entrant en compétition vis-à-vis des sites de fixation du calcium à une valeur efficace pour réduire la calcification du tissu après la greffe; et b) maintien du tissu en contact avec ledit cation. 53 Procédé selon la revendication 52, caractérisé en ce que le cation divalent est l'ion magnésium ou un de ses sels. 54 Procédé selon la revendication 53, caractérisé en ce que le sel de magnésium est choisi parmi Mg C 12, Mg SOL, et Mg CO 3. Procédé selon la revendication 53, caractérisé en ce que le sel de magnésium est le chlorure de magnésium. 56 Procédé selon l'une quelconque des revendications 52, 53 ou , caractérisé en ce que le tissu est traité avec une quantité de cation divalent suffisante pour le saturer. 57 Procédé selon l'une quelconque des revendications 52, 53 ou , caractérisé en ce que le tissu biologique est utilisé pour la prépara- tion d'une valvule cardiaque. 58 Procédé selon la revendication 55, caractérisé en ce que le tissu est utilisé pour la préparation d'une valvule cardiaque et la concen- tration du chlorure de magnésium est d'environ 0,26 % en poids. 59 Bioprothêse stable ayant une tendance réduite à la calcifica- tion, caractérisée en ce qu'on l'a traitée avant la greffe avec une solution efficace pour réduire la calcification. 60 Bioprothése selon la revendication 59, caractérisée en ce qu'avant la greffe, le tissu est traité avec une quantité de solution hypophosphatée efficace pour réduire la calcification du tissu après la greffe. 61 Bioprothèse selon la revendication 59, caractérisée en ce que le tissu est traité avec une quantité d'un cation divalent efficace pour réduire la calcification du tissu après la greffe. 62 Bioprothèse selon la revendication 60, caractérisée en ce qu'elle est de plus traitée avec une quantité d'un cation divalent effi- cace pour réduire la calcification de cette bioprothèse après la greffe. 63 Bioprothése selon l'une quelconque des revendications 59, , 61 ou 62, caractérisée en ce qu'on l'utilise pour des valvules cardiaques. 64 Bioprothèse selon l'une des revendications 61 ou 62, carac- térisée en ce que le cation divalent est un ion magnésium ou un de ses sels.