FR 2529461 A1 19840106 FR 8212222 A 19820702 -1 - TRIPEPTIDE PROVENANT D'UN FRAGMENT D'IMMUNOGLOBULINE, SON PROCEDE DE PREPARATION ET SES APPLICATIONS. La présente invention se rapporte, d'une manière générale, à un polypeptide et en particulier à un tripeptide provenant d'un fragment d'immunoglobuline ainsi qu'à ses applications dans le domaine thérapeutique. Le tripeptide en question, en l'occurence: L-Thréonyl-Llysyl-L-proline et ses sels pharmaceutiquement acceptables de métaux alcalins,par exemple le sel sodique,ou d'addition d'acide, par exemple l'acétate, s'est révélé capable d'inhiber l'activité phagocytaire des macrophages et à ce titre peut être utilisé en thérapeutique. Un autre objet de l'invention concerne la L-thréonyl-L-lysyl-L-proline et ses sels pharmaceutiquement acceptables en tant que médicaments utiles notam- ment pour inhiber l'activité phagocytaire des macrophages. De même, l'invention se rapporte à des compositions pharmaceutiques ou vétérinaires contenant comme principe actif la L-thréonyl-L-lysyl-Lproline ou ses sels pharmaceutiquement acceptables, en association avec un véhicule pharmaceutique ou un excipient approprié. Il est connu que les immunoglobulines de type G peuvent être adsorbées à la surface des formes larvaires de Schistosoma mansoni De même, on a montré que ces immunoglobulines sont ensuite clivées par des enzymes pro- téolytiques d'origine parasitaire secrétées par la larve elle-même. Ce clivage a pour effet de libérer des peptides (solubles dans l'acide trichloroacétique à 6 %) dans le milieu environnant le parasite en mainte- nant en place la partie Fc des immunoglobulines (C Auriault et coll, Parasite Immunology 1981, 3, 33-44). L'intérêt particulier de ce phénomène est apparu lorsqu'il a été possible de mettre en évidence l'action fortement inhibitrice de ces peptides ainsi 2 2- libérés vis-à-vis de l'activité des macrophages Le macrophage étant l'une des cellules effectrices principales impliquées dans la réponse immunitaire dirigée contre leschistosome, la modulation de cette cellule par le para- site lui-même présente un intérêt particulier Des études complémentaires ultérieures ont montré, en outre, que de façon générale l'activité phago- cytaire des macrophages péritonéaux de rat ou alvéolaires humains est égale- ment déprimée de manière très significative en présence d'un hydrolysat d'Ig G par les protéases parasitaires sans toutefois altérer la viabilité des cellules. En effet, les mécanismes intervenant au cours de la phagocytose et plus particulièrement de la cytotoxicité anti-schistosomules anticorps dépen- dante des macrophages sont inhibés dans des proportions variant de 50 à % De même, les tests basés sur la libération d'anion superoxyde 02 responsable de la bactéricidie par les macrophages, l'incorporation de glucosamine, la libération de P-glucoronidase ainsi que la phagocytose de particules de latex radiomarquées montrent une inhibition dans les mêmes proportions (C Auriault et coll, Immunology Letters, 2, ( 1980),135-139). Ces résultats indiquent que c'est essentiellement le méca 4 isme d'activa- tion du macrophage qui est partiellement bloqué. L'hydrolysat des Ig G par les protéases parasitaires maintient les cellules à leur niveau de base d'activité quelle que soit la stimulation utilisée comme les réactions Ig E-anti-Ig E, Ig G-anti-Ig G, les peptides muramyl- dipeptide ou cyclomunine ou encore une "elicitation" "in vivo" par la protéose peptone. D'autre part, les macrophages alvéolaires de sujets allergiques stimulés par l'allergène correspondant sont également inhibés de manière signifi- cative ( 50 à 60 %) s'ils ont été préalablement incubés avec des produits de l'hydrolyse des Ig G par les protéases parasitaires. En outre, il semble que les peptides de cet hydrolysat n'exercent pas d'activité inhibitrice vis-à-vis d'autres types cellulaires comme les lymphocytes et les éosinophiles et soient par conséquent spécifiques des cellules phagocytaires. On a montré également que l'inhibition des macrophages par les peptides d'Ig G n'est pas la conséquence d'une cytotoxicité de l'hydrolysat Des contrôles effectués au bleu trypan ou au diacétate de fluorescéine ont révélé que le nombre de cellules vivantes est identique avec ou sans 3 préincubation avec un hydrolysat d'Ig G. A la lumière de ces informations, on a émis l'hypothèse, dans le cadre de la présente invention, que le ou les peptides inhibiteurs pourraient se trouver dans la région charnière des Ig G particulièrement riche en proline. En effet, la spécificité des enzymes secrétés par les schistosomules et particulièrement les iminopeptidases pourraient vraisemblablement générer, à partir de cette région, des peptides susceptibles d'inhiber le macro- phage, cellule impliquée dans la réponse immunitaire anti-schistosome. De plus, l'hydrolyse des molécules d'Ig G monoclonales de rat (Ig G 2 a) ou humaines (Ig GI) génère une activité inhibitrice identique à celle obtenue avec des Ig G polyclonales de rat ou humaines alors qu'un hydrolysat effec- tué à partir d'Ig G 4 humaine est très faiblement ou même non inhibiteur. La région charnière des Ig GI humaines dans laquelle se trouve la séquence Val-Gln-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Gln-Gln montre notamment l'existence de proline fixée entre la lysine d'une part et l'arginine d'autre part. Dans le cadre de l'invention, on a testé vis-à-vis de l'activité macro- phagique, deux-tripeptides issus de la région charnière de la sous-classe Ig GI à savoir la L-thréonyl-L-lysyl-L-proline et la L-lysyl-L-prolyl-L- arginine et on a constaté, de manière surprenante, que de ces deux tripep- tides seule la L-thréonyl-L-lysyl-L-proline est inhibitrice de l'activité des macrophages de rat. Ainsi, on a pu mettre en évidence, dans le cadre de la présente invention qu'un tripeptide situé dans la région CH 2 des Ig GI humaines en l'occurence la L-thréonyl-L-lysyl-L-proline peut être considérée au sein de l'hydrolysat des Ig G par les protéases parasitaires comme au moins un des peptides responsables de l'inhibition de la fonction phagocytaire des macrophages découverte antérieurement pour l'ensemble de cet hydrolysat. Selon des tests effectués par les méthodes décrites dans Immunology Letters cité ci-dessus, la L-thréonyl-L-lysyl-L-proline s'est révélée atoxique pour les cellules et inhibitrice non seulement de la libération mais également de la synthèse de P-glucoronidase, enzyme lysosomial puisque le taux intra- cellulaire de cet enzyme décroit également Enfin, lorsque des macrophages de patients allergiques sont pré-incubés en présence de L-thréonyl-Llysyl- L-proline, leur stimulation par l'allergène correspondant "in vitro" est déprimée de manière très significative ( 50 à 70 %) La L-thréonyl-L-lysyl- 2529461 - 4 - L-proline présente un tel pouvoir inhibiteur d'environ 60 % aux concentra- tions de 200 nanogrammes à 20 picogrammes, ce pouvoir inhibiteur étant même de 50 % à 2 picogrammes La libération d'anion superoxyde par les ma- crophages de rats est également inhibée par le tripeptide en question. Le macrophage étant l'une des principales cellules impliquées dans des processus pathologiques par exemple inflammatoires, les composés capables d'inhiber son activité devraient présenter un intérêt pharmacologique tout particulier. Le tripeptide ainsi décrit à savoir la L-thréonyl-Llysyl-L-proline et ses sels pharmaceutiquement acceptables seront par conséquent susceptibles de grande utilité thérapeutique comme agents anti-inflammatoires, anti-aller- giques ou antalgiques. Ce composé étant un peptide, il aura l'avantage supplémentaire d'être peu ou pas immunogène, facile à synthétiser et biochimiquement stable. La L-thréonyl-L-lysyl-L-proline est un produit connu Elle a été publiée par exemple par Nishioka, Satok, Constantopoulos et Najjar dans Biochem. Biophys Acta 1973, 310 ( 1), pp 230-237 ou par Stabinsky, Gottlieb et Fridkin dans Mol Cell Biochem vol 30, No 3, pp 165-170 qui renseignent également un procédé pour la préparer Néanmoins, aucune propriété ni phar- macologique ni thérapeutique n'a jamais été révélée par ce tripeptide. D'une manière classique, ce composé peut être obtenu suivant la technique de la phase solide de Merrifield, technique basée sur une synthèse progres- sive par additions successives des trois acides aminés. Ces additions se font par condensation entre le groupe carboxyle d'un acide aminé et le groupe amino de l'autre acide aminé pour former une liaison peptidique En outre, il est nécessaire de bloquer le groupe amino d'un des acides et le groupe carboxyle de l'autre au moyen de groupements blo- queurs faciles à éliminer. Dans le cas présent, on fixe tout d'abord la proline sur une particule de résine, par une liaison ester et on forme progressivement le peptide par additions successives, à la proline, de lysine protégée et de thréonine protégée. Les sels pharmaceutiquement acceptables, quant à eux, sont préparés de manière classique en traitant la L-thréonyl-L-lysyl-L-proline avec la quantité équivalente d'hydroxyde de métal alcalin en vue d'obtenir un sel de métal alcalin ou avec la quantité équivalente d'acide organique ou inorganique approprié en vue d'obtenir un sel d'addition d'acide. La L-thréonyl-L-lysyl-L-proline et ses sels pharmaceutiquement acceptables peuvent être administrés seuls mais plus généralement en association avec un véhicule pharmaceutique ou un excipient approprié. De telles compositions thérapeutiques peuvent être présentées sous toute forme convenant à l'administration en thérapie humaine ou vétérinaire Pour ce qui concerne l'unité d'administration, celle-ci peut prendre la forme, par exemple, d'un comprimé,d'une dragée, d'une capsule, d'une gélule, d'une poudre, d'une suspension ou d'un sirop pour l'administration orale, d'un suppositoire pour l'administration rectale,d'une solution stérile ou sus- pension pour l'administration parentérale ou d'une crème, d'un onguent, d'une lotion ou d'un gel pour l'administration topique. De même, les compositions thérapeutiques en question pourront également se présenter sous forme d'une capsule ou d'un aérosol pour l'administration par voie respiratoire, d'une solution ou suspension pour l'administration nasale ou encore d'une solution ou suspension pour l'administration ophtal- mique. Suivant la voie d'administration choisie, les compositions thérapeutiques de l'invention seront préparées en associant la L-thréonylL-lysyl-L-proline ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, avec un véhicule ou un excipient approprié, ce dernier pouvant être constitué par exemple d'au moins un ingrédient sélectionné parmi des substances telles que l'eau dis- tillée, l'alcool benzylique, le lactose, les amidons, le talc, le stéarate de magnésium, la polyvinylpyrrolidone, l'acide alginique, la silice colloï- dale, les agents édulcorants etc La quantité de principe actif selon l'invention par unité d'administration variera selon que cette unité sera destinée à l'administration orale, rectale, parentérale, respiratoire, nasale ou autre Dans le cas d'admi- nistration respiratoire, l'unité qui pourra être une capsule pour inhala- tion, comprendra par exemple de 10 à 30 mg par unité d'administration. Pour l'administration nasale, on pourra envisager par exemple des solutions contenant de 1 à 3 % de principe actif selon l'invention. L'administration journalière de L-thréonyl-L-lysyl-L-proline ou de ses sels pharmaceutiquement acceptables dépendra de la voie d'administration choisie. Par exemple, lors d'administration par voie respiratoire, la quantité de ce principe actif pourra varier de 20 à 100 mg/jour à un être humain adulte -6 - tandis que lors d'administration nasale ou ophtalmique, cette quantité pourra être de 10 à 30 mg/jour. A titre d'exemples, non limitatifs, on décrira, par la suite, la prépara- tion de la L-thréonyl-L-lysyl-L-proline et de ses sels pharmaceutiquement acceptables ainsi que de compositions thérapeutiques les contenant. EXEMPLE 1 L-Thréonyl-L-lysyl-L-proline et ses sels Sous agitation mécanique, on fait réagir pendant 24 h à 80 C, 13,8 mmoles de t-BOC-proline (BOC = tert-butyloxycarbonyl) avec 20 g de résine chloro- méthylée (résine de polystyrène-divinylbenzène chlorométhylée contenant 2, 2 mmoles de chlorure par gramme de résine) dans un mélange constitué de 12,4 mmoles de triéthylamine et 30 ml d'éthanol On lave la résine avec de l'acide acétique puis avec de l'alcool absolu et on poursuit le lavage avec de l'eau contenant des quantités croissantes d'éthanol On continue le lavage avec de l'éthanol, du méthanol:et du chlorure de méthylène puis on sèche la résine sous vide jusqu'à poids constant. Dans un ballon équipé pour la réaction de Merrifield, on place 1,5 g de résine correspondant à 0,45 mmole de t-BOC-proline et on élimine, à température ordinaire pendant une durée de 30 min, le groupement protec- teur t-BOC avec 15 ml d'acide trifluoroacétique dans le chlorure de méthyl- ène On lave la résine avec du chlorure de méthylène puis avec 3 fractions de 15 ml de chloroforme. On ajoute à la résine 1 ml de triéthylamine et 9 ml de chloroforme et on agite pendant 10 min de façon à neutraliser le chlorhydrate Après lavage au chloroforme et au chlorure de méthylène, on couple le Na de la proline pendant 2 heures et de façon continue avec 1,35 mmole de N-t-BOC-Ne-carbo- benzyloxy-lysine dans 15 ml de chlorure de méthylène et ce, au moyen de 1, 35 mmole de dicyclohexylcarbodiimide On lave la résine avec de l'éthanol, du chloroforme et du chlorure de méthylène en utilisant dans chaque cas 3 fractions de 15 ml On combine alors, de manière semblable au N de la lysine après élimination du groupe protecteur et neutralisation 1,35 mmole de N -t-BOC-O-benzyl-thréonine et on répète les mêmes opérations ultérieures. On sépare le tripeptide de la résine en utilisant un mélange acide bromhy- drique/acide trifluoroacétique à la température ambiante pendant 1,5 heure. On sèche sous vide, lave à l'eau et lyophilise On reprend le produit obtenu dans 10 ml de méthanol contenant 10 % d'acide acétique et on chromatographie -7- ce mélange sur une colonne d'aminex en utilisant la pyridine comme éluant. On sèche le produit recueilli, on le lave deux fois avec de l'acide acétique 0,1 molaire, on le reprend dans l'acide acétique 0,1 molaire et on le lyophilise. On obtient ainsi la L-thréonyl-L-lysyl-L-proline sous forme ac 6 tate que l'on peut éventuellement faire réagir avec la quantité appropriée d'hydro- xyde de sodium pour donner la L-thréonyl-L-lysyl-L-proline sous forme de sel sodique. EXEMPLE 2 Suivant des techniques pharmaceutiques connues, on a préparé les composi- tions suivantes: a) Capsule pour administration respiratoire L-Thréonyl-Llysyl-L-proline 20 mg (sel sodique) Lactose 30 mg mg b) Solution pour administration nasale L-Thréonyl-L-lysyl-L-proline 2000 mg (sel sodique) Chlorure de benzalkonium 10 mg Edetate sodique 10 mg Eau distillée qs p 100 ml 2529461 _ 8- REVENDICATIONS 1 Nouveaux médicaments utiles notamment pour inhiber l'activité phago- cytaire des macrophages, caractérisés en ce qu'ils consistent en la L-thréonyl-L-lysyl-L-proline et ses sels pharmaceutiquement acceptables. 2 Nouveaux médicaments utiles notamment comme agents anti-inflammatoires, anti-allergiques ou antalgiques, caractérisés en ce qu'ils consistent en la L-thréonyl-L-lysyl-L-proline et ses sels pharmaceutiquement acceptables. 3 Nouveau médicament selon la Revendication I ou 2 caractérisé en ce qu'il consiste en la L-thréonyl-L-lysyl-L-proline sous forme sodique. 4 Compositions thérapeutiques caractérisées en ce qu'elles contiennent, à titre de principe actif au moins un médicament selon la Revendication 1, en association avec un véhicule pharmaceutique ou un excipient appro- prié. 5 Compositions thérapeutiques caractérisées en ce qu'elles contiennent, à titre de principe actif, au moins un médicament selon la Revendication 2, en association avec un véhicule pharmaceutique ou un excipient appro- prié. 6 Compositions thérapeutiques caractérisées en ce qu'elles contiennent, à titre de principe actif le médicament selon la Revendication 3, en association avec un véhicule pharmaceutique ou un excipient approprié. 7.Compositions thérapeutiques selon l'une quelconque des Revendications 4 à 6, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous forme unitaire, pour l'administration orale, rectale, parentérale ou topique. 8 Compositions thérapeutiques selon l'une quelconque des Revendications 4 à 6 caractérisées en ce qu'elles se présentent sous forme unitaire pour l'administration respiratoire. 9 Compositions thérapeutiques selon l'une quelconque des Revendications 4 à 6, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous forme unitaire pour l'administration nasale ou ophtalmique. Compositions thérapeutiques selon l'une quelconque des Revendications 4 à 6 caractérisées en ce qu'elles se présentent sous forme de comprimé, de dragée, de capsule, de gélule, de poudre, de solution stérile, de suspension, de sirop, de suppositoire, de crème, d'onguent ou de gel.