FR 2530662 A1 19840127 FR 8303756 A 19830308 La présente invention concerne dans son ensemble le domaine de la technologie de recombinaison de l'ADN, des moyens et des procédés utilisant cette technologie dans l'élaboration d'une large classe d'interférons ani- maux et leur production, ainsi que les divers produits de cette production et leurs applications. La présente invention a plus particulièrement trait à l'isolement et à l'identification de séquences d'ADN codant pour des interférons animaux, et à l'éta- blissement de véhicules d'expression d'ADN recombiné, contenant ces séquences d'ADN, en liaison opérationnelle avec des séquences de promoteurs effectuant l'expression, et aux véhicules d'expression ainsi constitués Selon un autre aspect, la présente invention concerne des systèmes de cultures hôtes, par exemple des cultures de cellules de divers micro-organismes et vertébrés, transformées avec ces véhicules d'expression et,par conséquent, orien- tées sur l'expression des séquences d'ADN auxquelles il est fait allusion ci-dessus Selon d'autres aspects, l'in- vention concerne des moyens et des procédés de transfor- mation des nouveaux produits finals de cette expression en entités telles que des compositions pharmaceutiques utiles au traitement prophylactique ou thérapeutique d'animaux En outre, l'invention se rapporte à divers procédés utiles à la production des séquences d'ADN, des véhicules d'expression, des systèmes de cultures hôtes et des produits finals et de leurs entités en question, et à leurs formes de réalisation particulières et asso- ciées. La présente invention provient en partie de la découverte de la séquence d'ADN et de la séquence d'amino- acides déduite codant pour une série d'interférons alpha de boeuf, y compris leurs séquences de flanquement 3 ' et 5 ' facilitant leur liaison in vitro dans des véhicules d'ex- pression Ces découvertes, quant à elles, permettent le développement des moyens et des procédés de production, par la technologie de recombinaison de l'ADN, de quantités suffisantes d'interférons animaux pour permettre, à leur tour, la détermination de leurs propriétés biochimiques et de leur bio-activité, rendant ainsi possible leur production efficace en vue d'une exploitation industrielle/ biologique. Des publications et autres informations utilisées dans le présent mémoire pour éclairer le fond de l'inven- tion, et dans des cas particuliers, pour apporter d'autres détails concernant sa mise en pratique, sont incorporées au présent mémoire à titre de référence et, par commodité, elles sont désignées par un numéro de référence dans la description qui suit et groupées, respectivement, sous le titre "bibliographie" en fin de description. A Interférons animaux Des composants appelés interférons ont été isolés de tissus de diverses espèces phylogénétiques inférieures à l'homme ( 1,2, 3) Des études d'activité conduites avec ces interférons ont montré divers degrés d'effets anti- viraux chez l'animal-hôte nécessaire ( 3,4,5,6) Il a aussi été démontré que ces interférons n'étaient pas toujours propres à l'espèce Par exemple, des préparations d'inter- férons bovins isolés de tissus ont exercé une activité antivirale sur des cellules de singes et d'homme ( 7) De même, des interférons humains se sont montrés actifs dans diverses cellules d'espèces inférieures du point de vue phylogénétique (voir 7). Cette interactivité entre espèces est due sans aucun doute à un haut degré de conservation homologue, tant dans la composition que dans la séquence des amino- acides, parmi les interférons Toutefois, jusqu'à présent, cette explication est restée théorique parce que les quan- tités et les puretés d'interférons animaux qui ont pu être obtenus ont été insuffisantes pour la conduite d'expériences non ambiguës sur la caractérisation et sur les propriétés biologiques des composants purifiés vis-à-vis de plusieurs de leurs contreparties humaines ( 8,9,10,11,12). En tout cas, malgré ces faibles quantités et ces faibles puretés, une liaison de cause à effet a été établie entre l'interféron et l'activité antivirale chez l'animal- hôte nécessaire Ainsi, la production d'interférons animaux en de hauts rendements et avec de grandes puretés serait désirable en vue d'entreprendre et de conduire avec succès des épreuves biologiques sur des animaux et conduisant à une exploitation commerciale, dans le traitement d'animaux contre des infections virales et d'affections malignes et résultant d'une immunosuppression ou d'une immunodéficience. En outre, la production d'espèces isolées d'interférons animaux permettrait leur caractérisation, tant physique que bio-active, et constituerait donc une base de classi- fication et, par conséquent, d'études comparatives avec des espèces correspondantes d'interférons humains (voir 8 à 20). Des études effectuées avec des interférons ani- maux, jusqu'à l'avènement de la présente invention, étant 1-5 limitées à l'utilisation de préparations plutôt brutes, en raison de leur très faible disponibilité, suggèrent néanmoins des fonctions biologiques très importantes La classe d'interférons animaux est non seulement liée à une puissante activité thérapeutique antivirale, mais ces interférons constituent également, à l'état potentiel, un auxiliaire prophylactique conjointement avec un vaccin et/ou un traitement antibiotique, ce qui indique claire- ment qu'il s'agit de candidats cliniques et commerciaux très prometteurs. Il a été ressenti que la mise en pratique de la technologie de recombinaison de l'ADN constituerait un moyen très efficace d'obtention des plus grandes quan- tités désirées d'interférons animaux nécessaires pour réaliser une exploitation clinique et commerciale Les matières ainsi produites, qu'elles comportent ou non une glycosylation qui est considérée comme caractéristique de la matière dérivant de l'état naturel, présenteraient vraisemblablement une activité biologique admettant leur utilisation clinique dans le traitement d'une large gamme d'affections ou de maladies virales, néoplastiques et à immunosuppression chez les animaux. B Technologie de recombinaison de l'ADN La technologie de recombinaison de l'ADN est parvenue à l'âge d'une certaine sophistication Les spécialistes en biologie moléculaire sont capables de recombiner diverses séquences d'ADN avec une certaine facilité, en créant de nouvelles entités d'ADN capables de produire des quantités importantes de protéine exogène dans des micro-organismes transformés On dispose de moyens et de procédés généraux pour la liaison in vitro de divers fragments d'ADN à extrémité émoussée ou "col- lante", donnant des véhicules d'expression puissants et pouvant être utilisés dans la transformation d'organismes particuliers, ce qui oriente donc leur synthèse efficace d'un produit exogène désiré Toutefois, sur la base d'un produit individuel, la voie à suivre reste un peu tor- tueuse et la science n'a pas progressé au point que de véritables prédictions de succès puissent être faites. En effet, ceux qui pressentent des résultats couronnés de succès sans l'appui de la base expérimentale le font avec un risque considérable d'inefficacité. Le plasmide, boucle extrachromosomique d'ADN à deux brins, que l'on rencontre dans des bactéries et dans d'autres micro-organismes, souvent en plusieurs répliques par cellule, demeure un élément fondamental de la technologie de recombinaison de l'ADN L'information codée dans l'ADN de plasmide renferme celle qui est né- cessaire à la reproduction du plasmide dans des cellules filles (c'est-àdire une origine de réplication) et ordinairement, une ou plusieurs caractéristiques phéno- typiques de sélection telles que, dans le cas de bactéries, la résistance aux antibiotiques, qui permettent à des clones de la cellule-hôte contenant le plasmide en ques- tion d'être reconnus et préférentiellement développés dans des milieux sélectifs L'utilité de plasmides réside dans le fait qu'ils peuvent être clivés spécifiquement par une certaine endonucléase de restriction ou un certain "enzyme de restriction", chacun reconnaissant un site différent sur l'ADN du plasmide Ensuite, des gènes ou fragments de gènes hétérologues peuvent être insérés dans le plasmide par liaison bout à bout sur le site de clivage ou aux extrémités reconstituées adjacentes au site de clivage On crée ainsi des véhicules d'expression que l'on qualifie d'aptes à la réplication La recombinaison de l'ADN s'effectue en dehors de la cellule, mais le véhicule d'expression répliquable "recombinant" résultant, ou plasmide, peut être introduit dans des cellules par un processus appelé transformation, et de grandes quantités du véhicule recombinant sont obtenues par le développement du transformant En outre, lorsque le gène est convenable- ment introduit par rapport à des portions du plasmide qui régissent la transcription et la traduction du message d'ADN codé, le véhicule d'expression résultant peut être utilisé pour produire réellement la séquence polypeptidi- que pour laquelle code le gène inséré, processus que l'on appelle expression. L'expression est amorcée dans une région appelée promoteur, qui est reconnue par l'ARN-polymérase et liée par cette dernière Dans la phase de transcription de l'expression, l'ADN se déroule, ce qui l'expose comme un gabarit à la synthèse de l'ARN messager amorcée à partir de la séquence d'ADN L'ARN messager est traduit,quant à lui, en un polypeptide qui présente la séquence d'amino- acides codée par l'ARN messager (AR Nm) Chaque amino-acide est codé par un triplet de nucléotides ou "codon" qui constitue collectivement le "gène structural", c'est-à-dire la partie qui code la séquence d'amino- acides du produit polypeptidique exprimé La traduction est amorcée à un signal de "départ" (ordinairement un signal ATG, qui devient un signal AUG dans l'ARN messager résultant) Des codons dits de terminaison définissent la fin de la traduction et, par conséquent, de la production d'autres motifs d'amino- acides Le produit résultant peut être obtenu par lyse éventuelle de la cellule-hôte, dans des systèmes micro- biens, et isolement du produit d'autres protéines par une purification appropriée. Dans la pratique, l'utilisation de la technologie de recombinaison de l'ADN peut exprimer des polypeptides entièrement hétérologues ce que l'on appelle expression directe ou bien, à titre de variante, elle peut exprimer un polypeptide hétérologue soudé à une portion de la séquence d'amino-acides d'un polypeptide homologue Dans les derniers cas, le produit bio-actif désiré est parfois rendu bio-inactif au sein du polypeptide homologue/hété- rologue soudé jusqu'à ce qu'il soit clivé dans un environ- nement extracellulaire ( 21, 22). C Technologie de la culture cellulaire L'art de la culture des cellules ou des tissus en vue de l'étude de la génétique et de la physiologie cellulaire est une technique bien établie Des moyens et des procédés sont disponibles pour maintenir des lignées cellulaires permanentes, préparées par des transferts successifs en série à partir de cellules normales isolées. En vue de leur utilisation dans la recherche, ces lignées cellulaires sont maintenues sur un support solide dans un milieu liquide, ou par culture dans une suspension contenant des éléments nutritifs de support L'adaptation à une grande échelle de préparation semble ne poser que des problèmes mécaniques (on renvoie d'une façon générale à 23 et 24). La présente invention est basée sur la découverte selon laquelle la technique de recombinaison de l'ADN peut être utilisée pour produire avec succès des interférons animaux, et chacun d'entre eux, de préférence sous la forme directe et en quantités suffisantes pour la mise en route et la conduite d'essais cliniques constituant des conditions préalables à l'approbation commerciale. Le produit est apte à être utilisé, sous toutes ses formes, dans le traitement prophylactique ou thérapeutique d'ani- maux, notamment pour des infections virales et des condi- tions malignes et impliquant une immunosuppression ou une immunodéficience Ses formes comprennent diverses formes oligomériques possibles qui peuvent comprendre une glycosylation associée de même que des variations d'allèles intéressant des membres individuels ou des familles uni- taires Les produits sont formés par des micro-organismes fabriqués génétiquement ou des systèmes de cultures de cellules Par conséquent, on est à présent à même de préparer et d'isoler des interférons animaux d'une manière plus efficace que cela n'avait été possible Un facteur important de la présente invention, dans sa forme de réa- lisation la plus appréciée, réside dans l'accomplissement de l'orientation génétique d'un micro-organisme ou d'une culture cellulaire pour produire un interféron animal représentatif, à savoir un interféron de boeuf, en quan- tités pouvant être isolées, engendré par la cellule-hâte sous la forme mature. La présente invention comprend les interférons animaux ainsi produits et les moyens et les procédés per- mettant de les obtenir La présente invention est en outre axée sur des véhicules d'expression d'ADN susceptibles de réplication, abritant des séquences de gènes qui codent des interférons animaux sous une forme apte à l'expression. En outre, la présente invention est orientée sur des souches de microorganismes ou des cultures de cellules transformées avec les véhicules d'expression décrits ci-dessus, et sur des milieux de fermentation comprenant ces souches ou cultures transformées, capables de produire des interférons animaux. Selon d'autres aspects, la présente invention pro- pose divers procédés utiles pour la préparation desdites séquences de gènes d'interféron, de véhicules d'expression d'ADN, de souches de micro-organismes et de cultures cel- lulaires et leurs formes de réalisation particulières. L'invention a trait en outre à la préparation de milieux de fermentation desdits micro-organismes et desdites cul- tures de cellules En outre, dans certains systèmes-hôtes, des vecteurs peuvent être conçus pour produire l'interféron animal désiré, sécrété par la cellule-hôte sous la forme mature L'interféron contenant la séquence de signaux dérivée de la région de flanqu Ement 5 ' du gène correct est considérée comme étant transportée vers la paroi cellulaire des organismes-hôtes o, aidant à ce transport, la portion de signal est clivée pendant le processus de sécrétion de l'interféron à maturité obtenu comme produit Cette forme de réalisation permet d'isoler et de purifier l'interféron mature désiré sans recourir à des processus compliqués conçus pour éliminer des impuretés de la protéine-hôte intracellulaire ou des débris cellulaires. En outre, l'invention est particulièrement axée sur la préparation d'un interféron de boeuf représentatif de la classe des interférons animaux couverte par la pré- sente invention, produits par expression directe sous la forme mature. L'expression "interféron animal mature" utilisée dans le présent mémoire signifie la production microbien- ne ou par culture cellulaire d'interféron animal ne s'ac- compagnant pas du peptide de signal ou du peptide de pré- séquence qui est immédiatement lié à la traduction de l'AR Nm de l'interféron animal Conformément à la présente invention, il est produit de la sorte un interféron animal mature dont le premier amino-acide est la méthionine (pré- sente par suite de l'insertion du codon de signal de départ ATG en face du gène structural) ou bien comportant son amino-acide normalement le premier lorsque la méthionine est clivée intracellulairement ou extracellulairement. Un interféron animal mature peut aussi être produit, con- formément à ce qui précède, conjointement avec une pro- téine conjuguée autre que le polypeptide de signal clas- sique, le conjugué étant clivable spécifiquement dans un environnement intracellulaire ou extracellulaire (voir 21) Enfin, l'interféron animal mature peut être produit par expression directe sans qu'il soit nécessaire d'éli- miner par clivage tout polypeptide étranger superflu Cela revêt une importance particulière lorsqu'un hôte donné ne peut pas éliminer, ou ne peut pas le faire efficace- ment, un peptide de signal dont le véhicule d'expression est destiné à exprimer l'interféron mature en même temps que son peptide de signal L'interféron mature ainsi pro- duit est recueilli et purifié à un point permettant son utilisation dans le traitement d'affections viralesmali- gnes et d'affections à immunosuppression ou immuno- déficience. Des interférons animaux selon la présente inven- tion sont des interférons autrement endogènes vis-à-vis de l'organisme de l'animal comprenant, selon une nomen- clature analogue à celle des interférons humains, des interférons animaux alpha (leucocyte), bêta (fibroblaste) et gamma (immun) Ces trois séries ont toutes été iden- tifiées dans un modèle animal En outre, en se basant sur l'exemple de l'interféron de boeuf, la série animale alpha est composée d'une famille de protéines comme dans le cas humain; les protéines qui ont été examinées ont un plus faible degré d'homologie,vis-à-vis d'interférons alpha humains correspondants, que ces interférons animaux n'en ont entre eux ou que les interférons humains alpha n'en ont entre eux En outre, la série bovine bêta est composée d'une famille de protéines distinctes du cas humain De plus, l'invention propose des interférons hybrides entre espèces et entre familles, en tirant profit de sites communs de restriction dans les gènes des divers interférons animaux en question et recombinaison de por- tions correspondantes, conformément à des procédés connus (voir 57). En tout cas, les interférons animaux entrant dans le cadre de la présente invention comprennent ceux qui sont normalement d'origine endogène chez des animaux du type oiseau, boeuf, chien, cheval, chat, chèvre, mouton, poisson et porc En particulier, la présente invention propose des interférons d'animaux fissipèdes tels que les bovins, les ovins et les chèvres Les interférons offerts par la présente invention trouvent une application comme agents antiviraux et antitumoraux chez l'animal-hôte respectif Par exemple, les interférons de boeuf doivent trouver des applications pratiques dans le traitement du complexe respiratoire-chez les bovins, soit conjointement avec des antibiotiques (connus) en tant que composant thérapeutique, soit avec des vaccins en tant que composant prophylactique L'utilité au niveau de la classe, démontrée de la manière décrite ci-dessus, s'étendrait à d'autres bovins et aux chèvres, aux moutons, aux porcs, aux chevaux, aux chiens, aux chats, aux oiseaux et aux poissons Chez les chevaux, les chiens, les chats et les oiseaux, on pourrait s'attendre à ce que l'effet antitumoral des inter- férons correspondants revête une importance commerciale particulière. Le mode opératoire suivant, basé sur l'interféron de boeuf en tant que représentant de la classe, peut être utilisé pour l'obtention d'interférons animaux conformé- ment à l'invention: 1 Des tissus de boeuf, par exemple le tissu pancréatique de boeuf, ont été réduits en poudre congelée et traités pour digérer l'ARN et les mabières protéiniques et pour former,par précipitation,de l'ADN de boeuf de haut poids moléculaire. 2 L'ADN de haut poids moléculaire a été partielle- ment digéré en vue d'une coupure s'effectuant au hasard par rapport au locus du gène. 3 Les fragments d'ADN résultants ont été frac- tionnés par grandeurs en donnant des fragments de 15 à 000 paires de bases. 4 Les fragments résultants de l'étape 3 ont été clonés en utilisant comme vecteur un phage X Charon 30. Les vecteurs ainsi préparés ont été groupés in vitro ein particules infectieuses de phages contenant de l'AD Nr pour réaliser une phagothèque Cette action a été amplifiée par propagation sur des cellules bactérien- nes jusqu'à un facteur d'environ 106 Les phages ont été développés jusqu'à l'obtention d'une confluence effective sur un tapis de bactéries, et sélectionnés en vue d'une hybridation avec un échantillon radio-actif d'interféron humain. 6 L'ADN correspondant a été isolé des clones appropriés et on en a dressé la carte de restriction que l'on a analysé par hybridation selon Southern Des fragments de restriction contenant des gènes d'interféron de boeuf ont été subclonés en véhicules plasmidiques, puis séquen- cés. 7 L'ADN séquencé a ensuite été adapté in vitro à l'insertion dans un véhicule d'expression approprié qui a été utilisé pour transformer une cellule-hâte appropriée que l'on a laissée, quant à elle, se développer dans une culture et exprimer l'interféron de boeuf constituant le produit désiré. 8 L'interféron de boeuf ainsi produit comprend 166 amino-acides dans sa forme mature, commençant par la cystéine, et 23 dans la pré-séquence, et il est de carac- tère très hydrophobe Son poids moléculaire monomérique a été trouvé égal à environ 21 409 par le calcul Il pré- sente des caractéristiques semblables aux interférons leucocytaires humains ( 8,9,10,11) et on a trouvé qu'il était homologue vis-à-vis de l'interféron leucocytaire humain en proportion d'environ 60 %. A Micro-organismes/cultures cellulaires 1 Souches bactériennes/promoteurs Les travaux décrits dans le présent mémoire ont été exécutés au moyen, entre autres, du micro-organisme E coli K-12, souche 294 (extrémité A, thi, hsr-, khsm+) ( 25) Cette souche a été déposée auprès de l'American Type Culture Collection, sous le N ATCC 31446 Toutefois, diverses autres souches microbiennes sont utiles, par exemple les souches connues de E coli telles que E coli B, E coli X 1776 (ATCC N 31537) et E coli W 3 110 (F-, X-, protrophique) (ATCC N 27325), E coli DP 50 Su PF (ATCC N 39061, déposé le 5 Mars 1982), E coli JM 83 (ATCC N 39062, déposé le-5 Mars 1982) et d'autres souches micro- biennes dont beaucoup sont déposées et disponibles (à l'état potentiel) auprès d'institutions reconnues pour le dépôt de micro-organismes, par exemple American Type Culture Collection (ATCC) cf liste du catalogue ATCC (voir égale- ment 26, 26 a) Ces autres micro-organismes comprennent, entre autres, des espèces du genre Bacillus telles que Bacillus subtilis et d'autres enterobacteriaceae parmi les- quelles on peut mentionner, à titre d'exemples, Salmonella typhimurium et Serratia marcescens, en utilisant des plas- mides qui peuvent répliquer et exprimer des séquences de gènes hétérologues qui s'y trouvent. A titre d'exemples, les systèmes promoteurs formés de bêta-lactamase et de lactose ont Èté avantageusement utilisés pour amorcer et entretenir la production micro- bienne de polypeptides hétérologues Des détails relatifs à la composition et à la constitution de ces systèmes promoteurs peuvent être trouvés dans les références ( 27) et ( 28) Plus récemment, un système basé sur l'opéron du tryptophane, système promoteur appelé trp, a été mis au point Des détails relatifs à la composition et à la constitution de ce système ont été publiés par Goeddel et collaborateurs ( 12) et par Kleid et collaborateurs ( 29). De nombreux autres promoteurs microbiens ont été découverts et utilisés et des détails concernant leurs séquences de nucléotides, permettant à un opérateur expérimenté de les lier fonctionnellement dans des vecteurs plasmidiques, ont été publiés voir ( 30). 2 Souches de levures/promoteurs de levures Le système d'expression dont il s'agit peut aussi utiliser le plasmide Y Rp 7 ( 31, 32, 33) qui est capable de sélection et de réplication à la fois dans E coli et dans la levure Saccharomyces cerevisiae Pour la sélec- tion dans la levure, le plasmide contient le gène TR Pl ( 31, 32, 33) qui complémente (permet le développement en l'absence de tryptophane) la levure renfermant des muta- tions dans ce gène porté par le chromosone IV de la levure ( 34) Une souche utile est la souche RH 218 ( 35) déposée auprès de l'American Type Culture Collection sans restric- tion une mutation qui produit la cellule trp 1 constituerait l'en- vironnement efficace pour l'expression du plasmide conte- nant le système d'expression Un exemple d'une autre souche que l'on pourrait utiliser est la souche pep 4-1 ( 36) Cette souche auxotrophe de tryptophane a également une mutation ponctuelle dans le gène TRP 1. Lorsqu'elle est placée du côté 5 ' d'un gène de non-levure, la séquence de flanquement 5 ' de l'ADN (promoteur) d'un gène de levure (pour l'alcool déshydrogénase 1) peut activer l'expression d'un gène étranger de la levure en position dans un plasmide utilisé pour transformer la levure Outre un promoteur, l'expression correcte, dans la levure, d'un gène de non-levure nécessite une seconde séquence de levure disposée à l'extrémité 3 ' du gène de non-levure sur le plasmide de manière à permettre la terminaison correcte de transcription et une polyadényla- tion dans la levure Ce promoteur peut être convenablement utilisé dans la présente invention de même que d'autres voir ci-dessous Dans les formes de réalisation préconisées, la séquence de flanquement 5 ' du gène de 3-phosphoglycêrate- kinase de la levure ( 37) est placée en amont du gène struc- tural suivi de nouveau d'ADN contenant des signaux de terminaison polyadénylation, par exemple, le gène de TR Pl ( 31, 32, 33) ou le gène de PGK ( 37). Du fait que la séquence de flanquement 5 ' de la levure (conjointement avec l'ADN de terminaison de levure 3 ') (voir ci-dessous) peut fonctionner en activant l'ex- pression de gènes étrangers dans la levure, il semble probable que les séquences de flanquement 5 ' de tout gène de levure à forte expression pourraient être utilisées pour l'expression de produits de gènes importants Etant donné que dans certaines circonstances, une levure a exprimé jusqu'à 65 % de sa protéine soluble comme enzymes glycolytiques ( 38) et attendu que ce haut degré semble résulter de la production de fortes proportions d'AR Nm individuels ( 39), il serait possible d'utiliser les séquences de flanquement 5 ' de tous autres gènes glycoly- tiques à de telles fins d'expression par exemple énolase, glycéraldéhyde3-phosphate-déshydrogénase, hexokinase, pyruvate-décarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6- phosphate-isomérase, 3-phosphoglycérate-mutase, pyruvate- kinase, triosephosphate-isomérase, phosphoglucose-isomérase et glucokinase L'une quelconque des séquences de flanque- ment 3 ' de ces gènes pourrait aussi être utilisée pour la terminaison correcte et la polyadénylation d'AR Nm dans un tel système deexpression voir ci-dessus Quelques autres gènes fortement exprimés sont ceux qui correspondent à des phosphatases acides ( 40) et ceux qui expriment de hauts degrés de production par suite de mutations dans les régions de flanquement 5 ' (mutants qui accroissent l'ex- pression) -, habituellement à cause de la présence d'un élément-transposable TY 1 ( 41). Tous les gènes mentionnés ci-dessus sont consi- dérés comme transcrits par l'AMN polymérase II de levure ( 41) Il est possible que les promoteurs d'ARN polymérase I et III qui transcrivent des gènes pour l'ARN de ribosome, l'ARN 5 S et des t ARN ( 41, 42) puissent également être utiles dans de telles constitutions d'expression. Enfin, de nombreux promoteurs de levures contien- nent également un réglage de transcription, si bien qu'ils peuvent être fermés ou ouverts par variation des conditions de croissance Quelques exemples de ces promoteurs de levures sont les gènes qui produisent les protéines sui- vantes: alcool déshydrogénase II, isocytochrome-c, phos- phatase acide, enzymes de dégradation associés au métabolis- me de l'azote, glycéraldéhyde-3-phosphate-déshydrogénase et enzymes responsables de l'utilisation du maltose et du galactose ( 39) Une telle région de réglage serait très utile pour influencer l'expression de produits protéiniques - notamment lorsque leur production est toxique envers la levure Il serait également possible de placer la région de réglage d'une séquence de flanquement 5 ' avec une séquence de flanquement 5 ' contenant un promoteur venant d'un gène fortement exprimé Il en résulterait un promo- teur hybride et cela serait possible, attendu que la région de réglage et le promoteur apparaissent comme des séquences physiquement distinctes d'ADN. 3 Systèmes de cultures cellulaires/vecteurs de cultures cellulaires La propagation de cellules de vertébrés dans une culture (culture de tissus) est devenue au cours des der- nières années un procédé classique (voir 43) La lignée COS-7 de fibroblastes de rein de singe peut être utilisée comme hôte pour la production d'interférons animaux ( 44). Toutefois, les expériences dont les détails sont donnés ici pourraient être effectuées dans toute lignée cellu- laire qui est capable de réplication et d'expression d'un vecteur compatible, par exemple les lignées cellulaires WI 38, BHK, 3 T 3, CHO-, VERO et He La En outre, ce que l'on attend du vecteur d'expression est une origine de répli- cation et un promoteur établi en face du gène à exprimer, en même temps que tous sites nécessaires de liaison du ribosome, les sites de jonction de l'ARN, le site de polyadénylation et les séquences de terminaison de la transcription Bien que ces éléments essentiels de SV 40 aient été exploités ici, il y a lieu de remarquer que bien que les termes de la description de la présente invention s'adressent à une forme de réalisation préconisée, l'invention ne doit nullement être considérée comme limitée à ces séquences Par exemple, l'origine de la réplication d'autres vecteurs viraux (par exemple Polyoma, Adeno, VSV, * BPV, etc) pourrait être utilisée, de même que des ori- gines cellulaires de réplication de l'ADN qui pourraient fonctionner dans un état non intégré. B Systèmes vecteurs 1 Expression directe de l'Interféron de Boeuf Mature chez E coli Le mode opératoire utilisé pour-obtenir l'expres- sion directe d'interféron de boeuf chez E coli en tant que polypeptide d'interféron à maturité (moins la séquen- ce de signaux) a impliqué la combinaison d'un plasmide contenant un fragment de promoteur et le signal de début de traduction avec un fragment adapté d'ADN de génome animal qui contenait la région codant pour l'interféron à maturité. 2 Expression dans une levure Pour exprimer un gène hétérologue tel que l'ADN pour l'interféron animal dans une levure, il est nécessaire de construire un vecteur plasmidique renfermant quatre composants Le premier composant est la partie qui tient compte de la transformation de E coli et de la levure et qui doit donc contenir un gène pouvant être choisi provenant de chaque organisme, par exemple le gène de la résistance à l'ampicilline de E coli et le gène TR Pl de la levure Ce composant exige également une origine de réplication des deux organismes, pour être maintenu comme ADN de plasmide dans les deux organismes, comme l'origine de p BR 322 de E coli et l'origine arsl du chromosome III de la levure. Le second composant du plasmide est une séquence de flanquement 5 ' partant d'un gène de levure fortement exprimé pour promouvoir la transcription d'un gène struc- tural placé en aval, par exemple la séquence de flanque- ment 5 ' utilisée est celle qui part du gène de 3-phospho- glycérate-kinase (PGK) de la levure. Le troisième composant du système est un gène structural construit de telle façon qu'il contient à la fois un départ de traduction ATG et des signaux d'arrêt de traduction L'isolement et la construction d'un tel gène sont décrits ci-après. Le quatrième composant est une séquence d'ADN de levure contenant la séquence de flanquement 3 ' d'un gène de levure, qui renferme les signaux appropriés pour la terminaison de transcription et la polyadénylation. 3 Expression dans une culture de cellules de mammifère La stratégie adoptée pour la synthèse d'interfé- ron immunitaire dans une culture de cellules de mammifère se base sur le développement d'un vecteur capable à la fois d'une réplication et d'une expression autonomes d'un gène étranger sous l'influence d'une unité de transcrip- tion hétérologue La réplication de ce vecteur dans la culture de tissu peut être accomplie en prévoyant une origine de réplication d'ADN (dérivant du virus SV 40) et en créant une fonction d'assistance (antigène T) par l'introduction du vecteur dans une lignée cellulaire don- nant l'expression endogène de cet antigène ( 46, 47). L'ancien promoteur du virus SV 40 précédait le gène struc- tural de l'interféron et assurait la transcription du gène. Un vecteur utile pour obtenir l'expression con- siste en séquences p BR 322, ce qui constitue un marqueur qui peut être choisi pour la sélection dans E coli (résis- tance à l'ampicilline) de même que comme origine de répli- cation d'ADN de E coli Ces séquences sont dérivées du plasmide p ML-1 ( 46) et couvrent la région s'étendant sur les sites de restriction Eco RI et Bam HI L'origine de SV 40 est dérivée d'un fragment Pvu II-Hind III comprenant 342 paires de bases et couvrant cette région ( 48, 49) (les deux extrémités étant converties en extrémités Eco RI). Ces séquences, outre le fait qu'elles comprennent l'ori- gine virale de réplication de l'ADN, codent le promoteur aussi bien pour l'unité précoce que pour l'unité tardive de transcription L'orientation de la région d'origine de SV 40 est telle que le promoteur pour l'unité tardive de transcription occupe une position proche du gène codant pour l'interféron. Sur les dessins annexés La figure 1 reproduit une hybridation de Southern d'ADN de génome (a) humain, (b) bovin et (c> porcin digéré avec Eco RI et hybridé à différentes concentrations de formamide avec un fragment Eco RI comprenant 570 paires de bases et marqué au 32 p, contenant la région de codage de l'hybride A/D d'interféron leucocytaire humain L'hybrida- tion à 20 % de formamide donne l'image la plus claire des familles de gènes mutateurs d'interféron leucocytaire de boeuf et de porc. La figure 2 illustre l'hybridation selon Southern de quatre recombinants phagiques différents d'ADN de génome de boeuf digérés avec Eco RI, Bam HI et Hind III et hybridés avec un échantillon de gènes leucocytaires humains marqués au P Le clone 83 donne deux fragments d'hybridation avec chaque enzyme de restriction. La figure 3 a montre une portion de la séquence de nucléotides issue du sous-clone plasmidique p 83 Bam HI 1 9 kb de même que la séquence d'amino-acides déduite pour l'inter- féron leucocytaire de boeuf qui y est codé Le peptide du signal est représenté par les résidus d'amino-acides 51 à 523. La figure 3 b illustre la séquence de nucléotides et la séquence d'aminoacides dédu Lte pour un second inter- féron leucocytaire de boeuf (a 2) venant du sous-clone plasmidique p 67 Eco RI 3,2 kb. La figure 3 c illustre la séquence totale des nucléotides à l'état mûr et la séquence d'amino-acides déduite pour un troisième interféron leucocytaire (a 3) de boeuf venant du sous-clone plasmidique p 35 Eco RIBam HI 3,5 kb. La figure 3 d illustre la séquence de nucléotides et la séquence d'amino-acides déduite pour un quatrième interféron leucocytaire de boeuf venant du sous-clone plasmidique p 83 Eco RI-Bam HI 2,9 kb Le signal est repré- senté par des résidus d'amino-acides 51 à 523 La protéine à maturité comprend 172 résidus d'amino-acides Il y a lieu de remarquer que le dernier tronçon de 6 résidus d'amino-acides est attribué à un changement des bases du nucléotide dans la position 511, qui permet six autres codons pouvant être traduits avant le dernier signal d'arrêt en phase. La figure 4 compare les séquences d'amino-acides de Bo IFN-a I, a 2, a 3 et a 4 avec les séquences pour 11 inter- férons leucocytaires humains connus Elle indique égale- ment les amino-acides conservés parmi tous les interférons leucocytaires humains, tous les interférons leucocytaires bovins, et vis-à-vis des séquences al et a 4 bovines, les positions dans lesquelles une homologie existe avec la plupart des interférons leucocytaires humains. La figure 5 est une représentation schématique de la constitution du plasmide p Bo IFN-altrp 55 d'expression d'un interféron leucocytaire bovin Les matières de départ sont le vecteur pdelta R Isrc d'expression de trp et le fragment Bam HI venant du sous-clone plasmidique p 83 Bam HI 1 9 kb. La figure 6 reproduit une hybridation de Southern d'ADN de boeuf digéré avec Eco RI, Hind III, Bam HI, Bgl II ou Pvu II avec un échantillon radio-actif préparé à partir de fragments de gènes de Bo IFN- al ou Bo IFN-a 4 Chaque gène IFN s'hybride préférentiellement avec une sous- famille distincte de gènes Bo IFN-a. La figure 7 illustre une carte de restriction des inserts génomiques d'ADN de boeuf venant de trois recombinants phagiques qui hybrident l'échantillon de gènes d'interféron humain de fibroblastes humains La disposition et l'orientation de chaque Bo IFN- sont indi- quées par le rectangle noir Les sites de restriction désignés par un astérisque représentent l'information partielle d'établissement de la carte de restriction. La figure 8 montre une carte de restriction à résolution plus fine pour les trois gènes dont il est question sur la figure 7 Les parties hachurées représen- tent la séquence des signaux; les parties ombrées repré- sentent la séquence à l'état de maturité. Les figures 9 a, 9 b et 9 c représentent le nucléo- tide et les séquences d'amino-acides déduites pour les gènes Bo IFN-e 1, 2 et 3. La figure 10 compare les séquences d'amino-acides des trois Bo IFN-3 avec Hu IFN-5. La figure 11 représante une réhybridation selon le diagramme de Southern de la figure 6 avec un échantillon de gènes Bo IFN- 1 dans des conditions dans lesquelles un unique fragment d'hybridation apparaîtrait en général lors de la conduite d'une expérience analogue avec de l'ADN de génome humain et le gène Hu IFN- ( 9). La figure 12 illustre schématiquement la stratégie utilisée pour exprimer les trois Bo IFN-1 sous l'effet régulateur de l'opéron trp de E coli. La figure 13 établit la comparaison des séquences d'amino-acides déduites de Bo IFN-y, Hu IFN-y et IFN-y de souris. La description détaillée suivante illustre l'in- vention pour la préparation, selon la technologie de recom- binaison de l'ADN, des divers interférons animaux consi- dérés, et elle indique la méthodologie généralement appli- cable à la préparation d'interférons leucocytaires bovins particuliers Ce procédé est décrit en rapport avec un système bactérien. A Isolement de l'ADN de boeuf En vue de réaliser une "bibliothèque" de gènes animaux, de l'ADN de haut poids moléculaire a été isolé d'un tissu animal selon une version modifiée de la méthode de Blin et Stafford ( 50), fragmenté au hasard par rapport au locus du gène, et fractionné par tailles en vue d'obte- nir des fragments de 15 à 20 kilobases pour le clonage dans un vecteur de phage lambda ( 51). Un tissu congelé, par exemple un tissu pancréati- que de boeuf, a été broyé en poudre fine dans de l'azote liquide et solubilisé dans de i'EDTA 0,25 M à 1 % de "Sarkosyl", avec 0,1 mg/ml de Protéinase K ( 25 ml/g de tissu) à 50 C pendant 3 heures La solution visqueuse obtenue a été débarrassée de la protéine par trois extrac- tions au phénol et une extraction au chloroforme, dialysée vis-à-vis de chlorhydrate de Tris 50 m M (p H 8), d'EDTA m M, de Na Cl 10 m M, et exposée à une digestion avec de la ribonucléase pancréatique ( 0,1 mg/ml) traitée à chaud pendant 2 heures à 37 C Après extraction au phénol et à l'éther, l'ADN a été précipité avec deux volumes d'éthanol, lavé dans de l'étilanol à 95 %, lyophilisé et redissous dans le tampon TE ( 10 m M de chlorhydrate de Tris (p H 7,5), 1 m M d'EDTA) pendant environ 16 heures à 4 C à une concentration finale de 1-2 mg/ml La prépara- tion d'ADN finale avait une longueur de plus de 100 kilo- bases, comme déterminé par électrophorèse sur un gel d'agarose neutre à 0,5 %. B Digestion partielle à l'endonucléase et fractionnement selon la taille de l'ADN bovin On a fait digérer des portions aliquotes ( 0,1 mg) d'ADN de boeuf avec 1,25; 2,5; 5 et 10 unités de Sau 3 A à 37 C pendant 60 minutes dans un mélange réactionnel ( 1 ml) contenant 10 m M de chlorhydrate de Tris (p H 7,5), m M de Mg C 12, 2 m M de dithiothréitol Des incubations ont été arrêtées par l'addition d'EDTA jusqu'à une con- centration de 25 m M, extraites au phénol et à l'éther, rendues 0,3 M en acétate de sodium (p H 5,2) et précipitées avec 3 volumes d'éthanol L'ADN a été redissous dans le tampon TE à 68 C et sédimenté suivant un gradient linéaire de saccharose de 10 à 40 % ( 51) dans un rotor Beckman SW 27 à 27 000 tr/min pendant 22 heures à 20 C Des frac- tions ( 0,5 ml) ont été analysées sur un gel à 0,5 % en utilisant de l'ADN Charon 4 A digéré par Eco RI ( 51 a) comme étalon de poids moléculaire Les fractions contenant des fragments d'ADN de 15 à 20 kilobases ont été rassem- blées, précipitées à l'éthanol et redissoutes dans le tampon TE. C Construction de la "bibliothèque" de l'ADN de génome de boeuf Le produit de digestion non limitée d'ADN de boeuf de 15 à 20 kilobases a été cloné en un vecteur lambda Charon 30 A ( 52) à extrémités "collantes" G-A-T-C engendrées par enlèvement des deux fragments Bam HI inter- nes du phage Le vecteur Charon 30 A a été développé dans la souche DP 50 Sup F de E coli (ATCC N 39061, déposée le 5 Mars 1982) en bouillon NZYDT, concentré par précipi- tation au polyéthylène-glycol et purifié par centrifuga- tion selon un gradient de densité de chlorure de césium Cs Cl ( 53) L'ADN de phage a été préparé par extraction du phage purifié deux fois avec du phénol, une fois avec du phénol et de l'éther, et concentration de l'ADN par précipitation à l'éthanol. Pour la préparation des fragments d'extrémité de Charon 30 A, 50/ug d'ADN de phage ont été fixés pen- dant 2 heures à 42 C dans 0,25 ml de chlorhydrate de Tris m M (p H 8), 10 m M de Mg Cl 2 et 0,15 M de Na Cl, digérés jusqu'à épuisement avec Bam HI, extraits au phénol et à l'éther et sédimentés dans un gradient de saccharose de à 40 % comme décrit ci-dessus Les fractions contenant les segments fixés de 32 kilobases du phage ont été ras- semblées et précipitées à l'éthanol. IS Les segments Charon 30 A purifiés ( 6 micro- grammes) ont été fixés à nouveau à 42 C pendant 2 heures, réunis avec 0,3 microgramme d'ADN de boeuf de 15 à 20 kilo- bases et 400 unités de polynucléotide-ligase de phage T 4 et mis à incuber pendant la nuit à 12 C dans 0,075 ml de mélange réactionnel contenant 50 n M de chlorhydrate de Tris (p H 7,5), 10 m M de Mg C 12, 20 m M de dithiothréitol et 50 microgrammes/ml de sérum-albumine de boeuf Le mélange d'ADN après ligation a ensuite été groupé en particules de phages lambda à maturité en utilisant un système de groupement de lambda in vitro ( 54). Les composants de ce système extrait aux ultra- sons (EUS), lysat de congélation et décongélation (LCD), protéine A et tampons A et M 1 ont été préparés comme décrit ( 54) Des portions aliquotes de 3 microlitres du mélange d'ADN après ligation ont été exposées à l'incuba- tion avec 15 microlitres de tampon A, 2 microlitres de tampon M 1, 10 microlitres de EUS et 1 microlitre de protéine A pendant 45 minutes à 27 C Le LCD a été décongelé sur de la glace pendant 45 minutes, mélangé avec 0,1 volume de tampon M 1, centrifugé à 35 000 tr/min à 4 C pendant minutes, et des portions aliquotes de 0,075 ml de la liqueur surnageante ont été ajoutées au mélange réaction- nel ci-dessus Après une nouvelle période d'incubation de 2 heures à 27 C, une petite portion aliquote du mélange réactionnel de groupement a été titrée sur souche DP 50 Sup F, voir ci-dessus Cette méthode a donné un total d'en- viron 1,1 x 106 recombinants indépendants d'ADN de boeuf. Le reste du mélange de groupement a été amplifié par une méthode de lyse en boîte ( 52) par dépôt des recombinaisons sur DP 50 Sup F à une densité de 10 000 unités de formation de plaques par boîte de gélose NZYDT de 15 cm. D Sélection de la phagothèque pour des gènes d'interféron de boeuf La stratégie utilisée pour identifier les recom- binants phagiques portant des gènes d'interféron de boeuf a consisté à détecter une homologie entre nucléotides avec des échantillons radioactifs préparés à partir de gènes d'interféron de leucocytes humains clonés ( 8,9), d'inter- féron de fibroblastes ( 12) et d'interféron immunitaire ( 55) Les conditions d'hybridation ont été établies d'après des diagrammes de Southern ( 56) d'ADN animal génomique. On a procédé à la digestion totale avec Eco RI d'ADN de haut poids moléculaire (préparé comme décrit ci-dessus), de placenta humain, de pancréas de boeuf et de glande sous-maxillaire de porc ( 5 microgrammes chacun), on a effectué l'électrophorèse sur un gel d'agarose à 0,5 % et on a procédé au transfert sur du papier à la nitro- cellulose ( 56) Un échantillon d'ADN marqué au P a été préparé à partir d'un fragment d'Eco RI de 570 paires de bases, contenant la région codant pour la protéine de l'hybride A/D d'interféron leucocytaire humain à l'état mûr au niveau du site de restriction Bgl II ( 57) par des méthodes normales ( 58) Chaque filtre de nitrocellulose a été préhybridé à 42 C pendant environ 16 heures au x SSC ( 56), dans 50 m M de phosphate de sodium (p H 6,5), 0,1 mg/ml d'ADN de sperme de saumon traité aux ultrasons, la solution de Denhardt 5 x ( 59), 0,1 % de dodécylsulfate de sodium, 0,1 % de pyrophosphate de sodium contenant %, 20 % ou 30 % de formamide, puis il a été hybridé avec 100 x 10 o 6 chocs/minute de l'échantillon marqué dans la même solution contenant 10 % de dextranesulfate de sodium ( 60) Après incubation à 42 C pendant environ 16 heures, les filtres ont été lavés quatre fois au 2 x SSC avec 0,1 % de dodécylsulfate de sodium à la tempé- rature ambiante, une fois au 2 x SSC, puis exposés à un film radiographique Kodak XR-5 avec des filtres d'inten- sification Cronex Dupont pendant environ 16 heures Comme le fait apparaître la figure 1, plusieurs bandes d'hybri- dation sont très rapidement détectées dans les produits de digestion d'ADN de boeuf et de porc lorsque 20 % de formamide sont présents au cours de l'hybridâtion Ce résultat prouve l'existence d'une famille multigénique de gènes d'interféron leucocytaire chez la vache et le porc analogues à ceux qui ont déjà été démontrés chez des humains ( 12,61) Les mêmes conditions d'hybridation ont onc été utilisdes pour sélectionner des genes d'in- ron dans la bibliothèque d'ADN de boeuf. 500 000 phages de recombinaison ont été déposés sur DP 50 Sup F à une densité de 10 000 unités de formation de plaques par boite de 15 cm, et des répliques de filtres nitrocellulosiques à deux exemplaires ont été préparées pour chaque boîte d'après la méthode de Benton et Davis ( 62) Les filtres ont été hybridés avec l'échantillon de gènes Le IF humains comme décrit ci-dessus On a obtenu 96 plaques d'hybridation en double, qui ont donné des signaux intenses à l'occasion d'investigations répétées. Des investigations ont en outre été effectuées dans la "bibliothèque" bovine pour détecter des gènes d'interféron de fibroblastes et d'interféron immunitaire. Les essais ont été effectués à partir d'un fragment Xba 1- Bgl III à 502 paires de bases, contenant le gène entier d'interféron de fibroblaste humain à l'état mûr ( 12) et un fragment Alu I à 318 paires de bases (contenant les amino-acides 12-116) et un fragment Mbo II à 190 paires de bases (contenant les amino-acides 99-162) de la région de codage à maturité du gène d'interféron immunitaire humain ( 55) L'hybridation de 1,2 x 106 phages de recom- binaison a donné un total de 26 clones d'interféron de fibroblaste bovin et 10 clones d'interféron immunitaire bovin. E Caractérisation du phage recombinant On a préparé un ADN phagique (comme décrit ci- dessus) à partir de 12 recombinants qui s'hybridaient avec l'échantillon d'interféron leucocytaire humain On a fait digérer chaque ADN individuellement et en associa- tion avec Eco RI, Bam, HI et Hind III, on a procédé à l'électrophorèse sur un gène d'agarose à 0,5 % et on a construit la carte de localisation des séquences d'hybri- dation d'après la méthode Southern ( 56) Une comparaison entre les ADN de simple digestion provenant de clones 10, , 78 et 83 est représentée sur la figure 2 Pour chaque phage, les longueurs des fragments de restriction observés de même que les diagrammes d'hybridation correspondants sont distincts et sans recouvrement, ce qui suggère que chacun de ces quatre phages porte un gène d'interféron bovin différent En outre, la digestion du clone 83 avec chacun des trois enzymes donne dans chaque cas deux bandes d'hybridation distinctes, ce qui indique que ce recombi- nant peut porter deux gènes d'interféron étroitement liés. F Sous-clonage des gènes d'interféron leucocy- taire de boeuf Des fragments de restriction provenant de trois des phages recombinants qui se sont hybridés avec l'échan- tillon de gènes de leucocytes humains ont été sous-clonés en le site de clonage par l'enzyme de restriction multiple du dérivé p BR 322, à savoir p UC 9 On a fait dériver le plasmide p UC 9 de p BR 322 en enlevant tout d'abord le frag- ment Eco RI-Pvu II à 2067 paires de bases contenant le gène de résistance à la tétracycline, puis en insérant un fragment Hae II de 425 paires de bases venant du dérivé m P 9 ( 62 a) du phage M 13 dans le site Hae II du plasmide résultant, en position 2352 (par rapport à la notation p BR 322) Le fragment Hae II venant de mp 9 contient la région de codage Nterminale du gène lac Z de E coli dans laquelle un site de clonage par un enzyme de restriction multiple de la séquence CCA AGC TTG GCT GCA GGT CGA CGG ATC CCC GGG, a été inséré entre le 4 ème et le 5 ème résidu d'aminoacides de la S-galactosidase L"insertion d'un fragment d'ADN-étranger dans ces sites de clonage inter- rompt la continuité entre le promoteur lac et le gène lac Z, ce qui modifie donc le phénotype d'un JM 83 transformé avec le plasmide en le faisant passer de lac à lac-. Les fragments auxquels il a été fait allusion ci-dessus étaient les suivants: (a) un fragment Bam HI de 1,9 kilobase et un fragment Eco RI de 3,7 kilobases du clone 83 (qui correspond aux segments sans chevauchement du même recombinant), (b) un fragment Bam HI-Eco RI de 3,5 kilobases du clone 35 et (c) un fragment Eco RI de 3,2 kilo- bases du clone 67 Dans chaque cas, une quantité de 0,1 micro- gramme de vecteur convenablement digéré a été liée avec un excès décamolaire du fragment purifié, transformée en la souche E coli JM 83 (ATCC N 39062, déposé le 5 Mars 1982), inoculée sur des boites M 9 ( 63) contenant 0,04 mg/ml de 5- bromo-4-chloro-3-indolyl-S-D-galactoside et 0,2 mg/ml d'am- picilline Des colonies blanches, sortant vraisemblablement un insert d'ADN au niveau d'un site de restriction inter- rompant la région de codage du gène lac Z sur p UC 9, ont été repiquées dans 5 ml de bouillon LB additionné de 0,02 mg/ml d'ampicilline, cultives pendant plusieurs heures à 37 C et le fragment inséré a été recherché par une méthode de minipréparation d'ADN de plasmide ( 64). G Séquence d'ADN d'un gène d'interféron leuco- cytaire de boeuf sur clone 83 La séquence d'ADN partant du site Bam HI de p 83 Bam HI 1,9 kb (fragment sous-clonal de 1,9 kb du clone 83) a été déterminée par la méthode chimique de Maxam- Gilbert ( 65), et elle est reproduite sur la figure 3. Le cadre de lecture ouvert le plus long code un poly- peptide de 189 amino-acides présentant une homologie im- portante avec les interférons leucocytaires humains (figure 4) Par analogie avec les protéines humaines, l'interféron leucocytaire de boeuf est formé d'un peptide de signal hydrophobe à 23 amino-acides qui précède une protéine mûre à 166 amino-acides d'une séquence identique ser-leu-glycys Quatre résidus de cystéine dans les positions 1, 29, 99 et 139 sont exactement conservés entre les espèces Une comparaison de l'homologie par paires entre interférons bovins et humains est représentée sur le tableau I Comme on peut s'y attendre, la protéine de boeuf est notablement moins homologue (environ 60 %) à chacune des protéines humaines que ces dernières ne le sont entre elles (plus de 80 %). La séquence d'ADN et la séquence d'amino-acides déduite pour trois autres gènes d'interféron leucocytaire de boeuf apparaissant sur les sous-clones plasmidiques p 67 Eco RI 3,2 kb, p 35 Eco RI-Bam HI 3,5 kb et p 83 Eco RI 3,7 kb, sont représentées, respectivement, sur les figures 3 b, 3 c et 3 d. Comme récapitulé sur le tableau I, tandiz -us les gènes Bo IFN-e 2 et 3 codent des peptides ne présentant que de faibles différences apparentes par rapport à Bo IFN-al, la protéine Bo IFN-a 4 est aussi distincte des autres peptides de boeuf que le sont deux interférons leucocytaires bovins et humains quelconques. Pour déterminer si le gène a 4 dérive d'une aussi large classe deprotéines cellulaires que les autres Bo IFN-a, on a fait digérer de l'ADN de génome de boeuf avec plu- sieurs endonucléases de restriction et on l'a hybridé avec des fragments d'ADN radio-actif représentant les régions de codage des protéines des gènes ai (fragment Aval I à 612 paires de bases, figure 6) et a 4 (fragment Eco RI-Xmn I de p Bo IFN-a 4 trp 15) dans des conditions très rigoureuses ( 50 % de formamide) ne permettant pas d'hybri- dation croisée des deux gènes Comme le fait apparaître la figure 6, chaque gène s'hybride préférentiellement à un ensemble distinct de fragments d'ADN de boeuf Ces résultats démontrent clairement ensemble l'existence de deux familles différentes de peptides IFN de leucocytes de boeuf, dont les protéines ai et a 4 peuvent être con- sidérées comme des représentants. TABLEAU I - Comparaisons par paires des différences résidant dans des séquences de codage d'IFN-a de boeuf et d'humain Bo IFN-al Bo IFN-a 2 Bo IFN-a 3 Bo IFN-a 4 Hu IFN -a A Hu IFN-a B Hu IFN-a C Hu IFN-a D Hu IFN-a F F Hu IFNa H Hu IFN-a I Hu IFN-a J Hu IFN-a K a a 2 a 3 94 92 a 4 a A a B a C 61 62 63 61 o 61 64 54 54 58 39 81 81 48 70 81 52 70 65 48 74 61 65 52 '70 65 100 52 74 74 74 52 70 65 100 48 61 57 91 48 83 70 74 Les nombres représentent le pourcentage d'homo- logie. La moitié inférieure gauche représente une pré- séquence de 23 acides. La moitié supérieure droite représente une pro- téine mûre de 166 acides. A, B, C, etc désignent les interférons leucocy- taires humains A, B, C, etc. a H a I a D a F 64 61 63 62 56 83 82 77 81 81 89 83 74 100 91 91 74 58 56 83 81 83 80 86 94 81 80 83 89 a J a K 61 65 64 64 54 54 86 *79 81 92 83 78 84 86 83 84 84 91 81 H Expression directe de Bo IFN-al à l'état mûr dans E coli La construction du plasmide d'expression directe est reproduite sur la figure 5 Le sous-clone plasmidique p 83 Bam HI 1,9 kb a été exposé à la digestion totale avec Ava II et le fragment de 612 paires de bases contenant le gène d'interféron leucocytaire de boeuf isolé par électro- phorèse sur un gel de polyacrylamide à 6 % et électro- élué On a fait digérer environ 1,5 microgramme de ce fragment avec Fnu 4 H, on l'a extrait au phénol et à l'éther et on l'a précipité à l'éthanol Les extrémités collantes Fnu 4 H résultantes ont été allongées en extrémités tronquées avec 6 unités d'ADN-polymérase I (fragment de Klenow) à 12 C pendant 30 minutes dans 20 microlitres de solution contenant 20 m M de chlorhydrate de Tris (p H 7,5), 10 m M de Mg C 12, 4 m M de dithiothréitol et 0,1 m M (chacun) de d ATP, de d GTP, de d CTP et de d TTP Après extraction au phénol et à l'éther, on a fait digérer l'ADN avec Pst I et on a procédé à l'électrophorèse sur un gel à 6 %. Le fragment Pst I à extrémités tronquées à 92 paires de bases résultant, qui s'étend du premier nucléotide de la région de codage pour l'interféron leucocytaire de boeuf à l'état mûr, a été électro-élué du gel. Le reste de la région codant pour l'interféron à l'état mûr a été isolé comme suit Trois microgrammes de l'insert Bam HI de p 83 Bam HI 1,9 kb a été partiellement digéré avec 14 unités de Pst I pendant 10 minutes à 37 C dans 45 microlitres de solution réactionnelle contenant m M de chlorhydrate de Tris (p H 7,5), 10 m M de Mg C 12, 2 m M de dithiothréitol, et on a procédé à l'extraction au phénol et à l'éther Le fragment Pst I-Bam HI partiel à 1440 paires de bases désiré s'étendant du nucléotide 93 de la région codant pour l'interféron à l'état mûr a été isolé d'un gel de polyacrylamide à 6 %. Le plasmide pdelta R Isrc est un dérivé du plasmide p SR Cex 16 ( 66) dans lequel les sites Eco RI proches du promoteur trp et distants du gène src ont été enlevés par réparation avec l'ADN-polymérase I ( 67), et l'oligo- déoxynucl Uect C cl a:it AATTATGAA Y (synthétisé par la méthode au phosphotriester ( 68)) a été inséré au niveau du site Eco RI restant immédiatement adjacent au site Xba i On a fait digérer totalement 20 microgrammes de pdelta R Isrc ave, l'enzyme Eco RI, on a extrait le produit au phénol et à l'éther et on l'a précipité à l'éthanol Le plasmide a ensuite été digéré avec 100 unités de nucléase 51 i à 16 C pendant 30 minutes dans une solution à 25 m M d'acétate de sodium (p H 4, 6), 1 m M de Zn C 12 et 0,3 M de Na Cl pour créer une extrémité tronquée avec la séquence ATG Après extraction au phénol et à l'éther et précipitation à l'éthanol, on a fait digérer l'ADN avec l'enzyme Bam HI, on a effectué son électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 6 % et on a recueilli par électro-élution le grand fragment vecteur ( 4300 paires de bases). Le plasmide d'expression a été assemblé par ligation de 0,2 microgramme du vecteur, 0,02 microgramme du fragment Pst I tronqué de 92 paires de bases et 0,25 microgramme du fragment Pst I Bam HI partiel de 1400 paires de bases avec 400 unités d'ADN-ligase T 4 pendant environ 16 heures à 12 C, et on a utilisé le produit pour transformer la souche 294 de E coli (ATCC N 31446) en souche résistant à l'ampicilline L'ADN de plasmide a été préparé à partir de 96 des colonies et on l'a fait digérer avec Xba I et Pst I Dix-neuf de ces plasmides contenaient les fragments désirés Xba I- Pst I à 103 paires de bases et Pst I à 1050 paires de bases L'analyse de la séquence d'ADN a trouvé que plu- sieurs de ces plasmides avaient un codon d'initiation ATG correctement placé au début de la région codant pour l'interféron de boeuf L'un de ces plasmides, p Bo IFN-eltrp 55, a été choisi en vue d'études subséquentes. I Expression directe d'une seconde classe d'inter- féron leucocytaire de boeuf à l'état mûr (a-4) dans E coli Un codon d'initiation ATG a été placé en face de la région codant pour l'interféron à l'état mûr par l'ex- 2530662- tension enzymatique d'une amorce d'ADN synthétique, CATGTGTGACTTGTCT L'heptadécamère a été phosphorylé au moyen de polynucléotide-kinase de T 4 et de y_ 32 p ATP, comme décrit ci-dessus ( 12) 250 picomoles de l'amorce ont été mélangées avec environ 1 microgramme d'un fragment Hinc II à 319 paires de bases contenant des résidus d'amino- acides-520 à 102 dans 30 microlitres d'eau, le mélange a été maintenu à l'ébullition pendant 5 minutes, et une extension a été effectuée avec 25 unités d'ADN-polymérase I de E coli (fragment de Klenow) à 37 C pendant 3 heures. Le produit de cette réaction a été digéré avec Hgi AI et le fragment Hgi AI tronqué à 181 paires de bases résultant a été isolé d'un gel à 6 % de polyacrylamide. Le gène entier codant pour le peptide à l'état mûr a été assemblé derrière le promoteur trp par ligation enzymatique du fragment ci-dessus avec un fragment Hgi A- Pst I de 508 paires de bases contenant la portion à termi- naison carboxy du peptide et le plasmide d'expression de Hu IFN-y, p IFN-ytrp 48-13 ( 55), qui a été digéré avec l'en- zyme Eco RI, allongé à extrémités rases avec l'ADN- polymérase de Klenow, digéré avec Pst I et finalement isolé sur un gel à 6 % de polyacrylamide Lors de la trans- formation du mélange résultant dans E coli 294, on a identifié plusieurs clones qui ont rétabli le site de reconnaissance de Eco RI entre la région du site de liai- son entre promoteur trp et ribosome du vecteur d'expres- sion de départ et la région de codage total de l'IFN de boeuf à l'état mûr (p Bo IFN-a 4 trp 15). J Sous-clonage de gènes d'interféron de f Eibro- blastes-de boeuf Six des recombinants phagiques qui s'hybridaient avec l'échantillon d'ADN IFN- humain ont été purifiés et leur ADN a été isolé comme décrit ci-dessus en vue d'une analyse ultérieure La carte de restriction en com- binaison avec analyse d'hybridation selon Southern a indi- qué que les six isolats comprenaient trois régions dis- tinctes du génome de boeuf, cela impliquant une famille Bo IFN-1 multigénique Ces résultats sont reproduits par les cartes de restriction illustrées sur la figure 7 Pour obtenir une carte de restriction plus détaillée et la séquence nucléotidique pour chaque classe distincte de recombinant, des fragments d'hybridation ont été sous- clones en vecteurs plasmidiques Plus particulièrement, le fragment Bgl II de 5 kilobases du phage X 51 et le frag- ment Bam HI de 5 kilobases du phage X$ 2 ont été clones individuellement en p BR 322 au niveau du site Bam HI, le fragment Eco RI-Xho I de 4,5 kilobases et le fragment Pst I- Hpa I de 1,4 kilobase se recouvrant du phage Xk 3 ont été insérés dans p UC 9 (retirés des sites Eco RI-Sal I) et, respectivement p Le IF 87 ( 10) (retirés de Hpa I-Pst I). K Séquences d'ADN de trois gènes IFN distincts de fibroblastes de boeuf La figure 8 montre les cartes de restriction pour chacun des trois types de gènes IFN-e de boeuf qui ont été sous-clonés Ils sont aisément distingués par la pré- sence de sites de clivage propres à chacun Les régions de codage peptidique de même que les séquences immédiate- ment en amont et en aval pour chaque gène ont été déter- minées par la méthode chimique de Maxam-Gilbert et sont représentées sur les figures 9 a, 9 b et 9 c L'homologie des nucléotides avec la séquence déterminée pour le gène d'interféron de fibroblaste humain ( 12) prédit le cadre de lecture correct et la séquence entière des amino- acides pour chaque gène de boeuf obtenu comme produit, qui comprend un peptide de signal hydrophobe formé de 21 amino-acides que suit une protéine mûre de 185 résidus. Les protéines de boeuf sont tout à fait distinctes les unes des autres (tableau II, figure 10), mais elles mon- trent une différence encore plus grande (environ 60 %) avec le peptide humain. La nature multigénique de l'interféron de fibro- blaste de boeuf a encore été démontrée par une réhybrida- tion du diagramme de Southern représenté sur la figure 11, avec un échantillon radio-actif préparé à partir d'un fragment Eco RI-Pvu I de 415 paires de bases dérivé de p Bo IFN- 1 trp (décrit ci-dessous) Comme le fait appara Utre la figure 11, cette expérience démontre l'existence d'autres gènes IFN-3 homologues Les bandes présentant moins d'hybri- dation peuvent en fait représenter des gènes à relation plus éloignée, qui coderaient, quant à eux, des 8 IFN plus distincts. TABLEAU II Comparaisons par paires de l'homologie dans des séquences de codage d'IFNo de boeuf et d'IFN-" humain et 1 82 33 Hu B M 1 138 ( 83) 138 ( 83) 84 ( 51) e 2 20 ( 95) 146 ( 88) 92 ( 55) e 3 20 ( 95) 19 ( 90) 87 ( 52) Huj 16 ( 76) 17 ( 81) 16 ( 76) Le nombre d'amino-acides identiques dans chaque paire de séquences de codage a été représenté Les peptides de signal formés de 21 amino-acides sont comparés dans la partie inférieure gauche et les IFN-3 à l'état mûr com- prenant 166 amino-acides sont comparés dans la partie supé- rieure droite du tableau Le nombre total d'amino-acides identiques dans chaque paire est indiqué en tête, suivi du pourcentage d'homologie. L Expression directe de trois IFN-8 de boeuf chez E coli Attendu que les trois gènes IFN-8 de boeuf parta- gent de nombreuses séquences d'ADN communes et de nombreux sites de restriction (voir figure 8), le schéma général est réalisable pour l'expression des trois gènes Du fait que la séquence d'ADN codant pour les cinq premiers amino- acides, qui renferme deux sites Alu I, a été identique dans chaque cas, on a conçu deux oligonucléotides synthétiques complémentaires qui comportent un codon d'initiation de traduction d'ATG, rétablissent les codons pour les quatre premiers amino-acides d'IFN-e de boeuf à l'état mûr et créent une extrémité Eco RI collante pour l'insertion après une séquence du promoteur trp La construction des plasmides d'expression est schématisée sur la figure 12 Une ligation ::S 2 u paires de bases dérivé des plasmides sous-clonaux Bo IFN-3, suivie d'une digestion avec les enzymes Eco RI et Xho I, engendre un fragment de 104 paires de bases flanqué d'extrémités collantes Eco RI et Xh)I Le codage entier a ensuite été assemblé en le vecteur d'expression trp par ligation du fragment de 104 paires de bases conjoin- tement avec le fragment Xho I-Pst d'environ 700 paires de bases codant pour le reste de chaque protéine p Bo IFN- et le plasmide p IFN-ytr 48-13 ( 55) duquel le fragment Eco RI- Pst I interne a été enlevé Les plasmides p Bo IFN- 1 trp, p Bo IFN-B 2 trp et p Bo IFN-33 trp résultants placent tous la transcription et la traduction correctes des gènes IFN- sous l'influence de l'opéron trp de E coli. M Caractérisation et sous-clonage du gène d'interféron immunitaire (Bo IFN-y) de boeuf Les dix recombinants phagiques qui s'hybridaient avec l'échantillon IFN-y humain ont été purifiés et de l'ADN a été préparé comme décrit ci-dessus Les dix échan- tillons d'ADN ont tous donné des bandes d'hybridation particulières d'après l'analyse de Southern Les clones Ày 4 et Ày 7 ont été choisis pour une analyse subséquente, attendu qu'ils ont des diagrammes de bandes d'hybridation distinctes La carte de restriction de ces deux clones montre que leurs séquences d'ADN se recouvrent mutuelle- ment La région de recouvrement renferme les sites de restriction Xba I, Eco RV et Nco I L'analyse de la séquence d'ADN de ces deux clones montre une structure générale des gènes semblable à celle du gène de l'interféron immu- nitaire humain ( 70) et que le clone ky 7 contient la séquence codant pour le quatrième exon et que le clone Xy 4 contient des séquences codant pour ies trois premiers exons du gène IFN-y de boeuf basé sur l'homologie de séquence d'ADN avec le gène IFN-y humain La séquence d'amino-acides déduite pour Bo IFN-y est comparée sur la figure 13 avec celle de Hu IEN-Y( 55) et d'IFN-y de souris. Pour assembler le gène entier IFN-y de boeuf sur un segment continu d'ADN, le fragment Bam HI-Nco I de 3000 paires de bases couvrant les trois premiers exons du gène IFN-y de boeuf dérivé du clone y 4 et le fragment Nco I-Hind III de 2500 paires de bases couvrant le dernier exon dérivé de Ày 7 ont été isolés Ces deux fragments d'ADN ont ensuite été clonés en un vecteur Bam HI-Hind III dérivé de p BR 322 par une ligation en trois parties. N Expression du gène IFN-y de boeuf dans l'organis- me d'un mammifère En vue d'obtenir une version sans intron de Bo IFN-y pour que ce gène puisse être exprimé dans un système pro- karyotique tel que E coli, le gène a été adapté à un haut niveau d'expression dans un système d'expression de cellu- les animales pour obtenir des quantités importantes d'ARN messager spécifique Le fragment Bam HI-Hind III de 5500 pai- res de bases s'étendant sur le gène entier IFN-y de boeuf a été inséré dans un vecteur SV 40 en vue de l'expression dans des cellules COS ( 44) En particulier, le fragment de gène IFN-y de boeuf Bam HI-Hind III a été cloné en un vecteur p DLAR 1 de plasmide SV 40 à 2800 paires de bases (obtenu à partir du plasmide p H Bs 348-L d'expression de l'antigène HBV par suppression enzymatique du site Eco RI en amont de l'origine SV 40 de réplication sélective vis- à-vis de la direction de dernière transcription Le plas- mide d'expression p H Bs 348-L a été construit par clonage du fragment de 1986 paires de bases résultant de la diges- tion par Eco RI et Bgl II de HBV ( 71) (qui couvre le gène codant pour H Bs Ag) en le plasmide p ML ( 72) au niveau des sites Eco RI et Bam HI (p ML est un dérivé de p BR 322 qui a des séquences d'élimination de suppression exerçant un effet inhibiteur sur la réplication du plasmide dans des cellules de singe ( 72)) Le plasmide résultant (p RI-Bgl) a ensuite été linéarisé avec Eco RI, et le fragment de 348 paires de bases représentant la région d'origine de SV 40 a été introduit dans le site Eco RI de p RI-Bgl Le fragment d'origine peut être inséré dans l'une ou l'autre des orien- tations Etant donné que ce fragment code à la fois les promoteurs précoces et tardifs de SV 40 en plus de l'ori- gine de réplication, des gènes HBV pourraient être exprimés sous l'influence de l'un ou l'autre des promoteurs selon cette orientation (p H Bs 348-L représentant H Bs exprimé sous l'influence du promoteur tardif) entre le site Bam HI et le site Sal I par une ligation en trois parties en pré- sence d'un fragment convertisseur Iind III-Sal I de 600 paires de bases dérivé de p BR 322 La transfection du plasmide résultant en cellules COS aboutit à l'expression effective d'IFN-y de boeuf sous l'influence du promoteur tardif SV 40. On a préparé le poly A plus le m ARN à partir de cellules de COS transfectées et on les a utilisés ensuite pour la préparation de c ADN par des méthodes classiques ( 55) On a isolé des clones de c ADN s'hybridant avec l'échantillon de gènes IFN-y de boeuf Le clone de c ADN présentant l'insert Pst I le plus long a été choisi pour l'analyse subséquente L'analyse de la séquence d'ADN de ce clone de c ADN montre que toutes les séquences d'in- tron prédites par le clone génomique IFN-y de boeuf sont correctement éliminées. Le c ADN a été adapté en vue de l'expression dans E coli par la méthode de réparation par amorce décrite ci-dessus. O Préparation d'extraits bactériens Des cultures de la nuit obtenues en bouillon LB contenant 0,02 mg/ml d'ampicilline ou 0,005 mg/ml de tétra- cycline ont été inoculées, dans un rapport de dilution de 1:100, dans 50 ml de milieu M 9 ( 63) contenant 0,2 % de glucose, 0,5 % de casaminoacides et la substance active appropriée, et la culture est conduite à 37 C sous agita- tion par secousses jusqu'à une valeur A 550 de 1,0 Des échantillons de 10 ml ont été récoltés par centrifugation et ils ont été immédiatement exposés à une congélation rapide dans un bain de neige carbonique et d'éthanol Les culots congelés ont été remis en suspension dans 1 ml de guanidine 7 M, on a fait incuber la suspension sur de la glace pendant 5 minutes et on l'a diluée en PBS en vue d'une épreuve A titre de variante, les culots congelés ont été lysés par l'addition de 0,2 ml de saccharose à %, 100 m M de chlorhydrate de Tris (p H 8,0), 20 m M d'EDTA et 5 mg/ml de lyzozyme Après 20 minutes sur de la glace, on a ajouté 0,8 ml de "Triton X-100 " à 0,3 %, du chlorhy- drate de tris 0,15 M (p H 8,0), de 1 'EDTA 0,2 M et du PMSF 0,1 m M Le lysat a été clarifié par centrifugation à 19 000 tr/min pendant 15 minutes et la liqueur surnageante a été soumise à l'essai après dilution en PBS. P Titres en interféron L'activité en interféron de boeuf a été déterminée par une épreuve d'inhibition de l'effet cytopathique (CPE) conduite en plaques de microtitrage à 96 alvéoles comme indiqué ci-après: 1 Ajouter à chaque alvéole d'une plaque de micro- titrage à 96 alvéoles ( 8 rangées x 12 colonnes) 100 l d'une suspension de cellules dans un milieu contenant du sérum de foetus de veau à 10 % On ajuste la concentration des cellules pour obtenir une monocouche confluente le lendemain. 2 Agiter modérément les plaques par secousses sur la plate-forme d'une secoueuse pendant 10 minutes pour distribuer uniformément les cellules. Le lendemain: 3 Ajouter à chaque alvéole de la première colonne il de milieu additionnel. 4 Ajouter à un alvéole de la première colonne 20 il d'un échantillon dont on doit titrer l'activité en interféron. Mélanger l'échantillon et le milieu dans l'al- véole en prélevant et en éjectant 100 gl du contenu de l'alvéole plusieurs fois à l'aide d'une pipette de 100 Al. 6 Transférer 100 l du contenu d'un alvéole dans la première colonne horizontalement dans un alvéole de la deuxième colonne. 7 Mélanger comme en 3. 8 Continuer à transférer 100 Al du contenu d'un alvéole de la colonne à la colonne suivante jusqu'à ce qu'un total de 11 transferts ait été effectué. 9 Retirer et jeter 100 4 l du contenu de l'alvéole de la douzième colonne On obtient par cette méthode une série de dilutions de moitié. Chaque plaque d'épreuve comporte des étalons de référence du NIH appropriés. 11 Faire incuber les plaques dans un incubateur à Co 2, pendant 370 C pendant 24 heu:es. 12 Chaque plaque d'essai comprend des alvéoles qui reçoivent 100 4 l de suspension cellulaire et 100 il de milieu pour former des témoins de croissance cellulaire et des alvéoles qui reçoivent 100 il de suspension cellu- laire, 100 Al de milieu et 50 4 l de suspension virale pour former des témoins cytopathogéniques à induction virale. 13 Mettre à l'épreuve tous les alvéoles excepté les témoins cellulaires avec 50 4 l d'une suspension virale. La multiplicité d'infection utilisée est la quantité de virus qui provoque un effet cytopathique à 100 % sur la lignée cellulaire particulière en 24 heures. 14 Faire incuber à nouveau les plaques pendant 24 heures à 370 C sous atmosphère d'incubation de CO 2. Prélever du liquide des plaques et colorer les cellules avec du violet cristal à 0,5 % Laisser les cellules se colorer pendant 2 à 5 minutes. 16 Rincer correctement les plaques à l'eau de ville et les laisser sécher. 17 Le titre en interféron de l'échantillon est l'inverse de la dilution pour laquelle il reste 50 % de cellules viables. 18 L'activité de tous les échantillons est nor- malisée par le facteur de conversion d'unités de référence que l'on calcule d'après la formule suivante: Titre réel de l'étalon NIH = Facteur de conversion Titre observé dans l'essai des unités de référence (voir 69) Des extraits préparés à partir de la souche 294 de E coli (ATCC N O 31446) transformée avec p Bo IFN-altrp 55 ont montré une activité importante sur une lignée de cellules de rein de boeuf (MDBK) mise à l'épreuve avec le virus VS (souche Indiana), mais n'ont pas eu d'activité sur des lignées cellulaires de rein de singe (VERO), de carcinome cervical humain (He La), de rein de lapin (Rk-13) ou de souris (L 929) mises à l'épreuve d'une façon similaire. Des extraits témoins préparés à partir de la souche 294 transformée avec p BR 322 n'ont pas présenté d'activité sur des cellules MDBK Le tableau III récapitule l'activité antivirale in vitro de Bo IFN-al sur diverses lignées cellu- laires animales et humaines mises à l'épreuve Bo IFN-a 1 l se distingue aisément des IFN leucocytaires humains par un manque manifeste d'activité antivirale sur des cellules humaines, comparativement à son activité sur des cellules de boeuf, lorsqu'on utilise le virus VS comme virus d'épreuve Le tableau IV indique le degré d'activité d'in- terféron obtenu dans des extraits préparés à partir de E coli W 3110, qui a été transformé avec les plasmides d'expression p Bo IFN-a 4 trp 15, p Bo IFN-61 trp, p Bo IFN-52 trp et p Bo IFN-63 trp On doit observer le fait particulièrement important que les interférons de fibroblastes de boeuf sont environ 30 fois plus actifs sur une lignée de cellu- les de rein de boeuf que sur une lignée de cellules amniotiques humaines, tandis que la relation inverse existe pour le fibroblaste IFN humain ( 12). MDBK He La L-929 RK-13 VERO TABLEAU III Préparation d'IFN Etalon Le IF A IFN leucocytaire de boeuf Extrait témoin Etalon Le IF A IFN leucocytaire de boeuf Extrait témoin Etalon d'IFN de souris IFN leucocytaire de boeuf Extrait témoin Etalon d'IFN de lapin IFN leucocytaire bovin Extrait témoin Etalon Le IF A IFN leucocytaire de boeuf Extrait témoin Titre (unités/ml) Virus Virus VS EMC 640 NA 300 000 NA 650 1500 640 1000 1000 NA pas bien dans la cellule correspondante. TABLEAU IV Activité en interféron d'extraits de E coli E coli 294 Activité en IFN-3 Activité en IFN-g transformé par: (unités/litre de (unités/litre de culture) culture) MDBK-VSV WISH-VSV p IFN-al 1,0 x 108 N D. p IFN-31 2,2 x 108 6,5 x 106 p IFN-32 1,1 x 108 3, 5 x 106 p IFN-63 6,0 x 108 2,0 x 107 Des extraits bactériens ont été préparés et titrés en vue de déterminer l'activité en interféron au moyen de la lignée cellulaire MDBK de rein de boeuf et de la lignée cellulaire WISH d'amnios humain et le virus VS comme virus d'épreuve, conformément à une méthode publiée (voir Weck et collaborateurs, 1981) - Lignée cellulaire Compositions pharmaceutiques Les composés de la présente invention peuvent être formulés conformément à des procédés connus pour préparer des compositions à usage pharmaceutique, procédés par lesquels les interférons animaux de l'invention-sont associés en mélange avec un ou plusieurs véhicules accep- tables Des véhicules convenables et leur formulation ont été décrits Ces compositions renferment une quantité effi- cace de l'interféron de l'invention conjointement avec une quantité convenable de véhicule en vue de préparer des compositions acceptables qui conviennent pour une adminis- tration efficace à l'hôte, par des voies connues d'adminis- tration, par exemple par voie parentérale. Il y a lieu de remarquer que les interférons animaux décrits dans le présent mémoire existent avec des variations alléliques naturelles Ces variations peuvent résider dans une ou plusieurs différences entre amino- acides dans la séquence globale ou par des délétions, des substitutions, des insertions, des inversions ou des additions d'un ou plusieurs amino-acides dans la séquence. Toutes ces variations alléliques sont incluses dans le cadre de la présente invention. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être appor- tées sans sortir de son cadre. Bibliographie 1 Rinaido et al, Infection and Immunity 14, 660 ( 1976). 2 Fulton et Rosenquist, Am J Vet Res 37, 1497 ( 1976). 3 Babrick et Rouse, Infection and Immunity 13, 1567 ( 1976). 4 Todd et al, Infection and Imaunity 5, 699 ( 1972). 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Polypeptide *suivant la revendication 1, carac- térisé en ce qu'il contient une protéine conjuguée ou de signal clivable liée à l'atome terminal d'azote de l'amino- acide normalement le premier dudit interféron. 6 Polypeptide suivant l'une quelconque des reven- dications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il est l'interféron leucocytaire de boeuf à l'état mûr. 7 Séquence d'ADN comprenant une séquence codant un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 3 à 5. 8 Séquence d'ADN suivant la revendication 7, en liaison opérationnelle avec une seconde séquence d'ADN capable d'effectuer son expression. 9 Véhicule d'expression susceptible de réplica- tion, capable, dans une culture de micro-organismes ou de cellules transformants, d'exprimer la séquence d'ADN suivant la revendication 8. Culture de micro-organismes ou de cellules transformée avec-le véhicule suivant la revendication 9. 11 Micro-organisme suivant la revendication 10, obtenu par transformation d'une souche de E coli. 12 Le plasmide p Bo IFN-al-trp 55. 13 Culture de micro-organismes ou de cellules transformée avec le plasmide suivant la revendication 12. 14 Culture de cellules transformantes capable de produire un interféron animal sous la forme m re. Interféron animal suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, destiné à être utilisé dans un traitement antitumoral, antiviral ou immunosuppresseur ou pour la préparation de compositions utiles pour un tel traitement. 1.6 Procédé,caractérisé en ce qu'il consiste à exprimer un gene codant un interféron animal sous la forme m re dans une culture de micro-organismes ou de cellules. 17 Procédé, caractérisé en ce qu'il consiste à produire un polypeptide suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5 dans une culture de micro-organismes ou de cellules. 18 Procédé de production d'un'polypeptide sui- vànt l'une quelconque des revendications l à 5, caractérisé en ce qu'il consiste à amener une culture d'un micro- organisme ou de cellules, transformée avec un véhicule d'expression susceptible de réplication, à se développer et à effectuer la production dudit polypeptide, et à re- cueillir ce dernier. 19 Procédé de production d'un véhicule d'expres- sion suivant la revendication 9, caractérisé en ce qu'il- t à co Jl L -ucpr L re-une-M-'- pour ledit polypeptide et à effectuer la liaison opéra- tionnelle de ladite première séquence d'ADN avec une seconde séquence d'ADN capable d'effectuer l'expression de ladite première séquence d'ADN. Composition, caractérisée en ce qu'elle com- prend un interféron de boeuf à l'état mûir, sensiblement dépourvu d'autres protéines d'origine bovine.