FR 2532940 A1 19840316 FR 8301449 A 19830131 La présente invention concerne de nouveaux composés perfluorobicyclo utilisables comme consti- tuants transportant de l'oxygène ainsi que des émul- sions-contenant ces constituants y Elle concerne plus précisément des composés perfluorobicyclo répondant à la formule générale F F R (i Y dans laquelle R représente un groupe perfluorométhyle ou perfluoroéthyle, ainsi qpe des émulsions de fluoro- carburesthérapeutiques ayant des propriétés de trans- port de l'oxygène contenant ce composé comme consti- tuant transportant de l'oxygène, utilisables pour. secourir des malades atteints d'hémorragies massives, pour le stockage des organes devant être transplantésg etc. On a déjà signalé que les émulsions de fluo rocarbures peuvent être utilisées comme substituts des globules rouges chez les mammifères et comme perfsats de stockage des organes pour la transplantation d'or- ganes, en particulier comme transfusions en vue de jouer le r 8 le de transporteurs d'oxygène lLeland C. Clark, Jr, Becattini, F, Kaplan, S, The Physiology of Synthetic Blood, Journal of Thoracie Cardiovascular Surgery, Vol 60, po 757-773, 1970, Geyer, R Po, Fluo- carbon-Polyol Artificial Blood Substitutes, New Engl. J Med, Vo o 289, p 1077-1082, 1973 l. Cependant, les émulsions de fluorocarbures connues jusqu'à présent ne sont pas pratiques en raison de leur instabilité pharmaceutique, et il est nécessaire de mettre au point une préparation stable dans laquelle le diamètre des particules ne change pas pendant une durée prolongée, de façon à pouvoir utiliser dans la pratique des émulsions de fluorocarbures comme globules rouges artificiels. Dans les émulsions de fluorocarbures, la taille des particules joue un rôle important dans la toxicité et l'efficacité de l'émulsion lYokoyama, K, Yamanouchi, K, Watanabe, M, Murashima, R, Matsumoto, T, Hamano, T, Okamoto, H, Suyama, T, Watanabe, R_, Naito, R, Preparation of Perfluorodecalin Emulsion, an Approach to the Red Cells Substitute, Fedexation Proceeding, Vol 3 4, p- 147 S-1483-, May, 175 l E. d'autres termes, un émulsion ayant un diamètre de par- ticules élevé présente une toxicité élevée, et en outre le temps de rétention des particules dans te courant sanguin est court Par conséquent, lorsqu'on utilise une émulsion de fluorocarbures conmmne globules rouges artificiels pour une transfusion salvatrice à des malades atteints d'hémorragies massives, le diamètre de particules des particules d'émulsion doit être de 0,3 micron ou moins, de préférence de 0,2 micron ou moins (demande de brevet japonais n L 22 612 / 1973). En dehors du diamètre de particulé, pour utiliser un fluorocarbure pour des globules rouges artificiels, le fluorocarbure administré dans la veine doit être rapidement éliminé du corps lorsque la fonction ini- tiale de transport d'oxygène a cessé (brevet des E U A n 3 911 138, Leland C Clark, Jr) Le Dr Clark nomme ces composés des "composés organiques fluorés RES phobiques" (RES = système réticuloendo- thélial), et distingue ces composés des composés RES- philes, qui sont caractérisés par la présence d'un atome tel que l'oxygène ou l'azote dans leur structure ou par leur nature hétérocyclique. La demanderesse a effectué des études pous- sées pour trouver des composés perfluorocarbonés satis- faisant aux exigences ci-dessus, et est parvenue à obtenir des composés "RES-philes", à savoir les compo- sés perfluorobicyclo répondant à la formule générale: F R (I) N dans laquelle R repr Osente un groupe perfluorométhyle ou perfluoroéthyle, et-elle a trouvé que ces composés peuvent donner des émulsions stables à long terme. ayant des particules extrémemen't fines; et de plus- que ces composés prgsentent des propriétés d'éii nation excellentes et inattendues Telle est l'origine de la présente invention. Un des buts de la présente invention est de fournir de nouveaux composés perfluorobicyclo, ainsi qu'une préparation d'émulsion de fluorocarbures-théra- peutique capable de transporter de l'oxygène, contenant un composé répondant à la formule générale (I) ci- dessus comme composé transportant l'oxygène- D'autres buts et avantages de la présente invention ressortiront-de la description ci-après O En ce qui concerne la formule générale (I), bien que la position de substitution du groupe perfluo- rométhyle ne soit pas particulièrement limitée, on préfère qu'il n'y ait qu'un seul substituant. Le composé répondant à la formule générale (I) peut se préparer en fluorant un composé perhydro correspondant au composé répondant à la formule géné- rale (I) Comme procédés de fluorationon peut citer par exemple des procédés de fluoration connus tels que le procédé de fluoration directe, le procédé de fluora- tion au cobalt, le procédé de fluoration électrolytique, etc. Pour la préparation du composé (I), on pré- fère le procédé de f luoration électrôlytique, et on peut l'effectuer par exemple en mélangeant et en dis- solvant de l'acide fluorhydiique anhydre et un composé perhydro comme produit de départ dans une cellule électrolytique, puis en effectuant l'électrolyse Dans cette électrolyse, le voltage est généralement de 3 à 9 V, la densité de courant anodique est générale- ment de 1 à 300 A/dm 2 et la température de bain est généralement de 4 à 10 C. Comme le composé répondant à la formule générale (I) ainsi formé est insoluble dans l'acide fluorhydrique anhydre, il pxécipite dans la couche inférieure de la cellule éltectra Iytique La séparation et la purification du composé (I) à partir de ces précipités peut s'effectuer par exemple en ajoutant un mélange liquide de volumes égaux d'une solution alcaline aqueuse et d'un composé aminé aux précipités récupérés en séparant la couche inférieure contenant le composé (I) (à ce moment, des composés par- tiellement fluorés sont séparés dans la couche aminée), en le lavant avec une quantité approprié d'acétone aqueuse contenant de l'iodure de potassium pour élimi- ner des composés dans lesquels des atomes de fluor sont' liés à des atomes d'azote, puis en le soumettant à une distillation-fractionnée pour séparer le composé (I). Les émulsions de perfluorocarbures thérapeu- tiques capables de transporter l'oxygène sont connues en soi dans la technique, et par conséquent la carac- téristique de la présente invention réside dans le choix de composés perfluoro particuliers, à savoir les composés répondant à la formule générale (I) comme composés perfluorocarbonés Par conséquent, on peut envisager comme préparations d'émulsions de perfluoro- carbures de la présente invention, des émulsions ana- logues aux produits précédemment connus, à savoir des émulsions huiledans-eau dans lesquelles un composé perfluoro est dispersé dans l'eau, et la proportion de composé perfluoro est de 5 à 50 % (P/V), de préférence de 10 à 40 % (P/V). i I Lorsqu'on prépare l'émulsion, on utilise un surfactif non ionique polymère, tel qu'un phospho- lipide, etc, seul ou en mélange, comme agent émul- sionnant, et la proportion à ajouter est de 1 à 5 % (P/V). L'agent tensio-actif non ionique polymère utilisé ici a une masse moléculaire de 2 000 à 20 000. Comme exemples de celui-ci, on citera Ies copolymeres polyoxyéthylènepolyoxypropylène, des esters d'acides gras du polyéthylène, des dérivés de l'huile de ricin et du polyoxyéthylène, etco Comme exemples du phospho- lipide, on citera le phospholipide de la vitelline, le phospholipide du soja, etc o En outre, si nécessaire, on peut aussi ajouter comme agent émulsionnant-, par exemple en C 8 C 22, en particulier en C 14 à C 20, ou un de ses sels physiologiquement acceptables (par exemple des sels de métaux alcalins, comme le sel de sodium, le sel de potassium, etc, des monoglycérides de celui-ci). Comme exemples de l'acide gras ci-dessus, on citera l'acide caprylique', l'acide caprique, l'acide laurique, l'acide myristique, l'acide palmitique, l'acide stéa- rique, l'acide béhénique, l'acide palmitoléique, l'acide oléique, l'acide linoléique, l'acide arachidonique, leurs sels de sodium ou de potassium, leurx glycérides, etc La proportion de ceux-ci à ajouter est de 0,001 à 0,01 % (P/V). Comme milieu, on peut utiliser une solution aqueuse physiologiquement acceptable, par exemple une solution saline physiologique, la solution de Ringer additionnée d'acide lactique, etco Si nécessaire, on peut ajouter en outre une quantité isotonisante d'un agent isotonisant tel que le glycérol pour isotoniser l'émulsion, et un substi- tut du plasma sanguin tel que l'amidon hydroxyéthylé, le dextrane, etc, pour ajuster la pression osmotique colloidale de l'émulsion. Les émulsions de la présente invention peuvent se préparer en mélangeant les divers consti- tuants dans un ordre quelconque, en émulsionnant et en homogénéisant grossièrement au moyen d'un émul- sionneur approprié (par exemple un émulsionneur du type Manton-Gaulin) jusqu'à ce que le diamètre des particules soit de 0,3 micron ou moins. Les préparations d-'émulsons de composés perfluorobicyclo de la présente invention ont une capacité de transport de l'oxygène, et sont par con- séquent utilisés par exemple dans des transfusions, pour le transport de l'oxygène (les "substituts des globules rouges"), comme perfusats de stockage des organes, etc. Lorsqu'on utilise la préparation d'émulsions de composés perfluorobicyclo de la présente invention, par exemple comme transfusion pour le transport de l'oxygène, on l'administre généralement par injection intraveineuse, et la posologie pour un adulte humain est de 50 à 2 000 ml par dose. Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustrations de l'invention. EXEMPLE 1 Comme cellule électrolytique, on utilise un réservoir (en métal Monel), d'une capacité de 1,5 ú, contenant des électrodes de nickel (pureté: 99,6 % ou supérieure) (six anodes et sept cathodes) disposées alternativement avec un intervalle d'électrodes de 1,7 à 2,0 mm, ayant une surface anodique effective de 10,5 dm 2, et équipées en outre d'un condenseur à reflux en cuivre sur le dessus. Dans cette cellule électrolytique, on introduit 1,2 d'acide fluorhydrique anhydre et on élimine les impuretés (eau et acide sulfurique) présentes en très faibles quantités par une électrolyse préliminaire On dissout ensuite dans l'acide fluo- rhydrique 0,85 mole ( 130 g) de 4-méthyloctahydroquino- lidine et, tout en faisant passer de l 'hlium sous un débit de 100 ml/min par la partie inférieure de la. cellule, on effectue l'électrolyse avec une densité de courant anodique de 1,0 a 2,0 A/dm, une tension de 4,0 à 6, 2 V et une tempéra-turxe de bain de -4 C à â:C On poursuit l'électrolyse pendant 1 051 A-hi jusqtà ce que la tension électrolytique atteigne 9,0 Vo On intro- duit en outre 200 ml d'acide fluorhydrique:par 2 '4 heures-o. Le gaz formé pendant l'électrolyse est envoyé dans un tube de fer garni de granules de fluorure de sodium pour éliminer l'acide fluorhydrique anhydre entraîné, puis il est conduit dans un piège refroidi avec de la glace sèche-acétone pour le liquéfier et le piéger, et l'on obtient 9,5 g de liquide incolore Par ailleurs, la solution de bain dans la cellule électrolytique se sépare en deux phases, la couche supérieure contenant de l'acide fluorhydrique anhydre et la couche inférieure, le composé fluorobicycloo On sépare la couche inférieure qui pèse 263 go Le liquide recueilli par refroidissement du gaz formé ci-dessus et le liquide de la couche inférieure de la cellule électrolytique sont rassemblés, on y ajoute des volumes égaux de solution aqueuse de KOH à 70 % et de diisobutylamine, et on effectue le reflux pendant sept jours On sépare le produit perfluoro au moyen d'une ampoule à décantation, on le lave avec une solution aqueuse d'acétone à 90 % (P/V) contenant % (P/V) d'iodure de potassium, puis on le soumet à une distillation fractionnée en utilisant un appa- reil de distillation fractionnée équipé d'une colonne à bande tournante, et l'on obtient 44 g (rendement: 10 %) de perfluoro-4méthyloctahydroquinolidine (Ebo -155 'C/760 mm de Hg) Par spectrographie infrarouge, résonance magnétique nucléaire et spectre de masse, on confirme que le produit obtenu est le composé per- fluoro-4-méthyloctahydroquinolidine désiré. EXEMPLE 2 On prépare les composés perfluorobicyclo suivants de la même manière qu'à l'exemple 1. Perfluoro-2-méthyloctahydroquinolidine (Eb 145 C 155 l C/760 nm Hg I; Perfluoro-1-méthyloctahydroquino Iidine (Eb 145 C 155 C/760 mm Hg); Perfluoro-9 a-méthyloctahydroquinolidine (Eb 145 C 155 C/760 mm Hg); Perfluoro-4-éthyloctahydroquinolidine (Eb 165 C 175 C/760 mm Hg). EXEMPLE 3 On ajoute 400 g de phospholipide de la vitelline à 8,5 2 de solution de Ringer additionnée d'acide lactique, et on agite avec un mélangeur pour préparer une émulsion grossière, puis on y ajoute 2,5 kg de perfluoro-4méthyloctahydroquinolidine et on agite à nouveau énergiquement avec le mélangeur pour préparer une émulsion grossière On place cette émulsion grossière dans le réservoir à liquide d'un émulsionneur à jet (fabriqué par la Manton-Gaulin Co) et on la fait circuler tout en maintenant la tempéra- ture du liquide à 50 5 C pour effectuer l'émulsifica- tion La concentration de la perfluoro-4-méthylocta- hydroquinolidine dans l'émulsion obtenue est de 27,3 % (P/V) Le diamètre de particules, mesuré par la méthode de sédimentation centrifuge, est de 0,05- 0,27 micron Cette émulsion est répartie dans des flacons pour injection, bouchés et stérilisés thermi- quement dans un stérilisateur rotatif, mais on observe aucune augmentation importante du diamètre des parti- cules. 9. EXEMPLE 4 On obtient une émulsion suivant un mode opératoire semblable à celui de l'exemple 1, excepté que la perfluoro-4-méthyloctahydroquinolidine est remplacée par la perfluoro-4-éthylocctahydroqiinol-idine o Le diamètre de particule de l'émulsion ainsi obtenue est de 0,05 à 0,25 micxon Exemple expérimental 1 Stabilité des émulsions On ajoute de l'eau a 20 g de chacun des composés perfluorobicyclo choisis, dans la présente invention et 4 g de phospholipide de la vitelline de façon à faire un volume total de 200 ml, et on effectue la mise en émulsion en utilisant un émul- sionneur de Manton-Gaulin tel que celui utilisé ci- dessus sous un courant d'azote, sous 19 600 à 58 800 k Pa tout en maintenant la température du liquide à 40-45 C. Chacune des émulsions obtenues est filtrée à travers un filtre à membrane de 0,65 micron, répartie dans des flacons de 20 ml, et, après avoir remplacé l'at- mosphère par de l'azote, traitée thermiquement à 1000 C, pendant 30 minutes, puis stockée à 4 C pour examiner la stabilité Le diamètre de particules de l'émulsion est mesuré par la méthode de sédimentation centrifuge de Yokoyama et al lChem Pharm Bull 22 ( 12) 2966 ( 1974)l, et, à partir des données obtenues, on calcule la répar- tition du diamètre de particules moyen en utilisant un microcalculateur. Les répartitions de diamètre de particules de chacune des émulsions de perfluorocarbures avant et après chauffage, et après chauffage et stockage à 4 C et à la température ambiante ( 15-28 C) sont donnés dans les tableaux 1 et 2 Comme il ressort des résul- tats, les émulsions de l'invention sont très stables vis-à-vis du chauffage et aucune influence sur le dia- mètre moyen de particules due au chauffage n'a été observée En outre, lorsqu'elles sont stockées à 4 C après chauffage, on n'observe aucune augmentation du diamètre moyen de particules, même au bout de cinq mois. a t sd amêtkoe de pgtt cules moyen de particules > à 4 IIC 0,122 33,0 61,5 5,5 a la t OE*Crature ambiants0,114 31,3 6 ?,6 Au bout dé 5 mois 4 'IC 0,135 25,5 64,2 10,4 CABLEAU 1 Stabilité de l'émulsion de perfluoro-4-méthyloçt Ahydroquinolîdine Fi j PO ui L 4 r%) % O - 4 , C> 1 1 TABLEAU 2 Stabilité de l 'émuls ion de perfluoro-4-éthyloc'tahydroquinol idi'ne Diamètre Répartit on-deÉdú xigètreg de part cules moyen de ______ en Poids particules 0,3 pw Avant chauffage 0, 2122 38,0 51 f 2 10,8 O Aussitôt après chauffage 0,122 34,3 57, 5 8, 2 O Au bout de 2 semaines à 40 C 0,118 37,1 61,0 1,9 O à la ter Zrature afrbiante 0,128 31,3 63,5 5, 2 O Au bout de 4 semaines à 40 C 0,123 38,5 60,2 1,3 O A la tenpérature arcbiante 0,119 34,1 60,5 5,4 O Au bout de 5 mois à 401 C 0,126 37,9 58,1 4,0 O I.L La Exemple expérimental 2 Test de toxicité aiguë. Le test de toxicité aiguë a été effectuée sur les préparations de l'invention en utilisant les préparations du tableau 3 qui ont été physiologi que- ment isotonisées Les animaux d'ess'ai étaient des rats mâles de souche Wister (pesant 100 à 120 g). L'émulsion est admini strée par voi e intvein se et l'on observe les akn'maux pendant une senaiue aprs l'administration On constate que tant avec l'émulsion con- tenant de la per-fluoro-4-méthyloctahydroquinolidine qu'avec celle contenant de la perfluoro-4-éthylocta- hydroquinolidine, il n'y a pas de cas de mort à la dose de 100 ml/kg de poids du corps, et que par con- séquent leur toxocité est très faible - TABLEAU 3 Composition Rapport _, __ , __ ___ _,,,%(P/V) Constituant C Onposé perfluorobicyclo 30 huileux ( 9 vol) Agent émulsionnant: Phospholipide de la vitelline 4,0 ,,, t Na Cl 6,00 Na HCO 3 2,1 Electrolyte K Cl 0,336 ( 1 vol) ' ( 1 vol) Mg C 12 '6 H 20 0,427 Ca C 12 2 H 2 O 0,356 D-Glucose 1,802 p H 8,0 , I _,, Exemple expérimental 3 Répartition du composé per- fluoro dans les organes En utilisant des rats mâles de souche Wister pesant 120-130 g, on administre l'émulsion préparée dans l'exemple 1 dans la veine de la queue (à raison de 4 g/kg, calculé en perfluoro-4méthyloctahydroquinoli- dine), et, pendant une durée de trois mois après l'ad- ministration, an mesure la teneur de ce composée dams le foie, la rate et les tissus adipeux résultant de la fixation. La teneur en perfluoro-4-méthyloctahydro- quinolidine fixée dans chaque organe une, deux et quatre semaines et trois mois après l'administration est indiquée dans le tableau 4 Le composé est fixé en quantités plus importantes par l'organe réticulo- endothélial peut après l'administration, mais dispa- raît rapidement Il n'y a pas d'indice d'influence nocive sur le foie ou la rate. En conséquence, la demi-vie de la perfluoro- 4-méthyloctahydroquinolidine est de 7,33 jours. TABLEAU 4 Organe temps après taux résiduel l'administration de composé perfluoro- bicyclo, % 1 semaine 19,92 Foie 2 semaines 8,66 4 semaines 1,88 3 mois 0, 30 1 semaine 11,61 Rate 2 semaines 9,33 4 semaines 2,45 3 mois 0,09 Exemple expérimental 4 Remarques anatomiques A des rats males de souche Wister pesant -130 g, on administre 4 g/kg de l'émulsion de composé perfluorobicyclo préparée dans l'exemple 1 ou dans l'exemple 2, et on observe les orgartes disséqu's peni- dant une période de trois mois après l'administration, on pèse les organes (foiea et ratsr pour dêtexmine r leur poids par rapport au, p cids crporeîi Une, deux et quatre semaines et trois mois après l'administration de l'émulsion, les organes importants, a savoir le poumon, le foie et la rate- sont observés, et l'on ne trouve aucun signe de l'in- fluence de l'un ou l'autre de ces composés sur les organes en raison de leur élimination rapide. REVENDICATIONS 1 Composé perfluorobicyclo répondant à la formule générale: F dans laquelle R représente un groupe perfloluométhyle ou perfluoro- thyle. 2 Perfluoro-4-méthyloctahydroquinolidine. 3 Perfluoro-2-méthyloctahydroquinolidine 4 Perfluoro-1-méthyloctahydroquinolidine. Perfluoro-9 a-méthyloctahydroquinolidine. 6 Perfluoro-4-éthyloctahydroquinolidine. 7 Préparation d'émulsion de composé pet- fluorobicyclo capable de transporter de l'oxygène comprenant 5 à 50 % (P/V) d'un composé perfluorobicyclo répondant à la formule générale F F R dans laquelle R représente un groupe perfluorométhyle ou perfluoroéthyle, comme constituant transportant de l'oxygène, 1 à 5 % (P/V) d'un agent émulsionnant et le reste d'une solution aqueuse physiologiquement accep- table, l'émulsion ayant un diamètre de particules de 0,3 micron ou moins. 8 Préparation suivant la revendication 7, caractérisée en ce que le composé perfluorobicyclo est la perfluoro-4-méthyloctahydroquinolidine, la perfluoro-2-méthyloctahydroquinolidine, la perfluoro- 1-méthyloctahydroquinolidine, la perfluoro-9 a-méthyl- octahydroquinolidine, ou la perfluoro-4-éthyloctahydro- quinolidine. 9 Préparation suivant la revendication 7, caractérisée en ce que l'agent émulsionnant est un agent tensioactif non ionique polymère ou un phospho- lipide. 10 Préparation suivant la revendication 7,, caractérisée en ce qu'on ajoute comme agent émulsion- nant 0,001 à 0,01 % (P/V) d'un acide gras en Cà a C 22 ou un sel physiologiquement:acceptable de? iui-e 11 Préparation suivant la revendication 7 ', caractérisée en ce qu'on ajoute une quantité isotoni- sante d'une agent isotonisant. 12 Préparation suivant la revendication 7, caractérisée ence qu'on ajoute un substitut du plasma.