FR 2527448 A1 19831202 FR 8309002 A 19830531 La présente invention concerne un procédé pour la pro- duction en masse d'interféron par contact de cellules culti- vées avec un polyol. L'interféron a été découvert par Nagano et coll (Compt. Rend Soc Biol, vol 148, p 1700, 1954) et Isaacs et coll. (Proc Roy Soc Ser B vol 147, p 258, 1957) Récemment, on a signalé que l'interféron avait diverses activités biolo- giques telles qu'un effet antitumoral (Gressor et coll, B B A, vol 516, p 231, 1978) en plus de l'activité antivirale et on s'est intéressé à la possibilité de son emploi comme agent thé- rapeutique L'interféron est de façon générale subdivisé en trois groupes Ces groupes sont appelés interféron-çk, inter- féron-) et interféron- La production d'interféron-o est induite par la stimu- lation de leucocytes ou de cellules lymphoblastoldes cultivés avec divers virus tels que le virus Sendai (HVJ), le virus de la maladie de Newcastle (NDV) et le virus grippal. La production de l'interféron-) est induite par stimula- tion de cellules diploldes normales avec divers virus tels que HVJ, NDV et le virus grippal ou avec de l'ARN bicaténaire,etc. Récemment, ce procédé a été nettement perfectionné Par exem- ple, le procédé de superinduction de Vilcék et coll (Anti- microb Ag Chemother vol 2, p 476, 1972) qui comprend la stimulationdes cellules avec des inducteurs tels que de i'ARN bicaténaire puis le traitement avec des inhibiteurs pétaboli- ques tels que le cycloheximide et l'actinomycine D accro t re- marquablement la production de l'interfron-). La production drinterféron 9 est induite par stimula- tion de lymphocytes T avec des mitogènes tels que la phyto- hémagglutinine (PHA) et la concanavaline A (Con A) ou avec une réaction antigène-anticorps. On sait également que la production d'interféron est ac- crue par une incubation pendant une nuit des cellules dans un milieu contenant de l'interféron avant la stimulation avec di- vers inducteurs Cet effet est connu sous le nom d'effet d'a- norcaae. L'invention a pour objet un procédé nour la production en masse d'interféron par culture de cellules Plus particu- lièrement, l'invention fournit un procédé perfectionné pour la production de quantités importantes d'interféron qui com- prend la mise en contact de cellules cultivées avec au moins un polyol. Plus particulièrement, l'invention a pour objet un pro- cédé pour produire de l'interféron dans lequel des cellules cultivées sont mises en contact avec ledit polyol par addition du polyol au milieu d'amorçage, au milieu d'induction et/ou au milieu de production. L'invention a également pour objet un procédé de produc- tion d'interféron dans lequel des cellules cultivées sont mi- ses en contact avec ledit polyol par exposition passagère des cellules à l'action d'une solution dudit polyol en un stade approprié. L'invention concerne également un procédé pour la pro- duction d'interféron dans lequel le contact des cellules cul- tivées avec le polyol est effectué par combinaison de l'addi- tion dudit polyol au milieu de culture et de l'exposition pas- sagère des cellules cultivées à l'action d'une solution con- tenant ledit polyol en un stade approprié. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la des- cription qui va suivre, faite en regard des dessins annexés dans lesquels: la Fig 1 est un diagramme illustrant un procédé général de production de l'interféron-J 3 qui est utilisé dans l'expérience 1, la Fig 2 est un diagramme illustrant un procédé géneral de production de l'interféron-0 qui est utilisé dans l'expérience 3, et la Fig 3 est un diagramme illustrant un procédé général de production de l'interféron-1 qui est utilisé dans l'expérience 4. Selon l'invention, on met des cellules cultivées en contact avec une solution contenant au moins un polyol. Ce contact peut être effectué par addition dudit polyol au milieu d'amorçage, au milieu d'induction et/ou au milieu de produc- tion Sinon, les cellules cultivées peuvent tre exposées de façon passagère à l'action d'une solution du polyol en un sta- de approprié, par exemple par rinçage lors du changement de milieu Le rinçage peut être effectué avant que le milieu soit remplacé par le milieu d'amorçage, le milieu d'induction et/ou le milieu de production L'addition de l'alcool au milieu peut être combinée au rinçage des cellules avec l'alcool. Les polyols utiles dans l'invention sont ceux dont la molécule comporte deux groupes hydroxy (-OH) alcooliques ou plus On peut employer des alcools de poids moléculaire élevé sous réserve qu'ils soient solubles dans le milieu, etc et qu'ils ne soient pas toxiques pour les cellules à leur concen- tration d'emploi Par exemple, on peut employer les alcools suivants: polyéthylèneglycol (poids moléculaire moyen: v 20 000), polypropylèneglycol de type diol (poids molécu- laire moyen: 1000 3 000), polypropylèneglycol de type triol (degré de polymérisation: 500 O/2 0003 éthylèneglycol, propanediol, glycérine, butanediol, butanetriol, butanetétrol, pentanediol, pentaérythritol et hexanetriol Parmi ces alcools, on préfère tout particulièrement le polyéthylèneglycol. Comme la concentration efficace du polyol dépend de la nature des cellules cultivées, du milieu de culture, des in- ducteurs et des polyols employés, on peut facilement détermi- ner expérimentalement la concentration la mieux appropriée à chaque cas Cependant, en général, on peut employer comme concentration standard environ O,001 à 30 % en poids, de préfé- rence environ 0,1 à 5-% en poids, pour l'addition au milieu et environ 0, 1 à 60 S en poids, de préférence environ 1 à 30 % en poids, pour l'exposition passagère des cellules cultivées. L'emploi d'un seul polyol produit généralement un effet suffisant Cependant, on peut, si on le désire, employer un mélange de deux ou plusieurs polyols. Les cellules suivantes peuvent 9 tre employées pour la production d'interféron selon l'invention: cellules diploïdes humaines MRC-5, cellules lymphoblasto:des humaines Namalva, cellules de souris L 929 et cellules humaines T De plus, d'au- tres cellules humaines telles que les cellules WI-38, les cel- lules IMR-90, les cellules MG-63, les cellules Flow 1 000, les cellules Flow 4 000 et les cellules Ball-1 peuvent être em- ployées pour la production de l'interféron D'autres cellules de mammifères telles que les cellules RK-13 et les cellules MIDBK peuvent être emtloyées ainsi que diverses cultures pri- maires de cellules de mammifères Les cellules citées en exem- ple sont bien connues dans la technique et peuvent être obte- nues selon une technique classique de culture ou, lorsqu'elles appartiennent à une lignée cellulaire établie, on peut par exem- ple se les procurer auprès de Dainippon Pharmaceutical Co, Ltd, Osaka, Japon,; de 1 'ATCC; ou de Hayashibara Biology and Chemistry Research Co,, Ltd, Japon. Comme inducteurs d'interféron, on peut employer pour la production de l'interféron des inducteurs classiques tels que Poly(I) Poly(C), HVJ, NDV et Con A On peut également employer d'autres inducteurs tels que Chlamydia, Rickettsia, des mito- gènes et des lipopolysaccharides. On emploie généralement comme milieu d'amorçage et mi- lieu d'induction, le milieu minimum essentiel (MEM) de Eagle et le RPMI 1640 De plus, on peut employer d'autres milieux tels que McCoy 5 A, 199, Ham F 12 et L 15. Comme milieux de production de l'interféron, on peut non seulement employer le IEM de Eagle mais également des solu- tions salines tamponnées telles que la solution de Hanks et la solution tamponnée phosphatée de Dulbecco (PBS). Lorsque les cellules cultivées sont soumises à l'action du polyol, on peut employer des solutions salines telles que la solution de Hanks et la solution de Earle ou le milieu de culture lui-même ainsi que le PBS comme solvant du polyol. Les effets du polyol sur la production de l'interféron sont illustrés ci-après par des exemples expérimentaux. Expérience 1 L'effet du polyol sur la production de l'interféron-B a été étudié. On a cultivé des cellules diploïdes humaines MRC-5 (fournies par Dainippdn Pharimaceutical Co, Ltd) dans du MEM de Eagle additionné de 10 Fa de sérum de veau dans un flacon d'incuba- tion en matière plastique à 37 C sous une atmosphère a 5 % de C 02 Après obtention d'une couche monocellulaire, le mi- lieu a été remplacé par du MEM de Eagle contenant 100 UI/ml d'interféron-p et 0,1 % de sérum-albumine humaine L'incuba- tion a été effectuée dans ce milieu pendant une nuit, puis on a effectué une incubation de 5 heures avec addition de Poly(I) Poly(C) et de cycloheximide à des concentrations fi- nales respectives de 30 pg/ml et 2 pg/ml De l'actinomycine D a été ajoutée à la culture à une concentration de 1 jg/ml et l'incubation a été poursuivie pendant 2 heures Les cellu- les ont été rincées deux lois avec du PBS et incubées pen- dant une nuit dans le milieu de production (milieu MEM de Ea- gle additionné de 0,1 % de sérum-albumine humaine) L'acti- vité de l'interféron produit a été mesurée par l'inhibition de l'effet cytopathogène (CPE) avec le système cellules FL- virus Sindbis (Kohase et coll, Protein, Nucleic acid and En- zyme, numéro spécial, n 25, pp 355-363, 1981). Le procédé de production décrit ci-dessus est un procé- dé général pour la production d'interféron-3 à partir de cel- lules normales avec emploi de Poly(I) Poly(C) comme inducteur. Le procédé est illustré par la figure 1. On a employé comme polyol du PEG 1540 (polyéthylènegly- col ayant un poids moléculaire moyen de 1 540) et on a étudié son effet sur la production de l'interféron-p selon le procé- dé illustré par la figure 1 Le PEG 1540 a été appliqué à la culture par addition au milieu d'amorçage et/ou au milieu de production à une concentration de 0,3 % en poids ou par expo- sition passagère des cellules à l'action de PBS contenant du PEG 1540 avant le remplacement du milieu par le milieu d'a- morçage ou par le milieu de production De plus, les deux procédés cidessus ont été, dans certains cas, combinés Les xzsultats sont illustrés par le tableau 1. Tableau 1 Traitement avec le PEG 1540 1 Pas de traitement 2 Addition de PEG 1540 au milieu d'a- morçage à la concentration de 0,3 O* 3 Addition de PEG 1540 au milieu de production à la concentration de 0,3 * 4 Rinçage de la surface des cellules avec du FBS contenant O l o* de PEG 1540 avant le remplacement par le milieu d'amorçage Rinçage de la surface des cellules avec du PBS contenant 10 o* de PEG 1540 avant le remplacement par le milieu de production 6 Traitement 2 + traitement 3 7 Traitement 2 + traitement 4 8 Traitement 2 + traitement 5 Rendement en inter- féron)3 (UI/ml) 12 700 600 16 200 17 500 22 300 27 100 27 400 28 700 * % exprimés en poids Le PEG 1540 a été ajouté au milieu d'amorçage à diffé- rentes concentrations de 0, 0,001, 0,01, 0,1, 1,0 et 10,0 % en poids et l'accroissement de la production de l'interféron-P a été étudié Les résultats figurent dans le tableau 2. Tableau 2 Concentration de PEG 1540 ajoutee au milieu d'lor-çage ( 5 en Doidsl o O 0,001 0, 01 0,1 1,0 ,0 Rendement en interúeron-p (UI/ml) 12 700 13 800 100 27 900 24 600 500 Divers polyols tels que 1 'hexanetriol, le butanediol et le pentaërythritol ont été ajoutés au milieu d'amorçage et l'ac- croissement de la production de l'interféron-3 a été étudié. Les résultats figurent dans le tableau 3. Tableau 3 Polyols ajoutés au milieu Rendement en interféron-3 d'amorçage (% en poids) (UI/ml) Néant 11 800 0,3 % de PEG 1540 27 300 0,3 %o d'hexanetriol 19 700 0,3,o butanediol 17 100 0,3 o de pentaérythritol 16 400 Ex_érience 2 On a ensemencé du MEM de Eagle additionné de 10 a de sérum de veau dans un flacon en matière plastique ayant une surface de culture de 150 cm avec des cellules de souris L 929 (fournies par Dainippon Pharmaceutical Co, Ltd) et on a culti- vé les cellules à 37 C sous une atmosphère à 5 % de CO 2. Après obtention d'une couche monocellulaire, on a induit la production d'interféron selon la méthode illustrée par la fi- aure 1 Comme polyol, on a ajouté au milieu d'amorçage, à la concentration de 0,3 % en poids, du PEG 1540 ou de l'hexane- J triol Pour l'exposition passagère, les cellules ont été rin- cées deux fois avec du PBS contenant 10 % en poids de PEG 1540 avant que le milieu soit remplacé par le milieu de pro- duction L'activité de l'interféron produit a été mesurée par l'inhibition de l'effet cytopathogène (CPE) avec le système cellules L 929-virus Sindbis Les résultats figurent dans le tableau 4. Tableau 4 Traitement Rendement en interféron-p (UI/ml) Pas de traitement 2 090 Addition de 0,3 o* de PEG 1540 au milieu d'amorçage 3 240 Addition de 0, 33 %* d'hexanetriol au milieu d'amorçage 2 970 Rinçage de la surface des cellules deux fois avec du PBS contenant 10 %* de PEG 1540 avant le remplacement par le milieu de production 2 560 *% exprimé en poids Expérience 3 Les effets de polyols sur la production de l'interféron- ont été étudiés. Des cellules lymphoblastordes Namalwa (fournies par Dainippon Pharmaceutical Co, Ltd) qui ont été entretenues dans du milieu RPMI 1640 additionné de 5 % de sérum de veau ont été soumises à un traitement d'amorçage pendant une nuit dans du milieu RPMI 1640 contenant 100 UI/ml d'interféron-O et 0,1 % de sérum-albumine humaine On a ajouté à la culture du virus HVJ à la concentration de 100 HAV/m I et on a incubé la culture pendant une nuit On a ensuite inactivé 1 'HVJ en conditions acides (p H 2) Après neutralisation du milieu & p H 7, on a mesuré le rendement de l'interféron. Le procédé de production décrit ci-dessus est un procédé général de production d'interféron-d à partir de leucocytes ou de cellules lymphoblastoldes Le procédé est illustré par la figure 2. Comme polyol, on a ajouté du PEG 1540 à la concentration de 0,3 % en poids au milieu d'amorçage ou, pour l'exposition passagère, on a rincé deux fois les cellules avec du PBS con- tenant 10 % en poids de PEG 1540 avant de remplacer le milieu par le milieu d'amorçage Les résultats figurent dans le ta- bleau 5. Tableau 5 Traitement Rendement en interféron O (UI/ml) Pas de traitement 1 740 Addition de 0,3 %* de PEG 1540 au milieu dtamorçage 3 620 Rinçage de la surface des cellules avec du PBS contenant 1 C* de PEG 1540 avant le remplacement par le milieu d'amorçage 2 980 E va exprime en poias Dans l'exposition passagère décrite ci-dessus, on a utilisé des concentrations en PEG 1540 de 0,1, 1,0, 10, 30 et 60 % en poids pour étudier l'effet sur l'accroissement de la production de l'interféron, Les résultats figurent dans le tableau 6. 2527448 ' Tableau 6 Concentration en PEG 1540 pour l'exposition passagère avant le remplacement par le milieu d'amorçage endpmient en:tirf Jr:: (UI/mi) ( 55 en pois) Néant 1 740 0,1 S 1 960 1,0 % 2 170 % 2 980 % 2 950 O 2 630 Expérience 4 Les effets de polyols sur la production d'interféron ont été étudiés. On a isolé des leucocytes du sang périphérique de vo- lontaires adultes sains avec un gradient de Ficoll-Hypaque. Les leucocytes ont été cultivés dans des bottes en matière plastique et les cellules n'adhérant pas à la surface des boites ont été recueillies Ces cellules ont été mises en sus- pension dans du milieu RPMI 1640 additionné de 051 % de sérum- albumine humaine On a ajouté de la Con A à la suspension à une concentration de 5 pg/ml et on a incubé pendant 48 heu- res. Le procédé de production décrit ci-dessus est un procé- dé général de production d'interféron Le procédé est illus- tré par la figure 3. Comme polyol, on a ajouté du PEG 1540 à la concentration de 0,3 % en poids au milieu RPMI 1640 additionné de 0,1 % de sérum-albumine humaine Les résultats figurent dans le tableau 7. Tableau 7 PEG ayant à la suspension Rendement en interféron de leucocytes (I en poids) -T (UI/ml) Néant 790 0,3 5 de PEG 1540 1 420 L'invention est de plus illustrée par les exemples non limitatifs suivants. Exemple 1 Production d'interféron t On a ensemencé avec des cellules Namalwa du milieu RPMI 1640 additionné de 5 5 de sérum de veau à raison de 3 x 105 cellules/ml et on a cultivé pendant 3 jours Après cette pé- riode, on a rincé les cellules avec du PBS contenant 10 % en poids de PEG 1540 Les cellules ont ensuite été mises en suspension à la concentration de 1 x 106 cellules/ml dans du milieu RPMI 1640 contenant 100 UI/ml d'interféron-c r 0,1 % de sérum-albumine humaine et 0,3 % en poids de PEG 1540 Après 18 heures d'incubation, on a ajouté 100 HAV/ml d'HVJ et on a poursuivi l'incubation pendant une nuit On a ensuite inacti- vé 1 'HVJ en conditions acides (p H 2) par addition d'acide chlorhydrique L'activité de l'interféron-r a été mesurée après la neutralisation du milieu à p H 7 Le rendement en in- terféron, a été de 4 700 UI/mle Exemple 2 Production d'interféron-_ On a ensemencé avec des cellules WI-38 (fournies par Dainippon Pharmaceutical Co,-Ltd à raison de 5 x 106 cellules/ 150 cm 2 un flacon du milieu MEM de Eagle additionné de 10 % de sérum de veau et on a cultivé pendant 5 jours On a effec- tué un traitement d'amorçage pendant une nuit dans le milieu MEM contenant 100 UI/ml d'interféron-p, 0,1 % de sérum-albu- mine humaine et 0,5 % en poids de PEG 1540 La production d'interféron a été induite selon le procédé de superinduction avec du Poly(I) Poly(C), du cycloheximide et de l'actinomycine D La surface des cellules a ét 6 rincée avec une solution à % en poids de butanediol avant remplacement du milieu par le milieu de production constitué de solution de Earle conte- nant 0,1 % de sérum albumine humaine Le rendement en inter- féron-p a été de 37 500 UI/ml. ? 7448 R E V E N D I C A T I O N S 1 Procédé de production d'interf 6 ron par stimulation de cellules cultivées avec un inducteur d'interf 6 ron, carac- térisé en ce que les cellules sont mises en contact avec au moins un polyol. 2 Procédé de production d'interféron selon la reven- dication 1, caractérisé en ce que les cellules cultivées sont choisies parmi les cellules diploides humaines MRC-5, les cel- lules lymphoblastoldes humaines Namalwa, les cellules T hu- maines, les cellules de souris L 929, les cellules WI-38, les cellules IMR-90, les cellules MG-63, les cellules Flow 1 000, les cellules Flow 4 000, les cellules Ball-l, les cellules RK-13, les cellules >MBK et diverses cellules de mammifères en culture primaire. 3 Procédé de production d'interféron selon la reven- dication 1, caract 6 risé en ce que l'inducteur est choisi parmi Poly(I) Poly(C), HVJ, NDV, la concanavaline A, Chlamydia, Rickettsia, les mitogènes et les lipopolysaccharides. 4 Procédé de production d'interféron selon l'une quel- conque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le po- lyol est choisi parmi un polyéthylèneglycol, un polypropylène- glycol de type diol, un polypropylèneglycol de type triol, l'éthylèneglycol, le propanediol, le butanediol, le butane- triol, le butanetétrol, le pentanediol, le pentaérythritol et l'hexanetriol. Procédé de production d'interféron selon la reven- dication 4, caractérisé en ce qu'on emploie en combinaison deux polyols ou plus - 6 Procédé de production d'interféron selon la reven- dication 4, caractérisé en ce que le polyol est le polyéthy- lèneglycol. 7 Procédé de production d'interféron selon l'une quel- conque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le polyol est ajouté au milieu d'amorçage. 8 Procédé de production d'interféron selon l'une quel- conque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le polyol est ajouté au milieu d'induction. 9 Procédé de production d'interféron selon l'une quel- conque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le polyol est ajouté au milieu de production. Procédé de production d'interféron selon l'une quel- conque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le po- lyol est ajouté à au moins deux milieux choisis parmi le mi- lieu d'amorçage, le milieu d'induction et le milieu de pro- duction. 11 Procédé de production d'interféron selon l'une quel- conque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que le polyol est employé à la concentration de 0,001 à 30 % en poids. 12 Procédé de production d'interféron selon la reven- dication 11, caractérisé en ce que la concentration du polyol est de 0,1 à 5 Sa en poids. 13 Procédé de production d'interféron selon l'une quel- conque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on rince les cellules cultivées avec la solution du polyol avant de remplacer le milieu par le milieu d'amorçage, le milieu d'in- duction et/ou le milieu de production. 14 Procédé de production d'interféron selon la reven- dication 13, caractérisé en ce qu'on emploie le polyol à la concentration de 0,1 à 60 % en poids. Procédé de production d'interféron selon la reven- dication 14, caractérisé en ce que la concentration du polyol est de 1 à 30 Sa en poids. 16 Procédé de production d'interféron selon l'une quel- conque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le contact des cellules cultivées avec le polyol est effectué par combinaison de l'addition du polyol au milieu de culture et du rinçage des cellules cultivées avec une solution conte- nant le polyol lors du changement de milieu. 17 Procédé de production dtinterféron selon la reven- dication 16, caractérisé en ce que la concentration du polyol dans le milieu de culture est de 0,001 à 30 t O e en poids et la concentration du polyol dans la solution de rinçage est ce 0,1 à 60 en poids. 18 Procédé de production d'interféron selon la reven- dication 17, caractérisé en ce que la concentration du polyol dans le milieu de culture est de 0,1 à 5 %o en poids et la concentration du polyol dans la solution de rinçage est de 1 à 30 %o en poids.