FR 2532657 A1 19840309 FR 8314287 A 19830907 VECTEURS PLASMIDES S'EXPRIMANT EN BACILLUS SUBTILIS ET PROCEDE POUR LEUR PREPARATION La présente invention a pour objet de nouveaux vec- teurs plasmides permettant l'expression en Bacillus Subti- lis de hauts niveaux de produits protidiques codifiés par ADN hétérologue; en outre, elle se réfère aux moyens qui en permettent la préparation. On connaît la possibilité d'isoler des fragments d'ADN d'organismes eucaryotes et procaryotes qui codifient des protéines bien déterminées et de les insérer dans des micro-organismes de manière à en permettre la répétition, la transcription et la traduction. En fait, d'après le brevet américain N O 4 237 224, un processus pour la préparation de chimères biologiques prévoit (les) la coupe de l'ADN hétérologue au moyen d'un enzyme de restriction approprié, (les) l'insertion des fragments ainsi obtenus au moyen d'un deuxième enzyme dit ligase, sur un vecteur, découpé à son tour de ce même en- zyme (les) le transfert des molécules hybrides ainsi constituées dans des cellules réceptrices à travers un mécanisme de transformation, conjugaison ou de transfec- tion, et pour finir le screening des clones obtenus de manière à identifier les porteurs de l'ADN codifiant pour la protéine particulière objet de notre intérêt. On sait par ailleurs qu'afin qu'une protéine déter- minée puisse être synthétisée, la cellule requiert des séquences spécifiques (le promoteur ou la Shine-Dalgarno), présentes sur l'ADN et permettant à l'ARN polimérase de transcrire l'ADN en ARN et aux ribosomes et aux enzymes mis en corrélation de traduire l'ARN en protéines. Dans la mesure o ces séquences de reconnaissance peuvent différer d'un organisme à l'autre, la meilleure façon pour s'assurer l'expression d'une protéine hétéro- logue dans une cellule réceptrice donnée consiste à pla- cer le gène structurel de la protéine sous le contrôle de séquences de reconnaissance propres à la cellule récep- trice. -2- Or, pour ce qui concerne la biologie moléculaire de l'Escherichia coli, nombreuses sont les publications (par exemple références 1 et 2) démontrant la facilité d'expres- sion à hauts niveaux de protéines hétérologues après que les gènes codifiants ont été placés sous contrôle de sé- quences bien reconnues par le système de transcription et de traduction de la cellule réceptrice. Cependant, le caractère pathogène du micro-organis- me en question fait prévoir une utilisation restreinte ou tout au moins contrastée des produits obtenus par son intermédiaire dans des domaines tels que, par exemple, le domaine pharmaceutique ou alimentaire. C'est pourquoi il est intéressant de faire exprimer des gènes hétérologues en Bacillus Subtilis, organisme ne présentant pas les inconvénients mentionnés pour l'E coli et qui semble donc présenter un très haut intérêt du point de vue industriel. D'après ce qui vient d'être dit, la présente inven- tion se réfère justement à de nouveaux vecteurs pouvant être utilisés pour la synthèse de protéines hétérologues en Bacillus Subtilis; elle comprend en outre des plas- mides à deux fonctions, capables de s'exprimer tant en Bacillus Subtilis qu'en E coli, permettant la prépara- tion des vecteurs précédents. L'objet sus mentionné est obtenu d'après une métho- de qui prévoit l'utilisation d'un plasmide isolé au dé- part en Staphilococcus aureus, après modification préa- lable laquelle constitue la partie intégrante de la pré- sente invention. Le plasmide en question (p E 194), largement étudié et dont la structure primaire a été partiellement déter- minée (réf 3,4,5,6,7 et 8) possède des séquences de re- connaissance extrêmement actives (réf 5,7 et 8) pour le système de transcription et de traduction qui permettent la synthèse d'une métilase conférant de la résistance à l'érythromycine Le plasmide p E 194 a été modifié, comme 3 - mentionné ci-dessus, par rapport à ce qu'en dit la lit- térature (et celà constitue l'un des principaux objets de cette invention) dans la mesure o on a utilisé le promo- teur et la séquence de Shine-Dalgarno du gène de la méti- lase comme point de reconnaissance de l'ARN-polimérase et des ribosomes, pour la synthèse de protéines hétérologues en E coli et en B subtilis Ainsi, la construction d'un site de restriction aussitôt après la séquence reconnue par les ribosomes permet l'insertion d'un gène quelconque qui est exprimé de cette façon sous le contrôle du promo- teur et de la séquence "Shine Dalgarno" du gène de la résistance à l'érythromycine; par ailleurs, comme celà se produit pour la métilase (réf 4 et 5), il est possible d'induire la synthèse de la protéine hétérologue codifiée à partir du gène cloné en exposant les cellules à des do- ses subinhibantes d'érythromycine. L'utilisation du plasmide p E 194 modifié permet d'obtenir des plasmides hybrides dérivés de l'accouple- ment de ce même plasmide avec les plasmides p UB 110 et p BR 322: ces plasmides hybrides constituent l'objet prin- cipal de cette invention. Parmi tous les plasmides, les p SM 15, p SM 16 et p SM 17 ont une importance toute particulière dans la mesure o ils sont vecteurs de clonage en Bacillus subtilis et o ils sont caractérisés par un marqueur de résistance à la - Kanamycine leur permettant d'être sélectionnés, et par un site Eco RI localisé justement à l'issue de la séquen- ce de reconnaissance des ribosomes C'est là que peuvent être clones des fragments d'ADN obtenus à partir d'Adn hétérologue à la suite d'une coupe avec Eco RI En trai- tant les vecteurs avec l'enzyme Sl après linéarisation avec Eco RI, il est possible de cloner tant des fragments obtenus à partir de n'importe quel enzyme que des coupes en "blunt end", en "sticky end", après traitement avec 51 Une des autres caractéristiques de ces plasmides consiste dans la possibilité d'induire la protéine hété- 4- rologue codifiée par 'ADN cloné avec des doses subinhiban- tes O 0,02/ug/ml) d'érythromycine pour en obtenir une hyper production Le plasmide p SM 115 est clairement décrit dans l'image de la figure 1 et approximativement dans celle dé la figure 2 o le schéma du processus complet a été égale- ment reporté lequel débouche, dans ce cas particulier, sur la préparation du plasmide p SM 15. Les séquences de la région modifiée o a été inséré le site Eco RI sont indiquées à leur tour, figure 7 sur la- quelle on peut également voir les différences entre les plasmides p SM 16 et p SM 17 et le plasmide p SM 15. Comme on l'a dit, les plasmides décrits ici sont des vecteurs par-clonage d'ADN hétérologue permettant, se- lon des voies opportunes, l'incorporation des gènes dési- rés dans la cellule réceptrice parmi les gènes mention- nés, celui dela beta-lactamase, de t'iso-amilase et de la déshydrofolato-réductase méritent une mention particu- lière, Nous tenons à répéter que les plasmides objet de cette invention sont obtenus au moyen d'une méthode pré- voyant l'utilisation, en guise de matériaux de base, des plasmides p E 194 et p BR 322 extraits respectivement des sou- ches de Bacillus subtilis BD 170 (réf 4) et de Escherichia coli HB 101 {réf 9) tous deux faciles à obtenir auprès de n'importe quel Laboratoire de Biologie Moléculaire; nous rappelons également le plasmide p BU 110 utilisé au cours de la preparation et qui a été décrit à la référence 4. Outre la modification initiale du plasmide p E 194, le-point crucial de la méthode consiste en la préparation et l'isolement des plasmides p SM 4 {figure 3), p SM 5 et p SM 6 capables de s'exprimer en B subtilis comme en E. coli et qui sont donc les intermédiaires intéressants per- mettant l'obtention finale des plasmides p SM 15, p SM 16 et p SMI 17. Dans les figures mentionnées jusqu'ici, comme dans celles qui le seront par la suite, ont été indiqués les - sites o les différents enzymes de restriction coupent les plasmides: citons, outre le site Eco RI, parmi les-plus importants: Bam HI, Hind III, Xba I e Sst I, tous en mesure de linéariser les plasmides, avec un seul site de recon- naissance. D'autres objet de cette invention, seront connus des techniciens du secteur se basant sur la description ci-dessus considérée en fonction des dessins joints, o la figure 1 est une image restrictive du plasmide p SM 15; a figure 2 est une illustration schématique de la construction du plasmide p SM 15; la figure 3 est une image restrictive du piasmide p SM 4; la figure 4 montre l'orientation différente du fragment p E 194 par rapport au p BR 322 dans les plasmides p SM 1 et p SM 2 la figure 5 est une illustration schématique de la construction du plasmide p SM 3 par le p SM 2; la figure 6 est une illustration schématique de la réduction de la longueur d'un fragment d'ADN linéaire du fait d'une action associée des enzymes Exo II et Sl; la figure 7 est une illustration schématique du fragment p E 194 contenant le promoteur et la séquence Shi- ne-Dalgarno et de sa modification en p SM 15, p SM 16 et p SM 17. 1 Préparation des plasmides p E 194 et p BR 322 La souche BD 431 (o E 194 de B subtilis et la souche HB 101 (p B 322) de E coli ont été utilisées pour inoculer l 1 t de LB ( 10 g /lt Tryptone, 5 g /lt Yeast extracts; 10 g /lt CI Na) Les cellules ont été recueillies par cen- trifugation à 5000 rpm/10 minutes, après croissance d'une durée de une nuit à 32 C et 37 C, respectivement. I Les cellules ont été lavées dans une suspension à 1/2 du volume initial avec une solution à 25 % de saccha- rose, 0,1 M Clna, 0,05 M Tris Cl (p H 7,5), recentrifugées et remises en suspension dans 1/10 du volume initial -2 6 7 -6- ( 100 ml) avec la même solution Par la suite, une fois ajou- té le lysozyme avec une concentration finale de 0,5 rg/ml, les cellules ont été incubées à 37 C pendant 15 minutes. Pour finir, on a ajouté à chacun des deux tubes con- tenant les 100 ml de suspension cellulaire, dans l'ordre 24 ml Cl Na 5 M, 6 ml 0,5 N EDTA p H 8,5 et 130 ml 2 % SDS, 0,7 M CI Na. Le tout a été maintenu à 4 C pendant une nuit. Le lendemain, les solutions ont été centrifugées à 8000 rpm dans un rotor Sorvall GSA pendant 45 minutes et l'on a ajouté 1/10 de volume d'une solution 3 M d'acétate de sodium et 2 volumes d'éthanol 95 % aux éléments surna- ceants. Les solutions ont été maintenues à -20 C pendant 3 heures et ensuite centrifugées dans un rotor Sorvall GSA à 8000 rpm pendant 30 minutes. Les pellets ont été remis en suspension dans TES ( 30 m 1 Tris-Cl p H 7,5, 50 m M Cl Na, 5 m 4 EDTA) obtenant à la fin tant pour la préparation du p E 194 que du p BR 322 un volume final de 24 ml Chaque préparation a été ensuite répartie en 4 tubes contenant chacun: 6 ml de solution plasmide, 2 ml de Bromure d'Ethydium 1 mg /ml et 7,35 gr de Chlorure de césium. Les tubes ont été centrifugés à 40 000 rpm pendant 40 heures dans un rotor Beckman 70 ti. Au terme de la course, à la lumière UV, dans chacun -des tubes étaient bien visibles deux bandes distinctes re- présentant l'une l'ADN chromosomal et -l'autre, au-dessous, l'ADN p Iasmide. Les bandes inférieures ont été prélevées à l'aide d'une seringue, les solutions ont été lavées 4 fois à l'alcool isopropylique et amplement dialysées contre tam- pon TE ( 10 m M Tris-Cl, 1 m 4 EDTA p H 8,0). Pour finir, les deux ADN plasmides ont été préci- pités à l'éthanol à -20 C en ajoutant aux deux solutions 1/10 de volume d'une solution 3 M d'Acétate de Sodium et 2532657 ' 7- 2 volumes d'éthanol 95 % Après centrifugation'1 O 000 rpm pendant 30 minu- tes dans-un rotor Sorval I SS 34, les pellets ont été lavés- àl'Ethanol 70 %, séché et remis en suspension dans TE tam- pon de manière à obtenir une solution plasmide de 100 g / MI. ml 2. Préparation du plasmide hybride p E 194 p BR 322 1 pg de p E 194 et 1,4 pg de p B 322 ont été mélanges et linéarisés à l'aide de -i'enzyme de restriction Pstl, acheté chez BRL et utilisé 'd'après les spécifications du fournisseur, à la suite de quoi les réactions ont été ar- rêtées en ajoutant un volume égal de phénol saturé avec tampon TE Après agitation, le phénol présent dans les - phases acqueuses a été extrait trois fois à l'éther et l'ADN a été ensuite précipité à -70 C pendant 10 minutes après adjonction de'1/10 de volume d'Acétate Na 3 M et de 2 volumes d'éthanol 95 % L'ADN a été remis en suspension dans 100 pl d'une solution contenant 50 m M Tris-Cl (p H 7, 6, m M Mg CL 2, 10 m M Dithytréithol,-50 W ATP, 0,05 U de li- gase T 4 préparée selon Weiss ont été ajoutées par la suite et la réaction a été conduite à 10 OC pendant 4 heures. il du mélange de ligase ont été utilisés pour la transformation des cellules de E coli HB 101 rendues com- pétentes à l'aide d'une solution 0,1 M de Ca Ci 2 ( 11). La sélection a-été faite en mettant sur plaques 0,1 ml de cellules transformées sur des plaques contenant L agar + 15 pg /ml de tétracycline et l'on'a ensuite contrô- lé que les colonies étaient Ampicilline sensibles (puisque, en effet, la coupe avec'Pst I inactive dans p BR 322 la e- lactamase qui donne sa résistance à l'Ai Tpicilline, un in- sertion dans le site'Pst I de p BR 322 d'une molécule d'ADN rend inactive la B-lactamase). R S A partir de 6 colonies Tc, Amp les plasmides ont été purifiés de la façon suivante: -1 ml de culture O N de chaque clone a été centri- fugé pendant une minute dans un centrifugeur Epperdof type 5414 Les cellules ont été remises en suspension dans 1 mi de saccharose 25 %, 0,1 M Cl Na, 0,05 M Tris-Cl p H 7,5 et centrifugées à nouveau Les cellules ont été ensuite remi- ses en suspension dans 100 gl de la même solution conte- nant 0,5 mg/cl de lysosyme et incubées à 370 C pendant 15 minutes Dans l'ordre on a ensuite ajouté: 24 Il d'une solution 5 M Cl Na, 6 4 l de 0,5 M EDTA p H 8,5 et 135 il de SDS 2 %, 0,7 M Cl Na Les solutions ont été conservées à 4 C pendant 3 heures et ensuite centrifugées pendant 15 minutes dans une centrifugeuse Epperdorf 541, à froid. Apres adjonction de 2 Il d'une solution d'ADN pan- créatique, les éléments surnageants ont été incubés à 370 C pendant 15 min les ADN ont été précipités à -70 C pendant 10 minutes. Après centrifugation, les pellets ont été séchés et remis en suspension dans 40 gl de tampon de réaction de l'enzyme Pst I ( 20 m M Tris-Cl p H 7, 5, 10 m M de Mg C 12, 50 m M de sulfate d'ammonium) Apres adjonction d'une unité d'en- zyme et incubation à 370 C pendant une heure, les échantil- lons ont été chargés sur gel d'agarose à 0,8 % et les ADN séparés, en appliquant une différence de potentiel de volts pendant 15 heures. La coloration du gel avec une solution à 0,5 y/ml de Bromure d'Ethydium mettait en évidence le fait que tou- tes les 6 colonies analysées portaient un ADN plasmide qui apres digestion avec Pst I, donnait leur origine à deux bandes distinctes qui émigraient avec les molécules liné- arisées de p E 194 et p BR 322. Ceci indiquait donc qu'en réalité les plasmides étaient composés par le p E 194 et le p BR 322 liés entre eux dans le site Pst I Par la suite, deux clones pris-au ha- sard ont été étudiés afin d'analyser l'orientation de la? molécule de p E 194 par rapport à p B 322. Pour réaliser ceci l'ADN plasmide extrait des deux clones a été linéarisé avec l'enzyme Hind III, qui coupe dans la région du p B 322 à une distance du site Pst I de 783 BP, par la suite ils ont été coupés avec Sst I qui coupe dans le p E 194 à une distance de 1059 BP du site Pstl Donc, selon l'orientation du p E 194 par rapport au p BR 322, à par- tir de cette double digestion, on s'attend à voir apparal- tre sur le gel d'agarose deux bandes d'un poids moléculai- 6 6 re de 3,14 x 10 et 2,2 x 10 ou d'un poids moléculaire de 4,1 x 106 et 1,3 x 106. Partant de l'analyse sur gel d'agarose, on a consta- té qu'un clone portait un plasmide qui, à la suite de la coupe avec Hind III et Sst I donnait lieu à deux fragments d'ADN d'un poids moléculaire égal à 3,20 x 106 et 2,32 x 10, alors que l'autre clone avait un ADN plasmide sur lequel les mêmes digestions engendraient deux fragments de 4, 20 x 106 et 1,32 x 106. le phénomène indiquait donc que les deux plasmides, p SM 1 et p SM 2, avaient des orientations différentes (figu- re 4). 3 Elimination du site Eco RI sur le plasmide p SM 2 Le plasmide p SM 2 ne porte qu'un seul site Eco RI dans la région du p BR 322 (figure 4) Dans le but de l'éli- miner, 1 pg de p SM 2 ( 10 il) a été digéré à l'aide d'une unité d'enzyme Eco RI dans 30 Dl d'une solution à 100 mn M Tris-Cl p H 7,5, 5 m M Mg C 12, 2 m M mercapto éthanol, 50 m M Cl Na pendant une heure à 37 C. L'enzyme a été inactivé en ajoutant 30 Bl de phénol saturé avec TE Après élimination du phénol-par la phase aqueuse et précipitation de l'ADN, selon la méthode décri- te plus haut, le plasmide linéarisé a été remis en suspen- sion dans 40 Bl d'une solution à 10 m M de Na OAC-HOAC p H 4,13, 300 m M Cl Na, 12 m M Zn SO 4 et 2 B d'enzyme 51 ( 11,7 U/ gl) ont été rajoutés par la suite. - On a fait réagir l'enzyme pendant une heure i 15 ec et on l'a rendu inactif par adjonction d'une goutte de phé- nol. Apres élimination du phénol apr trois extractions avec éther, l'ADN a été précipité à -70 C pendant 10 minu- tes en ajoutant 4 pl de 3 M Na OAC et 100 gl d'éthanol 95 %. Le pellet, obtenu apres centrifugation dans une cen- trifugeuse du type Epperdorf 5414 pendant 10 minutes, a été séché et remis en suspension dans 40 i 1 d'une solution à 50 m M Tris-Cl p H 7,5, 10 m M Mg C 12, 10 m M Dithytreithol, p M ATP. Une unité de ligase T 4 a été ajoutée à ces solutions et la réaction a été menée à 10 C pendant 12 heures. Après inactivation de l'enzyme à 65 C pendant 10 mi- nutes, 5 il de mélange de réaction ont été utilisés pour transformer 100 4 l de cellules d'E coli HB 101 rendues com- pétentes comme précédemment décrit. R A partir de cette transformation 44 clones Tc ont été obtenus Trois de ces clones ont été ultérieurement analysés et, après extraction du plasmide d'i ml de cultu- re selon la méthode d'extraction rapide déjà mentionnée, il a été possible de constater que deux d'entre eux por- -taient un plasmide qui, à la suite de la digestion avec l'enzyme-Eco RI, ne montrait pas de conversion de la forme super enroulée en une forme linéaire, indiquant ainsi la perte du site Eco RI. Un de ces plasmides, purifié par la suite au moyen d'un lt de culture, a été appelé p SM 3 (figure 5 '). 4. Isolement du grand fragment Hpa I-Sst I du p SM 3 Comme on peut le voir sur la figure 5, le p SM 3 ne présente qu'un seul site Hpa I et un seul site Sst I, tous deux localisés dans la région de p E 194. La coupe de l'ADN de p SM 3 avec ces enzymes de res- triction engendre deux fragments, l'un d'un poids molécu- laire de 5 x 105 et l'autre de 4,83 x 106. 7 gg d'ADN de p SM 3, purifies selon la méthode déjà 11 - décrite pour le p E 194 et le p BR 322, ont été coupés avec 7 UD d'enzyme Hpa I en utilisant le tampon conseillé-par le four- nisseur {BRL) dans 100 pl d'une solution finale à 37 ?C pen- dant une heure et, après activation de l'enzyme à 65 DC pen- dant 10 minutes, 1,8 pl de CI Na 5 M, 3 pl de Eercaptoétha- nol concentré-et 7 U de Sst I ont été ajoutés La réaction a été effectuée à-37 r C pendant une heure à la suite de quoi l'enzyme a été de nouveau inactivé à 65 'C pendant 10 minu- -tes. L'ADN a été traité au phénol> saturé avec tampon TE, et précipité en ajoutant 1/10 de volume de 3 M ha-Acétate et 2 volumes d'éthanol 95 % à -70 'C Le précipitat a été séché et remis en suspension dans 300 p 1 30 m M-Tris-Cl p H 8,1, 1 m M EDTA, I m Cl Na. Cet échantillon a été chargé sur 5 ml d'un gradient 5-20 % de saccharose et centrifugé à 40 000 rpm pendant 7 heures 40 dans un rotor Beckman Sw 55,1. On a ensuite recueilli 23 fractions de 6 gouttes chacune et 15 pl de chaque fraction-analysée sur un gel de gélose à 0,8 % Les fractions de 16 à 21 laissaient ap- paraître qu'elles possédaient la quasi totalité du grand fragment Hpa ISst I Celles-ci ont été recueillies ensemble, le pool dilué avec un volume égal de 320 et l'ADN précipi- té à -20 DC pendant 14 heures après adjonction de 2 volumes d'éthanol à 95 %. Après centrifugation à 10 000 rpm pendant 30 minu- * tes, dans un rotor Sorvall S 534, le pellet a été lavé dans % d'éthanol, séché et remis en suspension dans du TE de manière à obtenir une concentration finale de 100 pg ml d'ADN. 5 Attaque d'un Linker au fragment Sst I pa I - A titre d'exemple, on a utilisé le linker porteur du site Eco RI 1 'jg de fragment Sst I pal ( 10 il) a été GGAATTCC utilisé pour l'attaque du linker Eco RI CCTTAAGG a son ex- trémité "blunt end" Dans 50 1 il de réaction contenant 1 pg- de fragment, 50 p M ATP, 50 m M Tris-:Cl p H 7,5, 10 m M Fig 12,10 i M de Dithiotréithol, le linker Eco RI a été ajouté avec une mo- 12 - larité 500 fois supérieure par rapport au fragyrent. On a ensuite ajouté 2 -U de ligase T 4 et la réaction a été conduite à 10 DC pendant 12 heures. L'enzyme a été inactivé à 650 C pendant 10 minutes. 6 Préparation du fragment d'ADN de p E 194 portant les sé- uences "Promoteur" et "Sh}ine-Dallarno" dlu gne de la mné- t hy ase. En éliminant toute la partie 3 ' superflue de la Shi- ne-Dalgarno, on a procédé de la manière suivante pour ob- tenir ce fragment. pg de p E 194 ont été digérés dans 150 pl de volu- me final dans 6 m M Tris-Cl p H 7,6, 6 m M Mig C 12 N 6 ml mer- captoéthanol avec 10 unités de Haelll pendant une heure à 37 C. L'enzyme a été ensuite inactivé par adjonction d'un volume égal de phénol saturé avec TE Le phénol dissout dans les phases aqueuses a été éliminé à la suite de trois extractions à l'éther et l'ADN précipité à 7 D O C pendant minutes, en ajoutant 20 pl de Na-Acétate, 3 M et 400 pl de ETOH à 95 % Après 10 minutes de centrifugation dans une centrifugeuse Epperdorf 5414, le pellet a été lavé dans pl d'éthanol à 70 %, et séché sous vide. L'ADN a été remis en suspension dans 40 pl de 100 m M Tris-Cl p H 7,6, 10 m M Mg C 12 et après adjonction de 4 pl de Exo III {BRL, 25 unités/pl) la réaction a -été menée à 'C pendant 16 minutes. Dans de telles conditions on élimine des extrémités environ 8-10 bases à la minute. La réaction a été inactivée en y ajoutant 40 pl 3 D d'une solution à 200 m M Na OAC-BOAC p H 4,13, 600 M CîNa, 24 rm N ANSO. On a ajouté ensuite 3,5 pl d'enzyme 51 ( 11,7 U/pl) et le mélange de réaction a été incubé à 15 'C pendant 2 heures et demi Inactivation de l'enzyme avec une goutte de phénol et extraction successive à l'éther. l'ADN a été précipité à -70 'C pendant 10 minutes 13 - après adjonction de 9 pl 3 M Na OAC et 250 pl éthanol à 95 %, et centrifugé dans une centrifugeuse Epperdor 5414. Le pellet a été séché et remis en suspension dans pl de TE Dans le but d'éliminer les sels contaminants, la solution a été chargée sur une colonne de 1 ml de G-50 Sephadex, précédemrment portée à sec grâce à une centrigu- gation à 200 rpnm. L'ADN a été recueilli en centrifuguant à nouveau la petite colonne à 2000 rpm pendant 2 minutes. Aux 40 pl de solution recueillis, on a directement ajouté 5 pl de sels pour l'enzyme Sst I 10 fois concentrés (sels 1 X: 14 m M Tris-Cl p H 7,4, 6 m M Mg C 12, 90 m M Cl Na, 2 m M mercaptoéthanol) et 6 unités d'enzyme Sst I (BRL). Après incubation à 37 C pendant une heure, l'enzyme a été inactivé à 650 C pendant 10 minutes. l'ADN ainsi traité a été chargé sur un gel à 7,5 % d'acrylamide à côté du p BR 322, digéré à l'aide de Hpa II, comme standard des poids moléculaires, et séparé en appli- quant une différence de potentiel de 100 volts pendant 3 heures Après coloration du gel à l'aide d'une solution à 0,2 pg /ml de bromure d'éthydium et visualisation aux U V, l'échantillon d'ADN donnait, comme prévu, une série de bandes très peu résolubles qui variaient d'un nombre de couples de base de 130 à 180 environ, et une série de ban- des à poids moléculaire beaucoup plus élevé. Etant donné la distance du site Sst I de la fin de la séquence de reconnaissance des ribosomes ( GTT) est de 157 BP + 4 bases (extrémités "sticky end" de la coupe avec Sst I), la portion de gel compris entre la 13 ème et la 14 ème bande engendrée par la coupe de p BR 322 avec Hpa II (respec- tivement 160 et 147 couples de base) a été coupée à la la- me de rasoir. L'ADN compris dans la portion de gel ainsi découpé a été élué dans 0,8 ml d'une solution à 10 m M Mg-acétate, 0,5 M NH-acétate, 0,1 % SDS, 0,1 m M EDTA, à 650 C pendant 14 heures, comme décrit par Maxam et Gilbert ( 16). 25326-57 14 - Aux 0,8 ml de solution ont été ajoutés 2 ml l'étha- nol à 95 % et l'ADN précipité à -20 'C pendant 24 heures. Après centrifugation à 10 000 rpm pendant 30 minu- tes dans un rotor Sorvall S 534, le pellet a été lavé avec 0,5 ml d'éthanol à 70 %, séché sous vide et ensuite remis en suspension dans 0,5 ml de TE Le bromure d'éthydium qui se trouvait encore intercalé dans la double hélice de l'ADN a été éliminé après 4 extractionsavec 1-buthanol. A l'issue de l'extraction à l'alcool, le volume fi- nal de la solution aqueuse était de 160 pl. A ces 160 pl ont été ajoutés 18 pl d'une solution 3 M de Na OAC, 2 pl de 1 M Mg C 12 et 400 il d'éthanol à 95 %. L'ADN a été précipité à 70 C pendant 10 minutes et centrifugé pendant 10 minutes dans une centrifugeuse Ep- perdorf 5414. Après lavage du pellet dans 100 pl d'éthanol à 70 % et séchage sous vide, l'ADN a été remis en suspension dans du TE à une concentration de 100 il g /mi. 7 Lien du fragment du p E 194 au fragment Hpa I-Sst I de p SM 3et transformation. 0,1 gg du fragment du p E 194 purifié comme celà a été décrit au point 6 a été lié avec 1 gg du fragment Hpa I-Sst I du p SM 3, dans 50 pl de mélange de ligase conte- nant 50 m M Tris-Cl p H 7,5, 10 m M Mg C 12, 10 m M dithyotre- ithol et 50 g M ATP avec 4 unités d'enzyme T 4 ligase. Après 4 heures d'incubation à 10 C, 10 Bl de mélan- ge de ligase ont été dilués 10 fois dans le même tampon et, après adjonction de 4 autres U de ligase T 4, la réac- tion a été menée à 4 C pendant 20 heures. L'enzyme a été inactivé à 65 C pendant 10 minutes. pl du mélange de ligase dilué ont été utilisés pour transformer 100 Dl de cellules compétente de HB 101, préparées comme décrit ci-dessus, en sélectionnant pour la résistance à la tétracycline (TC) sur plaque de L agar + 15 pg /ml de Tc. Des 486 clones obtenus, 30 ont été utilisés pour la -' préparation du plasmide selon la procédure rapide décrite ci-dessus {voir point 2) Apres la précipitation de l'étha- nol, chaque pellet a été remis en suspension dans 40 pi de. Eco RI tampon 1 x ( 100 m M Tris-Cl p H 7,5, 5 m N Ng CI 2 50 Mn M CI Na, 2 m M mercaptoéthanol) et les ADN ont été incubés à 370 C pendant 30 minutes après adjonction d'une unité de Eco RI. Après inactivation de l'enzyme à 650 C pendant 10, minutes, les échantillons ont été chargés sur un gel d'aga- rose à 0,8 % et séparés à un voltage de 30 volts pendant 14 heures Le gel a été ensuite coloré pendant 15 minutes dans une solution à O,5 pg /ml de bromure d'éthydium et visualisé aux U V. 21 des 30 plasmides obtenus avaient été 'linéarisés" après traitement à l'enzyme Eco RI, mettant en évidence la présence du site Eco RI dans leur séquence. de ces clones qui montraient avoir acquis le site Eco RI ont servi de base pour la préparation des plasmides à partir d'un litre de culture, comme décrit ci-dessus. Tous les plasmides ont été analysés avec une série d'endonucléases de restriction {Pst I, Sst I, Eco RI, Epal) et confrontés aux plasmides p SM 2, p BR 322, p E 194. Après coupe avec Pst I, tous les plasmides donnaient lieu à deux fragments dont le plus gros migrait sur gel dtagarose avec le p BR 322 linéarisé, alors que le plus pe- tit migrait légèrement plus vite, comme prévu, que le p E 194 En outre, la coupe avec Sst I et Eco RI sur les 10 plasmides engendrait des fragments dont le plus gros mi- grait légèrement plus vite que le p SM 2 linéarisé et le plus petit était de 160 BP environ, comme prévu. Les 10 plasmides ont été nommés p SM ( 4-13). 8 Séquence du petit fragment Eco RI Pst I des plasmides p SM, SM 5, p SM 6. La double digestion avec Eco RI et Pstl de l'ADN des plasmides hybrides obtenus (exemple p SM 4, p SM 5, etc) en- gendre trois fragments aisément séparables sur gel d'aga- 16 - rose Le plus petit (BP 1220 chacun) porte les régions "promoteur" et "Shine-Dalgarno" du gène de la méthylase de p E 194. Pour déterminer la distance entre la "Shine-Dalgar- no" et le site Eco RI (engendré par le linter inséré), ce fragment -après avoir été purifié au gel d'acrylamide com- me décrit ci-dessus au point 6 a été cloné dans le phago M 13 (forme répétitive à double hélice) et mis en séquence selon la méthode des "dadésoxynucléotidesi' Il ne nous semble pas opportun de rapporter la procédure dans ses détails car elle a déjà été amplement décrite ( 12, 13). Une fois le M 13 coupé avec Eco RI et Pst I, on a préparé le mélange de réaction suivant: 4 gl de M 13 mp 9 ( 0,01 pml ADN), 4 pl du fragment Eco RI-Pst I de p SM 4, (ou p SM 5, p SM 6) ( 0,03 pmol ADN). 2 gl d'une solution à 500 m M Tris-Cl p H 7,5, 100 m M Mg C 12, 10 Tl M dithyotreithol, 2 il 1 m M ATP, 7 p 1 H 20, I 1 l de ligase T 4 ( 50 unités/ml). La réaction a été faite à 12,5 C pendant 18 heures. 2-5 ng d'ADN du mélange de ligase ont été utilisés pour transformer des cellules de E coli 71 18 (qui nous a été donné par R Cortese) rendues compétentes à l'aide de Ca C 12, comme décrit ci-dessus. Les plaques blanches, porteuses du phago dans le- quel le fragment souhaité a été inséré, ont été sélection- nées sur plaque YT agar ( 8 g Bacto-tryptone, 8 g Bacto Yeast Extract, 5 g Cl Na/1) après adjonction, à 0,3 ml de cellules transformées, de: 0,2 ml de cellules d'E coi 71.18 en phase exponentielle de croissance, 0,01 ml de IPTG ( 100 m M), 0,05 ml de Xgal ( 2 % dans dimétylformamide) 3 ml d'agar souple - La séquence de la région proche du site Eco RI des trois plasmides p SM 4, p SM 5 et p SM 6 est reportée à la fi- gure 7 Les données reportées indiquent comment le linker d'Eco RI a été inséré dans p SM 4, p SM 5 et p SM 6 à 0,3 et 4 bases de distance du dernier G de la séquence GAGGG jugée 17 - 1 7 être celle reconnue par l'ADN ribosomal 16 S et qui facili- te le lien des ribosomes à l'ADN. 9 Elimination de la séquence de p BR 322 des plasmides p SM, p SM 5 et SIM 6 et insertion du p UB 110 dans le site Xba I. 2 pg d'ADN de p SM 4, p SM 5 et p SM 6 ont été coupés avec l'enzyme Pst I dans 50 g 1 d'une solution 20 m M Tris-Cl p H 7,5, 10 mn Mg C 12, 50 m M de sulfate d'ammonium, contenant 2 unités d'enzyme Pst I. Après une heure d'incubation à 37 C, l'enzyme a été inactivé à 65 C pendant 10 minutes. Les trois mélanges de réaction ont été chargés sur un gel d'agarose "low melting" et l'ADN a été séparé en appliquant une différence de potentiel de 30 volts pendant 14 heures. Après coloration au bromure d'éthydium comme décrit ci-dessus, le gel a été exposé aux-U V, et les 3 ADN char- gés ont révélé être composés de deux fragments, le plus gros migrant avec le p BR 322 linéarisé, le plus petit avec une mobilité électrophorétique légèrement plus rapide que le p E 1 14. Ces fragments plus petits ont été élués du gel après extraction de la fraction de gel qui les contenait, au moyen d'une fusion à 650 C de I'agarose et double extrac- tion au phénol, L'ADN contenu dans la phase aqueuse a été précipité deux fois dans l'éthanol comme déjà décrit ci- dessus. Apres séchage du pellet, l'ADN a été remis en sus- pension dans TE à une concentration finale de 20 5 /ml- 0,1 pg de cet ADN a été lié avec 0,05 unités de T 4 dans 20 gl d'une solution 50 m M Tris-Cl p H 7,5, 10 m M Ng C 12, 10 m M dithytréithol, 100 p M ATP Apres incubation à 12 C pendant 18 heures, l'enzy- me a été inactivé à 65 C pendant 10 minutes. Les plasmides circularisés ont été ensuite reliné- arisés en les coupant avec 0,1 unité de Wba I (qui coupe en un seul site dans p E 194) dans 50 Dl d'une solution 6 m M 18 - Tris-Cl p H 7,5, 0,1 M Cl Na, 6 m Mlg C 12, pendant une heure à 37 C. Enfin, après inactivation au phénol et précipitation à l'alcool cormne celà a déjà été décrit, les ADN plasmides ont été liés au plasmide p UB 110 ( 14), à son tour linéarisé avec l'enzyme Xba I à une concentration d'ADN dans le mélan- ge de licase de 100 pg /ml. Les trois mélanges de ligase ont été utilisés pour transformer des celiules de B subtilis BD rendues compé- tentes comme celà a été décrit par Anagnostopoulos et Spizizen ( 15) en sélectionnant sur plaques de L agar conte- nant 5 pg /ml de Kanamycine (Km). Des 10 colonies obtenues à partir de chaque trans- formation, les plasmides ont été extraits selon la méthode d'extraction rapide décrite au point 2 et les plasmides ont été coupés avec l'enzyme Xba I puis confrontés avec l'ADN de p UB 110 coupé à son tour avec Xba I ainsi qu'à l'ADN des plasmides p SM 4, p SM 5 et p SM 6 coupés avec Pst I. Ces colonies qui révélaient posséder un plasmide qui, après coupe avec Xba I, donnait lieu à deux fragments, le plus grand co-migrant avec le petit fragment des plasmides p SM 4, p SM 5 et p SM 6 coupé avec Pst I, ont été utilisées pour préparer les plasmides à partir d'1 lt de culture. Ces plasmides appelés p SM 1 N p 516 et p SM 17, après ana- lyse avec différents enzymes de restriction, étaient com- posés de la manière suivante: p SM 15: p UB 110 + petit fragment Pst I de p SM 4 p SM 16: p UB 110 + petit fragment Pst I de p SM 5 p SM 17: p UB 110 + petit fragment Pst I de p SM 6. BIBLIÈOGRPIITE 1 Robert Tr M, Kacich R and Ptahne M ( 1-979) Proc Nati. Acad Sci U S A 76, 760-764. 2 Talmadge K and Gilbert W ( 1980) Gene_ 12, 235-241 3 Iordanescu S ( 1976) Arch Rouxu Pathi Exp Microbjo. , 111-118 4 Weisblum B N Graham M Y, Gryczan' and Dubnau D ( 1979) J Bacterio 137, 635 643 Shivakumar A G, Hahn J and Duhnau D 2, 279-289. 6 Shivakumnar A G,, flahn J, Grandi G, Rozlov Y and Dubnau D ( 1980) Proc Nati Acad Sci U S, A 77, 3903-3907. 7 Gryczan T J, Grandi G, Hahn J, Grandi R and Dubnau D 8 Horinouchi S et d'autres -( 1982) J Bactériol 150, 804-814. 9 Bolivar F,, Rodriguez R, Betlach M C and Boyer H W. ( 1.977) Gene 2, 75-93. 10 Weiss B et autres ( 1968) J Biol Chemu 243, 4543-4555. 11 Dagert M and Ehrlich S D 12 Sanger F, Nicklen S' and Coulson A R ( 1977) Proc. Nati Acad Sci -U S A 74, 5463-5467. 13 Messing J, Crea R and Seeberg P H ( 1981 l) Nuci Ac. Res 9, 303-321. 14 Gryczan T J, Contente S and Dubnau D ( 1978) 134; 318-329. Anagnostopoulos and Spizizien ( 1961) J Bacteriol 81, 741-746. 16 Maxamn A and Gilbert W ( 1977) Proc Mati Ac Sci. U.S A 74, 560-564. 17 Kuhn S et autres ( 1979) Molec Gen Genet 167, 235- 241. - REVENDICATIONS. 1. Plasmides hybrides dérivés de l'accouplement successif du plasmide p E 194 avec le plasmide p BR 322 et p UB 110 o ledit plasmide p E 194 est modifié en plaçant un site de restriction après la séquence Shine-Da Igarno du gène de la méthylase dans une position qui permette le clonage et l'expression d'un gène hétérologue. 2. Plasmides hybrides dérivés de l'accouplement du plasmide p UB 110 avec le plasmide p E 194 modifié selon la revendication précédente utiles comme vecteurs de clonage en B subtilis choisis entre p SM 15, p SM 16 et p SM 17 j carac- térisé par un marqueur de résistance à la Kanamycine, par un site Eco RI localisé à la fin de la séquence de recon- naissance des ribosomes et par la possibilité d'induire la protéine hétérologue codifiée par l'ADN cloné avec des do- ses subinhibantes d' érythromycine. -' 3 Plasmide p SM 15 selon la revendication précédente, caractérisé par le fait qu'il est constitué par l'accouple- ment du plasmide p UB 110 avec le petit fragment Pst I du plasmide p SM 4 - 4. Plasmide-p SM 16 selon la revendication 3, carac- térisé par le fait qu'il est constitué par l'accouplement du plasmide p UB 110 avec le petit fragment Pst I du plasmide p SM 5. 5 Plasmide p SM 17 selon la revendication 2, carac- térisé par le fait qu'il est constitué par l'accouplement du plasmide p UB 110 avec le petit fragment Pst I du plasmide p SM 6. 6. Plasmides p SM 4, p SM 5, p SM 6 dérivant de la modi- fication du plasmide p E 194 capables de s'exprimer tant en B Subtilis qu'en E coli.