FR 2523961 A1 19830930 FR 8204886 A 19820323 La présente invention concerne un procédé de préparation d'a-amino-acides libres L par conversion complète de leurs antipodes D pris seuls ou éventuellement en mélanges racémiques. L'utilisation des a-amino-acides s'est récemment dévelop- pée de façon importante, en particulier dans les domaines de la médecine et de l'alimentation,et la préparation des aamino-acides de la série L devient notamment de plus en plus importante. Trois voies principales sont actuellement connues pour préparer les aamino-acides L Il s'agit de: 1/ L'utilisation d'hydrolysats de protéines naturelles, dont la phase limitante est la séparation et la purifica- tion de chaque acide aminé. 2/ La méthode fermentative qui tout en étant plus intéressante que la précédente ne couvre pas la production de tous les a-amino-acides désirés. 3/ La synthèse chimique qui peut produire, facilement et à bas prix, de grosses quantités d'a-amino-acides, mais qui a le désavantage de produire essentiellement des mélanges racémiques. L'intérêt et la rentabilité de cette 3 ème voie, certai- nement la plus porteuse d'avenir du point de vue économique, se trouvent étroitement liés à la disponibilité de méthodes générales de résolution des mélanges racémiques. Dans ce contexte, l'introduction des enzymes dans la technologie des aamino-acides constitue actuellement une voie beaucoup plus intéressante que les méthodes de séparation physique ou chimique traditionnelles Les enzymes actuellement utilisées dans ce but peuvent être des exopeptidases comme par exemple la leucine amino peptidase (LAP) qui, à partir de l'amide d'un a-amino-acide DL n'hydrolyse que l'énantiomère L (R Koelsch, Enzymologia, 42,257 ( 1972)). DL-RCHCONH + H 20 LAP L RCHC 02 H + D-RCHCONH 2 i 2 2 i I NH 2 NH 2 NH 2 Par un mécanisme analogue, la carboxypeptidase a été utilisée sur les dérivés N chloro acetyl de certains acides aminés(N Grubhofer and L Schleith, Naturwissen- shaften, 40,508 ( 1953)). f H 3 carboxy H 3 2 -CO 2 H pelpti-das-e DL Cl CH CO-N-CH-CH peptiase Lalanine + D Cl CH 2 CO-Ala H Dans ces deux exemples, le rendement en isomère L ne peut évidemment pas dépasser 50 % puisque l'isomère D n'est pas récupéré. Une amélioration à cette technique enzymatique a été apportée en couplant l'action de l'enzyme a un procédé de racémisation de type chimique (I Chibata, T Tosa, T Sato and T Mori, Methods in Enzymology, vol 44, p 746, Academic Press, 1976) et (I Chibata, T Tosa, T Sato, T Mori and Y Matuo, Proceedings of the I Vth International Fermentation Symposium: Fermentation Technology Today, p.383, Society of Fermentation Technology, Japan, 1972). L'exemple le plus connu concerne l'utilisation, comme enzyme, de l'amino acylase immobilisée qui à partir des N-acetyl acides aminés DL, hydrolyse exclusivement l'isomère L. L'acide aminé L est alors séparé du milieu par cristal- lisation après concentration du solvant. Le D acetyl a-amino-acide restant est soumis alors à un traitement à l'anhydride acétique en milieu anhydre qui conduit à la formation d'une 2 méthyl oxazoline 5 DL. Celle-ci est ensuite hydrolysée en N-acétyl acide aminé DL qui est à nouveau soumis à l'action de l'amino acylase. Par un procédé en continu ce système conduit en conséquence à la récupération totale du mélange racémique sous forme de l'isomère L. Malgré le progrès considérable amené par ce mode de préparation, il convient cependant de souligner dans ce procédé la très grande différence de concept entre la catalyse enzymatique utilisée et l'étape de racémisation de type chimique non catalytique qui nécessite des conditions expérimentales totalement différentes En effet, après l'étape d'hydrolyse enzymatique, qui se déroule en solution aqueuse, et après une première concen- tration qui permet la séparation de l'acide a-aminé L produit, il faut éliminer complètement l'eau qui est alors remplacée par l'anhydride acétique, réactif consommé stoechiométriquement à chaque étape de la racémisation. Puis, avant de revenir à l'étape enzymatique, il faut encore évaporer l'acide acétique formé dans le milieu et le remplacer par l'eau Ce procédé quoique intéressant est donc très lourd d'un point de vue technique et économique. La présente invention se rapporte à un procédé de préparation d'a-amino-acides L, par conversion complète de leurs antipodes D soit seuls,soit en mélangesracémiques qui permet précisément d'écarter ces inconvénients Le procédé conforme à l'invention consiste à introduire, conjointement à une étape de catalyse enzymatique, une étape de racémisation catalytique chimique capable de se produire dans les mêmes conditions réactionnelles (solvants, p H, température) que l'étape de catalyse enzymatique. Il convient en outre de noter que dans le procédé objet de la présente invention, il n'y a pas de consomma- tion de réactifs dans l'étape de racémisation De plus,- l'utilisation d'un solvant unique permet de concevoir la réalisation d'un système de production en continu extrêmement simplifié et donc très économique. Le procédé objet de la présente invention est caracté- risé en ce que l'on racémise l'antipode D d'un ester dudit a-amino-acide en présence d'un catalyseur chimique constitué par au moins un aldéhyde aromatique de formule générale Ar CR O (C) \B dans laquelle Ar représente un cycle aromatique comportant éventuel- lement un hétéroatome tel que l'azote, et B représente une fonction basique, pour conduire à un mélange en équilibre dynamique des deux formes D et L dudit ester, en ce que l'ester présent sous la forme L est hydrolysé de façon irréversible par voie enzymatique en a-amino-acide L stéréostable corres- pondant, lesdites étapes de racémisation chimique et d'hydrolyse enzymatique étant conduites dans des conditions réactionnelles identiques, et en ce que l'on récupère l'a-amino-acide libre L. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée faite ci-après. Il est tout d'abord exposé qu'au cours d'un travail sur les a-aminoacides et certains de leurs dérivés la demanderesse a observé que certains dérivés d'"-amino- acides et particulièrement, les esters optiquement actifs (de configuration D ou de configuration L) se racémisent, lorsqu'ils sont mis en présence de certains composés carbonylés ou d'un mélange de ces composés, et ceci dans divers types de solvants, comme par exemple, les alcools, notamment les alcools aliphatiques inférieurs, tels que le méthanol, l'éthanol, le propanol et l'iso- propanol, le formamide, le diméthyl formamide, l'eau ou les mélanges de ces solvants. Dans l'eau en particulier, et dans des conditions de p H et de températures physiologiques dans lesquelles les enzymes présentent leur activité catalytique maximale, on observe également une excellente racémisation. Par conditions physiologiques, il convient notamment d'entendre: une température comprise entre O et 500 C, et plus particulièrement comprise entre 20 et 40 C, et un p H compris entre 5 et 10, et plus particulièrement entre 6 et 9. Les aldéhydes susceptibles d'être utilisés, en tant que catalyseurs de racémisation, pour la mise en oeuvre du procédé-selon la présente invention répondent à la formule générale Ar CHO (I) \B dans laquelle Ar représente un cycle aromatique comportant éventuel- lement un hétéroatome tel que l'azote, et B représente une fonction basique. Les aldéhydes aromatiques utilisables dans le cadre de la présente invention répondenten particulier à la formule générale: (CH 2) n-CHO Ar (II)- (CH 2)m B dans laquelle: Ar représente un cycle aromatique comprenant de 5 à 7 chaînons et éventuellement un hétéroatome tel que l'azote, F B représente une fonction basique telle qu'une amine tertiaire ou un anion dérivant de l'ionisation d'une fonction acide, tel que -C 02, -OP 03, -OP 03 H et et m et N représentent des nombres entiers compris entre O et 5. Les aldéhydes les plus intéressants pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention sont les aldéhydes hydrosolubles, notamment les aldéhydes de formules générales I et II dans lesquelles le fragment aromatique Ar, tel que par exemple le pyridine 2 aldéhyde et le pyridine 4 aldéhyde, est fonctionnalisé par des groupements hydrophiles, tels que -OH, -SQ 3 H ou encore par d'autres groupements, tels que les radicaux alcoyle inférieur en C 1 à C 5 et les radicaux hydroxyalcoyle inférieur en Ci à C 5. La présente invention vise plus particulièrement un procédé faisant intervenir, à titre de catalyseur de racémisation un aldéhyde de formule générale C _N CHO (III) dans laquelle: B représente une fonction basique telle qu'une amine tertiaire ou un anion dérivant de l'ionisation d'une fonction acide, tel que -C 02, -OP 03, -OP 03 H et -503. A titre d'exemples particuliers de ces aldéhydes de formule générale III, on mentionnera notamment le pyridoxal-5 '-phosphate et le 5 '-Scarboxyméthyl thio pyridoxal qui se sont révélés parfaitement appropriés dans leur utilisation comme catalyseurs de racémisation. En solution,ces deux aldéhydes s'ionisent pour donner respectivement les anions suivants: H 3 H H 3 H N\ / CHO et CH 2-O-P 03 CH 2-S-CH 2 CO 2 Il convient de noter que parmi les aldéhydes de formule générale III, certains composés comme le pyridoxal-5 '-phosphate sont connus, alors que d'autres comme le 5 '-S-carboxyméthyl thio pyridoxal sont nouveaux. Ces nouveaux composés peuvent être obtenus par la mise en oeuvre des procédés analogues à celui mentionné ci- après à titre d'exemple pour la préparation du 5 '-S- carboxyméthyl thio pyridoxal Le mode de préparation peut être illustré par le schéma réactionnel suivant. (a) CH 3 OH N\ CH 2 OH CH 2 OH PYRIDOXINE (b) CH 3 COCH 3/H C 11 eeoc (c) CH 2 C j, (d) CH 2-S-CH 2 CH 2 OH CH OH N CH 2 OH H 2 S-CH 2 CH 2 OH CH 3 OH CH 2 -S-CH 2 CH 2 OH (g) CHH N CH 2 OH (e) CH 2-S-CH 2-COOH Io C 3 He> CH 2-S-CH 2-COOH '-S-carboxyméthyl thio pyridoxal 2 OH 1-1 A m 2 '1 M Synthèse d'analogues structuraux du pyridoxal g de vitamine B 6 (pyridoxine) sous forme de chlorhydrate (a) sont mis en suspension dans 250 ml d'acétone On envoie dans le mélange de l'acide chlorhydrique gazeux jusqu'à dissolution complète du produit La solution est laissée 1 heure à température ambiante dans un erlen bouché, après quoi on ajoute 3 volumes d'éther éthylique Le cétal cyclique (b) sous forme de chlorhydrate précipite immédiatement puis est laissé à cristalliser durant une nuit à 50 C Le composé (b) est isolé par filtration, lavé à l'éther et séché sous vide à 40 jusqu'à poids constant Rendement 95 %. 1 g du composé (b) est dissous dans 15 ml de SO C 12 et laissé à température ambiante 1 heure. Le dérivé chloré (c) est récupéré sous forme de poudre blanche après évaporation du solvant et conservé sous vide en présence de soude en pastilles. Le rendement de cette opération est pratiquement quantitatif. Le dérivé chloré (c) peut réagir avec différents nucléophiles et constitue donc le produit de départ pour plusieurs synthèses Il est apparu que les mercaptans sont les plus réactifs parmi les nucléophiles étudiés et le schéma illustre deux exemples de synthèse. Obtention du 5 '-S-carboxyméthyl thio pyridoxal (f) -3 moles de composé (c) sous forme de chlorhydrate dissous dans 3 ml de méthanol, sont additionnées à 2.10 3 moles d'acide thio glycolique On ajoute au mélange 4 ml de méthanol N en soude. Le Na Cl commence à précipiter dans les premières minutes, on laisse la réaction se poursuivre pendant 3 heures à 500 C Après élimination du Na Cl par filtration, le filtrat est concentré à pression réduite et repris par ml d'un mélange CH 3 OH HC 1 ( 36 %) = 8: 2 La solution est maintenue à 500 C pendant 3 heures Le Na Cl est éliminé par filtration et le filtrat évaporé à sec à pression réduite Le produit (e) cristallise sous forme de chlorhydrate par addition d'éther éthylique. Rendement 76 %. Le composé (e) est dissous dans l'eau à une concentra- tion de 10 1 M et ajusté à p H 7 avec de la soude Après addition de Mn O 2 Z 5 g pour lg de produit (e)l, on laisse la suspension en agitation vigoureuse 4 à 5 heures à température ambiante Mn O 2 est éliminé par centrifugation et le produit (f) peut être isolé aprèstévaporation de l'eau ou bien être utilisé tel quel en solution aqueuse. L'utilisation du mercaptoéthanol au lieu de l'acide thioglycolique conduit à travers une synthèse analogue au composé (g) qui s'est d'ailleurs avéré très peu actif au cours des expériences de racémisation. La demanderesse a donc constaté que ces aldéhydes aromatiques, et plus particulièrement les analogues structuraux du pyridoxal répondant à la formule générale III, sont utilisables de façon parfaitement satisfaisante en tant que catalyseurs de racémisation, soit en phase homogène, soit en phase hétérogène après immobilisation sur un support insoluble dans le milieu réactionnel Une telle immobilisation peut être obtenue par toutes les méthodes connues, telles que par liaisons ioniques avec des résines échangeuses d'anions ou par liaisons covalentes qui peuvent être réalisées après une fonctionnalisation adéquate. Selon une caractéristique additionnelle de la présente invention, le catalyseur de racémisation, cons- titué par un ou plusieurs aldéhydes aromatiques de formules I, II ou III, est introduit dans le milieu réactionnel à raison de moins de quatre fois la stoechiométrie, et de préférence moins d'une fois la stoechiométrie, par rapport à l'ester d'a-amino-acide D de départ. La demanderesse a notamment observé que dans des conditions réactionnelles définies précédemment (par exemple en solution aqueuse, entre p H 7 et 8) en présence de pyridoxal 5 ' phosphate à concentration égale à 0,1 mole par litre, les esters méthyliques des a-amino-acides D ou L sont racémisés avec des temps de 1/2 réaction compris entre 2 et 10 minutes, ceci à une température égale à C et pour une concentration en pyridoxal 5 ' phosphate sensiblement égale à celle d'ester. Une telle racémisation a en particulier été obtenue avec les esters méthyliques de l'alanine, l'arginine, l'acide aspartique, l'asparagine, l'acide glutamique, la glutamine, la leucine, la lysine, la 5-phényl alanine, la sérine, la tyrosine, le tryptophane, la cystine, la méthionine. Les esters susceptibles d'être soumis à la première étape de racémisation catalytique chimique sont princi- palement constitués par les esters alcoyliques, éven- tuellement activés tels que les thioesters, les a-amino- acides pris soit sous la forme de leurs antipodes D, soit en mélangesracémiques Ils peuvent être pris sous forme de bases libres ou encore de sels. Il a également été observé que la vitesse de la racémisation pouvait dépendre de la nature chimique de l'ester; par exemple, elle décroît en passant de l'ester méthylique aux esters éthylique et isopropylique. La demanderesse a en outre observé que la vitesse de racémisation est également une fonction croissante de la concentration en aldéhyde Pour une concentration en aldéhyde nettement inférieure à celle de l'ester de l'a-amino-acide, la vitesse de racémisation décroît, mais la totalité de l'ester de l'a-amino-acide est néanmoins racémisé ce qui démontre le pouvoir catalytique de l'aldéhyde dans le processus de racémisation des esters des a-amino-acides. Il convient également de bien noter que les a-amino- acides libres, contrairement aux esters d'a-amino-acides, ne se racémisent pas en présence de l'aldéhyde, dans les mêmes conditions réactionnelles Ceci est capital comme on le verra plus tard pour la suite du procédé - Enfin, il faut veiller à ce que des cations métalli- ques tels que ceux dérivés par exemple des métaux suivants: Mg, Ca, Bu, Zn, Cd, Hg, Sn, Pb, Mn, Fe, CO, Ni, Cu, Al, ne soient pas présents dans le milieu réactionnel, pour éviter que les a-amino-acides libres puissent être à leur tour racémisés ou desaminés. A l'issue de ces diverses observations, la demanderesse propose, sans pour autant entendre se limiter à cette interprétation, d'expliquer la racémisation catalytique chimique par le mécanisme suivant: R H Ar-COH + NH -C-C -R = Ar-C=N-C-COOR Ar-CH +NH 2-C-CO 2 R H B B G> |H H Ar-C=N-C-COOR \B H HI I X Ar-COH + NH 2-C-C 02 R Ar-C=N-C-COOR L Bae S I R B R L Base de Schiff L L'intermédiaire envisageable est le passage par un carbanion doublement favorisé, d'une part par sa conju- gaison avec la fonction carbonyle de l'ester et la fonction imine, et d'autre part par l'assistance intra- moléculaire de la fonction basique (B) qui labilise le proton du carbone asymétrique. L'importance de cette fonction basique est d'ailleurs mise en lumière par l'observation d'une nette différence d'efficacité catalytique des composés (f) et (g) du schéma de la page 8: H CH 3 OH H H h 4 HO N HO CHSCHCOOH CH 2 SCH 2 CO 2 OH (f) (g) En effet, le remplacement de la fonction -COO par la fonction CH 2 OH beaucoup moins basique, fait que le composé (g) devient beaucoup moins actif d'un point de vue catalytique que le composé (f) Ceci illustre bien l'importance de la catalyse bifonctionnelle dans le phénomène de racémisation. Les aldéhydes ayant une telle structure générale sont considérés comme des catalyseurs bifonctionnels associant la fonction aldéhydique, qui conduit à la base de Schiff de l'acide aminé ester, et la fonction basique respon- sable de la formation du carbanion, intermédiaire de racémisation. La catalyse basique qui montre son maximum d'effi- cacité dans un mécanisme intramoléculaire est cependant également décelable dans un mécanisme intermoléculaire. La demanderesse a en effet observé que la vitesse de racémisation des acides aminés esters en présence d'une aldéhyde aromatique simple,(par exemple un analogue du pyridoxal exempt de fonction basique) peut être sensiblement augmentée par la présence dans le milieu réactionnel d'une fonction basique, telle qu'un anion carboxylate (acétate de sodium ou acétate de trialkyl ammonium) Les conditions de température et de p H restant constantes au cours de ces expériences. On notera enfin que dans le cas des a-amino-acides libres, l'absence de la fonction ester est suffisante pour empêcher tout arrachement du proton lié au carbone assymétrique. Selon ce schéma, une partie de l'ester de l'a- amino-acide, est bloquée sous forme de base de Schiff dans une proportion qui est fonction de son rapport de concentration avec le catalyseur. D'un point de vue économique, le rapport entre catalyseur et ester devra être le résultat d'un compromis entre une vitesse satisfaisante de racémisation (d'autant plus grande qu'une plus grande concentration d'ester est piégée sous forme de base de Schiff) et la nécessité d'avoir une concentration importante d'ester libre présent à l'équilibre afin que celui-ci puisse (comme on le verra plus tard) être soumis à l'hydrolyse enzymatique. Ce processus de racémisation ayant été observé et expliqué, on remarque que les esters des a-amino-acides concernés peuvent être considérés comme des substrats pour certaines enzymes. De plus, les conditions dans lesquelles s'opèrent les racémisations coincident rigoureusement avec celles requises en général pour le fonctionnement des enzymes. Il est connu en effet qu'un certain nombre de dérivés carboxyliques des aamino-acides, parmi lesquels les esters peuvent être hydrolysés en aamino-acids libres par catalyse enzymatique Certaines de ces enzymes sont dotées d'une haute chiralité et n'hydrolysent que les isomères L en laissant inaltérés les antipodes D présents. La demanderesse a observé qu'une telle-catalyse enzymatique, couplée à la catalyse de racémisation ainsi qu'elle a été définie précédemment, appliquée à des esters d'a-amino-acides, soit de configuration D, soit de configuration L, soit du mélange des deux antipodes dans n'importe quel rapport, conduit dans tous-les cas à la seule obtention de l'a-aminoacide libre de la série L avec un rendement quantitatif par rapport à l'ester de l'a-amino-acide de départ. Le rendement quantitatif de ce procédé est expliqué par le fait que le substrat de la réaction enzymatique est en équilibre de racémisation, alors que le produit de la réaction, qui se forme de manière irréversible, est stéréostable dans les mêmes conditions et peut donc s'accumuler. Le principe de fonctionnement global du système peut être alors schématisé ainsi: aldéhyde a-amino-acide ester D catalyseur a-amino-acide ester L de racémisation O de I N O -H r x a-amino-acide D a-amino-acide libre L a-amino-acide D a-amino-acide libre L Dans ce schéma général illustrant le redressement de configuration, la première étape est l'estérification des a-amino-acides D,L ou DL, pour laquelle on dispose d'un certain nombre de réactifs déjà connus, tels que par exemple l'alcool additionné d'un catalyseur acide, ou du méthylsulfate ou du diméthyl sulfite. A partir des esters, les deux types de catalyse im- pliquées: la catalyse de racémisation, qui produit les substrats pour l'enzyme, et la catalyse enzymatique qui suit, peuvent évidemment agir ensemble dans un système homogène Néanmoins, ce mode d'action tout en étant le plus simple à réaliser comporte un certain nombre d'incon- vénients dont les plus importants sont la séparation des a-amino-acides libres et la récupération des catalyseurs. De plus, la réaction chimique possible entre le(s) catalyseur(s) de racémisation et certains groupements fonctionnels des enzymes peuvent conduire à une perte d'activité des catalyseurs, mais également à une modifi- cation de l'activité catalytique de l'enzyme. Pour ces raisons, il est préférable de faire agir ces deux catalyseurs en les maintenant séparés dans le milieu réactionnel par immobilisation, par exemple par fixation sur des supports insolubles dans le milieu réactionnel. Les supports insolubles portant les deux catalyseurs peuvent être utilisés comme matériel de remplissage de deux réacteurs séparés et reliés par un système de circula- tion du milieu liquide. Un système plus simplifié consiste à mélanger aux milieux réactionnels les deux supports insolubles portant les deux catalyseurs dans un seul réacteur. Etant donné les caractères consécutifs de ces deux types de catalyse, un modèle de réacteur envisageable pourrait être également constitué par un ensemble de couches des deux catalyseurs immobilisées et empilées de manière alternative dans un réacteur à circulation. Les enzymes immobilisées le seront par toutes les méthodes de l'art, de même que les catalyseurs aldéhy- diques de racémisation. Les supports utilisés lors de la mise en oeuvre du procédé de l'invention, pour fixer le catalyseur aldéhy- dique de racémisation, ont été des résines échangeuses d'anions telles que la diéthylaminoéthyl Sephadexe, la diéthylaminoéthyl cellulose, ou des résines à matrices polystyréniques portant des ammonium quaternaires Sur de telles résines, le pyridoxal phosphate se fixe par exemple complètement de façon ionique dans l'intervalle de p H utilisé et défini précédemment. Les enzymes utilisées dans ce procédé l'ont été soit en phase homogène, soit fixées sur supports insolubles dans le milieu réactionnel, à matrice polyacrylique ou polysaccharidique. Dans ces réactions, les supports insolubles et les modes de fixation sont donnés à titre d'exemples et ne sont nullement limitatifs. Les enzymes les plus courantes utilisables dans le procédé de l'invention, sont les enzymes hydrolytiques telles que trypsine, a-chymotrypsine, papaine, chymopapaine, leucine amino peptidase, cette liste n'étant nullement limitative Leur choix particulier est fonction de leur spécificité vis-à-vis de l'a-amino-acide à préparer. Les exemples suivants illustrent le procédé de l'invention sans toutefois le limiter. Exemples de racémisation en phase homogène: Dans une expérience type, à une solution aqueuse 10-1 molaire d'un ester d'a-amino-acide L ou D sous forme de chlorhydrate, ramené à p H 7 par addition de soude, on ajoute un volume égal d'une solution aqueuse de pyridoxal ' phosphate (p H 7) de molarité inférieure ou égale à celle de l'ester d'a-amino-acide La température est maintenue constante à la valeur désirée, par exemple à 20 C. Le pouvoir rotatoire de la solution est suivi en continu à 546 nanomètre à l'aide d'un micro-polarimètre. Lorsque ce pouvoir rotatoire est nul (dans des temps de 1/2 réaction variables fonctions de la température et du rapport de concentration ester/pyridoxal) le mélange réactionnel est analysé par chromatographie en couche mince et comparé à la solution de départ pour contrôler que la fonction ester n'a pas été hydrolysée chimiquement. Les résultats concernant un certain nombre d'a-amino- acides sont donnés dans le tableau ci-après: Exexrles n? esters mèthy- ligues de Alanine Leucine e-phény 1 alanine Tyrosine Méthionine Lysine Glutamique Aspartique t 1/2 (min) de racémnisation 3,9 6,6 3,8 12,1 16,7 4,62 8,1 4,2 9 Leucine éthyl 90 ester 90 Leucine iso- propyl ester 10,07 R lyridoxal 5 ' phosphate J= R Zèster d'a-amino-acidel = 0, t 1/2 (min) de racémisation ,1 9,6 , 39 ,5 13,4 17,9 ,4 Ln u\l L 4 Exemples de racémisation en phase hétérogène et résolution enzymatique du mélange racémique Exemple Il Dans une expérience type, le pyridoxal 5 ' phosphate en solution 0,510-2 molaire dans l'eau est ramené à p H 7, ce qui constitue une solution mère. microlitres de cette solution sont dilués dans 3 ml de tampon acétate (p H 5,4) et la densité optique est mesurée à 400 nm pour contrôle On ajoute alors à 20 ml de la solution mère, 3 g de résine diéthylamino- éthyl cellulose et la suspension est maintenue à p H 7 sous agitation t Après 5 minutes on laisse décanter et prélève microlitres de surnageant qui est analysé spectralement à 400 nm dans les conditions précédentes La densité * optique nulle observée indique que le pyridoxal 5 ' phos- phate est complètement fixé au support La D tyrosine méthyl ester est alors ajoutée à la solution ainsi obtenue pour avoir une concentration finale de 10-2 molaire. La suspension est maintenue sous agitation vigoureuse à température constante égale à 20 C. A des intervalles de temps régulier, des séries de trois échantillons sont alors prélevés: le premier échantillon est analysépar analyse automatique et permet de montrer qu'il n'y a pas trace d'a-amino-acide libre dans le milieu. le deuxième échantillon après dilution convenable, est analysé spectrophotométriquement (A max 274 nm) et permet de déterminer la concentration de tyrosine méthyl ester libre qui est le seul chromophore présent dans le surnageant (la partie manquante restant accrochée au catalyseur). le troisième échantillon est soumis à hydrolyse chymotrypsique, qui ne libère que l'a-amino-acide L à partir de l'ester correspondant. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau suivant: t tyrosine min ester fixée en% 0,49 fi Il il t' 16 8. If 8 O 9 3 4 6,5 I Exemple 12 En utilisant le même protocole expérimental que dans l'exemple 11, mais à une température de 40 C, on obtient les résultats suivants: t tyrosine méthyl tyrosine méthyl racémisa L tyrosine min ester fixée ester libre tion en libérée en % en % % % 0,49 0,51 95 47,5 " " 100 50 V" " 100 50 t 0,51 Il 23 5 37,5 46 5 Exemple 13 '-S-carboxyméthyl thio pyridoxal: racémisation en phase homogène et résolution enzymatique du mélange racémique. 5 ml d'une solution aqueuse de 5 '-S-carboxyméthyl thio pyridoxal 10-2 M ramené à p H 7, sont additionnés à 5 ml d'une solution aqueuse de D-phénylalanine méthyl ester 5 x 10-2 M à p H 7 Le mélange est maintenu sous agitation à une température de 20 C Aux temps voulus (voir tableau) 1 ml du mélange réactionnel est dilué avec 1 ml de Na HCO 3 5 % dans l'eau et extrait par 2 ml d'acétate d'éthyle saturés d'eau Ceci permet une séparation nette du catalyseur de racémisation qui reste dans la phase aqueuse, alors que la phase organique contiendra l'ester de l'a-amino-acide. Une fraction de la phase organique est évaporée, soumise à une hydrolyse acide et analysée sur analyseur automatique d'a-amino-acides Cette opération permet de déterminer quantitativement l'ester d'a-amino-acide séparé par extraction. Une autre fraction est évaporée et traitée avec l'a-chymotrypsine: la phénylalanine libérée est analysée sur analyseur automatique Cette dernière analyse permet de déterminer la fraction d'isomère L présent dans le mélange (seul à être digéré). Des contrôles chromatographiques ont montré l'absence de phénylalanine libre dans la phase acétate d'éthyle de départ. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau ci-après. Exemples de redressement de configuration: Exemple 14 Le pyridoxal 5 ' phosphate est immobilisé comme décrit dans les exemples 11 et 12 à une concentration identique à celle décrite dans l'exemple 11 ( 20 ml de solution 0,510-2 molaire plus 3 g de résine diéthylaminoéthyl cellulose, c'est-à-dire 0,1 milliéquivalent). On ajoute à cette solution 50,9 mg de D tryptophane méthyl ester sous forme de chlorhydrate ( 0,2 milliéqui- valent) Le p H est ajusté à 7, et la température maintenue à 40 C. 20 mg de chymotrypsine sont alors ajoutés à cette solution. Après 30 minutes de réaction le pyridoxal phosphate fixé sur support est séparé du milieu par filtration Le volume du surnageant est mesuré, égal à 17 ml. Une partie aliquote est soumise dans un premier temps à deux analyses: 1/ Il est montré par chromatographie la disparition complète de l'a-aminoacide ester, et la seule présence dans la phase liquide de l'a-amino-acide libre. 2/ Une deuxième analyse quantitative sur auto-ana- lyseur indique que la quantité de tryptophane libre présent dans le surnageant séparé est égale à 40 % de la temps de racémi L-phénylalanine taux de racémisa- sation (min) formée (%) tion (%) 25 50 36 72 quantité molaire d'ester initialement introduit dans le milieu (les 60 % restant sont considérés fixés sur le support directement et par l'intermédiaire du catalyseur ainsi que dans la phase liquide baignant le support). A la phase solide contenant le catalyseur de racé- misation, on ajoute alors 17 ml d'eau et 16,5 mg de D tryptophane méthyl ester (équivalent à la quantité de tryptophane précédemment hydrolysée) plus 10 mg de chymotrypsine. Après un nouveau temps réactionnel de 30 minutes à 40 C on sépare à nouveau les deux phases Le tryptophane acide libre est dosé Le taux de transfbrmation de cette réaction: D tryptophane ester m acide libre L est quantitatif si on le compare à la dernière addition. Le surnageant est lyophilisé et l'a-amino-acide libre purifié par filtration sur Sephadex G 25 équilibré avec de l'acide acétique à 1 %. La fraction contenant l'a-amino-acide est lyophilisée à nouveau et l'aamino-acide est estérifié par la méthode méthanol-chlorure de thionyle à température ambiante. L'ester ainsi obtenu est soumis à nouveau à l'hydrolyse chymotrypsique en l'absence de pyridoxal phosphate La totalité de l'ester est rapidement hydrolysée en a-amino- acide libre, ce qui démontre son appartenance à la série L. Des essais parallèles sur des esters d'a-amino-acides D n'ont donné dans des conditions comparatives aucune trace d'a-amino-acide libre. Exemple 15 La D tyrosine méthyl ester a été traitée comme le D tryptophane de l'exemple 14. La récupération de la L tyrosine après la première étape a été de 42 %. Le remplacement de cette première fraction de L tyrosine par une quantité équivalente de D tyrosine ester sur le même catalyseur, a conduit, dans les mêmes conditions opératoires que celles de l'exemple 14, à une conversion quantitative en L tyrosine. La série stérique de l'a-amino-acide a été contrôlée comme précédemment. Exemple 16 La D phénylalanine méthyl ester dans les mêmes conditions opératoires que l'exemple 14 donne 39 % de L phénylalanine à la première addition ( 61 % restant réversiblement fixéssur le support). La deuxième addition est transformée quantitativement ainsi qu'une troisième Ceci montre la possibilité de travail en continu de ce système. Bien entendu, la présente invention ne saurait être limitée aux exemples de mise en oeuvre particuliers décrits Il est en revanche parfaitement possible, sans pour autant sortir du cadre de la présente invention, d'en imaginer un certain nombre de variantes, en particulier dans le choix de l'ester soumis à la racémisation et de l'aldéhyde catalysant la racémisation Le procédé de la présente invention permet de façon très générale d'assurer le redressement de configuration d'antipodes D de divers a-amino-acides, tels que l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la e-phénylalanine, la sérine, la thréonine, la lysine, la 6-hydroxylysine, l'arginine, l'acide aspartique, l'asparagine, l'acide glutamique, la glutamine, la cystéine, la cystine, la méthionine, la tyrosine, la thyroxine, la proline, l'hydroxyproline, le tryptophane et l'histidine. t REVENDICATIONS 1/ Procédé de préparation d'un a-amino-acide libre L, caractérisé en ce que l'on racémise l'antipode D d'un ester dudit a-amino-acide en présence d'un catalyseur chimique constitué par au moins un aldéhyde aromatique de formule générale: Ar CHO (I) \ B dans laquelle: Ar représente un cycle aromatique comportant éven- tuellement un hétéroatome tel que l'azote, et B représente une fonction basique, pour conduire à un mélange en équilibre dynamique des deux formes D et L dudit ester, en ce que l'ester présent sous la forme L est hydrolysé de façon irréversible par voie enzymatique en a-amino-acide L stéréostable correspondant, lesdites étapes de racémisation chimique et d'hydrolyse enzymatique étant conduites dans des conditions réactionnelles identiques, et en ce que l'on récupère l'a-amino-acide libre L. 2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit aldéhyde aromatique répond à la formule générale: /(CH 2) n-CHO (II) 3 (CH 2) m-B dans laquelle Ar représente un cycle aromatique comprenant de à 7 chaînons et éventuellement un hétéroatome tel que l'azote, B représente une fonction basique telle qu'une amine tertiaire ou un anion dérivant de l'ioni- sation d'une fonction acide, tel que -CO 2 -O Pa 3, -OPO 3 H, et -503, et m et N représentent des nombres entiers compris entre O et 5. 3/ Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que ledit aldéhyde aromatique répond à la formule générale CH 3 OH N > CHO (III) B dans laquelle B représente une fonction basique telle qu'une amine tertiaire ou un anion dérivant de l'ionisation d'une fonction acide, tel que -C 02, -OP 03,-OP 03 H et -SQ 3 4/ Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit aldéhyde aromatique répond à la formule III dans laquelle la fonction basique B représente le groupement -CH 2-0-PO 3 / Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit aldéhyde aromatique répond à la formule III dans laquelle la fonction basique B représente le groupement -CH 2-S-CH 2-CO 2. 6/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le catalyseur chimique de racémi- sation constitué par au moins un aldéhyde aromatique selon l'une des revendications 1 à 5 est introduit dans le milieu réactionnel à raison de moins de quatre fois la stoechiométrie par rapport à l'ester de l'a-amino- acide D, et de préférence moins de une fois la stoechio- métrie. 7/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le catalyseur chimique de racémi- sation est fixé sur un support insoluble dans le milieu réactionnel t 8/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les étapes de racémisation chimique et d'hydrolyse enzymatique sont conduites dans un solvant choisi parmi des alcools, le formamide, le diméthyl formamide et l'eau, ainsi que les mélanges de ces solvants. 9/ Prbcédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les étapes de racémisation chimique et d'hydrolyse enzymatique sont conduites dans un milieu réactionnel dont le p H est sensiblement compris entre et 10 et plus particulièrement entre 6 et 9. / Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les étapes de racémisation chimique et d'hydrolyse enzymatique sont conduites:dans un milieu réactionnel dont la température est sensiblement comprise entre O et 500 C et plus particulièrement entre 20 et 400 C. 11/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'ester de départ de l'a-amino- acide est introduit dans le milieu réactionnel sous la forme d'un mélange racémique. 12/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'ester de départ de l'a-amino- acide utilisé est choisi parmi les esters méthylique, éthylique, propylique ou isopropylique, sous la forme d'une base libre ou sous forme d'un sel. 13/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que l'étape d'hydrolyse enzymatique est obtenue à l'aide d'estérases telles que la trypsine, la chymotrypsine, la papaine, la chymopapaine et la leucine amino peptidase. 14/ Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que lesdites estérases sont fixées'sur un support insoluble dans le milieu réactionnel. / Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que l'ester de départ de l'a-amino- acide D est obtenu, par des moyens en soi connus, à partir de l'a-aminoacide D. 16/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que l'on prépare l'antipode L d'un c-amino-acide choisi parmi: l'alanine,la valine, la leucine, l'isoleucine, la e-phénylalanine, la sérine, la thréonine, la lysine, la 6-hydroxylysine, l'arginine, l'acide aspartique, l'asparagine, l'acide glutamique, la glutamine, la cystéine, la cystine, la méthionine, la tyrosine, la thyroxine, la proline, l'hydroxyproline, le tryptophane et l'histidine. 17/ Le 5 '-S-carboxyméthyl-thio-pyridoxal de formule CH OH CHO CH 2-S-CH 2-CO 2 2 en tant que catalyseur chimique de racémisation nécessaire pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendi- cations 1 à 16.