FR 2533209 A1 19840323 FR 8215976 A 19820922 1 2533209 La présente invention concerne la synthèse de lipopepti- des, et plus particulièrement de lipopeptides amphipatiques, et l'application de ces composés comme émulsifiants ou comme cristaux liquides. L'invention a pour premier objet une nouvelle classe de lipopeptides, qui sont des lipopeptides amphipatiques composés d'une chaîne hydrophobe comprenant au moins 8 ato- mes de carbone environ,et de préférence de & à,24 'atomes de carbone environ,et d'une chaîne peptidique hydrophile ou rendue hydrophile. Les lipopeptides selon l'invention peuvent être définis par la formule générale: Cn PP dans laquelle Cn représente une chalne'hydrophobe ayant au moins 8 atomes de carbone environet de préférence 8 à 24 atomes de carbone environ, et PP représente un polypeptide obtenu à partir des acides aminés naturels ou de leurs déri- vés,(de configuration 1 ou d, 1) En pratique le polypeptide PP est formé d'un ou plusieurs acides aminésselon le degré de polymérisation retenu,ce dernier pouvant être de 1 ou plus La nomenclature de certaines, parmi les plus courantes, des séquences peptidiques qu'il est possible d'utiliser est regroupée plus loin dans le tableau I. Par chaîne hydrophobe on entend de préférence, mais non exclusivementune chaîne hydrocarbonée aliphatique,éventuel- lement substituée, ayant un nombre d'atomes de carbone tel qu'indiqué. On a obtenu ces composés selon une technique elle-même nouvelle. L'invention a donc également pour objet un procédé pour l'obtention de lipopeptides amphipatiques tels que définis ci-dessus,consistant fondamentalement à. 1) -réaliser un couplage peptidique entre une amine grasse et un amino acide N-protégé,pour obtenir un lipopetide dont la chaîne peptidique a un degré de polymérisation de 1, et, si l'on désire obtenir B un degré de polymérisation de 2 ou 3 pour la chaîne peptidiquegréaliser un autre couplage peptidique d'un amino acide N-protégé sur le produit de degré de poly- mérisation immédiatement inférieur,ou 2 a) effectuer la polymérisation du N-carboxy-anhydride de l'amino acide en l'initiant par une amine grasse, pour obtenir des lipopeptides dont les chaines peptidiques ont des degrés de'polymérisation supérieurs à 3, et 2 b) si on le désirefractionner en composition les lipopepti- des de l'étape 2 a),et- 3) excepté dans le cas o la chaîne peptidique du produit de l'étape 1) et/ou 2 a) ou 2 b) est directement une chaîne hydrophile,débloquer la chaîne latérale des chaînes peptidiques hydrophobes pour la rendre hydrophile. Comme on le voitla méthode de synthèse à employer dépend de la longueur de la ohaîne peptidique désirée. Pour obtenir des lipopeptides à degré de polymérisation 1, 2 ou 3,on procède par couplage peptidique entre l'amine grasse de formule Cn NH 2, o Cn est tel que précédemment défi- ni,et l'amino acide dont l'atome d'azote amino est protégé, par exemple par le groupement tert-butyl-oxycarbonyle (en abrégé Boc); on débloque cet atome d'azote amino et on débloque l'atome d'azote amino après chaque étape. Pour obtenir des lipopeptides dont le degré de polyméri- sation de la cha Sne peptidique est supérieur à 3,on polyméri- se le N-carboxy-anhydride (en abrégé NCA) de l'amino acide en initiant la polymérisation par l'amine grasse Cn NH 2 On réalise ensuite,si on le désire,un fractionnement en composi- tion (la séquence lipidique étant monodispersé),par précipita- tion sélective des lipopeptideset on obtient une série de lipopeptides qui diffèrent par leur composition en peptides. Les peptides monomères mis en oeuvre sont des produits commerciaux ou sont préparés de manière connue. Le monomère utilisé pour la partie peptidique des lipo- peptides selon l'invention n'est pas l'acide aminé lui-même, mais son dérivé cyclique, le N-carboxy-anhydride d'amino-acide (NCA)Iobtenu par action du phosgène sur l'amino acide selon la réaction: R R H 2 N-CH-COOH 2 CH- 1 O NH-C On prépare les NCA dans le TH Ff, en faisant réagir sur l'amino acide une solution de phosgène dans le TH Fo Cette méthode est une variante de la méthode de Fuller, Verlander et Goodman (Biopolymers, 15,( du phosgène est le benzène. L'amine grasse Cn NH 2 est soit une amine commercialement disponiblesoit obtenue à partir de l'acide gras en C(n+l) par la réaction de dégradation de Schmidt utilisant l'azide de sodium en milieu acide fort (Indian J Technol, 5 3 262, ( 1967)) Le choix d'une chaîne Cn ayant de 8 à 24 atomes dé carbone environ n'est pas critiquemais tient uniquement à la plus grande disponibilité des produits correspondantso. Cette cha Ine hydrophobe Cn peut être une chaîne hydrocarbure quelconquemais elle peut aussi comporter des substituants et/ou des hétéro-atomes,pour autant qu'ils n'influent pas dé- favorablement sur le processus de synthèse. On décrit ci-aprèsen référence à la nomenclature expo- sée au tableau Isuccessivement la préparation de lipopepti- des hydrophobes et leur transformation en lipopeptides amphi- patiquesjet la préparation directe de lipopeptides amphipati- ques. A-1 Synthèse de lipopeptides hydrophobes (Cn Eb Cn Db et Cn Kt) On dissout l'amine grasse (Cn NH 2)dans le chloroforme, puis on ajoute le NCA d'acide aminé approprié et on laisse polymériser à la température ambiante,sous agitation, pendant deux jours On obtient ainsi les lipopeptides Cn Eb possédant une séquence peptidique de poly(glutamate de benzyle), Cn Db possédant une séquence peptidique de poly(aspartate de benzyle) et Cn Kt possédant une séquence peptidique de polytrifluoroacétyllysine. A titre d'exemple,pour la synthèse de lipopeptides C 17 Kt,on utilise de l'heptadécylamine obtenue à partir de l'acide stéarique (voir Indian 3 Technol 5, 262 ( 1967). Pour obtenir plus précisément du C 17 Kt de degré de polymé- risation 10 (DP= 10), on ajoute à 2,55 g( o 0,01 mole) d'amine- en C 17 en solution dans 150 ml de chloroforme,27 g ( 0,1 mole)de NCA de trifluoroacétyllysine et on laisse poly- mériser à température ambiante sous agitation pendant plusieurs heures Le chloroforme est ensuite évaporé,le résidu est- repris dans le méthanol et le polymère est précipité dans l'eaupuis est filtré,lavé et séché. A-2) Transformation de lipopeptides hydrophobes en lipopepti- des amphipatiques 1 Lipopeptides Cn K On a préparé les lipopeptides Cn K possédant une séquence hydrophile de polylysine (K) à partir des lipopeptides Cn Kt par la méthode de Sela et al (Biopolymers, 1, 517,( 1963)). On traite les lipopeptides Cn Kt en solution dans le THF, d'abord par une solution de pipéridine dans le méthanol, puis par une solution de pipéridine dans l'eau. A titre d'exemple illustrant une transformation de C 17 Kt en C 17 K, 5 g de C 17 Kt sont dissous dans 150 ml d'une solution molaire de pipéridine dans le méthanol à températu- re ambiante Apres 2 heureseon ajoute 100 ml d'une solution molaire de pipéridine et on laisse 48 heures à température ambiante On élimine le méthanol à l'évaporateur et on passe la solution sur une colonne de résine échangeuse d'anions (Duolite A 102 D, forme OH-)pour éliminer les anions trifluoroacétate et on lyophilise pour récupérer le C 17 K. 2.Lipopeptides Cn E et Cn D On obtient les lipopeptides Cn E possédant une séquence hydrophile d'acide poly-glutamique (E) et Cn D possédant une séquence hydrophile d'acide poiy-aspartique (D) à partir des lipopeptides Cn Eb et Cn Db en traitant ces lipopeptides par H Ci et H Br à température ambiante (J Am Chem. Soc, 80, 4631,( 1958)). 3.Lipopeptides Cn Ep On prépare les lipopeptides C Cn Ep possédant une séquence hydrophile de poly-hydroxypropylglutamine (Ep) en traitant les lipopeptides Cn Eb par l'aminopropanol à 60 C en solution dans le dioxane (Biopolymers, 3, 625,( 1965)). 4.Lipopeptides Cn Ee On prépare les lipopeptides Cn Ee possédant une séquence hydrophile de poly-hydroxyéthylglutamine (Ee) en traitant les lipopeptides Cn Eb par l'éthanolamine à 60 C en solution dans le dioxane (Biopolymers, 9, 717,( 1970). B-Synthèse dee lipopeptides amphi 2 ptligues On dissout l'amine grasse Cn NH 2 dans le chloroforme, puis on ajoute le NCA d'acide aminé et on laisse polymériser, a température ambiante,sous agitation, pendant deux jours On obtient ainsi les lipopeptides Cn Sar possédant une séquence peptidique de polysarcosineo Pour illustrer plus concrètement le procédé de synthèse de lipopeptides selon l'invention,on décrit ci-après la synthèse des lipopeptides-amphipatiques C 17 Sar formés d'une chaîne aliphatique contenant 17 atomes de carbone (C 17) et d'une chaine de polysarcosine (Sar). 1 Synthèse de lipopeptides de degré de polymérisation supé- rieur à 3. L'heptodécylamine C 17 NH 2 obtenue à partir de l'acide stéarique (voir Indian 3 Technol, 5, 262,( 1967)) est d'abord dissoute dans le chloroforme,puis on y ajoute la quantité de NCA de sarcosine calculée pour obtenir le degré de polymérisation choisi Par exemple,si on veut obtenir du C 17 Sar de degré de polymérisation 10 (DP:10), à 2,55 g( 0,01 mole)d'amine en C 171 en solution dans 100 ml de chloroforme,on ajoute 11, 5 g de NCA de sarcosine ( 0,1 mole) et on laisse polymériser à température ambiante,sous agita- tion pendant 48 heures. On fractionne les lipopeptides C 17 Sar par précipita- tion fractionnée en utilisant le mélange solvant/précipitant DMF/acétone. 2 Synthèse de lipopeptides de degrés de polymérisation 1, 2 et 3. Pour obtenir des lipopeptides de degrés de polymérisa- tion 1, 2 et 3,on procède par couplage peptidique entre l'amine grasse et l'amino acide N protégé par le groupement tert-butyl-oxycarbonyle(Boc). Les Boc-amino acides sont préparés à partir de l'amino acide et du ditert-butyl-dicarbonate par la méthode de Morsder et al (Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem 357 1651, ( 1976)) a) Synthèse de C 175 ar o)C 17 Boc Sar:on obtient le produit Cl I 7 Boc Sar en couplant l'heptadécylamine au Boo Sar par l'intermédiaire du dicyclohexylcarbodiimide (DCCI) On mélange à froid (à O C),dans 100 ml de chloroforme, 3,78 g ( 0,02 mole) de Boc Sar et 2 y 06 g( 0,01 mole) de DCCI I 1 se forme un préci- pité abondant de dicyclohexylurée (DCU) On laisse 30 minutes à O C sous agitation et on ajoute 2,55 g ( 0,01 mole) d'heptaf décylamine On laisse la réaction se poursuivre pendant heures On filtreon lave le précipité,on récupère le filtraton évapore le chloroforme,on reprend le résidu dans 50 ml de THF,on refroidit à O C,on filtre pour éliminer le maximum de dicyclohexyluréeet on lave le préci- pité avec un minimum de THF froid. >)C 17 Sar, HC 1: au filtraton ajoute 20 ml d'H Cl en solution 5 N dans du THF et on laisse sous agitation pendant 24 heures à température ambiante I 1 se forme un précipité abondant de C 17 Sar,H Clqu'on filtre et lave au THF. Y)C 17 Sar:on reprend le précipité dans 100 ml de THF et on chauffe à 50 C,puis on ajoute 2 ml de triéthylamine et on laisse reposer pendant 2 heures On refroidit à O C, 7 2533209 on filtre le précipité de chlorhydrate de triéthylamine, on évapore le THF et on recristallise le C 17 Sar dans 1 ' acétone. On obtient 2,lg de C 17 Sar (rendement 65 %) b)Synthèse de C 175 ar 2 Pour obtenir du C 17 Sar 2,on opère de la même manière mais on part de C 17 Sar et de Boc Sar. c)Synthèse de C 175 ar 3 Pour obtenir du EC 17 Sar 3,on opère de la même manière, 1:0 mais on part de C 17 Sar 2 et de Boc Sar. La structure des lipopeptides selon l'invention a été étudiée par la technique de diffraction des rayons X. On a ainsi pu établir que les lipopeptides amphipati- ques présentent des mésophases à structure périodique en solution aqueuse pour des concentrations en eau inférieures à 60 % environ et que la structure périodique peut être conservée à l'état sec par évaporation lente de l'eau de la mésophase Les lipopeptides amphipatiques selon l'invention constituent ainsi une nouvelle classe de cristaux liquides liotropes et ils peuvent avoir les mêmes applications que ces cristaux liquides. La structure des lipopeptides amphipatiques est mainte- nant décrite plus en détails en référence à lgexemple des lipopetides C 17 Sar constitués d'une chaîne aliphatique pos- sédant 17 atomes de carbone et d'une chaîne de polysaroosi- ne,dont on a fait varier le degré de polymérisation de 1 à 60. Les lipopeptides C 17 Sar présentent un double polymor- phisme: en fonction de la longueur de la chaîne polypepti- dique d'une part et en fonction de la teneur en eau d'autre part Les lipopeptides adoptentsuivant leur composition, trois types de structures lamellaires pour les degrés de polymérisation (DP)inférieurs à 9, hexagonale pour les DP compris entre 10 et 35 environ et cubique centrée pour les DP supérieurs à environ 35 o De plus;les lipopeptides peuvent présenter un polymorphisme en fonction de la teneur en eau de leurs mésophases L'addition d'eau modifie le rapport en- tre les volumes des phases hydrophile et hydrophobe et peut faire passer la structure de lamellaire à hexagonale (pour les DP compris entre 5 et 9 environ) ou d'hexagonale à cu- bique (pour les DP compris entre 17 et 35 environ). L'kinvention a donc également pour objet l'applica- tion des lipopeptides amphipatiques à la constitution de cristaux liquides liotropes. Les mésophases de lipopeptides amphipatiques peuvent en outre incorporer de nombreux composants, tant hydrophiles qu'hydrophobes, tels que: alcools, acides, paraffines, hui- le de carnation, stéarate d'éthyle, palmitate d'isopropyle, etc, et donner ainsi par exemple des laits ou des crèmes, dont on peut faire varier facilement la viscosité en jouant sur la structure des mésophases, elle-même déterminée par la longueur respective des séquences hydrophobes et peptidi- ques des lipopeptides. On a également testé les propriétés émulsifiantes des lipopeptides amphipatiques vis-à-vis de nombreux couples de liquides non miscibles tels que eau/hydrocarbures et eau/ produits de base de l'industrie des cosmétiques On a étu- dié le type et la stabilité des émulsions obtenues par la méthode des colorants sélectifs, la méthode des dilutions, la conductivité électrique, la cryofracture et la microsco- pie électronique. Pour obtenir des émulsions, on ajoute aux deux liqui- des non misciblesenvironl% en poids de lipopeptide amphipati- que (C 17 Sar,DP=l,par exemple), on agite avec un agitateur magné- tique et l'émulsion se forme facilement On a ainsi préparé des émulsions de différentes compositions avec les systè- mes eau/octane, eau/huile de carnation, eau/stéarate d'éthy- le et eau/palimitate d'isopropyle Les émulsions obtenues sont très stables (plusieurs mois) et résistent à des élé- vations de température jusqu'à 60 C environ. L'invention a donc en outre poo objet l'application des lipopeptides amphipatiques comme émulsifiants et les émulsions comprenant des lipopeptides amphipatiques a titre d'agent émulsifiant, en pratique de l'ordre de 1 % en poids ou plus. On peut faire varier à volonté la solubilité et l'affi- nité pour différents solvants des lipopeptides en jouant sur la longueur de la chaîne aliphatique et sur la nature de la chaine peptidique On peut aussi modifier facilement la balance hydrophile-hydrophobe de tels lipopeptides en jouant sur la longueur de la chaîne aliphatique et sur le degré de polymérisation de la chaîne peptidique. Les lipopeptides amphipatiques selon l'invention don- nent facilement des émulsions très stables pour des teneurs en lipopeptides très faibles (environ 1 % en poids) contre -16 % avec les agents de surface classiques De plus ils ont l'avantage d'être réalisés avec des composants naturels (lipides et peptides) Ces lipopeptides amphipatiques peuvent trouver une application comme agents émulsifiants de milieux non miscibles dans des domaines très divers,par exemple dans l'industrie cosmétique (crèmes hydratantescrèmes antirides, vernis, dissolvants de vernisetc),dans l'industrie alimentaire (moutardes, mayonnaises,etc)et dans l'industrie pétrolière (additifs pour huiles, récupération assistée de pétrole),entre autres. it J TABLEAU I N 4 omenc Iature des séquences peptidiques Désignat-ion Nom du'polypeptide Poly(glutamate de benzyle) Poly mine) Poly (hydroxyéthylgluta- mine> Poly (CH 2 > 2 C 00-CH 2 C 6 H 5 (CH)2-CO-NH (CH 2)3 OH (CH 2),-CO-NH-(CH 2)20 OH -(CH 2)2-COOH - -CH 2-COO-CH 2-C 6 H 5 -CH 2-COOH (CH 2) 4-NH-CO-CF 3 (CH 2) 4-NH 2 -CH 2-OH -CH-OH I C Hn 3 (+) Polysarcosine: ( H 2-O) CH 3 Eb Ep Ee- E Db Kt T Sar il REVENDICATIONS 1 Lipopeptides, caractérisés en ce qu'ils sont amphi- patiques et sont constitués d'une chaîne hydrophobe comprenant de 8 à 24 atomes de carbone environ et d'une chaîne peptidique hydrophile ou rendue hydrophile. 2 Lipopeptides selon la revendication l caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule générale Cn PP dans laquelle Cn représente une chaîne hydrophobe ayant de 8 à 24 atomes de carbone environ, et PP représente un polypep- tide obtenu à partir des acides aminés naturels ou de leurs dérivés. 3 Procédé pour l'obtention de lipopeptides selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il consiste fondamentalement à 1) réaliser un couplage peptidique entre une amine grasse et un amino acide N-protégé, pour obtenir un lipo- peptide dont la chalne peptidique a un degré de polyméri- sation de 1 et, si l'on désire obtenir un degré de polymé- risation de 2 ou 3 pour la chaîne peptidique, réaliser un autre couplage peptidique d'un amino acide N-protégé sur le produit de degré de polymérisation immédiatement in- férieurou 2 a) effectuer la polymérisation du N-carboxy-anhydri- de de l'amino acide en l'initiant par une amine grasse, pour obtenir des lipopeptides dont les chaînes peptidiques ont des degrés de polymérisation supérieurs à 3, et 2 b) si on le désire, fractionner en composition les lipopeptides de l'étape 2 a), et 3) excepté dans le cas o la chaîne peptidique du produit de l'étape 1) et/ou 2 a) ou 2 b) est directement-une chaine hydrophile, débloquer la chaîne latérale des chaines peptidiques hydrophobes pour la rendre hy drophile. 4 o Procédé selon la revendication 3 pour l'obtention de lipopeptides ayant un degré de polymérisation de 1 l 2 ou 32 caractérisé en ce qu'on effectue un couplage peptidique entre une amine grasse de formule Cn NH 2 o U Cn est tel que précédem- ment défini, et l'amino acide dont l'atome d'azote amino est protégé, par exemple par le groupement tert-butyl-oxycarbonyle, obtenant ainsi un lipopeptide ayant un degré de polymérisation de 1, et pour obtenir des lipopeptides ayant un degré de poly- mérisation de 2 ou 3 pour la chaine peptidique on réalise un autre couplage peptidique d'un amino acide N-protégé sur le produit de degré de polymérisation immédiatement inférieur, Procédé selon la revendication 3 pour l'obtention de lipopeptides dont le degré de polymérisation de la chaine peptidique est supérieur à 3, caractérisé en ce qu'on poly- mérise le N-carboxy-anhydride de l'amino acide en initiant la polymérisation par une amine grasse Cn NH 2 o Cn est tel que précédemment défini, et on réalise ensuite, si on le désire, un fractionnement en composition par précipitation sélective des lipopeptides, obtenant ainsi une série de lipopeptides qui diffèrent par leur composition en peptides. 6 Application des lipopeptides selon l'une des reven- dicationsl ou 2 à l'obtention de cristaux liquides liotropes. 7 Cristaux liquides, caractérisés en ce qu'ils com- prennent au moins un lipopeptide selon l'une des revendications 1 ou 2. 8 Application des lipopeptides selon l'une des reven- dications 1 ou 2 comme émuisifiants. 9 Emulsions de milieux non miscibles, caractérisées en ce qu'elles comprennent, de préférence à raison d'environ 1 % en poids, au moins un lipopeptide selon l'une des revendi- cations 1 ou 2.