FR 2531223 A1 19840203 FR 8312645 A 19830801 1 - La présente invention concerne un procédé pour le dosage simultané de la quantité totale de deux ou plusieurs substances différentes présentes dans un échantillon, et un réactif pour ce procédé. Grâce aux récents progrès de la médecine clinique, il est devenu possible d'effectuer un diagnostic précis, ainsi que le traitement qui en découle, pour diverses mala- dies, en mesurant un certain nombre de paramètres cliniques et en jugeant les résultats-d'une manière globale Cepen- dant, dans les dosages immunochimiques actuels, il faut de 1 à 4 jours environ pour effectuer un test sur un seul pa- ramètre, et donc plusieurs jourssont nécessaires pour tes- ter un certain nombre de paramètres, et par conséquent cer- tains tests nécessaires doivent être omis lorsqu'un traite- ment médical rapide est nécessaire Dans ces conditions, il peut arriver que le traitement ne soit pas toujours celui qui conviendrait le mieux au malade. Par exemple, en ce qui concerne le cancer, qui s'est classé ces derniers temps parmi les premières causes de mortalité, on pense que les dosages de divers marqueurs de tumeurs sont utiles pour un diagnostic précoce, pour la com- préhension de l'état de la maladie, pour juger de l'effet thérapeutique, pour reconnaître une rechute de la maladie, etc Dans un pareil cas, le dosage d'un certain nombre de marqueurs de tumeurs et l'étude globale des résultats de ces dosages offrent plus d'efficacité et de précision que le dosage et l'étude des résultats -du dosage d'un' seul mar- queur de tumeur Cependant, comme il a été dit précédemment, il faut plusieurs jours pour doser plusieurs marqueurs de tumeurs De plus, la quantité d'échantillon nécessaire (prin- cipalement sérum, plasma, etc) est inévitablement plus grande, ce qui est gênant pour le malade. Un des buts de la présente invention est de fournir un procédé pour doser en une seule fois la quantité totale de deux ou plusieurs substances présentes dans un seul échantillcn par une seule opération de dosage. Un autre b-_t de la présente invention est de four- nir un réactif nor doser en une seule fois la quantité totale de deux ou plusieurs substances présentes dans un seul échantillon Par une seule opération de dosage. En conséquence, la présente invention concerne un procédé de dosage immunologique et un réactif de dosage pour doser en une seule fois la quantité totale deux ou plusieurs substances à doser, procédé qui consiste à faire 0 réagir un échanti Llon contenant les substances à doser avec un anticorps ou un antigène insolubilisés constitué de deux ou plusieurs anticorps ou antigènes différents, et à doser les substances à tester en se basant sur la réaction imnunologique qui se produit entre ces substances. Selon la présente invention, puisque deux ou plu- sieurs substances à doser peuvent être dosées en même temps, le temps nécessaire au dosage peut être considérablement réduit, si l'on compare avec les méthodes classiques qui impliquent des dosages séparés des substances à doser. Aux dessins annexés, donnés uniquement à titre dlexemple les Fia 1 à 4 sont des graphiques représentant les courbes étalons de l'Exemple 6; les Fia 5 à 8 sont des graphiques représentant 23 les courbes étalons de l'Exemple 10; la Fig ? est un graphique représentant les cour- bes étalons de l'xemple 12; et la Fig 10 est un graohique représentant les courbes de dilution de l'Exemple 13. La Demanderesse a découvert que, par le diagnostic précoce d'un cancer gràce au dosage de marqueurs de tu- meurs, bien que l'on préfère de beaucoup effectuer des do- sages séparés pour découvrir quelles sortes de marqueurs de tumeurs sont présents et en quelles quantités, il est 33 en pratique possible de faire un diagnostic en se basant sur la quantité totale des marqueurs de tumeurs, comme le prouveront les Exemples 2, 4, 6 et 11 décrits plus loin. En se basant sur cette découverte, la Demanderesse a effec- tué des recherches intensives sur un procédé permettant de doser la quantité de deux ou plusieurs substances pré- sentes dans un échantillon, en dosant simultanément la quantité totale des substances en une seule opération de dosage Comme résultat, ils ont découvert que l'on pouvait dosex la quantité totale de deux ou plusieurs substances à doser en une seule opération de dosage en se basant sur un principe de dosage immunologique, dosage effectué en fixant deux ou plusieurs anticorps différents correspon- dant-à deux ou plusieurs antigènes à doser, au même support ou véhicule insoluble, ou bien en mélangeant et utilisant deux ou plusieurs anticorps insolubilisés-obtenus en fi- xant des anticorps, correspondant aux deux ou plusieurs an- tigènes à doser, à des Supporte insolubles séparés, sans provoquer aucune modification de la réactivité entre chaque antigène à doser et les anticorps correspondants La pré- sente invention a ainsi été réalisée. Les méthodes de dosage immunologique sur lesquelles se base le procédé de dosage selon la présente invention sont largement employées comme méthodes de dosage physio- logique de substances actives présentes en quantités ex- trtmement faibles dans des échantillons tels que le sérum, l'urine, etc, par exemple les concentrations d'hormones peptidiques, de stéroides, de protéines, etc, les concen- trations de médicaments administrés au corps humain, etc. Parmi ces techniques, on emploie de préférence la réaction d'hémagglutination et la réaction d,'agglutination au latex, car elles présentent certains avantages comme d'être des opérations de dosage simples, qui nécessitent peu de temps, etc; on utilise aussi de préférence le dosage immunoenzy- matique, le dosage radioimmunologiqme et le dosage par im- munofluorescence, car ces dosages présentent des avantages cnmme une grande sensibilité, une exce -ente précision,etc. Les principes de ces méthodes de dosage vont être à présent brièvement décrits ci-dess-s: 1) Réaction d'agglutination: Lnrsqu'-n fait réagir une quantité inconnue d'un antigène à d-ser avec un anticorps correspondant lié à un support particzlaire (désigné ci- apres sous le nom de phase solide) tel cue des globules rouges, du latex de polymère, etc, l'antigène se lie alors à l'anticorps sur la phase solide en fonction de sa quan- tité, ce qui entraine une agglutination de la phase solide. On mesure le degré de ladite agglutina-ion, et la quantité d'antigène à doser est déterminée par comparaison avec les degrés d'agglutination obtenus en dosant des concentrations connues de la même substance par des oorations analogues. 2) Méthode du sandwich: Lorsqu'on fait réagir une quantité inconnue d'un antigène non marqué (anrigène à doser) avec un anticorps correspondant lié à une Dbase solide (pre- mière réaction), l'antigène à doser se lie à l'anticorps pour former un complexe antigène-anticorps Lorsqu'on fait réagir une quantité donnée du même an:icorps marqué avec un agent de marquage avec ledit complexe antigène-anticorps (deuxième réaction), l'anticorps marcue se lie au complexe précité, mais une partie de l'anticors marqué, dépassant la capacité de liaison du complexe, ne se lie pas et reste sous forme libre Ensuite, la phase solide est séparée de la phase liquide, on mesure l'activité de l'agent de mar- quage dans la phase solide ou dans la ohase liquide, et la quantité d'antigène non marqué a doser est déterminée en se basant sur la courbe étalon préparée par des opérations analogues en utilisant des concentrations connues de l'an- tigène non marque. 3) Méthode par réaction de compétitin: Lorsqu'on fait réagir en compétition une quantité inconnue d'un antigène non marqué (antigène à doser) ainsi cu'une quantité donnée d'un antigène marqué avec un anticorps correspondant lié à 2531223 1 $ une phase solide, l'antigène non marqué et l'antigène mar- qué se lient respectivement à l'anticorps en fonction de leurs quantités existantes, de telle sorte que la quantité de l'antigène marqué qui se lie à l'anticorps est inverse- ment proportionnelle à la quantité de l'antigène non mar- qué Ensuite, la phase soliide est séparée de la phase li- quide, on mesure l'activité de l'agent de marquage dans la phase solide ou dans La phase liquide, et la quantité de I'antigène est déterminée en se basant sur la courbe étalon préparée par des opérations analogues en utilisant des concentrations connues de la substance non marquée. 4) Méthode immunométrique: Lorsqu'on fait réagir une quan- tité inconnue d'un antigène non marqué (antigène à doser) avec une quantité donnée d'un anticorps marqué correspon- dant, et qu'ensuite on ajoute le même antigène lié à une phase solide pour qu'il réagisse avec l'anticorps marqué qui n'a pas réagi, l'anticorps marqué se lie à l'antigène sur la phase solide en quantité inversement proportionnel- le à la quantité de l'antigène non marqué Ensuite, la phase solide et la phase liquide sont séparées, on mesure l'activité de l'agent de marquage dans la phase solide ou dans la phase liquide, et la quantité de l'antigène non marqué est déterminée en se basant sur la courbe étalon préparée par des opérations analogues en utilisant des concentrations connues de la substance non marquée. La présente invention fournit un procédé et un réac- tif pour doser en une seule fois la quantité totale de deux ou plusieurs substances A doser présentes dans un échan- tillon en utilisant les principes des méthodes de dosage 3 ' immunologique décrits plus haut. Le procédé de dosage de la présente invention peut s'appliquer à n'importe laquelle des méthodes de dosage immunologique classiques qui impliquent la liaison d'un anticorps ou d'un antigène à un support insoluble, par exemple, la réaction d'hémagglutination, la réaction d'in- 2531223 i hibition d'agglutination, la méthode par réaction de com- pétition, la méthide du sandwich, la méthode immunométri- que, etc Le procédé de la présente invention est mainte- nant décrit schématiquement en utilisant comme seuls exem- pies la réaction d'agglutination et la méthode du sand- wvich. ( 1) Réaction d'agglutination: Lorsqu'on doit doser un échantillon qui est supposé contenir quatre substances A, B, C et D, quatre anticorps différents correspondant aux substances a doser, à savoir l'anticorps anti-A, l'anti- corps anti-B, l'anticorps anti-C et l'anticorps anti-D, sont fixés au même support particulaire insoluble, ou bien sont fixés séparément à des supports particulaires insolu- bles individuels, pour préparer une suspension ou quatre suspensions différentes de support particulaire insoluble portant les quatre dits anticorps Lorsqu'on fait réagir l'échantillon avec ces suspensions, les substances à doser A, B, C et D se lient alors respectivement aux anticorps correspondants sur les supports, ce qui entraîne l'agglu- tination des supports particulaires En mesurant le degré de cette agglutination, on peut doser la quantité totale des deux ou plusieurs substances à doser présentes dans un échantillon. ( 2) Méthode du sandwich: Lorsqu'on doit doser un échantil- lon supposé contenir quatre substances A, B, C et D, qua- tre différents anticorps correspondant aux substances à doser, à savoir l'anticorps anti-A, l'anticorps anti-B, l'anticorps anti-C et l'anticorps anti-D, sont fixés au même support insoluble, ou bien sont fixés séparément à des supports insolubles individuels pour préparer un sup- port insoluble ou quatre supports insolubles différents contenant les quatre dits anticorps Lorsqu'on fait réagir l'échantillon avec ces supports insolubles, les substances respectives à doser, A, B, C et D, se lient respectivement aux anticorps correspondants sur les supports Après sépa- 253 223 ration de la bphase solide, si nécessaire, on fait réagir les anticorps marqués obtenus en liant un agent de marqua- ge aux anticorps respectifs, anticorps anti-A, anticorps anti-3, anticorps anti-C et anticorps anti-D, avec la pha- se solide, ce qui fait que les anticorps marqués respectifs se lient respectivement aux substances à doser corres Don- dantes Ensuite la phase solide est séparée, puis l'acti- vité totale de l'agent de marquage lié à la phase solide est dosée Ainsi, on peut doser en une seule fois la quan- tité totale de deux ou plusieurs substances à doser présen- tes dans un seul échantillon. Le support particulaire insoluble à utiliser dans le procédé d'agglutination dela présente invention peut être n'importe lequel des supports classiquement employés. C'est-à-dire que des cellules de bactérie, par exemple des globules rouges, etc, des latex de polymères organiques, comme un latex de polystyrène, un latex de polystyrène in- corporant des groupes carboxyle, un latex de copolymère styrène-divinylbenzène, un latex de polymère styrène-divi- nylbenzène incorporant des groupes hydroxyle ou des groupes carboxyle, un latex d'alcool polyvinylique, un latex de po- lyacrylate, un latex de copolymère acétate de vinyle déri- vé acrylique, etc, des substances minérales comme la sili- ce, le noir de carbone, alumine, etc, peuvent être employés seuls ou en association. Comme substance pour le support insoluble dans la méthode du sandwich, la méthode par réaction de compétition, et la méthode immunométrique, selon la présente invention, on peut utiliser, seules ou en association, n'importe les- quelles des substances employées dans les dosages immunolo- giques classiques, par exemple, du polystyrène, du poly- éthylène, du polyacrylate, du Téflon, du papier, du verre, de l'agarose, etc De plus, la forme à utiliser peut être de manière appropriée, par exemple, une sphère, une tige, un disque, ou une forme de récipient, par exemple, une cel- luie optique, un tube à essai, etc, bien que d'autres formes puissent également être utilisées. Les anticorps utilisés dans le Drocédé de dosage de la présente invention peuvent être des anticorps nulti- clonaux ordinaires, mais l'utilisation d'anticorps mono- clonaux donne des résultats encore meilleurs Par exemple, l'utilisation d'anticorps monocionaux entratne une amé- lioration de la sensibilité et de l'exactitude du dosage, une réduction du temps de réaction, une amélioration de la spécificité, la simplification des opérations de dosage, l'exclusion de toute réaction non spécifique, l'exclusion de toute inhibition de la réaction due aux composants bio- logiques de l'échantillon, par exemple sérum, urine, etc, ou effets analogues Lorsque l'on doit employer des anti- corps monoclonaux dans la réaction d'agglutination, il est nécessaire d'utiliser en combinaison deux ou plusieurs anticorps monoclonaux correspondant aux différents sites d'antigène d'une substance à doser de manière à provoquer l' agglutination. On peut employer comme méthode de fixation d'un ou plusieurs anticorps ou antigènes à un support insoluble les méthodes décrites dans "Clinica Chimica Acta" 48, 15 ( 1973); "Journal of Immunology", 116, 1554 ( 1976); et "Science", 158, 1570 ( 1967) Lorsqu'il faut fixer deux ou plusieurs anticorps différents à un seul support inso- luble, une solution d'anticorps obtenue en mélangeant les anticorps a fixer en proportions appropriées, par exemple, une solution contenant 0,5 mg/ni d'anticorps anti-AFP, 0,1 mg/ml d'anticorps anti-HCG et 0,25 mg/ml d'anticorps anti-CEA dans du sérum physiologique tamponné avec du phosphate 0,05 M, p H 6,4, est préparée à l'avance, puis cette solution d'anticorps mélangés est mise en contact avec les supports insolubles et la réaction est effectuée a 30 56 OC pendant 2 3 heures Après la réaction, les supports sont lavés avec du sérum physiologique pour pré- parer les supports avec des anticorps fixés. Lorsque l'anticorps anti-AFP, l'anticorps anti-IICG et l'anticorps anti-CEA doivent être fixés individuelle- ment à des supports insolubles séparés, lesdits anticorps anti-AFP, anticorps anti-HCG et anticorps anti-CEA sont dissous séparément dlans du sérum physiologique à tampon phosphate 0,05 M, p H 6,4 à des concentrations de 0,5 mg/ml, 0,1 mg/ml et 0,25 mg/ml respectivement, puis mis en con- tact avec des supports insolubles séparés, et chaque mélan- ge est mis a réagir a 30 56 "C pendant 2 3 heures. Aores la réaction, les supports insolubles sont lavés avec du sérum physiologique, pour préparer les supports avec les anticorps fixés respectifs Le rapport de mélange des anticorps insolubles ainsi obtenus est choisi de manière appropriée dans la gamme dîenviron 1 10: 1 10: 1 10 bien qu'il varie selon la quantité de chaque anticorps à fixer au support insoluble et le titre de chaque anticorps. La quantité de chaque anticorps à fixer au support- insoluble est de manière appropriée 10 -0,05 mg/ml, de préférence 5 0,1 mg/ml, bien qu'elle varie selon le genre de substance à doser, la quantité de chaque substance à doser présente dans l'échantillon, le titre de chaque an- ticorps, etc. Lorsque le dosage est effectué 9 les conditions opti- males sont déterminées expérimentalement, puisque la quan- tité d'échantillon à utiliser, la quantité de chaque anti- corps marqué ou de chaque antigène marqué, et les condi- tions telles que le temps de réaction, la température, etc,, varient selon la nature de chaque substance à doser, le ti- tre de chaque anticorps utilisé, et la nature de l'agent de marquage, etc La préparation de l'anticorps marqué et de l'anti- gène marqué peut Atre faite par un procédé classique. Lorsque le procédé de la présente invention doit être mis en oeuvre en se basant sur la réaction de compéti- tion, l'antig&ne marqué a utiliser est celui qui se liera avec l'anticorps insolubilisé en compétition avec la subs- tance à doser, de telle sorte qu'en général, on emploie cnmme antienne la même substance que la substance à doser. Cependant, 'es substances physiologiquement actives, pré- sentes dans le corps humain, peuvent exister liées à d'au- tres composants biolngiques, ou être partiellement méta- bolis-es et ainsi ne pas être quelquefois tout à fait les mêmes que lorsqu'elles se trouvent hors du corps humain. Par conséquent, si tel est le cas, une substance qui a pra- tiquement la meme réactivité d'un point de vue immunologi- que peut être employée comme la substance identique à doser. Bien que la présente invention vise simultanément le dosage de deux ou plusieurs substances, il est aussi possible de doser une seule substance en utilisant un seul anticorps narqué, même lorsqu'on emploie deux ou plusieurs anticorps insolubilisés, a moins que les substances à do- ser ne se genent les unes les autres. Conne agent de marquage, on peut utiliser des enzy- mes (par exemple la peroxydase, la p-galactosidase, la phosphatase alcaline, la glucose oxydase, etc), des iso- topes radioactifs (par exemple 125, H, etc), des subs- tances fluorescentes (par exemple l'isothioxyanate de fluo- rescéine, l'isothiocyanate de tétraméthyl rhodamine, etc). Dans la réaction d'agglutination, en employant le support portant deux ou plusieurs anticorps obtenu de la façon décrite précédemment, on peut doser en une seule fois la quantité totale des deux ou plusieurs substances à do- ser Dans la méthode du sandwich et dans la méthode par réaction de compétition, en utilisant deux ou plusieurs antigènes narqués ou anticorps marqués correspondant aux deux ou plusieurs anticorps fixés aux supports insolubili- sés conne il a été décrit Drécédemment, on peut doser en une seule fois la quantité totale des deux ou plusieurs 33 substances à doser De plus, dans la méthode du sandwich et dans la méthode par r 6 action de compétition, en utili- sant un seul antigène marqu 6 é ou anticorps marqué, on peut également doser uniquement une seule substance Par exen- pie, on introduit un échantillon dilué à une concentration appropriée dans un tube à essai o un anticorps a été fixé, et -n effectue la réaction antigène-anticorps Lorsque la réaction est terminée, on lave le tube à essai avec de l'eau distillée, on ajoute un anticorps marqué et on ef- fectue la réaction Puis, après lavage avec de l'eau dis- tillée, on dose l'activité de l'agent de marquage dans la, phase solide (tube à essai) par un moyen approprié A par- tir de la valeur obtenue, on calcule la quantit 6 des subs- tances à doser présentes dans l'échantillon en se basant sur une courbe étalon obtenue par des opérations analogues sur des concentrations connues de la substance étalon. Dans ce cas la substance étalon peut tre un seul antigène ou un mélange de plusieurs antigènes. Avec le procédé de dosage de la présente invention, on peut doser toute substance qui peut être dosée par les méthodes de dosage immunologique classiques Des substan- ces à doser particulièrement importantes sont, par exemple, des marqueurs de tumeurs ayant-une signification importante dans le diagnostic précoce des tumeurs, le jugement des ef- fets thérapeutiques des traitements effectués, etc. Comme exemples on peut citer l'antigène carcinoem- bryonnaire (désigné ci-après par CEA), l 1 -fètoprotéine (AFP), la choriogonadotropine humaine (ECG), la P 2-micro- alobuline (p 2 m), la fetoprotéine basique (BFP), la phos- phatase alcaline (ALP), la It L " 2-glycoprotéine associée à la grossesse (SP 3), la pro- téine acide immunosuppressive (IAP),il' t 2-macroglobuline immunosuppressive, l'isoferritine acide, le fibrinogène, l'haptoglobine, la calcitonine, les hormones stéroidiennes, les polyamines, les protéines liant 1 'ADN, l' 1-antitryp- sine, l'antig O ne oncofétal pancréatique, la galactosyl transférase (GT-II), etc, ainsi que de nombreuses subs- * tances en ce moment à l'étude De plus, comme substances ayant une signification dans le diagnostic et la prophyla- xie de l'hépatite provoquée par l'infection avec le virus de l'hépatite a Drès transfusion sanguine, il y a les anti- genes du virus de l'hépatite B (H Bs, H Bc, H Be) et les anti- gènes du virus de l'hépatite non-A non-B. Comme exemples de combinaisons de deux ou plusieurs substances différentes à doser on peut citer: ( 1) AFP, CEA, HCG, ( 2) SP 3, fibrinogène, ( 3) AFP, CEA, HCG, SP 3, fibrinogène, ( 4) fibrinogè&e, haptoglobine, ferritine, ( 5) haptoglobine, 32 m, 02-macroglobuline imnuno-suppressive, \\l-antitrypsine, ( 6) ALP, Y-GTP, GT-II ( 7) polyamines, hor- mones stéroïdiennes, ( 8) H Bs, H Be, et combinaisons analo- gues. La réalisation de la présente invention permet de réduire le temps de dosage, tandis que, lorsqu'on devait doser un certain nombre d'antigènes par une méthode classi- que, on devait doser chaque antigène séparément et il fal- lait donc plus de temps De plus, la quantité d'échantillon nécessaire a été réduite de manière importante. La présente invention est maintenant décrite plus en détail par les exemples non limitatifs suivants: EXEMPLE 1 Dosage de la quantité totale de fibrinogène, d'haotoglobine et de úerritine a) Production du réactif au latex avec anticorps fixé. L'anticorps anti-fibrinogène (DAKO Co), l'anticorps anti-haptoglobine (DC, 'O Co) et l'anticorps anti-ferritine (DAKO Co) ont été dilués et mélangés dans du sérum physio- looique tamponné avec du phosphate 0,05 M, p H 6,4 (désigné ci-après par PBS) pour obtenir des concentrations de 5 mg/ml, 1,3 mg/ml et 0,7 mg/ml respectivement On a ajouté 0,5 ml d'une suspension de latex de polystyrène à 10 % (particules 2531223 i de latex uniformes, Dowv Chemical Co) à 2 ml de la solu- tion d'anticorps mélangés précédente, et -n a agité et mis à réagir à 37 C pendant 2 heures Lorsque la réaction a été terminée, le mélange réactionnel a été refroidi avec 3 de la glace, centrifugé, lavé avec du PBS, et mis en sus- pension dans du PBS contenant de la sérum albumine de bo- vins à 1 5 (désignée ci-a Drès par BSA), pour obtenir un réactif au latex avec anticorps fixé. b) Préparation des solutions étalons Du fibrinogène (Sigma Co), de l'haptoglobine (Sig- ma Co) et de la ferritine (Signma Co) ont été dilués sé- parément avec du PBS contenant 1 % de BSA jusqu'à des con- centrations de 120, 60, 30, 15 et O pg/ml, 12, 6, 3, 1,5 et O mg/ml et 0,8, 0,4, 0,2, 0,1 et O jug/ml, respectivement. c) Dosage du fibrinogène, de l'haptoglobine et de la fer- ritine. 1 de chacune des solutions de fibrinogène, d'hap- toglobine et de ferritine, avec leurs concentrations res- pectives, produites en b) ci-dessus ont été placés sur une lame de verre, puis on a ajouté 50 Pl de PBS contenant 1 o de BSA et 20 j 1 du réactif au latex avec anticorps fixé produit en a) ci-dessus On a fait réagir le mélange en agitant pendant 3 minutes, et le degré d'agglutination a été observé au microscope La réaction ne présentant aucune 23 agglutination a été dite négative (-), et celle présentant une agglutination a été dite positive (+, ++ ou +++ selon le degré-d'agglutination); on obtient ainsi quatre degrés. La sensibilité du réactif au fibrinogène, à l'haptoglobine et à la ferritine était de 15 pg/ml, 1,5 ug/m J et 0,1 ig/ml respectivement. EXEMPLE 2 Dosage sur des échantillons de sérum de nalades On a effectué des dosages selon la présente inven- tion sur des échantillons de sérum obtenus à partir de 18 malades souffrant d'un cancer du Foie, 20 malades souffrant 2531223 l d'un cancer de l'estomac, 20 malades souffrant d'un cancer du gros intestin, 8 malades souffrant d'un cancer du pou- mon, 25 malades souffrant de diverses maladies bénignes et personnes en bonne santé Les modes opératoires des do- sages étaient analogues à ceux de l'Exemple 1 c) Les ré- sultats sont présentés dans le Tableau 1. TABLEAU 1 No lapport Nom de la maladie I Nombre Jugement Dasport de _+ ++ +++ positif de ++ +++ malades (î ) Cancer du foie 18 1 2 9 6 94 Cancer de 1 ' est omac 20 3 4 8 5 85 Cancer du gros intestin 20 2 3 7 8 90 Cancer du poumon 8 O 2 4 2 100 Maladies bénignes 25 19 5 1 O 24 Humains en bonne santé 20 18 2 O O 10 ,; ,, Comme on le voit dans le Tableau 1, les malades can- céreux ont orésenté un rapport positif élevé, ce qui indi- que l'utilité du procédé de dosage de la présente invention pour: la détection des malades cancéreux. EXEMPLE 3 Dosaae de la quantité totale de fibrinogène, d'ha Dtoglobine et de ferritine a) Production de Latex avec un anticorps anti-fibrinogène fixé. Un anticorps anti-fibrinogène (DAKO Co) a été di- lué avec du PBS pour obtenir une concentration de 5 mg/ml. On a ajouté à 2 ml de l'anticorps dilué 0,5 ml d'une sus- pension de latex de polystyrène à le % (diamètre particu- laire moyen 0,48 u, Dowv Chemical), et le mélange a été agi- té et mis à réagir a 37 C pendant 2 heures Une fois la 1 ( O rôaction terninée, le mélange réactionnel a été refroidi avec de la glace, centrifugé, lavé avec du PBS, puis mis en suspension dans du PBS contenant 1 % de BSA pour obtenir un latex avec un anticorps antifibrinogène fixé. b)-Production d'un latex avec un anticorps anti-haptoglo- bine fixé. Un anticorps anti-haptoglobine (D Ai O Co) a été di- lué avec du PBS pour obtenir une concentration de 1,8 mg/ml, et cette solution a été utilisée pour réagir avec une sus- pension de latex de polystyrène a 10 à de la mrme manière que dans a) ci-dessus pour obtenir un latex avec un anti- corps anti-haptoglobine fixé. c) Préparation d'un latex avec un anticorps anti-ferritine fixé. 13 Un anticor Ds anti-ferritine (D AKO Co) a été dilué avec du PBS Jusqut'à une concentration de 1,2 mg/ml, et cet- te solution a été mise à réagir avec une suspension de la- tex de polystyrène à 10 %v ayant des groupes carboxyle in- corporés (diamètre particulaire moyen 0,25 À, Dow Chemical) de la même manière que dans a) ci-dessus pour obtenir un latex avec un anticorps anti-ferritine fixé. d) Production d'un réactif au latex avec anticorps fixés. Le latex avec un anticorps anti-fibrinogène fixé, le latex avec un anticorps anti-haptoglobine fixé et le latex avec un anticorps anti-ferritine fixé produits respec- tivement en a), b) et c) ci-dessus ont été mélangés dans un rapport de 2: 5: 1 pour obtenir un réactif au latex avec anticorps fixés. e) Dosage du fibrinogène, de lthaptoglobine et de la fer- ritine. Pl de chacune des solutions étalons de fibrino- gène, haptoglobine et ferritine produites dans -l',xemple 1 b) ont été placées sur une lame de verre, puis 50 '1 de PBS contenant 1 G de BSA et 20 pil du réactif au-latex avec anticorps fixés produit en d) ci-dessus ont été ajoutés à la slution étalon sur la lame de verre On a laissé ce mélan 9 e réagir en agitant pendant 3 minutes, et le degré d'ac 1 'utination a été observé au microscope La réaction ne présentant pas d'agglutination a été dite négative (-) et c 2 lle présentant une agglutination a été dite positive +: -+ ou +++ sel'n le degré d'agglutination) ce qui donne quatre degrés La sensibilité du réactif au fibrinogène, â l'khaptoglobine et à la ferritine était de 13 p 9/nl, 1,5 g/ml et O,1 Fg/ml respectivement. -t O Ek E MPLE 4 Dosages sur des échantillons de sérum de malades On a effectué des dosages utilisant le réactif pro- duit dans 1 'Exemple 3 sur des échantillons de sérum obte- nus ' partir de 15 malades souffrant d'un cancer du foie, de 20 malades souffrant d'un cancer de l'estomac, de 17 malades souffrant d'un cancer du gros intestin, de 12 ma- lades souffrant d'un cancer du poumon, de 25 malades souf- frant de maladies bénignes et de santé Les résultats sont donnés TABLEAU 2 personnes en dans le Tableau /',om de la maladieNombre de Jugement Rapport malades _+ ++ positif Cancer du foie 15 1 2 7 5 93 Cancer de l'estomac 20 3 4 & 5 85 Cancer du gros intestin 17 2 2 6 7 88 Cancer du poumon 12 1 2 6 3 92 V;aladies bénignes 25 20 4 1 O 20 -ummaans en bonne santé 20 19 1 C O 5 Comme on le voit dans céreux présentent un rapport le Tableau 2, les positif élevé, ce malades can- qui indique bonne 2. 2531223, l'utilité du procédé de dosage de la présente invention pour la détection des malades cancéreux. EXE Pi-LE 5 Production d'AFP purifiée et d'anticorps Anti-A Fv P 3 a) Production dtli FP purifiée 16 2 g d'extrait brut d'AFP ont été obtenus à par- tir de 5 1 des ascites de malades souffrant d'un cancer du foie par relargage au sulfate d'ammonium L'extrait brut a été purifié par chromatographie d'affinité en uti- lisant 50 ml de Sepharose 4 B avec de l'anticorps anti-AFP - de lapin lié ( 1 mg d'anticorps/ml de Sepharose) pour obte- nir 924 mg d'AFP purifiée. b) Production d'anticorps anti-AFP monoclonal pg d'AFP purifiée produite en a) ci-dessus ainsi 13 que de l'adjuvant complet de Freund (FCA) ont été adminis- trés par voie sous-cutanée à une souris BALB/c Les admi- nistrations ont été répétées quatre fois à une semaine d'intervalle, et quatre jours après la dernière adminis- tration, la rate a été isolée, et les cellules de la rate ont été recueillies Les cellules de la rate ont été la- vées avec du milieu 5 EM modifié de Dulbecco (désigné ci- après par D-ME), lxl O cellules ont été comptées et mé- langées avec 1 x 10 cellules myélomateuses de souris (P 3-NSI/l-Ag 4-1) Elles ont été soumises à une fusion cel- lulaire dans un ml de D-MEM contenant 42,5 de polyéthy- lene glycol 1540 et 7,5 % de diméthylsulfoxyde à 37 C pen- dant 1 minute On a ajouté à ces cellules du milieu HAT (milieu RPMI-1640 contenant de l'hypoxanthine, de l'amino- ptérine, de la thymidine et 10 % de sérum de foetus de bo- vin) jusqu'à un volume de 20 ml, puis le mélange de cellu- les a été réparti dans les puits d'une microplaque à 96 puits, à raison de 0,2 ml par puits, et cultivé pendant 2 semaines, après quoi l'activité de l'anticorps dans le sur- nageant de culture des puits o il y a eu prolifération a été mesurée. Ensuite, les cellules des puits présentant une ac tivité ont été recueillies et ajoutées à 40 ml de milieu RPMI-1640 contenant 10 %' de sérum de foetus de bovin et des cellules de thymus d'une souris BALB/C Cette suspen- sion de cellules a été répartie dans deux microplaques de 96 puits, et cultivée pendant une semaine pour obtenir 9 clones d'hybridome produisant un anticorps anti-AFP. Ils ont été transférés dans des cultures à grande échelle, et un litre de chaque surnageant de culture obtenu a été soumis à une chromatographie d'affinité utilisant 50 ml de Sépharose 4 B avec AFP purifiée liée ( 0,5 mg d'AFP/ml de Sepharose) pour obtenir respectivement de 4,2 à 11,6 mg d'anticorps monoclonaux Les anticorps respectifs ont été désignés par Lot N 1 9. c) Identification de sites de reconnaissance d'antigène i) Production de tubes à essai avec anticorps anti- AFP fixé. Des volumes de 1 ml de PBS contenant 0,5 mg de l'anticorps anti-Av P monoclonal Lot N 1 9 ont été res- pectivement ajoutés à des tubes à essai en polystyrène sé- oarés ayant été lavés avec du PBS, et chaque tube à essai a été incubé à 37 C pendant 3 heures pour faciliter la fixation de l'anticorps à la surface interne du tube à es- sai Après la réaction, les tubes à essai ont été lavés avec du PBS pour obtenir des tubes à essai avec anticorps monoclonal fixé. ii) Production de l'anticorps anti-AFP marqué avec une enzyme. mg de peroxydase de raifort (Behringer 1 an- heim Co, Qualité I; désigné ci-après par HRPO) ont été dissous dans 1,0 ml de tampon de bicarbonate de sodium 0,3 M, et à cette solution on a ajouté 0,1 ml de 1-fluoro- 2 4-dinitrobenzène à 1 %o dans de l'éthanol et le mélange a été mis à réagir pendant une heure Ensuite, 1,0 ml d'u- ne solution de periodate de sodium 0,06 M a été ajouté au mélange, la réaction a eu lieu pendant 30 minutes, puis on a ajouté 1,0 ml d'une solution d'éthylène glycol 0,16 hi, et on a laissé la réaction se poursuivre pendant une heure. Le mnélange réactionnel a été dialysé contre une solution de carbonate de sodium 0,01 M, p H 9,5 On a ajouté à cet- te solution de dialysat 5 mg de chacun des 9 lots d'anti- cords anti-i FP produits dans b) ci-dessus, et on a laissé chaque mélange réagir à température ambiante pendant 3 heures Puis, on a ajouté 5 mg de borohydrure de sodiun, et on a laissé la réaction se Poursuivre toute la nuit. Les mélanges réactionnels ont été respectivement dialysés contre du PBS 0, 01 N, p H 7,2 pour obtenir chaque anticorps anti-AFP marqué à l I'HPO. iii) Identification de sites de reconnaissance d'an- aine. A chacun des tubes à essai avec anticorps anti-A Fr P fixé produits en i) ci-dessus ont été ajoutés 0,1 ml de la solution étalon diluée avec du PBS de manière à contenir 100 ng/ml de 1 'A P produit en a) ci-dessus et 0,4 ml d'une dilution au centième de chaque anticorps anti- :P marqué à l'HRPO produit dans ii) ci-dessus, et chaque réaction a eu lieu pendant 30 minutes Lorsque la réaction a été terminée, chaque tube à essai a été lavé avec une solution de lavage, on a ajouté 0,5 ml d'une solution de substrat d'enzyme contenant 20 mg/dl de o-phénylènediamine et 6 m M de peroxyde d'hydrogène, et la réaction a eu lieu pendant 30 minutes, 2 ml d'acide chlorhydrique 1 N ont été ajoutés pour arrêter la réaction enzymatique, et l'absor- bance du mélange réactionnel à 492 nm a été mesurée Les résultats sont présentés dans le Tableau 3, les combinai- sons réalisant la réaction colorée étant notées + et celles ne la réalisant pas étant notées -. -20 TAl 3 LEAIJ 3 Anticorps marqué à 11 HRPO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 u 1 + + + + _ 4 + _ + + + 3 + + + + c 4 + + + + + + - H _ + + + 6 + + + + + ++ + O 7 + + + + 8 + + + + + + 9 + + + + + + - D'apres la différence dans les sites de reconnais- sance de l'antigène, les 9 lots des anticorps anti-AFP 1-5 1 monoclonaux ont été classés en 3 groupes, c'est-à-dire le premier groupe constitué des Lots N 1, 2, 3, 5 et 7, le deuxième grou De constitué du Lot N 6 et le troisième grou- pe constitué des Lots N 4, 8 et 9 Ces groupes ont été nommés anticorps anti-AFP (A), (B) et (C) respectivement. Parmi eux, (A) sera employé en tant qu'anticorps insolu- bilisé et (C) sera employé en tant qu'anticorps marqué dans les exemples suivants. EXE PLE 6 Production de CEA purifié et d'anticorps anti-CEA a) Production de CEA purifié. g de tissus cancéreux du gros-intestin ont été -hchés menu et, après addition de 100 ml d'eau distillée, homogénéisés dans un homogénéiseur On a ajouté à cette suspension le même volume d'acide perchlorique 1,2 M et le mélange a été extrait avec agitation pendant 30 minutes. Le surnageant centrifugé a été dialysé contre de l'eau dis- tillée pour obtenir un extrait brut de CEA. Cet extrait brut a été concentré jusqu'à 10 ml et soumis à une filtration sur gel en utilisant du Sepharose 4 B équilibré avec du sérum physiologique et la première úraction de protéine a été recueillie Puis, la fraction a été de nouveau soumise à une filtration sur gel en uti- lisant du Sephadex G-200 équilibré de la meme manière et la deuxième fraction de protéine a été recueillie, qui a été ensuite concentrée jusqu'à 2 ml pour obtenir 135 g de CZA purifié. b) Production d'anticorps anti-CEA monoclonal Huit clones d'un hybridome produisant un anticor Ds anti-CEA ont été obtenus à partir du CEA purifié produit dans a) ci-dessus par des modes opératoires analogues à ceux de l'Exemple 5 b) Pour immuniser les souris, on a utilisé à chaque administration 30 g du CEA purifié. 1 x A 10 cellules d'hybridome ont été inoculées par voie intranéritonéale à une souris BALB/c à laquelle on avait administré par voie intra Déritonéale 0,5 ml de pris- tane ( 2, 6, 10, 14-tétraméthylpentadécane; un produit de Wako Pure Chemicals, Co, Ltd) Deux semaines après, on a recueilli les ascites Chaque ascite a été soumis à une chromatographie sur DEAE-cellulose équilibrée avec un tam- pon au phosphate 0,01 M, p H 7,0, pour obtenir un anticorps anti-CEA monoclonal dans la fraction non adsorbée Comme résultat du test d'identification des sites de reconnais- sance de l'antigène selon l'Exemole 5 c) les anticorps respectifs ont été classés en trois groupes constitués cha- cun de 5 lots, 2 lots et 1 lot, qui ont été nommés respec- tivement anticorps anti-CEA (A), (B) et (C) Parmi eux, l'anticorps anti-CEA (A) sera utilisé comme anticorps inso- lubilisé et l'anticorps anti-CEA (B) sera utilisé comme anticorps marqué dans les exemples suivants. EX El' PLE ? Prénaration de HCG-E et d'anticorps anti-HCG-. a) Production d'une sous-unité de HCG-p Un gramme de HCG ( 2 000 UI/mg) a été dissous dans 2 ml de tampon au phosphate 0,025 M, p H 5,-6 et soumis à une chromatographie sur 3 9 de DE-_Sephadex-A-50 équili- bré avec le même tampon La fraction éluée avec du tampon au phosphate 0, 05 M, p H 5,6 a été recueillie et dialysée contre de l'eau distillée pour obtenir 308 g de HCG purifiée, qui a été ensuite lyophilisée 300 mg de HCG Durifiée ont été dissous dans 10 ml d'urée 10 M (OH 4,5) et la réaction a eu lieu a 40 C pendant une heure, suivie d'une chroma- tograohie utilisant 2 g de DAE-Se Dhadex A-50 équilibré avec une solution contenant de la glycine 0,03 M et de l'urée 'M La fraction éluée avec une solution contenant de la glycine 0,2 M, du Na Cl 1 M et de l'urée 8 M a été dialy- se contre du sérum physioloaique pour obtenir 147 mg de sous-unité de HCG-3. b) Production d'anticorps anti-HCG-3 Onze lots d'hybridomes produisant des anticorps anti-HCG-J 3 ont été obtenus à partir de la sous-unité HCG-3 produite en a) ci-dessus par des modes opératoires analo- gues à ceux de l'Exemple 5 b) L'identification des sites de reconnaissance de l'antigène a été faite sur les anti- corps obtenus à partir de ces lots, selon les modes opéra- toires de l'Exemple 5 c), ce qui a permis de les classer en 2 groupes comprenant respectivement 8 lots et 2 lots, et de les désigner respectivement par anticorps anti-I 4 CG (A) et anticorps anti-HCG-3 (B) L'anticorps anti-HCG-F (A) sera utilisé dans les exemples suivants comme anticorps insolu- bilisé et l'anticorps anti-HCG-3 comme anticorps marqué. Lorsque ces anticorps ont été examinés pour leurs réactions croisées avec l'hormone lutéinisante (LH) en utilisant la combinaison ci-dessus, la réactivité a été trouvée infé- rieure à i, la réactivité pour HCG étant prise pour 100 %. 3 N EXE-MIPLE 8 Dosage de la quantité totale de l AFP, CEA et HCG a) Production d'un réactif constitué d'un tube à essai avec anticorps fixé. A des tubes à essai en polystyrène on a ajouté 1 ml d'une solution contenant 0,1 mg/ml d'anticorps anti-AFP :ionoclonal, 0,5 mg/ml d'anticorps anti-CEA monoclonal et Q,25 mg/ml d'anticorps anti-HCG-n monoclonial produits res- pectivement dans les úxemples 5, 6 et 7, et chaque tube a essai a été incubé à 37 C pendant 3 heures Lorsque l'in- * cuoation a été terminée, chaque tube à essai a été lavé avec du P 13 S, pour obtenir les réactifs constituésdes tubes à es- sai avec anticorps fixés. b) Prédparation des solutions étalons 1 'AFP produit dans l'Exemple Sa), le CA produit dans l'Exemple 6 a) et l'HCG (HICG Mochida, Mochida Pharma- ceutical) ont été dilués avec du PBS contenant 1 % de BSA nour préparer des solutions de 80, 40, 20, 10, 5 et O ng/ml, , -0, 20, 10, 5 et O ng/ml et 80, 40, 20, 10, 5 et O miui/ml respectivement. c) Dosage de AFP, CEA et HCG Aux réactifs constitués des tubes à essai avec anti- corps fixés produits dans a) ci-dessus ont été ajoutés des Portions de 0, 1 ml des solutions étalons de AFP, CEA et HCG avec leurs concentrations respectives, suivi par l'addition de portions de 0,4 ml de PBS contenant 1 % de BSA, et cha- aue réaction a eu lieu à température ambiante pendant 2 heures Lorsque la réaction a été terminée, les tubes à es- sai ont été lavés avec de l'eau distillée Par ailleurs, les anticorps marqués à l'enzyme produits dans les Exem- ples 5, 6 et 7 ont été dilués et mélangés dans du PBS con- tenant 1 % de BSA pour obtenir une solution contenant une dilution au 1/2000 ème d'anticorps anti-AFP marqué à l'en- zyme, une dilution au 1/800 ème d'anticorps anti-CEA marqué pu A l'enzyme et une dilution au 1/500 ème de l'anticorps anti- HCG marqué à l'enzyme Des portions de 0,5 ml dudit mélange ont été ajoutés aux tubes à essai précédents, et chaque réaction a eu lieu à température ambiante pendant 2 heures. Lorsque la réaction a été terminée, les tubes à essai ont été lavés avec de l'eau distillée, on a ajouté des portions d'une solution de substrat ( 6 m M/1 de peroxyde d'hydrogène et 2 to m M/1 de o-ph nylnediamine dans du PBIS), et chaque réaction a eu lieu à température ambiante pendant 30 minu- tes à l'abri de la lumière Ensuite, 2 ml d'acide chlorhy- drique 1 N ont été ai-utés prur stopper la réaction, et l'absorbance du mélange réactionnel à été mesurée à une l 1-naueur d'nnde de 492 nm Des dosaaes ont également été effectués pour la cnomparaison, dans le cas o les anticorps marqués n'étaient pas mélanges mais mis à réagir séparément. Les résultats sont résumés aux figures I f 4 Les combinai- il sons de l'anticorps insolubilisé et de l'anticorps marqué utilisés dans les figures respectives sont présentées dans le Tableau 4. TABLEAU 4 D'après les résultats précédents, on peut voir que, puisque AFP, CEA et HCG ne présentent pas de réactions croisées les uns avec les autres, ils peuvent être dosés individuellement en utilisant les anticorps marqués res- pectifs même si ces substances sont présentes sous forme de mélange, et que même lorsque les anticorps marqués sont utilisés sous forme de mélange, seuls les antigènes et an- ticorps correspondants respectifs réagissent et cette réac- tivité n'est pas influencée par la présence d'autres subs- tances. Anticorps insolubilisé Anticorps marqué Anticorps anti-AFP, Fig 1 anticorps anti-CEA & Anticorps anti-AFP, anticorps anti-HCG en mélange anticorps anti-CEA & en mélange anticorps anti-HCG Fig 2 anticorps antiHCG Anticorps anti-AFP en mélange seul - Fig 3 Anticorps anti-CEA seul Fig 4 Anticorps anti-HCG seul EXEMPLE 9 Dosage sur des échantillons de sérum de malades Des échantillons de sérum pris chez 10 malades souf- frant d'un cancer du foie, 10 malades souffrant d'un can- cer de l'estomac, 10 malades souffrant dtun cancer du gros intestin, 10 malades souffrant de diverses maladies béni- gnes et 10 hpmains en bonne santé ont été dosés pour la quantité totale de AFP, CEA et HCG Chaque dosage a été effectué en utilisant 0,1 ml de solution étalon ou de sé- rum à tester par des modes opératoires analogues à ceux de l'Exemple 8 c) Les résultats sont exprimés en mesurant directement l'absorbance à 492 nm et aussi en valeur con- vertie en CEA, obtenue en appliquant ladite valeur de l'ab- sorbance à titre d'expérience à la courbe étalon du CEA. Pour comparaison, AFP, CEA et HCG ont été également mesu- rés individuellement sur les mêmes échantillons Les ré- sultats sont présentés dans le Tableau 5. 2551223 Il TABLEAU 5 Nom de l a Présente invention Référence maladie Absorbance Valeur convertie AFP CEA HCG 492 nm en ng/ml ng/ml mui/'ml CEA ng/ml 0,570 20,0 20,1 2,1 2,0 0,392 10,7 10,5 5,8 1,8 1,608 85,2 101,8 1,1 3,1 0,231 4,0 2 J 3 2,2 2,0 Cancer 3,205 147,5 158,7 0, 2,0 du foie 0,261 5,3 0,2 0,3 4,4 1,785 99,7 60,1 51,1 3,5 0,431 10,2 12,3 1,2 2,7 0,818 32,0 33,9 0,8 1,3 0,211 57,1 63,2 0,5 1,5 0,473 1-5,0 4,0 8,8 4,1 0,915 27,5 1,7 0,7 30,1 0,731 28,8 1,5 1,3 30,8 0,321 7,1 3,1 4,1 O,9 Cancer 0,492 19,8 1,1 1,7 21,1 de 0,501 16,8 1,0 17,2 0,8 l'estomac 0,481 18,1 16,3 0,3 4,1 0,336 8,1 4,4 1,1 3,1 0,270 5,1 1,0 2,2 3,7 03,260 4,7 2,0 1,0 4,0 TABLEAU 5 (suite) Nom de la Présente invention Réú rence maladie Absorbance Valeur 492 nmconvertie AFP CEA H{CG 492 'en ng/ml ng/ml mui/mil CEA ng/ml 0,788 4 Y 4 3,2 0,8 2,1 3,109 138,5 1,5 152,1 2,1 1,.121 50,3 4,0 50,5 3,3 0,228 3,8 1,0 2 8 0,9 Cancer 0,388 10,1 1,95 11,3 0,8 du gros 0401 $, 30 31 intestin 047148 12 1, 32 0,323 6,9 8,8 0,7 1,4 0,450 13,9 10,3 6,1 1,5 2,712 119,3 138,1 1,5 1,8 0,620 20 $ 9 2 V 521,8 2,0 0,231 4,0 1,3 0,3 3,0 0,219 3,8 1,3 0,2 1,9 0,320 6,9 3,1 3,2 2,22 0,301 6,0 2,1 3,1 2,5 Maladies 0,371 9,8 2,2 6,1 -1,1 bénignes0,333 8,5 2,5 1,8 3,5 0,261 4,9 0,8 2,1 3,3 0,321 7,1 2,9 292 2,2 0,271 S Pl 0,8 3,1 2,8 0,270 5,1 4,1 0,9 1,0 TABLEAU 5 (suite) Nom Présente invention Référence de la maladie Absorbance Valeur 492 nm convertie AFP CEA HCG en ng/ml ng/ml mui/ml CEA ng/ml 0,230 4,0 1,1 1,2 2,2 0,241 4,2 1,2 1,3 2,2 0,281 5,3 3,1 1,5 3,2 0,267 4,8 0,7 1,5 3,8 Humains 0,259 4,7 0,7 2,8 3,3 en bonne 0,268 4,8 2,0 2,1 2,0 santé 0,221 3,7 1,1 1,5 1,8 0,260 4,7 0,8 3,1 1,7 0,253 4,5 0,7 2,1 2,1 0,231 4,0 0,7 0,9 2,1 i, Le Tableau 6 de positivité chez ' ci-dessous présente -les les malades souffrant de pourcentage chaque maladie, obtenus dans les dosages d'un seul paramètre, lorsqu'on suppose que les valeurs étalons de diagnostic pour la pré- sence soupçonnée de cancer sont 10 ng/ml ou plus pour 1 'AFP, 5 ng/ml ou plus pour le CEA et 5 mui/ml ou plus pour 1 'HCG. Le tableau 6 présente également les pourcentages de positivité chez les malades souffrant de chaque maladie dans les dosages du Tableau 5 précédent, o, lorsque l'on dose la quantité totale des trois substances selon le pro- c 4 dé de la présente invention, l'absorbance à 492 nm de 0,350 ou plus ou la valeur convertie en CEA de 8,5 ng/ml ou plus sont regardées comme positives pour un cancer. TABLEAU 6 Nom de la Présente AFP CEA HCG Un ou plu- maladie invention sieurs marqueurs Cancer du foie 80 % 80 % 20 O % 80 % Cancer de l'estomac 60 10 20 30 60 Cancer du gros intestin 60 10 60 O 60 Maladies bénignes 10 O 10 O 10 Humains en bonne santé O O O O O De plus, lorsque les pourcentages de positivité chez les malades de chaque maladie sont calculés en suppo- sant qu'un malade est "positif pour un cancer" si au moins un des trois marqueurs de tumeurs dosés individuellement dépasse les valeurs étalons, ces pourcentages de positivité, qui sont également inclus dans la colonne de droite du Ta- bleau 6, étaient les m 9 mes que les pourcentages de'positi= vité pour le cancer dans le cas o les trois marqueurs de tumeurs étaient mesurés en quantité totale (deuxième co- lonne du Tableau 6) Ceci indique que lors d'un diagnostic de cancer, il n'est pas nécessaire de doser des marqueurs de tumeurs individuellement, mais, en pratique, un diag- nostic est possible à partir de la valeur mesurée de la quantité totale. -EXEMPLE 10 Dosage de la quantité totale de AFP, CEA et HCG a) Production d'un réactif constitué d'une perle de polys- tyrène avec anticorps fixé. L'anticorps anti-AFP monoclonal, l'anticorps anti- CEA monoclonal et l'anticorps anti-HCG monoclonal produits dans les Exemples 5, 6 et 7 respectivement, ont été dilués à des concentrations de 1,0, 0,8 et 0,5 mg/ml respective- ment Des perles de polystyrène (diamètre 2,5 mm) ont été trempées dans chaque solution, et chaque mélange a été mis à réagir à 37 OC pendant 3 heures Lorsque la réaction a été terminée, les perles ont été lavées avec du PBS pour préparer les réactifs constitués de perles de polys- tyrène avec anticorps fixé, chaque jeu de réactif étant constitué de 3 perles portant chacune des anticorps diffé- rents. b) Dosage de AFP, CEA et HCG On a ajouté à des tubes à essai (diamètre interne mm, longueur 60 mm) des portions de 0,1 ml des solutions étalons de AFP, CEA et HCG avec leurs concentrations res- pectives préparées dans lt Exemple 8 b'), puis on a ajouté des portions de 0,4 ml de solution de PBS contenant 1 % de BSA et un jeu de réactif constitué de trois différentes perles de polystyrène avec anticorps fixé produites en a) ci-dessus Après agitation, la réaction a eu lieu à température ambiante pendant 2 heures Lorsque la réaction a été terminée, lès perles de polystyrène ont été lavées avec de l'eau distillée Par ailleurs, les anticorps mar- qués à l'enzyme produits dans les Exemples 5, 6 et 7 ont été dilués et mélangés dans du PBS contenant 1 %o de BSA pour-obtenir une solution contenant une dilution au 1/2500 éme de l'anticorps anti-AFP marqué à l'enzyme, une dilution au 1/1000 ème de l'anticorps anti-CEA marqué à l'enzyme et une dilution au 1/650 ème de l'anticorps anti- HCG marqué à l'enzyme Des portions de 0,5 ml dudit mélan- ge ont été ajoutées aux perles précédentes, et chaque ré- action a eu lieu à température ambiante pendant 2 heures. Lorsque la réaction a été terminée, les perles de polysty- rène ont été lavées avec de l'eau distillée, on a ajouté des portions de 0,5 ml d'une solution de substrat ( 6 m M/l- de peroxyde d'hydrogène et 20 m M/1 de o-phénylènediamine dans du PBS), et chaque mélange a été mis à réagir à tem- pérature ambiante pendant 30 minutes à l'abri de la lu- mière Ensuite, on a ajouté 2 ml d'acide chlorhydrique 1 N pour stopper la réaction, et ltabsorbance a été mesurée à une longueur d'onde de 492 nm Pour la comparaison, des dosages ont également été effectués dans le cas o les an- 3 ticorps marqués n'étaient pas mélangés mais séparées Les résultats sont résumés aux Figures 5 8 o Les Combinaisons de l'anticorps insolubilisé et de l'anticorps marqué uti- lisés dans les figures respectives sont présentées dans le Tableau 7. TABLEAU 7 Anticorps insolubilisé Anticorps marqué Anticorps anti-AFP Fig 5 anticorps anti-CEA & Mélange de trois perles anticorps anti-HCG en mélange - Perle avec anticorps Anticorps anti-AFP Fig 6 anti-AFP fixé seul. perle avec anticorps anti-CEA fixé et perle avec anticorps anti-HCG fixé Fig 7 Anticorps anti-CEA seul Fig 8 Anticorps anti-HCG seul - D'après les résultats précédents, de la même maniè- re que dans l'Exemple 8, on peut voir que, puisque AFP, CEA et HCG neprésentent pas de réaction croisée les uns avec les autres, ils peuvent etre dosés individuellement en employant les anticorps marqués respectifs même si ces substances sont présentes sous forme de mélange, et que mê- me lorsque les anticorps marqués sont sous forme de mélan- ge, seuls les antigènes et anticorps correspondants res- pectifs réagissent et cette réactivité n'est pas influencée par la présence d'autres substances. EXEMPLE il Dosage sur des échantillons de sérum de malades Des échantillons de sérum provenant respectivement de 10 malades souffrant d'un cancer du foie, 10 malades souffrant d'un cancer de l'estomac, 10 malades souffrant d'un cancer du gros intestin, 10 malades souffrant de ma- ladies bénignes et 10 humains en bonne santé ont été dosés pour la quantité totale de AFP, CEA et HCG Chaque dosage a été fait en utilisant 0,1 ml de la solution étalon ou du sérum à tester par des modes opératoires analogues à ceux de l'Exemple 8 c) Les résultats sont exprimés par la me- sure directe de l'absorbance à 492 nm et également par la valeur convertie en CEA obtenue en appliquant ladite va- leur de l'absorbance à titre d'expérience à la courbe éta- lon CEA Pour la comparaison, AFP, CEA et HCG ont été éga- lement dosés individuellement sur les mêmes échantillons. Les résultats sont présentés dans le Tableau 8. TABLEAU 8 Nom de Présente invention Référence aladie Absorbance Valeur A CA HC maladie 492 nm convertie AF Pm ng/m mui en CEA n/in/imi ne/mi mil 1,55 80 320,5 9,6 1,2 1,55 80 173,6 3,0 1,4 0,221 5,6 4,0 0,6 1,4 1,186 58,1 57,3 0,3 3,0 Cancer 0,518 21,6 13,8 7,2 1,6 du foie 0,197 4,q 3 1,4 0,3 2,3 1,547 79,8 82,1 1,1 1,2 0,374 13,9 11,8 0,3 2,6 0,473 19,q 2 20,5 0,5 1,5 1,368 68,8 73,0 2,3 1,2 0,175 3,1 1,6 0,3 1,6 0,582 25,0 4,9 0,6 20,3 0,207 4,8 2,7 -1,4 1,2 0,313 10,6 3,3 7,2 1,8 Cancer de 0,481 19,6 5,2 0,3 15,9 l'estomac 0,475 19,3 17,1 0,7 2,2 0,238 6,5 1,1 2,4 1,3 0,207 4,8 2,3 1,1 1,-6 0,322 11,1 4,9 5,2 1,5 0,339 12,10 3,5 0,2 8,1 TABLEAU 8 (suite) Nom de la Présente invention Référence maladie Absorbance Valeur AFP CEA HCG 492 nm convertie ng/ml ng/ml mui/ml en CEA ___________ n g /m l_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 0 $ 582 25,0 13,0 12,2 1,4 0 $ 245 6,9 4,5 0,6 1,6 0,864 40,2 8,0 32,2 3,0 Cancer 0,785 35,9 1,6 35,0 1,1 du gros 0562,) 1, e intestin 051215461, 1, 0,249 7,1 1,2 4,0 2,0 0,192 4,0 1,5 1,3 1,7 0,269 8,2 7,0 0,4 1,1 0,339 12,0 2,6 5,9 -4 e 2 1,110 53,8 3,3 54,1 1,6 0,232 6,2 5,2 0,2 1,0 0,265 8,0 7,3 0,4 111 0,230 6,1 2,3 0,8 3,0 0,249 7,1 3,4 1,4 2,15 Maladies 0,177 3,2 1,7 0,3 1,9 bénignes 0,247 7,0 1,9 4,0 1,2 0,484 19,8 4,2 12,4 3,8 0,245 6,9 2,2 0,7 4,0 0,216 5,3 3,8 1,4 111 0,203 4,6 2,8 1,8 1,2 -TABLEAU 8 (suite) Le tableau 9 positivité chez des ci-dessous malades de présente les pourcentages de chaque maladie obtenus dans les dosages d'un seul paramètre lorsqu'on suppose que les valeurs étalons de diagnostic pour la présence soupçonnée de cancer sont 10 ng/ml ou plus pour 1 i AFP, 5 ng/ml ou plus pour le CEA et 5 mui/ml ou plus pour lt HC Go Le Tableau 9 présente également les pourcentages de positivité chez les malades de chaque maladie dans les dosages du Tableau 8 ci-dessus, dans lequel, lorsqu'on dose la quantité totale des trois dites substances selon la méthode de la présente invention, l'absorbance A 492 nm de 0,350 ou plus ou sa va- leur convertie en CEA de 8,5 ng/ml ou plus sont considérées comme "positives pour le cancer". Nom de Présente Invention Référence la maladie Absorbance Valeur AFP CEA HCG 492 nm convertie ng/m ng/ml mui/ en CEA ng/ml ng/ml mui/ml en CEA ng/ml 0,155 290 1,2 0,2 190 0,165 2,5 2,0 0,2 1,0 0,168 2,7 1,8 0,3 1,2 0,157 2,1 1,4 0,5 0,7 Humains 0,t 61 2,3 1,0 0,3 1,0 en 0,192 4,0 2,1 0,2 2,0 bonne O 0181 3,4 1,0 1,6 1,3 santé 0,155 2,0 0,8 0,3 1,0 0,157 2,1 0,8 0,4 1,4 0,155 2,0 0,6 093 1,4 10. TABLEAU 9 i I l I Nom de la Présente AFP CEA HCG Un ou plusieurs maladie inven marqueurs tion Cancer du foie 80 % 80 % 20 % O % 80 o Cancer de l'estomac 60 10 20 30 60 Cancer du gros intestin 60 10 60 O 60 Maladies b 6 nignes 10 O 10 O 10 Humains en bonne santé O O O O O De plus, lorsque les pourcentages de positivité chez les malades de chaque maladie sont calculés en suppo- sant que le malade est "positif pour le cancer" si au moins un des trois marqueurs de tumeurs dosés individuelle- ment dépasse les valeurs étalons, ces pourcentages de posi- tivité, qui sont aussi présentés dans le Tableau 9, étaient les mêmes que les pourcentages de positivité pour le cancer dans le cas o les trois marqueurs tumoraux 6 taient mesu- rés en quantité totale Ceci indique que lors d'un diagnos- tic de cancer, il neest pas nécessaire de doser les mar- queurs de tumeurs individuellement, mais, en principe, un diagnostic est possible a partir de la valeur mesurée de la quantité totale. *EXEMFLE 12 Dosage de la quantité totale de fibrinogène et SP 3 a) Production de réactif constitué de Sepharose 4 B avec anticorps fix 6 L'anticorps anti-fibrinogène (DAKO Co) et l'anti- corps anti-SP 3 (DAKO Co) ont été respectivement dilués avec du tampon au bicarbonate de sodium 0,1 M, p H 8,3 pour obtenir des concentrations de 5 et 3 mg/ml respectivement. On a ajouté à des portions de 5 ml des dilutions respecti- ves des portions de 5 ml de Sepharose 4 B activé au CN Br (Pharmacia Co) et la réaction a eu lieu à température am- biante pendant 2 heures Lorsque la réaction a été termi- née, le mélange réactionnel a été lavé avec du tampon à l'acétate 0,1 M contenant du chlorure de sodium 0,5 M, puis avec du PBS, ce qui a permis d'obtenir du Sepharose 4 B avec l'anticorps anti-fibrinogène fixé et du Sepharose avec l'anticorps anti-SP fixé Ils ont été mélangés dans un rapport 1: 1 pour produire un réactif constitué de Sepharose 4 B avec anticorps fixés. b) Préparation des solutions étalons de fibrinogène Du fibrinogène (Sigma Co) a été dilué avec du PBS contenant 1 % de BSA pour préparer des solutions étalons de 80, 40, 20, 10, 5 et O,g/ml respectivement. c) Préparation des solutions étalons de SP 3 Selon la méthode de Hans Bohn et al (Blut Band 33, 377-378, 1976), 5 kg de placenta ont été extraits avec du sérum physiologique, fractionnés en utilisant du Riva- nol et du sulfate d'ammonium, et purifiés par chromatogra- phie d'affinité en utilisant 50 ml de Sepharose 4 B avec anticorps antiSP 3 fixé ( 1 mg d'anticorps/ml de Sepharose) pour obtenir 3,7 mg de SP 3 purifiée Cette SP 3 purifiée a été diluée avec du PBS contenant 1 ode BSA pour prépa- rer des solutions étalons de 80, 40, 20, 10, 5 et O g/ml respectivement. d) Production d'anticorps anti-fibrinogène marqué à l'en- zyme et d'anticorps anti-SP marqué à l'enzyme L' anticorps antifibrinogène marqué à l'enzyme et l'anticorps anti-SP 3 marqué à l'enzyme ont été produits a partir de l'anticorps anti-fibrinogène et de l'anticorps anti-SP 3 par des modes opératoires analogues à ceux de l'Exemple 5 c) ii). e) Dosage du fibrinogène et de la SP P 3 On a ajouté à des tubes à essai séparés des portions de 0,1 ml des solutions étalons de fibrinogène et de SP 3 avec leurs concentrations respectives produites en b) et c) cidessus, suivi par les additions successives de por- tions de 0,4 ml de solution de PBS contenant 1 % de BSA et de portions de 0,2 ml du réactif constitué de Sepharose 4 B avec anticorps fixé produit en a) ci-dessus, et, après agitation, chaque réaction a eu lieu à température ambiante pendant une heure Après la réaction, les contenus des tu- bes à essai ont été centrifugés et lavés avec de l'eau dis- tillée Par ailleurs, l'anticorps anti-fibrinogène marqué a l'enzyme et l'anticorps anti-SP 3 marqué à l'enzyme pro- duit dans d) ci-dessus ont été mélangés et dilués pour con- tenir une dilution au 1/1500 ème de l'anticorps anti-fibri- nogène marqué à l'enzyme et une dilution au 1/10 Cènme de l'anticorps anti-SP 3 marqué à l'enzyme Des portions de 0,5 ml du mélange ont été ajoutés aux tubes à essai précé- dents, et le mélange de chaque tube à essai a été mis à réagir à température ambiante pendant une heure Lorsque la réaction a été terminée, les contenus des tubes à essai ont été centrifugés et lavés avec de l'eau distillée, et, après addition de portions de 0,5 ml d'une solution de substrat ( 6 m M/1 de peroxyde d'hydrogène et 20 m M/1 de o- phénylènediamine dans du PBS), chaque mélange a été mis à réagir à température ambiante pendant 30 minutes à l'abri de la lumière Ensuite, on a ajouté 2 ml d'acide chlorhy- drique 1 N pour arr 4 ter la réaction, et l'absorbance de la solution résultante a été mesurée à une longueur d'onde de 492 nm Les résultats sont présentés dans la figure 9. EXEMPLE 13 Dosage de la quantité totale de AFP, CEA et HCG a) Préparation des solutions étalons LAFP produit dans l'Exemple 5 a), le CEA produit dans l'Exemple 6 a) et 1 'HCG (HCG Mochida) ont été dilués avec du PBS contenant 1 % de BSA pour préparer des solu- tions de 80 ng/ml, 80 ng/ml et 80 mui/ml respectivement, et ces solutions ont été mélangées dans des proportions variées présentées dans le Tableau 10 pour préparer 5 différentes solutions mélangéeso TABLEAU 10 Numéro de la solution mélangée AFP CEA HCG 1 1 1 1 2 5 1 1 3 I 5 1 4 1 1 5 3 2 1 Chacune des solutions mélangées 1 5 ci-dessus a été diluée à la moitié, au quart et au huitième avec du PBS contenant 1 5 de BSA pour préparer les solutions éta- lons b) Dosage de AFP, CEA et HCG En utilisant des portions de 0,1 ml des solutions étalons produites en a) ci-dessus et les mélanges des trois différents anticorps marqués, on a effectué un dosage deu- ne manière analogue à celle-de 19 Exemple 8 c)0 Les courbes étalons respectives sont presentées dans la figure l Oo Même lorsque les solutions étalons contenant AFP, CEA et HCG en mélange ont été employées, on a obtenu des courbes étalons analogues à celles de la figure 1 Ceci indique que, même lorsque AFP, CEA et HCG sont présents en mélange, ils peuvent être dosés individuellement et par conséquent la valeur du dosage de leur quantité totale peut 9 tre obte- nue par le procédé de la présente invention. R E V E N D I C A T I O N S 1 Un procédé de dosage immunologique caractérisé en ce qu'on fait réagir un échantillon contenant deux ou plusieurs substances à doser avec deux ou plusieurs anti- corps ou antigènes insolubilisés simultanément et à doser lesdites substances en se basant sur une réaction immuno- logique se produisant entre lesdites substances et les deux ou plusieurs anticorps ou antigènes insolubilisés. 2 Procédé de dosage selon la revendication 1, ca- ractérisé en ce que les deux ou plusieurs anticorps ou antigènes insolubilisés sont fixés ensemble à un support insoluble. 3 Procédé de dosage selon la revendication 1, ca- ractérisé en ce que les deux ou plusieurs anticorps ou an- tigènes insolubilisés sont fixés respectivement à des sup- ports séparés. 4 Procédé de dosage selon la revendication 2, ca- ractérisé en ce que le-support insoluble est choisi parmi des globules rouges, un latex de polymère, du noir de car- bone et une surface interne d'un récipient de réaction. Procédé de dosage selon la revendication 3, caractérisé en ce que les supports insolubles sozit choisis parmi des globules rouges, un latex de polymère et du noir de carbone. 6 Procédé de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la réaction immunologique est une réaction d'agglutination ou une ré- action d'inhibition d'agglutination. 7 Procédé de dosage selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la méthode de dosage immunologique est un dosage immunoenzymatique, un dosage radioimmunologique ou un dosage par immunofluo- rescence. 8 Procédé de dosage selon la revendication 7, caractérisé en ce que la méthode de dosage immunologique est encore choisie parmi une méthode du sandwich, une mé- thode par réaction de compétition et une méthode immuno- métrique. 9 Procédé de dosage selon l'une quelconque des revendications, 1, 2, 3, 6, 7 et 8, caractérisé en ce que lesdits anticorps sont des anticorps de marqueurs de tu- meurs. Procédé de dosage selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 3, 6, 7, 8 et 9, caractérisé en ce que les anticorps sont des anticorps monoclonaux. 11 Un réactif de dosage immunologique conçu pour réagir avec un échantillon contenant deux ou plusieurs substances à doser par une réaction immunologique, carac- térisé en ce qu'il comprend un mélange de deux ou plusieurs anticorps insolubilisés ou antigènes insolubilisés* 12 Réactif de dosage selon la revendication 11, caractérisé en ce que les deux ou plusieurs anticorps in- solubilisés ou antigènes insolubilisés sont fixés ensemble à un support insoluble. 13 Réactif de dosage selon la revendication 11, caractérisé en ce que les deux ou plusieurs anticorps in- solubilisés ou antigènes insolubilisés sont fixés respec- tivement à des supports insolubles séparés. 14 Réactif de dosage selon la revendication 12, caractérisé en ce que le support insoluble est choisi parmi des globules rouges, un latex de poids moléculaire élevé, du noir de carbone et une surface interne d'un récipient de réaction. Réactif de dosage selon la revendication 13, caractérisé en ce que les véhicules insolubles sont choisis parmi: globules rouges, latex de polymère et noir de cars bone. 16 Réactif de dosage selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce qu'il est conçu pour réagir dans une réaction d'agglutination ou une réac- tion d'inhibition d'agglutination. 17 Réactif de dosage selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractéris 6 en ce qu'il est conçu pour réagir dans une m 6thode de dosage immunologique choi- sie parmi un dosage immunoenzymatique, un dosage radioim- munologique et un dosage par immunofluorescence. 18 Réactif de dosage selon la revendication 17, caractérisé en ce que ladite méthode de dosage immunologi- que est encore choisie parmi la méthode du sandwich, la méthode par réaction de compétition et la méthode immuno- métrique. 19 Réactif de dosage selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que lesdits anti- corps sont des anticorps de marqueurs de tumeurs. 20 Réactif de dosage selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que lesdits an- ticorps sont des anticorps monoclonaux.