FR 2513895 A1 19830408 FR 8216751 A 19821006 Substrat pour chromatographie liquide et procédé pour isoler et purifier une substance soluble dans la graisse par chromatographie liquide sur ce substrat. La présente invention est relative à un sub- strat de polymère réticulé utilisable pour réaliser une chromatographie en phase liquide et à unprocédé pour isoler et purifier une substance soluble dans la graisse par une chromatographie liquide, dans laquelle le polymère réticulé sert de substrat En particulier, l'invention concerne des particules polymères dures et sphériques, préparées par forte réticulation d'un polymère d'ester vinylique, acrylate ou méthacrylate, ces esters portant une longue chaîne laté- rale alcoyle, et un procédé pour isoler et purifier une sub- stance soluble dans la graisse, par exemple un ester d'al- coyle inférieur d'acide eicosapentaènoïque ou docosahexaènoï- que par la chromatographie liquide dans laquelle un substrat comprend les particules polymères. La chromatographie constitue l'une des méthodes les plus fondamentales en chimie pour réaliser l'isolement, la purification et l'analyse et elle est donc fréqoenment appliquée à de nombreuses substances variées Parmi les diverses sortes de chromatographies,la chromatographie liquide constitue une méthode excellente pour isoler et analyser des specimen à température normale et elle peut être convenablement appli- quée à une substance qui doit être traitée dans des condi- tions douces pour que ses propriétés soient conservées, com- me des substances d'origine naturelle et des substances bio- tiques. La chromatographie liquide est en gros subdivi- sée en fonction des modes d'isolement en chromatographie par échange d'ions, imprégnation, absorption et de partage Le procédé pour isoler et purifier conformément à la présente invention appartient à une chromatographie de partage à phase inverse La chromatographie de partage repose sur les différences existant entre la solubilité d'un specimen à isoler dans la phase stationnaire et dans la phase mobile et elle constitue l'une des méthodes d'extraction à étapes multiples. Jusqu'à maintenant, on connait deux types de substrats pour effectuer l'isolement et la purification de la substance soluble dans la graisse par chromatographie liquide de partage L'un d'entre eux est un gel de silice revêtu d'un composé comportant un ou plusieurs groupes alcoyle, et l'au- tre est également enduit, cependant, par des groupes lipcphiles tels que des groupes alcoyle liés chimiquement à des groupes silanol réactifs sur la surface du gel de silice Ces deux types de substrats ont leur phase stationnaire sur la surfa- ce du gel de silice support. Cependant, les substrats mentionnés ci-dessus conviennent pour réaliser l'isolement du specimen à purifier à l'échelle du laboratoire mais non pour effectuer cet isolement à une grande échelle industrielle, puisque leur phase stationnaire est limitée à la surface du support et qu'en conséquence, leur capacité de chargement du spécimen est trop petite pour être appliquée à l'isolement et la purification industrielle d'une grande quantité de specimen. De plus, dans le ty De de substrat dans lequel les groupes lipophiles tels que des groupes alcoyle sont fixés aux grou- pes silanol du support, quelques groupes silanol risquent de ne pas réagir avec les groupes lipophiles et ces groupes si- lanol n'ayant pas réagi adsorbent le spécimen à purifier. Il est donc nécessaire de disposer d'une phase mobile de forte polarité Dans un tel cas, on observe un inconvénient en ce que la phase mobile de haute polarité, par exemple l'eau, l'alcool et similaires, hydrolyse la liaison du sila- nol avec le groupe alcoyle, Si-O-R, dans laquelle R repré- sente le groupe alcoyle. A titre d'autre substrat pour réaliser l'isole- ment et la purification des substances solubles dans la graisse et appartenant à des types autres que ceux qui sont mentionnés plus haut, on connaît également des polymères poreux de polystyrène, d'acétate de polyvinyle, de métha- crylate de polyméthyle, etc Cependant, ainsi qu'on le cons- tate dans les exemples comparatifs ci-après, ces subs- trats ne sont pas satisfaisants pour réaliser l'isolement et la purification de composés aliphatiques à longue chaîne parce qu'ils manquent de longues chaînes latérales carbo- nées De plus, comme les polymères poreux exercent une forte influence sur la séparation du specimen à purifier pour la même raison, il doit être réalisé un examen préliminaire de leurs propriétés de séparation spécifiques pour chaque spe- cimen à purifier, tout en faisant attention à léluant uti- lisé avec ceux-ci De plus, dans ce cas, on observe un autre inconvénient en ce que les polymères poreux risquent d'etre gonflés par le solvant d'élution et les éluants utilisables sont alors fortement limités. On n'a donc pas encore trouvé un substrat sa- tisfaisant pour chromatographie liquide, qui offre une si forte aptitude à isoler avec une grande pureté et en des quantités industrielles, la substance fortement soluble dans la graisse et instable, en particulier des acides ali- phatiques à longue chaîne fortement insaturés, nar exemple un ester d'alcoyle inférieur d'acide éicoasa pentaenoique, EPA, et d'acide docosahexaendîque, DPRA Les esters alcoyliques inférieurs de EPA et DHA, dont on connaît l'activité pro- phylactique et thérapeutique vis-à-vis de la thrombose cé- rébrale et de l'infarctus du myocarde, sont fortement solu- bles dans la graisse et de plus instables, puisqu'ils ris- quent d'être affectés par la chaleur, la lumière, l'oxygène, etc, en raison de la présence de 5 à 6 doubles liaisons carbone-carbone de type cis dans leur molécule. La présente invention a pour objet de fournir un substrat satisfaisant pour la chromatographie liquide, qui offre une forte aptitude à isoler et à purifier une substance instable et soluble dans la graisse de façon industrielle en grande quantité Un autre objet de la pré- sente invention est de fournir un procédé pour isoler et purifier la substance instable et soluble dans la graisse en particulier des esters alcoyliques inférieurs de EPA et DHA Les autres objets de la présente invention découleront des descriptions ultérieures. Le substrat conforme à la présente invention et utilisable pour réaliser une chromatographie liquide, comprend des particules sphériques d'un polymère fortement réticulé qui est produit à partir de: (a) 100 parties en poids d'une unité monomère choisie dans le groupe formé par un monomère représenté par la formule générale (I) ou (II) ci-après CH 2 CH CH CX I (i) I I 1 OCOR COOR dans lesquelles R représente un groupe alcoyle contenant au moins 6 atomes de carbone et X est un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, et un mélange du monomère avec un como- nomère copolymérisable avec le monomère, (b) 10 à 80 parties en poids d'un agent de réticulation co- polymérisable avec le monomère et ayant au moins deux grou- pes fonctionnels. Le procédé pour isoler et purifier la substan- ce soluble dans la graisse et instable, conformement à la présente inven- tion est caractérisé par la mise en oeuvre du substrat indi- qué plus haut, pour réaliser une chromatographie liquide sur colonne. Comme les particules sphériques du substrat présentent fondamentalement le polymère vinylique avec une longue chaîne latérale carbonée, il est possible d'éluer les substances adsorbées de la colonne l'une après l'autre dans l'ordre de leur polarité (solubilité dans la graisse) sans que le polymère vinylique n'exerce d'influence, en particulier, il est possible d'isoler et de purifier les aci- des aliphatiques longue chaîne fortement insaturés et for- tement solublesdans la graisse et leurs dérivés Par exem- ple, ainsi que le montrent les exemples ci-après, il devient possible de purifier l'ester inférieur d'acide eicosapentaè- noique tel que l'éicosapentanoate de méthyle avec une pureté relativement importante, qui était auparavant considérée comme difficile à atteindre De plus, comme les particules sphériques du substrat conforme à la présente invention sont fortement réticulées, on peut utiliser divers solvants orga- niques à titre d'éluant De plus, comme la longue chaîne latérale est fixée au polymère vinylique par une liaison ester, le substrat conforme à la présente invention est très stable vis-à-vis de presque tous les solvants autres que les solvants alcalins forts. Le substrat conforme à la présente invention qui comprend un polymère vinylique fortement réticulé avec une longue chaîne latérale alcoylique, est également pourvu d'une forte capacité de chargement du specimen à purifier,. de même que les polymères poreux Le substrat est extrême- ment utile dans une chromatographie de partage à phase in- verse à l'échelle industrielle. La présente invention est décrite plus en dé- tails ci-après. Le substrat conforme à la présente invention comprend des particules de gel sphériques de structure for- tement réticulée, obtenues par la copolymérisation de (a) parties en poids d'une unité monomère contenant 10 à 100 % en poids d'un monomère représenté par la formule gé- nérale (I) ou (II) et 90 à O % en poids du comonomère co- polymérisable avec le monomère et (b) 10 à 80 parties en poids de l'agent de réticulation copolymérisable avec le monomère et, comportant au moins deux groupes fonctionnels Le substrat est ordinairement produit par copolymérisation en suspension. Dans l'ester vinylique représenté par la for- mule générale (I) et l'acrylate ou méthacrylate représenté par la formule générale (II), plus le nombre d'atomes de carbone dans le groupe alcoylique R est élevé, plus faible est l'interaction mutuelle entre la partie de liaison ester et le specimen et plus élevé est le caractère lipotrope du substrat En conséquence, le nombre d'atomes de carbone dans le groupe alcoyle de formule (I) ou (II) est d'au moins 6 et inférieur à environ 30 Le nombre d'atomes de carbone dans le groupe alcoyle peut être choisi dans cette gamme en fonction des propriétés spécifiques du specimen à isoler et à purifier et de celles de l'éluant. L'ester vinylique, l'acrylate et le méthacry- late peuvent être polymérisés en monopolymère, respective- ment, ou en copolymère l'un avec l'autre De tels esters sont par exemple l'octanoate de vinyle, le laurate de viny- le, le stéarate de vinyle, l'ester 2-éthylhexylique, dodé- cyclique et stéarylique d'acide acrylique et d'acide méthacrylique. En particulier, dans le cas o l'on purifie une substance soluble dans la graisse portant une longue chaîne carbonée, telle qu'un ester alcoylique inférieur de EPA ou DHA jusqu'à un fort degré de pureté, on préfère utiliser des esters al- coyliques portant une longue chaîne alcoylique et tout par- ticulièrement utiliser le monomère choisi dans le groupe formé par le stéarate de vinyle et le méthacrylate de stéa- ryle. Le copolymère copolymérisable avec l'ester vi- nylique, l'acrylate ou le méthacrylate peut être choisi sans limite particulière, cependant, ce ne doit pas être un mono- mère fortement hydrophile A titre de comonomère, on peut mettre en oeuvre des esters vinyliques, des acrylates et des méthacrylates ne comprenant pas plus de 5 atomes de carbone dans leurs groupes alcoyle et d'autres composés vinyliques tels que le styrène, le méthylstyrène, l'acrylo- nitrile, le chlorure de vinyle, le chlorure de vinylidène, l'isobutylène, etc et des composés diéniques tels que le butadiène, l'isoprène, le chloroprène, etc. La quantité d'ester vinylique, d'acrylate ou de méthacrylate à polymériser conformément à la présente invention est de 10 à 100 % en poids Avec une quantité in- férieure à 10 % en poids, comme le caractère lipotrope du polymère produit est insuffisant, le polymère résultant est moins capable d'isoler et de purifier l'ester d'acide ali- phatique à longue chaîne et l'isolement du specimen soluble dans la graisse ne se déroule pas bien. L'unité monomère peut être uniquement composée de l'ester vinylique, l'acrylate ou le méthacrylate repré- sentés par les formules (I) ou (II) Cependant, dans ce cas, comme l'éluant de forte polarité peut ralentir l'élution de la substance soluble dans la graisse adsorbée, cet éluant doit être choisi de façon appropriée. L'agent de réticulation conforme à la présente invention peut être l'un quelconque des agents de réticulation dans la mesure o il est copolymérisable avec le monomère mentionné ci-dessus et présente au moins deux groupes fonctionnels. Par exemple, on peut utiliser des composés multifonctionnels et insaturés, tels que par exemple des composés aromatiques polyalcényl-substitués tels que le divinylbenzène, le trivi- nylbenzéne, etc, des polyesters d'alcoor polyvalents avec des acides carboxyliques insaturés tels que le diméthacrylate de mono et de polyéthylèneglycol, le diméthacrylate de po- lypropylèneglycol, le triméthacrylate de triméthylolpropane, etc, des esters d'acide polycarboxyliques d'alcool insaturs tels que l'adipate de divinyle, le phtalate de diallyle, etc, des éthers de deux alcools insaturés tels que le divinyl- éther, le vinylallyléther, etc, et des esters d'acidesinsa- turés avec un alcool insaturé tels que l'acrylate de vinyle, etc. En particulier, les agents de réticulation re- présentés par les formules générales suivantes (III) et (IV) sont tout particulièrement préférés entre autres: O OR 1 Il I cc R C 3 Nt R-N N-R N N I i (III) R 2 1 il 3 (IV) N I I(Ill)v U=U R O -C / C-OR N N R Dans ces formules R 1, R 2 et R sont identiques ou différents et représentent chacun un groupe allyle, un groupe 2-propy- nyle ou un groupe 2-méthyl-2-propényle L'agent de réticu- lation représenté par les formules (III) ou (IV), qui est trifonctionnel et présente une structure à cycle triazine, manifeste non seulement une aptitude favorable à réaliser la réticulation, mais également offre un fort caractère li- potrope. La quantité d'agent de réticulation utilisée pour produire le polymère réticulé est très importante, parce que la propriété de gonflement du polymère réticulé résultant, provoqué par l'éluant, dépend fortement de l'im- portance du degré de réticulation Pour que le substrat conforme à la présente invention n'offre pas un grand chan- gement en fonction de la nature de l'éluant, la quantité d'agent de réticulation est de 10 à 80 parties enpoids pour parties en poids de la quantité d'unité monomère, et de préférence de 15 à 60 parties en poids En-dessous de parties en poids, le substrat présente un médiocre degré de réticulation D'un autre côté, au-delà de 80 parties en poids, le substrat est fragile, et de plus il est difficile d'obtenir le substrat offrant une forte capacité de charge- ment du specimen et le volume occupé par les groupes alcoy- liques à longue chaine dans le substrat polymère est rela- tivement réduit. Conformément à la présente invention, dans le procédé de production du polymère réticulé qui est utilisé comme substrat pour chromatographie liquide, il est préfé- rable d'ajouter un solvant organique au cours de l'étape de polymérisation. En ajoutant le solvant organique, le polymère réticulé obtenu devient poreux et offre une plus grande ca- pacité de chargement du specimen L'addition de solvants est donc particulièrement favorable pour réaliser l'isolement et la purification du specimen à l'échelle industrielle Le sol- vant ajouté ne doit pas être polymérisable et ne doit pas inhiber la réaction de polymérisation Le solvant qui est compatible avec le polymère constituant le substrat rend les pores de celui-ci relativement petits et le solvant qui n'est pas compatible avec le polymère constituant le substrat rend les pores de celui-ci relativement grands en raison d'une séparation de phase apparaissant pendant la polymérisation En général, plus le polymère est poreux et plus la dimension des pores est importante, et plus est grande la capacité de chargement du specimen offerte par le substrat Il est possible de contrôler la porosité et la dimension des pores du substrat en modifiant la quantité et la nature du solvant à ajouter en fonction de la substan- ce devant être isolée En général, le solvantorganique est uti- lisé en une quantité de 30 à 300 parties en poids, de préfé- rence de 30 à 250 parties en poids pour 100 parties en poids de l'unité monomère. Lorsque l'addition de solvant dépasse 300 par- ties en poids, on risque de réduire la polymérisabilité de l'unité monomère et le polymère réticulé obtenu offre une résistance insuffisante pour pouvoir être utilisé dans une opération d'isolement à grande vitesse. Pour obtenir le substrat conformément à la pré- sente invention, il est préférable d'effectuer une polyméri- sation radicalaire usuelle en suspension aqueuse, de façon à obtenir des particules sphériques du polymère réticulé. A titre d'agent de suspension, par exemple, on peut utili- ser un haut polymère soluble dans l'eau tel que l'alcool polyvinylique, la méthylcellulose, l'oxyde de polyéthylène, la polyvinylpyrrolidone, etc, et des poudres ou des granulés d'hydroxyapatite, de carbonate de calcium, de bentonite et de talc Différentes sortes d'agents tensio-actifs peuvent être mis en oeuvre avec l'agent de suspension afin de con- trôler le diamètre des particules polymères sphériques du substrat Le diamètre préféré des particules de polymère conformément à la présente invention est de 3 à 500 microns. A titre d'initiateur de la polymérisation radi- calaire, on utilise un initiateur soluble dans l'huile, par exemple un peroxyde organique tel qu'un peroxyde de diacyle comme le peroxyde de lauroyle, le peroxyde de benzoyle, le peroxyde d'acétyle, etc, un peroxyde d'alcoyle, par exemple le peroxyde de di-t-butyle, le peroxyde de dicumyle, etc, un peroxyester, par exemple le peroxybenzoate de t butyle, le peroxyacétate de t-butyle,le peroxyoctanoate de butyle etc, et un composé azoique tel que l'azobisisobutyronitrile, l'azobisisovaléronitrile. Les particules sphériques de polymère réticulé obtenues par la polymérisation radicalaire ci-dessus sont bien lavées à l'eau, à l'acide chlorhydrique ou dans un solvant organique tel que le méthanol, l'acétone, etc, puis elles sont séchées Le polymère réticulé ainsi obtenu est utilisé comme substrat pour réaliser une chromatographie liquide. Les substances solubles dans la graisse pouvant être isolées et nurifiées conformément à la présente inven- tion sont par exemple des substances insolubles dans l'eau avec une solubilité dans la graisse relativement importante, telles que par exemple des hydrocarbures aliphatiques satu- rés ou insaturés contenant une chaine carbonée relativement longue, des esters et alcools aliphatiques saturés ou insa- turés, des glycérides portant des groupes alcoyle saturés ? 513895 11 13 ou insaturés, des vitamines solubles dans la graisse telles que les vitamines A, D, E, etc, divers stéro:des et leurs dérivés, et des composés aromatiques, polycycliques aroma- tiques et hétérocycliques aromatiques ainsi que leurs dé- rivés. Ainsi qu'il a été décrit plus haut, le procédé pour effectuer l'isolement et la purification conformément à la présente invention est applicable aux substances solu- bles dans la graisse dans un sens large, et toutparticulièrement il convient pour réaliser l'isolement et la purification des substances présentant une forte solubilité dans la graisse telles que des esters d'alcoyle de EPA et DHA La substance à traiter conformément à la présente invention peut renfer- mer soit l'un des esters de EPA ou des esters de DHA ou les deux ensemble Les esters alcoyliques de EPA et DHA sont généralement contenus dans de l'huile de poisson et de l'huile de foie de morue, et leur teneur en ceuxci est généralement voisine de 10 % en poids Bien que l'huile de poisson et l'huile de foie de morue puissent en elles-mêmes être traitées selon le procédé d'isolement et de purifica- tion selon l'invention p o u r i S o le r 1 es esters al- coyliques, il est préférable de purifier d'abord l'huile pour qu'elle renferme l'ester d'alcoyle de EPA et/ou DHA avec une pureté de 60 à 80 % en poids, pour améliorer l'ef- ficacité de la purification par chromatographie effectuée conformément à la présente invention Cette purification préliminaire peut être réalisée par exemple au cours d'un procédé de fractionnement à l'aide d'urée et d'un procédé de distillation sous vide poussé qui sont bien connus, et facilement réalisés à l'échelle industrielle. La colonne utilisable dans le procédé selon l'invention n'est pas limitée, pour autant qu'elle soit utilisée dans une chromatographie liquide ordinaire, et des colonnes en verre ou en acier inoxydable ou en divers matériaux plastiques sont souvent employées sous forme d'un cylindre. Lorsqu'on exécute le procédé de purification conforme à la présente invention, on disperse généralement le substrat dans un solvant qui présente la même composi- tion que l'éluant ou offre une polarité légèrement supé- rieure à celle de l'éluant (à savoir le solvant dans lequel- le substrat gonfle moins que dans l'éluant), puis on verse la dispersion ainsi formée dans la colonne ou on l'envoie sous pression dans la colonne à l'aide d'une pompe, etc, après avoir éliminé les bulles de la dispersion par agita- tion On effectue favorablement le remplissage du substrat en remplaçant le solvant dans la colonne par l'éluant Comme le substrat conformément à la présente invention est résis- tant du point de vue mécanique, son aptitude à réaliser une sénaration n'est pas affectée par une compression dans la colonne par une pompe Après avoir ainsi rempli la colonne de substrat, on verse une solution de la substance soluble dans la graisse à purifier dans la colonne garnie, et lors- que la substance a été adsorbée de façon différentielle sur le substrat dans la colonne, on envoie sous pression l'élu- ant dans cette colonne par une pompe afin de réaliser l'iso- lement et la purification. A titre d'éluant, on utilise un solvant présen- tant une polarité convenable L'éluant peut être choisi en fonction de la nature et de la quantité des impuretés et de la substance soluble dans la graisse, la pureté, la vitesse d'élution du produit purifié et la quantité nécessaire d'é- luant Par exemple, dans le cas de l'isolement de linoléate de méthyle et de stéarate de méthyle à partir de leur mélan- ge, on emploie un mélange d'acétonitrile, de dichlorométhane et de tétrahydrofuranne; dans le cas d'un mélange de ben- zène et de p-xylène, on utilise un mélange d'acétonitrile et d'eau Pour réaliser l'isolement et la purification d'un ester d'acide gras insaturé portant une longue chaîne car- bonée, tel que EPA et DHA, on utilise à titre d'éluant un mélange comprenant 10 à 25 % en volume d'eau, 50 à 70 % en volume d'un alcool inférieur contenant 1 à 3 atomes de carbone, de préférence du méthanol et 10 à 40 % en volume d'un solvant choisi dans le groupe formé par le dioxanne, l'éther éthylique et le tétrahydrofuranne. Dans le cas de la purification d'un ester d'un acide gras insaturé à longue chaine carbonée, une teneur plus importante en eau dans l'éluant rend la vitesse d'élu- tion plus lente et la quantité nécessaire d'éluant plus im- portante, et d'un autre côté, une teneur supérieure en éther, dioxanne et tétrahydrofuranne dans l'éluant ne tend pas à élever la pureté du produit obtenu, bien qu'elle augmente la vitesse d'élution En conséquence, ainsi que cela a été éta- bli, il est nécessaire de choisir le rapport convenable de mélange de composants solvants pour chaque purification. L'éluat sortant de la colonne de chromatographie est soumis à un réfractomètre différentiel, un détecteur travaillant dans l'ultraviolet, etc, permettant la détection de la substance dans celui-ci, puis il est fractionné. La présente invention est davantage exnliquée à l'aide des exemples non limitatifs qui suivent. EXEMPLE 1. * Préparation d'un substrat conformément à la présente inven- tion. On soumet à une polymérisation en suspension dans l'eau 60 g de stéarate de vinyle (monomère), 12 g de cyanurate de triallyle (agent de réticulation) dans un mé- lange de solvants comprenant 20 g de n-octane et 40 g d'acé- tate d'éthyle, de l'oxyde de polyéthylène sert d'agent de suspension et du peroxyde de lauroyle sert d'initiateur; on travaille à 600 C, sous agitation, après avoir remplacé l'espace aérien du réacteur par de l'azote gazeux Après avoir effectué la polymérisation pendant 16 heures, le pro- duit de réaction est lavé avec du méthanol puis de l'acétone de façon à éliminer les solvants dans le produit de Darti- cules sphériques de gel polymère et à nouveau lavé à l'eau. Les particules ainsi lavées sont soumises à un criblage de façon à recueillir les particules tamisées dont le diamètre est dans la gamme de 53 à 250 micromètres, qui sont forte- ment réticulées de façon à ne pas se dissoudre du tout dans divers solvants organiques Après avoir remplacé l'eau dans les particules par du méthanol, les particules sont intro- duites à titre de substrat dans une colonne de verre de mm de diamètre. Chromatoaraphie liquide sur colonne utilisant le substrat ainsi préparé. Après avoir rempli la colonne avec les parti- cules ainsi préparées du substrat pour chromatographie li- quide, on remplace le méthanol en versant un éluant consis- tant en 80 % en poids d'acétonitrile, 10 % en poids de di- chlorométhane et 10 % en poids de tétrahydrofuranne dans la colonne garnie sur une hauteur de 205 mm. On verse dans la colonne ainsi préparée un mé- lange liquide de linoléatede méthyle et de stéarate de mé- thyle selon un rapport pondéral de 3:1, représentant 0,2 ml, comme spécimen à séparer, de façon à réaliser le développe- ment chromatographique à une vitesse d'éluant de 1,1 ml/min. L'éluat est ensuite soumis à un réfractomètre de diffraction de haute sensibilité (naom comercial SHODEX, Modèle RI-SE-12, fabriqué par SHOWA DENKO Co, Ltd, Japon) pour détecter la présence de substance dans celui-ci Le diagramme d'enregistrement ainsi obtenu d'indice de réfraction est représenté à la figure 1 Ainsi qu'on le constate dans la figure 1, le li- noléate de méthyle et le stéarate de méthyle sont complète- ment séparés l'un de l'autre, ce qui montre que le substrat préparé cidessus est extrêmement efficace pour séparer les esters d'acides gras à longue chaine carbonée. EXEMPLE COMPARATIF 1. Préparation d'un substrat selon un procédé classique. D'autres particules sphériques de gel polymère sont préparées selon le procédé décrit dans l'exemple 1 et dans les mêmes conditions, si ce n:est que de l'acétate de vinyle est utilisé à la place du stéarate de vinyle de l'exemple 1; on obtient ainsi un substrat pour chromato- graphie liquide. Chromatoaraphie liquide sur colonne utilisant le substrat. Après avoir soumis le substrat ainsi préparé au post-traitement décrit dans l'exemple 1, ce substrat est introduit dans une colonne de verre de 10 mm de diamètre, garnie sur une hauteur de 200 mm Le même mélange de lino- léate de méthyle et de stéarate de méthyle que dans l'exemple 1 est soumis à une chromatographie tandis qu'on utilise le même éluant à la même vitesse d'élution que dans l'exemple 1, puis à une vitesse inférieure de 0,82 ml/min. Les résultats obtenus montrent que les deux composants sont à peine séparés, même à la vitesse infé- rieure de l'éluant de 0,82 ml/min. Ces résultats obtenus dans l'exemple 1 et dans l'exemple comparatif 1 montrent que le substrat conforme à la présente invention est extrêmement efficace pour l'iso- lement et la purification du stéarate de méthyle ou du li- noléate de méthyle par chromatographie liquide. EXEMPLE 2. Préparation d'un substrat conformément à la présente inven- tion. On soumet à une polymérisation dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, 30 g de stéarate de vinyle (monomère), 30 g d'acétate de vinyle (comonomère), 12 g d'i- socyanurate de triallyle (agent de réticulation) et 40 g d'acétate d'éthyle comme solvant organique, pour obtenir des particules sphériques dures de gel polymère qui sont ensuite passées au crible pour fournir un support dont les particules ont un diamètre de 53 à 305 microns, après le meme post-traitement que celui qui est décrit dans l'exem- ple 1. Chromatoqraphie liquide sur colonne utilisant le substrat ainsi préparé. Après avoir remplacé l'eau dans le substrat ainsi préparé par du méthanol, le substrat est introduit dans une colonne de verre de 10 mm de diamètre sur une hau- teur de remplissage de 230 mm, et après avoir versé un élu- ant comprenant 60 % en poids d'acétonitrile et 40 % en poids d'eau dans la colonne, on introduit dans la colonne ainsi préparée 0,3 ml d'une solution à 2 % en poids d'un mélange de 1:1 en poids de benzène et de p-xylène, c'est-à- dire du specimen, dissous dans le mélange de solvant ayant la même composition que l'éluant Le développement de la colonne est effectué par introduction d'éluant à une vitesse de 1,78 ml/min, l'éluat étant soumis au même réfractomètre que celui qui est indiqué dans l'exemple 1 pour fournir le diagramme d'enregistrement de la courbe d'élution. Sur la courbe d'élution représentée par ce diagramme, les pics d'élution du benzène et du p-xylène apparaissent après 18 et 30 minutes, respectivement, à par- tir du commencement du développement. En versant dans la même colonne 0,3 ml d'une solution à 1 % en poids du 2méthyl-naphtalène dans l'éluant et en développant avec la même vitesse de l'éluant, le pic de la courbe d'élution apparait 47 minutes après le commen- cement du développement. Les résultats de l'exemple 2 montrent que le substrat préparé dans l'exemple 2 présente une élution cor- respondant pratiquement à sa propriété hydrophobe (à savoir le caractère lipotrope). EXEMPLE 3. Préparation d'un substrat conformément à la présente inven- tion. En suivant le procédé décrit dans l'exemple 1, on polymérise 30 g de stéarate de vinyle (monomère), 30 g d'acétate de vinyle (comonomère), 12 g d'isocyanurate de triallyle, 20 g de n-octane et 40 g d'acétate d'éthyle pour obtenir un substrat dur constitué de particules polymères sphériques Après avoir soumis le produit au même post- traitement que celui décrit dans l'exemple 1, le substrat ainsi obtenu est introduit dans une colonne de verre de mm de diamètre sur une hauteur de remplissage de 135 mm. Chromatoaramhie liquide sur colonne utilisant le substrat ainsi préparé. On effectue une chromatographie sur colonne selon le procédé de l'exemple 1 dans les conditions sui- vantes Specimen à séparer Une quantité de 0,6 ml d'une solution à 1 % en poids d'un mélange 1:1 en poids de benzène et de 2-méthyl- naphtalène dans un mélange de 60:40 en volume d'acétonitrile et d'eau (le même que l'éluant). Eluant: CH 3 CN/H 20 60/40 Vitesse de l'éluant 4,4 ml/min. La courbe d'élution est montrée dans la figure 2 Ainsi qu'on le constate dans la figure 2, le substrat préparé dans l'exemple 3 est extrêmement efficace pour iso- ler et purifier des substances aromatiques. EXEMPLE 4. En suivant la technique de polymérisation dé- crite dans l'exemple 1, on soumet à une polymérisation 60 g de méthacrylate de stéaryle (monomère), 12 g de diméthacry- late d'éthylène-glycol, 20 g de n-octane et 40 g d'acétate d'éthyle Le produit est tamisé pour fournir un substrat composé de particules sphériques dures dont le diamètre est dans la gamme de 53 à 350 microns. Après avoir remplacé l'eau dans le substrat par du méthanol, ce substrat est introduit dans une colonne de verre de 10 mm de diamètre sur une hauteur de remplissage de 207 mm Un mélange de linoléate de méthyle et de stéarate de méthyle est soumis à une séparation dans cette colonne avec un éluant composé par un mélange de 80:10:10 en volume d'acétonitrile, de dichlorométhane et de tétrahydrofuranne, avec une vitesse de 1,0 ml/min. Les résultats montrent que les pics d'élution du linoléatede méthyle et du stéarate de méthyle apparais- sent sur la courbe d'élution après 19 et 38 minutes, respec- tivement, après le commencement du développement Les deux composants peuvent tout à fait bien être séparés l'un de l'autre Les résultats montrent que le substrat préparé dans l'exemple 4 conformément à la présente invention est efficace pour séparer un mélange d'esters d'acides gras à longue chaîne en ses composants respectifs. EXEMPLE 5. En suivant le procédé de polymérisation décrit dans l'exemple 1, on soumet à une polymérisation dans une suspension aqueuse 60 g d'acrylate de 2-éthylhexyle (mono- mère), 12 g de diméthacrylate d'éthylène glycol, et 60 g d'acétate d'éthyle; on obtient un substrat pour chromato- graphie liquide composé de particules de polymère sphé- riques très dures. Parmi ces particules, on introduit dans une colonne de verre de 10 mm de diamètre sur une hauteur de remplissage de 200 mm, celles dont le diamètre est dans la gamme de 53 à 250 microns En utilisant un éluant compre- nant 60 % en poids d'acétonitrile et 40 % en poids d'eau, avec une vitesse de 1,4 ml/min, on effectue la séparation d'un mélange 1:1 en poids de benzène et d'acénaphtylène (sous forme de 0,3 ml d'une solution à 1 % en poids dans l'éluant) La courbe d'élution ainsi obtenue est représen- tée dans la figure 3. Ainsi qu'on le constate dans la figure 3, le substrat préparé dans l'exemple 5 est efficace pour réali- ser la séparation d'un mélange de composés aromatiques so- lubles dans la graisse. EXEMPLE 6. D'une façon analogue à celle décrite dans l'e- xemple 1, on effectue une polymérisation en suspension aqueu- se de 30 g de méthacrylate de stéaryle (monomère), 30 g de méthacrylate de méthyle (comonomère), 12 g de diméthacrylate d'éthylène-glycol, 40 g d'acétate d'éthyle et 20 g de n-oc- tane pour obtenir des Particules de polymère sphériques ayant un diamètre dans la gamme allant de 53 à 350 microns. On introduit les particules à titre de substrat dans une colonne de verre de 10 mm de diamètre sur une hau- teur de remplissage de 219 mm, puis en utilisant un éluant composé d'un mélange de 60:40 en poids d'acétonitrile et d'eau à une vitesse de 1,8 ml/min, on soumet à une chromato- graphie liquide une quantité de 0,3 ml d'un mélange 1:1 en poids de benzène et de 2-méthylnaphtalène dissous dans 1 % en poids de l'éluant. Dans la courbe d'élution ainsi obtenue, on constate que les pics d'élution du benzène et du 2-méthyl- naphtalène apparaissent respectivement 18,5 et 48 minutes après le début du développement, ce qui montre que l'on a obtenu une séparation pratiquement complète des composants l'un de l'autre. EXEMPLE 7. D'une façon analogue à ce qui est décrit dans l'exemple 1, on effectue une polymérisation dans un système de suspension aqueuse de 60 g de méthacrylate de n-dodécyle (monomère), 24 g de diméthacrylate d'éthylèneglycol et 30 g d'acétate d'éthyle pour obtenir un substrat composé de par- ticules polymères sphériques dures Parmi ces particules ainsi obtenues, on introduit celles dont le diamètre est dans la gamme de 53 à 250 microns dans une colonne de 10 mm- de diamètre sur une hauteur de remplissage de 193 mm, puis op effectue la séparation d'une quantité de 0,3 ml d'un mé- lange 1:1 en poids de nitrobenzène et de 2-méthylnaphtalène dissous dans un éluant com Dosé d'un mélange 60:25:15 en vo- lume de méthanol, de tétrahydrofuranne et d'eau, avec une vitesse de l'éluant de 1,7 ml/min La courbe d'élution ainsi obtenue est représentée dans la figure 4. Ainsi qu'on le constate dans la figure 4, la vitesse d'élution dans la colonne garnie de substrat pré- paré dans l'exemple 7 est plutôt importante, et néanmoins, le substrat joue suffisamment le rôle de substrat pour la chromatogra Dhie liquide. EXEMPLE 8. En suivant le Drocédé décrit dans l'exemple 1, et utilisant 30 g de stéarate de vinyle (monomère), 30 g d'acétate de vinyle (comonomère), 12 g d'isocyanurate de triallyle (agent de réticulation) et 20 g de n-octane et g d'acétate d'éthyle (solvants organiques) et en effec- tuant le même post-traitement que celui décrit dans l'exem- ple 1, on prépare des particules sphériques de polymère ré- ticulé dont le diamètre est dans la gamme de 53 à 250 mi- crons On introduit 500 ml de particules ainsi préparées dans 1000 ml de méthanol tout en agitant, puis on verse le mélange dans une colonne cylindrique de chromatographie, ayant un diamètre de 4 cm et 30 cm de hauteur de façon à remplir cette colonne Après avoir remplacé le solvant dans la colonne par 1,5 litre d'un éluant composé d'un mélange de 60:25:15 en volume de méthanol, de tétrahydrofuranne et d'eau, on verse dans la colonne pour y être adsorbé de fa- çon différentielle 5 g d'ester méthylique de EPA (pureté de 81,5 %) obtenu var estérification d'huile de sardine conformément i un nrocédé d'estérification classique suivie par une purification nar urée et une distillation frac- tionnée, ouis dissous dans 500 ml de l'éluant; puis on dévelooppe la colonne en versant l'éluant dans celle-ci avec une vitesse de 20 ml/min L'éluat est soumis au réfracto- mètre différentiel de haute sensibilité décrit dans l'exem- Dle 1 pour obtenir un diagramme d'enregistrement représenté dans la figure 5 De plus, l'éluat provenant de la colonne est analysé tous les 200 ml par chromatographie en phase gazeuse pour examiner la pureté de l'eicosa Dentaènoate de méthyle, et les fractions présentant une pureté en éicosa- pentaènoate de méthyle supérieure à 98 % (représentées par une ligne pointillée dans la figure 5) sont recueillies et constituent un volume de 800 ml Les fractions ainsi ras- semblées sont soumises à une distillation sous vide Dour chasser le solvant et le résidu est séché à 20 à 40 C sous vide pour fournir 2,5 g d'un liquide incolore dont la pureté est de 98,4 % en éicosapentaènoate de méthyle, avec un rendement de ,4 % Les conditions de la chromatographie en phase gazeu- se indiquée plus haut sont les suivantes: Colonne: 2 m de longueur et 3 mm de diamètre intérieur, colonne en verre ganie de 10 % de DEGS de 0,177 à 0,250 mm avec HP Uniport (fabriqué par Gaschro Industry Co, Ltd, Japon), travaillant à 2000 C avec un gaz support d'hélium, muni d'un détecteur de type FID. EXEMPLE 9. On dissout 4 g de docosahexaènoate impur (pureté de 77 %) obtenu selon le procédé de méthyle décrit dans l'exemple 8 à partir d'huile de foie de morue, dans 500 ml d'un mélange de 60:25:15 en volume de méthanol, de dioxanne et d'eau, puis on soumet la solution ainsi préparée à une chromatographie liquide sur colonne tout en utilisant le même substrat que celui préparé dans l'exemple 8 et un éluant décrit dans l'exemple 8, avec une vitesse de 20 ml/ min En traitant l'éluat de la façon décrite dans l'exemple 8, on obtient le résultat représenté dans la figure 6 Les fractions dont la pureté est de 98 % (telles qu'illustrées par la ligne en pointillés dans la figure 6) sont rassem- blées En traitant les fractions réunies ( 600 ml) selon le procédé décrit dans l'exemple 8, on recueille 1,4 g de li- quide incolore ayant une pureté de 98,1 % en docosahexaènoa- te de méthyle, avec un rendement de 44,5 %. EXEMPLE 10. On dissout 5 g dlun mélange d'estersméthyliques contenant 40 % en poids d'éicosapentaènoate de méthyle et % en poids de docosahexaènoate de méthyle obtenus par estérification d'huile de sardine selon un procédé ordi- naire suivie d'une étape de fractionnement avec de l'urée, dans 500 ml d'un mélange à 65:15:20 en volume de méthanol, d'éther éthylique et d'eau, et on soumet la solution à une purification par chromatographie de partage en utilisant le irme substrat dans la colonne de l'exemple 8 avec l'éluant de l'exemple 8 à une vitesse de 20 ml/min L'éluat est ana- lysé tous les 200 ml par chromatographie en phase gazeuse. Les résultats obtenus sont représentés dans la figure 7. Les parties A et B montrées par les courbes en pointillés dans la figure 7 sont respectivement traites selon le pro- cédé décrit dans l'exemple 8 Par ces traitements, on ob- tient 1,4 g de liquide transparent incolore à partir de A, et 0,6 g de liquide transparent incolore à partir de B. Conformément aux analyses chromatographiques en phase ga- zeuse, A correspond à l'icosapentaènoate de méthyle à la pureté de 89,3 % avec un rendement de 59 %, et B correspond au docosahexaènoate de méthyle à la pureté de 80 % avec un rendement de 48 % déterminé par calcul. EXE 4 PLE 11. On dissout 3 g d'éicosapentaënoate de méthyle à la pureté de 81,5 % obtenu par estérification d'huile de sardine selon un procédé ordinaire, suivie d'un fractionne- ment avec de l'urée et d'une distillation fractionnée, dans 300 ml d'un mélange de 60:25:15 en volume de méthanol, de tétrahydrofuranne et d'eau On soumet ensuite la solution ainsi préparée à une séparation et une purification en la versant dans une colonne chromatographique de 4 cm de diamètre et cm de hauteur, garnie avec 500 ml du substrat préparé selon le procédé décrit dans l'exemple 7 La colonne est dévelonoppee par un éluant qui a la même composition que le solvant de l'éicosapentaènoate de méthyle à traiter La cour- be d'élution est montrée dans la figure 8. De la façon indiquée dans l'exemple 8, l'éluat correspondant à la ligne en pointillés dans la figure 8 re- présente 600 ml que l'on soumet à une distillation sous vide et on sèche le résidu sous vide pour obtenir 1,1 g d'un li- quide incolore et transparent; on constate que celui con- tient 95,2 % en poids d'éicosapentaènoate de méthyle corres- pondant à un rendement de 42,8 %. REVENDICATIONS 1 Substrat pour chromatographie liquide, ca- ractérisé en ce qu'il comprend des particules sphériques de polymère fortement réticulé qui est produit à partir de: (a) 100 parties en poids d'une unité monomère choisie dans le groupe formé par un monomère représenté par la formule générale (I) ou (II) CH 2 CH CH 2 CX 1 (I) 1 (II) OCOR COOR dans lesquelles R représente un groupe alcoyle contenant au moins 6 atomes de carbone et X est un atome d'hydrogène ou un aroune méthyle, et un mélange d'un tel monomère avec un comonomère comolymérisable avec ce monomère, (b) 10 à 80 parties en poids d'un agent de ré- ticulation copolymérisable avec ce monomère et ayant au moins deux groupes fonctionnels. 2 Substrat selon la revendication 1, caracté- risé en ce que le diamètre d es particules sphériques est dans la gamme de 3 à 500 microns. 3 Substrat selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le monomère est du stéarate de vinyle ou du méthacrylate de stéaryle. 4 Substrat selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'agent de réticulation est tri- fonctionnel e t e S t représenté par la formule générale (III) ou (IV): O OR 1 Il I CC 1 N R_-N/ N-R C N l I (III) 2 1 il 3 (IV) O=CC=O R O-C, /C-OR 3 N N R 2 dans lesquelles R, R et R sont identiques ou différents et sont choisis dans le groupe formé par lesgroupesallyle, 2-propynyle et 2-méthyl-2-propényle. Substrat selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est poreux. 6 Procédé pour isoler et purifier une substan- ce soluble dans la graisse, caractériséen oe qu'on en effec- tue une chromatographie liquide sur un substrat selon l'une des revendications 1 à 5. 7 Procédé selon la revendication 6, caracté- risé en ce que la substance soluble dans la graisse est un ester d'alcoyle inférieur, d'acide éicosapentaènolque ou d'acide docosahexaènoique.