FR 2513126 A1 19830325 FR 8214595 A 19820825 FORMULATIONS PHARMACEUTIQUES COMPRENANT DE L'INSULINE HUMAINE ET DU C PEPTIDE HUMAIN. Le diabète sucré est un trouble métabolique caractérisé par le fait que les tissus du corps ne parviennent pas à oxyder les carbohydrates au régime normal Son facteur le plus important est une défi- cience en insul ine Au cours dles 60 dernières années, les personnes souffrant du diabète ont été considéra- blement aidées en recevant des quantités réglées d'in- sulirne Actuellement, l'insuline utilisée par les diabétiques a été isolée du pancréas des animaux, généralement des bovidés et des porcs L'insuline des bovidés et des porcs a une structure différente de celle de 1 iinsuline produite par le pancréas humain. Récemment, par la méthodologie de 1 l ADN (ADN = acide désoxyribonucléique) recombinant, il est devenu pos- sible (le préparer (le L insuline identique à celle produite par le pancréas humain L'utilisation de cette insuline permettra: au diabétique, d'imiter le système naturel plus étroitement que ce nt'était pos- sible jusqu'à présent. o; Néannmoins, il est admis depuis l ongtleîips que la seule administration d'insuline à un diabétique est insuffisante pour rétablir et/oul maintenizr l'état métabolique normal Bien que l'insuline manifeste son effet sur Je métabolisme des carbohydrates, le diabète sucré provoque des troubles supplémentaires dont la plupart, sinon tous, sont en relation avec la structure et la fonction des vaisseaux sanguins Les déficiences conduisant à ces troubles sont rarement corrigées com- plètement par la thérapie classique à l'insuline. Les anomalies vasculaires associées au dia- bète sont souvent appelées "complications du diabète". Elles consistent généralement en changements micro- angiopathiques donnant lieu à des lésions de la rétine et des reins La neuropathie représente une complica- tion diabétique supplémentaire qui peut être en rela- 13126 tion ou non, directement ou indirectement, avec les changements microangiopathiques précités Parmi les manifestations spécifiques des complications du dia- bète, il y a, par exemple: ( 1) les maladies de l'oeil, notamment la rétinopathie, la formation de la cataracte, le glaucome et les paralysies musculaires extra-oculai- res; ( 2) les maladies de la bouche, notamment la gingivite, lapparition accrue de caries dentaires, la périodontite et une plus forte résorption de l'os alvéolaire; ( 3) les neuropathies motrice, sensorielle et autonome; ( 4) la maladie des grands vaisseaux; ( 5) la micro-angiopathie; ( 6) des maladies de la peau, notamment le xanthome du diabète sucré, la nécro- biose lipoidique du diabète sucré, la furonculose, la- mycose et le prurit; ( 7) des maladies des reins, notamment la glomérulosclérose diabétique, la néphro- sclérose artériolaire et la pyélonéphrite; et ( 8) des problèmes au cours de la grossesse, notamment un accroissement des naissances de gros bébés, des mises au monde d'enfants morts-nés, des fausses couches, des mortalités néo-natales et des défauts congénitaux. Bon nombre et peut-être la totalité des complications diabétiques résultent du fait qu'à elle seule, l'insuline ne parvient pas à ramener le corps à son équilibre hormonal naturel. La présente invention concerne des composi- tions pharmaceutiques permettant d'atteindre et de maintenir, chez un sujet diabétique, un état plus proche de lihoméostase hormonale naturelle que celui pouvant être obtenu par l'administration d'insuline seule. Dès lors, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant, en association avec un support pharmaceutiquement acceptable, de l'in- suline humaine et du C-peptide humain dans un rapport molaire (insuline humaine/C-peptide humain) se situant entre environ 1:4 et environ 4:1. Les deux constituants essentiels des composi- tions pharmaceutiques de la présente invention sont l'insuline humaine et le C-peptide humain. L'insuline humaine peut être obtenue de diverses manières, notamment par synthèse organique, par isolation du pancréas humain, par transformation de pro-insuline, par transformation d'insuline animale isolée et, plus récemment, par la méthodologie à l'aci- de désoxyribonucléique recombinant. En adoptant la méthodologie à l'acide désoxy- ribonucléique recombinant, on peut préparer l'insuline humaine par l'expression et l'isolation séparées de la chaîne A et de la chaîne B de l'insuline humaine en formant ensuite leurs liaisons disulfure correctes. En variante, le produit d'expression de l'acide désoxy- ribonucléique recombinant peut être la pro-insuline humaine elle-même ou un précurseur de pro-insuline humaine qui est transformé en pro-insuline humaine. La pro-insuline est ensuite clivée par voie enzymatique, par exemple, en utilisant la trypsine et la carboxy- peptidase B pour obtenir l'insuline humaine. L'insuline humaine peut également être pré- parée à partir de l'insuline de porcs L'insuline humaine se différencie de l'insuline de porcs par un seul acide aminé, c'est-à-dire l'acide carboxy-amino terminal de la chaîne B L'alanine, c'est-à-dire l'acide aminé B-30 de l'insuline de porcs, est clivée et remplacée par la thréonine A cet égard, on se référera, par exemple, au brevet des Etats-Unis d'Amé- rique no 3 276 961. L'autre constituant actif de la composition de la présente invention, à savoir le C-peptide humain, est une portion d'un peptide présent dans la pro-insu- Uine humaine et auquel les chaînes A et B de 1 'insuline sont réunies Ce peptide appelé "peptide de liaison" est éliminé au cours de la production d'insuline hu- maine à partir de pro-insuline Le peptide de liaison présent dans la proinsuline humaine répond à la for- mule suivante: Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Va 1-Glu- Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu- Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg. Le C-peptide humain présent dans la composi- tion de la présente invention se différencie du peptide de liaison par l'élimination de quatre acides aminés, à savoir deux à chaque extrémité Dès lors, le C-pep- tide humain a la structure suivante: Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly- Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu- Glu-Gly-Ser-Leu-Gln. Le C-peptide humain qui est un constituant de la composition de la présente invention, peut être obtenu par synthèse chimique rvoir,p ex,N Yanaiharaet C. Yanaihara, M Sakagami, N Sakura, T Hashimoto et T. Nishida, "Diabetes" 27 (supplément 1), 149-160 ( 1978)l ou à partir de pro-insuline humaine suite à son cliva- ge pour obtenir l'insuline humaine. En conséquence, comme on l'a indiqué, les constituants actifs de la composition de la présente invention peuvent être obtenus de diverses manières, y compris par la pro-insuline humaine Dans ses gran- des lignes, la production d'insuline en adoptant la méthodologie à l'acide désoxyribonucléique recombi- nant consiste à obtenir, par isolation et/ou par cons- truction, une séquence de codage d'acide désoxyribo- nucléique pour la séquence des acides aminés de la pro- insuline humaine On introduit ensuite l'acide désoxy- ribonucléique de pro-insuline humaine en phase de lec- ture dans wun véhicule approprié de clonage et d' expres- sion Le véhicule est utilisé pour transformer un micro-organisme approprié, après quoi le micro-orga- nisme transformé est soumis à des conditions de fermen- tation conduisant à: (a) la production de copies sup- plémentaires du vecteur contenant le gène de pro- insuline et (b) l'expression de la pro-insuline ou un produit précurseur de la pro-insuline. Si le produit d'expression est un précurseur de pro-insuline, il comprendra généralement la séquen- ce des acides aminés de la pro-insuline humaine réunie, à sa terminaison amino, à un fragment d'une protéine normalement exprimée dans la séquence de gènes dans laquelle le gène de pro-insuline a été introduit La séquence d'acides aminés de la pro-insuline est réunie au fragment de protéine par l'intermédiaire d'un siège spécifiquement clivable, notamment la méthionine Ce produit est habituellement appelé "produit génétique fusionné". g O La séquence des acides aminés de la pro- insuline est clivée du produit génétique fusionné en utilisant du bromure de cyanogène, après quoi les fractions sulfhydryle de la cystéine de la séquence des acides aminés de la pro-insuline sont stabilisées par transformation en leurs S-sulfonates correspon- dants. On purifie le S-sulfonate de pro-insuline obtenu, puis on transforme le S-sulfonate de pro- insuline purifié en pro-insuline par formation des trois liaisons disulfure correctement localisées. Lors de la purification de la pro-insuline, celle-ci est clivée par voie enzymatique, spécifique- nient en utilisant la trypsine et la carboxypeptidase B, donnant ainsi lieu à la formation de l'insuline humai- ne et du C-peptide humain, Les compositions de la présente invention contiennent l'insuline humaine et le C-peptide humain dans un rapport molaire se situant entre environ 1:4 et environ 4:1 De préférence, le rapport entre l'in- suline humaine et le C-peptide humain se situe entre environ 1:2 et environ 2:1, mieux encore, entre environ 1:1 et environ 2:1. Comme on l'a indiqué, les compositions de la présente invention sont utiles pour favoriser l'obten- tion de l'homéostase hormonale naturelle et ainsi em- pêcher ou atténuer ou encore freiner sensiblement les complications diabétiques bien connues qui ont été mentionnées ci-dessus Bien entendu, la quantité dans laquelle les compositions de la présente inven- tion doivent être utilisées pour maintenir l'homéosta- se hormonale naturelle ou pour atteindre un état se rapprochant plus étroitement de lthoméostase hormonale naturelle chez un sujet diabétique, dépendra de la gra- vité de l'état diabétique De plus, cette quantité variera en fonction du mode d'administration Enfin, la quantité de composition administrée et la fréquence de cette administration seront laissées au choix du médecin particulier Toutefois, en règle générale, le dosage se situera dans l'intervalle donnant environ 0,02 à environ 5 unités d'activité d'insuline humaine par kg du poids du corps et par jour, de préférence, entre environ 0,1 et environ 1 unité d'activité dtin- suline humaine par kg du poids du corps et par jour. On administre la composition par voie pa- rentérale, notamment, par voie sous-cutanée, par voie intramusculaire et par voie intraveineuse Les com- positions de la présente invention comprennent les ingrédients actifs, à savoir l'insuline et le C-pep- tide humainsensemble avec un support pharmaceutique- ment acceptable pour ces derniers et éventuellement avec d'autres ingrédients thérapeutiques La quantité totale des ingrédients actifs présents dans la compo- sition se situe entre environ 99,99 et environ 0,01 % en poids Le support doit être acceptable en ce sens qu'il doit être compatible avec d'autres composants de la composition et il ne doit pas être néfaste pour le receveur de celle-ci. Les compositions de la présente invention, qui sont appropriées pour une administration par voie parentérale, comprennent avantageusement des suspen- sions et/ou des solutions aqueuses stériles des in- grédients pharmaceutiquement actifs, ces solutions ou suspensions étant, de préférence, rendues isotoniques avec le sang du receveur en utilisant généralement du chlorure de sodium, de la glycérine, du glucose, du mannitol, du sorbitol et des agents analogues connus. En outre, les compositions peuvent contenir l'un ou l'autre adjuvant tel que des agents tampons, des agents de conservation, des agents dispersants, des agents favorisant un début rapide de l'activité, des agents favorisant une prolongation diactivité et d'autres agents connus Comme agents spécifiques de conservation, on mentionnera, par exemple, le phénol, le m-crésol, le p-hydroxybenzoate de méthyle et autres. Comme agents tampons spécifiques, on-mentionnera, par exemple, le phosphate de sodium, l'acétate de sodium, le citrate de sodium et autres. De plus, on peut utiliser un acide tel que l'acide chlorhydrique, ou une base telle que l'hydro- xyde de sodium pour régler le p H En règle générale, le p H de la composition aqueuse se situera entre en- viron 2 et environ 8, de préférence, entre environ 6,8 et environ 8. Parmi d'autres additifs appropriés, on men- tionnera, par exemple, l'ion zinc bivalent dont la quantité, s'il est présent, se situe généralement entre environ 0,01 mg et environ 0,5 mg par 100 unités d'insuline humaine, de même qutun sel de protamine (par exemple, sous forme de son sulfate)dont la quan- tité, s'il est présent, se situe généralement entre environ 0,1 mg et environ 2 mg par 100 unités d'acti- vité d'insuline humaine. On donnera ci-après des exemples de composi- tions pharmaceutiques particulières suivant la pré- sente invention. Exemple 1 Formulation d'insuline' humaine régulière neutre/C-pep- tide humain lrapport molaire -entre l'insuline humaine et le C-peptide humain = 1:4 à 40 unités d'insuline par cm 3 l. Pour préparer 10 cm 3 de la composition, on mélange: Insuline zinc humaine ( 28 unités/mg) 400 unités C-peptide humain 30 mg Phénol (distillé) 20 mg Glycérine 160 mg Eau et soit de l'acide chlorhydrique à 10 %, soit de l'hydroxyde de sodium à 10 %: quantité suffisante pour obtenir une composition d'un volume de 10 cm 3 et d'un p H final de 7-7,8. Exemple 2 Formulation d'insuline humaine régulière neutre/C-pep- tide humain lrapport molaire entre l'insuline humaine et le C-peptide humain = 1:1 à 100 unités d'insuline par cm 3 l. Pour préparer 10 cm 3 de la composition, on mélange: Insuline zinc humaine ( 28 unités/mg) 1000 unités C-peptide humain 19 mg Phénol (distillé) 20 mg Glycérine 160 mg Eau et soit de l'acide chlorhydrique à 10 %, soit de l'hydroxyde de sodium à 10 %: quantité suffisante pour obtenir une composition d'un volume de 10 cm 3 et d'un p H final de 7-7,8. Exemple 3 Formulation d'insuline humaine protamine-zinc/C-peptide humain lrapport molaire entre 11 insuline humaine et le C-peptide humain = 1:1 à 40 unités d'insuline par cm 3 lJ. Pour préparer 10 cm 3 de la composition, on mélange: Insuline zinc humaine ( 28 unités/mg) 400 unités C-peptide humain 8 mg Phénol (distillé) 25 mg Oxyde de zinc 0578 mg Glycérine 160 mg Sulfate de protamine 4,0-6, 0 mg Phosphate de sodium (cristaux) 38 mug Eau et soit de l'acide chlorhydrique à 10 %e soit de lthydroxyde de sodium à 1)0 %: quantité suffisante pour obtenir une composition d'un volume de 10 rcm 3 et deun p H final de 7,1-7,4. Exemple 4 Formulation d'insuline humaine pr,,tamine-zinc/C-peptide humain lrappor L molaire entre l'insul ine humaine et le C-peptide humain = 2:1 à 100 unités dinsuline par cm 3 l. Pour préparer 10 cm 3 de la composition, on mélange: Insuline zinc humaine ( 28 unités/mg) C-peptide humain Phénol (distillé) Oxyde de zinc Glycérine Sulfate de protamine Phosphate de sodirum (cristaux) 1.000 unités 9 mg mg 2 mg mg -15 mg 38 mg Eau et soit de l'acide chlorhydrique à 10 %, soit de l'hydroxyde de sodium à 10 %: quantité suffisante pour obtenir une composition d'un volume de 10 cm 3 et d'un p H final de 7,1-7,4. Exemple 5 Formulation d'insuline humaine isophane-protamine-zinc/ C-peptide humain lrapport molaire entre llinsuline humaine et le C-peptide humain = 1:1 à 40 unités d'in- suline par cm 3 l. Pour préparer 10 cm 3 de la composition, on mélange: Insuline zinc humaine ( 28 unités/mg) 400 unités C-peptide humain 8 mg m-crésol (distillé) 16 mg Phénol (distillé) 6,5 mg Glycérine 160 mg Sulfate de protamine 1,2-2,4 mg Phosphate de sodium (cristaux) 38 mg Eau et soit de l'acide chlorhydrique à 10 %, soit de l'hydroxyde de sodium à 10 %: quantité suffisante pour obtenir une composition d'un volume de 10 cm 3 et dlun p H final de 7,1-7,4. Exemple 6 Formulation d'insuline humaine isophane-protamine-zinc/ C-peptide humain lrapport molaire entre l'insuline humaine et le C-peptide humain = 4:1 à 100 unités d'insuline par cm 3 l. Pour préparer 10 cm 3 de la composition, on mélange: Insuline zinc humaine ( 28 unités/mg) 1 000 unités C-peptide humain 5 mg m-crésol (distillé) 16 mg Phénol (distillé) 6,5 mg Glycérine 160 mg Sulfate de protamine 3,O 0-6,0 mg Phosphate de sodium (cristaux) 38 mg Eau et soit de l'acide chlorhydrique à 10 %, soit de l'hydroxyde de sodium à 10 %: quantité suffisante pour obtenir une composition d'un volume de 10 cm 3 et dlun p H final de 7,1-7,4. Exemple 7 Formulation d'une suspension d'insuline zinc humaine/ C-peptide humain lrapport molaire entre ltinsuline humaine et le C-peptide humain = 1:2 à 40 unités d'in- suline par cm 3 l. Pour préparer 10 cm 3 de la composition, on mélange: Insuline zinc humaine ( 28 unités/mg) 400 unités C-peptide humain 15 mg Acétate de sodium (anhydre) 16 mg Chlorure de sodium (granulaire) 70 mg p- hydroxybenzoate de méthyle 10 mg Oxyde de zinc 0,63 mg Eau et soit de l'acide chlorhydrique à 10 %, soit de l'hydroxyde de sodium à 10 %: quantité suffisante pour obtenir une composition d'un volume de 10 cm 3 et d'un p H final de 7,2-7,5. Exemple 8 Formulation d'une suspension d'insuline zinc humaine/ C-peptide humain lrapport molaire entre l'insuline humaine et le C-peptide humain = 1:1 à 100 unités d'insuline par cm 3 l. Pour préparer 10 cm 3 de la composition, on mélange: Insuline zinc humaine ( 28 unités/mg) C-peptide humain Acétate de sodium (anhydre) Chlorure de sodium (granulaire). p-hydroxybenzoate de méthyle Oxyde de zinc 1.00 O unités 19 mg 16 mg mg mg 1,6 mg Eau et soit de l'acide chlorhydrique à 10 %, soit de l'hydroxyde de sodium à 10 %: quantité suffisante pour obtenir une composition d'un volume de 10 cm 3 et d'un p H final de 7,2-7,5. Exemple 9 Formulation d'insuline humaine régulière neutre/C-pep- tide humain lrapport molaire entre l'insuline humaine et le C-peptide humain = 1:4 à 40 unités d'insuline par cm 3 l. Pour préparer 10 cm 3 de la composition, on mélange: Insuline sodium humaine ( 28 unités/mg) 400 unités C-peptide humain 30 mg Phénol (distillé) 20 mg Glycérine 160 mg Eau et soit de l'acide chlorhydrique à 10 %, soit de l'hydroxyde de sodium à 10 %: quantité suffisante pour obtenir une composition d'un volume de 10 cm 3-et d'un p H final de 7,0-7,8. Exemple 10 Formulation d'insuline humaine régulière neutre/C-pep- tide humain lrapport molaire entre l'insuline humaine et le C-peptide humain = 1:1 à 100 unités d'insuline par cm 3 l. Pour préparer 10 cm 3 de la composition, on mélange: Insuline sodium humaine ( 28 unités/mg) 1 000 unités C-peptide humain 19 mg Phénol (distillé) 20 mg Glycérine 160 mg Eau et soit de l'acide chlorhydrique à 10 %, soit de l'hydroxyde de sodium à 10 %: quantité suffisante pour obtenir une composition d'un volume de 10 cmni 3 et d'un p H final de 7,0-7,8. M 3 REVENDICATIONS 1 Composition pharmaceutique comprenant, en association avec un support pharmaceutiquement acceptable, de l'insuline humaine et du C-peptide humain dans un rapport molaire (entre l'insuline hu- maine et le Cpeptide humain) se situant entre environ 1:4 et environ 4:1. 2, Composition suivant la revendication 1, caractériséeen ce que le rapport molaire entre l'insu- line humaine et le C-peptide humain se situe entre environ 1:2 et environ 2:1. 3 Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce que le rapporb molaire entre l'in- suline humaine et le C-peptide humain se situe entre environ 1:1 et environ 2:1. 4 Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient l'ion zinc biva- lent. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient un sel de prota- mine.