FR 2522682 A1 19830909 FR 8301430 A 19830131 -1- Il y a trois étapes générales impliquées dans la production d'une protéine par utilisation de techniques de génie génétique La première étape comprend la production en laboratoire ou l'isolement et la purification du gène désiré qui gouverne la synthèse d'une protéine particulière. La deuxième étape est la recombinaison du gène avec un vecteur de transfert approprié tel qu'un plasmide La troisième étape comprend le transfert du vecteur recombiné dans un microorganisme particulier et l'induction du micro- organisme à produire le produit correspondant au gène particulier. La présente invention concerne un procédé pour l'exécution de la première étape La méthodologie courante pour la production in vitro de gènes par addition successive de nucléotides consiste à utiliser des techniques chimiques (Itakura, K et Riggs, A, Science 209:1401 ( 1980), (Khorana, H G, Science 203:614 ( 1979), des techniques enzymatiques (S Gillam, P Jahnke, C Astell, S Phillips, C.A Hutchinson, M Smith, Nucleic Acids Res 6,2973 ( 1979) et des techniques en phase solide pour produire les molé- cules désirées d'ADN ou d'ARN Les techniques chimiques de synthèse d'ADN sont fastidieuses parce que les réactions impliquées sont non-spécifiques, de sorte qu'une purification poussée du produit désiré est nécessaire après chaque étape opératoire Ainsi, la synthèse d'ARN ou d'ADN par des techniques chimiques est notablement moins avantageuse que des systèmes enzymatiques parce que de plus grandes quan- tités de matière de départ sont nécessaire pour l'obtention de productions comparables, ce qui augmente les coûts, les techniques de purification sont longues et entraînent de grandes pertes de matière, un peu de produit étant perdu à chaque étape, et le grand nombre d'étapes impliquées dans le blocage et le déblocage de sites réactifs entraîne de nombreuses occasions d'erreurs et un risque de contamination par des enzymes dégradantes qui détruisent le produit formé par synthèse. -2- La synthèse enzymatique d'ARN en utilisant de la polynucléotide phosphorylase et de la T 4 ARN ligase a été rapportée La méthode utilisant la polynucléotide phospho- rylase est limitée à la production d'oligodésoxynucléo- tides Dans des conditions contrôlées, la polynucléotide phosphorylase ajoute principalement un seul nucléotide à un oligodésoxynucléotide court qui est ensuite isolé par des techniques chromatographiques Les techniques en phase solide sont mises en oeuvre en liant la cha Tne du nucléotide à une matière solide de support et en utilisant la méthodologie chimique ci-dessus pour ajouter des nucléotides d'une manière échelonnée. La présente invention enseigne la composition et le procédé de production d'un composé utile dans la synthèse d'une séquence prédéterminée d'ARN en utilisant l'enzyme T 4 ARN ligase Des procédés pour la transcription de i'ARN formé par synthèse en ADN de manière que le gène obtenu par synthèse puisse être incorporé dans un plasmide, inséré dans un microorganisme et exprimé sont connus dans la technique. L'existence, la purification et le mécanisme de l'enzyme T 4 ARN ligase qui est isolée à partir d'Escherichia coli infecté de bactériophage T 4 ont été décrits (Silber, R., Malathi, V G et Hurwitz, J, Proc Natl Acad Sci. ( 1972) 69:3009) Cette enzyme catalyse la formation d'une liaison phosphodiester entre le groupe phosphate sur l'extrémité 5 ' d'un nucléotide donneur et le groupe hydroxyle sur l'extrémité 3 ' de l'oligonucléotide receveur comme indiqué ci-dessous. 3 ' 5 ', OH + H 203 PO OPO + H 2 OH La demande de brevet japonais 1980-19003 (publiée le 9 février 1980) enseigne l'utilisation de la T 4 ARN ligase -3- pour l'élongation d'un polynucléotide par attachement d'un seul mononucléoside diphosphate (p Np) sur l'extrémité 3 ' d'une séquence de nucléoside sans groupes phosphate ter- minaux Cette méthodologie exige comme substrat de départ un trinucléotide, que l'on doit se procurer dans le com- merce ou préparer par synthèse par des techniques chimiques, et exige du triphosphate d'adénosine (ATP) comme source d'énergie pour la réaction, De plus, l'invention enseigne seulement l'addition d'une base unique et n'est pas capable de produire des oligo ou polynucléotides pour lesquels des additions successives sont nécessaires. HO Ap Ap AOH +p Cp + ATP HO Ap Ap Ap Cp + AMP+ P Pl Les abréviations utilisées pour des raisons de com- modité dans la présente demande de brevet sont indiquées dans le Tableau 1. Abréviation A C G U N,X,Y,Z ADN ARN BAP VPD App Np jil nm TEAB DTT PNK Tableau 1 Définition Adénosine Cytosine Guanosine Uridine Ribonucléotide quelconque Acide désoxyribonucléique Acide ribonucléique Phosphatase alcaline bactérienne Phosphodiestérase de venin ' 5 ' 3 ' A p N p (voir texte pour explication complémentaire) liaison de phosphoester cyclisé en 2 ' 3 ' Microlitre Nanomètre Tampon bicarbonate de triéthyl- ammonium DL-dithiothreitol (réactif de Cleiland) Polynucléotide kinase -4pnbzl 'Groupe o-nitrobenzyl phosphate UV Rayons ultra-violets MOPS Acide 3-(N-morpholino)propane- sulfonique HEPES Acide N-2-hydroxyéthylpipérazine- N'-2-éthanesulfonique La présente invention enseigne la synthèse de molé- cules d'ARN et d'ADN biologiquement actives Toutes les séquences de nucléotides sont indiquées par leurs abré- viations selon le Tableau 1 Toutes les liaisons phospho- diester entre nucléotides sont des liaisons 3 '-5 ', à moins d'indication contraire. L'invention décrite ici enseigne des procédés de synthèse de molécules d'ARN à un seul brin d'une séquence de basesprédéterminée en utilisant l'enzyme T 4 ARN ligase pour ajouter spécifiquement un mono-, di-, oligo ou poly- nucléotide (le donneur) sur l'extrémité 3 ' d'une séquence de ribonucléotide de deux bases ou plus longue (le receveur) par une liaison 5 '-3 ' Le receveur le plus court sur lequel la T 4 ARN ligase agira dans la catalyse est un dinucléotide phosphorylé dans la position 5 ' Si le receveur est un tri- nucléotide ou est plus long, l'extrémité terminale 5 ' peut être phosphorylée ou hydroxylée pour permettre une addition spécifique du donneur à l'extrémité 3 ' du receveur A propos de la méthode d'addition d'une base unique comme donneur sur l'extrémité d'un receveur, si la matière de départ pour le receveur est un dinucléotide obtenu commer- cialement ou obtenu par synthèse par des techniques chi- miques connues de l'homme de l'art, la première étape consiste à phosphoryler l'extrémité 5 ' libre On conduit cette étape en mélangeant le dinucléotide avec ATP en présence de l'enzyme polynucléotide kinase (PNK) (Richardson, C C, Proc Natl Acad Sci U S A 54, 158 ( 1965)) qui phosphoryle de manière spécifique l'extrémité 5 ' d'un nucléotide comme représenté dans l'équation 1 Si le receveur est un trinucléotide ou est plus long, cette étape - de phosphorylation n'est pas nécessaire. ( 1)OH Xp YOH + ATP P Xp Yo H + ADP La deuxième étape consiste à mélanger le dinucléotide receveur avec le composé chimique pl 1-adénosine, p 2-( 3 ' nucléotide monophosphate)-5 ' pyrophosphate de la forme (App Np), o N est un ribonucléotide choisi dans le groupe adénine, cytosine, guanine, uracile et inosine Le composé App Np et sa synthèse sont décrits dans la demande de brevet au nomr de la Demanderesse intitulé Composition et procédé pour former A 5 p p N p (App Np) La réaction du ribonucléotide receveur connu avec le composé App Np en présence d'ARN ligase entraîne la pro- duction d'un nucléotide comme représenté dans l'équation 2. Cette réaction n'exige pas ATP comme source d'énergie. ( 2) p Xp Yo H + App Np ARN ligase p Xp Yp Np + A p p OH pp p >p p pp p La présente invention décrit aussi un procédé pour l'addition d'une molécule d'ARN donneur d'une longueur de 2 bases ou plus à un ribonucléotide receveur de manière que le groupe phosphate en position 5 ' sur le donneur se lie spécifiquement au groupe hydroxyle à la position 3 ' du receveur en présence d'ATP et d'ARN ligase pour former un ribonucléotide allongé (équation 3) Le groupe phosphate sur l'extrémité 3 ' de la molécule du donneur rend cette extrémité non-réactive avec l'ARN ligase, de façon à empêcher une addition supplémentaire des molécules de donneur Pour ce procédé également, si le receveur est un dinucléotide, il doit être phosphorylé sur l'extrémité ', tandis que si c'est un trinucléotide ou s'il est plus long, une phosphorylation n'est pas nécessaire (équation 4). ( 3) p Xp Yo H+ p Yp Zp ARN ligase> p Xp Yp Yp Zp ( 4) X Yo + Appnbzl ARN ligase, p Xp Ypnbz 4) p p OH ppnbzl ? p p pnbzl Pour phosphoryler l'extrémité 3 ' de la molécule du donneur, on fait réagir le dinucléotide phosphorylé en 5 ' -6- avec le composé Appnbzl en présence d'ARN ligase (équation 4) La portion nbzl peut être éliminée du nucléotide résultant par exposition à une lumière intense (équation 5). ( 5)p Xp Ypnbzlumière Xy + nbzl p ppnbzl> XY +fbz Le ribonucléoride allongé résultant peut être traité ensuite par une phosphatase alcaline bactérienne (BAP) qui élimine les groupes phosphate terminaux, le préparant à servir de receveur, ou il peut être traité par une poly- nucléotide kinase (PNK) phosphorylant la position 5 ' de façon à le transformer en un donneur (équation 6). ARN l i a e p p p p D ( 6) X X X+ Y Z AR se X X X Y Z XX YZ p p p p p ATP P pp P P - p pp pp Ap K X X X y Z qrp XXXYZ Les réactions décrites ci-dessus sont des exemples d'un certain nombre de procédés de production de nucléo- tides Ces procédés peuvent être utilisés efficacement sur des oligonucléotides plus longs aussi bien que sur les dinucléotides décrits dans la présente description De cette manière, on peut faire la synthèse de molécules entières d'ARN gouvernant la production de protéines particulières. Pour chacune des réactions décrites ci-après, il est nécessaire de déterminer l'identité des produits de réaction L'identification dés produits de réaction dans tous ces exemples est effectuée en déterminant les rapports d'absorption à 250, 260 et 280 nm et en les comparant à des étalons connus L'identification et la détermination de la pureté sont effectuées aussi par électrophorèse sur papier au p H 5,0 dans un tampon citrate de sodiumet au p H 2,8 dans du tampon formiate d'ammonium à 800 volts pendant 1 heure. La présente invention enseigne l'utilisation de T 4 ARN ligase dans la préparation de nucléotides d'une -7- séquence de bases prédéterminée Comme décrit ci-dessus d'une manière générale, deux procédés sont enseignés Un procédé enseigne l'addition de mononucléotides donneurs à un ribonucléotide receveur comportant au moins deux -bases L'autre procédé enseigne l'addition de nucléotides donneurs ayant deux bases ou plus, La décision en ce qui concerne lequel de ces procédés on doit utiliser dépend de la composition de la séquence de bases du nucléotide désiré et de la disponibilité de nucléotides préparés commercialement à utiliser comme matières de départ. Dans la synthèse d'un trinucléotide d'une séquence de bases prédéterminée à partir d'un dinucléotide connu et d'un composé App Np, il est nécessaire d'abord de phosphoryler l'extrémité 5 ' libre du dinucléotide On utilise à cet effet l'enzyme polynucléotide kinase dans des conditions connues dans la technique. Après l'étape de phosphorylation, il est nécessaire d'isoler le dinucléotide phosphorylé des autres constituants du mélange de réaction On effectue cela en fractionnant le mélange de réaction et en traitant les fractions combinées contenant le dinucléotide phosphorylé par l'AT Pase qui élimine un pyrophosphate de 1 'ATP contaminant la masse de dinucléotide phosphorylé L'isolement du dinucléotide phosphorylé par fractionnement est alors possible. L'AT Pase utilisée dans l'exemple 1 ci-après a été obtenue et purifiée comme sous-produit de la purification de la T 4 ARN ligase, toutefois n'importe quelle AT Pase serait efficace. On fait ensuite incuber le dinucléotide phosphorylé ou une autre forme de nucléotide receveur avec un composé App Np, le composé particulier à utiliser étant un composé pour lequel N est le nucléotide à ajouter à l'extrémité 3 ' du dinucléotide Les conditions préférées de réaction sont indiquées dans les exemples ci-après. -8- Finalement, le nucléotide résultant peut être traité par une phosphatase qui élimine les phosphates terminaux, laissant des groupes hydroxyle sur les extrémités 5 ' et 3 ' Les conditions pour les réactions des phosphatases, dépendant de la phosphatase utilisée, sont bien connues dans la technique Le nucléotide traité par la phosphatase est ensuite préparé par des additions suivantes comme décrit ci-après. L'addition de ribonucléotides donneurs ayant deux bases ou plus peut être effectuée à l'extrémité 3 ' d'un ribonucléotide receveur en phosphorylant les extrémités ' et 3 ' du donneur et en mettant à incuber le donneur phosphorylé avec le receveur en présence d'ARN ligase et d'ATP Le ribonucléotide receveur pour cette réaction doit être un dinucléotide phosphorylé en 5 ' ou un oligo- nucléotide avec une extrémité 5 ' phosphorylée ou libre. Pour phosphoryler l'extrémité 5 ' du ribonucléotide donneur, on fait incuber le ribonucléotide avec Appnbzl en présence d'ARN ligase, de manière à lier la portion pnbzl à l'extrémité 3 ' On fait bouillir le mélange de réaction pour inactiver l'ARN ligase et ensuite on le mélange avec ATP en présence de polynucléotide kinase pour phosphoryler l'extrémité 5 ' de la molécule du donneur. On isole le donneur et on peut ensuite l'exposer à une lumière intense comme celle d'une lampe à vapeur de mercure de 300 watts pour éliminer la portion nbzl, laissant le donneur se phosphoryler aux extrémités 5 ' et 3 ' On peut ajouter le donneur au receveur avec ou sans élimination de la portion nbzl. Après l'addition du ribonucléotide donneur au receveur, le nucléotide allongé résultant peut être traité par une phosphatase pour élimination de tous les groupes phosphate terminaux de façon qu'il soit mis à une forme dans laquelle il pourra agir comme receveur En variante, le nucléotide allongé peut être traité par PNK de façon qu'il se -9- phosphoryle à l'extrémité 5 ' et qu'il puisse être utilisé comme donneur. On envisage que toutes les étapes de purification dans lesquelles la méthode préférée décrite est un frac- tionnement utilisant une colonne de DEAE Sephadex peuvent aussi être effectuées par chromatographie en phase liquide à haute pression, chromatographie sur couche mince, électrophorèse sur gel et sur papier et d'autres techniques connues de séparation, sans qu'on sorte pour autant du cadre général de la présente invention. Exemple 1 Synthèse d'Ap Gp A On mélange d'abord de l'édénylyl ( 3 ' 5 ') guanosine (Ap G) avec ATP en présence de polynucléotide kinase de manière à former p Ap G Le mélange réactionnel contenant gl de 15 m M AG (SIGMA), 60 gl de l M Tris-H Cl (p H 8,1), il de 2-mercaptoéthanol, 100 il de 100 m M Mg C 12, 150 il de 20 m M ATP, 50 il de H 20 et 100 il de PNK ( 1500 unités/ cm 3) est mis à incuber à 37 C pendant 1 heure, puis frac- tionné par une colonne de DEAE Sephadex A-25 sur un gradient linéaire de 0,2 à 0,8 M TEAB (p H 7,6) Le qua- trième pic contenant ATP et p Ap G comme identifié par - absorption UV est combiné, porté à sec avec du méthanol sous vide et ensuite lyophilisé. Pour séparer l'ATP du p Ap G, la fraction combinée est traitée par l'AT Pase et fractionnée sur une colonne. il du mélange p Ap G/ATP (A 260 = 49,2), 100 gl de m M DTT, 100 il de 1 M MOPS, p H 7,9, 150 gl de 100 m M Mg C 12, 800 i 1 de H 20 et 250 il de T 4 AT Pase ( 5000 unités/ cm 3) sont mélangés et mis à incuber pendant 1 heure à 37 C. Le produit résultant est fractionné sur une colonne de DEAE Sephadex A-25 sur un gradient linéaire de 0,2 0,8 M TEAB (p H 7,6) On combine le deuxième pic majeur à 260 nm, la fraction p Ap G. -10- La fraction de p Ap G provenant de la réaction ci-dessus est utilisée ensuite dans la synthèse de p Ap Gp Ap On obtient la T 4 ARN ligase en utilisant la méthode de Silber et autres 112 1 l de p Ap G ( 0,87 m M), 58 g 1 d'App Ap ( 3,4 m M), 15 gl de l M HEPES, p H 7,5 et 50 U 1 d'ARN ligase ( 1500 unités/cm 3) sont mélangés et mis à incuber pendant 1 heure à la température ambiante On fractionne le mélange résultant sur DEAE Sephadex A-25 et le pic de p Ap Gp Ap est identifié par électrophorèse sur papier au p H 5,0 dans du tampon citrate de sodium 50 m M La fraction de p Ap Gp Ap combinée est évaporée à sec en présence de méthanol sous vide et lyophilisée. On traite ensuite l'échantillon par de la phosphatase alcaline bactérienne (BAP) 40 il de p Ap Gp Ap (environ 1,0 unité à 260 nm), 5 g 1 de 1 M Tris-H Cl, p H 8,1, 5 g 1 de BAP C ( 200 unités/cm 3, Worthington Biochemical) et 50 g 1 de H 20 sont mis à incuber pendant 30 minutes à 65 C et fractionnés sur une colonne de DEAE Sephadex A-25 avec un gradient linéaire de 0,1 à 1,0 M TEAB, p H 7,6 On combine les fractions contenant Ap Gp A. Exemple 2 Synthèse de p GA Up à partir de GAU On détermine par électrophorèse la pureté du tri- nucléotide GAU (Collaborative Research) Un mélange réac- tionnel contenant 225 il de 26 m M Appnbzl, 300 1 de 3,3 m M Gp Ap U, 75 il de 1 M MOPS, p H 7,9, 300 Al de 0,1 M Mg Cl 2, 4 l de 100 m M DTT, 120 4 l de H 20, 180 4 l d'ARN ligase et 4 l de 100 % diméthylsulfoxyde DMSO sont mis h incuber à la température ambiante pendant 2 heures On fait bouillir ensuite le mélange de réaction pendant deux minutes et on mélange ensuite 1400 il d U mélange ayant bouilli avec 300 4 l de 20 m M ATP, 200 4 l de 100 m M DTT et 100 gl de PNK ( 1500 unités/cm 3) et on fait incuber l'ensemble pendant 90 minutes à 37 C. -11- On fractionne ensuite le mélange de réaction sur une colonne de DEAE Sephadex A-25 avec un gradient linéaire de 0,1 M à 1,0 M de TEAB, p H 7,6, On combine le quatrième pic contenant le p Gp Ap Upnbzl et on l'expose ensuite à une lampe à vapeur de mercure de 300 watts à une distance de 5 cm pendant 15 minutes dans une chambte refroidie par enveloppe d'eau. Exemple 3 Ap Ap A + p Gp Anbzl >AAAGA Le mélange réactionnel constitué de 34 Ul de 3,3 m M AAA (Boehringer), de 70 1 l de 1,0 m M p Gp Apnbzl (préparé par synthèse par la méthode de l'exemple 2), de 40 1 l de 1,0 M HEPES, p H 7, 83, de 5 il de 1,0 M Mg C 12, de 25 g 1 de 20 m M ATP (SIGMA), de 2 1 l d'albumine de sérum bovin (BSA)( 1 mg/cm 3), de 40 i 11 d'ARN ligase ( 1500 unités/cm 3 et de 20 il de 100 % diméthylsulfoxyde est mis à incuber toute une nuit à la température ambiante On fractionne le mélange de réaction sur une colonne de DEAE Sephadex A-25. Le sixième pic ayant les rapports d'absorption à 250/260 = 1,17 et à 280/260 = 0,667 est identifié comme étant le produit AAAG Apnbzl L'oligonucléotide est ensuite exposé à la lampe à vapeur de mercure comme décrit dans l'exemple 2 pour élimination du groupe nbzl. Exemple 4 Ap Cp Cp U + p Cp Cp Gp Ap 4 Ap Cp Cp Up Cp Cp Gp Ap Le mélange réactionnel contenant 75 il de ( 1,2 m M) ACCU (qui peut être préparé par synthèse en opérant comme dans l'exemple 1), 90 il de 1 m M p CCG Ap (exemple 1), 30 1 l de 1,0 M MOPS (p H 7,9), 120 g 1 de 100 m M Mg C 12, 70 1 l de 100 m M DTT, 60 1 l de DMSO ( 100 %), 60 1 l de 20 m M ATP, 1 l de BAS ( 10 mg/cm 3), 60 gl d'ARN ligase ( 1500 unités/ cm 3) et 100 1 l de H 20 est mis à incuber à la température ambiante (environ 240 C) pendant 16 heures, On fractionne le mélange sur une colonne de PEAE Sephadex A-25 avec un gradient linéaire de 0,1 à 2,0 M TEAB, p H 7,5, et le sixième -12- pic est identifié par absorption UV comme étant le poly- nucléotide Ap Cp Cp Up Cp Cp Gp Ap. -13- REVENDICATIONS 1 Un procédé de synthèse d'ARN d'une séquence pké- déterminée de bases en utilisant l'enzyme T 4 ARN ligase, selon lequel on ajoute un donneur de manière spécifique à l'extrémité 3 ' hydroxylée d'un receveur comportant au moins deux bases, du triphosphate d'adénosine étant présent comme source d'énergie pour l'addition si le donneur est constitué de deux bases de nucléotide ou plus. 2 Un procédé pour ajouter un ribonucléotide unique prédéterminé à un ribonucléotide receveur ayant au moins deux bases, selon lequel: on mélange le ribonucléotide receveur avec un com- posé de la forme App Np en présence de T 4 ARN ligase dans des conditions qui favorisent le transfert de la portion p Np du composé App Np au ribonucléotide phosphorylé à l'extrémité 3 ', le N du composé App Np étant un ribo- nucléotide choisi parmi l'adénine, la guanine, la cytosine, l'uracile et l'inosine. 3 Un procédé pour ajouter un ribonucléotide pré- déterminé comportant au moins 2 bases à un ribonucléotide receveur comportant au moins deux bases, qui comprend les étapes consistant à: phosphoryler spécifiquement l'extrémité 3 ' du ribonucléotide donneur; phosphoryler l'extrémité 5 ' du ribonucléotide donneur; faire incuber le ribonucléotide receveur avec le ribonucléotide donneur phosphorylé en présence de T 4 ARN ligase dans des conditions qui permettent la formation d'une liaison covalente entre le ribonucléotide receveur et le donneur. 4 Un procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le ribonucléotide receveur est choisi parmi un diribonucléotide phosphorylé en 5 ' et hydroxylé en 3 ', un oligonucléotide phosphorylé à l'extrémité 5 ' et hydroxylé à l'extrémité 3 ' et un oligonucléotide hydroxylé aux extrémités 5 ' et 3 '. Un procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le nucléotide receveur est choisi parmi un diribonucléotide phosphorylé en 5 ' et hydroxylé en 3 ', un oligonucléotide phosphorylé à l'extrémité 5 ' et hydroxylé à l'extrémité 3 ' et un oligonucléotide hydroxylé aux extrémités 5 ' et 3 '. 6 Un procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape consistant à faire la synthèse du ribonucléotide phosphorylé en 5 ' et hydroxylé en 3 ' en faisant réagir un ribonucléotide hydroxylé aux extrémités 3 ' et 5 ' libres avec du tri- phosphate d'adénosine (ATP) en présence de polynucléotide kinase. 7 Un procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes selon lesquelles: on fait réagir un ribonucléotide hydroxylé aux extrémités 3 ' et 5 ' libres avec ATP en présence de poly- nucléotide kinase de manière à former un ribonucléotide phosphorylé; on fractionne le mélange de réaction par une chromatographie sur colonne échangeuse; on traite la portion du mélange de réaction frac- tionné contenant le ribonucléotide phosphorylé au moyen d'une AT Pase; on fractionne le mélange de réaction traité par l'AT Pase de manière à isoler le ribonucléotide phosphorylé. 8 Un procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape consistant à phospho- ryler de manière spécifique l'extrémité 5 ' d'un ribo- nucléotide receveur en faisant réagir ce ribonucléotide avec ATP en présence de polynucléotide kinase. 9 Un procédé selon la revendication 3, caractérisé -15- en ce que l'étape de phosphorylation de l'extrémité 5 ' du ribonucléotide donneur comprend l'étape consistant à faire réagir ce ribonucléotide avec ATP en présence de polynucléotide kinase. 10 Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape de phosphorylation de l'extrémité 3 ' du ribonucléotide donneur comprend l'étape consistant à faire réagir un ribonucléotide comportant au moins deux bases avec le composé Appnbzl en présence de T 4 ARN ligase dans des conditions qui favorisent la fixation du groupe pnbzl sur l'extrémité 3 ' du ribonucléotide. 11 Un procédé de synthèse d'ARN d'une séquence prédéterminée de bases, comprenant les étapes qui consistent à: a) phosphoryler un ribonucléotide d'une séquence de bases connue comportant au moins deux bases à l'extré- mité 5 '; faire réagir cet ARN avec App Np en présence de T 4 ARN ligase de manière à fixer la portion p Np de App Np sur l'extrémité 3 ' du ribonucléotide; c) traiter l'ARN allongé résultant avec une enzyme qui élimine les groupes phosphate terminaux; d) répéter les étapes b et c jusqu'à ce que l'acide ribonucléique de la séquence prédéterminée soit produit; N étant un ribonucléotide choisi parmi l'adénine, la guanine, la cytosine, l'uracile et l'inosine. 12 Un procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les conditions dans lesquelles le transfert de la portion p Np est favorisé consistent en l'incubation du ribonucléotide receveur avec le composé App Np en présence d'ARN ligase dans un petit volume de tampon HEPES pendant 1 heure à 370 C.