FR 2520619 A1 19830805 FR 8201397 A 19820129 L'invention concerne l'association de trois produits chimiques: le polyéthylène glycol le diméthylsulfoxyde et/ou la théophylline réalisée par simple mélange dans de l'eau distillée. Ajouté à une culture de cellules cancéreuses dans le milieu de culture même quiles baigne (cellules de la lignée Re La par exemple) ce mélange fait apparattre la reversion tumorale. On appelle reversion tumorale une opération qui consiste à trai- ter la cellule cancéreuse pour lui permettre de retrouver les carac- tères de la cellule normale sans la tuer. Cette reversion tumorale peut être identifiée par la réapparition d'au moins l'un des caractères phénotypiques qui avaient disparu Or le principal de ces caractères se trouve être l'inhibition de contact dont la réapparition peut mettre un terme au processus anarchique et invasif du cancer. La cellule tumorale étant scientifiquement considérée comme une cellule normale transformée, il s'agit donc d'une retransformation en sens inverse. Le 13 Octobre 1981 à l'UNESCO le Professeur Michel BOIRON de l'Hôpital St Louis a déclaré: "la reversion tumorale lorsqu'elle sera réalisée constituera une véritable révolution biologique". L'état de la technique antérieure ne permet pas de faire jusqu'à présent état de la reversion tu" rale comme d'une réalité, même si certains articles scientifiques mettant en jeu certains composés chi- miques laissaient entrevoir qu'ils pouvaient être soupçonnés d'avoir des propriétés révertantes. La composition et le procédé d'utilisation de la composition se- ront décrits avec plus de précision selon l'exemple suivant non limi- tatif. Descriptif expérimental Un tapis confluent de cellules He La (cellules cancéreuses) en culture a été traité par l'invention. Il s'agissait d'une culture en botte Falcon de 75 cm 2 de surface contenant 30 ml de milieu de culture (HEM 2011 Eurobio) complété à % de sérum de veau foetal (SVF Eurobio). lè Expérience Expérience de base Le Phénomène de la Réversion Flacon ne 1 Il fut ajouté le mélange établi dans les proportions sui- vantes: 1 ml 5 d'une solution à 10 % de polyéthylène glycol O ml 5 de diméthylsulfoxyde pur 20619 il de théophylline A la suite de quoi le milieu a été renouvelé deux fois à une semaine d'intervalle et dans les proportions décrites ci-dessus. Enfin la culture a été renouvelée de semaine en semaine sans qu'il soit rajouté à nouveau la composition revertante. Parallèlement à cette expérience de base-d'autres flacons de même nature ont été mis en compétition. Flacon n' 2 Flacon témoin sans aucune addition pour témoigner de l'évo- lution normale de la culture He La dans son milieu habituel. Flacon n' 3 Additionné seulement de polyéthylène glycol ( 1,5 ml de la solution à 10 %). Flacon nô 4 Additionné seulement de diméthylsulfoxyde pur ( 0,5 ml). Flacon nô 5 Additionné seulement de 50 el de théophylline. Flacon nl 6 Additionné par contre de polyéthylène glycol ( 1,5 m Il de la solution à 10 %) et de diméthylsulfoxyde pur ( 0,5 ml) sans théophylline. Résultats Flacon nô 1 Huit jours après le temps O on pouvait déjà distinguer des cellules en disposition régulièrement ordonnée qui continuaient à rester collées au verre alors que dans d'autres endroits le caractère anarchique des cellules originelles persistait. Puis au fur et à mesure des renouvellements du milieu, on pouvait voir que le processus engagé se poursuivait pour arriver un mois à six semai- nes plus tard à obtenir un tapis cellulaire strictement monocouche et étendu à toute la surface du flacon après avoir réussi à éliminer les cellules non reversées, repoussées, décollées et véritablement sapées par les cellules normales. Flacon nô 2 Lg culture de cellules He La s'est décollée et les cellules sont passées en suspension comme il est courant de l'observer dans ce type de culture et cela au bout de trois semaines. Flacon n" 3 L'addition de polyéthylène glycol n'a rien changé à la cul- ture qui a suivi l'évolution du flacon n* 2. Flacon nô 4 L'addition de diméthylsulfoxyde n'a rien changé à la culture qui a suivi l'évolution des flacons nô 2 et 3. Flacon nô 5 L'addition de théophylline n'a rien changé non plus à la culture qui a suivi l'évolution des flacons nô 2 nô 3 et nô 4. Flacon nô 6 Dans ce flacon par contre il a pu être observé au bout de 8 jours des plages de cellules apparemment reversées, en disposition ré- gulièrement ordonnée et qui continuaient à rester collées au verre au milieu du tapis apparemment anarchique. Mais au fur et à mesure des renouvellements du milieu le processus engagé ne semblait pas se poursuivre. Six semaines plus tard l'aspect de la culture était resté dans le même état état quiescent sans obtenir un tapis étendu à toute la surface du flacon. Cependant il est à noter un caractère important: le maintien en place des cellules de la culture alors que dans le flacon témoin pendant le m 4 me temps toutes les cellules étaient en suspension depuis déjà trois semaines. Après six semaines, bien que l'expérience soit terminée, le flacon ne 1 a été conservé Or dix mois après on constate toujours que la culture cellulaire reversée reste dans le même état nommé quiescent mono- couche, et limité aux bords du flacon. 2 è Expérience Compétition entre cellules Re La et cellules reversées Pendant l'expérimentation de base, des tapis cellulaires He La autres que le tapis He La témoin étaient entretenus simplement pour maintenir la souche en lignée continue. Or il s'est produit une "contamination" accidentelle par des cellules reversées sur l'un de ces tapis. Il s'est alors produit un véritable ensemencement cellulaire (analo- gue à un ensemencement microbien) et des colonies éparses sont apparues dix à quinze jours après, comme un mouchetis. Puis ces colonies se sont mises à prendre possession du fond du fla- con en sapant la culture Elles s'agrandirent en formant des cercles, des disques de culture cellulaire strictement monocouche, qui se rejoi- gnirent et devinrent confluents, repoussant devant eux le tapis cellu- laire He La en produisant au contact la formation d'une sorte de boursou- flure, une sorte de lèvre. Le tapis He La ne fut bient 8 t plus qu'un maillage (comme un grillage de fil de fer)c Enfin détruites, dilacérées, désorganisées, les cellules He La passant en suspension les unes après les autres, il ne resta plus alors qu'un tissu de cellules reversées monocouche et limité aux bords du flacon. Il ressort de cette expérience que les cellules reversées présentent une bien meilleure adhérence au verre et une vitalité supérieure aux cellules He La en culture (ce qui a été vérifié ultérieurement par le fait que leur trypsination est plus difficile à effectuer). 2 520619 A la suite de cette expérience réalisée sans avoir été projetée, le tapis des cellules reversées ayant colonisé tout le fond du flacon a observé l'inhibition de contact Il est resté alors quiescent, état dans lequel il se maintient depuis neuf mois. p 3 è ExérienceMaintien de l'état quiescent L'un des flacons ayant été négligé pendant 4 semaines,8 mois après le temps 0, certaines cellules reversées sont mortes, se sont décol- lées, sont passées en suspension laissant apparattre des trous dans le tapis cellulaire, le milieu de culture par ailleurs étant devenu acide. Après rinçage et renouvellement le tapis s'est reconstitué inté- gralement et la culture a retrouvé son aspect quiescent qu'elle con- naissait A dix mois du temps O elle se trouve toujours dans le même état. 4 è Expérience Mise en évidence du caractère héréditaire de la réapparition de l'inhibition de contact Au temps 0 l'un des flacons quiescents a été trypsiné pour réali- ser un premier "passage" (terme désignant une opération identique au repiquage bactériologique). La culture constitua sans difficulté un nouveau tapis monocouche qui devint quiescent dès qu'il eut atteint les bords du flacon. Un 2 è passage fut réalisé à 23 jours (temps J 23) Un 3 è passage " " 26 jours après (temps j 49) Un 4 è passage " " 25 jours après (temps J 74) Enfin un 5 è et dernier passage fut réalisé 16 jours après (temps j 90) Au bout de cinq passages, l'expérience s'étant déroulée sur 90 jours et les conditions expérimentales démontrant amplement une constance dans la reproduction du phénomène, l'expérience fut arrêtée en considérant comme prouvées l'établissement en lignée continue et le caractère héréditaire des cellules He La reversées. Depuis lors il est possible d'utiliser en permanence ces cellules reversées comme s'agissant des cellules d'une lignée continue nouvelle pour d'autres besoins du laboratoire. 5 è Expérience Mise en évidence de l'indépendance de la reprise de la culture (à partir de l'état quiescent) vis-à-vis du temps Pour que cette dernière expérience soit démonstrative il fut fait appel à un flacon de cellules reversées en culture quiescente et ggée de quatre mois. Après trypsination ces cellules ensemencées ont colonisé le nou- veau flacon Une suite de trois passages réussie a même été effectuée à titre de confirmation. La démonstration expérimentale de la reversion tumorale était faite. Elle était due ni au hasard ni à un artefact, et de plus la reproduc- tibilité était un fait acquis. En résumé, les expériences ci-dessus décrites démontrent que La composition revertante réalise, sur les cellules He La en culture, la reversion tumorale. Cette reversion se caractérise par la réapparition de caractères nou- veaux que la transformation cancéreuse avait fait disparattre, et au nombre desquels ont été identifiées: l'inhibition de contact, une meilleure adhérence au verre et une meilleure cohésion entre les cellules constitutives du tissu cellulaire. Il a été mis en évidence que l'inhibition de contact en particulier se conservait au fur et à mesure des mitoses nouvelles, que ce carac- tère était donc héréditairement transmis au sein des générations successives et qu'il était indépendant du temps de reprise de la culture et de la longueur des périodes de quiescence. Il a été mis en évidence qu'il était indispensable d'associer au moins deux composants à savoir le polyéthylène glycol et le diméthyl- sulfoxyde mais aussi d'y ajouter la théophylline qui donne toute sa valeur à la reversion. Donc l'action revertaute de la composition repose sur l'association d'un modificateur membranaire le polyéthylène glycol (dont le poids moléculaire 1 000 ou 6 000 est indifférent) et d'un revertant le diméthyleulfoxyde auxquels est ajouté un adjuvant, la théophylline. Les proportions indiquées dans la première expérience constituent une base et une moyenne. Des expériences complémentaires ont permis de mettre en évidence que: 1 La proportion du modificateur membranaire (polyéthylène glycol) atoxique ne peut être affecté que par les limites de sa viscosité, sa proportion optimum se situant à 15 % ( 1 7 %) en solution dans de l'eau distillée. 2 La proportion du revertant de base (diméthylsulfoxyde) quasiment atoxique peut être accrue de façon importante Ce composé ne connait pas de limite de viscosité car sa vitesse de diffusion est très connue pour être incroyablement grande. Donc si l'on peut facilement la fixer à 20 o (+ 10 %) du volume de la solution de polyéthylène glycol, une augmentation de la propor- tion n'est pas en elle-mime un avantage à rechercher systématique- ment. 3 La proportion de la théophylline par contre devra observer une four- chette assez étroite La théophylline fixée à 50 el pour 30 ml de milieu est une norme optimum (et en accord avec l'expérience) de laquelle il est prudent de ne pas trop s'écarter en observant donc une proportion de 5 % ( 2,5 %) du mélange déjà obtenu. Extension de l'application de l'invention du domaine in vitro au do- maine in vivo Après les résultats obtenus et vérifiés in vitro, il est logique de penser à une utilisation dans le domaine de la thérapeutique en qua- lité de médicament anticancéreux. Pour cela il faut s'appuyer sur deux séries d'informations: 1 ') Informations toxicologiques 2-) Expérimentation clinique Afin d'étayer les possibilités d'utilisation industrielle pharma- ceutique de l'invention, ces deux points vont être successivement abor- dées. 1 l) Informations toxicologiques a) Le polyéthylène glycol est un composé chimique neutre dépourvu de toute toxicité et qui déjà utilisé en injections sous-cutanées ou intraveineuses n'a jamais eu aucun effet innédiat (allergique) ou secondaire, que ce soit sur l'animal ou chez l'homme. b) Le diméthylsulfoxyde C 2 H 60 S a fait l'objet d'études cliniques très approfondies en mime temps que très variées autant chez l'homme que sur l'animal à la suite d'études toxicologiques sur un certain nombre d'espèces animales et sur l'homme. Toutes ces recherches et études ont fait l'objet d'un compte rendu de 671 pages publié le 15 Mars 1967 dans les Annales de l'Académie des Sciences de New York (vol n 141, art 1, p 1 671) Mais à aucun moment ce composé chimique n'est cité comme revertant. Par ailleurs, il ressort de ces études que le diméthylsulfoxyde est dépourvu de toxicité. 25206 I 9 c) La théophylline C 7 H 8 N 402 (diméthyl 1,3 xanthine) est un composé chimique utilisé comme médicament depuis de très nombreuses années, diurétique, tonicardiaque et vasodilatateur bronchique employé en particulier en cas de crises d'asthme. Il est donc inutile de reprendre in extenso une étude toxicologique nouvelle de ces trois composants. 2 ') Expérimentation clinique Très sommaire pour l'instant elle permet pourtant de retenir les observations importantes suivantes obtenues après une série d'injec- tions par voie sous-cutanée. a) Sur le chien Il a été réalisé: l'obtention d'un flétrissement, d'un dessèche- ment et la disparition à 90 % d'une néoformation épidermique (petite tumeur blanche secondaire, à peau lisse et sans poils) la transformation sur le merne animal de la tumeur principale: un sarcome de la face sous oculaire, volumineux qui est devenu fluctuant pour en arriver à la fonte purulente et à l'écoulement externe comme un abcès froid. b) Sur l'homme Il a été obtenu sur un leucémique à quelques jours de l'issue fatale la chute du nombre des éléments de la lignée blanche de 000 à 10 000 en 48 heures avec conservation de la valeur fonc- tionnelle des éléments restants. REVENDICATIONS 1 ') Composition destinée à réaliser la reversion tumorale et caractérisée en ce qu'elle comprend: un modificateur membranaire (le polyéthylène glycol) un composé revertant de base (le diméthylsulfoxyde) et/ou un adjuvant (la théophylline) 2 ') Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle comprend: du polyéthylène glycol de poids moléculaire 1 000 ou 6 000 en solu- tion à 15 % (+ 7 %) dans de l'eau distillée du diméthylsulfoxyde pur ajouté à la solution de polyéthylène glycol dans la proportion de 20 7 (+ 10 %) et/ou de la théophylline ajoutée au mélange déjà obtenu dans la proportion de 5 % (+ 2,5 %) 3 ') Médicament destiné à la reversion tumorale caractérisé en ce qu'il comprend comme principes actifs l'association de la revendica- tion 1.