FR 2516927 A1 19830527 FR 8122606 A 19811126 La présente invention concerne un procédé de pré- paration industrielle de nouveaux matériaux collagéni- ques, insolubles et solubles, à partir de tissus placen- taires humains ainsi que les matériaux collagéniques hu- mains obtenus et leur application comme biomatériaux. Les collagènes sont les principaux constituants prothniques de tissus conjonctifs comme le derme, le cartilage, les tendons, les parois vasculaires aux- quels ils apportent les propriétés mécaniques essen- tielles à leurs fonctions physiologiques Actuellement au moins cinq types principaux de collagènes ont été isolés et caractérisés Ils peuvent être classés en deux groupes principaux: les collagènes de types I, II, III, présents dans les tissus sous forme de fibres et souvent appelés collagènes intersticiels et les col- lagénes de types IV et V appelés collagènes de membranes basales dont la composition moléculaire et la forme au sein des tissus sont encore mal connues. Ces collagènes, bien que différents de par leur séquence primaire, possèdent une structure tertiaire en triple hélice commune, structure qui les protège con- tre la dégradation par les enzymes protéolytiques autres que les collagénases. Après leur synthèse intracellulaire, les collagènes sont excrétés sous une forme soluble dans le milieu ex- tracellulaire o ils s'aggrègent pour former des fi- brilles Au cours de la maturation des tissus, ces fi- brilles s'insolubilisent rapidement du fait de la réticu- lation des molécules de collagènes par la formation de liaisons de covalence interchaines Ces liaisons pren- nent naissance à l'extrémité d'au moins une des molé- cules dans une région non hélicoïdale donc dans une région susceptible d'être clivée par l'action d'enzymes protéolytiques. Deux types de procédés permettent actuellement d'extraire d'un tissu des quantités notables de col- lagènes. Un de ces procédés utilise des tissus de jeunes mammifères dans lesquels existe une fraction importante de collagène non réticulé et utilise les propriétés de solubilité de ces collagènes dans des solutions salines neutres ou dans des acides dilués comme décrit par exem- ple dans les brevets français 1 568 829 et 1 596 789 qui préparent du collagène soluble à partir de la peau du veau. Ces procédés d'extraction présentent toutefois plusieurs inconvénients: d'une part ils nécessitent l'u- tilisation, comme matière de base, des seuls tissus animaux et d'autre part, ils ne permettent d'obtenir que du col- lagène type I. D'autres types de procédés utilisent des tissus matures; il devient alors indispensable d'utiliser l'acti- vité protéolytique d'enzymes comme la pepsine, la pronase ou la trypsine pour couper les télopeptides des collagènes non protégés par la triple hélice et rompre ainsi des liai- sons intermoléculaires responsables de leur insolubilité. Parmi les tissus humains, seul le tissu placen- taire est disponible en quantité suffisante pour permettre éventuellement une préparation de collagènes humains à l'échelle industrielle. Les difficultés rencontrées pour la préparation de collagènes purifiés à partir de ce tissu sont nombreuses et proviennent essentiellement: de la faible teneur en collagènes du tissu de départ (de 10 à 15 %) de l'insolubilité de ces collagènes de la présence possible dans le matériau de départ des virus de l'hépatite- On a proposé de traiter ce tissu par des solu- tions salines (CI Na) neutres ou acides (demande de brevet allemand DAS 26 16 939) ou des solutions d'urée concentrées (demande de brevet allemand OS 24 62 221) afin d'en ex- traire la faible partie soluble Différents travaux ef- fectués au niveau laboratoire ont amélioré cette extrac- tion des collagènes à partir de tissu placentaire par di- gestion ménagée à la pepsine de 20 à 40 % des collagènes de départ et leur fractionnement en collagènes de types 1, III, IV, V Les principaux inconvénients de ces méthodes sont les suivants la digestion enzymatique du tissu total néces- -5 site le traitement de poids et de volume impor- tants de tissu et d'extraits et l'utilisation de quantités élevées d'enzymes En effet, l'enzyme protéolytique agit à ce niveau non seulement sur les télopeptides du collagène mais aussi sur la masse des protéines non collagéniques ( 60 % du poids sec de départ il n'est possible d'extraire que 20 à 40 % du col- lagène total et les extraits sont très peu concen- trés en collagènes. les virus de l'hépatite contaminent généralement les différentes fractions extraites et donc empê- chent l'utilisation des produits comme biomaté- riaux Il devient alors nécessaire de partir de tissus placentaires préalablement sélectionnés par une méthode immunologique et dépourvus de ce- contaminant viral. La présente invention s'est donnée pour but de remédier à ces inconvénients en proposant un procédé de traitement industriel de tissus placentaires humains qui permet d'obtenir de nouveaux matériaux collagéniques in- solubles ainsi que des collagènes solubles de différents types notamment dépourvus de contamination virale. Ce procédé présente l'originalité: de partir de lots de tissus placentaires hu- mains même contaminés par les virus de l'hépatite de solubiliser jusqu'à 40 % du collagène total sans avoir à utiliser des enzymes protéolytiques de solubiliser la quasi totalité du collagène par une attaque enzymatique en utilisant de très faibles quantités d'une large gamme d'enzymes protéolytiques; -d'obtenirdes collagènes légèrement modifiés(désa- midation et élimination d'une partie des télopeptides) 2 516927 mais conservant leurs propriétés biologiques. de préparer un matériau en collagène insoluble pratiquement pur utilisable comme support de cul- tures de différents types de cellules tous les composés obtenus étant dépourvus de conta- mination virale peuvent être utilisés comme biomaté- riaux. Les étapes du procédé selon l'invention vont mainte- nant être décrites en détail: La mise en forme des tissus placentaires (qu'il s'agisse de tissus frais ou du résidu final des tissus traités en vue de la préparation des gamma-globulines et de l'albumine thérapeutiques) consiste en une succession de pressages, broyages, lavages en milieu neutre et acide. Ce matériau est alors soumis à un premier traitement al- calin, par exemple par des solutions de soude ( 0,1 à 0,5 M) ou de chaux saturée pendant des temps variables à des tem- pératures ne dépassant pas 101 C Ce premier traitement est essentiel pour plusieurs raisons: Il élimine la majeure partie des composés non col- lagéniques qui sont solubilisés; Il est une première étape d'inactivation des virus de l'hépatite; Il solubilise directement 10 à 20 % du collagène qui pourraient être purifiés par la méthode générale décrite par la suite (extrait 1); Il facilite la solubilisation ultérieure du colla- gène insoluble avec ou sans l'aide d'enzymes protéo- lytiques; - Il fournit un résidu insoluble A équivalent a seulement 20 % en poids du matériau sec de départ mais contenant plus de 70 % de collagène ( > 80 % du collagène de départ). A partir de ce résidu A, il est ensuite possible de préparer un matériau collagénique insoluble et de solubi- liser 20 à 35 % du collagène total sans utilisation d'en- zymes protéolytiques. 16927 Pour ce faire, le résidu A est traité successivement par une seconde solution alcaline (par exemple solution de soude 0,1 à 0,5 M à 40 C pendant 12 à 48 heures) (ex- trait 2) puis par une solution acide diluée (par exemple acide acétique ( 0,1 à 0,5 M) (extrait acide) à 40 C pen- dant 5 à 12 heures) Le résidu est appelé Résidu B. L'avantage de ce traitement du résidu A est multiple inactivation complète des virus de l'hépatite préparation d'un matériau insoluble (résidu B) purifié en collagène (teneur en collagène> 85 %) et correspondant à 50-70 % du collagène de départ solubilisation de 20 à 35 % du collagène total sans enzymes. Ces collagènes se trouvent concentrés dans le deuxième extrait alcalin ( 60-70 % de collagène) et dans l'extrait acide ( 75-85 % de collagène) ce qui facilite leur ultime purification. A partir du résidu A, il est également possible de solubiliser la quasi-totalité des collagènes présents. Le résidu A est soumis à une digestion enzymatique mé- nagée par des enzymes protéolytiques comme la pepsine, la pronase, la papaine, la trypsine Du fait de la fragilisa- tion par le premier traitement alcalin des extrémités non hélicoïdales, les collagènes sont solubilisés en totalité. L'extrait déjà purifié en collagène ( 70-80 %) peut ensuite subir le protocole de fractionnement mis au point pour les différents extraits. La purification et le fractionnement des collagènes présents dans les différents extraits (extraits alcalins n 1 et 2, extrait acide et extrait enzymatique) sont réalisés selon le protocole général suivant: la première étape comporte une chromatographie sur résine échangeuse d'anions de type DEAE, à l'échelle industrielle à une température ne dépassant pas 10 'C Les collagènes à l'état natif ne sont pas retenus sur la colonne alors que les glycoprotéines acides et les protéoglycannes contaminants restent sur la colonne De plus, dans le cas de l'extrait alcalin n 1 qui contient encore des virus de l'hépatite éven- tuellement non détruits, cette chromatographie permet la séparation des collagènes des contaminants viraux. La seconde étape est la précipitation fractionnée des collagènes par des sels en milieu acide Ainsi la frac- tion collagénique non retenue sur la colonne de DEAES Phé- rosil est concentrée puis passée en milieu acide (acide acétique 0,1 M) Par addition progressive de sels neutres (ex Na Ci) les collagènes de Types I et III sont précipités à 0,7 M en Na CI puis les collagènes de types IV et V à 1,2 M Na Cl Si la séparation ultime de ces deux groupes de collagènes est nécessaire, il est alors possible d'utiliser des méthodes classiques Pour les collagènes de type I et III une chromatographie sur DEAE -Sphérosil avec élution par gradient de force ionique croissante et pour les col- lagènesde Types IV et V une précipitation du Type V par une solution Na 2 l P 04 0,02 M Le collagène de Type IV res- tant en solution. Les collagènes extraits du placenta par le procédé décrit ici sont chimiquement différents des collagènes ex- traits par attaque pepsique du placenta total En effet, le traitement alcalin induit une désamidation partielle ( 20 à 30 %) de l'asparagine et de la glutamine qui se traduit par une charge négative plus importante La solubilité en milieu neutre de ces collagènes est améliorée Leurs di- mensions moléculaires et leur structure hélicoïdale ne sont pas modifiées mais leur capacité à reformer des fi- brilles in vitro est diminuée comme pour les collagènes pepsines Leurs propriétés biologiques ne sont cependant pas altérées ce qui permet leur utilisation comme biomatériaux comme décrit par la suite. La présente invention va maintenant être illustrée par les exemples suivants donnés 4 à titre non limitatif. Exemple 1 Des placentas humains ( 160 kg humides) fraîchement prélevés ou congelés, transportés à -20 'C et décongelés par passage sur une vis chauffante, sont broyés et pressés de façon à séparer le sang intersticiel du tissu placentaire. 16927 Le tissu est alors lavé dans une solution de Na Cl 9 'Zocon- tenant de l'éthanol ( 3 %) à raison de quatre volumes de so- lution pour 1 volume de tissu, de façon à éliminer le maxi- mum de liquide sanguin et d' hémoglobine. Le tissu résiduel ( 80 kg humides contenant 14 % de matière sèche soit 11, 2 kg dont 14,8 % de collagène soit 1,65 kg), est considéré comme le matériau de départ pour le calcul des taux d'extraction Il est soumis à un pre- mier traitement alcalin par 2 x 400 litres de solution de Na OH 0,5 M à 40 C pendant 48 heures Après centrifugation mn à 2000 g, l'extrait alcalin (n'1) contenant 15 % du collagène de départ est soit éliminé, soit soumis au schéma de purification des collagènes décrits dans l'exemple N O 2. Le résidu du traitement alcalin n" 1 ( 20 kg humide) est appelé résidu A Il contient 17 % du poids sec de départ soit 1,9 kg et 82 % du collagène de départ ( 1,35 kg) Sa te- neur en collagène étant en effet de 71 %. Ce résidu A est soumis à un second traitement alcalin ( 100 litres de Na OH 0,5 M) pendant 48 heures à 4 'C Après centrifugation l'extrait alcalin n' 2 ( 0,4 kg) qui contient 16 % du collagène total peut être soit éliminé, soit traité selon le protocole décrit dans l'exemple n' 2 Le résidu de ce deuxième traitement alcalin est extrait par 2 x 80 litres d'une solution d'acide acétique 0,5 M pendant 12 heures à 10 C Cet extrait acide contient 5 % du collagène total ( 0,08 kg) Le résidu final, appelé résidu B, est lavé à l'eau distillée puis conservé congelé ou lyophilisé sui- vant l'utilisation prévue Il correspond à 12 % du poids sec de départ ( 1, 34 kg) et à 68 % du collagène ( 1,13 kg) Sa teneur en collagène est en effet de 85 %. Exemple 2 kg du résidu A (résidu du premier traitement al- calin du tissu placentaire) et contenant 1,9 kg de matière sèche dont 1,35 kg de collagène) sont placés dans 100 li- tres d'acide acétique 0,5 M contenant 100 g de pepsine (Organotechnie, Type 700, 10000 NS) Après incubation 24 heures à 10 i C, le résidu insoluble (moins de 10 % du rési- du A) est élimin 6 par centrifugation L'extrait pepsique est concentr 6 par ultrafiltration sur membrane Millipore (PTGC 1000) puis repris et équilibr 6 dans un tampon phos- phate 0,1 M p H 6,8. Cette solution est chromatographiée sur une colonne Pharmacia de 50 cm/1 O Ocm garnie d'une résine DEAE Sph 6 rosil à une vitesse d'élution de 10 1/heure La fraction non retenue ( 80 1) qui contient les collagènes est ensuite de nouveau concentrée et équilibrée dans 50 litres d'acide ac 6 tique 0,5 M par ultrafiltration Des quantit 6 S croissantes de Na Cl sont ajoutées à cette solution et,à une concentra- tion de 0,7 M en Na C; les collagènes de Types I et III copr 6 cipitent ( 720 g) et à 1,2 M en Na 1 les collagènes de types IV et V ( 50 g) Afin d'améliorer la purification, on peut r 6 aliser des redissolutions et des repr 6 cipitations salines successives. Ce processus de purification (chromatographie sur DEAE Sph 6 rosil + pr 6 cipitations salines) peut être utilisé pour les collagènes extraits selon l'exemple 1 sans digestion enzymatique et contenus dans les extraits alcalins n 1 et n 2 et l'extrait acide. Le dosage immunologique par radioimmunoessai de l'an- tig 6 nicit 6 virale dans les différents résidus et extraits de ces deux exemples montre que: après deux traitements alcalins, l'antigène viral a complètement disparu; après un seul traitement alcalin l'antigénicité est att 6 nu 6 e mais encore pr 6 sente Elle est alors éli- minée totalement des collagènes extraits par la chro- matographie sur DEAE Sphérosil. L'invention concerne également les applications indus- trielles, notamment dans les domaines de la biotechnologie et de la pharmacie des diff 6 rentes préparations de colla- gènes placentaires humains obtenus par mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Applications en biotechnologie: a) Cultures de cellules: Les collagènes obtenus selon l'invention sont utili- sables en tant que supports de culture invitro pour di- verses espèces et types cellulaires différenciés. A titre d'exemple non limitatif, on peut indiquer la culture cellulaire suivante: Les collagènes insolubles (résidu B de l'exemple 1) obtenus à la suite des extractions alcalines (étapes i et 9) et constitués des mélanges des types I, III, V, sont textures sous forme de film puis déposés sur le fond de différents récipients pour culture de tissu tels que cuves, flacons, boites de Pétri, etc De même, les collagènes placentaires solubles de différents types obtenus selon le procédé objet de l'invention peuvent être déposés avec ou sans réticulation à la surface de divers récipients (fla- cons, boites, lamelles, etc)ou matériaux (billes de verre, etc) et servir de supports de culture à divers types cellulaires Les récipients contenant la couche de collagène sont ensuite stérilisés soit à la chaleur ( 1101 C à l'autoclave pendant 40 mn) soit par rayonnements (rayons-r ou ultraviolets) On peut alors procéder à la mise en culture d'hépatocytes de la manière suivante: on pro- cède à l'exérèse chirurgicale stérile d'un fragment de foie de singe Le prélèvement est sectionné en petits fragments de 5 mm de diamètre, placés en milieu de Bagle puis dis- sociés par grattage entre 2 lames de verre stériles La suspension cellulaire obtenue est dénombrée par dilution- numération en cellule de Thoma sous le microscope, puis ajustée à 107 cellules/ml en milieu de Eagle additionné de 10 % de sérum de veau foetal On dépose alors 10 ml ( 100 x 106 cellules) de la suspension cellulaire sur le film de collagène contenu dans un flacon de 250 ml et on rajoute 90 ml de milieu de Eagle additionné de 10 % de sérum de veau foetal Le flacon fermé est placé à l'étuve à 370 C pendant 24 heures Le surnageant liquide est alors éliminé puis remplacé par 100 ml de milieu neuf (Eagle + 20 % sérum veau foetal) Le flacon est replacé à 370 C pendant plusieurs jours Dans ces conditions, la culture d'hépa- tocytes différenciés sur lit de collagène peut être obser- vée pendant plus de 10 jours Cette culture d'hépatocytes différenciés peut constituer un support de replication et de multiplication des virus de l'hépatite humaine en vue de la fabrication ultérieure d'un vaccin. Les cultures de diverses cellules différenciées telles que lymphocytes, macrophages, chondrocytes, endothéliocites, cellules nerveuses, cellules glandulaires peuvent être éga- lement obtenues sur couche de collagène placentaire humain. b) Culture d'embryons: Les boîtes de Pétri recouvertes d'un gel-de collagène insoluble peuvent recevoir des ovocytes fécondés de mammi- fères, cultivés en milieu de Ham Le support collagénique facilite une meilleure nidation et une segmentation amé- liorée et prolongée de l'ovocyte au-delà du stade blas- tocyste Cette culture embryonnaire avancée autorise une observation, une analyse et une sélection accrues de l'embryon avant son transfert dans l'utérus. c) Culture de tissus ou d'organes: La culture de fragments de tissus ou d'organes dif- férenciés (peau, glandes thyroïde, surrénale, pancréas etc) peut également être obtenue sur supports collage- niques placentaires humains obtenus selon l'invention. d) Fabrication de matériels et appareils utilisables en génie biologique et médical et en génie industriel: Les collagènes obtenus selon l'invention sont uti- lisables par exemple pour la fabrication d'appareils à visées thérapeutiques d'épuration ou de complémentation du plasma ou du sang humain (dialyse, pancréas artifi- ciel, etc) C'est ainsi qu'ils peuvent être utilisés sous forme de membranes pouvant être montées en parallèle dans un module destiné à la dialyse extracorporelle chez l'homme Les membranes peuvent être prétraitées avant montage, par exemple par greffage ou inclusion dans ou sur le matériel collagénique de molécules biologiques actives anticorps, antigènes, enzymes, hormones, etc), de fa- çon à présenter une spécificité d'action immunologique, enzymatique ou hormonale qui se manifestera lors d'une dialyse, d'une épuration ou d'une complémentation thé- rapeutique par circulation sanguine extracorporelle chez l'homme. De même, les collagènes obtenus selon l'invention et inclus sous forme de membranes dans des appareils in- dustriels de filtration, de dialyse ou de fractionnement, permettent d'obtenir des séparations industrielles de liquides biologiques complexes hautement résolutives par chromatographie d'affinité. Fabrication de Drothèses et de biomatériaux à usage pharmaceutique: a) Collagènes insolubles Les collagènes insolubles selon l'invention peu- vent être utilisés dans la fabrication d'éponges hémos- tatiques ou encore textures sous forme de fils de suture, ou de membranes à usage chirurgical. Les collagènes insolubles obtenus selon l'invention peuvent être texturés en film pouvant recevoir par codépo- sition, par adsorption, par emprisonnement mécanique ou par greffage tous les composés biologiquement actifs tels qu'enzymes, hormones, antigènes, anticorps, vitamines et facteurs de croissance; ces filmde collagène ainsi ac- tivés constituent des prothèses implantables biologique- ment actives et aux effets thérapeutiques permanents et filés pour un certain nombres d'affections humaines. b) Collagènes solubles: Les collagène solubleosn répars sous forme de mi- crofibrilles biodégradables/utilisables soit isolément dans les thérapeutiques de complémentation post-trauma- tique, soit combinés à de l'hémoglobine humaine en vue par exemple de la fabrication de sang synthétique homologue biodégradable. Les prothèses et biomatériaux préparés à partir des différents types de collagènes humains d'origine placen- taire, seuls ou en association, obtenus selon l'invention, sont dépourvus d'antigénicité notable pour l'espèce hu- maine Ils sont de ce fait bien tolérés et représentent une nouvelle génération -de biomatériaux pour la méde- cine humaine. REVENDICATIONS - 1 Procédé de préparation industrielle de matériaux collagéniques humains à partir de tissus placentaires hu- mains, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre ledit tissu placentaire après pressage, broyage et lavage en milieu neutre et acide à un traitement en milieu alcalin à une température inférieure ou égale à 100 C puis à sou- mettre les portions de collagène solubilisées au cours de ce traitement, de même que les solutions de collagènes ré- sultant d'un traitement ultérieur éventuel de solubilisa- tion au moins partielle du résidu insoluble à une purifi- cation par chromatographie sur résine échangeuse d'anions, à une température inférieure ou égale à 10 'C suivie d'une précipitation fractionnée des collagènes par des sels en milieu acide. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les tissus placentaires humains sont choisis parmi les tissus frais et les résidus tissulaires finals de placentas traités en vue de la préparation des gamma- globulines et de l'albumine thérapeutiques. 3 Procédé selon les revendications 1 et 2, caracté- risé en ce que le milieu alcalin est choisi parmi les so- lutions de soude et de potasse de 0,1 à 0,5 M et la chaux saturée. 4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le traitement ultérieur de solubilisation du rési- du insoluble est un traitement en milieu alcalin à tempé- rature inférieure à 10 C et de préférence aux environs de 4 C, éventuellement suivi d'un traitement acide à une température inférieure à 101 C et de préférence aux envi- rons de 4 C. -Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les résidus insolubles sont solubilisés par digestion enzymatique ménagée par des en- zymes protéolytiques. 6 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les résidus de collagène in- 16927 solubles provenant des différentes étapes du traitement sont isolés par toute méthode connue en soi. 7 Biomatériaux collagéniques humains obtenus par mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des re- vendications 1 à 6. 8 Applications des matériaux collagéniques humains selon la revendication 7 comme biomatériaux utilisables en biotechnologie et en pharmacie, d'une parfaite innocui- té immunologique pour l'espèce humaine. 9 Application des biomatériaux selon les revendi- cations 7 et 8 comme supports de culture de cellules, d'embryons, de tissus et/ou d'organes. Applications des biomatériaux selon les reven- dications 7 et 8 en tant qu'éponges à usage hémostatique, fils de suture, solutés et supports biodégradables de com- posés biologiquement actifs et prothèses (films, tubes, ciment, poudre, microfibrilles, etc). 11 Applications des biomatériaux selon les reven- dications 7 et 8 en tant que matériels et appareils extra- corporels utilisables en géniebiomédical pour des théra- peutiques d'épuration ou de complémentation du plasma ou du sang humain (dialyse, pancréas artificiel, etc) après greffage ou inclusion dans ou sur le matériel col- lagénique de molécules biologiques actives: anticorps, antigènes, enzymes, hormones, etc 12 Applications des biomatériaux selon les reven- dications 7 et 8 en tant que matériels et appareils uti- lisables en génie industriel pour les processus de frac- tionnement sélectifs (chromatographie d'affinité) de li- quides biologiques complexes.