FR 2523305 A1 19830916 FR 8221469 A 19821221 Â e- "Dispositif pour mesurer la polarisation de fluorencencee L'invention concerne un dispositif pour me- surer la polarisation de fluorescence de cellules et de particules, lesquelles, alignées isolément le long d'un fil sont irradiées par un champ d'éclairage Lors de la mesure du degré de polarlsation de fluorescence, la lumière de fluorescence est habiytu,- lement, soit détectée sous 90 avec un certain arngle d'ouverture, soit détectée dans la direction arr Istr, ( O ^) dans une zone angulaire En vue d'4 quilibrer les ldeul panneaux de détection (photodétecte r, amplificateur d'c- lectrons) pour la lumière de fluoresce-ne pi aris ral lèlement ou bien perpendiculairement, on fa? dan as d'un dispositif 900, pivoter le plan de polariî'ation Nile la lumière d'excitation de façon qa 2 il se îJ uie dr U plan sous-tendu par les deux axes optiquee (e:citat n détection) Les deux panneaux de détection reeoivert aidrs de la lumière noh polarisée et peuvent ainsi at régi r,: sur la même sensibilité lors de la mesure propprement i le vecteur de polarisation est perpendirn'Jaire a à plan Comme la fluorescence est captée avec un eart'ail angle d'ouverture, les différences d'indices de r'raction ds chaque cellule, mais aussi dans les milieux envi rounarv t jouent un rôle essentiel lors de l'atténuation de i:unue des composantes de polarisation au cours de la mesue- Un tel équilibrage devait en conséquence dans le disposi Fif 2.- à 90 , s'effectuer pour chaque cellule à mesurer, mais ceci est tout à fait impraticable lorsque pour l'enre- gistrement d'une fonction de répartition, de grandes quan- tités de cellules doivent tre successivement mesurées dans un court laps de temps, comme cela est par exemple le cas pour la cytométrie de débit. Dans le cas de la mesure de polarisation de fluorescence en Iumière incidente un certain avantage ré- sulte de ce que les influences de la dispersion de la lumière de fluorescence sur les structures internes, sont d'une importance beaucoup plus réduite sur la mesure du degré réel de polarisation de fluorescence que dans le cas de la mesure à 90 , Pour iéquilibrge des deux photo- détecteurs, on fait également pivober pour une mesure in- dividuelle, la direction de polarisation de la lumière in- cidente de 90 o si bien que le détecteur pour la lumière de fluorescence polarisée parallèlu:ment, reçoit alors la lumière de fluorescence polarisé; perpendiculairement et vice-versa Ce procédé présente en outre l'avantage supplémentaire que deux mesures individuelles contribuent à l'amélioration de la précision le Ia mesure du degré de polarisation de fluorescence* Lors d'une mesure rndividuei 2 e rapide sur un groupe important de cellules,, &roupe set au choix divisé en une ou plusieurs paires die population de cellu- les d'importance respective identique 3 Pour chacune des paires, le degré de polarisation de fluorescence de l'une des moitiés de la population, est alors tout d'abord enre- gistré sur un histogramme avec une polarisation d'excita- lion, puis on fait pivoter la polarisation d'excitation de 900 et le degré de polarisation de fluorescence de la seconde moitié est enregistré sur un second histogramre. Pour un équilibrage parfait des canaux de détection, en supposant que les deux moitiés de la population de cellu- les présentent un comportement identique en ce qui concerne 3.- leur degré de polarisation de fluorescence, les deux his- tograme de degré de polarisation doivent être identiques. Si ces deux histogramres ne sont pas identiques, ce qui peut Qtre observé au cours de la pluralité des mesures, alors, contrairement & la mesure dans un dispositif à 900 , les valeur obtenues ne doivent pas être rejetées mais peu- vent à l'aide d'un calculateur de table, être combinées de façon & obtenir un histogramme corrigé du degré de po- larisation de fluorescence (voir: V G Eisert und V. Beilker; Biophys J 31, 97 ( 1980)). Tous ces procédés de mesures nécessitent pour l'équilibrage du système de mesure ainsi que pour la cor- rection, deux mesures individuelles pour un objet unique. Dans le cas du dispositif à 900, cette correction ne peut pas étre effectuée du tout, ou alors seulement par équili- brage avant la mesure et contrôle de l'équilibrage aprbs la mesure, cependant que dans le cas de la polarisation de fluorescence en lumière incidente, elle peut être ef- fectuée par l'intermédiaire d'une analyse statistique des sous-populations. Le but de l'invention est alors de créer un dispositif grace auquel une mesure de la polarisation de la lumibre de fluorescence est possible avec auto-correc- tion dans la mmse émisphère de l'excitation de la fluores- cence de particules individuelles, auquel cas les cellules ou particules passent individuellement et successivement à travers un champ de mesures et le degré de polarisation de l'émission de fluorescence est alors mesuré de façon que les fluctuations inévitables dans le systbme de mesure optique et électronique, n'influencent pas la valeur de w Eee. Ce but est atteint, conformément à l'inven- tion, en ce que les cellules traversent l'un après l'autre deux faisceaux lumineux pour exciter leur fluorescence, les directions de polarisation des faisceaux d'excitation 4.- étant perpendiculaires l'une à l'autre, une paire de ca- naux de détection enregistrant successivement les deux composantes de la fluorescence aux deux emplacements d'exci- tation, tandis qu'il est prévu un système dn&lyse qui, à partir des valeurs mesurées, calcule le degré de polarisa- tion de fluorescence corrigé pour les différentes cellules. D'autres exemples de réalisation et d'autres formes de l'invention découlent avantageusement des carac- téristiques ci-après: Les deux faisceaux lumineux sont susceptibles d'être obtenus par division d'un faisceau d'excitation non polarisé, ou bien d'un faisceau d'excitation polarisé, en réglant la direction de polarisation selon un angle de 450 par rapport aux directions de polarisation après divi- cion. L'excitation s'effectue au moyen d'un faisceau lumineux dont on fait pivoter la direction de polarisation de 900 pendant l'excitation de la fluorescence. L'extinction est susceptible d'être mesurée dans les deux zones d'excitation. Dans le cas de la correction de la mesure de polarisation de fluorescence effectuée conformément à l'in- vention sur un objet unique, dans le dispositif à lu- mière incidente gr Ace à une autre mesure avec la polarisa- tion d'excitation ayant pivoté de 900, il existe ainsi en principe, deux possibilités: Système à un faisceau: tandis que la cellule est dans le champ de mesure ou bien se déplace à travers celui- ci, on fait pivoter la direction de polarisation de 901 et gràce à un branchement électronique approprié, quatre valeurs de mesure sont enregistrées pour l'ob- jet considéré, (deux mesures d'intensité parallèles, deux mesures d'intensité perpendiculaires) Cette pos- sibilité est réalisable dans le cas d'un changement lent de l'objet, 5.2. Système à double faisceaux: un objet traverse dans un champ de mesure deux faisceaux de lumière qui exci- tent successivement la fluorescence Les directions de polarisation des faisceaux d'excitation Sont alors perpendiculaires l'une à l'autre Les deux ccmposantes de polarisation de fluorescence aux deux emplacemente d'excitation sont successivement enregistrées i l'aie d'une paire de canaux de détection Un système 1 leztro- nique d'analyse spécial calcule à partir des quatre -ra- leurs de mesure existantes, le degré de polarisation de fluorescence corrigé avant que l'objet suivant pé- nètre dans le champ de mesure, Lors de la division d'un faisceau d'excitation non polarisé selon ces deux directions de polarisation, celles-ci-peuvent Atre ga- lement séparées spatialement en deux faisceaux parole lèles en utilisant un cristal de calcite coupé de a- çon appropriée. Ce dispositif conforme à l'invention permet pour la première fois, en maintenant une correction inter- ne, de mesurer en successions rapides des modiflcations dans le degré de polarisation des cellules individuelles d'un groupe La vitesse actuellement obtenue du traitemernt et de la mise en mémoire électronique et des valeaurs de mesure, permet une mesure toutes les 100 ksecondee envi- ron Ainsi, en mémorisant les données de mesures: N nne liste, on peut également mesurer de rapides modifiet-: du degré de polarisation de fluorescence sur une popua tion se modifiant Le calcul du degré de polarisation à partir de quatre mesures individuelles, permet en outre, pour chaque cellule) correction numérique de ce Que l'oa appelle l'ouverture et l'erreur de diffractior L'invention va être expliquée plus en dêtail en se référant à un exemple de réalisation représenté sur le dessin ci-joint dans lequel: la figure 1 est une représentation schéma- 6.- tique de l'installation d'irradiation, la figure 2 montre le dispositif de détec- tion, la figure 3 est une représentation schémati- que du branchement de calcul et de contrôle pour l'auto- correction. la figure 4 est un schéma de l'unité d'ana- lyse d'impulsions. La figure 1 montre schématiquement l'installa- tion d'irradiation des cellules 2, 2 ', alignées iso- lément sur un fil d'écoulement 1 Un faisceau laser 3 est à cet effet divisé dans un diviseur de polarisation 4 en deux faisceaux individuels 5, 6, dont les directions de polarisation B sont perpendiculaires l'une à l'autre (dou- ble flèche) Un miroir de deviation 7 faisant un angle avec les deux faisceaux 5, 6, dirige les deux faisceaux , 6 s'étendant parallèlement l'un à l'autre, sur l'opti- que 8, comportant notamment les deux lentilles 9 et 10. La lentille 9 focalise les deux faisceaux 5, 6 avec leurs directiomedepolarisation perpendiculaires l'une à l'autre, sur deux zones 11, 12 à l'intérieur du fil d'écoulement 1, zones à travers lesquelles passent les cellules individuel- les 2, 2 ', en conservant une distance constante les unes par rapport aux autres, L'extinction est mesurée au moyen des deux détecteurs 13, 14 sur lesquels est dirigé le rayonnement au moyen de la lentille 10. La figure 2 représente le diopositif de détec- tion du rayonnement de fluorescence émis par les cellules 2 (seul est représenté ici le passage d'une cellule 2 à travers les deux zones de focalisation 11, 12) L'instal- lation d'éclairement avec les deux faisceaux 5, 6 est ici omise pour simplifier la figure, les trajets des faisceaux se situant toutefois sur le même axe optique Le rayonne- ment de fluorescence excité dans les zones 11, 12 dans les cellules 2, 2 ' par le rayonnement 5, 6 traversant la 7.- fenêtre plane 18, avec des directions de polarisation per- pendiculaires l'une à l'autre et une intensité différente en ce qui concerne la zone d'excitation 11 ou bien 12, de l'emplacement de stationnement de la cellule 2 (une fois dans la zone 11 et après le temps L 4 t dans la zone 12) est simultanément mesurée avec le détecteur 15 ( PMX) et avec le détecteur 16 (PM) A cet effet, les rayonne- ments de fluorescence sont à nouveau divisés par un autre diviseur de rayonnement de polarisation 17 selon la direc- tion de polarisation et de faqon correspondante, au Kdegrés de polarisation des cellules 2 excitées, si bien que res- pectivement, deux paires de valeurs de mesures des détec- teurs 15 ou 16 à un intervalle de temps úi t, c'est-à-dire pendant le parcours des emplacements de mesure 11 et 12, sont captées indépendamment l'une de l'autre Ces quatre valeurs de mesures servent alors à l'autocorrection du système de mesure de polarisation de fluorescence du type correspondant à la présente invention L'extinction, comme déjà indiqué sur la figure 1, est mesurée avec les deux détecteurs 13 et 14, le rayonnement d'excitation ou de fluorescence quittant le système à travers la fenêtre 19 également plane. Le branchement de calcul et de contrôle pour cette auto-correction est représenté schématiquement sur la figure 3 Les quatre valeurs de mesures 2 x PXI, 2 x PM des détecteurs 15, 16, dont l'intensité et la forme sont représentées dans l'intervalle de temps ú t, sont appliquées par l'intermédiaire d'un branchement de décodage de maximum avec une logique de contrôle TTé 20 t et délivre les amplitudes X 1, X 2, Y 1, Y 2, au convertisseur analogique numérique 21 puis, par l'intermédiaire de la li- gne 22 d'adresses et de contrôle de données, au micro- calculateur Z-8 u référencé 23 Ce microcalculateur 23 avec ses appareillages périphériques appropriés 24, 25, calcule respectivement l'auto-correction par cellules 2 et sert à 8.- la mémorisation des données, dans la mesure o aucune transmission immédiate par l'intermédiaire de 25 sur un minicalculateur n'a lieu Les valeurs de mesures d'ex- tinction EX 1, EX 2, dont la position dans le temps corres- pondant aux valeurs de mesures PM x est également représen- tée, sont appliquées à un décodeur 26, qui est en liaison avec l'unité de calcul 23 par l'intermédiaire du calcula- teur t 27 (Start-Stop). Les signaux respectifs aux limites 51, 52 (voir figures 3 et 4) ainsi que les signaux TLL et TVL qui sont engendrés en 27 par comparaison de l'état de comptage actuel 4 t avec les valeurs ( 1 O) d t et ( 1 +o)/tt transmises à partir de 23 et 27, sont appli- quées à l'unité d'analyse d'impulsion selon la figure 4. Pour TLL et TUL on a: TLL= i 1, si t ( 1 c() t 0 dans les autres cas TUL = 1 si t > ( 1 + oc) t 0 dans les autres cas L'ensemble logique de calculation de 51, 32, TUL, TLL permettant d'établir les signaux de commande pour le décodeur de maximum en 20 est représenté sur la figure 4 28 bloque l'unité poulr respectivement un intervalle de temps réglable (par exemple 40 i s) après chaque particule par 51 29 combine les conditions possibles d'erreurs et positionne éventuellement la bascule d'erreur 30, qui peut être interrogée à partir de 23 par l'intermédiaire de ERRORFLAG Les bascules 31 et 32 servent à mémoriser le maximum d'impulsions dans le décodeur de maximum et peuvent être ramenées à zéro par l'intermédiaire de (RI 1) par 23 Pour chaque particule l'ensemble calcul est démar- ré en 23 par l'intermédiaire de (INTERRUPT) Par l'inter- médiaire de là mono-bascule 33 la bascule 34 est position- née pour empocher la commande du décodeur de maximum par 9.- une autre particule passant à l'intérieur du temps de ca l- cul en 23 le premier foyer Il * Simu-1 tanémerit 33 détermin e la longueur du signal IN'TERRUPT, tj t 4 (î-o t.:O O -O O ( 1 t cm. O I if' 1 1 Iciïci est une grandeur pouvant être libre- ment choisie pour la largeur de la f enôtre de temps (par exemple = 0 '1) t: temps de parcours WT: temps de parcours moyen (après calculation) Légende - Colonne ( 1) S temps de parcours A t entre les -JJ 1 i Ltel colonne ( 2): colonne ( 3): colonne ( 4): colonne ( 5) 51 et 52 interruption simultanée des focyer: Si et 52,(zones 11 f, 12)soit par une particule trop longue, soit par une seconde rarticu J e, particules en Sl (zone 1 i) à l'intéricuz d'tze intervalle de temps (pouvant être clioîsi à volonté) après une interruption de la lîmite Si. Pour la formation de la moyennre du te-mp ic parcours se présentant à l'enseub-le de a cul. mesure de la polarisation de fluorescence. une condition supplémentaire à ce sujet est que fintensité de fluorescence de l'ensemble des quatre canaux de mesure se situe au-dessus d'un niveau pouvrant être choisi Suivant l'usage nous indiquons que les expressions du texte comme ERIWFLAG signifient: drapeau d'erreur et ITERRUPT À signal d' interruption. 1 l s- REVENDICATIONS 1. Dispositif pour mesurer la polarisation de fluorescence de cellules, lesquelles, alignées isolé- ment le long d'un fil, sont irradiées par un champ d'éclai- rement, dispositif caractérisé en ce que les cellules ( 2, 2 ') traversent l'un après l'autre deux faisceaux lu- mineux ( 5, 6) pour exciter leur fluorescence, les direc- tions de polarisation des faisceaux d'excitation ( 5, 6) étant perpendiculaires l'une à l'autre, une paire de ca- naux de détection ( 15, 16) enregistrant successivement les deux composantes de la fluorescence aux deux emplace- ments ( 11, 12) d'excitation, tandis qu'il est prévu un système d'analyse ( 20 à 27) qui à partir des valeurs me- surées, calcule le degré de polarisation de fluorescence corrigé pour les différentes cellules ( 2, 2 '). 2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que les deux faisceaux lumineux ( 5, 6) sont susceptibles d'être obtenus par division d'un fais- ceau d'excitation non polarisé ( 3) ou bien d'un faisceau d'excitation polarisé ( 3) en réglant la direction de pola- risation selon un angle de 450 par rapport aux directions de polarisation après division. 3. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'excitation s'effectue au moyen d'un faisceau lumineux dont on fait pivoter la direction de polarisation de 900 pendant l'excitation de la fluores- cence. 4, Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'extinction est susceptible d'être mesurée dans les deux zones d'exci- tation ( 11, 12).