FR 2520378 A1 19830729 FR 8201325 A 19820128 La présente invention est relative à des perfectionnements apportés aux procédés de préparation de suspensions de cellules fraîches stabilisées destinées à l'usage pharmaceutique, cosmé- tique ou alimentaire. Les cellules, qu'elles soient d'origine végétale, animale, humaine ou microbienne, constituent de véritables réservoirs des divers organites et principes actifs et sont toujours très utilisées soit telles quelles, soit sous forme t'extraits dans de nombreuses préparations et notamment à usage pharmaceutique. Les procédés pour obtenir ces préparations cellulaires comportent deux grands écueils Le premier écueil est constitué par le broyage lui-même s'il est pratiqué sans précautions, il a pour effet immédiat de mettre en contact des sites qui, à l'état normal, étaient géo- graphiquement séparés et, de ce fait, favoriser l'action d'en- zymes sur des substrats. Un autre écueil est constitué par divers processus physi- queset chimiques mis en oeuvre (tels que température, p H, sol- vants, etc) qui tous ont une influence plus ou moins néfaste sur les principes actifs et l'équipement enzymatique de la cel- lule. Enfin, il est très important de stabiliser les différentes préparations cellulaires afin d'éviter la dégradation des diffé- rents principes actifs avec le temps. Les différents procédés tels que pratiqués actuellement, et ceci malgré les grandes précautions prises, n'ont pu éviter les différents écueils et fournissent des préparations cellulaires transformées et notablement appauvries en diffé- rents principes actifs. Ainsi par exemple, même la lyophilisation qui permet un séchage rapide à basse température outre qu'elle constitue une technique coûteuse, provoque la perte par évaporation des divers principes volatils tels que les huiles essentielles, certaines amines et divers arômes Elle provoque même certaines altéra- tions dues à la phase ultime du séchage fait à une température voisine de 20 'C. Ainsi également par exemple, il y a _is risques S 'eux de dégra- dation par l'extraction aux divers solvants, très largement utilisée et qui fait appel à la solubilisation des substances contenues dans la cellule En outre, cette solubilisation n'est pas complète, même si l'on fait appel à toute une série de solvants successifs L'évaporation du solvant (ou même l'extraction elle-même),se fait parfois à chaud et est donc dangereuse pour les divers principes actifs De plus, les rési- dus des divers solvants s'avèrent souvent toxiques. La'présente invention s'est par conséquent fixé pour but de pourvoir à un procédé de préparation de suspensions de cel- lules fraîches, qui répond mieux aux nécessités de la pratique que les procédés visant au même but et antérieurement connus, notamment en ce qu'il préserve la quasi totalité des principes actifs de la cellule tout en étant économique et facile à mettre en oeuvre. La présente invention a pour objet un procédé de prépara- tion de suspensionsde cellules fraîches stabilisées, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: a) nettoyage poussé de la matière première (plante ou organe de l'animal),opéré 24 heures au plus tard après la récolte; b) broyage à une température inférieure à O C jusqu'à l'obtention d'une granulométrie inférieure à environ 100 g; c) un premier broyage colloidal ou micronisation en présence d'un solvant miscible à l'eau à une température inférieure à -5 C et de préférence inférieure à -15 C afin d'obtenir des par- ticules de granulométrie'inférieures à 50; d) un deuxième broyage colloidal ou micronisation opéré dans les mêmes conditions que le premier broyage colloidal, mais à un débit deux fois plus faible que le premier broyage col- loidal, afin d'obtenirdes particules de granulométrie moyenne de , mais toujours inférieure à 20; e) conditionnement de la suspension de cellules fraîches à une température inférieure à 30 C dans un flaconnage opaque, à l'abri de la chaleur. Conformément à l'invention, le solvant utilisé est pris dans le groupe qui comprend l'éthanol, le glycérol, le mono- propylène-glycol, le dipropylène-glycol, le triprcpylène-glycol, l'éthyl-diglycol, l'éthylène-glycol et l'isopopylidène-glycérol. Selon un mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention, le broyage opéré en étape b) du pro- cédé est également effectué en présence d'un solvant choisi parmi ceux mentionnés ci-dessus et en quantité M telle que M soit compris entre RP et 5 RP, M étant le poids de solvant utilisé (pur ou dilué) en litres; R étant la teneur en matière sèche de là matière première; et P étant le poids de la matière première en kg. Conformément à l'invention, la quantité M' du solvant (pur ou dilué) utilisé lors des broyages colloïdaux ou micro- nisations est comprise entre 10 RP et 100 RP, R et P ayant la même signification que ci-dessus Il est bien entendu que le solvant utilisé sera le même que celui éventuellement mis en oeuvre à l'étape b) du procédé et l'on se contentera d'ajuster la quantité M pour obtenir M' qui sera compris entre 10 RP et RP. Conformément à l'invention, la quantité d'eau de dilu- tion -éventuellement ajoutée au solvant sera calculée de manière à ce que le point de congélation du solvant dilué soit toujours inférieur à -150 C. Selon un mode de réalisation particulièrement avantagrux du procédé objet de la présente invention, on procède à un troisième, quatrième, nième broyage colloïdal ou micro- nisation, s'il s'avérait que la granulométrie inférieure à 20 g n'était pas atteinte. Suivant une modalité particulière de ce mode de réalisation, le débit de chacun des broyages colloïdaux successifs sera réduit entre 1,5 à 2 fois. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention pourra être mieux comprise à l'aide du complé- ment de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. Il doit être bien entendu toutefois, que ces exemples de mise en oeuvre qui sont décrits ci-après sont donnés unique- ment à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemples de préparation: EXEMPLE I préparation d'une suspension éthanoliqcue de cellules de feuilles de Cynara scolymus destinée à l'usage pharmaceutique. Les feuilles d'artichaut ou Cynara scolymus sont employées en thérapeutique pour traiter des désordres hépatiques Les feuilles aussitôt après la cueillette sont passées sous un cou- rant d'eau froide, puis soigneusement égouttées et placées au congélateur à -85 C. Cinq échantillons de 10 g environ sont broyés dans un mixer de laboratoire placés à l'étuve à 120 C et pesés à poids constant pour déterminer R, soit le taux de matières sèches On prélève 10 kg de feuilles fraîches congelées et on les place dans un broyeur à couteaux d'une contenance de 60 litres. On pèse 10 kg d'éthanol pur que l'on dilue par 18 kg d'eau distillée, et on le verse dans une cuve agitée lentement puis on abaisse la température à -50 C par une addition d'azote liquide Quand la température est atteinte, on verse l'éthanol dilué refroidi dans le broyeur à couteaux et l'on broie 2 minutes à 3000 tpm. La température de la suspension est alors abaissée si besoin est à -25 C puis on opère un premier broyage colloidal à un débit de 1,5 litre par seconde La température est à nou- veau portée à -25 C et on réalise un deuxième broyage à un débit de 0,75 litre par seconde. Après mesure de la granulométrie au micromètre sous micro- scope, on décide de l'opportunité d'un ou de plusieurs broyages supplémentaires dans les mêmes conditions Si la granulométrie est atteinte, c'est-à-dire si aucune particule n'est supérieure à 20 et si la moyenne se situe aux alentours de 10 g, alors on conditionne dans un récipient opaque et on stocke à + 10 C. On obtiet ainsi 40 kg de suspension à 30 % d'éthanol pur en poids et 5 % de matière sèche totale. Analyse du produit obtenu: a) Chromatographie sur couches minces des flavones: Support: Silicagel G Solvant: Acétate d'éthyle, acide formique, eau:8 / 1 / 1 Révélateur: Chlorure d'aluminium à 5 % dans le méthanol pur Observation des spots sous lumière U V à 366 nm Résultats: Cynaroside Rf = 0,81 Scolymoside Rf = 0,53 Lutéoline Rf = 0,88 b) Dosage des flavones par la méthode de WILSON (J Am Chem. Soc 1939, 61, p 2303): g de préparation sont soumis à une extraction totale dans un extracteur Soxlhet par de l'éthanol aqueux à 30 C. On peut ainsi évaluer la quantité réelle de principes flavo- niques contenus dans la préparation, en effectuant le dosage sur la solution extractive La teneur en flavones est égale à celle de la plante fraîiche + 5 %. c) Dosage des ortho diphénols: Sur la même solution extractive que pour le dosage des flavones, on réalise le dosage suivant: Réactif: Nitrite de sodium Molybdate de sodium Eau distillée g g ml Témoin: Solution à doser H Cl 0,5 N Eau distillée 0,5 ml 0,5 ml 14 ml Essai: On attend on ajoute 2 ml densité optique La valeur plante fraîche Solution à doser 0,5 ml H Cl 0,5 N 0,5 ml Eau distillée 13,5 ml Réactif 0,5 ml dix minutes à la température du laboratoire et de soude à 40 % dans tous les tubes On lit la (D.O) à 515 nm. lue pour la préparation est égale à celle de la 5 %. d) Dosage des oxydases: g de préparation homogénéisée sont filtrés sur un filtre en verre fitté N O 3 La partie insoluble, lavée une fois par 100 ml d'eau distillée froide (environ 50 C) est mise en suspension dans une solution à 0,1 % de paraphénylènediamine tamponnée à p H 5,6, et placée au bain-marie à 400 C pendant minutes La D O est lue après filtration sur papier à 483 nm contre un témoin réalisé dans les mêmes conditions mais sans insoluble La valeur trouvée est au moins égale à 70 % de la valeur trouvée pour un poids (le feuilles fraîches correspondant à une quantité de matière sèche égale à celle de la préparation soumise au dosage. e) Contrôles physiques Mesure de la granulométrie: aucune particule ne devra posséder une taille supérieure à 20 g et la moyenne devra se situer aux alentours de 10; Mesure de la matière sèche totale: on pèse exactement environ lg de suspension parfaitement homogénéisée que l'on place à l'étuve à 120 'C On le pèse à poids cons- tant Le pourcentage de matière sèche sera égal à la valeur théorique 2 %. EXEMPLE II Préparation d'une suspension hydroglycolique de cellules de bulbes frais de Lilium candidum destinée à l'usage cosmé- tologique. Imlédiatement après la récolte, les bulbes de lis sont triés et écail- les soigneusement, puis lavés rapidement sous un courant d'eau froide, égouttés sur un grillage en acier inoxydable puis placés au congélateur à -850 C. On détermine le taux R de matière sèche sur 5 échantillons comme dans l'exemple I. On prélève une quantité P de bulbes frais congelés corres- pondant à un poids de 4 kg de matière sèche et on la place dans un broyeur à couteaux d'une contenance de 60 litres On broie d'abord à une vitesse de 1500 tpm pour casser les plus grosses masses congelées puis on opère un broyage à 3000 tpm pendant environ 2 minutes On doit alors obtenir une poudre fine Si i i i i i i i i i i i i i la poudre a tendance à s'agglomérer en masses molles, on in- jecte de l'azote liquide afin de se placer à une température de -250 C et on opère un autre broyage à 3000 tpm pendant 30 secondes. Dans une cuve agitée contenant 20 kg de monopropylène glycol et un volume V d'eau distillée tel que V = 20 P. porté à une température de -250 C par addition d'azote liquide on place la plante congelée et broyée Après stabilisation de la température, on ajoute à nouveau de l'azote liquide pour at- teindre -25 o C et on réalise un premier broyage colloïdal à un débit de 2 litres par seconde Puis on effectue, comme dans l'exemple I, d'autres broyages colloïdaux afin d'atteindre une granulométrie moyenne de 10 Et maximale de 20 g t On conditionne dans des récipients opaques et l'on stocke à + 100 C. Contrôle du produit terminé On procède tout d'abord à l'identification microscopique, à la meusre de la granulométrie, au dosage de l'eau par entraî- nement azéotropique, à la mesure de la matière sèche totale, à la recherche des métaux lourds par la méthode de la Pharma- copée; puis on effectue les dosages suivants: 1) Dosages des mucilages g de suspension sont portés dans un sac en acétate de cellulose que l'on ferme -de façon étanche on place le sac dans un bac dans lequel circule de l'eau à 200 C Puis le sac est sorti de l'eau, ouvert, et'vidé de son contenu dans un extrac- teur Soxlhet o l'on effectue une extraction par l'eau jusqu'à ce que la solution extractive ne-laisse plus aucun résidu à l'évaporation. Sur la solution extractive diluée au 1/100 on réalise le dosage suivant Réactif: Anthrone 200 mg H 2 SO 4 concentré: 200 ml Eau distillée: 100 ml & Témoin Réactif 10 ml Eau distillée: 1 ml Essai Réactif 10 ml Solution à doser: 1 ml On place tous les tubes pendant 15 minutes au bain marie bouillant et on lit la D O à 620 nm. L'étalonnage est réalisé par une gamme de glucose qui sw-t de référence pour l'expression des résultats. La valeur trouvée est égale à celle des bulbes frais 10 %. 2) Dosage des oxydases: On opère comme dans l'exemple I La valeur trouvée est au moins égale à 60 % de la valeur trouvée pour les bulbes frais. EXEMPLE III: Préparation d'une suspension hydroglycérolique de cellules de noix (onoes) de Cupressus se Tpervirens fraîches à usage pharmaceuti- que. La noix de Cyprès -possède une nette activité veinotrope utilisable en thérapeutique dans les troubles circulatoires périphériques. Les noix ne peuvent être broyées en présence d'un trop grand volume de solvant pour des raisons mécaniques Elles sont cueillies, rincées à l'eau froide et essuyées dans un linge. Le taux de matière sèche est déterminé par entraînement azéotropique au xylène car'la présence d'huile essentielle rend la méthode par dessication invalide par défaut. Un poids P de noix fraîches correspondant à un poids p = 2 kg de matière sèche est immergé dans une cuve sous agi- tation lente mais constante et contenant 6 kg de glycérol pur et un volume V 1 d'eau distillée tel que: V 1 20 P Le solvant est porté à une température de -550 C par addi- tion d'azote liquide Quand la température est stabilisée, on transfère les noix et le solvant dans un broyeur à couteaux de 60 litres de capacité On effectue tout d'abord un broyage à 1500 tpm pendant 30 secondes puis un broyage à 3000 tpm pen- dant 4 minutes. Dans la cuve agitée, on place alors 14 kg de glycérol pur et un volume V 2 d'eau distillée tel que: V 2 = 2 (-20 P 2 2 3 Ce mélange est porté à -550 C par de l'azote liquide et transféré dans le broyeur à couteaux. On effectue alors un troisème broyage à 3000 tpm pendant 2 minutes, puis la température est éventuelbnent ajustée à -250 C par de l'azote liquide et on réalise un premier broyage colloïdal à un débit de 1 litre par minute. On ajuste de nouveau la température à -250 C et on effectue un deuxième broyage colloïdal à un débit de 0,5 litre par minute. Si la granulométrie de 10 en moyenne et de 20 g au maxi- mum n'est pas atteinte, on opère comme dans les exemples I et II. Le produit est ensuite conditionné dans des récipients étanches aux gaz et opaques à la lumière On stocke à 150 C. Contrôle du produit terminé: On procède tout d'abord à l'identification microscopique, à la mesure de la granulométrie et à la mesure de la matière sèche totale. Puis on effectue les dosages suivants 1) Dosage des huiles essentielles (par la méthode de la Pharma- copée), on doit trouver une valeur égale à celle de la plante fraîche + 5 %. 2 > Chromatographie sur couche mince des leucoanthocyanes g de suspension sont hydrolysés pendant une heure par de l'acide chlorhydrique normal au bain marie bouillant à reflux. Puis on extrait une fois par du n-butanol après avoir ajouté ml d'eau distillée La phase butanolique est ensuite chroma- tographiée Support: Cellulose MN 300 Solvant: Acide acétique, acide chlorhydrique concentré, eau distillée: 30-3-10 Observation directe à la lumière ordinaire Résultats: Un spot rose à Rf 0,40 Un spot brun-rose à Rf 0,98 3) Dosage des tanins catéchiques g de suspension sont extraits par de l'éthanol à 500 C dans un extracteur Soxlhet. La solution extractive est concentrée sous pression réduite à 500 C jusqu'à évaporation totale de l'eau et de l'alcool Puis on traite le résidu glycérolique par 200 ml de formol à 30 % et 100 ml d'acide chlorhydrique concentré Le mélange est placé au bain marie bouillant à reflux sous un léger courant d'azote. Après polymérisation, on filtre sur verre fritté N O 3 taré. On lave abondamment par de l'eau distillée, puis on sèche à l'étuve à 120 'C à poids constant. On-trouve une valeur égale à celle trouvée pour la plante fra 1 che 10 %. 4) Dosage des oxydases On opère comme dans les exemples I et II Le résultat doit être au moins égal à 70 % de la valeur trouvée pour la plante fraiche. Il résulte de la description qui précède que quels que soient les modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'appli- cation adoptés on obtient un procédé de préparation de suspen- sions de cellules fra 1 ches (végétales, animales ou microbiennes) qui présentent par-rapport aux procédés visant au même but antérieurement connus des avantages importants et notamment l'avantage d'obtenir des cellules ayant conservé pratiquement intacts tous les principes actifs de la cellule vivante. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la ma- tière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. 1 1 REVENDICATIONS 1 Procédé de préparation de suspensions de cellules fraîches stabilisées caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: a) nettoyage poussé de la matière première(plante ou organe de l'animal), opéré 24 heures au plus tard après la récolte; b) broyage à une température inférieure à O C jusqu'à l'obtention d'une granulométrie inférieure à environ ; c) un premier broyage colloïdal ou micronisation en pré- sence d'un solvant miscible à l'eau à une température inférieure à -5 C et de préférence inférieure à -15 C, afin d'obtenir des particules de granulométrie infé- rieure à 50; d) un deuxième broyage colloidal ou micronisation opéré dans les mêmes conditions que le premier broyage collol- dal, mais à un débit deux fois plus faible que le premier broyage colloidal, afin d'obtenir des particules de gra- nulométrie moyenne de 10 g, mais toujours inférieure à 20 g; e) conditionnement de la suspension de cellules fraîches à une température inférieure à 30 C dans un flaconnage opaque, à l'abri de la chaleur. 2 Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que le solvant utilisé est pris dans le groupe qui comprend: l'étha- nol, le glycérol, le monopropylène-glycol, le dipropylène-glycol, le tripropylène-glycol, -léthyl-diglycol, l'éthylène-glycol et l'isopropylidène-glycérol. 3 Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que le broyage opéré en étape b) du procédé est également effectué en présence d'un solvant choisi dans le groupe qui comprend: l'éthanol, le glycérol, le monopropylène-glycol, le dipropylène- glycol, le tripropylène-glycol, l'éthyl-diglycol, l'éthylène- glycol et l'isopropylidène-glycérol et en quantité M telle que M soit compris entre RP et 5 RP, M étant le poids de solvant utilisé (pur ou dilué) en litres; R étant la teneur en matière sèche de la nctière première, et P étant le poids de la matière première en kg. 4 Procédé selon les Revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la quantité M' du solvant (pur ou dilué) utilisé lors des broyages colloïdaux ou micronisations sera comprise entre 10 RP et 100 RP, R et P ayant la même signification que ci-dessus. Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la quantité d'eau de dilution éven- tuellement ajoutée au solvant sera calculée de manière à ce que le point de congélation du solvant dilué soit toujours inférieur à -150 C. 6 Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que l'on procède à un troisième, quatrième nième broyage colloi- dal ou micronisation, s'il s'avérait que la granulométrie infé- rieure à 20 g n'était pas atteinte. 7 Procédé selon la Revendication 6, caractérisé en ce que le débit de chacun des broyages colloïdaux successifs sera réduit entre 1,5 à 2 fois. 8 Suspension de cellules (végétales, animales ou micro- biennes) obtenue suivant l'une quelconque des revendications 1 à 7. 9 Application de cellules selon la Revendication 8 à usage pharmaceutique, cosmétologique ou alimentaire.