FR 2521165 A1 19830812 FR 8202013 A 19820208 Fragments d'ADN codant pour un peptide immunogène suscep- tible d'induire in vito la synthèse d'anticorps anti- poliovirus. L'invention est relative à un fragment d'ADN codant pour un peptide immunogène susceptible d'induire in vivo la formation d'anticorps anti-poliovirus Elle concerne plus particulièrement des fragments d'ADN de ce type ayant, au niveau de l'information génétique qu'ils contiennent, des parties en commun avec les poliovirus, de préférence, mais non exclusivement du type PV-1, tout en étant cependant de tailles plus réduites En d'autres termes, l'invention concerne un fragment d'ADN codant pour un déterminant antigénique appartenant normalement aux peptides codés par l'ARN du poliovirus ou par des c ADN correspondants, ce déterminant antigénique jouant un rôle essentiel au niveau des propriétés antigéniques des produits d'expression de l'ARN viral naturel. Les fragments d'ADN selon l'invention possè- dent une longueur n'excédant pas celle d'un fragment d'ADN comportant de l'ordre de 1,2 kb (kilopaires de bases), ces fragments étant plus particulièrement caractérisés en ce qu'ils contiennent une séquence nucléotidique codant pour la protéine V Pl ou pour la partie de cette dernière qui code pour celui ou ceux des déterminants antigéniques qui peuvent être considérés comme essentiellement responsa- bles de l'immunogénicité et de la spécificité immunologique de la protéine VP-1 du poliovirus. L'invention concerne également les vecteurs, notamment plasmides ou phages, qui contiennent dans un de leurs sites de restriction spécifiques l'un des fragments tels que que ci-dessus définis, fragments hétérologues vis- à-vis de ce qui peut alors être considéré comme le "corps" du vecteur (séquence(s) d'ADN propre(s) au vecteur lui- même). L'invention découle de la découverte que le peptide ou fragment de protéine codé par le fragment d'ADN représenté dans la succession des figures 1 et 2 ci- annexées, est susceptible de former des complexes antigène- anticorps avec des sérums neutralisants mono ou polyclo- naux, préparés par injection à l'animal du poliovirus entier fixé au formol (sérum de spécificité D). L'invention concerne bien entendu également des fragments d'ADN qui peuvent être un peu plus grands, par exemple celui qui est normalement délimité par des sites Pst I aux positions 2243 et 3417 (vis-à-vis de l'ex- trémité 5 '), dans le fragment d'ADN clonable du polio- virus décrit dans l'article de Sylvie Van Der WERF et autres auteurs intitulé "Molecular cloning of the genome of poliovirus" dans Proc Nat Acad Sci U S A, volume 78, N O 10, pp 5983-5987, octobre 1981 La séquence de nu- cléotides de ce fragment d'ADN est indiquée dans la suc- cession des figures 3 et 4. La séquence de nucléotides selon l'invention codant la protéine V Pl peut être obtenue à partir d'un précurseur plus courant la contenant Les figures 5 a à 5 h schématisent un mode de production d'un tel précurseur, obtenu à partir des clones p PVI-846 et p PVI-120 décrits dans l'article sus-indiqué La procédure de recombinai- son des deux clones sus-indiqués pour obtenir le clone p PV 1-X est décrite ci-après. Les figures 6 a à 6 f représentent schématique- ment les étapes d'un mode de production d'un plasmide contenant l'essentiel de l'information génétique de la séquence d'ADN, telle qu'elle résulte des figures 1 et 2. 1 Hydrolyse des DNA clones par des enzymes de restriction 1.1 L'ADN du plasmide p PVI-846 est hydrolysé complètement par Eco RI La forme linéaire du DNA plasmi- dique ainsi obtenue (figure 5 c) est hydrolysée par diges- tion partielle avec Kpn I; les fragments obtenus (figure 5 d) sont séparés par électrophorèse en gel d'agarose à 0 7 %. Le fragment de taille 6 6 kbp est sélectionné. Il représente en effet la séquence du plasmide p BR 322 du site Ecor Bau site Pst I, prolongée de celle du DNA corres- pondant à la séquence du poliovirus qui s'étend du nuclé- otide 1 35) au nucléotide 3050 ( 2 e site Kpn I). o 1 2 L'ADN du clone p PVI-120 est hydrolysé dans une digestion complète par Ava I et Eco RI formant ainsi 2 fragments de tailles différentes (figure 5 e) L'ADN est hydrolysé ensuite partiellement par Kpn I Les fragments ainsi obtenus (figure 5 f) sont séparés par élec- trophorèse en gel d'agarose à 0,7 %. Le fragment de taille 3 55 kbp est sélectionné Il représente en effet la séquence du c DNA du poliovirus allant du nucléotide 3050 ( 2 e site Kpn I) au nucléotide 5650 environ, prolongée de celle des 752 paires de bases du segment Pst I-Eco R Idu plasmide p BR 322. 2 Extraction des fragments de DNA des gels 2.1 Les fragments sont visualisés dans les gels par coloration au bromure d'éthidium; ceux de la taille voulue sont extraits des gels par électroélution en sac à dialyse. 2.2 Le matériel ainsi obtenu est purifié et concen- tré. 3 Recollage des fragments (recombinaison) Les deux fragments sélectionnés provenant des clones p PVI-846 et p PVI-120 et décrits cidessus sont mélangés et recollés à l'aide de la DNA ligase du phage T 4 Les bouts collants formés aux points de coupure par Eco RI et Kpn I et portés à chaque extrémité des deux fragments favorisent leur recollage et assurent que celui-ci ne puisse se faire que dans le sens désir (figures 5 g et 5 h). Le génome du plasmide p BR 322 est ainsi reconstitué sans modification ni délétion dans le plasmide recombinant. En particulier, les régions nécessaires à sa réplication et à l'expression de la résistance à la tétracycline ne sont pas touchées. 4 Transformation de la souche E coli 1106 Les fragments des plasmides p PVI- 846 et -120 recollés par leurs sites Kpr> I et Eco RI sont mises en contact avec des bactéries compétentes de souche E coli 1106 dans les conditions de transformation Les colonies de bactéries résistantes à la tétracycline et sensibles à l'ampicilline sont sélectionnées. Analyse des nouveaux clones 5.1 Le DNA plasmidique des bactéries tétracycline résistantes est purifié Sa masse est déterminée par élec- trophorèse en gel d'agarose Elle est égale à celle du plasmide p BR 322 augmentée des 5650 paires de bases du c DNA viral formé par recombinaison. 5.2 L'hybridation in vitro des c DNA ainsi obtenus avec des sondes spécifiques provenant des clones p PVI-846 et p PVI-120 permet la vérification de la présence dans un seul clone recombinant du matériel génétique du poliovirus inséré originellement dans les deux clones parentaux. 5.3 L'analyse détaillée des nouveaux clones est effectuée par les méthodes utilisées antérieurement pour l'étude des clones déjà caractérisés (cartographie physique par enzymes de restriction, microsccpie électronique, séquence nucléotidique, etc). 5.4 Le c DNA porté par le plasmide recombinant (p PV 1-X) porte l'information génétique nécessaire à la synthese de la protéine pl, précurseur des protéines de capside VP 4 (nucléotides 741 à 975), VP 2 (nucléotides 976 à 1818), VP 3 ( 1819 à 2562) et V Pl ( 2563 à 3501), suivie de celles qui correspondent à la protéine p 2 (précurseur notamment de la protéine NCVPX) et au début de la protéine p 3. L'ensemble couvre environ 5650 des 7432 bases du génome viral. Le plasmide p PVI-846 a été déposé à la C N C M sous le n I-155 et le plasmide 120 sous le n I-156 le 19 mai 1981. Le plasmide p PV 1-X obtenu contient dans son insérat la séquence nucléotidique qui code pour les protéines VPO (nucléotides 743 à 1765), VP 3 (nucléotides 1766 à 2479) et V Pl (nucléotides 2480 à 3385) suivie de la séquence codant pour la protéine P 2 (nucléotides 3386 à 5100 et quelque) et du début de celle de la protéine P 3. Partant du plasmide p PV 1-X, on peut alors obtenir un fragment de c DNA codant pour V Pl en procédant comme suit. I ISOLEMENT ET RECLONAGE D'UN FRAGMENT DE c DNA RENFERMANT LA SEQUENCE DE VP 1. La séquence de nucléotides qui code pour la protéine V Pl est encadrée, dans le génome viral, et par conséquent aussi dans l'insérat porté par p PV 1-X, de deux sites Pst I, situés respectivement 237 nucléotides en amont (position 2243) et 32 nucléotides en aval (position 3417) du premier et du dernier nucléotide de cette séquence (cf carte de restriction dans la susdite publication et fig 1 et 2). Le découpage de p PV 1-X (fig 6 a) par l'enzyme de res- triction Pst I engendre donc une famille de fragments ayant des longueurs correspondant respectivement à 4,36 kb (corps du plasmide) et à 1,8 kb; 0, 43 kb; 1,17 kb et environ 2,23 kb Le fragment de 1,17 kb porte la séquence nucléoti- dique codant pour la fin de VP 3 et la totalité de VPI Ce dernier fragment commence par la séquence nucléotidique: 5 ' G T C C T C A T G T A et s'achève par la séquence G T A C A C T G C A 3, On le sépare des autres fragments Pst I par électrophorèse en gel d'agarose On prélève la ba Dde du gel qui le contient, et on la soumet à une électroélution pour en extraire le DNA On suit l'électroélution par illu- mination aux ultraviolets après coloration du gel au bromure d'éthidium Le fragment ainsi préparé correspond aux nucléo- tides du poliovirus 2248 à 3421 On l'insère par ligation avec de la DNA ligase au site Pst I du plasmide vecteur p BR-322 préalablement linéarisé par cette même enzyme Les plasmides recombinants qu'on a formés ainsi sont clonés dans la souche 1106 d'Escherichia co Zi (sélection des colonies devenues ré- sistantes à la tétracycline mais demeurées sensibles à l'am- picilline après transformation par le plasmide). L'analyse de leur ADN par cartographie aux enzymes de restriction permet d'identifier et de sélectionner les plasmides recombinants qui portent le fragment du c ADN polioviral inséré dans le sens contraire aux aiguilles d'une montre par rapport à la carte de p BR-322, c'est-à- dire dans le même sens transcriptionnel que le gène de la e-lactamase (gène de la résistance à l'ampicilline) Il faut noter que l'insertion du fragment 2248-3421 au site Pst I de p BR-322 interrompt la continuité de la séquence nucléotidique, et inactive donc le gène de la e-lactamase du vecteur, mais ne permet cependant pas d'assurer l'ex- pression des protéines poliovirales car elle entraîne un changement de phase de lecture de l'insérat. On dénomme p SW-11 (fig 6 b), le plasmide ayant ces propriétés. II ELIMINATION DES SEQUENCES CODANT POUR LA PARTIE C TERMINALE DE VP 3: EMONDAGE DE VP 1. Le plasmide p SW-11 contient, précédant, dans le sens transcriptionnel 5 + 3 ', la séquence de VP 1, 232 nucléotides de c ADN de poliovirus relevant de la séquence de VP 3 Ces nucléotides excédentaires peuvent être enle- vés d'au moins deux manières: a) par traitement ménagé du fragment Pst I (préalablement extrait de p SW-11: fig 6 c) de 1,17 kb par l'enzyme de restriction Hae II (digestion partielle au nucléotide 2472), puis sélection par électrophorèse du fragment Hae II-Pst I de 0,945 kb (fig 6 d) (nucléotides polioviraux 2472 à 3421) et reclonage de ce fragment dans les plasmides ap- propriés On peut faciliter le reclonage en accrochant de façon en soi connue aux extrémités du fragment émondé des adaptateurs ("linkers") synthétiques, courtes séquen- ces de nucléotides contenant un site de restriction dé- terminé obtenu par synthèse, par exemple selon la tech- nique décrite par R H SCHELLER et al, Science, tome 196 ( 1977), pp 177180 Le type de'linker" choisi dépend essentiellement du site de coupure de l'enzyme de restric- tion utilisée dans le vecteur d'expression. b) par linéarisation du plasmide p SW-11 par digestion com- plète par l'enzyme Pvu I, suivie d'un traitement éxonueléo- lytique à l'enzyme Bal 31, puis de l'addition d'adapta- teurs ("linkers") synthétiques types (Biolabs, Collabora- tive Research) et de la recircularisation du plasmide par la DNA ligase. On traite les plasmides ainsi formés par l'enzyme de restriction correspondant au "linker". On ouvre donc les molécules On analyse par migra- tion en électrophorèse en gel d'agarose leurs tailles pour identifier celles qui ont perdu environ 700 paires de base (perte qui dans la figure 6 e est symbolisée par un arc de cercle en pointillés), c'est-à-dire quelques 350 de part et d'autre du site Pvu I, soit le fragment Pvu I-Pst I de p BR-322 plus la séquence de VP 3 jusqu'à VP 1, d'un c 6 té,et à une longueur similaire de p BR-322 allant de Pvu I vers Eco RI, de l'autre côté. De cette façon, on peut isoler un fragment dont l'une des extrémités coincide avec l'extrémité de la sé- quence d'ADN codant pour V Pl; ou en tous les cas en est très proche. En effet, le site Pvu I se trouvait à 126 paires de bases (b) du site proximal Pst I de la séquence du fragment Pst I de 1,17 kb et à 356 paires de bases de l'extrémité proximale du fragment de c DNA codant pour VP 1, dans le plasmide p SW-11. Après fixation aux extrémités du fragment sélection- né de "linkers" contenant par exemple un site Bgl II au moyen d'une ligase, on sélectionne les plasmides dont la taille est de 4,8 à 5 kb (fig 6 f) On détermine ensuite ceux des plasmides qui ont conservé la séquence entière de VP 1, tout en ayant perdu la totalité ou la quasi-totali- té de VP 3 On vérifie cela en déterminant la séquence nu- cléotidique du fragment Bgl II-Pst I des plasmides sélection- nés Si l'on utilise la méthode de SANGER, on insère les fragments à séquencer dans la forme réplicative du phage M 13 et on clone les phages recombinants ainsi constitués. On utilise ensuite leur ADN pour séquencer le fragment inséré, selon la technique décrite par SANGER On peut aussi procéder à la détermination de la séquence nucléo- tidique conservée par la méthode décrite par MAXAM et GILBERT. III INSERTION DU FRAGMENT EMONDE DANS UN VECTEUR D'EXPRESSION. La séquence codant pour V Pl ne comporte ni codon d'initiation, ni codon de terminaison Elle ne comporte non plus ni promoteur pour sa transcription, ni signal de reconnaissance par les ribosomes (séquence de SHINE et DALGARNO, décrite dans GIRARD et HIRTH, Virologie Molécu- laire, Edition Doin 1980, pp 15-46 et 263-264) Pour la faire exprimer, il faut donc l'insérer en phase au milieu de la séquence nueléotidique (et en tout cas derrière l'AUG d'initiation) d'un gène cloné avec son promoteur (ou auquel on adjoindra en amont, un promoteur étranger). L'utilisation de "linkers", comme décrit ci-dessus, per- met d'envisager l'utilisation de plusieurs types de vec- teurs d'expression différents selon le promoteur consi- déré: par exemple du type de ceux indiqués ci-après à titre d'exemple. a) Promoteurs bactériens. C'est notamment le cas des plasmides contenant la région promoteuropérateur de l'opéron lactose d'E ooli (opéron lac), suivie de la partie 5 ' du gène de la e-galactosidase Ces vecteurs, du type p PC (CHARNAY et al, Nucleic Acid Research 1978, tome V, pp 4479-4494) permettent l'insertion du fragment V Pl au site Eco RI situé à 21 nucléotides derrière l'AUG d'initia- tion de la e-galactosidase La protéine à laquelle ils donnent naissance comporte donc pour extrémité N terminale les sept (ou huit) premiers acides aminés de la 8-galactosidase bactérienne, suivis des acides aminés de VP 1. e b) Promoteurs de _phage. C'est notamment le cas des plasmides contenant la région promoteuropérateur de l'opéron de gauche (PL) o de l'opéron de droite (PR) du phage R Ces vecteurs, res- pectivement du type p KC 30 (ROSENBERG, Nature 1981, Vol. 292, p 128) ou p RL 447 (ZABEAU; dérivé de p RC 5 et de p LG 400, ce dernier étant décrit dans Cell, 1980, Vol 20, pp 543-553) permettent d'effectuer l'insertion du frag- ment V Pl au sein des séquences nucléotidiques codant res- pectivement pour l'extrémité N terminale du produit du gène N ou pour celle du produit du gène cro déposé le 8 février 1982 à la C N C M sous le no I-184. Ces systèmes de vecteurs sont propagés à 30 C dans des bactéries lysogénisées par un phage À à répresseur thermosensible (c I 857) ou en présence de plas- mides porteurs du même gène (c I 857) codant pour un répres- seur thermosensible Ils demeurent inactifs, du fait du répresseur, tant que la culture est maintenue à 30 C Le transfert de la culture à 42 C est suivi de l'activation des promoteurs de >(PL ou PR) portés par le plasmide recombinant, du fait de l'inactivation du répresseur du gène c I 857. c) Promoteurs viraux. C'est en particulier le cas de l'utilisation du virus SV 40 comme vecteur Dans ce cas, on utilise le pro- -.moteur viral tardif et l'on insère le fragment V Pl du po- liovirus à la place de tout ou partie de la région codant pour les protéines tardives de SV 40 (V Pl ou VP 2) On construit ainsi des ADN de SV 40 substitués dans lesquels les séquences codant pour les protéines de capside de ce virus sont remplacées par la séquence codant pour la pro- téine V Pl du poliovirus Ainsi, l'insertion du fragment Hae II-Pst I de poliovirus décrit au paragraphe 3 ci-dessus, à la place du fragment tardif Hae II-Pst I de SV 40 (nucléo- tides de 767 à 1923) aboutit, après remise en phase des deux séquences au niveau du site Hae II, à créer un gène chimérique possédant la séquence de V Pl du poliovirus di- rectement accrochée derrière la portion N terminale de la protéine VP 2 du SV 40 De nombreuses autres constructions sont possibles, par exemple par insertion du fragment Pst I du poliovirus (fragment de 1,17 kb) au site Pst I (nucléotide 1923) du SV 40 ou par insertion du fragment Hae II- Pst I à la place des séquences Acc I-Bam H 1 ( 1563 à 2468) du SV 40 Tous les SV 40 chimériques ainsi constitués sont défectifs Ils ne peuvent se multiplier qu'en pré- sence d'un virus assistant (par exemple, mutant précoce type ts A 30 ou ts A 58) qui leur apporte les protéines de capside de SV 40. On peut envisager de procéder à des délétions par- tielles du virus SV 40 utilisé comme vecteur, telles que décrites dans l'article de PAVLAKIS, HIZUKA, GORDEN, SEEBURG et HAMER, dans PNAS 1981, 78, p 7398-7402, ce qui il permet d'obtenir un vecteur de plus faible poids moléculaire. On peut, d'autre part, après avoir inséré la sé- quence de V Pl de poliovirus au sein du gène V Pl du SV 40 (par exemple au site Eco RI), éliminer le reste des sé- quences nucléotidiques de SV 40 qui séparent V Pl du polio- virus de l'AUG de V Pl du SV 40 (par exemple par utilisation de l'enzyme Bal 3 l,après ouverture au site Acc I) On re- marque que la séquence des nucléotides au niveau de l'AUG de V Pl du SV 40 est: ATG GCC (codons des deux premiers acides aminés de VP 1). Or, la séquence du c DNA polioviral après coupure au niveau du site Hae III (comme décrit en I Ia) est: TA.GCA CAG GCC (codons des trois derniers acides aminés de VP 3 et du premier acide aminé de V Pl du polio- virus). L'addition d'un "linker" Eco RI (BIOLABS) devant cette séquence par la DNA ligase aboutit à la formation d'une séquence nouvelle: CGG AAT TCC GTA GCA CAG GGG (séquence de VP 1). On fait suivre la ligation d'une digestion par l'enzyme Eco RI, puis du remplissage de l'extrémité 3 ' par la DNA polymérase I d'E coti en présence des quatre désoxyribonucléosides-tri-phosphates Ceci conduit à l'obtention d'une extrémité entièrement bicaténarisée dont la séquence est: AAT TCC GTA GCA CAG GGG (séquence de V Pl du polio- virus) La ligation de cet ADN dans un vecteur SV 40, der- rière le codon du deuxième acide aminé de V Pl du SV 40, permet de recréer une séquence en phase: ATG GCC AAT TCC Gr A GCA CAG GGG -SV 40 J linker l-poliovirus- dans laquelle les nucléotides soulignés (TGGCCA) forment un site Bali qui n'existait ni dans le SV 40 vecteur ni dans le fragment V Pl de poliovirus inséré, et qui permet donc de sélectionner de manière univoque un recombinant "SV 40-poliovirus" dans lequel la séquence du V Pl de polio- virus, précédée de celle de cinq acides amins, est insé- rée, en phase, derrière celle des deux premiers acides aminés de V Pl du SV 40. d) Promoteurs de virus animaux _ortés par des plasmides bactériens. C'est le cas des plasmides portant les promoteurs du gène de la thymidinekinase du virus de l'herpès (p AGO), du gène de l'antigène HBS du virus de l'hépatite-B (p AC-2 ou p AC-14) ou des gènes précoces ou tardifs de l'adéno- virus 2, etc L'insertion du fragment V Pl du poliovirus derrière l'AUG du gène viral cloné avec son promoteur per- met d'en assurer l'expression dans la cellule animale (après transfection, micro-injection ou fusion cellules-proto- plastes), ou in vitro, la transcription par un extrait de cellules animales (cellules He La), ce qui conduit à la syn- thèse de l'ARN messager correspondant. IV DETECTION DE L'EXPRESSION DE VP 1. L'expression des plasmides recombinants porteurs du fragment V Pl et capables de l'exprimer, c'est-à-dire la synthèse de VP 1, est détectée par diverses méthodes d'ana- lyse immunologique mettant en jeu l'emploi d'immunsérums anti-poliovirus: sérums neutralisants, mono ou polyclonaux, préparés par injection à l'animal de virus fixé au formol (sérums de spécificité D); sérums non neutralisants préparés par injection à l'ani- mal de virus dissocié par la chaleur en l'absence de for- mol, ou de capsides virales vides (sérums de spécificité C); sérums antiprotéines capsidales (VPO, VP 1, VP 2 ou VP 3) du poliovirus, obtenus par injection à l'animal de proté- ines capsidales préparées par électroélution après sépa- ration sur gel de polyacrylamide-SDS à partir de virions dissociés au SDS et à la chaleur. Les sérums sont utilisés en tests d'immuno-préci- pitation sur extraits bactériens prémarqués à la méthio- nine 35 S, ou en tests radio-immunologiques sur répliques avec Ig G marquées à 1 '125 I Ces tests sont aussi bien utilisables aux extraits de cellules animales. V PROPRIETES DE VP 1. La protéine V Pl produite selon l'une des mé- thodes ci-dessus, est purifiée selon une technologie classique telle que par exemple la chromatographie d'affi- nité. La protéine VP 1, synthétisée dans les diverses conditions décrites, peut être couplée à un "carrier", c'est-à-dire à une protéine naturelle ou un polypeptide synthétique ayant un poids moléculaire suffisant pour que le conjugué formé soit capable d'induire in vivo la pro- duction d'anticorps selon les techniques classiques On peut la faire réagir avec les anticorps anti-poliovirus. Elle est immiunogène et inoculée à l'animal; elle induit la synthèse d'anticorps anti-poliovirus. Par ailleurs, on peut l'utiliser comme réactif pour le diagnostic et le titrage des anticorps anti- poliomyélitiques La séquence d'ADN selon l'invention peut elle-même être utilisée comme sonde d'hybridation permettant la détection de la présence d'ARN viral ou du c ADN correspondant dans un échantillon biologique - L'invention concerne naturellement toutes les séquences d'ADN équivalentes conduisant à des produits d'expression doués de propriétés immunologiques équiva- lentes, telles que révélées par exemple -par la capacité des anticorps induits par le produit d'expression équi- valent à réagir avec le produit d'expression des frag- ments d'ADN plus particulièrement décrits et vice versa. En particulier, l'invention s'étend à des séquences d'ADN pouvant différer de celles qui ont été plus particulière- ment décrites, par des délétions, additions ou substitu- tions d'acides nucléiques, pour autant que les propriétés immunologiques des produits d'expression soient équiva- *lentes. L'invention concerne enfin les produits d'expres- sion eux-mêmes, tels que produits par-les micro-organismes. appropriés transformables par des vecteurs (plasmides ou phages) comprenant un insérat constitué par l'un des sus- dits fragments d'ADN ou leurs équivalents. REVENDICATIONS 1 Fragment d'ADN possédant jusqu'à de l'ordre de 1200 kilopaires de bases et contenant une séquence nucléotidique codant pour la protéine V Pl du poliovirus. 2 Fragment d'ADN selon la revendication 1, ca- ractérisé en ce qu'il contient la séquence de nucléotides délimitée par deux sites Pst I et s'étendant de la position 2243 à la position 3417 du c DNA codant pour un poliovirus du type PV-i. 3 Fragment d'ADY selon la revendication 1, carac- térisé en ce qu'il contient la séquence de nucléotides s'étendant de la position 2248 à la position 3421 du c DNA codant pour un poliovirus du type PV-1. 4 Fragment d'ADN selon la revendication 1, carac- térisé en ce qu'il contient la séquence de nucléotides déli- mitée par des extrémités Hae II et Pst I et s'étendant de la position 2472 à la position 3421 du c DNA codant pour un poliovirus du type PV-1. Fragment d'ADN selon la revendication 1, carac- térisé en ce qu'il contient la séquence de nucléotides s'étendant de la position 2480 à la position 3385 du c DNA codant pour un poiiovirus du type PV-1. 6 Vecteur, notamment du type plasmide, caractéri- sé en ce qu'il contient un insérat consistant essentielle- ment en un fragment d'ADN selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 5. 7 Gène clone comprenant un promoteur et contenant, inséré dans sa séquence nucléotidique, un insérat consis- tant essentiellement en un fragment d'ADN selon l'une quel- conque des revendications 1 à 5. 8 Le produit d'expression de l'insérat produit par un micro-organisme transformable par le vecteur selon la revendication 6 ou le géne clone selon la revendication 7. 9 Le principe actif de vaccin contenant le pro- duit d'expression de la revendication 8 couplé à une pro- téine naturelle ou à un polypeptide synthétique ayant un poids moléculaire suffisant pour que le conjugué formé soit capable d'induire in vivo la production d'anticorps anti- poliovirus.