FR 2516355 A1 19830520 FR 8219043 A 19821115 16355 O.n tant qu'aliment pour le nouveau-né, le lait maternel est le meilleur Cependant, dans de nombreuses occasion telles que maladie de la mère, qualité défectueuse de la sécrétion lactée, ou même à cause de certains facteurs sociaux et/ou économiques, les nouveaux-nés doivent être nourris à l'aide de produits lactés qui tentent de ressembler le plus possible au lait maternel aussi bien du point de vue de la qualité que de la quantité de celui-ci Ces produits seront désignés par "laits maternisés" 1,"laits adaptés" ou "laits humanisés,' par opposition au lait maternel naturel ou lait humain. En 1978, le Comité Européen de la Société de Gastroentérologie et de Nutrition Pédiatrique, connu sous le sigle EPSGAN, édicta une série de normes que doivent respecter les produits lactés humanisés destinées à l'alimentation des nour- rissons. Pareillement, en 1976, le Comité de Nutrition de l'Académie Américaine de Pédiatrie (APA) publia les normes proposées pour la mise au point d'aliments infantiles qui remplacent le lait maternel. Les normes mentionnées définissent les contenus maxima et minima se référant aux protéines, aux lipides, aux glucides, auxbelsminéraux et aux vitamines pour un produit lacté maternisé destiné à l'alimentation de nourrissons sains nés à terme De la même manière, 1 'EPSGAN a prescrit que ce type de laits artificiels, fàbriqué S principalement à bas de lait de vache et dérivés lactés doivent avoir une relations caséine/ lactoalbumine d'environ 40:60, semblable à celle que l'on trouve dans le lait maternel, ainsi qu'un spectre d'acides gras le plus semblable possible, de point de vue de leur qualité et de leur quantité, à celui que l'on trouve dans le lait maternel. Malgré les efforts réalisés par les scienti- fiques jusqu'à présent,il a été impossible de trouver un produit dont la composition soit tout fait semblable au lait maternel Ceci est dû, principalement, à l'existence de micro- composants spécifiques au lait maternel, qui peuvent même être différents selon les individus Un exemple de ces composants 2 e 516355 sont les immunoglobines sécrétrices qui confèrent au lait de chaque mère un apport d'anticorps spécifiques contre de nombreuses maladies Ces anticorps protègent le nourrisson pendant les pre- miers mois de vie contre les maladies dont la mère fut atteinte. A l'intérieur des microcomposants du lait, il existe une autre série de substances inconnues du point de vue structurel et surtout physiologique. Les nucléotides sont des substances fondamentales pour la vie étant donné qu'ils sont les unités structurelles des acides nucléiques, composants responsables de la charge héréditaire de l'individu Bien que les nucléotides soient impliqués dans de multiples réactions d'ordre biochimique, on ignore encore la mission qu'ils remplissent dans le lait Les études réalisées dans le but d'élucider la composition nucléique du lait de diverses espèces sont peu nombreuses et se sont limitées à l'analyse exclu- sivement chromatographique de quelques échantillons individuels, qui ne permettent pas de tirer des conclusions sans risque d'erreur. Avant de poursuivre la présente description, on considère convenable d'établir quelques explications et équivalences des mots et dénominations qui seront utilisées. En ce qui concerne l'identification des différentes classes de nucléotides, on les désignera par leurs initiales, correspondant selon une pratique établie aux noms complets désignés en regard. AMP = Adénosine-monophosphate CMP = Cytidine monophosphate GMP = Guanosine-monophosphate IMP = Inosine-monophosphate UMP = Uridinemonophosphate ADP = Adénosine-diphosphate CDP = Cytidine-diphosphate UDP = Uridine-diphosphate ATP = Adénosine-triphosphate UTP = Uridinetriphosphate NAD = Nicotine-adénine-dinucléotide UDPG = Uridinediphosphate-glucose UDP Ga = Uridine-diphosphate-galactose 3 2516355 UDP-N-AG = Uridine-diphosphate-N-acétyl-glucosamine UDP-N-A Ga = Uridinediphosphate-N-acétyl-galactosamine GDP Man = Guanosine-diphosphatemannose GDP Fuc = Guanosine-diphosphate-fucose ANTECEDENTS SCIENTIFIQUES ET TECHNOLOGIQUES: Les différences qualitatives et quantitatives de la composition chimique entre le lait maternel et le lait secrété par les autres espèces ont fait l'objet de recherches constantes, par exemple, du point due vue de leurs aspects biologiques, microbiologiques, immunologiques et bromatologiques A tout instant, les différences sont évaluées sur le plan de la pédiatrie et,du côté industriel, existe le souhait d'une adéquation de plus en plus étroite entre le lait maternisé, préparé à base de lait de vache et le lait maternel. Un des aspects les moins connus de la biochim du lait est son contenu en nucléotides, bien que ces biomolécule soient fondamentales aussi bien dans le métabolisme intermédaire que dans les réactions de transformation d'énergie. Les études réalisées afin d'élucider la compo sition nucléique dans le lait de différentes espèces, y compris le lait maternel, se limitent à l'analyse exclusivement chromato graphique de quelques échantillons individuels qui ne permettent pas de tirer des conclusions sans risque d'erreur. Les premiers travaux réalisés sur les composal nucléiques de la glande mammaire remontent à 1952 lorsque RUTTER et HANSEN (W J Rutter,R G Hansen J Biol Chem 202,323,191 purent démontrer la présence de UDPG dans la glande mammaire de lafemelle du rat. En 1956, W MANSON (Biochim Biophys Acta,19, 398,1956) étudia les nucléotides présents dans la glande mammaire de la vache et de la chèvre en période d'allaitement et constata qu'il n'existait aucune différence du point de vue de la qualité entre les nucléotides provenant des deux sources citées mais de grandes différences en ce qui concerne leurs quantités Les différences constatées étaient probablement dues au fait que 4 2516355 les extraits tissulaires étaient prélevés sur des animaux à des étapes de lactation différentes En plus de AMP,CMP,UMP,GMP,CDP, ADP,UDP,ATP, et UTP, il identifia également UDP-N-AG et UDPG en grandes quantités ( 15-401 moles/100 gr de tissu) En ce qui concerne l'acide orotique, il n'en trouva que des traces. Malgré les méthodes analytiques employées et bien que le nombre d'échantillons biologiques examinés ne permit pas de faire une analyse statistique des résultats obtenus, ces scientifiques arrivèrent cependant à la conclusion que la composition nucléique de la glande mammaire dépendait de son activité physiologique, gestation et allaitement, et que les nucléotides les plus abondants pendant l'allaitement étaient les dérivés de l'adénosine, de la guanine et de l'inosine, tandis que pendant la gestation, les nucléotides dérivés de l'uridine étaient beaucoup plus abondants ( 61 % des nucléotides totaux) Le contenu en NAD+ est multiplié par quatre dans la glande mammaire en période de sécrétion, ce qui correspond aux résultats obtenus par MAC LEAN pour la rate (Biochim Biophys Acta,30,316,1958). Il semble que UDP-Ga s'accumule avant l'accouchement et ensuite diminue progressivement dans le courant de la lactation D'autre part, peu avant l'accouchement, les UDP-N-acétyl-hexosamines sont particulièrement abondants. Les rares travaux de recherche réalisés dans le but d'éclaircir la composition nucléique de la glande mammaire et du lait de diverses espèces paraissent indiquer que le contenu de nucléotides acido-solubles de la glande mammaire diffère en qualité et en quantité de celui du lait secrété. L'acide orotique fut découvert dans le sérum* du lait de vache en 1904 et depuis lors il a été supposé être un composant typique du lait des ruminants Néanmoins, les valeurs indiquées dans la littérature scientifique sont hautement contra- dictoires en conséquence de l'application de différentes méthodes analytiques, relativement peu spécifiques Cependant, l'opinion actuelle la plus répandue est que seul le lait qui provient des bovidés contient des quantités élevées d'acide orotique 2516355 (jusqu'à 6 mg/l O Oml), à la différence du lait qui provient des ovidés qui n'en contient que de petites quantités ( 0,8-lmg/l O Omll et du lait maternel o il est pratiquement absent. Les valeurs d'acide orotique rencontrées dans la cellule sécrétrice de la glande mamhaire de la vache sont sem- blables à celles des autres tissus et organes animaux, ce qui permet de penser que la haute teneur en acide orotique est appa- remment propre au lait des bovidés. La présence de l'acide orotique dans le lait de vache et d'autres ruminants à haute concentration/est un point très intéressant étant donné que les régimes artificiels pour nourrissons se basent principalement sur le lait de vache et quelques-un de ses dérivés, et il a été démontré que la présence de cet acide en concentration de 1 % dans l'alimentation provoque des graisses dans le foie (J L ROBINSON J of Dairy SC; 63,865,19 E Jusqu'à présent, on ignore quelles peuvent être les missions physiologiques des nucléotides et de l'acide orotique dans le lait des diverses espèces qui en contiennent. D'autre part, l'application des méthodes quan- titatives à l'étude bactériologique des matières fécales a changé complètement la conception primitive sur la composition normale de la flore intestinale Depuis longtemps, cette conception a toujours été basée sur des résultats purement qualitatifs obtefius à partir de cultures aérobies On admettait la prépondérance normale et obligatoire de Escherichia coli dans les selles de l'homme et des diverses espèces animales Dans l'homme sain, on n'admettait qu'une seule exception: le contenu bactérien des selles du nourrisson allaité au lait maternel, o le Bifidobacterium bifidum Ti, découvert par TISSIER, était l'espèce prédominante et pratiquement exclusive. Les recherches effectuées par WERNER et SEELIGER (Ann ins Pasteur,103,911, 1963) ainsi que par SPAULDING et COL (J Bact 83,968,1962) ont fait changer complètement la conception sur la composition de la flore intestinale de l'homme. Les germes anaérobies constituent 80-95 % des bactéries culti- vables de la flore fécale de l'adute Chez l'adulte, le pourcen- tage de E coli ainsi que celui des entérocoques varie de 1-5 % 6 2516355 et celui des bactérobacilles ne dépasse pas 6 % de la microflore totale D'autres espèces, telles que les staphylocoques, bacilles sportulés, Pseudomonas spp et levures ne sont pas présentes d'une façon régulière et leur nombre n'est pas important. La grande majorité des bactéries anaérobies de l'intestin humain est formée par des bacilles Gram positifs non sportulés et des bacilles Gram négatifs Les espèces Gram négatives anaérobies constituent un groupe hétérogène de bactéries protéolytiques et sacaroclastiques appartenant au genre Bactéroides, lesquelles, selon le milieu de culture utilisé peuvent constituer 40-80 % de la totalité des bactéries fécales cultivables chez l'adulte De la même fa -çon, chez les adultes normaux, les bactéries Gram positives non sportulées anaérobies supposent de 10 à 60 % des pourcentages totaux Contrairement à l'adulte, les selles des nourrissons alimentés exclusivement au lait maternel se caractérisent par une prédominance absolue des bacilles Gram posi tifs anaérobies et normalement les bactéries anaérobies Gram négatives en sont absentes. Jusqu'au classement définitif du Gen Bifi- dobacterium en 1974, les controverses étaient nombreuses étant donné que de nombreux investigateurs considéraient les bifido- bactéries comme appartenant au Ge Lactobacillus et plus concrè- tement à l'espèce L bifidus. Les travaux effectués par DEFNERT améliorèrent les connaissances sur les bifidobactéries en présentant le premier schéma pratique de diagnostice pour la différenciation en groupes et types biochimiques Le diagnostic différentiel, à part des différences morphologiques minoritaires, se base sur la fermentation de certains hydrocarbonates (J DEHNERT, Zentbl Bakt Parasitenk Abt I Orig,169,66,1957). En 1963, REUTER donna les noms de B adoles- centis, B longum, B breve, B parvolorum,B infantis,B liberorum, et B lactentis à ce qui, en principe, était des biotypes de B bifidum (G REUTER-Zentbl Bakt Parasitenk Abt I. Orig,191,486,1963). 7 2516355 Les études, réalisées principalement par W Eh'Rn r L et SEELIGER, indiquent que la majorité des bactéries anaérobies Gram positives isolées dans les selles appartiennent au genre Bifidobacterium Parfois on trouve des corynebactéries mais celles-ci ne sont pas considérées comme élément constant et persistent, et lorsqu'elles sont présentes, leur nombre ne dépasse pas 104/g de matériel fécal. Le nombre de bifidobactéries par rapport au nombre total de bactéries viables et la distribution des dif- férentes espèces ou types biochimiques varie selon l'âge et les aliments ingérés Dans-les selles des nourrissons alimentés exclusivement au lait maternel, le nombre de bifidobactéries présentes oscille entre 109/g et 1011/g et excède largement celui des autres espèces présentes, spécialement E coli Dans les selles des nourrissons alimentés à l'aide de produits infantiles à base de lait de vache, on trouve un nombre de bifidobactéries similaire mais le nombre de bactéries Gram négatives aérobies et anaérobies, en plus des entérocoques, augmente jusqu'à égaler et même dépasser les bifidobactéries. Dans les selles des adultes, les bifidobactéries persistent encore parmi un nombre croissant d'espèces, parmi lesquelles prédominent les bactéries Gram négatives De cette façon, on confirme l'hypothèse d'ORLA-JENSEN et HAENEL et d'autres investigateurs dans le sens que la multiplication des diffé- rents biotypes bactériens ne provoque pas la disparition des bifidobactéries de la flore fécale de l'adulte (S.ORLA-JENSEN, E OLSEN et T GEITLL: senility and intestinal flora, K Danske Vidensk Selssk Biol Skirft,III,44,1945 - H.HAENEL: Zentbl Bakt Parasitenk Abt I Orig,170,323,1957). Les bifidobactéries des nourrissons ali- mentés au lait maternel diffèrent de celles des nourrissons alimentés avec des produits infantiles dérivés du lait de de vache, ainsi que celles des adultes Le type biochimique prépondérant dans les selles des enfants allemands nourris au sein correspond aux groupes III et IV de DEHNER (B.infantis) mais on y trouve également B bifidum (groupes I et II de DEHNER). Les bifidobactéries présentes chez les enfants nourris au lait maternel en alternance avec des produits infantiles à base de lait de vache ne diffèrent aucunement de celles des enfants alimentés exclusivement au lait maternel. (F PETUELY et G LINDNER: Zentbl Bakt Parasitenk Abt I. Orig,195,347,1965). Les besoins nutritifs des bifidobactéries sont complexes Leur développement dépend de la présence d'hydrates de carbone et d'azote organique D'autre part, la l'anhydride carbonique est indispensable Leur anaérobie est stricte et elles meurent rapidement dans des subcultures aérobiques Les bifidobactéries acidifient le lait et le coagulent lorsqu'on y ajoute de lacistéine. Selon GYLLENBERG, les demandes de base des facteurs de croissance varient selon l'espèce de bifidobactéries, le groupe IV de Dehnert a besoin de cistéine, de biotine et d'acide panthoténique; les groupes III et V ont besoin de cistéine, panthétine et ribloflavine; le groupe I, en plus de ces facteurs, peut avoir besoin de sucres aminés surtout pendant l'isolement (H J GYLLENBERG,V SUNDIAN et K A F. BJORKSTEN: J Gen Microb,21,371,1959). D'autre part, il semble que le type et la quantit de sucres disponibles dans le contenu intestinal influencent les différences observées chez les nourrissons alimentés avec les deux types d'aliment, en ce qui concerne le type et le nombre de bifidobactéries. GYORGY et COL ont isolé une race de B.bifidum désignée par variété Pennsylvanicus à partir des selles de nourrissons et de secrétions vaginales de femmes enceintes, qui-a besoin de lait maternel pour se développer mais après un certain temps, cette dépendance se renverse. (P.GYORGY: Pediatrics, 11,98,1951 P GYORGY et COL: Arch Biochem and Biophys; 48,193,1954). Ce facteur de croissance présent dans le lait maternel en concentration cinquante fois supérieure 9 2516355 à celle du lait des ruminants a été identifié comme NJ-acétyl lactosamine, bien qu'une grande quantité des dérivés du N-acétyl-glucosamine présentent une certaine activité face au développement de B bifidum var Penn L'unité pour ce facteur de développement de B bifidum wvar Penn fut définie d'une façon arbitraire par GYORGY et COL comme l'équivalent à 0,0 m de lait maternel ( 5-6 mg de substance sèche); cependant, on ne peut maintenir cette unité étant donné que comme ont démontré CABEZAS,CARRION et VASQUEZ-PORTO (Rev Espa de Physiol. 24,2,85,1968), la quantité d'acides sialiques dans le colostrum et dans le lait maternel varie fortement selon le temps d'allaitement. Des applications industrielles de ces con- naissances ont été étudiées notamment dans les brevets suivants Le brevet US 3 274 003 est orienté vers l'incorporation de composants chimiques de grande activité pour promouvoir la croissance de Lactobacillus bifidus variété Pennsylvanicus Ces composants sont dérivés de la glucosamine (Noctanoil,N-benzoil ou N-carboxietoxi-d-glucosamine) Ce brevet propose la composition d'un lait destiné à l'alimen- tation infantile auquel sont ajoutés les dérivés de la glucosamine mentionnés ci-dessus. À Le brevet US 3 231 385 établit que les nuclé- otides présents dans le lait maternel, lorsqu'ils sont ajoutés au lait de vache, améliorent le goût de ce dernier et en plus réduisent la tension de son colostrum et de ce fait amé- liorent sa digestibilité Avec ces objectifs, les auteurs de ce brevet formulent un lait destiné à l'alimentation infantile qui contient de la saccharose et des polysacharides soludes, en plus des nucléotides. Le brevet US 3 338 719 établit que si on soumet le lait de vache à un traitement avec de la muramidase cristalline en proportion 0,05-0,1 mg/ml de lait à 30 C pendant 3 heures, le produit qui en résulte donne lieu au développement de Lactobacillus bifidum dans la même proportion que dans le lait maternel. O 2516355 Les brevets mentionnés se réfèrent à la capacité que présentent certains composants chimiques dérivés de la glucosamine ou de certaines enzymes, telles que les muramidases, de promouvoir la croissance de la variété Pennsylvanicus du Bifidobacterium bifidum: ou bien à l'utilisation de nucléotides afin d'améliorer le goût et la digestibilité des laits infantiles non maternisés. La présente invention concerne la composition et le procédé d'obtention d'un lait humanisé additionné de nucléotides destiné à l'alimentation infantile, dont le but est de promouvoir la croissance dans l'intestin de nourrissons mais de non pas de la variété Pennsylvanicus /-Bifidobacterium bifidum Ti, ce qui suppose jusqu'à 80 % du total des bifido- bactéries présentes dans les selles des nourrissons allaités au sein. D'autre part, le lait humanisé proposé, obtenu au moyen de nouvelles méthodes analytiques de type en 2 jnatiqpe, permet d'établir un spectre d'acides gras sériques chez les nourrissons alimentés avec ce lait maternisé, semblable à celui que possèdent les nourrissons alimentés au lait maternel. Pendant un espace de temps assez long, la demanderesse a étudié les différences dans la composition du lait maternel et de celui de différentes espèces de ruminants, spécialement du lait de vache, en ce qui concerne leur contenu en nucléotides acido-solubles Pour cela, on a utilisé de nouvelles méthodes analytiques basées sur des déterminations enzymatiques de AMP,CMP,GMP,IMP,UMP et adenine, citidine,guanosine et uridine nucléotides totaux; ainsi que sur les techniques traditionnelles de détermination des nucléotides acido-solubles par chromatographie d'échange d'ions. Les études et recherches ont permis d'aboutir aux conclusions suivantes: (i) Le contenu nucléique de la sécrétion du il 25 16355 colostrum est très étendu et sa qualité est semblable dans tous les laits étudiés La même chose a lieu généralement dans le lail excepté dans le lait de vache Dans le lait de vache, l'orotate s'accumule en grande quantité et les nucléotides sont moins nombreux. (ii) L'évolution de la composition nucléique dans le lait de vache, de brebis et de chèvre pendant la lactation se caractérise par un accroissement rapide de la concentration de nuçléotides à partir de l'accouchement jusqu'à 48-120 heures après celui-ci Une fois que le maximum a été atteint, la réduction se fait lentement, varie selon chaque espèce et dure entre 15 et 30 jours Par contre, dans le lait humain, le contenu nucléique reste constant pendant toute la période d'allaitement. (iii) Dans le lait de vache, les dérivés de l'uridine sont particulièrement abondants et ils arrivent à -90 % des nucléotides totaux pendant les 24-48 heures sui- vant l'accouchement Les uridine-nucléotides présentes en plus grande quantité sont UDP-N-AG, UDP-N-A Ga, UDPG et UDP Ga Comme il a été signalé, la concentration de tous les composants nucléiques du lait de vache, excepté l'orotate, augmente fortement à partir de l'accouchement jusqu'à 48 heures après celui-ci Postérieurement, CMP et AMP diminuent très lentement jusqu'à la fin de la lactation et le contenu en dérivés de l'uridine baisse rapidement jusqu'à sa disparition au bout d'un mois de lactation Les nucléotides dérivés de la guanine sont peu, importants du point de vue quantité dans le lait de vache et leur évolution pendant la lactation suit un cours semblable à celui des dérivés de l'urîdine Le contenu en orotate pendant toute la période de lactation arrive à 90 % du total des nucléotides. (iv) Le lait de brebis contient un nombre élevé de nucléotides; leur concentration est de l'ordre de -7 fois plus élevée que dans le lait de vache Les dérivés de l'uridine, principalement ceux qui sont unis à des restes de glucides tels que l$ glucose, la galactose, N-acétyl- 12 2516355 glucosamine, N-acétyl-galactosamine et l'acide glucoronique en sont les composants prédominants D'autre part, il existe un grand nombre de dérivés de la guanine et parmi ceux-ci, GDP Man, GDP Fuc, CMP et AMP sont régulièrement présents dans le lait de brebis et leur contenu est approximativement 4 fois plus élevé que dans le lait de vache La concentration de tous les nucléotides augmente rapidement dans le lait de brebis à partir de l'accouchement jusqu'à 48 heures après celui-ci. Postérieurement, le contenu en nucléotides baisse jusqu'à atteindre une valeur plus ou moins stable vers les 15 à 30 jours de la période de lactation. (v) Dans le lait de chèvre, les nucléotides totaux atteignent le double ou le triple de ceux du lait de vache, mais ne représentent que la moitié de ceux du lait de brebis, en temps de lactation semblables Pendant cette période, les nucléotides dérivés de la guanine sont abondants et leur concentration ressemble fort à celle que l'on trouve dans le lait de brebis Dans les dérivés de la citosine et de l'adénine, CMP et AMP sont les nucléotides majoritaires dans le lait de chèvre pendant tout l'allaitement L'orotate est également présent dans le lait de chèvre mais ses proportions sont trois fois inférieures à celles que l'on trouve dans le lait de vache'et d'autre part, sa concentration ne varie pas brusquement au cours de la lactation. (vi) La composition nucléique du lait maternel, du point de vue de la qualité, est semblable à la sécrétion de colostrum de la vache et aux laits de brebis- et de chèvre mais très différente néanmoins du lait de vache. En ce qui concerne le point de vue de la quantité des nuclé- otides, il y a des différences notables avec les laits de brebis et de chèvre, étant donné qu'ils ne représentent que ojmoles/100 ml Les dérivés de l'uridine (UMP,UDP-N-AG, UDP-N-A Ga, UDPG et UDP) forment la plus grande partie des nucléotides présents dans le lait humain Les nucléotides dérivés de la guanine sont régulièrement présents bien que leur concentration soit peu élevée On ne peut y démontrer 13 _ 516355 la présence de GDP Fuc, dont la présence est fréquente dans les laits de brebis et de chèvre Par contre, GMP est un composant typique du lait maternel pendant tout l'allaitement Les dérivés de la citidine et de l'adénosine du lait maternel représentent environ 25 % des nucléotides totaux, ce qui signifie que ces composants sont beaucoup plus abondants que dans le lait des autres espèces analysées au cours de la présente Irvention. Il faut souligner surtout que le lait humain se distingue nettement des laits de vache, de brebis et de chèvre par l'absence de quantités détectables d'orotate. (vii) L'analyse statistique comparée des résultats obtenus en ce qui concerne la composition nucléique des laits des différentes espèces et à des périodes de lactation diverses, démontre que les différences mises en évidence dans chacune des sources de variation, ne sont pas dues au hasard et en plus sont très significatives Cela empêche de généraliser aux autres espèces les analyses réalisées dans une seule espèce, comme dans le cas par exemple de l'orotate. Un autre aspect fondamental pour le nouveau-né et le nourrisson est le maintien de leur physiologie digestive. En ce sens, il est certain que chez ceux qui sont alimentés au lait maternel, ce sont les bifidobactéries qui prédominent dans la flore intestinale Ces bactéries intestinales s'opposent au développement de bactéries pathogènes telles que E coli et Salmonella. La conséquence de l'alimentation artificielle est une diminution des bifidobactéries dans l'intestin du nourrisson, ce qui peut donner lieu à l'apparition de certaines maladies d'origine gastro-intestinale. Une autre conclusion de nos recherches est le fait que si on ajoute en concentrations adéquates les nucléotides présents dans le lait maternel, au lait de vache, ceux-ci activent le développement des bifidobactéries. Comme il a été exposé dans les antécédents scientifiques et technologiques, la plupart des recherches 1 516355 internationales réalisées dans le but de déterminer les substances de stimulation du développement des bifidobactéries se sont limitées à l'emploi de Bifidobacterium bifidum (B bifidum) variété Pennsylvanicus, qui a perdu la capacité de synthétiser la glucosamine, et les résultats obtenus ont été généralisés au reste des espèces du genre Bifidumbacterium Cependant au cours de cette dernière décade, il a été démontré que la présence de cette bifidobactérie dans lés selles des nourris- sons alimentés aussi bien au lait maternel qu'au lait maternel en alternance avec le lait artificiel, et au lait artificiel exclusivement, est minoritaire et ne représente que 15 % du total des bifidobactéries isolées dans les selles des nour- rissons. Dans les recherches réalisées par la dema deresse, il a été démontré que "in vitro" l'espèce B bifidum Ti représente 80 % de ces B bifidum isolées dans les selles de nourrissons alimentés au sein et que son développement est accru de façon significative lorsque dans les milieux de culture à base de lait de vache on additionne un mélange de nucléotides monophosphates (AMP,CMP,GMP,UMP et IMP) dans les proportions indiquées concrètement au tableau V de cette description. L'addition séparée de AMP,CMP,GMP,UMP ou IMP dans les proportions indiquées, stimule également le développement "in vitro" de B bifidum Ti mais à un degré moindre que s'ils sont présents en même temps dans le milieu de culture. L'addition de toutes les combinaisons pos- sibles de deux, trois ou quatre de ces nucléotides stimule également le développement de B bifidum Ti, mais la stimu- lation maximum ne s'atteint que lorsque AMP,CMP,GMP,UMP et IMP sont présents de façon simultanée dans les proportions molaires 1:1:1:3:0,5 respectivement. D'autres nucléotides présents dans le lait maternel, tels que UDPG,UDP Ga, UDP-N-AG et UDP-N-A Ga ne 2516355 stimulent le développement "in vitro" de B bifidum Ti que si on ajoute préalablement au milieu de culture (lait de vache) les nucléotides monophosphate dérivés de l'adénine citosine, guanine, uracile et inosine. Au cours des recherches cliniques réalisées par la demanderesse sur le produit de l'invention, il-s'est confirmé que, dans les selles des nouveau-nés alimentés avec ce produit, le niveau des bifidobactéries augmente de façon significative par rapport à celui que l'on trouve dans les selles des nourrissons alimentés au lait maternisé qui ne contient pas des nucléotides. La concentration et les espèces de bifido- bactéries diagnostiquées dans les selles des nouveau-nés alimentés au lait maternel et au lait maternisé additionné de nucléotides sont très semblables tandis que dans le cas de nourrissons alimentés au lait maternisé sans nucléotides, le nombre absolu ainsi que les espèces diagnostiquées dif- fèrent de façon significative. Chez les enfants alimentés au lait maternel et au lait maternisé additionné de nucléotides, les espèces prédominantes de bifidobactéries sont B adolescentis et B.bifidum, ainsi que B breve dans une proportion relative- ment élevée tandis que les autres espèces (B infantis, B.liberorum,B lactentis et B asteroides) ne sy trouvent qu'en proportion réduite. Dans les selles des nouveau-nés alimentés au lait maternisé sans nucléotides, l'espèce prédominante est B infantis, bien que les autres espèces de bifido- bactéries mentionnées ci-dessus soient présentes également. Les recherches réalisées par la demanderesse démontrent donc que l'addition de certains nucléotides, présents dans le lait maternel, au lait artificel, dans des concentrations adéquates, stimule le développement des bifidobactéries dans l'intestin du nouveau-né à un niveau proche de celui qui est alimenté au sein. 16 2516355 Un autre des aspects physiologiques avantageux de l'emploi du lait maternisé additionné de nucléotides est l'établissement d'un spectre d'acide gras sériques chez le nouveau-né, semblable à celui des enfants alimentés au sein. En effet, les niveaux sériques d'acides gras saturés (palmitate, palmitoléate et oléate) baissent progres- sivement et d'une façon significative au bout de 7 jours et au bout de 30 jours à partir de la naissance, avec n'importe quelle alimentation, soit maternelle, soit maternisée La baisse du niveau de ces acides gras est moindre, en quantité, chez les nourrissons alimentés au lait maternel ou au lait maternisé additionné de nucléotides. En ce qui concerne les acides gras sériques insaturés, le niveau de linoléate plasmatique augmente d'une 1.5 manière significative après l'instauration du régime, mais cette augmentation est plus élevée chez les nourrissons alimentés au lait humanisé qui ne contient pas de nucléotides. D'autre part, les niveaux sériques de l'acide arachidonique se maintiennent constants chez les nourrissons alimentés au lait maternel ou au lait humanisé additionné de nucléotides, mais diminuent chez ceux alimentés au lait humanisé sans nucléotides En plus, les rapports acide arachidonique/acide linoléique et acides trienoiques/tétranoiques augmentent et diminuent respectivement chez les nourrissons alimentés au lait maternel et au lait maternisé additionné de nucléotides. Ces résultats suggèrent donc que les nucléotides dans le lait maternel remplissent une mission physiologique importante, ayant une influence certaine sur la composition lipidique, déterminée dans la structure des acides gras sériques et par conséquent dans la structure et la perméabilité des membranes cellulaires. En partant de tous ces antécédents, il a été mis au point la composition et le procédé d'obtention d'un lait humanisé qui, satisfaisant aux critères de EPSGAN, contient en outre certains nucléotides en quantité et qualité 17 d 5 16355 égales à celles du lait maternel. Les objectifs du produit (lait humanisé) de l'invention coïncidents avec les résultats qui s'obtienneat par son administration à un nourrisson, sont donc les suivants Meilleure comparaison au lait maternel Possibilité de régulation de la flore intestinale du nourrisson et, Etablissement d'un spectre d'acides gras sériques semblable à celui des ncurrissons alimentés au lait humain. Le lait humanisé dont la composition et le procédé d'obtention font l'objet du présent brevet se présente soit sous la forme d'un produit en poudre instan- tané, soit la forme d'un produit liquide Le produit liquide est stérilisé de façon conventionnelle et mis en bouteille ou bien stérilisé à ultra-haute-température (UHT) et condi- tionné en milieu aseptique. En premier lieu et afin de permettre une meilleure compréhension de la composition et du procédé, sont énoncées ci-après les matières premières qui intervien- nent ainsi que leur conditionnement éventuel, et modifications auxquelles elles sont soumises. Les substances ou mélanges de substances qui entrent dans la composition sont, à titre d'exemple, les suivants: lait de vache contenant 3,10 % de matière grasse, 8,200/ode solides non gras, sans antibiotique ou autres substances impropres au lait; lactosérum déminéralisé contenant 65 % de protéines, obtenu au moyen d'électrodialyse; mélange d'huiles végétales, formé par % de triglycérides de chaîne moyenne obtenus par le raffinage de l'huile de coco; 19 % de la fraction oléicole de l'huile de palmier; 26 % d'huile de mals et 25 % d'huile de soja; lactose (degré pharmaceutique) 18 4-2-516355 phosphate dipotassique; citrate tripotassique; ascorbate sodique; vitamines; nucléotides Al;PP,CMP,G Mp P,U Mp et I Mi P), et sels minéraux (Fe,Mn,Cu,I). Le lait de vache, comme mati 6 re première du lait humanisé, se modifiera au rroyen de l'addition de sérum déminéralisé, d'huiles végétales, de lactose, des vitamines, des sels minéraux et des nucléotides, afin d'amé- liorer sa valeur biologique et sa digestibilité l'accommo- dant ainsiaux besoins spécifiques du nourrisson Les nucléotides ajoutés rendent possible le développement d'une flore intestinale et d'un spectre d'acides gras sériques similaires à ceux qu'on observe habituellement chez les nourrissons alimentés au lait maternel. Selon les normes établies par EPSGAN et APA, le rapport caséine/lactoalbumine sera adapté au moyen ae l'addition de lactosérum afin qu 'il soit sembla- ble à celui du lait maternel ( 40:60) L'apport protéique du lait humanisé additionné de nucléotides est de 2,3 g/ calories. Par rapport à la matière grasse du lait de * vache, la matière grasse du lait maternel présente deux avan- tages fondamentaux: a) indice d'absorption plus élevé b) contenu en acides gras essentiels (AGE) plus élevé. Pour pouvoir utiliser la matière grasse du lait de vache dans l'alimentation du nourrisson, il faut donc modifier son indice d'absorption et son contenu en AGE. Suivant ces critères, dans le lait humanisé additionné de nucléotides, la matière grasse du lait de vache a donc dû 39 2 516355 être modifiée au moyen de l'incorporation d'un mélange d'huiles végétales, de préférence des triglycérides de chaîne moyenne (MCT), d'huile de palmier, de mais et de soja. La pésence de triglocérides MCT en même temps que des concentrations des acides stéariques et palmitiques inférieures à 10 et 20 % respectivement, confère au lait huma- nisé additionné de nucléotides, un indice d'absorption élevé. En plus, l'incorporation des huiles de mais et de soja, riches en acides gras polyinsaturés, confère à ce lait huma- nisé une valeur biologique élevée étant donné la richesse en AGE dont l'importance est vitale pour le développement du nouveau-né. L'apport en matière grasse du lait humanisé additionné de nucléotides atteint 5,5 g/100 calories et l'apport en acide linoléique 1,32 g/100 calories. Le contenu en hydrates de carbone du lait maternel est d'environ 7 g/100 ml et le composant principal en est la lactose C'est la raison pour laquelle la lactose est le seul hydrate de carbone de ce lait maternisé, ce qui correspond au recommandations de EPSGAN. La teneur en sels minéraux du lait mater- nisé additionné de nucléotides dont le rapport K+/1 l+a est a égal à 3 et le rapport Ca/P est égal à 1,9, est semblable à celle du lait maternel. La présence des nucléotides est considérée comme un caractère fondamental du produit obtenu au moyen du procédé de l'invention selon les raisons exposées ci- dessus. L'ensemble des vitamines répond aux caracté- ristiques d'un produit qui garantit au nourrisson l'inges- tion des besoins minimum par jour de chacune de celles-ci. Pareillement, le complexe minéral garantit l'ingestion adéquate des oligoéléments nécessaires à la croissance et au développement normaux du nourrisson. Les tableaux suivants traduisent la compo- sition typique qui correspond nucléotides: au lait humanisé addiitionn 6 de TABLEAU I Humidité Protéines Lipides Glucides Sels minéraux Apport calorique 2, 5 % 12, 2 % 29, 5 % 53, 7 % 2, 1 % 530 Kcal. TABLEAU II Contenu en acides gras (g/100 g de matière grasse) Butirique Capronique Caprilique Caprique Laurique Miristique Palmitique Stéarique Palmitoléique Oléique Linolénique Linoléique Arachidonique 0, O, 11, 7, 1, 3, 19, , 0, 24, 1, 24, O, 6 % % 2 % 6 % 1 % 0 % 0 % 6 % 7 % 2 % 9 % 0 % 6 % TABLEAU III Contenu des sels minéraux Calcium Phosphore Sodium Potassium mg mg mg mg 16355 Chlore Magnésium Fer Zinc Cuivre Manganèse Iode 330 mg % mg % 6 mg % 1,5 mg % 0,3 mg % O, 006 mg % 0, 03 mg %/ TABIEAU IV Vitamines /100 g de produit Vitamine Vitamine Vitamine Vitamine Vitamine Vitamine Vitamine Vitamine A P 3 Bl B 2 B 6 B 12 C E Folacine Pantothenate Nicotinamide Biotine Vitamine K 1 calcique 1600 U I. 300 U I. 0,40 mg 0, 45 mg 0, 20 mg 1, 1 jug mg mg g , 5 mg 6, 7 mg Fg ug TABLEAU V Nucléotides par 100 gr de produit Citidine-5 '-monophosphate sel dissodique(CMP) 1,12 mg Adenosine-5 '-monophosphate sel dissodique AMP)1, 32 mg Guanosine-5 '-monophosphate sel dissodique(GMP)l,49 mg Uridine-5 'monophosphate sel dissodique (UMP) 3,42 mg Inosine-5 '-monophosphate sel dissodique (IMP) 0,45 mg La composition du produit liquide est la même que celle du produit en poudre mais en tenant compte que le produit liquide contient 13 % de solides qui correspondent au pro- duit en poudre. 22 2516355 Le procédé de fabrication de lait m ernzé additionné de nucléotides en poudre se compose de deux rpases bien différentes: il s'agit d'abord d'obtenir un produit de base en rn,dre et ensuite on mélange cette bas aux vita - minesdans une une partie du lactose Le produit final est soumis à un procédé de granulation et instantan Slsation avant d'être emballé. Pour obtenir la base en poudre, onr part initialement d'un produit liquide contenant ll % de solides totaux obtenus par la dissolution des composants. Le procédé est le suivant: dissolution du lactose ( 2,66 %) au moyen d'un agitateur à grande vitesse dans l'eau ( 10 %) à faible teneur en sel Ajuste- ment du p H à 7,5 en ajoutant de la potasse Ce point est très important dans le procédé étant donné que de celui-ci dépend la stabilité du produit final, ce qui le différencie grandement par rapport aux autres produits lactés fabriqués en suivant d'autres procédés. La solution de lactose ( 34,25 %) est mélangée au lait de vache contenant 3,2 % de matière grasse et 8,20 % de solides non gras, dilués au préalable dans l'eau ( 48,1 %) dans laquelle on a dissout le phosphate de potasse ( 0,48 %), le citrate potassique ( 0,03 %) ainsi que le complexe minéral ( 0,00001 %). Dans ce mélange, on disperse le lacto- sérum ( 1,32 %) au moyen d'un équipement spécial qui se compose d'un entonnoir raccordé à un circuit o une pompe centrifuge de grande capacité aspire le liquide Au travers d'un rétrécissement en tuyau, et justement par dessous o est placé l'entonnoir, un effet Ventri est produit, ce qui permet que le lactosérum soit introduit lentement et mélangé avec le liquide lacté (lait,eau,lactose,sels). Le mélange d'huiles végétales ( 3,52 %) est incorporé a travers l'entonnoir une fois que le lactosérum a été dissous au moyen de l'équipement décrit. 23 Q 516355 Dans ce cas, une pompe centrifuge dirige le produit vers un réservoir qui contient un agitateur-homogénéisateur de grande vitesse, ce qui permet d'effectuer l'émulsion de l'huile dans le reste du produit liquide de façon mécanique sans avoir besoin de recourir à des agents émulsifiantschimiques Ce point est essentiel pour obtenir un produit terminé dans lequel il n'apparaîtra pas de graisse libre, ce qui est très fréquent dans les laits maternisés com- mercialisés actuellement. On chauffe la base liquide jusqu'à 650 C, on homogénéise à 200 Kg/cm 2 de pression Immédiatement après, on pasteurise à 95-1000 C Ce mélange est ensuite évaporé au moyen d'un évaporateur conventionnel à double ou triple effet, avec recompression de la vapeur jusqu'à 45-50 % de solides totaux. Ce produit évaporé est séché par pulvéri- sation dans une tour de séchage conventionnelle, soit horizontale soit verticale par l'emploi de courants d'air comme moyen de déshydratation On obtient donc ainsi la base du lait maternisé additionné de nucléotides en poudre. Les nucléotides seront ajoutés au produit liquide de base immédiatement après la pasteurisation ou bien au produit concentré Cette phase est fondamentale dans le procédé étant donné que si on ajoute les nucléo- tides au lait cru, ceux-ci sont détruits, tout au moins en grande partie par la phosphatase alcaline présente dans le lait. Ensuite, on mélange la lactose et les vitamines au produit de base du lait maternisé additionné de nucléotides dans les proportions de 26,9 %, 0,1 % et 73 % respectivement Ce mélange est soumis au processus d'instantanéisation et agglomération dans un tunnel d'agglomération horizontal tout à fait conventionnel Le produit en sort prêt à être emballé. 24 L 516355 Le procédé de fabrication du lait maternisé additionné de nucléotides sous forme liquide, est identique pour la majorité des phases du procédé décrit pour la fabrica- tion du produit en poudre étant donné que la différence réside dans la proportion de solides. Pour ne pas faire de répétitions, le procédé en vue d'obtenir le lait maternisé additionné de nucléotides, sous forme liquide-, est le suivant: dissolution du lactose ( 5,58 %) dans l'eau ( 20 %) et ajustement du PH à 7,5 par addition de potasse; mélange du lait de vache ( 30,60 %) avec de l'eau ( 39,80 %), du phosphate de potasse ( 0, 10 %), du citrate potassique ( 0,02 %), de l'ascorbate sodique ( 0,03 %) et le mélange de vitamines et sels minéraux ( 0,013 %); mélange de la solution de lactose et de la solution de sels dans le lait et l'eau; dispersion du lactosérum déminéralisé ( 1,10 %) dans le mélange antérieur; émulsion du mélange végétal ( 2,91 %) dans le produit -préchauffage jusqu'à 650 C et homogénéisation à 200 Kg/cm 2, ensuite stérilisation à 1350 C pendant 15 secondes et refroidissement à 30 QC; addition des nucléotides à 30 QC au pro- duit pré-stérilisé, et mise en bouteille de polyéthylène de haute densité et stérilisation à 1210 C dans une tour de sté- rilisation en continu. Le produit émulsionné pourrait également être stérilisé par le procédé de ultra-haute-température ( 15000 C pendant 2-4 secondes) et conditionné ensuite en milieu aseptique Dans ce cas, on ajoute les nucléotides immédiatement avant la stérilisation ou bien on emploie du lait pasteurisé (dont la phosphatase est inactive), pour la fabrication du produit liquide, ce qui permet de réaliser la stérilisation à n'importe quel moment après la reconstitu- tion et l'émulsion des huiles végétales. Il va de soi que de nombreuses variantes peuvent être introduites, notamment par substitution de moyens ou de produits techniquement équivalents, sans sortir pour celà du cadre de la présente invention. REVENDICATIONS 1 Lait maternisé composé de lait de vache auquel est ajouté au moins un nucléotide, caractérisé en ce qu'il inclût en outre, du lactosérum déminéralisé, des huiles végétales, du lactose, du phosphate dipotassique, du citrate tripotassique, de l'ascorbate sodique, des vitamines et un complexe minéral. 2 Lait maternisé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le lait de vache contient 3,1 % de matière grasse et 8,20 % de solides non gras, le lactosérum déminéralisé contient 65 % de protéines, les huiles végétales étant constituées par un mélange de 30 % de triglycérides de chaîne moyenne, de 19 % de fraction oléique d'huile de palmier, de 26 % d'huile de mais et de 25 % d'huile de soja. 3 Lait maternisé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'au moins l'un des nucléotides ajouté au lait de vache est choisi dans la classe regroupant: le citidine-monophosphate (CMP),le guanosine- monophosphate (GMP), l'uridine-monophosphate (UMP), l'adénosinemonophosphate (AMP), l'inosine-monophosphate (IMP) 4 Lait maternisé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il inclût l'ensemble des nucléotides définis dans la revendication 3. Lait maternisé selon la revendication 4, caractérisé en-ce que, pour 100 grammes de lait maternisé les nucléotides se trouvent dans les proportions suivantes: CMP 1,12 mg; AMP 1,32 mg; GMP 1,49 mg; UMP 3,42 mg; IMP 0,45 mg. 6 Procédé de fabrication de lait maternisé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend les phases suivantes: Dissolution du lactose,au moyen d'un agitateur à grande vitesse, dans de l'eau à faible teneur en sel; Ajustement du p H de cette solution au moyen de potasse; Préparation d'un mélange de lait de vache,eau et sels minéraux; Mélange d'une partie de la première solution avec le mélange obtenu précédemment d'o un premier sous-produit liquide; Dispersion lente du lactosérum dans le premier sousproduit; Incorporation et émulsion des huiles végétales dans le premier sous-produit; Préchauffage du premier sous-produit,homogénéisa- tion sous pression, pasteurisation et évaporation; Addition des nucléotides; Séchage sous jet d'air chaud et obtention d'un second sousproduit en poudre; Mélange du second sous-produit avec les reste de la solution de lactose et addition de vitamines donnant le produit final recherché. Procédé de fabrication de lait maternisé selon l'une des revendications 1 à 6, sous forme liquide, caractérisé en ce qu'il comprend les phases suivantes: Dissolution du lactose dans l'eau et ajustement du p H au moyen de potasse; Préparation d'un mélange de lait de vache, eau, vitamines et sels minéraux; Mélange de la dissolution et du mélange précédent ce qui donne un premier sous-produit; Dispersion de lactosérum déminéralisé dans le sous-produit obtenu; Emulsion d'un mélange d'huiles végétales dans le sous-produit; Préchauffage du sous-produit, homogénéisation suivie d'une première stérilisation et d'un refroidissement; 1 516355 Addition de nucléotides; Seconde stérilisation et obtention du produit final. 8 " Procédé de fabrication de lait maternisé selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que le sous-produit est soumis à une seule stérilisation à Ultra Haute Température, les nucléotides étant ajoutés avant cette stérilisation. 9 g Procédé de fabrication de lait maternisé selon la revendication 7, caractérisé en ce que, le lait de vache étant préalablement pasteurisé, les nucléotides sont ajoutés et la stérilisation est effectuée à n'importe quel moment après émulsion du mélange d'huiles végétales.