FR 2519648 A1 19830718 FR 8217160 A 19821013 -1- Culture biologique capable de causer la mort d'insectes ainsi que la composition et le procédé utiliséspour son application. L'invention concerne un procédé de mattrise des populations d'insectes, spécialement de celles qui sont herbivores et en particulier, un procédé pour réaliser cette maltrisé par des moyens biologiques. Au cours des années, l'existence de différentes - espèces d'insectes qui influencent leur environnement local pendant un ou plusieurs stades de leur cycle vital a eu, à certains moments, une influence nuisible sur la végétation locale et/ou les êtres vivants indigènes Ce coup porté à l'environnement s'est souvent révélé nuisible au bien-être physique, économique et social des humains Comme exemple récent d'insecte indésirable, on citera le bombyx disparate ou zigzag (voir Marshall, E, Science, volume 213 du 28 Aot 1981, pages 991 à 993, qui dénude pratique- ment les arbres feuillus et la mouche méditerranéenne des fruits (Ceratitis capitata) qui infeste et détruit les récoltes de fruits destinées à la consommation humaine. Que les insectes soient directement nuisibles à l'homme comme ceux que l'on a mentionnés ci-dessus ou qu'ils ne fassent que perturber localement l'équilibre de la nature, on a nettement besoin de maîtriser les populations d'insectes ou les insectes Les premiers procédés de maltrise étaient principalement de nature chimique Les procédés plus récents sont chimiques et biologiques On a adopté divers procédés utilisables contre les insectes pendant les phases vulnérables de leur cycle vital, notamment l'usage d'agents chimiques toxiques, l'introduction de spécimens stériles dans les populations d'insectes, l'utilisation de leurres tels que les phéromones pour attirer les insectes etc. On a aussi utilisé, avec un certain succès, des organismes pathogènes tels que le Bacillus thuringiensis. On peut utiliser l'un ou l'autre des procédés de -2- maîtrise ci-dessus selon le type d'insecte dont il s'agit et aussi selon l'environnement dans lequel il s'agit de les utiliser Malheureusement, ltutili- sation d'agents chimiques pour la lutte contre les insectes a certains inconvénients tels qu'un effet résiduel non désiré, une mortalité sans discrimination pour les organismes vivants, des effets imprévisibles à long termes sur les organismes exposés, la persistance dans les chaînes alimentaires et le fait que le public désapprouve l'utilisation d'agents chimiques. Par conséquent, il est devenu désirable, comme solution de rechange, de maîtriser les populations d'insectes par des moyens biologiques Un procédé à cet effet consiste à disséminer des insectes miles stériles dans une population d'insectes d'une espbce particulière, de sorte que les instincts d'accouplement sent satisfait sans production de descendance Ce procédé a aussi certains inconvénients en ce sens qu'il uta pas un effet immédiat et qu'il risque d'être insuffisant quantitativement en face d'une population considérable d'insectes. Beaucoup des problèmes associés A la maîtrise des populations d'insectes comme la sélectivité, l'oexisteance d'un résidu, le manque d'aetion immédiat etc semblent être résolus par l'invention qui, en résumé, cause la mort des insectes par un ou des mécanismea associés au dépérissement. Le dépérissement, chez un insecte, est caractérisé par le fait qu'il cesse de s'alimenter, que son activité ralentit et qu'ensuite, il devient complètement immobile Au bout d'un certain temps, habituellement quelques heures, du liquide putréfié et foncé suinte par les orifices du corps tels que la bouche et l'anus. L'insecte, par exemple la chenille, devient extrêmement flaccide, les pattes cessent d'être préhensiles, jusqu'à ce que finalement, par un ou deux seulement de ses pseudopodes ou par ses ptérogopodes anaux, elle 3reste accrochée, flasque et morte Au moment de la mort, sa peau est habituellement noire, elle peut facilement crever en émettant un liquide fluide et foncé d'odeur extr&mement désagréable. Le dépérissement est surtout connu comme atteignant la larve du bombyx disparate, Lymantria dispar Linnaeus, mais on a signalé qu'au moins 35 autres espèces d'insectes étaient atteints par la même maladie ou des maladies très similaires Voir Stienhaus, Insect Microbiology S An Account of the Microbes Associated with Insects & Ticks, page 414 ( 1946) On croyait d'abord qu'un petit coccus motile, le Gyrococcus flaccidifex, était l'agent étielogique de la maladie du bombyx disparate, mais une étude étendue sur le dépérissement du bombyx disparate, effectuée par R . Glaser et JW Chapman au début de ce siècle, a conduit à déterminer que le dépérissement du bombyx disparate est causé par un virus filtrant L'efficacité de ce travail est rendu évidente par le fait que l'on 8 t'est mis à utiliser le mot dépérissement" comame terme général peur désigner toute maladie virale des insectes, idem page 421. Une étude supplémentaire concernant le dépéris- sement a conduit à la découverte d'un autre micrococcus, à savoir le Micrococcus flaccidifex danai, Index ne 3322-22120-2131, que l'on a identifié comme l'agent étielogique du "dépérissement" chez la chenille du Danais plexippus; voir American Museum Novitates, n 251, pages 5 et 6 ( 1927). Ces études étiologiques, et peut-être d'autres, sur la mort des insectes par flétrissement ont révélé différents microorganismes léthaux, mais il ne semble pas que l'on ait efficacement utilisé aucun micoor- ganisme causant le dépérissement pour la maîtrise biologique d'une population d'insectes. L'invention propose un insecticide biologique nouveau pour la maîtrise des insectes caractérisé par -4- le fait qu'il constitue une culture biologiquement pure du microorganisme Micrococcus pseudoflaccidifex de aorte que lorsque cette culture est ingérée par les insectes, elle cause leur mort. Une culture viable de cet organisme est déposée à l'Amerioan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, E U A, et a été incorporée à la collection permanente de cet organisme sous le numéro d'admission ATCC 31970. Le microorganisme Micrococcus pseudoflaccidifex, ATCC nÀ 31970, eat très efficace pour causer la mort des insectes, généralement au stade de la larve On entend ici par insectes les insectes proprement dits et les acariens Plus précisément, cette bactérie est capable de causer la mort des insectes qui ingèrent l'organisme Visiblement, on maîtrise la population d'insectes visée en causant la mort de ces insectes par un ou des mécanismes associés au dépérissement. On pense que ces mécanismes pourraient être, isolément ou encombinaison, la pénétration dans le tube digestif, la digestion des tissus, l'inactivation de mécanisme d'inmunité etc Mais on n'indique pas ici de mécanisme qui puisse en aucune façon limiter la portée de l'invention. L'inventeur a découvert que le Micrococcus pseudo- flaccidifex est l'agent étiologique du dépérissement chez le Danais plexippus On a isolé l'organisme par des procédés microbiologiques classiques, en partant de larves mortes, dans une population de laboratoire. Les essais effectués jusqu'ici indiquent que le Micrococcus pseudoflaccidifex cause aussi la mort de la chenille du bombyx disparate, des vers à soie, du Protoparce sexta et d'autres insectes lorsqu'ils ingèrent le microorganisme Il n'est pas question de limiter la portée de l'invention aux résultats expérimentaux dont on dispose actuellement. Etant donné que le microorganisme cause la mort -5- lorsqu'il est simplement ingéré par les larves, on effectue facilement la mattrise d'une population en déposant le M psoudoflaccidifex dans l'environnement de la population d'insectes visée, sous une forme qui le rend accessible à la consommation par les larves du ou des insectes Par exemple,-on peut mettre en suspension une certains concentration du micrococcus léthal dans un milieu inoffensif pour l'environnement, puis pulvériser ou nébuliser le tout ou l'appliquer à une matière pouvant être ingérée, par tout procédé praticable, dans une zone à traiter. On utilise normalement un support ou une charge pour une composition insecticide appropriée Les supports ou diluants liquides que l'on utilisera normalement pour l'application par pulvérisation comprennent l'eau, l'éthylèneglyool, le glycérol, les polyglycols à poids moléculaire élevé, le pétrole lampant, diverses huiles minérales, l'huile de mats et d'autres liquides organiques tels que le xylène, les alcools et les cétones La préparation peut être sous la forme d'une émulsion, habituellement du type L-H, utilisant des émulsifiants connus On peut utiliser des charges ou poudres pour préparer une composition sèche convenant à l'application par poudrage Des poudres sèches des bactéries (principalement formées de spores ou de cultures entières finales) peuvent être préparées par des techniques de pulvérisation, de séchage sous vide ou de lyophilisation Les poudres appropriées comprennent le talc, le kaolin, la bentonite et d'autres argiles, le carbonate de calcium, la zéolite, la terre d'infusoires et l'alumine La composition insecticide peut aussi être appliquée par la technique des aérosols, avec utilisation, comme propulseurs, d'hydrocarbures gazeux appropriés sous pression. Pour mieux comprendre l'invention, on pourra se référer à la description suivante ainsi qu'aux i -6- exemples qui l'accompagnent. Selon l'invention, on propose une culture microbiologiquement pure du microorganisme Micrococcus pseudoflaccidifex ATCC nÀ 31970 qui cause la mort des insectes L'organisme susdit, qui est un micrococcus, a été isolé du corps de chenilles de Danais plexippus fournies par Queens, New York Des spécimens de Danais plexippus ont été ramassés sous forme d'oeufs et élevés dans une colonie séparée de l'environnement naturel. Ltobservation des papillons au stade de la larve a révélé un niveau d'activité réduit chez plusieurs spécimens et ensuite la mort causée visiblement par dépérissement Lorsqu'on a ouvert le corps des chenilles mortes, un liquide putride foncé et fluide a été émis et on a observé que pratiquement tous les organes internes de la chenille étaient détruits. Pour tenter de déterminer la cause de la mort, on a fait des tralnées du liquide corporel sur des bottes de culture et finalement, on a isolé une culture pure du microorganisme par une technique classique à bottes de coulée et on l'a étudiée. On a fait ingérer l'organisme à des chenilles de Danais plexippus et on l'a inoculé à celles-ci. Teus les insectes sont morts et on a isolé à nouveau l'organisme en partant des chenilles traitées. Le Micrococcus pseudoflaccidifex ATCC ne 31970 a les caractéristiques morphologiques suivantes. C'est un micrococcus gram+ Cette coloration peut varier selon lt'ge de la culture Il se développe de façon aérobie sur agar ou dans des milieux de bouillons, généralement par groupes de deux, bien que l'on puisse trouver parfois de courts bâtonnets comportant quatre cellules ou davantage en chatne. Les colonies sont circulaires, lisses d'apparence blanch&tre luisante. L'organisme se développe dans une mesure appropriée -7- sur divers milieux mais jusqu'ici, on l'a le mieux cultivé sur bouillon d'infusion de cerveau et de coeur (BHI) ou sur agar additionné de sérum de cheval inactivé à raison de 0,5 ml pour 10 ml de milieu. Le métabolisme d'hydrates de carbone du M pseaudoflaccidifex est le suivant (sucre à 1 % de rouge de phénol) s Hydrate de carbone Développement d'acide arabinose formation d'acide fructose galactose maltose amidon -sucrose inuline légère formation d'acide lactose mannose sorbitel xylose Le procédé utilisé pour déterminer le métabolisme des hydrates de carbone utilise des méthodes classiques comme celles qui sont décrites par A C Baird-Parker, "Methods for Identifying Staphylococci and Micrococci" dans l'édition 1979 de Identification Methods for Microbiologists, publié par la Society of Applied Microbiologists, sous la direction de F A Skinner et D.W Lavelock et les méthodes d'essai de Gunn et coll, "Comparison of Methods for Identifying Staphylococcus and Micrococcus", Journal of Chemical Microbiology, volume 14, N 2, aoit 1981, pages 195 à 200. On a aussi conduit d'autres réactios biochimiques selon les méthodes décrites dans les publications citées ci-dessus, avec les résultats suivants: Métabolisme biochimique du Micrococcus pseudoflaccidifex A 35 robie et microaérophile Hémolyse: a catalase t positif oub g Anoaq u uo) quemego Tagd 9 p op g 4 aou quos quoq 40 4 ueme Tnes 01, 'q ooot op gri Td op 4 u U Tav A soiquou ne ena Tule 2 joi T PTUOOUT v uo 'OTOR l oie & ose -lè 1-0-tdlexe aud -uo T 4-éTnoou T aud pioqiesp Ixej Tp Toovljopnend ON op sesop sep -q OU Ai VT 001 STUMOO v uo gooàa-OT op gedú 4 squeapjj Tp ans qua Tuu 2 ao O ao Tm up 94 TOMOTJJO&T jeu Twael:pp inod oenrboejje 9-çusee *op omm(r op Tougio oinpioq sepuoi 90 TUOI 00 oc luqme Tneq OPTOU ego lueme Tn O 9 OPTOM eu T Tniy T quemeines ep Tow 090 JOUS, Z* 2 qe OPTOU 4 ueme Tnes op Tov esou-çqlejm 8 UOT 4104 uemmzeî Z JT 4 v 29 u JT 4 TS Od mmau u O-Fl-Uj OTO 3 TVUVP XOJTPTOOVTJ ON XOJTPTOOUTJO Pneid ON oe 4 mm &Tno enb TS*To Twúqd uos-çis radmoo UT 4- r"J v ue 6 ç eaud 4,Lz 6 L ZP 4 L Z ou 904 UI-TAON umeaux UVOTJOUY Ilaqoeaul UT pimo'l oz v Tiol oua AON JO BUO Tld Tjoqoa 4 uaeau u Tjx*N O& ared 4 Tao 9 p 4 se T Tnb Teq Tuump xej Tp Too"Tj enoooooao TN up xej Tp Toov T Zepnond enoooooao TN e T aen 2 u Tqe Tp op u Tjy quequ Tega 8 OUTOO Tqoeox 4 tm I *Tgpj 8 ewúzoell t elq T*uog *u T-qdw 4 oooúl e Tqyeues *u Toúuoa-q 4 úaq *Tqn Tos t e T Tq UT suvp p 4 TT Tqule S OA Tqu 2 pu 1 e OL 'q Toux gump eouges Taio 9 A TqT 9 od *Tqu 4 somieqq oeup Tou N ot OAT Tgod sqq UjlTu sep UOT 40 uppu sinon L op lueq nu j T 4 T 9 od t olm Toiqo Xxosqq elopul (,rgig) inooo op:e nve &aeo op uo Tenju Tip no TT Tu ans e Tnadvo j Tq-v 2 pu 8 S z x q q- 'eu Tpseo UT op e 4 ue T euúToap Liq a joueujnol ne 4-çel queu Tpps je e-qouvlq e Tno TT Ted emioj Toous uo T 4 o"jpnb TI eu Tqulp S UT guvp oieb Td 19648 -9- était un minimum commode étant donné la difficulté d'obtenir de si petites quantités du microorganisme). De façon similaire, l'inoculation sur des chenilles de Danais plexippus, des chenilles de bombyx disparate et des Protoparce sexta a donné 100 % de mortalité. Dans des essais effectués pour déterminer la léthalité de la bactérie, on a badigeonné des feuilles avec des cultures de 24 heures et on a fait ingérer les bactéries par les quatre espèces différentes de chenilles Toutes sont mortes de dépérissement. Dans une expérience sur des chenilles de bombyx disparate, 76 % étaient mortes dans les deux jours et 100 % dans les trois jours Les chenilles témoins ont présenté une mortalité d'environ 4 à 5 % en trois jours, ce qui confirme une mortalité d'au moins 95 % due à la bactérie. On estime donc que le Mierococcus pseudoflaccidifex sera efficace aussi sur tous les insectes, spécialement les insectes herbivores au stade de la larve, mime à très faible concentration Actuellement, on n'a pas connaissance que cette bactérie cause de maladie chez l'homme ni chez les animaux autres qu'insectes. En conséquence, l'invention comprend un procédé pour ma triser la population de tous insectes et en particulier d'insectes herbivores. -10- REVENDICATIONS 1. Culture biologiquement pure du microorganisme Micrococcus pseudoflaccidifex, ATCC n 31970, cette culture étant capable de causer la mort des insectes. 2 _ Composition utile pour provoquer une maladie chez les insectes et caractérisée par le fait qu'elle comprend une population pathogène de Micrococcus pseudoflaccidifex ATCC ne 31970 dans un véhicule approprié. 3 Procédé pour provoquer une maladie chez un insecte, caractérisé par le fait que l'on administre à l'insecte une population pathogène de Micrococcus pseudoflaccidifex ATCC ne 31970. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que pour introduire le microorganisme, on applique/sur ou dans une matière pouvant &tre ingéré eun milieu inoffensif pour l'environnement et contenant le microorganisme, dans l'environnement o l'on désire provoquer une maladie chez les insectes. 5 Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que le milieu est à base aqueuse. 6. Procédé selon l'une des revendications 4 et , caractérisé par le fait que la concentration de microorganismes dans le milieu est d'environ 1 partie par million en poids. 7. Procédé selon l'une des revendications 3 à 6, caractérisé par le fait que les insectes sont herbivores. 8. Procédé selon l'une des revendications 3 à 6, caractérisé par le fait que la maladie est le dépéris- semant. 9. Procédé selon l'une des revendications 3 à 6, caractérisé par le fait que l'insecte est au stade de la larve. 10. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'insecte est une chenille de Danais plexippus, une chenille de bombyx disparate, un ver à soie ou un Protoparce sexta.