FR 2523597 A1 19830923 FR 8304399 A 19830317 La présente invention un nouveau procédé pour la pré- paration d'un micro-organisme immobilise. Les micro-organismes immobilisés (c'est-à-dire les micro-organismes fixes sur des supports) ont acquis une grande importance dans diverses réactions enzymatiques et on connaissait déjà dans la technique antérieure divers procédés pour préparer des micro-organismes immobilises Par exemple, le brevet des Etats-Unis d'Amérique N O 4 138 292 décrit un procédé pour préparer un micro-organisme immobilisé,dans lequel on mélange les cellules microbiennes avec une solution aqueuse d'un polysaccharide ayant une teneur en restes sulfates dans sa molécule de 10 % en poids ou plus, tel que le carragheenanne, et ensuite on gélifie le polysaccha- ride contenu dans le mélange résultant pour fixer les cellules microbiennes dans la matrice de gel afin d'obtenir le micro-orga- nisme immobilise En outre, le brevet des Etats-Unis d'Amérique ci-dessus décrit également la stabilisation de l'activité enzymatique du micro-organisme immobilise par traitement de la préparation immo- bilisée obtenue ci-dessus par le glutaraldèhyde. Cependant, cette stabilisation de l'activité enzyma- tique du micro-organisme immobilisé par traitement par le glutaral- déhyde après fixation des cellules microbiennes dans le gel n'est pas nécessairement satisfaisante, lorsqu'on l'effectue à l'échelle industrielle Autrement dit, comme le polysaccharide ci-dessus est relativement fragile vis-à-vis des forces de cisaillement, la conser- vation de la forme du gel peut être altérée pendant le traitement par le glutaraldéhyde et il est difficile d'effectuer le traitement de manière uniforme. A la suite de recherches approfondies pour surmonter ces difficultés, la demanderesse a découvert selon l'invention que l'on peut facilement préparer un micro-organisme immobilisé ayant une activité enzymatique élevée,ainsi qu'une stabilité élevéeen traitant le bouillon de culture de micro-organismes par le gluta- raldéhyde lorsque la culture est terminée au lieu d'effectuer le traitement par le glutaraldehyde après la fixation dans le gel du polysaccharide. Le principal objet de la présente invention est de proposer un nouveau procédé pour préparer un microorganisme immo- bilisé ayant une activité enzymatique supérieure et une stabilité supérieure, permettant de produire la préparation immobilisée sans rencontrer les difficultés ci-dessus à l'échelle industrielle Ce but et d'autres objets et avantages de l'invention apparaîtront à l'homme de l'art à la lecture de la description qui va suivre. Selon l'invention, on propose un procede pour preparer un micro-organisme immobilisé qui consiste à cultiver un micro- organisme dans un bouillon de culture, à traiter le bouillon par le glutaraldehyde lorsque la culture est terminée, à recueillir les cellules microbiennes du bouillon, à mélanger les cellules microbiennes avec une solution aqueuse d'un polysaccharide ayant une teneur en restes sulfates dans sa molécule de 10 7 % en poids ou plus, et ensuite à gélifier le polysaccharide dans le mélange resultant pour fixer les cellules microbiennes dans la matrice de gel du polysaccharide. Selon l'invention, on peut utiliser n'importe quel micro-organisme ayant des activités enzymatiques recherchées Des exemples préferes de ces microorganismes comprennent Escherichia coli ATCC 11303 (IAM 1268) doué d'activité d'aspartase, Pseudomonas dacunhae IAM 1152 doué d'activité de L-aspartate P-décarboxylase, et les analogues. On peut utiliser comme bouillon de culture n'importe quelbouillon de culture classique pour la culture des micro-organismes tels que ceux indiqués ci-dessus et il peut contenir les quantités appropriées des ingrédients classiques, tels que sources de carbone, sources d'azote, substances nutritives organiques, substances inor- ganiques, etc. Des exemples de polysaccharides ayant une teneur en restes sulfates de 10 % en poids ou plus de la molecule utilises selon l'invention comprennent le carragheenanne, le furcellaranne, le sulfate de celluloseetc Le carragheenanne est un polysaccharide contenant 20 à 30 % en poids de restes sulfates, qui est obtenu par raffinage d'un extrait d'algues du genre des Rhodophyceae, tels que Gigartinaceae et Solievianceae Selon l'invention, on peut uti- liser du carragheenanne du commerce, par exemple ceux fabriqués par Kopenhagen Pectin Factory Ltd sous les noms de "GENU GEL WG'", IENU GEL a CW'et "GENU VISCO" Le furcellaranne est un polysaccharide contenant 12 à 16 % en poids de restes sulfates, qui est obtenu par extraction d'une espèce d'algues appartenant aux Rhodophyceae, c'est-à-dire Furcellaria fastigiota et on peut utiliser, par exemple, le furcellaranne fabrique au Danemark par la Société Litex Co En exemple de sulfate de cellulose est le produit fabrique par la societé Kelco Co sous le nom de "KELCO SCS". Dans la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, on cultive d'abord le micro-organisme dans le bouillon de culture. Le mode de culture n'est pas particulièrement limite et on peut cultiver le micro-organisme selon une technique connue Facultative- ment, lorsque la culture est terminée, on peut éliminer l'activité enzymatique pour un système de reaction secondaire du micro-organisme par une technique connue avant l'étape suivante de traitement par le glutaraldehyde. Ensuite, lorsque la culture est terminée, on traite le bouillon de culture par le glutaraldehyde Ce traitement peut être facilement effectue en mélangeant le glutaraldehyde avec le bouillon de culture en agitant ou en secouant De préférence, la quantité de glutaraldehyde à ajouter est telle que sa concentra- tion finale dans le bouillon de culture soit de 0,1 m M à 0,5 M, en particulier de 1 m M à 0,1 M De préférence, ce traitement par le glutaraldehyde est effectue & 0-60 *C, en particulier à 0-40 C. La durée nécessaire pour ce traitement dépend de la température mais on préfère ordinairement effectuer le traitement pendant 1 min à 24 h, en particulier pendant 5 min à 5 h Après traitement par le glutaraldehyde, on recueille les cellules microbiennes, par exemple par centrifugation du bouillon de culture. On mélange les cellules microbiennes ainsi obtenues avec une solution aqueuse du polysaccharide contenant 10 % en poids ou plus de restes sulfates dans sa molécule (ci-après dénomme "polysaccharide") On peut facilement préparer la solution aqueuse du polysaccharide en mélangeant le polysaccharide avec de l'eau à -100 C La concentration du polysaccharide dans l'eau est de préférence de 0,2 à 20 % en poids, en particulier de 1 à 10 % en poids On mélange la solution aqueuse du polysaccharide ainsi obtenue avec les cellules microbiennes ci-dessus pour préparer un mélange Dans la préparation du mélange, on met de preférence les cellules microbiennes en suspension dans l'eau, dans une solution de sérum physiologique ou une solution-tampon appropriée (p: _ à 10, de préférence p H 4 à 8) et on mélange ensuite la suspens ia résultante avec la solution aqueuse du polysaccharide chauffée à 30-60 C. L'étape suivante consiste & gélifier le polysaccharide dans le mélange pour fixer les cellules microbiennes dans la matrice de gel du polysaccharide On peut effectuer facilement la gélifi- cation du polysaccharide par refroidissement du mélange Par exezple, lorsqu'on laisse reposer le mélange à environ 0-20 C pendant envi ron 1 min à 5 h, le polysaccharide est gélifié et simultanément les cellules microbiennes sont fixées dans la matrice de gel résultante du polysaccharide Le gel ainsi obtenu peut Otre moule dans diverses formes. De plus, on peut aussi effectuer la gélification ci- dessus par une technique autre que le refroidissement du mélange. Par exemple, on peut effectuer la gélification par mise en contact du mélange avec des ions ammonium ou des ions métalliques ayant un poids atomique de 24 ou plus (par exemple des ions potassium, magné- sium, calcium, etc), mise en contact du mélange avec un composé ayant dans sa molécule deux groupes fonctionnels basiques ou plus (par exemple méthylènediamine, éthylènediamine, p-phenylènediamine, etc) ou mise en contact du mélange avec un solvant organique miscible avec l'eau (par exemple acetone, méthanol, éthanol, propanol, dioxanne, tétrahydrofuranne, etc). On peut utiliser le micro-organisme immobilisé preparé par le procède de l'invention dans diverses réactions enzymatiques selon une technique connue En comparaison avec le procéde décrit dans le brevet des EtatsUnis d'Amérique n 4 138 292 ci-dessus, dans lequel le traitement par le glutaraldehyde est effectue après la fixation des cellules microbiennes dans le gel, le procédé selon l'invention,dans lequel le traitement par le glutaraldéhyde est effectue sur le bouillonde culture lorsque la culture est terminée, présente les avantages suivants. Comme le traitement par le glutaraldéhyde dans le procéde ci-dessus de la technique antérieure est effectué après la fixation dans le gel, la conservation de la forme du gel peut être altérée et il est difficile d'effectuer le traitement de manière uniforme Au contraire, comme le traitement par le gluta- raldéhyde dans le procédé selon l'invention est effectue sur le bouillon de culture à la fin de la culture, les difficultés ci- dessus du procédé de la technique antérieure sont éliminées et le traitement peut être effectué de manière uniforme dans une opération très simple De plus, on peut obtenir par le procédé selon l'invention un microorganisme immobilisé ayant une activité enzymatique plus élevée que celui prépare par le procèdé de la technique antérieure En outre, en comparaison avec le micro- organisme immobilisé obtenu par le procédé de la technique anté- rieure, le micro-organisme immobilise obtenu par le procédé de l'invention conserve une activité enzymatique plus élevée pendant une plus longue durée dans une réaction enzymatique continue. Le procédé selon l'invention est donc un excellent procédé industriel pour la préparation de micro-organismes immobi- lises. Les exemples et expériences ci-après illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 On distribue des portions de chacune 100 ml d'un bouillon de culture à p H 7,0 contenant 2,0 % de liqueur de trempage de mais, 2 % d'extrait de levure, 1,14 % d'acide fumarique, 0,5 %/e de fumarate diammonique, 0,2 % de dihydrogénophosphate de potassium et 0,05 % de sulfate de magnésium dans 10 fioles de Sakaguchi de 500 ml On inocule chaque fiole avec Escherichia coli ATCC 11303 (IAM 1268) On fait incuber la fiole en secouant à 300 C pendant 16 h,et ensuite on refroidit à 5 'C pour terminer la culture On ajoute à la fiole 2 ml d'une solution aqueuse à 25 % de glutaraldéhyde, de sorte que la concentration finale de glutaral- déhyde est de 5 m M,et on secoue la fiole pendant 30 min On recueille 23 g (poids humide) de cellules microbiennes de Escherichia coli ATCC 11303 par centrifugation du bouillon de culture. On dissout sépareément 6 g de carragheenanne fabriqué par la Société Kopenhagen Pectin Factory Ltd, sous le nom de "GENU GEL WG", dans 129 ml d'eau tiède à 45 C pour préparer une solution aqueuse de carragheenanne. On nmlange une suspension des 23 g de cellules microbiennes ci-dessus dans 23 ml de solution de sérum physiologique avec la solution de carragheenanne à 40 C et on laisse reposer le mélange résultant à 40 C pendant 30 min pour gélifier le carragheenanne. On moule le gel résultant sous forme de cubes d'environ 3 mm d'arête. On plonge le gel dans 400 ml d'une solution de substrat contenant du fumarate diammonique 1 M, on laisse reposer à 37 C pendant 48 h et ensuite on lave par une solution aqueuse à 2 % de chlorure de potassium pour obtenir 180 g (poids humide) d'une préparation de Escherichia coli immobilisé La préparation immobilisée ainsi obtenue a une activité d'aspartase de 48 680 pmoles/h par gramme de cellules. EXEMPLE 2 On distribue des portions de chacune 120 ml d'un milieu de culture à p H 7,3 contenant 3,2 % de glutamate de sodium, 0,5 % d'extrait de levure, 0, 05 % de dihydrogénophosphate de potassium et 0,01 % de sulfate de magnésium dans 10 fioles de Sakaguchi de 500 ml On inocule chaque fiole avec Pseudomonas dacunhae (IAM 1152). On fait incuber les fioles en secouant à 300 C pendant 24 h Lorsque la culture est terminée, on ajoute à la fiole 26 ml d'acide acétique pour ajuster le p H à 4,75 et on laisse reposer à 30 C pendant 1 h. On ajoute aux fioles 86 ml d'hydroxyde de sodium 3 N pour ajuster le p H à 6,0 et on refroidit à 10 C On ajoute 2,6 ml de solution aqueuse à 25 % de glutaraldéhyde, de sorte que la concentration finale du glutaraldéhyde est de 5 n Met on secoue pendant 30 min. On recueille par centrifugation du bouillon de culture 20 g (poids humide) de Pseudomonas dacunhae IAM 1152. On dissout séparement 4,03 g de carragheenanne fabrique par la Société Kpenhagen Pectin Factory Ltd, sous le nom de "GENU GEL WG", dans 85 ml d'eau tiède à 50 C pour préparer une solution aqueuse de carragheenanne. On mélange une suspension des 20 g de cellules microbiennes ci-dessus dans 20 ml de solution de sérum physiologique avec la solution de carragheenanne à 450 C et on laisse reposer le mélange résultant à 40 C pendant 30 min pour gelifier le carraghee- nanne On moule le gel résultant sous forme de cubes ayant environ 3 mm d'arête On lave le gel par une solution aqueuse à 2 % de chlorure de potassium pour obtenir 130 g (poids humide) d'une préparation immobilisée de Pseudomonas dacunhae IAM 1152 La préparation immobilisée ainsi obtenue a une activité de L-aspartate- 9-decarboxylase de 9 050 /Pmoles/h par gramme de cellules. On effectue plusieurs essais de la réaction enzymatique continue suivante en utilisant la préparation immobilisée de Escherichia coli douée d'activité d'aspartase préparée & l'exemple 1 (micro-organisme immobilisé selon l'invention,ci-après dénommé préparation A), une préparation immobilisée de Escherichia coli obtenue sans traitement par le glutaraldehyde (micro-organisme immobilise témoin,ci-après dénommé préparation B) et une préparation immobilisée de Escherichia coli préparée en effectuant le traitement par le glutarate d'éthyle après la fixation des cellules microbiennes dans le gel (micro-organisme immobilisé témoin, ci-après dénommé préparation C) pour illustrer la stabilité de l'activité enzymatique et de la production d'acide L-aspartique de chaque préparation. Les préparations B et C utilisées comme témoins sont préparées de la manière suivante. Préparation B On procède de la même manière qu'a l'exemple 1, sauf que l'on n'effectue pas le traitement par le glutaraldehyde. Préparation C On met en suspension 10 g (poids humide) de la préparation B ci-dessus dans 100 ml de solution aqueuse à 2 % de chlorure de potassium contenant du glutaraldehyde 5 m M, on secoue la suspension à 5 C pendant 15 min et ensuite on lave par une solu- tion aqueuse de chlorure de potassium à 2 %. Réaction enzymatique continue On garnit avec 4 g de chaque préparation immo- bilisée de Escherichia coli une colonne munie d'une chemise ( 1,6 cm de diamètre et 10,5 cm de long) et on fait passer en continu à tra- vers la colonne une solution aqueuse de fumarate d'anmonium 1 M contenant du chlorure de magnésium 10-3 M (p H de la solution ajuste à 8,5 par fa oniac) à 37 C à un débit de 40 m L/h On recueille l'éluat de la colonne par intervalles et-on détermine la demi-période de l'activité d'aspartase (durée en jours nécessaire pour que l'acti- vite enzymatique soit réduite de 50 Z de la valeur initiale) et la production d'acide L-aspartique de la préparation im Jmbilisée en mesurant la quantité d'acide L-aspartique dans l'éluat La mesure quantitative de l'acide L-aspartique est effectuée par un dosage microbiologique utilisant Leuconostoc mesenteroides P-60. Résultats Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau I ci-après Come on le voit dans le tableau I, la prepa- ration A (micro-organisme immobilise selon l'invention) conserve une activité enzymatique plus elevée eta une excellente production d'acide Laspartique, en comparaison avec les préparations B et C. TABLEAU I Duree en fonction Activité d'aspartase nement continu (Ymoles d'acide Laspartique/h par g de cellules (jours) Preéparation A Preéparation B Préparation C 1 48 680 56 340 37 460 48 000 51 100 36 400 47 360 46 030 35 410 45 100 41 860 34 260 43 880 37 900 33 290 42 730 34 450 32 480 38 910 25 530 29 710 36 700 20 910 28 110 32 830 12 760 23 900 27 940 7 730 21 070 250 24 300 4 750 18 120 Demi-période de l'activité d'as 250 70 240 partase (jours) " Production dacide 309 100 228 L-aspartique 309 t 100 * La production d'acide Laspartique est exprimée par la valeur relative de la quantité totale d'acide L-aspartique produit pendant la demi-période de l'activite enzymatique, en prenant comme égale à O la quantité obtenue avec la préparation B. Experience 2 On effectue plusieurs essais de la réac- tion enzymatique continue suivante en utilisant la préparation immo- bilisée de Pseudomonas dacunhae IAM 1152 douée d'activité de L-aspartate P-décarboxylase (micro-organisme immobilise selon l'inven- tion, ci-après dénommé préparation D), une préparation immobilisée de Pseudomonas dacunhae IAM 1152 obtenue sans traitement par le glutaraldehyde (microorganisme immobilisé témoin, ci-après dénommé préparation E) et une préparation immobilisée de Pseudomonas dactunhae (IAM 1152) obtenue en effectuant le traitement par le glutaraldehyde après la fixation des cellules microbiennes dans le gel (micro- organisme immobilise témoin, ci-après dénomme préparation F) pour étudier la stabilité de l'activité enzymatique et la production de L-alanine de chaque préparation. Les préparations E et F utilisées comme témoins sont préparées de la manière suivante Préparation E On procède comme à l'exemple 2, sauf que l'on n'effectue pas le traitement par le glutaraldehyde. Préparation F On ajoute 20 ml de solution-tampon au phosphate 0,2 M à p H 7 contenant du chlorhydrate de L-lysine 1,67 M a 10 g (poids humide) de la préparation E ci-dessus, on laisse reposer le mélange résultant à 10 C pendant 10 min, on y ajoute 13,3 ml de solution aqueuse de glutaraldèhyde à 25 %, on laisse reposer le mélange à 10 C pendant 10 min et ensuite on le lave par une solution aqueuse de chlorure de potassium à 2 %. Réaction enzymatique continue On garnit une colonne chemisee ( 1,6 cm de diamètre et 10,5 cm de longueur) avec 4 g de chaque préparation immo- bilisee de Pseudomonas dacunhae \IAM 1152 et on fait passer en continu à travers la colonne une solution aqueuse de L-aspartate d'ammonium 1 M contenant du phosphate de pyridoxal 10 '4 M (solution ajustée à p H 555 par l'ammoniac) a 37 C à un debit de 18 ml/h On recueille par inter- valles l'eluat de la colonne et on détermine la demi-pariode de l'acti- vite de L-aspartate P-decarboxylase (jours) et la production de 25235 Q 7 L-alanine de la préparation immobilisée en mesurant la quantité L-alanine dans l'éluat La mesure quantitative de la L-alanine est effectuée par un dosage microbiologique utilisant Leuconostoc citrovorum ATCC 8081. Résultats Les résultats obtenus sont indiques dans le tableau I ci-après Comme on le voit dans le tableau II, la pré- paration D (micro-organisme immobilisé selon l'invention) conserve O 10 une activité enzymatique plus élevée et a une excellente production de Lalanine, en comparaison avec les préparations E et F. TABLEAU II *La production de L-alanine est exprimée par la valeur relative de la quantité totale de L-alanine produite pendant la demi-période de l'activité enzymatique, en prenant comme égale à 100 la quantité obtenue avec la préparation E. Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustration et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifi- cations et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention. Durée en fonction Activité de L-aspartate P-décarboxylase nement continu pmoles de L-alanine/h par gramme de cellules) (jours) Preparation D Préparation E Préparation F 1 9 050 9 050 4 680 8910 5 520 4 550 8 320 3 330 4 400 8 000 2 080 4 240 7 530 1 210 4 120 6 910 750 4 110 7 530 280 3 750 oo 6910 3390 6 090 2 910 5 350 2 470 250 4 610 2 190 300 4 140 1 860 350 3 650 1 600 Demi-période de l'activité de L- aspartate 9-décar 270 14 22 boxylase (jours) Production de L-alanine* 1 929 100 831 3. RE V E N D I C A T I ONS 1 Procéde pour préparer un micro-organisme immobilise, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver un micro- organisme dans un bouillon de culture, à traiter le bouillon par le glutaraldehyde lorsque la culture est terminée, à recueillir les cellules microbiennes du bouillon, à mélanger les cellules micro- biennes avec une solution aqueuse d'un polysaccharide ayant une teneur en restes sulfates dans sa molécule de 10 % en poids ou plus, et ensuite à gélifier le polysaccharide dans le mélange résultant pour fixer les cellules microbiennes dans la matrice de gel du polysaccharide. 2 Procede selon la revendication 1, caracté- rise en ce que le micro-organisme est Escherichia coli ayant une activité d'aspartase ou Pseudomonas dacunhae ayant une activité de L-aspartate P décarboxylase. 3 Procede selon la revendication 1, caracte- rise en ce que le polysaccharide est le carragheenanne, le furcella- ranne ou le sulfate de cellulose. 4 Procède selon la revendication 1, caracté- risé en ce que le traitement par le glutaraldehyde est effectue en mélangeant le glutaraldehyde avec le bouillon de culture en agitant ou en secouant en quantité telle que la concentration finale du glutaraldehyde dans le bouillon de culture soit de 0,1 m M à 0,5 M. Procede selon la revendication 1, carac- terise en ce que la solution aqueuse du polysaccharide contient 0,2 à 20 % en poids du polysaccharide. 6 Procedé selon la revendication 1, caractérise en ce que l'on met les cellules microbiennes en suspension dans l'eau, dans une solution de sérum physiologique ou une solution-tampon de p H 3 à 10 et on mélange ensuite la suspension résultante avec la solution aqueuse du polysaccharide à 30-60 C.