FR 2511866 A1 19830304 FR 8214597 A 19820825 FORMULATIONS PHARMACEUTIQUES DE PRO-INSULINE HUMAINE. Le diabète sucré est un trouble métabolique caractérisé par le fait que les tissus du corps ne parviennent pas à oxyder les carbohydrates au régime normal Son facteur le plus important est une défi- cience en insuline Au cours des 60 dernières années, les personnes souffrant du diabète ont été considéra- blement aidées en recevant des quantités réglées d'in- suline Actuellement, llinsuline utilisée par les diabétiques a été isolée du pancréas des animaux, l O généralement des bovidés et des porcs L'insuline des bovidés et des porcs a mune structure différente de celle de l'insuline produite par le pancréas humain. Récemment, par la méthodologie de l'ADN (ADN = acide désoxyribonucléique) recombinant, il est devenu pos- sible de préparer de l'insuline identique à celle produite par le pancréas humain L'utilisation de cette insuline permettra, au diabétique, d'imiter le système naturel plus étroitement que ce ntétait pos- sible jusqu'à présent. Néanmoins, il est admis depuis longtemps que la seule administration d'insuline à un diabétique est insuffisante pour rétablir et/ou maintenir l'état métabolique normal Bien que 1 linsuline manifeste son effet sur le métabolisme des carbohydrates, le diabète sucré provoque des troubles supplémentaires dont la plupart, sinon tous, sont en relation avec la structure et la fonction des vaisseaux sanguins Les déficiences conduisant à ces troubles sont rarement corrigées com- plètement par la thérapie classique à l'insuline. Les anomalies vasculaires associées au dia- bète sont sotivent, appelées "complications du diabète". Eltes coiisi sttnt génértalement en changements micro- angiopathiques donnant lieu à des lésions de la rétine et des reins La neuropathie représente une complica- tion tliabétique supplédmentaire qui peut être en rela- Z 251 1866 Lion ou Élol, diir'e ellellmt Ott oui(lil'ectllemmt;ave'c les changementls mi icro-angiopahitli(luts p Gécités -Par mli les manifestations spécifiques (les complications du dia- bète, il y a, par cxemple: (l) Les maladies de ú 10 cilj notamnient la rétinopathiie, la formation de la cataracte, 1 e g'lauconie el le-s paal; iysies l II Lts Usuair Irs extra ocutilai- res; ( 2) les maladies de la bouche, notamment la gingivite, l apparition accrue de caries dentaires, la périodontite et mune plus forte résorption de l'os alvéolaire; ( 3) les neuropathies motrice, sensorielle et autonome; ( 4) la maladie des grands vaisseaux; ( 5) la micro-angiopathie; ( 6) des maladies de la peau, notanunent le xantliome (lu diabète sucré, la nécro- biose lipol'dique du diabète sucré, la furonculose, la mycose et le prurit; ( 7) des maladies des reins, notamment la glomérulosclérose diabétique, la néphro- sclérose artériolaire et la pyélonéphrite; et ( 8) des problèmes au cours de la grossesse, notamment un accroissement des naissances de gros bébés, des mises au monde d'enfants morts-nés, des fausses couches,' des mortalités néo-natales et des défauts congénitaux. Bon nombre et peut-être' la totalité des complications diabétiques résultent du fait qu'à elle seule, 11 insuline ne parvient pas à ramener le corps à son équilibre hormonal naturel. La présente invention concerne des comiposi- tions pharmaceutiques permettant d'atteindre et de maintenir, chez un sujet diabétique, un état plus proche de l th 6 mdéostase hormonale naturelle que celui pouvant être obtenu par l'administration d'insuline seule. Dès lors, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant de la pro-insu- line humaine en association avec un support pharma- ceutiquement acceptable. Le con Isti t Luant essenltiel des compositions pharmaceutiques de la présente invention est la pro- insuline humaine L'administration de pro-insuline humaine en utilisant unle composition suivant la présente inven- tion permettra d'obtenir une utilisation plus natu- relle du glucose et un meilleur contrôle de la glycé- mie, atténuant ainsi les complications diabétiques néfastes qui ont été décrites ci-dessus. La pro-insuline humaine peut être obtenue de diverses manières, notamment par synthèse organique, par isolation du pancréas humain selon la méthodologie classique et, plus récenmment, selon la méthodologie à l'acide désoxyribonucléique recombinant. Dans ses grandes lignes, la production de pro-insuline en adoptant la méthodologie à l'acide désoxyribonucléique recombinant consiste à obtenir, par isolation et/ou par construction, une séquence de codage d'acide désoxyribonucléique pour la sé- quence des acides aminés de la -pro-insuline humaine. On introduit ensuite l'acide désoxyribonucléique de pro-insuline humaine en phase de lecture dans un vé- hicule approprié de clonage et d'expression Le vé- hicule est utilisé pour transformer un micro-organis- me approprié, après quoi le micro-organisme transformé est soumis à des conditions de fermentation conduisant à: (a) la production de copies supplémentaires du vecteur contenant le gène de pro-insuline et (b) l'ex- pression de la pro-insuline ou un produit précurseur de la pro-insuline. Si le produit d'expression est un précur- seur de pro-insuline, il comprendra généralement la séquence des acides aminés de la pro-insuline humaine réunie, à sa terminaison amino, à un fragment d'une protéine normalement exprimée dans la séquence de gènes dans laquelle le gène de pro-insuline a été introduit La séquence dl'acides aminés de la pro- insuline est réunie au fragment de protéine par ltin- termédiaire d'un siège spécifiquement clivable, no- tammnent la méthionine Ce produit est habituellement appelé "produit génétique fusionné". La séquence des acides aminés de la pro- insuline est clivée du produit génétique fusionné en utilisant du bromure de cyanogène, après quoi les fractions sulfhydryle de la cystéine de la séquence des acides aminés de la pro-insuliine sont stabilisées par transformation en leurs S-sulfonates correspon- dants. On purifie le S-sulfonate de pro-insuline obtenu, puis on transformne le S-sulfonate de pro- insuline purifié en pro-insuline par formation des trois liaisons disulfure correctement localisées. La pro-insuline obtenue est ensuite purifiée. Comme on lia indiqué, les compositions de la présente invention sont utiles pour favoriser 11 obtention de l'homéostase hormonale naturelle et ainsi cmpêchuer ou a LLéI Iueri ou encore freiner sensible- ment les complications diabétiques bien connues qui ont été mentionnées ci-dessus. Il est admis que certains diabétiques sont inaptes à recevoir efficacement dle linsuline par injection sous-cutanée par suite de la présence, à l'endroit de l'injection, de protéases qui détruisent rapidement l'insuline avant qu'elle ait pu être ab- sorbée dans le courant sanguin et transportée vers les sièges récepteurs Si ces diabétiques doivent absolument recevoir de llt insuline, ils devront la recevoir par injection intraveineuse Les injections intraveineuses répétées et indispensables sont inop- portunes par suite de l'effet néfaste qu'elles exer- cent sur les veines du receveur avec les infections q(ui y sont associées On a découvert que la pro-in- sulie humaine li éLtaitt pas dégradée pa ces pi'o Céases dégradant l'insuline et que, partant, elle pouvait être adhiniistrle par injection sous-cutanée Sa sta- bilité et, dès lors, sa disponibilité favorisent l'ob- tention d'une homéostase hormonale naturelle. A la suite d'études récentes lPodlecki et ai., "Diabetes", 31, supplément 2, 126 A ( 1982)l, on a également noté qlue la pro-insuline humaine se si- tuait à l'intérieur d(le tissus cibles, par exemple, des cellules de graisse Bien que son action intra- cellulaire particulière à une échelle moléculaire soit encore indéterminée, ces découvertes étayent davantage la description donnée dans la présente spé- cification selon laquelle la pro-insuline humaine joue un rôle actif et est indispensable pour l'obten- tion de I'homnéostase hormonale naturelle. Dans "Diabetes" 31, supplément 2, 135 A ( 1982), Schluter et al décrivent des études démlon- trant que la fixation du récepteur d'insuline humaine est favorisée pal lia pléselce(o de p'o-iinsulie Ihuma III i n(, Ces résultats étayent également davantage la descrip- tion de la présente spécification selon laquelle la disponibilité et la présence de la pro-insuline humai- ne favorisent ou rétablissent 1 'hoinéostase hormonale naturelle. Bien entendu, la quantité dans laquelle les compositions de la présente invention doivent être utilisées pour maintenir l'homéostase hormonale natu- relle ou pour atteindre un état se rapprochant plus étroitement de l homéostase hormonale naturelle chez un sujet diabétique, dépendra de la gravité de( l'état diabétique De plus, cette quantité variera en fonc- tion du mode d'administration Enfin, la quantité de composition administrée et la fréquence de cette ad- ministration seront laisse:s au choix dlu tédlecin par- ticulier Toutefois, en règle générale, cn se basant sur le fait que 1 mg de pro-insuline humaine donne environ 3,5 unités d'activité d'insuline humaine, le dosage de la pro-insuline humaine se situera dans l'intervalle donnant environ 0,02 à environ 5 unités d'activité d'insuline humaine par kg d(lu poids du corps et par jour, de préférence, environ 0,1 à environ 1 unité d'activité d'insuline humaine par kg du poids du corps et par jour. On administre la composition par voie pa- rentérale, notanuinent, par voie sous-cutanée, par voie intramusculaire et par voie intraveineuse Les com- positions de la présente invention comprennent 11 in- grédient actif, à savoir la pro-insuline humaine ensemble avec un support pharmaceutiquement accepta- ble pour cette dernière et éventuellement avec dlau- tres ingrédients thérapeutiques La quantité totale de l'ingrédient actif présent dans la composition se situe entre environ 99,99 et environ 0,01 % en poids. Le support doit être acceptable en ce sens qu'il doit être compatible avec d'autres composants de la compo- sition et il ne doit pas être néfaste pour le receveur de celle-ci. Les compositions d(le la présente invention, qui sont appropriées pour une administration par voie parentérale, comprennent avantageusement des suspen- sions et/ou des solutions aqueuses stériles des in- grédients pharmaceutiquement actifs, ces solutions ou suspensions étant, de préfúrcnce, rendues isotoni- ques avec le sang du receveur en utilisant générale- ment du chlorure de sodium, de la glycérine, du glu- cose, du mannitol, du sorbitol et des agents analogues connus En outre, les compositions peuvent contenir llun ou 1 Vautre adjuvant L tel (lque des agents tampons, des agents de conservation, des agents dispersants, des agents favorisant un début rapide de l'activité, des agents favorisant une prolongation d'activité et dtautres agents connus Comme agents spécifiques de conservation, on 'mentionnera, par-exemple, le phénol, le m-crésol, l e p-hydroxybenzoate de méthyle et autres. Conmme agents tampons spécifiques, on mentionnera, par exemple, le phosphate de sodium, l'acétate de sodiumn, le citrate de sodium et autres. De plus, on peut utiliser un acide tel que l 1 acide chlorhydrique, ou une base telle que lthydro- xyde de sodium pour régler le pli En règle générale, le pli de la composition aqueuse se situera entre en- viron 2 et environ 8, de préférence, entre environ 6,8 et environ 8. Parmi d'autres additifs appropriés, on men- tionnelra, par exemple, Itionl zinc bi vallelt (dont la quantité, sjil est présent, se situe généralement entre environ 0,1 mg et environ 3 mg par 100 unités de pro-insuline humaine, de même qu'un sel de protamine (par exemple, sous forme de son sulfate) dont la quantité, s'il est présent, se situe généralement entre environ 0,5 mg et environ 20 mg par 100 unités de pro-insuline humaine. On donnera ci-après des exemples de composi- tions pharmaceutiques particulières suivant la pré- sente invention. Exemple 1 Formulation de pro-insuline humaine régulière neutre l 40 unités de proinsuline humaine par ecm 3 J. Pour préparer 10 cm 3 de la composition, on mélange: Pro-insuline humaine ( 3,5 unités/mg) 114 mg ( 400 unités) Phenol (distillé) 20 mg Glycérine 160 mg Eau et soit de ltacide chlorhydrique à 10 %, soit de l'hydroxyde de sodium à 10 %: quantité suffisante pour obtenir une composition d'un volume de 10 cm 3 et d'un p H final de 7-7,8. Exemple 2 Formulation de pro-insuline humaine protamine-zinc l 40 unités de pro-insuline humaine par cm 3 l. Pour préparer 10 cm 3 de la composition, on mélange: Pro-insuline humaine ( 3,5 unités/mg) 114 mg ( 400 unités) Phénol (distillé) 25 mg Oxyde de zinc 0,95-3,8 mg Glycérine 160 mg Sulfate de protamine 32-64 mg Phosphate de sodium (cristaux) 38 mg Eau et soit de l'acide chlorhydrique à 10 %, soit de l'hydroxyde de sodium à 10 % ' quantité suffisante pour obtenir une composition d'un volume de 10 cm 3 et d'un pli final de 7,1-7,4. Exemple 3 Formulation de pro-insuline humaine isophane-protamine l 40 unités de pro-insuline humaine par cm 3 l. Pour préparer 10 cm 3 de la composition, on ml:l alige: Pro-insuline humaine ( 3,5 unités/mg) 114 mg ( 400 unités) m-crésol (distillé) 16 mg Phénol (distillé) 6,5 mg Glycérine 160 mg Sulfate de protamine 9,6-19,2 mg Phosphate de sodium (cristaux) 38 mg Eau et soit de l'acide chlorhydrique à 10 %, soit de l'hydroxyde de sodium à 10 %o: quantité suffisante pour obtenir une composition d'un volume de 10 cin 3 et diun pli final de 7,1-7,4. Exemple 4 Formulation de pro-insulille zinc humaine l 40 unités de pro-insuline humaine par cm 3 l, Pour préparer 10 cm 3 de la composition, on mélange: Pro-insulinle humaine ( 3,5 unités/mg) 114 mg ( 400 unités) Acétate de sodiumn (anhydre) 16 mg Chlorure de sodium (granulaire) 70 mg phydroxybenzoate de m,éthyle 10 mg Oxyde de zinc 1-8 mg Eau et soit de l'acide chlorhydrique à 10 %, soit de l'hydroxyde de sodium à 10 %: quantité suffisante pour obtenir une composition d'un volume de 10 cm 3 et d'un p H final de 7,2-7,5. 2511866 REVENDICATIONS 2511866 1. Composition pharmaceutique comprenant de la pro-insuline humaine en association avec un support pharmaceutiquement acceptable. 2. Composition suivant la revendication 1, caractérisee en ce qu'elle contient l'ion zinc bivalent. 3 Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient un sel de protamine.