FR 2518572 A1 19830624 FR 8300612 A 19830117 18572 L'ADN (acide désoxyribonucléique) dont sont formés les gènes comprend à la fois des gènes codant les protéines ou "gènes de structure" et des régions de commande qui médient l'expression de leur information par l'intermédiaire de la fourniture de sites pour la liaison de l'ARNpolymérase, l'information concernant les sites de liaison ribosomique, etc La protéine codée est "exprimée" de son ADN correspondant par un procédé en plusieurs étapes dans un organisme, grâce auquel: 1 L'enzyme, l'ARN polymérase, est activée dans la région de commande (appelée ci- après "promoteur") et voyage le long du gène de structure, en transcrivant son information codée dans l'acide ribonucléique messager (ARN m) jusqu'à ce que la transcription se termine à un ou plusieurs codons "stop". 2 Le message de l'ARN m est traduit au niveau des ribosomes en une protéine dont le gène code la séquence des amino-acides, en commençant à un signal de "départ" de traduction, le plus couramment ATG (qui est traduit "f- méthionine"). Selon le code génétique, l'ADN décrit chaque amino- acide par un triplet-ou "codon" de trois nucléotides adjacents choisis parmi l'adénosine, la thymidine, la cytidine et la guanine, appelés ci-après A, T, C et G respectivement Ceux- ci apparaissent dans la chaîne de codage ou la séquence de codage de 1 'ADN à double chaîne, dont la chaîne restante ou "complémentaire" est formée de nucléotides ("bases") qui sont liés par liaison hydrogène à leurs compléments dans la chaîne de codage La base A est le complément de la base T, et la base C est le complément de la base G Tout ceci concernant l'arrière-plan technologique de l'invention est décrit en détail dans Benjamin Lewin, Gene Expression 1, 2 ( 1974) et 3 ( 1977), John Wiley and Sons, N Y Cette publication et les autres publications auxquelles il est fait référence ici sont incorporées ici par voie de référence. Coupure et ligature de l'ADN Diverses techniques sont disponibles pour la recombinaison de l'ADN, selon lesquelles les extrémités contiguës de fragments d'ADN séparés sont adaptées d'une façon ou d'une autre pour faciliter la ligature Ce dernier terme se réfère à la formation de liaisons phosphodiester entre les nucléotides contigus, le plus souvent par l'intermédiaire d'une enzyme, la T 4 ADN ligase Ainsi, les extrémités inertes peuvent être directement ligaturées Ou bien, des fragments contenant des chaînes uniques complémentaires à leurs extrémités contiguës sont avantagés par une liaison hydrogène qui positionne les extrémités correspondantes pour une ligature ultérieure De telles chaînes uniques, appelées "extrémités cohésives", peuvent être formées par l'addition de nucléotides à des extrémités inertes en utilisant la transférase terminale, et parfois simplement en détruisant une chaîne d'une extrémité inerte par une enzyme comme la X-exonucléase Egalement, et le plus souvent, on a recours à des endonucléases de restriction (appelées ci-après "enzymes de restriction"), qui coupent les liaisons phosphodiester dans et autour de séquences uniques de nucléotides d'une longueur d'environ 4 à 6 paires de bases ("sites de restriction") On connaît de nombreuses enzymes de restriction et leurs sites de reconnaissance Voir, par exemple, R J Roberts, CRC Critical Reviews in Biochemistry, 123 (Nov 1976) Un grand nombre fournissent des coupures étagées qui forment de courtes séquences complémehtaires à une seule chaîne aux extrémités des fragments à doublé chaîne. En tant que séquences complémentaires, les extrémités en saillie ou cohésives" peuvent se recombiner par appariement de bases Quand on coupe avec cette enzyme deux molécules différentes, un appariement croisé des chaînes uniques complémentaires forme une nouvelle molécule d'ADN, à laquelle on peut donner une intégrité de covalence en utilisant la ligase pour fermer les extrémités à une seule chaîne qui restent au point de fermeture Les enzymes de restriction qui laissent des extrémités "inertes" sur l'ADN à double chaîne qui a été coupé, permettent la recombinaison par l'intermédiaire de la T 4 ligase, par exemple, avec d'autres séquences a extrémités inertes. Vecteurs de clonage et ADN recombinant Pour les besoins de la présente invention, un "vecteur de clonage" est une longueur non chromosomique d'ADN à double chaîne comprenant un duplicon intact de sorte que le vecteur peut être dupliqué quand il est placé dans un organisme unicellulaire("microbe")par transformation Un organisme ainsi transformé est appelé un "transformant" A l'heure actuelle, les vecteurs de clonage couramment utilisés proviennent de virus et de bactéries et, le plus souvent, sont des boucles d'ADN bactérien appelées "plasmides". Les progrès effectués en biochimie au cours des dernières années ont conduit à la construction de vecteurs de clonage "recombinants" dans' lesquels, par exemple, les plasmides sont fabriqués pour contenir de l'ADN exogêne Dans des cas particuliers, le recombinant peut comporter de l'ADN "hétérologue', c'est-à-dire de l'ADN qui code des polypeptides qui ne sont habituellement pas produits par l'organisme susceptible de transformation dans le vecteur recombinant. Ainsi, des plasmides sont coupés par des enzymes de restriction pour former de l'ADN linéaire ayant des extrémités ligaturables Celles-ci sont liées à un gène exogène ayant des extrémités ligaturables pour former un élément fonctionnel sur le plan biologique ayant un duplicon intact et une propriété phénotype utilisable pour choisir des transformants L'élément recombinant est inséré dans un micro-organisme par transformation et le transformant est isolé et cloné, dans le but d'obtenir de larges populations qui comprennent des copies du gène exogène et, dans des cas particuliers, dans le but d'exprimer la protéine que le gène code La technologie associée et ses applications potentielles sont décrites en -détail dans Miles International Symposium Series 10 Recombinant Molecules: Impact on Science and Society, Beers anc Bosseff, eds, Raven Press, N Y ( 1977). Expression de l'ADN recombinant A côté de l'utilisation des vecteurs de clonage pour augmenter la fourniture de gènes par duplication, il y a eu plusieurs essais, dont plusieurs avec succès, pour exprimer réellement les protéines que les gènes codent Dans un premier cas, le gène de la somatostatine, une hormone du cerveau, sous l'influence du promoteur lac, a été exprimé dans des bactéries E Coli K Itakura et al, Science 1984 1056 ( 1977) Plus récemment, les chaînes A et B de l'insuline humaine ont été exprimées de la même façon et combinées pour former l'hormone. D.V Goeddel et al, Proc -Nat'l Acad Sci, USA 76, 106 ( 1979) Dans chaque cas, les gènes ont totalement été construits par synthèse Dans chaque cas, les enzymes protéolytiques présentes dans la cellule dégraderaient apparemment le produit désiré, ce qui nécessite sa production sous forme conjuguée, c'est-à-dire en tandem avec une autre protéine qui le protège par compartimentalisation et qui doit être coupée de façon extracellulaire pour former le produit recherché Ce travail est décrit dans les publications de demandes de brevets britanniques suivantes: N' 2 007 675, 2 007 670, 2 007 676 et- 2.008 123. Bien que la solution des gènes synthétiques se soit révélée utilisable dans les plusieurs cas décrits précédemment, des difficultés réelles se posent dans le cas de protéines beaucoup plus importantes, par exemple l'hormone de croissance, l'interféron, etc, dont les gènes sont évidemment plus complexes et moins sujets à une facile synthèse Simultanément, il serait indiqué d'exprimer ces produits non accompagnés d'une protéine conjuguée, la nécessité de cette expression demandant -e recours à d'autres ressources, dans l'organisme, qui sont mieux appropriées à la construction du produit recherché. D'autres chercheurs ont essayé d'exprimer des gènes obtenus non par synthèse organique mais plutôt par transcription inverse à partir de l'ARN messager correspondant purifié à partir de tissu Deux problèmes se sont' posés dans cette solution Pour commencer, la transcriptase inverse peut arrêter la transcription de l'ARN m peu avant d'achever l'ADN c pour toute la séquence d'amino-acides 'désirée Ainsi, par exemple, Villa- Komaroff et al ont obtenu de l'ADN c pour la proinsuline de rat qui ne posslède pas les codons pour les trois premiers amino-acides du précurseur de l'insuline Proc. Nat'l Acad Sci, USA 75 3727 ( 1978) En outre, la transcription inverse de l'ARN m pour les polypeptides qui sont exprimés sous forme précurseur a fourni de l'ADN c pour la forme précurseur au lieu de la protéine active sur le plan 2 518572 biologique, ce qui fait que, dans une cellule eucaryote, les séquences meneuses sont éliminées par voie enzymatique. Jusqu'à présent, on n'a trouvé aucune cellule bactérienne partageant cette aptitude, de sorte que les produits transcrits d'ARN m fournissent des produits d'expression contenant les séquences meneuses de la forme précurseur au lieu de la protéine biologiquement active elle-même VillaKomaroff, voir ci-dessus (proinsuline de rat); P H Seeburg et al, Nature 276, 795 ( 1978) (préhormone de croissance du rat). Enfin, des essais passés effectués par d'autres pour exprimer par voie bactérienne des hormones humaines (ou leurs précurseurs) à partir de produits transcrits d'ARN m ont à l'occasion conduit seulement à la production de protéines conjuguées sur lesquelles on ne peut apparemment pas effectuer une coupure extracellulaire, par exemple, Villa-Komaroff, voir ci-dessus (pénicillinase-proinsuline); Seeburg, voir ci-dessus (bêta-lactamase-préhormone de croissance). Hormone de croissance humaine L'hormone de croissance humaine ("HCH") est sécrétée dans l'hypophyse humaine Elle comprend 191 amino-acides et, avec son poids moléculaire d'environ 21 500, est plus de trois fois plus grosse que l'insuline Jusqu'à la présente invention, l'hormone de croissance humaine ne pouvait être obtenue que par une extraction laborieuse à partir d'une source limitée, les hypophyses de cadavres humains La rareté conséquente de la substance a limité ses applications au traitement du nanisme hypopituitaire, et même alors des estimations fiables suggèrent que la HCH d'origine humaine est disponible en quantité ne permettant de traiter qu'environ la moitié des sujets atteints. On a donc besoin de nouveaux procédés de production de l'hormone de croissance humaine et d'autres polypeptides en quantité, et ce besoin est particulièrement aigu dans le cas de polypeptides trop importants pour permettre une synthèse organique ou, pour cette raison, une expression microbienne à partir de gènes totalement synthétiques L'expression d'hormones mammifères à partir de produits transcrits d'ARN m offrait la promesse d'éviter les difficultés de la solution synthétique, mais jusqu'à présent elle n'avait permis que la production microbienne de produits conjugués inactifs sur le plan biologique d'o l'hormone désirée ne pouvait en pratique pas être coupée. La présente invention fournit des procédés et des moyens d'expression de gènes quasi-synthétiques o la transcription inverse fournit une partie substantielle, de préférence la majeure partie, de la séquence de codage sans recourir à une construction totalement synthétique qui est laborieuse, tandis que la synthèse du reste de la séquence de 1 o codage fournit un gène complet pouvant exprimer le polypeptide désiré non accompagné de séquences meneuses inactivantes sur le plan biologique ou d'une autre protéine étrangère Ou bien, le reste synthétique peut fournir un produit conjugué résistant à la protéolyse,conçu de façon à permettre une coupure extra-cellulaire de la protéine étrangère, ce qui fournit la forme active sur le plan biologique L'invention fournit en conséquence des procédés et des moyens de -production microbienne de nombreuses substances qui n'étaient produites jusqu'à présent qu'en quantités limitées par une extraction co Qteuse à partir de tissu, et d'encore d'autres dont la fabrication industrielle était jusqu'à présent impossible Dans son mode de réalisation nettement préféré, cette invention constitue le premier cas dans lequel une hormone polypeptidique importante sur le plan médical (l'hormone de croissance humaine) a été exprimée par voie bactérienne tout en évitant à la fois la protéolyse intra- cellulaire et la nécessité de compartimentaliser la forme biologiquement active dans une protéine étrangère nécessitant une coupure extracellulaire Les sources microbiennes de l'hormone de croissance humaine que fournit l'invention offrent, pour la première fois, des approvisionnements importants en hormone pour le traitement du nanisme hypopituitaire, ainsi que pour d'autres applications qui étaient jusqu'à présent en-deçà des possibilités des sources d'hormone obtenue à partir des tissus, comprenant le saignement gastrique diffus, la pseudo-arthrose, la thérapie des brûlures, la cicatrisation des plaies, la dystrophie et la consolidation des os. La manière par laquelle on peut obtenir ces buts et autres avantages de l'invention apparaitra plus complètement d'après la description détaillée suivante et d'après les dessins annexés concernant un mode de réalisation préféré de l'invention, dans lesquels: La Figure 1 représente le schéma synthétique pour la construction d'un fragment de gène codant pour les 24 premiers aminoacides de l'hormone de croissance-humaine, ainsi que le signal de départ ATG et les éléments de liaison utilisés dans le clonage Les flèches dans la chaîne de codage ou supérieure ("U") et dans la chaîne complémentaire ou inférieure ("L") indiquent les oliconucléotides réunis pour former le fragment décrit; La Figure 2 décrit la réunion des oligonucléotides "U" et "L" pour former le fragment de gène de la Figure 1, et son insertion dans un vecteur de clonage de type plasmide La Figure 3 représente la séquence d'ADN (chaîne de codage seulement) du fragment obtenu par l'enzyme de restriction Hae III d'un produit de transcription d'ARN m pituitaire, ainsi que les amino-acides numérotés de l'hormone de croissance humaine qu'il code Les sites de restriction clés sont indiqués, ainsi que l'ADN (après "stop") pour l'ARN non traduit La Figure 4 illustre la construction d'un vecteur de clonage pour un fragment de gène codant les amino-acides de L'hormone de croissance humaine qui ne sont pas obtenus par synthèse, et la construction de ce fragment de gène en tant qu'ADN complémentaire par transcription inverse à partir d'AR Nm isolé d'une source pituitaire humaine; et La Figure 5 illustre la construction d'un plasmide pouvant, dans des bactéries, exprimer l'hormone de croissance humaine, en partant des plasmides des Figures 2 et 3. La technique générale de l'invention implique la combinaison, dans un seul vecteur de clonage, de plusieurs fragments de gène qui, en combinaison, codent pour l'expressio du produit désiré Parmi ceux-ci, au moins l'un est un fragment d'ADN c obtenu par transcription inverse d'ARN m isolé d'un tissu, comme par le procédé de A Ullrich et al, Science 196, 1313 ( 1977) L'ADN c fournit une partie substantielle, et de préférence au moins la majeure partie, tandis que les portions restantes du gène sont fournies par synthèse Les- fragments synthétiques et les fragments-transcrits d'ARN m-' sont clonés séparément pour obtenir d'amples quantités que l'on utilise dans l'étape de combinaison ultérieure. Diverses considérations influencent la distribution des codons pour le produit final entre partie synthétique et partie ADN-c, plus particulièrement la séquence ADN de l'ADN complémentaire déterminé par exemple par le procédé de Maxam and Gilbert, Proc Nat'l Acad Sci U S A 74, 560 ( 1977) L'ADN complémentaire obtenu par transcription inverse contiendra invariablement des codons pour au moins une partie terminale carboxylique du produit désiré, ains-i que d'autres codons pour l'ARN in non traduit en aval du ou des signaux d'arrêt de traduction proches de l'extrémité carboxylique La présence d'ADN pour l ARN non traduit est sans grande importance, bien que des séquences trop longues de cette sorte puissent être enlevées, par exemple par coupure par des enzymes de restriction, pour conserver les ressources cellulaires utilisées dans la duplication et l'expression de l'ADN pour le produit recherché Dans des cas particuliers, l'ADN c contiendra des codons pour la séquence globale d'amino-acides désirée,-ainsi que des codons étrangers en amont de l'extrémité aminée du produit recherché Par exemple, la plupart si ce n'est la totalité des hormones polypeptidiques sont exprimées sous la forme d'un précurseur avec des séquences meneuses ou signalitiques de protéines utilisées, par exemple, dans le transport jusqu'à la membrane cellulaire. Dans l'expression à partir de cellules eucaryotes, ces séquences sont éliminées par voie enzymatique, de sorte que l'hormone pénètre dans l'espace cytoplasmique sous sa forme libre active sur le plan biologique Cependant, on ne peut pas se fier aux cellules microbiennes pour effectuer ce rôle, et il est donc indiqué d'enlever, du produit transcrit d'ARN m, les séquences codant de telles séquences meneuses ou signalitiques Au cours de cette élimination, le signal de départ de la traduction est également perdu, et presque invariablement quelques codons du produit recherché seront également enlevés Le composant synthétique du gène quasi synthétique de l'invention fournit ces derniers codons, et fournit également un nouveau signal de départ de traduction quand le vecteur dans lequel le gène hybride sera finalement introduit manque lui- même d'un codon départ placé de façon appropriée. L'élimination de la séquence meneuse pour l'ADN c de la préhormone de croissance est facilitée par la disponibilité d'un site de restriction dans la partie du gène codant l'hormone de croissance L'invention peut néanmoins être mise en pratique indépendamment de la disponibilité d'un tel site, ou dans un quelconque cas indépendamment de la disponibilité d'un site de restriction suffisamment proche de l'extrémité aminée du polypeptide désiré, en ce qui concerne l'élimination du besoin d'effectuer une synthèse importante du composant du gène qui n'est pas obtenu de l'ARN m Ainsi, dans un quelconque ADN c codant le polypeptide désiré et une séquence meneuse ou une autre séquence inactivante sur le plan biologique, la frontière entre les codons de cette dernière et ceux du polypeptide complet apparaîtront d'après la séquence des amino-acides du polypeptide complet On peut simplement digérer dans le gène codant le peptide de choix, en enlevant la séquence meneuse ou autre indésirée Ainsi, par exemple, étant donné un-ADN c comme ' h I TTAAGCCCTGATC G etc. KATTCGGG' CTAGCA o le point final de la digestion est indiqué par une flèche, on peut choisir les conditions de réaction pour la digestion par une exonucléase de façon à enlever les séquences supérieures "a" et "b", et par la suite une digestion par la nucléase Si éliminera automatiquement les séquences inférieures "c" et "d" Ou bien et de façon plus précise, on peut utiliser la digestion par l'ADN polymérase en présence de triphosphates de désoxynucléotide ("d(A, T, C, G)TP") Ainsi, dans l'exemple précédent, 1 'ADN polymérase, en présence de d GTP éliminera la séquence "c" (puis s'arrêtera à "G"), la nucléase 51 digérera ensuite "a"; l'ADN polymérase en présence de d TTP éliminera "d", (en s'arrêtant à "T") et la nucléase Sl excisera ensuite "b", etc Voir de façon générale A Kornberg, DNA Synthesis, pp 87-88, W H Freeman an-d Co, San Francisco ( 1974). De préférence on peut simplement construire un site de restriction en un point commode dans la partie de l'ADN c codant le produit désiré, en appliquant la technique de synthèse de réparation d'erreurs de A Razin et al, Proc. Nat'l Acad Sci USA 75, 4268 ( 1978) Par cette technique, une ou plusieurs bases peuvent être introduites dans une séquence d'ADN existante, en utilisant des produits de départ contenant le substituant erroné Au moins sept séquences de-paires de quatre bases de type palindrome sont reconnues de façon unique par des enzymes de restriction connues, c'est-à-dire AGCT (Alu I), CCGG (Hpa II), CGCG (Tha I), GATC (S au 3 A), GCGC (Hha), GGCC (Hae III) et TCGA (Taq I) Quand la séquence d'ADN c contient une séquence différant d'un tel site par une seule base, comme cela est très probable statistiquement, la synthèse de réparation fournira l'ADN c dupliqué contenant la base substituante appropriée et donc le site de restriction désiré La coupure enlèvera l'ADN codant la séquence meneuse indésirée, après quoi la synthèse remplacera les codons nécessaires pour l'expression du polypeptide complet Par exemple: il codons du produit sequence désiré meneuse CACG ^ synthèse de réparation d'erreurs I CCGG I na I Il "A' ADN c -a S ycelu i ADN quasi- | synthétique codons du produit H -ddésiré On verra évidemment que des sites de restriction plus longs peuvent de même être insérés là o on le désires ou que des réparations successives peuvent créer des sites de restriction de paires de quatre bases o seulement deux bases communes au site apparaissent au point désiré, etc. Il existera des applications dans lesquelles il est indiqué d'exprimer non seulement la séquence d'aminoacides du produit recherché, mais également une protéine étrangère mais conçue de façon spécifique On peut mentionner à titre d'exemple quatre applications de ce genre Premièrement, le gène quasi-synthétique peut représenter un haptène ou un autre déterminant immunologique, auquel est conféré un caractère immunogène par conjugaison à une protéine supplémentaire, de sorte que des vaccins sont produits Voir de façon générale, la publication de la demande britannique N O 2 008 123 A. Deuxièmement, il peut être désirable pour des raisons de sécurité biologique d'exprimer le produit recherché sous forme d'un produit conjugué avec une autre protéine inactivante sur le plan biologiqueconçue de façon à permettre une coupure extra-cellulaire pour former la forme active Troisièmement, il existera des applications dans lesquelles des polypeptides signalitiques de transport précéderont le produit désiré, pour permettre la production de celui-ci par excrétion à travers la membrane cellulaire, pourvu que le peptide signalitique puisse ensuite être coupé Enfin, un produit conjugué étranger, conçu pour permettre une coupure spécifique de façon extra-cellulaire, peut être utilisé pour compartimentaliser les produits recherchés qui seraient sinon susceptibles de dégradation en raison des protéases endogènes à l'hôte microbien Au moins dans les trois dernières applications, la molécule de prolongateur synthétique utilisée pour compléter la séquence de codage du produit transcrit d'ARN m peut incorporer en outre des codons pour des séquences d'amino-acides pouvant être coupées de façon - spécifique, par exemple par action enzymatique Par exemple, la trypsine ou la chymotrypsine effectueront une coupure spécifique au niveau arg-arg ou lys-lys, etc Voir la publication de demande britannique N 2 008 123 A ci-dessus. D'après ce qui précède, on voit que dans son aspect le plus large, l'invention permet de nombreuses applications, ayant chacune en commun les caractéristiques suivantes: on utilise un produit transcrit d'ARN m qui code pour une partie substantielle de la séquence d'amino- acides du polypeptide désiré mais qui, s'il était exprimé- seul, produirait un polypeptide différent plus petit ou - plus grand que le produit recherché; les codons de codage de protéine pour des séquences d'amino-acides autres que celles contenues-dans le produit désiré, s'il y en a, sont enlevés; une synthèse organique fournit le ou les. fragments codant le reste de la séquence désirée; et le produit transcrit d'ARN m et le ou les fragments synthétiques sont combinés et places dans un vecteur de clonage contenant un promoteur pour la - duplication et l'expression du produit recherché en l'absence de protéines conjuguées étrangères, ou du - produit recherché conjugué à une protéine étrangère pouvant être coupée de façon spécifique. 35.Evidemment, le produit d'expression commencera dans chaque cas par l'amino-acide codé par le signal de départ de traduction (dans le cas de ATG, la f-méthionine) On peut s'attendre à ce que celle-ci soit éliminée de façon intracellulaire, ou dans tous les cas qu'elle ne modifie pratiquement pas l'activité biologique du produit final. Bien que l'invention fournisse un procédé ayant des possibilités d'application générale pour la production de protéines utiles, y compris les anticorps, les enzymes, etc, l'invention convient particulièrement à l'expression d'hormones polypeptidiques mammifères et d'autres substances ayant des applications médicales, par exemple le glucagon, le polypeptide inhibiteur gastro-intestinal, le polypeptide pancréatique, l'adrénocorticotropine, les bêta-endorphines, l'interféron, l'urokinase, les facteurs de coagulation du sang, l'albumine humaine, etc Un mode de réalisation préféré représentatif de l'invention est décrit ci-après, dans lequel on construit, on clone et on exprime par voie microbienne un gène quasi-synthétique codant l'hormone de croissance humaine. CONSTRUCTION ET EXPRESSION D'UN VECTEUR DE CLONAGE POUR L'HORMONE DE CROISSANCE HUMAINE 1 Clonage du fragment Hae III du produit transcrit d'ARN m (Figures 3 et 4) On prépare de l'ARN m polyadénylé pour l'hormone de croissance humaine (HCH) à partir de tumeurs productrices d'hormone de croissance pituitaire, par le mode opératoire de A Ullrich et al, Science 196, 1313 ( 1977) On prépare 1,5 pg d'ADN c à double chaîne ("dc") à partir de 5 pg de cet ARN essentiellement comme décrit par Wickens et al J. Biol Chem 253 2483 ( 1978), mais on utilise le "fragment de Klenow" de 'ARN polymrérase lH Klenow, Proc Nat'l Aci USA. , 168 ( 1970)l, à la place de l'ADN polymérase I dans la synthèse de la seconde chaîne Le schéma de restriction de HCH est tel que des sites de restriction Ilae III sont présents dans la région de non-codage 3 ' et dans la séquence codant les amino-acides 23 et 24 de HCH, comme indiqué sur la Figure 3 Le traitement de l'ADN c de HCH dc par Hae III donne un fragment d'ADN de 551 paires de bases codant les amino-acides 24 à 191 de HCH On traite ainsi 90 ng de l'ADN c par Hae III, on effectue une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 8 % et on élue la région à 551 paires de bases On obtient environ 1 ng de ADN c. On choisit comme vecteur de clonage pour l'ADN c - le p BR 322 préparé comme dans-F Bolivar et ai, Gene 2 ( 1977) -113 p BR 322 a été totalement caractérisé, J G Sutcliffe; Cold Spring Harbor Symposium 43, 70 ( 1978), et est un plasmide de duplication de multicopie qui présente une résistance à l'ampicilline et une résistance à la tétracycline, en raison de l'inclusion des gènes correspondants ("Ap R" et "Tc R" respectivement, voir la Figure 4), et il contient des sites de reconnaissance pour les enzymes de restriction Pst I, Eco RI et Hind III, comme indiqué sur la figure. Les produits de coupure de Hae III et Pst I sont tous deux à extrémitéinerte La méthode d'adaptation GC de Chang A C Y et ai Nature 275 617 ( 1978) doit donc être utilisée pour combiner les produits à extrémité inerte du produit de coupure par Pst I de p BR 322 et de la digestion par Hae III du produit transcrit d'ARN m, en insérant le fragment d'ADN c dans le site Pst I de p BR 322 de manière à restaurer les sites de restriction Hae III (GG;CC) sur l'ADN c tout en restaurant les sites de restriction de Pst I (CTGCA 4 G) à chaque extrémité du produit inséré. On utilise ainsi de la désoxynucléotidyl transférase terminale (Td T) pour ajouter environ 20 restes d C par extrémité 3 ', comme décrit précédemment, Chang, A Y C, voir ci-dessus On adapte de façon similaire 60 ng de p BR 322 traités par Pst I, avec environ 10 restes d G par extrémité 3 '. On effectue la cyclisation de l'ADN c dc comportant une extrémité d C avec l'ADN vecteur à extrémité d G, dans 130 pi de Tris-H Cl 10 m M (p H 7,5), Na Cl 100 m M, EDTA 0,25 m M On chauffe le mélange à 70 C, on le laisse refroidir lentement jusqu'à 37 C ( 12 heures) puis jusqu'à 20 C ( 6 heures) avant de l'utiliser pour transformer E Coli x 1776 L'analyse de la séquence d'ADN pour le plasmide p GH 31 cloné dans x 1776 par le procédé de Maxam and Gilbert, Proc Nat'l Acad Sci USA 74, 560 ( 1977) confirme la présence des codons des amino-acides 24-191 de HCH, comme représenté sur la Figure 3 (Dans certains cas, et en particulier dans le nom du plasmide, on a utilisé les initiales anglo-saxonnes HGH de l'hormone de croissance humaine). i ' La souche x 1776 de E Coli K-12 a le génotype F ton A 53 dap D 8 min Al sup E 42 A 40 ligal-uvr Bl > min B 2 rfb-2 nal A 25 oms-2 thy A 57::met C 65 oms l A 29 lbio H-asdl cyc B 2 cyc Al hsd R 2 x 1776 a été certifié par le National Institutes of Health comme un système vecteur hôte EK 2. x 1776 a un besoin obligatoire d'acide diamino- pimélique (DAP) et ne peut pas synthétiser le mucopoly- saccharide qu'est l'acide colanique Il subit donc une mort par défaut de DAP dans tous les milieux o DAP est limitatif mais o suffisamment de produits nutritifs existent pour supporter le métabolisme et la croissance cellulaires Il a besoin de thymine ou de thymidine et subit une mort par défaut de thymine avec dégradation de l'ADN quand la thymine et la thymidine sont absentes du milieu mais quand suffisamment d'agents nutritifs sont présents pour soutenir l'activité métabolique x 1776 est extrêmement sensible à la bile et est donc incapable de survivre à un passage dans l'appareil intestinal des rats x 1776 est extrêmement sensible aux détergents, aux antibiotiques, aux drogues et aux produits chimiques x 1776 est incapable d'effectuer la réparation à l'obscurité ou photochimique des dommages induits par les rayons ultra-violets et est donc-de plusieurs ordres de grandeur plus sensible à la lumière solaire que les souches naturelles de E Coli x 1776 est résistant à de nombreux phages transducteurs et est déficient en conjugaison pour l'héritage de nombreux types différents de plasmides conjugatifs en raison de la présence de diverses mutations. x 1776 est résistant à l'acide nalidixique, à la cyclosérine et au triméthoprim Ces drogues peuvent donc être ajoutées à des milieux pour permettre de contrôler la souche et pour empêcher la transformation des contaminants, au cours de la transformation. x 1776 se développe avec un temnps pour une génération d'environ 50 minutes dans le bouillon L ou le bouillon de Penassay quand ils sont additionnés de 100 lig de DAP/ml et de 4 pg de thymidine/ml et atteint des densités finales de 8-10 x 108 cellules/ml à la phase stationnaire Une agitation modérée par remuage et agitation d'avant en arrière pendant une période de une à deux minutes met les cellules en suspension suffisante avec le maintien d'une viabilité à 100 %. On trouvera des détails supplémentaires concernant la souche x 1776 dans R Curtis et al, Molecutlar Cloning of Recombinant DNA, 99-177, Scott and Werner, eds, Academic Press (N Y 1977). x 1776 a été déposé à la American Type Culture Collection ( 3 juillet 1979, numéro d'accès ATCC n 31537, sans restriction). 2 Construction et clonage du fragment de gène synthétique (Figures 1 et 2) La stratégie de construction du gène quasi- synthétique de HCH comprend la construction d'un fragment synthétique comportant un site de coupure de restriction à extrémité inerte, proche du point auquel le fragment doit être réuni au produit transcrit d'ARN m Ainsi, comme représenté sur la Figure 1, le gène synthétique pour les 24 premiers amino acides de HCH contient un site de coupure Hae III après l'amino-acide n 23 L'extrémité éloignée du fragment synthétique comporte un "élément de liaison" qui permet la cyclisation à une extrémité à une seule chaîne résultant de la coupure par restriction dans le plasmide dans lequel le produit transcrit d'ARN m-et le fragment synthétique doivent finalement être réunis. Comme représenté sur la Figure 1, les extrémités 5 ' du fragment à double chaîne ont des extrémités cohésives à une seule chaîne pour les endonucléases de restriction Eco RI et Hind III pour faciliter la construction du plasmide Le codon méthionine à l'extrémité gauche fournit un site pour le début de la traduction Douze oligonucléotides différents, dont la dimension varie de l'undécamère à l'hexadécamêre, ont été synthétisés par le procédé amélioré par la voie tri- ester de Crea, R Proc Nat'l Acad Sci USA 75,-5765 ( 1978). Ces oligonucléotides, U 1 à U 6 et L 1 à L 6, sont indiqués par des flèches. -On phosphoryle des quantités de 10 pg de U 2 à U 6 et de L 2 à L 6, en utilisant la polynucléotide kinase T 4 et ( 132 P)ATP, selon un mode opératoire publié, Goeddel, D V et al Proc Nat'l Acad Sci USA 76, 106 ( 1979). On effectue trois réactions séparées catalysées par la T 4 ligase: on combine 10 pg du fragment U 1 à extrémité '-OH avec les fragments U 2, L 5 et L 6 phosphorylés; on combine les fragments U 3, U 4, L 3 et L 4 phosphorylés; et on combine 10 pg du fragment L 1 à extrémité 5 '-OH avec les fragments L 2, U 5 et U 6 phosphorylés On effectue ces ligatures à 4 C pendant 6 heures dans 300 pl de tampon Tris-H Cl 20 m M (p H 7,5), Mg C 12 1 m M, dithiothréitol 10 m M, ATP 0,5 m M, en utilisant 100 unites de T 4 ligase On réunit ces trois mélanges de ligature, on ajoute 100 unités de T 4 ligase et on laisse la réaction se faire pendant 12 heures à 20 C On précipite le mélange par l'éthanol et on effectue une électrophorèse sur un gellde polyacrylamide à 10 % On découpe du gel la bande migrant au niveau de 84 paires de bases et on l'élue On traite p BR 322 ( 1 pg) par Eco RI et Hind III, on isole le grand fragment par électrophorèse sur gel et on le ligature à l'ADN synthétique On utilise ce mélange pour transformer la souche 294 de E Coli K-12 (extrémité A, thi, hsr, hsmk +) La souche 294 a été déposée le 30 octobre 1978 à la American Type Culture Collection (ATCC N 31446), sans restriction L'analyse de la séquence par la technique de Maxam et Gilbert, voir ci- dessus, sur le produit inséré Eco RI Hind III provenant d'un plasmide p HGH 3 d'un transformant confirme celle décrite sur la Figure 1. 3 Construction du plasmide pour l'expression bactérienne de HCH (Figure 5) Avec le fragment synthétique dans p HGH 3 et le produit transcrit d'ARN m dans p HGH 31 i, on construit un plasmide pouvant être dupliqué contenant les deux fragments, en utilisant le plasmide d'expression p GH 6, comme représenté sur la Figure 5 Le plasmide d'expression, qui contient les promoteurs lac en tandem, a d'abord été construit comme suit. On isole à partir du plasmide p KB 268, K Backman, et al, Cell, Vol 13, 65-71 ( 1978), un fragment Eco RI à 285 paires de bases contenant deux fragments à promoteur lac UV 5 et 95 paires de bases, séparés par un fragment d'ADN hétérologue à paires de bases Le fragment à 285 paires de bases est inséré dans le site Eco RI de p BR 322 et un clone p GH 1 est isolé, les promoteurs étant orientés vers le gène de résistance à la tétracycline et dans une phase de lecture appropriée avec ce gène Le site Eco RI éloigné de ce dernier gène est détruit par digestion partielle par Eco RI, réparation des extrémités Eco RI à une seule chaîne résultante avec l'ADN polymérase I et recyclisation du plasmide par ligature des extrémités inertes Le plasmide résultant, p GH 6, contient un seul site Eco RI placé de façon appropriée par rapport au système promoteur dans lequel le gène complété pour HCH doit être inséré. Pour préparer le fragment synthétique pour la combinaison avec le produit transcrit d'ARN, on coupe 10 pg de p HGH 3 avec des endonucléases de restriction Eco RI et Hae III, et on isole sur un gel de polyacrylamide à 8 % le fragment à 77 paires de bases contenant les séquences de codage pour les amino acides 1-23 de HCH. Puis on coupe avec Hae III 5 ig du plasmide p HGH 31. On purifie par électrophorèse sur gel la séquence HCH à 551 paires de bases et un fragment de p BR 322 Hae III migrant simultanément et contenant 540 paires de bases Un traitement ultérieur par Xma I coupe seulement la séquence HCH, en enlevant 39 paires de bases de la région de non codage en 3 ' On sépare le fragment à 512 paires de bases résultant de l'élément Hae III de p BR 322 à 540 paires de bases, par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 6 % On polymérise 0,3 pg du fragment Eco RI Hae III à 77 paires de bases avec de la T 4 ligase dans 16 Pl d'un milieu de réaction pendant 14 heures à 40 C On chauffe le mélange à 70 C pendant minutes pour inactiver la ligase, puis on le traite par Eco RI (pour couper les fragments qui se sont dimérisés par l'intermédiaire de leurs sites Eco RI) et par Sma I (pour couper les dimères Xma I), ce qui donne un fragment à 591 paires de bases avec une extrémité "cohésive" Eco RI et une extrémité "inerte" Sma I Après purification sur un gel de polyacrylamide à 6 %, on obtient environ 30 ng de ce fragment. On notera que le plasmide d'expression p GH 6 ne contient pas de site de reconnaissance Xma I Cependant, Sma I reconnaît le même site que Xma I, mais le coupe par son milieu, en -19 donnant des extrémités inertes L'extrémité coupée par Sma du fragment dérivé de p HGH 31 peut donc être ligaturée par extrémités inertes dans p GH 6. On traite le plasmide d'exprcsion p GH 6, contenant les promoteurs lac UV 5 en tandem, successivement par Ilind III, ia nucléase SI et Eco RI, et on le purifie par électrophorèse sur gel On ligature 50 ng du vecteur résultant, qui a une extrémité cohésive Eco RI et une extrémité inerte, à 10 ng d'ADN de HCH à 591 paires de bases On utilise le mélange de ligature pour transformer E Coli x 1776 On choisit des colonies pour la culture sur tétracycline ( 12,5 pg/ml) Il est intéressant de noter que l'insertion du gène de HGH hybride dans p GH 6 détruit le promoteur pour le gène de la résistance à la tétracycline, mais que le promoteur lac en tandem permet la lecture du gène de structure pour la résistance à tet, conservant cette caractéristique de sélection On obtient environ 400 transformants L'hybridation sur filtre par le mode opératoire de Grunstein Hogness, Proc Nat'l Acad. Sci USA, 72, 3961 ( 1975) permet l'identification de 12 colonies ne contenant pas de séquence HCH Les plasmides isolés de trois de ces colonies donnent les schémas de restriction attendus quand on les coupe par Hae III, Pvu II et Pst I La séquence d'ADN d'un clone, p HGH 107, a été déterminée. L'hormone de croissance humaine exprimée par les transformants estfacilement détectée par des dosages radio- immunologiques directs effectués sur des dilutions en série de liqueur surnageante de cellules lysées en utilisant le coffret Phadebas HGH PRIST (Farmàcia). Pour démontrer que l'expression de HCH est sous la commande du promoteur lac, on transforme p GHG 107 dans la souche de E Coli D 1210 a lac+ (i Q O +zty+), un surproducteur de répresseur lac On ne peut pas détecter de niveau significatif de l'expression de HGH jusqu'à addition de l'inducteur IPTG (isopropylthiogalactoside). L'enlèvement du site Eco RI dans p GH 107 devrait laisser le signal de départ ATG à la même distance par rapport aux codons du site de fixation du ribosome du promoteur lac que celle qui se produit dans la nature entre ces codons et le signal de départ pour la 3-galactosidase. Pour déterminer si l'expression serait accrue en reproduisant cet espacement naturel, on a transformé p GH 107 en p GH 107-1- en ouvrant le premier avec Eco RI, en digérant les extrémités à une seule chaîne résultante avec l'endonucléase Sl et en refermant par ligature par extrémités inertes avec la T 4 ligase Bien que le plasmide résultant se révèle pouvoir de même exprimer HCH, 1 il le fait de façon surprenante à un degré- inférieur à celui de p GH-107, comme le montre un dosage radio- immunologique direct. L'homme de l'art verra que la présente invention n'est pas limitée au mode de réalisation que l'on vient de décrire et qu'elle n'est limitée que par l'étendue juridique des revendications annexées Des variantes autres que celles décrites précédemment seront-évidentes, que ce soit dans le choix du système promoteur, du plasmide parental, du produit polypeptidique recherché, ou de tout autre paramètre t Par exemple, d'autres systèmes promoteurs que l'on peut utiliser dans la présente invention comprennent le promoteur lambda, l'opéron arabinose (phi 80 d ara) ou les systèmes promoteurs colicine El, galactose, phosphatase alcaline ou tryptophane. Les organismes hôtes pour l'expression bactérienne peuvent être choisis, par exemple, parmi les Enterobactériacées,comme les souches d'Escherichia coli et de Salmonella; les Bacillacés, comme Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus; et Haemophilus influenzae Evidemment, le choix de l'organisme commandera les degrés de limitation matérielle du clonage et de l'expression qui doivent être mis en oeuvre pour satisfaire les exigences légales (par exemple National Institutes of Health Guidelines for Recombinant DNA, 43 Fed Reg 60,080 ( 1978). Bien que préféré pour la mise en oeuvre à l'échelle du laboratoire-de la présente invention, E Coli x 1776 peut se révéler d'un caractère pratique limité dans une fabrication industrielle à grande échelle en raison des caractères débilitants qui lui ont été incorporés volontairement pour des raisons de sécurité biologique Avec les degrés appropriés de restrictions physiques, plutôt que biologiques, on peut utiliser dans une opération à grande échelle des organismes comme E Coli K-12 souche 294, voir cidessus, et E Coli souche RR 1, génotype: Pro Leu Thi RB rec A+Strr Lac y E. B_ Coli RR 1 est dérivé de E Coli HB 101 (E W Boyer, et al, J. Mol Bio ( 1969) 41 459-472) par accouplement avec la souche E Coli K-12 KL 16 comme donneur Hfr Voir J E Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972) Une culture de E Coli RR 1 a été déposée le 30 octobre 1978 à la American Type Culture Collection, sans limitation d'accessibilité (ATCC N 31343) Une culture de x 1776 a également été déposée le 3 juillet 1979 à cette même collection de culture (ATCC N 31537) Les organismes suivants ont également été déposés à cette même collection de culture le 3 juillet 1979: plasmide p HGH 107 (ATCC N 40011); plasmide p GH 6 (ATCC N 40012); souche x 1776 transformée par p HGH 107 (ATCC N 31538) et souche 294 de E Coli K 12 transformée par p GH 6 (ATCC N 31539). Les organismes produits selon l'invention peuvent être utilisés dans la production par fermentation à échelle industrielle de l'hormone de croissance humaine, en donnant le produit en quantité et pour des applications qui n'étaient pas réalisables jusqu'à présent Par exemple, les cultures de transformant de E Coli peuvent être cultivées dans des milieux aqueux dans un récipient de fermentation en acier ou dans tout autre récipient de fermentation, aéré et agité de façon classique, dans des milieux aqueux à une température d'environ 37 C, par exemple, et à un p H voisin de la neutralité (par exemple p H 7 + 0,3) dans lequel on a introduit les agents nutritifs appropriés comme un glucide ou du glycérol, des sources d'azote comme le sulfate d'ammonium, des sources de potassium comme le phosphate de potassium, des oligo-éléments, du sulfate de magnésium, etc Les organismes transformants présentent de préférence une ou plusieurs caractéristiques de sélection, comme une résistance aux antibiotiques, de sorte que des contraintes de sélection peuvent être imposées pour décourager la croissance concurrente de E. Coli de type naturel Par exemple, dans le cas d'un organisme résistant à l'ampicilline ou à la tétracycline, l'antibiotique peut être ajouté au milieu de fermentation pour éliminer les organismes de type naturel qui ne présentent pas la caractéristique de résistance. A la fin de la fermentation, on centrifuge la suspension bactérienne ou bien on recueille de toute autre façon les matières solides cellulaires du bouillon puis on les lyse par des moyens physiques ou chimiques Les débris cellulaires sont enlevés de la liqueur surnageante et l'hormone de croissance soluble est isolée et purifiée. L'hormone de croissance humaine peut être purifiée à-partir d'extraits bactériens en utilisant un ou une combinaison des moyens suivants:'( 1) fractionnement par la polyéthylèneimine; ( 2) chromatographie par filtration sur gel de Sephacryl S-200; ( 3) chromatographie d'échange d'ions, sur une résine Biorex 70 ou Sephadex CM; ( 4) fractionnement par le sulfate d'ammonium et/ou le p H; et ( 5) chromatographie d'affinité en utilisant des résinés de type anticorps préparées à partir d'anti-HGH Ig G isolée à partir d'animaux immuno-sensibilisés ou d'hybridomes; et désorbée dans des conditions acides ou légèrement dénaturantes. REVENDICATIONS 1 Plasmide d'expression comprenant des gènes fonctionnels pour la résistance à l'ampicilline et la tétracycline et, entre lesdits gènes, un système de promoteurs lac en tandem orientés de façon à promouvoir l'expression dans la direction du gène pour la résistance à la tétracy- cline, plusieurs sites de restriction étant placés en aval dudit système promoteur qui founrissent respectivement des extrémités cohésives et inertes par coupure, en permettant l'insertion appropriée d'ADN hétérologue entre les sites pour qu'ils viennent sous la commande dudit système promo- teur. 2 Plasmide p GH 6.