FR 2522679 A1 19830909 FR 8300850 A 19830120 La présente invention concerne des lignées d'hybri- domes et leur procédé de production, ainsi que leur utilisation pour la production de substances particulières, par exemple des anticorps. Le terme"hybridome" s'applique à des cellules formées par fusion d'une cellule non transformée "immortalisante"(en parti- culier,une cellule de myélome) avec une cellule "normale" ordinai- rement choisie pour son aptitude à produire une substance particu- lière (par exempleun lymphocyte pour produire des anticorps) pour for- mer un hybride Ces hybrides peuvent être sélectionnés et clonés pour obtenir des lignées de cellules produisant des substances ayant une structure et/ou une propriété uniques En particulier, ces hybri- domes formés avec des lymphocytes peuvent être utilisés pour pro- duire des anticorps monoclonaux. Le développement de la technologie des hybridones ces dernières années a été dirigé vers l'obtention de lignées de cellules qui sont à la fois stables et produisent avec un rende- ment élevé et de manière spécifique une substance particulière que l'on désire obtenir Il y a eu diverses approches de ce problème qui, en raison de leur origine historique, ont été largement con- centrées dans le domaine des immunoglobulines/anticorps. Une étude d'activités préalables dans ce domaine donne une vue d'ensemble des types de problèmes rencontrés et des diverses solutions tentées jusqu'à présent. L'impulsion initiale pour la recherche dans les lignées de cellules hybrides fabriquant des produits monoclonaux est venue du domaine de l'immunobiologie, les produits étant des anticorps monoclonaux. Les antisérums classiques contiennent ordinairement un très grand nombre d'anticorps qui diffèrent structurellement par le site de fixation de l'antigène, mais se fixent chacun sur le même antigène avec un plus ou moins grand degré d'avidité et/ou de spécificité En outre, les antisérume classiques contiennent égale- ment un grand nombre d'anticorps dirigés contre d'autres antigènes et réfléchissant les réactions de défense préalables de l'individu récepteur à partir duquel on a obtenu l'antisérum Bien que ces anti- sérums "larges" soient suffisants pour la plupart des applications, on a estimé qu'une plus grande spécificité et une reproductibilité accrue marqueraient un progrès notable et fourniraient un instru- ment scientifique au potentiel considérable, en particulier dans le domaine du diagnostic et de la thérapie. La première solution maintenant classique a été celle décrite par Kdhler et Milstein lNature, 256, pager 495-497 ( 1975)l, qui ont réussi à fusionner des cellules de rate de souris préimmunisées avec des cellules de myélome de souris sensibles au "médicament" On a pu faire pousser in vitro les cellules fusion- nées ainsi immortalisées et les cloner à partir du stade de la cel- lule unique pour produire une population de cellules homogène pro- duisant une population d'anticorps homogène (anticorps monoclonaux). Par sélection entre les nombreuses cellules uniques et reclonage sélectif, il a été possible d'obtenir et de faire pousser des cel- lules qui produisent des anticorps ayant la spécificité désirée vis- à-vis de l'antigène. Les anticorps de souris produits de cette manière se sont révélés utiles pour des applications en recherche et en diagnostic et certains d'entre eux ont même été utilisés en théra- peutique chez l'homme On réaliserait cependant un progrès considé- rable dans la thérapie humaine par l'immunoglobuline si l'on pou- vait obtenir de cette manière des anticorps humains de spécificité et de reproductibilité semblables Ceci réduirait également le risque de sensibilisation Plusieurs approches du problème de pro- duction de ces anticorps humains in vitro ont été tentées,mais ont jusqu'à présent largement échoué. Elles comprennent: (i) La transformation de lymphocytes humains normaux par le virus d'Epstein-Barr (EBV) Cette méthode a rencontré peu de succès, car les cellules de ce type nécessitent un procédé long et fastidieux pour leur établissement et sont extrêmement difficiles à cloner et à sélectionner. (ii) La fusion de lymphocytes (humains) normaux avec des cellules de myélome humain Cette méthode représente une analogie évi- dente avec l'approche souris-hybridome de souris, mais ren- contre le problème quedans le système humain, on n'a disposé que d'une lignée de cellulesde myélome et on a trouvé que celle-ci était contaminée par du mycoplasma qui empêche la réussite des fusions. (iii) La fusion de lymphocytes humains normaux avec une lignée de de cellules de lymphoblastolde B humain transformé par EBV. Bien que cette méthode soit probablement la plus fiable et la plus reproductible décrite jusqu'à présent, elle présente l'inconvénient de base in vitro rencontré avec les cellules de lymphoblastoide: elles sont extrêmement difficiles à cloner et, comme elles représentent un stade antérieur dans la.ligne de différenciation de cellules B, leur capacité à produire et sécréter des anticorps est environ dix fois plus faible que celle des myélomes vrais. (iv) La fusion de lymphocytes humains avec des cellules de myélome de souris Cette méthode produit des cellules ayant les mêmes excellentes caractéristiques in vitro que les hybridomes souris-souris, mais avec le gros inconvénient que ces hybrides ont une instabilité génétique intrinsèque Un résultat parti- culièrement gênant de ceci est qu'elles expulsent le chromo- some humain sur lequel est situé le génome pour la formation de la chaîne kappa légère de l'immunoglobuline. En résumé, le procédé (i) est donc trop fastidieux et inefficace pour pouvoir être mis en oeuvre; le procédé (ii) n'a pas encore un importance pratique; le procédé (iii) est le meilleur de ceux actuellement disponibles; et le procédé (iv), bien qu'il soit viable, ne peut pas mainten Ir la productivité, même avec des procédés extrêmement fastidieux de clonage. Bien que la discussion ci-dessus et la plupart des travaux effectués jusqu'à présent dient été concentrés sur la pro- duction d'anticorps, il est clair que la cellule "productrice" peut être sélectionnée pour la sécrétion d'une substance particulière que l'on désire obtenir et fusionnée avec la lignée de cellules conférant l'immortalité ou "immortalisantes". La demanderesse a découvert selon l'invention qu'en utilisant une cellule d'hybridome xénogénétique comme-parent pour la fusion ultérieure avec une autre cellule, il est possible d'obte- nir un hybridome ayant une stabilité fortement améliorée. L'invention a donc pour objet une lignée de cellules d'hybridome comprenant une cellule conférant l'immortalité fusion- née avec une cellule produisant une substance prédéterminée, carac- térisée en ce que la cellule conférant l'immortalité est une cellule d'hybridome xénogénétique et en ce que la cellule produc- trice de la substance est génétiquement compatible avec le parte- naire non transformé dans l'hybridome xénogénétique. La stabilité de ces cellules réside dans leur apti- tude, si elles sont correctement cultivées, à maintenir la produc- tion d'une substance prédéterminée telle qu'un anticorps. Selon un aspect particulier de l'invention, l'hybri- dome xénogénétique choisi comme cellule conférant l'immortalité est un hybride de myélome qui a perdu son aptitude propre à pro- duire l'immunoglobuline Un exemple de cette cellule d'hybridome xénogénétique serait celle obtenue par fusion entre une cellule de myélome et un lymphocyte Des exemples de cellules de myélomes appropriées sont celles obtenues sur des-souris et des rats et de préférence ne produisent pas d'immunoglobuline Ces myélomes peuvent être eux-mêmes des hybrides (par exemplemyélome de souris/ lymphocyte de souris) qui sont en effet des myélomes Cette cel- lule estpar exemple, la lignée de cellules de myëlome SP-2 de souris On la fusionne ensuite, par exemple, avec un lymphocyte obtenu sur une autre espèce, par exemple un lymphocyte humain. Selon un mode de mise en oeuvre préféré, les hybri- domes xénogénétiques résultant de ces fusions, qui ne produisent plus d'immunoglobuline, sont choisis pour la fusion ultérieure avec des cellules productrices de la substance. Ces hybridomes xénogénétiques présentent un environ- nement plus bénin pour la stabilité ultérieure en ce qui concerne la perte des chromosomes. Les hybridomes xénogénétiques utilisés pour l'immor- talisation sont rendus résistants aux médicaments de manière clas- sique avant la fusion Une méthode particulière est la sélection pour la résistance à la 8-azaguanine. Les hybridomes ainsi obtenus constituent des parents stables pour la nouvelle fusion L'autre partenaire de fusion est sélectionné pour son aptitude à produire une substance prédéterminée - par exemple un lymphocyte pour produire un anticorps et il est génétiquement compatible avec le partenaire non transformé dans l'hybridome xénogénétique. Pour obtenir le degré nécessaire de spécificité, il est souhaitable de présensibiliser la cellule choisie pour produire la substance désirée Ceci peut s'obtenir,par exemple dans le cas des anticorps, par immunisation d'un hôte (récepteur) avec un anti- gène particulier et obtention ultérieure d'immunocytes (c'est-à- dire des cellules qui sont immunologiquement compétentes) qui produisent les anticorps correspondants. Ces cellules peuvent être,par exemple, des cellules de rate, de ganglion lymphatique ou des globules sanguins. La fusion de la cellule mère d'hybridome xénogéné- tique avec la cellule productrice de la substance a lieu de manière classique Elle s'effectue ordinairement par incubation de quan- tités comparables de chaque cellule dans un milieu convenable avec une substance qui favorise la fusion (par exemple polyéthylene- glycol de poids moléculaire 1500, ou PEG 1500) La sélection des hybrides désirés est'à nouveau classique et peut être effectuée dans des milieux sélectifs (par exemple,hypoxanthine/aminoptérine/ thymidine ou HAT si la cellule immortalisante ne contient pas d'hypoxanthinephosphoribosyltransférase). Les lignées de cellules résultantes sont stables et produisent l'anticorps avec des rendements élevés. Elles peuvent également être clonées et resélectionnées si nécessaire ou si on le désire. Llinvention concerne donc également un procédé de production d'une lignée stable de cellules d'hybridome, qui consiste à rendre résistante aux médicaments une cellule mère d'hybridome xénogénétique par fusion de celle-ci avec une cellule productrice de la substance qui est génétiquement compatible avec le partenaire non transformé dans l'hybridome xénogénétique et à sélectionner un hybride désiré. La production d'anticorps au moyen de ces cellules peut être effectuée selon des lignées classiques soit in vitro dans des milieux convenables (contenant par exemple du sérum de foetus de veau dilué), soit in vivo par injection chez un hôte (par exemple souris ou rat athymiques) et récolte du liquide ascitique. Selon la méthode utilisée, une ou plusieurs étapes de purification peuvent être nécessaires. L'invention concerne également la production d'anti- corps utilisant ces lignées de cellules. Bien qu'il soit clair que l'on préfère, pour des raisons économiques, les lignées de cellules d'hybridomes simples ayant les propriétés désirées, il est également possible de fusion- ner encore ces lignées de cellules,si on le désire ou si cela est nécessaire. Un hybridome producteur d'anticorps caractéristique selon l'invention serait un hybridome formé à partir d'un myélome de souris fusionné avec un lymphocyte humain comme cellule mère et ensuite avec un lymphocyte humain présensibilisé comme producteur d'anticorps N'importe lesquelles des cellules de myélome peuvent, si cela convient, être elles-mêmes des hybrides (par exemple dans la lignée souris SP-2 qui est elle-même un hybride souris/souris). Des exemples de références bibliographiques décrivant des techniques classiques et des travaux récents sont les suivantes 1 I Chler, G et Milstein, C Nature, 5 p 495-497 ( 1975) 2 Nadler, L M et coll, Cancer Research, 40, p 3147-3154 ( 1980) 3 Cosimi, A B et coll,N Engl J Med, 305, p 308-314 ( 1981) 4 Zurawski, V R etcoll, Science, 199, p 1439-1441 ( 1978) Koskimies, S, Scand J Immunol, 11, p 73-77 ( 1980) 6 Steinitz, M et coll, Nature, 287, p 443-445 ( 1980) 7 Olsson, L et Kaplan, H S, Proc Natl Acad Sci U S A, 77, p 5429-5431 ( 1980) 8 Croce, C M et coll, Nature, 288, p 488-489 ( 1980) 9 Nowinski, R et coll, Science, 210, p 537-539 ( 1980) 10 Croce, C M et coll, Proc Natl Acad Sci U S A, 76, p 3416-3419 ( 1979) 11 Galfre, G et coll, Nature 266, p 550, 1977 12 Miller, R A et coll, N Engi J Med 306, p 517, 1982 13 Sikora K, et coll, Lancet, ill, 1982 et, par exemple, le brevet des E U A 4 172 124 et les demandes de brevets européens publiées n 0043 718 et 0044 722, et le livre récemment publié par McIntyre sur les anticorps mono- clonaux. La présente invention, en utilisant une cellule mère de fusion xénogénétique (qui a perdu sa capacité de produire des substances prédéterminées) permet d'obtenir des hybridomes qui sont stables, poussent rapidement, sont facilement clonables et ont une vitesse élevée de production de la substance désirée, par exemple des anticorps humains. Les anticorps humains produits selon l'invention peuvent être utilisés de manière classique pour ces anticorps Des exemples de ces domaines d'application sont les suivants: Maladies infectieuses: virus (cytomegalo, varicella zoster, herpes simplex, hépatite A et B, rubella, etc) Bactéries (antitoxines, anti-paroi cellulaire) Champignons (Candida). Maladies malignes: anticorps contre toutes sortes de tumeurs malignesavec et sans conjugaison avec des toxines. Intoxication: anticorps anti-poisons (antidotes, digitale, opiacées, anti-dépresseurs tricycliques, barbiturates, etc). Anti-idiotypes: anti-anticellule pancréatique P, anti-antirécepteur d'acétylcholine, anti-facteur rhumatoîde. Antigènes de groupes sanguins: anti Rh. Transplantation: anti-cellule T pour mattriser les rejets, anti- corps facilitant la greffe pour réduire la capacité de stimulation de la greffe. Allergie: anticorps Ig G contre les allergènes, alternative à l'hyposensibilisation. Hormones: anticorps de gonadotropine chorionique pour l'utilisa- tion comme contraceptif. Les cellules d'hybridomes elles-mêmes peuvent également être utili- sées comme source d'AR Nm si l'on recherche le clonage des gènes d'immunoglobuline. Selon un mode de mise en oeuvre particulier de l'inven- tion, on utilise la lignée de cellules SP-2 qui a perdu sa capacité à produire des anticorps, qui est elle-même initialement un hybri- dome entre la lignée P 3-X 63-Ag 8 et les cellules de rate de souris qui produisent des anticorps contre les hématies de mouton (C F M. Shulmann et coll, Nature 276, p 269, 1978). On l'obtient, par exemple, au NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository, Ref GM 35669 A (voir US DHHS 1982 Catalog of Cell Lines). Cette lignée de cellules est rendue résistante aux médicaments et ensuite fusionnée par des techniques classiques avec des lymphocytes de sang périphérique humain normal lC F G Galfre et coll Nature 266, p 550 ( 1977) et R Nowinski et coll, Science 210, p 537 ( 1980)l. On obtient un grand nombre d'hybrides et, après envi- ron 5 semaines, on sélectionne 5 clones qui présentent une crois- sance rapide et pas de production d'anticorps Ces cellules sont sélectionnées pour la résistance à la 8-azaguanine et il est pos- sible avec trois de ces lignées d'obtenir des mutants qui sont résistants à 20 pg/ml de 8-azaguanine Ces cellules sont en même temps sensibles au milieu HAT (hypoxanthine/aminoptérine/thymidine), ce qui montre qu'elles ont perdu leur capacité de produire de l 'hypoxanthine-phosphoribosyltransférase. On fusionne ensuite in vitro l'une de ces lignées (SPAZ 4) avec des lymphocytes amygdaliens humains en utilisant 108 cellules amygdaliennes avec 2 107 cellules SPAZ 4 La fusion est effec- tuée selon des techniques classiques A titre comparatif, on fusionne également la lignée de cellules SP-2 Les populations de cellules résultantes sont sélectionnées dans le milieu HAT pour récupérer les hybrides nécessaires Dès qua toutes les cellules ont été tuées dans les cultures de contrôle non fusionn 4 es, le milieu HAT est remplacé par un milieu de croissance non sélectif normal. Après deux se maines de croissance, on effectue le test initial de recherche de la production d'anticorps et on trouve que les 47 cultures de chacune des fusions produisent toutes l'anti- corps humain Par un nouvel essai après encore quatre semaines, on découvre cependant que 83 % des hybridomes SPAZ-4 produisent encore l'anticorps au lieu de 55 % des hybridomes SP/2 On trouve un taux élevé de production chez 28 % des lignées SPAZ-4 au lieu de 3 % seu- lement des lignées SP/2. Compte tenu du fait qu'un facteur prépondérant dans la perte de production d'anticorps est la perte du génome de chaîne L, on effectue un essai spécifique de la production de chaîne légère. On trouve que 67 % des lignées SPAZ-4 produisent des chaînes kappa et 88 % des chaînes lambda Les valeurs correspondantes pour les lignées SP/2 sont de 39 % et 61 % respectivement (ces pourcentages sont évidem- ment comparables pour l'expérience particulière et l'immunoglobu- line Ig utilisée) Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau I ci-après On notera que l'hybridome SPAZ-4 est dans tous les cas supérieur au SP/2, spécialement en ce qui concerne les valeurs pour la production'"forte", qui sont les plus importantes du point de vue pratique Toutes ces expériences sont effectuées avec des cellules non clonées afin de maximiser la pression contre les clones stables (les clones stables portent davantage de matériau génétique et poussent toujours moins bien que les cellules qui ont réussi à expulser leurs chromosomes "inutiles"). On a cependant effectué des expériences pour cloner les cellules Les résultats obtenus jusqu'à présent indiquent que l'on n'a pas obtenu un hybride SP/2 unique stable et producteur (c'est-à-dire pas de lignée dans laquelle les cellules produisent l'anticorps) Dans les hybrides SPAZ-4, par contre, il est possible de dériver ces clones. La présente invention permet d'obtenir des résultats sensiblement meilleurs que les procédés connus jusqu'à présent en résultant le problème de l'instabilité, dans lesquels il vaut la peine de mentionner que même les hybridomes souris-souris"elassiques" sont instables et un sous-clonage est toujours nécessaire, ilssont cependant possibles à mettre en oeuvre Le degré d'instabilité apparaissant avec les hybridomes SPAZ-4 est plus faible que pour les hybridomes souris-souris et il est donc même plus facile de les mettre en oeuvre. Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLE 1 Production de la lignée SPAZ-4. On isole des lymphocytes de sang périphérique (PBL) du sang héparinisé d'un donneur sain par centrifugation sur "Ficoll- Isopaque" Après lavage, on mélange 108 PBL avec 5 107 cellules SP/2 dans 50 ml de milieu "Dulbeccos 1121 " ajusté à p H 8,0 On agglutine les cellules ensemble à 600 g pendant 5 mirn, après quoi on sépare avec soin le liquide surnageant En maintenant les cellules à 37 C, on ajoute lentement, en 1 min, 1 ml de PEG 4000 à 50 % dans le "H 21 ". On ajoute encore 10 ml de H 21 pendant 2 min On recueille les cel- lules par centrifugation (agglomération) et on les remet en suspen- sion dans 55 ml de milieu HAT (milieu HAT: "Dulbeccos H 21 " avec 20 % de sérum de foetus de veau (FCS), 10 % de "NCTC 109 ", 1 % d'aminoacides non essentiels, 0,5 % de pyruvate, 0,2 U/ml d'insuline, acide oxal- acétique 1 m M, hypoxanthine 10 -4 M, aminoptérine 4 10 M et thymi- dine 1,6 10 M) et on ensemence dans 528 cultures de 0,1 ml dans des microplaques de culture de tissusà fond plat On donne aux cultures du milieu HAT frais tous les 3-5 jours pendant 2 semaines, après quoi on remplace le milieu par un milieu HT ("Dulbeccos H 21 " avec 10 % de FCS, hypoxanthine 10-4 M et thymidine 1,6 103 M). Après le 15 e jour, on prélève des échantillons pour la recherche de l'anticorps humain On sélectionne cinq cultures présentant une bonne croissance et une production d'anticorps nulle Celles-ci sont ensuite sélectionnées pour la production de sous-lignées résis- tantes à la 8-azaguanine. Les cinq lignées de cellules sont ensemencées à 2.105 cellules/ml dans le "Dulbeccos H 21 " avec 10 % de FCS et g/ml de 8-azaguanine A partir de trois de ces cultures, il est possible, après deux semaines de récupérer des cellules en crois- sance viables L'une de celles-ci est la SPAZ-4 qui est sensible au HAT et qui est utilisée pour de nouveaux essais. EXEMPLE 2 Fusion avec des lymphocytes amygdaliens. On débarrasse des amygdales d'un enfant du tissu conjonctif et on les fait passer à travers un tamis métallique à mailles finei pour donner une préparation de cellules uniques Afin réduire le nombre d'hématies, on fractionne toutes les cellules sur "Ficoll-Isopaque" Sur la population de cellules résultante, on fusionne 108 cellules avec 27 cellules, soit SPAZ4, soit SP/2, par un mode opératoire identique à celui décrit à l'exemple 1 Les cel- lules sont ultérieurement ensemencées dans 47 cultures de 0,5 ml dans un milieu HAT qui contient cette fois un supplément de 0,5 pg/ml de cyclosporine A Après 1 jour, on ajoute 0,5 ml de milieu HAT sans cyclosporine A Au troisième jour, déjà, on remplace 50 % du milieu par du milieu HT Ensuite, les cellules sont maintenues dans le milieu HT avec des passages tous les 3-5 jours. Essai de production d'immunoglobuline. On utilise un système classique de dosage enzymo- immunologique ("ELISA") On fixe de l'anti-immunoglobuline humaine de lapin sur des plaques "Nunc EIA" à une dilution de 1:400 dans un tampon au bicarbonate à p H 9,6 Après lavage des plaques, on fait incuber le liquide surnageant des cultures pendant 30 min à 37 "C. Après encore un lavage, on traite les milieux incubés par un réac- tif Ig G, Ig M, Ig A anti-humaine de lapin conjugué à la peroxydase (Société Miles-Yeda) à la dilution 1:400 Apres lavage la réaction enzymatique est effectuée avec le dichlorhydrate de 1,2-phénylène- diamine et H 202. L'essai de production de chaîne légère est effectué exactement de la même manière, sauf que l'on utilise le réactif lambda-anti-humain de chèvre ou le réactif kappa-anti-humain de chèvre (Tago) à la dilution 1:3000 au lieu d'Ig G, Ig M, Ig A anti- humaine de lapin. Les résultats sont évalués sur un photomètre "Titertek Multiscan" pour ELISA et les valeurs " 4 " et " 7 " dans le tableau 1 concernent les lectures basse et hauterespectivement,sur ce photo- mètre. EXEMPLE 3 Production d'anticorps monoclonaux contre l'inluenza (grippe) type A et type B (après immunisation in vivo). Le vaccin contre la grippe utilisé est le "SANDOVAC" contenant de l'hémaglutinine et de la neuraminidase de A/Bangkok, A/Brésil et B/Singapour Trois volontaires sains sont immunisés et saignées les 3 e, 7 e, 10 e, 14 e et 17 e jours On prélève chaque fois -60 ml de sang de la veine cubitale dans des seringues contenant de l'héparine Les lymphocytes sont isolées par centrifugation sur "Ficoli-Paque" (de la Société Pharmacia) et lavés deux fois au sérum physiologique avec l'emploi. Les parents de fusion sont a) SPAZ-4 (cf exemple 1) b) SP/2 (voir cidessus) c) cellule de lymphoblastoide humain GM 1500 rendue résistante à la 8-azaguanine au WISTAR INSTITUTE (produit de l'Ig G 2 kappa humaine). Les cellules SPAZ-4 et SP-2 sont fusionnées de manière identique On mélange le myélome ( 107 cellules) et les lymphocytes humains (environ 3 10 cellules) dans un tube à essais en présence de milieu DMEM exempt de sérum à p H 8,0 On centrifuge les cellules ensemble à 600 g pendant 5 min On traite le bouton résultant avec du PEG 4000 à 50 % pendant 1 min, après quoi on dilue lentement le PEG par le milieu Aprèes un lavage,on ensemence les cellules dans 176 cultures de l OO/pl dans le milieu DMEM- HAT contenant 20 % de sérum de foetus de veau Les cellules sont culti- vées à 370 C en atmosphère humide à 10 % de C 02, On mélange les cellules GM 1500 ( 107 cellules) avec les lymphocytes humains (environ 3 107 cellules) dans le milieu DMEM exempt de sérum à p H 8,0 et on centrifuge à 600 g pendant min On traite le bouton avec 50 % de PEG 6000 pendant 5 min en centrifugeant les cellules à 600 g Après cette durée, le PEG est dilué lentement par le milieu Après un lavage, les cellules sont ensemencées dans 176 cultures de 100 p 1 dans le milieu RPMI 1640-HAT contenant 20 % de sérum de foetus de veau Les cellules sont culti- vées à 37 C dans une atmosphère humide à 5 % de C 02. On effectue un total de 35 fusions ( 15 fusions GM 1500; 14 fusions sur SPAZ-4 et 6 fusions sur SP-2) comportant 6160 cultures ( 2640 avec GM 1500; 2464 avec SPAZ-4; et 1056 avec SP-2). On change les milieux dans les cultures lorsque la prolifération uniforme des cellules le lend nécessaire, en général tous les trois à cinq jours On recherche la présence d'anticorps anti-grippe dans les liquides surnageants par la méthode ELISA les antigènes de la grippe correspondants sont fixés dans des puits de microplaques (Nunc), on ajoute le liquide surnageant et on le laisse réagir avec l'antigène Après lavage, on ajoute dans les puits un conjugué d'Ig G, Ig A, Ig M anti- humaine de lapin avec la peroxydase (Miles) Après incubation, on élimine par lavage le conjugué de peroxydase non fixé et on ajoute dans les puits un substrat coloré de l'enzyme La réaction est estimée visuellement et évaluée avec un photomètre à microplaques Titertek Les cultures présentant des résultats positifs sont clouées dans les conditions limites de dilu- tion dans 88 nouveaux puits par ensemencement des cellules à une cellule par culture dans 100 jil de DMEM + 20 % de sérum de foetus de veau avec des cellules "feeder" de thymocyte de souris (cellules dérivées de SPAZ-4 et SP-2) ou dans le RPMI 1640 + 20 % de sérum de foetus de veau sur des cellules "feeder" MRC-5 (cellules dérivées de GM 1500) On fait pousser les cellules productrices à grande échelle et on les congèle dans l'azote liquide, On clone un total de 86 cultures ( 58 cultures à partir GM 1500; 26 à partir de SPAZ-4; 2 à partir de SP-2) On applique des critères tout àfait larges pour décider si une cellule doit être clonée ou non, ce qui tient au faible rendement en cellules vraiment positives après clonage Ceci a été fait parce que lei GM 1500, par exemple, ne donnent pas de cellules à production élevée A partir des cellules SPAZ-4, on identifie quatre clones positifs, à partir des SP-2 un qui, cependant, n'est pas un hybride mais plutôt une cellule transformée par virus EB apparaissant spontanément Il n'y a pas de cellule productrice dérivée des GM 1500. Les résultats de la fusion sont rassemblés dans le tableau ci-dessous. Jour GM 1500 SPAZ-4 SP-2 Cultures Cultures Cultures Cultures Cultures Cultures fusion positives fusion positives fusion positives nées nées ___ _ nées 3 528 O 528 O 176 O *7 528 O 352 2 176 O 528 O 528 1 176 O 14 528 O 528 O 354 1 * 17 528 O 528 1 176 O Somme 2640 O 2464 4 1056 1 Cellule EBV spontanée. Les cinq lignées de cellules positives-sont reclonées plusieurs fois et on les fait pousser à grande échelle Ceci conduit à la mort de la lignée EBV (il est bien connu que ces colonies de cellules ne survivent pas à un clonage à faible densité). Les quatre lignées de cellules d'hybridome SPAZ-4 positives sont identifiées comme C 15, C 28, C 29 et C 75. EXEMPLE 4 Production d'hybridome anti-grippe (après immunisation in vitro). On ensemence des cellules de rate humaine à 106 cellules/ml dans des portions aliquotes de 2 ml dans des tubes "Falcon 2051 "; on utilise un total de 34 10 cellules On ajoute une quantité optimale de virus A/Bangkok purifié par gradient de densité de saccharose et on maintient les cultures dans le milieu "RPMI 1640 'i avec 5 % de plasma humain inactivé par la chaleur pendant 101 h à 370 C en atmosphère d'air à 5 % de C 2 O On fusionne les 6 2 9.10 cellules récupérées avec un nombre semblable de cellules SPAZ-4 comme décrit à l'exemple 3 Les cellules sont ensemencées dans 176 cultures et on les fait pousser-dans le MEM de Dulbecco contenant 20 % de sérum de foetus de veau, du HAT et lpg/ml de cyclosporine A Après 2 jours, le milieu HAT est progressivement déplacé par le milieu HT et changé ensuite à intervalles de 4-5 jours. On sélectionne les cultures pour les anticorps anti-grippe les lie et 19 e jours après la fusion et l'on clone les cultures positives. On obtient un clone positif (identifié comme B 2) qui est apte à la croissance à grande échelle et à l'utilisation pour la prépa- ration in vitro de quantités "chimiques" d'anticorps pur. EXEMPLE 5 Caractérisation d'anticorps monoclonaux anti-grippe humains. a) Anticorps/C 15 L'anticorps appartient à la classe Ig G 1 et possède une chaîne légère kappa L'anticorps réagit avec tous les virus essayés du type grippe A (Hl Nl, H 2 N 2, H 3 N 2), il est très probable- ment dirigé contre la nucléoprotéine du virus L'anticorps n'a pas d'activité neutralisante in vitro et pas d'effet protecteur in vivo. b) Ant Lcor 2 s IC 28. L'anticorps appartient à la classe Ig G 1 et possède une chaîne légère lambda L'anticorps réagit seulement sur le virus de grippe du type H 3 N 2, il est très probablement dirigé contre l'hémagglutinine du virus L'anticorps a un fort effet neutralisant in vitro et une activité protectrice considérable in vivo Il peut neutraliser tous les virus H 3 N 2 essayés, c'est-à-dire les virus des années 1968, 1969, 1973, 1974, 1975, 1977, 1979 et 1980. Dans l'essai avec 1973 A/Port Chalmers sur des cellules MDCK, on trouve qu'une préparation d'anticorps contenant 1,5 mg/ml d'anticorps pur a un titre de neutralisation de 12800. Dans la même expérience, on trouve qu'une préparation d'immunoglo- buline humaine classique (Sandoglobulin) à une concentration de 60 mg/ml a un titre de neutralisation de 50 Ceci signifie que l'anticorps monoclonal C 98 à un niveau équivalent en protéine a un pouvoir 10240 fois plus élevé que l'immunoglobuline normale Il convient de noter à ce sujet que l'anticorps antigrippe est l'un des composants prédominants dans une préparation d'immunoglobuline normale, ce qui signifie qu'avec les anticorps de mime pouvoir de neutralisation de C 28-mais dirigés,par exemple, contre le virus cytomégalo ou le virus varicella-zoster, o le niveau d'anticorps dans les préparations d'immunoglobuline normale est assez faible, le pouvoir relatif peut atteindre des valeurs beaucoup plus éle- vées. c) Anticorps/C_ 29. L'anticorps appartient à la classe Ig G 1 et possède une chaine légère lambda L'anticorps réagit avec le virus de grippe type B/Singapour, il n'a pas été essayé contre un autre virus de type B Il n'a pas d'activité contre le virus de type A. d) Anticor 2 s/CZ 5. L'anticorps appartient à la classe Ig G 3 et possède une chaîne légère kappa L'anticorps réagit seulement sur les virus du type H 3 N 2, il est très probablement dirigé contre l'hémagglutinine du virus Il n'a pas d'activité neutralisante in vitro et pas d'effet protecteur in vivo. e) Anticorps/b 2. L'anticorps appartient à la classe Ig G 1 et possède une chaîne légère kappa Il réagit seulement sur les virus du type H 3 N 2 et il est très probablement dirigé contre l'hémagglutinine du virus L'anticorps n'a pas d'effet neutralisant in vitro, on n'a pas recherché la protection in vivo. TABLEAU 1 Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illus- tration et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifica- tions et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention. Cel Immunoglobuline % Kappa % Lambda % lule Jour 4 7 4 7 SPAZ-4 4 83 28 SP/2 4 55 3 SPAZ-4 5 67 25 88 46 SP/2 5 39 13 61 17 SPAZ-4 6 36 9 SP/2 6 25 2 R E V E N D I C A T I O N S 1 Lignée de cellules d'hybridomes consistant en une cellule d'immortalisation fusionnée avec une cellule produisant une substance prédéterminée, caractérisée en ce que la cellule d'immortalisation est une cellule d'hybridome xénogénétique et en ce que la cellule produisant la substance est génétiquement compa- tible avec le partenaire non transformé dans l'hybridome xénogéné- tique. 2 Lignée d'hybridome selon la revendication 1, caractérisée en ce que la cellule produisant la substance est de la même espèce que le partenaire non transformé dans la cellule mère d'hybridome xénogénétique. 3 Lignée d'hybridome selon la revendication 2, caractérisée en ce que la cellule produisant la substance et le partenaire non transformé dans la cellule mère d'hybridome xéno- génétique sont d'origine humaine. 4 Lignée d'hybridome selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la substance produite est un anticorps. 5 Lignée d'hybridome selon la revendication 4, caractérisée en ce que la cellule produisant la substance est pré- sensibilisée,soit in vitro, soit in vivopour produire la substance prédéterminée. 6 Lignée d'hybridome selon l'une quelconque des revendication 1 à 5, caractérisée en ce que la cellule produisant la substance est un lymphocyte. 7 Lignée d'hybridome selon la revendication 6, caractérisée en ce que le lymphocyte est d'origine humaine. 8 Lignée d'hybridome selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce que le lymphocyte a été présensibilisé,soit in vivo, soit in vitropour la production d'anticorps. 9 Lignée d'hybridome selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que le myélome dans la cellule d'hybridome xénogénétique est un myélome murin qui ne pro- duit pas d'immunoglobuline. 2522679. Lignée d'hybridome selon la revendication 9, caractérisée en ce que le myélome murin est un myélome de souris. 11 Lignée d'hybridome selon la revendication LO, caractérisée en ce que le myélome de souris est fourni par la lignée SP-2. 12 Lignée d'hybridome selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que la cellule mère d'hybridome xénogénétique a perdu son aptitude ou est autrement incapable de produire une substance prédéterminée. 13 Lignée d'hybridome selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce qu'elle comprend une cellule d'hybridome xénogénétique formée par fusion d'une cellule de myélome de souris avec un lymphocyte comme cellule mère et un lymphocyte humain présensibilisé producteur d'anticorps comme cellule produisant la substance. 14 Procédé pour produire une lignée d'hybridome stable, caractérisé en ce que l'on rend résistante aux médicaments une cellule d'hybridome xénogénétique en la fusionnant avec une cellule productrice d'une substance qui est génétiquement compa- tible avec le partenaire non transformé dans l'hybridome xénogéné- tique et on sélectionne un hybride désiré. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que les partenaires de fusion utilisés sont choisis parmi ceux décrits dans l'une quelconque des revendications 1 à 13. 2 ' 16 Procédé selon la revendication 14 ou 15, carac- térisé-en ce que la résistance aux médicaments est obtenue par sélection de cellules résistantes à la 8-azaguanine. 17 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 14 à 16, caractérisé en ce que la fusion a lieu en présence d'une substance activante qui facilite celle-ci. 18 Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la substance activante est un polyéthylèneglycol. 19 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 14 à 18, caractérisé en ce que la sélection d'un hybride désiré s'effectue sur la base de l'absence de sensibilité au milieu hypoxanthine-aminoptérine-thymidine (HAT) et la recherche de l'apti- tude à produire la substance prédéterminée. Système de fusion cellulaire, caractérisé en ce qu'il consiste en une cellule mère d'hybridome xénogénétique et une cellule productrice de la substance dans un milieu nutritif, avec un agent qui facilite la fusion desdites cellules, 21 Système de fusion cellulaire selon la revendication 20, caractérisé en ce que les partenaires cellulaires sont ceux décrits dans l'une quelconque des revendications 1 à 13. 22 Système de fusion cellulaire selon la revendica- tion 20 ou 21, caractérisé en ce que l'agent qui facilite la fusion est un polyéthylèneglycol. 23 Procédé pour la production d'une substance pré- déterminée, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver une lignée de cellules d'hybridomes selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, ou telle que produite selon l'une quelconque des revendica- tions 14 à 19,dans un milieu de culture in vitro ou in vivo pour ladite culture et à isoler ensuite la substance dudit milieu. 24 Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que la substance obtenue est un anticorps. Procédé selon la revendication 23 ou 24, carac- térisé en ce que la culture in vivo est effectuée sur une souris ou un rat athymique. 26 Substance prédéterminée, caractérisée en ce qu'elle est produite selon l'une quelconque des revendications 23 à 25. 27 Lignée de cellules d'hybridomes xénogénétique selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, pour l'utilisa- tion comme partenaire dans la fusion cellulaire pour obtenir une lignée de cellules d'hybridomes. 28 Lignée de cellules d'hybridomes souris/humain/ humain. 29 Lignée de cellules d'hybridomes stable souris/ humain/humain, caractérisée en ce qu'elle est capable de produire des anticorps humains d'une spécificité prédéterminée. Lignée de cellules d'hybridomes selon la reven- dication 28 ou 29, caractérisée en ce que la cellule de souris est elle-même un hybridome souris/souris. 31 Procédé pour la fabrication de lignées cellu- laires qui produisent des anticorps humains pandant une durée pro- longée, caractérisé en ce qu'il consiste à produire des hybridomes souris/humain résistants aim"médicaments", qui ont perdu leur capa- cité de produire des anticorps et à construire ainsi une cellule de myélome de souris "humanifiée" qui présente un environnement plus favorable pour de nouveaux chromosomes humains et une stabilité plus élevée pour entretenir la production d'anticorps. 32 Procédé selon la revendication 31, caractérisé en ce que l'on fusionne de manière classique une lignée de cellules SP-2 avec des lymphocytes humains normaux, on sélectionne parmi les hybrides obtenus des clones présentant une croissance rapide sans production d'anticorps, on sélectionne encore ceux-ci pour la résis- tance à la 8-azaguanine, on fusionne ensuite ceux-ci à nouveau avec des lymphocytes humains et on sélectionne la population cellulaire ainsi obtenue dans le milieu HAT.