FR 2515685 A1 19830506 FR 8218495 A 19821104 1 - L'invention concerne un virus rabique, et plus précisément le virus rabique de souche ERA. Cette invention concerne en particulier l'ADN qui porte le code pour la glycoprotéine du virus rabique de souche ERA. Le virus à ARN rabique est un rhabdovirus qui comporte un génome d'ARN à brin unique négatif (nonsegmenté) qui est transcrit lors de l'infection pour produire 5 espèces de m ARN monocistroniques, complémentaires, polyadénylées Chacun des ARN messagers (m ARN) spécifiques d'un virus représentant un gène structural du génome du virus rabique (voir Flamand et Delagneau, J Virol 28, 518523 ( 1978)) code pour une protéine structurale du virus dont la dimension correspond à la capacité de codage apparente de son m ARN (voir Pennica et al, Virology, 103, 517-521 ( 1980); et Wunner et al J Virol 35, 133-142 ( 1980)) Le gène d'ARN de la glycoprotéine code pour une molécule associée à une membrane qui forme des projections en forme de pointe sur la surface des virus rabiques matures et est responsable de l'induction et de la fixation d'anticorps, neutralisant le virus, opposés au virus rabique (voir Wiktor et al, J Immun 110, 269-276 ( 1973); Cox et al, Infect Immun 16, 754-759 ( 1977); et Dietzschold et al, J gen Virol 40, 131-139 ( 1978)). Etant donné que la glycoprotéine rabique est l'antigène primaire dans le virus rabique, on suppose qu'éventuellement une injection de la glyco- protéine ou de segments de la glycoprotéine qui contient un site antigénique chez un animal, s'avère être un procédé immunologique efficace, sans les risques inhérents associés à l'immunisation d'un patient avec un virus rabique dénaturé. 2 - Les virus rabiques isolés à partir de différentes espèces animales dans diverses parties du monde, ont été considérés dans le passé comme très proches les uns des autres dans des tests sérologiques. Cependant, plusieurs virus proches de la rage (voir Shope et al, J Virol 6, 690-692 ( 1970); et Tignor et al., J gen Virol 37, 595-611 ( 1977)), isolés princi- palement à partir de chauves-souris et considérés comme appartenant au même genre que le virus rabique dans la famille des Rhabdoviridées, ont montré des relations sérologiques plus distantes entre eux et vis-à-vis des virus antirabiques (Fenner, F Intervirology 7, 42-43 ( 1976)) Récemment, des différences antigéniques parmi des sources de virus rabique elles-mêmes ont également été observées avec des anticorps monoclonaux dirigés contre la glycoprotéine (voir Wiktor et Koprowski, Proc. Nat Acad Sci USA 75, 3938-3942 ( 1978); et Flamand et al., J gen Virol 48, 105-109 ( 1980)). L'invention a pour principal objet de caractériser une structure de nucléotides pour le gène de la glycoprotéine dans des virus rabiques de source ERA. L'invention a encore pour objet de fournir un ADN approprié à une analyse en vue d'évaluer des sites antigéniques. Conformément à l'invention, on fournit un ADN qui est une copie du m ARN de la glycoprotéine du virus rabique de souche ERA Cet ADN monocaténaire spécifique de la glycoprotéine contient un codon d'initiation (ATG) et un codon de terminaison (TGA). Brève description des figures des dessins annexés La figure 1 illustre les résultats d'une analyse d'hybridation d'ARN poly A de glycoprotéine de la surface du virus rabique et d'ARN poly A de protéine nucléocapsidique de virus rabique, à partir de cellules infestées par le virus rabique. 3 - La Fig 2 illustre les sites auxquels diverses enzymes de restriction scindent le c ADN (c ADN = ADN com- plémentaire) spécifique de la glycoprotéine rabique. La Fig 3 illustre les séquences complètes des nucléotides du c ADN et des acides aminés, prédits, corres- pondantes, de la glycoprotéine rabique de souche ERA. Conformément à l'invention, la séquence complète du c ADN de la partie codante du gène de la glycoprotéine dans le virus rabique de souche ERA a été caractérisée. Cette séquence est la suivante: ATG GTT CCT CAG GCT CTC CTG r Tm GTA CCC CTT OTG GTT TTT CCA TTG TGT TTT GGG AAA TTC C T ATT TAC ACG ATA CTA GAC AAG CTT GGT CCC TGG AGC CCG ATT GAC ATA CAT CAC CTC AGC TGC CCA AAC AAT TTG GTA GTG GAG GAC GAA GGCA TGC ACC AAC CTG TCA GGG TTC TCC TAC ATG GAA CTT AAA GTT GGA TAC ATC TTA GCC ATA AAA ATG AAC GG TTC ACT TGC ACA GGC GTT GTG ACG GAG GCT GAA ACC TAC ACT AAC TTC GTT GGT TAT GTC ACA ACC ACG TTC AAA AGA AAG CAT TTC CGC CCA ACA CCA GAT GCA TGT AGA GCC GCG TAC AAC TGG AAG ATG GCC GGT GAC CCC AGA TAT GAA GAG TCT CTA CAC AAT CCG TAC CCT GAC TAC CGC TGG CTT CGA ACT GTA AAA ACC ACC AAG GAG TCT CTC GTT ATC ATA TCT CCA AGT GTA GCA GAT TTG GAC CCA TAT GAC AGA TCC CTT CAC TCG AGG GTC TTC CCT AGC GGG AAG TGC TCA GGA GTA GCG GTG TCT TCT ACC TAC TGC TCC ACT AAC CAC GAT TAC ACC ATT TGG ATG CCC GAG AAT CCG AGA CTA GGG ATG TCT TGT GAC ATT TTT ACC AAT AGT AGA GGG AAG AGA GCA TCC AAA GGG AGT GAG ACT TGC GGC TTT GTA GAT GAA AGA GGC CTA TAT AAG TCT TTA AAA GGA GCA TGC AAA CTC AAG TTA TGT GGA GTT CTA GGA CTT AGA CTT ATG GAT GGA ACA TGG GTC GCG ATG CAA ACA TCA AAT GAA ACC AAA TGG TGC CCT CCC GAT CAG TTG GTG AAC CTG CAC GAC TTT CGC TCA GAC GAA ATT GAG CAC CTT GTT GTA GAG GAG TTG GTC AGG AAG AGA GAG GAG TGT CTG GAT GCA CTA GAG TCC ATC ATG ACA ACC AAG TCA GTG AGT TTC AGA CGT CTC AGT CAT TTA AGA AAA CTT GTC CCT GGG TTT GGA AAA GCA TAT ACC ATA ITC AAC AAG ACC TTG ATG GAA CGCC GAT GCT CAC TAC AAG TCA GTC AGA ACT TGG AAT GAG ATC CTC CCT TCA AAA GGG TGT TTA AGA GTT GGG GGG AGG TGT CAT CCT CAT GTO AAC GGG GTG TTT TTC AAT GGT ATA ATA TTA GGA CCT GAC GGC AAT GTC TTA ATC CCA GAG ATG CAA TCA TCC CTC CTC CAG CAA CAT ATG GAG TTG TTG GAA TCC TCG GTT ATC CCC CTT GTG CAC CCC CTG GCA GAC CCG TCT ACC GTT TTC AAG GAC GGT GAC GAG GCT GAG GAT TTT GTT GAA GTT CACCT CCC GAT GTG CAC AAT CAG GTC TCA GGA GTT GAC TTG GGT CTC CCG AAC TGG GGG AAG TAT GTA TTA CTG AGT GCA GGG GCC CTG ACT GCC TTG ATG TTG ATA ATT ll'C CTG ATG ACA TGT TGT AGA AGA GTC AAT CGA TCA GAA CCT ACG CAA CAC AAT CTC AGA GGG ACA GGG AGG GAG GTG TCA GIC A Ci CCC C " AGC GGG G T-i C ATA TC-I ICA TGG u A 'i C,# CAG AAG AGT GGG GGT GAG ACC AGA CTG TGA. -4 - Un c ADN constituant une copie de la séquence du m ARN de la glycoprotéine a été cloné dans un plasmide p BR 322 de manière à définir les propriétés antigéniques et immunogéniques de la glycoprotéine du virus rabique. Clonage de la séquence du m ARN de la glycoprotéine Pour cloner le m ARN de la glycoprotéine rabique, on a isolé l'ARN poly A par chromatographie sur une cellulose oligo-d T à partir de l'ARN total extrait de cellules infestées par le virus rabique La sélection du m ARN de la glycoprotéine rabique a été réalisée par un procédé de sélection par dimension ( gradient de saccharose) On a identifié l'ARN poly A se trouvant dans la zone 15-205 par la capacité des échantillons à diriger la synthèse de la glycoprotéine dans des ovocytes micro-injectés. On n'a pas cherché à cloner des gènes spécifiques du virus rabique M 1, M 2 et L, car les protéines M et 2 sont synthétisées par de plus petits m ARN ( environ 12 S) et la protéine L est synthétisée par un m ARN beaucoup plus grand (supérieur à environ 28 S) (Voir Pennica et al, Virology 103, 517-521 ( 1980)). Cependant, on n'a pas exclu le clonage du gène spécifique du virus rabique pour la protéine nucléocapsidique (NC), comme on l'expliquera ci-après. - On a converti l'ARN poly A isolé en ADN complémentaire à double brin avec 1 'AMV reverse transcriptase et E coli ADN polymérase I Après la digestion avec la 51 nucléase et addition en bout de chaîne de résidus de d CMP (d CMP = désoxycytosine monophosphate), on a sélectionné un ADN contenant plus d'un Kilobase de paires, par centrifugation avec un gradient de saccharose On a hydridé l'ADN sélectionné avec p BR 322 auquel on a ajouté une queue de d G avant la transformation de E coli x 1776 On a isolé des colonies résistant à la tétracycline en utilisant l'ARN du virion rabique marqué à 32 p Environ 1 % des colonies répondait à l'essai avec des intensités variables Parmi 100 colonies de nouveau isolées, 20 ont été choisies en raison de la forte intensité des signaux qu'elles donnaient à partir de l'échantillon. On a préparé un c ADN monocatenaire dans une réaction d'un volume de 400) 11 contenant 204 g d'ARN poly A-15-205 provenant de cellules infestées avec la souche ERA du virus rabique, 50 m M (millimoles) de Tris -H Cl(p H de 8,3), 35 m M de K Cl, 10 m M de Mg C 12, m M de IS-mercaptoéthanol, 203 M Ci de d CTP (d CTP = désoxycytosine triphosphate) marqué à 3 H ( 17 Ci/mmole, ICN), 0,5 m M de d ATP (d ATP = désoxyadénosine triphosphate), c CTP, d GTP (d GTP =désoxyguanidine triphosphate), d TTP (d TTP = désoxythymine triphosphate), 200 A g/ml de BSA et 150 unités d'AMV reverse transcriptase On a incubé le mélange réactionnel à 42 C pendant 60 minutes. On a purifié le c ADN ( 6 J 1 g) par extraction avec du phénol et chromatographie sur Sephadex G 100 On a synthétisé un c ADN bicaténaire dans un volume de réaction de 400 fil contenant 25 m M de Tris-HC 1 (p H de 8,3), 70 m M de KC 1, 5 m M de Mg C 12, 16 m M def-mercapto- éthanol, 100 m M de tampon Hepes (p H de 6,9 >, 50, Ci ae 0-d CTP marqué au 32 p ( 400 Ci/mmole,Amersham), 0,1 m M de 6 - d CTP, 0,5 m M de d ATP, d GTP, d TTP et 12,5 unités de E coli ADN polymérase I (Boehringer Mannheim) On a incubé le mélange réactionnel à 15 C pendant 4 heures On a traité 5 jg de c ADN bicaténaire purifié à partir de la réaction comme ci-dessus avec de la 51 nucléase ( 4000 unités (Miles), dans 0,25 M de Na Cl, 0,03 M d'acétate de sodium (p H de 4,5 et 1 m M de Zn C 12) à 37 C pendant minutes On a allongé 2 Jg de l'ADN avec des résidus de d CMP dans 160/l contenant 0,1 M de cacodylate de sodium (p H de 7,0), 2,5 m M de Co Cl 2, 150 MM de d CTP, ,g/ml de BSA et 48 unités de désoxynucléotide transférase terminale (University de Zurich) par incubation à O C pendant 30 minutes On a fractionné le c ADN bicaténaire avec une queue de d C, purifié selon une technique par dimension par sédimentation dans un gradient de Saccharose de 5 à 23 % et centrifugation à 49000 tours/minute pendant 5 heures à 10 C dans un rotor SW 65. On a rassemblé l'ADN sédimentant entre les repères de dimension de 3,2 et 1,1 Kilobase de paires, soit 0,12 g). On a formé une structure annulaire avec 6 ng de c ADN bicaténaire, auquel on a ajouté en bout de chaîne des résidus de d CMP avec 25 ng de p BR 322 qui avait été scindé avec Pst I et complété en bout de chaîne avec des résidus de d GMP. Le mélange de forme annulaire donnait approximativement 1000 colonies résistant à la tétra- cycline par transformation de E coli x 1776 (Villa- komaroff et al, Proc Nat Acad Sci USA 75, 3727-3731 ( 1978)) On a développé les colonies résistant à la tétracycline pendant 48 heures sur des plaques de gélose avant de les transférer sur des filtres Whatman N 540 On avait préparé les filtres telsque décrits par Grunstein et Hogness, Proc Nat Acad Sci USA 72, 3961-3965 ( 1975) (sauf jn traitement initial avec H Cl 0,2 N pendant 20 minutes) et hybridés dans du formamide 7 - à 50 % (Alwine et al, Proc Nat Acad Sci USA 74, 5350-5354 ( 1977)) Pour préparer un échantillon en vue de sélectionner les colonies, on a partiellement dégradé un ARN de virion rabique par chauffage à 55 C pendant 50 minutes dans Na 2 CO 3 0,05 M, neutralisé en ajustant à 0,3 M d'acétate de sodium (p H de 5,5) et précipité avec de l'éthanol On a marqué l'ARN partiel- lement dégradé ( 11 g) par incubation dans 50 m M de tris-H Cl (p H de 8, 0), 10 m M de Mg C 12, 10 m M de dithiothréitol, 50 Ci de Y-ATP marqué à 32 P (environ 5000 Ci/mmole, Amersham), avec 10 unités de polynucléo- tide kinase (PO Biochemicals) à 37 C pendant 60 minutes. On a déterminé la dimension de plasmides à partir des 20 colonies sélectionnées ci-dessus par digestion avec Bam H I pour obtenir des molécules linéaires, et avec Pst I pour exciser le c ADN inséré. Spécifiquement, les ADN-plasmiques coupés par Bam H I et Pst I, contenant les séquences des gènes du virus rabique ont été examinés par électro- phorèse sur des gels d'agarose à 1 et 5 % respectivement. Environ la moitié des plasmides contenaient un site Bam H I supplémentaire et ces plasmides contenaient en moyenne des insertions plus courtes que ceux n'ayant pas de site Bam H I Le résultat indique la présence de deux séquences différentes, une pour la glycoprotéine du virus, l'autre pour la protéine nucléocapsidique du virus Dans chaque groupe on a choisi un plasmide pour une analyse ultérieure: A 344 qui contenait un insert ayant selon l'évaluation 1,75 Kilobase de paires et n'ayant pas de site Bam H I supplémentaire et B 333 qui contenait un insert ayant selon l'évaluation 1,3 Kilobase de paires et ayant un site Bam H I supplé- mentaire. 8- On a identifié deux espèces de m ARN qui spécifiaient respectivement la séquence codant pour (a) la glycoprotéine de surface du virus rabique et (b) la principale protéine nucléocapsidique, par translation, après une microinjection dans des ovocytes de X laevis et dosage immunologique pour déceler les produits de polypeptides utilisantdes anticorps monoclonaux spécifiques de la glycoprotéine et de Ia protéine nucléocapsidique (voir Wunner et al, J Virol 35, 133-142 ( 1980)) Cet essai a permis de déterminer que les m ARN de la glycoprotéine et de protéine nucléocapsidique sédimentaient respectivement à 18 S et 165. Pour distinguer entre eux les plasmides spécifiques des m ARN pour la glycoprotéine et pour la protéine nucléocapsidique attendus, on a isolé les inserts de A 344 et B 333 par digestion par Pst I et électrophorèse sur gel d'agarose à 1,5 % (Tabak and Flavell, Nucl Acid Res 5, 2321-2332 ( 1978)). On a marqué chaque brin d'ADN inséré par traduction de "nick" (Rigby et al, J mol Biol. 113, 237-251 ( 1977)) et hybridé avec des fractions individuelles d'ARN poly A provenant de cellules infestées par un virus rabique, et sédimenté dans un gradient de saccharose. Spécifiquement, on a chauffé les échantillons marqués à 100 QC pendant 5 minutes, ajusté à 50 % de formamide, 0,75 M de Na Cl, 10 m M de tampon Hepes (p H de 6,8), 1 m M d'EDTA, 1 mg/ml d'ARN de levure, puis chauffé avec l'ARN poly A fractionné provenant de cellules infestées par un virus rabique, dans un volume total de 1014 l à 45 C pendant 16 heures sous une huile de paraffine On a terminé l'hybridation par addition de 0,25 M de Na Cl froid, 0,03 M d'acétate de sodium 9 - (p H de 4,5) et 1 m M de Zn C 12 Après avoir séparé l'huile de paraffine, on a ajouté 100 unités de 51 nucléase et on a incubé la solution à 37 C pendant minutes On a déterminé par acptage le pourcentage insoluble dans l'acide par précipitation avec TCA. On a dénaturé à chaud, à 100 C environ } 4 g d'ARN poly A pendant 1 minute et centrifugé dans un gradient de saccharose à 5 à 23 % à 25000 tours/ minute à 10 C pendant 16 heures dans un rotor Beckman SW 41 On a dilué chaque fraction ( 0,5 ml) du gradient dans le rapport 1:60 avec de l'eau et hybridé 1/41 de la solution avec un échantillon marqué (environ 3000 cpm, activité spécifique 108 cpm/lg). Les résultats de ce procédé sont rapportés sur la Fig 1, sur laquelle la droite interrompue par des points noirs représente le résultat pour le plasmide B 333 et la droite interrompue par des points blancs représente les résultats pour le plasmide A 344. L'insert de plasmide A 344 s'hybridait avec un n ARN sédimentant à 18 S, l'emplacement de l'activité maximale m ARN pour la synthèse de la glycoprotéine, alors que l'insert du plasmide B 333 s'hybridait avec un m ARN sédimentant à 16 S, l'emplace- ment du m ARN capable de diriger la synthèse dans des ovocytes de protéine nucléocapsidique C'est ainsi que les plasmides A 344 et B 333 ont été désignés respectivement par p RG (glycoprotéine) et p RN (protéine nucléocapsidique). Caractérisation de p RG La séquence complète de nucléotides c ADN de la glycoprotéine a été déterminée par une technique utilisant les deux fragments de restriction marqués en 5 ' et en 3 ', définis par les sites indiqués sur la Fig 2 (Maxam et Gilbert, Meth Enzym 65, 499-560 ( 1980)). - Plus spécifiquement, la Fig 2 montre une carte de restriction de l'insert de p RG A l'extrémité de la séquence du c ADN correspondant à la terminaison 5 ' du m ARN, une chaîne oligo-d G:d C de 24 résidus est présent, alors que près de l'extrémité opposée on observe une chaîne oligo-d G:d C de 14 résidus. Ces chaînes ont été ajoutées sur le c ADN par le procédé d'addition de queue préparatoire à la mise sous forme annulaire avec p BR 322 A l'extrémité 3 ', on observe également la présence d'une séquence de polyd A (appelé (A)nsur la Fig 2) qui existe dans le clone sous forme de deux longueurs d'environ 50 et 80 paires de base. La séquence complète des nucléotides du c ADN et la séquence des acides aminés, déduite, ( 524 acides aminés) pour la glycoprotéine du virus rabique (souche ERA) sont rapportées sur la Fig 3. La terminologie utilisée sur la Fig 3 est rapportée dans le Tableau I ci-dessous. T A B L E A U I A Nucléotides A = adénine C = cytosine B Acides aminés Nom entier Alanine Arginine Asparagine Acide aspartique Cystéine Acide glutamique Glutamine Glycine Histidine Isoleucine G = guanine T = thymine. tbréviation Ala Arg Asn Asp Cys Glu Gln Gly His Ile Sur la Fig Nom entier Ab Leucine Lysine Méthionine Phénylalanine Proline Serine Thréonine Tryptophane Tyrosine Valine j 3, les rectangles bréviation Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val désignent 11 - le codon d'initiation (ATG) et le codon de terminaison (TGA) Le codon d'initiation (ATG) est situé sur les nucléotides 8 à 10 à partir de l'extrémité 5 ' du clone. Les deux autres cadres de lecture contiennent de nombreux codons d'arrêt, de telle sorte que le polypeptide le plus long qui peut en être dérivé, a une longueur inférieure à 50 acides aminés. Les nombres entre parenthèses sur la Fig 3 désignent la séquence numérique des acides aminés comptés à partir du résidu de lysine N- terminal de la glycoprotéine mature qui est situé à 20 acides aminés du codon d'initiation (ATG). Les 6 premiers résidus d'acides aminés de la glycoprotéine mature, (Lysphe-pro-ile-tyr-thr-), ont été identifiés indépendamment par analyse directe de la séquence des acides aminés N-terminaux de la glycoprotéine de virus rabique purifiée Cette séquence d'acides aminés est située à 2025 résidus du codon de méthionine d'initiation dans la séquence déduite. La composition en acides aminés de la glycoprotéine de virus rabique mature (souche ERA) (résidus par molécule), ainsi déduite, est représentée dans le Tableau II. 2 2515685 12 - T TABLEAU II Acide aminé Résidu par Acide aminé Résidu par molécule molécule Alanine 20 Leucine 51 Arginine 28 Lysine 28 Asparagine 21 Méthionine 13 Acide aspartique 25 Phénylalanine 18 Cystéine 16 Proline 28 Acide glutamique 31 Sérine 42 Glutamine 8 Thréonine 34 Glycine 38 Tryptophane 9 Histidine 18 Tyrosine 16 Isoleucine 22 Valine 39 La séquence déterminée code pour une protéine de 524 acides aminés comprenant un peptide signal de 19 acides aminés non-polaires précédant le résidu de lysine amino-terminal de la glycoprotéine mature Le polypeptide signal est normalement associé avec une protéine transmembranaire (Lingappa et al J. Biol Chem 253, 8667-8670 ( 1978)) et est éliminé pendant la maturation du polypeptide Les résidus d'acides aminés dans la structure de c ADN de la glycoprotéine rabique représentés sur la Fig 3 ont en conséquence été numérotés en commençant par la lysine N-terminale de la glycoprotéine mature. Un domaine hydrophobe ininterrompu de 22 acides aminés non-polaires relié par les résidus de lysine à la position 439 et les deux résidus d'arginine aux positions 462 et 463 prés de la région carboxy terminale du polypeptide prédit est semblable au segment de polypeptide transmembranaire possible de la glyco- protéine de Semliki Forest Virus (SFV) (Garoff et al, Nature 288, 236-241 ( 1980)). 13 - Une séquence relativement longue de 44 résidus chargés et nonchargés s'étend du domaine du polypeptide transmembranaire possible au codon de leucine carboxy-terminal à la position 505. La séquence d'acides aminés, déduits, contient 4 sites accepteurs d'hydrate de carbone, tel que défini par la séquence (asn-X-ser) et (asn-X-thr). Trois de ces sites sont situés sur le côté N-terminal du segment transmembranaire possible dans le c ADN de la glycoprotéine ERA Trois chaînes d'hydrate de carbone ont été trouvées sur la glycoprotéine du virus rabique de souche ERA (Dietzschold B, J Virol 23, 286-293 ( 1977)), conformément au nombre prévu de sites de fixation d'hydrates de carbone, à l'exclusion du quatrième site accepteur d'hydrate de carbone aux positions 465-467 (qui se trouve dans le domaine trans- membranaire possible). Détermination complète de la séquence du m ARN clon' L'utilisation de la carte de restriction a permis d'établir la dimension du c ADN de p RG inséré à environ 1,75 Kilobase de paires (voir Fig 2) Pour établir qu'aucun nucléotide essentiel ne manquait de l'insert du c ADN de la glycoprotéine, on a marque un petit fragment initiateur situé près de l'extrémité 5 ' de la séquence de la glycoprotéine et fixé par les sites de restriction pour Pvu II et Hind III (voir Fig 2), et hybridé avec l'ARN poly A 18 S provenant de cellules infestées par le virus rabique L'incubation de l'hybride formé entre le m ARN de la glycoprotéine et le fragment de c ADN marqué avec l'AMV reverse transcriptase a prolongé le fragment initiateur jusqu'à la terminaison ' du m ARN de la glycoprotéine On a résolu les produits de réaction sur un gel dénaturant et identifié par 14 - autoradiographie. On a restreint la séquence de gènes de la glycoprotéine avec Pvu II, marqué par Y-ATP à 2 p avec la polynucléotide kinase et ensuite digéré avec Hind III On a isolé le fragment marqué résultant constitué de 36 paires de base sur un gel de polyacrylamide à 5 % ( 0,1 % de bis-acrylamide) dans 50 m M de Tris-borate (p H de 8,3), 1 m M d'EDTA, puis on a élué et séché Le fragment marque à 32 p était ensuite dénaturé dans 20 Xl de formamide à 80 % (volume/volume) en chauffant à 100 C pendant 3 minutes On a séché un échantillon d'ARN poly A 18 S ( 104 g) provenant de cellules infestées par le virus rabique, avec 20 J 1 d'une solution contenant 0,4 M de Na Cl, 20 m M de tampon Hepes (p H de 6, 8) et 1 m M d'EDTA (p H de 7,5) On a ajouté la solution de l'ADN marqué à 32 P, dénaturé, à l'ARN séché et incubé successivement à 60 C, 58 C, 56 C et 54 C pendant 1 heure à chaque température Après mise sous forme annulaire, on a transféré le mélange dans 1001 l d'acétate de sodium 0,3 M froid (p H de 5,5) et précipité par 2,5 volumes d'éthanol à -20 C On a dissous les acides nucléiques précipités dans 40 A 1 d'une solution contenant 50 m M de Tris-H Cl (p H de 8,3), 10 m M de Mg C 12, 35 m M de K Cl, m M de)G-mercaptoéthanol, 0,5 m M de chacun des 4 désoxynucléoside triphosphates, 200/ig/ml de BSA, 12,5 _/g/ml d'actinomycine D et 12 unités d'AMV reverse transcriptase, et on a incubé à 37 C pendant 90 minutes. Après précipitation à partir du mélange réactionnel avec de l'éthanol, on a dissous les acides nucléiques dans 4 Jfl de formamide à 80 %, 50 m M de Tris-borate (p H de 8,3), 1 m M d'EDTA, 0,1 % de xylène cyanol FF et 0,1 % de bleu de bromophénol et on a chauffé à 90 C pendant 1 minute avant de charger sur un gel de polyacrylamide à 8 % ( 0,4 % de bis-acrylamide} contenant 50 % (poids/volume) d'urée, - m M de Tris-borate (p H de 8,3) et 2 m M d'EDTA On a déterminé les acides nucléiques marqués par autoradiographie en utilisant un écran intensifiant à -70 C. En dehors du fragment d'initiateur marqué (longueur réelle 36 nucléotides) , les produits majeurs avaient des longueurs d'environ 40 et 165 nucléotides Des produits ayant 40 nucléotides provenaient probablement de la reconstitution du site d'action de Hind III par le fait de mettre sous forme annulaire des brins d'ADN obtenus par l'action du Pvu I Iet Hind III, alors que les produits ayant 165 nucléotides résultaient de l'extension de l'initiateur qui était hybridé avec le m ARN de la glycoprotéine. Etant donné que le site Pvu II se trouve à 129 paires de base de la terminaison 5 ' de la séquence de la glycoprotéine clonée (à l'exclusion de la petite queue d G-d C de 24 paires de base), les résultats indiquaient qu'à la séquence de la glycoprotéine clonée il manquait seulement environ 35 nucléotides à partir de la terminaison 5 ' de la m ARN de la glycoprotéine. (La séquence du c ADN de la glycoprotéine rabique, insérée, contient environ 1,69 Kilobase de paires). Par comparaison avec le m ARN de la glycoprotéine du virus de la stomatite vésiculaire, apparentée dans lequel la région non-codante 5 ' contient 30 nucléotides, suivis de 48 nucléotides pour le peptide signal (Rose J K, Cel 19, 415-421 ( 1980)); et Rose et al, Proc Nat Acad Sci USA 77, 3884-3888 ( 1980)), on pense que la première méthionine (voir Fig 3) serait le site d'initiation de la synthèse de la glycoprotéine. Les carastéristiques actives du c ADN de la glycoprotéine sont contenues entre le codon d'initiation (ATG) et le codon de terminaison (TGA), tel que représenté sur la Fig 3 Cette séquence qui contient la séquence codant pour la glycoprotéine, 16- débute à la méthionine d'initiation et comprend la séquence signal qui consiste en les 19 premiers codons après le codon d'initiation (ATG) En conséquence, le fait qu'environ 35 nucléotides soient manquants à partir de la terminaison 5 ' du c ADN de la glycoprotéine, tel que caractérisé par l'invention, n'a rien à voir ici. Les nucléotides manquants ne font pas partie de la séquence codant pour la glycoprotéine active Les codons se trouvant après et avant les codons d'initia- tion et de terminaison, tel que partiellement décrit sur la Fig 3, sont donc considérés comme instructifs, mais l'invention concerne en particulier la portion de la séquence avec les codons d'initiation et de termi- naison comme points extrêmes. La souche ERA du virus rabique contient une forme simple de glycoprotéine avec une masse moléculaire d'environ 67000, alors qu'à l'intérieur de la cellule, il existe une forme plus petite qui a une masse moléculaire d'environ 63000 (déterminée par analyse sur gel de polyacrylamide) Cette forme plus petite de glycoprotéine dans laquelle manquent la plupart des hydrates de carbone de la forme mature, comprend au plus 570 acides aminés (masse moléculaire moyenne 110), compatibl Esavec la dimension, déduite, de 505 résidus pour la glycoprotéine mature. On a utilisé des anticorps monoclonaux anti-glycoprotéine neutralisant le virus, pour sélectionner des variants du virus qui ne peuvent plus être neutralisés par de simples anticorps monoclonaux utilisés pour une sélection On suppose qu'un chan- gement d'acide aminé serait responsable de la modifi- cation des sites de fixation de l'anticorps Pour traduire de tels changements sur une carte, on peut 17 - utiliser le c ADN de la glycoprotéine clonée pour préparer des amorceurs pour la synthèse de l'ADN sur un ADN viral parent et variant, comme copies de manière à comparer entre elles les séquences de nucléotides pour des virus parents et variants Une analyse des séquences sur ordinateur peut être utilisée pour prédire les régions antigéniques exposées sur la glycoprotéine virale. Plus spécifiquement, le c ADN de la glycoprotéine clonée est traité par des enzymes de restriction appropriées et selon des techniques de séparation pour sélectionner une séquence d'initiateur qui est située près de, mais pas à l'intérieur, des lieux de fixation d'un site antigénique ou d'un site antigénique proposé L'amorceur résultant est d'abord hybridé avec un m ARN de glycoprotéine ou à un AIN viral provenant d'une souche de virus rabique probablement variant Un c ADN pour le variant dans la région du site antigénique est produit en traitant le m ARN ou ARN viral/hybridé avec l'initiateur de c ADN avec 1 'AMV reverse transcriptase (en utilisant les techniques discutées ci- dessus) Des différences dans la séquence du c ADN du produit, par rapport à la séquence du c ADN de la souche ERA peuvent alors être représentées sur une carte en déterminant la nouvelle séquence du c ADN au moyen des- techniques déjà discutées ci-dessus. Le c ADN du virus rabique et le m ARN de la glycoprotéine, variants, peuvent être utilisés pour transformer une bactérie, de manière à produire un polypeptide antigénique en quantités suffisantes pour être utilisé dans une immunisation Ou bien, le polypeptide antigénique peut être synthétisé in vitro pour être utilisé dans une immunisation. 18 - -R E V E N D I C A T ION- ADN monocaténaire de glycoprotéine pour un ARN de virus rabique de souche ERA, débutant avec un codon d'initiation (ATG) et se terminant avec un codon de terminaison (TGA) et ayant la séquence de nucléotides suivante: ATG GTT CCT CAG GCT CTC CTG TTT GTA CCC CTT CTG GTT TTT CCA TTG TGT TTT GGG AAA TTC CCT ATT TAC ACG ATA CTA GAC AAG CTT GGT CCC TGG AGC CCG ATT GAC ATA CAT CAC CTC AGC TGC CCA AAC AAT TTG GTA GTG GAG GAC GAA GGA TGC ACC AAC CTG TCA GGG TTC TCC TAC ATG GAA CTT AAA GTT GGA TAC ATC TTA GCC ATA AAA ATG AAC GGG TTC ACT TGC ACA GGC GTT GTG ACG GAG GCT GAA ACC TAC ACT AAC TTC GTT GGT TAT GTC ACA ACC ACG TTC AAA AGA AAG CAT TTC CGC CCA ACA CCA GAT GCA TGT AGA GCC GCG TAC AAC TGG AAG ATG GCC GGT GAC CCC AGA TAT GAA GAG TCT CTA CAC AAT CCG TAC CCT GAC TAC CGC TGG CTT CGA ACT GTA AAA ACC ACC AAG GAG TCT CTC GTT ATC ATA TCT CCA AGT GTA GCA GAT TTG GAC CCA TAT GAC AGA TCC CTT CAC TCG AGG GTC TTC CCT AGC GGG AAG TGC TCA GGA GTA GCG GTG TCT TCT ACC TAC TGC TCC ACT AAC CAC GAT TAC ACC ATT TGG ATG CCC GAG AAT CCG AGA CTA GGG ATG TCT TGT GAC ATT TTT ACC AAT AGT AGA GGG AAG AGA GCA-TCC AAA GGG AGT GAG ACT TGC GGC TTT GTA GAT GAA AGA GGC CTA TAT AAG TCT TTA AAA GGA GCA TGC AAA CTC AAG TTA TGT GGA GTT CTA GGA CTT AGA CTT ATG GAT GGA ACA TGG GTC GCG ATG CAA ACA TCA AAT GAA ACC AAA TGG TGC CCT CCC GAT CAG TTG GTG AAC CTG CAC GAC TTT CGC TCA GAC GAA ATT GAG CAC CTT GTT GTA GAG GAG TTG GTC AGG AAG AGA GAG GAG TGT CTG GAT GCA CTA GAG TCC ATC ATG ACA ACC AAG TCA GTG AGT TTC AGA CGT CTC AGT CAT TTA AGA AAA CTT GTC CCT GGG TTT GGA AAA GCA TAT ACC ATA TTC AAC AAG ACC TTG ATG GAA GCC GAT GCT CAC TAC AAG TCA GTC AGA ACT TGG AAT GAG ATC CTC CCT TCA AAA GGG TGT TTA AGA GTT GGG GGG AGG TGT CAT CCT CAT GTG AAC GGG GTG r TTT TTC AAT GGT ATA ATA TTA GGA CCT GAC GGC AAT GTC TTA ATC CCA GAG ATG CAA TCA TCC CTC CTC CAG CAA CAT ATG GAG TTG TTG GAA TCC TCG GTT ATC CCC CTT GTG CAC CCC CTG GCA GAC CCG TCT ACC GTT TTC AAG GAC GGT GAC GAG GCT GAG GAT Trr CTT GAA GTT CAC CTT CCC GAT GTG CAC AAT CAG GTC TCA GGA GTT CAC TTG GGT CTC CCG AAC TGG GGG AAG TAT GTA TTA CTG AGT GCA GGG GCC CTC ACT GCC TTG ATG TTG ATA ATT Tl C CTG ATG ACA TGT TGT AGA AGA GTC AAT CUA TCA GAA CCT ACG CAA CAC AAT CTC AGA GGG ACA GGG AGG GAG GTG TCA GTC ACT CCC CAA AGC GGG AAG ATC ATA TCT TCA TGG GAA TCA CAC AAG AGT GGG GGT GAG ACC AGA CTG TGA.