FR 2523152 A1 19830916 FR 8303755 A 19830308 La présente invention concerne dans son ensemble la technologie de recombinaison de l'ADN utilisant des systèmes de levures-hôtes et des véhicules d'expression qui expriment, traitent et sécrètent une protéine hétéro- logue en tant que produit discret ne s'accompagnant pas d'une préséquence non désirée ou d'un autre artefact d'expression. L'invention est basée sur la découverte selon laquelle, pour la première fois, une protéine normalement hétérologue vis-à-vis d'une levure-hôte peut être recueil- lie, en quantités intéressantes, du milieu servant de support à la culture de la levure, cette protéine ayant été exprimée, traitée et sécrétée par la levure d'une manière mimant sa production dans l'environnement cellu- laire naturel Ainsi, la présente invention résulte du succès de la manipulation de véhicules d'expression et d'une levure-hôte de manière à diriger la synthèse d'une protéine qui n'est pas normalement synthétisée par la levure-hôte et, notamment, à influencer la levure-hôte de manière que la protéine vienne sous la direction de son processus sécrétoire L'invention est donc axée sur les moyens et les procédés permettant de tirer des quan- tités intéressantes de protéine hétérologue du milieu d'une culture de levure contenant des cellules viables abritant des véhicules d'expression contenant de l'ADN qui code la protéine Un avantage considérable réside dans la possibilité, offerte par l'invention, d'obtention d'un produit protéinique discret utile dans le milieu de culture cellulaire, éliminant la nécessité de recourir à une lyse cellulaire en vue de recueillir le produit qui n'était jusqu'alors accessible qu'à partir du contenu cellulaire, souvent sous une forme autre que la forme mûre. Les publications et autres informations auxquelles on se réfère dans le présent mémoire pour éclaircir le fond de l'invention è,dans des cas particulierspour apporter des détails supplémentaires en ce qui concerne sa mise en oeuvre, sont incorporées ici à titre de réfé- rence et, pour la commodité, elles ont été affectées de références numériques et rassemblées sous le titre bibliographie" à la fin du présent mémoire. Les organismes appelés levure transportent norma- lement un petit nombre de protéines homologues déterminées vers la membrane plasmatique et parfois à travers cette membrane, comme contribution essentielle à la croissance en surface de la cellule et au métabolisme cellulaire. Lorsque la cellule bourgeonne, ce qui est un signe de reproduction préliminaire à la formation d'une cellule fille, d'autres protéines sont nécessaires pour la forma- tion de la paroi cellulaire et de la membrane plasmatique de même que pour le métabolisme Certaines de ces pro- téines doivent se rendre sur le site de fonctionnement; par conséquent, on admet qu'un processus de sécrétion existe ( 1) Certaines protéines homologues impliquées dans les processus ci-dessus sont formées par traduction dans le reticulum endoplasmique Des protéines homologues sont celles qui sont normalement produites par l'espèce de levure et qui sont nécessaires pour sa viabilité Une fois formées, elles émigrent par transfert enzymatique vers l'appareil de Golgi, duquel elles se rendent dans des vésicules vers des membranes plasmatiques o certaines s'associent ou, dans une certaine mesure, pénètrent dans l'espace existant entre la membrane plasmatique et la paroi cellulaire Un petit nombre de protéines homologues semble s'exporter complètement à travers la paroi cellulaire, par exemple le facteur alpha et la toxine lytique (killer) ( 2,3). Là encore, la région de bourgeonnement de la cellule semble être le site d'une attraction des vésicules et, par leur fusion à la surface interne du bourgeon, elles contribuent à la croissance globale de la membrane plasma- tique et vraisemblablement de la paroi cellulaire ( 4, 5, 6). Cette théorie ne prouve nullement que la sécrétion ou la migration de la ou des protéines à travers la membrane a réellement lieu De même, on se pose encore la question de savoir si la glycosylation de la protéine peut favori- ser le processus dit sécrétoire ou y est impliquée En outre, par définition, des protéines "sécrétées" sont considérées comme ayant un prépeptide de signal, supposé être associé avec le processus de transport ou d'incorpo- ration à la surface de la membrane Le rôle de ces modi- fications de la protéine mûre, si ce rôle existe, dans le processus de sécrétion et le rôle global du processus sécrétoire dans la croissance en surface sont des spécula- tions qui ne sont pas fondées sur des preuves réelles. On a considéré que la technologie de recombinai- son de l'ADN pourrait apporter une aide intéressante en répondant aux questions ouvertes sur le processus sécré- toire dans des organismes tels que des levures et, étant donné la preuve de sa possibilité d'utilisation, en per- mettant à ces organismes ainsi qu'à d'autres de produire des quantités abondantes de polypeptides hétérologues par voie endogène (voir, par exemple, 7 à 17), en effectuant la manipulation appropriée de la levurehôte de manière à diriger la sécrétion de protéine hétérologue sous la forme mûre physiquement distincte. L'invention est basée sur la découverte résidant dans le fait que des levures peuvent être amendes à expri- mer, à traiter et à sécréter une protéine qui est normale- ment hétérologue pour la levure et qui n'est pas exigée pour sa viabilité, en sorte que la protéine peut être obtenue à partir du milieu supportant les cellules pro- ductrices viables de la levure sous une forme physiquement distincte ne s'accompagnant pas d'une pré-séquence poly- peptidique non désirée ou d'un autre artefact d'expression. Des cellules de levure convenables dans une culture viable sont transformées avec des véhicules d'expression abritant de l'ADN codant une protéine hétérologue et un polypeptide hétérologue de signal Lors de l'expression de la protéine conjointement avec le polypeptide de signal hétérologue, le produit d'expression est traité et la protéine hétéro- logue mûre est exportée dans le milieu de la culture cellulaire Le produit est isolé du milieu avec une rela- tive facilité, sans qu'il soit nécessaire de perturber par rupture les cellules viables de levure, et il est recueilli sous une forme autrement naturelle en vue de son utilisation sans qu'il soit nécessaire d'éliminer une pré-séquence non désirée ou d'autres artefacts d'expres- sion (par exemple la méthionine liée à l'amino-acide N- terminal autrement le premier, qui est une conséquence expçessionnelle du codon signal de départ de traduction de AUG) Ainsi, le milieu peut être obtenu sous une forme quasiment dépourvue de cellules viables ou rompues (c'est- à-dire lysées ou rompues d'une autre façon) et, attendu qu'il contient le produit désiré, il est accessible à des techniques de purification plus faciles à utiliser. Ce produit, après purification, est prêt à être utilisé pour le but désiré Par exemple, l'interféron leucocytaire humain trouve une application comme agent anti-viral et/ou anti-tumoral humain (voir, d'une manière générale, 7 à 17). En résumé, la présente invention concerne une protéine normalement hétérologue vis-à-vis d'une levure et non nécessaire à sa viabilité, sous une forme physique- ment distincte ne s'accompagnant pas d'une séquence poly- peptidique ou d'un autre artefact d'expression, en tant que produit d'expression de la levure, de traitement et de sécrétion, ainsi que les moyens et les procédés utilisés pour produire cette protéine L'iniention propose en outre des cultures de levures capables de produire cette protéine et les milieux de culture de levure résultants, contenant cette protéine comme produit. L'expression "protéine hétérologue" utilisée dans le présent mémoire désigne une protéine qui n'est pas normalement produite par une levure ou nécessaire à la viabilité de cette dernière Cette expression couvre l'insertion fonctionnelle d'ADN codant une telle protéine, par la technologie de recombinaison de l'ADN, dans un véhicule d'expression, utilisé quant à lui pour transfor- mer une levure-hôte Une insertion fonctionnelle d'ADN représente l'insertion d'ADN codant la protéine hétérolo- gue et la pré-séquence dans un vecteur d'expression sous l'influence de systèmes promoteurs dirigeant l'expression. Des exemples d'une telle protéine hétérologue comprennent des hormones, par exemple l'hormone de croissance humaine, l'hormone de croissance de boeuf, etc; des lymphokines; des enzymes; des interférons, par exemple ''interféron de fibroblaste humain, l'interféron immunitaire humain et les interférons leucocytaires humains et hybrides, etc; des antigènes ou immunogènes viraux, par exemple les antigènes de la fièvre aphteuse, la protéine antigénique de la grippe, les antigènes profonds et de surface de l'hépatite, etc; et divers autres polypeptides, par exemple la sérumalbumine humaine, l'insuline humaine, diverses glycoprotéines, etc Les expressions "pré- séquence hétérologue' ou "polypeptide de signal hétéro- logue" se réfèrent à des polypeptides qui ne sont pas normalement produits ou utilisés par l'organisme d'une levure et que l'on peut choisir entre le polypeptide de signal naturel pour la protéine hétérologue considérée ou un autre polypeptide hétérologue (de signal) lié fonctionnellement à la protéine hétérologue considérée. Le terme "sécrétion" utilisé dans le présent mémoire désigne l'exportation du produit à travers la membrane plasmatique et au moins dans ou à travers la paroi cellulaire de la levure dans le milieu o a lieu la culture cellulaire A ce point de vue, il y a lieu de remarquer que dans quelques cas, le produit "sécrété" s'associe d'une certaine manière avec la paroi cellulaire, en nécessitant peut-être une opération différente de purification ou une modification de la structure et de la fonction de la levure-hôte Le terme "traitement" signifie le clivage cellulaire du polypeptide de signal is de la protéine à l'état mûr de manière à produire la protéine dépourvue de peptide étranger sous une forme mûre, dite physiquement distincte Le terme "étranger" qualifiant le peptide couvre des artefacts peptidiques d'expression tels que la méthionine, comme indiqué ci- dessus Le traitement comporte un clivage sans importance du polypeptide de signal en un lieu qui n'est pas rappro- ché, de façon inactivante, du point précis d'union du polypeptide de signal avec la protéine mûre. Sur les dessins annexés: la figure 1 reproduit une comparaison de la séquence d'amino-acides du prépeptide de signal d'IFN-cl (pré-D), d'IFN-a 2 (pré-A), d'IFN-al,2 (pré-D/A), d'IFN-y (pré-y) et d'IFN-e(pré-e) humains Les amino-acides sou- lignés représentent des différences entre les séquences d'amino-acides de pré-A et de pré-D Le site Dde I indique la jonction des pré-séquences D et A dans la préparation de la pré-séquence hybride pré-D/A. La figure 2 est un diagramme du plasmide Y Ep IPT d'expression de levure, utilisé conformément à l'invention comme véhicule général pour l'expression de divers inserts de gènes, montrant une partie de ses sites de restriction et diverses régions intéressantes. La figure 3 montre la construction d'un-fragment Eco RI contenant le gène pré-plus IFN-al pour l'expression directe de IFN-al dans la levure. La figure 4 montre la construction d'un fragment Eco RI contenant le gène IFN-a 2 mûr pour l'expression de direction dans la levure. La figure 5 montre la construction d'un fragment Eco RI contenant le gène pré-plus IFN-a 2 avec la séquence de codage des quatorze premiers amino-acides dans la pré- séquence de pré-IFN-al pour l'expression directe de IFN-a 2 dans la levure. La figure 6 montre la construction d'un fragment Eco RI contenant le gène pré-plus IFN-y avec 70 paires de bases de la séquence de direction précédant le codon ATG initiateur de l'expression de IFN-y dans la levure. La figure 7 montre la construction d'un fragment Eco RI contenant le gène pré-plus IFN-y pour l'expression directe de IFN-y dans la levure. La figure 8 présente un résumé de toutes les constructions utilisées pour la mise en oeuvre de la présente invention dans l'expression, le traitement et la sécrétion des divers gènes d'IFN dans la levure. La figure 9 est une courbe de croissance a) de Y Ep 1 PT-Le IF Al/pep 4-3 et b) de Y Ep 1 PT-pre Le IFA 53 t/pep 4-3, mesuré par absorption à 660 mum L'activité en interféron a été titrée dans les milieux pour a) et b) en utilisant une épreuve biologique Les temps indiquent le nombre d'heures de croissance à 30 C. La figure 10 A est une courbe de croissance pour une fermentation de 5 litres de Y Ep 1 PT-pre Le IFA 53 t/pep 4-3. L'axe des ordonnées représente, à gauche, l'absorption à 660 mgm et, à droite, le nombre de millions d'unités par litre d'activité en interféron à l'intérieur des cellules. La figure 1 OB est la même courbe de croissance que celle qui a été définie pour la figure 1 OA, représen- tant l'activité extraite des milieux. La figure 11 est un profil d'élution de pré-D/A Le IF du milieu, d'une colonne d'anticorps monoclonaux. La figure 12 est la représentation graphique, obtenue par chromatographie en phase liquide sous haute pression, de l'interféron du pic A collecté sur une colonne d'anticorps monoclonaux. La figure 13 est le résultat de la formation de la séquence d'amino-acides du produit obtenu après puri- fication par chromatographie en phase liquide sous haute pression. La figure 14 représente les diverses concentra- tions utilisées pour produire l'hormone humaine de crois- sançe (HHC) conformément à l'invention. La figure 15 illustre schématiquement la carte de restriction de l'insert Hind III à 3,1 kiiopaires de bases du vecteur p Bl duquel le promoteur de PGK a été isolé La figure indique l'insertion d'un site Eco RI et d'un site Xba I dans l'ADN de flanquement 5 ' du gène de PGK. La figure 16 illustre la séquence de flanquement ' plus la séquence de codage initial pour le gène de PGK avant l'insertion de sites Xba I et Eco RI. La figure 17 illustre schématiquement des techni- ques utilisées pour insérer un site Xba I en position 8 dans le promoteur de PGK et pour isoler un fragment de 39 paires de bases de la séquence de flanquement 5 ' de PGK contenant cette extrémité Xba I et une extrémité Sau 3 A. La figure 18 illustre schématiquement la construc- tion d'un fragment de 300 paires de bases contenant le fragment de 39 paires de bases ci-dessus, une autre séquence de flanquement 5 ' de PGK ( 265 paires de bases) de Pvu I à Sau 3 A (voir figure 15) et un site Eco RI adjacent à Xba I. La figure 19 illustre schématiquement la construc- tion du fragment de promoteur de PGK à 1500 paires de bases (Hind III/Eco RI) qui contient, en plus du fragment construit à la figure 4, un fragment Hind III Pvu I de 1300 paires de bases, venant de la séquence de fragment 5 ' de PGK (voir figure 15). Matériels Tous les enzymes de métabolisme et de restriction d'ADN ont été acquis auprès des firmes New England Biolabs et Bethesda Research Laboratories L'enzyme de restriction de l'ADN et les enzymes métaboliques ont été utilisés dans des conditions et dans des tampons décrits par leurs fabri- cants respectifs L'ATP et les déoxynucléotides triphos- phates d ATP, d GTP, d CTP et d TTP ont été fournis par la firme PL Biochemicals Les liaisons avec l'ADN ont été réalisées par des procédés classiques. Préparation et transformation de l'ADN La purification d'ADN plasmidiques circulaires issus de E coli ( 18) fermés par covalence et la transfor- mation de E coli ( 19) ont été effectuées conformément à des méthodes déjà décrites Des mini-sélections de E coli ont été effectuées comme décrit en ( 20) La transformation de levure a été effectuée comme décrit ci-dessus ( 21), avec toutefois les modifications suivantes 200 ml de cellules ont été utilisés à la concentration de 2 x 107 cellules/ml et les cellules ont été lavées avec 25 ml d'eau par centri- fugation Ces cellules ont été traitées avec 10 ml de sorbitol 1 M, de l'EDTA 25 m M (p H = 8) et du dithiothréitol m M pendant 10 minutes à 30 "C, l'opération étant suivie d'un lavage avec 10 ml de sorbitol 1 M Les culots cellu- laires ont été remis en suspension dans des conditions modérées dans 10 ml de SCE (sorbitol 1 M, citrate de sodium 0,1 M, p H = 5,8, et EDTA 0,01 M) et ils ont été traités à C avec 200 gg de zymolyase 60 000 (Kirin Brewery) La formation de sphéroplastes a été suivie à 80 % par l'addi- tion de 100 gl de la suspension à 0,9 ml de SDS à 10 % et mesure de l'absorption à 800 mum en utilisant une dilution de cellules avant d'ajouter l'enzyme, comme valeur de 0 % (la lyse dans le SDS à 10 % entraîne une baisse de l'absorption à 800 mim) Les cellules ont ensuite été lavées trois fois avec 10 ml de sorbitol 1 M Les cellules peuvent être conservées plusieurs jours à O C dans le sorbitol Elles ont ensuite été lavées une fois avec une solution contenant du sorbitol 1 M, Ca C 12 10 m M et du chlorhydrate de tris 10 m M (p H 7,4), puis remises en suspension dans 1 ml de la même solution On a ensuite ajouté 5 à 15 gg d'ADN plasmidique purifié ou 20 il d'ADN de mini-sélections de E coli ( 2/5 de l'ADN plasmidique venant d'une culture statique de 5 ml de E coli développée en milieu LB) et on a agité modérément avec 100 gl de cellules remises en suspension, pendant 15 minutes Ensuite, on a ajouté en agitant modérément pendant 15 minutes, 1 ml d'une solution contenant 20 % (en poids/volume) de polyéthylène-glycol 4000 (Baker), du chlorure de calcium 10 m M et du chlorhydrate de tris 10 m M (p H 7,5) Ensuite, on a séparé les cellules par centrifugation et on les a remises en suspension en douceur dans 200 il de milieu SOS (sorbitol 1 M, bouillon YEPD à 33,5 % (en volume/volume) et Ca Cl 6,5 m M) et on a fait incuber la suspension à 30 C pendant 20 minutes On a ensuite déposé 100 g 1 de cette suspension sur une botte de Pétri contenant 20 ml de gélose ( 182 g de sorbitol, 20 g de glucose, 6,7 g de YNB et 30 g de gélose "Difco" par litre d'eau) constituant le fond que l'on a recouvert de 10 ml de gélose formant une surcouche à 50 C (la même que la gélose de fond, mais additionnée de 1 ml d'adénine ( 1,2 mg/ml), 1 ml d'uracile ( 2,4 mg/ml) et 1 ml de mélange séparateur -trp pour 50 ml de gélose constituant le fond /-le mélange séparateur -trp contient les amino-acides suivants, pour 100 ml d'eau, 0, 2 g de arg, 0,1 g de his, 0,6 g de ile, 0,6 g de leu, 1 1 0,4 g de lys, 0,1 g de met, 0,6 g de phe, 0,5 g de thr_ 7. Cette sélection Trp donne 103 à 104 transformants de levure par Fg d'ADN de plasmide. Le plasmide a été obtenu à partir de la levure par développement de 15 ml de levure jusqu'à la phase stationnaire (Abs 660 = 5-6) en milieu YNB+CAA (voir souches et milieux ci-après) par formation de sphéroplas- tes comme dans la méthode ci-dessus, par centrifugation des cellules, et en utilisant la méthode de mini- sélections de E coli (sans lysozyme) comme décrit en ( 20). La stabilité des plasmides dans la levure a été déterminée par dilution de cellules pendant la croissance sélective en milieu YNB+CAA et ensemencement sur plaques de YEPD (non sélectives) Après 2 jours de développement à 30 "C, ces plaques ont été inoculées pour former des répliques sur des plaques YNB+CAA (sélection Trp+) On a calculé le pourcentage de stabilité des plasmides d'après le nombre de colonies qui se développent non sélectivement moins celles qui ne se développent pas sélectivement, divisé par le nombre de colonies développées non sélectivement, multiplié par 100. Souches et milieux On a utilisé la souche 294 (ATCC N 31446) de E coli K12 ( 22) pour toutes les autres transformations bactériennes Les souches de levures pep 4-3 ( 20 B-12, d trpl pep 4-3) ( 23) et GM 3 C-2 (a, leu 23, leu 2-112, trp 1-1, his 4-519, cyc 1-1, p 3-1) ( 24) ont été utilisées pour les transformations de levures Les souches de levures 20 B-12 et GM 3 C-2 ont été déposées sans restriction auprès de l'American Type Culture Collection, respectivement, sous les numéros ATCC 20626 et 20625, chacune le 5 Mars 1982 Diverses souches de levures peuvent être utilisées voir Lodder et collaborateurs, The Yeasts, a Taxonomic Study, North-Holland Publ Co, Amsterdam De même, on peut utiliser différents milieux Difco Manual of Dehydrated Culture Media and Reagents for Microbiological and Clinical Laboratory Procedures, 9 ème édition, Difco Laboratories, Inc, Détroit, Michigan ( 1953). Le milieu LB était comme décrit par Miller ( 25), avec l'addition de 20 gg/ml d'ampicilline (Sigma) après l'autoclavage du milieu et refroidissement La levure a été cultivée sur les milieux suivants: le milieu YEPD contenait 1 % d'extrait de levure, 2 % de peptone et 2 % de glucose + 3 % de gélose "Difco" Le milieu YNB+CAA contenait 6,7 g de base azotée pour levure (sans amino- acides) (YNB) (Difco), 10 mg d'adénine, 10 mg d'uracile, g de casaminoacides Difco (CAA), 20 g de glucose et + 30 g de gélose par litre (utilisé pour la sélection Trp+). Courbe de croissance et préparation de l'extrait Des colonies individuelles de souches de levures Y Ep I Pt-pre Le If-A 53 t/pep 4-3 et Y Ep I Pt-Le IF-A 1/pep 4-3 ont été cultivées pendant 7 heures à 30 C dans 100 ml de milieu YNB+CAA jusqu'à une valeur A 660 d'environ 1,1. 100 ml de ces cultures ont été dilués à 1 litre avec le milieu YNB+CAA pour obtenir une solution de valeur A 660 égale à 0,1 Ces cultures diluées à 1 litre ont ensuite été développées à 30 C et des portions aliquotes de 10 ml ont été prélevées périodiquement pour mesurer la densité optique, la production d'interféron et la sécrétion. Pour le titrage, chaque portion aliquote de 10 ml a été centrifugée à 7000 tr/min pendant 15 minutes dans une centrifugeuse Sorval RC 3 B La liqueur surnageante (milieu) a été titrée sans dilution Les cellules ont été remises en suspension dans 0,4 ml de chlorhydrate de guanidine 7 M contenant un volume égal de perles de verre et que l'on a fait tourbillonner deux fois pendant 2 minutes à grande vitesse Le lysat cellulaire a ensuite été dilué en milieu PBS/BSA ( 150 m M de Na Cl, 20 m M de phosphate de sodium (p H = 7,9) et 0,5 % de sérum-albumine de boeuf) en vue de l'épreuve biologique. Titrage de l'interféron Des extraits de levure ont été analysés en vue de titrer l'interféron par comparaison avec les étalons d'interféron par l'épreuve d'inhib Ltion de l'effet cyto- pathique (CPE) ( 26) On a préparé des extraits de levure de la façon suivante: Des cultures de 10 ml ont été développées en milieu YNB+CAA jusqu'à ce qu'une valeur A 660 d'en- viron 1-2 ait été atteinte Les cellules ont été recueil- lies par centrifugation, puis remises en suspension dans 3 ml de solution de sorbitol 1,2 M, de KH 2 PO 4 10 m M, p H = 6,8, et de 1 % de zymolyase 60 000, puis on les a fait incubées à 30 C pendant 30 minutes (jusqu'à un taux de formation de sphéroplastes de 90 %) Les sphéroplastes ont été centrifugés à 3000 x g pendant 10 minutes, puis remis en suspension dans 150 gl de chlorhydrate de guani- dine (GH Cl) 7 M plus 1 m M de fluorure de phénylm 2thylsulfonyle (PMSF) Des extraits ont été dilués 20 à 100 fois dans le tampon PBS/BSA ( 20 m M de Na H 2 P 04, PH = 7,4, 150 m M de Na Cl, 0,5 % de BSA) immédiatement avant le titrage A titre de variante, 10 ml de cellules à la même valeur A 660 ont été centrifugés et le culot a été remis en sus- pension dans 0,4 ml de GH Cl 7 M dans un tube d'Eppendorf ( 1,5 ml) contenant environ 0,4 ml de perles de verre ( 0,45 à 0,5 mm, B Braun Melsurgen AG) On a fait tour- billonner ces tubes deux fois pendant 2 minutes au réglage maximal du tourbillon, en les maintenant entre-temps sur de la glace Les extraits ont été centrifugés pendant 0,5 minute dans une centrifugeuse d'Eppendorf et dilués dans le tampon PBS/BSA comme ci-dessus On a effectué des titrages biologiques avec des cellules MDBK ( 26) pour Le IF A, Le IF D et les pré-formes, mais avec des cellules He La ( 26) pour IFN-y et préIFN-y. Purification de (pré-D/A) Le IF A à partir du milieu Une colonie unique de levure de souche Yep IPT- pre Le IF-A 53 t/pep 4-3 a été cultivée à 30 C dans 500 ml de milieu YNB+ CAA jusqu'à une valeur A 660 de 2,4 500 ml de cette culture ont été dilués à 5 litres avec le milieu YNB+CAA pour obtenir une valeur A 660 de 0,21; les litres de culture résultants ont été cultivés à 30 C jusqu'à ce que A 660 ait la valeur 4 A ce moment, les litres de culture ont été récoltés par centrifugation 1 o à 7000 tr/min pendant 10 minutes Ensuite, des portions aliquotes de 10 ml ont été prélevées périodiquement pen- dant la fermentation pour mesurer la densité optique, la production d'interféron et la sécrétion Avant l'épreuve, chaque portion aliquote a été centrifugée pendant 5 mi- nutes dans une centrifugeuse de paillasse à réfricrant pour séparer les cellules du milieu Le milieu et les cellules ont été titrés comme décrit ci-dessus (voir figures 9, 10 A, 10 B). Le milieu a été concentré jusqu'à un volume final de 200 ml, puis filtré par dialyse vis-à-vis de tris/cys/ EDTA à p H 8,0 sur une membrane d'ultrafiltration de 1000 daltons (O-PS, Osmonics) dans un appareil Amicon à fins canaux (TCF 10) Le produit retenu ( 200 ml) a été trans- féré sur une colonne d'immuno-affinité de 1,5 ml contenant un anticorps monoclonal relatif à Le IF-A en liaison de covalence avec le produit "Affigel 10 " (Bio Rad) à une vitesse d'écoulement de 15 ml/h Plus de 80 % de l'activité en interféron de la solution initiale ont été fixés à la colonne Le liquide ayant traversé la colonne a été chargé à nouveau sur cette dernière à un débit de 40 ml/h Après la seconde application, environ 7 % de l'activité initiale en interféron ont été trouvés dans le liquide ayant traversé la colonne Cette dernière a ensuite été lavée avec Na Cl 0,2 M en milieu tris/cys/EDTA à p H 8,0 Une proportion d'environ 1, 7 % de l'activité a été éluée pendant ce lavage. La majeure partie de l'activité en interféron (environ 50 % de l'activité initiale) a ensuite été éluée de la colonne avec 51,5 ml d'eau désionisée à p H 5,5 La colonne a été finalement lavée avec 22,5 ml d'acide acéti- que 0,2 M pour éluer toute protéine restante; on a élué environ 8 % de l'activité initiale Après l'élution à l'acide acétique, la colonne a été rééquilibrée au mélange tris/qys/EDTA à p H 8,0 Des fractions de 2,25-4,5 ml ont été recueillies pendant les opérations de lavage à l'eau, à l'acide acétique et au mélange tris/cys/EDTA (figure 11) Les fractions portant les numéros 1-7 ont été ras- semblées et lyophilisées à sec Le résidu a été redissous dans 200 "l d'acide trifluoracétique (TFA) à 0,1 %, à p H 2,5, et encore purifié par chromatographie en phase liquide sous haute pression sur une colonne "Synchropak" RP-P La colonne a été éluée à un débit de 1 ml/min avec un gradient linéaire de 0-100 % d'acétonitrile dans du TFA à 0,1 % à p H 2,5 Des fractions de 1 ml ont été recueillies et titrées après dilution en milieu PBS/BSA comme décrit ci-dessus. Un échantillon de 2,5 gg d'IFN-A purifié a aussi été chromatographié comme témoin (figure 12) L'activité en interféron a été éluée de la colonne en un seul pic centré autour de la fraction 39 Cette fraction a été lyophilisée à sec et le résidu a été séquencé. Analyse de la séquence L'analyse de la séquence a été basée sur la dé- gradation d'Edman ( 27) L'échantillon a été introduit dans la coupelle d'un séquenceur à coupelle rotative Beckman 890 B Du "Polybrene" (marque déposée du diacétate de poly-N,N,N 1,N 1-tétraméthyl)-N-triméthylènehexaméthylène- diammonium) a été utilisé comme support dans la coupelle ( 28) Le séquenceur a été modifié par l'adjonction d'un piège froid et par certains changements de programme pour réduire les pics de fond Les réactifs consistaient en tampon "Quadrol" 0,1 M de qualité pour séquence Beckman, l'isothiocyanate de phényle et l'acide heptafluorobutyri- que. Une modification comportait également la trans- formation automatique des dérivés de 2-anilino-5-thiazo- linone à mesure qu'ils étaient extraits du séquenceur. Le 1-chlorobutane a été recueilli dans une fiole "Reacti- Vial" (marque déposée) Pierce et séché sous atmosphère d'azote Ensuite, on a ajouté de l'acide trifluoracétique (TFA) à 25 % dans l'eau à la 2anilino-5-thiazolinone et on a chauffé le mélange à 20 C pendant 10 minutes pour effectuer la transformation en 3-phényl-2-thiohydantoine (dérivé PTH) ( 29) Le résidu de PTH-amino-acide a ensuite été automatiquement dissous dans 50 % d'acétonitrile et de l'eau et la solution a été injectée dans un chromato- graphe liquide à haute pression à phase inverse Chaque PTH-amino-acide a ensuite été identifié par comparaison avec les temps de rétention d'un mélange de PTH-amino- acides de référence qui avait été introduit dans la fiole de transformation et traité de la même façon qu'un cou- rant recyclé du séquenceur Les résultats sont reproduits sur la figure 13 et commentés ci-dessous. Méthode Western (formation de tache) Des protéines ont tout d'abord été soumises à l'électrophorèse sur un gel en plaque de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium ( 46,47) avant le transfert par électrophorèse à du papier nitrocellulo- sique (S + S BA 85) et identification immunologique subséquente de HHC L'appareil de transfert (Electroblot, E.C Apparatus Corp, St Petersburg, FL) a été monté après que le gel et le papier à la nitrocellulose avaient été lavés brièvement à l'aide d'un tampon de transfert contenant du tris 25 m M et de la glycine 192 m M, à p H 8,4. Le transfert a été effectué à 400 m A pendant 1,5 heure, après quoi la tache a été placée dans du tris 50 m M à p H 7,4 contenant Na Cl 0,15 M, EDTA 5 m M, de la gélatine à 0,25 % (en poids/volume) et 0,05 % de NP-40, et on a agité modérément pendant la nuit Une dilution appropriée d'anti- sérum de lapin anti-HHC humaine a été placée dans un sac en matière plastique avec la tache et du tampon NP-40/ gélatine (normalement 100 gl/cm 2) *t on a fait incuber ensemble pendant 2 heures à la température ambiante en agitant modérément par secousses La tache a été lavée brièvement avec de l'eau, puis avec le tampon NP-40/géla- tine pendant 1 heure et un essai a été effectué avec la protéine A marquée à l'iode 125 I (New England Nuclear) diluée dans le tampon NP-40/gélatine dans un sac Seal-a- Meal pendant 1 heure à la température ambiante en agitant modérément par secousses Après lavage plusieurs fois à l'eau, la tache a été enveloppée dans de la 'ellophane" et maintenue pendant la nuit dans une cassette avec un film X-Omat-AR (Kodak) avec un filtre d'intensification à -700 C. Coloration du gel Les gels de polyacrylamide contenant la protéine ont été colorés par la méthode de Oakley et collabora- teurs ( 41). Séquences du signal de sécrétion de gènes pour l'inter- féron de mammifères Grâce à l'isolement récent de c ADN contenant les gènes pour les interférons leucocytaire ( 7), fibro- blastique ( 10) et immunitaire ( 30), etau développement récent de levure comme système d'expression pour des gènes hétérologues ( 14), il est devenu possible de tester l'expression de gènes hétérologues contenant des régions codant pour des séquences peptidiques de signal dans la levure. La figure 1 montre les séquences de signaux pour cinq interférons différents Ces séquences à terminaison amino sont considérées comme facilitant la sécrétion pro- téinique d'interférons dé cellules de mammifères Au cours du procédé, la séquence de signal est enlevée par clivage par une protéase spécifique entre les positions -1 et + 1 pour donner ce qui est connu comme étant la forme mère de l'interféron Ces séquences ont les caractéristiques géné- rales d'autres séquences de signaux de sécrétion ( 31 >. Elles sont toutes très hydrophobes, elles ont à peu près la même longueur que d'autres signaux et elles présentent un petit amino-acide sur la gauche du site de clivage. Bien que prêLe IFA, préLe IFD et PréIFN-y clivent tous entre la glycine et la cystéine, il n'existe pas de-règle géné- rale pour d'autres signaux de mammifères, comme mis en évidence par préIFN-e. En effet, il n'y a pas de séquence de signal de consensus parmi les divers organismes et au sein du même organisme Il n'y a également pas de séquence de consensus au point de clivage entre la séquence de signal et la forme mûre du produit protéinique. Par conséquent, il était très intéressant de tenter l'expression de ces pré-interférons dans une levure pour déterminer si ces protéines hétérologues seraient sécrétées par la levure et ce que la nature du traitement de ces protéines pouvait être Bien qu'une levure soit un organisme eukaryotique comme les cellules de mammifères, et bien que la levure semble avoir un processus de sécrétion semblable sous de nombreux rapports à celui d'eukaryotes supérieurs ( 1,32), il s'agit d'un eukaryote très primitif, et la fonc- tion correcte et le traitement de ces produits géniques nécessiteraient une grande conservation de processus entre cellules de levure et cellules de mammifères pendant * l'évolution, dont les résultats ne sont pas du tout mani- festes. Construction d'un plasmide de levure en vue de l'expression des gènes de pré-interférons Des informations pour la construction d'un plasmide en vue de l'expression d'un gène hétérologue dans une levure ont été publiées ( 14). Le plasmide utilisé dans cette étude est illustré sur la figure 2 Ce plasmide comprend une portion de p BR 322 ( 33) présentant le gène de résistance à l'ampicilline (Ap R) et l'origine E coli de réplcation pour la sélec- tion et la croissance stable dans E coli (utilisé comme intermédiaire entre la construction in vitro et la trans- formation d'une levure) Le plasmide contient également le gène TR Pl sur un fragment de Eco RI à Pstl qui tire son origine du chromosome III de la levure ( 34-36) Ce gène permet la sélection dans la levure trp 1 et peut donc être utilisé pour isoler des cellules de levure contenant le plasmide et pour l'entretien du plasmide En outre, le plasmide contient une origine de réplication de levure sur un fragment de 2,0 kpb provenant d'ADN de plasmide de levure 2 g endogène ( 37) Cette origine permet à l'ADN une réplication autonome dans la levure et son maintien comme plasmide. L'autre composant principal du système est le fragment de promoteur de 3phosphoglycérate-kinase (PGK) de levure qui provient de la transcription près du seul site Eco RI du plasmide (l'autre site Eco RI a été retiré par garnissage du site de restriction en utilisant la polymérase I d'ADN de E coli (Klenow), puis la ligation de l'extrémité tronquée). L'isolement du gène de 3-phosphoglycérate-kinase (PGK) a été commenté ailleurs ( 37 a) de même que la cons- truction du fragment de promoteur de 1,6 kpb (voir ci- dessous) Un fragment Hind III/Bg 1 II de la région du gène TRP 1 de la levure ( 34-36) du chromosome III a été utilisé comme convertisseur de Hind III en Bgl II pour la ligation avec le site Bam HI de p BR 322, rendant ainsi le plasmide sensible à la tétracycline (Tc S) En outre, il y a lieu de remarquer que le fragment de 2,0 kpb venant du 2 g-ADN assume une autre fonction, en ce qu'il contient un signal de fin de transcription/polyadénylation qui est normalement le signal de terminaison pour le gène "capable" dans le plasmide 2 g ( 37) Une telle région semble être essentielle pour une bonne expression Des inserts de gène comme des fragments Eco RI dans l'orientation droite peuvent ensuite être exprimés comme protéine lorsque le vecteur est intro- duit dans la levure. Construction de plasmides de levure en vue de l'expression des divers gènes de l'interféron Le plasmide Y Ep IPT d'expression de la levure con- tient un seul site de restriction Eco RI L'insertion d'un gène étranger dans ce site Eco RI unique conduit à l'expres- sion de ce gène sous l'influence du promoteur de phospho- glycérate-kinase (PGK) de levure Un moyen pratique d'in- sérer les divers gènes d'interféron dans le site Eco RI de ce plasmide de levure consiste à faire en sorte que des fragments d'ADN présentant des sites Eco RI flanquent le codon de commencement et le codon de terminaison des divers gènes d'interféron Le présent mémoire donne la description de la construction de ces fragments Eco RI pour l'expression de gènes d'interféron Il importe d'utiliser des convertis- seurs en Eco RI à l'extrémité 3 ' du gène pour qu'ils ne - terminent pas la transcription, mais la permettent jusqu'au site de terminaison 2 i. On a décrit dans ce qui précède la construction d'un site Eco RI précédant juste le codon initiateur ATG pour le gène IFN-al mûr ( 14,17), le gène IFN-ci 2 mûr ( 7), le gène IFN-e mûr ( 10) et le gène IFN-y mûr ( 30). L'analyse de restriction de l'ADN montre qu'il y a un site Eco RI convenablement disposé dans la région non codante 3 ' du clone de c ADN de IFN-a 1 ( 8), et que, par conséquent, la digestion du plasmide p Le IFD 3 ( 17) avec Eco RI engendre un fragment Eco RI de 583 paires de bases qui contient le gène IFN-al entier. La figure 3 montre la construction d'un fragment Eco RI contenant le gène pre-IFN-al Un site Hae III est disposé entre le premier et le second amino-acide de pre-IFN-oa ( 8) Un fragment de 254 paires de bases par- tiellement digérées par Hae III, qu s'étend de ce site Hae III jusqu'au site Bgl II au milieu de la région de codage, a été isolé Un oligonucléotide synthétique auto- complémentaire 5 '-CCATGAATTCATGG-3 ' a été attaché par ligation par les extrémités tronquées au fragment Hae III- Bgi II de 254 paires de bases en vue d'engendrer un site Eco RI précédant le codon initiateur de ATG Un fragment Eco RI-Bgl II de 264 paires de bases a ensuite été isolé par digestion du mélange de ligation avec Eco RI et Bgl II. Ce fragment Eco RI-Bgl II, qui contient la moitié antérieure du gène préIFN-cl, a ensuite été fixé par ligation à la moitié postérieure du gène pré-IFN-al, fragment Bgl II- Eco RI de 372 paires de bases isolé par digestion du clone d'AD Nc d'IFNal avec Bgl II et Eco RI Le fragment Eco RI contenant le gène de pré-IFNa 1 entier a ensuite été engendré par digestion du mélange après ligation avec Eco RI et isolement d'un fragment de 636 paires de bases. La figure 4 montre la construction d'un fragment Eco RI contenant le gène de IFN-a 2 à l'état mar Un fragment Eco RI-Pst I de 876 paires de bases qui contient le gène de IFN-a 2 mûr avec un site Eco RI précédant juste le codon initiateur d'ATG et avec 400 paires de bases de la région 3 '- non codante dérivée du clone d'AD Nc a été isolé par digestion du plasmide p Le IFA 25 ( 7) avec Eco RI et Pst I. L'extrémité Pst I de ce fragment de 876 paires de bases a ensuite été convertie en un site Eco RI par l'utilisation d'un fragment adaptateur Ce fragment adaptateur de 978 paires de bases contient un site Eco RI interne et présente des sites Pst I aux deux extrémités 230 paires de bases de ce fragment qui s'étend d'une extrémité Pst I aux sites Eco RI dérivent de l'ADN du plasmide de levure 2 g ( 37) 748 paires de bases du reste du fragment qui s'étend du site Eco RI à l'autre extrémité Pst I dérivent du plasmide bactérien p BR 322 (le fragment entier étant dérivé de Y Ep 13 ( 37 b)) La ligation de ce fragment adaptateur au fragment Eco RI-Pst I de 876 paires le bases contenant le gène d'IFN-a 2 à l'état mûr, suivie de la digestion subsé- quente avec Eco RI, engendre un fragment de 1096 paires de bases contenant le gène d'IFN-a 2 à l'état mûr avec des sites Eco RI aux deux extrémités. La figure 5 montre la construction d'un fragment Eco RI contenant le gène de pré-IFN-a 2 L'analyse de res- triction montre un site Dde I commun présent entre le 14 ème et le 15 ème amino-acide dans la pré-séquence des deux gènes de pré-IFN-a 1 et a 2 La ligation du fragment Eco RI-Dde I de 44 paires de bases dérivé du fragment Eco RI codant le gène de pré-IFN-al et le fragment de 900 paires de bases Dde I-Pst I dérivé du clone d'AD Nc d'IFN-a 2, suivie d'une digestion subséquente avec Eco RI et Pst I, engendre un fragment de 944 paires de bases Ce fragment Eco RI-Pst I de 944 paires de bases contient la séquence de codage des 14 premiers amino-acides du prépeptide dérivé d'IFN-al, la séquence de codage du reste du prépeptide et la pro- téine mûre entière dérivée de IFN-a 2 L'extrémité Pst I de ce fragment de 944 paires de bases a ensuite été convertie en un site Eco RI en utilisant le fragment adaptateur comme dans le cas de la construction d'un fragment Eco RI pour l'IFN-a 2 mûr. La figure 6 montre la construction d'un fragment Eco RI contenant le gène de pré-IFN-y avec 70 paires de bases de la séquence directrice précédant le codon ATG initiateur La digestion du clone de c ADN de IFN-y ( 30) engendre un fragment Sau 3 A de 842 paires de bases avec une séquence de 60 paires de bases de flanquement 5 ', la séquence entière de codage de pré-IFN-y et une séquence de 290 paires de bases de non-codage 3 ' Ce fragment Sau 3 A a ensuite été cloné en un vecteur p UC 7 digéré par Baba HI, contrepartie plasmidique du phage M 13 mp 7 ( 38) à brin uni- que Le plasmide p UC 7 a été obtenu à partir de p BR 322 en éliminant d'abord le fragment Eco RI-Pvu II à 2067 paires de bases contenant le gène de résistance à la tétracycline, puis en insérant un fragment Hae II à 425 paires de bases venant du dérivé m P 7 ( 38) du phage M 13 dans le site Hae II du plasmide résultant, en position 2352 (par rapport à la notation p BR 322) Le fragment Hae II venant de mp 7 contient la région de codage N-terminale du gène lac Z de E coli o un site de clonage d'enzyme de multi- restriction de la séquence a été inséré entre les quatrième et cinquième résidus d'amino-acides de la P-galactosidase. L'insertion d'un fragment d'ADN étranger dans ces sites de clonage rompt la continuité entre le promoteur lac et le gène lac Z, en modifiant ainsi le phénotype d'un JM 83 transformé avec le plasmide, de lac à lac- Attendu qu'il y a deux sites Eco RI flanquant les sites Bam HI dans le site de clonage de multi-restriction du plasmide p UC 7, la digestion du plasmide contenant l'insert Sau 3 A à 842 paires de bases avec Eco RI donnerait un fragment de 862 paires de bases contenant la séquence pré- IFN-y entière flanquée des sites Eco RI. La digestion du plasmide p IFN-ytrp 48 ( 30) avec Eco Ri et Bgl I engendre un fragment de 689 paires de bases avec une extrémité Eco RI précédant le codon initiateur ATG, la séquence entière de codage de IFN-y mûr et 210 paires de bases de séquence non codante L'extrémité Bgl I a ensuite été convertie en une extrémité Eco RI par ligation à un segment adaptateur Bgl I-Eco RI de 29 paires de bases dérivé du fragment pré-IFN- y Eco RI décrit ci-dessus La digestion subséquente par Eco RI du mélange de ligation engendrerait alors un fragment Eco RI à 718 paires de bases contenant le gène d'IFN-y à l'état mûr. La figure 7 illustre la construction d'un fragment Eco RI contenant le gène de pré-IFN-y avec une extrémité Eco RI et la séquence AAA précédant le codon initiateur ATG Le fragment Eco RI contenant le gène de pré-IFN-y décrit ci-dessus a été digéré avec Eco RI et Mbo II pour engendrer un fragment de 184 paires de bases Ce fragment, contenant la partie antérieure du gène de pré-IFN-y, a été dénaturé par la chaleur et fixé ( 10) à un oligonucléotide synthétique 5 '-p ATGAAATATACA ayant subi l'effet de la kinase en position 5 ', codant pour les quatre premiers amino-acides du gène pré-IFN-y Avec le brin inférieur du fragment Eco RI-Mbo II, c'est-à-dire le modèle, et l'oligo- nucléide comme amorce, le fragment de Klenow de l'ADN- polymérase de E coli a été utilisé pour synthétiser le brin supérieur et pour éliminer l'extrémité 3 ' en saillie du brin inférieur Le fragment à extrémité tronquée à 178 paires de bases résultant, qui s'étend du codon initia- teur ATG au premier site Mbo II en aval, a ensuite été fixé par ligation à un segment dg liaison Eco RI 5 '- TTTGAATTCAAA-3 ' d'auto-complémentarité La digestion du mélange obtenu par ligation avec Eco RI et Dde I engendre un fragment Eco RI-Dde I à 165 paires de bases qui contient la partie antérieure du gène pré-IFN-y Le gène entier a ensuite été assemblé par ligation du fragment Dde I-Eco RI de 600 paires de bases qui contient la partie postérieure du gène d'IFN-y et la région non codante de l'extrémité 3 ' Le mélange obtenu par ligation a ensuite été digéré avec l'enzyme Eco RI pour engendrer un fragment Eco RI de 765 paires de bases contenant le gène pré-IFN-y entier. Une récapitulation de toutes les constructions de ces fragments Eco RI (I à IX) est illustrée sur la figure 8 Toutes ces constructions ont été placées dans le vecteur Y Ep IPT (figure 2) en vue des expériences d'expression et de sécrétion utilisant une levure. Niveaux d'expression et de sécrétion d'interférons par une levure contenant ces plasmides Après que les gènes du fragment Eco RI de la figure 8 ont été introduits dans Y Ep IPT (figure 2), soumis à un contrôle d'orientation et incorporés à la levure, en utilisant la complémentation de Trp+, on a soumis la levure contenant ces plasmides au titrage de l'interféron en utilisant l'épreuve d'effet cytopathique (CPE) ( 26) (épreuve biologique) pour les extraits, la matière libérée de la paroi cellulaire et le milieu Les titrages d'interféron ont été effectués sur trois compartiments distincts de la culture de levure Les résultats de ces titrages sont reproduits sur le tableau. ceci ln le- m VU tn tu Ot ú 6 O LL Olt 9 L ú 6 O a.m 90 LX 6 VO a.m 90 LX 6 VO G'N gotxgolo G.K 9 Om', L Z-DM G.N 9 Otx 6 '0 E-Vclad (l Iq 99 ME 1 O Z-DM G.K gom'o c-tclad t -mi-fid À -Rai-p:d ç 4 uamnb -uvil op O>mrb 2 s Na P +,k-NM-pad S 4 ummlb -uni; ep 9 oenbpg Nffl + k -bul-gad À -NM vain (y/a-pid) v mon (y/cl-pad) Y aloi (v/a-pad) v JIM, ci ilwi-pxd G men G.M Cl.1 i ti.li (I àî IIA IIA IA IA A Ai Ai AI Ili II I st, El L Glu 90 txcolo M, O gotxgz gotxçz 9 O Lx 6 L gotxoct 9 pixa. OLXOCL E:-tdod Z-DEM E:-mbd t-Oad C-bdad E-DM Z-DM 0 Olt O E Elt soolo 8 Il-ú LOOIO 9 Olt soolo 0 Olt O v tlt 900,10 0 oit O txslo 9 OLXZ 9 OVSIO LX 910 G.K úO ú,O zlo 00 L t'Io ú 00,10 soolo toolo gptxc"o G'N 9 otxsllo gotxtjo ( 1)999 qv/l/ffi ex Twml -Ibo Toamd VI ep luaw itqxdv epzm T 94 T-%TI W 0999 qv/T/a (no TI Tw) elnllea VI op ana Tif; _XDIT y exri T -nilea ivre; etrr pl -WCI ap P 0999 qî 969;wo -M'oa ex TVT -nl-loo 9 UT 94 -oed op 96 % 4 uao -miod t U 099 *w/vin lolnllw VI op WXMTX" emvwl UT&I V îp;fjzp s PITAT; -0129 P abv;UGD -miod az Tfflilea Mq 9 q -ald op cp&a;uao -xnod 1965 â oueb Seo 149 ouaqum np UDT'4 Ca; micro Op Tmoid -$ma op 'N u=p;-,Bq UT a T op uopoe-,clmop xrwmlti a) Voir la rubrique Procédés pour la préparation de l'extrait On remarquera que deux procédés sont utilisés pour les extraits Lorsque des sphéroplastes cellulaires sont formés, la quantité "à l'intérieur de la cellule" est réellement la matière interne; toutefois, lorsque la men- tion N D (non déterminé) est précisée, la quantité "à l'intérieur de la cellule" et la quantité "libérée après enlèvement de la paroi cellulaire" appartiennent toutes deux à la quantité "à l'intérieur de la cellule" ce type d'extrait implique le traitement des cellules avec des perles de verre sans enlèvement de la paroi cellulaire. Il y a lieu de remarquer que les extraits obtenus avec des perles de verre sans formation de sphéroplastes ont toujours été formés pour INF-T et pré-IFN-T et que le tampon PBS a été utilisé au lieu de GHC 1 7 M. b) Les activités spécifiques de Le IFA et Le IFD sont toutes deux supposées égales à 108 U/mg de protéine pour les calculs Une culture de levure contient environ mg de protéine pour une valeur Abs 660 égale à l'unité. c) Voir la rubrique Procédés pour la formation des sphéroplastes. d) Valeur Abs de la culture pour laquelle le titrage est effectué. e) Le pourcentage de sécrétion est le pourcentage "libéré après l'élimination des parois cellulaires" plus le pourcentage "à l'extérieur de la cellule" Lorsque la formation de sphéroplastes n'a pas eu lieu, le "pourcen- tage d'activité sécrétée" n'englobe pas cette activité de sécrétion de la paroi cellulaire et le pourcentage est plus faible (peut être de moitié) qu'il ne doit l'être réellement. Le premier compartiment est à l'intérieur de la cellule Cette fraction est mesurée par formation d'un extrait cellulaire après que la paroi de la cellule a été retirée et définit l'activité en interféron qui n'est pas sécrétée Les deux autres compartiments sont le milieu (matière complètement séparée de la cellule de levure) et l'activité libérée des cellules après l'enlèvement de la paroi cellulaire au moyen de zymolyase (matière sécré- tée, mais retenue sans covalence dans la paroi cellulaire). La fraction du milieu et la fraction libérée après l'enlève- ment de la paroi cellulaire représentent la matière sécré- tée totale A titre de variante, lorsque les parois cel- lulaires n'ont pas été retirées (voir Procédés), l'activité à l'intérieur de la cellule comprend également l'activité sécrétée retenue dans la paroi cellulaire. Il y a lieu de remarquer, sur le tableau, que (pré-D/A) Le IFA est un gène Le IFA à l'état mûr avec une séquence peptide de signal hybride (voir figures 1 et 8). Cette construction a déjà été commentée; mais en la réexaminant, elle a été construite en utilisant le site de restriction Dde I commun à préLe IFD et à préLe IFA La figure 1 montre ce site Dde I au niveau de l'aminoacide -10 Les amino-acides soulignés représentent les différences entre la séquence d'amino-acides de préLe IFD et de préLe IFA. L'hybride (pré-D/A) Le IFA est plus près de préD que de préA. Les gènes Le IFA et Le IFD tous deux à l'état mûr (constructions I et III) sont exprimés dans la levure aux niveaux de 1,0 % de protéine cellulaire totale (on a égale- ment rencontré des niveaux de 2,0 %) Les mauvaises orien- tations de ces gènes ou les pré-gènes ne s'expriment pas. Pour ces deux gènes, de même que pour le gène IFN-a à l'état mûr, aucune sécrétion n'a lieu Toutefois, lorsque des pré-séquences sont utilisées sur ces gènes, les pro- duits protéiniques sont trouvés tous les trois dans le milieu, comme produits sécrétés Des niveaux atteignant 8 % de l'activité totale ont été observés dans le milieu de (pré-D/A) Le IFA pour une valeur Abs 660 de 34 Il y a lieu de remarquer que tous ces pla 3 nides sont dans 95 % des cellules d'une culture se développant sous la pression sélective de Trp+ témoignant de la présence d'un plasmide à réplication autonome. Courbe de croissance et production dans le milieu à partir d'une levure contenant le gène (pré-DIA) Le IFA Deux levures produisant de l'interféron ont été étudiées par une caractérisation plus poussée Il s'agis- sait de Y Epl PT-préLe IFA 53 t/pep 4-3 et de Y Ep 1 PT-Le IFA 1/pep 4-3. La première contient deux copies de la construction IV (figure 8) dans le site Eco RI de Y Epl PT et a pour résultat que l'activité réside à l'intérieur de la cellule, dans la paroi cellulaire et à l'extérieur de la cellule (milieu). Ce plasmide contenant les gènes des deux copies (orienta- tion en tandem en vue de l'expression correcte) a été uti- lisé au lieu de la construction à copie unique, parce qu'il a donné parfois de plus hauts niveaux d'activité en inter- féron dans le milieu La levure pep 4-3 a été utilisée parce qu'elle a des taux de protéase intracellulaire et extracellulaire ( 23) grandement réduits, ce qui pourrait être un avantage pour l'obtention de protéine non dégradée (interféron) à partir du milieu. Ce dernier contient la construction III (figure 8) dans Y Epl PT et exprime Le IFA mûr à l'intérieur de la cellule, mais n'effectue pas de sécrétion. La figure 9 illustre une courbe de croissance de ces deux souches de levures dans le milieu YNB+CAA (crois- sance sélective Trp>) La phase logarithmique se poursuit jusqu'à une valeur Abs 660 mgm de 3-4, puis la phase sta- tionnaire débute Les deux courbes sont essentiellement identiques (ce qui donne à penser que la production de ces deux protéines différentes / Le IFA et (préD/A) Le IFA 7 n'affecte pas la croissance ou la viabilité de la levure). Le milieu a été soumis à des épreuves biologiques à divers moments au cours de la croissance cellulaire, pour examiner la dépendance de la courbe de croissance par rapport à la production d'interféron dans le milieu par ces deux souches. Il est évident, d'après les résultats, que la pré-séquence sur Le IFA provoque une libération d'activité en interféron dans le milieu En l'absence de cette séquence, il n'y a essentiellement pas de libération d'activité Il est égale- ment évident que les niveaux d'activité dans le milieu atteignent un maximum près de la phase stationnaire. Purification de (pré-D/A) Le IFA séparé du milieu En vue de déterminer lanature du processus de sécrétion de (pré-D/A) Le IFA dans le milieu contenant la levure, il a été nécessaire de purifier le produit protéi- nique séparé du milieu Si la levure est à même de sécréter la protéine, elle traite vraisemblablement l'extrémité amino-terminale d'une certaine manière pendant le proces- sus de sécrétion comme le font normalement des cellules de mammifères avec une protéine du type pré-interféron. L'objet d'études plus poussées a été de déterminer la nature de ce traitement, comme suit: A) Fermentation de 5 litres La figure 1 OA montre l'activité en interféron dans la paroi cellulaire et dans la cellule pendant la même fermentation Ces extraits ont été obtenus par forma- tion du culot de centrifugation suivie d'un traitement aux perles de verre en milieu GH Cl 7 M, en sorte que cette activité contient à la fois la matière intracellulaire et la matière intrapariétale de la cellule Cette activité a atteint un maximum d'environ 25 x* 10 U/1 pour une valeur de Abs 66 m Wm de 1,5 à 2,0, suggérant que la produc- tion intracellulaire d'interféron s'achève dans la phase logarithmique avant la phase stationnaire, contrairement à la matière extracellulaire Par conséquent, environ 8 % de l'activité sont sécrétés librement dans le milieu. 2523152- Toutefois, là encore, il peut y avoir autant d'activité dans la paroi cellulaire (voir tableau) La matière de l'extrait contient principalement de l'interféron intra- cellulaire, et cette matière est purifiée à ce moment, pour voir si elle est traitée ou non. La figure 1 OB représente une courbe de culture pour une fermentation de 5 litres de Y Ep 1 PT-préLe IFA 53 t/pep 4-3 en milieu YNB+CAA A la fin de la fermentation, il y avait environ 2,0 x 106 U/1 d'activité en interféron d'après les titrages MDBK Là encore, la production maxi- male apparait pour la phase stationnaire On doit remar- quer que l'interféron obtenu comme produit dans ce milieu est très stable, même si l'on agite encore par secousses pendant 24 heures à 30 'C après que la phase stationnaire a été atteinte Ce milieu a été utilisé-pour d'autres étapes de purification. B) Concentré de milieu chargé sur colonne d'immuno- affinité Le milieu issu de Y Ep 1 PT-préLe IPA 53 t/pep 4-3 a tout d'abord été soumis à une ultrafiltration Ce concentré a été chargé sur une colonne contenant un anticorps mono- clonal relatif à Le IFA mûr Après lavage avec du chlorure de sodium 0,2 M en milieu tris/cys/EDTA à p H 8,0, l'inter- féron a été élué avec de l'eau (p H égal 5,5) comme repré- senté sur la figure 11 Le pic A élué (la flèche représente le moment o l'eau entre en jeu) a été obtenu par ce mode opératoire et représente 50 % de l'activité chargée sur la colonne Le pic A a été rassemblé, comme représenté par l'accolade, et utilisé en vue d'une purification subséquente. L'élution effectuée avec de l'acide acétique 0,2 M a donné le pic B (la flèche représente le stade de changement du tampon) èt la position C représente le stade d'application du tampon initial de lavage. C) Détermination de l'activité du pic A par chromatographie en phase liquide sous haute pression Les fractions du pic A ont été lyophilisées à sec, puis soumises à un essai de chroma:ographie en phase liquide sous haute pression (voir Procédés) La figure 12 illustre les résultats de cet essai Un échantillon de 2,5 gg de Le IFA purifié (provenant de E coli) a été utilisé séparé- ment dans l'essai, comme témoin. L'étalon et la protéine (pré-D/A) Le IF A (ou préLe IF A) ont eu des temps de rétention identiques comme le démontre la figure Ces résultats montrent que l'inter- féron provenant du milieu est traité, attendu que préLe IF A a un temps de rétention très différent La fraction ombrée venant de cet essai de chromatographie en phase liquide sous haute pression a été utilisée ensuite pour la séquence de la protéine. Séquence amino-terminale de (pré-D/A) Le IF A purifiée par isolement du milieu contenant la levure La figure 13 montre en partie les résultats de l'établissement de la séquence de l'interféron purifié. La séquence supérieure est celle qui est attendue de (pré- D/A) Le IF A s'il n'y a pas de traitement Le point normal de clivage de cet interféron qui est probablement reconnu par des cellules de mammifères est représenté. On a interprété la séquence de la protéine en notant quels amino-acides de PTH croissaient dans chaque cgcle d'Edman correspondant, puis décroissaient dans le cycle suivant Les amino-acides de PTH qui sont normale- ment recueillis en faibles quantités (cys, ser, thr, arg, his) ont été considérés lorsqu'on n'observait aucun accrois- sement de quantité de tout autre amino-acide de PTH La quantité en mg a été évaluée par comparaison des aires du résidu interprété avec l'aire venant d'un mélange de réfé- rence d'amino-acides de PTH soumis à la même chromatographie en phase liquide sous haute pression Un étalon interne de Nor-Leucine a été introduit dans chaque chromatogramme pour assurer la reproductibilité des temps de rétention. La figure 13 montre les résultats de la forma- tion de la séquence protéinique, obtenus pour la protéine (pré-D/A) Le IF A purifiée La séquence attendue, si aucun traitement n'avait lieu, et le point normal de clivage de ce pré-interféron dans des cellules de mammifère sont également présentés Deux essais indépendants de formation de séquences ont été exécutés sur deux échantillons puri- fiés différents issus de cellules et du milieu La figure 13 démontre que la majeure partie de l'interféron se trou- vant dans le milieu a été correctement traitée ( 64 %), mais une autre forme ( 36 %) contenant trois autres amino- acides de la pré-séquence a aussi été formée L'interféron intracellulaire contenait également ces deux formes, mais en proportions légèrement différentes, de même qu'une troisième forme contenant 8 amino-acides de la pré- séquence Une pré-séquence de longueur totale n'a jamais été observée, ce qui donne à penser que la levure traite la totalité du pré-IFN d'une certaine façon. Il est possible que la forme traitée contenant trois amino-acides de la pré-séquence résultait de la nature hybride de la séquence du signal de pré-D/A. Par conséquent, le traitement de (pré-D) Le IF D non hybride a aussi été examiné Pré-D ne diffère de pré-D/A qu'au niveau dela position d'aminoacide -2 (leu au lieu de val) En examinant le traitement de pré-IFN-al séparé et purifié du milieu, on a observé là encore les formes + 1 et -3 (figure 13) Toutefois, une espèce secondaire était également présente dans le milieu en tant que forme -14, qui n'a pas été observée pour (pré- D/A) Le IF A. Pour étudier la sécrétion de protéines hétérologues par S cerevisiae, la Demanderesse a construit des plasmides en vue de la transcription in vivo des gènes pour plusieurs interférons mers (IFN) et plusieurs pré-IFN Chaque fois que les séquences codant pour des peptides de signaux hydrophobes étaient présentes, une activité antivirale en IFN a pu être recueillie tant des cellules-hôtes que du milieu de culture, bien que la totalité de l'IFN dont la synthèse était dirigée par des gènes d'IFN mûrs subsis- tait à l'intérieur des cellules On a tenté de caractériser les conditions nécessaires à la sécrétion en entreprenant des constructions dans lesquelles le gène de l'interféron serait doté de ses propres séquences naturelles de signaux, comme dans (pré-D) Le IF D, ou serait doté d'une séquence de signal hybride concue comme un composite de deux espèces d'IFN-a, comme dans (pré-D/A) Le IF A Bien qu'il y eût en général sécrétion d'IFN dans le milieu de culture de la part des cellules de levure qui abritaient ces construc- tions, la quantité d'activité différait entre souches et l'IFN spécifique purifié et séquencé différait également. Trois formes d'interférons non sécrétées, repré- sentant 90 % de l'interféron total exprimé, ont été puri- fiées à partir de cellules abritant le gène de (pré-D/A) Le IF A L'une des formes ( 33 %) a été convenablement trai- tée (+ 1, figure 13), une deuxième forme ( 55 %) contenait trois autres amino-acides (-3, figure 13), et une troisième forme ( 11 %) contenait huit autres amino-acides (-8) La dernière forme n'a pas été observée dans le milieu, tandis que de l'IFN à longueur totale de pré-séquence n'a jamais été observé dans les cellules ou dans le milieu. Traitement de (pré-D) Le IF D Au lieu de la croissance en fiole agitée par secousses utilisée pour la levure (pré-D/A) Le IF A, on a cultivé la levure exprimant (pré-D) Le IF D dans un appareil de fermentation de 10 litres jusqu'à ce que le paramètre A 550 ait atteint la valeur 60. En examinant le traitement de (pré-D) Le IF D séparé du milieu et purifié (même purification que pour 2523152 u pré-D/A Le IF A), on a observé les deux formes + 1 et -3 (figure 13) Une autre espèce de moindre importance était également présente dans le milieu en tant que forme -14. Aucun signe de lyse cellulaire n'apparaissait dans la culture, d'après l'examen par électrophorèse sur gel SDS de la protéine du milieu, comparativement aux protéines cellulaires Il est intéressant de noter que pour cette forte densité de croissance, un très haut pourcentage de sécrétion ( 30 %) dans le milieu a été obtenu pour Le IF D. De hautes densités de fermentation de levure exprimant (pré-D/A) Le IF A montrent également ce pourcentage élevé de sécrétion. Il apparaît que la levure traite à la fois l'interféron sécrété et l'interféron non sécrété La quantité d'activité sécrétée varie selon le stade de crois- sance des cellules, les pourcentages maximaux apparaissant pour la phase stationnaire dans les fioles agitées par secousses et au terme des fermentations à haute densité ( 30 % dans le milieu). Confirmation de la composition des plasmides dans la levure contenant Y Ep 1 PT-préLe IFA 53 t et Y Ep 1 PT-Le IFA 1 La levure contenant ces deux plasmides et utilisée pour les expériences précédentes a encore été contr 8 lée par recouvrement des plasmides de la levure On est parvenu à ce résultat en isolant l'ADN de plasmide de l'extrait de levure par transformation de E coli, suivie de la prépara- tion d'ADN de mini-sélection et d'une analyse de restric- tion des ADN de plasmides Plusieurs ADN plasmidiques isolés de E coli ont été caractérisés pour les deux types de levures Dans tous les cas, les plasmides contenaient la séquence de restriction attendue, attestant de la pré- sence de la pré-séquence sur le plasmide contenant (pré-D/A) Le IF A et de l'absence de cette pré-séquence sur le plasmide contenant Le IF A à l'état mûr. Carte de restriction et formation de la séquence partielle de l'insert de 3,1 kilobases de p B 1 On a procédé à la digestion exhaustive de 300 g de p B 1 ( 37 a) avec Hind III dans un volume réactionnel de 500 g 1, puis on a effectué l'élect'ophorèse sur un gel préparatif d'agarose (Sea Kem) à 1 % d'agarose L'insert Hind III à 3,1 kilobases a été détaché du gel coloré à l'éthidium, électro-élué ( 39), extrait deux fois avec des volumes égaux de phénol saturé de tampon et de chloroforme, avant précipitation à l'éthanol Des portions du fragment d'ADN remis en suspension ont été séparées et soumises à des coupures par restriction avec un groupe d'enzymes de * restriction différents, pour obtenir la carte de restric- tion partielle représentée sur la figure 15 Cette figure montre l'insertion d'un site Eco RI dans l'ADN de flanque- ment 5 ' du gène de 3-phosphoglycérate d'une levure. gg de l'insert purifié à 3,1 kilobases ont été coupés avec Sau 3 A, puis déposés sur un gel à 6 % d'acryl- amide Les fragments correspondant aux 265 et aux 141 paires de bases ont été purifiés séparément par électro- élution comme décrit ci-dessus Chaque fragment d'ADN a ensuite été soumis à l'analyse de séquence d'ADN ( 39). Une portion de cette séquence d'ADN est repro- duite sur la figure 16 Il s'agit de la séquence d'ADN de l'extrémité 5 ' du gène structural de 3-phosphoglycérate- kinase et d'ADN de flanquement de la levure Les amino- acides correspondant aux amino-acides N-terminaux du gène structural de PGK sont imprimés au-dessus de la séquence d'ADN. Insertion d'un site de restriction dans la région du promoteur 5 ' de PGK Un oligonucléotide synthétique présentant la séquence 5 'ATTTGTTGTAAA 3 ' a été synthétisé par des méthodes classiques '( 40) 100 ng de cette amorce ont été marqués à l'extrémité 5 ' au moyen de 10 unités de T 4-polynucléotide- kinase dans 20 g 1 de milieu réactionnel contenant aussi L Ci de /-y_ 32 p 7 ATP Cette solution d'amorce marquée a été utilisée dans une réaction de réparation avec amorce conçue pour représenter la première étape dans un procédé à étapes multiples pour placer un site de restriction Eco RI dans l'ADN de flanquement 5 ' de PGK précédant juste la séquence du gène structural de PGK Le processus à étapes multiples est expliqué cidessous: Etape 1 (figure 17) Réactions de réparation par amorce et clonage du morceau de PGK de Xba I à Sau 3 A à 39 paires de bases Gg de p Bl ont été complètement digérés avec Hae III, puis déposés sur un gel à 6 % de polyacrylamide. La bande la plus haute sur le gel coloré à l'éthidium (renfermant la région du promoteur de PGK) a été isolée par électro-élution comme décrit ci-dessus Ce morceau Hae III d'ADN à 1200 paires de bases a été soumis à l'ac- tion de l'enzyme de restriction Hind II, puis placé sur un gel à 6 % d'acrylamide La bande de 650 paires de bases a été isolée par électro-élution On a isolé 5 gg d'ADN. Ce morceau d'ADN de Hae III à Hind II à 650 paires de bases a été remis en suspension dans 20 i de d IH 2 O, puis mélangé avec les 20 1 de la solution d'amorce phosphorylée décrite ci-dessus Ce mélange a été extrait une fois avec un mélange de phénol et de chloroforme, puis précipité à l'éthanol. L'ADN séché a été remis en suspension dans 50 1 d'eau, puis la suspension a été chauffée au bain-marie bouillant pendant 7 minutes Cette solution a ensuite été refroidie rapidement dans un bain de neige carbonique et d'éthanol ( 10-20 secondes), puis transférée dans un bain de glace et d'eau On a ajouté à cette solution 50 1 d'une solu- tion contenant 10 1 de tampon d'ADN-polymérase I 10 X (Boehringer Mannheim), 10 1 d'une solution préalablement rendue 2,5 m M en chaque déoxynucléoside-triphosphate (d ATP, d TTP, d GTP et d CTP), 25 g 1 de d IH 20 et 5 unités d'ADN- polymérase I, fragment de Klenow On a fait incuber ces gl de milieu réactionnel à 37 C pendant 4 heures. *La solution a été extraite ensuite une fois avec un mélange de phénol et de chloroforme, précipitée à l'étha- nol, déshydratée par lyophilisatioi, puis soumise à une restriction exhaustive avec 10 unités de Sau 3 A La solu- tion a été déposée ensuite sur un gel à 6 % d'acrylamide. La bande correspondant à une longueur de 39 paires de bases a été détachée du gel, puis isolée par électro- élution comme décrit ci-dessus Cette bande de 39 paires de bases a une extrémité tronquée et une extrémité Sau 3 A collante Ce fragment a été cloné A un vecteur p FI Ftrp 69 modifié ( 10) 10 ig de p FI Ftrp 69 ont été linéarisés avec Xba I, extraits une fois avec un mélange de rhénol et de chloroforme, puis précipités à l'éthanol L'extrémit Xba I collante a t gcarnie en uti- lisant le fragment de Klenow d'ADN-polymérase I dans 50 il d'un milieu réactionnel contenant 250 p M de chaque nucléo- side triphosphate Cet ADN a été coupé avec Bam HI, puis placé sur un gel à 6 % d'acrylamide Le fragment vecteur a été isolé du gel par électro-élution, puis remis en sus- pension dans 20 gl de d IH 20 20 ng de ce vecteur ont été associés par ligation avec 20 ng du fragment de 39 paires de bases synthétisé ci-dessus pendant 4 heures à la tempé- rature ambiante Le cinquième du mélangg traité par liga- tion a été utilisé pour transformer la souche 294 de E. coli en souche résistant à l'ampicilline (sur des plaques LB additionnées de 20 pg/ml d'ampicilline) Les plasmides issus des transformants ont été soumis à un examen par une méthode de sélection rapide ( 20) L'un des plasmides, à savoir p PGK-39 (ficure 17), a été choisi en vue de l'ana- lyse de la séquence 20 gg de ce plasmide ont été digérés avec Xba I, précipités à l'éthanol, puis traités avec 1000 unités de phosphatase alcaline bactérienne à 68 C pendant 45 minutes L'ADN a été extrait trois fois avec un mélange de phénol et de chloroforme, puis précipité à l'éthanol Les extrémités déphosphorylées ont ensuite été marquées dans 20 1 de milieu réactionnel contenant I Ci de /6 32 p_ 7 ATP et 10 unités de T 4-polynucléotide- kinase Le plasmide a été coupé avec Sal I et déposé sur un gel à 6 % d'acrylamide La bande d'insertion marquée a été isolée du gel et séquencée par la méthode de dégra- dation chimique ( 39) La séquence d'ADN à l'extrémité 3 ' de ce morceau d'amorce a été telle qu'on s'y attendait. Etape 2 (figure 18) Construction du fragment de promoteur PGK à 312 paires de bases de Pvu I à Eco RI gg de p PGK-39 (fiure 17} ont été digérés simul- tanément avec Sal I et Xba I ( 5 unités de chaque), puis sou- mis à l'électrophorèse sur un gel à 6 % La bande à 390 pai- res de bases contenant le morceau de promoteur à 39 paires de bases a été isolée par électro-élution L'ADN remis en suspension a été soumis à la restriction avec Sau 3 A, puis exposé à l'électrophorèse sur un gel à 8 % d'acrylamide. La bande de promoteur PGK à 39 paires de bases a été isolée par électroélution Cet ADN contenait 39 paires de bases de l'extrémité 5 ' du promoteur de PGK sur un fragment allant de Sau 3 A à Xba I. Fg de p B 1 ont été exposés à une restriction avec Pvu I et Kpn I, puis soumis à l'électrophorèse sur un gel à 6 % La bande d'ADN à 800 paires de bases a été isolée par électro-élution, puis exposée à la restriction avec Sau 3 A et soumise à l'électrophorèse sur un gel à 6 %. La bande à 265 paires de bases venant du promoteur PGK (figure 15) a été isolée par électro-élution. Cet ADN a ensuite été soumis à la ligation avec le fragment de promoteur à 39 paires de bases obtenu comme indiqué ci-dessus, pendant 2 heures à la température am- biante Le mélange exposé la ligation a été soumis à la restriction avec Xba I et Pvu I, puis analysé par électro- phorèse sur un gel à 6 % d'acrylamide Le fragment de res- triction à 312 paires de bases allant de Xba I à Pvu I a été isolé par électro-élution, puis ajouté à un mélange de ligation contenant 200 ng de p BR 322 ( 33) _-préalable- ment isolé en omettant le fragment de restriction à 162 paires de bases de -Pvu I à Pst I 7 t 200 ng de gène de c ADN de Le IFA allant de Xba I à Pstl préalablement isolé de 20 Fg de p Le I Ftrp A Ce mélange de ligation à 3 facteurs a été utilisé pour transformer la souche 294 de E coli en une souche résistant à la tétracycline Des colonies de transformants ont été soumises à une mini-sélection et l'une des colonies, p PGK-300, a été isolée comme colonie ayant 304 paires de bases d'ADN de flanquement 5 ' de PGK soudées au gène Le IFA dans un vecteur à base de p BR 322. L'extrémité 5 ' du gène Le IFA présente la séquence suivante 5 'CTAGAAATTC 3 ', par conséquent la fusion du site Xba I issu du fragment de promoteur PGK en cette séquence tient compte de l'addition d'un site Eco RI au site Xba I Par conséquent, p PGK-300 contient une partie du promoteur PGK isolé dans un fragment de Pvu I à Eco RI. Etape 4 Construction d'un fragment de promoteur PGK à 1500 paires de bases de Eco RI à Eco RI On a fait digérer 10 gg de p B 1 avec Pvu I et Eco RI et on l'a fait agir sur un gel à 6 % d'acrylamide La bande d'ADN à 1,3 kilobase de Pvu I à Eco RI issue de l'ADN de flanquement 5 ' de PGK a été isolée par électro-élution. On a fait digérer 10 gg de p PGK-300 avec Eco RI et Pvu I et on a isolé le fragment de promoteur à 312 paires de bases par électro-élution après électrophorèse du mélange digéré sur du gel à 6 % On a coupé 5 gg de p FRL 4 avec Eco RI, on a effectué une précipitation à l'éthanol, puis un traitement avec de la phosphatase alcaline bactérienne à 68 C pendant 45 minutes Après traitement de l'ADN 3 fois avec un mélange de phénol et de chloroforme, précipitation à l'éthanol et remise en suspension dans 20 ml de d IH 20, on a effectué la ligation de 200 ng du vecteur avec 100 ng d'ADN de Eco RI à Pvu I à 312 paires de bases issu de p PGK- 300 et 100 ng d'ADN de Eco RI à Pvu I issu de p B 1 Le mélange de ligation a été utilisé pour transformer la souche 294 E coli en une forme résistant à l'ampicilline On a obtenu p PGK 1500 à partir de l'une des colonies Ap R Ce plasmide contient le fragment de promoteur PGK à 1500 paires de bases sous la forme d'un morceau d'ADN de Eco RI à Eco RI ou de Hind III à Eco RI. Construction de plasmides d'expression de HHC (hormone humaine de croissance) mûre et de préHHC Les constructions A à E de la figure 14 ont été réalisées dans des vecteurs présentant des sites convenables. Dans la construction A, un ADN synthétique a été formé de manière qu'il reproduise la séquence d'ADN au début de l'AD Nc ( 42) de préHWC à partir du site Hpa II avec forma- tion d'un Eco RI en face du début de traduction de ATG. Le fragment de Hpa II à Pst I a été obtenu à partir d'AD Nc de préHHC ( 42) et ce fragment, avec l'ADN synthétique, a été attaché par ligation avec un vecteur de Eco RI à Pst I (p HHC 207-1, avec enlèvement du fragment de Eco RI à Pstl contenant une partie du gène Ap R et religation des deux sites après insertion du fragment de Klenow pour retirer les deux sites) contenant la partie allant du site Pst I au site Sma I de l'AD Nc de HHC ( 43) pour obtenir la cons- truction A La construction B a été faite à partir d'un plasmide contenant le gène de HHC mûre qui a été préalable- ment fixé en vue de l'expression directe, contenant 23 amino-acides de la séquence synthétique de codage au niveau de l'extrémité amino-terminale ( 44) Un plasmide contenant ce gène a été coupé avec Pvu II dans le gène de HHC et avec Bam HI dans le gène Tc R Le grand fragment contenant la majeure partie du gène a ensuite été attaché avec l'ADN synthétique qui reproduit l'extrémité du gène de HHC (TAG) et crée un site Hind III Ce site Hind III a été attaché avec le fragment Hind III/Bam HI de p BR 322 comme 3 ème facteur d'ine ligation à 3 facteurs pour obtenir un plasmide con- tenant la construction B. A et B ont été combinés ensuite comme représenté sur la figure 14 pour obtenir la construction C Cette dernière a encore été modifiée en donnant la construction D, o le site Hind III a été converti en un site Eco RI ou (Eco RI) Le morceau Eco RI ainsi obtenu a été disposé dans le site Eco RI du plasmide Y Ep IPT d'expression de la levure, pour exprimer le gène de préHHC dans la levure La cons- truction E a aussi été réalisée en utilisant le segment de transformation utilisé dans D pour obtenir un gène d'interféron mûr (sans la séquence de signal de sécrétion) sur un fragment Eco RI pour l'expression dans Y Ep IPT. Expression de HHC mère et de préHHC dans la levure La construction (E) de m HHC dans Y Ep IPT a été incorporée à la souche p M 4-3 trpl ( 20 B-12) et les extraits ont été préparés en utilisant des perles de verre comme décrit sous la rubrique Procédés Toutefois, des perles de verre ont été ajoutées à 10 ml de culot de centrifugation de cellules avec 0,5 ml de SDS à 0,1 % Des dilutions ont été effectuées dans du sérum de cheval et des titrages de AIR ont été effectués comme décrit ci-dessus ( 44). L'hormone HHC a été exprimée par l'épreuve AIR comme représentant environ 0,5 % de la protéine totale de levure pour une valeur de A 660 de 1,0 ( 0,5 mg/l/A 660). L'hormone HHC n'a été nullement détectée dans le milieu. La construction préH Hc (D) dans Y Ep IPT a égale- ment été incorporée à la levure, et cellules et milieu ont été soumis à un titrage de HHC Un taux plus faible d'expression a été détecté dans les cellules ( 0,08 mg/l/ A 660), soit environ 0,08 % de la protéine totale de la levure Ainsi, le niveau est d'environ 1/6 de celui de l'expression de HHC mûre, ce qui est très proche des résultats concernant l'interféron leucocytaire Toutefois, cela ne peut pas constituer une comparaison fiable, attendu que l'emploi de codons de l'hormone HHC mûre ( 44) est diffé- rent pour 23 amino-acides, comparativement aux mêmes amino- acides pour la'forme préHHC Une telle différence peut entraîner des différences du niveau d'expression de ces deux produits 145) On a trouvé 10 % ou 8 ig/l/(A 660 = 1) du niveau exprimé dans la cellule, dans le milieu de la levure exprimant préHHC Dans un appareil de fermentation de 10 litres pour une valeur A 550 = 85, il y a eu là encore environ 10 % de sécrétion avec 1 mg/l de HHG dans le milieu. Nature de l'expression de préHHC Une comparaison entre la protéine de HHC dans la cellule et celle qui se trouve à l'extérieur de la cellule a été effectuée en utilisant la méthode Western de formation d'une tache comme décrit ci-dessus Les résultats font connaltre le milieu à partir d'une fermen- tation à forte densité (A 550 = 85) de levure exprimant préHHC Une seule bande correspondant à la grandeur de l'hormone HHC mûre est présente Cette bande correspond à 1-2 % de la protéine du milieu contenant la levure. Lorsque cette hormone HHC du milieu a été purifiée par chromatographie par affinité avec des anticorps (Hybri- tech Ab) et chromatographie en phase liquide sous haute pression, telle qu'on l'utilise pour les interférons, la séquence amino-terminale a montré que pratiquement % de l'hormone HHC consistaient en HHC mûre (la séquence a été établie pour 10 résidus) comme représenté en partie sur la figure 13 Par conséquent, la totalité de l'hormone humaine de croissance du milieu est traitée fidèlement comme elle 1 ' est par des cellules humaines. Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre. 1 Novick, P, Filed, C, et Schekman, Cell 21, 205-215 2 Duntze, et al, Science 168 1472 ( 1970). 3Woods, et ai, J Gen Microbiol 51, 115 ( 1968). 4.' Cabib et al, J Bacteriolocty 124 1586 Farkas, M 4 icrobiol R 1 ev 43, 117 ( 1979). 6 Moor, Arch Mikcrobiol 57, 135 ( 1967). 7 Goeddel, et al, nature 287, 411 . S Goeddel, et ai, Nature 290, 20 ( 1981). 9 Yelverton, et al, Nucilec Acids Researchi 9, 731 ( 1981). Goeddel, et ai, Nucleic Acids Research 8, 4057 ( 1980). Il Wetzel, Amer'ican Scientist 68, 664 ( 1980). 12 Wetzel, et ai, Biochemnlstry 19, 6096 ( 1980). 13Davis, et ai, Proc Natl Acad Sci (USA) 78, 5376 ( 1981). 14 H Itzeman, et ai, Nature 293, 717 ( 1981). Kleld, et al, Science 214, 1125 16 Lawn, et ai, Nucleic Acids Res 9, 6103 ( 1981). 17 Veck, et al, Nucliec Acids Res 9 6153 ( 1981 >. 18 Clarke, L et Carbon, J Cell 9, 91-99 ( 1976). 19 Clarke, L et Carbon, J PNAS 72, 4351-4365 ( 1975). Birnbolm, H C, et Doly, J Nucleic Acids Res 7, 1513-1523 ( 1979). 21 Hinnen, A, Hicks, J 8, et Fink, F R Proc Nati Acad. Sci USA 75, 1929-1933 ( 1978). 22 Backman, K, Ptashne, M, et Gilbert, W, Proc Natl. Acad Sci USA 73, 4174-4178 ( 1976). 23 Jon-es, E Genetics 85, 23 ( 1976 >. 24 Faye, G, Leung, D W, Tachell, K, Hall, B D, et Smith, M Proc Mati Acad Sci USA 78, 2258-2262 ( 1981). M Iiller, J H 1, Excerinents in;îolecular Genetics, pp. 431-433, Co Id Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Hlarbor, NY. 26 Stewart W E Il The Intefe-;an System (Springer, New York, 1979). 27 P Ednian, G Begg, "A Protein Sequencer O Eur J. Biochein, 1, 80-91 28 Tarr, G E, Beecher, J F Bell M et 1 McKean O J Anal. 81 ochemi 84, 622-627, ( 1978). 29 Wltttnann-Liebold, 8, Graffunder, H, et Kohls, H Anal - Slochem 75, 621-633 Gray, P W, et al, Nature 295, 503-508 ( 1982). 31 Cmr, S D, et-al, Nature 285,_ 82-85 32 Novick, P et Schekman Proc Nati Acad Sci USA 76, 1858-1862 ( 1979). 33 Bolivar, F, Rodriguez, R L, Green, P Y, 8 ctlach, N C, Heyneker, H L, Bayer, H W, Crosa, Ytii, et Falkow, S. Gen 2, 95-113 ( 1977). 34 Stinchcomb, O T, Struhl, K, et Oavis, R W Nature 282, 39-43 Ktngsmaan, A J, Clarke, L, Mortimer, R, et Carbon, J. Gene 7, 141-153 ( 1979). 36 Tschumper, G, et Carbon, J Gene 10, ( 1980). 37 I$artley, J L et Donelson, J E Nature 286, 860-865 âs ( 1980). 37 h Hltzeiuan, R A, Clarke, L, et Carbon, J J Siol - Che* 255, 12073 ( 1980). 37 b Broach et al, Gene 8, 121 38 Nessing, et ai, Nucleic Acids Research 9, 309 39 Maxage, A M, et Gilbert, W M 4 ethodt Ini Enzymnol65, 490-565 Crea, R et Horn, T Nucleic Acids Res 8, 2331-2348. -23152 41 Oakley, B R et al, Anal Bloc-hem 105 361 42 Goodman, H M, et al ln Specific Eukaryotlc Genes Engberg, 3, Klenow, H, et Leick, V) 179-190 43De Boer, H, et al ln Promoters: Structure and Function (eds Prayer) pp 468-481 ( 1982). 44 Goeddel O V et ai, Nature 291, 544 ( 1979). Sennetzen, J 3 L, et Hall, B D, J Bild Chem 257, 3026 . 46 Ames, G F -L, J Biol Cheu, 249, 634 ( 1974). 47 -Totibin, H et ai, Proc N 4 tl Acad Scl 76, 4350 REVENDICATIONS 1 Produit protéinique d'expression et de traite- ment par un organisme, caractérisé en ce que l'organisme est une levure et le produit protéinique est hétérologue vis-à-vis de l'organisme de la levure et est sécrété par cet organisme sous une forme physiquement distincte non accompagnée de pré-séquence polypeptidique non désirée ou d'autres artefacts d'expression. 2 Produit suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est un interféron humain, de préférence un interféron leucocytaire humain, notamment l'interféron leucocytaire humain A ou D. 3 Culture cellulaire de levure, caractérisée en ce qu'elle est capable de produire une protéine hétérolo- gue vis-à-vis de la levure et comprend 1) des cellules viables de levure transformées avec un véhicule d'expres- sion abritant fonctionnellement de l'ADN codant ladite protéine conjointement avec un polypeptide de signal hété- rologue correspondant et 2) un milieu entretenant la culture des cellules, le milieu contenant ladite protéine comme produit d'expression,de traitement et de sécrétion de la levure. 4 Culture de cellules suivant la revendication 3, caractérisée en ce que la levure est Saccharomyces cerevisiae. Culture de cellules suivant l'une des revendi- cations 3 et 4, caractérisée en ce que le polypeptide de signal hétérologue est un hybride de signal naturel pour ladite protéine et d'un second polypeptide de signal hétéro- logue. 6 Milieu de culture de cellules de levure suivant l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce qu'il est sensiblement dépourvu de cellules de levure viables ou rompues et renferme une protéine hétérologue vis-à-vis de la levure en tant que produit d'expressionde traitement et de sécrétion de la levure. 7 Culture de cellules de levure, caractérisée en ce qu'elle est capable d'exporter dans un milieu adé- quat une protéine hétérologue sous une forme physiquement distincte, la levure étant de préférence Saccharomyces cerevisiae. 8 Véhicule d'expression, caractérisé en ce qu'il est un véhicule d'expression de levure Y Epl PT qui abrite fonctionnellement de l'ADN codant une protéine hétérologue vis-à-vis de la levure, le véhicule abritant en outre de préférence de l'ADN codant un polypeptide de signal hété- rologue en disposition de lecture par traduction avec l'ADN codant ladite protéine hétérologue, le polypeptide de signal hétérologue étant de préférence un hybride de signal naturel pour la protéine hétérologue et d'un second polypeptide de signal hétérologue. 9 Véhicule d'expression, caractérisé en ce qu'il est un véhicule d'expression de levure qui abrite fonc- tionnellement de l'ADN codant un polypeptide de signal DA leucocytaire humain en disposition de lecture par traduc- tion avec la protéine leucocytaire humaine A. Procédé pour obtenir une protéine comme pro- duit d'expression et de traitement par un organisme, caractérisé par la transformation d'une levure avec un véhicule d'expression abritant fonctionnellement de l'ADN codant une protéine hétérologue et un polypeptide de signal hétérologue, préparation d'une culture de l'organisme trans- formé, développement de la culture et isolement de ladite protéine hétérologue du milieu de culture.