FR 2513124 A1 19830325 FR 8212541 A 19820719 La présente invention apporte un procédé pour la production du facteur de lyse de cellules-cibles,désigné par TCLF dans la suite de la description; elle concerne également les applications de ce facteur comme agent thérapeutique, en particulier contre des tumeurs malignes. Le facteur de lysesuivant l'invention ("Target Cell Lysis Factor", en abrégé TCLF),est un facteur de cyto- toxicité vis-à-vis de la lignée fibroblastoîde de la souris, L-929,avec cytolyse subséquente de ces cellules; deux types de TCLF sont connus jusqu'à présent,notamment la lymphotoxine et le facteur de nécrose tumorale (TNF). Comme décrit par Ryaichi AOKI et coll SHIN-MENE- KIGAKU SOSHO Vol 6 "Lymphokines ",publié par Igaku Shoin Ltd, Tokyo,Japan ( 1979),et B R Bloom et P R Glade,"In Vitro Methods in Cell-Mediated Immunity",publié par Academic Press,Inc. ( 1971), la lymphotoxine désigne une substance protéiniquej capable d'exercer la cytotoxicité intra ou/et extra cellu- laire, qui peut être induite par exemple par l'exposition des cellules T sensibilisées à un antigène ou des cellules T non sensibilisées à un inducteur de lymphotoxine tel que mitogène comprenant la phyto hemaglutinine ou concanavaline A Il est bien établi que la cytotoxicité de la lymphotoxine s'exerce tant sur des cellules tumorales que sur des cellules normales. D'après E A Carswell et coll Proc Natl Acad Sci. USA,vol 72,No 9,p 56663670 ( 197,5) et E Pick,"Tumor necrosis Factor in Lymphokiness,vol 2,p 235-272 ( 1981)publié par Aca- demic Press,Inc le facteur de nécrose tumorale TNF est une subs- tance protéinique inductible,par exemple,dans des macropha- ges par l'administration parentérale au lapin d'un inducteur de TNF, tel que bacille de Calmet -Guérin(BCG), corynebacte- rium parvum,ou endotoxine; il est capable de produirela nécrose hémorragique du sarcome Meth A Il est également bien connu que le TNF ne donne lieu pratiquement à aucune cy- tolyse des cellules humaines normalesmais remarquablement sur les cellules-cibles de la lignée L 929 de souris et sur les cellules tumorales de l'homme L'activité prometteuse du TCLF, comme agent thérapeutique contre les tumeurs malignes, se double d'une forte utilité due à sa fonction cytolytique sur les cellules tumorales Bien que pratiquement la spécifi- cité du TCLF ne fait pas prévoir la possibilité d'utiliser du TOLF d'origine animale, par exemple du lapin ou du rat, pour traiter les maladies humaines, l'emploi du TCLF,pro- venant des cellules humaines viables 4 est recommandable parce qu'il élimine l'antigenicité et les autes effets secondaires du 1 aitement. Les auteurs de la présente invention ont étudié différents procédés applicables à l'échelle industrielle pour la production du TCL Fainsi que les applications poten- tielles de ce dernier comme agent thérapeutique pour les tu meurs malignes Ils ont trouvé que de grandes quantités de TCLF peuvent être obtenues aisément à partir des cellules humainesproduites par la multiplication ee lignées Lapa- bles de former du TCLF,par exposition de ces cellules à l'ac- tion d'un inducteur approprié et ensuite collecte et puri- fication du TCLF accumulé. Ces études ont montré que le TCLF obtenu comprend au moins 3 types de glycoprotéines de masses molaires dif- férentes, d'environ 104 à 105 dalton,qui n'ont pratiquement aucune action cytolytique sur des cellules humaines norma- les, mais une action remarquable sur les cellules tumorales humainesainsi que sur les cellules-cibles de souris L 929. La lignée de cellules humaines,utilisable pour la présente invention, est une de celles qui sont multiplia- bles in vitro par des méthodes habituelles Afin de réali- ser l'invention d'une façon plus efficace, il est préféra- ble d'utiliser les cellules humaines qui ont été multipliées par la transplantation de la lignée donnée dans un animal à sang chaud ou bien dans une chambre de diffusion de type usuelydans laquelle elles ont été nourries avec un fluide de l'animal Contrairement aux procédés habituels, o les çellules humaines sont multipliées in vitro, des teneurs bien plus fortes en TCLF sont obtenues par la méthode in vivo qui n'exige pas ou peu de milieu nutritif contenant du serum coûteux; la culture des cellules est ainsi plus aisée. USP n 4 276 282 (Sujimoto et coll) décrit un procédé perfectionné pour la production de l'interferon spécifique humain,désigné par Hu IFN,qui présente une ac- tivité inhibitrice des infections virales, mais ce brevet n'indique aucune possibilité d'utilisation d'animaux à sans chaud pour produire du TCLF. Suivant la présente invention, certaines lignées de cellules humaines peuvent être aisément multipliées par l'utilisation d'un fluide nutritif d'un animal à sang chaud: cela est réalisé par la transplantation de ces cel- lules dans l'animal ou par l'emploi d'une chambre de dif- fusion recevant ce fluide nutritif de l'animal,la chambre étant placée dans le corps de ce dernier, qui est alimenté à la manière habituelle. Par rapport à la méthode classique de multipli- cation des cellules in vitro, à partir de culture de tissu, le procédé suivant l'invention permet une multiplication plus régulière, plus rapide, & rendement plus grand avec une production plus importante de TCLF par cellule. Les cellules humaines facilement transplantables et multipliables dans un corps d'animal, employées sui- vant l'invention pour la production du facteur TCLF,sont par exemple Namalwa, Journal of Clinical Microbiology, Vol 1,p 116-117 ( 1975); BALL1, TALL-1 et NALL-1,selon I.Miyoshi, Nature, Vol 267,p 843-844 ( 1977); M7002 et B-7101,Journal of Immunology,Vol 113, p 1334-1345 ( 1974); JBL, EBV-Sa, EBV-Wa, MOLT-3 et EBV-HO, The Tissue Culture, Vol 6, No 13, p 527546 ( 1980);CCRF-SB (ATCC CCL 120); BALM 2; DND-41 D'autres lignées de cellules établies convien- nent, notamment celles qui proviennent de la transforma- tion de monocytes ou de granulocytes normaux sous l'effet 13124 de tout virus, agent ou radiation carcinogène. Une augmentation sensible de la vitesse de multiplica- tion des cellules et/ou de la production de TCLF par cellule, peut être réalisée par l'emploi d'une lignée de lymphoblastoi- des humains avec des gènes humains codant pour le TCLF au moyen de la fusion cellulaire au polyéthylène glycol ou au virus Sen- dai, ou bien par la technique de recombinaison de gènes avec de la nucléase, la ligase et l'ADN polymérase. Il est bien entendu que l'énumération ci-dessus de différentes cellules est donnée seulement à titre d'exemple non limitatif. Ainsi des leucocytes humains,préparés à partir du sang frais, peuvent être utilisés en combinaison avec les-diffé- rentes lignées sus-indiquées. Les animaux à sang chaud, qui peuvent être utilisés dans le cadre de l'invention, et dans lesquels la lignée des cellules appropriées est multipliable, sont tels que volailles, notamment poulet ou pigeon, mammifères comme chien, chat, singe, chèvre, porc, cheval, vachecochon d'Inde, rat, rat nu, Hamster, souris et souris nue. Afin de réduire au minimum limmuno réaction, il est recommandable d'employer des animaux aussi jeunes que pos- sible, de préférence dans un stade tel que oeuf, embryon, fétus ou nouveau né. Avant la transplantation, l'animal peut être traité par des rayons X ou gamma, à environ 200 à 600 rem. ou par injection d'antiserum ou d'un immuno suppresseur. Un tel traitement, réducteur de l'immuno réaction, peut être omis lorsqu'on utilise la souris ou le rat nus. Il est possible d'améliorer la stabilisation de la multiplication cellulaire et l'augmentation de la pro- duction de TCLF par des transplantations répétées dans différents animaux à sang chaud Par exemple, peut-on d'abord transplanter les cellules dans un hamster et ensuiteaprès leur multiplication,les retransplanter dans la souris nue. La retransplantation peut d'ailleurs avoir lieu dans un animal de la même espèce que pour la transplantation initiale. En ce qui concerne l'endroit du corps de l'animal, pour effectuer la transplantation, il peut être choisi par- mi tous ceux qui permettent la multplication des cellules, par exemple cavité allantoique, veine, péritoine, peau. Dans le cas o la multiplication des cellules humaines est effectuée dans une chambre de diffusion placée dans le corps de l'animal, la chambre est muni d'un filtre, d'un ultrafiltre ou d'un filtre creux, d'unlme dimension nominale de pores d'environ 10-7 à 1 -5 m pour éviter la contamina- tion de la chambre avec les cellules animales, tout en lais- sant alimenter cette chambre avec le fluide nutritif du corps de l'animal La chambre est insérée dans le corps de l'animal,par exemple sous le péritoine, de façon à y laisser circuler librement la solution nutritive La culture des cellules peut être observée éventuellement par une fengtre transparente placée dans la paroi de la chambrez La cham- bre peut être remplacée périodiquement par une autre cham- bre fraiche,de façon à continuer la multiplication sans sacrifier l'animal. Le temps nécessaire à l'obtention du maximum de multiplications cellulaires est généralement de I à 10 semaines Le nombre des cellules humaines, ainsi obtenues, peut s'élever à 107 à 1012 par animal, ou même davantage, autrement dit le nombre des cellules transplantées suivant l'invention est multiplié par 102 à 107,ou davantage c'est-à-dire environ 10 à 10 o 6 fois plus de ce que l'on obtient par culture in vitro. Les cellules humaines multipliées sont soumises à l'action de l'inducteur approprié de TCLF Par exemple, les cellules multipliées dans une suspension d'ascite o les cellules tumorales,formées par exemple sous la peau, sont exposées in vivo, directement à l'action de l'inducteur de TCLF, après quoi le TCLF formé est récolté à partir de l'ascite du serum ou/et de la tuneur; il eet ensuite purifié On peut cependant d'abord récolter les cellules multipliées et les soumettre ensuite in vitro à l'action de l'inducteur Pour cela elles peuvent être susp endues dans un milieu nutritif, chauffées vers 20 à 40 C de façon à atteindre une densité de 105 à 108 cellules par ml, avant d'tre soumises à l'action de l'inducteur de TCLF. Dans le cas de l'utilisation d'une chambre de diffusion, l'induction peut avoir lieu dans cette chambre même ou après la récolte des cellules multipliées Il peut être indiqué de continuer la culture in vitro pendant 1 à 4 jours après le retrait de la chambre de diffusion, avant le traitement par l'inducteur. La production de facteur TCLF peut être augmentée par l'application d'un des modes opératoires suivants. ( 1) Les cellules humaines multipliées,sont expo- sées à l'action de l'inducteur de TCLF, dans l'animal-h 8 te lui-même, dans lequel a eu lieu la ultiplication;elles sont ensuite récoltées et à nouveau traitées par l'induc- teur, cette fois in vitro; cela peut concerner les cellules retirées d'une ou de plusieurs parties du corps de l'animal. ( 2)-Les cellules humaines, multipliées, sont ex- posées de façon répétée à l'inducteur de TCLF in vitro ou/et in vivo. ( 3)-La chambre de diffusion, incorporée dans l'animal est remplacée successivement par une nouvelle chambre. Parmi les inducteurs du facteur de lyse de cel- lules-cible, TOLF, on peut citer l'inducteur usuel d'a-in- terféron (IFN-c),tel que virus, acide nucléique ou nucléo- tide; inducteur de -interféron (IFN-_),notamment phyto- hemagglutinine, concanavaline A, -'togène de phytolaque, lipopolysaccharide, endotoxine, polysaccharide, ou bactéries. En général, un inducteur IFN- est préférable, parce qu'il permet d'induire un titre beaucoup plus élevé en TCLF. Certains antigènes n'agissent pas comme inducteurs de TCLF dans des cellules qui ont été sensibilisées avec cet antigène. On a constaté que l'emploi conjoint des inducteurs IFN-0 et IFN- présente l'avantage d'une augmentation re- marquable de la production de TCLF Il s'avère également que cette combinaison conduit à la production simultanée de Hu-IFN Cela signifie qu'avec de tels inducteurs on peut ob- tenir, à bas prix, une production en masse de simultanément deux, ou plus, substances biologiquement actives,notamment TCLF et Hu-IFN; l'utilisation des cellules humaines, mul- tipliées, est ainsi plus efficace. Le TCLF obtenu peut être aisément récupéré avec purification et séparation par des méthodes classiques, par exemple par concentration, relargage, dialyse, filtration, centrigugation et/ou lyophilisation Un produit de plus haute pureté peut être obtenu par les méthodes précédentes, combinées avec d'autres, par exemple adsorption, désorption avec échange d'ions, filtration sur gel, électrophorèse ou/et fractionnement au point isoélectrique. Au lieu des méthodes ci-dessus, on peut appliquer celle de la chromatographie d'affinité avec de l'anticorps ou du mitogène comme ligand, par exemple "Con A-Sepharose" produit par Pharmacia Fine Chemicals AB à Upsala(Suède); on peut atteindre ainsi une production plus rapide et plus abondante de TCLF de haute pureté. Les trois glycoprotéines,composant le facteur TCLF suivant l'invention, ont respectivement les masses molaires d'environ 104 à 2 x 104, 3,5 x 104 à 5 x 104 et - 4 9 4 àa Mkii&" 6 7 x 104 à 9 x 104/ Elles n'exercent pratiquement aucune cyto- lyse sur les cellules humaines normales, tout en cytolysant remarquablement les cellules humaines, tumoralestet également celles de la lignée L-929 de sourie Le TCLF est donc avan- tageusement utilisable comme agent prophylactique et/ou thérapeutique d 9 ns lee cas de ma aide ustnciablz dc ce facteur;par exemple dans celui des tumeurs malignes dont le traitement était fort difficile jusqu'à présent. Selon la présente description, les titres en le facteur TCLF sont déterminés par le dosage de la lympho- toxine par la méthode de B R Bloom et P R Glade "In Vitro" Methods in Cell-Mediated Immunity",publié par Academic Press, Inc ( 1971)ou par celui de TNF pour la méthode de E Pick, "Tumor Necrosis Factor in Lymphokines"'Vol 2,p 235-272, publié par Academic Press,Inc ( 1981) Les cellules de la lignée L-929 de souris sont incubées en présence de TCLF pour un certain temps, après quoi les cellules survivantes sont comptées. Les titres en Hu-IFN sont déterminés par la mé- thode classique de réduction sur plaque,utilisant des cel- lules humaines FL amnioniques;cette méthode est décrite dans "Protein, Nucleic Acid and Enzyme" Vol 20,n 6,p 616- 643 ( 1975). Quant à l'hemagglutination, ses degris sont in- qués par la méthode de S E SALK (Journal of Immunology, Vol 49, page 87 de 1944)avec des légères modifications. Des productions de lymphotoxine, un des types de TCLF, à partir de cellules humaines multipliées in vitro ou in vivo, sont décrites dans EXPERIENCES A qui suivent. EXPERIENCE A-1 ( in vitro) Des cellules humaines, de la lignée lymphoblas- tolde d'origine de cellules B, BALL-1, ont été transplantées dans le milieu RPMI 1640 (p H 7,2)additionnées de 20 %, v/v de serum foetal de veau, et cultivées en suspension à 37 C. Les cellules, ainsi multipliées, ont été lavées avec du milieu RPMI-1640 exempt de serum,puis remises en suspen- tion dans du milieu frais de même composition, pour donner une densité cellulaire d'environ 106 cellules/ml. EXPERIENCE A-2 (in vivo) De l'antiserum de lapin, préparé à la manière habituelle, est injecté à des hamsters pour réduire l'immunoréaction de ceux-ci On transplante alors à ces hamsters, en subcutané, des cellules humaines lymphoblas- toides d'origine des cellules B, BALL-1; les animaux sont nourris normalement durant trois semaines Les tumeurs mas- sives résultantes,formées sous la peau, sont extraites et désagrégées par suspension dans une solution salinephysio- logique)contenant de la trypsine Ensuite,les cellules sont lavées avec du milieu RPMI 1640 exempt de sérum (p H 7,2) et remises en suspension dans du même milieu, frais, jusqu'à une densité d'environ 106 cellules/ml. EXPERIENCE A-3 (Production de lymphotoxine) Dans chacune des suspension de cellules BALL-1, préparées aux expériences A-1 et A-2 ci-dessus, on a effectué l'induction de la lymphotoxine à l'aide du virus de Sendai et/ou de phytohémaggl utinine Ces inducteurs étaient ajoutés à la suspension des cellules à raison respectivement de 300 titres hémagglutinatiorn par ml et/ou environ 50 Mg par ml; les mélanges étaient ensuite laissés incuber à 37 pendant 2 jours Après l'incubation, on a noté la forte production simultanée de T Hu-IFN-t et Hu-IFN-4, ainsi que de lymphotoxine Le tableau I donne la production de celle-ci. On voit que la production de lanphotoxine in vivo est considérablement plus élevée qu'in vitro L'emploi conjoint de virus Sendai de de phytohemagglutinine donne lieu à une action synergique extremement efficaceet plus forte in vivo Il en résulte que l'emploi de l'inducteur IFN, très spécifique préféré,est la combinaison d'IFN-C avec IFN-\ pour l'induction de la lymphotoxine non spécifi- que de l'espèce animale. Les exemples qui sui-ent illustrent la production de lymphotoxine et du TNF,c'est-â-dire des deux types de constituants du TCLF suivant l'invention. (Voir tableau I page suivante) TABLEAU I Productions en titres/ml In vitro In vivo Inducteur Lympho Hu-IF Lympho Hu-IFN de lmphotoxine toxine toxine Virus Sendai (IFN-d) 300 1 600 4 000 7 000 Phytohemagglutinine (IFN-A 160 20 2 200 400 Virus Sendai + phytohemagglutinine 900 I 700 38 000 26 000 EXEMPLE AI A des hamsters nouveaux-nés, on injecte d'abord de l'antisérum de lapin, préparé à la manière classique,afin de réduire leur immunoréaction Des cellules humaines de lignée lymphoblastoae, BALL-1, sont alors transplantées sous la peau de ces animaux Les hamsters sont nourris normalement, pendant trois semaines Les tumeurs massives, formées, subcu- tanées d'environ 15 g chacune, sont alors extraites, émin- cées et désagrégées par mise en suspension dans une solution saline, physiologique,contenant de la trypsine. Les cellules humaines, ainsi obtenues, sont lavées avec du milieu RPMI 1640 (p H 7,2) exempt de sérum et remises en sus- pension dans du méme milieu, frais, jusqu'à une densité d'environ 5 x O 16 cellules/ml A cette suspension, on ajoute à la fois du virus de Sendai et de la phytohemagglutinine à environ respectivement I 000 titres d'hémagglutination par ml et 200 g/ml Le mélange est laissé incuber à 37 C pendant 2 jours pour induire la formation de lymphotoxine. Après ce temps, la culture est centrifugée à 4 C sous en- viron 1 000 g et le surnageant est dialysé pendant 21 heures contre une solution saline, physiologique, contenant 0,01 M de tampon phosphate à p H 7,2 La solution résultante, douée d'une activité de lymphotoxine, est ensuite filtrée, sur membrane; le filtrat est concentré et lyophilisé pour former une poudre. Le rendement en lymphotoxine est d'environ 5 x 107 unités par hamster; la poudre renferme également 3,2 x 107 unités Hu-IFN. EXEMPLE A 2 Des cellules humaines BAIL-1 sont mises dans le milieu minimal, essentiel, d'Eagle, de p H 7,4,additionné de 20 % v/v de sérum foetal de veau, et sont cultivées ainsi in vitro à 37 C Après lavage des cellules multipliées, avec du milieu Eagle sans sérum, elles sont remises en suspen- sion dans du même milieu, frais, jusqu'à la densité de 107 cellules/ml. On ajoute alors à la suspension à la fois du virus de Sendai et de la concanavaline A, à raison de, respectivement, envi- ron 1 000 titres d'hémagglutination par ml et environ 5,1 g/ml; le mélange est incubé à 380 C durant une journée pour induire la production de lymphotoxine. Après centrifugation de la culture à 4 C sous environ 1 000 g, le surnageant est dialysé 15 heures et traité comme à la fin de l'exemple précédent. Le rendement en lymphotoxine est d'environ 4,5 x 106 unités par litre de suspension, après l'induction La production de Hu-IFN est d'environ 1,2 x 107 unités/litre. EXEMPLEA 3 Dans des souris nues, adultes, on transplante intra- périto Mlement des cellules humaines Namalva, après quoi, les animaux sont nourris normalement pendant 5 semaines. On in Jecte alors aux animaux, toujours par voie intrapéri- toi Lle,du virus de la maladie de Newcastle préalablement inactivé par des rayons ultraviolets, dans un inulum, d'en- viron 3 000 titres d'hémagglutination par animal. 24 heures après, les animaux sont sacrifiés et l'on récolte l'ascite formée Celle-ci est purifiée et traitée comme dans l'exemple A-1 pour l'obtention d'une poudre. Le rendement en lymphotoxine est d'environ 9 x 106 unités par animal; la poudre contient également 5,2 x 106 unités de Hu-IFN. EXEMPLE A-4 Les souris adultes sont irradiées aux rayons X à environ 400 rem, pour réduire leurs-immunoréactions On leur injecte ensuite, par voie souscutanée,des cellules humaines de la lignée lymphoblastoide d'origine B, CCRF-SB. Les animaux sont nourris normalement durent 3 semaines. Les tumeurs massives, d'environ 10 g chacune,ainsi formées, sont extraites et traitées comme dans l'exemple A-1 On ajoute à la suspension de cellules obtenue du virus Sendai et de la concanavaline A en les quantités respectives d'en- viron 500 titres d'hemagglutination par ml et environ 0,8 Mg par ml On laisse l'incubation se poursuivre pen- dant I journée à 37 C pour induire la production de lym- photoxine. Comme dans l'exemple A-1, la culture est purifiée et con- centrée en un produit pulvérulent. Le rendement en lymphotoxine est d'environ 2,4 x 107 unités par souris; la poudre renferme aussi environ 1,9 x 107 unités de Hu-IFN. EXEMPLE A-5 Comme dans l'exemple A-1, on opère sur des hams- ters nouveaux-nés, avec des cellules humaines de la lignée * lymphoblastoide, JBL, On nourrit les animaux traités norma- lement,pendant 4 semaines. Les tumeurs massives, formées sous la peau, d'environ 20 g chacune, sont désagrégées comme dans l'exemple A-1; la suspension présente une densité d'environ 3 x 106 cellules/ml; elle est additionnée de virus Sendai à raison d'environ 1000 titres d'hémagglutination par ml, et soumise à l'in cubation à 360 C pendant 2 jours Après purification etcon- centration comme dans l'exemple A-2, la culture fournit par hamster 1,6 x 107 unités de lymphotoxine et 7 x 106 unités Hu-IFN. EXEMPLE A-6 Des cellules humaines lymphoblastoides, EBV-HO, d'origine de cellules B, sont mises en suspension dans une solution saline, physiologique, et la suspension résultante est placée dans des chambres de diffusion cylindriques, en matière plastique, d'environ 10 ml de volume intérieur, munies d'un filtre de dimension nominale des pores d'en- viron 0,5/(L Ces chambres sont insérées intraperitonalement dans les corps de rats adultes. Les animaux sont nourris normalement pendant 4 semaines, après quoi, les chambres sont retirées. La densité des cellules multipliéesdans les chambres, est alors de 6 x 108 cellules par ml,soit environ 102 fois plus élevée que dans la culture irn vitro avec un incubateur à CO 2 utilisant un milieu nutritif. Les cellules humainesainsi obtenues,sont traitées comme dans l'exemple A2 L'induction avec du virus de la maladie de Newcastle prinac-tivé thermiquement, à environ 500 titres d'hémagglutination par ml, et avec environ 100/M'g de phytohémagglutlnine/ml, est suivie d'une incubation de 2 jours à 37 e C. Purifiée et concentrée comme dans l'exemple A-I, la poudre est obtenue avec un rendement en lymphotoxine d'environ 5,4 x 106 unités par rat, et elle contient 6,8 x O 106 unités Hu-IFN. EXEMPLE A-7 Des cellules BALE-I,1 de la lignée lymphoblas- toide humaine,sont trasplaantées dans la cavité allan- tolque d'oeufs embryonnés,preincubés a 37 C pendant 5 jours; après la transplantation, les oeufs continuent à être inc 4 és encore durant une semaine Les cellules multipliées sont récoltées des oeufs et mises en suspension comme dans l'exemple A-1,pour donner une densité de 5 x 106 cellules/ml. On ajoute à la suspension du virus de Sendai à raison de 1 000 titres d'hémagglutination par ml, et on laisse incuber I jour à 37 C La culture est ensuite purifiée et concentrée comme dans l'exemple A-2. Le rendement en lymphotoxine est d'environ 9 x 105 unités et 3,5 x 105 unités Hu-IFN pour 10 oeufs embryonnés. EXEMPLE A-8 Les opérations sont celles de l'exemple A-4,mais les cellules humaines, utilisées, de la lignée lymphoblastoide, sont les cellules MOLT-5. Le rendement en lymphotoxine est alors d'environ 3,3 x 107 uni- tés par souris Le produit contient également environ 1,4 x 107 unités de Hu-IFN. EXEMPLE A-9 Le constituant Hu-IFN, d'un produit en poudre ob- tenu selon l'exemple A-1, est éliminé par adsorption et désorption avec un échangeur d'ions, fractionnement suivant masse molaire par filtration sur gel,concentration et fil- tration sur membrane, selon la méthode de G BODO ("Sympo- sium sur Préparation, Standardisation et Applications chi- miques de l'Interféron" 11 Symposium International d'Im- munologie, 8-9 Juin 1977, Zagrev,Yougoslavie) Le produit résultant,exempt de Hu-IFN, est concentré et purifié par relargage au sulfate d'ammonium Le produit résultant est traité par la chromatographie d'affinité utilisant du phytohémagglutinine-sépharose dans du tampon phosphate 0,10 M (p H 7,4); la partie adsorbée est éluée par une por- tion fraiche du même tampon additionné de 0,1 M N-acétyl D- galactosamine Les fractions éluées, à activité de lympho- toxine, sont dialysées contre du tampon frais,mais exempt de galactosamine; elles sont concentrées et ly-ophilisées en poudre. Llactivité spécifique de la lymphotoxine, ainsi obtenue, est d'environ 30 000 unités par mg de protéine. La filtration sur gel du produit pulvérulent a permis de séparer trois constituants de masses moléculaires différentes: environ 7 x 104 à 9 x 104 daltons, environ 3,5 x 104 à 5 x 104 et environ 104 à 2 x 104, ayant leurs activités dans les rapports d'environ 1:1:2 Cela correspondrait respectivement aux lymphotoxines CO 1, et', d'après leurs masses molaires et autres données physico-chimiques connues. Tous ces constituants sont des glycoprotéine et leur teneur en saccharide est de l'ordre de 5 à 45 %, selon la masse moléculaire. EXEMPLE A-10 On opère sur des hamsters nouveaux-nés,comme dans l'exemple A-1, en sous-cutané, mais les cellules hu- maines employées proviennent des monocytes transformés par des virus SV-40. Nourriture normale une semaine Injection intrapéritonale avec des cellules vivantes BCG dans un inoculum, de 107 cellules par animal De nouveau, nourriture normale deux se- maines Les tumeurs massives de 15 g environ chacune sont traitées comme dans les exemples précédents, avec du milieu Eagle, d'abord avec 5 % v/v de sérum humain Densité de la suspension 5 x 106 cellules; elle est additionnée de 10/Lg d'endotoxine d'E coli par ml, et incubée à 37 C en 16 h. Centrifugation à 40 C sous I 000 g; dialyse comme à la fin de l'exemple A-2,mais en 21 heures. Le constituant Hu-IFN est séparé,comme dans l'exemple A-9, par la méthode de G BODO précitée. Le TNF, ainsi obtenu, exempt de son inducteur,présente une activité spécifique d'environ 350 000 unités par mg de protéine. EXEMPLE A-11 Des hamsters sont traités comme dans l'exemple précédent; la transplantation sous-cutanée est faite avec des cellules humaines BALL-1 Nourriture normale 3 semaines. Tumeurs massives,d'environ 15 g chacune,traitées comme pré- cédemment, lavage avec du milieu RPMI 1640 Suspension à environ 107 cellules/ml. Inducteurs: virus Sendai I 000 titres hémaggl /ml et endoto- xine E coli 20,g/ml; 2 jours d'incubation à 37 C. Centrifugation à 4 C, dialyse et filtration,comme plus haut. On a obtenu du TNF lyophilisé à raison de 8,3 x 107 unités par hamster; il contient 4,1 x 107 unités Hu-IFN. EXEMPLE A-12 Animal: souris nue,adulte. Cellules humaines:TALL-1 Nourriture normale semaines. Injection de virus Newcastle dans les conditions décrites dans l'exemple A-3. Traitement de l'ascite comme dans l'exemple A-11, On obtient par souris 6, 2 x 106 unités de TNF qui contient 4,5 x 106 unités Hu-IFN. EXEMPLE A-13 Souris adultes traitées comme dans l'exemple A-4, mais les cellules humaines transplantées,en sous- cutané,sont des Mono-1 Nourriture normale 3 semaines. Tumeurs massives de 10 g chacune, traitées selon l'ex- emple A-10 Ajouté concanavaline A et virus Sendai, laissé incuberla jour à 37 C,puis traité comme dans l'exemple A-11. Rendement en TNF 6,8 x 107 unités par souris Le produit con- tient environ 1,3 x 107 unités Hu-IFN. EXEMPLE A-14 Animaux:hamsters nouveaux-nés. Cellules humaines:NAMALWA Opérations comme dans l'exemple A-10,ensuite comme A-11 Rendement en TNF 4,3 x 107 unités par hamster Le produit contient environ 8,2 x 106 unités Hu-IFN. EXEMPLE A-15 Cellules humaines NALL-1 cultivéesen chambre de diffusion comme dans l'exepple A-6 Resuspension dans du milieu frais selon la technique de l'exemple A-10 Puri- fication et concentration comme dans l'exemple A-11. Rendement en TNF environ 2,6 x 107 unités par rat Le produit renferme 9,4 x 106 unités Hu-IFN. EXEMPLE A-16 Cellules humaines JBL cultivées dans la cavité allantoique de l'oeuf, comme à l'exemple A-7 Ensuite, traitement comme dans l'exemple A-10 Rendement en TNF environ 1,5 x 106 unités pour 10 oeufs;les propriétés physicochimiques sont en accord avec celles de Carswell et coll Le concentré renferme environ 4 x 105 unités de Hu-IFN pour 10 oeufs. Le TCLF obtenu,suivant l'invention,conrivient avan- tageusement en tant qu'agent prophylactique ou/et thérapeu- tique, notamment eil injections, administration interne ou externe, collyre,etc,seul ou conjointement avec d'autres agents Sont, par exemple, justiciables de cet agent des ma- ladies telles que tumeurs malignes, notamment cancer du sein, carcinome du poumon, cancer utérin ou vésical, carci- nome du colon, cancer gastrique, leucémie, lymphoma ou cancer de la peau. Les exemples de la série B, suivants, en montrent l'efficacité. EXPERIENCE B-1 Dans le dos de souris nues, on a implanté sous la peau, des petits fragments de tissu humain du cancer du sein. Lorsque la tumeur massive, qui en est résultéee a atteint environ 200 mm),on a commence à injecter aux souris, par voie intraveineuse, une préparation aliquote de TNF obte- nue selon l'exemple A-10 L'injection était pratiquée'tous les jours à raison de 100 -mités/kg/jour ou I 000 unités/kg/ jour 15 jours après la première injection, les animaux ont été sacrifiés et on a pesé les tumeurs Les résultats sont réunis au Tableau II, ci-après, dans lquel les nombres té- moins s'entendent pour des souris auxquelles a la place de TNF on injectait une solution saline,physiologique On voit un effet net du TNF en faveur de la diminution de la tumeur. A noter que l'écart de + 0,4 est insignifiant en comparaison de + 1,4 pour le témoin. TABLEAU II Traitement Dosage/jour Poids de la tumeur en - Témoin 11,0 + 1,4 TNF 100 U/kg 7,5 + 0,8 TNF 1 000 U/kg 7,1 + 0,4 EXPERIENCE B-2 L'expérience analogue à celle de B-I est effectuée avec 10 souris mâles BDFI pendant environ 25 g; le tissu cancéreux est celui du carcinome pulmonaire de Lewis Après jours, injections intraveineuses de TNF: 100 et 1 000 unités/kg/jour Le tableau III donne les résultats après 21 jours. TABLEAU III Traitement Dose par jour Poids de la tumeur Témoin 7,5 + 0,5 TNF 100 U/Kg/j 6,7 + 0,8 TNF 1 000 " 4,5 + 0,4 La combinaison est la même que pour l'expérience B-I. EXPERIENCE B-3 La détermination de la toxicité aig Ue du TNF de l'exemple A-10 sur des souris de 20 jours indique que cette toxicité est très faible,DL 50 étant de 200 000 unités/kg ou plus, par voie intrapéritonéale. La série des expériences C, qui suivent, mon- trent l'efficacité de la lymphotoxine. EXPERIENCE C-I Par la même technique que plus haut, on implante à des souris nues BALB/C, sous la peau du dos, des petits fragments de tissu humain cancéreux du sein Lorsque les tumeurs ont atteint environ 200 mm 3, on injectait aux sou- ris des mélanges de lymphotoxine obtenus selon l'exemple A-9, par voie intraveineuse, deux fois par jour, à raison de 4 et 40 unités/kg/jour Les résultats après 15 jours se trou- vent au Tableau IV. TABLEAU IV traitement Dose par jour Poids de la tumeur ______ __E,__i_Z______ Témoin 10,8 + 1,2 mélange de) 4 U/kg 7,9 + 0,7 lymphotoxine 40 " 7,4 + 0,5 On notera l'amélioration marquée selon la dernière ligne. EXPERIENCE C-2 Des essais analogues à C-1 sont faits sur 10 souris mâles BDF 1 de 25 g, avec 2 mm 2 de tissus carcino- mique du poumon(Lewis). Après 8 jours, injections intraveineuses de - lymphotoxine de masse molaire 104 à 2 x 104 daltons obtenue dans l'exemple A-9. Le tableau ci-après montre les résultats après 21 jours. TABLEAU V Traitement Dose par jour en Poids de la tu- ______ Unitms/k E meur humide en g Témoin 7,3 + 0,3 Lymphotoxine) 4 6,6 + 0,7 mélange mélange 40 4,7 + 0,5 Le résultat de la dernière ligne est remarquable. EXPERIENCE C-3 Suivant la même technique que plus haut, on trai- te 20 souris mâles BDF 1 de 25 g; implantation sous la peau de cellules de la lignée L-1210 leucémique de souris. Ensuite injection journalière, intraveineuse de substances indiquées au Tableau VI, qui indique le temps de survie de 50 % d'animaux. TABLEAU VI Traitement Solution saline Mitomycine C) ( 0,5 mg/kg/jour) Injections Une 9 jours Mélange de) 30 unités/kg/jour 9 " 15 Lymphotoxine 300 " " 12 " 16 On voit que même avec une faible dose de lymphotoxine ( 30 unités) on peut obtenir de bons résultats en augmentant le nombre de doses journalières. EXPERIENCE C-4 A 20 souris mâles BDF 1 on implante des cellules de souris de la lignée P 388 de leucémie, à la manière dé- crite dans C-3 Après les injections intraveineuses de substances indiquées au Tableau VII, on note le % d'animaux ayant survécu après certains nombres de jours. TABLEAU VII Essai Traitement ( Solution saline Témoin ( Mitomycine C ( 0,5 mg/kg/jour ( 300 unités/kg/j Mélange ( 1000 " de Lympho ( 3000 " " " toxine ( 10000 " Jours de survie I 6 15 30 80 % d'animaux O ) 0 O O 35 O O O 40 45 70 100 0 O O 30 30 65 65 85 85 Il en résulte que des fortes doses de mélange de lympho- toxine,suivant l'invention,sont efficaces comme agent prophylactique ou thérapeutique. EXPERIENCE C-5 Des déterminations sur souris de 20 jours ont Essai Témoin) Témoin) ) ) par jour Deux 9 jours 9 " Il montré que la toxicité aigae du mélange de lymphotoxine, obtenu suivant l'exemple A-9, est extrêmement faible: la DL 50 est de 10 000 unités/kg ou plus, par injection intrapéritonéale. Les concentrations en mélange lymphotoxines, requises pour 50 %/ d'inhibition in vitro de la multipli- cation de cellules ont été déterminées sur des cellules humaines normales et sur celles de tun;eurs, à la manière habituelle Ainsi trouve-t-on pour les cellules humai- nes normales, par exemple de l'intestin (lignée 407), du foie(Chang), du coeur (Girardi), une concentration très élevée, notamment 20 000 uni tés/,'i Lou davantage. Par contre, pour les cellules de tumeurs humaines, par exemple cellules KB de nasopharynx, les H Ep-2 du larynx, HEL du carcinome pulmonaire,les concentrations sont très basses, à savoir respectivement 18, 24 et 33 unités/n L. On voit donc l'utilité du TCLF suivant l'invention pour des traitements thérapeutiques ou préventifs Dans le cas d'une tumeur maligne, il peut être indiqué, avant l'application du TCLF, de traiter le produit d'abord in vitro par un fragment de tissu de la tumeur du patient, afin d'exalter son immunogénicité, et l'administrer au malade avant la suite du traitement. Les doses de TCLF à utiliser sont en général de 5 à 50 000 000 d'unités par jour pour -un adulte; pour l'administration locale, par exemple pour un Collyre ou une injection locale 5 à 1 000 000 d'unités par jour; dans le cas du traitement percutané ou sur des muqueuses, par exemple en suppositoires ou pommades, conviennent surtout des doses de 10 à 5 000 000 d'unités par jour; pour les applications systémiques, notamment intravei- neuses ou intramusculaires,les doses préférées sont de 50 à 1 000 0000, et per os de 500 à 50 000 000 d'unités/jour Les doses varient bien entendu selon les circonstances et suivant l'état du malade. Le TCLF peut être mis sous toute forme médica- menteuse requise avec des supports appropriés,mais il est préférable que ce dernier en contienne au moins 5 unités par gramme. Les exemples de la série B, suivants, montrent non limitativement quelques-unes des formes d'application du TCLF suivant l'invention. EXEMPLE B-1 20 000 unités de mélange de lymphotoxines,pré- paré suivant l'exemple A-9,sont dissoutes dans 200 ml se solution saline physiologique La solution obtenue est filtrée sur membrane Dans une série de tubes en verre stérilisés, on met 2 ml de la solution filtrée que l'on lyophilise et scelle de façon à constituer des doses prê- tes à l'utilisation médicale. Les injections de ce produit sont utiles pour le traite- ment du cancer du sein,du carcinome pulmonaire ou hépati- que, de la leucémie,etc. EXEMPLE B-2 Le mélange de lymphotoxine, obtenu selon l'ex- emple A-3,est mélangé avec un minimum de paraffine liquide, et additionné de vaseline,de façon à former une pommade à unités de lymphotoxine par gramme. Cet onguent est utile pour le traitement du carcinome de la peau, du cancer du sein ou du lymphadénome. EXEMPLE B-3 Un collyre est préparé par mélange de 800 ml d'eau distillée, de 5 ml de P-phényl-éthyl alcool et de 40 000 unités de mélange de lymphotoxines préparé selon l'exemple A-6,1 e tout étant complété à 1 000 ml de solu- tion isotonique,par addition d'une solution de Na Cl. Le collyre convient en particulier contre le rétino- blastome. EXEMPLE B-4 Des comprimés entériques, enrobés, sont préparés, à la manière classique, par mélange de l'amidon, du maltose et de la préparation de lymphotoxine de masse molaire de 104 à 2 x 104 daltons, obtenue comme dans l'exemple A9 Les comprimés de 100 mg,titrant chacun 2 000 unités lymphotoxine, sont enrobés d'ester phtalique de méthyl cellulose. Ces comprimés sont recommandables pour le traitement du carcinome du colon ou du foie. EXEMPLE B-5 500 000 unités de préparation de TNF,obtenue suivant l'exemple A-10, sont dissoutes dans 200 ml de so- lution saline physiologique et la solution est filtrée stérilement sur membrane. 2 ml de portion aliquote de cette solution sont lyophili- sés dans des tubes en verre stérilisés, puis scellés Les tubes servent à des injections utiles au traitement du cancer du sein, du carcinome du poumon ou du foie, et de la leucémie. EXEMPLE B-6 Suivant le mode opératoire de l'exemple B-2, on prépare une pommade de TNF obtenu dans l'exemple A-l; elle titre 20 000 unités TNF par gramme et a les mêmes applications que celle de l'exemple B-2 EXEMPLE B-7 Un collyre est préparé comme en B-3, mais avec 000 000 unités de TNF préparé suivant l'exemple A-14. Il convient également au traitement du rétinoblastome. EXEMPLE B-8 Des comprimés entériques sont confectionnés à la manière décrite en B-4,mais avec du TNF de l'exem- ple A-12, à la place de la lymphotoxine Ils titrent 000 unités TNF par comprimé de 100 mg, et ont la même utilité que celle de l'exemple B-4. REVENDICATIONS 1 Procédé de production d'un facteur de lyse de cellu- les-cibles (désigné ci-après par l'abréviation TCLF),carac- térisé en ce que des cellules humaines, capables de produire ce facteur, sont soumises & l'action d'un inducteur,après quoi, le facteur TCLF est récolté et purifié. 2 Procédé suivant la revendication 1, dans lequel les cellules humaines sont multipliées par leur transplan- tation dans le corps d'un animal à sang chaud ou dans une chambre de diffusion implantée dans un tel animal,caracté- risé en ce qu'après multiplication,elles sont soumises à l'action d'un inducteur de TCLF, les cellules humaines pré- férées étant choisies parmi les lignées:BALL-1, NAMALWA, CCRF-SB, EBV, TALL-1, IMOLT-3,NALL-1, Mono-1, JBL,EBV-HO et des cellules établies d'origine monocytique. 3 Procédé suivant la revendication I ou 2,caractéri- sé en ce que l'inducteur est celui de IFN-a ou Y,en particu- lier un virus, la phytohemagglutinine ou la concanavaline A, et que le TCLF est produit simultanément avec de l'interfé- ron humain(Hu-IFN). 4 Procédé suivant une des revendications I à 3,carac- térisé en ce que l'on recueille, à partir des cellules indui- tes, le TOLE constitué, par des glycoprotéines de masses mo- léculaires de 104 à 105 daltons avec 5 à 45 % de saccharides, et en particulier au moins une des trois sortes de glycopro- téines ayant des masses molaires de 104 à 2 x 104, 3,5 x 10 à x 104 et/ou 7 x 104 à 9 x 104 daltons. Procédé suivant une des revendications I à 4,carac- térisé en ce que l'on recueille, en tant que TCLF, des lym- photoxines et/ou du facteur de nécrose de tumeurs(TNF). 6 Agent thérapeutique, particulièrement utile contre les tumeurs malignes, caractérisé en ce qu'il est constitué ou comprend le facteur de lyse de cellules-cibles(TCLF),et en particulier un tel agent renfermant des glycoprotéines de masses moléculaires de 104 à 105 daltons avec 5 à 45 %o de saccharides. 7 Agent suivant la revendication 6,caractéris 6 en ce qu'il comprend au moins une des trois sortes de glycoprotéines de masses mol 6 culaires respectivement de 104 à 2 x 104, 3,5 x 104 à 5 x 104 et 7 x 104 à 9 x 104 daltons, la teneur en TCLF y étant de préférence d'au moins 5 unités par granmme. 8 Agent suivant la revendication 6 ou 7,caractéris 6 en ce qu'il renferme à la fois du TCLF et de l'interf 6 ron hu- main (Hu-IFN). 9 Agent suivant une des revendications 6 à 8,caracté- risé en ce qu'il renferme des lyr:photoxines et/ou du TNF.