FR 2520381 A1 19830729 FR 8300703 A 19830118 La présente invention concerne un procédé pour éliminer l'interférence de la bilirubine dans les déterminations clinico- chimiques reposant sur la production de peroxyde d'hydrogène et son dosage quantitatif avec un système chromogène en présence de peroxy- dases et des réactifs pour la mise en pratique d'un tel procédé. L'emploi de certains systèmes chromogènes pour détermi- ner le peroxyde d'hydrogène produit à partir de substrats biolo- giques par des oxydases spécifiques est connu. Dans Ann Clin: Biochem, 6, 24, 1969, P Trinder décrit par exemple un procédé pour la détermination quantitative du glucose dans le sang après déprotéinisation, ce procédé comprenant l'emploi d'un système chromogène constitué d'amino-4 phénazone et de phénol pour déterminer, en présence de peroxydase, le peroxyde d'hydrogène produit à partir du glucose par la glucose-oxydase. A ce jour, des techniques analogues ont été étendues à la détermination de nombreux substrats oxydables, y compris par exemple le cholestérol, l'acide urique, les triglycérides et les phospholipides, dans des liquides biologiques, tels que le sang ou l'urine Généralement, on ne considère pas que la déprotéinisation est nécessaire. La réaction connue sous le nom de réaction de Trinder peut être définie schématiquement comme suit, tel qu'on l'entend généralement: le peroxyde d'hydrogène (H 202) se formant par suite de l'action d'oxydases spécifiques sur certains métabolites, pro- voque, en présence de peroxydases, l'oxydation d'un système cons- titué de phénol ou d'un dérivé de phénol, ou d'une amine aromatique et d'amino-4 antipyrine (également appelée amino-4 phénazone) ou d'une autre substance d'un groupe hétérogène fréquemment appelé "accepteurs d'électrons ou de radicaux" (par exemple la N,N-diméthyl- amino-4 antipyrine, la benzidine, la méthyl-3 benzothiazolone-2 hydrazone, etc) Le mécanisme de la réaction est encore controversé. Le produit de la réaction, dans laquelle l'anino-4 antipyrine agit comme un accepteur, est connu en ce qui concerne sa structure fonda- mendale: c'est une quinonimine qui, généralement, présente une bonne absorption dans la gamme des longueurs d'onde comprises entre 500 et 600 na Comme le système de Trinder produit une coloration visible, la détermination de métabolites selon cette méthode est "calorimétrique" et le composé de phénol ou l'amine aromatique, avec l'accepteur, forment le "système chromogène" Comme la réaction colorimétrique provoque la formation stoechiométrique de 0,5 mole de quinanimine par mole de peroxyde d'hydrogène réduite par le système chromogène en présence de peroxydases, l'absorbance mesurée à l'équilibre est proportionnelle à la concentration totale du peroxyde d'hydrogène libéré dans le système De plus, l'oxyda- tion avant la réaction colorimétrique provoque la formation stoe- chimétrique de 1 mole de peroxyde d'hydrogène par mole de substrat spécifique de l'oxydase, si bien que l'absorbance mesurée à l'équi- libre est proportionnelle à la concentration de ce substrat. La méthode de Trinder permet la détermination quantita- tive de nombreuses substances d'intérêt clinique dans les liquides biologiques, telles que le glucose (par emploi de la glucose-oxydase, EC 1 1 3 4), du cholestérol (après hydrolyse complète des esters, en utilisant la cholestérol-oxydase EC 1 1 3 6), l'acide urique (en utilisant l'urate-oxydase EC 1 7 3 3), les triglycérides (par exemple après hydrolyse complète des liaisons esters et transfor- mation en glycérol, par emploi de la glycérol-oxydase, à laquelle un nom systématique EC n'a pas encore été attribué; d'autres voies nécessitant l'emploi d'autres oxydases existant également pour les triglycérides), les phospholipides (après hydrolyse des liaisons esters et transformation en choline, en utilisant la choline- oxydase EC 1 1 3 17), les acides gras non estérifiés (après activa- tion en acyl-Co A, par emploi de l'acyl-Co A-oxydase, à laquelle un nom systématique EC n'a pas encore été attribué). La détermination des métabolites dans les liquides biolo- giques souffre de l'inconvénient majeur qu'est l'interférence dans la mesure de nombreux autres composants de ces échantillons parfois présents à des concentrations élevées La nécessité, jusqu'à une date récente, de déçrotéiniser le sérum ou le plasma avant le dosage de certains constituants, découle de la tendance nette des protéines du sérum ou du plasma, présentes à des concentrations moyennes d'environ 70 g/l, d'interférer dans la détermination par suite de leurs propriétés réductrices ou complexantes, ou de leur capacité de porter de petites molécules qui, à leur tour, provoquent une interférence. Lorsqu'on a mis au point led microméthodes qui garantissent des déterminations spécifiques grace à l'emploi d'enzymes de grande pureté et qui offrent une sensibilité suffisante pour permettre des rapports volumétriques très faibles de l'échan- tillon au réactif ( 4 1/40), l'effet de l'interférence de protéines est devenu minime Il est donc devenu habituel de déterminer direc- tement les métabolites sans déprotéiniser au préalable l'échantillon. La mesure des métabolites par emploi du système de Trinder est également généralement directe Cependant, lorsqu'on utilise comme échantillon du sérum ou du plasma, une petite molé- cule portée par l'albumine, c'est-à-dire la bilirubine, demeure dans le mélange réactionnel La bilirubine peut provoquer une interférence considérable de l'absorbance détectable finale Normalement, cette molécule est présente dans le sérum à des concentrations inférieures à 17 pmol/ 1, mais, dans la jaunisse, la concentration peut dépasser 500 Pmol/l. Elle provoque deux types d'interférence: une inter- férence colorimétrique positive et une interférence chimique néga- tive. 1) Interférence colorimétrique positive: la bili- rubine, liée à l'albumine, a un spectre d'absorption présentant un maximum a 460 nm avec un étalement à droite qui se superpose à une partie considérable de la gamme des longueurs d'onde des spectres d'absorption de beaucoup de quinonimines produites par le# divers systèmes de type Trinder C'est par exemple le cas dans les systèmes qui utilisent le phénol et ses dérivés comme chromogènes Par consé- quent, une partie de l'absorbance mesurée à la fin de la détermina- tion est due non & la quinonimine comme c'est le but spécifique de l'analyse, mais à la bilirubine présente dans l'échantillon. Ce type d'interférence dépend de a) la teneur en bilirubine de l'échantillon; b) la dilution de l'échantillon réalisée pour la détermination Celle- ci dépend bien sûr de la sensibilité du procédé qui correspond à une combinaison optimalisée de deux éléments: la capacité d'absorption du produit coloré final et la gamme des concentra- tions dans laquelle le métabolite peut être trouvé dans l'échan- tillon; c) la longueur d'onde à laquelle on lit l'absorbance finale. Ce type d'interférence peut être réduit au minimum plutbt par des moyens opératoires que par des additifs chimiques, généralement par ajustement du rapport volumétrique de l'échantillon réactif à une valeur aussi basse que possible, et choix d'une longueur d'onde aussi éloignée que possible du maxi- m m d'absorbance de la bilirubine liée à l'albumine ( 460 na). Il est devenu habituel de négliger la partie de l'absorbance due au pigment qu'est la bilirubine Il est difficile d'effectuer une évaluationquantitative (Perlstein, M T et coll, Microchem J 22 i 403, 1977) car la bilirubine réagit partiellement chimiquement dans le système, si bien que l'absorbance du pigment a l'équilibre est de toute façon inférieure à celle initialement mesurable De plus, cette réaction chimique de la bilirubine provoque l'interférence négative exposée ci-dessous Il est donc habituel de considérer l'effet spectral résiduel à l'équilibre conne une "com- pensation" de la baisse de la réponse provoquée par les autres voies. On peut donc effectuer des déterminations précises, sans dispositifs particuliers de métabolites qui sont normalement présents à des concentrations élevées dans le sang, même si les échantillons ont une concentration assez élevée en biluribine; des exemples en sont le glucose et le cholestérol (environ 5,5 mmol/l dans le plasma). Cependant, pour les dosages des substances dont les concentrations dans le sang sont plus faibles, telles que les triglycérides (envi- ron 1,1 nmolfl) ou notamment l'acide urique (environ 0,3 M Mol/l), le rapport volumétrique nécessaire de l'échantillon au réactif et la sensibilité extrême des chromogènes que l'on doit utiliser font que l'interférence chimique négative de la bilirubine surpasse son inter- férence colorimétrique positive. 2) Interférence chimique négative: on dispose de peu de connaissance pour clarifier le mécanisme de cette interfé- rence, en particulier du fait que le mécanisme de la réaction de Trinder, sans interférence, n'est que mal compris On peut citer par exemple deux hypothèses contradictoires: dans la réaction de Trinder, le composant non phénolique et non anilinique du système chromogène provoque la formation d'un inter- médiaire élec Lrophile qui réagit avec l'autre composant ou avec la bilirubine (Witte D L et coll ' Clin Chem 24, 1778, 1978); dans la réaction de Trinder, le composant phénolique ou anilinique provoque la formation d'un radical intermédiaire qui est fixé par l'accepteur de radicaux ou par la bilirubine (Brodersen R et coll Scand J Clin Lab Invest 39, 143, 1979). De plus, il convient de noter que la bilirubine peut se comporter conmme un donneur d'hydrogène dans la réaction de la peroxydase et que ceci se produit également dans le système de Trinder (Matsumoto K et coll, Rinsho Kagaku 8, 63, 1979). Quels que soient le ou les mécanismes de l'inter- férence chimique négative par la bilirubine, elle constitue en pra- tique un problème grave dans la mise au point d'un procédé analytique reposant sur le principe de Trinder. La demanderesse a découvert que ladite interférence de la bilirubine, en particulier l'interférence négative, peut être éliminée par addition, à la composition optimale du système chromo- gène, d'un complexe soluble dans l'eau particulier ayant une acti- vité redox qui agit sur le processus de couplage des chromogènes s'effectuant par l'intermédiaire de l'action des peroxydases et annule complètement ou au moins dans une grande mesure l'interfé- rence due à la bilirubine, en particulier toute interférence chimique négative. Plus précisément, l'invention fournit un procédé pour éliminer l'interférence de la bilirubine, en particulier l'interférence négative, dans les déterminations clinico-chimniques reposant sur la production de peroxyde d'hydrogène et son dosage quantitatif par un système chromogène, en présence de peroxydases, caractérisé en ce qu'un complexe soluble dans l'eau contenant un ion cyanomolybdate ou cyanoruthénate est ajouté au système chromo- gène. L'addition de complexes de ruthénium ou de molybdène au système chromogène selon le procédé de l'invention permet d'éli- miner l'interférence de la bilirubine dans les évaluations cliniques de tout échantillon biologique encore qu'on obtienne les meilleurs résultats avec des échantillons biologiques contenant jusqu'à environ 3501 mol/1 de bilirubine Le procédé de l'invention peut être appliqué à l'analyse d'un substrat biologique oxydable quel- conque et il est particulièrement utile dans la détermination de l'acide urique et des triglycérides. Bien entendu, lorsque le substrat oxydable à déter- miner est sous une forme liée, il peut être nécessaire de le libé- rer avant la détermination Par exemple, dans le dosage des tri- glycérides, il est nécessaire de libérer le substrat oxydable qu'est le glycérol du fragment lipidique, par exemple au moyen d'une lipase, avant la détermination. L'ion cyanomolybdate ou cyanoruthénate, caractéri- sant le complexe soluble dans l'eau employé dans le procédé de l'invention,est, de préférence, un ion salifié avec un cation de métal alcalin ou alcalino-terreux, de préférence un cation sodium ou potassium. Parmi les ions cyanomolybdates, on préfère les octacyanomolybdates de molybdène tétravalent. Parmi les ions cyanoruthénates, on préfère les hexacyanoruthénates de ruthénium bivalent. Des complexes que l'on préfère particulièrement sont l'octacyanomolybdate de potassium et l'hexacyanoruthénate de potassium, de préférence leurs formes hydratées K 4 Mo(CN)8 2 H 20 et K 4 Ru(CN)6 3 H 20 Lesdits complexes sont généralement actifs dans un tampon quelconque et de concentration quelconque, dans une gamme des p H d'environ 5,5 à environ 8,5 et, de préférence, entre 6 et 8 On les utilise de préférence à une concentration de 0,1-10 mmol/1 dans le mélange réactionnel On préfère particulièrement utiliser les ions cyanomolybdates, notamm-ent K 4 Mo(CN) 8 H 20, à une concentration d'environ 0,5-1,5, en particulier d'environ 1 mmol/l dans le mélange réactionnel, de préférence en présence d'un tampon à p H 5,5-8,5. Pour les ions cyanoruthénates, en particulier K 4 Ru(CN)6 3 H 20, on préfère particulièrement une concentration d'environ 1 à 3, et mieux d'environ 2 mmol/l, dans le mélange réac- tionnel toujours en présence d'un tampon à p H 5,5-8,5. Le système chromogène fondamental (auquel, selon l'invention, on ajoute un ion cyanomolybdate ou cyanoruthénate) comprend généralement un premier composant qui peut être un composé quelconque capable de se comporter comme un accepteur d'électrons ou de radicaux et un second composant capable de former un produit coloré par couplage au premier composant. Le composant agissant comme un accepteur peut par exemple être un composé choisi parmi le groupe constitué par l'amino-4 antipyrins, la N,Ndiméthylamino-4 antipyrine, la benzidine, la méthyl-3 benzothiazolone-2hydrazone et similaires Un accepteur particulièrement préféré est l'amino-4 antipyrine. Le second composant est de préférence un dérivé de phénol Un dérivé de phénol peut être un phénol éventuellement substitué,par exemple par un ou plusieurs halogènes, en particulier le chlore, et/ou par un ou plusieurs groupes acides, par exemple carboxy ou sulfo. Les dérivés de phénol particulièrement préférés sont les dichlorophénols sulfonés, tels que par exemple l'acide dichloro- 3,5 hydroxy-2 benzènesulfonique. Selon les caractéristiques particulièrement préférées le système chromogène fondamental utilisé dans le procédé de l'inven- tion comprend de l'amino-4 phénazone (également appelée amino-4 antipyrine) et de l'acide dichloro-3,5 hydroxy-2 benzênesulfonique (désigné ici sous le nom trivial de "dichlorophénol sulfoné"). Comme déjà dit, en plus du procédé précédemment décrit d'élimination de l'interférence de la dilirubine, l'invention fournit également des réactifs pour la réalisation de ce procédé. Chacun desdits réactifs comprend comme composants essentiels: a) un système chromogane capable de détecter le peroxyde d'hydrogène en présence de peroxydases; b) un complexe soluble dans l'eau contenant un ion cyanomolybdate ou cyanoruthénate; c) une oxydase spécifique; d) une peroxydase; et e) un tampon. Le système chromogène capable de révéler le peroxyde d'hydrogène en présence de peroxydase peut être un système chromo- gène quelconque correspondant à la définition précédemment indiquée dans la présente description, la combinaison d'amino-4 antipyrine et de dichlorophénol sulfoné étant particulièrement préférée. Egalement, le complexe soluble dans l'eau contenant un ion cyanomolybdate ou cyanoruthénate peut être un complexe quel- conque correspondant à la définition précédemment indiquée. Comme déjà dit, on préfère un complexe de type cyano de molybdène tétravalent ou de ruthénium divalent salifié avec un cation de métal alcalin ou alcalino-terreux, en particulier le sodium ou le potassium Comme déjà dit, les complexes préférés sont K Mo() O et K 4 Ru(M)6 320. L'enzyme oxydase présente dans chaque réactif doit être une oxydase spécifique du substrat à déterminer C'est par exemple une urate-oxydase dans un réactif utilisé pour la détermi- nation de l'acide urique et une glycérol-oxydase ou une glycérol- phosphate-oxydase dans un réactif utilisé pour la détermination des triglycérides De préférence, on utilise une oxydase spécifique d'origine microbienne En particulier, par exemple dans la détermi- nation de l'acide urique, on peut utiliser une urate-oxydase du type présenté par Bassi et coll sous le titre "New Microbial uricase" dans le premier Session-Poster n 3 du 9th International Symposium on Clinical Enzymology -Vérone ( 17-20 avril 1980). L'enzyme peroxydase peut être une enzyme quelconque à activité peroxydasique. Ce peut, par exemple, être la peroxydase de raifort. Le tampon fourni comme attre composant des réac- tifs selon l'invention peut être un tampon quelconque à une concen- tration quelconque ayant un p H compris entre environ 5,5 et environ 8,5, de préférence entre 6 et 8 Des tampons particulièrement pré- férés sont le tampon imidazole/H Cl à p H 6,6 avec une concentration d'environ 20 à 100 et de préférence d'environ 50 mmol/l dans le mélange réactionnel, un tampon phosphate de sodium ou de potassium à p H 7,0 à une concentration d'environ 20-200, de préférence d'envi- ron 50 mmol/1, un tampon éthylènediaminetétraacétate de sodium à p H 7,3 à une concentration d'environ 10 à 30, de préférence d'environ 20 mmol/1 et un tampon Tris/H Cl à p H 8,0 à une concentra- tion d'environ 20-100, de préférence d'environ 50 mmol/1 Pour des déterminatiorn cliniques différentes, on fournit des réactifs dis- tincts différant principalement les uns des autres par la nature de l'oxydase spécifiquement nécessaire. De plus, certaines déterminations nécessitent des réactifs qui, en plus des composants essentiels précités, peuvent contenir de façon facultative ou non des composants complémentaires, tels que, par exemple, d'autres enzymes, des cosubstrats, des substances tensioactives et des activateurs ou accélérateurs enzy- matiques Par exemple, un réactif utile pour la détermination des triglycérides peut contenir comme composants additionnels, une lipase, une substance tensioactive et éventuellement, si on utilise une glycérophosphate-oxydase, une glycérol-kinase, un cosubstrat de type nucléotide et un activateur de la glycérol-kinase, ainsi que, si on le désire, un accélérateur de la lipase Une lipase est de préférence une lipase microbienne, en particulier une lipoprotéine- lipase microbienne Elle peut par exemple être une lipase du type présenté par Bassi D et coll dans le Poster P 9-12 du lst African and Mediterranean Congress of Clinical Chemistry, Milan ( 1980) ou une lipase de muvor Juvanicus, de Pseudomonas Fluorescens, de Pseudomonas aeruginosa ou de Staphylococcus aureus Les substances tensioactives et les activateurs ou accélérateurs enzymatiques peuvent être ceux généralement employés dans les nécessaires de diagnostic. Une substance tensioactive utile peut être par exemple un détergent non ionique tel que le Triton ou le Nonidet, ou un agent tensioactif anionique tel que par exemple un cholate ou un dodécylsulfate, en particulier par exemple le sel de sodium de l'acide cholique. Un accélérateur de l'enzyme lipase peut par exemple être une protéine telle que l'albumine, l'albumine bovine notamment. Un activateur de la glycérol-kinase peut par exemple être un sel de magnésium, en particulier un sulfate ou acétate de magnésium. Un nucléotide agissant comme cosubstrat avec la glycérol-kinase peut par exemple être l'adénosine-triphosphate, en particulier le sel disodique trihydraté de l'adénosinetriphosphate. Dans le cadre d'un tel réactif, la nature des composants et leur concentration peuvent varier dans des gammes étendues L'activité des camposants enzymatiques peut également varier selon la nature de l'enzyme utilisée et la détermination clinique A effectuer. Ainsi, par exemple, un réactif préféré utile pour la détermination clinique de l'acide urique est un réactif comprenant: 1) de l'amino-4 antipyrine; 2) du dichlorophénol sulfoné; 3) un complexe soluble dans l'eau contenant un ion cyanomolybdate ou cyanoruthénate; 4) une urateoxydase; ) une peroxydase; et 6) un tampon. De préférence, dans un tel réactif, le complexe soluble dans l'eau contenant un ion cyanomolybdate ou cyanoruthénate est K 4 Mo(CN))8 2 H 20 ou, sinon, K 4 Ru(CN)6 3 H 20; l'urate-oxydase est une urate-oxydase microbienne du type indiqué ci-dessus; la peroxydase est la peroxydase de raifort; le tampon est un tampon de p H 5,5-8,5, en particulier de p H 68, par exemple un tampon imidazole/H Cl à p H 6,6 ou un tampon éthylène- diaminetétraacétate de sodium à p H 7,3. Selon une caractéristique particulièrement préférée, le réactif pour la détermination de l'acide urique selon la pré- sente invention, a la composition suivante: 1) amino-4 antipyrine: environ 0,2-2,0 de préférence environ 0,4 mmol/l; 2) dichlorophénol sulfoné: environ 2-6 de préférence environ 4 mmol/l; 3) K 4 Mo(CN)8 2 H 20: environ 0,5-1,5 de préférence environ I mmol/l; 4) urate-oxydase microbienne: >,800 U/1, depréférence environ 2 000 U/1; ) peroxydase de raifort: > 5 000 U/1, de préférence environ 000 U/1; 6) tampon imidazole/H Cl p H 6,6: environ 20-100, de préférence envi- ron 50 mmol/l. Selon une autre caractéristique préférée, le réactif pour la détermination de l'acide urique comprend: 1) amino-4 antipyrine: environ 0,2-2,0 de préférence environ 0,4 mmol/l; 2) dichlorophénol sulfoné: environ 2-6 de préférence environ 4 mmol/l; 3 'a 3) K 4 Ru(CN)6 3 H 20: environ 1,5-2,5 de préférence environ 2 mmol/l; 4) urate-oxydase microbienne: > 800 U/1 i, de préférence environ 2 000 U/l; ).:peroxydase de raifort: 5 000 U/l, de préférence environ 000 U/l; 6) tampon imidazole/H Cl à p H 6,6: environ 20-100 de préférence envi- ron 50 mmol/l. Selon'une autre caractéristique, le réactif pour la détermination de l'acide urique comprend: 1) amino-4 antipyrine: environ 0,2-2,0 de préférence environ 0,4 mmol/l; 2) dichlorophénol sulfoné: environ 2-6 de préférence environ 4 mmol/l; 3) K 4 Ru(CN)6 3 H 20: environ 1,5-2,5, de préférence environ 2 mmol/1; 4) urate-oxydase microbienne: 800 U/l,de préférence environ 2 000 U/l; 5) peroxydase de raifort: 5 000 U/l, de préférence environ 000 U/l; 6) tampon éthylènediaminetétraacétate de sodium à p H 7,3: environ -30 de préférence environ 20 mmol/l, et 7) une substance tensioactive, de préférence le sel de sodium de l'acide cholique à la concentration de 1 g/1. Des réactifs analogues mais contenant des oxydases spécifiques différentes sont généralement préférés pour les détermina- tions cliniques d'autres substrats biologiques. Ainsi, pour la détermination des triglycérides, on utilise des réactifs analogues contenant une glycérol-oxydase. Ces réactifs peuvent comprendre comme composant complémentaire une lipase, de préférence une lipase microbienne, pour libérer le glycérol du fragment lipidique et éventuellement un autre composant enzymatique tel que, par exemple, une glycérol- kinase dans le cas ola glycérol-oxydase utilisée est une glycérophosphate-oxydase Une substance tensioactive qui peut par exemple être le sel de sodium de l'acide cholique et un activateur de la glycérol-kinase qui peut par exemple être l'acétate de magnésium peuvent être présents; un accélérateur des lipases,tel que par exemple une protéine, notamment une albumine et en particulier l'a lbumine bovine, peut également être présent. Lorsqu'on utilise une glycérol-kinase, il est nécessaire qu'un nucléotide soit présent comme cosubstrat et ce peut par exemple être l'adésonine triphosphate, en particulier le sel disodique trihydraté de l'adénosine tr iphosphate. Par conséquent, selon une caractéristique préférée, un réactif pour la détermination des triglycérides contient: 1) amino-4 antipyrine: environ 0,2-2,0 de préférence environ 0,4 mmol/l; 2) dichlorophénol sulfoné: environ 2-6 de préférence environ 4 mmol/1; 3) K 4 Ru(CN)6 3 H 20: environ 1,5-2,5 de préférence environ 2 mmol/l; 4) glycéro-phosphate- oxydase: > 2 000 U/1 l, de préférence environ 000 -U/Il; 5) peroxydase: 95 000 U/l, de préférence environ 30 000 U/Il; 6) glycérol-kinase: 200 U/l, de préférence environ 1 000 U/l; 7) lipase microbienne: >, 100 U/1 de préférence environ 500 U/l; 8) une substance tensioactive; 9) un accélérateur de la lipase; 10) un activateur de la glycérol-kinase; 11) un cosubstrat de la glycérol-kinase, et 12) un tampon. Dans un tel réactif, la substance tensioactive peut par exemple être le sel de sodium de l'acide cholique à une concentration d'environ 5-10, de préférence d'environ 7 g/l dans le mélange réactionnel L'accélérateur de la lipase peut par exemple tre l'albumine bovine à une concentration d'environ 0,2 à 5,0 de préférence d'environ 1,0 g/l dans le mélange réaction- nel Le tampon peut par exemple être un tampon imidazole/H Cl à p H 6,6 à une concentration d'environ 20-100 de préférence 50 mmol/l. La glycérol-kinase est de préférence une glycérol-kinase microbienne provenant par exemple de Candida mycoderma. L'activateur de la glycérol-kinase peut par exemple être l'acétate de magnésium à une concentration d'environ 0,2-5,0 de préférence d'environ 1,0 g/l dans le mélange réactionnel. Le cosubstrat de la glycérol-kinase peut par exemple être le sel disodique trihydraté de l'adénosinetriphosphate à une concentration d'environ 0,1 à 2,O de préférence d'environ 0,5 mmol/1 dans le mélange réactionnel. La glycéro-phosphate-oxydase est de préférence d'origine microbienne. La peroxydase peut par exemple être la peroxydase de raifort et la lipase peut par exemple être une lipase micro- bienne du type indiqué par Bassi D et coll dans le Poster P 9-12 du lst African and Mediterranean Congress of Clinical Chemistry, Milan, 1980. La possibilité de mise en oeuvre du procédé et des réactifs de l'invention a été vérifiée par des déterminations sur des échantillons biologiques auxquels des quantités variables de bilirubine avaient été précédemment ajoutées et dans des détermi- nations d'échantillons biologiques ne contenant que de la biliru- bine endogène. Ces dernières évaluations ont été effectuées de façon à ne modifier en rien, par exemple par des additions et/ou des dilutions, les conditions réelles des échantillons biologiques. Les abréviations "EC" et "Tris" utilisées dans la demande désignent respectivement "Enzyme Commission" et "tris- (hydroxyméthyl)aminométhane". Les unités indiquées pour l'activité peroxydasique sont les unités d'o-dianisidine. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. 2520381- EXEMPLE 1 Détermination de l'acide urique en utilisant un réactif ayant la composition fondamentale suivante: dichlorophénol sulfoné 4 mmol/1 amino4 antipyrine 0,4 nmol/l tampon imidazole/H Cl à p H 6,6 50 mmol/1 urateoxydase 2000 UI/1 peroxydase 20000 U/1 On choisit trois sérums humains non ictériques (numé- * rotas 1 à 3) et cinq sérums humains ayant des teneurs en bilirubine supérieures à la normale (numérotés 4 à 8) On dose l'acide urique dans ces sérums en utilisant le réactif fondamental ci-dessus A titre comparatif, on utilise le réactif fondamental avec addition de 1 rmol/1 d'octacyanomolybdate de potassium dihydraté On effectue les lectures à 515 nm avec un spectrophotomètre Beckman Acta C III. On établit les concentrations exactes en acide urique dans les échantillons en utilisant la méthode ultraviolette à l'uricase (Praetorius E et coll, Scand J Clin Lab Invest, , 273, 1953). TABLEAU 1 Sérum Bilirubine Acide urique Acide urique Acide urique Pmol/l exact trouvé sans trouvé avec K 4 Mo(CN) 8 K 4 Mo(C)o ___ __mg/dl mg/dl 8 mg/dl 1 9,2 5,68 5,63 5,69 2 16,8 4,02 4,11 4,17 3 13,2 7,86 7,79 7,85 4 68,6 5,34 4,24 5,42 123,1 4,32 3,60 4,31 6 189,8 9,18 7,78 9,30 7 263,4 4,25 3,00 4,17 8 340,9 6,11 4,08 5,98 EXEMPLE 2 Détermination de l'acide urique en utilisant un réactif ayant la même composition fondamentale que celle indiquée dans l'exemple 1. On reprend les échantillons utilisés dans l'exemple 1 pour la détermination de l'acide urique avec le réactif fondamental et, à titre comparatif, avec le réactif fondamental contenant 2 mmol/l d'hexacyanoruthénate de potassium trihydraté. On effectue les lectures à 515 nm avec un spectro- photomètre Beckman Acta C III. *On détermine les concentrations exactes en acide urique des échantillons en utilisant la méthode ultraviolette à l'uricase (voir la référence de l'exemple 1). TABLEAU 2 Sérum Bilirubine Acide urique Acide urique Acide urique - trouvé sans trouvé avec pmol/l mg/dl K 4 Ru(CN)6 _______ __ mg/dl mg/dl 1 9,2 5,68 5,63 5,74 2 16,8 4,02 4,11 4,09 3 13,2 7,86 7,79 7,84 4 68,6 5,34 4,24 5,41 123,1 4,32 3,60 4,40 6 189,8 9,18 7,78 9,12 7 263,4 4,25 3,00 4,25 8 340,9 6,11 4,08 6,05 ,,,,,, )XEMPLE 3 Détermination de l'acide urique Echantillon: mélange de sérums humainsnon ictériques ayant une teneur en acide urique de 5,05 mg/dl (méthode ultraviolette à l'uricase, voir la référence dans l'exemple 1). A des portions de cet échantillons, on ajoute de la bilirubine en solution alcaline contenant 40 g/l d'albumine humaine. Lorsqu'il est nécessaire, on ajoute du soluté salé physiologique pour obtenir une sérib' d'échantillons tous dilués au 4/5 par rapport au mélange d'origine et auxquels on ajoute les quantités suivantes de bilirubine: O, 50, 100, 150, 200, 250, 300 et 3501 mol/1. On détermine l'acide urique en double sur ces échan- tillons en utilisant: le rdacti le réacti le réacti photaomètre Lf fondamental Lf fondamental + K 4 Mo(CN)8 2 H 20 1 mmol/1 f fondamental + K 4 Ru(CN)6 3 H 20 2 mmol/l On exprime la moyenne des deux déterminations. On effectue les lectures à 515 nm avec un spectro- Beckman Acta C III. TABLEAU 3 i 5 EXEMPLE 4 Détermination des triglycérides en i composition fondamentale suivante: tampon imidazole/H Cl à p H 6,6 sel de sodium de l'acide cholique lipase (microbienne) albumine bovine glycérol-kinase acétate de magnésium sel disodique trihydraté de l'adéno glycérophosphate-oxydase dichlorophénol sulfoné amino-4 antipyrine peroxydase (raifort) utilisant un réactif ayant la sinetriphosphate mmo/l 7 g/l 500 U/1 1 g/1 1000 U/1 1 g/l 0,5 mmol/l 5000 -U/1 4 mmol/l 0,4 mmol/l 30000 U/1 Bilirubine Acide urique Acide urique Acide urique ajoutée trouvé lréactif trouvé lréactif trouvé lréactif fondamentall fondamental + fondamental + K 4 Mo(CN)8 l K 4 Ru(CN)6 l pmol/l mg/dl mg/dl mg/dl O 5,10 5,15 5,18 4332 5,07 5,09 3,65 4,97 4,90 3,15 4,78 4,72 3,03 4,85 4,81 250 3,34 5,00 5,06 300 3,68 5,25 5,28 350 3,92 5,52 5,62 On reprend les échantillons utilisés dans l'exemple 1 pour la détermination des triglycérides avec le réactif fondamental et, à titre comparatif, avec le réactif fondamental contenant 2 mmol/l d'hexacyanoruthénate de potassium trihydraté. On effectue les lectures à 515 nm avec un spectrophotomètre Beckman Acta C III. On établit les concentrations exactes en trigly- cérides dans les échantillons suivant la méthode enzymatique ultraviolette lWahlefeld, A W, dans Bergmeyer, H t T, Methods of Enzymatic Analysis, 2 e édition, Academic Press, New York et Londres, 1974, page 1831 l. TABLEAU 4 Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention. Sérum Bilirubine Triglycérides Triglycérides Triglycérides exacts trouvés sans trouvés avec rmol/l K 4 Ru(CN)6 K 4 Ru(CN)6 mg/dl mg/dl mg/dl 1 9,2 98 100 101 2 16,8 112 115 117 3 13,2 87 84 t 88 4 68,6 142 122 142 123,1 264 220 262 6 189,8 198 148 i 199 7 263,4 308 257 I 318 8 340,9 150 95 146 R E V E N D I C A T I ONS 1 Procédé pour éliminer l'interférence de la bilirubine dans des déterminations clinico-chimiques reposant sur la production de peroxyde d'hydrogène et son dosage quantitatif par un système chromogène, en présence de peroxydases, caractérisé en ce qu'un complexe soluble dans l'eau contenant un ion cyano- molybdate ou un ion cyanoruthénate est ajouté au système chromogène. 2 Procédé pour éliminer l'interférence de la bilirubine selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'inter- férence de la bilirubine est l'interférence chimique négative. 3 Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, pour l'élimination de l'interférence de la bilirubine, caractérisé en ce qu'elle s'applique à des déterminations clinicochimiques d'échantillons biologiques contenant de la bilirubine à une concen- tration pouvant atteindre 350,mol/1. 4 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la concentration de la bilirubine dans les échantillons biologiques peut atteindre 250 pmol/1. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il s'applique à la détermination de l'acide urique dans des échantillons biologiques. 6 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il s'applique A la détermination des tri- glycdrides dans des échantillons biologiques. 7 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le complexe soluble dans l'eau ajouté au système chromogène contient un ion cyanomolybdate ou un ion cyanoruthénate salifié avec un métal alcalin ou alcalino-terreux. 8 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 A 7, caractérisé en ce que le complexe soluble dans l'eau ajouté au système chromogène est l'hexacyanoruthénate de potassium. 9 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le système chromogène comprend un premier composant capable de se comporter comme un accepteur d'élec- trons ou de radicaux et un second composant capable de produire par couplage avec le premier un produit coloré. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le système chromogène comprend de l'amino-4 antipyrine comme premier composant et du dichlorophénol sulfoné comme second composant. i 11Réactif pour la réalisation d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 & 10, caractérisé en ce qu'il comprend: a) un système chromogène capable de détecter le peroxyde d'hydrogène en présence de peroxydases; b) un complexe soluble dans l'eau contenant un ion cyanomolybdate ou un ion cyanoruthénate; c) une oxydase spécifique; d) une peroxydase; et e) un tampon. -12 Réactif selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il contient comme composants additionnels un ou plusieurs activateurs ou accélérateurs d'enzymes ou cosubstrats et/ou subs- tances tensioactives. 13 Réactif selon l'une des revendications 11 ou 12 pour la détermination de l'acide urique, caractérisé en ce que l'oxydase spécifique est une urate-oxydase. 14 Réactif selon l'une des revendications il ou 12 pour la détermination des triglycérides, caractérisé en ce que l'oxydase spécifique est une glycérol-oxydase. 15 Réactif selon l'une des revendications 11 ou 12 pour la détermination des triglycérides selon la revendica- tion 14, caractérisé en ce qu'il contient,en plus des composants a) à e) de la revendication 11, une lipase et une substance tensio- active. 16 Réactif selon l'une quelconque des revendica- tions l à 15, caractérisé en ce que le système chromogène comprend un premier composant capable de se comporter comme un accepteur d'électrons ou de radicaux et un second composant capable de former un produit coloré par couplage avec le premier. 17 Réactif selon la revendication 16, caractérisé en ce que le système chromogène comprend de l'amino-4 antipyrine comme premier composant et du dichlorophénol sulfoné comme second composant. 18 Réactif selon l'une quelconque des revendica- tions 11 à 17, caractérisé en ce que le complexe soluble dans l'eau contient un ion cyanomolybdate ou un ion cyanoruthénate salifié avec un métal alcalin ou alcalino-terreux. 19 Réactif selon la revendication 18, caractérisé en ce que le complexe soluble dans l'eau est l'hexacyanoruthénate de potassium. Réactif pour la détermination de l'acide urique dans les échantillons biologiques, caractérisé en ce qu'il comprend 1) de l'amino-4 antipyrine; 2) du dichlorophénol sulfoné; 3) un complexe soluble dans l'eau contenant un ion cyanomolybdate ou un ion cyanoruthénate; 4) une urate-oxydase microbienne; 5) une peroxydase; et 6) un tampon. 21 Réactif selon la revendication 20, caractérisé en ce que le complexe soluble dans l'eau est l'hexacyanoruthénate de potassium. 22 Réactif selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il comprend: 1) de l'amino-4 antipyrine: 0,2-2,0 mmol/l; 2) du dichlorophénol sulfoné: 26 mmol/l; 3) du K 4 Ru(CN)6 3 H 20: 1,5-2,5 mmol/l; 4) une urate-oxydase microbienne: 800 U/I; ) de la peroxydase de raifort: > 5 000 U/I; 6) du tampon imidazole/H Cl a p Hl 6,6: 20-100 mmol/l. 23 Réactif po r la détermination de l'acide urique dans les échantillons biologiques, caractérisé en ce qu'il comprend: 1) de l'amino-4 antipyrine: 0,2-2,0 mmol/l; 2) du dichlorophénol sulfoné: 2-6 mmol/l; 3) du K 4 Ru(CN)6 3 H 20: 1,5-2,5 mmol/l; 4) une urate-oxydase microbienne: a 800 U/l; 5) de la peroxydase de raifort: /5 000 U/I; 6) du tampon éthylènediaminetétraacétate de sodium à p Hi 7,3 -30 nmiol/1; et 7) une substance tensioactive. 24 Réactif pour la détermination des triglycérides dans des échantillons biologiques, caractérisé en ce qu'il comprend 1) de l'amino-4 antipyrine:0,2-2,0 mmol/l; 2) du dichlorophénol sulfoné:2-6 amol/l; 3) du K 4 Ru(oe) 6 3 H 20:1,5-2,5 n MO Io/l; 4) de la glycérophosphate oxydase: >, 2 000 U/l; 5) de la peroxydase: 5 000 U/l; 6) une glycérol-kinase 200 U/l;. 7) une lipase: > 100 U/l; 8) une substance tensioactive; 9) un accélérateur de la lipase; 10) un activateur de la glycérol-kina Se; 11) un cosubstrat de la glycérol-kinase; et 12) un tampon.