FR 2516385 A1 19830520 FR 8121676 A 19811119 La présente invention a trait à un vaccin anti-aphteux et anti-colibacillaire permettant l'immunisa- tion'd'animaux et notamment de bovins,contre la fièvre aph- teuse et contre la colibacillose L'invention a également trait à un procédé pour la préparation de ces vaccins. On sait que la fièvre aphteuse des bovins peut être efficacement combattue par les vaccins anti- aphteux actuellement disponibles, obtenus à partir de vi- rions aphteux Il existe également des vaccins efficaces obtenus à partir de virions pour les porcins La procédure de vaccination comporte en général une vaccination annuelle régulière réglementée. Cette procédure permet d'obtenir, avec les vaccins préci- tés,une mmunisation efficace Cependant, l'immunisation obtenue n'est pas immédiate, notamment après la première vaccination, et peut demander, avec les vaccins actuels, une durée de I 5 à 20 jours environ après la vaccination. Ce délai,s'il n'est pas gênant d'une façon générale,peut cependant se révéler préjudiciable, par exemple lors- qu'une épizootie s'est déclarée. On a proposé récemment de réaliser des vac- cins purifiés contre la fièvre aphteuse à base d'une pro- téine virale provenant du virus aphteux et appelée V P thré- onine, obtenue soit à partir de virions, soit par recombi- naisons génétiques La diffusion de tels vaccins se heur- te cependant au pouvoir faiblement immunogène de cette protéine On connait par ailleurs un antigène d'atta- chement présent sur certaines souches de Escherichia coli, appelé K 99 (K 88 pour les colibacilles porcins) Cet anti- gène est considéré comme responsable de l'attachement des bactéries sur la muqueuse intestinale et ses propriétés ainsi que ses procédés de préparation sont décrits par ex- emple dans la publication américaine Infection and Imuni- ty, Jan 1977, Vol 15,N 1, p 272-279; Nov 1978, Vol 22, No 2, p 555-559; Sept 1980, Vol 29, No 3, p 1125 - La présente invention a pour but de four- nir des vaccins anti-aphteux et anti-colibacillaires qui permettent à la fois de remédier aux inconvénients préci -s tés et de fournir une immunisation efficace contre la fièvre aphteuse et contre la colibacillose néonatale des ruminants ou des porcins L'invention repose sur la constatation surprenante que des virions ou protéines virales aphteux peuvent être associés audit antigène d'attachement pour former un vaccin bi-valent stable et efficace et que les vaccins ainsi obtenus, tout en conférant une immunité anti- colibacillaireaméliorent et augmentent l'inmmunogénicité de la valence aphteuse. L'invention a donc pour objet un vaccin bi- valent anti-aphteux et anticolibacillaire, caractérisé par le fait qu'il comporte, dans un véhicule convenable,d'une I 5 part des antigènes vaccinants anti-aphteux sous forme de virions, d'autre part des antigènes d'attachement K 99 (ou K 88 pour les vaccins pour les porcins) De préférence, la proportion d'antigènes anti-aphteux par rapport aux antigènes d'attachement K 99 est de 107 à 108 DECP 50 en titre viral aphteux pour un titre d'antigène K 99 équivalent à 20 à 40 milliards de bactéries Ces titres sont de préférence présentés par dose de 5 ml. * D Les antigènes viraux vaccinants anti-aph- teux sont de préférence des antigènes présents dans les vaccins classiques anti-aphteux Ils comportent générale- ment des virions entiers Ils peuvent comprendre l'une quelconque des valences aphteuses O,A, C ou toutes com- binaisons de ces valences Le vaccin selon l'invention peut comporter un adjuvant classique de l'immunité tel qu'une émulsion ou un gel d'alumine ou de la saponine De préférence,il com- porte 1,7 mg d'alumine et 0,6 mg de saponine,par dose L'invention a également pour objet un vac- cin bi-valent anti-aphteux et anti-colibacillaire caracté- ris 6 par le fait qu'il comporte, dans un véhicule convena- ble, d'une part la protéine aphteuse V P thréonine, d'au- tre part l'antigène d'attachement colibacillaire K 99 ( ou K 88 dans le cas d'un vaccin pour les porcins). La proportion de protéine virale par rapport à l'antigène d'attachement est de préférence de 100 à 300 og de protéine virale aphteuse pour 0,3 à 2 mg d'an- tigène K 99, par exemple 250 pg de protéine pour l mg d'antigène K 99. On doit comprendre que le véhicule contenant les antigènes est tel que les antigènes aphteux d'une part et les antigènes d'attachement d'autre part se trouvent associés dans une même phase aqueuse du véhicule Les particules ou molécules peuvent ainsi réagir et d'une façon générale, on préfère que les particules ou protéines virales soient por- tées par l'antigène d'attachement constituant en quelque sorte une protéine porteuse de l'antigène aphteux. L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un vaccin bivalent anti-aphteux et anti-coli- bacillaire, caractérisé par le fait que l'on mélange, dans une même phase, l'antigène viral anti-aphteux et l'antigène d'attachement K 99 (ou K 88). L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un vaccin bivalent anti-aphteux et anti-coli- bacillaire, caractérisé par le fait que l'on mélange dans une même phase la protéine virale V P thréonine et l'an- tigène d'attachement K 99 (ou K 88). De préférence, pour la préparation d'un vaccin contenant des virions à la façon de vaccins anti-aphteux classiques, on prépare le vaccin antiaphteux classique sans procéder à une adsorption sur gel d'alumine ou autre, on ajoute la suspension convenable de facteur d'attachement K 99 puis l'on procède à l'adsorption. Cependant, on peut également préparer un vaccin anti-aphteux habituel, le laisser décanter et remplacer le liquide surnageant (en général de l'ordre de 10 %) par une suspension concentrée contenant les facteurs d'attache- ment K 99. Pour préparer les antigènes d'attache- ment, on peut utiliser des bactéries inactivées portant les facteurs d'attachement, par exemple les souches dé- crites dans la littérature précitée:, de sorte que le vaccin contiendra ces bactéries En variante, on peut également, selon des techniques connues, préparer des suspensions contenant principalement les facteurs d'at- tachemet K 99 ou K 88 à i'exclusion des bactéries Les-,vaccins selon l'invention peuvent être avantageusement présentés sous forme de doses indivi- duelles de 5 ml D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparattront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemples non limitatifs. Exemple 1:vaccin anti-aphteux O A C et anti-colibacillaire Le vaccin aphteux est produit à partir de virus multiplié soit sur explants d'épithélium lin- gual, soit sur culture cellulaire en suspension ( voir DUBOUCLARD C et coll Vaccin aphteux sur épithélium. Bull Soc Sci Vêt Lyon 1966, 68 ( 3) 243 253 ou FAURE-H- et coll Dév Biol Standard 1976, 35, 409 - 423) L'inactivation est effectuée soit par le formol à 0,02 % (V/V),soit par l'éthylèneimine à 0,05 % (P/V). Le virus inactivé est alors adsorbé sur gel d'alumine ( Al++ 1,7 mg) et de la saponine est ajoutée à 0,6 mg / ml On prépare une suspension concentrée d' Escherichia coli entéro-toxique de souche O= 101 K 99 n IFFA 15-192 ( ACRES S D, ISSACSON R E, BABINK L A, KAPITANY R A Immunization of calves against enterotoxi- genic colibacillosis by vaccinating dams with purified K 99 antigen and whole cell bacterins Inf Immunity, 1979, 25, 121 126) à une concentration 150 x 109 équivalents bactéries / ml et l'on inactive les bacté- ries, qui portent les facteurs d'attachement K 99, au formol à 4 0/o Le vaccin selon l'invention est préparé en laissant décanter le vaccin aphteux obtenu, en évacu- ant le liquide surnageant d'un volume d'environ 10 % et en le remplaçant par un même volume de la suspension concentrée de bactéries inactivées précitée On a effectué une vaccination de trois lots de cinq bovins Le premier lot est soumis à la vaccination à l'aide du vaccin anti-aphteux tel que préparé ci-dessus Le deuxième lot est soumis à une vac- cination par un vaccin colibacillaire constitué par la suspension concentrée de bactéries inactivées précitée et le troisième lot est soumis à la vacci- nation à l'aide du vaccin selon l'invention Le tableau I donne le résultat des titrages, les anti- corps de la fièvre aphteuse ( Ac O,A,ou C) étant titrés en log 10 de séroneutralisation sur cellules et les anticorps K 99 étant titrés par agglutination bacté- rienne ( log 10) TABLEAU I (: : :) (: : :) ( V A C C I N: JOUR 7: JOUR 14: JOUR 21) (: : :) ( à) (: : :) ( Lot 1 Ac: 0,91: 1,87: 1,80) (: : :) ( A: 0,53: 1,90: 1,87) (: : :) ( C: 1,58: 2,47: 1,70) ::: " ( (vaccin anti) ( aphteux) K 99: 0,6: 0,6: 0,8) ( *:: :) () : (: : :) ( Lot 2 ( O: A ( (Vaccin K 99) () C : = 0,67 = 0,60: = 0,60) (: : :) ( K 99: 1,14: 2,8: 2,8) (: : :) (: : :) (: : :) ( Lot 3 O: 1,58: 1,90: 1,61) :) ((Vaccin selon: :: ) ( l'invention) A: 0, 98: 2,06: 1,88) (: : :) ( C: 1,78: 2,48: 1,66) (: : :) ( K 99: 1,6: 2,6: 2,6) (: : :) (: : :) ==S===== ======== == 3 = 5 aaaa= =a===aaa=== ====== as S =ans ss as=Ss On voit que, pour un taux d'anticorps anti-colibacillaires à peu près similaire par rapport au vaccin anti-colibacillaire, le vaccin selon l'in- vention présente une augmentation rapide du taux d' anticorps anti-aphteux le septième jour. Le tableau II ci-dessous représente une évaluation de la protection contre la fièvre aphteuse ( en %) par corrélation titre anticorps/protection des bovins 16385 TABLEAU II (::) ( JOUR 7: JOUR 14: JOUR 21) : : ) ( -:: :) (Lot 1: ::) ( (vaccin anti: ::) ( aphteux) O: 70 %:Z 99 % 99 %) (: : :) ( A: 50 %: 99 %: 99 %) (: : :) ( C: 95 %: 99 %: 99 %) (: : :) (: :-:) (: : : ') (Lot 2: ::) ((vaccin selon: ::) ( l'invention) O: 98 %: 99 %: 98 %) (: : :) ( A: 78 %: 99 %: 99 %) (: : :) ( C: 99 %: 99 %: 98 %) (: : :) (: : :) Au septième jour,donc précocement, l'in- nocuité anti-aphteuse s'installe beaucoup plus forte - ment, les vaccins devenant ensuite comparables vers le quatorzième jour Le vaccin selon l'invention permet donc une protection précoce Exemple 2: vaccin à V P thréonine. On produit une V P thréonine par extrac- tion du virus aphteux(selon BACHRACH H L, MORGAN DO, MOORE D M Foot and Mooth Disease virus immunogenic capsid protein VPT: N-terminal sequences and immuno- genic peptides by CNBR and tryptic cleavages Intervi- rology, 1979, 12 ( 2), 65-72), ou par recombinai- son génétique ( selon BROOKSBY J B Genetic engineering and Foot and Mooth Disease vaccine Nature, 1981, 289, p 5798) La solution contenant la V P thréonine qui est obtenue est ajustée à la concentration requise pour obtenir 250 pg de V P thréonine pour 1 mg d'antigène K 99 On ajoute à la solution la quantité d'antigène K 99 Après avoir laissé la protéine et l'antigène in- terréagir, on effectue une dispersion dans un excipient huileux usuel faisant office d'adjuvant REVEND I CAT IONS 1 Vaccin bivalent anti-aphteux et anti-colibacil- laire, caractérisé en ce qu'il comporte, dans un véhicule con- venable, d'une part des antigènes vaccinants anti-aphteux ob- tenus à partir de virus, d'autre part des antigènes d'attache- ment K 99 d'Escherichia coli. 2. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que la proportion d'antigènes anti-aphteux par rapport aux antigènes d'attachement K 99 est de 107 à 108 DECP 50 lO pour un équivalent de 20 à 40 milliards de bactéries. 3. Vaccin selon l'une quelconque des revendications i et 2, caractérisé en ce que les antigènes anti-aphteux com- prennent au moins l'une des valences aphteuses 0,A,C. 4. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comporte un gel d'alumine et de la saponine. 5. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les antigènes anti-aphteux et d'attachement sont contenus dans une même phase. 6 Vaccin anti-aphteux et anti-colibacillaire, caractérisé en ce qu'il comporte, dans un véhicule convenable et dans une mime phase, d'une part la protéine virale aphteuse V.P thréonine, d'autre part les antigènes d'attachement K 99 d'Escherichia coli. 7 Vaccin selon la revendication 6, caractérisé en ce que la proportion de protéines virales par rapport aux antigènes d'attachement est de 100 à 300 >g de protéine pour 0,3 à 2 mg d'antigène K 99. 8. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 6 et 7, caractérisé en ce que la phase contenant la protéine virale et l'antigène K 99, est dispersée dans un adjuvant hui- leux. 9. Vaccin anti-aphteux et anti-colibacillaire pour les porcins selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel l'antigène d'attachement K 99 est remplacé par l'antigène d'attachement K 88. 10. Procédé de préparation d'un vaccin bivalent anti-aphteux et anticolibacillaire, caractérisé en ce que lion mélange, dans une même phase, l'antigène viral anti-aph- teux et l'antigène d'attachement K 99. Il Procédé de préparation d'un vaccin bivalent anti-aphteux et anticolibacillaire, caractérisé en ce que l'on mélange dans une phase la protéine virale V P thréo- nine et l'antigène d'attachement K 99. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 10 et 1 1 pour la préparation d'un vaccin bivalent anti- aphteux et anti-colibacillaire pour les porcins, caractérisé en ce que l'on mélange, dans une même phase, l'antigène anti- aphteux ou la protéine virale V P thréonine et l'antigène d'attachement K 88. 13 Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 10 à 12, caractérisé en ce que l'on effectue une adsorp- tion du mélange. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 10 à 13, caractérisé en ce que l'on utilise des bacté- ries entières inactivées d'Escherichia coli portant l'anti- gène d' attachement. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 10 à 13, caractérisé en ce que l'on utilise pour l'an- tigène d'attachement une suspension d'antigène d'attachement sensiblement exempte de bactéries.