FR 2516794 A1 19830527 FR 8121836 A 19811120 Nouveaux médicament anticancéreux pour le traitement des leucémies T constituas de la chaine A de la ricine et d'un anticorps monoclonal spécifique, Dans les demandes antérieures No 78/27838 du 28/09/78 et addition No 79/24655 du 03/10/79, la demanderesse a décrit la préparation de produits anti- cancéreux dits conjugués obtenus par couplage par liai- son covalente de la chaîne A de la ricine à une structure protéique telle qu'un anticorps, une immunoglobuline ou un fragment d'immunoglobuline capable de reconnaître sélectivement un antigène donné à la surface des cellules porteuses que l'on veut atteindre telles que les cellules cancéreuses La propriété principale de ces conjugués est d'être des agents cytotoxiques spécifiques des cellules cibles visées. L'utilisation d'anticorps dirigés contre les antigènes de différentiation des cellules cancé- reuses avait déjà permis d'obtenir des conjugués pré- sentant une spécificité notable vis-à-vis des cellules cibles. La présente invention a pour objet à titre de médicaments des produits dits conjugués obtenus à partir de la chaîne A de la ricine et d'un anticorps monoclonal anti-cellules T humaines. On entend par conjugués des molécules mixtes artificielles dans lesquelles la chaîne A de la ricine est associée par une liaison covalente de type disulfure à un anticorps anti-cellules T humaines capable de reconnaître sélectivement un antigène associé à des cellules cancéreuses. L'obtention de la chaîne A de ricine pure a été décrite dans nos brevets antérieurs La préparation d'anticorps monoclonaux dirigés contre des cellules leucémiques T humaines a été mentionnée dans la litté- rature scientifique (On peut se reporter en particulier à Journal of Immunology 125 ( 2), 725-737, ( 1980). Pour réaliser les conjugués, il est nécessaire que les protéines & coupler portent chacune au moins un atome de soufre naturellement apte ou arti- ficiellement rendu apte à créer la liaison disulfure recherchée. La chaîne A de ricine présente naturelle- ment un seul atome de soufre permettant le couplage souhaité C'est celui de la fonction thiol du résidu de cystéine inclus dans la chaîne A et qui assurait la liaison de cette chaîne A à la chaîne B dans la toxine complète. L'anticorps entier de spécificité anti- cellules T humaines ne comporte ni fonction thiol libre ni d'autres atomes de soufre susceptibles d'être utilisés pour le couplage Si l'on utilise cet anticorps entier, il conviendra donc d'introduire artificiellement sur la molécule d'immunoglobuline un ou plusieurs atomes de soufre susceptibles d'être engagés ultérieurement dans la liaison disulfure à établir avec une ou plusieurs molé- cules de chaîne A de ricine. Si par contre on utilise le fragment Fab' de cet anticorps tel qu'il est classiquement obtenu par protéolyse limitée en présence de pepsine suivie d'une réduction du (ou des) ponts disulfure entre chaînes lourdes, ce fragment présente alors au moins un groupement thiol disponible pour créer le pont disulfure avec la chaîne A de ricine Dans ce dernier cas, selon l'inven- tion, le groupement thiol disponible sur le fragment d'anticorps sera en général transformé par des méthodes connues en disulfure mixte activé, avant d'être mis en réaction avec le thiol de la chaîne A pour créer le groupement disulfure recherché. Si l'on utilise l'anticorps entier, selon l'invention, le préparation du conjugué est effectuée en mettant en présence la chaîne A de ricine porteuse de son groupement SH libre avec l'anticorps dans lequel le groupement SH a été artificiellement introduit sous forme activée et notamment sous la forme d'un disulfure mixte avec un radical organique soufré convenable. La préparation du conjugué peut alors être représentée par le schéma: RA SH + AC R S S X RA S S R AC + XSH dans lequel: RA désigne la chaîne A de ricine AC désigne l'anticorps X désigne le radical activateur. L'anticorps substitué par un atome de soufre activé est obtenu à partir de l'anticorps lui- même, par substitution à l'aide d'un réactif (lui-même porteur d'un atome de soufre activé selon le schéma: AC + Y R S S X + AC R S S X dans lequel: AC désigne l'anticorps Y représente une fonction permettant la fixation covalente du réactif sur la pro- téine R désigne un groupement pouvant porter simultanément les substituants Y et S - S X X désigne le radical activateur. Le groupement fonctionnel Y est une fonction capable de se lier de façon covalente avec l'une quel- conque des fonctions portées par les chaînes latérales des aminoacides constitutifs de la protéine à substituer. Parmi celles-ci, les fonctions aminées terminales des radicaux lysyle contenues dans la protéine sont parti- culièrement indiquées Dans ce cas, Y pourra notamment représenter: un groupe carboxylique qui pourra se lier aux fonctions aminées de la protéine en présence d'un agent de couplage tel qu'un carbodiimide et notamment un dérivé soluble dans l'eau comme l'éthyl-l (diéthylamino-3 propyl)-3 carbodiimide, un chlorure d'acide carboxylique qui est susceptible de réagir directement avec les fonctions aminées pour les acyler, un ester dit "activé" tel qu'un ester d'ortho ou para-, nitro ou dinitro-ph 6 nyle ou encore un ester de N-hydroxy succinimide qui réagit directement avec les fonctions aminées pour les acyler, un anhydride interne d'un diacide carboxv- lique tel, par exemple, l'anhydride succinique qui réagit spontanément avec les fonctions amines pour créer des liaisons amides, /NH un groupement imidoester C o R OR 1 est un groupe alkyle réagissant avec les groupes aminés de la protéine selon la réaction: H HN N o % RO Prot NH 2 + C R 2 Prot NH C R 2 + R 1 OH R 10 Le radical -S-S-X désigne un disulfure mixte activé capable de réagir avec un radical thiol libre. En particulier dans ce disulfure mixte, X pourra désigner un groupe pyridyl-2 ou pyridyl-4 éventuellement substitué par un ou des radicaux alkyle, halogène, carboxyliques X peut aussi désigner Lun groupe phényle de préférence substitué par un ou des groupes nitro ou carboxyliques. X peut encore représenter un groupe alcoxycarbonyle tel que le groupe méthoxycarbonyle. Le radical R désigne tout radical capable de porter simultanément les substituants Y et S S X. Il devra être choisi de façon à ne pas comporter de fonctions susceptibles d'interférer au cours des réactions ultérieures avec les réactifs utilisés et les produits synthétisés En particulier, le groupe R peut être un groupe (CH 2)n avec N compris entre 1 et 10, ou encore un groupe: R 3 CH- 3 I CH - R 4 dans lequel R 4 désigne l'hydrogène ou un groupe alkyle ayant de 1 à 8 atomes de carbone et R 3 désigne un substi- tuant inerte vis-à-vis des réactifs utilisés ultérieure- ment tel qu'unt groupe carbamate NH C OR o R Fil 5 5 j LO o désigne un groupe alkyle droit ou ramifié ayant de 1 à atomes de carbone et notamment le groupe tertiobutyle. La réaction du composé Y R S S X avec l'immunoglobuline est effectuée en phase liquide homogène le plus souvent dans l'eau ou une solution tampon Lorsque la solubilité des réactifs l'exige, il est possible d'ajouter au milieu réactionnel jusqu'& 20 % en volume d'un solvant organique miscible à l'eau tel qu'un alcool et notamment le butanol tertiaire. La réaction est effectuée à température ambiante pendant un temps variant de quelques heures à 24 heures Après quoi, une dialyse permet d'éliminer les produits de faible masse moléculaire et, en parti- culier, les excès de réactifs Ce procédé permet d'introduire in hombre de groupements substituants par mole de protéine compris entre 1 et 5 si la protéine est une immunoglobuline de classe G, compris entre 1 et 15 si la protéine est une immunoglobuline de classe M. En utilisant de tels composés, le couplage avec la chaîne A de ricine est réalisé par mise en. présence en solution aqueuse des deux protéines à une température ne dépassant pas 30 C pendant un temps variant de quelques heures à un jour La solution obtenue est dialysée pour éliminer les produits de faible masse molé- culaire, puis le conjugué peut être purifié par diverses méthodes connues. L'exemple suivant permet de mieux com- prendre l'invention sans en limiter la portée. EXEMPLE 1: décrite dans lyse contre chlorure de et purifiée antérieures Conjugué obtenu par réaction entre un anti- corps anti-cellules T humaines (anticorps dirigé contre l'antigène T 65) substitué par un groupe disulfure activé et la chaîne A de la ricine. a) Anticorps anti-cellules T humaines (ou anticorps T 101) Cet anticorps a été obtenu selon la méthode Journal of Immunology 125 ( 2), 725-737 ( 1980). I 1 subit une ultime purification par dia- du tampon PBS ( 10 m M de phosphate, 140 m M de sodium, p H 7,4). b) Chaîne A de la ricine: La chaine A de la ricine a été préparée ainsi qu'il a été indiqué dans nos demandes (brevet No 78/27838 et addition No 79/24655). c) Anticorps anti-cellules T humaines activé: A 0,5 ml d'une solution 14, 2 mg/ml d'acide (pyridyl-2 disulfanyl)-3 propionique dans le tertiobutanol, on ajoute 0,1 ml d'une solution à 42,7 mg/ml d'éthyl-l (dimethylamino-3 propyl)-3 carbo- diimide et laisse 3 minutes à température ambiante. On ajoute 180,pl de la solution ainsi obtenue à 5,6 ml d'une solution d'anticorps à 3,6 mg/ml dans le tampon PBS On laisse l'incubation se poursuivre pendant 20 heures à 30 C. On dialyse ensuite la solution en continue pendant 3 jours contre 21 litres de tampon PBS à 4 C On obtient ainsi 16 mg d'anticorps activé à une concentration de 2,6 mg/ml. Par dosage spectrophotométrique à 343 nm de la pyridine thione-2 libérée par échange avec le glutathion réduit, on constate que l'on a obtenu un anti- -7 un anticorps portant 3,1 groupements activateurs par mole d'anticorps. d) Conjugué: A 4,6 ml d'une solution d'anticorps activé dans le tampon PBS (concentration 2,6 mg/ml, soit 12 mg d'anticorps activé), on ajoute 0, 87 ml dtune solution de chaîne A de ricine dans le même tampon (concentration 6,6 mg/ml) et effectue l'incubation à 25 C pendant 20 heures. On chromatographie le mélange réactionnel sur colonne de gel de Sephadex G 1 OO Dans chaque fraction, on détermine la concentration en anticorps par spectrophoto- métrie à 280 nm et celle de la chaîne A par son pouvoir inhibiteur de la protéosynthèse mesurée sur un système acellulaire On réunit les fractions identiques contenant le conjugué et on obtient ainsi environ 11 mg du conjugué à la concentration de 0,8 mg/ml. Les déterminations analytiques effectuées permettent de montrer que la solution contient 140 yg/ml de chaîne A biologiquement active, soit environ 1,1 mole de chaîne A par mole d'anticorps. Une étude effectuée par cytofluorométrie a en outre permis de montrer que l'anticorps anti- cellules T humaines utilisé, l'anticorps activé corres- pondant et le conjlugué de cet anticorps avec la chaîne A de la ricine présentent des histogrammes de fluorescence superposables permettant d'affirmer que l'anticorps n'a subi aucune altération importante aux cours des réactions d'activation et de couplage aux- quelles il a été soumis et en particulier qu'il reste capable, au sein même du conjugué, de reconnaître l'anti- gène T humain contre lequel il est dirigé. Le conjugué, selon l'invention, obtenu précédemment a été étudié en ce qui concerne ses proprié- tés biologiques et plus spécialement son action anti- cancéreuse. 1) INHIBITION DE LA PROTEOSYNTHESE La propriété biologique fondamentale de la chaîne A de ricine est d'inhiber la protéosynthèse cellu- laire par altération de la sous-unité ribosomale 60 S. On a utilisé ici un modèle cellulaire Ce test mesure l'effet des substances étudiées sur l'in- corporation de 14 C-leucine dans les cellules cancéreuses en culture. Les cellules utilisées appartiennent à la lignée cellulaire CEM issue d'une leucémie T humaine qui porte l'antigène T 65 Les cellules sont incubées en présence de la substance à étudier puis, en fin drin- cubation, on procède à la mesure du taux d'incorporation de 14 C-leucine par les cellules ainsi traitées. Cette mesure est effectuée selon une technique adaptée de la technique décrite dans Journal of Biological Chemistry 1974, 249 ( 11), 3557-62 utilisant le traceur 14 C-leucine pour la détermination du taux de protéosynthèse La détermination de la radioactivité incorporée est effectuée ici sur les cellules entières isolées par filtration. A partir de ces déterminations, on peut tracer les courbes effets/doses présentant en abscisse la concentration molaire en chaîne A des substances étudiées et en ordonnée l'incorporation de l C-leucine exprimée en pourcentage de l'incorporation des cellules témoins en l'absence de toute substance affectant la synthèse protéique. On peut ainsi déterminer pour chaque substance étudiée la concentration qui inhibe 50 % de l'incorporation de 14 C-leucine ou "concentration inhibi- trice 50 " (CI 50). La figure 1 représente les courbes obtenues dans la même expérience avec la ricine, avec sa chaîne A libre et avec le conjugué RT 2, (composé préparé selon l'exemple 1), en présence et en l'absence de chlorure d'ammonium 10 m M dans le milieu d'incubation. Même l'absence de chlorure d'ammonium et après incubation de 48 h on peut constater sur cette figure que le conjugué étudié RT 2 présente une forte activité cytotoxique (Cl 50 = 7 x l O 12 M), environ 7000 fois supérieure à celle de la chaîne A de ricine. 2) POTENTIALISATION DE L'ACTIVITE DUCONJUGUERT 2 PAR LE CHLORURE D'AAMMONIUM Commne le montre aussi la figure 1, la pré- sence de chlorure d'ammonium 10 m M dans le milieu d'incubation des cellules avec le conjugué RT 2, augmente de façon très importante environ 80 fois l'activité cytotoxique du conjugué sur les cellules-cibles Cet effet potentialisatei-r n'est pas obtenu ni avec la ricine, ni avec la chaîne A, ni avec un conjugué non spécifique des cellules étudiées Ainsi, en présence de chlorure d'ammonium conmme agent potentialisateur, l'activité cytotoxique du conjugué (CI 50 = 8,5 10 14 M) devient environ 600 000 fois plus élevée que celle de la chaîne A seule et dépasse même en puissance l'activité de la ricine, ce qui n'a jamais été décrit pour aucun conjugué entre la chaîne A de ricine et un anticorps quelconque. Les conjugués préparés selon l'invention présentent par eux-mêmes une forte activité cytotoxique spécifique vis-à-vis des lignées cellulaires de leucémies T humaines Ils peuvent donc être utilisés en thérapeutique humaine dans le traitement des leucémies T ou de toute autre affection, cancéreuse ou non, dans laquelle il conviendrait de détruire sélectivement des cellules qui seraient sensibles au conjugué préparé selon l'inven- tion Ceci est envisageable dans les transplantations ou dans certaines maladies autoimmunes pour diminuer l'acti- vité des lymphocytes T ou de telle sous-population de lymphocytes T. Si l'on tient compte en outre de l'effet potentialisateur très important du chlorure d'ammoniun sur ltactivité de ces conjugués vis-à-vis des cellules- cibles correspondantes-, il est possible de tirer parti de cette propriété nouvelle en vue d'accroitre l'effi- cacité thérapeutique du conjugué dans le traitement des maladies auxquelles il s'applique Cette amélioration peut être exploitée selon deux schémas thérapeutiques différents: a) on peut traiter in vitro par le conjugué RT 2 en présence de chlorure d'ammonium des prélèvements de moelle osseuse humaine provenant de patients notamment leucémiques Cette association présentant une efficacité cytotoxique très élevée ettrès spécifique, il est possible d'éliminer de la moelle ainsi traitée toute cellule portant l'antigène reconnu par le conjugué et en particulier toute cellule tumorale. Par ailleurs, le patient peut être traité par toute thérapeutique appropriée telle que radiothérapie et/ou chimiothérapie à dose supralétale de façon à éliminer les cellules tumorales de son organisme Enfin la moulle, purifiée comme indiqués est transplantée à nouveau dans l'organisme du patient sous forme de greffe autologue pour permettre la reconstitution des populations de cellules sanguines détruites par le traitement supralétale. b) l'application de la propriété potentiali- satrice du chlorure d'ammonium chez le patient in vivo peut aussi être exploitée pour obtenir l'efficacité maximale du conjugué En effet, il a été montré que des souris chez qui on a préalablement transplanté des cellules tumorales et à qui on administre le conjugué en même temps que 3 injections de 7 mg de chlorure d'ammonium espacées toutes les 15 minutes, présentent un meilleur pourcentage de survie et une meilleure in- hibition de croissance de la tumeur que ne présentent les souris-témoins ayant reçu le conjugué seul. Ces conjugués sont conditionnés pour être utilisés par voie injectable Ils-peuvent être utilisés soit seuls, soit associés au chlorure d'ammonium, soit associés à un autre traitement de l'affection cancéreuse concernée et>en particulier, associés à d'autres médi- caments immunodépresseurs afin de retarder et d'affaiblir la réaction immunitaire naturelle du patient vis-à-vis de la protéine étrangère à son organisme que représente le conjugué. Visant à éliminer la totalité des cellules cancéreuses, le traitement devra être effectué avec une dose suffisante de conjugué et la durée du traitement devra être déterminée dans chaque cas en fonction du sujet et de la nature de l'affectation à traiter. REVENDICATIONS 1 i Médicament anticancéreux, caractérisé en ce qu'il contient au moins un produit constitué par la chaîne A de la ricine conjugué au moyen d'un pont disulfure avec au moins une fraction d'un anticorps mono- clonal de spécificité anti-cellules leucémiques. 2 Médicament anticancéreux selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit anticorps monoclonal est un anticorps monoclonal connu sur lequel a été introduit le groupement SH activé. 3 Médicament selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit groupement SH activé est sous la forme d'un pont disulfure reliant ledit anticorps et un radical organique activateur connu. 4 Médicament selon la revendication 1, caractérisé en ce que comme anticorps monoclonal on utilise le fragment Fab' de cet anticorps. Médicament selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il contient en outre du chlorure d'ammonium. 6 Procédé de préparation du principe actif du médicament selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on utilise un anticorps substitué par un atome de soufre activé ayant pour formule: AC R S S X dans laquelle AC est l'anticorps monoclonal choisi, S est le soufre, X désigne un radical activateur et que l'on fait réagir ledit produit sur le thiol de la chaîne A de la ricine. 7 Procédé de préparation du principe actif du médicament selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'on pré- pare tout d'abord, selon des procédés connus, le fragment Fab' de l'anticorps, puis on transforme ledit fragment en un disulfure mixte activé que lon fait réagir avec le thiol de la chaîne A de la ricine.