FR 2515354 A1 19830429 FR 8120179 A 19811027 1.- La présente invention a pour objet un procédé de mise en oeuvre d'analyses en chimie biologique ainsi qu'un dispositif et un appareillage permettant la mise en oeuvre de ce procédé. Depuis longtemps, on a cherché à effectuer de manière automatique diverses analyses habituelles en chimie biologique, et par suite, un certain nombre de procédés ainsi que de dispositifs ont déjà été proposés sur le marché. Ces dispositifs et appareillages sont basés sur des technologies différentes, parmi lesquelles on peut no- ter le transfert des liquides par pompes péristaltiques (Techni- con), ou le tranfert des liquides par la force centrifuge (Cen- trifichem, Cobas). Depuis quelques temps, on a proposé des systèmes séquentiels, c'est-àdire réalisant automatiquement plusieurs étapes de l'analyse qui utilisent un dispositif jetable à dose unitaire des réactifs Ces appareillages, de par leur côté pra- tique et leur faible coftt de revient, sont appelés, dans l'ave- nir, à connaitre un développement important, et attirent de plus en plus l'intérgt des techniciens. Parmi les exemples de tels types d'appareillage qui ont déjà été proposés, on peut noter le système ACA de DUPONT DE NEMOURS qui utilise des cassettes de réactifs consti- tuées d'une enveloppe de plastique souple accrochée à une bar- rette rigide Dans ce dispositif, la barrette supporte un code et l'enveloppe plastique est équipée de plusieurs cavités qui contiennent des réactifs en solution ou sous forme de éompri- més, et une cavité qui sert au mélange de l'échantillon et des réactifs. Par ailleurs, il a également été mis au point une installation permettant l'utilisation de ces cassettes de manière totalement automatique. Dans le m 8 me ordre d'idée, on peut mentionner également le dispositif Ektachem de KODAK qui utilise des films de 30 x 40 mm environ, formés de plusieurs couches de papier: certaines couches renferment les réactifs nécessaires, la couche supérieure est destinée à assurer la bonne répartition de l'é 6 chantillon déposé à la surface et la couche inférieure sert à réfléchir le faisceau lumineux utilisé pour le dosage par ré- flexion à travers les couches semi-transparentes. 2.- Cependant, les dispositifs et appareillages men- i.or ris ci-dessus rie sont pas sans présenter un certain nombre d'inconvénients, étant dionné que l'utilisation de réactifs sous forme de dossunitaire se heurte à la difficulté de conservation de certains des réactifs utilisés en chimie biologique. En effet, certains de ces réactifs d'origine biologique (principalement les enzymes et les anticorps) doivent Otre lyophilisés ou mis sous forme de comprimés, ce qui augmente notablement la difficulté de fabrication et la longueur néces- saire à la mise en oeuvre des analyses. La présente invention a pour objet de remédier à ces inconvénients, tout en proposant un procédé, un disposi- tif et un appareillage permettant d'utiliser les avantages des solutions mentionnées ci-dessus, c'est-à-dire l'utilisation de "cassettes"t renfermant des doses unitaires de réactifs spé- cifiques aux tests, dans lesquelles il ne reste plus qu'à ajou- ter l'échantillon à doser et un diluant, la cassette contenant la dose de réactifs étant ensuite purement et simplement jetée. A cet effet, la présente invention se rapporte à un procédé de mise en oeuvre d'analyses en chimie biologique par lequel on utilise des doses unitaires de réactifs, caracté- risé en ce que l'on absorbe une dose unitaire de réactifs biolo- giques liquides ou en solution sur un support solide constitué par une substance poreuse, notamment du papier, on la sèche et on la désorbe de son support au moment de son utilisation par action d'un solvant aqueux approprié. Il est en effet reconnu qu'une alternative à la conservation par lyophilisation des produits d'origine biologique est l'introduction de ce produit dans une matrice poreuse et rigide qui lui sert de protection. la présente invention est donc basée sur cette propriété qu'ont les substances poreuses, et plus particulière- ment certains types de papier, de maintenir intactes les proprié- tés des substances biologiques qui y ont été absorbées en solu- tion puis séchées. Il 'agit là d'un procédé original, étant donné qu'il comporte une étape de désorption du réactif biologique de son support, par action d'un solvant aqueux appropri 4. Conformément à 1 'invention, le matériau absor- tant peut être du papier _t plus particulièrement les papiers 3.- tels que ceux Réf 2992 de Schleider et Schull et Réf 818 de Macherey-Nagel, du coton sous différentes formes absorbantes, ou également des fibres synthétiques sous des formes absorbantes. L'objectif est d'obtenir une matrice semi-rigide poreuse qui protégera les substances biologiques, Selon une autre caractéristique de l'invention, pour réaliser l'absorption de la dose unitaire de réactifs, on ajoute un volume connu d'une solution aqueuse de ces réactifs, à une concentration connue, l'évaporation de l'eau contenue dans la solution absorbée pouvant s'effectuer à l'air libre, sous air deshydraté ou dans un lyophilisateur. Dans tous les cas, la stabilité est assurée se- lon des conditions de séchage qui peuvent varier d'une substan- ce à l'autre mais qui nécessitent toujours une deshydratation assez complète. Par ailleurs, il a été également reconnu que, selon le support solide choisi, la substance à protéger désorbe plus ou moins vite. Un conséquence, et selon une autre caractéristi- que de l'invention, on ajoute au réactif, préalablement à son absorption, un agent susceptible d'accélérer sa désorption, tel que par exemple une protéine Par exemple, dans le cas des en- zymes et des anticorps, on ajoute une quantité de sérum albumine bovine égale à 5 à 20 fois la quantité pondérale du réactif. Par ailleurs, et selon une autre caractéristique de l'invention, l'étape de désorption se compose en fait de deux étapes qui peuvent être dans certains cas quasi-simulta- nées. En effet, on réhydrate tout d'abord le support solide par une solution aqueuse et quelque fois tamponnée, telle que par exemple le tampon phosphate p H 7,4, ensuite, on sépare de ce support solide la solution aqueuse imprégnante. Les modalités de mise en oeuvre du procédé dé- crit ci-dessus, ainsi que les dispositifs tels que les cassettes utilisées, peuvent être de plusieurs types, permettant une mi- se en oeuvre plus ou moins automatisée, sans pour cela sortir du cadre de l'invention. Notamment, et selon une autre caractéristique de l'invention, on dépose la dose unitaire de réactif (s) sur un ou plusieurs support (s) constitué (s) par un disque de papier 4._ que l'on laisse sécher à l'air, puis, on place sous atmosphère sèche le ou les disques(s) de papier dans un tube similaire au tube en plastique couramment utilisé en biologie que l'on ferme et ouvre pour y insérer la substance à analyser et effectuer-la désorption, puis on aspire la solution contenue dans le tube pour la transférer dans un appareillage d'analyse biologique connu en lui-même, notamment un photomètre à cellule de lecture fixe. Il s'agit là en fait du processus d'application le plus simple du procédé qui est à la base de la présente de- mande; ce procédé particulièrement simple est bien adapté aux dosages des analytes non enzymes telles que l'urée, le glucose, le cholestérol, l'acide urique, etc Dans le cas o le test nécessite l'addition de deux réactifs, non pas simultanément, mais à des temps différ é rente, il est possible que le second réactif soit déposé hors du tube, sur une feuille de papier mise dans une enveloppe plas- tique souple et étanche Ces doses unitaires sont alors empilées en paquets et disposées dans un magasin alimentant par un sys- tème à tiroir un système perforant qui découpe des disques au diamètre voulu dans le papier et les enveloppes Le mandrin perforant pousse ensuite les disques dans le tube situé en- dessous. La mesure optique ne s'effectue bien entendu pas dans le tube à cause de la présence des disques de papier, mais par exemple dans un photomètre à cellule de lecture fixe o la solution contenue dans le tube est aspirée. Une variante du procédé ci-dessus est caracté- risée en ce que l'on pose les disques de papier sur lesquels ont été déposés les réactifs sur un support venant se placer à l'extrémité supérieure d'un tube d'analyse biologique de type classique, on ajoute dans le tube la substance à analyser et sur ce ou ces disque(s) de papier les liquides nécessaires à la mise en oeuvre de l'étape de désorption, puis on pousse les liquides réactionnels à l'intérieur du tube en exerçant une pres- sion d'air sur son sommet, et on effectue l'analyse notamment à l'aide d'un appareillage de mesure optique. Lors de la mise en oeuvre de ce procédé, il est nécessaire que la décroissance de la pression soit réalisée len- tement afin d'éviter que les disques ne soient projetés au-dessus ,- du tube. Selon l'invention, et dans certains cas particu- liers, pour lesquels la substance à analyser est constituée par une substance pouvant elle aussi Ètre absorbée et désorbée facilement, telle que par exemple le sang, on peut également utiliser le processus cidessus en absorbant en plus cette substance à analyser sur un support solide tel qu'un disque de papier similaire au support utilisé pour le ou les réactifs, Dans ce cas, la désorption des substances à analyser s'effectue d'une manière identique à la désorption des doses unitaires de réactifs, La présente invention se rapporte également à un dispositif permettent la mise en oeuvre du procédé décrit ci- dessus. Ce dispositif est caractérisé en ce qu'il se compose d'un tube d'analyse de type classique ainsi que d'un support venant se placer à son extrémité supérieure. Cependant, dans le cas ol pour réaliser l'ana- lyse, au moins deux réactifs doivent être ajoutés à des temps différents, il devient impossible d'utiliser des tubes d'analyse de type classique, tels qu'ils ont été décrits ci-dessus. A cet effet, la présente invention propose éga- lement un dispositif permettant la mise en oeuvre du procédé décrit cidessus, dans le cas o plusieurs réactifs doivent être ajoutés à des temps différents. Ce dispositif est caractérisé en ce qu'il se compose d'une cassette en forme de parallélépipède creux en na- tériau plastique dont l'un des petits c 8 tés est ouvert et des- tiné à recevoir un bouchon supportant au moins deux c 8 nes en plastique ouverts à leurs extrémités équipés chacun d'un c 8 ne en papier filtre destiné chacun à recevoir une solution de réac- tifs, le bouchon comportant en outre, un trou destiné à permet- tre l'introduction des substances à analyser. les c 8 nes en plastique sont en fait identiques pour leur forme à ceux utilisés dans les pipettes à embout je- table Bien entendu, ils seront prévus en nombre correspondant au nombre de réactifs à utiliser. Dans le cas o, comme mentionné précédemmen;, la substance à analyser est elle aussi absorbée sur un support solide similaire à celui o sont absorbés les réactifs, le tror destiné à permettre l'introduction des substances à analyser peut être supprimé et un cone en plastique supplémentaire est prévu. La présente invention se rapporte également à une installation permettant, notamment à partir du dispositif décrit cidessus, la mise en oeuvre de façon automatique du procédé objet de l'invention. Cette installation est caractérisée en ce qu'elle se compose d'un poste d'échantillonnage, équipé d'un diluteur dans lequel on prélève la substance à analyser et on l'introduit avec un volume donné de diluant dans la cassette, un poste d'analyse dans lequel on effectue l'introduction de la cassette ainsi que de données sur le patient, et le dosage à effectuer dans l'appareillage d'analyses biologiques, ainsi qu'un magasin de stockage des cassettes. Le poste d'échantillonnage, ainsi que le maga- sin de stockage des cassettes, sont en fait des dispositifs qui sont confis en eux-mêmes, et ne nécessitent donc pas une des- cription plus précise dans le cadre de cet exposé. Le diluteur peut être un produit commercial ac- tuellement disponible; il en existe beaucoup de modèles dont certains sont très satisfaisants Le magasin de cassettes, s'il doit 8 tre construit aux dimensions des cassettes ne comporte aucune innovation particulière Il suffit simplement que l Vac- cès à tous les types différents de cassettes soit facile et ra- pide Un tourniquet portant un nombre de magasins verticaux cor- respondant au nombre de cassettes différentes, avec prélèvement manuel, simple par glissement au bas du magasin, donne toute sa- tisfaction. 301 Selon une autre caractéristique de l'invention, le poste d'analyse comporte deux disques dont l'un est fixe et dont l'autre est mobile selon un mouvement pas-à-pas et comporte à sa périphérie des orifices destinés à recevoir les cassettes d'analyse; les cassettes sont maintenues par la table tournante, mais glissent sur la table fixe, et les deux disques sont situés à une certaine distance l'un de l'autre pour permettre l'inser- tion de l'appareillage d'analyse biologique, notamment des con- duits de _umière du Jdisp-sittf de mesure optique. Les d 5 sies tifs permettant la mise en oeuvre du pro-Jéde seic 1 N neuto: o: dalotits plus en détails en se 7.- référant aux dessins annexés qui représentent deux variantes de ce dispositif Selon la figure 1 imn dispositif particulière- ment simple permettant la mise en oeuvre du procédé décrit ci- dessus est constitué par un tube d'analyses biologiques 10 de type classique à l'extrémité supérieure 11 duquel vient se placer un support annulaire 12 en un matériau quelconque, notam- ment en métal ou en un matériau synthétique, Ce support 12 pré- sente à son extrémité inférieure un orifice 13 permettant le passage des liquides nécessaires à la mise en oeuvre de l'éta- pe de désorption et à son extrémité supérieure un rebord 14 qui vient s'appuyer sur les extrémités supérieures 11 du tube 10 pour permettre de maintenir le support 12. La figure 2 se rapporte à un dispositif permet- tant d'effectuer des analyses biologiques dans lesquelles au moins deux réactifs doivent être ajoutés à des temps différents. Ce dispositif se compose d'une cassette 1 en forme de parallélépipède creux en matériau plastique dont l'un des petits côtés 2 est ouvert et reçoit un bouchon 3 qui suppor- te au moins deux cônes 4 et 5 équipés chacun de c Snes en papier filtre 40 et 50 destinés chacun à recevoir une solution de réac- tifs Le bouchon 3 comporte, en outre, un trou 6 destiné à per- mettre l'introduction des substances à analyser. Les différentes variantes correspondant au pro- cédé qui fait l'objet de l'invention seront décrites plus en détail en se référant aux exemples ci-après EXEMPLE 1 - Préparation et mise en oeuvre d'une analyse de glucose à l'aide du dispositif représenté sur la figure 1. Le réactif suivant a été préparé dans 5,6 ml d'eau distillée (méthode de Barthelmai et Crock) s Hexokinase (source: levure) 15 UI Glucose 6 phosphate deshydrogérase 15 UI (source: leuconostoe mésentéroldes) Adénosine triphosphate 16,95 mg Nicotamide Adénine Dinucléotide 7,5 mg Chlorure de magnésium en tampon triéthanol-amine 51,3 mg Chlorhydrate de triêthanolamilc 139 mg 2 x 150 microlitres du réactif décrit ci-dessus ont rté déposés 8.- sur deux dlxues de 12 mm de diamètre en papier Réf 2992 de Schleicher et Schull (U S A) Ces disques ont été posés sur un support mince pour autoriser une circulation aussi complète que possible de l'air autour du papier. Une lampe infrarouge a été dirigée sur les deux disques afin d'acoélérer le séchage Après quarante minutes, les deux papiers étaient sacs. Deux supports de diamètre extérieur 14 mm cor- respondant au dispositif représenté sur la figure 1 ont été équipés avec les deux disques ci-dessus Dans deux tubes, on a ajouté 5 microlitres d'un sérum à concentration connue de glu- cose dilué avec 50 microlitres d'eau distillée Les deux sup- ports précédemment décrits ont été disposés respectivement au- dessus des deux tubes, et 350 microlitres d'eau distillée ont été rajoutés sur chacun des deux supports. Après une minute, une pression d'air a été exercée au-dessus du support à l'aide d'une seringue et d'un bouchon. Après six minutes de contact entre le sérum di- lué et le réactif, une mesure a été effectuée sur un appareil Centrifichem 500 à 340 manomètres à 30 C. On a ai si lu deux valeurs très voisines, à savoir 0,75 et 0,77 g/litre inférieures à la valeur réelle du sérum ( 0,88) car l'incubation a eu lieu à une température infé- rieure ( 27 c 00 au lieu de 3000 C). EX 4 MPLE 2 f - Préparation et mise en oeuvre d'une analyse de glucose en uti- lisant un dispositif analogue à celui représenté sur la fi- gure 2. On a utilisé un réactif correspondant à celui qui a été utilisé pour l'exemple 1. microlitres de ce réactif ont été disposés sur un embout de pipette équipé d'un filtre Réf 2992 de Schleicher et Schull Ceci a été répété sur un deuxième embout. Les deux embouts ont été mis à sécher en uti- lisant un jet d'air sec et chaud à 350 C dirigé sur le haut des embouts. Le papler a ainsi séché en environ 30 minutes, et a éte conservé airf pendant 24 heures. Afin de tien vérifier que l'élution du réactif 9.- donne un résultat convenable, 150 microlitres d'eau distillée ont été rajoutés au-dessus de chacun des deux embouts et poussés à l'aide d'une pipette dans deux cuvettes d'un disque de trans- fert de Centrifichem 500, les deux positions "échantillon" de ces deux cuvettes ayant été préalablement remplies avec 5 mi- crolitres (dilués avec 50 microlitres d'eau distillée) d'un sérum à concentration de glucose connue. Après 6 minutes d'incubation à 30 C 0, le résultat a été lu à 340 nanomètres On a trouvé des valeurs de 0,84 et 0,87 g/litre pour une valeur connue de 0,88 g/litre. R E V N D 1 CA T I O N S 1. Procédé de m-se en oeuvre d'analyses en chimie-biologique par lequel on utilise des doses unitaires de réactifs, caractérisé en ce que l'on absorbe une dose unitaire de réactifs biologiques liquides ou en solution sur un support solide constitué par une substance poreuse notamment du papier, on la sèche et on la désorbe de son support au moment de son utilisation par action d'un solvant aqueux approprié. 2. Procédé selon la revendication 1, caracté- risé en ce que pour réaliser l'absorption de la dose unitaire de réactifs, on ajoute un volume connu d'une solution aqueuse de ces réactifs à une concentration connue, l'évaporation de l'eau contenue dans la solution absorbée pouvant s'effectuer à l'air libre, sous air deshydraté, ou dans un lyophilisateur. 3 Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 et 2, caractérisé en ce que l'on ajoute aux réactifs, préalablement à leur absorption, un agent susceptible d'accélé- rer la désorption. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 ? 3, caractérisé en ce que l'agent susceptible d'accé- lérer la désorption est une protéine et notamment de la sérum- albumine bovine. 5. Procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on effectue la désorp- tion en deux étapes, la première de ces étapes étant constituée par une réhydratation du support solide par une solution aqueuse, le cas échéant tamponnée, et la seconde par une séparation du support solide et de la solution des réactifs. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 5, caractérisé en ce que l'on dépose la dose uni- taire de réactif(s) sur un ou plusieurs support(s) constitué(s) par un disque de papier que l'on laisse sécher à l'air, puis on place sous atmosphère sèche le ou les disque(s) de papier dans un tube similaire aux tubes en plastique couramment utili- sés en biologie que l'on ferme et ouvre pour y insérer la subs- tance à analyser et effectuer la désorption, puis on aspire la solution contenue dans le tube pour la transférer dans un appa- reillage d'analyse biologique connu en lui-même, notamment un photomètre à cellule de lecture fixe. 7 Proce 11 o - ations 1 à 6, caractérisé en ce que l'on pose le ou les disque(s) de papier sur lequel (lesquels) a ou ont été déposé(s) le ou les réactif(s) sur un support venaiu: se placer à l'extrémité supérieure d'un tube d'analyse biologique de type classique, on ajoute dans le tube la substance à analyser et sur ce ou ces disque(s) de papier les liquides nécessaires à la mise en oeuvre de l'étape de désorption, puis on pousse les liquides réaction- nels à l'intérieur du tube en exerçant une pression d'air sur son sommet et on effectue l'analyse notamment à l'aide d'un appareillage de mesure optique. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 7, dans lequel la substance à analyser est consti- tuée par du sang ou une substance autre pouvant Otre absorbée et désorbée facilement, caractérisé en ce que l'on absorbe cet- te substance à analyser sur un support solide tel qu'un disque de papier similaire au(x) support(s) utilisé(s) pour le ou les réactif(s). 9. Dispositif permettant la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, carac- térisé en ce qu'il se compose d'un tube d'analyse de type clas- sique ainsi que d'un support venant se placer à son extrémité supérieure. 10. Dispositif permettant la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 dans le cas d'analyses biologiques dans lesquelles au moins deux réactifs doivent être ajoutés à des temps différents, caracté- risé en ce qu'il se compose d'une cassette en forme de parallé- lépipède creux en matériau plastique dont l'un des petits côtés est ouvert et destiné à recevoir un bouchon supportant au moins deux cônes en plastique équipés chacun d'un cône en papier fil- tre destiné chacun à recevoir une solution de réactifs, le bou- chon comportant en outre, un trou destiné à permettre l'intro- duction des substances à analyser. 11 Installation permettant, à partir des dis- * positifs selon les revendications 9 et 10, la mise en oeuvre de façon automatique du procédé selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 8, installation caractérisée en ce qu'elle se compose d'un poste d'éthantillonnage équipé d'un diluteur dans lequel on prélève la sub óance à anal;fer et on l'introduit avec un volume donné de di luant dans la cassette, un poste 12.- d'analyse dans lequel on effectue l'introduction de la cassette ainsi que de ioanes S lu e patient, et le dosage à effectuer dans l'apparellage d'analyse biologique, ainsi qu'un magasin de stc'o age des ctasseittes. 142 Installation selon la revendication 11, aa:- térisée en ce que le poste d'analyse comporte deux disques dont l'un est fixe et dont l'autre est mobile selon un mouvement pas-à-pas et comporte, à sa périphérie, des orifices destinés recevoir les cassettes d'analyse, les deux disques étant si- tués à une certaine distance l'un de l'autre pour permettre l'insertion de l'appareil d'analyse biologique, notamment des conduits de lumière d'un photomètre à cellule de lecture fixe, les cassettes étant maintenue par la table tournante mais glis- sant sur la table fixe.