FR 2521166 A1 19830812 FR 8301792 A 19830204 2521 166 PROCEDE ET DISPOSITIF POUR INJECTER DE TRES PETITES QUANTI- TES D'ECHANTILLONS EXPERIMENTAUX DANS DES CELLULES. La présente invention se rapporte à un procédé pour injecter, en particulier dans des cellules, de très petites quantités d'échantillons expérimentaux, au moyen d'un micro-capillaire dont l'une des extrémités comporte une pointe dont le diamètre interne est de l'ordre de quelques micromètres, un liquide expérimental étant introduit dans le microcapillaire et l'espace interne dudit capillaire étant soumis, lors de l'injection, à une pression d'injec- tion qui est appliquée à l'autre extrémité du capillaire et qui provoque un écoulement de liquide expérimental hors de la pointe. Dans un procédé connu de ce type ( Graessmann A, Graessmann M et M ller C, " Methods in enzymology ", Volu- me 65, 1980, pages 816 à 825), l'espace interne du capillai- re est raccordé à une seringue d'injection manuelle Pour injecter l'échantillon expérimental, une poussée de durée correspondante est exercée à la main sur le piston d'injec- tion Il s'est toutefois avéré que, très souvent, la pointe du microcapillaire ne permet plus un libre écoulement après qu'un certain nombre de cellules a été soumis à inoculation, ce qui oblige à utiliser un nouveau micro-capillaire. La présente invention a par conséquent pour objet, dans un procédé du type précité, de réduire au moins forte- ment le risque d'obstruction de la pointe du micro-capillaire pendant son utilisation. Selon les caractéristiques essentielles du procédé de l'invention, après l'injection de la quantité expérimen- tale souhaitée, on fait baisser la pression qui règne dans l'espace interne du capillaire pour la faire passer de sa valeur de pression d'injection à une valeur de pression de retenue inférieure à ladite pression d'injection différant de zéro et en présence de laquelle sensiblement plus aucun liquide expérimental ne s'écoule de la pointe; et cette pression de retenue est maintenue jusqu'au début de l'injection suivante Il s'est avéré que cette pression de retenue empêche de manière fiable un blocage de la pointe lors d'injections répétées. Il s'est révélé particulièrement efficace d'utili- ser une pression de retenue dont la valeur représente de 0,1 à 0,5 fois,, de préférence de 0,2 à 0,3 fois et, de maniè- re optimale, environ 0,25 fois la valeur de la pression d'in- jection. Pour accélérer la première sortie, par la pointe, du liquide expérimental introduit dans l'espace interne du capillaire, et pour supprimer éventuellement une obstruction initiale de cette pointe, l'invention propose que, après l'introduction du liquide expérimental et avant sa première injection, l'espace interne du capillaire soit balayé par une haute pression dont la valeur dépasse celle de la pression d'injection Pour exclure également l'apparition d'obstruc- tions ou de dépôts à l'intérieur de la pointe du capillaire après de nombreuses injections successives, l'invention pro- pose de balayer l'espace interne dudit capillaire par la haute pression, de manière répétitive,après chacune desdites injections Dans ce cas, la valeur de la haute pression peut représenter environ de 5 à 100 fois, de préférence de 10 à 30 fois et, de manière optimale, environ 17 fois la valeur de la pression d'injection. L'invention propose que la pression d'injection soit de 0,01 bar à 0,5 bar, de préférence de 0,1 bar à 0,2 bar et, de manière optimale, d'environ 0,12 bar On peut ainsi obtenir des débits d'injection extrêmement faibles, qui peuvent atteindre entre 10-il et 10 13 ml de liquide expéri- mental par seconde En fonction de la durée de l'injection, on peut inoculer dans les cellules individuelles des quanti- tés expérimentales comprises entre 10 il et 10 ml La dimen- sion des cellules concernées peut alors être inférieure à pm, voire même à 60 pm. Dans le procédé connu du type précité, pour emplir le micro-capillaire de liquide expérimental, la pointe de ce capillaire est plongée dans ledit liquide et une dépres- sion est engendrée dans l'espace interne du capillaire par une traction exercée sur le piston d'injection Le processus d'aspiration dure relativement longtemps; de plus, il faut préparer une quantité de liquide expérimental supérieure à celle qui est nécessaire pour l'injection Conformément à l'invention, pour éviter ces inconvénients, le liquide expé- rimental est introduit par l'autre extrémité du capillaire, de préférence au moyen d'un capillaire de remplissage dont le diamètre externe est plus petit que le diamètre interne du micro-capillaire, l'extrémité de sortie dudit capillaire de remplissage étant préalablement enfilée dans ledit micro- capillaire jusqu'au voisinage de la pointe de ce dernier. Etant donné que le liquide expérimental est introduit dans la région de la pointe du capillaire, cela supprime le ris- que de voir le liquide expérimental, s'écoulant le long de la face interne de la paroi du capillaire, drainer des impu- retés qui y adhérent, ce qui peut à nouveau entraîner une obstruction de la pointe Par ailleurs, à la différence du procédé connu, on ne constate pratiquement aucune perte de liquide expérimental par évaporation lors de son introduc- tion. Le document cité au début du présent mémoire décrit un procédé de fabrication des micro -capillaires devant être utilisés pour le procédé d'injection Dans ce cas, un tube capillaire est serré par ses deux extrémités dans les mâchoi- res d'un dispositif d'étirage, un tronçon tubulaire situé entre ces mâchoires est chauffé au moyen d'une bobine à filament chauffant qui entoure le tube, puis le tube capillai- re est finalement étiré par un déplacement desdites mâchoires à l'écart l'une de l'autre, ce qui fait qu'on obtient deux micro-capillaires munis chacun d'une pointe Dans ce procédé connu, le tube capillaire est passé à la main dans la flamme d'un bec Bunsen avant d'être serré dans le dispositif, si bien que le tronçon tubulaire précité est,d'emblée, déjà soumis à une striction plus ou moins forte L'inconvénient réside alors d'une part dans le fait que les micro-capillai- res obtenus de cette manière présentent des dimensions diffé- rant pdus ou moins fortement les unes des autres, et en 1 o particulier des pointes de diamètres internes différents En outre, ce procédé de fabrication est fatigant et relative- ment long En revanche, pour obtenir de manière simple et rapide des mnicro-capillaires de dimensions reproductibles, le tube capillaire uniforme sur toute sa longueur est placé dans le dispositif d'étirage sans étirage manuel préalable. -Le document précité propose également de soumettre le tube capillaire à un lavage avant son étirage, de façon à éviter des obstructions de sa pointe dues à des impuretés préséntes dans l'espace interne du capillaire Alors que, dans ce procédé connu, on utilise un mélange de H 2504 et de HNO 3, l'invention propose de laver le tube capillaire à l'éthanol pendant au moins 1 heure avant son étirage, puis de le faire sécher, de préférence immédiatement après, pen- dant environ 30 minutes à environ 1300 C On obtient de la sorte des résultats de lavage particulièrement bons. De plus, il s'est avéré avantageux de rendre le tube capillaire hydrophobe avant son étirage, de préférence par un traitement au diméthyldichlorsilane dans l'éthanol, ou avec une solution de traitement au silicone dans l'éther ( 1:3). L'invention concerne aussi un dispositif pour la mise en oeuvre du procédé d'injection Il est connu ( docu- ment précité) d'engendrer la pression d'injection à l'aide d'une seringue actionnée manuellement L'inconvénient réside alors dans le fait qu'il n'est pratiquement pas possible de régler la pression d'injection de manière reproductible à une valeur constante prédéterminée La possibilité d'un fonc- tionnement automatique ne s'offre pas non plus Pour pallier ces inconvénients, le dispositif selon l'invention est carac- térisé en ce qu'il comporte au moins une source de pression délivrant une pression constante et se présentant de préfé- rence sous la forme d'une bouteille de gaz comprimé. Pour pouvoir soumettre à inoculation le plus grand nombre possible de cellules par unité de temps, la commande doit être la plus simple possible Il suffit d'uti- liser pourcette commande un bouton unique lorsque, comme le propose l'invention, un distributeur à trois positions actionné à la main est intercalé entre au moins l'une des sources de pression et le microcapillaire, de telle sorte que ce micro-capillaire soit soumis à la pression de retenue lorsque ledit distributeur occupe une première position, à la pression d'injection lorsque ce distributeur est dans une deuxième position, et à la haute pression quand ledit distributeur se trouve dans une troisième position Le distributeur à trois positions peut alors être actionné d'une main et l'autre main peut manoeuvrer le manipulateur miniaturisé associé au micro-capillaire Sans aucune forma- tion particulière ni aucun long entraînement, on peut atteindre un nombre de 400 à 800 cellules soumises à injec- tion en une heure. Conformément à l'invention, pour faire l'économie d'une source individuelle de pression de retenue, sont prévues une source de haute pression et une source de pression d'injection qui, par l'intermédiaire d'un conduit d'admission de haute pression ou d'un conduit d'admission de pression d'injection, sont reliées à un conduit principal commun débouchant dans le micro-capillaire, un clapet anti- retour s'ouvrant en direction dudit conduit principal étant éventuellement installé dans ledit conduit d'admission de pression d'injection, cependant que le distributeur à trois positions est installé dans le conduit d'admission de haute pression, ce distributeur étant en outre doté d'un troisième raccord étranglé qui, lorsque ledit distributeur est dans sa première position de distribution, est relié à la source de pression d'injection afin d'abaisser jusqu'à la valeur de la pression de retenue la pression qui règne dans ledit conduit principal. Le clapet anti-retour prévu dans le conduit d'admis- sion de la pression d'injection permet de brancher dans ce îO conduit d'admission un manomètre pour contrôler la pression d'injection et éventuellement la pression de retenue. Pour éviter que, au cours de l'injection, par suite d'une commutation involontaire du distributeur à trois posi- tions à sa troisième position de distribution, du liquide expérimental soit brusquement expulsé sous l'effet de la haute pression, il est possible, à la place dudit distribu- teur à trois positions, d'installer dans le conduit d'admis- sion de haute pression un premier distributeur à deux posi- tions et de brancher un second distributeur à deux positions dans un conduit secondaire comportant un étranglement, ce conduit secondaire communiquant en permanence avec le conduit principal, ou bien étant relié à un troisième raccord dudit premier distributeur à deux positions, qui peut être raccordé à la source de pression d'injection De ce fait, le second distributeur à deux positions sert exclusivement à assurer la sélection entre la pression de retenue et la pression d'injection, ce qui exclut des erreurs de commande Lorsque le point d'étranglement est formé par une valve d'étrangle- ment, il es It possible d'ajuster la pression de retenue de manière précise et en continu. Conformément à l'invention, pour que l'opérateur, lors de-l'injection dans les cellules,ait les deux mains libres pour actionner le manipulateur ou le microscope, le second distributeur à deux positions peut être commandé au pied. Pour faire l'économie d'une source individuelle de pression d'injection, cette source de pression d'injection est formée par une sortie à étranglement de la source de hau te pression. Une valve de détente raccordée au conduit principal peut être prévue pour faciliter les interventions de mainte- nance, par exemple pour remplacer des micro-capillaires. De surcroît, un conduit supplémentaire muni d'un robinet d'isolement peut être relié au conduit principal en vue du raccordement à une source supplémentaire de pres- sion et/ou de dépression Dans ce cas, la source de dépression peut être mise en service pour vider le dispositif par pompa- ge à des fins de nettoyage, ou bien pour vérifier des zones d'étanchéité défectueuse. L'invention va à présent être décrite plus en détail en regard des dessins annexés à titre d'exemples nul- lement limitatifs et sur lesquels: la figure 1 représente schématiquement une première forme de réalisation du dispositif d'injection selon l'inven- tion; la figure 2 représente schématiquement une deuxième forme de réalisation de ce dispositif; la figure 3 illustre schématiquement une autre variante deréalisation dudit dispositif; et la figure 4 est une élévation schématique en pers- pective représentant un micro-capillaire juste avant son remplissage. Le dispositif d'injection selon l'invention se prête particulièrement bien à l'injection de liquide expéri- mental dans des cellules vivantes et il permet d'obtenir, pour chaque cellule, de très petits volumes expérimentaux de l'ordre de 10 il à io 13 ml L'injection peut être exécutée de manière rapide et simple,de sorte qu'une courte période de familiarisation suffit pour obtenir un nombre de 400 à 800 cellules inoculées par heure Le dispositif de l'inven- tion fonctionne d'une manière extrêmement fiable, parce que le risque d'obstructions des pointes des capillaires est notable- ment réduit et que, de plus, le remplacement d'un micro-capil- laire, y compris la fabrication et le remplissage du nouveau microcapillaire, peut avoir lieu en une minute environ Le dispositif d'injection décrit ci-après,fonctionnant manuelle- ment, peut aussi être transformé sans difficultés en vue d'un fonctionnement automatique. Un micro-capillaire portant la référence 1 à sur les figures 1 à 4 et muni d'une pointe allongée 12-est fabriqué de la façon suivante: un mince tube de verre d'environ 10 cm de longueur, d'un diamètre interne de 0,7 mm à 0,8 mm et d'un diamètre externe de O,l mm est tout d'abord lavé et, à cet effet, on traite ce tube à l'éthanol pendant environ une heure, puis on le laisse s'égoutter, après quoi on le sèche enfin pendant environ 30 minutes à 130 %C En outre, ce tube capil- laire peut être rendu hydrophobe lorsqu'on le plonge dans une solution renfermant de 1 o à 2 % de diméthyldichlorsilane dans de l'éthanol, et qu'on laisse agir cette solution pendant environ 1 heure à 1300 C On peut aussi utiliser une solution de traitement au silicone ( fabriquée, par exemple, par la société SERVA) dans de l'éther ( 1:3). Ensuite, le tube capillaire est placé dans un dis- positif d'étirage non représenté et, pour cela, les deux extrémités du tube sont serrées dans des mâchoires de traction dudit dispositif d'étirage Un tel dispositif est illustré, par exemple, dans le document cité dans le préambule du présent mémoire La contrainte de traction agissant sur les mâchoires est réglée à sa valeur minimale et une bobine à filament chauffant, entourant le tube au centre de sa longueur, est alimentée en courant électrique dont l'intensité est, par exemple, de 5,7 A à 5,8 A lorsqu'il s'agit d'un dispositif d'étirage fabriqué par la société E Leitz, Wetzlar Du fait de son chauffage par la bobine à filament, le verre commence à fluer dans cette zone Sous l'effet de traction exercé par 2521 166 les mâchoires, il se forme un resserrement, dé sorte qu'on obtient pour finir deux moitiés de tube qui forment chacune un micro-capillaire présentant une pointe Le diamètre exter- ne de cette pointe est d'environ 1 pm et son diamètre inter- ne mesure environ 0,5 pm Du fait que les paramètres de traction ( force de traction des mâchoires; courant de chauffage; dimensions du tube mis en place) sont constants, on obtient des micro-capillaires de dimensions reproductibles. Le micro-capillaire 10 ainsi obtenu est ensuite l 0 placé sur un support 14 illustré sur la figure 4 Ce dernier consiste en un corps de b*ase cunéiforme 16 dont l'une des faces repose sur la base d'appui et dont l'autre face ( supé- rieure) 18, inclinée par rapport à l'horizontale, sert de zone de soutien du micro-capillaire 10 La pointe du bloc cunéiforme a été rognée par fraisage, de sorte qu'une dété- rioration de la pointe 12 est évitée lorsque le micro-capil- laire Tnest disposé avec ladite pointe 12 saillant vers le bas au-delà de la face supérieure 18 Le corps de base 16 est de nouveau biseauté à proximité de l'extrémité supéri- eure de sa face 18; une couche intermédiaire 20 en caout- chouc est collée sur la surface inclinée ainsi obtenue; cette couche 20 supporte à son tour une tête de support 22 qui, également cunéiforme, coopère avec le corps de base 16 pour conférer au support sa configuration cunéiforme. Par conséquent, la face 18 du bloc 16 se prolonge par une face 24 de la tête 22 du support Le micro-capillaire 10 est d onc placé sur les faces 18 et 24 et il se trouve alors dans un plan vertical parallèle à ces faces 18 et 24 Le micro-capillaire 10 est, par exemple, collé sur lesdites faces 18 et 24 Dans l'exemple illustré, ce micro-capillaire est, dans un but de simplification, coincé dans une gorge 26 qui est formée par la couche intermédiaire 20 en caoutchouc dépassant légèrement des faces 18 et 24. Ensuite, on introduit par exemple de-0,1 pl à 1 pl d'un liquide expérimental dans le micro-capillaire 10. Ce liquide'expérimental peut consister, par exemple, en une solution renfermant de 0,02 mg à 1 mg d'ADN par ml, qui a été centrifugée préalablement pendant environ 10 minutes à 10 000 g ou plus Pour introduire ce liquide expérimental, on utilise un capillaire de remplissage 28 se présentant sous la forme d'un mince petit tube de verre de 0,12 mm de diamètre externe et de 0,1 mm de diamètre interne Des petits tubes de verre de ce type sont disponibles en tant que " tubes à rayons X " Le capillaire de remplissage 28 est engagé avec précaution dans une extrémité 30 du micro-capillaire 10 oppo- sée à sa pointe 12, puis il est enfilé jusqu'à ce que la pointe 32 dudit capillaire 28 atteigne le voisinage de la pointe 12 à l'intérieur du micro-capillaire 10 On procède ensuite à l'introduction du liquide expérimental. A l'aide d'un autre capillaire de remplissage d'environ 0,52 mm de diamètre externe et de 0,5 mm de diamb- tre interne, une colonne liquide d'un ou de plusieurs centi- mètres de hauteur,formée par une huile de paraffine lourde, peut 'être déposée sur le liquide expérimental dans l'espace interne du capillaire Avant leur utilisation, les deux capillaires de remplissage sont lavés de la même manière que le micro-capillai re. A présent, le micro-capillaire 10 empli peut être placé dans le dispositif d'injection illustré grossièrement de manière schématique sur la figure 1 et portant globale- ment-la référence 34 Dans ce but, le micro-capillaire 10 est serré dans un manipulateur miniaturisé 36 représenté schématiquement, qui autorise un déplacement de la pointe 12 du capillaire dans les trois dimensions de l'espace La figure 1 montre deux boutons tournants 38 L'espace inter- ne du capillaire est raccordé, par l'extrémité 30 de ce dernier, à un conduit principal 40 de gaz comprimé; un conduit intermédiaire souple 42, permettant le mouvement du manipulateur miniaturisé 36 et intercalé entre celui-ci et le conduit principal 40, est illustré sur la figure 1. 2521 1 66 Le conduit principal 40, et donc l'espace interne du capil- laire, peuvent être sollicités sélectivement par trois pres- sions gazeuses, c'est-à-dire une haute pression p 1, une pression d'injection P 2 et une pression de retenue p 3 Une seule et unique valve, à savoir un distributeur 42 ' à trois positions dont les fonctions de commutation sont illustrées sur la figure 1, sert à passer d'une pression à une autre. Deux sources de pression, une source 44 de haute pression et une source 46 de pression d'injection, sont prévues sous la forme de bouteilles d'air ou d'azote comprimé Un conduit 49 d'admission de la haute pression relie la source 44 à un point de bifurcation 48 du conduit principal 40; de mani- ère correspondante, un conduit 50 d'admission de la pression d'injection raccorde la source 46 à ce même point de bifur- cation 48 dudit conduit principal 40 Une valve d'étrangle- ment 52 à réglage manuel ( réducteur de pression ou régula- teur), placée dans le conduit 49 ( ou dans la source 44 de haute pression) , permet un ajustement précis de la haute pression p 1 à une valeur de 2 bars par exemple Si nécessai- re, cette pression p 1 peut aussi être ajustée électronique- ment De même, une valve d'étranglement 54 ( réducteur de pression ou régulateur) est incorporée dans le conduit 50 en vue d'un réglage fin de la pression P 2 à 0,12 bar Entre la valve d'étranglement 54 et le point de bifurcation 48, le conduit 50 loge un clapet anti-retour 56 qui s'ouvre en direction dudit point 48 La figure 1 met en évidence les fonctions de commutation du distributeur 42 ' à trois posi- tions intercalé, dans le conduit 49, entre la valve d'étran- glement 52 et le point de bifurcation 48 Trois raccords de ce distributeur 42 ' sont en service: un premier raccord 58, sur lequel est branché un tronçon 60 du conduit 49 débou- chant dans la valve d'étranglement 52; un raccord voisin 64 qui est étranglé ( symbolisé par un étranglement 66 sur la figure 1); ainsi qu'un troisième raccord 68 qui est opposé au raccord 58 et d ont part un tronçon 70 du conduit 49 débouchant au point de bifurcation 48. Dans la première position ( ou position de repos 3 du distributeur 42 ' illustrée sur la figure 1, le raccord 58 est obturé, le raccord 68 communiquant en revanche avec le raccord 64 Par conséquent, l'étranglement 66 est relié à la source 46 de pression d'injection Cet étranglement 66 est réglé de telle sorte qu'une pression p 3 se développe avant cet étranglement, donc dans le tronçon 70 et ainsi dans le conduit principal 40 Cette pression p 3 qualifiée de " pres- la sion de retenue " mesure 0,03 bar L'étranglement 66 peut être formé par une valve d'étranglement'correspondante pour régler avec précision cette pression de retenue p 3 Cepen- dant, il est également possible d'installer dans le tronçon de conduit 70, entre le distributeur 42 ' et le point de bifurcation 48, une autre valve d'étranglement 66 ' ( réduc- teur de pression ou régulateur) qui autorise un réglage fin de l'adite pression de retenue p 3. Lorsque le distributeur 42 ' est amené manuelle- ment à une deuxième position ( ou position centrale) de commutation, son obturateur ou tiroir illustré symbolique- ment sur la figure 1 se déplace par conséquent vers la droite jusqu'à une position centrale, à l'encontre de l'action d'un ressort 72 Désormais, tous les raccords 58, 64 et 68 du distributeur 42 ' sont isolés, de sorte que la pression d'injection p 2 s'établit dans le tronçon de conduit 70 et donc dans le conduit principal 40. Enfin, lorsque le distributeur 42 ' est commuté à sa troisième position dans laquelle son tiroir prend sa position située à l'extrême-droite sur la figure 1, les deux raccords 58 et 68 communiquent mutuellement, le raccord 64 étant en revanche isolé Le tronçon de conduit 70 et donc le conduit principal 40 sont ainsi reliés à la source 44 de haute pression et ils sont sollicités par la pression pl. Le clapet'anti-retour 56 évite une détérioration de la valve d'étranglement 54 et de la source 46 de pression d'injection Ladite valve d'étranglement 52 peut éventuelle- ment aussi être supprimée en présence d'un réducteur de pression 52 ' qui, équipant de manière classique des sources de pression sous la forme de bouteilles de gaz comprimé et évoqué sur la figure 1, fait chuter la pression de 10 bars à 150 bars régnant à l'intérieur de la bouteille, jusqu'à une valeur de O bar à 7 bars Dans ce cas, le réducteur de pression 52 ' doit être ajusté de telle manière que, lorsque le distributeur 42 ' occupe sa troisième position, la pres- sion régnant dans le tronçon de conduit 70 ( dans le cas o on utilise la valve d'étranglement 66 ' immédiatement après ledit distributeur 42 ') prenne précisément sa valeur prédéterminée pl. Après l'insertion du micro-capillaire 10 dans le manipulateur miniaturisé 36, la haute pression p 1 est en premier lieu admise dans l'espace interne du capillaire ( troisième position de distribution), pour emplir rapide- ment Ia pointe 12 et pour déboucher cette dernière si besoin est Ensuite, la pression de retenue p 3 est appliquée à l'espace interne du capillaire et cette pression est choisie suffisamment forte pour que, d'une part, sensiblement aucun liquide expérimental ne s'écoule de la pointe et que, d'au- tre part, rien ne puisse pénétrer de l'extérieur dans ladi- te pointe 12 du capillaire Par un actionnement correspon- dant du manipulateur miniaturisé 36, cette pointe 12 est alors enfoncée dans l'unede cellules 74 illustrées à échel- le excessivement agrandie sur la figure 1, avec observation à l'aide d'un microscope dont l'objectif 76 est représenté de manière fragmentaire sur la figure 1 Dès que la pointe 12 se trouve à l'intérieur de la cellule ( dans le cytoplas- me ou dans le noyau), la pression d'injection P 2 ( deuxième position de distribution) est appliquée à l'espace interne du capillaire et elle provoque un écoulement de liquide expé- rimental hors de la pointe 12 Le débit est alors compris entre 10 il et 10 î 13 ml par seconde Le distributeur 42 ' est maintenu dans sa deuxième position pendant une période dont la durée est fonction du volume injecté souhaité, puis il est aussitôt relaxé de sorte qu'il prend sa position de repos selon la figure I et que la pression de retenue p 3 est appliquée à l'espace interne du capillaire Le micro-capil- lai Te l Q est alors déplacé jusqu'à la cellule 74 suivante et cette dernière est soumise à inoculation de la manière décrite ci-avant S'il n'est pas certain que la pointe 12 permet intégralement un libre écoulement, la haute pression p 1 ( troisième position de distribution) peut être admise dans l'espace interne du capillaire pour faire de nouveau passer de " l'air de chasse " dans ladite pointe 12. L'actionnement du distributeur 42 ' peut, par exemples être assuré par un bouton d'actionnement 80 repré- senté sur la figure 1 et pouvant coulisser à l'encontre de la force du ressort 72. Pour désaérer le dispositif 34, une valve de détente 82 consistant en une valve à deux voies est instal- lée dans un conduit secondaire 84 qui débouche dans le conduit principal 40 En outre, il est prévu un conduit supplémentaire 86 débouchant dans ledit conduit principal et doté d'un robinet d'isolement 88 pour raccorder sélec- tivement une source supplémentaire de pression et/ou de dépression, comme par exemple une pompe à aquarium qui peut être utilisée aussi bien comme source de pression que comme source de dépression Entre les embouchures des conduits 84 et 86 dans le conduit principal 40, ce conduit 40 loge une valve d'isolement ou d'étranglement 90 qui permet un réglage concomitant des pressions pl, P 2 et p 3 en fonction de la viscosité considérée du liquide expérimental. La figure 2 illustre une autre forme de réalisa- tion du dispositif d'injection selon l'invention, qui porte la référence 134 Les organes de la figure 2 qui correspon- dent à ceux de la figure 1 sont repérés par les mêmes réfé- rences numériques affectées toutefois du chiffre de la première centaine Ce dispositif d'injection 134 nécessite la présence d'une seule et unique source de pression, c'est- à-dire d'une source 144 de haute pression Un conduit initi- al 192 partant de cette source 144 se prolonge par deux conduits parallèles 149 et 150 qui correspondent respective- * ment au conduit 49 d'admission de haute pression et au conduit 50 d'admission de pression d'injection selon la figu- re 1, et qui aboutissent au point de bifurcation 148 d'un conduit principal 140 Une valve d'étranglement 152, de nou- veau incorporée dans le conduit 149, permet un réglage précis de la haute pression p 1 dans le tronçon de conduit contigu. De manière analogue, une valve d'étranglement 154 et un clapet anti-retour 156 sont branchés sur le conduit 150, le- dit clapet 156 excluant la détérioration, par la pression p 3 -1 us forte, d'un n-ancmètre 210 (pour mesurer la pression p 2) intercalé en- tre la valve 154 et ledit clapet 156 dans le conduit 150 La valve 159 per- set le réglage précis de la pression p 2 le distributeur 42 ' à trois posi- ticns selon la figure 1 pourrait étre incorporé dans un tronçon de conduit 170 entre la valve d'étranglement 152 et le point de bffurcation 148 Cependant, sur la figure 2, ce distri- buteur estremplacé par des premier et second distributeurs à deux positions 194 et 196, respectivement Les deux posi- tions de commutation du premier distributeur 194 à deux positions, incorporé dans le tronçon 170, ressortent de la figure 2 En position de repos, la liaison est rompue entre la valve d'étranglement 152 et le point de bifurcation 148, une sortie 164 à étranglement étant en revanche raccordée au circuit de pression P 2 Cette sortie 164, dont l'étrangle- ment 166 est de nouveau représenté symboliquement,est en communication avec le distributeur 196 à deux positions par l'intermédiaire-d'un conduit de jonction 198 Dans la posi- tion de repos du distributeur 196 illustrée sur la figure * 2, ce distributeur autorise le libre passage, de sorte que la pression de retenue p 3 se développe dans le conduit prin- cipal 140 Cependant, lorsque le distributeur 196 est amené à son autre position de commutation, le conduit de jonction 198 est isolé, si bien que c'est la pression d'injection P 2 qui s'établit dans le conduit principal 140 De ce fait, un actionnement du distributeur 196 permet d'assurer la sélec- tion entre la pression d'injection P 2 et la pression de rete- nue-p 3, sans qu'il soit à craindre que la haute pression p 1 soit libérée en plus par erreur Pour admettre en plus cette haute pression p 1, il convient d'actionner le premier distri- buteur 194 à deux positions Pour permettre un réglage précis et continu de la pression de retenue p 3, l'étranglement 166 peut, là encore, être formé par une valve d'étranglement 166 " évoquée en pointillé sur la figure 2 et branchée sur le conduit 198 entre les deux distributeurs 194 et 196 Néan- moins, d'une manière correspondant à l'agencement de la figure 1, on peut aussi incorporer une valve d'étranglement- 166 ' dans le tronçon de conduit 170, entre le distributeur 194 et le point de bifurcation 148 Enfin, la valve d'étran- glement 152 peut aussi être éventuellement supprimée dans le cas o un réducteur de pression 152 ' est suffisamment précis pour ajuster la haute pression p 1 - Dans l'agencement selon la figure 2 également,une valve de détente 182 destinée au désaérage du dispositif 134 peut être incorporée dans un conduit secondaire 184 débou- chant dans le conduit principal 140 Là encore, une valve d'isolement ou d'étranglement 190 est incorporée dans le conduit principal 140 et il est enfin prévu un conduit sup- plémentaire 186 muni d'un robinet d'isolement 188. Un dispositif d'injection 234 illustré sur la figu- re 3 est de forme de réalisation analogue à celle des disposi- tifs 34 et 134 selon les figures 1 et 2, respectivement Les -organes de la figure 3 qui correspondent à ceux de la figure 1 sont repérés par les mêmes références numériques qui ont été affectées du chiffre de la deuxième centaine. Tout comme dans l'agencement de la figure 2, le dispositif 234 selon la figure 3 nécessite la présence d'une seule et unique source de pression, c'est-à-dire une source 244 de haute pression Un réducteur de pression 252 ' équipant cette source 244 permet le réglage précis de la haute pression Pl dans un conduit initial contigu 292 La haute pression p 1 ajustée peut être lue sur un manomètre 300 associé au réduc- teur de pression 252 ' Le conduit initial 292 se divise en un point de bifurcation 302 et il se prolonge par deux conduits parallèles 249 et 250 qui se rejoignent de nouveau finalement en un autre point de bifurcation 248, o ilsdébou- chent dans un conduit principal adjacent 240. Dans le conduit 249 situé en bas sur la figure 3, est incorporé un distributeur 294 à deux positions, qui iso- le le conduit 249 lorsqu'il occupe sa position de repos illustrée sur la figure 3; lorsqu'on actionne ledit distri- buteur 294, ce dernier assure un libre passage, si bien que la haute pression p 1 s'établit au point de bifurcation 248, et donc dans le conduit principal 240. Le conduit 250 situé en haut sur la figure 3 loge une valve d'étranglement 254 ( réducteur de précision pour basse pression, constitué-par exemple par le modèle 10 de la société Fairchild Ind) en vue de régler la pression d'injection P 2 dans un tronçon contigu 304 dudit conduit 250. Dans le sens de la circulation, au voisinage de la valve d'étranglement 254, un conduit auxiliaire 306 débouche dans le conduit 250 ( son point d'embouchure 308 est illustré sur la figure 3) Dans ce conduit auxiliaire 306, est incorporé un distributeur 296 à deux positions et, entre ce distribu- teur et le point 308, est intercalée une valve d'étranglement 266 " Comme l'indiquent déjà leurs numéros de référence, les fonctions de la valve 266 " et du distributeur 296 correspon- 830 dent à celles de la valve 166 " et du distributeur 196 selon la figure 2 De ce fait, lorsqu'il occupe sa position de repos illustrée sur la figure 3, le distributeur 296 permet un libre écoulement et il assure une baisse, jusqu'à la valeur de la pression de retenue p 3, de la pression qui règne dans le conduit 250 ( au voisinage de la valve d'étranglement 254). Le réglage fin de la pression de retenue p 3 est assuré par la valve d'étranglement 266 " Il convient de souligner qu'un réglage de cette pression p 3 reste sans influence sur les valeurs respectives de p 1 et P 2 Les valeurs respectives ajustées de P 2 et p 3 peuvent être lues sur un manomètre 310 qui est relié par un conduit auxiliaire 312 au conduit 250 ( point d'embouchure 314) Tout comme sur la figure 2, il est de nouveau prévu, entre le point d'embouchure 314 et le point de bifurcation 248, un clapet anti-retour 256 qui évite, lors de la mise en service additionnelle du distri- buteur 294 à deux positions, que la haute pression p 1 par- vienne dans le tronçon du conduit 250 compris entre la valve d'étranglement 254 et ledit clapet anti-retour 256, ce qui pourrait provoquer une détérioration de la valve d'étranglement 266 " réglée en fonction de la pression P 2 plus faible, et éventuellement du manomètre 310. Enfin, dans un conduit secondaire correspondant 284 du conduit principal 240, on peut là encore prévoir une valve de détente 282, ainsi qu'un robinet d'isolement 288 dans un conduit supplémentaire 296 qui débouche dans ledit conduit principal 240 Il convient encore de mention- ner la présence d'une valve d'isolement ou d'étranglement 290 entre les embouchures desdits conduits 284 et 286 dans ledit conduit principal 240 Ce dernier débouche pour finir dans le, micro-capillaire 10. Lors de l'injection proprement dite, il suffit d'actionner le distributeur 296 à deux positions pour assu- rer la sélection entre la pression d'injection P 2 et la pression de retenue p 3 Dans ce cas, il n'est pas à craindre que la haute pression p 1 soit libérée en plus par erreur, car cette libération supplémentaire est assurée par l'autre distributeur 294 à deux positions Pour simplifier davantage la commande, il peut être prévu une mise en fonction du distributeur 296 par un interrupteur à pédale Dans ce cas, les deux mains sont libres pour actionner le manipulateur miniaturisé et éventuellement le microscope d'observation. Il est évident que, également dans le dispositif d'injection 34 selon la figure 1, on peut utiliser à la place du distributeur 42 ' à trois positions la combinaison des deux distributeurs 194 et 196 ( ou bien 294 et 296) à deux positions Les distributeurs 42 ' et 194 sont du type à deux voies, le distributeur 196 étant en revanche du type à une seule voie. A l'aide du dispositif d'injection décrit ci-avant, de très petites quantités de liquide expérimental peuvent être injectées de manière reproductible dans des cellules vivantes, par exemple pour examiner la répartition de pro- téines qui ont été repérées par fluorescence, ou bien pour isoler des recombinants clonés. Il va de soi que de nombreuses modifications peu- vent être apportées aux procédés et au dispositif décrits et représenté," sans sortir du cadre de l'invention. REVENDICATIONS 1 Procédé pour injecter, en particulier dans des cellules, de très petites quantités d'échantillons expérimen- taux, au moyen d'un micro-capillaire, dont l'une des extrémi- tés comporte une pointe dont le diamètre interne est de l'ordre de quelques micromètres, un liquide expérimental étant introduit dans le micro-capillaire et l'espace interne de ce capillaire étant soumis, lors de l'injection, à une pression d'injection qui est appliquée à l'autre extrémité dudit capillaire et qui provoque un écoulement de liquide expérimen- tal hors de la pointe, procédé caractérisé par le fait que, après l'injection de la quantité expérimentale souhaitée, on fait baisser la pression qui règne dans l'espace interne du capillaire pour la faire passer de sa valeur de pression d'injection à une valeur de pression de retenue inférieure à ladite pression d'injection, différant de zéro et en présence de laquelle sensiblement plus aucun liquide expérimental ne s'écoule de la pointe; et par le fait que cette pression de'retenue est maintenue jusqu'au début de l'injection suivante. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la valeur de la pression de retenue représen- te de 0,1 à 0,5 fois, de préférence de 0,2 à 0,3 fois et, de manière optimale, environ 0,25 fois la valeur de la pres- sion d'injection. 3 Procédé selon ln revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que, après l'introduction du li- quide expérimental et avant la première injection, de préfé- rence aussi répétitivement après plusieurs injections respec- tives, l'espace interne du capillaire est balayé par une haute pression dont la valeur excède celle de la pression d'injection. 4 Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que la valeur de la haute pression représente environ 5 à 100 fois, de préférence de 10 à 30 fois et, de manière optimale, environ 17 fois la valeur de la pression d'injection. Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 4, caractérisé par le fait que la pression d'injection mesure de 0,01 à 0,5 bar, de préférence de 0,1 à 0,2 bar et, de manière optimale, environ 0,12 bar. 6 Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 5, caractérisé par le fait que le liquide expérimental est introduit par l'extrémité du capil- laire opposée à sa pointe, de préférence au moyen d'un capillaire de remplissage dont le diamètre externe est plus petit que le diamètre interne du micro-capil- laire, l'extrémité de sortie dudit capillaire de rem- plissage étant préalablement enfilée dans ledit micro- capillaire jusqu'au voisinage de la pointede ce dernier. 7 Procédé de fabrication d'un micro-capillaire approprié pour mettre en oeuvre un procédé pour injec- ter, en particulier dans des cellulesde très petites quantités d'échantillons expérimentaux, au moyen du micro-capillaire, dont l'une des extrémités comporte une pointe dont le diamètre interne est de l'ordre de quelques micromètres, un liquide expérimental étant introduit dans le micro-capillaire et l'espace interne de ce capillaire étant soumis, lors de l'injection, à une pression d'injection qui est appliquée à l'autre extrémité dudit capillaire et qui provoque un écoule- ment de liquide expérimental hors de la pointe, procé- dé de fabrication dans lequel un tube capillaire est serré par ses deux extrémités dans les mâchoires d'un dispositif d'étirage, un tronçon tubulaire situé entre ces mâchoires est éventuellement chauffé à l'aide d'une bobine à filament chauffant qui entoure le tube, puis le tube capillaire est finalement étiré par un déplacement desdites mâchoires à l'écart l'une de l'autre, ce qui fait qu'on obtient deux micro-capil- laires munis chacun d'une pointe, procédé de fabrication caractérisé par le fait que le tube capillaire uniforme sur toute sa longueur est placé dans le dispositif d'étirage sans aucun étirage manuel préalable. 8 Procédé de fabrication d'un micro-capillaire approprié pour mettre en oeuvre un procédé pour injecter, en particulier dans des cellules, de très petites quan- tités d'échantillons expérimentaux, au moyen du micro- capillaire, dont l'une des extrémités comporte une pointe dont le diamètre interne est de l'ordre de quelques micromètres, un liquide expérimental étant introduit dans le micro-capillaire et l'espace interne de ce capillaire étant soumis, lors de l'injection, à une pression d'injection qui est appliquée à l'autre extrémité dudit capillaire et qui provoque un écoulement de liquide expérimental hors de la pointe, procédé de fabrication dans lequel un tube capillaire est serré par ses deux extrémités dans les mâchoires d'un dispo- sitif d'étirage, un tronçon tubulaire situé entre ces mâchoires est éventuellement chauffé à l'aide d'une bobine à filament chauffant qui entoure le tube, puis le tube capillaire est finalement étiré par un déplacement desdites mâchoires à l'écart l'une de l'autre, ce qui fait qu'on obtient deux micro-capillaires munis chacun d'une pointe, le tube capillaire étant sou- mis à un lavage avant son étirage, procédé caractérisé par le fait que ce tube capillaire est lavé à l'éthanol pendant au moins une heure-avant son étirage, puis est mis à sécher, de préférence immédiatement après, pen- dant environ 30 minutes à environ 130 'C. 9 Procédé de fabrication d'un micro-capillaire approprié pour mettre en oeuvre un procédé pour injec- ter, en particulier dans des cellules, de très petites quantités d'échantillons expérimentaux, au moyen du micro-capillaire, dont l'une des extrémités comporte une pointe dont le diamètre interne est de l'ordre de quelques micromètres, un liquide expérimental étant introduit dans le micro-capillaire et l'espace interne de ce capillaire étant soumis, lors de l'injection, à une pression d'injection qui est appliquée à l'autre extrémité dudit capillaire et qui provoque un écoulement de liquideexpérimental horsde la pointe, procédé de fabrication dans lequel un tube capillaire est serré par ses deux extrémités dans les mâchoires d'un dispo- sitif d'étirage, un tronçon tubulaire situé entre ces mâchoires est éventuellement chauffé à l'aide d'une bobine à filament chauffant qui entoure le tube, puis le tube capillaire est finalement étiré par un dépla- cement desdites mâchoires à l'écart l'une de l'autre,ce qui faitqu'on obtient deux micro-capillaires munis chacun d'une pointe, procédé de fabrication caracté- risé par lé fait que le tube capillaire est rendu hydrophobe avant son étirage, de préférence par un traitement au diméthyldichlorosilane dans l'éthanol, ou avec une solution de traitement au silicone dans l'éther. Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait qu'il comporte au moins une source de pression ( 44, 46; 144; 244) délivrant une pression constante et se présentant de préférence sous la forme d'une bouteille de gaz comprimé. 11 Dispositif selon la revendication 10, caractérisé par le fait qu'un distributeur ( 42 ') à trois position action- né à la main est intercalé entre au moins l'une des sources de pression ( 44, 46) et le micro-capillaire ( 10), de telle -30 sorte que ce microcapillaire ( 10) soit soumis à la pression de retenue (p 3) lorsque ledit distributeur occupe une premiè- re position, à la pression d'injection (P 2) lorsque ce dis- tributeur est dans une deuxième position, et à la haute pres- sion (pl) quand ledit distributeur se trouve dans une troi- sième position. 12 Dispositif selon la revendication 11, caractéri- sé par le fait qu'il est équipé d'une source ( 44) de haute pression et d'une source ( 46) de pression d'injection qui, par l'intermédiaire d'un conduit ( 49) d'admission de la haute pression et d'un conduit ( 50) d'admission de la pression d'injection, respectivement, sont raccordés à un conduit prin- cipal commun ( 40) débouchant dans le micro-capillaire ( 10); et par le fait qu'un clapet anti-retour ( 56) s'ouvrant en di- rection dudit conduit principal ( 40) est éventuellement ins- tallé dans ledit conduit ( 50) d'admission de pression d'in- jection, cependant que le distributeur ( 42 ') à trois posi- tions est installé dans le conduit ( 49) d'admission de haute pression, ce distributeur ( 42 ') étant en outre doté d'un troi- sième raccord étranglé ( 64) qui, lorsque ledit distributeur occupe sa première position de distribution, est relié à la source ( 46) de pression d'injection afin d'abaisser jusqu'à la valeur de la pression de retenue (p 3) la pression qui rè- gne dans ledit conduit principal ( 40). 13 Dispositif selon la revendication 12, caracté- risé par le fait qu'un manomètre ( 210; 310) est branché dans le conduit ( 150; 250) d'admission de la pression d'in- jection, entre la source de pression d'injection et le cla- pet anti-retour ( 156; 256). 14 Dispositif selon la revendication 12 ou 13, ca- ractérisé par le fait que, à la place du distributeur à trois positions, un premier distributeur ( 194; 294) à deux posi- tions-est installé dans le conduit ( 149; 249) d'admission de haute pression et un second distributeur ( 196; 296) à deux positions est branché sur un conduit secondaire ( 198; 306) comportant un étranglement ( 166) formé de préférence par une valve d'étranglement ( 166 "; 266 "), ce conduit secondaire communiquant en permanence avec le conduit principal ( 240) éventuellement par l'intermédiaire d'un autre conduit tel que, par exemple, le conduit ( 250) d'admission de pression d'in- jection, ou bien étant relié à un troisième raccord ( 164) du premier distributeur ( 194) à deux positions, qui peut être raccordé à la source de pression d'injection. Dispositif selon la revendication 14, carac- térisé par le fait que le second distributeur ( 196; 296) à deux positions peut être commandé au pied. 16 Dispositif selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 15, caractérisé par le fait que la source de pression d'injection est formée par une sortie à étran- glement ( 192, 150, 154; 292, 302, 250, 254) de la source ( 144; 244) de haute pression. 17 Dispositif selon l'une quelconque des reven- dications 11 à 16, caractérisé par le fait qu'il comporte une valve de détente ( 82; 182; 282) raccordée au conduit principal ( 40; 140; 240). 18 Dispositif selon l'une quelconque des revendi- cations 11 à 15, caractérisé par ie fait qu'il comporte, en vue du raccordement à une source supplémentaire de pression et éventuellement, ou en variante, de dépression, un conduit supplémentaire ( 86; 186; 286) relié au conduit principal ( 40; 140; 240) et muni d'un robinet d'isolement ( 88; 188; 288),