FR 2521588 A1 19830819 FR 8302180 A 19830211 La présente invention concerne un procédé de production d'une substance biologiquement active, en particulier de Suppresseur de Réponse Immunitaire Humain, ci- après désigné en abrégé par SRIH, dont l'utilisation en phar- macologie s'avère prometteuse. SRIH désigne un Suppresseur de Réponse Immunitai- re provenant de cellules humaines viables. Ainsi qu'il est décrit par Carl Waltenbaugh dans Biology of the Lymphokines, pp 422-427 ( 1979), publié par Academic Press, Inc (New York) , le Suppresseur de Réponse Immunitaire (SRI) est une substance protéinique trouvée dans le fluide corporel, qui inhibe la réponse immunitaire non spécifique des espèces, indépendamment du type d'antigène On a donc pensé que SRI serait un agent prophylactique ou thérapeutique contre l'hypersensibilité, par exemple l'allergie, le choc a- naphylactique ou l'hyper-auto-immunisation, ainsi que contre le rejet lors de transplantations de tissus ou d'organes. Bien que la non-spécificité vis-à-vis des espèces de SRI, suggère la possibilité d'utiliser des SRI d'origines non hu- maines, pour le traitement de maladies de l'homme, le SRIH provenant de cellules humaines viables s'avère s Cre et excel- lent en raison de son moindre pouvoir antigénique. Cependant, il n'existe pas à ce jour de production à l'échel- le industrielle de SRIH permettant la prévention ou le trai- tement des maladies de l'homme. La présente invention permet de remédier à cet inconvénient de l'art antérieur, et d'obtenir à l'échelle in- dustrielle et à faible coût, des cellules humaines capables de produire SRIH à titre élevé, grâce à un procédé efficace de multiplication de ces cellules, et avec un rendement plus élevé de SRIH par cellule, éventuellement par hybridation cellulaire. Le nouveau procédé selon l'invention qui consiste à transplanter des cellules humaines dans un animal à sang chaud, ou dans un dispositif dans lequel circule le fluide nutritif corporel d'un animal à sang chaud, et à laisser ces cellules se multiplier in vivo dans l'animal ou dans le dis- positif, est caractérisé en ce que les cellules sont des cellules humaines, capables de produire du SRIH, et en ce que l'on laisse les cellules multipliées libérer ce facteur, par leur culture in vitro dans un milieu nutritif, éventuel- lement en présence d'un inducteur de SRIH. -Plus particulièrement, ce procédé consiste à transplanter des cellules humaines, capables de produire du SRIH dans un animal à sang chaud, à nourrir cet animal, afin que les cellules humaines puissent utiliser son fluide cor- porel nutritif pour leur multiplication, à extraire et à dé- sagréger la tumeur résultante qui se forme chez l'animal, pour obtenir les cellules humaines multipliées, à cultiver ces cellules in vitro dans un milieu nutritif en présence é- ventuellement d'un inducteur de SRIH, pendant une durée suf- fisante pour accumuler une quantité sensible de SRIH, et à récolter ce dernier accumulé dans la culture On peut égale- ment placer une suspension de cellules humaines, capables de produire du SRIH, dans une chambre de diffusion de type clas- sique, conçue pour recevoir le fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud, placer sur, ou inclure dans cet animal la-dite chambre, nourrir l'animal, afin de permettre aux cel- lules humaines d'utiliser son fluide corporel pour leur mul- tiplication, recueillir dans la chambre les cellules humaines multipliées, les cultiver in vitro, éventuellement en présen- ce d'un inducteur de SRIH pendant une durée suffisante, pour accumuler une quantité sensible de SRIH, puis récolter le SRIH accumulé dans la culture. On constate que la production de SRIH est bien supérieure si l'on utilise des cellules humaines, obtenues par multiplication in vivo à l'aide d'un animal à sang chaud des cellules humaines capables de produire SRIH, au lieu d' employer les mêmes cellules multipliées in vitro. Contrairement aux procédés classiques de culture de tissus in vitro, le procédé utilisant le mode opératoire in vivo ne nécessite que peu ou pas de milieu nutritif contenant du sé- rum coûteux, et rend plus facile le maintien du milieu de culture pendant la multiplication cellulaire, tout en produi- sant SRIH à un titre beaucoup plus élevé. En outre, le procédé selon l'invention diffère des procédés classiques de multiplication cellulaire in vi- tro par les caractéristiques suivantes: multiplication cel- lulaire beaucoup plus stable et rapide, production cellulai- re supérieure et production bien supérieure de SRIH par cel- lule. Les cellules humaines, utilisables selon l'in- vention, sont des cellules qui produisent une quantité sen- sible de SRIH et qui sont capables de se multiplier dans un animal à sang chaud, lorsqu'on les y transplante: convien- nent par exemple des cellules humaines normales, comme cel- les du sang périphérique, de la rate et des amygdales; des cellules obtenues par transformation de cellules humaines normales à l'aide de radiations ou de virus carcinogènes; des cellules humaines provenant d'abcès tonsillaire, de car- cinome du foie ou du poumon, de tumeur de la rate; ainsi que des lignées de cellules établies des cellules humaines ci-dessus On peut utiliser, conformément à l'invention, des lignées de cellules humaines connues, comme Ad-L, HL-4, L 84-Ly, NPC-501, et HB-7, ainsi qu'il est décrit dans The Tissue Culture, Vol 6, pp 527-546 ( 1980). Un taux de multiplication cellulaire très supérieur peut ê- tre atteint par l'utilisation, à la place des cellules hu- maines décrites plus haut, d'une lignée de lymphoblastoldes humains, qui peut beaucoup plus facilement être soumise à un repiquage, et dans laquelle peuvent être introduits des gènes humains codants la production de SRIH, au moyen d'une technique de fusion cellulaire utilisant du polyéthylène glycol ou du virus de Sendai, ou par une technique de re- combinaison génétique utilisant de la nucléase, ligase et ADN polymérase. On a ainsi une production plus élevée de SRIH par cellule, notamment environ 2 à 10 fois supérieure à celle que l'on obtient lors de l'utilisation des cellules normales ou tu- morales, décrites plus haut. La transplantation de ces lignées de lympho- blastoides humains dans un animal, conduit à la formation de tumeurs qui ne sont guère contaminées par les cellules de l'hôte animal De plus, leur post-extraction et désagré- gation est très facile, et la récolte des cellules humaines viables peut s'effectuer aisément A ces fins conviennent des lignées connues de lymphoblastoides humains, de la leu- cémie ou du lymphome, par exemple Namalwa, BALL-l, NALL-1, TALL-1 et JBL. Comme animaux à sang chaud, utilisables dans le procédé selon l'invention, on peut prendre tout animal, pourvu que les lignées cellulaires se développent dans son organisme Par exemple on peut utiliser des volailles com- me poulets et pigeons, ou des mammifères tels que chien, chat, singe, chèvre, porc, cheval, lapin, vache, cobaye, rat nu, hamster, souris, ou souris nue. Comme la transplantation des cellules humaines à l'animal provoque une réaction immunitaire indésirable, l'emploi d'un animal très jeune, nouveau né ou au stade le plus précoce possible, par exemple d'oeuf, d'embryon ou de foetus, est souhaitable Pour réduire autant que possible la réaction immunitaire, on peut traiter l'animal, avant la transplantation cellulaire, par irradiation avec des rayons X ou Y à raison d'environ 200 à 600 rems, ou par in- jection d'un antisérum ou d'un agent immunosuppresseur. Comme la souris nue, ou le rat nu utilisé comme animal hôte, présente une réaction immunitaire plus faible, même à l'état adulte, on peut de façon pratique lui transplanter des li- gnées cellulaires humaines établies, pour qu'elles se multi- plient rapidement, sans qu'un prétraitement soit nécessaire. On peut effectuer la multiplication cellulaire, stabilisée, et l'accroissement de la production de SRIH par transplantation répétée avec une combinaison de différents animaux à sang chaud; par exemple on peut atteindre les objectifs visés, en implantant d'abord les cellules humai- nes à des hamsters, puis en réimplantant les cellules ain- si multipliées à des souris nues Dans ce cas la trans- plantation répétée peut avoir lieu avec des animaux à sang chaud de la même classe ou du même groupe, de la même es- pèce ou du même genre. On peut implanter les cellules humaines en un site quelconque de l'animal, pourvu qu'elles s'y multi- plient: par exemple, on peut effectuer l'implantation dans la cavité allantoique, par voie intraveineuse, intrapérito- néale ou sous-cutanée. Au lieu de transplanter dans l'animal des cel- lules humaines on peut faire facilement se multiplier l'une des cellules humaines décrites précédemment, en les plaçant dans une chambre de diffusion classique, de forme et de taille appropriées, munie d'une membrane filtrante poreuse, d'un ultrafiltre ou de fibres creuses ayant des pores d'en- viron 10-7 à 10-5 m de diamètre, empêchant la contamination de la chambre par les cellules de l'animal hôte et permet- tant l'apport du liquide nutritif de l'organisme de l'ani- mal aux cellules humaines Cette chambre est incluse, par exemple par voie intrapéritonéale, dans l'animal; on lais- se les cellules humaines s'y multiplier en utilisant le fluide corporel nutritif fourni par l'animal. En outre, la chambre de diffusion peut être conçue pour ê- tre placée par exemple sur l'animal, de telle manière que le fluide nutritif de l'organisme et la solution nutritive puissent circuler librement dans la chambre De cette ma- nière, on peut observer la culture dans la chambre, pendant la multiplication cellulaire, par une ou plusieurs fenêtres latérales transparentes, prévues sur les parois de la cham- bre, et/ou on peut remplacer cette chambre par une chambre neuve, à la fois pour poursuivre la multiplication cellu- laire pendant la durée de vie de l'animal, sans qu'il soit nécessaire de sacrifier celui-ci, et pour augmenter encore plus la production cellulaire par animal De plus, par l'u- tilisation d'une telle chambre de diffusion, l'absence de contact direct des cellules humaines transplantées avec les cellules de l'animal hôte, a pour résultat de ne pas provo- quer de réaction immunitaire, si bien que l'on peut em- ployer divers animaux à sang chaud, comme hôtes, sans avoir à effectuer un prétraitement pour réduire leurs réactions immunitaires, et l'on peut recueillir facilement les cellu- les humaines multipliées, viables. On pelut alimenter l'animal hôte de façon classi- que, même après la transplantation cellulaire, et aucun soin particulier n'est nécessaire. La multiplication des cellules atteint générale- ment un maximum 1 à 20 semaines après la transplantation. Lorsque les cellules humaines, transplantées à l'animal hôte, sont d'origine tumorale ou lymphoblastoide, on peut obtenir leur multiplication maximale 1 à 5 semaines après la trans- plantation. Le nombre de cellules humaines ainsi obtenues par hôte, est d'environ 107 à 1012 ou plus En d'autres ter- mes, le nombre de cellules humaines, transplantées à l'ani- mal, s'accroit d'environ lo 2 à 107 fois ou plus cela re- présente environ 10 à 10 fois plus par rapport à ce que l' on obtient par la méthode de multiplication du milieu nutri- tif in vitro Les cellules humaines obtenues peuvent donc ê- tre avantageusement utilisées pour la production de SRIH. La génération cellulaire des cellules humaines, ainsi multipliées, peut être réglée en soumettant ces cellu- les à une culture tissulaire in vitro de 1 à 4 jours, avant de les soumettre au stade d'introduction décrit ci-après. Conformément à l'invention, on peut utiliser pour produire SRIH, tout procédé permettant d'induire cette production dans les cellules humaines multipliées; par ex- emple, on met en suspension dans un milieu nutritif pré- chauffé entre 20 à 400 C environ des cellules humaines, obtenues par multiplication en suspension dans le liqui- de d'ascite et récolte dans ce liquide, ou par extraction d'une tumeur massive, formée sous la peau, puis récolte après désagrégation de la tumeur, pour obtenir une con- centration d'environ 104 à 108 cellules/ml; on met en- suite à incuber à la même température pour produire SRIH. Les cellules humaines peuvent alors être exposées à l'ac- tion d'un inducteur, afin d'augmenter encore la production de SRI. Conviennent comme inducteurs ceux qui susci- tent la production de SRIH par les cellules humaines mul- tipliées dans le corps d'un animal à sang chaud; on peut utiliser, par exemple des mitogènes comme phytohémoagglu- tinine, concanavaline A, lipopolysaccharide, endotoxine, polysaccharide, bactérie, virus, acide nucléique, ou un mitogène végétal ("pokeweed"). Le milieu de culture peut également, pendant la production de SRIH, être additionné avec un agent de stabilisation du SRIH formé, qui augmente encore la pro- duction de celui-ci. On peut facilement recueillir SRIH, à partir de la culture, par des techniques de purification et de séparation utilisant des opérations classiques, telles que relargage, dialyse, filtration, centrifugation, concentra- tion et/ou lyophilisation Si l'on désire une préparation plus purifiée, on peut y arriver en combinant les opéra- tions précitées avec une ou plusieurs autres, telles qu'ad- sorption et désorption, avec échange d'ions, filtration sur gel, chromatographie par affinité, fractionnement au point isoélectrique et/ou électrophorèse. SRIH selon l'invention peut être avantageusement utilisé i- solément ou en combinaison avec un ou plusieurs agents com- me vitamine, hormone, agent carcinostatique, par administra- tion par voie interne ou injection, pour la prévention ou le traitement de maladies humaines. Dans la présente invention, les titres de SRIH sont déterminés par le procédé mentionné par Robelt R Rich et Carl W Pierce dans "Journal of Immunology", Vol 112, pp. 1360-1368 primés en la quantité qui supprime la réponse des cellules formant des plaques; des portions de 1 ml d'une suspension cellulaire contenant 1 x 10 cellules de rate provenant de souris C 57 BL/6, sont placées dans des boites de Pétri et sont additionnées chacune avec des portions de 0,1 ml de préparationsde SRIH d'une série de dilutions Les mélanges dans les boites de Pétri sont mis à incuber pendant un cer- tain temps, puis on compte les plaques formées au cours de cette incubation Le titre en SRIH correspond à la dilution pour laquelle on obtient une réduction de plaques de 50 %. Plusieurs modes de réalisation de l'invention sont décrits ci-après, qui, toutefois n'en limitent pas la portée. EXEMPLE 1 On transplante par voie sous-cutanée chez des souris nues, adultes, une lignée adénoide humaine Ad-L, et les animaux sont nourris de manière habituelle pendant 3 semaines. Cette transplantation cellulaire, et l'alimentation pour- suivie des animaux, aboutissent à la formation de tumeurs massives souscutanées de 12 g chacune environ, qui sont ensuites extraites, hachées et désagrégées par mise en sus- pension dans une solution physiologique renfermant de la trypsine. -30 Les cellules humaines sont ensuite lavées avec du milieu RPMI 1640 exempt de sérum (p H 7,2), et mises en suspension dans du milieu frais de composition identique, de manière à avoir une concentration de l'ordre de 1 x 10 cellules/ml. A cette suspension cellulaire, on ajoute de la concanavali- nèe A à raison de l ug/ml, et l'on fait incuber ce mélange à 370 C pendant 20 heures, afin d'induire la production de SRIH. La culture est centrifugée à 8 000 tours/minute pendant 30 minutes et le titre en SRIH de la partie surnageante est dé- terminé comme décrit plus haut La production est de l'ordre de 2 400 unités/O,l ml de culture. L'expérimentation témoin se déroule comme suit: la lignée adénoide humaine Ad-L est cultivée in vitro dans du milieu de Eagle (p H 7,2), additionné de 1 % en volume/volume de sé- rum foetal de veau et 20 % en volume/volume d'extrait de viande, en vue de sa multiplication, puis on traite comme plus haut pour induire la production de SRIH Cette produc- tion dans la culture résultante n'est que de 90 unités/O,l ml environ. EXEMPLE 2 On met en suspension ensemble, des cellules de tumeur désa- grégée de rate humaine, obtenues par extraction et hachage du tissu tumoral provenant d'un patient, et une lignée lym- phoblastoide, humaine, Namalwa, dans une solution salée contenant 140 m M Na Cl, 54 m M K Cl, 1 m M en Na H 2 PO 4 et 2 m M Ca C 12, pour obtenir une concentration de chaque type de cellules d'environ 1000 cellules par ml On ajoute à la suspension cellulaire, en refroidissant par de la glace, une préparation fraîche de la solution salée de même compo- sition, contenant du virus Sendai préalablement inactivé par irradiation aux ultraviolets; on transfère dans une é- tuve à 370 C au bout de 5 minutes, après le mélange, et on agite pendant 30 minutes, pour effectuer la fusion cellu- laire et introduire la capacité de production de SRIH des cellules humaines de la tumeur splénique dans les cellules de-Namalwa. Les cellules de Namalwa hybrides, résultantes, sont alors transplantées par voie intrapéritonéale chez des souris nues, adultes, que l'on nourrit de manière habituelle pen- dant 5 semaines Les tumeurs massives, formées intrapéri- tonéalement, et pesant environ 15 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 1 pour produire du SRIH, à ceci près que la concanavaline A est remplacée par en- viron 10 pg/ml de phytohaemagglutinine. La production de SRIH est de l'ordre de 12 800 unités/O,1 mi de culture. Le témoin, dans lequel les cellules hybridées sont culti- vées in vitro pour leur multiplication, puis traitées comme dans l'exemple 1 pour induire la production de SRIH, ne donne qu'environ 400 unités de SRIH par 0,1 ml de cul- ture. EXEMPLE 3 Après avoir injecté à des hamsters nouveau-nés un antisé- rum préparé à partir du lapin selon un procédé classique, pour réduire leur réaction immunitaire, on implante aux animaux par voie sous-cutanée, des cellules de la lignée lymphoblasto Ide, humaine hybridée, JBL auxquelles on a conféré, comme dans l'exemple 2, la capacité de produc- tion du SRIH, puis on alimente les animaux de façon habi- tuelle pendant 3 semaines On extrait les tumeurs massives, résultantes, formées sous la peau et pesant environ 18 g chacune; les cellules sont traitées comme dans l'exemple 1 pour induire la production de SRIH, à ceci près que le mi- j lieu RPMI 1640, exempt de sérum, est remplacé par du milieu de Eagle (p H 7,2) additionné de 20 % en volume/volume d'ex- trait de v Lande. La production de SRIH est de l'ordre de 8 500 unités/O,1 ml'de culture. Le témoin, dans lequel les cellules hybridées JBL sont cul- tivées in vitro pour leur multiplication, puis sont traitées comme dans l'exemple l pour induire la production de SRIH, ne donne qu'environ 240 unités de SRIH/O,1 ml de culture. EXEMPLE 4 * On implante par voie intraveineuse à des rats nouveau-nés une lignée delymphoblastoides hybrides, humaines, BALL-1, auxquels on a conféré, comme dans l'exemple 2, la capacité de production de SRIH, puis on alimente les animaux de façon habituelle pendant 4 semaines On extrait les tumeurs massi- ves, résultantes, pesant environ 35 g chacune, et on les traite comme dans l'exemple 2 pour produire du SRIH. La production de SRIH est de l'ordre de 9 400 unités/O,1 ml de culture. Le témoin, dans lequel les cellules BALL-1 hybridées sont cultivées in vitro pour leur multiplication, puis traitées comme dans l'exemple 1 pour induire la production de SRIH, ne donne qu'environ 350 unités/ de SRIH par 0,1 ml de cultu- re. EXEMPLE 5 Après avoir irradié des rats adultes avec un équivalent de dose de rayon Y d'environ 400 rems pour réduire leurs réac- tions immunitaires on implante aux animaux par voie sous- cutanée une lignée de cellules provenant de nodosités lym- phatiques humaines, HL-4, puis on alimente les animaux de façon habituelle pendant 4 semaines. Les tumeurs massives, résultantes, formées sous la peau et pesant environ 15 g chacune, sont extraites et traitées com- me dans l'exemple 3 pour induire la production de SRIH Cet- te production est de l'ordre de 3 600 unités/O,l ml de cul- ture. Le témoin, pour lequel la lignée cellulaire humaine est cul- tivée in vitro pour sa multiplication, puis est abandonnée pour laisser le SRIH se libérer, ne donne qu'environ 30 uni- tés de SRIH/O,1 ml de culture. EXEMPLE 6 Une lignée de lymphoblastoides humains, Ad-L, est mise en suspension dans du sérum physiologique, dans une chambre de diffusion cylindrique, en matière plastique, ayant un volume intérieur d'environ 10 ml et munie d'une membrane filtrante dont les pores ont environ 0,5 pim de diamètre Après inclu- sion intrapéritonéale de la chambre à un rat adulte, on ali- mente l'animal de façon habituelle pendant 4 semaines puis on retire la chambre et on recueille les cellules humaines. La densité des cellules humaines dans la chambre atteint jusqu'à environ 109 cellules par ml, ce qui est environ 100 fois supérieur à ce que l'on obtient par culture de tissu in vitro, avec un incubateur à C 02. Les cellules humaines sont traitées comme dans l'exemple 3 pour induire la production de SRIH, qui est d'environ 4 200 unités/O,l ml de culture. EXEMPLE 7 On implante dans les cavités allantoiques d'oeufs embryon- nés, préincubés à 370 C pendant 5 jours, une lignée de lym- phoblastoldes humains, hybrides, BALL-1, auxquels on a conféré comme dans l'exemple 4 la capacité de production de SRIH Après incubation des oeufs à cette température pendant encore une semaine, on récolte les cellules humai- nes multipliées, et on les traite comme dans l'exemple 1 pour induire la production de SRIH Cette production est de l'ordre de 3 200 unités/o,l ml de culture. REVENDICATIONS 1 Application du procédé qui consiste à transplanter des cellules humaines dans un animal à sang chaud ou dans un dispositif, dans lequel circule le fluide nutritif cor- porel d'un animal à sang chaud, et à laisser ces cellules s'y multiplier caractérisée en ce que les cellules choisies sont celles qui sont capables de produire le Suppres- seur de Réponse Immunitaire Humain (SRIH), et en ce que l' on laisse les cellules multipliées libérer ce facteur. 2 Application selon la revendication 1, caractérisée en ce que les cellules humaines, capables de produire du SRIH, sont des cellules normales, provenant du sang péri- phérique, de la rate ou de l'amygdale. 3 Application selon la revendication 1, caractérisée en ce que les cellules humaines capables de produire le SRIH sont des cellules tumorales, provenant de tumeurs tonsillaire ou splénique, ou de carcinome du foie ou du poumon, ou des cellules obtenues par transformation des cellules humaines selon la revendication 3. 4 Application selon la revendication 1, caractérisée en ce que les cellules humaines sont des cellules hybrides, auxquelles on a conféré l'aptitude à produire SRIH. Application selon la revendication 1, caractérisée en ce que les cellules humaines sont des lignées de lympho- blasto Ides humains, hybridées avec une des cellules humai- nes selon les revendications 3 ou 4, afin d'introduire 1 ' aptitude à produire SRIH des dernières dans les premières. 6 Application selon la revendication 5, caractérisée en ce que la lignée de lymphoblastoides humains est la li- gnée de Namalwa, de BALL-1, de NALL-1, de TALL-1 ou de JBL. 7 Application selon une des revendications 1 à 6, ca- ractérisée en ce que les cellules multipliées sont soumises à l'action d'un inducteur de SRIH, pour favoriser la pro- duction de celui-ci. 8 Application selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'inducteur est un mitogène, un virus, ou un aci- de nucléique. 9 Application selon une des revendications 1 à 8, dans laquelle l'animal à sang chaud est un poulet, pigeon, chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, co- baye, rat, hamster, souris,rat nu ou souris nue.