FR 2522664 A1 19830909 FR 8303268 A 19830228 La présente invention a pour objet des protéines succinylées, avec un degré de succinylation compris entre 20 et 100 %, contenant 0,1 à 20 % en poids de fer, et obtenues par le traitement de protéines succinylées avec des sels de fer dans des intervalles appropriés de p H Les composés en cause, parfaitement tolérés, sont caractérisés par une biodisponibilité optimale du fer. Le fer, qui est présent dans tous les tissus de l'organisme, joue un rôle physiologique irremplaçable Il fait partiècomme composant essentiel de l'hémoglobine, de la myoglobine et des enzymes: catalase, fumariquedéhydro- genase, peroxydase, cytochromes, DPN-cytochromoréductase et métalflavoprotéines, comme la férroflavine Les tissus d'un être humain adulte contiennent de 1,5 à 5 grammes de fer dont 60-65 % sont concentrés dans les globules rouges, alors que 18-30 % sont liés aux protéines ferritine et hémosidérine, situées dans le foie, la rate, la moelle des os et les cellules du système réticulo- endothélial Ce qui reste est distribué dans les divers systèmes enzymatiques susmentionnés, dans la myoglobine (environ 4 %) et la transferrine (environ 0,1 %), la 1 globuline chargée du transfert hématique du fer d'origine intes- tinale Elle est en mesure de lier, de façon pratiquement inséparable, deux atomes de fer aux valeurs physiologiques de p H. Le besoin en fer est satisfait, en partie par l'utilisation de fer endogène (dérivant de la destruction de globules rouges vieillis), et en partie par le fer exogène L'absorption du fer exogène a lieu le long de tout le duodénum et de la partie supérieure du jéjunum et s'accumule principalement dans le foie La première manifestation pathologique de la carence en fer est l'anémie hypochromique sidéropénienne dont les causes premières peuvent être variées hémorragies chroniques dérivant d'ulcères gastroduodénaux ou néo- plasies, apport diététique insuffisant, ou bien mauvaise absorption comme dans les états diarrhéiques; augmentation de besoin en état de grossesse, allaitement, maladies infectieuses, etc; utilisation métabolique défec- tueuse; thérapies particulières comme par exemple celle par ACTH et de pro- duits de la cortisone La thérapie la plus appropriée est constituée par l'ap- port de fer; elle est efficace pour réduire l'état d'anémie quand il dérive, évidemment, d'une carence en fer effective. Toutefois, cette dernière est généralement accompagnée par des effets secondaires non souhaités liés au type de vecteur utilisé pour le fer Les préparations pharmaceutiques pour voie orale les plus diffusées sont à base des sels les Dlus divers d'acides organiques et inorganiques de plus en plus introduits dans la thérapeutique dans 1 espoir de réduire les effets secon- daires déjà mentionnés Ainsi, l'on trouve dans le commerce des spécialités pour voie orale à base de sels inorganiques type: chlorure ferrique, sulfate ferreux, phosphate ferrique, ou bien organiques, tels que; citrate, colinate, aspartate, fumarate, gluconate, lactate, oxalate, succinate Par voie intra- musculaire profonde, on propose le complexe ferro-dextrane alors que, pour les traitements i v (pour les anémies sidéropéniennes o la thérapie par voie orale a échoué), on utilise le complexe ferro-dextrine Pour ces derniers types de complexes, les effets-secondaires peuvent consister dans des réactions al- lergiques, des hausses de température, tachycardie, leucocytose, lymphoadéno- pathie, pour le traitement intramusculaire, et même des chocs de type ana- phylactique, thrombophlébites et collapsus cardio-vasculaire pour le traite- ment i v; dans la thérapie par voie orale avec des formulations à base des composés susmentionnés, apparaissent en général des dommages gastrointesti- naux, avec nécrose et perforation des muqueuses parmi les plus graves, diarrhée et vomissement En outre, la médiocre tolérance rend difficile l'administra- tion de quantités précises de fer Pour minimiser les effets secondaires, on suggère l'administration simultanée d'aliments, mais cela est en contradiction avec la variabilité prouvée d'absorption du fer en fonction de la composition des aliments mêmes Il est prouvé, en effet, que l'absorption du fer de médicaments n'est optimaleque lorsque le sujet est à jeun A l'irritation gas- trique, suit l'usage d'antiacides qui, à leur tour, réduisent l'absorption avec aggravation de l'état anémique. Un progrès considérable dans la thérapie par le fer, évidemment par vqie orale, a été réalisé avec l'introduction sur le marché de spécialités à base de ferritine. La ferritine est une globuline ferrique, et représente, dans les organes desmanmifères, la protéine de réserve du fer la plus importante Le produit dans le commerce, en tant que matière première, est extrait de la rate du cheval Sa teneur en fer est de 20 % sur la base du poids sec; la part protéique, l'apoferritine, a un poids moléculaire d'environ 445 00 et entoure le noyau de fer oxydo-phosphaté cristallin Soluble dans l'eau, elle est appropriée à l'administration par voie orale. La thérapie à basede ferritine ne présente pas les effets secondaires gastro-intestinaux relevés lors de l'usage des dérivés du fer, indiqués plus haut Une grave limitation à l'utilisation des dérivés du fer dérive soit du coûât très élevé de la matière première soit, surtout, de la disponibilité limitée des sources d'extraction. Les connaissances actuelles à ce sujet semblent indiquer que le support optimal du fer aux fins d'une administration exempte d'effets secon- daires pourrait être un vecteur protéique Plusieurs protéines présentent une certaine affinité pour le fer On a donc essayé d'utiliser comme vecteurs quelques types de protéines d'origine animale (sérum-protéines, protéines d'organe, ovalbumine, lacto-protéines) ou végétale (protéines de soja). L'interaction entre sels ferriques inorganiques et les susdites pro- téines conduit à la formation de dérivés ferro-protéiques dont l'intérêt thérapeutique est toutefois infirmé par une série de caractéristiques néga- tives, parmi lesquelles: la non solubilité des dérivés obtenus lorsque le pourcentage de fer lié à la protéine atteint des valeurs supérieures à 0, 5 %; la difficulté ou même l'impossibilité d'évaluer dans ces conditions d'insolubilité quelle fraction du fer total est réellement liée à la protéine et quelle fraction coprécipité simplement sous forme d'oxydes hydratés, hautement dommageables pour le système gastro- intestinal; le défaut d'homogénéité et constance de composition en fer de ces dérivés. En outre, pour certaines protéines, parmi lesquelles celles dérivées du lait, on a relevé la présence de dérivés de fer solubles avec une quantité considérable de dérivés insolubles, à diverses valeurs de p H, mais la composi- tion de ces fractions soluble apparaît comme très variable en fonction de variations minimes des paramètres expérimentaux. Or, on a trouvé d'une façon surprenante qu'en soumettant à une succi- nylation d'une manière appropriée ces protéines (un procédé utilisé normalement pour obtenir des dérivés succinylés des protéines pour usage alimentaire et pour aliments d'animaux), il est possible d'obtenir, par la réaction de celles- ci avec le fer, des dérivés ferro-protéiques même à teneur en fer élevée, qui sont stables, solubles à des valeurs de p H supérieures à 5, ayant des teneurs en fer différentes mais reproductibles, en mesure d'apporter du fer dans des organismes à sang chaud, lorsqu'ils sont administrés par voie orale, sans produire des effets secondaires dommageables au système gastrointestinal. En effet, chez les rats l'administration quotidienne, par voie orale et pendant 20 jours consécutifs, n'a montré aucune manifestation d'effets dommageables pour le système gastro-intestinal, et a été bien tolérée. En outre, toujours chez ce même type d'animaux, la comparaison des siderémies, après administration par voie orale, de quantités équivalentes de fer sous forme de sulfate ferreux, ferritine de rate chevaline (Sigma, Saint Louis, Missouri) et d'un dérivé ferroprotéique de protéines succinylées de lait, préparé suivant la description dans l'exemple 1, met en évidence que a) les niveaux hématiques du fer induits par le dérivé faisant l'objet de la présente invention, par rapport à ceux induits par le sulfate ferreux, sont plus prolongés dans le temps (voir tableau IX), b) lesniveauxhématiques de fer induits par le dérivé faisant l'objet de la présente invention, par rapport à ceux induits par la ferritine témoin, sont plus élevés (environ 1,5:1 en moyenne) dans l'espace de temps des six heures de durée de l'expérience (voir tableau X). Si l'on considère la tolérance optimale du produit, sa toxicité très basse (plus grande de 4 000 mg/kg chez le rat Swiss), les taux hématiques élevés en fer réalisables et la facilité de trouver la matière première, l'utilisation des dérivés, faisant l'objet de la présente invention, constitue une nette amélioration de l'état actuel de la thérapeutique par le fer. Les caractéristiques physico-chimiques de ces dérivés succinyl-ferro- protéiques, comme il a été indiqué plus haut, sont reproductibles et cons- tantes comme il résulte des exemples qui ne sont pas limitatifs L'absence de fer non lié est démontrée par la solubilité totale en milieu alcalin (con- ditions o l'ion fer précipite comme oxyde hydraté) des remèdes obtenus à partir de protéines succinylées et d'un sel de fer. L'objet de la présente demande de brevet est donc constitué par les dérivés, jusqu'à ce jour inconnus, caractérisés par le fait qu'ils contiennent une quantité de fer variable en pourcentage, des protéines animales ou végé- tales succinyléesà des degrés divers de succinylation et qui se révélent appropriées à l'apport de fer, biodisponible, dans des organismes à sang chaud, sans effets dommageables au système gastro-intestinal si elles sont administrées par voie orale, suivant les exemples ci-dessous, qui sont indi- catifs et non limitatifs Ces dérivés s'avèrent propres, comme principes actifs, à la réalisation de préparations pharmaceutiques utilisables dans le traite- ment des anémies dérivant de carence de fer chez les animaux à sang chaud, et par conséquent toutes formes pharmaceutiques d'administration contenant ces dérivés comme principe actif, pour usage humain ou vétérinaire, constituent un objet ultérieur de ce brevet. En outre, la présente invention a pour objet un procédé pour la pré- paration des dérivés succinyl-ferro-protéiques en cause, ce procédé étant caractérisé par le fait qu'on fait réagir des protéines succinylées (de manière connue en soi) avec des ions fer à un p H compris entre environ 2 et environ 10, de préférence à un p H voisin de la neutralité, dans des solvants aqueux, et par le fait que les produits obtenus sont isolés du milieu de réaction par précipitation à un p H de l'ordre de 2-4, ce dernier intervalle de p H étant réalisé spontanément ou au moyen d'acidification En alternative, le produit de réaction peut être isolé par élimination du solvant après réglage du p H à des valeurs proches de la neutralité. EXEMPLE 1 Préparation de dérivés de fer à 5 %, à partir de protéines succinylées du lait en poudre entier I kg de lait en poudre est mis en suspension dans 6 litres de bicar- bonate de soude 0,3 M et, sous agitation mécanique et contrôle de p H, on ajoute 500 g d'anhydride succinique en portions successives, tout en maintenant le p H dans un intervalle compris entre 7,5 et 8 par addition de Na OH h N A la fin de l'addition, on laisse sous agitation durant 2-3 heures à température am- biante; pendant cette période la suspension passe totalement en solution La solution opalescente est centrifugée ou filtrée jusqu'à arriver presque à la limpidité, et ensuite acidifiée avec H Cl, lentement, jusqu'à p H 3 Le préci- pité qui se forme est séparé par centrifugation ou filtration et mis à nouveau en suspension dans l'eau (environ 8 litres); on additionne une solution de Na OH jusqu'à dissolution complète (p H environ 7,5); on centrifuge et la solu- tion limpideest acidifiée de nouveau à p H 2,5-3 par addition de H Cl. Le précipité est récupéré par filtration ou centrifugation puis lavé avec une solution de H Cl à p H 3. Le résidu, constitué par les protéines succinylées (dont le degré de succinylation est variable en fonction de la quantité d'anhydride surcinique utilisée; pour l'exemple porté ici, il est de 90 % par rapport aux groupes qu'on peut succinylo Eprésents dans la protéine de départ comme il sera indi- qué par la suite), est dispersé, après séchage sous vide, dans l'eau distillée il est dissous par addition de Na OH jusqu'à p H de 7,5 en diluant la solution de manière que la concentration finale de protéine s'élève environ à 0,04 g/ml. On ajoute à cette solution une solution d'un sel de fer (exemple: Fe Cl 3) avec un rapport de Fe 3 + /protéine succinylée de 1:10 en poids On obtient une sus- pension qui est dispersée finement par agitation mécanique pendant que le p H descend à environ 2,5 On laisse en agitation pendant 3 heures à température ambiante puis la suspension est filtrée; la partie solide est mise en suspen- sion dans l'eau (environ trois volumes) et dissoute par addition de Na OH (p H 7,5). La solution pas tout à fait limpide est filtrée, et la récupération du produit à l'état solide peut gtre indifféremment effectuée par deux voies a) on ag Eidifie la solution, et le précipité obtenu à p H 2,5 est filtré et séché sous vide; b) la solution limpide est dialysée contre l'eau pour éliminer le chlorure de sodium, puis lyophilisée ou séchée par séchage-atomisation. Dans les deux cas les rendements en produit final sont équivalents et s'élèvent à environ 20 % en poids du lait en poudre de départ Les caractéris- tiques du produit sont décrites dans le tableau I (exemple 1 b). EXEMPLE 2 Préparation de dérivés du fer à 5 % de protéines succinylées du lait Comme il a été décrit dans l'exemple 1, avec la variante que le produit de départ est constitué par 350 grammes de protéines du lait, préalablement précipitées de la poudre de lait par dispersion de la poudre dans l'eau (en- viron 5 litres), acidification à p H 2,5 par un acide minéral, puis filtration ou centrifugation du solide protéique et séchage. La teneur en fer, comme indiqué ci-dessous (tableau I), pour les dérivés obtenus dans les exemples 1 et 2, s'élève à environ 4-5 % en poids. EXEMPLE 3 Préparation de dérivés de fer de protéines succinylées du lait à diverses teneurs en fer. En opérant suivant la description des exemples 1 et 2 en ce qui concerne la méthode et la quantité de poudre de lait ou les protéines du lait préalablement précipitées, mais avec un rapport en poids Fe /protéine succinylée de 0,1:10, 0,2:10; 0,5:10 et 1,5:10, on obtient des dérivés de fer dont les caractéristiques sont portées dans le tableau I. EXEMPLE 4 Préparation de dérivés de fer de protéines succinylées d'oeuf (Ovalbumine) On dissout 5 grammes d'ovalbumine dans 100 ml d'eau contenant 3 grammes de KHCO 3, on additionne à la solution limpide 2,5 g d'anhydride succinique par portions successives tout en maintenant le p H à des valeurs comprises entre 5 et 8, par addition de Na OH; on laisse réagir pendant 2 heures à température ambiante; après acidification de la solution à p H 3,4, on obtient un pré- cipité qui est isolé par centrifugation, purifié par dissolution à p H 7, 5, par Na OH, puis reprécipité à p H 3,4. La partie solide est récupérée par centrifugation, et séchée sous vide La partie solide séchée est mise en suspension dans l'eau distillée et dissoute par addition de Na OH (p H 8) de façon à obtenir une solution finale de 0,04 g de protéine/ml On additionne à cette solution très visqueuse une solution de sel de Fe (par ex, chlorure ferrique) de façon à avoir un rapport, en poids, protéines succinylées/Fe 3 + de 10:1 Dans ces conditions le p H chute à 2,6 avec formation d'un précipité qui est récupéré par filtra- tion Ce précipité est à nouveau dissous dans l'eau avec addition de Na OH jusqu'à dissolution complète (p H 7,5) Après dialyse contre de l'eau, pour éliminer le chlorure de sodium, le produit solide est récupéré par lyophilisa- tion ou séchage-atomisation Le rendement en dérivé est égal à 33 % en poids de la protéine de départ Le contenu en fer et les caractéristiques sont portés dans le tableau I. EXEMPLE 5 Préparation de dérivés du fer de protéines succinylées de sérum bovin On additionne à 50 millilitres de solution de séroprotéines bovines (teneur en protéines environ 4 g) 1,5 g de Na HC 03 et on traite avec 6 g d'anhydride succinique, en portions successives, en maintenant le p H entre les valeurs de 7,5 et 8 avec addition de Na OH A la fin de l'addition, on poursuit la réaction durant 2 heures à température ambiante puis on précipite en acidifiant à p H 2,4 par un acide minéral; le précipité est récupéré par centrifugation et purifié suivant la description de l'exemple 4 Le produit solide est mis en suspension dans l'eau et porté à p H 7,5 par Na OH; la solu- tion ainsi obtenue est additionnée d'une solution de sel de fer III (par ex; chlorure ferrique) jusqu'à atteindre un rapport, en poids, protéine succinylée/ Fe 3 + de 10:1 Le p H chute spontanément à 2,4 et on obtient un précipité qui, lorsqu'il est porté à p H 7,5,ne se dissout qu'en partie On sépare la solution du résidu par centrifugation, on dialyse contre de l'eau pour éliminer le chlorure de sodium, puis on lyophilise Le rendement pondéral en dérivé de fer, par rapport à la protéine de départ, est d'environ 30 % Pour la teneur en fer et les caractéristiques, on se reportera au tableau I. EXEMPLE 6 Préparation de dérivés du fer de protéines succinylées de foie de porc On homogénéise 400 grammes de foie de porc frais au moyen de l'homo- généisateur Silverson avec 800 ml de solution 0,2 M de KHC 03, p H 8,3; après centrifugation à 9000 t p m à 5 2 C, la partie qui surnage est recueillie et filtrée sur membrane d'acétate de cellulose 0,45,1 On ajoute à 50 millitres de solution limpide 1,2 g d'anhydride succinique, en portions successives, en maintenant le p H entre 7,5 et 8 par addition de Na OH. Après repos d'une heure à température ambiante, la solution est acidifiée par un acide minéral à p H 3, et on obtient un précipité qui est traité comme dans l'exemple 4, si ce n'est que la récupération finale est effectuée par lyophilisation de la solution, dialysée contre de l'eau Je résidu de la lyophilisation est mis en suspension dans l'eau et porté à p H 8, au moyen de soude On obtient une solution pas tout à fait limpide qui est centrifugée; on ajoute à la partie qui surnage une solution de fer (par ex. Chlorure ferrique) de façon que le rapport (estimé) entre protéine succinylée et Fe 3 -soit d'environ 10:1. Le p H de-la solution descend à 2,6, et on obtient un précipité qui est purifié comme dans les exemples précédents Le produit solide obtenu par lyophilisation de la solution finale, dialysée contre de l'eau, a les carac- téristiques et la teneur en fer répertoriées dans le tableau I. EXEMPLE 7 Préparation de dérivés du fer de protéines succinylées de soja On suspend 5 grammes de protéines de soja dans 100 ml d'eau contenant 3 g de Na HCO 3; on laisse sous agitation jusqu'à dissolution complète; tout en maintenant le p H entre 7,5 et 8 par addition de Na OH on ajoute par portions successives 2,5 g d'anhydride succinique On laisse sous agitation pendant 2 heures à température ambiante et, par addition d'acide minéral, on porte le p H à 3,4 en obtenant un précipité qui est purifié comme dans les exemples précédents Le résidu solide de la lyophilisation finale est mis en suspension dans 100 ml d'eau, on règle le p H à 8 par addition de soude, puis on centri- fuge la solution pas tout à fait limpide. La partie limpide qui surnage est traitée par une solution de fer (par ex chlorure ferrique) de façon que le rapport entre protéine succinylée et Fe 3 + soit de 10:1 en poids. Le p H de la solution chute spontanément à 2,6 et il se forme un préci- pité qui est traité comme dans les exemples précédents Le produit solide obtenu par lyophilisation de la solution finale présente la teneur en fer et les caractéristiques répertoriées dans le tableau I Le rendement en poids par rapport à la protéine de départ est de 22 %. CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE DES DERIVES DE FER DE PROTEINES SUCCINYLEES OBTENUS SUIVANT LES EXEMPLE 51-7 Les dérivés obtenus suivant les exemples exposés ci-dessus ont été analysés suivant les méthodes précisées ci-après: a) degré de succinylation Cette caractéristique est exprimée par le pourcentage de groupes suc- cinylés par rapport aux groupes pouvant être succinylés de la protéine de départ On a appliqué la méthode décrite par S Moore et W H Stein, J Biol. Chem, 211, 907, 1954 par réaction àla ninhydrine des groupes aminés libres. Les résultats sont donnés dans le tableau I. b) teneur en fer La teneur en fer a été déterminée, soit après extraction à chaud par H Cl 2 N, soit après digestion complète de la protéine par l'acide sulfurique, suivant le protocole décrit dans Standard Methods, 14 th ed, 1975 page 208, APHAAWWA-WPCF (réaction à l'o-phénanthroline) Les valeurs sont reportées dans le tableau I. c) données spectroscopiques 1) Spectroscopie RPE Tous les dérivés décrits dans les exemples exposés ci-dessus, pré- sentent le même comportement spectroscopique Nous décrivons, à titre d'exemple, le spectre RPE du dérivé succinyl-ferro-protéique préparé suivant l'exemple 1 Le spectre a été enregistré en poudre lyophilisée et présente un signal très large, centré autour de g= 2,0, avec une amplitude de signal d'environ 2000 G On remarque un autre signal, très bien défini et centré, lui aussi, à environ g= 2,0 La forme des deux signaux est caractéristique des centres paramagnétiques de Fe 3 liés en interaction (F Reid et autres Inorg. Chem 7, 119, 1968) L'ensemble de ces données semble indiquer la présence de structures protéiques fermées autour du ligand. 2) Dichroisme circulaire Ici également le comportement des divers dérivés décrits est similaire; nous décrivons, à titre d'exemple, le spectre de dichroisme circulaire du dérivé succinyl-ferro-protéique obtenu suivant l'exemple 1 Le spectre est il caractérisé par une activit 6 négative dans la zone U V; on remarque une bande négative intense avec un maximum autour de 225 nm, avec un épaulement, toujours négatif, centré autour de 225 n Ces caractéristiques spectrales semblent indiquer la prédominance d'une structure protéique désordonnée (entre autres: F Ciardelli et P Salvadori Optical Rotatory Dispersion and Circular Dichroism Heyden & Son Ltd, London, 1973 -Chapitre 4 5). 3) Spectres d'absorption U V -Visible Le comportement au spectre électronique des divers dérivés décrits est similaire; nousreportons dans la figure 1 le spectre U V -Visible pour le dérivé succinyl-ferro-protéique préparé suivant la description de l'exemple 1. Le spectre (ligne continue) ne présente pas de maximum d'absorption dans le visible, mais seulement un épaulement très faible autour de 450 nm. Dans l'ultraviolet on remarque un épaulement assez défini centré au- tour de 270 nm et une absorption très intense avec un maximum au-dessous de 220 nm. Dans la figure 1 est aussi reporté (ligne en tirets), pour comparaison le spectre de la ferritine de rate chevaline (Boehringer-iannheim). Les spectres d'absorption dans le visible sont reportés sur la figure 1, et ils ont été effectués dans l'eau, p H 7 Est aussi reporté, pour comparaison le spectre de la ferritine de rate chevaline, réalisé dans les mêmes condi- tions (Boehringer-Mannheim). 4) Spectre d'émission de fluorescence Les spectres d'émission de fluorescence sont portés sur la figure 2, o la ligne continue correspond aux dérivés succinyl-ferro-proteiques de l'in- vention, la ligne à points et tirets aux lacto-protéines telles quelles, et celle à tirets aux lacto-protéines succinylées. On observe une extinction de la fluorescence de la protéine due à la présence du métal. d) électrophorèse Les tracés électrophorétiques sur acétate de cellulose des divers dérivés en comparaison avec les protéines succinylées, les protéines d'origine et la ferritine sont portés sur les figures 3, 4, 5 et 6. La figure 3 illustre les résultats de l'électrophorèse réalisée sur des protéines de soja (tracé n 1), protéines de soja succinylées (tracé n 2), dérivé de fer de protéines de soja non succinylées, fraction soluble (tracé n 4). La figure 4 illustre les résultats de l'électrophorèse réalisée sur l'ovalbumine (tracé n 1), l'ovalbumine succinylée (tracé n 2), un dérivé de fer d'ovalbumine succinylée (tracé n 3), un dérivé de fer d'ovalbumine (tracé n 4). La figure 5 illustre les résultats de l'électrophorèse réalis Cesur des lacto-protéines (tracé n 1), lacto-protéines succinylées (tracé n 2), dérivés de fer de lacto-protéines succinylées (tracé n 3), ferritine de rate chevaline (tracé n 4). La figure 6 illustre les résultats de l'électrophorèse (lecture densi- tométrique à 550 nm) réalisée sur dérivé de fer de lacto-protéines succinylées (ligne continue), dérivé de fer de protéines de soja succinylées (points et tirets) et dérivé de fer d'ovalbumine succinylée (ligne à tirets). e) gel filtration Le profil de gel filtration sur Sephadex G 75 (Pharmacia, Uppsala); du dérivé de fer des protéines succinylées du lait (obtenu comme décrit dans l'exemple 1) par comparaison aux protéines succinylées elles-mêmes, est illustré par la figure 7, dans laquelle la ligne continue concerne les lacto-protéines succinylées, celle à tirets le dérivé de fer correspondant; en ordonnée est reportée l'absorption à 280 nm, et en abscisse le nombre progressif des frac- tions recueillies D'après le profil, on constate que la présence du fer fait naître un pic unique en sortie avec un temps de rétention analogue à celui du volume mort de la colonne Si l'on considère que l'exclusion moléculaire de la Sephadex G 75 est d'environ 75 000 Daltons, le poids moléculaire minimum apparent de cet agrégat est supérieur à cette valeur En outre, s'il y a une différence, dans les protéines succinylées on remarque un dédoublement de pic avec une "randomisation" plus grande Ce fait est aussi vérifié au niveau de l'électrophorèse (figure 5) Un tel comportement montre que le fer présent est un centre d'agrégation intermoléculaire du milieu protéique Par le gel filtra- tion sur Sephadex G 200 on peut mettre en évidence d'autres informations, par comparaison avec la-ferritine (figure 8, dans laquelle lesabscisses et les ordonnées sont comme dans la figure 7, alors que la ligne continue correspond au dérivé du fer de lacto-protéines succinylées et celle à tirets concerne la ferritine de rate chevaline) Aussi dans ce cas, le pic est univoque alors que le temps de rétention est supérieur à celui de la ferritine Cela semble montrer que le poids moléculaire apparent est inférieur à celui de la ferri- tine de rate chevaline. f) stabilité du suc gastrique Cet essai est effectué sur le dérivé de fer obtenu suivant l'exemple 1. Il est réalisé par la dissolution de 25 mg de dérivé dans 0,5 ml d'eau distil- lée et l'addition de cette solution à 5 ml de suc gastrique de rat On obtient un précipité et la suspension est incubée à 370 C durant 60 ' sous agitation. Après cette période de temps, le précipité est séparé par centrifugation et le produit surnageant est analysé en vue de la délimitation de la teneur en fer. La quantité de fer cédé au suc gastrique était de 1 % du total initial. g) précipitation du dérivé de fer par le sulfate d'ammonium A une solution à 10 % (p/v) de dérivé de fer préparé suivant l'exemple 1, on additionne 30 % (p/v) de sulfate d'ammonium On obtient un précipité de dérivé protéique du fer qui présente des caractéristiques identiques à celles du dérivé de départ et qui est encore soluble dans l'eau. L'ensemble de données exposées ci-dessus démontre que la capacité complexante des protéines succinylées à l'égard du fer n'est pas typique seulement des protéines succinylées du lait, mais qu'elle est caractéristique des dérivés succinylés de protéines d'origine et de fonction physiologique diverses, animale et végétale. Comme nous l'avons précisé ailleurs, beaucoup de protéines animales ou végétales non modifiées sont capables de lier du fer En effet, quand on fait réagir des protéines non modifiées du lait, de l'ovalbumine et des pro- téines de soja,de sérum ou d'extraits d'organes (foie) avec le fer dans des conditions similaires à celles décrites, pour obtenir les dérivés correspon- dants des succinyl-protéines, on obtient des produits ayant également des teneurs en fer similaires, toutefois avec des caractéristiques de solubilité et stabilité complètement différentes En effet, à titre d'exemple, comme on voit sur le tableau I, la protéine de soja donne un produit final qui, une fois lyophilisé, est insoluble pour plus de 75 % et cède son fer après traite- ment avec un suc gastrique Par conséquent, outre la capacité complexante à l'égard du fer, le comportement des dérivés ferro-protéines succinylées, faisant l'objet de l'invention (à savoir solubilité en milieu alcalin, stabi- lité en milieu acide et en présence de sucs gastriques même pour des teneurs en fer élevées), n'est pas attribuable aux protéines de base, et n'était donc pas en tant que tel, prévisible. TOXICITE a) On a examiné la toxicité aiguë chez le rat Swiss, par voie orale, au moyen d'une sonde gastrique, de la ferro-succinyl-protéine de protéines de lait obtenue suivant la description de l'exemple 1, véhiculée par de l'eau dis- tillée La DL 50 était supérieure à 4 000 mg/kg. b) La toxicité par administration répétée chez le rat, par voie orale, du même dérivé de l'exemple 1 (appelé par la suite "Ferrolat") a été étudiée pendant jours de traitement continu chez des rats mâles Wistar d'un poids initial de 200 grammes, en stabulation pendant 14 Jours avant le traitement puis "randomisés" et séparés en groupes de 10 (groupe I: témoins, groupes II, III et IV Ferrolat à 30-100-300 mg/kg/jour) La préparation à tester, dissoute au moment de l'utilisation dans H 20 distillée a été administrée journellement, s.ans discontinuité et à la même heure de chaque jour, par sonde; les témoins ont reçu un volume égal ( 10 ml/kg)4 'eau de source Durant le traitement les rats ont été pesés journellement avant l'administration, et observés pendant quelques heures après l'administration du produit La quantité d'aliment con- sommé a été mesurée à la fin du traitement, 24 heures après la dernière adminis- tration, et après environ 20 heures de jeûne,les rats anesthésiés par l'éther ont été sacrifiés par coupure des carotides;une partie du sang a été recueillie dans une éprouvette contenant de l'EDTA ( 2 gouttes d'une solution à 4 %), le restant a été laissé se transformer en sérum Sur le sang total on a effec- tué les examens hémochromocytométriques et sur le sérum les examens hémato- chimiques. RESULTATS variations pondérales et consommation d'aliment Sur la figure 9 sont représentées les courbes de l'accroissement pon- déral obtenues durant le traitement jusqu'au jour précédent le sacrifice. Dans le tableau II et dans le tableau III, sont portées respectivement les valeurs inhérentes à l'accroissement pondéral et à la consommation d'ali- ment par les animaux en cours de traitement. La courbe d'accroissement du groupe de rats traités par Ferrolat à des doses de 300 mg/kg s'avérait ralentie d'une façon significative, par rapport à la courbe d'accroissement du groupe de rats témoins, à partir du éme jour du début du traitement; le même groupe de rats avait, en moyenne, consommé moins d'aliment (-11,7 %). Des différences mineures, statistiquement non significatives, ont été observées chez les groupes restants de rats traités par Ferrolat. Examens hématologiques * Les résultats sont portés dans le tableau IV. Examens hématochimiques Les résultats sont portés dans le tableau V Une modeste diminution de la phosphatage alcaline a été observée chez les rats traités par Ferrolat, 300 mg/kg/jour. Examens des urines Les résultats sont portés dans le tableau VI. Examenà des organes Dans le tableau VII sont portés les poids moyens absolus des organes principaux de rat, et dans le tableau VIII les poids moyens correspondants relatifs au poids corporel. Dans le groupe de rats traités par Ferrolat Oo O mgikgfour on a constaté un accroissement significatif du poids relatif de la rate et des poumons Dans le groupe de rats traités par Ferrolat 300 mg/kg/jour, outre une diminution significative du poids corporel apparaissait un accroissement significatif du poids moyen des testicules. NIVEAUX HEMATIQUES APRES ADMINISTRATION ORALE a) Comparaison Ferrolat-sulfate ferreux On a utilisé des rats mâles Wistar d'un poids d'environ 200 grammes à jeun depuis 18 heures, "randomisés" et séparés par groupes de 5; chaque groupe a été sacrifié à l'heure déterminée et on a prélevé le sang de chaque animal par résection de la carotide; sur le sang de chaque animal du groupe, la détermination du fer a été effectuée spedtrophotométriquement par mise en oeuvre d'acide bathophénanthrc Ine sulfonique (Fe-Test,Wako) L'administration a été effectuée par sonde en solution aqueuse ( 5 ml/kg) Le dérivé succinyl- ferro-protéique utilisé avait été préparé suivant la description de l'exemple 1 (Ferrolat) Les doses et les résultats sont portés dans le tableau IX A remarquer que la quantité de fer/kg était égale pour les deux dérivés (Fe: 1 mg/kg). b) Comparaison Ferrolat ferritine On a utilisé des rats mâles Wistar d'un poids d'environ 200 grammes à jeundepuis 18 heures, "randomisés" et séparés par groupes de 9; chaque groupe a été sacrifié à l'heure déterminée, et on a prélevé le sang de chaque animal par résection de la carotide; sur le sang de chaque animal du groupe, la détermination du fer a été effectuée par spectmhotométrie en employant la Iron Colorimetric Method (Boehringer-Mannheim) L'administration a été effectuée par sonde en solution aqueuse ( 5 ml/kg) Les doses et les résultats sont portés dans le tableau X A remarquer que la quantité de fer/kg pour le dérivé succinyl-ferro-protéique désigné Ferrolat était la même que celle de la Ferritine (Sigma, St Louis Missouri) et égale à 1 mg/kg. c) Comparaison entre dérivés succinyl-ferro-protéiques obtenus à-partir de divers types de protéines On a utilisé des rats mâles Wistar d'un poids d'environ 200 grammes, à jeun depuis 18 heures, "randomisés" et séparés par groupes de 5 (un pour l'administration du dérivé, et un groupe témoin) Chaque groupe a été sacrifié deux heures après l'administration et, par résection de la carotide, on a prélevé le sang de chaque animal pour la détermination du fer, par mise en oeuvre de l'acide bathophénanthrolinesulfonique (Fe-Test,Wako) L'administra- tion orale a été effectuée par sonde en solution aqueuse ( 5 ml/kg) Les doses de chaque dérivé utilisé ont été choisies de façon à administrer toujours 1 mg/kg de Fe. Produits essayés: 1) protéines de soja succinylées + Fe ( 4,42 %) 2) ovalbumine succinylée + Fe ( 3,57 %) 3) Séro protéines bovines succinylées + Fe ( 5, 78 %) 4) Protéines de lait succinylées + Fe ( 4,5 %) Les résultats sont portés dans le tableau XI. TABLEAU I SOURCE SUCCINYLATION Fe RENDEMENT SOLUBILITE PROTEIQUE (% de groupes (% g) (% de la à H 5 succinylables) protéine succinylée) Lait) 95 6,7 30 + " b) As 4,6 20 + c),i d)" 3,2 18 + d) " 2,5 18 + " e) " 0,8 13 + Lactoprotéines 95 4,5 + Ovalbumine 95 3,6 33 + Séroprotéines 82 5,8 + (bovines) 25,5 30 + - (Soja) 92 4,4 22 + ( Organe) (foire) n d 8,4 n d + - (foie) (Lait) 35 4,3 26 + Lactoprotéines O 4,8 - Ovalbumine O 04 (So Ja) O 4,5 0 O,4 ± Séroprotéines 0,5 (bovines) (Organe)0 n d n d. (foie) a), b), c), d), e) échantillons avec rapport de Fe 3 +: protéines compris entre 0,1: 1 et 5: 1 (p:p). f) complète (+); partielle (+ -); insoluble (-). TABLEAU II ACCROISSEMENT PONDERAL TRAITEMENT Poids moyen Poids moyen Accroissement mg/kg/Jour initial final pondérai moyenne ET Témoins 224,10 2,83 343,60 8,87 119,50 7,66 Ferrolat 30 224,40 3,03 325,50 4,56 101,20 4,35 Ferrolat 100 224,40 2,30 326,10 + 8,06 101,70 8,08 Ferrolat 300 224,30 + 3,71 307,00 * 10,15 82,77 8,28 * p TABLEAU III CONSOMMATION D'ALIMENT TABLEAU IV DONNEES HEMATOLOGIQUES TRAITEMENT mg/kg/jour Témoins Ferrolat 30 Ferrolat 100 Ferrolat 300 Hémoglobine g % 12,11 _ 0,47 11,77 + 0,37 12,39 _ 0,30 12,93 + 0,25 Hématocrite % 66,88-2,06 61,44 f 1,96l 66,90 + 2,77 64,16 + 1,80 Leucocytes 103/m 3 '16,95 + 2,25 16,551,65 23,46 + 2,16 19,93 _ 2,58 rythrocytes 19,91 + 0,68 31 Erythrocytes 10 /mm 5,76 _+ 0,51 6,1210,66 6, 2210 __________________ 6,12 ±0,66 i_ 5,91-+O'68 ___ 6,22 _ O '31 TRAITEMENT Consommation Variation mg/kg/jour moyenne % totale Témoins 32,33 - Ferrolat 30 30,42 5,91 Ferrolat 100 30,98 4,18 Ferrolat 3001 28,54 -11,72 Ferrolat 300 l 28,54 -11,72 TABLEAU V DONNEES HEMATO -CHIMIQUES TRAITEMIENT mg/kg/jour Témoins Ferrolat 30 Ferrolat 100 Ferrolat 300 Glucose 55,33 5,75 52,81 t 4,38 63,6115,58 60,74 f 14,97 mg % Azotémie++ mg % 32,7311,33 34,59 t 2,25 28,6812,34 32,33-2,52 GOT 110,51:t 7,10 130, 81 8,59 109,09-:5,21 113,36 7,29 mu/ml GPT 19,58 t 1,52 26,86-+,43 30, 14 't 6,02 23, 15 L 2, 57 mu/ml Phosphatase* alcaline 255,65113,82 229,53 f 17,03 257,53:t 22,35 213,80 t 12,72 mu/ml Protéines totales 6,19:b,12 6, O 2 f 0,17 6,37 0,12 6,2110,16 g % Signification * p TABLEAU VI EXAMEN D'URINES TRAITEMENT mg/kg/jour Témoins Ferrolat 30 Ferrolat 100 Ferrolat 300 p H 8,150 t,178, 5510,14 8,240 0,188,500 O, 12 protéines 21, 13,78 24, 13,05 63, 1 12,4 * 7 53,33 '11, 66 * glucose abs, abs, abs, abs. corpsab asab b. cétoniquesabasas b. bilirubine abs, abs abs abs. sang abs, abs abs, abs. Signification * p * p *** p TABLEAU VII POIDS FRAIS ABSOLU DES ORGANES DE RAT TRAITEMENT Ferrolat 30 mg/kg/jour Ferrolat 100 Ferrolat 300 Poids corporel g 310,60 7,53 300,3313,6 14 1296,816,16 278,* 44 I-8,89 Coeur g 1,151 O,05 1,10 0,03 1,14 Gt O,04 1,0910,07 Poumon g 1,551 O,05 1,70-0,20 1,6810,05 1,57 '0,12 Foie g 9,1410,35 8,8910,35 8,782 O,28 8,35 t 0,44 Rate g 1, 380, 13 1, 36 O,O 08 1, 65 O, 12 1,-370,09 I Reins g 2,28 ZO,07 2,2110,09 2,2210, 08 2,09 t 0,10 Surrénales g 50,3014,55 56,33:t 7,69 51,8016,O 7 37,4 4 t 5,56 Cervelle g 1,7740,031 1,7010,03 1,6740,05 1,6810,06 Testicules g 3, 3010,05 3,1220 O,10 3,08 '0,16 3,25 0,07 Estomac g 1,77 t 0,09 1,7740, 05 1,7510,07 1,53-0,09 Signification * p TABLEAU VIII POIDS FRAIS RELATIF DES ORGANES DE RAT Ferrolat 30 mg/kg/jour Ferrolat 100 Ferrolat 300 Poids | * corporel 310, 60-7,53 300,33-3,64 296,80-6,16 278,44 + 8,89 Coeur % 0,37 + 0,01 0,37 + 0,08 0,39 + 0,09 0,39 + 0,02 Poumons % 0,50 + 0,02 0,56-0,06 0,57-0,02 0, 57 + 0,06 Foie % 2,94 + 0,04 2,96 + 0,10 2,96-+ 0,06 2,99-0,08 Rate % 0, 44-0,03 0,45-0,03 0,56-0,04 0,49-0,03 Reins % 0,73-0,01 0,74-0,02 0,75-0, 03 0,75-0,02 Surrénales % 0,016 + 0,001 0,019 + 0,003 0,017-0,002 0,014 + 0,002 Cervelle % 0,57 + 0,02 0,57-0,01 0,57 + 0,02 0,60 + 0,01 Testicules % 1,06-0,02 1,04-0,03 1,04-0,05 1,18 + 0,04 Estomac % 0,56-0,02 0,59-0,02 0,59-:0,02 0,54-0,02 Signification * p TRAITEMENT Témoins TABLEAU IX NIVEAUX HEMATIQUES: COMPARAISON FERROLAT SULFATE FERREUX TRAITEMENT i Fer sérique Ag% heures apres traitement ' 1 2 4 6 Témoins H 20 5 ml/kg 99,22 59,91 98,23 80,17 74,- + 24,92 + 6,85 + 13,28 + 6,37 + 10,10 ( 5) ( 5) ( 5) ( 5) ( 5) ** *** *** ** ** Ferrolat; 22,37 mg/kg 227,45 275,28 269,61 203,16 148,18 (Fe égal à 1 mg/kg) + 16,40 + 18,91 + 22,51 + 27,74 + 16,73 ( 5) ( 5) ( 5) ( 5) ( 5) Fe SO 47 H 20:4,98 mg/kg 336,27 272,14 273,56 129,50 80,52 F/ p os) + 27, 79 + 24,09 + 19,32 + 6,21 + 5,65 (Fe gal1 mg/kg ( 5) ( 5) ( 5) ( 5) ( 5) Signification par rapport aux témoins: * p P* Signification entre deux préparations de fer: ': p TABLEAU X NIVEAUX HEMATIQUES: COMPARAISON FERROLAT-FERRITINE TRAITEMENT Fer sériqueug/100 ml heures après le traitement 1 2 4 6 Ferritine (F-4503 Sigma 168,79 170,66 148,08 89,22 dilution 1,08 % v/v, + 15,35 + 14,70 + 18,69 + 12,75 ml/kg soit 1 mg/kg de Fe) Ferrolat 21,46 mg/kg *** ** (soit 1 mg/kg de Fe) 302,07 269,81 223,72 106,24 dans 5 ml/kg + 15,59 + 29,94 + 18,51 + 11,30 Témoins, eau distillée ,40 ml/kg 86, 39 _+ 6, 39 * p de Student pour la Ferritine. TABLEAU XI NIVEAUX HEMATIQUES: COMPARAISON ENTRE DERIVES SUCCINYL- FERRO-PROTEIQUES DE DIFFERENTS TYPES DE PROTEINES T Signification par rapport aux témoins: * p industriellement et qui se rattachent à l'utilisation des dérivés succinyl- ferro-protéiques décrits ci-dessus et revendiqués, en tant qu'agents propres à la thérapie des anémies sidéropéniennes Donc, un aspect essentiel de l'in- vention est constitué par des formulations pharmaceutiques pour usage humain ou vétérinaire contenant des quantités prédéterminées de l'un au moins de ces dérivés Ces derniers peuvent être administrés par voie orale, par exemple sous forme de comprimés, granulés en sachets, sirops, capsules, ampoules, et poudres a ajouter au fourrage pour animaux, etc. A titre d'exemples, nous citons les formulations suivantes: ampoules contenant 5-10-40 mg de fer sous forme de ferro-succinyl-protéines, otre un dissolvantaqueux, des stabilisants, des aromatisants, etc communement employés dans la technique pharmaceutique; Comprimés à 5-10-40 mg de fer sous forme de ferro-succinyl-protéines, outre les excipients désagrégeants, etc communément employés dans la technique phar- maceutique; Capsules à 5-10-40 mg de fer sous forme de succinyl-ferroprotéines; TRAITEMENT Fer sérique enjrg/100 ml valeurs moyennes + ET Témoins 83,99 + 7,56 So Ja succ 260,68 + 29,52 Ovalbumine succ 235,82 + 46,06 Sroprotéines succ 277,63 + 49,35 Ferrolat 305,81 + 23,20 Sachets d'une dose contenant un granulé effervescent à 5-10-40 mg de fer sous forme de ferro-succinylrprotéines, outre un sucre, des aromatisants, des stabilisants, etc communément employés dans la technique pharmaceutique; Poudre de lait à ajouter au fourrage de sevrage pour animaux, à 5 % 20 % en poids de principe actif. REVENDICATIONS 1 Protéines succinylées contenant du fer. 2 Protéines succinylées contenant de 0,1 à 20 % en poids de fer. 3 Protéines succinylées selon la revendication 1 ou 2, caractérisées par le fait que leur degré de succinylation est compris entre 20 et 100 %. 4 Protéines succinylées suivant la revendication 1,2 ou 3, caracté- risées par le fait que la protéine de départ est une protéine d'origine végé- tale ou animale. Protéine de lait avec un degré de succinylation supérieur à 70 %, contenant plus de 4 % en poids de fer. 6 Ovalbumine avec un degré de succinylation supérieur à 70 %, con- tenant plus de 4 % en poids de fer. 7 Protéine de soja avec degré de succinylation supérieur à 70 %, con- tenant plus de 4 % en poids de fer. 8 Procédé pour la préparation de protéines succinylées contenant du fer suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'on fait réagir une protéine succinylée avec des sels de fer dans un milieu aqueux, à un p H compris entre environ 2 et environ 10, et qu'on isole le produit ainsi obtenu par précipitation à un p H de l'ordre de 2-4, ce dernier intervalle de p H étant réalisé spontanément ou par acidification. 9 Procédé suivant la revendication 8, caractérisé par le fait que la réaction entre la protéine succinylée et les sels de fer est réalisée à un p H voisin de la neutralité. Procédé pour la préparation de protéines succinylées contenant du fer suivant l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait qu'on fait réagir une protéine succinylée avec des sels de fer en milieu aqueux à un p H compris entre environ 2 et environ 10, et qu'on isole le pro- duit de réaction par séparation du solvant après ajustage du p H à des valeurs proches de la neutralité. 11 Compositions pharmaceutiques pour la thérapie des anrnies sidéropénienres cdez l'anima El et dez il'hame, caractérisées par le fait qu'elles ccntienent en tant que principe actif, au moins l'une des protéines succinylées contenant du fer suivant l'une quelconque des revendications 1 à 7.