FR 2523153 A1 19830916 FR 8203980 A 19820308 La fermentation acétonobutylique, connue depuis longtemps, permet de produire, à partir de sucres divers, un mélange de produits d'intérêt industriel, le butanol, l'acétone et l'éthanol (ABE), et constitue un moyen particulièrement efficace d'obtenir le produit principal, le nbutanol L'intérêt de cette voie d'obtention de composés entrant dans la composition de carburants de substitution a,par ailleurs,été récem- ment mise en évidence (demandes de brevets français 80/12822 et 80/ 17147 de l'Institut Français du Pétrole) La limitation principale de cette fermentation a cependant été jusqu'à présent, la faiblesse rela- tive de la concentration des produits formés qui ne dépasse générale- ment pas, dans les meilleures conditions, une concentration totale de 9/1, typiquement 10-13 g/l de n-butanol, 4 à 7 g/1 d'acétone, O à 2 g/l d'éthanol, comme indiqué dans les articles de synthèse de M.T Walton et J L Martin (Microbiol fermentation 2nd edition, vol 1, Academic Press, 1979, pp 187-209) et de S C Prescott et C G Dunn (Industrial Microbiology, Mc Graw Hill, 1959, pp 250-293). L'objet de la présente invention est de décrire une méthode d'obtention de mutants de Clostridium acetobutylicum, qui, cultivés dans des condi- tions adéquates, permettent d'obtenir des concentrations en ABE large- ment supérieures à celles fournies par la souche mère et dépassant g/l De tels mutants sont dénommés ici mutants hyperproducteurs d'ABE. L'utilisation des techniques habituelles de mutagénèse s'est heurtée dans le cas de Clostridium acetobutylicum, à plusieurs difficultés. La première réside dans le caractère anaérobie stricte de cette bac- térie On ne peut en effet obtenir un développement normal de colonies sur milieu nutritif solide, technique de base utilisée en microbiologie pour l'isolement, la sélection et la purification de souches de micro- organismes, qu'en utilisant des précautions particulières visant à éli- miner toutes traces d'oxygène dans les manipulations effectuées Les manipulations ont donc été effectuées dans une "boite à gants" anaéro- bii avec des milieux préalablement réduits, par exemple dans les condi- tions décrites par L V Holdeman, E P Cato et W E C Moore (Anaerobe Laboratory manual, 4th Edition, 1977, Virginia Polytechnic Institute, Blacksburg, Va, p 144). Plusieurs techniques de mutagénèse ont été utilisées dans les condi- tions qui viennent d'être mentionnées On a d'une part essayé plusieurs agents mutagènes notamment l'éthylméthylsulfonate (EMS) et la N-méthyl N'-nitro N-nitrosoguanidine (NG), l'ICR 191, l'acide nitreux, le'nitro- quinoline-N-oxyde On a d'autre part, fait varier la mise en oeuvre de ces agents mutagènes La technique la plus habituelle en la matière consiste à mutagénéiseren milieu liquide une suspension microbienne en l'exposant à une concentration donnée, pendant un temps déterminé, à l'agent mutagène étudié On centrifuge ensuite et on lave la suspen- sion microbienne pour éliminer l'agent mutagéne, on la remet en cul- ture puis on étale cette suspension sur milieu solide nutritif (boites de Pétri) pour obtenir des colonies individuelles de microorganismes survivants et on sélectionne ensuite parmi ces colonies, les mutants présentant les caractéristiques désirées En faisant varier le temps de mutagénése et la concentration de l'agent mutagène, on fait ainsi varier le taux de mutation et de mortalité imposé à la population de microorganismes étudiée et on sélectionne les conditions qui fournis- sent le taux de mutation le plus favorable Cette technique bien connue est décrite dans des ouvrages spécialisés, notamment par J H Miller (Experiments in molecular genetics Cold Spring Harbor, 1972, p 125). On a constaté, avec tous les agents mutagènes étudiés, que l'utilisa- tion de cette technique ne fournissait qu'un taux très réduit de mu- tants et en aucun cas des mutants hyperproducteurs d'ABE. La technique de mutagénèse de l'invention consiste à effectuer en une seule étape en milieu solide la mutagénèse dans une gamme de concen- tration variée et la sélection des mutants recherchés On a pour cela effectué des étalements, sur un milieu nutritif solide, renfermant du nbutanol, par exemple dans des boites de Pétri, de cultures liquides en croissance de Clostridium acetobutylicum Pour obtenir un gradient de concentration en agent mutagène, on a disposé en un point, par exemple au centre de chaque boite, l'agent mutagène, de préférence la nitrosoguanidine (NG) créant ainsi legradient recherché par diffusion progressive du mutagène Pour effectuer la sélection de mutants hyper- producteurs d'ABE, on recherche des mutants résistant au butanol dans l'hypothèse o ces derniers supporteraient une accumulation plus impor- tante de butanol lors des essais de production d'ABE On a donc ajouté le n-butanol aux boites de Pétri qui viennent d'être décrites à des concentrations différentes d'une botte à l'autre, mais de plus en plus importantes, toutes inhibitrices de la souche mère Après incubation, dans les conditions connues d'incubation de C acetobutylicum, ces bottes de Pétri ont fourni des colonies isolées de mutants résistant au n-butanol On a examiné les capacités de production d'ABE de ces mutants et constaté que la plupart étaient surproducteurs d'ABE Lors- que des concentrations adéquates de butanol étaient utilisées dans les bottes de Pétri, de nombreux mutants-ont été ainsi obtenus avec diver- ses souches de C acetobutylicum D'une façon générale, la technique s'est révélée reproductible Certaines souches de C acetobutylicum cependant ne fournissent pas naturellement de colonies isolées suffi- samment ponctuelles et aux contours distincts Dans ce dernier cas, l'obtention de mutants a nécessité l'isolement de variants spontanés formant des colonies aux contours distincts pour se prêter commodément aux manipulations décrites plus haut. Les raisons de l'efficacité de la-technique qui vient d'être décrite pour l'isolement de mutants hyperproducteurs d'ABE, ne sont pas complè- tement comprises On peut penser que cette technique qui ne comporte que des manipulations qui peuvent être effectuées en chambre anaérobie se prête mieux à des conditions d'anaérobiose poussée On remarque aussi que le test de sélection (crible) choisi, celui de résistance au butanol, est un bon crible pour la sélection de mutants hyperproducteurs d'ABE, ce qui indique que ces deux propriétés sont liées En ce qui concerne l'importance de l'agent mutagène utilisé, il faut noter que les agents mutagènes ne sont pas équivalents et que, par exemple, l'emploi de l'EMS, dans les mêmes conditions, a donné des résultats nettement moins favorables que ceux obtenus avec la nitrosoguanidine. Les mutants faisant l'objet de la présente invention ont donc été obtenus en utilisant, comme test de sélection, la résistance au buta- nol après un protocole de mutagénèse particulier Ces mutants ont pu être obtentu à partir de différentes souches-mères de Clostridium acetobutylicum, en particulier des souches précédemment isolées au laboratoire à partir de milieux naturels Ils sont caractérisés par leur résistance au butanol (et autres solvants) ainsi que par leur produc- tion de solvants (butanol et acétone) qui sont supérieures à celles de la souche-mère. On a également remarqué que les mutants obtenus présentaient des carac- tères de sporulation différents de ceux de la souche-mère, en ce sens que la proportion de la population bactérienne susceptible de former des spores en fin de culture était plus faible chez les mutants que chez la souche sauvage. Les exemples qui suivent illustrent le protocole d'obtention des mu- tants et leur caractérisation dans le cas d'une souche isolée au labo- ratoire (souche IFP 903) et utilisée pour la fermentation sur jus de topinambour L'obtention de mutants et leurs performances ne sont pas liées à l'utilisation d'un substrat sucré particulier et ont été ob- servées avec les divers sucres utilisables par Clostridium acetobutyli - cum notamment glucose, fructose, saccharose, amidon, cellobiose, xylose et hydrolysats de matériaux lignocellulosiques tels que les tiges de mais. Les caractéristiques de la souche IFP 903 qui ont conduit à l'identi- fier comme une souche de Clostridum acetobutylicum sont données ci- dessous Les mutants obtenus de la façon décrite plus haut et illustrés dans l'exemple 1, présentent les mêmes caractéristiques taxonomiques que la souche-mère sauf,comme mentionné plus haut,un taux de sporula- tion inférieur à celui de la souche-mère. CARACTERES DE LA SOUCHE IFP 903 DE CLOSTRIDIUM ACETOBUTYLICUM Morphologie: batonnets à bouts ronds, immobiles, isolés, Gram positifs avec spores ovales fréquemment subterminales, occasionnellement termi- nales, sporange glonflé. Culture: bouillon PY-glucose (milieu PY décrit par Miller, déjà cité): fort trouble avec gaz, bouillon PY: faible trouble sans gaz, gélose (PY-glucosé): colonies rondes blanches de 1-2 mm de diamètre, jaunissant en vieillissant. La croissance s'effectue dans des conditions d'anaérobiose stricte. Les sucres utilisés sont principalement transformés en butanol et en acétone (et un peu d'éthanol) Des acides volatils (acides acétique et butyrique) sont formés en plus faibles quantités Les gaz formés sont constitués de gaz carbonique et d'hydrogène. Glucides et autres substrats carbonés: Croissance vigoureuse avec production de gaz et d'acide sur: raffinose, lactose, mélibiose, lévulose, maltose, tréhalose, cellobiose, mannose, xylose, salicine, galactose, glucose, /3-méthylglucoside, amidon, saccharose, mannitol. Croissance moins vigoureuse avec production de gaz et d'acide sur: inositol, esculine, z(-méthylglucoside. Croissance peu vigoureuse, peu de gaz et d'acide: sorbitol, rhamnose. Non utilisés: érythritol, arabinose, ribose, glycérol, pectine. Protéines: lait: coagulé,;caséine non utilisée; sérum: non utilisé; gélatine: non utilisée. Lirides: é lécithinase: résultat négatif;tributyrine: pas de culture. Autres caractères: hémolyse: négative, urée: négative ou positive très faible, sulfites réduits, production de SH 2: positive; nitrates: non utilisés; indole: non formé; acétolne: non produite. L'ensemble de ces caractères comparés a ceux présentés par Mc Coy et coll (E E B Mc Coy, E B Fred, W H Peterson et E G Hastings, Journal of Infectious Diseases 1926 39, 457-483) pour Clostridium acetobutylicum conduisent à classer la souche IFP 903 et les souches obtenues à partir de cette dernière par le protocole décrit plus haut comme appartenant à l'espèce Clostridium acetobutylicum. EXEMPLE 1 1/ Protocole d'obtention de mutants résistants au butanol de Clostri- dium acetobutylicum Une souche de Clostridium acetobutylicum (IFP n 903) a été mise en croissance durant une nuit en chambre anaérobie sur un milieu complet, le milieu PY décrit par Miller, déjà cité La source de carbone était du glucose à raison de 10 g/l. La souche a été remise en croissance le lendemain matin dans 10 ml de milieu PY frais Le même jour, des boîtes de milieu PY gélosé ont été préparées dans la chambre anaérobie avec des concentrations croissantes de n-butanol: 5, 7, 10 et 12 grammes par litre Apres croissance de la souche ( 8 h), 0,1 ml de culture a été étalé sur chaque botte 15 minu- tes après, un cristal de nitrosoguanidine était déposé au centre de chaque boite Les boites ont été mises à incuber à 32 C pendant 3 jours dans la chambre anaérobie. On a pu observer l'action inhibitrice partielle de la nitrosoguanidine sur les boîtes contenant 5, 7 et 10 g par litre de butanol Aucune croissance n'était observée sur la boite contenant 12 grammes par litre de butanol Sur les boites contenant 5 et 7 grammes par litre, une croissance uniforme de la souche était observée au-delà de la zone toxique Sur la boite contenant 10 grammes par litre, des mutants résistant formaient une auréole et 11 d'entre eux ont été purifiés par deux passages successifs sur boîte contenant 10 g p-ar litre de n-butanol Avec cette concentration en n-butanol, aucune croissance de la souche sauvage n'était observée sur boite dans les conditions expé- rimentales utilisées. 2/ Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI). La résistance au n-butanol est une caractéristique importante des mutants obtenus comme le démontre l'expérience décrite ci-dessous. Dans cette expérience, comme certaines manipulations ne sont pas aisé- ment réalisables dans la chambre anaérobie, on utilise alors, hors de la chambre, des milieux préréduits préparés dans cette dernière Les milieux de culture habituels décrits plus haut sont préparés selon un protocole un peu différent On prépare le milieu, on ajoute un indica- teur deréduction, la résazurine hors de la chambre anaérobie, puis le milieu est chauffé jusqu'à décoloration de la résazurine et le milieu est alors introduit dans la chambre anaérobie, il est réparti dans des fioles en verre bouchées par un bouchon en butyl, puis une capsule en métal est scellée avec une pince On sort alors les fioles de la cham- bre et on peut les utiliser telles quelles après stérilisation En effet, on dispose d'un milieu sous atmosphère anaérobie dont on contrôle l'état réduit par la couleur de la résazurine. Ces milieux préréduits sont ensemencés à la seringue à travers le bouchon butyl; tous les prélèvements et toutes les additions-se font de cette manière. Ces milieux préréduits ont servi, entre autre, pour mesurer les concen- trations minimales inhibitrices (CMI) des différentes souches de mutants et de la souche-mère de C acetobutylicum pour le butanol Ce produit assez volatil ne subit pas d'évaporation dans les fioles scellées et on a ainsi une mesure exacte de la CMI. On ajoute le butanol dans les fioles à des concentrations variées à l'aide d'une seringue De la même façon, la souche à tester est intro- duite dans la fiole contenant 5 ml de milieu à raison de 0,1 ml d'une culture de 12 heures Apres 24 h d'incubation à 32 C, la lecture de la CMI est effectuée. Les résultats sont résumés dans le tableau 1 (par la CMI, on mesure la toxicité d'un produit sur une souche bactérienne donnée, cette CMI cor- respond à la première concentration de ce produit pour laquelle on n'ob- serve plus de croissance bactérienne). On voit ainsi qu'en général tantes au butanol que cette les souches dernière. mutantes sont plus résis- L'expérience décrite ci-dessous démontre que les mutants résistant au nbutanol obtenus sont également meilleurs producteurs d'ABE que la souchemère. \ Concentration en butanol (en g/l) O 5 10 13 15 18 20 Souches Témoin = souche- mère + + + Mutant n 1 + + + + " n 2 + + + + + " n 3 + + + + + n 4 + + + + + + - n 5 + + + + + + - " n 6 + + + + " n 7 + + + + " n 8 + + + + " n 9 + + + + n" 10 + + + + + n 11 + + + + + 2 523153 3/ Production de solvants par les mutants obtenus. L'excrétion de solvants a été déterminée dans des tubes contenant 10 ml d'un milieu synthétique aqueux, contenant par litre: (NH 4)2504, 3 g; K 2 HPO 4, 0,5 g; Mg 504,7 H 20, 10 mg; Mn C 12,4 H 20, 10 mg; (NH 4)2 Mo 7024, H 20, 10 mg; Ca CO 3, 3 q; extrait de levure, 4 g; glucose, 60 g. 2 3 % a onc Lé substrat utilisé était/le glucose Les cultures étaient effectuées dans les conditions classiques de stérilité et en anaérobiose (manipu- lations et incubation 3 jours à 32 C en chambre anaérobie). Les résultats sont indiqués dans le tableau 2 suivant: Tableau 2: Production de solvants par la Clostridium acetobutylicum et souches IFP 903 de ses mutants Acétone Butanol Solvants gx V 1 gx V 1 g totaux Acetoneg g x 1-1 Souche-mère (IFP 903) 2,6 7,8 10,4 Mutant n 1 5,0 11,6 16,6 N no 2 3,0 9,1 12,1 " n 3 3,9 10,2 14,1 " n 4 4,4 10,6 15,0 " n 5 3,9 10,7 14,6 "I n 6 4,1 10,5 14,6 "l n 7 4,4 12,3 16,7 " n 8 4,4 11,3 15,7 " n 9 3,3 9,4 12,7 " n 10 4,8 12,5 17,3 " n ll 4,1 12 16,1 EXEMPLE 2 Production de solvants en fermenteur par les mutants obtenus. La souche sauvage de C acetobutylicum (IFP 903) et les mutants obte- nus sont cultivés dans des fermenteurs de type BIOLAFITTE de 6 litres de capacité, contenant 4 litres d'un milieu constitué par un jus de pressage de topinambour dilué au demi, hydrolysé chimiquement à l'acide sulfurique puis neutralisé a la chaux à p H 7,0 Le milieu contient en outre 3 g 1-1 de (NH 4)2 SO 4 et 5 g 1-1 de Ca CO 3 L'activité fermentaire est mesurée par l'importance du dégagement gazeux sur un compteur volu- métrique et par la composition du milieu final en solvants, déterminée par chromatographie en phase gazeuse Le tableau ci-dessous rassemble les résultats obtenus par la souche sauvage et par 4 mutants hyperpro- ducteurs après une fermentation d'une durée de 36 heures à 34 C, conduite dans les conditions standard de stérilité et en anaérobiose (milieux désaérés par chauffage et maintenus sous atmosphère inerte). (a) le mutant n 8 a reçu le numéro 904 dans la collection IFP. Les souches IFP 903 et 904 ont été déposées le 4 mars 1982 à l'Ameri- can Type Culture Collection (ATCC) Elles ont regu les numéros respec- tifs ATCC 39 057 et 39 058. Acetone Butanol Solvants d m Souche (a) g x 1-1 g l V' totaux Ga mle g x 1-1 de milieu Souche-mère IFP 903 4,5 10,5 15,0 21,0 4 Mutant N8 (IFP 10, 0 15,0 25,0 37,0 904) Mutant n 5 9,0 13,6 22,6 33,5 Mutant n 4 8,0 13,4 21,4 31,5 Mutant n Il 8,4 13,3 21,7 32,5 REVENDICATIONS 1 Procédé d'obtention de mutants de Clostridium acetobutylicum à haute productivité de n-butanol et d'acétone et à résistance amé- liorée au n-butanol, qui consiste à étaler une culture aqueuse d'une souche de Clostridium acetobutylicum à la surface d'une série de bottes renfermant un milieu solide de culture, chaque boite ren- fermant du n-butanol à une concentration différente de celle des autres boîtes, à disposer un agent mutagéne en un point de la sur- face du milieu gélosé de chaque botte, à soumettre les bottes à des conditions anaérobies permettant le développement de la souche, et à recueillir au moins l'un des mutants qui s'est formé dans au moins une botte dans laquelle la concentration en n-butanol était suffisante pour inhiber la croissance de la souche mise en jeu mais insuffisante pour empêcher la formation de colonies de mutants. 2 Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'agent mutagène est la N-méthyl N'-nitro N-nitrosoguanidine. 3 Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le mutant recueilli est purifié en le mettant à nouveau en culture au moins une fois dans un milieu de culture renfermant du n-butanol en con- centration supérieure à la concentration minimale pour laquelle la souche non mutée ne se développe plus mais inférieure à la concen- tration minimale pour laquelle le mutant ne se développe plus. 4 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel la souche utilisée est IFP 903 (ATCC 39 057). 5 Mutant de Clostridium acetobutylicum, ledit mutant portant le numéro IFP 904 (ATCC 39 058). 6 Utilisation d'un mutant obtenu par le procédé de l'une quelconque % des revendications 1 à 4, comme agent de fermentation, pour la production d'un mélange de butanol et d'acétone. 7 Utilisation d'un mutant selon la revendication 6, ledit mutant étant IFP 904 (ATCC 39 058).