FR 2511867 A1 19830304 FR 8214594 A 19820825 t{ 2511867 FORMULATIONS PHAMACEUTIQUES COMPRENANT DE L'INSULINE ET DE LA PRO-INSULINE HUMAINES. Le diabète sucré est un trouble métabolique caractérisé par le fait que les tissus du corps ne parviennent pas à oxyder les carbohydrates au régime normal Son facteur le plus important est une défi- cience en insuline Au cours des 60 dernières années, les personnes souffrant du diabète ont été considéra- blement aidées en recevant des quantités réglées d'in- suline Actuellement, l'insuline utilisée par les diabétiques a été isolée du pancréas des animaux, généralement des bovidés et des porcs L'insuline des bovidés et des porcs a une structure différente de celle de l'insuline produite par le pancréas humain. Récemment, par la méthodologie de l'ADN (ADN = acide désoxyribonucléique) recombinant, il est devenu pos- sible de préparer de l'insuline identique à celle produite par le pancréas humnain Llutilisation de cette insuline permettra, au diabétique, dtimiter le système naturel plus étroitement que ce n'était pos- sible jusqu'à présent. Néanmoins, il est admis depuis longtemps que la seule administration d'insuline à un diabétique est insuffisante pour rétablir et/ou maintenir l'état métabolique normal Bien que l'insuline manifeste son effet sur le métabolisme des carbohydrates, le diabète sucré provoque des troubles supplémentaires dont la plupart, sinon toussont en relation avec la structure et la fonction des vaisseaux sanguins Les déficiences conduisant à ces troubles sont rarement corrigées com- plètement par la thérapie classique à l'insuline. Les anomalies vasculaires associées au dia- bète sont souvent appelées "complications du diabète". Elles consistent généralement en changements micro- angiopathiques donnant lieu à des lésions de la rétine et des reins La neuropathie représente une complica- tion diabétique supplémentaire qui peut être en rela- 2 2511867 tion ou non, directement ou indfrectemelnt, avec les changements microangiopathiques précités Parmi les manifestations spécifiques des complications du dia- bète, il y a, par exemple: ( 1) les maladies de l'oeil, notamment la rétinopathie, la formation de la cataracte, le glaucome et les paralysies musculaires extra-oculai- res; ( 2) les maladies de la bouche, notamment la gingivite, l'apparition accrue de caries dentaires, la périodontite et une plus forte résorption de l'os alvéolaire; ( 3) les neuropathies motrice, sensorielle et autonome; ( 4) la maladie des grands vaisseaux; ( 5) la micro-angiopathie; ( 6) des maladies de la peau, notamment le xanthome du diabète sucré, la nécro- biose lipoldique du diabète sucré, la furonculose, la mycose et le prurit; ( 7) des maladies des reins, notanunent la glomérulosclérose diabétique, la néphro- sclérose artériolaire et la pyélonéphrite; et ( 8) des problèmes au cours de la grossesse, notamment un accroissement des naissances de gros bébés, des mises au monde d'enfants morts-nés, des fausses couches, des mortalités néo-natales et des défauts congénitaux. Bon nombre et peut-être la totalité des complications diabétiques résultent du fait qu'à elle seule, l'insuline ne parvient pas à ramener le corps à son équilibre hormonal naturel. La présente invention concerne des composi- tions pharmaceutiques permettant d'atteindre et de maintenir, chez un sujet diabétique, un état plus proche de lthoméostase hormonale naturelle que celui pouvant 8 tre obtenu par lladministration d'insuline seule. Dès lors, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant, en association avec un support pharmaceutiquement acceptable, de ltin- suline et de la pro-insuline humaines, le rapport pon- 3 2511867 déral entre linsuline humaine et la pro-insuline humaine se situant entre environ 1:100 et environ :1. Les deux constituants essentiels des com- positions pharmaceutiques de la présente invention sont l'insuline et la pro-insuline humaines. L'administration d'une combinaison dtinsu- line et de pro-insuline humaines en utilisant une composition suivant la présente invention permet d'obtenir une utilisation plus naturelle du glucose et un meilleur contrôle du glucose qu'avec l'insuline seule, atténuant ainsi les complications diabétiques néfastes qui ont été décrites ci-dessus. La pro-insuline humaine peut être obtenue de diverses manières, notamment par synthèse organique, par isolation du pancréas humain selon la méthodologie classique et, plus récemment, selon la méthodologie à l'acide désoxyribonucléique recombinant. Dans ses grandes lignes, la production de pro-insuline en adoptant la méthodologie à liacide désoxyribonucléique recombinant consiste à obtenir, par isolation et/ou par construction, une séquence de codage d'acide désoxyribonucléique pour la sé- quence des acides aminés de la pro-insuline humaine. On introduit ensuite l'acide désoxyribonucléique de pro-insuline humaine en phase de lecture dans un vé- hicule approprié de clonage et d'expression Le vé- hicule est utilisé pour transformer un micro-organis- me approprié, après quoi le micro-organisme transformé est soumis à des conditions de fermentation conduisant à: (a) la production de copies supplémentaires du vecteur contenant le gène de pro-insuline et (b) llex- pression de la pro-insuline ou un produit précurseur de la pro-insuline. 4 2511867 Si le produit d'expression est un précur- seur de pro-insuline, il comprendra généralement la séquence des acides aminés de la pro-insuline humaine réunie à sa terminaison amino, à un fragment d'une protéine normalement exprimée dans la séquence de gènes dans laquelle le gène de pro-insuline a été introduit La séquence d'acides aminés de la pro- insuline est réunie au fragment de protéine par l'in- termédiaire d'un siège spécifiquement clivable, no- tamment la méthionine Ce produit est habituellement appelé "produit génétique fusionné". La séquence des acides aminés de la pro- insuline est clivée du produit génétique fusionné en utilisant du bromure de cyanogène, après quoi les 1 S fractions sulfhydryle de la cystéine de la séquence des acides aminés de la pro-insuline sont stabilisées par transformation en leurs S-sulfonates correspon- dants. On purifie le S-sulfonate de pro-insuline obtenu, puis on transforme le S-sulfonate de pro- insuline purifié en pro-insuline par formation des trois liaisons disulfure correctement localisées. La pro-insuline obtenue est ensuite purifiée. De même, l'insuline humaine peut être obte- nue de diverses manières, notamment par synthèse organique, par isolation du pancréas humain selon des techniques classiques, par transformation dtin- suline animale isolée, par transformation de pro- insuline humaine et par la méthodologie à l'acide désoxyribonucléique recombinant. Toutefois, lorsqu'elle est produite, la pro-insuline humaine peut être clivée par voie enzy- matique, par exemple, en utilisant de la trypsine et de la carboxypeptidase B pour produire l'insuline humaine. 2511867 En adoptant la méthodologie à l'acide déso- xyribonucléique recombinant d'une manière analogue à celle décrite ci-dessus pour la production de pro- insuline humaine, on peut préparer l'insuline humaine par l'expression et l'isolation séparées de la chaîne A et de la chaîne B de l'insuline humaine en formant ensuite leurs liaisons disulfure correctes. L'insuline humaine peut également être pré- parée à partir de l'insuline de porcs L'insuline humaine se différencie de l'insuline de porcs par un seul acide aminé, ctest-à-dire l'acide carboxy-amino terminal de la chaîne B L Ialanine, c'est-à-dire l'acide aminé B-30 de l'insuline de porcs, est clivée et remplacée par la thréonine A cet égard, on se référera, par exemple, au brevet des Etats-Unis dt Amé- rique n 3 276 961. Les compositions de la présente invention contiennent à la fois de l'insuline et de la pro- insuline humaines L'insuline et la pro-insuline humaines sont présentes dans un rapport pondéral se situant entre environ 1:100 et environ 100:1 De préférence, le rapport pondéral entre l'insuline et la pro-insuline humaines se situe entre environ 1:2 et environ 100:1, mieux encore, entre environ 1:1 et environ 20:1 et, de manière tout particuliè- rement préférée, entre environ 4:1 et environ 20:1. On mentionnera ci-après d'autres intervalles préférés pour le rapport pondéral entre llinsuline et la pro- insuline humaines: environ 1:30 à environ 100:1; environ 1:15 à environ 100:1; environ 1:10 à environ :1; environ 1:30 à environ 20:1; environ 1:15 à environ 20:1 et environ 1:10 à environ 20:1. Comme on l'a indiqué, les compositions de la présente invention sont utiles pour favoriser l'obtention de lhoméostase hormonale naturelle et 6 2511867 ainsi empêcher ou atténuer ou encore freiner sensible- ment les complications diabétiques bien connues qui ont été mentionnées ci-dessus. Il est admis que certains diabétiques sont inaptes à recevoir efficacement de llinsuline par injection sous-cutanée par suite de la présence, à l'endroit de l'injection, de protéases qui détruisent rapidement l'insuline avant qu'elle ait pu être ab- sorbée dans le courant sanguin et transportée vers les sièges récepteurs Si ces diabétiques doivent absolument recevoir de ltinsuline, ils devront la recevoir par injection intraveineuse Les injections intraveineuses répétées et indispensables sont inop- portunes par suite de l'effet néfaste qu'elles exer- cent sur les veines du receveur avec les infections qui y sont associées On a découvert que la pro- insuline humaine niétait pas dégradée par ces pro- téases dégradant l'insuline et que, partant, elle pouvait être administrée par injection sous-cutanée. Sa stabilité et, dès lors, sa disponibilité favorisent l'obtention d'une homéostase hormonale naturelle. De plus, étant donné que l'insuline et la pro-insuline ensemble forment des complexes, on peut escompter que la pro-insuline assurera une protection pour l'insuline qui est dégradable dans d'autres conditions. A la suite d'études récentes lPodlecki et al., "Diabetes'" 31, supplément 2, 126 A ( 1982)l, on a également noté' que la pro-insuline humaine se si- tuait à l Vintérieur de tissus cibles, par exemple, des cellules de graisse Bien que son action intra- cellulaire particulière à une échelle moléculaire soit encore indéterminée, ces découvertes étayent davantage la description donnée dans la-présente spé- cification selon laquelle la pro-insuline humaine joue un rôle actif et est indispensable pour ltobten- 7 2511867 tion de lthoméostose hormonale naturelle. Outre le fait qu'elles favorisent llobten- tion de lihoméostase hormonale naturele, les composi- tions de l'invention dans lesquelles le rapport pondé- ral entre l'insuline et la pro-insuline humaines est égal ou inférieur à environ 1:1, offrent l'avantage supplémentaire d'exercer un effet hypoglycémique de très longue durée Dans les compositions préférées offrant cet avantage supplémentaire, le rapport pon- déral entre ltinsuline et la pro-insuline humainesse situe entre environ 1:100 et environ 1:1 Dtautres rapports pondéraux préférés entre l'insuline et la pro-insuline humaines se situent entre environ 1:30 et environ 1:1, plus particulièrement entre environ 1:30 et environ 1:10 ou entre environ 1:10 et environ 1:1 Grâce à ces compositions, il est moins néces- saire de recourir à des additifs classiques pour la formulation de l'insuline, par exemple, la protamine qui est présente dans llinsuline NPH (protamine neutre Hagedorn) ou le zinc en excès qui est présent dans l'insuline retard Ces deux additifs sont artificiels et non physiologiques. Dans "Diabetes" 31, supplément 2, 135 A ( 1982), Schluter et al décrivent des études démon- trant que la fixation du récepteur d'insuline humaine est favorisée par la présence de pro-insuline humaine. Ces résultats étayent également davantage la descrip- tion de la présente spécification selon laquelle la disponibilité et la présence de la pro-insuline humai- ne favorisent ou rétablissent llhoméostase hormonale naturelle. Bien entendu, la quantité dans laquelle les compositions de la présente invention doivent être utilisées pour maintenir l'homéostase hormonale na- turelle ou pour atteindre un état se rapprochant plus 8 2511867 étroitement de l'homéostase hormonale naturelle chez un sujet diabétique> dépendra de la gravité de l'état diabétique De plus, cette quantité variera en fonc- tion du mode d'administration Enfin, la quantité de composition administrée et la fréquence de cette ad- ministration seront laissées au choix du médecin par- ticulier Toutefois, en règle générale, le dosage se situera dans l'intervalle donnant environ 0,02 à envi- ron 5 unités-d'activité d'insuline humaine par kg du poids du corps et par jour, de préférence, entre en- viron 0,1 et environ 1 unité d'activité d'insuline humaine par kg du poids du corps et par jour. On administre la composition par voie pa- rentérale notamment, par voie sous-cutanée, par voie intramusculaire et par voie intraveineuse, Les com- positions de la présente invention comprennent les ingrédients actifs, à savoir l'insuline et la pro- insuline humaines ensemble avec un support pharmaceu- tiquement acceptable pour ces dernières et éventuel- lement avec d'autres ingrédients thérapeutiques La quantité totale des ingrédients actifs présents dans la composition se situe entre environ 99, 99 et environ 0,01 % en poids Le support doit être acceptable en ce sens qu'il doit être compatible avec d 1 autres com- posants de la composition et il ne doit pas être né- faste pour le receveur de celle-ci. Les compositions de la présente invention, qui sont appropriées pour une administration par voie * parentérale, comprennent avantageusement des suspen- sions et/ou des solutions aqueuses stériles des in- grédients pharmaceutiquement actifs, ces solutions ou suspensions étant, de préférence, rendues isotoni- ques avec le sang du receveur en utilisant générale- ment du chlorure de sodium, de la glycérine, du glu- cose, du mannitol, du sorbitol et des agents analogues 9 2 2511867 connus En outre, les compositions peuvent contenir liun ou lautre adjuvant tel que des agents tampons, des agents de conservation, des agents dispersants, des agents favorisant un début rapide de l'activité, des agents favorisant une prolongation d'activité et d'autres agents connus Comme agents spécifiques de conservation, on mentionnera, par exemple, le phénol, le m-crésol, le p-hydroxybenzoate de méthyle et autres. Comme agents tampons spécifiques, on mentionnera, par exemple, le phosphate de sodiums l'acétate de sodium, le citrate de sodium et autres. De plus, on peut utiliser un acide tel que ltacide chlorhydrique, ou une base telle que l'hydro- xyde de sodium pour régler le p H En règle générale, le p H de la composition aqueuse se situera entre en- viron 2 et environ 8, de préférence, entre environ 6,8 et environ 8. Parmi d'autres additifs appropriés, on men- tionnera, par exemple, l'ion zinc bivalent dont la quantité, s'il est présent, se situe généralement entre environ 0,01 mg et environ 0,5 mg par 100 unités d'insuline humaine, de même qu'un sel de protamine (par exemple, sous forme de son sulfate) dont la quantité, s'il est présent, se situe généralement entre environ 0,1 mg et environ 3 mg par 100 unités diactivité dlinsuline humaine. On donnera ci-après des exemples de composi- tions pharmaceutiques particulières suivant la pré- sente invention. Exemple 1 Formulation d'insuline humaine régulière neutre/pro- insuline humaine lrapport pondéral entre l'insuline humaine et la proinsuline humaine = 100:1 à 40 unités d'insuline par cm 3 l. Pour préparer 10 cm 3 de la composition, on mélange: Insuline zinc humaine ( 28 unités/mg) 400 unités Pro-insuline humaine 0,14 mg Phénol (distillé) 20 mg Glycérine 160 mg Eau et soit de l'acide chlorhydrique à 10 %, soit de lthydroxyde de sodium à 10 %: quantité suffisante pour obtenir une composition d'un volume de 10 cm 3 et d'un p H final de 7-7,8. Exempie 2 Formulation d'insuline humaine régulière neutre/pro- insuline humaine lrapport pondérai entre l'insuline humaine et la proinsuline humaine = 20:1 à 100 unités d'insuline par cm 3 l. Pour préparer 10 cm 3 de la composition, on mélange: Insuline zinc humnaine ( 28 unités/mg) 1 000 unités Pro-insuline humaine 1,8 mg Phénol (distillé) 20 mg Glycérine 160 mg Eau et soit de l'acide chlorhydrique à 10 %, soit de l'hydroxyde de sodium à 10 %: quantité suffisante pour obtenir une composition d'un volume de 10 cm 3 et d'un p H final de 7-7,8. Exemple 3 Formulation d'insuline humaine protamine-zinc/pro- insuline humaine lrapport pondérai entre l'insuline humaine et la proinsuline humaine = 20:1 à 40 unités dlinsuline par cm 3 l. Pour préparer 10 cm 3 de la composition, on mélange: Insuline zinc humaine ( 28 unités/mg) Pro-insuline humaine Phénol (distillé) 400 unités 0,7 mg mg 11 i 2511867 Oxyde de zinc 0,78 mg Glycérine 160 mg Sulfate de protamine 4-6 mg Phosphate de sodium (cristaux) 38 mg Eau et soit de l'acide chlorhydrique à 10 %, soit de l'hydroxyde de sodium à 10 %: quantité suffisante pour obtenir une composition d'un volume de 10 cm 3 et d'un p H final de 71-7,4. Exemple 4 Formulation dtinsuline humaine protamine-zinc/pro- insuline humaine lrapport pondéral entre l'insuline humaine et la proinsuline humaine = 1:1 à 100 unités d'insuline par cm 3 l. Pour préparer 10 cm 3 de la composition, on mélange: Insuline zinc humaine ( 28 unités/mg) 1 000 unités Pro-insuline humaine 36 mg Phénol (distillé) 25 mg Oxyde de zinc 2,0 mg Glycérine 160 mg Sulfate de protamine 10-15 mg Phosphate de sodium (cristaux) 38 mg Eau et soit de ltacide chlorhydrique à 10 %, soit de l'hydroxyde de sodium à 10 %: quantité suffisante pour obtenir une composition d'un volume de 10 cm 3 et d'un p H final de 7,1-7,4. Exemple 5 Formulation dlinsuline humaine isophane-protamine- zinc/pro-insuline humaine lrapport pondéral entre l'insuline humaine et la pro-insuline humaine = 4:1 à 40 unités d'insuline par cm 3 l. Pour préparer 10 cm 3 de la composition, on mélange: Insuline zinc humaine ( 28 unités/mg) 400 unités Pro-insuline humaine 3,6 mg m-crésol (distillé) 16 mg Phénol (distillé) 6,5 mg Glycérine 160 mg Sulfate de protamine 1,2-2,4 mg Phosphate de sodium (cristaux) 38 mg Eau et soit de l'acide chlorhydrique à 10 %, soit de l'hydroxyde de sodium à 10 %: quantité suffisante pour obtenir une composition d'un volume de 10 cm 3 et d'un p H final de 7,1-7,4. Exemple 6 Formulation d'insuline humaine isophane-protamine- zinc/pro-insuline humaine lrapport pondéral entre l'insuline humaine et la pro-insuline humaine = 1:2 à 100 unités d'insuline par cm 3 l. Pour préparer 10 cm 3 de la compositions on mélange: Insuline zinc humaine ( 28 unités/mg) 1 000 unités Pro-insuline humaine 71 mg m-crésol (distillé) 16 mg Phénol (distillé) 6,5 mg Glycérine 160 mg Sulfate de protamine 3,o-6,0 mg Phosphate de sodium (cristaux) 38 mg Eau et soit de l'tacide chlorhydrique à 10 %, soit de l'hydroxyde de sodium à 10 %: quantité suffisante pour obtenir une composition d'un volume de 10 cm 3 et d'un p H final de 7,1-7,4. Exemple 7 Formulation d'une suspension d'insuline zinc humaine/ pro-insuline humaine lrapport pondéral entre 11 insu- line humaine et la pro-insuline humaine = 1:10 à 40 unités d'insuline par cm 3 l. 1 t 3 2511867 Pour préparer 10 cm 3 de la composition, on mélange: Insuline zinc humaine ( 28 unités/mg) 400 unités Pro-insuline humaine 143 mg Acétate de sodium (anhydre) 16 mg Chlorure de sodium (granulaire) 70 mg p-hydroxybenzoate de méthyle 10 mg Oxyde de zinc 0,63 mg Eau et soit de ltacide chlorhydrique à 10 %e soit de l'hydroxyde de sodium à 10 %: quantité suffisante pour obtenir une composition dt'mun volume de 10 cm 3 et dtun p H final de 7,2-7,5. Exemple 8 * Formulation d'une suspension d'insuline zinc humaine/ pro-insuline humaine lrapport pondéral entre llinsu- line humaine et la pro-insuline humaine = 20:1 à 100 unités d'insuline par cm 3 l. Pour préparer 10 cm 3 de la composition, on mélange: Insuline zinc humaine ( 28 unités/mg) 1 000 unités Pro-insuline humaine 1,8 mg Acétate de sodium (anhydre) 16 mg Chlorure de sodium (granulaire) 70 mg p- hydroxybenzoate de méthyle 10 mg Oxyde de zinc 1,6 mg Eau et soit de l'acide chlorhydrique à 10 %, soit de l'hydroxyde de sodium à 10 %: quantité suffisante pour obtenir une composition d'un volume de 10 cm 3 et d'un p H final de 7,2-7,5. Exemple 9 Formulation dtinsuline humaine régulière neutre/pro- insuline humaine lrapport pondéral entre l'insuline humaine et la proinsuline humaine = 100:1 à 40 unités d'insuline par cm 3 l. Pour préparer 10 cm 3 de la composition, on mélange Insuline sodium humaine ( 28 unités/mg) 400 unités Pro-insuline humaine 0,14 mg Phénol (distillé) 20 mg Glycérine 160 mg Eau et soit de l'acide chlorhydrique à 10 %, soit de l'hydroxyde de sodium à 10 %: quantité suffisante pour obtenir une composition d'un volume de 10 cm 3 et d'un p H final de 7-7,8. Exemple 10 Formulation d'insuline humaine régulière neutre/pro- insuline humaine lrapport pondérai entre l'insuline humaine et la proinsuline humaine = 20: 1 à 100 unités d'insuline par cm 3 l Pour préparer 10 cm 3 de la composition, on mélange: Insuline sodium humaine ( 28 unités/mg) Pro-insuline humaine Phénol (distillé) Glycérine Eau et soit de l'acide chlorhydrique à l'hydroxyde de sodium à 10 %: quantité obtenir une composition dlun volume de p H final de 7-7,8. 1.000 unités 1,8 mg mg mg %, soit de suffisante pour cm 3 et d'un REVENDICATIONS 1 Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient en association avec un support pharmaceuti- quementacceptable, de l'insuline humaine et de la pro-insuline humaine dans un rapport pondéral de l'insuline humaine à la pro-insuline humaine d'environ 1: 100 à environ 100: 1. 2 Composition suivant la revendication 1, carac- térisée en ce que le rapport pondéral entre l'insuline humaine et la proinsuline humaine se situe entre environ 1: 10 et environ 100: 1 et de préférence entre environ 1: 2 et environ 100 1. 3 Composition suivant l'une quelconque des reven- dications 1 et 2, caractérisée en ce que le rapport pondéral entre l'insuline humaine et la pro-insuline humaine se situe entre environ 1: 1 et environ 20: 1 et de préférence entre environ 4: 1 et environ 20: 1. 4 Composition suivant l'une quelconque des reven- dications 1 et 2, caractérisée en ce qu'elle contient l'ion zinc bivalent. Composition suivant l'une quelconque des reven- dications 1 et 2, caractérisée en ce qu'elle contient un sel de protamine. 6 Composition suivant la revendication 1, caracté- risée en ce que le rapport pondéral entre l'insuline humaine et la proinsuline humaine se situe entre environ 1: 30 et environ 100: 1 et de préférence entre environ 1: 15 et environ 100: 1. 7 Composition suivant la revendication 1, caracté- risée en ce que le rapport pondéral entre l'insuline humaine et la proinsuline humaine se situe entre environ 1: 30 et environ 20 1 et de préférence entre environ 1: 15 et environ 20; 1 ou entre environ 1: 10 et environ 20: 1. 8 Composition suivant la revendication 1, caracté- risée en ce que le rapport pondéral entre l'insuline humaine et la proinsuline humaine se situe entre environ 1 * 30 et environ 1: 1. 9 Composition suivant la revendication 1, carac- térisée en ce que le rapport pondéral entre l'insuline humaine et la proinsuline humaine se situe entre environ 1: 30 et environ 1; 10. 10 Composition suivant la revendication 1, carac- térisée en ce que le rapport pondéral entre l'insuline humaine et la pro-insuline humaine se situe entre environ 1: 10 et environ 1: 1.