FR 2512207 A1 19830304 FR 8214723 A 19820827 i La présente invention se rapporte à un procédé et à un appareil pour faire réagir des phases solides et liquides. Elle se rapporte plus particulièrement à un procédé permet- tant de faire réagir efficacement une substance réactive liée à une phase solide et une substance réactive contenue dans une phase liquide, et à un appareil utilisé pour la mise en oeuvre du procédé. On connaît une méthode immunologique qui utilise une ré- action antigène-anticorps pour doser une très petite quantité de substance contenue dans des fluides corporels, ou pour dé- terminer la concentration d'un médicament administré dans le sang ou l'urine d'un organisme On connait et on a déjà uti- lisé en pratique diverses méthodes qui sont basées sur diffé- rents principes de détermination Ces procédés comprennent le dosage radio-immunologique (RIA), le dosage immuno-enzymati- que (EIA) et le dosage par immuno-fluorescence (FIA), qui sont largement utilisés en raison de leur très haute sensibi- lité,et de leur haute efficacité en détermination quantitati- ve Quand ces dosages sont effectués, la méthode dite "du sandwich" ou la méthode par compétition sont utilisées comme principe de dosage Le procédé du sandwich est en particulier largement utilisé parce qu'il assure un haut degré de sensi- bilité analytique et qu'il est facile à mettre en oeuvre. Dans la méthode du sandwich, l'antigène à doser est mis en réaction avec un anticorps correspondant insolubilisé (première réaction), de telle sorte qu'il se forme un comple- xe antigène-anticorps Ce complexe est mis à réagir avec un anticorps marqué par un agent de marquage et capable de se combiner à l'antigène à doser (anticorps marqué) (deuxième réaction) Ensuite, l'anticorps marqué est divisé en deux parties; une partie qui s'est combinée au complexe antigène- anticorps et une autre qui ne s'est pas combinée et on dose l'activité de l'agent de marquage dans chaque partie D'autre part, on répète des procédures similaires pour un antigène à des concentrations connues pour établir une courbe d'étalon- nage La quantité de l'antigène à doser est obtenue à partir de la courbe d'étalonnage L'agent de marquage peut être, par exemple une enzyme, ou une substance radio-active ou fluores- cente. Suivant la méthode par compétition, qui a été la premiè- re utilisée dans l'essai radio-immunologique, le dosage est effectué comme suit: Quand l'antigène à doser et une quantité donnée de l'an- tigène marqué sont mis à réagir avec l'anticorps insolubilisé correspondant à l'antigène à doser, les deux antigènes se combinent de manière compétitive avec l'anticorps insolubili- sé Ensuite, l'antigène marqué est divisé en deux parties; l'une s'est combinée avec l'anticorps insolubilisé et l'autre ne s'est pas combinée, et on dose l'activité de l'agent de marquage dans chaque partie D'autre part, on répète des pro- cédures similaires pour un antigène à des concentrations con- nues pour établir une courbe d'étalonnage La quantité de 1 ' antigène à doser est obtenue à partir de la courbe d'étalon- nage. Dans la mise en oeuvre de ces réactions, il est avanta- geux d'utiliser la paroi interne d'un récipient comme support pour une substance réactive telle qu'un anticorps à insolubi- liser Par exemple, on utilise fréquemment un tube à essais en matière plaste-que parce qu'il sert à la fois de support pour l'insolubilisation et de récipient de réaction et qu'il est facile à manipuler Toutefois, la paroi interne d'un ré- cipient de réaction est désavantageuse en ce sens que la sur- face à laquelle un anticorps ou une autre substance réactive est fixée est plus petite que dans le cas d'autres supports, tels que des perles de matière plastique, du papier filtre ou des particules de cellulose et qu'il ne peut donc porter qu'une plus petite quantité de la substance réactive En con- séquence, le temps de réaction devient donc plus long dans le procédé classique dans lequel on maintient debout et immo- bile un tube à essais ou autre récipient de réaction portant une substance réactive insolubilisée sur sa paroi interne, ou son contenu est agité par intermittence. Le but de l'invention est de fournir un procédé pour faire réagir efficacement une substance réactive fixée sur une phase solide et une substance réactive contenue dans une phase liquide. En particulier, le but de l'invention est de fournir un procédé de réaction perfectionné permettant de déterminer la quantité d'une substance réactive contenue dans une phase li- quide au moyen d'une substance réactive fixée sur une phase solide. -lus spécialement, le but de l'invention est de fournir un procédé de réaction rapide pour doser un antigène ou un anticorps contenu dans une phase liquide au moyen d'un anti- corps ou d'un antigène ou d'un complexe de ceux-ci fixés sur une phase solide. Un autre but de l'invention est de fournir des appareils sur lesquels des récipients de réaction sont mis en rotation en position inclinée pour la mise en oeuvre du procédé ci- dessus. D'autres buts et caractéristiques de l'invention appa- raîtront au cours de la description qui va suivre Aux des- sins annexés, donnés uniquement à titre d'exemple: la Fig 1 est un graphique qui compare les courbes d'é- talonnage obtenues par le procédé suivant l'invention et par le procédé connu dans la technique; la Fig 2 est un graphique qui montre que le temps de réaction peut être raccourci grâce au procédé suivant l'in- vention; la Fig 3 est un graphique montrant une courbe standard pour le dosage d'AFP de l'Exemple 1; la Fig 4 est un graphique montrant une courbe standard pour le dosage de CEA de l'Exemple 2; la Fig 5 est une vue montrant un appareil suivant l'in- vention; la Fig 6 est une vue illustrant un dispositif de trans- mission de puissance pour l'appareil de la Fig 5; la Fig 7 est une vue montrant un autre appareil suivant l'invention; et les Fig 8 et 9 sont des vues partielles à plus grande échelle montrant la façon dont-les cuves de réaction sont montées dans l'appareil de la Fig 7. La demanderesse a effectué une étude approfondie pour éliminer les inconvénients ci-dessus du procédé classique qui utilise un récipient de réaction comme support pour l'insolu- bilisation A la suite de cette étude, elle a découvert qu'on peut obtenir un plus haut degré de sensibilité et une réduc- tion du temps de réaction lorsque le récipient de réaction est incliné d'un certain angle et qu'on le fait tourner à une certaine vitesse pendant la réaction, au lieu de le tenir de- bout et immobile et d'agiter son contenu par intermittence. Cette découverte a conduit à la présente invention. L'invention a donc pour objets un procédé de réaction dans lequel on fait tourner un récipient de réaction dans une position inclinée et un appareil pour la mise en oeuvre du procédé. Dans la description qui va suivre, le récipient de ré- action est un tube à essais, la substance portée par la paroi interne du récipient de réaction est un anticorps et la subs- tance contenue dans la phase liquide est un antigène Toute- fois, cette combinaison n'est utilisée que pour la commodité de la description et elle ne signifie pas que l'invention soit limitée à cette combinaison. Les substances contenues dans les-fluides corporels existent habituellement en très petites quantités et les fluides corporels euxmêmes ne sont fréquemment disponibles qu'en petits volumes Tout procédé utilisé pour doser ces substances doit nécessairement présenter un haut degré de sensibilité analytique pour un échantillon dont on ne dispo- se qu'en très petite quantité C'est pourquoi il était habi- tuel de ne fixer un anticorps à la paroi interne d'un tube à essai qu'au voisinage de son fond, par exemple dans une zone pouvant s'élever à une hauteur de 1 cm à partir du fond du tube. Au contraire, la présente invention permet de fixer un anticorps sur une plus grande surface, y compris la partie supérieure d'un tube à essais, puisque l'échantillon, même s'il n'est disponible qu'en un petit volume, peut être mis en large contact avec l'anticorps si le récipient de réac- tion est entraîné en rotation dans une position inclinée com- me on l'a décrit plus haut En outre, la rotation du tube à essais contribue à agiter son contenu et, par ce moyen, per- met d'effectuer des mesures avec une haute sensibilité dans un temps court. Le Tableau 1 montre la relation entre l'angle d'incli- naison d'un récinient de réaction et la quantité relative de l'échantillon qui est nécessaire pour mouiller la partie por- teuse d'anticorps du récipient de réaction lorsque la surface o est fixé l'anticorps dans le récipient est constante le Tableau 2 montre la relation entre l'angle d'inclinaison du récipient de réaction et la surface de contact entre l'échan- tillon et la surface interne du récipient dans le cas o la quantité Le l'échantillon est constante. TABLEAU 1 Angle d'inclinaison Volume relatif d'échantillon nécessaire 900 (vertical) 1 450 environ 1/2 30 " 1/3 ' 1/5 " 1/10 TABLEAU 2 Angle d'inclinaison Aire relative de la surface de contact 900 (vertical) 1 environ 1,5 300 " 2 " 3 100 h 4 Il est généralement vrai que plus la surface de contact de deux réactifs est grande, plus ils peuvent être mis en ré- action efficacement Ainsi qu'il ressort du Tableau 1, le vo- lume d'échantillon nécessaire pour mouiller la surface de contact constante décroit avec une diminution de l'angle d' inclinaison du récipient de réaction vers l'horizontale En conséquence, il est souhaitable d'incliner le récipient de réaction aussi près que possible de la position horizontale, pourvu que le liquide à faire réagir ne s'écoule pas à l'ex- térieur Môme lorsque l'inclinaison du récipient de réaction est très proche de-l'horizontale, par exemple de seulement au-dessus de l'horizontale, il n'y a pas à craindre que l'échantillon puisse manquer d'entrer en contact avec le fond du récipient, à moins que le volume de l'échantillon soit extrêmement petit. Bien qu'il n'y ait pas de limite supérieure particulière à l'angle d'inclinaison du récipient de réaction, il est pré- férable que cet angle soit maintenu au-dessous de 45 , de préférence entre 10 et 200, afin d'économiser sur le volume de l'échantillon et d'augmenter la sensibilité analytique. Il est également préférable de faire tourner le récipient de réaction incliné à une vitesse de 10 à 100 tr/mn de préfé- rence de 25 à 55 tr/mn Si la vitesse de rotation excède 100 tr/mn, l'échantillon ne peut pas s'écouler vers le bas le long de la paroi du tube mais il tourne avec le récipient, ce qui est préjudiciable au plein contact de l'échantillon avec l'anticorps Une vitesse de rotation inférieure à 10 tr/mn détermine au contraire une réduction considérable de l'effet d'agitation qu'il s'agit de créer par la rotation du réci- pient. Le procédé de réaction suivant l'invention a les avan- tages suivants: (i) la rotation continue du récipient de réaction assu- re une agitation suffisante du mélange réactionnel, une meil- leure efficacité de la réaction, une haute sensibilité et une précision améliorée du dosage. (ii) Pour obtenir un système de dosage de haute sensi- bilitr, il était habituel jusqu'à présent d'utiliser un plus grand volume d'échantillon Au contraire, suivant l'invention il est suffisant d'utiliser un volume d'échantillon qui est égal à seulement 1/2 ou 1/10 de celui qui était exigé jusqu'à présent, comme indiqué au Tableau 1 Ceci a le même effet que si le procédé classique était mis en oeuvre avec un volu- me d'échantillon 2 à 10 fois plus grand que celui habituelle- ment utilisé. (iii) Dans le procédé classique, lorsque le volume de l'échantillon est petit, le gradient de la courbe d'étalon- nage devient plus faible, ce qui réduit la précision des me- sures obtenues par ce procédé Au contraire, suivant l'in- vention, la surface de contact entre l'échantillon et la sur- Lace interne du récipient de réaction peut être accrue jusqu' à une valeur de 1,5 à 4 fois celle qui avait été obtenue jus- qu'à présent, même si l'on utilise le même petit volume d'é- chantillon, comme indiqué au Tableau 2 Etant donné que l'an- ticorps peut être fixé à une plus grande surface, il est pos- sible d'obtenir un système de dosage de haute sensibilité et de haute précision Le Tableau 3 montre le résultat d'un es- sai pour l'alpha-fétoprotéine (AFP) exécuté en utilisant le même réactif et le même volume d'échantillon Les essais ont été répétés cinq fois à chaque concentration, d'une part suivant le procédé de la présente invention et, d'autre part, suivant le procédé classique La Fig l montre les courbes d'étalonnage basées sur les résultats du Tableau 3 On re- marque que la courbe d'étalonnage suivant l'invention pos- sède un plus fort gradient que celle du procédé classique et que le procédé suivant l'invention assure une plus grande précision Ces dosages d'AFP ont été exécutés dans un réci- pient de réaction incliné à un angle de 100 et entraîné en rotation à une vitesse de 30 tr/mn. TABLEAU 3 Concentration d'AFP (n G/ml) 1 10 100 Procédé classique Densité (x ES) optioue 0,193-0,007 0,240 + 0,007 0,346-0,009 0,639-0,019 Coefficient de variation % 8,5 6,2 6,0 6,7 Procédé suivant l'invention. Densité optique (x ES) 0,025-0,001 0,154-0,002 0,412 + 0,105 0,970-0,006 Coefficient de - variation % 7,4 2,4 2,6 1,3 (iv) Le temps de réaction peut 8 tre considérablement ré- duit Par exemple, le Tableau 4 montre à titre de comparaison des temps d'essai nécessaires pour obtenir des sensibilités analytiques et précisions similaires, c'est-à-dire des cour- -bes de calibrage ayant des gradients similaires, en utilisant le même réactif dans un dosage de AFP Le récipient de réac- tion était incliné d'un angle de 20 pendant qu'il était en- tralns en rotation à une vitesse de 50 tr/mn Les courbes standard ainsi obtenues sont représentées sur la Fig 2 On remarque que la réduction du temps de dosage a été si forte que les réactions qui exigeaient un total de douze heures dans le procédé classique pouvaient être exécutées en une heure dans le procédé suivant l'invention Au contraire, un temps de réaction raccourci dans le procédé statique classi- que se traduisait par une courbe standard ayant un plus fai- ble gradient, comme représenté en C sur la Fig 2 et qui en conséquence, ne permettait pas de réaliser le dosage TALILAU 4 roc-dé classique Procidé suivant l'invention (le récipient est -(le récipient est incliné maintenu debout et mis en rotation) et immobile) Première réaction 60 min 20 min Deuxième réaction 60 min 20 min Réaction enzymatique 10 heures 20 min i.e récipient de réaction utilisé conformément au procédé suivant l'invention peut etre constitué par exemple par un tube à essais, une cellule optique ou une cuvette à échantil- lon dans lequel ou laquelle une substance réactive est fixée sur sa surface interne pour réagir avec une petite quantité d'échantillon contenue dans ce récipient Le récipient de ré- action est de préférence un cylindre à fond circulaire ou polygonal, fait de verre ou de matière plastique et ayant un diamètre interne de 5 à 20 mm Le procédé suivant l'invention peut être appliqué, par exemple (i) pour faire réagir un anti- corps fixé à la surface interne d'un récipient de réaction avec un antigène contenu dans une phase liquide et, également dans le cas de EIA par la méthode du sandwich, par exemple, (ii) pour faire réagir un anticorps marqué avec le complexe anticorps-antigène formé par la réaction indiquée sous (i) ci-dessus, pour former un complexe contenant l'anticorps- antigène insolubilisé à doser l'anticorps marqué, ou (iii) pour faire réagir un substrat d'enzyme avec le complexe indi- qué en (ii) ci-dessus pour effectuer une réaction enzymati- que. Dans le cas de la méthode de réaction par compétition, le procédé de la présente invention peut être utilisé quand l'antigène à doser et l'antigène marqué sont mis à réagir avec l'anticorps insolubilisé Naturellement, le procédé et l'appareil suivant l'invention peuvent être utilisés pour de nombreuses autres applications qui seront évidentes pour le spécialiste et l'invention ne doit pas être considérée comme limitée à cette utilisation particulière. Pour incliner et faire tourner le récipient de réaction de manière à mettre en oeuvre le procédé suivant l'invention, il est possible d'utiliser n'importe quel moyen ou appareil pourvu qu'il puisse maintenir le récipient à un angle pres- crit et le faire tourner à une vitesse prescrite Toutefois, dans ce but, il peut être avantageux d'utiliser l'appareil spécialement conçu suivant l'invention qui peut mettre le nrocédé en oeuvre d'une façon facile et convenable. L'appareil suivant l'invention destiné à faire tourner un récipient de réaction dans une position inclinée comprend une ou plusieurs rangées latérales de supports régulièrement espacés s'étendant à partir d'une surface externe d'un bâti, des moyens pour faire tourner les supports dans le même sens à une vitesse prédéterminée et des moyens pour positionner le bâti de telle manière que les supports puissent être inclinés vers le haut d'un angle prédéterminé au-dessus de l'horizon- tale. L'appareil sera maintenant décrit avec plus de détails en regard des dessins annexés Ta Fig 5 montre une forme de réalisation de l'appareil suivant l'invention Des supports longitudinaux 1 régulièrement espacés s'étendent à partir d'une surface externe d'un bâti 2 et supportent des récipients de réaction A Les supports 1 sont entraînés en rotation dans le même sens par un moteur 3, par l'intermédiaire d'un dispo- sitif de transmission de puissance qui sera décrit ci-après en se référant à la Fig 6 -La vitesse de rotation des sup- ports peut être choisie dans l'intervalle de 10 à 100 tr/mn par un dispositif de réglage 7 Le bâti 2 est fixé par une vis 5 sur une embase fixe 4 de manière que les supports 1 qui s'étendent à partir de sa surface externe puissent être in- clinés vers le haut d'un angle compris entre O et 900 sur 1 ' horizontale Des gaines d'un diamètre désiré peuvent être placées pour recouvrir les supports 1 de manière à ajuster la distance entre deux supports 1 adjacents de manière telle que les supports 1 puissent être capables de supporter des réci- pients de réaction d'un diamètre désiré afin de les faire tourner. La Fig 6 montre -i'appareil de la wig 5 vu de la face orposée aux supports 1 et elle illustre le dispositif de transmission de puissance de cet appareil La rotation du moteur, est réduite par un réducteur de vitesse 6 à un ni- veau prescrit et transmise nar in pignon conique 8 à l'un des pignons 9 qui sont coaxiaux aux supports 1 La rotation du pig-non coaxial 9 est transmise aux pignons coaxiaux 9 adja- cents, l'un après l'autre, par des pignons intermédiaires 10 oui déterminent le sens de la rotation de telle manière que tous les supports 1 soient entralinés en rotation dans le m S- me sens Si l'on désire un grand espace vertical entre les rangées adjacentes de supnorts 1, il est possible d'agrandir la distance entre les rangées de pignons intermédiaires 10 sur la face arrière du bâti 2 et de prévoir une chaîne entre l'un des pignons intermédiaires dtune rangée et l'un des pi- gnons intermédiaires-duie autre rangée. L'invention peut égaiement utiliser ul autre appareil qui comorend un transporteur tel qu'une chalne transporteuse ayant une surface de transport sur laquelle sont montés des rouleaux tournant librement, des moyens pour entralner le transporteur dans un sens à une vitesse comprise dans un in- tervalle prescrit, une courroie se déplaçant pour faire tour- ner les récipients de réaction dans un sens prédéterminé à une vitesse prédéterminée tout en étant en contact avec les récipients de réaction montés sur les rouleaux et, des moyens pour maintenir les récipients de réaction dans une position inclinée à un angle prédéterminé sur l'horizontale avec leur embouchure relevée. Cet appareil sera décrit avec plus de détails en regard des dessins annexés La Fig 7 montre une autre forme de réa- lisation de l'appareil suivant l'invention et les Fig 8 et 9 sont des vues partielles à plus grande échelle montrant la manière suivant laquelle les récipients de réaction sont sup- portés dans l'appareil de la Fig 7 Une chaîne transporteuse 101 présente une surface de transport dans laquelle sont mon- tés des rouleaux 117 tournant librement Des récipients de réaction A sont supportés par les rouleaux 117 La chaîne 101 est entraînée par un moteur 106 par l'intermédiaire d'un ré- ducteur de vitesse 105, de pignons 104, d'arbres 103 et de roues à chaînes 102 pour faire avancer progressivement les récipients de réaction dans un sens Le temps nécessaire pour déplacer les rouleaux d'une positioï à une position de rou- leaux adjacente peut être choisi comme on le désire, de pré- úérence dans l'intervalle de 0,5 à 5 minutes, au moyen d'un dispositif de réglage 107. Les récipients de réaction sont entra nés en rotation par une courroie 109 qui est pressée contre les récipients par des rouleaux presseurs 108 La courroie 109 est entra née par un moteur 114 par l'intermédiaire d'un réducteur de vi- tesse 113, de pignons 112, d'arbres 111 et de poulies 110 La vitesse de la courroie peut être réglée par un dispositif de réglage 115 de manière à faire tourner les récipients de ré- action à une vitesse de 10 à 100 tr/min. L'appareil est monté, par exemple, sur des plaques sup- ports 116 de telle manière que les récipients de réaction puissent avoir leur axe incliné d'un angle compris entre O et 90 sur l'horizontale avec leur embouchure relevée. L'appareil peut être utilisé pour transporter les réci- pients de réaction l'un après l'autre automatiquement pendant qu'ils sont entraînés continuellement en rotation et que leurs contenus sont continuellement agités En conséquence, il est possible, par exemple, de monter l'un après l'autre un grand nombre de récipients de réaction dont chacun con- * tient un échantillon de liquide sur la chalne transporteuse à sa position de départ, de faire effectuer la réaction dans les récipients de réaction pendant que ceux-ci sont mis en rotation et transférés automatiquement vers l'avant, et d'ef- fectuer l'examen des résultats de la réaction dans une posi- tion prédéterminée, automatiquement, par exemple au moyen d'un spectrophotomètre L'appareil suivant l'invention est donc particulièrement bien approprié pour l'automatisation du dosage Il est évident que des modifications peuvent être apportées à l'appareil décrit donné à titre d'exemple sans sortir du cadre de l'invention. Le procédé de réaction suivant l'invention sera à pré- sent décrit en se référant aux exemples non limitatifs sui- vants: Exemple 1 Dosage d'AFP (a) Préparation des tubes à essais réactionnels On a placé deux ml d'anticorps lAI anti-AFP monoclonal ( 1 mg/ml) dans chaque tube à essai en polystyrène de 12 mm de diamètre et de 100 mm de hauteur et on a effectué l'incu- bation à 50 C pendant 20 mn Ensuite, chaque tube à essai a été lavé avec 0,05 M de solution saline tamponnée au phospha- te (PBS) de p H 6,4, pour obtenir un tube à essai sensibilisé avec l'anticorps lAl On a marqué un autre anticorps monoclo- nal V d'un clone différent de celui de lAl avec une peroxy- dase de raifort (Boehringer I'ianheim Grade I, qui sera dési- gnée dans la suite pour simplifier par HRPO) par la méthode de Nakane et al décrite dans J Histochem, Cytochem 22, 1084 ( 1974) L'anticorps a été dilué avec du PBS dans le rapport 49 à 1 et on a placé 1 ml de l'anticorps dilué dans chaque tube à essai en polystyrène sensibilisé avec l'anticorpslA 7. Après avoir lyophilisé les tubes à essais, on les a fermés de manière étanche pour obtenir des tubes à essais appropriés pour le dosage d'AFP. (b) Dosage de l'AFP On a chargé des tubes à essais pour un dosage d'AFP qui ont été préparés comme décrit sous (a) ci-dessus avec 0,9 ml de PBS Chaque tube a essai a été placé dans 0,1 ml d'une solution standard de AFP préparée en diluant du AFP avec un sérum humain normal, de manière qu'il contienne 1, 10, 100 ou 1000 ng de AFP par millilitre Les tubes à essais ont été montés sur les supports de l'appareil de la Fig 5 alors que ces derniers étaient inclinés d'un angle de 20 sur l'hori- zontale La réaction a été effectuée pendant 30 minutes pen- dant que les tubes à essais fétaient entralnés -erxotation à une vi- tesse de 50 tr/mn Aurès la réaction, les tubes à essais ont été lavés avec une solution saline physiologique contenant 0,005 % de Tween 20 (qui sera appelée ci-après agent de la- vage) Chaque tube a été ensuite chargé de 2 ml d'une solu- tion de substrat d'enzyme contenant 50 mg/dl d'acide 5-amino- salicylique et 0,01 % de peroxyde d'hydrogène les tubes à essais ont été ensuite remis en place sur les supports dans une position inclinée vers le haut d'un angle de 20 sur 1 ' horizontale et la réaction a été effectuée pendant 30 minu- tes pendant que les tubes à essais étaient entraînés en ro- tation à une vitesse de 50 tr/mn. Ensuite, on a ajouté 50 1 d'azoture de sodium à 2 % pour arrêter la réaction Le pouvoir d'absorption du mélange réactionnel a été examiné à une longueur d'onde de 500 na au moyen d'un spectrophotomètre La courbe d'étalonnage ainsi obtenue est représentée sur la Fig 3. Exemple 2 Dosage de CEA (a) Préparation de tubes à essais réactionnels On a chargé chaque tube à essai en polystyrène de 8 mm de diamètre et 100 mm de hauteur avec 2 ml drun anticorps mono- clonalf A' d'antigène anticarcino-embryonique (CEA) ( 1 mg/ml) et on a incubé à 56 C pendant 20 mn Ensuite, on a lavé le tube à essais avec du PBS pour obtenir un tube à essais sen- sibilisé avec l'anticorps CEA de lA'7 On a marqué avec HRPO conformément au procédé décrit sous (a) à l'Exemple 1 un autre anticorps monoclonalLB'l d'un clone différent de celui de r A'l On a dilué l'anticorps à 50 volumes avec du PBS et on a placé 1 ml de l'anticorps dilué dans chaque tube à essai sensibilisé avec l'anticorps lA' de CEA Après avoir lyophilisé les tubes à essais, on les a fermés de manière étanche de façon à obtenir des tubes à essais pour le dosage de CEA. (b) Dosage de CEA On a chargé chacun des tubes à essais préparés comme décrit sous (a) ci-dessus de 0,9 ml de PBS et de 0,1 ml d'une solution de CEA standard préparée en diluant du CEA avec du sérum humain normal de manière qu'il contienne 1,3, 10, 30 ou ng de CEA Dar millilitre On a monté les tubes à essais sur la chaîne transporteuse de l'appareil de la Fig 7, dans une position inclinée vers le haut d'un angle de 10 sur 1 ' horizontale La réaction a été effectuée pendant 20 minutes pendant que les tubes à essais étaient entralnés en rotation à une vitesse de 30 tr/mn Ensuite, on a lavé chaque tube à essai avec l'agent de lavage puis on l'a chargé avec 2 ml d'une solution de substrat d'enzyme contenant 100 mg/dl de o-phénylène-diamine et d'une solution aqueuse à 0,315 % de pe- roxyde d'hydrogène On a à nouveau monté les tubes à essais sur la chaîne transporteuse dans une position inclinée vers le haut d'un angle de 10 sur l'horizontale La réaction a été poursuivie pendant 20 minutes alors que les tubes à es- sais étaient entraînés en rotation à une vitesse de 30 tr/mn. Ensuite, on a ajouté 0,5 ml d'acide chlorhydrique 4 N pour ar- rêter la réaction Le pouvoir d'absorption du produit de ré- action a été examiné à une longueur d'onde de 492 nm au spec- trophotomètre La courbe d'étalonnage obtenue est indiquée sur la Fig 4. REVENDICAT IONS 1 Procédé de réaction d'une première substance réacti- ve liée à la paroi interne d'un récipient de réaction et d' une seconde substance réactive contenue dans une phase liqui- de, caractérisé en ce au'on place un liquide contenant la se- conde substance réactive dans le récipient de réaction et on fait tourner ce récipient de réaction autour de son axe à une vitesce de 10 à 100 'tr/mn tandis que le récipient de réaction est maintenu incliné d'un angle compris entre 5 et 450 au- dessus de l'horizontale. 2 Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le récipient de réaction est maintenu incliné d'un an- le compris entre 10 et 200 au-dessus de l'horizontale. 3 Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la vitesse de rotation est comprise entre 25 et 55 tr/mn. 4 Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la première substance réactive est un antigène ou un anticorps tandis oue la seconde subs- tance réactive est un anticorps ou un antigène correspondant. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la première substance réactive est un anticorps, tandis que la seconde substance réactive est un mélange d'un antigène correspondant et d'un antigène marqué obtenu en marquant l'antigène avec un agent de marqua- ge choisi parmi des isotopes radioactifs, des enzymes et des substances fluorescentes. 6 Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la première substance réactive est un complexe d'un anticorps insolubilisé et d'un antigène correspondant, tandis que la seconde substance réactive est un anticorps marqué correspondant à la dite substance réacti- ve insolubilisée et marqué avec un agent de marquage choisi parmi des isotopes radioactifs, des enzymes et des substances fluorescentes. 2 512207 7 Procédé suivant l'une auelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce oue la première substance réactive est un complexe d'un anticorps insolubilisé et d'un antigène marqué correspondant tandis que la seconde substance réactive est un substrat d'enzyme. 8 Procédé suivant l'une quelconque des revendications i à 3, caractérisé en ce que la première substance réactive est un complexe d'un anticorps insolubilisé, d'un antigène correspondant et d'un anticorps marqué avec une enzyme, tan- dis nue la seconde substance réactive est un substrat d'en- zyme. 9 Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le récipient de réaction est un cylindre à fond circulaire fait d'une matière choisie parmi le verre et les matières plastiques, et qui possède un diamè- tre interne de 5 à 20 mm. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le récipient de réaction est un cylindre à fond polygonal fait d'une matière choisie parmi le verre et les matières plastiques, et qui possède un diamè- tre interne de 5 à 20 mm. 11 Appareil pour faire tourner un ou plusieurs réci- pients de réaction (A) dans une position inclinée, caracté- risé en ce qu'il comprend une ou plusieurs rangées latérales de supports ( 1) régulièrement espacés s'étendant à partir d'une surface externe d'un bâti ( 2), des moyens ( 3, 6, 10) pour faire tourner ces supports dans le même sens à une vi- tesse prédéterminée, et des moyens ( 5) pour positionner le bâti de telle manière que lesdits supports puissent être in- chinés vers le haut d'un angle prédéterminé sur l'horizonta- le. 12 Appareil suivant la revendication 11, caractérisé en ce que ladite vitesse prédéterminée est comprise dans 1 ' intervalle de 10 à 100 tr/mn et que ledit angle prédéterminé est compris entre 5 et 450. 13 Appareil suivant la revendication 12, caractérisé en ce que la vitesse prédéterminée est de 25 à 55 tr/mn. 14 Appareil suivant la revendication 19 ou 20, carac- térisé en ce que ledit angle prédéterminé est de 10 à 200. 15 Appareil Dour faire tourner au moins un récipient de réaction (A) dans une position inclinée, caractérisé en ce au'il comprend un transporteur ( 101) ayant une surface de transport sur laquelle sont montés des rouleaux ( 117) tour- nant librement, des moyens ( 102-106) pour entraîner le trans- porteur dans un sens à une vitesse comprise dans un intervalle prescrit, une courroie ( 109) qui entre en contact avec les récipients de réaction (A) montés sur les rouleaux ( 117) et qui se déplace pour faire tourner le récipient de réaction dans un sens prédéterminé à une vitesse prédétermi- née, et des moyens pour maintenir le récipient de réaction dans une position inclinée vers le haut, à un angle prédéter- miné sur l'horizontale. 16 Appareil suivant la revendication 15, caractérisé en ce que ladite vitesse prédéterminée est de 10 à 100 tr/mn et que ledit angle prédéterminé est de 5 à 45 . 17 Appareil suivant la revendication 16, caractérisé en ce que la vitesse prédéterminée est de 25 à 55 tr/mn. 18 Appareil suivant la revendication 16 ou 17, carac- térisé en ce que ledit angle prédéterminé est de 10 à 20 . 19 Appareil suivant l'une quelconque des revendica- tions 15 à 18, caractérisé en ce que le transporteur est un transporteur à chatne.