FR 2513656 A1 19830401 FR 8216234 A 19820927 Procédé de renforcement des conversions de stéroïdes utilisant des additifs cyclodextrines. L'invention concerne un procédé de renforcement dec conversions microbiologiques de stéroldes utilisant des additifs cyclodextrines. Dans la synthèse descomposés stéroïdes certains stades de réaction sont souvent mis en oeuvre au moyen de micro-organismes Les bioconversions utilisant des cellules de micro-organismes, des enzymes extraits de ces cellules ou des cellules fixes ou des enzymes,sont mises en oeuvre dans un milieu aqueux Ceci facilite le progrès des réactions enzyma- tiques, cependant, en même temps, il est désavantageux par suite de la faible solubilité des stéroides dans l'eau De nombreux stéroïdes ont une solubilité si faible dans l'eau que leur bioconversions ne peuvent être mises en oeuvre économiquement dans un milieu aqueux. Dans les procédés connus, une portion du substrat et les stéroïdes sont généralement à l'état solide pendant la réaction Dans de tels cas, la vitesse de la réaction peut être déterminée par la dissolution du substrat et si la grosseur des particules est hétérogène, c'est-à-dire si la grosseur moyenne croit graduellement à mesure que la réaction progresse, la vitesse décroît continuellement Par suite de ce fait et de problèmes similaires, la réaction se termine fréquemment avant d'atteindre le degré de conversion désirée. On connait plusieurs procédés pour améliorer la solu- bilité dans l'eau des substrats stéroldes ou pour accélérer la vitesse de leur dissolution Selon le brevet britannique 1 211 356, le stérolde devant étre soumis à la conversion est au préalable dispersé mécaniquement pour assurer une distribu- tion homogène de la grosseur des particules et une faible grosseur moyenne. Selon le brevet US 4 124 607, on prépare un substrat finement divisé en un stade séparé en émulsifiant une solution organique d'un stéroïde dans l'eau et ensuite en faisant évaporer le solvant organique D'autres auteurs suggèrent la dissolution desstéroldes dans un solvant organique, l'addition de la solution organique au milieu aqueux de la bioconversion au cours duquel le substrat précipite sous une forme finement divisée. Selon le brevet hongrois 149 678, le solvant organique utilisé pour l'introduction du substrat (tel que par exemple la pyridine, l'acide acétique) est neutralisé avant la bio- conversion Dans le cas des alcools, la dissolution est aug- mentée par l'addition de chloruresde métaux alcalins. Selon le brevet britannique 1 083 204, la solubilité des substrats dans un milieu aqueux est augmentée par des solvants organiques, en particulier par le diméthylsulfoxyde. On peut ajouter le solvant organique auxiliaire simultanément avec l'addition du substrat ou à la suite de nette addition. Dans un autre mode de réalisation, la solubilité dans l'eau des substrats peut être augmentée par des sol-ants non miscibles avec l'eau,lorsque l'interface élevée de l'émulsion formée assure un transport matériel rapide (Biotechn Bioenq 21, 39 ( 1979)). Des agents solubilisants sont fréqueme-at ut:lisés dans l'industrie pharmaceutique Par exemple, sel 'le brevet allemand 1 543 431, lors de la préparation de landrostène-dion à partir de 4-collesten-3-one, le rendement est considérablement augmenté en utilisant des agents solubilisants. Bien que les procédés connus diminuent les inconvénients dus à la faible solubilité dans l'eau des substrats, ils présentent d'autres inconvénients pour le système ou bien ne sont pas économiques Si, par exemple on prépare un substrat sous une forme microcristalline, ceci nécessite une opération additionnelle et comporte des pertes matérielles On a en outre observé que les solvants organiques en une quantité nécessaire pour suffisamment augmenter la solubilité des sté- roïdes, sont préjudiciables aux micro-orranistiies (Steroids, 12, 525 ( 1968)) Les agents solubilisants augmentent gélé- ralement la mousse, ce qui rend difficile l'aération du système de bioconversion. L'invention a pour objet un procédé permettant de renforcer de façon efficace la conversion microbiologique des stéroldes tout en évitant ou diminuant les inconvénients de l'art antérieur. On a découvert de façon surprenante que dans des systèmes de bioconversion, on peut utiliser avec succès les cyclodextrines pour augmenter la solubilité dans l'eau des molécules de stéroldes ou dans le cas d'un résidu solide pour augmenter la vitesse de dissolution, pour éviter "l':bhibition de produit " gênant le progrès de la réaction et dans certains cas, pour supprimer les réactions secondaires De plus, les e et P-cyclodextrines et éventuellement leur mélange, ont un effet catalytique sur l'hydrolyse des esters Si les micro-organismes ont deux ou plusieurs fonctions, les effets sélectifs peuvent être utilisés avantageusement pour influencer la proportion des produits de réaction. L'expression "renforcement" utilisée dans la description et dans les revendications, se réfère aux effets complexes décrits ci-dessus. Selon l'invention, on fait réagir un substrat stérolde avec un micro-organisme en présence d'un O -,( ou Y -cyclo- dextrine ou leur mélange éventuel et si on le désire après la fin de la réaction, on sépare la cyclodextrine du système. Dans ce qui suit et sauf mention contraire, l'expression "cyclodextrine" signifie un GL-, ou '-cyclodextrine ou leur mélange éventuel. La cyclodextrine peut être ajoutée avant la réaction microbiologique, au début ou à un stade facultatif de cette dernière, en une quantité de 0,2 à 3 moles de cyclodextrine pour 1 mole de substrat. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, on ajoute la cyclodextrine au milieu de bioconversion avant l'addition du substrat. Selon un autre mode de réalisation, on peut faire réagir la cyclodextrine avec le substrat et le complexe d'in- sertion obtenu ou une solution ou suspension aqueuse de ce complexe peut être ajoutée au milieu de bioconversion. Selon un autre mode de réalisation, la cyclodextrine est ajoutée à un certain stade de la réaction, de préférence après une conversion de 30 à 50 %, telle quelle,sous la forme d'un complexe d'insertion avec un substrat stéroide ou sous forme d'une solution ou suspension aaueuse de ce dernier Si l'on désire,une solution de cylodextrineou un omplexe d'insertion cyclodextrine-substrat peut être stérilisée avant l'addition au milieu dq bioconversion ou bien la stérilisation peut être mise en oeuvre ensemble avec celle du milieu de bio- conversion. La cyclodextrine peut être récupérée du milieu aqueux de la bioconversion par extraction du stérolde avec un solvant organique et précipitation subséquente de la cyclodextrine du raffinat au moyen d'un solvant diminuant sa solubilité de façon efficace et de préférence au moyen de l'hexane La cyclodextrine est ensuite isolée par filtration et si l'on désire, séchée. Le renforcement des conversions microbiologiques des stéroïdes est d'une importance essentielle étant donné qu'il a pour résultat l'augmentation de la vitesse de réaction, réduisant le temps nécessaire pour la conversion, augmentant la concentration du substrat dans le milieu, évitant l'inhi- bition du produit et les réactions désirées peuvent être catalysées sélectivement, c'est-à-dire la sélection micro- biologique est augmentée. Les complexes d'insertion dessubstrats stéroïdes avec la cyclodextrine peuvent être préparés par plusieurs voies différentes Selon le premier mode de réalisation, une solution aqueuse de la cyclodextrine désirée ayant une concentration appropriée en cyclodextrine est utilisée comme milieu pour la bioconversion et le substrat stéroïde est ajouté à cette solution dans laquelle un complexe d'insertion est formé selon l'état d'équilibre (variante 1). Selon un autre mode de réalisation, une solution aqueuse du complexe d'insertion substrat-cyclodextrine est préparée séparément et est ajoutée ultérieurement au milieu de bioconversion, après stérilisation par filtration (variante 2). En présence d'une petite quantité d'eau, les mélanges de stéroldes avec les cyclodextrines peuvent être recristallisés pour fournir des complexes stéroide-cyclodextrine qui peuvent êtreajoutés sous forme de solide aux bioconversions o la stérilisation n'est pas nécessaire (variante 3). Les cyclodextrines sont des molécules cycliques constitués de 6, 7 ou 8 unités glucopyranose formant des unités OC-1,4-glucose Structuralemen L elles sont caractérisées par unarrangement spécial des groupes hydroxyles Tous les hydroxyles secondaires sont situés sur une arete du noyau, tandis que tous les hydroxyles primaires sont placés sur une autre arête de ce noyau Par conséquent, la surface 1 o extérieure du noyau est essentiellement hydrophile, ce qui assure la solubilité dansl'eau des cyclodextrines D'autre part, la surface intérieure des noyaux a un caractère hydrophobe car dans cette partie de la molécula on ne trouve que des atomes d'hydrogène et des ponts oxygale glucoside Par conséquent, les molécules dont la dimension et la forme permettent la pénétration dans le "fond" à l'intérieur de la cyclodextrine, forment des complexes l'insertion avec les cyclodextrines. Le noyau constitué de 6 unités glucopyranose est appelé C-cyclodextrine, celui constitué de 7 unités est appelé ) -cyclodextrine et finalement le noyau ayant 8 unités gluco- pyranose est appelé -cyclodextrine Les cyclodextrines sont quelquefois appelées également cycloamyloses. Les complexes de divers composés stéroïdes pharmaceu- tiquement actifs avec les cyclodextrines ont été essayes par Lech et Pauli (J Pharm Sci 55, 32 ( 1966)) Pour les complexes die testostérone et d'acétate de cortisone, on a déterminé même les rapports stoechiométriques probables Lors des essais, l'adsorption des substances actives était influencée par solubilisation Cependant, aucune description et aucune 3 C indication ne concernent le renforcement des conversions microbiologiques des substrats steroides. On a découvert que les complexes de substrats stéroïdes avec les cyclodextrines se dissocient instantanément en milieu aqueux et dans un système de bioconversion, les complexes sont en équilibre dynamique avec le stéroide libre et les molécules Se cyclodextrine Dans les systèmes de bioconversion contenant un stéroide solide en suspension, la concentration réelle du stéroïde dissous, c'est-à-dire du stéroide qui est disponible pour l'enzyme,dépend de la vitesse de la réaction enzymatique et de la dissolution du substrat Si la dissolution du substrat est un procédé plus lent, la concentration du stéroide dans la solution reste considérablement en-dessous de la valeur de saturation et par consequent la vitesse de la réaction enzy- matique sera considérablement ralentie Etant donné que la libération du substrat d'un complexe d'insertion de cyclo- dextrine s'effectue instantanément en solution aqueuse, dans de telles circonstances, la concentration des substrats dissolves arrive à la valeur de saturation pendant tout le processus et par conséquent, on peut réaliser une vitesse maximale de la réaction enzymatique. Dans d'autres cas, le produit d'une réaction enzy- matique peut ralentir ou arrêter ccmplètement la conversion du composé stérolde de départ puisqu'il adhère à la surface du substrat ou de l'enzyme Cet effet est généralement appelél' "inhibition du produit final" Les complexes eu substrat et les stéroldes produit final, ont par rapport aux cyclo- dextrines, une stabilité différente due aux différencesde structure entre le substrat et le produit fi ïal Dans des conditions de réaction sélectionnées de façon appropriée, le stêrolde produit final responsable de l'inhibition du produit final peut être transformé en un complexe cyclodextrine relati- vement stable sans diminuer la possibilité d'obtention du substrat Lorsque le substrat forme un complexe plus stable avec les cyclodextrines que le produit final,on peut éviter l'inhibition du produit final en ajoutant la cyclodextrine au système seulement à un certain stade de la réaction, lorsqu' une quantité en excès du produit final peut déjà être déteetée dans le milieu réactionnel. D'autres essais ont montré que l'hydrolyse enzymatique desmolécules de stéroïdes estérifiées pouvaient être accélérée en préparant les complexes pondants Ceci est probablement dû à un effet catalytique de la molécule de cyclodextrine. 3656 Pendant les différentes bioconversions, on a également observé que la formation de complexes de cyclodextrine peut être utilisée également d'une autre façon Ainsi, par exemple, en formant un complexe suffisamment stable d'un omposé stéroide donné, la vitesse de formation d'une structure isomère donnée peut être diminuée ou bien la formation d'un isomère de structure peut être entièrement évitée, car la possibilité d'obtention de la molécule de départ donnée est diminuée. Les résultats ci-dessus indiqués peuvent être réalisés par les complexes cyclodextrine de composés facultatifs ayant une structure stérane Le procédé selon l'invention est illustré par les exemples illustratifs ci-après en relation avec des composés ayant un squelette oestrane, androstane, pregnane, colestane ou stigmastane, sans cependant limiter l'utilisation de ces composés Dans ces exemples, sauf mention contraire,les pourcentages s'entendent en poids. Exemple 1 Substrat: hydrocortisone Micro-organisme: Arthrobacter simplex (ATCC 6946) OC-cyclodextrine; accélération de la réaction. Introduction du substrat: variante 1 On prépare une suspension en lavant une culture d'Arthrobacter simplex (ATCC 6946) sur de l'agar agar avec une solution saline physiologique Par 5 ml de suspension, on injecte le milieu de culture suivant: glucose 0,3 %, caséine hydrolysée par voie enzymatique 0,5 %, extrait de levure 0,1 %, p H = 6,7 On complète ensuite le milieu à 100 ml et on le stérilise dans un flacon Erlenmeyer de 500 ml On continue la culture à 32 C sur une machine à secousses à 230 coups pendant 18 heures, ensuite on induit l'enzyme en ajoutant une solution de 5 mg d'hydrocortisone dans 0,5 ml de méthanol L'induction est réalisée dans les mêmes conditions que la culture, pendant 3 heures 50 ml de liqueur de culture contenant l'enzyme delta-l-déhydrogénase est ajouté dans un flacon Erlenmneyer de 3 litres contenant 950 ml d'eau stérilisée et on met en oeuvre la bioconversion avec la culture active obtenue diluée 20 fois. On ajoute comme substrat 2 g d'hydrocortisone, de la façon suivante: On ajoute à la culture 20 g d'c*-cyclodextrine L'hydro- cortisone est dissoute dans 20 ml de méthanol contenant 10 % en poids de Ca C 12 et la solution obtenue est ajoutée à la culture contenant l'kcyclodextrine La bioconversion est mise en oeuvre à 32 C sous agitation pendant 5 heures sur la machine sus-indiquée La présence d'ck-dextrine inhibe la précipitation du substrat en milieu aqueux et la conversion du substrat dissous est déterminée par l'activité de l'enzyme Autrement dit, la vitesse de réaction est supérieure qu'en l'absence de cyclo- dextrine, lorsqu'environ 8 heures sont nécessaires pour terminer la conversion désirée. A la fin de la réaction, le milieu de fermentation contient 1920 pug/ml de prednisolone, 40 pg/ml de 20 -hydroxy- prednisolone et 8 >g/ml d'hydrocortisone. Exemple 2 Substrat: 17 o C-méthyl-testostérone (dérivé d'andros- tane) Micro-organisme: Arthrobacter simplex (ATCC 6946) r-cyclodextrine; élimination de l'inhibition du produit final Introduction du substrat: variante 1 La culture préparée et induite comme décrite dans l'exemple 1 est diluée 5 fois de son volume d'origine et on y ajoute une solution de 1,0 g de 17 o C-méthyl-testostérone dans ml de méthanol La delta-l-déhydrogénation de la 17 d O-méthyl- testostérone est amorcée Le progrès de la réaction est contrôlé par chromatographie en couche mince Le substrat précipite dans le milieu et la déshydrogénation s'effectue parallèlement avec la dissolution graduelle du substrat Lorsqu'environ 400 g/ml de delta-l-méthyl- testostérone sont détectés, on ajoute au système 6,0 g de e - cyelodextrine Le produit forme un complexe d'insertion avec la cyclodextrine et de cette façon on évite l'effet "inhibition du produit" qui aurait résulté de la fin de la réaction La stabilité du complexe cyclodextrine du produit final est environ 5 fois celle du complexe cyclodextrine du substrat L'addition s'effectue dans la deuxième heure de la conversion et selon la chromatographie en coucheemince, l'incu- bation doit être terminée à la sixième heure. A la fin de la conversion, le milieu de culture contient 970 ^g/ml de delta-l-méthyl-testostérone et 6 pg/ml de méthyl- testostérone. En l'absence de cyclodextrine, la réaction se termine lorsque le milieu contient environ 100 à 120 pg/ml de substrat méthyltestostérone. Exemple 3 1 O Substrat: 5-pregnène-3 f,,i 70 C,21-triol-20-on-21-acétate (dérivé de pregnène acylé) Micro-organisme: Flavobacterium lucecoloratum (NCIB 9321 o,-cyclodextrine; augmentation de la concentration Introduction du substrat: va iante 3 is Dans un flacon Erlern Leyer de 750 mi, 200 ml de milieu de culture sont injectés avec une culture en pente sur agar de Flavobacterium leucecoloratum (NCIB 9324) La culture est realisée à 30 C sur une machine à secou 3 ses à 230 coups, pendant heures, à la suite de quoi 5 litres d'un milieu de culture stérile ayant la même composition sont injectés avec la culture dans un appareil de fermentation de laboratoire Le milieu de culture a la composition suivante: extrait de levure 1,0 %, phosphate diacide de potassium 0,1 %, phosphate acide dipotassique 0,4 % Apres l'injection, on ajoute au milieu de culture apres stérilisation par filtration, une solution de 250 mg de substrat dans 1,5 ml de diméthylformamide La présence du substrat assure la formation des enzymes nécessaires pendant la croissance de la culture Après la culture pendant 12 heures, le nombre de bactéries et l'activité de l'enzylme sont suffisants pour commence 2 t la bioconversion et pour cela on ajoute 100 mg de 5-pregnène-3 l 70 %, 21-trihydroxy 20-on-21- acétate à la culture apres prtraitmt c la cyclodex rine Le prétraitement est réalisé de la façon suivante: g de substrat sont homogéné-isés avec la même q-' uantit 2 de Y-cyclodextrine et 200 ml d'eau, pendant 20 minutes, pour for Px: un conip ea rapideiment soluble du substrat avec la cyclodextrine La s' p s on enueiu est ajoutée dans l'appareil 3656 de fermentation et on continue ensuite l'incubation jusqu'à ce que la quantité totale du substrat est consommée (environ 11 heures) L'incubation est réalisée à 30 C, avec agitation à 420 tours/minute et aération à un taux de 0,5 litre/litre/ minute Le progrès de la réaction est contrôlé par chroma- tographie en couche mince. A la fin de la réaction, la culture contient 9020 pg/ml de composé eichstein-S ( 4-pregnène-17 o(, 21-dihydroxy-3,20- dione) et 30 ug/ml de substrat En l'absence de cyclodextrine 10 g/litre de substrat auraient été nécessaires pour obtenir le résultat désiré. Exemple 4 Substrat: 4-pregnène-17 o(,21-dihydroxy-3,20-dione-17- acetate (corticostéroide acylé) Micro-organisme: Curvularia prasadii (IMI 71475) P-cyclodextrine; catalyse de l'hycdrolyse externe Introduction du substrat: variante I Dans un flacon Erlenmeyer de 500 m cortenant une suspension despores obtenue par lavage d'une culture de croître, on ajoute 0,12 g de substrat 4-pregnène-17 ",21- dihydroxy-3,20-dione-17-acétate dans 3 ml de méthanol Pendant la période d'incubation qui suit, le substrat est hydroxylé en position II-pour donner i'hvdrocortisone-17-acétate, Selon la chromatographie en couche mince à la 20 ème heure de la conversion, La culture contient 10 % de substrt n'ayant rpas réagi A ce stade, 0,96 g de -c c ode&trine Sont ajoute au système La cyclodextrine a un effet catalytqiîue sar Vhicroiyse enzymatique du groupe acétyle de la DoléMcu -a -de stérolde et par conséquent dans la phase subséquente de la bioconversion en plus de l'hydroxylation qui ralentit,le groupe acétyle est scindé Après environ 3 heures, la réaction est terminée, A la fin de la conversion, le milieu de fermentation contient 0,730 pg/ml d'hydrocortisone ( 4-pregnen-llp, 17 l-, 21- trihydroxy-3,20-dione), 0,185,g/ml d'hydrocortisone-17-acétate, 0,005 pg/ml de Reichstein-S-17-acétate et 0,040 jg/ml de composé Reichstein-S. Exemple 5 Substrat: hydrocortisone Micro-organisme: Arthrobacter simplex (ATCC 6946) f-cyclodextrine; accélération de la réaction Introduction du substrat: (variante 2) On injecte dans un appareil à fermentation de laboratoire avec 30 ml d'une suspension obtenue en lavant une culture d'Arthrobacter simplex sur un milieu de culture solide, 5 litres d'un milieu de culture stérilisé Le milieu de culture a la composition suivante: glucose 0,3 %, peptone 0,3 %, extrait de levure 0,1 %, p H 6,8 La culture est réalisée à 35 C, avec agitation à 240 tours/minute et avec une aération de 0,5 1/1/ minute pendant 20 heures Pour 1 litre de culture, on injecte dans un appareil à fermentation de laboratoire 9 litres d'un milieu de culture stérilisé Ce milieu de culture a la compo- sition suivante: glucose 0,5 %, peptone O,5 %, extrait de levure 0,4 %,p H 6,8 La culture est réalisée à 35 C avec agitation à 600 tours/minute et avec une aération de 0,3 1/1/minute, pendant 18 heures Ensuite, on ajoute pour induire la formation de l'enzyme, une solution de 0,5 g d'hydrocortisone dans 50 ml de méthanol Apres l'incubation pendant 4 heures, la culture active est transvasée dans un appareil résistant à l'acide dans lequel on a préalablement préparé le milieu de bioconversion. Milieu: on ajoute dans l'appareil 90 litres d'eau de robinet et 1200 g de f-cyclodextrine et on chauffe l'appareil à C, on stérilise le milieu à cette température pendant 20 minutes, après quoi on refroidit à 35 C On dissout 1 g de 2-méthyl-l,4-naphtoquinone et 400 g d'hydrocortisone dans 4 litres de méthanol contenant 400 g de Ca Cl 2 La solution est stérilisée par filtration et ajoutée dans l'appareil Simulta- nément avec l'addition, la bioconversion démarre Pendant la conversion, pratiquement toute la quantité de substrat stérolde est dissoute et par conséquent il n'y a pas de risque de formation de cristaux mixtes lorsque le produit précipite. Le milieu de bioconversion est incubé à 35 C sous une agitation de 180 tours/minute avec une aération de 0,6 1/1/ minute Le progrès de la réaction est contrôlé par chromato- graphie en couche mince et la réaction est terminée aussitôt que la quantité de substrat diminuede 2,0 % en poids Le milieu de fermentation est ensuite extrait deux fois avec de l'acétate d'éthyle à contre-courant L'extrait est concentré sous vide, à une température allant jusqu'à 40 C, jusqu'à une concentration de 8 g/litre (environ 50 litres d'un premier concentrat), décoloré avec un mélange de 40 g de charbon activé et 100 g de célite et on continue l'évaporation jusqu'à ce que la cristal- lisation se produise (environ 2 litres) La suspension est refroidie à 5-10 C et filtrée après un repos de plusieurs heures. La liqueur mère est traitée avec 5 fois son volume de di-iso- propyl-éther, refroidie eton sépare par filtration le précipité. On obtient 375 g de produit ayant les caractéristiques suivantes: pureté 98 % en poids perte par dessication 1 % en poids sulfate dans les cendres 0,1 % en poids résidu hydrocortisoae 1,2 % en poids autres stéroïdes 0,35 % en poids point de fusion 234-236 C jpe 20 = + 980 (dioxane, c = 1) Afin de récupérer la f-cyclodextrine, l'extrait est agité avec 1 litre de cyclohexane à 18-20 C pendant 1 heure. Le précipité obtenu est séparé par filtration, mis en suspension dans environ 1 litre d'eau et la cyclobexane est éliminée par distillation à la vapeur d'eauà l'ébullition On laisse la suspension aqueuse de Pcyclodextrine au repos à 5-10 C pendant la nuit, on sépare les cristaux par filtration et on sèche sous vide On récupère environ 700 g de cyclodextrine qu'on peut utiliser pour d'autres opérations. Exemirples 6 à 11 On met en oeuvre les conversions microbiologiques suivantes selon le procédé décrit dans les exemples précédents, dans les conditions de réaction indiquées,en utilisant la cyclodextrine pour renforcer la réaction. Exemple 6 Substrat: sitostérine Micro-organisme: Mycobacterium sp (NRRL C-3805) cyclodextrine; augmentation de la concentration Introduction du substrat: variante 1 Produit final: androstat-4-diene-3,17-dione La chaîne latérale du substrat est décomposée selon Marscheck, W J Kraychi et Muir R D ( 1972) Appl Microbiol. 23, 72 Le rapport molaire stéroide: cyclodextrine est de l:0,2 Le milieu de culture contient 0,5 % de Na 2 HPO 4 7 H 20. En présence de cyclodextrine, la concentration de sitostérine peut être augmentée jusqu'à 2 g/litre tandis qu'en l'absence de cyclodextrine, on n'obtient qu'une concentration de 1 g/litre (temps de conversion: 170 heures dans les deux cas). Exemple 7 Substrat: progestérone Micro-organisme: Ophiobolus herpotrichus Pcyclodextrine; achèvement de la conversion Introduction du substrat: variante 1 Produit final: 21-dihydroxy-progestérone Le procédé est mis en oeuvre selon Meystre et al, Helv Chim Acta 37, 1548 ( 1954) Le rapport molaire stéro Ide cyclodextrine est de 1:0,2 Le micro-organisme est cultivé sur du mo 6 t de bière pendant 3 jours a la suite de quoi on ajoute un substrat progestérone enl solution acétonlique jusqu'a une concentration de 0,25 g/1 de la liqueur de fermentation. Sans utiliser de cyclocdextrine, la bioconversion dure 3 jours de plus et la quantité de substrat résiduel est d'environ % Si 24 à 30 heures avant le départ de la bioconversion, on ajoute de la -cyclodextrine au milieu de la réaction, la quantité de substrat résiduel est considérablement réduite. Exemple 8 Substrat: 4-pregnène-17 o(, 21-dihydroxy-3,20-dione (Reichstein-S) Microorganisme: Curvularia Lunata (IFO 49 k cyclodextrine; influence du rapport des produits de réaction Introduction du substrat: variante 1 Produit principal: hydrocortisone La réaction est essentiellement mise en oeuvre selon Kondo, E et Mitsugi, T, J Agrc Chem Soc Japan 35, 521 ( 1961) Lerapport molaire stérolde: cyclodextrine est de 1:0,3 Sans utiliser la cyclodextrine, on obtient comme résultat de la bioconversion 35 à 40 % en poids de 6 b -hydroxy-Peichstein- S, 15 à 20 % en poids de 14 ck-hydroxy-Reichstein-S, 3 à 5 % en poids de 110-hydroxy-Reichstein-S et environ 5 % en poids de 7,14 d dihydroxy et 5 % en poids de 6 ?,14 d dihydroxy-Reichstein- S Si au début de la bioconversion, on ajoute de la (-cyclo- dextrine au mélange dans le rapport ci-dessus, la proportion de l 11 chydroxy-Reichstein-S (epi-hydrocortisone) peut être augmentée au double de la quantité ci-dessus. Exemple 9 Substrat: 16 c(-mêthyl-Reichstein-S Micro-organisme: Curvularia lunata ( 3 TCC 12017) f-cyclodextrine; augmentation du degré de conversion Introduction du substrat: variante 1 Produit final: l 11 >, 17 o(,21-trihydroxy-16 o S-méthyl- pregn-4-ène-3,20-dione ( 16 d méthyl-hydrocortisone) La réaction est essentiellement réalisée selon Canonica, L et al, Gass Chim Ital 93, 368 ( 1063) Le rapport molaire steroide:cyclodextrine est de 1:1 En l'absence de cyclodextrine, le produit final désiré est obtenu en une quantité d'environ % en poids Si au début de la bioconversion, on ajoute de la Pcyclodextrine au mélange, dans le rapport sus-indiqué, la proportion du produit final dans le mélange de réaction est augmentée d'environ 5 à 10 %. Exemple 10 Substrat: 3 f,17 c,21-trihydroxy-pregn-5-en-21-acétate Micro-organisme: Flavobacterium dehydrogenans (ATCC 13930) -cyclodextrine; augmentation de la concentration Introduction du substrat: variante 1 Produit final: Reichstein-S La réaction est essentiellement mise en oeuvre selon le brevet US 3 009 936 Le rapport molaire stéroïde: cyclo- dextrine est de 1:0,3 En utilisant la cyclodextrine, la con- centration peut être augmentée à la double de celle obtenue sans utiliser la cyclodextrine. Exemple 11 Substrat: Lanatoside-A (digitalis glucoside) Micro-organisme: Streptomyces purpurascens P-cyclodextrine; augmentation de la concentration Introduction du substrat: variante 1 La réaction est mise en oeuvre selon le brevet Hongrois 176 250 Le rapport molaire Lanatoside- A: cyclodextrine est de 1:1 Pour comparer sans l'utilisation de cyclodextrine, on ajoute une solution organique contenant 0,5 g/litre de Lanatoside-A au deuxième jour d'une culture de Streptomyces purpurascens Si après la culture du micro-organisme pendant 2 jours, au début de la bioconversion, on ajoute au milieu réaction- nel de la P-cyclodextrine dans le rapport sus-indiqué, la concentration du substrat peut être augmentée jusqu'à 2,0 g/ litre. 13656 REVENDICATIONS 1 Procédé de renforcement de conversions microbiologiques de stéroïdes, caractérisé par le fait qu'on met en oeuvre la conversion microbiologique d'un substrat stérolde en présence d'un o, Y ou -cyclodextrine ou d'un mélange de ces dernires, et si on le désire, on récupère la cyclodextrine du mélange réactionnel après la fin de la réaction. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'on ajoute la cyclodextrine au mélange réactionnel avant ou au début de la réaction microbiologique. 3 Procédé selon les revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait qu'on utilise 0,2 à 3 moles dé cyclodextrine par mole de substrat. 4 Procédé selon l'une quelconque des revendications -1 à 3, caractérisé par le fait qu'on ajoute la cyclodextrine au mélange réactionnel avant l'addition du substrat. Procédé selon l'une quelconque des revendicatons 1 à 3, caractérisé par le fait qu'on ajoute au mélange réactionnel avec la cyclodextrine un complexe d'insertion du substrat. 6 Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fit qu'on utilise une solution ou une suspension du complexe d'insertion du substrat avec la cyclodextrine. 7 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait qu'on ajoute la cyclodextrine au mélange réactionnel à un degré de conversion de 35 à 50 %. 8 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait qu'on stérilise une cyclodextrine, un complexe d'insertion avec le substrat stérolde ou une solution de ce dernier avant l'addition au milieu de -bio- conversion. 9 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait qu'on stérilise la cyclodextrine ajoutée au milieu de bioconversion ensemble avec le milieu. Procédé sel-on la revendication 1, caractérisé par lefait qu'on extrait le stéroide avec un solvant organique du milieu de bioconversion aqueux et du raffinat, on précipite la cyclodextrine en diminuant sa solubilité par l'addition d'un solvant, de préférence l'hexane et on sépare ensuite la cyclodextrine par filtration et on la sèche.