FR 2521304 A1 19830812 FR 8202058 A 19820209 La présente invention concerne un appareil automatisé permettant la réalisation de dosages biologiques, biochimiques ou physico-chimiques et plus particulièrement de dosages microbiolo- giques selon la méthode turbidimétrique. Un antibiotique possède une activité inhibitrice vis-à-vis des microorganismes vivants et cette propriété peut être mise à profit pour sa détection et son dosage au cours des diffé- rentes phases de sa fabrication et de son exploitation. Les méthodes classiquement utilisées pour les dosages microbiologiques sont la méthode dite de "dilution", la méthode de diffusion et la méthode turbidimétrique. La méthode de "dilution", bien que peu précise, est suffisante pour déterminer un spectre d'activité ou la sensibilité d'un germe à tel ou tel antibiotique Des solutions ont été apportées qui permettent une utilisation courante et rapide de cette méthode dans les hôpitaux ou les laboratoires d'analyses médicales. La méthode de diffusion, par son principe, est difficile à automatiser Cette méthode consiste à placer à la sur- face de plaques de milieu nutritif gélosé et ensemencé, en général dans des boites de Pétri, des solutions de concentrations crois- santes'd'antibiotiques, de raison 1,5 ou 2 Après incubation il apparait des zones d'inhibition circulaires dont le diamètre est en relation linéaire avec le logarithme des concentrations Le dosage est réalisé par comparaison des réponses obtenues pour l'échantillon avec celles de l'étalon. La méthode turbidimétrique consiste à préparer des séries de solutions de concentrations croissantes d'antibiotiques ou de facteurs de croissance, de raison donnée, dans un milieu nutritif ensemencé par le microorganisme approprié et à évaluer, après un temps d'incubation déterminé à une température constante, la turbidité produite par l'ensemble des corps microbiens. La turbidité évolue en fonction inverse de la concen- tration en antibiotique; ceci se traduit par une courbe en S qui ne correspond pas à une formule mathématique simple Par cette méthode, il est possible de définir l'unité d'activité d'un anti- biotique ou de comparer quantitativement l'activité d'un anti- biotique à celle d'un étalon. La méthode de dosage turbidimétrique nécessite la réalisation de 3 phases automatisées ou non qui peuvent se résumer de la manière suivante: a) préparation dans une série de tubes à essai d'un volume constant (par exemple 1 cm 3) de solutions de concentrations croissantes, de raison variable selon le type d'antibiotique (généralement de 1,1 à 1,5), de l'échantillon à étudier et du produit de référence et addition dans chaque tube d'un volume constant de milieu nutritif ensemencé (par exemple 9 cm 3), b) incubation des tubes dans des bains thermostatiques dont la température est généralement fixée à 370 C, c) mesure photométrique à la longueur d'onde' convenable de la turbi- dité après une phase intermédiaire de transfert de tout ou partie des échantillons dans la ou les cuves du photomètre. Les appareils qui existent actuellement manquent de souplesse et sont seulement adaptés à certains cas bien précis. Par ailleurs ils ne sont que partiellement automatisés. Il a maintenant été trouvé, et c'est ce qui fait l'objet de la présente invention, que différentes phases de la méthode peuvent être automatisées De cette manière, il est possible de réduire les causes d'erreurs en éliminant en particulier les manipulations et en traitant simultanément en une seule opération les différentes solutions de l'échantillon et du produit de réfé- rencee maîtrisant ainsi le synchronisme de la culture microbienne dans l'unité de dosage. Selon l'invention, un appareil automatisé de dosages biologiques, biochimiques ou physico-chimiques est constitué essèn- tiellement d'un automate de préparation et d'un appareil de mesure, l'automate de préparation et l'appareil de mesure étant reliés à un ordinateur unique. Selon l'invention, un appareil automatisé de dosages microbiologiques par turbidimétrie est constitué d'un automate de préparation, d'un incubateur à sec et d'un appareil de mesure tel qu'un photomètre, l'automate de préparation et l'appareil de mesure étant reliés à un ordinateur unique. En utilisant, par exemple, un appareil selon l'inven- tion pour les dosages microbiologiques par turbidimétrie, il est possible de comparer directement l'activité d'un échantillon à celle d'un produit étalon ou de déterminer l'activité d'un antibiotique par évaluation de la concentration diminuant de 50 % la croissance du microorganisme Une unité de dosage est constituée, par exemple, de 24 tubes et elle reste immuable depuis la phase de préparation jusqu'à la phase de mesure photométrique. Lorsque l'unité de dosage est utilisée pour contrôler un échantillon, c'est-à-dire pour comparer l'activité d'un échan- tillon à celle d'un produit étalon, il est nécessaire de répartir dans les tubes: une gamme de, par exemple, 4 concentrations de raison convenable- ment choisie ( 1,1 à 1,5) de l'échantillon, à partir d'une solution unique, une gamme de, par exemple, 4 concentrations de raison identique du produit étalon et, pour diminuer les causes d'erreurs, en particulier dues au caractère aléatoire de la multiplication microbienne, de répéter chaque gamme de concentration un certain nombre de fois, par exemple 3; les tubes étant disposés au hasard pour permettre l'analyse statistique ultérieure des résultats (randomisation). Chaque solution est préparée à volume constant en ajoutant à chaque prélèvement une quantité déterminée de diluant, par exemple de l'eau distillée, de façon que chaque tube contienne le même volume de solution (par exemple 0,3 cm 3). Enfin, chaque tube sera complété par l'addition d'un même volume de liquide nutritif ensemencé (par exemple 2,7 cm 3). Lorsque l'unité de dosage est utilisée pour déter- miner le titre d'un échantillon dont l'activité est inconnue, il est nécessaire de préparer une gamme de concentrations plus étendue: 1 gamme de 7 concentrations avec un témoin sans antibiotique, chaque gamme de concentrations pouvant être répétée 3 fois. Cependant la précision n'étant pas nécessairement recherchée dans ce cas, il n'est pas obligatoire d'effectuer une répétition de chaque concentration et il est alors possible de déterminer simul- tanément l'activité de trois produits différents. Selon l'invention, l'unité de dosage peut être préparée automatiquement à l'aide d'un automate qui est constitué par la combinaison de 8 diluteurs et d'un translateur. L'automate de préparation doit réaliser les fonctions suivantes-: prélèvement de volumes croissants d'une solution de l'antibiotique selon une raison convenablement choisie prélèvement d'un volume déterminé complémentaire de diluant tel que, par exemple, le volume total de la solution d'antibiotique et du diluant soit de 0,3 cm 3 prélèvement d'un volume déterminé, par exemple 2,7 cm 3, de milieu nutritif ensemencé maintenu à une température voisine de + 40 C distribution des différents volumes dans les tubes à essais randomisation de la distribution mémorisation de l'ensemble des données ci-dessus. Toutes les fonctions de prélèvement et de distribution sont réalisées par 8 diluteurs et les autres fonctions sont réalisées par le translateur, qui comprend en outre le sélecteur d'aiguilles mettant celles-ci en position de prélèvement ou non. La figure 1 représente le schéma de l'automate de préparation. Le préparateur comprend une table horizontale sur laquelle se trouvent, parfaitement positionnés, une barquette à 4 augets ( 3 au- get, pouvant contenir chacun un antibiotique différent, et le qua- trième contenant le diluant), un portoir contenant 24 tubes à essais, un poste de lavage des diluteurs et un poste d'essuyage des aiguilles de prélèvement. Le préparateur peut comporter deux postes de travail symé- triques, l'un à droite tel que représenté sur la figure 1, l'autre à gauche à proximité du poste de lavage-essuyage des aiguilles et comportant comme le premier, une barquette à 4 augets et un portoir contenant 24 tubes à essais. Au-dessus de la table du préparateur se trouve le sélecteur des aiguilles de prélèvement qui est constitué d'une tête de support des aiguilles, solidaire d'un chariot mobile, qui peut se déplacer dans un plan horizontal et dans un plan vertical au moyen de deux moteurs pas à pas pilotés par un microprocesseurs chaque aiguille étant, par ailleurs solidaire d'un électro-aimant commandé par l'ordinateur. Les aiguilles, au nombre de 8, situées dans un plan vertical parallèle aux axes des augets de la barquette, sont reliées aux diluteurs qui seront décrits ci-après. Les aiguilles sont normalement en position basse et peuvent, dans cette position, effectuer un prélèvement d'anti- biotique ou de diluant. L'excitation d'un électro-aimant permet de relever l'aiguille correspondante d'une hauteur d'environ 10 mm Dans la position haute, cette aiguille ne plonge plus dans la barquette contenant la solution d'antibiotique ou le diluant De cette manière est évité tout risque de prélèvement aberrant, de pollution interne par diffusion ou de pollution externe par passage d'une solution d'un antibiotique à une autre. La randomisation, c'est-à-dire la répartition aléa- toire des différentes solutions dans les tubes du portoir est calculée et mémorisée par l'ordinateur qui rétablira l'ordre cohérent des produits et des concentrations avant l'exploitation des résultats par calcul statistique. Chaque diluteur est composé d'une pompe constituée par une seringue de précision de 5 cm 3 dont l'extrémité est reliée à une vanne à 3 voies commandant 2 positions, le déplacement du piston de la seringue et l'ouverture de la vanne étant assurés par des moteurs pas à pas pilotés par un microprocesseur Une des voies de la vanne est reliée à la source du milieu nutritif maintenu à une température voisine de + 40 C, l'autre est reliée à une aiguille de prélèvement de la solution d'antibiotique ou de diluant au moyen d'un tube souple de longueur appropriée Un tel dispositif permet à la seringue d'effectuer tout prélèvement et toute distribution dans la direction choisie. La figure 2 donne le schéma de fonctionnement du diluteur La tubulure étant pleine de liquide nutritif, on effectue les prélèvements successifs de la solution d'antibiotique et de diluant; après inversion de la vanne, on prélève un volume constant de milieu nutritif Après nouveau positionnement de la vanne, la tota- lité des prélèvements est refoulée dans le tube à essai de l'unité de dosage. Pour éviter les mélanges par diffusion lors des prélè- vements successifs, une bulle d'air, d'un volume de 5 à 10 Pl est introduite pour séparer un prélèvement du suivant De plus, une bulle d'air est introduite dans l'extrémité de l'aiguille de façon à éliminer la formation, à son extrémité, de gouttelettes qui risqueraient d'être projetées lors des déplacements de la tête de support des aiguilles. Chaque diluteur est indépendant et est commandé séparément par l'ordinateur. Dans le tableau I est donné, à titre d'exemple, un schéma de commande des divers organes de l'automate de préparation. Tableau I no Translateur Diluteurs Electro-aimant d'instruction sélecteurd' aiguille Remise à zéro Essuyage des aiguilles Prélèvement d'une bulle d'air dans tous les diluteurs Déplacement hori- zontal de la tête support des -aiguil- les au-dessus de l'auget "étalon" Excitation sélection d' aiguilles en position haute (aiguilles poui prélèvement d' échantillon) Déplacement verti- cal descendant de la tête de support des aiguilles ne d'ins-Taste Dîluteurs Electro-aimant I truction Transateur sélecteur d' i I ________ _ aiguille Prélèvements de l'étalon par les diluteurs sélec- tionnés Déplacement ver- tical ascendant de la tête de support des ai- guilles Coupure de l'exci- tation: aiguilles en position basse Déplacement hori- zontal de la tête de support des aiguilles au-dessu E de l'auget "échan- tillon" Excitation: sélec- tion d'aiguilles en position haute (ai- guilles ayant pré- levé l'étalon) Déplacement ver- tical descendant de la tête support des aiguilles Prélèvement des échantillons par les diluteurs sélectionnés 140 Déplacement ver- tical ascendant de la tête sup- port des aiguil- les 150 Coupure de l'exci- tation: toutes les aiguilles en posi- tion basse - III IIII I _ _ l k f i D 1'tracslteu iontr t $ cd'ins Tr ltiu | Diluteurs Sélecteur d'i It t laiguille _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 2 Déplacement hori- zontal de la tête de support des aiguilles au-des- sus de l'auget "diluant" Déplacement ver- tical descendant de la tête sup- port des aiguilles Déplacement ver- tical ascendant de la tête sup- port des aiguilles Déplacement hori- zontal de la tête support au-dessus de l'unité de dosage Déplacement ver- tical descendant de la tête sup- port des aiguilles Prélèvement d'une bulle d'air dans tous les diluteurs Prélèvement de diluant par tous les diluteurs Prélèvement d'une bulle d'air Positionnement de la vanne Prélèvement du li- quide nutritif par les diluteurs Repositionnement de la vanne de chaque diluteur Distribution dans les tubes à essais de l'unité de dosage l 252 1304 L'unité de dosage ainsi préparée est placée dans un incubateur équipé d'un chauffage à sec thermostaté (dont la tempé- rature est préalablement fixée) pendant un temps prédéterminé. L'incubation étant terminée, la croissance du micro- organisme est arrêtée par addition d'une goutte de formol L'unité de dosage est placée dans le réceptacle d'un photomètre automatique qui permet la mesure directe de la densité optique des solutions étudiées; les parois du portoir étant munies, au niveau de chaque tube, de fenêtres laissant passer le faisceau de la source lumineuse jusqu'à la cellule photoélectrique. Par exemple, le photomètre, qui peut être un appareil commercialisé, est un analyseur à 24 canaux photométriques indi- viduels La lumière d'une lampe au xénon est conduite par 24 fibres optiques en quartz vers les 24 cuvettes de mesure Cependant, il existe entre les 24 faisceaux lumineux une distorsion de la mesure turbidimétrique qu'il est nécessaire de corriger. Le relevé de valeurs expérimentales obtenues pour différents microorganismes et différents niveaux de turbidité permet de calculer un facteur de correction pour chaque carnal optique. Tous ces facteurs de correction sont mémorisés grâce à un programme ordinateur. Les données expérimentales transférées et corrigées sur l'ordinateur sont exploitées selon les programmes statistiques classiques; les résultats sont exprimés sur une imprimante sous forme d'un tableau et d'une courbe de régression. no d'ins Translateur Diluteurs Electro-aimant truction Sélecteur d' aiguille 280 Déplacement vertical ascendant de la tête support des aiguilles 290 vers instruction i._____ N 020 O Plus particulièrement, l'ordinateur a pour fonction de gérer l'automate de préparation selon une séquence d'ins- tructions telle que celle décrite dans le tableau I ci-dessus concernant le translateur, les diluteurs et le sélecteur d'aiguilles d'assurer la randomisation des prélèvements de mémoriser les fonctions précédentes et l'identification de l'unité de dosage d'acquérir les mesures photométriques d'effectuer les corrections de ces mesures et leur analyse statistique d'éditer et d'archiver les résultats. -De plus l'ordinateur permet d'adapter cet ensemble de de fonctions et de programmes au type de dosage choisi et à l'évolution de la procédure dudit dosage. La chaîne de dosage, objet de la présente invention, peut être utilisée non seulement pour le dosage microbiologique par turbidimétrie, mais aussi pour tous les dosages qui nécessitent la préparation de solutions de concentration variable selon une disposition pouvant être randomisée avec ou sans répétition ou qui nécessitent l'apport de réactifs différents en proportions variables et programmables et qui mettent en jeu des réactions enzymatiques, immunologiques, sérologiques, chimiques ou biochimiques. R E V E N D I C À T I a N S 1 Appareil automatisé pour la réalisation de dosages biologiques, biochimiques ou physico-chimiques caractérisé en ce qu'il est constitué essentiellement d'un automate de préparation de solutions destinées à ces dosages et d'un appareil de mesure reliés à un ordinateur unique qui permet la gestion de l'automate et la mémo- risation des conditions de préparationl'acquisition des données et l'interprétation statistique des résultats. 2 Appareil automatisé pour la réalisation de dosages microbiolo- giques par turbidimétrie caractérisé en ce qu'il est constitué d'un automate de préparation, d'un incubateur à sec et d'un appareil de mesure, l'automate de préparation et l'appareil de mesure étant reliés à un ordinateur unique. 3 Automate de préparation de solutions destinées à des dosages biologiques ou physico-chimiques utilisable dans l'appareil auto- matisé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est constitué par la combinaison de diluteurs, d'un translateur et d'un sélecteur d'aiguilles commandés par un ordinateur, les diluteurs permettant a) le prélèvement des solutions du produit à doser et/ou de l'étalon à des volumes croissants de raison déterminée b) le complément de ces solutions à un volume constant par addition de diluant c) le prélèvement et la répartition d'un volume déterminé d'un ou des liquides nécessaires au dosage, et le translateur associé au sélecteur d'aiguilles permettant de réaliser les fonctions successives de prélèvement et de distribu- tion dans des tubes à essais placés dans une unité de dosage sans intervention manuelle. 4 Automate de préparation selon la revendication 3 caractérisé en ce que le translateur associé au sélecteur d'aiguilles et aux diluteurs permet de réaliser le prélèvement et la distri- bution dans les tubes à essais selon une disposition aléatoire. Utilisation d'un automate de préparation selon la revendication 3 ou 4 pour la préparation de solutions d'antibiotiques Du de facteurs de croissance destinées à des dosages micr Gbiologiques par turbidimétrie ou colorimétrie. 6 Utilisation d'un automate de préparation selon la revendication 3 ou 4 pour la préparation de mélanges dans des proportions variables et programmables de différents réactifs et/ou de solutions pour la réalisation de dosages enzymatiques, chimiques, biochimiques, immunologiques ou sérologiques.