FR 2522269 A1 19830902 FR 8203272 A 19820226 L'invention concerne le domaine des agents antitumoraux Dans la présente description,l'expression "agents antitumoraux" est synonyme de l'expression "agents cytostatiques" La présente invention a pour objet une forme de présentation améliorée de tels agents, qui permet de leur conférer une efficacité augmentée L'invention concerne égale- ment l'obtention des nouvelles formes de présentation des agents en cause et, d'une façon générale, un procédé pour augmenter l'efficacité d'emploi des agents antitumoraux ou cytostatiques. On sait que l'utilisation pratique des agents antitumoraux actuels soulève de nombreuses difficultés A des doses suffisantes pour être efficaces, de tels agents sont extrêmement toxiques Leur emploi se justifie cependant en raison de la gravité des affections contre lesquelles il faut lutter Par ailleurs, les conditions mêmes d'un traite- ment clinique sont loin d'être optimales car, dans de nombreux cas, les agents actifs s'éliminent très vite de l'organisme, de sorte qu'il est nécessaire de les appliquer plus fréquem- ment, ce qui augmente encore les risques de toxicité et, en tout cas,rend le traitement très inconfortable pour le malade. Dans des travaux récents, diverses tentatives ont été faites pour remédier à ces inconvénients, en particu- lier en fixant l'agent antitumoral, par exemple la daunomycine (ou daunorubicine) sur divers supports solubles ou insolubles. On peut citer à cet égard l'article de A Bernstein et al, J.Natl Cancer Inst 1978, 60, 379-384 Les auteurs proposent de fixer la daunomycine sur du dextran pour augmenter l'efficacité antitumorale En vue de la fixation, le dextran, préalablement oxydé, est mis en présence de la daunomycine et l'ensemble est ensuite réduit par le borohydrure de sodium. Lors de l'administration, les -auteurs constatent un certain nombre d'effets secondaires indésirables, en raison de la pré- sence du dextran comme support. A titre de référence bibliographique, on peut citer également l'article de Hurwitz E, Wilchek M and Pitha J. Soluble Macromolecules as Carriers for Daunorubicin J Appl. Biochem 2,25-35 ( 1980) Selon ces auteurs, la daunorubicine est fixée par son groupé cétonique sur des hydrazides macro- moléculaires solubles, et cela d'une manière réversible, La fixation a lieu, par conséquent, par des liaisons sulfures. Les difficultés rencontrées sont que le produit ne possède plus ses propriétés cytotoxiques ou encore que le conjugué devient progressivement insoluble, ce qui le rend impropre à l'application. L'article de Sjur Olsnes "Directing toxins to cancer cells" dans Nature Vol 290 12 mars 1981, décrit bien les problèmes liés à l'administration des agents anti- tumoraux dont la toxicité est très élevée Il évoque un cer- tain nombre de moyens pour essayer d'améliorer les condi- tions d'application, et en particulier pour permettre une action plus directe de l'agent actif sur la cellule cancé- reuse en améliorant sa sélectivité Il est proposé, par exemple, de fixer l'agent antitumoral sur une toxine capable d'agir directement sur la cellule. On peut citer également l'article de Jung-Yaw Lin, Jiann-Shyong Li and TaCheng Tung "Lectin Derivatives of Methotrexate and Chlorambucil as Chemotherapeutic Agents' JNCI Vol 66, No 3,Mars 1981 Les auteurs proposent de fixer les agents sur une lectine, par liaison covalente, de manière à préparer un produit conjugué ayant une efficacité supérieure à l'agent actif utilisé séparément. D'une manière générale on connait divers pro- cédés, surtout ces dernières années, ayant pour but de trans- porter des médicaments, de retarder leur élimination, de dimi- nuer leur toxicité, d'augmenter leur activité, notamment Ces études ont entre autres fait l'objet d'un ouvrage récent Drug Carriers in Biology and Medicine, G Gregoriadis ed. Academic Press 1979, qui résume les résultats obtenus avec des macromolécules naturelles, des cellules et des composants synthétiques (tels que les liposomes). D'autres voies ont fait l'objet de publica- tions récentes: la chimioembolisation artérielle avec des microcapsules contenant un anticancéreux (T Kato et al JAMA 1981, 245, 1123-1127), les anticorps porteurs de toxines ou d'agents anticancéreux (H E Blythman et al, NATURE 1981, 290 3 2522269 -146; S Olsnes, NATURE 1981, 290, 84; E Hurwitz et ai Europ 3 Cancer 1978, 14, 1213-1220), l'utilisation de pompes implantables ( 3 AMA 1981, 246, 925-926). Les problèmes posés par l'administration des agents antitumoraux ou cytostatiques sont rendus particulièrement difficiles par la nature de la maladie et la toxicité très élevée du produit actif L'invention a pour objet un moyen général pour améliorer l'efficacité d'emploi d'agents antitu- moraux, de manière à permettre une libération progressive de ceux-ci dans l'organisme, ce qui améliore nettement leur efficacité et le confort du malade. L'invention concerne des agents antitumoraux à efficacité améliorée, caractérisée en ce qu'ils se présentent sous une forme autopolymérisée après mise en contactd'une quantité efficace d'un agent de pontage bifonctionnel et d'au moins un agent antitumoral porteur de groupes capables de réagir avec l'agent de pontage considéré, ladite quantité étant capable de fournir un produit insoluble en milieu aqueux, lequel produit, après élimination de l'agent de pontage éventuel en excès, permet, mis en suspension dans un milieu aqueux, de libérer progressivement l'agent actif sous une forme soluble en conservant son activité antitumorale. L'agent de pontage bifonctionnel préféré est le gluta- raldéhyde Cependant l'invention n'est pas limitée à l'utili- sation du glutaraldéhyde et d'autres agents peuvent être mis en oeuvre, tels que le N-succinimidyl 3-( 2-pyridyldithio) propionate (SPDP) ou le succinimidyl 4-(p-maléimidophényl) butyrate (SMPB) L'homme de l'art trouvera dans la notice de la Société PIERCE Chemical Company publiée en 1981, volume 2, intitulée "Pierce Bio-research products technical bulletin Double-agents Bifunctional Cross-linking Reagents" une liste d'agents bifonctionnels de pontage ou de réticulation qui peuvent également être utilisés conformément à la présente invention La notice distribuée par la Société Pierce Chemical Company, Box 117 Rockford, IL USA 61105 contient également la liste des références bibliographiques fournissant les définitions et les caractéristiques respectives des agents de 4 -2522269 pontages La notice Pierce est introduite dans la présente description à titre de référence et l'homme de l'art pourra s'y reporter, si besoin est. Sous sa forme préférée, l'invention concerne des agents antitumoraux caractérisés en ce qu'ils se présentent sous une forme autopolymérisée après mise en contact d'au moins un agent antitumoral porteur de groupes capables de réagir avec un aldéhyde, avec une quantité efficace de glutaraldéhyde, ladite quantité étant capable de fournir un produit insoluble en milieux aqueux, lequel produit, après élimination du glutaraldéhyde éventuel en excès, permet, mis en suspension dans un milieu aqueux, de libérer progressive- ment l'agent actif sous une forme soluble en conservant son activité antitumorale. L'invention a également pour objet un procédé pour l'obtention des nouveaux agents antitumoraux précités, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact l'agent antitumoral à traiter avec une quantité efficace d'un agent de pontage bifonctionnel, capable de réagir avec l'agent antitumoral, et à récupérer un produit sous une forme autopolymérisée insoluble en milieu aqueux, ladite quantité d'agent de pontage étant capable de fournir un produit insoluble en milieu aqueux, lequel produit, après élimina- tion de l'agent de pontage éventuel en excès, permet, mis en suspension dans un milieu aqueux, de libérer progressive- ment l'agent actif sous une forme soluble en conservant son activité antitumorale. Sous un aspect préféré, l'invention a pour objet un procédé consistant à mettre en contact l'agent antitumoral à traiter avec une quantité efficace de glutaraldéhyde et à récupérer un produit sous forme autopolymérisée insoluble en milieu aqueux, ledit agent à traiter étant porteur de groupes capables de réagir avec un aldéhyde et ladite quantité de glutaraldéhyde étant capable de fournir un produit insoluble en milieux aqueux, lequel produit, après élimination éventuel du glutaraldéhyde/en exces permet, mis en suspension dans un milieu aqueux, de libérer progressivement l'agent actif sous une forme soluble en conservant son activité antitumorale. Sous un autre aspect encore, l'invention concerne un procédé pour améliorer l'efficacité d'emploi d'agents antitumoraux, ledit procédé consistant à mettre en contact l'agent à traiter avec une quantité efficace d'un agent de pontage bifonctionnel capable de réagir avec l'agent anti- tumoral et à récupérer un produit sous une forme autopolymé- risée insoluble en milieu aqueux,ladite quantité d'agent de pontage étant capable de fournir un produit insoluble en milieu aqueux, lequel produit, après élimination de l'agent de pontage éventuel en excès permet, mis en suspen- sion dans un milieu aqueux, de libérer progressivement l'agent actif sous une forme soluble en conservant son activité antitumorale. Sous un aspect préféré, l'invention concerne un procédé pour améliorer l'efficacité d'emploi d'agents antitumoraux porteurs de groupes capables de réagir avec des aldéhydes, ledit procédé consistant à mettre en contact l'agent à traiter avec une quantité efficace de glutaraldéhyde et à récupérer un produit sous forme autopolymérisée insoluble en milieu aqueux, ladite quantité de glutaraldéhyde étant capable de fournir un produit insoluble en milieu aqueux, lequel produit, après élimination du glutaraldéhyde éventuel en excès, permet, mis en suspension dans un milieu aqueux, de libérer progressivement l'agent actif sous une forme soluble en conservant son activité antitumorale. Dans tous les aspects de l'invention mentionnés ci-dessus, il est essentiel que l'agent de pontage soit capable de réagir avec l'agent antitumoral à traiter Bien entendu les groupes réactifs de celui-ci dépendront de la nature de l'agent de pontage L'agent antitumoral peut comporter par exemple des groupements -NH 2, des groupes epsilon aminés des résidus de lysine, des groupes sulfhydryles des résidus cystéine, et autres groupes réactifs semblables. Lorsqu'on utilise le glutaraldéhyde comme agent de pontage, l'invention est applicable aux agents antitumoraux les plus divers dès qu'il sont porteurs de groupes capables de réagir avec des aldéhydes Ces groupes sont par exemple des atomes d'hydrogène réactifs ou des groupes -NH 2. A titre d'exemples d'agents antitumoraux particuliers, on peut citer la daunorubicine, également dénommée dauno- mycine (voir Merck Index n O 2815 année 1976) ainsi que des dérivés similaires, tels que la doxorubicine ou adriamycine (Merck Index N O 3428 année 1976) On peut également citer les produits méthotrexate (Merck Index n O 5858, année 1976) et Mitomycine I (Merck Index n 6060, année 1976) Il va sans dire que ces exemples ne sont que purement illustratifs. Dans la description qui suit, on illustrera l'invention en se référant à l'agent de pontage préféré, à savoir le glutaraldéhyde, mais on notera que, ainsi qu'on l'a mentionné précédemment de nombreux autres agents bifonction- nels peuvent également être utilisés pour les besoins de l'invention. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'agent antitumoral à traiter est mis en contact avec le glutaraldéhyde dans des conditions bien définies. Ainsi qu'on l'a mentionné précédemment, l'agent antitumoral doit être du type capable de réagir avec le glutaraldéhyde et plus généralement avec n'importe quel aldéhyde Selon l'art antérieur, et notamment dans les articles mentionnés au début de la présente description, la fixation des agents antitumoraux sur certains supports se faisait par des réactions organiques ou d'affinité Selon la présente invention la réaction avec le glutaraldéhyde conduit à une autopolymérisation de l'agent actif Au sens de la présente description, l'expression "autopolymérisation" désigne une forme oligomère ou polymère de l'agent tumoral d'origine, laquelle, contrairement à l'agent de départ, est insoluble dans les milieux aqueux, en particulier les fluides biologiques ou -les soiutée 'hysio Iô- giques La nature -des réactions M-ises en jeu dans la technique antérieure ne permettait pas d'aboutir à une telle autopolymérisation. Les conditions de mise en présence de l'agent antitumoral et du glutaraldéhyde doivent non seulement conduire a un produit autopolymérisé insoluble, mais également être telles que ledit produit, étant ensuite, en l'absence de glutaraldéhyde,mis en suspension dans un milieu aqueux, soit à même de se dépolymériser, en libérant l'agent actif sous une forme soluble, en conservant son activité antitumorale. On doit donc choisir les conditions de réaction et en particu- lier la quantité de glutaraldéhyde mis en oeuvre, de façon à satisfaire aux exigences sus-mentionnées Si l'on utilise un excès de glutaraldéhyde, on aboutit à une saturation des groupements réactifs de l'agent antitumoral sur lesquels se fixent les groupes de glutaraldéhyde et l'on obtient en défi- nitive un produit soluble dans les milieux aqueux Au contrai- re,si l'on utilise une quantité trop faible de glutaraldéhyde, celui-ci n'est pas capable de fixer tous les groupes réactifs de toutes les molécules de l'agent antitumoral, de sorte qu'il subsiste des molécules libres de cet agent qui n'ont pas réagi L'homme de l'art comprendra que le juste milieu à adopter pour choisir la quantité de glutaraldéhyde à mettre en oeuvre dépendra de la nature de l'agent antitumoral, en particulier du nombre de groupes réactifs qu'il possède Des essais préalables permettent de déterminer les quantités op- timales de glutaraldéhyde, celles-ci devant se situer entre deux extrêmes, d'une part celles en' excès * qui conduisent à un produit soluble en milieu aqueux et,d'autre part, celles en défaut, qui laissent dans le milieu réactionnel des quan- tités résiduelles non réagies d'agent antitumoral. Il va sans dire également que la durée de réaction peut jouer un certain r Ole La réaction doit être poursuivie entre l'agent antitumoral et le glutaraldéhyde jusqu'à ce que les exigences ci-dessus soient satisfaites. Dans les exemples qui suivent on a illustré la réaction entre le glutaraldéhyde et la daunorubicine On a essayé trois concentrations en glutaraldéhyde, respective- ment de 0,027 % en poids, de 0,27 % et de 2,7 % par rapport au milieu réactionnel qui contenait 1 mg/ml de daunorubicine Avec des temps de contact à la température ambiante de 15 mn et de 30 mn, les conditions de réaction qui convenaient auxbesoinsde l'invention impliquaient l'utilisation de concentrations en glutaraldéhyde de 0,27 Y v)ec une telle concentration en effet, la quantité de produit autopolymérisé atteignait près de 100 % En revanche, à la concentration en glutaraldéhyde de 0,027 % la quantité de produit autopolymérisé était insuf- fisante et il demeurait de la daunorubicine libre non réagie. De même à des concentrations de 2,7 % en glutaraldéhyde, la quantité de produit restant soluble dans le milieu aqueux était devenue importante, ce qui n'était pas-satisfaisant. Les indications qui précèdent sont données à l'homme de l'art qui pourra dans chaque cas particulier, et par des essais préalables, définir les conditions optimales pour la réaction selon l'invention entre l'agent antitumoral et le glutaraldéhyde, ou tout autre agent de pontage bifonctionnel. Une autre caractéristique très importante de l'invention est que le produit autopolymérisé est capable, après élimination du glutaraldéhyde éventuel en excès, et une fois mis en suspensioxdans un milieu aqueux, de libérer progressivement l'agent actif sous une forme soluble en conser- vant l'activité antitumorale de celui-ci Ainsi, l'agent cytostatique actif se libère progressivement lorsque le pro- duit insoluble est mis en soluté physiologique, comme cela est le cas en application thérapeutique Les conditions réactionnelles mentionnées cidessus permettent de ne pas inhiber l'effet thérapeutique et, au contraire, d'augmenter l'efficacité d'emploi des agents antitumoraux. La fixation du glutaraldéhyde sur l'agent anti- tumoral peut s'effectuer directement ou indirectement Le moyen le plus simple consiste à mettre en présence, en par- ticulier à température ambiante, l'agent antitumoral à trai- ter avec la quantité' convenable de glutaraldéhyde et à pour- suivre la réaction jusqu'à ce que le produit insoluble soit formé et que l'on ne décèle plus, ou sensiblement plus, d'agent antitumoral non réagi. En variante,on peut également fixer au préa- lable le glutaraldéhyde sur un support et faire ensuite réagir l'ensemble sur un agent antitumoral, Pour les besoins de l'in- vention on utilise de préférence, à titre de support, des cellules et plus particulièrement des lymphocytes Cette technique de fixation est notamment décrite dans la demande de brevet français n 80 06537 du 24 mars 1980 au nom du pré- sent demandeur ayant pour titre "Préparations cellulaires applicables en thérapeutique humaine, procédé d'obtention et applications" On peut se reporter également à la demande de brevet suisse 5429/80 du 15 juillet 1980, correspondant à la demande de brevet français précitée D'autres détails sur cette technique se trouvent dans la publication de E H Relyveld et S Ben-Efraim Preparation of highly immunogenic protein conjugates by direct coupling to glutaraldehyde-treated cells: comparison with commonly used preparations J Immunol Methods 1981, 40, 209-217 Ces préparations cellulaires sont consti- tuées de cellules sur lesquelles sont fixées, à leur surface, des substances ayant une activité pharmacologique A titre de cellules on fait appel de préférence à des lymphocytes normaux ou leucémiques La fixation est effectuée en présence d'un agent de pontage, lequel est de préférence le glutaraldéhyde. Selon cette variante de mise en oeuvre de l'invention, le produit insoluble se présente sous la forme d'une préparation cellulaire, de préférence lymphocytaire, portant l'agent antitumoral sous forme couplée De la mê- me manière que dans le cas d'une fixation directe du glutaral- déhyde sur l'agent antitumoral, le produit insoluble obtenu conformément à ladite variante, peut, s'il est mis en suspen- sion dans un milieu aqueux en absence de glutaraldéhyde,comme cela peut être le cas, par exemple, dans l'organisme, libérer progressive- ment l'agent antitumoral en conservant acelui-ci son activité cytostatique. Les expériences rapportées ci-après concer- nent la daunorubicine Les résultats obtenus suivant les pro- tocoles classiques pour mesurer l'effet thérapeutique de la daunorubicine ont montré que les produits de l'invention à base de daunorubicine sont plus toxiques que la daunorubicine libre Cependant, ils permettent d'obtenir avec des quantités moindres, par exemple de l'ordre de la moitié des quantités correspondantes de daunorubicine libre, des résultats thérapeutiques sensiblement équivalents L'effet thérapeutique de la daunorubicine polymérisée est également meilleur si on le compare à celui de la même quantité du médicament injecté par doses successives, comme cela est le cas dans les traitements habituels, ou en une seule fois L'effet "retard" procuré par les produits de l'invention permet donc d'améliorer très sen- siblement les conditions du traitement et en particulier le confort du malade. Les produits de l'invention ont les mêmes applications que les agents antitumoraux dont ils dérivent. Ils se prêtent à toutes les formes de mise en oeuvre de tels agents tumoraux, par exemple l'injection du dérivé cytotoxique in situ, en particulier dans des tumeurs solides ou encore dans les traitements mentionnés au début de la présente descrip- tion impliquant la chimioembolisation ou des pompes implanta- bles. Dans les exemples qui suivent, on a illustré l'invention avec la daunorubicine (ou son chlorhydrate) comme agent antitumoral. EXEMPLE 1 Obtention d'un produit polymère par action du glutaraldéhyde sur la daunorubicine On met en contact à la température ambiante lmg/ml de daunorubicine (chlorhydrate) en solution aqueuse avec du glutaraldéhyde à diverses concentrations,à savoir 0,027 %, 0,27 % et 2,7 % en poids respectivement, pendant mn ou 30 mn Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 1. Les résultats du Tableau 1 montrent que la concentration de 0,27 % en poids de glutaraldéhyde est, parmi les trois concentrations essayées, la seule qui convienne selon l'invention pour obtenir pratiquement 100 % de produit polymère insoluble. EXEMPLE 2 Fixation de la daunorubicine sur cellules On a effectué le couplage de la daunorubicine (chlorhydrate) aux cellules leucémiques L 1210 de la souris C 57 BL/6 XDBA/2 F 1 Les conditions de réaction et les résultats obtenus sont rassemblés au Tableau 2 On constate que la daunorubicine se fixe sur les cellules et se polymérise. Les résultats du Tableau 2 montrent encore l'importance de la concentration en glutaraldéhyde Avec 2 x 10 i 7/m de cellules et lmg/ml de daunorubicine, on n'obtient pas de'poly- mère fixé à la concentration de 0,027 %, quelle que soit la durée de réac- tion, alors que la concentration de 0,27 % fournit' un polymère De même la concentration de 0,108 % en glutaialdéhyde pour 8 x 10 cellules/il et 1 mg/ml de daunorubicine ne fburn It pas de produit préciité, si l'action du glu'a- raldéhyde est intibie par une dilution rapide après la période de contact. Dans la description qui suit, on a rassemblé dans les Tableaux 3 à 7 ci-après, les résultats obtenus dans des essais pharmacologiques permettant de mesurer de façon comparée la toxicité et l'activité antitumorale de la dauno- rubicine libre, de la daunorubicine polymère (produit de l'invention obtenu par traitement direct de la daunorubicine au glutaraldéhyde) et de la daunorubicine greffée sous forme polymère (produit de l'invention obtenu par fixation préala- ble de la daunorubicine sur les cellules L 1210 et polyméri- sation) Les conditions des essais sont indiquées dans les Tableaux, avec les résultats et les observations. Les produits essayés sont injectés par voie i.p à des souris Pour les essais rapportés dans le Tableau 4, on a préparé la daunorubicine polymère conformément à l'Exem- ple 1 à partir d'une quantité de lmg/ml de daunorubicine et d'une concentration en glutaraldéhyde de 0,27 % en poids. Les conditions de traitement étaient les suivantes: daunorubicine libre: i injection de lmg/kg aux jours 3 1 2 3 4, une fois par jour daunorubicine polymère: 1 injection de lmg/kg aux jours 3 1 2 3 4, une fois par jour daunorubicine polymère: 1 injection de 4 mg/kg à 3 1. Au jour 3 O les souris étaient inoculées par 105 de cellules leucémiques L 1210. Il en est de même pour le Tableau 5 o les traitements ont eu lieu comme suit: daunorubicine libre: 1 mg/kg 3 1 2 3 4. daunorubicine polymère:1 mg/kg 3 1 4 7. 0,25 mg/kg 3 1 3 5 7 9. 0,25 mg/kg 3 1 2 3 4. Dans le tableau 6, après injection à 3 0 de 105 cellules leucémiques, on a comparé les résultats obtenus par les traitements suivants: daunorubicine libre 1 mg/kg 3 1 2 3 4. daunorubicine polymère 0,5 mg/kg 3 1 2 3 4. daunorubicine polymère 4 mg/kg 3 1. daunorubicine polymère greffée 0,5 mg/kg 3 1 2 3 4. Dans le Tableau 7 on a comparé les résultats des traitements par chimiothérapie dans les cas suivants: Témoins épreuve injection de 105 cellules leucémiques à 3 O Témoins daunorubicine libre lmg/kg 3 1 2 3 4. daunorubicine libre 4 mg/kg J 1 daunorubicine polymère 4 mg/kg 3 1 Les résultats des Tableaux 3 à 7 montrent que, d'une manière générale, les agents antitumoraux selon l'invention consistant en daunorubicine polymère, greffée ou non, sont plus toxiques que la daunorubicine libre Mals dans le traitement chimiothérapeutique, on obtient des résultats équivalents à ceux de la daunorubicine libre en utilisant une quantité quatre fois moindre de daunorubicine polymère, greffée ou non ou en injectant en une seule fois une quantité égale à la daunorubicine libre injectée successivement ( 4 mg/kg au jour 1, au lieu de 1 mg/kg aux jours 1 2 3 4). 13 2522269 Le traitement à la daunorubicine polymère conduit à un nombre de souris survivantes au moins égal à celui obtenu avec de la daunorubicine libre L'efficacité d'emploi de la daunorubicine est donc nettement améliorée par l'invention. Il va sans dire que l'invention n'est pas limitée aux exemples qui précèdent, lesquels sont relatifs à la daunorubicine (chlorhydrate) L'invention est en effet applicable d'une manière générale à tous les agents anti- tumoraux porteurs de groupes capables de réagir avec les agents de pontage bifonctionnels et spécialement avec le glutaraldéhyde De même le greffage de produit polymère n'est pas limité aux lymphocytes, normaux ou leucémiques. On peut en effet utiliser diverses préparations cellulaires conformément à l'enseignement de la demande de brevet français 80 06537 précitée. TABLEAU i Temps de concen Quantit __ da-undrubicine libérée contact tration pôlyrn&' 2 h -+ 2 h + 2 h + 2 h + 2 h + i nuit avec glu glutara risée à tempe-à 4 C taraldéhyd E Idéhyde rature 370 C 370 C 37 *C 370 C+ O ___ __ __ Z __ __ am bianté _ _ __ _ _ 0,027 68,75 10,9 6,5 4,9 3,8 3 8,1 0,7 97,4 7,2 7,3 8,6 4,9 4,1 11,3 inn 2 7 57,4 6,5 7,8 52,2 3,9 6,9 mn 0,027 9,4 I ,1 4,2 I 3,75 i ,25 0,27 97, i 4,61 1514,6 j 4,6 j 8, 2,7 73,5 ,6 4,5 4,6 ,6 3.9 ,6 1 V_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ TABLEAU 2 concentra concen concen emps de temps Aspect des cellules Z daunoru- tion glu tration tration ontact de bicine fi- taraldéhyde cellu daunoru-)réala contact au xée sur lei les bicine)le avec total microscope cellules et _____ellules Polymérisg E 0,27 Z 2 x O 7/MI l Mg/mlO 15 mn cellules incolores présence de dauno- rubicine polymérisée o 15 mn cellules oranges + ________ pas de polymère ___ 0,07 Z XIO 7 M 1 g/1 5 UM 15 mn cellules oranges ++ 0,02 % 2 x O /m lmgml ______ _____pas de polymère _____ Imnm 15 =i cellules oranges+++ ________ pas de polymère _ _ _ _ _ 0,5 mg/ml O I 5 mn 0,027 % 2 x 1107/ml 0,250 mgj 15 in quelques cellules ml colorées 0,125 mgj O 1 S Dmnclre _ __ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _m l _ _ _ _ O 15 mn 0,0027 % 2 x 10 /ml lmg/Ml 5 m 1 K 1 Smn cellules non _________ _______ 15 mn 15 Dmcolories 0,027 % 2 x 107/ml lmg/ml Smn I 5 mn -59,4 0,054 Z 2 x 10 7/m 11 l/ml5 mn 15 Dm 81, 8 0,108 Z j 2 x 10 /ml Img/ml5 mn 15 mn 84,8 0,108 % 2 x 107/ml Img/ml 5 mn 15 mn o 15 mn quelques cellules 7 colorées 0,027 % 8 xlb /ml Img/ml 5 mn 15 mu quelques cellules colorées lomn 1 Smn quelques cellules 3, ____ ___ _ _ ___ ___ ___ ___ ___ ___ __ __ co lor ies_ _ _ _ _ _ 0,054 % 8 X 107 /ml i mg /ml o mn l Omn Dm l 5 mn quelques cellules colories cellules bien colorées cellules faible- ment colorées 68,8 47,5 mn TABLEAU 2 (suite) concen-' tration cellu- l es zoncen- tration Jaunoru- bicine 8 X 107/m 11 Img/ml temnps de contact préala- ble avec r-el lul es o t ezp s d e contact total I Smn As 5 pect des cellules au -microscope quelques cellules colorées *Z daunoru- bicine fi- xtée sur e. cellules el polyméri sé mn f 5 mnjcellules bien I 87 I 1 colorées l Omn I Smn cellules bien colorées ,3 0,108 Z 8 x 10 /ml lmg/ml 5 mn I 5 mnw 84,8 0,216 % 8 x 107/ml lmÉ/ml 5 mn 15 mn 80,5 432 8 x I O /ml Img/ml5 mn 15 mn 86,5 0, 108 Z18 x 10 /ml l mg/ml 5 mn 151 mn164,4 concentra- tion glu- taraldéfydi 0, 108 Z TABLEAU 3 - Toxicité de la Daunorubicine libre Daunoru'icine polymflre Daunorubieine greffée i ** temps moyen de aurvie "I* M mort îo I ymre Injections et observations J 2 2 ème m In. RAS J 3 3 ème inj. RAS J.4 4 ême inj RAS J 5 J 6 J 7 Observations J.8 J 101 i 121 J 131 J 3 te tèeij3 mN 4 m N M M M 4 +t; 7 2 èe RASI-maigre -magrea*a i 1 II I 2diarrhéi 2-diarrhée III _____ __ _ _____ ____ ente RAS Ij reste RAS NTS * toutes aurv ivan- 2 ème inj. (malades + diarrh Ne-. 2 ème inj. RAS 3 ème inj, plus de diarrhée maigres 3 ème inj, I -diarrhé reste RAS f inie maigres 4 ème înj RAS 2 H 3 H m 6,3 Toutes survivan- ted RAS (maigres malades 2 M 8 H 6,8 2 èediarrhée) maigres ____________ diarrhée II ère inj. 2 ème inj. (malades diarrhée++) 2 ème inj. RAS 2 ème inj. RAS 2 ème inj (malades dia rrhéel') pas de 3 èrie min. diarrhée+± très màlade 3 ène inj. RAS 3 ème inj. 2-maigres diarrhée ( 9 souris> 3 èeinj 4 ème min. 1-m algre __diarrhée 4 èe minj lm malades maigres pas 3 è inj J 3 ème inj, diarrhéef*++ maigres très malad Ja diarrhée lm 8 H lm lm 3 H _ 4 HT 4H 1 4,8 9 survi- vantes 6,75 Il survi- vante) ,55 (J survi- tvante)> I.-J Lfl r>Q quantites iflject 6 ea (mg/kg) J I I ère inj le 1 ère min. 0.0 Io " 0. 04 J rs :1 O r.4 oo c 9 C lm TABLEAU 4 _ Préparations souris survivantes ars l' épreuve MS IS 8 j 3 TJTTTZ 15 17 19 120 21 24 126 r > 6-0 MIL Témoins Io/' IO/ IO/ 7/ 6/ 3/ 1/ O/ 12,8 10 10 10 10 10 10 10 Daunorubicine 6 19 libre 10/8/ 8/ 6/ 6/ 6/ I/ gue ( 4 sou 40,6 Img/kg 10 10 10 10 10 10 10 ries ris> J 1 2 3 4. Daunorubicine 9/ 7/ 6/ 4/ 4/ 4/ 41 3/ 3/ 2/ 2/ 2/ 2/ I/ 1 12,8 O polymère 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 gué ( 9 sou- lmg/kg rie ris) J 1 2 3 4. Daunorubicine 6 21 polymère O/ 8/ 8/ 8/ 7/ 6/ 6/ gué ( 4 sou 64 4 mg/kg 10 10 10 10 10 10 10 ries ris) J.1 I '% d'augmentation de survie TABLEAU 5 Souris survivantes après l 'épreuve _ _ _ _ _ _-_ _ _ MTSILS Jours 5 10 il 14 15 16 17 18 19 23 27 32 56 Témoins 8/10 7/10 1/10 1/10 0/10 9,1 - Daunorubicine 30 % libre lmg/kg 10/10 10/10 1 Q'10 9/10 8/10 6/10 4/10 3/10 3/10 3/10 3/10 /10 ué 15,4 69,2 J 1 2 3 4 ries )aunorubicine 10 % polymère 9/10 9/10 9/10 9/10 6/10 6/10 4/10 '3110 2/10 2/10 2/10 1/10 gé lmglkg ries 12,9 41,7 J.1 4 7. Daunorubi cine polymère 20 %_ 15,5 70,3 0,25 mg/kg 10/10 10/10 Q'10 1 Q'10 6/10 5/10 4/10 4/10 3/10 2/10 2/10 2/10 gueé 1.2 3 4 ries ) aunorubicine o 1 ymère ),25 mg/kg 10/10 10/10 1 Q'10 1 O'I O9/10 6/10 4/10 1/10 1/10 1/10 0/10 16,8 84,6 1.1 3 5 7 9. -.W % O r 1 jf NO TABLEAU 6 Témoins épreuve Témoins daunoru- Il bre k biciie l' m/k J 1 2 3 4. Daunorubicine polymère 0,5 mg/kg J.I 1 2 3 4. j.4 /10 9/10 /10 9/10 8/10 9/10 I 11 6/10 4 J 9/1019/ /10 11 o/10 110/1019/1019/ Survivantes après l'épreuve 2 13 14 15 16 17 18 19 21 22 23 O/Io 9/10 9/10 7/10 3/10 3/10 3/10 3/10 2/10 2/10 2/10 9/10 7/10 7/10 5/10 -5/10 4/10 3/10 3/10 2/10 1/10 r 24 125 k 4 16611 2/1 O 1/to 2/10 1/Ic ,8 2/11 2/l O O 13,2 1/loi MI/o 16 Daunorubicine 4 polymère 4 mg/kg 10/10 10/10 10/10 10/109 g/10 9/10 8/10 8/10 6/10 4/10 3/10 3/10 3/10 3/10 3/10 3/I O 3/10 2/IC 2/IC 18,2 c 69 J I Daunorubicine 2 greffée 0,5 mg/kg Io/Io 9/10 9/10 9/10 8/10 7/10 7/10 6/10 4/10 4/10 4/10 4/10 2/10 2/10 I/I 01 17,96, J 1 2 3 4. o O b O 22,2 48,1 l ut 1 r% w ' TABLEAU 7 Il 11213 141 116 117 118 19 20 21 122 1231 ILS il 1 13 14 15 T t 2,TSI Iz _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _1 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Témoins épreuve Daunorubi- cine libre I mg/kg J 1 2 3 4. / 10 11/10 0/ 10 /10 9/10 9/1018/1017/1015/1015/10 /1013/1011 I /10 O/ 10 P 5 18,2173, cine polymère 10/10 9/10 8/10 8/10 6/10 5/ 10 4/10 3/10 3/10 2/101/0 20,6 96,2 4 mg/kg Daunorubi- cine libre 4 mg/kg j 1 10/10 8/10 4/10 2/10 0/10 16,4 V 58,2 r'.> Lni 0 % No REVENDICATIONS 1 Agents antitumoraux à efficacité améliorée, carac- térisés en ce qu'ils se présentent sous une forme autopoly- mérisée après mise en contact d'une quantité efficace d'un agent de pontage bifonctionnel et d'au moins un agent anti- tumoral porteur de groupes capables de réagir avec l'agent de pontage considéré, ladite quantité étant capable de fournir un produit insoluble en milieu aqueux, lequel produit, après élimination de l'agent de pontage éventuel en excès, permet, mis en suspension dans un milieu aqueux, de libérer progressivement l'agent actif sous une forme soluble en conservant son activité antitumorale. 2 Agents antitumoraux selon la revendication 1, carac- térisé en ce que l'agent de pontage bifonctionnel est le glutaraldéhyde, le N-succinimidyl 3-( 2-pyridyldithio) propionate (SPDP) ou le succinimi dyl 4-(p-maléimidophényl) butyrate (SMPB). 3 Agents antitumoraux selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils se présentent sous une forme autopolymérisée apres mise en contact d'au moins un agent antitumoral, porteur de groupes capables de réagir avec un aldéhyde, avec une quantité efficace de glutaral- déhyde, ladite quantité étant capable de fournir un produit insoluble en milieu aqueux, lequel produit, après élimination du glutaraldéhyde éventuel en excès, permet, mis en suspension dans un milieu aqueux, de libérer progressivement l'agent actif sous une forme soluble en conservant son activité antitumorale. 4 Agents antitumoraux selon la revendication 1 caracté- risés en ce que l'agent antitumoral à traiter comporte des groupements NH 2, des groupes epsilon-aminés des résidus lysine, des groupes sulfhydryles des résidus cystéine, et autres groupes réactifs semblables. Agents antitumoraux selon la revendication 3, caractérisés en ce qu'ils sont formés à partir d'agents comportant des atomes d'hydrogène réactifs ou des groupes NH 2. 23 2522269 6 Agents antitumoraux selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisés en ce qu'ils sont formés à partir de la daunorubicine (ou daunomycine) ou de la doxorubicine (ou adriamycine). 7 Procédé pour l'obtention des agents antitumoraux selon l'une quelconque des revendications 1 à 6,caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact l'agent antitumoral à traiter avec une quantité efficace d'un agent de pontage bifonctionnel, capable de réagir avec l'agent antitumoral, et à récupérer un produit sous une forme autopolymérisée insoluble en milieu aqueux, ladite quantité d'agent de pontage étant capable de fournir un produit insoluble en milieu aqueux, lequel produit, après élimination de l'agent de pontage éventuel en excès, permet, mis en suspension dans un milieu aqueux,de libérer progressivement l'agent actif sous une forme soluble en conservant son activité antitumorale. 8 Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact l'agent antitumoral à traiter avec une quantité efficace de glutaraldéhyde et à récupérer un produit sous forme autopolymérisée insoluble en milieu aqueux, ledit agent à traiter étant porteur de groupes capables de réagir avec un aldéhyde et ladite quantité de glutaraldéhyde étant capable de fournir un produit insoluble en milieu aqueux, lequel produit, après élimination du glutaraldéhyde éventuel en excès permet, mis en suspension dans un milieu aqueux, de libérer progressivement l'agent actif sous une forme soluble en conservant son activité antitumorale. 9 Procédé pour améliorer l'efficacité d'emploi d'agents antitumoraux, ledit procédé consistant à mettre en contact l'agent à traiter avec une quantité efficace d'un agent de pontage bifonctionnel capable de réagir avec l'agent antitu- moral et à récupérer un produit sous une forme autopolymérisée insoluble en milieu aqueux, ladite quantité d'agent de pontage étant capable de fournir un produit insoluble en milieu aqueux, lequel produit, après élimination de l'agent de 24 2522269 pontage éventuel en excès permet, mis en suspension dans un milieu aqueux, de libérer progressivement l'agent actif sous une forme soluble en conservant son activité antitumorale. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on traite un agent antitumoral porteur de groupes capables de réagir avec les aldéhydes, en ce qu'on met en contact l'agent à traiter avec une quantité efficace de glutaraldéhyde et en ce qu'on récupère un produit sous forme autopolymérisée insoluble en milieu aqueux, ladite quantité de glutaraldéhyde étant capable de fournir un produit insoluble en milieu aqueux, lequel produit, après élimination du glutaraldéhyde éventuel en excès, permet, mis en suspension dans un milieu aqueux, de libérer progres- sivement l'agent actif sous une forme soluble en conservant son activité antitumorale. 11 Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce qu'on choisit les conditions de réaction entre l'agent antitumoral et l'agent de pontage bifonctionnel, tel que le glutaraldéhyde, et spécialement la quantité d'agent de pontage, en utilisant une quantité minimale d'agent de pontage, supérieure à celle qui laisse dans le milieu réactionnel des quantités résiduelles non réagies d'agent tumoral, sans dépasser les quantités excessi- ves d'agent de pontage susceptibles de conduire à un produit soluble en milieu aqueux par saturation des groupements réactifs de l'agent antitumoral. 12 Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, caractérisé en ce que la formation de la forme polymère de l'agent antitumoral s'effectue directement en mettant en présence, en particulier à température ambiante, l'agent antitumoral à traiter et la quantité convenable d'agent de pontage bifonctionnel, tel que le glutaraldéhyde, et en poursuivant la réaction Jusqu'à la formation d'un produit insoluble. 13 Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, caractérisé en ce qu'on fixe au préalable l'agent de pontage bifonctionnel tel que le glutaraldéhyde sur un support, tel que des cellules et plus particulièrement des lymphocytes et en ce qu'on fait ensuite réagir l'ensemble sur l'agent antitumoral. 14 Application à titre de médicaments des agents antitumoraux selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ou des produits obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 13, la libération progressive de l'agent antitumoral actif à partir de la forme polymérisée de celui-ci procurant un effet-retard et permettant d'obtenir des résultats équivalents à ceux réalisés par administration de l'agent antitumoral libre, à l'aide d'une quantité moindre de la forme polymérisée dudit agent.