FR 2513994 A1 19830408 FR 8216438 A 19820930 La présente invention est relative à de nouveaux tripeptides présentant une activité anorexigène, à un procédé pour les préparer et à des compositions pharmaceutiques les contenant Plus particulièrement, l'invention est relative à de nouveaux tripeptides qui répondent à la formule (I) ci- après: X-Y-Pro-OH ( 1) dans laquelle: X représente Glp, Kic, Tca; Y représente Gly, Ala, Val, Ile, Pro, Abu, Nva, Nle, Ada, Cha Phe, Trp, Tyr, Ser, Thr, Met, Gln, Lys, Arg, Leu, et à leurs sels d'addition d'acides et leurs complexes. Selon un autre aspect de la présente invention, celle- ci a pour objet un procédé de préparation des tripeptides de formule (I), ainsi que de leurs sels d'addition d'acides et de leurs complexes. L'invention se rapporte également à de nouvelles compositions pharmaceutiques présentant une activité anore- xigène, qui comprennent des composés de formule (I) et des sels ou des complexes de ceux-ci, acceptables du point de vue pharmaceutique, en tant que constituant actif. Reichelt et coll T Neuroscience 3, 1207 ( 1978)J ont isolé un tripeptide Glp-His-Gly-OH à partir de l'urine de malades souffrant d'anorexie nerveuse Le tripeptide a mani- festé une activité anorexigène dans des tests effectués sur des animaux Ce résultat expérimental a constitué une impor- tante contribution à l'hypothèse formulées antérieurement selon laquelle certains peptides peuvent jouer un-rôle essentiel dans le mécanisme inconnu jusqu'à présent du développement de la sensation de faim et de satiété, respectivement En tenant compte des analogies de structure existant entre le tripeptide ci-dessus et la TRH (hormone libérant la thyrosti- muline) (Glp-His-Pro-NH 2), on peut supposer que ces deux peptides sont formés à partir de la même molécule précurseur. La Demanderesse a constaté qu'une condition préalable nécessaire à l'activité anorexigène est la présence d'un groupe carboxyle libre sur la fraction de molécule portée par le C-terminal, car les composés contenant un groupe carboxamido sur le C-terminal ne manifestent aucune activité anorexigène. La Demanderesse a, en outre, constaté que la présence d'histi- dine au centre de la molécule n'est pas essentielle Les composés dans lesquels l'acide aminé central porte une chaîne latérale aliphatique et l'acide aminé du C-terminal est une proline contenant un groupe carboxyle libre, s'avèrent être les plus efficaces. Les composés de formule (I) ci-après: X-Y-Pro-OH (I) dans laquelle X et Y sont tels que définis plus haut, peuvent être préparés par n'importe quelle méthode habituellement mise en oeuvre dans la chimie des peptides Il est préférable que les aminoacides X et Y ou leurs dérivés protégés, soient couplés à la proline ou à l'un de ses dérivés dont le groupe carboxyleest protégé, en mettant en oeuvre une technique clas- sique dans la chimie des peptides, les groupes protecteurs étant éliminés de façon connue des tripeptides si ceux-ci sont obtenus sous une forme protégée. Conformément à un mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à la présente invention, l'ester méthylique de la proline est acylé par un amino acide tert-butyloxy- carbonyl-Y-OH protégé, l'ester méthylique du dipeptide résul- tant est saponifié à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium dans du dioxane et le groupe tert-butyloxycarbonyle protecteur est ensuite éliminé par traitement par un mélange d'acide chlorhydrique/acétate d'éthyle Le sel du dipeptide Y-Pro-OH,H Cl est alors acylé à l'aide du pentafluorophényl- ester de l'acide benzyloxycarbonyl-pyroglutamique et le groupe benzyloxy est éliminé du tripeptide protégé par hydrogénolyse catalytique. Les composés de formule (I) peuvent être purifiés par des techniques de purification classiques, de préférence, par chromatographie sur colonne ou par précipitation à partir d'un solvant convenable Les composés sont obtenus sous forme de poudres lyophilisées ou de poudres solides qui peuvent être formulées pour obtenir diverses préparations pharmaceutiques. L'activité anorexigène des composés de formule (I) a été évaluée chez des rats La consommation de nourriture d'animaux d'essai à jeun depuis 96 heures, a été mesurée une et cinq heures après l'administration intracérébroventricu- laire (icv) d'une solution saline physiologique (témoin) et des substances d'essai, respectivement Les données correspon- dantes pour certains composés conformes à la présente invention pour la TRH et pour le tripeptide de formule Glp-His-Gly-OH sont rassemblées dans le tableau 1 qui va suivre. Tableau 1 Temps de l'adminis Consommation de Dose tration de nourri Mode d'ad nourriture (g) en 24 ture après ministra heures chez des rats (g) injection tion à jeun depuis 96 (heures) heures + Témoin 5 icv 22,16 0,88 Glp-His-Pro-NH 2 300 1 icv 19,81 -1,52 300 5 icv 17,88 + 2,94 Glp-His-GlyOH 300 1 icv 19,33 1,08 300 5 icv 18,38 + 1,80 Glp-Leu-Pro-OH 300 1 icv 6, 10 1,99 icv 9,23 0,92 Glp-Abu-Pro-OH 300 5 icv 8,31 1,50 Ces données indiquent clairement que ni la TRH, ni le Glp-His-Gly-OH ne réduisent notablement la consom- mation de nourriture des animaux d'essai dans les conditions de test indiquées, à la différence des représentants testés des composés de formule (I) qui ont entrains une diminution notable de la prise de nourriture. Les peptides conformes à la présente invention, leurs sels et leurs complexes sont utilisés en thérapeutique sous forme de compositions pharmaceutiques Celles-ci renfer- ment les composés conformes à la présente invention en association avec des supports ou des excipients organiques ou minéraux classiques acceptables du point de vue pharmaceutique et convenant à l'administration par voie entérique ou-paren- térale On peut aussi préparer des lyophilisats solides, dans lesquels on utilise en général comme supports, des matières inertes vis-à-vis des peptides, par exemple, des hydrates de carbone D'autres compositions pharmaceutiques comprennent des émulsions et des suspensions concentrées ou diluées, qui contiennent en outre divers additifs stabilisants et conser- vateurs. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se refère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples de mise en oeuvre sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne cons- tituent en aucune manière une limitation. La présente invention est illustrée par deux exemples généraux Les composés préparés par l'une des méthodes décrites, ainsi que leurs constantes physiques, sont rassem- blés dans le tableau 2. Les abréviations utilisées dans les exemples et dans la description, sont les désignations acceptées à l'échelle internationale EJ Biol Chem 247, 977 ( 1972)l On trouvera ciaprès la définition d'autres abréviations: Abu = acide L-2-aminobutyrique; Ada = acide L-2-aminodécanoique; Cha = L-cyclohexylalanine; Kic = acide L-2-céto-imidazolidine-4-carboxylique; Tca = acide L-thiazolidine-4-carboxylique. L'évaporation a été réaliséedans tous les cas dans un équipement B Uchi Rotavapor "R" Les points de fusion ont été déterminés dans un appareil mis au point par le Dr Tottoli (Euchi) Les chromatogrammes en couche mince ont été préparés sur des phases de gel de silice de "Kieselgel G" (Merck) selon la méthode de Stahl Pour préparer les chroma- togrammes, les mélanges solvants suivants ont été utilisés: ( 1) mélange 3:2 d'acétate d'éthyle et de PAW; ( 2) mélange 1:1 d'acétate d'éthyle et de PAW; ( 3) mélange 3:1:1 de n-butanol, acide acétique et eau. Le terme "PAW" se réfère à un mélange 20:6:11 de pyridine, acide acétique et eau. Les chromatogrammes en couche mince ont été développés, après chloruration, par une pulvérisation de toluidine /iodure de potassium ou par de la ninhydrine. Certains composés ont été purifiés sur une colonne garnie de gel de silice "Kieselgel G", dont la dimension particulaire est comprise entre 0,062 et 0,2 mm. Exemple 1 L-Pyroglutamyl-L-leucyl-L-proline (méthode "A") Etape 1: L-Leucyl-Lproline, HC 1 On dissout 5,5 g ( 33 mmoles) de Pro-O Me,HCL dans ml de dichlorométhane; on refroidit la solution à O C et on y ajoute 4,52 ml ( 33 mmoles) de triéthylamine, puis 6,93 g ( 30 mmoles de Boc-Leu-OH, sous agitation Dès que les réactifs sont dissous, on ajoute une solution de 6, 18 g ( 30 mmoles) de dicyclohexyl-carbodiimide dans 40 ml de dichloro- méthane, après quoi on agite le mélange réactionnel à O C pendant 2 heures, puis on sépare le dicyclohexyl-carbodiimide par filtration Le f i 1 t r at est secoué avec trois portions de 30 ml d'une solution normale d'acide chlorhydrique, trois portions de 30 ml d'une solution normale de carbonate acide de sodium et 30 ml d'eau La solution dichlorométhanique est séchée à l'aide de sulfate de sodium anhydre et évaporée. On obtient 9,7 g de Boc-Leu-Pro-O Me sous la forme d'un produit huileux Celui-ci est dissous dans 43 ml de dioxane et on ajoute 43 ml d'une solution normale d'hydroxyde de sodium, sous agitation Le mélange réactionnel est agité à la tempé- rature ambiante pendant une heure et neutralisé par une - solution normale d'acide chlorhydrique Le dioxane est chassé par distillation et le p H de la solution aqueuse obtenue est ajusté à 2 par addition de 60 ml de chloroforme et d'acide sulfurique concentré Après séparation, la solution aqueuse est secouée avec deux autres portions de 30 ml de chloroforme Les solutions chloroformiques réunies sont secouées avec de l'eau et séchées sur du sulfate de sodium anhydre Le solvant est éliminé, le résidu ( 9 g) de Boc-Leu- Pro-OH est dissous dans 25 ml d'acétate d'éthyle et 25 ml d'une solution 5 N d'acide chlorhydrique dans de l'acétate d'éthyle sont ajoutés à la solution On laisse reposer le mélange réactionnel à la température ambiante pendant une heure, on le dilue avec de l'éther et la substance précipitée est séparée par filtration, lavée avec de l'éther et séchée. On obtient 6,48 g ( 81,5 % par rapport au Boc-Leu-OH) de H-Leu-Pro-OH,HC1 Le produit est une substance hygroscopique, blanche uniforme du point de vue chromatographique. R 2 0,20 R = 0,20; 41. f Etape 2: Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L- leucyl-L-proline. On dissout 2,09 g ( 7,87 mmoles) de H-Leu-Pro-OH, H Cl, 2,2 ml de triéthylamine et 3,38 g ( 7,87 mmoles) de pentafluorophénylester de l'acide benzyloxycarbonyl-L- pyroglutamique dans 50 ml de chloroforme Après 10 minutes de repos, on ajoute 1,1 ml ( 7,87 mmoles) de triéthylamine et on laisse reposer la solution pendant une nuit à la température ambiante On secoue ensuite le mélange réactionnel avec trois portions de 10 ml d'une solution normale d'acide chlor- hydrique et deux portions de 10 ml d'eau, on le sèche à l'aide de sulfate de sodium anhydre et on l'évapore La cristallisa- tion du résidu d'évaporation huileux dans de l'éther fournit 3,15 g d'un produit brut, qui est ensuite recristallisé dans ml d'acétate d'éthyle On obtient 2,7 g ( 73,5 %) de Z-Glp-Leu-Pro-OH chromatographiquement uniforme et fondant à 98-100 C. Etape 3. On dissout 4,13 g ( 8,7 mmoles) de Z-Glp-Leu-Pro- DH dans 80 ml d'éthanol; on y ajoute 0,8 g de catalyseur constitué par 10 % de carbone palladié à 10 % de palladium et l'on fait barboter de l'hydrogène gazeux dans la solution pendant une heure Le catalyseur est séparé par filtration, le filtrat est évaporé et le résidu amorphe est trituré avec de l'éther et séparé par filtration On obtient 2,8 g d'un produit brut que l'on dissout ensuite dans 20 ml d'eau, que l'on décolore avec du charbon, puis l'on lyophilise la solution On obtient 2,6 g ( 91 %) de Glp-Leu-Pro-OH amorphe chromatographiquement uniforme Rf = 0,33. Exemple 2 L-Pyroglutamyl-glycyl-L-proline (méthode "B"). Etape 1: Glycyl-L-proline. On dissout 5,33 g ( 22 mmoles) de H-Pro-O Bzl-H Cl et 4,2 g ( 20 mmoles) de Z-Gly-OH dans 50 ml de dichlorométhane, on ajoute à cette solution 3, 08 ml de triéthylamine et on la refroidit à O C On y ajoute alors une solution de 4,12 g ( 20 mmoles) de dicyclohexyl-carbodiimide dans 30 ml de dichloro- mnéthane Le mélange réactionnel est ensuite agité pendant une heure à O C et maintenu dans un réfrigérateur pendant une nuit Le dicyclohexylcarbodiimide est séparé par filtration et le filtrat est extrait par deux portions de 30 ml d'une solution normale d'acide chlorhydrique, deux portions de 30 ml d'une solution normale de carbonate acide de sodium et 30 ml d'eau La solution dichlorométhanique est séchée à l'aide de sulfate de sodium anhydre et évaporée On obtient 8,5 g de Z-Gly-Pro-O Bzl sous la forme d'une substance huileuse qui est dissoute dans 170 ml d'éthanol; on ajoute 1,5 g de catalyseur constitué par du carbone palladié à 10 % de palladium et on fait barboter de l'hydrogène à travers la solution Lorsque la réaction est achevée, le mélange réactionnel est dilué par ml d'eau, le catalyseur est séparé par filtration, lavé à l'eau et le filtrat est évaporé On recueille 2,12 g ( 62 % par rapport au Z-Gly-OH) de H-Gly-Pro-OH sous la forme d'un 3 01 produit chromatographiquement uniforme Rf = 0,19. Etape 2 Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-glycyl-L-proline. On met 2,15 g ( 5 mmoles) de Z-Glp-O Pfp et 0,86 g ( 5 mmoles) de H-Gly-Pro-OH en suspension dans 20 ml de diméthylformamide On ajoute 0,7 ml de triéthylamine à cette suspension Au bout d'une heure, le mélange réactionnel est évaporé, le résidu est dissous dans 30 ml de chloroforme et la solution est secouée avec deux portions de 7 ml d'une solution normale d'acide chlorhydrique, deux portions de 7 ml d'une solution normale de carbonate acide de sodium, et de l'eau. Apres séchage, la solution est évaporée Le résidu huileux est cristallisé dans de l'éther, séparé par filtration et le produit brut, qui pèse 1,4 g, est recristallisé dans un mélange d'éthanol et d'acétate d'éthyle On obtient 1,23 g ( 53 %) de Z-Glp-Gly-Pro-OH sous la forme d'un produit chroma- tographiquement uniforme. Etape 3 On dissout 0,35 g ( 0,84 mmoles) de Z-Glp-Gly-Pro-OH dans 30 ml d'éthanol; on ajoute 0,05 g de catalyseur constitué par du carbone palladié à 10 % de palladium et l'on fait barboter de l'hydrogène à travers la solution Le catalyseur est séparé par filtration, le filtrat est évaporé et le résidu est trituré avec de l'éther et filtré On obtient 0,22 g du produit recherché Ce produit est traite par de l'acétate d'éthyle et filtré pour fournir 0,17 g ( 71,5 %) d'une subs- tance amorphe, chromatographiquement unifcrme Rf = 0,06 3 f Rf = 0,25. Rf= Les nouveaux composés préparés selon l'une quel- conque des méthodes ci-dessus, sont indiqués dans le Tableau 2 qui va suivre Tableau 2 Tripeptides Méthodes Point de fusion R R Rf _______ __ 1_ c _ _ Glp-Ala-Pro-OH Glp-Val-Pro-OH Glp-Ile-Pro-OH Glp-Pro-Pro-OH GlpAbu-Pro-OH Glp-Nva-Pro-OH Glp-Nle-Pro-OH Glp-Ada-Pro-OH Glp-Cha-Pro-OH Glp-Phe-Pro OH Glp-Trp-Pro-OH Glp-Tyr-Pro-OH(a) Glp-Ser-Pro-OH(b) Glp-ThrPro-OH(c) Glp-Met-Pro-OH (d) Glp-Gln-Pro-OH (e) Glp-Lys-Pro-OH(f) Glp-ArgPro-OH (g) Glp-Gly-Pro-OH Kic-Leu-Pro-OH Tca-Leu-Pro-OH h) A A A A A A A A A A A A A A A A A A B A A (a): en utilisant Tyr (b): " Ser 234-236 amorphe amorphe 188-191 248-250 183-186 amorphe amorphe amorphe amorphe 204-206 132-134 144-146 179-181 amorphe amorphe -167 297-298 amorphe amorphe 157-160 t) (But) (Bzl) (décomp. (décomp. (décomp (décomp) (décomp) (décomp. (décomp. (décomp. (décomp) 0,20 0,26 0,11 0,19 0,26 0,35 0,30 0,22 0,27 0, 22 0,22 0,48 0,12 0,07 0,07 0,12 0,07 0,06 0,37 0,31 0,25 0,25 0,31 0,23 0,16 0,17 0,25 (c) en utilisant Thr (Bzl) (d): Le groupe protecteur Z a été éliminé à l'aide de TFA. (e) Sous forme de tripeptide protégé, purifié par chroma- tographie sur colonne (f) en utilisant Lyz (Z) (g) en utilisant Arg (No 2) (h) en utilisant Boc-Tca Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. REVENDICATIONS - 1 Tripeptides caractérisés-en ce qu'ils répon- dent à la formule (I) ci-après: X-Y-Pro-OH (I) dans laquelle: X représente Glp, Kic, Tca; Y représente Gly, Ala, Val, Ile, Pro, Abu, Nva, Nle, Ada, Cha, Phe, Trp, Tyr, Ser, Thr, Met, Gln, Lys, Arg, Leu, ainsi que leurs sels d'addition d'acides et leurs complexes. 2 Procédé de préparation de tripeptides de formule (I) selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on couple avec la proline ou l'un de ses dérivés dont le groupe carboxyle est protégé, les aminoacides X et Y ou leurs dérivés protégés, par une méthode classique dans la chimie des peptides, puis en ce que l'on élimine les groupes protecteurs d'une manière connue des tripeptides obtenus sous une forme protégée. 3 Procédé selon la revendication 2, caracté- risé en ce que l'on acyle l'ester méthylique de la proline par l'aminoacide-tert -butyloxycarbonyl-Y-OH protége, en ce que l'on saponifie l'ester méthylique du dipeptide obtenu, de préférence par une solution d'hydroxyde de sodium, dans le dioxane, en ce que l'on élimine le groupe tert -butyloxy- carbonyle protecteur, de préférence par traitement par de l'acétate d'éthyle et en ce qu'on acyle le dipeptide obtenu ou l'un de ses sels d'addition d'acidespar le pentafluoro- phénylester de l'acide benzyloxycarbonyl-pyroglutamique et on élimine le groupe protecteur du tripeptide protégé obtenu, de préférence par hydrogénation catalytique. 4 Compositions pharmaceutiques présentant une activité anorexigène, caractérisées en ce qu,'elles comprennent en tant que constituant actif, un tripeptide de formule (I), o X et Y sont tels que définis dans la reven- dication 1, ou 11 N de ses sels d'addition d'acides ou de ses complexes, en association avec des supports-et/ou des excipients pharmaceutiques classiques et/ou d'autres additifs classiques.