FR 2517967 A1 19830617 FR 8123067 A 19811210 PROCEDE DE PRODUCTION D'UN VACCIN BIOCHIMIQUE CONTRE LES FIEVRES A SALMONELLES " Invention de Philippe GIRARDON et Jean AMEN 25 1 7967 Au nom de la Sociét e dite: L'AIR LIQUIDE SOCIETE ANONYME POUR L'ETUDE ET L'EXPLOITATION DES PROCEDES EORGES CLUDE. La présenté invention concerne l'obtention d'un vaccin bio- chimique contre les fièvres à Salmonelleso La menace d'épidémie de fièvres à Salmonelles est permanente dans le monde comme en témoigne les relevés épidémiologiques; et la gravité de l'extension des épidémies dues aux diverses Salmonelles ont toutes pour origine, une résistance de plus en plus grande des germes aux antibiotiques. On sait depuis longtemps qu'il n'existe aucun parallélisme entre le taux des anticorps agglutinants anti-O, anti-H ou anti Vi, mis en évidence dans le cas des Salmonelloses et le degré de l'immu- nité acquise vis à vis de ces bactéries Actuellement, le seul cri- tère valable d'efficacité vaccinale demeure la protection de l'indi- vidu ou de l'animal vis à vis de la bactérie infectieuse homologue. Plusieurs types de vaccins ont déjà été proposés, cependant ces vacoins ne sont pas sans présenter divers inconvénients et ris- ques Ainsi les vaccins inactivés injectables (TAB) ne sont pas sans danger pour les sujets qui les reçoivent, et oeoi pour une efficacité relative par rapport à une dose d'épreuve ne dépassant pas 105 bacté- ries pathogènes Par contre, les vaccins buccaux, et plus particuliè- rement ceux qui contiennent des bactéries vivantes, se révèlent nette- ment plus efficaces mais leur utilisation pose encore un certains nombre de problèmes d'ordre pratique inhérents à des difficultés de conservation, et d'ordre psychologique. On a considéré que l'utilisation de fractions purifiées pro- tectrices extraites de bactéries résoudrait de manière satisfaisante ie problème de la vaccination contre les Salmonelles Et en sachant que toutes les bactéries peuvent être regardées comme constituées par des "mosaïques d'antigènes", la membrane externe de la paroi ectoplas- mique apparaissant, chez les Salmonelles (gram négatives) comme le support anatomique de l'antigène vaccinant il a été recherché un moyen d'extraction préférentielle de cet antigène vaccinant. Divers travaux, notamment ceux de O Westphal et al, du Max Planck Institut, publiés notamment dans Zentralbl Bacteriol Mikro- biol Hyg 1 A Bt Orig a med mikrobiol infektionskr Parasitol 248 ( 1), 1980, 64-80, ont montré l'utilisation de guanidine thiocyanate, urée et de tampon vénoral dans l'extraction de molécules à base de protéines, en particulier à partir de bactéries gram négatives telles Salmonella typhimurium et de S minnesota et des formes mutantes 5 R. Dans le cadre d'une technique par fermentation, extraction et purifioationil a t 6 é Ais au point -n pro pa tz'zu-t,t d 3 obtenir un vaccin biochimique actif contre l Os fiv 2 es a _imoneiles e ffe Z- tanrit les êtres humains et animaux, aussi offieace que le vaccin vivant de conserivation aisée et de très longuae dunre et adin rain facile en injection ou par voie buocale. Le procédé de l'invention est caractérisé par une séquence des diverses phases préparatives suivantes. Dans un premier stade on met en oeuvre la fermecntation en milieu liquide convenablement adapté d'une souche avirulente, telle Salmonella typhimurium M 206 Il est avantageux de maintenir la tem- perature du milieu de fermentation dans des conditions strictes de température comprise entre 33 et 35009 la tempêature de 34 ec O étant particulièrement adaptée au développement da Salmonerla typhimurium. La fermentation est conduite en moyenne aérobiose pendant une dée fonction de l'importance de l'inoculum; le p H du milieu étant ajusté un peu au-dessus de la neutralité. On procède ensuite à une centrifugation à faible vitesse, ayant pour objet la séparation du liquide et des bactéries sous forme de culot bactérien, qui est lavé. Puis on extrait les antigènes membranaires par un solvant sé- lectif déterminé et dans des conditions de p H et de durée bien précises. On réalise l'extraotion des antigènes memb-anaires vaccinants par mise en contact du culot bactérien avec un solvant de la classe des tris (hydroxy alcoyl) aminoalcanes inférieurs Le tris Chydroxymé- thyl) aminométhane est particulièrement adapté à l'extraction des anti- gènes membranaires dans le cadre du procédé. Le solvant est utilisé à concentration faible et le milieu d'extraction est tamponné, le p E étant régulé entre 8,4 et 8,6 par ajustage avec un acide fort Ltextraction est effectuée sur le culot bactérien sous agitation permanente, à une température réfrigérée, pour éviter tout développement enzymatique ou microbien, de préférence entre O et + 400 La durée d'extraction des antigènes sous-agitation du culot bactérien au contact du milieu tampon-solvant est au moins de soixante heures, de préférence de l'ordre de 70 heures. On effectue ensuite une décantation par centrifugation très légère, et une purification et fractionnement par ultrafiltration du surnageant sur membranes de seuils de coupure choisis en fonction des poids moléculaires recherchées, entre 10 000 et 300 000 On peut proc 6- der à une dialyse de la fraction de plus faible poids moléculaire afin d'éliminer les sels. Dans une dernière phase on lyophilise, selon les techniques oonnues la fraction antigénique vaccinante. Selon une variante avantageuse on peut conduire l'extraction des antigènes par un solvant en présence d'un tensio-actiftels les tensio- actlfs de la série des polyoxyéthylènes et des polyoxyéthanol, utilisé à raison de quelques pourcents par rapport au milieu extrac- tif, de préférence de l'ordre de 1 % A titre de tensio-actif conve- nant à l'amélioration de l'extraction des antigènes vaccinants on peut citer les polyoxyéthylènesorbates, vendus sous la marque com- merciale "Tween", les polyoxyéthylènelaurylesters, commercialisés sous la marque "Bridj" et le polyéthoxyéthanol connu sous la marque commerciale "Triton". Les vaccins biochimiques lyophilisés obtenus selon l'inven- tion, dont le poids moléculaire de la fraction antigénique vaccinan- te est supérieur à 50 000 sont utilisables dans la vaccination des êtres humains et des animaux, et vaccinent les souris aussi effioace- ment que le vaccin vivant Les vaccins dont le poids moléculaire de la fraction antigénique est compris entre 50 000 et 100 000 sont in- téressantss de même pour les fractions comprises entre 100 000 et 300 000 Ces vaccins peuvent être prescrits par voie injectable ou buccale Du fait de leur production sous forme lyophilisée leur con- servation est aisée et de très longue durée. Il est donné ci-après un exemple qui illustre l'invention à titre non limitatif. On conduit une fermentation de Salmonella typhimurium M 206 en fermenteur de 15 litres de volume utile, dans un milieu type bouil- lon Eugon, de composition pour 1 litre s Tryptone 15 g Peptone papainique de soja 5 g Glucose 5 g Na Cl 4 g L.cystine 053 g Sulfite de sodium 0,2 g Citrate de sodium 1 g La culture est conduite à une température de 3400, avec une aération 0,5 VVM, le p H est ajusté à 7,1, au départ on observe peu d'acidification La durée de fermentation est de 24 heures On procè- de à une centrifugation à faible vitesse, le culot est lavé à l'eau déminéralisé puis pesé - Sur 30 g de culot bactérien (poids humide), on procède à l'extraction par le solvant suivant tampon tris (hydroxyméthyl) aminométhane ( 0,05 M), HO 1 à p H 8,5 ( 200 ml), à une température de + 40 C, sous agitation permanente, et & p H régalé à 8,5 Le rende- ment de l'extraction contr 8 é 16 de l'absorption à 206 nanomètres est maximum au bout d'un temps moyen voisin de 67 à 72-heures Au-delà de cette durée, on observe un palier sans amélioration du rendemit d'extraction. On soumet à une décantation par centrifugation très légère puis à une-ultrafiltration sur membranes de seuils de coupure de 50.000 et 10 000 Daltons. On obtient les fractions suivantes: fractions antigéniques poids PM> 50 000 0,596 g 10.000 buccale de 200,u/g pendant 5 Jours. Après une période de 15 Jours, on inocule une dose épreuve de 4 i 6 104 Salmonella typhimurium C 5 par souris On procède de même avec un lot de 100 souris vaccinées par le vaccin vivant stm Ra, et un lot d'animaux non vaccinés. On obtient les résultats suivants: fractions antigéniques Pourcentage de survie osueris au bout de: 12 jours 23 Jours PH > 50 000 88 72 10 000 PM vaccin vivant stm Ra 93 83 animaux non vaccines 40 32 La fraction antigénique de poids moléculaire supérieur à 50 000 daltons vaccine les souris pratiquement aussi efficacement que le vaccin vivant. Une séparation plus poussée par chromatographie sur gel tend à montrer que la fraction vaccinante de poids moléculaire supérieur à 50 000 serait au moins en partie constituée d'agrégats moléculaires de plus faible poids. 1 7967 REVENDICATIONS 1 Procédé de production par fermentation, extraction et pu- rification d'un vaccin bioohimique contre les fièvres à Salmonelles, caraotérisé par la séquence préparative suivante: fermentation en milieu liquide adapté d'une souche aviru- lente à p H légèrement supérieur à la neutralité, en aérobiose moyenne, à une température comprise entre 33 et 3500 C, pendant une durée fonc- tion de l'importance de l'inoculum; centrifugation à faible vitesse, séparation du culot bac- térien; extraction des antigènes membranaires vaccinants par mise en contact du culot bactérien avec un solvant de la classe des tris (hydroxyalcoyl) aminoalcanes inférieurs, sous agitation, à températu- re réfrigérée, p H régulé entre 8,4 et 8,6 et pendant une durée d'au moins une soixantaine d'heures; décantation par centrifugation très légère, purification et fractionnement des antigènes vaccinants par ultrafiltration sur membranes de seuil de coupure choisis en fonction des poids molécu- laires recherchés; dialyse de la fraction de plus faible poids molé- culaire; et lyophilisation de la fraction antigénique vaccinante. 2 Procédé de production d'un vaccin biochimique contre les fièvres à Salmonelles, selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche avirulente est Salmonella thyphimurium. 3 Procédé de production d'un vaccin biochimique contre les fièvres à Salmonelles, selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le solvant extractif des antigènes membranaires est le tri (hydroxyméthyl) aminométhane. 4 Procédé de production d'un vaccin biochimique contre les fièvres à Salmonelles, selon une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que l'extraction des antigènes membranaires vacci- nants est mise en oeuvre sous agitation permanente à température com- prise entre O et + 400, avec régulation du p H entre 8,4 et 8,6 par un acide fort, le solvant tri (hydroxyméthyl) aminométhane étant employé à faible concentration. Procédé de production d'un vaccin biochimique contre les fièvres à Salmonelles, selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'extraction des antigènes membranaires vaccinants est conduite en présence d'un tensio-actif de la série des polyoxyéthylènes ou des 7967 polyoxyéthano Is à faible concentration de lordae au plus de quel- ques pour cernts par rapport au milieu extractifo 6 Vaccin biochimique lyophilisé utilisable contre les fièvres à Salmone Ol lss obtenu selon unea quelconquw des revendications -à 5. 7 Vaccin biochimique lyophilisé utilisable contre les fiè- vrres à Salmonellesq selon la revendication 6, caractéris Z N ce que le poids moléculaire de la fraction antigénique vaccinante est supé- rieur à 50 000. 8 Vaccin biochimique lyophilisé utilisable contre les fiè- vres à Salmonelles selon la revendication 7, caractérise en ce que le poids moléculaire de la fraction antigénique vaccinante est compris entre 50 000 et 100 000. 9 Application du vaccin biochimique lyophilisé contre les fièvres à Salmonelles selon une quelconque des revendications 6 à 8 à la vaccination des êtres humains et des animaux. Vaccin biochimique lyophilisé contre les fièvres à Salmonelles selon là revendication 7 caractérisé en ce que la frac- tion antigénique vaccinante est au moins en partie constituée d'agré- gats moléculaires de plus faible poids.