FR 2515517 A1 19830506 FR 8218199 A 19821029 Préparations stabilisées d'insuline et procédé de production de celles-ci. La présente invention concerne des nouvelles solutions physiquement stabilisées d'insuline; elle concerne également un procédé de production de telles solutions stabilisées d'insuline. L'insuline dissoute dans un milieu liquide, par exemple l'eau, peut être conservée pendant quelques années à température ambiante et ladite préparation est stable pendant cette période Cependant, si l'on chauffe une solution d'insuline jusqu'à environ 800 C, celle-ci se dénature en quelques minutes, la consé- quence étant dénommée dénaturation thermique ou polymérisation thermique Si l'on agite une solution d'insuline pendant quelques jours à une température inférieure à celle à laquelle il ne se passe aucune ou substantiellement aucune dénaturation thermique, par exemple à 41-C, un autre genre de polymérisation s'effectue, celle-ci étant dénommée ici polymérisation interfaciale non covalente. Normalement, les producteurs d'insuline, les pharmaciens et les patients conservent les prépara- tions d'insuline à environ 50 C et, apparemment, aucune polymérisation interfaciale n'a lieu dans de telles préparations bien qu'elles subissent inévitablement pendant le transport des secousses intermittentes. Ces dernières années, on a consacré des efforts toujours croissants au développement de systèmes portatifs ou pouvant être implantés permettant l'infusion continue de l'insuline au patient La partie mécanique d'un dispositif destiné à l'infusion continue d'insuline comporte essentiellement un réservoir d'insuline, un système de pompage et un cathéter adéquat pour injecter l'insuline au patient Si la solution d'insuline est injectée par une ser*ingue, celle-ci peut jouer le rôle de réservoir d'insuline. Malheureusement, lorsque des solutions d'insuline disponibles dans le commerce sont introduites dans de tels systèmes, on a observé que l'insuline présente une ten- daice à subir une polymérisation interfaciale à la température du corps, obturant ainsi autant les parties mécaniques que les cathéters Cette caractéristique des solutions d'insuline s'est révélée constituer un obstacle majeur au développement ultérieur et à l'application clinique de dispositifs d'infusion continue. *Bien entendu, dans chaque type de dispositif à infusion en continu, les solutions d'insuline sont soumises à des mouvements provoquant une polymérisation interfaciale Les inconvénients essentiels des prépara- tions d'insuline de l'art antérieur concernant ce point de vue sont amplement décrits dans la littérature, voir par exemple Diabetologia 19 ( 1980), 1 9. Afin de résoudre ce problème, on a proposé d'utiliser des solutions acides d'insuline contenant de l'acide glutamique ou de l'acide aspartique, voir Diabetes 30 ( 1981), 83 Cependant, l'insuline est chimiquement instable dans l'acide, même à des tempéra- tures inférieures au corps humain En outre, on a proposé d'utiliser des formulations d'insuline contenant des agents tensio-actifs non-ioniques, voir la demande de brevet DE 2 952 119 Cependant, des agents tensioactifs non ioniques peuvent être indésirables dans les médicaments à introduction par voie parentérale. La présente invention vise à pallier les incon- vénients précités en fournissant des nouvelles prépara- tions d'insuline dissoute dans lesquelles l'insuline a une tendance moindre à une polymérisation interfaciale non covalente dans les conditions régnant dans les dispositifs d'infusion d'insuline en continu que ce n'est le cas pour les préparations d'insuline classiques. On a constaté que, de manière surprenante, les solutions d'insuline sont stabilisées à l'égard de la polymérisation interfaciale lorsqu'au moins un phos- pholipide est présent dans ladite solution. Les phospholipides présents dans les solutions d'insuline de cette invention peuvent être représentés par la formule générale I: H-CH-OR' CH-OR" (I) H-CH-O-P(O)(OH)-OR"' dans laquelle R' et R" sont identiques ou différents, représentant chacun l'hydrogène, un radical alkylcarbonyle, un radical alkénylcarbonyl, un radical alkadiénylcarbonyle, un radical alkatriénylcarbonyle ou un radical alkatétra- énylcarbonyle, pour autant que R' et R"' ne représentent pas tous les deux l'hydrogène, et R"' représente un groupe hydrophile, par exemple, le 2-(triméthylammonio)- éthyle, le 2-aminoéthyle, le 2-carboxy-2-aminoéthyle, le 2,3-dihydroxypropyle ou le 2,3,4,5,6-pentahydroxy- cyclohexyle Les radicaux alkylcarbonyle, alkénylcar- bonyle, alkadiénylcarbonyle, alkatriénylcarbonyle et alkatétraénylcarbonyle cités ci-dessus peuvent comporter environ 8 à 22 atomes de carbone et, dans un mode d'exécution de la présente invention, ils contiennent environ 12 à 22 atomes de carbone. Par conséquent, la présente-invention est relative à une solution stabilisée d'insuline contenant de l'eau, de l'insuline dissoute, un ou plusieurs des phospholipides de formule I et, éventuellement un sel de zinc, un agent conservateur, un agent rendant la solution isotonique, un tampon et d'autres composés acceptables au point de vue physiologique connus en tant qu'additifs pour solutions d'insuline et similaires. Une sous-classe préférée de composés de formule I est formée par les composés dans lesquels R' et RI' représentent chacun un radical alkylcarbonyle Une autre sous-classe préférée de composés de formule I est consti- tuée par les composés dans lesquels R"' représente le groupe 2(triméthylammonio)éthyle; ces composés étant connus sous la dénomination lécithines On préfère, en outre, les composés de formule I, dans lesquels R' et R" repré- sentent chacun le radical alkylcarbonyle comportant environ 8 à 16 atomes de carbone ou environ 12 à 16 atomes de carbone et R"' représente le radical 2-(tri- méthylammonio)éthyle La sous-classe particulièrement préférée de composés de formule I est constituée par les composés dans lesquels R' et R" représentent chacun le radical octanoyle Les composés de formule I dans lesquels R' et R" représentent chacun le radical octanoyle sont préférés étant donné qu'ils ne semblent pas former des liposomes ni, en outre, des micelles, à des concentrations assez basses, par exemple infé- rieures à environ 160 lig/ml. De préférence, la quantité de phospholipide de formule I nécessaire pour stabiliser une solution d'insu- line est comprise dans l'intervalle d'environ 10 à 200 pg/ml, particulièrement d'environ 10 à 100 pg/ml, notamment d'environ 25 à 75 pg/ml, plus particulièrement d'environ 30 à 50 pg/ml, de solution' d'insuline La concentration de l'insuline dissoute dans les solutions de l'invention est comprise dans la ganme d'environ 5 à 1000 unités internationales (UI) par ml ou même plus. Certaines solutions stabilisées d'insuline prépa- rées suivant les exemples donnés ci-dessous peuvent contenir des liposomes Cependant, il est peu probable que de tels liposomes contiennent de l'insuline, étant donné qu'ils sont formés avant l'addition d'insuline. Si les solutions d'insuline suivant la présente invention contiennent des liposomes, il est préférable que l'insuline soit essentiellement endehors de tels liposomes Le mot "essentiellement" signifie que, de préférence, plus de 90 %, plus particulièrement plus de 99 % de l'insuline est en-dehors de tout liposome. Des liposomes contenant de l'insuline comme il est connu par l'art de la technique, voir par exemple la demande de brevet EP N O 32 622, peuvent être distingués de la présente invention par le but de celle-ci ainsi que par le fait que, dans les solutions d'insuline de la présente invention, l'insuline comprise à l'intérieur d'un vésicule de liposome ne s'y trouve qu'accidentellement Alors que les solutions d'insuline de la présente invention sont destinées à une administra- tion parentérale, la raison principale pour encapsuler l'insuline dans des liposomes est l'administration orale Une raison pour encapsuler l'insuline dans des liposomes est de protéger l'insuline des attaques chimiques indésirables, par exemple une décomposition chimique de l'insuline dans l'estomac lorsque celle-ci est administrée par voie orale Les documents traitant de liposomes contenant de l'insuline ne concernent en rien une stabilisation physique de solutions d'insuline à l'égard d'une polymérisation interfaciale Dans le cas de liposomes connus contenant de l'insuline, le rapport pondéral entre le phospholipide et l'insuline est, par exemple,dans la ganme de 1: 0,01 1: 0,001 alors que, dans le cas des solutions d'insuline de la présente invention, ledit rapport pondéral est dans la ganve d'environ 1 5 et 1: 10 000, de préférence d'environ 1: 10 à 1: 1 000. La demande de brevet allemand non examinée DE-A-2 652 636 concerne un procédé de stabilisation de protéines sensibles par addition de protecteurs ayant une structure amphophilique Contrairement à la présente invention, la stabilisation suivant ladite publication est obtenue en enveloppant la protéine sensible pour empêcher le contact avec l'eau En outre, suivant la terminologie de cette publication, l'insuline n'est pas considérée être une protéine %sensible. La présente invention vise également à maintenir l'insuline en contact avec l'eau, c'est-à-dire en solution, en empêchant le contact de l'insuline avec 1 O d'autres interfaces. * Les solutions d'insuline de la présente invention contiennent, de préférence, de l'insuline bovine, porcine ou humaine. Suivant un mode d'exécution préféré de la présente invention, la solution d'insuline contient du zinc. Cependant, la quantité de zinc doit être choisie de sorte qu'il n'en résulte aucune précipitation Une bonne stabilisation contre une polymérisation interfaciale est obtenue dans des solutions d'insuline dans lesquelles le rapport entre la concentration molaire d'ions de zinc à disposition de l'insuline et la concentration molaire de l'insuline calculée en tant qu'insuline hexamère est compris dans l'intervalle d'environ 1,5 à 4,6, de préférence dans l'intervalle d'environ 3 à 4,5, plus particulièrement dans l'intervalle d'environ 3,6 à 4,3. Des sels de zinc préférés sont des sels solubles tels que l'acétate ou le chlorure de zinc Si la solution d'insuline de la présente invention contient des composés qui forment des complexes avec l'insuline, tel qu'un amino-acide, par exemple la glycine ou l'histidine, ou un acide hydroxy-carboxylique, par exemple l'acide citrique, il n'y a qu'une partie de la teneur totale en zinc à la disposition de l'insuline. A titre d'exemple, un mode de préparation des solutions d'insuline suivant l'invention consiste i dissoudre l'insuline, par exemple l'insuline 'zincique" cristallinepar exemple de l'insuline hautement purifiée telle que l'insuline "monocomposante" (Cfr le brevet GB nô 1 285 023), dans de l'eau en présence d'acide, par exemple l'acide chlorhydrique Cn prépare séparément une solution aqueuse d'agent conservateur, par exemple de phénol, d'alkylphénol tel que le crésol ou le p-hydroxybenzoate de méthyle, contenant également, si on le désire, un agent rendant la solution isotonique tel que le chlorure de sodium ou le glycérol En outre, la solution conservatrice peut contenir un tampon tel que l'orthophosphate de sodium, le citrate de sodium, l'acétate de sodium ou le TRIS ltris(hydroxyméthyl)amino- méthanel La solution conservatrice obtenue est ensuite ajoutée, si on le désire, à la solution acide d'insuline avant d'ajouter une base, par exemple une solution d'hydroxyde de sodium, pour régler la valeur du p H à la neutralité Dans le contexte de la présente invention, il faut entendre par "p H neutre" une valeur de p H comprise dans la gagee d'environ 6,5 à 8 Le phospholipide de formule I peut être ajouté à la solution d'insuline en tant que solution ou en tant que solution colloïdale qui est préparée en dissolvant ou en mettant en suspension dans l'eau le phopspholipide de formule I et en soumettant, si nécessaire, toubesuspension à un traitement par ultrasons avant de la mélanger à la solution d'insuline La solution de phospholipide peut, si on le désire, contenir un tampon et un agent conservateur Après mélange avec le phospholipide, on peut de nouveau régler le p H de la préparation d- insuline à p H neutre Finalement, la solution d'insuline résultante est portée au volume calculé par addition d'eau, stérili- sée ensuite par filtration et transférée ensuite de manière aseptique dans des fioles stériles qui sont ensuite scellées. La présente invention concerne également un procédé pour la préparation des solutions d'insuline de l'invention, caractérisé en ce qu'on mélange l'insu- line avec un composé de formule I et éventuellement avec un sel de zinc, un agent conservateur, un agent rendant la solution isotonique et un tampon en présence d'eau. Certains composés de formule I sont connus et les autres composés de formule I peuvent être préparés par analogie à la préparation des composés connus. D'autres détails de la présente invention sont donnés dans les exemples suivants qui ne doivent cependant pas être considérés comme imposant une limitation du cadre de l'invention Le produit de départ de l'insuline utilisée dans les exemples contenait environ 20-à 35 pg de zinc par mg d'azote La détermi- nation du facteur de stabilité apparaît dans ce qui suit: Afin de déterminer la stabilité des solutions d'insuline à l'égard de la polymérisation interfaciale, on soumet lesdites solutions à un test de stabilité dans des conditions artificielles de la manière suivante: Les fioles (d'une capacité de 12,5 ml) contenant l'échantillon d'essai ( 10 ml) et munies chacune d'un bouchon en caoutchouc sont disposées verticalement sur une table à secousses (vendue par HETO, Danemark) qui est entièrement immergée dans un bain d'eau maintenu à 41 0,10 C La table est soumise à des muvements de se- causses horizontaux à raison d'une fréquence et d'une amplitude de, respectivement, loo tjmin et de 50 mm. L'opalescence des échantillons d'essai est contrôlée à des intervalles de temps réguliers sur un "néphélomètre FISCHER DRT 1000 " (vendu par Fischer, Canada) On considère que la polymérisation interfaciale a lieu, lorsque la turbidité excède 10 unités de turbidité néphélométrique (UTN). On calcule le facteurdestabilité en tant que rapport entre le temps de polymérisation interfaciale de l'échantillon d'essai et celui d'un échantillon témoin préparé de la même manière que l'échantillon d'essai, ne contenant toutefois pas de composé de formule I. Exemple 1. On a dissous 500 mg d'insuline humaine semi- synthétique dans 10 ml d'acide chlorhydrique 0,045 N et on a ajouté 359 mg de p-hydroxybenzoate de méthyle dissous dans 300 ml d'eau distillée En outre, on a ajouté 476 mg d'acétate sodique trihydraté, 2,46 g de chlorure de sodium et 4,73 ml d'une solution d'hydro- xyde de sodium 0,2 N dissoute dans 15 ml d'eau distillée. On a mis 9 mg de L-alpha-phosphatidylcholine de dimyristoyle en suspension dans 10 ml d'une solution de mg de chlorure de sodium, de 13,6 mg d'acétate de sodium et de 10 mg de p-hydroxybenzoate de méthyle dans de l'eau distillée On a fait barboter de l'azote dans la suspension qui a été soumise à un traitement par ultrasons dans un "bain d'ultrasons" pendant 2 heures. La solution colloïdale résultante a été ajoutée à la solution d'insuline en agitant On a réglé le p H à 7,45 au moyen d'acide chlorhydrique 0,2 N ou au moyen d'une solution d'hydroxyde de sodium 0,2 N et on a porté le volume à 350 ml avec de l'eau distillée. Le facteur de stabilité de la solution d'insuline résultante était supérieur à 125. Exemple 2. On a dissous 9,65 g d'insuline porcine dans 400 ml d'acide chlorhydrique 0,02 N et on a ajouté ,0 g de phénol cristallin et 40 g de glycérol anhydre et, en outre, de l'eau distilléepour porter le volume à à 515517 2200 ml On a réglé le p H à 7,45 au moyen d'une solution d'hydroxyde de sodium 0,2 N On a dissous 125 mg de L-alpha-phosphatidylcholine de distéaroyle dans 2 ml d'éthanol 15 minutes, on a ajouté la solution colloïdale résul- tante à la solution d'insuline en agitant et on a ajouté de l'eau distillée pour porter le volume à 2500 ml. Si nécessaire, on a réglé le p H à 7,45 Le facteur de stabilité était supérieur à 30. Exemples 3 à 8. On a préparé des solutions d'insuline de manière analogue au procédé décrit à l'exemple 1, sauf que les phospholipides étaient des lécithines dans lesquelles les radicaux hydrophobes, c'est-à-dire R' et R", sont identiques et sont ceux qui sont cités dans le tableau I. Les résultats apparaissent également dans le tableau I. Tableau I Exemple R' et Type Facteur de Né Ru R d'insuline stabilité 3 myristoyle porcine supérieur à 120 4 palmitoyle porcine 104 stéaroyle porcine supérieur à 117 6 lauroyle humaine supérieur à 133 7 myristoyle humaine supérieur à 133 8 palmitoyle humaine 75 il Exemple 9. On a préparé une solution d'insuline de manière analogue au procédé décrit à l'exemple 1, sauf que le phospholipide utilisé était de la lécithine d'oeuf et que l'insuline était de l'insuline porcine Le facteur de stabilité était de 96. Exemples 10 à 14. On a préparé des solutions d'insuline de manière analogue au procédé décrit dans l'exemple 1 sauf qu'on a ajouté de l'insuline porcine en une quantité donnant laconcentration indiquée dans le tableau Il Les résultats apparaissent également dans la tableau Il. Tableau II Exemple Insuline Facteur de NO U I /ml stabilité 20 supérieur à 120 il 40 supérieur à 120 12 100 97 13 200 79 14 500 53 Exemple 15. On a dissous 1,50 g d'insuline porcine dans 6,5 ml d'acide chlorhydrique 0,2 N et on a ajouté de l'eau pour porter à 50 ml On a dissous 1,0 g de phydroxybenzoate de méthyle et 1,78 g de phosphate de sodium dans 900 ml d'eau distillée et on a ajouté la solution d'insuline On a réglé le p H à 7,45 au moyen d'une solution d'hydroxyde de sodium 0,2 N. On a ajouté une solution colloïdale de L-alpha- phosphatidylcholine de dimyristoyle préparée de manière analogue au procédé décrit dans l'exemple 2 et de l'eau distillée pour porter à 1000 ml afin d'obtenir une concentration finale de phospholipides de 50 pg/ml. Le facteur de stabilité était au-dessus de 30. Exemple 16. On a préparé une solution d'insuline de manière analogue à l'exemple 15, sauf que la solution finale contenait 20 unités internationales d'insuline par ml Le facteur de stabilité était supérieur à 17. Exemple 17. On a préparé une solution d'insuline de manière analogue à l'exemple 15, sauf que la concentration finale en insuline était de 500 U I /ml, et que la teneur finale en L-alpha-phosphatidylcholine de dimyristoyle était de 50 pg/ml le facteur de stabilité était supérieur à 30. Exemples 18 à 20. On a préparé des solutions d'insuline de manière analogue au procédé décrit dans l'exemple 2, sauf qu'on a utilisé le L-alphaphosphatidylcholine de dimyristoyle de manière à obtenir les concentrations finales indiquées dans le tableau V Les résultats apparaissent également dans le tableau V. Tableau V Exemple Composé dimyristoylé, Facteur de No pg/ml stabilité 18 1 1,3 19 10 1,8 20 50 supérieur à 33- Exemple 21. On a dissous du L-alpha-phosphatidylcholine de dioctanoyle dans de l'eau distillée et on l'a ajouté à une solution d'insuline en une quantité suffisante pour obtenir une concentration finale de 30 pg/ml, ladite solution d'insuline ayant été préparée de manière analogue à la solution d'insuline de l'exemple 1 Le facteur de stabilité était supérieur à 63. Exemple 22. On a dissous 3,65 g d'insuline humaine semi- synthétique dans 100 ml d'acide chlorhydrique 0,02 N et 2,0 g de phénol cristallin On a ajouté 16 g de glycérol anhydre et 0,3 ml d'une solution de chlorure de zinc contenant 4 % de zinc et on a, en outre, ajouté de l'eau distillée pour porter à 900 ml On a réglé le p H à 7,45 au moyen d'une solution d'hydroxyde de sodium 0,2 N On a dissous 50 mg de L-alphaphosphatidylcholine de dioctanoyle dans de l'eau distillée et on l'a ajoutée à la solution On a ajouté de l'eau distillée pour porter à 100 O ml Le facteur de stabilité était de 65. REVENDICATIONS 1 Solution physiquement stabilisée d'insuline comprenant éventuellement du zinc, un agent conserva- teur, un agent rendant la solution isotonique et un tampon, caractérisée en ce qu'elle contient des proportions stabilisantes d'un phospholipide de formule générale I H-CH-OR' CH-OR" ( I) H-CH-0-P(O)(OH)-OR"' dans laquelle R' et R" sont identiques ou différents, représentant chacun l'hydrogène, un radical alkylcarbonyle, un radical alkénylcarbonyle,un radical alkadiénylcarbonyle, un radical alkatriénylcarbonyle ou un radical alkatétra- énylcarbonyle, pour autant que R' et R" ne représentent pas tous les deux l'hydrogène, et R"' représente un groupe hydrophile. 2 Solution d'insuline suivant la revendication 1, caractérisée en ce que le radical hydrophile est le 2-(triméthyl-ammonio)éthyle, le 2aminoéthyle, le 2-carboxy-2-aminoéthyle, le 2,3-dihydroxypropyle ou le 2, 3,4,5,6-pentahydroxycyclohexyle. 3 Solution d'insuline suivant la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'insuline se trouve essentielle- ment en-dehors de tout liposome. 4 Solution d'insuline suivant l'une quelconque des revendications précédentes,caractérisée en ce que lesdits radicaux alkylcarbonyle, alkénylcarbonyle, alkadiénylcarbonyle, alkatriénylcarbonyle et alka- tétraény-lcarbonyle comportent environ 8 à environ 22 atomes de carbone. Solution d'insuline suivant la revendication 4, caractérisée en ce que lesdits radicaux comportent environ 12 à environ 22 atomes de carbone. 6 Solution d'insuline suivant l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que R' et R" représentent chacun un radical alkylcarbonyle. 7 Solution d'insuline suivant l'une quelconque des revendications précécentescaractérisée en ce que R"' représente le radical 2-(triméthylammonio)éthyle. 8 Solution d'insuline suivant la revendication 7, caractérisée en ce que R' et R" représentent chacun un radical alkylcarbonyle comportant environ 8 à environ 16 atomes de carbone et de préférence environ 12 à environ 16 atomes de carbone. 9 Solution d'insuline suivant l'une quelconque des revendications précédentes/caractérisée en ce que R' et R" représentent chacun le radical octanoyle. Solution d'insuline suivant l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que la concentration en phospholipide de formule I dans ladite solution est comprise dans la gamme d'environ 10 à environ pg/ml, de préférence dans la ganme d'environ 10 à environ pg/ml, en particulierdans la garoe d'environ 25 à environ pg/ml et tout particulièrement dans la gamme d'environ 30 à environ 50 pg/ml. 11 Solution d'insuline suivant l'une quelconque des revendications précédentes,caractérisée en ce que le rapport pondérai entre le phospholipide de formule I et l'insuline est dans la gamme d'environ l: 5 à environ 1: 10 000 et de préférence d' environ 1: 10 à environ 1: 1 000. 12 Solution d'insuline suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle contient du zinc. 13 Solution d'insuline suivant la revendication 12,caractérisée en ce que-le rapport entre la concentra- tion molaire en ions de zinc à disposition de l'insuline et la concentration molaire d'insuline calculée en tant qu'insuline hexamère est dans la gamme d'environ 1,5 à environ 4,6, de préférence d' environ 3 à environ 4,5, en particulier d' environ 3,6 à 4,3. 14 Procédé de préparation d'une solution d'insuline suivant l'une quelconque des revendications précédentes,caractérisé-en ce qu'on mélange l'insuline avec un composé de formule I-suivant la revendication 1 et éventuellement avec un sel de zinc, un agent conser- vateur, un agent rendant la solution isotonique et un tampon en présence d'eau. Procédé suivant la revendication 14,carac- térisé en ce que le mélange est soumis à un traitement par ultra-sons avant l'addition d'insuline. 16 Procédé de stabilisation d'une solution d'insuline contenant éventuellement un agent conserva- teur, un agent rendant la solution isotonique et un tampon, caractérisé en ce qu'on y ajoute un phospholipide de formule générale I suivant la revendication 1, de préférence dans une solution aqueuse qui, si on le désire, a été soumise à un traitement ultrasonique.