FR 2518881 A1 19830701 FR 8222038 A 19821229 La présente invention se rapporte à des médicaments utiles notamment pour agir sur la concentration en calcium du sérum des animaux & sang chaud Elle concerne plus particulièrement des médicaments à base de 26,23lactones de la 25-hydroxyvitamine D 3 et des compositions pharmaceutiques contenant ces lactones en tant que composants actifs, avec un véhicule acceptable pour lusalge pharmaceutique Ces médicaments et compositions pharmaceutiques sont utiles notamment pour agir sur la concentration en calcium du sruz des animaux a sang chaud. Le 'la,25-dihydroxycholécalciférol, le la-hydroxychol:- calciférol, le lt,24-dihydroxycholécalciférol et des compbsés ana- logues ont été utilisés antérieurement en tant que médicaments pour le traitement de l'ostéoporose, de l'ostéomalacie et 4 'etats ana-. logues Toutefois, ces composés peuvent provoquer des effets secon- daires pathologiques tels que l'hypercalcémie et des troubles ana- logues lorsqu'ils sont administrés a fortes doses. La calcitonine est connue en tant que médiecament pour le traitement de l'hypercalcémie et d'états analogues, mais elle a l'incon- vénient de ne pas pouvoir être administrée par voie orale. On a récemment isolé la 26,23-lactone de 1 a laï 25-dihydroxy- vitamine D 3 du sérum de rat et ce composé a été identifié chimiquement comme nouveau métabolite de la la-hydroxyvitamine D 3 ou de la la 25- dihydroxyvitamine D 3 (Arch Biochem Biophs 204, pages 387 à 391, 1980; Febs Letters, 134, pages 207 à 211, 1981). On a également isole et identifié la 26,23-lactona de la -hydroxyvitamine D 3 du sérum de poulets, 4 e rats ou de porcs (Biochemistry 18, pages 4775 à 4780, 1979; Biochemical and Biophysical Research Communication, 89, pages 286 à 293, 1979; Biochemical and Biophysical Research Communication, 93, pages 149 à 154, 1980). Pour ce qui concerne les publications relatives a 1 à'tt- vite biologique de cette 26,23-lactone de la 25-hydroxyvitamine D 3, l'International Publication Number WO 81/500045 indique qu'on a administré la 26,23-lactone de la 25-hydroxyvitamine D 3 à des rats alimentés par un régime déficient en vitamine D 3 La mesure de la concentration du calcium dans le sérum exécutée 12 h après l'adminis- tration a montré que la 26,23-lactone de la 25-hydroxyvitamine D 3 augmentait la concentration du calcium dans le sérum et que, par conséquent, "elle a une activité semblable à celle de la vitamine D en ce qu'elle favorise la mobilisation du calcium pour les os". Pour ce qui concerne la 26,23-lactone de la 1 l,25- dihydroxyvitamine D 3, il n'existe encore aucune publication relative & son activité biologique sur labase de résultats pharmacologiques concrets. Après une étude patiente et approfondie sur l'activité biologique de la 26,23-lactone de la 25-hydroxyvitamine D 3, la deman- deresse a trouvé que, lorsqu'on administrait cette lactone a des rats manquant de vitamine D 3 et qu'on mesurait la concentration du calcium dans le sérum dans un délai de 48 à 96 h après l'administration, on trouvait contre toute attente que la teneur en calcium du sérum était remarquablement basse. On a également prouve que la 26,23-lactope de la lai 25 c dibydroxyvitamine D 3 provoquait une diminution analogue de la teneur en calcium De plus, la demanderesse a isolé et identifié la 26 23- peroxylactone de la 25-hydroxyvitamine D 3 en tant que nouveau méta- bolite et elle a trouve que ce nouveau compose provoquait également une diminution de la teneur en calcium du sérum. La présente invention est basée sur les découvertes men- tionnees ci-dessus Plus en détail, l'invention est baste sur la découverte que la 26,23-lactone de la 25-hydroxyvitamine D 3 et ses dérives provoquent une diminution de la teneur en calcium du sérum, que ces composes peuvent être administrés par voie orale et qu'ils sont utilisables pour le traitement de l'hypercalcémie et des états analogues résultant de l'administration du l",25-dihydroxycholical- ciférol ou de produits analogues - L'invention concerne donc, à titre de médicaments nouveaux, utiles notamment pour agir sur la concentration du calcium dans 1 l sérum des animaux à sang chaud, la 26,23-lactone de la 25-hydroxy- vitamine D 3 et ses dérivés répondant à la formule générale 251888 1 Ho dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy et X représente -0 ou -Q-0-. Ltinvention comprend également des compositions pharmaceutiques utiles notamment pour agir sur la concentration du calcium dans le sérum, ces compositions se caractérisant en ce qu'elles contiennent en tant que composant actif la 26,23-lactone de la 25-hydroxyvitamine D 3 ou l'un de ses dérivés répondant & la formule I ci-dessus avec un véhicule acceptable pour l'usage phar- maceutique. D'autres caractéristiques et avantages de l'inven- tion ressortiront plus clairement de la description détaillée donnée ci-après en référence aux figures des dessins annexes sur lesquels la figure 1 est un graphique qui représente l'influence de la 26,23-lactone de la 25-hydroxyvitamine D 3 sur le transport intestinal du calcium; la figure 2 est un graphique qui représente l'influence de la 26,23-lactone de la 25-hydroxyvitamtne D 3 sur la concentration du calcium dans le sérum; les figures 3 et 4 et les figures 5 et 6 repré- sentent respectivement les influences de la 26,23-lactone de la la,25- dihydroxyvitamine D 3 et de la 26,23-peroxylactone de la 25-hydroxy- vitamine D 3 sur le transport intestinal du calcium et sur la concen- traion en calcium du sérum. Les 26,23-lactones de la 25-dihydroxyvitamine D 3 à utiliser comme médicaments selon l'invention répondent la formulé I ci-dessus dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy et X représente -0 ou -0-0-. Les 26,23-lactones de la 25-hydroxyvitamine D 3 pour lesquelles X de la formule I représente -0 répondent elles-mêmes a. la formule I-1 H et ( 1 >-' dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy. Parmi les composés de ce type, on peut citer la 26,23-lactone de la -hydroxyvitamine D 3 et la 26,23-lactone de la lo,25-dihydroxyvita- mine D 3. La 26,23-lactone de la 25-hydroxyvttamine D 3 est un composé connu qui a éte isole du sérum des rats, poulets,-porcs, etc, suralimentés en vitamine D 3 et identifiée comme Le mitabolite résultant (Febs Letters, 134, pages 207 à 211, 1981; Bfochemistry, 18, pages 4775 à 4780, 1979; Biochemical and Biophysica I Research Communication, 89, pages 286 à 293, 1979). Ce composé peut également être obtenu par synthèse chimique Il existe plusieurs procédés cqnnus et, par exemple, un procédé dans lequel on fait réagir un-aldéhyde répondant à la for- mule 251888 1 avec l'acétone, ce qui donne le composé P-hydroxycetonique corres- pondant sur lequel on pratique-une synthèse par la cyanhydrine (Tetrahedron Lettees, 21, pages 4667 a 4670, 1980) et un procédé dans lequel on utlise comme matière prem Lère un aldéhyde obtenu à partir de l'ergosterol (Journal of Organic Chemistry, 46, pages 3422 à 3428, 1981). La 26,23-lactone de la 25-hydroxyvitamine D 3 contient un atome de carbone asymétrique en position 25 et en position 23 et, conformément a l'invention, la position 25 et la position 23 peuvent être en configuration R ou en configuration S ou à l'état de mélange de la configuration R et de la configuration S dans des proportions quelconques Parmi tous ces composés, le type naturel, la 26,23- lactone de la 23 (S),25 (R)-25-hydroxyvitamine D 3 convient tout parti- culièrement en tant que médicament conformément à l'invention en rai- son de ses propriétés physiologiques avantageuses. La 26,23-lactone de la la,25-dihydroxyvitamine D 3 est un compose connu qu'on isole du serum de rats ou de chiens en tant que metabolite après administration de la la-hydroxyvitamine D 3 ou de la la,25dihydroxyvitamine D 3 (Arch Biochem Biophs 204, pages 387 & 391, 1980). La 26,23-lactone de la la,25-dihydroxyvitamine D 3 peut également être obtenue par incubation de la 26,23-lactone de la 25- hydroxyvitamine D 3 avec un homogénéisat de rein de poulets (Febs Letters 134, pages 207 a 211, 1981). On peut également obtenir la 26,23-lactone de la la-25- dihydroxyvitamine D 3 par synthèse chimique On peut l'obtenir par synthèse à partir d'un dérive de l'ergosterol portant un groupe hydroxy en position a et répondant à la formule HO HO selon le procédé décrit dans Journal of Organic Chemtsery, 46, 251888 1 pages 3422 à 3428, 1981 On peut également la préparer par bynthèse en partant d'un aldéhyde de formule CHO Ac O I I 11 Ac selon le procédé de synthèse décrit dans Tetrahedron Letters, 21, pages 4667 à 4670, 1980. De plus, on peut encore l'obtenir par synthèse en soumettant directement la 26,23-lactone de la 25-hydroxyvitamine D 3 à hydroxylation en la par le procédé décrit dans Proc Natl Acad. Sci U S A, volume 75, n 5, pages 2080 et 2081, 1978. Comme dans le cas de la 26,23-lactone de la 25-hydroxy- vitamine D 3, la 26,23-lactone de la la, 25-dihydroxyvitamine D 3 porte également un atome de carbone asymétrique en position 25 et en posi- tion 23 et,dans la présente invention, la position 25 et la position 23 peuvent être en configuration R ou en configuration S ou sous forme d'un mélange consistant en la configuration R et la configuration S dans des proportions quelconques Parmi tous ces composés, un type naturel, la 26, 23-lactone de la 23 (S),25 (R)-la,25-dihydroxyvitamine D 3 convient tout spécialement en raison de son activité biologique avantageuse. Les 26,23lactones de la 25-hydroxyvitamine D 3 pour lesquelles X de la formule I représente -0-0 répondent à la for- mule I-Z OUX( ( 1)-2 R dans laquelle R représente un, atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy. Parmi les composes de ce type, on peut citer la 26,23-peroxylactone de la 25-hydroxyvitamine D 3 et la 26,23-peroxylactone de la la,25- hydroxyvitamine D 3 Ces composés sont nouveaux, découverts pour la première fois par la demanderesse, et ils, ont une structure de y-peroxylactone sur la chaîne latérale On peut obtenir la 26,23- peroxylactone de la 25-hydroxyvitamine D 3 par les modes opératoires suivants: on administre d'abord de la vitamine D 3 ou'de la 25-hydroxy- vitamine D 3 à des rats, poulets, porcs, etc, à une dose acceptable du point de vue toxicologique, par un mode d'administration ordinaire, tel que l'administration orale, l'injection intraveineuse ou l'injec- tion intramusculaire, et on extrait le compose recherche du sérum recueilli à partir du sang des rats, poulets, porcs, etc, environ 3 à 10 jours après l'administration, en tant que métabolite de la vitamine D 3 ou de la 25-hydroxyvitamine D 3 qui a été administrée; finalement, on isole le composé par chromatographie sur une colonne de Sephadex LH-20 ou par chromatographie de liquide sous haute pression. La 26,23- peroxylactone de la la,25-dihydroxyvitamine D 3 peut être obtenue en tant que métabolite de la la-hydroxyvitamine D 3 ou de la la,25- dihydroxyvitamine D 3 selon les mêmes modes opératoires d'isolement et d'extraction que pour la 26,23-lactone de la 25- hydroxyvitamine D 3. Parmi ces 26,23-lactones de la 25-hydroxyvitamine D 3, la 26,23-1 actone de la 25-hydroxyvitamine D 3 et la 26,23-lactone de la la,25dihydroxyvitamine D 3 sont précieuses en raison de leurs fonctions pharmacologiques et de leur stabilité chimique et on apprécie tout spécialement la 26,23-lactone de la la,25-dihydroxyvitamine D 3. Pour la 26,23-lactone de la la,25-dihydroxyvitamine D 3, on préfère la 26, 23-lactone de la 23 (S),25 (R)-lc,25-dihydroxyvitamine D 3 dont la configuration aux atomes de carbone dans les positions 23 et 25 est la même que dans le produit naturel. La 26 j 23-lactone de la 25-hydroxyvitamine D 3 et ses dérivés mentionnés ci-dessus permettent d'agir sur la concentration en calcium du sérum des animaux à sang chaud, et spécialement de dimi- nuer la concentration du calcium dans le sérum des animaux à sang chaud La 26,23-lactone de la 25-hydroxyvitamine D 3 et ses dérivés selon l'invention assurent en outre une grande sécurité toxicolo- - 2518 88 1 gique car il s'agit de métabolites obtenus in vivo sur des animaux A sang chaud Les médicaments selon l'invention peuvent donc être utilises avantageusement dans le traitement de maladies dues à des concentrations ahormalement fortes de calcium dans le sérum des animaux à sang chaud En outre, dans le cas o on peut prévoir une augmentation anormale éventuelle de la teneur en calcium du sérum des animaux à sangchaud, on peut utiliser les médicaments selon l'invention en prévention contre cette augmentation anormale. Les médicaments selon l'invention peuvent être appliqués avantageusement au traitement de maladies résultant de fortes teneurs en calcium du sérum, y compris par exemple l'hypercalcémie due a l'adminis t r a tion ade la-hydroxyvitamine D 3 > de la,25-dihydroxy- vitamine D 3, de la,24-dihydroxyvitamine D 3, etc, l'hypercalcémie due à des tumeurs malignes, l'hyperparathyroïdisme et la maladie de Behcet, etc. Parmi les indications des médicaments selon l'invention, on citera les cas dans lesquels des patients résistant à la vita- mine D nécessitent l'administration de fortes doses de vitamine D 3 et les cas dans lesquels des patients souffrant d'une tumeur maligne risquent d'être exposés à de fortes teneurs en calcium. Les médicaments:selon l'invention ont été conçus a l'ori- gine pour la médecine humaine, mais ils peuvent également être uti- lisés en médecine vétérinaire dans le traitement des animaux à sang chaud, tels que les porcs, les bovins, les caprins, les ovins, les- chevaux, les chiens, les chats, etc. Conformément à l'ihvention, la 26,-23-lactone de la 25- hydroxyvitamine D 3 et ses dérivés sont administres & des doses effi- caces et, par exemple, de 1 a 1000 ng/jour/kg de poids corporel, de préférence de 5 à 200 ng/jour/kg de poids corporel. Conformément à l'invention, ces médicaments peuvent être administrés une fois par jour ou à plusieurs reprises, par exemple en deux ou trois doses quotidiennes Les moments d'administration peuvent être déterminés à volonté tenu compte de l'état du patient par un médecin dans le cas de la médecine humaine et par un vété- rinaire ou un éleveur sous la direction d'un vétérinaire dans le cas d'animaux à sang chaud autres que lhomme. Conformément & l'invention,'les 26,23-lactones de la -hydroxyvitamine D 3 peuvent être administrées par des voies variées Plus précisément, les médicaments selon l'invention peuvent être administrés par voie orale ou parentérale, par exemple par voie intramusculaire, intraveineuse, souscutanée, à l'aide d'un suppo- sitoire, de préférence par voie orale Les médicaments selon l'inven- tion sont de préférence administrés sous la forme de compositions pharmaceutiques contenant également un véhicule acceptable pour l'usage pharmaceutique Ainsi, donc, l'invention comprend égale- ment des compositions pharmaceutiques utiles notamment paur agir sur la concentration en calcium du sérum, compositions qui se caractérisent en ce qu'elles contiennent la 26,23-lactone de la -hydroxyvitamine D 3 ou ses dérivés répondant a la formule I ci- dessus et un véhicule acceptable pour l'usage pharmaceutique Du fait que la 26,23-lactone de la 25-hydroxyvitamine D 3 et ses dérivés ont pour fonction pharmacologique spécifique de diminuer les teneurs en calcium du sérum, ces compositions pharmaceutiques sont utiles pour abaisser la concentration en calcium du sérum. Parmi les véhicules acceptables pour l'usage pharmaceutique, on citera par exemple l'alcool éthylique; des huiles végétales comme l'huile de mats, l'huile d'olive, l'huile de coton, l'huile de coco, l'huile d'amandes, l'huile d'arachide, etc; les huiles de foies de poissons; les esters huileux comme le Polysolvate 80 qui permettent d'obtenir des compositions pharmaceutiques liquides; le beurre de cacao, des triglycerides d'acides gras, etc, qui permettent de pré- parer des compositions pharmaceutiques solides fusibles a la température du corps; le carbonate de calcium, la fécule de pommes de terre, l'acide alginique, le lactose, etc, qui permettent de préparer des compositions pharmaceutiques solides infusibles à la température du corps, et des liquides organiques comme le propylèneglycol, le poly- éthylèneglycol et l'oléate d'éthyle qui permettent de préparer des compositions pharmaceutiques à l'état de solutions ou suspensions aqueuses ou non aqueuses. On peut introduire dans les compositions pharmaceutiques selon l'invention un antioxydant tel que l'acide ascorbique, l'hlydroxy- anisole butylé ou l'hydroquinone dans le but de stabiliser les 26,23- lactones de la 25-hydroxyvitamine D 3 contenues dans ces compositions 251888 1 car elles sont instables à l'oxydation, à la lumière ou à la chaleur. On peut également introduire les 26-23-lactones de la 25-hydroxyvita mine D 3 dans les compositions pharmaceutiques après les avoir conver- ties en composes d'inclusion à l'aide d R, e ou y-cyclodextrine éven- tuellement methylée par exemple. L'invention comprend en outre des compositions pharmaceu- tiques sous la forme d'unités de dôsage contenant la 26,23-lactone de la 25-hydroxyvitamine D 3 ou un dérivé et un véhicule acceptable pour l'usage pharmaceutique, ces compositions servant à agir bur la concen- tration du calcium dans le sérum. Parmi ces médicaments et compositions pharmaceutiques, on citera des comprimes, des pilules, des comprimés revêtus de sucre, des poudres, des granulés, des capsules de gélatine dure ou molle, des comprimés pour l'usage buccal, des suppositoires et des liquides pour injections, de préférence des capsules de gélatine dure ou molle, des poudres et des granules. Ces compositions peuvent contenir de 0,05 à 10 microgrammes, de préférence de 0,25 à 2 microgrammes de 26,23-lactone de la 25- hydroxyvitamine D 3; il s'agit habituellement de médicaments pour l'administration orale, sous la forme de capsules de gélatine dure ou molle, de poudres ou de granulés par exemple. Parmi les 26,23-1-actones de la 25-hydroxyvitamine D 3 et dérives contenus dans les compositions pharmaceutiques ou médicaments sous la forme d'unités de dosage selon l'invention, on préfère la 26,23-lactone de la 25-hydroxyvitamine D 3 et la 26,23-lactone de la la,25-dihydroxyvitamine D 3, et, parmi ces deux composés, plus spécia- lement la 26,23-lactone de la lai 25-dihydroxyvitamine D 3, spécialement la 26,23-lactone de la 23 (S),25 (R)-l",25-dihydroxyvitamine D 3. Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toute- fois en limiter la portée; dans ces exemples, les indications de parties et de % s'entendent en poids sauf mention contraire D'autre part, les composés actifs seront éventuellement désignés, dans ces exemples comme dans les graphiques des dessins annexés, par des abré- viations dont les significations sont indiquées ci-dessous: 25-OH-D 3-26, 23-lactone: 26,23-lactone de la 25-hydroxyvitamine D 3 la,25-(OH)2 D 3: la,25-dihydroxyvitamine D 3 - 11, la,25-(OH)2 D 3-26,23-lactone: 26,23-lactone de la la,25-dihydroxy- vitamine D 3 -OH-D 3-26,23-per Qxylaetone: 26,23-peroxylactone de la 25-hydroxy- vitamine D 3. EXEMPLE DE PREPARATION 1 Préparation de la 26,23-lactone de la 23 (S)i 25 (R)-25-hydroxyvitami ne D 3 On alimente des jeunes rats males de la souche Wistar par un régime normal contenant de la vitamine D 3 (Nippon Clea Corp CE-2: Ca: 1,0 %; P: 1,0 %; D 3: 2000 UI/kg) pendant 8 semaines à volonté On administre aux 150 rats à deux reprises, à trois jours d'intervalle, par voie intramusculaire, 4 x 105 UI de vitamine D 3 dans 100 microlitres d'éthanol Trois jours après la seconde dose, on anesthésie les rats à l'éther et on prélève leur sang par l'aorte abdominale On dilue le sérum ( 600 ml) par un volume égal d'eau et on extrait par deux volumes d'un mélange chloroforme/mé- thanol 1:1 On chromatographie l'extrait chloroformique du sérum sur une colonne de Sephadex LH-20 de 1,5 x 25 cm en éluant par un mélange chloroforme/n-hexane, 65-35 On soumet la fraction contenant la ( 24,25OH:)2 D 3 de la colonne de Sephadex LH-20 à chromatographie de liquide sous haute pression (CLHP) sur un appareil Hitachi, modèle 635, équipé d'une colonne de Zorbax Sil de 4,6 x 250 mm en éluant par le n-hexane à 9 % d'isopropanol à un débit de 1 ml/min. On rechromatographie la fraction contenant la 25-OH-D 3-26,23-lactone en utilisant le même solvant La 26,23-lactone de la 23 (S),25 (R)-25- hydroxyvitamine D 3 ainsi obtenue est à nouveau purifiée par CLHP sur une colonne de Zorbax Sil en eluant par le dichlorométhane à 1,5 % de méthanol au débit de '1 ml/min. EXEMPLE DE PREPARATION 2 Préparation de la 26,23-lactone de la 23 (S),25 (R)-là,25-dihydroxy- vitamine D 3 On administre à un chien beagl mâle (pesant 10 kg) par voie orale 2 mg de la-hydroxyvitamine D 3 en solution dans 20 mil d'une solution à 0,2 % de Triton X-l OO 8 h après l'administration, on anesthésie le chien par du Nembutal et on prélève le sang par l'artère carotide On dilue le sérum ( 600 ml) obtenu à partir du sang par un volume d'eau égal et on extrait par 2 volumes d'un mélange chloroforme/méthanol 1:1 L'extrait de sérum ainsi obtenu est 251888 1 chromatographié sur une colonne de Sephadex LH-20 de 1,5 x 25 cm, avec élution par un solvant'de développement consistant en chloro- forme/n-hexane/méthanol 75:23: 2 La fraction contenant la la,24,25- trihydroxyvitamine D 3 provenant de la colonne de Sephadex LH-20 est ensuite soumise à-CLHP sur une colonne de Zorbax Sil avec elution par le dichlorométhane à 3,5 % de méthanol au debit de 1 ml/min La- fraction contenant la 26,23-lactone de la la,25-dihydroxyvitamine D 3 obtenue à la OLHP est rechromatographiée par CLHP dans les mêmes condi- tions La 26,23-lactone de 23 (S),25 (R)-la,25-dihydroxyvif:amine D 3 ainsi ainsi obtenue est à nouveau purifiée par CLHP sur une colonne-de Zorbax Sil avec elution par le n-hexane a 18 % d'isopropanol au débit de 1 ml/min. EXEMPLE DE PREPARATION 3 - Préparation de la 26,23-peroxylactone de la 25-hydroxyvitamine D 3 (a) On alimente des jeunes rats mfles de la souche Wistar par un'régime normal contenant de la vitamine D 3 (Nippon Clea Corp CE-2; Ca: 1,0; P: 1,0 %; vitamine D 3: 2000 UI/kg)- pendant 8 semaines à volonté On administre ensuite aux 300 rats par voie intramusculaire 4 x 105 UI de vitamine D 3 en solution dans 100 microlitres d'éthanol et,3 jours plus tard, on administre encore par voie intramusculaire 4 x 105 UI de vitamine D 3 en solution dans microlitres d'éthanol, 3 jours après la seconde administration, on anesthésie les rats à l'éther et on prélève leur sang par l'aorte abdominale On centrifuge immédiatement le sang; on obtient 1200 ml de sérum On dilue les 1200 ml de sérum par un volume égal d'eau et on extrait par 2 volumes de mélange chloroforme/méthanol, 1:1 pendant 30 min On évapore la phase chloroformique, on sèche le résidu par azéotropie avec l'éthanol et on l'utilise pour la chromatographie. On chromatographie l'extrait chloroformique de l'échantillon de sérum sur une colonne de Sephadex LH-20 de 1,5 x 25 cm en éluant par le mélange chloroforme/n-hexane; 65:35. Les fractions sortant de la colonne et contenant la 24,25dihydroxyvitamine D 3 sont séparées, combinées entre elles et concentrées On soumet ensuite la fraction contenant la 24,25- dihydroxyvitamine D 3 à chromatographie de liquide sous haute pres- sion (CLHP) sur un appareil Hitachi modèle 635 équipe d'une colonne de Zorbax Sil de-4,6 x 250 mm en éluant par le n-hexane à 9 % 251888 1 d'isopropanol au débit de 1 ml/min L'éluat est contrôlée en continu par l'absorption dans l'ultraviolet à 264 nm, et les fractions cor- respondant a des pics d'absorption dans l'ultraviolet sont re- cueillies séparément La fraction correspondant au pic d'absorption maximal dans l'ultraviolet éluée entre la 25-OH-D 3 et la 24,25-e OH) 2 D 3 a un spectre d'absorption dans l'ultraviolet correspondant au maximum typique d'absorption du cis-triène de la vitamine D à 264 nm avec le minimum à 228 nm On chromatographie cette fraction par CLHP sur une colonne de Zorbax Sil de 4,6 x 250 mm en eluant par le dichloro- méthane à 1,5 % de méthanol au débit de 1 ml/min La 26,23-peroxy- lactone de la 25-hydroxyvitamine D 3 ainsi obtenue est éluee imméediate- ment apres la position d'elution de la 25-OH-D 3 Ce métabolite est soumis à nouvelle purification par CLHP sur une colonne de Zorbax Sil avec élution par le n-hexane à 9 % d'isopropanol au débit de 1 ml/min. Le composé est élue juste avant la position d'elu- tion de la 23 (S),25 (R)-25-OH-D 3-26,23-la Qtone ou de la 24,25-(OH)2 D 3. (b) Les caractéristiques spectrales des composés obtenus 'sont les suivantes: -spectre UV : 264 nm max A: 228 nm mi.n spectre de masse (m/e); 412, 400, 372, 354, 339, 313, 271, 253, 136, 118 sp e de masse FD pic d'ion moléculaire: 444 spectre infrarouge a transformation de Fourier -1 on détecte un pic spécifique à 1733 cm, cor- respondant à l'absorption de la -lactone. * Ces résultats confirment que le composé obtenu est la 26,23-peroxylactone de la 25-hydroxyvitamine D 3. EXEMPLE 1 Fonctions pharmacologiques des 26,23-lactones de 25-hydroxyvitamine D 3 (i) Influences des 26,23-lactones de 25-h 1 droxyvitamine D 3 sur le transport intestinal du calcium et la concentration du calcium dans le sérum (a) On alimente des jeunes rats màles de la souche 251888 1 Wistar par un régime à faible teneur en calcium et déficient en vitamine D 3 pendant 6 semaines à volonté Au bout des 6 semaines, on administre aux 5 rats pesant chacun 100 g environ, par voie intra- veineuse, 500 ng de la 26 23-lactone de la 25-hydroxyvitamine D 3 obtenue dans l'exemple de préparation 1, 250 ng de lc,25-dihydroxy- vitamine D 3 et 500 ng de 25-hydroxyvitamine D 3 dissoutes respecti- vement dans 0,2 ml de solution à 0,2-% de Tiiton X-100 Les rats sont ensuite sacrifiés et on détermine le transport intestinal du calcium et la concentration du calcium dans le sérum Le transport intestinal du calcium est mesuré par le mode opératoire décrit par De Luca et col (Am J Physiol, 216, pages 1351 à 1359, 1969) et la concentration du calcium dans le sérum par la méthode à l'O-crésol- phtaléine-complexone (méthode à l'OCPC, Am J Clin Pathol, 45, pages 290 à 296, 1966). Le résultat des mesures du transport intestinal du calcium est représenté graphiquement dans la figure 1 et la concen- tration du calcium dans le sérum dans la figure 2. (b) On procède à une expérience identique à celle effectuée ci-dessus sous (a)i mais en utilisant 125 ng de la 25,23- lactone de la la,25-dihydroxyvitamine D 3 obtenue dans l'exemple de préparation 2 et 125 ng de lai 25-dihydrovitamine D 3 Les résultats obtenus sont représentes dans les figures 3 et 4. (c) On procède à une expérience identique àcelle décrite ci-dessus sous (a), mais on utilise 125 ng de la 26,23-peroxy- lactone de la 25-hydroxyvitamine D 3 obtenue dans l'exemple de prepa- ration 3 et 125 ng de la,25-dihydroxyvitamine D 3 Les résultats obtenus sont représentés dans les figures 5 et 6. Les graphiques des figures 1, 3 et 5 montrent que les 26,23-lactones de 25-hydroxyvitamine D 3 selon l'invention stimulent légèrement le transport intestinal du calcium. Les graphiques des figures 2, 4 et 6 montrent que les 26,23-lactones-de 25-hydroxyvitamine D 3 selon l'invention provoquent une diminution des teneurs en calcium du sérum. (ii) Relation dose-réEonse entre les 25-O-D 3-2-6 23-lactones et le transport intestinal du calcium et les teneurs en calcium du serum (a) Après 6 semaines de régime à faible teneur en calcium et déficient en vitamine D, on divise les rats en groupes 2518 881 de 3 ou 5 et on administre à chacun des animaux, en une seule-dose intraveineuse, la 25-OH-D 3-26,23-lactone en solution dans 0,2 ml de solution de Triton X-100 à 0,2 L Aux animaux témoins, on administre uniquement les vehicules 8 ou 24 h plus tard, on décapite les animaux et on mesure le transport intestinal du calcium et la con- centration en calcium dans le sérum comme décrit en (i), (a) ci-dessus. Les résultats obtenus sont rapportés dans -le tableau I ci-dessous. Ces résultats sont exprimés par la moyenne + E T M Différence signi- fiante avec le témoin: a;p TABLEAU I (b) On procède a une expérience identique à celle décrite ci-dessus sous (a), mais on utilise la 26,23-lactone de la lu,25-dihydroxyvitamine D 3 Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau II ci-dessous Ces résultats sont exprimés en moyenne + E T M Difference signifiante avec le témoin: a;p b;p TABLEAU I Il Dose Temps Transport intestinal du Ca Ca dus rumi Compose 5 5 Composé (ng) (h) 450 a séreux/45 Ca muqueux (mg/100 mtj Vehicule 8 1,714 + 0,14 4,804 + 0,10 a al la 25-(OH) D o 10 8 2,50 + 0,15 c 4,9849,09 c 2 3 50 8 4, 150, 20 c 5, 530, 12 c 8 5,17 + O 18 5,66,18 c 250 8 5,370,23 c 6,1440,24 _: Dose Temps Transport intestinal du Ca Ca du sérum Composé (ng) () 4-4 Composé (ng) (h) 45 Ca sereux/45 ca muqueux (mg/100 ml) Véhicule 8 1,74 + 0,16 4,74 + 0,17 l, 25-(O 1 H) D 10 8 2,4840,15 a 4,95 + 0,18 a 8 4,2 _ O + 0,22 c 5,60 + 0,18 c 8 5,06 +O,31 c 5,92 + 0,20 250 8 5,33 + O > 28 -6; 0940,22 -OH-D 3-26,23 100 24 2,1440,13 4,8040,16 lactone 500 24 2,65 + 0,20 b 4,7040,18 2500 24 3,2740,24 b 4,62 + 0,21 _ _ _ __ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ I TABLEAU Il (suite) Compoé -Dose Temps Transport intestinal du Ca Ca du sérum (ng) (h) 45 Ca séreux/ 45 Ca muqueux (mg/100 ml) 1 l,25-(OH)2 D 3100 8 2,26 + 0,29 b 4,51 + 0,16 a 26-23-1 actone 250 8 2,7 14 b 4 $ 47 + 0,12 26-23-lactone500 8 3,13 + O; 24 4, 2340,13 24 1,96-0,27 a 4,25 + 0, 20 c 250 24 2,1240,22 4,10 îo,19 500 24 2,31 0,20 3,97 + 0,21 Les résultats rapportés dans les tableaux I et II montrent clairement que la-dose administrée des 26,23-lactones de 25- hydroxyvitamine D 3 selon l'invention stimule le transport intestinal du calcium et diminue 1 a teneur en calcium du sérum. (iii) Influence des 26231-lactones dela 25-hydroxyvitamine D 3 sur la l"L 25-dihydroxyvitamine D 3 À (a) On divise en 4 groupes de 5 animaux des rats alimentés par un régime à faible teneur en calcium et déficient en vita- mine D On administre la première dose de 500 ng de 25-OH-D 3-26,23- lactone en solution dans O,02 ml d'une solution de Triton X-100 à 0,2 % ou le vehicule seul par voie intraveineuse 80 h plus tard, on administre la seconde dose de 250 ng de la,25-(OH)2 D 3 en solution dans 0,2 ml de solution de Triton X-100 à 0,2 % ou le véhicule seul par la mime voie 15 h après la-seconde dose, on sacrifie les animaux et on mesure l'activité de transport intestinal du calcium et la concentration du calcium du sérum comme en (i), (a) ci-dessus Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau -III ci-dessous Ils sont exprimés en moyenne + E T M Différence signifiante avec le témoian: a;p TABLEAU III Composé Composé Transport intestinal du Ca Ca dusérum première dose seconde dose 45 45 Ca séreux/ Ca muqueux (mg/100 ml) Vehicule Véhicule 1 171 + 0,13 4 % 8440,18 -OH-D 3-26,23 Vehicule 1,80 + 0,09 4,1440,19 lactone Véhicule l,25-(OH)2 D 3 3,964 + 0,18 5,8240,16 -OH-D -26 223- -26,32 la 25-(OH)2 D 3 3,910,10 a 4,88 + 0,20 lactone H)2 - (b) on divise en 4 groupes'de 5 individus des rats alimentés par un régime à faible teneur en calcium et déficient en vitamine D pendant-6 semaines On leur administre la première dose de 125 ng de la,25-(OH)2 D 326,23-lactone en solution dans 0,2 ml de solution de Triton X-100 à 0,2 % ou le véhicule seulement par voie intraveineuse 12 h plus tard, on administre la seconde dose de nm de la,25-(OH)2 D 3 en solution dans 0,2 mi de solution de Triton X-100 à 0,2 % ou le véhicule seulement par la même voie 12 h après la seconde dose, on sacrifie les animaux et on mesure l'acti- vité de transport intestinal du calcium et la concentration en calcium du sérum comme décrit en (i), (a) ci-dessus Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau IV-ci-dessous Ils sont exprimés en moyenne + E T M Différence signifiante avec le témoin: a;p et b;p TABLEAU IV Les résultats rapportés dans les tableau: III et IV montrent clairement que la la,25-dihydroxyvitamine D 3 augmente dans une mesure notable les teneurs en calcium du sérum alors que, par contre, les 26,23-lactones de 25-hydroxyvitamine D 3 selon l'inven- tion provoquent une diminution notable des teneurs en calcium du sérum. Il est également clair que, lorsqu'on administre la 26,23-lactone de 25hydroxyvitamine D 3 (en première dose) avant la loe,25-dihydroxyvitamine D 3 (en seconde dose), on limite les augmentations des teneurs en calcium du sérum dues à la la,25-dihydroxy- vitamine D 3. Composé d a Cad éu Transport'intestinal du Ca Ca du sér première dose seconde dose 45 45 4 Ca séreux/45 Ca muqueux (mg/ 100 ml) Véhicule Véhicule 1,6640,21 4,8240,09 l 1, 25 (OH)2 D 3Vehicule 1,79 + 0, 13 4, 1240, 09 26, 23-lactone Véhicule la 125-(OH)2 D, 3 b 5340 14 5 9440 12 ba 1,G 25-(OH)D la,25-(OH)2 D 3,62 _ 4016 5 à 52- 10,12 a 26, 23-lactone (iv) Aumentation de l'excrétion urinaire du calcium 2 ar la la 22-(OH:D -23lactone ffl On alimente des rats méles de la souche Wistar par un régime à faible teneur en calcium et déficient en vitamine D pendant 6 semaines Après ligature des urètres, on administre à chacun des 5 rats, par voie intraveineuse, 125 ng de la,25-(OH)2 D 3- 26,23-lactone en solution dans 0,2 ml de solution de Triton X-100 à 0,2 % ou le véhicule seulement 24 h plus tard, on sacrifie les animaux et on recueille l'urine dans leur vessie On détermine la concentration en calcium de l'urine par la méthode de l'O-crésol- phtaléine-complexone Les résultats obtenus sont rapportes dans le tableau V ci-dessous. TABLEAU V Les résultats sont exprimés par la moyenne +E T M. Différence signifiante avec le témoin: a;p Les résultats rapportes dans le tableau V montrent clairement que la la, 25-(OH)2 D 3-26,23-lactone selon l'invention accroît l'excrétion urinaire du calcium. EXEMPLE 2 Préparation de capsules molles On dissout la 26,23-lactone de la la,25-dihydroxy- vitamine D 3 dans une huile grassé, une concentration de 7 /ug/ml. On fond à chaud les composants de l'enveloppe consistant en 100 par- ties en poids de gélatine, 20 parties en poids de glycérine, 0,2 par- tie en poids de parahydroxybenzoate d'éthyle, 0,2 partie en poids de parahydroxybenzoate de propyle, 0,5 partie en poids de sel di- sodique de l'acide l-para-sulfonylazo-2-naphtol-6-sulfonique et parties en poids d'eau purifiée, formant ainsi la matière Composé Ca du sérum Excrétion urinaire (mg/100 ml) du Ca (ug) Véhicule 4,90 + 0, 12 51 X 2 + 3,6 -(OH)2 D 3-26,23-bactone 3,970,07 69,84, 1 k X,25-(OH)2 Dj-26,23lactone 3,9740 O,07 69,8 + 4,A d'enveloppe On prépare des capsules molles contenant chacune 1 yg de 26,23-lactone de la la,25-dihydroxyvitamine D 3 en utilisant cette matière d'enveloppè sur une machine à former en continu des capsules molles - R E V E N D I C A T I ONS S ___________________________ 1 A titre de médicaments nouveaux, utiles notamment pour agir sur la concentration en calcium du sérum chez les animaux à sang chaud et les humains, les 26,23-lactones de 25-hydroxyvitamine D 3 et dérivés répondant à la formule I (I) HO R dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy et X représente -O ou -0-0-. 2 Médicaments selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'on les utilise pour diminuer la concentration en calcium du sérum. 3 Médicament selon la revendication 1 ou 2, caracté- risé en ce qu'il consiste en la 26,23-lactone de la la,25-dihydroxy- vitamine D 3. 4 Médicament selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 3, caractérisé en ce qu'il consiste en la 26,23-lactone de la 23 (S),25 (R)-la,25-dihydroxyvitamine D 3. Médicament selon l'une quelconque des revendications I à 4, caractérisé en ce qu'il est adminstré à des doses de 5 ng à ng/kg de poids corporel et par jour 6 Compositions thérapeutiques utiles notamment pour agir sur la-concentration du calcium dans le sérum des animaux à sang chaud, y compris les humains, caractérisées en ce qu'elles contiennent en tant que composant actif un médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, avec un véhicule acceptable pour l'usage phar- maceutique. 7 Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose unitaire de 26,23-lactone de 25- hydroxyvitamine D 3 de formule I selon la revendication 1 et un véhicule acceptable pour l'usage pharmaceutique. 8 Composition pharmaceutique selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce qu'on l'utilise pour diminuer la concentra- tion en calcium du sérum. 9 Composition selon la revendication 7 ou 8, caracté- risde en ce qu'elle est prévue pour l'administration orale. 10 Composition selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisée en ce qu'elle contient de 0,25 à 2 microgrammes de composant actif de formule I selon la revendication 1 par unité de dosage.