FR 2521569 A1 19830819 FR 8302332 A 19830214 2 5 2 1 5 6 9 1 La présente invention concerne la dépolymérisation spécifique d'un polysaccharide possédant une structure hélicoidale en bâtonnets. On a trouvé que plusieurs polysaccharides visqueux tels que xanthane, lentinane, schizophyllane, scléroglucane ou curdlane, possèdent des structures hélicoidales à deux ou trois nappes ( T Norisuye, et coll J Polymer Scien- ce, Polymer Physics Ed 18, 547-558 ( 1980):E D T Atkins et K D Parker; J Polymer Science Part C 28, 69-81 ( 1969): T L Bluhm et A Sarko; Can J. Chem 55, 293-299 ( 1977): R H Marchessault, et Coil Can J Chem 55, 300- 303 ( 1977): E R Morris; A C S Symposium Series, n, 45, 81 ( 1977): E R. Morris, et al; J Mol, Biol 110, 1 ( 1977)) On a recherché à exploiter les potentiels de ces polysaccharides, on en a développé certains à titre d'agents épaississant pour l'industrie alimentaire sur la base de leurs viscosités et on a trouvé que d'autres possèdent des activités antitumorales à médiation d'hôte puissantes Mais dans certains cas, les viscosités extrêmement élevées de leurs solutions ont rendu leurs utilisations difficiles. Afin de réduire correctement leurs viscosités, nous avons inventé une méthode à ultra-sons pour la dépolymérisation'des polysaccharides (brevet japon- nais rendu public (Kokai) n 57335/1977) Nos recherches sur le mode de la dépolymérisation par ultra-sons ont confirmé qu'elle était principalement due aux séparations de la chaine principale du polysaccharide et que ni la chaine latérale ni la liaison carbone-carbone dans le résidu glucose ne se coupait au cours de la dépolymérisation sonique Ainsi, le polysaccharide dégradé résul- tant se compose de la même unité périodique et il possède également la même structure hélicoïdale que celle du polysaccharide d'origine. Récemment, on a trouvé que la méthode de dépolymérisation par ultra- sons neconvenait pas pour une dépolymérisation industrielle d'un grand volume de polysaccharides du fait de sa faible efficacité La méthode de dépolyméri- sation par ultra-sons implique également un haut niveau sonore et une érosion de la tige de vibration de l'oscillateur à ultra-sons. La présente invention découle de la découverte que le traitement d'une solution du polysaccharide sous un taux de cisaillement élevé dépolymérise également le polysaccharide d'une manière semblable à celle du traitement aux ultra-sons; c'est-à-dire que seule la chaine principale du polysaccharide,à l'exclusion d'aucune autre liaison glucosidique et d'aucuneliaison carbone- carbone dans le résidu glucose, se coupe au cours du traitement de dépolymérisation réalisé dans ces conditions. Le polysaccharide à structure hélicoidale est connu pour se disperser en chaines uniques dans des conditionsspécifiques; par exemple, le béta11,3- D glucane se disperse en chainoe uniques dans une solution alcaline ou de diméthyl sulfoxyde Lorsque la solution de diméthyl sulfoxyde est diluée avec de l'eau ou la solution alcaline neutralisée avec de l'acide, on ne retrouve pas la structure hélicoïdale du polysaccharide mais, par associa- tion-au hasard, il se forme un gros agrégat La présente invention est seule- ment utile pour une solution de polysaccharide possédant une structure hélicoî- dale et non pour celle possédant une structure à chaine unique ou une struc- ture en agrégat. La présente méthode a confirmé sa capacité à surmonter les inconvé- nients précédents tels que faible efficacité, haut niveau sonore, ou érosion de la tige de vibration de l'oscillateur à ultra-sons, que l'on avait rencon- trés dans la méthode de dépolymérisation par ultra-sons. On connait llhydrolyse acide et la dégradation enzymatique d'un poly- saccharide L'hydrolyse acide coupe également toutes les liaisons glucosidiques du polysaccharide alors que la dégradation enzymatique provoque l'hydrolyse d'une liaison glucosidique spécifique. Mais leurs modes de dépolymérisation sont tout à fait différents de ceux de la méthode par ultra-sons et de la présente méthode Ils libèrent des mono-ou oligo-saccharides à très faible poids moléculaire et ils ne conduisent pas quantitativement à un polysaccharide dégradé qui possède les mêmes struc- tures chimiques et de conformation que celles du polysaccharide d'origine. Un objet de la présente invention est de dépolymériser un polysaccha- ride possédant une structure hélicoïdale en bâtonnets en forçant sa solution à a sécouleravecun tnuxde cisaillement élevé. Un autre objet de la présente invention consiste à fournir un polysac- charide dégxradâ particulier qui se compose de la même unité périodique et qui possède lamême structure 1 elicoidale que lepolysaccharide de départ Une solu- tion du polysaccharide dégradé présente une viscosité extrêmement plus faible comparativement à celle du polysaccharide de départ, et le polysaccharide con- serve encore les caractéristiques physiques et chimiques telles que l'activi- té anti-tumorale du polysaccharide d'origine excepté en ce qui concerne le poids moléculaire et la viscosité La réduction de la viscosité de la solution est utile pour son utilisation industrielle Par exemple, elle rend l'adminis- tration du polysaccharide facile dans le cas de son utilisation clinique comme médicament anticancéreux, ou une solution thixotropique du polysaccharide de départ se transforme en fluide Newtonien, améliorant la fluidité d'un aliment contenant le polysaccharide. On réalise la dépolymérisation selon la présente invention en forçant une solution du polysaccharide à passer à travers un capillaire avec un taux de 4 dr cisaillement élevé, de préférence supérieur à 1 X 10 sec Des exemples 1 despolysaccharidesutilisésdans la présente méthode sont la gomme de xanthane et les béta-1,3-D glucanes. On constate que l'efficacité de dépolymérisation de la présente métho- de est accrue, quand la concentration de la solution de polysac- charide augmente, en particulier lorsqu'elle est supérieure à 0,1 % en poids. On a également trouvé que l'addition d'un solvant ( solvant B) à la solution de polysaccharide augmente l'efficacité de la dépolymérisation selon la présen- te méthode lorsque le solvant B est miscible au solvant ( solvant A) de la solution de polysaccharide et ne dissout pas le polysaccharide. On réalise la dépolymérisation du polysaccharide en forçant une solu- tion du polysaccharide à passer à travers un capillaire tel qu'ajutage, fente, ou produits céramiques ou plaques frittées poreuses,en utilisant une force mo- trice produisant une pression élevée. La vitesse de dépolymérisation dépend seulement de la valeur du taux de cisaillement appliqué, qui résulte de la force motrice, de la pression, du diamètre et de la longueur du capillaire utilisé et de la viscosité de la solution Tandis que se répète le passage de la solution à travers un capillaire- dans certaines conditions, le poids moléculaire du polysaccharide diminue progressivement, approchant une valeur minimum, à partir de laquelle ne se pro- duit plus de dépolymérisation Le poids moléculaire minimum dépend également de la valeur du taux de cisaillement appliqué; un taux de cisaillement plus élevé donne un poids moléculaire plus faible. Ainsi, la valeur du taux de cisaillement appliqué est un facteur domi- nant pour la présente méthode Il ne se produit aucune dépolymérisation subs- tantielle à un taux de cisaillement trop faible Généralement, un taux de ci- saillement au moins supérieur à 1 X 104 sec 1 est nécessaire pour la présente méthode de dépolymérisation. Afin d'obtenir un taux de cisaillement aussi élevé, la pression appli- quée à la solution de polysaccharide et la surface de la section transversale du capillaire sont respectivement 20 10 -800 105 Pa et 1 X 10 100 mm 2 Mais ces valeurs ne sont pas limitées. La présente invention permet les constatations suivantes 1 une augmentation de la concentration de la solution de polysaccharide ac- croit l'efficacité de la dépolymérisation. 2 l'addition d'un solvant ( solvant B), qui est miscible au solvant (solvant A) de la solution de polysaccharide et ne dissout pas le polysaccha- ride, à la solution de polysaccharide augmente également l'efficacité de la dépolymérisation. L'effet de l'augmentation de la concentration de la solution de polysaccharide apparait de façon significative lorsqu'elle est supérieure à 0,1 % en poids Bien qu'il soit souhaitable que la concentration soit aussi élevée que possible, une partie du polysaccharide tend à demeurer non dissoute à une concentration trop élevée à cause de sa faible solubilité Ainsi, en pratique, la concentration se situe de préférence de 0,1 10 % en poids. Le solvant B est exemplifié par l'acétone, le méthanol, l'éthanol, l'iso- ou le n-propanol, le tétrahydrofurane etc lorsque le solvant A est l'eau Dans la plupart des cas l'eau est utile comme solvant A, mais pour un dérivé du poly- saccharide insoluble dans l'eau tel qu'un dérivé N-alkylol amide du polysaccha- ride, qui possède encore une structure hélicoïdale semblable à celle du polysac- charide d'origine, on utilise l'acétone ou le benzène comme solvant A et l'eau comme solvant B. Bien que l'efficacité de dépolymérisation augmente en même temps que la quantité du solvant B ajouté augmente, cette quantité doit être limitée de telle sorte qu'il ne se forme pas de précipité insoluble de polysaccharide. La température n'a pas d'influence significative sur le résultat de la présente méthode de dépolymérisation Cependant, on effectue généralement la dépolymérisation à une température inférieure à 1000 C. Afin de dépolymériser le polysaccharide jusqu'à un certain poids molécu- laire, on force sa solution à travers un capillaire de manière répétée Jusqu'à ce que son poids moléculaire atteigne la valeur voulue. Des particules en suspension dans la solution de polysaccharide obs- truent souvent le capillaire, conduisant à l'arrêt du fonctionnement Ainsi, on filtre de préférence la solution avant son passage à travers le capillaire. Du fait qu'une solution du polysaccharide est visqueuse et adhésive, il reste une quantité importante de la solution dans les récipients ou autres matériels utilisés, après qu'elle en soit évacuée Afin d'empêcher l'adhésion de la solution sur les surfaces internes des récipients ou matériels, il est souhai- table d'agiter modérément la solution L'agitation modérée empêche également la 3 rétention d'une partie de la solution adhérant aux parois des matériels, ce qui conduit à une dépolymérisation uniforme du polysaccharide. Exemple 1 On dissout du schizophyllane possédant un poids moléculaire de 5,6 X 10 dans de l'eau pour préparer une solution à 0,2 % en poids On force la solution à passer à travers un ajutage de 0,16 mm de rayon en l'actionnant à l'aide d'une pompe àpistonplongeur Onajustele débit la solution à 0,23 cm 3/ sec, 0,90 cm 3/ sec, 14,5 cm 3/sec et 35,4 cm 3/sec par contrôle de la vitesse de la pompe Le taux de cisaillement calculé pour chaque débit à partir de la formule ci-après 4 -l 5 -i est respectivement de 7,1 X 10 sec pour 0,23 cm 3/ sec de débit, 2,8 X 10 sec, pour 0,90 cm 3/sec de débit, 4,5 X 106 sec 1 pour 14,5 cm 3/sec de débit et 1,1 1 X 10 sec-1 pour 35,4 cm T/sec de débit. Taux de cisaillement = 4 X débit IX (rayon du capillaires La figure 1 montre la relation entre le temps de rétention de la solution dans l'ajutage et le poids moléculaire du polysaccharide. Le schizophyllane de départ et tous les schizophyllanes dépolymérisés sont méthylés par la méthode de Hakomori puis hydrolysés avec de l'acide formi- que et ensuite de l'acide trifluoro acétique L'hydrolysat est acétylé avec de l'acide acétique anhydre dans de la pyridine Les constituants sucre dans le produit sont analysés par chromatographie gaz-liquide et il en résulte qu'il contient du 1,5-di-O-acétyl-2,3,4,6-tétra-O-méthyl-D-glucitol, du 1,3,5tri-O- acétyl-2,4,6 tri-O-méthyl glucitol et du 1,3,5,6-tétra-0-acétyl-2,4-di-Ométhyl- D-glucitol dans un rapport molaire de 1: 2: 1. Le schizophyllane de départ et tous les schizophyllanes dépolymérisés sont oxydés avec du méta-périodate de sodium 0,01 N et les quantités de méta- périodate de sodium consommées et d'acide formique formé sont déterminées par iodométrie suivie par la titration avec unesolution d'hydroxyde de sodium On constate une consommation de 0,48 0,55 mole de méta-périodate de sodium et la formation de 6-2 ll' 0,27 mole d'acide formique, pour une mole de résidu glu- cose dans le schizophyllane. Le schizophyllane et tous les schizophyllanes dépolymérisés sont dégra- dés avec l'exo-béta-l,3-D-glucanase Il se confirme que le produit dégradé con- tient du glucose et de la gentiobiose dans un rapport molaire de 2: 1. Les poids moléculaire du schizophyllane de départ et de tous les schizo- phyllanes dépolymérisés dans l'eau ainsi que dans le diméthyl sulfoxyde sont déterminés par la méthode d'ultracentrifugation Chaque rapport du poids molécu- laire dans l'eau à celui dans le diméthyl sulfoxyde se situe entre 2,8 et 3,3. Ces résultats indiquent que chaque polysaccharide dépolymérisé possède les mêmes structures chimiques et de conformation que celles du polysaccharide de départ. Exemple 2 On dissout dans de l'eau du scléroglucane possédant un poids moléculaire de 5 X 106 et de la gomme de xanthane possédant un poids moléculaire de 1, 4 X 10 pour préparer avec chacun une solution aqueuse à 0,5 % en poids. On applique une pression de 200 105 Pa à chaque solution et on l'a fait passer à travers un ajutage de 0,1 mm de rayon et de 5 cm de longueur Les débits sont respectivement de 1,4 cm 3/sec pour le scléroglucane et de 7, 4 X 101 cm 3 / sec pour la gomme de xanthane Ainsi, le taux de cisaillement calculé à partir de la formule ci-après est de 1,8 X 106 sec -1 pour le scléroglucane 252 1 569 -1 et de 9,4 X 105 sec 1 pour la gomme de xanthane. Taux de cisaillement 4 X débit H X (rayon du capillaire)3 On fait passer chaque solution à travers l'ajutage 10 fois dans les conditionsci-dessus Le scléroglucane dépolymérisé possède un poids moléculaire 6 de 8 X 10 et la gomme de xanthane dépolymérisée de 1,05 X 10 respectivement. Les polysaccharides de départ et résultant sont méthylés et ensuite acétylés comme décrit dans l'exemple l puis les constituants des produits sont analysés par chromatographie gaz-liquide Les analyses montrent que chaque polysaccharide dépolymérisé possède pratiquement la même structure primaire que celle du polysaccharide de départ correspondant Les rapports des poids molécu- laires dans l'eau à ceux dans le diméthyl sulfoxyde des scléroglucanes de départ et dépolymérisé sont proches de trois, ce qui montre la ressemblance entre les structures de conformation des deux scléroglucanes Les viscosités intrinsèques de la gomme de xanthane de départ et de celle dépolymérisée sont respective- ment de 12000 dl/g et de 1070 dl/g La relation entre la viscosité intrinsèque et le poids moléculaire de chacune des gommes de xanthane dépolymérisée et de départ est en accord avec la relation déterminée par Holzwarth et Coll (G. Holzwarth; Carbohydrate Research 66, 173-186 ( 1978), ce qui indique que les deux gommes de xanthane possèdent des structures hélicoidales similaires. Exemple 3: On dissout du schizophyllane possédant un poids moléculaire de 2 X 106 dans de l'eau, dans un mélange de 20 % en poids d'acétone et de 80 % en poids d'eau, et dans un mélange de 20 % en poids d'éthanol et de 80 % en poids d'eau,dans chaque cas à une concentration de 0,8 % en poids On force chaque solution à passer à travers une plaque frittée possédant une épaisseur de 1 cm et une dimension moyenne de pore de 50 microns avec une pression de 400 105 Pa I 1 ressort de manière évidente de la formule suivante que le taux de cisaillement 6 -1 pour chaque solution est supérieur à 2,5 X 10 sec. Taux de cisaillement = ( pression) X ( diamètre du capillaire) 2 X ( viscosité de la solution) X (longueur du capillaire) La viscosité de chaque solution est inférieure à 38 c p. Après 5 passages de chaque solution à travers la plaque frittée, le polysaccharide possède le poids moléculaire suivant. Poids moléculaire Solution aqueuse d'éthanol 5,3 X 10 Solution aqueuse d'acétone 6,0 X 10 Eau 7,8 X 105 1 Exemple 4 On dissout du scléroglucane possédant un poids moléculaire de 5,2 X 106 dans de l'eau pour préparer une solution aqueuse à 0,1 % en poids, à 0,45 % en poids et à 0,90 %en poids Gn soumet chaque solution à une pression de 170 10 Pa pour Iafairepasserà travers un ajutage de 0,16 mm de rayon Après 20 passages, le polysaccharide dans chaque solution possède le poids moléculaire suivant. Concentration de la solution Poids moléculaire _ 0,1 % en poids 5,8 X 10 0,45 % en poids 4,2 X 10 0,90 % en poids 2,8 X 10 Exemple 5 On filtre une solution aqueuse à i,0 % en poids du schizophyllane utilisé dans l'exemple 1 en utilisant un filtre en céramique possédant des pores de O,lmm. On applique une pression de 50 105 Pa à un récipient rempli avec le filtrat pour forcer ce dernier à passer à travers un ajutage-de 0,515 mm derayonetilestrenvoyé vers le récipient On agite le filtrat dans le récipient à un nombre de Reynolds = 120 On poursuit les mêmes opérations pendant 8 heures Le poids moléculaire du schizophyllane est de 3,7 X 106 en findetraitement Une fois la solution évacuée du récipient, il reste 100 ml de la solution dans le récipient qui adhère sur sa surface interne. On contraint la même solution de schizophyllane à passer à travers le même ajutage mais sans sa filtration sur le filtre en céramique ni l'agitation au cours de son traitement Les opérations sont arrêtées à plusieurs reprises à cause de l'obstruction de l'ajutage par des particules en suspension dans la solution Une fois la solution évacuée du récipient, on recueille 2500 ml de la solution dans le bas du récipient, coulant le long de la paroi. REVENDICATIONS 1 Procédé de dépolymérisation d'un polysaccharide possédant une structure hélicoïdale en bâtonnets, caractérisé en ce qu'il comprend une étape qui consiste à forcer une solution du polysaccharide dans un solvant (solvant A) à travers un capillaire avec un taux de cisaillement élevé, afin de produire un polysaccharide dégradé à poids moléculaire plus faible, qui possède la même unité périodique et la même structure hélicoïdale que celles du polysaccharide d'origine. 2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le poly- saccharide est un béta-1,3-D glucane. 3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le poly- saccharide est le schizophyllane. 4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le poly- saccharide est le scléroglucane. 5 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le poly- saccharide est la gomme de xanthane. 6 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la solution de polysaccharide est traitée avec un taux de cisaille- 4 -1 ment supérieur à I X 10 sec 7 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la concentration de la solution de polysaccharide est de 0,1 10 % en poids. 8 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le solvant A est de l'eau. 9 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'un solvant (solvant B) autre que le solvant A, qui est un piètre solvant ou un non solvant du polysaccharide et qui est également miscible avec le solvant A, est ajouté à la solution de polysaccharide. Procédé selon l'une quelconque des revendicationsprécédentes, M O caractérisé en ce que la solution de polysaccharide est filtrée avant son traitement à un taux de cisaillement élevé. 11 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution de polysaccharide est modérément agitée pendant le traitement à un taux de cisaillement élevé.